KR20130098301A - 암 치료를 위한 키나제 억제제들의 병용물 - Google Patents

암 치료를 위한 키나제 억제제들의 병용물 Download PDF

Info

Publication number
KR20130098301A
KR20130098301A KR1020137003497A KR20137003497A KR20130098301A KR 20130098301 A KR20130098301 A KR 20130098301A KR 1020137003497 A KR1020137003497 A KR 1020137003497A KR 20137003497 A KR20137003497 A KR 20137003497A KR 20130098301 A KR20130098301 A KR 20130098301A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
nhc
carcinoma
cancer
her2
compound
Prior art date
Application number
KR1020137003497A
Other languages
English (en)
Inventor
카를로스 엘. 아르테아가
다나 티. 아프타브
베로니크 블랑
아닌디타 차크라바티
마리엘르 시롱-블롱델
셀린느 니콜라치
로익 벵상
아리엘라 핸커
Original Assignee
엑셀리시스, 인코포레이티드
사노피
벤더르빌트 유니버시티
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 엑셀리시스, 인코포레이티드, 사노피, 벤더르빌트 유니버시티 filed Critical 엑셀리시스, 인코포레이티드
Publication of KR20130098301A publication Critical patent/KR20130098301A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/498—Pyrazines or piperazines ortho- and peri-condensed with carbocyclic ring systems, e.g. quinoxaline, phenazine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/517—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with carbocyclic ring systems, e.g. quinazoline, perimidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/63—Compounds containing para-N-benzenesulfonyl-N-groups, e.g. sulfanilamide, p-nitrobenzenesulfonyl hydrazide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은, 화학식 I의 화합물을, 임의로는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 용매화물 및/또는 수화물로서, HER2 및/또는 HER3을 표적화하는 억제제와 병용하여 투여함에 의한 암 치료 방법을 제공한다:
[화학식 I]

Description

암 치료를 위한 키나제 억제제들의 병용물{COMBINATIONS OF KINASE INHIBITORS FOR THE TREATMENT OF CANCER}
관련 출원과의 상호참조
본 출원은 2010년 7월 9일 출원된 미국 가특허출원 제61/363,074호 및 2010년 12월 10일 출원된 미국 가특허출원 제61/421,929호의 우선권을 주장하며, 이 기초출원은 둘 다 본 명세서에 참조로 포함된다.
서열목록
본 출원은 2011년 7월 8일 만들어지고 2011년 7월 8일 본 명세서와 함께 제출된 파일명 "SequenceListing.txt"(28.2 KB)의 서열목록을 전체를 참조로 포함한다.
기술분야
본 발명은 하나 이상의 추가적인 퀴낙솔린 PI3K 억제제를 키나제 억제제와 병용하여 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
암, 대사 및 염증 질병과 같은 다양한 질병 상태를 치료하기 위하여 사용된 작용제(agent)의 특이성 개선은, 이들 작용제의 투여와 관련된 부작용이 감소될 수 있다면 실현되는 치료적 이점 때문에 상당한 관심을 가진다. 전통적으로, 암 치료의 극적인 개선은 신규 메커니즘을 통해 작용하는 치료제의 확인과 관련된다.
포스파티딜이노시톨 3-키나제(Phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)는 110 kDa 촉매 서브유닛(PIK3CA 유전자에 의해 암호화됨) 및 85 kDa 조절 서브유닛으로 구성된다. 촉매 서브유닛은 ATP를 사용하여 PtdIns, PtdIns4P 및 PtdIns(4,5)P2를 인산화하고, 2차 전달자인 PtdIns3P, PtdIns(3,4)P2 및 PtdIns(3,4,5)P3(PIP3)을 만든다. 다양한 메커니즘을 통하여 세포 성장을 억제하는 종양 억제자인 PTEN는 PIK3CA의 주된 생성물인 PIP3을 탈인산화할 수 있다. 결국 PIP3은 상류 키나제에 의해 인산화되고 활성화되는 세포막에 대한 단백질 키나제 B(AKT1, PKB)의 전좌에 필요하다. 세포사에서 PTEN의 효과는 PIK3CA/AKT1 경로를 통하여 매개된다.
PI3Kα는 세포골격 재조직화, 아포토시스(apoptosis), 소포 이동, 증식 및 분화 과정의 제어에 연루되었다. PIK3CA 또는 PIK3CA 내 활성화 돌연변이의 증가된 복제 수 및 발현은 난소 암과 같은 다수의 악성 종양과 관련된다(Campbell et al., Cancer Res 2004, 64, 7678-7681; Levine et al., Clin Cancer Res 2005, 11, 2875-2878; Wang et al., Hum Mutat 2005, 25, 322; Lee et al., Gynecol Oncol 2005, 97, 26-34), 자궁경부암, 유방암(Bachman, et al. Cancer Biol Ther 2004, 3, 772-775; Levine, et al., 상기 참조; Li et al., breast cancer Res Treat 2006, 96, 91-95; Saal et al., Cancer Res 2005, 65, 2554-2559; Samuels and Velculescu, Cell Cycle 2004, 3, 1221-1224), 대장암(Samuels, et al. Science 2004, 304, 554; Velho et al. Eur J Cancer 2005, 41, 1649-1654), 자궁내막암(Oda et al. Cancer Res . 2005, 65, 10669-10673), 위 암종(Byun et al., Int J Cancer 2003, 104, 318-327; Li et al., 상기 참조; Velho et al., 상기 참조; Lee et al., Oncogene 2005, 24, 1477-1480), 간암(Lee et al., id .), 소세포폐암 및 비-소세포폐암(Tang et al., Lung Cancer 2006, 51, 181-191; Massion et al., Am J Respir Crit Care Med 2004, 170, 1088-1094), 갑상선 암(Wu et al., J Clin Endocrinol Metab 2005, 90, 4688-4693), 급성 골수성 백혈병(acute myelogenous leukemia, AML)(Sujobert et al., Blood 1997, 106, 1063-1066), 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia, CML)(Hickey and Cotter J Biol Chem 2006, 281, 2441-2450) 및 교아 세포종(Hartmann et al. Acta Neuropathol ( Berl ) 2005, 109, 639-642; Samuels et al., 상기 참조). 생물학적 과정 및 질병 상태에서 PI3K-α의 중요한 역할에 대해서, 이 액체 키나제의 억제제 및/또는 조절자가 바람직하다.
추가로, 상이한 작용 메커니즘을 갖는 치료를 병용하는 것은 단일 치료가 단독으로 투여될 때와 비교하여 향상된 항-종양 활성을 야기할 수 있다. 예를 들어, PI3K 경로의 활성화는 특정 화학치료제, 예컨대 탁솔과 같은 미세소관 안정제에 대한 인간 종양 세포의 저항성의 원인이 될 수 있다(Brognard, J., et. al. Cancer Res 2001, 61, 3986-3997; Clark, A. S., et. al. Mol Cancer Ther 2002, 1, 707-717; Kraus, A. C., et. al. Oncogene 2002, 21, 8683-8695; Krystal, G. W., et. al. Mol Cancer Ther 2002, 1, 913-922; 및 Yuan, Z. Q., et. al. J Biol Chem 2003, 278, 23432-23440).
따라서, PI3K-α의 억제제를 다른 작용제와 병용하는 치료가 바람직하고 필요로 된다.
다음은 단지 본 발명의 특정 양태를 요약하며, 사실상 제한하는 것으로 의도하는 것은 아니다. 이들 양태 및 다른 양태 및 실시형태는 이하에 더 완전하게 기재된다. 본 명세서에 인용된 모든 참고문헌은 그것의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. 본 명세서의 개시 표현 및 참조로 포함되는 참조문헌 사이의 차이의 경우에, 본 명세서의 개시 표현으로 조절할 것이다.
본 발명의 조성물은 비정상 및 조절되지 않은 세포 활성과 관련된 질병을 치료하기 위하여 사용된다. 본 명세서에 제공된 방법 및 조성물로 치료될 수 있는 질병 상태는 암을 포함한다. 본 발명은 화학식 I 또는 I(a)의 화합물을 한 가지 이상의 치료와 병용하여 투여하는 것에 의해 이들 질병을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 양태는 방법이 화학식 I의 화합물 또는 이들의 단일 이성질체(해당 화합물은 이들의 선택적으로 약제학적으로 허용가능한 염, 추가로 선택적으로 수화물 및 추가로 선택적으로 용매화물임)의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 단계:
[화학식 I]
Figure pct00001
또는 화학식 I의 치료적 유효량 및 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 HER3, HER2, MSPR, Axl, MAP3K(ERK, JNK 및 p38 MAPK), MEKK 키나제들/키나제 수용체, INSR, IGF-IR 및 FGFR2와 병용하여 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료 방법에 관한 것이며, 화학식 I의 화합물은,
W1, W2, W3 및 W4는 -C(R1)=이며; 또는 W1, W2, W3 및 W4 중 1 또는 2개는 독립적으로 -N=이고 나머지는 -C(R1)=이며; 각각의 R1은 독립적으로 수소, 알킬, 할로알킬, 나이트로, 알콕시, 할로알콕시, 할로, 하이드록시, 시아노, 아미노, 알킬아미노 또는 다이알킬아미노이고;
R51은 수소 또는 알킬이며;
R52는 수소 또는 할로이고;
R50, R53 및 R54는 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 할로, 할로알킬, 할로알케닐, 하이드록시, 알콕시, 알케닐옥시, 할로알콕시, 나이트로, 아미노, 알킬아미노, 다이알킬아미노, -N(R55)C(O)-C1-C6-알킬렌-N(R55a)R55b, 알킬카보닐, 알케닐카보닐, 카복시, 알콕시카보닐, 시아노, 알킬티오, -S(O)2NR55R55a 또는 알킬카보닐아미노이며, R55 및 R55b는 독립적으로 수소, 알킬 또는 알케닐이고, R55a는 수소, 알킬, 알케닐, 하이드록시 또는 알콕시이며; 또는 R53 및 R54는 그것들이 부착된 탄소와 함께 5- 또는 6-원 헤테로아릴 또는 5- 또는 6-원 헤테로사이클로알킬을 형성하고;
B는 R3a로 치환되고 선택적으로 1, 2 또는 3개의 R3으로 추가로 치환된 페닐이며; 또는
B는 1, 2 또는 3개의 R3으로 선택적으로 치환된 헤테로아릴이고;
R3a는 시아노, 하이드록시아미노, 카복시, 알콕시카보닐, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 알킬카보닐, 할로알콕시, 알킬설포닐, 아미노알킬옥시, 알킬아미노알킬옥시 또는 다이알킬아미노알킬옥시이며; 또는
a) -N(R7)C(O)-C1-C6-알킬렌-N(R7a)(R7b), 여기서 R7 수소, 알킬 또는 알케닐이며, R7a 및 R7b는 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 하이드록시알킬, 할로알킬, 알콕시, 알콕시알킬, 아미노알킬, 알킬아미노알킬, 다이알킬아미노알킬, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬알킬, 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 아릴, 아릴알킬 또는 아릴알킬옥시이고, R7a 및 R7b(아릴알킬, 사이클로알킬알킬, 헤테로사이클로알킬알킬 및 헤테로아릴알킬의 부분으로서 또는 단독으로)의 아릴, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬 및 헤테로아릴 고리는 독립적으로 알킬, 아미노, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 하이드록시, 할로, 알콕시, 알킬티오 및 옥소로부터 독립적으로 선택되는 1, 2 또는 3개의 기로 선택적으로 치환되고;
b) -C(O)NR8R8a, 여기서 R8은 수소, 하이드록시, 알콕시, 알킬, 알케닐, 할로알킬 또는 할로알콕시이며, R8a는 수소, 알킬, 알케닐, 하이드록시알킬, 시아노알킬, 알콕시알킬, 알킬티오알킬, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬알킬, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬, 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 아릴 또는 아릴알킬이며, R8a의 아릴, 사이클로알킬, 헤테로아릴 및 헤테로사이클로알킬 고리(아릴알킬, 사이클로알킬알킬, 헤테로사이클로알킬알킬 및 헤테로아릴알킬의 부분으로서 또는 단독으로)는 독립적으로 알킬, 알케닐, 알콕시, 할로, 할로알킬, 할로알콕시, 하이드록시, 하이드록시알킬, 옥소, 아미노, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 알킬카보닐, 아미노알킬, 알킬아미노알킬, 다이알킬아미노알킬, 알콕시카보닐 및 -C(O)H로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 기로 선택적으로 치환되며;
c) -NR9C(O)R9a, 여기서 R9는 수소, 하이드록시, 알콕시, 알킬, 알케닐, 할로알킬 또는 할로알콕시이고, R9a는 수소, C2-C6-알킬, 알케닐, 하이드록시알킬, 알콕시알킬, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬알킬, 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 아릴 또는 아릴알킬이며, R9a의 아릴, 사이클로알킬, 헤테로아릴 및 헤테로사이클로알킬 고리(아릴알킬, 사이클로알킬알킬, 헤테로사이클로알킬알킬 및 헤테로아릴알킬의 부분으로서 또는 단독으로)는 독립적으로 알킬, 알케닐, 알콕시, 하이드록시, 하이드록시알킬, 할로, 할로알킬, 할로알콕시, 옥소, 아미노, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 알킬카보닐, 알콕시카보닐, -C(O)H, 아릴(1 또는 2개의 할로로 선택적으로 치환됨), 아릴알킬, 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬알킬, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬 및 사이클로알킬카보닐로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 기로 선택적으로 치환되고;
d) -C(O)N(R10)-C1-C6-알킬렌-N(R10a)R10b, 여기서 R10a는 수소, 하이드록시, 알콕시, 알킬, 알케닐, 할로알킬, 아미노알킬, 알킬아미노알킬, 다이알킬아미노알킬 또는 하이드록시알킬이며, R10 및 R10b는 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 할로알킬, 아미노알킬, 알킬아미노알킬, 다이알킬아미노알킬 또는 하이드록시알킬이고;
e) -NR11C(O)NR11aR11b, 여기서 R11a는 수소, 알킬, 알케닐, 하이드록시 또는 알콕시이며, R11 및 R11b는 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 아미노알킬, 알킬아미노알킬 또는 다이알킬아미노알킬이고;
f) -C(O)R12, 여기서 R12는 알킬, 옥소, 아미노, 알킬아미노 및 헤테로사이클로알킬알킬로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 기로 선택적으로 치환된 헤테로사이클로알킬이며;
g) -NR13C(O)OR13a, 여기서 R13은 수소, 알킬 또는 알케닐이며, R13a는 아미노알킬, 알킬아미노알킬, 다이알킬아미노알킬, 아릴 또는 아릴알킬이고;
h) -C(O)N(R14)N(R14a)(R14b), 여기서 R14, R14a 및 R14b는 독립적으로 수소, 알킬 또는 알케닐이며;
i) -S(O)2N(R15)-C1-C6-알킬렌-N(R15a)R15b, 여기서 R15, R15a 및 R15b는 독립적으로 수소, 알킬 또는 알케닐이고;
j) -C(O)N(R16)-C1-C6-알킬렌-C(O)OR16a, 여기서 R16은 수소, 알킬 또는 알케닐이며, R16a는 알킬 또는 알케닐이고;
k) 1 또는 2개의 아미노알킬, 알킬아미노알킬 또는 다이알킬아미노알킬로 선택적으로 치환된 헤테로아릴;
l) -N(R17)-C(=N(R17b)(R17a))(NR17cR17d), 여기서 R17, R17a, R17b, R17c 및 R17d는 독립적으로 수소, 알킬 또는 알케닐이며;
m) -N(R18)C(O)-C1-C6-알킬렌-N(R18b)C(O)R18a, 여기서 R18a는 수소, 알킬, 알케닐 또는 알콕시이고, R18 및 R18b는 독립적으로 수소, 알킬 또는 알케닐이고;
n) -C(O)N(R19)-C1-C6-알킬렌-C(O)R19a, 여기서 R19는 수소, 알킬 또는 알케닐이며, R19a는 아미노, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 또는 헤테로사이클로알킬이고;
o) -N(R20)C(O)-C1-C6-알킬렌-C(O)R20a, 여기서 R20은 수소, 알킬 또는 알케닐이며, R20a는 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬이며;
p) -NR21S(O)2-C1-C6-알킬렌-N(R21b)R21a, 여기서 R21은 수소, 알킬 또는 알케닐이고, R21a 및 R21b는 독립적으로 수소, 알킬 또는 알케닐이며;
q) -N(R22)C(O)-C1-C6-알킬렌-N(R22b)-N(R22c)(R22a), 여기서 R22, R22a 및 R22b는 독립적으로 수소, 알킬 또는 알케닐이고;
r) -C0 -C6-알킬렌-N(R23)-C1-C6-알킬렌-N(R23b)R23a, 여기서 R23, R23a 및 R23b는 독립적으로 수소, 알킬 또는 알케닐이며; 또는
s) -NR24C(O)-C1 -C6-알킬렌-OR24a, 여기서 R24는 수소, 알킬 또는 알케닐이고, R24a는 1 또는 2개의 할로 또는 알킬로 선택적으로 치환된 알콕시알킬 또는 아릴이며;
R3a의 각각의 알킬렌은 독립적으로 할로, 하이드록시, 아미노, 알킬아미노 및 다이알킬아미노로부터 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5개의 기로 선택적으로 추가로 치환되고;
각각의 R3(R3이 존재할 때)은 독립적으로 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로, 하이드록시, 옥소, 알콕시, 시아노, 하이드록시아미노, 카복시, 알콕시카보닐, 아미노, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 알킬카보닐, 할로알콕시, 알킬설포닐, 아미노알킬옥시, 알킬아미노알킬옥시 또는 다이알킬아미노알킬옥시이며; 또는
a) -N(R7)C(O)-C1-C6-알킬렌-N(R7a)(R7b), 여기서 R7은 수소, 알킬 또는 알케닐이고, R7a 및 R7b는 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 하이드록시알킬, 할로알킬, 알콕시, 알콕시알킬, 아미노알킬, 알킬아미노알킬, 다이알킬아미노알킬, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬알킬, 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 아릴, 아릴알킬 또는 아릴알킬옥시이며, R7a 및 R7b 내 아릴, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬 및 헤테로아릴 고리(아릴알킬, 사이클로알킬알킬, 헤테로사이클로알킬알킬 및 헤테로아릴알킬의 부분으로서 또는 단독으로)는 독립적으로 알킬, 아미노, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 하이드록시, 할로, 알콕시, 알킬티오 및 옥소로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 기로 선택적으로 치환되고;
b) -C(O)NR8R8a, 여기서 R8은 수소, 하이드록시, 알콕시, 알킬, 알케닐, 할로알킬 또는 할로알콕시이며, R8a는 수소, 알킬, 알케닐, 하이드록시알킬, 시아노알킬, 알콕시알킬, 알킬티오알킬, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬알킬, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬, 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 아릴 또는 아릴알킬이며, R8a 내 아릴, 사이클로알킬, 헤테로아릴 및 헤테로사이클로알킬 고리(아릴알킬, 사이클로알킬알킬, 헤테로사이클로알킬알킬 및 헤테로아릴알킬의 부분으로서 또는 단독으로)는 독립적으로 알킬, 알케닐, 알콕시, 할로, 할로알킬, 할로알콕시, 하이드록시, 하이드록시알킬, 옥소, 아미노, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 알킬카보닐, 아미노알킬, 알킬아미노알킬, 다이알킬아미노알킬, 알콕시카보닐 및 -C(O)H로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 기로 선택적으로 치환되며;
c) -NR9C(O)R9a, 여기서 R9는 수소, 하이드록시, 알콕시, 알킬, 알케닐, 할로알킬 또는 할로알콕시이고, R9a는 수소, C2-C6-알킬, 알케닐, 하이드록시알킬, 알콕시알킬, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬알킬, 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 아릴 또는 아릴알킬이며, R9a 내 아릴, 사이클로알킬, 헤테로아릴 및 헤테로사이클로알킬 고리(아릴알킬, 사이클로알킬알킬, 헤테로사이클로알킬알킬 및 헤테로아릴알킬의 부분으로서 또는 단독으로)는 독립적으로 알킬, 알케닐, 알콕시, 하이드록시, 하이드록시알킬, 할로, 할로알킬, 할로알콕시, 옥소, 아미노, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 알킬카보닐, 알콕시카보닐, -C(O)H, 아릴(선택적으로 1 또는 2개의 할로로 치환됨), 아릴알킬, 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬알킬, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬 및 사이클로알킬카보닐로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 기로 선택적으로 치환되고;
d) -C(O)N(R10)-C1-C6-알킬렌-N(R10a)R10b, 여기서 R10a는 수소, 하이드록시, 알콕시, 알킬, 알케닐, 할로알킬 또는 하이드록시알킬이며, R10 및 R10b는 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 할로알킬 또는 하이드록시알킬이고;
e) -NR11C(O)NR11aR11b, 여기서 R11a는 수소, 알킬, 알케닐, 하이드록시 또는 알콕시이며, R11 및 R11b는 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 아미노알킬, 알킬아미노알킬 또는 다이알킬아미노알킬이고;
f) -C(O)R12, R12는 알킬, 옥소, 아미노, 알킬아미노 및 헤테로사이클로알킬알킬로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 기로 선택적으로 치환된 헤테로사이클로알킬이고;
g) -NR13C(O)OR13a, 여기서 R13은 수소, 알킬 또는 알케닐이고, R13a는 아미노알킬, 알킬아미노알킬, 다이알킬아미노알킬, 아릴 또는 아릴알킬이며;
h) -C(O)N(R14)N(R14a)(R14b), 여기서 R14, R14a 및 R14b는 독립적으로 수소, 알킬 또는 알케닐이고;
i) -S(O)2N(R15)-C1-C6-알킬렌-N(R15a)R15b, 여기서 R15, R15a 및 R15b는 독립적으로 수소, 알킬 또는 알케닐이며;
j) -C(O)N(R16)-C1-C6-알킬렌-C(O)OR16a, 여기서 R16은 수소, 알킬 또는 알케닐이고, R16a는 알킬 또는 알케닐이며;
k) 1 또는 2개의 아미노알킬, 알킬아미노알킬 또는 다이알킬아미노알킬로 선택적으로 치환된 헤테로아릴;
l) -N(R17)-C(=N(R17b)(R17a))(NR17cR17d), 여기서 R17, R17a, R17b, R17c 및 R17d는 독립적으로 수소, 알킬 또는 알케닐이고;
m) -N(R18)C(O)-C1-C6-알킬렌-N(R18b)C(O)R18a, 여기서 R18a는 수소, 알킬, 알케닐 또는 알콕시이며, R18 및 R18b는 독립적으로 수소, 알킬 또는 알케닐이며;
n) -C(O)N(R19)-C1-C6-알킬렌-C(O)R19a, 여기서 R19는 수소, 알킬 또는 알케닐이고, R19a는 아미노, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 또는 헤테로사이클로알킬이고;
o) -N(R20)C(O)-C1-C6-알킬렌-C(O)R20a, 여기서 R20은 수소, 알킬 또는 알케닐이며, R20a는 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬이고;
p) -NR21S(O)2-C1-C6-알킬렌-N(R21b)R21a, 여기서 R21은 수소, 알킬 또는 알케닐이며, R21a 및 R21b는 독립적으로 수소, 알킬 또는 알케닐이고;
q) -N(R22)C(O)-C1-C6-알킬렌-N(R22b)-N(R22c)(R22a), 여기서 R22, R22a 및 R22b는 독립적으로 수소, 알킬 또는 알케닐이며;
r) -C0 -C6-알킬렌-N(R23)-C1-C6-알킬렌-N(R23b)R23a, 여기서 R23, R23a 및 R23b는 독립적으로 수소, 알킬 또는 알케닐이고; 또는
s) -NR24C(O)-C1 -C6-알킬렌-OR24a, 여기서 R24는 수소, 알킬 또는 알케닐이며, R24a는 1 또는 2개의 할로 또는 알킬로 선택적으로 치환된 알콕시알킬 또는 아릴이고;
R3의 각각의 알킬렌은 독립적으로 할로, 하이드록시, 아미노, 알킬아미노 및 다이알킬아미노로부터 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5개의 기로 선택적으로 추가로 치환되며;
단, R50 및 R52가 수소이고, R51이 수소 또는 메틸이며, R53은 수소 또는 메톡시이고, R54는 수소 또는 메톡시이면, B는 하나의 R3으로 치환된 2,3-다이하이드로-1,4-벤조다이옥신일, 티엔-2-일 또는 티엔-2-일이 아니며, R3은 할로이다.
한 양태에서, HER3, MSPR, Axl, MAP3K(ERK, JNK 및 p38 MAPK), 또는 MEKK 키나제들/키나제 수용체의 억제제는 기능성 핵산일 수 있는 한편, 다른 양태에서, 이는 항체 또는 단백질은 디스플레이 스캐폴드일 수 있다.
다른 양태에서, HER3, HER2, MSPR, Axl, MAP3K(ERK, JNK 및 p38 MAPK), MEKK 키나제들/키나제 수용체, INSR, IGF-IR, 또는 FGFR2의 억제제는 기능성 핵산인 라파티닙일 수 있는 한편, 다른 양태에서, 이는 항체 또는 단백질은 디스플레이 스캐폴드일 수 있다.
한 양태에서, 방법은 치료적 유효량의 화합물 A 및 치료적 유효량의 MM-121을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 HER2 비-과발현 암이 있는 환자를 치료하는 단계를 제공한다. 한 실시형태에서, 암은 비-HER2 증폭 종양을 포함한다. 일부 실시형태에서, 병용은 HER2 비-과발현 암의 치료에서 치료적 상승 작용(therapeutic synergy)을 나타낸다. 다른 실시형태에서, 병용은 적어도 2.8, 적어도 2.9 또는 적어도 3.0의 log10 세포 사멸을 달성한다.
다른 양태에서, 암은 HER2 비-과발현 암을 포함한다.
다른 양태에서, 암은 비-HER2 증폭 종양을 포함한다.
다른 양태에서, 화합물 A의 치료적 유효량은 치료적 유효량의 MM-121과 공동-투여된다.
다른 양태에서, 화합물 A과 MM121의 병용은 암 치료에서 치료적 상승 작용을 나타낸다.
다른 양태에서, 화합물 A와 MM121의 병용은 적어도 2.8, 적어도 2.9 또는 적어도 3.0의 log10 세포 사멸의 달성을 나타낸다.
다른 양태에서, 암은 폐암이다.
본 특허 또는 출원 파일은 컬러로 실행된 적어도 하나의 도면을 포함한다. 컬러 도면(들)을 지니는 이 특허 또는 특허 출원 공보의 사본은 요청 및 필요한 수수료의 지불 시 관할관청에 의해 제공될 것이다.
도 1a. PI3K 억제를 잠재적으로 보상하는 키나제를 확인하기 위한 siRNA 스크린. HCC1937 유방암 세포를 2.5% FBS를 함유하는 배지 내에서 6, 24 또는 72 시간 동안 화합물 A의 표시량으로 처리하였다. 세포 용해물을 표시한 항체로 면역블롯팅하여 분석하였다.
도 1b. PI3K 억제를 잠재적으로 보상하는 키나제를 확인하기 위한 siRNA 스크린. HCC1937 세포를 96-웰 플레이트 내에서 3회 씨딩(seeding)하였고, DMSO 또는 표시한 농도의 화합물 A로 72시간 동안 처리하였다. 알라마르 블루 분석(Alamar blue assay)으로 세포 생존력을 측정하였다.
도 2. RNAi 스크린의 계획. SMART풀 siRNA 표적화 779 키나제를 함유하는 Dharmacon RTF Protein 키나제 siRNA 라이브러리를 사용하였다. HCC1937 세포를 5 pmol siRNA/웰로 96-웰 플레이트 내 역-트랜스펙션시켰다. 플레이트는 분할 1:6이었고, 72시간 동안 DMSO 또는 10μM 화합물 A로 처리하였다. 알라마르 블루 분석을 사용하여 세포 생존력을 측정하였다. 스크린을 2회 수행하였다.
도 3a 및 도 3b. PI3K 억제는 RTK 및 세포내 키나제의 인산화를 유발한다. HCC1937 세포를 0적용 가능8, 24, 또는 48시간 동안 2.5% FBS를 함유하는 배지 내 10μM 화합물 A로 처리하였다. 배지 및 약물을 24시간마다 보충하였다. 프로브 포스포-RTK 분석(도 3a) 또는 포스포-키나제 분석(도 3b)(R&D 시스템)을 사용하여 용해물을 사용하였다. 모서리의 스팟은 양성 대조군이다. 화합물 A로 처리 시 또한 인산화된 siRNA 스크린으로부터 후보 키나제는 적색으로 나타난다.
도 4a 및 도 4b. HCC1937 세포를 0, 8, 24 또는 48시간 동안 2.5% FBS를 함유하는 배지 내에서 10 μM 화합물 A로 처리하였다. 배지 밀 약물을 24시간 마다 보충하였다. 포스포-RTK 분석(A) 또는 포스포-키나제 분석(B)(R&D systems)을 조사하기 위하여 용해물을 사용하였다. 모서리의 스팟은 양성 대조군이다. 화합물 A로 처리 시 인산화된 siRNA 스크린으로부터 후보 키나제는 적색으로 나타난다.
도 5. HCC1937 세포를 2.5% FBS를 함유하는 배지 내에서 10μM 화합물 A로 0, 2, 8 또는 24시간 동안 처리하였다. RNA를 Trizol로 분리시켰고, RNeasy 컬럼(Qiagen)을 사용하여 정제하였다. 3개의 독립 실험군으로부터 유전자 발현을 Gene titan 3'마이크로어레이를 사용하여 측정하였다. 0시간에 대해 *, p<0.05; **, p<0.01.
도 6a. HER3 siRNA는 PI3K 억제제의 항-증식 효과를 향상시킨다. BT474 세포를 대조군 또는 HER3 siRNA 올리고뉴클레오타이드로 트랜스펙션시킨 후, 2.5% FBS를 함유하는 배지 내 6μM 화합물 A로 처리하였다. 증식 분석(a)을 위해 세포를 채취하였다.
도 6b. HER3 siRNA는 PI3K 억제제의 항-증식 효과를 향상시킨다. 트랜스펙션 6일 후에 크리스탈 바이올렛 염색을 하였다.
도 7. BT-474 세포를 6μM 화합물 A로 처리하였다. 신선한 배지 및 억제제를 24시간 마다 보충하였다. 표시한 시간에, 세포를 프로테아제 및 포스파타제 억제제를 함유하는 NP-40 용해 완충제 중에서 채취하였다. 용해물을 제조하였고, SDS-PAGE로 분리하였으며, 표시된 항체로 면역블롯 분석을 실시하였다.
도 8a 및 도 8b. MDA-453(a) 및 SKBR-3(b) 세포를 도 7에 기재한 것과 같은 리포펙타민 RNAiMAX의 존재 내에서 10 nM HER3 또는 대조군 siRNA 듀플렉스로 트랜스펙션시켰다. 왼쪽 패널: 트랜스펙션 후, 5% 혈청±2 uM 화합물 A를 함유하는 배지 내에서 세포를 유지하였고, 24시간 후 채취하였다. 세포 용해물을 제조하였고, 표시한 항체로 면역블롯 분석을 실시하였다. 액틴을 대조군으로 사용하였다. 오른쪽 패널: 트랜스펙션 후, 2.5x104 세포/웰을 12-웰 플레이트 상에 씨딩하였고, 5% FCS±2μM 화합물 A를 함유하는 배지 내에서 유지하였다. 트랜스펙션 6일 후에, 세포를 트립신화하였고, 그것의 수를 쿨터 계수기(Coulter counter)로 정량화하였다. 각 막대는 3개 웰의 평균 세포 수±SE를 나타낸다(*, MDA-453에 대해 p<0.001, SKBR-3에 대해 p<0.01).
도 9a는 화합물 A의 존재에서 SKBR3, BT474, HCC1937, MDAMMB453, HCC1954, UACC893 및 SUM190 세포의 성장을 나타내는 막대 차트를 도시.
도 9b는 0-20μM 화합물 A의 부재 및 존재에서 Matrigel 내에서 배양된 BT474, HCC1937, MDA453 및 HCC1954 세포의 현미경사진을 도시.
도 10a는 상기 도 9a에서 표시된 농도의 화합물 A로 처리된 각 유방암 세포주에 대해 계산한 대로 제공되는 플레이팅 세포의 초기량에 대한 세포 수%의 막대 그래프를 도시. 100% 미만의 수(검정색 직선)는 아포토시스를 표시한다.
도 10b는 면역블롯을 도시하되, 세포는 0-20μM 화합물 A로 24시간 동안 처리되었다. 세포 용해물을 제조하였고, 패널의 왼족에 표시된 항체로 면역블롯팅을 실시하였다. 위쪽의 화살표는 전체 PARP를 표시하며, 아래쪽의 화살표는 절단된 PARP를 표시한다.
도 11은 0-20μM 화합물 A로 무혈청 배지 중에서 밤새 처리한 다양한 세포주의 면역블롯을 도시. 세포를 채취하였고, 용해물을 표시한 항체로 면역블롯팅 분석을 위해 사용하였다.
도 12a는 RNA 분리 및 HER3-특이적 프라이머로 실시간 qPCR 분석 전 표시한 시간 동안 6μM 화합물 A로 처리한 BT474 세포 내에서 타이밍된 HER3 mRNA 전사의 막대 그래프를 도시.
도 12b는 RNA 분리 및 HER3-특이적 프라이머로 실시간 qPCR 분석 전 10시간 동안 2μM 5J8, 20μM LY294002 및 50 nM 라파마이신으로 처리한 BT474 세포 내 타이밍한 HER3 mRNA 전사의 막대 차트를 도시.
도 12c는 RNA 분리 및 HER3-특이적 프라이머로 실시간 qPCR 분석 전 48 시간까지 표시한 시간 과정을 거쳐서 6μM 화합물 A로 처리한 MDA453 및 SKBR3 세포 내 HER3 mRNA 전사의 막대 차트를 도시.
도 12d는 DMSO (대조군), 6μM 화합물 A, 또는 2μM 5J8로 4시간 동안 처리한 BT474 및 MDA453 세포로부터 세포 용해물 면역블롯의 현미경 사진을 도시. 핵(Nu) 및 세포질(Cy) 추출물을 분리하였고, FoxO1 및 FoxO3a 항체로 면역블롯팅을 실시하였다. 로딩은 Nu에 대해: HDAC3; Cy에 대해: RhoA (BT474) 및 MEK1/2(MDA453)를 제어한다. 화살표는 FoxO3a-특이적 밴드를 표시한다.
도 12e는 대조군 또는 FoxO1 및 FoxO3a-특이적 siRNA 듀플렉스 중 하나로 트랜스펙션된 BT474, MDA453 및 SKBR3 세포를 표시하는 막대 차트를 도시. 트랜스펙션 2일 후, 채취, RNA 제조, 및 HER3을 위한 qPCR 분석 전 6시간 동안 세포를 화합물 A로 처리하였다.
도 12f는 대조군 또는 FoxO1 및 FoxO3a-특이적 siRNA 듀플렉스 중 하나로 트랜스펙션한 BT474, MDA453 및 SKBR3 세포를 표시하는 막대 차트를 도시. 트랜스펙션 2일 후, 채취, RNA 제조, 및 FoxO1 및 FoxO3a을 위한 qPCR 분석 전 6시간 동안 세포를 화합물 A로 처리하였다.
도 13a는 72 시간까지의 시간에 걸쳐 6μM 화합물 A로 처리하고, Y-축 상에 열거한 다양한 항체를 사용하여 면역블롯팅을 실시한 BT474 세포로부터의 세포 용해물 면역블롯의 현미경사진을 도시. 화합물 A 및 배지를 24시간 마다 보충하였다.
도 13b는 0 내지 48시간 동안 6μM 또는 20μM 화합물로 처리한 BT474 세포로부터의 세포 용해물 면역블롯의 현미경사진을 도시. 세포 용해물에 표시한 항체로 면역블롯팅을 실시하였다.
도 13c는 0-20μM 화합물 A로 24 시간 동안 처리한 BT474 세포 용해물 면역블롯의 현미경사진을 도시. 그 다음에 세포를 용해시켰고, 0.5㎎의 용해물에 p85 항체 다음에 p85 및 pTyr로 면역침강(immunoprecipitation, IP)을 실시하였다.
도 13d는 0-20μM 화합물 A로 24시간 동안 처리한 BT474 세포로부터 세포 면역블롯의 현미경 사진을 도시. 그 다음에 세포를 용해하였고, 0.5㎎의 용해물에 p85 항체 다음에 p85 및 HER3로 면역침강(IP)을 실시하였다.
도 13e는 대조군 또는 HER3-특이적 siRNA 듀플렉스로 트랜스펙션한 후 24시간 동안 6μM 화합물로 처리한 BT474 세포로부터 세포 용해물 면역블롯의 현미경 사진을 도시. 세포 용해물을 제조하였고, 0.5㎎에 p85 항체로 IP를 실시하였다. 면역 복합체를 SDS-PAGE로 분리하였고, p85 및 HER3 항체로 면역블롯팅하였다.
도 13f는 대조군 또는 HER3-특이적 siRNA 듀플렉스로 트랜스펙션한 후, 6μM 화합물 A로 24시간 동안 처리한 BT474 세포로부터 세포 용해물의 면역블롯의 현미경 사진을 도시. 세포 용해물을 제조하였고, 0.5㎎에 p85 항체로 IP를 실시하였다. 면역 복합체를 SDS-PAGE로 분리하였고, p85 및 pHER3Y1197 항체로 면역블롯팅하였다.
도 13g는 HER3-특이적 siRNA로 트랜스펙션하고 트랜스펙션 1일 후에 DMSO 또는 2μM 화합물 A로 처리한 BT474 세포를 나타내는 막대-그래프를 도시. 성장 배지 및 억제제를 3일 마다 보충하였다. 제6일에 세포를 계측하기 위하여 채취하였다.
도 13h는 HER3-특이적 siRNA로 트랜스펙션하고, 트랜스펙션 1일 후에 DMSO 또는 2μM 화합물 A로 처리한 BT474 세포를 나타내는 현미경 사진을 도시. 성장 배지 및 억제제를 3일 마다 보충하였다. 세포를 제6일에 크리스탈 바이올렛 염색을 하였고, 촬영하였다.
도 14a는 HER3 siRNA 또는 대조군 듀플렉스로 트랜스펙션 후 6μM 화합물 A로 3일 동안 처리한 PI 염색된 BT474 세포의 수를 나타내는 막대-그래프를 도시. 이때, 세포를 세척하였고, 채취하였으며, 세포 주기 분석을 위하여 준비하였다.
도 14b는 대조군 또는 HER3-특이적 siRNA 듀플렉스로 트랜스펙션한 후 6μM 화합물로 처리하고, 그 다음에 HER3 및 PARP항체로 면역블롯팅한 BT474 세포로부터의 세포 용해물 면역블롯의 현미경 사진을 도시.
