JP2023500456A - 人工抗原提示分子とその利用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、人工抗原提示分子（ａＡＰＭ）からなり、特にａＡＰＭの二量体からなる人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）、およびａＡＰＣの製造方法に関するものである。本発明は、さらに、ａＡＰＣを含む組成物、およびａＡＰＣのａＡＰＭをコードするベクターに関する。本発明の実施形態は、一の抗原特異的Ｔ細胞応答又は複数の抗原特異的Ｔ細胞応答を決定するためのアッセイに使用するために特に開発されたものであり、以下、本願明細書を参照しながら説明する。しかし、本発明がこの特定の使用分野に限定されないことは理解されよう。
Description
本発明は、人工抗原提示分子（ａＡＰＭ）を含み、特にａＡＰＭの二量体を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）、およびａＡＰＣの製造方法に関する。本発明は、さらに、ａＡＰＣを含む組成物、およびａＡＰＣのａＡＰＭをコードするベクターに関する。本発明の実施形態は、一の抗原特異的Ｔ細胞応答又は複数の抗原特異的Ｔ細胞応答を決定するためのアッセイに使用するために特に開発されたものであり、以下、本願明細書を参照しながら説明する。しかし、本発明がこの特定の使用分野に限定されないことは理解される。
本明細書における背景技術に関するいかなる議論も、そのような技術が周知であること、または当該分野における技術常識の一部を形成していることを認めるものと決してみなされるべきではない。
免疫反応において、抗原ペプチドの抗原特異的Ｔ細胞への提示は、通常、抗原提示分子（ＡＰＭ）を介して、すなわち抗原提示細胞（ＡＰＣ）の外膜に配置された主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）と抗原ペプチドが複合化することによって行われる。ＡＰＣは、抗原ペプチドを提示するために利用するＭＨＣのクラスによって区別される。体内のほとんどの細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子を介してＣＤ８+細胞傷害性Ｔ細胞に抗原ペプチドを提示することができる。ＭＨＣクラスＩ分子によって提示される抗原ペプチドは、通常、細胞質タンパク質に由来する。しかし、「特殊化」または「プロフェッショナル」ＡＰＣは、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子を介して、それぞれ細胞傷害性Ｔ細胞またはＣＤ４+ヘルパーＴ細胞に抗原性ペプチドを提示するものである。ＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示される抗原ペプチドは、通常、細胞外タンパク質に由来する。
人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで機能的な抗原特異的Ｔ細胞を大量に生成し、その後の治療に利用することを目的として開発された。さらに、ａＡＰＣは抗原特異的Ｔ細胞応答の研究、およびＡＰＣを利用した免疫療法前および免疫療法中の疾患関連抗原に対するＴ細胞認識を評価するアッセイに使用することができる。ＭＨＣクラスＩ分子などの膜結合型ＡＰＭを利用する、さまざまなタイプのａＡＰＣが知られている。ａＡＰＣの中には、脂質二重膜を含む合成小胞やリポソームを、膜結合型ＡＰＭと組み合わせて利用するものもある。組換え改変ａＡＰＣも知られており、例えば、特定のペプチドを負荷したＭＨＣの発現のためのベクター構築物をトランスフェクトしたマウス線維芽細胞が記載されている。さらに、粒子にＡＰＭを負荷したマイクロ粒子やナノ粒子システムも開発されている。しかし、このようなシステムでは、ＡＰＭの選択は、粒子への安定した取付けを可能にする膜貫通ドメインとの構造的互換性のために制限され、一方で、抗原特異的Ｔ細胞応答を再現性よく誘発するために標的Ｔ細胞への特異的かつ安定した結合を可能にする。
さらに、免疫反応の誘発および／または抑制に関与するタンパク質の可溶性アナログとして、またａＡＰＣに使用するための、人工ＡＰＭ（ａＡＰＭ）が開発されている。
例えばＵＳ６，２６８，４１１Ｂ１には、抗原特異的細胞依存性免疫反応を検出、活性化、抑制するための可溶性多価ペプチド負荷ＭＨＣ／Ｉｇ分子の使用が記載されている。この分子は、ＭＨＣクラスＩ分子部分と免疫グロブリン重鎖が融合したキメラ分子である。さらに、ペプチドテザーによって抗原ペプチドをＭＨＣクラスＩ分子部分に共有結合させることも記載されている。このように、重鎖と軽鎖を含む免疫グロブリンは、抗原提示ＭＨＣクラスＩ分子部分が両重鎖のＮ末端に融合されていることが記載されている。これらのキメラ分子は、２本の重鎖と２本の軽鎖を含む免疫グロブリンにＭＨＣクラスＩ分子部分全体が融合しているため可溶性ではあるが、確かに複雑な分子であり、ａＡＰＣへの使用適性は論外である。
当技術分野では、抗原特異的Ｔ細胞応答を決定するためのアッセイに使用するための改良された汎用性の高いツールが必要とされている。このようなツールには、Ｔ細胞集団と接触させたときに測定可能なＴ細胞応答を再現性よく誘発するように、ａＡＰＣの表面に取付けられながら抗原性ペプチドを安定的に結合するように特別に設計されたａＡＰＭを含む革新的なａＡＰＣが含まれる。
本発明の目的は、従来技術の欠点の少なくとも１つを克服または改善すること、あるいは有用な代替手段を提供することである。特に、本発明の目的は、Ｔ細胞の集団と接触させたときに測定可能なＴ細胞応答を誘発するように、ａＡＰＣの表面に取付けられながら抗原性ペプチドを安定的に結合するように特異的に設計されたａＡＰＭを含む改良型ａＡＰＣを提供することにある。特に、本発明の目的は、疾患関連、抗原誘発Ｔ細胞応答を決定するためのアッセイの汎用性を向上させる改良型ａＡＰＣおよびａＡＰＭを提供することにある。
上記に示したように、本発明は、選択された抗原に対するＴ細胞免疫応答を誘発し、決定する汎用性の高いアッセイに使用するためのａＡＰＣを提供することを目的とするものである。特に、患者のＴ細胞による疾患関連抗原の認識を評価することで、臨床に即した個別化治療のアプローチが可能になる。臨床現場で得られる患者サンプルは限られていることから、複合免疫反応の評価に適したａＡＰＣは、Ｔ細胞による免疫反応を誘発するために抗原を提示するだけでなく、抗原提示に応答してＴ細胞から特異的に放出されるエフェクター分子を検出・捕捉するように構成されていることが望ましい。
したがって、第１の局面において、本発明は、抗原ペプチド配列の提示に応答してＴ細胞のエフェクター分子を検出するための人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）に関するものであり、該ａＡＰＣは以下を含む：
（ａ） 表面であり、ここで、表面は粒子の表面であり、任意選択で、表面はビーズの表面である；
（ｂ） １つ以上の人工抗原提示分子（ａＡＰＭ）であって、取付け配列を介して、または直接化学結合を介して表面に取付けられた、ａＡＰＭ；および
（ｃ） 表面に取付けられた１つ以上の捕捉分子、
ここで、１つ以上のａＡＰＭの各々および／または１つ以上の二量体の各々は、同一の抗原ペプチド配列を含む。
（ａ） 表面であり、ここで、表面は粒子の表面であり、任意選択で、表面はビーズの表面である；
（ｂ） １つ以上の人工抗原提示分子（ａＡＰＭ）であって、取付け配列を介して、または直接化学結合を介して表面に取付けられた、ａＡＰＭ；および
（ｃ） 表面に取付けられた１つ以上の捕捉分子、
ここで、１つ以上のａＡＰＭの各々および／または１つ以上の二量体の各々は、同一の抗原ペプチド配列を含む。
異なるタイプの粒子は、本発明のａＡＰＣの表面を提供する、すなわち、１つ以上のａＡＰＭおよび１つ以上の捕捉分子が取付けされる表面を提供する役割を果たすことができる。特に、剛性球状粒子、非球状粒子および／または流動性脂質二重層含有系はすべて、本発明のａＡＰＣの表面を提供するのに適した粒子である。例えば、ポリスチレンラテックスマイクロビーズ、磁性ナノおよびマイクロ粒子またはビーズ、ナノサイズの量子ドット、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）マイクロスフェアは、本発明のａＡＰＣでの使用に適した硬質球状粒子として知られており、カーボンナノチューブバンドル、楕円体ＰＬＧＡマイクロ粒子、およびナノワームは、本発明のａＡＰＣにおける使用に適した既知の非球状粒子として知られており、２Ｄ－支持脂質二重層（２Ｄ－ＳＬＢ）、リポソームおよびＲＡＦＴソーム／マイクロドメインリポソームおよびＳＬＢ粒子は、本発明のａＡＰＣにおける使用に適した既知の流動性脂質二重層含有系として知られている。
本発明のａＡＰＣは、Ｔ細胞応答のマルチプレックス評価用に調整されたカスタムメイドのａＡＰＣ組成物を利用することにより、試料から様々な多数の抗原特異的Ｔ細胞を検出するための、堅牢で使いやすく、コストおよび時間効率の高いマルチプレックス評価プラットフォームを提供する。
本発明のａＡＰＭ、すなわちａＡＰＣの表面に取付け可能でなければならないａＡＰＭは、Ｔ細胞応答を誘発する、すなわちＴ細胞を活性化するように構成されたＭＨＣ部分を含む任意の単量体、二量体または多量体分子であり得る。例えば、ａＡＰＭは、以下のものであってもよい：可溶性抗原ペプチド負荷可能ＭＨＣクラスＩまたは可溶性抗原ペプチド負荷可能ＭＨＣクラスＩＩ部分を含む単量体、二量体または多量体分子；抗原提示ドメインに共有結合されており、好ましくは同時に捕捉された抗原ペプチドを含む分子。このように、ａＡＰＭは、β2ミクログロブリンおよび合成ペプチドとアセンブルされたタグ付き組換え可溶性ＭＨＣ－Ｉ分子、またはβ2ミクログロブリンと共有結合し、合成ペプチドとアセンブルされたタグ付き組換え可溶性ＭＨＣ－Ｉ分子であってもよい。にもかかわらず、本発明のａＡＰＭの抗原提示ドメインは、当業者に公知の任意のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）アレル（対立遺伝子）を含み得る。世界保健機関命名法委員会報告書に記載された、実質的にすべての既知のＨＬＡアレルをリストアップしたデータベースは、https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/allele.html で入手できる。さらに、本発明のａＡＰＭは、ａＡＰＣの表面への取付けの可能性に関して汎用性がある。しかしながら、本発明のａＡＰＭは、ＣＤ８+および／またはＣＤ４+Ｔ細胞のいずれかの免疫応答を抗原特異的に刺激することができるため、汎用性が特に向上する。
好ましくは、本発明のａＡＰＣのａＡＰＭは、（ａ）アミノ末端からカルボキシル末端の順に、抗原提示ドメイン、二量化ドメイン、免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｆｃドメインおよび取付け配列を含む単一ポリペプチド配列であって、抗原提示ドメインの配列がＮ末端の抗原ペプチド配列を含むもの；または（ｂ）アミノ末端からカルボキシル末端の順に、抗原提示ドメインと取付け配列を含む単一ポリペプチド配列であって、抗原提示ドメインの配列がＮ末端の抗原ペプチド配列を含むものからなる。このように、ここで説明するａＡＰＭは、様々な別々に製造されたポリペプチド鎖から組み立てられるのではなく、単一ポリペプチド鎖として製造され、それは既に本発明のａＡＰＣにおいてａＡＰＭが機能するために必要な全てのドメインおよび配列を含み、特にこのように製造された単一ポリペプチド配列は、提示すべき抗原ペプチド配列も含む。そのため、その後のローディングや抗原ペプチド配列との結合は必要ではない。これにより、これまで説明されてきた抗原ペプチドのローディングや結合の手順で生じる、ａＡＰＭの製造バッチ間の非効率性や不整合の可能性を回避することができる。
さらに、本発明のａＡＰＣは、二量体のａＡＰＭを含んでいてもよい。具体的には、本発明のａＡＰＣは、ａＡＰＭを含む二量体を含むものであってもよく、ここで
（ｄ） 二量体は、２つのａＡＰＭのホモ二量体またはヘテロ二量体であるか、または
（ｅ） 二量体は、ａＡＰＭと第２の分子のヘテロ二量体である。
（ｄ） 二量体は、２つのａＡＰＭのホモ二量体またはヘテロ二量体であるか、または
（ｅ） 二量体は、ａＡＰＭと第２の分子のヘテロ二量体である。
このように、第２の局面において、本発明は、以下を含む組成物に関する。
（ａ） 第１の局面による複数のａＡＰＣであって、組成物が複数の同一のａＡＰＣを含み、任意選択で、同一のａＡＰＣが、それぞれの単一のエフェクター分子に特異的な単一の捕捉分子を含むか、または同一のａＡＰＣが、いくつかのそれぞれのエフェクター分子に特異的ないくつかの捕捉分子を含む、複数のａＡＰＣ、または
（ｂ） 第１の局面によるａＡＰＣの複数の群であって、各群のすべてのａＡＰＣが同一にコードされ、各群のａＡＰＣによって提示される抗原ペプチド配列が群内で同一だが各群間で異なり、任意選択で各群のａＡＰＣがそれぞれの単一のエフェクター分子に特異的な単一の捕捉分子を含み、または各群のａＡＰＣがいくつかのそれぞれのエフェクター分子に特異的ないくつかの捕捉分子を含む、複数の群。
（ａ） 第１の局面による複数のａＡＰＣであって、組成物が複数の同一のａＡＰＣを含み、任意選択で、同一のａＡＰＣが、それぞれの単一のエフェクター分子に特異的な単一の捕捉分子を含むか、または同一のａＡＰＣが、いくつかのそれぞれのエフェクター分子に特異的ないくつかの捕捉分子を含む、複数のａＡＰＣ、または
（ｂ） 第１の局面によるａＡＰＣの複数の群であって、各群のすべてのａＡＰＣが同一にコードされ、各群のａＡＰＣによって提示される抗原ペプチド配列が群内で同一だが各群間で異なり、任意選択で各群のａＡＰＣがそれぞれの単一のエフェクター分子に特異的な単一の捕捉分子を含み、または各群のａＡＰＣがいくつかのそれぞれのエフェクター分子に特異的ないくつかの捕捉分子を含む、複数の群。
本発明のａＡＰＭ、ａＡＰＣ及びそれを含む組成物は、抗原特異的Ｔ細胞応答を評価するためのマルチプレックス化アッセイの様々な実施形態において特に有用である。具体的には、本発明のａＡＰＭ、ａＡＰＣおよびそれを含む組成物は、様々なレベルの複雑さ、すなわち様々な程度の「マルチプレックス性」を提供するように構成することができる。
したがって、第３の局面において、本発明は、抗原特異的Ｔ細胞応答を決定するためのアッセイに関し、該アッセイは、以下の工程を含む。
（ａ） 同一のａＡＰＣによる抗原ペプチド配列の提示時にＴ細胞からの応答を誘発するのに適した条件および時間で、第２の局面による組成物をＴ細胞に接触させること；
（ｂ） Ｔ細胞からａＡＰＣを分離すること；
（ｃ） ａＡＰＣを、ａＡＰＣの１つ以上の捕捉分子が特異的である１つ以上のエフェクター分子に対する検出抗体と接触させること；
（ｄ） ａＡＰＣの１つ以上の捕捉分子によって捕捉されたエフェクター分子を検出することによって、Ｔ細胞のエフェクター分子の放出を分析すること、
これにより、同一のａＡＰＣが提示する抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞応答が決定される。
（ｂ） Ｔ細胞からａＡＰＣを分離すること；
（ｃ） ａＡＰＣを、ａＡＰＣの１つ以上の捕捉分子が特異的である１つ以上のエフェクター分子に対する検出抗体と接触させること；
（ｄ） ａＡＰＣの１つ以上の捕捉分子によって捕捉されたエフェクター分子を検出することによって、Ｔ細胞のエフェクター分子の放出を分析すること、
これにより、同一のａＡＰＣが提示する抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞応答が決定される。
第４の局面において、本発明は、複数の抗原特異的Ｔ細胞応答を決定するためのアッセイに関し、該アッセイは、以下の工程を含む：
（ａ） 各群のａＡＰＣによって提示された異なる抗原ペプチド配列の各々の提示時 にＴ細胞から応答を誘発するのに適した条件及び時間で、第２の局面による組成物 をＴ細胞に接触させること；
（ｂ） Ｔ細胞からａＡＰＣを分離すること；
（ｃ） ａＡＰＣの各群内のａＡＰＣの１つ以上の捕捉分子が特異的である１つ以上 のエフェクター分子に対する検出抗体と、ａＡＰＣを接触させること、
（ｄ） 前記ａＡＰＣの各群のａＡＰＣを同定し、分離すること；
（ｅ） ａＡＰＣの各群内のａＡＰＣの１つ以上の捕捉分子によって捕捉されたエフ ェクター分子を検出することによって、Ｔ細胞のエフェクター分子の放出を分析す ること、
これにより、ａＡＰＣの各群によって提示された各抗原ペプチド配列に特異的な複数の抗原特異的Ｔ細胞応答が決定される。
（ａ） 各群のａＡＰＣによって提示された異なる抗原ペプチド配列の各々の提示時 にＴ細胞から応答を誘発するのに適した条件及び時間で、第２の局面による組成物 をＴ細胞に接触させること；
（ｂ） Ｔ細胞からａＡＰＣを分離すること；
（ｃ） ａＡＰＣの各群内のａＡＰＣの１つ以上の捕捉分子が特異的である１つ以上 のエフェクター分子に対する検出抗体と、ａＡＰＣを接触させること、
（ｄ） 前記ａＡＰＣの各群のａＡＰＣを同定し、分離すること；
（ｅ） ａＡＰＣの各群内のａＡＰＣの１つ以上の捕捉分子によって捕捉されたエフ ェクター分子を検出することによって、Ｔ細胞のエフェクター分子の放出を分析す ること、
これにより、ａＡＰＣの各群によって提示された各抗原ペプチド配列に特異的な複数の抗原特異的Ｔ細胞応答が決定される。
第５の局面では、本発明は、以下を含むベクターに関する。
（ａ） 第１の局面について定義されたａＡＰＭの単一ポリペプチド配列をコードす るポリヌクレオチド配列、または
（ｂ） 第１の局面に記載の二量体の両方のペプチド鎖をポリシストニック発現させ るためのポリヌクレオチド配列。
（ｂ） 第１の局面に記載の二量体の両方のペプチド鎖をポリシストニック発現させ るためのポリヌクレオチド配列。
さらなる局面において、本発明は、第１の局面に係るａＡＰＣの製造方法に関し、当該方法は、共有結合により
（ａ） ａＡＰＭ、好ましくはａＡＰＭは、アミノ末端からカルボキシル末端の順に 、抗原提示ドメイン、二量化ドメイン、免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｆｃドメインおよ び取付け配列を含む単一ポリペプチド配列であり、ここで、抗原提示ドメインの配 列は、Ｎ末端の抗原ペプチド配列を含む、ａＡＰＭ、および
（ｂ） 捕捉分子、好ましくは捕捉抗体、
をマイクロスフィア、好ましくは色分けされたマイクロスフィアの表面に取付けることを含む。
本発明の実施形態は、添付図面を参照しながら例示的に説明する。
（ａ） ａＡＰＭ、好ましくはａＡＰＭは、アミノ末端からカルボキシル末端の順に 、抗原提示ドメイン、二量化ドメイン、免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｆｃドメインおよ び取付け配列を含む単一ポリペプチド配列であり、ここで、抗原提示ドメインの配 列は、Ｎ末端の抗原ペプチド配列を含む、ａＡＰＭ、および
（ｂ） 捕捉分子、好ましくは捕捉抗体、
をマイクロスフィア、好ましくは色分けされたマイクロスフィアの表面に取付けることを含む。
本発明の実施形態は、添付図面を参照しながら例示的に説明する。
本明細書および請求項の明確かつ一貫した理解、およびそのような用語に与えられる範囲を提供するために、以下の定義が提供される。
定義
本出願の文脈において、以下に定義される用語は、以下の意味を有すると理解されるものとする。
本出願の文脈において、以下に定義される用語は、以下の意味を有すると理解されるものとする。
「人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）」－ペプチド負荷ＭＨＣ分子を含む人工抗原提示分子（ａＡＰＭ；以下に直接定義）を結合するように構成された生体細胞または合成物質の表面を含む人工的に生成された表面で、それぞれの抗原特異的Ｔ細胞を刺激するのに適した抗原を提示し、天然に存在する抗原提示細胞によって引き起こされるのと同様の刺激をもたらす。例えば、表面に複数の定義されたａＡＰＭが取付けされた粒子は、本開示によるａＡＰＣを構成する。さらに、本願の文脈において、ａＡＰＣは、さらに、活性化Ｔ細胞によって分泌される１つ以上のエフェクター分子を捕捉するように構成することができる、すなわち、その能力を有する。異なるタイプの粒子は、本発明のａＡＰＣの表面を提供する、すなわち、１つ以上のａＡＰＭおよび１つ以上の捕捉分子が取付けされる表面を提供する役割を果たすことができる。特に、剛性球状粒子、非球状粒子および／または流動性脂質二重層含有系はすべて、本発明のａＡＰＣの表面を提供するのに適した粒子である。例えば、ポリスチレンラテックスマイクロビーズ、磁性ナノおよびマイクロ粒子またはビーズ、ナノサイズの量子ドット、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）マイクロスフェアは、本発明のａＡＰＣでの使用に適した硬質球状粒子として知られており、カーボンナノチューブバンドル、楕円体ＰＬＧＡマイクロ粒子、およびナノワームは、本発明のａＡＰＣにおける使用に適した既知の非球状粒子として知られており、２Ｄ－支持脂質二重層（２Ｄ－ＳＬＢ）、リポソームおよびＲＡＦＴソーム／マイクロドメインリポソームおよびＳＬＢ粒子は、本発明のａＡＰＣにおける使用に適した既知の流動性脂質二重層含有系として知られている。特定の実施形態において、本明細書で定義されるようなビーズベースのａＡＰＣは、以下「Ｔ－Ｐｌｅｘビーズ」と称される。
