CN101397562B - 鸡主要组织相容性复合体/肽四聚体的构建方法及其产品 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鸡主要组织相容性复合体/肽四聚体的构建方法及由该方法得到的产品。本发明在大量表达的重组BF2-BSP、重组Chβ2m以及合成多肽的基础上，重折叠获得了BF2/肽单体复合物，进而在此基础上进行生物素化，制备得到了BF2/肽四聚体。本发明BF2/肽四聚体可用以评价IBV感染过程中抗原特异性CTLs效应，此外还可用来筛选BF2-限制的禽类病毒的T细胞表位。在制备BF2/肽四聚体的重折叠过程中，通过置换BF2肽结合槽中的肽段，所制备的BF2四聚体及可用以评价其它禽类病毒抗原特异性CTL效应。本发明为研究IBV的抗原特异性T细胞免疫奠定了基础，为研究IBV感染过程中抗原特异性CTLs的动态变化提供了有力的工具，也为BF2/肽四聚体技术应用于禽类其它病毒性疾病的T细胞免疫及表位筛选等研究工作奠定了基础。

Description

鸡主要组织相容性复合体/肽四聚体的构建方法及其产品

技术领域

本发明涉及主要组织相容性复合体(MHC)I类分子四聚体的构建方法，尤其涉及一种鸡主要组织相容性复合体/肽四聚体的构建方法及由该方法构建得到的四聚体，属于基因工程领域。

背景技术

主要组织相容性复合体(MHC)I类分子四聚体技术自1996年Altman等首次报道以来，已成为研究特异性CD8⁺T细胞免疫特性的重要技术，被广泛应用于包括SARS-CoV在内的病毒性疾病、自身免疫性疾病以及肿瘤等基础和临床免疫学研究领域。

MHC I类分子由一条45kD的重链(α链)和12kD的轻链(β链)经非共价键结合而成，其中重链由多个基因位点和多种等位基因所编码，共显性表达，呈高度多态性；成熟的α链由α1、α2、α3结构域组成，抗原结合槽位于α1和α2结构域之间，在抗原递呈过程中起着重要作用；而β2m对维持MHC I类分子天然构型的稳定性及其表达起关键作用。

MHC I类分子四聚体是通过生物素-亲和素的作用，将四个MHC-肽复合物连成一个四聚体。首先，设计特异的引物扩增MHC I类分子的胞外区，并在其COOH端加上15个氨基酸的BirA酶底物肽(BSP)；表达MHC I类分子融合蛋白，将其与β2m和特定病原的特异性T细胞表位肽进行体外折叠，形成MHC-β2m-肽复合物，并纯化该复合物；MHC-β2m-肽复合物在BirA酶的作用下被生物素标记；生物素标记的MHC-β2m-肽复合物与荧光标记(PE或FITC)的亲和素以4∶1的比例相混合，即得到荧光标记的四聚体。因此，获取大量纯化的MHCIα及β2m是制备抗原特异性MHC四聚体的必备条件之一。

目前，人MHC(即人白细胞抗原，HLA)、鼠MHC(即H-2)以及猿猴MHC I类分子四聚体技术都已得到广泛深入的研究，猪MHC(SLA)、马MHC(ELA)四聚体的相关研究也已起步。然而迄今为止，还未见到鸡MHC I类分子(BF)四聚体技术的相关报道及应用。

MHC I类分子-肽复合物的制备最先由Garboczi等报道，将人MHC I类分子HLA-A2和β2m基因克隆于原核表达载体，在大肠杆菌分别表达并可大量提纯一种可溶性分子，而后将其与HIV-1gp120包膜蛋白中的九肽以摩尔比1∶2∶40于4℃透析过夜混合(透析法)，或与肽共同稀释于200ml缓冲液10℃孵育混合(稀释法)。但由于与特异性CTLs表面TCR结合的MHC-肽复合物容易迅速解离，以致难以得到较为真实的结果。后来Altman等改进了制备工艺，将四个MHC-肽复合物连成一个四聚体，从而可获得理想稳定的结果。

常规的四聚体制备过程如下：首先，选择检测某一特定的抗原特异的T细胞所识别的抗原表位和与该表位结合MHC分子的类型；通过设计特异的引物扩增所选MHC分子的胞外区，并在其COOH端加上15个特异的氨基酸(BirA酶可识别该序列，并将该序列中的赖氨酸进行生物素标记)；表达MHC分子融合蛋白，将其与β2m和多肽进行体外折叠，形成MHC-β2m-肽复合物，并纯化该复合物；MHC-β2m-肽复合物在BirA酶的作用下，被生物素标记；生物素标记的MHC-β2m-肽复合体与荧光标记(PE或FITC)的亲和素以4∶1的比例相混合，即得到荧光标记的四聚体。

构建MHC/肽四聚体之前需要获得大量的MHC/肽单体复合物，而MHC/肽单体复合物的生成需要大量原核表达的MHC重链和β2微球蛋白，然后在高浓度的体外合成多肽的存在下重折叠而成。

MHC分子的结构与功能是近年来的免疫学界研究热点之一。MHC I递呈被CTL识别的抗原肽，在诱导机体产生抑制病毒增殖、控制肿瘤生长的细胞免疫反应过程中起关键作用。如何准确评价细胞免疫特别是特异性CTL反应一直是困扰免疫学家们的难题。1996年Altman等(Altman et al.，1996，Science 274：94)建立了MHC四聚体技术，他将MHC I类分子、抗原肽和荧光染料标记联接蛋白组成的单体物通过亲和素铰链成为四聚体复合物来定量检测HIV特异性CTL，获得了理想的结果。

β2m是组成MHC I类分子复合体的轻链分子，对于MHC I类分子在细胞表面稳定表达和有效递呈抗原肽必不可少，并且β2m能促进抗原肽与细胞表面MHC I类分子的结合；它也是制备MHC I类分子四聚体的必要成分之一。

最先用于制备四聚体的MHC分子是HLA-A2，通过形成A2-Gag和A2-Pol两种四聚体，标记HLA-A2限制的HIV特异的CTLs。起初，人们将MHC、β2m和多肽形成融合蛋白以制备四聚体，每研究一种多肽就需重新设计分子。后来研究者发现，MHC分子在体外也能与多肽结合，形成复合体，这样就大大加强了四聚体的应用。随后多种MHC分子，如HLA-A11、A28、B8、B27、B35、E1、G1、DR、DQ和CD1d分子的四聚体被制备成功，并被用于研究抗原特异的CD4⁺T辅助细胞、CD8⁺的T杀伤细胞和NK细胞在多种免疫应答中的作用。

随着MHC四聚体技术的应用和发展，人、鼠、猴等相应的四聚体都已得到长足的发展和广泛的应用。MHC四聚体技术在动物的相关研究方面也已起步，近年来该技术已先后在猪和马得以初步研究和应用(Oleksiewicz et al.，2002，VeterinaryImmunology and Immunopathology 86：55；Mealey et al.，2005，Virology 339：110)，而在禽类尚未见相关的研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种构建鸡主要组织相容性复合体/肽四聚体的方法。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种构建鸡主要组织相容性复合体/肽四聚体的方法，包括：

(1)按照现有技术分别分离、克隆鸡BF2全基因和鸡Chβ2m全基因；

(2)以鸡BF2全基因为模板，以SEQ ID No：1和SEQ ID No：2为引物按照常规PCR扩增方法，扩增得到去除了BF2的胞内区和跨膜区序列，并在C-末端融合了一段生物素化序列的鸡BF2基因片段；将该鸡BF2基因片段与pET-28a(+)表达载体相连接得到重组表达载体pET-BF2-BSP；将重组表达载体pET-BF2-BSP转化大肠杆菌，诱导目的基因表达，收集、纯化所表达的重组融合蛋白，得重组鸡BF2蛋白；

(3)以鸡Chβ2m全基因为模板，以SEQ ID No：3和SEQ ID No：4为引物按照常规PCR扩增方法，扩增得到去除了信号肽序列的鸡Chβ2m基因片段；将所扩增得到鸡Chβ2m基因片段与pET-28a(+)表达载体相连接得到重组表达载体pET-Chβ2m；将重组表达载体pET-Chβ2m转化大肠杆菌，诱导目的基因表达，收集、纯化所表达的重组蛋白，得重组Chβ2m鸡蛋白；