도 15A는 대조군 또는 HER3-특이적 siRNA 듀플렉스로 트랜스펙션한 후 6μM 화합물 A로 24시간 처리한 MDA453 세포로부터 세포 용해물 면역블롯의 현미경 사진을 도시. 세포 용해물을 제조하였고, Y-축 상에 표시된 항체로 면역블롯팅을 실시하였다.
도 15B는 세포를 성장시키는 한편 신선한 배지 및 화합물 A(2μM)를 3일마다 보충하고 제10일에 계측하는 것을 제외하고 도 7A에서 표시한 바와 같은 MDA453 세포의 성장 또는 감소를 나타내는 막대 그래프를 도시.
도 15C는 대조군 또는 HER3-특이적 siRNA 듀플렉스로 트랜스펙션한 후, 6μM 화합물 A로 24시간 동안 처리한 SKBR3 세포로부터 세포 용해물 면역블롯의 현미경 사진을 도시. 세포 용해물을 제조하였고, Y-축 상에서 표시된 항체로 면역블롯팅을 실시하였다.
도 15D는 세포를 성장시키는 한편, 신선한 배지 및 화합물 A(2μM)를 3일마다 보충하고 제10일에 계측하는 것을 제외하고 도 7C에서 표시한 것과 같은 SKBR3 세포의 성장 또는 감소를 나타내는 막대 그래프를 도시.
도 16a는 2μM 화합물 A 단독으로 또는 0.1μM 라파티닙(Lap)과의 병용물의 존재 또는 부재에서 처리된 BT474 세포의 세포 성장 또는 억제를 나타내는 막대-그래프를 도시.
도 16b는 2μM 화합물 A 단독으로 또는 10㎍/㎖ 트라스투주맙(Tras)과의 병용물의 존재 또는 부재에서 처리된 BT474 세포의 세포 성장 또는 억제를 나타내는 막대-그래프를 도시.
도 16c는 72시간 동안 표시된 억제제로 처리한 BT474 세포로부터의 용해물과 함께 아포토시스 및 G1-S 상 전이의 바이오마커를 위한 면역블롯의 현미경 사진을 도시.
도 16d는 화합물 A(6μM), 라파티닙(1μM), 트라스투주맙(10㎍/㎖), 또는 표시된 병용물로 10시간 동안 처리한 세포 내 HER3 mRNA의 실시간 qPCR 분석을 나타내는 막대-그래프를 도시.
도 16e는 화합물 A(6μM), 라파티닙(1μM), 트라스투주맙(10㎍/㎖), 또는 표시된 병용물을 시간 과정(0 내지 24시간)에 걸쳐 처리한 후 세포 용해물 내 HER3 및 인산화된 HER3의 존재를 측정한 BT474 세포로부터 세포의 면역블롯의 현미경사진을 도시.
도 17A는 0.1μM 라파티닙, 또는 2μM 화합물 A를 단독으로 또는 표시된 병용물로 총 6일 동안 처리한 HER2-의존적 MDAMB453 세포의 세포 성장 또는 억제를 나타내는 막대-그래프를 도시.
도 17B는 10㎍/㎖ 트라스투주맙, 또는 2μM 화합물 A를 단독으로 또는 표시된 병용물로 총 6일 동안 처리한 HER2-의존적 MDAMB453 세포의 세포 성장 또는 억제를 나타내는 막대-그래프를 도시.
도 17C은 0.1μM 라파티닙, 또는 2μM 화합물 A를 단독으로 또는 표시된 병용물로 총 6일 동안 처리한 HER2-의존적 SKBR3 세포의 세포 성장 또는 억제를 나타내는 막대-그래프를 도시.
도 17D는 10㎍/㎖ 트라스투주맙, 또는 2μM 화합물 A를 단독으로 또는 표시된 병용물로 총 6일 동안 처리한 HER2-의존적 SKBR3 세포의 세포 성장 또는 억제를 나타내는 막대-그래프의 도시.
도 18a는 방법에서 기재하는 것과 같이 에스트로겐-보충된 암컷 무흉선증 마우스 내에 피하 주사된 BT474 세포의 억제를 나타내는 그래프를 도시. 일단 종양이 용적 ≥200mm3에 도달하면, 마우르를 비히클(대조군), 화합물 A, 라파티닙, 트라스투주맙, 또는 표시된 병용물로 28일 동안 무작위화하였다. 종양 용적을 1주일에 2회 기록하였다. 각 데이터 점은 처리 유형마다 8마리 마우스의 ㎣±SE로 평균 종양 용적을 나타낸다. CR = 치료에 대한 완전한 반응.
도 18b는 포르말린-고정, 파라핀-포매된 종양 블록으로부터 면역조직화학번 부분의 현미경사진을 도시. 제28일에 라파티닙 및/또는 화합물 A의 마지막 용량 후 1시간에 이종이식편을 채취하였다. 사용한 항체는 HER3, pHER3Y1289 및 pAKTS473에 대한 것이다. 400x 배율(스케일 바: 50㎛)로 현미경 사진을 촬영하였다.
도 18c는 도 18b에서 제공되는 면역염색된 부분의 Histoscore(H-스코어) 분석을 나타내는 막대 그래프를 도시.
도 19a는 HER3 siRNA 듀플렉스로 트랜스펙션하고 화합물 A로 24시간 동안 처리한 BT474 세포를 나타내는 면역블롯의 현미경사진을 도시. 세포 용해물을 제조하였고, 0.5㎎을 p85 항체로 면역침강시켰다. 면역 복합체는 다음에 패널의 오른쪽에 표시된 항체로 면역블롯팅을 실시하였다. 6시간 동안 1μM 라파티닙과 함께 및 라파티닙 없이 처리한 BT474 세포로부터의 세포 용해물을 대조군으로 사용하였다(레인 1 & 2).
도 19b는 표시한 24시간까지의 시간 과정에 걸쳐서 6μM 화합물 A로 처리한 BT474 세포의 현미경사진을 도시. 세포 용해물을 제조하였고, 200㎍의 총 단백질을 42개의 상이한 티로신 키나제의 수용체(receptors of tyrosine kinase, RTK)를 위한 프로브를 함유하는 어레이로 혼성화하였다. 화살표는 PI3K 억제제로 처리시 인산화가 상향조절된 RTK를 표시한다.
도 19c는 표시된 바와 같이 24시간까지의 시간 과정을 걸쳐서 BT474 세포의 현미경 사진이 6μM 화합물 A로 처리된 것을 도시한다. 세포 용해물을 제조하였고, 500㎍의 총 단백질을 42개의 상이한 티로신 키나제 수용체(RTK)에 대한 프로브를 함유하는 어레이로 혼성화하였다. 화살표는 PI3K 억제제로 처리 시 인산화가 상향조절된 RTK를 표시한다.
도 19d는 DMSO 또는 10μM 화합물 A로 6시간 동안 처리한 BT474 세포로부터 수집한 RNA 내 표시된 RTK의 실시간 qPCR 분석을 사용하여 확인한 바와 같이 RTK mRNA의 양을 나타내는 막대-그래프를 도시.
도 19e는 FoxO1 및 FoxO3a siRNA 듀플렉스로 트랜스펙션한 BT474 세포로부터 추출한 다음 10 μM 화합물 A로 6시간 동안 처리한 RNA 내 실시간 qPCR을 사용하여 확인한 IGF-IR, InsR 및 FGFR2 mRNA 양을 표시하는 막대-그래프를 도시.
도 20a는 IGF-IR siRNA 또는 대조군 듀플렉스로 트랜스펙션한 BT474, MDA453 및 MCF7 세포 내 IGF1R mRNA 수준을 표시하는 막대-그래프를 도시. 8시간 후, RNA를 분리하였고, IGF-IRmRNA 수준에 대한 qPCR 분석을 실시하였다.
도 20b는 InsR siRNA 또는 대조군 듀플렉스로 트랜스펙션된 BT474, MDA453 및 MCF7 세포 내 InsR mRNA 수준을 표시하는 막대-그래프를 도시. 48시간 후, RNA를 분리하였고, InsR mRNA 수준에 대한 qPCR 분석을 실시하였다.
도 20c는 IGF-IR siRNA 또는 InsR siRNA 또는 대조군 듀플렉스로 트랜스펙션한 BT474 세포의 억제를 표시하는 막대-그래프를 도시. 48시간 후, 그것들을 10μM 화합물 A로 총 4일 동안 처리하였다. 이때, 세포를 계측하였다.
도 20d는 IGF-IR siRNA, InsR siRNA, 또는 대조군 듀플렉스로 트랜스펙션된 MDAMB453 세포의 억제를 표시하는 막대-그래프를 도시. 48시간 후, 그것들을 10μM 화합물 A로 총 4일 동안 처리하였다. 이때, 세포를 계측하였다.
도 20e는 IGF-IR siRNA, InsR siRNA, 또는 대조군 듀플렉스로 트랜스펙션된 MCF7 세포의 억제를 표시하는 막대-그래프를 도시. 48시간 후, 그것들을 10μM 화합물 A로 총 4일 동안 처리하였다. 이때, 세포를 계측하였다.
약어 및 정의
다음의 약어 및 용어는 하기의 표시된 의미를 가진다 :
Figure pct00002
정의
기호 "-"는 단일 결합을 의미하며, "="는 이중 결합을 의미하고, "≡"은 삼중 결합을 의미하며 "
Figure pct00003
"는 단일 결합 및 선택적으로 이중 결합을 의미한다. 화학적 구조가 도시되거나 기재될 때, 달리 명확하게 언급되지 않는다면, 모든 탄소는 4의 원자가를 따르는 수소 치환을 가지는 것으로 추정된다.
본 발명의 화합물에 대해서 "투여" 및 이들의 변형(예를 들어, 화합물을 "투여하는")은 치료가 필요한 동물의 시스템 내로 화합물 또는 화합물의 프로드러그를 도입하는 것을 의미한다. 본 발명의 화합물 또는 이것의 프로드러그가 하나 이상의 다른 활성제와의 병용물로 제공될 때(수술, 방사선, 화학치료 등), 투여 및 그것의 변형은 각각 화합물 또는 이것의 프로드러그 및 다른 작용제의 동시 및 순차적 도입을 포함하는 것으로 이해된다.
"알케닐" 또는 "저급 알케닐"은 2 내지 6개의 탄소 원자 및 적어도 하나의 이중 결합을 가지는 직선 또는 분지형 탄화수소 라디칼을 의미한다. 대표적인 예는 에테닐, 프로페닐, 1-뷰트-3-엔일, 1-펜트-3-엔일, 1-헥스-5-엔일 등을 포함한다.
"알케닐카보닐"은 C(O)R 기를 의미하며, 여기서 R은 상기 정의한 바와 같은 알케닐이다.
"알케닐옥시" 또는 "저급 알케닐옥시"는 -OR 기를 의미하며, 여기서 R은 상기 정의한 바와 같은 알케닐이다. 대표적인 예는 메톡시, 에톡시, 1-메톡시프로프-1-엔-3-일, 프로폭시, 아이소프로폭시, 사이클로프로필옥시, 사이클로헥실옥시 등을 포함한다.
"알콕시" 또는 "저급 알콕시"는 -OR 기를 의미하며, 여기서 R은 본 명세서에서 정의하는 바와 같은 알킬이다. 대표적인 예는 메톡시, 에톡시, 1-메톡시프로프-1-엔-3-일, 프로폭시, 아이소프로폭시, 사이클로프로필옥시, 사이클로헥실옥시 등을 포함한다.
"알콕시알킬"은 본 명세서에서 정의되는 1, 2 또는 3개의 알콕시 기로 치환되는 알킬 기를 의미한다.
"알콕시카보닐"은 -C(O)OR 기를 의미하며, R은 본 명세서에 정의한 바와 같은 알킬이다.
"알콕시카보닐알킬"은 본 명세서에서 정의하는 바와 같은 1, 2 또는 3개의 알콕시카보닐 기로 치환된 본 명세서에서 정의한 바와 같은 알킬 기를 의미한다.
"알킬" 또는 "저급 알킬"은 1 내지 6개의 탄소 원자를 가지는 선형 또는 분지형 탄화수소 기를 의미한다. 저급 알킬 기의 예는 메틸, 에틸, 프로필, 아이소프로필, 뷰틸, s-뷰틸, t-뷰틸, 아이소뷰틸, 펜틸, 헥실 등을 포함한다. "C0" 알킬("C0-C6-알킬"에서와 같음)은 공유 결합이다. "C6 알킬"은, 예를 들어 n-헥실, 아이소-헥실 등을 지칭한다.
"알킬아미노"는 -NHR 라디칼을 의미하며, R은 본 명세서에서 정의하는 알킬, 또는 이것의 N-옥사이드 유도체, 예를 들어 메틸아미노, 에틸아미노, n-, 아이소-프로필아미노, n-, 아이소-, tert-뷰틸아미노, 메틸아미노-N-옥사이드 등이다.
"알킬아미노알킬"은 본 명세서에서 정의하는 1 또는 2개의 알킬아미노 기로 치환된 알킬 기를 의미한다.
"알킬아미노알킬옥시"는 -OR기를 의미하며, R은 본 명세서에서 정의하는 알킬아미노알킬이다.
"알킬카보닐"은 C(O)R 기를 의미하며, R은 본 명세서에서 정의하는 알킬이다.
"알킬카보닐아미노"는 -NRC(O)R' 기를 의미하며, R은 본 명세서에서 정의하는 수소 또는 알킬이고, R'는 본 명세서에서 정의하는 알킬이다.
"알킬렌"은 불포화를 함유하지 않으며, 2 내지 8개의 탄소 원자를 가지는 직선 또는 분지형 2가 탄화수소를 말한다. 알킬렌의 예는 에트-다이일 (-CH2CH2-), 프로프-1,3-다이일 (-CH2CH2CH2-), 2,2-다이메틸프로프-1,3-다이일 (-CH2C(CH3)2CH2-) 등을 포함한다.
"알킬설포닐"은 -S(O)2R 기를 의미하며, R은 본 명세서에서 정의하는 알킬이다.
"알킬티오"는 -SR 기를 의미하며, R은 본 명세서에서 정의하는 바와 같은 알킬이다. 알킬티오의 예는 메틸티오, 에틸티오 등을 포함한다.
"알킬티오알킬"은 상기 정의한 1 또는 2개의 알킬티오 기로 치환된 알킬 기를 의미하며, 예는 2-(메틸티오)-에틸 및 2-(에틸티오)-에틸이다.
"알키닐" 또는 "저급 알키닐"은 2 내지 6개의 탄소 원자 및 적어도 하나의 삼중 결합을 가지는 직선 또는 분지형 탄화수소 라디칼을 의미한다. 대표적인 예는 에티닐, 프로피닐, 뷰티닐, 펜틴-2-일 등을 포함한다.
"아미노"는 -NH2 기를 의미한다.
"아미노알킬"은 적어도 하나, 예를 들어 1, 2 또는 3개의 아미노기로 치환된 알킬 기를 의미한다.
"아미노알킬옥시"는 -OR 기를 의미하며, R은 본 명세서에서 정의하는 본 명세서 아미노알킬이다.
"안티센스" 또는 "안티센스 올리고뉴클레오타이드"는 전사체로 혼성화할 수 있고 그것의 번역을 차단할 수 있는 특정 유전자 전사체의 부분에 상보적인 핵산 분자를 지칭하낟. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 RNA 또는 DNA를 포함할 수 있다.
"아릴"은 1가의 6- 내지 14-원, 모노-또는 바이-카보사이클릭 고리를 의미하되, 해당 모노사이클릭 고리는 방향족이며, 바이사이클릭 고리 내 고리 중 적어도 하나는 방향족이다. 대표적인 예는 페닐, 나프틸 및 인단일 등을 포함한다.
"아릴알킬"은 본 명세서에서 정의하는 1 또는 2개의 아릴 기로 치환된 본 명세서에서 정의하는 알킬 기를 의미한다. 예는 벤질, 펜에틸, 페닐비닐, 페닐알릴 등을 포함한다.
"아릴옥시"는 -OR 기를 의미하며, R은 본 명세서에서 정의하는 아릴이다.
"아릴알킬옥시"는 -OR 기를 의미하며, R은 본 명세서에서 정의하는 아릴알킬이다.
"아릴설포닐"은 SO2R 기를 의미하며, R은 본 명세서에서 정의하는 아릴이다.
"카복시알킬"은 1, 2 또는 3개의 -C(O)OH로 치환된 알킬 기를 의미한다.
"카복시 에스터"는 -C(O)OR 기를 의미하며, R은 저급 알킬, 저급 알케닐, 저급 알키닐, 사이클로알킬, 아릴 또는 아릴알킬이고, 이들 각각은 본 명세서에서 정의된다. 대표적인 예는 메톡시카보닐, 에톡시카보닐, 벤질옥시카보닐 등을 포함한다.
"화합물 A"는 하기 구조를 가지는 화학식 I 및 표 I의 화합물이다:
Figure pct00004
.
"시아노알킬"은 적어도 하나, 예를 들어 1, 2 또는 3개의 시아노 기로 치환되는 본 명세서에서 정의하는 알킬, 알케닐 또는 알키닐 라디칼을 의미한다.
"사이클로알킬"은 3 내지 13개의 탄소 원자를 가지는 모노사이클릭 또는 폴리사이클릭 탄화수소 라디칼을 의미한다. 사이클로알킬은 포화 또는 부분적으로 불포화될 수 있지만, 방향족 고리를 함유하지 않을 수 있다. 사이클로알킬은 융합된, 브릿지된, 및 스피로 고리 시스템을 포함한다. 이러한 라디칼의 예는 사이클로프로필, 사이클로뷰틸, 사이클로펜틸 및 사이클로헥실을 포함한다.
"사이클로알킬알킬"은 본 명세서에서 정의하는 1 또는 2개의 사이클로 알킬 기로 치환된 알킬 기를 의미한다. 대표적인 예는 사이클로프로필메틸, 2 사이클로뷰틸-에틸 등을 포함한다.
"사이클로알킬카보닐"은 -C(O)R 기를 의미하며, R은 본 명세서에서 정의하는 사이클로알킬이다.
"다이알킬아미노"는 NRR' 라디칼을 의미하며, R 및 R'는 독립적으로 본 명세서에서 정의하는 알킬, 또는 이것의 N-옥사이드 유도체, 또는 보호된 유도체, 예를 들어 다이메틸아미노, 다이에틸아미노, N,N-메틸프로필아미노, N,N-메틸에틸아미노 등이다.
"다이알킬아미노알킬"은 본 명세서에서 정의하는 하나 또는 다이알킬아미노 기로 치환된 알킬 기를 의미한다.
"다이알킬아미노알킬옥시"는 -OR 기를 의미하며, R은 본 명세서에서 정의하는 다이알킬아미노알킬이다.
"융합된 고리 시스템" 및 "융합된 고리"는 브릿지된 또는 융합된 고리를 함유하는 폴리사이클릭 고리 시스템을 지칭하며; 즉, 2개의 고리는 그것의 고리 구조 내에서 하나 이상의 공유된 원자를 가진다. 본 출원에서, 융합된-폴리사이클 및 융합된 고리 시스템이 필수적으로 모두 방향족 고리 시스템은 아니다. 전형적으로, 필수적이지는 않지만, 융합된-폴리사이클은 인접한 원자의 세트, 예를 들어 나프탈란 또는 1,2,3,4-테트라하이드로-나프탈렌을 공유한다. 스피로 고리 시스템은 본 정의에 의한 융합된-폴리사이클릭은 아니지만, 본 발명의 융합된 폴리사이클릭 고리 시스템은 그 자체가 융합된-폴리사이클의 단일 고리 원자를 통해 그것에 부착된 스피로 고리를 가질 수 있다. 일부 예에서, 당업자에게 명백한 바와 같이, 방향족 시스템 상의 2개의 인접한 기는 함께 융합되어 고리 구조를 형성할 수 있다. 융합된 고리 구조는 헤테로원자를 함유할 수 있고, 선택적으로 하나 이상의 기로 치환될 수 있다. 이러한 융합된 기의 포화 탄소(즉, 포화된 고리 구조)는 2개의 치환기를 함유할 수 있다는 것을 추가로 주목하여야 한다.
"할로알콕시"는 OR'기를 의미하며, R'는 본 명세서에서 정의하는 할로알킬, 예를 들어 트라이플루오로메톡시, 2,2,2-트라이플루오로에톡시 등이다.
"할로알콕시알킬"은 본 명세서에서 정의하는 1, 2 또는 3개의 할로알콕시로 치환된 본 명세서에서 정의하는 알킬 기를 의미한다.
"할로겐" 또는 "할로"는 플루오로, 클로로, 브로모 또는 요오도를 의미한다.
"할로알케닐"은 하나 이상의 할로겐, 예를 들어 1 내지 5개의 할로 원자로 치환된 본 명세서에서 정의하는 알케닐 기를 의미한다.
"할로알킬"은 하나 이상의 할로겐, 예를 들어 1 내지 5개의 할로 원자로 치환된 본 명세서에서 정의하는 알킬 기를 의미한다. 대표적인 예는 2,2-다이플루오로에틸, 트라이플루오로메틸, 2-클로로-1-플루오로에틸 등을 포함한다.
"헤테로아릴"은 O-, -S(O)n-(n은 0, 1 또는 2임)로부터 독립적으로 선택된 1개 이상, 예를 들어 1, 2, 3 또는 4개의 고리 헤테로원자를 함유하며, 남은 고리 원자는 탄소인 5 내지 14개의 고리 원자의 모노사이클릭, 융합된 바이사이클릭, 또는 융합된 트라이사이클릭, 1가 라디칼을 의미하되, 모노사이클릭 라디칼을 포함하는 고리는 방향족이고, 바이사이클릭 또는 트라이사이클릭 라디칼을 포함하는 융합된 고리 중 적어도 하나는 방향족이다. 바이사이클릭 또는 트라이사이클릭 라디칼을 포함하는 임의의 비방향족 고리의 1 또는 2개의 고리 탄소 원자는 C(O)-, -C(S)- 또는 -C(=NH)- 기로 대체될 수 있다. Rx는 수소, 알킬, 하이드록시, 알콕시, 아실 또는 알킬설포닐이다. 융합된 바이사이클릭 라디칼은 브릿지된 고리 시스템을 포함한다. 달리 언급되지 않는다면, 원자가는 헤테로아릴 기의 임의의 고리의 임의의 원자 상에 위치될 수 있으며, 원자가 규칙이 허용된다. 특히, 원자가 지점이 질소 상에 위치될 때, Rx는 없다. 다른 실시형태에서, 용어 헤테아릴은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 1,2,4-트라이아졸릴, 1,3,5-트라이아졸릴, 프탈리미딜, 피리디닐, 피롤릴, 이미다졸릴, 티에닐, 퓨란일, 인돌릴, 2,3-다이하이드로-1H-인돌릴(예를 들어, 2,3-다이하이드로-1H-인돌-2-일, 2,3-다이하이드로-1H-인돌-5-일 등을 포함), 아이소인돌릴, 인돌리닐, 아이소인돌리닐, 벤즈이미다졸릴, 벤조다이옥소l-4-일, 벤조퓨란일, 신놀리닐, 인돌리지닐, 나프티리딘-3-일, 프탈라진-3-일, 프탈라진-4-일, 프테리디닐, 퓨리닐, 퀴나졸리닐, 퀴녹살리닐, 테트라졸릴, 피라졸릴, 피라지닐, 피리미디닐, 피리다지닐, 옥사졸릴, 아이속사졸릴, 옥사디아졸릴, 벤족사졸릴, 퀴놀리닐, 아이소퀴놀리닐, 테트라하이드로아이소퀴놀리닐(예를 들어, 테트라하이드로아이소퀴놀린-4-일, 테트라하이드로아이소퀴놀린-6-일 등을 포함), 피롤로[3,2-c]피리디닐(예를 들어, 피롤로[3,2-c]피리딘-2-일, 피롤로[3,2-c]피리딘-7-일 등을 포함), 벤조피라닐, 티아졸릴, 아이소티아졸릴, 티아디아졸릴, 벤조티아졸릴, 벤조티에닐, 및 이들의 유도체, 또는 이들의 N-옥사이드 또는 보호된 유도체를 포함한다.
"헤테로아릴알킬"은 본 명세서에서 정의되는 1 또는 2개의 헤테로아릴 기로 치환된 알킬 기를 의미한다.
"헤테로사이클로알킬"은 3 내지 8개의 고리 원자의 포화된 또는 부분적으로 불포화된 1가 모노사이클릭 기 또는 5 내지 12개의 고리 원자의 포화된 또는 부분적으로 불포화된 1가 융합 바이사이클릭 기를 의미하며, 여기서 하나 이상, 예를 들어 예를 들어, 1, 2, 3 또는 4개의 고리 헤테로원자는 O-, -S(O)n-(n은 0, 1 또는 2임), -N=, -N(Ry)-(여기서 Ry는 수소, 알킬, 하이드록시, 알콕시, 아실 또는 알킬설포닐임)로부터 독립적으로 선택되고, 남은 고리 원자는 탄소이다. 1 또는 2개의 고리 탄소 원자는 C(O)-, -C(S)- 또는 -C(=NH)- 기로 대체될 수 있다. 융합된 바이사이클릭 라디칼은 브릿지된 고리 시스템을 포함한다. 달리 언급되지 않는다면, 기의 원자가는 원자가 규칙이 허용하는 라디칼 내 임의의 고리의 임의의 원자 상에 위치될 수 있다. 특히, 원자가의 지점은 질소 원자 상에 위치되며, Ry는 없다. 다른 실시형태에서 용어 헤테로사이클로알킬은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 아제티디닐, 피롤리디닐, 2-옥소피롤리디닐, 2,5-다이하이드로-1H-피롤릴, 피페리디닐, 4-피페리도닐, 모폴리닐, 피페라지닐, 2-옥소피페라지닐, 테트라하이드로피라닐, 2-옥소피페리디닐, 티오모폴리닐, 티아모폴리닐, 퍼하이드라제피닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 다이하이드로피리디니닐, 테트라하이드로피리디닐, 옥사졸리닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 티아졸리닐, 티아졸리디닐, 퀴뉴클리디닐, 아이소티아졸리디닐, 옥타하이드로인돌릴, 옥타하이드로아이소인돌릴, 데카하이드로아이소퀴놀릴, 테트라하이드로푸릴 및 테트라하이드로피라닐, 및 이들의 유도체, 및 N-옥사이드 또는 이들의 보호된 유도체를 포함한다.
"헤테로사이클로알킬알킬"은 본 명세서에서 정의하는 1 또는 2개의 헤테로사이클로알킬 기로 치환된 본 명세서에서 정의하는 알킬 기를 의미한다.
"하이드록시알킬"은 적어도 하나의, 예를 들어 1, 2 또는 3개의 하이드록시 기로 치환된 본 명세서에서 정의하는 알킬 라디칼을 의미하며, 단, 2개의 하이드록시 기가 존재한다면, 그것들은 동일 탄소 원자 상에 둘 다 존재 하지 않는다. 대표적인 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 하이드록시메틸, 2-하이드록시에틸, 2-하이드록시프로필, 3 하이드록시프로필, 1-(하이드록시메틸)-2-메틸프로필, 2-하이드록시뷰틸, 3-하이드록시뷰틸, 4 하이드록시뷰틸, 2,3-다이하이드록시프로필, 1-(하이드록시메틸)-2-하이드록시에틸, 2,3-다이하이드록시뷰틸, 3,4-다이하이드록시뷰틸 및 2-(하이드록시메틸)-3-하이드록시프로필, 예를 들어 2-하이드록시에틸, 2,3-다이하이드록시프로필, 1-(하이드록시메틸)-2-하이드록시에틸 등을 포함한다.
"하이드록시아미노"는 -NH(OH) 기를 의미한다.
어구 "핵산 분자" 및 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시뉴클레오타이드 중 하나인 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 폴리머 형태를 의미한다. 그것들은 단일-, 이중- 또는 다중-가닥 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 혼성체, 또는 퓨린 및 피리미딘 염기 또는 다른 천연물을 포함하는 폴리머, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된, 비-천연 또는 유도체화된 뉴클레오타이드 염기를 포함한다. 폴리뉴클레오타이드의 백본은 당 및 인산염 기(RNA 또는 DNA에서 전형적으로 발견될 수 있는 것과 같음), 또는 변형되거나 치환된 당 또는 인산염 기를 포함할 수 있다. 대안적으로 폴리뉴클레오타이드의 백본은 포스포라미다이트와 같은 합성 서브유닛의 폴리머를 포함할 수 있고, 따라서 올리고데옥시뉴클레오사이드 포스포라미다이트 또는 혼합된 포스포라미다이트-포스포다이에스터 올리고머일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 유도체, 유라실, 및 다른 당, 및 연결기, 예컨대 플루오로리보스 및 티오에이트, 및 뉴클레오타이드 분지를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 표지 성분과 컨쥬게이션에 의하는 것과 같이 추가로 변형될 수 있다. 다른 유형의 변형은 유도체에 의한 자연적으로 발생하는 뉴클레오타이드의 하나 이상의 캡, 치환, 및 단백질, 금속 이온, 표지 성분, 다른 폴리뉴클레오타이드, 또는 고체 지지체에 폴리뉴클레오타이드를 부착하기 위한 수단의 도입을 포함한다.
"광학적" 또는 "광학적으로"는 순차적으로 기재된 사건 또는 환경이 생길 수 있거나 생길 수 없는 것, 및 해당 기술이 상기 사건 또는 환경이 생기는 예 및 그렇지 않은 예를 포함하는 것을 의미한다. 당업자는 하나 이상의 치환체를 함유하는 것으로 기재된 임의의 분자에 대해, 단지 입체적으로 실행적인 및/또는 합성적으로 실현가능한 화합물을 포함하는 것을 의미하는 것을 이해할 것이다. "선택적으로 치환된 "은 용어에서 모든 이후의 변형어를 언급한다. 따라서, 예를 들어 용어 "선택적으로 치환된 아릴 C1 -8 알킬"에서, 분자의 "C1 -8 알킬"부분과 "아릴" 부분은 둘 다 치환될 수도 있고 치환되지 않을 수도 있다. 대표적인 선택적 치환의 열거는 이하의 "치환된"의 정의에서 제시한다.
"선택적으로 치환된 알킬"은 알킬카보닐, 알케닐카보닐, 사이클로알킬카보닐, 알킬카보닐옥시, 알케닐카보닐옥시, 아미노, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 아미노카보닐, 알킬아미노카보닐, 다이알킬아미노카보닐, 시아노, 시아노알킬아미노카보닐, 알콕시, 알케닐옥시, 하이드록시, 하이드록시알콕시, 카복시, 알킬카보닐아미노, 알킬카보닐옥시, 알킬-S(O)0-2-, 알케닐-S(O)0-2-, 아미노설포닐, 알킬아미노설포닐, 다이알킬아미노설포닐, 알킬설포닐-NRc-(Rc는 수소, 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 하이드록시, 알콕시, 알케닐옥시 또는 시아노알킬임), 알킬아미노카보닐옥시, 다이알킬아미노카보닐옥시, 알킬아미노알킬옥시, 다이알킬아미노알킬옥시, 알콕시카보닐, 알케닐옥시카보닐, 알콕시카보닐아미노, 알킬아미노카보닐아미노, 다이알킬아미노카보닐아미노, 알콕시알킬옥시 및 -C(O)NRaRb(Ra 및 Rb는 독립적으로 수소, 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 하이드록시, 알콕시, 알케닐옥시 또는 시아노알킬임)로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 기, 예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5개의 기로 선택적으로 치환된 본 명세서에서 정의되는 알킬 라디칼을 의미한다.
"선택적으로 치환된 알케닐"은 알킬카보닐, 알케닐카보닐, 사이클로알킬카보닐, 알킬카보닐옥시, 알케닐카보닐옥시, 아미노, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 아미노카보닐, 알킬아미노카보닐, 다이알킬아미노카보닐, 시아노, 시아노알킬아미노카보닐, 알콕시, 알케닐옥시, 하이드록시, 하이드록시알콕시, 카복시, 알킬카보닐아미노, 알킬카보닐옥시, 알킬 S(O)0-2-, 알케닐-S(O)0-2-, 아미노설포닐, 알킬아미노설포닐, 다이알킬아미노설포닐, 알킬설포닐-NRc-(Rc는 수소, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알키닐, 하이드록시, 알콕시 또는 알케닐옥시), 알킬아미노카보닐옥시, 다이알킬아미노카보닐옥시, 알킬아미노알킬옥시, 다이알킬아미노알킬옥시, 알콕시카보닐, 알케닐옥시카보닐, 알콕시카보닐아미노, 알킬아미노카보닐아미노, 다이알킬아미노카보닐아미노, 알콕시알킬옥시 및 -C(O)NRaRb(Ra 및 Rb는 독립적으로 수소, 선택적으로 치환된 알킬, 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 하이드록시, 알콕시, 또는 알케닐옥시)로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 기, 예를 들어 1, 2 또는 3개의 기로 선택적으로 치환된 본 명세서에서 정의하는 알케닐 라디칼을 의미한다.
"선택적으로 치환된 아릴"은 할로, 할로알킬, 할로알콕시, 하이드록시, 저급 알킬, 저급 알케닐, 저급 알키닐, 알콕시, 카복시, 카복시 에스터, 아미노, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 헤테로사이클로알킬, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, -C(O)NR'R"(R'는 수소 또는 알킬이고, R"는 수소, 알킬, 아릴, 헤테로아릴 또는 헤테로사이클로알킬임), -NR'C(O)R"(R'는 수소 또는 알킬이고 R"는 알킬, 아릴, 헤테로아릴 또는 헤테로사이클로알킬임), -NHS(O)2R'(R'는 알킬, 아릴 또는 헤테로아릴임)로부터 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5개의 기로 선택적으로 치환된 본 명세서에서 정의하는 아릴 기를 의미한다.
"선택적으로 치환된 헤테로아릴"은 할로, 할로알킬, 할로알콕시, 저급 알킬, 저급 알케닐, 저급 알키닐, 알콕시, 하이드록시, 옥소(원자가 규칙이 허용한다면), 카복시, 카복시 에스터, 아미노, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 헤테로사이클로알킬, 헤테로아릴, 선택적으로 치환된 아릴, -C(O)NR'R"(R'는 수소 또는 알킬이고, R"는 수소, 알킬, 아릴, 헤테로아릴 또는 헤테로사이클로알킬임), -NR'C(O)R"(R'는 수소 또는 알킬이고 R"는 알킬, 아릴, 헤테로아릴 또는 헤테로사이클로알킬임), NHS(O)2R'(R'는 알킬, 아릴 또는 헤테로아릴임)로부터 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5개의 기로 선택적으로 치환된 본 명세서에서 정의하는 헤테로아릴 기를 의미한다.
"선택적으로 치환된 헤테로사이클로알킬"은 할로, 할로알킬, 할로알콕시, 하이드록시, 옥소, 저급 알킬, 저급 알케닐, 저급 알키닐, 알콕시, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 알킬아미노알킬, 다이알킬아미노알킬, 카복시, 카복시 에스터, -C(O)NR'R"(R'는 수소 또는 알킬이고, R"는 수소, 알킬, 아릴, 헤테로아릴 또는 헤테로사이클로알킬임), -NR'C(O)R"(R'는 수소 또는 알킬이고, R"는 알킬, 아릴, 헤테로아릴 또는 헤테로사이클로알킬임), 아미노, 알킬아미노, 다이알킬아미노 및 NHS(O)2R'(R'는 알킬, 아릴 또는 헤테로아릴임)로부터 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5개의 기로 선택적으로 치환된 본 명세서에서 정의하는 헤테로사이클로알킬을 의미한다.
"포화 브릿지된 고리 시스템"은 방향족이 아닌 바이사이클릭 또는 폴리사이클릭 고리 시스템을 지칭한다. 이러한 시스템은 분리되거나 컨쥬게이트된 불포화를 함유할 수 있지만, 그것의 핵 구조 내 방향족 또는 헤테로방향족 고리는 함유할 수 없다(그러나 그것에 방향족 치환은 가질 수 있다). 예를 들어, 헥사하이드로-푸로[3,2-b]퓨란, 2,3,3a,4,7,7a-헥사하이드로-1H-인덴, 7-아자-바이사이클로[2.2.1]헵탄 및 1,2,3,4,4a,5,8,8a-옥타하이드로-나프탈렌은 분류 "포화 브릿지된 고리 시스템" 내에 모두 포함된다.
"짧은 간섭 RNA(short interfering RNA, siRNA)"는 RNA 간섭(RNA interference, RNAi)을 매개할 수 있는 이중-가닥 RNA 분자, 일반적으로 약 10개 내지 약 30개의 뉴클레오타이드를 지칭한다.
"스피로사이클릴" 또는 "스피로사이클릭 고리"는 다른 고리의 특정 고리모양 탄소로부터 유래되는 고리를 지칭한다. 예를 들어, 이하에 기재되는 바와 같이, 포화 브릿지된 고리 시스템이지만 브릿지헤드 원자가 아닌 고리 원자(고리 C 및 C')는 포화 브릿지된 고리 시스템과 그것에 부착된 스피로사이클릴(고리 D) 사이의 공유 원자일 수 있다. 스피로사이클릴은 카보사이클릭 또는 헤테로지환족일 수 있다.
Figure pct00005
본 명세서에 기재된 각 반응에 대한 "수율"은 이론적 수율의 백분율로 표현된다.
"항체"는 면역글로불린 분자의 가변 영역 내 적어도 하나의 항원 인식 부위를 통해 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 탄수화물, 폴리뉴클레오타이드, 지질 등과 같은 표적을 인식하고 이들에 특이적으로 결합하는 임의의 면역글로불린 분자를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어는 가장 넓은 의미로 사용되며, 항체가 요망되는 생물학적 활성을 나타낸다면, 무결함 다클론성 항체, 무결함 단클론성 항체, 항체 단편(예컨대 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편), 단일 쇄 Fv(scFv) 돌연변이체, 다중특이적 항체, 예컨대 적어도 2개의 무결함 항체로부터 만들어진 이중특이적 항체, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 및 항체 인식 부위를 포함하는 임의의 다른 변형된 면역글로불린 분자를 포함한다. 항체는 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 언급되는 그것의 중쇄 불변 도메인의 동일성을 기준으로 임의의 5가지 주요 분류의 면역글로불린: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM, 또는 이들의 하위분류(아이소타입)(예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2)를 가질 수 있다. 상이한 분류의 면역글로불린은 상이하며 잘 공지된 서브유닛 구조 및 3-차원 입체배치를 가진다. 항체는 네이키드(naked)일 수 있고, 또는 세포독성, 독소, 방사성동위원소 등과 같은 다른 분자에 컨쥬게이트될 수 있다.
