JP2009530290A - Cd4抗体を使用するループスの治療方法 - Google Patents
Cd4抗体を使用するループスの治療方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2009530290A JP2009530290A JP2009500460A JP2009500460A JP2009530290A JP 2009530290 A JP2009530290 A JP 2009530290A JP 2009500460 A JP2009500460 A JP 2009500460A JP 2009500460 A JP2009500460 A JP 2009500460A JP 2009530290 A JP2009530290 A JP 2009530290A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- seq
- amino acid
- acid sequence
- chain amino
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2812—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD4
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
- A61K31/5375—1,4-Oxazines, e.g. morpholine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/66—Phosphorus compounds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
- A61K39/39541—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against normal tissues, cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/06—Antiasthmatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/06—Antipsoriatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
Abstract
全身性エリテマトーデス、皮膚エリテマトーデス、及びループス腎炎等のループスの治療方法を提供する。前記方法は非消失性CD4抗体と、ループスの治療に臨床使用又は実験使用されている別の化合物を併用投与することを含む。腎機能の改善及び/又は蛋白尿もしくは活性尿沈渣の低減をもたらす非消失性CD4抗体の投与によるループス腎炎の治療方法も提供する。場合によりMSの治療に臨床使用又は実験使用されている別の化合物と併用して非消失性CD4抗体を投与することによる多発性硬化症の治療方法も記載する。移植片レシピエントと、関節リウマチ、喘息、乾癬、クローン病、潰瘍性大腸炎、及びシェーグレン症候群の対象の治療方法も提供する。
Description
(関連出願とのクロスリファレンス)
本願は各々言及によりその開示内容全体を全目的で本明細書に組込む以下の先願仮特許出願:USSN60/783,535(出願日2006年3月16日、発明の名称「CD4抗体を使用するループスの治療方法(METHODS OF TREATING LUPUS USING CD4 ANTIBODIES)」、発明者Bryan Irving)、及びUSSN60/873,881(出願日2006年12月7日、発明の名称「CD4抗体を使用するループスの治療方法(METHODS OF TREATING LUPUS USING CD4 ANTIBODIES)」、発明者Bryan Irving)の優先権と特典を主張する非仮実用特許出願である。
本願は各々言及によりその開示内容全体を全目的で本明細書に組込む以下の先願仮特許出願:USSN60/783,535(出願日2006年3月16日、発明の名称「CD4抗体を使用するループスの治療方法(METHODS OF TREATING LUPUS USING CD4 ANTIBODIES)」、発明者Bryan Irving)、及びUSSN60/873,881(出願日2006年12月7日、発明の名称「CD4抗体を使用するループスの治療方法(METHODS OF TREATING LUPUS USING CD4 ANTIBODIES)」、発明者Bryan Irving)の優先権と特典を主張する非仮実用特許出願である。
(発明の技術分野)
本発明は非消失性CD4抗体を単独使用又は他の化合物と併用する哺乳動物対象におけるループス及び他の自己免疫疾患の治療方法に関する。
本発明は非消失性CD4抗体を単独使用又は他の化合物と併用する哺乳動物対象におけるループス及び他の自己免疫疾患の治療方法に関する。
自己免疫疾患、特に全身性エリテマトーデス(SLE)、重症筋無力症、多発性硬化症、及び特発性血小板減少性紫斑病は依然としてヒトにおける臨床的に重要な疾患である。その名称が示す通り、自己免疫疾患は生体内の自己免疫系を介してその破壊作用を引き起こす。病理メカニズムは個々の自己免疫疾患の種類により異なるが、1つの一般的なメカニズムは患者の血清中に存在する所定の抗体(本明細書では自己反応性抗体又は自己抗体と言う)と自己核抗原又は細胞内抗原の結合を伴う。
ループスは結合組織を攻撃する抗体に起因する自己免疫疾患である。20〜40歳の女性を中心に約百万人の米国人がこの疾患の患者であると推定される。ループスの主要な形態は全身性である(全身性エリテマトーデス;SLE)。SLEは抗核抗体の産生、免疫複合体の循環、及び補体系の活性化に結び付けられる。SLEは20〜60歳の女性の700人に1人の割合で発生している。SLEはあらゆる臓器系を冒し、重度組織損傷を生じる可能性がある。SLEには異なる特異性の多数の自己抗体が存在する。SLE患者は抗DNA、抗Ro、及び抗血小板特異性をもち、糸球体腎炎、関節炎、漿膜炎、新生児完全心臓ブロック、及び血液異常等の疾患の臨床特徴を誘発することが可能な自己抗体を産生することが多い。これらの自己抗体は中枢神経系障害に関係している場合もある。ArbuckleらはSLEの臨床発症前の抗体の発生について記載している(Arbuckleら(2003)N.Engl.J.Med.349(16):1526−1533)。2本鎖天然DNAに対して免疫反応性の抗体の存在はSLEの診断マーカーとして頻用されている。
ループスを治療せずにおくと、皮膚及び関節の攻撃から肺、心臓及び腎臓等の内臓に進行し、致命的となる恐れがある(腎疾患が特に問題となる)。ループスは主に一連の突発として出現し、疾患徴候が殆ど又は全く現れない介在期間を伴う。尿中の蛋白尿の量により測定される腎損傷はSLEの病因に関連する最も急性の損傷領域の1つであり、この疾患の死亡率と罹病率の少なくとも50%を占める。
現時点では、SLEであると診断された患者の治癒治療法は存在しない。実用的観点から、医師は一般に高用量コルチコステロイド(例えばプレドニゾン)又はアザチオプリン又はシクロホスファミド等の多数の強力な免疫抑制薬を利用しており、これらの薬剤は突発期間中に投与されているが、突発頻度の高い患者には継続的に投与する場合もある。症状を緩和し、寿命を延長する有効な治療であっても、これらの薬剤の多くは治療中の患者に潜在的に有害な副作用がある。更に、これらの免疫抑制薬は自己反応性抗DNA抗体のみに止まらず、患者の全抗体の産生能を妨害する。免疫抑制剤は他の潜在的病原体に対する生体防御機能も弱めるため、患者は感染や、癌等の他の潜在的致死性疾患に極度に冒され易くなる。これらの場合には、現行治療薬の副作用と疾患の低レベル徴候の持続が相俟って重度障害や早期死亡に至る可能性もある。
最近の治療レジメンとしては、シクロホスファミド、メトトレキセート、抗マラリア剤、ホルモン療法(例えばDHEA)、及び抗ホルモン療法(例えば抗プロラクチン剤であるブロモクリプチン)が挙げられる。抗体を利用するSLEの治療方法も記載されている。例えば、Diamondら(米国特許第4,690,905号)の方法は抗DNA抗体に対するモノクローナル抗体(本明細書ではモノクローナル抗体を抗イディオタイプ抗体と言う)を作製する段階と、次にこれらの抗イディオタイプ抗体を使用して患者の生体系から病原性抗DNA抗体を除去する段階からなる。しかし、治療のために大量の血液を取り出すのは危険で煩雑な方法であると言える。米国特許第6,726,909号は患者に投与する抗体組成物を精製抗DNA抗イディオタイプ抗体から構成し、注射又は他の同等投与方法により投与するSLEの治療方法を開示している。
所定の自己免疫疾患の治療には高用量静脈内免疫グロブリン(IVIG)輸液も使用されている。現時点まででは、IVIGによるSLEの治療結果は交錯しており、ループス腎炎は解消している(Akashiら,J.Rheumatology 17:375−379(1990))が、少数の例では蛋白尿及び腎損傷の増悪を生じている(Jordanら,Clin.Immunol.Immunopathol.53:S164−169(1989))。
米国特許第4,690,905
米国特許第6,726,909
Arbuckleら(2003)N.Engl.J.Med.349(16):1526−1533
Akashiら,J.Rheumatology 17:375−379(1990)
Jordanら,Clin.Immunol.Immunopathol.53:S164−169(1989)
ループス腎炎の臨床徴候を示すSLE患者やループス腎炎患者等のループス患者は最終的に腎不全に至る組織損傷を改善する費用効率の高い安全な治療が必要であり、その症状により慢性血液透析及び/又は腎臓移植が必要になる。同様に、多発性硬化症(MS)、関節リウマチ、重症筋無力症、乾癬、若年性糖尿病、シェーグレン病、甲状腺疾患、及び炎症性腸疾患等の他の自己免疫疾患患者も有効で安全な治療が必要である。
1つの一般分類の態様は哺乳動物対象(例えばヒト対象)におけるループスの治療方法を提供する。前記方法では、非消失性CD4抗体と、例えばシクロホスファミド、ミコフェノール酸モフェチル、CTLA4−Ig、及びα4インテグリン抗体等から構成される群から選択される少なくとも第2の化合物の併用剤の治療有効量を対象に投与する。所定態様では、対象はヒトである。所定態様では、第2の化合物はシクロホスファミドである。
1分類の態様では、非消失性CD4抗体は配列番号3に記載の軽鎖アミノ酸配列と配列番号6に記載の重鎖アミノ酸配列、配列番号9に記載の軽鎖アミノ酸配列と配列番号12に記載の重鎖アミノ酸配列、配列番号15に記載の軽鎖アミノ酸配列と配列番号18に記載の重鎖アミノ酸配列、又は配列番号21に記載の軽鎖アミノ酸配列と配列番号24に記載の重鎖アミノ酸配列ををもつ。
1分類の態様では、非消失性CD4抗体は配列番号3に記載の軽鎖アミノ酸配列と配列番号6に記載の重鎖アミノ酸配列、配列番号9に記載の軽鎖アミノ酸配列と配列番号12に記載の重鎖アミノ酸配列、配列番号15に記載の軽鎖アミノ酸配列と配列番号18に記載の重鎖アミノ酸配列、又は配列番号21に記載の軽鎖アミノ酸配列と配列番号24に記載の重鎖アミノ酸配列を含む抗体のCD4結合フラグメントを含む。
1分類の態様では、非消失性CD4抗体は図1Aに示す軽鎖のCDR1(配列番号25)、CDR2(配列番号26)、又は好ましくはCDR3(配列番号27)を含み、例えば、抗体は図1Aに示す軽鎖のCDR1、CDR2、及びCDR3(即ち配列番号25、配列番号26、及び配列番号27)を含む。同様に、1分類の態様では、抗体は図1Dに示す重鎖のCDR1(配列番号28)、CDR2(配列番号29)、又は好ましくはCDR3(配列番号30)を含み、例えば、抗体は図1Dに示す重鎖のCDR1、CDR2、及びCDR3(即ち配列番号28、配列番号29、及び配列番号30)を含む。1態様では、抗体は図1Aに示す軽鎖のCDR1、CDR2、及びCDR3と、図1Dに示す重鎖のCDR1、CDR2、及びCDR3(即ち配列番号25〜30)を含む。他の典型的抗体としては限定されないが、図1〜4のいずれかに示す抗体と同一のエピトープと結合する抗体が挙げられる。
例えば治療する対象がヒトである場合には、非消失性CD4抗体はヒト化抗体とすることができる。抗体は非グリコシル化Fc部分をもつことができる。場合により、抗体はFc受容体と結合しない。所定態様では、抗体はFcRN受容体と結合することができる抗CD4変異体抗体である。抗体は場合によりFc領域の270位、322位、326位、327位、329位、313位、333位、及び/又は334位のアミノ酸位置の1個以上に(例えばこのような置換を含まない親抗体に対して)抗体のC1q結合及び/又は補体依存性細胞傷害性を改変するアミノ酸置換を含む。所定態様では、抗体はサルベージ受容体結合エピトープ又は血清アルブミン結合ペプチドを含む。場合により、抗体は3個以上の抗原結合部位を含む。
対象を治療するループスは一般に全身性エリテマトーデス(SLE)、皮膚エリテマトーデス(CLE)、又はループス腎炎である。治療するループスは治療開始時に初期、中期、又は後期段階の疾患とすることができる。ループス腎炎を治療する態様では、ループス腎炎はクラスI〜VIのいずれか1種とすることができる。例えば、治療するループスはクラスIIループス腎炎、クラスIIIループス腎炎、クラスIVループス腎炎、又はクラスVループス腎炎とすることができる。1態様では、併用剤の投与開始後に、対象は投与開始前に対象が示した蛋白尿及び/又は活性尿沈渣レベルに比較して蛋白尿の低減及び/又は活性尿沈渣の低減を示す。例えば、蛋白尿を少なくとも25%、少なくとも50%、少なくとも75%、又は少なくとも90%低減することができ、あるいは蛋白尿を1g/日未満又は500mg/日未満まで低減することができ、及び/又は活性尿沈渣を少なくとも25%、少なくとも50%、少なくとも75%、又は少なくとも90%低減することができ、あるいは投与開始後に不活性尿沈渣しか残存しないようにすることができる。
1態様では、併用剤の投与開始前に、対象は蛋白尿を示し、前記蛋白尿は投与後に改善される。例えば、投与開始前に、対象は>500mg/日、>1000mg/日、>2000mg/日、又は>3500mg/日の蛋白尿を示すことができる。投与開始後に、蛋白尿を少なくとも25%、少なくとも50%、少なくとも75%、又は少なくとも90%低減することができ、あるいは蛋白尿を1g/日未満又は500mg/日未満まで低減することができる。別の例として、投与開始前に、対象は>0.5、>1、又は>2の蛋白対クレアチニン比を示すことができ、投与開始後に、対象の尿蛋白対クレアチニン比を少なくとも25%又は少なくとも50%低減することができ、あるいは前記比を1未満又は0.5未満まで低減することができる。
1側面では、前記方法は症状を緩和するために非消失性CD4抗体と第2の化合物を対象に投与する段階と、その後、寛解を維持するために(相互に併用せずに)非消失性CD4抗体又は第2の化合物の対象への投与を継続する段階を含む。例えば、1分類の態様では、併用剤の投与開始後にループスが改善され、対象への併用剤の投与を中断し、治療有効量の非消失性CD4抗体を対象に投与する。別の典型的な分類の態様では、併用剤の投与開始後にループスが改善され、対象への併用剤の投与を中断し、治療有効量の第2の化合物又は1種以上の他の化合物を対象に投与する。
別の一般分類の態様は哺乳動物対象(例えばヒト)におけるループス腎炎の治療方法も提供する。前記方法では、治療有効量の非消失性CD4抗体を対象に投与する。非消失性抗体の投与開始後に、対象は投与開始前に対象が示した蛋白尿及び/又は活性尿沈渣レベルに比較して腎機能の改善、蛋白尿の低減及び/又は活性尿沈渣の低減を示す。例えば、蛋白尿を少なくとも25%、少なくとも50%、少なくとも75%、又は少なくとも90%低減することができ、あるいは蛋白尿を1g/日未満又は500mg/日未満まで低減することができ;蛋白対クレアチニン比を少なくとも25%又は少なくとも50%低減することができ、あるいは前記比を1未満又は0.5未満まで低減することができ;及び/又は活性尿沈渣を少なくとも25%、少なくとも50%、少なくとも75%、又は少なくとも90%低減することができ、あるいは投与開始後に不活性尿沈渣しか残存しないようにすることができる。
ループス腎炎はクラスI〜VIのいずれか1種とすることができる。例えば、治療するループスはクラスIIループス腎炎、クラスIIIループス腎炎、クラスIVループス腎炎、又はクラスVループス腎炎とすることができる。
1態様では、投与開始前に、対象は>500mg/日、>1000mg/日、>2000mg/日、又は>3500mg/日の蛋白尿を示す。1態様では、蛋白尿は抗体の投与開始後に例えば少なくとも25%、少なくとも50%、少なくとも75%、又は少なくとも90%低減し、あるいは1g/日未満又は500mg/日未満まで低減する。1態様では、蛋白対クレアチニン比は抗体の投与開始後に、例えば少なくとも25%又は少なくとも50%低減し、あるいは1未満又は0.5未満まで低減する。
非消失性CD4抗体は、a)配列番号3に記載の軽鎖アミノ酸配列と配列番号6に記載の重鎖アミノ酸配列を含む抗体;b)配列番号9に記載の軽鎖アミノ酸配列と配列番号12に記載の重鎖アミノ酸配列を含む抗体;c)配列番号15に記載の軽鎖アミノ酸配列と配列番号18に記載の重鎖アミノ酸配列を含む抗体;d)配列番号21に記載の軽鎖アミノ酸配列と配列番号24に記載の重鎖アミノ酸配列を含む抗体;e)a)、b)、c)、又はd)の抗体のCD4結合フラグメントを含む抗体;f)図1Aに示す軽鎖のCDR3(配列番号27)を含む抗体;g)図1Dに示す重鎖のCDR3(配列番号30)を含む抗体;h)図1Aに示す軽鎖のCDR1、CDR2、及びCDR3(配列番号25〜27)を含む抗体;i)図1Dに示す重鎖のCDR1、CDR2、及びCDR3(配列番号28〜30)を含む抗体;並びにj)図1Aに示す軽鎖のCDR1、CDR2、及びCDR3と図1Dに示す重鎖のCDR1、CDR2、及びCDR3(配列番号25〜30)を含む抗体から構成される群から選択することができる。同様に、抗体は図1〜4のいずれかに示す抗体と同一のエピトープと結合するCD4抗体とすることができる。
例えば非消失性抗体と少なくとも第2の化合物の選択的併用、抗体の種類、及び/又は同等事項等に関して上記方法について記載した基本的に全特徴がこれらの態様にも適宜適用される。例えば、本発明の1態様では、非消失性CD4抗体は場合によりヒト化抗体であり、非グリコシル化Fc部分をもち、Fc受容体と結合せず、C1q結合及び/又は補体依存性細胞傷害性を改変するアミノ酸置換を含み、サルベージ受容体結合エピトープを含み、血清アルブミン結合ペプチドを含み、及び/又は3個以上の抗原結合部位をもつ。所定態様では、抗体はFcRN受容体と結合することができる抗CD4変異体抗体である。
1つの一般分類の態様は哺乳動物対象(例えばヒト対象)における多発性硬化症の治療方法を提供する。前記方法では、治療有効量の非消失性CD4抗体及び/又は少なくとも第2の化合物を対象に投与する。例えば、適切な第2の化合物としては限定されないが、例えば細胞傷害性物質;免疫抑制剤(例えばシクロホスファミド);B細胞表面マーカーアンタゴニスト;B細胞表面マーカーに対する抗体;CD20抗体(例えばリツキシマブ);CD5、CD28、又はCD40抗体又は遮断薬;コルチコステロイド(例えばプレドニゾン)、CTLA4−Ig、α4インテグリン抗体(例えばナタリズマブ(Tysabri(登録商標)))、ミコフェノール酸モフェチル、スタチン、LFA−1又はCD−11a抗体又は遮断薬、インターロイキン−12抗体、βインターフェロン(例えばインターフェロンβ−1a、例えばAvonex(登録商標)又はRebif(登録商標)、又はインターフェロンβ−1b、例えばBetaseron(登録商標))、酢酸グラチラマー(Copaxone(登録商標))、CD52抗体(例えばアレムツズマブ(CamPath(登録商標)))、インターロイキン受容体抗体(例えばダクリズマブ(Zenapax(登録商標))、インターロイキン2受容体αサブユニットに対する抗体)等が挙げられる。
関連分類の態様は哺乳動物対象(例えばヒト対象)における疾患の治療方法を提供する。疾患は関節リウマチ、喘息、乾癬、移植拒絶反応、移植片対宿主病、多発性硬化症、クローン病、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、又は別の自己免疫障害もしくは疾患とすることができる。前記方法では、非消失性CD4抗体と少なくとも第2の化合物の併用剤の治療有効量を対象に投与する。1分類の態様では、第2の化合物はシクロホスファミド、ミコフェノール酸モフェチル、又はCTLA4−Igである。
例えば抗体の種類、第2の化合物の種類、及び/又は同等事項等に関して上記方法について記載した基本的に全特徴がこれらの分類の態様にも適宜適用される。例えば、非消失性CD4抗体は、a)配列番号3に記載の軽鎖アミノ酸配列と配列番号6に記載の重鎖アミノ酸配列を含む抗体;b)配列番号9に記載の軽鎖アミノ酸配列と配列番号12に記載の重鎖アミノ酸配列を含む抗体;c)配列番号15に記載の軽鎖アミノ酸配列と配列番号18に記載の重鎖アミノ酸配列を含む抗体;d)配列番号21に記載の軽鎖アミノ酸配列と配列番号24に記載の重鎖アミノ酸配列を含む抗体;e)a)、b)、c)、又はd)の抗体のCD4結合フラグメントを含む抗体;f)図1Aに示す軽鎖のCDR3(配列番号27)を含む抗体;g)図1Dに示す重鎖のCDR3(配列番号30)を含む抗体;h)図1Aに示す軽鎖のCDR1、CDR2、及びCDR3(配列番号25〜27)を含む抗体;i)図1Dに示す重鎖のCDR1、CDR2、及びCDR3(配列番号28〜30)を含む抗体;並びにj)図1Aに示す軽鎖のCDR1、CDR2、及びCDR3と図1Dに示す重鎖のCDR1、CDR2、及びCDR3(配列番号25〜30)を含む抗体から構成される群から選択することができる。同様に、抗体は図1〜4のいずれかに示す抗体と同一のエピトープと結合するCD4抗体とすることができる。
〔図面の簡単な説明〕
〔図1〕図1A〜1FはTRX1非消失性CD4抗体の1態様の重鎖及び軽鎖のヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。図1Aは軽鎖のヌクレオチド配列(配列番号1)及びアミノ酸配列(配列番号2)と、CDR領域及びフレームワーク領域を示す。図1Bは軽鎖のヌクレオチド配列(配列番号1)を示す。図1Cはリーダー配列をもつ軽鎖(配列番号2)ともたない軽鎖(配列番号3)のアミノ酸配列を示す。図1Dは重鎖のヌクレオチド配列(配列番号4)及びアミノ酸配列(配列番号5)と、CDR領域及びフレームワーク領域を示す。図1Eは重鎖のヌクレオチド配列(配列番号4)を示す。図1Fはリーダー配列をもつ重鎖(配列番号5)ともたない重鎖(配列番号6)のアミノ酸配列を示す。
〔図1〕図1A〜1FはTRX1非消失性CD4抗体の1態様の重鎖及び軽鎖のヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。図1Aは軽鎖のヌクレオチド配列(配列番号1)及びアミノ酸配列(配列番号2)と、CDR領域及びフレームワーク領域を示す。図1Bは軽鎖のヌクレオチド配列(配列番号1)を示す。図1Cはリーダー配列をもつ軽鎖(配列番号2)ともたない軽鎖(配列番号3)のアミノ酸配列を示す。図1Dは重鎖のヌクレオチド配列(配列番号4)及びアミノ酸配列(配列番号5)と、CDR領域及びフレームワーク領域を示す。図1Eは重鎖のヌクレオチド配列(配列番号4)を示す。図1Fはリーダー配列をもつ重鎖(配列番号5)ともたない重鎖(配列番号6)のアミノ酸配列を示す。
〔図2〕図2A〜2FはTRX1非消失性CD4抗体の1態様の重鎖及び軽鎖のヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。図2Aは軽鎖のヌクレオチド配列(配列番号7)及びアミノ酸配列(配列番号8)と、CDR領域及びフレームワーク領域を示す。図2Bは軽鎖のヌクレオチド配列(配列番号7)を示す。図2Cはリーダー配列をもつ軽鎖(配列番号8)ともたない軽鎖(配列番号9)のアミノ酸配列を示す。図2Dは重鎖のヌクレオチド配列(配列番号10)及びアミノ酸配列(配列番号11)と、CDR領域及びフレームワーク領域を示す。図2Eは重鎖のヌクレオチド配列(配列番号10)を示す。図2Fはリーダー配列をもつ重鎖(配列番号11)ともたない重鎖(配列番号12)のアミノ酸配列を示す。
〔図3〕図3A〜3FはTRX1非消失性CD4抗体の1態様の重鎖及び軽鎖のヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。図3Aは軽鎖のヌクレオチド配列(配列番号13)及びアミノ酸配列(配列番号14)と、CDR領域及びフレームワーク領域を示す。図3Bは軽鎖のヌクレオチド配列(配列番号13)を示す。図3Cはリーダー配列をもつ軽鎖(配列番号14)ともたない軽鎖(配列番号15)のアミノ酸配列を示す。図3Dは重鎖のヌクレオチド配列(配列番号16)及びアミノ酸配列(配列番号17)と、CDR領域及びフレームワーク領域を示す。図3Eは重鎖のヌクレオチド配列(配列番号16)を示す。図3Fはリーダー配列をもつ重鎖(配列番号17)ともたない重鎖(配列番号18)のアミノ酸配列を示す。
〔図4〕図4A〜4FはTRX1非消失性CD4抗体の1態様の重鎖及び軽鎖のヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。図4Aは軽鎖のヌクレオチド配列(配列番号19)及びアミノ酸配列(配列番号20)と、CDR領域及びフレームワーク領域を示す。図4Bは軽鎖のヌクレオチド配列(配列番号19)を示す。図4Cはリーダー配列をもつ軽鎖(配列番号20)ともたない軽鎖(配列番号21)のアミノ酸配列を示す。図4Dは重鎖のヌクレオチド配列(配列番号22)及びアミノ酸配列(配列番号23)と、CDR領域及びフレームワーク領域を示す。図4Eは重鎖のヌクレオチド配列(配列番号22)を示す。図4Fはリーダー配列をもつ重鎖(配列番号23)ともたない重鎖(配列番号24)のアミノ酸配列を示す。
〔図5〕SLEのNZBxW F1前臨床効力モデルにおける月齢に伴う疾患の進行を模式的に示す。
〔図6〕図6A〜6Fは非消失性CD4抗体の投与に対する応答を示すグラフである。8カ月齢で投与を開始した動物について、夫々図6Aは進行(蛋白尿300mg/dl又は死亡)までの時間、図6Bは投与開始後の時間の関数としての生存率百分率、図6Cは投与5カ月目の蛋白尿、図6Dは投与開始後の時間の関数として平均血中尿素窒素を示すグラフである。6カ月齢で投与を開始した動物について、夫々図6Eは進行(蛋白尿300mg/dl又は死亡)までの時間を示し、図6Fは投与開始後の時間の関数として生存率百分率を示す。
〔図7〕図7A〜7Bは非消失性CD4抗体投与による重度ループス腎炎の改善を示すグラフである。図7Aは投与後指定時間で蛋白尿300mg/dl未満のマウスの百分率を示すグラフである。図7Bは投与開始から1カ月以内に蛋白尿≧300mg/dlから改善したマウスの百分率を示す。
〔図8〕図8A〜8Dは非消失性CD4抗体の投与に対する応答を示すグラフである。図8Aは登録時のds−DNA抗体力価を示し、図8Bは投与後3カ月の力価を示す。図8Cは投与後3週間で脾臓に存在するCD4+CD69+細胞数を示す。図8Dは投与後3週間で脾臓に存在するCD4+CD25+細胞数を示す。
〔図9〕図9A〜9Bは投与6カ月の蛋白尿の多重比較分析を示し、図9Aではシクロホスファミド(Cytoxan(登録商標))投与群を対照群として使用し、図9BではCD4非消失性抗体投与群を対照群として使用した。
〔図10〕MSの前臨床効力モデルであるSJL/JマウスにPLPペプチド注射により誘発したEAEの再発と緩和により疾患の経時的進行を模式的に示す。
〔図11〕図11A〜11Bは非消失性CD4抗体の投与に対する応答を示すグラフである。図11Aは対照抗体である酢酸グラチラマー(Copaxone(登録商標))、α4インテグリン抗体CTLA4−Ig、及び非消失性CD4抗体を投与した群について経時的臨床スコアのグラフを示す。図11Bはこれらの群について平均1日臨床スコアを示す。
〔図12〕図12A〜12Bは非消失性CD4抗体の投与に対する応答を示すグラフである。図12Aは対照抗体、CTLA4−Ig、及び非消失性CD4抗体を投与した群について経時的臨床スコアのグラフを示す。図12Bはこれらの群について平均1日臨床スコアを示す。
〔図13〕図13A〜13Bは非消失性CD4抗体の投与に対する応答を示すグラフである。図13Aは対照抗体、CTLA4−Ig、及び非消失性CD4抗体を投与した群について経時的臨床スコアのグラフを示す。図13Bはこれらの群について平均1日臨床スコアを示す。
〔図14〕対照抗体又はCD4抗体を投与したマウスからの脊髄切片を示し、非消失性CD4抗体投与によりEAEの脱髄が低減していることを示す。
〔図15〕対照抗体、非消失性CD4抗体、又はCTLA4−Tgを投与した動物の血液1μl当たりのICOShiCD4又はICOShiCD8T細胞数を示すグラフである。
〔図16〕ミエリン希突起膠細胞糖蛋白(MOG)−ペプチドにより誘発したEAEに対する非消失性CD4抗体、消失性CD4抗体、対照抗体、CTLA4−Ig、又は消失性CD8抗体の投与を比較した経時的臨床スコアのグラフである。
〔図17〕図17A〜17Bは非消失性CD4抗体の投与に対する応答を示すグラフである。図17Aは指定投与後指定時間で蛋白尿300mg/dl未満のマウスの百分率を示すグラフである。図17Bは蛋白尿≧300mg/dlから改善したマウスの百分率を示す。
〔図18〕図18A〜18Dは治療応答を示すグラフである。非消失性CD4抗体とMMF50mg/kg/日を併用投与した動物について、夫々図18Aは進行(蛋白尿300mg/dl又は死亡)までの時間、図18Bは投与開始後の時間の関数としての生存率百分率を示すグラフであり、非消失性CD4抗体とMMF25mg/kg/日を併用投与した動物について、夫々図18Cは進行までの時間、図18Dは生存率百分率を示すグラフである。
〔図19〕図19A〜19Bは対照抗体投与群を対照群として使用した投与2カ月の蛋白尿の多重比較分析を示す。MMF50mg/kgを毎日(単独又は非消失性CD4抗体と併用)投与した群の結果を図19Aに示し、MMF25mg/kgを毎日投与した群の結果を図19Bに示す。
〔図20〕図20A〜20Iは治療応答を示すグラフである。グラフは対照抗体、非消失性CD4抗体、指定用量のMMF、又は非消失性CD4抗体と指定用量のMMFの併用剤を投与した動物について、夫々血液1μl当たりのCD4+T細胞数(図20A)、血液1μl当たりのB2B細胞数(図20B)、脾臓当たりのCD4+T細胞数(図20C)、脾臓当たりのB2B細胞数(図20D)、IgM+形質細胞数(図20E)、アイソタイプ転換形質細胞数(図20F)、胚中心細胞数(図20G)、脾臓当たりの形質細胞様樹状細胞数(図20H)、及び形質細胞様樹状細胞におけるMHCII発現レベル(図20I)を示す。
〔図21〕図21A〜21BはヒトCD4の核酸配列とアミノ酸配列を示す。図21Aはリーダーを切断した成熟蛋白質のヒトCD4アミノ酸配列を示す。図21Bは成熟ヒトCD4 DNA配列を示す。
定義
特に定義しない限り、本明細書で使用する全科学技術用語は本発明が属する分野の当業者に通常理解されている通りの意味をもつ。以下の定義により当分野の定義を補うが、これらの定義は本願に関するものであり、関連又は非関連ケース(例えば同一名義の特許又は出願)に帰属するものではない。本発明の試験の実施には本明細書に記載するものと類似又は等価の任意方法及び材料を使用することができ、本明細書には非限定的な材料及び方法を記載する。従って、本明細書で使用する用語は特定態様のみの説明を目的とし、限定的ではない。
特に定義しない限り、本明細書で使用する全科学技術用語は本発明が属する分野の当業者に通常理解されている通りの意味をもつ。以下の定義により当分野の定義を補うが、これらの定義は本願に関するものであり、関連又は非関連ケース(例えば同一名義の特許又は出願)に帰属するものではない。本発明の試験の実施には本明細書に記載するものと類似又は等価の任意方法及び材料を使用することができ、本明細書には非限定的な材料及び方法を記載する。従って、本明細書で使用する用語は特定態様のみの説明を目的とし、限定的ではない。
本明細書と特許請求の範囲で使用する単数形はそうでないことが内容から明白である場合を除き、複数も意味する。従って、例えば「蛋白質」と言う場合には複数の蛋白質を含み、「細胞」と言う場合には細胞混合物を含み、他の用語についても同様である。
本明細書で使用する「ループス」とは結合組織を攻撃する抗体に起因する自己免疫疾患又は障害である。ループスの主要な形態は全身性疾患である全身性エリテマトーデス(SLE)であり、皮膚性疾患を含む場合もある。本明細書で使用する「ループス」はSLEと他の型のループス(例えば皮膚エリテマトーデス(CLE)、ループス腎炎(LN)、腎外性、脳炎、小児性、非腎、円板状、及び脱毛症)を含む。
本明細書で使用する「対象」とは一般にヒトであるが、非ヒト哺乳動物でもよい。典型的な非ヒト哺乳動物としては実験動物、家畜、ペット、競技用動物、及び牧畜(例えばマウス、ネコ、イヌ、ウマ、及びウシ)が挙げられる。一般に、対象は治療(例えば自己免疫疾患の治療、組織移植に関連する治療等)に適格である。1側面では、このような対象はループスの治療に適格である。本発明の趣旨では、このような適格対象はループスの1種以上の徴候、症状もしくは他の指標を示しているかもしくは示したことがある対象、又はループスと診断されたことがある対象(例えば新規に診断されるか、過去に新規突発と診断されたことがあるか、慢性ステロイド依存性で新規突発と診断された対象)、又はループスを発症する危険がある対象である。ループスの治療に適格な対象は場合により腎生検によりスクリーニングされる対象及び/又は自己抗体産生を定性的、好ましくは定量的に評価する自己抗体検出アッセイ(例えば下記アッセイ)を使用してスクリーニングされる対象として同定することができる。SLEに関連する典型的なこのような自己抗体は抗核抗体(Ab)、抗2本鎖DNA(dsDNA)Ab、抗Sm Ab、抗核リボヌクレオ蛋白Ab、抗リン脂質Ab、抗リボソームP Ab、抗Ro/SS−A Ab、抗Ro Ab、及び抗La Abである。
