CN117756939A - 一种抗lilrb1抗体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种抗LILRB1抗体及其应用，所述抗LILRB1抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的CDR1包括如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；所述重链可变区的CDR2包括如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；所述重链可变区的CDR3包括如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；所述轻链可变区的CDR1包括如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；所述轻链可变区的CDR2包括如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；所述轻链可变区的CDR3包括如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。所述抗LILRB1抗体特异性结合细胞表面表达的LILRB1蛋白，并可以阻断配体与LILRB1结合。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种抗LILRB1抗体及其制备方法和应用。
背景技术
目前癌症免疫疗法研究的重点是通过靶向T细胞检查点来恢复抗肿瘤T细胞的功能，从而增强对肿瘤的适应性免疫。靶向PD-1(程序死亡受体-1)/PDL1(程序死亡受体配体-1)和CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白-4)/B7的信号通路取得了巨大成功。但是只有少数患者受益。嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T细胞)不容易进入实体瘤，导致其作用有限。肿瘤微环境中含有大量巨噬细胞，可占肿瘤体积的50％。重要的是，这些巨噬细胞具有免疫监视功能。随着“别吃我”分子CD47的发现，以巨噬细胞相关先天免疫抑制信号通路CD47-SIRPα为靶点的抗体药物应运而生，并在实验室和临床上取得了令人惊叹的成果，但仍存在无法解释的肿瘤免疫逃逸现象。在研究癌症对抗CD47抗体的免疫耐受性时，发现了肿瘤细胞上的第二个“别吃我”分子，即MHC I类的一个组成部分—β2微球蛋白(β2m)。一些肿瘤细胞通过减少其表面MHC I类的表达，来逃避T细胞的识别。然而，另一些肿瘤细胞则高表达与MHCI类重链复合的β2m，通过与巨噬细胞上的白细胞免疫球蛋白样受体B家族成员1(LILRB1)结合，发出“别吃我”的信号，从而失去免疫监视。通过阻断肿瘤相关巨噬细胞中这种免疫抑制MHC I类-LILRB1信号轴将有助于恢复巨噬细胞功能，增强抗肿瘤反应。
白细胞Ig样受体亚家族B(LILRB)是一类具有细胞外Ig样结构域和细胞内ITIM(基于酪氨酸的免疫受体抑制基序)的I型跨膜糖蛋白。包含5个成员，即LILRB1至LILRB5，也分别称为CD85J、CD85D、CD85A、CD85K和CD85C，或白细胞Ig样受体(分别为LIR1、LIR2、LIR3、LIR5和LIR8)。LILRB 1-4也被命名为Ig样转录本(分别为ILT2、ILT4、ILT5和ILT3)。人类这些受体的编码区位于染色体19q13.4白细胞受体复合体区域。LILRB1的胞质区有4个ITIM，胞外部分含4个免疫球蛋白结构域。LILRB1是分布最广的LILRBs，可在某些NK细胞、单核细胞/巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞、树突状细胞(DC)、T细胞亚群、B细胞、蜕膜巨噬细胞、祖肥大细胞和破骨细胞上表达。LILRB1在单核细胞和B细胞上均匀表达，但LILRB1在NK细胞上的表达因人而异，这是因为LILRB1基因座、启动子选择和翻译抑制具有很大程度的多样性。已知有多种配体与LILRB1相互作用，包括HLAI类分子(如HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F和HLA-G)，其亲和力在μM范围内。值得注意的是，与经典的HLA I类分子相比，LILRB1与HLA-G的结合力更强。
人类白细胞抗原G(HLA-G)主要表达于胎盘中的外绒毛层滋养细胞，它在妊娠期间介导母胎免疫耐受。虽然HLA-G在健康组织中的表达受到限制，但病理条件可诱导HLA-G的表达。在各种癌症中，包括结直肠癌(CRC)、乳腺癌、黑色素瘤和卵巢癌中，都可以观察到HLA-G的新表达。HLA-G表达经常与疾病进展、肿瘤转移和不良临床预后相关。HLA-G通过与LILRB1(ILT2)和LILRB2(ILT4)受体相互作用，抑制细胞毒性T细胞、自然杀伤细胞(NK)和B细胞的功能，诱导T细胞无能，调节髓系细胞，促进T调节细胞(Treg)。此外，在抗原递呈细胞(APCs)，如髓系来源抑制细胞(MDSCs)或耐受性树突状细胞(DCs)上表达的HLA-G可使T细胞低反应并诱导Treg分化。因此靶向LILRBs将对肿瘤治疗起到多种调节功能。