"항체 단편"은 무결함 항체의 일부를 지칭할 수 있다. 항체 단편의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 선형 항체, 단일-쇄 항체 분자, Fc 또는 Fc' 펩타이드, Fab 및 Fab 단편, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
"키메라 항체"는 항체를 지칭하되, 면역글로불린 분자의 아미노산 서열은 2 이상의 종으로부터 유래된다. 전형적으로, 경쇄와 중쇄 둘 다의 가변 영역은 요망되는 특이성, 친화도, 및 능력을 가지는 포유류(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼 등)의 종으로부터 유래된 항체의 가변 영역에 대응하는 한편, 불변 영역은 해당 종 내에서 면역 반응이 일어나는 것을 회피하기 위하여 다른 것(보통 인간)으로부터 유래된 항체 내 서열에 상동성이다.
비-인간(예를 들어, 토끼) 항체의 "인간화된" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소의 서열을 함유하거나 서열을 함유하지 않는 키메라 항체를 포함한다. 대부분에 대해, 인간화된 항체는 인간 면역글로불린(수용자 항체)이며, 해당 수용자의 초가변영역으로부터 잔기는 요망되는 특이성, 친화도, 및 능력을 가지는 마우스, 래트, 토끼, 또는 비인간 영장류와 같은 비-인간 종(공여체 항체)의 초가변영역으로부터의 잔기로 대체된다. 일부 예에서, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(framework region, FR) 잔기는 대응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 더 나아가, 인간화된 항체는 수용자 항체 내 또는 공여체 항체 내에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 가장 종종, 인간화된 항체는 실질적으로 모든 적어도 하나의, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 포함할 수 있으며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비인간 면역 글로불린의 그것에 대응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 잔기는 인간 면역글로불린 서열의 그것이다. 인간화된 항체는 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc), 전형적으로 인간 면역글로볼린의 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 인간화된 항체를 만들기 위하여 사용된 방법은 면역학 및 분자 생물학 분야에 잘 공지되어 있다.
"혼성체 항체"는 면역글로불린 분자를 포함할 수 있으며, 여기서 상이한 항원 결정소 영역을 가지는 항체로부터의 중쇄 및 경쇄 쌍은 함께 조립되어서 2개의 상이한 에피토프 또는 2개의 상이한 항원이 인식될 수 있으며 얻어진 테트라머에 의해 결합될 수 있다.
용어 "에피토프" 또는 "항원 결정소"는 본 명세서에서 상호호환적으로 사용되며, 특정 항체에 의해 인식되고 특이적으로 결합될 수 있는 항원의 일부를 지칭한다. 항원이 폴리펩타이드일 때, 에피토프는 단백질의 3차 폴딩에 의해 병치된 연속적 아미노산과 비연속적 아미노산 둘 다로부터 형성될 수 있다. 연속적 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 전형적으로 단백질 변성 시 보유되는 반면, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로 단백질 변성 시 상실된다. 에피토프는 전형적으로 독특한 공간 입체구조에서 적어도 3 내지 5, 및 더 보통으로는, 적어도 5 또는 8 내지 10개의 아미노산을 포함한다.
용어 "단백질 디스플레이 스캐폴드"는 본 명세서에 참조로 포함되는 문헌[Hosse et al., Protein Sci., 15(1):14-27 (2006)]에서 기재되는 것과 같은 결합 시약, 예컨대 애피바디(affibody), 면역 단백질, 방어소 A, T-세포 수용체 등을 지칭한다.
에피토프에 "특이적으로 결합하는" 또는 "특이적 결합"은 항체가 더 빈번하게, 및/또는 더 급속도로, 및/또는 더 큰 지속 기간으로, 및/또는 대안의 물질보다 에피토프에 더 큰 친화도로 반응하거나 결합하는 것을 의미한다.
HER2(또한 NEU, NGL, 인간 상피세포성장인자 수용체 2(Epidermal growth factor Receptor 2) 또는 ErbB2로 알려짐), p185 및 CD340), HER3(또한 c-ErbB3로 알려짐), ERBB4(또한 HER4, p180erbB4로 알려짐), 대식세포-자극 단백질 수용체(Macrophage-stimulating protein receptor, MSPR), AXL 수용체 티로신 키나제(Axl), 미토겐-활성화 단백질 키나제(Mitogen-activated protein kinase, MAP3K), 세포외 신호조절 키나제(extracellular signal-regulated kinase, ERK), C-jun N-말단 키나제(c-jun-N-terminal kinase, JNK), p38 미토겐-활성화 단백질 키나제(p38 mitogen-activated protein kinase, p38MAPK), MEK kinase-1-(MEKK), 인슐린 성장 인자 1 수용체(Insulin growth factor 1 receptor, IGF-IR 또는 CD221), 인슐린 수용체(Insulin receptor 1, InsR 또는 INS-IR), EphA1-(또한 에프린 A형 수용체 1, EPH 수용체 A1, EPH, EPHT1, 티로신-단백질 키나제 수용체 EPH, EPHT로 알려짐), 섬유아세포 성장 인자 수용체 2(Fibroblast growth factor receptor 2, FGFR2), 및 섬유아세포 성장 인자 수용체 3(FGFR3)의 억제제는 일반적으로 관심의 특이적 키나제 또는 키나제 수용체의 발현 및/또는 활성을 억제하는 능력을 가지는 분자를 지칭하며, 다음을 포함한다: HER3, HER2, MSPR, Axl, MAP3K(ERK, JNK 및 p38 MAPK), MEKK 키나제들/키나제 수용체, INSR, IGF-IR 및 FGFR2. 이들 억제제는 특이적 종일 수 있고 또는 천연에서 외인성일 수 있다.
"암"은, 이에 제한되는 것은 아니지만 다음을 포함하는, 세포-증식성 질병 상태를 지칭한다: 심장: 육종(혈관육종, 섬유육종, 횡문근육종, 지방육종), 점액종, 횡문근종, 섬유종, 지방종 및 기형종; 폐: 기관지원성암종(편평상피 세포, 미분화성 소세포, 미분화성 거대 세포, 선암종), 폐포(세기관지) 암종, 기관지 선종, 육종, 림프종, 폐과오종, 중피종; 유방: 유관 상피내암종, 침윤성 유관암종, 수질암, 침윤성 소엽 암종, 관상 암종, 점액 암종, 염증성 유방암; 위장: 식도(편평상피 세포 암종, 선암종, 평활근육종, 림프종), 위(암종, 림프종, 평활근육종), 췌장(췌관 선암종, 인슐린종, 글루카곤종, 가스트린종, 유암종, 비포마(vipoma)), 소장 (선암종, 림프종, 유암종, 카포시 육종, 평활근종, 혈관종, 지방종, 신경섬유종, 섬유종), 대장(선암종, 관상 선종, 융모 선종, 과오종, 평활근종); 비뇨생식관: 신장 (선암종, 빌름스 종양[신아세포종], 림프종, 백혈병), 방광 및 요도(편평상피 세포 암종, 이행세포 암종, 선암종), 전립선(선암종, 육종), 고환(정상피종, 기형종, 태생기암, 기형암종, 융모막암종, 육종, 간질세포 암종, 섬유종, 섬유선종, 유선종성 종양, 지방종); 간: 간암(간세포암), 담관암, 간아세포종, 혈관육종, 간세포 선종, 혈관종; 뼈: 골원성 육종(골육종), 섬유육종, 악성 섬유성 조직구종, 연골육종, 유윙 육종, 악성 림프종(세망세포 육종), 다발성 골수종, 악성 거세포종 척색종, 골연골종(골연골성 외골증), 양성 연골종, 연골모세포종, 연골점액섬유종, 유골종 및 거세포 종양; 신경계: 두개골(골종, 혈관종, 육아종, 황색종, 변형성 골염), 수막(뇌수막종, 뇌수막육종, 신경교종증), 뇌(성상세포종, 수모세포종, 신경교종, 상의세포종, 배아세포종[송과체종], 다형성 교모세포증, 핍지교종, 신경초종, 망막아세포종, 선천성 종양), 척수 신경섬유종, 뇌수막종, 신경교종, 육종); 부인과: 자궁(자궁 내막 암종), 자궁경부(자궁경부 암종, 종양전 자궁경부 이형성증), 난소(난소 암종[장액성 낭선암종, 점액성 낭선암종, 미분류 암종], 과립막-난포막 세포 종양, 세르톨리(Sertoli)-라이디히(Leydig) 세포 종양, 미분화 배세포종, 악성 기형종), 외음부(편평상피 세포 암종, 상피내 암종, 선암종, 섬유육종, 흑색종), 질(투명 세포 암종, 편평상피 세포 암종, 포도상 육종(배아 횡문근육종], 나팔관(암종); 혈액학: 혈액(골수성 백혈병[급성 및 만성], 급성 림프아구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 골수증식성 질환, 다발성 골수종, 골수이형성 증후군), 호지킨병, 비호지킨 림프종[악성 림프종]; 피부: 악성 흑색종, 기저 세포 암종, 편평상피 세포 암종, 카포시 육종, 이형성 모반(moles dysplastic nevi), 지방종, 맥관종, 피부섬유종, 켈로이드, 건선; 부신: 신경아세포종. 따라서, 본 명세서에 제공되는 용어 "암성 세포"는 상기 확인된 질환 중 어느 하나에 걸린 세포를 포함한다.
이론에 구속되지 않고, 포스파타제는 또한 키나제의 유사어로서 "키나제-의존적 질병 또는 질환"에서 중요한 역할을 할 수 있으며; 키나제 포스포릴레이트 및 포스파타제 데포스포릴레이트, 예를 들어 지질 기질이다. 따라서 본 발명의 화합물은 본 명세서에 기재된 키나제 활성을 조절하는 한편, 또한 직접적으로 또는 간접적으로 포스파타제 활성을 조절할 수 있다. 존재한다면 이 추가적인 조절은 관련된 또는 달리 상호의존적인 키나제 또는 키나제 패밀리에 대해 본 발명 화합물의 작용에 대해 상승적(또는 상승적이지 않을) 수 있다. 앞서 언급한 바와 같이, 어떤 경우에, 다른 키나제 수용체 억제제들의 병용물과 함께 사용될 때 본 발명의 화합물은 비정상적 세포 증식 수준(즉, 종양 성장), 프로그램된 세포사(아포토시스), 세포 이동 및 침해 및 종양 성장과 관련된 신생혈관생성을 부분적으로 특징으로 하는 질병을 치료하는 것에 유용하다.
HER 수용체를 "과발현시키는" 암은 동일 조직 유형의 비암성 세포와 비교하여 그것의 세포 표면에서 HER2와 같은 HER 수용체의 상당히 더 높은 수준을 가지는 것이다. 이러한 과발현은 유전자 증식 또는 증가된 전이 또는 번역에 의해 야기될 수 있다. HER 수용체 과발현은 세포 표면 상에 존재 하는 HER 단백질의 증가된 수준을 평가함으로써(예를 들어, 면역조직화학 분석(immunohistochemistry assay; IHC)을 통해) 진단 또는 예후 분석에서 결정될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 예를 들어 형광 인시츄 혼성화(FISH; 1998년 10월 공개된 WO98/45479 참조), 사우던 블롯팅, 또는 중합효소 연쇄 반응(polymerase Chain reaction, PCR) 기법, 예컨대 실시간 정량적 PCR(real time quantitative PCR, RT-PCR)을 통해 세포 내 HER-암호화 핵산 수준을 측정할 수 있다. 또한 생물학적 유체, 예컨대 혈청(예를 들어, 1990년 6월 12일 발행된 미국특허 제4,933,294호; 1991년 4월 18일 공개된 WO91/05264; 1995년 3월 28일 발행된 미국특허 제5,401,638호; 및 Sias et al. J. Immunol. Methods 132: 73-80 (1990)) 내 쉐드(shed) 항원(예를 들어 HER 세포 밖 도메인)을 측정함으로써 HER 수용체 과발현을 연구할 수 있다. 상기 분석 외에, 다양한 생체 내 분석이 당업자에게 이용가능하다. 예를 들어 검출가능한 표지, 예를 들어 방사성 동위원소로 선택적으로 표지된 항체에 환자의 신체 내에서 세포를 노출시킬 수 있고, 환자 내 세포에 항체의 결합이, 예를 들어 방사성 활성을 위한 외부 스캐닝에 의해 또는 항체에 앞서 노출된 환자로부터 취한 생검을 분석함으로써 평가될 수 있다.
HER2를 과발현하는 종양은 세포 당 발현된 HER2 분자의 복제물 수에 대응하는 면역조직 화학 스코어에 의해 평가될 수 있고, 생화학적으로 결정될 수 있다: 0=0 10,000개 복제물/세포, 1+ = 적어도 약 200,000 복제물/세포, 2+ = 적어도 약 500,000개 복제물/세포, 3+ = 적어도 약 2,000,000개 복제물/세포. 티로신 키나제의 리간드-독립적 활성화를 야기하는(Hudziak et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7159 7163[1987]) 3+ 수준에서 HER2 과발현은 대략 30%의 유방암에서 일어나며, 이들 환자에서, 재발이 없는 생존 및 전반적 생존은 감소된다(Slamon et al., Science 244: 707 712 [1989]; Slamon et al., Science 235: 177 182 [1987]).
"비-HER2 증폭된" 종양은 본질적으로 HER2 유전자의 정상(즉, 야생형) 복제 수를 처리하는 세포로 이루어진다.
본 발명의 목적을 위한 "환자"는 인간 및 다른 동물, 특히 포유류, 및 다른 유기체를 포함한다. 따라서, 해당 방법은 인간 치료 및 수의학 용도 둘 다에 적용 가능하다. 다른 실시형태에서 환자는 포유류이며, 다른 실시형태에서 환자는 인간이다.
화합물의 "약제학적으로 허용가능한 염"은 약제학적으로 허용가능하고 모 화합물의 요망되는 약리학적 활성을 소유하는 염을 의미한다. 약제학적으로 허용가능한 염은 비-독성인 것으로 이해된다. 적합한 약제학적으로 허용가능한 염에서 추가적인 정보는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1985] 또는 [S. M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts," J. Pharm. Sci., 1977;66:1-19]에서 찾을 수 있으며, 이들 둘은 본 명세서에 참조로 포함된다.
약제학적으로 허용가능한 산 부가 염의 예는 무기산, 예컨대 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등뿐만 아니라 유기산, 예컨대 아세트산, 트라이플루오로아세트산, 프로피온산, 헥산산, 사이클로펜탄프로피온산, 글라이콜산, 파이루브산, 락트산, 옥살산, 말레산, 말론산, 숙신산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 3-(4-하이드록시벤조일)벤조산, 만델산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 1,2-에탄다이설폰산, 2 하이드록시에탄설폰산, 벤젠설폰산, 4-클로로벤젠설폰산, 2 나프탈렌설폰산, 4 톨루엔설폰산, 캠퍼설폰산, 글루코헵톤산, 4,4'-메틸렌비스-(3-하이드록시-2-엔-1-카복실산), 3-페닐프로피온산, 트라이메틸아세트산, 3차 뷰틸아세트산, 라우릴 황산, 글루콘산, 글루탐산, 하이드록시나프톨산, 살리실산, 스테아르산, 뮤콘산, p-톨루엔설폰산, 살리실산 등에 의해 형성된 것을 포함한다.
약제학적으로 허용가능한 염기 추가 염의 예는 모 화합물 내 존재 하는 산성 양성자가 금속 이온, 예컨대 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘, 마그네슘, 철, 아연, 구리, 망간, 알루미늄 염 등에 의해 대체될 때 형성된 것을 포함한다. 바람직한 염은 암모늄, 칼륨, 나트륨, 칼슘 및 마그네슘 염이다. 약제학적으로 허용가능한 유기 비-독성 염기로부터 유래된 염은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 1차, 2차 및 3차 아민의 염, 자연적으로 발생하는 치환된 아민을 포함하는 치환된 아민, 사이클릭 아민 및 염기성 이온 교환 수지를 포함한다. 유기 염기의 예는 아이소프로필아민, 트라이메틸아민, 다이에틸아민, 트라이에틸아민, 트라이프로필아민, 에탄올아민, 2-다이메틸아미노에탄올, 2-다이에틸아미노에탄올, 다이사이클로헥실아민, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 카페인, 프로카인, 하이드라바민, 콜린, 베타인, 에틸렌다이아민, 글루코사민, 메틸글루카민, 테오브로민, 퓨린, 피페라진, 피페리딘, N-에틸피페리딘, 트로메타민, N-메틸글루카민, 폴리아민 수지 등을 포함한다. 대표적인 유기 염기는 아이소프로필아민, 다이에틸아민, 에탄올아민, 트라이메틸아민, 다이사이클로헥실아민, 콜린 및 카페인이다.
"프로드러그"는 생체 내에서 (전형적으로 급속도로) 변형되어, 예를 들어 혈액 내 가수분해에 의해 상기 화학식의 모 화합물을 수득하는 화합물을 지칭한다. 보통의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 카복실산 모이어티를 함유하는 활성 형태를 가지는 화합물의 에스터 및 아마이드 형태를 포함한다. 본 발명의 화합물의 약제학적으로 허용가능한 에스터의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 알킬 에스터(예를 들어, 약 1 내지 약 6개의 탄소를 가짐)를 포함하며, 알킬 기는 직쇄 또는 분지쇄이다. 허용가능한 에스터는 또한 사이클로알킬 에스터 및 아릴알킬 에스터, 예컨대 이에 제한되는 것은 아니지만, 벤질을 포함한다. 본 발명의 약제학적으로 허용가능한 아마이드의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 1차 아마이드, 및 2차 및 3차 알킬 아마이드(예를 들어, 약 1 내지 약 6개의 탄소를 가짐)를 포함한다. 본 발명의 화합물의 아마이드 및 에스터는 통상적인 방법에 따라서 제조될 수 있다. 프로드러그의 철저한 논의는 문헌[T. Higuchi and V. Stella, "Pro-drugs as Novel Delivery Systems," Vol 14 of the A.C.S. Symposium Series] 및 문헌[Bioreversible Carriers in Drug Design, ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987]에서 제공되며, 이들 둘 다 본 명세서에 모든 목적을 위하여 참조로 포함된다.
용어 "치료적 상승 작용"은 주어진 용량에서 두 제품의 병용물이 동일 용량을 고려하여 2개의 제품 단독의 최고보다 더 효능이 있을 때 사용된다. 한 양태에서, 치료적 상승은 변수 종양 용적 상에서 반복된 측정(시간 인자)으로 이원배치 분산분석(2-way analysis of variance)으로부터 얻은 추정치를 사용하여 최상의 단일 작용제와 병용물을 비교함으로써 평가될 수 있다. 다른 양태에서, 병용물의 최대 내성 용량은 고려사항 하의 연구에서 각 분리된 구성요소의 최대 내성 용량과 비교될 수 있다. 이 유효성은, 예를 들어 log10 세포 사멸에 의해 정량화될 수 있으며, 이는 다음의 식에 따라서 결정되고:
log10 세포사멸 = T-C(일)/3.32 × Td
여기서 T-C는 사전결정된 값(예를 들어 1g)에 도달한 처리군(T)의 종양 및 대조군(C)의 종양에 대해 일 수로 평균 시간인 세포 성장의 지연을 표시하며, Td는 대조군 동물에서 종양 용적이 2배로 되는데 필요한 일 수인 시간을 표시한다[T.H. Corbett et al., Cancer, 40, 2660.2680 (1977); F.M. Schabel et al., Cancer Drug Development, Part B, Methods in Cancer Research, 17, 3 51, New York, Academic Press Inc. (1979)]. log10 세포 사멸이 0.7 초과이거나 동일하다면, 제품은 활성인 것으로 고려된다. log10 세포 사멸이 2.8 초과라면 제품은 매우 활성인 것으로 고려된다. 각각의 구성요소가 일반적으로 그것의 최대 내성 용량 미만 또는 동일로 존재 하는 그 자체의 최대 내성 용량으로 사용된 병용물은, log10 세포 사멸이 최고 구성요소의 log10 세포 사멸 값을 초과한다면, 치료적 상승 작용을 나타낼 것이며, 그것이 단독으로 투여될 때 특히 적어도 하나의 log 세포 사멸의 우수성을 가진다.
"치료적으로 유효한"은, 예를 들어 환자에게 공동 투여될 때 질병의 증상을 완화시키는 화학식 I의 화합물 및/또는 키나제의 억제제 또는 수용체, 예를 들어 HER3, HER2, MSPR, Axl, MAP3K(ERK, JNK 및 p38 MAPK), MEKK 키나제들/키나제 수용체, INSR, IGF-IR 및 FGFR2의 양이다. "치료적 유효량"을 구성하는 본 발명의 화학식 I의 화합물, 또는 키나제의 억제제의 양은 화합물, 억제제, 질병 상태 및 그것의 중증도, 화합물 및/또는 억제제의 생물학적 이용가능성 특성, 치료되는 환자의 연령 등에 따라서 다양할 것이다. 치료적 유효량은 당업자가 그들의 지식에 따라서 및 본 개시에 따라서 일상적으로 결정될 수 있다. 치료적 유효량을 포함하는 투약량 또는 투약량들은 독성이 아니며, 적절한 위험/이익 비에 상응하는 허용되는 의학적 실행을 부여한다.
본 명세서에서 사용되는 질병, 장애 또는 증후군을 "치료하는" 또는 "치료"는 (i) 인간에서 생기는 질병, 장애 또는 증후군을 방지하는 것, 즉 질병, 장애 또는 증후군에 노출되거나 성향이 있을 수 있지만, 질병, 장애 또는 증후군의 증상을 아직 경험하거나 나타내지 않은 질병, 장애 또는 증후군의 임상적 증상이 동물에서 발생하도록 야기하는 것; (ii) 질병, 장애 또는 증후군을 억제하는 것, 즉 그것의 진행을 잡는 것; 및 (iii) 질병, 장애 또는 증후군을 경감하는 것, 즉 질병, 장애 또는 증후군의 퇴보를 야기하는 것을 포함한다. 당업계에 공지된 것과 같이, 전신 대 국소화된 전달을 위한 조절, 연령, 체중, 일반적 건강상태, 성별, 식이요법, 투여 시간, 약물 상호작용 및 질환의 중증도가 필요할 수 있으며, 당업자에 의해 일상적인 실험에 의해 확인될 것이다.
본 명세서에서 이용되는 "공동-투여", "병용 투여"는 1명의 환자에게 선택된 활성, 치료제의 투여 방식을 포함하는 것을 의미하며, 작용제가 반드시 동일 투여 경로 또는 동일 시간에 투여되는 것은 아닌 치료 섭생을 포함하도록 의도된다. 공동-투여는 또한 "고정된 병용물"로 활성 성분의 전달을 포함할 수 있으며, 예를 들어 화학식 I의 화합물 및 억제제(예를 들어 기능성 핵산, 라파티닙, 및/또는 키나제 또는 키나제 수용체에 대한 항체: HER3, HER2, MSPR, Axl, MAP3K(ERK, JNK 및 p38 MAPK), MEKK 키나제들/키나제 수용체, INSR, IGF-IR, 및 FGFR2에서 활성 성분의 전달은 단일 독립체 또는 투약량의 형태로 동시에 환자에게 둘 다 투여된다. 용어 "비-고정 병용물"은 활성 성분, 예를 들어 키나제 또는 수용체 중 임의의 하나 이상: HER3, HER2, MSPR, Axl, MAP3K(ERK, JNK 및 p38 MAPK), MEKK 키나제들/키나제 수용체, INSR, IGF-IR 및 FGFR2에 대한 화학식 I의 화합물 및 억제제(예를 들어 기능성 핵산 또는 항체)가 동시에, 함께 또는 순차적으로 구체적 시간 제한 없이 별개의 독립체로서 환자에게 둘 다 투여되어, 투여가 환자 신체 내에서 활성제들의 병용물의 치료적으로 유효한 수준을 제공하는 것을 의미한다.
본 발명의 실시형태
다음의 단락은 본 발명의 화합물의 수많은 실시형태를 제시한다. 각 예에서, 해당 실시형태는, 인용된 화합물뿐만 아니라 개개의 이성질체 및 이성질체의 혼합물을 포함한다. 추가로, 각 예에서 실시형태는 선택적으로 인용된 화합물의 약제학적으로 허용가능한 염, 수화물 및/또는 용매화물 및 이들의 임의의 개개의 이성질체 또는 이성질체의 혼합물을 포함한다.
각각의 다음의 실시형태에 대해, 화학식 I의 화합물은, 예를 들어 화합물 A일 수 있거나, 또는 표 1의 화합물로부터 선택될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 발명의 내용에서 정의한 바와 같은 화학식 I의 화합물의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 암 치료방법에 관한 것이며, 암의 종양 세포의 성장 및/또는 생존은, PI3K의 활성에 의해; HER3, MSPR, Axl, MAP3K(ERK, JNK 및 p38 MAPK), 및 MEKK 키나제들/키나제 수용체 중 하나 이상의 억제제와 병용하여 적어도 부분적으로 향상된다. 한 양태에서, 억제제는 기능성 핵산일 수 있는 반면, 다른 것에서 이는 항체이다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 발명의 내용에서 정의한 바와 같이 화학식 I의 화합물의 치료적 유효량을 HER3, MSPR, Axl, MAP3K(ERK, JNK 및 p38 MAPK) 및 MEKK 키나제들/키나제 수용체 중 하나 이상의 억제제와 병용하여 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료 방법에 관한 것이며; 암은 유방암, 유방암, 결장암, 직장암, 자궁내막암, 위 암종(위장 유암종 및 위장 기질 종양을 포함), 교모세포종, 간세포 암종, 소 세포 폐암, 비-소 세포 폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC), 흑색종, 난소암, 자궁경부암, 췌장암, 전립선 암종, 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병(CML), 비호지킨 림프종, 및 갑상선 암종으로부터 선택된다. 한 양태에서, 억제제는 기능성 핵산일 수 있는 반면, 다른 것에서 이는 항체이다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 발명의 내용에서 정의한 바와 같은 화학식 I의 화합물의 치료적 유효량을 HER3, MSPR, Axl, MAP3K(ERK, JNK 및 p38 MAPK), 및 MEKK 키나제들/키나제 수용체 중 하나 이상의 억제제와 병용하여 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암치료 방법에 관한 것이며; 암은 전립선암, NSCLC, 난소암, 자궁경부암, 유방암, 결장암, 직장암, 및 교모세포종으로부터 선택된다. 한 양태에서, 억제제는 기능성 핵산일 수 있는 반면, 다른 것에서 이는 항체이다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 발명의 내용에서 정의하는 바와 같은 화학식 I의 화합물의 치료적 유효량을 HER3, MSPR, Axl, MAP3K(ERK, JNK 및 p38 MAPK), 및 MEKK 키나제들/키나제 수용체 중 하나 이상과 병용하여 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료 방법에 관한 것이며; 암은 NSCLC, 유방암, 전립선암, 교모세포종, 및 난소암으로부터 선택된다. 한 양태에서, 억제제는 기능성 핵산일 수 있는 반면, 다른 것에서 이는 항체이다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 발명의 내용에서 정의하는 바와 같은 화학식 I의 화합물의 치료적 유효량을 치료와 병용하여 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 암치료 방법에 관한 것이며, 해당 치료는 HER3 수용체 티로신 키나제의 활성 및/또는 발현을 억제하도록 작용 가능한(operable) 하나 이상의 항체의 치료적 유효량을 포함한다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 PI3K의 활성에 의해 적어도 부분적으로 암의 종양 세포의 성장 및/또는 생존이 향상되는 발명의 내용에서 정의하는 바와 같은 화학식 I의 화합물의 치료적 유효량을 HER3, HER2, MSPR, Axl, MAP3K(ERK, JNK 및 p38 MAPK), MEKK 키나제들/키나제 수용체, INSR, IGF-IR 및 FGFR2 키나제들/키나제 수용체 중 하나 이상의 억제제와 병용하여 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료 방법에 관한 것이다. 한 양태에서, 억제제는 기능성 핵산 또는 라파타닙일 수 있는 반면, 다른 것에서 이는 항체이다.
다른 양태에서, 본 발명의 방법은 HER3 억제제와 병용하여 화학식 I의 화합물의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명의 방법은 HER2 억제제와 병용하여 화학식 I의 화합물의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명의 방법은 HER3 억제제 및 HER2 억제제와 병용하여 화학식 I의 화합물의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명의 방법은 라파티닙과 병용하여 화학식 I의 화합물의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명의 방법은 트라스투주맙과 병용하여 화학식 I의 화합물의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명의 방법은 라파티닙 및 트라스투주맙과 병용하여 화학식 I의 화합물의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명의 방법은 HER3 억제제 및 라파티닙과 병용하여 화학식 I의 화합물의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명의 방법은 HER3 억제제 및 트라스투주맙과 병용하여 화학식 I의 화합물의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명의 방법은 HER2 억제제 및 라파티닙과 병용하여 화학식 I의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명의 방법은 HER2 억제제 및 트라스투주맙과 병용하여 화학식 I의 화합물의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명의 방법은 HER3 억제제, HER2 억제제 및 라파티닙과 병용하여 화학식 I의 화합물의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명의 방법은 HER3 억제제, HER2 억제제, 및 트라스투주맙과 병용하여 화학식 I의 화합물의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명의 방법은 HER3 억제제, HER2 억제제, 라파티닙 및 트라스투주맙과 병용하여 화학식 I의 화합물의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 발명의 내용에서 정의하는 바와 같은 화학식 I의 화합물의 치료적 유효량을 HER3, HER2, MSPR, Axl, MAP3K(ERK, JNK 및 p38 MAPK), MEKK 키나제들/키나제 수용체, INSR, IGF-IR, 및 FGFR2 키나제들/키나제 수용체의 억제제 중 하나 이상과 병용하여 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 암치료 방법에 관한 것이며; 암은 유방암 (HER2+ 또는 HER2 과발현 유방암을 포함), 결장암, 직장암, 자궁내막암, 위 암종(위장 유암종 및 위장 기질 종양을 포함), 교모세포종, 간세포 암종, 소 세포 폐암, 비-소 세포 폐암(NSCLC), 흑색종, 난소암, 자궁경부암, 췌장암, 전립선 암종, 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병(CML), 비호지킨 림프종 및 갑상선 암종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 양태에서, 억제제는 기능성 핵산일 수 있는 반면, 억제제는 라파티닙일 수 있다. 다른 실시형태에서, 이는 항체인 반면, 다른 것에서, 억제제는 기능성 핵산의 병용물, 및/또는 라파티닙, 및/또는 항체의 병용물을 포함할 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 발명의 내용에서 정의하는 바와 같은 화학식 I의 화합물의 치료적 유효량을 HER3, HER2, MSPR, Axl, MAP3K(ERK, JNK 및 p38 MAPK), MEKK 키나제들/키나제 수용체, INSR, IGF-IR, 및 FGFR2 키나제들/키나제 수용체 중 하나 이상의 억제제와 병용하여 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료 방법에 관한 것이며; 암은 전립선암, NSCLC, 난소암, 자궁경부암, 위암, 유방암(HER2+ 또는 HER2 과발현 유방암을 포함), 결장암, 직장암 및 교모세포종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 양태에서, 억제제는 기능성 핵산일 수 있는 반면, 다른 것에서, 억제제는 라파티닙일 수 있다. 다른 실시형태에서, 이는 항체일 수 있는 반면, 다른 것에서 억제제는 기능성 핵산의 병용물, 및/또는 라파티닙, 및/또는 항체의 병용물을 포함할 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 발명의 내용에서 정의되는 바와 같은 화학식 I의 화합물의 치료적 유효량을, HER3, HER2, MSPR, Axl, MAP3K(ERK, JNK 및 p38 MAPK), MEKK 키나제들/키나제 수용체, INSR, IGF-IR, 및 FGFR2 키나제들/키나제 수용체 중 하나 이상의 억제제와 병용하여 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료 방법에 관한 것이며; 암은 NSCLC, 유방암, 전립선암, 교모세포종 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 양태에서, 억제제는 기능성 핵산일 수 있으며, 다른 것에서 억제제는 라파티닙일 수 있는 반면, 다른 것에서 이는 항체이지만, 다른 실시형태에서, 억제제는 기능성 핵산의 병용물, 및/또는 라파티닙 및/또는 항체의 병용물을 포함할 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 발명의 내용에서 정의되는 화학식 I의 치료적 유효량을 하나 이상의 기능성 핵산의 치료적 유효량 및/또는 HER2 수용체 티로신 키나제의 활성 및/또는 발현을 억제하도록 작용 가능한 하나 이상의 항체의 치료적 유효량을 포함하는 치료와 병용하여 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료 방법에 관한 것이다.
화학식 I의 화합물
각각의 앞서 언급한 실시형태에 대해, 화학식 I의 화합물은 표 1의 대표적인 화합물로부터 포함하는 어떤 다음의 실시형태로부터 선택된다.
하나의 실시형태는 화학식 I의 화합물에 관한 것이며, W1, W2, W3 및 W4는 -C(R1)=이고; 또는 W1, W2, W3 및 W4 중 1 또는 2개는 독립적으로 -N=이며 나머지는 -C(R1)=이고; 각각의 R1은 독립적으로 수소, 알킬, 할로알킬, 나이트로, 알콕시, 할로알콕시, 할로, 하이드록시, 시아노, 아미노, 알킬아미노 또는 다이알킬아미노이며; 모든 다른 기는 발명의 내용에서 정의된 바와 같다. 다른 실시형태에서, W1, W2, W3 및 W4는 -C(R1)=이고, 각각의 R1은 독립적으로 수소 또는 알킬이며; 또는 W1 및 W4 중 하나는 -N=이고 나머지는 -C(H)=이다. 추가 실시형태에서, W1, W2, W3 및 W4는 -C(R1)=이며, 각각의 R1은 독립적으로 수소 또는 알킬이다. 더 구체적으로는, R1은 수소이다.
다른 실시형태에서, R50은 수소, 알킬, 알케닐, 할로, 할로알킬, 할로알케닐, 하이드록시, 알콕시, 알케닐옥시, 할로알콕시, 나이트로, 아미노, 알킬아미노, 다이알킬아미노, -N(R55)C(O)-C1-C6-알킬렌-N(R55a)R55b, 알킬카보닐, 알케닐카보닐, 카복시, 알콕시카보닐, 시아노, 알킬티오, -S(O)2NR55R55a 또는 알킬카보닐아미노이며; R55 및 R55b는 독립적으로 수소, 알킬 또는 알케닐이고, R55a는 수소, 알킬, 알케닐, 하이드록시 또는 알콕시이며; 모든 다른 기는 발명의 내용에서 정의한 바와 같다. 추가 실시형태에서, R50은 수소이다.
다른 실시형태에서, R51은 수소 또는 알킬이며; 모든 다른 기는 발명의 내용에서 정의한 바와 같다. 추가 실시형태에서, R51은 알킬이다. 더 구체적으로는, R51은 메틸이다.
다른 실시형태에서, R52는 수소 또는 할로이고; 모든 다른 기는 발명의 내용에서 정의한 바와 같다. 추가 실시형태에서 R52는 수소 또는 플루오로이다. 더 구체적으로는, R52는 수소이다.
다른 실시형태에서, R53은 수소, 알킬, 알케닐, 할로, 할로알킬, 할로알케닐, 하이드록시, 알콕시, 알케닐옥시, 할로알콕시, 나이트로, 아미노, 알킬아미노, 다이알킬아미노, -N(R55)C(O)-C1-C6-알킬렌-N(R55a)R55b, 알킬카보닐, 알케닐카보닐, 카복시, 알콕시카보닐, 시아노, 알킬티오, -S(O)2NR55R55a 또는 알킬카보닐아미노이며; R55 및 R55b는 독립적으로 수소, 알킬 또는 알케닐이며, R55a는 수소, 알킬, 알케닐, 하이드록시 또는 알콕시이고; 모든 다른 기는 발명의 내용에서 정의한 바와 같다. 추가 실시형태에서, R53은 수소, 알콕시, 나이트로, 아미노 또는 -N(R55)C(O)-C1-C6-알킬렌-N(R55a)R55b이다. 또 다른 실시형태에서, R53은 수소, 메톡시, 나이트로, 아미노 또는 -NHC(O)CH2N(CH3)2이다. 더 구체적으로는, R53은 수소 또는 메톡시이다.
다른 실시형태에서, R54는 수소, 알킬, 알케닐, 할로, 할로알킬, 할로알케닐, 하이드록시, 알콕시, 알케닐옥시, 할로알콕시, 나이트로, 아미노, 알킬아미노, 다이알킬아미노, -N(R55)C(O)-C1-C6-알킬렌-N(R55a)R55b, 알킬카보닐, 알케닐카보닐, 카복시, 알콕시카보닐, 시아노, 알킬티오, -S(O)2NR55R55a 또는 알킬카보닐아미노이고; R55 및 R55b는 독립적으로 수소, 알킬 또는 알케닐이며, R55a는 수소, 알킬, 알케닐, 하이드록시 또는 알콕시이고; 모든 다른 기는 발명의 내용에서 정의한 바와 같다. 추가 실시형태에서, R54는 수소, 알킬, 알콕시 또는 할로이다. 또 다른 실시형태에서, R54는 수소, 메틸, 메톡시, 브로모 또는 클로로이다. 더 구체적으로는, R54는 수소, 메톡시 또는 클로로이다.
다른 실시형태에서, R50, R52 및 R53은 수소이고, R54는 할로 또는 알콕시이며; R50, R52 및 R54는 수소이고, R53은 알콕시이며; 또는 R50 및 R52는 수소이고, R53 및 R54는 그것들이 부착된 탄소와 함께 6-원 헤테로아릴을 형성하고; 모든 다른 기는 발명의 내용에서 정의하는 바와 같다. 다른 실시형태에서, R50, R52 및 R53은 수소이며, R54는 클로로 또는 메톡시이고; R50, R52 및 R54는 수소이며, R53은 메톡시이고; 또는 R50 및 R52는 수소이며, R53 및 R54는 그것들이 부착된 탄소와 함께 피리디닐을 형성한다. 추가 실시형태에서, R50, R52 및 R53은 수소이고, R54는 클로로 또는 메톡시이며; 또는 R50, R52 및 R54는 수소이고, R53은 메톡시이다. 더 구체적으로는, R51은 메틸이다.
한 실시형태에서, B는 R3a로 치환된 페닐이며, 선택적으로 1, 2 또는 3개의 R3로 추가로 치환되고; 모든 다른 기는 발명의 내용에서 정의하는 바와 같다. 추가 실시형태에서, B는 R3a로 치환된 페닐이다. 더 구체적으로는, 화학식 I의 화합물은 화학식 I(a)의 화합물이다:
[화학식 I(a)]
Figure pct00006
다른 실시형태에서, B는 화학식 I(a)]에서 도시하는 바와 같은 R3a로 치환된 페닐이며, R3으로 추가로 치환되지 않는다.