ループスの診断(及び治療適格性の判断)は当分野で定着しているように実施することができる。例えば、SLEの診断は現行のAmerican College of Rheumatology(ACR)基準に従うことができる。活性な疾患は例えば米国特許出願公開2006/0024295(発明者Brunetta、発明の名称「ループスの治療方法(Method for treating lupus)」)で適用されているようなBritish Isles Lupus Activity Group(BILAG)の1種の「A」基準又は2種のBILAG「B」基準により定義することができる。Tanら(1982)“The 1982 Revised Criteria for the Classification of SLE”Arth Rheum 25:1271−1277からSLE診断に応用される所定の徴候、症状又は他の指標としては、頬発疹(例えば頬全体の発疹、円板状発疹、又は隆起性紅斑)、光線過敏症(例えば日光に反応することによる皮膚発疹の発生又は増加)、口腔潰瘍(例えば通常は無痛性の鼻腔又は口内潰瘍)、関節炎、例えば2個以上の末梢関節を冒す非糜爛性関節炎(関節周囲の骨が破壊されない関節炎)、漿膜炎、胸膜炎ないし心膜炎、腎障害(例えば過剰尿蛋白)(蛋白尿>0.5g/日又は検査スティックで3+)及び/又は細胞円柱(尿及び/又は白血球及び/又は腎尿細管細胞に由来する異常成分)、神経徴候、症状、又は他の指標、発作(痙攣)、及び/又はこのような作用を生じることが知られている薬剤もしくは代謝障害の不在下の精神病、並びに血液徴候、症状、又は指標(例えば溶血性貧血又は白血球減少症)(1立方ミリメートル当たり白血球数4,000個未満)又はリンパ球減少症(1立方ミリメートル当たりリンパ球1,500個未満)又は血小板減少症(1立方ミリメートル当たり血小板100,000個未満)が挙げられる。白血球減少症とリンパ球減少症は2回以上検出する必要がある。血小板減少症はこれを誘発することが知られている薬剤の不在下で検出する必要がある。本発明はループスのこれらの徴候、症状、又は他の指標に限定されない。
ループス腎炎突発は1)1カ月以内にScrの>30%増加、又は2)ネフローゼ症候群の再発もしくは出現、又は3)基線蛋白尿>1g/24時間で尿蛋白の3倍増加として、又は米国特許出願公開2006/0024295に記載されているように定義することができる。ループス腎炎の治療適格性は米国特許出願公開2006/0024295に記載されているような腎基準により定義されるような腎炎突発により判定することができる。
ループス腎炎は場合により例えばWeeningら(2004)“The classification of glomerulonephritis in systemic lupus erythematosus revisited”Kidney International 65:521−530に記載されているように、ISN/WHO クラスI、クラスII、クラスIII、クラスIV、クラスV、又はクラスVIループス腎炎として診断及び分類される。
本明細書で使用する対象の「治療」とは治療処置と予防措置の両者を意味する。治療を必要とする対象としては既にループス(又は別の疾患又はMS、関節リウマチ、もしくは炎症性腸疾患等の自己免疫疾患)をもつ対象に加え、ループス(又は他の障害)を予防すべき対象が挙げられる。従って、対象はループス(又は他の障害)をもつと診断されたものでもよいし、ループス(又は他の障害)の素因をもつもの又はこれに冒され易いものでもよい。
本明細書で使用する「改善する」又は「改善」なる用語は病態、疾患、障害、又は表現型(異常又は症状を含む)の低減、緩和又は排除を意味する。
疾患又は障害(例えばループス)の「症状」とは対象が遭遇する構造、機能、又は感覚の任意病的現象又は異常であり、疾患を表すものである。
「治療有効量」なる用語は疾患又は障害(例えばループス、MS、関節リウマチ、又は炎症性腸疾患)を予防、改善、又は治療するために有効な量を意味する。例えば、抗体の「治療有効量」とは指定疾患又は障害を予防、改善、又は治療するために有効な抗体の量を意味する。同様に、抗体と第2の化合物の併用剤の「治療有効量」とは、併用して指定疾患又は障害を予防、改善、又は治療するために有効な抗体の量と第2の化合物の量を意味する。
当然のことながら、2種類の化合物の「併用剤」なる用語は相互に混合して投与する必要がある化合物を意味するものではない。従って、このような併用剤の投与又は使用は化合物の混合物又は化合物の別々の投与を意味し、同日又は別の日の投与を含む。従って、「併用剤」なる用語は2種類以上の化合物を別々又は相互に混合して治療に使用することを意味する。例えば、抗体と第2の化合物を対象に併用投与する場合には、抗体と第2の化合物を対象に別々に投与するか又は混合して投与するかに関係なく、抗体が対象の体内に存在するときに第2の混合物も対象の体内に存在する。
CD4抗原ないし「CD4」はTリンパ球及び所定の他の細胞の表面で発現される糖蛋白質である。文献でCD4に使用されている他の名称としてはcluster of differentiation 4とL3T4が挙げられる。CD4は例えば、ワールドワイドウェブwww(dot)ncbi(dot)nlm(dot)nih(dot)gov/OmimでManデータベースのOnline Mendelian Inheritanceのエントリー186940に記載されている。
「CD4抗体」とは十分な親和性と特異性でCD4と結合する抗体である。例えば、この抗体は場合によりCD4に対するTRX1抗体の結合親和性及び特異性と同等又は実質的に同様のCD4に対する親和性及び特異性でCD4と結合する。本明細書で使用する「CD4抗体」、「抗CD4抗体」、及び「抗CD4」は等価用語であり、同義に使用する。
「非消失性CD4抗体」とはCD4+細胞の50%未満、好ましくはCD4+細胞の25%未満、最も好ましくはCD4+細胞の10%しか消失させないCD4抗体である。逆に、「消失性CD4抗体」はCD4+細胞の50%以上、更にはCD4+細胞の75%以上又は90%以上を消失させるCD4抗体である。CD4+細胞の消失(例えば抗体を投与する対象における循環CD4+細胞レベルの低下)は抗体依存性細胞介在細胞傷害作用、補体依存性細胞傷害作用、T細胞増殖の阻害、及び/又はT細胞死の誘導等の種々のメカニズムにより得られる。
本明細書における「抗体」なる用語は最も広義に使用し、具体的には所望生物活性(例えばCD4結合)を示すという条件で、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも2個の無傷の抗体から形成される多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、キメラ抗体、ヒト抗体、及び抗体フラグメントを意味する。抗体は免疫グロブリン遺伝子又は免疫グロブリン遺伝子のフラグメントにより実質的又は部分的にコードされる1個以上のポリペプチドを含む蛋白質である。認識される免疫グロブリン遺伝子としてはκ、λ、α、γ、δ、ε及びμ定常領域遺伝子に加え、無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。
「抗体フラグメント」は無傷の抗体の一部を含み、その抗原結合領域を含むことが好ましい。抗体フラグメントの例としては、Fab、Fab’、F(ab’)2、及びFvフラグメント;ダイアボディ;直鎖抗体;1本鎖抗体分子;並びに抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられる。
「無傷の抗体」とは重鎖及び軽鎖可変領域とFc領域を含む抗体である。
「天然抗体」とは通常は2本の同一の軽鎖(L)と2本の同一の重鎖(H)から構成される約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖蛋白質である。各軽鎖は1個の共有ジスルフィド結合により重鎖と結合しており、ジスルフィド結合数は各種免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。各重鎖及び軽鎖は更に等間隔に配置された鎖内ジスルフィド結合をもつ。各重鎖は一端に可変領域(VH)とそれに続く多数の定常領域をもつ。各軽鎖は一端に可変領域(VL)をもち、その他端に定常領域をもち、軽鎖の定常領域は重鎖の第1の定常領域と整列しており、軽鎖可変領域は重鎖の可変領域と整列している。特定アミノ酸残基が軽鎖可変領域と重鎖可変領域の間の界面を形成すると考えられる。
「可変」なる用語は可変領域の所定部分の配列が抗体間で著しく相違しており、その特定抗原に対する各特定抗体の結合と特異性に使用されることを意味する。しかし、可変性は抗体の可変領域全体に均等に分配されているわけではない。軽鎖及び重鎖可変領域の両者の超可変領域と呼ばれる3個のセグメントに集中している。可変領域のより高度に保存された部分をフレームワーク領域(FR)と言う。天然重鎖及び軽鎖の可変領域は各々4個のFRを含み、これらは主にβシート構造をとり、3個の超可変領域により相互に結合され、これらの超可変領域はβシート構造と結合し、場合によってはその一部となるループを形成する。各鎖の超可変領域はFRにより緊密に結合され、他方の鎖の超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する(Kabatら,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)参照)。定常領域は抗体と抗原の結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用への抗体の関与等の各種エフェクター機能を示す。
抗体をパパインで消化すると、各々1個の抗原結合部位をもつ「Fab」フラグメントと呼ばれる2個の同一抗原結合フラグメントと、残りの「Fc」フラグメントを生じ、後者は容易に結晶できることからこう呼ばれる。ペプシンで処理すると、2個の抗原結合部位をもち、依然として抗原と架橋することが可能なF(ab’)2フラグメントを生じる。
「Fv」とは完全な抗原認識抗原結合部位を含む最小抗体フラグメントである。この領域は1個の重鎖可変領域と1個の軽鎖可変領域が非共有的に緊密に結合した二量体から構成される。この構成では各可変領域の3個の超可変領域はVH−VL二量体の表面に抗原結合部位を規定するように相互作用する。合計6個の超可変領域が抗体に対する抗原結合特異性を付与する。しかし、完全結合部位より親和性は低いが、1個の可変領域(又は抗原に特異的な超可変領域3個のみを含むFvの半分)でも抗原を認識してこれと結合することができる。
Fabフラグメントは更に軽鎖の定常領域と重鎖の第1の定常領域(CH1)を含む。Fab’フラグメントは抗体ヒンジ領域に由来する1個以上のシステインを含む少数の残基を重鎖CH1領域のカルボキシ末端に付加した点がFabフラグメントと相違する。定常領域のシステイン残基が少なくとも1個の遊離チオール基をもつFab’を本明細書ではFab’−SHと言う。F(ab’)2抗体フラグメントは元々相互間にヒンジシステインをもつFab’フラグメントの対として作製された。抗体フラグメントの他の化学的カップリングも知られている。他の抗体フラグメントの更に詳細な記載については、例えばFundamental Immunology,W.E.Paul,ed.,Raven Press,N.Y.(1999)参照。
各種抗体フラグメントが無傷の抗体の消化に関して定義されるが、当業者に自明の通り、このようなフラグメントは化学的方法又は組換えDNA技術の利用によりde novo合成することができる。従って、本明細書で使用する抗体なる用語は全長抗体の修飾により作製されるか又は組換えDNA技術を使用してde novo合成される抗体又はそのフラグメントを含む。
任意脊椎動物種に由来する抗体(免疫グロブリン)の「軽鎖」はその定常領域のアミノ酸配列に基づいてカッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる2個の明白に異なる型の一方に分類することができる。
その重鎖の定常領域のアミノ酸配列により、抗体を異なるクラスに分類することができる。無傷の抗体にはIgA、IgD、IgE、IgG、及びIgMの5種類の主要クラスがあり、これらのいくつかを更にサブクラス(アイソタイプ)(例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、及びIgA2)に分類することができる。各抗体クラスに対応する重鎖定常領域を夫々α、δ、ε、γ、及びμと言う。各クラスの免疫グロブリンのサブユニット構造と三次元構成は周知である。
「1本鎖Fv」ないし「scFv」抗体フラグメントは抗体のVH領域とVL領域を含み、これらの領域は1本のポリペプチド鎖に存在する。FvポリペプチドはscFvが抗原結合のために望ましい構造を形成できるようにVH領域とVL領域の間に更にポリペプチドリンカーを含むことが好ましい。scFvについては、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer−Verlag,New York,pp.269−315(1994)参照。
「ダイアボディ」なる用語は2個の抗原結合部位をもつ小さい抗体フラグメントを意味し、このフラグメントは同一ポリペプチド鎖(VH−VL)で軽鎖可変領域(VL)と結合した重鎖可変領域(VH)を含む。同一鎖の2領域間の対合には短か過ぎるリンカーを使用することにより、これらの領域を別の鎖の相補的領域と対合させ、2個の抗原結合部位を形成させる。ダイアボディは例えば、EP 404,097;WO1993/11161;及びHollingerら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444−6448(1993)に更に詳細に記載されている。
本明細書で使用する「モノクローナル抗体」なる用語は実質的に均質の抗体集団から得られる抗体を意味し、即ちモノクローナル抗体の産生中に生じる可能性のある変異体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であるか、及び/又は同一エピトープと結合し、前記のような変異体は一般に存在するとしても少量である。一般に異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物に対して、各モノクローナル抗体は抗原上の単一決定基に対して産生される。その特異性に加え、モノクローナル抗体は他の免疫グロブリンで汚染されていないという利点もある。修飾語としての「モノクローナル」は抗体が実質的に均質の抗体集団から得られるという特徴を示すものであり、特定方法による抗体の作製が必要であると解釈すべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体はKohlerら,Nature,256:495(1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法により作製することもできるし、組換えDNA法(例えば米国特許第4,816,567号参照)により作製することもできる。「モノクローナル抗体」は例えばClacksonら,Nature,352:624−628(1991)及びMarksら,J.Mol.Biol.,222:581−597(1991)に記載の技術を使用してファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
本発明のモノクローナル抗体としては、所望生物活性を示すという条件で、具体的に重鎖及び/又は軽鎖の一部が特定種に由来するか又は特定抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応配列と同一又は相同であり、鎖の残余が別の種に由来するか又は別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応配列と同一又は相同である「キメラ」抗体(免疫グロブリン)と、このような抗体のフラグメントが挙げられる(米国特許第4,816,567号;Morrisonら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851−6855(1984))。本発明の該当キメラ抗体としては非ヒト霊長類(例えばヒヒ、アカゲザル、又はカニクイザル等の旧世界ザル)に由来する可変領域抗原結合配列と、ヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体が挙げられる(米国特許第5,693,780号)。
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」形態は非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。概ね、ヒト化抗体はレシピエントの超可変領域に由来する残基を所望特異性、親和性、及び能力をもつマウス、ラット、ウサギ、又は非ヒト霊長類等の非ヒト種(ドナー抗体)の超可変領域に由来する残基で置換したヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。場合により、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(FR)残基を対応する非ヒト残基で置換する。更に、ヒト化抗体はレシピエント抗体又はドナー抗体に存在しない残基を含む場合もある。これらの改変は抗体性能を更に高めるために行われる。一般に、ヒト化抗体は少なくとも1個、一般には2個の可変領域の実質的に全体を含み、超可変ループの全部又は実質的に全部が非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、上記のようなFR置換を除き、FRの全部又は実質的に全部がヒト免疫グロブリン配列のFRである。ヒト化抗体は更に場合により免疫グロブリン定常領域、一般にはヒト免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含む。更に詳細については、Jonesら,Nature 321:522−525(1986);Riechmannら,Nature 332:323−329(1988);及びPresta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593−596(1992)参照。
本明細書で使用する場合の「超可変領域」なる用語は抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を意味する。超可変領域は「相補性決定領域」ないし「CDR」(例えばKabatら,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)参照)に由来するアミノ酸残基及び/又は「超可変ループ」(例えばChothia and Lesk J.Mol.Biol.196:901−917(1987)参照)に由来するアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」ないし「FR」残基は本明細書に定義するような超可変領域残基以外の可変領域残基である。
「Fc受容体」及び「FcR」なる用語は抗体のFc領域と結合する受容体の意味で使用する。FcRはRavetch and Kinet(1991)Annu.Rev.Immunol 9:457−92;Capelら(1994)Immunomethods 4:25−34;及びde Haasら(1995)J.Lab.Clin.Med.126:330−41に概説されている。将来同定されるものを含めた他のFcRも本明細書で使用する「FcR」なる用語に含む。この用語は更に母親から胎児へのIgGの移動に関与する新生児受容体であるFcRnも意味する(Guyerら(1976)J.Immunol.117:587及びKimら(1994)J.Immunol.24:249)。
抗体の「CD4結合フラグメント」とはCD4との結合能を維持する抗体のフラグメントである。上記のように、フラグメントは場合により無傷の抗体の消化により作製又はde novo合成される。
「エピトープ」は抗体と結合する抗原分子の特定領域である。
本明細書で使用する「実質的に類似」又は「実質的に同一」なる用語は2個の数値(一般に一方は本発明の抗体に関連し、他方は参照/比較抗体に関連する数値)の類似度が十分に高く、2個の数値の差がこれらの数値(例えばKd値)により測定される生物学的特徴のコンテクスト内で生物学的及び/又は統計的に殆ど又は全く有意でないと当業者に判断されることを意味する。前記2個の数値の差は参照/比較抗体の数値の関数として約50%未満が好ましく、約40%未満が好ましく、約30%未満が好ましく、約20%未満が好ましく、約10%未満が好ましい。
「結合親和性」とは一般に分子(例えば抗体)の単一結合部位とその結合パートナー(例えば抗原)の非共有的相互作用の合計の強度を意味する。特に指定しない限り、本明細書で使用する「結合親和性」とは結合対のメンバー(例えば抗体と抗原)間の1:1相互作用を反映する固有結合親和性を意味する。分子XのそのパートナーYに対する親和性は一般に解離定数(Kd)により表すことができる。親和性は本明細書に記載する方法を含めた当分野で公知の一般方法により測定することができる。低親和性抗体は一般に抗原とゆっくりと結合し、解離し易い傾向があり、高親和性抗体は一般に抗原と迅速に結合し、長時間結合し続ける傾向がある。結合親和性の測定方法は種々のものが当分野で公知であり、本発明の趣旨では、そのうちの任意のものを使用することができる。特定の具体的態様を以下に記載する。
1態様では、本発明による「Kd」ないし「Kd値」は、非標識抗原の滴定系列の存在下にFabを最低濃度の[125I]標識抗原で平衡化した後に、抗Fab抗体をコーティングしたプレートで結合抗原を捕捉することにより抗原に対するFabの溶液結合親和性を測定する以下のアッセイに記載するように、該当抗体のFab形態とその抗原を使用して実施される放射性標識抗原結合アッセイ(RIA)により測定される(Chenら(1999)J.Mol Biol 293:865−881)。アッセイの条件を設定するために、50mM炭酸ナトリウム(pH9.6)中、5ug/mlの捕捉用抗Fab抗体(Cappel Labs)でマイクロタイタープレート(Dynex)を一晩コーティングした後に、PBS中、2%(w/v)ウシ血清アルブミンで2〜5時間室温(約23℃)にてブロックする。非吸着性プレート(Nunc #269620)で、100pM又は26pM[1251]抗原を該当Fab(例えばPrestaら(1997)Cancer Res.57:4593−4599に記載の抗VEGF抗体Fab−12の評価に合致するもの)の希釈系列と混合する。次に該当Fabを一晩インキュベートするが、平衡に達するようにインキュベーションをもっと長くしてもよい(例えば65時間)。その後、混合物を捕捉用プレートに移し、室温でインキュベーションする(例えば1時間)。その後、溶液を取出し、プレートをPBS中、0.1% Tween−20で8回洗浄する。プレートが乾燥したら、シンチラント(MicroScint(登録商標)−20;Packard)150ul/ウェルを加え、プレートをTopcount(登録商標)γカウンター(Packard)で10分間カウントする。最大結合の20%以下を示す各Fabの濃度を競合結合アッセイ用に選択する。別の態様によると、KdないしKd値はBIAcore(登録商標)−2000又はBIAcore(登録商標)−3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)を25℃で〜10応答単位(RU)の固相化抗原CM5チップと共に使用して表面プラズモン共鳴アッセイを使用することにより測定される。要約すると、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5,BIAcore Inc.)を供給業者の指示に従ってN−エチル−N’−(3−ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミド塩酸塩(EDC)とN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)で活性化する。抗原を10mM酢酸ナトリウム,pH4.8で5ug/ml(〜0.2uM)に希釈した後、約10応答単位(RU)の結合蛋白が得られるように流速5ul/分で注入する。抗原注入後、1Mエタノールアミンを注入し、未反応基をブロックする。動的測定のために、25℃のPBS+0.05% Tween 20(PBST)にFabの2倍希釈系列(0.78nM〜500nM)を流速約25ul/分で注入する。会合及び解離センサーグラムを同時にフィットさせることにより、単純な1対1ラングミュア結合モデル(BIAcore(登録商標)Evaluation Software version 3.2)を使用して会合速度(kon)と解離速度(koff)を計算する。koff/kon比として平衡解離定数(Kd)を計算する。例えばChenら(1999)J.Mol Biol 293:865−881参照。上記表面プラズモン共鳴アッセイにより会合速度が106M−1S−1を上回る場合には、ストップフロー分光光度計(Aviv Instruments)又は撹拌機能付きキュベットを備える8000−series SLM−Aminco(登録商標)分光光度計(ThermoSpectronic)等の分光計で測定した場合に漸増する抗原濃度の存在下で、PBS,pH7.2中、20nM抗抗原抗体(Fab形態)の25℃の蛍光発光強度(励起=295nm;発光=340nm,16nm帯域)の増減を測定する蛍光消光技術を使用して会合速度を測定することができる。
「アミノ酸配列」とは状況に応じてアミノ酸残基のポリマー(蛋白質、ポリペプチド等)又はアミノ酸ポリマーを表す文字列である。
本明細書で使用する「免疫抑制剤」なる用語は本発明で治療する哺乳動物の免疫系を抑制又は遮断するように作用する物質を意味する。この用語はサイトカイン産生を抑制、自己抗原発現をダウンレギュレートもしくは抑制、又はMHC抗原を遮断する物質を含む。このような物質の例としては2−アミノ−6−アリール−5−置換ピリミジン(米国特許第4,665,077号参照);非ステロイド性抗炎症薬(NSAID);ガンシクロビルタクロリムス、グルココルチコイド(例えばコルチゾール又はアルドステロン)、抗炎症薬(例えばシクロオキシゲナーゼ阻害剤、5−リポキシゲナーゼ阻害剤、又はロイコトリエン受容体アンタゴニスト);プリンアンタゴニスト(例えばアザチオプリン又はミコフェノール酸モフェチル(MMF));アルキル化剤(例えばシクロホスファミド);ブロモクリプチン;ダナゾール;ダプソン;(米国特許第4,120,649号に記載されているようにMHC抗原を遮断する)グルタルアルデヒド;MHC抗原及びMHCフラグメントに対する抗イディオタイプ抗体;シクロスポリンA;ステロイド(例えばコルチコステロイド又はグルココルチコステロイドもしくはグルココルチコイドアナログ、例えばプレドニゾン、メチルプレドニゾロン、及びデキサメタゾン);ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤(例えばメトトレキセート(経口又は皮下));ヒドロキシクロロキン;スルファサラジン;レフルノミド;サイトカイン又はサイトカイン受容体抗体、例えば抗インターフェロンα、β、又はγ抗体、抗腫瘍壊死因子α抗体(インフリキシマブ又はアダリムマブ)、抗TNFαイムノアドヘジン(エタネルセプト)、抗腫瘍壊死因子β抗体、抗インターロイキン−2抗体及び抗IL−2受容体抗体;抗LFA−1抗体(例えば抗CD11a及び抗CD18抗体);異種抗リンパ球グロブリン;pan−T抗体、好ましくは抗CD3;LFA−3結合ドメインを含む可溶性ペプチド(WO1990/08187、公開日1990年7月26日);ストレプトキナーゼ;TGFβ;ストレプトドルナーゼ;宿主由来RNA又はDNA;FK506;RS−61443;デオキシスペルグアリン;ラパマイシン;T細胞受容体(Cohenら,米国特許第5,114,721号);T細胞受容体フラグメント(Offnerら,Science,251:430−432(1991);WO1990/11294;Ianeway,Nature,341:482(1989);及びWO1991/01133);並びにT細胞受容体抗体(EP340,109)(例えばT10B9)が挙げられる。
本明細書で使用する「細胞傷害性物質」なる用語は細胞機能を阻害もしくは阻止及び/又は細胞破壊を誘発する物質を意味する。この用語は放射性同位体(例えばAt211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32及びLuの放射性同位体)、化学療法剤、及び毒素(例えば小分子性毒素又は細菌、真菌、植物もしくは動物に由来する酵素活性毒素又はそのフラグメント)を含むものとする。
「化学療法剤」は一般に癌治療で有用な化合物である。化学療法剤の例としてはアルキル化剤(例えばチオテパ及びCYTOXAN(登録商標)即ちシクロホスファミド);アルキルスルホネート(例えばブスルファン、インプロスルファン、及びピポスルファン);アジリジン(例えばベンゾデパ、カルボコン、メツレデパ、及びウレデパ);エチレンイミン及びメチルメラミン(例えばアルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホロアミド、トリエチレンチオホスホロアミド、及びトリメチロールメラミン);アセトゲニン(特にブラタシン及びブラタシノン);カンプトテシン(例えば合成アナログトポテカン);ブリオスタチン;カリスタチン;CC−1065(そのアドゼレシン、カルゼレシン、及びビゼレシン合成アナログを含む);クリプトフィシン(特にクリプトフィシン1及びクリプトフィシン8);ドラスタチン;デュオカルマイシン(合成アナログ、KW−2189及びCB1−TM1を含む);エレウテロビン;パンクラチスタチン;サルコジクチイン;スポンジスタチン;ナイトロジェンマスタード(例えばクロラムブシル、クロルナファジン、シクロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロルエタミン、メクロルエタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード);ニトロ尿素(例えばカルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン及びラニムスチン);抗生物質、例えばエンジイン抗生物質(例えばカリケアマイシン、特にカリケアマイシンγ1I及びカリケアマイシンωI1)(例えばAgnew,Chem Intl.Ed.Engl.,33:183−186(1994)参照);ジネマイシン(例えばジネマイシンA);ビホスホネート(例えばクロドロネート);エスペラマイシン;ネオカルジノスタチンクロモフォア及び関連クロモプロテインエンジイン抗生物質クロモフォア、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アンスラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6−ジアゾ−5−オキソ−L−ノルロイシン、ADRIAMYCIN(登録商標)即ちドキソルビシン(モルホリノドキソルビシン、シアノモルホリノドキソルビシン、2−ピロリノドキソルビシン、及びデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン(例えばマイトマイシンC)、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン;代謝拮抗剤(例えばメトトレキセート及び5−フルオロウラシル(5−FU));葉酸アナログ(例えばデノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセート);プリンアナログ(例えばフルダラビン、6−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン);ピリミジンアナログ(例えばアンシタビン、アザシチジン、6−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン);アンドロゲン(例えばカルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン);副腎阻害薬(例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン);葉酸補充剤(例えばフォリン酸);アセグラトン;アルドホスファミドグルコシド;アミノレブリン酸;エニルウラシル;アムサクリン;ベストラブシル;ビサントレン;エダトレキセート;デホファミン;デメコルシン;ジアジコン;エルフォルニチン;酢酸エリプチニウム;エポチロン;エトグルシド;硝酸ガリウム;ヒドロキシ尿素;レンチナン;ロニダミン;メイタンシノイド(例えばメイタンシン及びアンサマイトシン);ミトグアゾン;ミトキサントロン;モピダモール;ニトラエリン;ペントスタチン;フェナメト;ピラルビシン;ロソキサントロン;ポドフィリン酸;2−エチルヒドラジド;プロカルバジン;PSK(登録商標)即ち多糖複合体(JHS Natural Products,Eugene,Oreg.);ラゾキサン;リゾキシン;シゾフィラン;スピロゲルマニウム;テヌアゾン酸;トリアジコン;2,2’,2”−トリクロロトリエチルアミン;トリコテセン(特にT−2トキシン、ベルカリンA、ロリジンA及びアングイジン);ウレタン;ビンデシン;ダカルバジン;マンノムスチン;ミトブロニトール;ミトラクトール;ピポブロマン;ガシトシン;アラビノシド(「Ara−C」);シクロホスファミド;チオテパ;タキソイド(例えばTAXOL(登録商標)即ちパクリタキセル(Bristol−Myers Squibb Oncology,Princeton,NJ.)、ABRAXAN(登録商標)即ちパクリタキセルのクレモフォアフリーアルブミン結合ナノ粒子製剤(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Ill.)、及びTAXOTERE(登録商標)即ちドキセタキセル(Rhone−Poulenc Rorer,Antony,France));クロランブシル;GEMZAR(登録商標)即ちゲムシタビン;6−チオグアニン;メルカプトプリン;メトトレキセート;白金アナログ(例えばシスプラチン及びカルボプラチン);ビンブラスチン;白金;エトポシド(VP−16);イホスファミド;ミトキサントロン;ビンクリスチン;NAVELBINE(登録商標)即ちビノレルビン;ノバントロン;テニポシド;エダトレキセート;ダウノマイシン;アミノプテリン;ゼローダ;イバンドロネート;CPT−11;トポイソメラーゼ阻害剤RFS 2000;ジフルオロメチルオルニチン(DMFO);レチノイド(例えばレチノイン酸);カペシタビン;並びに上記化合物の任意のものの医薬的に許容可能な塩、酸、又は誘導体が挙げられる。
