BR112015032277B1 - complexo de apresentação de antígeno, seu uso, e composição - Google Patents

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Abstract

A presente invenção fornece composições e métodos para imunoterapia, que incluem composições farmacêuticas estáveis armazenadas sem refrigeração para indução de células T específicas ao antígeno. Tais composições são utilizadas como componentes de uma célula apresentadora de antígeno artificial (AAPC), para fornecer a um paciente complexos para apresentação de um antígeno (por exemplo, um antígeno de tumor) e/ou uma molécula coestimulatória de células T.

Description

PRIORIDADE
[0001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade para o Pe dido Provisório U.S. N° 61/838.547, depositado em 24 de junho de 2013, e Pedido Provisório U.S. N° 61/948.916, depositado em 6 de março de 2014, que estão incorporados por meio deste por referência em sua totalidade.
CAMPO DA INVENÇÃO
[0002] A presente invenção refere-se a composições, incluindo composições farmacêuticas, e a métodos que são úteis para a imuno- terapia.
ANTECEDENTES
[0003] Uma célula apresentadora de antígeno (APC) é uma célula que processa e exibe peptídeos antigênicos em complexos com proteínas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) em suas superfícies. Células efetoras, tais como células T, podem reconhecer esses complexos de peptídeo-MHC (pMHC) usando receptores, tais como receptores de células T (TCRs).
[0004] As células dendríticas (DCs) são um exemplo de uma célu la apresentadora de antígeno que pode ser estimulada para apresentar efetivamente o antígeno e apoiar a expansão de células imunes efetoras, ativando, desse modo, uma resposta citotóxica em direção ao antígeno. Em algumas imunoterapias, as DCs são colhidas de um paciente e pulsadas com um antígeno ou transfectadas com um vetor viral. Após a transfusão de volta para o paciente, essas células ativadas apresentam o antígeno tumoral a linfócitos efetores (por exemplo células T CD4+, células T CD8+, e células B). Se executada adequadamente, esta terapia pode iniciar uma resposta citotóxica contra célu- las que expressam antígenos (incluindo antígenos tumorais).
[0005] No entanto, a imunoterapia com DC, como muitas imunote- rapias, enfrenta limitações significativas. Por exemplo, há uma discre-pância entre respostas de células T fortes e antígeno-específicas em pacientes com câncer vacinados detectável ex vivo e apenas fracas respostas clínicas. Janikashvili N et al., Personalized dendritic cellbased tumor immunotherapy. Immunotherapy 2010 Jan. 1; 2(1):57.
[0006] Permanece uma necessidade de composições (incluindo composições farmacêuticas estáveis ao armazenamento) e métodos que sejam eficazes para a imunoterapia, incluindo imunoterapia antí- geno-específica.
BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
[0007] A presente invenção fornece composições e métodos para imunoterapia, que incluem composições farmacêuticas estáveis ao armazenamento para indução de células T antígeno-específicas em um paciente. Tais composições são úteis para o tratamento, por exemplo, de câncer e doenças infecciosas. A composição, em alguns aspectos, é uma célula apresentadora de antígeno artificial (aAPC) que compreende um grânulo ou partícula farmaceuticamente aceitável com complexos de apresentação de antígeno e, opcionalmente, sinais co-estimulatórios de células T em sua superfície, para fornecer, a um paciente, complexos moleculares que apresentam um ou mais antíge- nos (por exemplo, antígeno(s) tumoral(is)) no contexto apropriado para a ativação de células T antígeno-específicas. O grânulo ou partículas são projetados para fornecer vantagens farmacodinâmicas, incluindo propriedades de circulação, biodistribuição e cinética de degradação, bem como atividade. Tais parâmetros incluem tamanho, carga superficial, composição do polímero, química de conjugação do ligante, densidade do ligante, entre outros.
[0008] Em algumas modalidades, o sinal co-estimulatório das célu- las T é um anticorpo anti-CD28 ou uma porção do mesmo, que pode compreender sequências de aminoácidos de cadeia pesada humana, incluindo sequências selecionadas dentre os isótipos IgG, IgD, IgA ou IgM. Em algumas modalidade, as sequências de imunoglobulina incluem sequências variáveis e constantes de IgG humana. As sequências de estrutura (FW) podem ser modificadas para conter resíduos de estrutura murinos importantes ou desejados para manter a integridade do(s) sítio(s) de ligação ao antígeno. As regiões determinantes de complementariedade (CDRs) podem ser baseadas numa sequência de aminoácidos de anticorpo murino (por exemplo, mAb 9.3), ou outra sequência de ligação a CD28, das quais muitas são conhecidas. Em algumas modalidades, a cadeia pesada do anticorpo é uma variante de um FW de linha germinativa de IGHV4 humano (e.g., IGHV4-59). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma cadeia leve e a cadeia leve é uma variante de um FW de IGKV4-01 humano. O anticorpo pode compreender uma região constante e a região constante pode ser uma IgG4 humana ou sua variante.
[0009] A molécula co-estimulatória pode ser conjugada a um su porte sólido com complexos moleculares de apresentação de antígeno para induzir células T antígeno-específicas. O complexo molecular de apresentação de antígeno podem incluir complexos de MHC de Classe I e/ou de Classe II, ou porções dos mesmos, que compreendem uma fenda de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, o complexo molecular compreende uma ou mais sequências de aminoácidos de HLA (por exemplo, compreende o domínio extracelular de HLA ou de sua porção de apresentação de antígeno), que pode conter sequências adicionais, tais como sequências de imunoglobulina, ou outra sequência dimerizante ou estabilizante. As fusões dimerizantes de HLA- Ig, em algumas modalidades, fornecem vantagens na estabilidade e/ou afinidade de ligação.
[00010] Assim, em algumas modalidades, a invenção fornece um complexo molecular conjugado a um grânulo ou a uma partícula para a apresentação do antígeno às células T, onde o complexo compreende uma sequência de aminoácidos que forma a fenda de ligação ao antí- geno de Classe I ou Classe II, ou uma porção da mesma. As sequências de aminoácidos do complexo de apresentação de antígeno podem incluir fusões a sequências heterólogas para fornecer estabilidade, afinidade e vantagens estéricas, por exemplo. Em algumas modalidades, as sequências heterólogas incluem sequências de imunoglo- bulina. Em algumas modalidades, o complexo molecular inclui sequências de aminoácidos de HLA (por exemplo, HLA-A2) fundidas a sequências heterólogas, tais como sequências de imunoglobulina. Em algumas modalidades, a imunoglobulina compreende uma sequência de imunoglobulina de cadeia pesada humana (por exemplo, IGVH4), que pode incluir sequências constantes de imunoglobulina para fornecer HLA dimérico e pode, opcionalmente, compreender sequências de regiões variáveis. As sequências variáveis, se presentes, podem ser opcionalmente modificadas para reduzir ou eliminar uma potencial ligação ao antígeno, e opcionalmente sem resíduos de FW murinos. A sequência de aminoácidos de HLA pode ser HLA-A*02:01 (IMGT N° de Acesso HLA00005) ou um derivado da mesma.
[00011] O ligante co-estimulatório de células T e/ou os complexos de apresentação de antígeno (bem como outros ligantes divulgados neste documento, incluindo ligantes de direcionamento) podem ser conjugados a um suporte sólido para a apresentação de antígeno ex vivo ou in vivo e para a ativação de células T antígeno-específicas. Em algumas modalidades, o suporte sólido é um grânulo ou partícula (por exemplo, PLGA ou partícula de PLGA-PEG) com grupos funcionais superficiais para o acoplamento de ligantes. As partículas são projeta- das_para fornecer vantagens farmacodinâmicas, incluindo proprieda- des de circulação, biodistribuição e cinética de degradação, bem como atividade. Tais parâmetros incluem tamanho, carga superficial, composição do polímero, química de conjugação do ligante, densidade do ligante, entre outros.
[00012] A composição farmacêutica, nas diversas modalidades, pode compreender ainda um peptídeo antigênico para a apresentação às células T, e que pode ser co-formulado com o grânulo ou partícula conjugada ao ligante. Em várias modalidades, a composição farmacêutica é estável ao armazenamento e pode ser fornecida na forma liofilizada para a reconstituição antes da administração, ou alternativamente fornecida em outro formato conveniente para a administração aos pacientes (por exemplo, por administração parentérica).
[00013] As composições farmacêuticas descritas neste documento são úteis para a imunoterapia, por exemplo, nos métodos para a indução da formação de células T citotóxicas antígeno-específicas, pela administração de uma quantidade eficaz da composição a um paciente em necessidade. Em particular, as plataformas de apresentação de antígeno podem ser úteis tratar com doenças infecciosas, câncer ou doenças autoimunes, ou para fornecer proteção profilática a pacientes imunodeprimidos.
[00014] A invenção fornece ainda polinucleotídeos que codificam as sequências de aminoácidos descritas neste documento, bem as como células hospedeiras que expressam os mesmos.
[00015] Esta invenção é ilustrada ainda pelos seguintes exemplos não limitantes.
[00016] Os detalhes da invenção estão estabelecidos na descrição e reivindicações acompanhantes abaixo. Embora os métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos neste documento possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, os métodos e materiais ilustrativos são agora descritos. Outros recursos, objetos e vantagens da invenção estarão evidentes a partir da descrição e das reivindicações. Na especificação e nas reivindicações anexas, as formas singulares também incluem o plural, a menos que o contexto indique claramente o contrário. A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado conforme comumente entendido por um versado na técnica ao qual esta invenção pertence.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[00017] As FIGURAS 1-3 mostram três sequências pesadas variáveis humanizadas para anti-CD28.
[00018] As FIGURAS 4-6 mostram três sequências leves variáveis humanizadas para anti-CD28.
[00019] A FIGURA 7 mostra uma sequência pesada constante modificada.
[00020] A FIGURA 8 mostra uma sequência leve K constante.
[00021] A FIGURA 9 mostra uma região variável de não-ligação a CD28 humanizada para a construção de uma fusão de HLA.
[00022] A FIGURA 10 mostra a sequência de aminoácidos para HLA-IgG4HC humanizado.
[00023] A FIGURA 11 mostra a sequência de aminoácidos para a cadeia leve 3 (LC3, ou Vk3).
[00024] A FIGURA 12 mostra a sequência de aminoácidos para a cadeia pesada 1 (HC1).
[00025] A FIGURA 13 mostra a sequência de aminoácidos para a cadeia pesada 2 (HC2).
[00026] As FIGURAS 14-16 mostram construtos de expressão para a expressão na linhagem celular STABLEFAST-NS0.
[00027] A FIGURA 17 mostra que o mAb anti-CD28 humanizado não é um superagonista.
[00028] A FIGURA 18 mostra que os clones de anti-CD28 humani- zados coram especificamente a CD28 numa linhagem de células T humanas. FIGURA 18(A): coloração com mAB CD8 anti-humano muri- no (clone 9.3, Isotipo IgG2a); FIGURA18(B): coloração com anti-CD28 humanizado (isotipo IgG4).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[00029] As seguintes abreviações são usadas: BLAST - ferramenta de busca de alinhamento local básico, CDR - região determinante de complementariedade, CK - região constante de cadeia leve kappa, Fc - região cristalizável de fragmento de anticorpo, Fw - região de estrutura (de regiões variáveis), HLA - antígeno de leucócitos humanos, MHC - complexo principal de histocompatibilidade, VH - pesada variável, Vk - leve variável kappa, e região V - região variável de um anticorpo, tanto VH quanto Vk.
