KR20070026522A - 길항제 항-ｃｄ40 모노클론 항체 및 이들의 사용 방법 - Google Patents

길항제 항-ｃｄ40 모노클론 항체 및 이들의 사용 방법 Download PDF

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Abstract

C4BP와 CD40의 결합을 통하여 매개되는 CD40-유도 활성을 억제하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 본 발명의 조성물은 항-CD40 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편을 포함하는데, 이들은 1) CD40 항원에 결합했을 때 유의한 CD40 작용제 활성이 없고; 2) 세포 표면에 발현된 CD40 항원에 특이적으로 결합할 수 있으며, CD40 항원과의 결합은 C4BP-매개 CD40 신호전달을 차단함으로써 하나 이상의 CD40-유도 활성을 억제하는 특징을 가진다. 길항제 항-CD40 항체는 암, 예를 들면 B 세포 관련 암 및 고형 종양 및 기관 및 조직 이식 거부를 포함한 자가면역 및/또는 염증 성분을 가진 질병 또는 장애를 포함한 CD40 신호전달의 C4BP 자극에 의하여 매개되는 CD40-연관 질병을 치료하는 데 효과적으로 사용될 수 있다.
항-CD40 항체, C4BP, 길항제, 신호전달.

Description

길항제 항-ＣＤ40 모노클론 항체 및 이들의 사용 방법{ANTAGONIST ANTI-CD40 MONOCLONAL ANTIBODIES AND METHODS FOR THEIR USE}
본 발명은 CD40 세포 표면 항원에 결합하여 C4BP-매개 CD40 신호전달을 차단할 수 있는 항체 및 CD40-발현 세포 상에서 CD40 신호전달의 C4BP 자극에 의하여 매개되는 질병의 치료 방법을 포함한, 항체의 사용 방법에 관한 것이다.
CD40은 사람 신경 성장 인자(NGF) 수용체, 종양 괴사 인자-α(TNF-α) 수용체 및 Fas와 관련된 세포 표면 항원이다. TNF 수용체 패밀리의 이 구성원의 발현은 B 림프구에서 처음 특성화되었지만, 최근 연구는 이것이 다수의 세포 유형에 광범위하게 발현된다는 것을 보여준다. 조혈계에서, CD40 발현 세포는 CD34+ 조혈 전구세포, B 세포 전구체, 성숙한 B 림프구(정상 및 악성 모두), 형질세포, 단핵구, 수지상 세포, 호산구, 호염기성구 및 일부 T 림프구를 포함한다. 비-조혈계 CD40 발현 세포는 내피 세포, 상피 세포 및 섬유아세포를 포함한다. 또한, CD40 발현은 류마티스 관절염에서의 윤활막, 활성화된 혈소판, 흥분된 혈관 평활근세포, 및 진피 섬유아세포에서 일어난다. 혈관 내피세포에서 낮은 수준으로 발현되고, 국부 염증 부위에서 상향-조절된다. 이것의 광범위한 발현 패턴과 관련하여, CD40은 T-세포와 B-세포 간뿐만 아니라 다른 세포 유형의 상호작용을 매개함으로써 면역 조절에 더 일반적인 역할을 하는 것으로 보인다. 예를 들면, 문헌(Kooten and Banchereau (1997) Frontiers in Biosciences 2:1-11)을 참조하라.
CD40의 리간드, CD40L 또는 CD154와 CD40 수용체의 결합에 의하여 매개되는 CD40 신호전달의 활성화의 효과는 관련된 세포 유형에 의존한다. 따라서, B 세포에서의 CD40 신호전달의 활성화는 B 세포 증식 및 분화, 항체 생산, 동형 전환, B 세포 기억 발생을 자극하는 반면, 수지상 세포 및 단핵구에서의 CD40 신호전달의 활성화는 공동자극 분자의 발현 및 T 림프구의 효율적인 활성화를 제공하는 염증성 사이토카인(예를 들면, IL-8, IL-12 및 TNF-알파)의 분비를 유도한다. 작용제 항-CD40 모노클론 항체 및 올리고머 가용성 CD40L은 CD40 신호전달 경로를 자극할 수 있다(예를 들면, 국제 공보 WO 00/75348호 및 미국 특허 제6,087,329호 참조). 이들 신호의 전반적 효과는 T 세포 시동을 현저하게 증진시키고, CD40-발현 수지상 세포가 Th1 세포 면역 반응의 발생을 돕도록 한다.
보체 캐스케이드는 생체내 선천적 면역반응에 결정적 역할을 한다. 예를 들면, 문헌(William Paul (1993) Fundamental Immunology (3rd ed., Raven Press), pp. 924-929)을 참조하라. 보체 캐스케이드 동안, 항원-결합 IgG는 박테리아 세포막을 터트리는 막 공격 복합체(MAC)를 궁극적으로 생성하는 연속적 가수분해반응을 개시한다. C4는 이 경로에서 결정적 성분이다. 혈청에서 보통 비활성인 C4는 항원-항체 복합체에 존재하는 C1에 의하여 분열될 수 있다. C1은 C4를 C4a와 C4b 단편으로 분열시킨다. C4a는 약한 아나필로톡신으로 작용하는 소 가용성 단백질이다. C4b 는 박테리아 세포막의 표면에 결합하고, 옵소닌으로서 독립적으로 작용할 수 있거나, C3b와 결합하여 고전적 보체 고정 경로의 C3 콘버타제를 형성할 수 있다. 표적 결합 C4b의 발생은 비효율적 과정이어서, C4b의 5%-10%만이 결합된 기질이 된다. 혈청 조절 단백질은 초과 C4b의 제거에 관여한다.
C4b 결합 단백질(C4BP)은 C4b와 결합하는 혈청 조절 단백질 중의 하나이다. 간 세포 및 활성화된 단핵구에 의하여 합성되며, C4b 및 C3b의 인자-I-매개 이화작용에서 보조인자이다. 예를 들면, 문헌(Dahlback and Hildebrand (1983) Biochem. J. 209:857; Lappin and Whaley (1990) Biochem. J. 271:767; Kusada-Funakoshi et al. (1991) Biochem. Med. Metab. Biol. 45:350; Blom et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:27136; Blom et al. (2001) J. Immunol. 166:6764; Blom et al. (2003) MoI. Immunol. 399:547)을 참조하라. 순환시, C4BP는 알파(70 kDa) 및 베타(45 kDa) 사슬의 상이한 조합에 기초한 세 가지 이소형태로 존재한다. 우세한 이소형태는 7 알파 소단위 및 1 베타 소단위(α7β1)의 옥타머이다(Pardo-Manuel et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4529; Kask et al. (2002) Biochemistry 41:9348). 보고에 의하면, C4BP는 또한 CD40과 결합할 수 있고, B 세포 상의 CD40과의 시험관내 결합은 CD40L 결합을 모방하는 방식으로 이들 세포를 활성화할 수 있다(Brodeur et al. (2003) Immunity 18:837). 더욱이, 이 시험관내 활성은 CD40 리간드에 대하여 결합을 경쟁적으로 억제하지 않는 분자의 영역에 CD40 단백질을 직접적으로 결합하는 C4BP의 능력과 상호관련된다. CD40 자극은 자가면역 질병의 핵심 매개자이다. C4BP는 직접적으로 CD40 신호전달을 유도할 수 있으며, 그럼으로 써 자가면역 및 염증성 질병의 개시 및 진행에 기여한다. 따라서, C4BP와 CD40 상의 C4BP 결합 부위의 결합은 비정상 또는 바람직하지 않은 신호를 CD40을 발현하는 세포에 변환할 수 있다.
CD40 맞물림 및 활성화의 차단은 항체 및 세포-매개 면역 반응을 억제하는 잠재력을 가진다. 항-CD40 길항제 항체는 자가면역 장애, 예를 들면 전신성 루프스병, 건선, 다발성 경화증, 염증성 장 질환 및 류마티스 관절염을 치료하는 데 사용될 수 있다. 또한, 이러한 항체는 자가면역 반응을 억제함으로써 기관 및 조직 이식의 거부를 방지하고, CD40에 의하여 제공된 활성화 신호의 악성 B 림프구를 빼앗음으로써 림프종을 치료하며, 독소를 특정 방식으로 CD40 보유 세포에 전달하는 데 사용될 수 있다. 항-CD40 길항제 CD40 길항제 모노클론 항체의 두 가지 유형은 CD40 활성화를 차단할 수 있다: 1) CD40 리간드-매개 CD40 신호전달을 차단하는 것들, 및 2) C4BP-매개 CD40 신호전달을 차단하는 것들.
CD40 활성화 경로에서 C4BP의 후보 기능과 관련하여, C4BP-CD40 결합 상호작용과 연관된 질병이 치료될 수 있도록 C4BP-매개 CD40 신호전달을 통한 방해의 필요성이 있다.
발명의 개요
C4BP와 CD40의 결합을 통하여 매개되는 CD40-유도 활성을 억제하기 위한 조성물 및 방법이 제공되는데, 이는 이 C4BP-CD40 결합 상호작용을 통하여 매개되는 CD40-연관 질병을 치료하기 위한 방법이다. 본 발명의 조성물은 1) CD40 발현 세포 상의 CD40 항원과 결합할 때 유의한 CD40 작용제 활성이 없고; 2) 세포의 표면상에 발현된 CD40 항원에 특이적으로 결합할 수 있으며, CD40 항원의 이 결합이 이들 세포의 C4BP-매개 CD40 신호전달을 차단함으로써 하나 이상의 CD40-유도 활성을 억제하는 특징을 가지는 항-CD40 항체 또는 이들의 항원-결합 단편을 포함한다. 이들 항-CD40 항체 또는 이들의 항원-결합 단편은 CD40 세포 표면 항원에 강한 단일-부위 결합 친화성을 나타낸다. 일부 구체예에서, 본 발명의 항체는 적어도 10-5 M, 적어도 3 X 10-5 M, 바람직하게는 적어도 10-6 M 내지 10-7 M, 더 바람직하게는 적어도 10-8 M 내지 약 10-12 M의 CD40에 대한 해리 평형 상수(KD)를 나타낸다. 적합한 모노클론 항체는 사람 불변 영역을 가지고; 바람직하게는 이들은 또한 전체적으로 또는 부분적으로 사람화된 프레임워크 영역을 가지며; 가장 바람직하게는 완전히 사람의 항체 또는 이들의 항원-결합 단편이다. 또한, 조성물은 이러한 항체 또는 이들의 항원-결합 단편을 생성하는 하이브리도마 세포주 및 이러한 항체 또는 이들의 항원-결합 단편을 포함하는 약학적 조성물을 포함한다.
CD40-발현 세포의 CD40-유도 활성을 억제하기 위한 방법은 발명의 항-CD40 항체의 유효량 또는 이들의 항원-결합 단편의 유효량으로 세포를 접촉하는 것을 포함한다. 억제될 수 있는 CD40-유도 활성은, 한정하는 것은 아니지만, 세포 성장 및 증식, 세포 분화, 항체 생산, 세포 기억 발생, 이소형태 변환, 세포내 부착, 사이토카인의 분비, 메탈로프로테아제의 분비, 및 세포 부착 분자의 발현을 포함한다. 본 발명의 항-CD40 항체는, 한정하는 것은 아니지만, B 세포 관련 암 및 고형 종양을 포함한 암 및 기관 및 조직 이식 거부를 포함한 자가면역 및/또는 염증 성분을 가진 질병 또는 장애를 포함한 CD40-유도 활성의 C4BP 자극을 통하여 매개되는 CD40-연관 질병을 치료하는 데 사용될 수 있다. 또한, CD40에 대하여 길항제 활성을 가지고, CD30-발현 세포에서 C4BP-매개 CD40 신호전달을 방해하는 항체를 확인하는 방법이 제공된다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 항-CD40 항체 및 이들의 사용을 위한 방법에 관한 것이다. 이들 항-CD40 항체 및 이들의 항원-결합 단편은 세포의 표면에 발현된 CD40 항원에 특이적으로 결합할 수 있고, CD40 항원과 결합할 때 유의한 CD40 작용제 활성이 없다. 이러한 항-CD40 항체 또는 이들의 항원 결합 단편과 CD40-발현 세포 상의 CD40 항원의 결합은 이들 세포의 C4b 결합 단백질(C4BP)-매개 CD40 신호전달을 효과적으로 차단한다. "C4BP-매개 CD40 신호전달"은 C4BP가 세포의 표면상에 발현된 CD40 항원과 결합할 때 일어나는 CD40 신호전달의 자극을 의미한다. "차단하다" 또는 "차단"은 본 발명의 항-CD40 항체와 같은 길항제의 부재시 보통 C4BP와 세포의 표면상에 발현된 CD40 상의 그것의 결합 부위의 결합을 야기하는 CD40 신호전달의 부분적 또는 완전한 억제를 의미한다. 이 CD40 신호전달의 차단은 부분적으로(즉, 활성의 감소) 또는 완전히(즉, 활성의 방지) C4BP-매개 CD40 신호전달에서 기인된 하나 이상의 CD40-유도 활성을 억제하기 위한 수단을 제공한다. 이들 CD40-유도 활성의 억제는 한정하는 것은 아니지만, B 세포 관련 암 및 고형 종양과 같은 암, 및 본원 하기에 나타낸 기관 및 조직 이식 거부를 포함한 자가면역 및/또는 염증 성분을 가진 질병 또는 장애를 포함한 CD40-연관 질병을 치료하는 데 유리하게 사용될 수 있다.
하기 용어는 본 개시 전반에 나타나고, 본원 하기에 더 정의된다.
본원에 사용된 용어 "종양"은 그것이 악성이든 양성이든 모든 신생 세포 성장과 증식 및 모든 전암 및 암 세포와 조직을 말한다.
용어 "암" 및 "암에 걸린"은 통상적으로 조절되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는 포유류의 생리적 상태를 말하거나 나타내는 것이다. 암의 예는, 한정하는 것은 아니지만, 림프종과 백혈병을 포함한다.
"항체" 및 "면역글로불린"(Ig)은 동일한 구조적 특징을 가지는 당단백질들이다. 항체는 항원에 대한 결합 특이성을 나타내는 반면, 면역글로불린은 항체 및 항원 특이성이 없는 다른 항체-유사 분자를 모두 포함한다. 면역글로불린 유형의 폴리펩티드는 예를 들면 림프계에 의하여 저 수준으로, 그리고 골수종에 의하여 증가된 수준으로 생성된다.
용어 "항체"는 넓은 의미로 사용되며, 완전히 조립된 항체, 항원과 결합할 수 있는 항체 단편(예를 들면, Fab, F(ab')2, Fv, 단일 사슬 항체, 디아체(diabody)), 및 전술한 것들을 포함하는 재조합 펩티드를 포함한다.
본원에 사용되는 용어 "모노클론 항체"는 실질적으로 동종성 항체의 집단, 즉 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외한 동일 집단을 포함하는 개별적인 항체들로부터 얻어진 항체를 말한다.
"천연 항체" 및 "천연 면역글로불린"은 대개 2개의 동일한 경쇄(L)와 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성된, 약 150,000 달톤의 헤테로테트라머인 당단백질이다. 각각의 경쇄는 하나의 이황화 공유결합에 의하여 중쇄에 연결되는 반면, 이황화 결합의 수는 상이한 면역글로불린 이소타입의 중쇄 중에서 다양하다. 각 중쇄와 경쇄는 또한 규칙적으로 공간배치된 사슬간 이황화 가교를 포함한다. 각각의 중쇄는 한 단부에 가변 도메인(VH)과 이어지는 다수의 불변 도메인을 가진다. 각각의 경쇄는 한 단부에 가변 도메인(VL)과 그것의 다른 단부에 불변 도메인을 가지며; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 첫 번째 불변 도메인과 일렬 배열되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 일렬 배열된다. 특정한 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이의 계면을 형성하는 것으로 여겨진다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분들이 항체들 간에 서열에 있어 광범위하게 상이한 것을 말하고, 그것의 특정 항원에 대하여 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용된다. 그러나 가변성은 항체의 다양한 도메인 전반에 골고루 분포되지는 않는다. 가변성은 상보성 결정 영역(CDR) 또는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두의 초가변 영역으로 불리는 세 절편으로 집약된다. 가변 도메인의 보다 더 고도로 보존된 부분들은 프레임워크(FR) 영역으로 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 크게는 β-병풍 구조 형태를 취하고, β-병풍 구조 형태를 연결하고, 어떤 경우에는 β-병풍 구조 형태의 일부를 형성하는 루프를 형성하는 세 개의 CDR에 의해 연결된 4개의 FR 영역을 포함한다. 각 사슬의 CDR은 FR 영역에 의해 매우 가까운 곳에 함께 보유되고, 다른 사슬로부터의 CDR과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다(Kabat et al. (1991) NIH Publ. No. 91-3242, Vol. I, pp 647-669 참조). 불변 도메인은 항원에 대한 항체의 결합에 직접 관련되지는 않지만, 다양한 효과기 기능, 예를 들면 Fc 수용체(FcR) 결합, 항체-의존성 세포 독성에 항체의 참여, 보체 의존성 세포독성의 개시, 및 비만 세포 탈과립화를 나타낸다.
용어 "초가변 영역"은 항원 결합에 관여하는 항체의 아미노산 잔기를 말한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역"으로부터의 잔기(즉, 경쇄 가변 도메인의 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2), 및 89-97 (L3) 및 중쇄 가변 도메인의 잔기 31-35 (H1), 50-65 (H2), 및 95-102 (H3); Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest (5th ed.; Public Health Service, National Institute of Health, 메릴랜드주 베데스다 소재) 및/또는 "초가변 루프"로부터의 잔기들(즉, 경쇄 가변 도메인의 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 및 91-96 (L3) 및 중쇄 가변 도메인의 26-32 (H1), 53-55 (H2), 및 96-101 (H3); Clothia 및 Lesk (1987), J. Mol. Biol. 196:901)을 포함한다. "프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기들이다.
"항체 단편"은 무결 항체의 일부, 바람직하게는 무결 항체의 항원-결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 실시예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아체; 선형 항체(Zapata et al., (1995) Protein Eng. 8(10):1057); 단일-사슬 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다. 항체의 파파인 소화는, 각각 단일 항원-결합 부위가 있는 "Fab" 단편으로 불리는 2개의 동일한 항원-결합 단편 및, 용이하게 결정화되는 능력을 반영하는 이름인 잔기 "Fc" 단편으로 불리는 단편을 생성한다. 펩신으로 처리하면 두 개의 항원-결합 부위를 포함하는 F(ab')2 단편이 생성되며 항원과 교차-결합할 수 있다.
"Fv"는 완전한 항원 인지 및 결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 2-사슬 Fv 종에서, 이 영역은 빈틈없는 비-공유 결합으로 연결된 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 구성된다. 단일-사슬 Fv 종에서, 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인은 가요성 펩티드 링커에 의해 공유 결합될 수 있어서, 경쇄 및 중쇄는 상기 2-사슬 Fv 종에서와 유사한 "다이머" 구조로 결합할 수 있다. 각각의 가변 도메인의 세 개의 CDR은 VH-VL 다이머의 표면에 있는 항원-결합 부위를 한정하기 위해 상호작용하는 것은 바로 이 형태로서이다. 일괄적으로, 6개의 CDR이 항체에 대한 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나 단일 가변 도메인(또는 항원에 특이적인 단지 3개의 CDR을 포함하는 Fv의 절반)일지라도 전체 결합 부위보다 낮은 친화력에서이긴 하지만 항원을 인지하고 결합할 수 있는 능력을 가지고 있다.
Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인과 중쇄의 첫 번째 불변 도메인(CH1)을 함유한다. Fab 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 몇 개의 잔기를 첨가하는 것이 Fab' 단편과는 다르다. Fab'-SH는 본원에서는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 자유 티올기를 내포하는 Fab'를 표시하는 것이다. F(ab')2 항체 단편은 원래 그것들 사이에 힌지 시스테인을 가지고 있는 Fab' 단편의 쌍으로서 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 결합도 또한 공지되어 있다.
임의의 척추동물 종의 항체(면역글로불린)의 "경쇄"는 그것들의 불변 도메인의 아미노산 서열을 토대로 하여 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리는 2개의 부류 중 하나로 지정될 수 있다.
중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 부류를 포함한다. 사람 면역글로불린에는 5개의 주요 부류가 있다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM. 사람의 경우, 하위 부류(이소타입), 예를 들면 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 한층 더 나누어질 수 있다. 면역글로불린의 상이한 부류에 해당하는 중쇄 불변 도메인은 각각 알파, 델타, 입실론, 감마, 및 뮤로 불린다. 면역글로불린의 상이한 부류의 서브유닛 구조와 3차원 형태는 잘 알려져 있다. 상이한 이소타입은 상이한 효과기 기능을 가진다. 예를 들면, 사람 IgG1 및 IgG3 이소타입은 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC) 활성을 가진다.
본원에 사용되는 단어 "표지"는 "표지된" 항체를 생성하기 위하여 항체에 직접 또는 간접적으로 콘쥬게이트된 화합물 또는 조성물을 말한다. 표지는 그 자체로서 검출될 수 있거나(예를 들면, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 또는 효소적 표지인 경우에는 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변경을 촉진할 수 있다. 검출가능한 표지로서 작용할 수 있는 방사성 핵종으로는 예를 들면 I-131, I-123, I-125, Y-90, Re-188, Re-186, At-211, Cu-67, Bi-212, 및 Pd-109가 있다. 표지는 또한 독소와 같이 검출할 수 없는 것일 수도 있다.
용어 "길항제"는 광범위한 의미로 사용되는데, 본원에 개시된 천연 표적의 생물학적 활성 또는 그것의 전사 또는 번역을 부분적으로 또는 전체적으로 차단, 억제, 또는 중화시키는 임의의 분자를 포함한다. 길항제 항체는 신호를 세포에 전달하지 않고 세포-연관 항원과 결합하는 항체이다. 신호는 증식 및/또는 생존의 유도, 아포프토시스의 유도, 다른 단백질의 인산화의 유도, 칼슘 저장소의 분비의 유도, 및 사이토카인 분비의 유도를 포함하는 세포 상태의 변화를 초래하는 임의의 생화학적 반응을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 "담체"는 사용되는 용량 및 농도에서 그것에 노출되는 세포 또는 포유류에 비독성인 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정제를 포함한다. 흔히 생리학적으로 허용되는 담체는 수성 pH 완충 용액이다. 생리적으로 허용되는 담체의 예로는 인산염, 시트르산염, 및 다른 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산을 포함한 항산화제; 저분자량(약 10 아미노산 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들면 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 폴리머, 예를 들면 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들면 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류, 및 다른 탄수화물, 이를테면 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예를 들면 EDTA; 당 알코올, 예를 들면 만니톨 또는 소르비톨; 염-형성 카운터이온, 예를 들면 나트륨; 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들면 TWEEN, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 및 플루로닉이 있다. 하나 이상의 추가의 치료제"와 조합하여" 투여한다는 것은 동시의(병행의) 및 어떤 순서로든지 연속적인 투여를 포함한다.
본원에 사용되는 "숙주 세포"는 재조합 벡터 또는 다른 전달 폴리뉴클레오티드에 대한 수용체로서 사용될 수 있거나 사용되었던 단세포 실체로서 배양된 미생물 또는 진핵세포 또는 세포주를 말하며, 트랜스팩션된 원래 세포의 자손을 포함한다. 단일 세포의 자손은 자연적인, 우연한, 또는 계획적인 돌연변이로 인해, 형태나 게놈 또는 총 DNA 보체에 있어서 원래의 모세포와 완전히 동일할 필요는 없다는 것은 이해된다.
"사람 효과기 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하고 효과기 기능을 수행하는 백혈구이다. 바람직하게는, 세포는 적어도 FcγRIII를 발현하고 항원-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC) 효과기 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 사람 백혈구의 예로는 말초혈 단핵세포(PBMC), 자연 킬러(NK) 세포, 단핵구, 대식세포, 호산구, 및 호중구가 있으며, PBMC 및 NK 세포가 바람직하다. ADCC 활성을 가지는 항체는 통상적으로 IgG1 또는 IgG3 이소타입의 항체이다. IgG1 및 IgG3 항체를 분리하는 것 외에, ADCC-매개 항체는 비-ADCC 항체로부터 가변 영역을 공학 처리하거나 IgG1 또는 IgG3 이소타입 불변 영역에 가변 영역 단편을 공학 처리함으로써 제조될 수 있다.
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 설명하기 위해 사용된다. 바람직한 FcR은 천연-서열 사람 FcR이다. 더욱이 바람직한 FcR은 IgG 항체와 결합하는 것이고(감마 수용체) FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII 하위부류의 수용체를 포함하며, 대립형질 변이체 및 대안적으로 이들 수용체의 스플라이싱된 형태를 포함한다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA("활성화 수용체") 및 FcγRIIB("억제 수용체")를 포함하는데, 이것들은 주로 그것의 세포질성 도메인이 상이한 유사한 아미노산 서열을 가진다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그것의 세포질성 도메인에 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 그것의 세포질성 도메인에 면역수용체 티로신-기반 억제 모티프(ITIM)를 함유한다(Daeron (1997) Annu. Rev. Immumol. 15:203). FcR은 문헌(Ravetch and Kinet (l991) Annu. Rev. Immunol. 9:457 (1991); Capel et al. (1994) Immunomethods 4:25; 및 de Haas et al. (1995) J. Lab. Clin. Med. 126:330)에서 검토되었다. 향후에 확인될 것들을 포함하여, 다른 FcR은 본원의 용어 "FcR"에 포함된다. 이 용어는 또한 모계의 IgG를 태아에게 전달하는 것에 관여하는 신생아 수용체, FcRn도 포함한다(Guyer et aL (1976) J. Immunol. 117:587 및 Kim et al. (1994) J. Immunol. 24:249).
사람 항체를 합성하는 방법은 많이 있다. 예를 들면, 분비 세포는 엡스타인-바르 바이러스(EBV)로 감염시킴으로써 불멸화될 수 있다. 그러나 EBV-감염된 세포는 클로닝하기 어렵고 대개 단지 상대적으로 낮은 수율의 면역글로불린을 생성한다(James and Bell(1987) J. Immunol. Methods 100:5). 결국, 사람 B 세포의 불멸화는 한정된 조합의 형질전환 유전자를 도입함으로써 달성될 수 있다. 이러한 가능성은 텔로머라제 촉매활성의 서브유닛을 SV40 큰 암단백질 및 H-ras의 발암성 대립유전자와 함께 발현시키는 것이 정상적인 사람 상피 및 섬유아세포의 종양형성의 전환을 초래한다는 최근의 증거에 의해 강조된다(Hahn et al. (1999) Nature 400:464). 면역화할 때, 트랜스제닉 동물(예를 들면, 마우스)은 내인성 면역글로불린이 생성되지 않아도 일정한 목록의 사람 항체를 생성할 수 있다(Jakobovits et al. (1993) Nature 362:255; Lonberg and Huszar (1995) Int. Rev. Immunol. 13:65; Fishwild et al. (1996) Nat. Biotechnol. 14:845; Mendez et al. (1997) Nat. Genet. 15:146; Green (1999) J. Immunol. Methods 231:11; Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727; Little et al. (2000) Immunol. Today 21:364). 예를 들면, 키메라 및 생식계열 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 결합 영역(JH) 유전자의 동형접합 결실은 내인성 항체 생성을 완전히 억제하는 결과를 초래한다고 설명되었다(Jakobovits et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551). 그런 생식계열 돌연변이 마우스에서 사람 생식계열 면역글로불린 유전자 배열의 전달은 항원 도전시 사람 항체를 생성하는 결과를 초래할 수 있다(Jakobovits et al. (1993) Nature 362:255). Mendez et al.(Nature Genetics 15:146)은 항원으로 도전받을 때 고친화력의 완전히 사람의 항체를 생성하는 트랜스제닉 마우스의 라인을 제조하였다. 이것은 메가 염기의 사람 중쇄 및 경쇄 유전자좌를 전술한 바와 같이 내인성 JH 절편에 결실이 있는 마우스에 생식계열 통합시킴으로써 달성되었다. 이들 마우스(XenoMouse® II 기법 (Abgenix; 캘리포니아주 프리몬트 소재))는 대략 66 VH 유전자, 완전한 DH 및 JH 영역, 및 3개의 상이한 불변 영역을 함유하는 1,020 kb의 사람 중쇄 유전자좌를 내포하며, 또한 32 Vκ 유전자, Jκ 절편, 및 Cκ 유전자를 함유하는 800 kb의 사람 κ 유전자좌를 내포하고 있다. 이들 마우스에서 생성된 항체는 모든 측면, 이를테면 유전자 재배열, 어셈블리, 및 일정한 목록에 이르기까지 사람에게서 볼 수 있는 것과 매우 닮아있다. 사람 항체는 쥐과 유전자좌에서 유전자 재배열을 방지하는 내인성 절편의 결실 때문에 내인성 항체보다 우선적으로 발현된다. 이러한 마우스는 특정 관심대상의 항원으로 면역화될 수 있다.
그렇게 면역화된 동물의 혈청은 관심대상의 항원에 대한 항체 반응성에 대하여 스크린될 수 있다. 림프구는 림프절 또는 비장 세포로부터 분리될 수 있으며, 나아가서는 CD138-음성 및 CD19-양성 세포에 대하여 선택함으로써 B 세포에 대해 선택될 수 있다. 한 양태에서, 이러한 B 세포 배양물(BCC)은 골수종 세포와 융합되어 전술한 바와 같은 하이브리도마를 생성할 수 있다.
다른 양태에서, 이러한 B 세포 배양물은 바람직하게는 추가로 초기 항원에 대한 반응성에 대하여 스크린될 수 있다. 이러한 스크리닝에는 표적/항원 단백질을 이용하는 ELISA, 관심대상의 항원과 결합하는 공지의 항체를 이용하는 경쟁 분석, 및 표적 항원을 발현하는 일시적으로 트랜스팩션된 CHO 또는 다른 세포에 대한 시험관내 결합이 있다.
본 발명의 항-CD40 항체 및 이들의 사용 방법은 하기에 더 상세하게 설명된다.
길항제 항- CD40 항체
바람직하게는, 본 발명의 항-CD 항체 및 이들의 항원-결합 단편은 CD40에 대하여 길항제 활성을 가지고, 따라서 본원에서는 "길항제" 항-CD40 항체로 불린다. 더 구체적으로, 본 발명의 길항제 항-CD40 항체는 CD40-발현 세포의 표면상의 CD40 항원에 특이적으로 결합하며, 이 결합은 C4BP-매개 CD40 신호전달을 차단한다. 이 신호전달 과정의 차단은 C4BP와 같은 작용제가 CD40 세포 표면 항원과 결합할 때 개시되는 하나 이상의 CD40-유도 활성의 억제를 초래한다.
