KR102453188B1 - 면역요법을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

면역요법을 위한 조성물 및 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102453188B1
KR102453188B1 KR1020217034171A KR20217034171A KR102453188B1 KR 102453188 B1 KR102453188 B1 KR 102453188B1 KR 1020217034171 A KR1020217034171 A KR 1020217034171A KR 20217034171 A KR20217034171 A KR 20217034171A KR 102453188 B1 KR102453188 B1 KR 102453188B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
ser
val
poly
gly
leu
Prior art date
Application number
KR1020217034171A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20210130268A (ko
Inventor
브루스 멕크레디
티모시 데이비드 존스
프란시스 조셉 카
Original Assignee
넥스이뮨, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 넥스이뮨, 인크. filed Critical 넥스이뮨, 인크.
Publication of KR20210130268A publication Critical patent/KR20210130268A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102453188B1 publication Critical patent/KR102453188B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1774—Immunoglobulin superfamily (e.g. CD2, CD4, CD8, ICAM molecules, B7 molecules, Fc-receptors, MHC-molecules)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001154—Enzymes
    • A61K39/001156—Tyrosinase and tyrosinase related proteinases [TRP-1 or TRP-2]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001184—Cancer testis antigens, e.g. SSX, BAGE, GAGE or SAGE
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001184—Cancer testis antigens, e.g. SSX, BAGE, GAGE or SAGE
    • A61K39/001186—MAGE
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001184—Cancer testis antigens, e.g. SSX, BAGE, GAGE or SAGE
    • A61K39/001188—NY-ESO
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/00119—Melanoma antigens
    • A61K39/001191—Melan-A/MART
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/00119—Melanoma antigens
    • A61K39/001192—Glycoprotein 100 [Gp100]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/44—Antibodies bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
    • A61K47/6931—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer
    • A61K47/6935—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer the polymer being obtained otherwise than by reactions involving carbon to carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamides or polyglycerol
    • A61K47/6937—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer the polymer being obtained otherwise than by reactions involving carbon to carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamides or polyglycerol the polymer being PLGA, PLA or polyglycolic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C07K16/464—Igs containing CDR-residues from one specie grafted between FR-residues from another
    • C07K16/465—Igs containing CDR-residues from one specie grafted between FR-residues from another with additional modified FR-residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/605—MHC molecules or ligands thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6093—Synthetic polymers, e.g. polyethyleneglycol [PEG], Polymers or copolymers of (D) glutamate and (D) lysine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/18—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with another compound as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.18)
    • C12Y114/18001—Tyrosinase (1.14.18.1)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 항원-특이적 T 세포를 유도하기 위한 보관 안정성 약제학적 조성물을 포함하는, 면역요법용 조성물 및 방법을 제공한다. 그와 같은 조성물은 인공 항원-표출 세포(aAPC)의 성분으로 사용되어 환자에게 항원(예를 들면, 종양 항원)을 표출하기 위한 복합체 및/또는 T 세포 공동자극인자 분자를 제공한다.

