DE69833949T2 - Mutierte klasse-i-mhc-moleküle - Google Patents

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Description

  • Der Haupthistokompatibilitäts-Komplex ("MHC") spielt im Immunsystem eine wichtige Rolle. Antigen-spezifische T-Zellen erkennen antigene Peptide in Zusammenhang mit MHC Klasse I oder II Molekülen auf der Zelloberfläche. Klasse I Moleküle bestehen aus zwei nicht-kovalent zusammenhängenden Untereinheiten: einer hochpolymorphen α-Kette und einer konservierten β2-Mikroglobulin ("β2-M") leichten Kette. Zwei der drei extrazellulären Domänen der schweren Kette, d.h. die Domänen α1 und α2 sind in einer "Rillen" Struktur gefaltet, in der ein antigenes Peptid zur Präsentation für T-Zellen verankert ist.
  • Menschliche Klasse I Moleküle (oder "Komplexe") wurden aus mit E. coli hergestellten schweren Ketten und β2-M Untereinheiten in der Gegenwart von synthetischen Peptiden (Garboczi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 (1992) 3429–3433) wieder gefaltet. Die dreidimensionalen Strukturen derartiger rekombinanter Komplexe, wie mittels Röntgenstrahlen-Kristallographie bestimmt, sind nahezu identisch zu der Struktur des Klasse I Moleküls, wie von menschlichen Zellen isoliert (Madden et al., Cell, 75 (1993), 693–708; Bjorkman et al., Nature, 329 (1987), 506–512). Von der von HLA-A2 in E. coli hergestellten und mit synthetischen HIV-1 Nonapeptiden zusammengebauten Unterart A0201* wurde gezeigt cytolytische CD8+ T-Zell Antworten hervorzurufen (Walter et al., Int. Immunology, 9 (1997), 451–459).
  • Die herkömmliche Klasse I Genfamilie umfasst die hochpolymorphen, menschlichen Klasse I Moleküle HLA-A, -B, und -C, und Klasse I (d.h. H-2) Moleküle D, K, und L der Maus. Eine Reihe struktureller Verwandter (nicht-klassische Klasse I Moleküle) wurde in Menschen (beispielsweise HLA-E, -F, -G, -H, -I und -J; und CD1) und Mäusen gefunden (Q, T, M und CD1) (Shawar et al., Annu. Rev. Immunol., 12 (1994), 839–880). Diese Moleküle weisen die gewöhnliche Struktur eines Antigen-präsentierenden Moleküls auf, worin eine polymorphe schwere Kette mit der konservierten β2-M Untereinheit nicht-kovalent zusammenhängt. Das T-Zell-Repertoire, das mit diesen nicht-klassischen Liganden reagiert, wurde nur in einem begrenzten Ausmaß charakterisiert.
  • Parker et al. (Biochemistry, 22 (1983), 1145–53) betrifft die Lokalisierung der Iodierungsstellen im menschlichen β2-Mikroglobulin. Die jeweiligen Stellen werden mittels Modifikation der sechs Tyrosine in dem Polypeptid bestimmt, von denen vier zu einem gewissen Ausmaß modifiziert werden konnten. Zwei Tyrosine an den Stellen 63 und 76 können erheblich iodiert sein, während an den Stellen 10 und 26 andere zwei einer Iodierung zu einem geringeren Ausmaß unterworfen werden.
  • In der US 5,635,363 werden spezifisch markierte T-Zellen beschrieben. Die T-Zellen sind gemäß ihrer Spezifizität ihres Antigen-Rezeptors durch Binden an einen multimeren Komplex markiert, der aus entweder MHC Klasse I oder Klasse II Molekülen ausgewählt ist, und eine α- Kette und eine lösliche Form einer β-Kette umfasst, die beispielsweise einen ungepaarten Cysteinrest an irgendeiner Stelle zum Binden an ein antigenes Peptid eingefügt aufweist.
  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Konjugats eines MHC Klasse I Moleküls und einer Verbindung. In diesem Verfahren wird zuerst ein MHC Klasse I Molekül erhalten, worin ein Cysteinrest (d.h. ein nicht-natürlicher oder neuer Cysteinrest) in seiner β2-Mikroglobulin Untereinheit an der Stelle 52, 67 oder 91 eingebaut wurde. Die Verbindung (beispielsweise ein Protein, ein Carbohydrat, ein Fettmolekül oder irgendeine andere organische Verbindung) wird anschließend insbesondere über eine Bindung, die zwischen der Sulfhydryl-Gruppe des neuen Cysteinrests an der β2-M-Mikroglobulin Untereinheit und einer funktionellen Gruppe der Verbindung gebildet ist, an das Mutant Klasse I Molekül konjugiert. Alternativ dazu kann die Verbindung zuerst an die neue β2-M Untereinheit konjugiert werden, und anschließend wird die Untereinheit mit einer schweren α-Kette (von der gleichen oder verschiedenen Spezies wie der β2-M Untereinheit) in der Gegenwart eines geeignete Peptids zur Bildung einer Verbindungs-Klasse I Konjugats gemischt.
  • Der neue Cysteinrest ersetzt erfindungsgemäß einen Rest, der Serin 52, Tyrosin 67 oder Lysin 91 des reifen β2-Mikroglobulins entspricht.
  • Die Verbindung kann beispielsweise ein Ligand für ein multivalent bindendes Molekül, einen Antikörper (beispielsweise einer der spezifisch für ein Tumor-Antigen ist), ein Molekül auf der Oberfläche einer Zelle (beispielsweise einer Antigen-präsentierenden Zelle oder irgendeiner anderen Blut-bildenden Zelle) oder einen Ligand für einen Oberflächen-Rezeptor einer Zelle sein.
  • Die neuen Verbindung Klasse I Konjugate weisen verschiedene Verwendungen auf. Falls beispielsweise ein multivalent bindendes Molekül bereitgestellt wird, können Konjugate der Liganden für das bindende Molekül mit den neuen monomeren Klasse I Molekülen (beispielsweise solchen, die aus einer schweren α-Kette der neuen β2-M und einem Peptid bestehen, das mit der schweren Kette zusammenhängt) multimerisiert werden. Multimere Klasse I Moleküle können beispielsweise zum Markieren, Isolieren und Quantifizieren spezifischer T-Zellen verwendet werden. Beispiele für multivalent bindende Moleküle sind Avidin (oder ein Derivat davon, beispielsweise Streptavidin), dessen Liganden Biotin und Biotin-Derivate sind.
  • Ein erfindungsgemäßes Konjugat kann ebenso zur Stimulierung der Immunität eines Individuums (beispielsweise eines Menschen oder einer Maus) verwendet werden. Um dies zu erreichen, wird ein Konjugat eines neuen Klasse I Moleküls und einer Zelle (beispielsweise einer Antigen-präsentierenden Zelle) in ein Individuum eingefügt, wobei das Konjugat die Immunzellen, insbesondere für das Peptid in dem Konjugat spezifische T-Zellen, stimulieren kann. Die Zelle und das Klasse I Molekül in dem Konjugat sind in diesem Verfahren vorzugsweise syngen zu diesem Individuum.
  • Ein anderes erfindungsgemäßes Konjugat kann zur Auslöschung eines Tumors (oder irgendeiner anderen unerwünschten Zelle) in einem Individuum verwendet werden. Ein Konjugat eines neuen Klasse I Moleküls oder eines für ein Antigen (oder einen Liganden für einen Rezeptor) spezifischen Antikörpers wird in diesem Verfahren ausschließlich oder hauptsächlich auf der Zelle exprimiert, die in das Individuum eingeführt wird. Die schwere α-Kette in dem Konjugat kann für den Patienten allogen oder xenogen sein. Das Klasse I Molekül würde mit einem antigenen Peptid zusammenhängen, das eine starke T-Zell Antwort hervorrufen kann, falls die schwere Kette zu dem Patienten syngen ist.