(4)按照现有技术方法制备得到MHC限制性多肽IBV N_71-78；将步骤(2)和步骤(3)所制备的重组鸡BF2蛋白和重组Chβ2m鸡蛋白分别稀释后加入到溶解有MHC限制性多肽IBV N_71-78的重折叠缓冲液中，孵育8-44小时，浓缩，纯化，得到鸡BF2/肽单体复合物；

(5)将鸡BF2/肽单体复合物生物素化，纯化，加入PE-链霉亲和素，孵育，纯化浓缩，即得鸡主要组织相容性复合体/肽四聚体。

上述方法中，步骤(2)中所是述诱导目的基因表达的条件优选如下：IPTG的浓度是1.1mmol/L，菌体浓度OD_600nm在0.8-1.2，诱导时间为2-4h；步骤(3)中所述诱导目的基因表达的条件如下：IPTG的浓度是0.3mmol/L IPTG，菌体浓度OD_600nm在0.6，诱导时间为5h；

步骤(2)和(3)中纯化所表达的融合蛋白的方法优选如下：优化条件后大量表达的菌体经超声波裂解且洗涤后分别获得BF2-BSP包涵体和Chβ2m包涵体，将BF2-BSP包涵体和Chβ2m包涵体用浓度为8mol/L的脲溶解后与Ni2+NTA树脂结合加入Chromatography Column空纯化柱，混匀之后使其自然沉降，弃去上清，用结合缓冲液预洗1次，再用洗涤缓冲液洗涤2次，最后用洗脱液洗脱2次，收集洗脱液，得到纯化的重组融合蛋白；

步骤(4)中所述的浓缩优选采用超滤浓缩设备进行浓缩，该超滤浓缩设备采用氮气提供压力；

步骤(5)中所述的纯化优选采用用凝胶过滤柱的方式纯化。

步骤(5)中优选的，将PE-链霉亲和素分批次的加入到鸡BF2/肽单体复合物中，所加入的PE-链霉亲和素的总体积与鸡BF2/肽单体复合物的体积比例为1∶5；

步骤(5)中所述的纯化浓缩优选采用100kD的蛋白浓缩超滤离心管进行纯化浓缩。

本发明首先克隆了纯系SPF莱航鸡BF2及鸡β2m(Chβ2m)基因，采用相关软件预测了他们的信号肽序列，将表达BF2和Chβ2m成熟肽的基因分别克隆至原核表达载体。同时，为了便于四聚体的构建，在BF2羧基端融合了一段BSP。该重组表达质粒在大肠杆菌(E.coli)中获得了高效表达，所表达融合蛋白以包涵体形式存在，将其超声波破碎离心后沉淀溶于8mol/L脲，建立了简便的BF2-BSP包涵体变性状态下纯化方法，为以基因工程方法制备BF四聚体提供了物质保障。

本发明采用了pET-28a(+)高效表达载体，其表达产物在目的蛋白的氨基端融合了6×His标签。根据6×His与过度态金属离子Ni²⁺高亲和力结合的特性，利用Ni²⁺NTA鏊合物树脂可对表达产物直接纯化。Jauknecht等的研究表明：6×His融合表达产物的载体蛋白的分子量较小，因而免疫原性很低，对目的蛋白的构象及活力影响不大，故无需用蛋白水解酶切去融合部分。另外，6×His融合蛋白与Ni²⁺的结合不需要任何功能结构，在强变性剂存在的条件仍不影响其结合。这与Altman等建立MHC I类分子四聚体技术之初通过离子交换树脂和HPLC进行纯化方法相比大为简单。此外，该标签的引入还有利于采用商品化的His单抗检测融合的目的蛋白。此外，目的蛋白的羧基端融合了一段由15个氨基酸组成的可生物素化序列，所表达重组蛋白可在体外进行生物素化。

钱丽等(2002，上海免疫学杂志，22：26)在克隆构建人MHC I类分子四聚体时选用了pET-42b(+)表达载体，该载体同样引入了6×His标签，然而该标签位于所表达蛋白的羧基端。这将影响羧基端BSP在BirA酶作用下与生物素的结合，从而降低生物素化的效果。若纯化后再采用酶切除6×His标签，势必造成操作步骤繁琐，且目标蛋白得率降低，而本发明所采用的pET-28a(+)表达载体成功避免了这一问题。

本发明人在实验中发现：BF2和Chβ2m基因的信号肽序列均严重影响该基因在原核表达系统中的表达，含有信号肽序列的外源基因基本不表达，而在去除信号肽序列之后这两段基因则均能在原核表达系统中高效表达。Tobias等(Tobias et al.，1991，Science 254：1374)曾报道：在大肠杆菌表达系统中，如果所表达蛋白的氨基端含有Arg、Lys、phe、Leu、Trp和Tyr，其半衰期仅为2min；而氨基端为其它任何氨基酸，其半衰期均在10h以上。序列分析结果表明：BF2基因的信号肽序列G/C含量高达84.13％，在所编码的21个氨基酸中，富含11个强疏水性氨基酸以及5个Leu残基；同样，Chβ2m的信号肽序列G/C含量也高达76.19％，在所编码的氨基酸中，也富含5个Leu残基。这预示着包含信号肽序列的BF2和Chβ2m基因在原核表达系统中难以起始表达，即使有表达也将迅速被降解，而去除信号肽可降低其5’端G/C含量，同时也避免了易降解氨基酸的出现，这些都能有助于表达的进行，从而能使不含信号肽序列的pET-BF2-BSP和pET-Chβ2m在大肠杆菌表达系统中能得以高效表达。

对于人MHC I的原核表达，现有的国内外研究均表明人MHC I重链和β2m基因在大肠杆菌表达系统中以包涵体形式存在。本发明所表达的BF2-BSP和Chβ2m在大肠杆菌表达系统中仍以包涵体形式存在。Eliana(1998，Current Opinion inBiotechnology 9：157)指出：重组蛋白以包涵体形式表达具有表达量高、对宿主细胞毒性小、不易被降解且易于纯化等优点。并且复性也较易进行，这对于MHC I类分子四聚体的制备极为有利。为了获得高效表达，以便于构建人MHC I类分子四聚体，Piao等(2004，Protein Expression and Purification 35：210)先后尝试了pET-30a，pET-42b，pET-22b，pET-28b，pBV220，pKKH六种重组原核表达载体来优化表达条件，这极大地增加了克隆构建鉴定及表达过程中工作量。而本发明则以同一表达载体为基础，先后从IPTG诱导浓度、起始诱导菌体浓度和诱导时间等方面优化了诱导表达条件，使BF2-BSP和Chβ2m均得以高效表达。这些优化的表达条件在使之获得高效表达的同时节约了制备BF2四聚体所需的材料的成本。

SDS-PAGE分析表明所得目的蛋白与预期大小相符，Wstern-blot分析结果显示该重组蛋白成功融合了6×His标签。在此基础上建立了变性状态下纯化包涵体的方法，获得了高纯度的BF2-BSP和Chβ2m融合蛋白。

本发明在成功制备了SPF莱航鸡重组MHC I重链和轻链的基础上，又根据文献报道(Boots et al.，1991，Localization of a T-cell epitope within the nucleocapsid proteinof avian coronavirus.Immunology 74：8)鉴定正确的T细胞表位肽合成了IBV核蛋白N_71-78肽段(WRRQARYK)，将其三者按一定比例复性重折叠制备MHC/肽复合物单体，之后进行生物素化，然后与PE标记的链霉亲和素结合成荧光标记的MHC/肽四聚体。

本发明所制备的大量高纯度的重组BF2和Chβ2m，为了便于MHC/肽复合物的生成，去除了BF2的胞内区和跨膜区序列，并在其C-末端融合了一段生物素化序列(LHHILDAQKMVWNHR)，该序列可在生物素蛋白连接酶BirA作用下进行体外生物素化。由于链霉亲和素具有四个生物素结合位点，生物素化后的MHC/肽单体复合物能与链霉亲和素生成MHC/肽四聚体。该稳定的四聚体结构可以在无需体外增殖的情况下对抗原特异性T细胞进行计数、利用流式细胞仪对其进行表型分析以及对四聚体分选的T细胞克隆进行功能研究。此外，MHC I四聚体技术还可应用于原位四聚体染色，从而可以清楚地看到组织中的抗原特异性CD8⁺T细胞及其与其它细胞之间的空间关系。