Description

면역요법을 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR IMMUNOTHERAPY}
우선권
본원은 2013년 6월 24일자로 출원된 미국 가출원 번호 61/838,547, 및 2014년 3월 6일자로 출원된 미국 가출원 번호 61/948,916의 이익 및 우선권을 청구하며, 이는, 이의 전체가 본원에 참고로 편입되어 있다.
발명의 분야
본 발명은 면역요법에 유용한 약제학적 조성물을 포함하는 조성물, 및 방법에 관한 것이다.
배경
항원-표출 세포(APC)는 이의 표면 상에 주요 조직접합성 복합체(MHC) 단백질과의 복합체에서 항원성 펩타이드를 프로세싱하고 나타내는 세포이다. 효과기 세포, 예컨대 T-세포는 수용체, 예컨대 T-세포 수용체(TCR)를 사용하여 이들 펩타이드-MHC(pMHC) 복합체를 인식할 수 있다.
수지상 세포(DC)는 자극되어 항원을 효과적으로 제시하고 면역 효과 세포의 팽창(expansion)을 지지함으로써 항원에 대한 세포독성 반응을 활성화시킬 수 있는 항원-표출 세포의 예이다. 일부 면역요법에서, DC는 환자로부터 수거되어 항원으로 펄스되거나 바이러스 벡터로 형질감염된다. 환자내로 다시 수혈 시, 이들 활성화된 세포는 효과기 림프구(예를 들면, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 및 B 세포)에 대해 종양 항원을 나타낸다. 적절하게 실행되는 경우, 당해 요법은 세포 발현 항원(종양 항원을 포함함)에 대해 세포독성 반응을 개시할 수 있다.
그러나, 많은 면역요법과 같은 DC 면역요법은 유의미한 제한에 직면해있다. 예를 들면, 생체외(ex vivo)에서 검출가능한 백신접종된 암 환자에서 강하고 항원-특이적인 T 세포 반응과 단지 약한 임상 반응 사이에는 불일치가 존재한다[참조: Janikashvili N 등, Personalized dendritic cell-based tumor immunotherapy. Immunotherapy 2010 Jan. 1; 2(1):57].
항원-특이적 면역요법을 포함하는 면역요법에 대해 효과적인 조성물(보관-안정성 약제학적 조성물) 및 방법에 대한 요구가 남아있다.
발명의 간단한 설명
본 발명은 환자에서 항원-특이적 T 세포를 유도하기 위한 보관 안정성 약제학적 조성물을 포함하는, 면역요법을 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 이러한 조성물은 예를 들면, 암 및 감염성 질환의 치료에 유용하다. 일부 측면에서 상기 조성물은 이의 표면 상에 항원-표출 복합체 및 임의로 T 세포 공통-자극 신호를 가짐으로써, 환자에게 항원-특이적 T 세포의 활성화를 위한 적절한 맥락에서 하나 이상의 항원(예를 들면, 종양 항원(들))을 표출하는 분자 복합체를 제공하는 약제학적으로 허용되는 비드(bead) 또는 입자를 포함하는, 인공 항원-표출 세포(aAPC)이다. 비드 또는 입자는 순환 특성, 생체분포, 및 분해 동력학뿐만 아니라 활성을 포함하는 약동학적 이점을 제공하도록 설계된다. 이러한 파라미터는 특히 크기, 표면 전하, 폴리머 조성물, 리간드 콘주게이션 화학(ligand conjugation chemistry)을 포함한다.
일부 구현예에서, T-세포 공통자극 신호는 항-CD28 항체 또는 이의 일부이며, 이는 IgG, IgD, IgA, 또는 IgM 아이소타입으로부터 선택된 서열을 포함하는 인간 중쇄 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 면역글로불린 서열은 인간 IgG 불변(constant) 및 가변 서열을 포함한다. 프레임워크(FW) 서열은 개질되어 중요한 또는 바람직한 쥣과 프레임워크 잔기를 함유함으로써 항원-결합 부위(들)의 완전성을 유지할 수 있다. 상보성 결정 영역(CDR)은 쥣과 항체 아미노산 서열(예를 들면, 9.3 mAb), 또는 이들 중 많은 것이 공지되어 있는 다른 CD28 결합 서열을 기준으로 한다. 일부 구현예에서, 항체 중쇄는 인간 IGHV4(예를 들면, IGHV4-59) 생식계열 FW의 변이체이다. 일부 구현예에서, 상기 항체는 경쇄를 포함하며 당해 경쇄는 인간 IGKV4-01 FW의 변이체이다. 항체는 불변 영역을 포함할 수 있으며 당해 불변 영역은 인간 IgG4 또는 이의 변이체일 수 있다.
공동자극인자 분자는 항원-표출 분자 복합체와 함께 고형 지지체에 접합되어, 항원-특이적 T 세포를 유도할 수 있다. 항원-표출 분자 복합체는 MHC 제I 부류 및/또는 제II 부류 복합체, 또는 항원-결합 클레프트(antigen-binding cleft)를 포함하는 이의 일부를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 분자 착물은 하나 이상의 HLA 아미노산 서열(예를 들면, HLA의 세포외 도메인 또는 이의 항원-표출 부위를 포함함)을 포함하며, 이는 추가의 서열, 예컨대 면역글로불린 서열, 또는 다른 이합체화 또는 안정화 서열을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, HLA-Ig 이합체화 융합체는 안정성 및/또는 결합 친화도에 있어서 이점을 제공한다.
따라서, 일부 구현예에서, 본 발명은 T 세포에 대한 항원의 표출을 위한 비드- 또는 입자-접합된 분자 착물을 제공하며, 여기서, 당해 복합체는 제I 부류 또는 제II 부류 항원 결합 크레프트, 또는 이의 일부를 형성하는 아미노산 서열을 포함한다. 항원-표출 복합체의 아미노산 서열은 이종 서열에 대한 융합체를 포함함으로써 예를 들면, 안정성, 친화성, 및 입체 이점을 제공한다. 일부 구현예에서, 이종 서열은 면역글로불린 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 분자 복합체는 이종 서열, 예컨대 면역글로불린 서열에 융합된 HLA(예를 들면, HLA-A2) 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역글로불린은 인간 중쇄 면역글로불린 서열(예를 들면, IGVH4)을 포함하며, 이는 면역글로불린 불변 서열을 포함함으로써 이합체 HLA를 제공하고, 임의로 가변 영역 서열을 포함할 수 있다. 가변 서열은 존재하는 경우, 임의로 개질되어 강력한 항원 결합을 감소시키거나 제거할 수 있으며, 임의로 쥣과 FW 잔기를 가지지 않을 수 있다. HLA 아미노산 서열은 HLA-A*02:01(IMGT 수탁 번호 HLA00005) 또는 이의 유도체일 수 있다.
T 세포 공통자극 리간드 및/또는 항원-표출 복합체(뿐만 아니라 표적화 리간드를 포함하는, 본원에 개시된 다른 리간드)는 생체외 또는 생체내 항원 제시 및 항원-특이적 T 세포 활성화를 위해 고체 지지체에 접합될 수 있다. 일부 구현예에서, 고형 지지체는 커플링 리간드에 대해 표면 작용기를 지닌 비드 또는 입자(예를 들면, PLGA 또는 PLGA-PEG 입자)이다. 당해 입자는 순환 특성, 생체분포, 및 분해 동력학뿐만 아니라 활성도 제공하도록 설계된다. 이러한 파라미터는 특히 크기, 표면 전하, 폴리머 조성물, 리간드 콘주게이션 화학, 리간드 밀도를 포함한다.
다양한 구현예에서, 약제학적 조성물은 T 세포에 대한 표출을 위한 항원성 펩타이드를 추가로 포함할 수 있으며, 리간드-접합된 비드 또는 입자와 함께 동시-제형화될 수 있다. 다양한 구현예에서, 약제학적 조성물은 보관 안정성(shelf stable)이며, 투여 전에 재구성을 위해 동결건조된 형태로 제공될 수 있거나, 달리는 환자에게 투여하기에 다른 편리한 양식(예를 들면, 비경구 투여에 의해)으로 제공될 수 있다.
본원에 기재된 약제학적 조성물은 효과적인 양의 조성물을 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 면역요법, 예를 들면, 항원-특이적 세포독성 T 세포의 형성을 유도하기 위한 방법에서 유용하다. 특히, 항원-표출 플랫폼(antigen presenting platform)이 감염성 질환, 암, 또는 자가면역 질환을 치료하거나 면역억제된 환자에 대한 예방적 보호를 제공하는데 유용할 수 있다.
본 발명은 추가로, 본원에 기재된 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드뿐만 아니라 이를 발현하는 숙주세포도 포함한다.
본 발명은 하기 비-제한적인 예에 의해 추가로 실증된다.
본 발명의 세부사항은 첨부된 설명 및 하기 특허청구범위와 함께 설정된다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동일한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있다고 해도, 예증적인 방법 및 물질이 이제 기재된다. 본 발명의 다른 특징, 목적, 및 이점은 설명 및 특허청구범위로부터 명백할 것이다. 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서, 단수 형태는 또한 맥락에서 달리 명확히 나타내지 않는 한 복수를 포함한다. 다르게 정의되지 않으면, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어들은, 본 발명이 속한 당해분야의 숙련가에 의해 공통적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
도 1 내지 3은 항-CD28에 대한 3개의 인간화된 가변 중쇄 서열을 나타낸다.
도 4 내지 6은 항-CD28에 대한 3개의 인간화된 가변 경쇄 서열을 나타낸다.
도 7은 개질된 불변 중쇄 서열을 나타낸다.
도 8은 불변 κ 경쇄 서열을 나타낸다.
도 9는 HLA 융합체를 작제하기 위한 인간화된 비-CD28-결합 가변 영역을 나타낸다.
도 10은 인간화된 HLA-IgG4HC에 대한 아미노산 서열을 나타낸다.
도 11은 경쇄 3(LC3, 또는 Vκ3)에 대한 아미노산 서열을 나타낸다.
도 12는 중쇄 1(HC1)에 대한 아미노산 서열을 나타낸다.
도 13은 중쇄 2(HC2)에 대한 아미노산 서열을 나타낸다.
도 14 내지 16은 STABLE FAST-NS0 세포주내에서 발현시키기 위한 발현 작제물을 나타낸다.
도 17은, 인간화된 항-CD28 mAb가 슈퍼-작용제가 아님을 나타낸다.
도 18은 인간화된 항-CD28 클론이 인간 T-세포주에서 CD28을 특이적으로 염색함을 나타낸다. 도 18(A): 쥣과 항-인간 CD8 mAb(클론 9.3, 아이소타입 IgG2a)로 염색됨; FIG18(B): 인간화된 항-CD28(아이소타입 IgG4)로 염색됨.
발명의 상세한 설명
하기 약어가 전체적으로 사용된다: BLAST-기반 국소 정렬 조사 도구(Basic Local Alignment Search Tool), CDR-상보성 결정 영역, Cκ-카파 경쇄 불변 영역, Fc-항체 단편 결정화가능한 영역, Fw-프레임워크 영역(가변 영역의), HLA-인간 백혈구 항원, MHC-주요 조직접합성 복합체, VH-가변 중쇄, Vκ-가변 카파 경쇄, 및 V 영역-항체의 가변 영역, VH 또는 Vκ.
본 발명은 환자에서 항원-특이적 T 세포를 유도하기 위한 보관 안정성 약제학적 조성물을 포함하는, 면역요법용 조성물 및 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 이합체성 HLA 항원-표출 복합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 인공 항원-표출 세포(aAPC) 상에서 리간드의 성분으로서 사용됨으로써 환자에게 하나 이상의 항원(예를 들면, 종양 항원(들)) 및 임의로 하나 이상의 공통자극 신호를 표출하기 위한 이합체성 분자 복합체를 제공할 수 있는, 인간화된 면역글로불린 서열 또는 그것의 일부를 포함한다. 이하에서 보다 상세히 기재된 바와 같이, 항원-표출 플랫폼은 인공 고형 지지체, 예컨대 라텍스 또는 폴리머 비드 또는 입자를 포함하는 약제학적으로 허용가능한 지지체를 기반으로 할 수 있다.
일부 구현예에서, T-세포 공통자극 신호는 항-CD28 항체 또는 이의 일부이다. 일부 구현예에서, 항-CD28 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, 또는 IgM로부터 선택된 적어도 하나의 인간 면역글로불린 아이소타입을 포함한다. 예를 들면, 항-CD28 항체는 IgG 아이소타입일 수 있으며, 하나 이상의 IgG 생식계열 프레임워크 서열의 서열을 함유할 수 있다. 예를 들면, 항-CD28는 인간 IGHV4 중쇄 아미노산 서열을 함유할 수 있으며, 이는 1 내지 15개의 아미노산 변형으로 변형될 수 있다. 상기 변형은 쥣과 프레임워크 잔기를 포함함으로써 항원 결합 부위(들)의 완전성을 지지할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 상보성 결정 영역(CDR)은 쥣과 항체 아미노산 서열을 기반으로 하며, 이는 임의로 1 내지 10개, 예컨대 1 내지 5개의 아미노산 변형을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 1, 2, 3, 또는 그 이상의 CDR은 마우스 9.3 mAb(참조: Tan 등, J. Exp. Med. 1993 177:165)를 기반으로 하며, 이는 공공연하게 이용가능하다. 예시적인 CDR은 도 1 내지 6에 나타나 있다. 일부 구현예에서, 항체는 9.3 mAb의 완전한 세트의 중쇄 및/또는 완전한 세트의 경쇄 CDR을 갖는다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 중쇄 가변 영역은 1, 2 또는 3개의 하기 CDR을 함유하며, 이는 임의로 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 결실, 또는 부가에 의해 각각 변형될 수 있다: CDR1(DYGVH), CDR2(VIWAGGGTNYNSALMS), 및 CDR3(DKGYSYYYSMDY). 일부 구현예에서, 경쇄 가변 영역은 1, 2 또는 3개의 하기 CDR을 함유하며, 이들 각각은 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 결실, 또는 부가에 의해 변형될 수 있다: CDR1(RASESVEYYVTSLMQ), CDR2(AASNVES), 및 CDR3(QQSRKVPYT).
대안적인 CDR 서열, 가변 영역, 또는 CD28-결합 리간드를 다양한 구현예에서 이용할 수 있다. 대안적인 리간드 및 항체는 예를 들면, 미국 특허 7,612,170, 미국 특허 6,987,171, 및 미국 특허 6,887,466에 기재되어 있으며, 이들 개시내용은, 이의 전문이 본원에 참고로 편입된다.
일부 구현예에서, 항체 중쇄는 인간 IGHV4-59 생식계열 프레임워크(FW)의 변이체를 포함하며, 이는 변형되어 5 내지 15개의 쥣과 FW 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 경쇄 아미노산 서열을 포함하며, 당해 경쇄 서열은 인간 IGKV4-01 FW 서열의 변이체일 수 있고, 이는 3 내지 15개의 쥣과 FW 잔기를 포함하도록 변형될 수 있다.
항-CD28 인간 중쇄 서열은 변형되어 1, 3, 6, 37, 48, 67, 71, 73, 76, 78, 82, 82a, 및 82c번(카밧 넘버링(Kabat numbering)을 기반으로 함)의 위치에서 예를 들면, 하나 이상의(예를 들면, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 또는 모든) 쥣과 Fw 잔기를 포함할 수 있다. 이들 위치에서 쥣과 Fw 잔기는 9.3 mAb로서 존재할 수 있다. 경쇄는 변형되어 3, 4, 49, 70, 85, 87, 및 80번 위치에서 하나 이상(예를 들면, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 또는 모든) 쥣과 Fw 잔기를 포함할 수 있다. 선택된 쥣과 Fw 잔기는 항원-결합 부위의 완전성을 지지할 수 있다. 인간화된 항-CD28 항체는 CD28에 대한 친화성 및 9.3 mAb의 T 세포 공통자극 활성을 유지하며, 9.3 mAb보다 CD28 결합에 대해 적어도 40%, 50%, 75%, 80%, 90%, 및 일부 구현예에서 100% 이상 더 효과적이다. 다양한 구현예에서, 항-CD28 mAb는 슈퍼 작용제가 아니다.
항체는 불변 영역을 포함할 수 있으며 당해 불변 영역은 어떠한 아이소타입일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 항체 불변 영역은 인간 IgG4 또는 이의 변이체이다. 일부 구현예에서, 상기 불변 영역은 하나 이상의 힌지 안정화 돌연변이를 포함하며, 이는 CH 쇄(예를 들면, P로 치환될 수 있는 S241)내에 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 불변 영역을 포함하며 당해 불변 영역은 항체를 고형 지지체에 화학적으로 커플링시키기에 적합한 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 커플링에 적합한 하나 이상의 돌연변이는 아미노산 측쇄 작용기(예를 들면, 티올, 아민, 또는 하이드록실), 예컨대 쌍으로 되지 않은 된 시스테인(예를 들면, S473에서)을 생성할 수 있다. 불변 영역에 대한 다른 변화는 Fc 감마 수용체 결합을 감소시키기 위한 변형을 포함한다. 예를 들면, CH 쇄은 L248, 예를 들면, L248E에서 변형될 수 있다.
일부 구현예에서, 항체는 항체 단편, 예컨대 F(ab')2 또는 Fab이거나, 일본쇄 항체, 또는 다른 항원-결합 항체 단편이다. 예를 들면, 항체 단편은 본원에 기재된 인간화된 mAb 또는 다른 항-CD28의 일본쇄 가변 단편일 수 있다.
일부 구현예에서, 공동자극인자 분자는 항CD28 mAb, 예컨대 본원에 기재된 항체의 VH 및 VL 쇄에 의해 형성된 항원 결합 루프를 포함하거나 이로써 필수적으로 이루어진 일본쇄 가변 단편(scFv)이다. scFv 항체 작제물은 짧은 펩타이드 링커에 의해 헤드-헤드 또는 헤드-테일 입체배치로 함께 연결된 1개 또는 수 개(2, 3, 4, 또는 5)의 VH 및 VL 초가변 영역 쇄(함께 3-D 항원성 에피토프 결합 포켓(antigenic epitope binding pocket))를 포함할 수 있다. 그와 같은 작제물은 이들의 더 작은 크기로 인하여 완전한 합성 경로를 통해 편리하게 생산될 수 있다. 게다가, scFv는 면역원성에 대해 더 낮은 포텐셜을 나타낼 수 있다.
다른 구현예에서, 공통자극 리간드는 공동자극인자 분자 리간드 또는 억제 리간드의 scFv에 결합된 하나 이상의 HLA 분자를 포함하는 이중특이적 작제물이다. 항원-표출 복합체 및 공통자극 또는 억제 리간드는 이중특이적 작제물이 나노입자 표면에 공유 연결되도록 하는 펩타이드 테터(tether)를 통해 접합될 수 있다. 일부 구현예에서, 그와 같은 작제물은 NP 표면에 독립적으로 각각 연결된 HLA 및 공통자극 또는 억제 리간드의 보다 큰 작제물을 함유함으로써 제조 이점을 제공하는 나노입자와 동일한 활성을 생산한다.
공동자극인자 분자는 항원-표출 분자 복합체를 지닌 고형 지지체에 접합되어, 항원-특이적 T 세포를 유도할 수 있다. 항원-표출 분자 착물은 MHC 제I 부류 및/또는 제II 부류 복합체, 또는 항원-결합 클레프트를 포함하는 이의 일부를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 분자 착물은 1 또는 2개의 HLA 아미노산 서열을 포함하며, 이는 추가의 이종성 서열, 예컨대 면역글로불린 서열을 함유할 수 있다. 대안적인 이종성 서열은 이합체화 아미노산 서열, 예컨대 c-fos 및 c-jun을 포함한다. 일부 구현예에서, HLA-융합체는 안정성 및/또는 결합 친화도에 있어서 추가의 이점을 제공한다.
다양한 구현예에서, 항원-표출 복합체는 MHC 제I 부류 분자 착물 또는 MHC 제II 부류 분자 착물, 또는 대안적으로 CD1d이다. MHC 제I 부류 분자 착물은 적어도 2개의 융합 단백질을 포함할 수 있다. 제1 융합 단백질은 제1 MHC 제I 부류 α쇄 및 제1 면역글로불린 중쇄를 포함하며 제2 융합 단백질은 제2 MHC 제I 부류 α쇄 및 제2 면역글로불린 중쇄를 포함한다. 제1 및 제2 면역글로불린 중쇄는 연합하여 MHC 제I 부류 분자 복합체를 형성한다. MHC 제I 부류 분자 착물은 제1 MHC 제I 부류 펩타이드 결합 클레프트 및 제2 MHC 제I 부류 펩타이드 결합 클레프트를 포함한다. MHC 제II 부류 분자 복합체는 적어도 4개의 융합 단백질을 포함할 수 있다. 2개의 제1 융합 단백질은 (i) 면역글로불린 중쇄 및 (ii) MHC 제IIβ 쇄의 세포외 도메인을 포함한다. 2개의 제2 융합 단백질은 (i) 면역글로불린 경쇄 및 (ii) MHC 제IIα 쇄의 세포외 도메인을 포함한다. 2개의 제1 및 2개의 제2 융합 단백질은 연합하여 MHC 제II 분자 복합체를 형성한다. 각각의 제1 융합 단백질의 MHC 제IIβ 부류 쇄의 세포외 도메인 및 각각의 제2 융합 단백질의 MHC 제IIα 쇄의 세포외 도메인은 MHC 제II 펩타이드 결합 클레프트(cleft)를 형성한다. 항원성 펩타이드는 펩타이드 결합 클레프트에 결합된다. 다양한 구현예에서, 면역글로불린 서열은 힌지 영역을 포함함으로써 이합체화를 지지하는 부분 중쇄 서열이다.
일부 구현예에서, 항원-표출 복합체는 나노입자에 대한 접합을 위해, 가공되어 쌍으로 되지 않은 된 시스테인을 함유하거나, 천연 발생의 쌍으로 되지 않은 된 시스테인을 사용하는 합성 또는 재조합 HLA 단량체이다. 게다가, 공통자극 신호(또는 다른 항체-기반 리간드)는 Fab 또는 scFv일 수 있다. 그와 같은 구현예에서, 2개의 신호는 목적함 수용체에 결합하는 항원 결합 항체 단편(예를 들면, scFv)에 테터된 HLA 분자를 포함하는 단일의 다작용성 작제물내에서 조합될 수 있다.
다른 측면 및 구현예에서, 본 발명은 T 세포에 대한 항원의 표출을 위한 비드- 또는 입자-접합된 분자 복합체를 제공하며, 여기서 상기 복합체는 항원-표출 서열에 융합된 인간화된 면역글로불린 서열 또는 이의 일부, 예를 들면, HLA 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 면역글로불린 서열은 인간 중쇄 서열(예를 들면, IGHV4 프레임워크)이다. 가변 영역은 CD28, 또는 다른 인간 단백질에 대한 항원 결합 활성을 포함하지 않는다. HLA 아미노산 서열은 HLA-A*02:01(IMGT 수탁 번호 HLA00005) 또는 이의 유도체 또는 단편, 예컨대 1 내지 10개, 또는 1 내지 5개의 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입을 갖는 유도체일 수 있다. 인간화된 면역글로불린 서열은 또한 HLA과 면역글로불린 서열 사이에 링커 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 링커는 면역원성을 결여한다. 분자 착물은 β2-마이크로글로불린 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다.
다양한 구현예에서, 면역글로불린 융합 서열은 IgG, IgD, IgA, 또는 IgM 아이소타입이며, 어떠한 인간 생식계열 프레임워크로부터도 유도될 수 있다. 생식계열 프레임워크는 IGHV4(예를 들면, IGHV4-59)를 포함하며, 이는 항-CD28과 관련하여 기재된 하나 이상의 쥣과 프레임워크 잔기들을 함유할 수 있거나 함유하지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 기재된 항-CD28 항체의 중쇄(쥣과 프레임워크 잔기가 존재하거나 존재하지 않음)는 당해 측면에 따라서 HLA에 융합되며, 그와 같은 구현예에서, 가변 영역은 개질되어 CD28 결합을 감소시키거나 제거한다.
일부 구현예에서, HLA 융합 작제물은 가변 쇄 서열을 함유하지 않는다. 예를 들면, HLA 또는 항원-표출 복합체는 힌지 영역(hinge region) 위에서 Ig 불변 영역 서열에 융합되어 이합체 HLA를 제공할 수 있다. 예를 들면, HLA 또는 이의 항원-표출 부위는 각각의 IgG 중쇄의 CH1 부위에 접합될 수 있다. 모든 IgG 분자는 힌지 영역(상부 및 하부)내에서 디설파이드 결합에 의해 함께 결합된 2개의 동일한 중쇄(불변 및 가변 영역)로 이루어질 수 있다. 예를 들면, 일부 구현예에서, HLA 분자 또는 항원-표출 복합체는 CH1(힌지 영역 상부의 IgH 쇄의 N-말단)에 융합됨으로써 어떠한 VH 및 VL 경쇄 서열의 결여로 인해 보다 작은 이합체 융합 단백질을 생성할 수 있다. 그와 같은 작제물은 제조 이점을 제공할 뿐만 아니라 면역원성에 대한 잠재능을 나타내지 않는다.