「人工抗原提示分子（ａＡＰＭ）」－抗原提示ドメインと特異的で明確に定義された取付け配列を含む可溶性または細胞膜結合型の組換え生産されたＭＨＣタンパク質。例えば、ＭＨＣタンパク質は、一致する（同族）抗原特異性を有するＴ細胞受容体へのａＡＰＭの結合をａＡＰＭが媒介できるように、抗原性ペプチドを負荷可能であっても、既に負荷されていてもよく、一方、取付け配列は、例えば、ポリスチレンベースのミクロスフィアまたはビーズのような生体細胞または合成材料の表面上にａＡＰＭを固定化するように構成される。
「抗原提示ドメイン」－ａＡＰＭのタンパク質ドメイン（上記で直接定義した通り）であって、提示されるべき抗原ペプチドを負荷可能であるように構成されているか、または負荷されており、提示が、一致する（同族）抗原特異性を有するＴ細胞受容体の結合を媒介しうるもの。本願明細書に記載されるいくつかの実施形態において、ａＡＰＭの抗原提示ドメインは、以下のものであるか、または以下のものから誘導される：ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ又はＦ遺伝子（又は非ヒト種からのそれぞれの多型ＭＨＣ－Ｉ遺伝子）の対立遺伝子バリアントによってコードされるペプチド負荷β2－ミクログロブリン関連ＭＨＣ－Ｉエクトドメイン；または、ＨＬＡ－ＤＲＢ遺伝子およびＨＬＡ－ＤＲＡの対立遺伝子バリアント、ＨＬＡ－ＤＱＡ／ＨＬＡ－ＤＱＢ遺伝子の対立遺伝子バリアント、またはＨＬＡ－ＤＰＡ／ＤＰＢ遺伝子の対立遺伝子バリアント（または非ヒト種からのそれぞれの多型ＭＨＣ－ＩＩ遺伝子）によってコードされるペプチド負荷ＭＨＣ－ＩＩエクトドメイン。この文脈での「由来」とは、ある第一のドメインから「由来」するドメインは、この第一のドメインと少なくとも８０％の配列同一性を有し、重要なことに、一致する（同族）抗原特異性を有するＴ細胞受容体の結合を依然として媒介できる必要があることを意味している。
「二量体化ドメイン」－単量体ペプチド鎖中のタンパク質ドメインで、別の単量体ペプチド鎖中の対応するタンパク質ドメインと結合するように構成され、２つの対応するタンパク質ドメインの結合により、両方のペプチド鎖からなる二量体分子が形成されるものである。例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のヒンジドメイン、またはヘテロ親和性パラレルコイルドコイルロイシンジッパー配列または両者の組み合わせは、本開示に記載のａＡＰＭにおいて二量化ドメインとして機能することができる。
「Ｉｇ Ｆｃドメイン」とは、ＩｇＧの定常重鎖（ＣＨ）ドメイン２および３（ＣＨ２およびＣＨ３）からなる、またはそこから密接に派生したタンパク質配列である。この文脈での「由来」とは、ＩｇＧの定常重鎖（ＣＨ）ドメイン２および３（ＣＨ２およびＣＨ３）からなる第１の配列から「由来」する配列は、この第１の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有していなければならず、重要なことに、第１の配列と依然として機能的に同等でなければならないことを意味している。
「取付け配列」－ａＡＰＭを生体細胞または合成物質（例えば、ポリスチレンベースの微小球またはビーズ）の表面に取付けさせるように構成されたａＡＰＭのペプチド配列である。特定の実施形態では、取付け配列は、Ｉｇ Ｆｃドメインの一部であってもよいし、ポリヒスチジンタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ビオチン化Ａｖｉタグなどの短いペプチド配列であってもよく、親和性クロマトグラフィーに基づくタンパク質精製、ならびにａＡＰＣの表面への可溶性ａＡＰＭの結合を容易にする。
「ＭＨＣクラスＩ部分」－β2－ミクログロブリンに関連したペプチド負荷可能なＭＨＣ－Ｉ重鎖エクトドメイン（α1－α3）。
「ＭＨＣクラスＩＩ部分」－ＭＨＣ－ＩＩβ鎖（β1－β2）エクトドメインに関連するヘテロ二量体ペプチド負荷可能なＭＨＣ－ＩＩα鎖（α1－α2）エクトドメイン。
「エフェクター分子」とは、Ｔ細胞が分泌する分子で、サイトカイン、パーフォリン、細胞傷害性を誘発するグランザイムＢなどの酵素など、刺激性または抑制性の免疫機能を有するものをいう。
「捕捉分子」－定義されたエフェクター分子に特異的に結合し、それによって捕捉する抗体または組換え受容体タンパク質。
「共刺激作用分子」－Ｔ細胞共刺激性受容体（ＣＤ２８または４－１ＢＢなど）に関与するアゴニスト抗体または組換え可溶性リガンド。
「マルチプレックス化」－単一の反応において複数の分析物の同時かつ差次的な検出を可能にする方法論的プロセスを指し、したがって、このプロセスに依存する実験アッセイまたは方法は、本開示において「マルチプレックスアッセイ」と呼ばれる場合がある。本開示の文脈において、「マルチプレックス化」という用語は、典型的には、エフェクター分子捕捉能力を有する識別可能なａＡＰＣ（蛍光カラーコード化「バーコード」ａＡＰＣなど）の使用による複数の抗原特異的Ｔ細胞集団（分析物）の同時検出を表すために使用される。
「Ｔ－Ｐｌｅｘアッセイ」－利用されているＴ－Ｐｌｅｘビーズの別々に識別可能な集団に基づいて、複数の抗原特異的Ｔ細胞集団を検出できるアッセイ（一次元マルチプレックス化）。例えば、Ｔ－Ｐｌｅｘアッセイは、Ｔ－Ｐｌｅｘビーズの別々に識別可能な集団を用いて実施することができ、各集団は別々のａＡＰＭを提示する。このようなＴ－Ｐｌｅｘアッセイにおいて、すべてのＴ－Ｐｌｅｘビーズが少なくとも１つのエフェクター分子（例えば、インターフェロン－γ）を検出する能力を有する場合、少なくとも２次元のマルチプレックス評価が達成できる、すなわち：（１）複数の抗原特異的Ｔ細胞集団の検出と、（２）その抗原特異的Ｔ細胞集団がエフェクター分子（ここではインターフェロン－γ）を分泌しているか否かを同時に評価すること。複数のエフェクター分子を捕捉・評価する能力を有するＴ－Ｐｌｅｘビーズを用いて、複数の抗原特異的Ｔ細胞集団とその分泌するエフェクター分子を同時に検出できるＴ－Ｐｌｅｘアッセイは、「Ｔ－Ｐｌｅｘ2アッセイ」と呼ばれている。
上記の定義に加え、文脈上明らかに別段必要とされない限り、本明細書および特許請求の範囲を通じて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの語は、排他的または網羅的な意味ではなく、包括的な意味で、すなわち、「含むがこれに限定されない」の意味で解釈されるものとする。
さらに、本明細書全体を通して、「一実施形態」、「いくつかの実施形態」または「一実施形態」への言及は、実施形態に関連して説明される特定の特徴、構造または特性が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書中の各所における「一実施形態において」、「いくつかの実施形態において」または「ある実施形態において」という表現の出現は、必ずしもすべてが同じ実施形態を指すわけではなく、その可能性がある。さらに、特定の特徴、構造または特性は、本開示から当業者に明らかなように、１つ以上の実施形態において、任意の適切な方法で組み合わされてもよい。
本明細書で使用する場合、特に指定がない限り、共通のオブジェクトを説明する
ために序数的形容詞「第１」、「第２」、「第３」などを使用することは、単に
同様のオブジェクトの異なるインスタンスが参照されていることを示し、そう説
明したオブジェクトが時間的、空間的、順位的、または他の方法のいずれかで所
定の順序になければならないことを意味することは意図していない。
ために序数的形容詞「第１」、「第２」、「第３」などを使用することは、単に
同様のオブジェクトの異なるインスタンスが参照されていることを示し、そう説
明したオブジェクトが時間的、空間的、順位的、または他の方法のいずれかで所
定の順序になければならないことを意味することは意図していない。
本明細書では、「例示的」という用語は、品質を示すのではなく、例を示すという意味で使用される。すなわち、「例示的な実施形態」とは、必ずしも例示的な品質の実施形態である必要はなく、一例として提供される実施形態である。
（詳細な説明）
本発明の第１の局面によれば、また図に示されるように、人工抗原提示分子（ａＡＰＭ）を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）が提供される。
本発明の第１の局面によれば、また図に示されるように、人工抗原提示分子（ａＡＰＭ）を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）が提供される。
本発明のａＡＰＣと共に使用されるべきａＡＰＭ、すなわちａＡＰＣの表面に取付け可能でなければならないａＡＰＭは、Ｔ細胞応答を誘発する、すなわちＴ細胞を活性化するように構成されたＭＨＣ部分を含む任意の単量体、二量体または多量体分子であり得る。
例えば、ａＡＰＭは次のようなものであってもよい：可溶性抗原ペプチド負荷可能ＭＨＣクラスＩまたは可溶性抗原ペプチド負荷安納ＭＨＣクラスＩＩ部分を含む単量体、二量体または多量体分子；あるいは抗原提示ドメインに共有結合し、好ましくは同時に捕捉された抗原ペプチドを含む可溶性ＭＨＣ クラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ部分を含む分子。
Ｔ細胞応答を誘発し、Ｔ細胞を活性化するように構成された抗原性ペプチドを負荷した任意のＭＨＣ複合体は、本発明のａＡＰＣの表面に取付けされた後、ａＡＰＭとして使用することができる。このようなＭＨＣ複合体は、Ｔ細胞応答を引き起こし、Ｔ細胞を活性化するように構成されるために、少なくとも以下の基準を満たす必要がある。
（１） ペプチドを負荷したＭＨＣ複合体は、適切な３次ペプチド／タンパク質構造 を有していること；および
（２） 抗原ペプチドがＭＨＣ複合体の抗原提示ドメインに正しく提示されること。
（１） ペプチドを負荷したＭＨＣ複合体は、適切な３次ペプチド／タンパク質構造 を有していること；および
（２） 抗原ペプチドがＭＨＣ複合体の抗原提示ドメインに正しく提示されること。
もちろん、抗原ペプチドによって活性化されるためには、本発明のａＡＰＣに曝露されたＴ細胞は、以前に抗原ペプチドに曝露されている必要がある、すなわち、Ｔ細胞はナイーブＴ細胞ではない。
抗原ペプチドを負荷した、または負荷可能ないくつかの異なる可溶性ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ分子ならびにそれらの製造方法、すなわち本発明のａＡＰＣと共に用いるのに適したａＡＰＭが以前に記載されており、これらのａＡＰＭのいくつかは商業的に入手可能である。
このようなＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ部分からなるａＡＰＭとしては、抗原ペプチドがａＡＰＭと共有結合しているａＡＰＭ（ＭＨＣクラスＩの場合、これらはしばしば一本鎖三量体（トリマー）（ＳＣＴ ａＡＰＭ）と呼ばれる）と、抗原ペプチドがａＡＰＭと共有結合していないａＡＰＭ（非ＳＣＴ ａＡＰＭｓ）が公知である。市販されているａＡＰＭのほとんどはＮｏｎ－ＳＣＴ ａＡＰＭである。しかし、公知のＮｏｎ－ＳＣＴ ａＡＰＭは、再び、（ａ）既に目的の抗原ペプチドが負荷されているものと、（ｂ）その後目的の抗原ペプチドを負荷しなければならないものとして、すなわち、抗原ペプチドが負荷されているかまたは抗原ペプチド負荷可能であるＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ ａＡＰＭものとして区別される。
単量体非ＳＣＴ ＭＨＣクラスＩ ａＡＰＭは、典型的には、変性された形態で細菌溶解物から得られ、Ａｌｔｍａｎら、（ＵＳ５，６３５，３６３Ａ）によって記載されるように、ｉｎ ｖｉｔｒｏで目的の抗原性ペプチド及びβ2－ミクログロブリンと共にＭＨＣ複合体にリフォールディングされる。このようにして作られたａＡＰＭは、それぞれ目的の抗原ペプチドの存在下でリフォールディングする必要があるため、抗原ペプチドライブラリー全体を網羅するａＡＰＭ一式を作るのは非常に面倒である。この問題に対処するため、光切断可能なプレースホルダーペプチドの存在下でリフォールディングするａＡＰＭが記載されている（Ｔｏｅｂｅｓｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１２：２４６－２５１，２００６）．これらの分子では、光切断可能なプレースホルダーペプチドは、その後、紫外線を使って任意の抗原性ペプチドに置き換えることができる。より最近では、ペプチド交換触媒の使用により目的の抗原ペプチドをロードすることができる、安定なリフォールドされたが「空の」ＭＨＣクラスＩ分子の製造方法が記載されている（Ｓａｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１１２：２０２－２０７，２０１５）およびＨｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ１２７：２８８５－２８９７，２０１４）．しかし、ほとんどのＭＨＣクラスＩ ａＡＰＭは、真核細胞では最小限の効率と極めて低い収率でしか生産することができない。Ｓｃｈｎｅｃｋら（ＵＳ６，２６８，４１１Ｂ１）により記載された抗原ペプチド負荷可能ａＡＰＭは、真核細胞株において組換え二量体ＭＨＣ－ｍＩｇＧ１融合構築物（完全長マウスＩｇＧ１）として生産されるが、生産過程において無関係な内在性細胞ペプチドが負荷されている。これらの無関係なペプチドは、その後の非効率的で不完全な受動的ペプチド交換反応によって目的の抗原ペプチドに置き換える必要があり、再び、完全に機能する抗原ペプチド負荷ａＡＰＭの収量を減少させることにつながる。さらに、Ｓｃｈｎｅｃｋらによって提案された製造プロセスは、欠落しているマウス免疫グロブリン（Ｉｇ）軽鎖を提供し、ＭＨＣ－ｍＩｇＧ１構築物で安定的にトランスフェクトする必要がある全体的に低効率なマウスＢ骨髄腫（Ｊ５５８Ｌ）ベースのプロデューサー細胞株の確立を必要としている。また、Ｓｃｈｎｅｃｋら（ＵＳ６，２６８，４１１Ｂ１）、Ｇｒｅｔｅｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２７１：１２５－１３５，２００２は、Ｊ５５８Ｌ細胞株を用いた可溶性二量体ＳＣＴ－ｍＩｇＧ１分子の産生を報告している。
ＣＨＯ細胞から分泌される可溶性単量体マウスＭＨＣ－Ｉ ＳＣＴは、以前に記載されている（Ｍｏｔｔｅｚら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：４９３－５０２，１９９５）。細胞膜結合型ＳＣＴ ａＡＰＭ、特に「ジスルフィドトラップ」（ｄｔ）と呼ばれる追加のジスルフィド結合を用いて共有結合した抗原をＳＣＴ構築物の設計に固定するものは、Ｈａｎｓｅｎら（ＵＳ２００９０１１７１５３Ａ１）により以前に記載されたものである。さらに、Ｈａｎｓｅｎらは、細菌の溶解物から可溶性の単量体ジスルフィド捕捉型ＳＣＴを変性した形で生産し、その使用前に干渉を起こしやすいｉｎｖｉｔｒｏのリフォールディング手順を必要とすることを報告している。
上記のＭＨＣクラスＩ ａＡＰＭｓと同様に、単量体ＭＨＣクラスＩＩ ａＡＰＭｓの産生のためのわずかに異なるフォーマットが記載されており、Ｖｏｌｌｅｒｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １２３：３０５－３１３、２００８は、有用な概要を提供している。さらに、ヘテロ二量体として安定化させるために、ロイシンやＪｕｎ／ＦｏｓジッパーなどのＣ末端二量体化ドメインを持つＭＨＣクラスＩＩ ａＡＰＭが報告されている。
本発明のａＡＰＭは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでリフォールディングする必要なく真核細胞で容易に生産され、組換え生産時、特に懸濁増殖型フリースタイルＣＨＯ－Ｓまたはフリースタイル２９３－Ｆ細胞系などの一過性導入哺乳類発現系を用いて組換え生産時に既に抗原性ペプチド配列を含んでいるので、先行技術のこれらの不利な点を回避することができる。いくつかの実施形態において、本発明のａＡＰＭは、二量体または単量体ａＡＰＭのいずれかとして使用することができるが、当然に、本発明のアッセイにおける使用に適するように、ａＡＰＣの表面に取付けるための取付け配列を含まなければならない。本出願で提案するｄｔＳＣＴ－Ｆｃ構築物設計の主な利点は、増殖型フリースタイルＣＨＯ－Ｓ細胞またはフリースタイル２９３－Ｆ細胞のような一過性トランスフェクト哺乳類発現系で正しく折り畳まれたタンパク質を効率的に生産する能力があることである。
本発明のいくつかの実施形態において、ａＡＰＭは、アミノ末端からカルボキシル末端の順に、抗原提示ドメイン、二量化ドメイン、免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｆｃドメインおよび取付け配列を含む単一ポリペプチド配列であり、ここで、抗原提示ドメインの配列は、Ｎ末端の抗原ペプチド配列を含む。抗原提示ドメインは、当業者に公知の任意のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）アレルを含み得る。世界保健機関命名法委員会報告書に記載された、既知のＨＬＡアレルをリストアップしたデータベースは、https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/allele.htmlで入手できる。
このようなａＡＰＭでは、二量化ドメインはＩｇＧヒンジ領域を含み得る。典型的には、ＩｇＧヒンジ領域は、配列番号１または配列番号２を含む。配列番号１はマウスＩｇＧ２ａ配列に由来し、Ｃ２２４Ｓ変異を含んでおり、一方、配列番号２はヒトＩｇＧ１配列に由来し、Ｃ２２０Ｓ変異を含んでいる。配列番号１および配列番号２のヒンジ領域をそれぞれ含むａＡＰＭは、配列番号１を含む二量体化ドメインを有する２つのａＡＰＭまたは配列番号２を含む二量体化ドメインを有する２つのａＡＰＭが二量体化ドメイン内のそれぞれのシステイン残基間にジスルフィド橋を形成して二量体化するように補完的である。ジスルフィド結合はシステイン間にのみ形成されるため、通常分子間ジスルフィド橋を形成するＩｇ軽鎖が存在しない場合に、これらのシステインの異常なジスルフィド化を避けるためにＣ２２４ＳとＣ２２０Ｓの変異が導入された。
これらのａＡＰＭのいくつかのバージョンでは、Ｈｉｓ8－ｔａｇ、ビオチン化ＡｖｉＴａｇ、トロンビン切断部位などの切断配列が、抗原提示ドメインと二量化ドメインの間に（アミノ末端からカルボキシル末端の順に）存在し、生成したａＡＰＭにさらなる多様性を与えることができる。例えば、図４に示すように、このような更なる取付け配列と切断部位の組み合わせを導入することにより、図１に示す二量体ａＡＰＭとしても、トロンビン切断などの切断により抗原提示ドメインと二量体ドメインおよびＩｇ Ｆｃドメインを分離することにより抗原提示ドメインと取付け配列から単になるａＡＰＭとしても使用することができる。切断によって生成したこのようなａＡＰＭは、もはや二量体化することができないので、本発明のａＡＰＣ上で単量体ａＡＰＭとして機能することができる。例えば、図４に示す４量体のａＡＰＣは、このようなａＡＰＭを用いて組み立てることができる。
従って、本発明のａＡＰＣに用いられるａＡＰＭは、アミノ末端からカルボキシル末端の順に、抗原提示ドメインと取付け配列を含む単一ポリペプチド配列からなり、抗原提示ドメインの配列が、Ｎ末端の抗原ペプチド配列を含むものでもよい。
それにもかかわらず、ａＡＰＭがＩｇ Ｆｃドメインを含む実施形態では、ａＡＰＭのＩｇ Ｆｃドメインは、典型的には、定重鎖領域２および３（ＣＨ２－ＣＨ３）を含むマウスＩｇＧ２ａ Ｆｃ領域またはヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（ＣＨ２－ＣＨ３）領域のそれぞれ、アグリカン変異（ｔｈｅ ａｇｌｙｃａｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ）Ｎ２９７ＱまたはＮ２９７Ａを含むものである。特に、ＩｇＧ Ｆｃ領域は、配列番号３または配列番号４を含む。