다른 실시형태에서, B는 선택적으로 1, 2 또는 3개의 R3으로 선택적으로 치환된 헤테로아릴이다. 추가 실시형태에서, B는 티엔-3-일, 피리디닐, 피리미디닐, 피리다지닐, 피라지닐, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 피롤릴, 이미다졸릴, 피라졸릴 또는 티아졸릴이며, 이들 각각은 1 또는 2개의 R3으로 선택적으로 치환된다. 또 다른 실시형태에서, B는 티엔-3-일, 피리딘-2-일, 피리딘-3-일, 피리딘-4-일, 옥사졸-2-일, 옥사졸-4-일, 옥사졸-5-일, 이속사졸-3-일, 이속사졸-4-일, 이속사졸-5-일, 이미다졸-2-일, 피롤-2-일, 피롤-3-일, 이미다졸-4-일, 이미다졸-5-일, 피라졸-3-일, 피라졸-4-일 또는 피라졸-5-일이며, 이들 각각은 1 또는 2개의 R3으로 선택적으로 치환된다. 더 구체적으로는, B는 티엔-3-일, 피리딘-3-일, 피리딘-4-일, 이속사졸-4-일 또는 피라졸-4-일이며, 이들 각각은 1 또는 2개의 R3으로 선택적으로 치환된다. 추가 실시형태에서, B는 피리딘-3-일, 2-하이드록시-피리딘-5-일, 이속사졸-4-일, 또는 피라졸-4-일이며, 이들 각각은 1 또는 2개의 R3으로 선택적으로 치환된다.
한 실시형태에서, R3a은 시아노, 하이드록시아미노, 카복시, 알킬설포닐, 아미노알킬옥시, 알킬아미노알킬옥시, 다이알킬아미노알킬옥시, -N(R7)C(O)-C1-C6-알킬렌-N(R7a)(R7b), -C(O)NR8R8a, -NR9C(O)R9a, -C(O)N(R10)-C1-C6-알킬렌-N(R10a)R10b, -NR11C(O)NR11aR11b, R11a, -C(O)R12, -NR13C(O)OR13a, -C(O)N(R14)N(R14a)(R14b), -S(O)2N(R15)-C1-C6-알킬렌-N(R15a)R15b, -C(O)N(R16)-C1-C6-알킬렌-C(O)OR16a, 1 또는 2개의 아미노알킬, 알킬아미노알킬 또는 다이알킬아미노알킬로 선택적으로 치환된 헤테로아릴, -N(R17)-C(=N(R17b)(R17a))(NR17cR17d), -N(R18)C(O)-C1-C6-알킬렌-N(R18b)C(O)R18a, -C(O)N(R19)-C1-C6-알킬렌-C(O)R19a, -N(R22)C(O)-C1-C6-알킬렌-N(R22b)-N(R22c)(R22a), -C0 -C6-알킬렌-N(R23)-C1-C6-알킬렌-N(R23b)R23a 또는 -NR24C(O)-C1 -C6-알킬렌-OR24a이고; R3a에서 각각의 알킬렌은 독립적으로 할로, 하이드록시, 아미노, 알킬아미노 및 다이알킬아미노로부터 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5개의 기로 선택적으로 추가로 치환되며; 모든 나머지 기는 발명의 내용에서 정의한 바와 같다.
다른 실시형태에서, R3a는
-NHC(O)CH2NH(CH3), -NHC(O)CH2NH(CH2CH3), -NHC(O)CH(CH3)NH2, -NHC(O)C(CH3)2NH2, -NHC(O)CH2N(CH3)2, -NHC(O)CH2N(CH3)CH2CH2N(CH3)2, -NHC(O)CH(NH2)CH2CH3, -NHC(O)CH2N(CH3)CH2CH2N(CH3)2, -NHC(O)CH(CH3)NH(CH3), -NHC(O)CH2NH2, -NHC(O)H, -NHC(O)CH2(아제티딘-1-일), -NHC(O)(피롤리딘-2-일), -NHC(O)CH(NH2)CH2OH, -NHC(O)(아제티딘-4-일), -NHC(O)C(CH3)2NH(CH3), -NH2, -NHC(O)CH2NH(CH2CH2CH3), -NHC(O)CH2CH2NH2, -NHOH, -NHC(O)(피페리딘-3-일), -NHC(O)CH2(4-메틸-1,4-다이아제판-1-일), -NHC(O)CH(NH2)(CH2CH3), -NHC(O)CH2NH(CH2CH(OH)(CH3)), -NHC(O)CH2NHCH2CH2F, -NHC(O)CH2NH(OCH2CH(CH3)2), -NHC(O)(1-아미노사이클로프로프-1-일), -NHC(O)CH2NH(CH2사이클로프로필), -NHC(O)CH2(3-(다이메틸아미노)-아제티딘-1-일), -NHC(O)(피페리딘-2-일), -NHC(O)(모폴린-4-일), -NHC(O)CH2(피롤리딘-1-일), -NHC(O)CH(NH2)CH2CH2CH2CH2N(CH3)2, -NHC(O)CH2N(CH3)(CH2CH3), -NHC(O)CH2(이미다졸-5-일), -NHC(O)(1-아미노사이클로펜트-1-일), -NHC(O)CH2NH(CH2CH(CH3)2), -NHC(O)CH2N(CH3)(CH2CH3), -NHC(O)(N-(이미다졸-4-일메틸)-아제티딘-3-일), -NHC(O)(N-에틸-아제티딘-3-일), -NHCH2N(CH3)CH2CH2N(CH3)2, -NHC(O)CH2N(CH3)(N-메틸-피롤리딘-3-일), -NHC(O)CH2N(CH3)(CH2CH2N(CH3)2), -NHC(O)CH2(3-하이드록시-피롤리딘-1-일), -NHC(O)(1-아미노-사이클로뷰트-1-일), -NHC(O)CH2NH(CH2)3CH3, -NHC(O)CH2(3-피페리딘-1-일아제티딘-1일), -NHC(O)NH2, -NHC(O)(1-하이드록시사이클로프로필), -NHC(O)CH2NHN(CH3)2, -NHC(O)NH(CH2)2N(CH3)2, -NHC(O)CH2OH, -NHC(O)(피리다진-4-일), -NHC(O)(N-메틸-피페리딘-4-일), -NHC(O)CH2NHCH(CH3)3, -NHC(O)CH2(3-다이메틸아미노-피롤리딘-1일), -NHC(O)CH2NH(CH2)2N(CH3)2, -NHC(O)(1-사이클로프로필메틸-아제티딘-3-일), -NHC(O)CH2NH(CH3)3, -NHC(O)(이미다졸-2-일), -NHC(O)(이미다졸-4-일), -NHC(O)(1,2-옥사졸-5-일), -NHC(O)CH2NHCH2CF3, -NHC(O)CH2CH2(피페리딘-1-일), -NHC(O)(3-옥소-사이클로펜트-1-일), -NHC(O)(2-하이드록시-피리딘-6-일), -NHC(O)CH2NH(3-플루오로-4-하이드록시페닐), -NHC(O)(CH2)3N(CH3)2, -NHC(O)(1-(퓨란-2-일메틸)-아제티딘-3-일), -NHC(O)(피리미딘-5-일), -NHC(O)(피롤-2-일), -NHC(O)CH2N(CH3)CH(CH3)2, -NHC(O)CH2N(CH2CH3)2, -NHC(O)CH2(3-메틸-1,2-옥사졸-5-일), -NHC(O)CH2NHCH2(3-하이드록시페닐), -NHC(O)(N-메틸-피롤-2-일), -NHC(O)(2-아미노-테트라하이드로피란-2-일), -NHC(O)CH2(4-메틸아미노-피페리딘-1-일), -NHC(O)(피페리딘-1-일), -NHC(O)(N-메틸-피롤리딘-2일), -NHC(O)(티엔-3일), -NHC(O)(N-(사이클로프로필카보닐)아제티딘-3-일), -NHC(O)CH2(4-메틸피페라진-1-일), -NHC(O)(N-벤질아제티딘-3-일), -NHC(O)(2-클로로-피리딘-3-일), -NHC(O)CH2(피리딘-4-일), -NHC(O)CH2N(CH3)(CH2CH=CH2), -NHC(O)CH2NH(벤질), -NHC(O)CH2OCH3, -NHC(O)[1-(C(O)CH2CH3)-아제티딘-3-일], -NHC(O)(피리딘-3-일), -NHC(O)CH2NHCH2CH2OCH3, -NHC(O)(1-[C(O)CH3]피페리딘-4-일), -NHC(O)CH2(2-메틸-피롤리딘-1-일), -NHC(O)(퓨란-3-일), -NHC(O)CH2N(CH3)2, -NHC(O)(2-클로로-피리딘-5-일), -NHC(O)(2-클로로페닐), -NHC(O)CH2(피리딘-2-일), -NHC(O)CH2(3-다이메틸아미노-아제티딘-1-일), -NHC(O)CH2(피리딘-3-일), -NHC(O)CH2(2-클로로페닐), -NHC(O)CH2N(CH3)CH2CH2CH2N(CH3)2, -NHC(O)CH2N(CH2CH3)CH2CH2OH, -NHC(O)CH2(2-벤질-피롤리딘-1-일), -NHC(O)(퓨란-2-일, -NHC(O)(2-클로로-피리딘-4-일), -NHC(O)CH2NHC(O)CH3, -NHC(O)CH2CH2CH3, -NHC(O)(4-클로로페닐), -NHC(O)(4-메틸-페닐), -NHC(O)CH2NHC(O)O(CH3)3, -NHC(O)(벤조[d][1,3]다이옥솔-5-일), -NHC(O)CH2NHOCH2(2-메톡시페닐), -NHC(O)(피리딘-4-일), -NHC(O)CH2[4-(3,4-다이클로로페닐)-피페라진-1-일], -NHC(O)CH2CH2(피리딘-3-일), -NHC(O)(테트라하이드로퓨란-3-일), -NHC(O)CH2NHCH2(2-메틸페닐), -NHC(O)CH(CH3)CH2CH3, -NHC(O)CH2(3-플루오로페닐), -NHC(O)CH2C(CH3)2페닐, -NHC(O)(2-메틸-사이클로프로프-1-일), -NHC(O)(2-메틸-4-메톡시페닐), -NHC(O)(2-메틸피리딘-3-일), -NHC(O)(4-메톡시페닐), -NHC(O)CH2(4-에틸피페라진-1-일), -NHC(O)(티엔-2-일), -NHC(O)(3-플루오로-2-메틸페닐), -NHC(O)(2-브로모-티엔-3-일), -NHC(O)(4-플루오로페닐), -NHC(O)CH2(3-메틸피페리딘-1-일), -NHC(O)CH(CH3)2, -NHC(O)(CH2)3CH3, -NHC(O)CH2OCH2CH3, -NHC(O)CH2NH(2-플루오로페닐), -NHC(O)(3-다이메틸아미노페닐), -NHC(O)CH2(4-메틸피페리딘-1-일), -NHC(O)CH2NH(2-n-프로필페닐), -NHC(O)페닐, -NHC(O)(pyrazin2-일), -NHC(O)(3-플루오로-4-메톡시페닐), -NHC(O)C(CH3)2CH2CH3, -NHC(O)CH2O(4-플루오로페닐), -NHC(O)(1-메틸카보닐-아제티딘-3-일), -NHC(O)CH2NH(4-메틸페닐), -NHC(O)CH2NH(페닐), -NHC(O)CH2(4-알릴-피페라진-1-일), -NHC(O)(2-메틸페닐), -NHC(O)CH2CH2OCH3, -NHC(O)(3-메틸-퓨란-2-일), -NHC(O)C(CH3)3, -NHC(O)CH2NHO벤질, -NHC(O)CH2NH(3-클로로페닐), --NHC(O)사이클로뷰틸, -NHC(O)CH2(3-메톡시페닐), -NHC(O)(1-메틸사이클로프로프-1-일), -NHC(O)(3-플루오로페닐), -NHC(O)(4-다이메틸아미노페닐), -NHC(O)(3,4-다이클로로페닐), -NHC(O)CH2NHCH2(2-메틸티오페닐), -NHC(O)CH2(2-플루오로페닐), -NHC(O)CH2N(CH2CH3)CH(CH3)2, -NHC(O)(티아졸-4-일), -NHC(O)CH2N(CH3)벤질, -NHC(O)CH2NHCH2(티엔-2-일), -NHC(O)CH2NHCH2(피리딘-2-일), -NHC(O)(3-메톡시페닐), -NHC(O)CH2NHCH2(3-클로로-4-메틸페닐), -NHC(O)CH(CH3)CH2CH2CH3, -NHC(O)CH2(4-클로로페닐), -NHC(O)(3-플루오로-4-메틸페닐), -NHC(O)CH2O(2-메틸페닐), -NHC(O)CH2(사이클로헥실), -NHC(O)(2-페닐-사이클로프로프-1-일), -NHC(O)(3-클로로페닐), -NHC(O)CH2(2-메톡시페닐), -NHC(O)CH2CH2(3-메톡시페닐), -NHC(O)CH2NH(2-플루오로-4-메틸-페닐), -NHC(O)CH2NHCH2(3-플루오로-페닐), -NHC(O)CH2(4-메톡시-페닐), -NHC(O)벤질, -NHC(O)(2,4-다이클로로페닐), -NHC(O)(3-옥소-사이클로헥스-1-일), -NHC(O)CH2NH(3-플루오로페닐), -NHC(O)CH2(3-클로로페닐), -NHC(O)CH2NHCH2CH(CH3)페닐, -NHC(O)CH2NHCH2(2,4-다이메틸페닐), -NHC(O)CH2(2-메틸-피페리딘-1-일), -NHC(O)CH2NH(2-메톡시페닐), -NHC(O)CH2(1,2,3,4-테트라하이드로아이소퀴놀린-2-일), -NHC(O)CH2CH2CH=CH2, -NHC(O)CH2NH(2-메틸페닐), -NHC(O)CH2(4-옥소-피페리딘-1-일), -NHC(O)(2-플루오로페닐), -NHC(O)CH2NHCH(CH3)페닐, -NHC(O)(2-플루오로-6-메톡시페닐), -NHC(O)CH2NH(2-아이소프로필페닐), -NHC(O)CH2CH2(2-메톡시페닐), -NHC(O)CH2CH2CH(CH3)2, -NHC(O)CH2(2-페닐-모폴린-4-일), -NHC(O)CH2CH2(4-메톡시페닐), -NHC(O)CH2N(all일)사이클로펜틸, -NHC(O)CH2N(CH3)CH2CH2OCH3, -NHC(O)CH2CH2C(O)사이클로프로필, -NHC(O)CH2NH(3-tert-뷰틸페닐), -NHC(O)CH2N(n-프로필)(사이클로프로필메틸), -NHC(O)CH2(2-옥소-사이클로펜틸), -NHC(O)CH2NH(4-클로로페닐), -NHC(O)CH2(4-피페리딘-1-일피페리딘-1-일), -NHC(O)CH2(4-사이클로펜틸피페라진-1-일), -NHC(O)CH2(2-메틸페닐), -NHC(O)CH2NHCH2(3-플루오로-6-메틸페닐), -NHC(O)CH2C(CH3)3, -NHC(O)CH2NH(2-클로로페닐), -NHC(O)(3-플루오로-6-메틸페닐), -NHC(O)(4-플루오로-3-메틸페닐), -NHC(O)(2,3-다이클로로페닐), -NHC(O)CH2O페닐, -NHC(O)CH2NH(2,3-다이메틸페닐), -NHC(O)(2-플루오로-5-메틸페닐), -NHC(O)CH2NHOCH2(4-메틸페닐), -NHC(O)CH2(4-아이소프로필피페라진-1-일), -NHC(O)CH2(4-플루오로페닐), -NHC(O)CH2CH(CH3)2, -NHC(O)(2-메톡시-4-메틸페닐), -NHC(O)CH2(4-n-프로필피페리딘-1-일), -NHC(O)CH2O(3-메틸페닐), -NHC(O)(테트라하이드로퓨란-2-일), -NHC(O)CH2(3-하이드록시메틸피페리딘-1-일), -NHC(O)(1-tert-뷰톡시카보닐피페리딘-2-일), -NHC(O)CH2N(CH3)CH2(피리딘-3-일), -NHC(O)CH2N(CH2CH3)페닐, -NHC(O)CH2OCH2CH2OCH3, -NHC(O)CH2CH2(사이클로펜틸), -NHC(O)(2,5-다이클로로페닐), -NHC(O)CH2(4-메틸카보닐피페라진-1-일), -NHC(O)(5-플루오로-2-메톡시페닐), -NHC(O)CH2N(CH2CH3)사이클로헥실, -NHC(O)(5-메틸-1,2-옥사졸-3-일), -NHC(O)(3-메틸피리딘-3-일), -NHC(O)(2-메톡시피리딘-3-일), -NHC(O)(3,5-다이클로로페닐), -NHC(O)CH2(티아졸리딘3-일), -NHC(O)CH2(4-[C(O)H]-피페라진-1-일), -NHC(O)CH2(2-피리딘-4-일피페리딘-1-일), -NHC(O)(2-메톡시페닐), -NHC(O)CH2N(CH3)CH2CH(CH3)2, -NHC(O)CH2(4-[C(O)H]-호모피페라진-1-일), -NHC(O)(1-페닐사이클로프로프-1-일), -NHC(O)CH2(2,6-다이메틸모폴린-4-일), NHC(O)CH2(2-페닐피롤리딘-1-일), -NHC(O)CH2(모폴린-4-일), -C(O)NHCH(CH3)CH2N(CH3)2, -C(O)NHCH2CH2N(CH3)2, -C(O)NH(피롤리딘-3-일), -C(O)NHCH2CH2(피롤리딘-1-일), -C(O)NHCH2CH2NH2, -C(O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)2, -C(O)NHCH2(피페리딘-2-일), -C(O)NH(1-메틸아제티딘-3-일), -C(O)NHCH2CH2(피페리딘-1-일), -C(O)NHCH2CH2N(CH2CH3)2, -C(O)NH(1-메틸피페리딘-3-일), -C(O)NH(피페리딘-3-일), -C(O)NHCH2(1-메틸피페리딘-3-일), -C(O)NHCH2CH2N(CH2CH2OH)2, -C(O)NH(1-에틸피페리딘-3-일), -C(O)NH2, -C(O)(3-아미노피롤리딘-1-일), -C(O)(3-메틸아미노피롤리딘-1-일), -C(O)OH, -C(O)NHCH2CH2(모폴린-4-일), -C(O)NHCH2(1-에틸피롤리딘-2-일), -C(O)(4-아미노-3-옥소-피라졸리딘-1-일), -C(O)NHCH3, -C(O)(3-아미노사이클로뷰트-1-일), -C(O)NHCH2(피리딘-3-일), -C(O)NHCH2CH2OH, -C(O)NH(3-옥소-피라졸리딘-4-일), -NHCH2CH2(이미다졸-4-일), -C(O)(3-다이메틸아미노피롤리딘-1-일), -C(O)NHCH2(피리딘-4-일), -C(O)N(CH3)(1-메틸-피롤리딘-3-일), -C(O)(3-다이에틸아미노피롤리딘-1-일), -C(O)NH(피롤-1-일), -C(O)NHCH2CH2CH2(피롤리딘-1-일), -C(O)N(CH3)CH2CH2CN, -C(O)NHCH2CH2OCH3, -C(O)N(CH2CH3)CH2CH2CN, -C(O)(3-아미노피페리딘-1-일), -C(O)NHCH2CH2CH2N(CH3)2, -C(O)NH(모폴린-4-일), -C(O)NHN(CH3)2, -C(O)NHCH2CH2CH2(이미다졸-1-일), -C(O)NHCH2CH2CH2N(CH2CH3)2, -C(O)NHCH2CH2CN, -C(O)NHCH2CH2C(O)OCH3, -C(O)NHCH2CH2SCH3, -(O)NHCH2CH2SCH2CH3, -C(O)N(CH2CH3)CH2CH2N(CH3)2, -C(O)NHCH2CH2CH2(2-옥소-피롤리딘-1-일), -C(O)NHCH2CH2(피리딘-4-일), -C(O)NHCH2CH2CH2OCH2CH3, -C(O)NHCH2CH2CH2(모폴린-4-일), -C(O)NHCH2CH2CH2OCH3, -C(O)N(CH3)CH2CH2CH2N(CH3)2, -C(O)NHCH2CH2CH2OCH2CH2CH3, -C(O)NHCH2CH2C(O)OCH2CH3, -C(O)NHCH2CH2CH2OCH(CH3)2, -C(O)NHC(CH3)2CH2(피페리딘-1-일), -C(O)N(CH3)CH2CH2CH3, -C(O)NH(피페리딘-1-일), -C(O)NHCH(CH3)CH2OCH3, -C(O)NHC(CH3)2CH2(모폴린-4-일), -C(O)(2-다이메틸아미노메틸피페리딘-1-일), -C(O)NH(CH2)3O(CH2)3CH3, -C(O)NHCH(CH3)(CH2)3N(CH2CH3)2, -C(O)NHC(CH3)2C(O)(피페리딘-1-일), -C(O)(4-메틸피페라진-1-일), -C(O)(2-피페리딘-1-일메틸-피페리딘-1-일), 시아노, -NHCH3, -CH(CH3)NHCH2CH2N(CH3)2, -C(O)CH3, -S(O)2NHCH2CH2N(CH3)2, -S(O)2NH(CH2)3N(CH3)2, 5-(N,N-다이메틸아미노메틸)-1,3,4-옥사디아졸-2-일, -NHCH2CH2N(CH3)2, -N(CH3)2, -OCH2CH2N(CH3)2, -NHC[N(CH3)2][=N(CH3)2], -OCHF2, -S(O)2CH3, -OCF3 또는 -NHC(O)CH2(4-다이메틸아미노피페리딘-1-일)이다.
다른 실시형태에서, R3a는 하이드록시아미노, -N(R7)C(O)-C1-C6-알킬렌-N(R7a)(R7b), -C(O)NR8R8a, -NR9C(O)R9a, -C(O)N(R10)-C1-C6-알킬렌-N(R10a)R10b, -NR11C(O)NR11aR11b, -N(R22)C(O)-C1-C6-알킬렌-N(R22b)-N(R22c)(R22a), -NR13C(O)OR13a, -N(R18)C(O)-C1-C6-알킬렌-N(R18b)C(O)R18a, -NR24C(O)-C1 -C6-알킬렌-OR24a 또는 -N(R20)C(O)-C1-C6-알킬렌-C(O)R20a이며; R3a 내 각각의 알킬렌은 독립적으로 할로, 하이드록시 및 아미노로부터 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5개의 기로 선택적으로 추가로 치환되고; 모든 다른 기는 발명의 내용에서 정의한 바와 같다. 추가 실시형태에서, R3a는 -NHC(O)CH2NH(CH3), -NHC(O)CH(CH3)NH2, -NHC(O)C(CH3)2NH2, -NHC(O)CH2N(CH3)2, -NHC(O)CH2N(CH3)CH2CH2N(CH3)2, -NHC(O)CH(NH2)CH2CH3, -NHC(O)CH2N(CH3)CH2CH2N(CH3)2, -NHC(O)CH(CH3)NH(CH3), -NHC(O)H, -NHC(O)CH2(아제티딘-1-일), -NHC(O)(피롤리딘-2-일), -NHC(O)CH(NH2)CH2OH, -NHC(O)(아제티딘-4-일), -NHC(O)C(CH3)2NH(CH3), -NH2, -NHC(O)CH2NH(CH2CH2CH3), -NHC(O)CH2CH2NH2, -NHOH, 또는 -NHC(O)(피페리딘-3-일)이다.
다른 실시형태에서, R3a는 -N(R7)C(O)-C1-C6-알킬렌-N(R7a)(R7b)이고; R7은 수소 또는 알킬이며, R7a 및 R7b는 독립적으로 수소, 알킬, 아미노알킬, 알킬아미노알킬 또는 다이알킬아미노알킬이고; 모든 다른 기는 발명의 내용에서 정의한 바와 같다. 추가 실시형태에서, R3a는 -NHC(O)CH2NH(CH3), -NHC(O)CH(CH3)NH2, -NHC(O)C(CH3)2NH2, -NHC(O)CH2N(CH3)2, -NHC(O)CH2N(CH3)CH2CH2N(CH3)2, -NHC(O)CH(NH2)CH2CH3, -NHC(O)CH2N(CH3)CH2CH2N(CH3)2 또는 -NHC(O)CH(CH3)NH(CH3)이다.
한 실시형태에서, 각각의 R3은 독립적으로 할로, 시아노, 알킬, 알케닐, 알콕시, 하이드록시아미노, 카복시, 알킬설포닐, 아미노알킬옥시, 알킬아미노알킬옥시, 다이알킬아미노알킬옥시, -N(R7)C(O)-C1-C6-알킬렌-N(R7a)(R7b), -C(O)NR8R8a, -NR9C(O)R9a, -C(O)N(R10)-C1-C6-알킬렌-N(R10a)R10b, -NR11C(O)NR11aR11b, R11a, -C(O)R12, -NR13C(O)OR13a, -C(O)N(R14)N(R14a)(R14b), -S(O)2N(R15)-C1-C6-알킬렌-N(R15a)R15b, -C(O)N(R16)-C1-C6-알킬렌-C(O)OR16a, 1 또는 2개의 아미노알킬, 알킬아미노알킬 또는 다이알킬아미노알킬로 선택적으로 치환된 헤테로아릴, -N(R17)-C(=N(R17b)(R17a))(NR17cR17d), -N(R18)C(O)-C1-C6-알킬렌-N(R18b)C(O)R18a, -C(O)N(R19)-C1-C6-알킬렌-C(O)R19a, -N(R22)C(O)-C1-C6-알킬렌-N(R22b)-N(R22c)(R22a), -C0 -C6-알킬렌-N(R23)-C1-C6-알킬렌-N(R23b)R23a 또는 -NR24C(O)-C1 -C6-알킬렌-OR24a이고; R3의 각각의 알킬렌은 독립적으로 할로, 하이드록시, 아미노, 알킬아미노 및 다이알킬아미노로부터 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5개의 기로 선택적으로 추가로 치환되며; 모든 다른 기는 발명의 내용에서 정의한 바와 같다.
추가 실시형태에서, 각각의 R3은 독립적으로 메틸, 브로모, 클로로, 플루오로, -NHC(O)CH2NH(CH3), -NHC(O)CH2NH(CH2CH3), -NHC(O)CH(CH3)NH2, -NHC(O)C(CH3)2NH2, -NHC(O)CH2N(CH3)2, -NHC(O)CH2N(CH3)CH2CH2N(CH3)2, -NHC(O)CH(NH2)CH2CH3, -NHC(O)CH2N(CH3)CH2CH2N(CH3)2, -NHC(O)CH(CH3)NH(CH3), -NHC(O)CH2NH2, -NHC(O)H, -NHC(O)CH2(아제티딘-1-일), -NHC(O)(피롤리딘-2-일), -NHC(O)CH(NH2)CH2OH, -NHC(O)(아제티딘-4-일), -NHC(O)C(CH3)2NH(CH3), -NH2, -NHC(O)CH2NH(CH2CH2CH3), -NHC(O)CH2CH2NH2, -NHOH, -NHC(O)(피페리딘-3-일), -NHC(O)CH2(4-메틸-1,4-다이아제판-1-일), -NHC(O)CH(NH2)(CH2CH3), -NHC(O)CH2NH(CH2CH(OH)(CH3)), -NHC(O)CH2NHCH2CH2F, -NHC(O)CH2NH(OCH2CH(CH3)2), -NHC(O)(1-아미노사이클로프로프-1-일), -NHC(O)CH2NH(CH2사이클로프로필), -NHC(O)CH2(3-(다이메틸아미노)-아제티딘-1-일), -NHC(O)(피페리딘-2-일), -NHC(O)(모폴린-4-일), -NHC(O)CH2(피롤리딘-1-일), -NHC(O)CH(NH2)CH2CH2CH2CH2N(CH3)2, -NHC(O)CH2N(CH3)(CH2CH3), -NHC(O)CH2(이미다졸-5-일), -NHC(O)(1-아미노사이클로펜트-1-일), -NHC(O)CH2NH(CH2CH(CH3)2), -NHC(O)CH2N(CH3)(CH2CH3), -NHC(O)(N-(이미다졸-4-일메틸)-아제티딘-3-일), -NHC(O)(N-에틸-아제티딘-3-일), -NHCH2N(CH3)CH2CH2N(CH3)2, -NHC(O)CH2N(CH3)(N-메틸-피롤리딘-3-일), -NHC(O)CH2N(CH3)(CH2CH2N(CH3)2), -NHC(O)CH2(3-하이드록시-피롤리딘-1-일), -NHC(O)(1-아미노-사이클로뷰트-1-일), -NHC(O)CH2NH(CH2)3CH3, -NHC(O)CH2(3-피페리딘-1-일아제티딘-1일), -NHC(O)NH2, -NHC(O)(1-하이드록시사이클로프로필), -NHC(O)CH2NHN(CH3)2, -NHC(O)NH(CH2)2N(CH3)2, -NHC(O)CH2OH, -NHC(O)(피리다진-4-일), -NHC(O)(N-메틸-피페리딘-4-일), -NHC(O)CH2NHCH(CH3)3, -NHC(O)CH2(3-다이메틸아미노-피롤리딘-1일), -NHC(O)CH2NH(CH2)2N(CH3)2, -NHC(O)(1-사이클로프로필메틸-아제티딘-3-일), -NHC(O)CH2NH(CH3)3, -NHC(O)(이미다졸-2-일), -NHC(O)(이미다졸-4-일), -NHC(O)(1,2-옥사졸-5-일), -NHC(O)CH2NHCH2CF3, -NHC(O)CH2CH2(피페리딘-1-일), -NHC(O)(3-옥소-사이클로펜트-1-일), -NHC(O)(2-하이드록시-피리딘-6-일), -NHC(O)CH2NH(3-플루오로-4-하이드록시페닐), -NHC(O)(CH2)3N(CH3)2, -NHC(O)(1-(퓨란-2-일메틸)-아제티딘-3-일), -NHC(O)(피리미딘-5-일), -NHC(O)(피롤-2-일), -NHC(O)CH2N(CH3)CH(CH3)2, -NHC(O)CH2N(CH2CH3)2, -NHC(O)CH2(3-메틸-1,2-옥사졸-5-일), -NHC(O)CH2NHCH2(3-하이드록시페닐), -NHC(O)(N-메틸-피롤-2-일), -NHC(O)(2-아미노-테트라하이드로피란-2-일), -NHC(O)CH2(4-메틸아미노-피페리딘-1-일), -NHC(O)(피페리딘-1-일), -NHC(O)(N-메틸-피롤리딘-2일), -NHC(O)(티엔-3일), -NHC(O)(N-(사이클로프로필카보닐)아제티딘-3-일), -NHC(O)CH2(4-메틸피페라진-1-일), -NHC(O)(N-벤질아제티딘-3-일), -NHC(O)(2-클로로-피리딘-3-일), -NHC(O)CH2(피리딘-4-일), -NHC(O)CH2N(CH3)(CH2CH=CH2), -NHC(O)CH2NH(벤질), -NHC(O)CH2OCH3, -NHC(O)[1-(C(O)CH2CH3)-아제티딘-3-일], -NHC(O)(피리딘-3-일), -NHC(O)CH2NHCH2CH2OCH3, -NHC(O)(1-[C(O)CH3]피페리딘-4-일), -NHC(O)CH2(2-메틸-피롤리딘-1-일), -NHC(O)(퓨란-3-일), -NHC(O)CH2N(CH3)2, -NHC(O)(2-클로로-피리딘-5-일), -NHC(O)(2-클로로페닐), -NHC(O)CH2(피리딘-2-일), -NHC(O)CH2(3-다이메틸아미노-아제티딘-1-일), -NHC(O)CH2(피리딘-3-일), -NHC(O)CH2(2-클로로페닐), -NHC(O)CH2N(CH3)CH2CH2CH2N(CH3)2, -NHC(O)CH2N(CH2CH3)CH2CH2OH, -NHC(O)CH2(2-벤질-피롤리딘-1-일), -NHC(O)(퓨란-2-일, -NHC(O)(2-클로로-피리딘-4-일), -NHC(O)CH2NHC(O)CH3, -NHC(O)CH2CH2CH3, -NHC(O)(4-클로로페닐), -NHC(O)(4-메틸-페닐), -NHC(O)CH2NHC(O)O(CH3)3, -NHC(O)(벤조[d][1,3]다이옥솔-5-일), -NHC(O)CH2NHOCH2(2-메톡시페닐), -NHC(O)(피리딘-4-일), -NHC(O)CH2[4-(3,4-다이클로로페닐)-피페라진-1-일], -NHC(O)CH2CH2(피리딘-3-일), -NHC(O)(테트라하이드로퓨란-3-일), -NHC(O)CH2NHCH2(2-메틸페닐), -NHC(O)CH(CH3)CH2CH3, -NHC(O)CH2(3-플루오로페닐), -NHC(O)CH2C(CH3)2페닐, -NHC(O)(2-메틸-사이클로프로프-1-일), -NHC(O)(2-메틸-4-메톡시페닐), -NHC(O)(2-메틸피리딘-3-일), -NHC(O)(4-메톡시페닐), -NHC(O)CH2(4-에틸피페라진-1-일), -NHC(O)(티엔-2-일), -NHC(O)(3-플루오로-2-메틸페닐), -NHC(O)(2-브로모-티엔-3-일), -NHC(O)(4-플루오로페닐), -NHC(O)CH2(3-메틸피페리딘-1-일), -NHC(O)CH(CH3)2, -NHC(O)(CH2)3CH3, -NHC(O)CH2OCH2CH3, -NHC(O)CH2NH(2-플루오로페닐), -NHC(O)(3-다이메틸아미노페닐), -NHC(O)CH2(4-메틸피페리딘-1-일), -NHC(O)CH2NH(2-n-프로필페닐), -NHC(O)페닐, -NHC(O)(pyrazin2-일), -NHC(O)(3-플루오로-4-메톡시페닐), -NHC(O)C(CH3)2CH2CH3, -NHC(O)CH2O(4-플루오로페닐), -NHC(O)(1-메틸카보닐-아제티딘-3-일), -NHC(O)CH2NH(4-메틸페닐), -NHC(O)CH2NH(페닐), -NHC(O)CH2(4-알릴-피페라진-1-일), -NHC(O)(2-메틸페닐), -NHC(O)CH2CH2OCH3, -NHC(O)(3-메틸-퓨란-2-일), -NHC(O)C(CH3)3, -NHC(O)CH2NHO벤질, -NHC(O)CH2NH(3-클로로페닐), -NHC(O)사이클로뷰틸, -NHC(O)CH2(3-메톡시페닐), -NHC(O)(1-메틸사이클로프로프-1-일), -NHC(O)(3-fluro페닐), -NHC(O)(4-다이메틸아미노페닐), -NHC(O)(3,4-다이클로로페닐), -NHC(O)CH2NHCH2(2-메틸티오페닐), -NHC(O)CH2(2-플루오로페닐), -NHC(O)CH2N(CH2CH3)CH(CH3)2, -NHC(O)(티아졸-4-일), -NHC(O)CH2N(CH3)벤질, -NHC(O)CH2NHCH2(티엔-2-일), -NHC(O)CH2NHCH2(피리딘-2-일), -NHC(O)(3-메톡시페닐), -NHC(O)CH2NHCH2(3-클로로-4-메틸페닐), -NHC(O)CH(CH3)CH2CH2CH3, -NHC(O)CH2(4-클로로페닐), -NHC(O)(3-플루오로-4-메틸페닐), -NHC(O)CH2O(2-메틸페닐), -NHC(O)CH2(사이클로헥실), -NHC(O)(2-페닐-사이클로프로프-1-일), -NHC(O)(3-클로로페닐), -NHC(O)CH2(2-메톡시페닐), -NHC(O)CH2CH2(3-메톡시페닐), -NHC(O)CH2NH(2-플루오로-4-메틸-페닐), -NHC(O)CH2NHCH2(3-플루오로-페닐), -NHC(O)CH2(4-메톡시-페닐), -NHC(O)벤질, -NHC(O)(2,4-다이클로로페닐), -NHC(O)(3-옥소-사이클로헥스-1-일), -NHC(O)CH2NH(3-플루오로페닐), -NHC(O)CH2(3-클로로페닐), -NHC(O)CH2NHCH2CH(CH3)페닐, -NHC(O)CH2NHCH2(2,4-다이메틸페닐), -NHC(O)CH2(2-메틸-피페리딘-1-일), -NHC(O)CH2NH(2-메톡시페닐), -NHC(O)CH2(1,2,3,4-테트라하이드로아이소퀴놀린-2-일), -NHC(O)CH2CH2CH=CH2, -NHC(O)CH2NH(2-메틸페닐), -NHC(O)CH2(4-옥소-피페리딘-1-일), -NHC(O)(2-플루오로페닐), -NHC(O)CH2NHCH(CH3)페닐, -NHC(O)(2-플루오로-6-메톡시페닐), -NHC(O)CH2NH(2-아이소프로필페닐), -NHC(O)CH2CH2(2-메톡시페닐), -NHC(O)CH2CH2CH(CH3)2, -NHC(O)CH2(2-페닐-모폴린-4-일), -NHC(O)CH2CH2(4-메톡시페닐), -NHC(O)CH2N(all일)사이클로펜틸, -NHC(O)CH2N(CH3)CH2CH2OCH3, -NHC(O)CH2CH2C(O)사이클로프로필, -NHC(O)CH2NH(3-tert-뷰틸페닐), -NHC(O)CH2N(n-프로필)(사이클로프로필메틸), -NHC(O)CH2(2-옥소-사이클로펜틸), -NHC(O)CH2NH(4-클로로페닐), -NHC(O)CH2(4-피페리딘-1-일피페리딘-1-일), -NHC(O)CH2(4-사이클로펜틸피페라진-1-일), -NHC(O)CH2(2-메틸페닐), -NHC(O)CH2NHCH2(3-플루오로-6-메틸페닐), -NHC(O)CH2C(CH3)3, -NHC(O)CH2NH(2-클로로페닐), -NHC(O)(3-플루오로-6-메틸페닐), -NHC(O)(4-플루오로-3-메틸페닐), -NHC(O)(2,3-다이클로로페닐), -NHC(O)CH2O페닐, -NHC(O)CH2NH(2,3-다이메틸페닐), -NHC(O)(2-플루오로-5-메틸페닐), -NHC(O)CH2NHOCH2(4-메틸페닐), -NHC(O)CH2(4-아이소프로필피페라진-1-일), -NHC(O)CH2(4-플루오로페닐), -NHC(O)CH2CH(CH3)2, -NHC(O)(2-메톡시-4-메틸페닐), -NHC(O)CH2(4-n-프로필피페리딘-1-일), -NHC(O)CH2O(3-메틸페닐), -NHC(O)(테트라하이드로퓨란-2-일), -NHC(O)CH2(3-하이드록시메틸피페리딘-1-일), -NHC(O)(1-tert-뷰톡시카보닐피페리딘-2-일), -NHC(O)CH2N(CH3)CH2(피리딘-3-일), -NHC(O)CH2N(CH2CH3)페닐, -NHC(O)CH2OCH2CH2OCH3, -NHC(O)CH2CH2(사이클로펜틸), -NHC(O)(2,5-다이클로로페닐), -NHC(O)CH2(4-메틸카보닐피페라진-1-일), -NHC(O)(5-플루오로-2-메톡시페닐), -NHC(O)CH2N(CH2CH3)사이클로헥실, -NHC(O)(5-메틸-1,2-옥사졸-3-일), -NHC(O)(3-메틸피리딘-3-일), -NHC(O)(2-메톡시피리딘-3-일), -NHC(O)(3,5-다이클로로페닐), -NHC(O)CH2(티아졸리딘3-일), -NHC(O)CH2(4-[C(O)H]-피페라진-1-일), -NHC(O)CH2(2-피리딘-4-일피페리딘-1-일), -NHC(O)(2-메톡시페닐), -NHC(O)CH2N(CH3)CH2CH(CH3)2, -NHC(O)CH2(4-[C(O)H]-homo피페라진-1-일), -NHC(O)(1-페닐사이클로프로프-1-일), -NHC(O)CH2(2,6-다이메틸모폴린-4-일), NHC(O)CH2(2-페닐피롤리딘-1-일), -NHC(O)CH2(모폴린-4-일), -C(O)NHCH(CH3)CH2N(CH3)2, -C(O)NHCH2CH2N(CH3)2, -C(O)NH(피롤리딘-3-일), -C(O)NHCH2CH2(피롤리딘-1-일), -C(O)NHCH2CH2NH2, -C(O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)2, -C(O)NHCH2(피페리딘-2-일), -C(O)NH(1-메틸아제티딘-3-일), -C(O)NHCH2CH2(피페리딘-1-일), -C(O)NHCH2CH2N(CH2CH3)2, -C(O)NH(1-메틸피페리딘-3-일), -C(O)NH(피페리딘-3-일), -C(O)NHCH2(1-메틸피페리딘-3-일), -C(O)NHCH2CH2N(CH2CH2OH)2, -C(O)NH(1-에틸피페리딘-3-일), -C(O)NH2, -C(O)(3-아미노피롤리딘-1-일), -C(O)(3-메틸아미노피롤리딘-1-일), -C(O)OH, -C(O)NHCH2CH2(모폴린-4-일), -C(O)NHCH2(1-에틸피롤리딘-2-일), -C(O)(4-아미노-3-옥소-피라졸리딘-1-일), -C(O)NHCH3, -C(O)(3-아미노사이클로뷰트-1-일), -C(O)NHCH2(피리딘-3-일), -C(O)NHCH2CH2OH, -C(O)NH(3-옥소-피라졸리딘-4-일), -NHCH2CH2(이미다졸-4-일), -C(O)(3-다이메틸아미노피롤리딘-1-일), -C(O)NHCH2(피리딘-4-일), -C(O)N(CH3)(1-메틸-피롤리딘-3-일), -C(O)(3-다이에틸아미노피롤리딘-1-일), -C(O)NH(피롤-1-일), -C(O)NHCH2CH2CH2(피롤리딘-1-일), -C(O)N(CH3)CH2CH2CN, -C(O)NHCH2CH2OCH3, -C(O)N(CH2CH3)CH2CH2CN, -C(O)(3-아미노피페리딘-1-일), -C(O)NHCH2CH2CH2N(CH3)2, -C(O)NH(모폴린-4-일), -C(O)NHN(CH3)2, -C(O)NHCH2CH2CH2(이미다졸-1-일), -C(O)NHCH2CH2CH2N(CH2CH3)2, -C(O)NHCH2CH2CN, -C(O)NHCH2CH2C(O)OCH3, -C(O)NHCH2CH2SCH3, -C(O)NHCH2CH2SCH2CH3, -C(O)N(CH2CH3)CH2CH2N(CH3)2, -C(O)NHCH2CH2CH2(2-옥소-피롤리딘-1-일), -C(O)NHCH2CH2(피리딘-4-일), -C(O)NHCH2CH2CH2OCH2CH3, -C(O)NHCH2CH2CH2(모폴린-4-일), -C(O)NHCH2CH2CH2OCH3, -C(O)N(CH3)CH2CH2CH2N(CH3)2, -C(O)NHCH2CH2CH2OCH2CH2CH3, -C(O)NHCH2CH2C(O)OCH2CH3, -C(O)NHCH2CH2CH2OCH(CH3)2, -C(O)NHC(CH3)2CH2(피페리딘-1-일), -C(O)N(CH3)CH2CH2CH3, -C(O)NH(피페리딘-1-일), -C(O)NHCH(CH3)CH2OCH3, -C(O)NHC(CH3)2CH2(모폴린-4-일), -C(O)(2-다이메틸아미노메틸피페리딘-1-일), -C(O)NH(CH2)3O(CH2)3CH3, -C(O)NHCH(CH3)(CH2)3N(CH2CH3)2, -C(O)NHC(CH3)2C(O)(피페리딘-1-일), -C(O)(4-메틸피페라진-1-일), -C(O)(2-피페리딘-1-일메틸-피페리딘-1-일), 시아노, -NHCH3, -CH(CH3)NHCH2CH2N(CH3)2, -C(O)CH3, -S(O)2NHCH2CH2N(CH3)2, -S(O)2NH(CH2)3N(CH3)2, 5-(N,N-다이메틸아미노메틸)-1,3,4-옥사디아졸-2-일, -NHCH2CH2N(CH3)2, -N(CH3)2, -OCH2CH2N(CH3)2, -NHC[N(CH3)2][=N(CH3)2], -OCHF2, -CF3, -S(O)2CH3, -OCF3, -NHC(O)CH2(4-다이메틸아미노피페리딘-1-일) 또는 메톡시이다.