[00030] A presente invenção fornece composições e métodos para imunoterapia, que incluem composições farmacêuticas estáveis ao armazenamento para indução de células T antígeno-específicas em um paciente. Em algumas modalidades, as composições compreendem complexos de apresentação de antígeno HLA dimérico. Em algumas modalidades, as composições compreendem sequências de imunoglobulina humanizadas ou porções das mesmas, que podem ser empregadas como componentes dos ligantes nas células apresentadoras de antígeno artificial (aAPCs) para fornecer, a um paciente, complexos moleculares diméricos para a apresentação de um ou mais antígenos (por exemplo, antígeno(s) tumoral(is)) e opcionalmente um ou mais sinais co-estimulatórios. As plataformas de apresentação de antígeno, como descrito em mais detalhes abaixo, podem ser baseadas em suportes sólidos artificiais, tais como suportes farmaceutica- mente aceitáveis, incluindo grânulos ou partículas poliméricas ou de látex.
[00031] Em algumas modalidades, o sinal co-estimulatório de célu- las T é um anticorpo anti-CD28 ou uma porção do mesmo. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD28 compreende sequências de pelo menos um isotipo de imunoglobulina humana selecionado dentre IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA ou IgM. Por exemplo, o anticorpo anti-CD28 pode ser um isotipo IgG, e pode conter sequências de uma ou mais sequências de estrutura de linhagem germinativa de IgG. Por exemplo, o anticorpo anti-CD28 pode conter uma sequência de ami- noácidos de cadeia pesada de IGHV4 humano, que pode ser modificada com desde uma a quinze modificações de aminoácidos. As modi-ficações podem compreender resíduos de estrutura murino para suportar a integridade do(s) sítio(s) de ligação ao antígeno.
[00032] A região determinante de complementaridade (CDR), em algumas modalidades, baseia-se numa sequência de aminoácidos do anticorpo murino, que pode, opcionalmente, ter de um a dez, tal como de um a cinco, modificações de aminoácidos. Em algumas modalidades, uma, duas, três ou mais CDRs baseiam-se em mAb 9.3 de camundongo (Tan et al. J. Exp. Med. 1993 177:165), que está disponível publicamente. CDRs exemplares são mostradas nas FIGURAS 1-6. Em algumas modalidades, o anticorpo tem um conjunto total de CDRs de cadeia pesada e/ou um conjunto total de cadeia leve de mAb 9.3. Por exemplo, em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada contém uma, duas ou três das seguintes CDRs, que podem opcionalmente ser modificadas por uma, duas ou três substituições, deleções ou adições de aminoácidos: CDR1 (DYGVH), CDR2 (VI- WAGGGTNYNSALMS) e CDR3 (DKGYSYYYSMDY). Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve contém uma, duas ou três das seguintes CDRs, que podem, cada uma, ser modificadas por uma, duas ou três substituições, deleções ou adições de aminoácidos: CDR1 (RASESVEYYVTSLMQ), CDR2 (AASNVES) e CDR3 (QQS- RKVPYT).
[00033] Sequências de CDR alternativas, regiões variáveis, ou li- gantes de ligação à CD28 podem ser empregados em várias modalidades. Ligantes e anticorpos alternativos são descritos na Patente US 7.612.170, Patente US 6.987.171, e Patente US 6.887.466, por exemplo, e essas divulgações estão incorporadas por meio deste em sua totalidade por referência.
[00034] Em algumas modalidades, a cadeia pesada do anticorpo compreende uma variante de uma estrutura de linhagem germinativa de IGHV4-59 humana (FW), que é modificada para incluir de 5 a 15 resíduos de FW murinos. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende sequências de aminoácidos de cadeia leve, e as sequências de cadeia leve podem ser uma variante de sequências de FW de IGKV4-01 humanas, e que podem ser modificadas para incluir de 3 a 15 resíduos de FW murinos.
[00035] A sequência de cadeia pesada humana anti-CD28 pode ser modificada, por exemplo, para compreender um ou mais (por exemplo, 2 ou mais, 3 ou mais, 4 ou mais, 5 ou mais, ou todos) resíduos de FW murinos nas posições 1, 3, 6, 37, 48, 67, 71, 73, 76, 78, 82, 82a e 82c (com base na numeração de Kabat). Os resíduos de Fw murinos nessas posições podem ser como no mAb 9.3. A cadeia leve pode ser modificada para compreender um ou mais (por exemplo, 2 ou mais, 3 ou mais, 4 ou mais, 5 ou mais, ou todos) resíduos de FW murinos nas posições 3, 4, 49, 70, 85, 87 e 80. Os resíduos de FW murinos selecionados podem suportar a integridade dos sítios de ligação ao antí- geno. O anticorpo anti-CD28 humanizado mantém a afinidade pela CD28 e pela atividade co-estimulatória das células T do mAb 9.3, e é pelo menos 40%, 50%, 75%, 80%, 90%, e em algumas modalidades 100% ou mais eficaz para a ligação à CD28 do que o mAb 9.3. Em várias modalidades, o mAb anti-CD28 não é um superagonista.
[00036] O anticorpo pode compreender uma região constante e a região constante pode ser de qualquer isotipo. Em algumas modalidades, a região constante do anticorpo é a IgG4 humana ou uma variante da mesma. Em algumas modalidades, a região constante compreende uma ou mais mutações de estabilização de dobradiça, que podem ser introduzidas na cadeia CH (por exemplo, S241, que pode ser substituído por P). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região constante e a região constante compreende uma ou mais mutações adequadas para acoplar quimicamente o anticorpo a um suporte sólido. A uma ou mais mutações adequadas para o acoplamento podem criar um grupo funcional de cadeia lateral de aminoá- cidos (por exemplo, tiol, amina ou hidroxila), tal como uma cisteína não-pareada (por exemplo, em S473). Outras alterações na região constante incluem essas modificações para reduzir a ligação ao receptor gama de Fc. Por exemplo, a cadeia CH pode ser modificada em L248, por exemplo, L248E.
[00037] Em algumas modalidades, o anticorpo é um fragmento de anticorpo, tal como F(ab’)2 ou Fab, ou é um anticorpo de cadeia única, ou outro fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno. Por exemplo, o fragmento de anticorpo pode ser um fragmento variável de cadeia única do mAb humanizado descrito neste documento ou outro anti- CD28.
[00038] Em algumas modalidades, a molécula co-estimulatória é um fragmento variável de cadeia única (scFv) que compreende ou consiste essencialmente em alças de ligação ao antígeno formadas pelas cadeias VH e VL de um mAb antiCD28, tal como um anticorpo descrito neste documento. Construtos de anticorpo scFv podem compreender uma ou várias (2, 3, 4 ou 5) cadeias de região hipervariável VH e VL (cujas porções de cada cadeia, juntas, formam bolsos de ligação ao epítopo de ligação antigênico 3-D) ligadas nas configurações de cabeça-cabeça ou cabeça-cauda por ligantes peptídicos curtos. Tais construtos podem ser convenientemente produzidos através de uma via completamente sintética devido a seu tamanho menor. Além disso, scFv pode exibir menor potencial para imunogenicidade.
[00039] Em outras modalidades, o ligante co-estimulatório é um construto biespecífico que compreende uma ou mais moléculas HLA unidas a um scFv de um ligante de molécula co-estimulatória ou de um ligante inibitório. O complexo de apresentação de antígeno e o ligante co-estimulatório ou inibitório podem ser conjugados através de uma corrente peptídica que permita que o construto biespecífico seja cova- lentemente ligado a uma superfície de nanopartícula. Em algumas modalidades, tais construtos produzem a mesma atividade que nano- partículas contendo construtos maiores de HLA e ligante co- estimulatórios ou inibitórios, cada um ligado à superfície NP independentemente, fornecendo, desse modo, vantagens de fabricação.
[00040] A molécula co-estimulatória pode ser conjugada a um suporte sólido com complexos moleculares de apresentação de antígeno para induzir células T antígeno-específicas. O complexo molecular de apresentação de antígeno podem incluir complexos de MHC de Classe I e/ou de Classe II, ou porções dos mesmos, que compreendem uma fenda de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, o complexo molecular compreende uma ou duas sequências de aminoácidos de HLA, que pode conter sequências heterólogas adicionais, tais como sequências de imunoglobulina. Sequências heterólogas alternativas incluem sequências de aminoácidos dimerizantes, tais como c-fos e c- jun. As fusões de HLA, em algumas modalidades, fornecem vantagens adicionais na estabilidade e/ou afinidade de ligação.
[00041] Em várias modalidades, o complexo de apresentação de antígeno é um complexo molecular de MHC de classe I ou um complexo molecular de MHC de classe II, ou, alternativamente, CD1d. O complexo molecular de MHC de classe I pode compreender pelo me- nos duas proteínas de fusão. Uma primeira proteína de fusão compreende uma primeira cadeia a de MHC de classe I e uma primeira cadeia pesada de imunoglobulina e uma segunda proteína de fusão compreende uma segunda cadeia a de MHC de classe I e uma segunda cadeia pesada de imunoglobulina. A primeira e segunda cadeias pesadas de imunoglobulina se associam para formar o complexo molecular de MHC de classe I. O complexo molecular de MHC de classe I compreende uma primeira fenda de ligação a peptídeo de MHC de classe I e uma segunda fenda de ligação a peptídeo de MHC de classe I. O complexo molecular de MHC de classe II pode compreender, pelo menos, quatro proteínas de fusão. As duas primeiras proteínas de fusão compreendem (i) uma cadeia pesada de imunoglobulina e (ii) um domínio extracelular de uma cadeia p de MHC de classe II. As duas segundas proteínas de fusão compreendem (i) uma cadeia leve de imunoglobulina e (ii) um domínio extracelular de uma cadeia a de MHC de classe II. As duas primeiras e as duas segundas proteínas de fusão se associam para formar o complexo molecular de MHC de classe II. O domínio extracelular da cadeia p do MHC de classe II de cada primeira proteína de fusão e o domínio extracelular da cadeia a do MHC de classe II de cada segunda proteína de fusão formam uma fenda de ligação a peptídeo de MHC de classe II. Os peptídeos antigênicos são ligados às fendas de ligação a peptídeo. Em várias modalidades, a sequência de imunoglobulina é uma sequência de cadeia pesada parcial que compreende a região de dobradiça para suportar a dimerização.
[00042] Em algumas modalidades, o complexo de apresentação de antígeno é um monômero de HLA sintético ou recombinante projetado para conter uma cisteína não-pareada, ou para usar uma cisteína não- pareada de ocorrência natural, para a conjugação à nanopartículas. Além disso, o sinal co-estimulatório (ou outro ligante à base de anticorpo) pode ser um Fab ou scFv. Em tais modalidades, os dois sinais podem ser combinados em único construto multifuncional compreendendo uma molécula de HLA fixada a um fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno (por exemplo, scFv) que se liga a um receptor desejado.
[00043] Em outros aspectos e modalidades, a invenção fornece um complexo molecular conjugado a um grânulo ou partícula para a apre-sentação do antígeno às células T, onde o complexo compreende uma sequência de imunoglobulina humanizada, ou uma porção da mesma, fundida a uma sequência de apresentação de antígeno, por exemplo, uma sequência de aminoácidos de HLA. Em algumas modalidades, a sequência de imunoglobulina é uma sequência de cadeia pesada humana (por exemplo, estrutura de IGHV4). A região variável não compreende uma atividade de ligação ao antígeno para CD28, ou outra proteína humana. A sequência de aminoácidos de HLA pode ser HLA- A*02:01 (N° de Acesso IMGT HLA00005) ou um derivado ou fragmento da mesma, tal como um derivado tendo de 1 a 10, ou de 1 a 5, substituições, deleções ou inserções de aminoácidos. A sequência de imunoglobulina humanizada pode compreender ainda uma sequência de aminoácidos ligadora entre as sequências de HLA e de imunoglo- bulina. Preferencialmente, o ligante não tem imunogenicidade. O complexo molecular pode compreender ainda o peptídeo da p2- microglobulina.
