KR100918540B1 - 항-ｃｄ４０ 모노클로날 항체 - Google Patents

항-ｃｄ４０ 모노클로날 항체

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Abstract

본 발명은 CD40에 대해 아고니스트 작용 또는 길항 작용을 하는 항체 또는 그의 기능적 단편에 관한 것이다.

Description

항-ＣＤ４０ 모노클로날 항체 {Anti-CD40 Monoclonal Antibody}
본 발명은 인간의 B-세포, 수상돌기 세포 (DC) 등의 표면에 존재하는 인간 CD40 항원을 인식하는 항체 또는 그의 기능적 단편에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 수상돌기 세포 (DC) 표면의 인간 CD40 항원에 대하여 실질적으로 길항 작용을 하는 항-인간 CD40 항체 또는 그의 기능적 단편 및 종래의 항-인간 CD40 항체에 비해 치료 효과가 더욱 높을 것이라고 기대되는 항-인간 CD40 아고니스트 항체 또는 그의 기능적 단편에 관한 것이다.
1. CD40
CD40은 세포막 표면에 존재하는 분자량 50 kDa의 항원이며, B-세포, 수상돌기 세포 (DC), 특정 유형의 암세포 및 흉선 상피 세포에서 발현된다. CD40은 B-세포나 DC의 증식과 분화에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. CD40은 인간의 B-세포 표면에서 발현되는 항원으로서 확인된 바 있으며 ([E. A. Clark et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4494, 1986], [I. Stamenkovic et. al., EMBO J. 8:1403, 1989]), 아미노산 서열 상동성을 기초로 할 때, CD40은 저친화성 NGF 수용체, TNF 수용체, CD27, OX40, CD30 등이 속해 있는 TNF 수용체 족의 구성원 중 하나라고 여겨지고 있다. 인간 및 마우스의 CD40에 대한 리간드 (CD40L)가 최근에 클로닝되어, 이것이 제II형 막 단백질이며 활성화된 CD4+ T-세포에서 발현된다는 것이 밝혀졌다. CD40L은 인간 및 마우스의 B-세포에 강력한 활성화 신호를 도입한다는 것이 밝혀진 바 있다.
또한, 수상돌기 세포에서는 B-세포에서보다 CD40이 더 높은 빈도로 발현된다는 것이 확인되었고, 이들이 중요한 역할을 담당하고 있음이 명백해졌다. CD40과 CD40L의 결합은 항원 제시 세포 (APC)를 활성화시키는데, 구체적으로는 CD80 (B7-1)이나 CD86 (B7-2) 등과 같은 보조 자극 분자의 발현 또는 IL-12의 생산을 증대시킨다 ([Caux, C., et al.:Activation of human dendritic cells through CD40 cross-linking. J. Exp. Med., 180:1263, 1994], [Shu, U., et al.:Activated T cells induce interleukin-12 production by monocyte via CD40-CD40 ligand interaction. Eur. J. Immunol., 25:1125, 1995]). 수상돌기 세포는 강력한 항원 제시능을 가지며, 강력한 헬퍼 T (Th) 세포-활성화능을 가지고 있다. 추가로, 수상돌기 세포는 천연 (naive) Th 세포의 Th1 또는 Th2 세포로의 분화를 제어한다고 여겨지고 있다. 골수성 수상돌기 세포인 말초혈 단구를 GM-CSF 및 IL-4의 존재하에서 CD40L과 함께 배양하여 성숙시킨 수상돌기 세포 (DC1)는 시험관내에서 IL-12를 생산할 수 있고, 이계(異系) 천연 Th 세포를 자극 및 활성화시키기 때문에, IFN γ를 생산하는 T-세포를 유도한다 (즉, Th1로의 분화를 촉진함). 이 작용은 항-IL-12 항체에 의해 저해되기 때문에 IL-12에 의해 매개되는 반응이라고 여겨진다. 한편, 림프 조직 T 영역이나 말초혈에 존재하는 플라스마사이토이드 (plasmacytoid) T-세포를 IL-3 및 CD40 리간드와 함께 배양하여 수득한 림프구계 수상돌기 세포 (DC2)는 IL-12를 생산할 수는 없지만, 이계 천연 Th 세포를 자극 및 활성화시켜 IL-4를 생산하는 T-세포를 유도하고 이로 인해 Th2로의 분화를 촉진한다고 교시되어 있다. Th1 세포는 세포성 면역의 활성화에 관여하고, Th2 세포는 체액성 면역능을 증대시키는 동시에 세포성 면역능을 억제하는데 관여한다고 여겨진다. Th1 세포의 도움으로 활성화된 세포독성 T-세포 (CTL)는 세포질 내에서 증식하는 병원체 (많은 바이러스, 리스테리아균 (Listeria monocytogenes), 결핵균 및 톡소플라즈마 원충 등)나 종양 세포를 제거할 수 있다.
막 표면에 발현된 CD40을 인식하는 항-CD40 모노클로날 항체가 B-세포에 대하여 여러가지 생물학적 활성을 발휘함이 교시된 바 있다. 항-CD40 모노클로날 항체는 CD40과 CD40L의 상호작용에 대한 아고니스트 항체 및 길항 항체로 크게 분류된다.
2. 아고니스트 항체
아고니스트 항체의 작용으로는 B-세포의 활성화가 알려져 있다. 예를 들어 항-CD40 항체는 세포 접착을 유도하고 ([Barrett et al., J. Immunol. 146:1722, 1991], [Gordon et al., J. Immunol. 140:1425, 1988]), 세포의 크기를 증대시키며 ([Gordon et al., J. Immunol. 140:1425, 1988], [Valle et al., Eur. J. Immunol. 19:1463, 1989]), 항-IgM 항체, 항-CD20 항체 또는 포볼 에스테르를 사용할 경우라면 활성화된 B-세포의 분열을 유도하고 ([Clark and Ledbetter, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4494, 1986], [Gordon et al., LEUCOCYTE TYPING III. A. J. McMicheal ed. Oxford University Press. Oxford, p.426], [Paulie et al., J. Immunol. 142:590, 1989]), IL-4 존재하에서 B-세포의 분열을 유도하며 ([Valle et. al., Eur. J. Immunol. 19:1463, 1989], [Gordon et al., Eur. J. Immunol. 17:1535, 1987]), IL-4로 자극하고 T-세포는 없이 배양한 세포의 IgE ([Jabara et al., J. Exp. Med. 172:1861, 1990], [Gascan et al., J. Immunol. 147:8, 1991]), IgG 및 IgM [Gascan et al., J. Immunol. 147:8, 1991]의 발현을 유도하고, IL-4에 의한 B-세포로부터의 가용성 CD23/FcεRII의 분비 ([Gordon and Guy, Immunol. Today 8:339, 1987], [Cairns et al., Eur. J. Immunol. 18:349, 1988])와 세포 상의 발현을 증대시키며 [Challa A, Allergy, 54:576, 1999], IL-6의 생산을 촉진한다 [Clark and Shu, J. Immunol. 145:1400, 1990]고 보고되어 있다. 추가로, CDw32+ 접착 세포의 존재하에 IL-4 및 항-CD40 항체를 첨가함으로써 인간 초대(初代) 배양 B-세포로부터 B-세포 클론을 수립하는 방법 [Bancherau et al., Science 241:70, 1991]이나, 배중심 (胚中心)의 중심 세포의 아팝토시스 (apotosis)가 항원 수용체의 기능에 무관하게 CD40을 통해 저해된다 [Liu et al., Nature 342:929, 1989]고 보고되어 있다. 이상과 같이 CD40이 인간 B-세포 표면에 발현되는 항원으로서 확인되었기 때문에, 단리된 항체의 대부분은 주로 인간 B-세포의 증식과 분화 유도 기능 및 암세포에서의 세포 사멸 유도 활성을 지표로 하여 평가되어 왔다 ([Katira, A. et. al., LEUKOCYTE TYPING V. S. F. Schlossossman, et. al. eds. p.547. Oxford University Press. Oxford], [W. C. Flansow et. al., LEUKOCYTE TYPING V. S. F. Schlossossman, et. al. eds. p.555. Oxford University Press. Oxford], [J. D. Pound et. al., International Immunology, 11:11, 1999]).
항-CD40 항체가 DC를 성숙시킨다는 것이 밝혀졌다 [Z. H. Zhou et. al., Hybridoma, 18:471 1999]. 또한, 항원 특이적 CD8T-세포 프라이밍에서 CD4T-세포의 역할은 CD40-CD40L 신호전달을 통한 DC의 활성화임이 보고되었고, 수상돌기 세포 (DC)의 활성화에서 항-CD40 모노클로날 항체 (mAb)가 CD4 헬퍼 T-세포의 역할을 대체할 수 있음이 교시되었다 [Shoenberger, S. P., et.al.:T-cell help for cytotoxic T Lymphocytes is mediated by CD40-CD40L interactions. Nature, 480, 1998]. 추가로, 마우스에 항-CD40 항체를 투여하면, CD40을 발현하는 종양 세포 뿐 아니라 이를 발현하지 않는 종양 세포로부터의 생체 방어도 가능하다고 교시되었다 [French, R. R., et.al.:CD40 antibody evokes a cytotoxic T-cell response that eradicates Lymphoma and bypasses T-cell help. Nature Medicine, 5, 1999].
지금까지 보고되었던 항체의 대부분은 DC 세포에 대한 효과를 지표로 하여 단리된 것이 아니었다. 그러나, DC 세포의 기능 변형 측면에서, B-세포에 작용하는 것으로 선별된 항체는 치료제로서 불충분할 가능성이 높다. 마우스 CD40에 대한 모노클로날 항체의 경우에는 항체가 인식하는 에피토프에 따라, DC에는 반응하지만 혈관 내피 세포에는 반응하지 않는 클론 및 이와는 반대로 DC에는 반응하지 않지만 혈관 내피 세포에는 반응하는 클론이 존재한다고 보고되어 있다 [Van Den Berg, TK, et.al., Immunology, 88:294, 1996]. 인간 CD40 항체도 DC에의 결합이나 작용이 에피토프에 따라 다를 것이라고 추측된다.
항-CD40 항체 또는 CD40 리간드에 의해 CD40을 발현하는 림프종 세포주의 증식을 억제하여 세포 사멸을 유도할 수 있음이 밝혀졌다 ([Funakoshi S et al., Blood, 83:2782, 1994], [Funakoshi S et al., Journal of Immunotherapy, 19, 93, 1996], [Z. H. Zhou et. al., Hybridoma, 18:471 1999], [Joseph A et al., Cancer Research, 60:3225, 2000]). 아고니스트 항체에 있어서 흥미로운 것은, 항체의 기능이 CD40L의 기능과 반드시 일치하지는 않는다는 점이다. B-세포를 활성화시키는 작용도 B-세포 종양의 증식을 억제하는 작용과 반드시 일치하지는 않는다. DC 활성화능과 종양 세포 증식 억제 작용을 모두 보유하는 항체의 개발이 바람직하다. 또한, 아고니스트 항체 중에는 CD40L과 CD40의 결합을 저해하는 것도 존재하고 저해하지 않는 것도 존재한다 [Challa A et al., Allergy, 54:576, 1999]. 예를 들어, G28-5 (ATCC 기탁번호: HB-9110)가 생산하는 항체는 CD40L과 경쟁하기 때문에 CD40L과의 병용 효과는 없다. CD40 발현 세포의 활성화 정도에도 항체에 따라 차이가 있다. 단독으로는 약한 아고니스트 활성을 나타내는 항체일지라도, CD40 리간드와 병용함으로써 CD40 리간드의 활성이 CD40 리간드 단독일 경우보다 항체 존재하에서 현저히 촉진될 수 있다. 반대로, 단독으로는 아고니스트 활성을 나타내는 항체일지라도, 항체 존재하에서는 CD40 리간드가 저해되어 CD40 리간드의 활성이 CD40 리간드 단독일 경우보다 저하되는 경우가 있다 [Pound et al., International Immunology, 11:11, 1999]. CD40 리간드와 경쟁하지 않는 항체는 그것 자체에 의한 종양 세포 증식 억제 작용은 약할지라도 CD40 리간드의 존재하에서는 보다 강력한 증식 억제를 할 수 있음이 교시되어 있다 [Joseph A et al., Cancer Research, 60:3225, 2000]. 따라서, CD40에 결합하여 그 자체로 세포 증식을 억제하는 항체이면서, CD40에 대한 CD40 리간드의 결합은 저해하지 않는 것과 같은 항체를 개발하는 것이 바람직하다. 이러한 특징을 활용함으로써, 가용성 CD40L보다도 효과적인 치료제를 개발할 수 있다는 가능성이 있다. 예를 들면, 가용성 CD40L은 CD40과 결합하여 활성화되는 동시에, 생체내에 존재하는 CD40L의 기능은 억제한다. CD40L과 경쟁하지 않는 항체라면 이러한 경우를 발생시키지 않으면서 상승 효과를 일으켜, 보다 좋은 치료 효과를 기대할 수 있다.
3. 길항 항체
한편, 상기와 같이 CD40은 면역 반응에서 중요한 역할을 담당하고 있기 때문에, CD40과 그의 리간드의 결합을 저해함으로써 장기 이식시의 면역억제 또는 자가면역 질환에 대한 치료제를 개발할 수 있을 것으로 기대된다. 사와다-하세 (Sawada-Hase) 등은 클론병 환자의 말초혈 단구에서는 CD40을 강하게 발현하는 세포의 비율이 증가된다고 보고하였다. 그러나, CD40과 그의 리간드의 결합을 저해하는 항체에 대해서는 아직 잘 알려져 있지 않다. 예를 들어, 이러한 결합을 저해하는 항체는 CD40의 기능 분석이나 CD40의 활성화가 필요한 질환의 치료에 효과적일 수 있다. 또한, CD40 리간드를 저해하는 항체도 CD40과 CD40 리간드의 결합이 관여하는 질환의 약제로서 효과적일 가능성이 있다고 교시되어 있다. 그러나, CD40L은 활성화된 혈소판에서 발현된다는 보고가 있기 때문에 [V. Henn et. al., Nature 391:591, 1998], 항-CD40L 항체를 치료제로서 사용한 경우에는 혈전을 야기할 위험이 있다고 보고되어 있다 [T. Kawai et. al., Nat. Medi. 6:114, 2000]. 이러한 관점에서, CD40과 그의 리간드의 결합을 저해하는 항체 치료제로서, 항-CD40L 항체보다는 오히려 CD40에 대한 항체인 것이 안전성 측면에서 더욱 우수하다고 기대할 수 있다. 항-CD40 항체는 CD40L과 CD40의 결합을 억제하면서, 항체 자체가 CD40을 활성화시키지는 않을 것이 요구된다.
인간 CD40에 특이적으로 결합하여 CD40L과 CD40의 결합을 억제하면서 CD40을 활성화시키지 않는 항체에 대하여 오랫동안 방대한 양의 연구가 수행되어 왔음에도 불구하고, 5D12로 명명된 마우스 항-인간 CD40 항체에 대한 경우만이 보고되어 있다 [J. Kwekkeboom et. al., Immunology 79:439, 1993]. 또한, B-세포에 대한 중화 활성을 나타내는 항체가 DC 세포에 대해서도 동일하게 CD40 리간드의 작용을 중화할 수 있는지의 여부는 알려져 있지 않다. 추가로, 바이오틴화된 항-마우스 CD40 항체의 작용이 아비딘과의 가교에 의해 증대된다고 보고되어 있다 [Johnson et al., Eur. J. Immunol, 24:1835, 1994]. 본 발명자들은 가용성 CD40 리간드에 유전공학적으로 미리 태그 (FLAG)를 부착시키고, 이 태그에 대한 항체 (M2)를 사용하여 B-세포주 (라모스 (Ramos) 세포)에 대한 가용성 CD40 리간드의 작용을 증대시키고 그의 중화 활성을 측정한 결과, 5D12 (ATCC 기탁번호: HB-11339)가 단지 약간의 중화 활성만을 나타낸다는 것을 확인하였다.
본 발명자들은 CD40L가 존재하지 않을 경우에도 길항 항체인 5D12가 가교에 의해 그 자체로도 아고니스트 활성을 갖는다는 것을 새롭게 발견하였다. 종래에는 마우스 CD40 항체의 작용이 바이오틴과 아비딘의 가교에 의해 증대된다고 보고된 바 있다 [Johnson et al., Eur J Immunol, 24:1835, 1994]. 또한, 플레이트에 고상화시킨 항-면역글로불린 항체를 사용하여 CD40 항체를 고상화함으로써 종양 세포의 증식 억제 활성이 증가되는 것이 알려져 있었지만, 이것은 고상화에 의한 효과라고 여겨졌다. 그러나, 배양액 중에 항-면역글로불린 항체를 첨가하여 항-CD40 항체를 가교시킬 경우에는 길항 항체일지라도 아고니스트 활성을 나타낼 가능성이 있음은 알려져 있지 않았다. 치료에 사용되는 항체에 항원성이 있는 경우에는 완전히 반대의 상황이 발생할 수 있어서, 인간의 체내에서 CD40 항체에 결합하는 항체가 생성되고 이것과 CD40 항체가 가교됨으로써 CD40 리간드와 동일한 것으로 보이는 활성을 발생시킨다. 따라서, 치료제의 안전성 관점에서 항체의 항원성을 낮은 수준으로 유지하게 하는 것이 매우 중요하다. 인간화 기술을 통해 마우스 항체의 가변 영역 서열에 기초한 치료제로서 개발한 인간화 항체는 면역원성이 있는 것으로 알려져 있기 때문에, 투여 후에 항-인간화 항-CD40 항체가 생성될 수 있어서 아고니스트 항체가 생성될 위험이 있을 수 있다. 또한, 항원성이 낮더라도 항체 수용체 (FcR)에 의해 항-CD40 항체가 가교될 가능성도 있다. 이러한 점에서, 길항 항체는 CD40에 특이적으로 결합하여 CD40L의 결합을 억제하고, 가교에 의해서도 CD40을 활성화시키지 않는 인간 항체로서 FcR에의 결합이 약한 것이 바람직하다고 여겨진다.
도 1은 KM302-1 항체에 의한 CD95 발현 촉진 결과를 나타내는 도면이다.
도 2A는 길항 항체가 라모스 세포에 대한 CD40 리간드의 기능을 중화시킨다는 것을 나타내는 도면이다.
도 2B는 길항 항체가 라모스 세포에 대한 CD40 리간드의 기능을 중화시킨다는 것을 나타내는 도면이다.
도 3은 KM281-1-10 항체가 라모스 세포에 대한 CD40 리간드의 기능을 중화시킨다는 것을 나타내는 도면이다.
도 4는 가교된 KM281-1-10 항체가 CD95 발현을 촉진시키지 않는다는 결과를 나타내는 도면이다.
도 5는 가교된 5D12항체가 CD95 발현을 촉진한다는 결과를 나타내는 도면이다.
