DE60219592T2 - Intrinsische fluoreszierende, selbstmultimerisierende mhc-fusionsproteine und deren komplexe - Google Patents

Intrinsische fluoreszierende, selbstmultimerisierende mhc-fusionsproteine und deren komplexe Download PDF

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Lösliche Tetramere von Haupthistokompatibilitäts-Komplex(MHC)-Proteinen, welche mit spezifischem Peptidantigen beladen und fluoreszierend markiert sind ("MHC-Tetramere"), haben sich in den letzten fünf Jahren als außerordentlich nützlich bei der Detektion, der Zählung, Charakterisierung und Reinigung von antigenspezifischen T-Lymphocyten erwiesen. Anwendungen von MHC-Klasse I-Tetrameren wurden vor Kurzem übersichtsmäßig in Doherty et al., Annu. Rev. Immunol. 18: 561-92 (2000); Ogg et al., Immunol. Lett. 66 (1-3): 77-80 (1999); Maini et al., Immunol. Today 20 (6): 262-6 (1999); und Doherty, Curr. Opin. Microbiol. 1 (4): 419-22 (1998), zusammengefasst. Anwendungen von MHC-Klasse 11-Tetrameren werden in Reichstetter et al., J. Immunol. 165 (12): 6994-8 (2000); Kwok et al., J. Immunol. 164 (8): 4244-9 (2000); Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97 (26): 14596-14601 (2000); Novak et al., J. Clin. Invest. 104 (12): R63-7 (1999); Crawford et al., Immunity 8: 675-682 (1998), und Kozono et al., Nature 369: 151-154 (1994), erörtert.
  • MHC-Tetramere binden an den T-Zell-Rezeptor ("TCR") von T-Lymphocyten in einer Antigen- und MHC-spezifischen Weise; siehe z. B. Altman et al., Science 274:94 (1996), und U.S.-Patent Nr. 5 635 363.
  • Die Spezifität des Färbungsreagenz wird sowohl von der MHC-Struktureinheit als auch dem innerhalb des tetrameren Komplexes eingeschlossenen Peptid vermittelt. Somit werden Tetramere, welche die extrazellulären Domänen von MHC-Klasse-I-α-Ketten-Molekülen umfassen, die an β2-Mikroglobulin komplexiert und mit antigenen Peptiden von etwa 9 Aminosäuren beladen sind, an Klasse-I-restringierte, typischerweise CD8+-, T-Zellen binden, die für das beladende Peptid und das MHC-Allel spezifisch sind. Tetramere, welche vier Klasse-II-Heterodimere – wobei jedes Heterodimer die extrazellulären Domänen von MHC-Klasse-II-α- und -Klasse-II-β-Ketten umfasst – umfassen, die mit antige nen Peptiden beladen sind, werden an Klasse-II-eingeschränkte, typischerweise CD4+-, T-Zellen in einer antigenspezifischen und MHC-einschränkenden Weise binden.
  • Eine Avidität bzw. Bindungsfreudigkeit, die ausreicht, um eine stabile Bindung an den T-Lymphocyten zu erlauben, resultiert aus der Multimerisierung des MHC/Peptid-Komplexes. Zur Aufrechterhaltung der Selbst-Toleranz ist die natürliche Affinität von TCR für MHC/Peptid niedrig, und zwar zu niedrig, um die Verwendung eines einwertigen MHC/Peptid-Komplexes als ein immunologisches Färbemittel zu gestatten; Matsui et al., Science 254: 1788-91 (1991); Matsui et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 12862-6 (1994). Die Multimerisierung erhöht die Bindungsfreudigkeit des MHC/Peptid-Komplexes für TCR ausreichend, um eine stabile Bindung zu gestatten. Typischerweise wird die Multimerisierung durch enzymatische Biotinylierung eines BirA-Substratpeptids, welches künstlich in die MHC-Kette eingebaut wurde, erzielt; die biotinylierte MHC-Kette bindet danach Avidin oder Streptavidin mit einer molaren Stöchiometrie von 4:1.
  • Das MHC-Tetramer wird durch direkte oder indirekte Konjugierung an ein Fluorophor detektierbar gemacht. Typischweise wird eine direkte Konjugierung bewirkt durch Multimerisieren der MHC/Peptid-Moleküle unter Verwendung eines Streptavidin- oder Avidin-Moleküls, welches zuvor an ein Fluorophor konjugiert worden ist. Derartige Avidin- und Streptavidin-Proteine sind kommerziell von einer Vielzahl von Lieferanten erhältlich (z. B. Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA, USA; Biomeda, Foster City, CA, USA; Ancell Corp., Bayport, MN, USA; Southern Biotechnology Assocs., Inc., Birmingham, AL, USA). Eine indirekte Markierung kann unter Verwendung eines fluorophorkonjugierten Antikörpers durchgeführt werden, der Spezifität für den Avidin/Streptavidin-Rest oder für nicht-polymorphe Determinanten der multimerisierten MHC-Kette aufweist.
  • Obwohl sich MHC-Tetramere als äußerst nützlich erwiesen haben, stellen gewisse Aspekte ihrer Synthese ein Problem dar.
  • Eine korrekte Multimerisierung erfordert die kontrollierte stöchiometrische, vorausgehende Biotinylierung der MHC-Kette und erfordert ferner die anschließende stöchiometrische Bindung der biotinylierten Ketten an Avidin oder Streptavidin. Ineffizienz oder Ungenauigkeit bei einem oder beiden von diesen Schritten beeinflusst die Ausbeute und Anwendbarkeit des resultierenden tetrameren Komplexes.
  • Zum Beispiel wird eine ineffiziente Biotinylierung der MHC-Kette – d. h. das Versagen, wenigstens ein Biotin pro MHC-Molekül einzubauen – zu einer verminderten Ausbeute an Tetrameren führen. Die ineffiziente Entfernung von nicht-konjugiertem Biotin aus den Reaktionsprodukten, mit Übertrag von nicht-konjugierten Biotinmolekülen in die Multimerisierungsreaktion, kann Avidinmoleküle absättigen und ebenfalls die Tetramerausbeute verringern.
  • Die Biotinylierung von MHC-Molekülen an mehreren Stellen kann die Bindungsfreudigkeit der resultierenden tetrameren Komplexe reduzieren. Frühere Versuche zur Multimerisierung unter Anwendung chemischer Biotinylierung schlugen fehl, möglicherweise weil die mehrfache und statistische chemische Modifikation von MHC-Molekülen zu einer zufälligen und häufig inaktiven Orientierung der MHC/Peptid-Struktureinheiten in dem multimerisierten Komplex führte. Obwohl die enzymatische Biotinylierung die Steuerung des Biotinylierungs-Prozesses verbessert hat, ist eine enzymatische Modifikation selbst den allgemein bekannten Wechselhaftigkeiten unterworfen, einschließlich der Abhängigkeit von der Enzymkonzentration, Substratkonzentration, Substrat-Zugänglichkeit, Enzymaktivität und dergleichen; eine mehrfache enzymatische Biotinylierung kann die mit den früheren, chemisch-biotinylierten Komplexen beobachtete, geringe Bindungsfreudigkeit nachahmen.
  • Die Biotinylierung an mehreren Stellen der MHC-Kette, kombiniert mit der zwangsläufigen Verwendung einer extrinsischen Multimerisierungs-Struktureinheit, wie Avidin, macht auch die störende Erzeugung von Multimeren höherer Ordnung während der Multimerisierungsreaktion möglich. Selbst wenn eine geringe Anzahl von MHC/Peptid-Untereinheiten zwei oder mehrere Biotine enthält, kann eine Quervernetzung der Avidin/Strepavidin-Struktureinheit stattfinden. Derartige Multimere höherer Ordnung können eine verringerte Bindungsfreudigkeit aufgrund sterischer Behinderung aufzeigen, und können um gekehrt, unter anderen Umständen, zu Komplexen höherer Ordnung führen, welche eine erhöhte Bindungsfreudigkeit aufweisen. Variationen hinsichtlich der Bindungsfreudigkeit, ob Verringerungen oder Erhöhungen vom Mittelwert, können zu Variationen in der Färbungsintensität führen, welche nicht mit TCR-Dichte oder Antigenaffinität in Zusammenhang stehen. Multimere höherer Ordnung können ebenfalls ein intensiveres Fluoreszenzsignal erzeugen, was ferner zu verwirrenden Schwankungen in der Färbungsintensität führt.
  • Umgekehrt kann der Übertrag von nicht-konjugierten Biotinmolekülen in die Multimerisierungsreaktion zu einer partiellen Sättigung von Avidin/Streptavidin-Struktureinheiten mit unkonjugiertem Biotin führen, was zur Bildung von multimeren Komplexen führt, die weniger als vier MHC/Peptid-Untereinheiten aufweisen. Derartige Komplexe niedrigerer Ordnung können eine geringere Bindungsfreudigkeit für TCR aufzeigen, was zu Variationen in der Färbungsintensität führt, welche nicht mit der TCR-Dichte oder Antigen/MHC-Affinität zusammenhängen.
  • Das Erfordernis nach einem getrennten Fluorophor-Konjugationsschritt bietet ebenfalls Gelegenheiten für Ausbeuteverlust und unbeabsichtigte Schwankung entweder hinsichtlich der Avidität für TCR oder der Fluoreszenzintensität, oder beidem.
  • In einer verwandten Vorgehensweise werden MHC/Ig-Chimären, anstatt Tetrameren von MHC, verwendet, um antigenspezifische T-Lymphocyten zu markieren. Dal Porto et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6671-6675 (1993); Greten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 7568-7573 (1998); Hamad et al., J. Exp. Med. 188: 1633-1640 (1998); Schneck et al., U.S.-Patente Nr. 6 015 884 und 6 140 113.
  • In Klasse-I-Chimären werden die extrazellulären Domänen der MHC-Klasse Iα-Kette im Leseraster in die variable Region einer IgG-Schwerkette fusioniert. Unter geeigneten oxidierenden Bedingungen vollführen die Schwerketten-Chimären eine Selbst-Dimerisierung durch Disulfid-Bindungen: Eine Dimerisierung vermittelt eine Avidität für TCR, welche ausreicht, um die Anwendung des dimeren Fusionsproteins als ein T-Zell-Markierungsreagenz zu gestatten. Wie bei den MHC-Tetrameren, muss das dimere Klasse-I-Chimärenmolekül mit β2-Mikroglobulin assoziiert und mit spezifischem antigenem Peptid beladen sein, um eine Erkennung von antigenspezifischen T-Zellen zu gestatten; anders als bei MHC-Tetrameren, müssen die MHC/Ig-Chimärenmoleküle zusätzlich vor der Anwendung mit Ig-Leichtketten assoziiert werden.
  • In Klasse-II-MHC/Ig-Chimären sind die extrazellulären Domänen von MHC-Klasse-II-α- und -β-Ketten separat an Ig-Schwer- und -Leichtketten-Untereinheiten fusioniert, wobei typischerweise die β-Untereinheit-Domänen an IgG-Schwerkette und die Klasse-II-α-Domänen an Ig-Leichtkette, typischerweise κ, fusioniert sind. Wie bei MHC-Tetrameren, muss das Klasse-II-Chimärenmolekül mit spezifischem antigenem Peptid beladen sein, um die Erkennung von antigenspezifischen T-Zellen zu gestatten; für die Stabilität kann antigenes Peptid direkt an den N-Terminus der Klasse-II-β-Untereinheit fusioniert werden; Kozono et al., Nature 369: 151-154 (1994); Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 14596-14601 (2000).
  • Die Markierung der dimeren Chimären wird typischerweise unter Verwendung eines fluorophor-konjugierten Anti-Ig-Sekundärantikörpers bewerkstelligt.
  • Die selbst-dimerisierenden Chimären machen den Biotinylierungsschritt und die Verwendung einer extrinsischen Multimerisierungseinheit, welche von MHC-Chimären erfordert wird, mit ihren begleitenden Problemen unnötig. Die dimeren Chimären gestatten ebenfalls eine einfachere Nach-Synthese-Beladung mit antigenem Peptid.
  • Allerdings sind die dimeren Chimären nicht ohne ihre eigenen Probleme.
  • Zum Ersten kann die dimere Wertigkeit eine niedrigere Bindungsfreudigkeit für TCR verursachen, als man sie durch Verwenden von Tetrameren erhalten würde, was die Fähigkeit zur Markierung von Niedrigaffinitäts-TCRs verringert oder aufhebt.
  • Zum Zweiten macht das zusätzliche Erfordernis einer Ig-Leichtketten-Assoziation – ob native Ig-Leichtketten, wie in den Klasse-I-Chimären, oder rekombinante Ig-Leichtketten-Fusionsproteine, wie in den Klasse-II-Chimären – die Coexpression mehrerer rekombinanter Expressionskonstrukte in einer einzelnen Wirtszelle, oder, im Fall von Klasse-I-Chimären, die Verwendung einer Wirtszelllinie, welche konstitutiv Ig-Leichtkette exprimiert, notwendig.
  • Zum Dritten, obwohl die Selbst-Dimerisierung den Biotinylierungsschritt und das Beruhen auf einer extrinsischen Multimerisierungs-Struktureinheit von MHC-Tetrameren aufhebt, wobei die Ausbeute von Multimeren bekannter Wertigkeit (Komplexizität) potenziell verbessert wird, können die Dimere unter reduzierenden Bedingungen dissoziieren.
  • Darüber hinaus bringt jede der Strategien, um das dimere Chimär fluoreszierend detektierbar zu machen, Schwierigkeiten mit sich.
  • Zum Beispiel kann die Verwendung von sekundären Antikörpern zur Visualisierung einen gleichzeitigen Nachweis mehrerer Antigene schwieriger machen; dies kann ein bedeutendes Problem sein, wenn, wie es oft der Fall ist, die Population von antigenspezifischen T-Zellen klein ist, was die Verwendung mehrerer Parameter nötig macht, um die Zellen fehlerfrei nachzuweisen und zu zählen. Eine direkte chemische Konjugation von Fluorophor an die Chimäre, eine Alternative zur Verwendung von sekundären Antikörpern, kann Affinitätswechselwirkungen der Chimäre mit ihrem zugehörigen TCR stören oder sogar aufheben. Eine direkte chemische Konjugation kann auch zu chimären Molekülen führen, welche unterschiedliche Molverhältnisse an Markierung aufweisen, was flusszytometrische oder andere Fluoreszenz-basierende Analysen problematischer macht.
  • Daher besteht ein Bedarf an Reagenzien, welche verwendet werden können, um T-Lymphocyten basierend auf ihrer Antigen(und MHC)-Spezifität zu markieren, welche hinreichende Bindungsfreudigkeit aufweisen, um eine stabile Bindung an T-Lymphocyten durch Wechselwirkungen mit Oberflächen-TCR zu gestatten, aber welche keine Biotinylierung und extrinsische Multimerisierung erfordern; es besteht ein damit einhergehender Bedarf an antigenspezifischen T-Zell-Markierungsreagenzien, welche, ohne Erfordernis der Verwendung von sekundären Antikörpern oder direkter chemischer Konjugation an ein Fluorophor, fluoreszierend gemacht werden können.
  • Das substratunabhängige, selbstfluoreszierende Grün-Fluoreszenz-Protein aus Aequorea victoria ("GFP") ist in der flusszytometrischen ("FACS") Analyse von Zellen verwendet worden, welche GFP, oder GFP-Fusionen, innerhalb der Zelle exprimieren; dies wird übersichtsmäßig zusammengefasst in Galbraith et al., "Flow cytometric analysis and FACS sorting of cells based on GFP accumulation", Methods Cell Biol. 58: 315-41 (1999). GFP-Varianten, welche Merkmale aufweisen, die für die Flusszytometrie verbessert sind, wurden beschrieben; U.S.-Patente Nr. 6 090 919 und 5 804 387; Cormack et al., Gene 173: 33-38 (1996). GFP und GFP-Varianten sind typischerweise eher für die interne Markierung von Zellen als für die externe Markierung von Zelloberflächenstrukturen verwendet worden.
  • Ein entferntes Homolog von GFP, bezeichnet als DsRed (ebenfalls bezeichnet als drFP583) ist vor kurzem aus der Koralle Discosoma kloniert worden; Matz et al., Nature Biotechnol. 17: 969-973 (1999); Vektoren, welche für die Exzisions-Klonierung, bakterielle Expression und Säuger-Expression von DsRed, allein oder als Fusionsprotein, geeignet sind, sind nun kommerziell verfügbar (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA, USA).
  • Natives DsRed besitzt ein Anregungs(Absorptions)-Maximum von etwa 558 nm und weist ein Emissionsmaximum von etwa 583 nm auf, eine wesentliche Rotverschiebung von dem GFP-Emissionsmaximum von etwa 509 nm. DsRed wird somit ohne weiteres durch die Standard-488-nm-Laserlinie, die in Flusszytometern routinemäßig verfügbar ist, angeregt und weist ein Emissionsspektrum auf, das ohne weiteres vom Autofluoreszenz-Hintergrund und von demjenigen von GFP unterscheidbar ist, was DsRed zu einem Kandidaten für Zweifarb-Flusszytometrie-Anwendungen in Zusammenhang mit GFP oder FACS-optimierten Mutanten von GFP macht.
  • Ausführliche Untersuchungen der Struktur und spektralen Eigenschaften von DsRed, Baird et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 11984-11989 (2000); Gross et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 11990-11995 (2000); Heikal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 11996-12001 (2000); Wall et al., Nature Structural Biol. 7: 1133-1138 (2000), haben jedoch zwei Merkmale identifiziert, von welchen behauptet wird, gegen die weitverbreitete Anwendung von DsRed in flusszytometrischen und anderen Fluoreszenz-Analysen zu sprechen.
  • Zum Ersten reift die Rotfluoreszenz von DsRed nur langsam, wobei Tage erfordert werden, um vollständig von Grün zu Rot auszureifen, sowohl in vitro als auch in vivo. Eine Reifungszeit in der Größenordnung von Tagen wird Vorgehensweisen ausschließen, DsRed als einen Reporter der Kurzzeit-Genexpression zu verwenden oder Fusionsproteine in Organismen mit kurzen Generationszeiten oder einer schnellen Entwicklung zu verfolgen. Baird et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 11984-11989 (2000).
  • Zum Zweiten scheint DsRed ein zwangsläufiges, und selbst-multimerisierendes, Tetramer zu sein; Baird et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 11984-11989 (2000); Wall et al., Nature Structural Biol. 7: 1133-1138 (2000); Gross et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 11990-11995 (2000). Obwohl eine Oligomerisierung irrelevant für die Anwendung von DsRed als einfacher Reporter für Genexpression sein kann, wird sie zu ernsten Problemen in den meisten potenziellen Anwendungen führen, bei welchen man DsRed an ein Wirtsprotein fusioniert, um das "Trafficking" bzw. Wanderungsbewegungen oder Wechselwirkungen des Letzteren zu verfolgen. Weiterhin werden viele Proteine in der Signaltransduktion durch Oligomerisierung aktiviert; eine Fusion an DsRed könnte eine konstitutive Signalerzeugung verursachen. Für Wirtsproteine, welche bereits oligomer sind, könnte die Fusion an DsRed entweder Kollisionen hinsichtlich der Stöchiometrie, sterische Konflikte von quaternären Strukturen oder eine Vernetzung zu massiven Aggregaten verursachen.
  • Angesichts dieser "größeren Nachteile" werden "jegliche/viele potenzielle zellbiologische Anwendungen von DsRed die Unterdrückung der Tetramerisierung und die Beschleunigung der Reifung erfordern." Baird et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 11984-11989 (2000). "Für die meisten biotechnologischen Anwendungen sind sowohl die langsame Reifung als auch die Oligomerisierung von DsRed unerwünschte Eigenschaften, welche man durch systematische Mutagenese beheben muss.", Wall et al., Nature Structural Biol. 7: 1133-1138 (2000). "Die hervorragende Helligkeit und Stabilität von DsRed und viele potenzielle Anwendungen für ein Langwellen-Fluoreszenzprotein stellen eine umfassende Rechtfertigung für größere Anstrengungen zur Behebung dieser verbleibenden Mängel dar." Gross et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 11990-11995 (2000).
  • KURZBESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Reagenzien bereitzustellen, welche verwendet werden können, um T-Lymphocyten basierend auf ihrer Antigen(und MHC)-Spezifität zu markieren, welche eine ausreichende Bindungsfreudigkeit für T-Lymphocyten aufweisen, um eine stabile Bindung an Oberflächen-TCR ohne Erfordernis einer Biotinylierung und Anwendung einer extrinsischen Multimerisierungs-Struktureinheit zu gestatten, und welche fluoreszierend gemacht werden können, ohne Erfordernis der Anwendung von sekundären Antikörpern oder einer direkten chemischen Konjugation an das Fluorophor. Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, Verfahren zum Markieren, Nachweisen, Zählen, Anreichern, Isolieren, Abreichern und Aktivieren von antigenspezifischen T-Lymphocyten unter Verwendung derartiger Reagenzien bereitzustellen.