为了构建可溶性BF2/肽复合物，重组BF2重链和Chβ2m在高浓度MHC限制性多肽IBV N_71-78的条件下进行重折叠。所采用的方法借鉴了最初由David Garboczi建立的操作步骤，即：将溶解在脲中重组蛋白在特殊的折叠缓冲液(富含L-精氨酸的氧化-还原系统)中稀释，该方法效率较高，得率在10-20％(按加入折叠体系中的重链计算)。在操作过程中，本发明将David Garboczi的方法中的1L反应体系缩小到200mL，以便于操作。此外，还增加了BF2-BSP和Chβ2m的添加量，这样虽然略微降低了重折叠效率，然而却大大地提高了200mL反应体系的产量，但如果进一步提高重链浓度则会大量增加沉淀的形成。

一般情况下，本发明方法可以从一次反应中获得1-2mg MHC/肽单体复合物，这足以生成约800-1000次直接用于体外流式细胞染色所需的四聚体。如果一次需要大量的MHC/肽复合物，反应体系则可以成比例放大。在重折叠过程中，生物素化位点似乎是蛋白酶活性的偏嗜靶标而容易被降解，因此，在重折叠反应体系中需要加入蛋白酶抑制剂以保护生物素化位点，本发明人在试验中发现，如果不加入抑制剂经常会导致生物素化活性彻底消失。

在制备四聚体的过程中，本发明参考了Altman所建立的操作方法(NIH四聚体中心，www.niaid.nih.gov/reposit/tetramer/index.html)，但没有对折叠反应液进行透析，而是直接浓缩折叠缓冲液中的BF2/肽单体复合物，这样可以使过膜液中的大量剩余的多肽用于下一次重折叠。为了降低制备四聚体的成本，在合成MHC限制性的肽段时Busch等采用了未经HPLC纯化的粗肽，合成时冻干分装为12mg每管，冻存于-80℃条件下以免发生氧化等修饰过程。在重折叠前可直接溶解于重折叠缓冲液，用于200mL反应体系。

在对重折叠后的蛋白进行浓缩时，本发明采用了惰性气体氮气给超滤浓缩装置提供压力，这样既便于浓缩的进行，又不致于因影响缓冲液的pH值等而导致重折叠蛋白亚基的解离。此外，该方法便于操作且可与缓冲液交换相结合，这对后续的生物素化反应极为重要。在对重折叠后的蛋白进行浓缩时，还可采用将透析后的溶液加载至阴离子交换柱纯化之后采用超滤管离心浓缩洗脱液，但该方法与前者相比，操作相对繁琐、且损失较大。

纯化后的BF2/肽单体复合物与生物素蛋白连接酶BirA、d-生物素和ATP共同孵育可以将羧基端标记有生物素化位点的MHC重链在体外进行生物素化反应。生物素化后的样品可采用凝胶过滤柱纯化MHC/肽成分，在大约45kD处可检测到单一峰值。凝胶过滤可进一步除去游离的未结合的d-生物素，而它的存在可干扰四聚体的生成。

检测BF2/肽单体复合体外生物素化效率对生成BF2/肽四聚体的产量和质量来说十分重要。对于某些MHC等位基因而言，可利用单抗直接检测生物素化效率。该方法即通过生物素化复合物和含链霉亲和素的琼脂糖微粒先进行第一步沉淀反应，然后再采用结合了抗MHC单抗的琼脂糖微粒进行第二步沉淀反应，最后根据链霉亲和素所沉淀MHC与上清中残留MHC(被抗-MHC单抗沉淀，在蛋白胶上可分辨出来)的比例来确定生物素化效率。另一种确定生物素化程度的方法是链霉亲和素迁移试验。由于该试验比沉淀试验更加快捷且易于操作，且目前还没有BF2*15单抗的相关报道及其商品。因而本发明采用了后一种方法来检测BF2/肽单体复合物的生物素化效率。链霉亲和素迁移试验利用了生物素-链霉亲和素反应的极高亲和性(10^-14M)，这种亲和性甚至在标准SDS-PAGE条件下仍能使其结构保持稳定。少量样品在过量链霉亲和素的条件下孵育，从而使已生物素化物的BF2/肽单体复合物迅速与链霉亲和素结合，通过SDS-PAGE可检测到较大分子量蛋白的转移，而为生物素化蛋白保持不变。有文献报道，体外生物素化反应的效率应该远远大于90％，然而，必须注意的是，该酶反应的最优条件对pH值、盐离子浓度和d-生物素浓度的改变极为敏感。

链霉亲和素含有4个生物素结合位点，已生物素化的MHC/肽单体复合物纯化后可与其共同孵育形成四聚体。为了获得高质量的MHC/肽四聚体复合物，本发明将链霉亲和素将分成几小份分别加入反应体系，因此，一般情况下，MHC/肽复合物极大地超出了链霉亲和素的浓度，这一点对生成四聚体来说十分重要，因为并不能足以精确计算BF2/肽单体复合物的蛋白浓度及生物素化效率。为了进一步确保MHC/肽单体复合物总是多于可利用的结合生物素化结合位点的数量，在实验中我们将链霉亲和素和BF2/肽单体复合物按照1∶5的比例混合而不是1∶4，这一做法的结果就是造成多聚化步骤结束之后仍有BF2/肽单体复合物残存。为了除去这些因素给后续试验带来干扰，进一步采取在100 kD超滤膜上洗涤BF2/肽四聚体，同时也可以将缓冲液更换成PBS。

MHC四聚体试剂通常用于流式细胞术及原位四聚体染色，因此需要在链霉亲和素上结合适当的荧光染料(FITC、PE、TR、Alexa568或APE)。本发明选用了PE结合的链霉亲和素，因为PE激发的荧光信号强度较高，同时也便于与常用的FITC荧光区别，从而有利于对CD8⁺T细胞进行双染。

为了进一步检测本发明方法所制备的鸡BF2/肽四聚体是否能用于检测抗原特异性CD8⁺T细胞，本发明根据Seo和Collisson(1997，Journal of Virology 71：5173)的报道，用IBV H52株接种了SPF鸡，于接种10d后采血分离其PBMCs用于检测BF2/肽四聚体是否具有活性。流式细胞术检测结果表明，本发明所制备的BF2/肽四聚体可用于检测IBV N蛋白抗原特异性CTLs，并且在接种后第10天特异性CTLs的比率达3.65％。

本发明的BF2/肽四聚体可用以评价IBV感染过程中抗原特异性CTLs效应，此外还可用来筛选BF2-限制的禽类病毒的T细胞表位。在重折叠过程中，通过置换BF2肽结合槽中的肽段，所制备的BF2四聚体及可用以评价其它禽类病毒抗原特异性CTL效应。

总之，本发明在大量表达的重组BF2-BSP、重组Chβ2m以及合成多肽的基础上，成功地重折叠获得了BF2/肽单体复合物；进而在此基础上进行生物素化，制备得到了BF2/肽四聚体。这为研究IBV的抗原特异性T细胞免疫奠定了基础，也为研究IBV感染过程中抗原特异性CTLs的动态变化提供了有力的工具。此外，也为BF2/肽四聚体技术应用于禽类其它病毒性疾病的T细胞免疫及表位筛选等研究工作奠定了基础。

附图说明

图1鸡MHC I重链α(BF2)和轻链Chβ2m基因的RT-PCR扩增结果；1、4：DNA分子量标准DL-2000；2：BF2基因RT-PCR扩增结果；3、5：水对照；6：Chβ2m基因RT-PCR扩增结果。

图2BF2开放阅读框系统发育分析结果。

图3重组质粒pET-BF2-BSP和pET-Chβ2m的PCR鉴定；1、5：DNA分子量标准DL2000；2、7：pET-28a(+)通用引物扩增空载体产物；3：通用引物扩增pET-BF2-BSP结果；4、8：水对照；6：通用引物扩增pET-Chβ2m结果。

