CN117999097A - 用于产生个人化癌症免疫疗法的方法 - Google Patents

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Abstract

本公开的发明包括可用于产生靶向肿瘤相关新表位的个人化癌症免疫疗法的方法和组合物。还包括用于治疗有需要的对象中的癌症的方法。

Description

用于产生个人化癌症免疫疗法的方法
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)享有2021年8月6日提交的美国临时专利申请号63/230,161的优先权，该申请整体因此通过引用。
技术领域
本发明总体上涉及用于产生个人化癌症免疫疗法的方法，该癌症免疫疗法可以在逐一患者基础上被定制。更具体地，其涉及靶向患病细胞表面上的新表位的抗体，其中抗体结合免疫细胞发挥作用。
背景技术
癌症免疫疗法是利用免疫细胞、免疫系统相关分子或免疫化方法来治疗癌症。免疫疗法方式的实例包括检查点阻断、用单克隆抗体靶向疗法、过继细胞疗法和利用癌症抗原的治疗性免疫化。检查点阻断抗体(例如伊匹单抗(ipilimumab)、派姆单抗(pembrolizumab))意图增强或恢复天然抗癌免疫响应，而靶向的抗体疗法意图朝向过度表达某些表面分子的癌细胞定向细胞毒性响应(例如，针对表皮生长因子受体(EGFR)的西妥昔单抗(cetuximab))。细胞疗法包括离体扩增和给予自体或同种异体免疫细胞(例如，T细胞、天然杀伤(NK)细胞)以及工程细胞，以表达针对细胞表面分子如CD19的嵌合抗原受体(CAR)。在治疗性免疫化的相关领域中，研究仍在进行以开发基于源于突变的“新抗原”的策略，该“新抗原”通常由癌细胞表面的HLA分子呈递(作为“新表位”肽)。
理想的癌症治疗应特异性地仅破坏癌细胞，同时使正常细胞不受影响，导致高效力以及低毒性或无毒性。不幸的是，这仍然是未实现的愿景。检查点阻断，由于其非特异性激活免疫细胞，通常导致不利事件。大多数CAR-T细胞疗法基于最常选择的靶抗原而靶向癌细胞和正常细胞，并且因此缺乏真正的癌症特异性。虽然新表位免疫化的理论益处是其真正的癌症特异性，但这种方式尚未实现显著的临床成功。泛泛而言，迄今为止，免疫疗法方式特异性缺乏、高毒性、效力缺乏、生成具有挑战性或上述的组合。
因此，本领域需要不影响正常细胞并且引起最小限度的不利事件(如有)的有效的癌症特异性疗法。本发明解决了这种需要。
发明内容
以下给出了本发明的方面的简化概述，以提供对本发明的基本理解。这种概述不是本发明的广泛总览。其不意图确定本发明的重要/关键要素或界定本发明的范围。其唯一目的是以简化形式展示本发明的一些概念，作为稍后展示的更详细描述的前序。
在本发明的某些实施方式中，提供了用于治疗癌症的组合物，其包含特异性结合肿瘤特异性表位-HLA复合物的一种或多种抗体(或其抗原结合片段)，以及有效量的细胞毒性免疫效应细胞，其组合物是个人化的——鉴于[a]肿瘤特异性表位是HLA(人白细胞抗原)系统上显示的患者特异性新表位，并且[b]细胞毒性免疫效应细胞能够通过细胞表面的Fc-γ(Fcγ)受体来接合抗体(一种或多种，或抗体片段)，以及随后诱导ADCC(抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性)或ADCP(抗体依赖性的细胞介导的吞噬作用)，是选自NK细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞或其任何组合的细胞类型。
在某些实施方式中，提供了制备用于治疗癌症的组合物的方法，其包括以下步骤：从对象获得肿瘤样本和通过测序确定肿瘤表达的肿瘤特异性遗传突变，基于确定的肿瘤特异性遗传突变生成HLA/新表位复合物，用HLA/新表位复合物免疫化非人动物，从免疫化的非人动物分离产生新表位特异性抗体或其抗原结合片段的B细胞，验证新表位特异性抗体与肿瘤结合，产生有效量的新表位特异性抗体或抗体片段，以及将[a]有效量的特异性结合肿瘤特异性表位-HLA复合物的抗体(一种或多种，或抗体片段)与[b]有效量的能够通过细胞表面的Fc-γ(Fcγ)受体接合抗体(一种或多种，或抗体片段)的细胞毒性免疫效应细胞组合，以及随后诱导ADCC(抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性)或ADCP(抗体依赖性的细胞介导的吞噬作用)，该细胞毒性免疫效应细胞选自NK细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞或其任何组合。
一方面，本发明包括用于治疗癌症的组合物，所述组合物包含：
a.特异性结合一种或多种肿瘤特异性表位的一种或多种抗体或其抗原结合片段，和
b.有效量的细胞毒性免疫效应细胞。
在某些实施方式中，组合物是个人化的。
在某些实施方式中，肿瘤特异性表位是新表位。
在某些实施方式中，抗体或其抗原结合片段是人源化的。
在某些实施方式中，抗体或其抗原结合片段是完全人的。
在某些实施方式中，抗体或其抗原结合片段是非岩藻糖基化的(afucosylated)。
在某些实施方式中，抗体或其抗原结合片段是双特异性的。
在某些实施方式中，肿瘤特异性表位是新表位/HLA复合物。
在某些实施方式中，细胞毒性免疫效应细胞是选自NK细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞及其任何组合的细胞类型。
在某些实施方式中，细胞毒性免疫效应细胞被照射。
另一方面，本发明包括制备用于治疗癌症的组合物的方法，所述方法包括：
a.从对象获得肿瘤样本并且通过测序确定肿瘤表达的肿瘤特异性遗传突变，
b.基于确定的肿瘤特异性遗传突变，生成HLA/新表位复合物，
c.用HLA/新表位复合物免疫化非人动物，
d.从免疫化的非人动物分离B细胞，所述B细胞产生HLA/新表位特异性抗体或促进其抗原结合片段的生成，
e.验证HLA/新表位特异性抗体与肿瘤结合，
f.制备有效量的HLA/新表位特异性抗体，以及
g.将有效量的HLA/新表位特异性抗体与有效量的细胞毒性免疫效应细胞组合。
在某些实施方式中，测序是下一代测序(next-generation sequencing)。
在某些实施方式中，非人动物被人源化。
在某些实施方式中，非人动物产生完全人(fully-human)抗体。
在某些实施方式中，人源化的非人动物选自大鼠、小鼠、兔、驴、山羊、骆驼、美洲驼(llama)、羊驼和鲨鱼。
在某些实施方式中，HLA/新表位特异性抗体通过非动物方法生成。
在某些实施方式中，非动物方法是噬菌体展示。
在某些实施方式中，抗体或其抗原结合片段是非岩藻糖基化的。
在某些实施方式中，抗体的同种型支持ADCC或ADCP。
在某些实施方式中，抗体的同种型从不支持ADCC或ADCP的同种型被进一步修饰成支持ADCC或ADCP的同种型。
在某些实施方式中，HLA/新表位复合物选自单体复合物、五聚体复合物、四聚体复合物、葡聚糖连接的复合物及其任何组合。
在某些实施方式中，细胞毒性免疫效应细胞是选自NK细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞及其任何组合的细胞类型。
另一方面，本发明包括制备用于治疗癌症的组合物的方法，所述方法包括：
a.从对象获得肿瘤样本并且通过测序确定肿瘤表达的肿瘤特异性遗传突变，
b.基于确定的肿瘤特异性遗传突变，生成HLA/新表位复合物，
c.用HLA/新表位复合物免疫化非人动物，
d.从免疫化的非人动物分离B细胞，该B细胞产生HLA/新表位特异性抗体或促进其抗原结合片段的生成，
e.验证HLA/新表位特异性抗体与肿瘤结合，
f.生成一种或多种嵌合抗原受体(CAR)，其包含来自HLA/新表位特异性抗体的抗原结合结构域，以及
g.在细胞毒性免疫效应细胞中表达CAR。
在某些实施方式中，测序是下一代测序。
在某些实施方式中，非人动物被人源化。
在某些实施方式中，非人动物产生完全人抗体。
在某些实施方式中，人源化的非人动物选自大鼠、小鼠、兔、驴、山羊、骆驼、美洲驼、羊驼和鲨鱼。
在某些实施方式中，HLA/新表位特异性抗体通过非动物方法生成。
在某些实施方式中，非动物方法是噬菌体展示。
在某些实施方式中，生成CAR进一步包括基于抗体的抗原结合结构域生成scFv的步骤。
在某些实施方式中，CAR进一步包含跨膜结构域、信号传导结构域和共刺激结构域。
在某些实施方式中，HLA/新表位复合物选自单体复合物、五聚体复合物、四聚体复合物、葡聚糖连接的复合物及其任何组合。
在某些实施方式中，细胞毒性免疫效应细胞是选自NK细胞、T细胞、NK T细胞或其任何组合的细胞类型。
在某些实施方式中，细胞毒性免疫效应细胞是NK细胞。
在某些实施方式中，细胞毒性免疫效应细胞是CD8+T细胞。
另一方面，本发明包括治疗有需要的对象中的癌症的方法，所述方法包括：
a.从对象获得肿瘤样本并且通过测序确定肿瘤表达的肿瘤特异性新表位，
b.由确定的肿瘤特异性新表位生成HLA/新表位复合物，
c.用HLA/新表位复合物免疫化非人哺乳动物，
d.从免疫化的非人哺乳动物分离B细胞，该B细胞产生HLA/新表位特异性抗体或其抗原结合片段，
e.验证HLA/新表位特异性抗体与肿瘤结合，
f.制备有效量的HLA/新表位特异性抗体，以及
g.向对象给予有效量的HLA/新表位特异性抗体和有效量的细胞毒性免疫效应细胞，从而治疗癌症。
在某些实施方式中，测序是下一代测序。
在某些实施方式中，非人动物被人源化。
在某些实施方式中，非人动物产生完全人抗体。
在某些实施方式中，人源化的非人动物选自大鼠、小鼠、兔、驴、山羊、骆驼、美洲驼、羊驼和鲨鱼。
在某些实施方式中，HLA/新表位特异性抗体通过非动物方法生成。
在某些实施方式中，非动物方法是噬菌体展示。
在某些实施方式中，HLA/新表位特异性抗体是非岩藻糖基化的。
在某些实施方式中，抗体的同种型支持ADCC或ADCP。
在某些实施方式中，抗体的同种型从不支持ADCC或ADCP的同种型被进一步修饰成支持ADCC或ADCP的同种型。
在某些实施方式中，HLA/新表位复合物选自单体复合物、五聚体复合物、四聚体复合物、葡聚糖连接的复合物及其任何组合。
在某些实施方式中，细胞毒性免疫效应细胞是选自NK细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞或其任何组合的细胞类型。
另一方面，本发明包括治疗有需要的对象中的癌症的方法，所述方法包括：
a.从对象获得肿瘤样本并且通过测序确定肿瘤表达的肿瘤特异性新表位，
b.由确定的肿瘤特异性新表位生成HLA/新表位复合物，
c.用HLA/新表位复合物免疫化非人哺乳动物，
d.从免疫化的非人哺乳动物分离B细胞，该B细胞产生HLA/新表位特异性抗体或其抗原结合片段，
e.验证HLA/新表位特异性抗体与肿瘤结合，
f.生成包含来自HLA/新表位特异性抗体的抗原结合结构域的嵌合抗原受体(CAR)，
g.在细胞毒性免疫效应细胞中表达CAR，以及
h.向对象给予有效量的细胞毒性免疫效应细胞，从而治疗癌症。
在某些实施方式中，测序是下一代测序。
在某些实施方式中，非人动物被人源化。