또 다른 구현예에서, 항원-표출 복합체(예를 들면, HLA 서열)는 Ig 융합 파트너를 함유하지 않으며, 단량체성이다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 항원-표출 복합체 또는 HLA 분자(예를 들면 HLA-A2 등)의 C-말기 말단은 고체/반-고체 기질, 예컨대 합성 나노입자(예를 들면 PLGA-PEG-말레이미드 블록 폴리머, 또는 본원에 기재된 다른 입자) 상에서 작용기(예를 들면 말레이미드 잔기)에 대한 부위-지시된 결합에 적합한 펩타이드 테터 서열을 함유한다. 테터 서열은 어떠한 적합한 서열도 함유할 수 있으며, 이는 주로 친수성 잔기, 예컨대 Gly, Ser, Ala, 및 Thr, 예컨대 GGGSG 또는 AAAGG의 2, 3, 4, 또는 5개의 반복체와, 약 5 내지 약 15개(또는 약 5 내지 약 10개의 아미노산)의 테터내 어느 위치에 편입된 시스테인 잔기로 주로 구성될 수 있다. 시스테인 잔기는 분자내 디설파이드 결합을 형성하지 않는 것으로 예상된 부위에서 편입되어야 한다.
일부 구현예에서, HLA-Ig 융합체 또는 다른 HLA 작제물은 T 세포에 대한 표출을 위해 HLA에 결합된 항원성 펩타이드를 추가로 포함한다. 항원성 펩타이드는 하나 이상의 티로시나제, hTERT, MAGE-1, MAGE-3, gp-100, NY-ESO-1, Melan A/Mart-1, HPV 16-E7, gp75/브라운, BAGE, 및 S-100의 항원성 부위 및/또는 제I 부류 또는 제II 부류 복합체에 의한 표출을 위해 WO 2004/006951에 기재된 어떠한 항원성 펩타이드를 포함할 수 있으며, 이들의 내용은 그 전체가 참고로 본원에 편입된다. HLA 복합체는 고형 지지체, 예컨대 임의로 공통자극 신호를 지닌 T-세포에 대한 항원의 표출을 위해, 기술된 바와 같은 비드 또는 입자에 부착될 수 있다.
항원-표출 복합체와 함께 제공될 수 있는 다른 신호는 하기를 포함한다: CD80(B7-1), CD86(B7-2), B7-H3, 4-1BBL, CD27, CD30, CD134(OX-40L), B7h(B7RP-1), CD40, LIGHT(또는 그와 같은 분자 또는 그것의 활성 부위의, 본원에 기재된 바와 같이 임의로 인간화된, Ig 융합체), HVEM에 특이적으로 결합하는 항체, CD40L에 특이적으로 결합하는 항체, OX40에 특이적으로 결합하는 항체, Fas에 특이적으로 결합하는 항체, PD1에 특이적으로 결합하는 항체, GITR에 특이적으로 결합하는 항체, 및 4-1BB에 특이적으로 결합하는, 항체.
본 발명의 항원-표출 플랫폼에 유용한 부착 분자는 T 세포 또는 T 세포 전구체에 대한 플랫폼의 부착을 매개할 수 있다. 본 발명에서 유용한 부착 분자는 예를 들면, ICAM-1 및 LFA-3을 포함한다.
T 세포 성장 인자는 T 세포의 증식 및/또는 분화에 영향을 미친다. T 세포 성장 인자의 예는 사이토카인(예를 들면, 인터루킨, 인터페론) 및 초항원을 포함한다. 특히 유용한 사이토카인은 IL-2, IL-4, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, 및 감마 인터페론을 포함한다. T 세포 성장 인자는 비드 또는 입자 속에 캡슐화될 수 있거나 표면에 화학적으로 접합되거나 흡착될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 나노입자는 입자(예를 들면, 화학요법제, 사이토카인 또는 인터루킨, 예컨대 IL-2, T 세포를 유인하는 CCL9와 같은 케모카인, 및/또는 항-PD1 항체 또는 항-PD1 펩타이드와 같은 체크포인트 억제제 분자)의 소수성 코어에 갇힌 치료적 화합물 또는 단백질/펩타이드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 그와 같은 aAPC는 자극 또는 억제 뿐만 아니라 재프로그래밍을 위해 특이적인 세포를 표적화하도록 작제된다. 일부 구현예에서, 갇힌 화합물은 입자 매트릭스의 분해에 의해 방출된다. 그와 같은 aAPC는, 오프-표적(off-target) 상호작용으로 인하여 원치않는 활성을 제한함으로써 병용 요법이 보다 내성이고 효능성이 되도록 할 수 있다.
본 발명의 측면에 따라 표출된 항원은 종양 연관된 항원을 포함한다. 종양-연관된 항원은, 이들이 유도되는 종양에 의해 배타적으로 발현되어, 많은 종양에서 발현된 종양 항원을 공유하지만 정상의 성체 조직(종양태아 항원, 암/고환 항원)에서는 공유되지 않는 독특한 항원, 및 종양이 발생하는 정상의 조직에 의해 또한 발현된 조직-특이적인 항원을 포함한다. 종양-연관된 항원은, 예를 들면, 배아 항원, 비정상의 해독 후 변형을 지닌 항원, 분화 항원, 돌연변이된 종양유전자 또는 종양 억제제의 생성물, 융합 단백질, 또는 종양바이러스 단백질일 수 있다. 다양한 종양-연관된 항원이 당해기술에 공지되어 있으며, 이들 중 많은 것이 상업적으로 이용가능하다. 종양태아 및 배아 항원은 암종배아 항원 및 알파-태아단백질(보통 발달하는 배아내에서 크게 발현될 뿐 아니라 간, 및 결장 각각의 종양에 의해 흔히 크게 발현되는), 태반 알칼리성 포스파타제 시알릴-루이스 X(선암종에서 발현됨), CA-125 및 CA-19(위장, 간, 및 부인과 종양에서 발현됨), TAG-72(결직장 종양에서 발현됨), 상피성 당단백질 2(많은 암종에서 발현됨), 췌장 종양태아 항원, 5T4(위 암종에서 발현됨), 알파 태아단백 수용체(다중 종양 유형, 특히 유선 종양에서 발현됨), 및 M2A(생식세포 신조직형성에서 발현됨)를 포함한다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원은 암/고환(CT) 항원이며, 이는 NY-ESO-1, MAGE-A, B, 및 C, CTAG-1, CTAG-45, GAGE, 및 SSX를 포함할 수 있고, 이들은 고환의 생식세포에 의해 일반적으로 발현되지만 정상의 성인 체세포 조직에서는 발현되지 않는다. 그러나, 흑색종, 유방, 간, 폐, 난소, 및 호지킨 림프종을 포함하는 수많은 유형의 암 세포가 CT 항원을 발현하는 것으로 밝혀져 왔다.
종양-연관된 분화 항원은 티로시나제(흑색종에서 발현됨) 및 특히 표면 면역글로불린(림프종에서 발현됨)을 포함한다.
돌연변이된 종양유전자 또는 종양-억제제 유전자 생성물은 Ras 및 ρ53을 포함하며, 이 둘 모두는 많은 종양 유형, Her-2/neu(유방 - 및 부인과 암에서 발현됨), EGF-R, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 망막모세포종 유전자 생성물, myc(폐암과 연관됨), ras, 유방 종양과 연관된 p53 비변종, MAGE-1, 및 MAGE-3(흑색종, 폐, 및 다른 암과 연관됨)에서 발현된다.
다른 종양 항원은 만성 골수 백혈병에서 발현된, 융합 단백질, 예컨대 BCR-ABL, 및 종양바이러스 단백질, 자궁경부 암종에서 발견된, 예컨대 HPV 유형 16, E6, 및 E7을 포함한다. 조직-특이적 종양 항원은 멜라노트랜스페린 및 MUCl(췌장 및 유방암에서 발현됨); CD 10(이전에 공통의 급성 림프아구성 백혈병 항원, 또는 CALLA로서 공지됨) 또는 표면 면역글로불린(B 세포 백혈병 및 림프종에서 발현됨); IL-2 수용체, T 세포 수용체, CD45R, CD4+/CD8+(T 세포 백혈병 및 림프종에서 발현됨)의 α 쇄; 전립선-특이적 항원 및 전립선산-포스파타제(전립선 암종에서 발현됨); gp100, MelanA/Mart-1, 티로시나제, gp75/브라운, BAGE, 및 S-100(흑색종에서 발현됨); 사이토케라틴(다양한 암종에서 발현됨); 및 CD19, CD20, 및 CD37(림프종에서 발현됨)을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원성 펩타이드는 본원에 기재된 HLA 항원-표출 복합체, 예컨대 본원에 기재된 HLA-Ig 융합 복합체에 의해 표출된 MART-1, gp100, NY-ESO-1, 및 MAGE-A3을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 조성물은 종양 유형의 복수의 항원, 예컨대 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 항원(예를 들면, 2 내지 10개 또는 3 내지 8개의 항원)의 칵테일을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원은 자가항원이며, 이는, 유기체가 면역 반응을 생산하는 유기체 자체의 "자가 항원"이다. 자가항원은 자가면역 질환, 예컨대 굿파스튜어 증후군(Goodpasture's syndrome), 다발성 경화증, 그레이브스병(Graves' disease), 중증 근무력증, 전신 홍반성 낭창, 인슐린-의존적 진성 당뇨병, 류마티스성 관절염, 심상성 천포장, 애디슨병, 포진성 피부염, 소아지방변증, 및 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis)에 포함된다. 예를 들면, 당뇨병-관련된 자가항원은 인슐린, 글루탐산 탈탄산효소(GAD) 및 다른 소도세포 자가항원, 예를 들면, ICA 512/IA-2 단백질 티로신 포스파타제, ICA12, ICA69, 프레프로인슐린 또는 면역학적으로 활성인 그것의 단편(예를 들면, 인슐린 B-쇄, A 쇄, C 펩타이드 또는 면역학적으로 활성인 그것의 단편), IGRP, HSP60, 카복시펩티다아제 H, 페리페린, 강글리오사이드(예를 들면, GM1-2, GM3) 또는 면역학적으로 활성인 그것의 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 감염원의 항원(들)은, 예컨대 원생동물, 박테리아, 진균(단세포 및 다중세포 둘 다), 바이러스, 프리온, 세포내 기생충, 연충, 및 면역 반응을 유도할 수 있는 다른 감염원이다. 박테리아 항원은 그람-양성 구균, 그람 양성 바실러스, 그람- 음성 박테리아, 혐기성 박테리아, 예컨대 악티노마이세타세아에(Actinomycetaceae), 바실라세아에(Bacillaceae), 바르토넬라세아에(Bartonellaceae), 보데텔라에(Bordetellae), 캅토파가세아에(Captophagaceae), 코리네박테리아세아에(Corynebacteriaceae), 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 레지오넬라세아에(Legionellaceae), 마이크로코카세아에(Micrococcaceae), 마이코박테리아세아에(Mycobacteriaceae), 노카르디아세아에(Nocardiaceae), 파스튜렐라세아에(Pasteurellaceae), 슈도모나다세아에(Pseudomonadaceae), 스피로차에타세아에(Spirochaetaceae), 비브리오나세아에(Vibrionaceae)의 계열 및 아시네토박터(Acinetobacter), 브루셀라(Brucella), 캄필로박터(Campylobacter), 에리시펠로트릭스(Erysipelothrix), 어윙젤라(Ewingella), 프란시셀라(Francisella), 가르드네레일라(Gardnereila), 헬리코박터(Helicobacter), 레비네아(Levinea), 리스테리아(Listeria), 스트렙토바실러스(Streptobacillus) 및 트로페리마(Tropheryma)의 속의 유기체의 항원을 포함한다. 원생동물 감염원의 항원은 말라리아 플라스모디아(Malarial plasmodia), 라이쉬마니아(Leishmania) 종, 트라이파노소마(Trypanosoma) 종 및 주혈흡충 (Schistosoma) 종의 항원을 포함한다. 진균 항원은 아스페르길루스(Aspergillus), 블라스토마이세스(Blastomyces), 칸디다(Candida), 콕시디오이데스(Coccidioides), 크립토코쿠스(Cryptococcus), 히스토플라즈마(Histoplasma), 파라콕시디오이데스(Paracoccicioides), 스포로트릭스(Sporothrix), 뮤코랄레스 목(order Mucorales)의 유기체, 색소효모균종(Choromycosis) 및 균종(Mycetoma)의 유기체 및 트리코파이톤(Trichophyton), 마이크로스포럼(Microsporum), 에피더모파이톤(Epidermophyton), 및 말라쎄지아(Malassezia) 속의 유기체의 항원을 포함한다. 프리온의 항원은 스크라피(scrapie), 소 해면상 뇌병증(BSE), 고양이 해면상 뇌병증, 쿠루(Kuru), 크로이펠츠-야콥병(CJD), 게르스트만-스트라슬러-샤잉커 질환(GSS), 및 치명적 가족성 불면증(FFI)을 유발하는 프리온의 시알로당단백질 PrP 27-30을 포함한다. 이로부터 항원성 펩타이드가 수득될 수 있는 세포내 기생충은 비제한적으로, 클라미디아세아에(Chlamydiaceae), 마이코플라스마타세아에(Mycoplasmataceae), 아콜레플라즈마타세아에(Acholeplasmataceae), 리케차(Richettsiae), 및 콕시엘라(Coxiella) 및 에를리치아(Ehrlichia) 속의 유기체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 바이러스 펩타이드 항원은 비제한적으로, 아데노바이러스(adenovirus), 단순 포진 바이러스(herpes simplex virus), 유두종 바이러스(papilloma virus), 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus), 수두바이러스(poxvirus), HIV, 인플루엔자 바이러스(influenza virus), 및 CMV의 것들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특히 유용한 바이러스 펩타이드 항원은 HIV 단백질, 예컨대 HIV gag 단백질(막 고착(MA) 단백질, 코어 캡시드(CA) 단백질 및 뉴클레오캡시드(NC) 단백질을 포함하나, 이에 한정되지 않음), HJV 폴리머라제, 인플루엔자 바이러스 매트릭스(M) 단백질 및 인플루엔자 바이러스 뉴클레오캡시드(NP) 단백질, B형 간염 표면 항원(HBsAg), B형 간염 코어 단백질(HBcAg), E형 간염 단백질(HBeAg), B형 간염 DNA 폴리머라제, C형 간염 항원 등을 포함한다.
항원성 펩타이드를 포함하는 항원은 그 전체가 참고로 본원에 편입된 미국 특허 6,268,411에 기재된 바와 같이, 항원-표출 복합체의 항원 결합 클레프트에 활동적으로 또는 수동적으로 결합할 수 있다. 임의로, 항원성 펩타이드는 펩타이드 결합 클레프트에 공유결합될 수 있다.
원한다면, 펩타이드 테터는 항원성 펩타이드를 펩타이드 결합 클레프트에 연결하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 다중 제I 부류 MHC 분자의 결정 분석은, β2M의 아미노 말단이 MHC 펩타이드 결합 클레프트내 잔류하는 항원성 펩타이드의 카복실 말단으로부터 매우 근접하게, 대략 20.5 옹스트롱 떨어져 있음을 나타낸다. 따라서, 비교적 짧은, 길이가 대략 13개 아미노산인 링커 서열을 사용하여, β2M의 아미노 말단에 대해 펩타이드를 테터할 수 있다. 상기 서열이 적절한 경우, 상기 펩타이드는 MHC 결합 홈(MHC binding groove)에 결합할 것이다(미국 특허 6,268,411 참고).
항체 또는 단편 및/또는 항원-표출 복합체는 생체외 또는 생체내 항원 전달을 위해 고형 지지체에 접합될 수 있다. 다양한 고형 지지체가 WO 2004/006951에 기재되어 있으며, 이들의 내용은 그 전체가 참고로 본원에 편입된다. 일부 구현예에서, 고형 지지체는 커플링 리간드에 대한 작용기를 가진 비드 또는 입자이다. 물질은 생분해성 유기 물질, 예컨대 셀룰로오스 또는 덱스트란일 수 있다. 일부 구현예에서, 블록 코-폴리머가 특이적인 해부상의 부위로 수송(traffic)하고 특이적인 간격에 걸쳐 생분해하도록, 즉, 더 긴 또는 더 짧은 혈장 반감기, 또는 더 긴 또는 짧은 조직 체류 시간을 가지도록 선택된다.
일부 구현예에서, 비드 또는 입자는 폴리머, 예컨대 하나 이상의 사이클로덱스트린-함유 폴리머, 양이온성 사이클로덱스트린-함유 폴리머, 폴리(D,L-락트산-코-글라이콜산)(PLGA), 폴리(카프로락톤)(PCL), 에틸렌 비닐 아세테이트 폴리머(EVA), 폴리(락트산)(PLA), 폴리(L-락트산)(PLLA), 폴리(글라이콜산)(PGA), 폴리(L-락트산-코-글라이콜산)(PLLGA), 폴리(D,L-락타이드)(PDLA), 폴리(L-락타이드)(PLLA), PLGA-b-폴리(에틸렌 글리콜)-PLGA(PLGA-bPEG-PLGA), PLLA-bPEG-PLLA, PLGA-PEG-말레이미드(PLGA-PEG-말(mal)), 폴리(D,L-락타이드-코-카프로락톤), 폴리(D,L-락타이드-코-카프로락톤-코-글라이콜라이드), 폴리(D,L-락타이드-코-PEO-코-D,L-락타이드), 폴리(D,L-락타이드-코-PPO-코-D,L-락타이드), 폴리알킬 시아노아크랄레이트, 폴리우레탄, 폴리-L-라이신(PLL), 하이드록시프로필 메타크릴레이트(HPMA), 폴리에틸렌글리콜, 폴리-L-글루탐산, 폴리(하이드록시산), 폴리무수물, 폴리오르토에스테르, 폴리(에스테르 아미드), 폴리아미드, 폴리(에스테르 에테르), 폴리카보네이트, 폴리알킬렌, 예컨대 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌, 폴리알킬렌 글리콜, 예컨대 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG), 폴리알킬렌 옥사이드(PEO), 폴리알킬렌 테레프탈레이트, 예컨대 폴리(에틸렌 테레프탈레이트), 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리비닐 에테르, 폴리비닐 에스테르, 예컨대 폴리(비닐 아세테이트), 폴리비닐 할라이드, 예컨대 폴리(비닐 클로라이드)(PVC), 폴리비닐피롤리돈, 폴리실록산, 폴리스티렌(PS), 폴리우레탄, 유도된 셀룰로오스, 예컨대 알킬 셀룰로오스, 하이드록시알킬 셀룰로오스, 셀룰로오스 에테르, 셀룰로오스 에스테르, 니트로 셀룰로오스, 하이드록시프로필셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로오스, 아크릴산의 폴리머, 예컨대 폴리(메틸(메트)아크릴레이트)(PMMA), 폴리(에틸(메트)아크릴레이트), 폴리(부틸(메트)아크릴레이트), 폴리(이소부틸(메트)아크릴레이트), 폴리(헥실(메트)아크릴레이트), 폴리(이소데실(메트)아크릴레이트), 폴리(라우릴(메트)아크릴레이트), 폴리(페닐(메트)아크릴레이트), 폴리(메틸 아크릴레이트), 폴리(이소프로필 아크릴레이트), 폴리(이소부틸 아크릴레이트), 폴리(옥타데실 아크릴레이트)(폴리아크릴산), 및 공중합체 및 이들의 혼합물, 폴리디옥사논 및 그것의 공중합체, 폴리하이드록시알카노에이트, 폴리프로필렌 푸마레이트), 폴리옥시메틸렌, 폴록사머, 폴리(오르토)에스테르, 폴리(부티르산), 폴리(발레르산), 폴리(락타이드-코-카프로락톤), 트리메틸렌 카보네이트, 폴리비닐피롤리돈, 폴리오르토에스테르, 폴리포스파젠, 및 폴리포스포에스테르, 및 2개 이상의 그와 같은 폴리머의 배합물 및/또는 블록 공중합체를 포함한다. 다른 약제학적으로 허용가능한 물질, 예컨대 라텍스를 또한 고형 입자 지지체로서 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 항원-표출 복합체 및 공통자극 신호는 친수성 외부 표면에 화학적 커플링을 위한 작용기를 제공하는, 폴리머, 예컨대 PLGA-PEG-말레이미드 입자의 말기 말단(예를 들면, 입자의 표면을 향해 외부로 향한 말단) 상에 표면 작용기를 갖는 PLGA 또는 PLGA-PEG 입자에 접합된다. 일부 구현예에서, aAPC는 혈액/림프 교환을 통해 림프절로의 교통(trafficking)을 포함하는, 말초 혈액 순환내에서 표적 조직으로의 분포를 허용하기에 충분히 오랫동안 지속된다. 껍질(shell)의 조성은 또한 생체분포에 영항을 미친다. 따라서, 다양한 구현예에서, 상기 입자는 친수성 껍질을 가지며, 이는 PLGA-PEG 코-폴리머의 PEG에 의해 달성될 수 있다. 다양한 구현예에서, 입자의 전하는 예를 들면, PLGA 상의 COOH 그룹의 조합으로 인해서뿐만 아니라 입자의 표면에 부착된 표적화 리간드에 의해 기여된 전하에 의해 약간 음성이다. 일부 구현예에서, 입자(접합된 리간드의 존재 또는 부재하에)는, 표면 전하가 약 0 내지 약 -20 mV, 또는 일부 구현예에서 -5 내지 -15 mV, 또는 약 -10 mV이다.
PLGA-PEG 공중합체를 포함하는 나노입자는 예를 들면, 참고로 본원에 편입된, 미국 특허 8,420,123에 기재되어 있다.
입자는 형상에 있어서 비정규적으로부터 구형이도록 및/또는 불균일하거나 불규칙한 표면으로부터 평활면을 가지도록 변할 수 있다. 구형 입자는 불규칙한 크기의 입자에 대해 표면적을 가지지 않는다. 구형 입자가 사용되는 경우, 감소된 표면적으로 인하여 시약이 요구되지 않는다. 다른 한편으로, 불규칙하게 형상화된 입자는 구형 입자보다 유의미하게 더 큰 표면적을 가지므로, 이는 표면적당 접합된 단백질 함량 및 세포당 표면적 부착에 대한 이점을 제공한다. 예를 들면, 비대칭 나노입자는, 하기 범위 중의 하나인 적어도 하나의 축을 따라 곡률 반경을 갖는 적어도 하나의 표면을 가질 수 있다: (a) 약 1nm 내지 약 10nm; (b) 약 11nm 내지 약 100nm; (c) 약 101nm 내지 약 400nm; (d) 약 401nm 내지 약 1μm; (e) 약 10μ내지 약 20μm; (f) 약 20μm 내지 약 100μm; 및 (g) 약 101μm 내지 약 1mm. 일부 구현예에서, 비대칭 나노입자는 (a) X-축에 따른 치수, (b) Y-축에 따른 치수, 및 (c) z-축에 따른 치수로 정의된 비대칭 형상을 가질 수 있으며, 여기서 (a),(b), 또는 (c) 중의 적어도 하나는 적어도 하나의 다른 치수 (a),(b), 또는 (c)와 동일하지 않다. 일부 구현예에서, 비대칭 형상은 타원체이며, 이는 하기 방정식 중의 하나에 의해 기술될 수 있다: a > b = c(장형 타원체); a > b > c(3-축 타원체); 및 a = b > c(편평 타원체). 본 발명에 따라 사용될 수 있는 비대칭 나노입자는 WO 2013/086500에 기재되어 있으며, 이는 그 전체가 참고로 본원에 편입된다.
입자의 크기는 변할 수 있다. 다양한 구현예에서, 입자 크기(명목 직경)는 0.05 내지 50μm, 또는 일부 구현예에서 0.05 내지 35μm, 또는 일부 구현예에서 0.05 내지 10μm의 범위이고, 일부 구현예에서, 약 0.05 내지 약 3.0, 약 4.0, 또는 약 5.0μm이다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 입자는, 직경 또는 평균 직경이 50 내지 500nm이다. 일부 구현예에서, 입자는, 평균 크기가 약 400nm, 약 300nm, 약 200nm, 또는 약 100nm 미만이어서, 보다 우수한 말초 혈액 순환을 허용한다. 일부 구현예에서, 나노입자는, 평균 크기(예를 들면, 직경 또는 최대 축)가 약 100nm, 약 150nm, 또는 약 200nm이다. 용어 "약"은, 수치적 특징과 연결되는 경우, ±10%를 의미한다. 일부 구현예에서, 입자의 적어도 90%는 약 50 내지 약 250nm, 예컨대 약 100 내지 약 150nm이다. 입자는, 크기가 균일할 수 있거나 크기가 변할 수 있으며, 평균 입자 크기는 바람직하게는 상기에서 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 입자는 충분히 작아서 "EPR 효과"의 이점을 취한다(증대된 투과도 및 체류 효과).
본원에 기재된 리간드 및 분자 복합체는 어떠한 이용가능한 공정을 사용하여서도 비드에 화학적으로 접합될 수 있다. 리간드 결합을 위한 작용기는 PEG-COOH, PEG-NH2, PEG-SH 또는 상이한 폴리머, 예컨대 폴리시아노아크릴레이트 또는 폴리카프로락톤에 부착된 다른 작용기를 포함한다.
예를 들면, 고형 지지체는, 단백질이 이의 표면에 결합하기 전에 코팅될 수 있다. 코팅 화학물질이 선택되면, 고형 지지체의 표면을 활성화시켜 특정한 단백질 분자의 특이적인 부착을 허용할 수 있다. 따라서, 코팅물은 다양한 세포 집단과의 최적의 반응성 및 생체적합성을 고려하여 선택될 수 있다. 바람직하게는, 코팅 화학물이 사용되는 것에 상관없이 추가의 활성화 화학을 위한 적합한 매트릭스가 제공된다. 수많은 그와 같은 코팅물은 당해기술에 공지되어 있다. 예를 들면, 고형 지지체는 인간 혈청 알부민, 트리스(3-머캅토프로필)-N-글라이실아미노)메탄(미국 특허 6,074,884), 젤라틴-아미노덱스트란(미국 특허 5,466,609), 또는 아미노산 단독중합체 또는 랜덤 공중합체로 코팅될 수 있다. 일 구현예에서, 폴리(글루타메이트, 라이신, 티로신)[6:3:1]을 포함하는 랜덤 아미노산 공중합체가 사용되고; 당해 공중합체는 업자(Sigma Chemical Co.)로부터 생성물 번호 P8854로 이용가능하다. 이것은 6부의 글루탐산, 3부의 라이신, 및 1부의 티로신의 비율의 아미노산 글루탐산, 라이신, 및 티로신의 선형 랜덤 폴리머이다. 또 하나의 구현예에서, 4부의 라이신 대 1부의 티로신의 비로 라이신 및 티로신을 포함하는 아미노산 공중합체가 사용된다. 또 하나의 구현예에서, 1부의 라이신 대 1부의 알라닌의 비로 라이신 및 알라닌을 포함하는 아미노산 공중합체가 사용된다. 또 하나의 구현예에서, 고형 지지체는 합성 폴리머로 코팅된 후, 합성 폴리머는 이것이 단백질 분자에 연결되기 전에 활성화된다.