  • Diese und andere Anforderungen im Fachgebiet werden von der vorliegenden Erfindung erfüllt, welche eine Eigenschaft – Tetramerisierung – ausnutzt, die behauptetermaßen unvorteilhaft in dem neu entdeckten, selbstfluoreszierenden, selbst-multimerisierenden Fluorophor DsRed ist, und welche, durch Verwendung des resultierenden Tetrameren als einer extrazellulären anstatt einer intrazellulären Markierung, von der anderen Eigenschaft, von der im Fachgebiet behauptet wird, nachteilhaft bei DsRed zu sein, nicht beeinträchtigt wird, nämlich der langsamen Reifung seines Protein-Fluorophors nach der Translation.
  • In einem ersten Aspekt stellt die Erfindung somit ein rekombinantes Fusionsprotein bereit, umfassend: ein GFP-ähnliches Chromophor; mindestens eine Multimerisierungsdomäne; und eine MHC-peptidpräsentierende Struktureinheit bzw. MHC-Peptidpräsentierungs-Struktureinheit. Funktionell umfasst das Fusionsprotein Mittel zum Fluoreszieren, wobei die fluoreszierenden Mittel vollständig innerhalb der Aminosäuresequenz des Proteins codiert sind; Mittel zum Multimerisieren; und Mittel, welche zum Beitragen zur Präsentation eines Peptidantigens an einen MHC-eingeschränkten T-Lymphocyten fähig sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Fusionsprotein der vorliegenden Erfindung, vom N-Terminus zum C-Terminus, fortlaufende bzw. aneinander angrenzende α1-, α2- und α3-Domänen, herangezogen aus einer gewählten MHC-Klasse-I-α-Untereinheit, woran sich, im Leseraster, im Wesentlichen das vollständige DsRed anschließt, welches sowohl das GFP-ähnliche Fluorophor als auch zwei distinkte Multimerisierungsdomänen bereitstellt. Dieses bevorzugte Fusionsprotein tetramerisiert spontan in Lösung.
  • Wenn sie korrekt multimerisiert und mit dem Peptid beladen sind, können die Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung verwendet werden, ohne weitere direkte oder indirekte Konjugation an ein exogenes Fluorophor, um T-Lymphocyten, basierend auf ihrer Antigen(und MHC)-Spezifität fluoreszierend zu markieren; die Reagenzien der vorliegenden Erfindung können daher in allen Verfahren eingesetzt werden, für welche MHC-Tetramere und MHC/Ig-Chimären-Fusionsproteine derzeitig verwendet werden.
  • Die Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung werden typischerweise durch rekombinante Expression in Wirtszellen hergestellt. Somit schließt die vorliegende Erfindung in weiteren Aspekten, Nucleinsäuren, welche die obenstehend beschriebenen Fusionsproteine codieren, und ihre Komplemente, Vektoren, welche die Nucleinsäuren umfassen, Vektoren zur Expression der Fusionsproteine in Wirtszellen, Wirtszellen, welche episomale oder integrierte Vektoren enthalten, die zur Expression der Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung in der Lage sind, und Wirtszellen, welche ein Beliebiges aus den Nucleinsäuren, dem rekombinanten Vektor, dem Expressionsvektor und Fusionsproteinen der vorliegenden Erfindung in einem oder mehreren internen zellulären Kompartimenten enthalten, ein.
  • In anderen Aspekten sieht die vorliegende Erfindung multimere Komplexe vor, welche als mehrere Untereinheiten die Fusionsproteine der vorliegenden Erfin dung einschließen. Wenn sie korrekt mit passenden löslichen Proteinpartnern (z. B. β2-Mikroglobulin für Fusionsproteine, die eine Klasse-I-MHC-peptidpräsentierende Struktureinheit aufweisen) komplexiert und mit Peptid beladen sind, können diese selbstfluoreszierenden multimeren Komplexe verwendet werden, um T-Lymphocyten basierend auf ihrer Antigen(und MHC)-Spezifität zu markieren.
  • Im einfachsten derartigen Aspekt sieht die Erfindung einen selbstfluoreszierenden multimeren Proteinkomplex vor, umfassend: eine Vielzahl von Untereinheiten, wobei die Untereinheiten die quarternäre Formel im Komplex von (F)n aufweisen, worin F ein Fusionsprotein gemäß der vorliegenden Erfindung ist, und n eine ganze Zahl größer als 1 ist. Falls die Multimerisierungsdomäne des Fusionsproteins durch DsRed oder ein verwandtes Fusionsprotein vorgesehen wird, assembliert der Komplex typischerweise mit einer tetrameren Wertigkeit (d. h., n = 4).
  • In einem verwandten Aspekt sieht die Erfindung ferner einen selbstfluoreszierenden, multimeren Proteinkomplex vor, umfassend: eine Vielzahl von Untereinheiten, wobei die Untereinheiten die quarternäre Formel im Komplex von (F1S1)n aufweisen, worin F ein rekombinantes Fusionsprotein gemäß der vorliegenden Erfindung ist, S ein lösliches Protein ist und n eine ganze Zahl größer als 1 ist.
  • S wird gewählt aus der Gruppe, bestehend aus β2-Mikroglobulin, löslichen Klasse-II-β-MHC-peptidpräsentierenden Derivaten und Klasse-II-α-MHC-peptidpräsentierenden löslichen Derivaten. S ist β2-Mikroglobulin, wenn F eine Klasse-I-α-MHC-peptidpräsentierende Struktureinheit einschließt. S ist ein Klasse-II-β-MHC-peptidpräsentierendes lösliches Derivat, wenn F eine Klasse-II-α-MHC-peptidpräsentierende Struktureinheit einschließt, und S ist ein Klasse-II-α-MHC-peptidpräsentierendes lösliches Derivat, wenn F eine Klasse-II-β-MHC-peptidpräsentierende Struktureinheit einschließt.
  • Der multimere Komplex, welcher korrekt mit löslichem Protein assembliert bzw. zusammengebaut ist (d. h. mit quarternärer (F1S1)n-Stöchiometrie), kann danach mit spezifischem Peptid beladen werden, wodurch ein selbstfluoreszie rendes Reagenz bereitgestellt wird, welches nützlich zur nachweisbaren Markierung von T-Lymphocyten basierend auf deren Antigenspezifität ist.
  • Daher stellt die Erfindung, in einem anderen Aspekt, einen selbstfluoreszierenden, multimeren Proteinkomplex zum Markieren von T-Lymphocyten, basierend auf der Spezifität ihres Antigenrezeptors, bereit. Der Komplex dieses Aspekts der Erfindung umfasst eine Vielzahl von Untereinheiten, wobei die Untereinheiten die quarternäre Formel in den Komplex von (F1S1P1)n aufweisen, worin F, wie oben, ein rekombinantes Fusionsprotein der vorliegenden Erfindung ist, S ein lösliches Protein, wie oben beschrieben, ist, P ein Peptidantigen ist, und n eine ganze Zahl, die größer als 1 ist, ist.
  • Das Peptidantigen wird, wie in MHC-Tetrameren und MHC/Ig-Chimären, durch die MHC-Peptidpräsentierungs-Domänen des multimeren Komplexes der vorliegenden Erfindung gebunden werden: In einem selbstfluoreszierenden Klasse-I-MHC-Multimer durch die α1- und α2-Domänen der Klasse-I-α-MHC-peptidpräsentierenden Struktureinheit der Fusionsprotein-Untereinheit; in einem Klasse-II-Multimer durch die α1- und β1-Domänen der MHC-peptidpräsentierenden Struktureinheit und löslichen Derivate des Komplexes.
  • Funktionell umfasst der selbstfluoreszierende, multimere Proteinkomplex zur Markierung von T-Lymphocyten gemäß der Spezifität ihrer Antigenrezeptoren Folgendes: Mittel zum Fluoreszieren, wobei die Mittel vollständig innerhalb einer Aminosäuresequenz von wenigstens einer Untereinheit des multimeren Komplexes codiert werden; und Mittel zum Binden an einen T-Lymphocyten gemäß der Spezifität seines Antigenrezeptors.
  • Einmal beladen mit einem gegebenen Peptidantigen, können die selbstfluoreszierenden Komplexe der vorliegenden Erfindung an T-Lymphocyten binden, welche Antigenrezeptoren aufweisen, die für das gegebene Peptid und MHC-Peptidpräsentierungs-Domänen des multimeren Komplexes spezifisch sind. Weil die Peptidantigene und MHC-Peptidpräsentierungs-Domänen des Komplexes der vorliegenden Erfindung beide variiert werden können, können die selbstfluoreszierenden multimeren Komplexe der vorliegenden Erfindung im Allgemeinen verwendet werden, um eine nahezu unbegrenzte Vielfalt an T- Lymphocyten, basierend auf der Antigen(und MHC)-Spezifität ihrer Antigenrezeptoren, fluoreszierend zu markieren.
  • Es ist deshalb ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung, Verfahren zur Verwendung der multimeren Komplexe der vorliegenden Erfindung bereitzustellen, um T-Lymphocyten, basierend auf der Spezifität ihrer Antigenrezeptoren, nachweisbar zu markieren (färben).
  • In einer ersten Ausführungsform umfasst das Verfahren das Inkontaktbringen eines T-Lymphocyten, der markiert werden soll, mit einem selbstfluoreszierenden multimeren Komplex der vorliegenden Erfindung, wobei der Komplex Peptidantigen und MHC-Peptidpräsentierungs-Domänen aufweist, für welche der Antigenrezeptor des T-Lymphocyten spezifisch ist, während einer Zeit und unter Bedingungen, die ausreichend sind, um die nachweisbare Bindung des Komplexes an den T-Lymphocyt zu gestatten.
  • Typischerweise sind die zu markierenden T-Lymphocyten innerhalb einer heterogenen Probe von Zellen vorhanden, und das Ziel der Markierung besteht darin, die antigenspezifischen T-Lymphocyten innerhalb dieser Population nachzuweisen und oftmals zu zählen.
  • Somit sieht die vorliegende Erfindung in einem anderen Aspekt Verfahren zum Nachweisen von T-Lymphocyten, die für ein gewähltes Antigen spezifisch sind, in einer Probe von Zellen vor. Das Verfahren umfasst das Inkontaktbringen der Probe mit einem selbstfluoreszierenden multimeren Komplex gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei das Peptidantigen des Komplexes das gewählte Antigen ist, und die MHC-Präsentierungsdomänen des Komplexes diejenigen sind, hinsichtlich derer die T-Lymphocyten, für welche der Nachweis gewünscht wird, eingeschränkt sein werden, und zwar während einer Zeit und unter Bedingungen, die ausreichen, um die nachweisbare Bindung des Komplexes an für das gewählte Antigen und den MHC spezifische T-Lymphocyten in der Probe zu gestatten; und danach das Detektieren spezifischer T-Lymphocyten in der Probe durch die Fluoreszenz des daran gebundenen Komplexes. In einem verwandten Aspekt umfasst das Verfahren ferner das Zählen der so nachgewiesenen, antigenspezifischen T-Lymphocyten.
  • Abhängig vom verwendeten Instrument kann der Nachweis antigenspezifischer T-Lymphocyten direkt oder indirekt mit ihrer Sortierung gekoppelt werden, weshalb, in anderen Aspekten der Erfindung, Verfahren zur Anreicherung einer Probe und zur Abreicherung einer Probe an T-Lymphocyten, die spezifisch für ein gewähltes Antigen sind, bereitgestellt werden.
  • Im Allgemeinen umfassen die Verfahren dieses Aspekts der Erfindung das Inkontaktbringen der Probe mit einem selbstfluoreszierenden multimeren Komplex der vorliegenden Erfindung, wobei das Peptidantigen des Komplexes das gewählte Antigen ist, und die MHC-Präsentierungsdomänen des Komplexes diejenigen sind, für welche die T-Lymphocyten, für welche eine Anreicherung oder Abreicherung gewünscht wird, eingeschränkt sein werden, und zwar während einer Zeit und unter Bedingungen, die ausreichen, um die nachweisbare Bindung des Komplexes an für das gewählte Antigen und den MHC spezifische T-Lymphocyten in der Probe zu gestatten. Nach der Bindung werden markierte T-Lymphocyten basierend auf der Fluoreszenz des daran gebundenen Komplexes angereichert oder entfernt.
  • Derartige Verfahren werden zweckmäßigerweise unter Verwendung eines Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierers durchgeführt: eine Sortierung, die wenigstens zum Teil auf der Fluoreszenz aus dem multimeren Komplex der vorliegenden Erfindung basiert, reichert die Probe direkt ab, aus welcher die Zellen entfernt werden, und reichert das Aliquot, in das die Zellen eingebracht werden, an.
  • Die Multimer-Komplex-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können nützlicherweise in der Form von Kits bereitgestellt werden, welche die Ausübung der Verfahren der vorliegenden Erfindung erleichtern. Somit sieht die vorliegende Erfindung in einem anderen Aspekt, Kits vor, welche die selbstfluoreszierenden multimeren Komplexe der vorliegenden Erfindung umfassen.
  • In einer Serie von Ausführungsformen schließen die Kits der vorliegenden Erfindung als separate Zusammensetzungen ein selbstfluoreszierendes (F1S1)n-Multimer der vorliegenden Erfindung und ein antigenes Peptid vor; wie oben erwähnt, wird die Auswahl des Peptids von der Spezifität abhängen, die für das Markierungsreagenz gewünscht ist. In einer anderen Serie von Ausführungsformen ist das Multimer schon vorher mit dem Peptid beladen. Wahlweise, aber vorteilhaft, können in jeder dieser Serien von Kits, als separate Zusammensetzungen, jegliche von fluorophorkonjugierten Antikörpern gegen pan-T- oder T-Zell-Untergruppierungs-Antigene, fluorophorkonjugierten Antikörpern, die für T-Zell-Aktivierungs-Antigene spezifisch sind, und Reagenzien zum Lysieren von roten Blutkörperchen eingeschlossen sein.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Die oben erwähnten und andere Ziele und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden bei Betrachtung der nachfolgenden ausführlichen Beschreibung, welche im Zusammenhang mit den begleitenden Zeichnungen heranzuziehen ist, offensichtlich werden, in denen gleiche Bezugszeichen bzw. Buchstaben sich überall auf gleichartige Teile beziehen, und in welchen:
  • 1 die Konstruktion eines rekombinanten H2Ld-MHC-Klasse I-DsRed-Fusionskonstruktes gemäß der vorliegenden Erfindung schematisch darstellt;
  • 2 einen Doppel-Promotor-Expressionsvektor schematisch darstellt, welcher das rekombinante H2Ld-DsRed-Fusionskonstrukt gemäß der vorliegenden Erfindung enthält;
  • 3 eine Fotografie eines Agarosegels ist, welches das erwartete 1,5 kD-Insert für das rekombinante H2Ld-DsRed-Fusionskonstrukt nach Freisetzen aus mit NdeI und NotI verdauten Expressionsvektor-Plasmiden zeigt;
  • 4 eine automatische DNA-Sequenzierer-Spur ist, welche ferner die korrekte DNA-Sequenz an der Verbindungsstelle zwischen dem Expressionsvektor-Grundgerüst und dem H2Ld-Insert bestätigt;
  • 5 ist eine Fotografie eines gefärbten SDS-PAGE-Gels, welches die Induktion des rekombinanten H2Ld-DsRed-Fusionsproteins in transformierten E. coli durch IPTG zeigt;
  • 6 ist eine Fotografie eines gefärbten SDS-PAGE-Gels, welches die Induktion des rekombinantem H2Ld-DsRed-Fusionsproteins in unterschiedlichen transformierten E. coli-Stämmen durch IPTG zeigt;
  • 7 ist eine Fotografie eines gefärbten SDS-PAGE-Gels, welches die Expression des rekombinantem H2Ld-DsRed-Fusionsproteins in mit rekombinantem H2Ld-DsRed-Baculovirus infizierten Insektenzellen zeigt;
  • 8 ist eine mittels herkömmlicher Mikroskopie erstellte Fotografie von nicht-infizierten Sf9-Zellen, welche drei Tage lang in Kultur wachsen gelassen worden waren;
  • 9 ist eine mittels Fluoreszenzmikroskopie unter Verwendung eines Rhodamin-Filters erstellte Fotografie von nicht-infizierten Sf9-Zellen, welche drei Tage lang in Kultur wachsen gelassen worden waren;
  • 10 ist eine mittels herkömmlicher Mikroskopie erstellte Fotografie von mit dem rekombinanten H2Ld-DsRed-Baculovirus infizierten Sf9-Zellen, welche nach der Infektion drei Tage lang in Kultur wachsen gelassen worden waren;
  • 11 ist eine mittels Fluoreszenz-Mikroskopie unter Verwendung eines Rhodaminfilters erstellte Fotografie von mit dem rekombinanten H2Ld-DsRed-Baculovirus infizierten Sf9-Zellen, welche nach der Infektion drei Tage lang in Kultur wachsen gelassen worden waren, wobei sie eine rote Fluoreszenz aufzeigen;
  • 12 ist eine durch herkömmliche Mikroskopie erstellte Fotografie von mit dem rekombinanten H2Ld-DsRed-Baculorvirus infizierten Tni-Zellen, welche nach der Infektion drei Tage lang in Kultur wachsen gelassen worden waren; und
  • 13 ist eine mittels Fluoreszenzmikroskopie unter Verwendung eines Rhodaminfilters erstellte Fotografie von, mit dem rekombinanten H2Ld-DsRed-Baculorvirus infizierten Tni-Zellen, welche nach der Infektion drei Tage lang in Kultur wachsen gelassen worden waren, wobei sie eine rote Fluoreszenz aufzeigen.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Definitionen
  • Wie hierin verwendet, haben die nachstehend im Besonderen aufgeführten Begriffe die folgenden Definitionen. Falls es in diesem Abschnitt nicht anderslautend definiert wird, besitzen alle hier verwendeten Begriffe die Bedeutung, welche üblicherweise von einem Fachmann auf dem Gebiet, welchem die Erfindung angehört, verstanden wird.
  • "GFP-ähnliches Chromophor" bedeutet einen selbstfluoreszierenden Proteinrest, umfassend ein 11-strängiges β-Fass (β-Dose) mit einer zentralen α-Helix, wobei die zentrale α-Helix ein konjugiertes π-Resonanzsystem aufweist, welches zwei aromatische Ringsysteme und die Brücke zwischen ihnen einschließt. Mit "selbstfluoreszierend" ist gemeint, dass das GFP-ähnliche Chromophor vollständig von seiner Aminosäuresequenz codiert wird und ohne Erfordernis hinsichtlich Co-Faktor oder Substrat fluoreszieren kann.
  • "MHC-peptidpräsentierende Struktureinheit", "MHC-peptidpräsentierendes lösliches Derivat" und "MHC-peptidpräsentierende-Domänen" beziehen sich sämtlich auf Bereiche einer Haupt-Histokompatibilitätskomplex-Proteinkette, denen eine Transmembrandomäne fehlt, (und welche daher "löslich" sind), und welche an der Präsentation von Peptidantigen an einen T-Zell-Rezeptor teilnehmen können. Der Begriff "MHC-peptidpräsentierende Struktureinheit" wird verwendet, wenn der lösliche MHC-Bereich bzw. Abschnitt innerhalb eines Fusionsproteins eingeschlossen ist; die Variante "MHC-peptidpräsentierendes lösliches Derivat" wird verwendet, wenn das Protein unfusioniert exprimiert wird; der Ausdruck "MHC-peptidpräsentierende Domänen" wird generisch bzw. gattungsspezifisch in beiden Zusammenhängen verwendet.
  • Klasse-I-α-MHC-peptidpräsentierende Domänen schließen im Wesentlichen alle der α1-, α2- und α3-Domänen eines MHC-Klasse-I-Moleküls ein; mit "im Wesentlichen alle" wird gemeint, dass Deletionen daraus und Substitutionen davon nur zulässig sind, wenn sie die Fähigkeit der α3-Domäne, eine Intradomänen-Disulfidbindung zu bilden, oder die Fähigkeit von α1- und α2-Domänen, alpha-Helizes zu bilden, die richtig positioniert sind, um Peptid zu binden, nicht stören.