"CD40 항원", "CD40 세포 표면 항원", "CD40 수용체", 또는 "CD40"은 종양 괴사 인자(TNF) 수용체 패밀리에 속하는 경막 당단백질을 의미한다(예들 들면, 미국 특허 제5,674,492호 및 제4,708,871호; Stamenkovic et al. (1989) EMBO 8:1403; Clark (1990) Tissue Antigens 36:33; Barclay et al. (1997) The Leucocyte Antigen Facts Book (2d ed.; Academic Press, San Diego) 참조). 이 유전자의 상이하게 스플랑이싱된 전사물 변이체에 의하여 코딩된 사람 CD40의 두 가지 이소형태가 확인되었다. 첫 번째 이소형태(또는 "긴 이소형태" 또는 "이소형태 1"로 알려짐)는 277-아미노산 전구체 폴리펩티드(처음에 GenBank Accession No. CAA43045로서 보고되고, GenBank Accession No. NP_001241에서 이소형태 1로서 확인됨; GenBank Accession No. X60592 및 NM_001250에 의하여 코딩됨)로서 발현되며, 처음 19 잔기로 표시된 신호서열을 가진다. 두 번째 이소형태(또는 "짧은 이소형태" 또는 "이소형태 2"로 알려짐)는 203-아미노산 전구체 폴리펩티드(GenBank Accession No. NP_690593; GenBank Accession No. NM_152854로 코딩됨)로서 발현되며, 또한 처음 19 잔기로 표시되는 신호 서열을 가진다. 사람 CD40의 이들 두 이소형태의 전구체 폴리펩티드는 공통적으로 이들의 처음 165 잔기를 공유한다. 짧은 이소형태의 전구체 폴리펩티드는 번역 틀 이동을 유도하는 코딩 절편이 없는 전사물 변이체에 의해 코딩되며, 그 결과의 CD40 이소형태는 더 짧고 분명한 C-말단(GenBank Accession No. NP_690593의 잔기 166-203)을 함유하며, 그것으로부터 CD40의 긴 이소형태에 함유되었다(GenBank Accession No. CAA43045 및 GenBank Accession No. NP_001241의 잔기 166-277에 나타낸 C-말단). 본 발명의 목적을 위하여, 용어 "CD40 항원", "CD40 세포 표면 항원", "CD40 수용체", 또는 "CD40"은 CD40의 길고 짧은 이소형태 둘 다를 포함한다.
CD40 수용체는 본원의 다른 곳에서 설명한 바와 같이, 다양한 세포 유형의 표면 상에 나타난다. "표면에 나타난" 및 "표면에 발현된"이란 용어는 CD40 항원의 전부 또는 일부가 세포의 외부에 노출되는 것을 의미한다. 나타나거나 발현된 CD40 항원은 전체적으로 또는 부분적으로 글리코실화될 수 있다.
"C4b 결합 단백질" 또는 "C4BP"는 적어도 알파 서브유닛의 부분을 포함하는 가용성 펩티드 또는 그것의 임의의 단편(GenBank Accession No. NM__000715으로 코딩되는 GenBank Accession No. NP_000706; Kask et al. (2002) Biochemistry 41:9349) 또는 베타 서브유닛의 부분(GenBank Accession No. NM_000716으로 코딩되는 GenBank Accession No. NP_000707; Webb et al. (2003) Eur. J. Biochem. 270:93)을 의미한다. 본원에 사용되는 용어 "C4BP"는 개별적인 알파 또는 베타 서브유닛 또는 이들 서브유닛, 예를 들면 세 개의 혈청 이소형태 α7β1(혈청에서 우세한 이소형태), α7β0, 및 α6β1을 포함하는 더 큰 헤테로다이머를 포함할 수 있다. "CD40 상의 C4BP 결합 부위"는 임의의 C4BP 서브유닛의 임의의 부분이 결합하는 CD40 항원의 영역을 의미한다. 예를 들면, 그 전체로서 본원에 참고 인용되는 문헌(Brodeur et al. (2003) Immunity 18:837)을 참조하라. 결합 부위는 CD40 상의 선형 결정소를 포함할 수 있거나, 2차 또는 3차 입체형태 또는 이들의 조합을 통하여 C4BP 결합 부위를 형성하는 불연속적인 아미노산에 의하여 형성된 결합 도메인을 포함할 수 있다. 일부 예에서, C4BP 결합 부위는 C4BP 알파 서브유닛과 배타적으로 상호작용한다.
C4BP가 CD40-발현 세포 상의 CD40 항원과 결합할 때, 이것은 CD40 신호전달의 작용제로 작용하고, 따라서 CD40 작용제 활성을 가진다. "작용제 활성"은 물질이 작용제로 작용하는 것을 의미한다. 작용제는 세포 상의 수용체와 결합하고, CD40의 경우에 수용체의 천연 리간드, 예를 들면 CD40L에 의하여 개시된 것과 유사하거나 동일한 반응 또는 활성을 개시한다. CD40의 작용제, 예를 들면 C4BP는, 한정하는 것은 아니지만, CD40이 신호를 전달할 때 일어나는 하기 활성 중 어떤 것 또는 전부를 유도한다: 항원 제시 세포(APC)의 증식 및 분화; B 세포 항체 생성; 세포간 부착; B 세포 기억 발생; B 세포 이소형태 전환(특히, IL-4의 존재시 IgE 이소형태 전환); APC에서 MHC 부류 II, CD54, CD95 및 CD80/86의 세포 표면 발현의 상향조절; bcl-xL, A20, 디아실글리세롤 키나제 α, p38 및 c-myc 유전자 발현의 상향조절; NFκB의 핵 전위; 사이토카인, 예를 들면 IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12 및 TNFα의 분비; 메탈로프로테아제, 예를 들면 MMP-I/콜라게나제 및 MMP-9/젤라티나제 B의 분비; 및 세포 부착 분자, 예를 들면 E-셀렉틴, VCAM-1, 및 ICAM-1의 발현. 본 발명의 목적을 위해서, 이러한 활성을 "CD40-유도 활성"이라고 말하고, C4BP가 CD40 상의 그것의 결합 부위에 결합함으로써 이러한 활성을 유도하는 것을 "C4BP-매개 CD40 신호전달"이라고 말한다.
본 발명의 항-CD40 항체 및 이들의 항원-결합 단편은 이들의 CD40과의 결합 상호작용에 관한 길항제 활성을 가진다. 이 길항제 활성은 이들 항체가 CD40에 결합할 때 C4BP-매개 CD40 신호전달을 차단하거나 CD40을 통하여 음성 신호를 보내는 항-CD40 항체 능력으로부터 기인한다. "길항제 활성"은 물질이 길항제로서 기능하는 것을 의미한다. 본 발명의 길항제 항-CD40 항체는 CD40 수용체가 작용제 리간드, 특히 C4BP에 결합함으로써 유도되는 어떤 하나 이상의 CD40-유도 활성의 유도를 예방하거나 감소시킨다. 본 발명의 길항제 항-CD40 항체는 C4BP가 CD40에 결합함으로써 유도되는 어떤 하나 이상의 CD40-유도 활성의 유도를 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 바람직하게는 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 더 바람직하게는 70%, 80%, 85%, 및 가장 바람직하게는 90%, 95%, 99%, 또는 100% 감소시킬 수 있다. 항-CD40 항체 및 CD40-리간드 결합 특이성 및 길항제 활성을 측정하는 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 한정하는 것은 아니지만, 표준 경쟁 결합 분석, T 세포 증식의 수지상 세포 유도를 위한 분석, B 세포에 의한 면역글로불린 분비의 모니터링 분석, B 세포 증식 분석, 반크로우(Banchereau)-유사-B 세포 증식 분석, 항체 생성에 대한 T 세포 헬퍼 분석, B 세포 증식 분석의 공동-자극, 및 APC 활성화 마커의 상향조절을 위한 분석을 포함한다. 예를 들면, 본원에 참고 인용된 문헌(Brodeur et al. (2003) Immunity 18:837, WO 00/75348호 및 미국 특허 제6,087,329호)에 개시된 이러한 분석들을 참조하라. 일부 구체예에서, 사람 세포의 표면상에 디스플레이된 CD40과의 결합은 C4BP-매개 CD40 신호전달을 차단하고, 이들 사람 세포의 증식 및 분화의 억제를 초래한다. 따라서, 본 발명의 길항제 항-CD40 항체는 세포 표면 CD40 항원을 발현하는 정상 및 신생 사람 세포에 대하여 길항제 활성을 나타낼 수 있는 항체들을 포함한다.
본 발명의 항-CD40 항체의 길항제 활성은 C4BP-매개 CD40 신호전달의 차단을 통하여 예를 들면 C4BP이 CD40 상의 그것의 결합 부위에 결합하는 것을 경쟁적 또는 입체적 방해함으로써 명백해진다. "경쟁적으로 억제한다"는 것은 항-CD40 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편이 천연 가용성 C4BP인 CD40 상의 동일한 C4BP 결합 부위 또는 적어도 이들의 부분과 결합함으로써, C4BP가 CD40 상의 그것의 결합 부위에 결합하는 것을 억제한다는 것을 의미한다. "입체적으로 억제한다" 또는 "입체적 억제"는 항-CD40 항체 또는 이들의 항원-결합 단편이 CD40 상의 C4BP 결합 부위의외부, 또는 적어도 부분적으로 외부에 결합하는 것을 의미하고, 항체는 CD40 상의 C4BP 결합 부위의 구조를 입체적 방해 또는 붕괴 또는 이들의 일부 조합에 의하여 C4BP 또는 이들의 단편이 CD40에 결합하는 것을 여전히 방해한다. 일부 구체예에서, 길항제 항-CD40 항체 또는 이들의 항원-결합 단편이 CD40 항원에 결합하는 것은 C4BP가 CD40 항원에 결합할 때 CD40 신호 전달을 방해한다. 당업자는 당업계에 잘 공지된 표준 방법을 사용하여, 항체가 C4BP가 CD40에 결합하는 것을 경쟁적으로 또는 입체적으로 방해하는지, 또는 C4BP가 CD40 상의 그것의 결합 부위에 결합함으로써 CD40 신호 전달을 억제하는지를 결정할 수 있다.
본 발명의 길항제 항-CD40 항체가 CD40-발현 세포, 예를 들면 정상 및 신생 사람 B 세포 및 사람 수지상 세포의 표면에 디스플레이된 CD40과 결합할 때, 항체는 CD40에 결합할 때 유의한 작용제 활성이 없다. "유의한" 작용제 활성은 CD40-발현 세포의 반응의 작용제 활성보다 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100 % 더 큰 작용제 활성을 의미한다. 바람직하게는, "유의한" 작용제 활성은 B 세포 반응의 분석에서 측정된 중성 물질 또는 음성 대조군에 의해 유도된 작용제 활성보다 적어도 2배 또는 적어도 3배 더 큰 작용제 활성을 의미한다. 따라서, 예를 들면 관심대상의 B 세포 반응이 B 세포 증식이라면, "유의한" 작용제 활성은 중성 물질 또는 음성 대조군에 의해 유도된 B 세포 증식 수준보다 적어도 2배 더 크거나 적어도 3배 더 큰 B 세포 증식 수준의 유도일 것이다. 한 구체예에서, 비-특이적 면역글로불린, 예를 들면 CD40에 결합하지 않는 IgG1은 음성 대조군으로서 작용한다. "유의한 작용제 활성이 없는" 물질은 중성 물질 또는 음성 대조군에 의해 유도된 작용제 활성보다 약 25% 이하, 바람직하게는 중성 물질 또는 음성 대조군에 의해 유도된 작용제 활성보다 약 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 1% 이하, 0.5% 이하, 심지어는 약 0.1% 이하의 작용제 활성을 나타낼 것이다. 본 발명의 목적을 위해서, 본 발명의 항-CD40 항체의 작용제 활성은 B 세포 반응의 분석에서 측정된다. 이러한 방법들은 당업계에 공지되어 있으며, 한정하는 것은 아니지만, B 세포에 의한 면역글로불린 분비의 모니터링 분석, B 세포 증식 분석, 반크로우-유사-B 세포 증식 분석, B 세포 증식 분석의 공동-자극을 포함한다. 예를 들면, 본원에 참고 인용된 문헌(Brodeur et al. (2003) Immunity 18:837, WO 00/75348호 및 미국 특허 제6,087,329호)에 개시된 이러한 분석들을 참조하라. 본 발명의 한 구체예에서, 길항제 항-CD40 항체는 한 B 세포 반응에서 유의한 작용제 활성이 없다. 본 발명의 다른 구체예에서, 길항제 항-CD40 항체는 하나 이상의 B 세포 반응(예를 들면, 증식 및 분화, 또는 증식, 분화 및 항체 생성)에서 유의한 작용제 활성이 없다.
일부 구체예에서, 본 발명의 길항제 항-CD40 항체는 하이브리도마 세포주에서 생성된 IgG1 이소형태의 완전한 사람 항-CD 모노클론 항체이다. 이들 세포주는 미국 특허 제6,075,181호 및 PCT 국제공보 WO 94/02602호에 설명된 XenoMouse® 기술(Abgenix; 캘리포니아주 프리몬트 소재)을 사용하여 얻어진 마우스를 포함한, 면역화된 마우스의 비장림프구를 사용하여 제조되었다. 비장 세포는 마우스 골수종 SP2/0 세포와 융합된다(Sierra BioSource). 최종 하이브리도마를 수 회 서브클로닝하여 모노클론 세포주를 제조한다. 본 발명의 다른 항체는 유사하게 사람 면역글로불린 유전자좌에 대한 트랜스제닉 마우스를 사용하거나 당업계에 공지되고/되거나 본원에 설명된 다른 방법에 의하여 제조될 수 있다. 본 발명의 사람 항-CD40 모노클론 항체는 이들이 또한 사람 항-CD40 항체가 인식하는 에피토프를 가진 비-사람 서열에도 특이적으로 결합할 수 있다 하더라도, CD40, 예를 들면 사람 CD40에 특이적으로 결합한다.
대안적 구체예에서, CD40에 대한 쥐과 항체는 예를 들면 미국 특허 제5,766,886호 또는 미국 특허 제6,180,370호에 설명된 방법을 사용하여, 사람화될 수 있다. 또한, 사람 항체의 파지 디스플레이 라이브러리를 C4BP에 대하여 스크리닝하여 본원에 설명된 결합 특징을 가진 항-CD40 항체를 확인할 수 있다.
길항제 활성뿐만 아니라, 본 발명의 일부 항-CD40 항체는 작용의 다른 메커니즘을 가지는데, 예를 들면 항체는 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC)을 가진다. 대안적으로, 항-CD40 항체의 가변 영역은 ADCC 활성을 가진 다른 항체 이소타입 상에서 발현될 수 있다. 또한, 세포독성 독소에 대한 항-CD40 항체의 천연 형태, 재조합 형태, 또는 항원-결합 단편을 콘쥬게이션하는 것이 가능하다. 이러한 길항제 항-CD40 항체는 예를 들면 CD40-발현 신생 세포, 예를 들면 악성 B 세포 또는 고형 종양의 CD40-발현 신생 세포를 표적화하는 데 유용하다.
일부 구체예에서, 본 발명의 길항제 항-CD40 항체 또는 이들의 항원-결합 단편은 ELISA-타입 분석에서 가용성 CD40과 결합하고; 다른 구체예에서, 항체 또는 이들의 항원 결합 단편은 C4BP가 세포 표면 CD40에 결합하는 것을 억제하고, 그럼으로써 유체 세포측정 분석에 의해서 결정된 바와 같이 사전 결합된 C4BP를 대체한다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 적합한 길항제 항-CD40 항체 또는 이들의 항원-결합 단편은 CD40 세포-표면 항원에 대한 강한 단일-부위 결합 친화력을 나타낸다. 일부 구체예에서, 본 발명의 항체는 BiacoreTM와 같은 표준 분석을 사용하여 측정된, 적어도 10-5 M, 적어도 3 X 10-5 M, 바람직하게는 적어도 10-6 M 내지 10-7 M, 더 바람직하게는 적어도 10-8 M 내지 약 10-12 M의 CD40에 대한 해리 평형상수를 나타낸다. Biacore 분석은 당업계에 공지되어 있고, 상세한 내용은 BIAapplications Handbook에 제공된다. WO 01/27160호에 설명된 방법은 결합 친화력을 조절하는 데 사용될 수 있다.
길항제 항- CD40 항체의 제조
본 발명의 길항제 항-CD40 항체는 폴리클론 항체, 모노클론 항체, 단쇄 항체, 및 Fab, F(ab')2, Fv와 같은 이들의 단편, 및 모 항-CD40 항체의 항원 결합 기능을 보유하는 다른 단편을 포함한, CD40 세포 표면 항원을 특이적으로 인식하는 항체를 포함한다. 본 발명의 방법의 특별한 관심대상은 C4BP-매개 CD40 세포 신호를 차단하고, CD40과 결합할 때 유의한 작용제 활성이 없는 항-CD40 항체이다. 이들 항체는 당업자에게 공지된 임의의 항체 제조 방법을 사용하여 제조될 수 있고, C4BP-매개 CD40 신호전달을 차단하고, 재조합으로 생성되는 길항제 항-CD40 항체 및 이들의 항원-결합 단편을 포함한다.
폴리클론 혈청은 종래의 방법에 의하여 제조할 수 있다. 대체로, CD40 항원을 함유한 용액은 적합한 동물, 바람직하게는 마우스, 래트, 토끼 또는 염소를 면역화하는 데 최초로 사용된다. 얻을 수 있는 혈청의 양 및 표지된 항-토끼 및 항-염소 항체의 활용성 때문에 폴리클론 혈청의 제조를 위해서는 토끼나 염소가 바람직하다.
폴리클론 혈청은 트랜스제닉 동물, 바람직하게는 사람 면역글로불린 유전자좌를 보유하는 마우스에서 제조될 수 있다. 바람직한 구체예에서, CD40을 발현하는 Sf9 세포가 면역원으로서 사용된다. 면역화는 또한 식염수 중의, 바람직하게는 프로인트(Freund) 완전 보조제와 같은 보조제 중의 항원-함유 용액을 혼합 또는 유화한 후, 그 혼합물 또는 에멀션을 비경구로(일반적으로는, 피하 또는 근육내로) 주사함으로써 수행될 수 있다. 통상적으로 50 내지 200 ㎍/1회 주사의 용량이면 충분하다. 면역화는 보통 2 내지 6주 후에 1회 또는 그 이상의 식염수 중의 단백질의 주사로 추가면역되며, 바람직하게는 프로인트 불완전 보조제를 사용한다. 대안적으로, 당업계에 공지되어 있는 방법을 사용하여 시험관내 면역화함으로써 항체를 생성할 수도 있으며, 이것은 본 발명의 목적을 위해서 생체내 면역화와 동등한 것으로 여겨진다.
폴리클론 항혈청은 면역화된 동물을 유리 또는 플라스틱 용기 내로 출혈시키고, 그 혈액을 25℃에서 한 시간 동안 인큐베이션한 후 4 ℃에서 2 내지 18시간 동안 인큐베이션함으로써 얻어진다. 혈청은 원심분리(예를 들면, 1,000 x g, 10분)에 의해 회수된다. 1회 출혈 당 약 20 내지 50 ml이 토끼로부터 얻어질 수 있다.
Sf9(Spodoptera frugiperda)의 제조는 본원에 참고 인용되는 미국 특허 제6,004,552호에 개시되어 있다. 간단히 설명하면, 사람 CD40을 코딩하는 서열은 전달 벡터를 사용하여 배큘로바이러스 내에 재조합되었다. 플라스미드는 Sf9 세포 안에 야생형 배큘로바이러스 DNA와 함께 공동-트랜스팩션된다. 재조합 배큘로바이러스 감염 Sf9 세포는 확인되고, 클론 정제된다.
바람직하게는, 항체는 성질상 모노클론이다. "모노클론 항체"는 실질적으로 동종성인 항체 집단으로부터 얻어진 항체, 즉 집단을 포함하는 개별적인 항체가 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다는 것을 의미한다. 이 용어는 종 또는 항체의 기원에 관하여 제한되지 않는다. 이 용어는 Fab, F(ab')2, Fv, 및 항체의 항원 결합 기능을 보유하고 있는 다른 것과 같은 단편뿐만 아니라 전체 면역글로불린도 포함한다. 모노클론 항체는 고도로 특이적이며, 단일 항원 부위, 즉 본 발명에서는 CD40 세포 표면 항원에 대하여 특정되어 있다. 나아가, 전형적으로 상이한 결정소(에피토프)에 대해 특정된 상이한 항체를 포함하는 종래의 (폴리클론) 항체 제제와는 대조적으로, 각 모노클론 항체는 항원 상의 단일 결정소에 대해서 특정된다. 변형제 "모노클론"은 실질적으로 동종성 항체 집단으로부터 얻어진 상태의 항체의 특성을 나타내는 것으로, 어떤 특별한 방법에 의한 항체의 제조를 필요로 하는 것으로 간주되지는 않는다. 예를 들면, 본 발명에 따라서 사용되는 모노클론 항체는 문헌(Kohler et al (1975) Nature 256:495)에 의해 최초로 설명된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있고, 또는 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다(예를 들면, 미국 특허 제4,816,567호). 또한, "모노클론 항체"는 예를 들면 문헌(Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222:581-597; 및 미국 특허 제5,514,548호)에 설명된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 분리될 수 있다 .
"에피토프"는 그것에 대해 항체가 제조되고 그것에 항체가 결합하게 될 항원성 분자의 일부를 의미한다. 에피토프는 선형 아미노산 잔기(즉, 에피토프 내의 잔기들은 선형 방식으로 순차적으로 하나 뒤에 하나가 배열된다), 비선형 아미노산 잔기(본원에서는 "비선형 에피토프"로 언급됨, 이들 에피토프는 순차적으로 배열되지 않는다), 또는 선형과 비선형 아미노산 잔기를 둘 다 포함할 수 있다.
모노클론 항체는 문헌(Kohler et al (1975) Nature 256:495-496)의 방법을 사용하여, 또는 그것의 변형방법을 사용하여 제조될 수 있다. 통상적으로, 마우스는 항원을 함유하고 있는 용액으로 면역화된다. 면역화는 식염수, 바람직하게는 프로인트 완전 보조제와 같은 보조제 중의 항원-함유 용액을 혼합 또는 유화시키고, 그 혼합물 또는 에멀션을 비경구로 주사함으로써 수행될 수 있다. 당업계에 공지되어 있는 어떤 면역화 방법이든지 본 발명의 모노클론 항체를 얻기 위해 사용될 수 있다. 동물의 면역화 후, 비장 (및 선택적으로, 일부 큰 림프절)이 제거되고 단일 세포로 분리된다. 비장 세포는 세포 현탁액을 관심대상의 항원으로 코팅된 플레이트 또는 웰에 적용함으로써 스크린될 수 있다. 항원에 특이적인 막 결합 면역글로불린을 발현하는 B 세포는 플레이트에 결합하고 세정으로 제거되지 않는다. 그 다음, 그 결과의 B 세포, 또는 분리된 모든 비장 세포는 골수종 세포와 융합되어 하이브리도마를 형성하도록 유도되고, 선택 배지 중에서 배양된다. 그 결과의 세포는 여러 배의 희석률로 플레이팅되고, 관심대상의 항원에 특이적으로 결합하는 (그리고 관련되지 않은 항원에는 결합하지 않는) 항체의 제조에 대하여 분석된다. 그 다음, 선택된 모노클론 항체(mAb)-분비 하이브리도마는 시험관내에서(예를 들면, 조직 배양 병에서 또는 중공 섬유 반응기에서) 또는 생체내에서(마우스에서 복수로서) 배양된다.
본 발명의 길항제 항-CD40 항체가 재조합 DNA 방법을 사용하여 제조되는 경우(즉, 재조합으로 생성된 길항제 항-CD40 항체), 모노클론 항체를 코딩하는 DNA는 종래 과정을 사용하여(예를 들면, 쥐과 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 분리되고 시퀀싱된다. 본원에 설명된 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로서 작용한다. DNA는 일단 분리되면 발현 벡터 안에 놓이게 되고, 그런 다음 대장균 세포, 유인원 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 그렇지 않으면 면역글로불린 단백질을 생성하지 못하는 골수종 세포와 같은 숙주 세포 안에 트랜스팩션되어 재조합 숙주 세포에서 모노클론 항체의 합성이 이루어진다. 항체를 코딩하는 DNA의 박테리아에서의 재조합 발현에 대한 개관 논문은 문헌(Skerra et al. (1993) Curr. Opinion in Immunol. 5:256 및 Phickthun (1992) Immunol. Revs. 130:151)을 참조하라.
대안적으로, 항체는 미국 특허 제5,545,403호, 제5,545,405호, 및 제5,998,144호에서 개시되어 있는 바와 같이, CHO 세포주와 같은 세포주에서 제조될 수 있다. 간단히 설명하면, 세포주는 각각 경쇄와 중쇄를 발현할 수 있는 벡터로 트랜스팩션된다. 별개의 벡터 상에 2개의 단백질을 트랜스팩션함으로써, 키메라 항체가 제조될 수 있다. 다른 이점은 항체의 정확한 글리코실화이다. 다른 구체예에서, 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 CHO 세포에서 GS 유전자 발현 시스템(Lonza Biologics, 햄프셔주 포츠머스 소재)을 사용하여 제조되는데, 상기 시스템은 마커로서 글루타민 합성효소를 사용한다. 또한, 본원에 그 내용이 전체로서 참고 인용되는 미국 특허 제5,122,464호; 제5,591,639호; 제5,658,759호; 제5,770,359호; 제5,827,739호; 제5,879,936호; 제5,891,693호; 및 제5,981,216호를 참조하라.
CD40에 대한 모노클론 항체는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 이들 모두가 본원에 참고 인용되는 문헌(McMichael, ed. (1987; 1989) Leukocyte Typing III and IV (Oxford University Press, New York))에서 B-세포 항원에 대한 단원; 미국 특허 제5,674,492호; 제5,874,082호; 제5,677,165호; 제6,056,959호; WO 00/63395호; 국제공보 WO 02/28905호 및 WO 02/28904호; 특허출원공보 US 2002/0142358 A1 및 2003/0059427호; 2003년 11월 4일, 2003년 11월 26일 및 2004년 4월 27일 출원되어, 각각 미국 특허출원 제60/517,337호(Attorney Docket No. PP20107.001 (035784/258442)), 제60/525,579호(Attorney Docket No. PP20107.002 (035784/271525)) 및 제60/565,710호(Attorney Docket No. PP20107.003 (035784/277214))를 부여받은, "Antagonist Anti-CD40 Monoclonal Antibodies and Methods for Their Use" 명칭의 가출원 및 2004년 11월 4일에 출원되어, 역시 "Antagonist Anti-CD40 Monoclonal Antibodies and Methods for Their Use" 명칭의 특허출원 PCT/US2004/037152호(Attorney Docket No. PP20107.004 (035784/282916))에 개시된 길항제 항-CD40 항체; Gordon et al. (1988) J. Immunol. 140:1425; Valle et al. (1989) Eur. J. Immunol. 19:1463; Clark et al. (1986) PNAS 83:4494; Paulie et al. (1989) J. Immunol. 142:590; Gordon et al. (1987) Eur. J. Immunol. 17:1535; Jabara et al. (1990) J. Exp. Med. 172:1861; Zhang et al. (1991) J. Immunol. 146:1836; Gascan et al. (1991) J Immunol. 147:8; Banchereau et al. (1991) Clin. Immunol. Spectrum 3:8; 및 Banchereau et al. (1991) Science 251:70))을 참조하라. 본 발명의 특별한 관심대상은 CD40 상의 C4BP 결합 부위에 또는 가까이에 결합함으로써, CD40-매개 CD40 신호전달을 차단하는, 본원에 개시된 길항제 항-CD40 항체인데, 이는 C4BP가 C4BP 상의 그것의 결합 부위에 결합하는 것을 경쟁적으로 또는 입체적으로 억제하는 길항제 항-CD40 항체의 능력 또는 C4BP가 CD40 상의 그것의 결합 부위에 결합함으로써 CD40 신호전달을 방해하는 능력의 결과일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "CD40-항원 에피토프"는 본 발명의 항-CD40 모노클론 항체와 면역반응할 수 있는 분자를 말하며, CD40 항원 자체는 배제한다. CD40-항원 에피토프는 단백질, 단백질 단편, 펩티드, 탄수화물, 지질, 및 다른 분자들을 포함할 수 있지만, 본 발명의 목적에 위해서 가장 통상적인 것은 단백질, 짧은 올리고펩티드, 올리고펩티드 모방물(즉, CD40 항원의 항체 결합 성질을 모방하는 유기 화합물), 또는 이들의 조합이다. 적합한 올리고펩티드 모방물은 문헌에 소개되어 있으며, 그중에서도 PCT 출원 US 91/04282호에 설명되어 있다.
또한, 본 발명의 길항제 항-CD40 항체는 키메라 항-CD40 항체 및 사람화 항-CD40 항체를 포함하며; 본 발명의 이 키메라 항-CD40 항체 및 사람화 항-CD 항체는 CD40 상의 C4BP 결합 부위에 또는 가까이에 결합함으로써, C4BP-매개 CD40 신호전달을 차단한다. "키메라" 항체는 가장 바람직하게는 재조합 디옥시리보핵산 기술을 사용하여 유래된 것으로 사람(면역학적으로 "관련된" 종, 예를 들면 침팬지를 포함)과 비-사람 성분을 둘 다 포함하는 항체를 의미한다. 그러므로 키메라 항체의 불변 영역은 가장 바람직하게는 실질적으로 천연 사람 항체의 불변 영역과 동일하고; 키메라 항체의 가변 영역은 가장 바람직하게는 비-사람 공급원으로부터 유도되며 CD40 세포 표면 항원에 대하여 원하는 항원적 특이성을 갖는다. 비-사람 공급원은 사람 CD40 세포 표면 항원에 대한 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있는 모든 척추동물 공급원 또는 사람 CD40 세포 표면 항원을 포함하는 물질일 수 있다. 이러한 비-사람 공급원으로는, 한정하는 것은 아니지만, 설치류(예를 들면, 토끼, 쥐, 마우스 등; 예를 들면, 본원에 참고 인용된 미국 특허 제4,816,567호 참조) 및 비-사람 영장류(예를 들면, 구세계 원숭이, 원숭이 등; 예를 들면, 본원에 참고 인용된 미국 특허 제5,750,105호 및 제5,756,096호 참조)가 있다. Rituxan®은 쥐과 가변 영역 및 사람 불변 영역을 가진 키메라 항체의 예이다. 본원에 사용되는 바와 같이, 키메라 항-CD40 항체와 관련하여 사용되는 경우, 구절 "면역학적으로 활성"이라는 말은 CD40, 특히 사람 CD40에 결합하는 키메라 항체를 의미한다.
"사람화된"은 비-사람 면역글로불린 서열로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 항-CD40 항체의 형태를 의미한다. 대부분의 경우에, 사람화된 항체는 사람 면역글로불린(수용자의 항체)인데, 그 항체에서 수용자의 초가변 영역(또한 상보성 결정 영역 또는 CDR로 알려짐)의 잔기는 원하는 특이성, 친화력 및 수용력을 가지고 있는 비-사람 종(공여자 항체), 예를 들면 마우스, 쥐, 토끼, 또는 비사람 영장류의 초가변 영역의 잔기로 대체된다. "상보성 결정 영역"이라는 것은 천연 면역글로불린 결합 부위의 천연 Fv 영역의 결합 친화력과 특이성을 함께 결정하는 아미노산 서열을 말한다. 예를 들면 문헌(Chothia et al (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Kabat et al (1991) U.S. Dept. of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). "불변 영역"은 효과기 기능을 부여하는 항체 분자의 부분을 말한다. 사람 질병의 치료에 사용하기 위한 비-면역원성 항체의 제조를 중점적으로 연구한 이전의 작업에서, 마우스 불변 영역은 사람 불변 영역에 의해 치환되었다. 대상이 되는 사람화된 항체의 불변 영역은 사람 면역글로불린으로부터 유래되었다. 그러나, 이들 사람화된 항체는 여전히 사람에게서 바람직하지 못하고 잠재적으로는 위험한 면역 반응을 유도했으며, 친화력의 손실이 있었다. 또한, 본 발명의 사람화된 항-CD40 항체는 CD40에 특이적으로 결합함으로써, C4BP-매개 CD40 신호전달을 차단 또는 억제한다.