图4  重组质粒pET-BF2-BSP和pET-Chβ2m酶切鉴定结果；1、4、5、9：DNA分子量标准DL15000、2000；2：重组质粒pET-BF2-BSP；3：重组质粒pET-BF2-BSP经Xho I酶切结果；6：重组质粒pET-Chβ2m；7：线性化的重组质粒pET-Chβ2m；8：重组质粒pET-Chβ2m经BamH I酶切结果。

图5重组蛋白BF2-BSP和Chβ2m的SDS-PAGE分析结果；1、6：蛋白质分子量标准(10-200kD)；2、7：pET-28a(+)空载体诱导产物；3：重组子pET-BF2-BSP诱导表达产物；4、9：pET-28a(+)空载体未诱导产物；5：重组子pET-BF2-BSP未诱导产物；8：重组子pET-Cβ2m诱导表达产物。

图6重组蛋白BF2-BSP和Chβ2m的Western-blot鉴定结果；1、4：蛋白质分子量标准(10-200kD)；2、5：pET-28a(+)空载体对照；3：重组蛋白BF2-BSP的Western-blot鉴定结果；6：重组蛋白Chβ2m的Western-blot鉴定结果。

图7 pET-BF2-BSP和pET-Chβ2m表达条件的优化结果A：不同IPTG诱导浓度(0到1.5mM)；B：不同的菌体浓度(OD_600nm从0.1到1.6)；C：不同的诱导时间(1-8h)。

图8重组蛋白BF2-BSP和Chβ2m的纯化结果；1、4：蛋白分子量标准(10-200kD)；2：未纯化重组蛋白BF2-BSP；3：纯化后的重组蛋白BF2-BSP；5：空载体pET-28a(+)表达结果；6：未纯化的重组蛋白Chβ2m；7：纯化过程中的洗涤液；8：纯化后洗脱的目标蛋白Chβ2m。

图9BF2-BSP和Chβ2m包涵体纯化结果；1：蛋白分子量标准(10-200kD)；2：空载体pET-28a(+)；3：纯化后的Chβ2m包涵体；4：纯化后的BF2-BSP包涵体。

图10重折叠产物非还原型SDS-PAGE检测结果。

图11BF2、Chβ2m和肽重折叠后FPLC纯化产物。

图12生物素化BF2/肽单体复合物经FPLC纯化。

图13链霉亲和素迁移实验鉴定BF2/肽四聚体的生成；1、蛋白分子量标准(10-200kD)；2、生物素化后的BF2/肽复合物；3、生物素化BF2/肽复合物与PE-链霉亲和素多聚化产物；4、PE-链霉亲和素

图14BD流式细胞仪双色荧光校正补偿。

图15BF2/肽四聚体的功能检测；A.接种IBV H52株鸡的PBMCs检测结果；B.阴性对照鸡的PBMCs检测结果。

具体实施方式

以下通过实施例来进一步描述本发明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

实施例1  可生物素化鸡MHCIα(BF2)及鸡β2微球蛋白(Chβ2m)的克隆构建、表达及纯化

1.1材料

1.1.1实验动物

纯系SPF级莱航鸡(Gallus gallus)抗凝血由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。

1.1.2感受态菌种和表达载体

大肠肝菌(Escherichia coli)感受态菌种DH5α、BL21(DE3)菌株、表达载体pET-28a(+)质粒、由中国农业科学院哈尔滨兽医研究人畜共患病研究室保存。

1.1.3主要试剂

6×His单抗、His-Bind Resin和Chromatography Column纯化柱购自于Novagen；DNA分子量标准DL2000、DL15000、pMD18-T载体、限制性内切酶EcoR I、Hind III、Xho I、BamH I、DNA快速连接试剂盒、X-ga1、反转录酶AMV、普通耐热DNA聚合酶、长片段耐热DNA聚合酶等均为宝生物工程(大连)有限公司产品；DEPC、TRIzol试剂购自Invitrogen；质粒小量提取试剂盒与胶回收试剂盒为上海华舜公司产品；辣根过氧化物酶(HRP)标记兔抗鼠IgG为Sigma产品；蛋白分子量标准PageRuler^TMProtein Ladder为Fragments产品；氨苄青霉素、卡那霉素、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、尿素等为上海华舜分装Amerosco产品；DAB购自北京中杉公司。

1.1.4主要仪器

Thermo PX2基因扩增仪。HITACHI CF16RX落地式低温离心机，Eppendorf连接仪，电热恒温培养箱(上海医用仪表厂WMZK-01)，pH计(BECKMAN 320 PHMeter)，水平电泳槽(北京六一仪器厂)，Bio-Rad蛋白电泳仪及转印系统，电热恒温水浴锅(DK-8D上海精宏实验设备有限公司)，JY92-2D超声波破碎仪。

2.1方法

2.2.1引物设计

参考GenBank已登录的BF2和Chβ2m基因序列，采用OLIGO6.0软件选取其开放阅读框(ORF)两端高度保守区域分别设计克隆引物，其序列分别如下：

Fa1：5′-TGC AGC GGT GCG AGG CGA T-3′；

Ra1：5′-TTA TTT CAC AGG AAG CAG TGC-3′；

Fb1：5′-ACAGCG GAG CCATGG GGAA-3′；

Rb1：5′-ATC CCG GGCACA GCT CAGA-3′。

待BF2和Chβ2m的基因序列确定后，采用SingnalP 3.0软件预测该基因信号肽及BF2的跨膜区序列，同时根据其基因特性结合pET-28a(+)载体多克隆位点，采用OLIGO6.0软件设计去除信号肽及跨膜区序列的特异性表达引物，在各自的上下游引物分别引入EcoR I和Hind III酶切位点，同时在BF2下游引物序列区引入编码长度为15个氨基酸的BSP DNA序列，BF2和Chβ2m的上下游引物分别如下：

Fa2：5’-G

AT GGG GCC GTG CGG GG-3’；(SEQ ID NO：1)

Ra2-BSP：5’-GCG C

TT AAC GAT GAT TCC ACA CCA TTT TCTGTG CAT CCA GAA TAT GAT GCA GGA TGG AGG GGT TGC TCC CGG G-3’；(SEQ ID NO：2)

Fb2：5’-G

AT GGG GAAGGC GGC GGC-3’；(SEQ ID NO：3)

Rb2：5’-GCG C

TTAGAACT CGG GAT CCC A3’(SEQ ID NO：4)

以上引物均由上海英骏(Ivitrogen)公司合成。

2.2.2鸡全血总RNA的提取

取SPF级莱航鸡EDTA-2Na抗凝静脉全血400μL，加入1mL TRIzol混匀，室温静置5分钟；加300μL氯仿剧烈振荡15s，室温静置3min后于12000r/min 4℃离心15min；取水相移入新离心管，取等体积异丙醇混匀室温静置10min；12000r/min 4℃离心10min，弃上清，用500μL 75％乙醇洗涤离心后将沉淀溶于30μL DEPC水，于-80℃保存备用。

2.2.3RT-PCR扩增BF2和Chβ2m基因及其克隆

分别取10μL总RNA悬液与1μL(20pmol)BF2和Chβ2m基因的下游引物Ra1和Rb1混匀后置于70℃水浴中，作用10min，再依次加入5×反转录酶缓冲液、100mmol/LdNTP 4μL、RNA酶抑制剂1μL(20U)、M-MLV反转录酶1μL(10U)，42℃水浴中作用1.5h，转录完毕后，在冰上冷却2min。在PCR管中依次加入10×长片段耐热DNA聚合酶缓冲液10μL、2.5mmol dNTP 4μL、20pmol/μL Fa1、Ra1以及Fb1、Rb1引物各1μL、长片段耐热DNA聚合酶1μL(2.5U)，灭菌去离子水补足50μL，在基因扩增仪上扩增。反应条件是95℃预变性5min，94℃1min、62℃1min、72℃1min，35个循环，最后72℃延伸10min。取5μL PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳鉴定扩增结果。