  • Klasse-II-α-MHC-peptidpräsentierende Domänen schließen im Wesentlichen alle der α1- und α2-Domänen eines MHC-Klasse-II-α-Kettenmoleküls ein; mit "im Wesentlichen alle" wird gemeint, dass Deletionen oder Substitutionen davon nur zulässig sind, wenn sie die Fähigkeit der α2-Domäne, Intraketten-Disulfidbindungen auszubilden, oder die Fähigkeit der α1-Domäne, eine peptidbindende α-Helix zu bilden, nicht stören.
  • Klasse-II-β-MHC-peptidpräsentierende Domänen schließen im Wesentlichen alle der β1- und β2-Domänen eines MHC-Klasse-II-β-Ketten-Moleküls ein. Mit "im Wesentlichen alle" wird gemeint, dass Deletionen daraus oder Substitutionen davon nur zulässig sind, wenn sie die Fähigkeit der β2-Domäne, Intraketten-Disulfidbindungen zu bilden, oder der β1-Domäne, eine peptidbindende α-Helix zu bilden, nicht stören.
  • Fusionsproteine
  • In einem ersten Aspekt sieht die vorliegende Erfindung ein rekombinantes Fusionsprotein vor, welches, wenn es richtig multimerisiert und mit Peptid beladen ist, ohne weitere direkte oder indirekte Konjugation an ein exogenes Fluorophor verwendet werden kann, um T-Lymphocyten basierend auf ihrer Antigen und MHC)-Spezifität fluoreszierend zu markieren; die Reagenzien der vorliegenden Erfindung können somit in allen Verfahren verwendet werden, für welche MHC-Tetramere und MHC/Ig-Chimären-Fusionsproteine derzeitig verwendet werden, einschließlich der Peptidantigen-spezifischen Aktivierung von T-Zellen.
  • Das Fusionsprotein der vorliegenden Erfindung umfasst ein GFP-ähnliches Chromophor, mindestens eine Multimerisierungsdomäne und eine MHC-peptidpräsentierende Struktureinheit.
  • Ein GFP-ähnliches Chromophor ist eine selbstfluoreszierende Protein-Struktureinheit. Mit "selbstfluoreszierend" ist gemeint, dass das GFP-ähnliche Chromophor vollständig von seiner Aminosäuresequenz codiert wird, und ohne Erfordernis für einen Cofaktor oder Substrat fluoreszieren kann.
  • Strukturell umfasst das GFP-ähnliche Chromophor ein 11-strängiges β-Fass (β-Dose) mit einer zentralen α-Helix, wobei die zentrale α-Helix ein konjugiertes π-Resonanzsystem aufweist, welches zwei aromatische Ringsysteme und die Brücke zwischen ihnen einschließt. Das π-Resonanzsystem wird durch autoka talytische Zyklisierung unter Aminosäuren erzeugt; die Zyklisierung erfolgt über ein Imidazolinon-Intermediat, mit anschließender Dehydrierung durch molekularen Sauerstoff an der Cα-Cβ-Bindung eines teilnehmenden Tyrosins.
  • Das GFP-ähnliche Chromophor kann unter GFP-ähnlichen Chromophoren gewählt werden, die in natürlich vorkommenden Proteinen gefunden werden, wie A. victoria-GFP (GenBank-Zugangsnummer AAA27721), Renilla reniformis-GFP, FP583 (GenBank-Zugangs-Nr. AF168419) (DsRed), FP593 (AF272711), FP483 (AF168420), FP484 (AF168424), FP595 (AF246709), FP486 (AF168421), FP538 (AF168423) und FP506 (AF168422), und muss nur soviel von dem natürlichen Protein einschließen, wie benötigt wird, um die intrinsische Fluoreszenz des Chromophors beizubehalten. Verfahren zum Bestimmen der Minimaldomäne, welche für die Fluoreszenz erforderlich ist, sind im Fachgebiet bekannt; Li et al., "Deletions of the Aequorea victoria Green Fluorescent Protein Define the Minimal Domain Required for Fluorescence", J. Biol. Chem. 272: 28545-28549 (1997).
  • Alternativ dazu kann das GFP-ähnliche Chromophor aus GFP-ähnlichen Chromophoren gewählt werden, die von denjenigen, welche in der Natur vorgefunden werden, modifiziert werden. Typischerweise werden derartige Modifikationen vorgenommen, um die rekombinante Produktion in heterologen Expressionssystemen (mit oder ohne Änderung in der Proteinsequenz) zu verbessern, um die Anregungs- und/oder Emissionsspektren des nativen Proteins zu verändern, um die Aufreinigung zu erleichtern, zur Erleichterung oder als Folge einer Klonierung, oder es handelt sich um eine zufällige Konsequenz von Forschungs-Untersuchungen.
  • Die Verfahren zur Manipulierung derartiger modifizierter GFP-ähnlicher Chromophore und zum Testen dieser hinsichtlich Fluoreszenzaktivität, sowohl allein als auch in Form eines Teils von Proteinfusionen, sind im Fachgebiet gut bekannt. Frühe Ergebnisse dieser Bestrebungen werden übersichtsmäßig zusammengefasst in Heim et al., Curr. Biol. 6: 178-182 (1996), auf das hierin vollständig Bezug genommen wird; ein noch aktuellerer Übersichtsartikel, mit tabellarischer Auflistung nützlicher Mutationen, findet sich in Palm et al., "Spectral Variants of Green Fluorescent Protein", in Green Fluorescent Proteins, Conn (Hrsg.), Methods Enzymol., Band 302, S. 378-394 (1999), auf das hierin ausdrücklich Bezug genommen wird. Eine Vielzahl derartiger modifizierter Chromophore sind nun kommerziell verfügbar und können ohne weiteres in den Fusionsproteinen der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
  • Zum Beispiel ist EGFP ("verstärktes GFP"), Cormack et al., Gene 173: 33-38 (1996); U.S.-Patente Nr. 6 090 919 und 5 804 387, eine rot-verschobene, hinsichtlich menschlicher Codon-Verwendung optimierte Variante von GFP, welche für eine hellere Fluoreszenz, eine höhere Expression in Säugerzellen und ein zur Anwendung in Flusszytometern optimiertes Anregungsspektrum technisch verändert worden ist. EGFP kann in nützlicher Weise ein GFP-ähnliches Chromophor zu den Fusionsproteinen der vorliegenden Erfindung beisteuern. Eine Vielzahl von EGFP-Vektoren, sowohl Plasmid- als auch virale Vektoren, ist im Handel erhältlich (Clontech Labs, Palo Alto, CA, USA), einschließlich Vektoren für bakterielle Expression, Vektoren für N-terminale Proteinfusions-Expression, Vektoren für die Expression von C-terminalen Proteinfusionen und für bicistronische Expression.
  • In Richtung auf das andere Ende des Emissionsspektrums hin, enthalten EBFP ("enhanced blue fluorescent protein", verstärktes Blau-Fluoreszenz-Protein) und BFP2 vier Aminosäuresubstitutionen, welche die Emission von Grün zu Blau verschieben, die Helligkeit der Fluoreszenz verstärken und die Löslichkeit des Proteins verbessern, Heim et al., Curr. Biol. 6: 178-182 (1996); Cormack et al., Gene 173: 33-38 (1996). EBFP ist hinsichtlich der Expression in Säugerzellen optimiert, wohingegen BFP2, welches die ursprünglichen Quallen-Codons beibehält, in Bakterien exprimiert werden kann; wie es nachstehend ferner erörtert wird, beeinflusst die Wirtszelle der Produktion nicht die Nützlichkeit des resultierenden Fusionsproteins. Die GFP-ähnlichen Chromophoren aus EBFP und BFP2 können in nützlicher Weise in den Fusionsproteinen der vorliegenden Erfindung eingeschlossen werden, und Vektoren, welche diese blau-verschobenen Varianten enthalten, sind von Clontech Labs (Palo Alto, CA, USA) erhältlich.
  • In analoger Weise enthält EYFP ("enhanced yellow fluorescent protein"), das ebenfalls von Clontech Labs erhältlich ist, vier zu EBFP verschiedene Aminosäuresubstitutionen, Ormö et al., Science 273: 1392-1395 (1996), welche die Emission von Grün zu Gelb-Grün verschieben. Citrin, eine verbesserte Gelb- Fluoreszenz-Protein-Mutante, wird in Heikal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 11996-12001 (2000) beschrieben. ECFP ("enhanced cyan fluorescent protein") (Clontech Labs, Palo Alto, CA, USA) enthält sechs Aminosäuresubstitutionen, von denen eine das Emissionsspektrum von Grün zu Cyan verschiebt; Heim et al., Curr. Biol. 6: 178-182 (1996); Miyawaki et al., Nature 388: 882-887 (1997). Das GFP-ähnliche Chromophor von jeder dieser GFP-Varianten kann in nützlicher Weise in den Fusionsproteinen der vorliegenden Erfindung eingeschlossen werden.
  • Das GFP-ähnliche Chromophor kann des Weiteren aus anderen modifizierten GFPs herangezogen werden, einschließlich denjenigen, welche beschrieben werden in den U.S.-Patenten Nr. 6 124 128; 6 096 865; 6 090 919; 6 066 476; 6 054 321; 6 027 881; 5 968 750; 5 874 304; 5 804 387; 5 777 079; 5 741 668 und 5 625 048, wobei auf dieselben hierin ausdrücklich Bezug genommen wird.
  • Die Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung schließen ferner mindestens eine Multimerisierungsdomäne ein. Wenn mehrere Multimerisierungsdomänen vorhanden sind, müssen die Domänen nicht miteinander identisch sein. Die Multimerisierungsdomänen können entweder zur Bewirkung von Homomultimerisierung oder Heteromultimerisierung wirken und können zu nicht-kovalenter oder kovalenter Assoziation der einzelnen Untereinheiten beitragen.
  • Zum Beispiel kann die Multimerisierungsdomäne in nützlicher Weise aus existierenden, selbst-dimerisierenden MHC/Ig-Chimären herangezogen werden, welche weiter beschrieben werden in Dal Porto et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6671-6675 (1993); Greten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 7568-7573 (1998); Hamad et al. J. Exp. Med. 188: 1633-1640 (1998); Schneck et al., U.S.-Patente Nr. 6 015 884 und 6 140 113, wobei auf dieselben hierin ausdrücklich Bezug genommen wird. Die Multimerisierungs-Struktureinheit dieser Chimären schließt eine IgG-Fc-Region ein, welche zu Disulfid-verknüpfter Homodimerisierung in der Lage ist.
  • Andere Protein-Multimerisierungsdomänen sind gut bekannt und schließen zum Beispiel Leucin-Zipper-Domänen ein.
  • Die Multimerisierungsdomäne(n) kann/können ebenfalls in nützlicher Weise von demselben Protein bereitgestellt werden, welches das GFP-ähnliche Chromophor bereitstellt.
  • DsRed existiert als ein zwangsläufiges Tetramer, sogar in verdünnter Lösung, und von ihm wurde nicht beobachtet, ohne Proteindenaturierung zu monomerisieren, Gross et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 11990-11995 (2000); Wall et al., Nature Structural Biol. 7: 1133-1138 (2000), eine Eigenschaft, welche im Fachgebiet als nachteilig und eine vermittelnde Entfernung (interventional ablation) bzw. das Unterlassen von Eingriffen rechtfertigend angesehen worden ist. In der vorliegenden Erfindung erweist sich diese nachteilige Eigenschaft überraschenderweise als nützlich, wobei sie gestattet, dass DsRed sowohl das GFP-ähnliche Chromophor als auch die Multimerisierungsdomänen für das Fusionsprotein der vorliegenden Erfindung bereitstellt; mit derartigen Multimerisierungsdomänen fügen sich die Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung ohne weiteres zu löslichen MHC/Peptid-Komplexen mit der tetrameren Wertigkeit und somit Bindungsfreudigkeits-Merkmalen von bekannten MHC-Tetrameren zusammen.
  • DsRed enthält zwei unähnliche Multimerisierungsdomänen, welche beide für seine Tetramerisierung notwendig zu sein scheinen. Die kleinere Domäne zeigt Charakteristika, die typisch für viele Hochaffinitäts-Protein-Protein-Wechselwirkungsoberflächen sind, und ist möglicherweise spezifisch auf eine homooligomere Wechselwirkung abgestimmt; die größere Grenzfläche bzw. Anschlussstelle ist hinsichtlich des chemischen Charakters drastisch unterschiedlich und besitzt Merkmale, welche bei Oligomerisierungs-Anschlussstellen beobachtet werden, die eine breitere Abstimmung der Substratspezifität zu erfordern scheinen.
  • Die zwei Multimerisierungsdomänen von DsRed können in vorteilhafter Weise in den Fusionsproteinen der vorliegenden Erfindung in Assoziation mit dem nativen, GFP-ähnlichen Chromophor von DsRed verwendet werden, wobei das Anregungs(Absorptions-)maximum von etwa 558 nm, das Emissionsmaximum von etwa 583 nm, eine starke Beständigkeit gegen Fotoausbleichen und eine starke pH-Unabhängigkeit des nativen DsRed-Proteins bereitgestellt werden.
  • Alternativ dazu können die Multimerisierungsdomänen von DsRed mit GFP-ähnlichen Chromophoren verwendet werden, die aus dem nativen DsRed-Chromophor modifiziert wurden. Zum Beispiel versagt die nur-grüne DsRed-Mutante K83R (Lysin zum Arginin am Rest 83, Nummerierung wie in Baird et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 11984-11989 (2000)) darin, zu roter Fluoreszenz zu reifen, aber tetramerisiert dennoch, und wird sich somit als nützlich in den Fusionsproteinen der vorliegenden Erfindung erweisen, wobei Tetramere mit einem Emissionsspektrum bereitgestellt werden, welches leicht von demjenigen von Tetrameren unterscheidbar ist, welche aus Fusionen unter Verwendung des nativen DsRed-Fluorophors bestehen. Umgekehrt besitzt die DsRed-Mutante K83M ein Emissionsmaximum bei 602 nm mit relativ wenig restlicher grüner Fluoreszenz, Baird et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 11984-11989 (2000), und wird daher eine weitere spektrale Trennung von Grün- und Gelbemittierenden Fluorophoren bereitstellen. Andere DsRed-Chromophor-Mutanten können leicht erzeugt, exprimiert und hinsichtlich spektralen und Oligomerisierungs-Merkmalen gescreent werden, im Wesentlichen wie es in Baird et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 11984-11989 (2000), beschrieben wird.
  • Darüber hinaus ist, obwohl DsRed hinsichtlich der Sequenz nur 22% identisch zu GFP ist, die Gesamtstruktur des Chromophors zwischen diesen entfernten Homologen bemerkenswert konserviert. So können das Chromophor von A. victoria-GFP und seine vielen bekannten Varianten, einschließlich EGFP, EYFP, EBFP und Citrin, leicht das DsRed-Chromophor ersetzen, wobei die Spektraleigenschaften des Proteins verändert werden, während die DsRed-Multimerisierungsdomänen beibehalten werden. Dies kann in vorteilhafter Weise durch technisches Einbauen von Restriktionsstellen, die das DsRed-Chromophor flankieren und für Exzision und In-Raster-Ersetzung des GFP-ähnlichen Chromophors von DsRed durch Kassetten, welche die für andere GFP-ähnliche Chromophore codierende Sequenz enthalten, geeignet sind, in existierende DsRed-Vektoren bewerkstelligt werden.
  • Derartige DsRed/GFP-Chimären sind somit geeignet für, und können vorteilhaft angewandt werden für, den Einschluss in die Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung. Wie nachstehend weiter erörtert wird, können Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung, welche die DsRed-Multimerisierungseinheiten und abweichende GFP-ähnliche Chromophore aufweisen, zu heteromeren Tetrameren zusammengebaut werden, in welchen die jeweiligen Chromophore als Donor und Akzeptor in Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer ("FRET")-Reaktionen teilnehmen.
  • Multimerisierungsdomänen können ebenfalls von fluoreszierenden Protein-Homologen von DsRed oder A. victoria-GFP bereitgestellt werden.
  • Zum Beispiel ist Renilla reniformis-GFP angenommenermaßen ein obligates Dimer; Ward, in Green Fluorescent Protein: Properties, Applications, and Protocols, Hrsg. Chalfie & Kain (Wiley, New York) (1998). Die Renilla-GFP-Multimerisierungsdomäne kann in nützlicher Weise in den Fusionsproteinen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um die Selbst-Organisation von Komplexen mit der dimeren Wertigkeit, und somit Bindungsfreudigkeits-Merkmalen, von existierenden MHC/Ig-Chimären zu gestatten.
  • Ferner berichten Wall et al., Nature Structural Biol. 7: 1133-1138 (2000), dass Oligomerisierung eine allgemeine Eigenschaft der DsRed-ähnlichen fluoreszierenden Proteine, wie FP593, FP483, FP484, FP595, FP486, FP538 und FP506 zu sein scheint. Daher kann jedes dieser fluoreszierenden Proteine in nützlicher Weise eine oder mehrere Multimerisierungsdomänen zum Fusionsprotein der vorliegenden Erfindung beisteuern. Wie mit der Verwendung der DsRed-Multimerisierungsdomänen, kann das Fusionsprotein der vorliegenden Erfindung das GFP-ähnliche Chromophor des fluoreszierenden Proteins, welches die Multimerisierungsdomäne(n) beisteuert, [oder] eine Mutationsvariante davon, einschließen, oder kann alternativer Weise das GFP-ähnliche Chromophor eines anderen, homologen, fluoreszierenden Proteins oder einer Variante davon einschließen.
  • Die Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung schließen ferner eine MHC-peptidpräsentierende Struktureinheit ein.
  • Die MHC-peptidpräsentierende Struktureinheit ist ein löslicher Bereich einer Haupt-Histokompatibilitätskomplex-Proteinkette, welcher zur Teilnahme an der Antigenpräsentation an einen T-Zell-Rezeptor in der Lage ist, aber selber dafür nicht ausreichend sein kann.
  • Die MHC-peptidpräsentierende Struktureinheit kann aus MHC-Klasse I-, MHC-Klasse II- oder nicht-klassischen MHC-Molekülen abgeleitet sein.
  • Falls sie aus der Klasse I abgeleitet ist, wird die MHC-peptidpräsentierende Struktureinheit aus der MHC-Klasse-I-α-Kette abgeleitet sein und wird die α1-, α2- und α3-Domänen einschließen; zulässige Deletionen daraus oder Substitutionen davon können die Fähigkeit der α3-Domäne, eine Intradomänen-Disulfidbindung zu bilden, oder die Fähigkeit der α1- und α2-Domänen, alpha-Helices zu bilden, welche richtig positioniert sind, um Peptid zu binden, nicht stören.
  • Falls sie aus Klasse II abgeleitet ist, wird die MHC-peptidpräsentierende Struktureinheit des Fusionsproteins der vorliegenden Erfindung entweder aus der MHC-Klasse-II-α- oder -β-Kette abgeleitet sein; multimere Komplexe der vorliegenden Erfindung, nützlich zum Detektieren von Klasse-II-restringierter antigenspezifischer T-Zell-Markierung, werden, wie nachstehend weiter erörtert, sowohl Fusionsproteine mit einer von Klasse-II-α als auch einer von Klasse-II-β abgeleiteten MHC-peptidpräsentierenden Struktureinheit einschließen.
  • Wenn sie aus der Klasse-II-α-Kette abgeleitet ist, wird die MHC-peptidpräsentierende Struktureinheit des Fusionsproteins der vorliegenden Erfindung α1- und α2-Domänen einschließen; zulässige Deletionen daraus oder Substitutionen davon dürfen die Fähigkeit der α2-Domäne, Intraketten-Disulfidbindungen zu bilden, oder die Fähigkeit der α1-Domäne, eine peptidbindende α-Helix zu bilden, nicht stören. Falls sie aus der Klasse-II-β-Kette abgeleitet ist, wird die MHC-peptidpräsentierende Struktureinheit des Fusionsproteins der vorliegenden Erfindung β1- und β2-Domänen einschließen; zulässige Deletionen daraus oder Substitutionen davon dürfen die Fähigkeit der β2-Domäne, Intraketten-Disulfidbindungen zu bilden, oder der β1-Domäne, eine peptidbindende α-Helix auszubilden, nicht stören.
  • Falls sie aus einem nicht-klassischen MHC-Molekül abgeleitet sind, werden die einzuschließenden Domänen davon abhängen, ob das Molekül eine größere Sequenzhomologie zu klassischen Klasse-I- oder Klasse-II-MHC-Molekülen trägt.
  • Der MHC-peptidpräsentierende Struktureinheit wird die Transmembranregion ihres jeweiligen Stammform-MHC-Moleküls fehlen; typischerweise wird der MHC-peptidpräsentierenden Struktureinheit ebenfalls die cytoplasmatische Region des jeweiligen MHC-Moleküls fehlen.