다른 실시형태에서, 각각의 R3은 독립적으로 할로, 알킬, 하이드록시아미노, -N(R7)C(O)-C1-C6-알킬렌-N(R7a)(R7b), -C(O)NR8R8a, -NR9C(O)R9a, -C(O)N(R10)-C1-C6-알킬렌-N(R10a)R10b-NR11C(O)NR11aR11b, -N(R22)C(O)-C1-C6-알킬렌-N(R22b)-N(R22c)(R22a), -NR13C(O)OR13a, -N(R18)C(O)-C1-C6-알킬렌-N(R18b)C(O)R18a, -NR24C(O)-C1 -C6-알킬렌-OR24a 또는 -N(R20)C(O)-C1-C6-알킬렌-C(O)R20a이며; R3의 각각의 알킬렌은 독립적으로 할로, 하이드록시 및 아미노로부터 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5개의 기로 선택적으로 추가로 치환되며; 모든 다른 기는 발명의 내용에서 정의한 바와 같다. 더 구체적으로는, 각각의 R3은 독립적으로 메틸, 클로로, -NHC(O)CH2NH(CH3), -NHC(O)CH(CH3)NH2, -NHC(O)C(CH3)2NH2, -NHC(O)CH2N(CH3)2, -NHC(O)CH2N(CH3)CH2CH2N(CH3)2, -NHC(O)CH(NH2)CH2CH3, -NHC(O)CH2N(CH3)CH2CH2N(CH3)2, -NHC(O)CH(CH3)NH(CH3), -NHC(O)H, -NHC(O)CH2(아제티딘-1-일), -NHC(O)(피롤리딘-2-일), -NHC(O)CH(NH2)CH2OH, -NHC(O)(아제티딘-4-일), -NHC(O)C(CH3)2NH(CH3), -NH2, -NHC(O)CH2NH(CH2CH2CH3), -NHC(O)CH2CH2NH2, -NHOH 또는 -NHC(O)(피페리딘-3-일)이다.
한 실시형태에서, R3은 알킬 또는 -N(R7)C(O)-C1-C6-알킬렌-N(R7a)(R7b)이며; R7은 수소 또는 알킬이고, R7a 및 R7b는 독립적으로 수소, 알킬, 아미노알킬, 알킬아미노알킬 또는 다이알킬아미노알킬이며; 모든 다른 기는 발명의 내용에서 정의한 바와 같다. 더 구체적으로는, 각각의 R3은 독립적으로 메틸, -NHC(O)CH2NH(CH3), -NHC(O)CH(CH3)NH2, -NHC(O)C(CH3)2NH2, -NHC(O)-CH2N(CH3)2, -NHC(O)CH2N(CH3)CH2CH2N(CH3)2, -NHC(O)CH(NH2)CH2CH3, -NHC(O)CH2N(CH3)CH2CH2N(CH3)2 또는 -NHC(O)CH(CH3)NH(CH3)이다.
다른 실시형태에서, B는 페닐이며, R3은 존재 하지 않거나 R3은 할로, 알킬, 또는 알콕시이고; R3a는 -C(O)NR8R8a, -NR9C(O)R9a, -N(R7)C(O)-C1-C6-알킬렌-N(R7a)(R7b) 또는 -C(O)N(R10)-C1-C6-알킬렌-N(R10a)R10b이며; R3a의 각각의 알킬렌은 독립적으로 할로, 하이드록시 및 아미노로부터 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5개의 기로 선택적으로 추가로 치환되고; 모든 다른 기는 발명의 내용에서 정의한 바와 같다.
추가 실시형태에서, R50, R52 및 R53은 수소이며, R54는 할로 또는 알콕시이고; R50, R52 및 R54는 수소이며, R53은 알콕시이고; 또는 R50 및 R52는 수소이며, R53 및 R54는 그것들이 부착된 탄소와 함께 6-원 헤테로아릴을 형성하고; 모든 다른 기는 발명의 내용에서 정의한 바와 같다. 또 다른 실시형태에서, R50, R52 및 R53은 수소이며, R54는 할로 또는 알콕시이고; 또는 R50, R52 및 R54는 수소이며, R53은 알콕시이다. 더 구체적으로는, R51은 메틸이다.
화학식 I(a)의 다른 실시형태에서:
[화학식 I(a)]
Figure pct00007
상기 식에서 R3은 존재 하지 않거나 R3은 알킬이고, R3a는 -N(R7)C(O)-C1-C6-알킬렌-N(R7a)(R7b), -C(O)NR8R8a, -NR9C(O)R9a 또는 -C(O)N(R10)-C1-C6-알킬렌-N(R10a)R10b이며; R3a의 각각의 알킬렌은 독립적으로 할로, 하이드록시 및 아미노로부터 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5개의 기로 선택적으로 추가로 치환되며; 모든 다른 기는 발명의 내용에서 정의한 바와 같다. 추가 실시형태에서, R3은 존재 하지 않거나 메틸이다. 더 구체적으로는, R3은 존재 하지 않는다.
다른 실시형태에서, R7은 수소 또는 알킬이며, R7a 및 R7b는 독립적으로 수소, 알킬, 하이드록시알킬, 아미노알킬, 알킬아미노알킬 또는 다이알킬아미노알킬이고; R8은 수소 또는 알킬이며, R8a는 헤테로사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬알킬이고; R9는 수소 또는 알킬이며, R9a는 수소, 헤테로사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬알킬이고; R10, R10a 및 R10b는 독립적으로 수소, 알킬, 하이드록시알킬, 아미노알킬, 알킬아미노알킬 또는 다이알킬아미노알킬이다.
추가 실시형태에서, R50, R52 및 R53은 수소이며, R54는 할로 또는 알콕시이며; 또는 R50, R52 및 R54는 수소이고, R53은 알콕시이며; 또는 R50 및 R52는 수소이고, R53 및 R54는 그것들이 부착된 탄소와 함께 6-원 헤테로아릴을 형성한다. 또 다른 실시형태에서, R50, R52 및 R53은 수소이고, R54는 할로 또는 알콕시이며; 또는 R50, R52 및 R54는 수소이고, R53은 알콕시이다. 더 구체적으로는, R51은 메틸이다.
한 실시형태에서, B는 헤테로아릴이며, 하나의 R3은 할로, 알킬 또는 알콕시이고, 두 번째 R3은 -C(O)NR8R8a, -NR9C(O)R9a, -N(R7)C(O)-C1-C6-알킬렌-N(R7a)(R7b) 또는 -C(O)N(R10)-C1-C6-알킬렌-N(R10a)R10b이며, R3의 각각의 알킬렌은 할로, 하이드록시 및 아미노로부터 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5개의 기로 선택적으로 추가로 치환되고; 모든 다른 기는 발명의 내용에서 정의한 바와 같다.
추가 실시형태에서, R7은 수소 또는 알킬이고, R7a 및 R7b는 독립적으로 수소, 알킬, 하이드록시알킬, 아미노알킬, 알킬아미노알킬 또는 다이알킬아미노알킬이며; R8은 수소 또는 알킬이고, R8a는 헤테로사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬알킬이며; R9는 수소 또는 알킬이고, R9a는 수소, 헤테로사이클로알킬, 또는 헤테로사이클로알킬알킬이며; R10, R10a 및 R10b는 독립적으로 수소, 알킬, 하이드록시알킬, 아미노알킬, 알킬아미노알킬 또는 다이알킬아미노알킬이다.
다른 실시형태에서, B는
Figure pct00008
이며;
각 R3(R3이 존재할 때)은 독립적으로 할로, 알킬, 알콕시, 아미노알킬옥시, 알킬아미노알킬옥시, 다이알킬아미노알킬옥시, 알킬아미노, 다이알킬아미노, -C(O)NR8R8a, -NR9C(O)R9a, -N(R7)C(O)-C1-C6-알킬렌-N(R7a)(R7b) 또는 -C(O)N(R10)-C1-C6-알킬렌-N(R10a)R10b이며; 모든 다른 기는 발명의 내용에서 정의한 바와 같다.
다른 실시형태에서, R50, R52 및 R53은 수소이고, R54는 할로 또는 알콕시이며; R50, R52 및 R54는 수소이고, R53은 알콕시이며; 또는 R50 및 R52은 수소이고, R53 및 R54은 그것들이 부착된 탄소와 함께 6-원 헤테로아릴을 형성하며; 모든 다른 기는 발명의 내용에서 정의한 바와 같다. 추가 실시형태에서, R50, R52 및 R53은 수소이며, R54는 할로 또는 알콕시이고; 또는 R50, R52 및 R54는 수소이며 R53은 알콕시이다. 더 구체적으로는, R51은 메틸이다.
또 다른 실시형태에서, R7은 수소 또는 알킬이며, R7a 및 R7b는 독립적으로 수소, 알킬, 하이드록시알킬, 아미노알킬, 알킬아미노알킬 또는 다이알킬아미노알킬이고; R8은 수소 또는 알킬이며, R8a는 헤테로사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬알킬이고; R9는 수소 또는 알킬이며, R9a는 수소, 헤테로사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬알킬이고; R10, R10a 및 R10b는 독립적으로 수소, 알킬, 하이드록시알킬, 아미노알킬, 알킬아미노알킬 또는 다이알킬아미노알킬이다.
한 실시형태에서, W1, W2, W3 및 W4는 -C(H)=이고; 또는 W2 및 W3은 -C(H)=이며, W1 및 W4 중 하나는 -N=이고, 나머지는 -C(H)=이며;
R50 은 수소이며;
R51은 수소 또는 알킬이고;
R52는 수소이며;
R53은 수소, 알콕시, 나이트로, 아미노 또는 -N(R55)C(O)-C1-C6-알킬렌-N(R55a)R55b이고; R54는 수소, 알킬, 알콕시 또는 할로이며; 또는 R53 및 R54는 그것들이 부착된 탄소와 함께 6-원 헤테로아릴을 형성하고;
B는 R3a로 치환된 페닐이며, 선택적으로 하나의 R3으로 선택적으로 추가로 치환되고; 또는
B는 1 또는 2개의 R3으로 선택적으로 치환된 헤테로아릴이며;
R3a는 시아노, 하이드록시아미노, 카복시, 알킬설포닐, 아미노알킬옥시, 알킬아미노알킬옥시, 다이알킬아미노알킬옥시, -N(R7)C(O)-C1-C6-알킬렌-N(R7a)(R7b), -C(O)NR8R8a, -NR9C(O)R9a, -C(O)N(R10)-C1-C6-알킬렌-N(R10a)R10b, -NR11C(O)NR11aR11b, R11a, -C(O)R12; -NR13C(O)OR13a, -C(O)N(R14)N(R14a)(R14b), -S(O)2N(R15)-C1-C6-알킬렌-N(R15a)R15b, -C(O)N(R16)-C1-C6-알킬렌-C(O)OR16a, 1 또는 2개의 아미노알킬, 알킬아미노알킬 또는 다이알킬아미노알킬로 선택적으로 치환된 헤테로아릴, -N(R17)-C(=N(R17b)(R17a))(NR17cR17d), -N(R18)C(O)-C1-C6-알킬렌-N(R18b)C(O)R18a, -C(O)N(R19)-C1-C6-알킬렌-C(O)R19a, -N(R22)C(O)-C1-C6-알킬렌-N(R22b)-N(R22c)(R22a), -C0 -C6-알킬렌-N(R23)-C1-C6-알킬렌-N(R23b)R23a 또는 -NR24C(O)-C1 -C6-알킬렌-OR24a이고; R3a의 각각의 알킬렌은 독립적으로 할로, 하이드록시 및 아미노로부터 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5개의 기로 선택적으로 추가로 치환되며;
각각의 R3(R3이 존재할 때)은 독립적으로 할로, 시아노, 알킬, 알케닐, 알콕시, 하이드록시아미노, 카복시, 알킬설포닐, 아미노알킬옥시, 알킬아미노알킬옥시, 다이알킬아미노알킬옥시, -N(R7)C(O)-C1-C6-알킬렌-N(R7a)(R7b), -C(O)NR8R8a, -NR9C(O)R9a, -C(O)N(R10)-C1-C6-알킬렌-N(R10a)R10b, -NR11C(O)NR11aR11b이며 R11a은 -C(O)R12, -NR13C(O)OR13a, -C(O)N(R14)N(R14a)(R14b), -S(O)2N(R15)-C1-C6-알킬렌-N(R15a)R15b, -C(O)N(R16)-C1-C6-알킬렌-C(O)OR16a, 1 또는 2개의 아미노알킬로 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 알킬아미노알킬 또는 다이알킬아미노알킬, -N(R17)-C(=N(R17b)(R17a))(NR17cR17d), -N(R18)C(O)-C1-C6-알킬렌-N(R18b)C(O)R18a, -C(O)N(R19)-C1-C6-알킬렌-C(O)R19a, -N(R22)C(O)-C1-C6-알킬렌-N(R22b)-N(R22c)(R22a), -C0 -C6-알킬렌-N(R23)-C1-C6-알킬렌-N(R23b)R23a 또는 -NR24C(O)-C1 -C6-알킬렌-OR24a이고; R3의 각각의 알킬렌은 독립적으로 할로, 하이드록시 및 아미노로부터 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5개의 기로 선택적으로 추가로 치환되며;
단, R50 및 R52가 수소이고, R51이 수소 또는 메틸이며, R53이 수소 또는 메톡시이고, R54가 수소 또는 메톡시이면, B는 하나의 R3으로 치환된 2,3-다이하이드로-1,4-벤조다이옥신일, 티엔-2-일, 또는 티엔-2-일이 아니며, R3은 할로이다.
다른 실시형태에서, R50, R53 및 R54는 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 할로, 할로알킬, 할로알케닐, 하이드록시, 알콕시, 알케닐옥시, 할로알콕시, 나이트로, 아미노, 알킬아미노, 다이알킬아미노, -N(R55)C(O)-C1-C6-알킬렌-N(R55a)R55b, 알킬카보닐, 알케닐카보닐, 카복시, 알콕시카보닐, 시아노, 알킬티오, -S(O)2NR55R55a 또는 알킬카보닐아미노이며 R55 및 R55b는 독립적으로 수소, 알킬 또는 알케닐이고 R55a는 수소, 알킬, 알케닐, 하이드록시 또는 알콕시이며; 또는 R53 및 R54는 그것들이 부착된 탄소와 함께 5- 또는 6-원 헤테로아릴 또는 5- 또는 6-원 헤테로사이클로알킬을 형성한다.
더 구체적으로는, R53 및 R54는 그것들이 부착된 탄소와 함께 5- 또는 6-원 헤테로아릴 또는 5- 또는 6-원 헤테로사이클로알킬을 형성한다.
화학식 I(a)의 화합물 또는 이들의 단일 입체이성질체 또는 입체이성질체의 혼합물 및 선택적으로 이들의 약제학적으로 허용가능한 염의 다른 실시형태에서:
[화학식 I(a)]
Figure pct00009
W1, W2,W3 및 W4는 -C(H)-이고;
R50은 수소이며;
R51은 메틸이고;
R52는 수소이며;
R53은 수소 또는 알콕시이고;
R54는 수소, 알킬, 알콕시 또는 할로이며; 또는 R53 및 R54는 그것들이 부착된 탄소와 함께 6-원 헤테로아릴을 형성하고;
R3은 할로 또는 메틸이며;
R3a는 -N(R7)C(O)-C1-C6-알킬렌-N(R7a)(R7b)이고 R7은 수소이며 R7a 및 R7b는 독립적으로 수소, 알킬, 아미노알킬, 알킬아미노알킬 또는 다이알킬아미노알킬이다.
화학식 I(a)의 화합물 또는 이것의 단일 입체이성질체 및 선택적으로 이들의 약제학적으로 허용가능한 염의 다른 실시형태에서, R51은 메틸이며; R50, R52 및 R53은 수소이고 R54는 할로 또는 알콕시이거나, 또는 R50, R52 및 R54는 수소이고 R53은 알콕시이다.
화학식 I(a)의 화합물 또는 이것의 기하이성질체 및 선택적으로 이들의 약제학적으로 허용가능한 염의 다른 실시형태에서, R3a는
-NHHC(O)CH2NH(CH3),
-NHC(O)CH(CH3)NH2,
-NHC(O)C(CH3)2NH2,
-NHC(O)CH2N(CH3)2,
-NHC(O)CH2N(CH3)CH2CH2N(CH3)2,
-NHC(O)CH(NH2)CH2CH3,
-NHC(O)CH2N(CH3)CH2CH2N(CH3)2 또는
-NHC(O)CH(CH3)NH(CH3)이다.
다른 실시형태에서, 화학식 I(a)의 화합물은:
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
또는 이들의 약제학적으로 허용가능한 염이다.
다른 실시형태에서, 화학식 I(a)의 화합물은:
[화학식 I(a)]
Figure pct00013
또는 이것의 약제학적으로 허용가능한 염이다.
대표적인 화합물
화학식 I 및/또는 화학식 I(a)의 대표적인 화합물은 이하에 도시한다. 실시예는 단지 예시적인 것이며 본 발명의 범주를 어떤 방식으로 제한하는 것은 아니다. 본 발명의 화합물은 국제 순수 응용 화학 연합(International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC), 국제 생화학 및 분자생물학 연합회(International Union of Biochemistry and Molecular Biology, IUBMB), 및 화학 초록 서비스(Chemical Abstracts Service, CAS)에 의해 합의된 명명 규칙의 체계적 적용에 따라서 명명된다. 표 1의 명칭은 ChemDraw v. 9.0.1을 사용하여 명명된 화합물 374를 제외하고 제품 버전 8.08의 ACD/Labs 명명 소프트웨어 8.00 출시품을 사용하여 만들었다.
표 1
대표적인 PI3K -알파 억제제
표 1의 화합물은 이들의 약제학적으로 허용가능한 염, 용매화물, 수화물, 및/또는 이성질체로 제조될 수 있다. 표 1의 화합물의 모든 이러한 염, 용매화물, 수화물, 및 이성질체는 본 발명을 실시하기 위하여 사용될 수 있다. 특히, 본 발명은 표 1의 화합물의 1 또는 2개의 약제학적으로 허용가능한 염으로 실시될 수 있되, 해당 염(들)은 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산, 아세트산, 트라이플루오로아세트산, 프로피온산, 헥산산, 사이클로펜탄프로피온산, 글라이콜산, 피루브산, 락트산, 옥살산, 말레산, 말론산, 숙신산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 3-(4-하이드록시벤조일)벤조산, 만델산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 1,2 에탄다이설폰산, 2-하이드록시에탄설폰산, 벤젠설폰산, 4 클로로벤젠설폰산, 2-나프탈렌설폰산, 4-톨루엔설폰산, 캠퍼설폰산, 글루코헵톤산, 4,4'-메틸렌비스-(3-하이드록시-2-엔-1-카복실산), 3-페닐프로피온산, 트라이메틸아세트산, 3차 뷰틸아세트산, 라우릴 황산, 글루콘산, 글루탐산, 하이드록시나프톨산, 살리실산, 스테아르산, 뮤콘산, p-톨루엔설폰산 및 살리실산으로부터 독립적으로 선택된 1 또는 2개의 산으로 형성된다. 특히, 본 발명은 표 1의 화합물의 1 또는 2개의 약제학적으로 허용가능한 염으로 실시될 수 있되, 해당 염(들)은 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘, 마그네슘, 철, 아연, 구리, 망간, 알루미늄, 아이소프로필아민, 트라이메틸아민, 다이에틸아민, 트라이에틸아민, 트라이프로필아민, 에탄올아민, 2-다이메틸아미노에탄올, 2-다이에틸아미노에탄올, 다이사이클로헥실아민, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 카페인, 프로카인, 하이드라바민, 콜린, 베타인, 에틸렌다이아민, 글루코사민, 메틸글루카민, 테오브로민, 퓨린, 피페라진, 피페리딘, N-에틸피페리딘, 트로메타민 및 N-메틸글루카민으로부터 독립적으로 선택된 1 또는 2개의 염기로 형성된다. 표 1의 임의의 개개의 화합물(및 이들의 임의의 선택적 염, 선택적 용매화물 및 선택적 수화물)은 어떤 상기 실시형태와 병용하여 사용될 수 있다.
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
Figure pct00057
Figure pct00058
Figure pct00059
Figure pct00060
Figure pct00061
Figure pct00062
Figure pct00063
Figure pct00064
Figure pct00065
Figure pct00066
Figure pct00067
Figure pct00068
Figure pct00069
Figure pct00070
Figure pct00071
Figure pct00072
Figure pct00073
Figure pct00074
Figure pct00075
Figure pct00076
Figure pct00077
Figure pct00078
Figure pct00079
Figure pct00080
Figure pct00081
Figure pct00082
Figure pct00083
Figure pct00084
Figure pct00085
Figure pct00086
Figure pct00087
Figure pct00088
Figure pct00089
Figure pct00090
Figure pct00091
Figure pct00092
Figure pct00093
Figure pct00094
Figure pct00095
Figure pct00096
Figure pct00097
Figure pct00098
Figure pct00099
Figure pct00100
Figure pct00101
Figure pct00102
Figure pct00103
Figure pct00104
Figure pct00105
Figure pct00106
Figure pct00107
Figure pct00108
Figure pct00109
Figure pct00110
Figure pct00111
Figure pct00112
Figure pct00113
Figure pct00114
Figure pct00115
Figure pct00116
Figure pct00117
Figure pct00118
Figure pct00119
Figure pct00120
Figure pct00121
Figure pct00122
Figure pct00123
Figure pct00124
Figure pct00125
Figure pct00126
Figure pct00127
Figure pct00128
Figure pct00129
Figure pct00130
Figure pct00131
Figure pct00132
Figure pct00133
Figure pct00134
Figure pct00135
Figure pct00136
Figure pct00137
Figure pct00138
Figure pct00139
Figure pct00140
Figure pct00141
Figure pct00142
Figure pct00143
Figure pct00144
Figure pct00145
Figure pct00146
Figure pct00147
Figure pct00148
Figure pct00149
Figure pct00150
Figure pct00151
Figure pct00152
Figure pct00153
Figure pct00154
Figure pct00155
Figure pct00156
Figure pct00157
Figure pct00158
Figure pct00159
Figure pct00160
Figure pct00161
Figure pct00162
억제제
본 발명의 화학식 I의 화합물은 화학식 I 화합물의 투여에 의해 상향조절된 키나제/키나제 수용체의 억제제와 함께 공동투여될 수 있다. 이에 대해서, 화학식 I 화합물에 노출된 암 세포는 화합물에 의해 야기된 PI3K 억제를 보상하기 위한 명백한 시도에서 다수의 키나제 경로의 이후의 상향조절을 나타낸다. 화학식 I 화합물의 치료 섭생을 사용할 때 이들 상향조절된 키나제를 억제하는 것은 종양 세포 생존력을 상승적으로 억제할 것이고, 따라서 투여된 화합물의 유효성을 개선시킨다. 따라서, 본 발명의 한 양태에서, HER3, HER2, MSPR, Axl, MAP3K(ERK, JNK 및 p38 MAPK), MEKK 키나제들/키나제 수용체, INSR, IGF-IR, 및 FGFR2 키나제들/키나제 수용체의 억제제는 암 치료를 받고 있는 환자에게 화학식 I 화합물과 공동투여될 수 있다. 본 발명의 한 양태에서, HER2 및/또는 HER3의 억제제는 암 치료를 받고 있는 환자에게 화학식 I 화합물과 공동투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, HER2 및/또는 HER3의 억제제는 암 치료를 받고 있는 환자에게 화학식 I 화합물과 공동투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, HER2 및/또는 HER3의 억제제는 암 치료를 받고 있는 환자에게 화학식 I 화합물과 공동투여될 수 있되, 해당 암은 HER2를 과발현시키는 암, 예를 들어 HER2 과발현 유방암이다.
일부 실시형태에서, HER2 억제제는, 예를 들어 상표명 TYKERB(등록상표) 하에 상업적으로 입수가능한 라파티닙 다이토실레이트의 형태로 라파티닙 (N-[3-클로로-4-[(3-플루오로페닐)메톡시]페닐]-6-[5-[(2-메틸설포닐에틸아미노)메틸]-2-푸릴]퀴나졸린-4-아민이다. 라파티닙은 하기 화학적 구조를 가진다:
Figure pct00163
사용된 라파티닙 투약량은 당업계에서 일상적인 기술을 사용하여 처방하는 담당의에 의해 직접 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 화학식 I의 화합물과 병용하여 투여되는 라파티닙의 투약량은 1일 당 약 0.1㎎/㎏ 내지 약 100㎎/㎏의 범위에 있을 수 있고, 예를 들어 1일 당 약 100 또는 200 또는 300 또는 500 또는 600 또는 700 또는 800 또는 900 또는 1,000, 내지 약 1,500 또는 약 1,600 또는 약 2,000㎎의 범위에 있는 1일 용량이다.
한 실시형태에서, 억제제는 기능성 핵산일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는, "기능성 핵산"의 범주는 siRNA 분자, shRNA 분자, miRNA 분자 및 안티센스 핵산 분자를 포함한다. 용어 "siRNA"는 RNA 간섭(RNAi) 경로를 유발하는 작은 억제 RNA 듀플렉스를 지칭한다. 이들 분자는 길이가 다양할 수 있고(일반적으로 18-30개의 염기쌍), 안티센스 가닥에서 그것의 표적 mRNA와 다양한 정도의 상보성을 함유한다. 모두는 아니지만 일부 siRNA는 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥의 5' 또는 3' 말단 상에서 짝지어지지 않은 돌출부 염기를 가진다. 용어 "siRNA"는 2개의 별개 가닥의 듀플렉스뿐만 아니라 듀플렉스 영역을 포함하는 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 단일 가닥을 포함한다.
한 예에서, 기능성 핵산은 리간드 결합이 일어나는 세포밖 도메인과 같은 키나제 수용체의 유전자 또는 전사체를 표적화한다. 다른 예에서, 기능성 핵산은 세포내 단백질 키나제 도메인을 표적화한다. 다른 예에서, 기능성 핵산은 헤테로다이머 결합 부위(즉, 리간드 결합을 안정화시키도록 작용 가능한 HER2와 헤테로다이머를 형성하고 하류 신호처리 경로의 키나제-매개 활성화를 향상시키는 다른 EGF 수용체 패밀리 막과 결합에 관련된 아미노산 서열)를 표적화한다. 수많은 적합한 기능성 핵산이 상업적으로 입수가능하다. 이에 대해서는, 예를 들어, 캘리포니아주 발렌시아에 소재한 Qiagen를 참조한다. 대안적으로, 기능성 핵산은 당업계에 잘 공지된 방법을 사용하여 표적 키나제/수용체 상의 뉴클레오타이드 서열 정보에 기반한 실험을 통하여 또는 합리적 설계를 통하여 확인되고/확인되거나 합성될 수 있다. 서열은 관심의 특정 키나제, (표적)즉, HER3, HER2, MSPR, Axl, MAP3K(ERK, JNK 및 p38 MAPK), MEKK 키나제들/키나제 수용체, INSR, IGF-IR 및 FGFR2를 발현시키는 것으로 알려진 유전자의 암호화 영역을 개시하는 생물정보학 데이터베이스(예를 들어, GENBANK, NCBI, PKR 등)를 참조로 결정될 수 있다. 순수한 예시적 목적을 위하여, HER2에 대한 생물정보학 서열은 이하에 제공한다. 억제를 위해 본 명세서에서 다른 키나제 및 키나제 수용체 mRNA 및 아미노산 서열이 본 명세서에서 생각되며, 예를 들어, HER3, MSPR, Axl, MAP3K(ERK, JNK 및 p38 MAPK), MEKK 키나제들/키나제 수용체, INSR, IGF-IR 및 FGFR2가 또한 상기 언급한 데이터베이스를 사용하여 확인될 수 있다.
일부 실시형태에서, 몇몇 기능성 HER2 폴리펩타이드 중 하나를 암호화하는 mRNA에 혼성화될 수 있는 기능성 핵산의 생성은 서열번호 1에 제공된다. 이하의 mRNA 서열은 대표적인 HER2 mRNA 서열이며, 대표적인 당업자에게 공지되고, 또한 본 명세서에서 고려되는 인간 HER2 및/또는 HER3의 다른 아이소형을 암호화하는 다른 변이체 서열(스플라이싱 변이체를 포함), 예를 들어 NM_004448.1, GI: 4758297이다. HER2 mRNA를 발현시키기 위하여 작용 가능한 cDNA 클론은 제품 ID No. B0017로서 GeneCopoeia(상표명)로부터 상업적으로 입수가능하다. 이하에 제공되는 바와 같이, 서열번호 1은 mRNA 전사 변이체 NM 004448 Version NM 004448.2; GI 54792095이다.
HER2 및/또는 HER3 의 siRNA 억제제
합리적 설계 과정은 모든 18-30개의 염기쌍 서열 또는 고정된 길이, 예를 들어 19개의 염기쌍의 서열 만에 대한 기준을 평가하기 위한 컴퓨터 프로그램 사용을 수반할 수 있다. 바람직하게는, 컴퓨터 프로그램은 서열이 가장 높은 값을 만들어내는 것에 따라서 순위가 매겨진 모든 잠재적 siRNAs 18-30 염기쌍의 보고 순위를 제공하도록 설계된다. 더 높은 값은 특정 표적 유전자에 대해 더 효율적인 siRNA를 지칭한다. 사용될 수 있는 컴퓨터 프로그램은 스코어링 뉴클레오타이드 서열에 유용한 것으로 알려진 임의의 컴퓨터 언어로 개발될 수 있거나, 또는 마이크로소프트 제품.net과 같은 상업적으로 입수가능한 제품의 보조로 개발될 수 있다. 추가적으로, 하나의 및/또는 다른 화학식을 통해 모든 서열을 실행하는 것보다, 예를 들어 단지 서브세트를 입수가능하다면 바람직할 수 있는, 서열의 서브세트를 비교할 수 있다. 예를 들어, BLAST(Basic Local Alignment Search Tool) 조사를 유선 수행하고, 다른 표적에 상동성을 가지지 않는 서열을 확인하는 것이 바람직할 수 있다. 대안적으로, 서열을 스캔하고 보통의 GC 맥락의 영역을 확인하는 것이 바람직할 수 있다면, 이들 영역 상에서 상기-기재된 화학식의 하나를 사용하여 적절한 계산을 수행한다. 이들 계산은 수동으로 또는 컴퓨터의 도움으로 행해질 수 있다.
일부 실시형태에서, 표적화된 키나제는 HER2 및/또는 HER3, HER2 및/또는 HER3 돌연변이체, 또는 이들의 대안의 스플라이싱 변이체, 특히 인간 HER2 및/또는 HER3이다.
용어 "표적"은 본 명세서를 통해 다양한 상이한 형태로 사용되며, 그것이 사용된 문맥에 의해 정의된다. "표적 mRNA"는 주어진 siRNA에 대해 지정된 전령 RNA를 지칭한다. "표적 서열" 및 "표적 부위"는 siRNA의 센스 가닥이 다양한 정도의 상동성을 나타내며 안티센스 가닥이 다양한 정도의 상보성을 나타내는 mRNA 내 서열을 지칭한다. 어구 "siRNA 표적"은 유전자, mRNA 또는 siRNA가 관련된 단백질을 지칭할 수 있다. 유사하게, "표적 침묵"은 유전자, 또는 대응하는 mRNA 또는 단백질의 상태를 지칭한다.
siRNA는 부분적으로 정제된 RNA, 실질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 또는 재조합적으로 생성된 RNA뿐만 아니라 하나 이상의 뉴크렐오타이드의 첨가, 결실, 치환 및/또는 변경에 의해 자연적으로 발생하는 RNA와 다른 변경된 RNA를 포함할 수 있다. 이러한 변경은 siRNA가 뉴클레아제 분해에 저항하도록 하는 변형을 포함하여, 예컨대 siRNA의 말단(들)에 또는 siRNA의 하나 이상의 내부 뉴클레오타이드에 비-뉴클레오타이드 물질의 첨가를 포함할 수 있다. siRNA는 임의의 표적 mRNA 서열 내 대략 18-30개의 연속적 뉴클레오타이드, 예를 들어 각 가닥에서 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 뉴클레오타이드의 어떤 신장을 표적으로 할 수 있되, 해당 가닥 중 하나는, 예를 들어 적어도 80%(또는 그 이상, 예를 들어 85%, 90%, 95% 또는 100%)로 실질적으로 상보적이고, 예를 들어 3, 2, 1, 또는 0개의 미스매치 뉴클레오타이드(들)를 가지며 표적 mRNA 서열에 상보적이다. siRNA에 대해 표적 서열을 선택하기 위한 기법은, 예를 들어 본 명세서에 전문이 참조로 포함된 2002년 10월 11일 개정된 문헌[Tuschl T et al., "The siRNA User Guide"]에서 제공된다. "The siRNA User Guide"는 독일 괴팅겐 37077에 소재한 막스 플랑크 생물리화학 연구소 아게 105 세포 생화학부의 Dr. Thomas Tuschl에 의해 유지되는 웹사이트의 월드 와이드 웹 상에서 입수가능하고, 막스 플랑크 연구소의 웹사이트를 평가하고 키워드 "siRNA"로 검색함으로써 찾을 수 있다. 따라서, 본 siRNA의 센스 가닥은 표적 mRNA 내 약 18개 내지 약 30개의 임의의 연속적 신장과 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, siRNA의 하나 또는 두 가닥은 또한 3' 돌출부를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "3' 돌출부"는 듀플렉스 RNA 가닥의 3'-말단으로부터 연장되는 적어도 하나의 짝지어지지 않은 뉴클레오타이드를 지칭한다. 일부 실시형태에서, siRNA는 길이로 1 내지 6개의 뉴클레오타이드(이는 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시뉴클레오타이드를 포함), 바람직하게는 길이로 1 내지 약 5개의 뉴클레오타이드, 더 바람직하게는 길이로 1 내지 약 4개의 뉴클레오타이드, 및 특히 바람직하게는 약 2 내지 약 4개의 뉴클레오타이드의 적어도 하나의 3' 돌출부를 포함한다. siRNA 분자의 가닥이 둘 다 3' 돌출부를 포함하는 실시형태에서, 돌출부의 길이는 각 가닥에 대해 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 실시형태에서, 3' 돌출부는 siRNA의 가닥 둘 다에 존재 하며, 길이로 2개의 뉴클레오타이드이다. 예를 들어 siRNA의 각 가닥은 다이티미딜산(dithymidylic acid, "TT") 또는 다이유리딜산(diuridylic acid, "uu")의 3' 돌출부를 포함할 수 있다.
siRNA는 당업자에게 공지된 다수의 기법을 사용하여 얻을 수 있다. 예를 들어, siRNA는 본 명세서에 전문이 참조로 포함되는 Tuschl 등의 미국특허 공개 2002/0086356호에 기재된 초파리 시험관 내 시스템과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성되거나 재조합적으로 생성될 수 있다.