도 6은 종양 세포에 대한 KM302-1 항체의 증식 억제 효과를 나타내는 도면이다.
도 7은 KM302-1 항체가 DC 세포의 성숙을 촉진한다는 결과를 나타내는 도면이다.
도 8은 KM302-1 항체가 DC 세포의 IL-12 생산을 촉진한다는 결과를 나타내는 도면이다.
도 9는 KM281-1-10 항체가 DC에 대한 CD40 리간드의 기능을 중화시킨다는 것을 나타내는 도면이다.
도 10은 KM281-1-10 항체가 DC에 대한 CD40 리간드의 기능을 중화시킨다는 것을 나타내는 도면이다.
도 11은 KM302-1 항체가 미성숙 DC-MLR를 활성화시킨다는 것을 나타내는 도면이다.
도 12는 KM341-1-19 항체 등이 라모스 세포의 CD95 발현을 촉진한다는 결과를 나타내는 도면이다.
도 13은 KM341-1-19 항체가 성숙 DC 세포의 IL-12 생산을 촉진한다는 결과를 나타내는 도면이다.
도 14는 KM341-1-19 항체가 성숙 DC 세포의 IL-10 생산을 촉진한다는 결과를 나타내는 도면이다.
도 15는 4D11 항체 등이 라모스 세포에 대한 CD40 리간드의 기능을 중화시킨다는 것을 나타내는 도면이다.
도 16은 인간 종양 세포 이식 마우스 모델에서 KM302-1 항체의 항종양 효과를 나타내는 도면이다.
도 17은 종양 세포에 대한 KM341-1-19 항체의 증식 억제 효과를 나타내는 도면이다.
도 18은 F4-465, 4D11, KM281-1-10이 항원 특이적 IgG의 생산을 억제한다는 것을 나타내는 도면이다.
도 19는 F4-465, 4D11, KM281-1-10이 항원 특이적 IgM의 생산을 억제한다는 것을 나타내는 도면이다.
도 20은 F4-465가 편도선 B-세포의 증식을 억제한다는 것을 나타내는 도면이다.
<발명의 개시>
상술된 바와 같이 최근에는 DC 세포의 기능 분석이 진행되어, CD40이 DC 세포의 기능을 제어하는 중요한 유전자로서 인식되기 시작하였다. 본 발명은 이러한 배경지식으로부터 출발하여 DC 세포를 이용한 평가계를 사용함으로써, 수상돌기 세포 (DC) 표면의 인간 CD40 항원에 대해서도 실질적으로 길항 작용을 하는 항-인간 CD40 항체 또는 그의 기능적 단편 및 종래의 항-인간 CD40 항체에 비해 치료 효과가 더욱 높을 것이라고 기대되는 항-인간 CD40 아고니스트 항체 또는 그의 기능적 단편을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들이 인간 CD40에 대한 항체의 제조에 대하여 집중적으로 연구한 결과, 기존에 알려져 있던 항-CD40 항체에 비해 질환 치료 효과가 더욱 높다고 여겨지는 신규 아고니스트 항체 및 길항 항체를 제조하는 것에 성공하여 본 발명을 완성하였다. 즉, 본 발명은 이하와 같다:
(1) 이하의 (a) 내지 (f)로부터 선택되는 하나 이상의 성질을 갖는, 인간 CD40에 대한 항체 또는 그의 기능적 단편:
(a) LPS 및 IFNγ의 존재하에서 수상돌기 세포에 작용하여 IL-12를 생산하게 하는 성질,
(b) 수상돌기 세포에 작용하여 이를 성숙시키는 활성이 G28-5 항체에 의한 활성보다 높은 성질,
(c) B-세포 수립 세포주에 대한 CD95 발현 촉진 활성이 G28-5 항체에 의한 활성보다 높은 성질,
(d) B-세포 수립 세포주에 대한 증식 억제 활성이 G28-5 항체에 의한 활성보다 높은 성질,
(e) B-세포 수립 세포주의 세포 사멸을 유도하는 성질 및
(f) CD40에 대한 CD40 리간드의 결합을 저해하지 않는 성질.
(2) 20 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 수상돌기 세포를 성숙시키는 상기한 본 발명의 항체 또는 그의 기능적 단편. 또한, 20 ㎍/㎖ 이하의 항체 농도에서 B-세포 수립 세포주에 대해 CD95 발현을 촉진시키는 본 발명의 항체 또는 그의 기능적 단편. B-세포 수립 세포주의 예로는 라모스 또는 HS-술톤 (HS-Sulton) 등이 있다.
(3) 또한, 1 ×106 개/㎖ 농도의 수상돌기 세포에 0.1 ㎍/㎖ 이상의 농도로 첨가된 경우에 IL-12가 100 pg/㎖ 이상 생산되도록 하고, 1 ㎍/㎖ 이상의 농도로 첨가된 경우에는 1000 pg/㎖ 이상, 바람직하게는 10000 pg/㎖ 이상 생산되도록 하는 상기한 본 발명의 항체 또는 그의 기능적 단편.
(4) 또한, B-세포 수립 세포주 (라모스 세포)에 대한 CD95 발현 촉진 활성이 항체 농도 0.01 ㎍/㎖ 내지 10 ㎍/㎖의 범위에서 대조군 G28-5 항체의 약 2배 내지 3배 이상인 상기한 본 발명의 항체 또는 그의 기능적 단편. 예를 들면, 상기한 발현 촉진 활성이 항체 농도 0.01 ㎍/㎖에서는 대조군 G28-5 항체의 약 2배 내지 6배 이상이고, 항체 농도 0.1 ㎍/㎖에서는 대조군 G28-5 항체의 약 2배 내지 7배 이상이고, 항체 농도 1 ㎍/㎖에서는 대조군 G28-5 항체의 약 2배 내지 7배 이상이고, 항체 농도 10 ㎍/㎖에서는 대조군 G28-5 항체의 약 2배 내지 6배 이상인 상기한 본 발명의 항체 또는 그의 기능적 단편.
(5) 하이브리도마 KM302-1 (기탁번호: FERM BP-7578), KM341-1-19 (기탁번호: FERM BP-7759), 2105 (기탁번호: FERM BP-8024) 또는 F1-102 (기탁번호: ATCC PTA-3337)에 의해 생산되는 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 갖는 항체 또는 그의 기능적 단편.
명칭 기탁번호 기탁일 기탁기관
KM302-1 FERM BP-7578 2001년 5월 9일 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터 (일본 이바라기껭 쯔꾸바시 도 1쪼메 1반지 1주오 다이 6)
KM341-1-19 FERM BP-7759 2001년 9월 27일
2105 FERM BP-8024 2002년 4월 17일
F1-102 ATCC PTA-3337 2001년 4월 24일 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (미국 20110-2209 버지니아주 마나사스 유니버시티 블레바드 10801)
(6) 하이브리도마 F2-103이 생산하며 기탁번호 ATCC PTA-3302 및 ATCC PTA-3303의 플라스미드 DNA 각각에 의해 코딩되는 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역, 하이브리도마 F5-77이 생산하며 기탁번호 ATCC PTA-3304 및 ATCC PTA-3305의 플라스미드 DNA 각각에 의해 코딩되는 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 또는 하이브리도마 F5-157이 생산하며 기탁번호 ATCC PTA-3306 및 ATCC PTA-3307의 플라스미드 DNA 각각에 의해 코딩되는 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 성숙 부분 아미노산 서열을 갖는 항체 또는 그의 기능적 단편.
명칭 기탁번호 기탁일 기탁기관
F2-103 중쇄(F2-103-H) ATCC PTA-3302 2001년 4월 19일 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (미국 20110-2209 버지니아주 마나사스 유니버시티 블레바드 10801)
F2-103경쇄(F2-103-L) ATCC PTA-3303 2001년 4월 19일
F5-77 중쇄(F5-77-H) ATCC PTA-3304 2001년 4월 19일
F5-77 경쇄(F5-77-L) ATCC PTA-3305 2001년 4월 19일
F5-157중쇄(F5-157-H) ATCC PTA-3306 2001년 4월 19일
F5-157경쇄(F5-157-L) ATCC PTA-3307 2001년 4월 19일
(7) 하이브리도마 KM341-1-19가 생산하며 서열 28 및 30으로 각각 표시되는 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역, 하이브리도마 2105가 생산하며 서열 32 및 34로 각각 표시되는 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역, 하이브리도마 110이 생산하며 서열 36 및 38로 각각 표시되는 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역, 하이브리도마 115가 생산하며 서열 40 및 42로 각각 표시되는 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역, 하이브리도마 KM643-4-11이 생산하며 서열 52 및 54로 각각 표시되는 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역, 하이브리도마 F2-103이 생산하며 서열 60 및 62로 각각 표시되는 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 또는 하이브리도마 F5-77이 생산하며 서열 64 및 66으로 각각 표시되는 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 성숙 부분 아미노산 서열을 갖는 항체 또는 그의 기능적 단편.
(8) 하이브리도마 KM341-1-19로부터 단리되며 서열 27 및 29로 각각 표시되는 핵산 서열에 의해 코딩되는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역, 하이브리도마 2105로부터 단리되며 서열 31 및 33으로 각각 표시되는 핵산 서열에 의해 코딩되는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역, 하이브리도마 110으로부터 단리되며 서열 35 및 37로 각각 표시되는 핵산 서열에 의해 코딩되는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역, 하이브리도마 115로부터 단리되며 서열 39 및 41로 각각 표시되는 핵산 서열에 의해 코딩되는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역, 하이브리도마 KM643-4-11로부터 단리되며 서열 51 및 53으로 각각 표시되는 핵산 서열에 의해 코딩되는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역, 하이브리도마 F2-103으로부터 단리되며 서열 59 및 61로 각각 표시되는 핵산 서열에 의해 코딩되는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 또는 하이브리도마 F5-77로부터 단리되며 서열 63 및 65로 각각 표시되는 핵산 서열에 의해 코딩되는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 성숙 부분 아미노산 서열을 갖는 항체 또는 그의 기능적 단편.
(9) 이하의 (g) 내지 (j)로부터 선택되는 하나 이상의 성질을 갖는, 인간 CD40에 대한 항체 또는 그의 기능적 단편:
(g) CD40에 대한 리간드의 작용을 중화시키는 성질,
(h) B-세포 수립 세포주 상의 CD40에 대한 리간드가 CD40 발현 세포에 제공하는 영향 중 하나 이상을 중화시키거나 완화시키고, 상기 B-세포 수립 세포주 상의 CD40에 대한 아고니스트 작용이 항-면역글로불린 항체와의 가교로 인해 5D12에 의한 작용보다 약한 성질,
(i) B-세포 수립 세포주에 대한 CD40 리간드의 CD95 발현 증가 작용을 완화시키거나 중화시키는 성질 및
(j) 수상돌기 세포 상에 발현된 CD40에 대하여 길항 작용을 하는 성질.
(10) 상기 (9)의 항체 또는 그의 기능적 단편으로서, 포화량의 CD40L-발현 세포를 첨가한 1 ×106 개/㎖ 농도의 라모스 세포에 0.1 ㎍/㎖ 농도로 첨가된 경우에 라모스 세포의 CD95 발현을 대조군의 약 10％ 이하로 억제할 수 있고, 1 ㎍/㎖ 농도로 첨가된 경우에는 라모스 세포의 CD95 발현을 음성 대조군과 동일한 수준으로 억제하고, 10 ㎍/㎖ 농도의 항체가 첨가된 경우에는 라모스 세포의 CD95 발현을 음성 대조군과 동일한 수준으로 억제하는 항체 또는 그의 기능적 단편.
(11) 상기 (9)의 항체 또는 그의 기능적 단편으로서, 시험관내에서 가용성 CD40L (1 ㎍/㎖)을 첨가한 1 ×105 개의 편도선 B-세포에 0.001 ㎍/㎖ 내지 10 ㎍/㎖ 농도로 첨가된 경우에 편도선 B-세포의 증식을 약 80 내지 95％ 이상 억제하는 항체 또는 그의 기능적 단편. 예를 들면, 0.01 ㎍/㎖ 내지 10 ㎍/㎖ 농도로 첨가된 경우에는 편도선 B-세포의 증식을 약 95％ 이상 억제하고, 특히 0.001 ㎍/㎖ 농도로 첨가된 경우에는 편도선 B-세포의 증식을 약 80％ 이상 억제한다.
(12) 하이브리도마 KM281-1-10 (기탁번호: FERM BP-7579), 4D11 (기탁번호: FERM BP-7758) 또는 F4-465 (기탁번호: ATCC PTA-3338)에 의해 생산되는 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 갖는 항체 또는 그의 기능적 단편.
명칭 기탁번호 기탁일 기탁기관
KM281-1-10 FERM BP-7579 2001년 5월 9일 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터 (일본 이바라기껭 쯔꾸바시 도 1쪼메 1반지 1주오 다이 6)
4D11 FERM BP-7758 2001년 9월 27일
F4-465 ATCC PTA-3338 2001년 4월 21일 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (미국 20110-2209 버지니아주 마나사스 유니버시티 블레바드 10801)
(13) 하이브리도마 KM281-1-10이 생산하며 서열 44 및 46으로 각각 표시되는 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역, 하이브리도마 4D11이 생산하며 서열 48 및 50으로 각각 표시되는 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 또는 하이브리도마 F4-465가 생산하며 서열 56 및 58로 각각 표시되는 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 성숙 부분 아미노산 서열을 갖는 항체 또는 그의 기능적 단편.
(14) 하이브리도마 KM281-1-10으로부터 단리되며 서열 43 및 45로 각각 표시되는 핵산 서열에 의해 코딩되는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역, 하이브리도마 4D11이 생산하며 서열 47 및 49로 각각 표시되는 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 또는 하이브리도마 F4-465로부터 단리되며 서열 55 및 57로 각각 표시되는 핵산 서열에 의해 코딩되는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 성숙 부분 아미노산 서열을 갖는 항체 또는 그의 기능적 단편.
(15) 인간 항체일 수 있는 상기 (1) 내지 (14)의 항체 또는 그의 기능적 단편.
(16) 상기 (1) 내지 (15) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그의 기능적 단편을 활성 성분으로 포함하는 제약 조성물.
(17) 상기 (1) 내지 (8) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그의 기능적 단편을 활성 성분으로 포함하는 면역강화제, 항종양제 또는 자가면역 질환 치료제.
(18) 상기 (9) 내지 (14) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그의 기능적 단편을 활성 성분으로 포함하는 면역억제제, 자가면역 질환 치료제, 알레르기 치료제 또는 혈액 응고 인자 VIII 저해 증후군 치료제.
(19) 여기서, 본 발명의 모노클로날 항체가 인식하는 인간 CD40의 에피토프는 인간 CD40의 1차 아미노산 서열로부터 얻어진 중첩된 합성 올리고펩티드에의 결합을 조사하는 등의 공지된 방법에 의해 결정할 수 있다 (예를 들어 문헌 [Ed Harlow and David Lane(eds.), Antibodies:A Laboratory Manual, 1988 Cold Spring Harbor Laboratory Press] 및 미국 특허 제4708871호). 파지 디스플레이 방법을 이용한 펩티드 라이브러리 키트 (뉴 잉글랜드 바이오랩스 (New England Biolabs))를 에피토프 맵핑에 사용할 수도 있다. 본 발명은 상술한 각각의 하이브리도마에 의해 생산되는 항체 또는 그의 기능적 단편이 인식하는 인간 CD40의 신규 에피토프를 인식하는 항체 또는 그의 기능적 단편도 포함한다.
(20) 본 발명은 상술한 각각의 하이브리도마로부터 단리된 항체의 중쇄및(또는) 경쇄의 적어도 가변 영역을 코딩하는 핵산 (RNA 또는 cDNA), 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 핵산을 보유하는 숙주 세포를 추가로 제공한다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다. 본 명세서는 본원의 우선권의 기초인 PCT 출원 PCT/US01/13672 (2001년 4월 27일 출원), 일본 특허 출원 제2001-142482호 (2001년 5월 11일 출원), 일본 특허 출원 제2001-310535호 (2001년 10월 5일 출원) 및 미국 특허 출원 USSN 10/040,244 (2001년 10월 26일 출원)의 명세서 및(또는) 도면에 기재된 내용 전부 또는 일부를 포함한다.
후술하는 바와 같이, 본 발명자들은 B-세포 상의 CD40에 대하여 길항 작용을 하는 공지된 모노클로날 항체 5D12 (ATCC 기탁번호: HB-11339)가 DC 세포 상의 CD40에 대해서는 길항 작용을 하지 않는다는 것을 알아냈다. 또한, 본 발명자들은 CD40L의 작용을 차단하는 길항 항체일지라도, 대부분의 모노클로날 항체가 항-면역글로불린 항체에 의한 가교에 의해 그 자체가 아고니스트 활성을 나타내게 됨을 발견하였다.
1. 정의
본 명세서에서 사용되는 용어의 정의는 이하와 같다.
본 발명에서 말하는 "인간 CD40"은 클락 등 [E. A. Clark et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4494, 1986] 또는 스타멘코빅 등 [I. Stamenkovic et. al., EMBO J. 8:1403, 1989]에 의해 교시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 의미하며, 특히 B-세포, DC, 대식세포, 내피 세포, 상피 세포 또는 이들의 종양 세포 표면에 발현되는 항원 폴리펩티드이다.
"항-CD40 모노클로날 항체"는 세포가 발현한 CD40, 전장 CD40 또는 부분 길이 CD40에 대한 임의의 모노클로날 항체를 의미하지만, 더욱 바람직하게는 CD40의 세포외 부분에 결합하여 CD40을 발현하는 세포에 아고니스트 또는 길항 작용을 하는 모노클로날 항체를 의미한다.
추가로, 본 발명에서 "항체"는 면역글로불린을 구성하는 중쇄 가변 영역과 중쇄 불변 영역 및 경쇄 가변 영역과 경쇄 불변 영역을 코딩하는 유전자 ("항체 유전자"로 총칭함)에서 유래하는 것이다. 본 발명의 항체에는 임의의 면역글로불린 클래스 및 임의의 이소형 (isoform)을 갖는 항체도 포함한다. 본 발명에서 항체의 "기능적 단편"은 상기에서 정의된 항체의 일부분 (부분 단편)으로서, 항원에 대한 항체의 작용을 하나 이상 보유하는 것을 의미하여, 구체적으로는 F(ab')2, Fab', Fab, Fv, 디술피드 결합 FV, 단쇄 FV (scFV) 및 이들의 중합체 등을 들 수 있다 [D. J. King., Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies., 1998 T. J. International Ltd].
본 발명에서 "인간 항체"는 인간에서 유래된 항체 유전자의 발현 산물인 항체를 의미한다.