  • Die MHC-peptidpräsentierende Struktureinheit des Fusionsproteins der vorliegenden Erfindung kann von den MHC-Molekülen jedweder Säuger- oder Vogelspezies abgeleitet werden. Zur Verwendung in multimeren Komplexen zur Markierung von antigenspezifischen T-Zellen, wird die MHC-peptidpräsentierende Struktureinheit in vorteilhafter Weise aus den MHC-Molekülen der Spezies herangezogen werden, deren T-Zellen nachgewiesen werden sollen.
  • Somit kann die MHC-peptidpräsentierende Struktureinheit des Fusionsproteins der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise aus MHC-Molekülen aus dem Menschen oder anderen Primaten, aus Nagetier-, insbesondere Maus-, Ratte-, Hamster- und Meerschweinchen-MHC und aus Kaninchen-, Rinder-, Hund-, Katzen- und Pferde-MHC abgeleitet werden. Die MHC-peptidpräsentierende Struktureinheit des Fusionsproteins der vorliegenden Erfindung kann somit nützlicherweise aus den humanen Klasse-II-Untereinheiten HLA-DPa, HLA-DPβ, HLA-DQα, HLA-DQβ, HLA-DRα und HLA-DRβ, den humanen Klasse-I-Untereinheiten HLA-A, HLA-B, HLA-C, den murinen Klasse-II-Untereinheiten I-Aα, I-Aβ, I-Eα, I-Eβ und den murinen Klasse-I-Untereinheiten H-2K, H-2D und H-2L herangezogen werden.
  • Die MHC-peptidpräsentierende Struktureinheit des Fusionsproteins der vorliegenden Erfindung kann im Wesentlichen gleich sein, und kann identisch sein, zu den aus MHC abgeleiteten Bereichen von MHC-Tetrameren, welche in Doherty et al., Annu. Rev. Immunol. 18: 561-92 (2000); Ogg et al., Immunol. Lett. 66 (1-3): 77-80 (1999); Maini et al., Immunol. Today 20 (6): 262-6 (1999); Doherty, Curr. Opin. Microbiol. 1 (4): 419-22 (1998); Reichstetter et al., J. Immunol. 165 (12): 6994-8 (2000); Kwok et al., J. Immunol. 164 (8): 4244-9 (2000); Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (26): 14596-14601 (2000); Novak et al., J. Clin. Invest. 104 (12): R 63-7 (1999); Crawford et al., Immunity 8: 675-682 (1998); Kozono et al., Nature 369: 151-154 (1994); Altman et al., Science 274: 94 (1996), und Altman et al., U.S.-Patent Nr. 5 635 363, weiter beschrieben werden.
  • Die MHC-peptidpräsentierende Struktureinheit des Fusionsproteins der vorliegenden Erfindung kann im Wesentlichen gleich sein, und kann identisch sein, zu den aus MHC abgeleiteten Abschnitten von MHC/Ig-Chimären, welche in Dal Porto et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6671-6675 (1993); Greten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 7568-7573 (1998); Hamad et al., J. Exp. Med. 188: 1633-1640 (1998); Schneck et al., U.S.-Patente Nr. 6 015 884 und 6 140 113, wobei auf diese Offenbarungen hierin ausdrücklich Bezug genommen wird, weiter beschrieben werden.
  • Andere MHC-Moleküle, welche MHC-peptidpräsentierende Struktureinheiten beisteuern können, kann man in Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat et al., (Hrsg.), 5. Ausgabe, U.S. Dept. of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health (1991), wobei auf diese Offenbarung hierin ausdrücklich Bezug genommen wird, und "The Kabat Database of Sequences of Proteins of Immunological Interest", http://immuno.bme.nwu.edu/, was ferner in Johnson et al., Nucl. Acids Res. 29: 205-206 (2001) beschrieben wird, finden.
  • Typischerweise, aber nicht invariabel, wird die MHC-peptidpräsentierende Struktureinheit N-terminal sowohl zu dem GFP-ähnlichen Chromophor als auch den Multimerisierungsdomänen des Fusionsproteins der vorliegenden Erfindung lokalisiert sein. Die relative Position des Chromophors und der Multimerisierungsdomänen wird ihrerseits zu einem großen Teil von deren Quelle abhängen.
  • Falls zum Beispiel die Multimerisierungsdomäne (und möglicherweise auch die MHC-peptidpräsentierende Struktureinheit) aus einer existierenden MHC/Ig-Chimäre herangezogen wird, ist das GFP-ähnliche Chromophor vorteilhafter Weise an den C-Terminus der existierenden MHC/Ig-Chimäre fusioniert. Als ein anderes Beispiel, in dem das GFP-ähnliche Chromophor und die Multimerisierungsdomänen aus einem einzelnen [fluor]eszenten Protein, wie DsRed, herangezogen werden, werden die relativen Positionen durch deren relative Positionen in dem nativen Protein bestimmt. Die relative Positionierung der Multimerisierungsdomäne(n) und des GFP-ähnlichen Chromophors können auch von Klonierungs-Erwägungen abhängen, wobei Lösungen hierfür allgemein inner halb des Kenntnisstandes des Fachmanns auf dem Gebiet der Molekularbiologie liegen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Fusionsprotein der vorliegenden Erfindung vom N-Terminus zum C-Terminus, benachbarte bzw. fortlaufende α1-, α2- und α3-Domänen, welche aus einer gewählten MHC-Klasse-I-α-Untereinheit herangezogen werden, worauf, im Leseraster, im Wesentlichen die Gesamtheit von DsRed folgt, welches sowohl das GFP-ähnliche Chromophor als auch zwei getrennte Multimerisierungsdomänen bereitstellt. Das Fusionsprotein tetramerisiert spontan in Lösung. Die resultierenden Tetramere können, nach Komplexierung mit β2-Mikroglobulin und Beladen mit Peptid, und ohne weitere Markierung, in allen Anwendungen verwendet werden, für welche sich klassische Klasse-I-MHC-Tetramere und Klasse-I-MHC/Ig-Chimären als nützlich erwiesen haben.
  • Das Fusionsprotein der vorliegenden Erfindung kann in nützlicher Weise N-terminal zur MHC-Präsentierungseinheit auch das antigene Peptid selbst einschließen; dies ist besonders nützlich in Fusionen, welche eine MHC-Klasse-II-β-Untereinheit-peptidpräsentierende Struktureinheit einschließen; Kozono et al., Nature 369: 151-154 (1994); Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 14596-14601 (2000), auf welche hierin ausdrücklich Bezug genommen wird.
  • Das Fusionsprotein kann in vorteilhafter Weise ebenfalls, entweder am N-Terminus oder C-Terminus, eine zur Aufreinigung nützliche Sequenz einschließen. Falls es direkt benachbart zur MHC-peptidpräsentierenden Struktureinheit vorliegt, ist dieses anfusionierte Tag bzw. Markierungsanhängsel vorzugsweise selektiv entfernbar.
  • Zum Beispiel kann das Fusionsprotein ein Polyhistidin-Tag einschließen, welches eine Reinigung durch immobilisierte Metall-Affinitätschromatographie, zum Beispiel unter Verwendung von NiNTA-Harz (Qiagen Inc., Valencia, CA, USA) oder TALONTM-Harz (Kobalt-immobilisiertes Affinitätschromatographie-Medium, Clontech Labs, Palo Alto, CA, USA), gestattet. Als ein anderes Beispiel kann das Fusionsprotein ein Chitin-Bindungs-Tag und selbst-herausschneidendes Intein einschließen, was die Chitin-basierende Reinigung mit Selbstentfernung des fusionierten Tags gestattet (IMPACTTM-System, New England Biolabs, Inc., Beverly, MA, USA). Alternativ dazu kann das Fusionsprotein ein Calmodulinbindendes Peptid-Tag, welches die Reinigung durch Calmodulin-Affinitätsharz (Stratagene, La Jolla, CA, USA) gestattet, oder ein spezifisch herausschneidbares Fragment des Biotin-Carboxylase-Trägerproteins einschließen, welches die Reinigung von in vivo biotinyliertem Protein unter Verwendung eines Avidin-Harzes und anschließender Tag-Entfernung gestattet (Promega, Madison, WI, USA).
  • In alternativen Ausführungsformen kann das Fusionsprotein in vorteilhafter Weise auch einen Protein-Abstandhalter einschließen, welcher im Leseraster zwischen der MHC-Präsentierungseinheit und jeglichem von dem GFP-ähnlichen Chromophor und der/den Multimerisierungsdomäne oder -domänen einfusioniert ist. Der Abstandhalter sieht eine flexible Verknüpfung zwischen der MHC-Präsentierungseinheit und anderen Komponenten des Fusionsproteins vor. Die Linker-Sequenz kann einmalig oder als mehrfache Tandem-Wiederholung derselben Sequenz auftreten. Geeignete Aminosäuresequenzen, die eine flexible Verknüpfung zwischen der MHC-Präsentierungseinheit und DsRed bereitstellen, und Techniken zum Inserieren eines derartigen Abstandhalters in das Fusionskonstrukt liegen innerhalb des Kenntnisstandes des Fachmanns auf dem Gebiet.
  • Nucleinsäuren, Vektoren und Wirtszellen
  • Die Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung werden typischerweise durch rekombinante Expression in Wirtszellen hergestellt. Daher schließt die vorliegende Erfindung, in weiteren Aspekten, Nucleinsäuren, welche die oben beschriebenen Fusionsproteine codieren, Vektoren, welche die Nucleinsäuren umfassen, Vektoren zum Exprimieren der Fusionsproteine in Wirtszellen, Wirtszellen, welche episomale oder integrierte Vektoren enthalten, die zum Exprimieren der Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung in der Lage sind, und Wirtszellen, welche die Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung in einem oder mehreren internen zellulären Kompartimenten enthalten, ein.
  • Die Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung umfassen Sequenzen, die das Fusionsprotein codieren oder hinsichtlich der Sequenz zu denjenigen, die das Fusionsprotein codieren, komplementär sind. Die Nucleinsäuren (oder jeweilige Komplemente davon) können das Fusionsprotein als ein einzelnes offenes Leseraster codieren, oder können, wenn die codierende Nucleinsäure für eukaryotische Expression des Fusionsproteins verwendet werden soll, das Fusionprotein in Form einer Vielzahl von Exons mit dazwischenliegenden Introns codieren.
  • Die Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung können in der Form von DNA, typischerweise aber nicht invariabel doppelsträngig, oder in der Form von RNA vorliegen. Falls die DNA das Fusionsprotein in Form einer Vielzahl von Exons codiert, kann das RNA-Transkript sowohl in der ungespleissten, die Introns enthaltenden, Form als auch in einer oder mehreren gespleissten Formen existieren. Die Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung können ebenfalls nicht-native Nukleotide, alternative Internukleotid-Bindungen, oder beides, einschließen, typischerweise, wenn die Nucleinsäuren eher als Sonden als für die Expression des Fusionsproteins verwendet werden. Sonden sind nützlich zur Bestätigung der Transfektion der Nucleinsäure in Wirtszellen und ihrer Transkription, obwohl die Fluoreszenzemission selbst häufig als Maß der Transfektions- und Expressionseffizienz verwendet werden kann, wie es von 11 und 13 gezeigt wird.
  • Die Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung können technisch verändert werden, um Codons zu verwenden, welche für die Expression in verschiedenen Typen von Wirtszellen optimiert sind, wobei Nucleinsäuremoleküle von abweichender Nucleinsäuresequenz bereitgestellt werden, die das gleiche Fusionsprotein codieren. Die Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung können in isolierter und gereinigter Form, z. B. in der Form einer gereinigten Plasmidpräparation vorliegen, und können ebenfalls in der Form von Nucleinsäuren vorliegen, welche in ein oder mehrere Chromosomen einer prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszelle integriert sind.
  • Wie in den nachstehenden Beispielen weiter verdeutlicht wird, können die Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung in nützlicher Weise in Vektoren eingebaut werden, welche die Vermehrung und Amplifizierung bzw. Vervielfältigung der Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung in einem oder mehreren Typen von eukaryotischen und prokaryotischen Wirtszellen gestatten, einschließlich Säugerzellen, insbesondere Menschen- und Nagetierzellen, Insektenzellen, He fezellen und bakteriellen Zellen, insbesondere E. coli-Zellen, wodurch Nucleinsäuren für die Sondenkonstruktion, für weitere rekombinante Verfahrensweisen, wie Mutagenese, und für die Klonierung in weitere Vektoren bereitgestellt werden.
  • Die Vektoren der vorliegenden Erfindung können ein Plasmid, viral oder eine Kombination oder Variante davon (z. B. Phagmid, Cosmid) sein, können ein künstliches Chromosom (z. B. BAC, YAC, HAC) sein, oder können jedweder andere Typ von Klonierungs- und/oder Expressionsvektor sein, der im Fachgebiet bekannt ist.
  • Vektoren können de novo konstruiert werden, unter Anwendung von im Fachgebiet allgemein bekannten Techniken, wie sie unter anderem in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2000); Ausubel et al. (Hrsg.), Short Protocols in Molecular Biology: A. Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, 4. Ausgabe, John Wiley & Sons (1999); Jones et al. (Hrsg.), Vectors: Cloning Applications: Essential Techniques (Essential Techniques Series), John Wiley & Son Ltd. (1998); Cid-Arregui et al. (Hrsg.), Viral Vectors: Basic Science and Gene Therapy, Eaton Publishing Company/Bio Techniques Books Division (2000), wobei auf dieselben hierin ausdrücklich Bezug genommen wird, beschrieben werden.
  • Alternativ dazu können die Vektoren der vorliegenden Erfindung in nützlicher und vorteilhafter Weise modifiziert werden, oder relevante Bereiche einschließen, aus Vektoren, die derzeitig verwendet werden, um DsRed und/oder andere fluoreszierende Proteine, MHC-Tetramere und/oder MHC/Ig-Chimären zu vermehren und/oder zu exprimieren.
  • Zum Beispiel ist eine Vielzahl von DsRed-Vektoren, welche nützlich als Ausgangsmaterial zum Konstruieren der Vektoren der vorliegenden Erfindung sind, kommerziell von Clontech Labs (Palo Alto, CA USA) verfügbar. Der Vektor pDsRed ist ein prokaryotischer Expressionsvektor, der die native DsRed-Sequenz, flankiert von Mehrfachklonierungsstellen enthält; die für DsRed codierende Sequenz kann durch Restriktionsverdau herausgeschnitten oder durch PCR-Amplifikation wiedergewonnen werden. pDsRed1-1 codiert eine DsRed- Variante mit einer Valin-Insertion an der Position 2, mit 144 stillen Austauschungen zur Optimierung der Expression in Säugerzellen. pDsRed1-N1 gestattet leicht die Säugerexpression von Fusionen an den N-Terminus von DsRed; pDsRed1-C1 gestattet leicht die Säugerexpression von Fusionen an den C-Terminus von DsRed.
  • Zum Beispiel werden MHC-Tetramer-Expressionsvektoren, die als Ausgangsmaterial zum Konstruieren der Vektoren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, beschrieben in Doherty et al., Annu. Rev. Immunol. 18: 561-92 (2000); Ogg et al., Immunol. Lett. 66(1-3): 77-80 (1999); Maini et al., Immunol. Today 20 (6): 262-6 (1999); Doherty, Curr. Opin. Microbiol. 1 (4): 419-22 (1998); Reichstetter et al.; J. Immunol. 165 (12): 6994-8 (2000); Kwok et al., J. Immunol. 164 (8): 4244-9 (2000); Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (26): 14596-14601 (2000); Novak et al., J. Clin. Invest. 104 (12): R 63-7 (1999); Crawford et al., Immunity 8: 675-682 (1998); Kozono et al., Nature 369: 151-154 (1994); Altman et al., Science 274: 94 (1996) und Altman et al., U.S.-Patent Nr. 5 635 363, wobei auf die Offenbarungen derselben ausdrücklich Bezug genommen wird.
  • Zum Beispiel werden Vektoren zur Expression von MHC/Ig-Chimären, welche nützlich als Ausgangsmaterial zum Konstruieren der Vektoren der vorliegenden Erfindung sind, weiter in Dal Porto et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6671-6675 (1993); Greten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 7568-7573 (1998); Hamad et al., J. Exp. Med. 188: 1633-1640 (1998); Schneck et al., U.S.-Patente Nr. 6 015 884 und 6 140 113, wobei auf die Offenbarungen derselben ausdrücklich Bezug genommen wird, beschrieben.
  • Besonders nützlich unter den Vektoren der vorliegenden Erfindung sind diejenigen, welche zur Expression der Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung in Wirtszellen verwendet werden können. Einzelheiten der Expressionsvektorkonstruktion sind im Fachgebiet allgemein bekannt und müssen hier nicht erneut zusammengefasst werden. Allgemein gesagt, schließen jedoch die Expressionsvektoren der vorliegenden Erfindung diejenigen, welche episomal innerhalb der Wirtszelle replizieren, und diejenigen, welche an einer oder mehreren Stellen des Wirtszellgenoms integriert sind, ein. Die Expression des Fusionsproteins von dem Vektor aus kann konstitutiv oder induzierbar sein, und das expri mierte Fusionsprotein kann innerhalb der Zelle zurückgehalten oder sezerniert werden.
  • Die vorliegende Erfindung schließt ferner Wirtszellen ein, welche die Nucleinsäuren, typischerweise die Vektoren, einschließlich Expressionsvektoren, der vorliegenden Erfindung entweder episomal oder an einer oder mehreren Stellen im Wirtszell-Chromosom integriert enthalten. Falls integriert vorliegend, ist der Expressionsvektor in nützlicher Weise in mehreren Kopien vorhanden, wobei die erhöhte Kopienzahl bewirkt werden kann durch Amplifikationstechniken, welche im Fachgebiet allgemein bekannt sind (siehe z. B. Axel et al., U.S.-Patent Nr. 4 399 216, auf das hierin ausdrücklich Bezug genommen wird). Falls die Wirtszellen Expressionsvektoren der vorliegenden Erfindung einschließen, schließen die Wirtszellen typischerweise ferner die Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung in einem oder mehreren zellulären Kompartimenten ein.
  • Die Wirtszellen der vorliegenden Erfindung können eine Vielzahl von Vektoren, einschließlich Expressionsvektoren, der vorliegenden Erfindung enthalten; die Vielzahl von Vektoren kann jeweils eine Vielzahl von unterschiedlichen Fusionsproteinen codieren, wodurch eine Expression von heteromeren Multimeren innerhalb der Zelle gestattet wird. Wie weiter beschrieben wird, können derartige heteromeren Multimere in nützlicher Weise Fusionsproteine einschließen, die (eine) identische MHC-Antigen-Präsentierungseinheit und Multimerisierungsdomänen aber unterschiedliche GFP-ähnliche Chromophoren aufweisen.
  • Zur Vermehrung der Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung nützliche Wirtszellen schließen bakterielle Zellen, insbesondere E. coli-Zellen, und eukaryotische Zellen ein.
  • Für die rekombinante Produktion der Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung nützliche Wirtszellen schließen alle Typen von Zellen ein, die typischerweise zur rekombinanten Expression verwendet werden, einschließlich sowohl prokaryotischen als auch eukaryotischen Zellen, wobei die letztgenannten Menschen-, Nagetier-, Insekten- und Hefezellen einschließen.
  • Insektenzellen, wie Sf9- und Tni-Zellen, bieten bestimmte Vorteile für die Expression der Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung, einschließlich dem hohen Ertrag (siehe z. B. 11 und 13) und einer wahrscheinlich niedrigen Beladung mit endogenem Peptid, welches irrtümlich während der Synthese auf die naszenten Multimere geladen wird. Nagetier-Myelomzellen bieten insbesondere dann bestimmte Vorteile für die Expression, wenn das Fusionsprotein den Großteil oder die Gesamtheit einer Ig/MHC-Chimäre, fusioniert an ein GFP-ähnliches Chromophor, einschließt; unter den derartigen Vorteilen ist die gleichzeitige Produktion von Ig-Leichtkette bemerkenswert.
  • Falls das zu exprimierende Fusionsprotein eine MHC-peptidpräsentierende Struktureinheit aus einem Klasse-I-MHC-Molekül einschließt, können die Wirtszellen der vorliegenden Erfindung des Weiteren in nützlicher Weise und gleichzeitig β2-Mikroglobulin, entweder endogen oder über die Expression eines zweiten rekombinanten Konstrukts, exprimieren.