  • Eine Verwendung der neuen rekombinanten β2-M monomeren und multimeren Klasse I Moleküle, die die neuen β2-M und die neue Bindungs-Klasse I Konjugate beinhalten, liegt ebenso im Bereich der Erfindung.
  • Die neuen β2-M beseitigen das Bedürfnis eines genetischen Manipulierens von MHC schweren Ketten um eine chemisch-reaktive Stelle in jedem der verschiedenen MHS Klasse I Moleküle zu erzeugen. Dies ist ein wesentlicher Vorteil hinsichtlich des enormen Polymorphismus von MHC schweren Ketten.
  • Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der nachstehenden ausführlichen Beschreibung und den Ansprüchen ersichtlich werden.
  • Die 1A–1C zeigen einen Satz von Graphen, die die Ergebnisse einer Flusszytometrie Analyse des Phycoerythrin-markierten HLA-A2-SL9 Tetramers an Mensch cytotoxischen T-Lymphozyten Zellen von jeweils den Klonen 68A62 (spezifisch für HLA-A2-IV9), 18030 (spezifisch für HLA-A2-SL9) und 63D35 (spezifisch für HLA-B11-AK9) zeigen. Die Zellen wurden ebenso mit einem anti-CD8 monoklonalen Antikörper gefärbt, der mit Cy Chrom, d.h. einem fluoreszierendem Komplex aus Phycoerythrin und Texas Rot, markiert war.
  • Die 2A–2C zeigen einen Satz von Graphen, die die Ergebnisse einer Flusszytometrie Analyse des Bindens des Phycoerythrin-markierten chimären H-2Kb-SV9 Tetramers an Maus cytotoxischen T-Lymphozyten Zellen von jeweils den Klonen 2F3 (spezifisch für das SV9 Peptid gebunden an H-2Kb), 3C2 (spezifisch für das SV9 Peptid gebunden an H-2Db) und 4G3 (spezifisch für das OVA Peptid gebunden an H-2Kb) zeigen. Die Färbeintensität des H-2Kb-SV9 Tetramers wird in durchgehender Linie und die Intensität der Hintergrund-Fluoreszenz (d.h. ausschließliches Färben mit Avidin-PE) wird in gestrichelter Linie gezeigt.
  • Die 3A und 3B zeigen einen Satz von Graphen, die das Binden eines tetrameren MHC-Peptid Komplexes (H-2Kb komplexiert mit SV9) an CTLs zeigen, worin Kb syngen (3A) oder allogen (3B) ist. Zwei Parameter Kontur Diagramme in den 3A und 3C zeigen den Phänotyp (anti-CD8 gegenüber anti-H-2Kb) von jeweils CTLs (doppelt positiv) erzeugt in H-2b Mäusen und CTLs (einfach positiv) erzeugt in H-2d Mäusen. Die Färbintensitäten mit dem H-2Kb-SV9 Reagenz (fettgedruckte Linie) in den 3A und 3C werden in den 3B und 3D jeweils im Vergleich mit der Hintergrundintensität (nur Avidin-PE, gestrichelte Linie) gezeigt. Bemerke die vergleichbare Verschiebung der Fluoreszenzintensität für syngene (3B) und die Mehrzahl der allogenen CTLs (3D).
  • Verfahren zur Herstellung eines Konjugats eines MHC Klasse I Moleküls und einer Verbindung werden bereitgestellt. Das MHC Klasse I Molekül umfasst eine rekombinante β2-M Untereinheit, in welcher ein Cysteinrest an der Stelle 52, 67 oder 91 des reifen menschlichen β2-Mikroglobulins eingefügt wurde. Gewöhnliche Mutagenese Verfahren können zur Erzeugung von DNA verwendet werden, die derartige Mutant β2-Moleküle kodiert. Eine allgemeine Anleitung kann in Sambrook et al., Molecular Kloning, A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; und Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1993 gefunden werden. Der in die β2-M Untereinheit eingefügte Cysteinrest stellt eine bequeme Stelle für eine hochselektive chemische Modifikation bereit. Ein Binden zwischen Sulfhydrylen und gewissen funktionellen Gruppen ist darüber hinaus reversibel, wodurch ein Lösen einer Verbindung von dem Klasse I Molekül, an welches es konjugiert wurde, ermöglicht wird.
  • Die Verbindung kann an den neuen Cysteinrest in dem Klasse I Molekül über eine eigene funktionelle Gruppe verbunden werden. Sulfhydryl-reaktive funktionelle Gruppen schließen ein, sind allerdings nicht darauf beschränkt, Maleimide, Pyridyl-Disulfide, α-Haloacyl Derivate (beispielsweise Iodoacytamide), Alkylhalide und Arylhalide. Maleimide, Alkyl- und Arylhalide und α-Haloacyle reagieren mit Sulfhydrylen zur Bildung von Thioether Bindungen. Andererseits reagieren Pyridyl-Disulfide mit Sulfhydrylen zur Erzeugung gemischter Disulfide. Das Pyridyl-Disulfid Produkt kann geschnitten bzw. getrennt werden. Ein Sulfhydryl-reaktiver Vernetzer kann ebenso, insbesondere falls die Verbindung selbst keine Sulfhydryl-reaktiven Gruppen enthält verwendet werden. Ein derartiger Vernetzer weist zwei oder mehrere verschiedene reaktive Gruppen auf, welche seine sequentiellen Konjugationen mit zwei oder mehreren anderen Molekülen ermöglicht. Vernetzer, die zu einem Teil Amin-reaktiv und anderen Teils Sulfhydrylreaktiv (beispielsweise einige DOUBLE-AGENTTM Vernetzer sind verfügbar von PIERCE, Rockford, Illinois) sind, können beispielsweise verwendet werden, um eine Amin enthaltene Verbindung mit dem Mutant Klasse I Molekül zu verbinden. Beispielsweise stellt N-Succinimidyl 3-(2-Pyridyldithio)-Propionat ("SPDP") einen reversiblen NHS-Ester (d.h. N-Hydroxysuccinamid-Ester), Pyridyl-Disulfid Vernetzer dar, wobei der Amin-reaktive NHS-Ester in SPDP zuerst mit einer Verbindung von Interesse und anschließend mit der freien -SH Gruppe des neuen Klasse I Moleküls reagiert werden kann. Nützliche wasserlösliche SPDP Analoge umfassen Sulfosuccinimidyl 6-(3-[2-Pyridyldithio]Propionamid) Hexanoat (d.h. sulfonierendes bzw. sulfoniertes langkettiges SPDP Analog oder Sulfo-LC-SPDP), LC-SPDP, 4-Succinimidyloxycarbonyl-α-methyl-α-(2-Pyridyldithio)-toluol ("SMPT") und Sulfosuccinimidyl-6-(α-Methyl-α-[2-Pyridyldithio]-toluamid) Hexamoat ("SULFO-LC-SMPT"). Zusätzliche Sulfhydryl- und Amin-reaktive heterofunktionelle Vernetzer umfassen Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)-Cyclohexan-1-Carboxylat ("SMCC"), N-γ-Maleimidobutyryloxysulfosuccinimid Ester, m-Male imidobenzoyl-N-hydroxysulfosuccinimid Ester, Sulfosuccinimidyl [4-Iodacetyl] Aminobenzoat und Sulfosuccinimidyl 4-[p-Meleimidophenyl] Butyrat (Pierce Illinois). Homobifunktionelle Sulfhydryl-reaktive Vernetzer sowie Bis-Maleimidohexane ("BMH"), 1,4-Di-(3'-[2'-Pyridyldithio] Propionamid-Butan ("DPDPB") und 1,5-Difluor-2,4-Dinitrobenzol ("DFDNB") können ebenso verwendet werden, falls die zu konjugierende Verbindung ein Sulfhydryl enthält.