사람화는 본질적으로 윈터와 협력자들의 방법을 따라 설치류 또는 돌연변이 설치류의 CDR 또는 CDR 서열을 사람 항체의 상응하는 서열로 대체함으로써 수행될 수 있다(Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536). 또한, 미국 특허 제5,225,539호, 제5,585,089호, 제5,693,761호, 제5,693,762호, 제5,859,205호를 참조하라. 어떤 경우에는, 사람 면역글로불린의 하나 이상의 가변 영역의 프레임워크 영역 내에 있는 잔기들이 상응하는 비-사람 잔기들로 대체되기도 한다(예를 들면, 미국 특허 제5,585,089호, 제5,693,761호, 제5,693,762호, 및 제6,180,370호 참조). 나아가, 사람화된 항체는 수용자의 항체나 공여자의 항체에서 발견되지 않는 잔기들을 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 한층 더 개량하기 위하여 (예를 들면, 원하는 친화력을 얻기 위하여) 이루어진다. 일반적으로 사람화된 항체는 적어도 하나, 전형적으로는 두 개의 가변 도메인을 실질적으로 전부 포함할 것이며, 그때에 초가변 영역의 전부 또는 실질적으로 전부는 비-사람 면역글로불린의 그것과 상응하며, 프레임워크 영역의 전부 또는 실질적으로 전부는 사람 면역글로불린 서열의 것이다. 사람화된 항체는 또한 임의적으로 면역글로불린 불변 영역(Fc), 전형적으로는 사람 면역글로불린의 불변 영역의 적어도 부분을 포함할 것이다. 더 상세한 것은 본원에 참고 인용된 문헌(Jones et al. (1986) Nature 331:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-329; 및 Presta (1992) Curr. Op.Struct. Biol. 2:593-596)을 참조하라. 따라서, 그러한 "사람화된" 항체는 무결 사람 가변 도메인보다 실질적으로 적은 부분이 비-사람 종의 상응하는 서열에 의해 치환되는 항체를 포함할 수 있다. 실제로, 사람화된 항체는 전형적으로 일부 CDR 잔기와 아마도 일부의 프레임워크 잔기가 설치류 항체의 유사한 부위의 잔기로 치환된 사람 항체이다. 예를 들면, 미국 특허 제5,225,539호; 제5,585,089호; 제5,693,761호; 제5,693,762호; 제5,859,205호를 참조하라. 또한, 예정된 항원에 대한 개선된 친화력을 가진 사람화된 항체 및 사람화된 항체를 제조하기 위한 기술이 개시되어 있는 미국 특허 제6,180,370호 및 국제 공보 WO 01/27160호를 참조하라.
또한, 항-CD40 항체는 비-사람 포유류 숙주, 보다 구체적으로는 트랜스제닉 마우스에서 제조된 이종개체의 또는 변형된 항-CD40 항체를 포함하는데, 이것은 비활성화된 내인성 면역글로불린(Ig) 유전자좌를 특징으로 한다. 이러한 트랜스제닉 동물에서, 숙주 면역글로불린의 경 서브유닛 및 중 서브유닛의 발현을 위하여 항체반응을 일으키는(competent) 내인성 유전자들은 비-기능적이며, 유사한 사람 면역글로불린 유전자좌로 치환되려는 경향이 있다. 이들 트랜스제닉 동물은 경 또는 중 숙주 면역글로불린 서브유닛의 실질적인 부재시에 사람 항체를 생성한다. 예를 들면, 본원에 참고 인용된 미국 특허 제5,877,397호 및 제5,939,598호를 참조하라. 따라서, 이러한 항체는 완전 사람 항-CD40 항체이다.
바람직하게는, CD40에 대한 완전 사람 항체는 트랜스제닉 마우스를 면역화함으로써 얻어진다. 이러한 마우스 중 하나는 XenoMouse® 기술(Abgenix; 캐리포니아주 프리몬트 소재)을 사용하여 얻어지고, 미국 특허 제6,075,181호, 제6,091,001호, 및 제6,114,598호에 개시되어 있으며, 이들 모두는 본원에 참고 인용된다. 따라서, 예를 들면, 한 구체예에서, 본원에 개시된 항체는 사람 IgG1 중쇄 유전자좌와 사람 κ 경쇄 유전자좌에 대한 트랜스제닉 마우스를 사람 CD40을 발현하는 Sf9 세포로 면역화함으로써 제조될 수 있다. 마우스는 또한 다른 이소타입에 대해서도 트랜스제닉이 될 수 있다. 본 발명의 완전 사람 길항제 항-CD40 항체는 CD40 상의 C4BP 결합 부위에 또는 가까이에 결합하여, C4BP-매개 CD40 신호전달을 차단하는 특성을 가진다.
본 발명의 길항제 항-CD40 항체의 단편들은 그것들이 상응하는 전체 길이 길항제 항-CD40 항체의 원하는 친화력을 보유하고, 상응하는 전체 길이 길항제 항-CD40 항체에 유사한 특징의 특성이 있는 한, 본 발명의 방법에 사용하기에 적합하다. 즉, 단편들은 세포의 표면에 발현된 CD40 항원, 예를 들면 사람 세포의 표면상의 사람 CD40 항원에 특이적으로 결합할 것이고, 유의한 작용제 활성은 없지만, CD40 항원에 결합할 때 길항제 활성을 나타낸다. 따라서, 이러한 단편이 CD40 발현 세포 상의 CD40에 결합하는 것은 C4BP-매개 CD40 신호전달을 차단하고, 그럼으로써 하나 이상의 CD40-유도 활성을 억제한다. 이러한 단편들은 본원에서 "항원-결합" 단편으로 언급되며, 본 발명의 임의의 방법에 사용하기에 적합하다.
항체의 적합한 항원-결합 단편들은 전체 길이의 항체의 일부, 대개는 그것의 항원-결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예로는, 한정하는 것은 아니지만, Fab, F(ab')2, 및 Fv 단편 및 단일-사슬 항체 분자가 있다. "Fab"는 경쇄 및 중쇄의 부분으로 구성된 면역글로불린의 일가 항원-결합 단편을 의미한다. F(ab')2는 경쇄 및 2개의 중쇄의 부분을 함유하는 면역글로불린의 2가 항원-결합 단편을 의미한다. "단일-사슬 Fv" 또는 "sFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 단편을 의미하는데, 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬에 존재한다. 예를 들면, 본원에 참고 인용된 미국 특허 제4,946,778호, 제5,260,203호, 제5,455,030호, 및 제5,856,456호를 참조하라. 일반적으로, Fv 폴리펩티드는 sFv가 항원 결합을 위해 원하는 구조를 형성하도록, VH와 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 더 포함한다. sFv의 개관에 대해서는, 문헌(Pluckthun (1994) in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol.113, ed. Rosenburg and Moore (Springer-Verlag, New York), pp.269-315)을 참조하라. 또한, 본원에 개시된 길항제 항-CD40 항체의 항원-결합 단편은 하기에 설명되는 바과 같이, 표적 세포, 예를 들면 표적 암 세포를 효과적으로 죽이기 위하여 세포독소에 콘쥬게이트될 수 있다.
항체 또는 항체 단편은 예를 들면, 문헌(McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-554 (1990) 및 미국 특허 제5,514,548호)에 설명된 기술들을 사용하여 생성된 항체 파지 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 문헌(Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628 및 Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222:581-597)은 파지 라이브러리를 사용하여 각각 쥐과 및 사람 항체의 분리를 설명한다. 계속해서 발표된 공보들도 사슬 셔플링(chain shuffling)에 의해서(Marks et al. (1992) Bio/Technology 10:779-783)뿐 아니라, 매우 큰 파지 라이브러리를 구성하기 위한 전략으로서 조합 감염 및 생체내 재조합에 의해(Waterhouse et al. (1993) Nucleic. Acids Res. 21:2265-2266) 고친화력(nM 범위)의 사람 항체를 제조하는 것을 설명한다. 따라서, 이들 기술은 모노클론 항체를 분리하기 위하여 종래의 모노클론 항체 하이브리도마 기술에 대한 실행가능한 대안이다.
항체 단편을 제조하기 위하여 다양한 기술들이 개발되었다. 전통적으로, 이들 단편은 무결 항체의 단백질 가수분해성 소화를 경유하여 유도되었다(예를 들면, Morimoto et al. (1992) Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) 및 Brennan et al. (1985) Science 229:81 참조). 그러나, 이들 단편은 현재 재조합 숙주 세포에 의해 직접 제조될 수 있다. 예를 들면 항체 단편은 상기에서 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 대안적으로, Fab'-SH 단편은 대장균으로부터 직접 회수되고 화학적으로 결합하여 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다(Carter et al. (1992) Bio/Technology 10:163-167). 다른 접근법에 따르면 F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 분리될 수 있다. 항체 단편을 제조하기 위한 다른 기법들은 당업자들에게도 명백할 것이다.
본 발명의 방법에 유용한 길항제 항-CD40 항체는 본원에 개시된 항-CD40 모노클론 항체뿐만 아니라, 이 항체와는 다르지만 CDR을 보유하고 있는 항체, 및 하나 이상의 아미노산이 첨가, 결실 또는 치환된 항체들을 포함하며, 길항제 활성은 C4BP-매개 CD40 신호전달을 차단함으로써, 하나 이상의 CD40-유도 활성을 억제하는 능력에 의해서 측정된다. 본 발명은 또한 본원에 참고 인용된 국제 공보 WO 98/52976호 및 WO 0034317호에 설명된 바와 같이 제조될 수 있는 탈-면역화된 길항제 항-CD40 항체도 포함한다. 이런 방식으로, 본 발명의 길항제 항-CD40 항체 내에 있는 잔기들은 변형되어 사람에 대한 면역원성을 전혀 또는 덜 나타내는 한편 사람 CD40-발현 세포를 향한 이들의 길항제 활성은 여전히 보유하고 있는 항체가 되려는 경향이 있으며, 이때 이러한 활성은 본원의 다른 곳에 나타낸 분석법들에 의해 측정된다. 또한, 본 발명의 길항제 항-CD40 항체, 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 단백질은 본 발명의 청구범위에 포함되는데, 이 융합 단백질은 당업계에 공지되어 있는 바와 같이 상응하는 폴리뉴클레오티드 벡터로부터 합성되거나 발현될 수 있다. 이러한 융합 단백질은 하기에 나타낸 항체의 콘쥬게이션과 관련하여 설명된다.
본 발명의 항체는 예를 들면 본원에 참고 인용되는 특허 공보 EP 0 983 303 A1, WO 00/34317호 및 WO 98/52976호에 설명되어 있는 방법을 사용하여 제조된 서열 변이를 가질 수 있다. 예를 들면, CDR 내에 있는 서열은 항체가 MHC 클래스 II에 결합하도록 유도하여 원하지 않는 헬퍼 T-세포 반응을 유발할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 보존적 치환은 항체가 결합 활성을 보유하면서도 그것이 원하지 않는 T-세포 반응을 유발하는 능력을 잃어버리도록 할 수 있다. 그런 보존적 또는 비-보존적 치환들은 모두 당업계에 인정된 방법, 예를 들면 본원의 다른 곳에 나타낸 방법들을 사용하여 제조될 수 있고, 그 결과의 항체는 본 발명의 범주에 속할 것이다. 변이 항체는 기본적으로 본원에 설명된 방법을 사용하여 길항제 활성, 친화력, 및 특이성에 대하여 테스트할 수 있다.
상기에 설명된 방법들 중 어느 하나, 또는 본원에 기재되지 않은 어떤 다른 방법에 의해 제조된 항체는 항체와 CD40 항원의 결합이 C4BP-매개 CD40 신호전달을 차단하면 본 발명의 범주에 속할 것이다. 항체는, 한정하는 것은 아니지만, C4BP가 CD40 상의 그것의 결합 부위에 결합하는 것을 입체적으로 억제함으로써 C4BP의 결합을 방지하는 것, CD40 상의 C4BP 결합 부위의 적어도 일부에 대하여 경쟁함으로써 C4BP의 결합을 경쟁적으로 억제하는 것, 및 C4BP가 세포 표면 CD40과 연결될 때 CD40 신호전달을 방지하는 것을 포함한 임의의 수단에 의해서 C4BP-매개 CD40 신호전달을 차단할 수 있다. 따라서, 본 발명의 길항제 항-CD40 항체는, 한정하는 것은 아니지만, 본원에 개시된 CD40-유도 활성, 예를 들면 T 세포에 의해 자극된 정상 사람 말초 B 세포에 의한 면역글로불린 분비; Jurkat T 세포에 의해 자극된 정상 사람 말초 B 세포의 생존 및/또는 증식; C4BP-발현 세포 또는 가용성 C4BP에 의해 자극된 정상인 말초 B 세포의 생존 및/또는 증식; 가용성 C4BP 또는 고체-상 C4BP에 의하여 자극된 어떤 세포에서의 "생존" 항-아포프토시스 세포내 신호; 가용성 C4BP 또는 고체-상 C4BP와 리게이션시 어떤 세포에서의 CD40 신호 전달; 및 하기에 나타내는 바와 같은 사람 악성 B 세포의 증식을 포함한, C4BP가 CD40 상의 그것의 결합 부위에 결합함으로써 유도되는 하나 이상의 CD40-유도 활성을 억제할 수 있다. 이들 CD40-유도 활성을 억제하는 길항제 항-CD40 항체의 능력을 결정하기 위한 분석은 본원의 실시예에 설명되는 바와 같이 수행될 수 있다. 또한 문헌(Schultze et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:8200-8204; Denton et al. (1998) Pediatr. Transplant. 2:6-15; Evans et al. (2000) J. Immunol. 164:688-697; Noelle (1998) Agents Actions Suppl. 49:17-22; Lederman et al. (1996) Curr Opin. Hematol. 3:77-86; Coligan et al. (1991) Current Protocols in Immunology 13:12; Kwekkeboom et al. (1993) Immunology 79:439-444; 및 미국 특허 제5,674,492호 및 제5,847,082호를 참조하라.
본원에 확인된 방식대로 CD40 항원에 특이적으로 결합하고 C4BP-매개 CD40 신호전달을 차단하는 길항제 항-CD40 항체를 검출하는 대표적인 분석은 "경쟁 결합 분석"이다. 경쟁 결합 분석은 미지의 것이 표지된 공지의 리간드, 예를 들면 C4BP가 그것의 특이적 수용체, 예를 들면 CD40에 결합하는 것을 억제하는 이들의 능력에 의해서 검출되고 정량화되는 혈청학적 분석이다. 이것은 또한 경쟁 억제 분석으로도 언급된다. 대표적인 경쟁 결합 분석에서, 표지된 CD40 폴리펩티드는 예를 들면 본 발명의 모노클론 항체의 하나 이상의 에피토프에 대하여 발생된 모노클론 항체와 조합하여 샘플 중의 후보 항체에 의해 침전된다. 관심대상의 에피토프와 특이적으로 결합하는 항-CD40 항체는 CD40 단백질 또는 관심대상의 CD40 단백질의 특정 에피토프를 포함하는 단백질 단편에 대하여 제조된 일련의 항체를 스크린함으로써 확인될 수 있다. 예를 들면 사람 CD40의 경우, 관심대상의 에피토프는 짧은 이소형태의 사람 CD40(GenBank Accession No. NM_152854에 의해서 코딩되는, GenBank Accession No. Np_690593 참조) 또는 사람 CD40의 긴 이소형태(GenBank No. X60892 및 NM_001250에 의해서 코딩되는, GenBank Accession No. CAA43045 및 NP_001241 참조)의 선형 및/또는 비선형 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프를 포함한다. 대안적으로, 사전에 확인된 적합한 길항제 항-CD40 항체를 사용하는 경쟁 결합 분석은 사전에 확인된 항체에 비교할만한 모노클론 항체를 선택하기 위해 사용될 수 있다.
이러한 면역 분석에 사용되는 항체는 표지되거나 표지되지 않을 수 있다. 표지되지 않은 항체는 응집 또는 ELISA에 사용될 수 있고, 표지된 항체는 광범위한 표지를 사용하여 광범위한 분석에 사용될 수 있다. 항-CD40 항체와 관심대상의 에피토프 사이의 항체-항원 복합체의 형성의 검출은 검출가능한 물질을 항체에 부착함으로써 용이해질 수 있다. 적합한 검출 수단으로는 방사성 핵종, 효소, 조효소, 형광물질, 화학 발광제, 색원체, 효소 기질 또는 보조-인자, 효소 억제제, 보결분자단 복합체, 자유 라디칼, 입자, 염료 등과 같은 표지의 사용을 포함한다. 적합한 효소의 예로는 양고추냉이 페록시다제, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린에스테라제가 있고; 적합한 보결분자단 복합체의 예로는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴이 있으며; 적합한 형광 물질의 예로는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 댄실 클로라이드 또는 피코에리트린이 있고; 발광 물질의 예로는 루미놀이 있으며; 생물학적 발광 물질의 예로는 루시페라제, 루시페린 및 에쿼린이 있고; 적합한 방사성 물질의 예로는 125I, 131I, 35S, 또는 3H가 있다. 이러한 표지된 시약은 잘 공지된 다양한 분석법, 예를 들면 방사성 면역분석, 효소 면역분석, 예를 들면 ELISA, 형광 면역분석 등에 사용될 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제3,766,162호, 제3,791,932호, 제3,817,837호 및 제4,233,402호를 참조하라.
앞에서 설명된 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항체 단편 중 어느 것이든지 본 발명의 방법에 사용되기 전에 콘쥬게이트될 수 있다. 콘쥬게이트된 항체를 생성하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 그러므로 항-CD40 항체는 간접 표지화 또는 간접 표지화 접근법을 사용하여 표지될 수 있다. "간접 표지화" 또는 "간접 표지화 접근법"은 킬레이트화제가 항체에 공유 부착되고 하나 이상의 방사성 핵종이 킬레이트화제 안에 삽입되는 것을 의미한다. 본원에 참고 인용되는 문헌(Srivagtava and Mease (1991) Nucl. Med. Bio. 18:589-603)에 설명된 킬레이트화제와 방사성 핵종을 참조하라. 적합한 표지로는 플루오로포어, 크로모포어, 방사성 원자(특히 32P 및 125I), 전자-밀집 시약, 효소 및 특이한 결합 파트너를 가지고 있는 리간드가 있다. 효소는 통상적으로 그것의 활성에 의해 검출된다. 예를 들면, 양고추냉이 페록시다제는 대개 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)을 분광광도기로 정량할 수 있는 푸른색 안료로 변환시키는 능력에 의해 검출된다. "특이적 결합 파트너"란 예를 들면 항원과 그것에 특이한 모노클론 항체의 경우에서처럼, 고친화력으로 리간드 분자에 결합할 수 있는 단백질을 말한다. 다른 특이적 결합 파트너로는 비오틴과 아비딘 또는 스트렙타비딘, IgG와 단백질 A, 및 당업계에 공지된 수많은 수용체-리간드 커플이 있다. 상기의 설명은 동일한 표지가 여러 상이한 방식으로 사용될 수 있기 때문에, 다양한 표지를 명확한 부류 안에 범주화하는 것을 의미하는 것은 아니라는 것이 인지되어야 한다. 예를 들면 125I는 방사성 표지로서 또는 전자-밀집 시약으로서 작용할 수 있다. 양고추냉이 페록시다제(HRP)는 효소로서 또는 모노클론 항체의 항원으로서 작용할 수 있다. 나아가, 원하는 효과를 위해 다양한 표지를 조합할 수 있다. 예를 들면 모노클론 항체와 아비딘 또한 본 발명을 실행할 때 표지를 필요로 하므로, 모노클론 항체를 비오틴으로 표지하고, 그것의 존재는 125I로 표지된 아비딘, 또는 HRP로 표지된 항-비오틴 모노클론 항체로 검출할 수 있다. 다른 변경 및 가능성도 당업자에게 쉽게 드러날 것이며, 그것 역시 본 발명의 범주 내에 동등한 것으로 간주된다.
대안적으로, 항-CD40 항체는 "직접 표지화" 또는 "직접 표지화 접근법"을 사용하여 표지될 수 있는데, 여기서는 방사성 핵종이 직접 항체에 공유 부착된다(통상적으로 아미노산 잔기를 경유하여). 바람직한 방사성 핵종은 문헌(Srivagtava and Mease (1991) 상기 참조)에 제시된다. 간접 표지화 접근법이 특히 바람직하다. 또한 예를 들면 본원에 참고 인용된, 항체에 방사성 표지를 부착하기 위해 링커가 사용되는 것에 대한 국제 공보 WO 00/52031호 및 WO 00/52473호; 및 미국 특허 제6,015,542호에 설명되어 있는 항-CD40 항체의 표지된 형태를 참조하라.
나아가, 항체 (또는 이것의 단편)는 세포독소, 치료제, 또는 방사성 금속 이온 또는 방사성 동위원소와 같은 치료 부분에 콘쥬게이트될 수 있다. 세포독소 또는 세포독성 제제는 세포에 해로운 것이면 어떤 제제라도 포함한다. 예를 들면 탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티디움 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 미토크산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-디히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 및 퓨로마이신 및 그것의 유사체 또는 동족체가 있다. 치료제로는, 한정하는 것은 아니지만, 대사길항물질(예를 들면, 메토트렉세이트, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬화제(예를 들면, 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴(BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 사이클로포스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-디클로로디아민 플라티늄(II)(DDP) 시스플라틴), 안트라사이클린(예를 들면, 다우노루비신 (이전에는 다우노마이신이라 언급됨) 및 독소루비신), 항생제(예를 들면, 닥티노마이신 (이전에는 악티노마이신으로 언급됨), 블레오마이신, 미트라마이신, 및 안트라아미신(AMC)), 및 항-유사분열 촉진제(예를 들면, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)가 있다. 방사성 동위원소로는, 한정하는 것은 아니지만, I-131, I-123, I-125, Y-90, Re-188, Re-186, At-211, Cu-67, Bi-212, Bi-213, Pd-109, Tc-99, In-111 등이 있다. 본 발명의 콘쥬게이트된 항체는 주어진 생물학적 반응을 변형시키기 위해 사용될 수 있고; 약물 부분은 고전적인 화학적 치료제에 한정되는 것으로 간주되지 않는다. 예를 들면, 약물 부분은 원하는 생물학적 활성을 가지고 있는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 단백질로는 예를 들면 독소, 예를 들면 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소, 또는 디프테리아 독소; 단백질, 예를 들면 종양 괴사 인자, 인터페론-알파, 인터페론-베타, 신경 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 조직 플라스미노센 활성화제; 또는 생물학적 반응 변형제, 예를 들면 림포카인, 인터류킨-1("IL-1"), 인터류킨-2("IL-2"), 인터류킨-6("IL-6"), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자("GM-CSF"), 과립구 콜로니 자극 인자("G-CSF"), 또는 다른 성장 인자들이 있다.
이러한 치료 부분을 항체에 콘쥬게이트하기 위한 기술들은 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌(Arnon et al. (1985) "Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, ed. Reisfeld et al. (Alan R. Liss, Inc.), pp.243-256; ed. Hellstrom et al. (1987) "Antibodies for Drug Delivery," in Controlled Drug Delivery, ed. Robinson et al. (2d ed; Marcel Dekker, Inc.), pp.623-653; Thorpe (1985) "Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, ed. Pinchera et al. pp.475-506 (Editrice Kurtis, Milano, Italy, 1985); "Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy," in Monoclonal Atitibodies for Cancer Detection and Therapy, ed. Baldwin et al. (Academic Press, New York, 1985), pp.303-316; 및 Thorpe et al. (1982) Immunol. Rev. 62:119-158)을 참조하라.
대안적으로, 항체는 미국 특허 제4,676,980호에 기재되어 있는 바와 같이 제2항체에 콘쥬게이트되어 항체 헤테로콘쥬게이트를 형성할 수 있다. 또한 표지와 본 발명의 항체 사이에 링커가 사용될 수 있다(미국 특허 제4,831,175호 참조). 항체, 또는 이것의 항원-결합 단편은 방사성 요오드, 인듐, 이트륨, 또는 당업계에 공지되어 있는 다른 방사성 입자로 직접 표지될 수 있다(미국 특허 제5,595,721호). 치료는 동시에 또는 계속해서 투여되는 콘쥬게이트되거나 콘쥬게이트되지 않은 항체를 이용한 치료의 조합으로 이루어질 수 있다(국제 공보 WO 00/52031호 및 WO 00/52473호).
길항제 항- CD40 항체의 변이체
길항제 항-CD40 항체의 적합한 생물학적 활성 변이체는 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 이러한 변이체는 모 길항제 항-CD40 항체의 원하는 결합 특성을 보유할 것이다. 항체 변이체를 제조하는 방법은 일반적으로 당업계에서 사용될 수 있다.
예를 들면, 길항제 항-CD40 항체의 아미노산 서열 변이체는 관심대상의 항체를 코딩하는 클로닝된 DNA 서열에서 돌연변이에 의해 제조될 수 있다. 돌연변이 생성 및 뉴클레오티드 서열 변경 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 본원에 참고 인용된 문헌(Walker and Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York); Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488; Kunkel et al. (1987) Methods Enzymol. 154:367; Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, New York); 미국 특허 제4,873,192호; 및 그곳에 인용된 참고문헌들)을 참조하라. 관심대상의 폴리펩티드의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는 적절한 아미노산 치환에 대한 지침도 본원에 참고 인용된 문헌(Dayhoff et al. (1978) in Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.))에서 찾아볼 수 있다. 보존적 치환, 예를 들면 하나의 아미노산을 유사한 특성을 가지고 있는 다른 아미노산으로 교환하는 것이 바람직할 수 있다. 보존적 치환의 예로는, 한정하는 것은 아니지만, Gly⇔Ala, Val⇔Ile⇔Leu, Asp⇔Glu, Lys⇔Arg, Asn⇔Gln, 및 Phe⇔Trp⇔Tyr이 있다.
관심대상의 길항제 항-CD40 항체 폴리펩티드의 변이체를 제조함에 있어서, 변이체가 계속 원하는 활성, 즉 유사한 결합 친화력을 가지도록 변형이 이루어질 수 있고, 변형은 사람 세포의 표면에 발현된 사람 CD40 항원에 특이적으로 결합함으로써 C4BP-매개 CD40 신호전달을 차단할 수 있으며, 유의한 작용제 활성은 없지만 사람 CD40-발현 세포 상의 CD40 항원에 결합했을 때 길항제 활성을 나타낸다. 분명한 것은 변이체 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 이루어진 어떠한 돌연변이든지 리딩 프레임 밖에 있는 서열을 대체해서는 안되고, 바람직하게는 2차 mRNA 구조를 제조할 수 있는 상보적 영역을 생성하지 못할 것이라는 것이다. 유럽 특허출원 공보 제75,444호를 참조하라.
또한, 길항제 항-CD40 항체의 불변 영역은 효과기 기능을 변경시키기 위하여 많은 방법으로 돌연변이가 이루어질 수 있다. 예를 들면, Fc 수용체에 대한 항체 결합을 최적화하는 Fc 돌연변이에 대해 개시하는 미국 특허 제6,737,056B1 및 미국 특허출원 공보 제2004/0132101A1호를 참조하라.
바람직하게는, 길항제 항-CD40 항체의 변이체는 기준 길항제 항-CD40 항체 분자에 대한 아미노산 서열 대하여 또는 기준 항체 분자의 더 짧은 부분에 대하여 적어도 70% 또는 75%의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 80% 또는 85%의 서열 동일성, 더 바람직하게는 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 또는 95%의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 갖는다. 더 바람직하게는, 분자들은 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 공유한다. 본 발명의 목적을 위해서, 백분율 서열 동일성은 12의 갭 오픈 페널티 및 2의 갭 연장 페널티, 62의 BLOSUM 매트릭스를 이용한 아핀 갭 검색을 사용한 Smith-Waterman 상동성 검색 알고리즘을 사용하여 결정된다. Smith-Waterman 상동성 검색 알고리즘은 문헌(Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482-489)에 교시된다. 변이체는 예를 들면 기준 길항제 항-CD40 항체와 1 내지 15 아미노산 잔기만큼 적게, 1 내지 10 아미노산 잔기만큼, 예를 들면 6 내지 10 아미노산 정도, 5만큼 적게, 4, 3, 2, 또는 심지어 1 아미노산 잔기만큼 적게 다를 수 있다.
두 아미노산 서열의 최적 정렬과 관련하여, 변이체 아미노산 서열의 인접한 절편은 기준 아미노산 서열에 관해서 추가 아미노산 잔기 또는 결실된 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 기준 아미노산 서열과 비교하기 위하여 사용된 인접한 절편은 적어도 20개의 인접한 아미노산 잔기를 포함할 것이고, 30, 40, 50, 또는 그 이상의 아미노산 잔기일 수 있다. 보존적 잔기 치환 또는 갭과 연관된 서열 동일성에 대한 보정이 이루어질 수 있다(Smith-Waterman 상동성 검색 알고리즘 참조).
특히 CD40 항원에 결합할 때 CD40에 특이적으로 결합할 수 있고 작용제 활성을 보유할 수 있는 항-CD40 항체의 정확한 화학적 구조는 많은 인자에 좌우된다. 이온화될 수 있는 아미노기 및 카르복실기가 분자 내에 존재하기 때문에, 특정 폴리펩티드는 산성 또는 염기성 염으로서, 또는 중성 형태로 얻어질 수 있다. 적합한 환경적 조건에 놓이게 될 때 생물학적 활성을 보유하는 이러한 모든 제제는 본원에 사용된 길항제 항-CD40 항체의 정의에 포함된다. 나아가, 폴리펩티드의 일차 아미노산 서열은 당 부분을 사용하여 유도체를 형성함으로써(글리코실화) 또는 지질, 포스페이트, 아세틸기 등과 같은 다른 보충 분자에 의해 증대될 수 있다. 또한 당과의 콘쥬게이션에 의해서도 증대될 수 있다. 이러한 증대의 특정 양태는 생성 숙주의 번역 후 가공 시스템을 통하여 달성되고; 이러한 다른 변형은 시험관내에 도입될 수 있다. 어떤 경우든지, 이러한 변형은 항-CD40 항체의 길항제 특성이 파괴되지 않는 한 본원에 사용된 항-CD40 항체의 정의에 포함된다. 이러한 변형은 다양한 분석에서 항체의 활성을 증가 또는 감소시킴으로써 정량적으로 또는 정성적으로 활성에 영향을 미칠 수 있을 것으로 예상된다. 나아가 사슬 내의 개별적인 아미노산 잔기는 산화, 환원, 또는 다른 유도체 형성에 의해 변형될 수 있고, 항체는 활성을 보유하는 단편들을 얻기 위해 분열될 수 있다. 길항제 활성을 파괴하지 않는 이러한 변경은 본원에 사용되는 바와 같은 관심대상의 항-CD40 항체의 정의로부터 폴리펩티드 서열을 제거하지 않는다.