  • Falls das exprimierte Fusionsprotein zur Multimerisierung im intrazellulären Milieu in der Lage ist, schließen die Wirtszellen typischerweise ferner solche Multimere ein.
  • Multimere Komplexe
  • In einem anderen Aspekt sieht die vorliegende Erfindung multimere Komplexe vor, welche, in Form mehrerer Untereinheiten, Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung einschließen. Wenn sie geeignet mit passenden löslichen Proteinpartnern (z. B. β2-Mikroglobulin für Fusionsproteine mit einer Klasse-I-MHC-peptidpräsentierenden Struktureinheit) komplexiert und mit Peptid beladen sind, können diese selbstfluoreszierenden multimeren Komplexe verwendet werden, um T-Lymphocyten basierend auf deren Antigen(und MHC)-Spezifität zu markieren.
  • In seiner einfachsten Form umfasst der multimere Komplex der vorliegenden Erfindung ein Multimer der Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung, was den Komplex einer quarternären Formel von (F)n ergibt, worin F ein Fusionsprotein, wie oben beschrieben, ist und n eine ganze Zahl ist, die größer als 1 ist.
  • Die Multimerisierung wird von den Multimerisierungsdomänen des Fusionsproteins angetrieben und vermittelt. Wo die Multimeriserungsdomäne(n) der Fusi onsprotein-Untereinheiten aus DsRed, Varianten davon oder verwandten fluoreszierenden Proteinen herangezogen werden, werden sich die Fusionsprotein-Untereinheiten typischerweise vorwiegend zu Tetramaren (n = 4) zusammenfügen, mit einer möglichen Bildung von schwach assoziierten Oktameren (n = 8). Falls die Multimerisierungsdomäne(n) der Fusionsprotein-Untereinheiten anstatt dessen aus Renilla-GFP- oder aus IgG-Fc-Regionen herangezogen werden, werden sich die Fusionsprotein-Untereinheiten typischerweise vorwiegend zu Dimeren (n = 2) zusammenfügen.
  • Wenn die Fusionsprotein-Untereinheiten in eukaryotischen Zellen, wie Nagetier-Myelomzellen oder Insektenzellen, exprimiert werden, werden sich die Fusionsprotein-Untereinheiten typischerweise innerhalb der Zelle zu Komplexen der erwarteten Wertigkeit von selbst zusammenfügen. Wenn die Fusionsprotein-Untereinheiten anstatt dessen in prokaryotischen Zellen, wie E. coli, exprimiert werden, werden sich die Untereinheiten typischerweise nur nach Denaturierung (z. B. in 8 M Harnstoff) und Renaturierung zusammenfügen, wie es auf dem MHC-Tetramer-Fachgebiet allgemein bekannt ist.
  • Der resultierende multimere Komplex ist selbstfluoreszierend aufgrund des Vorliegens von GFP-ähnlichen Chromophoren in jeder der teilnehmenden Untereinheiten. Die Spektral-Merkmale des Komplexes werden nicht nur von den spektralen Eigenschaften der einzelnen, innerhalb des Komplexes vorhandenen GFP-ähnlichen Chromophoren vorgegeben sondern auch von ihrer kollektiven Wechselwirkung.
  • Eine besonders bedeutende Wechselwirkung unter GFP-ähnlichen Chromophoren ist der Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer ("FRET").
  • Der multimere Komplex der vorliegenden Erfindung kann Fusionsprotein-Untereinheiten mit verschiedenen GFP-ähnlichen Chromophoren einschließen, solange die Fusionsprotein-Untereinheiten in der Lage bleiben, über ihre jeweiligen Multimerisierungsdomänen zu multimerisieren. Typischerweise, aber nicht invariabel, werden die Fusionsprotein-Untereinheiten solcher heteromultimeren Komplexe alle die gleichen MHC-peptidpräsentierenden Struktureinheiten aufweisen. Falls die verschiedenen GFP-ähnlichen Chromophoren eine geeignete spektrale Überlappung aufweisen, kann ihre Nähe und relative Winkelverset zung innerhalb des multimeren Komplexes einen Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer zwischen den verschiedenen GFP-ähnlichen Chromophoren gestatten.
  • Es ist zum Beispiel bekannt, dass das DsRed-Chromophor als ein Akzeptor in einem Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer(FRET)-Paar mit Verstärktem-Grünfluoreszenz-Protein (EGFP) oder Gelbfluoreszenzprotein(YFG)-Mutanten verwendet werden kann; Heikal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 11996-12001 (2000). Darüber hinaus ist von Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer unter Monomeren im nativen DsRed-Tetramer berichtet worden. Wo der multimere Komplex der vorliegenden Erfindung sowohl eine Fusionsprotein-Untereinheit mit einem GFP-ähnlichen Chromophor von DsRed als auch eine Fusionsprotein-Untereinheit mit einem GFP-ähnlichen Chromophor von EGFP einschließt, können die spektralen Eigenschaften des Komplexes somit den Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer zwischen EGFP- und DsRed-Chromophoren widerspiegeln, was zulässt, dass der Komplex leichter beim EGFP-Absorptionsmaximum angeregt wird als dies mit einem Homotetramer, welches nur die DsRed-Chromophoren aufweist, möglich gewesen wäre.
  • Wie oben angemerkt, kann ein Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer zwischen und unter GFP-ähnlichen Chromophoren stattfinden, welche in den Untereinheiten der multimeren Komplexe der vorliegenden Erfindung vorhanden sind. Ein FRET kann darüber hinaus und in nützlicher Weise zwischen dem GFP-ähnlichen Chromophor einer oder mehrerer der Untereinheiten des Komplexes und einem damit assoziierten Fluorophor etabliert werden.
  • Techniken zum Assoziieren eines Fluorophors mit einer Untereinheit des multimeren Komplexes, so dass der FRET unterstützt wird – durch Konjugieren, Verknüpfen oder Hinzufügen des Fluorophors zu der Untereinheit, oder anderweitiges Modifizieren einer Untereinheit mit dem Fluorophor – liegen innerhalb des Kenntnisstands des Fachmanns auf dem Gebiet.
  • Abhängig von den Absorptions- und Emissionsspektren des Fluorophors, welches mit einem besonderen Typ von GFP-ähnlichem Chromophor assoziiert ist, kann entweder das Fluorophor oder das GFP-ähnliche Chromophor als der Fluoreszenzenergie-Donor oder -Akzeptor dienen.
  • Fluorophore, die als FRET-Donoren oder -Akzeptoren nützlich sind, wenn sie mit einer oder mehreren Untereinheiten des multimeren Komplexes der vorliegenden Erfindung assoziiert sind, schließen die folgenden ein: Cyanin 3 (z. B. Cy3, Cy3B); Cyanin 5 (z. B. Cy5, Cy5Q); Cyanin 5.5; Cyanin 7 (z. B. Cy7Q); SYBR® Green (Molecular Probes); Fluoreszein und Fluoreszeinderivate (z. B. 6-Carboxyfluoreszein); Rhodamin und Rhodaminderivate (z. B. Dichlorrhodamin, dR110, dR6G, dTAMRA, dROX); Allophycocyanin und Allophycocyaninderivate (z. B. GT5 APC); R-Phycoerythrin; B-Phycoerythrin, Y-Phycoerythrin; R-Phycocyanin; C-Phycocyanin; Texas Red®; und proteinartige Fluorophoren, z. B. PerCP.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dient das GFP-ähnliche Chromophor als der FRET-Donor, und das Fluorophor dient als der FRET-Akzeptor. Auf diese Weise wird stimulierende Lichtenergie der geeigneten Wellenlänge von dem GFP-ähnlichen Chromophor absorbiert und wird intramolekular auf das Fluorophor übertragen, welches dann fluoreszierend die Energie bei einer unterschiedlichen, längeren Wellenlänge emittiert.
  • Diese Anordnung kann die Geschwindigkeit der Fluoreszenzlichtemission in nützlicher Weise beschleunigen.
  • Die Geschwindigkeit des Fluoreszenz-Zerfalls von einigen GFP-ähnlichen Fluorophoren nach der Lichtanregung ist relativ langsam. Zum Beispiel zerfällt das angeregte bzw. energetisierte DsRed-Chromophor durch Fluoreszenzemission über eine Zeitdauer von Mikrosekunden zu seinem Grundzustand. Im Gegensatz dazu findet der intramolekulare Energietransfer mittels FRET zwischen einem GFP-ähnlichen Chromophor, wie DsRed, und einem assoziierten Fluorophor typischerweise in Nanosekunden statt. Als Ergebnis kann die Fluoreszenzemission durch das Fluorophor schneller sein als die Fluoreszenzemission durch das GFP-ähnliche Fluorophor. Der Effekt dieses Unterschieds hinsichtlich der Geschwindigkeit der Fluoreszenzenergie-Emission besteht darin, dass innerhalb einer kurzen vorbestimmten Zeitdauer die Fluoreszenzlichtemission durch das Fluorophor, das mittels FRET an das GFP-ähnliche Chromophor gekoppelt ist, größer ist, und das Signal heller erscheint. Im Gegensatz dazu ist innerhalb der gleichen Zeitdauer die Fluoreszenzlichtemission durch das GFP- ähnliche Chromophor, welches nicht durch FRET und ein Fluorophor unterstützt wird, niedriger, und das Signal erscheint schwächer.
  • Die Erhöhung der Geschwindigkeit der Fluoreszenzemission von GFP-ähnlichen Chromophoren, wie etwa durch den oben beschriebenen FRET-vermittelten Mechanismus, kann besonders vorteilhaft bei der Anwendung von Flusszytometrie sein. Die FRET-vermittelte Beschleunigung der Fluoreszenzemission durch Assoziieren eines Fluorophors mit einem GFP-ähnlichen Chromophor wird ebenfalls in jedweder anderen Anwendung wünschenswert sein, in welcher die Signalerfassung rasch erfolgen muss oder das Signal maximiert werden muss.
  • Im Allgemeinen wird die geeignete Auswahl von GFP-ähnlichen Chromophoren, welche in die Fusionsprotein-Untereinheiten einzuschließen sind, die im Komplex multimerisiert werden (und gegebenenfalls von FRET-Donoren und -Akzeptoren, welche daran konjugiert sind), die Feinabstimmung der Spektral-Charakteristika des Komplexes gestatten. Eine wichtige Anwendung einer derartigen Abstimmung besteht darin, die Absorptions- und Emissionscharakteristika des Komplexes an die Anregungs- und Detektions-Parameter des Analysegerätes, typischerweise eines Flusszytometers, anzupassen. Umgekehrt, wie es nachstehend weiter erörtert wird, können Laser, Filtersätze und Detektoren gewählt werden, welche den Absorptions- und Emissions-Charakteristika des multimeren Komplexes entsprechen.
  • Für die nachweisbare Markierung von antigenspezifischen T-Lymphocyten wird der multimere Komplex der vorliegenden Erfindung ferner lösliche Proteinpartner und Peptide einschließen. Die oben beschriebenen (F)n-Komplexe sind jedoch nützliche Zwischenstufen in der Herstellung dieser Markierungsreagenzien und werden in nützlicher Weise an Endverbraucher verkauft werden, welche wünschen, die Bildung des Komplexes selber zu vervollständigen.
  • Somit schließt die Erfindung, in einem weiteren Aspekt, selbstfluoreszierende, multimere Proteinkomplexe ein, umfassend eine Vielzahl von Untereinheiten, wobei die Untereinheiten die quarternäre Formel in dem Komplex von (F1S1)n aufweisen, worin F, wie oben beschrieben, ein rekombinantes Fusionsprotein der vorliegenden Erfindung ist, S ein lösliches Protein ist, und n eine ganze Zahl ist, welche größer als 1 ist.
  • S wird aus der Gruppe gewählt, die aus β2-Mikroglobulin, Klasse-II-β-MHC-peptidpräsentierenden löslichen Derivaten und Klasse-II-α-MHC-peptidpräsentierenden löslichen Derivaten besteht: S ist β2-Mikroglobulin, wenn F eine Klasse-I-α-MHC-peptidpräsentierende Struktureinheit einschließt; S ist ein Klasse-II-β-MHC-peptidpräsentierendes lösliches Derivat, wenn F eine Klasse-II-α-MHC-peptidpräsentierende Struktureinheit einschließt; und S ist ein Klasse-II-α-MHC-peptidpräsentierendes lösliches Derivat, wenn F eine Klasse-II-β-MHC-peptidpräsentierende Struktureinheit einschließt.
  • Typischerweise ist das lösliche Protein aus der gleichen taxonomischen Spezies abgeleitet, welche die MHC-peptidpräsentierende Struktureinheit des Fusionsproteins in dem Komplex bereitstellt. Wenn das Fusionsprotein zum Beispiel MHC-Klasse-I-α-Domänen aus der Maus einschließt, wird das im multimeren Komplex verwendete lösliche β2-Mikroglobulin ein murines β2-Mikroglobulin sein. Wenn zum Beispiel das Fusionsprotein humane HLA-DQα-Domänen einschließt, wird das innerhalb des Komplexes eingeschlossene MHC-peptidpräsentierende lösliche Derivat humane Klasse-II-β-Domänen, wie etwa HLA-DQβ-Domänen, einschließen.
  • Das lösliche Protein kann mit den Fusionprotein-Untereinheiten in einer einzelnen Wirtszelle co-exprimiert werden, was die Selbst-Organisation des (F1S1)n-Komplexes innerhalb der Zelle erleichtert, oder kann zu einem zuvor zusammengefügtem Komplex, der die quarternäre Formel Fn aufweist, zugegeben werden. Wenn die Fusionsprotein-Untereinheiten des multimeren Komplexes eine Klasse-II-MHC-peptidpräsentierende Struktureinheit einschließen, wird das lösliche Klasse-II-MHC-peptidpräsentierende Derivat am typischsten damit co-exprimiert werden, insbesondere, wenn die Expression des Fusionsproteins in eukaryotischen Zellen bewirkt wird; wenn die Fusionsprotein-Untereinheiten des multimeren Komplexes eine Klasse-I-α-MHC-peptidpräsentierende Struktureinheit einschließen, kann das lösliche β2-Mikroglobulin-Protein leicht damit co-exprimiert werden oder nach dem Zusammenfügen des (F)n-Multimers zugegeben werden. Die Co-Expression von β2-Mikroglobulin in eukaryotischen Zellen kann entweder aus einer Expression von einem rekombinanten Konstrukt aus oder, abhängig von der Wahl der Wirtszelle, aus einer endogenen Expression durch die Wirtszelle selbst resultieren.
  • Der multimere Komplex, der korrekt mit löslichem Protein zusammengefügt ist, kann danach mit spezifischem Peptid beladen werden, wodurch ein selbstfluoreszierendes Reagenz bereitgestellt wird, das für die nachweisbare Markierung (und in anderen Verfahren die Aktivierung) von T-Lymphocyten basierend auf ihrer Antigenspezifität nützlich ist.
  • Es versteht sich, dass der oben beschriebene Komplex – d.h. einschließlich Fusionsprotein und löslichen Proteinuntereinheiten, aber ohne Peptidantigen – mit einer enormen Vielfalt von Peptidantigenen beladen werden kann, wobei jedes Peptid dem vervollständigten Markierungsreagenz seine eigene Spezifität verleiht. Der oben beschriebene (F1S1)n-Komplex ist daher äußerst nützlich bei der Herstellung von Markierungsreagenzien; und häufig werden die selbstfluoreszierenden Komplexe der vorliegenden Erfindung an den Endverbraucher in nützlicher Weise in einer solchen Form verkauft, dass dem Endverbraucher gestattet wird, den Komplex mit dem Peptidantigen seiner oder ihrer Wahl zu beladen.
  • Beladen mit Peptidantigen, ist der multimere Komplex direkt verwendbar, um T-Lymphocyten basierend auf der Antigen(und MHC)-Spezifität ihrer T-Zell-Rezeptoren zu markieren. Daher stellt die Erfindung, in einem anderen Aspekt, einen selbstfluoreszierenden multimeren Proteinkomplex zum Markieren von T-Lymphocyten bereit, wobei der Komplex eine Vielzahl von Untereinheiten umfasst, wobei die Untereinheiten die quarternäre Formel in Komplex von (F1S1P1)n aufweisen, worin F, wie oben, ein rekombinantes Fusionsprotein der vorliegenden Erfindung ist, S ein lösliches Protein, wie oben beschrieben, ist, P ein Peptidantigen ist, und n eine ganze Zahl ist, welche größer als 1 ist.
  • Das Peptidantigen wird, wie in MHC-Tetrameren und MHC/Ig-Chimären, durch die MHC-Peptidpräsentierungs-Domänen des multimeren Komplexes der vorliegenden Erfindung gebunden werden: in einem selbstfluoreszierenden Klasse-I-MHC-Multimer durch die α1- und α2-Domänen der Klasse-I-α-MHC-peptidpräsentierenden Struktureinheit der Fusionsprotein-Untereinheit; in einem Klasse-II-Multimer durch die α1- und β1-Domänen der MHC-peptidpräsentierenden Struktureinheit und löslichen Derivaten des Komplexes.
  • Falls der Komplex der vorliegenden Erfindung ein Klasse-I-Multimer ist, wird das Peptidantigen typischerweise eine Länge von nicht weniger als etwa 5, noch typischer nicht weniger als etwa 6, noch typischer nicht weniger als etwa 7, häufig nicht weniger als etwa 8 oder 9 Aminosäuren aufweisen, und wird typischerweise eine Länge von nicht mehr als etwa 15, typischerweise nicht mehr als etwa 14, noch typischer nicht mehr als etwa 13, 12 oder 11 und häufig nicht mehr als etwa 10 oder 9 Aminosäuren aufweisen.
  • Wie es auf dem Fachgebiet der Immunologie gut bekannt ist, können die antigenen Peptide einen breiteren Längenbereich aufweisen, wenn sie an MHC-Klasse-II komplexiert sind. Zum Beladen von Klasse-II-Multimeren werden die Peptide daher typischerweise eine Länge von nicht weniger als etwa 8, typischerweise nicht weniger als etwa 9, 10, 11 oder 12 Aminosäuren aufweisen, und werden typischerweise eine Länge von nicht mehr als etwa 30, typischerweise nicht mehr als etwa 25, typischerweise nicht mehr als etwa 19, 18, 17 oder 16 Aminosäuren, häufig eine Länge von nicht mehr als etwa 12 Aminosäuren, aufweisen. Für Klasse-II-Multimere können die Peptide des weiteren, wie oben erwähnt, kovalent an den N-Terminus der MHC-peptidpräsentierenden Struktureinheit oder eines löslichen Derivats fusioniert sein, Kozono et al., Nature 369: 151-154 (1994), Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 14596-14601 (2000), anstatt nicht-kovalent assoziiert zu sein.
  • Peptide werden typischerweise im Wesentlichen rein und von einheitlicher Sequenz sein, wie sie vorteilhaft durch chemische Synthese hergestellt werden können, woran sich gegebenenfalls eine weitere Reinigung, wie z. B. durch HPLC, anschließt. Für einige Anwendungen kann allerdings eine Kollektion von Peptiden – z. B. eine Kollektion von Peptiden, die zum Impfen gegen CMV nützlich ist, wie es in der WO 00/75180 beschrieben wird, auf deren Offenbarung hierin Bezug genommen wird – verwendet werden, um die selbstfluoreszierenden Multimere der vorliegenden Erfindung zu beladen. In diesem letzteren Fall wird eine Population von Multimeren erzeugt, welche T-Lymphocyten kollektiv markieren, die irgendeines der Beladungs-Peptide erkennen. Für derarti ge Zwecke können die Peptide vorteilhafterweise durch endoproteolytischen Verdau eines nativen Proteins, wie eines viralen Proteins, erzeugt werden.
  • Peptide können nicht-native Aminosäuren und nicht-native Bindungen einschließen, falls solche nicht-nativen Aminosäuren und/oder nicht-nativen Bindungen die Fähigkeit des selbstfluoreszierenden Komplexes, T-Lymphocyten zu markieren, nicht stören. Zum Beispiel können nicht-native Aminosäuren und/oder Bindungen verwendet werden, um die T-Zell-Antwort auf die Immunisierung mit einem Protein oder Peptid, das solche nicht-nativen Aminosäuren oder Bindungen einschließt, auszuwerten, oder um T-Lymphocyten nachzuweisen, die für das Peptid in seiner nativen Form spezifisch sind, falls die nicht-nativen Aminosäuren und/oder Bindungen die dreidimensionale Struktur des Peptids nicht beeinflussen.