ホルモン作用を制御又は阻害するように作用する抗ホルモン剤もこの定義に含まれ、例えば抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体モジュレーター(SERM)、例えばタモキシフェン(例えばNOLVADEX(登録商標)即ちタモキシフェン)、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、4−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、LYI17018、オナプリストン、及びFARESTON(登録商標)即ちトレミフェン;副腎におけるエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば、4(5)−イミダゾール、アミノグルテチミド、MEGASE(登録商標)即ち酢酸メゲストロール、AROMASIN(登録商標)即ちエキセメスタン、フォルメスタン、ファドロゾール、RTVISOR(登録商標)即ちボロゾール、FEMARA(登録商標)即ちレトロゾール、及びARIMIDEX(登録商標)即ちアナストロゾール;抗アンドロゲン剤、例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン;トロキサシタビン(1,3−ジオキソランヌクレオチドシトシンアナログ);アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に異常細胞増殖に関与するシグナル伝達経路における遺伝子発現を阻害するもの、例えば、PKC−α、Raf、及びH−Ras;遺伝子治療用ワクチン等のワクチン、例えば、ALLOVECTIN(登録商標)ワクチン、LEUVECTIN(登録商標)ワクチン、及びVAXID(登録商標)ワクチン;PROLEUKIN(登録商標)rIL−2;LURTOTECAN(登録商標)トポイソメラーゼ1阻害剤;ABARELIX(登録商標)rmRH;並びに上記化合物の任意のものの医薬的に許容可能な塩、酸、又は誘導体が挙げられる。
「サイトカイン」なる用語は細胞間メディエーターとして別の細胞に作用する特定細胞集団から放出される蛋白質の総称である。このようなサイトカインの例はリンホカイン、モノカイン、インターロイキン(IL)(例えばIL−1、IL−1a、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−8、IL−9、IL−11、IL−12、IL−15)、腫瘍壊死因子(例えばTNF−α又はTNF−β)、及び他のポリペプチド因子(例えばLIF及びキットリガンド(KL))である。本明細書で使用するサイトカインなる用語は天然起源又は組換え細胞培養に由来する蛋白質と、天然配列サイトカインの生物学的に活性な等価物(例えば合成により作製した小分子化合物とその医薬的に許容可能な誘導体及び塩)を包含する。
「ホルモン」なる用語は管を備える腺臓器により一般に分泌されるポリペプチドホルモンを意味する。ホルモンとしては例えば成長ホルモン(例えばヒト成長ホルモン、N−メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン);副甲状腺ホルモン;チロキシン;インスリン;プロインスリン;リラキシン;プロリラキシン;糖蛋白ホルモン(例えば卵胞刺激ホルモン(FSH)、甲状腺刺激ホルモン(TSH)、及び黄体形成ホルモン(LH));プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、インヒビン;アクチビン;ミューラー管阻害物質;及びトロンボポエチンが挙げられる。本明細書で使用するホルモンなる用語は天然起源又は組換え細胞培養に由来する蛋白質と、天然配列ホルモンの生物学的に活性な等価物(例えば合成により作製した小分子化合物とその医薬的に許容可能な誘導体及び塩)を包含する。
「増殖因子」なる用語は増殖を促進する蛋白質を意味し、例えば肝細胞増殖因子;繊維芽細胞増殖因子;血管内皮細胞増殖因子;神経増殖因子(例えばNGF−β);血小板由来増殖因子;トランスフォーミング増殖因子(TGF)(例えばTGF−α及びTGF−β);インスリン様増殖因子I及びII;エリスロポエチン(EPO);骨誘導因子;インターフェロン(例えばインターフェロンα、β、及びγ);並びにコロニー刺激因子(CSF)(例えばマクロファージCSF(M−CSF);顆粒球マクロファージCSF(GM−CSF);及び顆粒球CSF(G−CSF))が挙げられる。本明細書で使用する増殖因子なる用語は天然起源又は組換え細胞培養に由来する蛋白質と、天然配列増殖因子の生物学的に活性な等価物(例えば合成により作製した小分子化合物とその医薬的に許容可能な誘導体及び塩)を包含する。
本発明の趣旨では、「腫瘍壊死因子α(TNFα)」なる用語はPennicaら,Nature,312:721(1984)又はAggarwalら,JBC,260:2345(1985)に記載されているようなアミノ酸配列を含むヒトTNFα分子を意味する。
本明細書において「TNFα阻害剤」とは一般にTNFαとの結合とその活性の中和によりTNFαの生物学的機能をある程度まで阻害する物質である。本発明で特に想定されるTNF阻害剤の例はエタネルセプト(ENBREL(登録商標))、インフリキシマブ(REMICADE(登録商標))、及びアダリムマブ(HUMIRA(登録商標))である。
「非ステロイド性抗炎症薬」ないし「NSAID」の例はアセチルサリチル酸、イブプロフェン、ナプロキセン、インドメタシン、スリンダク、トルメチンとその塩及び誘導体等である。
「インテグリン」なる用語は細胞を細胞外マトリックスに結合させると共に応答させ、創傷治癒、細胞分化、腫瘍細胞ホーミング、及びアポトーシス等の各種細胞機能に関与する受容体蛋白質を意味する。これらは細胞と細胞外マトリックス及び細胞同士の相互作用に関与する大きな細胞接着受容体ファミリーの一部である。機能的インテグリンは非共有的に結合したα及びβと呼ばれる2個の膜貫通糖蛋白サブユニットから構成される。αサブユニットはいずれも相互にある程度相同であり、βサブユニットも同様である。受容体は常に1本のα鎖と1本のβ鎖を含む。例としてはα6β1、α3β1、α7β1、LFA−1等が挙げられる。本明細書で使用するインテグリンなる用語は天然起源又は組換え細胞培養に由来する蛋白質と、天然配列インテグリンの生物学的に活性な等価物(例えば合成により作製した小分子化合物とその医薬的に許容可能な誘導体及び塩)を包含する。「α4インテグリン」は好中球以外の白血球の表面で発現されるα4−β1及びα4−β7インテグリンのα4サブユニットである。
本明細書における「インテグリンアンタゴニスト又は抗体」の例としてはLFA−1抗体(例えばGenentechから市販されているエファリズマブ(RAPTIVA(登録商標)))、又はα4インテグリン抗体(例えば「α4インテグリン抗体」はα4インテグリンと結合する抗体である)(例えばBiogenから市販されているナタリズマブ(Tysabri(登録商標)))、あるいはジアザ環状フェニルアラニン誘導体(WO2003/89410)、フェニルアラニン誘導体(WO2003/70709、WO2002/28830、WO2002/16329及びWO2003/53926)、フェニルプロピオン酸誘導体(WO2003/10135)、エナミン誘導体(WO2001/79173)、プロパン酸誘導体(WO2000/37444)、アルカン酸誘導体(WO2000/32575)、置換フェニル誘導体(米国特許第6,677,339号及び6,348,463号)、芳香族アミン誘導体(米国特許第6,369,229号)、ADAMジスインテグリンドメイミンポリペプチド(US 2002/0042368)、αvβ3インテグリンに対する抗体(EP 633945)、アザ架橋二環式アミノ酸誘導体(WO2002/02556)等が挙げられる。
「コルチコステロイド」とはステロイドの一般化学構造をもち、天然コルチコステロイドと同等以上の作用をもつ数種の合成又は天然物質のいずれか1種を意味する。合成コルチコステロイドの例としてはプレドニゾン、プレドニゾロン(メチルプレドニゾロンを含む)、デキサメタゾン、トリアムシノロン、及びベタメタゾンが挙げられる。
本明細書における「B細胞表面マーカー」ないし「B細胞表面抗原」とはこれと結合するアンタゴニストでターゲティングすることができるB細胞の表面で発現される抗原である。典型的なB細胞表面マーカーとしてはCD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD40、CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CDw78、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85、及びCD86白血球表面マーカーが挙げられる(詳細については、The Leukocyte Antigen Facts Book,2nd Edition.1997,ed.Barclayら,Academic Press,Harcourt Brace & Co.,New York参照)。他のB細胞表面マーカーとしてはRP105、FcRH2、B細胞CR2、CCR6、P2X5、HLA−DOB、CXCR5、FCER2、BR3、Btig、NAG14、SLGC16270、FcRH1、IRTA2、ATWD578、FcRH3、IRTA1、FcRH6、BCMA、及び239287が挙げられる。特に有用なB細胞表面マーカーは哺乳動物の他のB細胞以外の組織に比較してB細胞で優先的に発現され、前駆体B細胞と成熟B細胞の両者で発現することができる。
「B細胞表面マーカーと結合する抗体」とはB細胞表面マーカーと結合すると、例えばB細胞により誘発される体液性応答を低下又は阻止することにより、哺乳動物でB細胞を破壊又は消失させ、及び/又は1種以上のB細胞機能を妨害する分子である。この抗体はこれを投与した哺乳動物でB細胞を消失(即ち循環B細胞濃度を低下)できることが好ましい。このような消失は抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用(ADCC)及び/又は補体依存性細胞傷害作用(CDC)、B細胞増殖の阻害、及び/又は(例えばアポトーシスによる)B細胞死の誘導等の各種メカニズムにより得られる。
「アンタゴニスト」とは特定又は指定蛋白質の活性(例えばリガンドの場合には1種以上の受容体とのその結合、又は受容体の場合には1種以上のリガンドとの結合)を中和、遮断、抑制、排除、低下又は妨害することが可能な分子である。アンタゴニストとしては抗体とその抗原結合フラグメント、蛋白質、ペプチド、糖蛋白質、糖ペプチド、糖脂質、多糖、オリゴ糖、核酸、生体有機分子、ペプチドミメティクス、薬剤とその代謝産物、転写及び翻訳調節配列等が挙げられる。アンタゴニストとしては更に蛋白質の小分子阻害剤、蛋白質と特異的に結合することによりそのターゲットとの結合を妨害する融合蛋白質、受容体分子及び誘導体、蛋白質のアンタゴニスト変異体、蛋白質に対するアンチセンス分子、RNAアプタマー、並びに蛋白質に対するリボザイムが挙げられる。
「B細胞表面マーカーアンタゴニスト」とはB細胞表面マーカーと結合すると、例えばB細胞により誘発される体液性応答を低下又は阻止することにより、哺乳動物でB細胞を破壊又は消失させ、及び/又は1種以上のB細胞機能を妨害する分子である。このアンタゴニストはこれを投与した哺乳動物でB細胞を消失(即ち循環B細胞濃度を低下)できることが好ましい。このような消失はADCC及び/又はCDC、B細胞増殖の阻害、及び/又は(例えばアポトーシスによる)B細胞死の誘導等の各種メカニズムにより得られる。本発明の範囲に含まれるアンタゴニストとしてはB細胞マーカーと結合する抗体、合成又は天然配列ペプチド、融合蛋白質、及び小分子アンタゴニストが挙げられ、場合により細胞傷害性物質と共役又は融合している。例としては限定されないが、例えばCD20抗体、BR3抗体(例えばWO0224909)、BR3−Fc等が挙げられる。
CD20抗体の例としては、「C2B8」(現名称「リツキシマブ」)(「R1TUXAN(登録商標)」)(米国特許第5,736,137号);IDEC Pharmaceuticals,Inc.から市販されている「Y2B8」ないし「イブリツモマブチウキセタン」(ZEVALIN(登録商標))と呼称されるイットリウム[90]標識2B8マウス抗体(米国特許第5,736,137号;1993年6月22日にアクセション番号HB11388でATCCに登録された2B8);場合により131Iで標識され、「131I−B1」ないし「ヨウ素I131トシツモマブ」抗体(BEXXAR(登録商標))としてCorixaから市販されているマウスIgG2a「B1」別称「トシツモマブ」(米国特許第5,595,721号も参照);マウスモノクローナル抗体「1F5」(Pressら,Blood 69(2):584−591(1987))及び「フレームワーク修復」又はヒト化1F5を含むその変異体(WO2003/002607,Leung,S.;ATCC寄託HB−96450);マウス2H7及びキメラ2H7抗体(米国特許第5,677,180号);ヒト化2H7(例えばWO04/056312;US20060024295参照);HUMAX−CD20(登録商標)抗体(Genmab,Denmark);WO2004/035607(Teelingら)に記載のヒトモノクローナル抗体;AME−133(登録商標)抗体(Applied Molecular Evolution);A20抗体又はその変異体(例えばキメラ又はヒト化A20抗体(夫々cA20、hA20))(US 2003/0219433,Immunomedics);並びにInternational Leukocyte Typing Workshop(Valentineら,In:Leukocyte Typing III(McMichael,Ed.,p.440,Oxford University Press(1987))から入手可能なモノクローナル抗体L27、G28−2、93−1 B3、B−C1又はNU−B2が挙げられる。
「疾患修飾性抗リウマチ薬」ないし「DMARD」の例としてはヒドロキシクロロキン、スルファサラジン、メトトレキセート、レフルノミド、エタネルセプト、インフリキシマブ(+経口及び皮下メトトレキセート)、アザチオプリン、D−ペニシラミン、金剤(経口)、金剤(筋肉内)、ミノサイクリン、シクロスポリン、ブドウ球菌プロテインA免疫吸着剤とその塩及び誘導体等が挙げられる。
「CTLA4」は活性化Tリンパ球で発現され、免疫応答のダウンレギュレーションに関与している。文献中のCTLA4の他の呼称としては、細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4、細胞傷害性Tリンパ球関連プロテイン4、細胞分化抗原CD152、及び細胞傷害性Tリンパ球関連顆粒セリンプロテアーゼ4が挙げられる。
他の各種用語については本明細書中に定義又は他の方法で説明する。
CD4は大半の胸腺細胞と末梢T細胞のサブセットを含むTリンパ球系列の細胞で主に発現される表面糖蛋白質である。リンパ球以外の所定の細胞でも低レベルのCD4が発現されるが、このような広い細胞分布の機能的意味は不明である。成熟T細胞で、CD4は抗原提示細胞で発現されるMHCクラスII分子との相互作用を介して同時認識機能を果たす。CD4+T細胞は主にウイルス、細菌、真菌及び寄生生物感染に対するT依存性応答中にT及びB細胞機能を調節するヘルパーサブセットを構成する。
自己免疫疾患の発病中、特に自己抗原に対する耐性の低下時に、CD4+T細胞は炎症応答に寄与し、関節と組織の破壊をもたらす。これらのプロセスは例えば造血系列の炎症性細胞の動員、抗体、炎症性サイトカイン及びメディエーターの産生、更にキラー細胞の活性化により助長される。
CD4+T細胞はループスの病因に関係があるとされている。例えば、CD4+T細胞は糸球体腎炎の部位に存在する。SLE患者からのCD4+T細胞は抗原に対する反応が亢進し、in vitroアポトーシス耐性であることが報告されている。SLE患者にはB細胞による自己抗体産生を助長し得る自己抗原特異的CD4+T細胞(IFN−γをを産生するエフェクター/メモリーCD4+細胞)が存在する。更に、MHCクラスII対立遺伝子とSLEの危険の間には強い相関が認められる。
CD4+T細胞はMSの病因にも関係があるとされている。例えば、CD4+ヘルパーT細胞はMS及び対応する実験モデルである実験的アレルギー性脳脊髄炎(EAE)の病因に関与しており、T細胞を消失させた実験動物はEAE発症性の低下を示す(USPN4,695,459、発明者Steinmanら、発明の名称「Leu3/CD4表現型T細胞に媒介される自己免疫疾患の治療方法(Method of treating autoimmune diseases that are mediated by Leu3/CD4 phenotype T cells)」、Traugottら(1983)“Multiple sclerosis:distribution of T cell subsets within active chronic lesions”Science 219:308−310、Arnasonら(1962)“Role of the thymus in immune reaction in rats:H Suppressive effect of thymectomy at birth on reactions of delayed(cellular)hypersensitivity and the circulating small lymphocyte”J Exp Med 116:177−186、及びGonatas and Howard(1974)“Inhibition of experimental allergic encephalomyelitis in rats severely depleted of T cells”Science 186:839−841参照)。MS病巣にはCD4+及びCD8+T細胞が存在し、どちらも炎症性サイトカインを産生することが知られているが、病因へのそれらの相対寄与は分かっていない。MS患者の血液中ではミエリン特異性CD4+細胞頻度の4倍の増加が認められる。MSの治療に現在使用されている又は将来使用される可能性の高い数種の薬剤(例えば、Tysabri(登録商標)(ナタリズマブ、α4インテグリン抗体)、CamPath(登録商標)(アレムツズマブ、CD52抗体)、及びダクリズマブ(IL−2Rα抗体))はT細胞への作用も介して機能すると考えられている。更に、MSの危険の増加はMHCクラスII対立遺伝子(3.6倍)、及び程度は低いが、クラスI対立遺伝子(2倍)と相関している。
1側面では、本発明は非消失性CD4抗体と、ループスを治療するために臨床使用又は実験使用されている別の化合物の併用剤を投与することによるSLEとループス腎炎を含むループスの治療方法を提供する。本発明の別の側面は腎機能の改善及び/又は蛋白尿もしくは活性尿沈渣の低減をもたらす非消失性CD4抗体を投与することによる中期〜後期疾患を含むループス腎炎の治療方法を提供する。本発明の更に別の側面は、場合によりMSを治療するために臨床使用又は実験使用されている別の化合物と併用して非消失性CD4抗体を投与することによるMSの治療方法を提供する。本発明の更に別の側面は、自己免疫疾患を治療するために臨床使用又は実験使用されている別の化合物と一般に併用して非消失性CD4抗体を投与することによる移植レシピエント又は関節リウマチ、喘息、乾癬、炎症性腸疾患(例えばクローン病及び潰瘍性大腸炎)、及びシェーグレン症候群等の自己免疫疾患対象の治療方法を提供する。
CD4抗体
消失性と非消失性の両者の多数のCD4抗体が文献に記載されている。自己抗原を含む抗原に対する耐性を誘導するためのこのような抗体の使用も報告されている。例えばUSPN4,695,459;USPN6,056,956、発明者Cobbold and Waldmann、発明の名称「非消失性抗CD4モノクローナル抗体と耐性誘導(Non−depleting anti−CD4 monoclonal antibodies and tolerance induction)」;USPN5,690,933、発明者Cobbold and Waldmann、発明の名称「耐性誘導用モノクローナル抗体(Monoclonal antibodies for inducing tolerance)」;ヨーロッパ特許出願公開0240344、発明者Cobboldら、発明の名称「モノクローナル抗体とその使用(Monoclonal antibodies and their use)」;USPN6,136,310、発明者Hannaら、発明の名称「ヒト治療用組換え抗CD4抗体(Recombinant anti−CD4 antibodies for human therapy)」;USPN5,756,096、発明者Newmanら、発明の名称「ヒト治療用組換え抗体(Recombinant antibodies for human therapy)」;USPN5,750,105、発明者Newmanら、発明の名称「ヒト治療用組換え抗体(Recombinant antibodies for human therapy)」;USPN4,381,295、発明者Kung and Goldstein、発明の名称「ヒトヘルパーT細胞に対するモノクローナル抗体及びその作製方法(Monoclonal antibody to human helper T cells and methods of preparing same)」;Waldmann(1989)“Manipulation of T−cell responses with monoclonal antibodies”Ann Rev Immunol 7:407−44;及びWofsy and Seaman(1987)“Reversal of advanced murine lupus in NZB/NZW F1 mice by treatment with monoclonal antibody to L3T4” J Immunol 138:3247−53参照。特に、非消失性CD4抗体と、耐性誘導におけるその使用については各々言及により本明細書に組込む米国特許出願公開2003/0108518、発明者Frewinら、発明の名称「TRX1抗体とその使用(TRX1 antibody and uses therefor)」及び米国特許出願公開2003/0219403、発明者Frewinら、発明の名称「霊長類を抗原に耐性にする組成物及び方法(Compositions and methods of tolerizing a primate to an antigen)」に記載されている。
消失性と非消失性の両者の多数のCD4抗体が文献に記載されている。自己抗原を含む抗原に対する耐性を誘導するためのこのような抗体の使用も報告されている。例えばUSPN4,695,459;USPN6,056,956、発明者Cobbold and Waldmann、発明の名称「非消失性抗CD4モノクローナル抗体と耐性誘導(Non−depleting anti−CD4 monoclonal antibodies and tolerance induction)」;USPN5,690,933、発明者Cobbold and Waldmann、発明の名称「耐性誘導用モノクローナル抗体(Monoclonal antibodies for inducing tolerance)」;ヨーロッパ特許出願公開0240344、発明者Cobboldら、発明の名称「モノクローナル抗体とその使用(Monoclonal antibodies and their use)」;USPN6,136,310、発明者Hannaら、発明の名称「ヒト治療用組換え抗CD4抗体(Recombinant anti−CD4 antibodies for human therapy)」;USPN5,756,096、発明者Newmanら、発明の名称「ヒト治療用組換え抗体(Recombinant antibodies for human therapy)」;USPN5,750,105、発明者Newmanら、発明の名称「ヒト治療用組換え抗体(Recombinant antibodies for human therapy)」;USPN4,381,295、発明者Kung and Goldstein、発明の名称「ヒトヘルパーT細胞に対するモノクローナル抗体及びその作製方法(Monoclonal antibody to human helper T cells and methods of preparing same)」;Waldmann(1989)“Manipulation of T−cell responses with monoclonal antibodies”Ann Rev Immunol 7:407−44;及びWofsy and Seaman(1987)“Reversal of advanced murine lupus in NZB/NZW F1 mice by treatment with monoclonal antibody to L3T4” J Immunol 138:3247−53参照。特に、非消失性CD4抗体と、耐性誘導におけるその使用については各々言及により本明細書に組込む米国特許出願公開2003/0108518、発明者Frewinら、発明の名称「TRX1抗体とその使用(TRX1 antibody and uses therefor)」及び米国特許出願公開2003/0219403、発明者Frewinら、発明の名称「霊長類を抗原に耐性にする組成物及び方法(Compositions and methods of tolerizing a primate to an antigen)」に記載されている。
前記方法で使用するのに適した典型的な非消失性CD4抗体としては、米国特許出願公開2003/0108518、発明者Frewinら、発明の名称「TRX1抗体とその使用(TRX1 antibody and uses therefor)」及び米国特許出願公開2003/0219403、発明者Frewinら、発明の名称「霊長類を抗原に耐性にする組成物及び方法(Compositions and methods of tolerizing a primate to an antigen)」に記載のTRX1抗体が挙げられる。これらの抗体はヒト抗体の改変定常領域と、ヒト抗体の軽鎖及び重鎖フレームワーク領域と、マウスモノクローナル抗体に由来する軽鎖及び重鎖CDRを含むヒト化抗体である。
従って、1分類の態様では、非消失性CD4抗体は図1〜4のいずれかに示すようなTRX1抗体である。抗体は配列番号3に記載の軽鎖アミノ酸配列と配列番号6に記載の重鎖アミノ酸配列、配列番号9に記載の軽鎖アミノ酸配列と配列番号12に記載の重鎖アミノ酸配列、配列番号15に記載の軽鎖アミノ酸配列と配列番号18に記載の重鎖アミノ酸配列、又は配列番号21に記載の軽鎖アミノ酸配列と配列番号24に記載の重鎖アミノ酸配列をもつことができる。関連分類の態様では、抗体は配列番号3に記載の軽鎖アミノ酸配列と配列番号6に記載の重鎖アミノ酸配列、配列番号9に記載の軽鎖アミノ酸配列と配列番号12に記載の重鎖アミノ酸配列、配列番号15に記載の軽鎖アミノ酸配列と配列番号18に記載の重鎖アミノ酸配列、又は配列番号21に記載の軽鎖アミノ酸配列と配列番号24に記載の重鎖アミノ酸配列を含む抗体のCD4結合フラグメントを含む。
前記方法ではTRX1抗体に由来する1個以上のCDRを含む抗体も有用である。従って、1分類の態様では、非消失性CD4抗体は図1Aに示す軽鎖のCDR1(配列番号25)、CDR2(配列番号26)、又は好ましくはCDR3(配列番号27)を含む。抗体は場合により図1Aに示す軽鎖のCDR1、CDR2、及びCDR3(配列番号25〜27)を含む。同様に、1分類の態様では、抗体は図1Dに示す重鎖のCDR1(配列番号28)、CDR2(配列番号29)、又は好ましくはCDR3(配列番号30)を含む。抗体は場合により図1Dに示す重鎖のCDR1、CDR2、及びCDR3(配列番号28〜30)を含む。1分類の態様では、抗体は図1Aに示す軽鎖のCDR1、CDR2、及びCDR3と、図1Dに示す重鎖のCDR1、CDR2、及びCDR3(配列番号25〜30)を含む。抗体は場合により図1A、図2A、図3A、又は図4Aに示す軽鎖のFR1,FR2、及び/又はFR3、及び/又は図1D、図2D、図3D、又は図4Dに示す重鎖のFR1,FR2、FR3、及び/又はFR4も含む。
他の典型的な抗体としては限定されないが、TRX1抗体と同一のエピトープと結合する抗体(例えば図1〜4のいずれかに示す抗体)が挙げられる。
対象がヒトである場合には、抗体はヒト化抗体又はヒト抗体が好ましい。当然のことながら、非ヒト哺乳動物の治療には、例えば適切な種の哺乳動物からの免疫グロブリンに由来するフレームワーク配列と定常領域配列を組込むことにより、該当動物で使用するように抗体を適応させる。抗体は場合によりモノクローナル抗体、無傷の抗体、抗体フラグメント、及び/又は天然抗体である。
抗体は場合により、補体活性化及び/又は抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用を誘導する能力を低下するように、例えばヒトIgG1に比較してエフェクター機能を低下させる。例えば、抗体はFc受容体との結合を低下(又は除去)することができる。同様に、抗体は非グリコシル化Fc部分をもつことができる。抗体は場合によりFcRNと結合することが可能な抗CD4変異体抗体でもよい。
ループスの治療
1側面では、本発明は治療有効量の抗CD4非消失性抗体及び/又は第2の物質を投与することによる哺乳動物対象(例えばヒト対象)におけるループスの治療方法を提供する。対象を治療するループスは一般に全身性エリテマトーデス(SLE)、皮膚エリテマトーデス(CLE)、又はループス腎炎であるが、腎外、脳炎、小児、非腎、円板状、又は脱毛症等の別の形態のループスでもよい。治療するループスは治療開始時に初期、中期又は後期段階の疾患とすることができる。ループス腎炎を治療する態様では、ループス腎炎はクラスI〜VIのいずれか1種とすることができる。例えば、治療するループスはメサンギウム増殖性ループス腎炎(クラスII)又は膜性ループス腎炎(クラスV)とすることができる。一般に、ループスは蛋白尿の低減、活性尿沈渣の低減、及び腎機能の正常化又は安定化を達成する目的で治療する増殖性ループス腎炎(クラスIII又はクラスIV)である。例えば、(例えば下記実施例1に記載するようにディップスティック又は他の日常分析を使用して例えば24時間尿蛋白測定により、当分野で定着しているように測定した場合に)蛋白尿を少なくとも25%又は少なくとも50%、更には少なくとも75%又は少なくとも90%低減することができ、あるいは蛋白尿を1g/日未満又は500mg/日未満まで低減することができる。別の例として、対象の尿蛋白対クレアチニン比を少なくとも25%又は少なくとも50%低減することができ、あるいは前記比を1未満又は0.5未満まで低減することができる。同様に、(例えば顕微鏡観察により、当分野で定着しているようにモニターした場合に)活性尿沈渣を少なくとも25%、少なくとも50%、少なくとも75%、又は少なくとも90%低減することができ、あるいは(赤血球10個未満/高パワー電場及び赤血球円柱の不在、好ましくは赤血球5個未満/高パワー電場により判定されるように)治療開始後に不活性尿沈渣しか残存しないようにすることができる。1側面では、ループス腎炎を治療する場合には、対象は併用剤の投与開始後に蛋白尿の低減及び/又は活性尿沈渣の低減を示す。例えば、対象の尿蛋白濃度を併用剤の投与開始前の対象の尿蛋白濃度の75%未満、50%未満、25%未満、又は10%未満まで、あるいは1g/日未満又は500mg/日未満まで低減することができ、及び/又は活性尿沈渣を少なくとも25%、少なくとも50%、少なくとも75%、又は少なくとも90%低減することができ、あるいは治療開始後に不活性尿沈渣しか残存しないようにすることができる(例えば赤血球10個未満、好ましくは5個未満/高パワー電場)。
1側面では、本発明は治療有効量の抗CD4非消失性抗体及び/又は第2の物質を投与することによる哺乳動物対象(例えばヒト対象)におけるループスの治療方法を提供する。対象を治療するループスは一般に全身性エリテマトーデス(SLE)、皮膚エリテマトーデス(CLE)、又はループス腎炎であるが、腎外、脳炎、小児、非腎、円板状、又は脱毛症等の別の形態のループスでもよい。治療するループスは治療開始時に初期、中期又は後期段階の疾患とすることができる。ループス腎炎を治療する態様では、ループス腎炎はクラスI〜VIのいずれか1種とすることができる。例えば、治療するループスはメサンギウム増殖性ループス腎炎(クラスII)又は膜性ループス腎炎(クラスV)とすることができる。一般に、ループスは蛋白尿の低減、活性尿沈渣の低減、及び腎機能の正常化又は安定化を達成する目的で治療する増殖性ループス腎炎(クラスIII又はクラスIV)である。例えば、(例えば下記実施例1に記載するようにディップスティック又は他の日常分析を使用して例えば24時間尿蛋白測定により、当分野で定着しているように測定した場合に)蛋白尿を少なくとも25%又は少なくとも50%、更には少なくとも75%又は少なくとも90%低減することができ、あるいは蛋白尿を1g/日未満又は500mg/日未満まで低減することができる。別の例として、対象の尿蛋白対クレアチニン比を少なくとも25%又は少なくとも50%低減することができ、あるいは前記比を1未満又は0.5未満まで低減することができる。同様に、(例えば顕微鏡観察により、当分野で定着しているようにモニターした場合に)活性尿沈渣を少なくとも25%、少なくとも50%、少なくとも75%、又は少なくとも90%低減することができ、あるいは(赤血球10個未満/高パワー電場及び赤血球円柱の不在、好ましくは赤血球5個未満/高パワー電場により判定されるように)治療開始後に不活性尿沈渣しか残存しないようにすることができる。1側面では、ループス腎炎を治療する場合には、対象は併用剤の投与開始後に蛋白尿の低減及び/又は活性尿沈渣の低減を示す。例えば、対象の尿蛋白濃度を併用剤の投与開始前の対象の尿蛋白濃度の75%未満、50%未満、25%未満、又は10%未満まで、あるいは1g/日未満又は500mg/日未満まで低減することができ、及び/又は活性尿沈渣を少なくとも25%、少なくとも50%、少なくとも75%、又は少なくとも90%低減することができ、あるいは治療開始後に不活性尿沈渣しか残存しないようにすることができる(例えば赤血球10個未満、好ましくは5個未満/高パワー電場)。
1つの一般分類の態様では、前記方法において、ループスを治療するために非消失性CD4抗体と少なくとも第2の化合物の併用剤の治療有効量を対象に投与する。非消失性CD4抗体は本明細書に記載する任意のものとすることができる。第2の化合物は一般にループスの治療に使用される化合物(例えば標準看護又は実験治療薬)である。典型的な第2の化合物としては限定されないが、細胞傷害性物質;免疫抑制剤;抗マラリア薬(例えばヒドロキシクロロキン、クロロキン、又はキナクリン);化学療法剤;サイトカインアンタゴニスト又は抗体;増殖因子;ホルモン(例えばホルモン置換療法);抗ホルモン療法;インテグリンアンタゴニスト又は抗体(例えばα4インテグリン抗体又はアンタゴニスト);B細胞表面マーカーアンタゴニスト;B細胞表面マーカーに対する抗体(例えばCD20抗体、例えばリツキシマブ、別称Rituxan(登録商標));CD5、CD28、又はCD40抗体又は遮断薬;コルチコステロイド(例えば全身コルチコステロイド療法を含む関節注射による例えばメチルプレドニゾロン、プレドニゾン(例えば低用量プレドニゾン)、デキサメタゾン、又はグルココルチコイド);DMARD;あるいは上記化合物の任意組み合わせ等が挙げられる。米国特許出願公開2006/0024295及び2003/0219403も参照。
