JP2002524104A

JP2002524104A - 機能化免疫グロブリンスーパーファミリータンパク質を製造する方法

Info

Publication number: JP2002524104A
Application number: JP2000570203A
Authority: JP
Inventors: ラースオースターガードペダーセン; ソーレンブース
Original assignee: ラースオースターガードペダーセン; ソーレンブース
Priority date: 1998-09-14
Filing date: 1999-09-14
Publication date: 2002-08-06
Also published as: AU771239B2; NZ511031A; KR20010075108A; MXPA01002674A; WO2000015665A2; EP1114063A2; CA2343313A1; CN1326466A; AU5504799A; AU771239C; WO2000015665A3; BR9914491A

Abstract

(57)【要約】本発明は、機能化したときに少なくとも一つのジスルフィド結合を有する機能化免疫グロブリンスーパーファミリータンパク質を製造する方法において、(i)前記タンパク質をコードするとともに、細胞内で発現可能な遺伝子を含むバクテリア細胞を提供し、(ii)前記遺伝子を発現させる条件下で前記細胞を培養し、(iii)前記タンパク質を還元することなく単離し、(iv)前記単離タンパク質を折りたたみ（フォールディング）処理にあてることを特徴とする方法である。好ましくは、前記免疫グロブリンスーパーファミリータンパク質が、抗体、免疫グロブリン可変（Ｖ）領域、免疫グロブリン定常（Ｃ）領域、免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、クラスＩおよびクラスＩＩ組織適合分子、β₂ミクログロブリン（β₂ｍ）、リンパ球機能関連抗原−３（LFA-3）およびＦｃγＲIII、ＣＤ７、ＣＤ８、Thy-1およびTp44（ＣＤ２８）、Ｔ細胞受容体、ＣＤ４、ポリ免疫グロブリン受容体、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、Ｐミエリンタンパク質、ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、コロニー刺激因子−１受容体、αβ−糖タンパク質、ＩＣＡＭ（細胞間接着分子）、血小板およびインターロイキンからなる群より選択される。本発明の重要な実施態様は、本発明の方法により得られた安定なペプチドフリーのＭＨＣタンパク質、およびＭＨＣクラスＩ重鎖およびβ₂ｍを含み、ＭＨＣクラスＩタンパク質に結合可能なペプチド添加して、機能化ＭＨＣクラスＩタンパク質の生成を導くことを可能にする受容体に、機能化ＭＨＣクラスＩタンパク質を製造させ、および測定または検出させることを許容するキットである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の簡潔な開示】

ヒト免疫系の特異性および反応性は、MHC（ヒトではHLA）分子により支配され
る。HLAの機能は、抗原ペプチドを選択することおよび免疫T細胞に提示すること
である。免疫系は、MHCの目を通して世界を眺めており、また、免疫操作に対す
るいかなる合理的アプローチもMHCを考慮しなければならないということができ
る。このような合理的アプローチは、多くの科学的、実用的、臨床的用途を有す
るはずである。これらの可能性を活かすために、我々は、新規で、しかも容易で
、確固とした、安価な手法で、高純度の組み換えMHC分子を発生する方法を考案
した。これらの組み換え分子は、ペプチドバインダーおよびT細胞刺激物質（sti
mulator）として、機能的に充分に活性である。それらは、２つの異なる形式：
ａ）非常に安定で、Ｔ細胞刺激性の、完全に成熟し、ペプチドが詰った部分とし
て、またｂ）適度に安定しており、直ちにペプチドを受容しうる、部分的に成熟
した、ペプチドなしの部分として（「空の」MHC分子）発生しうる。後者の結果
は、「空の」ＭＨＣ分子は存在しない、あるいは少なくとも非常に不安定である
という現行の誤解を正すものとして注目すべきである。

【０００２】公知の他のすべての組み換えまたは非組み換えMHC生産方法は、かなり厄介で
、かつ／または、効率および純度が制限された生産物を生じる。このMHC分子の
複雑性さとその乏しい安定性では、純粋なペプチド受容MHC分子を生ずるのは、
非常に困難であり、その結果、予定されかつ純粋なペプチド−MHC複合体を生じ
させるのは非常に困難となる。天然源由来の天然分子として、MHC分子の生産は
、冗長で低収率である。さらに、MHCは大量の異なるペプチドの派生物（gamesh
）で占められており、ときには、他のMHCのハプロタイプによって混成されてお
り、この調製は、正味の結果は、非常に混成された調製物となるため、これらは
厄介な方法によってのみにしか精製できない。

【０００３】 MHC分子を生ずる際、いっそう大きい問題は、MHC遺伝子座の極端な多型性であ
る。ヒト集団では、400より多い異なるHLA-A、HLA-BおよびHLA-C対立遺伝子が存
在し、また200より多いHLA-D対立遺伝子が存在する。この多様性は、免疫学的目
的があるのだが、多くの異なるMHCは生じさせられ、個別に最適化され、確認さ
れ、特徴づけられ、貯蔵するなどの必要があるので、MHCの生産に対しては、実
際的な障害である。

【０００４】組み換え発現システムは、いくつかの利点を有している。潜在的により高い収
率、容易な精製スキームを得ることができ、分子を一つの特定なペプチドを用い
て、均一に標識し得る。しかしながら、このようなアプローチの主な障害物は、
正確に折りたたまれたMHC構造は、3つの成分（重鎖、軽鎖（ベータ2−ミクログ
ロブリン、β₂m）およびペプチド）からなるむしろ複雑な構造であるということ
である。MHCの充分な安定性は、3つの成分すべてを一緒にしたときにしか得るこ
とができない。特に、重鎖は、他の2つの成分の存在がないと非常に不安定であ
る。したがって、β₂mおよびペプチドなしには、単離された重鎖を生産し、取り
扱い、貯蔵することは困難であり、それゆえ実験者が選択する任意のペプチドと
直ちに結合可能なMHC分子を生じさせることは困難である。安定性が制限されて
いるため、単離されたMHC分子は、急速に凝集し、消失して非常に乏しい最終的
収率となる。

【０００５】本特許出願は、大量かつ任意の所望の対立遺伝子特異性を有する組み換えMHC
分子を生じさせるための一般的アプローチについて記載する。本発明の方法によ
って、初めて、真に空の、しかも適度に安定な、MHC分子を得ることができ、そ
の結果は、これらの空の分子の結合特性は、従来の生産されたMHCを用いて得ら
れる特性からはずれることを示している。従来使用されたMHC分子がより人為的
な変換反応を反映していたのに対し、これらの空の分子は、de novo結合を反映
しているため、生理的なMHC結合とより関係が深い。MHCの質の改良に加え、この
新規な生産方法は、容易で、確固としており、直ちに大半の（おそらくすべての
）MHC分子に適用可能であり、また、純粋かつ充分機能的なMHC分子が高収率で得
られる。ペプチド結合活性が、2-4ngの単離されたMHCの重鎖と同じ位の少量でも
検出され、また、T細胞結合能が、150ngのペプチド／MHCと同じくらい僅かでも
検出されることから、これらの組み換え分子は、非常に強力である。それらは、
天然に見出される分子で測定された親和性と同様の親和性、より速い結合速度、
および充分な結合能を有し非常に活性である（すなわち、内因性ペプチドがなく
とも）。我々は、これらの分子を貯蔵することができ、何ヶ月にもわたりその活
性を維持することができる。このことは、分析的にも治療的にも両方に役立つこ
とを暗示している。

【０００６】ここに記載の方法は、最終的に、たとえばCD3複合体の成分のような、他の（
非MHC）分子にも首尾よく適用できた。事実、開示された方法は、任意のタンパ
ク生産スキームに利用することができるだろう（それが組み換えされていてもい
なくても、原核生物または真核生物にあってもなくても）。生産中のある時点に
おけるタンパク質は、その後に復元（renaturation）/再折りたたみ（refolding
）段階を必要とするような変性（denaturation）またはアンフォールディング（
unfolding）（この目的は、タンパク凝集物を溶解し、タンパク質を精製しうる
ことなどにある）により溶媒和される。したがって、本発明の方法は、非常に広
い応用分野を有していてもよい。特に、我々は、本発明の方法は、抗体、MHCお
よびT細胞受容体を含む、免疫グロブリンスーパーファミリーのすべての構成員
に有用であろうと推測している。本発明の方法は、少なくとも一つのシステイン
を含むすべての分子の生産に有用であろう。

【０００７】

【発明の技術的背景】

免疫系は、天然バイオ情報科学（natures nioinformatics）システムの一つと
してみることができる。これは、我々の内部環境に入ってくる任意の物質を評価
し、その特質を決定し、それに対し作用するか否かを決定する。タンパク質およ
びペプチドは、このような免疫情報を取得し、伝達する最も重要な手段である。
この観点からみると、MHC分子は、免疫系の中心である。MHC分子は、ペプチド情
報のためにタンパク質代謝全体をサンプリングし、この情報を免疫系の中心的認
識単位であるT細胞に利用可能にしている。本特許出願は、MHCの機能（ヒトMHC
の反応性の完全なマッピング）を決定し、予見するための正確な方法を生み出す
ことを主な約束とすることに関する。ヒトおよび寄生虫の主要なタンパク質配列
の発展するゲノムデータベースを、この免疫分子がいかにペプチド情報を取り扱
うかという正確な知識を結びつけることにより、エピトープを予測するための強
力で、新たな戦略が導き出されるであろう。このことはまた、管理された、効果
的免疫操作の可能性を向上するであろう。組み換えMHC分子を生じさせうること
は、この大規模なMHC/HLAマッピング計画を可能とし、また、下記に示すように
、直接的な商業的関心につながる実用的、臨床的、科学的利用法をも有する。

【０００８】

【序説】

免疫系の目的は、微生物（たとえば、バクテリア、ウイルス、寄生虫）および
おそらく癌から、われわれの身体を守ることにある。事実、いずれの脅威も免疫
系によって、除去され、中和される。このような能力を管理するためには、免疫
系は、攻撃すべきもの、攻撃すべきでないものを知らなければならない；理想的
には、外来物質は消失させるべきであり、一方で、身体それ自身は、害のないま
まにされるべきである。免疫系の真の特徴は、したがって、特異性の一つ、すな
わち、多様な標的物質間での区別、特に、自己および非自己の区別をする能力に
ある。特異的免疫系は、多数の細胞、あるいは体液性（抗体）および細胞性応答
をそれぞれ示すB細胞およびT細胞の副区分に分けられる、リンパ球から構成され
る。両方の細胞とも受容体を使用し、それらのゲノムにおいて、受容体は、膨大
な組み換え受容体の多様性を与える多くの寄せ集め片にコードされている。B細
胞またはT細胞はそれぞれ、これらの受容体のうちの一つ、しかも一つしか所有
しておらず、全領域のうちのほんの小さな部分を認識し得る。しかしながら、す
べてのリンパ球は、一緒になれば全領域を認識し得る。免疫系の全体的な特異性
は、個々のリンパ球を制御する過程を通じて、発生し、制御され、調整される。
リンパ球クローンは、消失または不活性化することで、能力範囲（repertoire）
から、対応する特異性を取り除いている。再度、同じ抗原に曝されるとリンパ球
クロ−ンの活性化および増殖により、対応する特異性が高められ、免疫系を迅速
に応答させることを可能としている。