  • Wenn die multimeren Komplexe der vorliegenden Erfindung durch rekombinante Expression in eukaryotischen Zellen, insbesondere Säugerzellen, hergestellt werden, kann das Multimer irrtümlich endogene Peptide der Wirtszelle einschließen. Obwohl eine Expression in Insektenzellen das Ausmaß der Beladung mit endogenem Peptid verringern kann, kann nichtsdestoweniger ein gewisser Prozentsatz der Peptidbindungsstellen vor der beabsichtigten Beladung besetzt sein. In derartigen Fällen wird die Peptidbeladung der multimeren Komplexe ein gewisses Maß an Peptid-Austausch einschließen. Der Austausch kann bei höheren Temperaturen, wie 37°C, und durch Verwenden höherer Konzentrationen an Beladungs-Peptid erleichtert werden. Falls die Konzentration des Peptids, welches für die Beladung verwendet wird, hoch ist, und tatsächlich bei jeder Peptidkonzentration, kann wahlweise eine Dialyse nach Vervollständigung des Beladens durchgeführt werden, um die Konzentration von ungebundenem Peptid zu verringern.
  • Die Sequenz des Beladungs-Peptids wird von der Anwendung diktiert, für welche das Markierungsreagenz eingesetzt werden soll. Zum Nachweisen der antigenspezifischen CD8+-T-Zellantwort auf virale Infektion oder virale Impfung wird beispielsweise eine Peptidsequenz, welche aus viralem Protein abgeleitet ist, verwendet, um ein selbstfluoreszierendes Klasse-I-Multimer zu beladen; zum Nachweis des Vorliegens von Autoimmun-T-Lymphocyten, welche mit Multipler Sklerose assoziiert sind, kann ein aus basischem Myelin-Protein (myelin basic protein) abgeleitetes Peptid verwendet werden, um ein selbstfluoreszierendes Klasse-I- oder Klasse-II-Multimer zu beladen.
  • Wie erwähnt, sind Peptide aus Viren, wie HIV (Humanes Immundefizienz-Virus), SIV (Affen-Immundefizienz-Virus), CMV (Cytomegalovirus), HBV (Hepatitis-B-Virus), HCV (Hepatitis-C-Virus), HSV (Herpes-Simplex-Virus), EBV (Epstein-Barr-Virus) und HPV (Humanes Papillom-Virus), besonderes nützlich. Ebenfalls nützlich sind bakterielle Peptide, wie Peptide aus Mycobakterien, einschließlich TB. Eine andere Klasse von Peptiden, welche vorteilhaft angewandt wird, sind die Peptide, welche aus mit Krebs zusammenhängenden Antigenen abgeleitet sind, insbesondere Krebs-Antigenen, die in potenziellen Krebs-Impfstoffen, besonders Impfstoffen gegen Melanom, Prostatakrebs und Brustkrebs, eingesetzt werden.
  • In den multimeren Komplexen der vorliegenden Erfindung verwendete Peptide können ebenfalls auf der Basis ihrer Mimikry von Nicht-Peptid-Strukturen, wie Kohlenhydraten, ausgewählt werden; Luo et al., J. Biol. Chem. 275 (21): 16146-54 (2000); O et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 5; 268 (1): 106-11 (2000); Grothaus et al., Vaccine 18 (13): 1253-63 (2000); und Phalipon et al., Eur. J. Immunol. 27 (10): 2620-5 (1997).
  • Die multimeren Komplexe der vorliegenden Erfindung, mit oder ohne assoziiertem Peptid (d.h. entweder mit den quarternären Formeln (F1S1)n oder (F1S1P1)n), können nützlicherweise als eine wässrige Zusammensetzung, typischerweise einschließlich Puffern, Salzen und/oder Stabilisatoren, bereitgestellt werden, z. B. Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung mit Gelatine und 0,1% Natriumazid, und es ist daher ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung, derartige Zusammensetzungen bereitzustellen. Alternativ dazu können die Komplexe als nicht-wässrige, lyophilisierte Zusammensetzungen bereitgestellt werden.
  • Anwendungsverfahren
  • Sobald sie mit einem gegebenen Peptidantigen beladen sind, können die selbstfluoreszierenden Komplexe der vorliegenden Erfindung an T-Lymphocyten binden, welche Antigenrezeptoren besitzen, die spezifisch für das gegebene Peptid und die MHC-peptidpräsentierenden Domänen des multimeren Komplexes sind. Weil die Peptidantigene und MHC-peptidpräsentierenden Domänen der Komplexe der vorliegenden Erfindung beide variiert werden können, können die selbstfluoreszierenden multimeren Komplexe der vorliegenden Erfindung im Allgemeinen verwendet werden, um eine nahezu unbegrenzte Vielfalt von T-Lymphocyten basierend auf der Antigen(und MHC)-Spezifität von deren Antigenrezeptoren fluoreszierend zu markieren.
  • Es ist deshalb ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung, Verfahren zur Verwendung der multimeren Komplexe der vorliegenden Erfindung bereitzustellen, um T-Lymphocyten basierend auf der Spezifität ihrer Antigenrezeptoren nachweisbar zu markieren (färben).
  • In einer ersten Ausführungsform umfasst das Verfahren das Inkontaktbringen eines T-Lymphocyten, welcher mit einem selbstfluoreszierenden multimeren Komplex der vorliegenden Erfindung markiert werden soll, wobei der Komplex ein Peptidantigen und MHC-peptidpräsentierende Domänen aufweist, für welche der Antigenrezeptor des T-Lymphocyten spezifisch ist, und zwar während einer Zeit und unter Bedingungen, die ausreichen, um die nachweisbare Bindung des Komplexes an den T-Lymphocyten zu erlauben.
  • Im vorliegenden Kontext wird von einem T-Lymphocyten gesagt, spezifisch für ein Peptidantigen zu sein, wenn die Affinität seines Antigenrezeptors (TCR) für das Peptidantigen im MHC-Kontext des Komplexes ausreichend hoch ist, um dem Komplex als Ganzem Bindungsfreudigkeit für den T-Lymphocyten zu vermitteln, welche ausreichend ist, um eine nachweisbare Bindung des Komplexes an TCRs auf der Lymphocytenoberfläche zu erzielen.
  • Häufig werden die Peptidantigen(e), für welche der T-Lymphocyt nach dieser Definition behauptetermaßen spezifisch ist, ebenfalls in der Lage sein, eine Zy tokin-Expression durch den T-Lymphocyten zu stimulieren; eine derartige funktionelle Antwort ist jedoch nicht erforderlich, da die Nützlichkeit der multimeren Komplexe der vorliegenden Erfindung, wie für MHC-Tetramere, nicht auf die Markierung und Identifizierung funktionell reaktionsfähiger T-Lymphocyten eingeschränkt ist. Weiterhin ist es mit dieser Definition für einen einzelnen T-Lymphocyten, der eine einzelne αβ- oder γδ-TCR-Spezies auf seiner Oberfläche aufweist, nicht unmöglich, behauptetermaßen für eine Vielzahl von (typischerweise nah-verwandten) Peptidantigenen spezifisch zu sein. In solchen Fällen wird der TCR typischerweise eine größere Affinität für eines der Peptide als für die anderen besitzen.
  • Bedingungen und Zeiten, die für eine derartige Markierung angemessen sind, können vom Fachmann auf dem Gebiet für die Färbung von T-Lymphocyten mit MHC-Tetrameren oder MHC/Ig-Fusionen bequem angepasst werden.
  • Zum Beispiel färbten Altman et al., Science 274: 94-96 (1996), 200000 cytotoxische Lymphocyten mit MHC-Tetrameren durch Inkubation bei 4°C während einer Stunde bei einer Konzentration an Tetramer von ungefähr 0,5 mg/ml; die NIAID-"Tetramer-Facility" (http://www.niaid.nih.gov/reposit/tetramer/genguide.htm) empfiehlt derzeit eine Färbung bei jeweils 4°C, Raumtemperatur und 37° während 15-60 Minuten, um das Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis zu optimieren, wobei abnehmende Inkubationszeiten für höhere Temperaturen verwendet werden; Greten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 7568-7573 (1998), färben 1 × 106 mononucleare Zellen des peripheren Blutes bei 4° mit 3 μg MHC-Klasse-I-MHC/Ig-Chimäre.
  • Somit können T-Lymphocyten bequem mit den selbstfluoreszierenden multimeren Komplexen in den Verfahren der vorliegenden Erfindung markiert werden, wobei mindestens etwa 0,1 μg, typischerweise mindestens etwa 0,25 μg, noch typischer etwa 1 μg, 2 μg, 3 μg, 4 μg oder sogar mindestens etwa 5 μg Multimer verwendet werden, um etwa 104, 105, 106 oder sogar 107 mononucleare Zellen des peripheren Bluts unter Anwendung einer Inkubation von 15-60 Minuten bei einer Temperatur zwischen 4°C und 37°C zu markieren.
  • Ausgehend von diesen groben exemplarischen Richtlinien wird der Fachmann auf dem Gebiet der Markierung von T-Lymphocyten unter Verwendung von MHC-Tetrameren, MHC/Ig-Fusionen und fluorophorkonjugierten Antikörpern ohne weiteres in der Lage sein, optimale Markierungsbedingungen zu bestimmen. Variablen, welche die zu verwendende Menge an multimeren Reagenz und die Temperatur und Dauer der Färbung beeinflussen, schließen diejenigen, welche mit den T-Lymphocyten zusammenhängen – die Anzahl von T-Lymphocyten in der Probe, welche spezifisch für das Peptidantigen (und den MHC) des Komplexes sind, die Gesamtzahl von Zellen in der Probe, die Form der zellulären Probe (z. B. Vollblut, Vollblut nach Lyse der roten Blutkörperchen, Ficoll-gereinigte Fraktion mononuclearer Zellen aus peripherem Blut (PBMC)) – und diejenigen, welche mit dem multimeren Komplex zusammenhängen, einschließlich der Stöchiometrie und dem Molekulargewicht des Markierungskomplexes, der Identität des Peptidantigens und der Auswahl von MHC-Allelen, welche im Komplex eingeschlossen sind, ein.
  • Um die Markierungsbedingungen zu optimieren, können Markierungsreaktionen ohne weiteres unter Verwendung paralleler Aliquots der zu markierenden Zellprobe durchgeführt werden, wobei eine einzelne Spezies an multimeren Komplex und variierende Markierungsbedingungen (z. B. Temperatur, Dauer, Komplex-Konzentration, Zellzahl, Zellkonzentration, Zell-Reinheit) verwendet werden. Negativkontrollen können Markierungsreaktionen ohne Verwendung von Multimer, unter Verwendung von Multimer ohne Peptid und/oder unter Verwendung von Multimer, das MHC-Peptidpräsentierungs-Domänen und/oder Peptidantigene enthält, die von T-Lymphocyten in der Zellprobe nicht erkannt werden, einschließen. Die Effektivität der Markierung kann ohne weiteres für jedes Aliquot durch flusszytometrische Zählung von T-Lymphocyten in der Probe, welche den fluoreszierenden Komplex binden, bestimmt werden. Wie es auf dem Fachgebiet der Flusszytometrie gut bekannt ist, können die markierten Zellen vor einer Flusszytometrie gewaschen werden, um nicht-gebundenen Komplex von den Zellen und aus dem Medium zu entfernen. Alle diese Optimierungstechniken und -vorgehensweisen sind Routineangelegenheiten und werden vom Fachmann auf dem Gebiet der Flusszytometrie routinemäßig durchgeführt.
  • Typischerweise sind die zu markierenden T-Lymphocyten innerhalb einer heterogenen Probe von Zellen vorhanden, und das Ziel der Markierung besteht darin, die antigenspezifischen T-Lymphocyten innerhalb dieser Population nachzuweisen und häufig auch zu zählen.
  • Somit stellt die vorliegende Erfindung in einem anderen Aspekt, Verfahren zum Nachweisen von T-Lymphocyten, welche für ein gewähltes Antigen spezifisch sind, in einer Probe von Zellen bereit. Das Verfahren umfasst das Inkontaktbringen der Probe mit einem selbstfluoreszierenden multimeren Komplex gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei das Peptidantigen des Komplexes das gewählte Antigen ist, und die MHC-Präsentierungs-Domänen des Komplexes diejenigen sind, hinsichtlich derer die T-Lymphocyten, für die der Nachweis gewünscht wird, restringiert sein werden, und zwar während einer Zeit und unter Bedingungen, die ausreiche, um die nachweisbare Bindung des Komplexes an T-Lymphocyten in der Probe, welche für das gewählte Antigen und MHC spezifisch sind, zu gestatten; und danach das Nachweisen von spezifischen T-Lymphocyten in der Probe durch die Fluoreszenz des daran gebundenen Komplexes.
  • Die Detektion von zellgebundender Fluoreszenz wird typischerweise ausgeführt unter Verwendung eines Flusszytometers, wie eines FACSVantageTM, FACS-VantageTM SE oder FACSCaliburTM-Flusszytometers (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA, USA). Die für die Anregung gewählten Laser werden durch das Absorptionsspektrum des multimeren Komplexes und beliebige zusätzliche Fluorophore, für die ein gleichzeitiger Nachweis gewünscht wird, in der Probe bestimmt. Wenn zum Beispiel der multimere Komplex die spektralen Charakteristika von nativem DsRed aufweist – z. B. ein Homotetramer, in welchem die Fusionsprotein-Untereinheiten alle das native GFP-ähnliche Chromophor von DsRed aufweisen – kann ein Standard-Argonionenlaser mit 488-nm-Linie für die Anregung verwendet werden. Für den Nachweis werden die Filtersätze und Detektor-Typen gemäß des Emissionsspektrums des multimeren Komplexes und jeglicher zusätzlicher Fluorophoren, deren Nachweis gewünscht wird, in der Probe, gewählt. Wenn der multimere Komplex beispielsweise die spektralen Charakteristika von nativem DsRed aufweist, mit einem Emissionsmaximum bei etwa 583 nm, kann die Fluoreszenzemission aus dem Komplex im FL2-Kanal unter Anwendung einer PE-Aufstellung nachgewiesen werden.
  • Alternativ dazu kann die zellgebundene Komplex-Fluoreszenz unter Anwendung eines Mikrovolumen-Fluorimeters wie dem IMAGN 2000 (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA, USA) nachgewiesen werden.
  • Anwendungen von Mikrovolumen-Fluorimetrie auf die Charakterisierung von Blutzellen und Bedingungen dafür werden unter anderem in Seghatchian et al., Transfus. Sci. 22 (1-2): 77-9 (2000); Glencross et al., Clin. Lab. Haematol. 21(6): 391-5 (1999), und Read et al., J. Hematother. 6 (4): 291-301 (1997), beschrieben.
  • Alternativ dazu kann zellgebundene Komplex-Fluoreszenz unter Anwendung eines Laser-Scanning-Zytometers (Compucyte Corp., Cambridge, MA, USA) nachgewiesen werden.
  • Die zellgebundene Fluoreszenz des multimeren Komplexes kann ebenfalls direkt auf einem Mikroskop-Objektträger unter Anwendung von Bedingungen nachgewiesen werden, im Wesentlichen wie beschrieben in Skinner et al., "Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues", J. Immunol. 165 (2): 613-7 (2000).
  • Die T-Lymphocyten enthaltende Probe kann eine Vollblut-Probe sein, typischerweise eine Probe von peripherem venösem Blut, welche direkt in ein Antikoagulans-Proberöhrchen abgenommen wurde (z. B. EDTA enthaltendes oder Heparin enthaltendes VacutainerTM-Röhrchen, Becton Dickinson Vacutainer Systems, Franklin Lakes, NJ, USA).
  • Vorteilhafterweise kann die T-Lymphocyten enthaltende Probe auch eine Vollblutprobe sein, welche vor dem Nachweis mit einem Mittel zur Lysierung von roten Blutkörperchen (RBC) behandelt worden ist, wie es unter anderem in Chang et al., U.S.-Patente Nr. 4 902 613 und 4 654 312 beschrieben ist. Lysierende Mittel sind im Fachgebiet gut bekannt und sind kommerziell von einer Anzahl von Herstellern verfügbar (FACSTM Lysing Solution, Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA, USA; Cal-LyseTM Lysing Solution, Caltag Labs, Burlingame, CA, USA; No-Wash Lysing Solution, Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA). Die Probe kann nach der RBC-Lyse und vor der Detektion gegebenenfalls gewaschen werden.
  • Die Probe, innerhalb der der Nachweis von T-Lymphocyten gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung gewünscht wird, kann des Weiteren eine Fraktion von peripherem Blut sein, vorteilhafterweise eine Fraktion mononuclearer Zellen (PBMC). PBMCs können gemäß jeder der im Fachgebiet angenommenen, allgemein bekannten Techniken präpariert werden, unter welche die Zentrifugation durch ein Dichtemedium, wie Ficoll-Paque (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA), und die direkte Zentrifugation in ein speziell entworfenes Zellpräparations-Blutentnahme-Röhrchen (z. B. VacutainerTM CPTTM Cell Preparation Tube, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) zählen.
  • Die Probe, innerhalb der der Nachweis von T-Lymphocyten gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung gewünscht wird, kann vorteilhafterweise auch eine Probe sein, welche hinsichtlich T-Lymphocyten angereichert ist. Zum Beispiel kann es sich bei der Probe um eine Probe von kultivierten Lymphocyten (wie aus einer klonalen Zelllinie oder multiklonalen Kultur), Lymphocyten, die extrahiert oder eluiert wurden aus einem Gewebe, das lymphocytisches Infiltrat aufweist (z. B. Tumor-infiltrierende Lymphocyten, die aus einer Tumorbiopsie extrahiert und gegebenenfalls in Kultur vermehrt wurden), Lymphocyten, die aus Lymphgefäßen oder Thymus entnommen wurden, oder Lymphocyten, die nach mindestens einer ersten Runde von Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung erhalten wurden, handeln.
  • In einer anderen Ausführungsform umfasst das Verfahren ferner das Zählen der so nachgewiesenen antigenspezifischen T-Lymphocyten. Das Zählen kann zweckmäßigerweise in der Form einer Gesamtzellzählung, als Prozentsatz von antigenspezifischen T-Lymphocyten unter den geassayten Zellen (entweder insgesamt, mononuclear oder T-lymphocytisch) oder als Prozentsatz von antigenspezifischen Lymphocyten in einer T-Zell-Untergruppe ausgedrückt werden.
  • Für mehrere dieser Maße ist es notwendig, zusätzlich die Gesamtzahl an T-Lymphocyten in der Probe als Ganzes oder die Gesamtzahl an T-Lymphocyten einer besonderen Untergruppe innerhalb der Probe als Ganzes zu quantifizieren.
  • Somit umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung in anderen Ausführungsformen ferner das Inkontaktbringen der Probe mit mindestens einem fluorophorkonjugiertem Antikörper, wobei der Antikörper aus der aus pan-T-Antikörpern und T-Zell-Untergruppierungs-Antikörpern bestehenden Gruppe gewählt wird, und dann das Nachweisen von Fluoreszenz, gleichzeitig von dem multimeren fluoreszierenden Komplex und von den fluorophorkonjugierten Antikörpern. Mit "pan-T-Antikörper" ist ein Antikörper gemeint, welcher einen Oberflächenmarker oder ein Epitop erkennt, der/das auf allen oder im Wesentlichen allen T-Lymphocyten vorhanden ist. Mit "T-Zell-Untergruppierungs-Antikörper" wird ein Antikörper gemeint, der an einen Oberflächenmarker bindet, der auf weniger als allen T-Lymphocyten vorhanden ist.
  • In dieser Ausführungsform nützlicherweise verwendete Antikörper schließen Antikörper ein, welche für CD3, CD4, CD8, CD45RO, CD45RA und CD27 spezifisch sind. Es versteht sich, dass die Antikörper typischerweise für den Marker spezifisch sein werden, wie er von der taxonomischen Spezies (Mensch, Maus, Ratte etc.) exprimiert wird, für deren T-Lymphocyten man den Nachweis vornimmt, oder damit kreuzreaktiv sein werden.
  • Wie es auf dem Fachgebiet der Flusszytometrie allgemein bekannt ist, kann die Fluoreszenzemission aus den pan-T- und/oder T-Lymphocyten-Untergruppierungs-Antikörpern für jedes oder alles unter "Triggering"-Daten-Erfassung, "Live-Gating" oder "Gating" von zuvor erfassten Daten angewandt werden.
  • In den Verfahren der vorliegenden Erfindung ist es häufig vorteilhaft, eine große Anzahl von Ereignissen zu erfassen, da in vielen Proben antigenspezifische T-Lymphocyten nicht häufig auftreten. Darüber hinaus ist es zuweilen möglich, das Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis zum Nachweisen solcher seltenen antigenspezifischen T-Zell-Ereignisse durch "Triggering" oder "Gating" hinsichtlich der Fluoreszenz von Antikörpern, die für T-Lymphocyten-Aktivierungs-Antigene spezifisch sind, zu verbessern.