"아고니스트"는 B-세포, 종양 세포 또는 수상돌기 세포 등의 세포 표면 상에서 발현된 CD40에 그의 리간드가 결합하는 것을 촉진하는 작용 또는 CD40 리간드가 CD40 발현 세포에 제공하는 영향 중 하나 이상을 CD40 발현 세포에 제공하는 작용을 의미하고, "아고니스트 항체"는 이러한 아고니스트 작용을 갖는 항체를 의미한다.
"길항 작용"은 B-세포, 종양 세포 또는 수상돌기 세포 등의 세포 표면 상에서 발현된 CD40에 그의 리간드가 결합하는 것을 저해하는 작용 또는 CD40 리간드가 CD40 발현 세포에 제공하는 영향 중 하나 이상을 중화시키는 작용을 의미하고, "길항 항체"는 이러한 작용을 갖는 항체를 의미한다.
본 발명에서 말하는 "수상돌기 세포 (DC)"는 수상 백혈구라고도 불리며, 강력한 항원 제시 기능을 갖는 세포군을 가리킨다. 본원에 사용되는 수상돌기 세포는 예를 들어 골수, 제대혈 또는 말초혈 중에 존재하는 CD34 양성 전구 세포를 배양함으로써 유도된다. 별법으로, 말초혈 중의 CD14 양성 단구를 GM-CSF 및 IL-4의 존재하에서 배양함으로써 얻어진다.
"미성숙 DC"는 CD14 음성, CD1a 강(强)양성, CD83, CD86 양성, MHC 클래스 II 양성인 DC를 의미한다.
"성숙 DC"는 CD14 음성, CD1a 양성이며 CD83, CD86, MHC 클래스 II 강양성이 된 DC를 의미한다.
본 발명에서 "DC의 활성화"는 CD40에 의한 자극에 반응하여 DC가 유도하는 변화를 의미하며, 예를 들어 미성숙 DC를 성숙시켜 CD80, CD86, HLA-클래스 II를 높은 비율로 발현시키고, IL-12의 생산을 더욱 증대시키거나, T-세포가 공존하는 경우에는 이를 자극하여 증식을 촉진시키는 것을 의미한다.
본 발명에서 "B-세포, B-세포주의 활성화"는 CD40에 의한 자극에 반응하여 상기 세포가 유도하는 변화를 의미하며, 예를 들어 DNA 합성을 일으켜 티미딘 혼입을 촉진시키고 CD95의 발현을 증가시키는 것을 말한다.
2. 항체의 수득
본 발명의 항체를 수득하기 위해서는, 재조합체에서 생산 및 정제한 가용성 인간 CD40 또는 인간 CD40을 발현하는 유전자 재조합 마우스 세포주를 항원으로서 사용하여 마우스를 면역화하는 것이 바람직하다. 면역화에 사용되는 마우스는 인간 항체를 생산하는 마우스 [Tomizuka. et al., Proc Natl Acad Sci USA., 2000 Vol 97:722]인 것이 바람직하다. 재조합체에서 생산 및 정제한 가용성 인간 CD40에 결합하는 모노클로날 항체를 선별하는 것이 B-세포 특이적으로 반응하는 클론을 선택하는 것보다 B-세포가 아닌 세포에서 발현된 CD40에도 반응하는 항체를 얻기에 수월하다고 여겨진다. 면역화된 마우스의 림프절 세포나 비장 세포를 사용하는 모노클로날 항체 제조에 일반적으로 사용되는 콜러 (Kohler) 및 밀스타인 (Milstein) 등의 방법 [Nature., 1975 Vol. 256:495]을 이용하여 하이브리도마를 제조할 수 있다.
또한, BIAcore 2000 (비아코어 (Biacore) 제품) 등의 표면 플라즈몬 공명 측정 장치를 이용하여 가용성 CD40L과 CD40의 결합을 분석하고, CD40L과 경쟁하지 않는 항체를 선별한다. 또한, B 림프종의 세포 증식을 단독으로 억제하는 항체를 선별한다. 또한, DC에 작용하는지의 여부를 지표로 하여 항체를 선별함으로써, CD40L과 경쟁하지 않고 수상돌기 세포 또는 B-세포에 작용하면서 CD40 발현 암세포의 증식을 억제한다는 이점을 구비한 항체를 제조ㆍ선별할 수 있다.
본 발명의 항체는 이로써 수득된 하이브리도마를 배양함으로써 얻어진다. 추가로, B-세포 또는 하이브리도마 등의 항체 생산 세포로부터 인간 모노클로날 항체 또는 그의 가변 영역을 코딩하는 유전자를 클로닝하여 적당한 벡터로 조립한 후에 이것을 숙주 (예를 들어 포유동물 세포주, 대장균, 효모 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등)에 도입함으로써 유전자 재조합 기술을 이용하여 생산된 재조합 항체를 제조할 수 있다 ([P. J. Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES., 1997 WILEY, P. Shepherd and C. Dean., Monoclonal Antibodies., 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS], [J. W. Goding., Monoclonal Antibodies:principles and practice., 1993 ACADEMIC PRESS]). 또한, 트랜스제닉 동물 제조 기술을 통해 목적 항체 유전자를 내재성 유전자로 조립시킨 트랜스제닉 소, 염소, 양 또는 돼지를 제조하고, 이러한 트랜스제닉 동물의 유(乳)로부터 상기 항체 유전자에서 유래한 모노클로날 항체를 대량으로 수득할 수도 있다. 하이브리도마를 시험관내 배양하는 경우에는, 배양하는 세포종의 특성, 실험 및 연구 목적 및 배양 방법 등의 여러가지 조건에 따라서 하이브리도마를 증식, 유지 및 보존시키고, 배양 상청액 중에 모노클로날 항체가 생산되도록 하는데 사용될 수 있는 공지된 영양 배지 또는 공지된 기본 배지로부터 유도 제조되는 임의의 영양 배지를 사용하여 하이브리도마를 배양할 수 있다.
3. 스크리닝
아고니스트 항체는 인간 B-림프종을 사용한 분석을 통해 선별함으로써, CD95 발현을 촉진시키는 항체의 선별이 가능하다. 또한, 정제된 DC의 배양액에 첨가했을 경우에 이를 성숙시키는 항체를 선별한다. 별법으로, 미성숙 DC 세포를 이용한 혼합 림프구 반응에서 T-세포 증식 활성을 나타내는 항체를 선별한다. 추가로, 성숙 DC에 첨가했을 경우에 IL-12 생산 촉진 작용을 나타내는 항체를 선별한다. 또한, CD40을 발현하는 종양 세포의 증식을 억제시키거나 이들의 세포 사멸을 유도하는 활성을 갖는 항체를 선별한다. CD40L과의 경쟁은 BIACore와 같은 표면 플라즈몬 공명 측정 장치 등을 이용하여 항체가 가용성 CD40과 가용성 CD40 리간드의 결합을 저해하는지의 여부를 기준으로 판별할 수 있다. 별법으로, B-세포주에 대한 CD40 리간드의 작용을 증대시키는지의 여부를 기준으로 판별한다.
길항 항체는 인간 B-림프종을 사용한 분석을 통해 스크리닝하는데, 태그로서 FLAG를 갖는 가용성 CD40L을 항-FLAG 항체의 존재하에서 첨가함으로써 가용성 CD40L과 인간 B-림프종 세포 상의 CD40과의 결합을 보다 강력하게 저해하는 항체를 선별할 수 있다. 가용성 CD40L 대신에 CD40L을 코딩하는 유전자를 도입하여 세포 표면에 CD40L을 많이 발현하는 재조합 세포를 사용할 수도 있다. 이후, 인간 항체를 항-인간 IgG 항체로 가교시키고, 이러한 가교에 의해 B 림프종을 활성화시키는 클론을 제거한다. 또한, 정제하여 성숙시킨 DC 세포를 이용한 혼합 림프구 반응에서 T-세포 증식 억제 활성을 나타내는 항체 또는 성숙 DC에 CD40 리간드를 첨가한 경우에 IL-12 생산을 억제하는 작용이 있는 항체를 선별한다.
이러한 방식으로 수득한 항체는 적어도 이하 중 어느 하나의 치료 효과상 유용하다고 여겨지는 성질을 갖는다:
(1) 아고니스트 항체의 경우
(a) LPS (리포폴리사카라이드) 및 IFNγ의 존재하에서 수상돌기 세포에 작용하여 IL-12를 생산한다. 이 경우의 LPS 농도는 10 pg/㎖ 내지 10 ng/㎖이고, IFNγ의 농도는 10-4 M 내지 10-2 M이다. 1 ㎍/㎖ 이상의 항체 농도, 바람직하게는 0.1 ㎍/㎖ 이상의 항체 농도에 있어서, 공지된 항-CD40 아고니스트 항체인 G28-5 항체를 대조군으로 한 시험에 비해 IL-12의 생산량이 많다. 1 ×106 개/㎖ 농도의 수상돌기 세포에 항체 농도 0.1 ㎍/㎖ 이상이 첨가된 경우에는 IL-12가 100 pg/㎖ 이상 생산되고, 또는 1 ㎍/㎖ 이상이 첨가된 경우에는 IL-12가 1000 pg/㎖ 이상, 바람직하게는 10000 pg/㎖ 이상 생산된다 (실시예 9 및 실시예 13 참조).
(b) 수상돌기 세포에 결합하여 수상돌기 세포를 성숙시키는 작용을 한다. 또한, 항체를 20 ㎍/㎖ 이하의 농도, 바람직하게는 0.1 내지 15 ㎍/㎖, 더욱 바람직하게는 5 내지 15 ㎍/㎖의 농도로 수상돌기 세포와 함께 배양한 경우, 그의 성숙 활성은 G28-5 항체에 의한 활성보다 높다는 결과가 얻어진다 (실시예 9 참조).
(c) B-세포 수립 세포주에 대한 CD95 발현 촉진 활성이 G28-5 항체에 의한 활성보다 높다. 이 경우, 10 ㎍/㎖ 이상, 바람직하게는 1 ㎍/㎖ 이상, 더욱 바람직하게는 0.1 ㎍/㎖ 이상, 훨씬 더욱 바람직하게는 0.01 ㎍/㎖ 이상, 가장 바람직하게는 0.001 ㎍/㎖를 초과하는 항체 농도에서의 CD95 발현 촉진 활성은, G28-5 항체를 대조군으로 한 시험에서의 G28-5 항체에 의한 활성보다 높다. 상기 항체 농도가 10 ㎍/㎖, 1 ㎍/㎖, 0.1 ㎍/㎖, 0.01 ㎍/㎖일 때의 CD95 발현 촉진 활성은, 동일 농도의 G28-5 항체를 대조군으로 사용한 경우에 이에 의한 상기 활성에 대한 비율이 이하와 같다 (표 1):
항체 농도 비율
10 ㎍/㎖ 약 2배, 바람직하게는 약 3배, 더욱 바람직하게는 4.5배, 훨씬 더욱 바람직하게는 6배
1 ㎍/㎖ 약 2배, 바람직하게는 약 5배, 더욱 바람직하게는 약 6배, 훨씬 더욱 바람직하게는 7배
0.1 ㎍/㎖ 2배, 바람직하게는 6배, 더욱 바람직하게는 약 7배
0.01 ㎍/㎖ 2배, 바람직하게는 4배, 더욱 바람직하게는 5배, 훨씬 더욱 바람직하게는 약 6배
CD95의 발현 촉진은, 항체가 B-세포 수립 세포주를 활성화시킨다는 것을 의미한다. 여기서, B-세포 수립 세포주의 예로는 라모스 세포, HS-술톤 세포 등이 있다. 또한, 라모스 세포는 버킷 (Burkitt) 림프종이고, 인간 배중심의 B-세포의 모델 세포이다. HS-술톤 세포는 버킷 림프종이다 (실시예 6 및 실시예 12 참조).
(d) B-세포 수립 세포주 (라모스 세포 또는 HS-술톤 세포)의 DNA 합성 억제, 티미딘 혼입 억제 및 증식 억제 활성이 G28-5 항체에 의한 활성보다 높다. 이 경우의 항체 농도는 0.05 ㎍/㎖ 이상, 바람직하게는 0.1 내지 15 ㎍/㎖이다 (실시예 8 참조).
(e) B-세포 수립 세포주의 세포 사멸을 유도한다 (실시예 16 참조).
(f) CD40 리간드와 CD40의 결합을 저해하지 않는다. "저해하지 않는다"는 것은 CD40에 상기 항체가 이미 결합한 상태에서도 (즉, 항체의 존재하에서도) 상기 항체의 부재시와 동일한 정도로 CD40L이 CD40에 결합할 수 있음을 의미한다. CD40 리간드와 CD40은 어느 하나 또는 두가지 모두가 막 발현형이거나 가용성 단백질일 수도 있다 (실시예 11 참조).
이러한 성질을 갖는 항체는 예를 들어 하이브리도마 KM302-1 (FERM BP-7578), 하이브리도마 KM341-1-19 (FERM BP-7759) 등에 의해 생산된다.
하이브리도마 KM341-1-19에 의해 생산되는 모노클로날 항체의 중쇄 (H쇄) 및 경쇄 (L쇄) 가변 영역의 염기 서열 및 아미노산 서열이 결정되었다 (실시예 17). 본 발명은 하이브리도마 KM341-1-19가 생산하는 모노클로날 항체에서 적어도 중쇄 가변 영역 또는 중쇄 전장을 코딩하는 DNA 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA를 제공한다. 상기 DNA는 실시예 17에 기재된 것 이외에도, 코돈의 동의성 (degeneration)으로 인해 동일 아미노산 서열을 코딩하는 다른 DNA도 포함한다. 또한, 실시예 17에 개시된 바와 같이, 본 발명은 적어도 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 또는 중쇄 전장의 아미노산 서열과 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열에 의해 규정되는 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편을 제공한다.
(2) 길항 항체의 경우
(g) CD40에 대한 리간드의 작용을 중화시킨다. 여기서, "리간드의 작용"은 T-세포 또는 다른 세포 상에 발현된 리간드의 작용 및 CD40에 대한 유리 리간드의 작용 모두를 의미한다 (실시예 7 및 실시예 14 참조).
(h) B-세포 수립 세포주 상의 CD40에 대한 리간드가 CD40 발현 세포에 제공하는 영향 중 하나 이상을 중화시키고, 상기 B-세포 수립 세포주 상의 CD40에 대한 아고니스트 작용이 항-면역글로불린 항체와의 가교로 인해 나타나지 않는다. 이 작용은 5D12에 의한 작용보다 약하다. "CD40 발현 세포에 제공하는 영향"은 CD40 발현 세포의 활성화를 의미하며, B-세포에서는 티미딘 혼입 및 B-세포의 증식을 의미하고, B-세포 수립 세포주에서는 CD95 발현 증대 등을 의미한다. 또한, DC에서는 DC의 성숙, CD86 및 HLA-DR의 발현 증대, 공존하는 T-세포의 티미딘 혼입 증가, 증식의 촉진, IL-12이나 IL-10의 생산 증가 등을 의미한다. 항-면역글로불린 항체에 의한 가교는 배양액 중에 0.1 ㎍/㎖ 이상의 항-면역글로불린 항체를 존재시킴으로써 수행된다 (실시예 7 참조).
(i) B-세포 수립 세포주에서, 가교된 CD40L 또는 세포가 발현한 CD40L의 CD95 발현 증가 활성을 완화 또는 중화시킨다. 태그에 대한 항체 등으로 가교하여 작용이 증대된 CD40L에 대해서도 활성을 완화 또는 중화시킨다. CD40에 대한 리간드 (유리 리간드, 특정 세포가 발현하는 리간드를 모두 포함함)가 CD40 발현 세포에 결합하면 세포내 신호전달이 일어나서 최종적으로는 세포 표면 상에 CD95 (Fas)가 발현된다. 따라서, 본 발명의 길항 항체는 CD40에 결합하여 상기한 신호전달을 저해함으로써 CD95의 발현을 중화시킨다. 이 경우의 항체 농도는 1 ㎍/㎖ 이상, 바람직하게는 0.1 ㎍/㎖ 이상이다 (실시예 7 및 실시예 14 참조).
(j) DC 상의 CD40에 대하여 길항 작용을 한다. 즉, CD40L의 DC 활성화 활성을 완화 또는 중화시킨다. DC가 공존하는 T-세포 상의 리간드에 의해 자극될 경우, T-세포를 활성화하여 티미딘 혼입을 증가시키는 등의 작용을 한다. 다른 개체에서 유래된 DC와 T-세포를 공존시키는 혼합 림프구 반응에서는, DC가 T-세포와 상호작용하여 T-세포를 활성화시킨다. 본 발명의 길항 항체는 CD40에 결합하여 상기 상호작용을 저해하기 때문에, 결과적으로는 티미딘 혼입이 억제된다. 이 경우의 항체 농도는 0.001 ㎍/㎖ 이상이고, 바람직하게는 0.1 내지 10 ㎍/㎖이다 (실시예 10 참조).
상기 길항 항체는 예를 들어 하이브리도마 KM281-1-10 (FERM BP-7579), KM281-2-10-1-2 (FERM BP-7580) (2001년 5월 9일, 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터 (일본 이바라기껭 쯔꾸바시 도 1쪼메 1반지 1주오 다이 6)) 및 4D11 (FERM BP-7758)에 의해 생산된다.
(3) 본 발명의 항체를 당업자에게 공지된 바와 같이 유전공학적 변형, 즉 항체 중쇄의 서브클래스를 규정하는 영역을 다른 서브클래스를 규정하는 영역으로 치환시킴으로써, 다른 서브클래스의 항체로 변경시킬 수 있다 (예를 들어 EP 314161 공보 참조). 중쇄 가변 영역을 다른 서브클래스의 불변 영역에 직접 연결할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 항체의 서브클래스를 IgG2 또는 IgG4로 변경시킴으로써 Fc 수용체에 대한 결합성을 저하시키는 것이 가능하다. 구체적으로, 카뱃 (Kabat) 등 [Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)]에 의하면, 인간 항체 중쇄, EU 인덱스 118 (Ala), 119 (Ser) 부위에 NheI 부위 (GCTAGC)를 도입하고 상기 제한 효소를 사용하여 소화시킴으로써, 아미노산을 변화시키지 않은 채로 다른 서브클래스인 IgG와 연결하여 변화시킬 수 있다. 또한, 불변 영역의 아미노산 서열을 인위적으로 변경시키거나, 이렇게 변경된 서열을 갖는 불변 영역 서열과 본 발명의 항체의 가변 영역을 결합시킴으로써 Fc 수용체에 대한 결합성을 저하시키거나 [Lund J., et al., J. Immunol. 1991 vol 147:2657-2662], CDC 활성을 증가 또는 감소시킬 수 있다 [Tao M., et. Al., J. Exp. Med. 1991 vol 1025-1028, Idusogie E E., et. al., J. Immunol. 2001 vol 166:2571-5]. 또한, ADCC이나 CDC 등의 작용을 피하기 위해서는 미리 IgG2나 IgG4 서브클래스의 항체만을 선별하는 것도 가능하다. 또한, 본 발명의 항체에 방사성핵종, 세균 독소, 화학요법제, 전구약물 등을 결합시킴으로써 암 등의 질환 치료 효과를 더욱 증대시킬 수도 있다.