本発明のａＡＰＭにおいて、特に上記で既に詳細に説明した実施形態では、取付け配列は、ａＡＰＭを表面に取付けさせるためのペプチドタグであり、特にａＡＰＭを表面へのアフィニティーベースの結合および／またはコンジュゲーションによって表面に取付けるためのペプチドタグである。
いくつかの実施形態では、取付け配列は、Ｈｉｓ－ｔａｇ（配列番号５）、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ ＩＩ（配列番号６）、グリシンセリンに富むスペーサー配列を挟む２つのＳｔｒｅｐ－ｔａｇ ＩＩ配列（配列番号７）、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ ＩＩ及びＣ末端システイン残基（配列番号８）及び／又はビオチン化取付け部位（ＡｖｉＴａｇ）（配列番号９）を含む。
いくついかの実施形態では、上記のペプチドタグ配列を組み合わせて、二重特異性を有する取付け配列を形成することができる。
本発明のａＡＰＭは、抗原ペプチド配列を含む。一般に、抗原ペプチド配列は、ウイルス抗原；細菌抗原；真菌抗原；寄生虫抗原；自己免疫抗原；アレルギー関連抗原および腫瘍抗原からなる群から選択される抗原である。一般に、ａＡＰＭは抗原特異的なＴ細胞応答を誘発することを目的としており、例えば、以前に抗原に曝露された患者サンプル中のＴ細胞を同定するために、抗原ペプチド配列は疾患関連抗原の配列である。しかしながら、当業者は、惹起され分析されたＴ細胞応答に応じて、そのようなペプチド抗原が、Ｔ細胞サンプルが得られた患者に起因する疾患表現型と相関し得るので、特性不明のペプチド配列の臨床関連性は、それらを本発明のａＡＰＭの抗原ペプチド配列として組み込むことによっても決定し得ることを理解するものと思われる。
いくつかの例示的な抗原ペプチド配列を以下に挙げるが、当業者は、Ｉｍｍｕｎｅ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＩＥＤＢ；オンラインでアクセス可能：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ）またはＭＨＣリガンドデータベースのＳＹＦＰＥＩＴＨＩデータベース（オンラインでアクセス可能：ｈｔｔｐ：／／ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｄｅ／）などの当該分野で認められている確立したペプチドエピトープデータベースを通じて利用できる抗原ペプチド配列に気付くであろう。ＩＥＤＢには５０万以上のペプチドエピトープが、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩにはクラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣ分子と結合することが知られている７０００以上のペプチド配列がリストアップされている。
本発明のａＡＰＭと共に使用するのに適したＭＨＣ－Ｉ抗原ペプチド配列の例は、配列番号１０～２９の配列である。
既に示したように、上記の抗原ペプチド配列の候補は決して網羅的なものではない。特定の実施形態では、抗原ペプチド配列は、以下からなる群から選択される。ヒトサイトメガロウイルスｐｐ６５ ４９５－５０３（配列番号１０）；エプスタイン－バーウイルスＢＭＬＦ－１ ２５９－２６７（配列番号１３）；インフルエンザウイルスマトリクスタンパク質５８－６６（配列番号１４）、ＮＹ－ＥＳＯ－１ １５７－１６５／１６５Ｖ（配列番号１１）；及びＳｕｒｖｉｖｉｎ９６－１０４／９７Ｍ（配列番号１２）。
本発明のａＡＰＭは、有利には、ＣＤ８+Ｔ細胞から免疫応答を引き出すのに適した抗原提示ドメインを含むか、または代替的に、ＣＤ４+Ｔ細胞から抗原提示ドメインを含むように構成されることができる。したがって、いくつかの実施形態では、単一ポリペプチド配列の抗原提示ドメインは、アミノ末端からカルボキシル末端の順に、抗原ペプチド配列、第１のリンカー配列、及びＭＨＣクラスＩ部分を含む。具体的には、そのような実施形態において、アミノ末端からカルボキシル末端までの順序のＭＨＣクラスＩ部分は、β2－ミクログロブリン配列、第２のリンカー配列、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ａ２ α１配列、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ａ２ α２配列及びＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ａ２ α３配列を含む。第１のリンカー配列は好適には第１のシステイン残基を含み、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ａ２ α１配列は第２のシステイン残基を含み、第１および第２のシステイン残基は、共有結合を介して抗原提示ドメインのＭＨＣクラスＩ部分への抗原ペプチド配列の結合を増強するジスルフィドトラップを形成している。好ましくは、第１のリンカー配列は、配列番号３０を含む。
ＭＨＣ クラスＩ ＨＬＡ－Ａ２ α１配列の２番目のシステイン残基は、ＭＨＣ クラス Ｉ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ α１配列の８４位のチロシンからシステインへの変異の結果である。好ましくは、ＭＨＣクラスＩ部分は、配列番号３１を含む。
加えて、いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ａ２ α２配列のグルタミン残基１１５は、ＣＤ８結合を強化するためにグルタミン酸に変異される。好ましくは、ＭＨＣクラスＩ部分は、配列番号３２を含む。
好ましい実施形態では、ａＡＰＭは、アミノ末端からカルボキシル末端の順序で以下のものを含む：抗原ペプチド配列および配列番号３３、これは、β2－ミクログロブリン配列（配列番号３４）、第２のリンカー配列（配列番号３５）、ＨＬＡ－Ａ＊０２．Ａ、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１［Ｙ８４Ｃ］エクトドメイン配列（配列番号３６）、第３のリンカー配列（配列番号３７）、マウスＩｇＧ２ａ－Ｆｃ［Ｃ２２４Ｓ，Ｎ２９７Ｑ］（配列番号３８）およびリンカー配列に接続したＳｔｒｅｐ－ｔａｇ ＩＩ（配列番号６）を含む。
代替的な実施形態では、単一ポリペプチド配列の抗原提示ドメインは、アミノ末端からカルボキシル末端の順に、抗原ペプチド配列、第１のリンカー配列、およびＭＨＣクラスＩＩ部分を含む。具体的には、そのような実施形態において、アミノ末端からカルボキシル末端の順序のＭＨＣクラスＩＩ部分は、ＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ－ＤＲβ１配列及びＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ－ＤＲβ２配列を含む。
配列番号３９（インフルエンザウイルスＨＡ１タンパク質由来／改変）および配列番号４０（ヒト血清アルブミンタンパク質由来）の小胞体（ＥＲ）リーダー配列は、それぞれＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩβ鎖ａＡＰＭについて生成したｃＤＮＡに存在し、発現／分泌の効力に影響を与えるが、成熟タンパク質から切断されることに注意されたい。これは、ＭＨＣ－ＩとＭＨＣ－ＩＩのａＡＰＭに当てはまる。
いくつかの好ましい実施形態では、ＤＲＢ１＊０３：０１／ＤＲＡ結合ペプチドリガンドは、配列番号４１～４６のペプチドから選択され得る。
それぞれのペプチドとＤＲＢ１＊０３：０１（または他のＭＨＣクラスＩＩアロフォーム）エクトドメインとを接続する第１のリンカー配列は、グリシンセリンに富む配列、配列番号４７を含んでいてよい。ＣＬＩＰ（ｃｌａｓｓ ＩＩ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｎｖａｒｉａｎｔ ｃｈａｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅ， ｈｕｍａｎ Ｉｎｖａｒｉａｎｔ Ｃｈａｉｎ 103-117）は、配列番号４９のようなＣＬＩＰと種々のＭＨＣ クラス ＩＩ ＤＲＢ ａｌｌｏｆｏｒｍｓとをつなぐトロンビン切断部位を有する配列と共に、配列番号４８のような普遍的プレースホルダーペプチドとして使用することができる。
いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩ部分は、配列番号５０のＤＲＢ１＊０３：０１エクトドメイン配列を含み、及び／又はアミノ末端からカルボキシル末端順にＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ－ＤＲα１配列及びＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ－ＤＲα２配列を含み、ここでＭＨＣクラスＩＩ部分は配列番号５１のＤＲＡ＊０１：０１配列を含む。
ここでも、ａＡＰＭをコードするｃＤＮＡにコードされている配列番号５２のＨＬＡ－ＤＲＡ ＥＲリーダー配列は、ａＡＰＭの可溶性タンパク質としての発現／分泌に有益であるが、成熟タンパク質の処理中に切り離される。このように、ＤＲＡ鎖のＥＲリーダーペプチド（配列番号５２）は、配列番号５１の成熟タンパク質には存在しない。
ＭＨＣクラスＩＩ抗原提示ドメインを有するａＡＰＭにおいて、二量化ドメインは、配列番号５３を構成するパラレルコイルドコイルド基本ジッパーモチーフのような酸性／塩基性ジッパーモチーフ、または代替的に、配列番号５４を含むパラレルコイルドコイルド酸性ジッパーモチーフのような酸性ジッパーモチーフをさらに含んでいる。例えば、配列番号５３がＭＨＣクラスＩＩヘテロ二量体の一方の鎖上に存在する場合、配列番号５４はＭＨＣクラスＩＩヘテロ二量体の他方の鎖上に存在する。
好ましくは、ａＡＰＭは、アミノ末端からカルボキシル末端の順序で、抗原ペプチド配列と、配列番号５６と強制的に共発現される配列番号５５を含む。
すでに述べたように、本発明は、二量体を形成するように構成された、特別に設計されたａＡＰＭに関するもので、同じタイプの別のａＡＰＭとホモ二量体を形成するか、あるいは、ａＡＰＭのみが抗原ペプチド配列を含んでいるヘテロ二量体を形成するように別の分子と二量体を形成するように構成されている。
本発明のａＡＰＭは、二量体化するように特別に設計されている。従って、本発明は、上記のような人工抗原提示分子（ａＡＰＭ）を含む二量体からなるａＡＰＣにも関する。
二量体は、ＭＨＣクラスＩ抗原提示ドメインを含む２つのａＡＰＭのホモまたはヘテロ二量体、あるいはＭＨＣクラスＩＩ抗原提示ドメインを含むものと第２の分子のヘテロ二量体のいずれかである。
ＭＨＣクラスＩＩ ａＡＰＭヘテロ二量体において、第２の分子は、アミノ末端からカルボキシル末端の順に、ａＡＰＭのＭＨＣクラスＩＩ部分に相当するがＮ末端の抗原ペプチド配列を持たないＭＨＣクラスＩＩ部分、ａＡＰＭの二量化ドメインと相補的な二量化ドメイン、免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｆｃドメインおよび取付け配列からなる単一ポリペプチド配列を含む。
ヘテロ二量体において、第２の分子の二量化ドメインは、ａＡＰＭのＩｇＧヒンジ領域と相補的なＩｇＧヒンジ領域と、ａＡＰＭのパラレルコイルドコイル酸性／塩基ジッパーモチーフと相補的なパラレルコイルドコイル酸性／塩基性ジッパーモチーフを含んでいる。
ヘテロ二量体の第２の分子の取付け配列は、ａＡＰＭの取付け配列と同じ配列であるか、異なる配列であるかのいずれかである。例えば、ＭＨＣクラスＩＩ二量体は、異なる取付け配列を有する配列番号５５及び配列番号５６を含んでもよい。
ａＡＰＭの取り付けを可能にする例示的な取付け配列は、すでにリストアップされ、上述されている。また、これらの取付け配列は、第２の分子の取付け配列として利用することができる。このように、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇのような取付け配列を用いて、ａＡＰＭ二量体を特異的に操作されたストレプトアビジン、すなわちＳｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎからなるビーズに結合させることができる。同様に、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ－ｔａｇ）取付け配列を用いて、ニッケルニトリロ三酢酸（Ｎｉ－ＮＴＡ）結合ビーズに二量体を取付けることも可能である。さらに、部位特異的な酵素的ビオチン化可能なタグ配列（すなわちＡｖｉＴａｇ）を用いて、二量体をストレプトアビジン結合ビーズに結合させることができる。さらに、表面への取付けは、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド）／１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド（ＮＨＳ／ＥＤＣ）架橋を介してカルボキシビーズの表面にａＡＰＭおよび／または第２の分子のＮ－末端を直接結合することにより媒介することが可能である。さらに、ＩｇＧ２ａ－Ｆｃドメインは、抗ＩｇＧ２ａ抗体またはプロテインＡ／Ｇでコートされたビーズに捕捉され、それによってａＡＰＭおよび／または第２の分子がビーズの表面に取付けされ得る。同様に、取付け配列がペプチドタグの場合、そのような二量体は、抗Ｈｉｓ－ｔａｇ抗体や抗Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ抗体など、タグのペプチド配列に特異的な抗体でコーティングされたビーズに取付けることができる。
取付け配列が異なる場合、ペプチドタグを介したコンジュゲーションとアフィニティーに基づく取付けの組み合わせなど、取付け配列の適切な変形や組み合わせを選択することは、当業者であれば容易にできるであろう。
ヘテロ二量体（ＤＲＡ／ＤＲＢ）の精製とホモ二量体（ＤＲＡ／ＤＲＡ＋ＤＲＢ／ＤＲＢ）の除去には、異なる取付け配列を使用することができる。しかし、本発明者らは、ＩｇＧヒンジ領域とパラレルコイルドコイル酸性／塩基性ジッパーモチーフの組み合わせにより、所望のヘテロ二量体が優位に形成されることを突き止めた。そのような実施形態では、したがって、順次／差分精製は無視されてもよい。
しかし、ビオチン化構築物を使用する場合、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇによる精製が不可能になるため、ヒスチジンタグを介して精製される。
Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ ＩＩ／Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ 精製システムは、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ ＩＩ配列（ＷＳＨＰＱＦＥＫ）を含み、この配列は改変型／変異型ストレプトアビジンであるＳｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎに高い選択性で結合する。このように、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇは、Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ樹脂を介して、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇに融合した目的のタンパク質をアフィニティ精製することができる。ここで、デスチオビオチンやビオチンは、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇとしてＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎへの親和性が高いため、Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎからタグ付きタンパク質を溶出するために使用される。ビオチンはＳｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎとほとんど不可逆的に結合し、ＮａＯＨを用いてのみ溶出させることが可能である。そのため、目的のタンパク質がビオチン化されていると、ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎに不可逆的に結合してしまい、ほとんど溶出させることができない。そのため、別の精製システムが必要になる。
Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ ＩＩ／Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ 精製システムは、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ ＩＩ配列（ＷＳＨＰＱＦＥＫ）を含み、この配列は改変型／変異型ストレプトアビジンであるＳｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎに高い選択性で結合する。このように、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇは、Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ樹脂を介して、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇに融合した目的のタンパク質をアフィニティ精製することができる。ここで、デスチオビオチンやビオチンは、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇとしてＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎへの親和性が高いため、Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎからタグ付きタンパク質を溶出するために使用される。ビオチンはＳｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎとほとんど不可逆的に結合し、ＮａＯＨを用いてのみ溶出させることが可能である。そのため、目的のタンパク質がビオチン化されていると、ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎに不可逆的に結合してしまい、ほとんど溶出させることができない。そのため、別の精製システムが必要になる。
このように、第二分子のペプチドタグにより、アフィニティーベースの取付けおよび／または直接コンジュゲーションによって、二量体を表面に取付けることができる。
第２の分子の取付け配列は、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８または配列番号９を含むペプチドタグから選択することができる。
図１は、本発明のａＡＰＣに使用するための例示的なＭＨＣ－Ｉ二量体（ａＡＰＭ）のドメイン構造およびアセンブリを示す図である。示された例示的なジスルフィドトラップ（ｄｔ）ペプチド－ＭＨＣ－クラスＩ（ｐＭＨＣ－Ｉ）免疫グロブリンＦｃ（Ｆｃ）ａＡＰＭ二量体は、共有結合したＴ細胞エピトープペプチドリガンド（８～１１アミノ酸）を含む二つの単一ポリペプチド鎖、ヒトβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）、ＨＬＡクラスＩアレルのエクトドメイン、マウス免疫グロブリンのアイソタイプＩｇＧ２ａの定重鎖（ＣＨ）ドメイン２および３を含む。点線は柔軟なグリシン－セリンリンカーを示す。Ｃ末端ペプチド伸長部とＭＨＣ－Ｉチロシン（Ｙ）８４残基の代わりにシステイン（Ｃ）残基との分子内ジスルフィドトラップは、ｐＭＨＣ複合体をさらに安定化させている。Ｃ末端のＳｔｒｅｐ－Ｔａｇ ＩＩ（ＳＴａｇ）配列により、中性条件下でのアフィニティ精製が可能である。