1分類の態様では、第2の化合物は例えばシクロホスファミド、ミコフェノール酸モフェチル、CTLA4−Ig、及びBR3−Fcから選択される。シクロホスファミドは商標名Cytoxan(登録商標)でも知られている。ミコフェノール酸モフェチルはCellCept(登録商標)、MMF、又は(E)−6−(1,3−ジヒドロ−4−ヒドロキシ−6−メトキシ−7−メチル−3−オキソ−5−イソベンゾフラニル)−4−メチル−4−ヘキセン酸2−モルホリノエチルとも呼ばれる。CTLA4−Igはヒト細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4(CTLA−4)の細胞外ドメインをヒト免疫グロブリンの改変Fc部分と結合したものである(例えばアバタセプト(Bristol−Myers Squibb製品Orencia(登録商標)又はRepliGen製品RG2077)。典型的なα4インテグリン抗体はナタリズマブ(Tysabri(登録商標))である。BR3−FcはBAFFの可溶性アンタゴニストであり、ヒトBR3(B細胞に存在するBAFF受容体)の細胞外ドメインとヒトIgG1 Fcを含む融合蛋白質である(例えばVugmeysterら(2006)American Journal of Pathology 168:476−489及びKayagakiら(2002)Immunity 10:515−524参照)。場合により第3、第4等の化合物も併用剤に加えてもよく、ほんの1例としてメチルプレドニゾロン及び/又はプレドニゾン等のコルチコステロイドをCD4抗体及びシクロホスファミドと併用投与することができる。
1態様では、対象は過去にループスを治療するために免疫抑制剤等の薬剤を投与したことがなく、及び/又は過去に抗CD4抗体を投与したことがない。別の態様では、対象は過去にループスを治療するために薬剤を投与したことがあり、及び/又は過去に抗CD4抗体を投与したことがある。別の態様では、対象は関節リウマチをもたない。更に別の態様では、対象は多発性硬化症をもたない。更に別の態様では、対象はループス以外の自己免疫疾患をもたない。本明細書における「自己免疫疾患」とは個体自身の組織もしくは臓器に起因し、これを攻撃する疾患もしくは障害又はその同時分離もしくは発現又はその結果として生じる病態である。1態様では、この用語は正常生体組織及び抗原に対して反応性の抗体がB細胞により産生されることにより誘発又は悪化する病態を意味する。他の態様では、自己免疫疾患とは自己抗原(例えば核抗原)からのエピトープに特異的な自己抗体の分泌を伴う疾患である。
1態様では、併用剤の投与開始前に、対象は蛋白尿を示し、前記蛋白尿は投与後に改善される。例えば、投与開始前に、対象は>500mg/日、>1000mg/日、>2000mg/日、又は>3500mg/日の蛋白尿を示すことができ、投与開始後に、蛋白尿を少なくとも25%、又は少なくとも50%、又は少なくとも75%、又は少なくとも90%低減することができ、あるいは例えば24時間尿蛋白測定により測定した場合に蛋白尿を1g/日未満又は500mg/日未満まで低減することができる。
蛋白対クレアチニン比の低下をモニターすることもできる。例えばランダム尿サンプルの例えばスポット尿蛋白対クレアチニン比の測定により、当分野で定着しているように尿蛋白及びクレアチニン濃度を測定することができる。1態様では、併用剤の投与開始前に、対象は>0.5、>1、又は>2の蛋白対クレアチニン比を示し、投与開始後に、蛋白対クレアチニン比を例えば1未満(例えば部分的な治療応答の場合)又は0.5未満(例えば完全応答の場合)まで低減することができる。投与開始後に、蛋白対クレアチニン比を投与前の値に比較して少なくとも25%又は少なくとも50%低減することができる。1態様では、併用剤の投与開始前に、対象は腎炎範囲の蛋白尿を示し、蛋白対クレアチニン比が3を上回り、投与開始後に蛋白対クレアチニン比は3未満まで低下し、又は場合により少なくとも25%もしくは少なくとも50%又は2未満もしくは1未満まで低下する。
併用剤によるループス腎炎を含むループスの治療に対する応答は例えば補体レベル、自己抗体レベル、及び/又は総合疾患活性をモニターすることにより評価することもできる。例えば、補体レベル(例えばC3、C4、及びCH50)の正常化を治療の成功の指標とすることができる。同様に、投与開始後に、抗2本鎖DNA抗体、ANA、及び抗Clq等の自己抗体レベルを例えば少なくとも25%、少なくとも50%、又は少なくとも75%低下させることができる。腎生検の改善も治療の成功の指標として観察することができる。
場合により、併用剤の投与開始前に、対象はネフローゼ症候群を示す。ネフローゼ症候群の診断は当分野で定着しているように実施することができる。ネフローゼ症候群を診断するために使用することができる所定の徴候、症状、又は他の指標としては3.5g/日を上回る24時間尿蛋白、3を上回る蛋白対クレアチニン比、低アルブミン血症(血中アルブミン濃度の低下)、特に眼球、足、及び手の周囲の浮腫(腫脹)、及び/又は高コレステロール血症(血中コレステロール濃度の上昇)が挙げられる。本発明はネフローゼ症候群のこれらの徴候、症状、又は他の指標に限定されない。ネフローゼ症候群は場合により併用剤の投与により改善される。例えば、対象は場合により治療開始後に3.5g/日未満まで、例えば3g/日未満、2g/日未満、1g/日未満、更には0.5g/日未満までの蛋白尿低減を示し、及び/又は治療開始後に3未満まで、例えば2未満、1未満、更には0.5未満までの蛋白対クレアチニン比の低下を示す。
対象に併用剤を投与すると、例えば望ましくない副作用の低減という点で対象に多大な利点が得られる。例えば、非消失性CD4抗体との併用投与に必要な第2の化合物(例えばシクロホスファミド)の量は第2の化合物の単独投与により症状を改善するために必要な量よりも著しく減らすことができる。例えば、シクロホスファミドは重度の副作用を生じる可能性があるので、治療を達成するためにこの薬剤の使用量を減らすことは非常に望ましい。
1側面では、前記方法は症状を緩和するために非消失性CD4抗体と第2の化合物を対象に投与する段階と、その後、寛解を維持するために(第2の化合物と併用せずに)非消失性CD4抗体の対象への投与を継続する段階を含む。例えば、症状を緩和するために非消失性CD4抗体とシクロホスファミド、ミコフェノール酸モフェチル、又はCTLA4−Igの併用剤を対象に投与した後に、寛解を維持するために非消失性CD4抗体を単独投与する(即ちシクロホスファミド、ミコフェノール酸モフェチル、又はCTLA4−Igと併用しない)。このような方法も第2の化合物への対象の暴露を最小限にすることにより副作用を減らすことができる。別の態様では、症状を緩和するために非消失性CD4抗体と第2の化合物を対象に投与した後に、第2の化合物又は非消失性CD4抗体以外の1種以上の他の化合物の投与を継続する。
別の一般分類の態様は哺乳動物対象(例えばヒト)におけるループス腎炎の治療方法も提供する。前記方法では、治療有効量の非消失性CD4抗体を対象に投与する。抗体の投与開始後に、対象は投与開始前に対象が示した蛋白尿及び/又は活性尿沈渣レベルに比較して腎機能の改善、蛋白尿の低減及び/又は活性尿沈渣の低減を示す。例えば、蛋白尿を少なくとも25%、少なくとも50%、少なくとも75%、又は少なくとも90%低減することができ、あるいは蛋白尿を1g/日未満又は500mg/日未満まで低減することができ;尿蛋白対クレアチニン比を少なくとも25%又は少なくとも50%低減することができ、あるいは前記比を1未満又は0.5未満まで低減することができ;及び/又は活性尿沈渣を少なくとも25%、少なくとも50%、少なくとも75%、又は少なくとも90%低減することができ、あるいは投与開始後に不活性尿沈渣しか残存しないようにすることができる。非消失性CD4抗体は本明細書に記載する任意のものとすることができる。
1態様では、対象は過去にループス腎炎を治療するために薬剤を投与したことがなく、及び/又は過去に抗CD4抗体を投与したことがない。別の態様では、対象は過去にループス腎炎を治療するために薬剤を投与したことがあり、及び/又は過去に抗CD4抗体を投与したことがある。別の態様では、本発明の非消失性抗CD4抗体はループス腎炎を治療するために対象に投与する唯一の医薬である。別の態様では、本発明の非消失性CD4抗体はループス腎炎を治療するために使用する医薬の1種である。別の態様では、対象は関節リウマチをもたない。更に別の態様では、対象は多発性硬化症をもたない。更に別の態様では、対象はループス及び/又はループス腎炎以外の自己免疫疾患をもたない。
1分類の態様では、前記方法は本明細書に記載する任意のもの等の少なくとも第2の化合物を非消失性CD4抗体と併用投与する段階を含む。例えば、シクロホスファミド、ミコフェノール酸モフェチル、CTLA4−Ig、又はα4インテグリン抗体を対象に非消失性CD4抗体と併用投与することができる。場合により第3、第4等の化合物も併用剤に加え、例えば、メチルプレドニゾロン及び/又はプレドニゾン等のコルチコステロイドをCD4抗体及びシクロホスファミドと併用投与することができる。
1態様では、非消失性CD4抗体の投与開始前に、対象は蛋白尿を示し、前記蛋白尿は非消失性CD4抗体の投与開始後に低減する。例えば、投与開始前に、対象は>500mg/日、>1000mg/日、>2000mg/日、又は>3500mg/日の蛋白尿を示すことができ、投与開始後に、蛋白尿を少なくとも25%、少なくとも50%、少なくとも75%、又は少なくとも90%低減することができ、あるいは蛋白尿を1g/日未満又は500mg/日未満まで低減することができる。同様に、蛋白対クレアチニン比の低下をモニターすることもできる。1態様では、投与開始前に、対象は>0.5、>1、又は>2の蛋白対クレアチニン比を示し、投与開始後に、蛋白対クレアチニン比を少なくとも25%又は少なくとも50%低減することができ、あるいは1未満又は0.5未満まで低減することができる。1態様では、併用剤の投与開始前に、対象は腎炎範囲の蛋白尿を示し、蛋白対クレアチニン比が3を上回り、投与開始後に蛋白対クレアチニン比は3未満まで低下し、又は場合により少なくとも25%もしくは少なくとも50%又は2未満もしくは1未満まで低下する。場合により、投与開始前に、対象はネフローゼ症候群を示す。ネフローゼ症候群は場合により投与により改善される。例えば、対象は場合により投与開始後に3.5g/日未満まで、例えば3g/日未満、2g/日未満、1g/日未満、更には1g/日未満又は0.5g/日未満までの蛋白尿の低減を示す。
多発性硬化症の治療
多発性硬化症(MS)はヒト中枢神経系(CNS)の炎症性脱髄性変性疾患である。これは世界中に広がる疾患であり、米国の患者数は約300,000人であり、若年成人の疾患であり、70%〜80%が20〜40代で発症する(Andersonら,Ann Neurology 31(3):333−6(1992);Noonanら,Neurology 58:136−8(2002))。MSは臨床経過、磁気共鳴画像(MRI)スキャン診断、並びに生検及び検死材料の病理分析に診断される不均一な疾患である(Lucchinettiら,Ann Neurol 47:707−17(2000))。この疾患は脊髄、脳幹、脳神経、小脳、大脳、及び認知症候群等の障害の多数の可能な組み合わせとして発現する。特に25年展望で考えると、大半のMS患者の最終結果は進行性の身体障害である。MS患者の半数は発症から15年以内に歩行に杖が必要になる。MSは若年及び中年成人の神経性身体障害の主要な原因であり、過去十年間まで、有益な治療法は分かっていない。MSは非特異的な臨床所見により診断が困難であるため、MRIスキャン、誘発電位、及び脳脊髄液(CSF)検査から構成される数種の先進技術を含む高度に構造化された診断基準が開発されている。全診断基準は種々の時点で中枢白質に発生し、感染、血管障害、又は別の自己免疫疾患等の他の病因により説明されない散在性病巣の一般原理に依存する(McDonaldら,Ann Neurol 50:121−7(2001))。MSは再発寛解型MS(RRMS;発症時の症例の80%〜85%)、原発性進行性MS(PPMS;発症時10%〜15%)、進行性再発型MS(PRMS;発症時5%);及び二次進行性MS(SPMS)の4つの疾患パターンがある(KremenchutzkyらBrain 122(Pt 10):1941−50(1999);Confavreuxら,N Engl J Med 343(20):1430−8(2000))。RRMS患者の50%が10年以内にSPMSを発症し、RRMS患者の90%までが最終的にSPMSを発症すると推定される(Weinshenkerら,Brain 112(Pt 1):133−46(1989))。
多発性硬化症(MS)はヒト中枢神経系(CNS)の炎症性脱髄性変性疾患である。これは世界中に広がる疾患であり、米国の患者数は約300,000人であり、若年成人の疾患であり、70%〜80%が20〜40代で発症する(Andersonら,Ann Neurology 31(3):333−6(1992);Noonanら,Neurology 58:136−8(2002))。MSは臨床経過、磁気共鳴画像(MRI)スキャン診断、並びに生検及び検死材料の病理分析に診断される不均一な疾患である(Lucchinettiら,Ann Neurol 47:707−17(2000))。この疾患は脊髄、脳幹、脳神経、小脳、大脳、及び認知症候群等の障害の多数の可能な組み合わせとして発現する。特に25年展望で考えると、大半のMS患者の最終結果は進行性の身体障害である。MS患者の半数は発症から15年以内に歩行に杖が必要になる。MSは若年及び中年成人の神経性身体障害の主要な原因であり、過去十年間まで、有益な治療法は分かっていない。MSは非特異的な臨床所見により診断が困難であるため、MRIスキャン、誘発電位、及び脳脊髄液(CSF)検査から構成される数種の先進技術を含む高度に構造化された診断基準が開発されている。全診断基準は種々の時点で中枢白質に発生し、感染、血管障害、又は別の自己免疫疾患等の他の病因により説明されない散在性病巣の一般原理に依存する(McDonaldら,Ann Neurol 50:121−7(2001))。MSは再発寛解型MS(RRMS;発症時の症例の80%〜85%)、原発性進行性MS(PPMS;発症時10%〜15%)、進行性再発型MS(PRMS;発症時5%);及び二次進行性MS(SPMS)の4つの疾患パターンがある(KremenchutzkyらBrain 122(Pt 10):1941−50(1999);Confavreuxら,N Engl J Med 343(20):1430−8(2000))。RRMS患者の50%が10年以内にSPMSを発症し、RRMS患者の90%までが最終的にSPMSを発症すると推定される(Weinshenkerら,Brain 112(Pt 1):133−46(1989))。
本発明は哺乳動物対象(例えばヒト対象)における多発性硬化症の治療方法を含む。1側面では、前記方法は治療有効量の非消失性CD4抗体を対象に投与する段階を含む。非消失性CD4抗体は本明細書に記載するこれらの抗体の任意のものとすることができる。別の側面では、前記方法は非消失性CD4抗体と少なくとも第2の化合物の併用剤の治療有効量を対象に投与する段階を含む。この場合も、非消失性CD4抗体は本明細書に記載するこれらの抗体の任意のものとすることができる。
第2の化合物は一般にMSの治療に使用される化合物(例えば標準看護又は実験治療薬)である。典型的な第2の化合物としては限定されないが、細胞傷害性物質;免疫抑制剤(例えばシクロホスファミド);B細胞表面マーカーアンタゴニスト;B細胞表面マーカーに対する抗体;CD20抗体(例えばリツキシマブ、US20060051345参照);CD5、CD28、又はCD40抗体又は遮断薬;コルチコステロイド(例えばプレドニゾン)、CTLA4−Ig、α4インテグリン抗体又はアンタゴニスト(例えばナタリズマブ(Tysabri(登録商標)))、ミコフェノール酸モフェチル、スタチン、LFA−1又はCD−11a抗体又は遮断薬(米国特許出願公開20050281817、発明者Jardieuら、発明の名称「多発性硬化症の治療方法(Method for treating multiple sclerosis)」参照)、インターロイキン12抗体、βインターフェロン(例えばインターフェロンβ−1a、例えばAvonex(登録商標)又はRebif(登録商標)、又はインターフェロンβ−1b、例えばBetaseron(登録商標))、酢酸グラチラマー(Copaxone(登録商標))、CD52抗体(例えばアレムツズマブ(CamPath(登録商標)))、インターロイキン受容体抗体(例えばダクリズマブ(Zenapax(登録商標))、インターロイキン2受容体αサブユニットに対する抗体)等が挙げられる。
1分類の態様では、前記方法は症状を緩和するために非消失性CD4抗体と第2の化合物を対象に投与する段階と、その後、寛解を維持するために(第2の化合物と併用せずに)非消失性CD4抗体の対象への投与を継続する段階を含む。例えば、非消失性CD4抗体と酢酸グラチラマーの併用剤を対象に投与した後に、寛解を維持するために非消失性CD4抗体を単独投与することができる。別の態様では、症状を緩和するために非消失性CD4抗体と第2の化合物を対象に投与した後に、第2の化合物又はMSを治療するために一般に使用される非消失性CD4抗体化合物以外の1種以上の化合物の投与を継続する。
1態様では、対象は過去に多発性硬化症を治療するために免疫抑制剤等の薬剤を投与したことがなく、及び/又は過去に抗CD4抗体を投与したことがない。別の態様では、対象は過去に多発性硬化症を治療するために薬剤を投与したことがあり、及び/又は過去に抗CD4抗体を投与したことがある。
一般に、対象は多発性硬化症の治療に適格であり、即ち対象はMS対象である。本発明の趣旨では、このようなMS対象は多発性硬化症の1種類以上の徴候、症状もしくは他の指標を示しているか、示したことがあるか、もしくは示す可能性が高い対象;多発性硬化症であると診断されたことがある対象(例えば新規に(「新規発症MS」であると)診断されるか、過去に新規再発もしくは増悪と診断されたことがあるか、過去に診断され、寛解中の対象等);及び/又は多発性硬化症を発症する危険がある対象である。多発性硬化症の対象又はその危険のある対象は場合により血清、脳脊髄液(CSF)及び/又はMS病巣におけるCD20陽性B細胞濃度の上昇についてスクリーニングされた対象、及び/又は自己抗体の検出アッセイを使用してスクリーニングされ、定性、好ましくは定量評価される対象として同定することができる。多発性硬化症に関連する典型的なこのような自己抗体としては、抗ミエリン塩基性蛋白(MBP)、抗ミエリン希突起膠細胞糖蛋白(MOG)、抗ガングリオシド及び/又は抗ニューロフィラメント抗体か挙げられる。このような自己抗体は対象の血清、脳脊髄液(CSF)及び/又はMS病巣で検出することができる。本明細書において自己抗体又はB細胞濃度の「上昇」とはこのような自己抗体又はB細胞濃度がMSをもたない個体における濃度よりも有意に高いことを意味する。
本発明で治療するMSとしては、原発性進行性多発性硬化症(PPMS)、再発寛解型多発性硬化症(RRMS)、二次進行性多発性硬化症(SPMS)、及び進行性再発型多発性硬化症(PRMS)が挙げられる。MSは治療開始時に初期、中期又は後期段階の疾患とすることができる。MSの治療に関して「治療有効量」なる用語は多発性硬化症を予防、改善、又は治療するために有効な抗体(又は抗体と少なくとも第2の化合物の併用剤)の量を意味する。このような有効量は一般にMSの徴候、症状又は他の指標の改善、例えば再発率の低下、身体障害の予防、脳MRI病巣数及び/又は容積の低下、25フィート歩行時間の改善、疾患進行までの時間の延長(例えばExpanded Disability Status Scale,EDSS(総合障害度評価尺度))等をもたらす。1側面では、治療後の対象では脱髄が低減する。
「原発性進行性多発性硬化症」ないし「PPMS」は再発と寛解の反復を全く伴わずにその発症から疾患が漸次進行することを特徴とする。疾患活動性の安定期間を伴う場合があり、数日間又は数週間の良好な期間と悪化期間を伴う場合がある。PPMSは一般に30代後半又は40代前半に発症し、男性のほうが女性よりも発症し易く、初期疾患活動が脳ではなく脊髄のことが多いという点でRRMS及びSPMSと相違する。PPMSは脳に移動することが多いが、RRMS又はSPMSよりも脳領域を損傷する確率が低く、例えば、PPMS患者は認知障害を発症する確率が低い。PPMSはMRIスキャンで炎症性(ガドリニウム造影)病巣を示す確率が最も低いMSのサブタイプである。この疾患の原発性進行性形態は全多発性硬化症人口の10〜15%を占める。PPMSはMcDonaldら,Ann Neurol 50:121−7(2001)の基準に従って定義することができる。本発明で治療するPPMS対象は通常ではPPMSの推定又は確定診断を受けた対象である。
「再発寛解型多発性硬化症」ないし「RRMS」は新しい症状が出現し、古い症状が再来又は悪化する期間である再発(増悪とも言う)を特徴とする。再発後に寛解期間があり、この間に患者は再発中に獲得した障害から完全又は部分的に回復する。再発は数日間、数週間又は数カ月間続き、回復は緩慢で漸進的な場合もあれば、殆ど瞬時の場合もある。MS患者の大部分は先ずRRMSと診断される。これは一般には患者が20代か30代のときであるが、著しく早期又は後期の診断も知られている。このサブタイプのMSの女性は男性の2倍である。再発中には、中枢神経系(CNS)の白質領域の神経繊維(ニューロン)の周囲の保護絶縁髄鞘であるミエリンが生体自身の免疫系による炎症応答で損傷を受けると考えられる。この結果、CNSのどの領域が損傷を受けるかによって大幅に相違する多様な神経症状が発生する。再発直後に、炎症応答は治まり、CNSにおける特殊なグリア細胞(希突起膠細胞と言う)が髄鞘再形成(軸索周囲の髄鞘ミエリンを修復するプロセス)を助長する。この髄鞘再形成が寛解に関与していると思われる。RRMS患者の約50%は疾患発症から10年以内にSPMSに転換する。30年後にこの数値は90%に上昇する。どの時点においても、この疾患の再発寛解型は全MS人口の55%を占める。
「二次進行性多発性硬化症」ないし「SPMS」は再発及び低度の寛解の反復とプラトーを伴うか又は伴わない臨床神経損傷の定常的進行を特徴とする。SPMSの発症者は過去に2〜40年間以上のRRMS期間を経ている。再発と寛解の反復を伴う場合には、時と共に先細りになる。疾患の二次進行期の開始から身体障害が開始し、RRMS中よりも著しく速く進行するが、個体によっては進行がかなり遅い場合もある。10年後に、RRMS患者の50%がSPMSを発症する。25〜30年以内にこの数値は90%に上昇する。SPMSはRRMSよりも炎症性病巣形成レベルが低い傾向があるが、疾患の全体的な負担は進行し続ける。どの時点においても、SPMSは全多発性硬化症人口の30%を占める。
「進行性再発型多発性硬化症」ないし「PRMS」は再発と寛解の反復を伴う臨床神経損傷の定常的進行を特徴とする。再発直後に有意回復が認められるが、次の再発までの間に症状は漸次悪化する。PRMSは全多発性硬化症人口の5%を占める。PRMSはPPMSの変形であると考える神経学者もいる。
他の病態の治療
非消失性CD4抗体(非消失性CD4抗体と1種以上の他の化合物の併用剤を含む)はループス又は多発性硬化症以外の障害及び病態(例えばCD4+T細胞が関与する病態)の治療にも有用である。従って、本発明の1側面は哺乳動物対象(例えばヒト対象)における病態の治療方法を提供する。前記方法は非消失性CD4抗体と少なくとも第2の化合物の併用剤の治療有効量を対象に投与する段階を含む。1態様では、対象は組織移植レシピエントであり、治療する病態は移植拒絶反応又は移植片対宿主病である。前記併用剤で治療することができる他の病態としては限定されないが、関節リウマチ、喘息、乾癬、炎症性腸疾患(例えばクローン病又は潰瘍性大腸炎)、及びシェーグレン症候群等の自己免疫障害又は疾患が挙げられる。
非消失性CD4抗体(非消失性CD4抗体と1種以上の他の化合物の併用剤を含む)はループス又は多発性硬化症以外の障害及び病態(例えばCD4+T細胞が関与する病態)の治療にも有用である。従って、本発明の1側面は哺乳動物対象(例えばヒト対象)における病態の治療方法を提供する。前記方法は非消失性CD4抗体と少なくとも第2の化合物の併用剤の治療有効量を対象に投与する段階を含む。1態様では、対象は組織移植レシピエントであり、治療する病態は移植拒絶反応又は移植片対宿主病である。前記併用剤で治療することができる他の病態としては限定されないが、関節リウマチ、喘息、乾癬、炎症性腸疾患(例えばクローン病又は潰瘍性大腸炎)、及びシェーグレン症候群等の自己免疫障害又は疾患が挙げられる。
非消失性CD4抗体は本明細書に記載するこれらの抗体の任意のものとすることができる。第2の化合物は場合により病態を治療するために使用される化合物(例えば標準看護又は実験治療薬)である。典型的な第2の化合物としては限定されないが、細胞傷害性物質;免疫抑制剤(例えばシクロホスファミド);B細胞表面マーカーアンタゴニスト;B細胞表面マーカーに対する抗体;CD20抗体(例えばリツキシマブ、US20060051345参照);CD5、CD28、又はCD40抗体又は遮断薬;コルチコステロイド(例えばプレドニゾン)、CTLA4−Ig、α4インテグリン抗体又はアンタゴニスト(例えばナタリズマブ(Tysabri(登録商標)))、ミコフェノール酸モフェチル、スタチン、LFA−1又はCD−11a抗体又は遮断薬(米国特許出願公開20050281817、発明者Jardieuら、発明の名称「多発性硬化症の治療方法(Method for treating multiple sclerosis)」参照)、インターロイキン12抗体、βインターフェロン(例えばインターフェロンβ−1a、例えばAvonex(登録商標)又はRebif(登録商標)、又はインターフェロンβ−1b、例えばBetaseron(登録商標))、酢酸グラチラマー(Copaxone(登録商標))、CD52抗体(例えばアレムツズマブ(CamPath(登録商標)))、インターロイキン受容体抗体(例えばダクリズマブ(Zenapax(登録商標))、インターロイキン2受容体αサブユニットに対する抗体)等が挙げられる。その他の典型的な第2の化合物は本明細書に記載し、及び/又は当分野で公知である。場合により、第2の化合物はシクロホスファミド、ミコフェノール酸モフェチル、及びCTLA4−Igから構成される群から選択される。
1分類の態様では、前記方法は症状を緩和するために非消失性CD4抗体と第2の化合物を対象に投与する段階と、その後、寛解を維持するために(第2の化合物と併用せずに)非消失性CD4抗体の対象への投与を継続する段階を含む。別の態様では、症状を緩和するために非消失性CD4抗体と第2の化合物を対象に投与した後に、第2の化合物又は病態を治療するために一般に使用される1種以上の化合物の投与を継続する。
1態様では、対象は病態を治療するために免疫抑制剤等の薬剤を過去に投与されていないか、及び/又は抗CD4抗体を過去に投与されていない。別の態様では、対象は病態を治療するために薬剤を過去に投与されているか、及び/又は抗CD4抗体を過去に投与されている。
一般に、対象は病態の治療に適格である。本発明の趣旨では、このような対象は病態の1種類以上の徴候、症状もしくは他の指標を示しているか、示したことがあるか、もしくは示す可能性が高い対象;病態をもつと診断されたことがある対象(例えば新規に診断されるか、過去に新規再発もしくは増悪と診断されたことがあるか、過去に診断され、寛解中の対象等);及び/又は病態を発症する危険がある対象である。例えば、移植拒絶反応又は移植片対宿主病の治療に適格な対象は組織移植を待機している対象でもよいし、このような移植を既に受けた対象でもよく、後者の場合には、移植拒絶反応又は移植片対宿主病の1種類以上の徴候、症状もしくは他の指標を示しているか、示したことがあるか、又は示す可能性が高い対象とすることができる。このような病態と各種自己免疫疾患及び障害の症状及び指標は当分野で周知である。
抗体作製及び投与
本発明の方法はCD4と結合する抗体を使用する。1側面では、抗CD4抗体は非消失性抗体である。従って、このような抗体の作製方法について以下に記載する。
本発明の方法はCD4と結合する抗体を使用する。1側面では、抗CD4抗体は非消失性抗体である。従って、このような抗体の作製方法について以下に記載する。
抗体の作製又はスクリーニングに使用するCD4抗原は例えば可溶性CD4(例えばヒトCD4)又は所望エピトープを含むその一部とすることができる。ヒトCD4の核酸配列とアミノ酸配列を図21に示す。代替又は追加方法として、その細胞表面にCD4を発現する細胞を使用して抗体を作製又はスクリーニングすることもできる。抗体作製に有用な他のCD4形態も当業者に想到されよう。
以下、本発明により使用する抗体の典型的作製技術について記載する。非消失性CD4抗体(例えばTRX1抗体)の作製手順に関する情報を含めたその他の情報については、いずれも言及によりその開示内容全体を全目的で本明細書に組込む米国特許出願公開2003/0108518、発明者Frewinら、発明の名称「TRX1抗体とその使用(TRX1 antibody and uses therefor)」及び米国特許出願公開2003/0219403、発明者Frewinら、発明の名称「霊長類を抗原に耐性にする組成物及び方法(Compositions and methods of tolerizing a primate to an antigen)」参照。
ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は該当抗原とアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射することにより動物で産生させることが好ましい。二官能性物質又は誘導体化剤(例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を介する共役)、N−ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基を介する)、グルタルアルデヒド、琥珀酸無水物、SOCl2、又はR’N=C=NR(式中、RとR’は異なるアルキル基である))を使用し、免疫する種で免疫原性の蛋白質(例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビター)と該当抗原を共役させることが有用な場合もある。
ポリクローナル抗体は該当抗原とアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射することにより動物で産生させることが好ましい。二官能性物質又は誘導体化剤(例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を介する共役)、N−ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基を介する)、グルタルアルデヒド、琥珀酸無水物、SOCl2、又はR’N=C=NR(式中、RとR’は異なるアルキル基である))を使用し、免疫する種で免疫原性の蛋白質(例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビター)と該当抗原を共役させることが有用な場合もある。
例えば蛋白質又はコンジュゲート(夫々ウサギ又はマウス)100μg又は5μgをフロイント完全アジュバント3容量に加え、溶液を複数部位に皮内注射することにより抗原、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体で動物を免疫する。1カ月後に元の量の1/5〜1/10のペプチド又はコンジュゲートをフロイント完全アジュバントに加え、皮下注射により動物の複数部位にブースター接種する。7〜14日後に動物から採血し、血清の抗体力価をアッセイする。力価が一定になるまで動物にブースター接種する。同一抗原のコンジュゲートを動物にブースター接種することが好ましいが、別の蛋白質と共役させてもよいし、及び/又は別の架橋剤を使用してもよい。組換え細胞培養で融合蛋白質としてコンジュゲートを作製することもできる。更に、免疫応答を強化するためにミョウバン等の凝集剤を使用すると適切である。
モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は実質的に均質抗体の集団から得られ、即ちモノクローナル抗体の産生中に生じる可能性のある変異体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であるか、及び/又は同一エピトープと結合し、前記のような変異体は一般に存在するとしても少量である。従って、修飾語としての「モノクローナル」は抗体が別個ないしポリクローナルな抗体の混合物ではないという特徴を示す。
モノクローナル抗体は実質的に均質抗体の集団から得られ、即ちモノクローナル抗体の産生中に生じる可能性のある変異体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であるか、及び/又は同一エピトープと結合し、前記のような変異体は一般に存在するとしても少量である。従って、修飾語としての「モノクローナル」は抗体が別個ないしポリクローナルな抗体の混合物ではないという特徴を示す。
例えば、モノクローナル抗体はKohlerら,Nature,256:495(1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法を使用して作製することもできるし、組換えDNA法(米国特許第4,816,567号)を使用して作製することもできる。
ハイブリドーマ法では、マウス又は他の適当な宿主動物(例えばハムスター)を上記のように免疫し、免疫に使用した蛋白質と特異的に結合する抗体を産生するか又は産生することが可能なリンパ球を誘導する。あるいは、リンパ球をin vitroで免疫してもよい。その後、ポリエチレングリコール等の適切な融合剤を使用してリンパ球を骨髄腫細胞と融合し、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59−103(Academic Press,1986))。