发明内容
为了解决上述问题，本发明采用LILRB1的胞外域进行免疫，并在初筛阶段就对抗体与LILRB1在细胞水平的结合进行考察，筛选出特异性结合细胞表面LILRB1的高亲和力抗体。该抗体有希望用于治疗肿瘤。
本发明第一方面提供一种抗LILRB1抗体，所述抗LILRB1抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的CDR1包括如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；所述重链可变区的CDR2包括如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；所述重链可变区的CDR3包括如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；所述轻链可变区的CDR1包括如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；所述轻链可变区的CDR2包括如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；所述轻链可变区的CDR3包括如SEQID NO:8所示的氨基酸序列。
本发明第二方面提供一种多核苷酸，编码上述的抗LILRB1抗体。
本发明第三方面提供一种表达载体，含有上述的多核苷酸。
本发明第四方面提供一种宿主细胞，所述表达系统含有上述的表达载体或基因组中整合有外源的上述的多核苷酸。
本发明第五方面提供一种试剂盒或药物，所述试剂盒或药物包括上述的抗LILRB1抗体。
本发明第六方面提供一种制备上述抗LILRB1抗体的方法，包括在允许所述LILRB1抗体表达的条件下，培养上述的表达载体的宿主细胞或基因组中整合有外源的上述多核苷酸的宿主细胞，从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体。
本发明第七方面提供上述的抗LILRB1抗体、上述的多核苷酸、上述的表达载体、上述的试剂盒或药物、上述的方法在制备用于诊断、治疗或预防肿瘤的产品中的用途。
本发明的有益效果在于：
1)本发明提供的抗LILRB1抗体对细胞表面的LILRB1具有高亲和力，能特异性与LILRB1结合，而不与hLILRB2、hLILRA1、hLILRA2、hLILRA3结合。
2)抗LILRB1抗体具有良好的结合活性，结合活性高于对标抗体BION-202。
3)抗LILRB1抗体能有效阻断HLA-G与LILRB1的结合，为肿瘤治疗提供新的技术方案。
附图说明
图1本发明一些实施例所筛选的D87055-1173的荧光成像图。
图2本发明一些实施例所示的抗LILRB1抗体和对标单抗BION-202与HEK293T-hLILRB1/hLILRB2/hLILRA1/hLILRA2/hLILRA3的结合情况柱状图。
图3本发明一些实施例所示的抗LILRB1抗体在Jurkat-hLILRB1细胞上的结合曲线图。
图4本发明一些实施例所示的抗LILRB1抗体在Daudi细胞上的结合曲线图。
图5本发明一些实施例所示的抗LILRB1抗体阻断HLA-G与LILRB1结合的曲线图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所公布的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
LILR，即白细胞免疫球蛋白样受体，LILR家族是一组在人骨髓细胞群和淋巴细胞群中表达的成对免疫调节受体，可分为两类：抑制性LILR亚家族B(LILRB1-5)和激活性LILR亚家族A(LILRA1-6)。抑制性LILRB受体拥有免疫球蛋白类似(Ig-like)的胞外结构域与胞内ITIM基序(Immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif)。抑制性LILR亚家族B不仅在多种免疫细胞上广泛表达，参与抑制髓系细胞活化，介导肿瘤细胞发生免疫逃逸，也在癌症干细胞中高表达，并可能直接参与调控癌症的发生和复发以及肿瘤干细胞的活性。靶向LILRBs将对肿瘤治疗起到多种调节功能。
本申请中的LILRB1属于上述LILR家族中的亚家族B，包含四个胞外Ig结构域，一个跨膜结构域和四个胞质ITIM基序。在LILRB家族中，LILRB1的细胞分布最为广泛，包括原代NK细胞、B细胞、各种T细胞群、单核细胞/巨噬细胞、嗜酸性细胞和嗜碱性细胞、树突状细胞、蜕膜巨噬细胞和破骨细胞。LILRB1介导的抑制可导致T细胞和NK细胞的增殖障碍，并产生“别吃我”信号，从而阻止巨噬细胞吞噬肿瘤。
LILRB1蛋白具有650个氨基酸，氨基酸序列如下：
MTPILTVLICLGLSLGPRTHVQAGHLPKPTLWAEPGSVITQGSPVTLRCQGGQETQEYR