図２は、本発明のａＡＰＣに使用するための例示的なＭＨＣ－ＩＩ二量体（ａＡＰＭ）のドメイン構造およびアセンブリを示す図である。示される例示的なペプチド－ＭＨＣ－クラスＩＩ（ｐＭＨＣ－ＩＩ）単量体免疫グロブリンＦｃ融合ａＡＰＭ二量体は、ＭＨＣ－ＩＩ ａＡＰＭポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖（第２の分子）を含む。ＭＨＣ－ＩＩ ａＡＰＭポリペプチド鎖は、ＭＨＣ－ＩＩ β鎖のＮ末端に、柔軟なグリシン－セリンリンカーを介して抗原性ペプチドを融合させたものである。β鎖エクトドメイン（β１－β２）のＣ末端は、パラレルコイルドコイル（ｐＣＣ）塩基性ジッパーに融合し、ヒンジドメインとｍＩｇＧ２ａ（Ｆｃ）のＣＨ２およびＣＨ３、Ｃ末端のヘキサヒドロシジン（Ｈｉｓ6）タグとＡｖｉＴａｇで部位特異的に、酵素によりビオチン化されている。第２の分子は、単形ＭＨＣ－ＩＩ α鎖（α１－α２）のエクトドメインからなるポリペプチド鎖で、Ｃ末端に相補的な酸性ｐＣＣ－ＦｃとＣ末端のＳｔｒｅｐ－Ｔａｇ ＩＩが融合したものである。
第１の局面において、本発明は、抗原ペプチド配列の提示に応答してＴ細胞のエフェクター分子を検出するための人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）に関するものであり、ａＡＰＣは、以下を含む：
（ａ） 表面であって、表面は粒子、任意選択でビーズの表面；
（ｂ） １つ以上の人工抗原提示分子（ａＡＰＭ）であって、ａＡＰＭは、その取付 け配列を介してまたは直接化学結合を介して表面に取付けられた、ａＡＰＭおよび
（ｃ） 表面に取付けられた１つ以上の捕捉分子、
ここで、１つ以上のａＡＰＭの各々および／または１つ以上の二量体の各々は、同一の抗原ペプチド配列を含む。
（ａ） 表面であって、表面は粒子、任意選択でビーズの表面；
（ｂ） １つ以上の人工抗原提示分子（ａＡＰＭ）であって、ａＡＰＭは、その取付 け配列を介してまたは直接化学結合を介して表面に取付けられた、ａＡＰＭおよび
（ｃ） 表面に取付けられた１つ以上の捕捉分子、
ここで、１つ以上のａＡＰＭの各々および／または１つ以上の二量体の各々は、同一の抗原ペプチド配列を含む。
ａＡＰＭが取付けされ得る粒子又はビーズとしては、直径０．５～５０μｍ、特に０．５～４０μｍ、特に０．５～３０μｍ、特に０．５～２０μｍ、特に０．５～１０μｍ、特に２．５～７．５μｍ、特に３～７μｍ、特に４～７μｍ、特に５～７μｍの範囲、例えば６．５μｍの粒子又はビーズが好適である。本発明のａＡＰＣの特定の実施形態では、粒子は、直径約６．５μｍを有するＬｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって開発・提供された磁性ＭａｇＰｌｅｘ（登録商標）マイクロスフェア（以下、「Ｌｕｍｉｎｅｘビーズ」と称することがある）である。
本発明のａＡＰＣを形成するためにａＡＰＭを取付ける粒子またはビーズの表面は、ａＡＰＭそれぞれの取付け配列を介して上記のａＡＰＭを取付けるのに適したものである必要がある。特に、粒子またはビーズは、その表面に、ａＡＰＭの取付け配列の対応する部位と適合する部位を含むことができる。例えば、
（ａ） ａＡＰＭの取付け配列がビオチン配列を含み、粒子またはビーズがストレプ トアビジンでコーティングされている；
（ｂ） ａＡＰＭの取付け配列がＳｔｒｅｐ－ｔａｇ配列を含み、粒子またはビーズ がＳｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎで被覆されている；
（ｃ） ａＡＰＭの取付け配列がＩｇ Ｆｃ配列を含み、粒子またはビーズが抗Ｆｃ 抗体またはプロテインＡ／Ｇでコーティングされているなどである。
（ａ） ａＡＰＭの取付け配列がビオチン配列を含み、粒子またはビーズがストレプ トアビジンでコーティングされている；
（ｂ） ａＡＰＭの取付け配列がＳｔｒｅｐ－ｔａｇ配列を含み、粒子またはビーズ がＳｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎで被覆されている；
（ｃ） ａＡＰＭの取付け配列がＩｇ Ｆｃ配列を含み、粒子またはビーズが抗Ｆｃ 抗体またはプロテインＡ／Ｇでコーティングされているなどである。
ａＡＰＣの捕捉分子により、ａＡＰＣによる抗原提示に応答してＴ細胞が放出するエフェクター分子を捕捉することができる。ａＡＰＭｓに依存して、特にａＡＰＣのＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ ａＡＰＭｓの組み合わせに依存して、エフェクター分子はＣＤ４+および／またはＣＤ８+細胞によって放出されるかもしれない。このように、１つ以上の捕捉分子は、抗原ペプチド配列の提示に応答してＴ細胞から放出される、任意に分泌される、１つ以上のエフェクター分子に特異的な１つ以上の捕捉抗体である。例えば、１つ以上の捕捉抗体は、同じエフェクター分子に特異的であってもよいし、１つ以上の捕捉抗体群を含み、各群は異なるエフェクター分子に特異的であってもよい。１つ以上の捕捉分子は、以下からなる群から選択される１つ以上のエフェクター分子に特異的な捕捉抗体であってもよい。インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）、インターロイキン２（ＩＬ－２）、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７、ＩＬ－２１、ＩＬ－３５、グランザイムＢ、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）、リンパトキシンα（ＬＴ－α）、およびトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ－β）。このリストは例示であり、すべてを網羅するものではない。しかし、当業者に明らかなように、捕捉抗体の品質／親和性は、エフェクター分子を効率的に捕捉することに大きな影響を与える。
抗原提示時にＴ細胞を共刺激分子と接触させることで、提示された抗原に対するＴ細胞の反応を高めることができる。このような共刺激分子は数多く記載されており、そのいくつかは本発明において特に有用である。抗原ペプチド配列の提示に対するＴ細胞の応答を強化するための共刺激分子へのＴ細胞の暴露は、（ａ）可溶性の共刺激分子の使用、または（ｂ）その表面に取付けした１つ以上の固定化共刺激分子をさらに含む本発明のａＡＰＣの使用のいずれかで達成することができる。
選択肢（ａ）は、場合によっては選択肢（ｂ）と比較して好ましいかもしれない。なぜなら、共刺激分子の取付けによってａＡＰＣ表面の捕捉分子の容量が減少しないため、ａＡＰＣの感度を最大にすることができ、したがって、それらが使用されるアッセイの感度を最大にすることができるからである。しかし、選択肢（ｂ）を行う場合、ａＡＰＭそのものと同様の手段で共刺激分子をａＡＰＣに取付けることができる。例えば、共刺激分子は、Ｎ末端の刺激ドメインと免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｆｃドメイン、および任意でさらにＣ末端の取付け配列からなる融合タンパク質であり得る。特に、共刺激分子は、アフィニティーベースの取付けおよび／または直接的なコンジュゲーションによってａＡＰＣへの取付けに適している。例示的な共刺激分子は、ＩＣＡＭ１（ＣＤ５４）またはＬＦＡ－３（ＣＤ５８）の刺激因子ドメインとｍｌｇＧ２ａ－Ｆｃ部分との融合体である。
純粋かつ事前に特性評価したＴ細胞集団、すなわち、１つの抗原特異性のみを有し、「バイスタンダーＴ細胞を含まない」Ｔ細胞株を、Ｔ細胞の活性化を増強すると以前に説明した特定の共刺激分子と組み合わせて本発明のａＡＰＣに暴露したところ、本発明者は、共刺激分子がない場合でも本発明のａＡＰＣによってＴ細胞が非常に効率的に刺激されることを示して、Ｔ細胞の活性化が追加的に増強されないことを見いだした。特に、抗ＣＤ２８／抗４－１ＢＢまたは抗ＣＤ２抗体は、本発明のａＡＰＣを利用するＴ細胞応答アッセイにおいて決定可能なＴ細胞応答を改善しないことが指摘された。例えば、本発明者らは、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）ｐｐ６５495-503／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ ｐＭＨＣ－Ｉ複合体に特異的な、様々な健康なドナー由来の純ＣＤ８+Ｔ細胞株を使用した。そのウイルス特異的Ｔ細胞は（１）ｐＭＨＣ多量体染色を用いてＨＬＡ－Ａ＊０２：０１アレル発現（ＨＬＡ－Ａ２+）健康ドナー由来末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）で同定され、（２）同族ペプチドを用いて拡大し、（３）ｐＭＨＣ－Ｆｃ（本発明に記載のａＡＰＭ）と磁気ビーズを用いて分離し、（４）照射した同族ペプチド負荷ＨＬＡ－Ａ２+ ＰＢＭＣ（ｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌ）で再び拡大し、純Ｔ細胞系を取得された。
しかし、腫瘍患者から得られたＴ細胞サンプルに共刺激分子を作用させることは、このようなアッセイの感度を高めるために有益であると依然として考えられている。特に、本発明のａＡＰＣを用いるアッセイは、腫瘍特異的抗原に対する患者特異的Ｔ細胞応答を決定するために、すなわち患者のＴ細胞集団の免疫学的特徴付けを可能にし、したがって患者の腫瘍の抗原性構成の特徴付けを可能にするのに特に適しているので、本発明は、腫瘍特異的抗原の決定、すなわち患者の腫瘍の免疫学的特徴付けを可能にする。
さらにまた、組換えヒト４－１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、ヒトＣＤ７０、ヒトＢ７－１（ＣＤ８０）またはＢ７－２（ＣＤ８６）は、特にそれらがＩｇＦｃに融合されている場合、本発明のａＡＰＣとの使用に適した共刺激分子における刺激ドメインとして機能し得る。このような組換え生産された共刺激Ｉｇ Ｆｃ融合分子は、同じ共刺激受容体に結合する対応する抗ＣＤ２８抗体または抗４－１ＢＢ抗体と比較して、Ｔ細胞に対する共刺激作用が増加する可能性がある。いくつかの実施形態では、共刺激分子は、ａＡＰＭと同じａＡＰＣに取付けしていてもよい。また、Ｔ細胞がａＡＰＣによって抗原を提示されたときに、Ｔ細胞に対する刺激効果がまだ続いているように、ａＡＰＣへのＴ細胞の曝露と同時に、または少なくともそのような密接な時間順序で、Ｔ細胞が利用できるように異なる基材に取付けることもできる。いくつかの実施形態では、共刺激分子は、表面又は基質に取付けなくてもよいが、単にＴ細胞培養液の可溶性成分としてＴ細胞刺激に利用可能であってもよい。
１つ以上の共刺激分子は、任意に、抗ＣＤ２、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２７、抗ＣＤ１３４、抗ＣＤ１３７、またはＢ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、ＩＣＡＭ－１（ＣＤ５４）、ＬＦＡ－３（ＣＤ５８）、４－１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）およびＯＸ４０Ｌ（ＣＤ２５２）、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）およびＣＤ７０などの組み換え共刺激分子からなる群から選択される１つ以上の細胞表面発現共刺激性Ｔ細胞受容体に特異的な抗体から選択される１つ以上の共刺激抗体である。
１つ以上の好ましい実施形態において、１つ以上の共刺激抗体は、同じ共刺激受容体に特異的であるか、又は１つ以上の共刺激抗体は、１つ以上の共刺激抗体群を含み、各群は、同じ共刺激受容体の異なる群に特異的である。
本願発明のａＡＰＣは、様々なレベル及び／又はマルチプレックス化の程度を提供する。例えば、ａＡＰＣの粒子は、他の粒子から識別可能かつ分離可能であるようにコード化されてもよく、任意選択で粒子は色分けされてもよい。このような実施形態では、カラーコードは、ａＡＰＣに取付けしたａＡＰＭの抗原ペプチド配列を示す。このように、色分けされた粒子はフローサイトメトリー分析によって分離することができる。さらに、または代替的に、粒子は磁性体であってもよい。Ｔ細胞に提示された特定の抗原または抗原の組み合わせに基づいてａＡＰＣを選別・分離することで、ａＡＰＣの捕捉分子が捕捉したエフェクター分子を解析することができる。個々のＴ細胞が個々のａＡＰＣと相互作用し、その結果、Ｔ細胞とａＡＰＣが物理的に近接することにより、Ｔ細胞が放出したエフェクター分子が、細胞に特定の抗原を提示するａＡＰＣに捕捉されることを考慮すると、Ｔ細胞は、ａＡＰＣに捕捉されることができる。このように、ａＡＰＣが提示する抗原やａＡＰＣに結合する捕捉分子の同一性に基づいてａＡＰＣを分離することができるため、特定の抗原に応答してＴ細胞から放出されるエフェクター分子の組み合わせ（プロファイル）を解剖することができる。
本発明のアッセイにおける使用のために、本発明の第２の局面として、第１の局面による複数のａＡＰＣを含む組成物が開示され、ここで、組成物は、複数の同一のａＡＰＣを含む。同一のａＡＰＣは、それぞれの単一のエフェクター分子に特異的な単一の捕捉分子を含み、または同一のａＡＰＣは、それぞれの複数のエフェクター分子に特異的な複数の捕捉分子を含む。このような組成物は、以下にさらに説明する本発明の第３の局面のアッセイにおいて、特定の抗原の提示に応答して放出されるエフェクター分子のプロファイルを評価するために特に有用である。
あるいは、第２の局面の組成物において、各群の全てのａＡＰＣは同一にコードされ、各群のａＡＰＣが提示する抗原ペプチド配列は、群内では同一だが、各群間では異なるものである。好ましくは、各群のａＡＰＣは、それぞれの単一のエフェクター分子に特異的な単一の捕捉分子を含むか、または、各群のａＡＰＣは、いくつかのそれぞれのエフェクター分子に特異的な複数の捕捉分子を含む。
このような組成物は、さらなるマルチプレックス化の程度および／またはレベルを提供する。特に、異なるａＡＰＣ、すなわち提示される異なる抗原に対するＴ細胞集団の複数のＴ細胞応答を評価する場合や、さらに後述する本発明の第４の局面のアッセイにおいて、ａＡＰＣ上に複数の捕捉抗体を含ませて、複数のエフェクター分子を検出する場合などに有用である。
図３は、例示的なポリシストロンＭＨＣ－Ｉ ａＡＰＭ構築物のドメイン構造、及び本発明のａＡＰＣに使用するためのＭＨＣ－Ｉ ａＡＰＭへのそのアセンブリを示す図である。示される例示的なポリシストロンＭＨＣ－Ｉ ａＡＰＭ構築物は、Ｔ２Ａ配列を介して単一のベクターで共発現された２つの別々のポリペプチド鎖からなるｐＭＨＣ－Ｉヘテロ二量体ビオチンタグ付きＦｃ構築物（ｐＭＨＣ－Ｉ－ｐＣＣ－Ｆｃ）である。第１のａＡＰＭポリペプチド鎖は、パラレルコイルドコイル（ｐＣＣ）塩基性ジッパーに融合した一本鎖三量体（ＳＣＴ）（ジスルフィドトラップペプチドリガンド、β２ｍ、ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子エクトドメイン）としてのｐＭＨＣ－Ｉ部分、続いてヒンジドメインとｍＩｇＧ２ａ（Ｆｃ）のＣＨ２およびＣＨ３、そして部位特異的ビオチン化用にＨｉｓ6タグとＡｖｉＴａｇを含む組み合わせＣ末取付け配列を含む。第２のａＡＰＭポリペプチド鎖は、同じｐＭＨＣ－Ｉ部分を含むが、相補的な酸性ｐＣＣおよびＦｃドメインと、Ｃ末端のＳｔｒｅｐ－Ｔａｇ ＩＩ取付け配列を含む。ＥＲ保持シグナル配列ＫＤＥＬと融合したＢｉｒＡリガーゼ分子（ＢｉｒＡ－ＫＤＥＬ）の共発現により、示されたｐＭＨＣ－Ｉ－ｐＣＣ－Ｆｃ ａＡＰＭはｉｎ ｖｉｖｏで部位特異的にビオチン化される。得られたビオチン化ｐＭＨＣ－Ｉ－ｐＣＣ－Ｆｃ－Ｂｉｏ ａＡＰＭは、ストレプトアビジン表面でｐＭＨＣ－Ｉ八量体に多量化するか、ストレプトアビジン被覆ビーズの表面に固定化し、図示するように本発明のａＡＰＣを生成することが可能である。
本発明のａＡＰＣに使用するためのさらなるＭＨＣ－Ｉ ａＡＰＭ構築物のドメイン構造、およびＭＨＣ－Ｉ ａＡＰＭへのそのアセンブリを示す図である。例示的なｐＭＨＣ－Ｉ－ホモ二量体ビオチンタグ付きａＡＰＭ構築物は、切断可能なＦｃ領域（ｐＭＨＣ－Ｉ－ＡｖｉＴａｇ－ＴＣＳ－Ｆｃ）を有する。特に、示された構築物は、順に、オクタヒスチジン（Ｈｉｓ8）－タグおよびＡｖｉＴａｇに続いてトロンビン切断部位（ＴＣＳ）配列と融合した一本鎖三量体（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ－ｔｉｍｅｒ、ＳＣＴ、上記の図３について記載される）としてのｐＭＨＣ－Ｉ複合体を含む単一ポリペプチド鎖を含む。切断部位はＣ末端にヒンジドメインとｍＩｇＧ２ａのＣＨ２、ＣＨ３（Ｆｃ）、オプションでＳｔｒｅｐ－Ｔａｇ ＩＩ（ＦｃのＣ末端）と融合している。ｐＭＨＣ－Ｉ－ＡｖｉＴａｇ－ＴＣＳ－Ｆｃ ａＡＰＭ構築物は、ＥＲ保持シグナル配列ＫＤＥＬ（ＢｉｒＡ－ＫＤＥＬ）と融合したＢｉｒＡリガーゼの共発現により、ｉｎ ｖｉｖｏで部位特異的にビオチン化される。ビオチン化ｐＭＨＣ－Ｉ ａＡＰＭ単量体を生成するために、Ｆｃ部分はトロンビンによって切断される。ｐＭＨＣ－Ｉ－ビオチンａＡＰＭ単量体は、可溶性ストレプトアビジンを用いてｐＭＨＣ－Ｉ多量体に多量化するか、またはストレプトアビジン被覆ビーズの表面に固定化し、示されるように本発明のａＡＰＣを生成することが可能である。
第３の局面において、本発明は、抗原特異的Ｔ細胞応答を決定するためのアッセイに関し、該アッセイは、以下の工程を含む。
（ａ） 同一のａＡＰＣによる抗原ペプチド配列の提示時にＴ細胞からの応答を誘発 するのに適した条件および時間で、第２の局面による組成物をＴ細胞に接触させる こと；
（ｂ） Ｔ細胞からａＡＰＣを分離すること；
（ｃ） ａＡＰＣを、ａＡＰＣの１つ以上の捕捉分子が特異的である１つ以上のエフェ クター分子に対する検出抗体と接触させること；
（ｄ） ａＡＰＣの１つ以上の捕捉分子によって捕捉されたエフェクター分子を検出 することによって、Ｔ細胞のエフェクター分子の放出を分析すること、
これにより、同一のａＡＰＣが提示する抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞応答が決定される。
（ａ） 同一のａＡＰＣによる抗原ペプチド配列の提示時にＴ細胞からの応答を誘発 するのに適した条件および時間で、第２の局面による組成物をＴ細胞に接触させる こと；
（ｂ） Ｔ細胞からａＡＰＣを分離すること；
（ｃ） ａＡＰＣを、ａＡＰＣの１つ以上の捕捉分子が特異的である１つ以上のエフェ クター分子に対する検出抗体と接触させること；
（ｄ） ａＡＰＣの１つ以上の捕捉分子によって捕捉されたエフェクター分子を検出 することによって、Ｔ細胞のエフェクター分子の放出を分析すること、
これにより、同一のａＡＰＣが提示する抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞応答が決定される。
第４の局面において、本発明は、複数の抗原特異的Ｔ細胞応答を決定するためのアッセイに関し、該アッセイは、以下の工程を含む。
（ａ） 各群のａＡＰＣによって提示された異なる抗原ペプチド配列の各々の提示時 にＴ細胞から応答を誘発するのに適した条件及び時間で、第２の局面による組成物 をＴ細胞に接触させること；
（ｂ） Ｔ細胞からａＡＰＣを分離すること；
（ｃ） ａＡＰＣの各群内のａＡＰＣの１つ以上の捕捉分子が特異的である１つ以上 のエフェクター分子に対する検出抗体と、ａＡＰＣを接触させること、
（ｄ） 前記ａＡＰＣの各群のａＡＰＣを同定し、分離すること；
（ｅ） ａＡＰＣの各群内のａＡＰＣの１つ以上の捕捉分子によって捕捉されたエフ ェクター分子を検出することによって、Ｔ細胞のエフェクター分子の放出を分析す ること、
これにより、ａＡＰＣの各群によって提示された各抗原ペプチド配列に特異的な複数の抗原特異的Ｔ細胞応答が決定される。
（ａ） 各群のａＡＰＣによって提示された異なる抗原ペプチド配列の各々の提示時 にＴ細胞から応答を誘発するのに適した条件及び時間で、第２の局面による組成物 をＴ細胞に接触させること；
（ｂ） Ｔ細胞からａＡＰＣを分離すること；
（ｃ） ａＡＰＣの各群内のａＡＰＣの１つ以上の捕捉分子が特異的である１つ以上 のエフェクター分子に対する検出抗体と、ａＡＰＣを接触させること、
（ｄ） 前記ａＡＰＣの各群のａＡＰＣを同定し、分離すること；
（ｅ） ａＡＰＣの各群内のａＡＰＣの１つ以上の捕捉分子によって捕捉されたエフ ェクター分子を検出することによって、Ｔ細胞のエフェクター分子の放出を分析す ること、
これにより、ａＡＰＣの各群によって提示された各抗原ペプチド配列に特異的な複数の抗原特異的Ｔ細胞応答が決定される。
本発明の第３および第４の局面に係るアッセイにおいてＴ細胞から応答を引き出すのに適した条件および時間については、以下の実施例にも示されているように、ある重要なパラメータが特定されている。しかし、当業者は、Ｔ－Ｐｌｅｘアッセイに使用されるＴ細胞の適切な維持を保証するために必要な培養条件及びパラメータに関する一般的な知識に基づいて、また日常的な実験を採用することによって、成功するために最も適した条件を決定することができる。