4. 제약 조성물
또한, 본 발명의 정제된 항체인 제제를 함유하는 제약 조성물도 본 발명의 범위 내에 포함된다. 이러한 제약 조성물은 바람직하게는 항체 뿐 아니라 생리적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 추가로 포함하고, 다른 항체 또는 항생제 등과 같은 다른 약제와의 혼합물일 수도 있다. 적절한 담체로는 생리적 염수 용액, 인산염 완충 염수 용액, 인산염 완충 염수 글루코스 용액 및 생리적 완충 염수 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 항체를 동결 건조시켰다가 필요할 때 상기와 같은 완충 수용액을 첨가하여 재구성하여 사용할 수도 있다. 투여 경로의 예로는 경구 경로 및 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 주사 또는 배약(配藥) 등과 같은 비경구 경로 등이 있다.
이 경우, 적절한 희석제 및 약리적으로 허용가능한 담체와의 배합물로서 투여되는 본 발명의 항체의 유효량은 1회 투여 당 체중 1 kg 당 0.1 mg 내지 100 mg이고, 2 일 내지 8 주의 간격으로 투여된다.
본 발명의 항체, 특히 아고니스트 항체를 포함하는 제약 조성물을 사용하는 경우, 상기 조성물은 면역강화제 (항바이러스제, 항감염증제), 항종양제, 자가면역 질환 치료제로서 사용될 수 있으며, 이러한 질환이 복수 발병해 있을 수도 있다. 또한, 보조제 (adjuvant)로서 암 특이적 펩티드 등의 백신과 병용할 수도 있다. 또한, 길항 항체를 포함하는 제약 조성물을 사용하는 경우, 이는 장기 이식시의 면역억제제 (예를 들어 췌도 이식 또는 신장 이식시의 거부 반응 또는 GVHD에 대한 예방제 또는 치료제) 또는 자가면역 질환 (예를 들어 류마티스, 동맥 경화 치료제, 다발성 경화증, 전신성 홍반, 특발성 혈소판 감소증, 클론병 등)의 치료제, 천식 등의 알레르기 치료제 또는 혈액 응고 인자 VIII 저해 증후군의 치료제로서 유용하고, 이러한 질환이 복수 발병해 있을 수도 있다.
CD40이 관여하는 질환의 치료 수단으로서 항-CD40 항체를 이용하는 경우, DC 세포의 기능을 지표로 이용하여 항체를 선별함으로써 보다 좋은 치료 효과를 제공하는 항체를 얻을 수 있다고 기대할 수 있다.
아고니스트 항체로는 DC를 보다 효과적으로 활성화시킬 수 있는 항체를 선별함으로써 면역강화 작용이 강한 항체가 얻어질 것이라고 기대된다. 추가로, 성숙 DC의 IL-12의 생산 촉진을 지표로서 이용함으로써 CTL 유도 작용이 강한 항체를 얻을 수 있다. CTL 유도에 의해, 바이러스로 감염된 세포나 종양 세포를 제거하는 효과가 높은 항체를 얻을 수 있다. 또한, 상승 효과를 기대할 수 있기 때문에 CD40에 결합하는 항체이면서 CD40 리간드와 CD40의 결합은 저해하지 않는 항체가 바람직하다. 암 치료를 고려할 때, CD40을 발현하는 암세포에서 직접 세포 사멸을 유도하거나 이의 증식을 억제하면서 DC 세포를 효율적으로 활성화시키는 항체가 존재할 경우에는 이것이 상승적인 효과가 기대되며 CD40을 발현하지 않는 종양에도 사용할 수 있는 치료제가 될 것이라 여겨진다. 이 항체는 바이러스 감염증의 치료제나 항종양제로서 유용하다고 여겨진다.
한편, CD40에 특이적으로 결합하여 CD40L의 결합을 억제하면서 CD40을 활성화시키지 않는 항체에 대해서도, B-세포에 대한 리간드의 작용을 억제할 뿐 아니라 DC 세포에의 작용까지도 억제할 수 있을 것이라 기대된다. 그러나, 지금까지 얻은 항체는 B-세포에 대한 효과를 지표로 하여 수득되어 왔기 때문에, 수상돌기 세포에도 강력한 억제 작용을 하는 항체를 수득하여 의약품으로서 개발하는 것은 의의가 크다. 또한, 상술한 바와 같이 항-CD40 항체는 가교로 인한 완전 반대의 작용이 우려되기 때문에, 가교에 의해서도 CD40을 활성화시키지 않는 항체가 필요하다. 지금까지 인간 CD40에 대한 항체로서 보고된, 마우스 등과 같은 비인간 포유동물에서 유래한 모노클로날 항체 및 마우스 모노클로날 항체의 가변 영역과 인간 면역글로불린의 불변 영역으로 이루어진 키메라 항체 또는 CDR 이식을 통한 인간화 항체는 항원성이 있을 것이라 우려되기 때문에, CD40 리간드와의 결합을 저해하는 항체로서는 인간 항체가 바람직하다.
<발명을 실시하기 위한 최선의 형태>
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 본 발명의 기술 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 항원의 제조
(1) 세포
EL-4 세포는 마우스 유래의 T-세포 수립주로서 쉽게 입수할 수 있다 (ATCC 기탁번호: TIB-39). 라모스 B-세포 (ATCC 기탁번호: CRL-1596) 및 마우스 항-CD40 항체 생산 하이브리도마 G28-5 (HB-9110) 및 5D12 (HB-11339)는 ATCC로부터 구입하였다.
(2) 항원의 발현과 정제
인간 CD40cDNA (진뱅크 (GeneBank) 관리번호: NM_001250)를 주형으로 하고, 이하의 프라이머를 사용하여 PCR (95℃에서 5 초, 55℃에서 30 초, 72℃에서 30 초)의 20 회 사이클 조건으로 세포외 영역을 증폭시켰다.
증폭된 cDNA는 pFastBac 벡터 (깁코 비알엘 (Gibco BRL))의 멜리틴 신호 서열 뒤, 인간 IgG1 유래 FC 또는 마우스 IgG2a 유래 FC 영역 앞에 삽입하였다. CD40 생산을 위해서, 사용 설명서에 따라 재조합 바큘로바이러스를 제조하였다. Tn5 세포를 재조합 바이러스로 감염시킨 후, 4 일간 배양하였다. 상청액을 0.22 nm 필터로 처리한 후, 프로테인G (ProteinG) 세파로스 (아머샴 파마시아 (Amersham Pharmacia))를 첨가하여 4℃에서 서서히 진탕하였다. 하룻밤 후, 세파로스를 컬럼에 옮기고 20배 용량의 PBS로 세척하였다. 인간 CD40 FC 단백질을 20 mM 글리신 완충액 (pH 3.0)으로 용출시켰다. CD40을 세포 표면에 발현시키기 위한 벡터는 란돌프 제이. 노엘 (Randolph J. Noelle)로부터 입수하였다 [Inui, S et al., EJI, 20, 1747-1753, 1990]. 전장 cDNA는 XbaI에 의해 효소 절단하여 pCDNA3 (인비트로젠 (INVITROGEN))에 삽입하였다. 벡터를 EL-4 세포에 도입하고, 0.5 mg/㎖의 G418 (깁코 비알엘) 존재하에 배양하여 안정한 발현주를 얻었다. CD40의 발현은 FITC-결합 항-인간 CD40 항체 (파민젠 (Pharmingen))를 사용하여 FACS 분석을 통해 확인하였다.
<실시예 2> 면역화를 위한 마우스의 제조
면역화에 사용된 마우스는 내인성 Ig 중쇄와 κ 경쇄가 둘다 파괴된 동종접합체라는 유전자 배경을 갖는 동시에, 인간 Ig 중쇄 유전자좌를 포함하는 14번 염색체 단편 (SC20) 및 인간 Igκ쇄 트랜스진 (transgene) (KCo5)을 보유한다. 이 마우스는 인간 Ig 중쇄 유전자좌를 갖는 계통 A의 마우스와 인간 Igκ쇄 트랜스진을 갖는 계통 B의 마우스를 교배하여 제조하였다. 계통 A의 마우스는 내인성 Ig 중쇄와 κ 경쇄가 둘다 파괴된 동종접합체이고, 자손으로 전달가능한 14번 염색체 단편 (SC20)을 보유하며, 예를 들어 도미즈까 (Tomizuka) 등의 보고 [Tomizuka. et al., Proc Natl Acad Sci USA., 2000 Vol 97:722]에 기재되어 있다. A 계통의 마우스를 면역화시켜 하기의 하이브리도마 F2-103 및 F5-77을 수득하였다. 또한, 계통 B는 내인성 g 중쇄와 κ 경쇄가 둘다 파괴된 동종접합체이고, 인간 Igκ쇄 트랜스진 (KCo5)을 보유하는 마우스 계통 (트랜스제닉 마우스)으로, 예를 들어 피쉬윌드 (Fishwild) 등의 보고 [Nat Biotechnol., 1996 Vol 14:845]에 기재되어 있다.
계통 A의 수컷 마우스와 계통 B의 암컷 마우스 또는 계통 A의 암컷 마우스와 계통 B의 수컷 마우스를 교배하여 수득한, 혈청 중에서 인간 Ig 중쇄 및 κ 경쇄가 동시에 검출되는 개체 [Ishida ＆ Lonberg, IBC's 11th Antibody Engineering, Abstract 2000]를 이하의 면역화 실험에 사용하였다. 또한, 상기 인간 항체 생산 마우스는 계약 체결에 따라서 기린비루 가부시키가이샤로부터 입수가능하다. 상기 마우스를 면역화시켜 하기의 하이브리도마 KM302-1, KM341-1-19, KM643-4-11, 2053, 2105, 3821, 3822, 285, 110, 115, KM281-1-10, KM281-2-10-1-2, KM283-5, KM292-1-24, KM225-2-56, KM341-6-9, 4D11, 5H10, 11E1, 5G3, 3811, 3411, 3417을 수득하였다. 또한, 쿠로이와 (Kuroiwa) 등이 보고한 인간 항체 람다쇄를 보유하는 키메라 마우스 [Kuroiwa et. Al., Nat Biotechnol., 2000 vol 18:1086]도 이하의 면역화 실험에 사용하였다. 상기 마우스로부터 하이브리도마 F4-465를 수득하였다.
<실시예 3> 인간 CD40에 대한 인간 모노클로날 항체의 제조
본 실시예의 모노클로날 항체는, 모노클로날 항체의 실험적 조작 입문서 (안도따미에 등 저작, 고단사 발행 1991)에 기재된 일반적인 방법에 따라서 제조하였다. 면역원으로서 사용한 인간 CD40은 실시예 1에서 제조한 인간 CD40 인간 FC와 CD40 발현 EL-4 세포였다. 면역화에 사용한 동물은 실시예 2에서 제조한 인간 면역글로불린을 생산하는 인간 항체 생산 마우스였다.
인간 항체 생산 마우스에게 CD40:hFc를 1 마리 당 2 내지 100 ㎍/회 면역화시켰다. 최초의 면역화 때를 제외하고는 항원 용액을 등량의 불완전 프로인트 (Freund) 보조제 (시그마 (Sigma))와 혼합하여 피하에 여러 군데로 나누어 주입하였다. 약 10 일 내지 3 주마다 3 내지 4회 면역화시켰다. 최초의 면역화 때에는 불완전 프로인트 보조제 (시그마)를 사용하였다. 마우스의 꼬리에서 채혈하여, 혈청 중의 CD40에 대한 인간 항체 γ 및 κ를 ELISA로 측정하였다. 비장을 적출하기 3 내지 4 일 전에는, PBS에 용해시킨 CD40:Fc 20 ㎍을 꼬리 정맥에 주사하여 최종적으로 면역화하였다.
인간 항체를 생산하는 마우스를 인간 CD40을 발현하는 마우스 EL-4 세포로 면역화시켰다. EL-4 세포 108 개/㎖가 되도록 PBS에 현탁시키고, 미리 PBS로 에멀젼화한 등량의 RIBI 보조제와 서서히 혼합하였다. 세포를 사용한 면역화는 약 10 일 내지 3 주마다 3 내지 5회 수행했다. 보조제를 사용하지 않는 경우에는 세포에 8000 rad의 X선을 조사하여 사용하였다.
면역화된 마우스에 외과술을 수행하여 비장을 수득하고, 회수한 비장 세포를 마우스 골수종 SP2/0 (ATCC 기탁번호: CRL1581)과 5:1로 혼합하고, 융합제로서 폴리에틸렌글리콜 1500 (뵈링거 만하임 (Boehringer Mannheim))을 사용하여 세포 융합시킴으로써 다수의 하이브리도마를 제조하였다. 하이브리도마의 선별은 10％ 소 태아 혈청 (FCS)과 히포크산틴 (H), 아미노프테린 (A) 및 티미딘 (T)를 함유하는 HAT-함유 DMEM 배지 (깁코 비알엘) 중에서 배양함으로써 수행하였다. 또한, HT-함유 DMEM 배지를 사용한 제한 희석법을 통해 단일 클론을 수득했다. 배양은 96웰 미량역가 플레이트 (벡톤 디킨슨 (Beckton Dickinson))에서 수행하였다. 항-인간 CD40 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 선별 (스크리닝)은 후술하는 실시예 4에서 효소 결합 면역흡착 분석법 (ELISA) 및 형광 활성화 세포 분류법 (FACS)으로 측정함으로써 수행하였다.
인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 ELISA에 의한 스크리닝은 이하에 서술하는 3가지 유형의 ELISA 및 FACS 분석법에 의해 수행하였고, 인간 면역글로불린 γ쇄 (hIgγ) 및 인간 면역글로불린 경쇄 κ를 보유하며 인간 CD40에 특이적인 반응성을 갖는 인간 모노클로날 항체를 생산하는 다수의 하이브리도마를 얻었다. 또한, 본 실시예를 포함하여 이하의 모든 실시예 및 실시예에서의 시험 결과로서 나타낸 표 또는 도면에 있어서는, 본 발명의 인간 항-인간 CD40 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 클론 각각을 기호로 명명하였다. 또한, 이러한 기호 다음에 "항체"를 붙인 것은, 각각의 하이브리도마에 의해 생산되는 항체 또는 상기 하이브리도마로부터 단리된 항체 유전자 (전장 또는 가변 영역)를 보유하는 숙주 세포에 의해 생산된 재조합 항체를 의미한다. 또한, 문맥상 분명한 범위에서, 하이브리도마 클론의 명칭이 항체의 명칭을 나타낼 수 있다.
이하의 하이브리도마 클론은 단일 클론을 나타낸다.
아고니스트 항체:
KM302-1, KM341-1-19, KM643-4-11, 2053, 2105, 3821, 3822, 285, 110, 115, F1-102, F2-103, F5-77 및 F5-157
길항 항체:
KM281-1-10, KM281-2-10-1-2, KM283-5, KM292-1-24, KM225-2-56, KM341-6-9, 4D11, 5H10, 11E1, 5G3, 3811, 3411, 3417 및 F4-465
이들 중 3개의 하이브리도마 클론 KM 302-1, KM 281-1-10 및 KM 281-2-10-1-2를 평성 13년 (2001년) 5월 9일자로, 클론 KM341-1-19 및 4D11을 평성 13년 (2001년) 9월 27일자로, 클론 2105를 평성 14년 (2002년) 4월 17일자로 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터 (일본 이바라기껭 쯔꾸바시 도 1쪼메 1반지 1주오 다이 6)에 부다페이트 조약에 기초하여 국제 기탁하였다. F2-103, F5-77 및 F5-157의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 플라스미드를 2001년 4월 19일자로, 하이브리도마 클론 F1-102 및 F4-465를 2001년 4월 24일자로 ATCC (아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션, 미국 20110-2209 버지니아주 마나사스 유니버시티 블레바드 10801)에 부다페이트 조약에 기초하여 국제 기탁하였다 (표 2).
<실시예 4> 하이브리도마의 스크리닝
인간 면역글로불린 γ쇄를 갖는 모노클로날 항체의 검출
실시예 1에서 제조한 인간 CD40 마우스 FC (1 ㎍/㎖) 50 ㎕/웰을 ELISA용 96웰 마이크로플레이트 (맥시솝 (Maxisorp), 넌크 (Nunc))의 각 웰에 첨가하여 4℃에서 배양하고, 인간 CD40 마우스 FC를 마이크로플레이트에 흡착시켰다. 이어서, 상청액을 버리고 각 웰에 차단 시약 (블럭에이스 (Block Ace), 다이닛본 세이야꾸 (DAINIPPON PHARMACEUTICAL))을 첨가하고 실온에서 배양하여 차단시켰다. 각 웰에 각각의 하이브리도마의 배양 상청액 (50 ㎕)을 첨가하고 반응시킨 후, 각 웰을 0.1％ 트윈 20-함유 인산 완충액 (PBS-T)으로 세척하였다. 이어서, 과산화 효소로 표지된 염소 항-인간 IgG (γ) 항체 (시그마, A0170)를 1％ FBS-함유 PBS-T로 5,000배 희석시킨 용액 (50 ㎕/웰)을 각 웰에 첨가하고 배양하였다. 마이크로플레이트를 PBS-T로 3회 세척한 후, 발색 기질액 (TMB, 50 ㎕/웰, 스미또모 벡라이트 (SUMITOMO BAKELITE))를 각 웰에 첨가하여 실온에서 30 분간 배양하였다. 각 웰에 정지액 (50 ㎕/웰)을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 파장 450 nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 판독기로 측정하였다. 양성 웰의 배양 상청액을 FACS로 분석하고, 라모스 세포가 염색된 웰을 선별하여 그 세포를 제한 희석법으로 클로닝하고, 각 웰 당 1개 클론의 세포를 얻었다. 인간 CD40 마우스 FC를 사용한 ELISA를 통해 hκ-양성임을 확인하였다. 그 결과, 20 마리의 마우스로부터 173개 클론의 항-인간 CD40 항체를 수득할 수 있었다. 이들 중 일부를 표 3 (아고니스트 항체) 및 표 4 (길항 항체)에 나타내었다. 아고니스트 항체 중 적어도 KM341-1-19와 2105는 CD40L-발현 세포, CD40-발현 세포 및 항체를 이용한 경쟁 시험에서 리간드와의 현저한 경쟁을 나타내지 않았다.
인간 면역글로불린 경쇄 κ (Igκ)를 갖는 모노클로날 항체의 검출은 과산화 효소로 표지한 양 항-인간 Igκ 항체 (1,000배 희석, 50 ㎕/웰, 서던 바이오테크놀로지 (Southern Biotechnology))를 사용한 것 이외에는, 상술한 인간 면역글로불린 γ쇄의 ELlSA와 동일하게 수행하였다.