일부 구현예에서, 분자는 고형 지지체에 흡착에 의해 또는 공유 결합화를 포함하는 직접적인 화학 결합에 의해 직접적으로 부착된다(참고: 예를 들면, Hermanson, BlOCONJUGATE TECHNIQUES, Academic Press, New York, 1996). 분자 자체는 친핵성 그룹, 이탈 그룹, 또는 친전자성 그룹을 포함하는 다양한 화학적 작용성으로 직접적으로 활성화될 수 있다. 활성화 작용기는 알킬 및 아실 할라이드, 아민, 설프하이드릴, 알데하이드, 불포화된 결합, 하이드라자이드, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 케톤, 및 화학 결합화를 위해 활성화하는 것으로 공지된 다른 그룹을 포함한다. 대안적으로, 분자는 고형 지지체에 소분자-커플링 시약을 통해 결합될 수 있다. 커플링 시약의 비-제한적인 예는 카보디이미드, 말레이미드, N-하이드록시석신이미드 에스테르, 비스클로로에틸아민, 이작용성 알데하이드, 예컨대 글루타르알데하이드, 무수물 등을 포함한다. 다른 구현예에서, 분자는 당해기술에서 공지되어 있는 바와 같이, 고형 지지체에 친화성 결합, 예컨대 바이오틴-스트렙타비딘 연결부 또는 커플링을 통해 커플링될 수 있다. 예를 들면, 스트렙타비딘은 고형 지지체에 공유 또는 비-공유 결합에 의해 결합될 수 있고, 바이오티닐화된 분자는 당해기술에 잘 공지된 방법을 사용하여 합성할 수 있다.
일부 구현예에서, 입자 또는 비드는 폴리머, 예컨대 PLGA-PEG, PLGA-PEG-말레이미드, 또는 에스테르-말단 캡핑된 PLGA이며, 여기서 표면 리간드의 접합을 위한 작용기가 중합 동안 생성된다. 말레이미드 그룹은 입자의 외표면 상에 친수성 "스텔스(stealth)" 코팅(PEG)입자 뿐만 아니라 이용가능한 적어도 하나의 유리 설프하이드릴(-SH) 그룹을 갖는 리간드의 공유결합 부착을 위해 사용될 수 있는 당해 껍질에 부착된 작용기를 지닌 형성된 입자를 제공한다. 예를 들면, HLA-Ig 리간드 및/또는 항-CD28은 Fc내에 S473C 치환을 함유하는 인간 IgG4 프레임워크(본원에 기재된 바와 같이)상에 작제될 수 있다. HLA-Ig 또는 항-CD28의 473번에서 이러한 쌍으로 되지 않은 된 시스테인 잔기는 온화한 환원 조건 하에서 PEG에 부착된 말레이미드 그룹에 접합될 수 있다. 온화한 환원 조건은 단백질, 특히 HLA-Ig 분자의 HLA-베타-2-마이크로글로불린를 비가역적으로 변성시키지 않는 경향이 있다.
예시적인 구현예에서, 나노입자는 약 50nm 내지 약 5μm로 큰 범위(예를 들면, 평균 직경 또는 최대 축)이고, 생체내에서 특이적인 생분해율로 변할 수 있는(LA:GA 비 및/또는 PLGA 폴리머의 mw를 조절함으로써) 코어(PLGA), 혈청 단백질에 의한 옵소닌화 및 순환으로부터의 제거("PEG 브러쉬"와 같이 작용함)로부터 보호하는 친수성 외부 껍질, 리간드 밀도의 일치된 조절(1개 분자/말레이미드 그룹의 확률적 관계)로 작용화된 표면 및 코어로부터 떨어진 리간드의 방향을 갖는다. 일부 구현예에서, LA:GA 비는 60%/40% 내지 40%/60%이고, 일부 구현예에서 약 50%/50%이다. 일부 구현예에서, PLGA는, 분자량이 약 25K 내지 약 35K(예를 들면, 약 30K)이고, PEG는, 분자량이 약 3K 내지 약 10K, 예컨대 약 5K이다. 일부 구현예에서, 코어 입자는, 직경이 약 150nm, 또는 약 200nm이다.
대안적인 구현예에서, 지지체는 전형적으로 링커(linker)를 통해, 적합한 반응물에 대한 공유결합성 부착에 이용가능한 하나 이상의 화학적 잔기 또는 작용기를 함유하는 폴리머로 코팅될 수 있다.
활성화 화학은 고형 지지체의 표면에 분자의 특이적이고, 안정한 부착을 허용한다. 단백질을 작용기에 부착시키는데 사용될 수 있는 다수의 방법이 존재한다. 예를 들면, 공통의 가교결합제 글루타르알데하이드를 사용하여 단백질 아민 그룹을 아민화된 고형 지지체 표면에 2-단계 공정으로 부착시킬 수 있다. 그 결과로 생긴 연결부는 가수분해적으로 안정하다. 다른 방법은 단백질 상에서 아민과 반응하는 n-하이드로-석신이미도(NHS) 에스테르를 함유하는 가교결합제, 아민-, 설프하이드릴-, 또는 히스티딘-함유 단백질과 반응하는 활성 할로겐을 함유하는 가교결합제, 아민 또는 설프하이드릴 그룹과 반응하는 에폭사이드를 함유하는 가교결합제, 말레이미드 그룹과 설프하이드릴 그룹 사이의 접합, 및 펜던트 당 잔기의 과옥소산염 산화에 이어 환원성 아미노화에 의한 단백질 알데하이드 그룹의 형성을 포함한다.
고형 지지체 표면에 대한 특이적인 단백질의 부착은 단백질의 직접적인 커플링에 의해 또는 간접적인 방법에 의해 달성될 수 있다. 특정 단백질은 자체적으로 직접적인 부착 또는 접합하지만 다른 단백질 또는 항체는 링커 또는 스페이서 단백질, 예컨대 항-마우스 IgG 또는 스트렙타비딘에 커플링되는 경우 더 나은 관능적 활성을 보유한다. 원한다면, 링커 또는 부착 단백질이 사용될 수 있다. 리간드, 예컨대 항원-표출 복합체 및 공동자극인자 분자는 아미노산 치환으로 변형되어 화학적 접합을 허용할 수 있다.
동일한 고형 지지체 상에서 특정한 단백질의 비는 변하여 항원 또는 항체 표출시 고체 지지체의 효능을 증가시킬 수 있다. 예를 들면, 항원-표출 복합체 대 항-CD28의 비는 적어도 약 30:1, 또는 적어도 약 10:1, 약 3:1, 약 1:1, 약 0.3:1; 약 0.1:1, 및 적어도 약 0.03:1일 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 비는 약 5:1, 약 4:1, 약 3:1, 약 2:1, 또는 약 1:1, 약 1:2, 약 1:3, 약 1:4, 또는 약 1:5이다. 지지체에 커플링된 단백질의 총량은 적어도 10 mg/ml, 적어도 25 mg/ml, 적어도 50 mg/ml, 적어도 100 mg/ml, 적어도 150 mg/ml, 또는 200 mg/ml보다 더 클 수 있다. 일부 구현예에서, 예컨대 표면 작용기(예를 들면, 말레이미드 또는 에스테르)를 가진 PLGA 또는 PLGA-PEG 입자를 사용하는 것과 같이, 입자에 커플링된 단백질의 총 량은 PLGA의 mg당 1 내지 10㎍, 또는 일부 구현예에서, PLGA의 mg당 2 내지 6㎍이다. 일부 구현예에서, 입자의 리간드 밀도는 약 103 내지 약 105개의 리간드/μm2, 또는 일부 구현예에서 약 104개의 리간드/μm2이다. 예를 들면, 크기가 100 내지 200nm인 나노입자의 경우, 당해 나노입자는 평균적으로 약 100 내지 약 1500개의 리간드, 예컨대 약 200 내지 약 1200개의 리간드, 또는 약 400 내지 약 1000개의 리간드, 또는 약 500 내지 약 800개의 리간드를 갖는다.
다양한 구현예에서, 본 발명은 폴리머 비드 또는 입자, 본원에 기재된 바와 같은 항-CD28 항체 및/또는 항원-표출 복합체, 예컨대 본원에 기재된 바와 같은 인간화된 Ig HLA 융합 복합체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 상기 약제학적 조성물은 기재된 바와 같은 T 세포에 표출하기 위한 항원성 펩타이드를 추가로 포함할 수 있고, 이는 접합된 비드 또는 입자와 함께 동시-제형화될 수 있다. 다양한 구현예에서, 약제학적 조성물은 저장-안정성이고, 일부 구현예에서, 투여 전에 재구성을 위한 동결건조된 형태로 제공되거나, 다른 "규격품(off-the-shelf)" 약제학적 제제로 제공된다.
일부 구현예에서, 본 발명은, 직경 또는 평균 직경이 50 내지 500nm이고, 표면-접합된 항-CD28 항체 및 항원-표출 복합체를 포함하는, PLGA 또는 PLGA-PEG 기반 나노입자를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 항-CD28 항체는 예를 들면, 본원에 기재된 바와 같은 인간화된 항체일 수 있으며, 항체 단편, 예컨대 일본쇄 가변 단편일 수 있다. 일부 구현예에서, 항원-표출 복합체는 적어도 하나의 HLA 항원-결합 클레프트를 포함한다. 항-CD28 및 HLA 복합체는 동일한 반응에서 별도로 또는 함께 입자에 커플링될 수 있다. 약제학적 조성물은 적어도 하나의 펩타이드 항원, 예컨대 종양 항원(예를 들면, MART-1)을 포함할 수 있으며, 이는 어떠한 활성 로딩 과정없이 입자와 함께 동시-제형화될 수 있다.
본원에 기재된 약제학적 조성물은 효과적인 양의 조성물을 필요로 하는 환자에게 투여함으로써, 면역요법, 예를 들면, 항원-특이적 세포독성 T 세포의 형성을 유도하는 방법에 유용하다. 일부 구현예에서, 상기 환자는 암 환자이다.
본원에 기재된 입자-기반 항원-표출 플랫폼은 환자에게 정맥내 투여, 동맥내 투여, 피하 투여, 진피내 투여, 림프내 투여, 및 종양내 투여를 포함하는, 어떠한 적절한 경로로도 투여될 수 있다. 환자는 인간 및 수의학적 환자 둘 다를 포함한다.
일부 예시적인 구현예에서 본 발명은 하기 기재된다.
일부 구현예에서 본 발명은, 크기가 약 100 내지 200nm의 범위이고, 표면 전하가 약 -0 내지 -20 mV(및 일부 구현예에서 -5 내지 -15 mV)이며, 입자당 단백질 리간드가 약 100 내지 1500개인 폴리머 PLGA-PEG 입자를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 단백질 리간드 각각은 입자에 설프하이드릴-말레이미드 화학을 통해 커플링된다. 상기 리간드는 항-CD28 항체 리간드의 집단, 및 HLA 리간드의 집단 및 T 세포에 표출하기 위한 하나 이상의 항원성 펩타이드를 포함한다. 본 조성물은 정맥내, 동맥내, 피하, 진피내, 림프내, 또는 종양내 투여를 위한 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.
일부 구현예에서, 입자는 실질적으로 구형 또는 대략 구형이다.
일부 구현예에서, PLGA는 약 50% 락트산(LA) 및 50% 글라이콜산(GA)의 폴리머이다.
일부 구현예에서, PLGA 폴리머는, 분자량이 약 30K이고, PEG는, 분자량이 약 3K 내지 약 10K, 예컨대 약 5K이다.
일부 구현예에서, 조성물은, 입자당 400 내지 1000개의 리간드를 갖는다.
일부 구현예에서, 항-CD28 항체 리간드는 5 내지 15 쥣과 프레임워크 잔기를 임의로 갖는 인간 IGHV4-59 생식계열 프레임워크, 및 3 내지 15개의 쥣과 프레임워크 잔기를 갖는 IGKV4-01 생식계열 프레임워크를 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD28은 ScFv이다.
일부 구현예에서, HLA는 HLA-A*02:01이며, 이는 이합체 HLA작제물을 제공하기에 충분한 힌지 영역 위의 면역글로불린 서열에 대한 융합물을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 조성물은 동결건조된다.
특히, 항원-표출 플랫폼은 감염성 질환, 암, 또는 자가면역 질환을 지닌 환자를 치료하거나, 면역억제된 환자에게 예방적 보호를 제공하는데 유용할 수 있다.
치료될 수 있는 감염성 질환은 박테리아, 바이러스, 프리온, 진균, 기생충, 연충 등에 의해 야기된 것들을 포함한다. 그와 같은 질환은 AIDS, 간염, CMV 감염, 및 이식후 림프증식성 장애(PTLD)를 포함한다. 예를 들면, CMV는 장기 이식 환자에서 발견된 가장 흔한 바이러스 병원체이며 골수 또는 말초 혈액 줄기 세포 이식을 겪은 환자에서 이환율 및 사망률의 주요 원인이다(참조: Zaia, Hematol. Oncol. Clin. North Am. 4, 603-23, 1990). 이것은 이들 환자의 면역저하된 상태에 기인하며, 이는 혈청양성 환자에서 잠재성 바이러스의 재활성화 또는 혈청검사음성인 개인에서 기회 감염을 허용한다. 현재의 치료는 항바이러스 화합물, 예컨대 간사이클로비르의 사용에 촛점을 맞추고 있으며, 이는 약물 내성 CMV의 개발인 가장 유의미한 결점을 갖는다. 이들 치료에 대한 유용한 대안은 환자로부터 또는 이식 수술의 개시 전 적절한 공여자로부터 유도된 바이러스-특이적 CTL의 생성을 포함하는 예방적 면역치료 요법이다.
PTLD는 이식 환자의 유의미한 분획에서 일어나며 엡슈타인-바르 바이러스(EBV) 감염으로부터 발생된다. EBV 감염은 미국에서 성인 집단의 대략 90%에서 존재하는 것으로 여겨지고 있다(참고: Anagnostopoulos & Hummel, Histopathology 29, 291-2) 15, 1996). 활성 바이러스 복제 및 감염은 면역계에 의한 점검시 유지되지만, CMV의 사례에서와 같이, 이식 요법에 의해 면역저하된 개인은 T 세포 집단를 조절하는 것을 상실하며, 이는 바이러스 재활성화를 허용한다. 이는 이식 프로토콜에 대한 심각한 장애를 나타낸다. EBV는 또한 다양한 혈액 및 비-혈액 암에서 종양 촉진에 관여할 수 있다. EBV와 비인두 암종 사이에는 또한 강력한 연관이 있다. 따라서, EBV-특이적 T 세포를 사용한 예방적 치료는 현재의 요법에 대해 탁월한 대안을 제공한다.
본 발명에 따라 치료될 수 있는 암은 흑색종, 암종, 예를 들면, 결장, 두경부암, 십이지장, 전립선, 유방, 폐, 난소, 도관, 결장, 간, 췌장, 신장, 자궁내막, 위, 형성이상 구강 점막, 용종증, 침습성 구강암, 비-소세포 폐 암종, 과도기적 및 편평상피 세포 비뇨 암종 등; 신경적 악성종양, 예를 들면, 신경교세포종, 신경아교종, 등; 혈액 악성종양, 예를 들면, 만성적 골수성 백혈병, 소아기 급성 백혈병, 비-호지킨 림프종, 만성적 림프구성 백혈병, 악성 피부 T-세포, 균상식육종, 비-MF 피부 T-세포 림프종, 림프종 구진증(lymphomatoid papulosis), T-세포 농축 피부 림프모양 과다형성(T-cell rich cutaneous lymphoid hyperplasia), 수포성 유천포창, 원판성 낭창 홍반성, 편평 태선, 등을 포함한다(참고, 예를 들면, Mackensen et al, Int. J. Cancer 86, 385-92, 2000; Jonuleit 등, Int. J. Cancer 93, 243-51, 2001; Lan 등, J. Immunotherapy 24, 66-78, 2001; Meidenbauer et al, J. Immunol. 170(4), 2161-69, 2003).
일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 약제학적 조성물의 투여를 통해 항종양 활성을 지닌 T-세포를 활성화시킴으로써 위에서 확인된 암을 포함하는 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 요법은 하나 이상의 면역 체크포인트 억제제, 예컨대 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 및 이필리무맙과 함께 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 추가의 요법은 항-CTLA4 또는 항-PD1, 또는 항-PD-L1이다. 추가의 요법 또는 체크포인트 억제제는 이의 종래의 요법을 통해 별도로 투여될 수 있거나, 본원에 기재된 나노입자에 대한 기재된 추가의 리간드로서 투여될 수 있거나, 나노입자의 별도의 집단에 부착될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 억제제는 개시 요법으로서, 및 개시된 본원에 기재된 나노입자와 함께 후속적으로, 예를 들면, 약 1 내지 약 8 주의 체크포인트 억제제 요법, 또는 약 2 내지 약 4 주의 체크포인트 억제제 요법 후 제공된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 체크포인트 억제제는 나노입자 요법과 함께 수반하여, 예를 들면, 요법의 개시에 및 약 매 2주마다, 또는 하나 이상의 체크포인트 억제제에 대해 요법의 개시에 및 약 매 2주마다 및 나노입자 요법에 대해 약 매 4주 마다 제공된다. 일부 구현예에서, 환자는 체크포인트 억제제 요법에 대해 내성이거나 단지 부분적으로 또는 일시적인 반응을 나타내며, 본원에 기재된 aAPC는 이들 환자에서 종양 퇴행을 향상시킨다. 여전히 다른 구현예에서, 체크포인트 억제제 요법에 대해 전형적으로 내성인 암의 경우, 본원에 기재된 조성물은 이러한 암에 대해 체크포인트 억제제의 성공적인 사용을 확장시킨다.
일부 구현예에서, 펩타이드 항원은 환자의 종양의 분석을 기반으로 하여, 환자에 대해 개인화된 기준으로 선택된다. 예를 들면, 문헌(참고: Ionov Y., A high 처리량 방법 for identifying personalized tumor-associated antigens, Oncotarget 1(2):148-155(2010))(이는 참고로 본원에 편입된다)에 기재된 공정, 또는 다른 공정을 사용할 수 있다. 이들 구현예에서, 나노입자가 제공될 수 있으며("규격품" 기준), 종양 항원이 선택되어 개인화된 기준으로 로딩(loading)될 수 있다.
치료될 수 있는 자가면역 질환은 천식, 전신 홍반성 낭창, 류마티스성 관절염, I형 당뇨병, 다발성 경화증, 크론병, 궤양성 대장염, 건선, 중증 근무력증, 굿파스튜어 증후군, 그레이브스병, 심상성 천포장, 애디슨병, 포진성 피부염, 소아지방변증, 및 하시모토 갑상선염을 포함한다.
항원-특이적 헬퍼 T 세포는 대식세포를 활성화시키거나 B 세포를 활성화시키는데 사용되어 예를 들면, 감염성 질환 및 암을 치료하는데 사용될 수 있는 특수한 항체를 생산할 수 있다. 항체-생산 B 세포 자체는 또한 이러한 목적을 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 추가로, 본원에 기재된 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 뿐만 아니라 이를 발현하는 숙주세포도 제공한다.
본 발명은 하기 비-제한적인 예에 의해 추가로 실증된다.
실시예
실시예 1: 생식계열 인간화된 가변 영역 및 인간 불변 영역 서열의 설계
본 실시예는 특히, 마우스 항-CD28 항체 주형으로부터 생식계열 인간화된(CDR 그라프팅된) 항체에 대한 서열의 설계; S241P(카밧 넘버링) 힌지 안정화 돌연변이를 함유하는 인간 IgG4, 잔류 Fc 감마 수용체 결합을 제거하기 위한 L248E(카밧 넘버링) 돌연변이 및 항체의 커플링에 적합한 Cys 잔기(S473C, 카밧 넘버링)를 포함하는 인간 불변 영역 서열의 설계; CD28에 대해 포텐셜 비-결합을 지닌 변이체 생식계열 인간화된 항체 V 도메인의 설계; 포텐셜 T 세포 에피토프를 함유하지 않는 생식계열 인간화된 항체의 N-말단에 대한 HLA-A*02:01의 융합을 위한 링커 서열의 설계를 입증한다.
개시 항-CD28 항체는 쥣과 9.3 단클론성 항체(참고: Tan 등, J. Exp. Med. 1993 177:165)이다. 9.3 항체 V 영역의 구조적 모델은 스위스(Swiss) PDB를 사용하여 생산하였으며 항체의 결합 특성에 필수적인 경향이 있는 V내 아미노산을 확인하기 위해 분석되었다. 수많은 프레임워크 잔기와 함께 CDR(카밧(Kabat) 및 코티아(Chothia) 정의 둘 다를 사용)내에 함유된 모든 잔기는 결합에 대해 잠재적인 중요성이 있는 것으로 고려하였다. 항-CD28의 VH 및 Vκ서열 둘 다는 전형적인 프레임워크(Fw) 잔기를 함유하며 CDR 1, 2 및 3 모티프는 많은 쥣과 항체와 비교할만 하다.
인간화를 위해, 인간 IGHV4-59 생식계열 Fw를 중쇄(문헌: Tan 등, J. Immunol 2002 169:1119-1125에 의해 선택된 IGHV3/OR16-10 선호)에 대한 주형으로서 선택하였다. IGKV4-01 생식계열 Fw는 경쇄에 대한 주형으로서 선택되었다. 이들 Fws 둘 다는 그것의 각 쥣과 VH 및 Vκ서열에 대해 62% 상동성을 가진다. 쥣과 CDR를 이들의 Fws내로 이식시키고, 쥣과 Fw 잔사의 다양한 구성원을 또한 포함시켜 3개의 인간화된 VH 변이체 및 3개의 인간화된 Vκ변이체를 생성하였다(도 1 내지 6).
중쇄 Fw의 경우, Fw1 잔기 1 및 3은 결합 포켓에 인접하므로 항원 결합에 중요한 것으로 고려하였지만, 잔기 6은 잔기 1 및 3을 지지하는 베타 쇄 둘 다의 구조 및 CDR3의 구조에 영향을 미치는 것으로 고려하였다. 따라서 이들 쥣과 Fw 잔류물을 모든 변이체 속에 보유시켰다.
Fw2에서, 잔기 37은 VH와 Vκ 사이의 계면을 유지하는데 중요한 것으로 고려하였지만, 잔기 48은 CDR2의 구조를 지지하는 것으로 고려하였으므로; 이들 잔사 둘 다를 모든 변이체 속에 유지시켰다.
Fw3에서, 잔기 73, 76 및 78은 CDR1과 직접 접촉하는 반면, 잔기 71은 CDR1 및 CDR2 둘 다와 접촉하였으므로; 이들 잔기는 항원 결합(CDR1 및 CDR2의 기여에 의존하여)을 필요로 하는 경향이 있으므로 모든 변이체 속에 유지시켰다. 잔기 71은 잔기 71 및 78의 구조에 영향을 미침으로써 CDR1의 구조에 간접적으로 영향을 미치지만, 잔기 82a 및 82c은 또한 CDR2의 구조에 간접적으로 영향을 미칠 수 있다. 이들 잔기는 따라서, VH1에서만 유지시켰다. 잔기 67 및 82은 3차원 구조에서 인접하며 상호작용하여 CDR2의 구조에 영향을 미치고 CDR 1 및 3을 지지하는 베타 쇄에 잠재적으로 영향을 미친다. 따라서, 이들 잔사는 변이체 VH1 및 VH2 속에 유지시켰다.
경쇄 Fw의 경우, Fw1 잔기 3은 결합 포켓에 인접해 있으며 항원 결합에 직접 관여될 수 있으나, 잔기 4는 CDR3의 구조를 직접 지지한다. 따라서 이들 쥣과 Fw 잔사는 모든 변이체에서 유지되었다.
Fw2에서, 잔기 49는 CDR2의 구조를 지지하며 또한 경쇄와 중쇄 사이의 계면에 중요하며, 여기서 이는 중쇄 CDR3의 구조를 직접적으로 지지하므로, 모든 변이체에서 유지되었다.
Fw3의 경우, 잔기 85 및 87은 중쇄 및 경쇄의 계면에 중요하며 또한 CDR3의 구조를 지지하는 것으로 고려되었으므로 모든 변이체에서 유지되었다. 잔기 80은 CDR 2 및 3의구조에 직접적인 효과를 잠재적으로 갖는 것으로 고려되었으므로 Vκ1 에만 유지되었다. 잔기 70은 통상적으로 경쇄 잔기 R24와의 염 브릿지를 형성하므로 Vκ 도메인에 있어 중요한 구조적 효과를 갖는 것으로 고려되었다. 항-CD28에서, 당해 염 브릿지(salt bridge)는 부재하고(잔기 70은 D라기보다는 N이다) 이러한 상호작용의 도입은 유리할 수 있었지만; 쥣과 항체에서 N70은 당화(NFS)되어 있으며 이는 인간화 동안에 이를 제거하는 것이 유리할 수 있으므로; 쥣과 N은 Vκ1 및 Vκ2에서 유지되었으나, Vκ3에서 D로 변화되었다.
인간 IgG4/κ를 기반으로 한 불변 영역 서열은 힌지 안정화 돌연변이(S241P) 및 돌연변이를 잔류하는 Fc 감마 수용체 결합(L248E)을 제거하는 하부 힌지내 돌연변이를 편입하도록 설계되었다. 시스테인 잔기는 또한 화학적 커플링 목적(S473C)을 위해 Fc의 C-말단에 인접하여 포함되었다. 개질된 IgG4 중쇄 불변 영역 서열은 도 7에 κ 경쇄 불변 영역 서열(도 8)과 함께 나타낸다.
추가의 VH 도메인을 CD28에 대한 잠재적인 비-결합을 위해 설계하였으며 당해 서열은 도 9에 나타낸다. 쥣과 V 영역 서열의 분석(마우스 생식계열 V 영역의 체세포 돌연변이의 정도로 부터)은, VH가 CD28 결합에 대한 주요 원인제공자인 경향이 있는 것으로 제안하였다. 따라서, 잠재적인 비-결합 인간화된 VH 변이체를 설계하였다. 당해 변이체는 어떠한 마우스 Fw 잔기로 함유하지 않음으로써 정확한 CDR 구조를 재구성하며 또한 결합에 중요할 수 있는 잔기에서 CDRH3내에 3개의 돌연변이를 함유한다(Y100A, Y100aA, Y100bA).
실시예 2: 인간화된 항체에 대한 HLA-A * 02:01의 융합용 링커의 설계
인간화된 항-CD28 항체의 N-말단에 대한 HLA-A*02:01(IMGT 수탁 번호 HLA00005)의 융합을 위한 링커를 작제하고 iTopeTM 및 TCEDTM에 의한 분석을 편입시켜 잠재적인 면역원성을 제거하였다.
iTopeTM 소프트웨어는 34 인간 MHC 제I 부류I 대립유전자의 개방-말단 결합 홈(groove)내의 펩타이드의 아미노산 측쇄와 특이적 결합 포켓병(특히 포켓 위치; p1, p4, p6, p7 및 p9) 사이의 호의적인 상호작용을 예측한다. 이들 대립유전자는 어떠한 특수한 민족 집단에서도 가장 흔하게 발견된 것에 기여하는 가중치없이 야생형에서 발견된 가장 일반적인 HLA-DR 대립유전자를 나타낸다. 대립유전자 중 20개는 '개방' p1 구조를 함유하며 14개는 '밀폐' 구조를 함유하고 여기서 83번 위치에서 글리신은 발린으로 대체된다. 주요 결합 잔기의 위치는 시험 단백질 서열에 걸쳐있는 하나의 아미노산에 의해 오버랩된 9mer 펩타이드의 인실리코(in silico) 발생에 의해 달성된다. 물리적 MHC 제II 부류 결합 실험과의 비교는, iTopeTM이 MHC 제II 부류 분자에 결합하거나 결합하지 않는 펩타이드들 사이에서 고 정확성으로 성공적으로 구별하는데 사용될 수 있음을 나타낸다. 인실리코 MHC 제II 부류 결합 분석의 어떠한 제한도 EpiScreenTM 생체외 T 세포 에피토프 맵핑 분석에서 이미 스크리닝된 서열로부터 유도된 펩타이드(>10,000 펩타이드)의 거대한 데이타베이스의 서열을 함유하는 TCEDTM을 사용하여 감소시킨다. 따라서, TCEDTM을 사용하여 관련되지 않은 항체와 단백질 서열에 대한 어떠한 시험 서열도 조사하여 실제의 생체외 면역원성과의 상관관계를 찾을 수 있다.