在某些实施方式中，人源化的非人动物选自大鼠、小鼠、兔、驴、山羊、骆驼、美洲驼、羊驼和鲨鱼。
在某些实施方式中，HLA/新表位特异性抗体通过非动物方法生成。
在某些实施方式中，非动物方法是噬菌体展示。
在某些实施方式中，HLA/新表位复合物选自单体复合物、五聚体复合物、四聚体复合物、葡聚糖连接的复合物及其任何组合。
在某些实施方式中，生成CAR进一步包括基于抗体的抗原结合结构域生成scFv的步骤。
在某些实施方式中，CAR进一步包含跨膜结构域、信号传导结构域和共刺激结构域。
在某些实施方式中，HLA/新表位复合物选自单体复合物、五聚体复合物、四聚体复合物、葡聚糖连接的复合物及其任何组合。
在某些实施方式中，细胞毒性免疫效应细胞是选自NK细胞、T细胞、NK T细胞或其任何组合的细胞类型。
在某些实施方式中，细胞毒性免疫效应细胞是NK细胞。
在某些实施方式中，细胞毒性免疫效应细胞是CD8+T细胞。
附图说明
以下对本发明的具体实施方式的详细描述将在结合附图阅读时被更好地理解。为了示例本发明，附图中示出了示例性实施方式。然而，应当理解，本发明不限于附图中所示的实施方式的精确布置和手段。
图1是所提出的个人化癌症免疫疗法的制造过程的简化流程图。
图2是本发明的作用机制。图2中隐含的是效应免疫细胞表面上的CD16取而代之是任何Fc-γ受体(包括但不限于CD16、CD32或CD64)的情形。图2的图例对应如下：201突变导致非自身氨基酸序列的翻译，202抗原加工途径导致HLA分子上新表位的呈递，203针对新表位-HLA复合物的个人化TCR样抗体以高特异性结合至癌细胞，204效应细胞上的CD16(FcγRIII)以高亲和力结合至Fc区，激活细胞毒效应功能，205细胞毒性活性导致癌细胞的特异性杀伤。
图3是在优选实施方式中所提出的个人化癌症免疫疗法的制造过程的简化流程图。
图4是在优选实施方式中所提出的免疫疗法的作用机制。图4的图例对应如下：401移码突变导致非自身氨基酸序列的翻译，402抗原加工途径导致HLA分子上新表位的呈递，403针对新表位-HLA复合物的个人化TCR样抗体以高特异性结合至癌细胞，404NK细胞上的CD16(FcγRIII)以高亲和力结合至非岩藻糖基化的Fc区，激活细胞毒性效应功能，405细胞毒性颗粒的脱粒和/或细胞因子的分泌导致癌细胞的特异性杀伤。
图5是在优选实施方式中所提出的个人化癌症免疫疗法的制造和给予过程的详细流程图。图5的图例对应如下：502血液样品、504肿瘤样品、506下一代DNA测序、508RNA测序、510确定肿瘤中表达的移码突变、512基于HLA单倍型预测源自移码的高亲和力新表位，514产生HLA新表位四聚体，516利用HLA-新表位四聚体免疫化OmniRats，518第二次利用HLA-新表位四聚体免疫化OmniRats，520富集来自脾脏和淋巴结的B细胞，522利用HLA-新表位四聚体对B细胞进行染色，524新表位特异性B细胞的单细胞分选，526通过ELISA524测试Ab:Ag，528RT-PCR和阳性的测序，530将(人)可变区序列克隆到人抗体载体中，532利用生产细胞系生产小测试批次的候选抗新表位抗体，534建立患者肿瘤细胞的单细胞悬浮液，536冷冻保存，538解冻患者肿瘤细胞，540通过ELISA用候选抗新表位抗体对肿瘤细胞进行染色，542在细胞毒性增强培养基中培养NK细胞系(其表达CD16)，544利用被改造以产生非岩藻糖基化抗体的生产细胞对成功的抗体进行大规模GMP生产，546选择成功的肿瘤结合HLA新表位特异性抗体，548照射NK细胞，550NK细胞输注，以及552抗体输注。
图6是靶向源自SNV的新表位的实施方式的详细流程图。图6的图例对应如下：601确定肿瘤中表达的移码突变，602基于HLA单倍型预测源自移码的高亲和力新表位，603通过ELISA测试Ab:Ag结合，604用候选抗新表位抗体对肿瘤细胞进行染色，605选择成功的肿瘤结合HLA新表位特异性抗体。
图7是靶向源自SNV的新表位的实施方式的作用机制。图7的图例对应如下：701SNV突变导致含有单个氨基酸变化的氨基酸序列的翻译，702抗原加工途径导致HLA分子上新表位的呈递，703针对新表位-HLA复合物的个人化TCR样抗体以高特异性结合至癌细胞，704NK细胞上的CD16(FcγRIII)以高亲和力结合至非岩藻糖基化的Fc区，激活细胞毒性效应功能，705细胞毒性颗粒的脱粒和/或细胞因子的分泌导致癌细胞的特异性杀伤。
图8是其中HLA-新表位复合物的单体或除四聚体之外的其他多聚体用于免疫化和/或测试的实施方式的详细流程图。图8的图例对应如下：801产生HLA-新表位单体或多聚体，802用HLA-新表位单体或多聚体免疫化OmniRats，803用HLA-新表位单体或多聚体第二次免疫化OmniRats，804用HLA-新表位单体或多聚体染色B细胞。
图9是其中TCR样抗体以某种方式例如双特异性或修饰的Fc区域被改造以优化效应功能的实施方式的详细流程图。图9的图例对应如下：901改造抗体以具有双特异性和/或具有修饰的Fc区。
图10是其中TCR样抗体以某种方式例如双特异性或修饰的Fc区域被改造以优化效应功能的实施方式的作用机制。图9的图例对应如下：1001移码突变导致非自身氨基酸序列的翻译，1002抗原加工途径导致HLA分子上新表位的呈递，1003针对新表位-HLA复合物的个人化TCR样和/或双特异性抗体以高特异性结合至癌细胞，1004NK细胞上的CD16(FcγRIII)以高亲和力结合至改造的Fc区，激活细胞毒性效应功能，1005细胞毒性颗粒的脱粒和/或细胞因子的分泌导致癌细胞的特异性杀伤。
图11是其中向患者给予不同的细胞类型如巨噬细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞或树突细胞的实施方式的详细流程图。图11的图例对应如下：1101在细胞毒性增强培养基中培养巨噬细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞或树突细胞，1102照射细胞(仅在永生化细胞系的情况下需要)。
图12是其中向患者给予不同的细胞类型例如巨噬细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞或树突细胞的实施方式的作用机制。图12的图例对应如下：1201移码突变导致非自身氨基酸序列的翻译，1202抗原加工途径导致在HLA分子上新表位的呈递，1203针对新表位-HLA复合物的个人化TCR样抗体以高特异性结合至癌细胞，1204效应细胞上的CD16(FcγRIII)或CD32(FcγRII)以高亲和力结合至非岩藻糖基化的Fc区，激活细胞毒性效应功能(ADCC或ADCP)，1205抗体依赖性的细胞的吞噬作用(ADCP)或其他细胞毒性机制。
图13是其中向患者给予的细胞被遗传改造的实施方式的详细流程图。图13的图例对应如下：1301遗传改造细胞毒性效应细胞(例如敲除某些基因)，1302照射改造的细胞。
图14是其中向患者给予的细胞被遗传改造的实施方式的作用机制。图14的图例对应如下：1401移码突变导致非自身氨基酸序列的翻译，1402抗原加工途径导致HLA分子上新表位的呈递，1403针对新表位-HLA复合物的个人化TCR样抗体以高特异性结合至癌细胞，1404改造的效应细胞上的Fcγ受体以高亲和力结合至非岩藻糖基化的Fc区，激活细胞毒效应功能，1405细胞毒颗粒的脱粒和/或细胞因子的分泌导致癌细胞的特异性杀伤。
图15是其中给予患者的NK细胞是自体细胞或者可选地来自血液供者或脐带血的同种异体细胞的实施方式的详细流程图。图15的图例对应如下：1501在细胞毒性增强培养基中培养自体NK细胞或源自脐带血或供者血液的同种异体NK细胞。
图16是其中给予的细胞毒性效应细胞表达CAR构建体并且新表位特异性不是由抗体而是由CAR的scFv部分赋予的实施方式的详细流程图。图16中隐含的是包括给予针对新表位-HLA复合物生成的TCR样抗体的选择。图16的图例对应如下：1601成功的肿瘤结合HLA新表位特异性抗体被转化成scFv序列并且被克隆到CAR构建体中，1602用CAR构建体转导细胞毒性效应细胞，1603表达CAR的效应细胞的输注。
图17是其中给予的细胞毒性效应细胞表达CAR构建体并且新表位特异性不是由抗体而是由CAR的scFv部分赋予的实施方式的作用机制。图17中隐含的是包括给予针对新表位-HLA复合物生成的TCR样抗体的选择。图17的图例对应如下：1701移码突变导致非自身氨基酸序列的翻译，1702抗原加工途径导致HLA分子上新表位的呈递，1703并入针对新表位-HLA复合物的嵌合抗原受体(CAR)中的个人化TCR样单链可变片段(scFv)以高特异性结合至癌细胞，1704细胞毒性效应细胞被改造以表达新表位特异性CAR，细胞毒性颗粒的脱粒和/或细胞因子的分泌导致癌细胞的特异性杀伤。
图18示例了流式细胞术分析的门控(gating)策略。为了利用流式细胞术评估NK细胞对靶细胞的细胞毒性活性，利用以下门控策略：使用捕获效应细胞和靶细胞的大正向散射/侧向散射门来排除碎片。基于CFSE染色，区分靶细胞(EL4)与效应细胞(NK)。分别利用磷脂酰丝氨酸的膜联蛋白V染色和DNA的SYTOX蓝染色来定量靶细胞的凋亡和死亡。利用针对CD107a的抗体定量NK细胞的脱粒，即细胞毒性活性。显示了几种不同共培养物的代表性点图用于证明。
图19A-图19B描绘了靶细胞的NK细胞杀伤的、ADCC介导的增强——经由针对靶细胞显示的新表位的TCR样抗体。将EL4细胞与SIINFEKL肽一起培育，以使细胞表面MHC分子(H2Kb)负载这种特定肽。图19A：在具有或不具有抗SIINFEKL-H2Kb IgG2a抗体的单培养中4小时后，用SYTOX蓝对EL4细胞进行染色以定量死细胞。图19B：代表与A中相同的实验终点，但是共培养实验组。以3种不同的效应：靶标比例添加新分离的原代小鼠NK细胞，并且在具有或不具有抗体的情况下共培养4小时。由于EL4单培养物显示出抗体的统计显著的直接细胞毒性作用(在无任何NK细胞的情况下)，从具有抗体的实验组的共培养结果中减去这种细胞毒性贡献(单独抗体带来)，以准确定量和比较[图19A]天然细胞毒性和[图19B]NK细胞的ADCC细胞毒性的总和——在存在或不存在抗体的情况下。在存在抗体的情况下vs在不存在抗体的情况下定量的测量细胞毒性(沿y轴)之间的差值代表了给定E:T比例的ADCC机制本身的定量。误差条表示标准偏差(n＝3)。统计结果表明未配对t检验得到的p值。*p<0.05；**p<0.01。
图20示例了乳酸脱氢酶(LDH)的释放证实通过流式细胞术定量的死细胞染色。4小时培育后，利用LDH酶活性比色测定来定量来自图19中描述的具有或不具有抗体的共培养物(和单培养物)的上清液的LDH存在。误差条表示标准偏差(n＝3)。统计结果表明未配对t检验得到的p值。*p<0.05；**p<0.01。
