TWI327574B - - Google Patents

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TWI327574B
TWI327574B TW091108894A TW91108894A TWI327574B TW I327574 B TWI327574 B TW I327574B TW 091108894 A TW091108894 A TW 091108894A TW 91108894 A TW91108894 A TW 91108894A TW I327574 B TWI327574 B TW I327574B
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TW
Taiwan
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ser
leu
cells
gly
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TW091108894A
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Mikayama Toshifumi
Yoshida Hitoshi
R Force Walker
Takahashi Nobuaki
Original Assignee
Kyowa Hakko Kirin Co Ltd
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Description

1327574 A7 B7 五、發明説明（1 ) 技術領域 本發明係關於識別存在於人類之B細胞，樹狀細胞（DC) 等表面之人類CD40抗原之抗體或其功能性片段。具體而 言，本發明係關於對於樹狀細胞（DC)表面之人類CD40抗 原，實質上為拮抗性之抗人類CD40抗體或其功能性片段； 及相較習知之抗人類CD40抗體，期待具有更高治療效果之 催動性抗人類CD40抗體或其功能性片段。 背景技術 1. CD40 CD40係分子量50kDa之存在於細胞膜表面之抗原，表現 在B細胞、樹狀細胞（DC)、某種癌細胞、以及胸腺上皮細 胞。已知CD40在B細胞或DC之增殖、分化上具有重要功 能* CD40被鑑定為表現在人類B細胞表面之抗原（Ε· A. Clark et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4494, 1986, I. Stamenkovic et. al·，EMBO J_ 8: 1403，1989)，由胺基酸序 列之相同性，CD40被認為係低親和性NGF受器或TNF受 器、CD27、0X40、CD30等所屬之TNF受器家族之一成 員。對於人類及小鼠之CD40之配位子（ligand)(CD40L)，近 年其基因經純系化（cloning)，已知係II型膜蛋白質，及表 現於經活化之CD4+T細胞。又已知CD40L將強力之活化信 號導入人類及小鼠之B細胞》 又，經確認樹狀細胞較B細胞表現較多之CD40，並逐漸 明瞭其擔負重要功能。CD40—經與CD40L結合，抗原呈現 細胞（APC)之活性化，亦即CD80 (B7-1)或CD86 (B7-2)等之 78148-990318.doc -6- 本纸張尺度適用中國國家檁準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 裝 訂
線 1327574 A7 B7 五、發明説明（2 ) 辅助刺激分子之表現，或IL-12之產生即有所增強（Caux，C.， et al.: Activation of human dendritic cells through CD40 cross-linking. J. Exp· Med.，180: 1263，1994)、（Shu. U.，et al.: Activated T cells induce interleukin-12 production by monocyte via CD40-CD40 ligand interaction. Eur. J. Immunol·，25: 1125，1995)。樹狀細胞具有強力之抗原呈現 能力，並具有強力之輔助者T(Th)細胞活化能力。又，樹 狀細胞被認為控制原始（naive) Th細胞分化為Thl或Th2。 將骨髓系樹狀細胞之末梢血液單核白血球與GM-CSF及IL-4一併培養，並藉由CD40L使其成熟之樹狀細胞（DC1)在體 外具有IL-12產生能力；刺激活化他系之naive Th細胞；誘 導產生IFN 7之T細胞（亦即促進分化為Th 1)。由該作用受 IL-12抗體抑制，推測其係以il-12為媒介之反應。另一方 面，將存在於淋巴組織T區域或末梢血液之漿細胞樣 (plasmacytoid) T細胞與IL-3、CD40配位子一併培養之淋巴 細胞系樹狀細胞（DC2)不具有IL-12產生能力、且顯示可刺 激活化他系之naive Th細胞；誘導產生IL-4之T細胞；促進 分化為Th2。據推測Th 1細胞係與細胞性免疫之活化有關， 而Th2細胞除増強體液性免疫能力，並參與細胞性免疫能 力之抑制。在Th 1細胞之輔助下被活化之細胞毒殺性τ細胞 (CTL·)，可去除細胞質内增殖之病原體（多數之病毒、李斯 特菌、結核菌、及毒漿（Toxoplasma)原蟲等）或腫瘤細胞。 經證實識別表現在膜表面之CD40的抗CD40單株抗體， 對於B細胞顯示具有各種生物活性。抗CD40單株抗體對於 78148-990318.doc 本紙張尺度適用中國國家操準(CNS) A4規格(21〇 x 297公釐） 1327574 A7 __B7___ 五、發明説明（3 ) CD40與CD40L間之相互作用大致區分為催動性者與拮抗性 者。 2.催動性抗體 催動性抗體之作用，已知有活化B細胞。有報告指出： 例如抗CD40抗體誘導細胞黏合（Barrett et al.，J. Immunol. 146: 1722, 1991; Gordon et al., J. Immunol. 140: 1425, 1988);增進細胞之大小（Gordon et al·，J. Immunol. 140: 1425，1988; Valle et al.，Eur· J. Immunol. 19: 1463，1989); 誘導僅藉由抗IgM抗體、抗CD20抗體或佛波酯（phorbol ester)被活化之 B 細胞之分裂（ClarkandLedbetter，Proc.Natl· Acad. Sci. USA 83: 4494, 1986; Gordon et al,, LEUCOCYTE TYPING III. A. J. McMicheal ed. Oxford University Press. Oxford, p.426; PauJie et al.，J. Immunol. 142: 590，1989); 在IL4存在下誘導B細胞之分裂（Valle et al.，Eur. J. Immunol. 19: 1463, 1989; Gordon et al., Eur. J. Immunol. 17: 1535, 1987);誘導IL-4刺激、T細胞去除培養細胞表現IgE (Jabara et al., J. Exp. Med. 172: 1861, 1990; Gascan et al., J. Immunol. 147: 8, 1991)、IgG、IgM (Gascan et al.，J.
Immunol. 147: 8，1991);增強藉由IL-4之自B細胞之可溶性 CD23/Fc ε ϊίΐΐ2*s(GordonandGuy，Immunol.Today8: 339，1987; Cairns et al.，Eur· J. Immunol· 18: 349，1988)與 細胞上之表現（Challa A. Allergy, 54: 576，1999);促進 IL-6 之產生（Clark and Shu，J. Immunol. 145: 1400，1990)。進一 步，有報告指出：在CDw32+黏合細胞存在下，藉由添加 78148-990318.doc -8- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1327574 A7 B7 五、發明説明（4 IL-4及抗CD40抗體，自人類初代培養B細胞建立B細胞株 (Bancherau et al.，Science 241: 70，1991)或胚中心之中心細 胞之凋零，無關於抗原受器之功能，以CD40為媒介而受抑 制（Liu et al_，Nature 342: 929，1989)。如上所述，CD40 因 被鑑定為表現於人類B細胞表面之抗原，所分離之多數抗 體之評估向來主要係以對於人類B細胞之增殖分化誘導功 能；癌細胞中細胞死亡誘導活性為指標（Katira，A. et. al.， LEUKOCYTE TYPING V. S. F. Schlossossman, et. al. eds. p. 547. Oxford University Press. Oxford, W. C. Flansow et. al., LEUKOCYTE TYPING V. S. F. Schlossossman, et. al. eds. p. 555. Oxford University Press. Oxford, J. D. Pound et. al., International Immunology, 11: 1.1，1999) ° 經證實抗CD40抗體可使DC成熟（Z. H. Zhou et. al., Hybridoma，18: 471，1999)。進一步，有報告指出：抗原專 一性CD8T細胞引導（priming)中’ CD4T細胞之功能係以 CD40-CD40L信號為媒介以活化DC，經證實藉由抗CD40單 株抗體（mAb)，可替代樹狀細胞（DC)之活化中，CD4辅助 者 T細胞之功能（Shoenberger，S.P·，et. al. :T-cell help for cytotoxic T lymphocytes is mediated by CD40-CD40L interactions. Nature，480，1998)。又，經證實藉由在小鼠中 投予抗CD40抗體，除可使生物體防禦表現CD40之腫瘤細 胞外’亦可防禦未表現CD40之腫瘤細胞（French，R. R.，et al.: CD40 antibody evokes a cytotoxic T-cell response that eradicates lymphoma and bypasses T-cell help. Nature 78148-990318.doc -9- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公爱) 裝 訂
線 1327574 A7 B7 五、發明説明（5 )
Medicine, 5, 1999)。 迄今經報告之抗體，以對於DC細胞之效果為指標而被 分離者較少。惟自DC細胞之功能修飾的觀點視之，在作 用於B細胞之抗體已經篩選之下，其不足以做為治療藥的 可能性高。有報告指出：對於小鼠CD40之抗體的單株抗體 中，存在因抗體所識別之抗原位置（epitope)，對於DC有反 應但對於血管内皮細胞不反應之純系（clone)，與反之對於 DC不反應而對於血管内皮細胞有反應之純系（Van Den Berg，TK，et. al·，Immunology, 88: 294，1996)。據推測有關 人類CD40抗體，亦因抗原位置造成與DC之結合與作用有 所不同。 已知藉由抗CD40抗體或CD40配位子可抑制表現CD40之 淋巴瘤細胞株增殖，並誘導細胞死亡（Funakoshi S et al.， Blood, 83: 2782, 1994)、（Funakoshi S et al.，Journal of Immunotherapy，.19，93, 1996)、（Z. H. Zhou et. al·，
Hybridoma, 18: 471, 1999) ' (Joseph A et al., Cancer Research, 60: 3225, 2000)。催動性抗體中深值玩味之處，係抗體之 功能未必與CD40L之功能一致。對於B細胞之活化作用與 對於B細胞腫瘤之增殖抑制作用亦未必一致。故開發兼具 DC活化能力與腫瘤細胞增殖抑制作用之抗體較理想。 又，催動性抗體中存在可抑制CD40L與CD40結合者及不抑 制者（Challa A et al·，Allergy，54: 576，1999)。例如，G28-5 (ATCC No. HB-9110)所產生之抗體因與CD40L競爭之故， 與CD40L並無併用效果。而抗體不同，活化CD40表現細胞 78148-990318.doc -10- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1327574 A7 B7 五、發明説明（6 ) 之程度亦有差異。即使單獨時顯示弱催動性活性之抗體， 藉由併用CD40配位子，相較CD40配位子單獨下的活性， 抗體存在下有時可顯著促進活性。反之，即使單獨時顯示 催動性活性之抗體，因抑制CD40配位子之故，相較CD40 配位子單獨下的活性，抗體存在下有時將導致活性減低 (Pound et al., International Immunology. 11: 11，1999) ° 經 證實不與CD40配位子競爭之抗體中，即使其自身抑制腫 瘤細胞增殖之作用微弱，在CD40配位子存在下可具有較強 之增殖抑制作用'（Joseph A et al.，Cancer Research, 60: 3225, 2000)。因此，以開發與CD40結合，藉由其自身可抑制細 胞增殖，且不抑制CD40配位子與CD40之結合之抗體較理 想。藉由活用此特徵，開發較可溶性CD40L有效之治療藥 有其可能性。例如，可溶性CD40L雖與CD40結合並使其活 化，但一併抑制存在於生物體内之CD40L的功能。若係不 與CD40L競爭之抗體，則不致引起此現象，且藉由協同效 果可期待更優良之治療效果。 3.结抗性抗體 另一方面，如上所述，因CD40在免疫反應中擔負重要 功能之故，正期待藉由抑制CD40與其配位子結合，可開發 器官移植時之免疫抑制或自體免疫疾病之治療藥。澤田-長谷（Sawada-Hase)等人曾報告克隆氏病（Crohn's disease)病 患之末梢血液中的單核白血球中，強力表現CD40之細胞的 比例上昇。惟，關於抑制CD40與其配位子結合之抗體，尚 未十分明瞭。該類抑制性抗體，可能對於例如CD40之功能 78148-990318.doc -11- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1327574 A7 _B7_ 五、發明説明（7 ) 分析，或活化CD40有所必要之疾病的治療有效。又，經證 實對於CD40配位子之抑制抗體亦可能有效做為CD40與 CD40配位子間之結合有所參與之疾病的藥物。惟，因有報 告指出：CD40L表現於經活化之血小板（V. Henn et. al·， Nature 391: 591，1998)故使用抗CD40L做為治療藥時，存 在引起血栓之危險性（T. Kawai et. al·，Nat. Medi. 6: 114, 2000)。由此觀點視之，抑制CD40與其配位子結合之抗體 治療藥，與其為抗CD40L抗艎，勿寧為對於CD40之抗體可 期待具較優越之安全性。抗CD40抗體抑制CD40L與CD40 結合外，且抗體本身必須不活化CD40。 有關與人類CD40專一性結合，抑制CD40L與CD40結 合，且不活化CD40之抗體的報告，儘管過去已有數量龐大 之研究，但僅有被命名為5D12之小鼠抗人類CD40抗體1例 (J. Kwekkeboom et. al., Immunology 79: 439，1993)。何 況，對於B細胞顯示具有中和作用之抗體，對於DC細胞是 否同樣具有中和CD40配位子的作用仍屬未知。進一步，有 報告指出：經生物素化之抗小鼠CD40抗體的作用，藉由親 和素（avidin)間之交聯（cross-linking)而有所增強（Johnson et al_，Eur J Immunol, 24 : 1835，1994)。本發明人使用預先以 基因重組技術被賦予在可溶性配位子之對於標記（FLAG)的 抗體（M2)，増強可溶性CD40配位子對於B細胞株（Ramos細 胞）的作用，並在測定其中和活性之際，確認5D12 (ATCC No_ HB-11339)僅具有些許中和活性。 本發明人重新發現：拮抗性抗體之5D12藉由交聯，即使 78I48-990318.doc 2- 本纸張尺度適用中國国家標準(CNS) Α4規格(210X297公釐） 1327574 A7 B7 五、發明説明（8 ) 在未存在CD40L下，抗體單獨即具有催動性活性。過去， 已有報告指出：小鼠CD40抗體的作用藉由生物素與親和素 交聯而有所增強（Johnson et al·，Eur J Immunol, 24 : 1835, 1994)。又，已知藉由使用固相化在培養盤之抗免疫球蛋 白抗體，將CD40抗體予以固相化，腫瘤細胞之增殖抑制活 性有所增加，但據推測此為固相化所產生之效果。惟，藉 由在培養液中添加抗免疫球蛋白抗體，與抗CD40抗體交 聯，造成雖係拮抗性抗體，卻顯示催動性活性之可能性仍 屬未知。用於治療之抗體若有抗原性，因人體内將產生與 CD40抗體結合之抗體，藉由CD40抗體受交聯，恰巧產生 如CD40配位子之活性，故具有完全相反作用之疑慮。因 此，由治療藥之安全性的觀點視之，降低抗體之抗原性被 認為非常重要。已知以小鼠抗體之可變區域的序列為基 礎，藉由人類化技術，開發為治療藥時，因人類化抗體具 有免疫原性之故，投予後可能產生抗人類化抗CD40抗體， 具有成為催動性抗體之危險性。又抗原性雖低，抗CD40抗 體亦可能藉由抗體受器（FcR)而受交聯。由此諸點，拮抗 性抗體被認為以可專一性與CD40結合、抑制CD40L之結 合，且藉由交聯亦不活化CD40之人類抗體，並與FcR之結 合微弱者較理想。 發明之揭示 如上所述，近年DC細胞之功能分析有所進展，並逐漸 認識CD40係調控DC細胞功能之重要基因^在此背景下， 本發明之目的係藉由使用以DC細胞為評估系統，提供對 78148-990318.doc -13- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1327574 A7 B7 五、發明説明（9 ) 於樹狀細胞（DC)表面之人類CD40抗原，實質上係拮抗性之 抗人類CD40抗體或其功能性片段；及相較習知之抗人類 CD40抗體，期待具有更高治療效果之催動性抗人類CD40 抗體或其功能性片段。 本發明人等，就有關對於人類CD40之抗體的製作戮力 研究結果，成功製作出被認為相較已知之抗CD40抗體，對 於疾病之治療效果更高之新穎催動性抗體；及拮抗性抗體 而完成本發明。即本發明如下。 (1) 一種對於人類CD40之抗體或其功能性片段，其特徵 為具有至少一種選自以下（a)〜（f)之性質： (a) 作用於樹狀細胞，在LPS及IFN r存在下使其產生IL- 12 (b) 作用於樹狀細胞，使該樹狀細胞成熟之活性較G28-5 抗體兩 (c) 對於B細胞所建立之細胞株，促進CD95表現之活性亦 較G28-5抗體高 (d) 對於B細胞所建立之細胞株，抑制增殖之活性亦較 G28-5抗體高 (e) 對於B細胞所建立之細胞株，誘導細胞死亡 (f) 不抑制CD40配位子對於CD40之結合 (2) 如上述本發明之抗體或其功能性片段，其中樹狀細胞 之成熟係在20 // g/ml以下之濃度下進行。又，對於B細胞所 建立之細胞株，促進CD95之表現係在20/zg/ml以下之濃度 下進行。所謂B細胞所建立之細胞株可列舉例如Ramos或 78148-990318.doc -14- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1327574 A7 B7 五、發明説明（10 ) HS-Sulton。 (3) 又，如上述本發明之抗體或其功能性片段，其中在 lxlO6個/ml之濃度的樹狀細胞中，添加0.1eg/ml以上之濃 度的抗體時，引發產生100 pg/ml以上之IL-12 ;而在添加1 /zg/ml以上之濃度的抗體時，引發產生1000 pg/ml以上，較 佳者係10000 pg/ml以上之IL-12。 (4) 進一步，如上述本發明之抗體或其功能性片段，其中 對於B細胞所建立之細胞株（Ramos細胞）促進CD95之表 現，在抗體濃度0.01 Ag/ml至10 yg/ml之範圍内，係對照之 G28-5抗體的約2倍至3倍以上。例如抗體濃度0.01 yg/ml 時，係對照之G28-5抗體的約2倍至6倍以上；抗體濃度0.1 #g/ml時，係對照之G28-5抗體的約2倍至7倍以上；抗體濃 度1/zg/ml時，係對照之G28-5抗體的約2倍至7倍以上；及 抗體濃度l〇Mg/ml時，係對照之G28-5抗體的約2倍至6倍以 上。 (5) —種抗體或其功能性片段，其特徵為具有自融合瘤 KM302-1(寄存編號FERM BP-7578) ; KM341-1-19(日本獨立 行政法人產業技術綜合研究所專利生物寄存中心之寄存編 號FERM BP-7759，台灣食品工業發展研究所之寄存編號 CCRC 960162) ; 2015(寄存編赛 FERM BP-8024，台灣食品 工業發展研究所之寄存編號CCRC 960163);或Fl-102(寄 存編號ATCC PTA-3337，台灣食品工業發展研究所之寄存 編號CCRC 96013 6)所產生之抗體的重鏈可變區域及輕鏈可 變區域之胺基酸序列。 78148-990318.doc -15- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1327574 A7 B7 五、發明説明（11 ) (6) —種抗體或其功能性片段，其特徵為具有分別編碼在 寄存編號 ATCC PTA-3302及 ATCC PTA-3303 之質體 DNA， 融合瘤F2-103所產生之抗體的重鏈可變區域及輕鏈可變區 域；分別編碼在寄存編號ATCC PTA-3304及ATCC PTA-3305之質體DNA，融合瘤F5-77所產生之抗體的重鏈可變 區域及輕鏈可變區域；或分別編碼在寄存編號ATCC PTA-3306及ATCC PTA-3307之質體DNA，融合瘤F5-157所產生 之抗體的重鏈可變區域及輕鏈可變區域之成熟（mature)部 分的胺基酸序列。 (7) —種抗體或其功能性片段，其特徵為具有序列編號28 及30分別所示，融合瘤KM341-卜19所產生之抗體的重鏈可 變區域及輕鏈可變區域；序列編號32及34分別所示，融合 瘤2105所產生之抗體的重鏈可變區域及輕鏈可變區域；序 列編號36及38分別所示，融合瘤1 10所產生之抗體的重鏈 可變區域及輕鏈可變區域；序列編號40及42分別所示，融 合瘤115所產生之抗體的重鏈可變區域及輕鏈可變區域； 序列編號52及54分別所示，融合瘤KM643-4-1 1所產生之抗 體的重鏈可變區域及輕鏈可變區域；序列編號60及62分別 所示，融合瘤F2-1 03所產生之抗體的重鏈可變區域及輕鏈 可變區域；或序列編號64及66分別所示，融合瘤F5-77所 產生之抗體的重鏈可變區域及輕鏈可變區域之成熟部分的 胺基酸序列。 (8) —種抗體或其功能性片段，其特徵為具有序列编號27 及29分別所示，編碼在分離自融合瘤KM34 1 -1 -1 9之核酸序 78148-990318.doc -16- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1327574 A7 _____B7___ 五、發明説明（12 ) 列的重鏈可變區域及輕鏈可變區域；序列編號3 1及33分別 所示’編碼在分離自融合瘤2105之核酸序列的重鏈可變區 域及輕鏈可變區域；序列編號35及37分別所示，編碼在分 離自融合瘤110之核酸序列的重鏈可變區域及輕鏈可變區 域；序列編號39及41分別所示，編碼在分離自融合瘤U 5 之核酸序列的重鏈可變區域及輕鏈可變區域；序列編號5 i 及53分別所示，編碼在分離自融合瘤KM643-4-l 1之核酸序 列的重鏈可變區域及輕鏈可變區域；序列編號59及61分別 所示’編碼在分離自融合瘤F2-103之核酸序列的重鏈可變 區域及輕鏈可變區域；或序列編號63及65分別所示，編碼 在分離自融合瘤F5-77之核酸序列的重鏈可變區域及輕鏈 可變區域之成熟部分的胺基酸序列。 (9) 一種對於人類CD40之抗體或其功能性片段，其特徵 為具有至少一種選自以下（g)~(j)之性質： (g) 中和對於CD40之配位子的作用 (h) 中和或緩和1種以上對於B細胞所建立之細胞株上的 CD40之配位子所給予CD40表現細胞的影響，且藉由因抗 免疫球蛋白抗體之交聯，對於上述B細胞所建立之細胞株 上的CD40之催動性作用較5D12弱 (i) 緩和或中和CD40配位子使^細胞所建立之細胞株增加 CD95之表現的作用 (j) 對於表現在樹狀細胞之CD40具有拮抗性作用。 (10) 如上述（9)之抗體或其功能性片段，其中在經添加飽 和量之CD40L表現細胞之lxlO6個/ml濃度的Ramos細胞中， -17- 78l48-990318.doc 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1327574 A7 ___B7 五、發明説明（13 ) 添加〇.l/zg/ml濃度之抗體時’抑制Ramos細胞之CD95之表 現為對照之約10%以下者；添加1以g/ml濃度之抗體時，抑 制Ramos細胞之CD95之表現至陰性對照組之同等級者；添 加10#g/ml濃度之抗體時，抑制Ramos細胞之CD95之表現 至陰性對照組之同等級者。 (Π)如上述（9)之抗體或其功能性片段，其中在體外，在 經添加可溶性CD40L (1 eg/ml)之1χ1〇6個的扁桃腺b細胞 中，添加0.001^/1111至10/^/1111濃度之抗體時，抑制扁桃 腺B細胞之增殖約80至95%以上者。例如添加0.01/ag/ml至 1 〇 /z g/ml濃度之抗體時，抑制扁桃腺B細胞之增殖約95%以 上者；特別在添加0.001 /zg/ml濃度之抗體時，抑制扁桃腺 B細胞之增殖約80%以上者。 (12) —種抗體或其功能性片段，其特徵為具有融合瘤 KM28 1 -卜1 〇(日本獨立行政法人產業技術綜合研究所專利 生物寄存中心之寄存編號FERM BP-7579，台灣食品工業 發展研究所之寄存編號CCRC 960160) ; 4D11 (曰本獨立行 政法人產業技術综合研究所專利生物寄存中心之寄存編號 FERM BP-7758 ’台灣食品工業發展研究所之寄存編號 CCRC 960161);或 F4-465(寄存編號 ATCCPTA-3338，台灣 食品工業發展研究所之寄存編號CCRC 960137)所產生之抗 體的重鏈可變區域及輕鏈可變區域之胺基酸序列。 (13) —種抗體或其功能性片段，其特徵為具有序列編號 44及46分別所示，融合瘤反河以卜卜⑺所產生之抗體的重鏈 可變區域及輕鏈可變區域；序列編號48及5〇分別所示，融 -18- 78148-990318.doc 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1327574 A7 _____B7_ 五、發明説明（14 ) 合瘤4D11所產生之抗體的重鏈可變區域及輕鏈可變區域： 或序列編號56及5 8分別所示，融合瘤F4-465所產生之抗體 的重鏈可變區域及輕鏈可變區域；之成熟部分的胺基酸序 列。 (14) 一種抗體或其功能性片段，其特徵為具有序列編號 43及45分別所示，編碼在分離自融合瘤km28 1-1-10之核酸 序列的重鏈可變區域及輕鏈可變區域；序列編號47及49分 別所示’編瑪在分離自融合瘤4D11之核酸序列的重鏈可變 區域及輕鏈可變區域；或序列編號55及57分別所示，編碼 在分離自融合瘤F4-465之核酸序列的重鍵可變區域及輕鏈 可變區域；之成熟部分的胺基酸序列。 (1 5)如上述（1)〜（14)之抗體或其功能性片段，其中係人類 抗體。 (16) —種醫藥組合物，其特徵為含有如上述（丨）〜（15)中任 一項之抗體或其功能性片段做為有效成分。 (17) —種免疫活化劑；抗腹瘤劑；或自體免疫疾病治療 劑’其特徵為含有如上述（1)〜(8)中任一項之抗體或其功能 性片段做為有效成分。 (1 8) —種免疫抑制劑；自體免疫疾病治療劑；過敏治療 劑；或血液凝固第VIII因子抑刮症候群治療劑，其特徵為 含有如上述（9)〜（14)中任一項之抗體或其功能性片段。 (19)在此，本發明之單株抗體所識別之人類CD40的抗原 位置，可藉由調查是否與由人類CD40之一次胺基酸序列所 得之重疊的合成寡肽（oligopeptide)結合等習知方法決定（例 -19- 78148-990318.doc 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1327574 A7 B7 五、發明説明（15 ) 如 Ed Harlow and David Lane (eds.)，Antibodies: A Laboratory Manual, 1988 Cold Spring Harbor Laboratory Press: US Patent No. 4708871)。亦可使用藉由噬菌體表達 (phage display)之肽庫（peptide library)套組（新英格蘭生物 實驗室（New England Biolabs))做為抗原位置定型（typing)之 用。本發明亦包含一種抗體或其功能性片段，其特徵為識 別藉由上述各融合瘤所產生之抗體或功能性片段所識別之 人類CD40之新穎抗原位置。 (20)本發明進一步提供一種分離自上述各融合瘤，至少 編碼抗體之重鏈及/或輊鏈可變區域的核酸（RNA或 cDNA);包含該核酸之載體；保有該核酸之宿主細胞。 以下’詳細說明本發明，本說明書包含做為本發明之優 先權基礎的PCT申請案PCT/US01/13672 (2001年4月27曰申 請）、曰本國專利申請案2001_142482號（2〇〇1年5月n曰申 請）、日本國專利申請案2001-3 10535號（2001年10月5曰申 請）及美國專利申請案USSN 10/040,244 (2001年10月26曰申 s青）之说明書及/或圖式所揭示之内容。 本發明人等，如下所述，得知對於B細胞上之CD40為拮 抗性之習知的單株抗體5D12 (ATCC No. HB-1 1339)，對於 DC細胞上之CD40非拮抗性。進一步發明人發現雖係阻斷 CD40L作用之拮抗性抗體，多數單株抗體藉由因抗免疫球 蛋白抗體之交聯，造成其自身顯示催動性活性。 1.定義 本說明書中所使用之用語的定義如下。 -20- 78148-990318.doc 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇x 297公爱) 1327574 A7 ________B7_ 五、發明說明（π ) 本發明中「人類CD40」，意指具有克拉克等人（E. A_
Clark et. al.，Proc·. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4494，1986)或 史塔門科維克等人（I· Stamenkovic et. al.，EMBO J. 8: 1403, 1989)所示之胺基酸序列之多肽，特別係指表現在b細胞； DC，巨嘆細胞；内皮細胞；上皮細胞；或彼等之腫瘤細 胞表面之抗原多肽。 「抗CD40單株抗體」’意指對於細胞所表現之CD40 ; 全長CD40 ;或部分長CD40之單株抗體的任一種，但較佳 者意指與CD40之細胞外部分結合，對於表現cd4〇之細胞 引發催動性或拮抗性作用之單株抗體。 進一步，本發明中「抗體」，意指來自編碼構成免疫球 蛋白之重鏈可變區域及重鏈怪定區域以及輕鏈可變區域及 輕鍵恨定區域之基因（合稱「抗體基因」）者。本發明之抗 體’亦包含具有任何免疫球蛋白種類（class)及同種型 (isotype)之抗體。本發明中抗體之「功能性片段」，意指 上述所定義之抗體的一部份（部分片段），並保有一種以上 抗體對抗原之作用》具體而言，可列舉F(ab，）2、Fab,、 Fab、Fv、二硫鍵結FV、單股FV(scFV)及此等之聚合物等 (D. J. King., Applications and Engineering of Monoclonal
Antibodies·，1998 T. J. Internati〇nal Ltd)。 本發明中「人類抗體」，意指抗體，其係人類由來之抗 體基因之表現產物。 催動性j ’思指促進對於表現在B細胞；腫瘤細胞； 或樹狀細胞等細胞表面上之CD40，其配位子結合的作用； -21- 78148-9903I8.doc 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公藿) 1327574 A7 B7 五、發明説明（17 ) 或將一種以上CD40配位子所給予CD40表現細胞之影響給 予表現CD40之細胞的作用，而「催動性抗體」，意指具有 如此催動性作用之抗體。 「拮抗性」，意指抑制對於表現在B細胞；腫瘤細胞； 或樹狀細胞等細胞表面上之CD40，其配位子結合的作用； 或中和一種以上CD40配位子所給予CD40表現細胞之影響 的作用；而「拮抗性抗體」，意指具有如此作用之抗體。 本發明中所謂「樹狀細胞（DC)」，亦稱作樹狀白血球， 意指具有強力抗原呈現功能之一群細胞。所使用之樹狀細 胞係藉由誘導培養例如骨髓；臍帶血；或末梢血液中所含 之CD34陽性前驅細胞而來。或藉由在GM-CSF及IL-4存在 下培養末梢血液中之CD 14陽性單核白血球所得。 「未成熟 DC」（Immmature DC)，意指 CD14陰性、CDla 強陽性、CD83、CD86陽性、MHC第II類陽性之DC。 「成熟DC」，意指CD14陰性、CDla陽性，CD83、 CD86、MHC第II類成為強陽性者。 本發明中「活化DC」，意指回應藉由CD40之刺激而DC 所引起的變化，意指例如使未成熟DC成熟，使CD80、 CD86、HLA-ClassII表現高，進一步增強IL-12之產生；或 與τ細胞共存時，給予τ細胞刺激，以促進增殖。 本發明中所謂活化B細胞、B細胞株，意指回應藉由 CD40之刺激而B細胞所引起的變化，意指例如產生DNA合 成、促進帶入胸苷、使CD95表現量增加。 2.抗體之取得 78148-990318.doc -22- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1327574 A7 B7__-_ 五、發明説明（18 ) 為取得本發明之抗體，以經藉由基因轉殖體生產•純化 之可溶性人類CD40 ;或表現人類CD40之基因重組小鼠細 胞株做為抗原針對小鼠進行免疫為佳。用於免疫之小鼠以 生產人類抗體之小鼠（Tomizuka. et al.，Proc Natl Acad Sci USA.，2000 Vol97: 722)較理想。據推測藉由篩選出與經藉 由基因轉殖體生產.純化之可溶性人類CD40結合的單株抗 體，相較筛選與B細胞專一性反應之純系，容易取得與表 現在B細胞以外之細胞的CD40亦有所反應的抗體。使用經 免疫之小鼠的淋巴結細胞或脾細胞，並使用製造單株抗體 中慣用之凱拉及米爾修丹等人之方法（Nature.，1975 Vol. 256: 495)可進行融合瘤之製作。 又，使用BIAcore 2000 (BIApore公司）等表面電漿共振測 定裝置分析可溶性CD40L與CD40之結合，以篩選不與 CD40L競爭之抗體。又篩選出抗體單獨下將B淋巴瘤細胞 增殖抑制予以抑制之抗體。進一步藉由以是否與DC細胞 作用為指標進行抗體之篩選，可製作•·篩選具備不與 CD40L競爭，作用於樹狀細胞或B細胞，且可抑制表現 CD40之癌細胞增殖之優點的抗體。 本發明之抗體，係藉由培養所取得之融合瘤所得。又，
自B細胞或融合瘤等抗體產生細胞，將編碼人類單株抗體 或其可變區域之基因予以純系化，嵌入適當之載體，並將 其導入宿主（例如哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆 蟲細胞 '植物細胞等），可調製使用基因重組技術所產生 之重組型抗體（p. j. Delves.，ANTIBODY PRODUCTION -23- 78148-990318.doc 本紙張尺度適用中國國家擦準(CNS〉A*規格(21〇χ 297公釐) 1327574 A7 B7 五、發明説明（19 ) ESSENTIAL TECHNIQUES., 1997 WILEY, P. Shepherd and C. Dean., Monoclonal Antibodies., 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS, J. W. Goding., Monoclonal Antibodies: principles and practice” 1993 ACADEMIC PRESS)。進一 步，亦可使用基因轉殖動物製作技術，製作將目的抗體之 基因嵌入内源性基因之基因轉殖牛；山羊；錦羊；或豬， 而自該基因轉殖動物之乳汁中大量取得該抗體基因由來之 單株抗體。在體外培養融合瘤時，配合所培養之細胞種類 的特性 '試驗研究目的及培養方法等種種條件，實施時可 使用習知用於增殖、維持及保存融合瘤，並使其產生單株 抗體於培養上清中之營養培養基或自習知的基本培養基所 誘導調製之所有營養培養基。. 3.篩選 篩選催動性抗體時，可藉由使用人類B淋巴瘤之分析進 行，而篩選促進CD95表現之抗體。進一步，在經純化DC 之培養液中添加抗體，篩選使其成熟之抗體。或根據使用 未成熟之DC細胞之混合淋巴細胞反應，篩選顯示τ細胞增 殖活性之抗體。進一步添加於成熟DC中以篩選具有IL-12 產生促進作用之抗體。又，篩選具有抑制表現CD40之腫瘤 細胞的增殖或誘導細胞死亡活性之抗體。與CD40L間之競 爭，可使用如BIACore之表面電漿共振測定裝置，根據抗 體是否抑制可溶性CD40與可溶性CD40配位子之結合加以 判別。或根據是否增強CD40配位子對於B細胞株之作用加 以判別。 -24- 78148-990318.doc 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇X297公釐） 1327574 A7 B7
筛選括抗性抗體時’可藉由使用人類B淋巴瘤之分析進 行’進一步藉由在抗FLAG抗體存在下’添加具有flag為 標s己之可溶性CD40L· ’筛選更加強力抑制可溶性CD40L與 人類B淋巴瘤細胞上之CD40結合的抗體。取代可溶性 CD40L ’亦可使用藉由導入編碼CD4〇L之基因，而在細胞 表面上表現多數CD40L之重組細胞。其次，藉由以抗人類 IgG抗體與人類抗體交聯，去除藉由交聯導致B淋巴瘤活化 之純系。進一步根據使用經純化並成熟之DC細胞的混合 淋巴細胞反應’篩選顯示T細胞增殖抑制活性之抗體；戋 在成熟DC中添加CD40配位子時具有IL-12產生抑制作用之 抗體。 以上所得之抗體，係具有被認為至少在以下任一種治療 效果上有用之性質者。 (1)催動性抗體之情形 (a) 作用於樹狀細胞，在LPS(脂多糖）及IFN r存在下，使 其產生IL-12。此時之LPS濃度為10 pg/ml至10 ng/m卜IFN r濃度為10·4Μ至1CT2M。在1 eg/ml以上之抗體濃度，較佳 者係〇. 1以g/m丨以上之抗體濃度下，相較以習知之催動性抗 CD40抗體之G28-5做為對照之試驗，il-12之產生量較多。 在lxlO6個/ml濃度之樹狀細胞中添加抗體濃度(u Mg/mla 上時，產生100 pg/m丨以上的IL-12 ;或添加1 " g/mi以上 時’產生1000 pg/ml以上，較佳者係loooo pg/mi以上的IL· 12。（參照實施例9、實施例13)。 (b) 具有與樹狀細胞結合，使樹狀細胞成熟之作用。且， -25- 78148-990318.doc 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1327574
五、發明説明（21 在20 #g/mi以下之濃度，鲂 鞔佳者係0.1〜15/zg/ml，進一步較 =者係5〜15"g/ml之濃度下，將抗體與樹狀細胞一併培養 可得到該使其成熟之活性較G28 5抗體高之結果表 照實施例9)。 (c)對於B細胞所建立夕u 之細胞株，促進CD95之表現的活性 亦較G28-5抗體高。此時， . 此畔，在10/^/111丨以上，較佳者係 1 g / m 1以上’進—步齡杜土 >> ，較佳者係〇· 1 V g/ml以上，更佳者係 〇 〇1/zg/ml以上，最佳去焱如' 敢佳者係超過0.001 Ag/ml之抗體濃度下， 相較以G28-5做為對昭之謎略 ~ τ,、，、之式驗，促進cd95之表現的活性 較（328-5抗體南。有關促+ W风進CD95之表現的活性，在抗體潰 度 10/zg/ml、1 //g/mi、〇 1 , / , 裝 .1 eg/ml、O.oi vg/mi下，為以 G28_ 5抗體做為對照之試驗的倍率如下（表i)。 抗體濃度 -'~~^^ ---- 倍率 10 fi g/ml 約2倍、較佳者為約3倍、更佳者為45倍、進 佳者為6倍 1 β g/ml 0Λ μ g/ml 約2倍、較佳者為約5倍、更佳者為約6倍、進 佳者為7倍 -~~_________ 為6倍、更佳者為釣7午 0.0 1 μ g/ml 2倍、k佳者為4倍、更佳者為5倍、進—步更 約6倍 尸 促進CD95之發現，音并pyL n -- -心k體活化B細胞所建立之細胞 株。在此’ B細胞所建立之細胞株可列舉以戰細胞意 Sulton細胞。又，Ram〇s細胞係勃克氏淋巴瘤⑺町如t η 線 -26- 78148-990318.doc 本纸張尺歧财S S家標準(CNS)A4規格(21〇χ297公爱) 1327574 A7 B7 五、發明説明（22 ) lymphoma)，人類之胚中心的B細胞之模型細胞。HS-Sulton 細胞係勃克氏淋巴瘤。（參照實施例6、實施例12)。 (d) 對於B細胞所建立之細胞株（Ramos細胞或HS-Sulton細 胞），DNA合成、胸：y：之帶入、增殖之抑制活性亦較G28-5 抗體高。此時之抗體濃度，至少為0.05 // g/ml，較佳者係 0.1〜15;^/1111=(參照實施例8) (e) 對於B細胞所建立之細胞株誘導細胞死亡。（參照實施 例 16)。 (f) 不抑制CD40配位子對於CD40之結合。「不抑制」， 意指即使在抗體已預先結合在CD40上的狀態下（亦即抗體 存在時），與該抗體不存在時相同程度，CD40L可與CD40 結合。CD40配位子與CD40之任一者或二者可為膜表現型 或可溶性蛋白質。（參照實施例11) » 具有上述性質之抗體，係藉由例如融合瘤KM302-1 (FERM BP-7578)、融合瘤 KM34 1 -1 -19(FERM BP-7759 及 CCRC 960162)所產生。 由融合瘤KM34 1-1-19所產生之單株抗體的重鏈（H鏈）及 輕鏈（L鏈）可變區域之鹼基序列及胺基酸序列已經決定（實 施例17)。本發明提供編碼由融合瘤KM34 1 -1 -1 9所產生之 單株抗體的至少重鏈可變區域；或重鏈全長之DNA，及編 碼輕鏈可變區域之DNA。該DNA除實施例17中所記載者 外，亦包含藉由密碼簡並（degeneracy)而編碼相同胺基酸序 列之其他DNA。又，本發明提供一種單株抗體或其功能性 片段，其特徵為藉由實施例17中所揭示之至少重鏈可變區 78148-990318.doc -27- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1327574 A7 B7 五、發明説明（23 ) 域之胺基酸序列；或重鏈全長之胺基酸序列；及輕鏈可變 區域之胺基酸序列所定義。 (2)拮抗性抗體之情形 (g) 中和對於CD40之配位子的作用。在此，「配位子的 作用」，意指表現在T細胞或其他細胞之配位子的作用； 及對於CD4〇之游離之配位子的作用之任一者。（參照實施 例7、實施例14)。 (h) 中和對於B細胞所建立之細胞株上的CD40之配位子所 給予CD40表現細胞之一種以上影響，且藉由因抗免疫球蛋 白抗體之交聯，對於上述B細胞所建立之細胞株上的CD40 未顯示催動性作用。該作用亦較5D12弱。「給予CD40表 現細胞之影響」，意指表現細.胞之活化，意指B細胞中胸 苷之帶入、增殖；B細胞所建立之細胞株中CD95發現之增 強等。又，在DC方面，意指使其成熟化、CD86、HLA-DR 表現增強；共存T細胞之胸：y：之帶入、增殖之促進；IL-12 或IL-10之產生等。因抗免疫球蛋白抗體之交聯，係藉由 使培養液中存在0.1" g/ml以上之抗免疫球蛋白抗體所進 行。（參照實施例7)。 (i) 緩和或中和對於B細胞所建立之細胞株，已交聯之 CD40L或表現在細胞之CD40L増加其CD95之表現的活性。 對於以對於標記之抗體等交聯，而增強其作用之CD40L， 亦緩和或中和其活性。對於CD40之配位子（包含游離之配 位子、表現在特定細胞之配位子二者），一與CD40表現細 胞結合，即在細胞内引起信號傳遞，最後在細胞表面上表 78148-990318.doc -28- 本纸張尺度適用中琴國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 裝 訂
線 1327574 A7 B7 五、發明説明（24 ) 現CD95 (Fas)。因此，本發明之拮抗性抗體，藉由與CD40 結合，抑制上述信號傳遞而中和CD95之表現。此時之抗體 濃度為1 μ g/ml以上，較佳者係0.1 a g/ml以上。（參照實施 例7、實施例14)。 (j)對於DC上之CD40具拮抗性。亦即，緩和或中和 CD40L活化DC之活性。DC—旦藉由共存T細胞上之配位子 而受刺激，即活化T細胞，促進其胸苷之帶入等。使不同 個體由來之DC與T細胞共存之混合淋巴細胞反應中，藉由 DC與T細胞所引起之相互作用，引起T細胞之活化。本發 明之拮抗性抗體，藉由與CD40結合，抑制上述相互作用， 其結果導致胸苷之帶入受抑制。此時之抗體濃度，至少為 O.OOl/zg/ml，較佳者係0.1〜10/i.g/ml。（參照實施例10)。 上述拮抗性抗體，係藉由例如融合瘤KM281-1-10 (FERM BP-7579 及 CCRC 960160)、KM281-2-10-1-2 (FERM BP-7580)、4D11 (FERM BP-7758及CCRC 960161)所產生。 (3)本發明之抗體，藉由該業者所週知之基因工程方式改 變，亦即將定義抗體重鏈之亞類（subclass)的區域與定義其 他亞類之區域置換，可變換為不同亞類（例如，參照EP 314161公報）。可將重鏈（heavy chain)之可變區域，保持原 狀與其他亞類之怪定區域（constant region)相接。可藉由例 如將本發明之抗體的亞類變換為IgG2或IgG4，使對於Fc受 器之結合度減低。具體而言，可藉由卡巴特等人之方法 (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service. National Institute of Health, Bethesda, 78148-990318.doc -29- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(210X297公釐） 1327574 A7 _____B7__ 五、發明説明（25 )
Md. (1991))，在人類抗體重鏈、EU index 118(Ala)，119 (Ser)位置上導入Nhel site (GCTAGC)，藉由使用該限制酶 進行消化，在未改變胺基酸下，與其他亞類之IgG相接。 進一步’可藉由將恆定區域之胺基酸序列做人為性改變； 或將具有如此序列之恆定區域序列與本發明之抗體的可變 區域結合，減低對於Fc受器之結合度（Lund J.，et al.，J.