iTopeTM을 사용한 링커 서열의 분석은 34 MHC 제II 부류 대립유전자 각각에 대해 시험한 링커 서열을 거치는 오버랩된 9mer를 사용하여 수행하였다. 각각의 9mer를 잠재적인 '피트(fit)' 및 MHC 제II 부류 분자와의 상호작용을 기반으로 점수를 매겼다. 소프트웨어에 의해 계산된 펩타이드 점수는 0과 1 사이에 있다. 높은 평균 결합 점수(iTopeTM 평점 기능에서 >0.55)를 생산한 비-생식계열 펩타이드를 강조하고, ≥50%의 MHC 제II 부류 결합 펩타이드(즉 34개의 대립유전자중 17개)가 높은 결합 친화도(점수 >0.6)를 갖는 경우, 이러한 펩타이드는 "불규칙한 고 친화성" MHC 제II 부류 결합 펩타이드(이는 CD4+ T 세포 에피토프를 함유하므로 고 위험으로 고려한다)로 정의하였다. >0.55(그러나 대부분 >0.6이 아님) 점수를 지닌 ≥50%의 MHC 제II 부류 결합 펩타이드는 "불규칙한 중간 정도의 친화성" MHC 제II 부류 결합 펩타이드로 정의하였다. 서열의 추가의 분석을 TCEDTM을 사용하여 수행하였다. 서열을 BLAST 조사에 의해 TCEDTM을 질의하는데 사용하여 앞서의 EpiScreenTM 연구에서 T 세포 반응을 자극한 관련되지 않은 단백질로부터의 펩타이드(T 세포 에피토프) 사이의 어떠한 높은 서열 상동성도 확인하였다.
슈넥(Schneck) 등이 사용한 서열을 2개의 링커에 편입시키는데, 하나는 HLA-A*02:01의 N-말단에 편입하여 N-말단 신호 서열과 연결시키고 하나는 항-CD28 VH 도메인에 대한 융합을 위해 C-말단에 편입시켰다(참고: 예를 들면, 도 9). N-말단 링커의 경우, 서열은 신호 서열 절단 부위롭부터 링커를 통해 및 HLA-A*02:01 성숙한 단백질의 처음 8개 아미노산을 포함시켜 분석하였다. C-말단 링커의 경우, 서열을 HLA-A*02:01 α3 도메인의 말기 8개 아미노산으로부터, 링커 서열을 통해 항-CD28 VH 도메인의 처음 8개 아미노산까지 분석하였다.
결합 점수가 >0.6(고 친화성)인 펩타이드는 대부분(≥17)의 MHC 제II 부류 대립유전자(부정확한 고 친화성 결합제)에 결합한다. 결합 점수가 0.55 내지 0.6인 중간 정도의 친화성 결합제는 ≥17 MHC 제II 부류 대립유전자에 결합한다. N-말단 링커는 2개의 부정확한 MHC 제II 부류 결합 서열, 즉 하나의 고 친화성(위치 2에서 p1 앵커) 및 하나의 중간 정도의 친화성(위치 4에서 p1 앵커)을 함유하는 것으로 밝혀졌다. C-말단 링커는 위치 11에서 p1 앵커와 함께 하나의 부정확한 중간 정도의 친화성 MHC 제II 부류 결합 펩타이드를 함유하는 것으로 밝혀졌다.
안티토프(Antitope)의 T 세포 에피토프 데이타베이스(TCEDTM)의 BLAST 조사를 iTopeTM 분석에서 사용된 바와 동일한 서열을 사용하여 수행함으로써 앞서 정의된 에피토프와의 어떠한 상동성도 측정하였다. TCEDTM을 사용하여 EpiScreenTM T 세포 에피토프 맵핑 분석에서 시험한 관련되지 않은 서열로부터 유도된 펩타이드의 거대(>10,000 펩타이드) 데이타베이스에 대한 어떠한 시험 서열도 조사하였다. 링커 서열 어느 것도 TCEDTM에서 어떠한 '히트(hit)'를 함유하지 않는 것으로 밝혀졌다.
iTopeTM을 추가로 사용하여 링커에 대한 서열 변화를 평가함으로써 MHC 제II 부류에 대한 결합에 있어 이들의 성향을 감소시켰다. N-말단 링커는 전적으로 제거되어 HLA-A*02:01의 N-말단이 pBFKsr 벡터 또는 이의 천연 신호 서열내에 제공된 신호 서열에 직접 융합될 수 있음이 주목되었다. 이는, 융합 단백질의 N-말단이 인간 생식계열 서열만을 함유하며 T 세포 에피토프의 위험을 피할 수 있음을 보증할 수 있다. 하기 권고된 링커 서열은 MHC 제II 부류 결합을 배경 잔류 수준(어떠한 9mer에 의해 결합된 <5의 대립유전자)으로 감소시키며, 클로닝에 적합한 제한 부위(서열 둘 다가 벡터의 변형을 필요로 할 것이라고 해도)를 제공하는 것으로 밝혀졌다.
N-말단 링커:
Figure 112021120789329-pat00001
C-말단 링커:
Figure 112021120789329-pat00002
실시예 3: 서열의 코돈 최적화 및 발현 클로닝
코돈을 GeneOptimizer®을 사용하여 최적화하고, 최적화된 서열을 이하에서 보여진 바와 같이 발현을 위해 클로닝하였다.
서열을 PmeI 제한 부위, 코작 서열, 및 NS0 세포내에서 발현용 신호 펩타이드로 가공하였다. 해독은 코작 서열 바로 하부에서 시작하였다.
HLA-IgG4HC 융합체의 완전히 해독된 아미노산 서열은 도 10에 나타낸다.
LC3(VK3)의 해독된 서열은 도 11에 나타낸다.
HC1에 대해 해독된 서열은 도 12에 나타낸다.
HC2에 대해 해독된 서열은 도 13에 나타낸다.
인간 β2 마이크로글로불린을 또한 발현시켰다.
실시예 4: NS0 세포내에서 발현
비아코어(Biacore) 친화성 데이타 및 다른 고려사항들을 기반으로 하여, HC1:LC3 및 HC2:LC3 중쇄 및 경쇄 조합을 StableFast-NS0 세포주 개발을 위한 1차 및 2차 mAb 후보로서 각각 선택하였다.
STABFAST-NS0 세포주 생성을 위한 pBFksr:HC1:LC3 비시스트론성 발현 벡터용 최종 벡터 맵을 도 14에 묘사한다. pBFksr:HC2:LC3의 작제는 동일한 시도를 사용하여 수행하였다.
모계 NS0 세포를 보강된 무혈청 성장 배지 속에서 증식시켰다. 건강한 배양이 설정되면, 천만개의 세포(10x106)를 45㎍의 선형화된(△PvuI) 발현 벡터 DNA로 형질감염시켰다. 세포가 성장 배지 속에서 대량으로 24시간 동안 회수되도록 하였다. 회수 후, 세포를 보강된 무혈청 선택적 배지(콜레스테롤-) 속에서 세척하고, 선택 배지 속에 재현탁시키고 40x96-웰 플레이트에 웰(well)당 200μL로 분포시켰다. 실제 분포는 HC1:LC3 및 HC2:LC3 각각에 대해 1140개 세포/웰 및 840개 세포/웰이었다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 1주 동안 항온처리하고 페놀 레드가 보충된 선택 배지를 공급하였다. 형질감염 후 2주째에, 다수의 웰은 적색에서 황색으로의 배지 색상 변화를 기반으로 하여 활동적으로 성장하였다.
HC1:LC3 형질감염으로부터 총 1,127개 웰들을 인간 IgG 발현에 대해 ELISA로 스크리닝하였다. HC2:LC3 형질감염으로부터 총 612개 웰들을 스크리닝하였다. IgG 농도를 기반으로 하여, 총 290 및 101개 세포주를 HC1:LC3 및 HC2:LC3 각각에 대해 최대 24-웰 플레이트로 확장시켰다. 24-시간 생산성 분석을 사용하여 추가의 분석을 위한 가장 우수한 발현기를 선택하였다. 요약하면, 24-웰 플레이트에 5x105개 세포를 500μL의 신선한 배지 속에서 씨딩(seeding)하였다. 24 시간 후에, 상청액을 ELISA로 스크리닝하였다. IgG 농도를 기반으로 하여, 총 60 및 24개 세포주를 HC1:LC3 및 HC2:LC3 각각에 대해 최대 6-웰 플레이트로 확장시켰다.
3-일의 비생산성 분석을 사용하여 추가의 분석을 위한 가장 우수한 발현기를 선택하였다. 요약하면, 6-웰 플레이트를 4x105개의 세포로 1.5mL의 신선한 배지에서 씨딩하였다. 3일 후, 세포를 계수하고 상청액을 ELISA로 스크리닝하였다. IgG 농도 및 성장을 기반으로 하여, pg/세포/1일에서의 평균 비생산 속도 또는 SPR을 계산하였다. 상대적인 SPR을 기반으로 하여, 총 20 및 10개의 세포주를 HC1:LC3 및 HC2:LC3 각각에 대해 최대 T-75 플라스크로 확장시켰다. 3-일의 SPR 분석을 T-75 규모에서 반복하여 현탁액 적응 및 mAb 생산을 위한 규모 확장을 위해 최종 세포주를 선택하였다.
각각의 mAb에 대한 5개의 세포주를 최대 30-mL 진탕기 배양물로 규모 확장시키고 SPR 및 성장에 대해 재평가하였다. 모든 현탁액 주(line)를 저장하였다. 각각의 mAb에 대해 가장 우수하게 수행하는 세포주를 소 규모 생산을 위한 스피너 배양물로 확장시켰다.
HLA-IgG4 융합 단백질의 경우, pBFksr:HLA-IgG4:LC3 비시스트론성 발현 벡터를 STABFAST-NS0 세포주 발생을 위해 작제하였다. 벡터 맵은 도 15에 나타낸다. 인간 β2 마이크로글로불린 유전자를 함유하는 발현 카세트 및 벡터를 또한 모든 3개의 융합 단백질 서브유닛(인간 HLA-IgG4 중쇄 융합, a-CD28 경쇄[LC3], 및 인간 β2 마이크로글로불린)을 암호화하는 트리시스트론성 발현 벡터에 대해 생성하였다. 트리시스트론성 작제물은 도 16에 나타낸다. 모든 3개의 유전자의 발현은 ELISA 및 상청액의 웨스턴 블랏 분석에 의해 일시적 HEK293 배양물에서 확인하였다.
실시예 5: 기능적 특성규명
CD28에 대한 인간화된 단클론성 항체를 mAb 코팅된 플레이트에서 새롭게 단리된 PBMC의 확장을 유도하는 이의 능력에 대해 시험하였다. 도 17에 나타낸 바와 같이, 인간화된 항-CD28은 슈퍼 작용제가 아니다.
인간화된 단클론성 항체를 인간 T-세포주에서 CD28를 염색하는 이의 능력에 대해 시험하였다. 결과는 도 18에 나타낸다. 도 18a는 쥣과 항-인간 CD8 mAb(클론 9.3, 아이소타입 IgG2a)을 사용한 염색을 나타내었다. 검정색 = 염색되지 않은 세포, 적색 = 항-IgG2a FITC, 청색= 항-CD28 + 항-IgG2a FITC. 도 18(B)은 인간화된 항-CD28(아이소타입 IgG4)을 사용한 염색을 나타낸다. 검정색 = 염색되지 않은 세포, 적색 = 항-IgG4 PE, 청색 = 항-CD28(35 ng) + 항-IgG4 PE, 자주색 = 항CD28(1㎍) + 항-IgG4 PE. 인간화된 항-CD28을 사용한 염색은 클론 9.3 mAb에 의해 차단될 수 있다(도시되지 않음).
HLA-Ig의 정제 후, 항원 펩타이드 로딩 효능을 ELISA에 의해 구조 의존적 항-HLA mAb를 사용하여 점검함으로써 펩타이드 로딩된 단백질을 포획하였다(Current protocols in Immunology Chapter 17.2에 기재된 바와 같음). 특이적인 펩타이드(즉, 정확한 MHC 제한)에 대해 ~90%의 재생가능한 로딩 효율성이, 비-특이적 펩타이드(즉 MHC 미스-매치(mis-match))에 대한 0%와 비교하여, 기대된다.
참고로 편입
본원에 참고된 모든 특허들 및 공보는 그것의 전체가 본원에 참고로 편입된다.
SEQUENCE LISTING <110> NEXIMMUNE MCCREEDY, Bruce JONES, Timothy David CARR, Francis Joseph <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR IMMUNOTHERAPY <130> NEX-001PC <140> PCT/US2014/043629 <141> 2014-06-23 <150> US 61/838,547 <151> 2013-06-24 <150> US 61/948,916 <151> 2014-03-06 <160> 34 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence (Humanized variable heavy sequence for anit-CD28) <220> <221> CDS <222> (1)..(360) <400> 1 gag gtg aag ctg cag cag tca gga cct ggc ctg gtg aag ccc tca gag 48 Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 acc ctg tcc ctc act tgt act gtc tct ggg ttt tca tta agc gac tat 96 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asp Tyr 20 25 30 ggt gtt cat tgg gtt cgc cag gct cca gga aag gga ctg gag tgg ctg 144 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 gga gta ata tgg gct ggt gga ggc acg aat tat aat tcg gct ctc atg 192 Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60 tcc aga aag acc atc agc aaa gac aac tcc aag agc caa gtt ttc tta 240 Ser Arg Lys Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 aaa atg aac agt ctg aca gct gct gac aca gcc gtg tat tac tgt gcc 288 Lys Met Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 aga gat aag gga tac tcc tat tac tat tct atg gac tac tgg ggc caa 336 Arg Asp Lys Gly Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tca 360 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asp Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60 Ser Arg Lys Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Lys Gly Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence (Anti-CD28 VH2) <220> <221> CDS <222> (1)..(360) <400> 3 gag gtg aag ctg cag cag tca gga cct ggc ctg gtg aag ccc tca gag 48 Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 acc ctg tcc ctc act tgt act gtc tct ggg ttt tca tta agc gac tat 96 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asp Tyr 20 25 30 ggt gtt cat tgg gtt cgc cag gct cca gga aag gga ctg gag tgg ctg 144 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 gga gta ata tgg gct ggt gga ggc acg aat tat aat tcg gct ctc atg 192 Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60 tcc aga aag acc atc agc aaa gac aac tcc aag agc caa gtt tcc tta 240 Ser Arg Lys Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu 65 70 75 80 aaa atg agc agt gtg aca gct gct gac aca gcc gtg tat tac tgt gcc 288 Lys Met Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 aga gat aag gga tac tcc tat tac tat tct atg gac tac tgg ggc caa 336 Arg Asp Lys Gly Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tca 360 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 4 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asp Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60 Ser Arg Lys Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu 65 70 75 80 Lys Met Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Lys Gly Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 5 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence ((Anti-CD28 VH3) <220> <221> CDS <222> (1)..(360) <400> 5 gag gtg aag ctg cag cag tca gga cct ggc ctg gtg aag ccc tca gag 48 Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 acc ctg tcc ctc act tgt act gtc tct ggg ttt tca tta agc gac tat 96 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asp Tyr 20 25 30 ggt gtt cat tgg gtt cgc cag gct cca gga aag gga ctg gag tgg ctg 144 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 gga gta ata tgg gct ggt gga ggc acg aat tat aat tcg gct ctc atg 192 Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60 tcc aga gtg acc atc agc aaa gac aac tcc aag agc caa gtt tcc tta 240 Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu 65 70 75 80 aaa ctg agc agt gtg aca gct gct gac aca gcc gtg tat tac tgt gcc 288 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 aga gat aag gga tac tcc tat tac tat tct atg gac tac tgg ggc caa 336 Arg Asp Lys Gly Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tca 360 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 6 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 6 Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asp Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Lys Gly Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 7 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence (Anti-CD28 VK1) <220> <221> CDS <222> (1)..(333) <400> 7 gac atc gag ctc act cag tct cca gat tct ttg gct gtg tct cta ggg 48 Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 gag aga gcc acc atc aac tgc aga gcc agt gag agt gtt gaa tat tat 96 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr 20 25 30 gtc aca agt tta atg cag tgg tac cag cag aag cca gga cag cca ccc 144 Val Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 aaa ctc ctc atc ttt gct gca tcc aac gta gaa tct ggg gtc cct gac 192 Lys Leu Leu Ile Phe Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 agg ttt agt ggc agt ggg tct ggg aca aac ttc acc ctc acc atc tct 240 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asn Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 tct ctg cag gag gag gat gtt gca atg tat ttc tgt cag caa agt agg 288 Ser Leu Gln Glu Glu Asp Val Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Arg 85 90 95 aag gtt cct tac acg ttc gga ggg ggg acc aag gtg gaa ata aaa 333 Lys Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 8 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 8 Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr 20 25 30 Val Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Phe Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asn Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Glu Glu Asp Val Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Arg 85 90 95 Lys Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 9 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence (Anti-CD28 VK2) <220> <221> CDS <222> (1)..(333) <400> 9 gac atc gag ctc act cag tct cca gat tct ttg gct gtg tct cta ggg 48 Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 gag aga gcc acc atc aac tgc aga gcc agt gag agt gtt gaa tat tat 96 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr 20 25 30 gtc aca agt tta atg cag tgg tac cag cag aag cca gga cag cca ccc 144 Val Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 aaa ctc ctc atc ttt gct gca tcc aac gta gaa tct ggg gtc cct gac 192 Lys Leu Leu Ile Phe Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 agg ttt agt ggc agt ggg tct ggg aca aac ttc acc ctc acc atc tct 240 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asn Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 tct ctg cag gcc gag gat gtt gca atg tat ttc tgt cag caa agt agg 288 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Arg 85 90 95 aag gtt cct tac acg ttc gga ggg ggg acc aag gtg gaa ata aaa 333 Lys Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 10 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 10 Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr 20 25 30 Val Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Phe Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asn Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Arg 85 90 95 Lys Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 11 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence (Anti-CD28 VK3) <220> <221> CDS <222> (1)..