당해 기술은 항체의 변이체의 제조 및 용도에 관하여 실질적 지침을 제공한다. 항-CD40 항체 변이체의 제조에서, 당업자는 천연 단백질 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열에 대한 어떤 변형이 본 발명의 방법에 사용된 약제학적 조성물의 치료적 활성 성분으로서 사용하기에 적합한 변이체를 초래할 것인지를 용이하게 결정할 수 있다.
본 발명의 길항제 항- CD40 항체를 사용한 치료 방법
길항제 항-CD40 항체는 C4BP-매개 CD40 신호전달을 차단하기 위한 수단을 제공하므로, 이들은 본원 상기에 나타낸 하나 이상의 CD40-유도 활성을 억제하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 CD40-발현 세포에서 CD40-유도 활성을 억제하기 위한 방법을 제공하는데, 이 방법은 C4BP-매개 CD40 신호전달을 차단하는 데 효과적인 본 발명의 길항제 항-CD40 항체의 양으로 세포를 접촉하는 것을 포함한다. 앞에서 나타낸 바와 같이, 신호전달 과정의 차단은 항-CD40 항체와 CD40의 결합이 C4BP-매개 CD40 신호전달을 방해하는 한, CD40 상의 결합 부위에 대한 C4BP의 결합의 경쟁적 억제 또는 입체적 억제, 또는 CD40 상의 결합 부위에 대한 C4BP의 결합을 통한 CD40 신호전달의 방해의 결과일 수 있다.
본원에 개시된 길항제 항-CD40 항체는 CD40-발현 세포 상의 CD40 신호전달의 C4BP 자극에 의하여 매개된 질병에 걸린 환자를 치료하기 위해 사용될 수 있다. "CD40-발현 세포"란 CD40 세포 표면 항원을 발현하는 임의의 세포 유형, 특히 B 세포 및 수지상 세포를 포함한 다른 APC를 의미하고, 정상 또는 악성 CD40-발현 세포일 수 있다. 세포 중의 CD40 발현을 검출하는 방법은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 한정하는 것은 아니지만, 예를 들면 PCR 기술, 면역조직화학, 유체 세포측정분석, 웨스턴 블롯, ELISA 등이 있다.
"악성" B 세포는 어떠한 신생 B 세포, 이를테면, 한정하는 것은 아니지만, 초기-, 중기-, 및 말기 B 세포 림프종을 포함한 림프종, 면역아세포성 림프종, 비-호지킨 림프종, 호지킨병, 엡스타인-바르 바이러스(EBV) 유도된 림프종, 및 AIDS-관련 림프종뿐만 아니라 B 세포 급성 림프아세포성 백혈병(ALL), 골수종, 만성 림프세포성 백혈병(CLL), 급성 골수아세포성 백혈병 등으로부터 유래된 B 세포를 의미한다. 다른 구체예에서, CD40-발현 세포는 고형 종양 세포이다. "CD40-발현 고형 종양 세포"는 CD40 세포-표면 항원을 발현하는 고형 종양의 임의의 악성 또는 전-악성 세포를 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, CD40 항원을 발현하는 암성 및 전암성 또는 전-악성 세포는 "CD40-발현 신생 세포"로 언급된다. 나아가, CD40 리간드(CD40L)와 C4BP가 CD49 활성화를 통하여 상승작용적으로 작용하는 경우, 본 발명의 항-CD40 항체는 C4BP-매개 CD40 신호전달을 차단하는 데 사용되어, CD40/CD40L 개입에 의하여 매개되는 질병에 영향을 미칠 수 있다.
"치료"는 본원에서 길항제 항-CD40 항체 또는 이것의 항원-결합 단편을 환자에게 적용 또는 투여하는 것으로서, 또는 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 단편을 환자로부터 분리된 조직 또는 세포주에 적용 또는 투여하는 것으로서 정의되며, 이 때 환자는 질병, 질병의 징후, 또는 질병에 대한 소질을 가지고, 치료의 목적은 질병, 질병의 징후, 또는 질병에 대한 소질을 돌봄, 치유, 경감, 완화, 변경, 치료, 개량, 개선, 또는 영향을 주는 것이다. "치료"는 또한 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 단편을 포함하는 약제학적 조성물을 환자에게 적용 또는 투여하는 것, 또는 항-CD40 항체 또는 그것의 단편을 포함하는 약제학적 조성물을 환자로부터 분리된 조직 또는 세포주에 적용 또는 투여하는 것을 의미하며, 이때 환자는 질병, 질병의 징후, 또는 질병에 대한 소질을 가지며, 치료의 목적은 질병, 질병의 징후, 또는 질병에 대한 소질을 돌봄, 치유, 경감, 완화, 변경, 치료, 개량, 개선, 또는 영향을 주는 것이다.
본 발명의 하나 이상의 길항제 항-CD40 항체(또는 이것의 항원-결합 단편)를 통한 치료는 본원에 CD40-연관 질병으로 언급된, 사람의 CD40-발현 세포에서 CD40 신호전달의 C4BP 자극과 연관된 질병의 치료에 관하여 이로운 생리학적 반응 을 야기한다. 이러한 CD40-연관 질병은, 한정하는 것은 아니지만, CD40-발현 신생 세포를 포함한 B 세포-관련 암 및 고형 종양을 포함한 암을 야기할 수 있는 고증식성 장애, 전-악성 상태 및 자가면역 및/또는 염증성 질병을 포함한다. 따라서, 본 발명의 길항제 항-CD40 항체는 자가면역 및/또는 염증성 질병, 예를 들면 전신성 루프스, 건선, 다발성 경화증, 염증성 장 질병(크론병), 류마티스 관절염, 및 기관 및 조직 이식의 거부를 치료하는 데, 악성 B 림프구에서 CD40에 의해서 제공된 활성화 신호를 제거함으로써 림프종을 치료하는 데, 그리고 특정 방식으로 독소를 CD40-보유 세포에 전달하는 데 사용될 수 있다.
따라서, 예를 들면, 본 발명의 길항제 항-CD40 항체는 비정상, 통제불가능한 B 세포 증식 및 축적과 관련된 비-호즈킨 림프종의 치료에 사용될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해서, 이러한 림프종은 Working Formulation 분류 개략도에 따라 언급될 것이며, 즉 그런 B 세포 림프종은 초기, 중기, 및 말기로 분류된다("The Non-Hodgkin's Lymphoma Pathologic Classification Project," Cancer 49 (1982):2112). 그러므로 초기 B 세포 림프종은 작은 림프세포성, 여포성 작은-절단된 세포, 및 여포성 혼합된 작은-절단된 및 큰 세포 림프종을 포함하고; 중기 림프종은 여포성 큰 세포, 미만성 작은 절단된 세포, 미만성 혼합된 작은 및 큰 세포, 및 미만성 큰 세포 림프종을 포함하며; 말기 림프종은 큰 세포 면역아세포성, 림프아세포성, 및 버킷 및 비-버킷 유형의 작은 비-절단된 세포 림프종을 포함한다.
본 발명의 방법은 개정된 유럽 및 미국 림프종 분류(REAL) 시스템에 따라 분류된 B 세포 림프종의 치료적 처치에 유용하다는 것이 인지된다. 이러한 B 세포 림프종으로는, 한정하는 것은 아니지만, 전구 B 세포 신생물로서 분류된 림프종, 예를 들면 림프아세포성 백혈병/림프종; 말초 B 세포 신생물, 이를테면 B 세포 만성 림프세포성 백혈병/작은 림프세포성 림프종, 림포플라스마사이토이드 림프종/면역종, 외막 세포 림프종(MCL), 여포 중심 림프종(여포성)(미만성 작은 세포, 미만성 혼합 작은 및 큰 세포, 및 미만성 큰 세포 림프종을 포함), 경계 지대 B 세포 림프종(결절 외, 결절의, 및 비장 타입을 포함), 유모 세포 백혈병, 플라스마사이토마/골수종, 하위타입 일차 종격동(흉선)의 미만성 큰 세포 B 세포 림프종, 버킷 림프종, 및 버킷 유사 말기 B 세포 림프종; 급성 백혈병; 급성 림프세포성 백혈병(ALL); 골수아세포성 백혈병; 급성 골수세포성 백혈병; 전골수세포성 백혈병; 골수단세포성 백혈병; 단세포성 백혈병; 적백혈병; 과립구성 백혈병(만성 골수세포성 백혈병); 만성 림프세포성 백혈병(CLL); 진성 적혈구증가증; 다발성 골수종; 반델스트룀 매크로글로불린혈증; 중쇄 질병; 및 미분류 초기 또는 말기 B 세포 림프종이 있다.
본 발명의 길항제 항-CD40 항체는 치료 동안 추가의 종양 파생물을 방지하는 데 유용할 수 있으며, 초기 B 세포 림프종에 걸린 환자, 특히 표준 화학요법 후에 재발된 환자들의 치료에 유용할 수 있다. 초기 B 세포 림프종은 중기 및 말기 B 세포 림프종보다 진행이 더 느리며, 재발/완화 과정을 특징으로 한다. 그러므로 이들 림프종의 치료는 재발 에피소드가 회수 및 중증 면에서 감소되기 때문에 본 발명의 길항제 항-CD40 항체를 사용하여 개선된다.
CD40-발현 신생 세포를 포함하는 고형 종양으로는, 한정하는 것은 아니지만, 난소암, 폐암(예를 들면, 편평세포 암종의 비-작은 세포 폐암, 아데노암종, 및 큰 세포 암종 유형, 및 작은 세포 폐암), 유방암, 결장암, 신장암(예를 들면, 신장세포 암종을 포함), 방광암(예를 들면, 방광 암종), 간암(예를 들면, 간세포 암종을 포함), 위암, 경부암, 전립선암, 비강인두암, 갑상선암(예를 들면, 갑상선 유두 암종), 및 흑색종 및 육종과 같은 피부암(예를 들면, 골육종 및 유윙(Ewing) 육종을 포함)이 있다.
CD40-발현 신생 세포를 포함한 암에 걸린 피험체에게 투여할 때, 본 발명의 길항제 항-CD40 항체 및 이들의 항원-결합 단편은 항-종양 활성을 제공할 수 있다. "항-종양 활성"은 CD40-발현 신생 세포 증식 또는 축적 속도의 감소, 및 그에 따라서 존재하는 종양의 성장 속도 또는 치료 동안 발생한 종양의 감소, 및/또는 존재하는 신생(종양) 세포 또는 새롭게 형성된 신생 세포의 파괴, 및 그에 따라서 치료 동안 종양의 전체 크기의 감소를 의미한다.
따라서, 본 발명은 CD40-발현 세포, 예를 들면 B 세포 림프종 및 고형 종양을 포함한 암을 치료하기 위한 방법을 제공하는데, 본 발명의 길항제 항-CD40 항체 및 이것의 항원-결합 단편의 치료적 유효량이 암에 걸린 피험체에게 투여된다. 이들 항체 또는 이들의 항원-결합 단편의 투여는 양성 치료 반응을 촉진한다. 암 치료와 관련하여 "양성 치료 반응"이란 이들 항체 또는 이들의 단편의 항-종양 활성과 연관된 질병의 개선, 및/또는 질병과 연관된 징후의 개선을 의미한다. 따라서, 예를 들면, 양성 치료 반응은 질병의 하기 개선 중 하나 이상을 나타낼 것이다: (1) 종양 크기의 감소; (2) 암(즉, 신생) 세포 수의 감소; (3) 신생 세포 사멸의 증가; (4) 신생 세포 생존의 억제: (4) 종양 성자의 억제(즉, 어느 정도까지 지연, 바람직하게는 정지); (5) 말초 기관 내로의 암 세포 침윤의 억제(즉, 어느 정도까지 지연, 바람직하게는 정지); (6) 종양 전이의 억제(즉, 어느 정도까지 지연, 바람직하게는 정지); (7) 추가 종양 파생물의 방지; (8) 증가된 환자 생존율; 및 (9) 암과 연관된 하나 이상의 징후로부터의 어느 정도의 경감. 이러한 치료 반응은 개선의 정도에 따라 더 특성화될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 질병의 개선은 완료된 반응으로서 특징지어질 수 있다. "완료된 반응"이란 어떠한 이전의 비정상적인 방사선사진 연구, 골수, 및 뇌척수액(CSF)의 표준화로 임상적으로 검출가능한 질병이 없다는 것을 의미한다. 이러한 반응은 본 발명의 방법에 따라 치료한 후 적어도 한 달 동안 지속되어야 한다. 대안적으로, 질병의 개선은 부분적인 반응으로서 분류될 수 있다. "부분적인 반응"이란 새로운 병변이 없을 때 측정가능한 모든 종양 부담 (즉, 환자에게 존재하는 종양 세포의 수)이 적어도 약 50% 감소하고 적어도 한 달 동안 지속되는 것을 말한다. 이러한 반응은 측정가능한 종양에만 적용할 수 있다.
종양 반응은 자기 공명 영상화(MRI) 스캔, x-방사선사진 영상화, 컴퓨터 X선 단층 촬영(CT) 스캔, 생물 발광 영상화, 예를 들면 루시페라제 영상화, 뼈 스캔 영상화, 및 골수 흡출(BMA)을 포함한 종양 생검 샘플링과 같은 스크리닝 기법을 사용하여 종양 형태(즉, 전체 종양 부담, 종양 크기 등)의 변화에 대하여 평가될 수 있다. 이들 양성 치료 반응 외에 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편으로 치료를 받고 있는 환자는 질병과 연관된 징후가 개선되는 이로운 효과를 경험할 수 있다. 그러므로, B 세포 종양의 경우, 피험체는 소위 B 징후, 즉 식은땀, 열, 체중 감소, 및/또는 두드러기가 줄어드는 경험을 할 수 있다.
또한, 본원에 설명된 길항제 항-CD40 항체는 또한 C4BP-매개 CD40 신호전달의 차단이 하나 이상의 CD40-유도 활성의 억제를 차단하는 다른 CD40-연관 질병의치료에 사용될 수 있으며, 이 때문에 이러한 억제는 질병의 개선 또는 적어도 질병의 하나 이상의 바람직하지 않은 징후를 감소시킨다. 따라서, C4BP-매개 CD40 신호전달이 자가면역 및/또는 염증 성분을 가진 질병 또는 장애로 발생하는 것과 같은 바람직하지 않은 면역 반응 및/또는 생체내 과정과 연관되는 경우, 본 발명의 길항제 항-CD40 항체는 C4BP-매개 CD40 신호전달을 차단함으로써 각각의 CD40-연관 질병과 연관된 징후를 억제 또는 방지하기 위해서 하나 이상의 이들 CD40-연관 질병의 치료가 필요한 피험자 또는 위험한 피험자에게 투여될 수 있다.
염증성 질병은 염증 및 조직 파괴, 또는 이들의 조합의 특징이 있다. "염증성 질병"은 면역 반응의 이벤트 또는 표적의 개시가 예를 들면 동종 항원, 이식 항원, 바이러스성 항원, 박테리아성 항원, 미지의 항원 또는 알레르겐을 포함한 비-자기 항원(들)과 관련되는 어떤 염증성 면역-매개 과정을 포함한다.
나아가, 본 발명의 목적을 위해서, 용어 "염증성 질병(들)"은 "자가면역 질병(들)"을 포함한다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "자가면역"은 일반적으로 "자기" 항원과 관련된 염증성 면역-매개 과정을 포함하는 것으로 이해된다. 자가면역 질병에서, 자기 항원(들)은 숙주 면역반응을 유발한다.
또한, 본 발명은 조직 이식 거부와 연관된 염증의 치료를 포함한다. "이식 거부" 또는 "그래프트 거부"는, 한정하는 것은 아니지만, HLA 항원, 혈액군 항원 등을 포함한 그래프트에 대한 어떤 숙주-장착된 면역 반응을 말한다.
본 발명은 또한 예를 들면 골수 이식과 연관된 경우와 같은, 이식 편대 숙주병을 치료하는 데 사용될 수 있다. 이러한 이식 편대 숙주병에서, 공여자 골수는 림프구 및 림프구로 성숙하는 세포를 포함한다. 공여자 림프구는 비-자기로서 수용자의 항원을 인식하고, 염증성 면역반응을 일으킨다. 그러므로, 본원에 사용되는 바와 같이, "이식 편대 숙주병" 또는 "이식 편대 숙주반응"은 공여자 림프구가 숙주의 항원에 반응하는 어떤 T 세포 매개 면역 반응을 말한다.
따라서, 본원에 설명된 길항제 항-CD40 항체 및 이들의 항원-결합 단편은, 한정하는 것은 아니지만, 전신성 홍반성 낭창(SLE), 원판상 낭창, 낭창성 신염, 유육종증, 소아 관절염, 류마티스 관절염, 건선성 관절염, 라이터 증후군, 강직성 척추염 및 통풍성 관절염을 포함한 염증성 관절염, 기관 또는 조직 이식의 거부, 초급성, 급성 또는 만성 거부 및/또는 이식 편대 숙주병, 다발성 경화증, 과 IgE 증후군, 결절성 다발성 동맥염, 원발성 담즙성 간경변증, 염증성 장 질환, 크론씨 병, 셀리악병(글루텐-민감성 창자병증), 자가면역 간염, 악성빈혈, 자가면역성 용혈성 빈혈, 건선, 경피증, 중증 근무력증, 자가면역 혈소판 감소성 자반증, 자가면역성 갑상선염, 그레이브병, 하시모토 갑상선염, 면역복합체병, 만성 피로 면역기능부전 증후군(CFIDS), 다발성근염과 피부근염, 크리오글로불리네미아, 혈전 용해, 심근증, 심상성천포창, 폐 간질성 섬유화증, 제1형 및 제2형 당뇨병, 제1형, 제2형, 제3형 및 제4형 지연형 과민증, 제1형, 제2형, 제3형 및 제4형 알레르기 또는 알레르기성 장애, 치료 단백질에 대한 원하지 않은/예상하지 않은 면역반응(예를 들면, 미국 특허출원 US 2002/0119151호 및 Koren, et al. (2002) Curr. Pharm. Biotechnol. 3:349-60 참조), 천식, 척－스트라우스 증후군(알레르기성 육아종증), 아토피성 피부염, 알레르기성 및 자극성 접촉 피부염, 두드러기, IgE-매개 알레르기, 아테롬성 동맥 경화증, 혈관염, 특발성 염증성 근병증, 용혈성 질병, 알츠하이머병, 만성 염증성 탈수초성 다발 신경병증 등을 포함하는 자가면역 및/또는 염증성 장애를 치료하는 데 본 발명의 방법에 따라서 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 길항제 항-CD40 항체는, 한정하는 것은 아니지만, 폐 그래프트 거부, 천식, 유육종증, 기종, 낭포성 섬유증, 특발성 폐 섬유화증, 만성기관지염, 알레르기성 비염 및 폐의 알레르기성 질병, 예를 들면 골수 및/또는 폐 이식 또는 다른 원인에 기인한 과민성 폐렴, 호산구성 폐렴, 폐색성 모세기관지염, 그래프트 동맥경화증/그래프트 정맥경화증, 뿐만 아니라 콜라겐으로부터 비롯된 폐섬유증, 혈관 및 자가면역 질병, 예를 들면 류마티스 관절염 및 홍반성 낭창을 포함한 폐 염증을 치료하는 데 유용하다.
"항-염증성 활성"은 염증의 감소 또는 방지를 의미한다. 본원의 다른 곳에 정의된, 하나 이상의 항-CD 항체 또는 이것의 항원-결합 단편을 통한 치료는 그 질병이 CD40 항원을 발현하는 세포와 관련되는 경우 자가면역 질병 및/또는 염증성 질병의 치료에 관하여 이로운 생리학적 반응을 야기한다. 본 발명의 방법은 세포의 표현형의 변화, 예를 들면 증식, 활성화 등을 방지하는 데 유용할 수 있다.
자가면역 및/또는 염증성 질병에 관한 "양성 치료 반응"은 이들 항체 또는 이들의 항원-결합 단편의 항-염증성 활성과 연관된 질병의 개선, 및/또는 그 질병과 연관된 징후의 개선을 의미한다. 즉, 한정하는 것은 아니지만, 염증성 사이토카인, 부착 분자, 프로테아제, 면역글로불린(CD40 보유 세포가 B 세포인 경우에), 이들의 조합 등의 감소된 분비, 항-염증성 단백질의 증가된 생성, 자가반응 세포의 수의 감소, 면역 내성의 증가, 자가반응 세포 생존의 억제, 및/또는 CD40-발현 세포의 자극에 의하여 매개된 하나 이상의 징후의 감소를 포함한 항-증식 효과, CD40-발현 세포의 추가 증식의 방지, 염증성 반응의 감소가 관찰될 수 있다. 이러한 양성 치료 반응은 투여 경로에 제한되지 않고, 공여자, 공여자 조직(예를 들면 기관 관류와 같은), 숙주, 이들의 임의의 조합 등에 투여하는 것을 포함할 수 있다.
자가면역 및/또는 염증성 질병에 대한 치료를 받은 피험체의 경우, 임상 반응은, 한정하는 것은 아니지만, ELISA, RIA, 크로마토그래피 등에 의하여 검출가능한 변화를 포함한, 자기 공명 영상화(MRI) 스캔, x-방사선 사진 영상화, 컴퓨터 단층촬영(CT) 스캔, 유체 세포측정 분석 또는 형광-활성화된 세포 분류기(FACS) 분석, 조직학, 일반 병리학, 및 혈액 화학을 사용하여 평가될 수 있다. 이들 양성 치료 반응뿐만 아니라, 길항제 항-CD40 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로 치료를 받은 피험체는 질병과 연관된 징후가 개선되는 이로운 효과를 경험할 수 있다.
"치료적 유효량 또는 함량"은 투여되었을 때 CD40-연관 질병을 가진 피험체의 치료와 관련하여 양성 치료 반응을 불러일으키는 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 양을 의미한다. 본 발명의 일부 구체예에서, 항-CD40 항체 또는 그것의 단편의 치료적 유효량은 약 0.003 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 40 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 약 3 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 약 3 mg/kg 내지 약 25 mg/kg, 약 3 mg/kg 내지 약 20 mg/kg, 약 5 mg/kg 내지 약 15 mg/kg, 약 7 mg/kg 내지 약 12 mg/kg의 범위에 있다. 치료 방법은 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 치료적 유효량의 단일 투여 또는 치료적 유효량의 다중 투여를 포함할 수 있는 것으로 인지된다.
본 발명의 추가 구체예는 예를 들면 주어진 치료 섭생의 효능을 측정하는 임상적인 시험 과정의 일부로서 조직에서 단백질 수준을 진단적으로 모니터하기 위하여 길항제 항-CD40 항체를 사용하는 것이다. 검출은 검출가능한 물질에 항체를 결합시킴으로써 용이해질 수 있다. 검출가능한 물질의 예로는 다양한 효소, 보결분자단, 형광 물질, 발광 물질, 생물 발광 물질, 및 방사능 물질이 있다. 적합한 효소의 예로는 양고추냉이 페록시다제, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린에스테라제가 있고; 적합한 보결분자단의 예로는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴이 있으며; 적합한 형광 물질의 예로는 움벨리페론, 플루오레세, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 댄실 클로라이드 또는 피코에리트린이 있고; 발광 물질의 예로는 루미놀이 있으며; 생물 발광 물질의 예로는 루시페라제, 루시페린, 및 에쿼린이 있으며; 적합한 방사능 물질의 예로는 125I, 131I, 35S, 또는 3H가 있다.
길항제 항-CD40 항체는 CD40-연관 질병의 치료에 대하여 상이한 작용 방식을 가진 다른 길항제 항-CD40 항체를 포함한, 공지된 화학요법제, 사이토카인, 및/또는 다른 모노클론 항체와 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 길항제 항-CD40 항체는 인터류킨-2와 같은 사이토카인과 조합하여 사용될 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명의 항-CD40 항체는 예를 들면 다른 모노클론 항체, 예를 들면 B 세포 림프종의 치료를 위한 리툭시맙(IDEC-C2B8; Rituxan®; IDEC Pharmaceuticals Corp., 캘리포니아주 샌디애고 소재)과 조합하여 사용될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 항-CD40 항체는 CD40L-매개 CD40 신호전달을 차단하는 항-CD40 모노클론 항체와 조합하여 사용될 수 있다. 이러한 조합은, 한정하는 것은 아니지만, 기관 및 조직 이식 거부를 포함한 자가면역 질병 및/또는 염증성 질병을 치료하는 데 잠재적으로 유용할 것이다. 피험체가 조직 또는 기관을 이식받은 경우, 길항제 항-CD40 항체는 이식된 조직/기관의 거부를 억제하는 다른 치료제와 조합하여 사용될 수 있다. 이러한 치료제는, 한정하는 것은 아니지만, 코르티코스테로이드, 사이클로스코린 및 아자티오프린을 포함한다. 복합치료제가 조합하여 사용되는 경우, 각각의 제제는 연속적으로, 순서대로 또는 동시적으로(즉, 병행해서 또는 동일한 시간 틀 내에) 투여될 수 있다.
이 방식으로, 피험체가, 한정하는 것은 아니지만, 본원의 상기에 개시한 것들을 포함한 B 세포 관련 암에 대해서 치료받는 경우, 본원에 설명된 길항제 항-CD40 항체 또는 이들의 항원-결합 단편은 하나 이상의 다른 암 치료법, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만 다음과 같은 것들과 조합하여 투여된다: 수술 또는 수술 과정(예를 들면, 비장 절제술, 간 절제술, 림프 절제술, 류코포레시스(leukophoresis), 골수 이식 등); 방사선 치료법; 임의로 자가 골수 이식과 함께 이루어지는 화학치료법, 이때 적합한 화학체료제로는, 한정하는 것은 아니지만 플루다라빈 또는 플루다라빈 포스페이트, 클로람부실, 빈크리스틴, 펜토스타틴, 2-클로로디옥시아데노신(클라드리빈), 사이클로포스파미드, 독소루비신, 프레드니손, 및 이들의 조합, 예를 들면 안트라사이클린-함유 섭생법, 예를 들면 CAP(사이클로포스파미드, 독소루비신과 프레드니손), CHOP(사이클로포스파미드, 빈크리스틴, 프레드니손과 독소루비신), VAD(빈크리스틴, 독소루비신과 덱사메타손), MP(멜팔란과 프레드니손) 및 다른 세포독성 및/또는 화학치료법에 사용되는 치료제, 예를 들면 미토크산트론, 다우노루비신, 이다루비신, 아스파라기나제, 및 대사길항물질, 이를테면, 한정하는 것은 아니지만, 시타라빈, 메톡트렉세이트, 5-플루오로우라실 데카르바진, 6-티오구아닌, 6-메르캅토퓨린, 및 넬라라빈이 있으며; 다른 항암 모노클론 항체 요법(예를 들면, 알렘투주맙(Campath®) 또는 악성 B 세포 상의 CD52 세포 표면 당단백질을 표적으로 하는 다른 항-CD52 항체; 리툭시맵(Rituxan®), 완전히 사람의 항체 HuMax-CD20, R-1594, IMMU-106, TRU-015, AME-133, 토시투모맙/I-131 토시투모맙(Bexxar®), 이브리투모맙 티욱세탄(Zevalin®), 또는 악성 B 세포 상의 CD20 항원을 표적으로 하는 다른 어떠한 치료적 항-CD20 항체; 항-CD19 항체(예를 들면, MT103, 이중특이적 항체); 항-CD22 항체(예를 들면, 사람화된 모노클론 항체 에프라투주맙); 베바시주맙(Avastin®) 또는 사람 혈관 내피 성장 인자를 표적으로 하는 다른 항암 항체; 악성 B 세포 상의 CD22 항원을 표적으로 하는 항-CD22 항체(예를 들면, 모노클론 항체 BL-22, 알파CD22 독소); 대식세포 콜로니 자극 인자를 표적으로 하는 α-M-CSF 항체; 다발성 골수종에서 과발현되는 핵 인자-카파B(RANK) 및 그것의 리간드(RANKL)의 수용체 활성화제를 표적으로 하는 항체; 악성 B 세포 상의 CD23 항원을 표적으로 하는 항-CD23 항체(예를 들면, IDEC-152); CD80 항원을 표적으로 하는 항-CD80 항체(예를 들면, IDEC-114); 악성 B 세포 상의 CD38 항원을 표적으로 하는 항-CD38 항체; 악성 B 세포 상에 발현된 주요 조직적합성 복합체 클래스 II 수용체를 표적으로 하는 항체(항-MHC 항체); 악성 B 세포 상의 CD40 항원을 표적으로 하는 다른 항-CD40 항체(예를 들면, SGN-40; 및 2004년 11월 4일 출원된, "Antagonist Anti-CD40 Monoclonal Antibodies and Methods for Their Use" 명칭의 PCT/US2004/037152호(Attorney Docket No. PP20107.004 (035784/282916))에 개시된 바와 같이, CD40L-매개 CD40 신호전달을 차단하는 CHIR-12.12 및CHIR-5.9와 같은 다른 길항제 항-CD40 항원, 및 이들의 항원-결합 단편; 종양 괴사 인자-관련 아포프토시스-유도 리간드 수용체 1(TRAIL-R1)(예를 들면, 작용성 사람 모노클론 항체 HGS-ETR1) 및 다수의 고형 종양 및 조혈 기원의 종양 상에 발현된 TRAIL-R2를 표적으로 하는 항체; 소분자-기초 암 치료법, 이를테면, 한정하는 것은 아니지만, 미세소관 및/또는 토포이소머라제 억제제(예를 들면, 유사분열 억제제 돌라스타틴 및 돌라스타틴 유사체; 튜불린-결합제 T900607; XL119; 및 토포이소머라제 억제제 아미노캄프토테신), SDX-105(벤다무스틴 염산염), 익사베필론(에포틸론 유사체, BMS-247550으로도 언급됨), 단백질 키나제 C 억제제, 예를 들면 미도스타우린(PKC-412, CGP 41251, N-벤조일스타우로스포린), 피크산트론, 엘록사틴(항신생물제), 가니트 (질산 갈륨), Thalomid® (티알리도미드), 티알리도미드의 면역조절 유도체(예를 들면 레블리미드(이전에는 레비미드)), AffinitakTM(단백질 키나제 C-알파의 안티센스 억제제), SDX-101(R-에토돌락, 악성 림프구의 아포프토시스를 유도함), 클로파라빈과 같은 2차 생성 퓨린 뉴클레오시드 유사체, 암세포에 의한 단백질 Bcl-2의 생성 억제제(예를 들면, 안티센스 제제 오블리머센 및 Genasense®), 프로테아좀 억제제 (예를 들면, VelcadeTM(보테조밉)), 소분자 키나제 억제제(예를 들면, CHIR-258), 소분자 VEGF 억제제(예를 들면, ZD-6474), 열 쇼크 단백질(HSP) 90의 소분자 억제제(예를 들면, 17-AAG), 히스톤 디아세틸라제의 소분자 억제제(예를 들면, 하이브리드/극성 세포분화 HPC) 제제, 예를 들면 수베라닐로히드록시암산(SAHA), 및 FR-901228) 및 아포프토시스 제제, 예를 들면 Trisenox®(삼산화 비소) 및 Xcytrin®(모텍사핀 가돌리늄); 백신/면역치료법-기반 암 치료법, 이를테면, 한정하는 것은 아니지만, 백신 접근법(예를 들면, Id-KLH, 발암성 파지(oncophage), 비탈레틴), 개인화된 면역요법 또는 활성 이디오타입 면역요법(예를 들면, MyVax® 개인화된 면역요법, 이전에는 GTOP-99로 표시됨), Promune®(CpG 7909, 톨(toll)-유사 수용체 9 (TLR9)에 대한 합성 작용제), 인터페론-알파 치료법, 인터류킨-2(IL-2) 치료법, IL-12 치료법, IL-15 치료법, 및 IL-21 치료법; 스테로이드 치료법; 또는 다른 암 치료법; 이때 추가의 암 치료법은 길항제 항-CD40 항체 치료법 전에, 중에, 또는 후에 투여된다.