アッセイを成功させるためには、ａＡＰＣを含む組成物をＴ細胞に接触させる工程の間、ａＡＰＣとＴ細胞の均一な混合懸濁液を生成するように試料を動かし続けることが重要である。
このような運動は、例えば、図６（ｂ）にも示されているように、実験室のローラー上で反応容器を静かに、しかし絶えずローリングすることで発生させることができる（「Ｏｎｅ－ｔｕｂｅ反応」）。例えば、アッセイチューブ（直径約１ｃｍ）をミキシング／ローリング装置の２つのローラー（直径約３ｃｍ）の隙間に水平に置き、アッセイチューブを長手軸方向に回転させる。装置の毎分回転数がアッセイチューブの毎分回転数とほぼ一致するため、サンプルのクロスコンタミネーションを最小限に抑えながら、適切な反応条件を実現することができる。特に、理論に縛られることなく、一定の動きによって、マッチングしないａＡＰＭに連結しているバイスタンダーａＡＰＣ上の可溶性エフェクターサイトカイン、すなわちＩＦＮ－γの交差汚染（または「交差出血」）が制限されると考えられる。これは、静的条件静置状態では、ａＡＰＭが一致するａＡＰＣと接触している活性化Ｔ細胞に近接していると考えられる。つまり、反応容器を常にローリングさせることで、Ｔ細胞反応を起こしていないａＡＰＣに捕捉されたエフェクター分子の交差汚染／交差出血を防ぐことができる。あるいは、１２－、２４－、４８－、９６－ウェルプレートのような転がらない反応容器では、図６（ａ）に示されるような容器の３Ｄ／軌道運動によって試験サンプルを運動させることができる。
このような運動は、例えば、図６（ｂ）にも示されているように、実験室のローラー上で反応容器を静かに、しかし絶えずローリングすることで発生させることができる（「Ｏｎｅ－ｔｕｂｅ反応」）。例えば、アッセイチューブ（直径約１ｃｍ）をミキシング／ローリング装置の２つのローラー（直径約３ｃｍ）の隙間に水平に置き、アッセイチューブを長手軸方向に回転させる。装置の毎分回転数がアッセイチューブの毎分回転数とほぼ一致するため、サンプルのクロスコンタミネーションを最小限に抑えながら、適切な反応条件を実現することができる。特に、理論に縛られることなく、一定の動きによって、マッチングしないａＡＰＭに連結しているバイスタンダーａＡＰＣ上の可溶性エフェクターサイトカイン、すなわちＩＦＮ－γの交差汚染（または「交差出血」）が制限されると考えられる。これは、静的条件静置状態では、ａＡＰＭが一致するａＡＰＣと接触している活性化Ｔ細胞に近接していると考えられる。つまり、反応容器を常にローリングさせることで、Ｔ細胞反応を起こしていないａＡＰＣに捕捉されたエフェクター分子の交差汚染／交差出血を防ぐことができる。あるいは、１２－、２４－、４８－、９６－ウェルプレートのような転がらない反応容器では、図６（ａ）に示されるような容器の３Ｄ／軌道運動によって試験サンプルを運動させることができる。
また、異なる色のビーズを空間的に分離し、共有のアッセイルーム内で固定化し（下に磁石がある６ウェル上のスポットビーズ）、その後、テストサンプルの軌道／３Ｄミキシング動作を行うことも可能である。さらに、ローリングさせやすい反応容器を使用する場合、ローリング前に遠心分離して細胞やａＡＰＣをコンパクトにすることが、アッセイ感度の向上に有効であることが証明されている。理論に縛られることなく、この最初の遠心分離の有益な効果は、ａＡＰＣと同族Ｔ細胞が形状（直径）や重量などの物理的特性が似ているため、ペレット内の近接、すなわちアッセイの最初から互いに近接するように配置される機会を最も高めると思われる。例えば、ヒトＴ細胞は７～９μｍの範囲の直径を有するが、本発明のａＡＰＣのいくつかの実施形態で用いられるＬｕｍｉｎｅｘビーズは約６．５μｍの直径を有する。このように、Ｔ細胞とａＡＰＣは、反応容積の三次元空間の類似した体積に存在する、すなわち、ペレット内で互いに近接した範囲に存在すると考えられる。そのため、ａＡＰＣとＴ細胞が直接的に相互作用する可能性が高くなる。
また、アッセイの感度は、ａＡＰＣに使用する捕捉分子の特異性と親和性に依存する。いくつかの実施形態では、捕捉分子として「より優れた」抗ＩＦＮ－γ抗体クローンを使用することにより、アッセイの感度が約２倍改善され得る。さらに、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦ－αが捕捉されるべきエフェクター分子である場合、ａＡＰＣを含む組成物をＴ細胞に適切な条件で約４～６時間接触させると、適切なＴ細胞応答を引き起こすためには、ａＡＰＣの結合分子の３０～５０％がｐＭＨＣ（ａＡＰＭ）でなければならないとされている。
４～６時間という時間は最適と思われ、活性化ＣＤ８+Ｔ細胞によるＩＦＮ－γの分泌がおよそ９０分のラグフェーズを持つことが示された文献で報告されている観察と一致しており（Ｄｕｓｈｅｋｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｓｉｇｎａｌ．４（１７６）：ｒａ３９，２０１１）、ＩＦＮ－γの分泌は、Ｔ細胞の最初の刺激から４時間後にピークに達し（Ｂｅｔｔｓｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２８１（１－２）：６５－７８，２００３）、一方、より長い曝露時間は、Ｔ細胞応答を誘発しなかったａＡＰＣ上のバイスタンダーエフェクター分子捕獲によって引き起こされるバックグラウンドシグナルを増加させる。
第３及び第４の局面のアッセイにおいて、Ｔ細胞は、精製Ｔ細胞である。
図５は記載されたアッセイおよび方法に従って抗原特異的Ｔ細胞応答を決定するためのマルチプレックスアッセイにおいて使用するための、本発明のａＡＰＣのアセンブリを示す図である。特に、Ｔ細胞特異性を定義されたビーズ色に結合するための本発明のａＡＰＣの使用は、本発明のａＡＰＣを通じて可能となるマルチプレックス化の第一レベルを説明するために示されている。（ａ）ａＡＰＣの概念。示された本発明のアッセイに使用するための例示的なａＡＰＣは、Ｔ細胞エフェクター分子捕捉能力、特にサイトカインインターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）を捕捉する能力を有するビーズベースの色分けされたａＡＰＣである。ａＡＰＣは、定義されたｐＭＨＣ－ＩまたはｐＭＨＣ－ＩＩおよび他の任意の共刺激分子とエフェクターサイトカイン捕捉抗体を色分けされたビーズに結合させることによって組み立てられる。（ｂ）本発明の例示的なａＡＰＣの構築およびアセンブリ。第一段階として、ＩＦＮ－γ捕捉抗体（マウスＩｇＧ１アイソタイプ）とモノクローナルラット抗ムリンＩｇＧ２ａ抗体を３対２の割合で、着色カルボキシル化磁性ポリスチレン微粒子（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐ．のＭａｇＰｌｅｘ（登録商標）Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ、以下「Ｌｕｍｉｎｅｘビーズ」）に共有結合させた。第二段階では、ａＡＰＭを発現するＣＨＯ－Ｓ細胞からの粗上清を用いるか、あるいはアフィニティークロマトグラフィーで精製したｐＭＨＣ－Ｉ－ｍＩｇＧ２ａ－Ｆｃを用いて、このように調製したビーズに飽和量のａＡＰＭを負荷させる。（ｃ）ａＡＰＣの配位系。上記のＬｕｍｉｎｅｘ社製ビーズを用いた３０種類のａＡＰＣプールと、フローサイトメーターで測定したそれぞれの領域（位置）の２次元ドットプロットを示す。各ａＡＰＣプールは、それぞれのｐＭＨＣ－ＩまたはｐＭＨＣ－ＩＩ ａＡＰＭとのコンジュゲーションにより、定義されたＴ細胞エピトープに簡単に結合させることができる。（ｄ）マルチプレックスアッセイの基本原理：ｐＭＨＣ－Ｆｃと抗ＩＦＮ－γ捕捉抗体を結合した色分けされたａＡＰＣ（Ｔ－Ｐｌｅｘビーズ）が抗原特異的にＴ細胞を活性化し、その活性化同族Ｔ細胞のＩＦＮ－γ分泌を促進させる。分泌されたＩＦＮ－γは同じビーズに近接して捕捉され、蛍光色素で標識されたαＩＦＮ－γ検出抗体によって検出することができる。Ｔ－Ｐｌｅｘビーズは、その固有の色（ビーズ分類）とＩＦＮ－γの負荷に基づいて、適切なビーズ分析装置（ＦＡＣＳ）で分析することができる。ｄｔ－ｐＭＨＣ－Ｉ－Ｆｃ二量体：ジスルフィドトラップされた（ｄｔ）ペプチド－ＭＨＣ－クラスＩ（ｐＭＨＣ－Ｉ）免疫グロブリンＦｃ（Ｆｃ）二量体；ｍＡｂ：モノクローナル抗体。
図６は、異なる２つの例示的なＴ－Ｐｌｅｘアッセイのワークフローを示す図である。（ａ）ビーズスポッティングに続き、軌道振とうを行うＴ－Ｐｌｅｘアッセイワークフロー。マルチプレックスアッセイを可能にし、ＩＦＮ－γのクロスブリードを避けるために、異なるｐＭＨＣ－Ｆｃ ａＡＰＭをロードした色分けされたＴ－Ｐｌｅｘビーズを、適切な反応室（６ウェルプレートまたはプレートの蓋）の下に置かれた９６ウェルの磁石によって発生する個々の磁気反応場にスポットする。Ｔ細胞を培地が満たされたチャンバーに加え、反応全体を３７℃で穏やかに一定の３Ｄ軌道攪拌下で４～６時間インキュベートする。最終段階では、Ｔ細胞とビーズを磁気的に分離することができる。その後、すべてのビーズをプールし、そのＩＦＮ－γ負荷を分析する。（ｂ）Ｔ－Ｐｌｅｘの「ローテーション・ワン・チューブ反応」原理。異なるｐＭＨＣ－Ｆｃ ａＡＰＭを負荷した色分けされたＴ－Ｐｌｅｘビーズを円錐形のスカート付きチューブに充填し、ＣＯ2－ｓａｔｕｒｅｄアッセイメディウムと分析するＴ細胞サンプルと一緒にセットする。アッセイチューブを閉め、図のように３７℃で４～６時間回転させる。最後に磁気ビーズを磁石で回収し、洗浄する。その後、Ｔ－ＰｌｅｘビーズはＩＦＮ－γの負荷量について分析される。
図７は記載されたアッセイおよび方法に従って抗原特異的Ｔ細胞応答を決定するためのマルチプレックスアッセイにおいて使用するための、本発明のさらなるａＡＰＣのアセンブリを示す図である。特に、抗原特異的ＣＤ４+Ｔ細胞検出および並行機能プロファイリングのための本発明のａＡＰＣの使用は、本発明のａＡＰＣを通じて可能となるマルチプレックス化のいくつかのレベルを説明するために示されている。マルチプレックスに基づく抗原特異的ＣＤ４+Ｔ細胞検出と並行機能プロファイリング。２つの異なるＴ－Ｐｌｅｘアッセイのワークフローを例示する。（ａ）ＣＤ４+Ｔ細胞集団のマルチプレックスベースの抗原特異的および機能的表現型プロファイリングのために、様々な異なる捕捉抗体からなるａＡＰＣは、ｐＭＨＣ－ＩＩ－ｐＣＣ－Ｆｃおよび他のオプションの共刺激分子などの特定のａＡＰＭを、いくつかの異なるエフェクターサイトカイン捕捉抗体とともに色分けしたビーズ（Ｔ－Ｐｌｅｘ2ビーズ）に結合させて組み上げられる。（ｂ）Ｔ－Ｐｌｅｘ2ビーズ（ａＡＰＣ）は、抗原特異的に同族ＣＤ４+Ｔ細胞を活性化し、機能表現型と活性化Ｔ細胞のものに応じたサイトカインの分泌を促進する。Ｔｈ１ＣＤ４+Ｔ細胞の決定的なサイトカインはＩＦＮ－γであるが、Ｔｈ２分化ではむしろＩＬ４、Ｔｈ１７分化ではＩＬ１７、Ｔｒｅｇ分化ではＩＬ１０が分泌されるようになる。分泌されたサイトカインは同じビーズに近接して捕捉され、サイトカインに応じて異なる蛍光色素（色素Ａ～Ｄ）で標識された検出抗体パネルで検出することができる。
図８は記載されたアッセイおよび方法に従ってＣＤ４+および／またはＣＤ８+ Ｔ－Ｐｌｅｘ2アッセイを設計するための例示的なアセンブリコンセプトを示す図である。異なるサイトカイン捕捉抗体と、異なる蛍光色素を結合させたサイトカイン検出抗体を組み合わせることで、２段階のマルチプレックス化、すなわち２次元での検出が可能となる（Ｔ－Ｐｌｅｘ2）。マルチプレックスアッセイの第一の次元は、内部カラーａＡＰＣによってコード化され、Ｔ細胞抗原特異性を反映する。一方、第二の次元は、同族Ｔ細胞刺激時に同じＴ－Ｐｌｅｘビーズ上で複数の異なるサイトカインを検出することに基づいている。これにより、１回のアッセイ反応内で、ＣＤ８+ Ｔ細胞プールだけでなく、抗原特異的ＣＤ４+Ｔ細胞プールの機能プロファイルの分化と解析が可能になる。
図９は、Ｔ－Ｐｌｅｘアッセイのプルーフオブコンセプトを示したものである。特に、以下の実施例１に記載された実験の結果は、３つの異なる純粋な抗原特異的ＣＤ８+Ｔ細胞株（モデルシステム）／ｐＭＨＣ－Ｉを用いたＴ－Ｐｌｅｘアッセイのマルチプレックス検出能力を強調するものである。
特に、実施例１～７は、本発明の第３及び第４の局面によるアッセイを説明するものである。第３及び第４の局面のアッセイは、Ｔ細胞からａＡＰＣを分離する追加の工程を含んでいてもよく、ａＡＰＣをＴ細胞の生存率を維持するのに適した条件下で洗浄し、その後、分離したＴ細胞をさらなるｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養のために回収する工程を含む。このようなＴ細胞回収は、以下の実施例８で詳細に説明する。
第５の局面では、本発明は、以下を含むベクターに関する。
（ａ） 第１の局面について定義されたａＡＰＭの単一ポリペプチド配列をコードす るポリヌクレオチド配列、または
（ｂ） 第１の局面について定義された二量体の両方のペプチド鎖をポリシストロン で発現させるためのポリヌクレオチド配列。
（ａ） 第１の局面について定義されたａＡＰＭの単一ポリペプチド配列をコードす るポリヌクレオチド配列、または
（ｂ） 第１の局面について定義された二量体の両方のペプチド鎖をポリシストロン で発現させるためのポリヌクレオチド配列。
本発明の第１の局面のａＡＰＭの単一ポリペプチド配列をコードするのに適したポリヌクレオチドベクター配列、ならびに第２の局面の二量体の両ペプチド鎖のポリシストロン発現に適したポリヌクレオチドベクター配列に関する配列情報は、配列番号５７および５８としてそれぞれ提供される。
さらなる局面において、本発明はまた、第１の局面に係るａＡＰＣの製造方法に関し、当該方法は、以下を共有結合により
（ａ） ａＡＰＭ、好ましくはａＡＰＭは、アミノ末端からカルボキシル末端の順に 、抗原提示ドメイン、二量化ドメイン、免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｆｃドメインおよ び取付け配列を含む単一ポリペプチド配列であり、ここで、抗原提示ドメインの配 列は、Ｎ末端の抗原ペプチド配列を含む、ａＡＰＭ、および
（ｂ） 捕捉分子、好ましくは捕捉抗体、
をマイクロスフィア、好ましくは色分けされたマイクロスフィアの表面に取付けることを含む。
（ａ） ａＡＰＭ、好ましくはａＡＰＭは、アミノ末端からカルボキシル末端の順に 、抗原提示ドメイン、二量化ドメイン、免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｆｃドメインおよ び取付け配列を含む単一ポリペプチド配列であり、ここで、抗原提示ドメインの配 列は、Ｎ末端の抗原ペプチド配列を含む、ａＡＰＭ、および
（ｂ） 捕捉分子、好ましくは捕捉抗体、
をマイクロスフィア、好ましくは色分けされたマイクロスフィアの表面に取付けることを含む。
本発明は、以下の非限定的な実施例によってさらに説明される。
実施例１Ｔ－Ｐｌｅｘアッセイを用いた抗原特異的マルチプレックス検出による、定義されたＴ細胞株セットの検出
この実験では、３つの異なる純粋な抗原特異的ＣＤ８+ Ｔ細胞株（モデルシステム）／ｐＭＨＣ－Ｉを用いたＴ－Ｐｌｅｘアッセイのマルチプレックス検出能力を明らかにしている。
この実験では、３つの異なる純粋な抗原特異的ＣＤ８+ Ｔ細胞株（モデルシステム）／ｐＭＨＣ－Ｉを用いたＴ－Ｐｌｅｘアッセイのマルチプレックス検出能力を明らかにしている。
４種類の色（Ｌｕｍｉｎｅｘ ｂｅａｄ ＩＤ／ｒｅｇｉｏｎ：０１２，０１３，０１４，０１８）の前駆体Ｔ－Ｐｌｅｘビーズ（抗ＩＮＦγｍＡｂおよび抗－ｍＩｇＧ２ａ－Ｆｃ（Ｆｃ）ｍＡｂ結合Ｌｕｍｉｎｅｘビーズ）に、定義されたｐＨＬＡ－Ａ２－Ｆｃ ａＡＰＭｓセットをロードした。
ａＡＰＭ負荷Ｔ－ＰｌｅｘビーズＩＤ／Ｔ細胞エピトープごとに１０，０００個のビーズを、ＣＯ2飽和細胞培地約５００μｌを満たした円錐形の５００μｌチューブ１本に、表示量の抗原特異的Ｔ細胞株と組み合わせた。Ｔ－Ｐｌｅｘアッセイは３７℃、４時間、４０ｒｐｍで実施した。Ｔ細胞株の存在は、図９に示すように、コントロールビーズを上回る同族Ｔ－ＰｌｅｘビーズのＩＦＮ－γ負荷（ＩＦＮ－γ＋ビーズ）サブポピュレーションが出現することで示された。ＥＢＶ ＢＭＬＦ－１259-267／ＨＬＡ－Ａ２（Ａ２）特異的ＣＤ８+ Ｔ細胞株＃０１４４（ＥＢＶ／Ａ２ Ｔ細胞）、ＨＣＭＶ ｐｐ６５495-503／Ａ２特異的ＣＤ８+ Ｔ細胞株＃４１６（ＣＭＶ／Ａ２ Ｔ細胞）、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ96-106／Ａ２特異的ＣＤ８+ Ｔ細胞株（Ｓｕｒ／Ａ２ Ｔ細胞）が使用された。図９のＴ－Ｐｌｅｘデータの行は、同じ反応／ビーズミックス（マルチプレックス検出）からの分析結果である。Ｔ－ＰｌｅｘビーズアセンブリにｐＨＬＡ－Ａ２－Ｆｃ ａＡＰＭｓを使用。Ｓｕｒｖｉｖｉｎ96-104/ＨＬＡ－Ａ２－Ｆｃ（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ／Ａ２－Ｆｃ），Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ＭＰ－１58-66/Ａ２－Ｆｃ（Ｆｌｕ／Ａ２－Ｆｃ），ＨＣＭＶ ｐｐ６５495-503／Ａ２－Ｆｃ（ＣＭＶ／Ａ２－Ｆｃ）およびＥＢＶ ＢＭＬＦ－１259-267／Ａ２－Ｆｃ（ＥＢＶ／Ａ２－Ｆｃ）．
ａＡＰＭ負荷Ｔ－ＰｌｅｘビーズＩＤ／Ｔ細胞エピトープごとに１０，０００個のビーズを、ＣＯ2飽和細胞培地約５００μｌを満たした円錐形の５００μｌチューブ１本に、表示量の抗原特異的Ｔ細胞株と組み合わせた。Ｔ－Ｐｌｅｘアッセイは３７℃、４時間、４０ｒｐｍで実施した。Ｔ細胞株の存在は、図９に示すように、コントロールビーズを上回る同族Ｔ－ＰｌｅｘビーズのＩＦＮ－γ負荷（ＩＦＮ－γ＋ビーズ）サブポピュレーションが出現することで示された。ＥＢＶ ＢＭＬＦ－１259-267／ＨＬＡ－Ａ２（Ａ２）特異的ＣＤ８+ Ｔ細胞株＃０１４４（ＥＢＶ／Ａ２ Ｔ細胞）、ＨＣＭＶ ｐｐ６５495-503／Ａ２特異的ＣＤ８+ Ｔ細胞株＃４１６（ＣＭＶ／Ａ２ Ｔ細胞）、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ96-106／Ａ２特異的ＣＤ８+ Ｔ細胞株（Ｓｕｒ／Ａ２ Ｔ細胞）が使用された。図９のＴ－Ｐｌｅｘデータの行は、同じ反応／ビーズミックス（マルチプレックス検出）からの分析結果である。Ｔ－ＰｌｅｘビーズアセンブリにｐＨＬＡ－Ａ２－Ｆｃ ａＡＰＭｓを使用。Ｓｕｒｖｉｖｉｎ96-104/ＨＬＡ－Ａ２－Ｆｃ（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ／Ａ２－Ｆｃ），Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ＭＰ－１58-66/Ａ２－Ｆｃ（Ｆｌｕ／Ａ２－Ｆｃ），ＨＣＭＶ ｐｐ６５495-503／Ａ２－Ｆｃ（ＣＭＶ／Ａ２－Ｆｃ）およびＥＢＶ ＢＭＬＦ－１259-267／Ａ２－Ｆｃ（ＥＢＶ／Ａ２－Ｆｃ）．
実施例２：バイスタンダーＴ細胞は、Ｔ－Ｐｌｅｘアッセイの感度を低下させない
ここでは、ある一定量のバイスタンダーＴ細胞がＴ－Ｐｌｅｘアッセイの検出感度を損なうかどうかを解析するために、バイスタンダー（ｃｔｒｌ）Ｔ細胞に検出対象のＴ細胞株を埋め込む（スパイクする）方法を採用した。しかし、図１０に示すように、そのようなことはない。
ここでは、ある一定量のバイスタンダーＴ細胞がＴ－Ｐｌｅｘアッセイの検出感度を損なうかどうかを解析するために、バイスタンダー（ｃｔｒｌ）Ｔ細胞に検出対象のＴ細胞株を埋め込む（スパイクする）方法を採用した。しかし、図１０に示すように、そのようなことはない。
ｐＭＨＣ－Ｉ－Ｆｃ ａＡＰＭをロードしたａＡＰＣ（すなわち、Ｔ－ＰｌｅｘビーズＩＤ／Ｔ細胞エピトープあたり１０，０００ビーズ）を、１，０００ＨＣＭＶｐｐ６５495-503／Ａ２特異的ＣＤ８+Ｔ細胞株＃４１６（ＣＭＶ／Ａ２ Ｔ細胞）、あるいは１，０００ＣＭＶ／Ａ２ Ｔ細胞、３０万バイスタンダーＳｕｒｖｉｖｉｎ96-106／Ａ２特異的ＣＤ８+Ｔ細胞（Ｓｕｒ／Ａ２ Ｔ細胞）に添加したもののいずれかと組み合わせた。Ｔ－Ｐｌｅｘアッセイは、５００μｌのチューブを３７℃、４０ｒｐｍで４時間回転させながら実施した。Ｔ細胞株の存在は、図１０に示すように、認識された同族Ｔ－ＰｌｅｘビーズにＩＦＮ－γ+サブポピュレーションが出現することで示された。Ｓｕｒ／Ａ２ Ｔ細胞と使用したすべてのＴ－Ｐｌｅｘビーズの機能性は、ｐｈｏｒｂｏｌ １２－ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３－ａｃｅｔａｔｅ （ＰＭＡ）／ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ （ｉｏｎｏ．）に基づく刺激によって確認された。この実験では、４色のＴ－Ｐｌｅｘビーズ（ビーズＩＤ：０１２，０１３，０１４，０１８）に、定義したｐＨＬＡ－Ａ２－Ｆｃ ａＡＰＭｓを負荷した。図１０では、同族ＣＭＶ／Ａ２ Ｔ－ＰｌｅｘビーズのＩＦＮ－γシグナルＩＤ １４（青色／薄灰色）および１つの代表的な対応するＣｔｒｌ－Ｔ－ＰｌｅｘビーズシグナルＩＤ ０１８（濃灰色）のみが示されている。上下のＦＡＣＳ－ｐｌｏｔは、同じ反応／ビーズミックス（マルチプレックス検出）からのデータ解析を表す。この実験では、Ｔ－ＰｌｅｘビーズのアセンブリにＳｕｒｖｉｖｉｎ96-104/ＨＬＡ－Ａ２－Ｆｃの代わりにｐＨＬＡ－Ａ２－Ｆｃ ａＡＰＭ ＮＹ－ＥＳＯ－１157-165/ＨＬＡ－Ａ２－Ｆｃが使用された。