Immunol· 1991 vol 147:2657-2662);或增加或減少 CDC 活 性（Tao M·，et. al·，J. Exp. Med. 1991 vol 1025-1028, Idusogie E E·, et. al·, J. Immunol. 2001 voll66: 257卜5)。 又’為避免ADCC或CDC等之作用，亦可預先僅篩選亞類 為IgG2或IgG4之抗體。又’亦可藉由在本發明之抗體上， 結合放射性同位素；細菌毒素；化學療法劑；前藥等，進 一步增強癌症等疾病之治療效果。 4.醫藥組合物 又’含有本發明之抗體之經純化製劑的醫藥組合物，亦 包含在本發明之範圍内。此類醫藥組合物，較佳者除抗體 外’含有生理學上容許之稀釋劑或載體，亦可為與如其他 抗體或抗生素之其他藥劑的混合物。適當之載體雖包含生 理食鹽水、磷酸緩衝生理食鹽水、磷酸緩衝生理食鹽水葡 萄糖液、及緩衝生理食鹽水，但並未限定為此等者。或， 亦可將抗體冷凍乾燥（freeze dry)，需要時藉由添加如上述 之緩衝水溶液予以再構成後再行使用。投予途徑為口服途 徑；及靜脈内、肌肉内、皮下及腹腔内注射；或包含配藥 之非經腸途徑。 μ -30- 78148-990318.doc _本紙锒尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210Χ 297公釐) ----- 1327574 A7
此時’本發明之抗體的有效 ^ s及與適當之稀釋劑及藥理 :了使用之載體的組合所投予之有效量為每回每i kg體 重O.lmg〜loomg，並以2日至8星期之間隔投予。 使本發明之抗體的醫藥組合物時，有關催動性抗 體，係免疫活化劑(抗病毒劑、抗感染症劑)、抗腫瘤劑、 自體免疫疾病治療劑’此等疾病亦可為複數併發者。或， 亦可併用做為癌專-性肽等之疫苗與佐劑。又關於结抗 性抗體，可有效做為器官移植時之免疫抑制劑（騰島移植 或腎臟等移植時之排斥反應、GVHk預防或治療劑），或 f為自體免疫疾病(例如，風濕性關節炎、動脈硬化治療 藥、多發性硬化症、全身性红班性狼瘡、特發性血小板減 少症、克隆氏病等）治療藥；氣喘等過敏治療藥；血液凝 固第VIII因子抑制症候群之治療藥。此等疾病亦可為複數 併發者。 做為CD40所參與之疾病的治療方法，在使用抗(：：〇4〇抗 體時，藉由以DC細胞為指標以篩選抗體，可期待獲得產 生更佳治療效果之抗體。 在催動性抗體中，藉由篩選可更加活化DC之抗體，可 期待獲得強免疫增強作用之抗體。進一步，以成熟DC之 IL-12生產促進為指標，可獲得強cTl誘導作用之抗體。可 獲得藉由CTL誘導’去除病毒感染細胞或腫瘤細胞效果較 高之抗體。又’為期待協同效果，雖為與CD40結合之抗 體，但以不抑制CD40與CD40結合之抗體較理想。在考量 癌症治療之情形時，認為只要係對於表現CD40之癌細胞可 78148-990318.doc -31- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇X 297公釐)
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線 1327574 A7 B7 五、發明説明（27 ) 直接誘導細胞死亡或抑制增殖，且可有效率地活化DC細 胞之抗體，即可期待協同效果，亦可做為未表現CD40之腫 瘤可使用之治療藥。該抗體被認為可有效做為病毒感染症 之治療藥或抗腫瘤藥。 另一方面，有關可與CD40專一性結合，並抑制CD40L之 結合，而且不活化CD40活性之抗體，以除抑制對於B細胞 之配位子的作用，亦可抑制對於DC細胞之作用者較理 想。惟，迄今所得之抗體，因係以對於B細胞之效果做為 指標，若能取得對於樹狀細胞亦具有強力抑制作用者，在 醫藥品開發上具有重大意義。進一步，如上所述，抗CD40 抗體藉由交聯，可能具有完全相反之作用的疑慮，故即使 藉由交聯亦不活化CD40之抗體有其必要。因對於迄今經報 告之人類CD40的小鼠等非人類哺乳動物由來之單株抗體； 及包含小鼠單株抗體之可變區域與人類免疫球蛋白之恆定 區域之嵌合抗體或藉由CDR移植之人類化抗體，疑慮其具 有抗原性，故做為抑制與CD40配位子間之結合的抗體以人 類抗體較理想。 圖式之簡單說明 圖1所示為KM302-1抗體促進CD95表現之結果。 圖2 A所示為拮抗性抗體中和CD40配位子對於Ramos細 胞之作用。 圖2B所示為拮抗性抗體中和CD40配位子對於Ramos細 胞之作用。 圖3所示為KM281-1-10抗體中和CD40配位子對於Ramos 78148-990318.doc -32- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1327574 A7 B7 五、發明説明（28 ) 細胞之作用。 圖4所示為受交聯之KM281-1-10抗體未促進CD95表現之 結果。 圖5所示為受交聯之5D12抗體，促進CD95表現之結果。 圖6所示為藉由KM302-1抗體，對於腫瘤細胞增殖抑制 之效果。 圖7所示為KM302-1抗體促進DC細胞成熟之結果。 圖8所示為KM302-1抗體促進DC細胞產生IL-12之結果。 圖9所示為藉由KM281-1-10抗體，中和CD40配位子對於 DC之作用。 圖1 0所示為藉由KM281-1-10抗體，中和CD40配位子對 於DC之作用。 圖11所示為藉由KM3 02-1抗體，活化未成熟DC-MLR。 圖1 2所示為KM341-1-19抗體等，促進Ramos細胞表現 CD95。 圖13所示為〖厘34卜1-19抗體，促進成熟0(：細胞產生11^ 12 ° 圖1 4所示為KM34卜1-19抗體，促進成熟DC細胞產生IL-10 ° 圖15所示為4D11抗體等，中和CD40配位子對於Ramos 細胞之作用。 圖1 6所示為KM302-1抗體在人類腫瘤細胞移植小鼠模型 中之抗腫瘤效果。 圖1 7所示為KM34 1 -1 - 1 9抗體對於腫瘤細胞之增殖抑制 78148-990318.doc -33- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1327574 A7 B7 五、發明説明（29 ) 效果》 圖1 8所示為F4-465、4D11、KM281-1-10之抗原專一性 抑制IgG產生。 圖1 9所示為F4-465、4D11、KM281-1-10之抗原專一性 抑制IgM產生。 圖2 0所示為F4-465抑制扁桃腺B細胞之增殖。 實施發明之最佳型態 以下，根據實施例進一步具體說明本發明。惟，本發明 不以此等實施例+中之技術範圍為限。 [實施例1]抗原之製作 (1) 細胞 EL-4細胞係小鼠由來之T細胞株，可容易取得（ATCC No. : TIB-39)。Ramos B 細胞（ATCC No. : CRL-1596);及小 鼠抗CD40抗體產生融合瘤G28-5 (HB-9110)及5D12 (HB-1 1339)購自 ATCC。 (2) 抗原之表現與純化 以人類CD40cDNA(基因庫寄託編號：NM 001250)為模 板，使用以下之引子，藉由PCR，根據（95°C 5秒、55°C 30 秒、72°C 30秒）X20循環之條件增幅細胞外區域。 引子 1 : 5’-CCCAGATCTGTCCATCCAGAACCACqCACTGCATGCAGAG-3，（序列编號 1) 引子2 : 5--ACAAGATCTGGGCTCTACGTATCTCAGCCGATCCTGGGGAC-3,(序列编號2) 所增幅之cDNA，嵌入pFastBac載體（Gibco BRL)之波狀 熱菌素信號序列之後，人類IgGl由來FC或小鼠IgG2a由來 FC區域之前。為生產CD40，根據使用說明書製作重組竿 78148-990318.doc _34- 本紙張尺度適用中國圉家擦準(CNS) A4规格(210X 297公爱) 裝 訂
線 1327574 A7 B7 五、發明説明（30 ) 狀病毒（Baculovirus)。Tn5細胞經重組病毒感染後，培養4 天。上清經0.22 nm過滤器處理後，添加ProteinG sephar〇se (安法瑪亞醫藥），在4°C下輕輕搖晃。一晚後，將sepharose 移至管柱’以20倍容量之PBS洗淨》人類CD40 FC蛋白質 係藉由20 mM甘胺酸緩衝液（pH 3.0)溶析。為使CD40表現 於細胞表面之載體，係購自Randolph J. Noelle (Inui，s et al.，EJI，20，1747-1753，1990)。全長 cDNA藉由 Xbal進行錄 素切斷，並嵌入pCDNA3 (INVITROGENE) »將載體導入 EL-4細胞，並藉由在0.5 mg/ml G418 (Gibco BRL)存在下培 養以獲得安定表現株》CD40之表現，係使用FITC-結合抗 人類CD40抗體（Pharmingen)，藉由FACS分析加以確認。 [實施例2]免疫用小鼠之製作. 用於免疫之小鼠，在内源性Ig重鏈及/C輕鏈破壞之二者 上，具有同源接合子之遺傳背景，且一併保有含有人類1g 重鏈基因座之14號染色體片段（SC20)及人類Ig/c鏈轉殖基 因（transgene)(Kco5) »該小鼠係藉由具有人類Ig重鏈基因座 之系統A小鼠，與具有人類ig /c鏈轉殖基因之系統b小鼠間 之交配所製得。系統A在内源性Ig重鏈及/c輕鏈破壞之二 者上，係同源接合子，為保有可傳遞子孫之14號染色體片 段（SC20)之小鼠系統，例如富塚等人之報告（Tomizuka· et al·，Proc Natl Acad Sci USA·，2000 Vol97: 722)所記載者。 藉由免疫A系統小鼠，取得如下所示之融合瘤、f2- 103、 F5-77。又，系統b在内源性Ig重鏈及/c輕鏈破壞之二者 上’係同源接合子，為保有人類Ig/C鏈轉殖基因（KCo5)之 -35- 78148-990318.doc 本纸張尺度適用中國国家標竿(CNS) A4規格(21〇x 297公釐) 1327574 A7 _B7 五、發明説明（31 ) 小鼠系統（基因轉殖小鼠），例如費許威爾德等人之報告 " (Nat Biotechnol.，1996 Vol 14: 845)所記載者。 . 將藉由系統A之雄性小鼠與系統B之雌性小鼠；或系統a 之雌性小鼠與系統B之雄性小鼠交配所得，血清中一併檢 測出人類Ig重鍵及/C輕鍵之個體（Ishida & Lonbefg，IBC，s 11th Antibody Engineering, Abstract 2000)，使用於以下之 免疫實驗。又’上述產生人類抗體小鼠，可藉由締結契 約，取自麒麟哗酒股份公司。藉由免疫上述小鼠，取得如 下所示之融合瘤·，KM302-1、KM341-1-19、KM643-4-11、 2053、2105、3821、3822、285、110、115、KM281-1-10 ' KM281-2-10-1-2 ' KM283-5 ' KM292-1-24 ^ KM225-2-56、KM341-6-9、4D11、5H10、11E1、5G3、3811、 341 1、3417。又黑岩（Kuroiwa)等人所報告之保有人類抗體 Lambda鏈之嵌合小鼠（Kuroiwa et. al.，Nat Biotechnol·，2000 vol 18: 1086)亦用於以下之免疫實驗。自該小鼠取得融合 瘤 F4-465 。 [實施例3]對於人類CD40之人類單株抗體之調製 本實驗中單株抗體之製作，係根據單株抗體實驗操作入 門（安東民衛等人著作，講談社發行1991)所記載之一般方 法調製。做為免疫原之人類CD40係使用實施例1所調製之 人類CD40人類FC與表現CD40的EL-4細胞。被免疫動物係 使用實施例2所製作之產生人類免疫球蛋白之人類抗體產 生小鼠。 針對人類抗體產生小鼠，免疫CD40 : hFc每1個體2至100 -36- 78148-990318.doc 本紙張尺度逋用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1327574 A7 B7 五、發明説明（32 ) β g/回。抗原溶液除初次外，與等量不完全之弗氏佐劑 (Freund’s adjuvant)(Sigma)混合，分數處注射皮下。每約1〇 日至3星期進行免疫3-4回。初次係使用不完全之弗氏佐劑 (Sigma)。自小鼠尾部抽血，使用ELISA測定對於血清中 CD40之人類抗體7及疋。取出脾臟3-4日前，自尾靜脈注 射經溶解於PBS之CD40 : Fc 2〇eg以進行最終免疫。 針對人類抗體產生小鼠，免疫表現人類CD40之小鼠EL-4細胞。將EL-4細胞以108個/ml懸浮於PB S，並緩慢與預先 以PBS乳化之等量的RIBI佐劑混合。細胞係每約10日至3星 期進行免疫3-5回。未使用佐劑時，以8000rad X線照射後 使用。 以外科方式自經免疫小鼠取得脾臟，將所回收之脾臟細 胞與小鼠骨髓瘤SP2/0 (ATCC No·: CRL1581)以5: 1混合， 使用聚乙二醇1500 (Boehringer Mannheim公司製）做為融合 劑藉由細胞融合製作多數之融合瘤。融合瘤之篩選，係藉 由在含有10%胎牛血清（Fetal Calf Serum; FCS)與次黃嗓吟 (hypoxanthine)(H)、胺基喋呤（aminopterin)(A)、胸苷（T)之 含有HAT的DMEM培養基（Gibco BRL公司製）中進行培養。 進一步，使用含有HT的DMEM培養基藉由極限稀釋法取得 單一純系（single clone)。培養係在96孔微量力價盤（Becton Dickinson公司製）。產生抗人類CD40人類單株抗體之融合 瘤純系的篩選（screening)，係藉由將記載在實施例4之藉由 酵素標示免疫吸附測定（ELISA)及螢光活化細胞篩選器 (FACS)之測定所進行。 78148-990318.doc -37- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 裝 訂
1327574 A7 ____B7___ 五、發明説明（33 ) 藉由ELISA對於產生人類單株抗體的融合瘤之篩選，係 藉由以下所述之3種ELISA及FACS分析，獲得產生具有人 • 類免疫球蛋白了鏈（hlgT )及人類免疫球蛋白輕鏈/c，且對 於人類CD40具有專一性反應之人類單株抗體的多數融合 瘤。又’包含本實施例之以下任一實施例中，以及實施例 中做為試驗結果所出示之表或圖中，各個本發明之產生人 類抗人類CD40單株抗體之融合瘤係使用記號予以命名。 又’接續在該記號之後的「抗體」，意指自個別融合瘤所 產生之抗體；或藉由宿主細胞所產生之重組抗體，該宿主 細胞保有自該融合瘤所分離之抗體基因（全長或可變區 域）。又在文義上明顯之範圍内，融合瘤純系的名稱有時 係表不抗體的名稱。 以下之融合瘤純系係表示單一純系。 催動性抗體： KM302-1、KM341-1-19、KM643-4-1 1、2053、2105、3821、 3822、285、1 10、115、Fl-102、F2-103、F5-77、F5-157 拮抗性抗體： KM281-1-10、KM281-2-10-1-2、KM283-5、KM292-1-24、 KM225-2-56、KM341-6-9、4D11、5H10、iiEl、5G3、 381 1、3411、3417、F4-465 將其中3種融合瘤純系KM302-1、KM281-1-10及KM281-2-10-1-2，在平成 13 年（2001 年）5月 9日；純系 KM34 1-1-19 及4D11 ’在平成13年（2001年）9月27日；純系21〇5，在平 成14年（2002年）4月17曰，根據布達佩斯條約國際寄存於 -38- 78148-990318.doc 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1327574 A7 B7 五、發明説明（34 ) 獨立行政法人產業技術總合研究所專利生物寄存中心（茨 城縣筑波市東1 丁目1番地）。將具有F2-103、F5-77及F5-157之重鏈及輕鏈可變區域的質體，在2001年4月19日；融 合瘤F1-102及F4-465，在2001年4月24日，根據布達佩斯條 約國際寄存於 ATCC (American Type Culture Collection, 10801 University Blvd·，Manassas, Virginia, USA)(美國國立 菌種培養收集中心，美利堅合眾國維吉尼亞州201 10-2209 馬那薩斯10801布魯維德大學）（表2)，其中融合瘤純系F5-77、F1-102及F4-465於2001年4月24曰寄存於台灣食品工業 發展研究所，寄存編號為CCRC 960135、CCRC 960136、 CCRC 960137，融合瘤純系 F2-103及F5-157於2001年6 月 27 曰寄存於台灣食品工業發展研究所，寄存編號為CCRC 960138、CCRC 960140，融合瘤純系 KM281-1-10、4D11、 KM34 1-1-19及2 105於2002年7月9日寄存於台灣食品工業發 展研究所，寄存編號為CCRC 960160、CCRC 960161、 CCRC 960162及CCRC 960163。 78148-990318.doc -39- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1327574 A7 B7 五、發明説明（35 ) 表2 名稱 國外寄存編號 台灣食品工業發展 研究所寄存編號 KM302-1 FERM BP-7578 KM281-1-10 FERM BP-7579 CCRC 960160 KM281-2-I0-1-2 FERM BP-7580 KM341-1-19 FERM BP-7759 CCRC 960162 4D11 FERM BP-7758 CCRC 960161 2105 FERM BP-8024 CCRC 960163 F1-102 ATCC PTA-3337 CCRC 960136 F4-465 ATCC PTA-3338 CCRC 960137 F5-77 CCRC 960135 F2-103 CCRC 960138 F5-157 CCRC 960140 F2-103 重鏈（F2-103-H) ATCC PTA-3302 F2-103 輕鏈（F2-103-L) ATCC PTA-3303 F5-77 重鏈（F5-77-H) ATCC PTA-3304 F5-77 輕鏈(F5-77-L) ATCC PTA-3305 F5-157 重鏈（F5-157-H) ATCC PTA-3306 F5-157 輕鏈(F5-157-L) ATCC PTA-3307 [實施例4]融合瘤之篩選 具有人類免疫球蛋白r鏈之單株抗體之測定 將實施例1所製做之人類CD40小鼠FC (1 /zg/ml)以50 #1/ 孔，添加於ELIS A用96孔微量盤（Maxisorp，Nunc公司製） 78148-990318.doc -40- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1327574 A7 B7 五、發明説明（36 ) 之各孔中，並培養在4°C下，使人類CD40小鼠FC吸附於微 量盤。其次，棄置上清，在各孔中添加阻斷試藥（布羅克 亞士（Block Ace)，大日本製藥），在室溫下培養以進行阻 斷。在各孔中，添加各融合瘤之培養上清（50 yl)，使其反 應後，以含有0.1 % Tween 20之磷酸緩衝液（PBS-T)洗淨各 孔。其次，在各孔中添加如下溶液（50 ^丨/孔）並進行培養， 該溶液係以含有1 % FBS之PBS-T將經過氧化酵素標示之山 羊抗人類180(7)抗體（8丨§1113;八0170)以5,000倍稀釋者。 將微量盤以PBS-T冼淨3回後，在各孔中添加呈色基質液 (TMB ’ 50 //1/孔，住友Bakelite公司製），並在室溫下培養 30分鐘。在各孔中添加終止液（50/zl/孔）以終止反應。以微 量盤讀數器測定波長450nm下之吸光度。在FACS中分析陽 性孔之培養上清，篩選將Ramos細胞染色的孔，根據極限 稀釋法將該細胞純系化，在每1孔中取得1純系。以使用人 類CD40小鼠FC之ELISA確認h /c陽性。其結果，自20個體 之小鼠取得1 73純系之抗人類CD40抗體。其一部份示於表3 (催動性抗體）及表4(拮抗性抗體）。催動性抗體中，至少 〖厘341-1-19與2105，在使用表現€0401^之細胞、表現0040 之細胞及抗體之競爭試驗中未顯示顯著競爭。 78148-990318.doc -41 - 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1327574 A7 B7 五、發明説明（37 ) 表3 催動, !·生抗體 融合瘤 抗原 亞類 t)C 腫瘤細胞 KM302-1 CD40小鼠FC IgG4 活性化 增殖抑制 KM341-1-19 表現人類CD40之EL-4 Ig〇2 活性化 增殖抑制 KM643-4-1 1 CD40小鼠FC IgGl 未實施 未實施 2053 CD40小鼠FC I§G2 未實施 未實施 2105 CD40小鼠FC IgG2 未實施 未實施 3821 表現人類CD40之EL-4 IgG3 未實施 未實施 3822 表現人類CD40之EL-4 IgG3 未實施 未實施 285 CD40小鼠FC IgGl 未實施 未實施 110 CD40小鼠FC IgG4 未實施 未實施 115 CD40小鼠FC IgG4 未實施 未實施 F2-103 CD40小鼠FC IgGl 未實施 未實施 F5-77 CD40小鼠FC IgGl 未實施 未實施 -42- 78148-990318.doc 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1327574 A7 B7 五、發明説明（38 ) 表4 抬抗* 14抗體 融合瘤 抗原 亞類 交聯之影響 DC-MLR KM281-1-10 CD40小鼠FC IgGl 小 抑制 KM281-2-10-1-2 CD40小鼠FC IgGl 小 未實施 KM283-5 CD40小鼠FC I§G4 大 未抑制 KM225-2-56 CD40小鼠FC IgG4 大 未實施 KM292-1-24 CD40小鼠FC IgG2 大 未實施 KM341-6-9 表現人類CD40之EL-4 IgGl 大 未實施 4D11 CD40小鼠FC IgGl 小 未實施 5H10 CD40小鼠FC IgGl 小 未實施 11E1 CD40小鼠FC IgGl 小 未實施 5G3 CD40小鼠FC Ig〇2 大 未實施 3811 表現人類CD40之EL-4 IgGl 大 未實施 3411 表現人類CD40之EL-4 IgG2 大 未實施 3417 表現人類CD40之EL-4 IgG2 大 未實施 F4-465 表現人類CD40之EL-4 IgGl 未實施 未實施 具有人類免疫球蛋白輕鏈/c (Ig /c )之單株抗體的測定， 除使用經過氧化酵素標示之山羊抗人類Ig /c抗體（1,000倍 稀釋 ’ 50 μ 1/孔，Southern Biotechnology 公司製）外，係以 上述人類免疫球蛋白T鏈之ELISA的相同方法進行。 各單株抗體之亞類鑑定，除分別使用經過氧化酵素標示 之綿羊抗人類IgGl抗體；綿羊抗人類IgG2抗體；綿羊抗人 類1§03抗體；或綿羊抗人類4〇4抗體（各2,000倍稀釋，50 μ 1/孔，The Binding Site公司製）外，係以上述人類免疫球 78148-990318.doc -43- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1327574 A7 B7 五、發明説明（39 ) 蛋白γ鏈之ELISA的相同方法進行。 對於人類CD40表現細胞之各單株抗體的反應試驗 各單株抗體對於經報告之CD40所表現之Ramos細胞株的 反應性，係根據FACS分析進行檢討。 將濃度為2x106/ml的Ramos細胞株懸浮於含有0.1% NaN3、2%FCS之PBS的染色緩衝液（SB)。將細胞懸浮液 (ΙΟΟμΙ/孔）分別注入於96孔圓底盤（Becton Dickinson公司 製）。添加各融合瘤之培養上清（50//1)，在冰溫下培養30分 鐘。使用對於人類血清白蛋白之人類IgGl抗體做為陰性對 照組，以培養融合瘤之培養基，調製為濃度2 // g/ml，添加 50"1後在冰溫下培養15分鐘。以SB洗淨後，添加經250倍 稀釋之R-PE榮光標示人類抗體（Southern Biotechnology公司 製）50 // 1，並在冰溫下培養1 5分鐘。以SB洗淨2回後，懸 浮於 300-500 1 的 FACS 緩衝液，並以 FACS (FACSort、 FACScan，Becton Dickinson公司製）測定各細胞之螢光強 度。其結果，篩選出具有與Ramos細胞株結合活性之抗 體。 [實施例5]各抗體之調製 含有單株抗體之培養上清係根據以下方法進行調製。 產生G28-5抗體的融合瘤係得自ATCC (ATCC No. HB-91 10)。在含有牛胰島素（5 eg/ml，Gibco BRL公司製）、人 類鐵傳遞蛋白（transferrin)(5 yg/ml，Gibco BRL公司製）、 乙醇胺（0.01 mM，Sigma公司製）、亞硒酸鈉（2.5x10-5ηΜ， Sigma公司製）之cRDF培養基（極東製藥公司製）中將抗CD40 78148-990318.doc -44- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1327574 A7 B7 五、發明説明（40 ) 抗體產生融合瘤予以酬化。在搜拌式培養瓶（spinner flask) 中培養，並在融合瘤之活細胞率到達90%時將培養上清回 收。所回收之上清，供l〇//m與0.2 μ m之過遽器（Gelman Science公司製）使用，以去除融合瘤等之雜質。 來自上述培養上清之抗CD40抗體係以如下方法進行純 化。使用Hyper D Protein A管柱（日本碍子製）或用於純化 小鼠 IgGl 之 Protein G管柱（Amersham Pharmacia Biotech)， 根據所附說明書，使用PBS(-)做為吸附緩衝液；0.1M檸檬 酸鈉緩衝液（pH 3)做為溶析緩衝液，將含有抗CD40抗體之 培養上清予以親和性純化*溶析部分添加1M Tris-HCl (pH 8.0)或Na2HP04溶液調整至PH 7.2附近。經調整之抗體溶 液，使用透析膜（10000 cut，Spectrum Laboratories 公司製） 或 SP 管柱（Amersham Pharmacia Biotech)置換為 PBS(-)，並 以孔徑0.22 "m之濾膜過濾器MILLEX-GV (MILLIPORE製） 過濾滅菌。純化抗體之濃度係測定280 nm之吸光度，並以 1 mg/ml為 1，45 OD所算出。 [實施例6] Ramos細胞中藉由抗CD40催動性抗體之CD95表 現之促進 將5.0xl05個/ml的Ramos細胞懸浮液，以ι〇0/ζι/孔接種至 96孔盤（每1孔5x 1 〇4個）。以培養基將融合瘤培養上清或純 化抗體稀釋至20 /zg/ml，並以100 a 1/孔之濃度添加至96孔 盤。經一晚培養後，收集細胞，使用R_PE標示抗CD95抗 體（Pharmingen NJ)，以 FACSCan 或 FACSsort (Becton Dickinson)進行分析。結果如圖1所示。圖中橫軸係表示 78148-990318.doc .45- 本纸银尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X297公釐） 1327574 A7 B7 五、發明説明（41 ) CD95之表現強度。添加抗體以粗線；未添加者以細線表 示。KM302-1抗體，相較習知抗體之G28-5，顯示較促進 CD95之表現。亦即，顯示係具較高效果之催動性抗體。 [實施例7] Ramos細胞中藉由抗CD40拮抗性抗體之CD95表 現之抑制 將1.0x106個/ml的Ramos細胞懸浮液，以50以1/孔接種至 96孔盤。以培養基將融合瘤培養上清或純化抗體調整至2 // g/ml，並以100 //1/孔之濃度添加至96孔盤。將可溶性CD40 配位子（ALEXIS 公司）4 μ g/ml 與抗 FLAG 抗體（M2，Sigma) 4 //g/ml添加於培養基中，並以50" 1/孔之濃度添加至96孔 盤。經一晚培養後，收集細胞，使用R-PE標示抗CD95抗 體（Pharmingen NJ)，以FACS進行分析。結果如圖2 A、圖 2 B、圖3所示。圖中橫軸係表示CD95之表現強度。 KM28卜 1-10、KM281-2-10-1-2、KM283-5、KM292-1-24、 KM225-2-56之各融合瘤所產生之抗體，抑制CD95之表現 至陰性對照組相同程度》 圖3中，KM28 1-1-10抗體（下方形圖），相較習知抗體之 5D12抗體（中央方形圖）僅略抑制CD95之表現，顯示更加抑 制CD95的表現。亦即，顯示係具較高效果之拮抗性抗體。 藉此顯示人類單株抗體係拮抗性抗體。 受抗免疫球蛋白交聯之影響 將1.0x106個/ml的Ramos細胞懸浮液，以50/zl/孔接種至 96孔盤。以培養基將融合瘤培養上清或純化抗體調整至2烊 g/ml，並以100 "1/孔之濃度添加至96孔盤。將抗人類IgG抗 78148-990318.doc -46- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1327574 A7 B7 五、發明説明（42 ) 體（Sigma，13382)或抗小鼠IgG 抗體（Biosource，AMI3401) 添加於培養基中，並使其濃度為4/z g/ml，以50 /z 1/孔之濃 度添加至96孔盤。經一晚培養後，收集細胞，使用R-PE標 示抗CD95抗體（Pharmingen NJ)，以FACS進行分析。結果 如圖4、圖5所示。圖中橫轴係表示CD95之表現強度。 KM281-1-10、KM281-2-10-1-2之各融合瘤所產生之抗體將 CD95 之表現予以抑制。惟 > 5D12 ' KM283-5 ' KM292-1-24、KM225-2-56之各融合瘤所產生之抗體反而增強CD95 之表現。 [實施例8] Ramos細胞中藉由抗CD40催動性抗體之增殖抑制 將1.0乂105個/1111的1^111〇5、118-31111〇11懸浮液’以100//1/孔 接種至96孔盤。在培養基中添加純化抗體或可溶性CD40配 位子及抗FLAG抗體（M2)之等量混合物，經2日培養後，添 加100/zCi/ml的3H-胸苷（安法瑪亞醫藥）10/zl。18小時後， 使用 Macro96 Harvester (SKATRON)採集（harvest)至 Printed Filtermat A (瓦拉克）（Wallac)，乾燥後充分浸潰於Betap: Scint(瓦拉克），封裝後，以1205 BETAPLATE液體閃爍計 數器測定活性。結果如圖6所示。圖中，縱轴係表示細胞 之3H-胸苷之帶入量；橫軸係表示培養液中抗體或CD40L濃 度。與Ramos細胞、HS-Sulton細胞一併，添加KM302-1抗 體時，相較習知之G28-5抗體或CD40L，胸甞之帶入較 低，顯示KM302-1抗體係可有效抑制腫瘤細胞增殖之催動 性抗體。 [實施例9]藉由CD40催動性抗體之樹狀細胞的活化 78148-990318.doc .47- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1327574 A7 B7 五、發明説明（43 ) (1) 材料及方法 重組型人類IL-4係講自Genzyme techne公司。抗人類 .CD14 MACS珠係購自米爾天伊生技（Miltenyi Biotech GmbH) 公司。Lymphoprep係購自Nycomed Pharma AS公司。用於 培養之培養基，DC誘導時，係使用在RPMI1640 (Gibco BRL)中添加10%熱去活化FCS(細胞培養技術）、l〇mM HEPES (Sigma)、55 //Μ 2-氫硫基乙醇（Gibco BRL)、硫酸 鍊黴素（明治製果）者。染色時之細胞洗淨，係使用添加2 % FCS (Cell Culture Technologies)、〇.〇2%Azaid 之 PBS (Sigma)。細胞冷凍時’係使用日本全藥工業公司製之西爾 班卡（Cell Banker)。 (2) 單核白血球由來DC之誘導 自末梢血液’藉由使用Lymphoprep之密度梯度離心調製 單核白血球（PBMC)。藉由將此以抗人類CD 14 MACS珠予 以陽性篩選’分離出CD14陽性部分與陰性部分。在陽性部 分中添加重組型人類GM-CSF (50ng/ml)與重組型人類IL-4 (100ng/ml)，在經添加i〇〇/oFCS之RPMI1640培養基中，以6 孔盤進行培養。培養開始時之細胞濃度為1 χ丨〇6/m卜每1孔 以3ml進行。培養中，每2曰進行i次培養基交換。培養基 父換係將1成之培養液置於離，q管並加以離心，去除上清 後，懸浮於所取培養液之2倍容量的新培養液（包含上述濃 度之細胞素等），並置回各孔。培養第6日將細胞回收，計 算細胞數後，以lxl〇6/ml的濃度懸浮於上述培養基，添加 抗CD40抗體或其同型物（iS0type)對照，進一步於24孔盤培 裝 訂
線 78148-990318.doc -48- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1327574 A7 B7 五、發明説明（44 ) 養4日。其間未進行培養基交換（每1孔之細胞數1X1 〇6個、 細胞濃度1χ1 〇6個/ml)。 (3) 藉由細胞染色及流式細胞儀之分析 染色係使用抗HLA-DR抗體（同型物對照：大鼠IgG2a)、 抗CD86抗體（同型物對照：大鼠IgGl)、抗CD83抗體（同型 物對照：大鼠IgG2b)。首先，添加抗體，在4°C下培養30 分鐘後，洗淨3回，再使用Beckton Dickinson公司製之 FACS Calibur進行分析。 (4) 對於成熟DC之IL-12分泌能力之亢進 取得如上之未成熟DC後，添加LPS(400 pg/ml)與IFN r (1(Γ3Μ)，進一步培養2曰後，獲得成熟DC。在其中添加抗 CD40抗體或同型物對照10 /zg/ml，就24小時後之上清，根 據ELISA (Pharmingen公司製）法測定IL-12之產生。 (5) 結果及考察 催動性抗體之KM302-1抗體，抗體對於DC成熟化之影響 如圖7所示；對於成熟DC之IL-12產生的影響如圖8所示。 以G28-5抗體為對照比較成熟之程度。觀察CD86、HLA-DR之表現的結果，相較G28-5抗體，KM302-1抗體進一步 使表現上昇，亦即顯示使成熟度亢進。又，有關IL-12之 分泌，藉由以KM302-1抗體處理成熟DC，顯示具亢進效 果。根據以上結果，顯示KM302-1抗體，對於DC具催動性 抗體之作用。