将鉴定正确的样品在琼脂糖凝胶上用胶回收试剂盒切胶回收纯化的目的基因，然后与pMD18-T载体按适当比例混合，加入连接酶I于14℃～16℃水浴中反应1h。取10μL连接液转化至感受态DH5α中，最后与20μL X-gal(50mg/mL)、4μLIPTG(200mmol/L)混匀后涂布于含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB平板，37℃培养过夜。挑取白色单菌落扩大培养后用质粒提取试剂盒提取重组质粒，并用PCR初步鉴定，最后将样品送至上海英骏(Invitrogen)生物技术有限公司以ABI 377自动DNA测序仪测定所获得的BF2及Chβ2m基因序列。鉴定阳性的重组质粒分别命名为T-BF2和T-Chβ2m。

2.2.4所扩增BF2基因的进化分析

采用DNASP4、PUAPwin32和Treeview等进化分析软件，将扩增所得的我所SPF鸡BF2基因序列与GenBank中所登录的所有BF2单倍型基因进行进化分析，以确定本实验所用的我所SPF鸡的MHC I的遗传背景。

2.2.5预测BF2和Chβ2m基因信号肽

采用丹麦科技大学生物序列分析中心官方网站提供的在线蛋白信号肽预测软件SignalP 3.0对本实验所获得的两段基因BF2和Chβ2m进行分析，以确定这两段基因是否含有信号肽以及其具体的切割位点等，同时预测BF2跨膜区序列，从而便于后续表达工作的开展。

2.2.6BF2和Chβ2m表达载体的亚克隆

采用删除信号肽和跨膜区、并添加BSP序列的BF2-BSP引物Fa2和Ra2以及扩增编码Chβ2m成熟肽的引物Fb2和Rb2，以携带BF2和Chβ2m基因全序列的质粒T-BF2和T-Chβ2m为模板，按2.2.3中所介绍的方法进行PCR扩增编码BF2-BSP和Chβ2m基因，扩增产物分别经EcoR I和Hind III双酶切后业克隆至同上酶切处理的pET-28a(+)表达载体、连接后转化DH5α感受态细胞、涂布于含卡那霉素抗性的LB平板于37℃培养过夜，挑取单菌落接种于5mL含卡那霉素抗性的液体LB培养基，于37℃空气浴摇床培养过夜，用质粒提取试剂盒提取单菌液质粒，置后采用pET-28a(+)通用引物PCR扩增及Xho I酶切鉴定筛选转化子，将初步判定阳性重组子菌种送至上海英骏(Invitrogen)生物技术有限公司采用pET-28a(+)通用引物以ABI 377自动DNA测序仪测序鉴定。将阳性克隆分别命名为pET-BF2-BSP和pET-Chβ2m。

2.2.7 pET-BF2-BSP和pET-Chβ2m在E.coli中的表达

以测序鉴定正确的pET-BF2-BSP和pET-Chβ2m重组质粒分别转化感受态细胞BL21(DE3)，挑取单菌落接种于含卡那霉素(50μg/mL)LB液体培养基，37℃振荡培养过夜；然后以1∶100的比例接种于含50μg/mL卡那霉素的LB培养液，37℃振荡培养至D_600nm为0.6时，加入终浓度为0.4mmol/L IPTG于37℃诱导培养4h；离心收集菌体，以50mmol/L Tris-HCl(pH 8.0，含1mmol/L EDTA，50mg/L蛋白酶抑制剂PMSF及10mmol/L DTT)重悬，在冰水浴中采用超声波破碎仪破碎菌体，离心后分别收集上清和沉淀，其中沉淀部分(包涵体)以50mmol/L Tris-HCl(pH8.0，含100mmol/LNaCl，1mmol/L EDTA，1mmol/L DTT及0.5％Triton X-100)重悬离心洗涤3次，然后再以不含Triton X-100的同一缓冲液洗涤3次，得到的包涵体用10mmol/L Tris-HCl(pH7.0，含8mol/L脲和1mmol/L DTT)溶解，30min后12000g离心10min，取上清待检。

2.2.8目的蛋白的鉴定

分别将裂解上清及溶解的包涵体加等量蛋白质电泳上样缓冲液，进行SDS-PAGE，浓缩胶浓度3％，分离胶浓度15％，然后用考马斯亮蓝R-250染色2h，脱色后观察目的条带。同时将另一块SDS-PAGE后的凝胶上的条带转至硝酸纤维滤膜上，膜以封闭液(PBS，pH 7.4，含1％牛血清白蛋白和0.05％Tween 20)于37℃振荡封闭2h，加入以封闭液稀释(1∶5000)的抗6×His单抗于37℃温育2h，洗膜后加1∶5000稀释的HRP-羊抗小鼠IgG于37℃温育1h，洗膜后用DAB显色，之后采用去离子水中止显色反应。

2.2.9 pET-BF2-BSP和pET-Chβ2m表达条件的优化

①优化IPTG诱导浓度：在一2000mL三角瓶中按1％接种剂量将阳性菌种接至400mL含卡那霉素的LB中，将其置于37℃恒温摇床225r/min振荡培养至OD_600nm为0.6时，将其分装至125mL三角瓶各20mL，分别向其中加入终浓度0～1.5mmol/L IPTG，继续在37℃恒温摇床培养4h，收菌离心后称量菌体湿重，超声裂解并洗涤后按每克菌体湿重加10mL 8mol/L脲溶解沉淀，沉淀溶解30min后12000g离心取上清用SDS-PAGE检测表达状况。

②优化菌体起始诱导浓度：在一三角瓶中如上法接种阳性菌种，在菌体浓度D_600nm每增加0.2时取出20ml菌液至小三角瓶，加入上述最佳诱导浓度的IPTG诱导培养4h，收菌后样品处理方法同上。

③优化最佳诱导时间：如上法接种阳性菌，取上述优化IPTG浓度和菌体起始诱导浓度诱导，诱导过程中每隔1h取20mL样品用上述方法处理样品后用于SDS-PAGE检测。

2.2.10目的蛋白BF2-BSP和Chβ2m的纯化

分别取1mL Ni²⁺NTA树脂与8mL 8mol/L脲溶解的BF2-BSP和Chβ2m包涵体上清混合物加入Chromatography Column空纯化柱中，轻柔混匀之后使其自然沉降，弃去上清，用3柱体积结合缓冲液(8mol/L脲；0.5mol/L NaCl；0.02mol/L Tris-HCl；0.005mol/L咪唑；pH7.9)预洗1次，再用3柱体积洗涤缓冲液(8mol/L脲；0.5mol/LNaCl；0.02mol/L Tris-HCl；0.02mol/L咪唑；pH7.9)洗涤2次，最后用3柱体积洗脱液(8mol/L脲；lmol/L咪唑；0.5mol/L NaCl；0.02mol/L Tris-HCl；pH7.9)洗脱2次，收集洗脱液，进行SDS-PAGE分析纯化产物。

2.3结果

2.3.1BF2和Chβ2m基因的克隆、序列测定及其分析

根据GenBank报道的几个不同品系鸡BF2和Chβ2m基因序列，在其ORF两端保守区设计引物，以SPF莱航鸡全血细胞总RNA反转录第一链cDNA为模板进行PCR扩增，分别得到与预计大小(1035、360bp)相符的DNA片段(图1，Lane 2，6)。

目的基因与pMD18-T载体连接，转化DH5α，选取白色菌落扩大培养后抽提质粒，经PCR初步鉴定为阳性之后经测序显示克隆正确，对这两段基因ORF序列分析结果显示：BF2 ORF的C+G含量显著高于A+T含量，分别为65.12％和34.88％；Chβ2mORF的C+G含量也显著高于A+T含量，分别为65.56％和34.44％。采用丹麦科技大学生物序列分析中心提供的蛋白信号肽在线预测软件SignalP 3.0分析，BF2 ORF的前63bp为信号肽序列，C+G含量高达84.13％，其编码的21个氨基酸中含有11个强疏水性氨基酸；Chβ2m ORF的前63bp亦为信号肽序列，其C+G含量为76.19％。这两段基因的序列已递交GenBank并正式公开，登录号分别为AY989897和AY989898。