바람직하게는, siRNA는 적절하게 보호된 리보뉴클레오사이드 포스포르아미다이트 및 통상적인 DNA/RNA 신시사이저를 사용하여 화학적으로 합성된다. siRNA는 2개의 별개의 상보적 RNA 분자로서, 또는 2개의 상보적 영역을 갖는 단일 RNA 분자로서 합성될 수 있다. 합성 RNA 분자 또는 합성 시약의 상업적 공급업자는 Proligo(독일 함부르크에 소재), Dharmacon Research(미국 콜로라도주 라파예트에 소재), Pierce Chemical(미국 일리노이주 락스포드에 소재한 Perbio Science의 파트), Glen Research(미국 버지니아주 스털링에 소재), ChemGenes(미국 매사추세츠주 애쉬랜드에 소재) 및 Cruachem(영국 글래스코에 소재)를 포함한다.
대안적으로, siRNA는 임의의 적합한 프로모터를 사용하여 재조합 원형 또는 선형 DNA 플라스미드로부터 발현될 수 있다. 플라스미드로부터 siRNA를 발현시키기 위한 적합한 프로모터는, 예를 들어 U6 또는 H1 RNA pol III 프로모터 서열 및 거대세포바이러스 프로모터를 포함한다. 적합한 프로모터의 선택은 당업계의 기술 내에 있다. 본 발명의 재조합 플라스미드는 또한 특정 조직에서 또는 특정 세포내 환경에서 siRNA의 발현을 위한 유도성 또는 조절가능한 프로모터를 포함할 수 있다.
재조합 플라스미드로부터 발현된 siRNA는 표준 기법에 의해 배양된 세포 발현 시스템으로부터 분리될 수 있거나, 또는 생체 내 신혈관화 영역에서 또는 근처에서 세포 내로 발현될 수 있다. 생체 내 세포에 siRNA를 전달하기 위한 재조합 플라스미드의 사용은 이하에 더욱 상세하게 논의한다.
siRNA는 2개의 별개의 상보적 RNA 분자로서, 또는 2개의 상보적 영역을 갖는 단일 RNA 분자로서 재조합 플라스미드로부터 발현될 수 있다.
siRNA를 발현시키는데 적합한 플라스미드의 선택방법, 플라스미드 내로 siRNA를 발현시키기 위한 핵산 서열의 삽입방법, 및 관심의 세포에 재조합 플라스미드의 전달방법은 당업계의 기술 내에 있다. 예를 들어, 문헌[Tuschl, T. (2002), Nat. Biotechnol, 20: 446-448; Brummelkamp T R et al. (2002), Science 296: 550-553; Miyagishi M et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20: 497-500; Paddison P J et al. (2002), Genes Dev. 16: 948-958; Lee N S et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20: 500-505; 및 Paul C P et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20: 505-508]을 참조하며, 이들의 전체 개시는 본 명세서에 참조로 포함된다. siRNA를 발현시키기 위한 핵산 서열을 포함하는 플라스미드는 이하의 실시예 7에 기재한다. pAAVsiRNA로 불리는 플라스미드는 인간 U6 RNA 프로모터의 제어 하에 polyT 종결 서열과 작용 가능하게 관련된 센스 RNA 가닥 암호화 서열 및 인간 U6 RNA 프로모터의 제어 하에 polyT 종결 서열과 작용 가능하게 관련된 안티센스 RNA 가닥 암호화 서열을 포함한다. 플라스미드 pAAVsiRNA는 siRNA를 발현시키기 위한 동일 핵산 서열을 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스 벡터를 생산하는 것에 사용을 위해 궁극적으로 의도된다.
본 명세서에서 사용되는, "polyT 종결 서열과 작용 가능하게 관련된"이란 센스 또는 안티센스 가닥을 암호화하는 핵산 서열이 5' 방향으로 polyT 종결 신호와 바로 인접해 있다는 것을 의미한다. 플라스미드로부터 센스 또는 안티센스 서열의 전사 동안, polyT 종결 신호는 전사를 종결하기 위한 작용을 한다.
본 명세서에 사용되는 프로모터의 "제어 하에"는 센스 또는 안티센스 가닥을 암호화하는 핵산 서열이 프로모터의 3'에 위치되고, 따라서 해당 프로모터가 센스 또는 안티센스 암호화 서열의 전사를 개시할 수 있다는 것을 의미한다.
siRNA는 또한 생체 내 HER2 및/또는 HER3 유전자 발현된 종양의 영역에서 또는 근처에서 세포 내로 재조합 바이러스 벡터로부터 발현될 수 있다. 본 발명의 재조합 바이러스 벡터는 siRNA를 암호화하는 서열 및 siRNA 서열을 발현시키는 임의의 적합한 프로모터를 포함한다. 적합한 프로모터는, 예를 들어 U6 또는 H1 RNA pol III 프로모터 서열 및 거대세포바이러스 프로모터를 포함한다. 다른 적합한 프로모터의 선택은 당업계의 기술 내에 있다. 본 발명의 재조합 바이러스 벡터는 또한 특정 조직에서 또는 특정 세포내 환경에서 siRNA의 발현을 위한 유도성 또는 조절가능한 프로모터를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, siRNA는 2개의 별개의 상보적 RNA 분자로서 또는 2개의 상보적 영역을 갖는 단일 RNA 분자로서 재조합 바이러스 벡터로부터 발현될 수 있다.
발현되는 siRNA 분자(들)에 대한 암호화 서열을 받아들일 수 있는 임의의 바이러스 벡터, 예를 들어 아데노바이러스(adenovirus, AV), 아데노-관련 바이러스(adeno-associated virus, AAV), 레트로바이러스(예를 들어, 렌티바이러스(lentiviruses, LV), 랩도 바이러스, 뮤린 백혈병 바이러스), 헤르페스바이러스 등이 사용될 수 있다. 바이러스 벡터의 향성은 또한 외피 단백질을 갖는 벡터 또는 다른 바이러스로부터 다른 표면 항원을 위형화(pseudotyping)함으로써 변형될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 AAV 벡터는 수포성 구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus, VSV), 광견병, 에볼라, 모콜라(Mokola) 등으로부터 표면 단백질과 함께 위형화될 수 있다.
본 발명에서 사용에 적합한 재조합 바이러스 벡터의 선택방법, 벡터 내로 siRNA를 발현시키기 위한 핵산 서열의 삽입 방법, 및 관심의 세포에 바이러스 벡터의 전달방법은 당업계의 기술 내에 있다. 예를 들어, 문헌[Dornburg R (1995), Gene Therap. 2: 301-310; Eglitis M A (1988), Biotechniques 6: 608-614; Miller A D (1990), Hum Gene Therap. 1: 5-14]; 및 문헌[Anderson W F (1998), Nature 392: 25-30]을 참조하며, 이들의 전체 개시는 본 명세서에 참조로 포함된다. 일부 경에수, 상업적으로 입수가능한 바이러스 전달 시스템이 사용될 수 있다(예를 들어, 텍사스주 오스틴에 소재한 Ambion으로부터 입수가능한 siRNA 전달을 위한 벡터). 전달을 위한 다른 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, siRNA Delivery Centre, sirna.dk/index.html).
바람직한 바이러스 벡터는 AV 및 AAV로부터 유래된 것이다. 특히 바람직한 실시형태에서, siRNA는 예를 들어 U6 또는 H1 RNA 프로모터, 또는 거대세포바이러스(CMV) 프로모터 중 하나를 포함하는, 2개의 별개의 재조합 AAV 벡터로부터의 상보적 단일-가닥 RNA 분자로 발현된다.
siRNA를 발현시키기 위한 적합한 AV 벡터, 재조합 AV 벡터를 구성하는 방법 및 표적 세포에 벡터를 전달하하는 방법은 문헌[Xia H et al. (2002), Nat. Biotech. 20: 1006-1010]에서 기재되며, 이것의 전체 개시는 본 명세서에 참조로 포함된다.
siRNA의 발현을 위한 적합한 AAV 벡터, 재조합 AAV 벡터의 구성 방법, 및 표적 세포 내에 벡터를 전달하는 방법은 문헌[Samulski R et al. (1987), J. Virol. 61: 3096-3101; Fisher K J et al. (1996), J. Virol., 70: 520-532; Samulski R et al. (1989), J. Virol. 63: 3822-3826]; 미국특허 제5,252,479호; 미국특허 제5,139,941호; 국제특허출원 WO 94/13788; 및 국제특허출원 WO 93/24641에 기재되며, 이것의 전체 개시는 본 명세서에 참조로 포함된다.
표적 mRNA의 RNAi-매개 분해를 야기하는 주어진 표적 서열을 함유하는 siRNA 능력은 RNA 또는 세포 내 단백질 수준을 측정하기 위한 표준 기법을 사용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, siRNA는 배양된 세포에 전달될 수 있고, 표적 mRNA 수준은 노던 블롯 또는 점 블롯 기법 또는 정량적 RT-PCR로 측정될 수 있다. 대안으로, 감염 세포 내 HER3, HER2, MSPR, Axl, MAP3K(ERK, JNK 및 p38 MAPK), MEKK 키나제들/키나제 수용체, INSR, IGF-IR 및 FGFR2 키나제들/키나제 수용체 단백질의 수준은 ELISA 또는 웨스턴 블롯으로 측정될 수 있다. 표적 mRNA 또는 단백질 수준 상에 존재 하는 siRNA의 효과를 측정하기 위한 적합한 세포 배양 시스템은 이하의 실시예에서 기재한다.
일부 실시형태에서, 시험관내 및/또는 생체내 HER2 및/또는 HER3의 활성 및/또는 발현의 하향조절을 위한 특이적 siRNA가 합성될 수 있다. HER2 억제를 위한 예시적인 siRNA 쌍은 하기 서열 쌍을 포함할 수 있으며: 서열번호 3-
:CCUGGAACUCACCUACCUGdTdT/ 서열번호 4-
CAGGUAGGUGAGUUCCAGGdTdT; 서열번호 5-
CUACCUUUCUACGGACGUGdTdT/ 서열번호 6-
CACGUCCGUAGAAAGGUAGdTdT; 및 서열번호 7-
GAUCCGGAAGUACACGAUGdTdT/ 서열번호 8-
CAUCGUGUACUUCCGGAUCdTdT)는 화학적으로 합성되고 어닐링될 수 있다. 이들 합리적으로 설계된 siRNA는 합성될 수 있고, Dharmacon으로부터 상업적으로 입수가능하다. 또 다른 실시형태에서, siRNA shRNA, 및 HER2 및/또는 HER3 발현 및/또는 활성을 억제하는데 유용한 RNA 서열을 발현할 수 있는 렌티바이러스 벡터는 Santa Cruz Biotechnology(미국 캘리포니아주 산타 크루즈에 소재)제의 카탈로그 번호: sc-156048 및 sc-29405로부터 상업적으로 입수가능하다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에서 유용한 기능성 핵산의 효능은 기능성 핵산이, 예를 들어 siRNA가 종양 표적화되고, 전신으로 반복적으로 안전하게 전달될 때 증가될 수 있다. 기능성 핵산이 보호적이며 기능성인 비히클, 예를 들어 바이러스 벡터, 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine, PEI)과 복합체화되고, 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF) 수용체-2와 연결된 리포좀, 및 원위 말단에서 RGD 펩타이드 리간드와 페길화된 PEI, 프로타민-항체 융합 단백질, 및 종양-표적화 면역리포좀 복합체 내로 포함될 때, 낮은 트랜스펙션 효율, 뉴클레아제 축퇴, 불량한 조직 침투, 및 비특이적 면역 축퇴가 극복될 수 있다. 이들 전략의 임의의 조합은 앞서 1세대 전달 방법으로 나타난 상기 기재한 문제를 개선하고 없앨 수 있다. 일부 실시형태에서, 기능성 핵산은 전달 시약과 함께 네이키드 siRNA로서, 또는 siRNA를 발현시키는 재조합 플라스미드 또는 바이러스 벡터로서 피험체에게 투여된다.
본 siRNA와 함께 투여를 위한 적합한 전달 시약은 Mirus Transit TKO 친유성 시약, 리포펙틴, 리포펙타민, 셀펙틴, 또는 다양이온(예를 들어, 폴리리신), 박테리아 미니셀, 또는 리포좀을 포함한다. 바람직한 전달 시약은 리포좀이다.
리포좀은 종양 조직과 같은 특정 조직에 siRNA 전달에 도움을 줄 수 있고, 또한 siRNA의 혈액 반감기를 증가시킬 수 있다. 본 발명에 적합한 리포좀은 표준 소수포-형성 지질로부터 형성되는데, 이는 일반적으로 중성 또는 음으로 하전된 인지질 및 스테롤, 예컨대 콜레스테롤을 포함한다. 지질의 선택은 일반적으로 요망되는 리포좀 크기 및 혈액 스트림 내 리포좀의 반감기와 같은 인자의 고려에 의해 인도된다. 리포좀 제조를 위한 다양한 방법이, 예를 들어 문헌[Szoka et al. (1980), Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9: 467]; 및 미국특허 제4,235,871호, 제4,501,728호, 제4,837,028호, 및 제5,019,369호에 기재된 바와 같이 공지되어 있으며, 이들 전체 개시는 본 명세서에 참조로 포함된다.
일부 실시형태에서, 본 siRNA를 캡슐화하는 리포좀은 신생혈관생성 부위에서 또는 근처에서 특정 세포 또는 조직에 리포좀을 표적화할 수 있는 리포좀 분자를 포함한다. HER2 및/또는 HER3 과발현 종양에서 우세한 수용체에 결합하는 리간드, 예컨대 종양 항원에 결합하는 단클론성 항체가 바람직하다. 예를 들어, 본 siRNA를 캡슐화하는 리포좀은, 예를 들어 구조의 표면에 결합된 옵소닌작용-억제 모이어티를 가짐으로써 단핵 대식세포 및 세망내피계에 의한 클리어런스를 회피하기 위하여 변형된다. 한 실시형태에서, 본 발명의 리포좀은 옵소닌작용-억제 모이어티와 리간드를 둘 다 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 본 발명의 리포좀을 제조하는데 사용을 위한 옵소닌작용-억제 모이어티는 리포좀 막에 결합된 도시되는 거대한 친수성 폴리머이다. 본 명세서에 사용되는 옵소닌작용 억제 모이어티는, 예를 들어 막 자체 내에 리포좀-가용성 앵커의 인터칼레이션(intercalation)에 의해, 또는 막 지질의 활성 기에 직접적 결합에 의해 막에 화학적으로 또는 물리적으로 부착될 때 리포좀 막에 "결합"된다. 이들 옵소닌작용-억제 친수성 폴리머는 대식세포-단핵구 시스템(macrophage-monocyte system, "MMS") 및 세망내피계(reticuloendothelial system, "RES")에 의한 리포좀의 흡수를 상당히 감소시키는 보호 표면층을 형성하며; 예를 들어 본 명세서에 참조로 포함된 미국특허 제4,920,016호에 기재된 것과 같다. 옵소닌작용-억제 모이어티로 변형된 리포좀은 따라서 비변형 리포좀보다 훨씬 더 긴 순환에 남아있다. 이들 리포좀은 때때로 "컨실드(concealed)" 리포좀으로 불린다.
컨실드 리포좀은 다공성 또는 "누설" 미소혈관계에 의해 공급된 조직 내에 축적되는 것으로 알려져 있다. 따라서, 이러한 미소혈관계 결함을 특징으로 하는 표적 조직, 예를 들어 고체 종양은 이들 리포좀을 효율적으로 축적할 것이다. 추가로, 세망내피계에 의한 감소된 흡수는 간 및 비장 내 상당한 축적을 방지함으로써 컨실드 리포좀의 독성을 낮춘다. 따라서, 옵소닌작용-억제 모이어티로 변형된 본 발명의 리포좀은 본 명세서에 예시되는 종양 세포에 본 siRNA를 전달할 수 있다.
리포좀을 변형하는데 적합한 옵소닌 억제 모이어티는 바람직하게는 약 500 내지 약 40,000 달톤, 및 더 바람직하게는 약 2,000 내지 약 20,000 달톤의 수-평균 분자량을 갖는 수용성 폴리머이다. 이러한 폴리머는 폴리에틸렌 글라이콜(PEG) 또는 폴리프로필렌 글라이콜(PPG) 유도체; 예를 들어 메톡시 PEG 또는 PPG, 및 PEG 또는 PPG 스테아레이트; 합성 폴리머, 예컨대 폴리아크릴아마이드 또는 폴리 N-비닐 피롤리돈; 선형, 분지형 또는 덴드리머 폴리아미도아민; 폴리아크릴산; 카복실 또는 아미노기가 화학적으로 연결된 폴리알코올, 예를 들어 폴리비닐알코올 및 폴리자일리톨, 및 강글리오사이드, 예컨대 강글리오사이드 GM1을 포함한다. PEG의 공중합체, 메톡시 PEG 또는 메톡시 PPG, 또는 이들의 유도체가 또한 적합하다. 추가로, 옵소닌작용 억제 폴리머는 PEG의 블록 공중합체 및 폴리아미노산, 다당류, 폴리아미도아민, 폴리에틸렌아민 또는 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 옵소닌작용 억제 폴리머는 또한, 예를 들어 카복실 기의 결과 연결을 갖는 탄산 유도체화 반응된, 아미노산 또는 카복실산을 함유하는 중성 다당류, 예를 들어 갈락투론산, 글루쿠론산, 만누론산, 히알루론산, 펙틴산, 뉴라미닌산, 알긴산, 카라기난, 아미노화된 다당류 또는 올리고당(선형 또는 분지형), 또는 카복실화된 다당류 또는 올리고당일 수 있다.
바람직하게는, 옵소닌작용-억제 모이어티는 PEG, PPG, 또는 이들의 유도체이다. PEG 또는 PEG-유도체로 변형된 리포좀은 때때로 "페길화된 리포좀"으로 불린다.
옵소닌작용 억제 모이어티는 수많은 잘-공지된 기법 중 어느 하나에 의해 리포좀 막에 결합될 수 있다. 예를 들어, PEG의 N-하이드록시숙신이미드 에스터는 포스파티딜-에탄올아민 지질-가용성 앵커에 결합된 다음, 막에 결합될 수 있다. 유사하게, 덱스트란 폴리머는 60℃에서 30:12 비로 테트라하이드로퓨란 및 물과 같은 용매 혼합물을 사용하여 Na(CN)BH3 환원성 아미노화를 통해 스테아릴아민지질-가용성 앵커로 유도체화될 수 있다.
siRNA를 발현할 수 있는 예시적인 재조합 플라스미드는 상기 논의되었다. 이러한 재조합 플라스미드는 또한 직접 또는 Mirus Transit LT1 친유성 시약, 리포펙틴, 리포펙타민, 셀펙틴, 다양이온(예를 들어, 폴리리신), 박테리아 미니셀 또는 리포좀을 포함하는 적합한 전달 시약과 함께 투여될 수 있다. siRNA를 발현시키는 재조합체 바이러스 벡터가 또한 상기 논의되었으며, 이러한 벡터를 환자 내 고체 종양에 전달하는 방법은 당업계의 기술 내에 있다. 일부 실시형태에서, 전달 방법은 종양 내로, 또는 주변 조직에 벡터의 정위 주사를 포함할 수 있다.
siRNA는 종양에서 또는 근처에서 종양 조직 세포에 siRNA를 전달하는데 적합한 임의의 수단에 의해 피험체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, siRNA는 유전자 총, 전기천공법, 주촉성 주사에 의해, 또는 다른 적합한 비경구 또는 장용 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. 적합한 장용 투여 경로는 경구, 직장, 경피 또는 비강내 전달을 포함한다.
적합한 비경구 투여 경로는 혈관내 투여(예를 들어 정맥주사 볼루스 주사, 정맥주사 주입, 동맥내 볼루스 주사, 동맥내 주입 및 혈관 내 카테터 점적주입), 주변 조직 및 조직 내 투여(예를 들어, 종양 주변 및 종양 내 주사), 피하 주사 또는 피하 주입을 포함하는 증착(예컨대 삼투압 펌프), 종양 부위에 또는 근처의 영역에 직접(예를 들어, 주사) 적용, 예를 들어 카테터, 주사기 또는 다른 배치 장치(예를 들어 다공성, 비-다공성 또는 교질 물질을 포함하는 이식물), 흡입, 또는 주촉성 주사를 포함한다.
일부 실시형태에서, siRNA의 주사 또는 주입은 HER2 과발현 종양의 부위에 또는 근처에 주어진다. 더 바람직하게는, siRNA는 종양에 또는 종양에 영양분을 공급하는 혈관 내로 주사에 의해 직접 투여된다.
siRNA는 단일 용량 또는 다회 용량으로 투여될 수 있다. siRNA의 투여가 주입에 의하는 경우, 주입은 1회의 지속된 용량일 수 있고 또는 다회의 주입으로 전달될 수 있다. 종양 조직 내에 직접적인 작용제의 주사는 HER2 과발현 종양/암, 예를 들어 유방암 부위에서 또는 근처에서이다. 종양 조직 내로 또는 종양 부위에서 또는 근처에서 작용제의 다회 주사가 특히 바람직하다.
당업자는 또한 주어진 피험체에 siRNA를 투여하기 위한 적절한 투약 섭생을 용이하게 결정할 수 있다. 예를 들어, siRNA는 종양에, 종양 내로, 또는 종양 근처에, 예컨대 1회 주사 또는 증착에 의해 피험체에 1회 투여될 수 있다. 대안적으로, siRNA는 매일 또는 매주 여러번 피험체에 투여될 수 있다. 예를 들어, siRNA는 약 3 내지 약 28주, 더 바람직하게는 약 7 내지 약 10주의 기간 동안 매주 1회 피험체에 투여될 수 있다. 바람직한 투약 섭생에서, siRNA는 7주 동안 1주일에 1회 종양 부위 내로 또는 종양 부위에서 또는 종양 부위 근처에 주사된다(주촉성 주사). 다른 실시형태에서, siRNA는 1일에 또는 1주일에, 또는 1개월에 1회 또는 다회의 용량을 사용하여 정맥내로 투여된다. 무기한의 시간 길이 동안 siRNA의 주기적 투여는 나이브하거나 난치이고 또는 다른 암 치료에 대해 비-반응성인 만성 HER2 과발현 암 질병, 예컨대 HER2 과발현 유방암에 걸린 피험체에게 필요할 수 있다.
투약 섭생이 다회 투여를 포함하는 경우, 피험체에게 투여된 siRNA의 유효한 양은 전체 투약 섭생에 걸쳐 투여된 siRNA의 총량을 포함할 수 있다는 것이 이해된다.
siRNA는 당업계에 공지된 기법에 따라서 피험체에게 투여 전 약제학적 조성물로서 바람직하게 제형화된다. 본 발명의 약제학적 조성물은 적어도 치료적으로 유효한 멸균, 무-파이로겐을 특징으로 하며, 약제학적으로 유효하고, 적정한 염 용액, 0.4% 식염수, 0.3% 글라이신, 히알루론산 등이 있는 것을 의미한다.
약제학적 조성물은 또한 통상적인 약제학적 부형제 및/또는 첨가제를 포함할 수 있다. 적합한 약제학적 부형제는 안정제, 항산화제, 삼투압 조절제, 완충제 및 pH 조절제를 포함한다. 적합한 첨가제는 생리적으로 생체에 적합한 완충제(예를 들어, 트로메타민 하이드로클로라이드), 킬레이트의 첨가(예를 들어, DTPA 또는 DTPA-비스아마이드), 또는 칼슘 킬레이트 복합체(예를 들어 칼슘 DTPA, CaNaDTPA-비스아마이드), 및 선택적으로 칼슘 또는 나트륨 염의 첨가(예를 들어 염화칼슘, 아스코르브산칼슘, 글루콘산칼슘 또는 락트산칼슘)을 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 액체 형태로 사용을 위해 포장될 수 있고 또는 동결건조될 수 있다.
고체 조성물에 대해, 통상적인 비독성 고체 담체, 예를 들어, 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산 마그네슘, 사카린 나트륨, 탤컴, 셀룰로스, 글루코스, 수크로스, 탄산마그네슘 등이 사용될 수 있다.
예를 들어, 경구 투여를 위한 고체 약제학적 조성물은 상기 열거한 임의의 담체 및 부형제 및 하나 이상의 siRNA의 10 내지 95%, 바람직하게는 25% 내지 75%를 포함할 수 있다. 에어로졸(흡입) 투여를 위한 약제학적 조성물은 상기 기재한 바와 같은 리포좀 내에서 캡슐화된 하나 이상의 siRNA의 0.01 내지 20중량%, 바람직하게는 1중량% 내지 10중량%, 및 추진체를 포함할 수 있다. 원한다면 담체; 예를 들어 비강내 전달을 위한 레시틴이 또한 포함될 수 있다.
shRNA 억제 분자
일부 실시형태에서, shRNA 핵산 분자는 상보적 서열의 제1 및 제2 영역을 포함하는 스템-루프(stem-loop) 구조를 가지는 RNA 작용제를 지칭하며, 영역의 상보성 및 배향 정도는 염기쌍이 영역 사이에 생기기에 충분하고, 제1 및 제2 영역은 루프 영역에 의해 결합되며, 루프는 루프 영역 내 뉴클레오타이드(또는 뉴클레오타이드 유사체) 사이의 염기쌍의 결여로부터 초래된다. shRNA 구조의 듀플렉스 스템의 일부분 또는 절편은 안티센스 가닥이며 또는 표적 유전자, 예를 들어 HER2 및/또는 HER3의 mRNA의 약 18 내지 약 40개 이상의 뉴클레오타이드 부문에 상보적, 예를 들어 완전히 상보적이다. siRNA에 대조적으로, shRNA는 마이크로 RNA(miRNA)의 천연 전구체를 모방한다. miRNA는 식물 및 동물 발생 동안 전사 후 또는 번역 수준에서 유전자 발현을 조절할 수 있는 대략 22개의 뉴클레오타이드의 비암호화 RNA이다. miRNA의 한 가지 흔한 특징은 그것들이 아마도 다이서(Dicer)에 의해 모두 프레-miRNA, RNase III-형 효소, 또는 이것의 상동체로 칭해지는 대략 70개의 뉴클레오타이드 전구체 RNA 스템-루프로부터 절단된다는 것이다. 자연적으로-발생하는 miRNA 전구체(프레-miRNA)는 일반적으로 상보적인 2 부분을 포함하는 듀플렉스 스템, 및 스템의 2 부분을 연결하는 루프를 형성하는 단일 가닥을 가진다. 전형적인, 프레-miRNA에서, 스템은 하나 이상의 벌지(bulge), 예를 들어 스템의 일 부분에서 단일 뉴클레오타이드 "루프"를 만드는 여분의 뉴클레오타이드, 및/또는 2 부분의 스템을 서로 혼성화하는 갭을 만드는 하나 이상의 짝지어지지 않은 뉴클레오타이드를 포함한다. 본 발명의 짧은 헤어핀 RNA, 또는 유전자조작된 RNA 전구체는 이들 자연적으로 발생하는 프레-miRNA를 기반으로 한 인공 구성체이지만, 이는 요망되는 RNAi 작용제(예를 들어, 본 발명의 siRNA)를 전달하도록 유전자조작된다. 표적 mRNA에 상보적인 서열을 갖는 프레-miRNA의 스템 서열을 치환함으로써, shRNA가 형성된다. shRNA는 세포의 경로를 침묵시키는 전체 유전자에 의해 처리되고, 이에 의해 RNAi를 효율적으로 매개한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 shRNA 분자는, 예를 들어 세포 내에 존재 하는 Dicer에 의해 세포 내에서 처리될 때 상기 기재한 어떤 siRNA를 생성하도록 설계된다. shRNA 분자의 필수 요소는 듀플렉스 또는 이중-가닥 스템 부분을 형성하기 위하여 어닐링 또는 혼성화하는 충분한 상보성을 가지는 제1 부분 및 제2 부분을 포함한다. 2개의 부분은 완전히 또는 완벽하게 상보성일 필요는 없다. 제1 및 제2 "스템" 부분은 shRNA의 다른 부분에 어닐링하거나 혼성화하기에 불충분한 서열 상보성을 가지는 서열을 가지는 부분에 의해 연결된다. 이 후자의 부분은 shRNA 분자 내 "루프" 부분으로서 언급된다. shRNA 분자는 siRNA를 만들도록 처리된다. shRNA는 또한 하나 이상의 벌지, 즉 스템의 부분에서 작은 뉴클레오타이드 "루프", 예를 들어 1-, 2- 또는 3-뉴클레오타이드 루프를 만드는 여분의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 스템 부분은 동일한 길이일 수 있고, 또는 한 부분은, 예를 들어 1-5개의 뉴클레오타이드의 돌출부를 포함할 수 있다. 돌출부 뉴클레오타이드는, 예를 들어 유라실(U), 예를 들어 모든 U을 포함할 수 있다. 이러한 U은 전사 종결을 신호처리하는 shRNA-암호화 DNA에서 티미딘(T)에 의해 명백히 암호화된다.
shRNA의 스템 부분 중 한 가닥은 RNA 간섭(RNAi)을 통해 상기 표적 RNA의 축퇴 또는 클리어런스를 매개하는 HER2 및/또는 HER3(예를 들어 서열번호 1에서 제공되는 HER2의 mRNA) 서열의 표적 RNA에 더욱 충분하게 상보적이다(예를 들어, 안티센스). 안티센스 부분은 스템의 5' 또는 3' 말단 상에 있을 수 있다. shRNA의 스템 부분은 바람직하게는 길이로 약 15 내지 약 50개의 뉴클레오타이드이다. 바람직하게는 2개의 스템 부분은 길이로 약 18 또는 19 내지 약 25, 30, 35, 37, 38, 39 또는 40개 이상의 뉴클레오타이드이다. 포유류 세포에서 사용될 때, 스템 부분의 길이는 인터페론 경로와 같은 비특이적 반응이 일어나는 것을 회피하기 위하여 약 30개 미만의 뉴클레오타이드이어야 한다. 비-포유류 세포에서, 줄기는 30개 초과의 뉴클레오타이드일 수 있다. 사실, 스템 부분은 표적 mRNA에 상보적인 훨씬 더 큰 부문을 포함할 수 있다(최대 및 전체 mRNA를 포함함). 듀플렉스 스템의 2 부분은 듀플렉스 스템을 형성하기 위하여 혼성화되도록 충분히 상보적이어야 한다. 따라서, 2 부분은 필요한 것은 아니지만, 완전히 또는 완벽하게 상보적일 수 있다.
shRNA 또는 유전자조작된 RNA 전구체 내 루프는 짝지어진 뉴클레오타이드의 수를 증가시키거나 감소시키는 루프 서열을 변형시키거나, 또는 루프 서열의 모든 또는 부분을 테트라루프 또는 다른 루프 서열로 대체함으로써 천연 프레-miRNA 서열과 상이할 수 있다. 따라서, shRNA 내 루프 부분은 길이로 약 2 내지 약 20개의 뉴클레오타이드, 즉, 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 그 이상, 예를 들어 길이로 15 또는 20개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드일 수 있다. 바람직한 루프는 "테트라루프" 서열로 이루어지거나 이것을 포함한다. 대표적인 테트라루프 서열은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 서열 GNRA를 포함하며, 여기서 N은 임의의 뉴클레오타이드이고, R은 퓨린 뉴클레오타이드, GGGG 및 UUUU이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 shRNA는 상기 기재한 요망되는 siRNA 분자 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, shRNA의 안티센스 부분 서열은 본질적으로 상기 기재한 것과 같이 또는 예를 들어 번역 시작의 상류 또는 하류의 영역 100 내지 200 또는 300개의 뉴클레오타이드로부터 표적 RNA(예를 들어 HER2 및/또는 HER3 mRNA) 내에서 18, 19, 20 또는 21개의 뉴클레오타이드, 또는 더 긴 서열을 일반적으로 선택함으로써 설계될 수 있다. 일반적으로, 해당 서열은 5' UTR(미번역 영역), 암호화 서열, 또는 3' UTR을 포함하는 표적 RNA(예를 들어, mRNA)의 임의의 부분으로부터 선택될 수 있으며, 단 상기 부분은 기능획득 돌연변이(gain-of-function mutation) 부위로부터 원위에 있다. 이 서열은 2개의 인접 AA 뉴클레오타이드를 함유하는 표적 유전자의 영역 바로 다음에 선택적으로 따라올 수 있다. 뉴클레오타이드 서열의 마지막 두 개의 뉴클레오타이드는 UU가 되도록 선택될 수 있다. 이런 21개 또는 그런 뉴클레오타이드 서열은 shRNA 내 듀플렉스 스템의 일부분을 만드는데 사용된다. 이 서열은 야생형 프레-miRNA 서열의 스템 부분을, 예를 들어 효소적으로 대체할 수 있고, 또는 합성된 완전 서열 내에 포함된다. 예를 들어 전체 스템-루프 유전자조작 RNA 전구체를 암호화하거나, 전구체의 듀플렉스 스템 내로 삽입되는 부분만을 암호화하는 DNA 올리고뉴클레오타이드를, 예를 들어 야생형 프레-miRNA로부터 유전자조작된 RNA 전구체 구성체를 구성하기 위한 제한 효소를 사용하여 합성할 수 있다.
HER2 및/또는 HER3, 예를 들어 HER2 NM_ 004448.1-(제품 ID B0017에 기반)의 mRNA를 표적화하는 특이적 기능성 핵산(예를 들어 shRNA 클론)은 또한 shRNA 발현 구성체인 제품 ID No. HSH004969로서 GeneCopoeia(상표명)(미국 메릴랜드주 락스빌에 소재한 GeneCopoeia)로부터 상업적으로 입수가능하다. 7개의 염기 루프 및 19-29개의 염기 스템으로 이루어진 헤어핀은 표적 mRNA 등록번호 NM_004448.2(서열번호 1로 나타냄)의 특이적 유전자 서열로 최적화되었다.
HER2 및/또는 HER3 의 안티센스 억제제
HER2 및/또는 HER3 뉴클레오타이드 서열에 안티센스인 분리된 기능성 핵산 분자는 HER2 및/또는 HER3 mRNA 또는 폴리펩타이드의 활성 또는 발현을 감소시키는데 유용하다. "안티센스" 기능성 핵산(안티센스 올리고뉴클레오타이드)는 단백질을 암호화하는 "센스" 핵산에 상보적인, 예를 들어 이중-가닥 cDNA 분자의 암호화 가닥에 상보적인, 또는 예를 들어 서열번호 1에서 제공되는 바와 같이 mRNA 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 안티센스 핵산은 전체 HER2 및/또는 HER3 암호화 가닥에, 또는 이들의 단비 일부에(예를 들어, 인간 HER2 및/또는 HER3 뉴클레오타이드서열의 암호화 영역) 상보적일 수 있다. 다른 실시형태에서, 안티센스 핵산 분자는 HER2 및/또는 HER3 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 암호화 가닥의 "비암호화 영역"(예를 들어, 5' 또는 3' 미번역 영역)에 대한 안티센스이다.
안티센스 핵산은 HER2 및/또는 HER3 mRNA의 전체 암호화 영역에 상보적이 되도록 설계될 수 있지만, 일반적으로 HER2 및/또는 HER3 mRNA의 암호화 또는 비암호화 영역의 일부에만 안티센스인 올리고뉴클레오타이드이다. 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 HER2 및/또는 HER3 mRNA의 번역 출발 부위 주변의 영역, 예를 들어 관심의 표적 유전자 뉴클레오타이드 서열의 -10 내지 +10 영역에 상보적일 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는, 예를 들어 길이로 약 5 내지 100, 또는 약 7, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 또는 80개 또는 초과의 뉴클레오타이드일 수 있다.
안티센스 핵산은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 화학적 합성 및 효소적 결찰 반응을 사용하여 구성될 수 있다. 예를 들어, 안티센스 핵산(예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오타이드)은 자연적으로 발생하는 뉴클레오타이드 또는 분자의 생물학적 안정성을 증가시키도록 또는 안티센스와 센스 핵산 사이에 형성된 듀플렉스의 물리적 안정성을 증가시키도록 설계된 다양하게 변형된 뉴클레오타이드를 사용하여 화학적으로 합성될 수 있으며, 예를 들어 포스포로티오에이트 유도체 및 아크리딘 치환된 뉴클레오타이드가 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Protocols for Oligonucleotide Conjugates. Totowa, N.J.: Humana Press, 1994], 및 예를 들어 미국 콜로라도주 라파예트에 소재한 Dharmacon 및 미국 텍사스주 오스틴에 소재한 Ambion으로부터 상업적으로 입수가능한 서비스를 참조). 안티센스 핵산은 또한 핵산 내로 안티센스 배향에서 서브클로닝된 발현 벡터를 사용하여 생물학적으로 생성될 수 있다(즉, 삽입된 핵산으로부터 전사된 RNA는 관심의 표적 핵산에 대한 안티센스 배향을 가질 것이다). 안티센스 핵산은 또한 포스포르아미다이트 방법, H-포스포네이트 방법 및 포스파이트 트라이메스터 방법과 같은 합성 방법으로부터 생성될 수 있다. 안티센스 핵산은 또한 PCR 방법으로 생성될 수 있다. 이러한 방법은 cDNA 및 mRNA에 상보적인 cDNA 서열을 생성한다.