图21A-图21B描绘了经由TCR样抗体的ADCC通过凋亡比通过坏死更多地发生，并且ADCC-凋亡和ADCC-坏死均通过增加E:T比例而增强。基于膜联蛋白-V染色进一步分析图19中所示的数据以定量：[图21A]通过凋亡的靶细胞死亡(膜联蛋白-V阳性染色)和[图21B]通过非凋亡的坏死的靶细胞死亡(膜联蛋白-V阴性染色)。如前图中在具有或不具有抗SIINFEKL-H2Kb IgG2a抗体的情况下，培养负载SIINFEKL肽的EL4细胞。在相同实验中，还用膜联蛋白-V对细胞进行染色，以定量经历凋亡的细胞。通过将死细胞的SYTOX染色与凋亡细胞的膜联蛋白-V染色结合，可以在(图21A)晚期凋亡和(图21B)坏死之间进行区分——在ADCC介导的靶细胞死亡增加方面。误差条表示标准偏差(n＝3)。统计结果表明未配对t检验得到的p值。*p<0.05；**p<0.01。
图22示例了通过CD107a染色测量的在抗体存在下的NK细胞脱粒增加。如前图中在具有或不具有抗SIINFEKL-H2Kb IgG2a抗体的情况下培养负载SIINFEKL肽的EL4细胞。在相同实验中，贯穿4小时培育还用CD107a的抗体染色细胞。CD107a是NK细胞脱粒的标记物，NK细胞用于诱导靶细胞杀伤的机制。还单独培养NK细胞(NK单培养物)，以在没有任何靶细胞的情况下建立CD107a染色的基线水平。误差条表示标准偏差(n＝3)。统计结果表明未配对t检验得到的p值。***p<0.001；****p<0.0001。
图23A-图23B描绘了与SIINFEKL脉冲的EL4细胞特异性结合的抗SIINFEKL-H2Kb抗体。在与图18-22的对应实验分开的实验中，将EL4细胞与SIINFEKL肽一起培育以负载细胞表面MHC分子，或者在没有任何肽的类似条件下培育。然后将肽脉冲的和未脉冲的细胞在具有或不具有抗SIINFEKL-H2Kb抗体的情况下培育。全部四个这些实验组随后都用针对小鼠IgG的PE缀合二抗进行染色——以通过流式细胞术进行分析。四个复本用于这四种条件中的每一种。
图24是示例生成针对AML中常见的源自“公共”移码的新抗原的几种新型TCR样抗体的工作流程的图。图例对应如下：2401产生HLA-新表位复合物，2402用HLA-新表位复合物免疫化OmniRats，2403用HLA-新表位复合物第二次免疫化OmniRats，2404富集来自脾脏和淋巴结的B细胞，2405用HLA-新表位复合物染色B细胞，2406新表位特异性B细胞的单细胞分选，2407RT-PCR和测序，2408将(人)可变区序列克隆到人抗体载体中，2409转染CHO细胞并且产生测试批次的候选抗体，2410通过ELISA测试Ab:Ag结合，2411自体NK细胞，2412同种异体NK细胞(例如源自供者、源自脐带血、源自iPSC)，2413照射的NK细胞系。
具体实施方式
定义：
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文所述那些类似或等同的任何方法和材料可以用于测试本发明的实践，本文描述了优选的材料和方法。在描述和主张本发明时，以下术语将被使用。还应当理解，本文所使用的术语仅为描述具体实施方式，而不意图限制。
冠词“一种”和“一个”在本文中用于指代该冠词的语法对象的一个或多于一个(即，至少一个)。举例来说，“一个元件”意为一个元件或多于一个元件。
本文使用的“约”，在涉及可测量值如量、持续时间等时，意为涵盖相对于指定值±20％或±10％、更优选±5％、甚至更优选±1％，并且还更优选地±0.1％的变异，因为这样的变异适于执行所公开的方法。
本文所用的抗原结合片段应意为抗体中促进与其同源抗原结合的部分，包括但不限于F(ab’)2片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)和单结构域抗体。
本文所用的免疫球蛋白人源化意为这样的动物：已经经历遗传修饰，使得其内源免疫球蛋白基因不再被表达，并且取而代之表达人免疫球蛋白基因。这些动物产生“完全人”抗体，而不是“人源化”抗体。
本文所用的新抗原意为由于体细胞突变而与缺乏该突变的细胞产生的正常蛋白质相比在其氨基酸序列中含有一个或多个变化的蛋白质。
本文所用的新表位将意为在细胞表面MHC分子上呈递的，源自新抗原的，并且含有其一个或多个改变的氨基酸残基的肽。
本文所用的个人化的将意为单独地针对每个患者开发的。
尽管新抗原-HLA(人白细胞抗原)复合物已在本发明中被提及用于治疗人类患者，然而新抗原-MHC(主要组织相容性复合物)的意义也是隐含的(例如用于治疗非人对象)。
范围：贯穿本公开，本发明的各种方面可以范围形式展示。应当理解，范围形式的描述仅为方便和简洁，并且不应当被理解为对本发明范围的僵硬限制。因此，范围的描述应当被认为已经具体公开了该范围内所有可能的子范围以及个体数值。例如，诸如1至6的范围的描述应当被认为已经具体公开该范围内的子范围如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及个体数值例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。这无论范围宽度而适用。
描述：
本文描述的发明是个人化癌症免疫疗法的新方式，其利用针对肿瘤特异性新表位-HLA复合物的单克隆抗体(针对每个患者的癌症)来诱导表达Fcγ(Fcγ)受体的细胞毒性效应细胞(内源性的和/或通过细胞输注外源性引入的)，从而以高度特异性的方式杀伤癌细胞。本发明包括通过以下靶向患者的肿瘤特异性新抗原：通过表达Fcγ受体的细胞毒性效应细胞来撬动(促进，leveraging)抗体依赖性的细胞的细胞毒性(ADCC)或抗体依赖性的细胞的吞噬作用(ADCP)，而非更常规的依赖于来自患者自身免疫系统的天然抗新抗原T细胞响应。本发明通过独特地组合和撬动几种不同的概念而克服了现有免疫疗法方式的限制和挑战，该概念包括但不限于：(1)靶向新表位-HLA复合物，(2)针对特定抗原的单克隆抗体与细胞毒性效应免疫细胞的组合，以及(3)由内源免疫细胞或过继细胞疗法提供的ADCC(或ADCP，或ADCC和ADCP的组合)的特定机制。针对癌细胞上HLA分子呈递的突变肽(这些HLA-肽复合物通常被T细胞受体(TCR)靶向；因此，该抗体是“TCR样”)(Dahan,R.&Reiter,Y.(2012)Expert Rev.Mol.Med.14,e6)呈递的突变肽，可以在逐患者的基础上或者在一组患者之间共有的新表位的基础上开发抗体。输注的表达Fcγ受体的细胞毒性效应细胞(例如表达CD16的NK细胞、表达CD32的巨噬细胞)被这些TCR样抗体定向特异性攻击每个具体患者的癌细胞，主要撬动ADCC或ADCP(或ADCC和ADCP)机制。在以下实例中以实施细节描述了本发明，该实例可以代表本发明的多于一种实施方式。
图1是本发明的一种实施方式的图画表示。以在手术或活组织检查后新分离的肿瘤组织为起点，可以通过比较肿瘤组织和正常组织(血液)的DNA序列来确定突变。下一代测序平台如Illumina和/或Ion Torrent可以被单独或组合使用——通过利用两个不同平台进行测序并且仅采用两者都检测到的突变，确定的突变的置信度很高(Sherafat,等(2020)BMC Bioinformatics 21:498)。与HLA分子复合的突变肽可被用于免疫化大鼠。产生新表位-HLA复合物的特异性TCR样抗体的大鼠B细胞可以被分离，并且可以测试抗体与肿瘤细胞的结合(Ouisse,(2017)BMC Biotechnol.17,3)。可以通过生产细胞(例如，CHO，HEK-293)以较大量生产肿瘤特异性结合测试呈阳性的那些抗体。所得靶向肿瘤特异性突变的单克隆抗体可以被单独或与表达Fcγ受体的细胞毒性效应细胞的输注一起给予患者。
由于靶向肿瘤特异性新表位的TCR样抗体可以与表达Fc-γ受体的细胞毒性效应细胞一起被给予，输注的细胞的细胞毒性作用被特异性地针对肿瘤细胞定向。本发明的这种实施方式的机制被描绘在图2中。
在作为优选实施方式的一个实施方式中，TCR样抗体靶向的具体类别的新表位是源自导致移码的插入/缺失(InDel)突变的新表位。移码突变产生的新表位完全是外来的；不同于单个核苷酸变体(SNV)突变产生的新表位，不存在相关的“自身”对应表位。因此，通过靶向源自移码的新表位，避免了抗体与正常呈递的“自身”表位交叉反应的风险。在优选的实施方式中，利用免疫球蛋白人源化大鼠(“OmniRats”)进行免疫化以产生新表位特异性B细胞。这导致“完全人”抗体的产生，最小化患者中的不利事件风险。在优选的实施方式中，将被递送给患者的最终抗体由被改造以生成非岩藻糖基化抗体的生产细胞产生，这导致效应细胞的增强的细胞毒性活性。在优选的实施方式中，效应细胞是天然杀伤(NK)细胞，其在培养基中被培养以增强其细胞毒性活性并且在给予患者之前被照射。在图3中，优选实施方式的这些方面被合并到图1中所示的相同流程图中。
本发明的这种优选实施方式意图将不同研究途径和治疗方式的最有前景的方面——突变肽新表位、利用单克隆抗体的靶向疗法和过继NK细胞疗法——独特地并且最佳地组合成新方式，其中个人化抗体疗法与细胞疗法结合发挥作用，并且总体上效率更高并且毒性更小。
图4中描绘了一种实施方式的作用机制，该实施方式是图3中所描绘的优选实施方式。某些癌症类型(例如肾细胞癌)往往具有平均高量的InDel突变——这些高InDel癌症因此在蛋白质编码基因中具有移码的可能性最高(Bailey,等(2018)Cell 173:371–385.e18)(Turajlic,等(2017)Lancet Oncol.18:1009–1021)。移码通常导致全新的氨基酸延长序列——即，其不同于正常人细胞中看到的任何氨基酸序列。当这些新序列经历抗原加工(例如蛋白酶体降解)和在细胞表面HLA分子上呈递时，其构成真正的癌症特异性表位(“新表位”)，完全不同于任何HLA呈递的“自身”表位，并且因此代表了用于疗法个人化的独特靶标(Linnebacher等(2001)Int.J.Cancer.93:6–11)。在优选的实施方式中，高InDel癌症类型是免疫疗法的主要候选者，并且源自移码的新表位是单克隆TCR样抗体开发的优选靶标。这是因为以下事实：源自移码的新表位，不同于源自SNV的新表位，缺乏可能由正常细胞呈递的类似的“自身”肽对应序列；因此，源自移码的新表位提供了针对癌细胞的定向疗法的较高特异性同时不影响正常细胞的前景。抗体的可变区结合新表位-HLA复合物，并且恒定区(即Fc区)可用于被Fc受体如CD16、或CD32、或CD64结合。在优选的实施方式中，Fc区是非岩藻糖基化的，已被经改造以生成非岩藻糖基化抗体的生产细胞生产(这种修饰大大增加了效应细胞的细胞毒性活性)。输注的NK细胞表面上的CD16分子引起细胞毒性活性，其由细胞因子分泌和/或细胞毒性颗粒的释放组成，杀伤肿瘤细胞。在优选的实施方式中，细胞毒性活性是抗体依赖性的细胞的细胞毒性(ADCC)。