(333) <400> 11 gac atc gag ctc act cag tct cca gat tct ttg gct gtg tct cta ggg 48 Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 gag aga gcc acc atc aac tgc aga gcc agt gag agt gtt gaa tat tat 96 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr 20 25 30 gtc aca agt tta atg cag tgg tac cag cag aag cca gga cag cca ccc 144 Val Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 aaa ctc ctc atc ttt gct gca tcc aac gta gaa tct ggg gtc cct gac 192 Lys Leu Leu Ile Phe Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 agg ttt agt ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc acc ctc acc atc tct 240 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 tct ctg cag gcc gag gat gtt gca atg tat ttc tgt cag caa agt agg 288 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Arg 85 90 95 aag gtt cct tac acg ttc gga ggg ggg acc aag gtg gaa ata aaa 333 Lys Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 12 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 12 Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr 20 25 30 Val Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Phe Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Arg 85 90 95 Lys Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 13 <211> 984 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence (modified constant heavy sequence) <220> <221> CDS <222> (1)..(984) <400> 13 gct tcc acc aag ggc cca tcc gtc ttc ccc ctg gcg ccc tgc tcc agg 48 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 agc acc tcc gag agc aca gcc gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac 96 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc 144 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc 192 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acg aag acc 240 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 tac acc tgc aat gta gat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag 288 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 aga gtt gag tcc aaa tat ggt ccc cca tgc cca cca tgc cca gca cct 336 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 gag ttc gag ggg gga cca tca gtc ttc ctg ttc ccc cca aaa ccc aag 384 Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 gac act ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc acg tgc gtg gtg gtg 432 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 gac gtg agc cag gaa gac ccc gag gtc cag ttc aac tgg tac gtg gat 480 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag ttc 528 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac 576 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 tgg ctg aac ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa ggc ctc 624 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 ccg tcc tcc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga 672 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 gag cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cag gag gag atg acc aag 720 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tac ccc agc gac 768 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag 816 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc 864 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 agg cta acc gtg gac aag agc agg tgg cag gag ggg aat gtc ttc tca 912 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac aca cag aag agc 960 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 ctc tgc ctg tct ctg ggt aaa tga 984 Leu Cys Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 14 <211> 327 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 14 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Cys Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 15 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence (constant k Light sequence) <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <400> 15 cga act gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag 48 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 cag ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc 96 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa 144 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 tcg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc 192 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag 240 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg 288 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 ccc gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt tag 324 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 16 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 16 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 17 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence (humanized non-CD28-binding variable region) <220> <221> CDS <222> (1)..(360) <400> 17 gag gtg aag ctg cag cag tca gga cct ggc ctg gtg aag ccc tca gag 48 Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 acc ctg tcc ctc act tgt act gtc tct ggg ttt aca ttc agc gac tat 96 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 ggt gtt cat tgg att cgc cag cct cca gga aag gga ctg gag tgg atc 144 Gly Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga gta ata tgg gct ggt gga ggc acg aat tat aat tcg gct ctc atg 192 Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60 tcc aga gtg acc atc agc gtg gac acc tcc aag aac caa ttt tcc tta 240 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 aaa ctg agc agt gtg aca gct gct gac aca gcc gtg tat tac tgt gcc 288 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 aga gat aag gga tac tcc gct gcc gct tct atg gac tac tgg ggc caa 336 Arg Asp Lys Gly Tyr Ser Ala Ala Ala Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tca 360 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 18 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 18 Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Lys Gly Tyr Ser Ala Ala Ala Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 19 <211> 733 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence (humanized HLA-IgG4HC) <400> 19 Gln Val Gln Leu Thr Arg Glu Gly Ser Gly Ser His Ser Met Arg Tyr 1 5 10 15 Phe Phe Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile 20 25 30 Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp 35 40 45 Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu 50 55 60 Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gly Glu Thr Arg Lys Val Lys Ala His Ser 65 70 75 80 Gln Thr His Arg Val Asp Leu Gly Thr Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln 85 90 95 Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Val Gln Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val 100 105 110 Gly Ser Asp Trp Arg Phe Leu Arg Gly Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp 115 120 125 Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala 130 135 140 Ala Asp Met Ala Ala Gln Thr Thr Lys His Lys Trp Glu Ala Ala His 145 150 155 160 Val Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp 165 170 175 Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp 180 185 190 Ala Pro Lys Thr His Met Thr His His Ala Val Ser Asp His Glu Ala 195 200 205 Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Ser Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu 210 215 220 Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val 225 230 235 240 Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val 245 250 255 Val Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His 260 265 270 Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Trp Ala Arg Glu Val Ser Glu Val 275 280 285 Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu 290 295 300 Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Gly Val 305 310 315 320 His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val 325 330 335 Ile Trp Ala Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met Ser Arg 340 345 350 Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu 355 360 365 Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp 370 375 380 Lys Gly Tyr Ser Ala Ala Ala Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 385 390 395 400 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 405 410 415 Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly 420 425 430 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 435 440 445 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 450 455 460 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 465 470 475 480 Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser 485 490 495 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys 500 505 510 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 515 520 525 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 530 535 540 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln 545 550 555 560 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 565 570 575 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 580 585 590 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 595 600 605 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 610 615 620 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 625 630 635 640 Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 645 650 655 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 660 665 670 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 675 680 685 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 690 695 700 Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 705 710 715 720 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Cys Leu Ser Leu Gly Lys 725 730 <210> 20 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence (Light Chain 3 (LC3 or Vk3)) <400> 20 Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr 20 25 30 Val Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Phe Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Arg 85 90 95 Lys Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 21 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence (Heavy Chain 1 (HC1)) <400> 21 Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asp Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60 Ser Arg Lys Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Lys Gly Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Cys Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 22 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence (Heavy Chain 2 (HC2)) <400> 22 Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asp Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60 Ser Arg Lys Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu 65 70 75 80 Lys Met Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Lys Gly Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Cys Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 23 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 23 Asp Tyr Gly Val His 1 5 <210> 24 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 24 Val Ile Trp Ala Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met Ser 1 5 10 15 <210> 25 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 25 Asp Lys Gly Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 26 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 26 Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr Val Thr Ser Leu Met Gln 1 5 10 15 <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 27 Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser 1 5 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 28 Gln Gln Ser Arg Lys Val Pro Tyr Thr 1 5 <210> 29 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 29 Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 <210> 30 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 30 Ala Ala Ala Gly Gly 1 5 <210> 31 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence (N-terminal linker) <220> <221> CDS <222> (1)..(51) <400> 31 cag gtc caa ctg acg cgt gag ggg tcc ggc tct cac tcc atg agg tat 48 Gln Val Gln Leu Thr Arg Glu Gly Ser Gly Ser His Ser Met Arg Tyr 1 5 10 15 ttc 51 Phe <210> 32 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 32 Gln Val Gln Leu Thr Arg Glu Gly Ser Gly Ser His Ser Met Arg Tyr 1 5 10 15 Phe <210> 33 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence (C-terminal linker) <220> <221> CDS <222> (1)..(57) <400> 33 gag ggt ttg ccc aag ccc ctc acc tgg gct cga gag gtg agc gag gtc 48 Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Trp Ala Arg Glu Val Ser Glu Val 1 5 10 15 aag ctg cag 57 Lys Leu Gln <210> 34 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 34 Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Trp Ala Arg Glu Val Ser Glu Val 1 5 10 15 Lys Leu Gln