  • Die α und β2-M Untereinheiten des MHC Klasse I Proteins können von der gleichen oder verschiedenen Spezies (beispielsweise Menschen, Ratten, Mäuse, Hamster, Frösche, Hühner usw.) stammen. Transmembrane und wahlweise intrazelluläre Domänen der α-Untereinheit können entfernt werden, um ein richtiges in vitro Falten zu fördern. Verfahren zum Erhalten von Klasse I schweren Ketten und β2-M Untereinheiten und zur Bildung monomerer Klasse I Peptid Komplexe sind im Stand der Technik gut bekannt (siehe beispielsweise Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 (1992), 8403–8407; und Garboczi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 (1992), 3429–3433). Die mit einem rekombinanten Expressionssystem (beispielsweise einem E. coli oder einem Baculovirus System) erhaltenen α und β2-M Untereinheiten können getrennt oder zusammen wiedergefaltet werden und anschließend in der Gegenwart von geeigneten Peptiden (beispielsweise Peptide von ungefähr 8–12 Aminosäureresten in der Länge) verbunden werden. Die Mutant β2-M Untereinheit kann alternativ mit der α-Untereinheit eines vorgebildeten Klasse I Moleküls mittels Austausch mit der β2-M Untereinheit in den vorgebildeten Molekülen verbunden werden, wobei in diesem Fall keine Peptid Unterstützung bei der Verbindungsreaktion benötigt wird, falls das vorgebildete Klasse I Molekül bereits durch ein Peptid besetzt ist.
  • Die Konjugation zwischen dem Klasse I Protein und der Verbindung wird im Allgemeinen durchgeführt, nachdem die β2-M Untereinheit in eine native oder nativähnliche Konformation gefaltet wurde. In dieser Konfirmation sind die natürlich auftretenden Cysteinreste (4 in der schweren Kette und 2 in β2-M) in stabilen Disulfid-Bindungen eingebracht und daher für eine chemische Modifizierung nicht zugänglich. Eine Konjugation tritt daher insbesondere mittels der nicht-gepaarten Oberflächen-ausgesetzten Cysteine auf.
  • Nachstehend sind die Erzeugung und Verwendung verschiedener Konjugate der Erfindung beschrieben. Ausgenommen anders definiert, weisen alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung auf, wie allgemein von einem Fachmann dem diese Erfindung gehört, verstanden wird. Beispielhafte Verfahren und Material sind nachstehend beschrieben, obgleich Verfahren und Materialien ähnlich oder äquivalent zu jenen hierin beschriebenen in der Durchführung oder beim Testen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Diese beispielhaften Verfahren und Materialien sind ausschließlich illustrativ und nicht beabsichtigt einschränkend zu sein.
  • I. Zell-Klasse I Konjugate
  • Das neue Klasse I Molekül kann an eine Verbindung (beispielsweise ein Protein, Carbohydrat oder Fettmolekül) auf einer Zelloberfläche mittels des neuen Cysteins in der β2-M Untereinheit konjugiert werden. Um dies zu erreichen, kann die Oberfläche der Zelle unter milden Bedingungen mit einem reduzierenden Reagenz (beispielsweise Dithiothreitol ("DDT"), 2-Mercaptoethanol; oder 2-Mercaptoethylamin·HCL) reduziert werden, was zu reaktiven Stellen (beispielsweise Sulfhydryl-Gruppen) auf der Zelloberfläche führt. Derartige reaktive Stellen werden anschließend unmittelbar oder durch einen bi-funktionellen Vernetzer mit der freien Sulfhydryl Gruppe in dem Klasse I Molekül zur Reaktion gebracht. Beispielsweise werden durch die Sulfonyl-Gruppen, die an den Succinimidylringen in Sulfo-NHS Estern (beispielsweise Sulfo-LC-SPDP oder Sulfo-SMCC) angebracht sind, diese Vernetzer Membran undurchdringlich und daher mit inneren Membran Proteinen nicht reaktiv und daher sind diese Vernetzer beim Vernetzen neuer Klasse I Komplexe mit der Zelloberfläche von Nutzen. Klasse I negative Zellen, wie beispielsweise menschliche HMy2. C1R Zellen (American Type Culture Collection CRL-1993), können verwendet werden, um optimale Konjugationsbedingungen zu bestimmen. Die Dichte der auf der Zelloberfläche verankerten Klasse I Peptid Komplexe kann durch Fluoreszenz aktiviertes Zellsortieren ("FACS") Analyse unter Verwendung monoklonaler Antikörper ("Mab"s) gegen das Klasse I bestimmt werden.
  • Peptid Klasse I Komplexe, die an syngene Zellen konjugiert sind, können zur Stimulierung der Immunität in einem Individuum verwendet werden. Um dies zu bewerkstelligen, werden Zellen, die von diesem Individuum oder einem anderen abgeleitet sind mit passenden MHC Haplotypen an die neuen Klasse I Moleküle in vitro konjugiert, die mit Antigen-Peptiden von Interesse beladen wurden. Nützliche Zellen schließen ein, sind aber nicht darauf begrenzt, periphere Blutlymphozyten, die von einem Ficoll Dichtegradienten entnommen wurden, gereinigte Antigen-präsentierende Zellen, wie beispielsweise Macrophagen/Monocyten, dendritische Zellen und B-Zellen oder rote Blutzellen. Antigene Peptide von Interesse sind beispielsweise Melanom assoziierte immundominante Epitope, die von Melanom assoziierten Antigenen, wie beispielsweise MART-1/Melan A, gp 100/Pmel 17, Tyrosinase, Mage 3, p15, TRP-1 und β-Catenin (Tsomides et al., International Immunol., 9 327–338) abgeleitet sind. Die Zellkonjugate werden anschließend in das Individuum eingefügt. Falls die Konjugate für eine Impfung verwendet werden, kann eine Verwendung von Antigen-präsentierenden Zellen als die zellulären Komponenten der Konjugate bevorzugt sein, da diese Zellen die benötigten costimulatorischen Signale zur Induzierung einer effektiven T-Zell Antwort bereitstellen können.
  • Die vorstehende Immunisierungs-Strategie ermöglicht die Steuerung der Epitopdichte und umgeht zahlreiche Schwierigkeiten, die mit herkömmlichen Impfungs-Strategien zusammenhängen. Beispielsweise sind die Peptide, die in den vorliegenden vorgebildeten Klasse I Peptid Komplexen eingebettet sind, unähnlich zu herkömmlichen Peptid Impfstoffen vor schneller enzymatischer Zersetzung oder intrazellulärem Prozessieren geschützt. Herkömmliche Peptid Impfstoffe werden im Allgemeinen nicht unmittelbar durch Klasse I Moleküle auf der Zelloberfläche präsentiert, stattdessen werden sie für gewöhnlich verinnerlicht und im Inneren der Zelle für eine Verbindung mit MHC-Klasse I Molekülen prozessiert. Eine Peptid-Präsentierung hängt daher von einer Reihe intrazellulärer Ereignisse ab, die die Rate einer Proteinzersetzung, den Peptid Transport und die Konkurrenz mit endogenen Peptiden umfassen.
  • Beispiel 1
  • Unmittelbare Konjugation von Klasse I Komplexen mit Zellen.
  • 106 Zellen in PBS werden mit 50 μM DDT für 30 Minuten reduziert. In Folge werden reaktive -SH Gruppen auf der Zelloberfläche erzeugt. Nach zwei Waschschritten mit PBS, werden die reduzierten Zellen mit den neuen Klasse I Komplexen inkubiert, was zu einer Bildung von Disulfid-Bindungen zwischen den -SH Gruppen in den β2-M Untereinheiten und den -SH Gruppen auf der Oberfläche der reduzierten Zellen führt.