产生个人化治疗方案的过程中的步骤顺序概述如下。其以详细流程图在图5中描绘。图5的图例对应如下：502血液样品、504肿瘤样品、506下一代DNA测序、508RNA测序、510确定肿瘤中表达的移码突变，512基于HLA单倍型预测源自移码的高亲和力新表位，514产生HLA新表位四聚体，516利用HLA-新表位四聚体免疫化OmniRats，518第二次利用HLA-新表位四聚体免疫化OmniRats，520富集来自脾脏和淋巴结的B细胞，522利用HLA-新表位四聚体对B细胞进行染色，524新表位特异性B细胞的单细胞分选，526通过ELISA524测试Ab:Ag，528RT-PCR和阳性的测序，530将(人)可变区序列克隆到人抗体载体中，532利用生产细胞系生产小测试批次的候选抗新表位抗体，534建立患者肿瘤细胞的单细胞悬浮液，536冷冻保存，538解冻患者肿瘤细胞，540通过ELISA用候选抗新表位抗体对肿瘤细胞进行染色，542在细胞毒性增强培养基中培养NK细胞系(其表达CD16)，544利用被改造以产生非岩藻糖基化抗体的生产细胞进行成功抗体的较大规模GMP生产，546选择成功的肿瘤结合HLA新表位特异性抗体，548照射NK细胞，550NK细胞输注，以及552抗体输注。
(1)原发性肿瘤的手术切除或活组织检查，解离成单细胞悬浮液，以及冷冻保存(用于步骤8)。
(2)对血液和肿瘤组织的测序，以确定导致移码的被表达的肿瘤特异性InDel突变。下一代测序平台如Illumina和/或Ion Torrent可以被单独或组合使用。
(3)对患者HLA I类分子具有高亲和力的新表位的算法预测。例如开源NetMHC预测算法利用人工神经网络准确预测全部12种HLA-A和-B超型的HLA I类表位。
(4)生产HLA-新表位四聚体(用于步骤5和6)。若干公司(例如GenScript、JPT)合成定制肽。若干公司(例如MBL International、ProImmune)生产定制HLA-肽四聚体，和/或提供试剂盒。
(5)利用HLA-新表位四聚体对免疫球蛋白人源化大鼠(“OmniRats”)进行免疫化，以生成具有TCR样新表位特异性的B细胞。在完全弗氏佐剂(Complete Freund’s Adjuvant)中的100μg HLA-肽复合物然后16天后在PBS中的100μg HLA-肽复合物的免疫方案已显示在第二次免疫化后5天在大鼠中生成高亲和力的抗HLA-肽抗体。
(6)HLA新表位特异性大鼠B细胞的分离(利用四聚体染色和细胞分选)，以及抗体基因(重链和轻链)的测序。
(7)利用ELISA对候选抗体与HLA-新表位复合物的结合进行初步测试(用于定制ELISA的试剂盒可商购)。
(8)将成功的抗体可变序列克隆到人抗体质粒主链(可从若干公司商购，例如InvivoGen)中，转染生产细胞(例如CHO、HEK-293)，以及小规模生产待测试的几种候选抗新表位抗体。
(9)解冻冷冻保存的肿瘤细胞，以及用候选抗体染色以测试肿瘤特异性结合。
(10)利用被改造以产生非岩藻糖基化的(ADCC优化的)抗体的生产细胞进行肿瘤细胞结合抗体的较大规模生产(GMP)。
(11)给予患者的治疗：输注NK细胞(在最大化细胞毒性活性的条件下生长的)连同输注抗新表位TCR样抗体。
对优选实施方式有多种可能的修改，其构成本发明的其他实施方式。在一个实施方式中，确定肿瘤中源自SNV的新表位。虽然这些新表位具有仅一个氨基酸残基区别的“自身”对应表位，并且因此增加TCR样抗体对正常组织的交叉反应的可能性，但通过在过程中添加更多轮的特异性测试可以克服这个挑战(参见图6和图7)。此外，由任何其他类型的突变(例如易位)、或异常RNA剪接或任何其他肿瘤特异性机制产生的新表位构成这种疗法的候选靶标。
在另一实施方式中，由I类之外的HLA类别(例如，HLA II类)呈递的新表位构成所述疗法的靶标。
在另一实施方式中，代替HLA呈递的新表位肽，疗法靶向的肿瘤特异性分子是突变的细胞表面分子(例如受体、粘附分子)，其中突变已在分子的细胞外部分的结构中建立了实质性的肿瘤特异性变化，使得抗体可以将其与其未突变的对应体区分。
本发明的实施方式包括任何种类/来源的突变，例如体细胞突变、乘客突变(passenger mutation)等。
在另一实施方式中，疗法的肿瘤特异性分子靶标不是氨基酸序列本身的变化，而是翻译后修饰的变化，包括但不限于糖基化样式和乙酰化。包括由于氨基酸序列变化与翻译后修饰的组合而产生的新抗原。
在另一实施方式中，用于免疫化大鼠的HLA-表位复合物、和/或用于分离特异性大鼠B细胞的那些、和/或用于测试抗体结合的那些是单体型、五聚体型、或葡聚糖连接型，以代替四聚体连接型(见图8)。
在另一实施方式中，免疫化的大鼠是OmniRats之外的大鼠品系。
在另一实施方式中，免疫化的动物是大鼠之外的动物，包括但不限于小鼠、兔、驴、山羊、骆驼、美洲驼、羊驼和鲨鱼。
在另一实施方式中，肿瘤特异性抗体通过免疫化动物和分选其抗原特异性B细胞以外的方式生成，包括但不限于噬菌体展示文库的使用，和通过注射抗体编码核酸(例如DNA)到患者中以进行抗体基因转移。
在另一实施方式中，TCR样抗体以与优选实施方式不同的方式被改造或生产。不是简单地采用非岩藻糖基化作为增加ADCC活性的方式，可以以其他方式改变抗体的Fc区(例如抗体结构内的二硫键的改造；Hagihara,Y.and Saerens,D.,(2014).Biochimica etBiophysica Acta(BBA)-Proteins and Proteomics,1844(11),pp.2016-2023)。同时，可变区也可以通过各种方式被改造，例如，抗体可以是双特异性的(参见图9和10)，其中双特异性抗体可以被定向针对两个不同的新表位，或者新表位和常规表位(即不是新表位的表位)的组合。可选地或另外地，抗体可被缀合至药物如抗癌药物，即抗体-药物缀合物。其他实施方式包括修饰/改造抗体的方法(例如分子方法)。
在另一实施方式中，疗法中利用的新表位特异性抗体是多克隆的，以代替单克隆。
在另一实施方式中，新表位特异性抗体不是完全抗体，而是抗原结合片段，包括但不限于F(ab’)2片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)和单结构域抗体。
在本发明的某些实施方式中，NK细胞之外的细胞类型可以被撬动(利用，leveraged)(被内源或外源给予)——与新表位靶向抗体结合。疗法取决于TCR样抗体的Fc区与效应细胞表面的Fcγ受体之间的相互作用。某些细胞类型，包括但不限于先天免疫系统的细胞如表达Fcγ受体CD16、CD32和CD64中的一种或其组合的巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞和树突细胞；这些细胞类型也可以可选地作为疗法中的效应细胞(参见图11和12)。这些可选的实施方式中隐含的是使用这些细胞类型的子集或亚群例如记忆NK细胞的选择。
在某些实施方式中，可以使用(与靶向新表位的抗体结合)先天免疫系统的细胞之外的细胞类型，例如也已知表达Fcγ受体的以下细胞类型：激活的T细胞、内皮细胞、小胶质细胞细胞、破骨细胞和系膜细胞。
在本发明的某些实施方式中，靶标疾病细胞可以在癌症之外的疾病(一种或多种)的环境中表现新表位，包括但不限于自身免疫疾病。
此详细描述中隐含疗法中利用的新表位特异性抗体将是同种型IgG，因为Fcγ受体与IgG抗体的恒定区结合。选择用于治疗应用的IgG的具体亚类(例如，IgG1、IgG3等)将取决于目标作用机制(例如，ADCC、ADCP)以及疗法中采用的细胞类型。几种不同的同种型或同种型亚类可以在具体疗法中被单独或组合使用。
在另一实施方式中，抗体的同种型(或亚类)从无活性或不期望的同种型(或亚类)被切换成具有期望特性的同种型(或亚类)。
在本发明的某些实施方式中，包括以下情形：相同的抗体并且甚至相同的效应细胞(例如单核细胞)可以诱导ADCC和ADCP两者(Strohl,W.and Strohl,L.,2012.8-Monoclonal antibody targets and mechanisms of action.Thera Antibody Eng,9,pp.163-196)。而且，针对相同靶标的不同抗体可以诱导多种机制，其包括ADCC和ADCP(Cleary,K.L.,Chan,H.C.,James,S.,Glennie,M.J.and Cragg,M.S.,2017.Antibodydistance from the cell membrane regulates antibody effector mechanisms.TheJournal of Immunology,198(10),pp.3999-4011)。此外，不同的抗体同种型能够不同地诱发和引发ADCC和ADCP机制(Tipton,T.R.,Roghanian,A.,Oldham,R.J.,Carter,M.J.,Cox,K.L.,Mockridge,C.I.,French,R.R.,Dahal,L.N.,Duriez,P.J.,Hargreaves,P.G.andCragg,M.S.,2015.Antigenic modulation limits the effector cell mechanismsemployed by type I anti-CD20 monoclonal antibodies.Blood,The Journal of theAmerican Society of Hematology,125(12),pp.1901-1909)。
在本发明的某些实施方式中，可以针对给定新表位生成一组抗体(无论是否来自抗体文库)。
在另一实施方式中，输注的效应细胞被遗传改造。这些操作可包括但不限于敲除或敲低某些基因、某些基因的过表达、或外源基因的表达(参见图13和14)。
在另一实施方式中，输注的效应细胞获自若干潜在来源中的一种。NK细胞可以源自同种异体供者、脐带血、或患者自己的血液；可选地，若干NK细胞系可以潜在地被使用，条件是其表达CD16，并且在给予患者之前被照射(参见图15)。在另一实施方式中，完全抗体的生产被相应scFv序列的生产代替，然后克隆到嵌合抗原受体(CAR)构建体中。然后改造效应细胞以在输注前表达CAR构建体。在此实施方式中，针对新表位的TCR样抗体的给予可以与CAR效应细胞组合应用，或者TCR样抗体可以不是疗法方案的一部分，通过膜结合CAR提供抗原特异性(参见图16和17)。图16和17中隐含的是包括给予针对新表位-HLA复合物生成的TCR样抗体的选择。
本发明的某些实施方式可以撬动独立于ADCC或ADCP的抗体治疗机制，例如CDC(补体依赖性细胞毒性)。
本发明的某些实施方式包括用针对患者体内经过时间显现的更新的新表位(例如在癌症转移过程中在不同肿瘤中出现的不同的新表位)生成的多于一种抗体来治疗相同患者。
此详细描述部分中描述的每个实施方式也适用于两个或更多个患者之间共有的突变和产生的新表位(也称为“公共新抗原”和“公共新表位”)。
示例性使用方法：本发明可以潜在地用于治疗其中可获得活组织检查或外科样品的任何癌症。最有前景的治疗候选者是那些含有平均高量InDel突变的癌症。InDel突变产生的源自移码的新表位最有可能实现缺乏与“自身”表位的交叉反应性的成功肿瘤特异性抗体的产生。因此，一系列实施方式致力于高InDel癌症及其相关的移码来源新表位。然而，某些实施方式也靶向其他类型的突变，例如单核苷酸变体(SNV)。
一系列实施方式致力于倾向含有高量InDel的癌症，包括但不限于肾癌、黑素瘤、膀胱尿路上皮癌、肺腺癌、子宫癌肉瘤、子宫体子宫内膜癌、乳腺癌、头颈癌和胃腺癌。
对于取而代之靶向SNV的实施方式，任何在外显子组中表达的SNV突变的癌症将是这种免疫疗法的候选者。这将包括绝大多数癌症。