[00044] Em várias modalidades, as sequências de fusão da imuno- globulina são do isotipo IgG, IgD, IgA ou IgM, e podem ser derivadas de qualquer estrutura de linhagem germinativa humana. A estrutura de linhagem germinativa inclui IGHV4 (por exemplo, IGHV4-59), que pode ou não conter um ou mais dos resíduos de estrutura murinos descritos em relação ao anti-CD28. Em algumas modalidades, a cadeia pesada do anticorpo anti-CD28 descrita acima (com ou sem os resíduos de estrutura murinos) é fundida ao HLA de acordo com este aspecto e, em tais modalidades, a região variável é modificada para reduzir ou eliminar a ligação à CD28.
[00045] Em algumas modalidades, o construto de fusão de HLA não contém nenhuma sequência de cadeia variável. Por exemplo, o HLA ou o complexo de apresentação de antígeno pode ser fundido a uma sequência de região constante de Ig acima da região de dobradiça para fornecer um HLA dimérico. Por exemplo, um HLA ou sua porção de apresentação de antígeno pode ser conjugado a uma porção CH1 de cada cadeia pesada de IgG. Todas as moléculas de IgG consistem em duas cadeias pesadas idênticas (regiões constantes e variáveis) unidas por ligações dissulfeto na região de dobradiça (superior e inferior). Por exemplo, em algumas modalidades, uma molécula de HLA ou complexo de apresentação de antígeno é fundido à CH1 (extremidade N-terminal da cadeia de IgH acima da região de dobradiça), criando, desse modo, uma proteína de fusão dimérica que é menor devido à falta de quaisquer sequências de cadeia leve VH e VL. Tal construto pode fornecer vantagens de fabricação, bem como exibir menos potencial para a imunogenicidade.
[00046] Em ainda outras modalidades, os complexos de apresentação de antígeno (por exemplo, sequências de HLA) não contêm parceiros de fusão de Ig e são monoméricos. Por exemplo, em algumas modalidades, a extremidade C-terminal do complexo de apresentação de antígeno ou molécula de HLA (por exemplo, HLA-A2) contém uma sequência de corrente peptídica adequada para a ligação sítio- direcionada a um grupo funcional (por exemplo, fração de maleimida) em um substrato sólido/semissólido, tal como uma nanopartícula sintética (por exemplo, polímeros em bloco de PLGA-PEG-maleimida, ou outras partículas descritas neste documento). A sequência de corrente pode conter qualquer sequência adequada, que pode ser predominantemente composta de resíduos hidrofílicos, tais como Gly, Ser, Ala e Thr, tais como duas, três, quatro ou cinco repetições de GGGSG ou AAAGG, com um resíduo de cisteína incorporado em algum lugar dentro da corrente de cerca de 5 a cerca de 15 (ou cerca de 5 a cerca de 10 aminoácidos). O resíduo de cisteína deve ser incorporado num sítio previsto para não formar ligações dissulfeto intramoleculares.
[00047] Em algumas modalidades, a fusão de HLA-Ig ou outro construto de HLA compreende ainda um peptídeo antigênico ligado ao HLA para a apresentação às células T. O peptídeo antigênico pode compreender uma porção antigênica de um ou mais dentre tirosinase, hTERT, MAGE-1, MAGE-3, gp-100, NY-ESO-1, Melan A/Mart-1, HPV 16-E7, gp75/brown, BAGE e S-100 e/ou qualquer um dos peptídeos antigênicos, como descrito em WO 2004/006951 para a apresentação pelos complexos de classe I ou classe II, cujos conteúdos estão incorporados por meio deste por referência em sua totalidade. Os complexos de HLA podem ser fixados a um suporte sólido, tal como um grânulo ou partícula, como descrito, para a apresentação do antígeno às células T opcionalmente com o sinal co-estimulatório.
[00048] Outros sinais que podem ser fornecidos com o complexo de apresentação de antígeno incluem: CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), B7-H3, 4-1BBL, CD27, CD30, CD134 (OX-40L), B7h (B7RP-1), CD40, LIGHT, (ou fusões de Ig, opcionalmente humanizadas, como descrito neste documento, dessas moléculas ou suas porções ativas), anticorpos que se ligam especificamente a HVEM, anticorpos que se ligam especificamente a CD40L, anticorpos que se ligam especificamente a OX40, anticorpos que se ligam especificamente a Fas, anticorpos que se ligam especificamente a PD1, anticorpos que se ligam especificamente a GITR, e anticorpos que se ligam especificamente a 4-1BB.
[00049] As moléculas de adesão úteis para as plataformas de apresentação de antígeno da invenção podem mediar a aderência da plataforma a uma célula T ou a um precursor de célula T. As moléculas de adesão úteis na presente invenção incluem, por exemplo, ICAM-1 e LFA-3.
[00050] Os fatores de crescimento de células T afetam a proliferação e/ou diferenciação da células T. Exemplos de fatores de crescimento de células T incluem citocinas (por exemplo, interleucinas, interferons) e superantígenos. Citocinas particularmente úteis incluem IL-2, IL-4, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15 e interferon gama. Os fatores de crescimento de células T podem ser encapsulados nos grânulos ou partículas ou conjugados quimicamente ou adsorvidos na superfície. Assim, em algumas modalidades, as nanopartículas compreendem ainda um composto terapêutico ou proteína/peptídeo aprisionado no núcleo hi- drofóbico da partícula (por exemplo, um agente quimioterápico, citoci- na ou interleucina, tal como IL-2, uma quimiocina, como CCL9, que atrai células T, e/ou uma molécula inibidora da via de sinalização, como anticorpo anti-PD1 ou peptídeo anti-PD1). Tal aAPC, em algumas modalidades, é construída para se direcionar a células específicas para a estimulação ou inibição, bem como para a reprogramação. Em algumas modalidades, os compostos aprisionados são liberados pela degradação da matriz da partícula. Tal aAPC poderia_produzir terapias de combinação mais toleráveis e eficazes através da limitação da atividade indesejada devido a interações inespecíficas.
[00051] Os antígenos apresentados de acordo com os aspectos da invenção incluem antígenos associados a tumor. Os antígenos associados a tumor incluem antígenos tumorais únicos expressos exclusivamente pelo tumor do qual eles se derivam, antígenos tumorais compartilhados expressos em muitos tumores, mas não nos tecidos adultos normais (antígenos oncofetais, antígenos de câncer/testículo) e antígenos tecido-específicos expressos também pelo tecido normal a partir do qual o tumor surge. Os antígenos associados a tumor podem ser, por exemplo, antígenos embrionários, antígenos com modificações pós-traducionais anormais, antígenos de diferenciação, produtos de oncogenes mutantes ou supressores de tumor, proteínas de fusão, ou proteínas oncovirais. Uma variedade de antígenos associados a tumor é conhecida na técnica, e muitos desses estão disponíveis comercialmente. Antígenos oncofetais e embrionários incluem antígeno carcinoembrionário e alfa-fetoproteína (geralmente apenas altamente expressos em embriões em desenvolvimento, mas frequentemente altamente expressos por tumores do fígado e cólon, respectivamente), sialil-Lewis X da fosfatase alcalina placentária (expresso no adenocarcinoma), CA-125 e CA-19 (expressos em tumores gastrointestinal, hepático e ginecológico), TAG-72 (expresso em tumores colorretais), gli- coproteína epitelial 2 (expresso em muitos carcinomas), antígeno oncofetal pancreático, 5T4 (expresso no carcinoma gástrico), receptor de alfa-fetoproteína (expresso em vários tipos de tumor, particularmente tumores mamários), e M2A (expresso em neoplasia de células germi- nativas).
[00052] Em algumas modalidades, pelo menos um antígeno é um antígeno de Câncer/Testículo (CT), que pode incluir NY-ESO-1, MAGE-A, B e C, CTAG-1, CTAG-45, GAGE e SSX, que são normalmente expressos pelas células germinativas do testículo e não nos tecidos somáticos adultos normais. No entanto, foi mostrado que inúmeros tipos de células cancerosas expressam antígenos CT, incluindo melanoma, mama, fígado, pulmão, ovário e linfoma Hodgkin.
[00053] Os antígenos de diferenciação associados a tumor incluem tirosinase (expressa no melanoma) e imunoglobulinas de superfície específicas (expressas nos linfomas).
[00054] Produtos de oncogene mutante ou de gene supressor de tumor incluem Ras e p53, ambos os quais são expressos em muitos tipos de tumor, Her-2/neu (expresso em câncer de mama e ginecológico), EGF-R, receptor de estrogênio, receptor de progesterona, produto de gene de retinoblastoma, myc (associado a câncer de pulmão), ras, p53 não-mutante associado a tumores de mama, MAGE-1 e MAGE-3 (associado a melanoma, câncer de pulmão e outros cânceres).
[00055] Outros antígenos tumorais incluem proteínas de fusão, tais como BCR-ABL, que é expressa em leucemia mieloide crônica, e proteínas oncovirais, tais como E6 e E7 do HPV tipo 16, que são encontradas no carcinoma cervical. Antígenos tumorais tecido-específicos incluem melanotransferrina e MUCl (expressos em câncer pancreático e de mama); CD 10 (anteriormente conhecido como antígeno da leucemia limfoblástica aguda comum, ou CALLA) ou imunoglobulina de superfície (expressa em leucemias de células B e linfomas); a cadeia a do receptor de IL-2, receptor de células T, CD45R, CD4+/CD8+ (expressos em leucemias de células T e linfomas); antígeno específico da próstata e fosfatase ácida prostática (expressos no carcinoma de próstata); gp100, MelanA/Mart-1, tirosinase, gp75/brown, BAGE e S-100 (expressos no melanoma); citoqueratinas (expressas em vários carcinomas); e CD19, CD20 e CD37 (expressas em linfomas).
[00056] Em algumas modalidades, os peptídeos antigênicos incluem MART-1, gp100, NY-ESO-1 e MAGE-A3 que são apresentados pelos complexos de apresentação de antígeno HLA descritos neste documento, tais como complexo de fusão de HLA-Ig descrito neste documento.
[00057] Em ainda outras modalidades, a composição compreende um coquetel de uma pluralidade de antígenos do tipo tumoral, tal como pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 antígenos (por exemplo, de 2 a 10 ou 3-8 antígenos).
[00058] Em algumas modalidades, o antígeno é um autoantígeno, que é um "autoantígeno" do próprio organismo contra o qual o organismo produz uma resposta imune. Os autoantígenos estão envolvidos em doenças autoimunes, tais como síndrome de Goodpasture, esclerose múltipla, doença de Graves, miastenia gravis, lúpus eritematoso sistêmico, diabetes mellitus dependente de insulina, artrite reumatoide, pênfigurao vulgar, doença de Addison, dermatite herpetiforme, doença celíaca e tireoidite de Hashimoto. Por exemplo, autoantígenos relacionados a diabetes incluem insulina, ácido glutâmico descarboxilase (GAD) e outros autoantígenos de células da ilhota, por exemplo, proteína tirosina fosfatase ICA 512/IA-2, ICA12, ICA69, pré-proinsulina ou um fragmento imunologicamente ativo da mesma (por exemplo, cadeia B, cadeia A da insulina, peptídeo C ou um fragmento imunologicamen- te ativo dos mesmos), IGRP, HSP60, carboxipeptidase H, periferina, gangliosídeos (por exemplo, GM1-2, GM3) ou fragmentos imunologi- camente ativos dos mesmos.