[實施例 10] DC-MLR 將採自正常人類之血液（末梢血液），以2000rpm離心10分 78148-990318.doc -49- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1327574 A7 B7 五、發明説明（45 ) 鐘，並吸取血清。將血球部分以PBS再懸浮，並輕置於 Ficoll(安法瑪亞）上。以2000rpm離心30分鐘，回收中間層 之PBMC部分。以PBS洗淨2回後，使用MACS用於特定細 胞之分離》 DC培養為目的之單核白血球的分離，係使用MACS (Miltenyi Biotec GmbH公司）並根據所附說明書進行。簡言 之，對於PBMC lxlO8個，添加MACS緩衝液800 "1、MACS CD14(Miltenyi Biotec GmbH公司，502-01) 200 //1，並在 4 °C下處理1 5分鐘、使細胞吸附於MACS LS管柱，並予以洗 淨。將吸附於管柱之細胞做為單核白血球予以回收。在未 吸附於管柱之細胞中，添加MACS HLA-DR (Miltenyi Biotee GmbH公司，461-01)，並以BS管柱去除HLR-DR陽性 細胞，取得T細胞部分。藉由FACS測量CD3陽性細胞之比 率’並由T細胞部分之整體細胞數算出實際T細胞數。所得 之單核白血球，在6孔培養皿中，以1X1 〇6細胞/ml的濃度， 在含有 100ng/ml IL-4(研發系統）、50ng/mlG-CSF (KIRIN)、 10%FCS (SIGMA)之R0培養基（在PPMI培養基中添加召氫 硫乙醇（Gibco)、HEPES (SIGMA)者）中培養。培養5曰後， 添加10ng/ml LPS (DIFCO)，使其分化為成熟DC。 MLR係藉由混合分離自不同人類之τ細胞與成熟DC所進 行。T細胞/DC細胞比分別為1: 80，T細胞數為2x 105細胞/ 扎。首先’最初在DC中添加抗體並反應30分鐘。其後，添 加T細胞並培養4曰後，添加100 //Ci/ml 3H-胸苷（安法瑪 亞）10 μΐ。14小時後，使用 Macro96 Harvester (SKATRON) 78148-990318.doc _5〇. 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇Χ297公釐） 1327574 A7 B7 五、發明説明（46 ) 採集至Printed Filtermat A(瓦拉克），乾燥後充分浸潰於 Betap:Scint(瓦拉克），封裝後，以1205 BETAPLATE液體閃 爍計數器測定活性。又使用未成熟DC之MLR，係藉由混 合分離自不同人類之T細胞與成熟DC所進行。T細胞/DC之 細胞比分別為1: 40，並以相同方法進行。結果如圖9、圖 10所示/顯示藉由KM281-卜10抗體之添加，胸苷之帶入 減低，MLR被抑制。又圖1 〇中，KM283-5、5D12抗體未能 抑制DC-MLR，亦即顯示僅KM281-1-10係中和CD40配位子 對於DC之作用的拮抗性抗體。進一步，調查催動性抗體 之KM302-1抗體，抗體對於使用未成熟DC之MLR的影響， 結果如圖1 1所示。藉由DC之活化，與T細胞之相互作用受 促進，胸甞之帶入有所增加。由此顯示KM302-1係作用於 未成熟DC之催動性抗體。 [實施例11]藉由CD40抗體對於CD40L與CD40結合之影響 使用BIAcore 2000 (比亞可亞），使抗CD40抗體與經固定 之CD40人類FC結合後，測定可溶性CD40L與CD40之結合 量的變化。根據裝置所附之說明書，將可溶性CD40人類 FC 固定於 CM 晶片（CM5，BIAcore)。其次，添加 25( yg/ml) 之抗CD40抗體，使其與CD40結合。進一步添加i〇(^g/mi) 之可溶性CD40L使其結合。測定CD40L添加前後之結合量 的差。添加對照組IgG時，CD40L之結合量為100RU。 KM302-1抗體添加後，CD40L之結合量為1 l〇RU ; KM283-5 抗體添加後則為18RU。由此，顯示KM302-1抗體未抑制 CD40L與 CD40結合。 -51- 78148-990318.doc 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1327574 A7 _ B7 五、發明説明（47 ) [實施例12] Ramos細胞中藉由抗CD40催動性抗體之CD95 表現之促進 將實施例4所得之融合瘤之經製抗體，根據實施例6之方 法予以分析，篩選產生催動性抗體之純系（每1孔之細胞數 5xl04個，細胞濃度2.5x105個/ml)。結果如圖1 2所示。圖 中橫軸係表示培養液中之抗體濃度；縱軸係表示平均勞光 強度，亦即CD95表現強度。KM341-1-19、2105抗體，在 0 01 /z g/ml以上之漠度下’相較習知之小鼠抗體之^28-5抗 體，對於Ramos'纟田胞顯示更加促進CD95之表現。亦即，顯 示具更高效果之催動性。又，在0.01 /zg/ml下，KM341-1-19、21〇5抗體對於Ramos細胞促進CD95表現之催動性活 性，較10 μ g/ml之G28-5抗體的活性高（圖1 2 )。各抗體濃度 下’ CD95之表現相當添加G28-5抗體時之若干倍數整理如 表5。 表5 抗體濃度 (^g/ml) KM341-1-19 2105 F5-77 F2-103 0.01 5.7 3.9 0.1 7.0 7.1 1.2 1.2 1 5.7 5.1 - 1.7 1.8 10 4.5 3.3 2.0 1.7 [實施例13]藉由CD40催動性抗體之樹狀細胞的活化 根據實施例9之方法，調查藉由CD40催動性抗體對於成 熟DC之IL-12及IL-10產生的影響》IL-10係以ELISA法 -52- 78148-990318.doc 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1327574 A7 ____B7__ 五、發明説明（48 ) (Pharmingen公司製）測定。結果如圖！ 3及圖14所示。顯示 藉由KM341-1-19抗體之處理使IL-12之分泌亢進。另一方 面，在共存2xl〇5個/ml經以5000 rad進行X線照射之表現 CD40配位子的重組l細胞下，IL-12與IL-10在培養液中之 濃度為254、51 pg/ml，相較添加KM341-卜19抗體1 yg/mi時 較少。 以上結果顯示KM34 1-1-1 9抗體對於DC具有效之催動性 抗體的作用。在〇·1 gg/m丨下，KMM1-1-19使成熟DC分泌 IL-12之催動性活性較loo^g/m丨之G28-5抗體的活性高；在 l"g/ml下，KM341-1-19使成熟DC分泌IL-12之催動性活性 較l〇〇Mg/ml G28-5抗體之活性高100倍以上（圖13)。又，在 l^g/ml下，KM34卜1-19使成熟DC分泌IL-10之催動性活性 較100 //g/ml G28-5抗體之活性高10倍以上（圖14)。又， KM341-1-19抗體，亞類係IgG2，相較IgGl或IgG3，與Fc受 器之結合性低’ NK細胞的殺手活性之免疫刺激或補體系 之活化亦較弱。由此，推測因抗體，導致CD40表現細胞之 功能或細胞本身減少之危險性低。又因不易藉由Fe受器受 交聯，體内之催動性活性，不因交聯而發生大變動，容易 控制藥效而受期待。 [實施例14] Ramos細胞中藉由抗CD40拮抗性抗體之CD95 表現之抑制 將1.0x1 〇5個/ml之Ramos細胞懸浮液以50 #1/孔接種於平 底96孔盤（每1孔細胞數5χΐ〇4個）。在96孔盤中添加經培養 基稀釋之純化抗體100^/1/孔。調製1·〇χ105個/m丨之表現人 78148-990318.doc -53- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1327574 A7 B7 五、發明説明（49 ) 類CD40配位子的重組小鼠L細胞（參照Spriggs，Μ. K. et. al.， J. Exp. Med., 176: 1543, 1992; Garrone, P. et. al., J. Exp. Med” 182: 1265，1995 等），並添加 50"1/孔（每 1 孔之 Ramos 細胞的細胞數5x104個，細胞濃度2.5x105個/ml;每1孔之小 鼠L細胞的細胞數5xl03個，細胞濃度2.5xl〇4個/ml)。經一 晚培養後，收集細胞，使用R-PE標示抗CD95抗體，以 FACS進行分析。結果如圖1 5所示。圖中縱轴係表示平均 螢光強度’亦即CD95之表現強度。相較習知抗體之5D12 抗體僅略抑制，4D11抗體即使在0.1/zg/ml之濃度下亦抑制 CD95之表現，且與未添加CD40L表現細胞之陰性對照組相 同程度。又，在1 μ g/ml之濃度下，4D11、F4-465、 KM28卜1-10抑制CD95之表現，與未添加CD40L表現細胞之 陰性對照組相同程度。由此顯示4D1 1、F4-465、KM28卜1-10抗體，係較具效果之拮抗性抗體。表6所示為各濃度 下’以未添加拮抗性抗體之對照為1 〇〇時，平均螢光強度 之相對值。 表6 抗體濃度 ("g/ml) 5D12 4D1 1 F4-465 KM281-1-10 0.1 77.6 11.8 49.6 60.1 1 72.3 0.01 2.5 7.3 10 69.5 0 1.1 2.6 [貫施例1 5]藉由抗CD40催動性抗體之Ramos細胞移植模型 中之抗腫瘤效果 -54- 78l48-990318.doc 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公爱·) 1327574 A7 -----------B7 五、發明説明（50 ) 針對出生後5週齡的c. B. 17/Icr-scidJcl小鼠（日本克雷亞） 靜脈注射亞西亞羅（Asial0) GM1抗體。i日後以Ram〇s細胞 做為腫瘤細胞靜脈注射每1之小鼠5X1O、0。〗日後靜脈注 射KM302-1抗體或做為陰性對照之抗人類白蛋白人類Ig(} 抗體°技予篁係單次投予每1隻小鼠KM3 02 -1抗體1、1 〇、 100以g ,陰性對照抗體1 〇〇 μg，分別各5個體之小鼠。結果 如圖1 6所示。相對陰性對照投予組在移植34日後全數死 亡，KM302-1抗體l〇"g、100"g投予組5隻全數存活，確認 KM302-1抗體之抗腫瘤效果。KM302-1抗體係lgG4亞類， 對於以Fc受器為媒介之抗體依賴性細胞殺害機制（ADCC)或 補體系之活化雖弱’藉由單次投予丨〇 可見載癌小鼠之存 活期間延長。 [實把例16]藉由抗CD40催動性抗體之Ramos細胞之增殖抑制 在96孔盤中，分別注入以添加1〇0/〇fbs之RPMI 1640培養 基調製為lxl 04個/ml之Ramos細胞懸浮液lOOyi，並添加2〇 ^g/ml之使用培養基所調製《KM341_119抗體或可溶性配 位子溶液。在可溶性配位子中，共存與配位子同濃度（反 應溶液中之濃度為10 yg/ml)之抗FLAG抗體（M2)以增強活 性。經5日培養後，.在各孔中添加2〇 v 1的MTS試藥 (Promega) ’並反應2至3小時。在波長490nm下，測定與孔 令僅為不含細胞或抗體之培養基間之吸光度的差，測定存 活之細胞數》又，以相同方法使用96孔1;底盤與G28-5抗體 進行增殖抑制作用之比較。添加2 yg/ml之使用培養基所調 製之反1^341-1-19抗體或〇28-5抗體。結果如圖17所示。經 -55- 78148-990318.doc 本纸張尺度逍用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公爱) 1327574 A7 B7 五、發明説明（51 ) 添加KM341 -1 -1 9之孔中觀察有死細胞，細胞數相較孔中添 加G28-5抗體或配位子者顯著較少，吸光度亦變低，顯示 腫瘤細胞受抑制，誘導細胞死亡。 [實施例1 7]抗體基因之cDNA純系化 培養產生 KM341-1-19、2105、1 10、115、KM281-1-10、 4D11、KM643-4-1 1、F4_465、F2-103、F5-77抗體之融合 瘤，並藉由離心收集細胞。在其中添加TRIZOL (Gibco BRL)，根據使用說明書抽出Total RNA »抗體cDNA之可變 區域之純系化係使用CLONTECH公司之SMART RACE cDNA增殖套組，根據所附說明書進行。以5 # g的total RNA做為模板製作第一股（lstStΓand)cDNA。K：M341-卜 19、2105、110、115、KM281-1-10、4D11、KM643-4-1 1、 F2-103、F5-77之重鏈（H鏈）的增幅，係使用寶酒造公司之 Z-Taq，以UMP與hh6引子，重複98°C 1秒、68°C 30秒之循 環30回。進一步，以該反應液Ιμΐ為模板，使用NUMP與 hh3引子，重複98°C 1秒、68°C 30秒之循環20回。F4-465重 鏈之增幅，係使用UMP與hh2引子，以Advantage 2 PCR套 組（Clonthech，目錄編號1910)，進行94°C 5秒、72°C 3分鐘 5循環；94°C 5秒、70°C 5秒、72°C 3分鐘5循環；94°C 5秒、 68°C 10秒、72°C 3分鐘25循環。 hh6引子：5，-GGT CCG GGA GAT CAT GAG GGT GTC CTT-3,（序列編號3) hh3 引子：5，-GTG CAC GCC GCT GGT CAG GGC GCC TG-3'(序列編號4) hh2 引子：51-GCT GGA GGG CAC GGT CAC CAC GCT G-3,(序列編號5) 其後，藉由PCR純化套組（QIAGEN)純化所增幅之PCR產 78148-990318.doc «56- 本纸張尺度適用中国國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1327574 A7 _B7_____ 五、發明説明（52 ) 物。或，以 PCRScript (Stratagene，Lajolla，CA)或 PCR-• - Blunt (Invitrogene，Carlsbad, CA)進行次純系化（subcloning) 以決定序列。以序列資訊為基礎，合成抗體重鏈專一性引 子。KM341-1-19 時為 341H引子；2105 時為 2105Hsal引子； 110、115 時為 llOHsal 引子；KM281-1-10 時為 281Hsal 引 子；4D11 時為 4DllSal引子；KM643-4-11 時為 643Hsal引 子；F4-465 時為 H11-951 引子；F2-103 時為 F2-103H 引子； F5-77時為F5-77H引子。使用抗體重鏈專一性引子與hh4， 自第一股cDNA增幅cDNA，以此為模板，使用抗體專一性 引子決定來自相反方向之序列。 hh4引子：5'-GGTGCCAGGGGGAAGACCGATGG-3·(序列編號6) 341H引子：5'-atatgtcgacGCTGAATTCTGGCTGACCAGGGCAG-3'(序列編 號7) 2105Hsal : atatgtcgacTCCCAGGTGTTTCCATTCAGTGATCAG (序列編號 8) llOHsal : atatgtcgacTTCCATTCGGTGATCAGCACTGAACAC (序列編號9) 281Hsal : atatgtcgacTTTGAGAGTCCTGGACCTCCTGTG (序列編號 10) 4D11 Sal : atatgtcgacGAGTCATGGATCTCATGTGCAAG (序列編號 11) 643Hsal : atatgtcgacCCAGGGCAGTCACCAGAGCTCCAGAC (序列編號 12) H11-9 5':-ACC GTG TCG ACT ACG CGG GAG TGA CT (序列編號 13) F2-103H: accgtgtcgacgctgatcaggactgcaca (序列編號 14) F5-77H: accgtgtcgacggtgatcaggactgaacag (序列編號 15) KM341-1-19、2105、110、115、KM281-1-10、4D11、 KM643-4-11、F2-103、F5-77之輕鏈（L鏈）的增幅，係使用 78148-990318.doc -57- 本纸張尺度適用中國團家標準(CNS) A4規格(210X 297公爱) 1327574 A7 B7 五、發明説明（53 ) UMP與hk2引子，重複98°C 1秒、68°C 30秒之循環30回以進 行增幅。F4-465之輕鏈，係使用UMP與hL2引子，重複98 °C 1秒、68°C 30秒之循環30回以進行增幅。將所增幅之PCR 產物，藉由PCR純化套組予以純化，並使用hk6或hL2引子 以決定鹼基序列。以該序列為基礎，合成輕鏈專一性引 子。KM341-1-19時為 341K引子；2105 時為 2053KBgl引子： 110、1 15 時為 1 lOKBgl 引子；KM281-1-10 時為 281KBgl 引 子；4D11 時為 4DllKBgl引子；KM643-4-11 時為 643KBgl 引 子；F4-465 時為 Lamda 51引子；F-103、F5-77 時為 F2-103K 引子。 341-1-19、110、115、KM643-4-1 1、KM281-1-10、 4D11、2 105時，使用輕鏈專一性引子與hk6，自第一股 cDNA增幅cDNA，以此為模板，決定來自相反方向之序 列。關於F4-465、F2-103、F5-77，以 PCRScript (Stratagene, Lajolla，CA)或 PCR-Blunt，（Invitrogene，Carlsbad, CA)進行 次純系化以決定序列。 hk2引子：5'-GTT GAA GCT CTT TGT GAC GGG CGA GC-3·(序列編號 16) hL2引子：5'_TCT TCT CCA CGG TGC TCC CTT CAT-31 (序歹編號17) 341K引子：5’-atatagatctGAACTGCTCAGTTAGGACCCAGAGG-3 (序列編 號18) 2053KBgl: atatagatctCGCGGGGAAGGAGACTGCTCAGTT (序列編號 19) llOKBgl: atatagatctAGTCAGACCCAGTCAGGACACAGC (序列編號20) 281KBgl: atatagatctGAGCTGCTCAGTTAGGACCCAGAGGG (序列編號21) 4DllKBgl: atat^gatctTAAGCAAGTGTAACAACTCAGAGTAC (序列編號 78148-990318.doc -58- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1327574 A7 B7 五、發明説明（54 ) 22) 643KBgl: atatagatctGAGGAACTGCTCAGTTAGGACCCAGAGG (序列編 號23) Lamda5' : -^01\^八0八丁(：丁0。。1^：八00^0€八0€八丁(：（序列編號24) F2-103K : aactccagatctagggcaagcagtggtaac (序列編號25) hk6引子：5’-TGGCGGGAAGATGAAGACAGATGGTG-3,（序列編號26) 編碼34 1-1-19之Η鏈全長，及L鏈可變區域之DNA ;及Η 鏈及L鏈之胺基酸序列分別如下所示。 Η鏈DNA之轉錄開始點，係序列編號27中，5'末端起第 50號之腺嘌呤（Α)為起始之ATG密碼，而終止密碼係第1472 號之胸腺嘧啶（Τ)為起始之TGA。抗體可變區域與恆定區域 之交界’係位於5’末端起第493號之腺嘌呤（Α)與第494號之 鳥糞嘌呤（G)之間》胺基酸序列方面，Η鏈可變區域係序列 編號28中’自Ν末端起，.至第148號之絲胺酸（S)殘基為 止；而第149號之丙胺酸（Α)以下為恆定區域。藉由基因序 列預測軟體（Signal Ρ第二版），預測Η鏈之信號序列為序列 編號28中’自Ν末端起，至第20號之絲胺酸（S)為止。成熟 體之Ν末端被認為係序列編號28中，第21號之麵醯胺酸 (Q) 0 L鏈DNA之轉錄開始點，係序列編號29中，5,末端起第 29號之Α為起始之ATG密碼，可變區域為自5,末端起，至 第400號之腺嘌呤（α)為止。胺基酸序列方面，可變區域為 序列編號30中，自ν末端起，至第124號之離胺酸（K)為 止。藉由分析經純化之L鏈的N末端得知，L鏈之信號序列 78148-990318.doc -59- 本纸張尺度適用中國國家樣準(CNS) A4規格(21〇 X 297公爱) 裝 町
線 1327574 A7 B7 五、發明説明（55 ) 為序列編號30中，自N末端起，至第20號之甘胺酸（G)為 止；成熟體之N末端係序列編號30中，第21號之麩胺酸 (E)。 341-1-19 Η鏈（序列編號27):
GTCGACGCTGAATTCTGGCTGACCAGGGCAGCCACCAGAGCTCCAGACAATGTCTGTCTCCTTCCTCATCTT
CCTCCCCGTGCTGGGCCTCCCATGGGGTGTCCTGTCACAGGTCCAACTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGT
GAAGCCCTCCCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTACTTG gaactggatcaggcagtccccatcgagagaccttgagtggctgggaaggacatactacaggtccaactggta tcgtgattatctaggatctgtgaaaagtcgaataatcatcaacccagacacatccaacaaccagttctccct
GCACCTGAACTCTGrGACTCCCGAGGACACGGCTATATATTACTGTACAAGAGCACAGTGGCTGGGAGGGGA
TTACCCCTACTACTACAGTATCGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCTTCAGCCTCCACCAA
GGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCT
GGTCAAGCACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTCGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACAC
CTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCACCACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGCTGACCGTGCCCTCCAGCAACTT cgccacccagacctacacctgcaacctagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagacagttgagcg
CAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCC
AAAACCCAAGGACACCCTCATCATCTCCCGGACCCCTCAGGTCACGTGCGTGGTGCTGGACGTGAGCCACGA
AGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCCTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGA ggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgttgtgcaccaggactggctgaacggcaa ggagtacaactgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatccagaaaaccatctccaaaaccaaagc
GCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCT
GACCTGCCTGCTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAA
CAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCAGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGA
CAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCCTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACAC
GCAGAACAGCCTCTCCCTGTCTCCGGCTAAATGAGGATCC 78148-990318.doc -60 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇x 297公釐) 1327574 A7 B7 五、發明説明（56 ) 34 1 -1 -19 Η鏈胺基酸序列（序列編號2 8 )
MSVSFLIFLPVLGI.PffCiVLSQYQLQQSGPGLYKPSQTLSLTCAISGD5YSSNSATWNWIHQSPSRDI,£WLGR TYYRSKWYRDYVGSVKSRIIINPDTSNNQFSLQLNSVTPEDTAIYYCTRAQWLGGDYPYYYSMDVffGQGTTV TVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLYKDYFPEPVTVSWNSGALTSGYHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVHRKCCVECPPCPAPPVAGP5VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VVVpVSHEDPEYQFNWyVDGVh'VHNAKTKPREEQFNSTFRVVSYLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIE KT1SKTK ⑽jREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTaVKGFYPSD 丨 AVEffESNGQPENNYKTTl^MIJSDGSJFF lyskltvdksrwqqgnvfscsvmiiealhnhytqkslslspgk 341-1-19 L鏈（序列編號29):
ACTGCTCAGTTAGGACCCAGAGGGAACCATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCT
CCCAGATACCACCGCAGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGC
CACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTCTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGCCCAGGC
TCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTC TGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCACCq
TAGCAACACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAACGTACG 341 -1 -19 L鏈胺基酸序列（序列編號3 0 )
MEAPAQU.FLLLLWIPDTTGEIYLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRUIYDAS
NRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNTFGPGTKVDIKRT 編碼2105之H鏈可變區域，及L鏈可變區域之DNA;以及 Η鏈及L鏈之胺基酸序列分別如下所示。 Η鏈DNA之轉錄開始點，係序列編號3 1中，5'末端起第 70號之腺嘌呤（Α)為起始之ATG密碼，抗體可變區域與恆定 區域之交界，係位於5’末端起第495號之腺嘌呤（Α)與第496 號之鳥糞嘌呤（G)之間。胺基酸序列方面，Η鏈可變區域係 序列編號32中，自Ν末端起，至第142號之絲胺酸（S)殘基 78148-990318.doc -61- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐） 1327574 A7 __B7_ 五、發明説明（57 ) 為止；而第149號之丙胺酸（A)以下為恆定區域。藉由基因 •- 序列預測軟體（Signal P第二版），預測Η鏈之信號序列為序 列編號32中，自Ν末端起，至第19號之半胱胺酸（C)為止。 成熟體之Ν末端被認為係序列編號32中，第20號之麩胺酸 (Ε)。 L鏈DNA之轉錄開始點，係序列編號33中，5'末端起第 28號之Α為起始之ATG密碼，可變區域為自5'末端起，至 第405號之腺嘌呤（A)為止。胺基酸序列方面，可變區域為 序列編號34中，自N末端起，至第126號之離胺酸（K)為 止。藉由基因序列預測軟體（Si’gnal P第二版），預測L鏈之 信號序列為序列編號34中，自N末端起，至第20號之甘胺 酸（G)為止。成熟體之N末端被認為係序列編號34中，第21 號之麩胺酸（E)。 2105 Η鏈（序列編號：3 1 )
CTGAACACAGACCCGTCGACTCCCAGGTGTTTCCATTCAGTGATCAGCAC
TGAACACAGAGGACTCACCATGGAGTTGGGACTGAGCTGGATTTTCCTTT
TGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGG
GGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTC
TGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGG
GAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATAGTGGTAGCTTGG
TGCATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCC
AAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGC
CTTGTATTACTGTGCAAGAGATAGGCTATTTCGGGGAGTTAGGTACTACGG
TATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCA
CCAAGG 78148-990318.doc -62- 本纸張尺度適用中國國家榡準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1327574 A7 B7 五、發明説明（58 )
2105 Η鏈胺基酸序列（序列編號：32) MELGLSWIFLLAILKGVQCEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDY AMHWVHQAPGKGLEWVSGISWNSGSLVHADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQ MNSLRAEDTALYYCAEDRLFRGVRYYGMDVWGQGTTVTVSSASTK 2105 L鏈（序列編號：33)
CTGCTCAGTTAGGACCCAGAGGGAACCATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCT
CTTCCTCCTGCTACTCTGQCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTGAC
ACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCT
CCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACrlTAGCCTGGTACCAACAG
AAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGC
CACTGOCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCA
CTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGGAGTTTATTACTGTC
AGCAGCGTAGCCACTGGCTCACTrTCGOCGGGGGGACCAAGGTGGAGAT
CAAACGTACGGTG
2 105 L鏈胺基酸序列（序列編號：3 4 ) MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYL AWYQQKPGQAPRLUYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVY YCQQESHWLTFGGGTKVEIKRTV 編碼110之H鏈可變區域，及L鏈可變區域之DNA ;以及 Η鍵及L鏈之胺基酸序列分別如下所示。 Η鏈DNA之轉錄開始點，係序列編號35中，5’末端起第 60號之腺嘌呤（Α)為起始之ATG密碼，抗體可變區域與恆定 區域之交界，係位於5'末端起第479號之腺嘌呤（Α)與第480 號之鳥糞嘌呤（G)之間。胺基酸序列方面，Η鏈可變區域係 序列編號36中，自Ν末端起，至第140號之絲胺酸（S)殘基 為止；而第141號之丙胺酸（Α)以下為恆定區域。藉由基因 78148-990318.doc .53. 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X297公釐) 1327574 A7 B7 五、發明説明（59 ) 序列預測軟體（Signal P第二版），預測Η鏈之信號序列為序 列編號36中，自Ν末端起，至第19號之半胱胺酸（C)為止。 成熟體之Ν末端被認為係序列編號36中，第20號之麵醯胺 酸（Q)。 L鏈DNA之轉錄開始點，係序列編號37中，5’末端起第 35號之Α為起始之ATG密碼，可變區域為自5'末端起，至 第421號之腺嘌呤（A)為止。胺基酸序列方面，可變區域為 序列編號38中，自N末端起，至第129號之離胺酸（K)為 止。藉由基因序列預測軟體（Signal P第二版），預測L鏈之 信號序列為序列編號38中，自N末端起，至第22號之半胱 胺酸（C)為止。成熟體之N末端被認為係序列編號38中，第 23號之纈胺酸（V)。 110 Η鏈（序列編號：3 5)