总览：本发明包括通过表达Fcγ受体的细胞毒性效应细胞来撬动抗体依赖性的细胞的细胞毒性(ADCC)或抗体依赖性的细胞的吞噬作用(ADCP)而靶向患者的肿瘤特异性新抗原，而不是更常规的依赖于来自患者自身免疫系统的天然抗新抗原T细胞响应。因此，本发明与现有的免疫疗法方式相比存在关键区别：
·与利用单克隆抗体的其他靶向疗法不同，本发明产生仅结合至肿瘤细胞的抗体：现有的靶向单克隆抗体治疗靶向细胞表面分子如CD20(例如利妥昔单抗(rituximab))、EGFR(例如西妥昔单抗)、HER2(例如曲妥珠单抗(trastuzumab))和其他几种。尽管在许多情况下被靶向的抗原在癌细胞上过表达，但其绝不是仅仅在癌细胞上表达。癌细胞中的突变产生的新表位仅仅于癌细胞上呈递，并且然后针对那些新表位的TCR样抗体仅以高亲和力结合至癌细胞。
·与其他基于NK细胞(或基于巨噬细胞、或基于嗜中性粒细胞)的免疫疗法不同，本发明以高度肿瘤特异性方式将输注的细胞靶向癌细胞：许多基于细胞的疗法正在进行临床试验，但是这些方式都不是基于以高度特异性方式将效应细胞靶向癌细胞。由于本发明利用抗体作为仅与癌细胞结合的桥梁将效应细胞靶向癌细胞，实现了远更高水平的效应特异性。
·与利用新表位的高肿瘤特异性的其他尝试不同，本发明不依赖于患者的天然T细胞免疫响应：其他组的研究工作的目标在于开发在逐一患者基础上的治疗性免疫，意图启动(或“重振”)针对癌细胞呈递的新表位的T细胞响应。这些工作已遇到了若干挑战，并且尚未取得显著的临床成功。本发明通过以不依赖于患者T细胞响应的方式靶向癌细胞而回避这些挑战。取而代之，其将靶向新表位的外部生成的抗体与外部生成的(即外部培养的、遗传修饰的、扩增的和激活的)效应细胞组合应用。与利用新表位和新抗原的基于免疫化的治疗工作相比，本发明因此使疗法结果更具可预测性和靶向性——鉴于其依赖于新表位的抗体识别以及ADCC或ADCP(或ADCC和ADCP的组合)的先天免疫效应细胞功能。
·与一些其他组的工作不同，我们的发明不以任何具体的新表位为中心，因此可以应用(例如以个人化方式)于任何新表位——已知的新表位抑或未来将发现的新表位。
·与生成靶向新表位的转基因TCR或CAR的一些组的工作不同，本发明可以更容易地在逐一患者的基础上被开发，以产生真正的个人化疗法：也在寻求利用新表位的敏锐癌症特异性的其他研究和开发组已开发转基因新表位特异性TCR和/或新表位特异性CAR。在这些情况的每一个中，当对基于抗体的新表位识别无依赖性时，细胞毒性效应细胞(无论NK细胞还是其他细胞)将需要用新表位特异性构建体转导。相比之下，本发明依赖于基于抗体的新表位识别，同时还具体地撬动那些免疫效应细胞的ADCC或ADCP机制，其能够通过Fc-γ受体来支持ADCC和ADCP(例如CD16和CD32受体，分别用于ADCC或ADCP)。由于个人化依赖于个人化抗体的生成而不是个人化的遗传修饰的免疫效应细胞，所以本发明还在个人化疗法的生成方面提供了更好的效率。本发明提供了以下的独特组合：[a]更时间有效性和资源有效性的基于抗体的疗法个人化，以及[b]免疫效应细胞与抗体结合工作以更具选择性地相对于正常细胞靶向癌细胞的效率——由于通过桥接过继转移的免疫效应细胞以靶向癌细胞的抗体来靶向新表位-HLA复合物。
对于本领域技术人员来说明显的是，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以利用所提及的特征和组分中的一些或全部来提供本发明的个人化癌症免疫疗法。对于本领域技术人员还明显的是，上述实施方式是一个更宽泛的发明的具体实例，其可以具有比任何所教导的单一描述更大的范围。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对描述进行许多改动。
实验实施例
现在参考以下实施例描述本发明。提供这些实施例仅用于示例的目的，并且本发明不限于这些实施例，而是涵盖因本文提供的教导而显而易见的所有变型。
实施例1：针对新表位的抗体诱导ADCC[抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性]的天 然杀伤(NK)细胞机制以杀伤呈递新表位的靶细胞。
虽然新表位构成癌症免疫疗法的具有吸引力的靶标(Brennick等(2017)Immunotherapy,9(4),pp.361-371)，本文公开的产生针对新表位定向的抗体疗法的新方法的中心在于两种特定细胞机制——其主要由利用抗体作为通向癌细胞表面新表位的桥梁的先天免疫系统的细胞而表现，即ADCC和ADCP[抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性和抗体依赖性的细胞介导的吞噬作用]的机制(Gogesch等(2021)International Journal ofMolecular Sciences,22(16),p.8947)。作为概念验证或原理验证，此实验研究示例，针对新表位生成的TCR样抗体可以诱导天然杀伤(NK)效应细胞对呈递那些特定新表位的靶细胞的ADCC细胞毒性活性。在下面总结的实验数据中，模型肽表位SIINFEKL充当“模型新表位”或“替代新表位”。即，出于概念验证实验的目的，针对替代新表位SIINFEKL的抗体介导的NK细胞响应被认为在机制上等同于预想的针对患病细胞(如癌细胞)中的新表位(特别是源自移码突变并且导致全新或外来的肽序列的那些表位)的抗体介导的NK细胞响应。
实验方法：抗SIINFEKL-H2Kb抗体(克隆25.D1-16)是可商购的“TCR样抗体”(即，其与肽-MHC复合物结合，就像TCR一样)。选择此抗体用于初步概念验证实验，因为其在检测SIINFEKL-H2Kb复合物(其中SIINFEKL代表模型新抗原或新表位)方面有建立好的应用。然而，由于这种小鼠抗体的同种型是IgG1(其不诱导ADCC活性)，这些实验中需要将其同种型切换成ADCC活性小鼠IgG2a同种型。IgG2a的切换通过将原始25.D1-16抗体的重链和轻链的可变区序列克隆到小鼠IgG2a质粒(pTRIOZ-mIgG2a)中进行，该质粒可从Invivogen(SanDiego,CA)商购。该质粒的制备以及随后抗体蛋白在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的重组表达由Azenta(Chelmsford,MA)进行。利用蛋白A琼脂糖进行蛋白纯化。
为了测试小鼠NK细胞经由抗SIINFEKL-H2KbTCR样抗体的ADCC诱导，利用原代小鼠NK效应细胞和EL4靶细胞(表达H2Kb的非粘附C57BL/6小鼠细胞系)，以3种不同的效应：靶标(E：T)比例建立共培养，4小时时间。在共培养设置之前，将活力>95％的EL4细胞利用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)染色剂(以提供区分靶标与效应的清晰手段)以0.25μM的染色浓度标记，并且与25μM SIINFEKL肽一起在37℃下培育(即“脉冲的”)1小时，其中每15分钟轻轻搅动。然后将这些CFSE染色的、SIINFEKL脉冲的EL4细胞以每孔50,000个细胞铺平在圆底96孔板中。纯化的抗SIINFEKL-H2Kb IgG2a抗体以3.5μg/mL的最终浓度被添加以诱导ADCC，或不被添加以测试“天然”细胞毒性。同时，利用StemCell Technologies(Vancouver,加拿大)的免疫磁性阴性选择试剂盒从5个小鼠脾脏中富集NK细胞。将原代NK细胞添加到孔中，以实现0.5:1、1.5:1和5:1的E:T比例。此外，还建立靶标(EL4细胞)和效应(NK细胞)的单一培养孔。每孔中包含针对CD107a的藻红蛋白(PE)缀合抗体。将平板在37℃下培养4小时，然后用SYTOX蓝死细胞染色剂、别藻蓝蛋白(APC)缀合的膜联蛋白V和APC/FireTM750缀合的抗NKp46抗体进行染色。数据在Bio-Rad ZE5流式细胞仪(Univ of CT)上采集。用于分析的门控策略描绘在图18中。
基于这种门控策略(图18)，生成了基于流式细胞术的实验结果，如结果部分示例。此外，在4小时共培养结束时收集细胞培养物上清液样品，以及利用Abeam(Cambridge,UK)的试剂盒测定乳酸脱氢酶(LDH)活性。
关键结果：如图19中总结的结果清楚地证实，抗SIINFEKL-H2Kb抗体与小鼠同种型IgG2a一起诱导小鼠NK细胞经由ADCC机制杀伤SIINFEKL脉冲的EL4细胞。图19B示例了NK细胞毒性活性在抗体存在下在全部三种E:T比例下增加。在靶细胞杀伤方面的这种增强——其随着递增的E:T比例而递增地显著——代表由添加的TCR样抗体介导的ADCC活性。在0.5:1的极低E:T比例下，与抗体不存在时NK细胞的背景“天然”细胞毒性活性相比，ADCC贡献靶细胞杀伤的10.4％增加。在1.5:1和5:1的较高比例下，ADCC贡献较高，分别为17.7％和38.1％，并且这两种情况下均是统计学显著的。重要的是，这些共培养的ADCC值是在减去抗体对肽脉冲EL4细胞的直接细胞毒性效果后计算的，如图19A中示例。
除了基于流式细胞术的细胞死亡测量方法之外，还利用基于比色酶的测定来证实结果。在4小时培育结束时定量所有单一培养物和共培养物的上清液样品中的乳酸脱氢酶(LDH)，一种仅在细胞死亡时释放到培养基中的胞质酶。与流式细胞术结果完全一致，TCR样抗体的添加导致NK细胞的细胞毒性活性以E:T比例依赖性方式增加(图20)。在最低比例下，LDH释放呈上升趋势，而未达到显著。在1.5:1和5:1的较高比例下，由ADCC活性导致的细胞死亡增强分别为54.2％和80％，并且在两种情况下均是统计学显著的。在此测定中，无需减去直接细胞毒性效果的贡献，因为较少的LDH在添加抗体的单一培养孔中被检测到。
图20提供了通过流式细胞术(图2)观察到的靶细胞死亡定量的进一步证实(通过LDH定量)。此外，通过流式细胞术(图2)观察到的作为递增E:T比例的函数的抗体诱导的ADCC细胞毒性的增强通过LDH定量(图20)被再确认，其再次确认了作为递增E:T比例的函数的抗体诱导的ADCC细胞毒性的增强。
图21证实了图2中观察到的ADCC定量是基于凋亡的ADCC细胞毒性(图21A)和非凋亡的基于坏死的ADCC细胞毒性(图21B)的累积结果。另外，如图19B中观察到的作为递增E:T比例的函数的抗体诱导的ADCC细胞毒性的增强对于两者(双重，both)ADCC-凋亡和ADCC-坏死也成立，其中抗体诱导的ADCC-凋亡随着递增E:T比例而增强(图21A，分别增强了18.8％、26.0％和49.8％)，并且抗体诱导的ADCC-坏死也随着递增E:T比例而增强(图21B，最高比例增强20.9％)。如图19中所示，对于这些具体细胞死亡机制中的每一种，这些值都是在减去抗体对肽脉冲的EL4细胞的直接效果后计算的。
图22清楚地证实，NK细胞的脱粒过程(这是其靶向患病细胞的先天免疫功能的核心)在NK细胞的ADCC机制的基于抗体的诱导过程中(通过针对肽-MHC复合物的TCR样抗体)被增强，被定向针对显示SIINFEKL-H2Kb复合物的靶细胞。按照这个标准，因抗体的存在造成的NK细胞的细胞毒性活性增强在全部三种E:T比例下都是高度显著的，分别增加了35.3、39.2和18.2。