피험체가, 한정하는 것은 아니지만, 본원 상기에 개시된 고형 종양을 포함한 CD40-발현 신생 세포를 포함하는 고형 종양에 대하여 치료받는 경우, 본원에 설명된 길항제 항-CD40 항체 또는 이들의 항원-결합 단편은, 한정하는 것은 아니지만, 관심대상의 고형 종양의 치료에 사용하기 위하여 의도된 수술, 방사선 치료법, 화학치료법, 사이토카인 치료법, 또는 다른 모노클론 항체를 포함한 하나 이상의 다른 암 치료법과 조합하여 투여될 수 있으며, 이때 추가 암 치료법은 항-CD40 항체 치료 전에, 중에, 또는 후에 투여된다.
그러므로, 조합된 치료법이 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 다른 치료제, 예를 들면 화학요법, 방사선 요법, 다른 항암 항체 요법, 소분자-기초 암 치료법, 또는 백신/면역요법-기초 암 치료법과 조합하여 투여하는 것을 포함하는 경우에, 본 발명의 방법은 별도의 제형 또는 단일 약제학적 제형을 사용한 공동투여, 또는 어떤 순서로든 연속적 투여를 포함한다. 본 발명의 방법이 조합된 치료 섭생을 포함하는 경우에, 이들 치료법은 동시에, 즉 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편이 다른 암 치료법과 동시적으로 또는 그것과 동일한 시간 틀 안에 투여될 수 있다(즉, 치료법은 병행하여 진행되지만, 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 정확히 다른 암 치료법과 동일한 시간에 투여되지는 않는다). 대안적으로, 본 발명의 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 또한 다른 암 치료법 전에 또는 그 후에 투여될 수 있다. 상이한 암 치료법의 순차적인 투여는 치료된 환자가 첫 번째 치료 과정에 반응하여 완화 또는 재발의 가능성이 감소되는 지의 여부에 관계없이 수행될 수 있다. 조합된 치료법이 세포독성제의 투여와 조합하여 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 투여를 포함하는 경우, 바람직하게는 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 세포독성제의 투여보다 앞서 투여되는 것이 좋다.
본 발명의 일부 구체예에서, 본원에 설명되는 길항제 항-CD40 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편은 화학치료와 조합되어, 그리고 임의적으로 자가 골수 이식과 조합되어 투여되는데, 이때 항체 및 화학치료제(들)은 순차적으로, 어떤 순서로든, 또는 동시에(즉, 동시에 또는 동일한 시간 틀 안에) 투여될 수 있다. 적합한 화학치료제의 예로는, 한정하는 것은 아니지만, 플루다라빈 또는 플루다라빈 포스페이트, 클로람부실, 빈크리스틴, 펜토스타틴, 2-클로로디옥시아데노신(클라드리빈), 사이클로포스파미드, 독소루비신, 프레드니손, 및 이들의 조합, 예를 들면 안트라사이클린-함유 섭생, 예를 들면 CAP(사이클로포스파미드, 독소루비신과 프레드니손), CHOP(사이클로포스파미드, 빈크리스틴, 프레드니손과 독소루비신), VAD(빈크리스틴, 독소루비신과 덱사메타손), MP(멜팔란과 프레드니손), 및 다른 세포독성 및/또는 화학치료에 사용되는 치료제, 예를 들면 미토크산트론, 다우노루비신, 이다루비신, 아스파라기나제, 및 대사길항물질, 이를테면, 한정하는 것은 아니지만, 시타라빈, 메톡트렉세이트, 5-플루오로우라실 데카르바진, 6-티오구아닌, 6-메르캅토퓨린, 및 넬라라빈이 있다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 길항제 항-CD40 항체 또는 이들의 항원-결합 단편은 화학치료제로 처리하기 전에 투여된다. 대안적 구체예에서, 길항제 항-CD40 항체자 화학치료제로 치료한 후에 투여된다. 또 다른 구체예에서, 화학치료제는 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편과 동시에 투여된다.
따라서, 예를 들면, 일부 구체예에서, 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 플루다라빈 또는 플루다라빈 포스페이트와 조합하여 B 세포-관련 암에 걸린 피험체에게 투여된다. 이러한 한 구체예에서, 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 플루다라빈 또는 플루다라빈 포스페이트의 투여 전에 투여된다. 대안적 구체예에서, 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 플루다라빈 또는 플루다라빈 포스페이트로 치료한 후에 투여된다. 또 다른 구체예에서, 플루다라빈 또는 플루다라빈 포스페이트는 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편과 동시에 투여된다.
본 발명의 다른 구체예에서, 알킬화제인 클로람부실은 본원에 설명된 길항제 항-CD40 항체, 또는 그것의 항원-결합 단편과 조합하여 B 세포-관련 암에 걸린 피험체에게 투여된다. 이러한 한 구체예에서, 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 클로람부실의 투여 전에 투여된다. 대안적 구체예에서, 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 클로람부실로 치료한 후에 투여된다. 또 다른 구체예에서, 클로람부실은 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편과 동시에 투여된다.
또 다른 구체예에서, 안트라사이클린-함유 섭생, 예를 들면 CAP(사이클로포스파미드, 독소루비신과 프레드니손) 및 CHOP(사이클로포스파미드, 빈크리스틴, 프레드니손과 독소루비신)은 본원에 설명된 길항제 항-CD40 항체, 또는 그것의 항원-결합 단편의 투여와 조합될 수 있다. 이러한 한 구체예에서, 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 안트라사이클린-함유 섭생의 투여 전에 B 세포-관련 암에 걸린 피험체에게 투여된다. 다른 구체예에서, 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 안트라사이클린-함유 섭생으로 치료된 후에 피험체에게 투여된다. 또 다른 구체예에서, 안트라사이클린-함유 섭생은 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편과 동시에 피험체에게 투여된다.
대안적 구체예에서, 본원에 설명된 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 알렘투주맙(Campath®; Berlex Laboratories(캘리포니아주 리치몬드 소재)에 의해 배급됨)과 조합하여 B 세포-관련 암에 걸린 피험체에게 투여된다. 알렘투주맙은 악성 B 세포 상에 발현된 CD52 항원을 표적으로 하는 재조합 사람화된 모노클론 항체(Campath-1H)이다. 이러한 한 구체예에서, 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 알렘투주맙의 투여 전에 투여된다. 다른 구체예에서, 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 알렘투주맙으로 치료한 후에 투여된다. 또 다른 구체예에서, 알렘투주맙은 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편과 동시에 투여된다.
대안적 구체예에서, 본원에 설명된 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 악성 B 세포 상의 CD20 항원을 표적으로 하는 치료적 항-CD20 항체, 예를 들면 리툭시맵(Rituxan®), 완전히 사람의 항체 HuMax-CD20, R-1594, IMMU-106, TRU-015, AME-133, 토시투모맙/I-131 토시투모맙(Bexxar®), 또는 이브리투모맙 티욱세탄(Zevalin®)과 조합하여 B 세포-관련 암에 걸린 피험체에게 투여된다. 이러한 한 구체예에서, 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 항-CD20 항체의 투여 전에 피험체에게 투여된다. 다른 구체예에서, 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 항-CD20 항체로 치료한 후에 투여된다. 또 다른 구체예에서, 항-CD20 항체는 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편과 동시에 피험체에게 투여된다.
본 발명의 항-CD40 항체와 조합하여 사용될 수 있는 B 세포-관련 암의 치료를 위해서 의도된 모노클론 항체의 다른 예는, 한정하는 것은 아니지만, 예를 들면 국제 특허출원 PCT/US2004/037152호(Attorney Docket No. PP20107.004 (035784/282916)), 발명의 명칭 "Antagonist Anti-CD40 Monoclonal Antibodies and Methods for Their Use", 2004년 11월 4일 출원)에 개시된, 완전히 사람의 모노클론 항체 CHIR-12.12 및 CHIR-5.9를 포함한 CD40L-매개 CD40 신호전달을 차단하는 다른 길항제 항-CD40 항체를 포함한다.
대안적 구체예에서, 본원에 설명된 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 소분자-기초 암 치료법, 이를테면, 한정하는 것은 아니지만, 미세소관 및/또는 토포이소머라제 억제제(예를 들면, 유사분열 억제제 돌라스타틴 및 돌라스타틴 유사체; 튜불린-결합제 T900607; XL119; 및 토포이소머라제 억제제 아미노캄프토테신), SDX-105(벤다무스틴 염산염), 익사베필론(에포틸론 유사체, BMS-247550으로도 언급됨), 단백질 키나제 C 억제제, 예를 들면 미도스타우린((PKC-412, CGP 41251, N-벤조일스타우로스포린), 피크산트론, 엘로크사틴(항신생물제), 가니트 (질산 갈륨), Thalomid®(티알리도미드), 티알리도미드의 면역조절 유도체(예를 들면 레블리미드(이전에는 레비미드)), AffinitakTM(단백질 키나제 C-알파의 안티센스 억제제), SDX-101(R-에토돌락, 악성 림프구의 아포프토시스를 유도함), 클로파라빈과 같은 2차 생성 퓨린 뉴클레오시드 유사체, 암세포에 의한 단백질 Bcl-2의 생성 억제제(예를 들면 안티센스 제제 오블리머센 및 Genasense®), 프로테아좀 억제제(예를 들면 VelcadeTM (보르테조밉)), 작은 분자 키나제 억제제(예를 들면 CHIR-258), 소분자 VEGF 억제제(예를 들면 ZD-6474), 열 쇼크 단백질(HSP) 90의 소분자 억제제(예를 들면 17-AAG), 히스톤 디아세틸라제의 소분자 억제제(예를 들면 하이브리드/극성 세포분화 HPC) 제제, 예를 들면 수베라닐로히드록시암산(SAHA), 및 FR-901228) 및 아포프토시스 제제, 예를 들면 Trisenox®(삼산화 비소) 및 Xcytrin®(모텍사핀 가돌리늄)과 조합하여 B 세포-관련 암에 걸린 피험체에게 투여된다. 이러한 한 구체예에서, 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 소분자-기초 암 치료법의 투여 전에 피험체에게 투여된다. 다른 구체예에서, 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 소분자-기초 암 치료법으로 치료한 후에 피험체에게 투여된다. 또 다른 구체예에서, 소분자-기초 암 치료법은 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편과 동시에 피험체에게 투여된다.
또 다른 구체예에서, 본원에 설명된 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 백신/면역치료법-기초 암 치료법, 이를테면, 한정하는 것은 아니지만, 백신 접근법(예를 들면, Id-KLH, 발암성 파지, 비탈레틴), 개인화된 면역요법 또는 활성 이디오타입 면역요법(예를 들면 MyVax® 개인화된 면역요법, 이전에는 GTOP-99로 표시됨), Promune®(CpG 7909, 톨(toll)-유사 수용체 9(TLR9)에 대한 합성 작용제), 인터페론-알파 치료법, 인터류킨-2(IL-2) 치료법, IL-12 치료법, IL-15 치료법, 및 IL-21 치료법; 또는 스테로이드 치료법과 조합하여 피험체에게 투여될 수 있다. 이러한 한 구체예에서, 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 백신/면역요법-기초 암 치료법의 투여 전에 피험체에게 투여된다. 다른 구체예에서, 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 백신/면역요법-기초 암치료법으로 치료한 후에 피험체에게 투여된다. 또 다른 구체예에서, 백신/면역요법-기초 암 치료법은 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편과 동시에 피험체에게 투여된다.
이러한 한 구체예에서, 본원에 설명된 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 IL-2와 조합하여 사용될 수 있다. 치료된 환자에게서 자연 킬러(NK) 효과기 세포의 수를 증가시키는 것으로 알려져 있는 제제인 IL-2는 본 발명의 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편보다 앞서, 또는 그것과 동시에 투여될 수 있다. 본 발명의 길항제 항-CD40 항체 또는 이것의 항원-결합 단편이 다른 방식의 작용으로서 항체-의존적 세포-매개 세포독성(ADCC)을 가지는 경우, IL-2 투여를 통하여 NK 효과기 세포의 증가된 수는 투여된 길항제 항-CD40 항체 또는 이것의 항원-결합 단편의 증대된 ADCC 활성을 야기할 수 있다. 다른 구체예에서, IL-21이 본원에 설명된 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편과 조합하여 투여되었을 때 NK 세포 활성을 자극하기 위한 면역치료제로서 작용한다.
본 발명의 일부 구체예에서, 피험체는 CD40-발현 신생 세포를 포함하는 고형 종양을 가지고, 본원에 설명된 항-CD40 항체 또는 이들의 항원-결합 단편은 화학치료법 또는 사이토카인 치료법과 조합하여 이 피험체에게 투여되며, 항체 및 화학치료제(들) 또는 사이토카인(들)은 순서대로든지 동시적으로든지(즉, 병행하여 또는 동일한 시간 틀 내에) 연속적으로 투여할 수 있다. CD40-발현 신생 세포를 포함하는 고형 종양을 가진 피험체에 대한 적합한 화학치료제의 예로는, 한정하는 것은 아니지만, 예를 들면 결장암 및 비-작은 세포 폐암을 치료하는 데 사용될 수 있는 CPT-11(Irinotecan), 예를 들면 폐암, 유방암, 및 상피 난소암을 치료하는 데 사용될 수 있는 겜시타빈 및 고형 종양의 치료에 적합한 다른 화학치료제가 있다. 관심대상의 사이토카인으로는, 한정하는 것은 아니지만, 알파 인터페론, 감마 인터페론, 인터류킨-2(IL-2), IL-12, IL-15 및 IL-21, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 또는 이들 사이토카인의 생물학적 활성 변이체가 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 본원에 개시된 항-CD40 항체 또는 이들의 항원-결합 단편은 고형 종양의 치료를 위해 의도된 다른 모노클론 항체와 조합하여 CD40-발현 신생 세포를 포함하는 고형 종양을 가진 피험체에게 투여된다. 따라서, 예를 들면, 피험체가 CD40-발현 암종 세포를 포함하는 유방암에 대한 치료를 받는 경우, 치료는 Her2+ 유방암 세포 상의 Her2 수용체 단백질을 표적으로 하는 Herceptin®(Genentech, Inc., 캘리포니아주 샌프란시스코 소재)의 유효량의 투여와 조합된 본원에 설명된 길항제 항-CD40 항체 또는 이것의 항원-결합 단편의 유효량의 투여를 포함할 수 있다. 마찬가지로, 피험체가 CD40-발현 암종 세포를 포함하는 결장직장암에 대한 치료를 받는 경우, 치료는 종양 혈관신생에서 중요한 역할을 하는 혈관 내피 성장인자(VEGF)에 결합하여 이것을 억제하는 사람화된 모노클론 항체 AvastinTM(베바시주맙이라고도 함; Genentech, Inc., 캘리포니아주 샌프란시스코 소재)의 유효량의 투여와 조합된 본원에 설명된 길항제 항-CD40 항체 또는 이것의 항원-결합 단편의 유효량의 투여를 포함할 수 있다. 본 발명의 항-CD40 항체와 조합하여 사용될 수 있는 고형 종양의 치료에 대하여 의도된 모노클론 항체의 다른 예로는, 한정하는 것은 아니지만, 표피 성장인자 수용체를 표적으로 하는 항-EGFR 항체(예를 들면, IMC-C225(ImClone system, 뉴욕주 뉴욕 소재)(예를 들면, 문헌(Mendelsohn and Baselga (2000) Oncogene 19:6550-6565 및 Solbach et al (2002) Int. J. Cancer 101:390-394)을 참조); IGF-1 수용체 단백질을 표적으로 하는 항-IGF-1 수용체 항체(예를 들면, Maloney et al. (2003) Cancer Res. 63:5073-5083 및 Hailey et al. (2002) Mol. Cancer. Ther. 1:1349-1353); 종양-연관 항원 MUC1을 표적으로 하는 항-MUC1 항체; 세포 증식 및 생존에 관련된 세포 부착 및 신호전달 과정을 조절하는 각각의 인테그린을 표적으로 하는 항-α5β1, 항-αvβ5, 및 항-αvβ3(예를 들면, 문헌(Laidler et al. (2000) Acta Biochimica Polonica 47(4):1159-1170 및 Cruet-Hennequart et al. (2003) Oncogene 22(ll):1688-1702)을 참조); 캐더린 패밀리 구성원을 표적으로 하는 항-P-캐더린 항체(예를 들면, 출원계류 중인 미국 특허출원 제20030194406을 참조); 내피세포 특이적 부착 분자의 혈관형성-관련 기능을 표적으로 하는 항-VE-캐더린 항체(예를 들면, 문헌(Liao et al. (2002) Cancer Res. 62:2567-2575)을 참조); 및 예를 들면, 국제 특허출원 PCT/US2004/037152(Attorney Docket No. PP20107.004 (035784/282916), 발명의 명칭 "Antagonist Anti-CD40 Monoclonal Antibodies and Methods for Their Use", 2004년 11월 4일 출원)에 개시된, 완전히 사람의 모노클론 항체 CHIR-12.12 및 CHIR-5.9를 포함한 CD40L-매개 CD40 신호전달을 차단하는 다른 길항제 항-CD40 항체가 있다.
조합 치료는 또한 자가면역 및/또는 염증 성분을 포함하는 CD40-연관 질병을 가진 피험체에 대하여 고려된다. 이 방식으로, 피험체가, 한정하는 것은 아니지만, 본원에 개시된 질병들을 포함한 자가면역 및/또는 염증성 질병에 대하여 치료받는 경우, C4BP-매개 CD40 신호전달을 표적으로 하는 본 발명의 길항제 항-CD40 항체 또는 이들의 항원-결합 단편은 자가면역 및 염증성 질병의 치료에 유용한 것으로 공지된 또는 사용되어온, 또는 현재 사용 중인 어떤 제제 또는 제제들의 조합을 포함한, 자가면역 및 염증성 질병에 대한 어떤 공지된 치료법과 조합하여 투여될 수 있다. 이러한 치료법과 치료제는, 한정하는 것은 아니지만, 수술 또는 수술 과정(예를 들면, 비장 절제술, 림프선 절제술, 갑상선 절제술, 플라스마포레시스(plasmaphoresis), 류코포레시스(leukophoresis), 세포, 조직, 또는 기관 이식, 장 과정, 기관 관류 등), 방사선 치료법, 스테로이드 치료법 및 비-스테로이드 치료법과 같은 치료법, 호르몬 치료법, 사이토카인 치료법, 피부병학적 제제를 통한 치료법(예를 들면, 알레르기, 접촉 피부염, 건선과 같은 피부 상태를 치료하는 데 사용되는 국소 제제), 면역억제 치료법, 및 다른 항-염증성 모노클론 항체 치료법 등이 있다. 이 방식으로, 본원에 설명된 길항제 항-CD40 항체 또는 이들의 항원-결합 단편은, 한정하는 것은 아니지만, 수술, 기관 관류, 방사선 치료법, 스테로이드 치료법, 비-스테로이드 치료법, 항생제 치료법, 항진균 치료법, 호르몬 치료법, 사이토카인 치료법, 피부병학적 제제를 통한 치료법(예를 들면, 알레르기, 접촉 피부염, 건선과 같은 피부 상태를 치료하는 데 사용되는 국소 제제), 면역억제 치료법, 및 다른 항-염증성 모노클론 항체 치료법 등을 포함한 하나 이상의 다른 치료법과 조합하여 투여된다.
본 발명의 방법은 자가면역 질병 및/또는 염증성 질병을 가진 피험체에 대한 조합된 치료 섭생을 포함하는 경우, 이들 치료법은 동시적으로 적용할 수 있는데, 즉, 길항제 항-CD40 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 다른 치료법과 동시에 또는 동일한 시간 틀 내에 투여된다(즉, 치료법들은 동시적으로 진행되지만, 항-CD40 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 다른 치료법과 정확히 동일한 시간에 투여되지는 않는다). 대안적으로, 본 발명의 길항제 항-CD40 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 또한 다른 치료 전에 또는 후에 투여될 수 있다. 다른 치료법의 연속적인 적용은 치료받은 피험체가 첫 번째 과정의 치료에 반응하여 완화 또는 재발의 가능성을 감소시키는지 여부와 관계없이 수행될 수 있다.
본 발명의 일부 구체예에서, 본원에 설명된 길항제 항-CD40 항체 또는 이들의 항원-결합 단편은 면역억제 약물 또는 항-염증 약물과 조합하여 투여되고, 항체 및 치료제(들)는 순서대로든지 동시적으로든지(즉, 동시에 또는 동일한 시간 틀 내에) 연속적으로 투여할 수 있다. 본원의 길항제 항-CD40 항체와 조합하여 투여될 수 있는 적합한 면역억제 약물의 예로는, 한정하는 것은 아니지만, 메토트랙세이트, 사이클로포스파미드, 미조리빈, 클로람부실, 사이클로스포린, 예를 들면 에어로졸화된 사이클로스포린(예를 들면, 본원에 그 전체로서 참고 인용된 미국 특허출원 공보 US20020006901호를 참조), 타크로리무스(FK506; ProGrafTM), 미코페놀레이트 모페틸, 및 아자티오프린(6-메르캡토퓨린), 시롤리무스(라파마이신), 디옥시스페르구아린, 레프루노미드 및 이것의 말로노니트릴로아미드 유사체, 및 면역억제 단백질, 예를 들면 항-CTLA4 항체 및 Ig 융합, 항-B 림프구 자극제 항체(예를 들면, LYMPHOSTAT-BTM) 및 Ig 융합(BLyS-Ig), 항-CD80 항체 및 에타너셉트(Enbrel®) 뿐만 아니라 항-T 세포 항체, 예를 들면 항-CD3(OKT3), 항-CD4 등이 있다. 적합한 항-염증 제제의 예로는, 한정하는 것은 아니지만, 코르티코스테로이드, 예를 들면 클로베타솔, 할로베타솔, 히드로코르티손, 트리암시놀론, 베타메타손, 플루오시놀, 플루오시노니드, 프레드니손, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론; 비-스테로이드 항-염증 약물(NSAID), 예를 들면 술파살라진, 메사라민을 함유한 의약(5-ASA 제제로 알려짐), 셀레콕십, 디클로페낙, 에토돌락, 펜프로펜, 플루비프로펜, 이부프로펜, 케토프로펜, 메클로파메이트, 멜로시캄, 나부메톤, 나프록센, 옥사프로진, 피록시캄, 로페콕십, 살리실레이트, 술린닥, 및 톨메틴; 항-염증 항체, 예를 들면 아달리무맙(HUMIRA®, TNF-α 길항제) 및 인플릭시맙(Remicade®, TNF-α 길항제) 등이 있다. 다른 구체예에서, 자가면역 및/또는 염증성 질병에 대한 치료를 받은 피험체는 본 발명의 항-CD40 항체, 또는 이들의 적합한 항원-결합 단편을 CD40-발현 세포 상에서 CD40L-매개 CD40 신호전달을 표적으로 하는 다른 길항제 항-CD40 항체, 예를 들면 국제 특허출원 PCT/US2004/037152(Attorney Docket No. PP20107.004 (035784/282916), 발명의 명칭 "Antagonist Anti-CD40 Monoclonal Antibodies and Methods for Their Use", 2004년 11월 4일 출원)에 개시된, 길항제 항-CD40 항체 CHIR-12.12 및 CHIR-5.9 및 이들의 항원-결합 단편과 조합하여 투여된다.
이식 거부 및 이식 편대 숙주병은 초급성(체액성), 급성(T 세포 매개), 또는 만성(미지의 병인론), 또는 이들의 조합일 수 있다. 따라서, 본 발명의 길항제 항-CD40 항체는, 한정하는 것은 아니지만, 간, 신장, 췌장, 췌장 섬 세포, 소장, 폐, 심장, 각막, 피부, 혈관, 뼈, 이종 또는 자가 골수 등을 포함한 어떤 조직의 초급성, 급성 및/또는 만성 이식 거부와 연관된 거부 및/또는 징후를 예방 및/또는 개선하기 위하여 일부 구체예에서 사용된다. 이식 조직은 임의의 기증자로부터 얻어서 임의의 수용자 숙주 내에 이식할 수 있으며, 따라서 이식 과정은 동물 조직을 사람에게 이식하는 것(예를 들면, 이종이식), 한 사람의 조직을 다른 사람에게 이식하는 것(예를 들면, 동종이식), 및/또는 사람 몸의 일부의 다른 부분에 이식하는 것(예를 들면, 자가이식)을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체로 치료하면 이식 후유증, 예를 들면 열, 식욕감퇴, 혈류운동 장애, 백혈구 감소증, 이식된 기관/조직의 백혈구 침윤뿐만 아니라 기회 감염을 감소시킬 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 길항제 항-CD40 항체는 초급성, 급성 및/또는 만성 거부 및/또는 이식 편대 숙주병과 같은 이식 거부를 치료 및/또는 예방하기 위하여 단독으로 또는 면역억제 약물과 조합하여 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 길항제 항-CD40 항체가 이식 거부를 치료하는 데 사용되는 일부 구체예에서, 항체는, 한정하는 것은 아니지만, 메토트렉세이트; 사이클로포스파미드; 미조리빈; 클로람부실; 사이클로스포린, 예를 들면 에어로졸화된 사이클로스포린(예를 들면, 본원에 그 전체로서 참고 인용된 미국 특허출원 공보 US20020006901호를 참조), 타크로리무스(FK506; ProGraFTM), 미코페롤레이트 모페틸, 및 아자티오프린(6-메르캅토퓨린), 시롤리무스(라파마이신), 디옥시스페르구알린, 레플루노미드 및 그것의 말로노니트릴로아미드 유사체; 면역억제 단백질, 예를 들면 항-CTLA 항체 및 Ig 융합, 항-B 림프구 자극자 항체(예를 들면, LYMPHOSTAT-BTM) 및 Ig 융합(BLyS-Ig), 항-CD80 항체 및 에타너셉트(Enbrel®) 뿐만 아니라, 항-T 세포 항체, 예를 들면 항-CD4(OKT3), 항-CD4 등; 또는 CD40-발현 세포 상에서 CD40L-매개 CD40 신호전달을 표적으로 하는 다른 길항제 항-CD40 항체, 예를 들면 CHIR-12.12 또는 CHIR-5.9 항체 또는 이것의 항원-결합 단편을 포함한 적합한 면역억제 약물과 조합하여 사용될 수 있다.
이와 같이, 본 발명의 조성물 및 방법은 이식 수용자들, 예를 들면 폐 이식을 받은 자들의 증상 및 결과를 더욱 향상시키기 위해서 다른 약물과 조합하여 사용된다고 구체적으로 고려된다. 따라서, 일부 구체예에서, 본 발명의 길항제 항-CD40 항체는 이식 거부를 치료하는 데 단독으로 또는 비경구 및/또는 경구 투여된 사이클로스포린, 예를 들면 경구 사이클로스포린, 주사가능한 사이클로스포린, 에어로졸화된(예를 들면, 흡입된) 사이클로스포린, 및 이들의 조합과 조합하여 사용된다. 적어도 치료의 성분이 에어로졸화된 사이클로스포린인 일부 구체예에서, 사이클로스포린은 예를 들면 가압된 전달 장치 또는 흡입치료기를 사용한 에어로졸 분사 형태로 사이클로스포린의 흡입에 의하여 수용자의 폐에 전달된다. 사이클로스포린은 건조 분말 또는 습윤 형태로 투여될 수 있다.
일부 다른 구체예에서, 본 발명의 길항제 항-CD40 항체는 류마티스 관절염을 치료 및/또는 예방하기 위하여 단독으로 또는 면역억제 약물과 조합하여 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 길항제 항-CD40 항체가 류마티스 관절염을 치료하는 데 사용되는 일부 구체예에서, 항체는, 한정하는 것은 아니지만, 메토트렉세이트; 사이클로포스파미드; 미조리빈; 클로람부실; 사이클로스포린, 타크로리무스(FK506; PROGRAFTM), 미코페롤레이트 모페틸, 및 아자티오프린(6-메르캅토퓨린), 시롤리무스(라파마이신), 디옥시스페르구알린, 레플루노미드 및 그것의 말로노니트릴로아미드 유사체; 면역억제 단백질, 예를 들면 항-CTLA 항체 및 Ig 융합, 항-B 림프구 자극자 항체(예를 들면, LYMPHOSTAT-BTM) 및 Ig 융합(BLyS-Ig), 항-CD20 항체(예를 들면, RITUXAN®); 완전히 사람의 항체 HuMax-CD20, R-1594, IMMU-106, TRU-015, AME-133, 토시투모맙/I-131, 토시투모맙(Bexxar®), 이브리투모맙 티툭세탄(Zevalin®); 항-CD80 항체 및 에타너셉트(Enbrel®) 뿐만 아니라, 항-T 세포 항체, 예를 들면 항-CD4(OKT3), 항-CD4 등; 또는 CD40-발현 세포 상에서 CD40L-매개 CD40 신호전달을 표적으로 하는 다른 길항제 항-CD40 항체, 예를 들면 CHIR-12.12 또는 CHIR-5.9 항체 또는 이것의 항원-결합 단편을 포함한 적합한 면역억제 약물과 조합하여 사용될 수 있다. 상기에서 논의한 바와 같이, 치료 효과는 임의의 수단을 사용하여서 평가할 수 있으며, 한정하는 것은 아니지만, 아메리칸 칼리지 오브 류마톨로지(American College of Rheumatology) 기준, 유럽피언 리그 오브 류마티즘(European League of Rheumatism) 기준 또는 어떤 다른 기준에 의하여 규정된 임상 반응에 의하여 측정된 효과를 포함한다. 예를 들면, 문헌(Felson et al. (1995) Arthritis. Rheum. 38:727-35 및 van Gestel et al. (1996) Arthritis Rheum. 39:34-40)을 참조하라.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 길항제 항-CD40 항체는 다발성 경화증을 치료 및/또는 예방하기 위하여 단독으로 또는 면역억제 약물과 조합하여 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 길항제 항-CD40 항체가 다발성 경화증을 치료하는 데 사용되는 일부 구체예에서, 항체는, 한정하는 것은 아니지만, 메토트렉세이트; 사이클로포스파미드; 미조리빈; 클로람부실; 사이클로스포린, 타크로리무스(FK506; PROGRAFTM), 미코페롤레이트 모페틸, 및 아자티오프린(6-메르캅토퓨린), 시롤리무스(라파마이신), 디옥시스페르구알린, 레플루노미드 및 그것의 말로노니트릴로아미드 유사체; 면역억제 단백질, 예를 들면 항-CTLA 항체 및 Ig 융합, 항-B 림프구 자극자 항체(예를 들면, LYMPHOSTAT-BTM) 및 Ig 융합(BLyS-Ig), 항-CD20 항체(예를 들면, RITUXAN®); 완전히 사람의 항체 HuMax-CD20, R-1594, IMMU-106, TRU-015, AME-133, 토시투모맙/I-131, 토시투모맙(Bexxar®), 이브리투모맙 티툭세탄(Zevalin®); 항-CD80 항체 및 에타너셉트(Enbrel®) 뿐만 아니라, 항-T 세포 항체, 예를 들면 항-CD4(OKT3), 항-CD4 등; 또는 CD40-발현 세포 상에서 CD40L-매개 CD40 신호전달을 표적으로 하는 다른 길항제 항-CD40 항체, 예를 들면 CHIR-12.12 또는 CHIR-5.9 항체 또는 이것의 항원-결합 단편을 포함한 적합한 면역억제 약물과 조합하여 사용될 수 있다.