각 모노클로날 항체의 서브클래스는, 각각 과산화 효소로 표지한 양 항-인간 IgG1 항체, 양 항-인간 IgG2 항체, 양 항-인간 IgG3 항체 또는 양 항-인간 IgG4 항체 (각 2,000배 희석, 50 ㎕/웰, 더 바인딩 사이트 (The Binding Site))를 사용한 것 이외에는 상술한 인간 면역글로불린 γ쇄의 ELISA와 동일한 방식으로 확인하였다.
<인간 CD40 발현 세포에 대한 각 모노클로날 항체의 반응 시험>
CD40을 발현한다고 보고된 라모스 세포주에 대한 각 모노클로날 항체의 반응성을 FACS 분석법으로 연구하였다.
라모스 세포주를 0.1％ NaN3, 2％ FCS-함유 PBS의 염색 완충액 (SB)에 2 x 106/㎖의 농도로 부유시켰다. 세포 부유액 (100 ㎕/웰)을 96웰 둥근 바닥 플레이트 (벡톤 디킨슨)에 나누어 담았다. 각각의 하이브리도마 배양 상청액 (50 ㎕)을 첨가하여 빙온하에 30 분간 배양하였다. 음성 대조군으로서는 인간 혈청 알부민에 대한 인간 IgG1 항체를 사용하였고, 하이브리도마 배양 배지에서 2 ㎍/㎖의 농도로 제조하여, 50 ㎕씩 첨가한 후에 빙온하에 15 분간 배양하였다. SB로 세척한 후, 250배 희석한 R-PE 형광 표지 항-인간 항체 (서던 바이오테크놀러지) 50 ㎕를 첨가하여 빙온하에 15 분간 배양하였다. SB로 2회 세척한 후, 300 내지 500 ㎕의 FACS 완충액에 현탁시키고, FACS (FACSort 및 FACScan, 벡톤 디킨슨)로 각 세포의 형광 강도를 측정하였다. 그 결과, 라모스 세포주에 결합 활성을 갖는 항체를 선별하였다.
<실시예 5> 각 항체의 제조
하기 방법으로 모노클로날 항체를 포함하는 배양 상청액을 제조하였다.
G28-5 항체 생산 하이브리도마는 ATCC로부터 입수하였다 (ATCC 기탁번호: HB-9110). 항-CD40 항체 생산 하이브리도마를 소 인슐린 (5 ㎍/㎖, 깁코 비알엘), 인간 트랜스페린 (5 ㎍/㎖, 깁코 비알엘), 에탄올아민 (0.01 mM, 시그마), 셀레늄산나트륨 (2.5 ×10-5 nM, 시그마)을 함유하는 eRDF 배지 (고꾸도 세이야꾸 (Kyokutoseiyaku)) 중에 순응시켰다. 회전 플라스크에서 배양하여 하이브리도마의 생세포율이 90％가 된 시점에서 배양 상청액을 회수하였다. 10 ㎛ 및 0.2 ㎛의 필터 (게르만 사이언스 (German Science))를 사용하여 회수된 상청액에서 하이브리도마 등의 불순물을 제거하였다.
하기 방법으로 상기 배양 상청액으로부터 항-CD40 항체를 정제하였다. 항-CD40 항체를 포함하는 배양 상청액을 하이퍼 D 프로테인A (Hyper D ProteinA) 컬럼 (닛본 가이시)을 사용하거나 마우스 IgG1의 정제에 단백질 G 컬럼 (아머샴 파마시아 바이오테크 (Amersham Pharmacia Biotech))을 사용하고, 부속 설명서에 따라 흡착 완충액으로서 PBS(-)를 사용하고 용출 완충액으로서 0.1 M 시트르산나트륨 완충액 (pH 3)을 사용하여 친화성 정제를 수행하였다. 용출 분획물은 1 M 트리스-HCl (pH 8.0) 또는 Na2HPO4 용액을 첨가하여 pH 7.2 정도로 조정하였다. 제조된 항체 용액은 투석막 (10000 컷트, 스펙트럼 래보러토리즈 (Spectrum Laboratories)) 또는 SP 컬럼 (아머샴 파마시아 바이오테크)을 사용하여 PBS(-)로 교체하고, 공경 0.22 ㎛의 막 필터 밀렉스 (MILLEX)-GV (밀리포어 (MILLIPORE))로 여과 멸균하였다. 정제된 항체의 농도는 280 nm에서의 흡광도를 측정하여 1 mg/㎖를 1.45 OD로서 산출하였다.
<실시예 6> 라모스 세포에서의 항-CD40 아고니스트 항체에 의한 CD95 발현 촉진
5.0 ×105 개/㎖의 라모스 세포 현탁액을 96웰 플레이트에 100 ㎕/웰로 접종하였다 (1웰 당 5 ×104 개). 배지를 사용하여 하이브리도마 배양 상청액 또는 정제 항체를 20 ㎍/㎖로 희석하여, 96웰 플레이트에 100 ㎕/웰의 농도로 첨가하였다. 하룻밤 배양한 후, 세포를 모아 R-PE 표지 항-CD95 항체 (파민젠 엔제이 (Pharmingen NJ))를 사용한 FACSCan 또는 FACSsort (벡톤 디킨슨)를 이용하여 분석하였다. 도 1에 결과를 나타내었다. 도면의 횡축은 CD95의 발현 강도를 나타낸다. 항체 첨가를 굵은 선, 항체 미첨가를 가는 선으로 표시하였다. KM302-1 항체는 공지된 항체인 G28-5 항체에 비해 CD95 발현을 더욱 촉진하는 것으로 나타났다. 즉, KM302-1 항체가 더욱 효과적인 아고니스트인 것으로 밝혀졌다.
<실시예 7> 라모스 세포에서의 항-CD40 길항 항체에 의한 CD95 발현 억제
1.0 ×106 개/㎖의 라모스 세포 현탁액을 96웰 플레이트에 50 ㎕/웰로 접종하였다. 배지를 사용하여 하이브리도마 배양 상청액 또는 정제 항체를 2 ㎍/㎖로 조정하여, 96웰 플레이트에 100 ㎕/웰을 첨가하였다. 배지에 가용성 CD40 리간드 (알렉시스 코포레이션 (ALEXIS CORPORATION)) 4 ㎍/㎖ 및 항-FLAG 항체 (M2, 시그마) 4 ㎍/㎖를 첨가하고, 배지를 96웰 플레이트에 50 ㎕/웰씩 첨가하였다. 하룻밤 배양한 후, 세포를 모아 R-PE 표지 항-CD95 항체 (파민젠 엔제이)를 사용하고, FACS를 이용하여 분석하였다. 도 2A, 도 2B 및 도 3에 결과를 나타내었다. 도면의 횡축은 CD95의 발현 강도를 나타낸다. KM281-1-10, KM281-2-10-1-2, KM283-5, KM292-1-24, KM225-2-56의 각 하이브리도마가 생산한 항체에서는 음성 대조군과 동일한 수준으로 CD95의 발현이 억제되었다.
도 3에 있어서, 공지된 항체인 5D12 항체 (중앙 패널)가 CD95의 발현을 약간만 억제한 것에 비하여, KM281-1-10 항체 (하부 패널)는 CD95의 발현을 더욱 억제하는 것으로 나타났다. 즉, 더욱 효과적인 길항제인 것으로 나타났다. 따라서, 상기 인간 모노클로날 항체가 길항 항체인 것으로 밝혀졌다.
<항-면역글로불린 항체에 의한 가교의 영향>
1.0 ×106 개/㎖의 라모스 세포 현탁액을 96웰 플레이트에 50 ㎕/웰로 접종하였다. 배지를 사용하여 하이브리도마 배양 상청액 또는 정제 항체를 2 ㎍/㎖로 조정하여, 96웰 플레이트에 100 ㎕/웰을 첨가하였다. 항-인간 IgG 항체 (시그마, I3382) 또는 항-마우스 IgG 항체 (바이오소스 (Biosource), AMI3401) 4 ㎍/㎖를 배지에 첨가하고, 배지를 96웰 플레이트에 50 ㎕/웰씩 첨가하였다. 하룻밤 배양한 후, 세포를 모아 R-PE 표지 항-CD95 항체 (파민젠 엔제이)를 사용하고, FACS를 이용하여 분석하였다. 도 4 및 도 5에 결과를 나타내었다. 도면의 횡축은 CD95의 발현 강도를 나타낸다. KM281-1-10, KM281-2-10-1-2의 각 하이브리도마가 생산한 항체에서는 CD95의 발현이 억제되었다. 그러나, 이와는 반대로 5D12, KM283-5, KM292-1-24, KM225-2-56의 각 하이브리도마가 생산한 항체에서는 CD95의 발현이 증대되었다.
<실시예 8> 라모스 세포에서의 항-CD40 아고니스트 항체에 의한 증식 억제
1.0 ×105 개/㎖의 라모스 세포, HS-술톤 현탁액을 96웰 플레이트에 100 ㎕/웰로 접종하였다. 정제 항체 또는 가용성 CD40 리간드와 항-FLAG 항체 (M2)와의 등량 혼합물을 배지에 첨가하고, 2 일 동안 배양한 후에 100 μCi/㎖의 3H-티미딘 (아머샴 파마시아)을 10 ㎕ 첨가하였다. 18 시간 후, 마크로 96 수거기 (Macro 96 Harvester) (스카트론 (SKATRON))를 사용하여 프린티드 필터매트 A (Printed Filtermat A) (월랙 (Wallac))에 배양 생성물을 수거하고, 건조 후에는 베탭;신트 (Betap;Scint) (월랙)에 잘 침지시켜 패키징한 후에 1205 베타플레이트 (BETAPLATE) 액체 섬광계수기로 활성을 측정하였다. 도 6에 결과를 나타내었다. 도면의 종축은 세포의 3H 티미딘 혼입량을, 횡축은 배양액 중의 항체 또는 CD40L의 농도를 나타낸다. 라모스 세포와 HS-술톤 세포 모두에서, KM302-1 항체를 첨가한 경우에는 종래의 G28-5 항체나 CD40L에 비해 티미딘 혼입량이 적었고, KM302-1 항체가 종양 세포의 증식을 효과적으로 억제할 수 있는 아고니스트 항체인 것으로 밝혀졌다.
<실시예 9> CD40 아고니스트 항체에 의한 수상돌기 세포의 활성화
(1) 재료 및 방법
재조합 인간 IL-4는 겐자임 테크네 (Genzyme techne)사로부터 구입하였다. 항-인간 CD14 MACS 비드는 밀테나이 바이오테크 게엠베하 (Miltenyi Biotech GmbH)사로부터 구입하였다. 림포프렙 (Lymphoprep)은 니콤드 파마 에이에스 (Nycomed Pharma AS)로부터 구입하였다. 배양에 사용된 배지는 DC 유도시에는 RPMI1640 (깁코 비알엘)에 10％ 가열 비활성화된 FCS (셀 컬처 테크놀로지즈(Cell Culture Technologies)), 10 mM HEPES (시그마), 55 μM 2-메르캅토에탄올 (깁코 비알엘), 황산 스트렙토마이신 (메이지 세이까 (MEIJI SEIKA))를 첨가하여 사용하였다. 염색시의 세포 세척에는 2％ FCS (셀 컬처 테크놀로지즈), 0.02％ 아자이드 첨가 PBS (시그마)를 사용하였다. 세포 동결시에는 닛본 젠야꾸 고교 (Nippon Zenyaku kogyo)의 셀 뱅커 (Cell banker)를 사용하였다.
(2) 단구 유래 DC의 유도
말초혈로부터 림포프렙을 사용한 밀도 구배 원심에 의해 단핵구를 제조하였다 (PBMC). 이것을 항-인간 CD14 MACS 비드에서 양성 선별함으로써 CD14 양성 분획물과 음성 분획물로 분리하였다. 양성 분획물에 재조합 인간 GM-CSF (50 ng/㎖)와 재조합 인간 IL-4 (100 ng/㎖)을 첨가하고, 6웰 플레이트에서 10％ FCS를 첨가한 RPMI1640 배지 중에 배양하였다. 배양 시작시에는 세포를 농도 1 ×106/㎖로 1웰에 3 ㎖씩 배양하였다. 배양하는 동안에는 2 일에 1회씩 배지를 교환하였다. 배지 교환은 배양액의 10％를 원심분리 튜브에 넣고 원심분리하여 상청액을 제거한 후, 넣은 배양액의 2배 용량의 새로운 배양액 (사이토카인 등을 상기 농도로 포함함)으로 현탁시켜 각 웰로 복귀시켰다. 배양 6 일째에는 세포를 회수하여 세포수를 계산한 후, 세포를 상기 배지 중에 1 ×106/㎖의 농도로 현탁시켰고, 항-CD40 항체 또는 그의 이소형 대조군을 상기 배지에 첨가하고 24웰 플레이트에서 4 일간 더 배양하였다. 이 기간 동안에는 배지를 교환하지 않았다 (1웰 당 세포수 1 ×106 개, 세포 농도 1 ×106 개/㎖).
(3) 세포 염색 및 유식세포측정법에 의한 분석
염색에는 항-HLA-DR 항체 (이소형 대조군: 래트 IgG2a), 항-CD86 항체 (이소형 대조군: 래트 IgG1), 항-CD83 항체 (이소형 대조군: 래트 IgG2b)를 사용하였다. 우선, 항체를 첨가하여 4℃에서 30 분 동안 배양한 후, 3회 세척하고 벡톤 디킨슨의 FACS 칼리버 (Calibur)를 사용하여 분석하였다.
(4) 성숙 DC의 IL-12 분비능 증가
상기와 같이 미성숙 DC를 얻은 후, LPS (400 pg/㎖)와 IFNγ (10-3 M)를 첨가하고 2 일간 더 배양한 후에 성숙 DC를 얻었다. 여기에 항-CD40 항체 또는 이소형 대조군 10 ㎍/㎖를 첨가하고, 24 시간 후의 상청액에 대하여 IL-12의 생산을 ELISA (파민젠)로 측정하였다.
(5) 결과 및 고찰
아고니스트 항체인 KM302-1 항체가 DC의 성숙에 미치는 영향을 도 7에 나타내었고, 성숙 DC의 IL-12 생산에 미치는 영향을 도 8에 나타내었다. G28-5 항체를 대조군으로 하여 성숙 정도를 비교하였다. CD86 및 HLA-DR의 발현을 조사한 결과, KM302-1 항체의 경우가 G28-5 항체에 비해 발현을 더욱 상승, 즉 성숙도를 증가시키는 것으로 나타났다. 또한, 성숙 DC에 KM302-1 항체를 처리함으로써 IL-12의 분비가 증가되는 것으로 나타났다. 따라서, KM302-1 항체가 DC에 대한 아고니스트 항체로서 작용한다는 것이 밝혀졌다.
<실시예 10> DC-MLR
정상 인간으로부터 채취한 혈액 (말초혈)을 2000 rpm에서 10 분 동안 원심분리하여 혈청을 취하였다. 혈구 분획물을 PBS에 재현탁하여 피콜 (Ficoll) (아머샴 파마시아)에 서서히 넣었다. 2000 rpm에서 30 분 동안 원심분리하여 중간층의 PBMC 부분을 회수하였다. PBS로 2회 세척한 후, 특정 세포 분리에 MACS를 사용하였다.
MACS (밀테나이 바이오텍 게엠베하)를 첨부된 설명서에 따라 사용하여, DC 배양을 위한 단구를 분리하였다. 간단히 설명하면, PBMC 1 ×108 개에 MACS 완충액 800 ㎕, MACS CD14 (밀테나이 바이오텍 게엠베하, 502-01) 200 ㎕를 첨가하여 4℃에서 15 분 동안 처리하였다. MACS LS 컬럼에 세포를 흡착시키고 세척하였다. 컬럼에 흡착된 세포를 단구로서 회수하였다. 컬럼에 흡착하지 않은 세포에 MACS HLA-DR (밀테나이 바이오텍 게엠베하, 461-01)을 첨가하고, BS 컬럼으로 HLR-DR 양성 세포를 제거하여 T-세포 분획물을 얻었다. CD3 양성 세포의 비율을 FACS로 계측하고, T-세포 분획물 전체의 세포수로부터 실질적인 T-세포수를 산출하였다. 수득한 단구는 6웰 배양 접시에 100 ng/㎖ IL-4 (R＆D 시스템 (R＆D system)), 50 ng/㎖ G-CSF (기린), 10％ FCS (시그마)를 포함하는 R0배지 (PPMI 배지에 β-메르캅토에탄올 (깁코), HEPES (시그마)를 첨가함)에서 1 ×106 세포/㎖ 농도로 배양하였다. 배양 5 일 후에 10 ng/㎖ LPS (디프코)를 첨가하여 성숙 DC로 분화시켰다.
다른 인간으로부터 분리한 T-세포와 성숙 DC를 혼합하여 MLR을 수행하였다. T-세포/DC의 세포비를 1:80으로 하고, T-세포수는 2 ×105 세포/웰로 하였다. 먼저, DC에 항체를 첨가하여 30 분간 반응시켰다. 이어서, T-세포를 첨가하여 4 일 동안 배양한 후에 100 μCi/㎖의 3H-티미딘 (아머샴 파마시아) 10 ㎕를 첨가하였다. 14 시간 후, 마크로 96 수거기 (스카트론)를 사용하여 프린티드 필터매트 A (월랙)에 세포를 수거하고, 건조 후에는 베탭;신트 (월랙)에 잘 침지시켜 패키징한 후에 1205 베타플레이트 액체 섬광계수기로 활성을 측정하였다. 또한, 미성숙 DC를 사용한 MLR은 다른 인간으로부터 단리한 T-세포와 성숙 DC를 혼합하여 수행하였다. T-세포/DC의 세포비를 각각 1:40으로 하여 상기와 유사하게 MLR을 수행하였다. 도 9 및 도 10에 결과를 나타내었다. KM281-1-10 항체의 첨가에 의해 티미딘의 혼입량이 감소되어 MLR이 억제되는 것으로 나타났다. 추가로, KM283-5 및 5D12 항체는 DC-MLR을 억제할 수 없고, 즉 KM281-1-10 항체만이 DC에 대한 CD40 리간드의 작용을 중화시키는 길항 항체인 것으로 나타났다 (도 10). 또한, 아고니스트 항체인 KM302-1 항체가 미성숙 DC를 사용한 MLR에 미치는 영향을 조사한 결과를 도 11에 나타내었다. DC가 활성화됨으로써 T-세포와의 상호작용이 촉진되고 티미딘의 혼입량이 증가되었다. 이로부터 KM302-1은 미성숙 DC에 작용하는 아고니스트 항체인 것으로 밝혀졌다.