こうして作製したハイブリドーマ細胞を適切な培地に播種し、増殖させ、培地には未融合親骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する1種以上の物質を添加することが好ましい。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠損する場合には、HGPRT欠損細胞の増殖を阻害する物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを一般にハイブリドーマの培地に添加する(HAT培地)。
ハイブリドーマの作製に有用な骨髄腫細胞は効率的に融合し、選択した抗体産生細胞による安定な高レベルの抗体産生を助長し、HAT培地等の培地に感受性の細胞である。特に、骨髄腫細胞株の非限定的な例としては、SaIk Institute Cell Distribution Center,San Diego,Calif.USAから入手可能なMOPC−21及びMPC−11マウス腫瘍や、American Type Culture Collection,Rockville,Md.USAから入手可能なSP−2又はX63−Ag8−653細胞から誘導される細胞株等のマウス骨髄腫細胞株が挙げられる。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株もヒトモノクローナル抗体作製用として記載されている(Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984);Brodeurら,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp.51−63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。
ハイブリドーマ細胞が増殖中の培地を抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降法又はin vitro結合アッセイ(例えばラジオイムノアッセイ(RIA)又は酵素免疫法(ELISA))により測定することができる。モノクローナル抗体の結合親和性は例えばMunsonら,Anal.Biochem.,107:220(1980)のスキャッチャードアッセイにより測定することができる。
所望特異性、親和性、及び/又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞の同定後、クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準方法により増殖させる(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59−103(Academic Press,1986))。この目的に適した培地としては、例えば、D−MEM又はRPMI−1640培地が挙げられる。更に、ハイブリドーマ細胞を動物体内で腹水腫瘍としてin vivo増殖させてもよい。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は例えばプロテインA−Sepharose(登録商標)架橋アガロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製法によりは培地、腹水、又は血清から分離すると適切である。
モノクローナル抗体をコードするDNAは(例えばマウス抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合することが可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより)従来方法を使用して容易に単離及び配列決定される。ハイブリドーマ細胞はこのようなDNAの有用なソースとして利用できる。単離後、DNAを発現ベクターに配置した後に、大腸菌細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、又は免疫グロブリン蛋白質を産生しない骨髄腫細胞等の宿主細胞にトランスフェクトし、組換え宿主細胞でモノクローナル抗体を合成する。抗体をコードするDNAの細菌における組換え発現に関する研究論文としては、Skerraら,Curr.Opinion in Immunol.,5:256−262(1993)とPluckthun,Immunol.Revs.,130:151−188(1992)が挙げられる。
別の態様では、McCaffertyら,Nature,348:552−554(1990)に記載の技術を使用して作製した抗体ファージライブラリーから抗体又は抗体フラグメントを単離することができる。Clacksonら,Nature,352:624−628(1991)及びMarksら,J.Mol.Biol.,222:581−597(1991)は夫々ファージライブラリーを使用したマウス及びヒト抗体の単離を記載している。その後に刊行された文献は、チェーンシャフリング法(Marksら,Bio/Technology,10:779−783(1992))や、非常に大きなファージライブラリーを構築するためのストラテジーとして感染とin vivo組換えの併用(Waterhouseら,Nuc.Acids.Res.,21:2265−2266(1993))による高親和性(nM範囲)ヒト抗体の作製を記載している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の単離用としての従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術の実現可能な代替方法である。
例えば、相同マウス配列の代わりにヒト重鎖及び軽鎖定常領域をコードする配列で置換する(米国特許第4,816,567号;Morrisonら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851(1984))か、又は免疫グロブリンコーディング配列と非免疫グロブリンポリペプチドのコーディング配列の全部もしくは一部を共有結合することにより、DNAを改変することもできる。
一般に、抗体の定常領域又は抗体の1個の抗原結合部位の可変領域をこのような非免疫グロブリンポリペプチドで置換し、抗原に対する特異性をもつ1個の抗原結合部位と、別の抗原に対する特異性をもつ別の抗原結合部位を含むキメラ2価抗体を作製する。
ヒト化抗体
非ヒト抗体のヒト化方法は文献に記載されている。ヒト化抗体は非ヒト由来の1個以上のアミノ酸残基を導入することが好ましい。これらの非ヒトアミノ酸残基は一般に「移入」可変領域に由来することから「移入」残基と呼ばれることが多い。ヒト化はヒト抗体の対応する配列を超可変領域配列で置換することにより、基本的にWinterら(Jonesら,Nature,321:522−525(1986);Riechmannら,Nature,332:323−327(1988);Verhoeyenら,Science,239:1534−1536(1988))の方法に従って実施することができる。従って、このような「ヒト化」抗体は無傷のヒト可変領域よりも実質的に小さい領域を非ヒト種に由来する対応する配列で置換したキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際に、ヒト化抗体は一般に所定の超可変領域残基と場合により所定のFR残基を齧歯類抗体の類似部位からの残基で置換したヒト抗体である。
非ヒト抗体のヒト化方法は文献に記載されている。ヒト化抗体は非ヒト由来の1個以上のアミノ酸残基を導入することが好ましい。これらの非ヒトアミノ酸残基は一般に「移入」可変領域に由来することから「移入」残基と呼ばれることが多い。ヒト化はヒト抗体の対応する配列を超可変領域配列で置換することにより、基本的にWinterら(Jonesら,Nature,321:522−525(1986);Riechmannら,Nature,332:323−327(1988);Verhoeyenら,Science,239:1534−1536(1988))の方法に従って実施することができる。従って、このような「ヒト化」抗体は無傷のヒト可変領域よりも実質的に小さい領域を非ヒト種に由来する対応する配列で置換したキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際に、ヒト化抗体は一般に所定の超可変領域残基と場合により所定のFR残基を齧歯類抗体の類似部位からの残基で置換したヒト抗体である。
ヒト化抗体の作製に使用する軽鎖及び重鎖両者のヒト可変領域の選択は抗原性を低減するために非常に重要である。所謂「ベストフィット」法に従い、齧歯類抗体の可変領域の配列を既知ヒト可変領域配列の完全ライブラリーに対してスクリーニングする。その後、齧歯類の配列に最も近いヒト配列をヒト化抗体のヒトフレームワーク領域(FR)として許容する(Simsら,J.Immunol.,151:2296(1993);Chothiaら,J.Mol.Biol.,196:901(1987))。別の方法では、軽鎖又は重鎖可変領域の特定サブグループの全ヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定フレームワーク領域を使用する。同一フレームワークを数種の異なるヒト化抗体に使用してもよい(Carterら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992);Prestaら,J.Immunol.,151:2623(1993))。
抗原に対する高い親和性と他の好ましい生物学的性質を維持しながら抗体をヒト化することが更に重要である。この目的を達成するためには、1方法によると、親配列とヒト化配列の三次元モデルを使用する親配列と各種概念上のヒト化作製物の分析法によりヒト化抗体を作製する。三次元免疫グロブリンモデルは広く入手可能であり、当業者に周知である。選択された候補免疫グロブリン配列の推定三次元立体構造を図解及び表示するコンピュータープログラムが入手可能である。これらの表示を検討すると、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の推定役割を分析することができ、即ち候補免疫グロブリンのその抗原との結合性に影響する残基を分析することができる。こうして、ターゲット抗原に対する親和性の増加等の所望抗体特性が達成されるように、レシピエント及び移入配列からFR残基を選択し、組み合わせる。一般に、抗原結合への影響に直接且つ最も実質的に関与しているのは超可変領域残基である。
ヒト抗体
ヒト化の代替方法として、ヒト抗体を作製することができる。例えば、免疫後に内在免疫グロブリン産生の不在下でヒト抗体の完全なレパートリーを産生することが可能なトランスジェニック動物(例えばマウス)を作製することが今日では可能である。例えば、キメラ及び生殖細胞系突然変異体マウスの抗体重鎖結合領域(JH)遺伝子のホモ欠失の結果、内在抗体産生の完全な阻害を生じることが記載されている。ヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイをこのような生殖細胞系突然変異体マウスに導入すると、抗原攻撃後にヒト抗体が産生されよう。例えばJakobovitsら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2551(1993);Jakobovitsら,Nature,362:255−258(1993);Bruggermannら,Year in Immune,7:33(1993);並びに米国特許第5,591,669号、5,589,369号及び5,545,807号参照。
ヒト化の代替方法として、ヒト抗体を作製することができる。例えば、免疫後に内在免疫グロブリン産生の不在下でヒト抗体の完全なレパートリーを産生することが可能なトランスジェニック動物(例えばマウス)を作製することが今日では可能である。例えば、キメラ及び生殖細胞系突然変異体マウスの抗体重鎖結合領域(JH)遺伝子のホモ欠失の結果、内在抗体産生の完全な阻害を生じることが記載されている。ヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイをこのような生殖細胞系突然変異体マウスに導入すると、抗原攻撃後にヒト抗体が産生されよう。例えばJakobovitsら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2551(1993);Jakobovitsら,Nature,362:255−258(1993);Bruggermannら,Year in Immune,7:33(1993);並びに米国特許第5,591,669号、5,589,369号及び5,545,807号参照。
あるいは、ファージディスプレイ技術(McCaffertyら,Nature 348:552−553(1990))を使用して非免疫ドナーに由来する免疫グロブリン可変(V)領域遺伝子レパートリーからヒト抗体及び抗体フラグメントをin vitroで作製することもできる。この技術によると、抗体V領域遺伝子をM13やfd等の線状バクテリオファージの大小いずれかのコート蛋白質遺伝子にクローニングし、ファージ粒子の表面に機能的抗体フラグメントを提示させる。線状粒子はファージゲノムの1本鎖DNAコピーを含むので、抗体の機能的性質に基づいて選択すると、これらの性質を示す抗体をコードする遺伝子も選択される。従って、ファージはB細胞の性質にある程度類似している。ファージディスプレイは各種フォーマットで実施することができ、詳細については、例えばJohnson,Kevin S.and Chiswell,David J.,Current Opinion in Structural Biology 3:564−571(1993)を参照されたい。ファージディスプレイには数種のV遺伝子セグメントソースを使用することができる。Clacksonら,Nature,352:624−628(1991)は免疫したマウスの脾臓に由来するV遺伝子の小さいランダムコンビナトリアルライブラリーから多様な抗オキサゾロン抗体を単離した。基本的にMarksら,J.Mol.Biol.222:581−597(1991)、又はGriffithら,EMBO J.12:725−734(1993)に記載の技術に従い、非免疫ヒトドナーに由来するV遺伝子のレパートリーを構築し、(自己抗原を含む)多様な抗原に対する抗体を単離することができる。米国特許第5,565,332号及び5,573,905号も参照。
in vitro活性化B細胞によりヒト抗体を作製することもできる(米国特許第5,567,610号及び5,229,275号参照)。
抗体フラグメント
抗体フラグメントの各種作製技術が開発されている。従来、これらのフラグメントは無傷の抗体の蛋白分解消化により誘導されていた(例えばMorimotoら,Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107−117(1992)及びBrennanら,Science,229:81(1985)参照)。しかし、現在では組換え宿主細胞によりこれらのフラグメントを直接作製することができる。例えば、上記抗体ファージライブラリーから抗体フラグメントを単離することができる。あるいは、Fab’−SHフラグメントを大腸菌から直接回収し、化学的にカップリングし、F(ab’)2フラグメントを形成することができる(Carterら,Bio/Technology 10:163−167(1992))。別のアプローチによると、組換え宿主細胞培養物からF(ab’)2フラグメントを直接単離することができる。他の抗体フラグメント作製技術も当業者に自明である。他の態様では、選択抗体は1本鎖Fvフラグメント(scFv)である。WO1993/16185並びに米国特許第5,571,894号及び5,587,458号参照。抗体フラグメントは例えば米国特許第5,641,870号に記載されているような「直鎖状抗体」でもよい。このような直鎖状抗体フラグメントは単一特異性でも二重特異性でもよい。
抗体フラグメントの各種作製技術が開発されている。従来、これらのフラグメントは無傷の抗体の蛋白分解消化により誘導されていた(例えばMorimotoら,Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107−117(1992)及びBrennanら,Science,229:81(1985)参照)。しかし、現在では組換え宿主細胞によりこれらのフラグメントを直接作製することができる。例えば、上記抗体ファージライブラリーから抗体フラグメントを単離することができる。あるいは、Fab’−SHフラグメントを大腸菌から直接回収し、化学的にカップリングし、F(ab’)2フラグメントを形成することができる(Carterら,Bio/Technology 10:163−167(1992))。別のアプローチによると、組換え宿主細胞培養物からF(ab’)2フラグメントを直接単離することができる。他の抗体フラグメント作製技術も当業者に自明である。他の態様では、選択抗体は1本鎖Fvフラグメント(scFv)である。WO1993/16185並びに米国特許第5,571,894号及び5,587,458号参照。抗体フラグメントは例えば米国特許第5,641,870号に記載されているような「直鎖状抗体」でもよい。このような直鎖状抗体フラグメントは単一特異性でも二重特異性でもよい。
二重特異性抗体
二重特異性抗体は少なくとも2個の異なるエピトープに対して結合特異性をもつ抗体である。典型的な二重特異性抗体はCD4抗原の2個の異なるエピトープと結合することができる。他のこのような抗体はCD4と結合すると共に更に第2のT細胞表面マーカーと結合することができる。薬剤又は細胞傷害性物質をT細胞に局在させるために二重特異性抗体を使用することもでき、これらの抗体はCD4結合アームに加え、薬剤又は細胞傷害性物質と結合するアームをもつ。二重特異性抗体は全長抗体又は抗体フラグメントとして作製することができる(例えばF(ab’)2二重特異性抗体)。
二重特異性抗体は少なくとも2個の異なるエピトープに対して結合特異性をもつ抗体である。典型的な二重特異性抗体はCD4抗原の2個の異なるエピトープと結合することができる。他のこのような抗体はCD4と結合すると共に更に第2のT細胞表面マーカーと結合することができる。薬剤又は細胞傷害性物質をT細胞に局在させるために二重特異性抗体を使用することもでき、これらの抗体はCD4結合アームに加え、薬剤又は細胞傷害性物質と結合するアームをもつ。二重特異性抗体は全長抗体又は抗体フラグメントとして作製することができる(例えばF(ab’)2二重特異性抗体)。
二重特異性抗体の作製方法は当分野で公知である。全長二重特異性抗体の従来の作製方法は各鎖が異なる特異性をもつ免疫グロブリン重鎖−軽鎖対2対の同時発現に基づいている(Millsteinら,Nature,305:537−539(1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の組み合わせはランダムであるため、これらのハイブリドーマ(カドローマ)は10個の異なる抗体分子の混合物を産生するが、このうちで正しい二重特異性構造をもつのは1分子のみである。正しい分子の精製は通常ではアフィニティークロマトグラフィー段階により実施され、かなり煩雑であり、生成物収率は低い。同様の方法がWO1993/08829、及びTrauneckerら,EMBO J.,10:3655−3659(1991)に開示されている。
別のアプローチによると、所望結合特異性(抗体抗原結合部位)をもつ抗体可変領域を免疫グロブリン定常領域配列と融合する。ヒンジ、CH2、及びCH3領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常領域と融合することが好ましい。1つのアプローチでは、軽鎖結合に必要な部位を含む第1の重鎖定常領域(CH1)を融合体の少なくとも1個に加える。免疫グロブリン重鎖融合体と、所望により免疫グロブリン軽鎖をコードするDNAを別々の発現ベクターに挿入し、適切な宿主生物に同時にトランスフェクトする。こうすると、構築に使用する3本のポリペプチド鎖の比が等しくない場合に最適収率が得られる態様で3個のポリペプチドフラグメントの相互比を調節する融通性が増す。他方、少なくとも2本のポリペプチド鎖を等しい比で発現させて高収率が得られる場合や、比に特に意味がない場合には、2本又は全3本のポリペプチド鎖をコードする配列を1個の発現ベクターに挿入することが可能である。
このアプローチの1態様では、二重特異性抗体は一方のアームに配置された第1の結合特異性をもつハイブリッド免疫グロブリン重鎖と、他方のアームに配置された(第2の結合特異性を提供する)ハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対から構成される。この対称構造では二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖が存在しないので分離し易くなり、望ましくない免疫グロブリン鎖の組み合わせから望ましい二重特異性化合物を分離し易くなることが判明した。このアプローチはWO1994/04690に開示されている。二重特異性抗体作製の更に詳細については、例えば、Sureshら,Methods in Enzymology,121:210(1986)参照。
米国特許第5,731,168号に記載の別のアプローチによると、組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーの百分率を最大にするように1対の抗体分子間の界面を改変することができる。このような界面の1例は抗体定常領域のCH3領域の少なくとも一部を含む。この方法では、第1の抗体分子の界面からの1本以上の小さいアミノ酸側鎖をより大きい側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)で置換する。大きいアミノ酸側鎖をより小さい側鎖(例えばアラニン又はスレオニン)で置換することにより第2の抗体分子の界面に大きい側鎖と同一又は同等寸法の補償「キャビティ」を形成する。こうすると、ホモダイマー等の他の望ましくない終産物よりもヘテロダイマーの収率を増加するメカニズムが得られる。
二重特異性抗体としては架橋又は「ヘテロコンジュゲート」抗体が挙げられる。例えば、ヘテロコンジュゲートの抗体の一方をアビジンと結合し、他方をビオチンと結合することができる。このような抗体は例えば免疫系細胞を望ましくない細胞にターゲティングする目的(米国特許第4,676,980号)や、HTV感染の治療用(WO1991/00360、WO1992/200373、及びEP03089)として提案されている。適当な任意架橋法を使用してヘテロコンジュゲート抗体を作製することができる。適切な架橋剤は多数の架橋技術と共に当分野で周知であり、例えば米国特許第4,676,980号に開示されている。
抗体フラグメントから二重特異性抗体を作製する技術も文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を作製することができる。Brennanら,Science,229:81(1985)は無傷の抗体を蛋白分解してF(ab’)2フラグメントを作製する方法を記載している。これらのフラグメントをジチオール錯化剤亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元し、ビシナルジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。次に、作製されたFab’フラグメントをチオニトロ安息香酸(TNB)誘導体に変換する。次にメルカプトエチルアミンで還元することによりFab’−TNB誘導体の1個をFab’−チオールに再変換し、等モル量の他のFab’−TNB誘導体と混合し、二重特異性抗体を形成する。作製された二重特異性抗体は酵素の選択的固定化剤として使用することができる。
組換え細胞培養から二重特異性抗体フラグメントを直接作製及び単離するための各種技術も記載されている。例えば、ロイシンジッパーを使用して二重特異性抗体が作製されている。Kostelnyら,J.Immunol.,148(5):1547−1553(1992)。Fos及びJun蛋白質に由来するロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により2種の異なる抗体のFab’部分と結合している。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元し、モノマーを形成した後、再酸化し、抗体ヘテロダイマーを形成している。この方法は抗体ホモダイマーの作製にも利用することができる。Hollingerら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444−6448(1993)により記載されている「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体フラグメントの代替作製メカニズムを提供している。フラグメントは同一鎖上の2領域を対合させるには短か過ぎるリンカーにより軽鎖可変領域(VL)と結合した重鎖可変領域(VH)を含む。従って、1個のフラグメントのVH領域とVL領域を別のフラグメントの相補的なVL領域とVH領域に対合させることにより、2個の抗原結合部位を形成する。1本鎖Fv(sFv)ダイマーの使用により二重特異性抗体フラグメントを作製する別のストラテジーも報告されている。Gruberら,J.Immunol.,152:5368(1994)参照。
3価以上の抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を作製することができる。Tuttら,J.Immunol.147:60(1991)。
抗体のコンジュゲート及び他の修飾物
本発明の方法で使用する抗体又は本発明の製品に含まれる抗体は場合により例えばWO2004/032828及び米国特許出願公開2006/0024295に記載されているように薬剤と共役させる。本発明の抗体はプロドラッグ(例えばペプチド系化学療法剤、WO1981/01145参照)を活性な抗癌薬に変換するプロドラッグ活性化酵素と共役させてもよい。例えば、WO1988/07378、米国特許第4,975,278号、及び米国特許出願公開2006/0024295参照。
本発明の方法で使用する抗体又は本発明の製品に含まれる抗体は場合により例えばWO2004/032828及び米国特許出願公開2006/0024295に記載されているように薬剤と共役させる。本発明の抗体はプロドラッグ(例えばペプチド系化学療法剤、WO1981/01145参照)を活性な抗癌薬に変換するプロドラッグ活性化酵素と共役させてもよい。例えば、WO1988/07378、米国特許第4,975,278号、及び米国特許出願公開2006/0024295参照。
本発明では抗体の他の修飾物も想定される。例えば、抗体を各種非蛋白性ポリマーの1種(例えばポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマー)と結合してもよい。
本明細書に開示する抗体はリポソームとして製剤化してもよい。抗体を収容するリポソームはEpsteinら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:3688(1985);Hwangら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4030(1980);米国特許第4,485,045号及び4,544,545号;並びにWO1997/38731、公開日1997年10月23日に記載されているような当分野で公知の方法により作製される。米国特許第5,013,556号には長時間循環型リポソームが開示されている。
特に有用なリポソームはホスファチジルコリン、コレステロール及びPEG修飾ホスファチジルエタノールアミン(PEG−PE)を含有する脂質組成物を使用して逆相蒸発法により作製することができる。規定細孔寸法のフィルターからリポソームを押出し、所望直径のリポソームを得る。ジスルフィド交換反応によりMartinら,J.Biol.Chem.257:286−288(1982)に記載されているように本発明の抗体のFab’フラグメントをリポソームと共役させることができる。場合により化学療法剤をリポソーム内に収容する。Gabizonら,J.National Cancer List.81(19)1484(1989)参照。
本明細書に記載する蛋白質又はペプチド抗体のアミノ酸配列改変物も想定される。例えば、抗体の結合親和性及び/又は他の生物学的性質を改善することが望ましい場合がある。適切なヌクレオチド変異を抗体核酸に導入するか又はペプチド合成により抗体のアミノ酸配列変異体を作製する。このような改変としては、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失、及び/又は挿入及び/又は置換が挙げられる。最終構築物が所望特性をもつという条件で、最終構築物に到達するために欠失、挿入、及び置換の任意組み合わせを行う。アミノ酸変異により、抗体の翻訳後プロセスを改変することもできる(例えばグリコシル化部位数又は位置の改変)。
突然変異誘発に有用な位置である抗体の所定残基又は領域の有用な同定方法の1つはCunningham and Wells Science,244:1081−1085(1989)に記載されているように「アラニンスキャニング突然変異誘発法」と呼ばれる。この方法では、残基又はターゲット残基群(例えばarg、asp、his、lys、及びglu等の荷電残基)を同定し、アミノ酸と抗原の相互作用を変化させるように中性又は負荷電アミノ酸(アラニン又はポリアラニンが最も好ましい)で置換する。次に、置換部位に他の変異体を導入することにより、置換に対して機能的感受性を示すこれらのアミノ酸位置を精緻化する。従って、アミノ酸配列変異の導入部位は予め決定しておくが、突然変異自体の種類は予め決定する必要がない。例えば、所与部位の突然変異の性能を分析するためには、ターゲットコドン又は領域でalaスキャニング又はランダム突然変異誘発を実施し、発現した抗体変異体を所望活性についてスクリーニングする。
アミノ酸配列挿入としては、残基1個から100個以上の残基を含むポリペプチドまでの長さにわたるアミノ及び/又はカルボキシル末端融合と、1個以上のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。末端挿入の例としては、N末端メチオニン残基をもつ抗体又は細胞傷害性ポリペプチドと融合した抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入変異体としては、酵素又は抗体の血清半減期を延長するポリペプチドを抗体のN又はC末端に融合した融合体が挙げられる。
別の型の変異体はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は抗体分子の少なくとも1個のアミノ酸残基が別の残基で置換されている。抗体の置換突然変異誘発に最も有用な部位としては超可変領域が挙げられるが、FR改変も考えられる。保存置換を表1の「保存置換」の欄に示す。このような置換の結果として生物活性が変化する場合には、表1の「典型的置換」の欄に示す変異や、アミノ酸分類を参照して以下に記載するようなより実質的な変異を導入し、産物をスクリーニングすればよい。
抗体の生物学的性質の実質的改変は(a)置換の領域におけるポリペプチド主鎖の構造(例えばシート又は螺旋構造)、(b)ターゲット部位における分子の電荷もしくは疎水性、又は(c)側鎖の嵩の維持に及ぼす効果が有意に相違する置換を選択することにより実施される。アミノ酸は(A.L.Lehninger,Biochemistry,second ed.,pp.73−75,Worth Publishers,New York(1975)に記載されているように)その側鎖の性質の類似性に従って以下のように分類することができる:(1)非極性:Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M);(2)非荷電極性:Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q);(3)酸性:Asp(D)、Glu(E);及び(4)塩基性:Lys(K)、Arg(R)、His(H)。
あるいは、共通の側鎖性質に基づいて天然残基を以下のように分類することもできる:(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;(2)中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;(3)酸性:Asp、Glu;(4)塩基性:His、Lys、Arg;(5)鎖の方向に影響を与える残基:Gly、Pro;及び(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
非保存置換はこれらの分類の1種のあるメンバーを別の分類のメンバーと交換し、保存置換はこれらの分類の1種のあるメンバーを同一分類内のメンバーと交換する。本明細書に記載するCD4抗体のいずれかのアミノ酸残基のうちの1アミノ酸又は低百分率のアミノ酸(一般に5%未満、より一般には4%、2%又は1%未満)を改変、付加又は欠失させる非保存又は保存置換、欠失、又は付加を含む非消失性CD4抗体も本発明の方法で使用するのに適している。
分子の酸化安定性を改善し、異常架橋を防ぐために、抗体の適正なコンフォーメーションの維持に関与しない任意システイン残基も一般にセリンで置換してもよい。逆に、(特に抗体がFvフラグメント等の抗体フラグメントである場合には)その安定性を改善するために、システイン残基を抗体に付加してもよい。
ある種の置換変異体は親抗体の1個以上の超可変領域残基を置換している。一般に、その後の開発のために選択する変異体は変異体の作製に使用した元の親抗体に比較して生物学的性質が改善している。このような置換変異体を作製するための簡便な方法はファージディスプレイを使用する親和性成熟法である。要約すると、数個の超可変領域部位(例えば6〜7部位)を突然変異させ、各部位に可能な全アミノ酸置換を作製する。こうして作製した抗体変異体を各粒子内にパッケージングしたM13の遺伝子III産物との融合体として線状ファージ粒子から1価で提示させる。次に、ファージ提示変異体を本明細書に開示するようにその生物活性(例えば結合親和性)についてスクリーニングする。改変の候補超可変領域部位を同定するためには、アラニンスキャニング突然変異誘発法を実施し、抗原結合に有意に寄与する超可変領域残基を同定することができる。代替又は追加方法として、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析し、抗体と抗原の接触点を同定することが有益な場合もある。このような接触残基と隣接残基が本明細書に詳述する技術による置換の候補である。このような変異体を作製したら、変異体群を本明細書に記載するようにスクリーニングし、1種以上の該当アッセイで優れた性質を示す抗体をその後の開発のために選択することができる。