実施例３：Ｔ細胞株スパイクサンプルのＴ－Ｐｌｅｘアッセイとの比較によるｐＭＨＣ－Ｉ多量体染色
２つのＴ細胞株（モデル系）を用いて、１つの「ゴールドスタンダード」アッセイ（ｐＭＨＣ－Ｉ多量体染色）と本発明によるＴ－Ｐｌｅｘアッセイとの比較を行い、結果を図１１に示す。
２つのＴ細胞株（モデル系）を用いて、１つの「ゴールドスタンダード」アッセイ（ｐＭＨＣ－Ｉ多量体染色）と本発明によるＴ－Ｐｌｅｘアッセイとの比較を行い、結果を図１１に示す。
ｐＭＨＣ多量体染色とは、可溶性ＭＨＣ－ペプチドオリゴマー（多量体）、例えば意図的に設計されたＭＨＣ二量体、五量体および／または高次オリゴマー、ならびに蛍光色素と共有結合したビオチン－ストレプトアビジンベース四量体（Ａｌｔｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２７４（５２８４）：９４－９６，１９９６）を用いてＴ細胞表面上に発現する抗原特異性Ｔ細胞受容体をフローサイトメトリに基づいて検知することである。この方法では、抗原特異的なＴ細胞が、その細胞の細胞表面に発現しているＴ細胞受容体にマッチング／同族ｐＭＨＣ多量体が結合することで、直接可視化することができる。
ＨＣＭＶ ｐｐ６５495-503/Ａ２特異的ＣＤ８+ Ｔ細胞株＃４１６（ＣＭＶ／Ａ２ Ｔ細胞）を５００，０００ Ｓｕｒｖｉｖｉｎ96-106／Ａ２ 特異的Ｔ細胞のプールに規定量（約４０－１００，０００）個別にスパイクした。スパイクされたテストサンプルを半分に分け、市販のｐＭＨＣ－Ｉ多量体染色（ａ）またはＴ－Ｐｌｅｘアッセイ（ｂ）で分析した。図１１（ａ）ｐＭＨＣ－Ｉ多量体染色の様子。スパイクしたサンプルを、５０ｎＭのダサチニブ存在下で、市販のＣＭＶ／Ａ２ ｐＭＨＣ－Ｉ五量体（ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ社製）で染色した。ＣＤ８+／ＣＤ３+ Ｔ細胞集団内のｐＭＨＣ－多量体+の頻度を示している。また、ｐＭＨＣ－Ｉ多量体細胞の総量を外挿したものを示す。図１１（ｂ）対応するＴ－Ｐｌｅｘアッセイ。同族ＣＭＶ／Ａ２－ＦｃまたはコントロールｐＭＨＣ－Ｉ－Ｆｃを添加した４種類のＴ－Ｐｌｅｘビーズプール（各１０，０００ビーズ）をスパイクしたＴ細胞サンプルと組み合わせ、Ｔ－Ｐｌｅｘアッセイで分析した。Ｔ－Ｐｌｅｘアッセイは、５００μｌのチューブを３７℃、４０ｒｐｍで４時間回転させながら実施した。同族ＣＭＶ／Ａ２ Ｔ－ＰｌｅｘビーズのＩＦＮ－γシグナル（青／薄灰色）と、対応するコントロールビーズの代表的なシグナル（濃灰色）を示す。ＩＦＮ－γ+ Ｔ－Ｐｌｅｘビーズの総量を外挿したものを赤の数字で示す。上下のＦＡＣＳ－ｐｌｏｔは、同じ反応／ビーズミックス（マルチプレックス検出）のデータ解析を表す。図１１（ｃ）線形範囲評価。カウンティングチャンバーに基づく計算で得られたスパイクＣＭＶ／Ａ２ Ｔ細胞の量は、ｐＭＨＣ－Ｉ多量体+細胞の外挿総量（左パネル）またはＩＦＮ－γ+ Ｔ－Ｐｌｅｘビーズの外挿総量（右パネル）に対してプロットされている。直線回帰曲線を示す（赤点線）。
図１１（ａ）に示すように、市販のＨＣＭＶ ｐｐ６５495-503／Ａ２－多量体（五量体、ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ）染色では０．００５％（２．５ｘ１０5細胞中約２０）という非常に低い頻度で確実に検出され、これは公表されているｐＭＨＣ－Ｉ多量体染色の検出限界である（Ｂｅｎｔｚｅｎ ａｎｄ Ｈａｄｒｕｐ，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．６６（５）：６５７－６６６，２０１７）。一方、Ｔ－Ｐｌｅｘアッセイでは、１００～２００個の抗原特異的Ｔ細胞が検出限界であり、周囲のバイスタンダーＴ細胞にほとんど依存しないことも示されている（図１１（ｂ）参照）。このように、ｐＭＨＣ－Ｉ多量体染色はＴ－Ｐｌｅｘアッセイと比較して約１０倍の感度を有しているが、Ｔ－Ｐｌｅｘアッセイとは対照的に、Ｔ細胞反応の機能評価や被験者の回収はできない。ダイナミックレンジの観点からは、１万個以上の同族Ｔ細胞が存在すると、コントロールＴ－ＰｌｅｘビーズへのＩＦＮ－γバイスタンダー捕捉が厳しくなり、同族（ＡＰＭに一致）とコントロールＴ－Ｐｌｅｘビーズ（ＡＰＭに一致せず）が明確に分離しなくなる。このような環境下では、Ｔ－Ｐｌｅｘアッセイの性能はＥＬＩＳｐｏｔアッセイとほぼ同等であることを示している。しかし、標準的な９６ウェルプレートベースのＥＬＩＳｐｏｔでは、９００～１０００個／ウェルのスポット形成細胞で既にシグナルが飽和状態に達しており、単一のスポット形成細胞の区別がつかない（Ｋａｒｌｓｓｏｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２８３（１－２）：１４１－１５３，２００３）。一方、Ｔ－Ｐｌｅｘアッセイは、約１００から１００００の同族Ｔ細胞の間で直線的な関係を示す（図１１（ｃ））。有利なことに、この範囲内では、検出されたＩＦＮ－γ負荷Ｔ－Ｐｌｅｘビーズ（ＩＦＮ－γ+）の量は、サンプル中に存在する抗原特異的Ｔ細胞の量を確実に反映する。この知見は、図１１で用いたモデルＴ細胞株だけでなく、図１７／実施例８に示すように、ＣＤ８+Ｔ細胞プール全体の中の抗原特異的Ｔ細胞についても当てはまる。さらに、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイとは異なり、Ｔ－Ｐｌｅｘアッセイは１回の反応で複数の抗原特異的Ｔ細胞応答を並行して検出することが可能である。
実施例４：Ｔ－Ｐｌｅｘ アッセイの最適化および重要なアッセイパラメータの特定
Ｔ－Ｐｌｅｘ アッセイの感度を向上させるために、（１）Ｔ－Ｐｌｅｘ ビーズ自体の組成、（２）Ｔ－Ｐｌｅｘ反応時間、（３）チューブローリングスピード、（４）ローリング前のテストサンプルとＴ－Ｐｌｅｘビーズの初期近接度などのパラメータによる影響を分析した（図１２）。さらに、図１３では、（５）使用したアッセイチューブの形状やサイズ、（６）Ｔ－Ｐｌｅｘビーズ上の共刺激作用抗体の存在、（７）１テストあたりの使用Ｔ－Ｐｌｅｘビーズ量、（８）ＩＦＮ－γ捕捉能力のみを有するバイスタンダービーズ（ＩＦＮ－γスカベンジャービーズ）によるアッセイ反応の追加補充などのパラメータが解析されている。
Ｔ－Ｐｌｅｘ アッセイの感度を向上させるために、（１）Ｔ－Ｐｌｅｘ ビーズ自体の組成、（２）Ｔ－Ｐｌｅｘ反応時間、（３）チューブローリングスピード、（４）ローリング前のテストサンプルとＴ－Ｐｌｅｘビーズの初期近接度などのパラメータによる影響を分析した（図１２）。さらに、図１３では、（５）使用したアッセイチューブの形状やサイズ、（６）Ｔ－Ｐｌｅｘビーズ上の共刺激作用抗体の存在、（７）１テストあたりの使用Ｔ－Ｐｌｅｘビーズ量、（８）ＩＦＮ－γ捕捉能力のみを有するバイスタンダービーズ（ＩＦＮ－γスカベンジャービーズ）によるアッセイ反応の追加補充などのパラメータが解析されている。
図１２に示すすべての実験において、ＨＣＭＶ ｐｐ６５495-503／ＨＬＡ－Ａ２（ＣＭＶ／Ａ２）特異的ＣＤ８+ Ｔ細胞株の約１０００個の細胞を、Ｔ－Ｐｌｅｘアッセイ反応の試験試料として使用した。図１２（ａ）および（ｂ）では健常者ドナー＃８６６７から、図１２（ｃ）および（ｄ）では＃４１６からＴ細胞株（Ｔｃ）を作製した。特に言及しない限り、Ｔ－Ｐｌｅｘビーズは、共有結合した抗ＩＦＮ－γ捕捉モノクローナル抗体（αＩＦＮ－γ ｍＡｂ）クローンＭＤ－１（ＭＤ－１）とラットα－マウスＩｇＧ２ａアイソタイプ（α－ｍＩｇＧ２ａ ｍＡｂ）クローンＲＭＧ２ａを用いて３対２比率（６０％ＭＤ－１／４０％Ｃｌｏｎｅ ＲＭＧ２ａ）でアセンブルされている。その後、定義された色分けされたビーズ（ＩＤ）にＳＣＴベースのｐＭＨＣ－Ｉ－ｍＩｇＧ２ａ－Ｆｃ構築物が装填された。組み立てたＴ－Ｐｌｅｘビーズ（４ｘマルチプレックス／各々１０，０００ビーズ）とテストサンプルを４０ｒｐｍ、３７℃、４時間回転させた。次に、Ｔ－ＰｌｅｘビーズをαＩＦＮ－γ検出用ｍＡｂ（クローン４Ｓ．Ｂ３）で染色し、解析した。図１２（ａ）Ｔ－Ｐｌｅｘビーズ上のα－ｍＩｇＧ２ａ／ｐＭＨＣ－Ｉ－Ｆｃとα－ＩＦＮ－γ ｍＡｂの比率の滴定と２種類のαＩＦＮ－γ ｍＡｂの使用量。αＩＦＮ－γ ｃｌｏｎｅ ＮＩＢ４２またはｃｌｏｎｅ ＭＤ－１ （ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）をベースにした６０：４０ αＩＦＮ－γ／ｐＭＨＣ－Ｉ－Ｆｃ Ｔ－ＰｌｅｘビーズのＦＡＣＳ ｂｌｏｔとしてＴ－Ｐｌｅｘアッセイの代表的結果を示す。同族ＣＭＶ／Ａ２ Ｔ－ＰｌｅｘビーズのＩＦＮ－γシグナル（青／薄灰色）と、対応するコントロールビーズの代表的なシグナル（濃灰色）を示す。棒グラフは、Ｔ－Ｐｌｅｘビーズ上の抗（α）－ＩＦＮ－γとα－ｍＩｇＧ２ａ／ｐＭＨＣ－Ｉ－Ｆｃの比率に依存したＴ－Ｐｌｅｘビーズの性能を示す。図１２（ｂ）Ｔ－Ｐｌｅｘアッセイのキネティックス。Ｔ－Ｐｌｅｘアッセイは上記のように実施し、指示されたインキュベーション時間後に反応を停止し、分析した。図１２（ｃ）ローリング速度に基づくＴ－Ｐｌｅｘアッセイの性能。Ｔ－Ｐｌｅｘアッセイは、５００μｌチューブを用いて様々な回転数で、またはＵ底９６ウェルのプレートを用いて静的条件で実施した。ＣＤ８+Ｔ細胞の脱顆粒を、（Ｂｅｔｔｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２８１（１－２）：６５－７８，２００３）によって方法論的に記載されたように、α－ＣＤ１０７ａ染色を用いて並行反応において分析した。図１２（ｄ）ローリング前のテストサンプルとＴ－Ｐｌｅｘビーズの遠心分離の影響。被験物質とＴ－Ｐｌｅｘビーズを、ＣＯ2飽和アッセイ培地と組み合わせた５００μｌのコニカルチューブに充填し、ボルテックスした。次の工程は、指示された通りにローリング前に行った。
図１３（ａ）、（ｃ）および（ｄ）に示す実験では、共有結合したαＩＦＮ－γ捕捉ｍＡｂ（クローンＭＤ－１）とラットα－ｍＩｇＧ２ａ（クローンＲＭＧ２ａ）を３対２の割合（６０％ＭＤ－１／４０％ ＲＭＧ２ａ）で用いてＴ－Ｐｌｅｘビーズが組み立てられた。その後、定義されたビーズ領域（ＩＤ）にｐＭＨＣ－ｍＩｇＧ２ａ－Ｆｃ構築物をロードした。特に指定のない限り、組み立てたＴ－Ｐｌｅｘビーズ（４ｘマルチプレックス／各々１０，０００ビーズ）と試験サンプルを６０ｒｐｍ、３７℃で４時間３０分間回転させた。次に、Ｔ－ＰｌｅｘビーズをαＩＦＮ－γ検出用ｍＡｂで染色し、分析した。図１３（ａ）～（ｃ）では約１，０００個、図１３（ｄ）では約１０，０００個のＣＭＶ ＨＣＭ ｐｐ６５495-503／ＨＬＡ－Ａ２（ＣＭＶ／Ａ２）固有のＣＤ８+Ｔ細胞株（ＴＣ）を、健常人ドナー＃８６６７または＃４１６由来のいずれかのＴ－Ｐｌｅｘアッセイ反応用の試験試料として使用した。図１３（ａ）～（ｄ）では、同族ＣＭＶ／Ａ２ Ｔ－ＰｌｅｘビーズのＩＦＮ－γシグナル（青、薄灰色）および３つ中１つの対応するＣｔｒｌビーズシグナル（濃灰色）を示している。
チューブの形状、サイズ、充填量がＴ－Ｐｌｅｘアッセイの性能に与える影響を評価し、結果を図１３（ａ）に示す。Ｔ－Ｐｌｅｘアッセイは、図に示すように、チューブのサイズ／形状や充填量（赤色）を変えて、上記のように実施した。さらに共刺激性ｍＡｂを添加したＴ－Ｐｌｅｘビーズの性能を評価し、その結果を図１３（ｂ）に示す。ここでは、ラットα－ｍＩｇＧ２ａ（Ｃｌｏｎｅ ＲＭＧ２ａ）、αＩＦＮ－γ ｃａｐｔｕｒｅ ｍＡｂ（Ｃｌｏｎｅ ＭＤ－１）、αＣＤ２８ ｍＡｂ（Ｃｌｏｎｅ １５Ｅ８）とαＣＤ２ ｍＡｂ（ＲＰＡ－２．１０）を指定比率で共有結合させたＴ－Ｐｌｅｘビーズを作成した。第二段階では、ｐＭＨＣ－Ｉ－Ｆｃをロードし、完全に組み立てられたＴ－Ｐｌｅｘビーズを生成した。Ｔ－Ｐｌｅｘビーズの量の影響を滴定実験により評価し、結果を図１３（ｃ）に示す。６０：４０ αＩＦＮ－γ／ｐＭＨＣ－Ｉ－Ｆｃ Ｔ－Ｐｌｅｘ ビーズと１，０００ＣＭＶ／Ａ２ Ｔ細胞試験サンプルでＴ－Ｐｌｅｘアッセイを実施したところ、表示された量のビーズが使用された。ＩＦＮ－γ+ Ｔ－Ｐｌｅｘビーズの総量を外挿したものを赤の数字で示す。さらに、ＩＦＮ－γスカベンジャービーズがＴ－Ｐｌｅｘアッセイの性能に与える影響を評価し、その結果を図１３（ｄ）に示す。Ｔ－Ｐｌｅｘアッセイは、αＩＦＮ－γ ｍＡｂ（ＭＤ－１）のみを負荷したヤギ－α－ｍＩｇＧダイナルビーズである２ｘ１０5 ＩＦＮ－γスカベンジャービーズの非存在下または存在下で実施された。Ｔ－Ｐｌｅｘアッセイの外側のダイナミックレンジを示す１０，０００個のＣＭＶ／Ａ２ Ｔ細胞を用いてＴ－Ｐｌｅｘアッセイを実施した。全ビーズ集団の中央値蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。
活性化したＴ細胞から分泌されるエフェクター分子を近接結合のＴ－Ｐｌｅｘビーズに捕捉することは、Ｔ－Ｐｌｅｘアッセイの重要な要素である。ここで、ＩＦＮ－γやその他の適切なエフェクターサイトカインの捕捉は、複数のパラメータに影響される。重要なパラメータの１つは、捕捉抗体の選択と固有の特性である。ＩＦＮ－γに関しては、ＭＤ－１クローンは、同族ＩＦＮ－γを負荷したＴ－Ｐｌｅｘビーズの全体の輝度とクラスタリング、および実際にＩＦＮ－γ+になったビーズの総割合に関して、ＮＩＢ４２クローンを上回った。さらに、ビーズ表面のｐＭＨＣとＩＦＮ－γ捕捉抗体の比率は５０：５０、アッセイ・インキュベーション時間は４～６時間、チューブ充填量は５００μＬが最も好ましいとされた。
また、ローリングする前にテストサンプルとＴ－Ｐｌｅｘビーズを６０～８０ｒｐｍで遠心分離することにより、アッセイの感度が向上する。これとは対照的に、９６ウェルプレート内で被験試料とＴ－Ｐｌｅｘビーズを動かさずにインキュベートする静的条件では、すべてのＴ－ＰｌｅｘビーズプールのＡＰＭに依存せず、区別できないバイスタンダーＩＦＮ－γのローディングが生じる。共刺激抗体（抗ＣＤ２８抗体）の結合や、Ｔ－Ｐｌｅｘビーズに結合するｐＭＨＣの量を減らすと、アッセイパフォーマンスが低下することがわかった。Ｔ細胞エピトープあたり１０，０００個以上のＴ－Ｐｌｅｘビーズを使用すると、アッセイの感度が若干上がる可能性がある。しかし、１０，０００個のＴ－Ｐｌｅｘビーズ／Ｔ細胞エピトープでは、２００個から１０，０００個の間で実質的な直線性が観察されるため、抗原特異的Ｔ細胞集団の計数には堅牢であることが証明された。このダイナミックレンジは、高いＩＦＮ－γ捕捉能力を示すがＴ細胞刺激能力を持たないビーズ（すなわちＩＦＮ－γスカベンジャービーズと呼ばれるＡＰＭの欠如）の追加使用によってさらに改善することができ、共培養中に存在するすべてのＴ－Ｐｌｅｘビーズへのバイスタンダー（抗原非依存性）ＩＦＮ－γ負荷全体を低減することが可能である。
実施例５：ａＡＰＣアセンブリのバリエーションとＴ－Ｐｌｅｘアッセイパフォーマンスへの影響
図１４（ａ）は、ａＡＰＣ（Ｔ－Ｐｌｅｘビーズ）アセンブリのバリエーションを示すスキームである。図の上段に示すデータを得るために、先に述べたＴ－Ｐｌｅｘビーズを使用し、色分けしたＬｕｍｉｎｅｘビーズ（Ｂｅａｄ）をαＩＦＮ－γ捕捉ｍＡｂ（Ｃｌｏｎｅ ＭＤ－１）とラットα－ｍＩｇＧ２ａ（Ｃｌｏｎｅ ＲＭＧ２ａ）と１対１（５０対５０）の割合で共有結合させるという変更を加えた。その後、定義されたビーズ領域（ＩＤ）に、ＣＨＯ－Ｓ細胞発現構築物の上清から得られた可溶性ｐＭＨＣ－Ｉ－ｍＩｇＧ２ａ－Ｆｃ ａＡＰＭｓ［ＣＭＶ／Ａ２－Ｆｃ ａｎｄ Ｓｕｒｖｉｖｉｎ／Ａ２－Ｆｃ］（図１にも示されている）構築物を装填した。図の中央パネルに示すデータを得るために、ＬｕｍｉｎｅｘビーズにストレプトアビジンとαＩＦＮ－γ捕捉ｍＡｂ（Ｃｌｏｎｅ ＭＤ１）を１：１の割合で共有結合させ、続いて精製ビオチン化ｐＭＨＣ－Ｉ－ｐＣＣ－ｍＩｇＧ２ａ－ＦＣ－Ｂｉｏ（図３にも示す）を負荷させた。下のパネルに示すデータを得るために、Ｌｕｍｉｎｅｘビーズに精製ｐＭＨＣ－Ｉ－Ｆｃ－ＳＴａｇ構築物とαＩＦＮ－γ捕捉ｍＡｂを５０％対５０％（１：１）または２５％対７５％（１：３）の比率で直接共有結合させた。図１４（ｂ）は、対応するコンジュゲーション品質管理を示す。ｐＨＬＡ－Ａ２コンジュゲーションは、ＩｇＧ２ｂアイソタイプのαＨＬＡ－Ａ２ ｍＡｂ（Ｃｌｏｎｅ ＢＢ７．２／ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で最終ｐＨＬＡ－Ａ２ロード／コンジュゲートＴ－Ｐｌｅｘビーズを染色して分析された。最大αＩＦＮ－γ捕捉能力は、完全に組み立てられたＴ－Ｐｌｅｘビーズを４ｎｇ／ｍｌの組換えＩＦＮ－γ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）と３７℃で２時間インキュベートした後、αＩＦＮ－γ－ＰＥ検出ｍＡｂ（Ｃｌｏｎｅ ４Ｓ．Ｂ３／ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）によって分析された。ＨＣＭＶ ｐｐ６５495-503／ＨＬＡ－Ａ２－Ｆｃ（ＣＭＶ／Ａ２－Ｆｃ）（青、薄灰色）とＳｕｒｖｉｖｉｎ96-104／ＨＬＡ－Ａ２－Ｆｃ（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ／Ａ２－Ｆｃ）結合Ｔ－ＰｌｅｘビーズおよびアンロードＬｕｍｉｎｅｘビーズ（点線）の蛍光シグナルが示されている。図１４（ｃ）は、対応するＴ－Ｐｌｅｘアッセイの性能を示したものである。Ｔ－Ｐｌｅｘアッセイは、（ａ）で示したＴ－Ｐｌｅｘビーズアセンブリーのバリエーションを用いて実施した。ＣＭＶ／Ａ２特異的Ｔ細胞（ＴＣ＃５５６１）１０００個を５００μｌチューブに入れ、Ｔ－Ｐｌｅｘビーズ（４ｘマルチプレックス／Ｔ細胞エピトープあたり１００００ビーズ）を組み合わせ、６０ｒｐｍ、３７℃で４時間のローリング前に遠心転動させた。同族ＣＭＶ／Ａ２ Ｔ－ＰｌｅｘビーズのＩＦＮ－γシグナル（青／薄灰色）と、対応するコントロールビーズの代表的なシグナル（濃灰色）を示す。上下のＦＡＣＳ－ｐｌｏｔは、同じ反応／ビーズミックス（マルチプレックス検出）のデータ解析を表す。
図１４（ａ）は、ａＡＰＣ（Ｔ－Ｐｌｅｘビーズ）アセンブリのバリエーションを示すスキームである。図の上段に示すデータを得るために、先に述べたＴ－Ｐｌｅｘビーズを使用し、色分けしたＬｕｍｉｎｅｘビーズ（Ｂｅａｄ）をαＩＦＮ－γ捕捉ｍＡｂ（Ｃｌｏｎｅ ＭＤ－１）とラットα－ｍＩｇＧ２ａ（Ｃｌｏｎｅ ＲＭＧ２ａ）と１対１（５０対５０）の割合で共有結合させるという変更を加えた。その後、定義されたビーズ領域（ＩＤ）に、ＣＨＯ－Ｓ細胞発現構築物の上清から得られた可溶性ｐＭＨＣ－Ｉ－ｍＩｇＧ２ａ－Ｆｃ ａＡＰＭｓ［ＣＭＶ／Ａ２－Ｆｃ ａｎｄ Ｓｕｒｖｉｖｉｎ／Ａ２－Ｆｃ］（図１にも示されている）構築物を装填した。図の中央パネルに示すデータを得るために、ＬｕｍｉｎｅｘビーズにストレプトアビジンとαＩＦＮ－γ捕捉ｍＡｂ（Ｃｌｏｎｅ ＭＤ１）を１：１の割合で共有結合させ、続いて精製ビオチン化ｐＭＨＣ－Ｉ－ｐＣＣ－ｍＩｇＧ２ａ－ＦＣ－Ｂｉｏ（図３にも示す）を負荷させた。下のパネルに示すデータを得るために、Ｌｕｍｉｎｅｘビーズに精製ｐＭＨＣ－Ｉ－Ｆｃ－ＳＴａｇ構築物とαＩＦＮ－γ捕捉ｍＡｂを５０％対５０％（１：１）または２５％対７５％（１：３）の比率で直接共有結合させた。図１４（ｂ）は、対応するコンジュゲーション品質管理を示す。ｐＨＬＡ－Ａ２コンジュゲーションは、ＩｇＧ２ｂアイソタイプのαＨＬＡ－Ａ２ ｍＡｂ（Ｃｌｏｎｅ ＢＢ７．２／ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で最終ｐＨＬＡ－Ａ２ロード／コンジュゲートＴ－Ｐｌｅｘビーズを染色して分析された。最大αＩＦＮ－γ捕捉能力は、完全に組み立てられたＴ－Ｐｌｅｘビーズを４ｎｇ／ｍｌの組換えＩＦＮ－γ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）と３７℃で２時間インキュベートした後、αＩＦＮ－γ－ＰＥ検出ｍＡｂ（Ｃｌｏｎｅ ４Ｓ．Ｂ３／ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）によって分析された。ＨＣＭＶ ｐｐ６５495-503／ＨＬＡ－Ａ２－Ｆｃ（ＣＭＶ／Ａ２－Ｆｃ）（青、薄灰色）とＳｕｒｖｉｖｉｎ96-104／ＨＬＡ－Ａ２－Ｆｃ（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ／Ａ２－Ｆｃ）結合Ｔ－ＰｌｅｘビーズおよびアンロードＬｕｍｉｎｅｘビーズ（点線）の蛍光シグナルが示されている。図１４（ｃ）は、対応するＴ－Ｐｌｅｘアッセイの性能を示したものである。Ｔ－Ｐｌｅｘアッセイは、（ａ）で示したＴ－Ｐｌｅｘビーズアセンブリーのバリエーションを用いて実施した。ＣＭＶ／Ａ２特異的Ｔ細胞（ＴＣ＃５５６１）１０００個を５００μｌチューブに入れ、Ｔ－Ｐｌｅｘビーズ（４ｘマルチプレックス／Ｔ細胞エピトープあたり１００００ビーズ）を組み合わせ、６０ｒｐｍ、３７℃で４時間のローリング前に遠心転動させた。同族ＣＭＶ／Ａ２ Ｔ－ＰｌｅｘビーズのＩＦＮ－γシグナル（青／薄灰色）と、対応するコントロールビーズの代表的なシグナル（濃灰色）を示す。上下のＦＡＣＳ－ｐｌｏｔは、同じ反応／ビーズミックス（マルチプレックス検出）のデータ解析を表す。