  • Daher umfasst das Verfahren in einer anderen Ausführungsform ferner das Inkontaktbringen der Probe mit mindestens einem fluorophorkonjugierten Antikörper, der für ein T-Zell-Aktivierungs-Antigen spezifisch ist, und danach das Detektieren der Fluoreszenz gleichzeitig aus dem multimeren fluoreszierenden Komplex und aus den fluorophorkonjugierten Antikörpern. Die Antikörper können in nützlicher Weise für ein Aktivierungs-Antigen spezifisch sein, das aus der Gruppe, bestehend aus CD69, CD25, CD71 und MHC-Klasse-II (zum Markieren von humanen T-Lymphocyten vorteilhaft HLA-DR), gewählt ist.
  • Vorteilhafter Weise werden die in diesen Ausführungsformen der Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Antikörper im Voraus direkt an ein Fluorophor konjugiert, typischerweise ein Fluorophor, dessen Emission flusszytometrisch unterscheidbar ist von derjenigen des selbstfluoreszierenden multimeren T-Zell-Markierungs-Komplexes und von derjenigen anderer Fluorophore, welche gleichzeitig in dem Verfahren verwendet werden. Fluorophore können nützlicherweise aus der Gruppe gewählt werden, die aus Fluoreszein-Isothiocyanat (FITC), Phycoerythrin (PE), Peridinin-Chlorophyll-Protein (PerCP), Allophycocyanin (APC), Texas Red, Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, Inc., Eugene Or.) und den Tandem-Fluorophoren PerCP-Cy5.5, PE-Cy5, PE-Cy7 und APC-Cy7 besteht. Antikörper können ebenfalls in nützlicher Weise an Biotin konjugiert werden, was einen Zweitstufen-Nachweis unter Verwendung von Fluorophor-markiertem Streptavidin gestattet.
  • Die Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Nachweisen und Zählen von antigenspezifischen T-Lymphocyten können für die gleichen Zwecke angewandt werden wie Verfahren zum Nachweisen und Zählen antigenspezifischer T-Lymphocyten des Stands der Technik, einschließlich Verfahren, basierend auf Oberflächenmarkierung von TCR (Verwendung von MHC-Tetrameren und MHC/Ig-Chimären), sowie Verfahren, basierend auf dem Nachweisen funktioneller Antworten von antigenspezifischen T-Zellen (limitierender Verdünnungsassay, Enzym-verknüpfter "Immunospot"-Assay und flusszytometrischer Nachweis intrazellulärer Cytokinexpression; Waldrop et al., J. Clin. Invest. 99 (7): 1739-50 (1997)). Die Verfahren können somit z. B. angewandt werden, um CD4+- und CD8+-T-Zellantworten auf Infektion, auf Impfstoffe und bei Autoimmunität auszuwerten.
  • Abhängig von dem verwendeten Instrument kann der Nachweis von antigenspezifischen T-Lymphocyten direkt oder indirekt mit ihrer Sortierung gekoppelt werden, wodurch in anderen Aspekten der Erfindung Verfahren zum Anreichern einer Probe und zum Abreichern einer Probe an T-Lymphocyten, die spezifisch für ein gewähltes Antigen sind, bereitgestellt werden.
  • Im Allgemeinen umfassen diese Verfahren das In-Kontakt-Bringen der Probe mit einem selbstfluoreszierenden multimeren Komplex der vorliegenden Erfindung, wobei das Peptidantigen des Komplexes das gewählte Antigen ist und die MHC-Präsentierungs-Domänen des Komplexes diejenigen sind, hinsichtlich derer die T-Lymphocyten, deren Anreicherung oder Entfernung gewünscht wird, restringiert sein werden, und zwar während einer Zeit und unter Bedingungen, die ausreichen, um die nachweisbare Bindung des Komplexes an T-Lymphocyten in der Probe, welche für das gewählte Antigen und MHC spezifisch sind, zu gestatten. Nach der Bindung werden markierte T-Lymphocyten, basierend auf der Fluoreszenz des daran gebundenen Komplexes, angereichert oder entfernt.
  • Derartige Verfahren werden herkömmlicherweise unter Verwendung eines Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierers durchgeführt: Die Sortierung, welche wenigstens zum Teil auf der Fluoreszenz aus dem multimeren Komplex der vorliegenden Erfindung basiert, reichert die Probe direkt ab, aus der die Zellen entfernt werden, und reichert das Aliquot an, in das die Zellen eingebracht werden.
  • Es ist allerdings möglich, die Multimere der vorliegenden Erfindung zu verwenden, um Proben hinsichtlich T-Lymphocyten von besonderer Antigenspezifität anzureichern oder abzureichern, wobei andere Vorgehensweisen als Fluoreszenz-aktivierte Zell-Sortierung angewandt werden.
  • Zum Beispiel können mit dem Multimer spezifisch gefärbte T-Lymphocyten magnetisch, anstatt fluorometrisch, durch weitere Konjugation des TCR-gebundenen Komplexes an ein superparamagnetisches Teilchen abgetrennt werden. Dies kann z. B. erfolgen unter Verwendung eines Antikörpers, welcher an ein magnetisches Teilchen konjugiert ist, und welcher für ein Epitop des Fusionsproteins spezifisch ist (falls z. B. DsRed das GFP-ähnliche Chromophor und/oder Mulimerisierungsdomänen beisteuert, kann der Antikörper der DsRed-spezifische Antikörper sein, der von Clontech Labs, Palo Alto, CA, USA, kommerziell erhältlich ist).
  • Als ein anderes Beispiel können spezifisch mit dem Multimer gefärbte T-Lymphocyten unter Anwendung von Biotin/Avidin-Affinitäts-Wechselwirkungen anstatt von Fluoreszenz abgetrennt werden, und zwar durch weitere Konjugati on des TCR-gebundenen Komplexes an Biotin, gefolgt von der Verwendung einer Avidin-Affinitätsmatrix. Diese weitere Markierung des multimeren Komplexes kann indirekt unter Verwendung eines Biotin-konjugierten Antikörpers, der für ein Epitop des Fusionsproteins spezifisch ist, erfolgen. Alternativ dazu kann man das Multimer selbst entweder chemisch oder, nach technischem Einbau eines BirA-Substratpeptids in den Komplex (typischerweise das Fusionsprotein), enzymatisch im Voraus an Biotin konjugieren.
  • Proben, welche hinsichtlich antigenspezifischen T-Zellen gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung angereichert wurden, können in vitro für die Untersuchung von spezifischen Wechselwirkungen von antigenspezifischen T-Zellen mit Antigen-präsentierenden Zellen, cytotoxischen Zielen, B-Zellen oder anderen zellulären Elementen des Immunsystems verwendet werden. Proben, welche hinsichtlich antigenspezifischen T-Zellen gemäß des Verfahrens der vorliegenden Erfindung angereichert wurden, können ebenfalls in vitro verwendet werden, um derartige Wechselwirkungen zu modifizieren; siehe z. B. Dal Porto et al., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6671-6675 (1993).
  • Proben, welche hinsichtlich antigenspezifischen T-Zellen gemäß der Verfahren der vorliegenden Erfindung angereichert wurden, können ebenfalls für therapeutische Eingriffe in vivo verwendet werden, wie etwa für die Tumor-Immuntherapie; siehe z. B. Oelke et al., Clin. Cancer Res. 6(5): 1997-2005 (2000). Umgekehrt können Proben, welche hinsichtlich besonderer antigenspezifischer T-Zellen gemäß der Verfahren der vorliegenden Erfindung abgereichert wurden, vorteilhaft an Patienten verabreicht werden, wo eine Infusion von Blutfraktionen, die T-Zellen enthalten, welche diese Antigenspezifität aufweisen, zu Erkrankungen oder Krankhaftigkeit führen könnte.
  • Als eine alternative Anwendung bzw. Nützlichkeit für den fluoreszierenden Nachweis von peptidspezifischen T-Zellen können die multimeren Proteinkomplexe der vorliegenden Erfindung auch vorteilhaft verwendet werden, um Peptidantigen-spezifische, MHC-abhängige Aktivierung von T-Zellen zu stimulieren.
  • Wie es im Fachgebiet bekannt ist, sind Komplexe, die mehrere mit Peptid beladene MHC-Moleküle umfassen, wirksamer als nicht-komplexierte, monomere MHC-Peptid-Kombinationen für die Stimulierung von T-Zellen, welche das Pep tid durch einen MHC-abhängigen Mechanismus spezifisch binden; siehe zum Beispiel Stryhn, A., et al., "Preformed purified peptide/major histocompatibility class I complexes are potent stimulators of class I-restricted T cell hybridomas", Eur. J. Immunol., 24 (6): 1404-9 (Juni 1994); Cochran, J.R., et al., "The relationship of MHC-peptide binding and T cell activation probed using chemically defined MHC class II oligomers", Immunity, 12 (3): 241-50 (März 2000); und Piccirillo, C. A., Shevach, E. M., "Cutting edge: control of CD8+ T cell activation by CD4+CD25+ immunoregulatory cells", J. Immunol., 167 (3): 1137-40 (August 2001), wobei auf die Offenbarung derselben hierin Bezug genommen wird.
  • Tetramere von MHC-Peptid-Präsentierungseinheiten, welche durch Wechselwirkung der Multimerisierungsdomänen gebildet werden, die innerhalb der DsRed-Untereinheiten der multimeren Komplexe der vorliegenden Erfindung enthalten sind, können deshalb mit Peptid beladen und mit einer gemischten Population von T-Zellen inkubiert werden. Subpopulationen von T-Zellen, welche T-Zell-Rezeptoren tragen, die zum spezifischen Binden des Peptids in einer MHC-abhängigen Weise fähig sind, werden aktiviert. Die größere Wirksamkeit der Tetramere im Vergleich zu Monomeren, Dimeren oder Trimeren, erleichtert die Aktivierung von T-Zellen unter Verwendung einer geringeren Konzentration von Peptid-MHC-Komplexen. Dies senkt die Kosten von Reagenzien und verringert eine irrtümliche Aktivierung, welche durch hohe Konzentrationen an aktivierenden Peptid-MHC-Komplexen verursacht wird. Alternativ dazu erleichtert die größere Wirksamkeit von Tetrameren die Aktivierung von T-Zell-Subpopulationen, welche Rezeptoren mit niedrigerer Affinität für das Peptid tragen.
  • Gemäß einer alternativen Ausführungsform können klonale Populationen von T-Zellen mit definierter Peptidspezifität sämtlich unter Verwendung von niedrigeren Konzentrationen an tetrameren Peptid-MHC-Komplexen aktiviert werden.
  • Somit sieht die vorliegende Erfindung, in einem anderen Aspekt, ein Verfahren zum Aktivieren von Peptidantigen-spezifischen, MHC-abhängigen, T-Zellen vor, welches das Inkontaktbringen einer T-Zelle mit einem selbstfluoreszierenden, selbst-multimerisierenden multimeren Komplex der vorliegenden Erfindung, an welchen das Peptid gebunden worden ist, während einer zum Bewirken einer Aktivierung ausreichenden Zeit umfasst.
  • Kits
  • Die Zusammensetzungen des multimeren Komplexes der vorliegenden Erfindung können nützlicherweise in der Form von Kits bereitgestellt werden, welche die Ausführung der Verfahren der vorliegenden Erfindung erleichtern. Somit sieht die vorliegende Erfindung, in einem anderen Aspekt, Kits vor, welche die selbstfluoreszierenden multimeren Komplexe der vorliegenden Erfindung umfassen.
  • In einer Ausführungsform schließen die Kits der vorliegenden Erfindung, als getrennte Zusammensetzungen, ein selbstfluoreszierendes (F1S1)n-Multimer der vorliegenden Erfindung und ein antigenes Peptid ein. Wie oben bemerkt wurde, wird die Auswahl des Peptids von der für das Markierungsreagenz gewünschten Spezifität abhängen.
  • In manchen Ausführungsformen wird in nützlicher Weise eine weitere Zusammensetzung, die ein zweites, Negativkontrollen-Peptid umfasst, eingeschlossen. Wenn das Negativkontrollen-Peptid zum Beladen des selbstfluoreszierenden (F1S1)n-Multimers des Kits verwendet wird, ergibt es einen multimeren Komplex, von dem im Voraus gezeigt wurde, dass es keinen signifikanten Prozentsatz von T-Lymphocyten in der zu testenden Probe markiert, vorsehen, wodurch ein Maß des auf die nicht-spezifische Bindung des Multimers an Zellen in der Probe zurückführbaren Hintergrunds bereitgestellt wird.
  • In anderen Ausführungsformen wird der Kit ferner mindestens einen pan-T- oder T-Lymphocyten-Untergruppierungs-Antikörper einschließen. Wie oben erwähnt, ist mit "pan-T-Antikörper" ein Antikörper gemeint, welcher einen Oberflächenmarker oder ein Epitop erkennt, das auf allen oder im Wesentlichen allen T-Lymphocyten vorhanden ist. Mit "T-Zell-Untergruppierungs-Antikörper" ist ein Antikörper gemeint, welcher an einen Oberflächenmarker bindet, der auf weniger als allen T-Lymphocyten vorhanden ist.
  • Wenn das selbstfluoreszierende Multimer im Voraus mit Peptid beladen worden ist, werden derartige Kits typischerweise, als separate Zusammensetzungen, ein Multimer und mindestens einen pan-T- oder Untergruppierungs-Antikörper einschließen; falls das selbstfluoreszierende Multimer ohne vorherige Beladung mit Peptid bereitgestellt wird (d. h. als eine (F1S1)n-Struktur), wird der Kit in nützlicher Weise, als separate Zusammensetzungen, ein selbstfluoreszierendes Multimer, ein Peptid, und mindestens einen pan-T- oder Untergruppierungs-Antikörper einschließen.
  • Pan-T- und Untergruppierungs-Antikörper, welche nützlicherweise in derartigen Kits eingeschlossen sind, schließen diejenigen ein, welche spezifisch für CD3, CD4, CD8, CD45RO, CD45RA und CD27 sind. Wie es sich versteht, werden die Antikörper typischerweise für den Oberflächenmarker spezifisch sein, wie er exprimiert wird von T-Lymphocyten der taxonomischen Spezies, deren T-Lymphocyten von dem selbstfluoreszierenden multimeren Komplex erkannt werden (z.B. Anti-Maus-CD3-Antikörper in einem Kit, welches einen multimeren Komplex einschließt, der murine MHC-peptidpräsentierende Struktureinheiten und lösliche Derivate einschließt).
  • In anderen Ausführungsformen wird der Kit mindestens einen Antikörper gegen ein T-Zell-Aktivierungs-Antigen einschließen. T-Zell-Aktivierungs-Antigene, die nützlicherweise in derartigen Kits enthalten sind, schließen diejenigen ein, welche für CD69, CD25, CD71 und, zur Markierung humaner T-Lymphocyten, HLA-DR spezifisch sind. Derartige Kits können in vorteilhafter Weise ebenfalls einen pan-T- und/oder T-Zell-Untergruppierungs-Antikörper, wie oben beschrieben, einschließen.
  • In Kits, welche Antikörper einschließen, werden die Antikörper in nützlicher Weise im Voraus direkt an ein Fluorophor konjugiert bereitgestellt, typischerweise ein Fluorophor, welches flusszytometrisch unterscheidbar ist von der Emission des selbstfluoreszierenden multimeren T-Zell-markierenden Komplexes und von der Emission anderer, in dem Kit verwendeter Fluorophore. Fluorophore können in nützlicher Weise aus der Gruppe gewählt werden, welche aus Fluoreszeinisothiocyanat (FITC), Phycoerythrin (PE), Peridinin-Chlorophyll-Protein (PerCP), Allophycocyanin (APC), Texas-Red, Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, Inc., Eugene Or.) und den Tandem-Fluorophoren PerCP-Cy5.5, PE-Cy5, PE-Cy7 und APC-Cy7 besteht. Antikörper in den Kits der vorliegenden Erfindung können ebenfalls in nützlicher Weise an Biotin konjugiert sein, was einen Zweitstufen-Nachweis unter Verwendung von markiertem Strepavidin gestattet.
  • In Kit-Ausführungsformen, welche Antikörper einschließen, sind nützlicherweise auch Isotyp-Kontrollantikörper enthalten; wie es allgemein bekannt ist, sind derartige Isotyp-Kontrollantikörper Antikörper von identischem Isotyp zu den fluorophorkonjugierten Antikörpern, welche jedoch gegen irrelevante Spezifitäten, wie KLH, gerichtet sind, geeignet zur Bereitstellung von Messungen der Hintergrundbindung und -fluoreszenz.
  • Andere Kit-Ausführungsformen schließen ferner ein rotes Blutkörperchen lysierendes Mittel ein, wie es unter anderem beschrieben wird in Chang et al., U.S.-Patente Nr. 4 902 613 und 4 654 312; lysierende Mittel sind im Fachgebiet allgemein bekannt und sind kommerziell von einer Anzahl von Verkäufern erhältlich (FACS-Lysing Solution, Becton Dickinson Biosciences Immunocytometry Systems, San Jose, CA, USA; Cal-LyseTM-Lysing Solution, Caltag Labs, Burlingame, CA, USA; "No-Wash"-Lysierungs-Lösung, Beckman Coulter, Inc., Fullterton, CA).
  • Viele der Kit-Ausführungsformen werden ferner Anweisungen zur Markierung (Färbung) mit dem multimeren Komplex und zur Ausführung einer flusszytometrischen Analyse einschließen.
  • Andere Kit-Ausführungsformen schließen ferner einen Antikörper ein, der zum spezifischen Erkennen und Binden von DsRed, oder anderen GFP-ähnlichen Chromophoren, in der Lage ist, wobei der Antikörper an ein Fluorophor konjugiert ist. Auf diese Weise können indirekte Immunfluoreszenztechniken angewandt werden. Zum Beispiel wird, in einem ersten Schritt, der selbstfluoreszierende, multimere Proteinkomplex der vorliegenden Erfindung, welcher Peptid trägt, mit T-Zellen inkubiert, um die spezifische Bindung von Peptid an T-Zell-Rezeptoren zu bewirken. Danach wird, in einem zweiten Schritt, der fluoreszierend markierte, sekundäre Antikörper mit den T-Zellen inkubiert, sodass der Antikörper das an T-Zellen gebundene GFP-ähnliche Chromophor bindet. Für die Analyse wird das mit dem sekundären Antikörper assoziierte Fluorophor mit Licht der passenden Wellenlänge stimuliert, welches typischerweise, aber nicht invariabel, so gewählt ist, dass eine wesentliche Stimulation der Fluoreszenzemission durch das GFP-ähnliche Fluorophor vermieden wird.
  • Eine indirekte Immunfluoreszenz kann ebenfalls in drei Schritten bewerkstelligt werden. Wie für das Zwei-Schritt-Verfahren, wird ein zweiter Antikörper verwendet, um das GFP-ähnliche Chromophor zu binden; der zweite Antikörper ist jedoch selbst nicht an ein Fluorophor konjugiert. Statt dessen wird, in einem dritten Schritt, ein fluoreszierend markierter dritter Antikörper zugegeben, welcher für den zweiten Antikörper spezifisch ist und daran bindet. Während der Analyse wird das an den dritten Antikörper konjugierte Fluorophor durch Licht der passenden Wellenlänge angeregt. Daher können Kits der vorliegenden Erfindung ferner einen zweiten Antikörper, welcher das GFP-ähnliche Chromophor erkennt, und einen fluoreszierend markierten dritten Antikörper, welcher den zweiten Antikörper erkennt, einschließen.
  • Wie hierin verwendet, beinhaltet der Ausdruck "Antikörper" gesamte Antikörper, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, diejenigen der Klassen IgG, IgM, IgA, IgE und IgD; und antigenspezifische Antikörperfragmente, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Fab, (Fab')2, Phagen-Display-Antikörper (phAb) und einzelkettige Variable-Region-Antikörper (scFv).
  • Die folgenden Beispiele sind zur Veranschaulichung und nicht zur Einschränkung angegeben.
  • BEISPIEL 1
  • Konstruktion eines Expressionsvektors für die Expression eines MHC-DsRed-Fusionsproteins.