抗体の別の型のアミノ酸変異体は抗体の元のグリコシル化パターンを改変する。このような改変としては、抗体に存在する1個以上の糖鎖部分の欠失、及び/又は抗体に存在していない1個以上のグリコシル化部位の付加が挙げられる。
ポリペプチドのグリコシル化は一般にN結合型又はO結合型である。N結合型とは糖鎖部分がアスパラギン残基の側鎖と結合していることを意味する。アスパラギン−X−セリンとアスパラギン−X−スレオニン(式中、Xはプロリン以外の任意アミノ酸である)のトリペプチド配列が糖鎖部分とアスパラギン側鎖の酵素結合の認識配列である。従って、ポリペプチドにこれらのトリペプチド配列のいずれかが存在するならば、潜在的グリコシル化部位が形成される。O結合型グリコシル化とはN−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの糖の1種とヒドロキシアミノ酸、最も一般にはセリン又はスレオニンの結合を意味するが、5−ヒドロキシプロリン又は5−ヒドロキシリジンも使用できる。
抗体へのグリコシル化部位の付加は上記トリペプチド配列の1個以上を含むようにアミノ酸配列を改変することにより簡便に実施される(N結合型グリコシル化部位の場合)。元の抗体の配列に1個以上のセリン又はスレオニン残基を付加又は置換することにより改変を行うこともできる(O結合型グリコシル化部位の場合)。
抗体がFc領域を含む場合には、これに結合した糖鎖を改変又は除去してもよい。例えば、本発明のグリコシル化変異体の1例では、1個以上のグリコシル化部位を除去するために1個以上のアミノ酸置換を抗体のFc領域に導入する。このような非グリコシル化抗体は補体活性化及び/又は抗体依存性細胞介在細胞傷害作用を誘導する能力が低下するように例えばヒトIgG1に比較してエフェクター機能が低下しており、非グリコシル化抗体はFc受容体との結合を低減(又は除去)することができる。
所定抗体(例えば本発明の方法で第2の化合物として使用される消失性抗体)では、抗体のADCC及び/又はCDCを強化するように抗体を改変することが望ましい場合がある。例えば、抗体のFc領域と結合したフコースをもたない成熟糖鎖構造をもつ抗体がU.S.2003/0157108(Presta,L.)に記載されている。U.S.2004/0093621(協和発酵工業株式会社)も参照。抗体のFc領域と結合した糖鎖に二分岐N−アセチルグルコサミン(GlcNAc)をもつ抗体もWO2003/011878(Jean−Mairetら)及び米国特許第6,602,684号(Umanaら)に記載されている。抗体のFc領域と結合したオリゴ糖に少なくとも1個のガラクトース残基をもつ抗体もWO1997/30087(Patelら)に報告されている。そのFc領域と結合した改変糖鎖をもつ抗体について記載しているWO1998/58964(Raju,S.)及びWO1999/22764(Raju,S.)も参照。
従って、グリコシル化変異体は場合によりFc領域を含み、Fc領域と結合した糖鎖構造はフコースをもたない。このような変異体はADCC機能が改善されている。場合により、Fc領域はADCCを更に改善する1個以上のアミノ酸置換(例えばFc領域の298位、333位、及び/又は334位の置換)を更に含む(Eu残基ナンバリング)。「脱フコシル化」ないし「フコース欠損」抗体に関する文献の例としては、U.S.2003/0157108;WO2000/61739;WO2001/29246;U.S.2003/0115614;U.S.2002/0164328;U.S.2004/0093621;U.S.2004/0132140;U.S.2004/0110704;U.S.2004/0110282;U.S.2004/0109865;WO2003/085119;WO2003/084570;WO2005/035586;WO2005/035778;Okazakiら,J.Mol.Biol.336:1239−1249(2004);及びYamane−Ohnukiら,Biotech.Bioeng.87:614(2004)が挙げられる。脱フコシル化抗体を産生する細胞株の例としては、蛋白フコシル化欠損Lec13 CHO細胞(Ripkaら,Arch.Biochem.Biophys.249:533−545(1986);U.S.2003/0157108,Presta,L;及びWO2004/056312,Adamsら,特に実施例11)と、α−1,6−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子FUT8ノックアウトCHO細胞(Yamane−Ohnukiら,Biotech.Bioeng.87:614(2004))等のノックアウト細胞株が挙げられる。
例えば抗体のADCC及び/又はCDCの強化を目的としたエフェクター機能に関する抗体の改変は抗体のFc領域に1個以上のアミノ酸置換を導入することにより実施することができる。代替又は追加方法として、システイン残基をFc領域に導入することにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成することができる。こうして作製されたホモダイマー抗体はインターナリゼーション機能の改善及び/又は補体介在性細胞死及びADCCの増加が得られる。Caronら,J.Exp Med.176:1191−1195(1992)及びShopes,B.J.Immunol 148:2918−2922(1992)参照。Wolffら,Cancer Research 53:2560−2565(1993)に記載されているようにヘテロ二官能性架橋剤を使用して抗腫瘍活性を強化したホモダイマー抗体を作製することもできる。あるいは、二重Fc領域をもつ抗体を作製することにより補体溶解能とADCC機能を強化することもできる。Stevensonら,Anti−Cancer Drug Design 3:219−230(1989)参照。WO2000/42072(Presta,L.)はヒトエフェクター細胞の存在下でADCC機能を改善した抗体について記載しており、この抗体はそのFc領域にアミノ酸置換を含む。ADCCを改善した抗体はFc領域の298位、333位、及び/又は334位に置換を含むことが好ましい。改変されたFc領域はこれらの位置の1、2、又は3個に置換を含むか又はこれらの位置の置換から構成されるヒトIgG1 Fc領域であることが好ましい。
WO1999/51642と、米国特許第6,194,551号、6,242,195号、6,528,624号、及び6,538,124号(Idusogieら)にはC1q結合及び/又はCDCを改変した抗体が記載されている。これらの抗体はそのFc領域のアミノ酸位置270位、322位、326位、327位、329位、313位、333位、及び/又は334位の1個以上にアミノ酸置換を含む。このようなアミノ酸置換を含む非消失性抗CD4抗体は本発明の1態様を構成する。
抗体の半減期を延長するためには、例えば米国特許第5,739,277号に記載されているようにサルベージ受容体結合エピトープを抗体(特に抗体フラグメント)に組込むことができる。本明細書で使用するサルベージ受容体結合エピトープなる用語はIgG分子(例えばIgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4)のin vivo血清半減期の延長に関与するIgG分子のFc領域のエピトープを意味する。そのFc領域に置換を含み、血清半減期を延長した抗体もWO2000/42072(Presta,L.)に記載されている。このようなサルベージ受容体結合エピトープを含む非消失性抗CD4抗体は本発明の1態様を構成する。
本発明の任意非消失性(又は他の)抗体はFcRn結合又は血清半減期を改善する少なくとも1個の置換をFc領域に含むことができる(例えば非消失性抗CD4変異体抗体)。例えば、本発明は新生児Fc受容体(FcRn)結合親和性を改変した変異体Fc領域を含む抗体も提供する。FcRnは主要組織適合性複合体(MHC)と構造的に類似しており、β2−マイクログロブリンと非共有的に結合したα鎖から構成される。新生児Fc受容体FcRnの多重機能はGhetie and Ward(2000)Annu.Rev.Immunol.18:39−766に概説されている。FcRnは母親から子供への免疫グロブリンIgGの受動的移動と血清IgG濃度の調節に役割を果たす。FcRnはサルベージ受容体として機能し、飲作用により取込まれた無傷の形態のIgGと結合し、細胞内及び細胞間に輸送し、デフォルト分解経路から救済する。IgGの救済に関与するメカニズムはまだ不明であるが、未結合IgGはリソソームで蛋白分解されるが、結合したIgGは細胞の表面に再循環され、放出されると考えられる。この制御は成人組織全体に位置する内皮細胞内で行われる。FcRnは少なくとも肝臓、乳腺、及び成人腸で発現される。FcRnはIgGと結合し、FcRn−IgG相互作用は広く研究されており、IgGのFc領域のCH2、CH3ドメイン界面に残基を含むと思われる。これらの残基は主にFcRnのα2ドメインに位置する残基と相互作用する。
本発明の所定態様では、非消失性抗CD4変異体抗体はFcRnとの結合の増加を示し、Fc領域の238位、256位、265位、272位、286位、303位、305位、307位、311位、312位、317位、340位、356位、360位、362位、376位、378位、380位、382位、413位、424位又は434位のアミノ酸位置の任意1個以上にアミノ酸改変を含むことができる(Fc領域における残基のナンバリングはKabatによるEUインデックスに従う)。例えば米国特許第6,737,056号;及びShieldsら,J.Biol.Chem.276:6591−6604(2001)参照。本発明の1態様では、抗体は少なくともAsn434→His(N434H)のアミノ酸置換を含む変異体IgG Fc領域を含む。本発明の1態様では、抗体は少なくともAsn434→Ala(N434A)のアミノ酸置換を含む変異体IgG Fc領域を含む。一般に、これらの変異体は天然配列/野生型配列Fc領域をもつポリペプチドよりもFcRNに対する結合親和性が高い。これらのFc変異体ポリペプチド及び抗体は分解されずに救済され、再循環されるという利点がある。本発明で提供する方法では、これらの非消失性抗CD4変異体抗体を使用することができる。非消失性CD4変異体抗体のほんの1例を挙げると、本明細書に記載する任意TRX1抗体は重鎖434位に置換(例えばN434A又はN434H)を含むことができる。
米国出願シリアル番号20040001827(Dennis,M.)に開示されているように血清アルブミン結合ペプチドを抗体に組込むことにより抗体の血清半減期を延長することもできる。このような血清アルブミン結合ペプチドを含む非消失性抗CD4抗体は本発明の1態様を構成する。
3個以上(好ましくは4個)の機能的抗原結合部位をもつ改変抗体も考えられる(US 2002/0004587 A1,Millerら)。このような多重抗原結合部位を含む非消失性抗CD4抗体は本発明の1態様を構成する。
抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は当分野で公知の各種方法により作製される。これらの方法としては限定されないが、天然資源からの単離(天然アミノ酸配列変異体の場合)又は抗体の以前に作製された変異体もしくは非変異体のオリゴヌクレオチドによる(又は部位特異的)突然変異誘発、PCR突然変異誘発、及びカセット突然変異誘発による作製が挙げられる。
本発明の実施にあたっては、分子生物学、微生物学、及び組換えDNAテクノロジーにおける多数の慣用技術を場合により使用する。これらの技術は周知であり、例えば、Berger and Kimmel,Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods in Enzymology volume 152 Academic Press,Inc.,San Diego,CA;Sambrookら,Molecular Cloning−A Laboratory Manual(3rd Ed.),Vol.1−3,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York,2000及びCurrent Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubelら,eds.,Current Protocols,a joint venture between Greene Publishing Associates,Inc.and John Wiley & Sons,Inc.,(2006年補遺)に説明されている。(例えばその後の核酸又は蛋白質単離のための)例えば細胞単離及び培養に有用な他の文献としては、Freshney(1994)Culture of Animal Cells,a Manual of Basic Technique,third edition,Wiley−Liss,New Yorkとその引用文献;Payneら(1992)Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons,Inc.New York,NY;Gamborg and Phillips(Eds.)(1995)Plant Cell,Tissue and Organ Culture;Fundamental Methods Springer Lab Manual,Springer−Verlag(Berlin Heidelberg New York)及びAtlas and Parks(Eds.)The Handbook of Microbiological Media(1993)CRC Press,Boca Raton,FLが挙げられる。(例えばin vitro増幅、細胞からの精製、又は化学的合成による)核酸の作製方法、核酸の操作方法(例えば部位特異的突然変異誘発、制限酵素消化、ライゲーション等)、並びに核酸の操作及び作製に有用な各種ベクター、細胞株等は上記文献に記載されている。更に、(例えば標識又はビオチン化ポリヌクレオチドを含む)基本的に任意ポリヌクレオチドを種々の商業ソースから個別注文又は標準注文することができる。
投与
当業者に自明の通り、非消失性CD4抗体の適切な用量は一般に同様の抗体を単独投与又は他の治療薬と併用投与する臨床療法で既に利用されている用量と同等である。試験する病態により、用量は変動する傾向がある。治療薬を投与する医師は個々の対象に適した用量を決定することができよう。非消失性CD4抗体と併用投与する市販の第2の化合物の調合及び投与スケジュールは製造業者の指示に従って使用してもよいし、当業者が経験により決定してもよい。
当業者に自明の通り、非消失性CD4抗体の適切な用量は一般に同様の抗体を単独投与又は他の治療薬と併用投与する臨床療法で既に利用されている用量と同等である。試験する病態により、用量は変動する傾向がある。治療薬を投与する医師は個々の対象に適した用量を決定することができよう。非消失性CD4抗体と併用投与する市販の第2の化合物の調合及び投与スケジュールは製造業者の指示に従って使用してもよいし、当業者が経験により決定してもよい。
疾患の予防又は治療には、抗体及び前記非消失性抗体と併用する場合には第2の化合物の適切な用量は上記に定義したような治療する疾患の種類、疾患の重篤度と経過、非消失性抗体又は併用剤を予防目的で投与するのか又は治療目的で投与するのか、治療暦、患者の臨床歴及び抗体又は併用剤に対する応答、並びに主治医の判断により異なる。非消失性抗体又は併用剤は一般には一連の治療期間にわたって患者に1回以上投与するのが適切である。
例えば1回以上に分けて投与するか又は連続輸液により投与するかに拘わらず、疾患の種類と重篤度に応じて非消失性CD4抗体1μg/kg〜50mg/kg(例えば0.1〜20mg/kg)が患者への初期候補投与用量である。典型的な1日用量は上記因子に応じて約1μg/kg〜約100mg/kg以上を利用ではる。病態に応じて数日間以上反復投与する場合には、疾患症状の所望抑制が生じるまで投与を持続する。しかし、他の用量レジメンが有用な場合もある。一般に、必要な生体効果を生じる用量に達するまで、臨床医は本発明の抗体を(単独又は第2の化合物と併用して)投与する。本発明の治療の進行は慣用技術及びアッセイにより容易にモニターされる。
例えば、TRX1非消失性CD4抗体を場合により上記のように又は米国特許出願公開2003/0108518もしくは2003/0219403に記載されているように投与する。1態様では、3〜5mg/kg(対象体重1kg当たり抗体mg)を単独又は本明細書に記載するような第2の化合物と併用投与し、疾患症状の所望抑制が生じるまで投与を継続する。症状の抑制を達成及び維持するように適切なレベルの抗体(あるいは抗体を第2の化合物と併用する場合には、適切なレベルの抗体と第2の化合物の併用剤)を対象に維持するためには、非消失性抗体を場合により一定期間投与する。
非消失性CD4抗体は非経口、局所、皮下、腹腔内、肺内、鼻腔内、及び/又は病巣内投与等の適切な任意手段により投与することができる。非経口輸液としては筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が挙げられる。鞘内輸液も考えられる(例えば米国特許出願公開2002/0009444、発明者Grillo−Lopez参照)。更に、例えば抗体用量を減らしながら、パルス輸液により抗体を投与すると適切な場合もある。静脈内又は皮下投与が好ましく、場合により静脈内輸液が好ましい。同一又は異なる投与手段を使用して個々の投与を行ってもよい。1態様では、静脈内投与により個々の投与を行う。
上記のように、非消失性CD4抗体は単独投与又は少なくとも第2の化合物と併用投与することができる。これらの第2の化合物は一般に従来使用されている用量及び経路と同一の用量及び投与経路で使用するか、又は従来使用されている用量の約1〜99%を使用する。このような第2の化合物を使用する場合には、その副作用を排除又は低減するように、非消失性CD4抗体と併用しない場合よりも低用量で使用する。
同じく上記のように、種々の適切な第2の化合物が当分野で公知であり、このような第2の化合物の用量と投与方法も従来記載されている。ほんの1例を挙げると、ループス(又はMS、関節リウマチ、又は炎症性腸疾患、又は本明細書に記載するような他の障害)を治療するために非消失性CD4抗体をシクロホスファミドと併用投与することができる。各種シクロホスファミド投与レジメンが文献に記載されている。典型的なレジメンとしては限定されないが、0.5〜1.0g/m2を毎月6カ月間〜3カ月おきに30カ月間の静脈内投与;500mgを2週間おきに3カ月間の静脈内投与;1〜3mg/kg/日を12週間又は6カ月間の経口投与が挙げられる。例えばPetri(2004)“Cyclosphosphamide:new approaches for systemic lupus erythematosus”Lupus 13:366−371及びPetri and Brodsky(2006)“High−dose cyclophosphamide and stem cell transplantation for refractory systemic lupus erythematosus”JAMA 295:559−560参照。
非消失性抗CD4抗体と本発明の任意第2の化合物の投与は例えば単一組成物として又は同一もしくは異なる投与経路を使用する2種以上の別個の組成物として同時に実施することができる。代替又は追加方法として、投与は任意順序で順次実施することができる。所定態様では、2種類以上の組成物の投与間隔は数分間から数日間、数週間、数カ月間とすることができる。例えば、非消失性抗CD4抗体を先ず投与した後に、本発明の第2の化合物を投与する。しかし、同時投与も考えられるし、本発明の第2の化合物を先に投与することも考えられる。
上記のように、場合により第3、第4等の化合物を非消失性CD4抗体及び第2の化合物と併用剤投与する。同様に、例えば非消失性CD4抗体又は併用剤の投与中に、ループスに続発もしくは関連する症状(例えば痙縮、失禁、疼痛、疲労)又はMS、関節リウマチ、炎症性腸疾患、又は他の病態もしくは疾患の治療薬を対象に投与してもよい。
医薬製剤
本発明に従って使用される抗体の治療用製剤は所望純度をもつ非消失性CD4抗体を任意成分としての医薬的に許容可能なキャリヤー、賦形剤、又は安定剤(Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980))と凍結乾燥製剤又は水溶液として混合することにより保存可能に製造される。許容可能なキャリヤー、賦形剤、又は安定剤は使用する用量と濃度でレシピエントに非毒性であり、緩衝剤(例えばリン酸、クエン酸、及び他の有機酸);酸化防止剤(例えばアスコルビン酸やメチオニン);防腐剤(例えば塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンズアルコニウム、塩化ベンズエトニウム;フェノール、ブチル又はベンジルアルコール;アルキルパラベン(例えばメチルパラベン又はプロピルパラベン);カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3−ペンタノール;及びm−クレゾール);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;蛋白質(例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン);親水性ポリマー(例えばポリビニルピロリドン);アミノ酸(例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン);単糖類、二糖類、及び他の糖質(例えばグルコース、マンノース、又はデキストリン);キレート剤(例えばEDTA);糖類(例えばスクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール);塩形成性対イオン(例えばナトリウム);金属錯体(例えばZn−蛋白質錯体);及び/又は非イオン性界面活性剤(例えばTween(登録商標)、Pluronics(登録商標)、又はPEG)が挙げられる。
本発明に従って使用される抗体の治療用製剤は所望純度をもつ非消失性CD4抗体を任意成分としての医薬的に許容可能なキャリヤー、賦形剤、又は安定剤(Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980))と凍結乾燥製剤又は水溶液として混合することにより保存可能に製造される。許容可能なキャリヤー、賦形剤、又は安定剤は使用する用量と濃度でレシピエントに非毒性であり、緩衝剤(例えばリン酸、クエン酸、及び他の有機酸);酸化防止剤(例えばアスコルビン酸やメチオニン);防腐剤(例えば塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンズアルコニウム、塩化ベンズエトニウム;フェノール、ブチル又はベンジルアルコール;アルキルパラベン(例えばメチルパラベン又はプロピルパラベン);カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3−ペンタノール;及びm−クレゾール);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;蛋白質(例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン);親水性ポリマー(例えばポリビニルピロリドン);アミノ酸(例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン);単糖類、二糖類、及び他の糖質(例えばグルコース、マンノース、又はデキストリン);キレート剤(例えばEDTA);糖類(例えばスクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール);塩形成性対イオン(例えばナトリウム);金属錯体(例えばZn−蛋白質錯体);及び/又は非イオン性界面活性剤(例えばTween(登録商標)、Pluronics(登録商標)、又はPEG)が挙げられる。
皮下投与に適した凍結乾燥製剤は例えば米国特許第6,267,958号(Andyaら)に記載されている。このような凍結乾燥製剤は適切な希釈剤で高蛋白濃度まで再構成することができ、再構成した製剤を本発明で治療する哺乳動物に皮下投与することができる。抗体の結晶形態も考えられる。例えば、U.S.2002/0136719A1(Shenoyら)参照。
本発明の製剤は治療する特定徴候の必要に応じて少なくとも第2の化合物、好ましくは相互に悪影響を与えない相補的活性をもつものを加えることができる。例えば、細胞傷害性物質(例えばメトトレキセート、シクロホスファミド、又はアザチオプリン)、化学療法剤、免疫抑制剤、サイトカイン、サイトカインアンタゴニスト又は抗体、増殖因子、ホルモン、インテグリン、インテグリンアンタゴニスト又は抗体(例えばLFA−1抗体、又はα4インテグリン抗体(例えばナタリズマブ))、インターフェロン類薬剤(例えばIFN−β−1a又はIFN−β−1b)、オリゴペプチド(例えば酢酸グラチラマー)、静脈内免疫グロブリン(γグロブリン)、リンパ球消失性薬剤(例えばミトキサントロン、シクロホスファミド、CamPath(登録商標)抗体、又はクラドリビン)、非リンパ球消失性免疫抑制薬(例えばMMF又はシクロスポリン)、「スタチン」類のコレステロール低下薬、エストラジオール、ループス、MS、関節リウマチ、又は炎症性腸疾患に続発又は関連する症状(例えば痙縮、失禁、疼痛、疲労)を治療する薬剤、TNF阻害剤、DMARD、NSAID、コルチコステロイド(例えばメチルプレドニゾロン、プレドニゾン、デキサメタゾン、又はグルココルチコイド)、レボチロキシン、シクロスポリンA、ソマトスタチンアナログ、代謝拮抗剤、T又はB細胞表面アンタゴニスト/抗体等、あるいは上記のような他の化合物を更に製剤に加えると望ましい場合がある。このような他の薬剤の種類と有効量は例えば製剤中に存在する抗体の量、治療するループス又はMS又は他の病態もしくは疾患の種類、及び対象の臨床パラメーターにより異なる。
例えばコアセルベーション技術又は界面重合により製造したマイクロカプセル(例えば、夫々ヒドロキシメチメルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ−(メチルメタクリレート)マイクロカプセル)、コロイドドラッグデリバリーシステム(例えばリポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)又はマクロエマルションに活性成分を封入してもよい。このような技術は例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980)に開示されている。
徐放製剤を製造してもよい。徐放製剤の適切な例としては非消失性抗体を収容した成形品(例えばフィルム又はマイクロカプセル)の形態の固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられる。徐放マトリックスの例としてはポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(2−ヒドロキシエチル−メタクリレート)又はポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第3,773,919号)、L−グルタミン酸とL−グルタミン酸エチルのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー(例えばLupron Depot(登録商標)(乳酸−グリコール酸コポリマーと酢酸ロイプロリドから構成される注射用マイクロスフェア)、及びポリ−D−(−)−3−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
in vivo投与に使用する製剤は無菌でなければならない。これは滅菌濾過膜で濾過することにより容易に実施される。
製品
本発明の別の態様では、ループス、MS、関節リウマチ、炎症性腸疾患、又は他の上記病態もしくは疾患の治療に有用な材料を含む製品を提供する。製品は(a)非消失性CD4抗体と医薬的に許容可能なキャリヤー又は希釈剤を含有する組成物を収容する容器と;(b)抗体を単独投与又は少なくとも第2の化合物と併用投与することにより対象におけるループス、MS、関節リウマチ、炎症性腸疾患、又は他の病態もしくは疾患を治療するための注意書きを記載したパッケージインサートを含むことが好ましい。
本発明の別の態様では、ループス、MS、関節リウマチ、炎症性腸疾患、又は他の上記病態もしくは疾患の治療に有用な材料を含む製品を提供する。製品は(a)非消失性CD4抗体と医薬的に許容可能なキャリヤー又は希釈剤を含有する組成物を収容する容器と;(b)抗体を単独投与又は少なくとも第2の化合物と併用投与することにより対象におけるループス、MS、関節リウマチ、炎症性腸疾患、又は他の病態もしくは疾患を治療するための注意書きを記載したパッケージインサートを含むことが好ましい。
パッケージインサートは容器に貼付又は添付する。適切な容器としては、例えばボトル、バイアル、シリンジ等が挙げられる。容器はガラスやプラスチック等の各種材料から形成することができる。容器はループス、MS、関節リウマチ、炎症性腸疾患、又は他の病態もしくは疾患を治療するために有効な組成物を保持又は収容しており、滅菌取出口を備えることができる(例えば、容器は静脈内溶液バッグ又は皮下注射針により穿孔可能なストッパー付きバイアルとすることができる)。組成物中の少なくとも1種の活性剤は非消失性抗体である。ラベル又はパッケージインサートには、治療に適格な対象でループス、MS、関節リウマチ、炎症性腸疾患、又は他の病態もしくは疾患を治療するために組成物を使用することを表示すると共に、抗体及び併用する場合には他の薬剤の投与量と投与間隔に関する個別の注意書きを記載する。
製品は更に医薬的に許容可能な希釈用緩衝液(例えば静菌性注射用水(BWFT)、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液、及びデキストロース液)を収容する第2の容器を含むことができる。製品は場合により第2の化合物(例えば本明細書に記載する任意化合物)を収容する第2又は第3の容器を含み、製品は更に対象に第2の化合物を投与するための注意書きをパッケージインサートに加える。あるいは、非消失性CD4抗体を含有する組成物に第2の化合物を加えてもよい。製品は更に商業的観点及び使用者の観点から望ましい他の材料(例えば他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針及びシリンジ)を同梱してもよい。
当然のことながら、本明細書に記載する実施例及び態様は例証の目的に過ぎず、これらの記載に鑑み、種々の変形又は変更が当業者に想到され、これらの変形又は変更も本願の精神及び範囲と特許請求の範囲に含むものとする。従って、以下の実施例は特許請求の範囲に記載する発明を例証するものであって、限定するものではない。
非消失性CD4抗体単独又は併用によるループスの治療
本実施例は非消失性CD4抗体がSLEの前臨床モデルで有効であることを実証する一連の実験について記載する。抗体の性能を典型的な看護及び実験治療標準の性能と比較する。
本実施例は非消失性CD4抗体がSLEの前臨床モデルで有効であることを実証する一連の実験について記載する。抗体の性能を典型的な看護及び実験治療標準の性能と比較する。
NZBxW F1マウスは自発性ループス様腎疾患を示すのでSLEの有用な前臨床効力モデルとなる(例えばTheofilopoulos(1992)“Murine models of systemic lupus erythematosus” in Systemic Lupus Erythematosus,Lahita(ed.)Churchill Livingstone,New York,121−194参照)。図5はこのモデルにおける月齢に伴う疾患の進行を模式的に示す。観察される症状としては、ds−DNA抗体の出現、蛋白尿、腎組織異常、血中尿素窒素(BUN)の増加、及び死亡率の増加が挙げられる。矢印は非消失性CD4抗体を他の治療と比較する2種類の試験で抗体投与を開始した時点を示す。
このモデルで、非消失性CD4抗体YTS177(Cobboldら(1990)“The induction of skingraft tolerance in MHC−mismatched or primed recipients:primed T cells can be tolerized in the periphery with CD4 and CD8 antibodies”Eur J Immunol 20:2747−2755)の前臨床効力を非結合性対照抗体(対照Ab又は対照Ig)、CTLA4−Ig(臨床開発中)、及びシクロホスファミド(Cytoxan(登録商標),CTX;看護治療の現在の標準)の効力と比較した。YTS177非消失性CD4抗体はHerman Waldmann,Oxfordから寄贈されたものを使用した。対照抗体は無関係のIgG1抗体とした(無関係のラット抗体は自己免疫応答を誘発する可能性があり、疾患過程に影響を与え、ラット抗CD4抗体はこのような自己応答を阻止するので、対照にはマウス抗体を使用した)。使用したCTLA4−Ig構築物はヒトIgG1ヒンジ−C3,C4 IgドメインにマウスCTLA−4の細胞外ドメインを融合したものであり、Linsleyら(1991)J Exp Med 174(3):561によりモデル化されている。
8カ月齢でNZBxNZWマウスを蛋白尿についてスクリーニングし、その蛋白尿スコアに基づいてランダムに5群に分けた。この月齢で、疾患は中等度〜重度とみなす。実験開始時に、マウス19匹からなる各群の尿中蛋白濃度分布は>300mg/dl 32%;100〜300mg/dl 24%;及び30〜100mg/dl 44%であった。いずれかの対照抗体(対照Ab又は対照Ig)、YTS177(非消失性抗CD4)、CTLA4−Ig、シクロホスファミド(CTX)、又は抗CD4とCTXの併用剤をマウスに6カ月間連続投与した。YTS177とCTLA4−Igは5mg/kgを週3回腹腔内(IP)注射により投与し;シクロホスファミド(CTX)は50mg/kgを(単独又は指定量のYTS177と併用して)10日おきにIP投与した。尿蛋白濃度(例えば蛋白尿)、血中尿素窒素(BUN)、及び生存率の変化についてマウスをモニターした。
図6に示すように、非消失性CD4抗体を投与すると進行までの時間が延び(図6A)、生存率が上昇し(図6B)、蛋白尿が低減し(図6C,投与後5カ月のデータを示す)、平均BUNが低下した(図6D)。