Ｌｕｍｉｎｅｘビーズにα－ｍＩｇＧ２ａ－Ｆｃを５０：５０の割合で共有結合させたもの。
（α－Ｆｃ）ｍＡｂ［ＲＭＧ２ａ］／ＩＦＮ－γ－ｃａｐｔｕｒｅ ｍＡｂ［ＭＤ－１］またはストレプトアビジン［ＳＡｖ］／ＩＦＮ－γ－ｃａｐｔｕｒｅ ｍＡｂ［ＭＤ－１］とｐＨＬＡ－Ａ２－Ｆｃまたはビオチン化ｐＨＬＡ－Ａ２－ｐＣＣ－Ｆｃをロードすると非常に似たｐＭＨＣ－Ｆｃ結合と最大ＩＦＮ－γ－ｃａｐｔｕｒｅ容量が示された。しかし、ｐＭＨＣ－Ｆｃ負荷α－ＦｃベースＴ－ＰｌｅｘビーズのＨＬＡ－Ａ２（クローンＢＢ７．２、ＩｇＧ２ｂアイソタイプ）の染色では、ｐＭＨＣ－ｐＣＣ－Ｆｃ負荷ＳＡＶベースＴ－Ｐｌｅｘビーズに比べて約４倍の蛍光強度（ＭＦＩ値）が得られ、α－ＦｃベースのＴ－ＰｌｅｘビーズのｐＭＨＣ結合能力がわずかに優れていることが示された。しかし、ＣＭＶ／Ａ２特異的ＣＤ８+Ｔ細胞１，０００個を検出するＴ－Ｐｌｅｘアッセイ（ＴＣ＃５５６１）では、α－ＦｃベースまたはＳＡｖベースのＴ－Ｐｌｅｘビーズがほぼ同等の性能を示した。このように、異なるＴ－Ｐｌｅｘビーズ構造（すなわち、ＩＦＮ－γ－ｃａｐｔｕｒｅ ｍＡｂ／α－ｍＩｇＧ２ａ－Ｆｃ ｍＡｂビーズまたはＩＦＮ－γ－ｃａｐｔｕｒｅ ｍＡｂ／ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎビーズにｐＭＨＣ－Ｆｃまたはビオチン化ｐＭＨＣをそれぞれ負荷した場合、有利で全体的に非常に類似したＴ－Ｐｌｅｘアッセイ性能をもたらすことが示された。
（α－Ｆｃ）ｍＡｂ［ＲＭＧ２ａ］／ＩＦＮ－γ－ｃａｐｔｕｒｅ ｍＡｂ［ＭＤ－１］またはストレプトアビジン［ＳＡｖ］／ＩＦＮ－γ－ｃａｐｔｕｒｅ ｍＡｂ［ＭＤ－１］とｐＨＬＡ－Ａ２－Ｆｃまたはビオチン化ｐＨＬＡ－Ａ２－ｐＣＣ－Ｆｃをロードすると非常に似たｐＭＨＣ－Ｆｃ結合と最大ＩＦＮ－γ－ｃａｐｔｕｒｅ容量が示された。しかし、ｐＭＨＣ－Ｆｃ負荷α－ＦｃベースＴ－ＰｌｅｘビーズのＨＬＡ－Ａ２（クローンＢＢ７．２、ＩｇＧ２ｂアイソタイプ）の染色では、ｐＭＨＣ－ｐＣＣ－Ｆｃ負荷ＳＡＶベースＴ－Ｐｌｅｘビーズに比べて約４倍の蛍光強度（ＭＦＩ値）が得られ、α－ＦｃベースのＴ－ＰｌｅｘビーズのｐＭＨＣ結合能力がわずかに優れていることが示された。しかし、ＣＭＶ／Ａ２特異的ＣＤ８+Ｔ細胞１，０００個を検出するＴ－Ｐｌｅｘアッセイ（ＴＣ＃５５６１）では、α－ＦｃベースまたはＳＡｖベースのＴ－Ｐｌｅｘビーズがほぼ同等の性能を示した。このように、異なるＴ－Ｐｌｅｘビーズ構造（すなわち、ＩＦＮ－γ－ｃａｐｔｕｒｅ ｍＡｂ／α－ｍＩｇＧ２ａ－Ｆｃ ｍＡｂビーズまたはＩＦＮ－γ－ｃａｐｔｕｒｅ ｍＡｂ／ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎビーズにｐＭＨＣ－Ｆｃまたはビオチン化ｐＭＨＣをそれぞれ負荷した場合、有利で全体的に非常に類似したＴ－Ｐｌｅｘアッセイ性能をもたらすことが示された。
抗原依存性ＩＦＮ－γ負荷Ｔ－Ｐｌｅｘビーズ（すなわち、同族Ｔ細胞応答を誘導したａＡＰＣ）とバイスタンダーＩＦＮ－γ負荷Ｔ－Ｐｌｅｘビーズ（すなわち、ａＡＰＣとＴ細胞の全群の共培養中に存在する非マッチングＡＰＭを有するａＡＰＣ）を区別するために、同族とコントロールＴ－Ｐｌｅｘビーズは同じＩＦＮ－γ結合能であるということが重要な鍵となる。これは、色は異なるがタンパク質結合能は均質な複数のＬｕｍｉｎｅｘビーズを共有結合させ、ＩＦＮ－γ－ｃａｐｔｕｒｅ ｍＡｂとストレプトアビジン、あるいはα－ｍＩｇＧ２ａ－Ｆｃ ｍＡｂを含む共有マスターミックスを「生産バッチ」として使用すれば容易に達成される。
実施例６：ｐＭＨＣ－ＩＩ－Ｆｃ負荷Ｔ－ＰｌｅｘビーズによるＭＴＢ／ＤＲ３ ＣＤ４+Ｔ細胞クローンＲＰ１５．１．１の抗原特異的な検出
図１５は、単一のＣＤ４+ Ｔ細胞ライン（モデルシステム）の検出のためのｐＭＨＣ－ＩＩに基づくＴ－Ｐｌｅｘアッセイを示す。特に、Ｔ－Ｐｌｅｘアッセイによる結核菌（ＭＴＢ）熱ショックタンパク質６５（Ｈｓｐ６５）1-13／ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０３：０１／ＤＲＡ＊０１（ＭＴＢ／ＤＲ３）－特異的ＣＤ４+Ｔ細胞株クローンＲＰ１５．１．１の検出は図１５（ａ）に示す通りである。Ｔ－Ｐｌｅｘビーズ（６０％ αＩＦＮ－ｙ ｍＡｂ［クローンＭＤ－１］／ラットα－ｍＩｇＧ２ａ ４０％［Ｃｌｏｎｅ ＲＭＧ２ａ］）にＭＴＢ Ｈｓｐ６５１－１３／ＨＬＡ－ＤＲ３－ｐＣＣ－Ｆｃ（紫色（薄灰色）／同族）またはＣＬＩＰ103-117／ＤＲ３－ｐＣＣ－Ｆｃ（濃灰色／コントロール）を図２のようにロードした。その後、ｐＭＨＣ－ＩＩ－Ｆｃ負荷Ｔ－Ｐｌｅｘビーズ（２ｘマルチプレックス／各々１０，０００ビーズ）を、２５０，０００ Ｓｕｒｖｉｖｉｎ96-104／ＨＬＡ－Ａ２特異的ＣＤ８+ Ｔ細胞（バイスタンダーＴ細胞）存在下で、ＭＴＢ Ｈｓｐ６５1-13／ＨＬＡ－ＤＲ３特異的ＣＤ４+ Ｔ細胞クローンＲＰ１５．１．１ （ＭＴＢ／ＤＲ３ Ｔ細胞）の表示量（赤の数字）とともに結合させた。Ｔ－Ｐｌｅｘアッセイは、５００μｌのチューブを３７℃、４０ｒｐｍで４時間回転させながら実施した。次に、Ｔ－ＰｌｅｘビーズをαＩＦＮ－γ検出用ｍＡｂ（クローン４Ｓ．Ｂ３）で染色し、解析した。抗原特異的Ｔ細胞の存在は、Ｔ－Ｐｌｅｘコントロールビーズ（濃灰色）よりも上のＩＦＮ－γ+サブポピュレーションが同族Ｔ－Ｐｌｅｘビーズに出現することで示された。上下のＦＡＣＳ－ｐｌｏｔは、同じ反応／ビーズミックス（マルチプレックス検出）のデータ解析を表す。図１５（ｂ）は、共刺激性ｍＡｂを添加したＴ－Ｐｌｅｘビーズの性能を示したものである。ここでは、ラットα－ｍＩｇＧ２ａ（クローンＲＭＧ２ａ）、αＩＦＮ－γ ｃａｐｔｕｒｅ ｍＡｂ（クローンＭＤ－１）、αＣＤ２８ ｍＡｂ（クローン１５Ｅ８）とαＣＤ２ ｍＡｂ（ＲＰＡ－２．１０）を指定比率で共有結合させたＴ－Ｐｌｅｘビーズを作成した。
第二段階では，ｐＭＨＣ－ＩＩ－Ｆｃをロードして完全に組み立てられたＴ－Ｐｌｅｘビーズを生成し，これを最後に１０，０００個のＭＴＢ／ＤＲ３ Ｔ細胞と結合して，上記のようにＴ－Ｐｌｅｘアッセイを実施した．
図１５は、単一のＣＤ４+ Ｔ細胞ライン（モデルシステム）の検出のためのｐＭＨＣ－ＩＩに基づくＴ－Ｐｌｅｘアッセイを示す。特に、Ｔ－Ｐｌｅｘアッセイによる結核菌（ＭＴＢ）熱ショックタンパク質６５（Ｈｓｐ６５）1-13／ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０３：０１／ＤＲＡ＊０１（ＭＴＢ／ＤＲ３）－特異的ＣＤ４+Ｔ細胞株クローンＲＰ１５．１．１の検出は図１５（ａ）に示す通りである。Ｔ－Ｐｌｅｘビーズ（６０％ αＩＦＮ－ｙ ｍＡｂ［クローンＭＤ－１］／ラットα－ｍＩｇＧ２ａ ４０％［Ｃｌｏｎｅ ＲＭＧ２ａ］）にＭＴＢ Ｈｓｐ６５１－１３／ＨＬＡ－ＤＲ３－ｐＣＣ－Ｆｃ（紫色（薄灰色）／同族）またはＣＬＩＰ103-117／ＤＲ３－ｐＣＣ－Ｆｃ（濃灰色／コントロール）を図２のようにロードした。その後、ｐＭＨＣ－ＩＩ－Ｆｃ負荷Ｔ－Ｐｌｅｘビーズ（２ｘマルチプレックス／各々１０，０００ビーズ）を、２５０，０００ Ｓｕｒｖｉｖｉｎ96-104／ＨＬＡ－Ａ２特異的ＣＤ８+ Ｔ細胞（バイスタンダーＴ細胞）存在下で、ＭＴＢ Ｈｓｐ６５1-13／ＨＬＡ－ＤＲ３特異的ＣＤ４+ Ｔ細胞クローンＲＰ１５．１．１ （ＭＴＢ／ＤＲ３ Ｔ細胞）の表示量（赤の数字）とともに結合させた。Ｔ－Ｐｌｅｘアッセイは、５００μｌのチューブを３７℃、４０ｒｐｍで４時間回転させながら実施した。次に、Ｔ－ＰｌｅｘビーズをαＩＦＮ－γ検出用ｍＡｂ（クローン４Ｓ．Ｂ３）で染色し、解析した。抗原特異的Ｔ細胞の存在は、Ｔ－Ｐｌｅｘコントロールビーズ（濃灰色）よりも上のＩＦＮ－γ+サブポピュレーションが同族Ｔ－Ｐｌｅｘビーズに出現することで示された。上下のＦＡＣＳ－ｐｌｏｔは、同じ反応／ビーズミックス（マルチプレックス検出）のデータ解析を表す。図１５（ｂ）は、共刺激性ｍＡｂを添加したＴ－Ｐｌｅｘビーズの性能を示したものである。ここでは、ラットα－ｍＩｇＧ２ａ（クローンＲＭＧ２ａ）、αＩＦＮ－γ ｃａｐｔｕｒｅ ｍＡｂ（クローンＭＤ－１）、αＣＤ２８ ｍＡｂ（クローン１５Ｅ８）とαＣＤ２ ｍＡｂ（ＲＰＡ－２．１０）を指定比率で共有結合させたＴ－Ｐｌｅｘビーズを作成した。
第二段階では，ｐＭＨＣ－ＩＩ－Ｆｃをロードして完全に組み立てられたＴ－Ｐｌｅｘビーズを生成し，これを最後に１０，０００個のＭＴＢ／ＤＲ３ Ｔ細胞と結合して，上記のようにＴ－Ｐｌｅｘアッセイを実施した．
同族ＭＴＢ／ＤＲ３－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｔ－Ｐｌｅｘビーズを使用して、５０，０００から２００のＭＴＢ／ＤＲ３特異的ＣＤ４+Ｔ細胞の存在を確実に検出した（図１５（ａ））。しかし、ＣＭＶ／Ａ２特異的ＣＤ８+ Ｔ細胞株＃４１６または＃５５６１を用いた同様の実験で見られたように、得られたＩＦＮ－γ+ Ｔ－Ｐｌｅｘビーズ集団の分画は幾分低いものであった。これは、ビーズベースのａＡＰＣで刺激すると、ＭＴＢ／ＤＲ３特異的ＣＤ４+ Ｔ細胞の４０～６０％だけが実際にＩＦＮ－γを発現するという事実で説明できる。さらに共刺激抗体を追加補充したＴ－Ｐｌｅｘビーズは、ＭＴＢ／ＤＲ３特異的ＣＤ４+Ｔ細胞ラインの検出性能を低下させ（図１５（ｂ））、これは図１３（ｂ）に示した以前のＴ－Ｐｌｅｘアッセイ最適化実験と一致した。結論として、本発明者らは、Ｔ－Ｐｌｅｘビーズに基づくＴ－Ｐｌｅｘアッセイのコンセプトが、ＩＦＮ－γを分泌するＴh１分化ＣＤ４+Ｔ細胞の抗原特異的検出にも適用可能であることを示すものである。
実施例７：Ｔ－Ｐｌｅｘの原理検証2ＣＤ４+Ｔ細胞の抗原特異的検出のためのアッセイ
本実施例のＴ－Ｐｌｅｘ2（同一ビーズ上で複数のサイトカインを検出する）概念実証データでは、以下のことが示されている。ａ）独立したアッセイを使用して、ＣＤ４+ Ｔ細胞株は、本発明のａＡＰＣでの刺激時に複数のサイトカインを産生する；ｂ）本発明の第３の局面のアッセイ（Ｔ－Ｐｌｅｘアッセイ）は、サイトカインＴＮＦａ、ＩＬ－４およびＩＬ－２を基準にしても機能する；およびｃ）本発明の第４の局面のアッセイ（Ｔ－Ｐｌｅｘ2アッセイ）は、複数のレベルのマルチプレックス化、すなわち複数のＴ細胞特異性（この例では２）および複数のサイトカイン（この例では３）の検出のために適している。
本実施例のＴ－Ｐｌｅｘ2（同一ビーズ上で複数のサイトカインを検出する）概念実証データでは、以下のことが示されている。ａ）独立したアッセイを使用して、ＣＤ４+ Ｔ細胞株は、本発明のａＡＰＣでの刺激時に複数のサイトカインを産生する；ｂ）本発明の第３の局面のアッセイ（Ｔ－Ｐｌｅｘアッセイ）は、サイトカインＴＮＦａ、ＩＬ－４およびＩＬ－２を基準にしても機能する；およびｃ）本発明の第４の局面のアッセイ（Ｔ－Ｐｌｅｘ2アッセイ）は、複数のレベルのマルチプレックス化、すなわち複数のＴ細胞特異性（この例では２）および複数のサイトカイン（この例では３）の検出のために適している。
図１６（ａ）は、ＭＴＢ／ＤＲ３ ＣＤ４+Ｔ細胞株の５ｈ ａＡＰＣベースの再刺激後のサイトカイン細胞内染色（ＩＣＳ）を示す。ＭＴＢ Ｈｓｐ６５／ＨＬＡ－ＤＲ３－ｐＣＣ－Ｆｃ（ＭＴＢ／ＤＲ３－Ｆｃ）（同族）およびＣＬＩＰ103-117／ＤＲ３－ｐＣＣ－Ｆｃ（ＣＬＩＰ／ＤＲ３－Ｆｃ）コーティングｇｏａｔ－α－ｍｏｕｓｅ－ＩｇＧ－Ｆｃ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を等量のＭＴＢ Ｈｓｐ６５1-13／ＨＬＡ－ＤＲ３－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ４+ Ｔ ｃｅｌｌ ｃｌｏｎｅ ＲＰ１５．１．１（ＭＴＢ／ＤＲ３ Ｔ細胞）と、サイトカイン分泌をブロックするためにブレフェルジンＡ（ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａ）およびモネンシンの存在下、９６ウェルＵボトムで３７℃、５時間、共培養させた。ＣＤ４+Ｔ細胞集団内のサイトカインを発現する細胞の頻度を示している。図１６（ｂ）は、Ｔ－Ｐｌｅｘビーズプラットフォームによる異なるサイトカインの検出を示したものである。共有結合したαＩＦＮ－γ捕捉ｍＡｂ（Ｃｌｏｎｅ ＭＤ－１）とモノクローナルα－ｍＩｇＧ２ａを６０％対４０％の割合で用いて、Ｔ－Ｐｌｅｘビーズを組み立てた。あるいは、αＩＦＮ－γの代わりに、ＩＬ－２（クローンＭＱ１－１７Ｈ１２）、ＩＬ－４（クローン８Ｄ４－８）またはＴＮＦ－α（クローンＭａｂ １）に結合するサイトカイン捕捉ｍＡｂを使用した。その後、異なるサイトカインｍＡｂに基づくｐＭＨＣ－ＩＩ負荷Ｔ－Ｐｌｅｘビーズプールに、ＭＴＢ／ＤＲ３－Ｆｃ（紫（薄灰色）／同族）またはＣＬＩＰ／ＤＲ３－Ｆｃ（濃灰色／コントロール）を負荷し、最後にＭＴＢ／ＤＲ３特異的ＣＤ４+Ｔ細胞と結合させた。アッセイは、５００μｌのチューブに１０，０００個のビーズをそれぞれ入れ、６０ｒｐｍ，３７°Ｃで５時間ローリングして行った（２ｘマルチプレックス）。Ｔ－Ｐｌｅｘ反応後、Ｔ－Ｐｌｅｘビーズは対応するサイトカイン検出用ｍＡｂ（すべて蛍光色素フィコエリトリン（ＰＥ）に結合）で染色され、最後にＦＡＣＳによって分析された。上下のＴ－ＰｌｅｘアッセイＦＡＣＳ－ｐｌｏｔのペアは、同じ反応／ビーズミックスからのデータ解析を表す。図１６（ｃ）は、Ｔ－Ｐｌｅｘ2アッセイの原理検証データである。Ｔ－Ｐｌｅｘ2ビーズは、αＩＦＮ－γ、αＴＮＦ－α、ＩＬ－４捕捉ｍＡｂ（それぞれ１／５（Ｌｕｍｉｎｅｘビーズタンパク質結合容量全体の２０％）とモノクローナルα－ｍＩｇＧ２ａ（２／５［４０％］）を共有結合させて組み立てた。ｐＭＨＣ－ＩＩを負荷したＴ－Ｐｌｅｘ2ビーズはＭＴＢ／ＤＲ３特異的Ｔ細胞とともにインキュベーションし、Ｔ－Ｐｌｅｘアッセイは上記に従って実施した。次に、Ｔ－Ｐｌｅｘ2ビーズを、図に示すように異なる蛍光色素（Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｖｉｏｌｅｔ ４２１ｎｍ（ＢＶ４２１）、ＰＥ、ＰＥ／Ｃｙ７）と結合した対応するサイトカイン検出ｍＡｂで染色し、ＦＡＣＳで分析した。表示されている４つのＴ－ＰｌｅｘアッセイＦＡＣＳプロットは、すべて同じＴ－Ｐｌｅｘ2反応／ビーズミックスから得られたものである。
ＭＴＢ／ＤＲ３特異的ＣＤ４+Ｔ細胞クローンと共培養すると、同族Ｔ－Ｐｌｅｘ2ビーズにエフェクターサイトカインの組み合わせ（ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－４）が一部負荷され、単一の多次元マルチプレックス反応で同時に検出されるようになった。このように、Ｔ－Ｐｌｅｘ2ビーズは、ＩＣＳデータと同様のＭＴＢ／ＤＲ３特異的ＣＤ４+ Ｔ細胞クローンの機能プロファイルを提供するのに適しており、これはＴ－Ｐｌｅｘ2コンセプトの原理実証を意味する。
実施例８：Ｔ－Ｐｌｅｘアッセイを用いた抗原特異的Ｔ細胞検出は、元のサンプルの表現型を変化させない。
この例のデータは、図１７にも示されているように、Ｔ細胞のサンプルに対して本発明のアッセイを行うことがどのような効果をもたらすかを示すものである。さらに以下に直接記述するように、ｐＭＨＣ－多量体分析によって並行して特徴づけられたサンプルは、Ｔ－Ｐｌｅｘアッセイによって分析され（ビーズはＦＡＣＳによって分析された）、Ｔ細胞は培養に戻された。６日後、あらかじめＴ－Ｐｌｅｘアッセイで解析したサンプルの表現型を、同じく６日間並行して培養した「手つかず“ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ”」のＴ細胞サンプルの表現型と比較した。これらのサンプルの表現型の間には、明らかな変化／差異は認められなかった。このように、Ｔ－Ｐｌｅｘアッセイを用いた解析では、サンプルの細胞にほとんど表現型の変化が生じない。
図１７（ａ）には、健常者（ＨＤ）試料＃３６３７のｐＭＨＣ－Ｉ多量体染色が示されている。ＨＬＡ－Ａ２+の健常者（ＨＤ）＃３６３７のＴ細胞サンプルは、まずｐＭＨＣ－Ｉ多量体染色で分析された（マルチプレックスなし）。ＣＤ８+Ｔ細胞集団内のｐＭＨＣ－Ｉ多量体+細胞の頻度は、黒／横の数字で示されている。２．５ｘ１０6ＰＢＭＣ内のそれぞれの抗原特異的ＣＤ８+ Ｔ細胞の総量を外挿したものを赤／縦数字で示す。図１７（ｂ）では、同じドナーのＴ細胞サンプルのＴ－Ｐｌｅｘアッセイに基づく解析に対応するデータを示している。Ｔ－Ｐｌｅｘランが抗原特異的な増殖を引き起こすかどうかを分析するために、ＨＤ＃３６３７のＰＢＭＣをＣｅｌｌＴｒａｃｅ ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識してから、手つかずのＣＤ８+Ｔ細胞を分離した。ｐＭＨＣ－Ｉ－Ｆｃ負荷Ｔ－Ｐｌｅｘビーズプール（４ｘマルチプレックス（ＣＭＶ／Ａ２；Ｆｌｕ／Ａ２；ＥＢＶ／Ａ２；Ｓｕｒｖｉｖｉｎ／Ａ２）／各々１０，０００ビーズ）を５００μｌチューブで２．５ｘ１０6，１０ｘ１０6のトータルＰＢＭＣから分離したＣＤ８+Ｔ細胞とインキュベーションした。
６０ｒｐｍ，５ｈ，３７°Ｃでローリングする前に、テストサンプルとＴ－Ｐｌｅｘビーズを１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。５時間後、Ｔ－ＰｌｅｘビーズはＴ細胞から磁気的に分離され、分析された。Ｔ細胞サンプルは、６日間一緒に培養に戻された。図１７（ｃ）は、Ｔ－Ｐｌｅｘアッセイ実行後のサンプルの表現型を、手を加えていないコントロールＴ細胞培養と比較して示している。６日間培養したＣＴＶ標識ＨＤ＃３６３７ ＣＤ８+Ｔ細胞（Ｔ－Ｐｌｅｘアッセイを実施済み、または未実施）を、系統および活性化マーカー染色前にｐＭＨＣ－Ｉ多量体で追加染色した。図１７（ｃ）上段は、ＣＤ８+Ｔ細胞集団内のｐＭＨＣ－Ｉ多量体+細胞の頻度を示す図である。図１７（ｃ）中段および下段は、ｐＭＨＣ－Ｉ多量体+ＣＤ８+Ｔ細胞の増殖マーカー（ＣＴＶdim）および活性化マーカー（ＣＤ２５+／４－１ＢＢ+）発現の割合を示す図である。
６０ｒｐｍ，５ｈ，３７°Ｃでローリングする前に、テストサンプルとＴ－Ｐｌｅｘビーズを１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。５時間後、Ｔ－ＰｌｅｘビーズはＴ細胞から磁気的に分離され、分析された。Ｔ細胞サンプルは、６日間一緒に培養に戻された。図１７（ｃ）は、Ｔ－Ｐｌｅｘアッセイ実行後のサンプルの表現型を、手を加えていないコントロールＴ細胞培養と比較して示している。６日間培養したＣＴＶ標識ＨＤ＃３６３７ ＣＤ８+Ｔ細胞（Ｔ－Ｐｌｅｘアッセイを実施済み、または未実施）を、系統および活性化マーカー染色前にｐＭＨＣ－Ｉ多量体で追加染色した。図１７（ｃ）上段は、ＣＤ８+Ｔ細胞集団内のｐＭＨＣ－Ｉ多量体+細胞の頻度を示す図である。図１７（ｃ）中段および下段は、ｐＭＨＣ－Ｉ多量体+ＣＤ８+Ｔ細胞の増殖マーカー（ＣＴＶdim）および活性化マーカー（ＣＤ２５+／４－１ＢＢ+）発現の割合を示す図である。
実施例９：真核細胞を用いた可溶性ｐＭＨＣ－Ｉ－Ｆｃ分子の生産と抗原特異的結合に成功した。