  • Beispiel 2
  • Mittelbare Konjugation von Klasse I Molekülen mit Zellen
  • 106 Zellen werden in 500 μL PBS Puffer (pH 7,2) suspendiert und 1 mg Sulfo-SMCC zu der Zelllösung hinzu gegeben. Die Inkubation schreitet für 1 Stunde bei Raumtemperatur oder 30 Minuten bei 37°C voran, was zu einer kovalenten Bindung zwischen der NHS-Ester Gruppe in Sulfo-SMCC und einem primären Amin auf der Zelloberfläche führt.
  • Die Zellen werden anschließend 3mal mit PBS gewaschen und bei 4°C für 1 Stunde mit 0,5 mg des neuen rekombinaten Klasse I Proteins inkubiert. Dieser Schritt führt zu einer Bildung einer kovalenten Bindung zwischen der freien -SH Gruppe in dem neuen Klasse I Protein und der Maleimid Gruppe in Sulfo-SMCC.
  • II. Antikörper-Klasse I Konjugate
  • Das neue MHC Klasse I Molekül kann auf eine Zelle durch Konjugieren an einen Antikörper gegen ein Antigen spezifisch gerichtet sein, das auf der Oberfläche der Zelle exprimiert ist. Beispielsweise können nicht selbstgerichtete (beispielsweise Allogene) Klasse I Moleküle, die an Antikörper spezifisch für ein Tumor Antigen (oder irgendein Antigen ausschließlich oder in erster Linie exprimiert durch irgendein anderes unerwünschtes Gewebe) konjugiert sind, an Tumor-Gewebe (oder das unerwünschte Gewebe) in einem Individuum angebracht werden. Das Gewebe, welches jetzt fremde MHC Moleküle trägt, wird ein Ziel einer Gewebeabstoßung, einer der stärksten bekannten Immunantworten, und kann dadurch zerstört werden.
  • Um eine starke Immunantwort gegen ein unerwünschtes Gewebe in einem Individuum hervorzurufen, kann ein für das Gewebe spezifischer Antikörper ebenso an ein syngenes Klasse I Molekül konjugiert werden, das mit einem möglichen T-Zell Epitop (wie beispielsweise HLA-A2 mit dem Influenza Matrix Protein 59–68 (ILGFVFTLTV, SEQ ID NO: 2) oder das Influenza B NP 85–94 (KLGEFYNQMM; SEQ ID NO: 3)) zusammenhängt. Ein derartiges Konjugat kann eine starke zytotoxische T-Zell Antwort hervorrufen, welche das unerwünschte Gewebe auslöscht.
  • Mehrere monoklonale Antikörper können zum Abzielen auf Tumorgewebe verwendet werden. Beispielhafte mit Tumor zusammenhängende Antigene schließen ein, sind aber nicht darauf begrenzt, das Lewisy-verwandte Carbohydrat (gefunden auf Epithel Carcinomen), die IL-2 Rezeptor p55 Untereinheit (exprimiert auf Leukämie und Lymphomzellen), das erbB2/p185 Carcimonverwandte proto-Onkogen (überexprimiert in Brustkrebs), Ganglioside (beispielsweise GM2, GD2 und GD3), epithel Tumormucin (beispielsweise MUC-1), Carcino embryonisches Antigen, Eierstock-Carcinom-Antigen MOv-18, schuppenartiges Carcinom-Antigen 17-1A und bösartiges Melanom-Antigen MAGE. Falls der zu behandelnde Tumor in einem Menschen vorliegt, kann der Antikörper humanisiert sein, um die Serum Halbwärtslehmzeit des MHC-Antikörper Konjugats zu verlängern.
  • Der Antikörper und die MHC-Bestandteile in dem vorliegenden Konjugat sind über eine kovalente Bindung zwischen dem neuen Cysteinrest in dem Mutant β2-M und einer funktionellen Gruppe in dem Antikörper konjugiert. Zwischenliegende Vernetzer können verwendet werden, um die kovalente Bindung zu bilden. Beispielsweise wird eine milde Oxidation der Zuckerreste in einem Antikörper unter Verwendung von beispielsweise Natrium-metaperiodat benachbarte Hydroxyle zu Aldehyden oder Ketonen umsetzen. Falls 1 mM Natrium-metaperiodat bei 0°C verwendet wird, wird die Reaktion auf Sialinsäure-Reste begrenzt sein. Eine anschließende Reaktion der Aldehyd- oder Keton-Gruppe mit einem Sulfhydryl-reaktiven Hydrazyd-enthaltenden Vernetzer (beispielsweise 3-(2-Pyridyldithiol)propionyl Hydrazid ("PDPH"), 4-(N-Maleimidomethyl) Cyclohexan-1-Carboxylhydrazid Hydrochlorid oder 4-(4-N-Maleimidphenyl)Buttersäure-Hydrazid-Hydrochlorid) führt zur Bildung einer Hydrazon-Bindung. Der Antikörper kann anschließend an das neue MHC Klasse I Molekül über eine Disulfid-Bindung gebunden werden, die zwischen dem neuen Cysteinrest in dem β2-M und der Sulfhydryl-reaktiven Gruppe in dem Vernetzer gebildet ist.
  • Eine milde Reduktion eines Immunoglobulins kann alternativ freie Sulfhydryl-Gruppen aus den Disulfid-Bindungen im Gelenkbereich erzeugen. Die Sulfhydryl-Gruppen können anschließend mit der freien Sulfhydryl-Gruppe des Klasse I Komplexes zur Reaktion gebracht werden, entweder unmittelbar oder über einen homo-bifunktionellen Vernetzer.
  • Antikörperfragmente (beispielsweise Fab oder F(ab)'2, die beide den glycolisierten Fc-Abschnitt nicht aufweisen) können ebenso an den Klasse I Komplex konjugiert werden. F(ab)'2 Fragmente können aus Antikörper-Molekülen durch Pepsin Spaltung erzeugt werden, wobei diese Fragmente durch heterofunktionelle Vernetzer wie beispielsweise jene, die Amin- und Sulfhydryl-reaktiv sind, verbunden werden. Eine Reduktion von F(ab)'2 Fragmenten erzeugt Fab' Fragmente, die freie Sulfhydryl-Gruppen enthalten. Diese freien Sulfhydryl-Gruppen können bei einer Konjugation mit den neuen Klasse I Proteinen verwendet werden.
  • Beispiel
  • Erzeugung eines Antikörper Klasse I Konjugats
  • Das nachstehende ist ein beispielhaftes Protokoll für Konjugieren eines Antikörpers an das neue MHC Klasse I Molekül.
  • Eine Immunoglobulin G ("IgG") Vorratslösung wird zuerst hergestellt. Sie enthält 2 mg/ml IgG (d.h. 13 μM) in 0,1 M Natriumacetat Puffer (pH 5,5). Die Lösung wird bei 0°C gelagert. 1 ml der IgG Vorratslösung wird mit 0,1 ml einer kalten Natriummetaperiodat Lösung (Vorrat: 1 mM Natriumperiodat in 0,1 M Natriumacetat Puffer, pH 5,5) für 20 Minuten bei 0°C im Dunkeln gemischt, um den Antikörper zu oxidieren. Um die Oxidationsreaktion abzustoppen, wird Glycerol zum Erreichen einer Endkonzentration von 15 mM hinzu gegeben, und die Inkubation schreitet für 5 zusätzliche Minuten bei 0°C voran.
  • Die IgG Probe wird anschließend über Nacht gegen 0,1 M Natriumacetat Puffer (pH 5,5) dialysiert, und in einem CENTRICON 30 konzentriert. Der Vernetzer PDPH wird anschließend zu der Probe in einer Endkonzentration von 5 mM hinzu gegeben, und die Probe wird für ungefähr 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.
  • Das an PDPH angebrachte IgG Protein wird mittels HPLC (d.h. Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie) Gelfiltration gereinigt. Der HPLC Laufpuffer ist 0,1 M Tris-Cl (pH 8). Die IgG Spitzenfraktion wird mit einem CENTRICON 30 auf ein Endvolumen von 100 μl konzentriert.