図7に示すように、非消失性CD4抗体を投与すると、重度ループス腎炎を改善することができる。図7Aは投与後指定時点における蛋白尿300mg/dl未満のマウスの百分率を示す。非消失性CD4抗体を単独又はシクロホスファミドと併用投与した結果、蛋白尿>300mg/dlを示すマウスは最終的に減少し、ごく後期にネフローゼ症状が改善されたが、対照抗体、CTLA4−Ig、又はシクロホスファミドを単独投与した群ではこのような結果は認められなかった。図7Bは投与から最初の1カ月以内に蛋白尿300mg/dlから改善したマウスの百分率を示す。(図7Bは本明細書に記載する試験と3種の同様の試験を含む4種の試験からの結果をまとめたデータを示す。データは投与開始時に蛋白尿が>300mg/dlであったマウスのみのデータである。)CD4抗体をシクロホスファミド(CTX)と併用した場合には、蛋白尿改善能の相乗効果が認められた。
非消失性CD4抗体とシクロホスファミドの併用投与も蛋白尿の低減に有効である。図9はダネット法を使用した投与6カ月の蛋白尿の多重比較分析を示し、図9Aではシクロホスファミド投与群を参照対照群とし、図9Bでは非消失性CD4抗体投与群を参照対照群としている。参照対照群は太字で示し、参照対照に対して統計的有意性に達する群のp値のみをグラフに示す。これらの結果からも、非消失性CD4抗体は蛋白尿の低減においてCTLA4−Igよりも優れていることが実証された(例えば図9B参照)。また、非消失性CD4抗体とシクロホスファミドを併用すると、このモデルで蛋白尿を低減するのにシクロホスファミド単独よりも有意効果があることも実証された(例えば図9A参照)。
CD4とCD8に対して染色した腎切片を検査した処、対照抗体の投与4カ月後に腎髄質又は骨盤間質へのリンパ球浸潤が判明した。他方、CD4抗体又はCTLA4−Igを投与すると、投与後4カ月に腎間質で観察されるCD4+細胞は減少した。CD4抗体投与は腎臓で観察されるCD8+T細胞数に影響を与えなかった。
自発性ループス様腎疾患を示すNZBxW F1マウス(SLEマウスモデル)に非消失性CD4抗体を投与すると、ds−DNA抗体力価の上昇も抑えられた。図8に示すように、ds−DNA抗体力価の経時的上昇は対照抗体を投与した動物に比較して非消失性CD4抗体を投与した動物にほうが少なかった。登録時の力価(各投与群の概算平均3log)を示す図8Aと、投与後3カ月の力価(非消失性抗CD4抗体投与群と対照抗体投与群で夫々約3.5log及び4.5log)を示す図8Bを比較されたい。本実験では、8カ月齢ではなく、6カ月齢で投与を開始した。
更に、CD4抗体を投与すると、T細胞活性化に関連する表面蛋白に対する抗体を使用してフローサイトメトリーにより測定した場合に、脾臓に存在する活性化CD4+T細胞数も減少した。図8に示すように、投与後3週間に脾臓に存在するCD4+CD69+細胞数(図8C)とCD4+CD25+細胞数(図8D)はいずれも非消失性CD4抗体を投与した動物のほうが対照抗体を投与した動物に比較して少なかった(8カ月齢で投与開始)。
中等度〜重度ではなく、軽度疾患に導入した場合も、非消失性CD4抗体投与は有効であった。いずれも蛋白尿30〜100mg/dlを示す6カ月齢NZBxNZWマウスに基本的に上記のように対照Ab、YTS177(非消失性抗CD4)、CTLA4−Ig、又はシクロホスファミド(Cytoxan(登録商標))を投与した。蛋白尿と生存率の変化についてマウスをモニターした。図6に示すように、6カ月齢で非消失性CD4抗体投与を開始すると、対照に比較して進行までの時間が延び(図6E)、生存率が上昇し(図6F)、非消失性CD4抗体は軽度疾患に導入した場合に非常に有効であることが分かった。(全投与は対照に比較して非常に有効であった:7カ月の進行までの時間*p<0.025(図6E)及び生存率*p<0.04(図6F))。
以上をまとめると、非消失性CD4抗体投与は疾患初期又は後期に導入した場合にNZBxW F1マウスで有効であった。抗体を投与すると、無疾患進行期間と生存期間が延び、BUN上昇と糸球体腎炎発症が遅れ、抗dsDNA力価上昇が抑えられ、活性化CD4+T細胞数が減少した。抗体投与5カ月又は6カ月で観察された効果は蛋白尿の低減に関してシクロホスファミドの効果と同等であり、CTLA4−Igよりも優れており、後期疾患では抗CD4とCTLA4−Igの差はより明白であった。更に、非消失性CD4抗体をシクロホスファミドと併用すると、SLEのNZBAV F1モデルでシクロホスファミド単独よりも有意な効果が得られた。
実験手順
検尿
蛋白尿はClinitek(登録商標)50 Urine Chemistry Analyzer(Bayer Corporation,Elkhart,IN,USA)を使用して測定した。新たに採取した尿1滴を試薬ストリップ(Multistix(登録商標)10 SG,Bayer)に滴下し、清浄なゲージスポンジで拭って過剰の尿を除去した後にストリップをすぐに分析器に挿入した。
検尿
蛋白尿はClinitek(登録商標)50 Urine Chemistry Analyzer(Bayer Corporation,Elkhart,IN,USA)を使用して測定した。新たに採取した尿1滴を試薬ストリップ(Multistix(登録商標)10 SG,Bayer)に滴下し、清浄なゲージスポンジで拭って過剰の尿を除去した後にストリップをすぐに分析器に挿入した。
血中尿素窒素濃度の測定
血中尿素窒素はCobas Integra(登録商標)400化学分析器(Roche Diagnostics,Basel,Switzerland)と尿素検出試薬(同じくRoche Diagnostics製品)を製造業者に指示に従って使用して測定した。Precinorm(登録商標)及びPrecipath(登録商標)凍結乾燥ヒト血清対照(Roche Diagnostics)を夫々正常及び異常対照として使用した。
血中尿素窒素はCobas Integra(登録商標)400化学分析器(Roche Diagnostics,Basel,Switzerland)と尿素検出試薬(同じくRoche Diagnostics製品)を製造業者に指示に従って使用して測定した。Precinorm(登録商標)及びPrecipath(登録商標)凍結乾燥ヒト血清対照(Roche Diagnostics)を夫々正常及び異常対照として使用した。
CD4及びCD8に対する腎切片染色
CD4/CD8二重標識免疫組織化学分析のために、厚さ5ミクロンの凍結腎切片を切りとり、氷冷アセトン(−20℃)で5分間固定し、2×5分間TBS/0.1% Tween 20(TBST)でリンスした後、グルコースオキシダーゼで1時間37℃にて内在ペルオキシダーゼ活性をブロックした。次に切片をTBSTでリンスし、 Vector Labs(Vector Labs,Burlingame,CA)製品であるアビジン/ビオチンブロッキングキットを使用して内在アビジン/ビオチンをブロックした。TBSTで更にリンスした後、10%ウサギ血清/3%BSA/TBSで30分間室温(RT)にて内在免疫グロブリンをブロックした。
CD4/CD8二重標識免疫組織化学分析のために、厚さ5ミクロンの凍結腎切片を切りとり、氷冷アセトン(−20℃)で5分間固定し、2×5分間TBS/0.1% Tween 20(TBST)でリンスした後、グルコースオキシダーゼで1時間37℃にて内在ペルオキシダーゼ活性をブロックした。次に切片をTBSTでリンスし、 Vector Labs(Vector Labs,Burlingame,CA)製品であるアビジン/ビオチンブロッキングキットを使用して内在アビジン/ビオチンをブロックした。TBSTで更にリンスした後、10%ウサギ血清/3%BSA/TBSで30分間室温(RT)にて内在免疫グロブリンをブロックした。
CD8標識のために、切片をビオチン化ラット抗マウスCD8モノクローナル抗体(MAb)クローン53.6−7(Pharmingen,San Diego,CA)8ug/mlと共に1時間室温でインキュベートした。陰性対照では、ナイーブアイソタイプラットIgG2aを一次抗血清として使用した。TBSTでリンスした後、切片をVectastain ABC−Elite試薬(Vector Labs)中で30分間室温にてインキュベートした。次に発色基質として金属増感型DAB(Pierce Biotechnology,Rockford,IL)を使用して染色反応を可視化した。
CD4抗体による二次標識のために、Vector Labsアビジン/ビオチンブロッキングキットを使用して切片の(一次反応からの)アビジン/ビオチンをもう一度ブロックした。次に切片をラット抗マウスCD4 MAbクローンRM4−4(Pharmingen)0.5ug/mlと共に1時間室温でインキュベートした。陰性対照では、ナイーブアイソタイプラットIgG2bを一次抗血清として使用した。TBSTでリンスした後、切片を次にTSA(登録商標)(チラミドシグナル増幅)キット(Perkin−Elmer LAS Inc.,Boston MA)からのストレプトアビジン−HRP複合体と共に30分間室温にてインキュベートした。TBSTでリンスした後、切片を次にビオチン化TSA(登録商標)増幅試薬(Perkin−Elmer LAS Inc)と共に3分間室温にてインキュベートした後、ストレプトアビジン−HRPと共に30分間室温で2回目のインキュベーションを行った。次に発色基質としてVector(登録商標)Red(Vector Labs)を使用して染色反応を可視化した。
次に二重標識切片をマイヤーヘマトキシリンで1分間軽く対比染色し、水道水でリンスし、Crystal/Mount(Biomeda Corporation,Foster City,CA)を使用してカバースリップで覆った。
2本鎖DNA抗体力価の測定
抗ds−DNA抗体力価をELISAにより測定した。Nunc MAXIsorb immunoplate 384ウェルプレート(型番464718)にポリ−L−リジン(25μl/ウェル,0.01%、Sigma P4707)を1時間室温でコーティングし、脱イオン水で洗浄し、室温で1時間風乾した後、ウシ胸腺DNA(Sigma D1501,25μl/ウェル,PBS中2.5μg/ml)を4℃で一晩コーティングした。ウシ胸腺DNA溶液をプレートからデカントし、ブロッキングバッファー(PBS,0.5% BSA pH7.2)50μlを加え、プレートを1時間室温で震盪した。次にプレートを洗浄用バッファー(PBS,0.05% Tween(登録商標)20(モノラウリン酸ポリオキシエチレン(20)ソルビタン),pH7.2)で3回洗浄した。
抗ds−DNA抗体力価をELISAにより測定した。Nunc MAXIsorb immunoplate 384ウェルプレート(型番464718)にポリ−L−リジン(25μl/ウェル,0.01%、Sigma P4707)を1時間室温でコーティングし、脱イオン水で洗浄し、室温で1時間風乾した後、ウシ胸腺DNA(Sigma D1501,25μl/ウェル,PBS中2.5μg/ml)を4℃で一晩コーティングした。ウシ胸腺DNA溶液をプレートからデカントし、ブロッキングバッファー(PBS,0.5% BSA pH7.2)50μlを加え、プレートを1時間室温で震盪した。次にプレートを洗浄用バッファー(PBS,0.05% Tween(登録商標)20(モノラウリン酸ポリオキシエチレン(20)ソルビタン),pH7.2)で3回洗浄した。
アッセイバッファー(PBS,0.5% BSA,0.05% Tween(登録商標)20,0.01% Procline 3000)で血清サンプルの希釈系列を作製し、まず25倍に希釈した後、Precision 2000(登録商標)自動ピペッティングシステムを使用して3倍希釈系列を実施した。こうして陰性対照血清の希釈系列(抗dsDNA抗体レベルが低いか又はバックグラウンドであるマウス血清プール)を作製した。陽性対照血清の1種以上の希釈液も場合により調製する(例えばNZB F1血清の5000倍希釈液)。
希釈血清サンプルを洗浄済みプレートに加え、例えば高速プレートロボットを使用して希釈血清25ulを加えた。プレートを2時間室温で静かに撹拌しながらインキュベートした後、洗浄用バッファーで6回洗浄した。HRP(西洋ワサビペルオキシダーゼ)標識抗マウスFc抗体(アッセイバッファーで5000倍に希釈したJackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.,の抗mu−FcHRP(カタログ番号115−035−071)25μl)を各ウェルに加え、プレートを静かに撹拌しながら室温で1時間インキュベートした。基質溶液(25μl/ウェル;いずれもKirkegaard & Perry製品であるTMB基質1部+Peroxidase Solution B 1部)を加え、発色させた。停止溶液(1M H3PO4 25μl/ウェル)を加え、プレートを450/620nmで読み取った。
下式:
[式中、CP(カットポイント)は陰性対照血清平均の吸光度の3倍であり、HighA450/620はカットポイントの値に最も近いが、それよりも高い吸光度(A450/620)であり、LowA450/6200はカットポイントの値に最も近いが、それよりも低い吸光度(A450/620)であり、DF1はカットポイントの値に最も近いが、それよりも低いLowA450/620値の希釈倍率であり、DF2はカットポイントの値に最も近いが、それよりも高いHighA450/620値である。]を使用して血清サンプルの抗ds−DNA抗体力価を計算した。
[式中、CP(カットポイント)は陰性対照血清平均の吸光度の3倍であり、HighA450/620はカットポイントの値に最も近いが、それよりも高い吸光度(A450/620)であり、LowA450/6200はカットポイントの値に最も近いが、それよりも低い吸光度(A450/620)であり、DF1はカットポイントの値に最も近いが、それよりも低いLowA450/620値の希釈倍率であり、DF2はカットポイントの値に最も近いが、それよりも高いHighA450/620値である。]を使用して血清サンプルの抗ds−DNA抗体力価を計算した。
フローサイトメトリー
脾臓に存在する活性化CD4+T細胞数をフローサイトメトリーにより以下のように測定した。脾臓全体を摘出し、シングルセル懸濁液で粉砕した後、ELバッファー(Qiagen,Valencia,CA製品の赤血球溶解用バッファー,カタログ番号79217)を使用して赤血球を溶解させ、70ミクロンセルストレーナーに通した後、細胞カウントのために再懸濁した。規定容量の各細胞懸濁液を既知濃度の蛍光ビーズ(Polysciences,Inc.,カタログ番号18862)溶液と混合した。次に混合物をBD Biosciences(Franklin Lakes,NJ)製品FACScan(登録商標)フローサイトメーターに流した。混合物毎に規定数のビーズを採取することにより合計生存細胞数を計算した後にこれを使用し、更にFACS分析後に各マウスの脾臓の合計細胞サブ集団数を決定した。
脾臓に存在する活性化CD4+T細胞数をフローサイトメトリーにより以下のように測定した。脾臓全体を摘出し、シングルセル懸濁液で粉砕した後、ELバッファー(Qiagen,Valencia,CA製品の赤血球溶解用バッファー,カタログ番号79217)を使用して赤血球を溶解させ、70ミクロンセルストレーナーに通した後、細胞カウントのために再懸濁した。規定容量の各細胞懸濁液を既知濃度の蛍光ビーズ(Polysciences,Inc.,カタログ番号18862)溶液と混合した。次に混合物をBD Biosciences(Franklin Lakes,NJ)製品FACScan(登録商標)フローサイトメーターに流した。混合物毎に規定数のビーズを採取することにより合計生存細胞数を計算した後にこれを使用し、更にFACS分析後に各マウスの脾臓の合計細胞サブ集団数を決定した。
細胞1×106個に飽和量のフルオロフォア標識抗体を加え、氷上で30分間インキュベートした後、冷緩衝液で洗浄した。脾細胞を抗CD4(BD Pharmingen,カタログ番号553055,クローンRM4−4)、抗CD3(BD Pharmingen,カタログ番号555276,クローン17A2)、及び抗CD69(BD Pharmingen,カタログ番号553237,クローンH1.2F3)又は抗CD4、抗CD3、及び抗CD25(Miltenyi Biotec,カタログ番号130−091−013)で染色した。CD8細胞はCD3に陽性であり、CD4に陰性であるため、CD3染色により、CD4T細胞とCD8T細胞の分離が容易になった。サンプルをBD Biosciences製品FACSCalibur(登録商標)フローサイトメーターでフローサイトメトリーにより分析した。
非消失性CD4抗体による多発性硬化症の治療
本実施例は非消失性CD4抗体がMSの前臨床モデルで有効であることを実証する一連の実験について記載する。抗体の性能を典型的な看護及び実験治療標準の性能と比較する。
本実施例は非消失性CD4抗体がMSの前臨床モデルで有効であることを実証する一連の実験について記載する。抗体の性能を典型的な看護及び実験治療標準の性能と比較する。
実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)はMSと類似する中枢神経系(CNS)の炎症性病態であり、いずれも脱髄の結果として神経伝導障害と麻痺を生じる。SJL/Jマウスにプロテオリピド蛋白(PLP)ペプチドを注射することにより誘発した再発寛解型EAEはMSの有用な前臨床効力モデルとなる(例えばMiller and Karpus(1996)“Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in the Mouse”in Current Protocols in Immunology,Coliganら(eds.),John Wiley & Sons,Inc.及びSobelら(1990)“Acute experimental allergic encephalomyelitis in SJL/J mice induced by a synthetic peptide of myelin proteolipid protein”J Neuropathol Exp Neurol.49(5):468−79参照)。
図10はこのモデルにおけるPLPペプチド注射後の疾患の経時的進行を模式的に示す。0日に注射後に疾患発症(0〜15日)、寛解(15〜25日)、及び再発(25日から60〜70日の試験終了まで)をたどる。標準化臨床神経スコアを次のように割り当てる。0−無疾患;1−尾の脱力又は後肢弱化が認められるが、両方は認められない;2−尾の脱力と後肢弱化;3−部分的な後肢麻痺;4−完全な後肢麻痺;5−瀕死状態、EAEによる死亡、安楽死。図中、矢印は非消失性CD4抗体を他の治療と比較する試験で抗体投与を開始した時点を示す。黒丸は他の治療が過去に有効であると示されている時点を示す。
このモデルで、非消失性CD4抗体の前臨床効力を対照抗体(上記)、CTLA4−Ig、α4インテグリン抗体、及び酢酸グラチラマー(Copaxone(登録商標))の効力と比較した。SJL/Jマウスに0日にPLP−139−151ペプチドのCFA(完全フロイントアジュバント)溶液を免疫した。マウスを週3回上記のような疾患スコアについてスクリーニングし、終点で組織異常(脳及び脊髄)を試験した。疾患発症後に治療を開始した場合には、マウスの疾患スコアをモニターした後に、治療前に同等疾患スコアの群にランダムに分けた。3回の別個の試験で、疾患発症期である8日、疾患のピーク期である14日、又はトラフ期である24日に抗体(又は他の)投与を開始した。非消失性CD4抗体、対照抗体、CTLA4−Ig、α4インテグリン抗体、及び酢酸グラチラマー10mg/kgを週3回投与した。
指定しない限り、これらの実験で使用した非消失性CD4抗体はマウス化YTS177抗体とした。マウス化YTS177はマウスIgG2a重鎖及びκ軽鎖定常領域配列の上流にラットYTS177抗体に由来する重鎖及び軽鎖可変領域をクローニングしたものである。重鎖はFc受容体結合領域の2カ所に1アミノ酸置換を含む(ヒトIgG1残基D265及びN297に対応する残基がアラニンに置換されている)。
図11に示すように、疾患発症時に導入した場合(8日に投与開始)には非消失性CD4抗体はCTLA4−Ig及び酢酸グラチラマーよりも優れていた。図11Aは対照抗体、酢酸グラチラマー、α4インテグリン抗体、CTLA4−Ig、及びCD4抗体を投与した群の経時的臨床スコアのグラフを示す。図11Bはこれらの群の平均1日臨床スコアを示す。
図12に示すように、疾患のピーク時に導入した場合(14日に投与開始)にもCD4抗体はCTLA4−Igよりも優れていた。図12Aは対照抗体、CTLA4−Ig、及びCD4抗体を投与した群の経時的臨床スコアのグラフを示す(酢酸グラチラマーとα4インテグリン抗体はこの時点で無効である)。図12Bはこれらの群の平均1日臨床スコアを示す。CD4抗体で観察された効果は3回の独立した実験の代表的なものである。
図13に示すように、疾患後期に導入した場合(24日に投与開始)にもCD4抗体はCTLA4−Igよりも優れていた。図13Aは対照抗体、CTLA4−Ig、及びCD4抗体を投与した群の経時的臨床スコアのグラフを示す。図13Bはこれらの群の平均1日臨床スコアを示す。非消失性CD4抗体で観察された効果は2回の独立した実験の代表的なものである。
図14に示すように、非消失性CD4抗体を投与すると、EAEの脱髄は低減した。疾患急性期のピーク付近(12日)で抗体(本実験ではマウス化YTS177ではなくYTS177)投与を開始し、80日の試験終了まで続けた。脊髄を摘出し、固定し、(無傷のミエリンを暗青色に染色する)Luxol Fast Blue色素で染色した。線で囲んだ領域は脱髄領域を示す。選択したマウスは各群の平均脱髄スコアの代表的なものである。
CD4抗体(マウス化YTS177)を投与すると、再発寛解型EAEモデルにおけるCD4+T細胞浸潤も低減した。例えば、14日に投与開始後60日に動物から脊髄切片を採取し、実施例1に記載したようにCD4とCD8で染色した処、対照抗体を投与した動物に比較してCD4抗体を投与した動物ではCD4+浸潤が低減したが、CD8+浸潤は低減しなかった。
非消失性CD4抗体を投与したマウスは免疫適格のままであり、Listeria感染後に正常生存率を示した。例えば、Listeria感染後8日目に、非消失性CD4抗体(マウス化YTS177)を投与した動物10匹中10匹が生存しており、これに対して対照Ig抗体を投与した動物は10匹中8匹、CTLA4−Igを投与した動物は10匹中3匹、TNFRII−Fcを投与した動物は10匹中0匹であった(Wooleyら(1993)J of Immunol 151(11):6602)。Listeria接種の1日前に初期用量20mg/kgで治療薬の投与を開始した後、試験期間中、全治療薬を5mg/kgで週3回投与した。
図15に示すように、CD4抗体を投与すると、血液中のCD4+エフェクター/メモリー細胞が選択的に減少した。対照抗体、CD4抗体、又はCTLA4−Igを投与した動物でフローサイトメトリーにより測定した血液1μl当たりのICOShiCD4又はICOShiCD8T細胞数を示す(ICOShiはエフェクター/メモリーT細胞のマーカーであり、正常マウスの血液中のT細胞の4%未満に相当し、EAE発症後に約15〜20%まで増加するとみなされる。)。CTLA4−Igと異なり、非消失性CD4抗体はCD8+細胞数を減らすことなしにCD4+細胞数を減らした。この実験では、14日に投与を開始し、46日に細胞をカウントした。
以上をまとめると、非消失性CD4抗体投与は再発寛解型EAEのSJL/Jモデルで有効である。この抗体を投与すると、全介入時点で臨床スコアが低下し、脳及び脊髄で組織スコアが低下し、CNSでCD8+浸潤は低減せずにCD4+が低減し、CD8+T細胞数は減少せずにICOShiCD4+T細胞数が減少した。CD4抗体の効力はCTLA4−Ig及び酢酸グラチラマーよりも優れており、α4インテグリンモノクローナル抗体と少なくとも同等であった。
CD4抗体投与は別のMSモデルであるC57B1k6マウスにMOG−ペプチドにより誘発したEAEでも有効である。MOGモデルは周期的寛解を示さないので、MSの急性/慢性モデルといえる。疾患のピーク付近で投与を開始した場合に、SJL/Jモデルで観察されたと同様の神経症状の急激な改善がMOGモデルでも認められた。図16に示すように、非消失性(又は消失性)CD4抗体を投与すると、対照抗体、CTLA4−Ig、又は消失性CD8抗体を投与した場合に比較して臨床スコアが低下した。
実験手順
フローサイトメトリー
血液中のエフェクター/メモリー細胞数をフローサイトメトリーにより以下のように測定した。規定容量の血液を眼窩後方からヘパリン管に採血した後、赤血球を溶解させ、赤血球カウントのために再懸濁した。実施例1に記載したように、規定容量の各細胞懸濁液を既知濃度の蛍光ビーズ溶液と混合し、各マウスの血液の合計細胞サブ集団数を決定した。
フローサイトメトリー
血液中のエフェクター/メモリー細胞数をフローサイトメトリーにより以下のように測定した。規定容量の血液を眼窩後方からヘパリン管に採血した後、赤血球を溶解させ、赤血球カウントのために再懸濁した。実施例1に記載したように、規定容量の各細胞懸濁液を既知濃度の蛍光ビーズ溶液と混合し、各マウスの血液の合計細胞サブ集団数を決定した。
細胞1×106個に飽和量のフルオロフォア標識抗体を加え、氷上で30分間インキュベートした後、冷緩衝液で洗浄した。血球を抗CD4(BD Pharmingen,カタログ番号553055,クローンRM4−4)、抗CD8a(BD Pharmingen,カタログ番号553033,クローン53−6.7)、ビオチン化抗ICOS(BD Pharmingen,カタログ番号552145、クローン7E.17G9)で染色した後、洗浄した。次に血球をストレプトアビジン−APC(BD Pharmingen,カタログ番号554067)で染色し、再び洗浄した。サンプルをBD Biosciences製品FACSCaliburでフローサイトメトリーにより分析した。
脊髄切片のLuxol Fast Blue染色
4μmに切りとったホルマリン固定パラフィン包埋脊髄切片でLuxol Fast Blue染色を実施した。脊髄切片を脱パラフィンし、95%エタノールまで水和した。次に、一晩(少なくとも16時間)Luxol Fast Blueで60℃にて染色した。過剰の色素を95%エタノールで洗い流し、スライドをdH2Oで洗浄した。次に0.05%炭酸リチウムに10〜20秒間素早く浸すことによりスライドを分別した後、灰白質を識別できるようになるまで70%エタノールを数回交換した。次にスライドをクレジルバイオレットで5分間37℃にて染色し、95%エタノールでリンスし、ゆっくりと脱水し、透徹し、マウントした。Sheehan(1980)Theory and Practice of Histotechnology.2nd ed.pp.263−264参照。
4μmに切りとったホルマリン固定パラフィン包埋脊髄切片でLuxol Fast Blue染色を実施した。脊髄切片を脱パラフィンし、95%エタノールまで水和した。次に、一晩(少なくとも16時間)Luxol Fast Blueで60℃にて染色した。過剰の色素を95%エタノールで洗い流し、スライドをdH2Oで洗浄した。次に0.05%炭酸リチウムに10〜20秒間素早く浸すことによりスライドを分別した後、灰白質を識別できるようになるまで70%エタノールを数回交換した。次にスライドをクレジルバイオレットで5分間37℃にて染色し、95%エタノールでリンスし、ゆっくりと脱水し、透徹し、マウントした。Sheehan(1980)Theory and Practice of Histotechnology.2nd ed.pp.263−264参照。
Listeria感染
Listeria monocytogenes(ATCC株#43251)100,000コロニー形成単位をPBS 100μlで希釈し、マウスに静脈内接種した。Listeria注射の前日にモノクローナル抗体又は融合蛋白質(マウス1匹当たり400μg(20mg/kgに等価)をPBS 100μlで希釈)のIP注射を開始し、Listeria注射後10日間週3回100μg(5mg/kg)の投与を続けた。マウスの疾患徴候を1日2回モニターした。
Listeria monocytogenes(ATCC株#43251)100,000コロニー形成単位をPBS 100μlで希釈し、マウスに静脈内接種した。Listeria注射の前日にモノクローナル抗体又は融合蛋白質(マウス1匹当たり400μg(20mg/kgに等価)をPBS 100μlで希釈)のIP注射を開始し、Listeria注射後10日間週3回100μg(5mg/kg)の投与を続けた。マウスの疾患徴候を1日2回モニターした。
Listeriaの作製
C57B1/6マウスで連続継代によりListeriaビルレンスを維持した。脳・心臓滲出液(BHI)又はBHI寒天プレート(Difco Labs,Detroit,MI)で増殖させた感染脾臓から新鮮な単離物を得た。細菌を反復洗浄し、滅菌PBSに再懸濁し、PBS+20% グリセロール中で−80℃にて保存した。
C57B1/6マウスで連続継代によりListeriaビルレンスを維持した。脳・心臓滲出液(BHI)又はBHI寒天プレート(Difco Labs,Detroit,MI)で増殖させた感染脾臓から新鮮な単離物を得た。細菌を反復洗浄し、滅菌PBSに再懸濁し、PBS+20% グリセロール中で−80℃にて保存した。
CD4抗体とMMFの併用によるループスの治療
本実施例は非消失性CD4抗体が単独又はミコフェノール酸モフェチルと併用した場合にSLEの前臨床モデルで有効であることを実証する一連の実験について記載する。
本実施例は非消失性CD4抗体が単独又はミコフェノール酸モフェチルと併用した場合にSLEの前臨床モデルで有効であることを実証する一連の実験について記載する。
SLEのNZBxW F1マウスモデルについては上記実施例1に記載した。このモデルで非消失性CD4抗体(上記YTS177)の前臨床効力を非結合性対照抗体(上記)、ミコフェノール酸モフェチル(CellCept(登録商標)ないしMMF、現在の治療薬)、及びCD4抗体とMMFの併用剤の効力と比較した。
9カ月齢でNZB x NZWマウスの治療を開始した。マウスを蛋白尿についてスクリーニングし、その蛋白尿スコアに基づいてランダムに群に分けた。実験開始時に、各群はマウス15匹からなり、その73%が>300mg/dlの蛋白尿レベルを示した(なお、上記実施例1に記載した実験の開始時に蛋白尿>300mg/dlのマウスは32%に過ぎず、本実施例のほうが重度の疾患状態である。)。対照Ab、非消失性CD4抗体(抗CD4)、MMF(CellCept(登録商標))、又は非消失性抗CD4とMMFの併用剤をマウスに2カ月間連続投与した。蛋白尿(検尿は上記実施例1に記載したように実施した)、疾患進行、及び生存率の変化についてマウスをモニターした。非消失性CD4抗体(YTS177)は5mg/kgを週3回腹腔内(IP)注射により投与した。MMFは(単独又はCD4抗体と併用して)25mg/kgを毎日又は50mg/kgを毎日IP投与した。
重度疾患状態で投与を開始した本実験では、CD4抗体又はMMFを個々に投与した場合には重度蛋白尿を有意に改善するには不十分であった(一部のマウスでは改善するが、その数は有意とみなすには不十分である)。しかし、両剤を併用すると相乗作用を生じて有意効果を示し、図17に示すように、CD4抗体をMMFと併用投与した場合には、蛋白尿改善能に相乗効果が認められた。図17Aは投与後指定時点における蛋白尿300mg/dl未満のマウスの百分率を示す。CD4抗体をMMF(CellCept(登録商標))と併用投与した結果、蛋白尿>300mg/dlを示すマウスは最終的に減少し、ごく後期疾患でネフローゼ症状の改善を示したが、対照抗体投与群又はCD4抗体もしくはMMFを個々に投与した群ではこのような結果は認められなかった。図17Bは投与から1カ月後に蛋白尿300mg/dlから改善したマウスの百分率を示す。
図18に示すように、非消失性CD4抗体をMMFと併用投与すると、どちらの用量のMMF(図18A及び18Bでは50mg/kg/日、図18C及び18Dでは25mg/kg/日)でも進行までの時間が延び(図18A及び18C)、生存率が上昇した(図18B及び18D)。非消失性CD4抗体とMMFの併用は非消失性CD4抗体又はMMF単独よりも有効であった。図18A〜18Dでは、参照対照(対照抗体投与群)を太字で示し、参照対照に対して統計的有意性に達する群のp値のみをグラフに示す。
CD4抗体とMMFの併用投与は蛋白尿の低減にも有効である。図19は対照抗体投与群を参照対照群としてダネット法を使用した投与2カ月の蛋白尿の多重比較分析を示す。MMF 50mg/kgを毎日単独又はCD4抗体と併用投与した群の結果を図19Aに示し、MMF 25mg/kgを毎日単独又はCD4抗体と併用投与した群の結果を図19Bに示す。参照対照(対照抗体投与群)を太字で示し、参照対照に対して統計的有意性に達する群のp値のみをグラフに示す。この結果、CD4抗体とMMFを併用すると、このモデルで蛋白尿を低減するのに有意効果があったが、対照抗体、抗CD4単独又はMMF単独の投与では蛋白尿の統計的に有意な低減を示さなかった。
非消失性CD4抗体とMMFの併用剤を投与すると、脾臓に存在するCD4+T細胞数が減少した。図20Cに示すように、併用剤を2カ月間投与した動物では対照抗体を投与した動物に比較して脾CD4+T細胞数が減少した(p=0.002)。併用剤投与の効果は下流でも観察され、例えばB細胞及び樹状細胞集団でも観察された。例えば、図20Dに示すように、CD4抗体とMMFの併用剤を投与すると、脾臓に存在するB2B細胞数が減少した(対照抗体を投与した動物に対してp=0.017)。血中合計CD4+T細胞及びB2B細胞数(夫々図20A及び20B)から明らかなように脾CD4+T細胞及びB2B細胞の減少は抗体による細胞消失に起因するものではなかった。実際に、夫々50mg/kg MMFをCD4抗体と併用投与した群及び25mg/kg MMFを投与した群では血中CD4+T細胞及びB2B細胞数の増加が認められた(但し、これらの増加は統計的に有意とは言えない)。CD4+T細胞及びB2B細胞数は各種細胞集団を同定するための抗体を使用して基本的に上記のようにフローサイトメトリーにより測定し、(合計リンパ球の)各集団の百分率に合計リンパ球数を乗じた値を使用して各集団数を決定した。B220(CD45)とCD38に対する陽性染色によりB2細胞(大半のB細胞)を同定した。抗B220/CD45と抗CD38はBD Pharmingenから入手した。
図20Eに示すように、非消失性CD4抗体とMMFの併用剤を投与すると、IgM+形質細胞数も減少した。IgM+形質細胞数は基本的に上記のようにフローサイトメトリーにより測定した。シンデカン−1の発現により形質細胞を同定し、その表面にIgMも発現するシンデカン−1陽性細胞をIgM形質細胞とした。シンデカン−1とIgMに対する抗体はBD Pharmingenから入手した。対照抗体投与群を参照対照群(太字で示す)としてダネット法を使用して比較を実施し、参照対照に対して統計的有意性に達する群のp値のみをグラフに示す。