나아가, 2개 이상의 치료제 및 본원에 설명된 길항제 항-CD40 항체와의 조합 치료는 또한 자극된 CD40-발현 세포를 포함한 질병 상태, 예를 들면 B 세포-관련 암, 고형 종양 및 자가면역 및/또는 염증 장애의 치료에 사용될 수 있다. 한정하지 않고, 예들은 삼중 조합 치료를 포함하는데, 이때 두 화학치료제는 본원에 설명된 길항제 항-CD40 항체와 조합하여 투여되고, 화학치료제 및 다른 항암 모노클론 항체(예를 들면, 알렘투주맙, 리툭시맙, 항-CD23 항체 또는 다른 길항제 항-CD40 항체, 예를 들면 CD40L-매개 CD40 신호전달을 표적으로 하는 CHIR-12.12 또는 CHIR-5.9)는 본원에 설명된 길항제 항-CD40 항체와 조합하여 투여된다. 이러한 조합의 예로는, 한정하는 것은 아니지만, 플루다라빈, 사이클로포스파미드, 및 본 발명의 길항제 항-CD40 항체, 또는 이것의 항원-결합 단편의 조합; 플루다라빈, 항-CD20 항체, 예를 들면 리툭시맙(Rituxan®; IDEC Pharmaceuticals Corp., 캘리포니아주 샌디에고 소재), 및 본 발명의 길항제 항-CD40 항체 또는 이것의 항원-결합 단편의 조합; 플루다라빈, CD40L-매개 CD40 신호전달을 표적으로 하는 다른 길항제 항-CD40 항체, 예를 들면 CHIR-12.12 또는 CHIR 5.9 및 C4BP-매개 CD40 신호전달을 표적으로 하는 본 발명의 길항제 항-CD40 항체, 또는 이것의 항원-결합 단편의 조합이 있다.
나아가, 본원에 설명된 길항제 항-CD40 항체는 제제, 즉 예를 들면 CD40을 발현하는 세포를 확인하기 위해 사용될 수 있는 표지된 항체를 제공하는 데 사용될 수 있다. 이것은 미지의 샘플의 세포 유형을 결정하는 데 매우 유용할 수 있다. 모노클론 항체의 패널은 종 및/또는 기관 유형에 의해서 조직을 확인하는 데 사용될 수 있다. 유사한 방식으로, 이들 항-CD40 항체는 오염에 대하여 조직 배양 세포를 스크린하는 데 사용될 수 있다(즉, 배양물 중의 CD40-발현 및 비-CD40 발현 세포의 혼합물의 존재의 스크린).
약제학적 제형 및 투여 방식
본 발명의 길항제 항-CD40 항체는 CD40-연관 질병, 예를 들면 자가면역, 초과민성, 염증, 자기-항체 생성, 기관 또는 조직 이식 거부, 이식 편대 숙주병 및 B-세포 림프종 및 고형 종양과 같은 CD40-발현 암을 방지 또는 치료하기에 치료적으로 유효한 농도로 투여된다. 이 목적을 달성하기 위해서, 항체는 당업계에 공지되어 있는 다양한 허용되는 부형제를 사용하여 제형될 수 있다. 전형적으로 항체는 정맥내 또는 복강내 주사 중 어느 하나에 의해 투여된다. 이 투여를 이루기 위한 방법은 당업자들에게 공지되어 있다. 또한 국소적으로 또는 경구로 투여될 수 있거나 점막을 통해 전달할 수 있는 조성물을 얻는 것도 가능하다.
정맥내 투여는 투여될 항-CD40 항체에 따라 바람직하게는 약 1 내지 약 10시간, 더 바람직하게는 약 1 내지 약 8시간, 더 바람직하게는 약 2 내지 약 7시간, 보다 더 바람직하게는 약 4 내지 약 6시간에 걸쳐 주입에 의해 일어나는 것이 바람직하다. 약제학적 조성물을 사용한 초기 주입은 약 4 내지 약 6시간의 주기에 걸쳐 제공될 수 있으며, 이어지는 주입은 보다 빠르게 전달된다. 계속되는 주입은 약 1 내지 약 6시간에 걸쳐, 예를 들면 약 1 내지 약 4시간, 약 1 내지 약 3시간, 또는 약 1 내지 약 2시간에 걸쳐 투여될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 그것의 의도된 투여 경로와 적합하도록 제형된다. 가능한 투여 경로의 예를 들면 비경구(예를 들면, 정맥내(IV), 근육내(IM), 피부내, 피하(SC), 또는 주입), 경구 및 폐(예를 들면 흡입), 비강, 경피(국소적), 점막을 통하여, 그리고 직장 투여가 있다. 비경구, 피내, 또는 피하 적용을 위해 사용된 용액 또는 현탁액은 다음 성분들을 포함할 수 있다: 멸균 희석제, 예를 들면 주사용 물, 식염수용액, 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항균제, 예를 들면 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예를 들면 아스코르브산 또는 이황화 나트륨; 킬레이트화제, 예를 들면 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충제, 예를 들면 아세테이트, 시트레이트, 또는 포스페이트 및 염화 나트륨 또는 덱스트로스와 같은 등장성 조절제. pH는 산 또는 염기, 예를 들면 염산 또는 수산화 나트륨을 사용하여 조절될 수 있다. 비경구용 제제는 유리 또는 플라스틱으로 만들어진 앰풀, 일회용 주사바늘, 또는 다중 용량 바이알에 봉함될 수 있다.
항-CD40 항체는 통상적으로는 약제학적으로 허용되는 완충제, 예를 들면 멸균 식염수, 멸균 완충수, 프로필렌 글리콜, 이것들의 조합 등에 담겨 표준 기법에 의해 제공된다. 비경구로 투여될 수 있는 제제의 제조 방법은 본원에 참고 인용된 문헌(Remington's Pharniaceutical Sciences(18th ed.; Mack Publishing Company, Eaton, Pennsylvania, 1990))에 설명된다. 또한, 예를 들면, 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 안정화된 항체 약제학적 제형을 설명하는 국제 특허 WO 98/56418호를 참조하라.
투여된 하나 이상의 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 양은 과도한 실험이 없이도 당업자에 의해 용이하게 결정된다. 하나 이상의 길항제 항-CD40 항체 (또는 그것의 항원-결합 단편)의 투여 방식 및 각각의 양에 영향을 주는 요인들로는, 한정하는 것은 아니지만, 질병의 중증, 병력, 치료를 진행하게 될 개체의 연령, 신장, 체중, 건강 상태 및 신체 조건이 있다. 마찬가지로 투여될 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 양도 투여 방식에 따라, 그리고 환자가 이 항-종양제를 단일 또는 다중 투여받을 것인지에 따라 좌우될 것이다. 일반적으로, 항-CD40 또는 그것의 항원-결합 단편의 더 많은 단위용량은 치료를 진행하는 환자의 증가하는 체중에 따라 바람직하다. 투여될 항-CD40 또는 그것의 항원-결합 단편의 용량은 약 0.003 mg/kg 내지 약 50 mg/kg의 범위, 바람직하게는 0.01 mg/kg 내지 약 40 mg/kg의 범위로 투여된다. 그러므로 용량은 예를 들면 0.01 mg/kg, 0.03 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 1.5 mg/kg, 2 mg/kg, 2.5 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg, 또는 50 mg/kg일 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 방법은 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 단위용량을 다중 투여하는 것을 포함한다. 방법은 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 포함하는 약제학적 조성물의 더 치료적으로 유효한 용량을 1회, 2회, 3회 , 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회, 15회, 20회, 25회, 30회, 35회, 40회, 또는 그 이상 투여하는 것을 포함한다. 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 포함하는 약제학적 조성물의 다중 용량의 투여 빈도와 기간은 치료를 받는 피험체의 질병, 질병의 상태 및 병력에 좌우된다. 더욱이 치료적 유효량의 항체로 피험체를 치료하는 것은 단일 치료를 포함하며, 또는 바람직하게는 일련의 치료를 포함할 수 있다. 바람직한 예에서, 피험체는 약 0.1 내지 20 mg/kg 체중의 범위로, 약 1 내지 10주 동안, 바람직하게는 약 2 내지 8주 동안, 더 바람직하게는 약 3 내지 7주 동안, 보다 더 바람직하게는 약 4, 5, 또는 6주 동안, 1주에 1회로 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편으로 치료된다. 치료는 재발을 방지하기 위해 또는 재발의 징후가 보일 때 해마다 실시될 수 있다. 또한 치료에 사용된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 유효량은 특정 치료 과정에 대하여 증가 또는 감소할 수 있다고 이해될 것이다. 단위용량의 변화는 본원에 설명되는 바와 같이 진단용 분석 결과로부터 유도되거나 분명해질 수 있다.
그러므로, 한 구체예에서, 투약 섭생은 치료기간의 제1일, 7일, 14일 및 21일에 치료적 유효량의 하나 이상의 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 첫 번째 투여하는 것을 포함한다. 다른 구체예에서, 투약 섭생은 치료기간의 주마다 제1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 및 7일에 치료적 유효량의 하나 이상의 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 첫 번째 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 치료기간의 주마다 제1일, 3일, 5일 및 7일에 치료적 유효량의 하나 이상의 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 첫 번째 투여하는 것을 포함하는 투약 섭생; 치료기간의 주마다 제1일과 제3일에 치료적 유효량의 하나 이상의 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 첫 번째 투여하는 것을 포함하는 투약 섭생; 및 치료기간의 주마다 제1일에 치료적 유효량의 하나 이상의 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 첫 번째 투여하는 것을 포함하는 바람직한 투약 섭생을 포함한다. 치료기간은 1주, 2주, 3주, 1개월, 3개월, 6개월 또는 1년을 포함할 수 있다. 치료기간은 하루, 1주일, 2주일, 1개월, 3개월, 6개월, 또는 1년 간격으로 연속적이거나 떨어질 수 있다.
일부 구체예에서, 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 치료적 유효량은 약 0.003 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 40 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 약 0.5 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 약 3 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 약 3 mg/kg 내지 약 25 mg/kg, 약 3 mg/kg 내지 약 20 mg/kg, 약 5 mg/kg 내지 약 15 mg/kg, 약 7 mg/kg 내지 약 12 mg/kg의 범위에 있다. 따라서, 예를 들면, 어떠한 하나의 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 양은 0.003 mg/kg, 0.01 mg/kg, 0.03 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 1.5 mg/kg, 2 mg/kg, 2.5 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg, 또는 50 mg/kg일 수 있으며, 또는 약 0.003 mg/kg 내지 약 50 mg/kg의 범위에 속하는 그런 다른 용량일 수 있다. 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 동일한 치료적 유효량은 항체 투약의 각 주에 걸쳐 투여될 수 있다. 대안적으로, 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 상이한 치료적 유효량이 치료기간의 전 과정에 걸쳐 사용될 수 있다.
다른 구체예에서, 본원에 다른 곳에서 설명된 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 초기 치료적 유효량은 더 낮은 용량 범위(즉, 약 0.003 mg/kg 내지 약 20 mg/kg)에 있을 수 있고, 후속되는 용량은 더 높은 용량 범위(즉, 약 20 mg/kg 내지 약 50 mg/kg)내에 있을 수 있다.
대안적 구체예에서, 본원에 다른 곳에서 설명된 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 초기 치료적 유효량은 더 높은 용량 범위(즉, 약 20 mg/kg 내지 약 50 mg/kg)내에 있을 수 있고, 후속되는 용량은 더 낮은 용량 범위(즉, 약 0.003 mg/kg 내지 약 20 mg/kg)에 있을 수 있다. 따라서, 한 구체예에서, 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 초기 치료적 유효량은 약 20 mg/kg 내지 약 35 mg/kg, 이를테면 약 20 mg/kg, 약 25 mg/kg, 약 30 mg/kg, 및 약 35 mg/kg이고, 후속되는 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 치료적 유효량은 약 5 mg/kg 내지 약 15 mg/kg, 이를테면 약 5 mg/kg, 8 mg/kg, 10 mg/kg, 12 mg/kg, 및 약 15 mg/kg이다.
본 발명의 일부 구체예에서, 길항제 항-CD40 항체 치료법은 길항제 항-CD40 항체 치료법이 필요한 피험체에게 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 "로딩 용량"을 투여함으로써 개시된다. "로딩 용량"이란 피험체에게 투여되는 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 초기 용량을 의미하며, 이때 투여되는 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 용량은 더 높은 용량 범위(즉, 약 20 mg/kg 내지 약 50 mg/kg)에 속한다. "로딩 용량"은 완전한 "로딩 용량"이 약 24시간 주기 안에 투여되는 한 단일 투여로서, 예를 들면 항체 또는 그것의 항원-결합 단편이 IV로 투여되는 단일 주입으로서, 또는 다중 투여로서, 예를 들면 항체 또는 그것의 항원-결합 단편이 IV로 투여되는 다중 주입으로서 투여될 수 있다. "로딩 용량"이 투여된 후에, 환자에게는 하나 이상의 추가의 치료적 유효량의 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편이 투여된다. 계속되는 치료적 유효량은 예를 들면 주 간격 투약 스케쥴에 따라, 또는 매 2주마다 1회씩, 매 3주마다 한 번씩, 또는 매 4주마다 한 번씩 투여될 수 있다. 이러한 구체예에서, 후속되는 치료적 유효량은 보통 더 적은 용량 범위(즉, 0.003 mg/kg 내지 약 20 mg/kg)에 속한다.
대안적으로, 일부 구체예에서, "로딩 용량" 후에 계속되는 치료적 유효량의 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 "유지 스케쥴"에 따라 투여되는데, 이때 치료적 유효량의 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 1개월에 한 번, 매 6주에 한 번, 매 2개월에 한 번, 매 10주에 한 번, 매 3개월에 한 번, 매 14주에 한 번, 매 4개월에 한 번, 매 18주에 한 번, 매 5개월에 한 번, 매 22주에 한 번, 매 6개월에 한 번, 매 7개월에 한 번, 매 8개월에 한 번, 매 9개월에 한 번, 매 10개월에 한 번, 매 11개월에 한 번, 또는 매 12개월에 한 번씩 투여된다. 이러한 구체예에서, 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 치료적 유효량은, 특히 계속되는 용량이 보다 빈번한 간격으로 투여될 때, 예를 들면 매 2주에 한 번 내지는 매 1개월에 한 번씩, 또는 보다 높은 용량 범위(즉, 약 20 mg/kg 내지 약 50 mg/kg)내의 양으로 투여될 때, 특히 덜 빈번한 간격으로 후속 용량이 투여될 때, 예를 들면 약 1개월 내지 약 12개월 떨어져서 후속 용량이 투여될 때 낮은 용량 범위(즉, 0.003 mg/kg 내지 약 20 mg/kg)에 속한다.
본 발명의 방법에 사용하기 위하여 본원에 설명된 약제학적 조성물에 존재하는 길항제 항-CD40 항체는 천연의 것이거나 재조합 기술에 의해 얻을 수 있으며, 예를 들면 마우스, 래트, 토끼, 영장류, 돼지, 및 사람을 포함한 모든 공급원으로부터 얻을 수 있다. 바람직하게는, 이러한 폴리펩티드는 사람 공급원으로부터 유래된 것이고, 더 바람직하게는 하이브리도마 세포주로부터의 재조합, 사람 단백질이다.
본 발명의 방법에 유용한 약제학적 조성물은 본 발명의 길항제 항-CD40 항체의 생물학적 활성 변이체를 포함할 수 있다. 이러한 변이체는 변이체 항체를 포함하는 약제학적 조성물이 피험체에게 투여되었을 때 표준 길항제 항-CD40 항체를 포함하는 약제학적 조성물과 동일한 치료적 효과를 가지도록 표준 폴리펩티드의 원하는 생물학적 활성을 보유하여야 한다. 즉, 변이체 항-CD40 항체는 표준 길항제 항- CD40 항체에 대하여 관찰되는 것과 유사한 방식으로 약제학적 조성물에서 치료적 활성 성분으로서 작용할 것이다. 방법들은 변이체 항-CD40 항체가 원하는 생물학적 활성을 보유하는 지의 여부를 결정하기 위해 당업계에서 사용가능하고, 따라서 약제학적 조성물의 치료적 활성 성분으로서 작용한다. 항체 변이체의 생물학적 활성은 본 발명에 설명된 분석을 포함한, 표준 길항제 항-CD40 항체의 활성을 측정하기 위하여 특별히 고안된 분석법을 사용하여 측정될 수 있다.
본원에 설명된 결합 특성을 가진 길항제 항-CD40 항체 또는 이것의 항원-결합 단편을 치료적 활성 성분으로서 포함하는 약제학적 조성물은 어느 것이든지 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 하나 이상의 길항제 항-CD40 항체 또는 이것의 항원-결합 단편을 포함하는 액체, 동결건조, 또는 분무-건조 조성물은 본 발명의 방법에 따라 피험체에게 계속해서 투여하기 위한 수성 또는 비수성 용액 또는 현탁액으로서 제조될 수 있다. 이들 조성물 각각은 본 발명의 하나 이상의 길항제 항-CD40 항체 또는 이것의 항원-결합 단편을 치료적 또는 예방학적 활성 성분으로서 포함할 것이다. "치료적 또는 예방학적 활성 성분"이란 항-CD40 항체 또는 이것의 항원-결합 단편이 조성물에 특이적으로 혼입되어 약제학적 조성물이 피험체에게 투여될 때 환자에게서 질병의 치료, 방지, 또는 진단과 관련하여 원하는 치료적 또는 예방학적 반응을 야기하는 것을 의미한다. 바람직하게는, 약제학적 조성물은 제조 및 보관 중에 단백질 안정성 및 생물학적 활성의 손실과 관련된 문제점을 최소화하기 위하여 적절한 안정화제, 벌크화제, 또는 둘 다를 포함한다.
제형화제(formulant)는 본 발명의 길항제 항-CD40 항체 또는 이것의 항원-결합 단편을 포함하는 약제학적 조성물에 첨가될 수 있다. 이러한 제형화제로는, 한정하는 것은 아니지만, 오일, 폴리머, 비타민, 탄수화물, 아민산, 염, 완충제, 알부민, 계면활성제, 또는 벌크화제가 있다. 바람직하게는, 탄수화물은 당 또는 당 알코올, 예를 들면 단당류, 이당류, 또는 다당류, 또는 수용성 글루칸을 포함한다. 당 또는 글루칸으로는 프룩토스, 글루코스, 만노스, 소르보스, 자일로스, 말토스, 수크로스, 덱스트란, 풀룰란, 덱스트린, α, β 및 γ 사이클로덱스트린, 가용성 전분, 히드록시에틸 전분, 및 카르복시메틸셀룰로스, 또는 이것들의 혼합물이 있다. "당 알코올"은 히드록실기를 가지는 C4 내지 C8 탄화수소로서 정의되며, 갈락티톨, 이노시톨, 만니톨, 자일리톨, 소르비톨, 글리세롤, 및 아라비톨이 있다. 이들 당 또는 당 알코올은 개별적으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 당 또는 당 알코올 농도는 1.0 % 내지 7 % w/v, 더 바람직하게는 2.0 % 내지 6.0 % w/v이다. 바람직하게는, 아미노산은 카르니틴, 아르기닌, 및 베타인의 좌선성 (L) 형태를 포함하지만, 다른 아미노산도 첨가될 수 있다. 바람직한 폴리머로는 평균 분자량이 2,000 내지 3,000 사이인 폴리비닐피롤리돈(PVP), 평균 분자량이 3,000과 5,000 사이인 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이 있다. 제형에 첨가될 수 있는 계면활성제는 EP 제270,799호 및 제268,110호에 개시되어 있다.
추가적으로, 항체는 폴리머에 공유 콘쥬게이션됨으로써 화학적으로 변형되어 예를 들면 이들의 순환 반감기를 증가시킬 수 있다. 바람직한 폴리머 및 그것들을 펩티드에 부착하는 방법은 본원에 미국 특허 제4,766,106호, 제4,179,337호, 제4,495,285호, 및 제4,609,546호에 개시되어 있으며, 이들 모두는 그 전체로서 본원에 참고 인용된다. 바람직한 폴리머는 폴리옥시에틸화된 폴리올 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다. PEG는 실온에서 물에 녹을 수 있고, 일반식: R(O--CH2--CH2)nO--R로 표시되는데, 이때 R은 수소이거나 알킬기 또는 알칸올기와 같은 보호기일 수 있다. 바람직하게는, 보호기는 1 내지 8 탄소를 가지고, 더 바람직하게는 메틸이다. 기호 n은 양의 정수로, 바람직하게는 1 내지 1,000, 더 바람직하게는 2 내지 500이다. PEG의 바람직한 평균 분자량은 1,000 내지 40,000이고, 더 바람직하게는 2,000 내지 20,000이고, 가장 바람직하게는 3,000 내지 12,000이다. 바람직하게는, PEG는 하나 이상의 히드록시기를 가지고, 더 바람직하게는 말단 히드록시기이다. 바람직하게는, 억제제 상의 자유 아미노기와 반응하기 위해 활성화되는 것은 바로 이 히드록시기이다. 그러나 반응성 기의 유형 및 양은 공유 콘쥬게이트된 PEG/본 발명의 항체를 이루기 위해 달라질 수 있다.
수용성 폴리옥시에틸화된 폴리올 또한 본 발명에 유용하다. 그들의 예로는 폴리옥시에틸화된 소르비톨, 폴리옥시에틸화된 글루코스, 폴리옥시에틸화된 글리세롤(POG) 등이 있다. POG가 바람직하다. 그 이유 중 한 가지는 폴리옥시에틸화된 글리세롤의 글리세롤 백본이 예를 들면 동물 및 사람에게서 모노-, 디-, 트리글리세리드로 자연적으로 발생하는 것과 동일한 백본이기 때문이다. 그러므로, 이런 가지화는 반드시 몸의 외래 제제로서 찾아볼 수 있어야 하는 것은 아니다. POG는 PEG와 동일한 바람직한 평균 분자량 범위를 갖는다. POG에 대한 구조는 문헌(Knauf et al. (1988) J. Bio. Chem. 263:15064-15070)에 있으며, POG/IL-2 콘쥬게이트에 대한 논의는 본원에 그 전체로서 참고 인용된 미국 특허 제4,766,106호에서 확인할 수 있다.
순환성 반감기를 증가시키기 위한 다른 약물 전달 시스템은 리포솜이다. 리포솜 전달 시스템을 제조하는 방법은 문헌(Gabizon et al. (1982) Cancer Research 42:4734; Cafiso (1981) Biochem Biophys Acta 649:129; 및 Szoka (1980) Ann. Rev. Biophys. Eng. 9:467)에서 논의되었다. 다른 약물 전달 시스템도 당업계에 공지되어 있으며, 문헌(Poznansky et al. (1980) Drug Delivery Systems (R.L. Juliano, ed., Oxford, New York), pp. 253; Poznansky (1984) Pharm Revs 36:277)에 설명되어 있다.
약제학적 조성물에 혼입될 제형화제는 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편에 안정성을 제공하여야 한다. 즉, 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 그것의 물리적 및/또는 화학적 안정성을 보유하여야 하고, 원하는 생물학적 활성, 즉 상기에서 규정된 것과 같은 하나 이상의 길항제 활성, 이를테면, 한정하는 것은 아니지만, T 세포에 의해 자극된 정상인 사람 말초 B 세포에 의한 면역글로불린 분비의 억제; Jurkat T 세포에 의해 자극된 정상인 사람 B 세포의 생존 및/또는 증식의 억제; C4BP-발현 세포 또는 가용성 C4BP에 의해 자극된 정상인 사람 B 세포의 생존 및/또는 증식의 억제; 가용성 C4BP 또는 고체상 C4BP에 의해 자극된 임의의 세포에서의 "생존" 항-아포프토시스 세포내 신호의 억제; 가용성 C4BP 또는 고체상 C4BP와 결찰된 임의의 세포에서의 CD40 신호 전달의 억제; 및 본원의 다른 곳에서 나타낸 것과 같이 사람 악성 B 세포의 증식의 억제 활성을 갖는다.
단백질 안정성을 모니터하는 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌(Jones (1993) Adv. Drug Delivery Rev. 10:29-90; Lee, ed. (1991) Peptide and Protein Drug Delivery (Marcel Dekker, Inc., New York, New York))을 참조하라. 일반적으로, 단백질 안정성은 선택된 온도에서 특정 시간 동안 측정된다. 바람직한 구체예에서, 안정한 항체 약제학적 제형은 실온(약 25 ℃)에서 적어도 1개월, 적어도 3개월, 또는 적어도 6개월 동안 보관될 때 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 안정성을 제공하고, 및/또는 약 2 내지 8 ℃에서 적어도 6개월, 적어도 9개월, 적어도 12개월, 적어도 18개월, 적어도 24개월 동안 안정하다.
항체와 같은 단백질은 약제학적 조성물로 제형될 때, 만약 그 약제학적 조성물의 침전, 응집, 및/또는 변성에 대해 가시적 신호(즉, 변색 또는 투명도의 상실) 또는 측정가능한 신호(예를 들면, 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 또는 UV 광 산란을 사용하여)를 나타내지 않는다면 주어진 시점에서 그것의 물리적 안정성을 보유하고 있는 것으로 간주된다. 화학적 안정성과 관련하여, 항체와 같은 단백질은 약제학적 조성물로 제형될 때, 만약 화학적 안정성의 측정이 단백질(즉 항체)이 그 조성물에서 관심대상의 생물학적 활성을 보유하고 있음을 나타내는 것이라면, 주어진 시점에서 그것의 화학적 안정성을 보유하고 있는 것으로 간주된다. 화학적 안정성의 변화를 모니터하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 한정하는 것은 아니지만, 예를 들면 SDS-PAGE, SEC, 및/또는 플라이트 질량 분광계의 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화/시간을 사용하여 클리핑에서 비롯된 결과와 같은 단백질의 화학적으로 변경된 형태를 검출하는 방법; 예를 들면 이온-교환 크로마토그래피를 사용한 분자 전하의 변화와 관련된(예를 들면, 탈아미드화와 관련된) 분해 방법이 있다. 예를 들면, 본원에 그 전체로서 참고 인용되는, 2004년 11월 4일 출원된, "Antagonist Anti-CD40 Monoclonal Antibodies and Methods for Their Use" 명칭의 국제 특허출원 PCT/US2004/037152(Attorney Docket No. PP20107.004(035784/282916))에 개시된 방법을 참조하라.
길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 약제학적 조성물로 제형될 때, 만약 주어진 시점에서 원하는 생물학적 활성이, 약제학적 조성물이 원하는 생물학적 활성에 대한 적합한 분석에서 결정되는 것과 같이 제조되었을 때에 나타난 원하는 생물학적 활성의 약 30%, 바람직하게는 약 20% 내에 있다면 그 시점에서 원하는 생물학적 활성을 보유하는 것으로 간주된다. 본원에 개시된 길항제 항-CD40 항체 및 그것의 항원-결합 단편의 원하는 생물학적 활성을 측정하기 위한 분석은 하기의 실시예에서 설명되는 것과 같이 수행될 수 있다. 또한, 본원에 참고 인용된 문헌(Schultze et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:8200-8204; Denton et al. (1998) Pediatr. Transplant. 2:6-15; Evans et aL (2000) J. Immunol. 164:688-697; Noelle (1998) Agents Actions Suppl. 49:17-22; Lederman et al. (1996) Curr. Opin. Hematol. 3:77-86; Coligan et al. (1991) Current Protocols in Immunology 13:12; Kwekkeboom et al. (1993) Immunology 79:439-444; 및 미국 특허 제5,674,492호 및 제5,847,082호)에 개시된 분석을 참조하라.
본 발명의 길항제 항-CD40 항체가 액체 제형으로 제형되는 경우, 액체 약제학적 조성물은 분해를 방지하고 멸균상태를 보존하기 위해서 바람직하게는 동결건조된다. 액체 조성물을 동결건조시키는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 사용 직전에 조성물은 추가의 성분들을 포함할 수 있는 멸균 희석제(예를 들면 링거액, 증류수, 또는 멸균 식염수)로 재구성될 수 있다. 재구성될 때 조성물은 바람직하게는 당업자에게 공지되어 있는 방법들을 사용하여 환자에게 투여된다.
의약의 제조시 길항제 항- CD40 항체의 사용
본 발명은 또한 CD40-발현 신생 세포를 포함하는 암에 대해 피험체를 치료하기 위한 의약을 제조하는 데 C4BP-매개 CD40 신호전달 또는 이들의 항원 결합 단편을 차단하는 본 발명의 길항제 항-CD40 항체의 용도를 제공하는데, 이때 의약은 하나 이상의 다른 암 치료법을 이용한 치료와 조화를 이룬다. 일부 구체예에서, 암은 신생 B 세포 성장을 특징으로 한다. 이러한 암으로는, 한정하는 것은 아니지만, 상기에서 논의된 B 세포-관련 암, 예를 들면 비-호지킨 림프종, 만성 림프구 백혈병, 다발성 골수종, B 세포 림프종, 말기 B 세포 림프종, 중기 B 세포 림프종, 초기 B 세포 림프종, B 세포 급성 림프아세포성 백혈병, 골수아세포성 백혈병, 호지킨병, 플라스마사이토마, 여포성 림프종, 여포성 작은 절단 림프종, 여포성 큰 세포 림프종, 여포성 혼합 작은 절단 림프종, 미만성 작은 절단 세포 림프종, 미만성 작은 림프구성 림프종, 선구림프구성 백혈병(PLL), 림포플라스마사이틱 림프종, 경계 지대 림프종, 점막 연관 림프성 조직 림프종, 모노사이토이드 B 세포 림프종, 비장성 림프종, 유모 세포 백혈병, 미만성 큰 세포 림프종, 격벽 큰 B 세포 림프종, 림프성 육아종, 혈관내 림프종증, 미만성 혼합 세포 림프종, 미만성 큰 세포 림프종, 면역아세포성 림프종, 버킷 림프종, AIDS-관련 림프종, 및 외막 세포 림프종이 있다. 다른 구체예에서, 암은 고형 종양이다. CD40-발현 신생 세포를 포함하는 고형 종양의 예는, 한정하는 것은 아니지만, 난소암, 폐암(예를 들면, 편평세포 암종의 비-작은 세포 폐암, 아데노암종, 및 큰 세포 암종 유형, 및 작은 세포 폐암), 유방암, 결장암, 신장암(예를 들면, 신장세포 암종을 포함), 방광암, 간암(예를 들면, 간세포 암종을 포함), 위암, 경부암, 전립선암, 비강인두암, 갑상선암(예를 들면, 갑상선 유두 암종), 및 흑색종 및 육종과 같은 피부암(예를 들면, 골육종 및 유윙(Ewing) 육종을 포함)이 있다.