  • 2 mg eines HPLC gereinigten Klasse I Moleküls werden mit einer 0,1 mM DTT und 0,1 M Tris-Cl (pH 8) enthaltenen Lösung für 1 Stunde bei Raumtemperatur mild reduziert, um das Klasse I Molekül in dem MHC-Antikörper Konjugat herzustellen. Dies wird das Cystein in einem reduzierten Zustand beibehalten. Die Klasse I Molekül Preparation wird anschließend durch HPLC gereinigt, wobei DTT entfernt wird, und mit einem CENTRICON 30 konjugiert.
  • 2 mg des erhaltenen Klasse I Moleküls wird in 0,5 ml Tris-Cl (pH 8) gelöst und zur Übernacht Inkubation bei 4°C zu 0,5 ml eines PDPH modifizierten IgG hinzu gegeben. Die Probe wird anschließend mit einem CENTRICON 100 konzentriert, und das derart erhaltene MHC-Antikörper Konjugat, welches eine Größe von ungefähr 200 kD Aufweist, wird mittels HPLC Gelfiltration oder Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie gereinigt. Das Konjugat wird mit einem CENTRICON 100 konzentriert. Überschüssiges Peptid (beispielsweise 5–15 facher Molarer Überschuss) wird zu der konzentrierten Konjugat Präparation hinzu gegeben, um das Klasse I Molekül in dem Konjugat zu stabilisieren.
  • III. Multimere MHC Klasse I Komplexe
  • Das neue MHC Klasse I Molekül kann ebenso zur Bildung eines multimeren MHC Klasse I Komplexes verwendet werden. Um dies zu bewerkstelligen, kann zuerst ein Konjugat eines monomeren Klasse I Moleküls und eines Liganden für ein multivalent bindendes Molekül erhalten werden. Das Konjugat wird spezifisch mittels einer Verbindung zwischen der Sulfhydryl-Gruppe des neuen Cysteins in der β2-M Untereinheit und einer funktionellen Gruppe des Liganden gebildet. Nützliche Liganden umfassen, sind aber nicht darauf begrenzt, Iodacetyl- LC-Biotin, N-(6-[Biotinamid]Hexyl)-3'-(2'Pyridyldithio)-Propionamid ("Biotin-HPDP") und 1-Biotinamido-4-(4'-[Meleimidomethyl]Cyclohexan-Carboxamido) Butan ("Biotin-BMCC"). Alle diese Biotin Derivate binden an Avidin (oder ein Derivat davon wie beispielsweise Streptavidin), einem tetravalenten Molekül. Durch quantitatives Blocken der Biotin-Bindestellen auf Avidin wird das Avidin-Molekül mono- bi- oder trivalent. Um das Konjugat zu erzeugen, kann den α und β2-M Untereinheiten ermöglicht werden, sich in der Gegenwart eines Peptids von Interesse zu verbinden, um einen stabilen Heteroduplex-Komplex zu bilden, und anschließend an den Liganden verbunden zu werden; alternativ kann die β2-M Untereinheit zuerst mit dem Liganden verbunden werden und anschließend ermöglicht in Gegenwart des Peptids mit der α-Kette zu verbinden. Multimere dieser Konjugate können durch Zugabe des multivalenten bindenden Moleküls, an welches der Ligand bindet, zu diesen Konjugaten gebildet werden.
  • Die multimeren MHC Klasse I Komplexe können zum Markieren, Quantifizieren, Isolieren und Stimulieren von T-Zellen verwendet werden. Die Klasse I Multimere können beispielsweise auf festphasen Matrizen immobilisiert werden, wobei ein Affinitätsträger zur Anreicherung und Isolierung von T-Zellen erzeugt wird, welche die entsprechenden Antigen-Rezeptoren beinhalten. Die Matrizen können beispielsweise Agarose Gel, gesickte bzw. kugelförmige Polymere, Polystyrolplatten, Objektträger aus Glas, eine nitrocellulose Membran oder Säulen sein. Eine Immobilisierung kann durch nicht-kovalentes Verbinden (beispielsweise zwischen Biotin-Avidin/Streptavidin Wechselwirkung oder mittels eines Magnetfelds) oder durch kovalentes Binden bewerkstelligt werden. Durch ein gewisses reversibles Verbinden, kann den angebrachten Zellen ermöglicht werden, von dem Affinitätsträger elluiert zu werden. Der Biotin-Rest kann beispielsweise von dem reagierten Sulfhydryl mit einem reduzierenden Agens (beispielsweise DDT oder β-Mercaptoethanol) geschnitten werden, falls der Komplex beispielsweise mit Biotin HPDP biotinyliert ist.
  • Die neuen Klasse I Multimere können ebenso zum Charakterisieren von T-Zellen verwendet werden, die nicht klassische Klasse I Proteine erkennen. Dies kann stattfinden, da die neuen β2-M mit einer großen Vielzahl von Klasse I schweren Ketten zusammenlagern können, wobei dadurch eine große Anzahl von Klasse I Multimer-Sonden unter Verwendung des neuen β2-M erzeugt werden kann.
  • Die HLA Klasse I Genfamilie (siehe beispielsweise "Phylogeny of the Major Histocompatibility Complex," in Immunological Reviews, 113 (1990), 1–241) umfasst die hochpolymorphen Klasse I Gene HLA-A, HLA-B und HLA-C, von denen alle eine weit verbreitete Gewebeexpression zeigen. Zumindest drei zusätzliche Klasse I Gene HLA-E, HLA-F und HLA-G (bekannt als nicht-klassische Klasse I b Gene) wurden nachgewiesen; wobei diese Gene hochhomolog zu den klassischen HLA Klasse I Genen sind und deren Polypeptid Produkte alle mit β2-M zusammenhängen. Die Familie der nicht-klassischen Klasse I Gene umfasst ebenso Mitglieder, die sich nicht in dem MHC Genom Komplex, wie beispielsweise die Unterfamilie der CD1 Gene, sowohl in der Maus als auch Mensch, und dem Mausthymus Leukämie (TL) Antigen befinden. Sowohl das TL Antigen als auch CD1 Proteine weisen die gewöhnliche Struktur eines Antigen-präsentierenden Klasse I Moleküls auf. Sie bilden auf der Zelloberfläche Heterodimere bei denen eine schwere Kette von ungefähr 38–50 kDa mit β2-M wechselwirkt. Ein anderes erwähnenswertes, nicht-klassisches Klasse I Gen in Mäusen ist das Qa-2 Gen. Die Qa-2 Produkte, wie andere Klasse I schwere Ketten, hängen mit β2-M zusammen. Die Funktion dieser nicht klassischen Moleküle und der antwortenden T-Zellen sind weitestgehend unbekannt.
  • Die Fähigkeit von β2-M mit verschiedenen schweren Ketten zusammen zu lagern und die Verwendung dieser Komplexe als Signal (beispielsweise Fluoreszenz) erzeugende Sonden, kann die Charakterisierung von den T-Zellen erleichtern, die mit diesen Klasse I Molekülen reagieren. Auskünfte über die entsprechenden T-Zellen können wichtige Rückschlüsse über ihre spezialisierte Funktion in dem Immunsystem bereitstellen.
  • An einen festen Träger konjugierte monomere Klasse I Komplexe, sind in der Tat aufgrund ihrer körperlichen Umgebung multimerisiert. Die neuen monomeren Klasse I Komplexe, die an eine feste Oberfläche mittels ihrer freien -SH Gruppen konjugiert sind, können daher ebenso für die gleichen Zwecke wie jene vorstehend für multimere Klasse I Komplexe beschriebenen, verwendet werden.