[00059] Em algumas modalidades, o(s) antígeno(s) é(são) de agentes infeciosos, tais como componentes de protozoários, bactérias, fungos (unicelulares e pluricelulares), vírus, príons, parasitas intracelulares, helmintos e outros agentes infeciosos que podem induzir uma resposta imune. Os antígenos bacterianos incluem antígenos de cocos gram-positivos, bacilos gram-positivos, bactérias gram-negativas, bactérias anaeróbicas, tais como organismos das famílias Actinomyceta- ceae, Bacillaceae, Bartonellaceae, Bordetellae, Captophagaceae, Corynebacteriaceae, Enterobacteriaceae, Legionellaceae, Micrococca- ceae, Mycobacteriaceae, Nocardiaceae, Pasteurellaceae, Pseudomo- nadaceae, Spirochaetaceae, Vibrionaceae e organismos dos gêneros Acinetobacter, Brucella, Campylobacter, Erysipelothrix, Ewingella, Francisella, Gardnerella, Helicobacter, Levinea, Listeria, Streptobaci- llus e Tropheryma. Os antígenos de agentes infeciosos protozoários incluem antígenos de plasmódios de malária, espécies de Leishmania, espécies de Trypanosoma e espécies de Schistosoma. Os antígenos fúngicos incluem antígenos de Aspergillus, Blastomyces, Candida, Coccidioides, Cryptococcus, Histoplasma, Paracoccicioides, Spo- rothrix, organismos da ordem Mucorales, organismos indutores de cromomicose e micetoma e organismos dos gêneros Trichophyton, Microsporum, Epidermophyton e Malassezia. Os antígenos de príons incluem a sialoglicoproteína PrP 27-30 dos príons que causam scrapie, encefalopatia espongiforme bovina (BSE), encefalopatia espongiforme felina, kuru, doença de Creutzfeldt-Jakob (CJD), doença de Gerst- mann-Strassler-Scheinker (GSS) e insônia familiar fatal (FFI). Os parasitas intracelulares dos quais peptídeos antigênicos podem ser obtidos incluem, mas não estão limitados a, Chlamydiaceae, Mycoplasma- taceae, Acholeplasmataceae, Rickettsiae, e organismos dos gêneros Coxiella e Ehrlichia. Os antígenos peptídicos virais incluem, mas não estão limitados a, aqueles do adenovírus, vírus herpes simplex, papi- lomavírus, vírus sincicial respiratório, poxvírus, HIV, vírus influenza e CMV. Os antígenos peptídicos virais particularmente úteis incluem pro-teínas do HIV, tais como proteínas gag do HIV (incluindo, mas não se limitando a, proteína de ancoragem da membrana (MA), proteína do capsídeo do core (CA) e proteína do nucleocapsídeo (NC)), HIV poli- merase, proteína da matriz do vírus influenza (M) e proteína do nucle- ocapsídeo do vírus influenza (NP), antígeno de superfície da hepatite B (HBsAg), proteína do core da hepatite B (HBcAg), proteína da hepatite E (HBeAg), DNA polimerase da hepatite B, antígenos da hepatite C, e similares.
[00060] Os antígenos, incluindo peptídeos antigênicos, podem estar ligados a uma fenda de ligação a antígeno de um complexo de apre-sentação de antígeno tanto ativa quanto passivamente, como descrito na Patente U.S. 6.268.411, que está incorporada por meio deste por referência em sua totalidade. Opcionalmente, um peptídeo antigênico pode estar covalentemente ligado a uma fenda de ligação a peptídeo.
[00061] Se desejado, uma corrente peptídica pode ser usada para ligar um peptídeo antigênico a uma fenda de ligação a peptídeo. Por exemplo, as análises cristalográficas de várias moléculas de MHC de classe I indicam que o terminal amino de p2M está bem próximo, aproximadamente 20,5 Angstroms de distância, do terminal carboxila de um peptídeo antigênico que fica na fenda de ligação a peptídeo do MHC. Assim, ao usar uma sequência de ligante relativamente curta, aproximadamente de 13 aminoácidos de comprimento, pode-se fixar um peptídeo ao terminal amino de p2M. Se a sequência for apropriada, esse peptídeo se ligará no sulco de ligação a MHC (ver Patente U.S. 6.268.411).
[00062] O anticorpo ou fragmento e/ou complexos de apresentação de antígeno podem ser conjugados a um suporte sólido para a apresentação de antígeno ex vivo ou in vivo. Vários suportes sólidos são descritos em WO 2004/006951, cujo conteúdo está incorporado por meio deste por referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, o suporte sólido é um grânulo ou partícula com grupos funcionais para o acoplamentos de ligantes. O material pode ser um material orgânico biodegradável, tal como celulose ou dextrano. Em algumas modalidades, os copolímeros em bloco são selecionados para transitar por sítios anatômicos específicos e se biodegradarem ao longo de intervalos específicos, ou seja, ter uma meia-vida plasmática mais longa ou mais curta, ou um tempo de permanência no tecido mais longo ou mais curto.
[00063] Em algumas modalidades, o grânulo ou partícula compreende um polímero, tal como um ou mais dentre polímeros contendo ciclodextrina, polímeros catiônicos contendo ciclodextrina, poli(D,L- ácido láctico-co-ácido glicólico) (PLGA), poli(caprolactona) (PCL), polímero de etileno acetato de vinila (EVA), ácido poli(láctico) (PLA), ácido poli(L-láctico) (PLLA), ácido poli(glicólico) (PGA), poli(L-ácido lácti- co-co-ácido glicólico) (PLLGA), poli(D,L-lactida) (PDLA), poli(L- lactida) (PLLA), PLGA-b-poli(etilenoglicol)-PLGA (PLGA-bPEG-PLGA), PLLA- bPEG-PLLA, PLGA-PEG-maleimida (PLGA-PEG-mal), poli(D,L-lactida- co-caprolactona), poli(D,L-lactida-co-caprolactona-co- glicolida), po- li(D,L-lactida-co-PEO-co-D,L-lactida), poli(D,L-lactida-co-PPO-co-D,L- lactida), polialquil cianoacrilato, poliuretano, poli-L-lisina (PLL), hidroxi- propil metacrilato (HPMA), polietilenoglicol, ácido poli-L-glutâmico, po- li(hidroxiácidos), polianidridos, poliortoésteres, poli(éster amidas), poli- amidas, poli(éster éteres), policarbonatos, poialquilenos, tais como po- lietileno e polipropileno, polialquileno glicóis, tais como po- li(etilenoglicol) (PEG), óxidos de polialquileno (PEO), tereftalatos de polialquileno, tais como tereftalato de poli(etileno), álcoois polivinílicos (PVA), polivinil éteres, polivinil ésteres, tais como acetato de poli(vinil), haletos de polivinil, tais como cloreto de poli(vinil) (PVC), polivinilpirro- lidona, polissiloxanos, poliestireno (PS), poliuretanos, celuloses derivadas, tais como alquil celuloses, hidroxialquil celuloses, éteres de celulose, ésteres de celulose, nitroceluloses, hidroxipropilcelulose, car- boximetilcelulose, polímeros de ácidos acrílicos, tais como po- li(metil(met)acrilato) (PMMA), poli(etil(met)acrilato), poli(butil(met) acri- lato), poli(isobutil(met)acrilato), poli(hexil(met)acrilato), poli (isode- cil(met) acrilato), poli(lauril(met)acrilato), poli(fenil(met)acrilato), acrilato de poli(metil), acrilato de poli(isopropil), acrilato de poli(isobutil), acrila- to de poli(octadecil) (ácidos poliacrílicos), e copolímeros e misturas dos mesmos, polidioxanona e seus copolímeros, polihidroxialcanoatos, fumarato de polipropileno, polioximetileno, poloxâmeros, poli(orto) és-teres, ácido poli(butírico), ácido poli(valérico), poli(lactida-co- caprolactona), carbonato de trimetileno, polivinilpirrolidona, poliortoés- teres, polifosfazenos, e polifosfoésteres, e misturas e/ou copolímeros em bloco de dois ou mais desses polímeros. Outros materiais farma- ceuticamente aceitáveis, tais como o látex, também podem ser usados como o suporte sólido de partículas.
[00064] Em algumas modalidades, o complexo de apresentação de antígeno e o sinal co-estimulatório são conjugados a partículas de PLGA ou de PLGA-PEG com grupos funcionais de superfície na ex-tremidade terminal do polímero (por exemplo, a extremidade que está voltada para fora da superfície da partícula), tal como partículas de PLGA-PEG-maleimida, que fornecem grupos funcionais para o aco-plamento químico na superfície externa hidrofílica. Em algumas moda-lidades, as aAPCs persistem na circulação do sangue periférico tempo suficiente para permitir a distribuição aos tecidos alvo, incluindo o transporte para os linfonodos através da troca de sangue/linfa. A com-posição da casca também pode ter impacto na biodistribuição. Assim, em várias modalidades, as partículas têm uma casca hidrofílica, que pode ser finalizada pelo PEG do copolímero de PLGA-PEG. Em várias modalidades, a carga das partículas é ligeiramente negativa, por exemplo, devido à combinação dos grupos COOH no PLGA, bem como pela carga contribuída pelos ligantes de direcionamento fixados à superfície da partícula. Em algumas modalidades, as partículas (tanto com quanto sem o ligante conjugado) têm uma carga de superfície de cerca de 0 a cerca de -20 mV, ou em algumas modalidades, de cerca de -5 a -15 mV, ou cerca de -10 mV.
[00065] Nanopartículas que compreendem copolímeros de PLGA- PEG são descritas na Patente US 8.420.123, por exemplo, que está incorporada por meio deste por referência.
[00066] As partículas podem variar na forma, de irregular a esférica, e/ou em ter uma superfície desigual ou irregular a ter uma superfície lisa. As partículas esféricas têm menos área de superfície em relação às partículas de tamanho irregular. Se forem usadas partículas esféricas, menos reagente é necessário devido à área de superfície reduzida. Por outro lado, uma partícula de forma irregular tem uma área de superfície significativamente maior que uma partícula esférica, o que proporciona uma vantagem para o teor de proteína conjugado por área de superfície e contato de área de superfície para as células. Por exemplo, as nanopartículas assimétricas podem ter pelo menos uma superfície com um raio de curvatura ao longo de pelo menos um eixo que se encontra em um dos seguintes intervalos: (a) cerca de 1 nm a cerca de 10 nm; (b) cerca de 11 nm a cerca de 100 nm; (c) cerca de 101 nm a cerca de 400 nm; (d) cerca de 401 nm a cerca de 1 pm; (e) cerca de 10 pm a cerca de 20 pm; (f) cerca de 20 pm a cerca de 100pm; e (g) cerca de 101 pm a cerca de 1 mm. Em algumas modalidades, a nanopartícula assimétrica pode ter uma forma assimétrica definida por uma dimensão (a) ao longo de um eixo x, uma dimensão (b) ao longo de um eixo y, e uma dimensão (c) ao longo de um eixo z, em que pelo menos um dentre (a), (b) ou (c) não é igual a pelo menos uma outra dimensão (a), (b) ou (c). Em algumas modalidades, a forma assimétrica é elipsoide, que pode ser descrita por uma das seguintes equações: a > b = c (elipsoide alongado); a > b > c (elipsoide tri-axial); e a = b > c (elipsoide achatado). As nanopartículas assimétricas que podem ser usadas de acordo com a invenção são descritas em WO 2013/086500, que está incorporada por meio deste por referência em sua totalidade.