Claims (34)

  1. 아미노산 서열:
    EVKLQQSGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLSDYGVHWVRQAPGKGLEWLGVIWAGGGTNYNSALMSRKTISKDNSKSQVSLKMSSVTAADTAVYYCARDKGYSYYYSMDYWGQGTLVTVSS을 갖는 면역글로불린 중쇄 가변 영역, 및
    아미노산 서열:
    DIELTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVEYYVTSLMQWYQQKPGQPPKLLIFAASNVESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAMYFCQQSRKVPYTFGGGTKVEIK을 갖는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하고,
    슈퍼-작용제가 아닌,
    항-CD28 항체 또는 이의 일부.
  2. 제1항에 있어서, 불변 영역 또는 이의 일부를 포함하는, 항체.
  3. 제2항에 있어서, 불변 영역이 인간 IgG4의 변이체인, 항체.
  4. 제2항에 있어서, 불변 영역이 하나 이상의 힌지 안정화 돌연변이를 포함하는, 항체.
  5. 제4항에 있어서, 힌지 안정화 돌연변이가 CH 쇄내에 도입된 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 것인, 항체.
  6. 제5항에 있어서, CH 쇄내에 도입된 하나 이상의 돌연변이가 S241P를 포함하는 것인, 항체.
  7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 불변 영역을 포함하고, 불변 영역이 항체를 고형 지지체에 화학적으로 커플링시키는데 적합한 하나 이상의 돌연변이를 포함하는, 항체.
  8. 제7항에 있어서, 커플링에 적합한 하나 이상의 돌연변이가 쌍으로 되지 않은(unpaired) 시스테인을 생성하는, 항체.
  9. 제8항에 있어서, 쌍으로 되지 않은 시스테인이 IgG4 중쇄 불변 영역 서열의 Fc 영역의 S473C인, 항체.
  10. 제8항에 있어서, 쌍으로 되지 않은 시스테인이 고형 지지체에 공유 결합 부착된, 항체.
  11. 제10항에 있어서, 공유 결합에 이용가능한 작용기를 갖는 비드 또는 입자에 부착되는, 항체.
  12. 제11항에 있어서, 작용기가 에스테르, 카르복실산, 말레이미드, 또는 알콜인, 항체.
  13. 제12항에 있어서, 비드 또는 입자가 하나 이상의 사이클로덱스트린-함유 폴리머, 양이온성 사이클로덱스트린-함유 폴리머, 폴리(D,L-락트산-코-글라이콜산)(PLGA), 폴리(카프로락톤)(PCL), 에틸렌 비닐 아세테이트 폴리머(EVA), 폴리(락트산)(PLA), 폴리(L-락트산)(PLLA), 폴리(글라이콜산)(PGA), 폴리(L-락트산-코-글라이콜산)(PLLGA), 폴리(D,L-락타이드)(PDLA), 폴리(L-락타이드)(PLLA), PLGA-b-폴리(에틸렌 글리콜)-PLGA(PLGA-bPEG-PLGA), PLLA-bPEG-PLLA, PLGA-PEG-말레이미드(PLGA-PEG-말(mal)), 폴리(D,L-락타이드-코-카프로락톤), 폴리(D,L-락타이드-코-카프로락톤-코-글라이콜라이드), 폴리(D,L-락타이드-코-PEO-코-D,L-락타이드), 폴리(D,L-락타이드-코-PPO-코-D,L-락타이드), 폴리알킬 시아노아크랄레이트, 폴리우레탄, 폴리-L-라이신(PLL), 하이드록시프로필 메타크릴레이트(HPMA), 폴리에틸렌글리콜, 폴리-L-글루탐산, 폴리(하이드록시산), 폴리무수물, 폴리오르토에스테르, 폴리(에스테르 아미드), 폴리아미드, 폴리(에스테르 에테르), 폴리카보네이트, 폴리알킬렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리알킬렌 글리콜, 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG), 폴리알킬렌 옥사이드(PEO), 폴리알킬렌 테레프탈레이트, 폴리(에틸렌 테레프탈레이트), 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리비닐 에테르, 폴리비닐 에스테르, 폴리(비닐 아세테이트), 폴리비닐 할라이드, 폴리(비닐 클로라이드)(PVC), 폴리비닐피롤리돈, 폴리실록산, 폴리스티렌(PS), 폴리우레탄, 유도된(derivatized) 셀룰로오스, 알킬 셀룰로오스, 하이드록시알킬 셀룰로오스, 셀룰로오스 에테르, 셀룰로오스 에스테르, 니트로 셀룰로오스, 하이드록시프로필셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로오스, 아크릴산의 폴리머, 폴리(메틸(메트)아크릴레이트)(PMMA), 폴리(에틸(메트)아크릴레이트), 폴리(부틸(메트)아크릴레이트), 폴리(이소부틸(메트)아크릴레이트), 폴리(헥실(메트)아크릴레이트), 폴리(이소데실(메트)아크릴레이트), 폴리(라우릴(메트)아크릴레이트), 폴리(페닐(메트)아크릴레이트), 폴리(메틸 아크릴레이트), 폴리(이소프로필 아크릴레이트), 폴리(이소부틸 아크릴레이트), 폴리(옥타데실 아크릴레이트)(폴리아크릴산), 및 공중합체 및 이들의 혼합물, 폴리디옥사논 및 그것의 공중합체, 폴리하이드록시알카노에이트, 폴리프로필렌 푸마레이트, 폴리옥시메틸렌, 폴록사머, 폴리(오르토)에스테르, 폴리(부티르산), 폴리(발레르산), 폴리(락타이드-코-카프로락톤), 트리메틸렌 카보네이트, 폴리비닐피롤리돈, 폴리오르토에스테르, 폴리포스파젠, 및 폴리포스포에스테르, 및 2개 이상의 그와 같은 폴리머의 배합물 및 블록 공중합체로부터 선택된 폴리머를 포함하는 것인, 항체.
  14. 제7항에 있어서, 불변 영역이 Fc 감마 수용체 결합을 감소시키기 위한 하나 이상의 돌연변이를 포함하는, 항체.
  15. 제14항에 있어서, Fc 감마 수용체 결합을 감소시키기 위한 하나 이상의 돌연변이가 CH 쇄내에 도입된 하나 이상의 돌연변이를 포함하는, 항체.
  16. 제15항에 있어서, CH 쇄내에 도입된 하나 이상의 돌연변이가 IgG4 서열의 L248E를 포함하는, 항체.
  17. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, T 세포에 의한 인식을 위해 항원을 표출(present)하는 분자 복합체를 지닌 고형 지지체에 접합된, 항체.
  18. 제17항에 있어서, 분자 복합체가 HLA-Ig 융합 복합체인, 항체.
  19. 제18항에 있어서, HLA 아미노산 서열이 HLA-A*02:01인, 항체.
  20. 중합체 비드 또는 입자, 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 따른 항-CD28 항체, 및 T 세포에 의한 인식을 위해 항원을 표출하는 분자 복합체를 포함하며, 여기서 항-CD28 항체 및 분자 복합체는 비드 또는 입자에 접합된, 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 폴리머 PLGA-PEG 입자를 포함하는, 조성물.
  22. 제20항에 있어서, PLGA-PEG 말레이미드 입자를 포함하는, 조성물.
  23. 제20항에 있어서, 입자 크기가 100 내지 200nm의 범위인 입자를 포함하는, 조성물.
  24. 제20항에 있어서, 입자가 -0 내지 -15 mV의 표면 전하를 갖는, 조성물.
  25. 제20항에 있어서, 입자가 -5 내지 -15mV의 표면 전하를 갖는, 조성물.
  26. 제20항에 있어서, 설프하이드릴-말레이미드 화학을 통해 각각 커플링된 단백질 리간드를 입자당 100 내지 1500개 포함하는, 조성물.
  27. 제20항에 있어서, 입자가 구형인, 조성물.
  28. 제21항에 있어서, PLGA가 50% 락트산(LA) 및 50% 글라이콜산(GA)의 폴리머인, 조성물.
  29. 제21항에 있어서, PLGA 폴리머가 25K 내지 35K의 분자량을 갖는, 조성물.
  30. 제21항에 있어서, PEG 폴리머가 3K 내지 10K의 분자량을 갖는, 조성물.
  31. 제20항에 있어서, 입자당 400 내지 1000개의 리간드를 갖는, 조성물.
  32. 제20항에 있어서, T-세포에 대해 표출되기 위한 항원성 펩타이드와 함께 동시-제형화(co-formulated)되는, 조성물.
  33. 제32항에 있어서, 항원성 펩타이드가 종양 연관된 항원 또는 감염성 질환의 것인, 조성물.
  34. 제32항에 있어서, 항원성 펩타이드가 티로시나제, MAGE-A1, MAGE-A3, gp100, Melan A/Mart-1, gp75/브라운, BAGE, NY-ESO-1, 및 S-100 중의 하나 이상인, 조성물.
KR1020217034171A 2013-06-24 2014-06-23 면역요법을 위한 조성물 및 방법 KR102453188B1 (ko)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361838547P 2013-06-24 2013-06-24
US61/838,547 2013-06-24
US201461948916P 2014-03-06 2014-03-06
US61/948,916 2014-03-06
PCT/US2014/043629 WO2014209868A1 (en) 2013-06-24 2014-06-23 Compositions and methods for immunotherapy
KR1020167001637A KR20160022370A (ko) 2013-06-24 2014-06-23 면역요법을 위한 조성물 및 방법