CTGAACACAGACCOm'CGACTTCCATTCGGTGATCAGCACTGAACACACxA
GGACTCACCATGGAGri,TGGGCTGAGCTGGG,mTCCTCGTTGCTCTTTTA
AGAGGTGTCCAGTGTCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGG tccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcotctggattcacc
TTCAGTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCT
GGAGTGGGTGGCAGTTATATGQTATGATGGAAGTATTAAATACTATGCAGA
CTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGC
TGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTAC tgtgcgagagagggctacaatattttgactggttattttggctactggggc
CAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGG -64- 78148-990318.doc 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1327574 A7 _B7__ 五、發明説明（60 ) 110 Η鏈胺基酸序列（序列編號：3 6 )
MEFGLSWVFLVALLRGVQCQVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSY
GMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSIKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQ
MNSLRAEDTAVYYCARBGYNILTGYFGYWGQGTLVTVSSASTK 110 L鏈（序列編號：37)
TCACAGATGTAGTCAGACCCAGTCAGGACACAGCATGGACATGAGGGTCC
CCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGT
GTCATCTGGATGACCCAGTCTCCATCCTTACTCTCTGCATCTACAGGAGAC
AGAGTCACCATCAGTTGTCGGATGAGTCAGGGCATTAGCAGTGATTTAGC
CTGGTATCAGCAAAAACCAGGGAAAGCCCCTGAGCTCCTGATCTCTGCTG
CATCCACTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCT
GGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCTGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCA acttattactgtcaacagtattatagttttccgtggacgttcggccaaggg accaaggtggaaatcaaacgtacg 110 L鏈胺基酸序列（序列編號：3 8 )
MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARCVIWMTQSPSLLSASTGDRVTISCRMSQGI
SSDLAWYQQKPGKAPELLISAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDhTLTISCJ.QSR
DFATYYCQQYYSFPWTFGQGTKVEIKRT 編碼115之H鏈可變區域，及L鏈可變區域之DNA ;以及 Η鏈及L鏈之胺基酸序列分別如下所示。 Η鏈DNA之轉錄開始點，係序列編號39中，5'末端起第 60號之腺嘌呤（Α)為起始之ATG密碼，抗體可變區域與恆定 區域之交界，係位於5’末端起第479號之腺嘌呤（Α)與第480 號之鳥糞嘌呤（G)之間。胺基酸序列方面，Η鏈可變區域係 序列編號40中，自Ν末端起，至第140號之絲胺酸（S)殘基 78148-990318.doc -65- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐）
裝 訂
1327574 A7 B7 五、發明説明（61 ) 為止；而第141號之丙胺酸（A)以下為恆定區域。藉由基因 序列預測軟體（Signal P第二版）’預測Η鏈之信號序列為序 列編號40中，自Ν末端起’至第19號之半胱胺酸（C)為止。 成熟體之Ν末端被認為係序列編號40中，第20號之麩醯胺 酸（Q)。 L鏈DNA之轉錄開始點，係序列編號41中，5'末端起第 35號之Α為起始之ATG密碼，可變區域為自5'末端起，至 第421號之腺嘌呤（A)為止。胺基酸序列方面，可變區域為 序列編號42中，自N末端起，至第129號之離胺酸（K)為 止。藉由基因序列預測軟體（Signal P第二版），預測L鏈之 信號序列為序列編號42中，自N末端起，至第22號之半胱 胺酸（C)為止。成熟體之N末端被認為係序列編號42中，第 23號之纈胺酸（V)。 115 Η鏈（序列編號：39)
CTGAACACAGACCCGTCGACTTCCATTCGGTGATCAGCACTGAACACAGA
GGACTCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTIOCTCTTTTA
AGAGGTGTCCAGTGTCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGG
TCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCACC
TTCAGTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCT
GGAGTGGGTGGCAGTTATATGGAATGATGGAAGTATTAAATACTATGCAGA
CTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAAITCCAAGAACACGC
TGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTAC
TGTGCGAGAGAGGGCTACAATAITTTGACTGGTTATTTTGGCTACTGGGGC cagggaaccctggtcaccgtctcctcagctagcaccaagg -66- 78148-990318.doc 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(210 ：< 297公釐) 1327574 A7 B7_ 五、發明説明（62 ) 115 Η鏈胺基酸序列（序列編號：4 0 )
MEKGLSWVFLVALLRGVQCQVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSY
GMHWVRQAPGKGLEWVAVlWNDGSIKYYADSVKGRiTISRDNSKNTLYLQ
MNSLRAEDTAVYYGAREGYNILTGYFQYWGQQTLVTVSSASTK 115 L鏈（序列編號：41)
TCACAGATCTAGTCAGACCCAGTCAGGACACAGCATGGACATGAGGGTCC
CCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCA(3GTGCCAGATGT
GTCATCTGGATGACCCAGTCTCCATCCTTACTCTCTGCATCTACAGGAGAC
AGAGTCACCATCAGTTGTCGGATGAGTCAGGGCATTAGCAGTGATTTAGC
CTGGTATCAGGAAAAACCAGGGAAAGCCCCTGAGCTCCTGATCTCTGCTG
CATCCACTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCT gggacagatttcactctcaccatcagctgcctgcagtctgaagattttgca
ACTTATTACTGTCAACAGTATTATAGTTTTCCGTGGACGTTCGGCCAAGGG
ACCAAGGTGGAAATCAAACGTACG 1 1 5 L鏈胺基酸序列（序列編號：4 2 ) mdmrvpaqixguxlwlpgarcviwmtqspsllsastgdrvtiscrmsqgi
SSDLAWYQQKPGKAPELLISAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISCLQSE
DPATYYCQQYYSFPWTFGQGTICVEIKRT 編碼28卜1-10之H鏈可變區域，及L鏈可變區域之DNA; 以及Η鏈及L鏈之胺基酸序列分別如下所示。 Η鏈DNA之轉錄開始點，係序列編號43中，5'末端起第 52號之腺嘌呤（Α)為起始之ATG密碼，抗體可變區域與恆定 區域之交界，係位於5·末端起第468號之腺嘌呤（Α)與第469 號之鳥糞嘌呤（G)之間。胺基酸序列方面，Η鏈可變區域係 序列編號44中，自Ν末端起，至第139號之絲胺酸（S)殘基 78148-990318.doc -67- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X297公釐了 1327574 A7 B7 _ 五、發明説明（63 ) 為止；而第140號之丙胺酸（A)以下為恆定區域。藉由基因 • · 序列預測軟體（Signal P第二版），預測Η鏈之信號序列為序 列編號44中，自Ν末端起，至第19號之絲胺酸（S)為止。成 ’ 熟體之Ν末端被認為係序列編號44中，第20號之麩醯胺酸 (Q)。 L鏈DNA之轉錄開始點，係序列編號45中，5'末端起第 41號之Α為起始之ATG密碼，可變區域為自5'末端起’至 第424號之腺嘌呤（A)為止。胺基酸序列方面，可變區域為 序列編號46中，自N末端起，至第128號之離胺酸（K)為 止。藉由基因序列預測軟體（Signal P第二版），預測L鏈之 信號序列為序列編號46中，自N末端起，至第20號之甘胺 酸（G)為止。成熟體之N末端被認為係序列編號46中，第21 號之麩胺酸（E)。 281-1-10 Η鏈（序列編號：43) ctgaacacagacccgtcgactttgagagtcctggacctcctgtgcaagaa
CATGAAACATCTGTGGTTCTTCCTTCTCCTGGTGGCAGCTCCCAGATGGGT
CCTGTCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCT tcggagaccctgtccctcacctgcactgtctctggtggctccatcagtgg
TTACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGG attgggtatatctattacagtgggagcaccaactacaatccctccctcaag
AGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAA
GCTGAATTCTGTGACCGCTGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAG
CCCCCTTGCACGGTGACTACAAATGGTTCCACCCCTGGGGCCAQGGAACC
CTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGG -68- 78148-990318.doc 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1327574 A7 _B7_ 五、發明説明（64 )
28 1 · 1 -10 Η鏈胺基酸序列（序列編號：4 4 ) MKHLWFFLLLVAAPRWVLSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISGY YWSWIRQPPGKGLEWIQYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLNS VTAADTAVYYCARAPLHGDYKWFHPWGQGTLVTVSSASTK 281-1-10 L鏈（序列編號：45) tcacagatctgagctgctcagttaggacccagagggaaccatggaaaccc
CAGCGCAGCTTCTCrrCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGA
GAAATTGTOTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCrrTGTCTCCAGGGGA
AAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACT tagcctggtaccagcagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctat ggtgcatccagcagggccactggcatcccagacaggttcagtggcagtg
GGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGAT
TTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCGATCACCTTCGGC
CAAGGGACACGACTGGAGATCAAACGTACG 28 1 -1 -10 L鏈胺基酸序列（序列編號：4 6 )
METPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSS ylawyqqkpgqaprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedf
AVYYCQQYGSSPITFGQGTRLEIKRT 編碼4D1 1之H鏈可變區域，及L鏈可變區域之DNA ;以 及Η鏈及L鏈之胺基酸序列分別如下所示。 Η鏈DNA之轉錄開始點，係序列編號47中，5,末端起第 16號之腺嘌呤（Α)為起始之ATG·密碼，抗體可變區域與恆定 區域之交界’係位於5,末端起第456號之腺嘌呤（Α)與第457 號之鳥糞嘌呤（G)之間。胺基酸序列方面，Η鏈可變區 域係序列編號48中，自Ν末端起，至第147號之絲胺酸（S) 殘基為止；而第148號之丙胺酸（Α)以下為恆定區域。藉由 78148-990318.doc .Q9- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐） 1327574 A7 _B7_____ 五、發明説明（65 ) 基因序列預測軟體（Signal P第二版）’預測Η鏈之信號序列 • 為序列編號48中，自Ν末端起’至第26號之絲胺酸（S)為 止。成熟體之Ν末端被認為係序列編號48中’第27號之麩 醯胺酸（Q)。 L鏈DNA之轉錄開始點，係序列編號49中’ 5'末端起第 59號之Α為起始之ATG密碼，可變區域為自Υ末端起’至 第442號之腺嘌呤（A)為止。胺基酸序列方面’可變區域為 序列編號50中，自N末端起，至第128號之離胺酸（K)為 止。藉由基因序列預測軟體（Signal P第二版），預測L鏈之 信號序列為序列編號50中’自N末端起’至第22號之半胱 胺酸（C)為止。成熟體之N末端被認為係序列編號50中’第 23號之丙胺酸（A)。 4D11 Η鏈（序列编號：47)
ATATGTCGACGAGTCATGGATCTCATGTGCAAGAAAATGAAGCACCTGTG
GTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCGGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCCAGCTGC
AGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTACTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCC
CTCACCTGCACTGTCTCTGGCGGCTCCATCAGCAGTCOTGGTTACTACGG
GGGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGAGT
ATCTATAAAAGTGGGAGCACCTACCACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGT
CACCATATCCGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCT
CTQTGACCGCCGCAGACACGGCTGTGTATTACTGTACGAGACCTGTAGTA
CGATATTTTGGGTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGT
CTCCTCAGCTAGC 78148-990318.doc -70- 本紙張尺度適用中國固家標準(CNS) A4規格(210 X 297公爱〉 1327574 A7 B7 五、發明説明（66 ) 4D11 Η鏈胺4酸序列（序列編號：4 8 ) ΜΌΕΜΟΚΚΜΚΗΙΛνΕΡυ^νΑΑΡΙ^ννί^Ι^ΙΘΕΘΟΡΟΙ^ΚΡβΕΤΙ^υΐΌΤν
5GGSISSPGYYGGWIRQPPGKGLEWIGSIYKSGSTYHNPSLKSRVTISVDTS
KNQFSLKXSSVTAADTAVYYCTRPWRYFGWFDIWGQGTLVTVSSAS 4D11 L鏈（序列編號：49)
AGATCTTAAGCMGTGTMCAACTCAGAGTACGCGGGGAGACCCACTCAGGACACAGCATGGACATGAGGGT
CCCCGCTCAGCTCCTCCGGCTtCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTCCCATCCAGTTGACCCAGTC tccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagggcattagcag
TGCTTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATCATGCCTCCAATTTGCA aagtgggctcccatcaaggttcagcggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgca gcctgaagattttgcaacttattactgtcaacagtttaatagttacccgacgttcggccaagggaccaagct
GGAAATCAMCGTACG 4D 1 1 L鏈胺基酸序列（序列編號：5 0 )
MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARCAIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALA1FYQQKPGKAPKLLIYD
ASNLESGYPSRFSGSCSGTDKTLTISSLQPEDFATyyCQQFNSYPTFGQGTKYEIKRT 編碼KM643-4-1 1之H鏈可變區域，及L鏈可變區域之 DNA ;以及Η鏈及L鏈之胺基酸序列分別如下所示。 Η鐽DNA之轉錄開始點，係序列編號5 1中，5,末端起第1 號之腺嘌呤（Α)為起始之ATG密碼，抗體可變區域與恆定 區域之交界，係位於51末端起第447號之腺嘌呤（Α)與第448 號之鳥糞嘌呤（G)之間。胺基酸序列方面，Η鏈可變區域係 序列編號52中，自Ν末端起，至第149號之絲胺酸（S)殘基 為止；而第15〇號之丙胺酸（Α)以下為恆定區域。藉由基因 序列預測軟體（Signal Ρ第二版），預測Η鏈之信號序列為序 78148-990318.doc _71 - 本纸張疋度逍用中國國家標準(CNS) Α4規格(2l〇x297公釐) 1327574 A7 B7 五、發明説明（67 ) 列編號52中，自N末端起，至第20號之絲胺酸（S)為止。成 - 熟體之N末端被認為係序列編號52中，第21號之麩醯胺酸 (Q)。 L鏈DNA之轉錄開始點，係序列編號53中，5·末端起第 38號之A為起始之ATG密碼，可變區域為自5'末端起，至 第409號之腺嘌呤（A)為止。胺基酸序列方面，可變區域為 序列編號54中’自N末端起，至第124號之離胺酸（K)為 止。藉由基因序列預測軟體（Signal P第二版），預測L鏈之 信號序列為序列編號54中，自N末端起，至第20號之甘胺 酸（G)為止。成熟體之N末端被認為係序列編號54中，第21 號之麩胺酸（E)。 KM643-4-1 1 Η鏈（序列編號：5 1 )
ATGTCTGTCTCCTTCCTCATCTTCCTGCCCGTGCTGGGCCTCCCATGQGGT
GTCCTGTCACAGGTACAGCTGCAQCAGTCAGGTCCAGGACTQGTGAAGCC ctcgcagaccctctcattcacctgtgccatctccggggacagtgtctcta
GCAACAaTGCTGCTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAGGCCTT
GAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAAGTGGTATAAAGATTATGC
AGTATCTGTGAAAAGTCGAATAACCATCAACCCAGACACATCCAAGAACCA
GTTCTCCCTGCAGCTGAACTCTGTGACCCCCGAGGACACGGCTGTGTATT actgtgcaagagggtattactatggttcggggagctatccctactactacc
AAATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGC KM643-4-1 1 H鏈胺基酸序列（序列編號：5 2)
MSVSFLIFLPVLGLPWGVLSQVQLQQSGPGLVKPSQTLSFTCAISGDSVSSN
SAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYKDYAVSV3CSRITINPDTSKNQFS
LQLNSVTPEDTAVYYCARGYYYGSGSYPYYYQMDVWGQGTTVTVSSAS -72- 78148-990318.doc 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1327574 A7 _B7_ 五、發明説明（68)
KM643-4-11 L鏈（序列编號：53) AATTGAGGAACTGCTCAGTTAGGACCCAGAGGQAACCATGGAAGCCCCAG CTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAA TTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGT GCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTG GTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATC CAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGG ACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTT TATTACTGTCAGCAGCGTAGCAACACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGA GATCAAACGAAC KM643-4-l 1 L鏈胺基酸序列（序列編號：54) mbapaqllfllllwlpdttgeivltqspatlslspgesatlscrasqsvssyl awyqqkpgqaprluydasnratgiparfsgsosgtdftltisslepedfavy
YCQQRSNTPGGGTKVEIKR 編碼F4-465之H鏈可變區域，及L鏈可變區域之DNA;以 及Η鏈及L鏈之胺基酸序列分別如下所示。 Η鏈DNA之轉錄開始點，係序列編號55中，5·末端起第 47號之腺嘌呤（Α)為起始之ATG密碼，抗體可變區域與恆定 區域之交界，係位於5·末端起第484號之腺嘌呤（Α)與第445 號之鳥糞嘌呤（G)之間。胺基酸序列方面，Η鏈可變區域係 序列編號56中，自Ν末端起，至第146號之絲胺酸（S)殘基 為止；而第147號之丙胺酸（Α)以下為恆定區域。藉由基因 序列預測軟體（Signal Ρ第二版），預測Η鏈之信號序列為序 列編號56中，自Ν末端起，至第19號之絲胺酸（S)為止。成 熟體之Ν末端被認為係序列編號56中，第20號之麩醯胺酸 78148-990318.doc -73- 本紙張尺度適用中国国家標竿(CNS) Α4規格(210Χ 297公釐) 1327574 A7 B7 五、發明説明（69 ) (Q)。 L鏈DNA之轉錄開始點，係序列編號57中，5'末端起第 81號之A為起始之ATG密碼，可變區域為自5'末端起，至 第440號之（C)為止。胺基酸序列方面，可變區域為序列編 號58中，自N末端起，至第120號之酥胺酸（T)為止。藉由 基因序列預測軟體（Signal P第二版），預測L鏈之信號序列 為序列編號58中，自N末端起，至第19號之丙胺酸（A)為 止。成熟體之N末端被認為係序列編號58中，第20號之絲 胺酸⑻。 F4-465 Η鏈（序歹丨J編號：5 5)
CTGAACACAGACCCGTCCACTACGCGGGAGACCACAGCTCCACACCATGGACTGGACCTGGAGGATCCTATT
CTTGGTGGCAGCAGCAACAGGTGCCCACTCCCAGGTGCACCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGAAGCC tggggcctcagtgaaggtcccctgcaaggcttctggatacaccttcactagctatgctatgaattgggtccc acaggcccctggacaagggcttgactccatggcatggatcaacaccaacactgggaacccaacgtatgccca
CGGCTTCACAGGACGGTTTGTCTTCTCCTTGGACACCTCTGTCAGCACGCCATATCTGCAGATCAGCACCCT aaaggctcaggacactgccgtgtattactgtccgagagaggtagtaccagttgctatgagggtaactcacta CTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCICAGCTAGCACCAA F4-465 H鏈胺基酸序列（序列編號：56) MDffTWRILFLYAAATGAiISQVQLVQSGSELKKPUASYKYFCKASGYTFTSYAMNffVRQAPGQGLEWMGWINT NTGNPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQJSSLKAEDTAVYYCAKBVVPVAMRVTHmGMDVWGQGTTVTV F4_465 L鏈（序列編號：5 7) ctgggtacggtaaccgtcagatcgcctggagacgccatcacagatctgcctcaccaagcagcatcggaggtg
CCTCAGCCATGGCATGGATCCCTCTCTTCCTCGGCGTCCTTCTTTACTGCACAGGATCCGTGGCCTCCTATG 78148-990318.doc -74- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇x 297公釐) 1327574 A7 _B7_ 五、發明説明（70 )
AGCTCACTCAGCCACCCTCAGTGTCCGTGGCCCCAGGACAGACAGCCAGCATCACCTGTTCTGGAGATAAAT TGGGGGATAATTTTACTTGCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCCACTCCCCTGTGCTGGTCATCTTTCAGGATr
GGAACCGGCGCCCAGGGATCCCTGCGCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGGAACACAGCCACTCTGACCATCA
GCGGGACCCAGGCTATGGATGAGGCTGACTATTACTGTCAGGCGTGGGACATCAGCACTGTGGTATTCGGCG
GAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTG aggagcttcaagccaacaaggccacactggtctgtctcataagtgacttctacccgggagccgtgacagtgg cctggaagccagatagcagccccgtcaacgcgggagtggagaccaccacaccctccaaacaaagcmcmca agtacgcggccagcagctacctgagcctgacgcctgagcagtggmgtcccacagaagctacagctgccagg
TCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCATGMTTCAGATCCGTTAAC
GGTTACCAACTACCTACACTGGATTCGTGACCAACATA F4-465 L鏈胺基酸序列（序列編號：5 8 )
MAWIPLFLGVLVYCTGSVASYELTQPPSVSVAPGQTASITCSGDKLGDNFTCWYQQKPGQSPVLVIFQDWKK
RPGIPARfSGSKSGNTATLTISGTQAMDEADnCQAWDISTYVFGGCTKLTVLGQPKAAPSYTLFPPSSEEL
QANKATLYCLISDFYPGAVTVAffKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQffKSHRSYSCQVTH
EGSTVEKTVAPTECS 編碼F2-103之H鏈可變區域，及L鏈可變區域之DNA;以 及Η鏈及L鏈之胺基酸序列分別如下所示。 Η鏈DNA之轉錄開始點，係序列編號59中，5'末端起第 32號之腺嘌呤（Α)為起始之ATG密碼，抗體可變區域與恆定 區域之交界，係位於5'末端起第463號之腺嘌呤（Α)與第464 號之鳥糞嘌呤（G)之間。胺基酸序列方面，Η鏈可變區域係 序列編號60中，自Ν末端起，至第144號之絲胺酸（S)殘基 為止；而第145號之丙胺酸（Α)以下為恆定區域。藉由基因 序列預測軟體（Signal Ρ第二版），預測Η鏈之信號序列為序 列編號60中，自Ν末端起，至第19號之半胱胺酸（C)為止。 成熟體之Ν末端被認為係序列編號60中，第20號之麩胺酸 78148-990318.doc -75- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐） 1327574 A7 B7 五、發明説明（71 ) (E)。 L鏈DNA之轉錄開始點，係序列編號61中，5'末端起第 29號之A為起始之ATG密碼，可變區域為自5'末端起，至 第415號之腺嘌呤（A)為止。胺基酸序列方面，可變區域為 序列編號62中，自N末端起，至第129號之離胺酸（K)為 止。藉由基因序列預測軟體（Signal P第二版），預測L鏈之 信號序列為序列編號62中，自N末端起，至第22號之半胱 胺酸（C)為止◊成熟體之N末端被認為係序列編號62中，第 23號之天冬胺酸（D)。 F2-103 Η鏈（序列編號：5 9)
GCTGATCAGGACTGCACACAGAGAACTCACCATGGAGTTTGGGCTCAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTT
AAAAGGTGTCCAGTGTGAGGTGCAGCTGCTGGAGTCCGGGGGAGGCTTAGTTCAGCCTGGGGGGTCCCTGAG
ACTCTCCTCTGCAGTCTCTGGATTCACCTTCAGTACCTACTGGATGCACTGGGTCCGCCAAGCTCCAGGGAA
GGGGCTGGTGTGGGTCTCACGTAmATAGTGATGGGAGTAGCACAACCTACCCGGACTCCGTGAAGGGCCG
ATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGMCAGTCTGAGAGCCGAGGACAC
GGCTGTCTATTACTGTGCAAGAGATAGAGTACTATGCATCGGGGAGTTATCCTACTACGGTATGCACGTCTG
GGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTC
CTCCAAGACCACCTCT
F2-103 H鏈胺基酸序列（序列編號：60) MEFGLSWVFLVAILKGVQCEVQLVESGGGLVQPGCSIRLSCAYSGFTFSTYWMHWVRQAPGKGLVWVSRINS DCSSTTYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVnCARDRVLWiGELSYYGMDVWGQGTTVTYSS .ASTKGPSVFPLAPSSKSTS F2-103 L鏈（序列編號：6 1 ) -76- 78148-990318.doc 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1327574 A7 __B7_ 五、發明説明（72 )
GGGGAGTCAGACCCAGTCAGGACACAGCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCT
CTGGCTCCCAGGTGCCAAATGTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGA
CAGAGTCACCATCACTTUCC(；GGCCARTCAnAGTATTAGTAACTGUTTGfiCCTGGTATCAGCAGAAACCAGG
GAAAGCCCCTAAGCTCCTGCTCTATAAGGCATCTGGTmGAAAGTCGCGTCCCATCMGGTTCAGCGGCAG
TGGATCTCGGACAGAATTCACTCTCACCATCAACAGCCTGCAGCCTGATGATTTrGCAACTTATTACTGCCA
ACAGTCTAATAGTTATTCGTGGACGTTCGGCCACGCGACCAAGGTGGAAATCAMCGTACGGTCGCTGCACC
ATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTCCCTGCTGAA taacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccagga.
GAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCACCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGA ctacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctga F2-103 L鏈胺基酸序列（序列編號：62)
MDMRVPAQLLGILUWLPGAKCDIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISNWLAffYQQKPGKAFKLLLYK
ASGLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTINSLQPDDFATYYCQQSNSySWTFGHGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSD
EQLKSGTASWCLLNNFYPRHAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYAC
EYTHQGL 編碼F5-77之H鏈可變區域，及L鏈可變區域之DNA ;以 及Η鏈及L鏈之胺基酸序列分別如下所示。 Η鏈DNA之轉錄開始點，係序列編號63中，5·末端起第 100號之腺嘌呤（Α)為起始之ATG密瑪，抗體可變區域與恆 定區域之交界’係位於5·末端起第528號之腺嘌呤（Α)與第 529號之鳥糞嘌呤（G)之間。胺基酸序列方面，η鏈可變區 域係序列編號64中，自Ν末端起，至第143號之絲胺酸（S) 殘基為止；而第144號之丙胺酸（Α)以下為恆定區域。藉由 基因序列預測軟體（Signal Ρ第二版），預測Η鏈之信號序列 為序列編號64中，自Ν末端起，至第19號之半胱胺酸（C)為 78148-990318.doc ,ηη _ 本纸張尺度適用中國國家標準(CMS) Α4規格(210X297公釐） 1327574 A7 B7 五、發明説明（7Z ) 止。成熟體之N末端被認為係序列編號64中，第20號之麩 胺酸（E)。 L鏈DNA之轉錄開始點，係序列編號65中，5'末端起第 59號之A為起始之ATG密碼，可變區域為自5'末端起，至 第445號之腺嘌呤（A)為止。胺基酸序列方面，可變區域為 序列編號66中，自N末端起，至第129號之離胺酸（K)為 止。藉由基因序列預測軟體（Signal P第二版），預測L鏈之 信號序列為序列編號66中，自N末端起，至第22號之半胱 胺酸（C)為止。成熟體之N末端被認為係序列編號66中，第 23號之天冬胺酸（D)。 F5-77 Η鏈（序列編號：63)
GGTCTATATAAfiCAGAGCTGGGTACGTCCTCACATTCAGTGATCAGCACTGMCACAGACCCGTCGACGGTG
ATCAGGACTGAACAGAGAGAACTCACCATGGAGTnGGGCTCACCTGGCTTTTTCTTGTGGCTATTTTAAAA ggtgtccagtgtgaggtgcagctgttggactctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgagactc tcctgtgcagcctctggattcacctttagcagctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaagggg
CTGGAGTGCGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTC
ACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCC
GTATATTACTGTGCGAAAGATGCCGGGTACTATGGTTCGGGCAGTTATGGGTACTTTGACTACTGGGGCCAC
GGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAfiCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAG
AGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCC F5-77 H鏈胺基酸序列（序列編錄：64) mefglswlflvailkgvqceyqllesggglvqpggslrlscaasgftfssyamswvrqapgkglrwysaisg
SGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDGGYYGSGSYGYFDWGQGTLVTVSSA
STKCPSVPPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFP 78I48-990318.doc -78- 本纸張尺度適用中國固家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1327574 A7 B7 五、發明説明（74 ) F5-77 L鏈（序列編號：65)
CAAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTACGCGGGGGGAGTCAGACCCACTCAGGACACAGCATGGACATGAGGGT
CCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTCGTTCCCAGGTTCCAGATGCGACATCCAGATGACCCAGTC
TCCATCTTCCGTGTCTGGATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCCGGCGAGTCAGGGTATTAGCAG
CTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGMAGCCCCTAACCTCCTGATCTATGCTGGATCCAGTTTGCA
AAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATTTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCA
GCCTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCAACAGGCTAGCAGrTTCCCTCGGACATTCGGCCAAGGGACCAA
GGTGGAGATCAAACGT/VCGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGArGAGCAGTTGAAATC
TGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGACCCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGA
TAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACACAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCT
CAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCA
GGGCCTGA F5-77 L鏈胺基酸序列（序列編號：66)
MnMRVPAQLLGLLLLWFPGSRCDIQMTQSPSSYSGSVGDRVTITCRASQGISSffl.AWYQQKPGKAPKLLlYA
GSSLQSGVPSRFSGSGFGTDFTLTISSLQPEDFATYyCQQASSFPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSD
EQLKSGrASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTySLSSTLTLSKAOYKKHKVyAC
EVTIIQGL
[實施例1 8]抗體蛋白質之動物細胞中的表現 藉由將上述所得之含有抗體之可變區域的DNA片段嵌入 N5KG1 (IDEC醫藥，美國專利6001358)等適當之載體，製 作抗體表現載體。用於表現之宿主細胞，以使用例如 CHO-Ras (Katakura Y., et al., Cytotechnology, 3 1: 103-109, 1999)較適宜。載體之導入宿主細胞，實施時可藉由例如 電穿孔法（clectoporation)。將抗體表現載體約2 /zg以限制 酶予以線狀化，使用Bio-Rad電穿孔儀，在350V、500 //F之 條件下，將基因導入4xl07個CHO-Ras細胞，並接種於96孔 78148-990318.doc -79- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1327574 A7 B7 五、發明説明（75 ) 培養盤。添加對應表現載體之選擇性標示的藥劑繼續培 養。一觀察到細胞株（colony)，即根據實施例4所示方法， 篩選抗體表現株。自所篩選細胞之抗體純化，可根據實施 例5進行。 [實施例19]藉由CD40拮抗性抗體之抗原專一性抗體產生抑 制作用 針對有關小鼠内源性CD40破壞具有同源接合子之基因 背景，且具有人類CD40基因之轉殖基因（transgene)的小鼠 (Yasui，et al. Int. Immunol. 2002 Voll4 : 319)，藉由腹腔内 注射4-羥基-3-硝苯基乙醯基-雞τ* -球蛋白綴合物 (conjugate)(NP-CGG :受贈自大阪大學微生物病研究所菊 谷仁教授）與亞拉姆（ARAM :抗原識別活化單元（Antigen recognition activation motif))之複合體 100 eg(做為 NP-CG—G 量）誘導免疫反應。各單株抗體係於即將接種抗原前經尾 靜脈内注射30或1 00 /z g的量。投予抗人類白蛋白人類IgG4 抗體100 //g做為陰性對照。誘導免疫7日後，自眼底靜脈叢 抽血，並藉由ELISA法測定血清中NP專一性IgGl及IgM抗 體量。ELISA法係在ELISA用96孔微量盤（Maxisorp ; Nunc 公司製）之各孔中，添加已與NP結合之牛血清白蛋白…卩-BSA : 2.5/zg/ml)50 #1/孔，並在 4°C 下培養，使NP-BSA吸 附。其次，捨棄上清，在各孔中添加阻斷試劑 (superblock ’ Pierce公司製），經室溫下培養、阻斷後，以 含有0.1% Tween 20之磷酸緩衝液（PBS-T)洗淨各孔3回。其 次，在各孔中添加經含有10%布羅克亞士之PBS-T稀釋的 78148-990318.doc -80- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1327574 A7 B7 五、發明説明（76 ) 各血清（50 #1/孔），並在37°C下培養2小時以使其反應《以 PBS-T將微量盤洗淨3回後，在各孔中添加將經標示鹼性磷 酸酶之山羊抗小鼠IgGl或IgM(柯斯摩生物，1070-04或 1020-04)抗體以含有10%布羅克亞士之PBS-T作1，000倍稀 釋之溶液（50 μ 1/孔），並在37°C下培養2小時。其次，以 PBS-T洗淨微量盤3回後，將呈色基質液（50# 1/孔，Sigma 104，磷酸酶基質）添加於各孔中，並以微量盤讀數器測定 在波長405nm下之吸光度。其結果如圖18、圖19所示。圖 中縱軸係表示對於針對C57BL/6小鼠注射2回NP-CGG後， 抽血並集中之血清，在IgGl抗體時係經稀釋10,000倍者； IgM抗體時係100倍，分別換算為1單位之值。F4-465、 4D11及KM281-1-10抗體，藉由投予100/zg，強力抑制NP專 一性IgGl及IgM抗體之產生。 [實施例20]藉由CD40拮抗性抗體之扁桃腺B細胞之增殖抑制 自吉爾德連斯醫院（聖地牙哥，美國加州）取得人類扁桃 腺。將扁桃腺裁切成小片，切割成細塊，藉由通過70 /zm 之尼龍篩細胞過渡器（strainer)，調製成細胞懸浮液。以 PBS洗淨數回後.，計數細胞數，以90%人類血清（ICN)、 10% DMSO冷凍保存。細胞解凍後，以經添加1 〇%人類血 清、2.5/zg /ml之兩性黴素（Amphotericin)(Fungizone, Gibco BRL)之標準RPMI培養基再懸浮後使用。 將lxlO5個細胞添加於96孔盤孔，並以0.01、0,1、1.0及 10 jag/ml的濃度添加抗人類CD40抗體。試驗係各濃度實施 3回。在各孔中添加經標示flag之CD40L (Alexis) 1 /zg/ml ; 78148-990318.doc -81 - 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1327574 A7 ______B7 五、發明説明（77 ) CD40L促進子（enheneer)抗體1 yg/m丨。經3日培養後，將i〆 Ci之[3H]胸甞添加於各孔中。ι2〜15小時後將細胞回收， 並藉由液體閃爍計數器測量扁桃腺B細胞之增殖。將B細胞 藉由CD40L刺激而增殖，未添加抗體時之計數訂為丨〇〇; 而未添加CD40L，B細胞未受刺激時之計數訂為〇 ^例如測 量出相對計數值為30時，即表示引起70〇/〇之增殖抑制。 習知之拮抗性抗體5D12，即使抗體濃度為10〇eg/mi亦未 顯示超過50%之增殖抑制》F4-465則僅在〇.〇leg/mi濃度下 即顯示80%之增殖抑制’並在〇·ι〜1〇从g/mi濃度下顯示9 5 % 之增殖抑制（圖2 0 ) 乂 本說明書中所引用之刊物、專利及專利申請案，均忠實 記載於本說明書以為參考之用。 產業上利用之可能性 根據本發明’可提供對於CD40之抗體。本發明之抗 體，因含有對於CD40具催動性作用及拮抗性作用之二者， 分別可有效做為免疫活化劑；免疫抑制劑等。 序列表免費全文
序列編號1 :合成DNA 序列編號2 :合成DNA 序列編號3 :合成DNA 序列編號4 :合成DNA 序列編號5 :合成DNA 序列編號6 :合成DNA 序列編號7 :合成DNA -82- 78148-990318.doc 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1327574 A7 B7 五、發明説明（ 78 ) 序列編號8 : 合成DNA 序列編號9 : 合成DNA 序列編號1 0 :合成DNA 序列編號11 :合成DNA 序列編號12 :合成DNA 序列編號1 3 :合成DNA 序列編號14 :合成DNA 序列編號1 5 :合成DNA 序列編號16 :合成DNA 序列編號17 :合成DNA 序列編號1 8 :合成DNA 序列編號1 9 :合成DNA 序列編號20 :合成DNA 序列編號21 :合成DNA 序列編號22 :合成DNA 序列編號23 :合成DNA 序列編號24 :合成DNA 序列編號25 :合成DNA 序列編號26 :合成DNA 78148-990318.doc -83- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1327574
<110〉日商協和醱酵麒麟有限公司 〈120>抗CD40單株抗體
<130〉 PH-1569-PCT <140> TW 091108894 <141〉 2002-04-26 <150> PCT/US01/13672 <151〉 2001-04-27 <150> US09/844, 684 <151〉 2001-04-27 <150> JP2001/142482 <151〉 2001-05-11 <150> JP2001/310535 <151〉 2001-10-05 <150> US10/040, 244 <151〉 2001—10—26 <160〉 66 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：合成DNA <400> 1 cccagatctg tccatccaga accacccact gcatgcagag 78148·序列表-990318.doc 1327574 <210〉 2 <211> 41 〈212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：合成DNA <400> 2 acaagatctg ggctctacgt atctcagccg atcctgggga c 41 <210〉 3 φ <211> 27 <212〉 DNA 〈213〉人工序列 <220> <223〉人工序列之描述：合成DNA <400〉 3 ggtccgggag atcatgaggg tgtcctt 27
<210〉 4 <211> 26 <212〉 DNA 〈213〉人工序列 <220〉 〈223>人工序列之描述：合成DNA <400〉 4 gtgcacgccg ctggtcaggg cgcctg 26 <210〉 5 <211〉 25 <212> DNA <213〉人工序列 78148-序列表-990318.doc 2 1327574 <220> <223〉人工序列之描述：合成DNA <400> 5 gctggagggc acggtcacca cgctg <210〉 6 <211〉 23 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 〈223>人工序列之描述：合成DNA <400> 6 ggtgccaggg ggaagaccga tgg <210> 7 <211〉 35 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：合成DNA <400〉 7 atatgtcgac gctgaattct ggctgaccag ggcag <210〉 8 <211> 37 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220> <223〉人工序列之描述：合成DNA <400〉 8 atatgtcgac tcccaggtgt ttccattcag tgatcag 78148-序列表-990318.doc 1327574 <210〉 9 <211〉 37 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220> <223〉人工序列之描述：合成DNA <400〉 9 atatgtcgac ttccattcgg tgatcagcac tgaacac 37 <210〉 10 • <211> 34 <212> DNA 〈213>人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：合成DNA <400> 10 atatgtcgac tttgagagtc ctggacctcc tgtg 34
<210> 11 <211〉 33 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：合成DNA <400> 11 atatgtcgac gagtcatgga tctcatgtgc aag 33 <210〉 12 <211〉 36 <212> DNA <213〉人工序列 78148·序列表-990318.doc 4· 1327574 <220> <223〉人工序列之描述：合成DNA <400〉 12 atatgtcgac ccagggcagt caccagagct ccagac 36 <210> 13 <211〉 26 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：合成DNA <400〉 13 accgtgtcga ctacgcggga gtgact
26 <210> 14 <211〉 29 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：合成DNA <400> 14 accgtgtcga cgctgatcag gactgcaca
29 <210〉 15 <211〉 30 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉人工序列之描述：合成DNA <400> 15 accgtgtcga cggtgatcag gactgaacag 30 78148·序列表-990318.doc • 5 1327574 <210> 16 <211〉 26 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 〈223>人工序列之描述··合成DNA <400> 16 gttgaagctc tttgtgacgg gcgagc <210> 17 φ <211> 24 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 〈223>人工序列之描述：合成DNA <400〉 17 tcttctccac ggtgctccct teat
<210> 18 <211〉 35 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220> <223〉人工序列之描述：合成DNA <400> 18 atatagatet gaactgctca gttaggaccc agagg <210> 19 〈211〉 34 <212〉 DNA <213〉人工序列 78148-序列表-990318.doc • 6 · 1327574 <220〉 〈223>人工序列之描述：合成DNA <400〉 19 atatagatct cgcggggaag gagactgctc agtt <210〉 20 〈211〉 34 <212〉 DNA 〈213〉人工序列 <220> <223〉人工序列之描述：合成DNA <400> 20 atatagatct agtcagaccc agtcaggaca cage 〈210〉 21 <211> 36 <212〉 DNA 〈213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：合成DNA <400> 21 atatagatct gagetgetea gttaggaccc agaggg <210〉 22 <211〉 36 <212> DNA 〈213>人工序列 <220〉 〈223>人工序列之描述：合成DNA <400〉 22 atatagatct taagcaagtg taacaactca gagtac 78148·序列表-990318.doc 1327574 <210> 23 <211〉 38 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220> <223〉人工序列之描述：合成DNA <400> 23 atatagatct gaggaactgc tcagttagga cccagagg 38
<210> 24 <211〉 30 〈212〉 DNA <213〉人工序列 <220> <223〉人工序列之描述：合成DNA <400〉 24 aactccagat ctgcctcagg aagcagcatc 30 <210〉 25 〈211〉 30 <212〉 DNA 〈213>人工序列 <220> 〈223>人工序列之描述：合成DNA <400〉 25 aactccagat ctagggcaag cagtggtaac 30 <210〉 26 <211〉 26 <212〉 DNA 〈213>人工序列 78148-序列表-990318.doc 8 - <220〉 <223〉人工序列之描述：合成DNA <400> 26 tggcgggaag atgaagacag atggtg 26 <210〉 27 <211〉 1480 <212〉 DNA <213〉智人 <400〉 27 gtcgacgctg aattctggct gaccagggca gccaccagag ctccagacaa tgtctgtctc 60 cttcctcatc ttcctgcccg tgctgggcct cccatggggt gtcctgtcac aggtccaact 120 gcagcagtca ggtccaggac tggtgaagcc ctcgcagacc ctctcactca cctgtgccat 180 ctccggggac agtgtctcta gcaacagtgc tacttggaac tggatcaggc agtccccatc 240 gagagacctt gagtggctgg gaaggacata ctacaggtcc aagtggtatc gtgattatgt 300 aggatctgtg aaaagtcgaa taatcatcaa cccagacaca tccaacaacc agttctccct 360 gcagctgaac tctgtgactc ccgaggacac ggctatatat tactgtacaa gagcacagtg 420 gctgggaggg gattacccct actactacag tatggacgtc tggggccaag ggaccacggt 480 caccgtctct tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcgc cctgctccag 540 gagcacctcc gagagcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc 600 ggtgacggtg tcgtggaact caggcgctct gaccagcggc gtgcacacct tcccagctgt 660 cctacagtcc tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcaactt 720 cggcacccag acctacacct gcaacgtaga tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa 780 gacagttgag cgcaaatgtt gtgtcgagtg cccaccgtgc ccagcaccac ctgtggcagg 840 accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc 900 tgaggtcacg tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cccgaggtcc agttcaactg 960 gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccacgggagg agcagttcaa 1020 cagcacgttc cgtgtggtca gcgtcctcac cgttgtgcac caggactggc tgaacggcaa 1080 ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc 1140 caaaaccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga 1200 gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat 1260 cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cacctcccat 1320 gctggactca gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg 1380 gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac 1440 gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa atgaggatcc 1480 <210> 28 <211〉 474 9· 78148·序列表-990318.doc 1327574 <212> PRT 〈213>智人 <400〉 28
Met Ser Val Ser Phe Leu lie Phe Leu Pro Val Leu Gly Leu Pro Trp 1 5 10 15
Gly Val Leu Ser Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Gly Leu Val 20 25 30
Lys Pro Ser Gin Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala lie Ser Gly Asp Ser 35 40 45
Val Ser Ser Asn Ser Ala Thr Trp Asn Trp lie Arg Gin Ser Pro Ser 50 55 60
Arg Asp Leu Glu Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr 65 70 75 80
Arg Asp Tyr Val Gly Ser Val Lys Ser Arg lie lie lie Asn Pro Asp 85 90 95
Thr Ser Asn Asn Gin Phe Ser Leu Gin Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu 100 105 110
Asp Thr Ala lie Tyr Tyr Cys Thr Arg Ala Gin Trp Leu Gly Gly Asp 115 120 125
Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val 130 135 140
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 145 150 155 160
Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 165 170 175
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 180 185 190
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser 195 200 205 -10· 78148-序列表.990318.doc 1327574
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe 210 215 220
Gly Thr Gin Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr 225 230 235 240
Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro 245 250 255
Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 260 265 270
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 275 280 285 Φ
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp 290 295 300
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 305 310 315 320
Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val 325 330 335
His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 340 345 350
Lys Gly Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Thr Lys Gly 355 360 365
Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 370 375 380
Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 385 390 395 400
Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 405 410 415
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 420 425 430 • 11 · 78148·序列表-990318.doc 1327574
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 435 440 445
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 450 455 460
Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210〉 29 <211〉 406 <212> DNA • <213〉智人 <400> 29 actgctcagt taggacccag agggaaccat ggaagcccca gctcagcttc tcttcctcct 60 gctactctgg ctcccagata ccaccggaga aattgtgttg acacagtctc cagccaccct 120 gtctttgtct ccaggggaaa gagccaccct ctcctgcagg gccagtcaga gtgttagcag 180 ctacttagcc tggtaccaac agaaacctgg ccaggctccc aggctcctca tctatgatgc 240 atccaacagg gccactggca tcccagccag gttcagtggc agtgggtctg ggacagactt 300 cactctcacc atcagcagcc tagagcctga agattttgca gtttattact gtcagcagcg 360 tagcaacact ttcggccctg ggaccaaagt ggatatcaaa cgtacg 406
<210〉 30 <211〉 126 <212> PRT <213〉智人 〈400〉 30
Met Glu Ala Pro Ala Gin Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 15 10 15
Asp Thr Thr Gly Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser I 20 25 30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser 35 40 45
Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro 12 · 78148·序列表-990318.doc 1327574 50 55 60
Arg Leu Leu lie Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala 65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser 85 90 95
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser 100 105 110
Asn Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp lie Lys Arg Thr 115 120 125 <210〉 31 <211〉 508 <212〉 DNA <213〉智人 <400> 31 ctgaacacag acccgtcgac tcccaggtgt ttccattcag tgatcagcac tgaacacaga 60 ggactcacca tggagttggg actgagctgg attttccttt tggctatttt aaaaggtgtc 120 cagtgtgaag tgcagctggt ggagtctggg ggaggcttgg tacagcctgg caggtccctg 180 agactctcct gtgcagcctc tggattcacc tttgatgatt atgccatgca ctgggtccgg 240 caagctccag ggaagggcct ggagtgggtc tcaggtatta gttggaatag tggtagcttg 300 gtgcatgcgg actctgtgaa gggccgattc accatctcca gagacaacgc caagaactcc 360 ctgtatctgc aaatgaacag tctgagagct gaggacacgg ccttgtatta ctgtgcaaga 420 gataggctat ttcggggagt taggtactac ggtatggacg tctggggcca agggaccacg 480 gtcaccgtct cctcagctag caccaagg 508 <210> 32 <211〉 146 〈212〉 PRT 〈213〉智人 〈400〉 32
Met Glu Leu Gly Leu Ser Trp lie Phe Leu Leu Ala lie Leu Lys Gly 15 10 15
Val Gin Cys Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin -13 - 78148-序列表-990318.doc 1327574
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45
Asp Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60
Glu Trp Val Ser Gly lie Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Val His Ala 65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 85 90 95
Ser Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu 100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Leu Phe Arg Gly Val Arg Tyr Tyr Gly 115 120 125
Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 130 135 140
Thr Lys 145 〈210〉 33 〈211〉 414 <212> DNA <213〉智人 cttcctcctg 60 agccaccctg 120 tgttagcagc 180 ctatgatgca 240 gacagacttc 300 tcagcagcgt 360 ggtg 414 <400〉 33 ctgctcagtt ctactctggc tctttgtctc tacttagcct tccaacaggg actctcacca agccactggc aggacccaga tcccagatac caggggaaag ggtaccaaca ccactggcat tcagcagcct tcactttcgg gggaaccatg caccggagaa agccaccctc gaaacctggc cccagccagg agagcctgaa cggggggacc gaagccccag attgtgttga tcctgcaggg caggctccca ttcagtggca gattttgcag aaggtggaga ctcagcttct cacagtctcc ccagtcagag ggctcctcat gtgggtctgg tttattactg tcaaacgtac •14- 78148-序列表.990318.doc 1327574 <210> 34 <211> 129 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 34
Met Glu Ala Pro Ala Gin Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 15 10 15
Asp Thr Thr Gly Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser 35 40 45
Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro 50 55 60
Arg Leu Leu He Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala 65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser 85 90 95
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser 100 105 no
His Trp Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys Arg Thr 115 120 125
Val <210> 35 <211〉 493 <212〉 DNA <213〉智人 <400〉 35 ctgaacacag acccgtcgac ttccattcgg tgatcagcac tgaacacaga ggactcacca 60 tggagtttgg gctgagctgg gttttcctcg ttgctctttt aagaggtgtc cagtgtcagg 120 • 15 - 78148-序列表-990318.doc rI327574 tgcagctggt ggagtctggg ggaggcgtgg tccagcctgg gaggtccctg agactctcct 180 gtgcagcgtc tggattcacc ttcagtagct atggcatgca ctgggtccgc caggctccag 240 gcaaggggct ggagtgggtg gcagttatat ggtatgatgg aagtattaaa tactatgcag 300 actccgtgaa gggccgattc accatctcca gagacaattc caagaacacg ctgtatctgc 360 aaatgaacag cctgagagcc gaggacacgg ctgtgtatta ctgtgcgaga gagggctaca 420 atattttgac tggttatttt ggctactggg gccagggaac cctggtcacc gtctcctcag 480 ctagcaccaa ggg 493 〈210〉 36 <211> 144 <212〉 PRT <213〉智人 φ <400> 36
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly 15 10 15
Val Gin Cys Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin 20 25 30
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45
Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60
Glu Trp Val Ala Val He Trp Tyr Asp Gly Ser lie Lys Tyr Tyr Ala 65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Tyr Asn lie Leu Thr Gly Tyr Phe Gly 115 120 125
Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 130 135 140 -16- 78148-序列表-990318.doc 1327574 <210〉 37 〈211〉 427 <212〉 DNA <213〉智人 <400〉 37 tcacagatct agtcagaccc agtcaggaca cagcatggac atgagggtcc ccgctcagct 60 cctggggctc ctgctgctct ggctcccagg tgccagatgt gtcatctgga tgacccagtc 120 tccatcctta ctctctgcat ctacaggaga cagagtcacc atcagttgtc ggatgagtca 180 gggcattagc agtgatttag cctggtatca gcaaaaacca gggaaagccc ctgagctcct 240 gatctctgct gcatccactt tgcaaagtgg ggtcccatca aggttcagtg gcagtggatc 300 tgggacagat ttcactctca ccatcagctg cctgcagtct gaagattttg caacttatta 360 ctgtcaacag tattatagtt ttccgtggac gttcggccaa gggaccaagg tggaaatcaa 420 acgtacg 427 <210〉 38 <211> 131 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 38
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 15 10 15
Leu Pro Gly Ala Arg Cys Val lie Trp Met Thr Gin Ser Pro Ser Leu 20 25 30
Leu Ser Ala Ser Thr Gly Asp Arg Val Thr lie Ser Cys Arg Met Ser 35 40 45
Gin Gly He Ser Ser Asp Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys 50 55 60
Ala Pro Glu Leu Leu lie Ser Ala Ala Ser Thr Leu Gin Ser Gly Val 65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 85 90 95 lie Ser Cys Leu Gin Ser Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 78148·序列表-990318.doc -17 100 105 110
Tyr Tyr Ser Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie 115 120 125
Lys Arg Thr 130 〈210〉 39 <211〉 492 <212〉 DNA <213〉智人 〈400〉 39 ctgaacacag acccgtcgac ttccattcgg tgatcagcac tgaacacaga ggactcacca 60 tggagtttgg gctgagctgg gttttcctcg ttgctctttt aagaggtgtc cagtgtcagg 120 tgcagctggt ggagtctggg ggaggcgtgg tccagcctgg gaggtccctg agactctcct 180 gtgcagcgtc tggattcacc ttcagtagct atggcatgca ctgggtccgc caggctccag 240 gcaaggggct ggagtgggtg gcagttatat ggaatgatgg aagtattaaa tactatgcag 300 actccgtgaa gggccgattc accatctcca gagacaattc caagaacacg ctgtatctgc 360 aaatgaacag cctgagagcc gaggacacgg ctgtgtatta ctgtgcgaga gagggctaca 420 atattttgac tggttatttt ggctactggg gccagggaac cctggtcacc gtctcctcag 480 ctagcaccaa gg 492 〈210〉 40 <211> 144 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 40
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly 15 10 15
Val Gin Cys Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin 20 25 30
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45
Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu -18· 78148·序列表-990318.doc 1327574 50 55 60
Glu Trp Val Ala Val He Trp Asn Asp Gly Ser lie Lys Tyr Tyr Ala 65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Tyr Asn lie Leu Thr Gly Tyr Phe Gly 115 120 125
Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 130 135 140 <210〉 41 <211〉 427 <212> DNA <213〉智人 <400> 41 tcacagatct agtcagaccc agtcaggaca cagcatggac atgagggtcc ccgctcagct 60 cctggggctc ctgctgctct ggctcccagg tgccagatgt gtcatctgga tgacccagtc 120 tccatcctta ctctctgcat ctacaggaga cagagtcacc atcagttgtc ggatgagtca 180 gggcattagc agtgatttag cctggtatca gcaaaaacca gggaaagccc ctgagctcct 240 gatctctgct gcatccactt tgcaaagtgg ggtcccatca aggttcagtg gcagtggatc 300 tgggacagat ttcactctca ccatcagctg cctgcagtct gaagattttg caacttatta 360 ctgtcaacag tattatagtt ttccgtggac gttcggccaa gggaccaagg tggaaatcaa 420 acgtacg 427 〈210〉 42 <211> 131 <212> PRT <213〉智人 <400〉 42
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp -19 - 78148-序列表-990318.doc 5 10 15
Leu Pro Gly Ala Arg Cys Val lie Trp Met Thr Gin Ser Pro Ser Leu 20 25 30
Leu Ser Ala Ser Thr Gly Asp Arg Val Thr lie Ser Cys Arg Met Ser 35 40 45
Gin Gly He Ser Ser Asp Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys 50 55 60
Ala Pro Glu Leu Leu lie Ser Ala Ala Ser Thr Leu Gin Ser Gly Val 65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 85 90 95 lie Ser Cys Leu Gin Ser Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 100 105 110
Tyr Tyr Ser Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie 115 120 125
Lys Arg Thr 130 <210> 43 <211〉 481 <212〉 DNA <213〉智人 <400〉 43 ctgaacacag acccgtcgac tttgagagtc ctggacctcc tgtgcaagaa catgaaacat 60 ctgtggttct tccttctcct ggtggcagct cccagatggg tcctgtccca ggtgcagctg 120 caggagtcgg gcccaggact ggtgaagcct tcggagaccc tgtccctcac ctgcactgtc 180 tctggtggct ccatcagtgg ttactactgg agctggatcc ggcagccccc agggaaggga 240 ctggagtgga ttgggtatat ctattacagt gggagcacca actacaatcc ctccctcaag 300 agtcgagtca ccatatcagt agacacgtcc aagaaccagt tctccctgaa gctgaattct 360 gtgaccgctg cggacacggc cgtgtattac tgtgcgagag cccccttgca cggtgactac 420 aaatggttcc acccctgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcctcagc tagcaccaag 480 g 481 20 - 78148·序列表 _990318.doc 1327574 <210〉 44 <211> 143 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 44
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 15 10 15
Val Leu Ser Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys 20 25 30
Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser lie 35 40 45
Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60
Glu Trp lie Gly Tyr lie Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro 65 70 75 80
Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr lie Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gin 85 90 95
Phe Ser Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr 100 105 110
Tyr Cys Ala Arg Ala Pro Leu His Gly Asp Tyr Lys Trp Phe His Pro 115 120 125
Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 130 135 140 <210> 45 <211〉 430 <212〉 DNA <213〉智人 <400〉 45 -21 · 78148-序列表-990318.doc 1327574 tcacagatct gagctgctca gttaggaccc agagggaacc atggaaaccc cagcgcagct 60 tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga gaaattgtgt tgacgcagtc 120 tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc ctctcctgca gggccagtca 180 gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa cctggccagg ctcccaggct 240 cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca gacaggttca gtggcagtgg 300 gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag cctgaagatt ttgcagtgta 360 ttactgtcag cagtatggta gctcaccgat caccttcggc caagggacac gactggagat 420 caaacgtacg 430 <210〉 46 <211〉 130 <212> PRT <213〉智人
<400〉 46
Met Glu Thr Pro Ala Gin Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser 20 25 30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser 35 40 45
Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala 50 55 60
Pro Arg Leu Leu lie Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly lie Pro 65 70 75 80
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie 85 90 95
Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr 100 105 110
Gly Ser Ser Pro He Thr Phe Gly Gin Gly Thr Arg Leu Glu lie Lys 115 120 125
Arg Thr 130 • 22 - 78148-序列表 _990318.doc 1327574 <210> 47 <211〉 462 <212> DNA <213〉智人 <400〉 47 atatgtcgac gagtcatgga tctcatgtgc aagaaaatga agcacctgtg gttcttcctc 60 ctgctggtgg cggctcccag atgggtcctg tcccagctgc agctgcagga gtcgggccca 120 ggactactga agccttcgga gaccctgtcc ctcacctgca ctgtctctgg cggctccatc 180 agcagtcctg gttactacgg gggctggatc cgccagcccc cagggaaggg gctggagtgg 240 attgggagta tctataaaag tgggagcacc taccacaacc cgtccctcaa gagtcgagtc 300 accatatccg tagacacgtc caagaaccag ttctccctga agctgagctc tgtgaccgcc 360 gcagacacgg ctgtgtatta ctgtacgaga cctgtagtac gatattttgg gtggttcgac 420 ccctggggcc agggaaccct ggtcaccgtc tcctcagcta gc 462 <210〉 48 <211〉 149 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 48
Met Asp Leu Met Cys Lys Lys Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu 15 10 15
Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp Val Leu Ser Gin Leu Gin Leu Gin Glu 20 25 30
Ser Gly Pro Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys 35 40 45
Thr Val Ser Gly Gly Ser lie Ser Ser Pro Gly Tyr Tyr Gly Gly Trp 50 55 60 lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie Gly Ser lie Tyr 65 70 75 80
Lys Ser Gly Ser Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr 85 90 95 -23 - 78148-序列表 _990318.doc 1327574 lie Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser 100 105 110
Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Pro Val Val 115 120 125
Arg Tyr Phe Gly Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr 130 135 140
Val Ser Ser Ala Ser 145 <210> 49 • <211> 448 <212> DNA 〈213〉智人 <400〉 49 agatcttaag caagtgtaac aactcagagt acgcggggag acccactcag gacacagcat 60 ggacatgagg gtccccgctc agctcctggg gcttctgctg ctctggctcc caggtgccag 120 atgtgccatc cagttgaccc agtctccatc ctccctgtct gcatctgtag gagacagagt 180 caccatcact tgccgggcaa gtcagggcat tagcagtgct ttagcctggt atcagcagaa 240 accagggaaa gctcctaagc tcctgatcta tgatgcctcc aatttggaaa gtggggtccc 300 atcaaggttc agcggcagtg gatctgggac agatttcact ctcaccatca gcagcctgca 360 gcctgaagat tttgcaactt attactgtca acagtttaat agttacccga cgttcggcca 420 agggaccaag gtggaaatca aacgtacg 448 <210> 50 <211〉 130 <212> PRT <213〉智人 <400〉 50
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 15 10 15
Leu Pro Gly Ala Arg Cys Ala lie Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser 20 25 30
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser -24· 78148·序列表-990318.doc 1327574 35 40 45
Gin Gly lie Ser Ser Ala Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys 50 55 60
Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val 65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 85 90 95 lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 100 105 110
Phe Asn Ser Tyr Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 115 120 125
Arg Thr 130 <210〉 51 <211> 453 <212〉 DNA <213〉智人 <400〉 51 atgtctgtct ccttcctcat cttcctgccc gtgctgggcc tcccatgggg tgtcctgtca 60 caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgaagc cctcgcagac cctctcattc 120 acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct agcaacagtg ctgcttggaa ctggatcagg 180 cagtccccat cgagaggcct tgagtggctg ggaaggacat actacaggtc caagtggtat 240 aaagattatg cagtatctgt gaaaagtcga ataaccatca acccagacac atccaagaac 300 cagttctccc tgcagctgaa ctctgtgacc cccgaggaca cggctgtgta ttactgtgca 360 agagggtatt actatggttc ggggagctat ccctactact accaaatgga cgtctggggc 420 caagggacca cggtcaccgt ctcctcagct age 453 <210〉 52 <211> 151 <212> PRT 〈213〉智人 25- 78148-序列表-990318.doc 1327574 <400〉 52