同様に、図20Fに示すように、CD4抗体とMMFの併用剤を投与すると、アイソタイプ転換形質細胞数も減少した。アイソタイプ転換形質細胞数は基本的に上記のようにフローサイトメトリーにより測定した。シンデカン−1の発現により形質細胞を同定し、IgM発現に陰性のシンデカン−1陽性抗体を(IgM以外のアイソタイプ、例えばIgG、IgE等を発現する)アイソタイプ転換形質細胞とした。シンデカン−1とIgMに対する抗体はBD Pharmingenから入手した。対照抗体投与群を参照対照群(太字で示す)としてダネット法を使用して比較を実施し、参照対照に対して統計的有意性に達する群のp値のみをグラフに示す。
図20Gに示すように、併用剤を投与すると、胚中心B細胞数も減少した。胚中心B細胞数は基本的に上記のようにフローサイトメトリーにより測定した。胚中心B細胞はB220に陽性でCD38表面発現に陰性の細胞として同定した(B220とCD38を同時発現するB2細胞から区別する)。抗B220/CD45及び抗CD38はBD Pharmingenから入手した。対照抗体投与群を参照対照群(太字で示す)としてダネット法を使用して比較を実施し、参照対照に対して統計的有意性に達する群のp値のみをグラフに示す。
形質細胞様樹状細胞は多量のタイプIインターフェロン(α及びβインターフェロン)を分泌することから潜在的に重要なループス誘発因子である。従って、図20Hに示すように、CD4抗体を単独又はMMFと併用投与すると、脾臓形質細胞様樹状細胞数が減少したことは注目に値する。形質細胞様樹状細胞数は基本的に上記のようにフローサイトメトリーにより測定した。夫々マーカーCD19及びCD3を使用してB細胞とT細胞を排除し、残りの細胞のうちでその固有のpDCA発現とB220のその中間発現に基づいて形質細胞様樹状細胞を同定した。抗pDCAはMiltenyiから入手したが、それ以外の抗体はBD Pharmingenから入手した。対照抗体投与群を参照対照群(太字で示す)としてダネット法を使用して比較を実施し、参照対照に対して統計的有意性に達する群のp値のみをグラフに示す。
更に、図20Iに示すように、抗体を(単独又はMMFと併用)投与すると、これらの樹状細胞におけるMHCクラスIIの発現レベルも低下した。形質細胞様樹状細胞数はpDCAに対する抗体(Miltenyi)を使用して基本的に上記のようにフローサイトメトリーにより測定し、IAd及びIEdMHCII分子の共通エピトープに対する抗体(BD Pharmingen)を使用してそのMHCIIレベルを評価した。対照抗体投与群を参照対照群(太字で示す)としてダネット法を使用して比較を実施し、参照対照に対して統計的有意性に達する群のp値のみをグラフに示す。MHCIIレベルは一般にこれらの樹状細胞の活性化状態に関連しており、レベルの増加は活性化状態の増加に相当するので、この知見からCD4抗体投与によりこの樹状細胞集団の活性化状態を低下できると考えられる。
以上をまとめると、例えばMMFとの併用による非消失性CD4抗体の投与は疾患後期に導入した場合でもNZBxW F1マウスで有効であった。併用投与により無疾患進行期間と生存期間が延び、脾CD4+T細胞数が減少した。更に、非消失性CD4抗体をMMFと併用すると、SLEのNZB/W F1モデルにおける
蛋白尿の改善にMMF単独よりも有意効果があった。非消失性CD4抗体は単独で大半のB細胞(B2細胞)に有意影響を与えずに胚中心B細胞とアイソタイプ転換形質細胞の数を選択的に減らすこともできた。更に、抗CD4はタイプIインターフェロンとIFN−α及びβの産生によりSLEの病因に結び付けられている細胞である形質細胞様樹状細胞数を減らすこともできた。
蛋白尿の改善にMMF単独よりも有意効果があった。非消失性CD4抗体は単独で大半のB細胞(B2細胞)に有意影響を与えずに胚中心B細胞とアイソタイプ転換形質細胞の数を選択的に減らすこともできた。更に、抗CD4はタイプIインターフェロンとIFN−α及びβの産生によりSLEの病因に結び付けられている細胞である形質細胞様樹状細胞数を減らすこともできた。
以上、明確に理解できるように本発明を多少詳細に記載したが、本発明の真の範囲を逸脱することなく形態や細部に種々の変更が可能であることは以上の開示から当業者に自明である。例えば、上記全技術及び組成物は種々に組合せて使用することができる。本明細書に引用した全刊行物、特許、特許出願、及び/又は他の文献は言及によりその開示内容全体を全目的で組込み、各刊行物、特許、特許出願、及び/又は他の文献を言及により全目的で組込むと個々に記載しているものとみなす。
Claims (40)
- 哺乳動物対象におけるループスの治療方法であって、非消失性CD4抗体と、シクロホスファミド、ミコフェノール酸モフェチル、及びCTLA4−Igから構成される群から選択される少なくとも第2の化合物の併用剤の治療有効量を対象に投与することを含む前記方法。
- 対象がヒトである請求項1に記載の方法。
- 第2の化合物がシクロホスファミドである請求項1に記載の方法。
- 抗体が配列番号27のアミノ酸配列をもつCDRを含む請求項1に記載の方法。
- 抗体が配列番号30のアミノ酸配列をもつCDRを含む請求項1に記載の方法。
- 抗体が配列番号25、配列番号26、及び配列番号27のアミノ酸配列をもつCDRを含む請求項1に記載の方法。
- 抗体が配列番号28、配列番号29、及び配列番号30のアミノ酸配列をもつCDRを含む請求項1に記載の方法。
- 抗体が配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、及び配列番号30のアミノ酸配列をもつCDRを含む請求項1に記載の方法。
- 抗体が配列番号3に記載の軽鎖アミノ酸配列と配列番号6に記載の重鎖アミノ酸配列、配列番号9に記載の軽鎖アミノ酸配列と配列番号12に記載の重鎖アミノ酸配列、配列番号15に記載の軽鎖アミノ酸配列と配列番号18に記載の重鎖アミノ酸配列、又は配列番号21に記載の軽鎖アミノ酸配列と配列番号24に記載の重鎖アミノ酸配列を含む請求項1に記載の方法。
- 対象がヒトであり、第2の化合物がシクロホスファミドである請求項9に記載の方法。
- ループスがループス腎炎である請求項10に記載の方法。
- ループスがクラスIIループス腎炎、クラスIIIループス腎炎、クラスIVループス腎炎、又はクラスVループス腎炎である請求項11に記載の方法。
- 併用剤の投与開始後に、対象が蛋白尿の低減及び/又は活性尿沈渣の低減を示す請求項11に記載の方法。
- 抗体が配列番号3に記載の軽鎖アミノ酸配列と配列番号6に記載の重鎖アミノ酸配列、配列番号9に記載の軽鎖アミノ酸配列と配列番号12に記載の重鎖アミノ酸配列、配列番号15に記載の軽鎖アミノ酸配列と配列番号18に記載の重鎖アミノ酸配列、又は配列番号21に記載の軽鎖アミノ酸配列と配列番号24に記載の重鎖アミノ酸配列を含む抗体のCD4結合フラグメントを含む請求項1に記載の方法。
- 抗体が配列番号3に記載の軽鎖アミノ酸配列と配列番号6に記載の重鎖アミノ酸配列を含む抗体、配列番号9に記載の軽鎖アミノ酸配列と配列番号12に記載の重鎖アミノ酸配列を含む抗体、配列番号15に記載の軽鎖アミノ酸配列と配列番号18に記載の重鎖アミノ酸配列を含む抗体、及び配列番号21に記載の軽鎖アミノ酸配列と配列番号24に記載の重鎖アミノ酸配列を含む抗体から構成される群から選択される抗体と同一のエピトープと結合するCD4抗体である請求項1に記載の方法。
- 抗体がヒト化抗体である請求項1に記載の方法。
- 抗体が非グリコシル化Fc部分をもつ請求項1に記載の方法。
- 抗体がFc受容体と結合しない請求項1に記載の方法。
- 抗体がFc領域の270位、322位、326位、327位、329位、313位、333位、及び/又は334位のアミノ酸位置の1個以上にC1q結合及び/又は補体依存性細胞傷害性を改変するアミノ酸置換を含む請求項1に記載の方法。
- 抗体がサルベージ受容体結合エピトープを含む請求項1に記載の方法。
- 抗体が血清アルブミン結合ペプチドを含む請求項1に記載の方法。
- 抗体が3個以上の抗原結合部位を含む請求項1に記載の方法。
- ループスが全身性エリテマトーデスである請求項1に記載の方法。
- ループスが皮膚エリテマトーデスである請求項1に記載の方法。
- ループスがループス腎炎である請求項1に記載の方法。
- ループスがクラスIIループス腎炎、クラスIIIループス腎炎、クラスIVループス腎炎、又はクラスVループス腎炎である請求項25に記載の方法。
- 併用剤の投与開始後に、対象が蛋白尿の低減及び/又は活性尿沈渣の低減を示す請求項25に記載の方法。
- 併用剤の投与開始前に対象が蛋白尿を示し、前記蛋白尿が投与により改善される請求項1に記載の方法。
- 併用剤の投与開始後にループスが改善され、方法が改善の観察後に、対象への併用剤の投与を中断し、治療有効量の非消失性CD4抗体を対象に投与することを含む請求項1に記載の方法。
- 併用剤の投与開始後にループスが改善され、方法が改善の観察後に、対象への併用剤の投与を中断し、治療有効量の第2の化合物又は1種以上の他の化合物を対象に投与することを含む請求項1に記載の方法。
- 哺乳動物対象におけるループス腎炎の治療方法であって、治療有効量の非消失性CD4抗体を対象に投与することを含み、抗体の投与開始後に対象が腎機能の改善、蛋白尿の低減、及び/又は活性尿沈渣の低減を示す前記方法。
- 対象がヒトである請求項31に記載の方法。
- 抗体の投与開始前に、対象が>500mg/日、>1000mg/日、>2000mg/日、又は>3500mg/日の蛋白尿を示し、前記蛋白尿が抗体の投与開始後に低減する請求項32に記載の方法。
- 抗体が、
a)配列番号3に記載の軽鎖アミノ酸配列と配列番号6に記載の重鎖アミノ酸配列を含む抗体;
b)配列番号9に記載の軽鎖アミノ酸配列と配列番号12に記載の重鎖アミノ酸配列を含む抗体;
c)配列番号15に記載の軽鎖アミノ酸配列と配列番号18に記載の重鎖アミノ酸配列を含む抗体;
d)配列番号21に記載の軽鎖アミノ酸配列と配列番号24に記載の重鎖アミノ酸配列を含む抗体;
e)a)、b)、c)、又はd)の抗体のCD4結合フラグメントを含む抗体;
f)配列番号27のアミノ酸配列をもつCDRを含む抗体;
g)配列番号30のアミノ酸配列をもつCDRを含む抗体;
h)配列番号25、配列番号26、及び配列番号27のアミノ酸配列をもつCDRを含む抗体;
i)配列番号28、配列番号29、及び配列番号30のアミノ酸配列をもつCDRを含む抗体;並びに
j)配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、及び配列番号30のアミノ酸配列をもつCDRを含む抗体から構成される群から選択される請求項31に記載の方法。 - 抗体が配列番号3に記載の軽鎖アミノ酸配列と配列番号6に記載の重鎖アミノ酸配列を含む抗体、配列番号9に記載の軽鎖アミノ酸配列と配列番号12に記載の重鎖アミノ酸配列を含む抗体、配列番号15に記載の軽鎖アミノ酸配列と配列番号18に記載の重鎖アミノ酸配列を含む抗体、及び配列番号21に記載の軽鎖アミノ酸配列と配列番号24に記載の重鎖アミノ酸配列を含む抗体から構成される群から選択される抗体と同一のエピトープと結合するCD4抗体である請求項31に記載の方法。
- ループスがクラスIIループス腎炎、クラスIIIループス腎炎、クラスIVループス腎炎、又はクラスVループス腎炎である請求項31に記載の方法。
- 哺乳動物対象における疾患の治療方法であって、非消失性CD4抗体と、シクロホスファミド、ミコフェノール酸モフェチル、及びCTLA4−Igから構成される群から選択される少なくとも第2の化合物の併用剤の治療有効量を対象に投与することを含み;
疾患が関節リウマチ、喘息、乾癬、移植拒絶反応、移植片対宿主病、多発性硬化症、クローン病、潰瘍性大腸炎、及びシェーグレン症候群から構成される群から選択される前記方法。 - 疾患が関節リウマチ、喘息、乾癬、移植拒絶反応、及び移植片対宿主病から構成される群から選択される請求項37に記載の方法。
- 対象がヒトである請求項37に記載の方法。
- 抗体が、
a)配列番号3に記載の軽鎖アミノ酸配列と配列番号6に記載の重鎖アミノ酸配列を含む抗体;
b)配列番号9に記載の軽鎖アミノ酸配列と配列番号12に記載の重鎖アミノ酸配列を含む抗体;
c)配列番号15に記載の軽鎖アミノ酸配列と配列番号18に記載の重鎖アミノ酸配列を含む抗体;
d)配列番号21に記載の軽鎖アミノ酸配列と配列番号24に記載の重鎖アミノ酸配列を含む抗体;
e)a)、b)、c)、又はd)の抗体のCD4結合フラグメントを含む抗体;
f)配列番号27のアミノ酸配列をもつCDRを含む抗体;
g)配列番号30のアミノ酸配列をもつCDRを含む抗体;
h)配列番号25、配列番号26、及び配列番号27のアミノ酸配列をもつCDRを含む抗体;
i)配列番号28、配列番号29、及び配列番号30のアミノ酸配列をもつCDRを含む抗体;並びに
j)配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、及び配列番号30のアミノ酸配列をもつCDRを含む抗体から構成される群から選択される請求項37に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US78353506P | 2006-03-16 | 2006-03-16 | |
US87388106P | 2006-12-07 | 2006-12-07 | |
PCT/US2007/006443 WO2007109052A2 (en) | 2006-03-16 | 2007-03-14 | Methods of treating lupus using cd4 antibodies |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2009530290A true JP2009530290A (ja) | 2009-08-27 |
Family
ID=38522934
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2009500460A Pending JP2009530290A (ja) | 2006-03-16 | 2007-03-14 | Cd4抗体を使用するループスの治療方法 |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20070218062A1 (ja) |
EP (1) | EP2001510A4 (ja) |
JP (1) | JP2009530290A (ja) |
KR (1) | KR20080112300A (ja) |
AU (1) | AU2007227609A1 (ja) |
BR (1) | BRPI0708902A2 (ja) |
CA (1) | CA2645322A1 (ja) |
IL (1) | IL193920A0 (ja) |
MX (1) | MX2008011785A (ja) |
NO (1) | NO20084317L (ja) |
RU (1) | RU2008137765A (ja) |
WO (1) | WO2007109052A2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2013521303A (ja) * | 2010-03-03 | 2013-06-10 | テバ ファーマシューティカル インダストリーズ リミティド | ラキニモドを使用したループス腎炎の治療 |
Families Citing this family (26)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101815786A (zh) * | 2007-10-12 | 2010-08-25 | 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 | 来自多个核酸的蛋白质表达 |
SG190627A1 (en) * | 2008-03-13 | 2013-06-28 | Biotest Ag | Agent for treating disease |
MX2010010026A (es) | 2008-03-13 | 2011-03-21 | Biotest Ag | Agente para tratar enfermedad. |
WO2009121690A1 (en) * | 2008-03-13 | 2009-10-08 | Biotest Ag | Agent for treating disease |
TW201016233A (en) * | 2008-07-15 | 2010-05-01 | Genentech Inc | Methods of treating autoimmune diseases using CD4 antibodies |
WO2010036706A1 (en) * | 2008-09-23 | 2010-04-01 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Recombination sequence (rs) rearrangement frequency as a measure of central b cell tolerance |
SG194362A1 (en) * | 2008-09-29 | 2013-11-29 | Biotest Ag | Composition for treating disease |
NO2344540T3 (ja) | 2008-10-02 | 2018-04-28 | ||
KR20190025057A (ko) * | 2008-10-14 | 2019-03-08 | 제넨테크, 인크. | 이뮤노글로불린 변이체 및 그의 용도 |
RU2016131167A (ru) | 2009-10-07 | 2018-12-07 | Дженентек, Инк. | Способы лечения, диагностики и мониторинга волчанки |
GB0920944D0 (en) | 2009-11-30 | 2010-01-13 | Biotest Ag | Agents for treating disease |
DE102011082871A1 (de) * | 2011-09-16 | 2013-03-21 | Florian, Prof. Dr. Lang | Therapeutische und diagnostische Targets für Autoimmunität, inflammatorische Prozesse und/oder immuner Pathogenese und/oder von Erkrankungen, welche auf Autoimmunität, inflammatorische Prozessen und/oder immuner Pathogenese beruhen |
CN104093310A (zh) | 2012-02-03 | 2014-10-08 | 泰华制药工业有限公司 | 拉喹莫德用于治疗一线抗TNFα疗法失败的克罗恩氏病患者的用途 |
CA2890194A1 (en) | 2012-11-07 | 2014-05-15 | Teva Pharmaceutical Industries Ltd. | Amine salts of laquinimod |
WO2014153145A2 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-25 | Teva Pharmaceutical Industries Ltd. | Crystals of laquinimod sodium and improved process for the manufacture thereof |
CA2935046C (en) | 2013-12-27 | 2021-04-13 | Osaka University | Vaccine targeting il-17a |
CN108291909B (zh) * | 2015-04-28 | 2022-07-12 | 森佐健康有限公司 | 分析物检测及其方法 |
KR20190120987A (ko) * | 2018-04-17 | 2019-10-25 | 국립암센터 | 고갈성 항 cd4 단일클론항체를 포함하는 항암 t 세포치료제 보조용 조성물 및 이의 용도 |
TW202321457A (zh) | 2021-08-04 | 2023-06-01 | 美商薩那生物科技公司 | 靶向cd4之病毒載體之用途 |
WO2023114949A1 (en) | 2021-12-16 | 2023-06-22 | Sana Biotechnology, Inc. | Methods and systems of particle production |
WO2023133595A2 (en) | 2022-01-10 | 2023-07-13 | Sana Biotechnology, Inc. | Methods of ex vivo dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses |
WO2023150647A1 (en) | 2022-02-02 | 2023-08-10 | Sana Biotechnology, Inc. | Methods of repeat dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses |
WO2023193015A1 (en) | 2022-04-01 | 2023-10-05 | Sana Biotechnology, Inc. | Cytokine receptor agonist and viral vector combination therapies |
WO2024026377A1 (en) | 2022-07-27 | 2024-02-01 | Sana Biotechnology, Inc. | Methods of transduction using a viral vector and inhibitors of antiviral restriction factors |
WO2024044655A1 (en) | 2022-08-24 | 2024-02-29 | Sana Biotechnology, Inc. | Delivery of heterologous proteins |
WO2024064838A1 (en) | 2022-09-21 | 2024-03-28 | Sana Biotechnology, Inc. | Lipid particles comprising variant paramyxovirus attachment glycoproteins and uses thereof |
Family Cites Families (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US77275A (en) * | 1868-04-28 | Improvement in tee manufacture of packing foe steam-engines | ||
US4381295A (en) * | 1979-04-26 | 1983-04-26 | Ortho Pharmaceutical Corporation | Monoclonal antibody to human helper T cells and methods of preparing same |
US4690905A (en) * | 1983-11-16 | 1987-09-01 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University, A Division Of Yeshiva University | Method for removal of human antibodies to native DNA from serum |
US4695459A (en) * | 1984-12-26 | 1987-09-22 | The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University | Method of treating autoimmune diseases that are mediated by Leu3/CD4 phenotype T cells |
US6685941B1 (en) * | 1988-11-23 | 2004-02-03 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods of treating autoimmune disease via CTLA-4Ig |
US5690933A (en) * | 1989-05-31 | 1997-11-25 | Glaxo Wellcome Inc. | Monoclonal antibodies for inducing tolerance |
GB9100741D0 (en) * | 1991-01-14 | 1991-02-27 | Univ London | Treatment of disease |
IE922437A1 (en) * | 1991-07-25 | 1993-01-27 | Idec Pharma Corp | Recombinant antibodies for human therapy |
US6136310A (en) * | 1991-07-25 | 2000-10-24 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Recombinant anti-CD4 antibodies for human therapy |
US5756096A (en) * | 1991-07-25 | 1998-05-26 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Recombinant antibodies for human therapy |
MX9305070A (es) * | 1992-08-21 | 1994-04-29 | Genentech Inc | Compocicion farmaceutica que contiene un antagonista de lfa-1 para el tratamiento de transtornos o desordenes mediados por el lfa-1 |
AU5605398A (en) * | 1996-12-11 | 1998-07-03 | University Of Florida | Novel methods and compositions for treatment of autoimmune diseases |
GB2376466A (en) * | 2001-06-14 | 2002-12-18 | Mark Frewin | TRX1 antibody |
US7541443B2 (en) * | 2001-06-14 | 2009-06-02 | Tolerrx, Inc. | Anti-CD4 antibodies |
US20060051345A1 (en) * | 2004-06-04 | 2006-03-09 | Genentech, Inc. | Method for treating multiple sclerosis |
AR049292A1 (es) * | 2004-06-04 | 2006-07-12 | Genentech Inc | Metodo para tratar lupus con un anticuerpo cd20 |
RU2007102055A (ru) * | 2004-06-22 | 2008-07-27 | Толерркс, Инк. (Us) | Оптимизированное введение доз анти-cd4-антител для индукции толерантности у приматов |
-
2007
- 2007-03-14 CA CA002645322A patent/CA2645322A1/en not_active Abandoned
- 2007-03-14 EP EP07753094A patent/EP2001510A4/en not_active Withdrawn
- 2007-03-14 JP JP2009500460A patent/JP2009530290A/ja active Pending
- 2007-03-14 MX MX2008011785A patent/MX2008011785A/es not_active Application Discontinuation
- 2007-03-14 AU AU2007227609A patent/AU2007227609A1/en not_active Abandoned
- 2007-03-14 US US11/724,595 patent/US20070218062A1/en not_active Abandoned
- 2007-03-14 WO PCT/US2007/006443 patent/WO2007109052A2/en active Application Filing
- 2007-03-14 BR BRPI0708902-3A patent/BRPI0708902A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2007-03-14 KR KR1020087025147A patent/KR20080112300A/ko not_active Application Discontinuation
- 2007-03-14 RU RU2008137765/14A patent/RU2008137765A/ru unknown
-
2008
- 2008-09-04 IL IL193920A patent/IL193920A0/en unknown
- 2008-10-15 NO NO20084317A patent/NO20084317L/no not_active Application Discontinuation
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2013521303A (ja) * | 2010-03-03 | 2013-06-10 | テバ ファーマシューティカル インダストリーズ リミティド | ラキニモドを使用したループス腎炎の治療 |
JP2016128464A (ja) * | 2010-03-03 | 2016-07-14 | テバ ファーマシューティカル インダストリーズ リミティド | ラキニモドを使用したループス腎炎の治療 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2001510A4 (en) | 2010-06-09 |
MX2008011785A (es) | 2008-09-25 |
US20070218062A1 (en) | 2007-09-20 |
RU2008137765A (ru) | 2010-04-27 |
BRPI0708902A2 (pt) | 2011-06-14 |
WO2007109052A2 (en) | 2007-09-27 |
AU2007227609A1 (en) | 2007-09-27 |
NO20084317L (no) | 2008-12-09 |
WO2007109052A3 (en) | 2008-12-11 |
IL193920A0 (en) | 2011-08-01 |
KR20080112300A (ko) | 2008-12-24 |
EP2001510A2 (en) | 2008-12-17 |
CA2645322A1 (en) | 2007-09-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2009530290A (ja) | Cd4抗体を使用するループスの治療方法 | |
US20220363772A1 (en) | Methods for treating progressive multiple sclerosis | |
RU2411956C2 (ru) | Способ лечения васкулита | |
US20060051345A1 (en) | Method for treating multiple sclerosis | |
US20070014797A1 (en) | Method for treating Sjogren's syndrome | |
JP2007536246A (ja) | 自己免疫疾患の予防法 | |
JP6963509B2 (ja) | 自己免疫障害及び同種免疫障害の処置方法 | |
EP2536430B1 (en) | Compositions and methods for targeting type 1 interferon producing cells | |
US20080279848A1 (en) | Methods of treating lupus using CD4 antibodies | |
JP2022506430A (ja) | Cd20に特異的に結合するモノクローナル抗体 | |
EA044757B1 (ru) | Моноклональное антитело, которое специфически связывается с cd20 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
RD13 | Notification of appointment of power of sub attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7433 Effective date: 20090610 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090626 |
|
RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20091005 |
|
RD14 | Notification of resignation of power of sub attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7434 Effective date: 20091005 |