图23所示的实验结果证实，在ADCC诱导的补充实验(图18-22所示)中获得的结果是基于抗-SIINFEKL-H2Kb抗体对在靶标EL4细胞表面上SIINFEKL-H2Kb复合物的特异性结合，并且此抗体结合是图19-21所示的ADCC定量的基础。
，通过抗SIINFEKL-H2Kb抗体结合到靶标EL4细胞表面上的SIINFEKL-H2Kb复合物进行的NK细胞ADCC诱导的观察结果在不同的定量靶细胞死亡的方法[SYTOX染色，经由流式细胞术(图19)和LDH测定(图20)]之间是一致的，并且ADCC系细胞毒性的两者(双重，both)潜在机制(凋亡和坏死)也是如此(图21)。
总之，利用SIINFEKL作为“替代新表位”，图18-图23中总结的实验结果建立了概念验证：针对新表位的TCR样抗体能够选择性地针对显示新表位的那些靶细胞诱导NK细胞的细胞毒性的ADCC机制。
NK细胞疗法的讨论、结论和启示：如图19和图20中概述，在抗体和效应细胞同时存在的情况下，效应NK细胞在靶细胞中诱导出显著更高的细胞毒性，示例了ADCC(抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性)机制的可测量表现。此外，靶细胞的ADCC杀伤存在剂量依赖性增加，其中效应：靶标(E:T)比例越高导致ADCC杀伤越高。换句话说，该数据示例了能够生成针对新表位的抗体以在NK细胞上诱导ADCC机制，以实现NK细胞杀伤显示新表位的患病细胞的目的。
这些实验结果的生物学意义在于实验论证和建立以下的概念验证或原理验证：已经特异性针对模型新抗原(即SIINFEKL-H2Kb复合物)生成的TCR样抗体能够诱导针对显示该新抗原的靶细胞的天然杀伤(NK)效应细胞的细胞毒性的ADCC机制。此实验论证示例了本发明在生成治疗癌症的新疗法方面提供的益处实例：
靶向患病细胞(如癌细胞)的高度特异性，同时通过靶向出现在患病细胞上而不出现在健康细胞上的新表位而最小化或避免对健康细胞的毒性(de Sousa等(2021)Frontiers in Immunology,p.1938)。
疗法的个人化，基于特异性靶向在个体患者水平上或在共有新表位的一组患者中表现的新表位的抗体的生成(Saini等,(2017)Annals of Oncology,28,pp.xii3-xii10)。
·如果个体患者的不同肿瘤之间新表位表现不同，则个人化也在每个个体肿瘤的水平上被促进。
·疗法的个人化的效率，就时间效率、或生成疗法的资源效率、或治疗选择或效力的效率而言，如下文进一步说明：
ο在本发明的几个实施方式中抗体是个人化的基础，而非细胞疗法是个人化的基础。与细胞疗法相比，抗体提供其生成和使用方面更高的效率，例如其生产更快和更低廉。
ο抗体可以作为单一抗体(针对单一新表位)或两种或更多种抗体的组合(针对两种或更多种不同表位)被给予患者，因此提供治疗效率。
ο外源添加的细胞疗法，即过继细胞疗法，是任选的，而不是必需的——鉴于本发明的一些实施方式仅需要向患者给予抗体，其中依赖患者体内的内源免疫细胞，并且不需要任何外源细胞疗法。
ο本发明的实施方式提供了治疗效率(功效，efficiency)。当外源细胞疗法与新表位靶向抗体疗法被结合给予时，有一系列的细胞供选择(例如，NK细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞等)。另外，出于生物效果协同作用的目的，可以给予一种或多种类型的细胞疗法，例如给予外源NK细胞与外源巨噬细胞的组合以诱导ADCC机制(通过NK细胞上的CD16)和ADCP机制(通过巨噬细胞上的CD32)两者，以对抗疾病。
ο更新的抗体能够在治疗过程中响应于疾病显现的进一步突变(例如，在癌症转移时出现不同新表位的情形下)而继续生成。这种治疗灵活性的可能性是通过抗体生成相对于细胞疗法生成固有的资源效率而提供的。换句话说，该疗法是可适应于疾病的。
总之，本节中总结的实验结果提供了证据证明本发明创造了通过生成选择性靶向患病细胞上的新表位的抗体以及撬动ADCC、ADCP或ADCC和ADCP组合的细胞机制而生成个人化疗法的新方法。
计划实验
本文公开的实验实施例证明，具体肽-MHC复合物(在本例中，充当“替代新表位”的模型抗原)的特异性TCR样抗体能够通过NK细胞诱导ADCC活性。计划进行进一步的实验以：[a]证明这种ADCC活性导致体内抗肿瘤活性，[b]证明利用详细说明中描述的方法可以针对人类的已知新表位生成新TCR样抗体，以及[c]证明新的抗新表位TCR样抗体诱导ADCC活性。
计划实验策略和方法：
测试由抗SIINFEKL-H2Kb IgG2a抗体在体内诱导的ADCC活性产生的抗肿瘤活性：体外ADCC诱导的演证明利用小鼠肿瘤细胞系EL4——当用SIINFEKL肽处理或“脉冲”EL4细胞时(参见实施例1)。另一种细胞系E.G7源自EL4，但不同于EL4细胞，E.G7经鸡蛋卵清蛋白(OVA)稳定地转染，并且鉴于OVA具有氨基酸序列SIINFEKL，E.G7细胞在细胞表面H2Kb分子上呈递“替代”新表位SIINFEKL——甚至在没有单独暴露于SIINFEKL肽的情况下。这些肿瘤细胞系在C57BL/6小鼠中都是均致瘤性的，即皮内植入导致进行性肿瘤生长，其可以经过时间被监测。在利用同型转换IgG2a形式的抗SIINFEKL抗体(克隆25-D1.16)的计划实验中，小鼠将被植入以[a]EL4肿瘤，其中EL4细胞尚未暴露于SIINFEKL肽(阴性对照)或[b]E.G7肿瘤(其表面上具有抗体的靶标)，以及用不同剂量的抗体处理小鼠。在一些实验中，将同时进行原代NK细胞(从其他C57BL/6小鼠中新分离)的过继转移以增加对于基于ADCC的抗肿瘤活性可利用的NK细胞数量，作为人类的NK细胞免疫疗法的模型。端点将包括经过时间的肿瘤尺寸变化以及小鼠的存活率。
针对在人类的已知的“公共”新表位的新型抗新表位抗体的生成：最初的抗体开发工作将致力于HLA-A*02:01结合新表位(氨基酸序列CLAVEEVSL)——其由NPM1中产生简短替代性阅读框翻译的四碱基对插入产生(Van der Lee,等(2019)J.Clin.Invest.129(2):774–85)。这种移码突变被发现于30％的AML患者中，使其成为“公共”新抗原。此外，HLA-A*02:01是高度普遍的HLA等位基因。项目的第一阶段将有以下目标：(1)生成针对AML中常见的这种源自“公共”移码的新抗原的几种新型TCR样抗体，以及(2)在体外测试候选抗体以评价其诱导人NK细胞针对AML细胞的ADCC活性的能力。表现最好的候选抗体(约3-5种不同的抗体)将构成将在项目的第二阶段进行临床前测试的候选名单。
为了实现第一个目标，将遵循图24中灰色突显的步骤。第一步，将合成“公共”新表位肽CLAVEEVSL。重要的是，已经显示此肽的实际呈递形式包括N端半胱氨酸残基的半胱氨酰化(Van der Lee 2019)。因此，被合成用于这些实验的肽也将需要进行半胱氨酰化。肽合成后，将制备利用重组HLA-A*02:01和β-2-微球蛋白(β2m)蛋白的HLA-肽复合物。将制备不具有生物素化或荧光团缀合的单体复合物，用于免疫化动物和进行ELISA(下文讨论)；此外，还将制备荧光团缀合的HLA-肽四聚体，用于荧光激活的细胞分选。
快速生成HLA-肽复合物的特异性高亲和力抗体(即“TCR样”抗体)的方案被发表于2017年(Ouisse,等(2017)BMC Biotechnol.17(1):3)。该方案使用OmniRats，其是用人抗体基因代替其天然大鼠抗体基因遗传改造的大鼠。当这些大鼠用抗原免疫化时，产生的抗体具有完全人序列。OmniRats将用HLA-A*02:01-CLAVEEVSL复合物(未缀合的单体)免疫化两次，其中免疫化间隔16天。在第二次免疫化后五天，将收集脾脏和淋巴结并且解离成单细胞悬浮液。
利用免疫磁性阴性选择试剂盒以通过去除解离的淋巴组织中存在的大多数T细胞和其他细胞来富集B细胞。制备由超过90％的B细胞组成的所得细胞悬浮液用于下一步，荧光激活的细胞分选。此步骤的目的是分离这样的单个B细胞：其B细胞受体特异性结合HLA-A*02:01-CLAVEEVSL复合物。将细胞用针对大鼠IgG(以选择B细胞)和T细胞受体(以排除T细胞)的抗体以及几种荧光标记的HLA-肽四聚体复合物进行染色。如参考号(Ref#)所示，利用以下染色和门控策略成功地分离对具体HLA-肽复合物具有特异性的B细胞：(1)用目标HLA-肽的四聚体对细胞进行染色，但使用两种不同的荧光团。例如，将细胞用与异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的四聚体染色，并且同时用与藻红蛋白(PE)缀合的相同四聚体染色。同时，还将细胞用另一与不同荧光团(例如APC)缀合的不相关的HLA-肽复合物的四聚体染色。(2)在细胞分选过程中，设置控门(gate)以选择对两种与目标四聚体结合的荧光团(在本例中，FITC和PE)均呈阳性的那些B细胞，即双阳性细胞。对于那些双阳性细胞，设置另外的控门以选择与不相关的四聚体结合的荧光团(在本例中，APC)呈阴性的那些细胞。使用用于目标四聚体阳性选择的两种不同的荧光团，排除了对荧光团具有特异性的B细胞；同时，对不相关的四聚体上的阴性控门排除了对HLA分子本身(而不是与HLA分子结合的抗原肽)具有特异性的B细胞，并且还排除了对β2m具有特异性的B细胞。所得的个体B细胞的收集数量小(少于100个)，但其中一些对用于免疫化的HLA-肽复合物显示高特异性和高亲和力(～12％)。
个体B细胞将被分选到单独的PCR管中。在逆转录成cDNA并且基于PCR扩增人重链和轻链基因后，将进行DNA测序以获得可变区的独特序列。将可变区序列克隆到编码IgG1同种型的人抗体的真核表达载体中。将CHO细胞瞬时转染以产生抗HLA新表位抗体。从转染的CHO细胞培养物中收集上清液，并且利用人IgG分离试剂盒进行抗体纯化。预期将从单个免疫化的OmniRat分离20-80个B细胞克隆；因此，预期按照此过程利用单个动物将产生2-9种完全人的CLAVEEVSL特异性的候选抗体。产生测试抗原特异性的30-50种候选抗体需要按照这个过程，但进行多次OmniRat免疫化。
为了测试候选抗体的特异性，将使用用于免疫化动物的相同HLA-A*02:01-CLAVEEVSL复合物(单体)。利用标准ELISA板，将孔涂覆以这些HLA-肽复合物或不相关的HLA-肽复合物。对各抗体单独测试与这些HLA-肽复合物的结合。仅显示与HLA-A*02:01-CLAVEEVSL弱结合的那些，或显示与不相关的复合物的结合显著高于背景的那些，将被丢弃。与HLA-A*02:01-CLAVEEVSL强结合但不与不相关的HLA-肽复合物结合的那些将被保留作为候选抗体，以进一步在ADCC测定中测试(第二目标)。
测试新型抗新表位TCR样抗体的ADCC活性：
为了实现第二目标，体外进行测试这些抗新表位“TCR样”候选抗体诱导NK细胞毒性的ADCC机制的能力的实验。初步实验已经证明，对SIINFEKL-H2Kb复合物(充当“替代新表位”的模型抗原)具有特异性的TCR样抗体能够通过NK细胞诱导ADCC活性。