  • Die nachstehenden Beispiele zeigen die Erzeugung und einige Verwendungen von mehreren neuen Klasse I MHC-Peptid Tetrameren. Die Beispiele dienen zum Veranschaulichen, aber nicht zum Begrenzen der neuen Verfahren und Reagenzien.
  • CTL Klone von asymptomatischen HIV-1 seropositiven Patienten wurden wie beschrieben in diesen Beispielen erstellt und beibehalten bzw. erhalten (Johnson et al., J. Immunol, 147 (1991), 1512–1521). HLA-Typisierung wurde durch das Massachusetts General Hospital Tissue Typing Laboratory unter Verwendung von gewöhnlichen serologischen Verfahren durchgeführt. H-2Kb-SV9 spezifische CTL Klone (syngen reaktiv) wurden in H-2b Mäusen (KbDb) wie beschrieben (Zhou et al., J. Immunol Methods, 153 (1992), 193–200) erzeugt. Das alloreaktive CTL wurde von H-2Kdm2 Mäusen (KdDd) abgeleitet. Alle CTLs wurden in Kultur durch periodische Stimulation mit RMA-S Zellen (H-2b; siehe beispielsweise Townsend et al., Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 54 Pt 1 (1989), 299–308) beibehalten, die mit SV9 Peptid beladen waren. Der in einer H-2Kb Maus entstandene CTL Klone 4G3, reagiert spezifisch mit dem Ovalbumin Octapeptid pOVA (SIINFEKL; SEQ ID NO: 12) in Zusammenhang mit H-2Kb (Walden et al., Proc. Natl., Acad. Sci. USA, 87 (1990), 9015–9019). Bis zu einem Beladen mit Peptiden aus dem externen Medium (Heemels et al., Ann. Rev. Biochem., 64 (1995), 463–491) sind Zelloberflächen MHC Klasse I Moleküle auf RMA-S Zellen größtenteils ohne Peptid.
  • Beispiel 1
  • Erzeugung eines Mutanten β2-M
  • Die Ribosom-Bindestelle und kodierende Bereich eines β2-M Expressionsplasmids (Garboczi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 3429–2433) wurde in den E. coli Expressionsvektor pLM1 (Garboczi et al., J. Immunol., 157 (1996), 5403–5410) kloniert, um eine höhere Proteinausbeute zu erhalten. Das β2-M Polypeptid stammt vom Menschen und weist 99 Aminosäurereste plus einen zusätzlichen Methioninrest an dem N-Terminus auf, der von der Expression in E. coli herrührt.
  • Ein Cysteinrest wurde durch den Tyrosin 67 Rest in dem Polypeptid durch Verwendung von überlappender Verlängerungs-PCRs (beispielsweise Polymerase-Kettenreaktionen) ersetzt. Vier PCR Primer wurden verwendet. Die ersten beiden wurden an den 5' und 3' Enden des β2-M kodierenden Bereichs in dem pHN1 Plasmid (Garboczi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 (1992), 3429–3433) verwendet. Diese beiden Primer waren der 5' Primer CTAGAGGATCCTCACACAGGAAACAGAATTTCGAG (SEQ ID NO: 4) und der 3' Primer CCACCGCGCTACTGCCGCCAGGC (SEQ ID NO: 5). Der 5' Primer führte eine neue BamHI Stelle an dem 5' Ende des β2-M kodierenden Bereichs ein. Die anderen beiden Primer wurden zur Mutagenese verwendet. Es handelte sich um den Primer für den oberen Strang CTC TTG TAC TGC ACT GAA TTC ACC CCC (SEQ ID NO: 6) und den Primer für den unteren Strang GAA TTC AGT GCA GTA CAA GAG ATA GAA (SEQ ID NO: 7). Das neue Cystein Codon und sein Komplementär sind unterstrichen.
  • Zur Erzeugung der Cystein Mutation, wurden die nachstehenden zwei Primer Paare zuerst auf das pHN1 Templat zum Erhalten zweier PCR Produkte verwendet: (i) der 5' Primer und der Primer von dem unteren Strang, und (ii) der 3' Primer und der Primer für den oberen Strang. Diese beiden PCR Produkte wurden einer Elektrophorese unterzogen und von einem Agarose Gel aufgereinigt. Anschließend wurden sie zusammen einer PCR Reaktion unter Verwendung der 5' und 3' Primer unterworfen. Das letztliche PCR Produkt, das den β2-M kodierenden Bereich mit der Cystein-Mutation enthielt, wurde mit BamH1 und HindIII verdaut und in die gleichen Stellen in die pLM1 kloniert. Die mutierte β2-M (d.h. "β2-M (Cys67)") Sequenz wurde mittels DNA Sequenzierung bestätigt. Das die β2-M (Cys67)-kodierende Sequenz tragende Plasmid pLM1 wurde in den E. coli Wirt BL21 (DE3)plysS (Studier et al., Methods Enzymol., 185: (1990), 60–89) transformiert und eine große Menge an β2-M (Cys67) wurde in der Form von Einschlusskörper-Protein erhalten.
  • Beispiel 2
  • Erzeugung von Peptid-MHC Tetramer
  • Der Tyrosin Rest an Stelle 67 des reifen menschlichen β2-M wurde zuerst durch einen Cysteinrest unter Verwendung von herkömmlichen Mutagenese Verfahren (Vergleiche vorstehend) ersetzt, um ein Klasse I MHC Peptid Tetramer zu erzeugen. Es gibt zwei natürlich vorkommende Cysteinreste in β2-M, die durch Bilden einer Disulfid-Bindung die Immunglobulin-Struktur von β2-M beibehalten. Der neue Cysteinrest band nicht mit irgendeinem der natürlichen Cysteinreste, was die richtige Faltung des Mutant β2-M ("β2-M (Cys67)") ermöglichte. Die freie Sulfhydryl-Gruppe in dem neuen Cysteinrest wurde für anschließende chemische Modifikationen der β2-M Untereinheit verwendet.
  • Eine monomere Mutante HLA-A2 wurde anschließend erzeugt, die β2-M(Cys67) umfasste. Die HLA-A2 schwere Kette und die Mutant β2-M Untereinheit wurden in großen Mengen von E. coli Wirtszellen erhalten, die mit den jeweiligen Expressionsvektoren transformiert waren. Die Bildung von HLA-A2 (Subtyp A0201) wurde in einer verdünnten Lösung initiiert, die eine denaturierte HLA-A2 schwere Kette (1 μM), das denaturierte β2-M(Cys67) Polypeptid (2 μM) und ein synthetisches Peptid (10 μM) (Vergleiche beispielsweise Garboczi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 3429–3433) enthielt. Die gefalteten MHC-Peptid Komplexe wurden durch HPLC (d.h. Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie) Gelfiltration gereinigt. Die Protein Konzentration des gereinigten Komplexes wurde durch Bestimmen seiner optischen Dichte ermittelt. 1 A280 Einheit stellt für HLA-A2 0,67 mg ml–1 des Proteins dar. Das Lösungsmittel zugängliche Cystein 67 in der Mutant β2-M Untereinheit wurde durch 0,1 mM DDT in einem reduzierten Zustand beibehalten.
  • Die monomere Mutante HLA-A2 wurde anschließend mit Iodacetyl-LC-Biotin ("ILB"; Pierce), einem Sulfhydryl reaktiven Reagenz, an dem Cystein 67 Rest von β2-M (Cys67) biotyliniert. ILB, das in N,N-Dimethyl-formamid gelöst war, wurde in einem 5-fachen molaren Überschuss über die Gesamtmenge von Cystein in Lösung angewendet. Die Biotinylierungs-Reaktion wurde in Tris-HCL (pH 8,0) und 0,1 mM DDT durchgeführt, wobei die Reaktion für 1 Stunde im Dunkeln bei Raumtemperatur andauerte. Anschließend an die Reaktion, wurde das Volumen der Reaktionsmischung mit CENTRICON 30 von 0,5–1 ml auf 50 μl verringert, wiederum in 1 ml Tris-HCL (pH 8,0) verdünnt, auf ungefähr 100 μl konzentriert und mittels HPLC Gelfiltration gereinigt. In dem biotynilierten β2-M (Cys67) war der Biotin-Rest von ILB von der Sulfhydryl-Gruppe des Cystein 67 Rests durch den langen Iodacetyl-LC Arm getrennt.