図１８（ａ）に示すように、二量体ジスルフィドトラップ（ｄｔ）ペプチド－ＭＨＣ－クラスＩ免疫グロブリンＦｃ融合分子（ｐＭＨＣ－Ｉ ａＡＰＭ）は、共有結合したＴ細胞エピトープペプチドリガンド（９～１０アミノ酸）、ヒトβ2ミクログロブリン（β２ｍ）、ＨＬＡクラスＩアレルのエクトドメイン、マウス免疫グロブリンのアイソタイプＩｇＧ２ａの定重鎖（ＣＨ）ドメイン２および３をそれぞれ含む二つの単一ポリペプチド鎖から構成されている。点線は柔軟なグリシン－セリンリンカーを示す。Ｃ末端ペプチド伸長部とＭＨＣ－Ｉチロシン（Ｙ）８４残基の代わりにシステイン（Ｃ）残基との分子内ジスルフィドトラップは、ｐＭＨＣ複合体をさらに安定化させている。Ｃ末端のＳｔｒｅｐ－Ｔａｇ ＩＩ（ＳＴａｇ）配列により、Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ（ＩＢＡ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いた中性条件下でのアフィニティ精製が可能である。図１８（ｂ）には、ｄｔ－ｐＨＬＡ－Ａ２－Ｆｃの発現と構造コンフォメーションの検証結果が示されている。Ｓｕｒｖｉｖｉｎ96-104／ＨＬＡ－Ａ２－Ｆｃ－ＳＴａｇ発現ＣＨＯ－Ｓ細胞を、トランスフェクション後３日目にα－ＨＬＡ－Ａ２ ｍＡｂ（クローンＢＢ７．２）（青、薄灰色）またはα－ｍＩｇＧ２ａ ｍＡｂ（クローンＲＭＧ２ａ）［濃灰色］で細胞内染色をした。図１８（ｃ）は、ｄｔ－ｐＨＬＡ－Ａ２－Ｆｃ－ＳＴａｇアフィニティークロマトグラフィーの結果を示す図である。６日間一過性にｐＭＨＣ－Ｆｃ－ＳＴａｇを発現させたＣＨＯ－Ｓ上清を、Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ高容量樹脂充填カラムを用いてｐＨ７．４で精製した。クマシー染色後、非還元および還元条件下で１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。Ｍ：マーカー、ＣＲ：粗／ＣＨＯ－Ｓ上清、ＦＴ：フロースルー；Ｗｐ：洗浄に使用したプールバッファ；ｄｉａｌ．ｐｒｏｄ；透析済み製品２．５μｇ／レーン。図１８（ｄ）は、ｄｔ－ｐＨＬＡ－Ａ２－Ｆｃ－ＳＴａｇタンパク質の抗原特異的結合を検証した結果を示す図である。Ｓｕｒｖｉｖｉｎ96-104／ＨＬＡ－Ａ２特異的ＣＤ８+Ｔ細胞株をダサチニブ［５０ｎＭ］存在下で同族［赤／濃灰］およびｃｔｒｌ．と染色した。（青、薄灰色）ｐＭＨＣ－Ｉ多量体を２５μｇ／ｍｌで染色し、次いで系統マーカー染色を行った。（左パネル）市販のｐＨＬＡ－Ａ２ ５量体（ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ社製）；（中パネル）ｄｔ－ｐＨＬＡ－Ａ２－Ｆｃ－ＳＴａｇとアロフィコシアニン結合（ＡＰＣ）Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ（ＩＢＡ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）複合体；（右パネル） ｄｔ－ｐＨＬＡ－Ａ２－Ｆｃ－ＳＴａｇとビオチン化α－ｍＩｇＧ２ａ ｍＡｂ（α－ｍＩｇＧ２ａ－ＢｉｏｔｉｎおよびＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＡＰＣ）による連続染色。死細胞を除外するため、多量体染色前にＴ細胞をＺｏｍｂｉｅＡｑｕａ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で標識した。ＭＦＩ：蛍光強度の中央値；ＦＭＯ：蛍光－マイナス１バックグラウンドｃｔｒｌ．
実施例１０：可溶性ｐＭＨＣ－ＩＩ－Ｆｃ分子の作製と抗原特異的結合の検証に成功
図１９（ａ）に示すように、ペプチド－ＭＨＣ－クラスＩＩ単量体免疫グロブリンＦｃ融合構築物（ｐＭＨＣ－ＩＩ ａＡＰＭｓ）は、２つの別々のポリペプチド鎖からなる。ＭＨＣ－ＩＩ β鎖はＮ末端にグリシン－セリンリンカーを介して抗原性ペプチドと融合している。Ｃ末端のβ鎖エクトドメイン（β１－β２）はパラレルコイルドコイル（ｐＣＣ）塩基性ジッパーに融合され、その後ヒンジドメインとｍＩｇＧ２ａ（Ｆｃ）のＣＨ２およびＣＨ３、Ｃ末端のＨｉｓ6－ａｇとＡｖｉＴａｇで部位特異的にビオチン化されている。単形α鎖のエクトドメイン（α１－α２）は、Ｃ末端に相補的な酸性ｐＣＣ－ＦｃとＳｔｒｅｐＴａｇ－ＩＩが融合されている。図１９（ｂ）には、ｐＨＬＡ－ＤＲ３－Ｆｃの発現と構造コンフォメーションの検証結果が示されている。ＭＴＢ Ｈｓｐ６５1-13／ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０３：０１／ＤＲＡ＊０１（ＭＴＢ／ＤＲ３）－Ｆｃ－Ｈｉｓ／Ａｖｉ／ＳＴａｇを発現するＣＨＯ－Ｓ細胞をトランスフェクション後３日目にα－ＨＬＡ－ＤＲ ｍＡｂ（Ｃｌｏｎｅ Ｌ２４３，薄灰色）［オレンジ］またはα－ｍＩｇＧ２ａ ｍＡｂ（Ｃｌｏｎｅ ＲＭＧ２ａ，濃灰色）で細胞内染色をした。図１９（ｃ）は、ｐＨＬＡ－ＤＲ３－Ｆｃアフィニティークロマトグラフィーの結果を示す図である。６日間一過性にｐＤＲ３－Ｆｃ－ＳＴａｇを発現させたＣＨＯ－Ｓ上清を、Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ高容量樹脂充填カラムを用いてｐＨ７．４で精製した。クマシー染色後、非還元および還元条件下で１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。図１９（ｄ）は、同族ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンを用いたＭＴＢ／ＤＲ３－Ｆｃ特異性及びビーズ結合刺激能の検証結果を示す図である。ＭＴＢ／ＤＲ３特異的ＣＤ４+ Ｔ細胞クローンＲＰ１５．１．１とビーズまたは細胞ベースのａＡＰＣの５時間共培養の結果を示す。ビーズベースのａＡＰＣとして、ＭＴＢ／ＤＲ３－ＦｃまたはＣＭＶ ｐｐ６５510-522／ＤＲ３（ＣＭＶ／ＤＲ３－Ｆｃ、コントロール）をあらかじめロードしたＧｏａｔ－α－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ－Ｆｃ－（ＧαＭ）Ｄｙｎａｂｅａｄｓを使用した。ＨＬＡ－ＤＲ３およびＨＬＡ－ＤＭを発現するＴ２細胞（Ｔ２．ＤＲ３．ＤＭ）を１０μＭ ＭＴＢ Ｈｓｐ６５1-13ペプチドまたはコントロールとしてＨＣＭＶ ｐｐ６５510-522で一晩パルスして、細胞性ａＡＰＣとして使用した。ＭＴＢ／ＤＲ３ ＣＤ４+Ｔ細胞クローンＲＰ１５．１．１の刺激は、系統マーカー染色後のＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γの細胞内染色によって分析したサイトカイン発現の誘導によって示されている。
図１９（ａ）に示すように、ペプチド－ＭＨＣ－クラスＩＩ単量体免疫グロブリンＦｃ融合構築物（ｐＭＨＣ－ＩＩ ａＡＰＭｓ）は、２つの別々のポリペプチド鎖からなる。ＭＨＣ－ＩＩ β鎖はＮ末端にグリシン－セリンリンカーを介して抗原性ペプチドと融合している。Ｃ末端のβ鎖エクトドメイン（β１－β２）はパラレルコイルドコイル（ｐＣＣ）塩基性ジッパーに融合され、その後ヒンジドメインとｍＩｇＧ２ａ（Ｆｃ）のＣＨ２およびＣＨ３、Ｃ末端のＨｉｓ6－ａｇとＡｖｉＴａｇで部位特異的にビオチン化されている。単形α鎖のエクトドメイン（α１－α２）は、Ｃ末端に相補的な酸性ｐＣＣ－ＦｃとＳｔｒｅｐＴａｇ－ＩＩが融合されている。図１９（ｂ）には、ｐＨＬＡ－ＤＲ３－Ｆｃの発現と構造コンフォメーションの検証結果が示されている。ＭＴＢ Ｈｓｐ６５1-13／ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０３：０１／ＤＲＡ＊０１（ＭＴＢ／ＤＲ３）－Ｆｃ－Ｈｉｓ／Ａｖｉ／ＳＴａｇを発現するＣＨＯ－Ｓ細胞をトランスフェクション後３日目にα－ＨＬＡ－ＤＲ ｍＡｂ（Ｃｌｏｎｅ Ｌ２４３，薄灰色）［オレンジ］またはα－ｍＩｇＧ２ａ ｍＡｂ（Ｃｌｏｎｅ ＲＭＧ２ａ，濃灰色）で細胞内染色をした。図１９（ｃ）は、ｐＨＬＡ－ＤＲ３－Ｆｃアフィニティークロマトグラフィーの結果を示す図である。６日間一過性にｐＤＲ３－Ｆｃ－ＳＴａｇを発現させたＣＨＯ－Ｓ上清を、Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ高容量樹脂充填カラムを用いてｐＨ７．４で精製した。クマシー染色後、非還元および還元条件下で１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。図１９（ｄ）は、同族ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンを用いたＭＴＢ／ＤＲ３－Ｆｃ特異性及びビーズ結合刺激能の検証結果を示す図である。ＭＴＢ／ＤＲ３特異的ＣＤ４+ Ｔ細胞クローンＲＰ１５．１．１とビーズまたは細胞ベースのａＡＰＣの５時間共培養の結果を示す。ビーズベースのａＡＰＣとして、ＭＴＢ／ＤＲ３－ＦｃまたはＣＭＶ ｐｐ６５510-522／ＤＲ３（ＣＭＶ／ＤＲ３－Ｆｃ、コントロール）をあらかじめロードしたＧｏａｔ－α－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ－Ｆｃ－（ＧαＭ）Ｄｙｎａｂｅａｄｓを使用した。ＨＬＡ－ＤＲ３およびＨＬＡ－ＤＭを発現するＴ２細胞（Ｔ２．ＤＲ３．ＤＭ）を１０μＭ ＭＴＢ Ｈｓｐ６５1-13ペプチドまたはコントロールとしてＨＣＭＶ ｐｐ６５510-522で一晩パルスして、細胞性ａＡＰＣとして使用した。ＭＴＢ／ＤＲ３ ＣＤ４+Ｔ細胞クローンＲＰ１５．１．１の刺激は、系統マーカー染色後のＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γの細胞内染色によって分析したサイトカイン発現の誘導によって示されている。
本明細書に記載された本発明の多くの変更および他の実施形態は、前述の説明および関連する図面に示された教示の利益を有する本発明に係る当業者には、想起されるであろう。したがって、本発明は開示された特定の実施形態に限定されるものではなく、修正および他の実施形態が添付の特許請求の範囲に含まれることが意図されていることを理解されたい。本書では特定の用語を用いていますが、これらは一般的かつ説明的な意味でのみ使用されており、限定を目的としたものではない。
Claims (14)
- 抗原ペプチド配列の提示に応答してＴ細胞のエフェクター分子を検出するための人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣは、
（ａ） 表面であり、粒子の表面であり、任意選択で、表面はビーズの表面である、表面；
（ｂ） １つ以上の人工抗原提示分子（ａＡＰＭ）であって、取付け配列を介して、または直接化学結合を介して表面に取付けられた、ａＡＰＭ；および
（ｃ） 表面に取付けられた１つ以上の捕捉分子
を含み、
１つ以上のａＡＰＭの各々は、同一の抗原ペプチド配列を含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）。 - １つ以上の捕捉分子が、前記抗原ペプチド配列の提示に応答してＴ細胞から放出される１つ以上のエフェクター分子に特異的な１つ以上の捕捉抗体であり、
任意選択で、
－ １つ以上の捕捉抗体が、同じエフェクター分子に特異的であるか、または１つ以上の捕捉抗体群を含み、各群が異なるエフェクター分子に特異的であり、および／または
－ ａＡＰＣが、抗原ペプチド配列の提示に対するＴ細胞の応答を強化するために表面に取付けした１つ以上の共刺激分子をさらに含み、および
任意選択で
（ｄ） １つ以上の共刺激抗体は、同じ共刺激受容体に特異的であるか、または
（ｅ） １つ以上の共刺激抗体は、１つ以上の共刺激抗体群を含み、各群は、同じ共刺激受容体の異なる群に特異的である、請求項１に記載のａＡＰＣ。 - 前記粒子は、他の粒子から識別可能かつ分離可能であるようにコードされており、任意選択で、
－ 粒子が色分けされ、その色分けがａＡＰＣに結合したａＡＰＭの抗原ペプチド配列を示すか、または
－ 粒子は磁性体である、
請求項１または請求項２に記載のａＡＰＣ。 - ａＡＰＭは、可溶性抗原ペプチド負荷可能またはペプチド負荷ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ部分を含む単量体、二量体または多量体分子、またはβ2－ミクログロブリンおよび合成ペプチドとアセンブルされたグ付き組換え可溶性ＭＨＣ－Ｉ分子のような可溶性ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ部分；またはβ2－ミクログロブリンと共有結合し、合成ペプチドとアセンブルされたタグ付き組換え可溶性ＭＨＣ－Ｉ分子；またはアミノ末端からカルボキシル末端の順序で抗原提示ドメイン、二量化ドメイン、免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｆｃドメインおよび取付け配列を含む単一ポリペプチド配列であって、抗原提示ドメインの配列がＮ末端の抗原ペプチド配列を含む、単一ポリペプチド配列である、前記請求項のいずれか１項に記載のａＡＰＣ。
- （ａ） 二量体化ドメインがＩｇＧヒンジ領域を含み、任意選択でＩｇＧヒンジ領域が配列番号１または配列番号２を含み、および／または
（ｂ） Ｉｇ Ｆｃドメインが、Ｎ２９７Ｑ変異を含むマウスＩｇＧ２ａ Ｆｃ領域であるか、またはＮ２９７Ｑ変異を含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域であり、任意選択でＩｇＧ Ｆｃ領域が配列番号３または配列番号４を含み、および／または
（ｃ） 取付け配列は、ａＡＰＭを表面に取付けるためのペプチドタグであり、任意選択で、ペプチドタグは、親和性に基づく結合および／または表面へのコンジュゲーションを介してａＡＰＭを表面に取付けることを可能にする、
請求項４に記載のａＡＰＣ。 - 抗原ペプチド配列が、ウイルス抗原；細菌抗原；真菌抗原；寄生虫抗原；自己免疫抗原；アレルギー関連抗原および腫瘍抗原からなる群より選択される抗原のペプチド配列であり、ここで、任意選択で、
－ 抗原ペプチド配列は以下からなる群より選択される：ＨＣＭＶ ｐｐ６５ ４９５－５０３（配列番号１０）；ＥＢＶのＢＭＬＦ－１ ２５９－２６７（配列番号１３）；インフルエンザウイルスＭＰ ５８－６６（配列番号１４）、ＮＹ－ＥＳＯ－１ １５７－１６５／１６５Ｖ（配列番号１１）；およびＳｕｒｖｉｖｉｎ９６－１０４／９７Ｍ（配列番号１２）、および／または
（ｄ） 単一ポリペプチド配列の抗原提示ドメインは、アミノ末端からカルボキシル末端の順に、抗原ペプチド配列、第１のリンカー配列、およびＭＨＣクラスＩＩ部分を含み、および／または
（ｅ） アミノ末端からカルボキシル末端の順に、ＭＨＣクラスＩ部分が、β2－ミクログロブリン配列、第２のリンカー配列、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ α１配列、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ α２配列およびＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ α３配列を含み、任意選択で、
－ 第１のリンカー配列が第１のシステイン残基を含み、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ α１配列が第２のシステイン残基を含み、第１および第２のシステイン残基が、共有結合を介して抗原ペプチド配列と抗原提示ドメインのＭＨＣクラスＩ部分の結合を強化するジスルフィドトラップを形成し、および／または
－ 第１のリンカー配列が配列番号３０を含み、および／または
（ｆ） ＭＨＣクラスＩ部分が配列番号３１または配列番号３２を含むか、または
（ｇ） ａＡＰＭは、アミノ末端からカルボキシル末端の順に、抗原ペプチド配列と配列番号３３を含む、
請求項４または請求項５に記載のａＡＰＣ。 - 単一ポリペプチド配列の抗原提示ドメインが、アミノ末端からカルボキシル末端の順に：抗原ペプチド配列およびＭＨＣクラスＩＩ部分を含み、任意選択で、
－ アミノ末端からカルボキシル末端までの順序のＭＨＣクラスＩＩ部分が、ＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ－ＤＲβ１配列及びＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ－ＤＲβ２配列、ＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ－ＤＲα１配列及びＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ－ＤＲα２配列を含み、これは抗原性ペプチド配列に繋がれておらず、又はＭＨＣクラスＩＩ部分が配列番号５０のＤＲＢ１＊０３：０１配列と配列番号５１のＤＲＡ＊０１：０１配列を含む、
請求項４に記載のａＡＰＣ。 - 二量化ドメインが、パラレルコイルドコイル酸性または塩基性ジッパーモチーフをさらに含み、任意選択で配列番号５３の塩基性ジッパーモチーフまたは配列番号５４の酸性ジッパーモチーフを含む、および／または
ａＡＰＭは、アミノ末端からカルボキシル末端の順序で、抗原ペプチド配列および配列番号５５；および配列番号５６を含む、
請求項７に記載のａＡＰＣ。 - ａＡＰＣがａＡＰＭを含む二量体を含み、
（ｈ） 二量体が、請求項４から６のいずれか一項に定義される２つのａＡＰＭのホモ二量体またはヘテロ二量体であるか、または
（ｉ） 二量体が、請求項７または請求項８に定義されるａＡＰＭと第２の分子とのヘテロ二量体である、
請求項４から８のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。 - （ａ）請求項１から９のいずれか一項に記載の複数のａＡＰＣを含む組成物であって、組成物が複数の同一のａＡＰＣを含み、任意選択で、同一のａＡＰＣが、それぞれの単一のエフェクター分子に特異的な単一の捕捉分子を含むか、または同一のａＡＰＣが、いくつかのそれぞれのエフェクター分子に特異的ないくつかの捕捉分子を含む、組成物、または
（ｂ） 請求項１～９のいずれか１項に記載のａＡＰＣの複数の群を含む組成物であって、各群の全てのａＡＰＣが同一にコードされ、各群のａＡＰＣによって提示される抗原ペプチド配列が群内で同一だが各群間で異なり、任意選択で各群のａＡＰＣがそれぞれの単一のエフェクター分子に特異的な単一の捕捉分子を含むか、または各群のａＡＰＣがいくつかのそれぞれのエフェクター分子に特異的ないくつかの捕捉分子を含む、組成物。 - 抗原特異的Ｔ細胞応答を決定するためのアッセイであって、以下の工程を含む、アッセイ。
（ａ） 同一のａＡＰＣによる抗原ペプチド配列の提示時にＴ細胞から応答を引き出すのに適した条件および時間において、請求項１０に記載の組成物とＴ細胞とを接触させること；
（ｂ） Ｔ細胞からａＡＰＣを分離すること；
（ｃ） ａＡＰＣを、ａＡＰＣの１つ以上の捕捉分子が特異的である１つ以上のエフェクター分子に対する検出抗体と接触させること；
（ｄ） ａＡＰＣの１つ以上の捕捉分子によって捕捉されたエフェクター分子を検出することによって、Ｔ細胞のエフェクター分子の放出を分析すること、
これにより、同一のａＡＰＣが提示する抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞応答が決定される。 - 複数の抗原特異的Ｔ細胞応答を決定するためのアッセイであって、以下の工程を含む、アッセイ。
（ａ） 各群のａＡＰＣが提示する異なる抗原ペプチド配列の各々の提示時にＴ細胞から応答を誘発するのに適した条件および時間において、請求項１０に記載の組成物をＴ細胞に接触させること；
（ｂ） Ｔ細胞からａＡＰＣを分離すること；
（ｃ） ａＡＰＣの各群内のａＡＰＣの１つ以上の捕捉分子が特異的である１つ以上のエフェクター分子に対する検出抗体と、ａＡＰＣとを接触させること、
（ｄ） 前記ａＡＰＣの各群のａＡＰＣを同定し、分離すること；
（ｅ） ａＡＰＣの各群内のａＡＰＣの１つ以上の捕捉分子によって捕捉されたエフェクター分子を検出することによって、Ｔ細胞のエフェクター分子の放出を分析すること、
これにより、ａＡＰＣの各群によって提示された各抗原ペプチド配列に特異的な複数の抗原特異的Ｔ細胞応答が決定される。 - － Ｔ細胞が末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の一部に含まれるか、または精製されたＴ細胞であり、および／または
－ Ｔ細胞からａＡＰＣを分離する工程は、Ｔ細胞の生存率を維持するのに適した条件下でａＡＰＣを洗浄し、その後、分離したＴ細胞をさらなるｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養のために回収することを含む、
請求項１１または請求項１２に記載のアッセイ。 - 以下を含むベクター。
（ａ） 請求項４から８のいずれか一項に記載のａＡＰＭの単一ポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列；または
（ｂ） 請求項９に記載の二量体の両方のペプチド鎖をポリシストロンで発現させるためのポリヌクレオチド配列。
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