암 치료가 필요한 피험체의 문맥에서 "조화를 이룬다"는 것은 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 포함하는 의약이 하나 이상의 다른 암 치료법으로 환자를 치료하기 전, 치료 중, 또는 후에 사용되는 것을 의미한다. B 세포-관련 암에 걸린 피험체를 위한 다른 암 치료법의 예로는, 한정하는 것은 아니지만, 다음과 같은 것들이 있다: 수술; 방사선 치료; 임의로 자가 골수 이식과 조합하여 이루어지는 화학요법, 이때 적합한 화학요법제로는, 한정하는 것은 아니지만, 플루다라빈 또는 플루다라빈 포스페이트, 클로람부실, 빈크리스틴, 펜토스타틴, 2-클로로디옥시아데노신(클라드리빈), 사이클로포스파미드, 독소루비신, 프레드니손, 및 이것들의 조합, 예를 들면 안트라사이클린-함유 섭생법, 예를 들면 CAP(사이클로포스파미드, 독소루비신과 프레드니손), CHOP(사이클로포스파미드, 빈크리스틴, 프레드니손과 독소루비신), VAD(빈크리스틴, 독소루비신과 덱사메타손), MP(멜팔란과 프레드니손), 및 다른 세포독성 및/또는 화학요법에 사용되는 치료제, 예를 들면 미토크산트론, 다우노루비신, 이다루비신, 아스파라기나제, 및 대사길항물질, 이를테면, 한정하는 것은 아니지만, 시타라빈, 메톡트렉세이트, 5-플루오로우라실 데카르바진, 6-티오구아닌, 6-메르캅토퓨린, 및 넬라라빈이 있으며; 다른 항암 모노클론 항체 요법(예를 들면 알렘투주맙(Campath®) 또는 악성 B 세포 상의 CD52 세포 표면 당단백질을 표적으로 하는 다른 항-CD52 항체; 리툭시맵(Rituxan®), 완전히 사람의 항체 HuMax-CD20, R-1594, IMMU-106, TRU-015, AME-133, 토시투모맙/I-131 토시투모맙(Bexxar®), 이브리투모맙 티욱세탄(Zevalin®), 또는 악성 B 세포 상의 CD20 항원을 표적으로 하는 어떠한 다른 치료적 항-CD20 항체; 항-CD19 항체 (예를 들면 MT103, 이중특이적 항체); 항-CD22 항체(예를 들면 사람화된 모노클론 항체 에프라투주맙); 베카시주맙(Avastin®) 또는 사람 혈관 내피 성장 인자를 표적으로 하는 다른 항암 항체; 악성 B 세포 상의 CD22 항원을 표적으로 하는 항-CD22 항체(예를 들면 모노클론 항체 BL-22, 알파CD22 독소); 대식세포 콜로니 자극 인자를 표적으로 하는 α-M-CSF 항체; 다발성 골수종에서 과발현되는 핵 인자-카파B (RANK) 및 이것의 리간드(RANKL)의 수용체 활성화제를 표적으로 하는 항체; 악성 B 세포 상의 CD23 항원을 표적으로 하는 항-CD23 항체 (예를 들면 IDEC-152); 악성 B 세포 상의 CD38 항원을 표적으로 하는 항-CD38 항체; 악성 B 세포 상에 발현된 주요 조직적 합성 복합체 클래스 II 수용체를 표적으로 하는 항체(항-MHC 항체); 악성 B 세포 상의 CD40 항원을 표적으로 하는 다른 항-CD40 항체(예를 들면 SGN-40; 및 국제 특허출원 PCT/US2004/037152(Attorney Docket No. PP20107.004 (035784/282916), 발명의 명칭 "Antagonist Anti-CD40 Monoclonal Antibodies and Methods for Their Use", 2004년 11월 4일 출원)에 개시된 바와 같이, CD40-발현 세포 상의 CD40L-매개 CD40 신호전달을 차단하는 다른 길항제 항-CD40 항체, 예를 들면 CHIR-12.12 및 CHIR-5.9, 및 이들의 항체-결합 단편); 및 많은 고형 종양 및 조혈 기원의 종양 상에 발현된 종양 괴사 인자-관련 아포프토시스-유도 리간드 수용체 1(TRAIL-R1)(예를 들면 작용제성 사람 모노클론 항체 HGS-ETR1)을 표적으로 하는 항체; 소분자-기초 암 치료법, 이를테면 한정하는 것은 아니지만, 미세소관 및/또는 토포이소머라제 억제제(예를 들면 유사분열 억제제 돌라스타틴 및 돌라스타틴 유사체; 튜불린-결합제 T900607; XL119; 및 토포이소머라제 억제제 아미노캄프토테신), SDX-105(벤다무스틴 염산염), 익사베필론(에포틸론 유사체, BMS-247550으로도 언급됨), 단백질 키나제 C 억제제, 예를 들면 미도스타우린((PKC-412, CGP 41251, N-벤조일스타우로스포린), 피크산트론, 엘로크사틴(항신생물제), 가니트(질산 갈륨), Thalomid®(티알리도미드), 티알리도미드의 면역조절 유도체(예를 들면 레블리미드(이전에는 레비미드)), AffinitakTM(단백질 키나제 C-알파의 안티센스 억제제), SDX-101(R-에토돌락, 악성 림프구의 아포프토시스를 유도함), 클로파라빈과 같은 2차 생성 퓨린 뉴클레오시드 유사체, 암세포에 의한 단백질 Bcl-2의 생성 억제제 (예를 들면 안티센스 제제 오블리머센 및 Genasense®), 프로테아좀 억제제(예를 들면 VelcadeTM(보르테조밉)), 소분자 키나제 억제제(예를 들면 CHIR-258), 소분자 VEGF 억제제(예를 들면 ZD-6474), 열 쇼크 단백질(HSP) 90의 소분자 억제제(예를 들면 17-AAG), 히스톤 디아세틸라제의 소분자 억제제(예를 들면 하이브리드/극성 세포분화 HPC) 제제, 예를 들면 수베라닐로히드록시암산(SAHA), 및 FR-901228) 및 아포프토시스 제제, 예를 들면 Trisenox®(삼산화 비소) 및 Xcytrin®(모텍사핀 가돌리늄); 백신/면역치료법-기초 암 치료법, 이를테면, 한정하는 것은 아니지만, 백신 접근법(예를 들면 Id-KLH, 발암성 파지(oncophage), 비탈레틴), 개인화된 면역요법 또는 활성 이디오타입 면역요법(예를 들면 MyVax® 개인화된 면역요법, 이전에는 GTOP-99로 표시됨), Promune®(CpG 7909, 톨(toll)-유사 수용체 9(TLR9)에 대한 합성 작용제), 인터페론-알파 치료법, 인터류킨-2(IL-2) 치료법, IL-12 치료법, IL-15 치료법, 및 IL-21 치료법; 스테로이드 치료법; 또는 다른 암 치료법; 이때 추가의 암 치료법 또는 추가의 암 치료법들로 치료하는 것은 본원의 상기에 나타낸 바와 같이, 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 포함하는 의약으로 치료하기 전, 치료하는 동안 또는 치료 후에 일어난다.
CD40-발현 신생 세포를 포함한 고형 종양인 암에 걸린 피험체를 위한 다른 암 치료법의 예로는, 한정하는 것은 아니지만, 수술; 방사선 치료법; 화학치료법, 이때 적합한 화학치료제는, 한정하는 것은 아니지만, 플루다라빈 또는 플루다라빈 포스페이트, 클로람부실, 빈크리스틴, 펜토스타틴, 2-클로로디옥시아데노신(클라드리빈), 사이클로포스파미드, 독소루비신, 프레드니손, 및 이들의 조합, 예를 들면 안트라사이클린-함유 섭생법, 예를 들면 CAP(사이클로포스파미드, 독소루비신과 프레드니손), CHOP(사이클로포스파미드, 빈크리스틴, 프레드니손과 독소루비신), VAD(빈크리스틴, 독소루비신과 덱사메타손), MP(멜팔란과 프레드니손), 및 다른 세포독성 및/또는 화학치료에 사용되는 치료제, 예를 들면 미토크산트론, 다우노루비신, 이다루비신, 아스파라기나제, 및 대사길항물질, 이를테면, 한정하는 것은 아니지만, 시타라빈, 메톡트렉세이트, 5-플루오로우라실 데카르바진, 6-티오구아닌, 6-메르캅토퓨린, 및 넬라라빈이 있고; 사이토카인 치료법, 이를 테면, 한정하는 것은 아니지만, 알파-인터페론 치료, 감마-인터페론 치료, 인터류킨-2(IL-2), IL-12, IL-15, 및 IL-21, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 또는 이들 사이토카인의 생물학적 활성 변이체를 통한 치료; 또는 관심대상의 치료 시에 사용하기 위하여 의도된 다른 모노클론 항체, 예를 들면, Her2+ 유방암 세포 상의 Her2 수용체 단백질을 표적으로 하는 Herceptin®(Genentech, Inc., 캘리포니아주 샌프란시스코 소재); 혈관내피성장인자(VEGF)에 결합하여 그것을 억제하고, 결장 암의 치료에 사용되는 사람화된 모노클론 항체 Avastin®(베바시주맙이라고도 함; Genentech, Inc., 캘리포니아주 샌프란시스코 소재); 표피성장인자수용체를 표적으로 하는 항-EGFR 항체(예를 들면, IMC-C225(ImClone system, 뉴욕주 뉴욕 소재); IGF-1 수용체 단백질을 표적으로 하는 항-IGF-1 수용체 항체; 종양-연관 항원 MUC1을 표적으로 하는 항-MUC1 항체; 세포 증식 및 생존에 관련된 세포 부착 및 신호전달 과정을 조절하는 각각의 인테그린을 표적으로 하는 항-α5β1, 항-αvβ5, 및 항-αvβ3; 캐더린 패밀리 구성원을 표적으로 하는 항-P-캐더린 항체(예를 들면, 출원계류 중인 미국 특허출원 공보 제20030194406을 참조); 내피세포 특이적 부착 분자의 항-혈관형성-관련 기능을 표적으로 하는 항-VE-캐더린 항체; 및 국제 특허출원 PCT/US2004/037152호(Attorney Docket No. PP20107.004 (035784/282916), 발명의 명칭 "Antagonist Anti-CD40 Monoclonal Antibodies and Methods for Their Use", 2004년 11월 4일 출원)에 개시된 바와 같이, CD40-발현 신생 세포 상의 CD40L-매개 CD40 신호전달을 차단하는 CHIR-12.12 및 CHIR-5.9와 같은 다른 길항제 항-CD40 항원, 및 이들의 항원-결합 단편이 있으며, 다른 치료법 또는 다른 암 치료법들을 통한 치료는 본원의 상기에 나타낸 바와 같이 길항제 항-CD40 항체 또는 이것의 항원-결합 단편을 포함한 의약을 통한 피험체의 치료 전에, 중에, 또는 후에 이루어질 수 있다.
따라서, 일부 구체예에서, 본 발명은 피험체에서 B 세포 림프종, 예를 들면 비-호즈킨 림프종을 치료하기 위한 의약의 제조시, C4BP-매개 CD40 신호전달을 차단하는 길항제 항-CD40 항체 또는 이것의 항원-결합 단편의 용도를 제공하는데, 상기 의약은 화학치료법, 항-암 항체 치료법, 소분자-기초 암 치료법, 및 백신/면역치료-기초 암 치료법로 구성된 군 중에서 선택된 하나 이상의 암 치료법을 통한 치료와 조화되고, 의약은 다른 암 치료법을 통한 피험체의 치료 전에, 중에, 또는 후에 사용되거나 또는 다른 암 치료법을 통한 피험체의 치료 전에, 중에 또는 후에 다중 조합 치료의 경우에 사용된다.
따라서, 예를 들면, 일부 구체예에서, 본 발명은 피험체에서 B 세포 림프종, 예를 들면 비-호즈킨 림프종을 치료하기 위한 의약의 제조시, 본 발명의 길항제 항-CD40 항체 또는 이것의 항원-결합 단편의 용도를 제공하는데, 상기 의약은 화학치료법을 통한 치료와 조화되고, 화학치료제는 사이톡산, 독소루비신, 빈크리스틴, 프레드니손 및 이들의 조합, 예를 들면 CHOP로 구성된 군 중에서 선택된다. 다른 구체예에서, 본 발명은 피험체에서 B 세포 림프종, 예를 들면 비-호즈킨 림프종을 치료하기 위한 의약의 제조시, 본 발명의 길항제 항-CD40 항체 또는 이것의 항원-결합 단편의 용도를 제공하는데, 상기 의약은 알레투주맙(Campath®) 또는 악성 B 세포 상의 CD52 세포 표면 당단백질을 표적으로 하는 다른 항-CD52 항체; 리툭시맙(Rituxan®), 완전히 사람의 항체 HuMax-CD20, R-1594, IMMU-106, TRU-015, AME-133, 토시투모맙/I-131 토시투모맙(Bexxar®), 이부리투모맙 티욱제탄(Zevalin®), 또는 악성 B 세포 상의 CD20 항원을 표적으로 하는 어떤 다른 치료적 항-CD20 항체; 항-CD19 항체(예를 들면 MT103, 이중특이적 항체); 항-CD22 항체(예를 들면 사람화된 모노클론 항체 에프라투주맙); 베바시주맙(Avastin®) 또는 사람 혈관 내피 성장 인자를 표적으로 하는 다른 항암 항체; CD40-매개 CD40 신호전달을 차단하는 완전히 사람의 모노클론 항체 CHIR-12.12 또는 CHIR-5.9 및 이것의 임의의 조합으로 구성된 군 중에서 선택된 하나 이상의 다른 항암 항체를 통한 치료와 조합되며, 상기 의약은 다른 암 치료법을 통한 피험체의 치료 전에, 중에, 또는 후에 사용되거나 또는 다른 암 치료법을 통한 피험체의 치료 전에, 중에 또는 후에 다중 조합 치료의 경우에 사용된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 피험체에서 B 세포 림프종, 예를 들면 비-호즈킨 림프종을 치료하기 위한 의약의 제조시, 본 발명의 길항제 항-CD40 항체 또는 이것의 항원-결합 단편의 용도를 제공하는데, 상기 의약은 미세소관 및/또는 토포이소머라제 억제제(예를 들면, 유사분열 억제제 돌라스타틴 및 돌라스타틴 유사체; 튜불린-결합제 T900607; XL119; 및 토포이소머라제 억제제 아미노캄프토테신), SDX-105(벤다무스틴 염산염), 익사베필론(에포틸론 유사체, BMS-247550으로도 언급됨), 단백질 키나제 C 억제제, 예를 들면 미도스타우린(PKC-412, CGP 41251, N-벤조일스타우로스포린), 피크산트론, 엘록사틴(항신생물제), 가니트(질산 갈륨), Thalomid®(티알리도미드), 어포프토시스 제제, 예를 들면 Xcytrin®(모텍사핀 가돌리늄), 암세포에 의한 단백질 Bcl-2의 생성 억제제(예를 들면, 안티센스 제제 오블리머센 및 Genasense®), 네라라빈, 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군 중에서 선택된 하나 이상의 다른 소분자-기초 암 치료법을 통한 치료와 조화되고, 상기 의약은 다른 암 치료법을 통한 피험체의 치료 전에, 중에, 또는 후에 사용되거나 또는 다른 암 치료법을 통한 피험체의 치료 전에, 중에 또는 후에 다중 조합 치료의 경우에 사용된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 피험체에서 B 세포 림프종, 예를 들면 비-호즈킨 림프종을 치료하기 위한 의약의 제조시, 본 발명의 길항제 항-CD40 항체 또는 이것의 항원-결합 단편의 용도를 제공하는데, 상기 의약은 백신 접근법(예를 들면, Id-KLH, 발암성 파지(oncophage), 비탈레틴), 개인화된 면역요법 또는 활성 이디오타입 면역요법(예를 들면 MyVax® 개인화된 면역요법, 이전에는 GTOP-99로 표시됨), Promune®(CpG 7909, 톨(toll)-유사 수용체 9(TLR9)에 대한 합성 작용제), 인터류킨-2(IL-2) 치료법, IL-12 치료법, IL-15 치료법, 및 IL-21 치료법; 이들의 임의의 조합으로 구성된 군 중에서 선택된 하나 이상의 다른 백신/면역요법-기초 암 치료법을 통한 치료와 조화되고, 상기 의약은 다른 암 치료법을 통한 피험체의 치료 전에, 중에, 또는 후에 사용되거나 또는 다른 암 치료법을 통한 피험체의 치료 전에, 중에 또는 후에 다중 조합 치료의 경우에 사용된다.
일부 구체예에서, 본 발명은 피험체에서 B 세포-관련 백혈병, 예를 들면 B 세포 급성 림프구 백혈병(B-ALL)을 치료하기 위한 의약의 제조시, 본 발명의 길항제 항-CD40 항체 또는 이것의 항원-결합 단편의 용도를 제공하는데, 상기 의약은 화학치료법 및 대사길항물질 치료법으로 구성된 군 중에서 선택된 하나 이상의 암 치료법을 통한 치료와 조화되고, 상기 의약은 다른 암 치료법을 통한 피험체의 치료 전에, 중에, 또는 후에 사용되거나 또는 다른 암 치료법을 통한 피험체의 치료 전에, 중에 또는 후에 다중 조합 치료의 경우에 사용된다. 이러한 구체예의 예는 길항제 항-CD40 항체 또는 이것의 항원-결합 단편을 포함하는 의약이 사이톡산, 독소루비신, 빈크리스틴, 프레드니손, 시타라빈, 미톡산트론, 이다루비신, 아스파라기나제, 메토트렉세이트, 6-티오구아닌, 6-메르캅토퓨린 및 이들의 조합으로 구성된 군 중에서 선택된 화학치료제 또는 물질대사길항제를 통한 치료제와 조화되고, 상기 의약은 다른 암 치료법을 통한 피험체의 치료 전에, 중에, 또는 후에 사용되거나 또는 다른 암 치료법을 통한 피험체의 치료 전에, 중에 또는 후에 다중 조합 치료의 경우에 사용된다. 이러한 한 예에서, 의약은 시타라빈과 다우노루비신, 시타라빈과 미톡산트론, 및/또는 시타라빈과 이다루비신을 통한 치료와 조화되고, 상기 의약은 다른 암 치료법을 통한 피험체의 치료 전에, 중에, 또는 후에 사용되거나 또는 다른 암 치료법을 통한 피험체의 치료 전에, 중에 또는 후에 다중 조합 치료의 경우에 사용된다. 이러한 한 예에서, 의약은 시타라빈과 다우노루비신, 시타라빈과 미톡산트론, 및/또는 시타라빈과 이다루비신을 통한 치료와 조화되고, 상기 의약은 다른 암 치료법을 통한 피험체의 치료 전에, 중에, 또는 후에 사용되거나 또는 다른 암 치료법을 통한 피험체의 치료 전에, 중에 또는 후에 다중 조합 치료의 경우에 사용된다.
일부 구체예에서, 신생 세포 발현 CD40 항원을 포함한 고형 종양에 대하여 피험체를 치료하기 위한 의약의 제조시, C4BP-매개 CD40 신호전달을 차단하는 본 발명의 길항제 항-CD40 항체 또는 이것의 항원-결합 단편의 용도를 제공하는데, 의약은 화학치료법을 통한 치료와 조화되고, 화학치료제는 예를 들면 결장직장암 및 비-작은 세포 폐암을 치료하는 데 사용될 수 있는 CPT-11(Irinotecan), 폐암, 유방암, 및 상피 난소암을 치료하는 데 사용될 수 있는 겜시타빈 및 고형 종양의 치료에 적합한 다른 화학치료제로 구성된 군 중에서 선택되며, 다른 암 치료법 또는 다른 암 치료법들을 통한 치료는 본원의 상기에 나타낸 바와 같이 길항제 항-CD40 항체 또는 이것의 항원-결합 단편을 포함한 의약을 통한 피험체의 치료 전에, 동안에, 또는 후에 이루어진다.
다른 구체예에서, 신생 세포 발현 CD40 항원을 포함한 고형 종양에 대하여 피험체를 치료하기 위한 의약의 제조시, 본 발명의 길항제 항-CD40 항체 또는 이것의 항원-결합 단편의 용도를 제공하는데, 상기 의약은 Her2+ 유방암 세포 상의 Her2 수용체 단백질을 표적으로 하는 Herceptin®(Genentech, Inc., 캘리포니아주 샌프란시스코 소재); 혈관내피성장인자(VEGF)에 결합하여 그것을 억제하고, 결장 암의 치료에 사용되는 사람화된 모노클론 항체 AvastinTM(베바시주맙이라고도 함; Genentech, Inc., 캘리포니아주 샌프란시스코 소재); 표피 성장인자 수용체를 표적으로 하는 항-EGFR 항체(예를 들면, IMC-C225(ImClone system, 뉴욕주 뉴욕 소재); IGF-1 수용체 단백질을 표적으로 하는 항-IGF-1 수용체 항체; 종양-연관 항원 MUC1을 표적으로 하는 항-MUC1 항체; 세포 증식 및 생존에 관련된 세포 부착 및 신호전달 과정을 조절하는 각각의 인테그린을 표적으로 하는 항-α5β1, 항-αvβ5, 및 항-αvβ3; 캐더린 패밀리 구성원을 표적으로 하는 항-P-캐더린 항체(예를 들면, 출원계류 중인 미국 특허출원 공보 제20030194406을 참조); 내피세포 특이적 부착 분자의 항-혈관형성-관련 기능을 표적으로 하는 항-VE-캐더린 항체; 및 완전히 사람의 모노클론 항체 CHIR-12.12 또는 CHIR-5.9 또는 CD40L-매개 CD40 신호전달을 차단하는 다른 길항제 항-CD40 항체로 구성된 군 중에서 선택된 하나 이상의 다른 항-암 항체를 통한 치료와 조화되고, 다른 치료법 또는 다른 암 치료법들을 통한 치료는 본원의 상기에 나타낸 바와 같이 길항제 항-CD40 항체 또는 이것의 항원-결합 단편을 포함한 의약을 통한 피험체의 치료 전에, 중에, 또는 후에 이루어질 수 있다.
본 발명은 또한 CD40-발현 신생 세포, 예를 들면 본원의 상기에 설명된 B 세포-관련 암 또는 고형 종양을 포함한 신생 B 세포 성장을 특징으로 하는 암을 포함한 암에 대하여 피험체를 치료하기 위한 의약의 제조시, 본 발명의 길항제 항-CD40 항체 또는 이것의 항원-결합 단편의 용도를 제공하는데, 상기 의약은 하나 이상의 다른 암 치료법으로 사전치료받은 적이 있었던 피험체에게 사용된다. "사전치료된" 또는 "사전치료"는 피험체가 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 포함하는 의약을 투여받기 전에 하나 이상의 다른 암 치료법을 받았던 것(즉 하나 이상의 다른 암 치료법으로 치료받은 것)을 의미한다. "사전치료된" 또는 "사전치료"는 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 포함하는 의약으로 치료를 개시하기 전 2년 내에, 18개월 내에, 1년 내에, 6개월 내에, 2개월 내에, 6주 내에, 1개월 내에, 4주 내에, 3주 내에, 2주 내에, 1주 내에, 6일 내에, 5일 내에, 4일 내에, 3일 내에, 2일 내에, 또는 심지어 1일 내에 피험체가 하나 이상의 다른 암 치료법으로 치료받은 것을 포함한다. 피험체가 이전의 암 치료법, 또는 이전의 암 치료법들로 사전치료했을 때 반응을 한 것은 필요하지 않다. 그러므로 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 포함하는 의약을 투여받은 피험체는 다중 암 치료법을 포함한 이전의 암 치료법으로의 사전치료에 대해, 또는 하나 이상의 이전 암 치료법에 대하여 반응할 수 있었거나, 또는 반응하는 데 실패할 수 있었을 것이다(즉, 암이 불응이었다). 피험체가 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 포함하는 의약을 투여받기 전에 환자가 사전 치료로 받을 수 있었던 다른 암 치료법의 예로는, 한정하는 것은 아니지만, 수술; 방사선 치료; 임의로 자가 골수 이식과 공동으로 진행될 수 있는 화학치료법, 이때 적합한 화학치료제로는, 한정하는 것은 아니지만, 본원의 상기에 열거된 것들이 있고; 한정하는 것은 아니지만 상기에 열거된 항암 항체를 포함하는 다른 항암 모노클론 항체 요법; 한정하는 것은 아니지만, 상기에 열거된 소분자들을 포함하는 소분자-기초 암 치료법; 한정하는 것은 아니지만, 상기에 열거된 것들을 포함하는 백신/면역요법-기초 암 치료법; 스테로이드 치료법; 다른 암 치료법; 또는 이것들의 임의의 조합이 있다.
하나 이상의 다른 암 치료법과 본원에 설명된 의약의 조화로운 사용이라는 관점에서 "치료"는 본원에서 환자에 대한 의약 또는 다른 암 치료법의 적용 또는 투여로서, 또는 피험체로부터 분리된 조직 또는 세포주에 의약 또는 다른 암 치료법을 적용 또는 투여하는 것으로서 규정되며, 이때 피험체는 신생 B 세포 성장, 이러한 암과 연관된 징후, 또는 이러한 암이 쉽게 발생되는 경향을 특징으로 하는 암에 걸려 있으며, 치료의 목적은 암, 암과 연관된 어떠한 징후, 또는 암이 쉽게 발생되는 경향을 돌봄, 치유, 경감, 완화, 변경, 치료, 개량, 개선, 또는 영향을 주는 것이다.
본 발명은 또한 피험체에서 자가면역 질병 및/또는 염증성 질병을 치료하기 위한 의약의 제조시, 본 발명의 길항제 항-CD40 항체 또는 이것의 항원-결합 단편의 용도를 제공하는데, 상기 의약은 하나 이상의 다른 치료법을 통한 치료와 조화된다. 자가면역 질병 및/또는 염증성 질병에 대한 치료가 필요한 피험체의 관점에서 "조화된"이란 말은 의약이 하나 이상의 다른 치료법을 통한 피험체의 치료 전에, 중에 또는 후에 사용되는 것을 의미한다. 자가면역 및/또는 염증성 질병의 다른 치료법의 예로는, 한정하는 것은 아니지만, 본원 상기에 설명된 것들, 즉 수술 또는 수술 과정(예를 들면, 비장 절제술, 림프선 절제술, 갑상선 절제술, 류코포레시스(leukophoresis), 세포, 조직, 또는 기관 이식, 기관 관류, 장 과정 등), 방사선 치료법, 스테로이드 치료법 및 비-스테로이드 치료법과 같은 치료법, 호르몬 치료법, 사이토카인 치료법, 피부병학적 제제를 통한 치료법(예를 들면, 알레르기, 접촉 피부염, 건선과 같은 피부 상태를 치료하는 데 사용되는 국소 제제), 면역억제 치료법, 및 다른 항-염증성 모노클론 항체 치료법 등이 있으며, 다른 치료법 또는 다른 암 치료법들을 통한 치료는 본원의 상기에 나타낸 바와 같이 길항제 항-CD40 항체 또는 이것의 항원-결합 단편을 포함한 의약을 통한 피험체의 치료 전에, 중에, 또는 후에 이루어질 수 있다. 이러한 한 구체예에서, 본 발명은 피험체에서 자가면역 질병 및/또는 염증성 질병을 치료하기 위한 의약의 제조시, 본 발명의 길항제 항-CD40 항체 또는 이것의 항원-결합 단편의 용도를 제공하는데, 상기 의약은 하나 이상의 다른 치료법을 통한 치료와 조화된다.
일부 구체예에서, 본 발명의 길항제 항-CD40 항체 또는 이것의 항원-결합 단편을 포함하는 의약은 두 개의 다른 치료법을 통한 치료와 조화된다. 길항제 항-CD40 항체 또는 이것의 항원-결합 단편을 포함하는 의약은 두 개의 다른 치료법과 조화되고, 상기 의약의 사용은 다른 치료법들 중 하나 또는 둘 다를 통한 피험체의 치료 전에, 중에, 또는 후에 이루어질 수 있다.
본 발명은 또한 피험체에서 자가면역 질병 및/또는 염증성 질병을 치료하기 위한 의약의 제조시, C4BP-매개 CD40 신호전달을 차단하는 길항제 항-CD40 항체 또는 이것의 항원-결합 단편의 용도를 제공하는데, 상기 의약은 하나 이상의 다른 치료법을 통하여 사전치료된 피험체에서 사용된다. "사전치료된" 또는 "사전치료"는 피험체가 길항제 항-CD40 항체 또는 이것의 항원-결합 단편을 포함한 의약을 투여받기 전에 하나 이상의 다른 치료법을 통하여 치료된 것을 의미한다. "사전치료된" 또는 "사전치료"는 길항제 항-CD40 항체 또는 이것의 항원-결합 단편을 포함하는 의약으로 치료를 개시하기 전 2년 내에, 18개월 내에, 1년 내에, 6개월 내에, 2개월 내에, 6주 내에, 1개월 내에, 4주 내에, 3주 내에, 2주 내에, 1주 내에, 6일 내에, 5일 내에, 4일 내에, 3일 내에, 2일 내에, 또는 심지어 1일 내에 피험체가 다른 치료법 또는 다른 치료법들로 치료받은 것을 포함한다. 피험체가 이전의 암 치료법, 또는 이전의 암 치료법들로 사전치료했을 때 반응을 한 것은 중요하지 않다. 그러므로 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 포함하는 의약을 투여받은 피험체는 다중 치료법을 포함한 이전의 치료법을 통한 사전치료에 대해, 또는 하나 이상의 이전 치료법들에 대하여 반응할 수 있었거나, 또는 반응하는 데 실패할 수 있었을 것이다.
자가면역 질병 및/또는 염증성 질병에 대한 하나 이상의 다른 암 치료법과 본원에 설명된 의약의 조화로운 사용이라는 관점에서 "치료"는 본원에서 피험체에 대한 의약 또는 다른 치료법의 적용 또는 투여로서, 또는 피험체로부터 분리된 조직 또는 세포주에 의약 또는 다른 치료법을 적용 또는 투여하는 것으로서 규정되며, 이때 피험체는 자가면역 질병 및/또는 염증성 질병, 자가면역 질병 및/또는 염증성 질병과 연관된 징후, 또는 자가면역 질병 및/또는 염증성 질병이 쉽게 발생되는 경향을 가지며, 치료의 목적은 자가면역 질병 및/또는 염증성 질병, 자가면역 질병 및/또는 염증성 질병과 연관된 어떠한 징후, 또는 자가면역 질병 및/또는 염증성 질병이 쉽게 발생되는 경향을 돌봄, 치유, 경감, 완화, 변경, 치료, 개량, 개선, 또는 영향을 주는 것이다.
하기 실시예는 본 발명을 제한함이 없이 예시하기 위하여 제공된다.
다음의 프로토콜을 하기에 설명된 실시예에 사용할 수 있다.
면역글로불린 정량을 위한 ELISA 분석
사람 IgM 및 IgG의 농도를 ELISA에 의해 계산한다. 96-웰 ELISA 플레이트를 0.05 M 탄산염 완충액(pH 9.6) 중의 2 ㎍/ml의 염소 항-사람 IgG mAb(The Jackson Laboratory, 메인주 바 하버 소재)로 또는 2 ㎍/ml의 염소 항-사람 IgM mAb 4102(Bio Source International, 캘리포니아 소재)로, 16시간 동안 4 ℃에서 인큐베이션함으로써 코팅한다. 플레이트를 PBS-0.05% Tween-20(PBS-Tween)으로 3회 세척하고, BSA로 1시간 동안 포화시킨다. 2회 세척 후에 플레이트를 2시간 동안 37 ℃에서 상이한 희석률의 시험 샘플과 함께 인큐베이션한다. 3회 세척 후, 결합된 Ig를 2시간 동안 37 ℃에서 1 ㎍/ml의 페록시다제-표지된 염소 항-사람 IgG mAb 또는 염소 항-사람 IgM mAb와 함께 인큐베이션함으로써 검출한다. 플레이트를 4회 세척하고, 결합된 페록시다제 활성은 기질로서 O-페닐렌디아민을 첨가함으로써 드러난다. 사람 IgG 또는 IgM 표준(Caltaq, 캘리포니아주 벌링앰 소재)을 사용하여 각 분석에 대한 표준 곡선을 확립한다.