  • Die biotinylierten MHC-Peptid Komplexe wurden durch HPLC-Gelfiltration gereinigt. Die gereinigten Komplexe wurden anschließend in der Gegenwart von deglycolisierten Avidinphycoerythrin ("Avidin-PE"; Molecular Probes) multimerisiert. Deglycolisiertes Avidin-PE bindet mehr als 12 μg Biotin pro mg Protein. Die erhaltenen tetrameren MHC-Peptid Komplexe wurden einer HPLC Gelfiltration (TSK G 3000SW, TOSO HAAS, Gel Filtration Standard/BIORAD) unterzogen und anschließend konzentriert (CENTRICON 100, Amicon).
  • Beispiel 3
  • Markieren von T-Zellen mit einem Peptid-Klasse I Tetramer
  • Ein Peptid-MHC Klasse I Tetramer wurde mit einem HIV-1 Gag Peptid (d.h. SL9, dessen Sequenz SLYNTVATL (SEQ ID NO: 8) ist) (Johnson et al., J. Immunol, 147 (1991), 1512–1521) und einem Kontrollpeptid der HIV-Transcriptase (d.h. IV9, dessen Sequenz ILKEPVHGV (SEQ ID NO: 9) ist) (Tsomides et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88 (1991), 11276–11280) hergestellt. Wie in dem vorstehenden Beispiel beschrieben, wird das Tetramer durch die Ver wendung von Avidin-PE gebildet. Das Binden des Tetramers an cytotoxische T-Lymphocyten ("CTL") Klone mit bekannter Antigen-bindenden Spezifizität wurde mittels Fluss-Cytometrie überwacht.
  • Insbesondere wurden 5 × 105 Zellen von jeder von drei menschlichen CTL Klone spezifisch für von HIV-1 abgeleiteten Peptiden mit einem anti-CD8 monoklonalen Antikörper ("mAb") Cy-Chrome (Pharmingen) vorgefärbt. Diese drei Klone, d.h. 68A62 (Tsomides et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88 (1991), 11276–11280), 18030 (Johnson et al., J. Immunol., 147 (1991), 1512–1521), und 63D35 sind jeweils spezifisch für HLA-A2-IV9 (d.h. durch HLA-A2 präsentiertes IV9) HLA-A2-SL9 und HLA-B11-AK9 (AK9: ein HIV-1 reverse Transcriptase Peptid mit der Sequenz von AIFQSSMTK (SEQ ID NO: 10)).
  • Die vorgefärbten Zellen wurden anschließend mit dem löslichen PE-markierten Tetramer HLA-A2-SL9 Komplex bei einer Konzentration von 50 μg/100 μl RPMI für 1 Stunde bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurden gewaschen und einer FACS (d.h. Fluoreszenz-aktiviertes Zellsortieren) Analyse unter Verwendung eines FACSAN Flusscytometers (Becton Dickinson) unterzogen.
  • Kontur-Diagramme basierten bei der FACS Analyse auf 10.000 Ereignissen, die als vorwärts gegenüber seitwärts Streuung in einem Gatter dargestellt waren. Eine zufällig gesetzte Grenze auf der PE-Fluoreszenzintensität einer negativen Kontrolle, war die Position des Quadrantmarkers der X-Achse, wobei zugrunde gelegt wurde, dass ungefähr 80% der Zellen als positiv für PE-Fluoreszenz erachtet werden können.
  • Die Daten zeigten, dass eine 10-fache Zunahme bei der PE-Fluoreszenzintensität im Fall der PE-markierten Tetramer gefärbten CTLs des Klons 18030 (1B) im Vergleich zu CTLs der Klone 68A82 und 63D35 (1A und 1C) vorlag.
  • Das Färben der CTLs durch das HLA-A2-SL9 Tetramer war daher spezifisch. Eine ähnliche Verschiebung der PE-Fluroeszenzintensität wurde mit CTLs des Klons 68A62 beobachtet, wenn jene CTLs mit einem HLA-A-IV9 Tetramer gefärbt wurden.
  • Basierend auf Quadrantenmarker wurden ungefähr 80% der für HLA-A2-SL 9 spezifischen CTLs mit dem Phycoerythrin markierten Tetramer positiv gefärbt.
  • Beispiel 4
  • Markieren von T-Zellen mit einem Hybrid Peptid-Klasse I Komplex
  • Das Mutant menschliche β2-M, in dem Tyr 67 mit einem Cysteinrest ersetzt wurde, wurde ebenso gezeigt, stabil an die schweren Ketten des Maus-MHC Klasse I Moleküls Kb zu binden.
  • Unter Verwendung einer gereinigten Maus H-2Kb ("Kb") schweren Kette (Zhang et al., Proc. natl. Acad. Sci. USA, 89 (1992), 8403–8407), der Mutant menschlichen β2-M und SV9 eines Sendai Virus Nukleoprotein-abgeleiteten Peptids (FAPGNYPAL, SEQ ID NO: 11) (Kast et al., Proc. natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 2283–2287; und Schumacher et al., Nature, 350 (1991), 703–706) wurden Tetramer MHC Klasse I Moleküle erzeugt. SV9 förderte ein Falten des Kb Hybrid Moleküls mit einer Effizienz, ähnlich zu jener von SL9 zum Fördern eines Faltens von HLA-A2. Das gereinigte Kb Tetramer wanderte als einzelne Spitze auf einer Gelfiltration HPLC. Die Gegenwart der schweren Kette und der β2-M Untereinheit in den Spitzenfraktionen wurde durch SDS Polyacrylamid Gel Elektrophorese bestätigt.
  • 5 × 105 Maus CTLs von drei verschiedenen Klonen wurden mit anti-CD8 TRI-COLOR (CALTAG) vorgefärbt und anschließend mit 50 μg/100 μl RPMI PE-markiertem chimären H-2Kb-SV9 Tetramer für 1 Stunde bei 4°C inkubiert. Die drei CTL Klone 2F3, 3C2 und 4G3 (Walden et al., Proc. natl. Acad. Sci. USA, 87 (1990), 9015–9019) sind jeweils spezifisch für SV9 gebunden an H-2Kb-SV9 gebunden an H-2Db und OVA (SIINFEKL, SEQ ID NO: 12; abgeleitet von Ovalbumin; Walden et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 9015–9019) gebunden an H-2Kb.
  • (Beruhend auf ihrer Lyse von Ziel-Zellen, die mit dem entsprechenden Peptid beladen wurden, wurde die Spezifizität der Klone bestimmt). Nach der Inkubation wurden die Zellen gewaschen und einer FACS Analyse unterzogen.
  • Histogramm-Diagramme (2A–2C) für die FACS Analyse beruhten auf 10.000 Ereignissen, die auf CD8 Fluoreszenz im Gatter dargestellt (gated) werden. Wie in den Diagrammen gezeigt, färbte das Kb-SV9 Tetramer ausschließlich 2F3 CTLs (2A), aber nicht 3C2 (2B) oder 4G3 (2C) CTLs.
  • Marker (M1, M2) wurden in der FACS Analyse platziert, um einen Bereich positiver Intensität hinsichtlich einer Kontrolle (2B und 2C) abzugrenzen. Basierend auf diesen Markern wurden 78% von 2F3 CTLs (2A) gefunden mit dem Kb-SV9 Tetramer positiv zu färben.