候选抗HLA-A*02:01-CLAVEEVSL抗体的测试将遵循与本文公开的初步实验类似的实验设计。然而，不是利用细胞系作为靶细胞，而是利用源自AML患者的癌细胞。这些癌细胞将从大学教学医院例如UConn Health或明University of Minnesota采购。由于候选抗体对HLA-A*02:01呈递的新表位具有特异性，将从患者获得大多数具有该HLA等位基因的AML样品。然而，也将获得少量缺乏该等位基因的AML样品，充当阴性对照。AML样品将进行Sanger测序，以测试NPM1中是否存在导致HLA-A*02:01上呈递“公共”新表位CLAVEEVSL的具体四碱基对插入(其应存在于30％的样品中)。所有HLA-A*02:01阳性的并且还具有正确突变的样品将被选择用于ADCC实验。然而，一些缺乏正确突变的HLA-A*02:01阳性样本也将被选择，以充当阴性对照。
对于ADCC测定中的效应细胞，将使用来自健康供者的原代人NK细胞。新鲜的血沉棕黄层(buffy coats)将从Research Blood Components(Watertown,MA)采购，并且将利用密度梯度离心获得PBMC。NK细胞将通过免疫磁性阴性选择来富集。
对各候选抗体测试其诱导针对具有或不具有HLA-A*02:01等位基因以及具有或不具有导致CLAVEEVSL呈递的移码突变的AML细胞的NK细胞的ADCC的能力。具体地，各实验将包括至少四个AML样品具有正确等位基因和正确突变，至少一个AML样品缺乏正确等位基因，以及至少一个AML样品缺乏正确突变。对于各抗体，将以多种效应：靶标比例(例如1:1、4:1和10:1)并且以多种抗体浓度(例如0μg/mL、0.02μg/mL、0.2μg/mL、2μg/mL)建立共培养。同种型对照抗体也将被包括作为阴性对照。共培养将进行4-6小时。在不存在效应(NK)细胞的情况下的AML细胞培养物将被类似地处理，以确立这些AML细胞在这些条件下的死亡基线。AML细胞的死亡将利用流式细胞术来定量，然后用膜不可透过的核染色剂(例如碘化丙啶)以及凋亡标记物(例如膜联蛋白V)进行染色。每组有四个技术复本。
预期在这些测定中观察到针对靶标AML细胞的一定量的细胞毒性活性，即使在没有添加抗体的情况下。这是由于NK细胞识别和杀伤的非抗原特异性机制。测试ADCC时的关键读取结果是，在抗体存在的情况下，NK细胞介导的杀伤增强到此基线以上。在抗体存在的情况下仅在以下时候预期杀伤(ADCC活性)增加：(1)AML样品含有导致“公共”新表位CLAVEEVSL呈递的NPM1移码突变，和(2)AML样品表达HLA-A*02:01。将选择诱导最高ADCC活性的3-5种抗体用于未来的动物实验。
列举的实施方式
提供了以下列举的实施方式，其编号不被解释为指定重要水平。
实施方式1提供了用于治疗癌症的组合物，所述组合物包含：
a.特异性结合一种或多种肿瘤特异性表位的一种或多种抗体或其抗原结合片段，和
b.有效量的细胞毒性免疫效应细胞。
实施方式2提供了实施方式1的组合物，其中组合物是个人化的。
实施方式3提供了实施方式1的组合物，其中肿瘤特异性表位是新表位。
实施方式4提供了实施方式1的组合物，其中抗体或其抗原结合片段是人源化的。
实施方式5提供了实施方式1的组合物，其中抗体或其抗原结合片段是完全人的。
实施方式6提供了实施方式1的组合物，其中抗体或其抗原结合片段是非岩藻糖基化的。
实施方式7提供了实施方式1的组合物，其中抗体或其抗原结合片段是双特异性的。
实施方式8提供了实施方式1的组合物，其中肿瘤特异性表位是新表位/HLA复合物。
实施方式9提供了实施方式1的组合物，其中细胞毒性免疫效应细胞是选自NK细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞或其任何组合的细胞类型。
实施方式10提供了实施方式1的组合物，其中细胞毒性免疫效应细胞被照射。
实施方式11提供了制备用于治疗癌症的组合物的方法，所述方法包括：
a.从对象获得肿瘤样本并且通过测序确定肿瘤表达的肿瘤特异性遗传突变，
b.基于确定的肿瘤特异性遗传突变生成HLA/新表位复合物，
c.用HLA/新表位复合物免疫化非人动物，
d.从免疫化的非人动物分离产生HLA/新表位特异性抗体或促进其抗原结合片段生成的B细胞，
e.验证HLA/新表位特异性抗体与肿瘤结合，
f.制备有效量的HLA/新表位特异性抗体，以及
g.将有效量的HLA/新表位特异性抗体与有效量的细胞毒性免疫效应细胞组合。
实施方式12提供了实施方式11的方法，其中测序是下一代测序。
实施方式13提供了实施方式11的方法，其中非人动物被人源化。
实施方式14提供了实施方式11的方法，其中非人动物产生完全人抗体。
实施方式15提供了实施方式13的方法，其中人源化的非人动物选自大鼠、小鼠、兔、驴、山羊、骆驼、美洲驼、羊驼和鲨鱼。
实施方式16提供了实施方式11的组合物，其中HLA/新表位特异性抗体通过非动物方法生成。
实施方式17提供了实施方式16的组合物，其中非动物方法是噬菌体展示。
实施方式18提供了实施方式11的组合物，其中抗体或其抗原结合片段是非岩藻糖基化的。
实施方式19提供实施方式11的组合物，其中抗体的同种型支持ADCC或ADCP。
实施方式20提供实施方式11的组合物，其中抗体的同种型被进一步从不支持ADCC或ADCP的同种型修饰成支持ADCC或ADCP的同种型。
实施方式21提供实施方式11的方法，其中HLA/新表位复合物选自单体复合物、五聚体复合物、四聚体复合物、葡聚糖连接的复合物及其任何组合。
实施方式22提供实施方式11的方法，其中细胞毒性免疫效应细胞是选自NK细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞或其任何组合的细胞类型。
实施方式23提供了制备用于治疗癌症的组合物的方法，所述方法包括：
a.从对象获得肿瘤样本并且通过测序确定肿瘤表达的肿瘤特异性遗传突变，
b.基于确定的肿瘤特异性遗传突变生成HLA/新表位复合物，
c.用HLA/新表位复合物免疫化非人动物，
d.从免疫化的非人动物分离产生HLA/新表位特异性抗体或促进其抗原结合片段生成的B细胞，
e.验证HLA/新表位特异性抗体与肿瘤结合，
f.生成一种或多种嵌合抗原受体(CAR)，其包含来自HLA/新表位特异性抗体的抗原结合结构域，以及
g.在细胞毒性免疫效应细胞中表达CAR。
实施方式24提供了实施方式23的方法，其中测序是下一代测序。
实施方式25提供了实施方式23的方法，其中非人动物被人源化。
实施方式26提供了实施方式23的方法，其中非人动物产生完全人抗体。
实施方式27提供了实施方式23的方法，其中人源化的非人动物选自大鼠、小鼠、兔、驴、山羊、骆驼、美洲驼、羊驼和鲨鱼。
实施方式28提供了实施方式23的方法，其中HLA/新表位特异性抗体通过非动物方法生成。
实施方式29提供了实施方式23的方法，其中非动物方法是噬菌体展示。
实施方式30提供了实施方式23的组合物，其中生成CAR进一步包括基于抗体的抗原结合结构域生成scFv的步骤。
实施方式31提供实施方式23的组合物，其中CAR进一步包含跨膜结构域、信号传导结构域和共刺激结构域。
实施方式32提供了实施方式23的方法，其中HLA/新表位复合物选自单体复合物、五聚体复合物、四聚体复合物、葡聚糖连接的复合物及其任何组合。
实施方式33提供了实施方式23的方法，其中细胞毒性免疫效应细胞是选自NK细胞、T细胞、NK T细胞或其任何组合的细胞类型。
实施方式34提供了实施方式23的方法，其中细胞毒性免疫效应细胞是NK细胞。
实施方式35提供了实施方式23的方法，其中细胞毒性免疫效应细胞是CD8+T细胞。
实施方式36提供了治疗有需要的对象中的癌症的方法，所述方法包括：
a.从对象获得肿瘤样本并且通过测序确定肿瘤表达的肿瘤特异性新表位，
b.由确定的肿瘤特异性新表位生成HLA/新表位复合物，
c.用HLA/新表位复合物免疫化非人哺乳动物，
d.从免疫化的非人哺乳动物分离产生HLA/新表位特异性抗体或其抗原结合片段的B细胞，
e.验证HLA/新表位特异性抗体与肿瘤结合，
f.制备有效量的HLA/新表位特异性抗体，以及
g.向对象给予有效量的HLA/新表位特异性抗体和有效量的细胞毒性免疫效应细胞，从而治疗癌症。
实施方式37提供了实施方式36的方法，其中测序是下一代测序。
实施方式38提供了实施方式36的方法，其中非人动物被人源化。
实施方式39提供了实施方式36的方法，其中非人动物产生完全人抗体。
实施方式40提供了实施方式36的方法，其中人源化的非人动物选自大鼠、小鼠、兔、驴、山羊、骆驼、美洲驼、羊驼和鲨鱼。
实施方式41提供了实施方式36的方法，其中HLA/新表位特异性抗体通过非动物方法生成。
实施方式42提供了实施方式36的方法，其中非动物方法是噬菌体展示。
实施方式43提供了实施方式36的方法，其中HLA/新表位特异性抗体是非岩藻糖基化的。
实施方式44提供了实施方式36的方法，其中抗体的同种型支持ADCC或ADCP。
实施方式45提供了实施方式36的方法，其中抗体的同种型被进一步从不支持ADCC或ADCP的同种型修饰成支持ADCC或ADCP的同种型。
实施方式46提供了实施方式36的方法，其中HLA/新表位复合物选自单体复合物、五聚体复合物、四聚体复合物、葡聚糖连接的复合物及其任何组合。
实施方式47提供了实施方式36的方法，其中细胞毒性免疫效应细胞是选自NK细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞或其任何组合的细胞类型。
实施方式48提供了治疗有需要的对象中的癌症的方法，所述方法包括：
a.从对象获得肿瘤样本并且通过测序确定肿瘤表达的肿瘤特异性新表位，
b.由确定的肿瘤特异性新表位生成HLA/新表位复合物，
c.用HLA/新表位复合物免疫化非人哺乳动物，
d.从免疫化的非人哺乳动物分离产生HLA/新表位特异性抗体或其抗原结合片段的B细胞，
e.验证HLA/新表位特异性抗体与肿瘤结合，
f.生成包含来自HLA/新表位特异性抗体的抗原结合结构域的嵌合抗原受体(CAR)，
g.在细胞毒性免疫效应细胞中表达CAR，以及
h.向对象给予有效量的细胞毒性免疫效应细胞，从而治疗癌症。
实施方式49提供了实施方式48的方法，其中测序是下一代测序。
实施方式50提供了实施方式48的方法，其中非人动物被人源化。
实施方式51提供了实施方式48的方法，其中非人动物产生完全人抗体。
实施方式52提供了实施方式48的方法，其中人源化的非人动物选自大鼠、小鼠、兔、驴、山羊、骆驼、美洲驼、羊驼和鲨鱼。
实施方式53提供了实施方式48的方法，其中HLA/新表位特异性抗体通过非动物方法生成。
实施方式54提供了实施方式48的方法，其中非动物方法是噬菌体展示。
实施方式55提供了实施方式48的方法，其中HLA/新表位复合物选自单体复合物、五聚体复合物、四聚体复合物、葡聚糖连接的复合物及其任何组合。
实施方式56提供了实施方式48所述的组合物，其中生成CAR进一步包括基于抗体的抗原结合结构域生成scFv的步骤。
实施方式57提供了实施方式48的组合物，其中CAR进一步包含跨膜结构域、信号传导结构域和共刺激结构域。