[00067] O tamanho das partículas pode variar. O tamanho da partícula (diâmetro nominal), em várias modalidades, está na faixa de 0,0550 pm, ou em algumas modalidades, 0,05-35 pm, ou em algumas modalidades, 0,05 a 10 pm, e em algumas modalidades, é de cerca de 0,05 a cerca de 3,0, cerca de 4,0, ou cerca de 5,0 pm. Por exemplo, em algumas modalidades, as partículas têm de 50 a 500 nm de diâmetro ou de diâmetro médio. Em algumas modalidades, as partículas têm um tamanho médio de menos de cerca de 400 nm, cerca de 300 nm, cerca de 200 nm, ou cerca de 100 nm, para permitir uma melhor circulação sanguínea periférica. Em algumas modalidades, as nanopartícu- las têm um tamanho médio (por exemplo, diâmetro ou maior eixo) de cerca de 100 nm, cerca de 150 nm, ou cerca de 200 nm. O termo "cer- ca de", quando ligado a uma característica numérica, significa ± 10%. Em algumas modalidades, pelo menos 90% das partículas estão na faixa de cerca de 50 a cerca de 250 nm, tal como de cerca de 100 a cerca de 150 nm. As partículas podem ser de tamanho uniforme ou podem variar de tamanho, com o tamanho médio de partícula sendo preferencialmente conforme descrito acima. Em algumas modalidades, as partículas são suficientemente pequenas para tirar proveito do "efeito EPR" (efeito de permeabilidade e retenção aumentadas).
[00068] Os ligantes e complexos moleculares descritos neste documento podem ser quimicamente conjugados aos grânulos usando qualquer processo disponível. Grupos funcionais para a ligação do li- gante incluem PEG-COOH, PEG-NH2, PEG-SH ou outro grupo funcional fixado a um polímero diferente, tal como policianoacrilato ou poli- caprolactona.
[00069] Por exemplo, um suporte sólido pode ser revestido antes de as proteínas se ligarem a sua superfície. Uma vez que uma química de revestimento tenha sido escolhida, a superfície de um suporte sólido pode ser ativada para permitir a fixação específica de moléculas específicas da proteína. Assim, os revestimentos podem ser selecionados tendo em vista uma reatividade ideal e biocompatibilidade com várias populações celulares. Preferencialmente, qualquer que seja a química de revestimento usada, é fornecida uma matriz adequada para posterior química de ativação. Inúmeros revestimentos desses são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, os suportes sólidos podem ser revestidos com albumina de soro humano, tris (3-mercaptopropil)-N- glicilamino)metano (Patente U.S. 6.074.884), gelatina-aminodextranos (Patente U.S. 5.466.609), ou homopolímeros ou copolímeros aleatórios de aminoácidos. Em uma modalidade, um copolímero de aminoá- cidos aleatório compreendendo poli(glutamato, lisina, tirosina) [6:3:1] é usado; este copolímero está disponível pela Sigma Chemical Co. co- mo Produto N°. P8854. Ele é um polímero aleatório linear dos aminoá- cidos ácido glutâmico, lisina e tirosina em uma razão de 6 partes de ácido glutâmico, 3 partes de lisina e 1 parte de tirosina. Em outra modalidade, é usado um copolímero de aminoácidos que inclui lisina e tirosina numa razão de 4 partes de lisina para 1 parte de tirosina. Em ainda outra modalidade, é usado um copolímero de aminoácidos que inclui lisina e alanina numa razão de 1 parte de lisina para 1 parte de alanina. Em outra modalidade, um suporte sólido é revestido por um polímero sintético, em seguida, o polímero sintético é ativado antes de se ligar a moléculas da proteína.
[00070] Em algumas modalidades, as moléculas são diretamente fixadas a suportes sólidos por adsorção ou por ligação química direta, incluindo ligação covalente. Ver, por exemplo, Hermanson, BlOCON- JUGATE TECHNIQUES, Academic Press, Nova York, 1996. A própria molécula pode ser diretamente ativada com uma variedade de funcionalidades químicas, incluindo grupos nucleofílicos, grupos lábeis, ou grupos eletrofílicos. Grupos funcionais de ativação incluem alquil e ha- letos de acila, amina, sulfidrilas, aldeídos, ligações insaturadas, hidra- zidas, isocianatos, isotiocianatos, cetonas e outros grupos conhecidos por ativar ligações químicas. Alternativamente, uma molécula pode ser ligada a um suporte sólido através do uso de um reagente de acoplamento de pequena molécula. Exemplos não limitantes de reagentes de acoplamento incluem carbodi-imidas, maleimidas, ésteres de N- hidroxissuccinimida, biscloroetilaminas, aldeídos bifuncionais, tais como glutaraldeído, anidridos e similares. Em outras modalidades, uma molécula pode ser acoplada a um suporte sólido através de ligação por afinidade, tal como ligação ou acoplamento de biotina- estreptavidina, como é bem conhecido na técnica. Por exemplo, a es- treptavidina pode ser ligada a um suporte sólido por fixação covalente ou não-covalente, e uma molécula biotinilada podem ser sintetizada usando métodos que são bem conhecidos na técnica.
[00071] Em algumas modalidades, a partícula ou grânulo é um polímero, tal como PLGA-PEG, PLGA-PEG-maleimida, ou um PLGA de extremidades revestidas por éster, em que os grupos funcionais para a conjugação de ligantes de superfície são criados durante a polimeriza- ção. O grupo maleimida fornece, às partículas formadas, um revestimento de "furto" ("stealth") hidrofílico (PEG) na superfície externa da partícula, bem como grupos funcionais fixados a esta casca que podem ser usados para a fixação covalente de ligantes que têm pelo menos um grupo sulfidrila (-SH) livre disponível. Por exemplo, ligante HLA-Ig e/ou anti-CD28 podem ser construídos em uma estrutura de IgG4 humana (como descrito neste documento) que contém uma substituição de S473C no Fc. Este resíduo de cisteína não-pareado em 473 de HLA-Ig ou de anti-CD28 pode ser conjugado ao grupo ma- leimida fixado ao PEG sob condições moderadas de redução. Condições moderadas de redução são improváveis de desnaturar irreversivelmente as proteínas, especialmente a porção de HLA-beta-2- microglobulina da molécula de HLA-Ig.
[00072] Em uma modalidade exemplar, as nanopartículas estão na mesma faixa de cerca de 50 nm a tão grandes quanto cerca de 5 pm (por exemplo, o diâmetro médio ou maior eixo), têm um núcleo (PLGA) que pode ser ajustado para uma taxa de biodegradação específica in vivo (pelo ajuste da razão de LA:GA e/ou peso molecular do polímero PLGA), uma casca externa hidrofílica que protege contra a opsoniza- ção pelas proteínas séricas e remoção da circulação (agindo como "escovas de PEG"), superfície funcionalizada com controle consistente de densidade do ligante (relação estocástica de 1 molécula/grupo ma- leimida) e orientação do ligante para longe do núcleo. Em algumas modalidades, a razão de LA:GA é de 60%/40% a 40%/60%, e em algumas modalidades, é cerca de 50%/50%. Em algumas modalidades, o PLGA tem um peso molecular de cerca de 25K a cerca de 35K (por exemplo, cerca de 30K), e o PEG tem um peso molecular de cerca de 3K a cerca de 10K, tal como cerca de 5K. Em algumas modalidades, a partícula do núcleo tem um diâmetro de cerca de 150 nm, ou cerca de 200 nm.
[00073] Em uma modalidade alternativa, o suporte pode ser revestido com um polímero que contém uma ou mais frações químicas ou grupos funcionais que estão disponíveis para a fixação covalente a um reagente adequado, normalmente através de um ligante.
[00074] As químicas de ativação permitem a fixação estável específica de moléculas à superfície de suportes sólidos. Existem inúmeros métodos que podem ser usados para fixar proteínas a grupos funcionais. Por exemplo, o glutaraldeído reticulador comum pode ser usado para fixar grupos amina da proteína a uma superfície de suporte sólido aminada em um processo de duas etapas. A ligação resultante é hi- droliticamente estável. Outros métodos incluem o uso de reticuladores contendo ésteres de n-hidro-succinimido (NHS) que reagem com aminas nas proteínas, reticuladores contendo halogênios ativos que reagem com proteínas contendo amina, sulfidrila ou histidina, reticulado- res contendo epóxidos que reagem com grupos amina ou sulfidrila, conjugação entre grupos maleimida e grupos sulfidrila, e a formação de grupos aldeído da proteína por oxidação de periodato de frações de açúcar pendentes seguido por aminação redutiva.
[00075] A fixação de proteínas específicas a uma superfície de suporte sólido pode ser realizada pelo acoplamento direto da proteína ou pelo uso de métodos indiretos. Certas proteínas se prestam à fixação direta ou conjugação, enquanto outras proteínas ou anticorpos mantêm melhor atividade funcional quando acoplados a um ligante ou proteína espaçadora, tal como IgG anti-camundongo ou estreptavidina. Se desejado, os ligantes ou proteínas de fixação podem ser usados. Os ligantes, tais como os complexos de apresentação de antígeno e moléculas co-estimulatórias, podem ser modificados com substituições de aminoácidos para permitir a conjugação química.
[00076] A razão de proteínas específicas no mesmo suporte sólido pode ser variada para aumentar a eficácia do suporte sólido na apresentação do antígeno ou anticorpo. Por exemplo, as razões entre complexo de apresentação de antígeno e anti-CD28 podem ser de pelo menos cerca de 30:1, ou pelo menos cerca de 10:1, cerca de 3:1, cerca de 1:1, cerca de 0,3:1; cerca de 0,1 :1, e pelo menos cerca de 0,03:1. Em algumas modalidades, a razão é cerca de 5:1, cerca de 4:1, cerca de 3:1, cerca de 2:1, ou cerca de 1:1, cerca de 1:2, cerca de 1:3, cerca de 1:4, ou cerca de 1:5. A quantidade total de proteína acoplada aos suportes pode ser de pelo menos 10 mg/ml, pelo menos 25mg/ml, pelo menos 50 mg/ml, pelo menos 100 mg/ml, pelo menos 150 mg/ml, ou maior que 200 mg/ml. Em algumas modalidades, tais como aquelas que empregam partículas de PLGA ou PLGA-PEG com grupos funcionais de superfície (por exemplo, maleimida ou éster), a quantidade total de proteína acoplada às partículas pode ser de 1 a 10pg por mg de PLGA, ou em algumas modalidades, de 2 a 6 pg por mg de PLGA. Em algumas modalidades, a densidade do ligante das partículas é de cerca de 103 a cerca de 105 ligantes/pm2, ou cerca de 104 ligantes/pm2 em algumas modalidades. Por exemplo, para as na- nopartículas na faixa de 100 a 200 nm de tamanho, as nanopartículas, em média, têm cerca de 100 a cerca de 1500 ligantes, tais como cerca de 200 a cerca de 1200 ligantes, ou cerca de 400 a cerca de 1000 li- gantes, ou cerca de 500 a cerca de 800 ligantes.