  • Beispiel 5
  • Binden von T-Zellen durch allogene Peptid-Klasse I Komplexe
  • Allogene Transplantatabstoßung ist wahrscheinlich die stärkste bekannte T-Zell Reaktion. T-Zellen eines Individuums antworten während einer derartigen Abstoßung stark auf Ziel-Zellen (beispielsweise eine Hautabstoßung eines genetisch ungleichen Individuums der gleichen Spezies), die allogene MHC Moleküle tragen. Es wurde vorgeschlagen, dass die Affinitäten der T-Zellen Rezeptoren für MHC Peptid-Komplexe höher sind, falls die MHC Komponente allogen (d.h. nicht-selbst) denn syngen (d.h. selbst) ist (Sykulev et al., Proc. natl. Acad. Sci. USA, 91 (1994), 11487–11491 und Eisen et al., Advances in Protein Chemistry 49 (1996), 1–56).
  • In den 3A–3D wird die Reaktivität des Kb-SV9 Tetramers mit CD8+ CTLs einer Maus von zwei verschiedenen Mauslinien verglichen. In Kürze wurden 5 × 105 syngene MHC- und allogene MHC-CTLs mit anti-CD8 TRI-COLOR und anti-H-2Kb-FITC mAbs (CALTAG) gefärbt, gewaschen und mittels FACS analysiert. Die CTLs wurden anschließend mit dem H-2Kb SV9 Tetramer-PE Reagenz (50 μg/100 μl RPMI, 4°C, 1 h.) inkubiert, gewaschen und anschließend einer FACS Analyse unterzogen. Alle drei Fluorchrome wurden mit einem Argon Laser in einem Instrument mit einem Laser (insgesamt 10.000 gesammelte Ereignisse) angeregt.
  • Die CTLs in 3A waren von einer Kb-positiven Maus abgeleitet und die gezeigte Reaktion ist syngen; wohingegen in 3C die CTL von einer Kb-negativen Maus abgeleitet waren und die gezeigte Reaktion allogen ist. Das Tetramer band spezifisch an CTLs von beiden Mauslinien (3B und 3D), ist aber durch zwei Untermengen der alloreaktiven CTLs (3D) verschieden, wobei die besser bindende Untermenge ungefähr 12–15% der gesamten CTL Population beträgt. Der beobachtete Unterschied bei Färbeintensitäten von CTLs (3D) könnte durch Unterschiede bei einer Zelloberflächendichte von TCR und vielleicht CD8 Molekülen beeinflusst werden. Unter Annahme eines 1:1 Verhältnisses ist TCR heterodimer mit dem CD3 Komplex, wurden CD3 und CD8 Expressionsniveaus analysiert. Die Analyse zeigte, dass die zellulären Untermengen der allogenen CTL Linie, die mit multimeren Kb-SV9 von verschiedenen Intensitäten färbte, die gleiche Menge an CD8 und CD3 pro Zelle aufwies.
  • Andere Ausführungsformen
  • Um beispielsweise ein fremdes Klasse I Molekül (beispielsweise eines mit einer allogenen oder sogar xenogenen schweren Kette) an einer Tumorzelle anzubringen, wird ein Ligand für einen Rezeptor spezifisch auf der Tumorzelle exprimiert, wobei an Stelle eines Tumor spezifischen Antikörpers wird an das fremde MHC Klasse I Molekül konjugiert, um eine Allo-Antwort auf das Tumorgewebe zu lenken.

Claims (18)

  1. Verfahren zur Herstellung eines Konjugats eines MHC Klasse I Moleküls und einer Verbindung, welches umfasst: Bereitstellen eines MHC Klasse I Moleküls, worin in der β2-Mikroglobulin Untereinheit des MHC Klasse I Moleküls ein Rest in Position 52, 67 oder 91 des reifen menschlichen β2-Mikroglobulins durch einen Cystein-Rest ersetzt wurde, und Konjugieren des MHC Moleküls und der Verbindung spezifisch über eine zwischen der Sulfhydryl-Gruppe des Cysteins im β2-Mikroglobulin und einer funktionellen Gruppe der Verbindung hergestellte Bindung.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Komponente ein Ligand für ein multivalentes Bindungsmolekül ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Verbindung ein Antikörper ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Antikörper spezifisch für ein Tumor-Antigen ist.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Verbindung auf der Zelloberfläche vorliegt.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Verbindung ein Protein ist.
  7. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Zelle eine Antigen-präsentierende Zelle ist.
  8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Verbindung ein Ligand für einen Oberflächenrezeptor einer Zelle ist.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Zelle eine Antigen-präsentierende Zelle ist.
  10. Verfahren zur Herstellung eines multimeren MHC Klasse I Moleküls, welches umfasst: Bereitstellen ein Konjugats eines monomeren MHC Klasse I Moleküls und eines Liganden für ein multivalentes Bindungsmolekül, wobei ein Cystein-Rest in die β2-Mikroglobulin Untereinheit des MHC Klasse I Moleküls in Position 52, 67 oder 91 des reifen menschlichen β2-Mikroglobulins eingeführt wird, wobei das Konjugat spezifisch durch eine Bindung zwischen der Sulfhydryl-Gruppe des Cystein-Restes in der β2-Mikroglobulin Untereinheit in Position 52, 67 oder 91 und einer funktionellen Gruppe des Liganden hergestellt wird, und Anbringen mehrerer der Konjugate über den Liganden, an das multivalenten Bindungsmolekül um eine multimeres MHC Klasse I Molekül herzustellen.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Ligand Biotin ist und das multivalente Bindungsmolekül Streptavidin oder Avidin ist.
  12. Verfahren zur Herstellung eines multimeren MHC Klasse I Moleküls, welches umfasst: Bereitstellen eines β2-Mikroglobulins, in das an Position 52, 67 oder 91 des reifen menschlichen β2-Mikroglobulin ein Cystein-Rest eingeführt wurde; Konjugieren des β2-Mikroglobulins und eines Liganden für ein multivalentes Bindungsmolekül spezifisch über eine zwischen der Sulfhydryl-Gruppe des Cystein-Restes im β2-Mikroglobulin und einer funktionellen Gruppe des Liganden hergestellten Bindung; Zusammenbringen des so erhaltenen Konjugats mit einer α-Kette eines MHC Klasse I Moleküls um ein monomeres MHC Klasse I Molekül zu bilden; und Anbringen mehrerer der so erhaltenen, monomeren Klasse I Moleküle, an das multivalente Bindungsmolekül über den Liganden, um ein multimeres MHC Klasse I Molekül zu bilden.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei der Ligand Biotin ist und das multivalente Bindungsmolekül Streptavidin oder Avidin ist.
  14. Konjugat eines MHC Klasse I Moleküls und einer Verbindung erhältlich nach einem Verfahren nach Anspruch 1–9.
  15. Multimeres MHC Klasse I Molekül erhältlich nach einem Verfahren nach Anspruch 10–13.
  16. Verwendung eines multimeren MHC Klasse I Moleküls nach Anspruch 14 zur Markierung, Quantifizierung und Isolierung von T-Zellen.
  17. In vitro Verfahren zur spezifischen Markierung und/oder Nachweis von T-Zell Populationen gemäß deren spezifischen T-Zell-Rezeptoren, welches umfasst: – Zusammenbringen eines MHC Komplexes nach einem der Ansprüche 14 oder 15 und einer T-Zellen enthaltenden Probe; und – Nachweisen der Spezifität der löslichen MHC-Peptid-Proben für die entsprechenden T-Zellen.
  18. In vitro Verfahren zur Markierung, Trennung und Anreicherung von T-Zell-Populationen entsprechend ihrem Antigen-spezifischen T-Zell-Rezeptor, wobei die Methode umfasst: – Zusammenbringen eines MHC Komplexes nach einem der Ansprüche 14 oder 15 und einer T-Zellen enthaltenden Probe; und – Abtrennen markierter T-Zellen von nicht-markierten T-Zellen.
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