일부 실시형태에서, 안티센스 분자는 변형된 또는 미변형된 RNA, DNA, 또는 혼합된 폴리머 올리고뉴클레오타이드일 수 있으며, 주로 펩타이드 합성의 억제, 예를 들어 HER3, HER2, MSPR, Axl, MAP3K(ERK, JNK 및 p38 MAPK), MEKK 키나제들/키나제 수용체, INSR, IGF-IR 및 FGFR2 중 하나 이상의 발현의 억제를 초래하는 매칭 서열에 특이적으로 결합하는 것에 의해 주로 작용한다. 안티센스 분자는 변형된 또는 미변형된 RNA, DNA 또는 혼합된 폴리머 올리고뉴클레오타이드일 수 있으며, 펩타이드 합성의 억제, 예를 들어 HER2 및/또는 HER3의 발현에서 억제를 초래하는 매칭 서열에 특이적으로 결합하는 것에 의해 주로 작용한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 왓슨 크릭 염기쌍에 의해 표적 RNA에 결합하며, RNase H 효소를 입체적으로 차단하거나 활성화함으로써 결합 서열의 리보솜 번역을 방지하여 유전자 발현을 차단한다. 안티센스 분자는 또한 RNA 처리를 간섭함으로써 단백질 합성을 변경할 수 있거나, 또는 핵으로부터 세포질 내로 수송될 수 있다.
안티센스 핵산은 α-아노머 핵산 분자일 수 있다. α-아노머 핵산 분자는 상보적 RNA를 갖는 특이적 이중-가닥 혼성체를 형성하며, 여기서 보통의 β-단위에 대조적으로, 가닥은 서로 평행하다. 안티센스 핵산 분자는 또한 2'-O-메틸 리보뉴클레오타이드 또는 키메라 RNA-DNA 유사체를 포함할 수 있으며, 혼합된 뉴클레오사이드 간 연결을 가질 수 있다(예를 들어, 문헌[Protocols for Oligonucleotide Conjugates. Totowa N.J.: Humana Press, 1994] 참조).
일부 실시형태에서, 암 치료 방법은 화합물 1과 안티센스 핵산의 병용물을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 안티센스 핵산 분자는 전형적으로 피험체에게 투여되며(예를 들어 조직 부위에서 직접 주사에 의해) 또는 인시츄로 생성되므로, 그것들은 예를 들어 서열번호 2에서 제공되는 것과 같은 HER2 및/또는 HER3 단백질을 암호화하는 세포 RNA(예를 들어 mRNA) 및/또는 게놈 DNA 또는 이들의 스플라이싱 변이체에 결합하거나 이들에 혼성화하고, 이에 의해, 예를 들어 전사 및/또는 번역을 억제함으로써 단백질의 발현을 억제한다. 대안적으로, 안티센스 핵산 분자는 선택된 세포를 표적화하기 위하여 변형될 수 있고, 그 다음에 전신에 투여될 수 있다. 전신 투여를 위하여, 안티센스 분자는 변형될 수 있어서, 그것들은 예를 들어, 종양 세포, 예를 들어 HER2 과발현 종양 세포 상에 존재 하는 세포 표면 수용체 또는 항원에 결합하는 펩타이드 또는 항체에 안티센스 핵산 분자를 연결함으로써, 선택된 세포 표면 상의 수용체 또는 발현된 항체에 특이적으로 결합한다. 안티센스 핵산 분자는 또한 본 명세서에 기재된 벡터를 사용하여 종양 세포에 전달될 수 있다. 안티센스 분자의 충분한 세포내 농도를 달성하기 위하여, 안티센스 핵산 분자 내 벡터 구성체는 강한 pol II 또는 pol III 프로모터의 제어 하에 위치된다. 안티센스 핵산 분자의 투여 방법은 또한 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, Wacheck et al. Chemosensitisation of malignant melanoma by BCL2 antisense therapy (2000) Lancet 356:1728-1733; Webb et al. BCL-2 antisense therapy in patients with non - Hodgkin lymphoma(1997) Lancet 349:1137-1141).
일부 실시형태에서, HER2 및/또는 HER3 유전자 발현은 HER2 및/또는 HER3의 조절 영역(예를 들어, HER2 및/또는 HER3 프로모터 및/또는 인핸서)에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 표적화함으로써 억제되어 표적 세포 내 HER2 및/또는 HER3 유전자의 전사를 방지하는 3중 나선형 구조를 형성한다. 일반적으로 본 명세서에 전문이 참조로 포함된 문헌[Hurst, H.C., Breast Cancer Res 2001, 3:395-398; Helene (1991) Anticancer Drug Des. 6(6):569-84; Helene et al. (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36; 및 Maher (1992) Bioassays 14:807-15)]을 참조한다. 3중 나선 형성을 위해 표적화될 수 있는 잠재적 서열은 소위 "스위치백(switchback)" 핵산 분자를 만드는 것에 의해 증가될 수 있다. 스위치백 분자는 교대로 5'-3', 3'-5' 방식에 의해 합성되므로, 그것들은 듀플렉스의 첫 번째 하나의 가닥, 그 다음에 서로가 염기 쌍이 되어서, 듀플렉스의 한 가닥에 존재 하는 퓨린 또는 피리미딘 중 하나의 상당한 신장에 대한 필요성을 제거한다.
HER2 및/또는 HER3 기능성 핵산 분자는, 예를 들어 분자의 안정성, 혼성화, 또는 가용성을 개선시키기 위하여 염기 모이어티, 당 모이어티 또는 포스페이트 백본에서 변형될 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자의 데옥시리보스 포스페이트 백본은 변형되어 펩타이드 핵산을 만들 수 있다(문헌[Hyrup et al. (1996) Bioorgan. Med. Chem. 4:5-23] 참조). 본 명세서에 사용되는 용어 "펩타이드 핵산" 또는 "PNA"는 핵산 모방체, 예를 들어 DNA 모방체를 지칭하며, 여기서 데옥시리보스 포스페이트 백본은 유사펩타이드(pseudopeptide) 백본으로 대체되고, 단지 4개의 천연 뉴클레오염기가 유지된다. PNA의 중성 백본은 낮은 이온 강도 하에서 DNA 및 RNA가 특이적 혼성화되도록 할 수 있다. PNA 올리고머의 합성은 문헌[Hyrup et al. (1996, 상기 참조) 및 Perry-O'Keefe et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:14670-14675)]에서 기재되는 바와 같은 표준 고체상 펩타이드 합성 프로토콜을 사용하여 수행될 수 있다.
HER2 및/또는 HER3 핵산 분자의 PNA는 치료적 및 진단적 용도로 사용될 수 있다. 예를 들어, PNA는 예를 들어 복제를 막거나 억제하는 전사 또는 번역을 유발함으로써 유전자 발현의 서열-특이적 조절을 위한 안티센스 또는 항원 작용제로 사용될 수 있다. HER2 및/또는 HER3 핵산 분자의 PNA는 또한 다른 효소(예를 들어, S1 뉴클레아제(Hyrup (1996, 상기 참조))와 병용하여 사용할 때 "인공 제한 효소"로서, 또는 DNA 서열 또는 혼성화를 위한 프로브 또는 프라이머로서(Hyrup et al. (1996, 상기 참조); Perry-O'Keefe et al. (1996, 상기 참조)) 유전자 내 단일 염기쌍 돌연변이의 분석에 (예를 들어, PNA-관련 PCR 클램핑에 의해) 사용할 수 있다.
HER2 및/또는 HER3 의 항체 억제제
다른 실시형태에서, 억제제는 항체 또는 그것의 단편일 수 있다. 항체는 예를 들어 키나제 수용체의 세포 밖 도메인에 결합하는 것에 의해 상향조절된 키나제 활성을 억제할 수 있다. 다양한 적합한 항체는 당업계에 공지되어 있으며, 상업적으로 입수가능하다. 예를 들어, 각각의 HER2, HER3, MSPR, Axl, MAP3K(ERK, JNK 및 p38 MAPK) 및 MEKK 키나제에 대한 항체는 R&D Systems(미네소타주 미네아폴리스에 소재)로부터 얻을 수 있다. 예를 들어 R&D Systems 카탈로그: MSPR에 대해(카탈로그 번호 AF691, FAB691A, BAF691, FAB691F, MAB691, FAB691P, DYC1947E, DYC1947-2, DYC1947-5, DYC691-2, DYC691-5, AF431, BAF431, 1947-MS-050 및 431-MS-100); Axl에 대해(카탈로그 번호 AF154 BAF154, DY154, MAB154 및 FAB1541); MAP3k에 대해(카탈로그 번호 4540-KS-010, MAB4540, MAB6095); MEKK에 대해(카탈로그 번호 MAB6095); HER2에 대해(카탈로그 번호 AF1768, MAB1129, AF1129, MAB11291, AF4438, MAB4360); HER3에 대해(카탈로그 번호 MAB3482, MAB3483, FAB3481P 및 MAB348); INSR에 대해(카탈로그 번호 AF1544, MAB1544, MAB15441 및 AF2507); IGF-IR에 대해(카탈로그 번호 MAB391, AF-305-NA 및 FAB391C); 및 FGFR2에 대해(카탈로그 번호 MAB6842, MAB684, MAB665 및 MAB6841). U3-1287(독일 마르틴스리이트에 소재한 U3 Pharma) 및 MM-121(여기서 항체는 WO 08/100624의 Ab#6이다)(매사추세츠주 캠브릿지에 소재한 Merrimack Pharmaceuticals)는 잘 알려진 항-HER3 항체의 추가적인 예이다. 추가적인 항-HER3 항체는 WO 97/35885, EP 1414494, WO 08/100624, US 7705130, US2010/0047829 및 문헌[Chen et al., J. Biol. Chem., 271:7620-7629 (1996)]에서 개시되며, 이들 모두는 본 명세서에 참조로 포함된다.
한 양태에서, HER3 억제제는 표면 플라스몬 공명 분석 또는 세포 결합 분석을 사용하여 측정한 바와 같은 적어도 4 nM의 KD를 갖는 ErbB3에 결합하는 항-ErbB3 항체이다. 한 실시형태에서, 이러한 항체는 다음의 CDR을 포함한다:
VH CDR1- 서열번호 9:
Figure pct00164
VH CDR2 - 서열번호 10:
Figure pct00165
VH CDR3- 서열번호 11:
Figure pct00166
VL CDR1 - 서열번호 12:
Figure pct00167
VL CDR2 - 서열번호 13:
Figure pct00168
VL CDR3 - 서열번호 14:
Figure pct00169
.
다른 실시형태에서, 이러한 항체는 서열번호 15:
Figure pct00170
의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 16:
Figure pct00171
의 서열을 가지는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
다른 실시형태에서, 이러한 항체는 MM-121이며, 이는 다음의 아미노산 서열-서열번호 17:
Figure pct00172
을 갖는 중쇄 및 아미노산 서열-서열번호 18:
Figure pct00173
을 갖는 경쇄를 포함한다.
일부 실시형태에서, HER2의 항체 억제제는 HERCEPTIN(등록상표)((huMAb4D5-8, rhuMAb HER2, 미국특허 제5,821,337호) 캘리포니아주 샌프란시스코에 소재한 Genentech, Inc.)로서 상업적으로 입수가능한 트라스투주맙을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 트라스투주맙은 화학식 I의 화합물과 병용하여 피험체에게 투여된다. 이러한 투여의 트라스투주맙의 투약량은 과도한 실험 없이 처방하는 의사에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 화학식 I의 화합물의 병용물로 투여되는 트라스투주맙의 1주일 투약량은 1주일에 약 0.01㎎/㎏ 내지 약 100㎎/㎏, 또는 약 0.1㎎/㎏ 내지 약 100㎎/㎏, 또는 약 1㎎/㎏ 내지 약 100㎎/㎏, 또는 약 0.1㎎/㎏ 내지 약 50㎎/㎏, 또는 약 0.1㎎/㎏ 내지 약 10㎎/㎏의 범위에 있을 수 있고, 바람직하게는 정맥 내로 투여될 수 있다.
일부 실시형태에서, HER2 항체 억제제는 용량당 약 100㎎ 내지 용량당 약 1500㎎의 범위에 있는 양으로 1회 이상의 용량으로 투여되는 항체 퍼투주맙(미국특허 제7,449,184호에 개시되며 그것의 전문이 본 명세서에 포함됨)을 포함하며, 대략 1주일마다, 대략 2주일마다, 대략 3주일마다 또는 대략 4주일마다 투여된다.
뮤린 기원의 항-HER2 항체 및 그것의 인간화된 형태 및 키메라 형태는 본 발명의 방법에서 사용에 적합하다. 이러한 HER2 항체의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 4D5 항체(미국특허 제5,677,171호 및 제5,772,997호에 기재됨) 및 520C9 항체 및 452F2, 736G9, 741F8, 758G5 및 761B10(미국특허 제6,054,561호에 기재됨)로 지정되는 그것의 기능성 동등물(WO93/21319)를 포함하며; 모든 이들 특허 및 특허 출원은 본 명세서에 참조로 포함된다. 일부 실시형태에서, HER2 항체 억제제는 본 명세서에 전문이 참조로 포함되는 미국특허 제5,821,337호의 표 3에서 기재되는 바와 같이 인간화된 항-HER2 항체, 예를 들어 huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 및 4D5-8로부터 선택된 하나 이상의 항체, 및 인간화된 2C4 항체를 포함할 수 있다. 대안으로, 적합한 항체는 이하에 기재하는 바와 같이 잘 알려진 기술을 사용하여 용이하게 제조될 수 있다.
항체의 제조
다클론성 항체
다클론성 항체는 동물 내에서 적절한 항원 및 보조제의 다회 피하(sc) 또는 복강내(ip) 주사에 의해 바람직하게 상승된다. 대안적으로, 항원은 동물의 림프절 내로 직접 주사될 수 있다(문헌[Kilpatrick et al., Hybridoma, 16:381-389, 1997] 참조). 개선된 항체 반응은 면역화된 종 내에서 2작용성 또는 유도체화제, 예를 들어 말레이미도벤조일 설포숙신이미드 에스터(시스테인 잔기를 통한 컨쥬게이션), N-하이드록시숙신이미드(리신 잔기를 통해), 글루타르알데하이드, 숙신 무수물, 또는 당업계에 공지된 다른 작용제를 사용하여 면역원성인 단백질, 예를 들어 키홀 림펫(keyhole limpet) 헤모사이아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린, 또는 대두 트립신 억제제에 적절한 항원을 컨쥬게이트함으로써 얻어질 수 있다.
예를 들어 100㎍의 단백질 또는 컨쥬게이트(마우스에 대해)를 3 용적의 프로인트 완전 보조제와 합하고, 다수 부위에 해당 용액을 피부 내로 주사함으로써 항원, 면역원성 컨쥬게이트 또는 유도체에 대해 동물을 면역화한다. 1개월 후, 동물을 다수의 부위에서 피하 주사로 프로인트 완전 보조제 중에서 본래 펩타이드 또는 컨쥬게이트 양의 1/5 내지 1/10로 부스팅한다. 부스터 주사 후 7 내지 14일에, 동물을 출혈시켰고, 혈청을 항체 역가에 대해 분석한다. 역가가 안정 상태를 유지할 때까지 동물을 부스팅한다. 바람직하게는 동물은 동일 항원의 컨쥬게이트로 부스팅하지만, 상이한 가교 시약을 통해 컨쥬게이션한다. 컨쥬게이트는 또한 단백질 융합으로서 재조합 세포 배양물 내에서 만들어질 수 있다. 또한 면역 반응을 향상시키기 위하여 알륨과 같은 응집화제가 적합하게 사용된다.
단클론성 항체
단클론성 항체는 문헌[Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 의해 우선 기재된 하이브리도마 방법을 사용하여, 또는 재조합 DNA 방법에 의해 만들어질 수 있다. 하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물, 예컨대 래트, 햄스터, 또는 짧은 꼬리 원숭이는 면역을 위하여 사용된 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생성하거나 생성할 수 있는 림프구를 유발하도록 면역화된다. 대안적으로, 림프구는 시험관내에서 면역화될 수 있다. 그 다음에 림프구는 적합한 융합제, 예컨대 폴리에틸렌 글라이콜을 사용하여 골수종 세포와 융합되어 하이브리도마 세포를 형성한다(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). 따라서 제조된 하이브리도마 세포는 씨딩되고 비융합, 모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 바람직하게 함유하는 적합한 배양 배지 내에서 성장된다. 예를 들어 모 골수종 세포가 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase, HGPRT 또는 HPRT)가 없다면, 하이브리도마에 대한 배양 배지는 전형적으로 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘(HAT 배지)을 포함할 것이며, 이 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지한다.
바람직한 골수종 세포는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체-생성 세포에 의해 항체의 안정한 고수준 생성을 지지하는 것이며, 배지에 민감하다. 인간 골수종 및 마우스-인간 헤테로골수종 세포주는 또한 인간 단클론성 항체의 생성에 대해 기재되었다(Kozbor, J. Immunol., 133: 3001-(1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). 대표적인 뮤린 골수종 계통은 미국 캘리포니아주 샌디에고 Salk Institute Cell Distribution Center로부터 입수가능한 MOP-21 및 M. C.-11 마우스 종양으로부터 유래된 것, 및 미국 메릴랜드주 락스빌에 소재한 미국 미생물보존센터(American Type Culture Collection)로부터 입수가능한 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포를 포함한다. 하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지는 항원에 대해 관련된 단클론성 항체의 생성에 대해 분석된다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생성된 단클론성 항체의 결합 특이성은 면역침강법에 의해 또는 시험관내 결합 분석에 의해, 예컨대 방사면역측정법(radioimmunoassay, RIA) 또는 효소결합 면역흡착 분석법(enzyme-linked immunoabsorbent assay, ELISA)에 의해 결정된다. 단클론성 항체의 결합 친화도는, 예를 들어 BIAcore 또는 스캐차드 분석(Scatchard analysis)(Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980))에 의해 결정될 수 있다.
하이브리도마 세포가 요망되는 특이성, 친화도 및/또는 활성의 항체를 생성하는 것이 확인된 후, 클론은 희석 과정을 제한함으로써 서브클로닝될 수 있고, 표준 방법에 의해 성장될 수 있다(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). 이 목적을 위한 적합한 배양 배지는, 예를 들어 D-MEMO 또는 RPMI 1640 배지를 포함한다. 추가로, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수 종양으로서 생체 내에서 성장될 수 있다. 서브클론에 의해 분비된 단클론성 항체는 통상적인 면역글로불린 정제 방법, 예컨대 단백질 A-세파로스, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기천공법, 투석 또는 친화도 크로마토그래피에 의해 배양 배지, 복수 유체 또는 혈청으로부터 적합하게 분리된다.
항체의 재조합 생성
관심의 면역글로불린의 아미노산 서열은 직접적 단백질 서열에 의해 결정될 수 있고, 적합한 암호화 뉴클레오타이드 서열은 보편적 코돈 표에 따라서 설계될 수 있다.
대안적으로, 단클론성 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 방법을 사용하여(예를 들어 단클론성 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용함으로써) 하이브리도마 세포로부터 분리되고 시퀀싱될 수 있다. 서열 결정은 일반적으로 관심의 유전자 또는 cDNA의 적어도 일부의 분리를 필요로 할 것이다. 보통 이는 단클론성 항체를 암호화하는 DNA 또는 mRNA의 클로닝을 필요로 한다. 클로닝은 표준 기법을 사용하여 수행된다(예를 들어, 문헌[Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide, Vols 1-3, Cold Spring Harbor Press], 이는 본 명세서에 참조로 포함됨). 예를 들어, cDNA 라이브러리는 polyA+ mRNA, 바람직하게는 막-관련 mRNA의 역 전사에 의해 구성될 수 있고, 해당 라이브러리는 인간 면역글로불린 폴리펩타이드 유전자 서열에 특이적인 프로브를 사용하여 스크리닝된다. 바람직한 실시형태에서, 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 관심의 면역글로불린 유전자 절편(예를 들어, 경쇄 가변 절편)을 암호화하는 cDNA(또는 전장 cDNA의 일부)를 증폭시킨다. 증폭된 서열은 임의의 적합한 벡터, 예를 들어 발현 벡터, 미니유전자 벡터 또는 파지 디스플레이 벡터 내로 용이하게 클로닝될 수 있다. 관심의 면역글로불린 폴리펩타이드의 일부분의 서열을 결정하는 것이 가능하다면, 사용된 특정 클로닝 방법은 중요하지 않다는 것이 인식될 것이다.
클로닝 및 시퀀싱을 위해 사용한 RNA에 대한 한 공급원은 유전자이식 마우스로부터 B 세포를 얻는 단계 및 불멸 세포에 B 세포를 융합시키는 단계에 의해 생성된 하이브리도마이다. 하이브리도마를 사용하는 것의 이점은 그것들이 용이하게 스크리닝될 수 있다는 것과 하이브리도마가 선택된 관심의 인간 단클론성 항체를 생성한다는 것이다. 대안적으로, RNA는 면역화된 동물의 B 세포(또는 전체 비장)로부터 분리될 수 있다. 하이브리도마 이외의 공급원이 사용될 때, 특이적 결합 특징을 갖는 면역글로불린 또는 면역글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 서열에 대한 스크리닝이 바람직할 수 있다. 이러한 스크리닝을 위한 한 방법은 파지 디스플레이 기법의 사용이다. 파지 디스플레이는, 예를 들어 Dower 등의 WO 91/17271, McCafferty 등의 WO 92/01047, 및 문헌[Caton and Koprowski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6450-6454 (1990)]에 기재되며, 이것들 각각은 본 명세서에 참조로 포함된다. 파지 디스플레이 기법을 사용하는 한 실시형태에서, 면역화된 유전자이식 마우스로부터의 cDNA(예를 들어, 전체 비장 cDNA)가 분리되며, PCR을 사용하여 면역글로불린 폴리펩타이드의 일부, 예를 들어 CDR 영역을 암호화하는 cDNA 서열을 증폭하며, 증폭된 서열은 파지 벡터 내로 삽입된다. 관심의 펩타이드, 예를 들어 요망되는 결합 특징을 갖는 가변 영역 펩타이드를 암호화하는 cDNA는 패닝(panning)과 같은 표준 기법에 의해 확인된다. 증폭되거나 클로닝된 핵산의 서열은 그 다음에 결정된다. 그러나 전형적으로 면역글로불린 폴리펩타이드의 전체 가변 영역을 암호화하는 서열은 때때로 시퀀싱될 필요가 있는 가변 영역의 일부만을, 예를 들어, CDR-암호화 일부를 결정한다. 전형적으로 시퀀싱된 부분은 길이로 적어도 30개의 염기일 수 있으며, 더 흔하게는 가변 영역 길이의 적어도 약 1/3 또는 적어도 약 1/2을 암호화하는 염기가 시퀀싱될 것이다. cDNA 라이브러리로부터 분리된 클론 상에서 또는 PCR이 사용될 때, 증폭된 서열을 서브클로닝한 후 또는 증폭된 절편의 직접적인 PCR 시퀀싱에 의해 시퀀싱이 수행될 수 있다. 시퀀싱은 표준 기법을 사용하여 수행된다(예를 들어, 문헌[Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide, Vols 1-3, Cold Spring Harbor Press 및 Sanger, F. et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467]을 참조하며, 이들은 본 명세서에 참조로 포함된다). 클로닝된 핵산 서열을 인간 면역글로불린 유전자의 공개된 서열 및 cDNA와 비교함으로써, 당업자는 시퀀싱된 영역에 따라서 용이하게 (i) 하이브리도마 면역글로불린 폴리펩타이드의 생식계열 절편 사용(중쇄의 아이소타입을 포함) 및 (ii) N-영역 첨가 및 체세포 돌연변이 과정으로부터 초래되는 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 서열을 결정할 수 있다. 면역글로불린 유전자 서열 정보의 한 공급원은 메릴랜드주 베데스다에 소재한 미국국립생물정보센터(National Center for Biotechnology Information), 미국국립의학도서관(National Library of Medicine), 미국 국립보건원(National Institutes of Health)이다.
일단 분리되면, DNA는 발현 제어 서열에 작용 가능하게 연결되거나 발현 벡터 내에 위치될 수 있고, 그 다음에 숙주 세포, 예컨대 대장균(E. coli) 세포, 시미안 COS 세포, 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary, CHO) 세포, 또는 달리 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 골수종 세포 내로 트랜스펙션되어 재조합 숙주 세포 내 단클론성 항체의 합성을 지시한다.
발현 대조군 서열은 특정 숙주 유기체 내에서 작용 가능하게 연결된 암호화 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 나타낸다. 원핵생물에 적합한 대조군 서열은, 예를 들어 프로모터, 작동가능한 오퍼레이터 서열, 및 리보솜-결합 부위를 포함한다. 진행 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 이용하는 것으로 알려져 있다.
핵산은 그것이 다른 핵산 서열과 함께 기능성 관계로 위치될 때 작용 가능하게 연결된다. 예를 들어, 전서열(presequence) 또는 분비 리더에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현될 때 폴리펩타이드에 대해 DNA에 작용 가능하게 연결되며; 프로모터 또는 인핸서는 그것이 서열의 전사에 영향을 미친다면 암호화 서열에 작용 가능하게 연결되고; 또는 리보솜-결합 부위는 그것이 번역을 용이하게 하도록 위치된다면 암호화 서열에 작용 가능하게 연결된다. 일반적으로, 작용 가능하게 연결된은 연결된 DNA 서열이 연속적이고, 분비 리더의 경우에 연속적이며 판독 단계에 있다는 것을 의미한다. 그러나 인핸서는 연속적이어서는 안 된다. 연결은 편리한 제한 부위에서 결찰에 의해 수행될 수 있다. 이러한 부위가 존재 하지 않는다면, 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커는 통상적인 실행에 따라서 사용될 수 있다.
세포, 세포주 및 세포 배양물은 종종 상호호환적으로 사용되며, 모든 이러한 지정은 자손을 포함한다. 형질변환체 및 형질변환된 세포는 1차 피험체 세포 및 이동된 수를 고려하지 않고 그것으로부터 유래된 배양물을 포함한다. 또한 의도적인 또는 유연의 돌연변이에 기인하여 모든 자손은 DNA 함량이 정확히 동일할 수 없다는 것이 이해된다. 본래 형질전환된 세포에 대해 스크리닝한 것과 동일한 작용 또는 생물학적 활성을 가지는 돌연변이체 자손이 포함된다.
분리된 핵산은 또한 숙주 세포, 벡터 및 핵산을 포함하는 숙주 세포에 의해 인식된 제어 서열에 선택적으로 작용 가능하게 연결된 특이적 항체를 암호화하도록 제공되며, 항체 생성을 위한 재조합 기법은 숙주 세포를 배양하여 핵산이 발현되도록 하는 단계, 및 선택적으로 숙주 세포 배양물 또는 배양 배지로부터 항체를 회수하는 단계를 포함할 수 있다.
다양한 벡터가 당업계에 공지되어 있다. 벡터 성분은 다음 중 한 가지 이상을 포함할 수 있다: 신호 서열(예를 들어, 항체의 분비를 지시할 수 있음), 복제원점, 하나 이상의 선택적 마커 유전자(예를 들어 항생제 또는 다른 약물 저항성을 부여하고, 영양 요구성 결핍을 보완하거나, 또는 배지 내에서 이용가능하지 않은 중요한 영양분을 공급할 수 있음), 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열, 이들 모두는 당업계에 잘 공지되어 있다.
적합한 숙주 세포는 원핵생물, 효모, 또는 고차의 진핵세포를 포함한다. 적합한 원핵생물은 진정세균, 예컨대 그램-음성 또는 그램-양성 유기체, 예컨대 에스케리키아(Escherichia)와 같은 엔테로학테리아세애(Enterohacteriaceae), 예를 들어 대장균, 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들어 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어, 세라티아 마르세칸스(Serratia marcescans) 및 쉬겔라(Shigella)뿐만 아니라 바실리(Bacilli) 예컨대 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) 및 바실러스 리체니포르미스(B. licheniformis), 슈도모나스(Pseudomonas), 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)를 포함한다. 원핵생물에 추가로, 진핵 미생물, 예컨대 곰팡이 또는 효모는 항체-암호화 벡터에 대한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 또는 통상의 빵 효모는 저급 진핵 숙주 미생물유기체 중에서 가장 흔하게 사용된다. 그러나, 다수의 다른 속, 종 및 균, 예컨대 피키아(Pichia), 예를 들어 피키아 파스토리스(P. pastoris), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 클루이베르마이세스(Kluyveromyces), 야로이야(Yarrowia); 칸디다(Candida); 트리코더마 리시아(Trichoderma reesia); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa); 스촨니오마이세스(Schwanniomyces), 예컨대 스촨니온마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis); 및 곰팡이, 예컨대 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨릴포클라디움(Tolypocladium), 및 아스퍼질러스 숙주, 예컨대 아스퍼질러스 니둘란스(A. nidulans) 및 아스퍼질러스 니거(A. niger)를 상업적으로 입수가능하다.
글라이코실화된 항체의 발현을 위한 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 수많은 바큘로바이러스 바이러스주 및 변이체 및 숙주로부터의 대응하는 허용 곤충 숙주 세포, 예컨대 스포돕테라 프러기페르다(Spodoptera frugiperda)(애벌레), 이집트숲모기(Aedes aegypti)(모기), 흰줄숲모기(Aedes albopictus)(모기), 노랑초파리(Drosophila melanogaster)(광대파리) 및 누에나방(Bombyx mori)이 확인되었다. 이러한 세포의 트랜스펙션을 위한 다양한 바이러스의 바이러스주는 공공연하게 입수가능하다. 예를 들어 Autographa californica NPV의 L-I 변이체 및 누에나방 NPV의 Bm-5 균주.
그러나, 관심은 척추동물 세포에서 가장 크며, 배양물(조직 배양물) 내 척추동물 세포의 증식은 일상적이 되었다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 예는 CHOKI 세포(ATCC CCL61) 및 중국 햄스터 난소 세포/-DHFR를 포함하는 중국 햄스터 난소 세포(DXB-11, DG-44; Urlaub et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); SV40(COS-7, ATCC CRL 1651)에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 계통; 인간 배아 신장 계통(현탁액 배양물 내 성장을 위하여 서브클로닝한 293 또는 293개 세포, [Graham et al., J. Gen Virol. 36: 59 (1977)]; 새끼 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 마우스 세르톨리 세포(TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251-(1980)); 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 그린 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포(HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포(WI38, ATCC CCL 75); 인간 간세포암 세포(Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양(MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포(Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)); MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다.
숙주 세포는 다양한 배지 내에서 배양될 수 있다. 상업적으로 입수가능한 배지, 예컨대 Ham's F10(Sigma), 최소 필수 배지((Minimal Essential Medium, MEM), (Sigma), RPMI-1640(Sigma) 및 둘베코 변형 이글스 배지((Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM), Sigma)는 숙주 세포를 배양하기에 적합하다. 추가로, 문헌[Ham et al., Meth. Enz. 58: 44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102: 255 (1980)], 미국특허 제4,767,704호; 제4,657,866호; 제4,927,762호; 제4,560,655호; 또는 제5,122,469호; WO90103430; WO 87/00195; 또는 미국특허 제30,985호에 기재된 어떤 배지가 숙주 세포에 대한 배양 배지로 사용될 수 있다. 이들 배지 중 어떤 것은 호르몬 및/또는 다른 성장 인자(예컨대, 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 생장 인자), 염(예컨대 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충제(예컨대 HEPES), 뉴클레오타이드(예컨대 아데노신 및 티미딘), 항생제(예컨대 Gentamycin(상표명) 약물), 미량 원소(마이크로몰 범위에서 최종 농도로 보통 존재 하는 무기 화합물로 정의됨), 및 글루코스 또는 등몰의 에너지 공급원이 필요하다면 보충될 수 있다. 임의의 다른 필요한 보충물은 또한 당업자에게 공지된 적절한 농도로 포함될 수 있다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 앞서 사용된 것이며, 당업자에게 명백할 것이다.
항체 조성물은, 예를 들어 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 양이온 또는 음이온 교환 크로마토그래피, 또는 바람직하게는 친화성 크로마토그래피를 사용하여, 친화성 리간드로서 관심의 항원 또는 단백질 A 또는 단백질 G를 사용하여 정제될 수 있다. 단백질 A는 인간 감마 1, 감마 2 또는 감마 4 중쇄에 기반한 항체를 정제하기 위하여 사용될 수 있다(Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)). 단백질 G는 모든 마우스 아이소타입에 대해 및 인간 감마 3에 대해 추천된다(Guss et al., 20 EMBO J. 5: 15671575 (1986)). 친화성 리간드에 부착되는 매트릭스는 가장 흔하게는 아가로스이지만, 다른 매트릭스가 이용가능하다. 제어된 다공성 유리 또는 폴리(스티렌다이비닐)벤젠과 같은 기계적으로 안정한 매트릭스는 유속을 더 빠르게 하며 아가로스로 달성될 수 있는 것보다 처리 시간을 더 짧게 한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, Bakerbond ABX(상표명) 수지(J. T. Baker, Phillipsburg, 25 NJ.)는 정제에 유용하다. 단백질 정제를 위한 다른 기법, 예컨대 에탄올 침전, 역상 HPLC, 크로마토포커싱, SDS-PAGE 및 암모늄 설페이트 침전은 또한 회수되는 특이적 결합제 또는 항체에 따라서 가능하다.
항-HER2 및/또는 HER3 항체의 단편은 그것들이 전장 항체의 요망되는 친화도를 유지한다면, 본 발명의 방법에서 사용에 적합하다. 따라서, 항-HER2 및/또는 HER3 항체의 단편은 HER2 및/또는 HER3 수용체 단백질에 결합하는 능력을 보유할 것이다. 항체의 단편은 전장 항체 부분, 일반적으로 항체 결합 또는 그것의 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, Fab, Fab'F(ab')2 및 Fv 단편 및 단일-쇄 항체 분자를 포함한다. "단일-쇄 Fv" 또는 "sFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 의도된 단편이되, 이들 도메인은 단일 폴리펩타이드 쇄 내에 존재한다. 예를 들어, 미국특허 제4,946,778호, 제5,260,203호, 제5,455,030호 및 제5,856,456호를 참조하며, 이것의 각각은 본 명세서에 참조로 포함된다. 일반적으로 Fv 폴리펩타이드는 sFv가 항원 결합을 위해 요망되는 구조를 형성하도록 할 수 있는 VH와 VL 도메인 사이의 폴리펩타이드 링커를 추가로 포함한다. sFv의 검토를 위해, 문헌[Pluckthun (1994) in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, ed. Rosenburg and Moore (Springer-Verlag, N.Y.), pp. 269-315]을 참조한다.
항체 또는 항체 단편은 문헌[McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-554 (1990). Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628]에 기재된 기법을 사용하여 만들어진 항체 파지 라이브러리로부터 분리될 수 있으며, 문헌[Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222:581-597]은 파지 라이브러리를 사용하여 뮤린 및 인간 항체의 분리를 각각 기재한다. 후속하는 간행물은 쇄 셔플링에 의한 고친화도(nM 범위) 인간 항체의 생성(Marks et al. (1992) Bio/Technology 10:779-783)뿐만 아니라 매우 큰 파지 라이브러리를 구성하기 위한 전략으로서 결합 감염 및 생체 내 재조합을 기재한다(Waterhouse et al. (1993) Nucleic. Acids Res. 21:2265-2266). 따라서, 이들 기법은 단클론성 항체의 분리를 위한 전통적인 단클론성 항체 하이브리도마 기법에 대한 실행가능한 대안이다.
인간화된 항체는 비-인간인 공급원으로부터 그것에 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 가진다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "공여체" 잔기로 언급되며, 이는 전형적으로 "공여체" 가변 도메인으로부터 취해진다. 인간화는 설치류 CDR 또는 CDR 서열을 인간 항체의 대응하는 서열로 치환함으로써, Winter 및 공동 연구자의 방법에 따라서 본질적으로 수행될 수 있다(Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536). 예를 들어, 미국특허 제5,225,539호; 제5,585,089호; 제5,693,761호; 제5,693,762호; 제5,859,205호를 참조하며; 이는 본 명세서에 참조로 포함된다. 따라서, 이러한 "인간화된" 항체는 항체를 포함하되, 실질적으로 더 적은 무결함 인간 가변 도메인은 비-인간 종으로부터 대응하는 서열로 치환되었다. 실행에서, 인간화된 항체는 전형적으로 인간 항체이며, 여기서 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 프레임워크 잔기는 설치류 항체 내 유사한 부위로부터의 잔기로 치환된다. 예를 들어, 미국특허 제5,225,539호; 제5,585,089호; 제5,693,761호; 제5,693,762호; 제5,859,205호를 참조한다.
항체 단편의 생성을 위한 다양한 기법이 개발되었다. 전통적으로, 이들 단편은 무결함 항체의 단백질 분해를 통해 유래된다(예를 들어, 문헌[Morimoto et al. (1992) Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)] 및 문헌[Brennan et al. (1985) Science 229:81] 참조). 그러나, 이들 단편은 현재 재조합 숙주 세포에 의해 직접 생성될 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 상기 논의한 항체 파지 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 대안으로, Fab'-SH 단편은 대장균으로부터 직접 회수되고 화학적으로 결합하여 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다(Carter et al. (1992) Bio/Technology 10:163-167). 다른 접근에 따라서, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 분리될 수 있다. 항체 단편의 생성을 위한 다른 기법은 당업자에게 명백할 것이다.
대안적으로, 감소된 면역원성 반응을 가지는 단백질 생성방법은 본 발명의 방법에서 사용에 적합한 항-HER2 및/또는 HER3 항체를 만들기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어 본 명세서에 참조로 포함된 WO 98/52976에 개시된 방법을 참조한다. 이러한 방법을 사용하여 만들어진 항- HER2 및/또는 HER3항체는 본 명세서에서 사용되는 용어 "항-HER2 및/또는 HER3 항체"에 포함된다.