  • Unter Anwendung von standardmäßigen Molekularbiologie-Techniken wird eine DNA-Sequenz, codierend die extrazelluläre Domäne (ECD) von murinem H2-Ld-MHC-Klasse-I-Protein aus der H2-Ld-cDNA entfernt und in die Mehrfachklonierungsstelle des Vektors pDsRed2-N1 (BD Biosciences-Clontech, Kat. #6973-1), welcher mit den Enzymen HindIII und BamHI verdaut worden war, ligiert. Dies führt zu einer Im-Raster-Fusion der codierenden Sequenz der ECD, die am aminoterminalen Teil der Fusion orientiert ist, mit der codierenden Sequenz des DsRed-Chromophors, orientiert am carboxyterminalen Teil der Fusion. Die Konstruktion des Fusionskonstrukts wird schematisch in 1 gezeigt.
  • Das H2Ld-DsRed2-Fusionskonstrukt wird dann in die NdeI- und NotI-Restriktionsenzymstellen von pBD1031S1 ligiert, einem BD Biosciences-Pharmingen-Vektor, welcher aus PVL1393, Kat. #21201P, entwickelt wurde. Der pBD1031S1-Vektor ist ein dualer Expressionsvektor, welcher einen T7-RNA-Polymerase-Promotor für die Expression des Fusionskonstrukts in Bakterien und einen Baculovirus-Polyhedrin-Promotor für die Expression des Fusionskonstruktes in einer Vielzahl von Insektenzelllinien, einschließlich Sf9- und Tni-Zellen, enthält. Ein Schema und eine Restriktionsenzymkarte des Expressionsvektors, welcher als dSS-H2LdECD-DsRed-pBD1031S1 bezeichnet wird, ist in 2 gezeigt.
  • Nach Vervollständigen der Ligationsreaktion unter Anwendung von Standardtechniken wird die ligierte DNA gereinigt und verwendet, um E. coli-Bakterien zu transformieren, welche dann über Nacht auf Agarplatten wachsen gelassen werden, welche Ampicillin enthalten, um hinsichtlich transformierter Zellen zu selektieren. Einzelne amp-resistente Kolonien werden dann in Flüssigkultur wachsen gelassen; Aliquots von Bakterien werden entnommen, aus welchen Plasmid-DNA isoliert und gereinigt wird.
  • Plasmid-DNA wird dann mit den Restriktionsenzymen NdeI und NotI doppelt verdaut, um einen Test hinsichtlich des Vorliegens des Ld-DsRed-Inserts in dem Vektor vorzunehmen. Die Verdaus werden durch Elektrophorese in 0,7%igem Agarosegel aufgetrennt, welches dann mit Ethidiumbromid oder einem anderen fluoreszierenden DNA-Farbstoff gefärbt, mit UV-Licht beleuchtet und unter Verwendung einer Video-Standbild-Kamera fotografiert wird. Plasmide, welche das erwartete 1,5 kb große Insert enthalten, werden für eine weitere Analyse durch Sequenzierung (siehe nachstehend) aufbewahrt, um das Vorliegen des Fusionskonstrukt-Inserts zu bestätigen. Eine Fotografie eines Agarosegels, welches, in sieben Plasmidklonen, das Vorliegen eines 1,5 kb großen Inserts zeigt, das durch NdeI/NotI-Verdau freigesetzt wurde, ist in der 3 gezeigt.
  • Im Anschluss an die Identifizierung von Insert-positiven Plasmidklonen werden die Klone unter Anwendung von Standardtechniken über die NdeI-Verbindungsstelle zwischen dem Expressionsvektor und der DNA-Sequenz der H2Ld-ECD hinweg sequenziert, um die Abwesenheit der Signalpeptid-Sequenz und das Vorliegen der korrekten aminoterminalen codierenden Sequenz zu bestätigen. Eine Sequenz-Spur eines automatischen Sequenziergerätes, aus der Sequenzierung eines Klons mit der korrekten aminoterminalen codierenden Sequenz, ist in der 4 gezeigt.
  • BEISPIEL 2
  • Expression des H2Ld-DsRed-Fusionsproteins in Bakterien
  • Unter Anwendung von Standardtechniken werden fünf Klone des H2Ld-DsRed-Fusionskonstrukt-Expressionsvektors verwendet, um kompetente E.coli-Bakterien zu transformieren, welche eine IPTG-induzierbare T7-RNA-Polymerase enthalten. Nach Wachstum auf Ampicillin-LB-Agarplatten über Nacht werden Kolonien von transformierten Zellen abgepickt und durch Wachstum über Nacht in LB-Medien vermehrt bzw. expandiert. Am nächsten Tag wird die Übernachtkultur bei 37°C in frischen LB-Medien, welche IPTG (Endkonzentration 1 mM) enthalten, 2 Stunden lang weiter kultiviert.
  • Proben von Bakterien aus induzierten Kulturen werden dann entnommen und in einem SDS-enthaltenden Puffer lysiert, wonach die Bestandteil-Proteine durch denaturierende SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) aufgetrennt werden. Nach der Elektrophorese werden die Gele mittels Coomassie-Färbung angefärbt, wonach die getrennten gefärbten Proteine mit sichtbarem Licht beleuchtet und mit einer Video-Standbildkamera für die visuelle Analyse fotografiert werden.
  • Wie es in 5 gezeigt ist, führt eine Induktion mit IPTG, für jeden von fünf H2Ld-DsRed-Fusionskonstrukt-Expressionsvektoren, die zum Transformieren von E. coli verwendet wurden, zur Expression eines 60 kD-Proteins, welches der erwartenden molekularen Masse des H2Ld-DsRed-Fusionsproteins entspricht. Im Gegensatz dazu ist die induzierte 60 kD-Bande bei Negativkontrollen abwesend, welche nicht mit IPTG induziert worden waren (5).
  • Wie gezeigt in 6 ist das Ausmaß der IPTG-abhängigen Induktion von dem E.coli-Stamm abhängig, welcher mit einem H2Ld-DsRed-Expressionsvektor transformiert wurde. Die Stämme "NovaBlue" und "Origami" zeigen eine starke IPTG-Induktion eines 60 kD-Proteins. Unter Anwendung von Standardtechniken bestätigt eine Western-Blot-Analyse des mit einem Anti-DsRed-Antikörper gefärbten Gels, dass die 60 kD-Bande DsRed-Protein enthält (Daten nicht gezeigt).
  • BEISPIEL 3
  • Expression des H2Ld-DsRed-Fusionsproteins in Insektenzellen
  • Der H2Ld-DsRed-Expressionsvektor wird mit BaculoGoldTM-DNA (BD-Pharmingen, Kat.-Nr. 554739, früher Kat.-Nr. 21100D) in Sf9- und Tni-Insektenzellen unter Anwendung von Standardtechniken cotransfiziert, welche erörtert sind in dem technischen "BD BaculoGoldTM Linearized Baculovirus DNA"-Datenblatt, auf das hierin vollständig Bezug genommen wird und auf der Website von Pharmingen (http://www.bdbiosciences.com/pharmingen/) verfügbar ist. Der Expressionsvektor dient als ein Transfervektor, welcher eine Deletion in der BaculoGoldTM-Virus-DNA komplementiert, so dass infektiöses Virus produziert wird, welches innerhalb seines Genoms die DNA enthält, welche das H2Ld-DsRed-Fusionsprotein codiert. Drei Tage nach der, unter Anwendung von Standardtechniken durchgeführten, Transfektion wird Medium aus den transfizierten Zellkulturen gesammelt, die Zellen werden entfernt, und der Überstand wird in der ersten von drei Amplifikationsrunden verwendet, um eine Hochtiter-Stammlösung von infektiösem Baculovirus zu erhalten.
  • Unter Anwendung von Standardtechniken wird die Hochtiter-Stammlösung dann verwendet, um Sf9- und Tni-Zellen für die Produktion von rekombinantem H2Ld-DsRed-Protein zu infizieren. Infizierte Zellen werden mit SDS-Puffer solubilisiert und mittels SDS-PAGE analysiert, wie es obenstehend für transformierte und IPTG-induzierte Bakterien beschrieben wurde. Wie gezeigt in 7, wird eine 60kD-Proteinbande durch infizierte Sf9- und Tni-Zellen exprimiert, aber nicht durch nicht-infizierten Negativkontrollen-Zellen exprimiert. Unter Anwendung von Standardtechniken bestätigt eine Western-Blot-Analyse des mit einem Anti-DsRed-Antikörper gefärbten Gels, dass die 60kD-Bande DsRed-Protein enthält (Daten nicht gezeigt).
  • BEISPIEL 4
  • Fluoreszenz-Nachweis von DsRed in mit H2Ld-DsRed infizierten Insektenzellen
  • Unter Anwendung von Standardtechniken der Fluoreszenzmikroskopie werden Insektenzellen, welche mit dem, wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellten, rekombinanten H2Ld-DsRed-Fusionskonstrukt-Baculovirus infiziert waren, hinsichtlich der Expression des H2Ld-DsRed-Fusionsproteins analysiert. Von infizierten Zellen, die H2Ld-DsRed-Fusionsprotein, das ein funktionelles DsRed-Chromophor enthält, produzieren, wird erwartet, rotes Licht durch Fluoreszenzemission zu emittieren.
  • 8 zeigt nicht-infizierte Negativkontrollen-Sf9-Zellen nach drei Tagen Wachstum in Kultur durch herkömmliche Lichtmikroskopie. Wie in 9 gezeigt, erzeugen Negativkontrollen-Sf9-Zellen keine rote Fluoreszenzemission, wenn sie durch Fluoreszenzmikroskopie drei Tage nach der Infektion stimuliert und analysiert werden.
  • Im Gegensatz dazu zeigt die 10 Sf9-Zellen, welche mit rekombinantem H2Ld-DsRed-Fusionskonstrukt-Baculovirus infiziert worden waren, durch herkömmliche Lichtmikroskopie nach drei Tagen Wachstum in Kultur nach der Infektion. Wie in 11 gezeigt, emittierten infizierte Sf9-Zellen rotes Fluoreszenzlicht, als sie durch Fluoreszenzmikroskopie drei Tage nach der Infektion stimuliert und analysiert wurden. Die Fluoreszenzemission von rotem Licht zeigt an, dass funktionelles (und damit beinahe sicher tetramerisiertes) DsRed-Chromophor von den, mit der H2Ld-DsRed-Fusion infizierten Sf9-Zellen produziert wird.
  • Ähnliche Ergebnisse werden mit Tni-Insektenzellen beobachtet. Die 12 zeigt Tni-Zellen, welche mit dem rekombinanten H2Ld-DsRed-Fusionskonstrukt-Baculovirus infiziert wurden, durch herkömmliche Lichtmikroskopie nach drei Tagen Wachstum in Kultur nach der Infektion. Wie in 13 gezeigt wird, infizierten Tni-Zellen rotes Fluoreszenzlicht, als sie durch Fluoreszenzmikroskopie drei Tage nach der Infektion stimuliert und analysiert wurden. Die Fluoreszenzemission von rotem Licht zeigt an, dass funktionelles DsRed-Chromophor von den infizierten Tni-Zellen produziert wird.

Claims (22)

  1. Rekombinantes Fusionsprotein, umfassend: ein GFP-artiges Chromophor, bei dem es sich um eine selbstfluoreszente Proteinstruktureinheit handelt, die eine 11-strängige β-Fass-Struktur mit einer zentralen α-Helix umfasst, wobei die zentrale α-Helix ein konjugiertes π-Resonanzsystem aufweist, das zwei aromatische Ringsysteme und die Brücke dazwischen beinhaltet; wenigstens eine Multimerisierungsdomäne, die eine Homomultimerisierung oder Heteromultimerisierung bewirkt und zur nichtkovalenten oder kovalenten Assoziation der einzelnen Untereinheiten des Fusionsproteins beiträgt; und eine MHC-peptidpräsentierende Struktureinheit, die ein Teil einer Proteinkette des Haupthistokompatibilitätskomplexes ist, der eine Transmembrandomäne fehlt und die sich an der Präsentation von Peptidantigen gegenüber einem T-Zell-Rezeptor beteiligen kann.
  2. Nucleinsäure, umfassend: eine Sequenz, die das Fusionsprotein von Anspruch 1 codiert oder zu einer Sequenz, die das Fusionsprotein von Anspruch 1 codiert, komplementär ist.
  3. Rekombinanter Vektor, umfassend: die Nucleinsäure von Anspruch 2.
  4. Rekombinanter Vektor gemäß Anspruch 3, wobei der Vektor die Expression des Fusionsproteins in einer Wirtszelle steuern kann.
  5. Wirtszelle, wobei die Wirtszelle Folgendes umfasst: ein oder mehrere Fusionsproteine gemäß Anspruch 1, die Nucleinsäure gemäß Anspruch 2, den Vektor gemäß Anspruch 3 und den rekombinanten Vektor gemäß Anspruch 4.
  6. Selbstfluoreszenter multimerer Proteinkomplex, umfassend: eine Menge von Untereinheiten, wobei die Untereinheiten in dem Komplex die quaternäre Formel (F)n haben, wobei F ein Fusionsprotein gemäß Anspruch 1 ist und n eine ganze Zahl größer als 1 ist.
  7. Selbstfluoreszenter multimerer Proteinkomplex, umfassend: eine Menge von Untereinheiten, wobei die Untereinheiten in dem Komplex die quaternäre Formel (F1S1)n haben, wobei F ein rekombinantes Fusionsprotein gemäß Anspruch 1 ist; S ein lösliches Protein ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus β2-Mikroglobulin, Klasse-II-β-MHC-peptidpräsentierenden löslichen Derivaten und Klasse-II-α-MHC-peptidpräsentierenden löslichen Derivaten besteht; S ein β2-Mikroglobulin ist, wenn F eine Klasse-I-α-MHC-peptidpräsentierende Struktureinheit umfasst, S ein Klasse-II-β-MHC-peptidpräsentierendes lösliches Derivat ist, wenn F eine Klasse-II-α-MHC-peptidpräsentierende Struktureinheit umfasst, und S ein Klasse-II-α-MHC-peptidpräsentierendes lösliches Derivat ist, wenn F eine Klasse-II-β-MHC-peptidpräsentierende Struktureinheit umfasst; und n eine ganze Zahl größer als 1 ist.
  8. Selbstfluoreszenter multimerer Proteinkomplex zum Markieren von T-Lymphocyten gemäß der Spezifität ihrer Antigenrezeptoren, umfassend: eine Menge von Untereinheiten, wobei die Untereinheiten in dem Komplex die quaternäre Formel (F1S1P1)n haben, wobei F ein rekombinantes Fusionsprotein gemäß Anspruch 1 ist; S ein lösliches Protein ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus β2-Mikroglobulin, Klasse-II-β-MHC-peptidpräsentierenden löslichen Derivaten und Klasse-II-α-MHC-peptidpräsentierenden löslichen Derivaten besteht; S ein β2-Mikroglobulin ist, wenn F eine Klasse-I-α-MHC-peptidpräsentierende Struktureinheit umfasst, 5 ein Klasse-II-β-MHC-peptidpräsentierendes lösliches Derivat ist, wenn F eine Klasse-II-α-MHC-peptidpräsentierende Struktureinheit umfasst, und S ein Klasse-II-α-MHC-peptidpräsentierendes lösliches Derivat ist, wenn F eine Klasse-II-β-MHC-peptidpräsentierende Struktureinheit umfasst; P ein Peptidantigen ist; und n eine ganze Zahl größer als 1 ist.
  9. Verfahren zum nachweisbaren Markieren eines T-Lymphocyten gemäß der Spezifität seines Antigenrezeptors, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: In-Kontakt-Bringen des T-Lymphocyten mit einem selbstfluoreszenten multimeren Komplex gemäß Anspruch 8, wobei der Antigenrezeptor des T-Lymphocyten spezifisch für das Peptidantigen und die MHC-präsentierenden Domänen des Komplexes ist, während einer Zeit und unter Bedingungen, die ausreichen, um eine nachweisbare Bindung des Komplexes an den T-Lymphocyten zu ermöglichen.
  10. Verfahren zum Nachweisen von T-Lymphocyten, die spezifisch für ein gewähltes Antigen sind, in einer Probe von Zellen, umfassend: In-Kontakt-Bringen der Probe mit einem selbstfluoreszenten multimeren Komplex gemäß Anspruch 8, wobei das Peptidantigen des Komplexes das gewählte Antigen ist und die MHC-präsentierenden Domänen des Komplexes diejenigen sind, für die die T-Lymphocyten, die man nachweisen möchte, restringiert sein werden, während einer Zeit und unter Bedingungen, die ausreichen, um eine nachweisbare Bindung des Komplexes an T-Lymphocyten, die spezifisch für das gewählte Antigen sind, zu ermöglichen; und dann Nachweisen von spezifischen T-Lymphocyten in der Probe anhand der Fluoreszenz des daran gebundenen Komplexes.
  11. Verfahren gemäß Anspruch 10, das weiterhin Folgendes umfasst: Aufzählen der so nachgewiesenen antigenspezifischen T-Lymphocyten.
  12. Verfahren gemäß Anspruch 10, das weiterhin Folgendes umfasst: In-Kontakt-Bringen der Probe mit wenigstens einem fluorophorkonjugierten Antikörper, wobei der Antikörper aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Pan-T-Antikörpern und T-Zell-Untergruppen-Antikörpern besteht; Nachweisen der zellgebundenen Fluoreszenz des multimeren fluoreszenten Komplexes; und Nachweisen der zellgebundenen Fluoreszenz, die von dem wenigstens einen fluorophorkonjugierten Antikörper ausgeht.
  13. Verfahren gemäß Anspruch 10, das weiterhin Folgendes umfasst: In-Kontakt-Bringen der Probe mit wenigstens einem fluorophorkonjugierten Antikörper, der spezifisch für ein T-Zell-Aktivierungsantigen ist; und dann Nachweisen von aktivierten spezifischen T-Lymphocyten in der Probe anhand der Fluoreszenz des multimeren fluoreszenten Komplexes und wenigstens eines daran gebundenen fluorophorkonjugierten Antikörpers.
  14. Verfahren zum Anreichern einer Probe an T-Lymphocyten, die spezifisch für ein gewähltes Antigen sind, umfassend: In-Kontakt-Bringen der Probe mit einem selbstfluoreszenten multimeren Komplex gemäß Anspruch 8, wobei das Peptidantigen des Komplexes das gewählte Antigen ist, während einer Zeit und unter Bedin gungen, die ausreichen, um eine nachweisbare Bindung des Komplexes an T-Lymphocyten, die spezifisch für das gewählte Antigen sind, zu ermöglichen; und dann Anreichern in Bezug auf die spezifischen T-Lymphocyten auf der Basis der Fluoreszenz des daran gebundenen Komplexes.
  15. Verfahren zum Abreichern einer Probe an T-Lymphocyten, die spezifisch für ein gewähltes Antigen sind, umfassend: In-Kontakt-Bringen der Probe mit einem selbstfluoreszenten multimeren Komplex gemäß Anspruch 8, wobei das Peptidantigen des Komplexes das gewählte Antigen ist, während einer Zeit und unter Bedingungen, die ausreichen, um eine nachweisbare Bindung des Komplexes an T-Lymphocyten, die spezifisch für das gewählte Antigen sind, zu ermöglichen; und dann Abreichern der Probe in Bezug auf die spezifischen T-Lymphocyten auf der Basis der Fluoreszenz des daran gebundenen Komplexes.
  16. Kit, der als getrennte Zusammensetzungen Folgendes umfasst: den multimeren Komplex gemäß Anspruch 7; und ein Peptidantigen.
  17. Kit gemäß Anspruch 16, der weiterhin Folgendes umfasst: einen fluorophorkonjugierten Antikörper, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Pan-T-Antikörpern und T-Zell-Untergruppen-Antikörpern besteht.
  18. Kit gemäß Anspruch 16 oder 17, der weiterhin Folgendes umfasst: einen fluorophorkonjugierten Antikörper, der spezifisch für ein T-Zell-Aktivierungsantigen ist.
  19. Kit, der als getrennte Zusammensetzungen Folgendes umfasst: den multimeren Komplex gemäß Anspruch 8; und einen fluorophorkonjugierten Antikörper, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Pan-T-Antikörpern und T-Zell-Untergruppen-Antikörpern besteht.
  20. Kit gemäß Anspruch 19, der weiterhin Folgendes umfasst: einen fluorophorkonjugierten Antikörper, der spezifisch für ein T-Zell-Aktivierungsantigen ist.
  21. Kit gemäß einem der Ansprüche 16 oder 19, der weiterhin Folgendes umfasst: ein rote Blutkörperchen lysierendes Mittel.
  22. Rekombinantes Fusionsprotein gemäß Anspruch 1, das weiterhin einen flexiblen Peptidspacer umfasst.
DE60219592T 2001-01-12 2002-01-11 Intrinsische fluoreszierende, selbstmultimerisierende mhc-fusionsproteine und deren komplexe Expired - Lifetime DE60219592T2 (de)

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