<실시예 11> CD40L와 CD40의 결합에 대한 CD40 항체의 영향
BIAcore 2000 (비아코어)를 사용하여 항-CD40 항체를 고정시킨 CD40 인간 FC에 결합시킨 후, 가용성 CD40L와 CD40의 결합량 변화를 측정하였다. 장치에 부속된 설명서에 따라, 가용성 CD40 인간 FC를 CM 칩 (CM5, 비아코어)에 고정시켰다. 이어서, 25 ㎍/㎖의 항-CD40 항체를 첨가하여 CD40에 결합시켰다. 또한, 10 ㎍/㎖의 가용성 CD40L을 첨가하여 결합시켰다. CD40L 첨가 전후의 결합량 차이를 측정하였다. 대조군 IgG를 첨가한 경우, CD40L의 결합량은 100 RU였다. KM302-1 항체 첨가 후의 CD40L 결합량은 110 RU였고, KM283-5 항체 첨가 후에는 18 RU였다. 이로부터, KM302-1 항체는 CD40L와 CD40의 결합을 저해하지 않는 것으로 밝혀졌다.
<실시예 12> 항-CD40 아고니스트 항체에 의한, 라모스 세포에서의 CD95 발현 촉진
실시예 4에서 얻은 하이브리도마의 정제 항체를 실시예 6의 방법에 따라 분석하여, 아고니스트 항체를 생산하는 클론을 선별하였다 (1웰 당 세포수 5 ×104 개, 세포 농도 2.5 ×105 개/㎖). 도 12에 결과를 나타내었다. 도면의 횡축은 배양액 중의 항체 농도를 나타내고, 종축은 평균 형광 강도, 즉 CD95 발현 강도를 나타낸다. KM341-1-19, 2105 항체는 0.01 ㎍/㎖ 이상의 농도에서 공지된 마우스 항체인 G28-5 항체에 비해 라모스 세포의 CD95 발현을 더욱 효과적으로 촉진시키는 것으로 나타났다. 즉, 더욱 효과적인 아고니스트 항체인 것으로 나타났다. 추가로, 라모스 세포에서 CD95 발현을 증진시키는 아고니스트 활성은 KM341-1-19 및 2105 항체 (0.01 ㎍/㎖)의 경우가 G28-5 항체 (10 ㎍/㎖)의 경우보다 높았다 (도 12). 각각의 항체 농도에서, G28-5 항체를 첨가한 경우의 CD95 발현량의 몇배에 상당하는가를 표 5에 요약하였다.
<실시예 13> CD40 아고니스트 항체에 의한 수상돌기 세포의 활성화
실시예 9의 방법에 따라서, CD40 아고니스트 항체가 성숙 DC의 IL-12 및 IL-10 생산에 미치는 영향을 조사하였다. IL-10은 ELISA (파민젠)로 측정하였다. 도 13 및 도 14에 결과를 나타내었다. KM341-1-19 항체를 처리하면 IL-12의 분비가 증가되는 것으로 나타났다. 한편, 5000 rad의 X선을 조사한 CD40 리간드 발현 재조합 L 세포 2 ×105 개/㎖를 공존시킨 경우일지라도, 배양액 중 IL-12와 IL-10의 농도는 각각 254 pg/㎖ 및 51 pg/㎖로서, KM341-1-19 항체 1 ㎍/㎖를 첨가한 경우보다 적었다.
이상으로부터 KM341-1-19 항체가 DC에 대하여 효과적인 아고니스트 항체로서 작용하는 것으로 밝혀졌다. 성숙 DC에 IL-12를 분비시키는 아고니스트 활성은 KM341-1-19 항체 (0.1 ㎍/㎖)의 경우가 G28-5 항체 (100 ㎍/㎖)의 경우보다 높았고, 성숙 DC가 IL-12를 분비하도록 하는 아고니스트 활성은 KM341-1-19 항체 (1 ㎍/㎖)의 경우가 G28-5 항체 (100 ㎍/㎖)의 경우보다 100배 이상 높았다 (도 13). 또한, 성숙 DC가 IL-10을 분비하도록 하는 아고니스트 활성은 KM341-1-19 항체 (1 ㎍/㎖)의 경우가 G28-5 항체 (100 ㎍/㎖)의 경우보다 10배 이상 높았다 (도 14). 또한, KM341-1-19 항체의 서브클래스가 IgG2였기 때문에, IgG1이나 IgG3보다 Fc 수용체에 대한 결합성이 낮고, NK 세포의 사멸 활성의 감작이나 보체 시스템의 활성화 능력도 약하였다. 이로부터, 항체에 의해 CD40 발현 세포의 기능 또는 세포의 수 자체가 감소해 버릴 위험성이 낮다고 생각할 수 있다. 또한, Fc 수용체에 의해 가교되기 어렵기 때문에, 체내에서의 아고니스트 활성이 가교에 의해 크게 변동되지 않으므로 약효를 제어하기 쉬울 것으로 기대된다.
<실시예 14> 항-CD40 길항 항체에 의한, 라모스 세포에서의 CD95 발현 억제
1.0 ×106 개/㎖의 라모스 세포 현탁액을 평평한 바닥 96웰 플레이트에 50 ㎕/웰로 접종하였다 (1웰 당 세포수 5 ×104 개). 배지로 희석시킨 정제 항체를 96웰 플레이트에 100 ㎕/웰로 첨가하였다. 인간 CD40 리간드를 발현하는 재조합 마우스 L 세포 ([Sriggs, M. K. et. al. J. Exp. Med., 176:1543, 1992], [Garrone, P. et. al. J. Exp. Med., 182:1265, 1995] 등 참조)를 1.0 ×105 개/㎖로 제조하고, 50 ㎕/웰로 첨가하였다 (1웰 당 라모스 세포의 세포수 5 ×104 개, 세포 농도 2.5 ×105 개/㎖, 1웰 당 마우스 L 세포의 세포수 5 ×103 개, 세포 농도 2.5 ×10 4 개/㎖). 하룻밤 배양한 후에 세포를 모으고, R-PE 표지된 항-CD95 항체를 사용한 FACS로 분석하였다. 도 15에 결과를 나타내었다. 도면의 종축은 평균 형광 강도, 즉 CD95의 발현 강도를 나타낸다. 공지된 항체인 5D12 항체가 CD95의 발현을 약간만 억제한 것에 비해, 4D11 항체는 0.1 ㎍/㎖의 농도에서도 CD40L 발현 세포를 첨가하지 않은 음성 대조군과 동일한 수준으로 CD95의 발현을 억제하였다. 또한, 4D11, F4-465 및 KM281-1-10은 1 ㎍/㎖의 농도에서 CD40L 발현 세포를 첨가하지 않은 음성 대조군과 동일한 수준으로 CD95 발현을 억제하였다. 이로써 4D11, F4-465 및 KM281-1-10 항체가 더욱 효과적인 길항 항체인 것으로 밝혀졌다. 길항 항체를 첨가하지 않은 대조군의 평균 형광 강도를 100으로 하고, 각각의 항체 농도에서의 평균 형광 강도를 이에 대한 상대치로 표 6에 나타내었다.
<실시예 15> 항-CD40 아고니스트 항체에 의한 라모스 세포 이식 모델에서의 항종양 효과
생후 5 주령의 C.B.17/Icr-scidJc1 마우스 (닛본 구레아)에 항-아시알로 GM1 항체를 정맥내 주사하였다. 1 일 후에는 종양 세포로서의 라모스 세포를 마우스 1 마리 당 5 ×106 개씩 정맥내 주사하였다. 1 일 후에는 KM302-1 항체 또는 음성 대조군으로서의 항-인간 알부민 인간 IgG 항체를 정맥내 주사하였다. 투여량은 마우스 1 마리 당 KM302-1 항체 1, 10, 100 ㎍ 및 음성 대조군 항체 100 ㎍이었고, 각각 5 마리의 마우스에 1회씩 투여하였다. 결과를 도 16에 나타내었다. 음성 대조 투여군은 이식 34 일 후에 모두 사망하였으나 KM302-1 항체 10 ㎍ 및 100 ㎍을 투여한 군에서는 5 마리 모두 생존하였으므로, KM302-1 항체의 항종양 효과가 확인되었다. KM302-1 항체는 IgG4 서브클래스라서 Fc 수용체를 통한 항체 의존성 세포내 세포독성 (ADCC)이나 보체 시스템의 활성화가 약함에도 불구하고, 10 ㎍의 1회 투여로도 종양을 보유하는 마우스의 생존 기간을 연장시킨 것으로 밝혀졌다.
<실시예 16> 항-CD40 아고니스트 항체에 의한 라모스 세포의 증식 억제
10％ FBS를 첨가한 RPMI1640 배지 중에 1 ×104 개/㎖로 제조한 라모스 세포 현탁액 100 ㎕를 96웰 플레이트에 분주하고, 배지를 사용하여 20 ㎍/㎖로 제조한 KM341-1-19 항체 또는 가용성 리간드 용액을 첨가하였다. 가용성 리간드에는 이와 동일한 농도 (반응 용액 중 10 ㎍/㎖의 농도)의 항-FLAG 항체 (M2)를 공존시켜, 이들의 활성을 강화시켰다. 5 일간 배양한 후, 각 웰에 20 ㎕의 MTS 시약 (프로메가)을 첨가하여 2 내지 3 시간 동안 반응시켰다. 파장 490 nm에서 세포 또는 항체를 포함하지 않는 배지 단독 웰과의 흡광도 차이를 측정하여 생존 세포수를 측정하였다. 추가로, 이와 동일하게 96웰 U 바닥 플레이트를 사용하여, 증식 억제 작용을 G28-5 항체와 비교하였다. 배지를 사용하여 2 ㎍/㎖로 제조한 KM341-1-19 항체 또는 G28-5 항체를 첨가하였다. 결과를 도 17에 나타내었다. KM341-1-19 항체를 첨가한 웰에서는 사멸 세포가 관찰되었고, 상기 웰에서는 G28-5 항체 또는 리간드를 첨가한 웰에 비해 세포수가 현저히 적고 흡광도도 낮아졌으며, 종양 세포의 증식이 억제되고 세포 사멸이 유도된 것으로 나타났다.
<실시예 17> 항체 유전자의 cDNA 클로닝
KM341-1-19, 2105, 110, 115, KM281-1-10, 4D11, KM643-4-11, F4-465, F2-103, F5-77 항체를 생산하는 하이브리도마를 배양하고, 원심분리하여 세포를 수집하였다. 여기에 트리졸 (TRIZOL) (깁코 비알엘)을 첨가하고 취급 설명서에 따라 전체 RNA를 추출하였다. 클론테크 (CLONTECH)의 스마트 레이스 (SMART RACE) cDNA 증폭 키트를 첨부된 설명서에 따라 사용하여, 항체 cDNA의 가변 영역을 클로닝하였다. 5 ㎍의 전체 RNA를 주형으로 하여 cDNA의 제1 가닥을 제조하였다. KM341-1-19, 2105, 110, 115, KM281-1-10, 4D11, KM643-4-11, F2-103 및 F5-77 중쇄 (H쇄)를 증폭시키기 위해, 다까라 (Takara) 제품인 Z-Taq를 사용하여 UMP와 hh6 프라이머로 98℃에서 1 초, 68℃에서 30 초의 사이클을 30회 반복하였다. 또한, 이 반응액 1 ㎕를 주형으로 하고, NUMP와 hh3 프라이머를 사용하여 98℃에서 1 초, 68℃에서 30 초의 사이클을 20회 반복하였다. F4-465 중쇄를 증폭시키기 위해, UMP와 hh2 프라이머를 사용하고 어드밴티지 (Advantage) 2 PCR 키트 (클론테크, 카탈로그 번호 1910)를 사용하여 94℃에서 5 초, 72℃에서 3 분의 5회 사이클, 94℃에서 5 초, 70℃에서 0 초, 72℃에서 3 분의 5회 사이클, 94℃에서 5 초, 68℃에서 10 초, 72℃에서 3 분의 25회 사이클을 수행하였다.
이어서, 증폭된 PCR 산물을 PCR 정제 키트 (퀴아젠 (QIAGEN))로 정제하고, hh4를 프라이머로 하여 염기 서열을 결정하였다. 별법으로, PCR-스크립트 (PCR-Script) (미국 캘리포니아주 라졸라에 소재하는 스트라타젠 (Stratagene)) 또는 PCR-블런트 (PCR-Blunt) (미국 캘리포니아주 칼스배드에 소재하는 인비트로젠)로 서브클로닝하여 서열결정을 수행하였다. 서열 정보를 기초로 항체 중쇄 특이적 프라이머를 합성하였다. KM341-1-19의 경우에는 341H 프라이머, 2105의 경우에는 2105Hsal 프라이머, 110, 115의 경우에는 110Hsal 프라이머, KM281-1-10의 경우에는 281Hsal 프라이머, 4D11의 경우에는 4D11Sal 프라이머, KM643-4-11의 경우에는 643Hsal 프라이머, F4-465의 경우에는 H11-9 5' 프라이머, F2-103의 경우에는 F2-103H 프라이머, F5-77의 경우에는 F5-77H 프라이머를 합성하였다. 항체 중쇄 특이적 프라이머 및 hh4를 사용하여 cDNA의 제1 가닥으로부터 cDNA를 증폭시키고, 이것을 주형으로 하여 항체 특이적 프라이머를 사용하여 역방향으로부터의 서열을 결정하였다.
KM341-1-19, 2105, 110, 115, KM281-1-10, 4D11, KM643-4-11, F2-103, F5-77의 경쇄 (L쇄)는 UMP와 hk2 프라이머를 사용하여 98℃에서 1 초, 68℃에서 30 초의 사이클을 30회 반복하여 증폭시켰다. F4-465의 경쇄는 UMP와 hL2 프라이머를 사용하여 98℃에서 1 초, 68℃에서 30 초의 사이클을 30회 반복하여 증폭시켰다. 증폭된 PCR 산물을 PCR 정제 키트로 정제하고, hk6 또는 hL2 프라이머를 사용하여 염기 서열을 결정하였다. 이 서열을 기초로 경쇄 특이적 프라이머를 합성하였다. KM341-1-19의 경우에는 341K 프라이머, 2105의 경우에는 2053KBgl 프라이머, 110, 115의 경우에는 110KBgl 프라이머, KM281-1-10의 경우에는 281KBgl 프라이머, 4D11의 경우에는 4D11KBgl, KM643-4-11의 경우에는 643KBgl 프라이머, F4-465의 경우에는 람다 5' 프라이머, F-103, F5-77의 경우에는 F2-103K 프라이머를 합성하였다.
341-1-19, 110, 115, KM643-4-11, KM281-1-10, 4D11, 2105의 경우에는, 경쇄 특이적 프라이머와 hk6 프라이머를 사용하여 cDNA의 제1 가닥으로부터 cDNA를 증폭시키고, 이것을 주형으로 하여 양방향에서의 서열을 결정하였다. F4-465, F2-103, F5-77의 경우에는 PCR 스크립트 (미국 캘리포니아주 라졸라에 소재하는 스트라타젠) 또는 PCR-블런트 (미국 캘리포니아주 칼스배드에 소재하는 인비트로젠)로 서브클로닝하여 서열을 결정하였다.
전장 H쇄와 L쇄 가변 영역을 코딩하는 341-1-19의 DNA 및 H쇄와 L쇄의 아미노산 서열을 각각 이하에 나타내었다.
H쇄 DNA의 번역 개시점은 서열 27의 5' 말단에서 50번째인 아데닌 (A)에서 시작되는 ATG 코돈이고, 종결 코돈은 1472번째인 티민 (T)에서 시작되는 TGA이다. 항체 가변 영역과 불변 영역의 경계는 5' 말단에서 493번째인 아데닌 (A)과 494번째인 구아닌 (G) 사이에 위치한다. 아미노산 서열에 있어서, H쇄 가변 영역은 서열 28의 N-말단부터 148번째인 세린 (S) 잔기까지이고, 불변 영역은 149번째인 알라닌 (A) 및 이후의 잔기들이다. 유전자 서열 예측 소프트웨어 (Signal P ver.2)에 따르면, H쇄 신호 서열은 서열 28의 N-말단부터 20번째인 세린 (S)까지인 것으로 예측되었다. 성숙 단백질의 N-말단은 서열 28의 21번째인 글루타민 (Q)인 것으로 여겨진다.
L쇄 DNA의 번역 개시점은 서열 29의 5' 말단에서 29번째인 A에서 시작되는 ATG 코돈이고, 가변 영역은 5' 말단부터 400번째인 아데닌 (A)까지이다. 아미노산 서열에 있어서, 가변 영역은 서열 30의 N-말단부터 124번째인 리신 (K)까지이다. 정제된 L쇄 단백질의 N-말단 분석에 의해, L쇄 신호 서열은 서열 30의 N-말단부터 20번째인 글리신 (G)까지이고, 성숙 단백질의 N-말단은 서열 30의 21번째인 글루타민산 (E)인 것이 밝혀졌다.
H쇄 가변 영역과 L쇄 가변 영역을 코딩하는 2105의 DNA 및 H쇄와 L쇄의 아미노산 서열을 각각 이하에 나타내었다.
H쇄 DNA의 번역 개시점은 서열 31의 5' 말단에서 70번째인 아데닌 (A)에서 시작되는 ATG 코돈이고, 항체 가변 영역과 불변 영역의 경계는 5' 말단에서 495번째인 아데닌 (A)과 496번째인 구아닌 (G) 사이에 위치한다. 아미노산 서열에 있어서, H쇄 가변 영역은 서열 32의 N-말단부터 142번째인 세린 (S) 잔기까지이고, 불변 영역은 149번째인 알라닌 (A) 및 이후의 잔기들이다. 유전자 서열 예측 소프트웨어 (Signal P ver.2)에 따르면, H쇄 신호 서열은 서열 32의 N-말단부터 19번째인 시스테인 (C)까지인 것으로 예측되었다. 성숙 단백질의 N-말단은 서열 32의 20번째인 글루탐산 (E)인 것으로 여겨진다.
L쇄 DNA의 번역 개시점은 서열 33의 5' 말단에서 28번째인 A에서 시작되는 ATG 코돈이고, 가변 영역은 5' 말단부터 405번째인 아데닌 (A)까지이다. 아미노산 서열에 있어서, 가변 영역은 서열 34의 N-말단부터 126번째인 리신 (K)까지이다. 유전자 서열 예측 소프트웨어 (Signal P ver.2)에 따르면, L쇄 신호 서열은 서열 34의 N-말단부터 20번째인 글리신 (G)까지인 것으로 예측되었다. 성숙 단백질의 N-말단은 서열 34의 21번째인 글루탐산 (E)인 것으로 여겨진다.
H쇄 가변 영역과 L쇄 가변 영역을 코딩하는 110의 DNA 및 H쇄와 L쇄의 아미노산 서열을 각각 이하에 나타내었다.