Met Ser Val Ser Phe Leu lie Phe Leu Pro Val Leu Gly Leu Pro Trp 15 10 15
Gly Val Leu Ser Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Gly Leu Val 20 25 30
Lys Pro Ser Gin Thr Leu Ser Phe Thr Cys Ala lie Ser Gly Asp Ser 35 40 45
Val Ser Ser Asn Ser Ala Ala Trp Asn Trp lie Arg Gin Ser Pro Ser 50 55 60
Arg Gly Leu Glu Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr
Lys Asp Tyr Ala Val Ser Val Lys Ser Arg lie Thr lie Asn Pro Asp 85 90 95
Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu Gin Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu 100 105 110
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly 115 120 125
Ser Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gin Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr 130 135 140
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 145 150 <210> 53 <211〉 414 <212〉 DNA <213〉智人 <400> 53 aattgaggaa ctgctcagtt aggacccaga gggaaccatg gaagccccag ctcagcttct 60 cttcctcctg ctactctggc tcccagatac caccggagaa attgtgttga cacagtctcc 120 agccaccctg tctttgtctc caggggaaag tgccaccctc tcctgcaggg ccagtcagag 180 tgttagcagc tacttagcct ggtaccaaca gaaacctggc caggctccca ggctcctcat 240 -26- 78148-序列表-990318.doc 1327574 ctatgatgca tccaacaggg ccactggcat cccagccagg ttcagtggca gtgggtctgg 300 gacagacttc actctcacca tcagcagcct agagcctgaa gattttgcag tttattactg 360 tcagcagcgt agcaacactt tcggcggagg gaccaaggtg gagatcaaac gaac 414 <210〉 54 <211〉 125 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 54
Met Glu Ala Pro Ala Gin Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 15 10 15
Asp Thr Thr Gly Glu He Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30
Leu Ser Pro Gly Glu Ser Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser 35 40 45
Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro 50 55 60
Arg Leu Leu lie Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala 65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser 85 90 95
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser 100 105 110
Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 115 120 125 <210〉 55 <211> 495 <212> DNA <213〉智人 <400〉 55 -27 · 78148-序列表-990318.doc 1327574 ctgaacacag acccgtcgac tacgcgggag accacagctc cacaccatgg actggacctg 60 gaggatccta ttcttggtgg cagcagcaac aggtgcccac tcccaggtgc agctggtgca 120 atctgggtct gagttgaaga agcctggggc ctcagtgaag gtcccctgca aggcttctgg 180 atacaccttc actagctatg ctatgaattg ggtgcgacag gcccctggac aagggcttga 240 gtggatggga tggatcaaca ccaacactgg gaacccaacg tatgcccagg gcttcacagg 300 acggtttgtc ttctccttgg acacctctgt cagcacggca tatctgcaga tcagcagcct 360 aaaggctgag gacactgccg tgtattactg tgcgagagag gtagtaccag ttgctatgag 420 ggtaactcac tactactacg gtatggacgt ctggggccaa gggaccacgg tcaccgtctc 480 ctcagctagc accaa 495 <210> 56 <211> 149 <212> PRT φ <213〉智人 <400> 56
Met Asp Trp Thr Trp Arg lie Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 15 10 15
Ala His Ser Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys 20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Pro Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45
Thr Ser Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu
Glu Trp Met Gly Trp lie Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala 65 70 75 80
Gin Gly Phe Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser 85 90 95
Thr Ala Tyr Leu Gin lie Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Val Val Pro Val Ala Met Arg Val Thr His 115 120 125
Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val -28- 78148-序列表-990318.doc 1327574 130 135 140
Ser Ser Ala Ser Thr 145 <210〉 57 <211〉 830 〈212〉 DNA <213〉智人 <400〉 57 ctgggtacgg taaccgtcag atcgcctgga gacgccatca cagatctgcc tcaggaagca 60 gcatcggagg tgcctcagcc atggcatgga tccctctctt cctcggcgtc cttgtttact 120 gcacaggatc cgtggcctcc tatgagctga ctcagccacc ctcagtgtcc gtggccccag 180 gacagacagc cagcatcacc tgttctggag ataaattggg ggataatttt acttgctggt 240 atcagcagaa gccaggccag tcccctgtgc tggtcatctt tcaggattgg aagcggcgcc 300 cagggatccc tgcgcgattc tctggctcca agtctgggaa cacagccact ctgaccatca 360 gcgggaccca ggctatggat gaggctgact attactgtca ggcgtgggac atcagcactg 420 tggtattcgg cggagggacc aagctgaccg tcctaggtca gcccaaggct gccccctcgg 480 tcactctgtt cccgccctcc tctgaggagc ttcaagccaa caaggccaca ctggtgtgtc 540 tcataagtga cttctacccg ggagccgtga cagtggcctg gaaggcagat agcagccccg 600 tcaaggcggg agtggagacc accacaccct ccaaacaaag caacaacaag tacgcggcca 660 gcagctacct gagcctgacg cctgagcagt ggaagtccca cagaagctac agctgccagg 720 tcacgcatga agggagcacc gtggagaaga cagtggcccc tacagaatgt tcatgaattc 780 agatccgtta acggttacca actacctaga ctggattcgt gaccaacata 830 <210> 58 <211〉 231 <212> PRT <213〉智人 <400〉 58
Met Ala Trp lie Pro Leu Phe Leu Gly Val Leu Val Tyr Cys Thr Gly 15 10 15
Ser Val Ala Ser Tyr Glu Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Val Ala 20 25 30
Pro Gly Gin Thr Ala Ser lie Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp 35 40 45 78148-序列表-990318.doc 1327574
Asn Phe Thr Cys Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Val Leu 50 55 60
Val lie Phe Gin Asp Trp Lys Arg Arg Pro Gly He Pro Ala Arg Phe 65 70 75 80
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr He Ser Gly Thr 85 90 95
Gin Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ala Trp Asp lie Ser 100 105 110
Thr Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro 115 120 125
Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu 130 135 140.
Gin Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu lie Ser Asp Phe Tyr Pro 145 150 155 160
Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala 165 170 175
Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gin Ser Asn Asn Lys Tyr Ala 180 185 190
Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gin Trp Lys Ser His Arg 195 200 205
Ser Tyr Ser Cys Gin Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr 210 215 220
Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 225 230 <210〉 59 〈211〉 520 <212> DNA <213〉智人 •30· 78148-序列表-990318.doc 1327574 <400〉 59 gctgatcagg actgcacaca gagaactcac catggagttt gggctgagct gggttttcct 60 tgttgctatt ttaaaaggtg tccagtgtga ggtgcagctg gtggagtccg ggggaggctt 120 agttcagcct ggggggtccc tgagactctc ctgtgcagtc tctggattca ccttcagtac 180 ctactggatg cactgggtcc gccaagctcc agggaagggg ctggtgtggg tctcacgtat 240 taatagtgat gggagtagca caacctacgc ggactccgtg aagggccgat tcaccatctc 300 cagagacaac gccaagaaca cgctgtatct gcaaatgaac agtctgagag ccgaggacac 360 ggctgtgtat tactgtgcaa gagatagagt actatggatc ggggagttat cctactacgg 420 tatggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc tcagctagca ccaagggccc 480 atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 520 <210〉 60 <211〉 163 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 60
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala lie Leu Lys Gly 15 10 15
Val Gin Cys Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin 20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45
Ser Thr Tyr Trp Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60
Val Trp Val Ser Arg lie Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Thr Tyr Ala 65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Val Leu Trp lie Gly Glu Leu Ser Tyr 115 120 125 • 31 · 78148·序列表-990318.doc 1327574
Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 130 135 140
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 145 150 155 160
Ser Thr Ser . 〈210〉 61 <211〉 698 <212〉 DNA • <213〉智人 <400〉 61 ggggagtcag acccagtcag gacacagcat ggacatgagg gtccccgctc agctcctggg 60 gctcctgctg ctctggctcc caggtgccaa atgtgacatc cagatgaccc agtctccttc 120 caccctgtct gcatctgtag gagacagagt caccatcact tgccgggcca gtcagagtat 180 tagtaactgg ttggcctggt atcagcagaa accagggaaa gcccctaagc tcctgctcta 240 taaggcatct ggtttagaaa gtggggtccc atcaaggttc agcggcagtg gatctgggac 300 agaattcact ctcaccatca acagcctgca gcctgatgat tttgcaactt attactgcca 360 acagtctaat agttattcgt ggacgttcgg ccacgggacc aaggtggaaa tcaaacgtac 420 ggtggctgca ccatctgtct tcatcttccc gccatctgat gagcagttga aatctggaac 480 tgcctctgtt gtgtgcctgc tgaataactt ctatcccaga gaggccaaag tacagtggaa 540 ggtggataac gccctccaat cgggtaactc ccaggagagt gtcacagagc aggacagcaa 600
ggacagcacc tacagcctca gcagcaccct gacgctgagc aaagcagact acgagaaaca 660 caaagtctac gcctgcgaag tcacccatca gggcctga 698 <210〉 62 <211〉 223 <212〉 PRT 〈213>智人 〈400〉 62
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 15 10 15
Leu Pro Gly Ala Lys Cys Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Thr 20 25 30 •32· 78148·序列表-990318.doc 1327574
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45
Gin Ser lie Ser Asn Trp Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys 50 55 60
Ala Pro Lys Leu Leu Leu Tyr Lys Ala Ser Gly Leu Glu Ser Gly Val 65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr 85 90 95 lie Asn Ser Leu Gin Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 100 105 110 ^
Ser Asn Ser Tyr Ser Trp Thr Phe Gly His Gly Thr Lys Val Glu lie 115 120 125
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp 130 135 140
Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 145 150 155 160
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 165 170 175
Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp 180 185 190
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 195 200 205
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu 210 215 220 <210〉 63 <211〉 630 <212> DNA <213〉智人 33- 78148-序列表-990318.doc <400> 63 ggtctatata agcagagctg ggtacgtcct cacattcagt gatcagcact gaacacagac 60 ccgtcgacgg tgatcaggac tgaacagaga gaactcacca tggagtttgg gctgagctgg 120 ctttttcttg tggctatttt aaaaggtgtc cagtgtgagg tgcagctgtt ggagtctggg 180 ggaggcttgg tacagcctgg ggggtccctg agactctcct gtgcagcctc tggattcacc 240 tttagcagct atgccatgag ctgggtccgc caggctccag ggaaggggct ggagtgggtc 300 tcagctatta gtggtagtgg tggtagcaca tactacgcag actccgtgaa gggccggttc 360 accatctcca gagacaattc caagaacacg ctgtatctgc aaatgaacag cctgagagcc 420 gaggacacgg ccgtatatta ctgtgcgaaa gatggggggt actatggttc ggggagttat 480 gggtactttg actactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcctcagc tagcaccaag 540 ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 600 ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc 630 <210〉 64 <211〉 177 <212> PRT <213〉智人 <400〉 64
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala lie Leu Lys Gly 15 10 15
Val Gin Cys Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin 20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45
Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60
Glu Trp Val Ser Ala He Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala 65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 -34- 78148-序列表-990318.doc
Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Gly Gly Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Gly 115 120 125
Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 130 135 140
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 145 150 155 160
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 165 170 175
Pro <210〉 65 <211> 728 〈212〉 DNA <213〉智人 <400〉 65 caagcagtgg taacaacgca gagtacgcgg ggggagtcag acccagtcag gacacagcat 60 ggacatgagg gtccccgctc agctcctggg gctcctgctg ctctggttcc caggttccag 120 atgcgacatc cagatgaccc agtctccatc ttccgtgtct ggatctgtag gagacagagt 180 caccatcact tgtcgggcga gtcagggtat tagcagctgg ttagcctggt atcagcagaa 240 accagggaaa gcccctaagc tcctgatcta tgctggatcc agtttgcaaa gtggggtccc 300 atcaaggttc agcggcagtg gatttgggac agatttcact ctcaccatca gcagcctgca 360 gcctgaagat tttgcaactt actattgtca acaggctagc agtttccctc ggacattcgg 420 ccaagggacc aaggtggaga tcaaacgtac ggtggctgca ccatctgtct tcatcttccc 480 gccatctgat gagcagttga aatctggaac tgcctctgtt gtgtgcctgc tgaataactt 540 ctatcccaga gaggccaaag tacagtggaa ggtggataac gccctccaat cgggtaactc 600 ccaggagagt gtcacagagc aggacagcaa ggacagcacc tacagcctca gcagcaccct 660 gacgctgagc aaagcagact acgagaaaca caaagtctac gcctgcgaag tcacccatca 720 gggcctga 728 <210> 66 〈211〉 223 <212〉 PRT <213〉智人 -35 - 78148-序列表-990318.doc 1327574 <400〉 66
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 15 10 15
Phe Pro Gly Ser Arg Cys Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser 20 25 30
Val Ser Gly Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45
Gin Gly lie Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys 50 55 60
Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ala Gly Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 85 90 95
He Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 100 105 110
Ala Ser Ser Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie 115 120 125
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro Ser Asp 130 135 140
Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 145 150 155 160
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 165 170 175
Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp 180 185 190
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 195 200 205
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu 210 215 220 -36- 78148-序列表-990318.doc

Claims (1)

1327574 六、申請專利範圍
A8 B8 C8 D8
曰修(更)正本 1. 一種針對人類CD40之抗體或其功能性片段，該抗體為 • 具有融合瘤4D11(寄存編號CCRC 960161)所產生之 抗體的重鏈可變區域及輕鏈可變區域之胺基酸序列。 2‘ 一種針對人類CD40之抗體或其功能性片段，該抗體具 有融合瘤4D11所產生之抗體的重鏈可變區域及輕鏈可 變區域之成熟部分的胺基酸序列，其係分別如序列編號 48及50所示。 3 · —種針對人類C 〇 4 0之抗體或其功能性片段，該抗體具 有序列編號48之自第27號之Q至第147號之S所表示的 胺基酸序列及序列編號50之自第23號之A至第128號之 K所表示的胺基酸序列。 4. 如申請專利範圍第1〜3項中任一項之抗體或其功能性片 段’該抗體為人類抗體。 5. —種醫藥組合物’其特徵為含有如申請專利範圍第1〜4 項中任一項之抗體或其功能性片段做為有效成分。 6. 如申請專利範圍第5項之醫藥組合物，其係作為免疫抑 制劑、自體免疫疾病治療劑、過敏治療劑或血液凝固第 V 111因子抑制症候群治療劑使用。 7. —種如申請專利範圍第1〜4項中任一項之抗體或其功能 性片段之用途，其係用於製造如申請專利範圍第5項之 醫藥組合物，該醫藥組合物係作為免疫抑制劑、自體免 疫疾病治療劑、過敏治療劑或血液凝固第V111因子抑制 症候群治療劑使用。 8. —種融合瘤4D11(寄存編號CCRC 960161)。 78148-990318.doc , -Ί -
_ A4 現格 1210X 297公釐） 1327574 A8 B8 C8 ______D8_ 六、申請專利範圍 9. 一種針對人類CD40之抗體或其功能性片段，其係由融 • · 合瘤4D 1 1 (寄存編號CCRC 960 1 6 1 )所產生。 . 1〇· 一種核酸’其係編碼分離自融合瘤4D11(寄存編號 CCRC 960161)所產生之抗體的重鏈可變區域。 11·如申請專利範圍第10項之核酸，其係rNA或cdna。 12. —種核酸，其係編碼分離自融合瘤4 d 1 1 (寄存編號 CCRC 960161)所產生之抗體的輕鏈可變區域。 13. 如申請專利範圍第1 2項之核酸，其係RNA或cDNA。 14· 一種載體，其係包含申請專利範圍第1 〇或1 2項之核酸。 15. —種宿主細胞，其係包含申請專利範圍第1 〇或1 2項之核 酸。 16. —種抗體或其功能性片段之製造方法，其係將包含申請 專利範圍第10或12項之核酸之載體導入宿主細胞。 17. 一種針對人類CD40之抗體或其功能性片段，該抗體具 有分離自融合瘤4D11之核酸序列所編碼的重鍵可變區 域及輕鏈可變區域之成熟部分的胺基酸序列，其係分別 如序列編號4 7及4 9所示。 18. —種針對人類C D 4 0之抗體或其功能性片段，該抗體具 有由序列編號47之自第94號之C至第456號之A所表示 的核酸序列及序列編號49之自第125號之G至第442號 之A所表示的核酸序列所編碼的胺基酸序列。 19_ 一種針對人類C D 4 0之抗體或其功能性片段之製造方 法，其係將載體導入宿主細胞，該載體係包含分離自融 合瘤4D11(CCRC 960161)且編碼抗體之重鍵可變區 -2- 78148-990318.doc 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公羡) 1327574 8 8 8 8 A Be D 六、申請專利範園 域及輕鏈可變區域之核酸序列。 20. —種針對人類CD40之抗體的重鏈可變區域，其係由融 合瘤4D11(寄存編號CCRC 960161)所產生。 21. —種針對人類CD40之抗體的輕鏈可變區域，其係由融 合瘤4D11(寄存編號CCRC 960161)所產生。 22. —種針對人類CD40之抗體的重鏈可變區域之成熟部 分’其係如序列編號4 8所示。 23. —種針對人類c D 4 0之抗體的輕鏈可變區域之成熟部 分’其係如序列編號5 0所示。 78148-990318.doc 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公爱)
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