[00077] Em várias modalidades, a invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende um grânulo ou partícula polimérica, um anticorpo anti-CD28 como descrito neste documento, e/ou um complexo de apresentação de antígeno, tal como complexo de fusão de Ig-HLA humanizado como descrito neste documento. A composição farmacêutica pode compreender ainda um peptídeo antigênico para a apresentação às células T, como descrito, e que pode ser co- formulado com o grânulo ou partícula conjugado. Em várias modalidades, a composição farmacêutica é estável ao armazenamento e, em algumas modalidades, é fornecida na forma liofilizada para a reconstituição antes da administração, ou fornecida em outra preparação farmacêutica "pronta para uso".
[00078] Em algumas modalidades, a invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende nanopartículas à base de PLGA ou PLGA-PEG, de 50 a 500 nm de diâmetro ou de diâmetro médio, e que compreende anticorpos anti-CD28 conjugados na superfície e complexos de apresentação de antígeno. O anticorpo anti-CD28 pode ser um anticorpo humanizado, por exemplo, como descrito neste documento, e pode ser um fragmento de anticorpo, tal como um fragmento variável de cadeia única. O complexo de apresentação de antí- geno, em algumas modalidades, compreende pelo menos uma fenda de ligação ao antígeno HLA. O anticorpo anti-CD28 e complexo de HLA podem ser acoplados às partículas separada ou conjuntamente na mesma reação. A composição farmacêutica pode incluir pelo menos um antígeno peptídico, tal como um antígeno tumoral (por exemplo, MART-1), e que pode ser formulado com as partículas sem nenhum processo de carregamento ativo.
[00079] As composições farmacêuticas descritas neste documento são úteis para a imunoterapia, por exemplo, nos métodos para a indução da formação de células T citotóxicas antígeno-específicas, pela administração de uma quantidade eficaz da composição a um paciente em necessidade. Em algumas modalidades, o paciente é um paciente de câncer.
[00080] As plataformas de apresentação de antígeno à base de partículas, descritas neste documento, podem ser administradas a paciente por quaisquer vias apropriadas, incluindo administração intravenosa, administração intra-arterial, administração subcutânea, administração intradérmica, administração intralinfática, e administração intratumoral. Os pacientes incluem tanto pacientes humanos quanto veterinários.
[00081] Algumas modalidades exemplares da invenção são descritas abaixo.
[00082] Em algumas modalidades, a invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende partículas de PLGA-PEG polimé- ricas com um tamanho na faixa de cerca de 100 a 200 nm, uma carga de superfície de cerca de -0 a -20 mV (e -5 a -15 mV em algumas modalidades), e de cerca de 100 a 1500 ligante de proteína por partícula. Os ligantes de proteína, em algumas modalidades, são, cada um, acoplados à partícula através de uma química de sulfidrila-maleimida. Os ligantes compreendem uma população de ligantes de anticorpo anti- CD28, e uma população de ligantes de HLA e um ou mais peptídeos antigênicos para a apresentação às células T. A composição compreende um veículo farmaceuticamente aceitável para administração intravenosa, intra-arterial, subcutânea, intradérmica, intralinfática ou in- tratumoral.
[00083] Em algumas modalidades, as partículas são substancialmente esféricas ou aproximadamente esféricas.
[00084] Em algumas modalidades, o PLGA é um polímero de cerca de 50% de ácido láctico (LA) e 50% de ácido glicólico (GA).
[00085] Em algumas modalidades, o polímero de PLGA tem um peso molecular de cerca de 30K, e o PEG tem um peso molecular de cerca de 3K a cerca de 10K, tal como cerca de 5K.
[00086] Em algumas modalidades, a composição tem de 400 a 1000 ligantes por partícula.
[00087] Em algumas modalidades, os ligantes de anticorpo anti- CD28 compreendem uma estrutura de linhagem germinativa de IGHV4-59 humano tendo opcionalmente de 5 a 15 resíduos de estrutura murinos, e uma estrutura de linhagem germinativa de IGKV4-01 tendo opcionalmente de 3 a 15 resíduos de estrutura murinos.
[00088] Em algumas modalidades, o anti-CD28 é um ScFv.
[00089] Em algumas modalidades, o HLA é HLA-A*02:01, que pode compreender uma fusão a sequências de imunoglobulina acima da região de dobradiça suficiente para fornecer um construto de HLA di- mérico.
[00090] Em algumas modalidades, a composição é liofilizada.
[00091] Em particular, as plataformas de apresentação de antígeno podem ser úteis tratar com doenças infecciosas, câncer ou doenças autoimunes, ou para fornecer proteção profilática a pacientes imuno- deprimidos.
[00092] As doenças infeciosas que podem ser tratadas incluem aquelas causadas por bactérias, vírus, príons, fungos, parasitas, helmintos, etc. Tais doenças incluem AIDS, hepatite, infecção por CMV e distúrbio linfoproliferativo pós-transplante (PTLD). O CMV, por exemplo, é o patógeno viral mais comum encontrado em pacientes de transplante de órgão e é a principal causa de morbidade e mortalidade em pacientes submetidos a transplantes de medula óssea ou de células-tronco do sangue periférico (Zaia, Hematol. Oncol. Clin. North Am. 4, 603-23, 1990). Isto é devido ao estado imunocomprometido desses pacientes, o que permite a reativação do vírus latente em pacientes soropositivos ou a infecção oportunista em indivíduos soronegativos. O tratamento atual foca no uso de compostos antivirais, tais como ganciclovir, que tem desvantagens, a mais significativa sendo o desenvolvimento de CMV resistente à droga. Uma alternativa útil para esses tratamentos é um regime imunoterapêutico profilático que envolve a geração de CTL vírus-específicos derivados do paciente ou de um doador apropriado antes do início do procedimento do transplante.
[00093] A PTLD ocorre numa fração significativa de pacientes de transplante e resulta da infecção pelo vírus Epstein-Barr (EBV). Acredita-se que a infecção por EBV esteja presente em aproximadamente 90% da população adulta nos Estados Unidos (Anagnostopoulos & Hummel, Histopathology 29, 291-2) 15, 1996). A replicação e infecção viral ativa são mantidas em verificação pelo sistema imune, mas, como nos casos do CMV, indivíduos imunocomprometidos por terapias de transplante perdem o controle das populações de células T, o que permite a reativação viral. Isto representa um sério impedimento para os protocolos de transplante. O EBV também pode estar envolvido na promoção do tumor em uma variedade de cânceres hematológicos e não-hematológicos. Há também uma forte associação entre o EBV e carcinomas de nasofaringe. Assim, um tratamento profiláctico com células T EBV-específicas oferece uma excelente alternativa às terapias atuais.
[00094] Os cânceres que podem ser tratados de acordo com a invenção incluem melanoma, carcinomas, por exemplo, de cólon, câncer de cabeça e pescoço, duodenal, de próstata, mama, pulmão, ovariano, ductal, cólon, hepático, pancreático, renal, endometrial, estômago, mucosa oral displásica, polipose, câncer oral invasivo, carcinoma de pulmão de células não-pequenas, carcinoma urinário de células transitórias e escamosas, etc.; malignidades neurológicas, por exemplo, neuroblastoma, gliomas, etc.; malignidades hematológicas, por exemplo, leucemia mieloide crônica, leucemia aguda da infância, linfomas não-Hodgkin, leucemia linfocítica crônica, células T cutâneas malignas, micose fungoides, linfoma de células T cutâneas não-MF, papulose linfomatoide, hiperplasia linfoide cutânea rica em células T, penFi- guraoide bolhoso, lúpus eritematoso discoide, líquen plano, etc.; e si- milares. Ver, por exemplo, Mackensen et al, Int. J. Cancer 86, 385-92, 2000; Jonuleit et al., Int. J. Cancer 93, 243-51, 2001; Lan et al., J. Immunotherapy 24, 66-78, 2001; Meidenbauer et al, J. Immunol. 170(4), 2161-69, 2003.
[00095] Em algumas modalidades, a invenção fornece um método de tratamento de câncer, incluindo aqueles cânceres identificados acima, através da administração da composição farmacêutica descrita neste documento para ativar as células T com atividade antitumo- ral. Em algumas modalidades, a terapia é fornecida juntamente com um ou mais inibidores imunes da via de sinalização, tais como Nivo- lumab, Pembrolizumab e Ipilimumab. Em algumas modalidades, a terapia adicional é com anti-CTLA4 ou anti-PD1, ou anti-PD-L1. A terapia adicional ou o inibidor da via de sinalização pode ser administrado separadamente através de seu regime convencional, ou pode ser administrado como um ligante adicional às nanopartículas descritas neste documento, ou fixado a uma população separada de nano- partículas. Em algumas modalidades, o um ou mais inibidores imunes da via de sinalização são fornecidos como terapia inicial, e a terapia com nanopartículas descrita neste documento iniciada subsequentemente, por exemplo, após cerca de 1 a cerca de 8 semanas da terapia com inibidor da via de sinalização, ou após cerca de 2 a cerca de 4 semanas da terapia do inibidor da via de sinalização. Em algumas modalidades, o um ou mais inibidores da via de sinalização são fornecidos concomitantemente com a terapia de nanopartículas, por exemplo, no início da terapia e cerca de a cada duas semanas, ou no início da terapia e cerca de a cada duas semanas para o um ou mais inibidores da via de sinalização e cerca de a cada quatro semanas para a terapia de nanopartículas. Em algumas modalidades, o paciente é resistente ou mostra apenas uma resposta parcial ou transitória à terapia com inibidor da via de sinalização, e as aAPCs descritas neste documento intensificam a regressão do tumor nesses pacientes. Em ainda outras modalidades, para cânceres que são normalmente resistentes à terapia com inibidor da via de sinalização, as composições descritas neste documento expandem o uso bem sucedido dos inibidores a esses cânceres.
[00096] Em algumas modalidades, o antígeno peptídico é selecionado numa base personalizada para o paciente, com base numa análise do tumor do paciente. Por exemplo, um processo descrito por Ionov Y., A high throughput method for identifying personalized tumor-associated antigens, Oncotarget 1(2):148-155 (2010) (que está incorporado por meio deste por referência) pode ser usado, ou outros processos. Nessas modalidades, as nanopartículas podem ser fornecidas (numa base "pronta para uso"), e os antígenos tu- morais podem ser selecionados e carregados numa base personalizada.
[00097] Doenças autoimunes que podem ser tratadas incluem asma, lúpus eritematoso sistêmico, artrite reumatoide, diabetes tipo I, esclerose múltipla, doença de Crohn, colite ulcerativa, psoríase, mias- tenia gravis, síndrome de Goodpasture, doença de Graves, pênFigu- rao vulgar, doença de Addison, dermatite herpetiforme, doença celíaca e tireoidite de Hashimoto.
[00098] As células T helper antígeno-específicas podem ser usadas para ativar macrófagos ou para ativar células B para produzir anticorpos específicos que podem ser usados, por exemplo, para tratar doenças infecciosas e câncer. As células B produtoras de anticorpo, em si, também podem ser usadas para esta finalidade.
[00099] A invenção fornece ainda polinucleotídeos que codificam as sequências de aminoácidos descritas neste documento, bem as como células hospedeiras que expressam os mesmos.