H쇄 DNA의 번역 개시점은 서열 35의 5' 말단에서 60번째인 아데닌 (A)에서 시작되는 ATG 코돈이고, 항체 가변 영역과 불변 영역의 경계는 5' 말단에서 479번째인 아데닌 (A)과 480번째인 구아닌 (G) 사이에 위치한다. 아미노산 서열에 있어서, H쇄 가변 영역은 서열 36의 N-말단부터 140번째인 세린 (S) 잔기까지이고, 불변 영역은 141번째인 알라닌 (A) 및 이후의 잔기들이다. 유전자 서열 예측 소프트웨어 (Signal P ver.2)에 따르면, H쇄 신호 서열은 서열 36의 N-말단부터 19번째인 시스테인 (C)까지인 것으로 예측되었다. 성숙 단백질의 N-말단은 서열 36의 20번째인 글루타민 (Q)인 것으로 여겨진다.
L쇄 DNA의 번역 개시점은 서열 37의 5' 말단에서 35번째인 A에서 시작되는 ATG 코돈이고, 가변 영역은 5' 말단부터 421번째인 아데닌 (A)까지이다. 아미노산 서열에 있어서, 가변 영역은 서열 38의 N-말단부터 129번째인 리신 (K)까지이다. 유전자 서열 예측 소프트웨어 (Signal P ver.2)에 따르면, L쇄 신호 서열은 서열 38의 N-말단부터 22번째인 시스테인 (C)까지인 것으로 예측되었다. 성숙 단백질의 N-말단은 서열 38의 23번째인 발린 (V)인 것으로 여겨진다.
H쇄 가변 영역과 L쇄 가변 영역을 코딩하는 115의 DNA 및 H쇄와 L쇄의 아미노산 서열을 각각 이하에 나타내었다.
H쇄 DNA의 번역 개시점은 서열 39의 5' 말단에서 60번째인 아데닌 (A)에서 시작되는 ATG 코돈이고, 항체 가변 영역과 불변 영역의 경계는 5' 말단에서 479번째인 아데닌 (A)과 480번째인 구아닌 (G) 사이에 위치한다. 아미노산 서열에 있어서, H쇄 가변 영역은 서열 40의 N-말단부터 140번째인 세린 (S) 잔기까지이고, 불변 영역은 141번째인 알라닌 (A) 및 이후의 잔기들이다. 유전자 서열 예측 소프트웨어 (Signal P ver.2)에 따르면, H쇄 신호 서열은 서열 40의 N-말단부터 19번째인 시스테인 (C)까지인 것으로 예측되었다. 성숙 단백질의 N-말단은 서열 40의 20번째인 글루타민 (Q)인 것으로 여겨진다.
L쇄 DNA의 번역 개시점은 서열 41의 5' 말단에서 35번째인 A에서 시작되는 ATG 코돈이고, 가변 영역은 5' 말단부터 421번째인 아데닌 (A)까지이다. 아미노산 서열에 있어서, 가변 영역은 서열 42의 N-말단부터 129번째인 리신 (K)까지이다. 유전자 서열 예측 소프트웨어 (Signal P ver.2)에 따르면, L쇄 신호 서열은 서열 42의 N-말단부터 22번째인 시스테인 (C)까지인 것으로 예측되었다. 성숙 단백질의 N-말단은 서열 42의 23번째인 발린 (V)인 것으로 여겨진다.
H쇄 가변 영역과 L쇄 가변 영역을 코딩하는 281-1-10의 DNA 및 H쇄와 L쇄의 아미노산 서열을 각각 이하에 나타내었다.
H쇄 DNA의 번역 개시점은 서열 43의 5' 말단에서 52번째인 아데닌 (A)에서 시작되는 ATG 코돈이고, 항체 가변 영역과 불변 영역의 경계는 5' 말단에서 468번째인 아데닌 (A)과 469번째인 구아닌 (G) 사이에 위치한다. 아미노산 서열에 있어서, H쇄 가변 영역은 서열 44의 N-말단부터 139번째인 세린 (S) 잔기까지이고, 불변 영역은 140번째인 알라닌 (A) 및 이후의 잔기들이다. 유전자 서열 예측 소프트웨어 (Signal P ver.2)에 따르면, H쇄 신호 서열은 서열 44의 N-말단부터 19번째인 세린 (S)까지인 것으로 예측되었다. 성숙 단백질의 N-말단은 서열 44의 20번째인 글루타민 (Q)인 것으로 여겨진다.
L쇄 DNA의 번역 개시점은 서열 45의 5' 말단에서 41번째인 A에서 시작되는 ATG 코돈이고, 가변 영역은 5' 말단부터 424번째인 아데닌 (A)까지이다. 아미노산 서열에 있어서, 가변 영역은 서열 46의 N-말단부터 128번째인 리신 (K)까지이다. 유전자 서열 예측 소프트웨어 (Signal P ver.2)에 따르면, L쇄 신호 서열은 서열 46의 N-말단부터 20번째인 글리신 (G)까지인 것으로 예측되었다. 성숙 단백질의 N-말단은 서열 46의 21번째인 글루탐산 (E)인 것으로 여겨진다.
H쇄 가변 영역과 L쇄 가변 영역을 코딩하는 4D11의 DNA 및 H쇄와 L쇄의 아미노산 서열을 각각 이하에 나타내었다.
H쇄 DNA의 번역 개시점은 서열 47의 5' 말단에서 16번째인 아데닌(A)에서 시작되는 ATG 코돈이고, 항체 가변 영역과 불변 영역의 경계는 5' 말단에서 456번째인 아데닌 (A)과 457번째인 구아닌 (G) 사이에 위치한다. 아미노산 서열에 있어서, H쇄 가변 영역은 서열 48의 N-말단부터 147번째인 세린 (S) 잔기까지이고, 불변 영역은 148번째인 알라닌 (A) 및 이후의 잔기들이다. 유전자 서열 예측 소프트웨어 (Signal P ver.2)에 따르면, H쇄 신호 서열은 서열 48의 N-말단부터 26번째인 세린 (S)까지인 것으로 예측되었다. 성숙 단백질의 N-말단은 서열 48의 27번째인 글루타민 (Q)인 것으로 여겨진다.
L쇄 DNA의 번역 개시점은 서열 49의 5' 말단에서 59번째인 A에서 시작되는 ATG 코돈이고, 가변 영역은 5' 말단부터 442번째인 아데닌 (A)까지이다. 아미노산 서열에 있어서, 가변 영역은 서열 50의 N-말단부터 128번째인 리신 (K)까지이다. 유전자 서열 예측 소프트웨어 (Signal P ver.2)에 따르면, L쇄 신호 서열은 서열 50의 N-말단부터 22번째인 시스테인 (C)까지인 것으로 예측되었다. 성숙 단백질의 N-말단은 서열 50의 21번째인 알라닌 (A)인 것으로 여겨진다.
H쇄 가변 영역과 L쇄 가변 영역을 코딩하는 KM643-4-11의 DNA 및 H쇄와 L쇄의 아미노산 서열을 각각 이하에 나타내었다.
H쇄 DNA의 번역 개시점은 서열 51의 5' 말단에서 1번째인 아데닌 (A)에서 시작되는 ATG 코돈이고, 항체 가변 영역과 불변 영역의 경계는 5' 말단에서 447번째인 아데닌 (A)과 448번째인 구아닌 (G) 사이에 위치한다. 아미노산 서열에 있어서, H쇄 가변 영역은 서열 52의 N-말단부터 149번째인 세린 (S) 잔기까지이고, 불변 영역은 150번째인 알라닌 (A) 및 이후의 잔기들이다. 유전자 서열 예측 소프트웨어 (Signal P ver.2)에 따르면, H쇄 신호 서열은 서열 52의 N-말단부터 20번째인 세린 (S)까지인 것으로 예측되었다. 성숙 단백질의 N-말단은 서열 52의 21번째인 글루타민 (Q)인 것으로 여겨진다.
L쇄 DNA의 번역 개시점은 서열 53의 5' 말단에서 38번째인 A에서 시작되는 ATG 코돈이고, 가변 영역은 5' 말단부터 409번째인 아데닌 (A)까지이다. 아미노산 서열에 있어서, 가변 영역은 서열 54의 N-말단부터 124번째인 리신 (K)까지이다. 유전자 서열 예측 소프트웨어 (Signal P ver.2)에 따르면, L쇄 신호 서열은 서열 54의 N-말단부터 20번째인 글리신 (G)까지인 것으로 예측되었다. 성숙 단백질의 N-말단은 서열 54의 21번째인 글루탐산 (E)인 것으로 여겨진다.
H쇄 가변 영역과 L쇄 가변 영역을 코딩하는 F4-465의 DNA 및 H쇄와 L쇄의 아미노산 서열을 각각 이하에 나타내었다.
H쇄 DNA의 번역 개시점은 서열 55의 5' 말단에서 47번째인 아데닌 (A)에서 시작되는 ATG 코돈이고, 항체 가변 영역과 불변 영역의 경계는 5' 말단에서 484번째인 아데닌 (A)과 445번째인 구아닌 (G) 사이에 위치한다. 아미노산 서열에 있어서, H쇄 가변 영역은 서열 56의 N-말단부터 146번째인 세린 (S) 잔기까지이고, 불변 영역은 147번째인 알라닌 (A) 및 이후의 잔기들이다. 유전자 서열 예측 소프트웨어 (Signal P ver.2)에 따르면, H쇄 신호 서열은 서열 56의 N-말단부터 19번째인 세린 (S)까지인 것으로 예측되었다. 성숙 단백질의 N-말단은 서열 56의 20번째인 글루타민 (Q)인 것으로 여겨진다.
L쇄 DNA의 번역 개시점은 서열 57의 5' 말단에서 81번째인 A에서 시작되는 ATG 코돈이고, 가변 영역은 5' 말단부터 440번째인 (C)까지이다. 아미노산 서열에 있어서, 가변 영역은 서열 58의 N-말단부터 120번째인 트레오닌 (T)까지이다. 유전자 서열 예측 소프트웨어 (Signal P ver.2)에 따르면, L쇄 신호 서열은 서열 58의 N-말단부터 19번째인 알라닌 (G)까지인 것으로 예측되었다. 성숙 단백질의 N-말단은 서열 58의 20번째인 세린 (S)인 것으로 여겨진다.
H쇄 가변 영역과 L쇄 가변 영역을 코딩하는 F2-103의 DNA 및 H쇄와 L쇄의 아미노산 서열을 각각 이하에 나타내었다.
H쇄 DNA의 번역 개시점은 서열 59의 5' 말단에서 32번째인 아데닌 (A)에서 시작되는 ATG 코돈이고, 항체 가변 영역과 불변 영역의 경계는 5' 말단에서 463번째인 아데닌 (A)과 464번째인 구아닌 (G) 사이에 위치한다. 아미노산 서열에 있어서, H쇄 가변 영역은 서열 60의 N-말단부터 144번째인 세린 (S) 잔기까지이고, 불변 영역은 145번째인 알라닌 (A) 및 이후의 잔기들이다. 유전자 서열 예측 소프트웨어 (Signal P ver.2)에 따르면, H쇄 신호 서열은 서열 60의 N-말단부터 19번째인 시스테인 (C)까지인 것으로 예측되었다. 성숙 단백질의 N-말단은 서열 60의 20번째인 글루탐산 (E)인 것으로 여겨진다.
L쇄 DNA의 번역 개시점은 서열 61의 5' 말단에서 29번째인 A에서 시작되는 ATG 코돈이고, 가변 영역은 5' 말단부터 415번째인 아데닌 (A)까지이다. 아미노산 서열에 있어서, 가변 영역은 서열 62의 N-말단부터 129번째인 리신 (K)까지이다. 유전자 서열 예측 소프트웨어 (Signal P ver.2)에 따르면, L쇄 신호 서열은 서열 62의 N-말단부터 22번째인 시스테인 (C)까지인 것으로 예측되었다. 성숙 단백질의 N-말단은 서열 62의 23번째인 아스파르트산 (D)인 것으로 여겨진다.
H쇄 가변 영역과 L쇄 가변 영역을 코딩하는 F5-77의 DNA 및 H쇄와 L쇄의 아미노산 서열을 각각 이하에 나타내었다.
H쇄 DNA의 번역 개시점은 서열 63의 5' 말단에서 100번째인 아데닌 (A)에서 시작되는 ATG 코돈이고, 항체 가변 영역과 불변 영역의 경계는 5' 말단에서 528번째인 아데닌 (A)과 529번째인 구아닌 (G) 사이에 위치한다. 아미노산 서열에 있어서, H쇄 가변 영역은 서열 64의 N-말단부터 143번째인 세린 (S) 잔기까지이고, 불변 영역은 144번째인 알라닌 (A) 및 이후의 잔기들이다. 유전자 서열 예측 소프트웨어 (Signal P ver.2)에 따르면, H쇄 신호 서열은 서열 64의 N-말단부터 19번째인 시스테인 (C)까지인 것으로 예측되었다. 성숙 단백질의 N-말단은 서열 64의 20번째인 글루탐산 (E)인 것으로 여겨진다.
L쇄 DNA의 번역 개시점은 서열 65의 5' 말단에서 59번째인 A에서 시작되는 ATG 코돈이고, 가변 영역은 5' 말단부터 445번째인 아데닌 (A)까지이다. 아미노산 서열에 있어서, 가변 영역은 서열 66의 N-말단부터 129번째인 리신 (K)까지이다. 유전자 서열 예측 소프트웨어 (Signal P ver.2)에 따르면, L쇄 신호 서열은 서열 66의 N-말단부터 22번째인 시스테인 (C)까지인 것으로 예측되었다. 성숙 단백질의 N-말단은 서열 66의 23번째인 아스파르트산 (D)인 것으로 여겨진다.
<실시예 18> 동물 세포에서의 항체 단백질 발현
상기에서 얻은 항체의 가변 영역을 포함하는 DNA 단편을 N5KG1 (IDEC 파마슈티칼스 (Pharmaceuticals), 미국 특허 제6001358호) 등의 적당한 벡터에 조립하여 항체 발현 벡터를 제조하였다. 발현을 위한 숙주 세포로는 CHO-Ras [Katakura Y., et. al. Cytotechnology, 31:103-109, 1999] 등이 바람직하게 사용된다. 숙주 세포로의 벡터 도입은 전기천공법 등을 통해 수행할 수 있다. 항체 발현 벡터 약 2 ㎍을 제한 효소로 선형화하고, 바이오-래드 (Bio-Rad) 전기천공기를 사용하여 350 V 및 500 μF의 조건하에 4 ×107 개의 CHO-Ras 세포에 유전자를 도입하여 96웰 배양 플레이트에 접종하였다. 발현 벡터의 선택 마커에 상응하는 약물을 첨가하고 계속 배양하였다. 콜로니가 관찰되면, 실시예 4에 나타낸 방법에 따라 항체 발현주를 선별하였다. 선별된 세포로부터의 항체는 실시예 5에 따라 정제할 수 있다.
<실시예 19> CD40 길항 항체에 의한 항원 특이적 항체 생산의 억제 작용
마우스 내인성 CD40이 파괴된 동종접합체의 유전자 배경을 가지면서 인간 CD40 유전자의 트랜스진을 보유한 마우스 [Yasui. et. al. Int. Immunol. 2002 Vol 14:319]에 4-히드록시-3-니트로페닐아세틸-닭 γ-글로불린 접합체 (NP-CGG: 오오사까 대학 미생물 질병 연구소 기꾸따니 히토시 (Kikutani Hitoshi) 교수로부터 분배받음)와 ARAM (Antigen Recognition Activation Motif (항원 인식 활성화 모티프))의 복합체 100 ㎍ (NP-CGG량으로서)을 복강내 주사함으로써 상기 마우스를 감작시켰다. 항원 감작 직전에, 각각의 모노클로날 항체를 30 또는 100 ㎍의 양으로 꼬리 정맥내 투여하였다. 음성 대조군으로서는 항-인간 알부민 인간 IgG4 항체 100 ㎍을 투여하였다. 감작 7 일 후, 안와 정맥충으로부터 채혈하고, 혈청 중의 NP 특이적 IgG1 및 IgM 항체량을 ELISA로 측정하였다. ELISA에서는 NP를 결합시킨 소혈청 알부민 (NP-BSA:2.5 ㎍/㎖) 50 ㎕/웰을 ELISA용 96웰 마이크로플레이트 (맥시솝, 넌크)의 각 웰에 첨가하고 4℃에서 배양하여 NP-BSA를 흡착시켰다. 이어서, 상청액을 버리고 각 웰에 차단 시약 (수퍼 블록 (Super Block), 피어스 (Pierce))을 첨가하여 실온에서 배양하고 차단시킨 후, 각 웰을 0.1％ 트윈 20-함유 인산 완충액 (PBS-T)으로 3회 세척하였다. 이어서, 각 웰에 10％ 블록에이스-함유 PBS-T로 희석시킨 각각의 혈청 (50 ㎕/웰)을 첨가하고 37℃에서 2 시간 동안 배양하여 반응시켰다. 마이크로플레이트를 PBS-T로 3회 세척한 후, 알칼리 포스파타제로 표지된 염소 항-마우스 IgG1 또는 IgM 항체 (코스모바이오 (COSMOBIO), 1070-04 또는 1020-04)를 10％ 블록에이스-함유 PBS-T로 1,000배 희석시킨 용액 (50 ㎕/웰)을 각 웰에 첨가하여 37℃에서 2 시간 동안 배양하였다. 이어서, 마이크로플레이트를 PBS-T로 3회 세척한 후에 발색 기질액 (50 ㎕/웰, 시그마 104, 포스파타제 기질)을 각 웰에 첨가하고, 파장 405 nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 판독기로 측정하였다. 그 결과를 도 18 및 도 19에 나타내었다. 도면의 종축은 NP-CGG를 C57BL/6 마우스에 2회 주사한 후 채혈하여 모은 혈청에 대하여, IgG1 항체의 경우에는 10,000배 희석한 혈청, IgM 항체의 경우에는 100배 희석한 혈청을 각각 1 유닛으로 환산한 값을 나타낸다. F4-465, 4D11 및 KM281-1-10 항체는 100 ㎍을 투여한 경우 NP 특이적인 IgG1 및 IgM 항체 생산을 강하게 억제하였다.
<실시예 20> CD40 길항 항체에 의한 편도선 B-세포의 증식 억제
인간 편도선은 칠드런 하스피털 (Chidren's Hospital) (미국 캘리포니아주 산 디에고 소재)로부터 입수하였다. 편도선을 작은 조각으로 절단하여 잘게 썰고, 70 ㎛의 나일론 메쉬 세포체를 통과시켜 세포 현탁액을 제조하였다. PBS로 여러회 세척한 후에 세포수를 계수하고, 90％ 인간 혈청 (ICN) 및 10％ DMSO를 사용하여 동결 보존시켰다. 세포를 해동시킨 후에 10％ 인간 혈청, 2.5 ㎍/㎖의 암포테리신 (판기존 (fangizon), 깁코/비알엘)을 첨가한 표준 RPMI 배지에 재현탁시켜 사용하였다.