本发明克隆所得基因与GenBank中登录的其他品系鸡Chβ2m ORF同源性高达100％，而本实验所扩得的BF2的基因序列与GenBank中登录的相关序列同源性差异较大，采用DNASP4、PUAPwin32和Treeview等软件将该序列与GenBank中所有登录的BF2 ORF进行系统发育分析，结果表明，本研究所得到的SPF白色莱航鸡的MHC I的单倍型与GenBank中的B15处于同一聚类枝(图2)，由此可知SPF鸡的MHC I为BF2*15。

2.3.2 pET-BF2-BSP和pET-Chβ2m重组质粒的构建及鉴定

为在E.coli中表达BF2-BSP和Chβ2m成熟肽融合蛋白，以含BF2和Chβ2m全基因的质粒T-BF2 T-Chβ2m为模板，分别以Fa2和Ra2以及Fb2和Rb2为引物，经PCR方法扩增得到了编码BF2-BSP和Chβ2m融合蛋白的DNA片段(长度分别为1017bp和300bp)，经酶切、连接至pET-28a(+)载体，提取重组质粒后采用PCR扩增和Xho I酶切筛选鉴定连入BF2-BSP基因的阳性克隆，PCR鉴定结果显示目的片段已克隆表达载体(图3 Lane 3，Lane 6)，重组质粒酶切结果与预期带型相符(图4 Lane 3，Lane 8)，经序列测定验证插入序列为正确编码BF2-BSP和Chβ2m融合蛋白的基因，且位于载体自带的6×His编码序列下游，ORF完整正确。获得的重组表达载体命名为pET-BF2-BSP和pET-Chβ2m。

2.3.3 pET-BF2-BSP和pET-Chβ2m在大肠杆菌中的表达及鉴定

将构建的重组质粒pET-BF2-BSP和pET-Chβ2m转化至大肠杆菌感受态BL21(DE3)，得到含重组质粒的基因工程菌。经IPTG在37℃诱导4h，菌体经超声波破碎离心后分为上清和沉淀，沉淀溶于8mol/L脲，样品经SDS-PAGE分析，结果表明：分子量约为38kD和15kD的融合蛋白分别得以表达，且大部分重组蛋白以包涵体形式存在于沉淀部分，而转入pET-28a(+)空载体对照的E.coli在相同分子量部位的蛋白条带明显较弱(图5 Lane 3，8)。Western-blot分析显示，含pET-BF2-BSP和pET-Chβ2m的工程菌表达产物分别在分子量38kD和15kD处的重组蛋白与抗6×His单抗有特异性反应(图6 Lane 3，6)，而阴性对照(即转入pET-28a(+)空载体的同一菌株)在IPTG诱导后，无任何特异性反应条带(图6Lane 2，5)；这说明所表达蛋白确为融合了6×His的重组蛋白。

2.3.4表达条件的优化

将含有pET-BF2-BSP和pET-Chβ2m重组质粒的阳性菌种[BL21(DE3)]分别接种至含50μg/mL卡那霉素的LB培养基，在菌体OD_600nm为0.6时分别加入0～1.5mmol/LIPTG诱导4小时，表达产物的SDS-PAGE结果显示：在培养液中极低的IPTG浓度时就能诱导重组质粒pET-BF2-BSP的表达融合蛋白，其表达量与IPTG浓度并不呈线性关系，并且IPTG浓度为1.1mmol/L时表达量最高(图7，A)；而pET-Chβ2m受IPTG诱导浓度的影响较小，各诱导浓度均能诱导pET-Chβ2m高效表达目的蛋白(图7，A)。最佳菌体起始诱导浓度的优化结果表明：菌体浓度OD_600nm为0.2和0.4时，pET-BF2-BSP表达目的蛋白的量极低，当菌体浓度OD_600nm在0.8到1.2之间时表达效果最佳(图7，B)；而pET-Chβ2m在各菌体浓度下均能高效表达目标蛋白，但在OD_600nm为0.6时表达量最高(图7，B)。从最佳诱导时间的SDS-PAGE分析结果可以看出，随着诱导时间的推移，目的蛋白表达量先呈上升趋势而后随之下降，其中在IPTG诱导2-4h之间时表达量最高(图7 C)；pET-Chβ2m的表达随诱导时间的推移略呈上升趋势，且在诱导后5h表达量最高(图7C)。综上所述，pET-BF2-BSP在大肠杆菌BL21(DE3)中优化的表达条件是：1.1mmol/L IPTG，菌体浓度OD_600nm在0.8-1.2，诱导时间为2-4h；而pET-Chβ2m最优表达条件分别为0.3mmol/L IPTG，菌体浓度OD_600nm在0.6，诱导时间为5h。

2.3.5融合蛋白BF2-BSP和Chβ2m的纯化

优化条件后大量表达的菌体经超声波裂解且洗涤后获得了纯度较高的BF2-BSP和Chβ2m包涵体(图8，Lane 2，6)，溶解在8mol/L脲的包涵体经与Ni2+NTA树脂结合后杂蛋白基本被除去(图8，Lane 7)，并获得了纯度极高的目标蛋白(图8，Lane 3，8)，且纯化后的目的蛋白大小正确、纯度高、损失较少。由此可见本实验建立的变性条件下包涵体纯化方法高效、简便易行。

实施例2 BF2/肽四聚体的构建及其功能检测

3.1材料

3.1.1实验动物

纯系SPF级莱航鸡(Gallus gallus)由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供，饲养于负压隔离器。

3.1.2病毒

IBV H52标准毒株由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所禽病研究室刘胜旺研究员滴定并惠赠。

3.1.3多肽

IBV N蛋白T细胞表位肽N_71-78(WRRQARYK)合成于上海吉尔生化有限公司，经HPLC纯化至纯度＞95％。

3.1.4主要试剂

溶菌酶、DNA酶、氧化型谷胱甘肽、还原型谷胱甘肽、胃蛋白酶、抑亮蛋白酶肽、DTT、购自于Sigma公司；MgCl₂、叠氮钠、脱氧胆酸钠、Tris.Hcl、蔗糖、TritonX-100、NaCl、脲、L-精氨酸、Na₂EDTA、盐酸胍、PMSF上海生工生物工程公司分装Amerosco产品；DMSO为Amerosco公司原装产品；BirA酶及配套试剂购自于Avidity公司；PE-链霉亲和素为Zymed公司产品；鼠抗鸡CD8单抗、FITC-羊抗鼠IgG购自于Southernbiotech公司；FITC-和PE-标记的Beads购自BD公司；BCA蛋白定量试剂盒购自于沈阳华特生生物公司；淋巴细胞分离液为天津灏洋生物技术有限公司产品。

3.1.5主要仪器设备

HITACHI CF16RX落地式低温离心机，BECKMAN超速离心机，pH计(BECKMAN 320 PH Meter)，Bio-Rad蛋白电泳仪，岛津蛋白薄层扫描仪，JY92-2D超声波破碎仪，蛋白超滤系统(AMICON A820)，10kD、100kD圆盘滤膜，10kD、100kD超滤离心管等购于Millipore公司，BD流式细胞仪。

3.2方法

3.2.1SPF鸡的接种试验

将出壳后饲养于负压隔离器的SPF鸡在一周龄时采用滴鼻方式接种10^5.5 EID₅₀IBV H52标准毒株，接种后继续饲养于负压隔离器内待用。

3.2.2包涵体的纯化

取表达BF2-BSP和Chβ2m的原始菌种稀释至1ml LB中，然后将其加入1L含卡那霉素抗性的LB培养液中，于37℃摇床振荡培养至OD_600nm为0.6时，按照上一章所优化的表达条件诱导表达，收菌后离心取沉淀，将沉淀重悬于13ml solution buffer(50mM TrisHCl，25％蔗糖，1mM NaEDTA，0.1％NaAzide，10mM DTT，pH 8.0)并转至30ml离心管(体积约15mL)，置于冰上；之后用超声波裂解仪将其分散混匀，然后在每管中各加入100μL溶菌酶(50mg/ml)、250μL DNA酶I(2mg/mL)、50ul MgCl(0.5M)储存液，轻柔混匀；再加入12.5mL裂解缓冲液(lysis buffer)，轻柔混匀；在室温下孵育至粘滞度下降为止(一般需要1h)，然后在-80℃冻20min，之后于37℃水浴解冻30min，之后加入50μl MgCl₂储存液；待粘滞度再次降低(约30min)后加入350μL Na₂EDTA储存液(0.5 M)；之后各步操作均在冰浴或4℃进行，11000g离心20min取沉淀，再将沉淀重悬于10ml含Triton X-100的洗涤缓冲液(50mM TrisHCl，0.5％Triton X-100，100mM NaCl，1mM NaEDTA，0.1％NaAzide，1mM DTTpH 8.0)中，随后用超声波裂解仪使其分散混匀；重复洗涤一次，最后于4℃ 11000g离心20min，将沉淀用溶于2-4ml 8M脲；再4℃ 35000g离心45min之后将上清分装后冻存于-80℃备用。