[000100] Esta invenção é ilustrada ainda pelos seguintes exemplos não limitantes. EXEMPLOS Exemplo 1: Desenho de Regiões Variáveis Humanizadas da Linhagem Germinativa e Sequências de Região Constante Humana
[000101] Este Exemplo demonstra, inter alia, um desenho de sequências para anticorpos humanizados da linhagem germinativa (CDR enxertada) de um modelo de anticorpo anti-CD28 de camundongo; um desenho de sequências de região constante humana, incluindo IgG4 humana contendo a mutação de estabilização de dobradiça de S241P (numeração de Kabat), a mutação de L248E (numeração de Kabat) para remover a ligação do receptor de Fc gama residual e um resíduo Cys (S473C, numeração de Kabat) adequados para o acoplamento do anticorpo; um desenho de um domínio V de anticorpo humanizado de linhagem germinativa variante sem ligação potencial à CD28; um desenho de uma sequência de ligante para a fusão de HLA-A*02:01 ao terminal N dos anticorpos humanizados da linhagem germinativa que não contém potenciais epítopos de células T.
[000102] O anticorpo anti-CD28 inicial foi o anticorpo monoclonal 9.3 murino (Tan et al. J. Exp. Med. 1993 177:165). Os modelos estruturais das regiões V do anticorpo 9.3 foram produzidos usando Swiss PDB e analisados a fim de identificar aminoácidos nas regiões V que eram prováveis de ser essenciais para as propriedades de ligação do anticorpo. Todos os resíduos contidos dentro das CDR (usando as definições de Kabat e Chothia) juntamente com uma quantidade de resíduos de estrutura foram considerados ser de potencial importância para a ligação. Ambas as sequências VH e VK do anti-CD28 contêm resíduos de estrutura típicos (Fw) e os motivos de CDR1, 2 e 3 são comparáveis a muitos anticorpos murinos.
[000103] Para a humanização, a Fw da linhagem germinativa de IGHV4-59 foi selecionada como um modelo para a cadeia pesada (de preferência ao IGHV3/OR16-10 selecionado por Tan et al. J. Immunol 2002 169:1119-1125). A Fw da linhagem germinativa de IGKV4-01 foi selecionada como um modelo para a cadeia leve. Ambas essas Fws têm 62% de homologia a suas respectivas sequências VH e VK muri- nas. As CDRs murinas foram enxertadas nessas Fws e números variáveis de resíduos de Fw murinos também foram incluídos para criar três variantes de VH humanizadas e três variantes de Vk humanizadas (FIGURAS 1-6).
[000104] Para a Fw da cadeia pesada, pensava-se que os resíduos 1 e 3 de Fw1 fossem importantes para a ligação ao antígeno uma vez que eles são adjacentes ao bolso de ligação, enquanto considerava-se que o resíduo 6 afetasse a conformação da fita beta que suporta os resíduos 1 e 3 e a conformação da CDR3. Portanto, esses resíduos de Fw murinos foram mantidos em todas as variantes.
[000105] Na Fw2, o resíduo 37 foi considerado ser importante para manter a interface entre a VH e Vk, enquanto o resíduo 48 foi considerado suportar a conformação da CDR2; portanto, ambos esses resíduos foram mantidos em todas as variantes.
[000106] Na Fw3, os resíduos 73, 76 e 78 entram em contato direto com a CDR1, enquanto o resíduo 71 entra em contato com a CDR1 e com a CDR2; portanto, esses resíduos são prováveis de serem necessários para a ligação ao antígeno (dependendo da contribuição da CDR1 e CDR2) e foram, portanto, mantidos em todas as variantes. O resíduo 71 pode, algumas vezes, afetar indiretamente a conformação da CDR1 através da influência da conformação dos resíduos 71 a 78, enquanto os resíduos 82a e 82c também podem influenciar indiretamente a conformação da CDR2. Esses resíduos foram, portanto, mantidos na VH1 apenas. Os resíduos 67 e 82 são adjacentes na estrutura tridimensional e interagem para preencher o espaço, o que pode afetar a conformação da CDR2 e potencialmente influenciar as fitas beta que suportam as CDR 1 e 3. Portanto, esses resíduos foram mantidos nas variantes VH1 e VH2.
[000107] Para a Fw da cadeia leve, o resíduo 3 da Fw1 é adjacente ao bolso de ligação e pode estar diretamente envolvido na ligação ao antígeno, enquanto o resíduo 4 suporta indiretamente a conformação da CDR3. Portanto, esses resíduos de Fw murinos foram mantidos em todas as variantes.
[000108] Na Fw2, o resíduo 49 suporta a conformação da CDR2 e também é crítica para a interface entre as cadeia pesada e leve, onde ele suporta diretamente a conformação da CDR3 de cadeia pesada, mantido, assim, em todas as variantes.
[000109] Na Fw3, os resíduos 85 e 87 foram considerados importantes para a interface das cadeias pesada e leve e também para suportar a conformação da CDR3 e foram, portanto, mantidos em todas as variantes. O resíduo 80 foi considerado ter potencialmente efeitos indiretos na conformação das CDRs 2 e 3 e foi mantido em VK1 apenas. O resíduo 70 comumente forma pontes de sal com o resíduo R24 da cadeia leve e, portanto, tem efeitos conformacionais importantes sobre o domínio de VK. No anti-CD28, esta ponte de sal está ausente (uma vez que o resíduo 70 é N, em vez de D) e a introdução desta interação poderia ser desvantajosa; no entanto, no anticorpo murino, N70 é glicosi- lado (NFS) e seria benéfico remover isto durante a humanização; portanto, o N murino foi mantido em Vk1 e Vk2, mas alterado para D em Vk3.
[000110] As sequências de região constante com base na IgG4/k humana foram projetadas para incorporar uma mutação de estabilização de dobradiça (S241P) e uma mutação na dobradiça inferior que remove a ligação do receptor de Fc gama residual (L248E). Um resíduo de cisteína também foi incluído próximo ao terminal C do Fc para fins de acoplamento químico (S473C). A sequência de região constan- te da cadeia pesada de IgG4 modificada é mostrada na FIGURA 7, juntamente com a sequência de região constante da cadeia leve K (FIGURA 8).
[000111] Um outro domínio VH foi projetado para potencialmente não se ligar à CD28 e esta sequência é mostrada na FIGURA 9. A análise das sequências da região V murina sugeriram (a partir da extensão da mutação somática das regiões V da linhagem germinativa de camundongo) que a VH era provavelmente o maior contribuidor para a ligação de CD28. Portanto, apenas uma potencial variante de VH humanizada de não-ligação foi projetada. Esta variante não contém nenhum resíduo de Fw de camundongo para reconstituir as conformações corretas de CDR e também contém três mutações na CDRH3 nos resíduos que são prováveis de serem críticos para a ligação (Y100A, Y100aA, Y100bA). Exemplo 2: Desenho de liganteLigantes para Fusão de HLA-A*02:01 a Anticorpos Humanizados
[000112] Os ligantes para a fusão de HLA-A*02:01 (IMGT N° de Acesso HLA00005) ao terminal N dos anticorpos anti-CD28 humanizados foram construídos e a análise incorporada por iTope™ e TCED™ para remover a potencial imunogenicidade.
[000113] O software iTope™ prevê as interações favoráveis entre as cadeias laterais de aminoácidos de um peptídeo e bolsos de ligação específicos (em particular, as posições de bolso; p1, p4, p6, p7 e p9) dentro dos sulcos de ligação de extremidades abertas dos 34 alelos humanos de MHC de classe II. Esses alelos representam os alelos de HLA-DR mais comuns encontrados em todo o mundo sem ponderação atribuída àqueles encontrados mais prevalentemente em qualquer população étnica específica. Vinte dos alelos contêm a conFIGURAção de p1 'aberta' e quatorze contêm a conFIGURAção 'fechada', onde a glicina, na posição 83, é substituída por uma valina. A localização dos resíduos de ligação chave é obtida pela geração in silico de peptídeos 9mer que se sobrepõem em um aminoácido que abrange a sequência proteica de teste. As comparações com os experimentos de ligação de MHC de classe II mostraram que iTope™ pode ser usado para discriminar, de forma bem sucedida, com alta precisão, os peptídeos que ligam ou não as moléculas do MHC de classe II. Quaisquer limitações da análise de ligação do MHC de classe II in silico são reduzidas usando o TCED™ que contém as sequências de um grande banco de dados de peptídeos (>10.000 peptídeos) derivados de sequências anteriormente triadas em ensaios de mapeamento de epítopo de células T ex vivo EpiScreen™. O TCED™ pode assim ser usado para pesquisar qualquer sequência de teste contra sequências de anticorpos e de proteínas não relacionadas para encontrar correlações com a real imunogenicidade ex vivo.
[000114] A análise das sequências de ligante usando iTope™ foi realizada com a sobreposição de 9mers que abrangiam as sequência do ligante que foram testadas contra cada um dos 34 alelos do MHC de classe II. Cada 9mer foi pontuado com base no potencial 'encaixe' e interações com as moléculas do MHC de classe II. As pontuações dos peptídeos calculadas pelo software ficaram entre 0 e 1. Os peptídeos não da linhagem germinativa que produziram uma alta pontuação de ligação média (>0,55 na função de pontuação de iTope™) foram destacados e, se >50% dos peptídeos de ligação do MHC de classe II (isto é, 17 dos 34 alelos) tivessem uma alta afinidade de ligação (pontuação >0,6), esses peptídeos eram definidos como peptídeos de ligação ao MHC de classe II "promíscuos de alta afinidade" (que são considerados um alto risco para conter epítopos de células T CD4+). Os pep- tídeos com >50% dos peptídeos de ligação do MHC de classe II com uma pontuação >0,55 (mas sem uma maioria >0,6) foram definidos como peptídeos de ligação ao MHC de classe II "promíscuos de afini- dade moderada". Outra análise das sequências foi realizada usando o TCED™. As sequências foram usadas para interrogar o TCED™ pela pesquisa no BLAST a fim de identificar qualquer alta homologia de sequência entre os peptídeos (epítopos de células T) de proteínas não relacionados que estimularam respostas de células T em estudos anteriores de EpiScreen™.
[000115] As sequências usadas por Schneck et al. incorporavam dois ligantes, um no terminal N de HLA-A*02:01 para se ligar a uma sequência sinal no terminal N e um no terminal C para a fusão ao domínio VH do anti-CD28 (ver a FIGURA 9 por exemplo). Para o ligante N-terminal, a sequência foi analisada a partir do sítio de clivagem da sequência sinal através do ligante e incluindo os primeiros 8 aminoáci- dos da proteína madura de HLA-A*02:01. Para o ligante C-terminal, a sequência foi analisada a partir dos últimos 8 aminoácidos do domínio a3 de HLA-A*02:01, através da sequência do ligante e até os primeiros 8 aminoácidos do domínio VH do anti-CD28.
[000116] Os peptídeos com pontuações de ligação >0,6 (alta afinidade) se ligam a maioria (>17) dos alelos do MHC de classe II (denominados ligante promíscuo de alta afinidade). Os ligantes de afinidade moderada com uma pontuação de ligação entre 0,55 e 0,6 ligam >17 dos alelos do MHC de classe II. Descobriu-se que o ligante N-terminal continha duas sequências promíscuas de ligação ao MHC de classe II, uma de alta afinidade (com p1-âncora na posição 2) e uma de afinidade moderada (com p1-âncora na posição 4). Descobriu-se que o ligan- te C-terminal continha um peptídeo promíscuo de afinidade moderada de ligação ao MHC de classe II com p1-âncora na posição 11.