【０００９】 B細胞およびT細胞の特異性 B細胞およびT細胞は、まったく異なるメカニズムを使用して、その標的物質を
認識する。B細胞は、溶解性の抗原を認識し、抗体として、その受容体を分泌し
うるため、細胞外スペースの流動相を通して、抗原と潜在的に相互作用し得る。
まったく対照的に、T細胞受容体は、常に膜に結合しており、抗原しか認識せず
、抗原はいわゆる抗原提示細胞（APC）の膜上に提示される。換言すれば、T細胞
の認識は、2つの細胞間、すなわちT細胞およびAPCでの直接的な物理的相互作用
を含む。B細胞およびT細胞は、認識するものに関しても異なる。B細胞は、ほと
んどあらゆる種類の有機物質も認識することができ、これに対し、T細胞は、タ
ンパク質しか認識しない（タンパク質は、すべての生き物の構造的および機能的
基盤を構成するため、生物学的標的として特に重要である）。B細胞は、すでに
示したように、生の（native）タンパク質および変性タンパク質を区別する能力
によって、タンパク質の三次元構造を認識する。これに対し、T細胞は、生のタ
ンパク質と変性タンパク質との区別ができない。早くから、このことは、T細胞
が変化したタンパク質を認識するという考えに導いた。現在、これが真実であり
、MHC分子との結合においてAPCの表面上の存在する抗原ペプチドしか認識しない
ことが知られている。一般的に、細胞障害性T細胞は、アミノおよびカルボキシ
末端をMHC内に深く埋め込まれた短いペプチド（8-11マー）を認識する（すなわ
ち、ペプチド長が制限されている）。これに対して、ヘルパーT細胞は、MHCから
伸びたアミノおよびカルボキシ末端を有するより長いペプチド（13-30マーまた
はより長いもの）を認識する傾向にある（すなわち、ペプチド長は制限されない
）。

【００１０】免疫応答およびMHCの制限 T細胞は、B細胞を含む、免疫系全体の反応性および特異性を決定するため、免
疫応答の誘導にはとりわけ重要である。したがって、これらの細胞に注意を集め
ることが適当である。T細胞は、特定のMHC分子の中に提示された場合に与えられ
た抗原しか認識できない。T細胞は、個体発生の間、「教育され」、さらに、特
定の抗原−MHC結合に特異的な受容体を有するT細胞を発生させるように設計され
た過程における最初の詰め込み（priming）の間、さらに活性化される。その後
、これらのT細胞は、同じ、まさに全く同じ抗原−MHC結合しか認識しないであろ
う。この現象は、「MHC拘束性」として知られている。その他の免疫現象である
、「応答体地位（responder status）」でもまた、MHCによって決定される。あ
るMHCのハプロタイプの個体では、ある種の抗原に対し応答するが、その他の抗
原には応答しないであろう。他のMHCのハプロタイプを有する他の個体では、異
なる応答をするだろう。これらの2つの現象は、合理的な免疫操作に対し、明ら
かに重要である。上述したように、これらは、両方ともMHC分子によって制御さ
れていることが知られている。これらの分子は、抗原の提示を目的として、特異
的に発展してきた。抗原提示について我々の現在の理解として、下記のように要
約することができる。まず最初に、外来性物質、すなわち抗原は、APCによって
取り上げられる。抗原ペプチドの細胞内のプールが、細胞に利用し得るすべての
タンパク質抗原のタンパク質分解の断片化により生じる。このペプチドのプール
を、その個体のMHC分子に提供され、長さおよび配列にしたがってサンプリング
される；結合しているものもあるが、他のものはしていない（MHCは、「決定要
素選択（determinant selection）」を行うといわれている）。続いて、MHC分子
は、選ばれたペプチドを、さらなる分解から保護し、APCの表面に輸送し、T細胞
による精査のために提示する。

【００１１】 MHCと多型性 MHCの2つのサブタイプ、MHCクラスIおよびIIが存在する。これらのサブタイプ
は、Tリンパ球の2つのサブセットに相当する：１）通常、MHCクラスI分子によっ
て提示されたペプチドを認識し、感染したまたは突然変異した細胞、T細胞を殺
す、CD8+細胞障害性T細胞、および２）通常、MHCクラスII分子によって提示され
るペプチドを認識し、免疫系の他の細胞の応答を制御する、CD4+ヘルパーT細胞
。MHCクラスIは、12,000MWの非グリコシル化タンパク質（β鎖、β₂−ミクログ
ロブリンとしても知られている）と非共有結合的に結合している43,000MWのトラ
ンスメンブラン糖タンパク質（α鎖）からなっている。MHCクラスIIは、ドメイ
ンの配置は異なっても全体にわたって、MHCクラスIに類似の構造を有している。
クラスIIは、約34,000および29,000の、非共有結合的に結合している2つのトラ
ンスメンブラン糖タンパク質からなっている。MHCクラスIおよびII分子の詳細な
構造は、X線結晶学レベルで解明された（Bjoerkman et al., 1987）。MHC構造の
最も興味深い部分は、グルーブ（溝）の壁を形成する2つのαへリックスおよび
グルーブの底面を形成する8個のβ−プリーツ・シーツ構造から構成され、ペプ
チドが結合する独特のグルーブを示す、上方部分である。

【００１２】 MHCは、きわめて多型である、すなわち、その集団中には、多くの異なるバー
ジョン（対立遺伝子、アロタイプ）が存在するが、それぞれの個体は、このうち
の一つまたは二つしか遺伝されない（父方から一つ、および母方から一つ）。MH
Cは、多型遺伝子（polygenic）でもあって、すなわち、いくつかのMHCをコード
する遺伝子座がゲノム中に存在するので、いくつかのアイソタイプが同時発現す
る。重要なことに、多型性の残余の大半は、ペプチドが結合するグルーブに向け
られ、その大きさ、形状、および機能性に影響を及ぼす（Matsumura et al., 19
92）。ペプチド−MHC相互作用は、特異的であり、たとえ、広範であっても、多
くの無関係なペプチドをそれぞれのMHCのアロタイプに結合させることができる
（Buus et al., 1987）。多型性は、ペプチドの結合の特異性を指令し、このこ
との生物学的帰結は、集団中の各個体が、教育し特有のT細胞の能力範囲を形作
ることである。

【００１３】 MHC特異性の発生構造的に、MHCのペプチド結合部位は、グルーブを形成し、さらに、これは、A
からFまでの種々のポケットに区分し得る。ペプチド−MHC結合エネルギーの大半
は、結合しているペプチドの主鎖原子が絡んでいる（MHCクラスIの末端を含む）
；すべてのペプチドに共通する特徴（Matsumura et al., 1992）。ペプチド側鎖
原子には、ほんの少しの結合エネルギーしか、関係していないが、これらの相互
作用が、MHCの特異性を説明すると信じられている。この機構は、いかにMHCが広
範な特異性、しかし高い親和性、ペプチド結合を達成し得るかを示している。MH
Cは、「モチーフ」の認識を通じて、機能的に、広範なペプチド結合の特異性を
達成する（Sette et al., 1987）。モチーフは、たとえばアンカー部位に、特定
のアミノ酸の存在および適度なスペーシングといったペプチドの結合に必要とさ
れる重要な構造的要件を示している。MHCの特異性およびモチーフどのように生
じるかを理解すること、また、種々のMHC分子の特異性を特徴付けることに、か
なりの関心が集まっている。そうした努力の最終目的の一つは、ペプチドの結合
を予見可能にすることにある。MHCの多型性（それ以来、構造的および機能的に
証明されてきた）から、MHCのアロタイプのそれぞれが、それ自身の特異的な特
徴を有することになる。今までのところ、この特異性は、実験的にしか記述し得
ない。

【００１４】 MHC特異性の説明と予測 MHCのペプチドの結合特異性を決定するために、２つの基本的には異なるが、
相補的なアプローチが一般に用いられる。一つのアプローチは、与えられたアロ
タイプのMHC分子に既に結合したペプチドの配列決定をすることからなり（Buus
ら、1988；Falkら、1991）、一方、他のアプローチは、いずれのペプチドがMHC
と結合するかを調べることからなる（Buusら、1986；Olsenら、1994）。双方の
アプローチは、利点と欠点を有する。配列決定の方法は、生来的に処理されたペ
プチド-MHC複合体に関する、しかしながら、重要か、それほど重要でないか、重
要でない残基を任意に割り当てて、消極的に相互作用をする残基を同定すること
ができない。したがって、積極的な相互作用をする残基のうち最も支配的なもの
を同定することが最適である。後者のアプローチ-直接結合方法-は、定量的であ
り、結合者と非結合者との比較が可能である。積極的におよび消極的に相互作用
をする残基を、ともに同定しかつ定量することが可能である。直接結合法（予測
したペプチドの約70％が実際に結合する）が、配列決定方法よりも（約30％が成
功）より良い予測性を与えることは、おそらく驚くべきことではない）（Kastら
、1994）。ペプチドの結合の正確な予測には、問題のMHCの明確な特異性が詳細
に知られることが必要であることが示された（ときには拡張モチーフと呼ばれる
）（Parkerら、1994；Rupertら、1933；Stryhnら、1996）。しかしながら、その
ような詳細なモチーフを得ることは、非常に骨が折れかつ資源集約的である。現
在、問題の各MHC分子の明確な特異性を決定するために、特定の配列またはモチ
ーフに偏向したペプチドの大きい一団が日常的に分析されている（Parkerら、19
94；Rupertら、1993）。

【００１５】我々は最近、MHCに結合するすべての機能的に重要な残基について正確で、偏
向しておらず定量的な説明をもたらすアプローチに基づいたペプチドライブラリ
ーを開発した（Styhnら、1996）。多くの異なるMHC分子がペプチドライブラリー
の同一セットで的を絞ることができること、また任意のMHC分子に対し結合を検
定するためのアッセイを開発できることから、そのライブラリーは普遍的である
。好都合なことに、この方法は実験的な準備および後のデータ処理をかなり減少
させ、それゆえMHCクラスＩ特異性の完全なマッピングを容易にする。このバイ
アスされていないペプチドライブラリーに基礎をおくアプローチは、向上したペ
プチドの結合の予測へ導く（Stryhnら、1996）。予測アルゴリズムの成功は、MH
CクラスI結合は、独立的にふるまう副特異性（sub−specification）の配列の結
果として大部分見なし得ることを示唆する。

【００１６】組換えMHC分子の生成組換えMHC分子の製造担体としてのバクテリアが、他の人々によって示された
（ParkerとWiley、1989）。しかしながら、バクテリア内の封入体にパックした
場合には、これらのMHC分子はペプチドの結合に利用することができなかった。
これらの封入体の完全な変性および還元を伴う戦略が、組換えMHC分子の抽出し
および可溶化するために用いられた（Parkerら、1992；Parkerら、1992；Parker
とWiley、1990）。翻ってこれは、たとえばグルタチオン（GSH/GSSG）のような
還元-酸化試薬の存在下、インビトロ（in vitro）での再折りたたみ操作の使用
を必要とする。凝集およびミス・フォールディングを阻止するためにL-アルギニ
ンのような他の成分を加えられた。しかしながら、インビトロでの折りたたみは
、正確に形成したジスルフィド架橋の生成に関する主要な問題に直面する。MHC
クラスI重鎖は４（いくつかの分子では５）システインを含有する。そのような
再折りたたみ中にジスルフィド架橋が対を形成する相手を誤る可能性が多くある
。このアプローチを用いた機能化MHCクラスI全体の収量が低いこと（約10-20％
）、および速度が非常に遅いことが報告されている（Garbocziら、1992）。

【００１７】

【発明の詳細な開示】

本発明は、封入体のような凝集体中で発現した機能化免疫グロブリンスーパー
ファミリータンパク質が有する問題を解決するために考案された方法に関する。
本発明の方法において、機能化タンパク質は、同じ細胞、または異なる細胞から
生成されるいくつかのタンパク質サブユニットから構成することができる。後者
の場合、機能化タンパク質―２種の異なるタンパク質、たとえばMHCクラスIの重
鎖とβ2ミクログロブリンが極めて好ましい―が折りたたみ時またはその後に結
合する。

【００１８】一つの態様において、本発明は機能化した場合に少なくとも1つのジスルフィ
ド結合を有する機能化免疫グロブリンスーパーファミリータンパク質の生成方法
に関し、その方法は以下の工程からなる： (i)タンパク質をコードするとともに、細胞内で発現可能な遺伝子を含むバクテリア細胞を提供し、 (ii)前記遺伝子を発現させる条件下でその細胞を培養し、 (iii)前記細胞によって生成したジスルフィド結合が変化しない条件下で、前記細胞からタンパク質を単離し、所望により該タンパク質を精製し、 (iv)前記単離タンパク質を折りたたみ処理にあてる。

【００１９】本願明細書および特許請求の範囲においては、"a"または"an"という用語が使
われた場合は、1以上、すなわち、少なくとも１を意味する。 "機能化タンパク質"という用語は、実質的な程度に、たとえばインビトロのア
ッセイにより評価される程度に自ら担う機能の少なくとも一つを発揮し得る免疫
グロブリンスーパーファミリータンパク質を意味する。実施例により、"機能化M
HCクラスIタンパク質"は重鎖、軽鎖（b2m）およびペプチドを含有するタンパク
質であると定義される。重鎖は水溶液に可溶化するために裁断形（truncate）で
あってもよい。上記ペプチドは、問題のMHCタンパク質と結合することができる
ペプチドである。そのようなペプチドは、たとえばBuusら、1986、およびOlsen
ら、1994に記載された直接結合法といった手段によって見出すことができる。

【００２０】 "機能化MHCクラスIIタンパク質"とは、2つの重鎖（α鎖とβ鎖）およびペプチ
ドの複合体を含有するタンパク質を意味する。その重鎖は複合体を水溶液に可溶
化するために裁断形であってもよい。該ペプチドは問題のMHCタンパク質と結合
することができるペプチドである。そのようなペプチドは、たとえばBuusら、19
86、およびOlsenら、1994に記載された直接結合法といった手段によって見出す
ことができる。

【００２１】本発明の特に好ましい態様として、MHCタンパク質が、重鎖、β2mと結合した
重鎖、機能化成熟MHCクラスＩタンパク質からなる群から選ばれるMHCクラスIタ
ンパク質であることを特徴とする；あるいは、α/β二量体およびペプチドを有
するα/β二量体からなる群から選ばれるMHCクラスIIタンパク質であることを特
徴とする方法がある。本発明の一つの重要な側面は、生成したMHCタンパク質が
ペプチドフリーのMHCタンパク質として得られることに特徴がある方法である。

【００２２】 "ペプチドフリーMHCクラスIタンパク質"とは、軽鎖(b2m)と結合するが何らペ
プチドを有さない重鎖を含有するタンパク質を意味する。そのようなタンパク質
は"空の"MHCクラスIタンパク質とも呼ばれる。 "ペプチドフリーMHCクラスIIタンパク質"とは、何らペプチドを有さない重鎖
複合体を含有するタンパク質を意味する。そのようなタンパク質は"空の"MHCク
ラスIIタンパク質とも呼ばれる。

【００２３】本発明は、MHCクラスIタンパク質に関して例示的に説明されるが、すべての免
疫グロブリンスーパーファミリータンパク質（これらは当然にジスルフィド結合
している）、たとえば、抗体、免疫グロブリン可変(V)領域、免疫グロブリン定
常(C)領域、免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖、CD1、CD2、CD3、クラス
IおよびクラスII組織適合性分子、β2ミクログロブリン（β2m）、リンパ球機能
に関係した抗原-3（LFA-3）およびFcyRIII、CD7、CD8、Thy-１およびTp44（CD28
）、Ｔ細胞受容体、CD4、ポリ免疫グロブリン受容体、神経細胞接着分子（NCAM
）、ミエリン関連糖タンパク質（MAG）、Pミエリンタンパク質、ガン胎児抗原(C
EA)、血小板由来成長因子受容体（PDGFR）、コロニー刺激因子-1受容体、αβ-
糖タンパク質、ICAM（細胞間接着分子）、血小板およびインターロイキンからな
る群から選ばれるタンパク質を類似の方法で生成することが可能であることを考
察する。本願発明者はいくつかのMHCクラスI分子、β2ミクロブロブリン、MHCク
ラスII分子、Ｔ細胞受容体CD3γ鎖およびε鎖に関するデータを既に提供してい
る。

【００２４】有用な種々のタンパク質をコードするcDNAのクローニングは、“Molecular cl
oning”（Sambrook、FritschとManiatis、Cold Spring Harbor Press、1989）に
記載された標準的な方法に従う。要するに、市販のcDNA合成キット（Pharmacia
からの場合）を用いて適切な細胞系でcDNAを合成する。ヒトの研究のための細胞
は、第12回国際組織適合性ワークショップ細胞系パネルデータベース（"HLA：HL
Aの遺伝的多様性、機能および医学的影響"、Ed、Domonique Charron、EDKpress
、1997、または HYPERLINK "http://www.icnet.uk/axp/tia/marsh/ihw.html" ht
tp://www.icnet.uk/axp/tia/marsh/ihw.htmlを参照）からのＢ細胞系から形質転
換されたEBVを発現しているHLAパネルに由来する。HLA-A^*0201に適切な細胞系は
IHW9012である。望ましいMHC/HLA分子に相当するヌクレオチド配列が HYPERLINK
"http://www.anthonynolan.com/HIG/index.html" http://www.anthonynolan.co
m/HIG/index.htmlまたは HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov" http://ww
w.ncbi.nlm.nih.govで見出だすことができる。この配列情報を用いることで、適
切なcDNAからポリメラーゼ連鎖反応によって、成熟MHC/HLA分子のアミノ酸1-274
を包含するコード領域を増幅するために、オリゴヌクレオチドプライマーを設計
できる。適切な上流および下流プライマーがHLA-A^*0201を増幅する目的で置かれ
、それをpET28a発現ベクターのNcolおよびHindIII制限位置に挿入する（Novagen
、 HYPERLINK "http://www.novagen.com/vectfram.html" http://www.novagen.c
om/vectfram.html参照）。結合した産物をバクテリアTOP10F'に形質転換し、一
晩のカナマイシン耐性により選別する。いくつかのクローンを拾い出し、Wizard
miniprep（Promega）によりそれらのプラスミドを調製する。該プラスミドを、
クローニングプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応における鋳型として用
い、増幅物をアガロース電気泳動法で分析し、臭化エチジウムで染色される。所
望する配列を含有するクローンを同定するために、適切なサイズの増幅物を導く
プラスミドは配列決定される（ABI310シークエンサー）。これらのクローンを確
保し、後の生成に用いる。任意の有用な遺伝子をクローン化するために同様の戦
略を用いることができる。

【００２５】該タンパク質は、脊椎動物性のタンパク質、たとえばヒト、ネズミ亜科、ラッ
ト、ブタ、ウシ族または鳥類のタンパク質が特に好ましい。他の態様としては、本発明は複数の機能化タンパク質の生成方法に関するもの
であり、少なくとも当該複数のタンパク質の１つは免疫グロブリンスーパーファ
ミリーであり、当該複数のタンパク質は、機能化した場合、少なくとも1つの分
子内または分子間ジスルフィド結合を含有するが、その方法は以下の工程からな
る： (i)それぞれ一つのタンパク質をコードするとともに、細胞内ですべてが発現可
能な複数の遺伝子を含むバクテリア細胞を提供し、 (ii)前記遺伝子を発現させる条件下で、前記細胞を培養し、 (iii)前記細胞により生成したジスルフィド結合を変化させない条件下で、該細
胞から上記タンパク質を単離し、所望によりそれらを精製し、 (iv)前記単離タンパク質を折りたたみ処理にあてる。

【００２６】この態様において、上記タンパク質は融合タンパク質であり得るし、あるいは
２つの別種のタンパク質、すなわち同時発現タンパク質であってもよい。さらに別の態様としては、機能化した場合に少なくとも１つのジスルフィド結
合を有する機能化免疫グロブリンスーパーファミリータンパク質を生成する方法
に関するもので、その方法は以下の工程からなる： (i)上記タンパク質をコードするとともに、細胞内で発現可能な遺伝子を含み、
該タンパク質が凝集体として発現されるバクテリア細胞を提供し、 (ii)前記遺伝子を発現させる条件下で上記細胞を培養し、 (iii)前記細胞により生成したジスルフィド結合を変化させない条件下で、該細
胞からタンパク質凝集体を単離し、所望によりそれらを精製し、 (iv)前記単離タンパク質を折りたたみ処理にあてる。

【００２７】変性したタンパク質には多くの異なるコンホメーションが存在する―一つの特
有のコンホメーションだけではない―これに対し、水溶液中で折りたたまれたタ
ンパク質には、1つまたはいくつかの独特なコンホメーションが存在する。本発
明の重要な特徴の１つは、完全にアンフォールド（unfold）したタンパク質に導
く還元条件下での変性によりもたらされるタンパク質凝集体について通常の溶媒
和を避けることである。正しく折りたたまれたタンパク質を生成するための後の
再折りたたみ（refolding）は、正しいジスルフィド結合の再構築が必要である
ため、困難である。本発明の方法は、驚くべきことに、たとえば封入体といった
凝集体中に存在するタンパク質が、正しいジスルフィド結合を有する機能化の形
態で存在するようであること、したがってジスルフィド結合を破壊することなく
それらのタンパク質を可溶化することが課業であることを見出した点で異なる。
本願発明者は、タンパク質の変性的溶媒和がタンパク質のレドックス状態を変え
ることなく非還元条件下で行われなければならないことを見出した。正しいジス
ルフィド結合を有する変性タンパク質を用いることは、今となってはレドックス
対を添加しないで、たとえば尿素の希釈と同じ位に容易である再折りたたみ方法
の単純化に導く。しかしながら、折りたたみは、シャペロン（chaperones）のよ
うな他のタンパク質によって補助される；MHCクラスIの場合は、β2mおよび/ま
たはペプチドによって補助される。さらに、本発明によれば、折りたたみ処理は
、たとえばMHCのごときあるタンパク質については、基本的にGSSG/GSHといった
レドックス対の不在のもとで行われる。

【００２８】その単離は、細胞の分裂、封入体などの凝集物の分離（たとえば遠心分離によ
る）、任意の洗浄、あるいは変性剤（たとえば尿素、塩酸グアニジン、または当
業者に知られたほかの方法による）中で可溶性タンパク質を抽出する凝集物（た
とえば封入体）の抽出により行うことができる。これは、修飾されたかまたは以
下のような当業者に公知の精製手段による、（iii）の単離プロセスの概要であ
る。これはＭＨＣ分子に特に都合のよい工程であり、オリゴペプチドを含有する
多くの非共有結合した分子から精製の工程を加えるのが特に好ましい。このよう
な精製は、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ア
フィニティクロマトグラフィー、疎水性相互作用、沈殿、ろ過、遠心分離および
その他の当業者に知られた方法により行うことができる。

【００２９】該折りたたみは、該変性剤（尿素など）をタンパク質の折りたたみを導く点ま
で希釈することにより開始される。好ましくは、本発明の方法での折りたたみ段
階（iv）は、少なくとも一つの緩衝剤を含む水性媒体中で行われるのが好ましい
。該タンパク質は、その後、上述した精製方法に供してもよい。本発明の方法では、非相同のまたは相同のタンパク質をコードする遺伝子を含
む細胞は、該遺伝子が該細胞中において発現可能であれば、どのような細胞であ
ってもよい。好ましくは、該細胞は、細菌細胞、真菌細胞、イースト細胞、動物
細胞および植物細胞よりなる群から選ばれるのが望ましい。より好ましくは、該
細胞は、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌よりなる群から選ばれる細菌細胞
であることが望ましい。ここで、グラム陰性細菌の好ましい具体例としては、Ｂ
Ｌ２１またはそれに由来する品種、ＸＡ９０またはそれに由来する品種を含むＥ
．ｃｏｌｉが挙げられる。

【００３０】細胞内環境の還元性が同種の非修飾細胞よりも少ないように遺伝的に修飾され
た細胞など、ほかの使用できる細胞も考えられ、たとえば、低減もしくは欠損し
た活性を有するように修飾された細胞チオレドキシンレダクターゼまたは、細胞
質のスルフヒドリル還元能力に同様の効果を示す酵素を有するように修飾された
、ｔｒｘＢ変異体などの細胞が挙げられる。ほかの有用な菌株としては、タンパ
ク質のビオチン結合化能を有する菌株、すなわち、ビオチン結合化配列を持つ、
タンパク質のビオチン結合化能を有する菌株が挙げられる。該タンパク質は、生
体内あるいは生体外で修飾されていてもよく、たとえばリン酸化、グリコシル化
、アセチル化、アミド化あるいは他の適切な方法により修飾されていてもよい。

【００３１】該発現したタンパク質は細胞内に位置してもよく、周縁細胞質に位置してもよ
く、細胞外に位置してもよい。機能化タンパク質をコードする遺伝子コードの挿入は、ヌクレオチド配列の細
胞への導入を行うための、どのような通常の技術により行ってもよく、たとえば
、形質転換、トランスフェクション、形質導入などが挙げられる。該遺伝子は、
典型的には、トランスポゾーム手段により、または組換えによりホスト細胞の染
色体に挿入されてもよく、また、適当なベクターによってエピソーム的に導入さ
れてもよい。そのような目的に適切なベクターには、Ｔ７プロモーターのような
ｐＥＴベクターが含まれる。

【００３２】該遺伝子は、ホスト細胞に単独で導入されてもよく、また、プロモーター配列
、プロモーター調整配列、エンハンサー配列、アンチセンスＲＮＡを含む抑制物
質をコードする配列などの配列を含む他のヌクレオチド配列とともに導入されて
もよい。タンパク質の製造量を多くするためには、該機能化タンパク質をコード
した遺伝子の多数の複製をホスト細胞に導入することができる。また、シャペロ
ンタンパク質をコードする配列、本来のシャペロンタンパク質の発現もしくは機
能を調整する配列、または、該機能化タンパク質のグリコシル化による遺伝子生
成物をコードする配列を導入することもできる。プロモーターは、構造に関する
ものでも誘導できるものでもよい。

【００３３】本発明の方法によれば、得られるタンパク質にひとつもしくはそれ以上の面で
利点がある。この方法により生産された機能化タンパク質の収量は、工程（iii
）を細胞からもたらされたジスルフィド結合を変更して行った以外は本質的に同
じ条件で得られる機能化タンパク質の収量と比較して、少なくとも１０％、たと
えば少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも７０％、あるいは少なく
とも１００％増加することができる。また、本発明の方法の速度は、工程（iii
）を細胞からもたらされたジスルフィド結合を変更した条件で行った場合と比較
して、少なくとも１０％以上、たとえば少なくとも２０％、少なくとも４０％、
少なくとも７０％、あるいは少なくとも１００％増加することができる。この速
度の増加は、折りたたみ２、折りたたみ５、折りたたみ１０、折りたたみ１００
、あるいは折りたたみ１００００増加したのに相当することができると考えられ
る。さいごに、該方法により製造された機能化タンパク質の純度は、工程（iii
）を細胞からもたらされたジスルフィド結合を変更した条件で行った場合に得ら
れた機能化タンパク質の純度と比較して、少なくとも１０％、たとえば少なくと
も２０％、少なくとも４０％、少なくとも７０％、あるいは少なくとも１００％
増加することができる。

【００３４】これらの例を参照すれば、特にＭＨＣタンパク質Ａ２では、折りたたみ効率は
少なくとも４０％、ＭＨＣタンパク質Ｄｂにおいても折りたたみ効率はさらに高
く、すなわち少なくとも５０％と考えられる。この％は、折りたたみプロセスに
導入したタンパク質の量と比較した、折りたたみ直後に活性タンパク質上で測定
した量である。これより、本件のタンパク質について最適化された本発明の方法
による場合には、免疫グロブリンスーパーファミリータンパク質の少なくとも２
５％が機能的構造で得られると考えられる。

【００３５】好ましくは、該タンパク質は不対システイン残基を含まないのが望ましい。し
かしながら、本発明の観点では、具体例として、一つの不対システイン残基を含
むタンパク質が挙げられる。該タンパク質は、少なくとも２、たとえば少なくと
も３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも
８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なく
とも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７
、少なくとも１８、少なくとも１９、あるいは、少なくとも２０のシステイン残
基を含むことができる。好ましくは、該タンパク質は偶数のシステイン残基を含
有するのが望ましい。より好ましくは、該タンパク質は、多くて２０、たとえば
多くて１４、多くて１０、多くて８、多くて５、多くて４、多くて３、あるいは
多くて２のシステイン残基を有する。該タンパク質は、多くて２０、たとえば多
くて１５、多くて１０、多くて８、多くて５、多くて４、多くて３、あるいは多
くて２のジスルフィド結合を有することができる。

【００３６】好ましい具体例としては、該遺伝子は、天然に存在する遺伝子の誘導体である
。該誘導体は、同じアミノ酸をコードするコドンであって、本来存在するコドン
よりも、ホスト細胞からより頻繁に用いられる少なくとも一つのコドンを置換し
て得ることができる。一般に、該遺伝子は、自然には該遺伝子に結合しない調節
ＤＮＡ配列の制御下にある。しかしながら、該遺伝子はそれ自身のプロモーター
の制御下にあってもよい。好ましい具体例としては、細菌細胞は、たとえばＴ７
プロモーターなどのｐＥＴベクターからなる群から選ばれる発現ベクターで形質
転換されたものが望ましい。その他のベクターは、当業者により自明である。

【００３７】本発明の最も重要な面は、本発明の方法により得られる安定したペプチドフリ
ーＭＨＣタンパク質である。安定したＭＨＣペプチドフリータンパク質は、当該
技術のうちどのような方法によっても以前には生成されていなかった。Ｔ２ある
いは昆虫細胞のような、ＴＡＰ欠落真核細胞から得られる、「空の」分子がクレ
ームされ（Matsumuraet al., 1992）、ペプチドが抽出され、特定の調製により
同定されてはいたが（Wei & Cresswell, 1992; Hendersonet al., 1992）、それ
らの調製は実際には「空」ではなかった。安定したペプチドフリーＭＨＣタンパ
ク質の用途の一つとしては、高度に有能な、純粋で均一なペプチド−ＭＨＣ複合
体生成物を製造することである。「安定した」とは、尿素中で単離された形態の
重鎖が、少なくとも３ヶ月間−２０℃でグリセロールで保管できることをいう。
該複合体の半減期は、実際に６ヶ月以上である。水性溶液中での機能化ＭＨＣ複
合体の安定性は、１：１の重鎖とβ２ｍとで調査する。しかしながら、水性溶液
中で安定した過度のβ２ｍ存在下における重鎖の半減期は、４℃で２日間である
ことが知られている。

【００３８】本発明のもう一つの重要な面は、ＭＨＣクラスＩ重鎖とβ２ｍとを含み、機能
ＭＨＣクラスＩタンパク質に結合可能なペプチドを添加して、機能化ＭＨＣクラ
スＩタンパク質を製造する受容体を与え、機能化ＭＨＣクラスＩタンパクの生成
を導くために添加できるキットである。該ＭＨＣタンパク質は、本発明による方
法で好ましく製造される。一例としては、該キットは、たとえば酵素結合免疫吸
収アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、あるいはその他の当
業者に知られた方法などの検出方法を用いて、最終消費者が、彼／彼女が選択し
たいずれのペプチドの結合も同定しうる試薬を含む。また一例としては、該キッ
トは、たとえば２量化、３量化、４量化あるいはそれ以上の、ＭＨＣタンパク質
のオリゴマー化物を含む。特定の具体例としては、該キットは、診断目的に適切
なキットをつくるマーカーとして、さらなる試薬を含む。該マーカーは、蛍光色
素、酵素、化学ルミネッセンスおよび放射性マーカーよりなる群から選ばれるの
が好ましい。

【００３９】本発明の方法の好ましい用途は、ＭＨＣ、特にペプチドフリーＭＨＣ分子の製
造である。安定したペプチドフリーＭＨＣタンパク質の好ましい用途は、ライブ
ラリー合成あるいは再結合のペプチドライブラリーアプローチを用いた解析によ
る評価としての、ＭＨＣの結合特異性におけるＭＨＣ中のアミノ酸変換の影響の
解析である。ペプチドライブラリーによる特異性解析に続く、このようなＭＨＣ
点突然変異の結合は、構造−機能関連の試験に新規なアプローチを構成する。

【００４０】組替えMHC I 分子の使用ａ）解析／診断（特にＥＬＩＳＡおよび／またはＦＡＣＳによる）ａ．１）ペプチド−ＭＨＣ相互作用の定量。ペプチドとＭＨＣとの間の相互作
用を測定することは興味深いことと思われる。いずれの推定上のＴ細胞エピトー
プも、好ましくは定量アッセイによりＭＨＣ結合を確認すべきである。このよう
な相互作用を測定する現在の方法は、空ＭＨＣ分子の欠落したおよび／または少
なくとも一成分のラベリングが要求される、不十分な制御のアッセイシステムに
より妨げられている。「空の」分子は高活性で、高度に制御されたＲＩＡタイプ
の生化学的アッセイシステム（Buuset al., 1995）に適応しやすい。また「空の
」分子は、ＥＬＩＳＡアプローチによる検出にも適合できる。好ましい具体例と
しては、ＥＬＩＳＡは、ｐａｎ−特異性ａｎｔｉ−ＭＨＣ抗体キャプチャーおよ
び、高い感度、量、非放射性での検出体であるｐａｎ−特異性ａｎｔｉ−ＭＨＣ
抗体検出体を含む。ＥＬＩＳＡ（たとえばアフィニティー標識など）のほかの設
計は、当業者に周知のものである。

【００４１】ａ．２）Ｔ細胞集団の量的および質的な評価のための、特異的Ｔ細胞の一覧。
Mark Davis and coworkersは、１９９６年（Altmanet al., 1996）に、重鎖のＣ
末端にビオチン単結合を付加して生成される、純粋なペプチド−ＭＨＣクラスＩ
複合体の再結合を証明した。酵素によるビオチン結合化プロセスのあと、これら
の複合体は、フィコレイシン標識ストレプトアビジンで四量化される。この多量
体である、標識したペプチド−ＭＨＣクラスＩ複合体は、その後ペプチド特異性
Ｔ細胞の標識、MHC I制限手段に用いることができる。ペプチド−ＭＨＣクラス
Ｉ複合体へのＴ細胞受容体の安定性は、通常、安定した生化学的結合に影響しな
いほど低いと思われる。しかしながら、四量化の後では、多量化された複合体の
結合力は、十分に生化学的結合に影響する。このため、このような四量体は、あ
らゆる細胞懸濁液中のＴ細胞数の、蛍光活性化細胞選択装置（ＦＡＣＳ）分析に
よる計数に用いられる。この方法は、希釈分析に限られ、相当に不正確で、特異
的Ｔ細胞の数の見積もりによる特異的Ｔ細胞を計数する古い方法の後で見られる
ようになった。このため、「四量体」分析をすることは、科学的観点だけではな
く、発表の観点からも、必要なものとなった。このDavis法には、２つの大きな
問題がある：大量の純粋なＭＨＣＩ分子を得るのが難しいことと、ビオチン結
合化プロセスが高価で、煩わしく、特に３７℃での長いインキュベーションが必
要であることである。多くのペプチドが、この後者のインキュベーションのため
にＭＨＣＩと結合して残存し、これが同じ実験室内であってさえも、様々な結
果が得られる理由となることがある。本件特許出願は、後結合の形成を最小限に
一掃したすばやく効果的なプロセスで、ペプチド−ＭＣＨＩ複合体が生成され
る方法を開示している。本発明の方法により製造されたＭＨＣＩ分子は、市販
のキットとして用いられ、輸送および貯蔵に取り扱いやすく、さらに、非専門の
実験室であっても、また最終消費者選択の適合するどのようなペプチドでも、最
終的ペプチド−ＭＣＨＩ複合体製品として用いられることが見込まれる。対照
的に、ＭＨＣＩを製造する前者の方法では、かなりの量のタンパク質、分子生
物学的知識および経験を必要とする。結局、酵素的ビオチン結合化よりも優れた
、多くのＭＨＣＩ標識方法が望まれていた（Gallimore et al., 1998; Walter
et al., 1998）。

【００４２】ａ．３）正確にモニターされた免疫操作を可能にする特異的Ｔ細胞の一覧。ど
のような免疫操作（たとえば、予防接種）でも、正確さと特定のモニタリングが
必要である。上述の「四量体」技術は、現時点では、科学的、臨床的および、免
疫操作の商業的評価の、絶好の標準である。 b) 科学性 b.1) MHC I 分子の特異性の機能および構造決定 MHC I分子は、すべてのT細胞媒介応答の発生における中心的役割を果たす。相
当の努力が、MHC I分子の機能と特異性を理解することに向けられる。すべての
これらの目的のために、機能的に活性なMHC I分子に近接する必要がある。天然
の資源からMHC I分子を生成することは、いくつかの深刻な問題がある。（面倒
で、費用のかかる生産であるにもかかわらず、不純物混じりのMHC Iが少量しか
得られない。）ここで開示する方法は、簡単で、速く、高い効率でペプチド-MHC
I複合体を作成できる。ペプチド-MHC I複合体を生成するのに用いられた以前の
方法は、過剰のペプチドが、再折りたたみ処理中にMHC Iに提供される工程を含
んでいた（Garboczi et al., 1992）。このようにして、得られる複合体は、ペ
プチドがすでに捕獲されており、新規の（de novo）ペプチドの結合には容易に
利用され得ないものだった。本発明で開示された方法によって生成されたMHC I
分子は、ペプチドの結合に直ちに使用され、ペプチドの結合の分析、特異性分析
を含むいかなる分析にも有用であろう。組替えMHC I分子と、最近公表されたペ
プチドライブラリー・アプローチ（Stryhn et al., 1996）とを結びつけると、
突然変異MHC I分子を含む任意のMHC I分子の特異性を詳細に調べることができ
る。このような詳細な分析が、またペプチドの結合予測を向上させることとなる
ことも強調されるべきことである（Stryhn et al., 1996）。

【００４３】 b.2) T細胞の特異性の機能及び構造決定ペプチド-MHC I複合体が、上記開示された方法により、速く、純粋に、効率的
に生産することができる。このような複合体は、前記ペプチド-MHC I複合体と相
互作用するT細胞受容体の構造の分析に用いることができる。そして、ペプチド
の変種および／またはMHC Iの変種を用いることにより、T細胞受容体の特異性に
ついて機能性の分析を行うことができる。

【００４４】 b.3) 特異的T細胞の処理（誘導または阻止）本明細書で開示されたペプチド-MHC I複合体は、与えられた標的細胞のT細胞
受容体と相互作用しうる。該細胞を刺激するために、そのT細胞受容体は、架橋
されていなければならない。こうして、重合したペプチド-MHC I複合体（「四量
体」という）が、適当なペプチド特異的、MHC I拘束T細胞を刺激することを予期
できる。ここでは、可溶性のペプチド-MHC I複合体は同じ細胞をブロックするか
もしれない。

【００４５】 b.4) 免疫操作（たとえばワクチノロジー）の特異的な効果のモニタリング T細胞免疫システムを操作する方法に係るあらゆる研究は、技術の更なる発展
があるまでは、四量体（あるいは四量体類似）技術の存在に依存するであろう。
特異的な所定の応答を誘導する能力は、正確かつ容易に決定可能なものであり、
最新のFACS分析により、亜集団への影響および程度さえもさらに分析できる。こ
のことから四量体技術は、免疫操作の将来の発展に不可欠のものである。

【００４６】 b.5) 特異的T細胞の精製四量体は、ペプチド特異的なMHC I拘束T細胞の効率的な精製を可能とする。例として、もしもビオチンを介して四量体が、常磁性ビーズと結合するならば、
磁石を用いて、すぐにも相当する特異的T細胞を比較的簡単に精製できる。そし
て、特異的T細胞は、溶出されて分析に用いられるか、用途が拡張されてさらに
、免疫操作（たとえば、選択的T細胞移入）に用いられる。これは、極度に面倒
かつ時間のかかる現状のクローニング技術と比較すると、大変な進歩である。

【００４７】 c)治療法 c.1) ワクチンの発達ワクチンの発達の効果は、直接的効果および間接的効果に、大まかに細分化で
きる。開示された技術の直接的効果は、前記ｂ３で述べた原理の治療法への応用
であろう。そこでは、特異的T細胞（そして引き続いて免疫システムの）の高度
に特異的でかつ極めて効率的な活性化が、単離され、ペプチドを負荷され、刺激
する方式（ビーズ上で四量体として架橋されるなど）で投与されたMHC I分子に
基づいて、推定できる。間接的効果は、開示された技術の結果となるワクチン候
補の改善された同定により引き起こされる。すべてのヒトMHC I分子の広範囲に
わたる詳細な分析を可能とすることにより、MHCと結合することができるペプチ
ドに由来する病原体の予知が改善され、そのような予知（MHC特異性エピトープ
分析）の容易な確認が可能になる。

【００４８】 c.2) 自己免疫疾患の治療自己免疫疾患の治療における効果は、直接的効果と間接的効果に大まかに細分
化できる。開示された技術による直接的効果は、前記ｂ３で述べた原理の治療法
への応用であろう。そこでは、特異的なT細胞（そして引き続いて免疫システム
の重要な部分）の高度に特異的なブロッキングは、単離され、ペプチド負荷され
、非刺激的な方式（すなわち、可溶性の非架橋複合体）により投与されたMHC I
分子に基づいて推定できる。間接的効果は、開示された技術の結果となる候補を
誘導する自己免疫性疾患についての改善された同定によりもたらされるであろう
。すべてのヒトMHC I分子の広範囲にわたる詳細な分析を可能とすることにより
、MHCと結合することができるペプチドに由来する自己タンパク質の予知が改善
され、そのような予知の容易な確認が可能になる。

【００４９】 c.3) 選択的免疫細胞移入に対するT細胞の精製 b5で詳説したように、T細胞は、四量体を使用して特異的にラベルできる。そ
して、所定の特異性を有する純粋なT細胞集団を導くように（たとえば磁性ビー
ズにより）選別することができる。このようなT細胞集団は、たとえば伝染性ま
たは腫瘍形成性の疾患に対する選択的免疫細胞移入について、拡張し使用するこ
とができる。

【００５０】 c.4) ガンへの治療多くのガンは、発ガン遺伝子／腫瘍抑制遺伝子の突然変異と、あるいは、発ガ
ン遺伝子／抑制遺伝子の調節不全と関係している。細胞の物質代謝の生起する変
化を、免疫システムにより検出できる。そうでなければ完全に正常な自己タンパ
ク質であるそのレベルを変えるように誘導する調節不全の例がある。しかし、自
己タンパク質の変化したレベルは、そのタンパク質を免疫原性とし、このような
ケースでは、腫瘍拒絶がみられる。（Vierboom et al., 1997）変異および調節
不全は、例証されるように検出され得るが、それに限定されず、遺伝子分析（た
とえば、単一鎖コンホーメーション多型現象、選択的ポリメラーゼ連鎖反応、あ
るいは示差表示）、あるいはタンパク質分析（質量分析により行われるプロテオ
ーム分析）によってもみられる。このように同定されたタンパク質は、すべて上
記のMHC特異的エピトープ分析に供することができ、ガンの特異的な治療がc1お
よびc3に詳説したようにして試みることができる。

【００５１】

【実施例】

原料および方法尿素、フェニルメチルスルホニルフルオライド(PMSF)、イソプロピル−ｂ−D
チオガラクトシダーゼ（isopropyl-b-D thiogalactidase (IPTG)）、ビシンコニ
ン酸溶液（bicinchoninic acid solution (BCS)）およびトリス[ヒドロキシメチ
ル]アミノメタン(トリス)は、シグマ(Sigma)社より購入した。Sephadex G50およ
びQ-sepharoseファーストフローアニオン交換材料は、スウェーデンのファーマ
シア(Pharmacia)社より購入した。

【００５２】ヒトおよびネズミMHCクラスI重鎖の製造 XA90細胞中の組換HLA-A^*0201重鎖(1-275)は、WileyおよびGarboczi博士からの
ご好意により提供された物である。一晩培養したXA90細胞を、100μg/mlのアン
ピシリン中のLuria-Bertani培地200ml中に接種し、３７℃で成長させて製造した
。

【００５３】 pGMT7ベクター（pET誘導体）中の組換H-2D^b(1-276) は、Gallimore博士からの
ご好意により提供された物である。H-2D^bを含有するプラスミドは、大腸菌株BL2
1(DE3) (Novagen)中に形質転換され、100μg/mlのアンピシリンを含むLuria-Ber
tani培地200ml中、３７℃で成長させた。一晩培養した細胞を、100μg/mlのアン
ピシリン中のLuria-Bertani培地200ml中に接種し、３７℃で成長させて製造した
。

【００５４】タンパク質質発現は、0.4 mMのイソプロピル−ｂ−ｄ−チオガラクトシダーゼ
(IPTG)を用いてミッドログ(midlog)相(A600=0.6)で誘導された。３時間後遠心
分離により細胞を得た。細胞を、10mlの20 mMトリス緩衝液（pH 8.0）および1 m
M EDTA中で懸濁し、−20℃で保存した。封入体の単離と組換HLA-A2^*01クラスI重鎖の精製凍結細胞調製体（培養物200mlより）を、10mlの20 mMトリス（pH 8.0）、なら
びにリソソーム(lyzosome)（100μg/ml）、EDTA（1mM）、PMSF（50μg/ml）中で
音波破砕し、室温で20分間インキュベートした。次いで、DNAse (10μg/ml)およ
びMgCl (10mM)を加えた。クリアランスの後、封入体は、10,000gにおける15分の
遠心分離により部分的に精製された。封入体を含むペレットをトリス緩衝液中で
３回洗浄した。ペレットを、3 mlの8 M尿素、PMSFを含む20 mMトリス (pH8.0)お
よびEDTA中で、４℃にて２時間インキュベートすることで、最終的に可溶化した
。不溶性物質は遠心分離により除去した。上澄み液を回収し、0.22 umのフィル
ターを通過させ、−80℃で保存した。これらの調製体は、SDS-PAGEによって見積
もられる純度が約60〜80％のHLA-A^*0201クラスI重鎖を含有していた。

【００５５】 HLA-A^*0201クラスI重鎖は、アニオン交換（Fast Flow, ファーマシア社）カラ
ム（１×25cm）を用いて精製された。部分的に精製された重鎖の調製体は、8 M
の尿素、20 mMのトリス (pH 8.0)を用いて５倍に希釈され、イオン交換マトリッ
クスを適用した。カラムを、20 mlの8 M尿素、20 mMのトリス (pH 8.0)で洗浄さ
れ、タンパク質は、8 M尿素、20 mMのトリス (pH 8.0)緩衝液中の０〜５００mM
のNaClのグラジエントで溶離した。溶離タンパク質は、BCAタンパク質決定法、S
DS-PAGE分析およびペプチド結合能によりモニターされた。高精製モノマー重鎖
タンパク質を含み、高いペプチド結合能を有する留分を溜め、−80℃で保存した
。

【００５６】 b2mのIII.4精製とモノクローナル抗体ヒトおよびネズミb2m組換体を、前述(Pedersenら、1995)に記載のようにして
製造し、精製した。モノクローナル抗体、W6/32 (α-HLA クラスI)、BB7.2 (α-
HLA-HLA-A^*0201)、11-4.1 (α-Kk)、S13-29 (α-Kk)、28-14-8S (α-H-2D^b)、B2
2-249 (α-H-2D^b)を腹水（ascites）として製造し、タンパク質Aクロマトグラフ
ィー（これらハイブリドーマの大部分は、ATCCからのものである）で精製した。

【００５７】 b2mおよびペプチドの放射性ヨウ素化 HLA-A^*0201およびH-2D^b特異的ペプチドを逆相HPLCクロマトグラフィーにより
精製し、凍結乾燥した。ペプチド(1-2μg)を前述(Olsenら、1994)に記載のよう
にして比活性60 mCi/μgまで放射性ラベル化した。組換体または母（native）MH
CクラスIに結合可能なラベル化されたペプチドの留分は、一定して８０％であっ
た。

【００５８】電気泳動一次元ミニスラップ(mini-slap)SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE
）を均一なポリアクリルアミドゲル（１５％）中で行った。SDS-PAGE分析に先立
ち、50 mM DTTを用いて、または用いずに、サンプルをLaemmli試料緩衝液中で沸
騰させた。タンパク質をクーマシーブルー（Coomassie Blue） R-250で染色した
。

【００５９】組換HLA-A^*201クラスI分子へのペプチド結合（トレーサー結合）アニオン交換精製を経た変性組換HLA-A^*0201重鎖について、b2mの存在下でペ
プチド結合能力のテストを行った。組換重鎖へのペプチドの結合は、放射性ラベ
ル化されたペプチドの量が痕跡量すなわち約２nMである点を除けば、希釈アッセ
イ（Garbocziら、1992）による従来のフォールディングのように必須として行わ
れた。典型的には、イオン交換精製の留出物から得られた変性重鎖溶液１マイク
ロリットルを後述するフォールディング緩衝液中で、１００倍に希釈した。反応
（系）は少なくとも４時間インキュベートした。ペプチド結合は、Sephadex G25
スパンカラムクロマトグラフィーにより試験した（Buusら、1995）。すべての実
験を２回以上行った。ペプチドの組換H-2D^bおよびHLA-A^*0201の結合の最適化は
、最適なフォールディング緩衝液が20 mM トリス（pH7）、150 mM NaCl、1 mM E
DTA、50 μg/ml PMSF、1 μM b2mおよび1-2 nMのトレーサーペプチドからなるも
のであることを示した。注目すべきことは、L-アルギニンのような古典的フォー
ルディング剤および、GRO-EL/ESのような細菌性シャペロニン(chaperonins)は、
ペプチド結合に対して否定的な影響を有していたことである（データは示さない
）。通常の範囲のGSH/GSSG濃度（たとえば1.8 mM/0.2mM）では、ペプチドの相互
作用に何の影響も及ぼさない。４℃〜３７℃の温度範囲におけるペプチド結合分
析は、１８℃で最適に結合することを示した。pH5.5〜９の範囲におけるペプチ
ド結合分析は、pH6.5〜7.5で最適な結合となることを示した。速度論的研究では
、トレーサーペプチド結合の平衡が、１８℃における４時間のインキュベーショ
ン後に達成されることを示した。

【００６０】機能化HLA-A^*201クラスI分子の生成（スケールアップされたフォールディング
）変性され、精製されたHLA-A^*201重鎖調製体（300〜600μg/ml）は、フォール
ディング緩衝液（上記参照）中の100倍希釈することによりフォールドされ、こ
れにペプチドを加え濃度を約10μMとした。カットオフが約10kDのアミコン(Amic
on)フィルターを用いて、反応系を４℃にて10〜20倍に濃縮した。濃縮物を４℃
にて１時間インキュベートし、15,000gにて15分遠心分離した。上澄み液を、カ
ットオフが約3kDのセントリコン(Centricon)装置を用い４℃にてさらに濃縮した
。遠心分離を繰り返し、上澄み液をサイズ排除クロマトグラフィー(Sephadex G5
0)に適用し、遊離b2mおよびペプチドを排除した。機能化HLA-A^*201クラスIを含
む留分を溜めて、最終濃度約１mg/mlに濃縮した。

【００６１】結果変性組換HLA-A^*201重鎖の発現と精製組換HLA-A^*0201およびH-2D^bは、本質的にGarbocziら(Garbocziら、1992)によ
り記載されているようにして発現させられ、部分的に精製された。細胞を、細胞
密度約0.6で0.4mM IPTGで誘導し、３７℃で３時間インキュベートした。IPTGを
用いてあるいは用いないで、沸騰され還元されたサンプルの電気泳動移動度を15
％SDS-PAGEゲル中で分析した。組換HLA-A^*0201の収率は、約40〜50mg/L培地にな
ると見積もられ、図１、レーン３における約33kDの優勢的タンパク質バンドに相
当する。

【００６２】封入体を単離するため、細胞を音波破砕した。（200mlの培地から得た）組換
重鎖を発現する細胞を、遠心分離し、ペレットを20 mM トリス（pH 8）、リゾチ
ーム（lysozyme）、PMSFおよびEDTAを含む緩衝液に再溶解した。次いで、DNAse
およびMgClを加えた。溶液のクリアランス後（20〜30分、22℃）遠心分離し、封
入体をペレット化した。ペレットをトリス緩衝液（pH８）で３回洗浄し、最終的
に8M尿素中に再溶解し、−80℃で保存した。

【００６３】封入体から得た部分精製タンパク質は、アニオンイオン交換クロマトグラフィ
ーを用いてさらに分別された。この精製工程の意味は、高いフォールディングを
有する組換HLA-A^*0201分子の調製体を効率的に高め、また、異種混交（heteroge
neiety）（わずかな汚染、細菌中における重鎖のわずかな酵素的変換等）を避け
ることにある。

【００６４】モノマー組換HLA-A^*0201およびH-2D^bを、勾配をかけたNaCl（0-500mM）で溶離
した。組換HLA-A^*0201およびH-2D^b重鎖モノマーは、それぞれ約200ｍMおよび350
mM NaClで溶離した。精製重鎖の純度、濃度および機能性を、SDS-PAGE（図１、
レーン４および図２）、およびBCA-タンパク質決定アッセイおよびトレーサーペ
プチド結合分析（図４）により分析した。

【００６５】アニオン交換精製および非還元SDS-PAGE分析によれば、もしすべてでないとし
ても、大部分の、単離封入体から可溶化された組換HLA-A^*0201タンパク質は、酸
化されていた、すなわちジスルフィド架橋を含有していたことが示された。図２
に示されるように、溶離された組換HLA-A^*0201重鎖は、非還元性SDS-PAGE分析に
おいては、２つの別個のバンドに移動した（以下、それぞれ２aおよび３と呼ぶ
）。サイズ排除、イオン交換ないし疎水性クロマトグラフィーでは、タンパク質
３からタンパク質２ａを分離することはできなかった。還元条件下では、２つの
HLA-A^*0201重鎖が、一つの単一タンパク質バンドのようにゆっくりと共に移動す
る−バンド１と呼ぶ（図３、レーン２および３とレーン４を比較）。このバンド
は、図１（レーン３）における優勢的HLA-A^*0201タンパク質バンドに相当する。
結論として、タンパク質は、少なくとも２つの別個のモノマーを導く無傷ジスル
フィド架橋とともに封入体中にパックされていると思われる。後述するフォール
ディング実験は、明らかにタンパク質バンド２ａのみが、機能性組換HLA-A^*0201
複合体中にフォールドされることを示している（図３、レーン１および２を比較
）。タンパク質バンド３は、希釈プロセスにより、フォールディングする間にミ
スフォールドし、移動する。おそらく、タンパク質バンド２ａは正しいジスルフ
ィド架橋を含み、一方、タンパク質バンド３は正しくない。また、組換HLA-A^*02
01重鎖への放射性ラベル化ペプチドの化学的架橋は、タンパク質バンド２ａをペ
プチドレセプターとして同定した（データ示さず）。

【００６６】封入体中にパックされたタンパク質の迅速な移動は、一般的な現象であると思
われる。非還元性SDS-PAGE分析において、ヒトb2m、CD3複合体タンパク質のガン
マおよびイプシロン鎖ドメイン、H2-K^k、MHCクラスIIアルファおよびベータ鎖の
ような広く異なるタンパク質のより迅速な移動が観察されている。また、組換H-
2D^b分子は、非還元性条件下でより高速に移動する（データ示さず）。HLA-A^*020
1重鎖との比較では、非還元性H-2D^b重鎖は、還元性SDS-PAGE分析では、ゆるやか
に移動する一つの単一高速移動バンドとして移動する（データ示さず）。

【００６７】部分精製変性組換HLA-A^*201重鎖への放射性ラベル化ペプチドの結合アニオン交換クロマトグラフィーにより分別された組換重鎖は、希釈プロセス
によりフォールディングする間に添加される放射性ラベル化特異的ペプチドを結
合する能力についてテストした（原材料および方法参照）。（図４）に示すよう
に、モノマー組換HLA-A^*0201重鎖モノマーの出現（バンド２ａおよび３）とペプ
チド結合能との間には良い相関関係がある。尿素調製体からの精製重鎖と還元剤
（0.1mM DTTより多く）では、生化学的精製の後ではGSH/GSSGの存在下において
さえ、ペプチドを結合しない。したがって、ペプチド結合能は、予め形成された
ジスルフィド架橋を有する重鎖に関係している。

【００６８】組換HLA-A^*0201重鎖も組換H-2D^b重鎖もともに、特異的ペプチドによって阻害
されるが、非結合ペプチドでは阻害されないだろう特異的放射性配位子を結合し
た。放射性ラベル化ペプチドを有する複合体中における組換HLA-A^*0201は、HLA-
A^*0201に対する特異的抗体とともに沈殿させることができるが、H2-KkおよびH-2
D^b分子に対する抗体とは沈殿せず、このことは正しいHLA-A^*0201が生じたことを
示す（図５）。

【００６９】高精製変性組換HLA-A2^*201重鎖への放射性ラベル化ペプチドの結合予め形成されたジスルフィド架橋を有する重鎖の変性状態から得られる機能化
MHCクラスIの生成は、放射性ラベル化ペプチドおよび放射性ラベル化b2mを用い
て評価された。タンパク質バンド２ａに相当する十分に精製されたHLA-A^*0201重
鎖は、8Ｍ尿素を用いた機能化組換HLA-A^*0201の変性を通して得られた。変性タ
ンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィー(Sephadex 50)により、８Ｍ尿素を
用いた20 mM トリス緩衝液（pH 8）中で、分別され、重鎖はボイドボリュームで
回収した。

【００７０】放射性ラベル化配位子（ペプチドまたはb2m）の結合は、上述したようにフォ
ールディング緩衝液中の希釈により行われる。ドーズレスポンス（図６）は、フ
ォールディング工程における変性重鎖への放射性ラベル化ペプチドの結合が非常
に有効であり、感度の良いことを示した。これと比較して、従来の親和性精製MH
CクラスI分子は、同様の量のペプチドを結合するためには、10〜50倍高い濃度を
要する。

【００７１】ペプチド結合の高効率が、阻害アッセイおよびスキャッチャード(Scatchard)
分析により分析された。図７に示すように、組換HLA-A^*0201のみが特異ペプチド
と相互作用した。スキャッチャード分析（図７、挿入）は、単純な直線スカッチ
ャードプロットおよび親和性平衡定数約30nMを示した。重要なことは、活性レセ
プターの留分が、投入タンパク質の約80〜90％であるということである。したが
って、HLA-A^*201重鎖は、細菌由来もしくは後続の何れかの工程により導かれる
ペプチドにより予備占拠されることがなく十分に活性である。これと比較して、
従来の親和性精製MHCクラスI調製体は、限定された数、典型的には２％、の活性
レセプターを有するペプチドで予備占拠される。

【００７２】ペプチド結合は、b2mにかなり依存する。図８に示されるように、結合反応に
加えられるb2mのドーズ量の増加は、放射性ラベル化ペプチドの結合を促進する
。b2mの不存在は、重鎖へのペプチド結合を完全に阻害した。また、逆反応、す
なわち重鎖へのb2mの結合は、特異的タンパク質の存在に幾分依存することを示
す（図９）。しかしながら、たとえ親和性が低いとしても、ペプチドの不存在下
でも重鎖へb2mが結合するので、ペプチドは絶対に必要なものではない。

【００７３】 b2m相互作用へのペプチドの効果は、さらに速度論的に分析された。放射性ラ
ベル化b2mと重鎖とからなるHLA-A201複合体の解離速度を、特異的タンパク質の
存在下または不存在下において分析した。ヘテロ二量体複合体、すなわち特異的
ペプチドの不存在下で生成され維持されたものは、３７℃における半減期約４時
間で迅速に解離した。これに対して、三量体ペプチド−b2m−重鎖複合体、すな
わちペプチドの存在下で生成され維持されたものは、半減期約１４時間と安定で
あった。このように、ペプチドはb2m結合を安定化する。われわれは、HLA-A^*020
1複合体は変性重鎖とb2mとの間の一次相互作用を通じて生成されるものと結論す
る。相互作用は、高親和性ペプチド結合サイトを発現するヘテロ二量体を生成す
る。次にペプチド自体が、結合したb2m分子の親和性を増加させ、安定な機能化H
LA-A^*0201複合体を生じる。

【００７４】機能化HLA-A^*0201の生成高いペプチド結合能の留分（約15mlでモノマー重鎖を有する留分の60〜70％に
相当）が回収され、官能性HLA-A^*0201分子の生成（フォールディング）のために
貯蔵された。組換HLA-A^*0201重鎖は、上記フォールディング緩衝液中で希釈され
た。１ml中における500μgの部分精製重鎖（約13mlの細菌培地に相当）を、99ml
の緩衝液に加え、カットオフ約10kDのアミコンフィルターを用いて直ちに濃縮し
た。濃縮物（１時間以内に得られたもの）５〜10mlを４℃にて１時間インキュベ
ートし、15,000gで遠心分離して集合体を除いた。上澄み液を回収し、カットオ
フ約３kDのセントリコン装置を用いて、約150〜200μlにまでさらに濃縮した。
さらなる遠心分離の後、遊離b2mおよびペプチドを維持するサイズ排除クロマト
グラフィー（G50）を用いて、フォールドされたHLA-A^*0201を精製した。集積さ
れたHLA-A^*0201を含む留分を溜め、セントリコンを用いて、最終濃度約１mg/ml
まで濃縮した。添加された変性タンパク質の量から計算されたフォールディング
効率は約40〜50％であった。全工程を通じての機能化HLA-A^*0201の収率は、約10
mg−機能化HLA-A^*0201／L細菌培地に相当する。フォールディングおよび精製の
すべての工程は２４時間以内に行うことができる。フォールディングでは、L-ア
ルギニンやGSH/GSSGのような従来の試薬を添加しないことに注意する。前者は、
予め形成されたジスルフィド架橋を有する変性HLA-A^*0201重鎖のフォールディン
グを阻害する。後者は結果に影響しない。フォールドされた組換 HLA-A^*0201分
子は、通常SDS-PAGE（図３）ならびに特異的抗体との反応性（図５）の試験に供
される。ビオチニル化b2mを用いた本手順で生成された組換H-2D^b複合体は、近年
、ストレプトアビジン（streptavidin）を用いたオリゴマー複合体中でさらに集
積された。オリゴマー化された（「四量体」）H-2D^b複合体は、特異的T細胞のFA
CS染色（図１１）や、共焦点顕微鏡により評価されるようなT細胞の染色に用い
られた。後者は、特異的結合およびインターナリゼーションを実証した。参考文献

【００７５】

【表１】

【００７６】

【表２】

【００７７】

【表３】

【００７８】

【表４】

【図面の簡単な説明】

【図１】組替えHLA-A^*0201の製造トランケート（truncated）A2(1-275)をコード化するXA90細胞を、0.4mM IPTGで
誘発した。生成物を、還元条件下で15%SDS-PAGEで分析した。レーン１：指示マーカーレーン２：誘発前の細胞タンパク質レーン３：誘発後３時間後の細胞タンパク質レーン４：アニオン交換クロマトグラフィーを用いて精製した後の組替えHLA-A^* 0201

【図２】非還元条件下での15%SDS-PAGEで分析した尿素溶解封入体のタンパク質から得ら
れた組替えHLA-A^*0201重鎖を含むアニオン交換フラクション精製したペプチド結合モノマーに対応するフラクション（上端に示されるフラク
ション番号は図４参照）を分析した。組替えHLA-A^*0201は、約31-32kDの２個の
別異タンパク質として泳動していることが分かる；タンパク質バンド2aおよび３
、両者ともインタクトなジスルフィド結合を有している。

【図３】 DTTの存在下または非存在下における精製組替えHLA-A^*0201分子のSDS-page分析
レーン１：希釈工程（非還元）による「折りたたみ」から得られる高純度に精製
された機能化HLA-A^*0201重鎖レーン２および３：非還元条件下におけるアニオン交換HLA-A^*0201重鎖（バンド
2aおよび３）。レーン３では、レーン４にある還元剤により、２つのタンパク質
バンドが部分的にバンド１に還元されていることが分かる。レーン４：タンパク質バンド１を明示した還元条件下でのアニオン交換HLA-A^*02
01重鎖。タンパク質バンド１は、タンパク質バンド2aおよび３より泳動が遅いこ
とが分かる。

【図４】溶出タンパク質量および対応するペプチド結合容量を分析したアニオン交換フラ
クション濃度をBCAで決定し、OD562（実線）で測定した。同一フラクションは、ペプチド
の結合についてもテストした。カラムに適用したタンパク質全量の約３０％は結
合していない（塩基性または中性荷電タンパク質）。これらのタンパク質は封入
体と同時精製されたバクテリアのバックグラウンドタンパク質に相当する。組替
えHLA-A^*0201分子は200mMのNaCl溶液に溶出させ、ペプチド結合分析（点線）お
よびSDS-PAGE分析（図３）により同定した。

【図５】特異的抗体を用いたフォールド組替えHLA-A^*0201分子の免疫沈降反応組替えHLA-A^*0201重鎖、b2mおよび放射性ラベル化ペプチドの複合体を、HLA-A*0
201、H-2K^kまたはH-2D^b分子のいずれかに対するモノクローナル抗体を４℃でイ
ンキュベートした。続いて、タンパク質Aを、該免疫複合体に加えて沈降させた
。沈降物を繰り返し洗浄し、放射活性をカウントした。HLA-A^*0201の特異的抗体
BB7.2およびW6/32だけが、組替えHLA-A^*0201結合放射性ラベルペプチドを沈降さ
せた。組替えHLA-A^*0201と無関係な特異性を有する抗体との間に、測定できる相
互作用はなかった。

【図６】組替えHLA-A^*0201重鎖に対するペプチド結合組替えHLA-A^*0201重鎖の投与量を増加させ、これとb2m（1μM）および微量の放
射性ラベル化ペプチド（2nM）とを１８℃で４時間インキュベートした。複合体
の形成度合いを、G25 spunカラムクロマトグラフィーにより決定した。

【図７】組替えHLA-A*0201とのペプチド相互作用の親和性５nM組替えHLA-A^*0201は、微量の放射性ラベル化ペプチドおよびb2m（1μM）で
インキュベートされ、HLA-A^*0201とH2-Kkに関してそれぞれ特異性を有する非ラ
ベルのペプチドの濃度を増加させた。反応は、１８℃の４時間インキュベートし
て行い、複合体形成の程度をG25 spunカラムクロマトグフィーで決定した。結合リガンド濃度vs結合および遊離リガンドの比をScatchardプロット（挿入図
）でプロットした。

【図８】組替えHLA-A^*0201へのb2m依存性ペプチド結合組替えHLA-A^*0201重鎖は、微量のペプチドでインキュベートするとともに、ヒト
とマウスのb2mの濃度を図に示すように増加させた。反応は、１８℃で４時間イ
ンキュベートして行い、複合体形成の程度をG25spunカラムクロマトグフィーで
決定した。

【図９】その投与量を増加させる組替えHLA-A^*0201重鎖は、特異的ペプチド（１０μM）
の存在下または非存在下に、放射性ラベル化ヒトb2mで、１８℃で４時間インキ
ュベートして行った。反応を、１８℃で４時間インキュベートして行い、複合体
形成の程度をG50spunカラムクロマトグフィーで決定した。

【図１０】組替えHLA-A^*0201複合体からのb2mの解離スパン（spun）カラムで精製した重鎖と放射性ラベル化b2mとのペプチド含有も
しくは非含有の複合体を３μMの非ラベルb2mと混合し、４℃で指示された時間イ
ンキュベートし、複合体形成の程度をG50spunカラムクロマトグフィーで決定し
た。

【図１１】 FACS分析で評価した四量体染色分析した細胞は、H-2D^bに関係するKAVYNFATMペプチドに対し特異的なT細胞受容
体の導入遺伝子を担持するマウス、または非導入遺伝子のコントロール（non-tr
ansgene control）H-2D^bマウスのいずれかから得たCD8陽性T細胞である。分析は
、組替えH-2D^bとビオチン化したb2mとの複合体中の関連するKAVYNFATMペプチド
、または組替えH-2D^bおよびビオチン化したb2mとの複合体中の関連しないFAPGNY
PALペプチドのいずれかを含有するフィコエリスリン-ストレプトアビジン生成四
量体を用いて行った。 FACS分析は、x軸での四量体染色と、ｙ軸でのCD8染色で行った。四量体陽性細
胞、CD8陽性細胞の量は、四辺形の上部、右側に観察される。四量体およびCD8と
もに陽性の全細胞のパーセンテージは、枠の右側から計算され、四辺形の上部右
から直接に与えられる。 T細胞複合体％（四量体＋CD8＋）図11A 関連あり関連あり５３％図11B 関連あり関連なし２％図11C 関連なし関連あり１％図11D 関連なし関連なし３％

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 30/88 ＪＧ０１Ｎ 33/68 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ // Ｇ０１Ｎ 30/88 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＡＣ１２Ｒ 1:19）Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 2G045 BB05 BB10 BB20 BB51 DA36 FB03 FB06 FB08 FB12 4B024 AA01 AA11 BA26 BA31 BA61 BA63 BA80 CA02 DA06 EA04 FA02 GA11 HA01 4B064 AG01 AG20 AG31 CA02 CA19 CE11 DA01 DA13 4C084 AA02 AA06 AA07 BA44 MA01 NA05 NA06 ZB072 ZB262 4H045 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA86 EA50 FA73 FA74 GA23

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】機能化したときに少なくとも一つのジスルフィド結合を有する機能化免疫グロ
ブリンスーパーファミリータンパク質を製造する方法において、 (i) 前記タンパク質をコードするとともに、細胞内で発現可能な遺伝子を含
むバクテリア細胞を提供し、 (ii) 前記遺伝子を発現させる条件下で前記細胞を培養し、 (iii) 前記タンパク質を還元することなく前記細胞から単離し、 (iv) 前記単離タンパク質を折りたたみ（フォールディング）処理にあてることを特徴とする方法。
【請求項２】免疫グロブリンスーパーファミリーからの少なくとも一つを含む複数の機能化
タンパク質を製造する方法において、前記複数の機能化タンパク質は、機能化したときに少なくとも一つの分子内お
よび／または一つの分子間ジスルフィド結合を有し、 (i) 前記タンパク質のそれぞれをコードするとともに、細胞内ですべてが発
現可能な複数の遺伝子を含むバクテリア細胞を提供し、 (ii) 前記遺伝子を発現させる条件下で前記細胞を培養し、 (iii) 前記タンパク質を還元することなく前記細胞から単離し、 (iv) 前記単離タンパク質を折りたたみ処理にあてることを特徴とする方法。
【請求項３】機能化したときに少なくとも一つのジスルフィド結合を有する機能化免疫グロ
ブリンスーパーファミリータンパク質を製造する方法において、 (i) 前記タンパク質をコードするとともに、細胞内で発現可能な遺伝子を含
み、前記タンパク質が凝集物として発現されるバクテリア細胞を提供し、 (ii) 前記遺伝子を発現させる条件下で前記細胞を培養し、 (iii) 前記タンパク質を還元することなく前記細胞から単離し、 (iv) 前記単離タンパク質を折りたたみ処理にあてることを特徴とする方法。
【請求項４】前記方法に従って製造された機能化タンパク質の収量が、工程(iii)を還元条
件下で行った以外は本質的に同一の条件で得られた機能化タンパク質の収量に比
べて、少なくとも１０％、たとえば少なくとも２０％、少なくとも４０％、少な
くとも５０％、少なくとも７０％または少なくとも１００％の割合で増加するこ
とを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】工程(iii)が非還元条件で行われたときに、工程(iii)を還元条件で行った場合
と比較してプロセスの速度を少なくとも１０％早くすることを特徴とする請求項
１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】前記方法に従って製造された機能化タンパク質の純度が、前記工程(iii)を還
元条件下で行った以外は本質的に同一の条件で得られた機能化タンパク質の純度
に比べて、少なくとも１０％の割合で増加することを特徴とする請求項１〜５の
いずれかに記載の方法。
【請求項７】前記タンパク質が、抗体、免疫グロブリン可変（Ｖ）領域、免疫グロブリン定
常（Ｃ）領域、免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖、ＣＤ１、ＣＤ２、Ｃ
Ｄ３、クラスＩおよびクラスＩＩ組織適合分子、β₂ミクログロブリン（β₂ｍ）
、リンパ球機能関連抗原−３（LFA-3）およびＦｃγＲIII、ＣＤ７、ＣＤ８、Th
y-1およびTp44（ＣＤ２８）、Ｔ細胞受容体、ＣＤ４、ポリ免疫グロブリン受容
体、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、Ｐ
ミエリンタンパク質、ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）、血小板由来増殖因子受容体（
ＰＤＧＦＲ）、コロニー刺激因子−１受容体、αβ−糖タンパク質、ＩＣＡＭ（
細胞間接着分子）、血小板およびインターロイキンからなる群より選択された免
疫グロブリンスーパーファミリータンパク質であることを特徴とする請求項１〜
６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】前記免疫グロブリンスーパーファミリータンパク質が、脊椎動物、たとえばヒ
ト、ネズミ亜科、ラット、ブタ、ウシ属のタンパク質、または鳥類タンパク質で
あることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】前記免疫グロブリンスーパーファミリータンパク質が、ＭＨＣであることを特
徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】前記ＭＨＣタンパク質が、ヒトＭＨＣであることを特徴とする請求項９に記載
の方法。
【請求項１１】前記ＭＨＣタンパク質が、重鎖、β₂ｍに結合した重鎖および機能化成熟ＭＨ
ＣクラスＩタンパク質からなる群から選択されるＭＨＣクラスＩタンパク質；ま
たはα／β二量体およびペプチド付きのα／β二量体からなる群から選択される
ＭＨＣクラスＩＩタンパク質であることを特徴とする請求項９または１０に記載
の方法。
【請求項１２】前記得られたＭＨＣタンパク質が、ペプチドフリーなＭＨＣタンパク質として
得られることを特徴とする請求項９〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】前記折りたたみプロセスが終了したときに、得られた免疫グロブリンスーパー
ファミリータンパク質の少なくとも２５％が機能化の形態で得られることを特徴
とする請求項７〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】工程(ii)におけるタンパク質が、封入体として製造されることを特徴とする請
求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】前記工程(iii)が、レドックス状態を変えることのない非還元条件下で行われ
ることを特徴とする請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】前記工程(iii)から単離されたタンパク質を、工程(iv)の前に精製工程にあて
る工程をさらに含むことを特徴とする請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】前記折りたたみ処理(iv)が、水溶性媒体および少なくとも一つの緩衝化合物中
で行われることを特徴とする請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】前記折りたたみ処理が、本質的に、還元剤、たとえばＤＴＴを存在させないで
行われることを特徴とする請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】前記発現させたタンパク質が、細胞内で局在化することを特徴とする請求項１
〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】前記発現させたタンパク質が、ペリプラズマで局在化することを特徴とする請
求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】前記発現させたタンパク質が、細胞外にトランスロケートされることを特徴と
する請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】前記タンパク質が、グリコシル化された形態で発現されることを特徴とする請
求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】前記タンパク質が、リン酸化された形態で発現されることを特徴とする請求項
１〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】前記タンパク質が、インビトロでグリコシル化またはリン酸化されることを特
徴とする請求項１〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】前記タンパク質が、不対システイン残基を含まないことを特徴とする請求項１
〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】前記タンパク質が、一つの不対システイン残基を含むことを特徴とする請求項
１〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】前記タンパク質が、少なくとも２、たとえば少なくとも３、少なくとも４、少
なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少な
くとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１
４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少な
くとも１９、または少なくとも２０のシステイン残基を含むことを特徴とする請
求項１〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】前記タンパク質が、偶数のシステイン残基を含むことを特徴とする請求項１〜
２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】前記タンパク質が、多くて２０、たとえば多くて１４、多くて１０、多くて８
、多くて５、多くて４、多くて３、多くて２のシステイン残基を含むことを特徴
とする請求項１〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】前記タンパク質が、少なくとも１、たとえば少なくとも２、少なくとも３、少
なくとも４、少なくとも５または少なくとも６のジスルフィド結合を含むことを
特徴とする請求項１〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】前記タンパク質が、多くて２０、たとえば多くて１５、多くて１０、多くて８
、多くて５、多くて４、多くて３、多くて２のジスルフィド結合を含むことを特
徴とする請求項１〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】前記細胞が、バクテリア細胞、真菌細胞、酵母細胞、動物細胞および植物細胞
からなる群から選択されることを特徴とする請求項３〜３１のいずれかに記載の
方法。
【請求項３３】前記細胞が、グラム陽性バクテリアおよびグラム陰性バクテリアよりなる群か
ら選択されるバクテリア細胞であることを特徴とする請求項１〜３２のいずれか
に記載の方法。
【請求項３４】前記グラム陰性バクテリアが、菌株ＢＬ２１またはその誘導体、または菌株Ｘ
Ａ９０またはその誘導体を包含するE.Coliであることを特徴とする請求項３３に
記載の方法。
【請求項３５】前記細胞を遺伝的に修飾して、同じ菌株の非修飾細胞よりも細胞内の環境の還
元性が低くなるようにしたことを特徴とする請求項１〜３４のいずれかに記載の
方法。
【請求項３６】前記細胞を修飾して、チオレドキシンレダクターゼ、または細胞質のスルフヒ
ドリル還元能力に対し同様の効果を有する酵素の活性を低減させるか、または欠
損させることを特徴とする請求項１〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】前記修飾細胞が、trxB-変異体であることを特徴とする請求項１〜３６のい
ずれかに記載の方法。
【請求項３８】前記遺伝子が、天然に存在する遺伝子の誘導体であることを特徴とする請求項
１〜３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】前記誘導体が、コドンが同じアミノ酸をコードするところで、もとから存在す
るコドンよりも頻繁に宿主細胞により用いられるコドンの少なくとも一つを置換
することにより得られることを特徴とする請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】前記遺伝子が、当該遺伝子には生来結合しない、調節ＤＮＡ配列の制御下にあ
ることを特徴とする請求項１〜３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】前記バクテリア細胞が、pETベクター類、たとえばT7プロモーターからなる群
より選択された発現ベクターで形質転換されることを特徴とする請求項１〜４０
のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】請求項１〜４１のいずれかに記載の方法により得ることができる安定なペプチ
ドフリーのＭＨＣタンパク質。
【請求項４３】ＭＨＣクラスＩ重鎖およびβ₂ｍを含み、ＭＨＣクラスＩタンパク質に結合可
能なペプチドを添加して、機能化ＭＨＣクラスＩタンパク質の生成を導くことを
可能にする受容体に、機能化ＭＨＣクラスＩタンパク質を製造させ、および測定
または検出させることを可能にするキット。
【請求項４４】ＭＨＣクラスＩタンパク質の生成を測定または検出するために、一つ以上のＭ
ＨＣクラスＩサブユニット（重鎖、ｂ2ｍおよび／またはペプチド）のラベル化
を含む、請求項４３に記載のキット。
【請求項４５】生成したＭＨＣクラスＩタンパク質の測定または検出システムが、ラジオリガ
ンド、免疫沈降、ELISA、プラズモン共鳴、蛍光偏光、分析的超遠心、生化学的
沈降、超濾過、クロマトグラフィーおよび平衡透析からなる技術の群から選択さ
れることを特徴とする請求項４３または４４に記載のキット。
【請求項４６】ＭＨＣタンパク質のたとえば二、三、四またはそれ以上のオリゴマー化物を含
む請求項４３〜４５のいずれかに記載のキット。
【請求項４７】前記キットを診断目的に好適にするマーカーとして、さらなる試薬を添加した
ことを特徴とする請求項４３〜４６のいずれかに記載のキット。
【請求項４８】前記マーカーが、ビオチン、蛍光色素、酵素、化学ルミネッセンスおよび放射
活性マーカーからなる群から選択されることを特徴とする請求項４４〜４７のい
ずれかに記載のキット。
【請求項４９】ＭＨＣの製造における請求項１〜４１のいずれかに記載の方法の使用。
【請求項５０】合成または組み換えライブラリーであるペプチドライブラリーアプローチを用
いる解析により見積もるような、ＭＨＣのアミノ酸変更が及ぼす、該ＭＨＣの結
合特異性に対する効果の解析において、請求項４２に記載の安定な空のＭＨＣタ
ンパク質の使用。