3.2.3BF2-BSP和Chβ2m的定量

将上述制备好的溶于8M脲的蛋白BF2-BSP和Chβ2m按照2.2.7所介绍的方法进行SDS-PAGE，然后将所制的蛋白胶采用岛津蛋白薄层扫描仪测定目标蛋白的纯度。同时采用BCA法测定所纯化的BF2-BSP和Chβ2m包涵体浓度，具体操作为：将BSA溶解于8M脲中，分别制成2000、1750、1500、1250、1000、750、500、250和0μg/ml的浓度梯度，检测样品用8M脲稀释10倍；然后将试剂A(1％二喹啉甲酸，2％Na₂CO₃，0.16％Na₂C₄H₄O₆，0.4％NaOH，0.95％NaHCO₃，pH 11.25)和试剂B(4％CuSO₄)按照50∶1混合制备工作液；按照蛋白样品和标准品与工作液1∶20的比例混匀后于37℃孵育30min；之后测定OD_562nm的吸光度，制作标准曲线，计算检测样品浓度。

3.2.4BF2/肽复合物的重折叠

计算重折叠所需BF2-BSP和Chβ2m的量，将其分别封装成3等份(每份约为0.2μmol)，冻存于-20℃待用；将200mL重折叠缓冲液(100mM Tris.HCl，400mM L-精氨酸，2mM NaEDTA，0.5mM氧化型谷胱甘肽，5mM还原型谷胱甘肽)置于250-300mL烧杯中采用磁力搅拌器搅拌并预冷至10℃；向重折叠缓冲液加入蛋白酶抑制剂：2ml PMSF(100 mM)，100μL胃蛋白酶抑制剂(2mg/mL)，100μL抑亮蛋白酶肽(2mg/mL)；将12mg肽N_71-78溶解于重折叠缓冲液；将BF2-BSP和Chβ2m样品分别按1∶2的比例稀释至盐酸胍溶液(3M盐酸胍，10mM醋酸钠，10mMNaEDTA)，将其中一份溶于盐酸胍溶液的Chβ2m用一个27号针头和一个1mL注射器将其注射至接近转轴中央，以便获得快速高效的稀释；然后采用同样的方法将BF2-BSP稀释至折叠缓冲液；将重折叠体系置于避光处10℃作用8h，并不断缓慢搅拌；采取同样的方法将第二等份Chβ2m和BF2-BSP样品稀释至盐酸胍溶液，再按照上述方法注射入重折叠缓冲液，继续避光10℃孵育6-12h，同时不断缓慢搅拌；最后一等份Chβ2m和BF2-BSP采用同上方法注射入重折叠缓冲液后继续避光10℃再孵育24h，并缓慢搅拌溶液。重折叠产物采用非还原型SDS-PAGE检测折叠效果。

3.2.5重折叠蛋白的浓缩

将重折叠缓冲液转移至离心瓶，于4℃ 2500g离心15min除去沉淀；小心将上清转移至压力搅拌式超滤浓缩杯(冷藏室、4℃、55psi)，采用氮气提供压力；在10kD超滤膜上浓缩溶液至体积约为10mL时，加入90mL交换缓冲液(20mM TrisHCl，50mM NaCl)；再次浓缩至至10mL时再加入90mL交换缓冲液；最后浓缩至10mL，采用0.22μm的针头滤器除去缓冲液交换过程中产生的沉淀，然后将其用于超滤离心管采用2000g离心浓缩至约700μl体积。

3.2.6BF2/肽单体复合物的纯化

洗涤快速蛋白液相色谱仪(FPLC)的上样泵并在FPLC缓冲液(20mM Tris HCl，50mM NaCl)中平衡凝胶柱；用0.22μm的微量滤器过滤样品，然后上样，在Superdex200HR凝胶柱上以0.5mL/min的流速运行，采用OD_280nm峰收集加定量收集的方式每500μL样品收集一管，将所收集的目标峰蛋白混合后将其用超滤离心管采用2000g离心浓缩至恰好700μL体积。

3.2.7体外生物素化

在700μL纯化的BF2/肽单体复合物中分别加入100μL溶液A，100μL溶液B，100μL d-生物素，10μL BirA酶，0.5μL胃蛋白酶抑制剂(2mg/mL)，0.5μL抑亮蛋白酶肽(2mg/mL)；于室温下孵育过夜进行生物素化。

3.2.8已生物素化BF2/肽单体复合物的纯化

采用3.2.6中的方法用FPLC进一步纯化已生物素化后的BF2/肽单体复合物，所收集的生物素化后的BF2/肽单体复合物采用微量超滤离心管(10kD)浓缩至500-1000μL，同样采用3.2.2所介绍的BCA法测量蛋白浓度，采用FPLC缓冲液溶解并稀释标准品。最后于每1000μL样品中分别加入0.5μL胃蛋白酶抑制剂(2mg/mL)，0.5μL抑亮蛋白酶肽(2mg/mL)，1μL叠氮钠(30％)，以及1μL Na₂EDTA(0.5M)。

3.2.9确定体外生物素化效率(链霉亲和素迁移试验)

将生物素化后BF2/肽单体复合物纯化浓缩样品取出两等份10μL样品(A+B)，再取等体积PBS作为第三份样品(C)，加5μL PBS至样品A，分别加5μL链霉亲和素(20mg/mL)至样品B和C，将上述样品在10％SDS-PAGE胶上进行非变性非还原型电泳，采用考马斯亮蓝染色观察蛋白条带。

3.2.10 BF2/肽四聚体的生成及纯化

计算生成四聚体所需的PE-链霉亲和素的总量，取出总量的一半直接加入生物素化后BF2/肽单体复合物纯化浓缩样品，在4℃避光孵育2h；将剩余的一半PE-链霉亲和素分成10等份，每隔20min取一份加入反应体系。反应结束后，将多聚化后的反应产物加至100kD的超滤离心管中，2000g 4℃离心浓缩至体积小于500μL；再用PBS(pH8.0)将样品在离心管中稀释至4mL，然后再次离心浓缩至体积小于500μL；用PBS(pH 8.0)重复四次交换缓冲液；再次用PBS(pH 8.0)将体积加至4mL后，向体系中加入2μL胃蛋白酶抑制剂(2mg/mL)，2μL抑亮蛋白酶肽(2mg/mL)，4μL叠氮钠(30％)，以及8μL NaEDTA(0.5M)，在超滤离心管中浓缩至四聚体浓度约为2-2.5mg/mL；然后将纯化后的四聚体分装于离心管中，加入1mM IBV N_71-78肽段，4℃避光保存。

3.2.11鸡PBMCs的分离

从接种IBV H52株的SPF鸡翅下静脉采取抗凝血3mL；在15mL离心管中加入3mL鸡淋巴细胞分离液(由小鼠淋巴细胞分离液和泛影葡胺按250∶8调制而成)，将3mL抗凝血缓缓加至淋巴细胞分离液上层；于室温下水平600g离心20min；采用长针头小心吸取中间单核细胞层；将吸出的PBMCs用5mL流式反应液(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na₂HPO₄，2mM KH₂PO₄，0.2％NaEDTA，0.1NaN₃)重悬洗涤，500g水平离心后弃上清；重复洗涤两次后细胞计数用流式反应液调整至浓度为2×10⁷个细胞/mL待用。