实施方式58提供了实施方式48的方法，其中细胞毒性免疫效应细胞是选自NK细胞、T细胞、NK T细胞或其任何组合的细胞类型。
实施方式59提供了实施方式48的方法，其中细胞毒性免疫效应细胞是NK细胞。
实施方式60提供了实施方式48的方法，其中细胞毒性免疫效应细胞是CD8+T细胞。
其他实施方式
本文在可变形式的任何定义中对一系列要素的叙述包括该可变形式作为所列要素中的任何单个要素或组合(或子组合)的定义。本文对实施方式的叙述包括该实施方式作为任何单个实施方式或与任何其他实施方式或其部分的组合。
本文引用的每一个专利、专利申请和出版物的公开内容均在此整体通过引用并入本文。虽然本发明已被参考具体实施方式公开，但是显而易见，在不背离本发明的真实精神和范围的情况下，本领域其他技术人员可以设计出本发明的其他实施方式和变型。所附权利要求意图被解释为包括所有这种实施方式和等效变型。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.用于治疗癌症的组合物，所述组合物包含：
a.特异性结合一种或多种肿瘤特异性表位的两种或更多种抗体或其抗原结合片段，和
b.有效量的两种或更多种细胞毒性免疫效应细胞。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中：
a.所述抗体或其抗原结合片段中的至少一种与效应细胞上的Fc-γ受体接合；并且
b.所述抗体或其抗原结合片段中的至少一种是双特异性的并且结合至免疫细胞表位。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中：
a.表达所述Fc-γ受体的效应细胞选自NK细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、γ-δT细胞及其任何组合；并且
b.所述免疫细胞表位由选自T细胞、B细胞及其任何组合的免疫细胞表达。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述肿瘤特异性表位是新表位。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物是个人化的。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段是人源化的。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段是完全人的。
8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段是非岩藻糖基化的。
9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述肿瘤特异性表位是新表位/HLA复合物。
10.根据权利要求1所述的组合物，其中：
a.所述细胞毒性免疫效应细胞中的至少一种是选自下列的表达Fc-γ受体的效应细胞：NK细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、γ-δT细胞及其任何组合；并且
b.所述细胞毒性免疫效应细胞中的至少一种选自T细胞、B细胞及其任何组合。
11.根据权利要求1所述的组合物，其中所述免疫效应细胞被照射。
12.用于治疗癌症的组合物，所述组合物包含：
a.有效量的一种或多种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段特异性结合一种或多种肿瘤特异性表位，和
b.有效量的一种或多种细胞毒性免疫效应细胞。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述肿瘤特异性表位是新表位。
14.根据权利要求12所述的组合物，其中所述组合物是个人化的。
15.根据权利要求12所述的组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段是人源化的。
16.根据权利要求12所述的组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段是完全人的。
17.根据权利要求12所述的组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段是非岩藻糖基化的。
18.根据权利要求12所述的组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段是双特异性的。
19.根据权利要求12所述的组合物，其中所述肿瘤特异性表位是新表位/HLA复合物。
20.根据权利要求12所述的组合物，其中所述细胞毒性免疫效应细胞是选自下列的表达Fc-γ受体的效应细胞：NK细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、γ-δT细胞及其任何组合。
21.根据权利要求12所述的组合物，其中所述细胞毒性免疫效应细胞被照射。

Claims (34)

1.用于治疗癌症的组合物，所述组合物包含：
a.特异性结合一种或多种肿瘤特异性表位的一种或多种抗体或其抗原结合片段，和
b.有效量的细胞毒性免疫效应细胞。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物是个人化的。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述肿瘤特异性表位是新表位。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段是人源化的。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段是完全人的。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段是非岩藻糖基化的。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段是双特异性的。
8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述肿瘤特异性表位是新表位/HLA复合物。
9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述细胞毒性免疫效应细胞是选自NK细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞或其任何组合的细胞类型。
10.根据权利要求1所述的组合物，其中所述细胞毒性免疫效应细胞被照射。
11.制备用于治疗癌症的组合物的方法，所述方法包括：
a.从对象获得肿瘤样本并且通过测序确定所述肿瘤表达的肿瘤特异性遗传突变，
b.基于确定的所述肿瘤特异性遗传突变生成HLA/新表位复合物，
c.用所述HLA/新表位复合物免疫化非人动物，
d.从免疫化的所述非人动物分离产生HLA/新表位特异性抗体或促进其抗原结合片段生成的B细胞，
e.验证所述HLA/新表位特异性抗体与所述肿瘤结合，
f.制备有效量的所述HLA/新表位特异性抗体，以及
g.将所述有效量的HLA/新表位特异性抗体与有效量的细胞毒性免疫效应细胞组合。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述测序是下一代测序。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述非人动物被人源化。
14.根据权利要求11所述的方法，其中所述非人动物产生完全人抗体。
15.根据权利要求13所述的方法，其中人源化的所述非人动物选自大鼠、小鼠、兔、驴、山羊、骆驼、美洲驼、羊驼和鲨鱼。
16.根据权利要求11所述的组合物，其中所述HLA/新表位特异性抗体通过非动物方法生成。
17.根据权利要求16所述的组合物，其中所述非动物方法是噬菌体展示。
18.根据权利要求11所述的组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段是非岩藻糖基化的。
19.根据权利要求11所述的组合物，其中所述抗体的同种型支持ADCC或ADCP。
20.根据权利要求11所述的组合物，其中所述抗体的同种型被进一步从不支持ADCC或ADCP的同种型修饰成支持ADCC或ADCP的同种型。
21.根据权利要求11所述的方法，其中所述HLA/新表位复合物选自单体复合物、五聚体复合物、四聚体复合物、葡聚糖连接的复合物及其任何组合。
22.根据权利要求11所述的方法，其中所述细胞毒性免疫效应细胞是选自NK细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞或其任何组合的细胞类型。
23.治疗有需要的对象中的癌症的方法，所述方法包括：
a.从所述对象获得肿瘤样本并且通过测序确定所述肿瘤表达的肿瘤特异性新表位，
b.由确定的所述肿瘤特异性新表位生成HLA/新表位复合物，
c.用所述HLA/新表位复合物免疫化非人哺乳动物，
d.从免疫化的所述非人哺乳动物分离产生HLA/新表位特异性抗体或其抗原结合片段的B细胞，
e.验证所述HLA/新表位特异性抗体与所述肿瘤结合，
f.制备有效量的所述HLA/新表位特异性抗体，以及
g.向所述对象给予有效量的所述HLA/新表位特异性抗体和有效量的细胞毒性免疫效应细胞，从而治疗所述癌症。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述测序是下一代测序。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述非人动物被人源化。
26.根据权利要求23所述的方法，其中所述非人动物产生完全人抗体。
27.根据权利要求26所述的方法，其中人源化的所述非人动物选自大鼠、小鼠、兔、驴、山羊、骆驼、美洲驼、羊驼和鲨鱼。
28.根据权利要求23所述的方法，其中所述HLA/新表位特异性抗体通过非动物方法生成。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述非动物方法是噬菌体展示。
30.根据权利要求23所述的方法，其中所述HLA/新表位特异性抗体是非岩藻糖基化的。
31.根据权利要求23所述的方法，其中所述抗体的同种型支持ADCC或ADCP。
32.根据权利要求23所述的方法，其中所述抗体的同种型被进一步从不支持ADCC或ADCP的同种型修饰成支持ADCC或ADCP的同种型。
33.根据权利要求23所述的方法，其中所述HLA/新表位复合物选自单体复合物、五聚体复合物、四聚体复合物、葡聚糖连接的复合物及其任何组合。
34.根据权利要求23所述的方法，其中所述细胞毒性免疫效应细胞是选自NK细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞或其任何组合的细胞类型。
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