사람 말초혈로부터 말초혈 단핵 세포( PBMC )의 분리
20 ml의 피콜-파크(Ficoll-Paque) 용액(저 내독소; Pharmacia)을 50 ml의 폴리스티렌 튜브 3개에 넣고, 30분 후에 혈액을 첨가한다. 피콜-파크 용액을 실온으로 가온한다. 1:10 희석률의 표백제 3 L를 제조하여 혈액과 접촉하는 모든 튜브와 피펫을 세척하는 데 사용한다. 피콜 층을 혼탁시키지 않으면서 혈액은 피콜-파크 용액의 상부에 1.5 ml 혈액/1 ml의 피콜-파크 농도로 층을 형성한다. 튜브를 1700 rpm에서 30분 동안 실온에서 원심분리하고, 원심분리가 끝났을 때 제동을 건다. 가능한 한 많은 상부층(혈장)을 제거하고, 두 번째 용액층이 제거되는 것을 피하기 위하여 진공을 최소화한다. B 및 T 림프구를 함유하는 두 번째 층을 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 수집하여서 2개의 50-ml 폴리스티렌 튜브에 넣는다. 수집액을 첨가물이 없는 저온 RPMI 부피의 3배로 희석하고, 1000 RPM에서 10분 동안 원심분리한다. 배지를 흡인에 의해 제거하고 두 개의 50-ml 튜브로부터의 세포를 총 10 ml의 저온 RPMI(첨가물이 있음)에 현탁하여 15-ml 튜브에 옮긴다. 세포를 혈구계산기를 사용하여 계수한 후, 1000 RPM에서 10분 동안 원심분리한다. 배지를 제거하고 세포를 4 ml의 RPMI에 재현탁한다. 이 분획은 PBMC를 함유한다.
PBMC 로부터 B 세포의 분리
100 ㎕의 다이나비즈(Dynabeads)(항-CD19)를 5-ml의 플라스틱 튜브에 넣는다. 비즈에 3 ml의 멸균 PBS를 첨가하고 혼합하여, 자기 홀더에 놓은 후, 2분 동안 놓아둔다. 용액을 파스퇴르 피펫을 사용하여 제거한다. 3 ml의 멸균 PBS를 첨가하고, 혼합한 후 자기 홀더에 놓고, 2분 동안 놓아둔다. 멸균 PBS를 사용하는 이 과정을 한 번 더 반복하여 총 3회 세척한다. PBMC를 비즈에 첨가하여 혼합하면서 30분 동안 40 ℃에서 인큐베이션한다. PBMC와 비즈를 함유하는 튜브를 자기 홀더에 2분 동안 놓아둔 후, 용액을 자기 홀더에 있는 새로운 5-ml 튜브에 옮긴다. 2분 후에 용액을 새로운 15-ml 튜브에 옮긴다. 이 단계를 4회 더 반복하고, 처음 4회의 용액을 15-ml 튜브에 수집한 후 1000 RPM에서 5분 동안 원심분리한다. 이 단계로 T-세포 분리를 위한 펠렛이 생성된다.
비즈를 수집하기 위하여 100 ㎕의 RPMI(첨가물 있음)를 첨가하고, 용액을 0.7-ml 튜브에 옮긴다. 10 ㎕의 다이날 데타차 비즈(Dynal Detacha Beads)를 실온 에서 현탁액에 첨가하고, 그것을 45분 동안 회전시킨다. 현탁액을 새로운 5-ml 튜브에 옮기고 3-ml의 RPMI(첨가물 있음)을 첨가한다. 튜브를 자기 홀더에 2분 동안 놓아둔다. 그 용액을 자기 홀더에 있는 새로운 5-ml 튜브에 옮겨서 2분 동안 놓아둔 후 15-ml 튜브에 옮긴다. 이전 단계를 3회 더 반복하고, 용액을 15-ml 튜브에 수집한다. 15-ml 튜브를 1000 RPM에서 10분 동안 원심분리하고, 세포를 10 ml의 RPMI에 재현탁한다. 세척 단계를 2회 더 반복하여 총 3회 세척한다. 세포를 마지막 원심분리 전에 계수한다. 이 단계로 B-세포 정제를 완료한다. 세포를 90% FCS 및 10% DMSO 중에 보관하여 -80℃에 동결한다.
유동 세포형광계 분석( Flow Cytofluorometric Assay )
라모스 세포(106 세포/샘플)를 100 ㎕의 일차 항체(PBS-BSA 중의 10 ㎍/ml)중에서 20분 동안 4 ℃에서 인큐베이션한다. PBS-BSA 또는 HBSS-BSA로 3회 세척한 후, 세포를 100 ㎕의 염소 항-(사람 IgG) 항체(Caltaq)의 FITC-표지된 F(ab')2 단편과 20분 동안 4 ℃에서 인큐베이션한다. PBS-BSA로 3회 세척하고, PBS로 1회 세척한 후, 세포를 0.5-ml의 PBS에 재현탁한다. 분석은 FACSCAN V(Becton Dickinson, 캘리포니아주 산호세 소재)로 수행한다.
하이브리도마 클론의 제조
면역화된 마우스로부터의 비장 세포를 문헌(Boer et al.(1988) J. Immunol. Meth. 113:143)에 이전에 설명된 바와 같이 SP 2/0 또는 P 3×63Ag8.653 쥐 골수종 세포와 10:의 비율로, 50% 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 융합한다. 융합된 세포를 히포크산틴(0.1 mM), 아미노프테린(0.01 mM), 티미딘(0.016 mM), 및 0.5 ng/ml의 hIL-6(Genzyme, 매사추세츠주 캠브리지 소재)이 첨가된 완전 IMDM 배지에 재현탁한다. 그 후, 융합된 세포를 96-웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 분배하여 각 웰이 평균 하나의 성장하는 하이브리도마를 함유하도록 한다.
10 내지 14일 후, 하이브리도마 집단의 상층액을 특이적 항체 생성에 대하여 스크린한다. 하이브리도마 클론에 의한 특이적 항체 생성의 스크리닝을 위해서는, 각 웰로부터의 상층액을 모아서 먼저 ELISA에 의해 항-CD40 활성 특이성에 대해 테스트한다. 그런 다음 양성을 FACS 분석에 대해 상기에서 설명한 바와 같이 EBV-형질전환된 B 세포의 형광 세포 염색에 대해 사용한다. 양성 하이브리도마 세포를 0.5 ng/ml hIL-6을 함유한 IMDM/FBS에서의 제한 희석에 의해 2회 클로닝한다.
실시예 1: 항- CD40 항체의 제조
항-CD40 항체를 제조하기 위하여 사람 IgG1 또는 IgG2 중쇄 유전자좌 및 사람 κ 사슬 유전자좌를 내포하고 있는 트랜스제닉 마우스(Abgenix γ-1 XenoMouse)를 사용한다. CD40 세포외재성 도메인을 발현하는 SF9 곤충 세포를 면역원으로서 사용한다. 마우스 비장을 마우스 골수종 SP2/0 세포와 융합하여 ELISA에서 재조합 CD40을 인식하는 항체를 제조한다. Abgenix XenoMouse에서 제조된 하이브리도마의 평균 대략 10%가 사람 카파 사슬 대신에 마우스 람다 경쇄를 함유할 수 있다. 마우스 경쇄 람다 사슬을 함유하는 항체를 선택한다. 또한 세포-표면 CD40에 결합하는 것으로 나타난 항체의 서브세트를 추가 분석을 위해 선택한다. 일련의 서브클로닝 과정 중에 선택된 안정한 하이브리도마를 결합 및 기능 분석에서 추가 특성화하는 데 사용한다. 길항제 활성을 갖고 있는 다른 하이브리도마에서 유래된 클론을 추가 확인한다. 이들의 상대적인 길항제 능력 및 C4BP-매개 CD40 신호전달을 억제함으로써 CD40-유도 활성에 영향을 미치는 능력에 기초하여, 하이브리도마 클론을 추가 평가를 위해 선택한다.
실시예 2: 선택된 하이브리도마의 결합 특성
단백질 A를 아민 결합을 통하여 CM5 바이오센서 칩상에 고정시킨다. 1.5 ㎍/ml 농도의 항-CD40 모노클론 항체를 변형된 바이오센서 표면상에 1.5분 동안 10 ㎕/분에서 포획시킨다. 재조합 가용성 CD40-his를 다양한 농도로 바이오센서 표면위를 흐르게 한다. 항체와 항원을 0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20(HBS-EP)로 희석한다. 역학 및 친화력 상수를 1:1 상호작용 모델/글로벌 피트로 Biaevaluation 소프트웨어를 사용하여 결정한다.
실시예 3: 시험관내에서 CD40 / C4BP 상호작용에 미치는 길항제 항- CD40 항체의 효과
일부 예에서, 후보 항체는 세포 표면 CD40에 C4BP가 결합하는 것을 방해하고 사전-결합된 C4BP를 대체한다. 후보 항체를 림프종 세포주(Ramos)의 표면상의 CD40에 결합하는 C4BP를 방해하는 능력에 대하여 시험한다. 적합한 길항제 항-CD40 항체가 이들 세포 상의 CD40 항원에 결합하면 PE-C4BP, FITC-4BP, 비오틴-C4BP, 또는 Alexfluor-C4BP의 연속적인 결합을 방해하는데, 이는 유체 세포측정 분석에 의하여 측정한다. 두 번째 세트의 분석에서, 후보 항체를 세포 표면 CD40에 사전-결합된 C4BP를 대체하는 능력에 대하여 시험한다.
실시예 4: 정상 피험체로부터의 사람 림프구의 CD40 -유도 증식에 대한 항체 길항제
CD40 옆에 CD40의 결합은 CD40 신호전달을 자극하고, 이는 정상 사람 B 세포의 증식을 유도한다. C4BP-매개 CD40 신호전달을 차단하는 길항제 항-CD40 항체는 이 증식을 억제하는 것으로 예상된다.
후보 항체를 C4BP-매개 CD40 신호전달 및 정상 사람 피험체로부터의 PBMC의 연속적 증식을 억제하는 능력에 대하여 시험한다. 가용성 C4BP 알파 사슬 서브유닛 및 C4BP α7β1 헤테로머를 작용제로 사용한다. PBMC의 증식은 3중수소 처리된 티미딘 혼입에 의해 측정한다. 실험은 관찰된 억제가 단일 기증자로부터의 세포의 독특함이 아니라는 것을 확실하게 하기 위해 PBMC의 다수 기증자(n>1)에게 수행한다. 이들 분석에 광범위한 항체 농도(0.01 ㎍/ml 내지 100 ㎍/ml)를 사용한다. 일반적으로, 관심대상의 항체는 C4BP-매개 CD40 신호전달을 방해하고, 그럼으로써 대부분의 경우 항체의 0.1 ㎍/ml 농도에서 CD40-유도 증식을 억제할 것이다.
B 세포 외에, 사람 PBMC는 또한 항체 의존성 세포독성(ADCC)을 매개할 수 있는 자연 킬러 세포를 함유한다. 증식의 항체-매개 억제의 메커니즘을 명확하게 하기 위하여, 분석을 사람 PBMC에서 정제한 B 세포로 수행한다. 항체가 C4BP가 CD40에 결합함으로써 유도되는 정제된 B 세포의 CD40-유도 증식을 억제할 수 있다면, ADCC의 메커니즘이 아닌, 후보 항체의 길항제 활성은 이들 분석에서 증식 억제를 야기한다.
실시예 5: 길항제 항체는 정상 피험체로부터의 사람 B 세포의 강한 증식을 유도하지 못한다
C4BP는 정상 B 세포가 증식하도록 유도한다. 길항제 항-CD40 항체의 결합은 정상 및 악성 B 세포의 증식에 대하여 유사한 자극 신호를 제공할 수 있다. 강력한 B 세포 자극 활성을 가진 항체는 B 세포 림프종 및 자가면역 장애의 치료적 처치에 적합한 후보가 아니다. C4BP-매개 CD40 신호전달을 차단하는 후보 항체를 정상 자원 기증자로부터의 B 세포의 증식을 유도하는 능력에 대하여 시험한다. 정상 기증자 PBMC로부터 정제된 B 세포를 총 4일 동안 다양한 농도의 후보 항체(0.001 내지 100 ㎍/ml의 범위)와 함께 배양한다. B 세포 증식을 3중 수소-표지 티미딘의 혼입에 의해 측정한다. 가용성 C4BP가 B 세포의 격렬한 증식을 유도하는 반면, 본 발명의 방법에 적합한 후보 항체들은 정상 B 세포의 약한 증식만을 유도한다.
B 세포 외에, 사람 PBMC는 B 세포 상의 CD40에 결합하는 항-CD40 항체의 교차 결합을 제공할 수 있는 IgG1 분자에 대한 Fc 수용체(FcR)을 내포하는 세포 유형을 함유한다. 이 교차결합은 항-CD40 항체의 자극 활성을 강력하게 증가시킨다. 교차결합 세포의 존재하에 후보 항체의 B 세포 자극 활성의 결여를 확인하기 위하여, FcR+ 세포뿐만 아니라 B 세포를 함유하는 총 PBMC로 증식 실험을 수행한다. 일반적으로, 이들 후보 항체들은 FcR-보유 세포의 존재하는 경우라도 B 세포가 대조군 사람 IgG1에 의하여 유도된 바탕 증식을 초과하여 증식하도록 자극하지 않는다. 후보 mAb들에 의한 자극 활성의 결여는 추가로 배양 웰의 플라스틱 표면상에 고정된 후보 항-CD40 항체에 반응하는 PBMC 증식을 측정함으로써 확인한다. 이들 데이터를 종합하면 후보 항-CD40 항체는 강한 B 세포 자극 특성을 갖지 않는다는 것을 보여준다.
실시예 6: 후보 항체들은 ADCC 에 의하여 CD40 -보유 표적 세포를 죽일 수 있다
일부 예에서, 후보 항체들은 ADCC의 메커니즘에 의해 CD40-보유 표적 세포 (림프종 라인 및/또는 고형 종양 라인)를 죽일 수 있다. IgG1 이소타입의 항체는 ADCC의 메커니즘에 의해 표적 세포의 죽음을 유도하는 능력을 가지고 있는 것으로 예상된다. 후보 항-CD40 항체들를 시험관내 분석에서 암 세포주를 죽이는 능력에 대하여 시험한다. 2개의 사람 림프종 세포주(Ramos 및 Daudi), 1개의 사람 결장암 세포주(HCT116), 및 7개의 다른 암종 세포주, 예를 들면 난소암 세포주 SKOV3 및 HEY, 피부 편평 암 세포주 A431, 유방암 세포주 MDA-MB231 및 MDA-MB435, 및 폐암 세포주 NCI-H460 및 SK-MES-1을 이들 분석에 대한 표적 세포로서 선택한다. 정상 자원 기증자로부터의 PBMC 또는 풍부해진 NK 세포를 이들 분석에서 효과기 세포로서 사용한다.
실시예 7: 후보 항체들은 NHL 환자의 림프절로부터의 암세포의 증식을 자극하지 않는다
CD40 신호전달은 NHL 환자로부터의 림프종 세포의 생존 및 증식을 유도한다. 이와 같이 C4BP는 NHL에서 기능을 할 수 있다. 일부 항-CD40 항체(작용제)의 결합은 환자 암세포의 증식에 대하여 유사한 자극 신호를 제공할 수 있다. 상기에 나타낸 바와 같이, 강력한 B 세포 자극 활성을 가지는 항체는 B 세포 림프종의 치료적 처치를 위한 적합한 후보가 아니다. 후보 항체를 환자로부터의 NHL 세포 증식을 유도하는 능력에 대하여 시험한다. 림프절(LN) 생검으로부터 분리한 세포를 총 3일 동안 다양한 농도(0.01 내지 300 ㎍/ml의 범위)로 배양한다. 세포 증식을 3중 수소로 처리한 티미딘의 혼입에 의해 측정한다. 일반적으로, 후보 mAb는 시험한 어떠한 농도에서 암세포의 어떠한 증식도 유도하지 않아야 한다. 외래적으로 첨가된 B 세포 성장 인자인 IL-4의 존재하에서도 항체는 NHL 세포의 증식을 유도하지 않아야 한다. 이들 결과는 항체가 비-작용제 항-CD40 항체이며, 환자로부터의 NHL 세포의 시험관내 증식을 자극하지 않는다는 것을 나타낸다.
실시예 8: 후보 항체들은 비- 호지킨 림프종 환자로부터의 암세포의 C4BP -유도된 증식을 차단할 수 있다
C4BP에 의한 CD40의 결합은 NHL 환자로부터의 암세포의 증식을 유도할 수 있다. 후보 길항제 항-CD40 항체는 이 증식을 억제할 것으로 예상된다. 후보 항-CD40 항체를 다양한 농도(0.01 ㎍/ml 내지 100 ㎍/ml)에서 C4BP가 이들 세포 상의 CD40 항원에 결합함으로써 유도된 NHL 세포의 CD40-유도된 증식을 억제하는 능력에 대하여 시험한다. 환자로부터의 NHL 세포를 IL-4의 존재하에 C4BP가 있는 현탁액 중에서 배양한다. NHL 세포 증식을 3H-티미딘 혼입에 의하여 측정한다. 관심대상의 후보 항체는 그 억제성 효과가 증가하는 길항제 항-CD40 항체 농도에 따라 증가하므로 농도-의존적 방식으로 대조군과 비교할 때 NHL 세포의 증식을 억제한다.
실시예 9: C4BP -발현 세포와 함께 배양되었을 때 생존가능한 NHL 세포의 수 에 미치는 후보 항체들의 효과
C4BP가 CD40에 결합하는 것은 CD40-발현 세포를 자극하는 대안적 방법이다. CD40 신호전달은 B 세포 생존에 중요하다. 이 세트의 실험은 C4BP의 존재하에서 7일, 10일 및 14일에 후보 항-CD40 항체가 NHL 세포 수에 미치는 효과를 평가한다. 환자로부터의 NHL 세포를 IL-4의 존재하에서 C4BP가 있는 현탁액에서 배양한다. 대조군 사람 IgG 및 후보 항체를 0일 및 7일에 10 ㎍/ml의 농도로 첨가한다. 각 조건 하에서 생존가능한 세포를 특정한 날에 계수한다. 대조군(IgG)의 세포 수는 대체로 시간에 따라 증가한다. 대체로, 감소된 수의 세포는 대조군과 비교할 때 길항제 항체의 존재하에서 회복된다.
본원에 나타낸 본 발명의 많은 변형 및 다른 구체예는 이 발명이 속한 분야의 당업자에게 이전의 상세한 설명 및 연관 도면에 나타낸 설명의 잇점을 가진 것으로 이해될 것이다. 따라서, 본 발명은 개시된 특정 구체예에 한정되지 않고, 변형 및 다른 구체예는 본원에 개시된 첨부된 청구범위의 범주 내에 포함되는 것으로 의도된다. 특정 용어들을 본원에 사용하였지만, 이들은 제한하려는 목적이 아니라 포괄적이고 설명적인 의미에서 사용된다.
본 명세서에 언급된 모든 공보 및 특허출원은 본 발명이 속한 분야의 당업자의 수준을 나타낸다. 모든 공보 및 특허 출원은 각각의 개별 공보 또는 특허출원이 특정적 및 개별적으로 참고 인용되도록 지시된 것과 같은 정도로 본원에 참고 인용된다.

Claims (46)

  1. 세포의 표면상에 발현된 CD40 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 유의한 CD40 작용제 활성이 없고, 상기 항체가 상기 CD40 항원에 결합하는 것이 C4b 결합 단백질(C4BP)-매개 CD40 신호전달을 차단하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체는 모노클론 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
  3. 제2항에 있어서, 상기 모노클론 항체는 완전히 사람의 항-CD 모노클론 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
  4. 제2항에 있어서, 상기 모노클론 항체는 사람화된 항-CD40 모노클론 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
  5. 제2항에 있어서, 상기 모노클론 항체는 면역학적으로 활성 키메라 항-CD 모노클론 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 항체는 상기 CD40 항원에 적어도 약 10_6 M 내지 약 10-12 M의 친화력(KD)으로 결합하는 것을 특징으로 하는 항체.
  7. 제1항에 있어서, 상기 항원-결합 단편은 Fab 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편 및 단쇄 Fv 단편으로 구성된 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항체.
  8. 제1항에 있어서, 상기 항체는 C4BP보다 더 높은 친화력으로 CD40 상의 C4BP 결합 부위의 적어도 일부와 결합하는 것을 특징으로 하는 항체.
  9. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이것의 항원-결합 단편이 상기 CD40 항원에 결합하는 것은 상기 C4BP가 상기 CD40 항원에 결합하는 것을 입체적으로 억제함으로써 C4BP-매개 CD40 신호전달을 차단하는 것을 특징으로 하는 항체.
  10. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 상기 CD40 항원 상의 C4BP 결합 부위의 적어도 일부에 대하여 경쟁함으로써 C4BP가 상기 CD40 항원에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하는 것을 특징으로 하는 항체.
  11. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이것의 항원-결합 단편이 상기 CD40 항원에 결합하는 것은 상기 C4BP가 상기 CD40 항원에 리게이트할 때 CD40 신호전달을 방해하는 것을 특징으로 하는 항체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 재조합으로 생성되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
  13. 제2항의 모노클론 항체를 생성할 수 있는 하이브리도마 세포주.
  14. CD40 상의 C4b 결합 단백질(C4BP) 결합 부위의 적어도 일부에 결합하는 길항제 항-CD40 항체.
  15. 제14항에 있어서, 상기 항체는 완전히 사람의 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
  16. 제14항에 있어서, 상기 항체는 유의한 CD40 작용제 활성이 없는 것을 특징으로 하는 항체.
  17. 제14항에 있어서, 상기 항체 또는 이것의 항원-결합 단편이 상기 CD40 항원에 결합하는 것은 상기 C4BP가 상기 CD40 항원에 결합하는 것을 입체적으로 억제함 으로써 C4BP-매개 CD40 신호전달을 차단하는 것을 특징으로 하는 항체.
  18. 제14항에 있어서, 상기 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 상기 CD40 항원 상의 C4BP 결합 부위의 적어도 일부에 대하여 경쟁함으로써 C4BP가 상기 CD40 항원에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하는 것을 특징으로 하는 항체.
  19. 제14항에 있어서, 상기 항체 또는 이것의 항원-결합 단편이 상기 CD40 항원에 결합하는 것은 상기 C4BP가 상기 CD40 항원에 리게이트할 때 CD40 신호전달을 방해하는 것을 특징으로 하는 항체.
  20. 제14항에 있어서, 항체는 C4BP보다 더 높은 친화력으로 CD40 상의 C4BP-결합 부위의 적어도 일부와 결합하는 것을 특징으로 하는 항체.
  21. CD40-발현 세포의 CD40-유도 활성을 억제하기 위한 방법으로서, 상기 CD40-유도 활성은 C4b 결합 단백질(C4BP)이 상기 세포의 표면상에 발현된 CD40 항원에 결합함으로써 매개되고, 상기 방법은 상기 CD40 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항-CD40 항체 또는 이것의 항원-결합 단편의 유효량으로 상기 세포를 접촉하는 것을 포함하며, 상기 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 유의한 CD40 작용제 활성이 없고, 상기 항체가 상기 CD40-발현 세포 상의 상기 CD40 항원에 결합하는 것은 C4BP-매개 CD40 신호전달을 차단함으로써, 상기 CD40-유도 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 CD40-유도 활성은 세포 증식, 세포 분화, 항체 생성, 세포 기억 발생, 이소타입 전환, 세포간 부착, 사이토카인의 분비, 메탈로프로테아제의 분비, 세포 부착 분자의 발현으로 구성된 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 CD40-발현 세포는 정상 B 세포이고, 억제되는 상기 CD40-유도 활성은 세포 증식, 세포 분화, 및 항체 생성으로 구성된 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제22항에 있어서, 상기 CD40-발현 세포는 악성 B 세포 또는 고형 종양의 CD40-발현 신생 세포이고, 억제되는 상기 CD40-유도 활성은 세포 증식인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제21항에 있어서, 상기 항-CD40 항체 또는 이것의 항원-결합 단편이 상기 CD40 항원에 결합하는 것은 상기 C4BP가 상기 CD40 항원에 결합하는 것을 입체적으로 억제함으로써 C4BP-매개 CD40 신호전달을 차단하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제21항에 있어서, 상기 항-CD40 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 상기 CD40 항원 상의 C4BP 결합 부위의 적어도 일부에 대하여 경쟁함으로써 C4BP가 상기 CD40 항원에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제21항에 있어서, 상기 항-CD40 항체 또는 이것의 항원-결합 단편이 상기 CD40 항원에 결합하는 것은 상기 C4BP가 상기 CD40 항원에 리게이트할 때 CD40 신호전달을 방해하는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제21항에 있어서, 항-CD40 항체는 모노클론 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 모노클론 항체는 완전히 사람의 항-CD40 모노클론 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제28항에 있어서, 상기 모노클론 항체는 사람화된 항-CD40 모노클론 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제28항에 있어서, 상기 모노클론 항체는 면역학적으로 활성 키메라 항-CD40 모노클론 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제21항에 있어서, 상기 항-CD40 항체는 상기 CD40 항원에 적어도 약 10_6 M 내지 약 10-12 M의 친화력(KD)으로 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제21항에 있어서, 상기 항원-결합 단편은 Fab 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편 및 단쇄 Fv 단편으로 구성된 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 치료가 필요한 피험체에서 CD40-연관 질병을 치료하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제12항 및 제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따르는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편의 치료적 유효량을 상기 피험체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 CD40-연관 질병은 암인 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 암은 비-호즈킨 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 다발성 골수종, B 세포 림프종, 말기 B 세포 림프종, 중기 B 세포 림프종, 초기 B 세포 림프종, B 세포 급성 림프아세포성 백혈병, 골수성 백혈병, 호즈킨 질병, 플라스마사이토마, 여포성 림프종, 여포성 작은 분열된 림프종, 여포성 큰 세포 림프종, 여포성 혼합된 작은 분열된 림프종, 미만성 작은 분열된 세포 림프종, 미만성 작은 림프구성 림프종, 전구림프구성 백혈병, 림포플라스마사이틱 림프종, 경계 지대 림프종, 점막 연관 림프구양 조직 림프종, 단핵구양 B 세포 림프종, 비장 림프종, 유모 세포 백혈병, 미만성 큰 세포 림프종, 종격동 큰 B 세포 림프종, 림프종모양 육아종증, 혈관내 림프종증, 미만성 혼합된 세포 림프종, 미만성 큰 세포 림프종, 면역아세포성 림프종, 버킷 림프종, AIDS-관련 림프종 및 외막 세포 림프종으로 구성된 군 중에서 선택된 암으로 구성된 군 중에서 선택된 B 세포-관련 암인 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제35항에 있어서, 상기 암은 CD40 항원을 발현하는 신생 세포를 포함하는 고형 종양인 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 고형 종양은 폐 암종, 유방 암종, 난소 암종, 피부 암종, 결장 암종, 방광 암종, 간 암종, 위 암종, 전립선 암종, 신장세포 암종, 비강인두 암종, 편평 세포 암종, 갑상선 유두 암종, 경부 암종 및 육종으로 구성된 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암의 치료에 사용하기 위하여 의도된 하나 이상의 다른 암 치료법을 상기 피험체에게 적용하는 것을 더 포함하고, 상기의 하나 이상의 다른 암 치료법은 수술, 방사선 치료법, 화학치료법, 다른 항암 모노클론 항체 치료법, 소분자-기초 암 치료법, 백신-기초 암 치료법, 면역치료-기초 암 치료법, 및 스테로이드 치료법으로 구성된 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제34항에 있어서, 상기 CD40-연관 질병은 염증성 질병 또는 자가면역 질병인 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 염증성 질병 또는 자가면역 질병은 전신성 홍반성 낭창(SLE), 원판상 낭창, 낭창성 신염, 유육종증, 소아 관절염, 류마티스 관절염, 건선성 관절염, 라이터 증후군, 강직성 척추염, 통풍성 관절염, 기관 또는 조직 이식의 거부, 이식 편대 숙주병, 다발성 경화증, 과 IgE 증후군, 결절성 다발성 동맥염, 원발성 담즙성 간경변증, 염증성 장 질환, 크론씨 병, 셀리악병(글루텐-민감성 창자병증), 자가면역 간염, 악성 빈혈, 자가면역성 용혈성 빈혈, 건선, 경피증, 중증 근무력증, 자가면역 혈소판 감소성 자반증, 자가면역성 갑상선염, 그레이브병, 하시모토 갑상선염, 면역복합체병, 만성 피로 면역기능부전 증후군(CFIDS), 다발성근염과 피부근염, 크리오글로불리네미아, 혈전 용해, 심근증, 심상성 천포창, 폐 간질성 섬유화증, 유육종증, 제1형 및 제2형 당뇨병, 제1형, 제2형, 제3형 및 제4형 지연형 과민증, 알레르기 또는 알레르기성 장애, 천식, 척－스트라우스 증후군(알레르기성 육아종증), 아토피성 피부염, 알레르기성 및 자극성 접촉 피부염, 두드러기, IgE-매개 알레르기, 아테롬성 동맥 경화증, 혈관염, 특발성 염증성 근병증, 용혈성 질병, 알츠하이머병 및 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증으로 구성된 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 기관 또는 조직 이식은 심장, 폐, 신장, 췌장, 피부 및 골수로 구성된 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제41항에 있어서, 상기 치료는 수술, 기관 관류, 방사선 치료법, 스테로이드 치료법, 비-스테로이드 치료법, 항생제 치료법, 항진균 치료법, 호르몬 치료법, 사이토카인 치료법, 피부병학적 제제를 통한 치료법, 면역억제 치료법 및 다른 항-염증성 모노클론 항체 치료법으로 구성된 군 중에서 선택된 하나 이상의 다른 치료법을 상기 피험체에게 적용하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 CD40-연관 질병은 기관 또는 조직 이식의 거부이고, 피험체는 또한 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 코르티코스테로이드, CTLA4-Ig 및 항-B 림프구 자극자 항체로 구성된 군 중에서 선택된 면역억제제로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  45. C4BP가 CD40 항원에 결합하는 것을 억제하는 항체를 확인하기 위한 방법으로서, C4BP와 CD40에 결합하는 항체 간에 경쟁적 결합 분석을 수행하는 것을 포함하는 하는 방법.
  46. 사람 CD40-발현 세포의 표면에 발현된 사람 CD40 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 사람 모노클론 항체로서, 상기 모노클론 항체는 유의한 작용제 활성이 없고, 상기 항체가 상기 CD40 항원에 결합하는 것은 상기 세포의 C4BP-매개 CD40 신호전달을 차단하는 것을 특징으로 하는 방법.
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