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020167001637A Division KR20160022370A (ko) 2013-06-24 2014-06-23 면역요법을 위한 조성물 및 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20210130268A KR20210130268A (ko) 2021-10-29
KR102453188B1 true KR102453188B1 (ko) 2022-10-07

Family

ID=52142591

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020167001637A KR20160022370A (ko) 2013-06-24 2014-06-23 면역요법을 위한 조성물 및 방법
KR1020217034171A KR102453188B1 (ko) 2013-06-24 2014-06-23 면역요법을 위한 조성물 및 방법

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020167001637A KR20160022370A (ko) 2013-06-24 2014-06-23 면역요법을 위한 조성물 및 방법

Country Status (13)

Country Link
US (3) US20160129133A1 (ko)
EP (2) EP3995145B1 (ko)
JP (1) JP6566938B2 (ko)
KR (2) KR20160022370A (ko)
CN (2) CN105555302B (ko)
AU (1) AU2014302784B2 (ko)
BR (1) BR112015032277B1 (ko)
CA (1) CA2916465C (ko)
ES (1) ES2902413T3 (ko)
IL (2) IL243235B (ko)
MX (1) MX2015017959A (ko)
SG (2) SG11201510377SA (ko)
WO (1) WO2014209868A1 (ko)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2015371265B2 (en) 2014-12-24 2021-06-03 Neximmune, Inc Nanoparticle compositions and methods for immunotherapy
US11433260B2 (en) 2015-12-21 2022-09-06 Gholam A. Peyman Cancer treatment methods using thermotherapy and/or enhanced immunotherapy
US10136820B2 (en) * 2015-12-21 2018-11-27 Gholam A. Peyman Method to visualize very early stage neoplasm or other lesions
WO2017216768A1 (en) 2016-06-16 2017-12-21 Association For The Advancement Of Tissue Engineering And Cell Based Technologies And Therapies - A4Tec Dendrimer-derived artificial antigen, methods and uses thereof
US10294454B2 (en) 2016-08-24 2019-05-21 General Electric Company Methods and kits for cell activation
CN118530373A (zh) 2017-11-10 2024-08-23 朱拉生物公司 基于主要组织相容性复合物的嵌合受体和其用于治疗自身免疫性疾病的用途
EP4021383A1 (en) * 2019-08-29 2022-07-06 Skinosive Bioadhesive particles comprising active agents, and uses thereof
WO2021216738A2 (en) * 2020-04-21 2021-10-28 Intima Bioscience, Inc. Compositions and methods of generating an immune response
IL310617A (en) * 2021-08-05 2024-04-01 Immunos Therapeutics Ag Combination drugs that include HLA FUSION proteins

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009032661A1 (en) * 2007-08-29 2009-03-12 Sanofi-Aventis Humanized anti-cxcr5 antibodies, derivatives thereof and their uses
US20100008920A1 (en) * 2002-07-12 2010-01-14 The Johns Hopkins University Reagents and Methods for Engaging Unique Clonotypic Lymphocyte Receptors
WO2013086500A1 (en) * 2011-12-09 2013-06-13 The Johns Hopkins University Artificial antigen presenting cells having a defined and dynamic shape

Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6352694B1 (en) 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
US5466609A (en) 1990-10-31 1995-11-14 Coulter Corporation Biodegradable gelatin-aminodextran particle coatings of and processes for making same
EP0997477B1 (en) * 1994-07-29 2006-03-15 Sunol Molecular Corporation MHC complexes and uses thereof
CA2250166A1 (en) 1996-03-28 1997-10-02 The Johns Hopkins University Soluble divalent and multivalent heterodimeric analogs of proteins
US7973137B1 (en) 1996-03-28 2011-07-05 Johns Hopkins University Cell compositions comprising molecular complexes that modify immune responses
US6140113A (en) 1996-03-28 2000-10-31 The Johns Hopkins University Polynucleotides encoding molecular complexes which modify immune responses
US6268411B1 (en) 1997-09-11 2001-07-31 The Johns Hopkins University Use of multivalent chimeric peptide-loaded, MHC/ig molecules to detect, activate or suppress antigen-specific T cell-dependent immune responses
DE19722888A1 (de) 1997-05-28 1998-12-03 Thomas Prof Dr Huenig Human-CD28 spezifische monoklonale Antikörper zur antigenunspezifischen Aktivierung von T-Lymphozyten
US6074884A (en) 1997-10-09 2000-06-13 Coulter International Corp. Stable protein-nickel particles and methods of production and use thereof
US6261606B1 (en) 1999-09-14 2001-07-17 Natural Compounds, Ltd. Naturally extracted and synthetic hypoglycemic or hypolipidemic compositions
EP1360290A2 (en) 2000-06-23 2003-11-12 Maxygen, Inc. Co-stimulatory molecules
EP1349569B1 (en) * 2001-01-12 2007-04-18 Becton Dickinson and Company Intrinsically fluorescent, self-multimerizing mhc fusion proteins and complexes thereof
US6811785B2 (en) * 2001-05-07 2004-11-02 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Multivalent MHC class II—peptide chimeras
AU2002368077B2 (en) * 2001-07-12 2010-03-04 Jefferson Foote Super humanized antibodies
EP1628675A4 (en) 2003-05-20 2008-05-07 Univ Virginia ANTIGENS TARGETED BY PATHOGENIC T LYMPHOCYTES PREDOMINANT IN DIABETES TYPE 1 AND USES THEREOF
WO2007087341A2 (en) * 2006-01-25 2007-08-02 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Tolerogenic biodegradable artificial antigen presenting system
KR100796985B1 (ko) * 2006-06-30 2008-01-22 연세대학교 산학협력단 금박막이 부분 증착된 다기능성 나노입자
AU2007307206B2 (en) * 2006-10-04 2016-02-11 Janssen Pharmaceutica, N.V. Preparation of inactivated artificial antigen presenting cells and their use in cell therapies
WO2008109852A2 (en) 2007-03-07 2008-09-12 Uti Limited Partnership Compositions and methods for the prevention and treatment of autoimmune conditions
WO2009094273A2 (en) * 2008-01-15 2009-07-30 Yale University Compositions and methods for adoptive and active immunotherapy
PL2774608T3 (pl) 2008-06-16 2020-05-18 Pfizer Inc. Polimerowe nanocząstki napełnione lekiem oraz sposoby ich wytwarzania i zastosowania
CN102099016A (zh) * 2008-06-16 2011-06-15 佰恩德生物科学股份有限公司 载药的聚合物纳米微粒及其制备和使用方法
US9333163B2 (en) 2008-10-06 2016-05-10 Massachusetts Institute Of Technology Particles with multiple functionalized surface domains
US8343497B2 (en) 2008-10-12 2013-01-01 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Targeting of antigen presenting cells with immunonanotherapeutics
WO2010136598A1 (en) * 2009-05-29 2010-12-02 Morphosys Ag A collection and methods for its use
WO2012021786A2 (en) * 2010-08-12 2012-02-16 Theraclone Sciences, Inc. Anti-hemagglutinin antibody compositions and methods of use thereof
US9511151B2 (en) 2010-11-12 2016-12-06 Uti Limited Partnership Compositions and methods for the prevention and treatment of cancer
AU2012274127B2 (en) * 2011-06-22 2017-06-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Removal of target cells by circulating virus-specific cytotoxic T-cells using MHC class I comprising complexes
US20130022551A1 (en) * 2011-07-22 2013-01-24 Trustees Of Boston University DEspR ANTAGONISTS AND AGONISTS AS THERAPEUTICS
US20150030619A1 (en) 2011-09-06 2015-01-29 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Activation and Expansion of T Cell Subsets Using Biocompatible Solid Substrates with Tunable Rigidity
RU2631599C2 (ru) * 2011-12-14 2017-09-25 Дзе Джонс Хопкинс Юниверсити Наночастицы, легче проникающие в слизистую оболочку или вызывающие меньше воспаления
JP2015502397A (ja) * 2011-12-23 2015-01-22 ファイザー・インク 部位特異的コンジュゲーションのための操作された抗体定常領域、ならびにそのための方法および使用
US10548957B2 (en) 2012-09-28 2020-02-04 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Targeted expansion of Qa-1-peptide-specific regulatory CD8 T cells to ameliorate arthritis
US9603948B2 (en) 2012-10-11 2017-03-28 Uti Limited Partnership Methods and compositions for treating multiple sclerosis and related disorders
US9550986B2 (en) 2012-12-21 2017-01-24 Abbvie Inc. High-throughput antibody humanization
KR102164405B1 (ko) * 2013-03-14 2020-10-12 더 존스 홉킨스 유니버시티 나노스케일 인공 항원 제시 세포
SG10201912301XA (en) 2013-11-04 2020-02-27 Uti Lp Methods and compositions for sustained immunotherapy

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100008920A1 (en) * 2002-07-12 2010-01-14 The Johns Hopkins University Reagents and Methods for Engaging Unique Clonotypic Lymphocyte Receptors
WO2009032661A1 (en) * 2007-08-29 2009-03-12 Sanofi-Aventis Humanized anti-cxcr5 antibodies, derivatives thereof and their uses
WO2013086500A1 (en) * 2011-12-09 2013-06-13 The Johns Hopkins University Artificial antigen presenting cells having a defined and dynamic shape

Also Published As

Publication number Publication date
IL285527B2 (en) 2023-06-01
IL243235B (en) 2021-09-30
CN105555302B (zh) 2021-07-30
JP2016530224A (ja) 2016-09-29
CN113797332A (zh) 2021-12-17
US11712477B2 (en) 2023-08-01
IL285527A (en) 2021-09-30
EP3995145B1 (en) 2024-10-16
BR112015032277B1 (pt) 2020-12-01
US20200345855A1 (en) 2020-11-05
EP3995145A1 (en) 2022-05-11
BR112015032277A2 (pt) 2017-11-07
MX2015017959A (es) 2018-03-01
CN113797332B (zh) 2024-08-09
CN105555302A (zh) 2016-05-04
EP3013361A1 (en) 2016-05-04
US20180214564A1 (en) 2018-08-02
KR20160022370A (ko) 2016-02-29
KR20210130268A (ko) 2021-10-29
IL243235A0 (en) 2016-03-31
US20160129133A1 (en) 2016-05-12
AU2014302784A1 (en) 2016-01-21
CA2916465A1 (en) 2014-12-31
SG11201510377SA (en) 2016-01-28
WO2014209868A1 (en) 2014-12-31
CA2916465C (en) 2023-05-23
JP6566938B2 (ja) 2019-08-28
ES2902413T3 (es) 2022-03-28
SG10201710737VA (en) 2018-01-30
EP3013361B1 (en) 2021-10-06
EP3013361A4 (en) 2017-05-24
AU2014302784B2 (en) 2020-01-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7542870B2 (ja) 免疫療法のためのナノ粒子組成物及び方法
US11712477B2 (en) Compositions and methods for immunotherapy

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant