BRPI0708902A2

BRPI0708902A2 - mÉtodos de tratar lupus usando anticorpos cd4

Info

Publication number: BRPI0708902A2
Application number: BRPI0708902-3A
Authority: BR
Inventors: Bryan Irving
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2006-03-16
Filing date: 2007-03-14
Publication date: 2011-06-14
Also published as: EP2001510A4; WO2007109052A3; CA2645322A1; US20070218062A1; NO20084317L; JP2009530290A; WO2007109052A2; KR20080112300A; RU2008137765A; IL193920A0; EP2001510A2; AU2007227609A1; MX2008011785A

Abstract

MÉTODOS DE TRATAR LUPUS USANDO ANTICORPOS CD4 São descritos métodos de tratar lupus, incluindo lupus eritomatoso sistêmico, lupus eritomatoso cutâneo e nefrite lúpica. Os métodos envolvem administração de uma combinação de um anticorpo CD4 não depletivo e um outro composto usado clinicamente ou experimentalmente para tratar lupus. São também providos métodos de tratar nefrite lúpica pela administração de um anticorpo CD4 não depletivo que resulta em uma melhoria na função renal e/ou redução de proteinúria ou sedimento urinário ativo. São também providos méto- dos de tratar esclerose múltipla pela administração de um anticorpo CD4 não depletivo, opcionalmente em combinação com um outro composto usado clinicamente ou experimentalmente para tratar MS. São também providos métodos de tratar recipientes de transplante e sujeitos com artrite reumatóide, asma, psoríase, doença de Crohn, colite ulcerativa e síndrome de Sjogren.

Description

"MÉTODOS DE TRATAR LUPUS USANDO ANTICORPOS CD4"

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido é um pedido de patente de utilidade não provisória que reivindicaprioridade e benefício dos pedidos de patente provisórios anteriores seguintes: U.S.60/783.535, depositado em 16 de março de 2006, intitulado "METHODS OF TREATINGLUPUS USING CD4 ANTIBODIES" por Bryan Irving, e U.S. 60/873.881, depositado em 7 dedezembro de 2006, intitulado "METHODS OF TREATING LUPUS USING CD4ANTIBODIES" por Bryan Irving, cada um dos quais está aqui incorporados pela suareferência na sua íntegra com todos os propósitos.

CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção diz respeito a métodos de tratar Iupus e outras desordens autoimunesem sujeitos mamíferos usando anticorpos CD4 não depletáveis, sozinhos ou emcombinação com outros compostos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Doenças autoimunes, tais como Iupus eritematoso sistêmico (SLE), miasteniagrave, esclerose múltipla e púrpura trombocitopênica idiopática, entre outras, continuamsendo doenças clinicamente importantes em humanos. Como o nome implica, doençasautoimunes dão livre curso aos seus danos através do próprio sistema imune do corpo.

Embora os mecanismos patológicos sejam diferentes entre tipos individuais de doençasautoimunes, um mecanismo geral envolve a ligação de certos anticorpos (referidos aquicomo anticorpos auto-reativos ou auto-anticorpos) presentes nos soros de pacientes paraantígenos auto-nuclear ou celular.

Lupus é uma doença autoimune que envolve anticorpos que atacam o tecidoconectivo. Estima-se que a doença afete aproximadamente 1 milhão de americanos,basicamente mulheres com a idade entre 20 e 40. A forma principal de Iupus é sistêmico(lupus eritematoso sistêmico; SLE). SLE é associado com a produção de anticorposantinucleares, complexos imunes circulantes, e ativação do sistema do complemento. SLEtem uma incidência de cerca de 1 em 700 mulheres com a idade entre 20 e 60. SLE podeafetar qualquer sistema orgânico e pode causar danos severos nos tecidos. Inúmeros auto-anticorpos de diferentes especificidades estão presentes em SLE. Pacientes de SLEfreqüentemente produzem auto-anticorpos tendo especificidade anti-DNA, anti-Ro, eantiplaqueta e que são capazes de iniciar características clínicas da doença, tais comoglomerulonefrite, artrite, serosite, bloqueio completo do coração em recém nascidos, eanormalidades hematológicas. Estes auto-anticorpos são também possivelmenterelacionados a distúrbios do sistema nervoso central. Arbuckle et al. descrevem odesenvolvimento de auto-anticorpos antes do início de ação clínico de SLE (Arbuckle et al.(2003) N. Engl. J. Med. 349(16): 1526- 1533). A presença de anticorpos imuno-reativos comDNA nativo de fita dupla é freqüentemente usada como um marcador de diagnóstico paraSLE.

Lupus não tratado pode ser fatal, já que ele progride a partir do ataque de pele ejunta para órgãos internos, incluindo pulmão, coração e rins (com doença renal sendo aprimeira preocupação). Lupus aparece principalmente como uma série de acessos, comperíodos intermediários de pouca ou nenhuma manifestação da doença. Danos no rim,medidos pela quantidade de proteinúria na urina, são uma das áreas mais agudas de danosassociada com patogenecidade em SLE1 e são responsáveis por pelo menos 50 % damortalidade e morbidez da doença.

Atualmente, não existem tratamentos curativos para pacientes que foramdiagnosticados com SLE. De um ponto de vista prático, médicos geralmente empregaminúmeros medicamentos imunossupressores potentes tais como corticosteróides de altadose, por exemplo, prednisona, ou azatioprina ou ciclofosfamida, que são dados duranteperíodos de acesso, mas que podem também ser dados persistentemente para aqueles quetêm apresentado acesso freqüente. Mesmo com tratamento efetivo, que reduz sintomas eprolonga a vida, muitos destes medicamentos têm efeitos colaterais potencialmenteprejudiciais os pacientes em tratamento. Além do mais, estes medicamentosimunossupressores interferem com a capacidade da pessoa de produzir todos anticorpos,não apenas os anticorpos de anti-DNA auto reativos. Imunossupressores tambémenfraquecem a defesa do corpo em função de outros patógenos potenciais, tornando dessamaneira o paciente extremamente suscetível a infecção e outras doenças potencialmentefatais, tal como câncer. Em alguns desses exemplos, os efeitos colaterais de modalidadesde tratamento atual, combinados com manifestação contínua de baixo nível da doença,podem causar sérias deficiência e morte prematura.

Regimes terapêuticos recentes incluem ciclofosfamida, metotrexato, antimalárias,tratamento hormonal (por exemplo, DHEA), e terapia anti-hormonal (por exemplo, o agentebromocriptina anti prolactina). Métodos para tratamento de SLE que envolvem anticorpossão também descritos. Por exemplo, o método em Diamond et al. (Patente U.S 4.690.905)consiste em gerar anticorpos monoclonais em função de anticorpos anti-DNA (os anticorposmonoclonais referidos aqui como anticorpos anti-idiotípicos) e em seguida usar estesanticorpos anti-idiotípicos para remover os anticorpos anti-DNA patogênicos do sistema dopaciente. Entretanto, a remoção de grandes quantidades de sangue para tratamento podeser um processo complicado, perigoso. Patente U.S 6.726.909 revela o tratamento de SLEem que a composição do anticorpo administrado ao paciente compreende anticorpos anti-idiotípicos anti-DNA purificados e a administração exige uma injeção, ou outro modo deadministração equivalente.

Infusões de globulina imune íntravenosa de alta dose (IVIG) têm também sidousadas no tratamento de certas doenças autoimunes. Até o presente momento, tratamentode SLE com rVIG tem fornecido resultados mistos, incluindo tanto resolução de nefrite lúpica(Akashi et al., J. Rheumatology 17:375-379 (1990)), quanto em poucos exemplos,exacerbação de proteinúria e danos no rim (Jordan et al., Clin. Imunol. Immunopathol. 53:S164-169 (1989)).

Pessoas acometidas com Iupus tais como aquelas com SLE que apresentamevidência clínica para nefrite lúpica e aquelas com nefrite lúpica necessitam de umtratamento barato e seguro que ajudará atenuar os danos aos tecido que leva finalmente afalência renal e a necessidade de hemodiálise crônica e/ou transplante renal causados porsua condição. Similarmente, pessoas acometidas com outras doenças autoimunes, taiscomo esclerose múltipla (MS), artrite reumatóide, miastenia grave, psoríase, diabetes deinício de ação juvenil, doença de Sjogren, doença da tireóide, e doença do intestinoinflamatório também necessitam de tratamentos baratos e seguros.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Uma classe geral de modalidades fornece métodos de tratar Iupus em um sujeitomamífero, por exemplo, um sujeito humano. Nos métodos, uma quantidadeterapeuticamente efetiva de uma combinação de um anticorpo CD4 não depletável e pelomenos um segundo composto selecionado, por exemplo, do grupo que consiste emciclofosfamida, micofenolato mofetil, CTLA4-lg, e um anticorpo a4-integrína, etc. éadministrada ao sujeito. Em certas modalidades, o sujeito é um humano. Em certasmodalidades, o segundo composto é ciclofosfamida.

Em uma classe de modalidades, o anticorpo CD4 não depletável tem umaseqüência de aminoácidos de cadeia leve apresentada na SEQ ID NO:3 e uma seqüênciade aminoácidos de cadeia pesada apresentada na SEQ ID NO:6, uma seqüência deaminoácidos de cadeia leve apresentada na SEQ ID NO:9 e uma seqüência de aminoácidosde cadeia pesada apresentada na SEQ ID NO: 12, uma seqüência de aminoácidos decadeia leve apresentada na SEQ ID NO: 15 e uma seqüência de aminoácidos de cadeiapesada apresentada na SEQ ID NO: 18, ou uma seqüência de aminoácidos de cadeia leveapresentada na SEQ ID NO:21 e uma seqüência de aminoácidos de cadeia pesadaapresentada na SEQ ID NO:24.

Em uma classe de modalidades, o anticorpo CD4 não depletável compreende umCD4 ligando fragmento de um anticorpo que compreende uma seqüência de aminoácidosde cadeia leve apresentada na SEQ TD NO:3 e uma seqüência de aminoácidos de cadeiapesada apresentada na SEQ ID NO:6, uma seqüência de aminoácidos de cadeia leveapresentada na SEQ ID NO:9 e uma seqüência de aminoácidos de cadeia pesadaapresentada na SEQ ID NO: 12, uma seqüência de aminoácidos de cadeia leveapresentada na SEQ ID NO: 15 e uma seqüência de aminoácidos de cadeia pesadaapresentada na SEQ ID NO: 18, ou uma seqüência de aminoácidos de cadeia leveapresentada na SEQ ID NO:21 e uma seqüência de aminoácidos de cadeia pesadaapresentada na SEQ ID NO:24.

Em uma classe de modalidades, o anticorpo CD4 não depletável compreendeCDR1 (SEQ ID NO:25), CDR2 (SEQ ID NO:26), ou preferivelmente CDR3 (SEQ ID NO:27)de cadeia leve apresentada na figura 1A; por exemplo, o anticorpo pode incluir CDR1, CDR2e CDR3 de cadeia leve apresentada na figura 1A (isto é, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, eSEQ ID NO:27). Similarmente, em uma classe de modalidades, o anticorpo compreendeCDR1 (SEQ ID NO:28), CDR2 (SEQ ID NO:29), ou preferivelmente CDR3 (SEQ ID N0:30)de cadeia pesada mostrada na figura 1D; por exemplo, o anticorpo pode incluir CDR1,CDR2 e CDR3 de cadeia pesada mostrada na figura 1D (isto é, SEQ ID NO:28, SEQ IDNO:29, e SEQ ID N0:30). Em uma modalidade, o anticorpo compreende CDR1, CDR2 eCDR3 de cadeia leve apresentada na figura 1A e CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesadamostrada na figura 1D (isto é, SEQ ID NOs: 25-30). Outros anticorpos exemplares incluem,mas sem limitações, anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo como um anticorpomostrado em qualquer de uma das figuras 1-4.

O anticorpo CD4 não depletável pode ser um anticorpo humanizado, por exemplo,onde o sujeito a ser tratado é um humano. O anticorpo pode ter uma porção Fc aglicosilada.Opcionalmente, o anticorpo não se liga ao receptor Fe. Em certas modalidades, o anticorpoé um anticorpo variante anti-CD4 que pode ligar um receptor de FcRN. O anticorpoopcionalmente inclui uma substituição de aminoácido em uma ou mais das posições deaminoácido 270, 322, 326, 327, 329, 313, 333, e/ou 334 da região Fc que altera a ligaçãoC1q e/ou citotoxicidade dependente do complemento do anticorpo (por exemplo, comrelação a um anticorpo parental não incluindo tal substituição). Em certas modalidades, oanticorpo compreende um epítopo de ligação do receptor de salvamento ou um peptídeo deligação de albumina sérica. Opcionalmente, o anticorpo compreende três ou mais sítios deligação de antígeno.

O Iupus para o qual o sujeito é tratado é tipicamente Iupus eritematoso sistêmico(SLE), Iupus eritematoso cutâneo (CLE), ou nefrite lúpica. O Iupus a ser tratado pode seruma doença de estágio inicial, intermediário ou avançado quando o tratamento é iniciado.

Em modalidades em que nefrite lúpica é tratada, a nefrite lúpica pode ser qualquer uma dasclasses I- VI. Por exemplo, o Iupus a ser tratado pode ser nefrite lúpica classe II, nefritelúpica classe III, nefrite lúpica classe IV, ou nefrite lúpica classe V. Em uma modalidade,após o início do tratamento com a combinação, o sujeito apresenta uma redução emproteinúria e/ou uma redução no sedimento urinário ativo, comparado ao(s) nível(s) deproteinúria e/ou sedimento urinário ativo apresentado pelo sujeito antes do início dotratamento. Por exemplo, proteinúria pode ser reduzida em pelo menos 25 %, em pelomenos 50 %, em pelo menos 75 %, ou em pelo menos 90 %, ou a proteinúria pode serreduzida para menos que 1 g por dia ou menos que 500 mg por dia, e/ou sedimento urinárioativo pode ser reduzido em pelo menos 25 %, em pelo menos 50 %, em pelo menos 75 %,ou em pelo menos 90 %, ou apenas sedimento urinário inativo pode permanecer após oinício do tratamento.

Em uma modalidade, antes do início do tratamento com a combinação, o sujeitoapresenta proteinúria, cuja proteinúria é melhorada pelo tratamento. Por exemplo, antes doinício do tratamento, o sujeito pode apresentar proteinúria maior que 500 mg por dia, maiorque 1.000 mg por dia, maior que 2.000 mg por dia, ou maior que 3.500 mg por dia. Após oinício do tratamento, a proteinúria pode ser reduzida em pelo menos 25 %, em pelo menos50 %, em pelo menos 75 %, ou em pelo menos 90 %, ou a proteinúria pode ser reduzida amenos que 1 g por dia ou menos que 500 mg por dia. Como um outro exemplo, antes doinício do tratamento, o sujeito pode apresentar uma razão de proteína para creatinina maiorque 0,5, maior que 1, ou maior que 2; após o início do tratamento, a razão de proteína paracreatinina na urina do sujeito pode ser reduzida em pelo menos 25 % ou em pelo menos 50%, ou a razão pode ser reduzida para menos que 1 ou menos que 0,5.

Em um aspecto, os métodos incluem tratar o sujeito com o anticorpo CD4 nãodepletável e o segundo composto para reduzir sintomas, e em seguida continuar otratamento do sujeito com o anticorpo CD4 não depletável ou com o segundo composto (nãoem combinação um com o outro) para manter a remissão. Por exemplo, em uma classe demodalidades, após o início do tratamento com a combinação, o Iupus é atenuado; otratamento do sujeito com a combinação é em seguida interrompido, e em vez disto umaquantidade terapeuticamente efetiva do anticorpo CD4 não depletável é administrado aosujeito. Em uma outra classe exemplar de modalidades, após o início do tratamento com acombinação, o Iupus é atenuado; tratamento do sujeito com a combinação é em seguidainterrompido, e em vez disto uma quantidade terapeuticamente efetiva do segundocomposto ou um ou mais outros compostos é administrada ao sujeito.

Uma outra classe geral de modalidades também fornece métodos de tratar nefritelúpica em um sujeito mamífero, por exemplo, um humano. Nos métodos, uma quantidadeterapeuticamente efetiva de um anticorpo CD4 não depletável é administrado ao sujeito.Após o início do tratamento com o anticorpo não depletável, o sujeito apresenta umamelhora na função renal, uma redução em proteinúria, e/ou uma redução em sedimentourinário ativo, comparado ao(s) nível(s) de proteinúria e/ou sedimento urinário ativoapresentado pelo sujeito antes do início do tratamento. Por exemplo, proteinúria pode serreduzida em pelo menos 25 %, em pelo menos 50 %, em pelo menos 75 %, ou em pelomenos 90 %, ou a proteinúria pode ser reduzida para menos que 1 g por dia ou menos que500 mg por dia; a razão de proteína para creatinina pode ser reduzida em pelo menos 25 %ou em pelo menos 50 %, ou a razão pode ser reduzida para menos que 1 ou menos que0,5; e/ou sedimento urinário ativo pode ser reduzido em pelo menos 25 %, em pelo menos50 %, em pelo menos 75 %, ou em pelo menos 90 %, ou apenas o sedimento urinárioinativo pode permanecer após o início do tratamento.

A nefrite lúpica pode ser qualquer uma das classes I- VI. Por exemplo, o Iupus a sertratado pode ser nefrite lúpica classe II, nefrite lúpica classe III, nefrite lúpica classe IV, ounefrite lúpica classe V.

Em uma modalidade, antes do início do tratamento, o sujeito apresenta proteinúriamaior que 500 mg por dia, maior que 1.000 mg por dia, maior que 2.000 mg por dia, oumaior que 3.500 mg por dia. Em uma modalidade, proteinúria é reduzida após o início dotratamento com o anticorpo, por exemplo, em pelo menos 25 %, em pelo menos 50 %, empelo menos 75 %, ou em pelo menos 90 %, ou a menos que 1 g por dia ou menos que 500mg por dia. Em uma modalidade, razão de proteína para creatinina é reduzida após o iníciodo tratamento com o anticorpo, por exemplo, em pelo menos 25 % ou em pelo menos 50 %,ou a menos que 1 ou menos que 0,5.

O anticorpo CD4 não depletável pode ser selecionado do grupo que consiste em:

a) um anticorpo que compreende uma seqüência de aminoácidos de cadeia leveapresentada na SEQ ID NO:3 e uma seqüência de aminoácidos de cadeia pesadaapresentada na SEQ ID NO:6;

b) um anticorpo que compreende uma seqüência de aminoácidos de cadeia leveapresentada na SEQ ID NO: 9 e uma seqüência de aminoácidos de cadeia pesadaapresentada na SEQ ID NO: 12;

c) um anticorpo que compreende uma seqüência de aminoácidos de cadeia leveapresentada na SEQ ID NO: 15 e uma seqüência de aminoácidos de cadeia pesadaapresentada na SEQ ID NO: 18;

d) um anticorpo que compreende uma seqüência de aminoácidos de cadeia leveapresentada na SEQ ID NO:21 e uma seqüência de aminoácidos de cadeia pesadaapresentada na SEQ ID NO:24;

e) um anticorpo que compreende um fragmento de ligação de CD4 do anticorpo dea), b), c), ou d);

f) um anticorpo que compreende CDR3 de cadeia leve apresentada na figura 1A(SEQ ID NO:27);

g) um anticorpo que compreende CDR3 de cadeia pesada mostrada na figura 1D(SEQ ID N0:30);

h) um anticorpo que compreende CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leveapresentada na figura 1A (SEQ ID NOs: 25-27);

i) um anticorpo que compreende CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada mostradana figura 1D (SEQ ID NOs: 28-30); e

j) um anticorpo que compreende CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve apresentadana figura 1A e CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada mostrada na figura 1D (SEQ IDNOs: 25-30). Similarmente, o anticorpo pode ser um anticorpo CD4 que liga o mesmoepítopo como um anticorpo mostrado em qualquer das figuras 1-4.

Essencialmente, todos os recursos notados para os métodos anteriores se aplicamigualmente a estas modalidades, de maneira relevante, por exemplo, com relação acombinação do anticorpo não depletável opcional com pelo menos um segundo composto,tipo de anticorpo, e/ou similares. Por exemplo, em uma modalidade da invenção, o anticorpoCD4 não depletável é opcionalmente um anticorpo humanizado, tem uma porção Fcaglicosilada, não se liga ao receptor Fc1 inclui substituições de aminoácido alterando aligação C1q e/ou citotoxicidade dependente do complemento, compreende um epítopo deligação do receptor de salvamento, compreende um peptídeo de ligação de albumina sérica,e/ou tem três ou mais sítios de ligação de antígeno. Em certas modalidades, o anticorpo éum anticorpo variante anti-CD4 que pode ligar um receptor de FcRN.

Uma classe geral de modalidades fornece métodos de tratar esclerose múltipla emum sujeito mamífero, por exemplo, um sujeito humano. Nos métodos, uma quantidadeterapeuticamente efetiva de um anticorpo CD4 não depletável e/ou pelo menos um segundocomposto é administrada ao sujeito. Por exemplo, segundos compostos adequados incluem,mas sem limitações, por exemplo, um agente citotóxico; um agente imunossupressor (porexemplo, ciclofosfamida); um antagonista do marcador superficial da célula B; um anticorpopara um marcador superficial da célula B; um anticorpo CD20 (por exemplo, Rituximab); umanticorpo ou agente de bloqueio CD5, CD28, ou CD40; um corticosteróide (por exemplo,prednisona), CTLA4-lg, um anticorpo a4-integrina tais como natalizumab (Tysabri®),micofenolato mofetil, uma estatina, um anticorpo ou agente de bloqueio LFA-1 ou CD-11a,um anticorpo interleucina-12, um beta interferon (por exemplo, um interferon /?-1a tais comoAvonex® ou Rebif®, ou um interferon /?-1b tal como Betaseron®), acetato de glatirâmero(Copaxone®), um anticorpo CD52 tal como alemtuzuman (CamPath®), um anticorpo receptorde interleucina tal como daclizumab (Zenapax®, um anticorpo para a subunidade alfa doreceptor de interleucina-2), etc.

Uma classe de modalidades relacionada fornece métodos de tratar uma condiçãoem um sujeito mamífero (por exemplo, um sujeito humano). A condição pode ser artritereumatóide, asma, psoríase, rejeição a transplante, doença do enxerto versus hospedeira,esclerose múltipla, doença de Crohn, colite ulcerativa, Síndrome de Sjogren, ou uma outradesordem ou doença autoimune. Nos métodos, uma quantidade terapeuticamente efetiva deuma combinação de um anticorpo CD4 não depletável e pelo menos um segundo compostoé administrado ao sujeito. Em uma classe de modalidades, o segundo composto éciclofosfamida, micofenolato mofetil, ou CTLA4-lg.

Essencialmente, todos os recursos notados para os métodos anteriores se aplicamigualmente a estas classes de modalidades, de maneira relevante, por exemplo, comrelação a tipo de anticorpo, tipo de segundo composto e/ou similares. Por exemplo, oanticorpo CD4 não depletável pode ser selecionado do grupo que consiste em:

b) um anticorpo que compreende uma seqüência de aminoácidos de cadeia leveapresentada na SEQ ID NO:9 e uma seqüência de aminoácidos de cadeia pesadaapresentada na SEQ ID NO: 12;

e) um anticorpo que compreende um fragmento de ligação de CD4 do anticorpo de), b), c), ou d);

DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS

Figuras 1A-1F mostram as seqüências de nucleotídeos e aminoácidos de cadeiaspesadas e leves de uma modalidade do anticorpo CD4 não depletável TRX1. A figura 1Aapresenta as seqüências de nucleotídeos (SEQ ID NO:1) e aminoácidos (SEQ ID NO: 2) decadeia leve, bem como as regiões de CDR e de estrutura. A figura 1B apresenta aseqüência de nucleotídeos de cadeia leve (SEQ ID NO:1). A figura 1C apresenta aseqüência de aminoácidos de cadeia leve com (SEQ ID NO:2) e sem a seqüência líder(SEQ ID NO: 3). A figura 1D apresenta as seqüências de nucleotídeos (SEQ ID NO:4) eaminoácido (SEQ ID NO:5) de cadeia pesada, bem como as regiões de CDR e de estrutura.A figura 1E apresenta a seqüência de nucleotídeos de cadeia pesada (SEQ ID NO:4). Afigura 1F apresenta a seqüência de aminoácidos de cadeia pesada com (SEQ ID NO:5) esem a seqüência líder (SEQ ID NO:6).

As figuras 2A-2F mostram as seqüências de nucleotídeos e aminoácidos decadeias pesadas e leves de uma modalidade do anticorpo CD4 não depletável TRX1. Afigura 2A apresenta as seqüências de nucleotídeos (SEQ ID NO:7) e aminoácidos (SEQ IDNO: 8) de cadeia leve, bem como as regiões de CDR e de estrutura. A figura 2B apresenta aseqüência de nucleotídeos de cadeia leve (SEQ ID NO:7). A figura 2C apresenta aseqüência de aminoácidos de cadeia leve com (SEQ ID NO:8) e sem a seqüência líder(SEQ ID NO:9). A figura 2D apresenta as seqüências de nucleotídeos (SEQ ID NO: 10) eaminoácido (SEQ ID NO: 11) de cadeia pesada, bem como as regiões de CDR e deestrutura. A figura 2E apresenta as seqüências de nucleotídeos de cadeia pesada (SEQ IDNO: 10). A figura 2F apresenta a seqüência de aminoácidos de cadeia pesada com (SEQ IDNO: 11) e sem a seqüência líder (SEQ ID NO: 12).

As figuras 3A-3F mostram as seqüências de nucleotídeos e aminoácidos decadeias pesadas e leves de uma modalidade do anticorpo CD4 não depletável TRX1. Afigura 3A apresenta as seqüências de nucleotídeos (SEQ ID NO: 13) e aminoácido (SEQ IDNO: 14) de cadeia leve, bem como as regiões de CDR e de estrutura. Afigura 3B apresentaa seqüência de nucleotídeos de cadeia leve (SEQ ID NO: 13). A figura 3C apresenta aseqüência de aminoácidos de cadeia leve com (SEQ ID NO: 14) e sem a seqüência líder(SEQ ID NO: 15).

A figura 3D apresenta as seqüências nucleotídeo (SEQ ID NO: 16) e aminoácido(SEQ ID NO: 17) de cadeia pesada, bem como as regiões de CDR e de estrutura. A figura3E apresenta a seqüência de nucleotídeos de cadeia pesada (SEQ ID NO: 16). A figura 3Fapresenta a seqüência de aminoácidos de cadeia pesada com (SEQ ID NO: 17) e sem aseqüência líder (SEQ ID NO: 18).

As figuras 4A-4F mostram as seqüências de nucleotídeos e aminoácidos decadeias pesadas e leves de uma modalidade do anticorpo CD4 não depletável TRX1. Afigura 4A apresenta as seqüências de nucleotídeos (SEQ ID NO: 19) e aminoácido (SEQ IDN0:20) de cadeia leve, bem como as regiões de CDR e de estrutura. A figura 4B apresentaa seqüência de nucleotídeos de cadeia leve (SEQ ID NO: 19). A figura 4C apresenta aseqüência de aminoácidos de cadeia leve com (SEQ ID N0:20) e sem a seqüência líder(SEQ ID NO:21). A figura 4D apresenta as seqüências de nucleotídeos (SEQ ID NO. -22) eaminoácido (SEQ DD NO:23) de cadeia pesada, bem como as regiões de CDR e deestrutura. A figura 4E apresenta a seqüência de nucleotídeos de cadeia pesada (SEQ IDNO:22). A figura 4F apresenta a seqüência de aminoácidos de cadeia pesada com (SEQ IDNO:23) e sem a seqüência líder (SEQ ID NO: 24).

A figura 5 ilustra esquematicamente a progressão da doença pela idade no modelode eficácia pré-clínica NZBxW F1 de SLE.

As figuras 6A-6F apresentam gráficos que ilustram resposta a administração doanticorpo CD4 não depletável. Gráficos apresentados são tempo de progressão (300 mg/dLde proteinúria ou morte) na figura 6A, sobrevivência percentual em função de tempo após oinício do tratamento na figura 6B, proteinúria em 5 meses de tratamento na figura 6C, enitrogênio da uréia sangüínea médio em função do tempo após o início do tratamento nafigura 6D, para animais nos quais o tratamento iniciou os oito meses de idade. A figura 6Emostra tempo de progressão (300 mg/dl_ de proteinúria) e a figura 6F mostra sobrevivênciapercentual em função do tempo após o início do tratamento, para animais nos quais otratamento iniciou aos seis meses de idade.

As figuras 7A-7B apresentam gráficos que ilustram a reversão de nefrite lúpicasevera pelo tratamento com o anticorpo CD4 não depletável. A figura 7A apresenta umgráfico mostrando a porcentagem de camundongos com 300 mg/dl_ de proteinúria no tempoindicado após o tratamento. A figura 7B mostra a porcentagem de camundongos revertidosde >300 mg/dL de proteinúria no primeiro mês de tratamento.

As figuras 8A-8D apresentam gráficos que ilustram resposta a administração doanticorpo CD4 não depletável. A figura 8A mostra titulador de anticorpo ds-DNA em questão,enquanto a figura 8B mostra titulador três meses após o tratamento. A figura 8C mostra onúmero de células CD4+CD69+ encontradas no baço três semanas após o tratamento. Afigura 8D mostra inúmeras CD4+CD25+ células encontradas no baço três semanas após otratamento.

As figuras 9A-9B ilustram múltipla análise de comparação de proteinúria no mês 6de tratamento, usando o grupo tratado com ciclofosfamida (Cytoxan®) como o grupo decontrole na figura 9A e o grupo tratado com anticorpo CD4 não depletável como o grupo decontrole na figura 9B.

A figura 10 ilustra esquematicamente a progressão da doença com o tempo emEAE reincidente e remitente induzido por injeção de peptídeo PLP em camundongos SJL/J,um modelo de eficácia pré-clínica de MS.

As figuras 11A-11B apresentam gráficos que ilustram resposta a administração doanticorpo CD4 não depletável. A figura 11A apresenta um gráfico da classificação clínicacom o tempo para grupos tratados com o anticorpo de controle, acetato de glatirâmero(Copaxone®), o anticorpo alfa-4 integrina, CTLA4-lg, e o anticorpo CD4 não depletável. Afigura 11B apresenta a média diária de classificações clínicas para estes grupos.As figuras 12A-12B apresentam gráficos que ilustram resposta a administração doanticorpo CD4 não depletável. A figura 12A apresenta um gráfico da classificação clínicacom o tempo para grupos tratados com o anticorpo de controle, CTLA4-lg, e o anticorpoCD4 não depletável. A figura 12B apresenta a média diária de classificações clínicas paraestes grupos.

As figuras 13A-13B apresentam gráficos que ilustram resposta a administração doanticorpo CD4 não depletável. A figura 13A apresenta um gráfico da classificação clínicacom o tempo para grupos tratados com o anticorpo de controle, CTLA4-lg, e CD4 anticorponão depletável. A figura 13B apresenta a média diária de classificações clínicas para estesgrupos.

A figura 14 representa as sessões da medula espinhal de camundongos tratadoscom o anticorpo de controle ou o anticorpo CD4, mostrando que o tratamento de anticorpoCD4 não depletável diminui a demielinização em EAE.

A figura 15 apresenta gráficos mostrando o número de células T ICOSh'CD4 ouICOShlCD8 por μΙ_ de sangue para animais tratados com o anticorpo de controle, o anticorpoCD4 não depletável, ou CTLA4-lg.

A figura 16 apresenta um gráfico da classificação clínica com o tempo comparandotratamento de EAE induzido por peptídeo de glicoproteína do oligodendrócito da mielina(MOG) com um anticorpo CD4 não depletável, um anticorpo CD4 depletável, um anticorpode controle, CTLA4-lg, ou um anticorpo CD8 depletável.

As figuras 17A-17B apresentam gráficos que ilustram resposta a administração doanticorpo CD4 não depletável. A figura 17A apresenta um gráfico mostrando a porcentagemde camundongos com 300 mg/dL de proteinúria no tempo indicado após o tratamentoindicado. A figura 17B mostra a porcentagem de camundongos reversos da >300 mg/dL deproteinúria.

As figuras 18A-18D apresentam gráficos que ilustram resposta a tratamento.Gráficos apresentados ilustram tempo de progressão (300 mg/dL de proteinúria ou morte)na figura 18A e sobrevivência percentual em função do tempo após o início do tratamentona figura 18B para animais tratados com uma combinação de anticorpo CD4 não depletávele 50 mg/kg por dia de MMF1 e tempo de progressão na figura 18C e sobrevivênciapercentual na figura 18D para animais tratados com uma combinação de anticorpo CD4 nãodepletável e 25 mg/kg por dia de MMF.

As figuras 19A-19B ilustram múltipla análise de comparação de proteinúria no mês2 de tratamento, usando o grupo tratado de anticorpo de controle como o grupo controle.Resultados para grupos tratados com 50 mg/kg de MMF diariamente (sozinho ou emcombinação com anticorpo CD4 não depletável) estão apresentados na figura 19A,enquanto resultados para grupos tratados com 25 mg/kg de MMF diariamente, estãoapresentados na figura 19B.

Figuras 20A-20I apresentam gráficos que ilustram resposta a tratamento. Gráficosapresentados mostram o número de células T CD4+ por μΙ_ de sangue (Figura 20A), célulasB B2 por μL. de sangue (Figura 20B), células T CD4+ por baço (Figura 20C), células B B2por baço (Figura 20D), células plasmáticas IgM+ (Figura 20E), células plasmáticas mudadaspor isótipo (Figura 20F), células do centro germinal (Figura 20G), e células dendríticasplasmacitóides por baço (Figura 20H), e nível de expressão MHC Il em células dendríticasplasmacitóides (Figura 20I), para animais tratados com o anticorpo de controle, o anticorpoCD4 não depletável, a dose de MMF indicada, ou uma combinação do anticorpo CD4 nãodepletável e a dose de MMF indicada.

As figuras 21A-21B mostram as seqüências de ácido nucléico e aminoácido de CD4humano. A figura 21A apresenta a seqüência de aminoácidos CD4 humano para proteínamadura com o líder clivado. A figura 21B apresenta a seqüência de DNA CD4 humanomadura.

DEFINIÇÕES

A menos que de outra forma definido, todos os termos técnicos e científicos aquiusados têm o mesmo significado comumente entendido pelos versados na tecnologia a quala invenção diz respeito. As definições seguintes suplementam as da tecnologia e sãodirecionadas para o pedido atual e não são atribuídas a nenhum caso relacionado ou nãorelacionado, por exemplo, nenhuma patente ou pedido de patente do mesmo requerente.

Quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes aos aqui descritos podem serusados na prática para teste da presente invenção, e materiais e métodos não Iimitantes sãoaqui descritos. Dessa maneira, a terminologia aqui usada é com o propósito de descreverapenas modalidades particulares, e não pretende-se limitá-las.

Da maneira usada nesta especificação e nas reivindicações anexas, as formassingulares "um", "uma", "o" e "a" incluem referentes ao plural, a menos que o contextoclaramente dite de outra forma. Assim, por exemplo, referência a "uma proteína" inclui umapluralidade de proteínas; referência a "uma célula" inclui misturas de células, e similares.

"Lupus" da maneira aqui usada é uma doença ou desordem autoimune que envolveanticorpos que atacam o tecido conectivo. A forma principal de lupus é sistêmico, lupuseritematoso sistêmico (SLE), que pode incluir envolvimento cutâneo. "Lupus", da maneiraaqui usada, inclui SLE bem como outros tipos de lupus (incluindo, por exemplo, lupuseritematoso cutâneo (CLE), nefrite lúpica (LN), extra-renal, cerebrite, pediátrico, não renal,discóide e alopecia).

Um "sujeito" aqui é tipicamente um humano, mas pode ser um mamífero nãohumano. Mamíferos não humanos exemplares incluem animais de laboratório, doméstico,de estimação, esporte, e reprodutor, por exemplo, camundongos, gatos, cães, cavalos, ecabra. Tipicamente, o sujeito é elegível para tratamento, por exemplo, tratamento de umadesordem autoimune, tratamento relacionados a um transplante de tecido, ou similares. Emum aspecto, tal sujeito é elegível para tratamento para lupus. Com os propósitos aqui, talsujeito elegível é um que apresenta ou apresentou um ou mais sinais, sintomas, ou outrosindicadores de lupus ou foi diagnosticado com lupus, quer, por exemplo, recém-diagnosticado, previamente diagnosticado com um nova sinalização, ou esteróidecronicamente dependente com uma nova sinalização, quer que corre o risco de desenvolverlupus. Um elegível para tratamento de lupus pode opcionalmente ser identificado um que éselecionado por biópsia renal e/ou é selecionado usando um ensaio para detectar auto-anticorpos, tais como aqueles notados a seguir, em que produção de auto-anticorpo éavaliada qualitativamente, e preferivelmente quantitativamente. Tais auto-anticorposexemplares associados com SLE são anticorpos anti nucleares (Ab), DNA anti-fita dupla(dsDNA) Ab1 anti-Sm Ab, ribonucleoproteína anti nuclear Ab, anti-fosfolipídio Ab1 anti-ribossomal P Ab, anti-Ro/SS-A Ab, anti-Ro Ab, e anti-La Ab.

Diagnóstico de lupus (e determinação de eligibilidade para tratamento) pode serrealizado da maneira estabelecida na tecnologia. Por exemplo, diagnóstico de SLE pode serde acordo com critérios atuais American College of Rheumatology (ACR). Doença ativapode ser definida por um critérios"A" British Isles Lupus Activity Group's (BILAG) ou doiscritérios "BnBDLAG1 por exemplo, da maneira aplicada na publicação de pedido de patenteU.S. 2006/0024295 por Brunetta intitulado "Method for treating lupus." Alguns sinais,sintomas, ou outros indicadores usados para diagnosticar SLE adaptados pela Tan et at.(1982) 'The 1982 Revised Criteria for the Classification of SLE" Arth Rheum 25:1271-1277podem ser erupção malar tais como erupção nas bochechas, erupção discóide, ou sinaissalientes vermelhos, foto-sensitividade tal como reação a luz do sol, resultando nodesenvolvimento ou aumento de erupção da pele, úlceras orais tais como úlceras no narizou boca, normalmente indolor, artrite, tais como artrite não erosiva que envolve duas oumais juntas periféricas (artrite em que os ossos em torno da junta não ficam destruídos),serosite, pleurite ou pericardite, desordem renal tais como proteína excessiva na urina(proteinúria, maior que 0,5 g (grama)/dia ou 3+ em bastões de teste) e/ou cilindros celulares(elementos normais derivados da urina e/ou células brancas e/ou células tubulares renais),sinais neurológicos, sintomas, ou outros indicadores, ataques (convulsões), e/ou psicosesna ausência de medicamentos ou distúrbios metabólicos que são conhecidos para causartais efeitos, e sinais hematológicos, sintomas, ou outros indicadores tais como anemia ouleucopenia hemolítica (contagem de células brancas no sangue abaixo de 4.000 células pormilímetro cúbico) ou Iinfopenia (menos que 1.500 linfócitos por milímetro cúbico) outrombocitopenia (menos que 100.000 plaquetas por milímetro cúbico). A Ieucopenia eIinfopenia deve ser detectada em duas ou mais ocasiões. A trombocitopenia deve serdetectada na ausência de medicamentos conhecidos para induzi-la. A invenção não estálimitada a estes sinais, sintomas, ou outros indicadores de lupus.

Uma sinalização de lupus nefrítico pode ser definida como:

1) um aumento de >30 % em Scr em um período de 1 mês, ou

2) uma recorrência ou surgimento de síndrome nefrítica, ou

3) um aumento 3 vezes na proteína urinária com linha de base de proteinúria >1g/24 horas ou da maneira notada na publicação do pedido de patente U.S. 2006/0024295.For nefrite lúpica, a eligibilidade do tratamento pode ser evidenciado por uma sinalizaçãonefrítica da maneira definida pelos critérios renais da maneira notada na publicação dopedido de patente U.S. 2006/0024295.

Nefrite lúpica é opcionalmente diagnosticada e classificada como nefrite lúpicaISN/WHO classe I, classe II, classe III, classe IV, classe V, ou classe VI, por exemplo, damaneira apresentada em Weening et al. (2004) "The classification of glomerulonephritis insystemic lupus erythematosus revisited" Kidney International 65:521-530.

"Tratamento" de um sujeito refere-se aqui tanto a tratamento terapêutico quantomedidas profiláticas ou preventivas. Aqueles que necessitam de tratamento, incluemaqueles já com lupus (ou uma outra condição ou desordem autoimune tais como MS, artritereumatóide, ou doença do intestino inflamatório) bem como aqueles em que o lupus (ououtra desordem) deve ser prevenido. Conseqüentemente, o sujeito deve ter sidodiagnosticado como tendo lupus (ou uma outra desordem) ou pode ser predisposto oususcetível ao lupus (ou outra desordem).

O termo "aliviar" ou "alívio" da maneira aqui usada refere-se a uma diminuição,redução ou eliminação de uma condição, doença, desordem ou fenótipo, incluindo umaanormalidade ou sintoma.

Um "sintoma" de uma doença ou desordem (por exemplo, lupus) é qualquerfenômeno mórbido ou desvio do normal na estrutura, função ou sensação, experimentadopor um sujeito e indicativo da doença.

A expressão "quantidade terapeuticamente efetiva" refere-se a uma quantidade queé efetiva para prevenir, aliviar, ou tratar uma doença ou desordem (por exemplo, lupus, MS,artrite reumatóide, ou doença do intestino inflamatório). Por exemplo, uma "quantidadeterapeuticamente efetiva" de um anticorpo refere-se a uma quantidade do anticorpo que éefetiva para prevenir, aliviar, ou tratar a doença ou desordem especificada. Similarmente,uma "quantidade terapeuticamente efetiva" de uma combinação de um anticorpo e umsegundo composto refere-se a uma quantidade do anticorpo e uma quantidade do segundocomposto que, em combinação, são efetivas para prevenir, aliviar, ou tratar o doença oudesordem especificada.

Deve-se entender que a terminologia "uma combinação" de dois compostos nãosignifica que os compostos tenham que ser administrados misturados uns com os outros.

Assim, o tratamento com, ou o uso de uma combinação como essa engloba uma misturados compostos ou administração separada dos compostos, e inclui administração no mesmodia ou em dias diferentes. Assim a terminologia "combinação" significa que dois ou maiscompostos são usados para o tratamento, tanto individualmente quanto misturados uns comos outros. Quando um anticorpo e um segundo composto, por exemplo, são administradoem combinação para um sujeito, o anticorpo está presente no sujeito em um tempo quandoo segundo composto está também presente no sujeito, quer o anticorpo e segundocomposto sejam administrado individualmente quer misturados ao sujeito.

O antígeno CD4, ou "CD4," é uma glicoproteína expressa na superfície de linfócitosT, bem como certas outras células. Outros nomes para CD4 na literatura incluemagrupamento de diferenciação 4 e L3T4. CD4 é descrito, por exemplo, na entrada 186940na base de dados Online Mendelian Inheritance in Man, no endereço de rede www (dot) ncbi(dot) nlm (dot) nih (dot) gov/Omim.

Um "anticorpo CD4" é um anticorpo que se liga a CD4 com afinidade eespecificidade suficientes. Por exemplo, o anticorpo opcionalmente se liga a CD4 com umaafinidade e especificidade para CD4 que são comparáveis a, ou substancialmente similaresa afinidade de ligação e especificidade de um anticorpo TRX1 pra CD4. Da maneira aquiusada, um "anticorpo CD4," um "anticorpo anti-CD4," e um "anti-CD4" são termosequivalentes e são usados indiferentemente.

Um "anticorpo CD4 não depletável" é um anticorpo CD4 que depleta menos que 50% de células CD4+, preferivelmente menos que 25 % de células CD4+, e maispreferivelmente menos que 10 % de células CD4+. Ao contrário, um "anticorpo CD4depletável" é um anticorpo CD4 que depleta 50 % ou mais de células CD4+, ou mesmo 75% ou mais, ou 90 % ou mais de células CD4+. Depleção de células CD4+ (por exemplo,redução na circulação de níveis de célula CD4+ em um sujeito tratado com o anticorpo)pode ser obtida por vários mecanismos, tais como citotoxicidade mediada por céluladependente de anticorpo, citotoxicidade dependente do complemento, inibição deproliferação de célula T, e/ou indução de morte da célula T.

O termo "anticorpo" é usado aqui no sentido mais amplo e cobre especificamenteanticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo,anticorpos biespecíficos) formados de pelo menos dois anticorpos intactos, anticorposquiméricos, anticorpos humanos, e fragmentos de anticorpo desde que eles exibam aatividade biológica desejada (por exemplo, ligação de CD4). Um anticorpo é uma proteínacompreendendo um ou mais polipeptídeos substancialmente ou parcialmente codificado porgenes de imunoglobulina ou fragmentos de genes de imunoglobulina. Os genes deimunoglobulina reconhecidos incluem os genes de região constante kapa, lambda, alpha,gama, delta, epsilori e mu, bem como uma diversidade de genes de região variáveis deimunoglobulina.

"Fragmentos de anticorpo" compreendem uma porção de um anticorpo intacto,preferivelmente compreendendo a região de ligação de antígeno destes. Exemplos defragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, e Fv; diacorpos; anticorposlineares; moléculas de anticorpo de cadeia única; e anticorpos multiespecíficos formadosdos fragmentos de anticorpo.

Um "anticorpo intacto" é um que compreende domínios variáveis pesado e levebem como uma região Fc.

"Anticorpos nativos" são geralmente glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de150.000 daltons, compostos de duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H)idênticas. Cada cadeia leve é ligada a uma cadeia pesada por uma ligação de dissulfetocovalente, embora inúmeras ligações de dissulfeto variem entre as cadeias pesadas deisótipos de imunoglobulina diferentes. Cada cadeia pesada e leve também tem ligações dedissulfeto intracadeias regularmente espaçadas. Cada cadeia pesada tem em umaextremidade um domínio variável (Vh) seguido por inúmeros domínios constantes. Cadacadeia leve tem um domínio variável em uma extremidade (Vl) e um domínio constante nasua outra extremidade; o domínio constante de cadeia leve é alinhado com o primeirodomínio constante de cadeia pesada, e o domínio variável de cadeia leve é alinhado com odomínio variável de cadeia pesada. Acredita-se que os resíduos de aminoácido particularessejam para formar uma interface entre os domínios variáveis de cadeia leve e cadeiapesada.

O termo "variável" refere-se ao fato de que certas porções dos domínios variáveisdiferem extensivamente em seqüência entre anticorpos e são usados na ligação eespecificidade de cada anticorpo particular com seu antígeno particular. Entretanto, avariabilidade não é igualmente distribuída por todos os domínios variáveis dos anticorpos.

Ela é concentrada em três segmentos chamados regiões hipervariáveis, tanto nos domíniosvariáveis de cadeia leve quanto nos de cadeia pesada. As porções mais altamenteconservadas de domínios variáveis são chamadas de regiões de estrutura (FRs). Osdomínios variáveis de cadeias pesadas e leves nativas compreendem cada qual quatro FRs,adotando a grosso modo uma configuração folha β, conectados por três regiõeshipervariáveis, que formam laços conectando, em alguns casos formando parte da estruturafolha β. As regiões hipervariáveis em cada cadeia são mantidas juntas em proximidadeíntima pela FRs e, com as regiões hipervariáveis da outra cadeia, contribui para a formaçãode site de anticorpos de ligação de antígeno (ver Kabat et al. Sequences of Proteins ofImunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda,Md. (1991)). Os domínios constantes não são envolvidos diretamente na ligação de umanticorpo a um antígeno, mas exibem várias funções efetoras, tais como participação doanticorpo em citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo.

Digestão de papaína de anticorpos produz dois fragmentos de ligação de antígenoidênticos, chamados fragmentos "Fab", cada qual com um sítio de ligação de antígenosimples, e um fragmento "Fc" residual, cujo nome reflete sua capacidade de cristalizarrapidamente. Tratamento de Pepsina disponibiliza um fragmento F(ab')2 que tem dois sítiosde ligação de antígeno e ainda é capaz de reticular antígeno.

"Fv" é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um complete sítio de ligaçãode antígeno e reconhecimento de antígeno. Esta região consiste de um dímero de umacadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve em associação não covalente firme. Énesta configuração que as três regiões hipervariáveis de cada domínio variável interagempara definir um sítio de ligação de antígeno na superfície do dímero Vh-Vl. Coletivamente,as seis regiões hipervariáveis conferem especificidade de ligação de antígeno para oanticorpo. Entretanto, mesmo um domínio variável simples (ou metade de um Fvcompreendendo apenas três regiões hipervariáveis específicas para um antígeno) tem acapacidade de reconhecer e ligar antígeno, embora a uma afinidade menor do que o sítio deligação total.

O fragmento Fab também contém o domínio constante de cadeia leve e o primeirodomínio constante (CH1) de cadeia pesada. Fragmentos Fab' diferem dos fragmentos Fabpela adição de uns poucos resíduos no término carbóxi do domínio CH1 de cadeia pesadaincluindo uma ou mais cisteínas da região de dobradiça do anticorpo. Fab1-SH é aqui adesignação para Fab' em que o(s) resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes levampelo menos um grupo tiol livre. F(ab')2 fragmentos de anticorpo foram originalmenteproduzidos como pares de fragmentos Fab' que têm cisteínas dobradiças entre eles. Outrosacoplamentos químicos de fragmentos de anticorpo são também conhecidos. Ver, porexemplo, Fundamental Imunology, W.E. Paul, ed., Raven Press, Ν. Y. (1999), para umadescrição mais detalhada de outros fragmentos de anticorpo.

Embora vários fragmentos de anticorpo estejam definidos em termos da digestãode um anticorpo intacto, versados na tecnologia percebem que tais fragmentos podem sersintetizados de novo tanto quimicamente quanto utilizando metodologia de DNArecombinante. Assim, o termo anticorpo, da maneira aqui usada, inclui anticorpos oufragmentos destes tanto produzidos pela modificação de todo o anticorpo quantosintetizados de novo usando metodologias de DNA recombinante.

As "cadeias leves" de anticorpos (imunoglobulinas) de qualquer espécie devertebrado podem ser projetadas para um dos dois tipos claramente distintos, chamadoskapa (κ) e Iambda (λ), com base nas seqüências de aminoácido de seus domíniosconstantes.Dependendo da seqüência de aminoácidos do domínio constante de suas cadeiaspesadas, anticorpos podem ser projetados para classes diferentes. Existem cinco classesprincipais de anticorpos intactos: IgA1 IgD1 IgE, IgG1 e IgM1 e diversos desses podem seradicionalmente divididos em subclasses (isótipos), por exemplo, IgGI, lgG2, lgG3, lgG4,IgA1 e lgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às classesdiferentes de anticorpos são chamados α, δ, ε, γ e μ, respectivamente. As estruturas dasubunidade e configurações tridimensionais de classes diferentes de imunoglobulinas sãobem conhecidas.

Fragmentos de anticorpo de "cadeia única Fv" ou "scFv" que compreendem osdomínios Vh e Vl de anticorpo, em que estes domínios estão presentes em uma cadeia depolipeptídeo simples. Preferivelmente, o polipeptídeo Fv compreende adicionalmente umIigador de polipeptídeo entre os domínios VH e VL que permite o scFv formar a estruturadesejada para ligação de antígeno. Para uma revisão de scFv, ver Pluckthun in ThePharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).

O termo "diacorpos" refere-se a pequenos fragmentos de anticorpos com dois sítiosde ligação de antígenos, cujos fragmentos compreendem um domínio variável de cadeiapesada (Vh) conectado a um domínio variável de cadeia leve (Vl) na mesma cadeia depolipeptídeo (Vh-Vl). Usando um Iigador que é muito pequeno para permitir pareamentoentre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a parear com osdomínios complementares de uma outra cadeia e criar dois sítios de ligação de antígenos.Diacorpos são descritos com mais detalhes em, por exemplo, EP 404,097; WO 1993/11161;e Hollinger et al„ Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:6444-6448 (1993).

O termo "anticorpo monoclonal" da maneira aqui usada refere-se a um anticorpoobtido de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorposindividuais compreendendo a população são idênticos e/ou se ligam ao mesmo epítopo,exceto para possíveis variantes que podem surgir durante a produção do anticorpomonoclonal, tais variantes geralmente estando presentes em quantidades inferiores. Aocontrário de preparações de anticorpo policlonal que tipicamente incluem anticorposdiferentes direcionado para determinantes diferentes (epítopos), cada anticorpo monoclonalé direcionado para um determinante simples no antígeno. Além da sua especificidadè, osanticorpos monoclonais são vantajosos em que eles não são contaminados por outrasimunoglobulinas. O modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo obtido de umapopulação de anticorpos substancialmente homogêneos, não deve ser interpretado exigindoprodução do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorposmonoclonais a ser usados de acordo com a presente invenção podem ser feitos pelométodo hibridoma primeiramente descrito por Kohler et al, Nature, 256:495 (1975), oupodem ser feitos por métodos de DNA recombinante (ver, por exemplo, Patente U.S4.816.567). Os "anticorpos monoclonais" podem também ser isolados das bibliotecas doanticorpo fago usando as técnicas descritas por exemplo, em Clackson et al., Nature,352:624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597(1991).

Os anticorpos monoclonais incluem especificamente aqui anticorpos "quiméricos"(imunoglobulínas) em que uma porção de cadeia leve e/ou pesada é idêntica ou homóloga aseqüências em anticorpos correspondentes derivados de uma espécie particular oupertencendo a uma classe ou subclasse de anticorpo particular, enquanto o restante da(s)cadeia(s) é idêntico ou homólogo a seqüências em anticorpos correspondentes derivados deuma outra espécie ou pertencendo a uma outra classe ou subclasse de anticorpo, bemcomo fragmentos de tais anticorpos, desde que eles exibam a atividade biológica desejada(Patente U.S No. 4.816.567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81:6851-6855(1984)). Anticorpos quiméricos de interesse incluem aqui anticorpos "primatizados"compreendendo seqüências de ligação de antígeno de domínio variável derivados doprimata não humano (por exemplo, Old World Monkey, tal como macaco babuíno, reso oucinomolgo) e seqüências de região constante humanas (Patente U.S 5.693.780).

Formas "Humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo, murino) sãoanticorpos quiméricos que contêm seqüência mínima derivada de imunoglobulina nãohumana. Para a maior parte, anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas(anticorpo recipiente) em que resíduos de uma região hipervariável do recipiente sãosubstituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana(anticorpo doador) tais como camundongo, rato, coelho, ou primata não humano tendo aespecificidade, afinidade, e capacidade desejada. Em alguns exemplos, resíduos da regiãode estrutura (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanoscorrespondentes. Além disso, anticorpos humanizados podem compreender resíduos quenão são encontrados no anticorpo recipiente ou no anticorpo doador. Estas modificaçõessão feitas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpohumanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois,domínios variáveis, em que todos ou substancialmente todos dos laços hipervariávelcorrespondentes aos de uma imunoglobulina não humana e todos ou substancialmentetodos dos FRs são aqueles de uma seqüência de imunoglobulina humana, exceto parasubstituição(s) de FR da maneira notada anteriormente. O anticorpo humanizadoopcionalmente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante deimunoglobulina, tipicamente que de uma imunoglobulina humana. Para mais detalhes, verJones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); ePresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).

O termo "região hipervariável" quando aqui usado refere-se aos resíduos deaminoácido de um anticorpo que são responsáveis por ligação de antígeno. A regiãohipervariável compreende resíduos de aminoácido de uma "região determinante decomplementaridade" ou "CDR" (ver, por exemplo, Kabat et al. Sequences of Proteins ofImunological Interesse, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health,Bethesda, Md. (1991)) e/ou os resíduos de um "laço hipervariável" (ver, por exemplo,Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Resíduos "de estrutura" ou "FR" são osresíduos de domínio variável sem ser os resíduos de região hipervariável da maneira aquidefinida.

Os termos "receptor Fe" e "FcR" são usados para descrever um receptor que seliga à região Fc de um anticorpo. FcRs são revisados em Ravetch and Kinet (1991) Annu.Rev. Imunol 9:457-92; Capei et al. (1994) Immunomethods 4:25-34; e de Haas et al. (1995)J. Lab. Clin. Med. 126:330-41. Outros FcRs, incluindo aqueles a ser identificados no futuro,são englobados aqui pelo termo "FcR". O termo também inclui o receptor neonatal, FcRn1que é responsável para a transferência de IgGs maternal para o feto (Guyer et al. (1976) J.Imunol. 117:587 e Kim et al. (1994) J. Imunol. 24:249).

Um "fragmento de ligação de CD4" de um anticorpo é um fragmento do anticorpoque retém a capacidade de se ligar a CD4. Da maneira notada, o fragmento éopcionalmente produzido por digestão do anticorpo intacto ou sintetizados de novo.

Um "epítopo" é a região específica de uma molécula antigênica que se liga a umanticorpo.

A frase "substancialmente similar" ou "substancialmente o mesmo", da maneiraaqui usada, denota um grau suficientemente alto de similaridade entre dois valoresnuméricos (geralmente um associado com um anticorpo da invenção e o outro associadocom um anticorpo referência/comparador) tais versados na tecnologia considerarão adiferença entre os dois valores para ter pouco ou nenhum significado biológico e/ouestatístico no contexto da característica biológica medida pelos ditos valores (por exemplo,valores Kd). A diferença entre os ditos dois valores é preferivelmente menos que cerca de50 %, preferivelmente menos que cerca de 40 %, preferivelmente menos que cerca de 30%, preferivelmente menos que cerca de 20 %, preferivelmente menos que cerca de 10 %como uma função do valor para o anticorpo referência/comparador.

"Afinidade de ligação" geralmente refere-se a intensidade da soma total deinterações não covalentes entre um sítio de ligação simples de uma molécula (por exemplo,um anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). A menos que indicadode outra forma, da maneira aqui usada, "afinidade de ligação" refere-se a afinidade deligação intrínseca que reflete uma interação 1:1 entre membros de um par de ligação (porexemplo, anticorpo e antígeno). A afinidade de uma molécula X com seu parceiro Y pode nogeral ser representada pela constante dissociação (Kd). Afinidade pode ser medida pormétodos comuns conhecidos na tecnologia, incluindo aqueles aqui descritos. Anticorpos deafinidade geralmente se ligam lentamente a antígeno e tendem a dissociar rapidamente, aopasso que anticorpos de alta afinidade geralmente se ligam rapidamente a antígeno etendem a permanecer ligados por mais tempo. Uma variedade de métodos de medirafinidade de ligação é conhecida na tecnologia, qualquer dos quais pode ser usado compropósitos da presente invenção. Modalidades ilustrativas específicas são descritas emseguida.

Em uma modalidade, o "valor Kd" ou "Kd" de acordo com esta invenção é medidopor um ensaio de ligação de antígeno radiomarcado (RIA) realizado com a versão Fab deum anticorpo de interesse e seu antígeno da maneira descrita pelo ensaio seguinte quemede afinidade de ligação de solução de Fabs para antígeno equilibrando Fab com umaconcentração mínima de antígeno marcado [1251] na presença de uma série de titulação deantígeno não marcado, em seguida capturando antígeno ligado com uma placa revestida deanticorpo anti-Fab (Chen et al. (1999) J. Mol Biol 293:865-881). Para estabelecer condiçõespara o ensaio, placas microtituladoras (Dynex) são revestidas por toda a noite com 5 ug/mLde um anticorpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) em sódio carbonato de sódio 50 mM (pH9,6), e subseqüentemente bloqueado com albumina sérica bovina 2 % (w/v) em PBS porduas a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C). Em uma placa nãoadsorvente (Nunc #269620), antígeno 100 pM ou 26 pM [1251] são misturados comdiluições seriais de um Fab de interesse (por exemplo, consistente com avaliação de umanticorpo anti-VEGF, Fab-12, em Presta et al. (1997) Câncer Res. 57:4593-4599). O Fab deinteresse é em seguida incubado por toda a noite. Entretanto, a incubação pode continuarpor um período maior (por exemplo, 65 horas) para assegurar que o equilíbrio seja tingido.

Em seguida, as misturas são transferidas para a placa de captura para incubação atemperatura ambiente (por exemplo, por uma hora). A solução é em seguida removida e aplaca lavada oito vezes com Tween-20 0,1 % em PBS. Quando as placas foram secas, 150ul/poço de cintilante (MicroScint™-20; Packard) são adicionados, e a placas são contadasem um contador gama Topcount® (Packard) por dez minutos. Concentrações de cada Fabque deu menos que ou igual a 20 % de ligação máxima são escolhidas para o uso emensaios de ligação competitiva. De acordo com uma outra modalidade, o valor Kd ou Kd émedido usando ensaios de ressonância plasmon superficial usando um BIAcore®-2000 ouum BIAcore®-3000 (BlAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25 0C com chips CM5 antígenoimobilizado a «10 unidades de resposta (RU). Resumidamente, chips biosensores decarboximetilado dextran (CM5, BIAcore Inc.) são ativados com cloridrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) e N-hidroxisuccinimida (NHS) de acordo com asinstruções do fornecedor. Antígeno é diluído com acetato de sódio 10 mM, pH 4,8, em 5ug/mL («0,2 uM) antes da injeção a uma vazão de 5 ul/minuto para obter aproximadamente10 unidades de resposta (RU) de proteína acoplada. Após a injeção de antígeno,etanolamina 1 M é injetado para bloquear grupos não reagidos. Para medições cinéticas,diluições seriais duas vezes de Fab (0,78 nM a 500 nM) são injetados em PBS com Tween200,05 % (PBST) a 25°C a uma vazão de aproximadamente 25 uL/min. Taxas deassociação (kon) e taxas de dissociação (koff) são calculadas usando um modelo de ligaçãoLangmuir um para um simples (BlAcore® Evaluation Software versão 3,2) ajustandosimultaneamente o sensorgrama de associação e dissociação. A constante dissociação deequilíbrio (Kd) é calculada como a razão kequilíbrio/kvelocidade· Ver, por exemplo, Chen et al.(1999) J. Mol Biol 293:865-881. Se constante de velocidade excede 106 M1 S"1 pelo ensaiode ressonância plasmon superficial anterior, em seguida constante de velocidade pode serdeterminada usando uma técnica de finalização fluorescente que mede o aumento oudiminuição na intensidade emissão de fluorescência (excitação = 295 nm; emissão = 340nm, passa-banda 16 nm) a 25 0C de um anticorpo anti-antígeno 20 nM (forma Fab) em PBS1pH 7,2, no presença de concentrações crescentes de antígeno medidos em umespectrofotômetro, tais como um espectrofotômetro equipado com dispositivo de interrupçãode fluxo (Instrumentos Aviv) ou um espectrofotômetro 8000-série SLM-Aminco®(ThermoSpectronic) com uma cubeta agitada.

Uma "seqüência de aminoácido" é um polímero de resíduos de aminoácido (umaproteína, polipeptídeo, etc.) ou uma cadeia de caracteres representando um polímero deaminoácido, dependendo do contexto.

O termo "agente imunossupressor" da maneira aqui usada para terapia refere-se asubstâncias que agem para supri ou mascarar o sistema imune do mamífero aqui emtratamento. Isto pode incluir substâncias que suprimem produção de citicina, infra-regulamou suprimem expressão de auto antígeno, ou mascara os antígenos MHC. Exemplos de taisagentes incluem pirimidinas 2-amino-6-aril-5-substituído (ver Patente U.S No. 4.665.077);medicamentos anti inflamatórios não esteroidaís (NSAIDs); ganciclovir, tacrolimus,glicocorticóides tais como Cortisol ou aldosterona, agentes anti inflamatório tais como uminibidor de ciclooxigenase, um inibidor de 5-lipoxigenase, ou um antagonista do receptor deleucotrieno; antagonistas de purina tais como azatioprina ou micofenolato mofetil (MMF);agentes de alquilação tais como ciclofosfamida; bromocriptina; danazol; dapsona;glutaraldeído (que mascara os antígenos MHC, da maneira descrita na Patente U.S No.4.120.649); anticorpos anti-idiotípicos para antígenos MHC e fragmentos MHC; ciclosporinaA; esteróides tais como análogos corticosteróides ou glicocorticosteróides ou glicocorticóide,por exemplo, prednisona, metilprednisolona, e dexametasona; inibidores de diidrofolatoredutase tais como metotrexato (oral ou subcutâneo); hidroxicloroquina; sulfasalazina;leflunomida; receptores de anticorpo citicina ou citicina incluindo anticorpos anti-interferon-alfa, -beta, ou -gama, anticorpos de fator-alfa de necrose antitumor (infliximab ouadalimumab), anti-TNF-alfa imunoahesin (etanercept), anticorpos de factor-beta de necroseantitumor, anticorpos anti-interleucina-2 e receptores de anticorpo anti-IL-2; anticorpos anti-LFA-1, incluindo anticorpos anti-CD11a e anti-CD18; globulina anti linfócito heteróloga;anticorpos pan-T, preferivelmente anti-CD3; peptídeo solúvel contendo um domínio deligação LFA-3 (WO 1990/08187 publicado em 26 de julho de 1990); estreptoquinase; TGP-beta; estreptodornase; RNA ou DNA do hospedeiro; FK506; RS- 61443; deoxispergualina;rapamicina; receptor da célula T (Cohen et al., Patent U.S No. 5,114,721); fragmentos doreceptor a célula T (Offner et al., Science, 251: 430-432 (1991); WO 1990/11294; Ianeway1Nature, 341: 482 (1989); and WO 1991/01133); e receptores de anticorpo célula T (EP340,109) tais como Τ10B9.

O termo "agente citotóxico" da maneira aqui usada refere-se a uma substância queinibe ou previne a função de células e/ou causa destruição de células. O termo deve incluirisótopos radioativos (por exemplo, At211, I1311 I1251 Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 eisótopos radioativos de Lu), agentes quimioterapêuticos, e toxinas tais como toxinas depequenas moléculas ou toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica,vegetal, ou animal, ou fragmentos destes.

Um "agente quimioterapêutico" é um composto químico tipicamente usado notratamento de câncer. Exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem agentes dealquilação tais como tiotepa e CYTOXAN® ciclosfosfamida; sulfonatos de alquila tais comobusulfan, improsulfan e piposulfan; aziridinas tais como benzodopa, carboquona,meturedopa e uredopa; etileniminas e metilamelaminas incluindo altretamina,trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilolomelamina;acetogeninas (especialmente bulatacina e bulatacinona); um camptotecina (incluindo oanálogo sintético topotecan); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluindo seus análogossintéticos adozelesina, carzelesina e bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficina 1e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluindo os análogos sintéticos, KW -2189 eCB1-TM1); eleuterobina; pancratiestatina; um sarcodictina; espongistatina; nitrogêniomostarda tais como clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida,mecloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, melfalan, novembichina, fenesterina,prednimustina, trofosfamida, uracil mostarda; nitrosuréias tais como carmustina,clorozotocina, fotemustina, Iomustina1 nimustina e ranimnustina; antibióticos tal como oantibiótico enedina (por exemplo, caliceamicina, especialmente caliceamicina gamai I ecalicheamicina omegaM (ver, por exemplo, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186(1994)); dinemicina, incluindo dinemicina A; bisfosfonatos, tal como clodronat; umesperamicina; bem como cromóforo de neocarzinostatina e cromóforos antibióticos deenedina de cromoproteína relacionados, aclacinomisinas, actinomicina, autramacina,azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina,cromomicinais, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina,ADRIAMICINA® doxorubicina (incluindo morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino- doxorubicina, e deoxidoxorubícina), epirubicína, esorubicina,idarubicina, marcelomicina, mitomicinas tais como mitomicina C, ácido micofenólico,nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina,rodorubicina, estreptonigrina, streptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina;antimetabólitos tais como metotrexato e 5- fluoruracil (5-FU); análogos de ácido fólico taiscomo denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tais comofludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tais comoancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina,enocitabina, floxuridina; andrógenos tais como calusterona, propionato de dromostanolona,epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti adrenais tais como aminoglutetimida, mitotano,trilostano; reabastecedor de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; aldofosfamidaglicosídeo; ácido aminolevulínico; eniluracil; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato;defofamina; demecolcina; diaziquona; elformitina; acetato eliptínio; um epotilona; etoglucid;nitrato de gálio; hidroxiuréia; lentinana; lonidainina; maitansinóide tais como maitansina eansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet;pirarubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2etilhidrazida; procarbazina; PSK® complexode polisacarídeo (JHS Natural Products, Eugene1 Oreg.); razoxano; rizoxina; sizofirano;espirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos(especialmente T-2 toxina, verracurina A, roridina A e anguidina); uretano; vindesina;dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinosídeo("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxóides, por exemplo, TAXOL® paclitaxel (Bristol-MyersSquibb Oncology, Princeton, NJ.), ABRAXAN™ Cremophor-free, formulação nanopartículade engenharia de albumina de paclitaxel (American Pharmaceutical Partners1 Schaumberg1Ill.), e TAXOTERE® doxetaxel (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Prance); cloranbucil;GEMZAR® gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina taiscomo cisplatina e carboplatina; vinblastina; platina; etoposídeo (VP-16); ifosfamida;mitoxantrona; vincristina; NAVELBINE® vinorelbina; novantrona; teniposida; edatrexato;daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inibidor de topoisomerase RFS2000; difluormetil ornitina (DMFO); retinóides tais como ácido retinóico; capecitabina; sais eácidos, ou derivados de qualquer dos anteriores farmaceuticamente aceitáveis.

Nesta definição também estão incluídos agentes anti-hormonais que agem pararegular ou inibir ação do hormônio tais como moduladores do receptor anti estrógenos eestrógeno seletivo (SERMs), incluindo, por exemplo, tamoxifeno (incluindo NOLVADEX®tamoxifeno), raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifene, LY117018,onapristona, e FARESTON® toremifeno; inibidores aromatase que inibem a enzimaaromatase, que regulam produção de estrógeno nas glândulas adrenais, tais como, porexemplo, acetato de 4(5)- imidazóis, aminoglutetimida, MEGASE® megestrol, AROMASIN®exemestano, formestanie, fadrozol, RIVISOR® vorozol, FEMARA® Ietrozol e ARIMIDEX®anastrozol; e anti-andrógenos tais como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida, egoserelina; bem como troxacitabina (um 1,3-dioxolano nucleosídeo citosina análogo);olígonucleotídeos anti-sentido, particularmente aqueles que inibem expressão de genes emcaminhos de sinalização implicados na proliferação célula aberrante, tais como, porexemplo, PKC-alfa, Raf, e H-Ras; vacinas tal como vacinas gene-terapia, por exemplo,vacina ALLOVECTIN®, vacina LEUVECTIN®, e vacina VAXID®; PROLEUKIN® rlL-2;LURTOTECAN® inibidor de topoisomerase 1; ABARELIX® rmRH; sais e ácidos, ou derivadosde qualquer dos anteriores farmaceuticamente aceitáveis.

O termo "citicina" é um termo genérico para proteínas liberadas por uma populaçãode célula que age em uma outra célula como mediadores intercelulares. Exemplos de taiscitocinas são linfocinas, monocinas; interleucinas (ILs) tais como IL-1, IL-1a, IL-2, IL-3, EL-4,EL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-15; um de fator necrose tumoral tais como TNF-σou TNF- β; e outros fatores de polipeptídeo incluindo LJF e Iigante do estojo (KX). Damaneira aqui usada, o termo citicina inclui proteínas de fontes naturais ou de cultura celularrecombinante e equivalentes biologicamente ativos das citocinas de seqüência nativa,incluindo entidades de moléculas pequenas produzidas sinteticamente e derivados e saisdestes farmaceuticamente aceitáveis.

O termo "hormônio" refere-se a hormônios do polipeptídeo, que são geralmentesecretados por órgãos glandulares com dutos. Estão incluídos entre os hormônios, porexemplo, hormônio do crescimento tais como hormônio do crescimento humano, hormôniodo crescimento humano N-metionila, e hormônio do crescimento bovino; hormônio daparatireóide; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorelaxina; hormônios da glicoproteínatais como hormônio de folículo estimulante (FSH), hormônio estimulante da tireóide (TSH), ehormônio Iuteinizante (LH); prolactina, lactogênio placental, peptídeo associado agonadotropina de camundongo, inibina; activina; substância de inibição de mullerian; etrombopoietina. Da maneira aqui usada, o termo hormônio inclui proteínas das fontesnaturais ou de cultura celular recombinante e equivalentes biologicamente ativos dohormônio de seqüência nativa, incluindo entidades de moléculas pequenas produzidassinteticamente e derivados e sais destes farmaceuticamente aceitáveis.

O termo "fator do crescimento" refere-se a proteínas que promove o crescimento, eincluem, por exemplo, fator do crescimento hepático; fator do crescimento fibroblasto; fatordo crescimento endotelial vascular; fatores do crescimento do nervo tais como NGF-/?; fatordo crescimento derivados de plaqueta; fatores do crescimento de transformação (TGFs) taiscomo TGF-σ e TGF-/?; fator I e Il do crescimento tipo insulina; eritropoietina (EPO); fatoresosteoindutivo; interferons tais como interferon-σ, -β, e -γ; e fatores estimulantes de colônia(CSFs) tais como macrófago-CSF (M-CSF); granulócito macrófago-CSF (GM-CSF); egranulócito-CSF (G-CSF). Da maneira aqui usada, o termo fator do crescimento incluiproteínas das fontes naturais ou da cultura celular recombinante e equivalentesbiologicamente ativos do fator do crescimento da seqüência nativa, incluindo entidades demoléculas pequenas produzidas sinteticamente e derivados e sais destesfarmaceuticamente aceitáveis.

Com os propósitos aqui, "fator-alfa de necrose tumoral (TNF-alfa)" refere-se a umamolécula TNF-alfa humana compreendendo a seqüência de aminoácidos da maneiradescrita em Pennica et al., Nature, 312:721 (1984) ou Aggarwal et ah, JBC, 260:2345 (1985).

Um "inibidor TNF-alfa" aqui é um agente que inibe, até certo ponto, uma funçãobiológica de TNF-alfa, geralmente através da ligação de TNF-alfa e neutralizando suaatividade. Exemplos de inibidores TNF especificamente contemplados aqui são etanercept(ENBREL®), infliximab (REMICADE®), e adalimumab (HUMIRA™).

Exemplos de "medicamentos anti inflamatório não esteroidais" ou "NSAIDs" sãoácido acetilsalicílico, ibuprofeno, naproxeno, índometacina, sulindac, tolmetina, incluindosais e derivados destes, etc.

O termo "integrina" refere-se a uma proteína receptora que permite que as célulastanto se liguem a matriz extracelular quanto respondam a elas sejam envolvidas em umavariedade de funções celulares tais como cícatrização de ferida, célula diferenciação, abrigode células tumorais, e apoptose. Elas são parte de um grande família de receptores deadesão celular que está envolvida com interações matriz célula-extracelular e célula-célula.Integrinas funcionais consistem de duas subunidades de glicoproteína transmembrana,chamadas alfa e beta, que são ligadas não covalentemente. As subunidades alfa todascompartilham alguma homologia umas com as outras, as subunidades da beta. Osreceptores sempre contêm uma cadeia alfa e uma cadeia beta. Exemplos incluem αββI,α3β\, α7β\, LFA-1 etc. Da maneira aqui usada, o termo integrina inclui proteínas das fontesnaturais ou da cultura celular recombinante e equivalentes biologicamente ativos daseqüência nativa integrina, incluindo entidades de moléculas pequenas produzidassinteticamente e derivados e sais destes farmaceuticamente aceitáveis. Um "a4-integrina" éa subunidade σ4 de integrinas αΛ-β'Ι e σ4-/?7 que são expressas na superfície de leucócitossem ser neutrófilos.

Exemplos de "antagonistas ou anticorpos integrina" aqui incluem um anticorpo LFA-1, tal como efalizumab (RAPTIV Um®) comercialmente disponível pela Genentech, ou umanticorpo alfa 4 integrina (por exemplo, um "anticorpo a4-integrina" é um anticorpo que seliga a a4-integrina) tal como natalizumab (Tysabri®) disponível pela Biogen, ou derivados defenilalanina diazacíclica (WO 2003/89410), derivados de fenilalanina (WO 2003/70709, WO2002/28830, WO 2002/16329 e WO 2003/53926), derivados de ácido fenilpropiônico (WO2003/10135), derivados de enamina (WO 2001/79173), derivados de ácido propanóico (WO2000/37444), derivados de ácido alcanóico (WO 2000/32575), derivados de fenilasubstituída (Patente U.S 6.677.339 e 6.348,.463), derivados amina aromática (Patente U.S6.369.229), ADAM polipeptídeos de domínio de desintegrina (US 2002/0042368), anticorpospara integrina alfavbeta3 (EP 633945), derivados de aminoácido bicíclico aza ligado (WO2002/02556), etc.

"Corticosteróide" refere-se a qualquer uma das diversas substâncias sintéticas oude ocorrência natural com a estrutura química geral de esteróides que mimetizam ouaumentam os efeitos dos corticosteróides de ocorrência natural. Exemplos decorticosteróides sintéticos incluem prednisona, prednisolona (incluindo metilprednisolona),dexametasona triamcinolona, e betametasona.

Um "marcador superficial da célula B" ou "antígeno superficial da célula B" aqui é um antígeno expresso na superfície de uma célula B que pode ser alvejada com umantagonista que se liga a ela. Marcadores exemplares superficiais de célula B incluem osmarcadores superficiais de leucócito CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37,CD40, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80,CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85 e CD86 (para descrições, ver The Leukocyte AntígenFacts Book, 2nd Edition. 1997, ed. Barclay et al. Academic Press, Harcourt Brace & Co.,New York). Outros marcadores superficiais de célula B incluem RP105, FcRH2, célula BCR2, CCR6, P2X5, HLA-DOB, CXCR5, FCER2, BR3, Btig, NAG14, SLGC16270, FcRHI,IRTA2, ATWD578, FcRH3, IRTA1, FcRH6, BCMA e 239287. O marcador superficial dacélula B de particular interesse é preferencialmente expresso nas células B comparado aoutros tecidos de célula não B de um mamífero e pode ser expresso tanto em precursor decélulas B quanto em células B maduras.

Um "anticorpo que se liga a um marcador superficial da célula B" é uma moléculaque, mediante ligação a uma marcador superficial da célula B1 destrói ou depleta células Bem um mamífero e/ou interfere com uma ou mais funções de célula B1 por exemplo,reduzindo ou prevenindo uma resposta humoral eliciada pela B célula. Preferivelmente oanticorpo é capaz de depletar células B (isto é reduzir níveis de célula B circulante) em ummamífero tratado com ele. Tal Depleção pode ser obtida por meio de vários mecanismostais como citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) e/oucitotoxicidade dependente do complemento (CDC)1 inibição de proliferação de célula B, e/ouindução de morte da célula B (por exemplo, por meio de apoptose).

Um "antagonista" refere-se a uma molécula capaz de neutralizar, bloquear, inibir,exterminar, reduzir ou interferir com as atividades de uma proteína particular ouespecificada, incluindo sua ligação com um ou mais receptores no case de um Iigante ouligação a um ou mais Iigantes no caso de um receptor. Antagonistas incluem anticorpos efragmentos de ligação de antígeno destes, proteínas, peptídeos, glicoproteínas,glicopeptídeos, glicolipídios, polissacarídeos, oligossacarídeos, ácidos nucléicos, moléculasbi orgânicas, peptidomiméticos, agentes farmacológicos e seus metabólitos, seqüências decontrole transcricionais e translacionais, e similares. Antagonistas também inclueminibidores de pequenas moléculas da proteína, e proteínas de fusão, moléculas receptoras ederivados que se ligam especificamente à proteína, seqüestrando assim sua ligação comseu alvo, variantes antagonistas da proteína, moléculas anti-sentido direcionadas à proteína,aptâmeros RNA, e ribozimas contra a proteína.

Um "antagonista do marcador superficial da célula B" é uma molécula que,mediante ligação a um marcador superficial de célula B1 destrói ou depleta células B em ummamífero e/ou interfere com uma ou mais funções da célula B1 por exemplo, reduzindo ouprevenindo uma resposta humoral elicitada pela célula Β. O antagonista preferivelmente écapaz de depletar células B (isto é reduzir níveis de célula B circulante) em um mamíferotratado com ele. Tal Depleção pode ser obtido por meio de vários mecanismos tais comoADCC e/ou CDC, inibição de proliferação de célula B, e/ou indução de morte de célula B(por exemplo, por meio de apoptose). Antagonistas incluídos no escopo da presenteinvenção incluem anticorpos, peptídeos de seqüência sintética ou nativa, proteínas de fusão,e antagonistas de pequenas moléculas que se ligam ao marcador da célula B,opcionalmente conjugado com ou fundidos a um agente citotóxico. Exemplos incluem massem limitações, por exemplo, anticorpos CD20, anticorpos BR3 (por exemplo, W00224909),BR3-Fc, etc.

Exemplos de anticorpos CD20 incluem: "C2B8," que é agora chamado "rituximab"("RITUXAN®") (Patente U.S 5.736.137); o anticorpo murino marcado com ítrio [90] 2B8designado "Y2B8" ou "Ibritumomab Tiuxetan" (ZEVALIN®) comercialmente disponível pelaIDEC Pharmaceuticals, Inc. (Patente U.S 5.736.137; 2B8 depositada com ATCC com o no.De acesso HB 11388 em 22 de junho de 1993); anticorpo murino lgG2a "B1," tambémchamado "Tositumomab", opcionalmente marcado com 131I para gerar o "131I-BI" ou "iodoI131 tositumomab" (BEXXARTm) comercialmente disponível pela Corixa (ver, também, patenteU.S No. 5.595.721); anticorpo murino monoclonal "1F5" (Press et al. Blood 69(2):584- 591(1987) e variantes destes incluindo "de estrutura em placas" ou humanizado 1F5 (WO2003/002607, Leung, S.; ATCC deposit HB-96450); anticorpo murino 2H7 e quimérico 2H7(Patente U.S No. 5.677.180); humanizado 2H7 (ver, por exemplo, W004/056312;US20060024295); HUMAX-CD20™ anticorpos (Genmab, Dinamarca); os anticorposhumanos monoclonais apresentados em WO 2004/035607 (Teeling et al.); anticorpos AME-133Tm (Applied Molecular Evolution); anticorpo A20 ou variantes destes tais como anticorpoΑ20 quimérico ou humanizado (cA20, hA20, respectivamente) (US 2003/0219433,Imunomédicos); e anticorpos monoclonais L27, G28-2, 93-1 B3, B-C1 ou NU-B2 disponíveispela International Leukocyte Typing Workshop (Valentine et al., In: Leukocyte Typing Ill(McMichael, Ed., p. 440, Oxford University Press (1987)).

Exemplos de "medicamentos anti-reumáticos de modificadores da doença" ou"DMARDs" incluem hidroxicloroquina, sulfasalazina, metotrexato, leflunomida, etanercept,infliximab (mais metrotrexato oral e subcutâneo), azatioprina, D-penicilamina, Gold (oral),Gold (intramuscular), minociclina, ciclosporina, imunoadsorção de proteína A estafilococal,incluindo sais e derivados destes, etc.

"CTLA4" é expresso em linfócitos T ativados e é envolvidos em infra-regulação daresposta imune. Outros nomes para CTLA4 na literatura incluem antígeno 4 associado alinfócito T citotóxico, proteína 4 associada a linfócito T citotóxico, antígeno CD 152diferenciação celular, e protease serina de grânulo associado linfócito T 4 citotóxico.

Uma variedade de termos adicionais é definida ou de outra forma caracterizadaaqui.

DESCRIÇÃO DETALHADA

CD4 é uma glicoproteína superficial basicamente expressa nas células da linhagemde linfócito T, incluindo uma maioria dos timócitos e um subconjunto de células T periféricas.Baixos níveis de CD4 são também expressos por algumas células não linfóides, embora osignificado funcional de tal distribuição celular divergente seja desconhecido. Nas células Tmaduras, CD4 serve uma função de co-reconhecimento através de interação com moléculasClasse Il MHC expressas em células apresentando antígeno. Células T CD4+ constituibasicamente o subconjunto auxiliar que regula funções da célula TeB durante respostasdependentes de T às infecções virais, bacterianas, fúngicas e parasíticas.

Durante a patogênese de doenças autoimunes, em particular quando tolerância aauto antígenos rompe, células T CD4+ podem contribuir para respostas inflamatórias queresultam na destruição de junta e tecido. Estes processos são facilitados, por exemplo, pelorecrutamento de células inflamatórias da linhagem hematopoiética, produção de anticorpos,citocinas e mediadores inflamatórios, e pela ativação de células matadoras.

Células T CD4+ têm sido implicadas na patogênese de lupus. Por exemplo, célulasT CD4+ estão presentes em sítios de glomerulonefrite. Células T CD4+ de pacientes de SLEsão reportadas para ser hiper-responsivas a antígeno e resistentes a apoptose in vitro.Células T CD4+ específicas auto antígenos que podem suportar produção de auto-anticorpos por células B (células CD4+ efetora/memória que produzem IFN-γ) estãopresentes em pacientes de SLE. Além do mais, uma forte associação entre alelos Classe IlMHC e risco para SLE é observado.

Células T CD4+ têm sido similarmente implicadas na patogênese de MS. Porexemplo, células T CD4+ auxiliares são envolvidas na patogênese de MS e um modelo delaboratório correspondente, encefalomielite alérgica experimental (EAE)1 e animais delaboratório depletados de células T exibem um perda de capacidade de desenvolver EAE(USPN 4,695,459 to Steinman et al. intitulado "Method of treating autolmmuno diseases thatare mediated by Leu3/CD4 phenotype cells T", Traugott et al. (1983) "Multiple sclerosis:distribuition of T cell subsets witin active chronic lesions" Science 219:308-310, Arnason etal. (1962) "Role of the thymus in Immuno reaction in rats: Il Suppressive effect ofthymectomy at birth on reactions of delayed (cellular) hipersensitivity and the circulatingsmall lymphocite" J Exp Med 116:177-186, and Gonatas and Howard (1974) "Inhibition ofexperimental allergic encephalomyelitis in rats severely depleted of T cells" Science 186:839-841). Células T CD4+ e CD8+ são encontradas em lesões MS; ambas são conhecidas paraproduzir citocinas inflamatórias, embora sua contribuição relativa com patogênese não tenhasido determinada. Um aumento quatro vezes é observado na freqüência de células CD4+específicas de mielina no sangue de pacientes de MS. Acredita-se que diversosmedicamentos atualmente usados ou que basicamente serão usados para tratamento deMS funcionem, em parte, através da sua ação nas células T; por exemplo, Tysabri®(natalizumab, anticorpo alfa-4 integrina), CamPath® (alemtuzumab, CD52 anticorpo), edaclizumab (anticorpo IL-2Ra). Além do mais, um maior risco de MS é associado com alelosClasse II MHC (3,6 vezes) e, em um menor grau, alelos Classe I (2 vezes).

Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos de tratar lupus, incluindoSLE e nefrite lúpica, administrando uma combinação de um anticorpo CD4 não depletável eum outro composto usado clinica ou experimentalmente para tratar lupus. Um outro aspectoda invenção, fornece métodos de tratar nefrite lúpica, incluindo doença no estágiointermediário ao final, pela administração de um anticorpo CD4 não depletável que resultaem uma melhoria na função renal e/ou uma redução em proteinúria ou sedimento urinárioativo. Ainda um outro aspecto da invenção, fornece métodos de tratar MS pelaadministração de um anticorpo CD4 não depletável, opcionalmente em combinação com umoutro composto usado clinica ou experimentalmente para tratar MS. Ainda um outro aspectoda invenção, fornece métodos de tratar recipientes de transplante ou sujeitos com doençasautoimunes tais como artrite reumatóide, asma, psoríase, doença do intestino inflamatório(por exemplo, doença de Crohn e colite ulcerativa), e síndrome de Sjogren poradministração de um anticorpo CD4 não depletável, tipicamente em combinação um outrocomposto usado clinica ou experimentalmente para tratar doença autoimune.

ANTICORPOS CD4.

Inúmeros anticorpos CD4, tanto depletáveis quanto não depletáveis, foramdescritos. O uso de tais anticorpos para induzir tolerância a antígenos, incluindo autoantígenos, tem também sido reportado. Ver, por exemplo, USPN 4.695.459; USPN6.056.956 to Cobbold and Waldmann intitulado "Non-depleting anti-CD4 monoclonalantibodies and tolerance induction"; USPN 5.690.933 to Cobbold and Waldmann intitulado"Monoclonal antibodies for inducing tolerance"; publicação de pedido de patente europeu0240344 pela Cobbold et al. intitulado "Monoclonal antibodies and their use"; USPN6.136.310 pela Hanna et al. intitulado "Recombinant anti-CD4 antibodies for humanotherapy"; USPN 5.756.096 pela Newman et al. intitulado "Recombinant antibodies forhumano therapy"; USPN 5.750.105 pela Newman et al. intitulado "Recombinant antibodiesfor humano therapy"; USPN 4.381.295 pela Kung and Goldstein intitulado "Monoclonalantibodies to human helper

T cells and methods of preparing same"; Waldmann (1989) "Manipulation of T cellsresponses with monoclonal antibodies" Ann Rev Imunol 7:407-44; and Wofsy and Seaman(1987) "Reversal of advanced murine Iupus in NZB/NZW F1 mice by treatment withmonoclonal antibody to L3T4" J Imunol 138:3247-53. Em particular, um anticorpo CD4 nãodepletável e seu uso na indução de tolerância foi descrito na publicação do pedido depatente U.S. 2003/0108518 by Frewin et al. intitulado "TRX1 antibody and uses therefor" epublicação de pedido de patente U.S. 2003/0219403 by Frewin et al. intitulado"Compositions and methods of tolerizing a primata to um antigen", cada um dos quais estápor meio desta incorporado pela referência.

Anticorpos CD4 não depletáveis exemplares adequados para uso nos métodos,incluem os anticorpos TRX1 descritos na publicação do pedido de patente U.S.2003/0108518 por Frewin et al. intitulado "TRX1 antibody and uses therefor" e publicação depedido de patente U.S. 2003/0219403 por Frewin et al. intitulado "Compositions andmethods of tolerizing a primata to an antegen." Estes anticorpos são anticorposhumanizados incluindo regiões constantes modificadas de um anticorpo humano, de regiõesde estrutura de cadeia leve e pesada de um anticorpo humano, e cadeia leve e pesadaCDRs derivados de um anticorpo monoclonal de camundongo.

Assim, em uma classe de modalidades, o anticorpo CD4 não depletável é umanticorpo TRX1 como mostrado em qualquer de uma das figuras 1-4. O anticorpo pode teruma seqüência de aminoácidos de cadeia leve apresentada na SEQ ID NO: 3 e umaseqüência de aminoácidos de cadeia pesada apresentada na SEQ ID NO:6, uma seqüênciade aminoácidos de cadeia leve apresentada na SEQ ID NO:9 e uma seqüência deaminoácidos de cadeia pesada apresentada na SEQ ID NO: 12, uma seqüência deaminoácidos de cadeia leve apresentada na SEQ ID NO: 15 e uma seqüência deaminoácidos de cadeia pesada apresentada na SEQ ID NO: 18, ou uma seqüência deaminoácidos de cadeia leve apresentada na SEQ ID NO:21 e uma seqüência deaminoácidos de cadeia pesada apresentada na SEQ ID NO:24. Em uma classe demodalidades relacionadas, o anticorpo compreende um CD4 ligando o fragmento de umanticorpo que compreende uma seqüência de aminoácidos de cadeia leve apresentada naSEQ ID NO:3 e uma seqüência de aminoácidos de cadeia pesada apresentada na SEQ IDNO:6, uma seqüência de aminoácidos de cadeia leve apresentada na SEQ ID NO:9 e umaseqüência de aminoácidos de cadeia pesada apresentada na SEQ ID NO: 12, umaseqüência de aminoácidos de cadeia leve apresentada na SEQ ID NO: 15 e uma seqüênciade aminoácidos de cadeia pesada apresentada na SEQ ID NO: 18, ou uma seqüência deaminoácidos de cadeia leve apresentada na SEQ ID NO:21 e uma seqüência deaminoácidos de cadeia pesada apresentada na SEQ ID NO:24.

Anticorpos compreendendo um ou mais CDRs de um anticorpo TRX1 são tambémusados nos métodos. Assim, em uma classe de modalidades, o anticorpo CD4 nãodepletável compreende CDR1 (SEQ ID NO:25), CDR2 (SEQ ID NO:26), ou preferivelmenteCDR3 (SEQ ID NO:27) de cadeia leve apresentada na figura 1A. O anticorpo opcionalmenteinclui CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve apresentada na figura 1A (SEQ ID NOs: 25-27).

Similarmente, em uma classe de modalidades, o anticorpo compreende CDR1 (SEQ IDNO:28), CDR2 (SEQ ID NO:29), ou preferivelmente CDR3 (SEQ ID N0:30) de cadeiapesada mostrada na figura 1D. O anticorpo opcionalmente inclui CDR1, CDR2 e CDR3 decadeia pesada mostrada na figura 1D (SEQ ID NOs: 28-30). Em uma classe demodalidades, o anticorpo compreende CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve apresentada nafigura 1A e CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada mostrada na figura 1D (SEQ ID NOs:25-30). O anticorpo opcionalmente também inclui FR1, FR2, e/ou FR3 de cadeia leveapresentada na figura 1A, figura 2A, a figura 3A, ou figura 4A e/ou FR1, FR2, FR3, e/ou FR4de cadeia pesada mostrada na figura 1 D, Figura 2D, Figura 3D, ou Figura 4D.

Outros anticorpos exemplares incluem, mas sem limitações, anticorpos que seligam ao mesmo epítopo como um anticorpo TRX1 (por exemplo, como um anticorpomostrado em qualquer de uma das figuras 1-4).

Onde o sujeito é um humano, o anticorpo é preferivelmente um anticorpohumanizado ou humano. Fica evidente que para tratamento de um mamífero não humano, oanticorpo é opcionalmente adaptado para o uso naquele animal, por exemplo, porincorporação de seqüências de estrutura e região constante de uma imunoglobulina de ummamífero da espécie apropriada. O anticorpo é opcionalmente um anticorpo monoclonal, umanticorpo intacto, um fragmento de anticorpo, e/ou um anticorpo nativo.

O anticorpo opcionalmente tem uma função efetora reduzida, por exemplo,comparado a IgGI humano, de maneira tal que sua capacidade de induzir ativaçãocomplementar/ou citotoxicidade dependente de anticorpo mediada por célula é aumentada.Por exemplo, o anticorpo pode ter ligação reduzida (ou nenhuma) ao receptor Fc.Similarmente, o anticorpo pode ter uma porção Fc aglicosilada. O anticorpo opcionalmentepode ser um anticorpo variante anti-CD4 tendo a capacidade de se ligar a FcRN.TRATAMENTO DE LUPUS

Em um aspecto, a invenção fornece métodos de tratar lupus em um sujeitomamífero, por exemplo, um sujeito humano, administrando uma quantidadeterapeuticamente efetiva de um anticorpo anti-CD4 não depletável e/ou um segundo agente.

O lupus para o qual o sujeito é tratado é tipicamente lupus eritematoso sistêmico (SLE),lupus eritematoso cutâneo (CLE), ou nefrite lúpica, mas pode ser uma outra forma de lupustais como extra-renal, cerebrite, pediátrico, não renal, discóide, ou alopecia. O lupus a sertratado pode ser uma doença de estágio inicial, intermediário ou avançado quando otratamento é iniciado. Em modalidades em que nefrite lúpica é tratada, a nefrite lúpica podeser qualquer uma das classes I- VI. Por exemplo, o lupus a ser tratado pode ser nefritelúpica mesangioproliferativa (classe II) ou nefrite lúpica de membrana (classe V).

Tipicamente o lupus é nefrite lúpica proliferativa (classe III ou classe IV), tratado com a metade obter uma redução em proteinúria, uma redução no sedimento urinário ativo, enormalização ou estabilização da função renal. Por exemplo, proteinúria (medida da maneiraestabelecida na tecnologia, por exemplo, em medições de proteína na urina por 24 horas,usando um bastão de inversão ou outra análise de rotina, por exemplo, da maneira descritano Exemplo 1 aqui) pode ser reduzida em pelo menos 25 % ou em pelo menos 50 %, oumesmo em pelo menos 75 % ou em pelo menos 90 %, ou a proteinúria pode ser reduzidapara menos que 1 g por dia ou menos que 500 mg por dia. Como um outro exemplo, a razãode proteína para creatinina na urina do sujeito pode ser reduzida em pelo menos 25 % ouem pelo menos 50 %, ou a razão pode ser reduzida para menos que 1 ou menos que 0,5.

Similarmente, o sedimento urinário ativo (monitorado da maneira estabelecida na tecnologia,por exemplo, por observação microscópica) pode ser reduzido em pelo menos 25 %, empelo menos 50 %, em pelo menos 75 %, ou em pelo menos 90 %, ou apenas o sedimentourinário inativo (da maneira evidenciada por menos que 10 células vermelhas dosangue/campo de alta potência e ausência de cilindros de células vermelhas, epreferivelmente por menos que 5 célula de sangue vermelhas/campo de alta potência) podepermanecer após o início do tratamento. Em um aspecto, quando nefrite lúpica é tratada, osujeito apresenta uma redução na proteinúria e/ou uma redução no sedimento urinário ativoapós o início do tratamento com a combinação. Por exemplo, a concentração de proteína naurina do sujeito pode ser reduzida para menos que 75 %, menos que 50 %, menos que 25%, ou menos que 10 % da concentração na urina do sujeito antes do início do tratamentocom a combinação, ou para menos que 1 g por dia ou menos que 500 mg por dia, e/ousedimento urinário ativo pode ser reduzido em pelo menos 25 %, em pelo menos 50 %, empelo menos 75 %, ou em pelo menos 90 %, ou apenas o sedimento urinário inativo podepermanecer após o início do tratamento (por exemplo, menos que 10 e preferivelmentemenos que 5 células vermelhas do sangue/campo de alta potência).Em uma classe geral de modalidades, nos métodos uma quantidadeterapeuticamente efetiva de uma combinação de um anticorpo CD4 não depletável e pelomenos um segundo composto é administrado ao sujeito para tratar lupus. Os anticorposCD4 não depletáveis podem ser qualquer daqueles aqui descritos. O segundo composto étipicamente um que é usado para tratar lupus, por exemplo, um padrão de cuidado outratamento experimental. Os segundos compostos exemplares incluem, mas sem limitações,um agente citotóxico; um agente imunossupressor; um medicamento antimalária tais como,por exemplo, hidroxicloroquina, cloroquina ou quinacrina; um agente quimioterpêutico; umantagonista ou anticorpo de citicina; um fator do crescimento; um hormônio (por exemplo,tratamento de reposição hormonal); terapia anti-hormonal; um antagonista ou anticorpo deintegrina, por exemplo, um anticorpo ou antagonista a4-integrina; um antagonista domarcador superficial da célula B; um anticorpo para um marcador superficial da célula B (porexemplo, um anticorpo CD20, por exemplo, Rituximab, também conhecido como Rituxan®);um anticorpo ou agente de bloqueio CD5, CD28, ou CD40; um corticosteróide, por exemplo,metilprednisolona, prednisona tais como prednisona de baixa dose, dexametasona, ouglicorticóide, por exemplo, por meio de injeção na junta, incluindo terapia de corticosteróidesistêmica; um DMARD; ou uma combinação de qualquer dos anteriores, etc. Ver tambémpublicação de pedido de patentes U.S. 2006/0024295 e 2003/0219403.

Em uma classe de modalidades, o segundo composto é selecionado, por exemplo,de ciclofosfamida, micofenolato mofetil, CTLA4-lg, e BR3-Fc. Ciclofosfamida é tambémconhecida pelo marca registrada Cytoxan®. Micofenolato mofetil é também chamadoCelICept®, MMF, ou 2-morfolinoetil (E)-6-(1,3-diidro-4-hidróxi-6-metóxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofuranil)-4-metil-4-hexenoato. CTLA4-lg é um domínio extracelular de antígeno 4associado a linfócito T citotóxico humano (CTLA-4) ligado a uma porção Fc modificada deum imunoglobulína humana, por exemplo, abatacept (Orencia® pela Bristol-Myers Squibb)ou RG2077 pela RepIiGen. Um anticorpo a4-integrina exemplar é natalizumab (Tysabri®).BR3-Fc, um antagonista solúvel de BAFF, é um proteína de fusão que inclui o domínioextracelular de BR3 humano (um receptor BAFF encontrado nas células B) e IgGI Fchumano (ver, por exemplo, Vugmeyster et al. (2006) American Journal of Pathology168:476-489 and Kayagaki et al. (2002) Immunity 10:515-524). Um terceiro, quarto, etc.composto é opcionalmente incluído na combinação; apenas um exemplo, um corticosteróidetais como metilprednisolona e/ou prednisona pode ser administrado junto com o anticorpoCD4 e ciclofosfamida.

Em uma modalidade, o sujeito nunca foi previamente tratado com medicamento(s),tais como agente(s) imunossupressor(s), para tratar o lupus e/ou nunca foi previamentetratado com um anticorpo anti-CD4. Em uma outra modalidade, o sujeito foi previamentetratado com medicamento(s) para tratar o lupus e/ou foi previamente tratado com umanticorpo anti-CD4. Em uma modalidade adicional, o sujeito não tem artrite reumatóide.Ainda em uma modalidade adicional, o sujeito não tem esclerose múltipla. Ainda em umaoutra modalidade, o sujeito não tem uma doença autoimune sem ser lupus. Uma "doençaautoimune" aqui é uma doença ou desordem que surge dos próprios tecidos ou órgãos doindivíduo, e são direcionados para eles, ou um co-segregado ou manifestação desta oucondição resultante desta. Em uma modalidade, ela refere-se a uma condição que resulta,ou é agravada, pela produção de anticorpos por células B que são reativas com tecidos eantígenos corporais normais. Em outras modalidades, a doença autoimune é uma queenvolve secreção de um auto-anticorpo que é específica para um epítopo de umautoantígeno (por exemplo, um antígeno nuclear).

Em uma modalidade, antes do início do tratamento com a combinação, o sujeitoapresenta proteinúria, cuja proteinúria é melhorada pelo tratamento. Por exemplo, antes doinício do tratamento, o sujeito pode apresentar proteinúria acima de 500 mg por dia, acimade 1.000 mg por dia, acima de 2.000 mg por dia, ou acima de 3.500 mg por dia; após oinício do tratamento, a proteinúria pode ser reduzida em pelo menos 25 % ou em pelomenos 50 %, ou mesmo em pelo menos 75 % ou em pelo menos 90 %, ou a proteinúriapode ser reduzida para menos que 1 g por dia ou menos que 500 mg por dia, por exemplo,determinada por medições por 24 horas de proteína na urina.

Uma diminuição na razão de proteína para creatinina pode ser similarmentemonitorada. Níveis de proteína e creatinina na urina podem ser medidos da maneiraestabelecida na tecnologia, por exemplo, por determinação de razão de proteína da urinaspot para creatinina, por exemplo, de uma amostra de urina aleatória. Em uma modalidade,antes do início do tratamento com a combinação, o sujeito apresenta uma razão de proteínapara creatinina maior que 0,5, maior que 1 ou maior que 2; após o início do tratamento, arazão de proteína para creatinina pode ser reduzida, por exemplo, para menos que 1 (porexemplo, para um resposta parcial ao tratamento) ou para menos que 0,5 (por exemplo,para um resposta total). Após o início de tratamento, a razão de proteína para creatininapode ser reduzida em pelo menos 25 % ou em pelo menos 50 % comparado ao valor dopré-tratamento. Em uma modalidade, antes do início do tratamento com a combinação, osujeito apresenta proteinúria de faixa nefrótica, com uma razão de proteína para creatininamaior que 3; após o início do tratamento, a razão de proteína para creatinina é reduzidapara menos que 3, ou opcionalmente em pelo menos 25 % ou em pelo menos 50 % ou paramenos que 2 ou menos que 1.

Resposta a tratamento de lupus, incluindo nefrite lúpica, com a combinação podetambém ser avaliada, por exemplo, monitorando níveis do complemento, níveis de auto-anticorpo, e/ou diversas atividades da doença. Por exemplo, normalização de níveis docomplemento (por exemplo, C3, C4, e CH50) pode ser indicativo de tratamento bemsucedido. Similarmente, após o início do tratamento, níveis de auto-anticorpos tais comoanticorpos de DNA de anti-fita dupla, ANA, e anti-C1q podem ser reduzidos, por exemplo,em pelo menos 25 %, em pelo menos 50 %, ou em pelo menos 75 %. Melhoria na biópsiarenal pode também ser observado como indicativo de tratamento bem sucedido.

Opcionalmente, antes do início do tratamento com a combinação, o sujeitoapresenta síndrome nefrótica. Diagnóstico de síndrome nefrótica pode ser realizado damaneira estabelecida na tecnologia. Alguns sinais, sintomas, ou outros indicadores quepodem ser usados para diagnosticar síndrome nefrótica incluem proteína da urina de 24horas maior que 3,5 g/dia, razão de proteína para creatinina maior que 3, hipoalbuminemia(baixo nível de albumina no sangue), edema (intumescimento), especialmente em torno dosolhos, pés, e mãos, e/ou hipercolesterolemia (alto nível de colesterol no sangue). A invençãonão está limitada a estes sinais, sintomas, ou outros indicadores de síndrome nefrótica. Asíndrome nefrótica é opcionalmente atenuada por o tratamento com a combinação. Porexemplo, o sujeito opcionalmente exibe uma redução em proteínúria para menos que 3,5g/dia após o início do tratamento, por exemplo, para menos que 3 g/dia, menos que 2 g/dia,menos que 1 g/dia, ou mesmo menos que 0,5 g/dia, e/ou uma redução na razão de proteínapara creatinina para menos que 3 após o início do tratamento, por exemplo, para menos que2, menos que 1, ou mesmo menos que 0,5.

Tratamento do sujeito com a combinação pode ter benefícios consideráveis para osujeito, por exemplo, na redução dos efeitos colaterais indesejáveis. Por exemplo, aquantidade do segundo composto (por exemplo, ciclofosfamida) exigida para tratamento emcombinação com o anticorpo CD4 não depletável pode ser consideravelmente menos que aquantidade exigida para atenuar sintomas através do tratamento com o segundo compostosozinho. Por exemplo, ciclofosfamida pode produzir sérios efeitos colaterais; uso de menosdo medicamento para obter tratamento, portanto, é altamente desejável.

Em um aspecto, os métodos incluem tratar o sujeito com o anticorpo CD4 nãodepletável e o segundo composto para reduzir sintomas, e em seguida continuar otratamento do sujeito com o anticorpo CD4 não depletável (não em combinação com osegundo composto) para manter a remissão. Por exemplo, o sujeito pode ser tratado comuma combinação do anticorpo CD4 não depletável e ciclofosfamida, micofenolato mofetil, ouCTLA4-lg para reduzir sintomas, e em seguida tratado com o anticorpo CD4 não depletávelsozinho (isto é, não em combinação com o ciclofosfamida, micofenolato mofetil, ou CTLA4-Ig) para manter a remissão. Tais métodos podem também reduzir efeitos colaterais,minimizando exposição do sujeito ao segundo composto. Em uma outra modalidade, osujeito é tratado com o anticorpo CD4 não depletável e o segundo composto para reduzirsintomas, e em seguida tratamento do sujeito com o segundo composto ou um ou maisoutros compostos, mas sem ser o anticorpo CD4 não depletável, continua para manter aremissão.

Uma outra classe geral de modalidades também fornece métodos de tratar nefritelúpica em um sujeito mamífero, por exemplo, um humano. Nos métodos, uma quantidadete rape uti ca mente efetiva de um anticorpo CD4 não depletável é administrada ao sujeito.

Após o início do tratamento com o anticorpo, o sujeito apresenta uma melhora na funçãorenal, uma redução na proteinúria, e/ou uma redução no sedimento urinário ativo,comparado ao(s) nível(s) de proteinúria e/ou sedimento urinário ativo apresentado pelosujeito antes do início do tratamento. Por exemplo, proteinúria pode ser reduzida em pelomenos 25 %, em pelo menos 50 %, em pelo menos 75 %, ou em pelo menos 90 %, ou aproteinúria pode ser reduzida para menos que 1 g por dia ou menos que 500 mg por dia;razão de proteína para creatinina da urina pode ser reduzida em pelo menos 25 % ou empelo menos 50 %, ou a razão pode ser reduzida para menos que 1 ou menos que 0,5; e/ousedimento urinário ativo pode ser reduzido em pelo menos 25 %, em pelo menos 50 %, empelo menos 75 %, ou em pelo menos 90 %, ou apenas o sedimento urinário inativo podepermanecer após o início do tratamento. O anticorpo CD4 não depletável pode ser qualquerdaqueles aqui descritos.

Em uma modalidade, o sujeito nunca foi previamente tratado com medicamento(s)para tratar a nefrite lúpica e/ou nunca foi previamente tratado com um anticorpo anti-CD4.

Em uma outra modalidade, o sujeito foi previamente tratado com medicamento(s) para tratara nefrite lúpica e/ou foi previamente tratado com um anticorpo anti-CD4. Em uma outramodalidade, o anticorpo anti-CD4 não depletável da invenção é o apenas medicamentoadministrado ao sujeito para tratar a nefrite lúpica. Em uma outra modalidade, o anticorpoCD4 não depletável da invenção é um dos medicamentos usados para tratar a nefrite lúpica.

Em um modalidade adicional, o sujeito não tem artrite reumatóide. Ainda em umamodalidade adicional, o sujeito não tem esclerose múltipla. Ainda em uma outra modalidade,o sujeito não tem uma doença autoimune sem ser Iupus e/ou nefrite lúpica.

Em uma classe de modalidades, os métodos incluem administração de pelo menosum segundo composto tal como qualquer daqueles aqui descritos em combinação com oanticorpo CD4 não depletável. Por exemplo, ciclofosfamida, micofenolato mofetil, CTLA4-lg,ou um anticorpo a4-integrina pode ser administrado ao sujeito em combinação com oanticorpo CD4 não depletável. Um terceiro, quarto, etc. composto é opcionalmente incluídona combinação; por exemplo, um corticosteróide tais como metilprednisolona e/ouprednisona pode ser administrado junto com o anticorpo CD4 não depletável eciclofosfamida.

Em uma modalidade, antes do início do tratamento com o anticorpo CD4 nãodepletável, o sujeito apresenta proteinúria, cuja proteinúria é reduzida após o início dotratamento com o anticorpo CD4 não depletável. Por exemplo, antes do início do tratamento,o sujeito pode apresentar proteinúria maior que 500 mg por dia, maior que 1.000 mg por dia,maior que 2.000 mg por dia, ou maior que 3.500 mg por dia; após o início do tratamento, aproteinúria pode ser reduzida em pelo menos 25 %, em pelo menos 50 %, em pelo menos75 %, ou em pelo menos 90 %, ou a proteinúria pode ser reduzida para menos que 1 g pordia ou menos que 500 mg por dia. Uma diminuição na razão de proteína para creatininapode ser similarmente monitorada. Em uma modalidade, antes do início do tratamento, osujeito apresenta uma razão de proteína para creatinina maior que 0,5, maior que 1, oumaior que 2; após o início do tratamento, a razão de proteína para creatinina pode serreduzida em pelo menos 25 % ou em pelo menos 50 %, ou para menos que 1 ou paramenos que 0,5. Em uma modalidade, antes do início do tratamento com a combinação, osujeito apresenta proteinúria de faixa nefrótica, com uma razão de proteína para creatininamaior que 3; após o início do tratamento, a razão de proteína para creatinina é reduzidapara menos que 3, ou opcionalmente em pelo menos 25 % ou em pelo menos 50 % ou paramenos que 2 ou menos que 1. Opcionalmente, antes do início do tratamento, o sujeitoapresenta síndrome nefrótica. A síndrome nefrótica é opcionalmente atenuada pelotratamento. Por exemplo, o sujeito opcionalmente exibe uma redução na proteinúria paramenos que 3,5 g/dia após o início do tratamento, por exemplo, para menos que 3 g/dia,menos que 2 g/dia, menos que 1 g/dia, ou mesmo menos que 1 g/dia ou menos que 0,5 g/dia.

TRATAMENTO DE ESCLEROSE MÚLTIPLA

Esclerose múltipla (MS) é uma doença degenerativa inflamatória e desmielinizantehumano sistema nervoso central do (CNS). Ela é uma doença disseminada em todo omundo que afeta aproximadamente 300,000 pessoas nos Estados Unidos; ela é umadoença de adultos jovens, com 70 %-80 % tendo o início de ação entre 20 e 40 anos deidade (Anderson et al. Ann Neurology 31(3): 333-6 (1992); Noonan et al. Neurology 58: 136-8 (2002)). MS é uma desordem heterogênea baseada em curso clínico, avaliação devarredura de imageamento por ressonância magnética (MRI), e material de análise depatologia de biópsia e autópsia (Lucchinetti et al. Ann Neurol 47: 707-17 (2000)). Umadoença se manifesta em um grande número de possíveis combinações de déficits, incluindomedula espinhal, haste do cérebro, nervo craniano, cerebelar, cerebral e síndromescognitivas. Incapacidade progressiva é o destino da maioria dos pacientes com MS,especialmente quando está incluída uma perspectiva de 25 anos. Metade dos pacientes deMS exige uma bengala para caminhar dentro de 15 anos do início de ação da doença. MS éuma causa principal de incapacidade neurológica em adultos jovens e de meia idade e, atéa década passada, não teve nenhum tratamento benéfico conhecido. MS é difícil dediagnosticar por causa das observações clínicas não específicas, que levaram aodesenvolvimento de critérios de diagnóstico altamente estruturados que incluem diversos deavanços tecnológicos, consistindo de varreduras de MRI1 potenciais evocados, e estudosfluido cerebroespinhal (CSF). Todos critérios de diagnóstico baseiam-se em nos princípiosgerais de lesões dispersas na matéria branca central ocorrendo em diferentes momentos enão explicados por outras etiologias tais como infecção, desordem vascular, ou uma outradesordem autoimune (McDonald et al. Ann Neurol 50: 121-7 (2001)). MS tem quatropadrões de doença: MS recorrente-remitente (RRMS; 80 %-85 % de casos no início deação), MS progressivo primário (PPMS; 10 %-15 % no início de ação), MS recorrenteprogressivo (PRMS; 5 % no início de ação); e MS progressivo secundário (SPMS)(Kremenchutzky et al. Brain 122 (Pt 10): 1941-50 (1999); Confavreux et al. N Engl J Med343(20): 1430-8 (2000)). Uma estimativa de 50 % de pacientes com RRMS desenvolveráSPMS em 10 anos, e até 90 % de pacientes com RRMS eventualmente desenvolverá SPMS(Weinshenker et al. Brain 112 (Pt 1): 133-46 (1989)).

A invenção inclui métodos de tratar esclerose múltipla em um sujeito mamífero, porexemplo, um sujeito humano. Em um aspecto, os métodos incluem administrar ao sujeitouma quantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo CD4 não depletável. O anticorpoCD4 não depletável pode ser qualquer desses aqui descritos. Em um outro aspecto, osmétodos incluem administrar ao sujeito uma quantidade terapeuticamente efetiva de umacombinação de um anticorpo CD4 não depletável e pelo menos um segundo composto.Novamente, o anticorpo CD4 não depletável pode ser qualquer desses aqui descritos.

O segundo composto é tipicamente um que é usado para tratar MS, por exemplo,um padrão de tratamento cuidadoso ou experimental. Segundos compostos exemplaresincluem, mas sem limitações, um agente citotóxico; um agente imunossupressor (porexemplo, ciclofosfamida); um antagonista do marcador superficial da célula B; um anticorpopara um marcador superficial da célula B; um anticorpo CD20, por exemplo, Rituximab1 verUS 20060051345); um anticorpo ou agente de bloqueio CD5, CD28, ou CD40; umcorticosteróide (por exemplo, prednisona), CTLA4-lg, um anticorpo ou antagonista aA-integrina tal como natalizumab (Tysabri®), micofenolato mofetil, uma estatina, um anticorpoou agente de bloqueio LFA-1 ou CD-11a (ver publicação de pedido de patente U.S.20050281817 por Jardieu et al. intitulado "Method for treating multiple sclerosis"), umanticorpo interleucina-12, um beta interferon (por exemplo, um interferon /?-1a tais comoAvonex® ou Rebif®, ou um interferon /?-1b tal como Betaseron®), acetato de glatirâmero(Copaxone®), um anticorpo CD52 tal como alemtuzuman (CamPath®), um anticorpo receptorde interleucina tal como daclizumab (Zenapax®, um anticorpo para a subunidade alfa doreceptor de interleucina-2), etc.

Em uma classe de modalidades, os métodos incluem tratar o sujeito com oanticorpo CD4 não depletável e o segundo composto para reduzir sintomas, e em seguidacontinuar o tratamento do sujeito com o anticorpo CD4 não depletável (não em combinaçãocom o segundo composto) para manter a remissão. Por exemplo, o sujeito pode ser tratadocom uma combinação do anticorpo CD4 não depletável e acetato de glatirâmero, e emseguida tratado com o anticorpo CD4 não depletável sozinho para manter a remissão. Emuma outra modalidade, o sujeito é tratado com o anticorpo CD4 não depletável e o segundocomposto para reduzir sintomas, e em seguida o tratamento continua com o segundocomposto, ou um ou mais compostos tipicamente usados para tratar MS, sem ser oanticorpo CD4 não depletável.

Em uma modalidade, o sujeito nunca foi previamente tratado com medicamento(s),tais como agente imunossupressor(s), para tratar a esclerose múltipla e/ou nunca foipreviamente tratado com um anticorpo anti-CD4. Em uma outra modalidade, o sujeito foipreviamente tratado com medicamento(s) para tratar a esclerose múltipla e/ou foipreviamente tratado com um anticorpo anti-CD4.

Tipicamente, o sujeito é elegível para tratamento para esclerose múltipla, isto é, osujeito é um sujeito MS. Com os propósitos aqui, tal sujeito MS é um que estáapresentando, apresentou ou que provavelmente apresentará um ou mais sinais, sintomasou outros indicadores de esclerose múltipla; foi diagnosticado com esclerose múltipla, querpor exemplo, recém-diagnosticado (com MS "novo início de ação"), previamentediagnosticado com uma nova recaída quer exacerbação, previamente diagnosticado eremissão, etc.; e/ou corre o risco de desenvolver esclerose múltipla. Alguém que sofre outenha o risco de sofrer de esclerose múltipla, pode opcionalmente ser identificado como umque foi selecionado para níveis elevados de células B CD20-positivas no soro, fluidocerebroespinhal (CSF) e/ou lesão(s) MS e/ou é selecionado para usar um ensaio paradetectar auto-anticorpos, avaliado qualitativamente, e preferível mente quantitativamente.

Tais auto-anticorpos exemplares associados com esclerose múltipla incluem proteína básicaanti mielina (MBP), anti glicoproteína oligodendrocítica da mielina (MOG), anticorpos antigangliosídeo e/ou de anti neurofilamento. Tais auto-anticorpos podem ser detectados nosoro do sujeito, fluido cerebroespinhal (CSF) e/ou lesão de MS. Por "elevado" nível(s) deauto-anticorpo ou célula B aqui significa nível(s) de tais auto-anticorpos ou células B queexcedem significativamente o(s) nível(s) em um individual sem MS.

O MS a ser tratado aqui, inclui esclerose múltipla progressiva primária (PPMS),esclerose múltipla recorrente-remitente (RRMS), esclerose múltipla progressiva secundária(SPMS), e esclerose múltipla recorrente progressiva (PRMS). O MS pode ser uma doençade estágio inicial, intermediário ou avançado quando o tratamento é iniciado. A expressão"quantidade terapeuticamente efetiva" com referência ao tratamento de MS refere-se a umaquantidade do anticorpo (ou combinação do anticorpo e pelo menos o segundo composto)que é efetiva para prevenir, aliviar ou tratar a esclerose múltipla. Uma quantidade efetivacomo essa geralmente resultará em uma melhoria nos sinais, sintomas ou outrosindicadores de MS, tais como redução na taxa de recaída, prevenção da incapacidade,redução do número e/ou volume de lesões de MRI lesões cerebrais, melhoria teste decaminhada cronometrada de 25 pés, extensão do tempo da progressão da doença (porexemplo, usando Expanded Disability Status Scale, EDSS), etc. Em um aspecto,demielinização é diminuída no tratado sujeito.

"Esclerose múltipla progressiva primária" ou "PPMS" é caracterizada por umaprogressão gradual da doença a partir de seu início de ação sem recaídas sobrepostas eremissões em todos. Pode haver períodos de um nivelamento da atividade da doença epode haver dias ou semanas boas ou ruins. PPMS difere de RRMS e SPMS em cujo iníciode ação é tipicamente nos últimos trinta ou primeiros quarenta, homens têm a mesmaprobabilidade que as mulheres de desenvolvê-lo, e a atividade da doença inicial éfreqüentemente na medula espinhal e não no cérebro. PPMS freqüentemente migra nocérebro, mas é menos provável que danifique as áreas cerebrais do que RRMS ou SPMS;por exemplo, pessoas com PPMS são menos prováveis de desenvolver problemascognitivos. PPMS é o subtipo de MS que é menos provável de mostrar lesões inflamatórias(melhor gadolínio) nas varreduras de MRI. A forma primária progressiva da doença afetaentre 10 e 15 % de todas as pessoas com esclerose múltipla. PPMS pode ser definida deacordo com os critérios em McDonald et al. Ann Neurol 50: 121-7 (2001). O sujeito comPPMS tratado aqui é geralmente um com diagnóstico de PPMS provável ou definitivo.

"Esclerose múltipla recorrente-remitente" ou "RRMS" é caracterizada por recaídas(também conhecidas como exacerbações) em cujo tempo novos sintomas podem aparecere os antigos ressurgirem ou piorar. As recaídas são seguidas por períodos de remissão,durante tempo em que a pessoa se recupera totalmente ou de forma parcial do déficitadquirido durante a recaída. Recaídas podem durar por dias, semanas ou meses e arecuperação pode ser lenta e gradual ou quase instantaneamente. A grande maioria depessoas apresentando MS é primeiramente diagnosticada com RRMS. Isto é tipicamentequando elas estão nos seus vinte ou trinta anos, embora diagnóstico muito mais cedo outardio seja conhecidos. O dobro das mulheres apresenta este subtipo de MS em relação aoshomens. Durante as recaídas, mielina, uma bainha de isolamento protetor em torno dasfibras nervosas (neurônios) nas regiões de matéria branca do sistema nervoso central(CNS), pode ser danificada em uma resposta inflamatória pelo próprio sistema imune docorpo. Isto causa uma ampla variedade de sintomas neurológicos que variamconsideravelmente dependendo quais áreas do CNS são danificados. Imediatamente apósuma recaída, a resposta inflamatória morre e um tipo especial de célula glial no CNS(chamado um oligodendrócito) responsável por um processo de remielinação por meio doqual a bainha de mielina em torno do axon pode ser reparada. Esta é a remielinação quepode ser responsável pela remissão. Aproximadamente 50 % dos pacientes com RRMSconvertem em SPMS nos 10 anos do início de ação da doença. Após 30 anos, este valorsobe para 90 %. A qualquer momento, a forma recorrente-remítente da doença chega emtorno de 55 % de todas as pessoas com MS.

"Esclerose múltipla progressiva secundária" ou "SPMS" é caracterizada por umaprogressão equilibrada de danos neurológicos clínicos com ou sem recaídas sobrepostas eremissões e platô menores. Pessoas que desenvolvem SPMS terão previamente passadopor um período de RRMS que pode ter durado qualquer coisa de dois a quarenta anos oumais. Qualquer recaída e remissão sobreposta que existam tende seguir com o tempo. Apartir do início de ação da fase progressiva secundária da doença, a incapacidade começa aavançar muito mais rápido do que seria durante RRMS1 embora a progressão possa serainda bastante lento em alguns indivíduos. Após 10 anos, 50 % das pessoas com RRMSterão desenvolvido SPMS. Perto de 25 a 30 anos, este valor terá aumentado para 90 %.SPMS tende a ser associado com menores níveis de formação de lesão inflamatória do queem RRMS mas a carga total da doença continua a progredir. A qualquer momento, SPMSchega a cerca de 30 % de todas as pessoas com esclerose múltipla.

"Esclerose múltipla recorrente progressiva" refere-se a "PRMS" é caracterizada poruma progressão de danos neurológicos clínicos equilibrados com recaídas sobrepostas eremissões. Existe recuperação significativa imediatamente após uma recaída, mas entrerecaídas existe uma piora gradual de sintomas. PRMS afeta em torno de 5 % de todas aspessoas com esclerose múltipla. Alguns neurologistas acreditam que PRMS seja umavariante de PPMS.

TRATAMENTO DE OUTRAS CONDIÇÕES

Anticorpos CD4 não depletáveis, incluindo combinações de anticorpos CD4 nãodepletáveis e um ou mais outros compostos, são também usados para tratar desordens econdições sem ser Iupus ou esclerose múltipla, por exemplo, condições patológicas para asquais células T CD4+ contribuem. Assim, um aspecto da invenção fornece métodos de trataruma condição em um sujeito mamífero, por exemplo, um sujeito humano. Métodos incluemadministrar ao sujeito uma quantidade terapeuticamente efetiva de uma combinação de umanticorpo CD4 não depletável e pelo menos um segundo composto. Em uma modalidade, osujeito é um recipiente de transplante de tecido, e a condição a ser tratada é rejeição atransplante ou doença do enxerto versus hospedeira. Outras condições que podem sertratadas com a combinação incluem, mas sem limitações, desordens autoimune ou doençastais como artrite reumatóide, asma, psoríase, doença do intestino inflamatório (por exemplo,doença de Crohn ou colite ulcerativa) e síndrome de Sjogren.

O anticorpo CD4 não depletável pode ser qualquer desses aqui descritos. Osegundo composto é opcionalmente um que é usado para tratar a condição, por exemplo,um padrão de tratamento cuidadoso ou experimental. Segundos compostos exemplaresincluem, mas sem limitações, um agente citotóxico; um agente imunossupressor (porexemplo, ciclofosfamida); um antagonista do marcador superficial da célula B; um anticorpopara um marcador superficial da célula B; um anticorpo CD20, por exemplo, Rituximab, verUS 20060051345); um anticorpo ou agente de bloqueio CD5, CD28, ou CD40; umcorticosteróide (por exemplo, prednisona), CTLA4-lg, um anticorpo ou antagonista aA-integrina tal como natalizumab (Tysabri®), micofenolato mofetil, uma estatina, um anticorpoou agente de bloqueio LFA-1 ou CD-11a (ver publicação de pedido de patente U.S.20050281817 por Jardieu et ai. intitulado "Method for treating multiple sclerosis"), umanticorpo interleucina-12, um beta interferon (por exemplo, um interferon /Ma tais comoAvonex® ou Rebif®, ou um interferon /?-lb tal como Betaseron®), acetato de glatirâmero(Copaxone®), um anticorpo CD52 tais como alemtuzuman (CamPath®), um anticorporeceptor de interleucina tal como daclizumab (Zenapax®, um anticorpo para a subunidadealfa do receptor de interleucina-2), etc. Segundos compostos exemplares adicionais sãoaqui descritos e/ou conhecidos na tecnologia. Opcionalmente, o segundo composto éselecionado do grupo que consiste em ciclofosfamida, micofenolato mofetil, e CTLA4-lg.

Em uma classe de modalidades, os métodos incluem tratar o sujeito com oanticorpo CD4 não depletável e o segundo composto para reduzir sintomas, e em seguidacontinuar o tratamento do sujeito com o anticorpo CD4 não depletável (não em combinaçãocom o segundo composto) para manter a remissão. Em uma outra modalidade, o sujeito étratado com o anticorpo CD4 não depletável e o segundo composto para reduzir sintomas, eem seguida o tratamento continua com o segundo composto, ou um ou mais compostostipicamente usados para tratar a condição.

Em uma modalidade, o sujeito nunca foi previamente tratado com medicamento(s),tal como agente imunossupressor(s), para tratar a condição e/ou nunca foi previamentetratado com um anticorpo anti-CD4. Em uma outra modalidade, o sujeito foi previamentetratado com medicamento(s) para tratar a condição e/ou foi previamente tratado com umanticorpo anti-CD4.

Tipicamente, o sujeito é elegível para tratamento para a condição. Com ospropósitos aqui, tal sujeito é um que apresenta, apresentou, ou que provavelmenteapresentará, um ou mais sinais, sintomas ou outros indicadores da condição; foidiagnosticado com a condição, quer, por exemplo, recém-diagnosticado, previamentediagnosticado com uma nova recaída ou exacerbação, previamente diagnosticado naremissão, etc.; e/ou corre o risco de desenvolver a condição. Por exemplo, um sujeitoelegível para o tratamento de rejeição a transplante ou doença do enxerto versushospedeira pode ter antecipado um transplante de tecido ou pode ter já recebido taltransplante, em último caso pode ser um que apresenta, apresentou, ou que provavelmenteapresentará um ou mais sinais, sintomas ou outros indicadores de rejeição a transplante oudoença do enxerto versus hospedeira. Sintomas e indicadores de tais condições, e de váriasdoenças autoimunes e desordens, são bem conhecidos na tecnologia.

PRODUÇÃO DE ANTICORPO E ADMINISTRAÇÃO

Os métodos da presente invenção usam um anticorpo que se liga a CD4. Em umaspecto, os anticorpos anti-CD4 são anticorpos não depletáveis. Dessa maneira, métodospara gerar tais anticorpos serão descritos aqui.

Antígeno CD4 a ser usado para produção, ou classificação de anticorpo(s) podeser, por exemplo, uma forma solúvel de CD4, tal como CD4 humano, ou uma porção destes,contendo o epítopo desejado. As seqüências de ácido nucléico e aminoácido de CD4humano são mostrados na figura 21. Alternativamente, ou adicionalmente, células queexpressam CD4 em sua superfície celular podem ser usadas para gerar, ou classificar,anticorpo(s). Outras formas de CD4 usadas para gerar anticorpos ficarão aparentes aosversados na tecnologia.

Segue-se uma descrição de técnicas exemplares para a produção dos anticorposusados de acordo com o presente invenção. Para informação adicional, ver publicação depedido de patente U.S. 2003/0108518 by Frewin et al. intitulado "TRX1 antibody and usestherefor" e publicação de pedido de patente U.S. 2003/0219403 by Frewin et al. intitulado"Compositions and methods of tolerizing a primate to an antigen", ambas as quais estãoincorporadas aqui pela referência na sua íntegra com todos os propósitos, incluindo comrelação a procedimentos para produzir anticorpos CD4 não depletáveis, tal como o anticorpoTRX1.

Anticorpos policlonais

Anticorpos policlonais são preferivelmente salientados em animais por injeçõessubcutâneas ou intraperitoniais múltiplas do antígeno relevante e um adjuvante. Eles podemser usados para conjugar o antígeno relevante com uma proteína que é imunogênica naespécie a ser imunizada, por exemplo, hemocianina do Iinfeto do buraco da fechadura,albumina sérica, tiroglobulina bovina, ou inibidor de tripsina de soja usando um agentebifuncional ou de derivatização, por exemplo, éster maleimidobenzoil sulfosuccinimida(conjugação através de resíduos de cisteína), N- hidroxisuccinimida (através de resíduos delisina), glutaraldeído, anidreto succínico, SOCI2, ou R1N=C=NR, onde ReR' são diferentegrupos alquila.

Animais são imunizados em função do antígeno, conjugados imunogênicos, ouderivados combinando, por exemplo, 100 /vg ou 5 μg da proteína ou conjugado (paracoelhos ou camundongos, respectivamente) com 3 volumes de adjuvante completo deFreund e injetando a solução intradermicamente em múltiplos sítios. Um mês depois osanimais foram aplicados novamente com 1/5 a 1/10 da quantidade original de peptídeo ouconjugado no adjuvante completo de Freund por injeção subcutânea nos múltiplos sítios.Sete a 14 dias depois de os animais serem sangrados e o soro ser ensaiado com relação aotitulador de anticorpo. Animais são aplicados novamente até o platô do titulador.Preferivelmente, o animal é aplicado com o conjugado do mesmo antígeno, mas conjugadocom uma proteína diferente e/ou através de um reagente de reticulação diferente.

Conjugados também podem ser feitos em cultura ceiuiar recombinante como fusões deproteína. Agentes de agregação tal como sulfato de alumínio também são adequadamenteusados para aumentar a resposta imune. Anticorpos monoclonais

Anticorpos monoclonais são obtidos a partir de uma população de anticorpossubstancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais compreendendo apopulação são idênticos e/ou se ligam ao mesmo epítopo exceto para possíveis variantesque surgirem durante a produção do anticorpo monoclonal, tais variantes geralmenteestando presentes em quantidades inferiores. Assim, o modificador "monoclonal" indica ocaráter do anticorpo como não sendo uma mistura de anticorpos discretos ou policlonais.

Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser feitos usando o métodohibridoma primeiramente descrito por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), ou pode ser feitopor métodos de DNA recombinante (Patente U.S No. 4.816.567).

No método hibridoma, um camundongo ou outro animal hospedeiro apropriado, talcomo um hamster, é imunizado da maneira aqui supradescrita para elicitar linfócitos queproduzem ou são capazes de produzir anticorpos que se ligarão especificamente à proteínausada para imunização. Alternativamente, linfócitos podem ser imunizados in vitro. Linfócitosem seguida são fundidos com células de mieloma usando um agente de fusão adequado, talcomo polietileno glicol, para formar uma célula hibridoma (Goding, Monoclonais Antibodies:Principies and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)).

As células hibridoma assim preparadas são semeadas e crescem em um meio decultura adequado que preferivelmente contém uma ou mais substâncias que inibem ocrescimento ou sobrevivência das células de mieloma parentais não fundidas. Por exemplo,se as células de mieloma parentais não tiverem a enzima hipoxantina guanina fosforibosiltransferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas tipicamente incluirãohipoxantina, aminopterina, e timidina (meio HAT), cujas substâncias impedem o crescimentode células deficientes de HGPRT.

Células de mieloma usadas para preparação de hibridomas são aquelas quefundem eficientemente, suportam produção de alto nível estável de anticorpo pelas célulasde produção de anticorpo selecionadas, e são sensíveis a um meio, tal como meio HAT.Entre estes, uma lista não. Iimitante de linhas celulares mieloma inclui linhas mielomamurino, tal como aquelas derivadas de tumores de camundongo MOPC-21 e MPC-11disponíveis pela Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. USA, e células SP-2ou X63-Ag8-653 disponíveis pela American Tipt Culture Collection, Rockville, Md. USA.Linhas celulares de mieloma humano e heteromieloma de camundongo-humano tambémforam descritos para a produção de anticorpos humanos monoclonais (Kozbor, J. Imunol.,133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications, pp. 51-63 (Mareei Dekker, Inc., New York, 1987)).

Meio de cultura em que células de hibridoma crescem é são ensaiadas paraprodução de anticorpos monoclonais direcionados ao antígeno. A especificidade de ligaçãode anticorpos monoclonais produzidos pelas células de hibridoma pode ser determinada porimunoprecipitação ou por um ensaio de ligação in vitro, tais como radioimunoensaio (RIA) ouensaio imunoabsorbente ligado a enzima (ELISA). A afinidade de ligação do anticorpomonoclonal pode, por exemplo, ser determinada pela Scatehard analysis of Munson et al.,Anal. Biochem., 107:220 (1980).

Após as células de hibridoma que produzem anticorpos da especificidade,afinidade, e/ou atividade desejada serem identificadas, os clones podem ser subclonadoslimitando procedimentos de diluição e crescimento por métodos padrões (Goding,Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). Meiode cultura adequado para este propósito incluem, por exemplo, meio D-MEM ou RPMI-1640.Além do mais, as células de hibridoma podem crescer in vivo como tumores de edema emum animal.

Os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones são adequadamenteseparados do meio de cultura, fluido de edema, ou soro por procedimentos de purificação deimunoglobulina convencionais, tais como, por exemplo, agarose reticulada de proteína A-Sepharose®, cromatografia de hidroxilapatito, eletroforese de gel, diálise, ou cromatografiade afinidade.

O DNA que codifica os anticorpos monoclonais é rapidamente isolado eseqüenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo, usando sondas deoligonucleotídeo que são capazes de ligar especificamente aos genes que codificam ascadeias pesadas e leves de anticorpos murino). As células de hibridoma servem como umafonte usada de tal DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores deexpressão, que são em seguida transfectados em células hospedeiras tais como células E.coli, células COS simian, células Chinese Hamster Ovary (CHO)1 ou células de mieloma quede outra forma não produzem proteína de imunoglobulina, para obter a síntese deanticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. Artigos de revisão sobreexpressão recombinante em bactéria de DNA que codifica o anticorpo incluem Skerra et al.,Curr. Opinion em Imunol., 5:256-262 (1993) e Pluckthun, Imunol. Revs., 130:151-188 (1992).

Em uma modalidade adicional, anticorpos ou fragmentos de anticorpo podem serisolados de bibliotecas fago de anticorpo geradas usando a técnica descrita em McCaffertyet al., Nature1 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature1 352:624-628 (1991) e Marks etai., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) descreve o isolamento de anticorpos murino ehumanos, respectivamente, usando bibliotecas fago. Publicações subseqüentes descrevema produção de anticorpos humanos de alta afinidade (faixa nM) pelo embaralhamento decadeia (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), bem como infecção combinatoriale recombinação in vivo como uma estratégia para construir bibliotecas fago muito grandes(Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)). Assim, estas técnicas sãoalternativas viáveis para técnicas de hibridoma de anticorpo monoclonal tradicionais paraisolamento de anticorpos monoclonais.

O DNA também pode ser modificado, por exemplo, substituindo a seqüência quecodifica domínios constantes de cadeia pesada e leve humana no lugar das seqüênciasmurino homólogas (Patente U.S No. 4.816.567; Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA,81:6851 (1984)), ou ligando covalentemente à seqüência que codifica imunoglobulina, todaou parte da seqüência que codifica um polipeptídeo não imunoglobulina.

Tipicamente, tais polipeptídeos não imunoglobulina são usados em substituição aosdomínios constantes de um anticorpo, ou eles são usados em substituição aos domíniosvariáveis de um sítio de combinação de antígeno de um anticorpo para criar um anticorpobivalente quimérico compreendendo um sítio de combinação de antígeno tendoespecificidade para um antígeno e um outro sítio de combinação de antígeno tendoespecificidade para um diferente antígeno.

Anticorpos humanizados

Métodos para humanizar anticorpos não humanos foram descritos na tecnologia.Preferivelmente, um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácidointroduzido-o em uma fonte que é não humana. Estes resíduos não humanos de aminoácidosão freqüentemente referidos como resíduos de "importação", que são tipicamente tomadosde um domínio variável de "importação". A humanização pode ser essencialmente realizadaseguindo o método de Winter e equipe (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986);Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536(1988)), usando seqüências de região hipervariável em substituição a seqüênciascorrespondentes de um anticorpo humano. Dessa maneira, tais anticorpos "humanizados"são anticorpos quiméricos (Patente U.S No. 4.816.567) em que substancialmente menosque um domínio variável humano intacto foi substituído pela seqüência correspondente deuma espécie não humano. Na prática, anticorpos humanizados são tipicamente anticorposhumanos em que alguns resíduos de região hipervariável e possivelmente alguns resíduosFR são substituídos por resíduos dos sítios análogos em anticorpos de roedores.

A escolha de domínios variáveis humanos, tanto leve quanto pesado, a ser usadoem fabricação dos anticorpos humanizados é muito importante para reduzir antigenicidade.De acordo com o assim chamado método "best-fit", a seqüência do domínio variável de umanticorpo roedor é selecionado em função da biblioteca total das seqüências de domíniovariável humanas conhecidas. A seqüência humana que está mais próxima da do roedor éem seguida aceita como a região de estrutura humana (FR) para o anticorpo humanizado(Sims et al., J. Imunol., 151:2296 (1993); Chotia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Umoutro método usa uma região de estrutura particular derivada da seqüência consenso detodos anticorpos humanos de um subgrupo particular de regiões variáveis de cadeia leve oupesada. A mesma estrutura pode ser usada para diversos anticorpos humanizadosdiferentes (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Imunol.,151:2623(1993)).

É ainda mais importante que anticorpos sejam humanizado com retenção de altaafinidade com o antígeno e outras propriedades biológicas favoráveis. Para atingir estameta, de acordo com um método, anticorpos humanizados são preparados por um processode análise das seqüências parentais e vários produtos humanizados conceituais usandomodelos tridimensionais das seqüências parentais e humanizadas. Modelos deimunoglobulina tridimensionais estão comumente disponíveis e são familiares aos versadosna tecnologia. Programas de computador que ilustram e exibem estruturas conformacionaistridimensionais prováveis de seqüências de imunoglobulina candidata selecionadas estãodisponíveis. Inspeção destas exibições permite análise de papel provável dos resíduos nofuncionamento da seqüência de imunoglobulina candidata, isto é, a análise de resíduos queinfluencia na capacidade da imunoglobulina candidata de se ligar seu antígeno. Destamaneira, resíduos FR podem ser selecionados e combinados das seqüências recipiente eimportantes de forma que a característica anticorpo desejado, tal como maior afinidade como antígeno(s) alvo, é obtida. Em geral, os resíduos da região hipervariável estão diretamentee mais substancialmente envolvidos em influenciar a ligação de antígeno.

Anticorpos humanos

Como uma alternativa para humanização, anticorpos humanos podem ser gerados.Por exemplo, agora é possível produzir animais transgênicos (por exemplo, camundongos)que são capazes, mediante imunização, de produzir um repertório completo de anticorposhumanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena. Por exemplo, foi descritoque o deleção homozigo do gene da região de união de cadeia pesada do anticorpo (Jh) emcamundongos mutantes quiméricos e linha germinal resulta na complete inibição deprodução de anticorpo endógeno. Transferência do arranjo do gene da imunoglobulina dalinha germinal humano em tais camundongos mutantes de linha germinal resultará naprodução de anticorpos humanos mediante desafio do antígeno. Ver, por exemplo,Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature,362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno, 7:33 (1993); e Patente U.S Nos.5,591,669, 5,589,369 e 5,545,807.Alternativamente, tecnologia de exibição de fago (McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)) pode ser usada para produzir anticorpos humanos e fragmentos de anticorpo invitro, dos repertórios do gene de domínio variável da imunoglobulina (V) de doadores nãoimunizados. De acordo com esta técnica, genes do domínio V do anticorpo são clonados emquadro tanto em um gene da proteína cabra principal ou secundária de um bacteriófagofilamentoso, tais como M13 ou fd, e exibidos como fragmentos funcionais de anticorpo nasuperfície da partícula do fago. Em virtude da partícula filamentosa conter uma cópia deDNA de fita única do genoma de fago, seleções com base nas propriedades funcionais doanticorpo também resultam na seleção do gene que codifica o anticorpo que apresentamaquelas propriedades. Assim, o fago mimetiza algumas das propriedades da célula B.

Exibição de fago pode ser realizada em uma variedade de formatos; para sua revisão, porexemplo, ver Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology3:564-571 (1993). Diversas fontes de segmentos do gene V podem ser usadas paraexibição de fago. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) isolaram um arranjo diversode anticorpos anti-oxazolona de um pequena biblioteca combinatorial aleatória de derivadosdos genes V dos baços de camundongos imunizados. Um repertório de genes V dosdoadores não imunizados humanos pode ser construído e anticorpos para um diversoarranjo de antígenos (incluindo auto antígenos) podem ser isolados essencialmente depoisda técnica descrita por Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), ou Griffith et al., EMBOJ. 12:725-734 (1993). Ver, também, Patente U.S Nos. 5.565.332 e 5.573.905.

Anticorpos humanos podem também ser gerados por células B ativadas in vitro (verPatente U.S Nos. 5,567,610 e 5,229,275).

Fragmentos de anticorpo

Várias técnicas foram desenvolvidas para a produção de fragmentos de anticorpo.Tradicionalmente, estes fragmentos foram derivados por meio de digestão proteolítica deanticorpos intactos (ver, por exemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical andBiophysical Methods 24:107-117 (1992) and Brennan et al., Science, 229:81 (1985)).

Entretanto, estes fragmentos podem agora ser produzidos diretamente por célulashospedeiras recombinantes. Por exemplo, os fragmentos de anticorpo podem ser isoladosdas bibliotecas fago de anticorpo discutidos anteriormente. Alternativamente, fragmentosFab1-SH podem ser diretamente recuperados de E. coli e acoplados quimicamente paraformar fragmentos F(ab')2 (Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). De acordo comuma outra abordagem, fragmentos F(ab')2 podem ser isolados diretamente de cultura decélula hospedeira recombinante. Outras técnicas para a produção de fragmentos deanticorpo ficarão aparentes aos versados na tecnologia. Em outras modalidades, o anticorpode escolha é um fragmento Fv de cadeia única (scFv). Ver WO 1993/16185 e Patente U.S5.571.894 e 5.587.458. O fragmento de anticorpo pode também ser um "anticorpo linear",por exemplo, da maneira descrita na Patente U.S 5.641.870. Tais fragmentos lineares deanticorpo podem ser monoespecífico ou biespecífico.

Anticorpos biespecífico

Anticorpos biespecíficos são anticorpos que têm especificidades de ligação compelo menos dois epítopos diferentes. Anticorpos biespecíficos exemplares podem se ligar adois epítopos diferentes do antígeno CD4. Outros tais anticorpos podem ligar CD4 eadicionalmente ligar um segundo marcador superficial de célula T. Anticorpos biespecíficospodem também ser usados para localizar medicamentos ou agentes citotóxicos para acélula T; estes anticorpos possuem um braço de ligação de CD4 e um braço que liga omedicamento ou agente citotóxico. Anticorpos biespecíficos podem ser preparados comoanticorpos de comprimento total ou fragmentos de anticorpo (por exemplo, anticorposbiespecíficos F(ab')2).

Métodos para fabricar anticorpos biespecíficos são conhecidos na tecnologia.Produção tradicional de anticorpos biespecíficos de comprimento total é baseada na coexpressão de dois pares de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina, onde as duascadeias têm especificidades diferentes (Millstein et al., Nature1 305:537-539 (1983)). Emvirtude do sortimento aleatório de cadeias pesadas e leves de imunoglobulina, esteshibridomas (quadromas) produzem um mistura potencial de 10 moléculas de anticorpodiferentes, das quais apenas uma tem a estrutura bi específica correta. A purificação damolécula correta, que é geralmente feita por

Etapas de cromatografia de afinidade, são bastante problemáticas, e osrendimentos do produto são baixos. Procedimentos similares são revelados em WO1993/08829, e em Trauneckeretal., EMBOJ., 10:3655-3659(1991).

De acordo com uma abordagem diferente, domínios variáveis de anticorpo com asespecificidades de ligação desejadas (sítios de combinação anticorpo-antígeno) sãofundidos com seqüências de domínio constante de imunoglobulina. A fusão preferivelmenteé com um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina, compreendendo pelomenos parte das regiões de dobradiça, CH2, e CH3. Em uma abordagem, a primeira regiãoconstante de cadeia pesada (CH1), contendo o sítio necessário para ligação de cadeia leve,está presente em pelo menos uma das fusões. DNAs que codificam as fusões de cadeiapesada de imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve de imunoglobulina, são inseridosem vetores de expressão separados, e são co-transfectados em um organismo hospedeiroadequado. Isto fornece maior flexibilidade no ajuste das proporções mutuais dos trêsfragmentos de polipeptídeo nas modalidades quando razões desiguais das três cadeias depolipeptídeo usadas na construção fornecem os rendimentos ideais. Entretanto, é possívelinserir as seqüências que codificam duas ou todas três cadeias de polipeptídeo em um vetorde expressão quando a expressão de pelo menos duas cadeias de polipeptídeo em razõesiguais resultarem em rendimentos altos, ou quando as razões não tiverem significadoparticular.

Em uma modalidade desta abordagem, os anticorpos biespecíficos são compostosde uma cadeia pesada de imunoglobulina híbrida com uma primeira especificidade deligação em um braço, e um par de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina híbrida(fornecendo uma segunda especificidade de ligação) no outro braço. Observou-se que estaestrutura assimétrica facilita a separação do composto biespecífico desejado decombinações de cadeia de imunoglobulina indesejáveis, como a presença de uma cadeialeve de imunoglobulina em apenas uma metade da molécula bi específica fornece um modofácil de separação. Esta abordagem é revelada em WO 1994/04690. Para maiores detalhesde gerar anticorpos biespecíficos, ver, por exemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology,121:210(1986).

De acordo com uma outra abordagem descrita na Patente U.S 5.731.168, ainterface entre um par de moléculas de anticorpo pode ser projetada por engenharia paramaximizar a porcentagem de heterodímeros que são recuperados da cultura celularrecombinante. Uma interface como essa compreende pelo menos uma parte do domínio Ch3de um domínio constante de anticorpo. Neste método, uma ou mais das pequenas cadeiaslaterais de aminoácido da interface da primeira molécula do anticorpo são substituídas comcadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou triptofano). "Cavidades" compensatóriasde tamanho idêntico ou similar às cadeia(s) lateral(s) maiores são criadas na interface dasegunda molécula do anticorpo substituindo cadeias laterais de aminoácido maiores comomenores (por exemplo, alanina ou treonina). Isto fornece um mecanismo para aumentar orendimento do heterodímero sobre outros produtos finais indesejáveis tais comohomodímeros.

Anticorpos biespecíficos incluem anticorpos reticulados ou "heteroconjugados". Porexemplo, um dos anticorpos no heteroconjugado pode ser acoplado a avidina, o outro abiotina. Tais anticorpos, por exemplo, foram propostos para alvejar células de sistema imunepara células indesejáveis (Patente U.S 4.676.980), e para tratamento de infecção HTV (WO1991/00360, WO 1992/200373, e EP 03089). Anticorpos heteroconjugados podem ser feitosusando quaisquer métodos de reticulação conveniente. Agentes de reticulação adequadosão bem conhecidos na tecnologia, e são revelados, por exemplo, na patente U.S4.676.980, junto com inúmeras técnicas de reticulação.

Técnicas para gerar anticorpos biespecíficos dos fragmentos de anticorpo tambémforam descritas na literatura. Por exemplo, anticorpos biespecíficos podem ser preparadosusando ligação química. Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) descrevem umprocedimento no qual anticorpos intactos são proteoliticamente clivados para gerarfragmentos F(ab')2. Estes fragmentos são reduzidos na presença do agente complexante deditiol de arsenito de sódio para estabilizar ditióis viciriais e impede formação de dissulfetointermolecular. Os fragmentos Fab' gerados são em seguida convertidos em derivados detionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados de Fab1-TNB é em seguida convertido novamenteno Fab'-tiol por redução com mercaptoetilamina e é misturado com uma quantidadeequimolar do outro derivado de Fab1-TNB para formar o anticorpo biespecífico. Osanticorpos biespecíficos produzidos podem ser usados como agentes para a imobilizaçãoseletiva de enzimas.

Várias técnicas para fabricar e isolar fragmentos de anticorpo biespecíficosdiretamente da cultura celular recombinante também foram descritas. Por exemplo,anticorpos biespecíficos foram produzidos usando zíper de leucina. Kostelny et ai., J.Imunol., 148(5): 1547-1553 (1992). Os peptídeos de zíper de leucina das proteínas Fos eJun foram ligados às porções de Fab1 de dois anticorpos diferentes por fusão do gene. Oshomodímeros do anticorpo foram reduzidos na região de dobradiça para formar monômerose em seguida oxidar novamente para formar os heterodímeros do anticorpo. Este métodopode também ser utilizado para a produção de homodímeros do anticorpo. A tecnologia de"diacorpo" descrita por Hollinger et al„ Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:6444-6448 (1993) temfornecido um mecanismo alternativo para fabricar fragmentos de anticorpo biespecíficos. Osfragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (Vh) conectados a umdomínio variável de cadeia leve (VL) por um Iigador que é muito pequeno para permitirpareamento entre os dois domínios na mesma cadeia. Dessa maneira, os domínios VH e VLde um fragmento são forçados a parear com os domínios Vl e Vh complementares de umoutro fragmento, formando assim dois sítios de ligação de antígeno. Uma outra estratégiapara fabricar fragmentos de anticorpo biespecíficos pelo uso de dímeros de cadeia única Fv(sFv) também foi reportada. Ver Gruber et ai., J. Imunol., 152:5368 (1994).

Anticorpos com mais que duas valências são contemplados. Por exemplo,anticorpos tri específico podem ser preparados. Tutt et al. J. Imunol. 147: 60 (1991).

Conjugados e outras modificações do anticorpo

O anticorpo usado nos métodos ou incluído nos artigos de fabricação aqui éopcionalmente conjugado com um medicamento, por exemplo, da maneira descrita em WO2004/032828 e publicação de pedido de patente U.S. 2006/0024295. Os anticorpos dapresente invenção podem também ser conjugados com uma enzima de ativação depromedicamento que converte um promedicamento (por exemplo, um agentequimioterpêutico de peptidila, ver WO 1981/01145) em um medicamento anti cancerígenoativo. Ver, por exemplo, WO 1988/07378, Patente U.S 4.975.278, e publicação de pedido depatente U.S. 2006/0024295.

Outras modificações do anticorpo são contempladas aqui. Por exemplo, o anticorpopode ser ligado a um de uma variedade de polímeros não proteináceos, por exemplo,polietileno glicol (PEG), polipropileno glicol, polioxialquilenos, ou copolímeros de polietilenoglicol e polipropileno glicol.

Os anticorpos revelados aqui podem também ser formulados como lipossomos.Lipossomos contendo o anticorpo são preparados por métodos conhecidos na tecnologia, talcomo descrito em Epstein et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al.,Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77:4030 (1980); Patente U.S Nos. 4.485.045 e 4.544.545; e WO1997/38731 publicados em 23 de outubro de 1997. Lipossomos com melhor tempo decirculação são revelados na Patente U.S 5.013.556.

Particularmente lipossomos usados podem ser gerados pelo método de evaporaçãode fase reversa com uma composição lipídio compreendendo fosfatidileolina, colesterol efosfatidiletanolamina derivatizado de PEG (PEG-PE). Lipossomos são extrudados atravésde filtros de tamanho de poro definido para render lipossomos com o diâmetro desejado.Fragmentos Fab de um anticorpo da presente invenção podem ser conjugados com oslipossomos da maneira descrita em Martin et al. J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982) pormeio de uma reação de troca de dissulfeto. Um agente quimioterpêutico é opcionalmentecontido no lipossomo. Ver Gabizon et al. J. National Câncer List. 81(19)1484 (1989).

Modificação(s) de seqüência de aminoácidos de anticorpos de proteína ou peptídeoaqui descritos são contempladas. Por exemplo, ela pode ser desejável para aumentar aafinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo. Variantes deseqüência de aminoácidos do anticorpo são preparadas introduzindo mudanças denucleotídeo apropriadas no ácido nucléico do anticorpo, ou por síntese de peptídeo. Taismodificações incluem, por exemplo, deleções e/ou inserções em e/ou substituições, deresíduos nas seqüências de aminoácido do anticorpo. Qualquer combinação de deleção,inserção, e substituição é feita para chegar na construção final, desde que a construção finalpossua as características desejadas. As mudanças de aminoácido também podem alterar osprocessos pós-translacionais do anticorpo, tais como mudar o número ou posição de sítiosde glicosilação.

Um método usado para identificação de certos resíduos ou regiões do anticorpoque são locações usadas para mutagênese é chamado "mutagênese de varredura dealanina" da maneira descrita por Cunningham and Wells Science, 244:1081-1085 (1989).Aqui, um resíduo ou grupo de resíduos alvos são identificados (por exemplo, resíduoscarregados tais como arg, asp, his, lis, e glu) e substituídos por um aminoácido neutro oucarregado negativamente (mais preferivelmente alanina ou polialanina) para afetar ainteração do aminoácidos com antígeno. Estes locais de aminoácido demonstrandosensibilidade funcional com as substituições em seguida são refinados introduzindovariantes adicionais ou outras variantes nos sítios de substituição ou para eles. Assim,quando o sítio para introduzir uma seqüência de variação de aminoácido é predeterminado,a natureza da mutação não precisa ser predeterminada. Por exemplo, para analisar odesempenho de uma mutação em um dado sítio, varredura ala ou mutagênese aleatória éconduzida no códon ou região alvo e as variantes do anticorpo expressas são selecionadaspara a atividade desejada.

Inserções de seqüência de aminoácidos incluem fusões amino- e/ou carboxil-terminal variando em comprimento de um resíduo para polipeptídeos contendo uma centenaou mais resíduos, bem como inserções intra-seqüências de resíduos de aminoácido únicosou múltiplos. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo demetionila N-terminal ou o anticorpo fundido em um polipeptídeo citotóxico. Outras variantesinsercionais da molécula do anticorpo incluem a fusão no terminal N- ou C- do anticorpo deuma enzima, ou um polipeptídeo que aumenta a meia vida do soro do anticorpo.

Um outro tipo de variante é uma substituição de variante de aminoácido. Estasvariantes têm pelo menos um resíduo de aminoácido na molécula do anticorpo substituídopor um diferente resíduo. Os sítios de maior interesse pra mutagênese substitucional deanticorpos incluem as regiões hipervariáveis, mas alterações de FR são tambémcontempladas. Substituições conservativas são mostradas na Tabela 1 com o título de"substituições conservativas". Se tais substituições resultam em uma mudança na atividadebiológica, em seguida mais mudanças substanciais, denominadas "substituiçõesexemplares" em Tabela 1, ou da maneira descrita mais detalhadamente a seguir nareferência a classes de aminoácido, podem ser introduzidas e o produtos selecionados.

Tabela 1. Substituições de aminoácido

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Modificações substanciais nas propriedades biológicas do anticorpo são realizadasselecionando substituições que diferem significativamente em seu efeito em manter (a) aestrutura da espinha dorsal do polipeptídeo na área da substituição, por exemplo, como umafolha ou conformação de hélice, (b) a carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio alvo, ou(c) o volume de cadeia lateral. Aminoácidos podem ser agrupados de acordo comsimilaridades nas propriedades de suas cadeias laterais (em A. L. Lehninger, emBiochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)): (1) não polar: Ala(A), Val (V), Leu (L), He (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M); (2) polar não carregada: Gly(G)1 Ser (S), Thr (T), Cys (C)1 Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q); (3) acídica: Asp (D), Glu (E); and (4)básica: Lys (K)1 Arg (R)1 Hls(H).

Alternativamente, resíduos de ocorrência natural podem ser divididos em gruposbaseados em propriedades de cadeia lateral comum: (1) hidrofóbica: Norleucina, Met, Ala,Val, Leu, He; (2) hidrofílica neutra: Cys, Ser, Thr, Asn, Glna; (3) acídica: Asp, Glu; (4)básica: His1 Lys, Arg; (5) resíduos que influenciam a orientação de cadeia: Gly, Pro; e (6)aromática: Trp1 Tyr1 Phe.

Substituições não conservativas implicam em trocar um membro de uma dessasclasses para uma outra classe, enquanto substituições conservativas implicam em trocar ummembro de uma dessas para uma na mesma classe, anticorpos CD4 não depletáveis quelevam substituições, deleções, ou adições não conservativas ou conservativas que alteram,adicionam ou deletam um aminoácido único ou uma pequena porcentagem de aminoácidos(tipicamente menos que 5 %, mais tipicamente menos que 4 %, 2 % ou 1 %) dos resíduosde aminoácido de qualquer dos anticorpos CD4 aqui descritos são também adequados parauso nos métodos da invenção.

Qualquer resíduo de cisteína não envolvido em manter a conformação devida doanticorpo, também pode ser substituído, geralmente com serina, para melhorar aestabilidade oxidativa da molécula e impedir reticulação aberrante. Ao contrário, ligações decisteína podem ser adicionadas ao anticorpo para melhorar sua estabilidade(particularmente onde o anticorpo é um fragmento de anticorpo tal como um fragmento Fv).

Um tipo de variante substitucional envolve substituir um ou mais resíduos de regiãohipervariável de um anticorpo pai. Geralmente, a(s) variante(s) resultante(s) selecionada(s)para desenvolvimento adicional terão propriedades biológicas melhores relativas aoanticorpo pai dos quais eles são gerados. Uma maneira conveniente para gerar tal variantesubstitucional é maturação da afinidade usando exibição de fago. Resumidamente, diversossítios de região hipervariável (por exemplo, sítios 6-7) são mutados para gerar todassubstituições possíveis de aminoácido em cada sítio. As variantes do anticorpo assimgeradas, são exibidas em um modo monovalente das partículas de fago filamentosas comofusões com o produto do gene Ill de M13 empacotado em cada partícula. As variantes deexibição de fago são em seguida selecionadas por sua atividade biológica (por exemplo,afinidade de ligação) da maneira aqui revelada. A fim de identificar sítios de regiãohipervariável candidatos para modificação, mutagênese de varredura de alanina pode serrealizada para identificar resíduos da região hipervariável contribuindo significativamentepara a ligação de antígeno. Alternativamente, ou adicionalmente, ela pode ser benéfica paraanalisar uma estrutura cristalina do complexo antígeno-anticorpo para identificar pontos decontato entre o anticorpo e antígeno. Tais resíduos de contato e resíduos vizinhos sãocandidatos para substituição, de acordo com as técnicas elaboradas aqui. Uma vez que taisvariantes são gerados, o painel de variantes é submetido a classificação da maneira aquidescrita e anticorpos com propriedades superiores em um ou mais ensaios relevantes podeser selecionado para desenvolvimento adicional.

Um outro tipo de variante do aminoácido do anticorpo altera o padrão deglicosilação original do anticorpo. Tal alteração inclui deletar uma ou mais frações decarboidrato encontradas no anticorpo, e/ou adicionar um ou mais sítios de glicosilação quenão estão presentes no anticorpo.

Glicosilação de polipeptídeos é tipicamente tanto N-Iigado quanto O-ligado. N-ligado refere-se a anexação da fração de carboidrato com a cadeia lateral de um resíduo deasparagina. As seqüências de tripeptídeo asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina,onde X é qualquer aminoácido exceto prolina, são o reconhecimento das seqüências paraanexação enzimática da fração de carboidrato com a cadeia lateral de asparagina. Assim, apresença qualquer dessas seqüências de tripeptídeo em um polipeptídeo cria um sítio deglicosilação potencial. Glicosilação O-Iigado refere-se a anexação de um dos açúcares N-aceilgalactosamina, galactose, ou xilose com um hidroxiaminoácido, mais comumente serinaou treonína, embora 5- hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina possam também ser usados.

Além de sítios de glicosilação no anticorpo é convenientemente realizado alterandoa seqüência de aminoácidos de maneira tal que ela contenha uma ou mais das seqüênciasde tripeptídeo supradescritas (para sítios de glicosilação N-ligado). A alteração podetambém ser feita pela adição de, ou substituição, por um ou mais resíduos de serina outreonina com a seqüência do anticorpo original (para sítios de glicosilação O-ligado).

Onde o anticorpo compreende uma região Fc1 o carboidrato anexado a ele pode seralterado ou removido. Por exemplo, em uma variante de glicosilação aqui, uma ou maissubstituições de aminoácido são introduzidas em uma região Fc de um anticorpo paraeliminar um ou mais sítios de glicosilação. Uma aglicosilado de anticorpo como essa podeter função efetora reduzida, por exemplo, comparado a IgGI humano, de maneira tal quesua capacidade para induzir ativação do complemento e/ou citotoxicidade dependente deanticorpo mediada por célula seja diminuída, e o anticorpo aglicosilado possa ter ligaçãoreduzida (ou nenhuma) com o receptor Fc.

Para certos anticorpos, por exemplo, um anticorpo depletável usado como umsegundo composto nos métodos da invenção, modificação do anticorpo para melhorarADCC e/ou CDC do anticorpo pode ser desejável. Por exemplo, anticorpos com umaestrutura de carboidrato madura que não têm fucose anexado a uma região Fc do anticorposão descrito em U.S. 2003/0157108 (Presta, L.). Ver também U.S. 2004/0093621 (KyowaHakko Kogyo Co., Ltd.). Anticorpos com um N-acetilglucosamina bi-setor (GIcNAc) nocarboidrato anexado a uma região Fc do anticorpo são referenciados em WO 2003/011878,Jean-Mairet et al. e patente U.S No. 6.602.684, Umana et al. Anticorpos com pelo menos umresíduo de galactose no oligosacarídeo anexado a uma região Fc do anticorpo sãoreportados em WO 1997/30087, Patel et al. Ver, também, WO 1998/58964 (Raju, S.) e WO1999/22764 (Raju, S.) anticorpos relativos a carboidrato alterado anexado à região Fcdestes.

Assim, uma variante de glicosilação opcionalmente compreende uma região Fc, emque uma estrutura de carboidrato anexado à região Fc não tem fucose. Tais variantes têmmelhor função ADCC. Opcionalmente, a região Fc compreende adicionalmente uma ou maissubstituições de aminoácido nela, que melhora ainda mais ADCC, por exemplo,substituições nas posições 298, 333, e/ou 334 da região Fc (numeração Eu de resíduos).Exemplos de publicações relacionados a anticorpos "defucosilado" ou "fucose-deficiente"incluem: U.S. 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; U.S. 2003/0115614; U.S.2002/0164328; U.S. 2004/0093621; U.S. 2004/0132140; U.S. 2004/0110704; U.S.2004/0110282; U.S. 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586;WO 2005/035778; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); and Yamane-Ohnuki etal. Biotech. Bioeng.87: 614 (2004). Exemplos de linhas celulares que produzem anticorposdefucosilado incluem células Lee 13 CHO deficiente em fucosilação de proteína (Ripka et al.Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); U.S. 2003/0157108, Presta, L; and WO2004/056312, Adams et al., especialmente no Exemplo 11), e celulares linhas knockout, taiscomo gene alfa-1,6- fucosiltransferase, FUT8, células CHO knockout (Yamane-Ohnuki et al.Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)).

Modificação do anticorpo com relação a função efetora, por exemplo, de maneira amelhorar ADCC e/ou CDC do anticorpo, pode ser obtida introduzindo uma ou maissubstituições de aminoácido em uma região Fc de um anticorpo. Alternativamente ouadicionalmente, resíduo(s) de cisteína pode ser introduzido(s) na região Fc, permitindodessa maneira ligação de formação de dissulfeto intercadeia nesta região. O anticorpohomodimérico assim gerado pode ter melhor capacidade de internalização e/ou maior mortecelular e ADCC mediada por complemento. Ver Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195

(1992) e Shopes, B. J. Imunol 148:2918-2922 (1992). Anticorpos homodiméricos commelhor atividade anti-tumor podem também ser preparados usando reticuladoresheterobifuncionais da maneira descrita em Wolff et al. Câncer Research 53:2560-2565

(1993). Alternativamente, um anticorpo pode ser projetado por engenharia que tem regiõesFc duplas e pode assim ter melhores capacidades de complemento Iisis e ADCC. VerStevenson et al. Anti-cancer Drug Design 3:219-230 (1989). WO 2000/42072 (Presta, L.)descreve anticorpos com melhor função de ADCC na presença de células efetora humana,onde os anticorpos compreendem substituições de aminoácido na região Fc destes.Preferivelmente, o anticorpo com melhor ADCC compreende substituições nas posições298, 333, e/ou 334 da região Fe. Preferivelmente, a região Fc alterada é um região Fc IgGIhumano compreendendo ou consistindo em substituições em uma, duas, ou três dessasposições.

Anticorpos com ligação C1q e/ou CDC alterada são descritos em WO 1999/51642 ePatentes U.S 6.194.551, 6.242.195, 6.528.624, e 6,538,124 (Idusogie et al.). Os anticorposcompreendem uma substituição de aminoácido em uma ou mais das posições deaminoácido 270, 322, 326, 327, 329, 313, 333, e/ou 334 da região Fc destes. Anticorposanti-CD4 não depletável compreendendo tais substituições de aminoácido constituem umamodalidade da invenção.

Para aumentar a meia vida do soro do anticorpo, pode-se incorporar um epítopo deligação do receptor de salvamento no anticorpo (especialmente um fragmento de anticorpo)da maneira descrita na Patente U.S 5.739.277, por exemplo. Da maneira aqui usada, otermo epítopo de ligação do receptor de salvamento refere-se a um epítopo da região Fc deuma molécula IgG (por exemplo, IgGI, lgG2, IgG3, ou IgG4) que é responsável pelo aumentoda meia vida do soro in vivo da molécula IgG. Anticorpos com substituições em uma regiãoFc destes e maiores meias vidas do soro, são também descritos em WO 2000/42072(Presta, L.). Anticorpos anti-CD4 não depletáveis compreendendo um epítopo de ligação doreceptor de salvamento como esse constituem uma modalidade da invenção.

Qualquer dos anticorpos não depletáveis (ou outros) da invenção podecompreender pelo menos uma substituição na região Fc que melhora ligação de FcRn oumeia vida do soro, por exemplo, um anticorpo variante anti-CD4 não depletável. Porexemplo, a invenção fornece adicionalmente um anticorpo compreendendo uma região Fcvariante com afinidade de ligação do receptor Fc neonatal alterado (FcRn). FcRn éestruturalmente similar ao complexo histocompatibilidade principal (MHC) e consiste em umσ-cadeia não covalentemente ligada a /?2-microglobulina. As funções múltiplas do receptorFc FcRn neonatal são revistas em Ghetie and Ward (2000) Annu. Rev. Imunol. 18:39-766.FcRn desempenha um papel na distribuição passiva de imunoglobulina IgGs da mãe paraos jovens e a regulação de níveis de IgG soro. FcRn age como um receptor de salvamento,ligação e transporte de IgGs pinocitosados em forma intacta tanto dentro quanto através dascélulas, e resgatando-as de um caminho degradativo padrão. Embora os mecanismosresponsáveis pelo salvamento de IgGs não sejam ainda claros, considera-se que IgGssejam diretamente voltados para proteólise em lisossomos, ao passo que IgGs ligados sãoreciclados na superfície das células e liberados. Este controle ocorre dentro das célulasendoteliais localizadas por todos tecidos adultos. FcRn é expresso pelo menos no fígado,glândula mamária, e intestino adulto. FcRn se liga a IgG; a interação FcRn-IgG foiextensivamente estudada e parece envolver resíduos na interface do domínio CH2, CH3 daregião Fc de IgG. Estes resíduos interagem com resíduos basicamente localizados nodomínio a2 de FcRn.

Em certas modalidades da invenção, um anticorpo variante anti-CD4 não depletávelpode exibir maior ligação de FcRn e compreender uma modificação de aminoácido emqualquer uma ou mais das posições de aminoácido 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307,311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ou 434 da região Fc1 emque a numeração dos resíduos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat. Ver, porexemplo, patente U.S. 6.737.056; e Shields et al., J. Biol. Chem. 276: 6591-6604 (2001). Emuma modalidade da invenção, um anticorpo compreende uma região Fc IgG variantecompreendendo pelo menos uma substituição de aminoácido em Asn 434 para His (N434H).

Em uma modalidade da invenção, um anticorpo compreende uma região Fc IgG variantecompreendendo pelo menos uma substituição de aminoácido em Asn 434 para Ala (N434A).Tipicamente, estas variantes compreendem uma maior afinidade de ligação com FcRN doque polipeptídeos tendo seqüência nativa/região Fc de seqüência tipo selvagem. Estespolipeptídeos e anticorpos de variante Fc têm a vantagem de ser salvos e reciclados em vezde degradados. Estes anticorpos variantes anti-CD4 não depletáveis podem ser usados nosmétodos fornecidos aqui. Como apenas um exemplo de um anticorpo variante CD4 nãodepletável, qualquer dos anticorpos TRX1 aqui descritos pode incluir uma substituição naposição 434 de cadeia pesada, tal como N434A ou N434H.

Meia vida do soro do anticorpo pode também ser aumentada pela incorporação deum peptídeo de ligação de albumina sérica no anticorpo da maneira revelada no pedido depatente U.S 20040001827 (Dennis, M.). Anticorpos anti-CD4 não depletáveiscompreendendo tais peptídeos de ligação de albumina sérica constituem uma modalidadeda invenção.

Anticorpos projetados por engenharia com três ou mais (preferivelmente quatro)sítios de ligação de antígeno funcionais são também contemplados (US 2002/0004587 Al,Miller et al.). Anticorpos anti-CD4 não depletáveis compreendendo tais sítios de ligação deantígeno múltiplos constituem uma modalidade da invenção.

Moléculas de ácido nucléico que codificam variantes de seqüência de aminoácidosdo anticorpo são preparadas por uma variedade de métodos conhecidos na tecnologia.Estes métodos incluem, mas sem limitações, isolamento de uma fonte natural (no caso devariantes de seqüência de aminoácidos de ocorrência natural) ou preparação pormutagênese mediado por oligonucleotídeo (ou sítio-dirigido), mutagênese PCR, emutagênese cassete de uma variante recém preparada ou uma versão não variante doanticorpo.

Na prática da presente invenção, muitas técnicas convencionais em biologiamolecular, microbiologia, e tecnologia de DNA recombinante são opcionalmente usados.Estas técnicas são bem conhecidas e são explicadas, por exemplo, em Berger and Kimmel,Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods ín Enzymology volume 152 AcademicPress, Inc., San Diego, CA; Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratório Manual (3rdEd.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 2000 andCurrent Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a jointventure between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc.,(suplementado em 2006). Outras referências usadas, por exemplo, para isolamento ecultura celular (por exemplo, para isolamento de ácido nucléico ou proteína subseqüente)incluem Freshney (1994) Culture of Animal cells, a Manual of Basic Technique, third edition,Wiley-Liss, New York as referências citadas neles; Payne et al. (1992) Plant Cell and tissueCulture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY; Gamborg and Phillips(Eds.) (1995) Plant cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer LabManual, Springer- Verlag (Berlin Heidelberg New York) e Atlas and Parks (Eds.) TheHandbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, F1. Métodos de fazerácidos nucléicos (por exemplo, por amplificação in vitro, purificação das células, ou síntesequímica), métodos para manipular ácidos nucléicos (por exemplo, mutagênese de sítio-dirigido, por digestão, ligação, etc. da enzima de restrição), e vários vetores, linhas celularese similares usados na manipular e fabricar ácidos nucléicos são descrito nas referênciasanteriores. Além do mais, essencialmente qualquer polinucleotídeo (incluindo, por exemplo,polinucleotídeos marcados ou biotinilados) podem ter custo ou padrão ordenado de qualquerde uma variedade de fontes comerciais.

Administração

Conforme entendido pelos versados na tecnologia, as doses apropriadas deanticorpos CD4 não depletáveis serão geralmente em torno daqueles já empregados emterapias clínicas em que anticorpos similares são administrados sozinhos ou emcombinação com outras terapêuticas. Variação na dosagem provavelmente ocorrerádependendo da condição em tratamento. O médico que administra o tratamento será capazde determinar a dose apropriada para o sujeito individual. Preparação e programas dedosagens para segundos compostos comercialmente disponíveis administrados emcombinação com os anticorpos CD4 não depletáveis podem ser usados de acordo cominstruções do fabricante ou determinado empiricamente pelo versado na tecnologia.

Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagem apropriada do anticorpo equalquer segundo composto administrado em combinação com o anticorpo não depletáveldependerá do tipo de doença a ser tratada, da maneira definida anteriormente, a gravidadee curso da doença, quer o anticorpo não depletável ou combinação seja administrado compropósitos preventivos ou terapêuticos, terapia prévia, a história clínica do paciente eresposta a o anticorpo ou combinação, e a critério do médico atendente. O anticorpo nãodepletável ou combinação é adequadamente administrado ao paciente de uma vez, ou maistipicamente em uma série de tratamentos.

Dependendo do tipo e gravidade da doença, cerca de 1 yug/kg a 50 mg/kg (porexemplo, 0,1-20 mg/kg) de anticorpo CD4 não depletável é um dosagem candidata inicialpara administração ao paciente, quer, por exemplo, por uma ou mais administraçõesseparadas, ou por infusão contínua. Uma dosagem diariamente típica pode variar de cercade 1 pg/kg a cerca de 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores supramencionados. Paraadministrações repetidas por diversos dias ou mais, dependendo da condição, o tratamentoé sustentado até que ocorra uma supressão desejada dos sintomas da doença. Entretanto,outros regimes de dosagem podem ser usados. Tipicamente, o médico administrará umanticorpo (sozinho ou em combinação com um segundo composto) da invenção até queuma dosagem(s) seja atingida que forneça o efeito biológico exigido. A progressão daterapia da invenção é facilmente monitorada por técnicas e ensaios convencionais.

Por exemplo, um anticorpo CD4 não depletável TRX1 é opcionalmenteadministrado da maneira descrita anteriormente ou na publicação do pedido de patente U.S.2003/0108518 ou 2003/0219403. Em uma modalidade, 3-5 mg/kg (mg de anticorpo por kgde peso corpóreo do sujeito) são administrados ao sujeito, sozinhos ou em combinação comum segundo composto da maneira aqui descrita, e o tratamento é sustentado até que umasupressão desejada dos sintomas da doença ocorra. O anticorpo não depletável éopcionalmente administrado por um período de tempo a fim de manter no sujeito níveisapropriado de anticorpo (ou se o anticorpo é usado em combinação com um segundocomposto, níveis apropriados da combinação do anticorpo e segundo composto) para obtere manter supressão de sintomas.

O anticorpo CD4 não depletável pode ser administrado por quaisquer meiosadequados, incluindo administração parenteral, tópico, subcutâneo, intraperitonial,intrapulmonar, intranasal, e/ou intralesional. Infusões parenteraís incluem administraçãointramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitonial, ou subcutânea. Administraçãointratecal é também contemplada (ver, por exemplo, publicação de pedido de patente U.S.2002/0009444 por Grillo- Lopez). Além do mais, o anticorpo pode ser adequadamenteadministrado por infusão pulsado, por exemplo, com doses decrescentes do anticorpo.Preferivelmente, a dosagem é dada intravenosamente ou subcutaneamente, eopcionalmente por infusão(s) intravenosa(s). Cada exposição pode ser fornecida usando omesmo ou um diferente meio de administração. Em uma modalidade, cada exposição é poradministração intravenosa.

Da maneira notada, o anticorpo CD4 não depletável pode ser administrado sozinhoou em combinação com pelo menos um segundo composto. Estes segundos compostos sãogeralmente usados nas mesmas dosagens e com vias de administração conforme usado atéagora, ou cerca de 1 a 99 % das dosagens até agora empregadas. Se tais segundoscompostos forem usados, preferivelmente eles são usados em menores quantidades do quese o anticorpo CD4 não depletável não estivesse presente, de maneira a eliminar ou reduzirefeitos colaterais causados.

Também da maneira notada, uma variedade de segundos compostos adequadossão conhecidos na tecnologia, e métodos de dosagens e administração para tais segundoscompostos foram igualmente descritos. Apenas como um exemplo, o anticorpo CD4 nãodepletável pode ser administrado em combinação com ciclofosfamida, para tratamento delupus (ou MS, artrite reumatóide, ou doença do intestino inflamatório, ou outra desordem damaneira aqui descrita). Uma variedade de regimes de tratamento de ciclofosfamida foidescrita na literatura. Regimes exemplares incluem, mas sem limitações, administraçãointravenosa de 0,5-1,0 g/m2 mensalmente durante seis meses e então a cada três meses emmeses; e administração intravenosa de 500 mg a cada duas semanas durante trêsmeses; administração oral de 1-3 mg/kg por dia durante doze semanas ou seis meses. Ver,por exemplo, Petri (2004) "Cyclosphosphamide: new approaches for systemic Iupuserythematosus" Lupus 13:366-371 e Petri e Brodsky (2006) "High- dose Cyclosphosphamideand stem cell transplantation for refractory systemic Iupus erythematosus" JAMA 295:559-560.

A administração do anticorpo anti-CD4 não depletável e qualquer segundocomposto da invenção pode ser feita simultaneamente, por exemplo, como uma composiçãoúnica ou como duas ou mais composições distintas usando as mesmas ou diferentes viasde administração. Alternativamente, ou adicionalmente, a administração pode ser feitaseqüencialmente, em qualquer ordem. Em certas modalidades, intervalos varando deminutos a dias, de semanas a meses, podem ser apresentados entre as administrações deduas ou mais composições. Por exemplo, o anticorpo anti-CD4 não depletável pode seradministrado primeiro, seguido pelo segundo composto da invenção. Entretanto,administração simultânea ou administração do segundo composto da primeira invenção étambém contemplada.

Da maneira notada anteriormente, um terceiro, quarto, etc. composto éopcionalmente administrado em combinação com o anticorpo CD4 não depletável e osegundo composto. Similarmente, tratamento para sintomas secundários ou relacionados aIupus (por exemplo, espasticidade, incontinência, dor, fadiga) ou MS, artrite reumatóide,doença do intestino inflamatório, ou outra condição ou doença pode ser administrado aosujeito, por exemplo, durante o tratamento com o anticorpo CD4 não depletável oucombinação.

FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS

Formulações farmacêuticas dos anticorpos usados de acordo com a presenteinvenção, são preparadas para armazenamento misturando um anticorpo CD4 nãodepletável tendo o grau de pureza desejada com veículos, excipientes, ou estabilizadoresfarmaceuticamente aceitáveis opcionais (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol, A. Ed. (1980)), na forma de formulações Iiofilizadas ou soluções aquosas. Veículos,excipientes ou estabilizadores aceitáveis são não tóxicos para recipientes nas dosagens econcentrações empregadas, e incluem tampões tais como fosfato, citrato, e outros ácidosorgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais comocloreto de octadecildimetilbenzil de amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio,cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquila parabéns tais como metilaou propila paraben; catecol; resorcinol; cicloexanol; 3-pentanol; e m-cresol); baixo pesomolecular (menos que cerca de 10 resíduos) polipeptídeos; proteínas, tais como albuminasérica, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona;aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, ou lisina;monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos incluindo glicose, manose, oudextrinas; agentes quelantes tal como EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol, trealoseou sorbitol; íons contadores de formação de sal tais como sódio; complexos metálicos (porexemplo, complexos de Zn-proteína); e/ou não iônico agentes tensoativos tais comoTween®, Pluronics®, ou PEG.

Formulações Iiofilizadas adaptada para administração subcutânea são descritas,por exemplo, em Patente U.S 6.267.958 (Andya et al.). Tais formulações Iiofilizadas podemser reconstituídas com um diluente adequado para uma alta concentração de proteína e aformulação reconstituída pode ser administrada subcutaneamente ao mamífero a ser tratadoaqui. Formas cristalizadas do anticorpo são também contempladas. Ver, por exemplo, U.S.2002/0136719A1 (Shenoy et al.).

A formulação aqui pode também conter pelo menos um segundo composto damaneira necessária para a indicação particular no tratamento, preferivelmente aquela comatividades complementares que não afeta adversamente uma a outra. Por exemplo, elapode ser desejável para fornecer adicionalmente um agente citotóxico (por exemplo,metotrexato, ciclofosfamida, ou azatioprina), agente quimioterpêutico, agenteimunossupressor, citicina, antagonista ou anticorpo de citicina, fator do crescimento,hormônio, integrina, antagonista ou anticorpo de integrina (por exemplo, um anticorpo LFA-1, ou um anticorpo alfa 4 integrina tal como natalizumab), medicamento da classe interferontais como IFN-beta-1a ou IFN-beta-1b, um oligopeptídeo tais como acetato de glatirâmero,imunoglobulina intravenosa (gama globulina), medicamento que depleta linfócito (porexemplo, mitoxantrona, ciclofosfamida, CamPath® anticorpos, ou cladribina), medicamentoimunossupressor que não depleta linfócito (por exemplo, MMF ou ciclosporina),medicamento para diminuir colesterol da classe "estatina", estradiol, medicamento que tratasintomas secundários ou relacionados a lupus, MS, artrite reumatóide, ou doença dointestino inflamatório (por exemplo, espasticidade, incontinência, dor, fadiga), um inibidor deTNF, DMARD, NSAID, corticosteróide (por exemplo, metilprednisolona, prednisona,dexametasona, ou glicocorticóide), levotiroxina, ciclosporina A, somatastatina análogo, antimetabólito, um antagonista/anticorpo da superfície da célula T ou B, etc., ou outros damaneira notada anteriormente na formulação. O tipo e quantidade efetivos de outrosagentes como estes depende, por exemplo, da quantidade de anticorpo presente naformulação, o tipo de lupus ou MS ou outra condição ou doença em tratamento, eparâmetros clínicos dos sujeitos.

Os ingredientes ativos podem também ser aprisionados em microcápsulaspreparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, porexemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou gelatina e microcápsulas poli-(metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de distribuição medicamento de coloidal(por exemplo, lipossomos, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas enanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são reveladas, por exemplo, emRemington1S Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, Um. Ed. (1980).Preparações de liberação sustentada podem ser preparadas. Exemplos adequadosde preparações de liberação sustentada incluem matrizes semipermeável de polímeroshidrofóbicos sólidos contendo o anticorpo não depletável, cujas matrizes são na forma deartigos formados, por exemplo, filmes, ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberaçãosustentada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hídroxietil-metacrilato), oupoli(vinilálcool)), polilactídeos (Patente U.S 3.773.919), copolímeros de ácido L- glutâmico eγ etil-L-glutamato, acetato de etileno-vinil não degradável, copolímeros de ácido lático-ácidoglicólico degradáveis tais como o Lupron Depot® (microesferas injetáveis compostas decopolímero de ácido lático-ácido glicólico e acetato de leuprolido), e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.

As formulações a ser usadas para administração in vivo devem ser estéreis. Isto érapidamente realizado por filtração através de membranas de filtração estéreis.

ARTIGOS DE FABRICAÇÃO

Em uma outra modalidade da invenção, é fornecido um artigo de fabricaçãocontendo materiais usados para o tratamento de lupus, MS, artrite reumatóide, doença dointestino inflamatório, ou outra condição ou doença descrito anteriormente. Preferivelmente,o artigo de fabricação compreende (a) um recipiente que compreende uma composiçãocompreendendo um anticorpo CD4 não depletável e um farmaceuticamente aceitáveisveículo ou diluente dento do recipiente; e (b) um encarte da embalagem com instruções paratratar lupus, MS, artrite reumatóide, doença do intestino inflamatório, ou outra condição oudoença em um sujeito por administração do anticorpo, sozinho ou em combinação com pelomenos um segundo composto.

O encarte da embalagem está no recipiente ou associado a ele. Recipientesadequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, etc. Os recipientes podem serformados de uma variedade de materiais tais como vidro ou plástico. O recipiente retém oucontém uma composição que é efetiva para tratar o lupus, MS, artrite reumatóide, doença dointestino inflamatório, ou outra condição ou doença e pode ter um orifício de acesso estéril(por exemplo, o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa ou um frasco tendo umtampão perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo nacomposição é o anticorpo não depletável. O rótulo ou encarte de embalagem indica que acomposição é usada para tratar lupus, MS, artrite reumatóide, doença do intestinoinflamatório, ou outra condição ou doença em um sujeito elegível para o tratamento comdiretriz específica com relação a quantidades de dosagens e intervalos de anticorpo equalquer outro medicamento sendo fornecido.

O artigo de fabricação pode compreender adicionalmente um segundo recipientecompreendendo um tampão diluente farmaceuticamente aceitável, tais como águabacteriostática para injeção (BWFT), solução salina tamponada com fosfato, solução deRinger, e solução de dextrose. O artigo de fabricação opcionalmente compreende umsegundo ou terceiro recipiente compreendendo um segundo composto, tal como qualquerdaqueles aqui descritos, onde o artigo compreende adicionalmente instruções no encarte daembalagem para tratar o sujeito com o segundo composto.

Alternativamente, a composição compreendendo o anticorpo CD4 não depletávelpode também compreender o segundo composto. O artigo de fabricação podeadicionalmente incluir outros materiais desejáveis de um ponto de vista comercial e usuário,incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, e seringas.EXEMPLOS

Deve-se entender que os exemplos e modalidades aqui descritos são compropósitos apenas ilustrativos e que várias modificações ou mudanças sob a luz destesserão sugeridos pelos versados na tecnologia e devem estar incluídas no espírito e alcancedeste pedido de patente e escopo das reivindicações anexas. Dessa maneira, os exemplosseguintes são oferecidos para ilustrar, mas não limitar, a invenção reivindicada.

EXEMPLO 1: TRATAMENTO DE LUPUS COM ANTICORPO CD4 NÃODEPLETÁVEL, SOZINHO E EM COMBINAÇÃO

A seguir é apresentado uma série de experimentos que demonstrou que umanticorpo CD4 não depletável é eficaz em um modelo pré-clínico de SLE. O desempenho doanticorpo é comparado àquele de padrão exemplar de tratamentos cuidadosos eexperimentais.

Camundongos NZBxW F1 exibem doença renal similar ao Iupus espontânea,fornecendo um modelo usado de eficácia pré-clínica de SLE (ver, por exemplo,Theofilopoulos (1992) "Murine models of sistemic Iupus erythematosus" in sistemic Iupuserythematosus, Lahita (ed.) Churchill Livingstona, New York, 121-194). A figura 5 ilustraesquematicamente o progressão da doença pela idade neste modelo. Sintomas observadosincluem a aparência de anticorpo ds-DNAs, proteinúria, histopatologia renal, aumento denitrogênio na uréia sangüínea (BUN), e aumento de mortalidade. A seta indica os pontos detempo nos quais o tratamento com o anticorpo CD4 não depletável iniciou em dois estudoscomparando o anticorpo com outros tratamentos.

Neste modelo, eficácia pré-clínica de anticorpo CD4 não depletável de rato YTS177(Cobbold et al. (1990) "The induction of skingraft tolerance in MHC-mismatched or primedrecipients: primed cells Tcan be tolerized in the periphery with CD4 and CD8 antibodies" EurJ Imunol 20:2747-2755) comparado àquele de um anticorpo de controle de não ligação(controle Ab ou controle Ig), CTLA4-lg (em desenvolvimento clínico), e ciclofosfamida(Cytoxan®, CTX; um padrão atual de tratamento cuidadoso). O anticorpo CD4 não depletávelYTS 177 foi uma doação de Herman Waldmann, Oxford. O anticorpo de controle foi umanticorpo IgGI de camundongo irrelevante (um anticorpo de camundongo conforme usadopara o controle uma vez que um anticorpo de rato irrelevante elicitaria uma resposta imunecontra si próprio, influenciando o curso da doença; o anticorpo anti-CD4 de rato impede umaresposta como essa a si próprio). A construção CTLA4-lg usado inclui o domínio extracelularde CTLA-4 de murino fundido na dobradiça C3 de IgGI humano, domínios Ig de C4 e émodelado após Linsley et al. (1991) I Exp Med 174(3):561.

Aos 8 meses de idade, camundongos NZB χ NZW foram selecionados porproteinúria e randomizados em 5 grupos baseado nas suas classificações de proteinúria.

Nesta idade, a doença é considerada ser moderada-severa. No início de ação doexperimento, cada grupo de 19 camundongos foi composto da seguinte distribuição deconcentrações de proteína na urina: 32 % a >300 mg/dL; 24 % a 100-300 mg/dL; e 44 % a30-100 mg/dL. Os camundongos foram tratados continuamente por 6 meses tanto comanticorpo de controle (controle Ab ou controle lg), YTS 177 (anti-CD4 não depletável),CTLA4-lg, ciclofosfamida (CTX), quanto um combinação de anti- CD4 e CTX. YTS 177 eCTLA4-lg foram distribuídos 3 x/semana a 5 mg/kg por injeção intraperitonial (IP);ciclofosfamida (CTX) foi dado IP a 50 mg/kg a cada 10 dias (sozinho ou em combinaçãocom a quantidade de YTS 177 indicada). Os camundongos foram monitorados pormudanças em concentração de proteína na urina (por exemplo, proteinúria), Nitrogênio deUréia no Sangue (BUN), e sobrevivência.

Da maneira mostrada na figura 6, administração do anticorpo CD4 não depletávelatrasou o tempo de progressão (Figura 6A), aumentou a sobrevivência (Figura 6B), diminuiua proteinúria (dados para 5 meses após o tratamento são mostrados, Figura 6C), e diminuiuBUN médio (Figura 6D).

O tratamento com o anticorpo CD4 não depletável pode reverter nefrite lúpicasevera, da maneira mostrada na figura 7. A figura 7A ilustra a porcentagem decamundongos em 300 mg/dL de proteinúria no tempo indicado após o tratamento. Aadministração do anticorpo CD4 não depletável sozinho ou em combinação comciclofosfamida resultou em uma diminuição líquida em camundongos que apresentam >300mg/dL de proteinúria, indicando uma reversão de sintomas de nefrite em bem no últimoestágio da doença que não foi observado em grupos tratados com o anticorpo de controle,CTLA4-lg, ou ciclofosfamida sozinho. A figura 7B mostra a porcentagem de camundongosrevertidos com 300 mg/dL de proteinúria no primeiro mês de tratamento. (Figura 7B ilustradados compilados de quatro estudos incluindo um aqui descrito e três estudos similares.Dados incluem apenas camundongos cuja proteinúria foi >300 mg/dL no momento do iníciode ação do tratamento.) Um efeito sinergístico na capacidade de reverter proteinúria foi vistoquando o anticorpo CD4 foi combinado com ciclofosfamida (CTX).

O tratamento com uma combinação do anticorpo CD4 não depletável eciclofosfamida é também efetivo na diminuição de proteinúria. A figura 9 ilustra análisemúltipla de comparação de proteinúria no mês 6 do tratamento, usando método de Dunnettcom o grupo ciclofosfamida tratado como o grupo de controle de referência na figura 9A e ogrupo de anticorpo CD4 não depletável tratado como o grupo de controle de referência nafigura 9B. Os controles de referência são designados em negrito, e apenas valores ρ paragrupos que obtêm significado estatístico vs. o controle de referência são designados nográfico. Os resultados novamente demonstram que o anticorpo CD4 não depletável foisuperior ao CTLA4-lg na diminuição de proteinúria (ver, por exemplo, Figura 9B). Osresultados também demonstram que a combinação do anticorpo CD4 não depletável eciclofosfamida forneceu benefício significativo em ciclofosfamida sozinha na diminuição deproteinúria no modelo (ver, por exemplo, Figura 9A).

Exame de sessões renais manchadas por CD4 e CD8 revelou infiltrados linfocíticosno interstício renal medular ou pélvico em camundongos após quatro meses de o tratamentocom anticorpo de controle. O tratamento com o anticorpo CD4 ou com CTLA4-lg, na outramão, resultou em uma redução nas células CD4+ observadas no interstício renal nos quatromeses após o tratamento. O tratamento com anticorpo CD4 não afeta o número de células TCD8+ observdas no rim.

Tratamento de camundongos NZBxW F1 que apresentam doença renal similar aoIupus espontânea (modelo camundongo SLE) com o anticorpo CD4 não depletável tambémlimitou o aumento no tituladores do anticorpo ds-DNA. Da maneira mostrada na figura 8, oaumento no tituladores de anticorpo de ds-DNA com o tempo foram menos em animaistratados no anticorpo CD4 não depletável comparado aos animais tratados com o anticorpode controle. Comparar a figura 8A, mostrando titulador em questão (um média aproximadade Iog 3 por cada um dos grupos de tratamento), com a figura 8B, mostrando titulador trêsmeses após o tratamento (aproximadamente Iog 3,5 e Iog 4,5 para o grupos de tratamentode anticorpo de controle e anti-CD4 não depletáveis, respectivamente). Neste experimento,o tratamento iniciou aos seis meses de idade em vez de oito meses de idade.

Além do mais, o tratamento com o anticorpo CD4 diminuiu o número de células TCD4+ ativadas encontradas no baço, da maneira determinada por citometria de fluxo comanticorpos direcionados para proteínas superficiais associadas com ativação de célula T. Damaneira mostrada na figura 8, tanto as o número de células CD4+CD69+ (Figura 8C) quantocélulas CD4+CD25+ (Figura 8D) encontradas no baço três semanas após o tratamentoforam menos nos animais tratados com anticorpo CD4 não depletável comparado aosanimais tratados com anticorpo de controle (tratamento iniciado aos oito meses de idade).

O tratamento com o anticorpo CD4 não depletável foi também efetivo quandointroduzido em doença branda em vez de doença severa moderada. Camundongos NZB χNZW aos seis meses de idade, todos em 30-100 mg/dL de proteinúria, foram tratados comcontrole Ab1 YTS 177 (anti-CD4 não depletável), CTLA4-lg, ou ciclofosfamida (Cytoxan®)basicamente da maneira descrita anteriormente. Os camundongos foram monitorados pormudanças em proteinúria e sobrevivência. Da maneira mostrada na figura 6, aadministração do anticorpo CD4 não depletável começando aos seis meses de idadeatrasou o tempo de progressão (Figura 6E) e aumentou a sobrevivência (Figura 6F) comrelação ao controle, demonstrando que o anticorpo CD4 não depletável é altamente efetivoquando introduzido na doença branda. (Todos os tratamentos são muito efetivos quandocomparados ao controle: no tempo de progressão para 7 meses *p<0,025 (Figura 6E) esobrevivência *p<0,04 (Figura 6F).)

Em resumo, o tratamento com o anticorpo CD4 não depletável foi eficiente emcamundongos NZBxW F1 quando introduzidos cedo ou tarde na doença. O tratamento como anticorpo estendeu a progressão sem doença e sobrevivência, atrasou a elevação de BUNe o desenvolvimento de glomerulonefrite, limitou o aumento nos tituladores de anti-dsDNA, ediminuiu aos números de célula T CD4+ ativadas. O efeito observado com o anticorpo nos 5ou 6 meses de tratamento foi comparáveis àquele de ciclofosfamida e superior àquele deCTLA4-lg na redução de proteinúria; o distinção entre anti-CD4 e CTLA4-lg foi maisevidente última doença. Além do mais, combinar o anticorpo CD4 não depletável comciclofosfamida forneceu benefício significativo em ciclofosfamida sozinho no modelo NZBAVF1 de SLE.

Procedimentos experimentais

Urinálise

Proteinúria foi medida usando um Clinitek® 50 Urine Chemistry Analyzer (BayerCorporation, Elkhart, EM, USA). Uma gota de urina frescamente coletada foi colocada emum strip reagente (Multistix® 10 SG, Bayer), e o strip foi imediatamente inserido noanalisador após a remoção do excesso de urina por blott com uma esponja de gaze limpa.

Medições de Níveis de Nitrogênio de Uréia no sangue

Nitrogênio de uréia no sangue foi medido usando um analisador químico CobasIntegra® 400 (Roche Diagnostics, Basel1 Suíça) e reagente detecção de uréia (tambémfornecido pela Roche Diagnostics) de acordo com as instruções do fabricante. Controles desoro humano Iiofilizado Precinorm™ e Precipath™ (Roche Diagnostics) foram usados comocontroles normais e anormais, respectivamente.

Manchamento de sessões renais para CD4 e CD8

Para CD4/CD8 imunoistoquímico duplo marcado, sessões congeladas de 5 micronde espessura do rim foram cortadas e fixadas em acetona resfriada no gelo (-20° C) por 5minutos, rinsadas 2X5 minutos em TBS/Tween 20 0,1 % (TBST), e em seguida bloqueadaspor atividade de peroxidase endógena com glicose oxidase por 1 hora a 37 0 C. Sessõesforam em seguida rinsadas em TBST e bloqueadas por avidina/biotina endógena usando umestojo de bloqueio avidina/biotina do Vector Labs (Vector Labs, Burlingame, CA). Apósrinsagem adicional em TBST, imunoglobulinas endógenas foram bloqueadas com soro decoelho 10 %/BSA/TBS 3 % por 30 minutos a temperatura ambiente (RT).

Para marcação de CD8, as sessões foram incubadas com anticorpo monoclonalCD8 de rato anti-camundongo biotinilado (MAb), clone 53,6-7 (Pharmingen, San Diego1 CA),a 8 ug/mL por 1 hora a RT. Para o controle negativo, um isótipo naive, lgG2a de rato,conforme usado como os anti-soros primários. Após rinsagem em TBST, as sessões foramincubadas em reagente Vectastain ABC-EIite (Vector Labs) por 30 minutos a RT. A reaçãodo manchamento foi em seguida visualizado usando DAB metal melhor como o cromogênio(Pierce Biotechnology, Rockford, IL).

For marcação secundária com anticorpo CD4, as sessões foram uma veznovamente bloqueadas por avidina/biotina (da primeira reação) usando o estojo de bloqueioVector Labs avidina/biotina. As sessões foram em seguida incubadas com um rato anti-camundongo CD4 MAb, clone RM4-4 (Pharmingen) a 0,5 ug/mL por 1 hora a RT. Para ocontrole negativo, um isótipo naive, lgG2b de rato, conforme usado como os anti-sorosprimários. Após rinsagem em TBST, as sessões foram em seguida incubadas comcomplexo estreptavidina-HRP de um estojo TSA™ (amplificação de sinal de tiramida)(Perkin-Elmer LAS Inc., Boston MA) por 30 minutos a RT. Após rinsagem em TBST, assessões foram em seguida incubadas com reagente de amplificação TSA™ biotinilado(Perkin-Elmer LAS Inc) por 3 minutos a RT seguido por uma segunda rodada deestreptavidina-HRP por 30 minutos a RT. A reação do manchamento foi em seguidavisualizada usando Vetor® Red (Vetor Labs) como o cromogênio.

Sessões marcadas duplas foram em seguida ligeiramente contramanchadas comhematoxilina de Myer por 1 minuto, rinsadas em água de torneira e cobertas com lamínulausando Crystal/Mount (Biomeda Corporation, Foster City, CA).

Determinação de tituladores de anticorpo de fita de DNA duplaTituladores de anticorpo de Anti ds-DNA foram determinados por ELISA. Placas de384 poços imunoplaca Nunc MAXIsorb (número 464718) foram revestidas com poli-L-lisina(25 uL por poço, Sigma 0,01 % P4707) por 1 hora a RT, lavada com água deionizada, secoao ar a RT por 1 hora, e em seguida revestidas com DNA de timo de bezerro (Sigma D1501,25 μL por poço, 2,5 jug/mL em PBS) a 4°C por toda a noite. A solução de DNA de timo debezerro foi decantada da placa, 50 //L de tampão de bloqueio (PBS, BSA 0,5 % pH 7,2) foiadicionado, e a placa foi agitada por 1 hora a RT. A placa foi em seguida lavada três vezescom tampão de lavagem (PBS, Tween™ 0,05 % 20 (polioxietileno(20) monolaurato desorbitano), pH 7,2).

Diluições seriais de amostras de soro em tampão de ensaio (PBS, BSA 0,5 %,Tween™ 0,05 % 20, Proclina 0,01 % 3000) foram preparadas; uma diluição 25 vezes inicialfoi seguida por diluições 3 vezes seriais realizadas com um sistema de pipetaçãoautomatizada Precision 2000™. Diluições seriais de soro de controle negativo (umagrupamento de soro de camundongo com um nível anticorpo de anti-dsDNA baixo ou defundo) foram preparadas da mesma maneira. Uma ou mais diluições de um soro de controlepositivo são opcionalmente também preparadas (por exemplo, uma diluição de 5.000 vezesde soro NZB F1).

Amostras de soro diluídas foram adicionadas à placa lavada, por exemplo, usandoum robô de placa rápido para adicionar 25 ul de soro diluído. A placa foi incubada por 2horas a RT com agitação branda, em seguida lavada seis vezes com tampão de lavagem.Anticorpo Fc anti-camundongo conjugado - HRP (peroxidase do rábano silvestre) foiadicionado a cada poço (25 μΙ_ de anti-mu-FcHRP pela Jackson ImunoResearchLaboratories, Inc., número de catálogo 115-035-071, diluído 5.000 vezes em tampão deensaio), e a placa foi incubada a RT por 1 hora com agitação branda. Solução de substrato(25 pL por poço; uma parte de substrato de TMB mais uma parte de Solução B Peroxidase,ambas obtidas pela Kirkegaard & Perry) foi adicionada, e a cor foi desenvolvida. Solução deparada foi adicionada (25 /vL por poço de IM H3P04)- e a placa foi lida a 450/620 nm.

Tituladores de anticorpo de Anti ds-DNA para as amostras de soro foram calculadosusando a seguinte fórmula:

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onde CP (o ponto de corte) é 3 vezes a absorbância do soro de controle negativomédio; A450/620 alto é a absorbância (A450/620) que está mais próxima, mas mais alta em valordo que o ponto de corte; A450m2Q baixo é a absorbância (A450Z620) que está mais próximo, masmenor em valor do que o ponto de corte; DF1 é o fator de diluição do valor de A450Z620 baixomais próximo, mas menor em valor do que o ponto de corte; e DF2 é o fator de diluição dovalor de A450Z62OaIto1 mais próximo, mas maior em valor do que o ponto de corte.

Citometria de fluxo

Números de células T CD4+ ativadas encontradas no baço foram determinados porcitometria de fluxo da maneira a seguir. Todos os baços foram colhidos e triturados emsuspensões de célula única, que foram em seguida Iisados com célula de sangue vermelhausando tampão EL (tampão Iisis de eritrócito, pela Qiagen, Valencia, CA, número decatálogo 79217), passados através de um filtro de célula de 70 micron, e em seguida ré-suspensos por contagens de célula. Um volume fixado de cada suspensão de célula foimisturado com uma solução de microesfera fluorescente (Polisciences, Inc., número decatálogo 18862) de concentração conhecida. A mistura foi em seguida corrida em umcitômetro de fluxo FACScan™ pela BD Biosciences (Franklin Lakes1 NJ). Colecionandodiversas microesferas fixadas para cada mistura, o número total de células vivas pode sercalculado e subseqüentemente usado para determinar os números totais de subpopulaçãode célula para o baço de cada camundongo após análise FACS adicional.

Para células 1 χ 106, uma quantidade de saturação de anticorpos conjugados comfluorforo foi adicionada e incubada no gelo por 30 minutos, seguido por lavagem comtampão frio. Células do baço foram manchadas com anti-CD4 (BD Pharmingen, número decatálogo 553055, clone RM4-4), anti-CD3 (BD Pharmingen, número de catálogo 555276,clone 17A2), e anti-CD69 (BD Pharmingen, número de catálogo 553237, clone H1.2F3) oucom anti-CD4, anti-CD3, e anti-CD25 (Miltenyi Biotec, número de catálogo 130-091-013). Omanchamento CD3 facilitou a separação de células T CD4 e CD8, uma vez que células CD8são positivas para CD3 mas negativas para CD4. As amostras foram analisadas porcitometria de fluxo rm um citômetro de fluxo FACSCalibur™ pela BD Biosciences.

EXEMPLO 2: TRATAMENTO DE ESCLEROSE MÚLTIPLA COM ANTICORPOCD4 NÃO DEPLETÁVEL

É apresentada a seguir uma série de experimentos que demonstram que umanticorpo CD4 não depletável é eficiente em um modelo pré-clínico de MS. O desempenhodo anticorpo é comparado àquele de padrões exemplares de tratamentos cuidadosos eexperimentais.

Encefalomielite autoimune experimental (EAE) é uma condição inflamatória dosistema nervoso central (CNS) com similaridades com MS; em ambas doenças,demielinização resulta em condução do nervo prejudicado e paralisia. EAE recorrente eremitente induzido por injeção de peptídeo de proteína de proteolipídio (PLP) emcamundongos SJL/J fornece um modelo usado de eficácia pré-clínica de MS (ver, porexemplo, Miller and Karpus (1996) "Experimental Autoimmune Encephalomielitis in the mice"em Current Protocols in Imunology, Coligan et al. (eds.), John Wiley & Sons, Inc. and Sobelet al. (1990) "Acute experimental aliergic Encephalomielitis in SJL/J mice induced by thesynthetic peptide of myelin proteolipid protein" J Neuropathol Exp Neurol. 49(5):468-79).

A figura 10 ilustra esquematicamente a progressão da doença com o tempo após ainjeção do peptídeo PLP neste modelo. A injeção no dia 0 é seguida pelo início de ação dadoença (dias 0-15), remissão (dias 15-25), e recaída (dia 25-término do estudo nos dias 60-70). Classificações neurológicas clínicas padronizadas são projetadas da maneira a seguir:0 - nenhuma doença; 1 - cauda fraca ou fraqueza no membro traseiro, mas não em ambos;2 - cauda fraca e fraqueza no membro traseiro; 3 - paralisia parcial no traseiro membro; 4 -paralisia completa no membro traseiro; e 5 - estado moribundo, morte por EAE, sacrifício porrazões humanas. No esquema, a seta indica os pontos de tempo nos quais o tratamentocom o anticorpo CD4 não depletável iniciou nos estudos de comparação do anticorpo comoutros tratamentos. Os pontos indicam os pontos de tempo nos quais outros tratamentos semostraram previamente efetivos.

Neste modelo, eficácia pré-clínica de anticorpo CD4 não depletável comparadoàquele de um anticorpo de controle (descrito anteriormente), CTLA4-lg, um anticorpo alfa-4integrina, e acetato de glatirâmero (Copaxone®). Camundongos SJUJ foram imunizados nodia O com o peptídeo PLP-139-151 em CFA (adjuvante de Freund completo). Oscamundongos foram selecionados 3 x/semana para classificações da doença, da maneiranotada anteriormente; nos pontos finais terminais, histopatologia (cérebro e medulaespinhal) foram examinados. Se a terapia começa após o início de ação da doença, oscamundongos foram monitorados para classificações da doença, em seguida randomizadosem grupos com classificações da doença comparáveis antes do tratamento. Em três estudosseparados, o tratamento de anticorpo (ou outro) começa durante o início de ação da doençano dia 8, no pico de doença no dia 14, ou no dia 24. O anticorpo CD4 não depletável, oanticorpo de controle, CTLA4-lg, o anticorpo alfa-4 integrina, e acetato de glatirâmero foramdistribuídos 3 x/semana em 10 mg/kg.

Exceto onde indicado, nestes experimentos, o anticorpo CD4 não depletável usadofoi um anticorpo YTS 177 murinizado. YTS 177 murinizado incluiu as regiões variáveis decadeia pesada e leve do anticorpo rato YTS 177, clonados a montante de seqüênciasconstantes de cadeia leve kapa e cadeia pesada lgG2a de camundongo. A cadeia pesadaincluiu 2 substituições únicas de aminoácido na região de ligação do receptor de Fc(resíduos correspondentes a resíduos IgGI humano D265 e N297 foram trocados poralanina).

Da maneira ilustrada na figura 11, o anticorpo CD4 não depletável foi superior aCTLA4-lg e acetato de glatirâmero quando introduzido no início de ação da doença(tratamento iniciado no dia 8). A figura 11A apresenta um gráfico da classificação clínicacom o tempo para grupos tratados com o anticorpo de controle, acetato de glatirâmero, oanticorpo alfa-4 integrina, CTLA4-lg, e o anticorpo CD4. A figura 11B apresenta a médiadiária de classificações clínicas para estes grupos.

O anticorpo CD4 foi também superior a CTLA4-lg quando introduzido no pico dadoença (tratamento iniciado no dia 14), da maneira ilustrada na figura 12. A figura 12Aapresenta um gráfico da classificação clínica como tempo para grupos tratados com oanticorpo de controle, CTLA4-lg, e o anticorpo CD4, (acetato de glatirâmero e o anticorpoalfa-4 integrina são inefetivos neste ponto de tempo.) A figura 12B apresenta a média diáriade classificações clínicas para estes grupos. O efeito observado com o anticorpo CD4 érepresentativo de três experimentos independentes.

Da maneira ilustrada na figura 13, o anticorpo CD4 foi também superior a CTLA4-lgquando introduzido tarde na doença (tratamento iniciado no dia 24). A figura 13A apresentaum gráfico da classificação clínica com o tempo para grupos tratados com o anticorpo decontrole, CTLA4-lg, e o anticorpo CD4. A figura 13B apresenta a média diária declassificações clínicas para estes grupos. O efeito observado com o anticorpo CD4 nãodepletável é representativo de dois experimentos independentes.

O tratamento com um anticorpo CD4 não depletável diminuiu a demielinização emEAE1 da maneira mostrada na figura 14. O tratamento com o anticorpo (YTS 177 em vez deYTS 177 murinizado neste experimento) começa próximo ao pico da fase aguda da doença(dia 12) e continuou até o término do estudo no dia 80. Medulas espinhais foram colhidas,fixadas, e manchadas com corante Luxol Fast Blue (que mancha mielina intacta de azulescuro). As áreas salientadas representam áreas de demielinização. Camundongosselecionados são representativos da classificação de demielinização média por grupo.

O tratamento com o anticorpo GD4 (YTS 177 murinizado) também reduziu célula TCD4+ infiltrada no modelo EAE recorrente/remitente. Por exemplo, em sessões da medulaespinhal retiradas de animais no dias 60 após o início do tratamento no dia 14 e manchadaspor CD4 e CD8 da maneira descrita anteriormente no Exemplo 1, CD4+ mas não CD8+infiltrado foi reduzido em animais tratados com anticorpo CD4 comparado com animaistratados com anticorpo de controle.

Camundongos tratados com o anticorpo CD4 não depletável permaneceuimunocompetente, mostrando sobrevivência normal depois de infecção de Listeria. Porexemplo, no dia 8 depois da infecção de Listeria, 10/10 animais tratados com o anticorpoCD4 não depletável (YTS177 murinizado) sobreviveram, comparado com 8/10 animaistratados com o anticorpo Ig de controle, 3/10 animais tratados com CTLA4-lg, e 0/10animais tratados com TNFRH-Fc (Wooley et al. (1993) J of immunol 151(ll):6602).

Tratamentos começando um dia antes da inoculação com Listeria com uma dose inicial de20 mg/kg das terapêuticas, depois que todas terapêuticas foram dosadas a 5 mg/kg 3x/semana para duração do estudo.

Da maneira mostrada na figura 15, o tratamento com o anticorpo CD4seletivamente reduziu células CD4+ efetora/memória no sangue. O número de células TICOShlCD4 ou ICOShlCD8 por //L de sangue da maneira determinada por citometria de fluxosão apresentadas para animais tratados com o anticorpo de controle, o anticorpo CD4, ouCTLA4-lg. (ICOSh' é um marcador de células T efetora/memória, representando menos que4% de células T no sangue de camundongos normal e parece aumentar mediante odesenvolvimento EAE para aproximadamente 15-20 %.) Ao contrário de CTLA4-lg, oanticorpo CD4 não depletável diminuiu o número de células CD4+ sem diminuir em onúmero de células CD8+. Neste experimento, o tratamento iniciou no dia 14; as célulasforam contadas no dia 46.Em resumo, o tratamento com anticorpo CD4 não depletável é eficiente no modeloSJL/J de EAE recorrente/remitente. O tratamento com o anticorpo diminuiu as classificaçõesclínicas em todos pontos de tempo de intervenção, diminuiu a classificações de histologia nocérebro e medula espinhal, diminuiu CD4+ mas não CD8+ infiltrado em CNS, e diminuiu osnúmeros célula T ICOSh' CD4+ mas não CD8+. A eficácia do anticorpo CD4 foi superioràquela de CTLA4-lg e acetato de glatirâmero, e pelo menos correspondeu à do anticorpoalfa-4 integrina monoclonal.

O tratamento com anticorpo CD4 é também efetivo em um modelo MS diferente,peptídeo MOG induziu EAE em camundongos C57Blk6. O modelo MOG não mostraremissões periódicas e é assim mais um modelo agudo/crônica de MS. Uma reversão rápidaem sintomas neurológicos foi observada no modelo MOG, similares ao observado nomodelo SJL/J, quando o tratamento começa próximo ao pico da doença. Da maneiramostrada na figura 16, o tratamento com um anticorpo CD4 não depletável (ou umdepletável) diminuiu a classificação clínica comparado ao tratamento com anticorpo decontrole, CTLA4-lg, ou um anticorpo CD8 depletável.

Procedimentos experimentais

Citometria de fluxo

Números de células efetora/memória no sangue foram determinados por citometriade fluxo da maneira a seguir. Um volume de sangue fixado foi coletado retro-orbitalmenteem tubos heparinizados, em seguida célula de sangue vermelha lisadas, e ré suspensas pracontagens de célula. Um volume fixado de cada suspensão da célula foi misturado com umasolução de microesfera fluorescente de concentração conhecida para determinação denúmeros totais de subpopulação da célula para o sangue de cada camundongo, da maneiradescrita anteriormente no Exemplo 1.

Para células 1 χ 1061 uma quantidade de saturação de anticorpos conjugados comfluorforo foi adicionada e incubada no gelo por 30 minutos, seguido por lavagem comtampão frio. Células do sangue foram manchadas com anti-CD4 (BD Pharmingen, númerode catálogo 553055, clone RM4-4), anti-CD8a (BD Pharmingen, número de catálogo553033, clone 53-6.7), anti-ICOS biotinilados (BD Pharmingen, número de catálogo 552145,clone 7E.17G9), e em seguida lavadas. Células do sangue foram em seguida manchadascom estreptavidina-APC (BD Pharmingen, número de catálogo 554067), e lavadasnovamente. As amostras foram analisadas por citometria de fluxo em um FACSCaIibur pelaBD Biosciences.

Manchamento Luxol Fast Blue de Sessões da medula espinhal

Manchamento Luxol Fast Blue foi realizado em medula espinhal fixada emformalina embutida em parafina seccionada em 4//m. As sessões da medula espinhal foramdesparafinizadas e hidratadas com 95 % de etanol. Elas foram em seguida manchadas portoda a noite (pelo menos 16 horas) em Luxol Fast Blue a 60 °C. Corante em excesso foirinsado em 95 % de etanol, e as lâminas foram lavadas em dH20. As lâminas foram emseguida diferenciadas imergindo rapidamente em carbonato de lítio 0,05 % por 10 a 20segundos e em seguida passa por diversas mudanças de 70 % de etanol até que matériacinza e branca possa ser distinguida. Lâminas foram em seguida manchadas com cresilvioleta por 5 minutos a 37 °C, rinsadas em 95 % de etanol, desidratadas lentamente,clareadas e montadas. Ver Sheehan (1980) Theory and Practice of Histotechnoloqv. 2nd ed.pp. 263-264.

Infecção de Listeria

Os camundongos foram inoculados intravenosamente com 100.000 UnidadesFormadoras de Colônia de monocitógenos de Listeria (cepa #43251 de ATCC) em 100microlitros de PBS. Uma injeção IP dos anticorpos monoclonais ou proteínas de fusão (400ug por camundongo, equivalente a 20 mg/kgs, em 100 μL PBS) foi iniciada no dia anterior ainjeção de Listeria; doses de 100 pg (5 mg/kg) 3 vezes por semana continuaram por 10 diasapós injeções de Listeria. Os camundongos foram monitorados duas vezes diariamente parasinais de doença.

Geração de Listeria

A virulência de Listeria foi mantida por passagem serial em camundongos C57B1/6.Isolados frescos foram obtidos de baços infectados, crescidos em infusão de cérebro ecoração líquida (BHI) ou em placas ágar de BHI (Difco Labs, Detroit, Ml). As bactérias foramlavadas repetidamente, ré-suspensas em PBS estéril, e armazenadas a -80°C em PBS comglicerol 20 %.

EXEMPLO 3: TRATAMENTO DE LUPUS COM ANTICORPO CD4 EM COMBINAÇÃO COM MMF

É apresentado a seguir uma série de experimentos que demonstra que umanticorpo CD4 não depletável, sozinho e em combinação com micofenolato mofetil, éeficiente em um modelo pré clínico de SLE.

O modelo de camundongo NZBxW F1 de SLE foi descrito anteriormente noExemplo 1. Neste modelo, eficácia pré-clínica de um anticorpo CD4 não depletável (YTS177, descrito anteriormente) foi comparado ao de um anticorpo de controle de não ligação(descrito anteriormente), micofenolato mofetil (CelICept® ou MMF1 um tratamento atual), euma combinação do anticorpo CD4 e MMF.

O tratamento de Camundongos NZB χ NZW iniciou aos 9 meses de idade. Oscamundongos foram selecionados por proteinúria e randomizados em grupos com base emsuas classificações de proteinúria. No início de ação do experimento, cada grupo detratamento incluiu 15 camundongos, dos quais 73 % exibiram níveis de proteinúria de >300mg/dL. (Note que isto é um estado da doença mais severo do que aquele no qual otratamento iniciou nos experimentos descritos no Exemplo 1 anteriormente, em que apenas32 % dos os camundongos foram a >300 mg/dL de proteinúria.) Os camundongos foramtratados continuamente por dois meses tanto com controle Ab1 o anticorpo CD4 nãodepletável (anti- CD4), MMF (CelICept®), quanto uma combinação de anti-CD4 nãodepletável e MMF. Os camundongos foram monitorados para mudanças em proteinúria(urinálise foi realizado da maneira descrita anteriormente no Exemplo 1), progressão dadoença, e sobrevivência. O anticorpo CD4 não depletável (YTS 177) foi distribuído 3x/semana a 5 mg/kg por injeção intraperitonial (TP). MMF foi dado IP tanto a 25 mg/kgdiariamente quanto 50 mg/kg diariamente (sozinho ou em combinação com o anticorpo CD4).

Neste experimento, nos quais o tratamento iniciou em um estado severo da doença,os tratamentos individuais com o anticorpo CD4 ou com MMF não foram suficientes parareverter proteinúria significativamente severa (alguns camundongos melhoram, mas osnúmeros são insuficientes para conhecer o significado). Entretanto, combinar os tratamentossinergizados para mostrar um efeito significativo; da maneira mostrada na figura 17, umefeito sinergístico na capacidade de reverter proteinúria foi encontrado quando o anticorpoCD4 foi administrado em combinação com MMF. A figura 17A ilustra a porcentagem decamundongos em 300 mg/dL de proteinúria no tempo indicado após o tratamento. Aadministração do anticorpo CD4 em combinação com MMF (CelICept®) resultou em umadiminuição líquida em camundongos que apresentam >300 mg/dL de proteinúria, indicandouma reversão de sintomas de nefrite em doença muito tardia no estágio que não foiobservado em grupos tratados com o anticorpo de controle ou tratamentos individuais com oanticorpo CD4 ou MMF. A figura 17B mostra a porcentagem de camundongos revertidos de300 mg/dL de proteinúria depois de um mês de tratamento.

Da maneira mostrada na figura 18, a administração do anticorpo CD4 nãodepletável em combinação com MMF atrasou o tempo de progressão (Figuras 18A e 18C) eaumentou a sobrevivência (Figuras 18B e 18D), em ambas doses de MMF (50 mg/kg por dianas figuras 18A e 18B e 25 mg/kg por dia nas figuras 18C e 18D). A combinação deanticorpo CD4 não depletável e MMF foi mais efetiva tanto do que o anticorpo CD4 nãodepletável quanto do MMF sozinho. Nas figuras 18A-18D, os controles de referência (grupotratado com anticorpo de controle) são designados em negrito, e apenas valores ρ paragrupos que obtêm significado estatístico vs. o controle de referência são designados nográfico.

O tratamento com uma combinação do anticorpo CD4 e MMF foi efetivo nadiminuição de proteinúria. A figura 19 ilustra a análise múltipla de comparação de proteinúriano mês 2 de tratamento, usando método de Dunnett com o grupo tratado com anticorpo decontrole como o grupo de controle de referência. Resultados para grupos tratados com 50mg/kg diariamente de MMF sozinho ou em combinação com o anticorpo CD4 estãoapresentados na figura 19A, enquanto resultados para grupos tratados com 25 mg/kgdiariamente de MMF sozinho ou em combinação com o anticorpo CD4 estão apresentadosna figura 19B. O controle de referência (tratado com anticorpo de controle) é designado emnegrito, e apenas valores ρ para grupos que obtêm significado estatístico vs. o controle dereferência são designados nos gráficos. Os resultados demonstram que a combinação doanticorpo CD4 e MMF forneceu benefício significativo na diminuição de proteinúria nomodelo, enquanto o tratamento com anticorpo de controle, anti-CD4 sozinho ou MMFsozinho não mostram redução estatisticamente significativa em proteinúria.

O tratamento com uma combinação do anticorpo CD4 não depletável e MMFdiminuiu o número de células T CD4+ encontradas no baço. Da maneira mostrada na figura20C, o número de células T CD4+ esplênicas foram reduzidas em animais tratados por doismeses com a combinação, comparado aos animais tratados com anticorpo de controle(p=0,002). Efeitos do tratamento com a combinação foram também observados a jusante,por exemplo, em populações de célula B e célula dendrítica. Por exemplo, o tratamento comuma combinação do anticorpo CD4 e MMF diminuiu o número de células B B2 encontradasno baço, da maneira mostrada na figura 20D (com relação a animais tratados com anticorpode controle; p=0,017). A redução nas células T CD4+ esplênicas e células B B2 não foi porcausa da depleção das células pelo anticorpo, da maneira evidenciada pela contagem totalde célula T CD4+ e célula B B2 no sangue (Figuras 20A e 20B, respectivamente). De fato,-um aumento nos números de célula T CD4+ e célula B B2 no sangue foi notado nos grupostratados com MMF 50 mg/kg em combinação com o anticorpo CD4 e com MMF 25 mg/kg,respectivamente (embora estes aumentos não possam ser estatisticamente significativos).

Os números de célula T CD4+ e célula B B2 foram determinados por citometria de fluxobasicamente da maneira descrita anteriormente, usando anticorpos para identificar as váriaspopulações de célula e em seguida usando a porcentagem de cada população representada(de linfócitos totais) multiplicado pelo número total de linfócitos para determinar o número decada população, células B2 (a maioria das células B) foram identificadas por manchamentopositivo para B220 (CD45) e CD38. Anti-B220/CD45 e anti-CD38 foram pela BDPharmingen.

O tratamento com uma combinação do anticorpo CD4 não depletável e MMFtambém diminuiu o número de células plasmáticas IgM+, da maneira ilustrada na figura 20E.

O número de células plasmáticas IgM+ foi determinado por citometria de fluxo basicamenteda maneira descrita anteriormente. Células plasmáticas foram identificadas por suaexpressão de sindecan-1; as células plasmáticas IgM foram aquelas células positivassindecan-1 que também expressam IgM na sua superfície. Anticorpos para sindecan-1 eIgM foram da BD Pharmingen. Comparações foram realizadas usando método de Dunnettcom o grupo tratado de anticorpo de controle como o grupo de controle de referência(designado em negrito), e apenas valores ρ para grupos que obtêm significado estatísticovs. o controle de referência são designados no gráfico.

Similarmente, o tratamento com a combinação do anticorpo CD4 e MMF diminuiu onúmero de células plasmáticas mudadas por isótipo, da maneira mostrada na figura 20F. Onúmero de células plasmáticas mudadas por isótipo foi determinado por citometria de fluxobasicamente da maneira descrita anteriormente. Células plasmáticas foram identificadas porsua expressão de sindecan-1; as células positivas sindecan-1 que foram negativas paraexpressão IgM foram as células plasmáticas mudadas por isótipo (que expressam isótipossem ser IgM1 por exemplo, IgG, IgE, etc.). Anticorpos para sindecan-1 e IgM foram da BDPharmingen. Comparações foram realizadas usando método de Dunnett com o grupotratado de anticorpo de controle como o grupo de controle de referência (designado emnegrito), e apenas valores ρ para grupos que obtêm significado estatístico vs. o controle dereferência são designados no gráfico.

O tratamento com a combinação também reduziu o número de células B do centrogerminal, da maneira mostrada na figura 20G. O número de célula B do centro germinal foideterminado por citometria de fluxo basicamente da maneira descrita anteriormente. CélulasB do centro germinal foram identificadas com as células positivas de expressão superficialpara B220 e negativas para CD38 (distinguindo-as das células B2, que co-expressam B220e CD38). Anti-B220/CD45 e anti-CD38 foram da BD Pharmingen. Comparações foramrealizadas usando método de Dunnett com o grupo tratado de anticorpo de controle como ogrupo de controle de referência (designado em negrito), e apenas valores ρ para grupos queobtêm significado estatístico vs. o controle de referência são designados no gráfico.

Células dendríticas plasmacitóides são condutores potencialmente importantes delupus por causa de sua secreção de altas quantidades de interferons tipo I (alfa e betainterferons). É portanto vale a pena notar que o tratamento com o anticorpo CD4, sozinho ouem combinação com MMF, reduziu o número de células dendríticas plasmacitóidesesplênicas, da maneira mostrada na figura 20H. O número de células dendríticasplasmacitóides foi determinado por citometria de fluxo basicamente da maneira descritaanteriormente, células BeT foram excluídas usando marcadores CD19 e CD3,respectivamente; das células restantes, células dendríticas plasmacitóides foramidentificadas com base na sua expressão exclusiva de pDCA e sua expressão intermediáriade B220. Anticorpos foram da BD Pharmingen, exceto anti-pDCA que foi da Miltenyi.Comparações foram realizadas usando método de Dunnett com o grupo tratado deanticorpo de controle como o grupo de controle de referência (designado em negrito), eapenas valores ρ para grupos que obtêm significado estatístico vs. o controle de referênciasão designados no gráfico.Além disso, o tratamento com o anticorpo (sozinho ou em combinação com MMF)reduziu os níveis de expressão de MHC Ciasse Il nestas células dendríticas, da maneiramostrada na figura 201. Células dendríticas plasmacitóides foram identificadas por citometriade fluxo basicamente da maneira descrita anteriormente, usando um anticorpo direcionado apDCA (Miltenyi), e seus níveis de MHC Il foram avaliados com um anticorpo direcionado aum epítopo comum em moléculas MHC H IAd e IEd (BD Pharmingen). Comparações foramrealizadas usando método de Dunnett com o grupo tratado de anticorpo de controle como ogrupo de controle de referência (designado em negrito), e apenas valores ρ para grupos queobtêm significado estatístico vs. o controle de referência são designados no gráfico. Umavez que níveis de MHC H são geralmente ligados ao estado de ativação destas célulasdendríticas, com maiores níveis indicando um maior estado de ativação, esta observaçãoindica que o tratamento com o anticorpo CD4 pode reduzir o estado da ativação destapopulação de célula dendrítica.

Em resumo, o tratamento com o anticorpo CD4 não depletável, por exemplo, emcombinação com MMF, foi eficiente em camundongos NZBxW F1 mesmo quandointroduzido no final da doença. O tratamento com a combinação estendeu a progressão semdoença e sobrevivência e diminuiu os números de célula T CD4+ esplênicas. Além do mais,combinar o anticorpo CD4 não depletável com MMF forneceu benefício significativo emMMF sozinho na reversão de proteinúria do modelo NZBAV F1 de SLE. O anticorpo CD4não depletável sozinho foi também capaz de reduzir seletivamente os números de células Bdo centro germinal e células plasmáticas mudadas por isótipo sem afetar significativamentea maioria das células B (células B2). Além do mais, anti-CD4 foi capaz de reduzir osnúmeros de células dendríticas plasmacitóides, células que foram ligadas a patogênese deSLE pela sua produção de interferons Tipo 1 e IFN-alfa e beta.

Embora a invenção antecedente tenha sido descrita com alguns detalhes compropósitos de clareza e entendimento, fica claro os versados na tecnologia a partir de umaleitura desta revelação que várias mudanças na forma e detalhes podem ser feitas sem fugirdo verdadeiro escopo da invenção. Por exemplo, todas as técnicas e composições descritasanteriormente podem ser usadas em várias combinações. Todas as publicações, patentes,pedidos de patente e/ou outros documentos citados neste pedido de patente estãoincorporados pela referência na sua íntegra com todos propósitos como se cada publicação,patente, pedido de patente individual e/ou outro documento estivessem individualmenteindicados para ser incorporados pela referência com todos propósitos.<110> GENENTECH, INC. Lista9em de SeqüênciaIrving, Bryan

<120> "MÉTODOS DE TRATAR LUPUS USANDO ANTICORPOS CD4"

<130> 4023-000120PC

<140> PCT/US 07/006443

<141> 2007-03-14

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<170> Patentln version 3.4

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<212> DNA

<213> Artificial

<220><223> cadeia leve TRX1 <400> 22 atggaatgga tctggatctt tctcctcatc ctgtcaggaa ctcgaggtgt ccagtcccag 60gttcagctgg tgcagtctgg agctgaagtg aagaagcctg gggcttcagt gaaggtgtcc 120tgtaaggctt ctggatacac attcactgcc tatgttataa gctgggtgag gcaggcacct 180ggacagggcc ttgagtggat gggagagatt tatcctggaa gcggtagtag ttattataat 240gagaagttca agggcagggt cacaatgact agagacacat ccaccagcac agtctacatg 300gaactcagca gcctgaggtc tgaggacact gcggtctatt actgtgcaag atccggggac 360ggcagtcggt ttgtttactg gggccaaggg acactagtca cagtctcctc agcctccacc 420aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 480gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 600tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 660aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 720gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 780ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 840tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 900ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacgc cagcacgtac 960cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1020tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1080gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1140aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1200tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1260gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1320aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1380ctctccctgt ctccgggtaa atga 1404

<210> 23

<211> 467

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> cadeia leve TRX1<400> 23

Met Glu Trp Xle Trp Ile Phe Leu Leu Ile Leu Ser Gly Thr Arg Gly1 5 10 15

Val Gln Ser Gln Val Gln Leu vai Gln ser Gly Ala Glu vai Lys Lys20 25 30Pro Gly Ala Ser Val Lys Val ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe35 40 45

Thr Ala Tyr vai ile Ser Trp vai Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu50 55 60

Glu Trp Met Gly Glu Ile Tyr Pro Gly ser Gly Ser Ser Tyr Tyr Asn65 70 75 80

Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr ser Thr ser85 90 95

Thr vai Tyr Met Glu Leu Ser ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala vai100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg ser Gly Asp Gly ser Arg Phe vai Tyr Trp Gly115 120 125

Gln Gly Thr Leu vai Thr vai Ser ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser130 135 140

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser ser Lys Ser Thr ser Gly Gly Thr Ala145 150 155 160

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro vai Thr Val165 170 175

^er τΓρ Asn Ser Gly Ala Leu Thr ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala180 185 190

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser ser Val Val Thr Val195 200 205

Pro ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn vai Asn His210 215 220

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys225 230 235 240

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly245 250 255

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met' 260 265 270

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr cys Val vai Val Asp Val Ser His275 280 285

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val290 295 300His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr305 310 315 320

Arg vai vai Ser vai Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly325 330 335

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile340 345 350

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val355 360 365

Tyr Thr Leu Pro Pro ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser370 375 380

Leu Thr cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu385 390 395 400

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro405 410 415

Val Leu Asp Ser Asp Gly ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr vai420 425 430

Asp Lys ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys ser vai Met435 440 445

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys ser Leu ser Leu ser450 455 460

Pro Gly Lys465

<210> 24<211> 448<212> PRT<213> Artificial

<220>

<223> cadeia leve TRX1<400> 24

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu vai Lys Lys Pro Gly Ala15 10 15

Ser Val Lys Val ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr20 25 30

Val Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Glu Ile Tyr Pro Gly ser Gly ser ser Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe50 55 60

Lys Gly Arg vai Thr Met Thr Arg Asp Thr ser Thr ser Thr Val Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu ser ser Leu Arg ser Glu Asp Thr Ala vai Tyr Tyr cys85 90 95

Ala Arg Ser Gly Asp Gly Ser Arg Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala ser Thr Lys Gly Pro Ser vai Phe Pro115 120 125

Leu Ala Pro ser Ser Lys Ser Thr ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly130 135 140

cys Leu vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro vai Thr Val Ser Trp Asn145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln165 170 175

Ser ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser ser vai vai Thr Val Pro Ser ser180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile cys Asn Val Asn His Lys Pro ser195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys vai Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser225 230 235 240

vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile ser Arg245 250 255

Thr Pro Glu vai Thr cys Val Val vai Asp Val Ser His Glu Asp Pro260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr vai Asp Gly Val Glu vai His Asn Ala275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg vai vai290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr305 310 315 320Lys Cys Lys vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro He Glu Lys Thr325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu340 345 350

Pro Pro ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln vai Ser Leu Thr cys355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser vai Met His Glu Ala420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu ser Leu ser Pro Gly Lys435 440 445

<210> 25

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> cadeia leve TRX1<400> 25

Lys Ala ser Gln Ser vai Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn1 5 10 15

<210> 26

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> cadeia leve TRX1<400> 26

vai Ala Ser Asn Leu Glu Ser1 5

<210> 27

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> cadeia leve TRX1<400> 27

Gln Gln Ser Leu Gln Asp Pro Pro Thr1 5

<210> 28

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> cadeia leve TRX1

<400> 28

Ala Tyr Val Ile Ser1 5

<210> 29

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> cadeia leve TRX1<400> 29

Glu Ile Tvr Pro Gly ser Gly Ser ser Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe Lys15 10 15

Gly

<210> 30

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> cadeia leve TRX1

<400> 30

Ser Gly Asp Gly Ser Arg Phe Val Tyr1 5

Claims

1. Método de tratar Iupus em um sujeito mamífero, CARACTERIZADO pelo fato deque o método compreende: administrar ao sujeito uma quantidade terapeuticamente efetivade uma combinação de um anticorpo CD4 não depletivo e pelo menos um segundo compos-to selecionado do grupo que consiste em: ciclofosfamida, micofenolato mofetil e CTLA4-lg.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que osujeito é um humano.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que osegundo composto é ciclofosfamida.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que oanticorpo compreende um CDR tendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:27.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que oanticorpo compreende um CDR tendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID N0:30.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que oanticorpo compreende CDRs tendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:25, SEQ IDNO:26 e SEQ ID NO:27.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que oanticorpo compreende CDRs tendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:28, SEQ IDNO:29 e SEQ ID N0:30.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que oanticorpo compreende CDRs tendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:25, SEQ IDNO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID N0.28, SEQ ID NO:29 e SEQ ID N0:30.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que oanticorpo compreende uma seqüência de aminoácidos de cadeia leve apresentada na SEQID NO:3 e uma seqüência de aminoácidos de cadeia pesada apresentada na SEQ ID NO:6,uma seqüência de aminoácidos de cadeia leve apresentada na SEQ ID NO:9 e uma se-qüência de aminoácidos de cadeia pesada apresentada na SEQ ID NO: 12, uma seqüênciade aminoácidos de cadeia leve apresentada na SEQ ID NO: 15 e uma seqüência de amino-ácidos de cadeia pesada apresentada na SEQ ID NO: 18, ou uma seqüência de aminoáci-dos de cadeia leve apresentada na SEQ ID NO:21 e uma seqüência de aminoácidos de ca-deia pesada apresentada na SEQ ID NO:24.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que osujeito é um humano e em que o segundo composto é ciclofosfamida.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de queo lupus é nefrite lúpica.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de queo Iupus é nefrite lúpica classe II, nefrite lúpica classe III1 nefrite lúpica classe IV, ou nefritelúpica classe V.

13. Método, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de queapós o início do tratamento com a combinação, o sujeito apresenta uma redução em protei-núria e/ou uma redução em sedimento urinário ativo.

14. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de queo anticorpo compreende um CD4 ligando fragmento de um anticorpo que compreende umaseqüência de aminoácidos de cadeia leve apresentada na SEQ ID NO:3 e uma seqüênciade aminoácidos de cadeia pesada apresentada na SEQ ID NO:6, uma seqüência de amino-ácidos de cadeia leve apresentada na SEQ ID NO:9 e uma seqüência de aminoácidos decadeia pesada apresentada na SEQ ID NO: 12, uma seqüência de aminoácidos de cadeialeve apresentada na SEQ ID NO: 15 e uma seqüência de aminoácidos de cadeia pesadaapresentada na SEQ ID NO: 18, ou uma seqüência de aminoácidos de cadeia leve apresen-tada na SEQ ID NO:21 e uma seqüência de aminoácidos de cadeia pesada apresentada naSEQ ID NO:24..

15. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de queo anticorpo é um anticorpo CD4 que liga o mesmo epítopo como um anticorpo selecionadodo grupo que consiste em: um anticorpo compreendendo uma seqüência de aminoácidos decadeia leve apresentada na SEQ ID NO:3 e uma seqüência de aminoácidos de cadeia pe-sada apresentada na SEQ ID NO:6, um anticorpo compreendendo uma seqüência de ami-noácidos de cadeia leve apresentada na SEQ ID NO:9 e uma seqüência de aminoácidos decadeia pesada apresentada na SEQ ID NO: 12, um anticorpo compreendendo uma seqüên-cia de aminoácidos de cadeia leve apresentada na SEQ ID NO: 15 e uma seqüência de a-minoácidos de cadeia pesada apresentada na SEQ ID NO: 18, e um anticorpo compreen-dendo uma seqüência de aminoácidos de cadeia leve apresentada na SEQ ID NO:21 e umaseqüência de aminoácidos de cadeia pesada apresentada na SEQ ID NO:24.

16. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de queo anticorpo é um anticorpo humanizado.

17. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de queo anticorpo tem uma porção Fc aglicosilada.

18. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de queo anticorpo não se liga ao receptor Fc.

19. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de queo anticorpo compreende uma substituição de aminoácido em uma ou mais das posições deaminoácido 270, 322, 326, 327, 329, 313, 333, e/ou 334 da região Fe, cuja substituição alte-ra ligação C1q e/ou citotoxicidade dependente do complemento.

20. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de queo anticorpo compreende um receptor de ligação de epítopo de salvamento.

21. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de queo anticorpo compreende um peptídeo de ligação de albumina sérica.

22. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de queo anticorpo compreende três ou mais sítios de ligação de antígeno.

23. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de queo lupus é Iupus eritomatoso sistêmico.

24. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de queo lupus é lupus eritomatoso cutâneo.

25. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de queo lupus é nefrite lúpica.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de queo lupus é nefrite lúpica classe II, nefrite lúpica classe III, nefrite lúpica classe IV, ou nefritelúpica classe V.

27. Método de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de queapós o início do tratamento com a combinação, o sujeito apresenta uma redução em protei-núria e/ou uma redução no sedimento urinário ativo.

28. Método de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que,antes do início do tratamento com a combinação, o sujeito apresenta proteinúria, cuja prote-inúria é melhorada pelo tratamento.

29. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que,após o início do tratamento com a combinação, o Iupus é atenuado; o método compreen-dendo, após a observação da atenuação, interromper o tratamento do sujeito com a combi-nação e administrar ao sujeito uma quantidade terapeuticamente efetiva do anticorpo CD4não depletivo .

30. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que,após o início do tratamento com a combinação, o Iupus é atenuado; o método compreen-dendo, após a observação da atenuação, interromper o tratamento do sujeito com a combi-nação e administrar ao sujeito uma quantidade terapeuticamente efetiva do segundo com-posto ou de um ou mais outros compostos.

31. Método de tratar nefrite lúpica em um sujeito mamífero, CARACTERIZADO pe-lo fato de que o método compreende: administrar ao sujeito uma quantidade terapeutica-mente efetiva de um anticorpo CD4 não depletivo, em que após o início de tratamento com oanticorpo o sujeito apresenta uma melhora na função renal, uma redução em proteinúriae/ou uma redução no sedimento urinário ativo.

32. Método, de acordo com a reivindicação 31, CARACTERIZADO pelo fato de queo sujeito é um humano.

33. Método de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADO pelo fato de que,antes do início de tratamento com o anticorpo, o sujeito apresenta proteinúria maior que 500mg por dia, maior que 1.000 mg por dia, maior que 2.000 mg por dia, ou maior que 3.500 mgpor dia, cuja proteinúria é reduzida após o início de tratamento com o anticorpo.

34. Método, de acordo com a reivindicação 31, CARACTERIZADO pelo fato de queo anticorpo é selecionado do grupo que consiste em:a) um anticorpo que compreende uma seqüência de aminoácidos de cadeia leveapresentada na SEQ ID NO:3 e uma seqüência de aminoácidos de cadeia pesada apresen-tada na SEQ ID NO:6;b) um anticorpo que compreende uma seqüência de aminoácidos de cadeia leveapresentada na SEQ ID NO:9 e uma seqüência de aminoácidos de cadeia pesada apresen-tada na SEQ ID NO: 12;c) um anticorpo que compreende uma seqüência de aminoácidos de cadeia leveapresentada na SEQ ID NO: 15 e uma seqüência de aminoácidos de cadeia pesada apre-sentada na SEQ ID NO: 18;d) um anticorpo que compreende uma seqüência de aminoácidos de cadeia leveapresentada na SEQ ED NO.21 e uma seqüência de aminoácidos de cadeia pesada apre-sentada na SEQ ID NO:24;e) um anticorpo que compreende um fragmento de ligação de CD4 do anticorpo dea), b), c), ou d); f) um anticorpo que compreende um CDR tendo a seqüência deaminoácidos de SEQ ID NO:27;g) um anticorpo que compreende um CDR tendo a seqüência de aminoácidos deSEQ ID N0:30;h) um anticorpo que compreende CDRs tendo a seqüência de aminoácidos de SEQID NO:25, SEQ ID NO:26 e SEQ ID NO:27;i) um anticorpo que compreende CDRs tendo a seqüência de aminoácidos de SEQID NO:28, SEQ ID NO:29 e SEQ ID N0:30; ej) um anticorpo que compreende CDRs tendo a seqüência de aminoácidos de SEQID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29 e SEQ ID N0:30.

35. Método, de acordo com a reivindicação 31, CARACTERIZADO pelo fato de queo anticorpo é um anticorpo CD4 que liga o mesmo epítopo como um anticorpo selecionadodo grupo que consiste em: um anticorpo compreendendo uma seqüência de aminoácidos decadeia leve apresentada na SEQ ID NO:3 e uma seqüência de aminoácidos de cadeia pe-sada apresentada na SEQ ID NO:6, um anticorpo compreendendo uma seqüência de ami-noácidos de cadeia leve apresentada na SEQ ID NO: 9 e uma seqüência de aminoácidos decadeia pesada apresentada na SEQ ID NO: 12, um anticorpo compreendendo uma seqüên-cia de aminoácidos de cadeia leve apresentada na SEQ ID NO: 15 e uma seqüência de a -minoácidos de cadeia pesada apresentada na SEQ ID NO: 18, e um anticorpo compreen-dendo uma seqüência de aminoácidos de cadeia leve apresentada na SEQ ID NO:21 e umaseqüência de aminoácidos de cadeia pesada apresentada na SEQ ID NO:24.

36. Método, de acordo com a reivindicação 31, CARACTERIZADO pelo fato de queo Iupus é nefrite lúpica classe II, nefrite lúpica classe III, nefrite lúpica classe IV, ou nefritelúpica classe V.

37. Método de tratar uma condição em um sujeito mamífero, CARACTERIZADOpelo fato de que o método compreende: administrar ao sujeito uma quantidade terapeutica-mente efetiva de uma combinação de um anticorpo CD4 não depletivo e pelo menos umsegundo composto selecionado do grupo que consiste em: ciclofosfamida, micofenolato mo-fetil e CTLA4-lg, em que a condição é selecionada do grupo que consiste em: artrite reuma-tóide, asma, psoríase, rejeição a transplante, enxerto versus doença hospedeira, esclerosemúltipla, doença de Crohn, colite ulcerativa e síndrome de Sjogren.

38. Método, de acordo com a reivindicação 37, CARACTERIZADO pelo fato de quea condição é selecionada do grupo que consiste em: artrite reumatóide, asma, psoríase,rejeição a transplante, e enxerto versus doença hospedeira.

39. Método, de acordo com a reivindicação 37, CARACTERIZADO pelo fato de queo sujeito é um humano.

40. Método, de acordo com a reivindicação 37, CARACTERIZADO pelo fato de queo anticorpo é selecionado do grupo que consiste em:a) um anticorpo que compreende uma seqüência de aminoácidos de cadeia leveapresentada na SEQ ID NO:3 e uma seqüência de aminoácidos de cadeia pesada apresen-tada na SEQ ID NO:6;b) um anticorpo que compreende uma seqüência de aminoácidos de cadeia leveapresentada na SEQ BD NO:9 e uma seqüência de aminoácidos de cadeia pesada apresen-tada na SEQ ID NO: 12;c) um anticorpo que compreende uma seqüência de aminoácidos de cadeia leveapresentada na SEQ ID NO: 15 e uma seqüência de aminoácidos de cadeia pesada apre-sentada na SEQ ID NO: 18;d) um anticorpo que compreende uma seqüência de aminoácidos de cadeia leveapresentada na SEQ ID NO:21 e uma seqüência de aminoácidos de cadeia pesada apre-sentada na SEQ ID NO:24;e) um anticorpo que compreende um fragmento de ligação de CD4 do anticorpo dea), b), c), ou d);f) um anticorpo que compreende um CDR tendo a seqüência de aminoácidos deSEQ ID NO-27;g) um anticorpo que compreende um CDR tendo a seqüência de aminoácidos deSEQ ID NQ:30;h) um anticorpo que compreende CDRs tendo a seqüência de aminoácidos de SEQID NO:25, SEQ ID NO:26 e SEQ ID NO:27;i) um anticorpo que compreende CDRs tendo a seqüência de aminoácidos de SEQID NO:28, SEQ ID NO:29 e SEQ ID N0:30; ej) um anticorpo que compreende CDRs tendo a seqüência de aminoácidos de SEQID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29 e SEQ ID NQ:30.