LYREKKTALWITRIPQELVKKGQFPIPSITWEHAGRYRCYYGSDTAGRSESSDPLELVVTGAY
IKPTLSAQPSPVVNSGGNVILQCDSQVAFDGFSLCKEGEDEHPQCLNSQPHARGSSRAIFSV
GPVSPSRRWWYRCYAYDSNSPYEWSLPSDLLELLVLGVSKKPSLSVQPGPIVAPEETLTLQC
GSDAGYNRFVLYKDGERDFLQLAGAQPQAGLSQANFTLGPVSRSYGGQYRCYGAHNLSSE
WSAPSDPLDILIAGQFYDRVSLSVQPGPTVASGENVTLLCQSQGWMQTFLLTKEGAADDPW
RLRSTYQSQKYQAEFPMGPVTSAHAGTYRCYGSQSSKPYLLTHPSDPLELVVSGPSGGPSSP
TTGPTSTSGPEDQPLTPTGSDPQSGLGRHLGVVIGILVAVILLLLLLLLLFLILRHRRQGKHWT
STQRKADFQHPAGAVGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKHTQPEDGVEMDTRSPH
DEDPQAVTYAEVKHSRPRREMASPPSPLSGEFLDTKDRQAEEDRQMDTEAAASEAPQDVT
YAQLHSLTLRREATEPPPSQEGPSPAVPSIYATLAIH(SEQ ID NO:12)。
本发明第一方面提供一种抗LILRB1抗体，其特征在于，所述抗LILRB1抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的CDR1包括如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；所述重链可变区的CDR2包括如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；所述重链可变区的CDR3包括如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；所述轻链可变区的CDR1包括如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；所述轻链可变区的CDR2包括如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；所述轻链可变区的CDR3包括如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列为：NSGVS。
SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列为：TIWGAGNTNYPSTLVS。
SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列为：GPNWDKGYFDY。
SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列为：RASQDISNFLN。
SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列为：STSTLHS。
SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列为：QQANTLWT。
在本发明的具体实施例中，所述抗LILRB1抗体的重链可变区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
在本发明的具体实施例中，所述抗LILRB1抗体的轻链可变区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列如下：
QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLSNSGVSWIRRPPGKGLEWLGTIWGAGNTNYPSTLVSRLSITKDNSKSQVFLKLNSLQSTDTATYYCAKGPNWDKGYFDYWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列如下：
DVQMTQTSSSLFASLGDRVTISCRASQDISNFLNWYQLKPDGTVKLLIYSTSTLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEEEDIATYFCQQANTLWTFGGGTKLEIK
抗体通常以一个或多个Y字形单体的形式存在，每个Y字形单体由4条多肽链组成，其中包含两条相同的重链和两条相同的轻链。根据它们的分子量大小来区分重链和轻链。基于小分子多肽结构的差异将轻链分为κ或λ型，重链分为μ、δ、γ、α或ε，限定了抗体的类或型，分别为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。