1 ×105 개의 세포를 96웰에 첨가하고, 항-인간 CD40 항체를 0.01, 0.1, 1.0 및 10 ㎍/㎖의 농도로 첨가하였다. 시험은 각 농도에 대하여 3벌씩 실시하였다. 플래그 (flag) 표지한 CD40L (알렉시스) 1 ㎍/㎖ 및 CD40L 인핸서 항체 (알렉시스) 1 ㎍/㎖를 각 웰에 첨가하여 3 일간 배양한 후, 1 μCi의 [3H]티미딘을 각 웰에 첨가하였다. 12 내지 15 시간 후에 세포를 회수하고, 액체 섬광계수기로 편도선 B-세포의 증식을 계측하였다. B-세포는 CD40L 자극에 의해 증식하였고, 항체를 첨가하지 않은 경우의 계수를 100으로 하고 CD40L를 첨가하지 않아 B-세포가 자극되지 않은 경우의 계수를 0으로 하였다. 예를 들어 상대적인 계수값이 30으로 계측된 경우, 본 실험에서는 70％의 증식 저해가 발생하였다고 표현하기로 하였다.
공지된 길항 항체인 5D12는, 100 ㎍/㎖의 항체 농도에서도 50％를 초과하는 증식 억제는 나타내지 않았다. F4-465는 항체 농도가 0.01 ㎍/㎖만큼으로 소량인 경우에도 약 80％의 증식 억제를 나타내었고, 항체 농도가 0.1 내지 10 ㎍/㎖인 경우에는 약 95％의 증식 억제를 나타내었다 (도 20).
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 그대로 참고로서 본 명세서에 도입된다.
본 발명은 CD40에 대한 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는 CD40에 대한 아고니스트 작용 및 길항 작용 모두를 포함하기 때문에 예를 들어 각각 면역강화제 및 면역억제제 등으로서 유용하다.
<서열 목록 프리텍스트>
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<110> KIRIN BEER KABUSHIKI KAISHA <120> ANTI CD40 MONOCLONAL ANTIBODY <130> PH-1569-PCT <140> <141> <150> PCT/US01/13672 <151> 2001-04-27 <150> JP2001-142482 <151> 2001-05-11 <150> JP2001-310535 <151> 2001-10-05 <150> US10/040,244 <151> 2001-10-26 <160> 66 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 1 cccagatctg tccatccaga accacccact gcatgcagag 40 <210> 2 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 2 acaagatctg ggctctacgt atctcagccg atcctgggga c 41 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 3 ggtccgggag atcatgaggg tgtcctt 27 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 4 gtgcacgccg ctggtcaggg cgcctg 26 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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gttaggaccc agagggaacc atggaaaccc cagcgcagct 60 tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga gaaattgtgt tgacgcagtc 120 tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc ctctcctgca gggccagtca 180 gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa cctggccagg ctcccaggct 240 cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca gacaggttca gtggcagtgg 300 gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag cctgaagatt ttgcagtgta 360 ttactgtcag cagtatggta gctcaccgat caccttcggc caagggacac gactggagat 420 caaacgtacg 430 <210> 46 <211> 130 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser 20 25 30 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 50 55 60 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro 65 70 75 80 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Arg Leu Glu Pro 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Thr Cys 35 40 45 Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Pro Gly Tyr Tyr Gly Gly Trp 50 55 60 Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ser Ile Tyr 65 70 75 80 Lys Ser Gly Ser Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr 85 90 95 Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser 100 105 110 Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Pro Val Val 115 120 125 Arg Tyr Phe Gly Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 130 135 140 Val Ser Ser Ala Ser 145 <210> 49 <211> 448 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 49 agatcttaag caagtgtaac aactcagagt acgcggggag acccactcag gacacagcat 60 ggacatgagg gtccccgctc agctcctggg gcttctgctg ctctggctcc caggtgccag 120 atgtgccatc cagttgaccc agtctccatc ctccctgtct gcatctgtag gagacagagt 180 caccatcact tgccgggcaa gtcagggcat tagcagtgct ttagcctggt atcagcagaa 240 accagggaaa gctcctaagc tcctgatcta tgatgcctcc aatttggaaa gtggggtccc 300 atcaaggttc agcggcagtg gatctgggac agatttcact ctcaccatca gcagcctgca 360 gcctgaagat tttgcaactt attactgtca acagtttaat agttacccga cgttcggcca 420 agggaccaag gtggaaatca aacgtacg 448 <210> 50 <211> 130 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Pro Gly Ala Arg Cys Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 100 105 110 Phe Asn Ser Tyr Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 Arg Thr 130 <210> 51 <211> 453 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 51 atgtctgtct ccttcctcat cttcctgccc gtgctgggcc tcccatgggg tgtcctgtca 60 caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgaagc cctcgcagac cctctcattc 120 acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct agcaacagtg ctgcttggaa ctggatcagg 180 cagtccccat cgagaggcct tgagtggctg ggaaggacat actacaggtc caagtggtat 240 aaagattatg cagtatctgt gaaaagtcga ataaccatca acccagacac atccaagaac 300 cagttctccc tgcagctgaa ctctgtgacc cccgaggaca cggctgtgta ttactgtgca 360 agagggtatt actatggttc ggggagctat ccctactact accaaatgga cgtctggggc 420 caagggacca cggtcaccgt ctcctcagct agc 453 <210> 52 <211> 151 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Met Ser Val Ser Phe Leu Ile Phe Leu Pro Val Leu Gly Leu Pro Trp 1 5 10 15 Gly Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val 20 25 30 Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Phe Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser 35 40 45 Val Ser Ser Asn Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser 50 55 60 Arg Gly Leu Glu Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr 65 70 75 80 Lys Asp Tyr Ala Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp 85 90 95 Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu 100 105 110 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly 115 120 125 Ser Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gln Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr 130 135 140 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 145 150 <210> 53 <211> 414 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 53 aattgaggaa ctgctcagtt aggacccaga gggaaccatg gaagccccag ctcagcttct 60 cttcctcctg ctactctggc tcccagatac caccggagaa attgtgttga cacagtctcc 120 agccaccctg tctttgtctc caggggaaag tgccaccctc tcctgcaggg ccagtcagag 180 tgttagcagc tacttagcct ggtaccaaca gaaacctggc caggctccca ggctcctcat 240 ctatgatgca tccaacaggg ccactggcat cccagccagg ttcagtggca gtgggtctgg 300 gacagacttc actctcacca tcagcagcct agagcctgaa gattttgcag tttattactg 360 tcagcagcgt agcaacactt tcggcggagg gaccaaggtg gagatcaaac gaac 414 <210> 54 <211> 125 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30 Leu Ser Pro Gly Glu Ser Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 50 55 60 Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser 100 105 110 Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 115 120 125 <210> 55 <211> 495 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 55 ctgaacacag acccgtcgac tacgcgggag accacagctc cacaccatgg actggacctg 60 gaggatccta ttcttggtgg cagcagcaac aggtgcccac tcccaggtgc agctggtgca 120 atctgggtct gagttgaaga agcctggggc ctcagtgaag gtcccctgca aggcttctgg 180 atacaccttc actagctatg ctatgaattg ggtgcgacag gcccctggac aagggcttga 240 gtggatggga tggatcaaca ccaacactgg gaacccaacg tatgcccagg gcttcacagg 300 acggtttgtc ttctccttgg acacctctgt cagcacggca tatctgcaga tcagcagcct 360 aaaggctgag gacactgccg tgtattactg tgcgagagag gtagtaccag ttgctatgag 420 ggtaactcac tactactacg gtatggacgt ctggggccaa gggaccacgg tcaccgtctc 480 ctcagctagc accaa 495 <210> 56 <211> 149 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Pro Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala 65 70 75 80 Gln Gly Phe Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Val Val Pro Val Ala Met Arg Val Thr His 115 120 125 Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val 130 135 140 Ser Ser Ala Ser Thr 145 <210> 57 <211> 830 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 57 ctgggtacgg taaccgtcag atcgcctgga gacgccatca cagatctgcc tcaggaagca 60 gcatcggagg tgcctcagcc atggcatgga tccctctctt cctcggcgtc cttgtttact 120 gcacaggatc cgtggcctcc tatgagctga ctcagccacc ctcagtgtcc gtggccccag 180 gacagacagc cagcatcacc tgttctggag ataaattggg ggataatttt acttgctggt 240 atcagcagaa gccaggccag tcccctgtgc tggtcatctt tcaggattgg aagcggcgcc 300 cagggatccc tgcgcgattc tctggctcca agtctgggaa cacagccact ctgaccatca 360 gcgggaccca ggctatggat gaggctgact attactgtca ggcgtgggac atcagcactg 420 tggtattcgg cggagggacc aagctgaccg tcctaggtca gcccaaggct gccccctcgg 480 tcactctgtt cccgccctcc tctgaggagc ttcaagccaa caaggccaca ctggtgtgtc 540 tcataagtga cttctacccg ggagccgtga cagtggcctg gaaggcagat agcagccccg 600 tcaaggcggg agtggagacc accacaccct ccaaacaaag caacaacaag tacgcggcca 660 gcagctacct gagcctgacg cctgagcagt ggaagtccca cagaagctac agctgccagg 720 tcacgcatga agggagcacc gtggagaaga cagtggcccc tacagaatgt tcatgaattc 780 agatccgtta acggttacca actacctaga ctggattcgt gaccaacata 830 <210> 58 <211> 231 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58 Met Ala Trp Ile Pro Leu Phe Leu Gly Val Leu Val Tyr Cys Thr Gly 1 5 10 15 Ser Val Ala Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala 20 25 30 Pro Gly Gln Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp 35 40 45 Asn Phe Thr Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu 50 55 60 Val Ile Phe Gln Asp Trp Lys Arg Arg Pro Gly Ile Pro Ala Arg Phe 65 70 75 80 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr 85 90 95 Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ile Ser 100 105 110 Thr Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro 115 120 125 Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu 130 135 140 Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro 145 150 155 160 Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala 165 170 175 Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala 180 185 190 Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg 195 200 205 Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr 210 215 220 Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 225 230 <210> 59 <211> 520 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 59 gctgatcagg actgcacaca gagaactcac catggagttt gggctgagct gggttttcct 60 tgttgctatt ttaaaaggtg tccagtgtga ggtgcagctg gtggagtccg ggggaggctt 120 agttcagcct ggggggtccc tgagactctc ctgtgcagtc tctggattca ccttcagtac 180 ctactggatg cactgggtcc gccaagctcc agggaagggg ctggtgtggg tctcacgtat 240 taatagtgat gggagtagca caacctacgc ggactccgtg aagggccgat tcaccatctc 300 cagagacaac gccaagaaca cgctgtatct gcaaatgaac agtctgagag ccgaggacac 360 ggctgtgtat tactgtgcaa gagatagagt actatggatc ggggagttat cctactacgg 420 tatggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc tcagctagca ccaagggccc 480 atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 520 <210> 60 <211> 163 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Thr Tyr Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Val Trp Val Ser Arg Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Thr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Val Leu Trp Ile Gly Glu Leu Ser Tyr 115 120 125 Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 145 150 155 160 Ser Thr Ser <210> 61 <211> 698 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 61 ggggagtcag acccagtcag gacacagcat ggacatgagg gtccccgctc agctcctggg 60 gctcctgctg ctctggctcc caggtgccaa atgtgacatc cagatgaccc agtctccttc 120 caccctgtct gcatctgtag gagacagagt caccatcact tgccgggcca gtcagagtat 180 tagtaactgg ttggcctggt atcagcagaa accagggaaa gcccctaagc tcctgctcta 240 taaggcatct ggtttagaaa gtggggtccc atcaaggttc agcggcagtg gatctgggac 300 agaattcact ctcaccatca acagcctgca gcctgatgat tttgcaactt attactgcca 360 acagtctaat agttattcgt ggacgttcgg ccacgggacc aaggtggaaa tcaaacgtac 420 ggtggctgca ccatctgtct tcatcttccc gccatctgat gagcagttga aatctggaac 480 tgcctctgtt gtgtgcctgc tgaataactt ctatcccaga gaggccaaag tacagtggaa 540 ggtggataac gccctccaat cgggtaactc ccaggagagt gtcacagagc aggacagcaa 600 ggacagcacc tacagcctca gcagcaccct gacgctgagc aaagcagact acgagaaaca 660 caaagtctac gcctgcgaag tcacccatca gggcctga 698 <210> 62 <211> 223 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Pro Gly Ala Lys Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Gln Ser Ile Ser Asn Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Leu Leu Leu Tyr Lys Ala Ser Gly Leu Glu Ser Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr 85 90 95 Ile Asn Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 100 105 110 Ser Asn Ser Tyr Ser Trp Thr Phe Gly His Gly Thr Lys Val Glu Ile 115 120 125 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 130 135 140 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 145 150 155 160 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 165 170 175 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 180 185 190 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 195 200 205 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu 210 215 220 <210> 63 <211> 630 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 63 ggtctatata agcagagctg ggtacgtcct cacattcagt gatcagcact gaacacagac 60 ccgtcgacgg tgatcaggac tgaacagaga gaactcacca tggagtttgg gctgagctgg 120 ctttttcttg tggctatttt aaaaggtgtc cagtgtgagg tgcagctgtt ggagtctggg 180 ggaggcttgg tacagcctgg ggggtccctg agactctcct gtgcagcctc tggattcacc 240 tttagcagct atgccatgag ctgggtccgc caggctccag ggaaggggct ggagtgggtc 300 tcagctatta gtggtagtgg tggtagcaca tactacgcag actccgtgaa gggccggttc 360 accatctcca gagacaattc caagaacacg ctgtatctgc aaatgaacag cctgagagcc 420 gaggacacgg ccgtatatta ctgtgcgaaa gatggggggt actatggttc ggggagttat 480 gggtactttg actactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcctcagc tagcaccaag 540 ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 600 ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc 630 <210> 64 <211> 177 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Gly Gly Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Gly 115 120 125 Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 130 135 140 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 145 150 155 160 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 165 170 175 Pro <210> 65 <211> 728 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 65 caagcagtgg taacaacgca gagtacgcgg ggggagtcag acccagtcag gacacagcat 60 ggacatgagg gtccccgctc agctcctggg gctcctgctg ctctggttcc caggttccag 120 atgcgacatc cagatgaccc agtctccatc ttccgtgtct ggatctgtag gagacagagt 180 caccatcact tgtcgggcga gtcagggtat tagcagctgg ttagcctggt atcagcagaa 240 accagggaaa gcccctaagc tcctgatcta tgctggatcc agtttgcaaa gtggggtccc 300 atcaaggttc agcggcagtg gatttgggac agatttcact ctcaccatca gcagcctgca 360 gcctgaagat tttgcaactt actattgtca acaggctagc agtttccctc ggacattcgg 420 ccaagggacc aaggtggaga tcaaacgtac ggtggctgca ccatctgtct tcatcttccc 480 gccatctgat gagcagttga aatctggaac tgcctctgtt gtgtgcctgc tgaataactt 540 ctatcccaga gaggccaaag tacagtggaa ggtggataac gccctccaat cgggtaactc 600 ccaggagagt gtcacagagc aggacagcaa ggacagcacc tacagcctca gcagcaccct 660 gacgctgagc aaagcagact acgagaaaca caaagtctac gcctgcgaag tcacccatca 720 gggcctga 728 <210> 66 <211> 223 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 66 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Phe Pro Gly Ser Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Val Ser Gly Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Gly Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 100 105 110 Ala Ser Ser Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 115 120 125 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 130 135 140 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 145 150 155 160 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 165 170 175 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 180 185 190 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 195 200 205 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu 210 215 220

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  31. 인간 CD40에 결합하며, 하이브리도마 4D11 (기탁번호: FERM BP-7758)에 의해 생산되는 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 갖는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부위.
  32. 인간 CD40에 결합하며, 하이브리도마 4D11 (기탁번호: FERM BP-7758)에 의해 생산되는 항체에서 서열 48로 표시되는 중쇄 가변 영역 및 서열 50으로 표시되는 경쇄 가변 영역의 성숙 부분 아미노산 서열을 갖는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부위.
  33. 인간 CD40에 결합하며, 서열 48로 표시되는 항체의 중쇄 가변 영역 및 서열 50으로 표시되는 항체의 경쇄 가변 영역의 성숙 부분 아미노산 서열을 갖는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부위.
  34. 인간 CD40에 결합하며, 서열 48의 27번째인 Q 잔기에서 147번째인 S 잔기까지의 아미노산 서열 및 서열 50의 23번째인 A 잔기에서 128번째인 K 잔기까지의 아미노산 서열을 갖는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부위.
  35. 인간 CD40에 결합하며, 서열 47로 표시되는 핵산 서열에 의해 코딩되는 중쇄 가변 영역 및 서열 49로 표시되는 핵산 서열에 의해 코딩되는 경쇄 가변 영역의 성숙 부분 아미노산 서열을 갖는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부위.
  36. 인간 CD40에 결합하며, 서열 47의 94번째인 C에서 456번째인 A까지의 핵산 서열 및 서열 49의 125번째인 G에서 442번째인 A까지의 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 갖는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부위.
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  40. 제31항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 CD40에 결합하며 인간 항체인 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부위.
  41. 제31항 내지 제36항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 부위를 활성 성분으로 포함하는, 면역억제제, 자가면역 질환 치료제, 알레르기 치료제 또는 혈액 응고 인자 VIII 저해 증후군 치료제.
  42. 제40항의 항체 또는 그의 항원 결합 부위를 활성 성분으로 포함하는, 면역억제제, 자가면역 질환 치료제, 알레르기 치료제 또는 혈액 응고 인자 VIII 저해 증후군 치료제.
  43. 하이브리도마 4D11 (기탁번호: FERM BP-7758).
  44. 하이브리도마 4D11 (기탁번호: FERM BP-7758)에 의해 생산되는 단리된 항체.
  45. 하이브리도마 4D11 (기탁번호: FERM BP-7758)로부터 단리된 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 단리된 핵산.
  46. 제45항에 있어서, RNA 또는 cDNA인 단리된 핵산.
  47. 하이브리도마 4D11 (기탁번호: FERM BP-7758)로부터 단리된 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 단리된 핵산.
  48. 제47항에 있어서, RNA 또는 cDNA인 단리된 핵산.
  49. 제46항 및 제48항의 단리된 핵산을 포함하는 벡터.
  50. 제49항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  51. 제50항의 숙주 세포를 상기 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역이 발현될 수 있는 조건하에서 배양함으로써 인간 CD40에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 부위를 생산하는 것을 포함하는, 인간 CD40에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 부위의 생산 방법.
  52. 하이브리도마 4D11 (기탁번호: FERM BP-7758)로부터 단리된 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 상기 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역이 발현될 수 있는 조건하에서 배양함으로써 인간 CD40에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 부위를 생산하는 것을 포함하는, 인간 CD40에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 부위의 생산 방법.
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