[000117] Uma busca no BLAST do banco de dados do epítopo de células T de Antitope (TCED™) foi realizada usando as mesmas sequências que as usadas na análise iTope™ para determinar qualquer homologia com os epítopos identificados anteriormente. O TCED™ é usado para pesquisar qualquer sequência de teste contra um grande banco de dados (> 10.000 peptídeos) derivado de sequências não relacionadas que foram testadas em ensaios de mapeamento de epítopo de células T EpiScreen™. Não foi encontrada nenhuma das sequências do ligante contendo nenhum 'hit' no TCED™.
[000118] iTope™ foi posteriormente usado para avaliar as alterações de sequência nos ligantes a fim de reduzir sua propensão à ligação ao MHC de classe II. Notou-se que o ligante N-terminal poderia ser removido inteiramente, tal que o terminal N do HLA-A*02:01 fosse fundido diretamente à sequência sinal fornecida no vetor PBFKsr ou a sua se-quência sinal natural. Isto garantiria que o terminal N da proteína de fusão conteria apenas a sequência da linhagem germinativa humana e evitaria o risco de epítopos de células T. Descobriu-se que as sequências de ligante recomendadas abaixo reduziam a ligação ao MHC de classe II aos níveis residuais básicos (<5 dos alelos ligados por qualquer 9mer), e forneciam sítios de restrição adequados para clonagem (embora ambas as sequências necessitassem de modificação do vetor):
Figure img0001
Exemplo 3: Otimização de sequências de códon e clonagem de expressão
[000119] Os códons foram otimizados usando GeneOptimizer®, e as sequências otimizadas foram clonadas para a expressão, conforme mostrado abaixo.
[000120] As sequências foram projetadas com sítios de restrição de PmeI, sequência de Kozak e peptídeo sinal para a expressão em células NS0. A tradução começa imediatamente a jusante da sequência de Kozak.
[000121] A sequência de aminoácidos traduzida completa da fusão de HLA-IgG4HC é mostrada na FIGURA 10.
[000122] A sequência traduzida de LC3 (VK3) é mostrada na FIGURA 11.
[000123] A sequência traduzida para HC1 é mostrada na FIGURA 12.
[000124] A sequência traduzida para HC2 é mostrada na FIGURA 13.
[000125] A microglobulina p2 humana também foi expressa. Exemplo 4: Expressão em células NS0
[000126] Com base em dados de afinidade do Biacore e em outras considerações, as combinações de cadeia pesada e cadeia leve de HC1::LC3 e HC2::LC3 foram selecionadas como os candidatos primários e secundários a mAb, respetivamente, para o desenvolvimento da linhagem celular StableFast-NS0.
[000127] O mapa do vetor fina para o vetor de expressão bicistrônico pBFksr::HC1::LC3 para a geração da linhagem celular STABLEFAST- NS0 está representado na FIGURA 14. A construção de pBF- ksr::HC2::LC3 foi feita usando as mesmas abordagens.
[000128] As células NS0 de origem foram expandidas em meio de crescimento sem soro complementado. Após o estabelecimento da cultura saudável, dez milhões de células (10x106) foram transfectadas com 45 pg de DNA do vetor de expressão linearizado (APvuI). As células foram deixadas se recuperar durante 24 horas em grande volume de meio de crescimento. Após a recuperação, as células foram lavadas em meio seletivo sem soro complementado (colesterol-), ressus- pensas no meio seletivo e distribuídas em placas de 40x96 poços a 200 pL por poço. A distribuição real foi de 1140 células/poço e 840 cé- lulas/poço para HC1::LC3 e HC2::LC3, respectivamente. As placas foram incubadas a 37°C, 5% de CO2 por 1 semana e alimentadas com meio seletivo complementado vermelho de fenol. Em duas semanas após a transfecção, inúmeros poços cresciam ativamente com base na mudança de cor de vermelho para amarelo.
[000129] Um total de 1.127 poços da transfecção de HC1::LC3 foi triado para a expressão de IgG humana por ELISA. Um total de 612 poços da transfecção de HC2::LC3 foi triado. Com base na concentração de IgG, um total de 290 a 101 linhagens celulares foi aumentado proporcionalmente até placas com 24 poços para HC1::LC3 e HC2::LC3, respectivamente. Um ensaio de produtividade de 24 horas foi usado para selecionar os melhores expressadores para análise posterior. Resumidamente, as placas com 24 poços foram triadas em 5x105 células em 500 pL de meio fresco. Após 24 horas, os sobrena- dantes foram triados por ELISA. Com base na concentração de IgG, um total de 60 e 24 linhagens celulares foi aumentado proporcionalmente até placas com 6 poços para HC1::LC3 e HC2::LC3, respectivamente.
[000130] Um ensaio de produtividade específico de 3 dias foi usado para selecionar os melhores expressadores para análise posterior. Resumidamente, as placas com 6 poços foram semeadas em 4x105 células em 1,5 mL de meio fresco. Após 3 dias, as células foram contadas e os sobrenadantes foram triados por ELISA. Com base na concentração de IgG e no crescimento, a taxa de produtividade específica média ou SPR em pg/célula/dia pode ser calculada. Com base na SPR relativa, um total de 20 e 10 linhagens celulares foi aumentado proporcionalmente até frascos T-75 para HC1::LC3 e HC2::LC3, respectivamente. O ensaio SPR de 3 dias foi repetido na escala de T-75 para selecionar as linhagens celulares finais para a adaptação à suspensão e aumento proporcional para a produção de mAb.
[000131] Cinco linhagens celulares para cada mAb foram aumenta- das proporcionalmente até cultura com agitador de 30 mL e reavaliadas para SPR e crescimento. Todas as linhas de suspensão foram agrupadas. A linhagem celular de melhor desempenho para cada mAb foi selecionada para cultura em rotação (spin) para produção em pequena escala.
[000132] Para a proteína de fusão HLA-IgG4, o vetor de expressão bicistrônico pBFksr::HLA-IgG4::LC3 foi construído para a geração da linhagem celular STABLEFAST-NS0. O mapa de vector é mostrado na FIGURA 15. Um cassette de expressão e o vetor contendo o gene da microglobulina p2 humana também foi criado para um vetor de expressão tricistrônico que codifica todas as três subunidades da proteína de fusão (fusão de cadeia pesada de HLA-IgG4 humana, cadeia leve de a-CD28 [LC3], e microglobulina p2 humana). O construto tricistrônico é mostrado na FIGURA 16. A expressão de todos os três genes foi confirmada na cultura de HEK293 transitória por ELISA e análises de Western Blot do sobrenadante. Exemplo 5: Caracterização Funcional
[000133] O anticorpo monoclonal humanizado contra CD28 foi testado quanto à sua capacidade de induzir a expansão de PBMCs recentemente isoladas em placas revestidas com mAb. Como mostrado em FIGURA 17, o anti-CD28 humanizado não é um superagonista.
[000134] O anticorpo monoclonal humanizado foi testado quanto à sua capacidade de corar a CD28 numa linhagem de células T humanas. Os resultados são mostrados na FIGURA 18. A FIGURA 18(A) mostra a coloração com mAb de CD28 anti-humano murino (clone 9.3, Isotipo IgG2a). Preto = células não coradas, vermelho = anti-IgG2a FITC, azul = anti-CD28 + anti-IgG2a FITC. A FIGURA 18(B) mostra a coloração com anti-CD28 humanizado (isotipo IgG4). Preto = células não coradas, vermelho = anti-IgG4 PE, azul = anti-CD28 (35 ng) + anti- IgG4 PE, roxo = antiCD28 (1 pg) + anti-IgG4 PE. A coloração com an- ticorpo anti-CD28 humanizado pode ser bloqueada com o mAb Clone 9.3 (não mostrado).
[000135] Após a purificação do HLA-Ig, a eficiência de carregamento do peptídeo antigênico é verificada por ELISA usando mAb anti-HLA dependente de conformação para capturar a proteína carregada de peptídeo (conforme descrito em Current protocols in Immunology capítulo 17.2). As eficiências de carregamento reprodutíveis de ~90% para peptídeos específicos (isto é, restrição de MHC correta) são previstas, em comparação a 0% para peptídeos não-específicos (isto é, incom-patibilidade de MHC).
INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA
[000136] Todas as patentes e publicações referidas neste documento estão incorporados em sua totalidade por meio deste por referência.

Claims (14)

1. Complexo de apresentação de antígeno, caracterizado pelo fato de que compreende duas sequências de aminoácidos da ca-deia pesada de imunoglobulina humana ou humanizada unidas por ligações dissulfeto, cada cadeia pesada sendo fundida acima da região de dobradiça com uma sequência de aminoácidos de HLA, em que o complexo não contém um domínio varável de ca-deia leve de imunoglobulina ou de cadeia pesada de imunoglobulina, em que o complexo de apresentação de antígeno compre-ende um peptídeo antigênico ligado ao HLA para apresentação às cé-lulas T e um peptídeo p2 de microglobulina, e em que o complexo de apresentação de antígeno está liga-do a uma nanopartícula formada de polímeros PLGA e PLGA-PEG e com um tamanho na faixa de 50 a 250 nm, a nanopartícula compreendendo ainda um ligante co-estimulador de linfócitos conjugado à superfície da nanopartícula, em que o ligante co-estimulador é um anticorpo anti-CD28 que compreende uma região variável de anticorpo monoclonal 9.3 de murino enxertada em um modelo de IGHV4-59 humano e modelo de IGKV4-01 humano, em que os resíduos da estrutura da cadeia pesada de murino são retidos em 5 ou mais posições com base na numeração de Kabat selecionada dentre 1, 3, 6, 37, 48, 67, 71, 73, 76, 78, 82, 82a e 82c e os resíduos da estrutura da cadeia leve de murinos são retidos em 3 ou mais posições selecionadas dentre 3, 4, 49 , 70, 85, 87 e 80.
2. Complexo de apresentação de antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência de ami- noácidos de HLA é HLA-A*02:01.
3. Complexo de apresentação de antígeno, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o peptídeo anti- gênico é um antígeno associado a tumor.
4. Complexo de apresentação de antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que é imobilizado através de uma cisteína não pareada no resíduo 473 com base na numeração de Kabat.
5. Complexo de apresentação de antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a nanopartícula é biodegradável.
6. Complexo de apresentação de antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que é conjugado à nanopartícula através de uma química de sulfidrila- maleimida.
7. Complexo de apresentação de antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a nano partícula tem um tamanho menor do que cerca de 200 nm.
8. Complexo de apresentação de antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a nanopartícula tem um tamanho menor do que cerca de 100 nm.
9. Complexo de apresentação de antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o complexo de apresentação de antígeno e o ligante co-estimulatório são conjugados a uma razão de 5:1 a 1:5.
10. Composição para induzir a formação de células T cito- tóxicas específicas para antígenos em um paciente, caracterizada pelo fato de que compreende o complexo de apresentação de antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9.
11. Composição, de acordo com a reivindicação 10, carac-terizada pelo fato de que o paciente é um paciente com câncer.
12. Composição, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizada pelo fato de que o paciente está passando ou foi subme-tido a terapia com um ou mais inibidores de checkpoint.
13. Complexo de apresentação de antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-CD28 compreende a sequência variável de aminoácidos de cadeia pesada apresentada na SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, e a sequência variável de aminoácidos de cadeia leve apresentada na SEQ ID NO: 12.
14. Uso de um complexo de apresentação de antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de uma composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 10 a 12, para induzir a formação de células T citotóxicas específicas para o antígeno em um paciente.
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