以IgG为例，抗体轻链的C末端和重链的C末端约3/4的结构为高度保守的恒定区，而对应的轻链的N末端和重链的N末端，为有着极高的氨基酸序列多样性的可变区。在轻链和重链的可变区内分别分布着三个相对短的序列，为高频突变区域，表现出极强的多样性，被称为CDR(complementarity determining regions，CDRs)，CDRs特异性地识别抗原。
本领域技术人员可知，包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')或F(ab')2、纳米抗体(VHH)、单链抗体(scFv)等非完整的四聚体形式的抗体也可发挥特异性结合抗原的功效。
在本发明的一些实施例中，所述抗LILRB1抗体为鼠源抗体或人源化抗体，优选的，所述人源化抗体包括嵌合抗体。
鼠源抗体即抗体的编码基因完全来源于鼠。
人源化抗体是指抗体的恒定区部分或抗体全部由人类抗体基因所编码。人源化抗体可以大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应。人源化抗体包括嵌合抗体、改型抗体和全人源化抗体等。
嵌合抗体是利用DNA重组技术将鼠源单抗的轻链、重链可变区插入含有人抗体恒定区的表达载体中，转化哺乳动物细胞进行表达所产生的单克隆抗体。嵌合抗体的人源化程度可达到70％，完整的保留了鼠源单抗的可变区及亲本活性，人抗体恒定区的引入降低了免疫原性。
在本发明的一些实施例中，所述抗LILRB1抗体还包括重链恒定区和轻链恒定区，优选的，所述重链恒定区为人源IgG4重链恒定区，所述轻链恒定区为人源Kappa轻链恒定区，优选的，所述IgG4重链恒定区氨基酸序列相对于野生型IgG4重链恒定区氨基酸序列存在如下突变：S228P，所述野生型IgG4重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。
lgG4是免疫球蛋白IgG的一个亚类，IgG是体内正常维持免疫需要的球蛋白人，IgG有四个亚型，分别为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，野生型IgG4重链恒定区氨基酸序列SEQ IDNO:11如下所示：
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK。
优选的，IgG4重链恒定区氨基酸序列发生S228P突变，用于增强IgG4的稳定。
在本发明的一些实施例中，所述抗LILRB1抗体的重链恒定区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列如下所示：
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK。
在本发明的一些实施例中，所述抗LILRB1抗体的轻链恒定区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列如下所示：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTE QDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。
本申请第二方面提供一种多核苷酸，编码上述的抗LILRB1抗体。
所述多核苷酸的制备方法为现有技术，可以根据具体情况选择常规，例如可以通过自动DNA合成制备，也可以通过重组DNA技术制备获得，也可以从适合的天然来源加以分离。
多核苷酸是指通常从一个脱氧核糖或核糖连接至另一个脱氧核糖或核糖的核苷酸的聚合物，本申请中的多核苷酸无大小限制，且可以包括包含修饰，特别是包含修饰的核苷酸的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸可以是RNA、DNA或cDNA等。
本发明第三方面提供一种表达载体，含有上述的多核苷酸。
本申请中的“载体”是指能携带至少一个多核苷酸片段的多核苷酸，载体可以是以环状或线性(线性化)形式存在，并且也包括载体片段，也可以是包含允许转移外源核酸片段的人工染色体或类似的各个多核苷酸。所述载体可以包含至少一种包含调节序列的表达盒，用于正确地表达掺入其中的多核苷酸。待引入到细胞中的多核苷酸(例如编码目的产物或选择标记的多核苷酸)可以插入到载体的表达盒中以从其表达。载体将多核苷酸递送到宿主细胞中进行表达。
所述载体可以选自DNA载体、RNA载体、质粒、转座子载体、CRISPR/Cas9载体或病毒载体等。
在本发明的具体实施方式中，所述表达载体为含有编码上述的抗LILRB1抗体基因的PTT5表达载体。
本发明第四方面提供一种宿主细胞，所述表达系统含有上述的表达载体或基因组中整合有外源的上述的多核苷酸。
所述宿主细胞可以选自细菌细胞、酵母细胞、丝状真菌细胞、哺乳动物细胞等，具体的，可以选自大肠杆菌，链霉菌属、鼠伤寒沙门氏菌、酵母、丝状真菌、果蝇S2或Sf9细胞、CHO细胞、COS细胞、293细胞、Bowes黑素瘤细胞等。
在本发明的具体实施方式中，所述宿主细胞为转染了含有抗体基因的PTT5表达载体的哺乳动物细胞293F。
将表达载体导入宿主细胞的方法可以根据实际情况选择常规，例如，可以选择显微注射法、基因枪法、电穿孔法、病毒介导的转化法、电子轰击法、磷酸钙沉淀法等方法。
本发明第五方面提供一种试剂盒或药物，所述试剂盒或药物包括上述的抗LILRB1抗体。
所述试剂盒还包括使用该试剂盒所必须的试剂、缓冲液、干燥剂、说明书等。
所述药物还包括上述的抗LILRB1抗体及药学上可接受的载体或辅料。可作为药学上可接受的载体或辅料的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醉、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂、抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。
本发明第六方面提供一种制备上述的抗LILRB1抗体的方法，包括，在允许所述LILRB1抗体表达的条件下，培养含有上述的表达载体的宿主细胞或基因组中整合有外源的上述多核苷酸的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体。
本发明第七方面提供上述的抗LILRB1抗体、上述的多核苷酸、上述的表达载体、上述的试剂盒或药物、上述的方法在制备用于诊断、治疗或预防肿瘤的药物中的用途。
所述肿瘤可以为食管癌、胃癌、大肠癌、肝癌、鼻咽癌、脑肿瘤、肺癌、乳腺癌、宫颈癌、骨癌、肾细胞癌、黑素瘤、胰腺癌、皮肤癌、卵巢癌、阴道癌、甲状腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、膀胱癌、中枢神经系统瘤、内分泌系统癌、尿道癌、脊椎肿瘤、血液瘤中的一种或多种；在本发明的具体实施方式中，优选的，所述肿瘤为血液瘤。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1基于单细胞的鼠源抗人LILRB1抗体筛选
通过慢病毒感染的方法(MOI＝3-10，5μg/mL polybrene)在Jurkat细胞(中国科学院)上过表达人源LILRB1。慢病毒由上海吉凯基因医学科技股份有限公司提供，细胞感染72小时后加相应抗生素继续培养2-4周，扩增并冻存，得到Jurkat-hLILRB1细胞，以用于后续实验。
为了获得抗LILRB1抗体，使用Human LILRB1/CD85j/ILT2 Domain1&2Protein(Kactus，LIL-HM11D)免疫Balb/c小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司，品系代码216)；初免佐剂使用完全弗氏佐剂CFA(Sigma，货号F5881-10 mL)，之后免疫佐剂都使用IFA(Sigma，货号F5506-10 mL)；免疫途径为皮下多点。多次免疫后取免疫小鼠的脾脏，使用CD138+Plasma Cell Isolation Kit,mouse(Stemcell，18957)分离小鼠浆B细胞，4℃静置备用。
基于单细胞的鼠抗高通量筛选：以Jurkat-hLILRB1为筛选细胞系，使用BerkeleyLights进行鼠抗筛选。样品buffer如无特殊说明，则均来自试剂盒opto-plasma BDiscovery Sample Prep kit，Mouse(BLI，750-02050)。首先将浆B细胞分载入筛选芯片(BLI，750-00060)的小室中：300g，4℃离心5min浆B细胞，去上清，重悬于Load Medium，调整密度至6E6/mL后上机载入筛选芯片。后将Jurkat-hLILRB1细胞载入芯片的小室上方通道中：取1E7细胞，以10mL DPBS离心清洗2次，重悬于Load Medium，调整密度至1E8/mL后，加入10μg/mL荧光二抗(DyLight488山羊抗鼠IgG，Abcam，ab97015)，混匀上机载入筛选芯片。最后孵育60分钟，期间每隔5分钟荧光拍照成像，完成鼠抗筛选。根据荧光状态判断小室内的浆B细胞产生的抗体与通道中筛选细胞的结合，确定结合人LILRB1的阳性小鼠浆B细胞：D87055-1173。图1为D87055-1173的荧光成像图。
取一块无核酶96孔PCR板(Axygen，PCR-96M2-HS-C)，每孔加入20μL Mineral Oil(Sigma,M5904)和10μL 2*TCL buffer(Qiagen，1070498)，贴上封板膜(Thermo，AB0558)，200g离心1分钟后室温静置备用。以10μL导出体系导出阳性浆B细胞D87055-1173至制备好的PCR板孔中，封板，1000g离心5分钟，保存于-80℃直至扩增测序。
实施例2鼠源抗人LILRB1抗体的可变区序列测定
取收集的单B细胞，200g离心30s，使细胞沉至底部。每孔加入10μL RNAclean XPbeads(Beckman Coulter，A63987)，吹打混匀10次，室温孵育20分钟。孵育完成后转移至磁力架(Borhee，MAG-96-11)上吸附5分钟，在不扰动磁珠的情况下去上清。保持细胞在磁力架上，加入现配80％乙醇(Sigma-Aldrich，E7023-500ML)清洗，30s后去除上清。重复清洗一次，室温放置2分钟，使磁珠干燥。使用opto-plasma B Discovery cDNA Synthesis kit(BLI，750-02030)进行单B细胞cDNA库扩增。使用AMPure XP beads(Beckman Coulter，A63881)进行cDNA纯化，照说明书操作，最后以15μL无核酶水洗脱。取1-2μL cDNA产物，使用Opto Plasma B Discovery Sanger Prep Kit(BLI，750-01004)进行BCR Hc/Lc cDNA扩增。由金唯智进行Hc/Lc测序。
GB7019-1173鼠源抗体的VH和VL序列如表1所示。进一步，还使用Kabat等人描述的方法(Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版，PublicHealth Service，美国国立卫生研究院，贝塞斯达、马里兰州(1991)，第647-669页)，确定了GB7019-1173鼠源单抗的CDR序列。
表1鼠源抗体的序列信息
实施例3抗LILRB1嵌合抗体的特异性检测
在获得抗体基因序列后，将鼠源抗体的可变区连接人源抗体的恒定区(人源IgG4(S228P)_kappa)，进行嵌合抗体的表达。将含有抗体基因的PTT5表达载体转染至哺乳动物细胞293F。收获培养瓶生长的含有抗体克隆的哺乳动物细胞上清液，使用protein A柱纯化，并且使用100mM醋酸pH3.0洗脱抗体蛋白。然后将纯化的抗体蛋白上样到分子排阻层析柱上进一步分离纯化。表达的抗体命名为cho1，之后检测抗体结合的特异性。将500,000个LILRB1过表达细胞株(HEK293T-hLILRB1，上海吉倍生物技术有限公司)、LILRB2过表达细胞株(HEK293T—hLILRB2，上海吉倍生物技术有限公司)、LILRA1过表达细胞株(HEK293T-hLILRA1，上海吉倍生物技术有限公司)、LILRA2过表达细胞株(HEK293T-hLILRA2，上海吉倍生物技术有限公司)、LILRA3过表达细胞株(HEK293T-hLILRA3，上海吉倍生物技术有限公司)，分别置于FACS buffer中待用，使用圆底96孔板。抗体样本使用FACS buffer进行稀释，终浓度为10μg/mL。细胞板中加入相应的抗体，阴性对照孔加入FACS buffer，4℃孵育1小时。离心去掉上清后，使用FACS buffer清洗两遍，每孔加入第二抗体(DyLight488山羊抗人IgG，Abcam目录编号ab97003)4℃再孵育0.5小时。染色完成后离心去掉上清，用FACSbuffer清洗两次后每孔加入FACS buffer重悬细胞，然后流式细胞仪(BD公司，型号CantoⅡ)进行读数。测定时先根据FCS和SSC圈定细胞位置，然后选择第二抗体对应荧光通道的平均荧光强度值和SSC对细胞进行分析。嵌合抗体ch01对HEK293T-hLILRB1/hLILRB2/hLILRA1/hLILRA2/hLILRA3的结合情况见图2及表2所示。结果表明，嵌合抗体ch01的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。如图2所示，嵌合抗体ch01特异性结合HEK293T-hLILRB1，而不与HEK293T-hLILRB2、HEK293T-hLILRA1、HEK293T-hLILRA2、HEK293T-hLILRA3细胞结合。对标单抗BION-202为Biond Biologics公司研发的靶向LILRB1人源化IgG4单克隆抗体。
表2.嵌合抗体的特异性
实施例4抗LILRB1嵌合抗体的抗原特异性结合活性评价
通过实施例3的方法制备嵌合抗体ch01，通过FACS检测(方法同实施例3)嵌合抗体ch01与LILRB1高表达细胞株Jurkat-hLILRB1(上海吉倍生物技术有限公司)、天然表达LILRB1细胞株Daudi(中国科学院)细胞的结合。数据分析使用GraphPad，横坐标使用抗体浓度的对数，纵坐标使用平均荧光强度，根据曲线拟合出抗LILRB1抗体的EC50。
嵌合抗体ch01对Jurkat-hLILRB1和Daudi的结合情况分别如图3、图4所示。表3列出了抗体在细胞上结合的EC50和最大结合值倍比(Top MFI FC)。结果表明，嵌合抗体ch01具有良好的结合活性。
表3抗体对LILRB1阳性细胞的结合
实施例5抗LILRB1嵌合抗体阻断HLA-G与LILRB1的结合
通过实施例3的方法制备嵌合抗体ch01，通过FACS检测抗体ch01阻断HLA-G与LILRB1的结合。处理HEK293T-hLILRB1细胞，置于FACS buffer中待用，使用圆底96孔板。ch01抗体样本使用FACS buffer进行不同浓度梯度稀释。细胞板中加入相应的抗体，阴性对照孔加入FACS buffer，4℃孵育30分钟。之后加入终浓度为2μg/mL的PE-Labeled HumanHLA-G Complex Tetramer Protein(恺佧生物，HLG-HM41CTP)4℃再孵育0.5小时。孵育完成后离心去掉上清，用FACS buffer清洗两次后每孔加入FACS buffer重悬细胞，然后流式细胞仪(BD公司，型号C6 Plus)进行读数。数据分析使用GraphPad，横坐标使用抗体浓度的对数，纵坐标平均荧光强度，根据曲线拟合出抗LILRB1抗体阻断HLA-G与LILRB1的结合的IC50。嵌合抗体ch01对HLA-G的阻断作用如图5所示。表4列出了抗体的IC50。结果表明，ch01对HLA-G与LILRB1结合的阻断作用强于对标抗体BION-202对HLA-G与LILRB1结合的阻断作用。
表4抗体阻断HLA-G与hLILRB1的结合
| 抗体名称 | IC50(μg/mL) |
| ch01 | 0.011 |
| BION-202 | 0.021 |
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
Claims (10)
1.一种抗LILRB1抗体，其特征在于，所述抗LILRB1抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的CDR1包括如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；所述重链可变区的CDR2包括如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；所述重链可变区的CDR3包括如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；所述轻链可变区的CDR1包括如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；所述轻链可变区的CDR2包括如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；所述轻链可变区的CDR3包括如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的抗LILRB1抗体，其特征在于，所述抗LILRB1抗体的重链可变区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
和/或，所述抗LILRB1抗体的轻链可变区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；
和/或，所述抗LILRB1抗体为鼠源抗体或人源化抗体，优选的，所述人源化抗体包括嵌合抗体。
3.根据权利要求1所述的抗LILRB1抗体，其特征在于，所述抗LILRB1抗体还包括重链恒定区和轻链恒定区，优选的，所述重链恒定区为人源IgG4重链恒定区，所述轻链恒定区为人源Kappa轻链恒定区，优选的，所述IgG4重链恒定区氨基酸序列相对于野生型IgG4重链恒定区氨基酸序列存在如下突变：S228P，所述野生型IgG4重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。
4.根据权利要求3所述的抗LILRB1抗体，其特征在于，所述抗LILRB1抗体的重链恒定区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；
和/或，所述抗LILRB1抗体的轻链恒定区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
5.一种多核苷酸，编码权利要求1-4任一项所述的抗LILRB1抗体。
6.一种表达载体，含有权利要求5所述的多核苷酸。
7.一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如权利要求6所述的表达载体或基因组中整合有外源的如权利要求5所述的多核苷酸。
8.一种试剂盒或药物，所述试剂盒或药物包括如权利要求1～4任一项所述的抗LILRB1抗体。
9.一种制备如权利要求1～4任一项所述的抗LILRB1抗体的方法，包括，在允许所述LILRB1抗体表达的条件下，培养含有权利要求6所述的表达载体的宿主细胞或基因组中整合有外源的权利要求5所述多核苷酸的宿主细胞，从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体。
10.权利要求1～4任一项权利要求所述的抗LILRB1抗体、权利要求5所述的多核苷酸、权利要求6所述的表达载体、权利要求7所述的宿主细胞、权利要求8所述的试剂盒或药物、权利要求9所述的方法在制备用于诊断、治疗或预防肿瘤的产品中的用途；优选的，所述肿瘤为食管癌、胃癌、大肠癌、肝癌、鼻咽癌、脑肿瘤、肺癌、乳腺癌、宫颈癌、骨癌、肾细胞癌、黑素瘤、胰腺癌、皮肤癌、卵巢癌、阴道癌、甲状腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、膀胱癌、中枢神经系统瘤、内分泌系统癌、尿道癌、脊椎肿瘤、血液瘤中的一种或多种；更优选的，所述肿瘤为血液瘤。
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