3.2.12 BF2/肽四聚体的功能检测

取2×10⁶个PBMC于4℃350g离心5min，弃上清；加入20μL用流式反应液按1∶100稀释的鼠抗鸡CD8单抗，将细胞重悬，置于4℃孵育30min； 4℃350g离心5min，加入1mL流式反应液重悬细胞，4℃350g离心10min，弃上清；再重复洗涤离心一次，弃去上清；加入20μL用流式反应液按1∶100稀释的FITC-羊抗鼠IgG，4℃孵育30min；按照上述方法洗涤细胞三次，弃去上清；加入20μL用流式反应液按10稀释的PE-BF2/肽四聚体，重悬细胞，于4℃孵育30min；洗涤细胞三次后，用500μL流式反应液重悬细胞待用；分别采用FITC-和PE-标记的Beads对流式细胞仪进行荧光补正，然后检测待检样品；采用CELLQuest软件分析并记录流式结果。

3.3结果

3.3.1包涵体的纯化及定量

采用上一章所优化的表达条件大量诱导表达BF2-BSP和Chβ2m，经包涵体纯化后溶解于8M脲。SDS-PAGE结果表明，所表达的蛋白条带大小正确，纯度较高(图9)。PAGE胶经岛津薄层扫描仪测定分析结果显示，BF2-BSP的纯度为89.3％，Chβ2m的纯度为85.3％。所表达的溶解于8M脲的BF2-BSP和Chβ2m蛋白浓度采用BCA试剂盒测定，测定结果经分析计算后可知：BF2-BSP的浓度为25.57mg/mL，Chβ2m的浓度18.86mg/mL。其浓度和纯度已满足体外重折叠的基本要求。

3.3.2BF2/肽复合物的重折叠及纯化

将上述纯化的BF2-BSP和Chβ2m与合成的IBV H52 N71-78肽段在10℃重折叠缓冲液中折叠48h，重折叠产物经非还原型SDS-PAGE检测可知BF2/肽单体复合物已成功组装(图10)。重折叠液浓缩后采用FPLC纯化，由图可以看出，在纯化进行至缓冲液消耗7-12mL时，BF2/肽单体复合物目标蛋白随过柱液流出(图11)。收集该峰的蛋白浓缩后进行生物素化，生物素化后的单体复合物进一步采用FPLC纯化，同样得到单一的生物素化的BF2/肽单体复合物(图12)。

3.3.3BF2/肽单体复合物生物素化效率的测定及其四聚体的生成

BF2/肽单体复合物生物素化后，采用链霉亲和素迁移实验检测生物素化效率，非还原性SDS-PAGE结果显示，在远远大于200kD的位置产生一条新生条带，(图13 Lane 3)。说明生物素化后的BF2/肽单体复合物与链霉亲和素发生了结合，生成了四聚体，但链霉亲和素和BF2/肽单体复合物都有剩余(图13 Lane 3)，表明BF2/肽单体复合物的生物素化并不彻底。采用PE-链霉亲和素将BF2/肽单体复合物结合成BF2/肽四聚体后，采用100kD的蛋白浓缩超滤离心管纯化浓缩后，除去了未发生结合的链霉亲和素和BF2/肽单体复合物，从而获得了浓度较高纯度较好的BF2/肽四聚体。

3.3.4 BF2/肽四聚体的功能检测

饲养于负压隔离器的SPF鸡接种10d后，采取翅下静脉血分离PBMC，分别于鼠抗鸡CD8单抗、羊抗鼠IgG和本实验所制备BF2四聚体分别作用后，采用流式细胞仪检测，为保证结果的准确性，分别采用FITC-Beads和PE-Beads对流式细胞仪进行双色荧光校正补偿(图14)。从图15的结果看出，在所检测样品的FITC和PE双阳性区域存在相对集中的细胞群，占细胞总数的3.65％(图15A)，而在所检测的对照细胞的双阳性区域仅存在极少量的散在细胞(图15B)。由此可见，本实验所构建的BF2/肽四聚体能用于检测IBV N抗原特异性CTLs细胞。

序列表

<110>中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

<120>鸡主要组织相容性复合体/肽四聚体的构建方法及其产品

<130>P0879

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial

<400>1

ggaattcatg gggccgtgcg ggg                                            23

<210>2

<211>79

<212>DNA

<213>Artificial

<400>2

gcgcaagctt ttaacgatga ttccacacca ttttctgtgc atccagaata tgatgcagga    60

tggaggggtt gctcccggg                                                 79

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>Artificial

<400>3

ggaat tcatg gggaaggcgg cggc                                          24

<210>4

<211>28

<212>DNA

<213>Artificial

<400>4

gcgcaagctt  ttagaactcg ggatccca                    28

Claims (6)

1.一种鸡主要组织相容性复合体/肽四聚体的构建方法，包括：

(1)按照现有技术分别分离、克隆鸡BF2全基因和鸡Chβ2m全基因；

(2)以鸡BF2全基因为模板，以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2为引物按照常规PCR扩增方法，扩增得到去除了BF2的胞内区和跨膜区序列，并在C-末端融合了一段生物素化序列的鸡BF2基因片段；将该鸡BF2基因片段与pET-28a(+)表达载体相连接得到重组表达载体pET-BF2-BSP；将重组表达载体pET-BF2-BSP转化大肠杆菌，诱导目的基因表达，收集、纯化所表达的重组融合蛋白，得重组鸡BF2蛋白；

(3)以鸡Chβ2m全基因为模板，以SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4为引物按照常规PCR扩增方法，扩增得到去除了信号肽序列的鸡Chβ2m基因片段；将所扩增得到鸡Chβ2m基因片段与pET-28a(+)表达载体相连接得到重组表达载体pET-Chβ2m；将重组表达载体pET-Chβ2m转化大肠杆菌，诱导目的基因表达，收集、纯化所表达的重组蛋白，得重组Chβ2m鸡蛋白；所述诱导目的基因表达的条件如下：IPTG的浓度是0.3mmol/L IPTG，菌体浓度OD_600nm在0.6，诱导时间为5h；

(4)按照现有技术方法制备得到MHC限制性多肽IBV N_71-78；将步骤(2)和步骤(3)所制备的重组鸡BF2蛋白和重组Chβ2m鸡蛋白分别稀释后加入到溶解有MHC限制性多肽IBV N_71-78的重折叠缓冲液中，孵育8-44小时，浓缩，纯化，得到鸡BF2/肽单体复合物；

(5)将鸡BF2/肽单体复合物生物素化，纯化，将PE-链霉亲和素分批次的加入到生物素化后的鸡BF2/肽单体复合物中，所加入的PE-链霉亲和素的总体积与鸡BF2/肽单体复合物的比例为1∶5；孵育，纯化浓缩，即得鸡主要组织相容性复合体/肽四聚体。

2.按照权利要求1的构建方法，其特征在于：步骤(2)中所述诱导目的基因表达的条件如下：IPTG的浓度是1.1mmol/L，菌体浓度OD_600nm在0.8-1.2，诱导时间为2-4h。

3.按照权利要求1的构建方法，其特征在于：步骤(2)或(3)中纯化所表达的融合蛋白的方法如下：将大量表达的菌体经超声波裂解且洗涤后分别获得BF2-BSP包涵体和Chβ2m包涵体，将BF2-BSP包涵体和Chβ2m包涵体用浓度为8mol/L的脲溶解后与Ni²⁺NTA树脂结合，加入色谱柱空纯化柱，混匀，弃去上清，用结合缓冲液预洗1次，再用洗涤缓冲液洗涤2次，最后用洗脱液洗脱2次，收集用洗脱液洗脱得到的2次洗脱液，得到纯化的重组融合蛋白。

4.按照权利要求1的构建方法，其特征在于：步骤(4)中所述的浓缩采用超滤浓缩设备进行浓缩，该超滤浓缩设备采用氮气提供压力。

5.按照权利要求1的构建方法，其特征在于：步骤(5)中所述的纯化采用用凝胶过滤柱的方式纯化。

6.按照权利要求1的构建方法，其特征在于：步骤(5)中所述的纯化浓缩采用100kD的蛋白浓缩超滤离心管进行纯化浓缩。

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