추가로, 어떤 앞서 기재된 항-HER2 및/또는 HER3 항체는 본 발명의 방법에서 사용 전 컨쥬게이션될 수 있다. 이러한 컨쥬게이션된 항체는 당업계에서 입수가능하다. 따라서, 항- HER2 및/또는 HER3 항체는 간접적 표시 또는 간접적 표지 접근을 사용하여 표지될 수 있다. "간접적 표지" 또는 "간접적 표지 접근"은 킬레이트제가 항체에 공유적으로 부착되고, 적어도 하나의 방사성핵종이 킬레이트제 내로 삽입되는 것으로 의도된다. 예를 들어, 킬레이트제 및 방사성핵종은 본 명세서에 참조로 포함되는 문헌[Srivagtava and Mease (1991) Nucl. Med. Bio. 18: 589-603]에 기재된다. 대안적으로, 항-HER2 및/또는 HER3 항체는 "직접 표지" 또는 직접 표지 접근"을 사용하여 표지될 수 있으며, 여기서 방상성핵종은 항체에 직접 공유적으로 부착된다(전형적으로 아미노산 잔기를 통해). 바람직한 방사성핵종은 문헌[Srivagtava and Mease (1991) 상기 참조]에 제공된다. 간접적 표지 접근이 특히 바람직하다.
일반적 투여
한 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따르는 PI3K 억제제 및 항체와 병용되는 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하며, 동일 또는 별개의 비히클로 투여된다. 특정의 다른 구체적 실시형태에서, 투여는 특이적으로 경구 경로에 의할 수 있다. 본 발명의 화합물, 또는 이것의 약제학적으로 허용가능한 염의 순수한 형태 또는 적절한 약제학적 조성물로 투여는 임의의 허용되는 투여 방식 또는 유사한 이용성을 위한 작용제를 통해 수행될 수 있다. 따라서, 투여는 예를 들어 경구로, 비강으로, 비경구로(정맥내, 근육내 또는 피하), 국소적으로, 경피로, 질내로, 방광내로, 소뇌연수조로 또는 직장으로 구체적으로 정확한 투약량의 간단한 투여에 적합한 단위제형으로, 고체, 반-고체, 동결건조된 분말 또는 액체 제형, 예를 들어, 정제, 좌약, 알약, 연질 탄성 및 경질 젤라틴 캡슐, 분말, 용액, 현탁액 또는 에어로졸 등일 수 있다. 교아 세포종을 포함하는 뇌암을 치료할 때, 구체적으로는 작용 동안 뇌 종양 내로 글리아델, 화학치료제 약물(특히 BCNU)을 함유하는 용해가능한 물질을 위치시킴으로써 투여될 수 있다.
조성물은 활성제로서 화학식 I 또는 화학식 Ia의 화합물을 포함할 것이며, 통상적인 약제학적 담체 또는 부형제를 포함할 수 있고, 추가로 암에 대해 치료되는 환자에게 일반적으로 투여되는 다른 약물 및 약제를 포함할 수 있다.
보조제는 보존제, 습윤제, 현탁제, 감미제, 향미제, 방향제, 에멀젼화제 및 조제 약제를 포함한다. 미생물유기체의 작용 방지는 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로뷰탄올, 페놀, 소르브산 등에 의해 보장될 수 있다. 또한 등장제, 예를 들어 당, 염화나트륨 등을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 주사가능한 약제학적 형태의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제의 사용, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴에 의해 초래될 수 있다.
원한다면, 본 발명의 약제학적 조성물은 부수적 양의 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 에멀젼화제, pH 완충제, 항산화제 등, 예컨대 시트르산, 솔비탄 모노라우레이트, 트라이에탄올아민 올레이트, 뷰틸화된 하이드록시톨루엔 등을 함유할 수 있다.
제형의 선택은 다양한 인자, 예컨대 약물 투여 방식(예를 들어 경구 투여, 정제, 알약 또는 캡슐 형태의 제형) 및 약물 물질의 생체 이용률에 의존한다. 최근에, 약제학적 제형은 표면적을 증가시킴으로써, 즉 입자 크기를 감소시킴으로써 생체 이용률이 증가될 수 있는 원리에 기반한 불량한 생체 이용률을 나타내는 약물에 대해 특히 개발되었다. 예를 들어, 미국특허 제4,107,288호는 10 내지 1,000㎚ 범위의 크기에서 입자를 가지는 약제학적 제형을 기재하며, 여기서 활성 물질은 거대분자의 가교 매트릭스 상에서 지지된다. 미국특허 제5,145,684호는 약물 물질이 표면 변형제의 존재에서 나노입자로(400㎚의 평균 입자 크기) 분쇄된 다음, 액체 배지 중에서 분산되어 현저하게 높은 생체 이용률을 나타내는 약제학적 제형을 제공하는 약제학적 제형의 생성을 기재한다.
비경구 주사에 적합한 조성물은 생리적으로 허용가능한 멸균 수용액 또는 비수성 용액, 분산액 또는 에멀젼, 및 멸균 주사 용액 또는 분산물로 복원을 위한 멸균 분말을 포함할 수 있다. 적합한 수성 및 비수성 담체, 희석제, 용매 또는 비히클의 예는 물, 에탄올, 폴리올(프로필렌글라이콜, 폴리에틸렌글라이콜, 글라이세롤 등), 이들의 적합한 혼합물, 식물성 오일(예컨대 올리브 오일), 및 주사가능한 유기 에스터(예컨대 에틸 올레이트)를 포함한다. 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산물의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 적절한 유동성이 유지될 수 있다.
하나의 특이적 투여 경로는 경구이며, 치료되는 질병 상태의 중증 정도에 따라서 조절될 수 있는 편리한 1일의 투약 섭생을 사용한다.
경구 투여를 위한 고체 제형은 캡슐, 정제, 알약, 분말 및 과립을 포함한다. 이러한 고체 제형에서, 활성 화합물은 적어도 하나의 비활성의 관례적 부형제(또는 담체), 예컨대 시트르산나트륨 또는 제2인산칼슘, 또는 (a) 충전제 또는 증량제, 예를 들어 전분, 락토스, 수크로스, 글루코스, 만니톨 및 규산, (b) 결합제, 예를 들어 셀룰로스 유도체, 전분, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈, 수크로스 및 아카시아검, (c) 보습제, 예를 들어 글라이세롤, (d) 붕해제, 예를 들어 한천, 탄산칼슘, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 크로스카멜로스 나트륨, 규산염 복합체 및 탄산나트륨, (e) 용액 응결지연지, 예를 들어 파라핀, (f) 흡수 촉진제, 예를 들어 4차 암모늄 화합물, (g) 습윤제, 예를 들어 세틸 알코올, 및 글라이세롤 모노스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트 등, (h) 흡착제, 예를 들어 카올린 및 벤토나이트, 및 (i) 윤활제, 예를 들어 탈크, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고체 폴리에틸렌 글라이콜, 라우릴 황산나트륨, 또는 이들의 혼합물과 혼합된다. 캡슐, 정제 및 알약의 경우에, 제형은 또한 완충제를 포함할 수 있다.
상기 기재된 것과 같은 고체 제형은 코팅 및 껍데기, 예컨대 장용 코팅 및 당업계에 잘 공지된 다른 것과 함께 제조될 수 있다. 그것들은 진정제를 함유할 수 있으며, 또한 지연된 방식으로 장관의 특정 부분 내에서 활성 화합물 또는 화합물들을 방출하는 이러한 조성물을 가질 수 있다. 사용될 수 있는 포매된 조성물의 예는 폴리머 물질 및 왁스이다. 활성 화합물은 또한 적절하다면, 상기 언급한 부형제 중 한 가지 이상과 함께 마이크로캡슐화된 형태일 수 있다.
경구 투여를 위한 액체 제형은 약제학적으로 허용가능한 에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭시르를 포함한다. 이러한 제형은, 예를 들어 본 발명의 화합물(들), 또는 이들의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물, 및 선택적으로 약제학적 보조제를 담체, 예컨대 물, 식염수, 수성 덱스트로스, 글라이세롤, 에탄올 등; 가용화제 및 에멀젼화제, 예컨대 에틸 알코올, 아이소프로필 알코올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글라이콜, 1,3-뷰틸렌글라이콜, 다이메틸포름아마이드 등; 오일, 예컨대 면실 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배아 오일, 올리브 오일, 피마자 오일, 참깨 오일 등; 글라이세롤; 테트라하이드로푸르푸릴 알코올; 폴리에틸렌글라이콜; 및 소르비탄의 지방산 에스터; 또는 이들 물질의 혼합물 등 중에서 용해하고, 분산시킴으로써, 용액 또는 현탁액을 형성한다.
활성 화합물에 추가로, 현탁액은 현탁제, 예를 들어 에톡실화된 아이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 및 소르비탄 에스터, 미정질 셀룰로스, 알루미늄 메타하이드록사이드, 벤토나이트, 한천 및 트래거캔스, 또는 이들 물질의 혼합물 등을 함유할 수 있다.
직장 투여를 위한 조성물은, 예를 들어 좌약이며, 이는 본 발명의 화합물을, 예를 들어 적합한 비-자극 부형제 또는 담체, 예컨대 보통의 온도에서 고체이지만 체온에서 액체이고, 따라서 적합한 체강 내에서 녹는 한편, 그 안에서 활성 성분을 방출시키는 코코아 버터, 폴리에틸렌글라이콜 또는 좌약 왁스와 함께 혼합함으로써 제조될 수 있다.
본 발명의 화합물의 국소 투여를 위한 제형은 연고, 분말, 스프레이 및 흡입제를 포함한다. 활성 성분은 필요하다면 생리적으로 허용가능한 담체 및 임의의 보존제, 완충제 또는 추진제와 함께 멸균 조건 하에 혼합된다. 안약 제형, 안 연고, 분말 및 용액이 또한 본 발명의 범주 내에서 고려된다.
압축 가스는 에어로졸 형태로 본 발명의 화합물을 분산시키기 위하여 사용될 수 있다. 본 목적에 적합한 비활성기체는 질소, 이산화탄소 등이다.
일반적으로 의도된 투여방식에 따라서, 약제학적으로 허용가능한 조성물은 본 발명의 화합물(들)의 약 1중량% 내지 약 99중량%, 또는 약제학적으로 허용가능한 염 또는 이들의 용매화물, 및 적합한 약제학적 부형제의 99중량% 내지 1중량%를 함유할 것이다. 한 예에서, 조성물은 본 발명의 화합물(들)의 약 5중량% 내지 약 75중량%, 또는 이들의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물일 수 있으며, 나머지는 적합한 약제학적 부형제이다.
이러한 제형의 실질적 제조방법은 공지되어 있거나, 또는 당업자에게 명백할 것이다; 이에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., (Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1990)]을 참조한다. 투여되는 조성물은 어떤 경우에 본 발명의 교시에 따라서 질병-상태의 치료를 위하여 본 발명의 화합물, 또는 이것의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물의 치료적 유효량을 함유할 것이다.
본 발명의 화합물, 또는 이것의 약제학적으로 허용가능한 염은 치료적 유효량으로 투여되며, 사용된 특정 화합물의 활성, 대사적 안정성 및 화합물의 작용 길이, 연령, 체중, 일반적 건강상태, 성별, 식이요법, 투여방식 및 투여시간, 배설 속도, 약물 병용물, 특정 질병-상태의 중증도, 및 치료를 받는 주체를 포함하는 다양한 인자에 의존하여 다를 것이다. 본 발명의 화합물은 1일 당 약 0.1 내지 약 1,000㎎의 범위의 투약 수준으로 환자에게 투여될 수 있다. 약 70 킬로그램의 체중을 가지는 정상 인간 성인에 대해, 예를 들어 1일 당 체중의 킬로그램당 약 0.01 내지 약 100㎎의 범위의 투약량이다. 그러나 사용된 구체적 투약량은 다를 수 있다. 예를 들어, 투약량은 환자의 필요, 치료되는 질환의 중증도, 및 사용되는 화합물의 약리학적 활성을 포함하는 다수의 인자에 의존할 수 있다. 특정 환자를 위한 최적의 투약량 결정은 당업자에게 잘 공지되어 있다.
고정된 용량으로 제형화된다면, 이러한 병용 생성물은 상기 기재한 투약량 범위 내의 본 발명의 화합물 및 그것의 승인된 투약량 범위 내의 다른 약제학적으로 활성인 작용제(들)를 사용한다. 본 발명의 화합물은 대안적으로 병용 제형이 부적절할 때 공지된 약제학적으로 허용가능한 작용제(들)와 함께 순차적으로 사용될 수 있다.
화학식 I 또는 화학식 Ia의 화합물을 함유하는 대표적인 약제학적 제형은 이하의 약제학적 조성물 실시예에서 기재된다.
HER3, HER2, MSPR, Axl, MAP3K(ERK, JNK 및 p38 MAPK), MEKK 키나제들/키나제 수용체, INSR, IGF-IR 및 FGFR-2 키나제들/키나제 수용체의 억제제는 상기 기재한 바와 같은 경구 또는 비경구 투여를 위한 약제학적으로 허용가능한 부형제를 사용하여 고체 또는 액체 형태로 제형화될 수 있다. 기능성 핵산의 투여를 위한 방법 및 제형은 용이하게 공지되어 있으며, 예를 들어 그것들은 당해 기능성 핵산의 투여방식을 위해 특이적으로 설계된 멸균 수성 시약 중에서 제형화될 수 있다. 본 발명의 한 실시형태에서, 기능성 핵산은 프로드러그 형태일 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 음으로 하전된 이온의 결과이다. 세포막의 친유성 특성 때문에, 올리고뉴클레오타이드의 세포 흡수는 중성 또는 친유성 동등물과 비교하여 감소된다. 이 극성 "장애"는 프로드러그 접근을 사용함으로써 회피될 수 있다. 이 접근에서, 올리고뉴클레오타이드는 보호된 방식으로 제조되며, 따라서 그것이 투여될 때 올리고는 중성이다. 이들 보호기는 그것들이 제거될 수 있는 방식으로 설계되며, 그 다음에 올리고는 세포에 취해진다. 이러한 보호기의 예는 S-아세틸티오에틸(SATE) 또는 S-피발로일티오에틸(t-뷰틸-SATE)이다. 이들 보호기는 뉴클레아제 저항성이며, 선택적으로 세포내에서 감소된다.
기능성 핵산은 의도된 표적 부위에 전달을 용이하게 하도록 리간드/컨쥬게이트에 결합되고 기능성 핵산의 활성을 향상시키며, 즉 기능성 핵산의 세포 섭취를 증가시킬 수 있다. 이 컨쥬게이션은 말단 위치 5'/3'-OH에서 일어날 수 있지만, 리간드는 또한 당 및/또는 염기에서 일어날 수 있다. 컨쥬게이트/리간드의 다른 예는 콜레스테롤 모이어티, 리포좀, 중성 리간드, 듀플렉스 인터컬레이터, 예컨대 아크리딘, 폴리-L-리신, 하나 이상의 뉴클레아제-저항성 연결기를 갖는 "말단-캡핑"이다.
일부 실시형태에서, 기능성 핵산은 2개 이상의 상이한 기능성 핵산을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 결합제 및 보조제는 제형화된 약물의 부분을 포함할 수 있다. 캡슐, 정제, 알약 등은, 예를 들어 다음의 화합물을 함유할 수 있다: 결합제로서 미정질 셀룰로스, 검 또는 젤라틴; 부형제로서 전분 또는 락토스; 윤활제로서 스테아레이트; 및 다양한 감미제 또는 향미제. 캡슐에 대해, 투약량 단위는 액체 담체, 예컨대 지방 오일을 함유할 수 있다. 마찬가지로 당 또는 장용 작용제의 코팅은 투약 단위의 부분일 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 제형은 또한 활성 약제학적 성분 및 미정질 에멀젼을 형성하는 액체의 에멀젼일 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 요망되는 작용을 부여하지 않는 임의의 물질과 함께, 또는 요망되는 작용을 보충하는 물질과 함께 혼합될 수 있다. 이들은 다른 뉴클레오타이드 화합물을 포함하는 다른 약물을 포함할 수 있었다.
비경구, 피하, 경피 또는 국소 투여에 대해, 제형은 멸균 희석제, 완충제, 등장 조절제 및 항박테리아제를 포함할 수 있다. 기능성 핵산은 제어된 방출 특성을 갖는 이식물 또는 마이크로캡슐을 포함하는 예를 들어 항뉴클레아제 활성을 신체로부터의 분해 또는 즉시 제거에 대해 보호하는 담체와 함께 제조될 수 있다. 정맥내 투여를 위하여, 바람직한 담체는 생리 식염수 또는 인산염 완충 식염수이다. 바람직하게는, 기능성 핵산은 치료된 환자에서 심각한 부작용을 야기하지 않고 환자에게 치료적 유효량을 전달하기에 충분한 양으로 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제에서와 같이 단위 제형으로 포함된다.
본 발명의 화학식 I의 화합물과 공동 투여되는 기능성 핵산은 국소 또는 전신 치료가 요망되는지의 여무 및 치료되는 부위에 따라서 다수의 방법으로 투여될 수 있다. 투여는 (a) 경구; (b) 폐, 예를 들어 네뷸라이저에 의하는 것을 포함하는 분말 또는 에어로졸의 흡입 또는 흡입제에 의해; 기관내 또는 비강내; (c) 상피, 경피, 눈, 및 질 및 직장 전달을 포함하는 점막을 포함하는 국소; (d) 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내, 또는 근육내 주사 또는 주입을 포함하는 비경구; 또는 (e) 두개내, 예를 들어 척추강내 또는 심실내 투여일 수 있다. 한 실시형태에서, 활성 올리고는 IV, IP, 경구로, 국소로 또는 볼루스 주사로 투여되며, 또는 표적 기관에 직접 투여된다. 일부 실시형태에서, 기능성 핵산은 CT 스캔, PET 스캔 장치 및 MRI 스캔 장치와 같은 스캔 장치의 도움으로 또는 이것들의 도움 없이 영향받은 조직 내로 직접 주촉성 주사를 통해 또는 종양 내 주사에 의해 투여된다. 비경구, 척추강내 또는 종양내 투여를 위한 조성물 및 제형은 완충제, 희석제, 및 다른 적합한 첨가제, 예컨대 이에 제한되는 것은 아니지만, 침투 향상제, 담체 화합물, 및 다른 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 함유할 수 있는 멸균 수용액을 포함할 수 있다.
본 발명의 항체는 임의의 표준 의학적으로 허용되는 방식으로 암 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 단위 용량으로 편리하게 투여될 수 있으며, 약제학적 분야에 공지된 방법에 따라서 제조될 수 있다. 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, (Mack Publishing Co., Easton Pa., (1980))]을 참조한다. 용어 "단위 용량"은 인간과 같은 영장류에 대해 통합된 투약량으로서 적합한 물리적으로 별개의 단위로 사용되는 본 발명의 치료 조성물을 의미하며, 각 단위는 필요한 희석제 또는 담체와 함께 요망되는 치료 효과를 생성하도록 계산된 활성 물질의 사전 결정된 양을 함유한다. 단위 용량은 치료되는 암의 유형 및 중증도, 항체를 전달하기 위한 피험체 혈액의 수용력, 및 견딜 수 없는 부작용이 없이 충분히 높은 용량을 견디는 환자의 능력을 포함하는 다수의 인자에 의존할 것이다. 투여되는 항체의 정확한 양은 그러나 전형적으로 상당한 종양파괴 활성을 가지는 높은 용량으로부터 견딜 수 있는 낮은 용량으로 적정하여 전형적으로 실행자의 판단에 의해 인도될 것이며, 단위 용량은 일반적으로 투여 경로에 의존할 것이고, 1일 당 10ng/㎏ 체중 내지 100㎎/㎏ 체중의 범위, 더 전형적으로는 1일 당 100ng/㎏ 체중 내지 약 40㎎/㎏ 체중의 범위에 있을 것이다. 부스터 투여를 위한 적합한 섭생은 또한 가변적이지만, 전형적으로 초기 투여에 의해 대표되며, 그 다음에 순차적 주사 또는 다른 투여에 의해 1시간 이상의 간격으로 용량이 반복된다. 대안적으로, 연속적 또는 간헐적 정맥내 주입은 혈액 내 항체의 적어도 약 10 나노몰 내지 10마이크로몰의 농도를 유지하기에 충분하게 만들어질 수 있다.
키트
일부 실시형태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 제1 용기를 포함하는 암 치료 조성물의 제조를 위한 키트를 제공한다: (a) 화학식 I의 화합물의 치료적 유효량; (b) 항-HER2 및/또는 HER3 항체와 같은 항체 용액의 치료적 유효량을 포함하는 제2 용기(대안적으로 동결건조된 형태); (c) 선택적으로, 하나 이상의 의약 전달 장치, 예를 들어 주사기 등; (d) 선택적으로 항-HER2 및/또는 HER3 항체를 재현탁하기 위한 희석제; 및 (e) 환자에서의 암 치료를 위한 조성물의 제조를 위한 설명서 세트.
유용성
화학식 I의 화합물을 WO2007044729의 생물학적 실시예 1에 기재한 분석을 사용하여 시험하였고, PI3K 억제제가 되는 것을 결정하였다. 이와 같이, 화학식 I의 화합물은 질병, 특히 PI3K 활성이 질병의 병적 측면 및/또는 징후에 기인하는 암의 치료에 유용하다. 예를 들어, PI3K 활성이 질병의 병적 측면 및/또는 징후에 기인하는 암은 유방암, 결장암, 직장암, 자궁내막암, 위 암종, 교모세포종, 간세포 암종, 소 세포 폐암, 비-소 세포 폐암, 흑색종, 난소암, 췌장암, 전립선 암종, 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병(CML) 및 갑상선 암종 등을 포함한다.
일부 실시형태에서, 보충적 키나제 경로의 확인 방법은 신규 암 치료제를 설계하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 한 실시형태에서, 본 발명은 PI3K 억제제의 효과를 약화시키는 암 세포 내 보충적 키나제 경로의 확인 방법을 제공한다. 해당 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 암 세포를 화학식 I의 화합물을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; (b) 조성물의 존재 및 부재에서 암 세포의 혼합물을 인큐베이션하는 단계; (c) 인큐베이션 기간 후 조성물의 존재 및 부재에서 다수의 키나제 효소의 발현을 측정하는 단계; 및 (d) 화학식 I의 화합물을 함유하는 조성물의 부재에서 인큐베이션된 암 세포 내 키나제 효소와 비교하여, 시험한 키나제 효소 그룹 내 키나제 효소가 키나제 발현 또는 키나제 활성 중 하나에서 증가를 나타내는지의 여부를 결정하는 단계. 키나제 효소 활성 또는 발현의 증가가 발견된다면, 확인된 키나제 효소는 PI3K 억제제의 효과를 약화시키는 보충적 키나제 경로 내에 수반된 확인된 키나제 효소의 표시이다.
화합물에 의해 PI3K 활성 및 이것의 억제를 측정하기 위한 적합한 시험관내 분석은 공지되어 있다. 전형적으로, 분석은 PI3K-유발 ATP 소모를 측정할 것이다. PI3K 활성을 측정하기 위한 시험관내 분석의 더욱 상세한 설명에 대해, 이하의 생물학적 실시예, 실시예 1을 참조한다. 세포 활성을 WO2007044729의 생물학적 실시예 2, 3 및 4에 기재된 바와 같은 분석을 사용하여 결정할 수 있다. 암의 적합한 생체내 모델은 당업자에게 공지되어 있다. 생체내 분석의 더욱 상세한 설명은 WO2007044729의 생물학적 실시예 5 내지 10을 참조한다. 항암제와 병용된 화학식 I의 화합물의 투여를 기재하는 실시예는 WO2007044729의 생물학적 실시예 11 내지 14에 기재되어 있다. 본 명세서에 개시될 뿐만 아닐 당업계에 개시된 예에 따라서, 당업자는 화학식 I의 화합물과 항암제의 병용이 암치료에 효과적이라는 것을 결정할 수 있다.
화학식 I의 중간체 및 화합물의 제조
본 발명의 화합물은 WO 2007/044729 및 WO 2008/127594에 기재된 합성 방법에 의해 만들어질 수 있으며, 이것의 개시는 본 명세서에 참조로 포함된다.
출발 물질 및 이들 화합물의 제조에 사용되는 시약은 상업적 공급업자, 예컨대 Aldrich Chemical Co.(위스콘신주 밀워키에 소재) 또는 Bache(캘리포니아주 토런스에 소재)로부터 입수가능하며, 또는 참고문헌, 예컨대 문헌[Fisher and Fisher's Reagents for Organic Synthesis, Volumes 1-17(John Wiley and Sons, 1991); Rod's Chemistry of Carbon Compounds, Volumes 1-5 and Supplemental (Elsevier Science Publishers, 1989); Organic Reactions, Volumes 1-40 (John Wiley and Sons, 1991), March's Advanced Organic Chemistry, (John Wiley and Sons, 4th Edition) 및 Larch's Comprehensive Organic Transformations (VICHY Publishers Inc., 1989)]에서 제시되는 과정에 따라서 당업자에게 공지된 방법으로 제조된다. 이들 반응식은 단지 본 발명의 화합물이 합성될 수 있는 일부 방법의 예시이며, 이들 반응식에 대한 다양한 변형이 만들어질 수 있고 본 개시에 언급된 당업자에게 제안될 것이다. 반응의 출발 물질 및 중간체는 원한다면, 이에 제한되는 것은 아니지만, 여과, 증류, 결정화, 크로마토그래피 등을 포함하는 통상적인 기법을 사용하여 분리되고 정제될 수 있다. 이러한 물질은 물리적 상수 및 스펙트럼 데이터를 포함하는 통상적인 수단을 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
달리 대조적으로 특정되지 않는다면, 본 명세서에 기재된 반응은 대기압에서 약 -78℃ 내지 약 150℃의 온도에 걸쳐, 다른 실시형태에서, 약 0℃ 내지 약 125℃, 및 더 구체적으로는 약 실온(또는 주위) 온도, 예를 들어 약 20℃에서 일어난다. 달리 언급되지 않는다면(수소화의 경우와 같이), 모든 반응은 질소 분위기 하에 수행된다.
프로드러그는 당업자에게 잘 공지된 기법으로 제조될 수 있다. 이들 기법은 일반적으로 주어진 화합물 내 적절한 작용기를 변형시킨다. 이들 변형된 작용기는 일상적인 조작에 의해 또는 생체내에서 본래 작용기를 재생한다. 본 발명의 화합물의 아마이드 및 에스터는 통상적인 방법에 따라서 제조될 수 있다. 프로드러그의 철저한 논의는 문헌[A.C.S. Symposium Series의 T. Higuchi and V. Stella, "Pro-drugs as Novel Delivery Systems," Vol 14], 및 문헌[Bioreversible Carriers in Drug Design, ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987]에서 제공되며, 이들 둘 다 본 명세서에 모든 목적을 위하여 참조로 포함된다.
본 발명의 화합물, 또는 이것의 약제학적으로 허용가능한 염은 그것의 구조에서 비대칭 탄소 원자 또는 4차화된 질소 원자를 가질 수 있다. 본 명세서에 기재된 합성을 통해 제조될 수 있는 화학식 I의 화합물은 단일 입체이성질체, 라세미체로서 및 거울상체 및 부분입체이성질체의 혼합물로서 존재할 수 있다. 화합물은 또한 기하이성질체로 존재할 수 있다. 모든 이러한 단일 입체이성질체, 라세미체, 및 이들의 혼합물, 및 기하 이성질체는 본 발명의 범주 내인 것으로 의도된다. 본 발명의 화합물의 일부는 호변이성체로 존재할 수 있다. 예를 들어, 케톤 또는 알데하이드가 존재 하는 경우, 분자는 엔올 형태로 존재할 수 있으며; 아마이드가 존재 하는 경우, 분자는 이미드산으로 존재할 수 있고; 엔아민이 존재 하는 경우, 분자는 이민으로 존재할 수 있다. 모든 이러한 호변이성체는 본 발명의 범주 내에 있다.
특히, 본 명세서에서 B는 2-하이드록시-피리디닐이며, 또한 그것의 구조로 기재될 수 있다:
Figure pct00174
2-하이드록시-피리디닐과 상기 구조 14는 둘 다 피리딘-2(1H)-온 및 그것의 구조 15를 포함하며, 동등하다:
Figure pct00175
구조 또는 용어가 사용되는 것과 상관없이, 각 호변이성체는 본 발명의 범주 내에 포함된다.
본 발명은 또한 N-옥사이드 유도체 및 화학식 I의 화합물의 보호된 유도체를 포함한다. 예를 들어, 화학식 I의 화합물이 산화성 질소 원자를 함유할 때, 질소 원자는 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 N-옥사이드로 전환될 수 있다. 화학식 I의 화합물이 하이드록시, 카복시, 티올 또는 질소 원자(들)를 함유하는 임의의 기와 같은 기들을 함유할 때, 이들 기는 "보호하는 기" 또는 "보호기"로 보호될 수 있다. 적합한 보고기의 보충적 열거는 문헌[T.W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, Inc. 1991]에서 발견될 수 있으며, 이것의 개시는 본 명세서에 전문이 참조로 포함된다. 화학식 I의 화합물의 보호된 유도체는 당업계에 잘 공지된 방법으로 제조될 수 있다.
입체이성질체의 라세미 혼합물 또는 비-라세미 혼합물로부터 단일 입체이성질체의 제조 및/또는 격리 및 분리 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 광학적으로 활성인 (R)- 및 (S)- 이성질체는 키랄 신톤 또는 키랄 시약을 사용하여 제조될 수 있거나, 또는 통상적인 기법을 사용하여 분해될 수 있다. 거울상체(R- 및 S-이성질체)는 당업자에게 잘 공지된 방법으로, 예를 들어 분리될 수 있는 부분입체이성질체 염 또는 복합체의 형성에 의해, 예를 들어 결정화에 의해; 분리될 수 있는 부분입체이성질체 유도체의 형성을 통해, 예를 들어 결정화에 의해; 거울상체-특이적 시약과 하나의 거울상체의 선택적 반응, 예를 들어 효소적 산화 또는 환원 다음에 변형된 및 비변형된 거울상체의 분리; 또는 키랄 환경에서 기체-액체 또는 액체 크로마토그래피, 예를 들어 키랄 지지체, 예컨대 결합된 키랄 리간드를 갖는 실리카 상에서 또는 키랄 용매의 존재에서 분해될 수 있다. 요망되는 거울상체가 상기 기재한 분리 방법 중 하나에 의해 다른 화학적 독립체로 전환되는 경우, 요망되는 거울상체 형태를 유리시키기 위하여 추가 단계가 필요할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 대안적으로 선택적으로 활성인 시약, 기질, 촉매 또는 용매를 사용하는 비대칭 합성에 의해, 또는 비대칭 변환에 의한 거울상체의 다른 것으로 전환에 의해 특이적 거울상체는 합성될 수 있다. 특정 거울상체가 풍부한 거울상체의 혼합물에 대해, 주된 성분의 거울상체는 재결정화에 의해(수율의 동시 감소와 함께) 추가로 풍부하게 될 수 있다.
추가로, 본 발명의 화합물은 물, 에탄올 등과 같은 약제학적으로 허용가능한 용매와 함께 비용매화된 형태뿐만 아닐 용매화된 형태로 존재할 수 있다. 일반적으로, 용매화된 형태는 본 발명의 목적을 위하여 비용매화된 형태와 동등한 것으로 고려된다.
화학식 I의 화합물에서:
Figure pct00176
,
NHS(O)2- 기 상의 수소는 매우 산성이다. 따라서, 화학식 I의 화합물을 유발하는 중간체뿐만 아니라 화학식 I의 화합물 그 자체는 B 고리 상의 치환 및 반응 조건에 의존하여 비하전된 또는 양쪽성이온 분자, 또는 나트륨 또는 칼륨과 같은 양이온 염으로 회수될 수 있다. 다음의 예에서 달리 특정되지 않는다면, 화합물의 최종 형태는 달리 결정되는 분석 기법이 없을 때 비하전된 분자가 되는 것으로 추정되었다.
화학식 I의 화합물은 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 다른 실시형태에서, K2CO3과 같은 염기 및 금속 구리의 존재 하에 180℃에서 적절한 시약의 융합은 화학식 1의 중간체를 제공하는 것으로 알려져 있다(문헌[S. H. Dandegaonker and C. K. Mesta, J. Med . Chem. 1965, 8, 884] 참조).
대안적으로, 화학식 3의 중간체는 이하의 반응식에 따라서 제조될 수 있으며, 여기서 각각의 LG1은 이탈기이고(한 실시형태에서 할로, 다른 실시형태에서 클로로), 모든 다른 기는 상세한 설명에서 정의하였다.
반응식 1
Figure pct00177
반응식 1에서 화학식 3의 중간체는 상업적으로 입수가능한 2,3-다이클로로퀴녹살린 및 화학식 2의 중간체(상업적으로 입수가능하거나 당업자에 의해 제조될 수 있음), K2CO3와 같은 염기를 DMF 또는 DMSO와 같은 용매 중에서 간단하게 가열함으로써 제조될 수 있다. 완료 시(약 2시간), 반응 혼합물을 물에 부은 다음 2N HCl을 부었다. 그 다음에 생성물을 에틸 아세테이트와 같은 용매 내로 추출하고, 물 및 염수로 세척하였다. 유기층을 합하고, 황산나트륨과 같은 건조제로 건조시키며, 여과하고 진공하에 농축한다.
그 다음에 화학식 3의 중간체를 환류 온도에서 DMF 또는 p-자일렌과 같은 용매 중에 화학식 4의 중간체로 처리한다. 반응의 완료 시(약 16시간 또는 그 미만), 반응물을 냉각시키고, DCM로 추출하며, 2 N HCl 및 염수로 세척하고, 황산나트륨 또는 황산마그네슘과 같은 건조제로 건조시키며, 여과하고, 농축하여 화학식 I의 화합물을 제공하였다.
대안적으로, 퀴녹살린 유도체를 제조하기 위한 다른 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 이에 제한되는 것은 아니지만, 문헌[S. V. Litvinenko, V. I. Savich, D. D. Bobrovnik, Chem . heterocycl . Compd. (Engl. Transl), 1994, 30, 340 및 W. C. Lumma, R. D. Hartman, J. Med . Chem. 1981, 24, 93]을 포함한다.
화학식 I의 화합물은 반응식 2에 따라서 제조될 수 있으며, B는 R3a로 치환된 페닐이며 R3a는 알킬아미노 또는 다이알킬아미노이고 또는 B는 R3로 치환된 헤테로아릴이며 R3은 아미노, 알킬아미노 또는 다이알킬아미노이고, 모든 다른 기는 발명의 내용에서 정의한 바와 같다.
반응식 2
Figure pct00178
LG는 클로로와 같은 이탈기이다. 5는 NHRaRb 또는 HO-C1-C6-알킬렌-NHRaRb와 반응되며, Ra 및 Rb는 독립적으로 수소 또는 알킬이다. 반응은 DMF와 같은 용매 중에서 KHCO3와 같은 염기의 존재 하에 수행된다.
화학식 I의 화합물은 반응식 3에 따라서 제조될 수 있으며, B는 R3a로 치환된 페닐이며 R3a는 아미노알킬옥시, 알킬아미노알킬옥시 또는 다이알킬아미노알킬옥시이고 또는 B는 R3으로 치환된 헤테로아릴이며 R3은 아미노알킬옥시, 알킬아미노알킬옥시 또는 다이알킬아미노알킬옥시이고, 모든 다른 기는 발명의 내용에서 정의한 바와 같다.
반응식 3
반응을 DMF와 같은 용매 중에서 NaH와 같은 염기의 존재 하에 수행한다.
Figure pct00179
화학식 I의 화합물에서, B는 R3a로 치환된 페닐이며; 또는 B는 R3으로 치환된 헤테로아릴이고; R3a 및 R3는 다음과 같다:
i. -N(R7)C(O)-C1-C6-알킬렌-N(R7a)(R7b), 여기서 R7, R7a 및 R7b는 발명의 내용에서 정의한 바와 같다;
ii. -NR9C(O)R9a, 여기서 R9는 발명의 내용에서 정의한 바와 같다;
iii. -NR11C(O)NR11aR11b, 여기서 R11a, R11a 및 R11b는 발명의 내용에서 정의한 바와 같다;
iv. -NR13C(O)OR13a, 여기서 R13 및 R13a는 발명의 내용에서 정의한 바와 같다;
v. -N(R18)C(O)-C1-C6-알킬렌-N(R18b)C(O)R18a, 여기서 R18, R18a 및 R18b는 발명의 내용에서 정의한 바와 같다;
vi. -N(R20)C(O)-C1-C6-알킬렌-C(O)R20a, 여기서 R20 및 R20a는 발명의 내용에서 정의한 바와 같다;
vii. -NR21S(O)2-C1-C6-알킬렌-N(R21b)R21a, 여기서 R21, R21a 및 R21b는 발명의 내용에서 정의한 바와 같다;
viii. -N(R22)C(O)-C0-C6-알킬렌-N(R22b)-N(R22c)(R22a), 여기서 R22, R22a 및 R22b는 발명의 내용에서 정의한 바와 같다;
ix. -NR24C(O)-C1 -C6-알킬렌-OR24a, 여기서 R24 및 R24a는 발명의 내용에서 정의한 바와 같다;
R3 및 R3a의 알킬렌은 독립적으로 발명의 내용에서 정의한 바와 같이 선택적으로 치환되며, 화학식 9(a), 9(b), 9(c), 9(d), 9(e), 9(f) 또는 9(g)의 중간체와 반응시킴으로써 반응식 4에 따라서 제조될 수 있다:
9(a) HOC(O)-C1-C6-알킬렌-N(R7a)(R7b), 여기서 Ra는 R7a 또는 N-보호기, 예컨대 Boc 또는 Fmoc이다;
9(b) HOC(O)R9a;
9(c) HOC(O)NR11aR11b;
9(d) HOC(O)OR13a;
9(e) HOC(O)-C1-C6-알킬렌-N(R18b)C(O)R18a;
9(f) HOC(O)-C1-C6-알킬렌-C(O)R20a;
9(g) LG-S(O)2-C1 -C6-알킬렌-N(R21b)Ra, 여기서 Ra는 R21a 또는 N-보호기, 예컨대 Boc 또는 Fmoc이다.
반응식 4
Figure pct00180
반응식 4의 R100은 -C(O)R9a, -C(O)NR11aR11b, -C(O)OR13a, -C(O)-C1-C6-알킬렌-N(R18b)C(O)R18a, -C(O)-C1-C6-알킬렌-C(O)R20a 또는 -S(O)2-C1 -C6-알킬렌-N(R21b)Ra이다. 당업자에게 알려진 표준 아마이드 커플링 조건 하에 반응을 수행한다. 특히, 반응을 HATU와 같은 커플링제, DIEA와 같은 염기의 존재 하에, DMF와 같은 용매 중에서 수행한다. 적용가능한 경우, 그 다음에 N-보호기는 PG가 Boc인 산으로 처리하는 것과 같은 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 제거된다.
반응식 4에 대해 기재한 바와 같은 과정에서, 본 발명의 화합물은 필요한 출발 물질을 교환함으로써 제조될 수 있고, B는 R3a로 치환된 페닐이며; 또는 B는 R3으로 치환된 헤테로아릴이고; R3a 및 R3는 다음과 같다
a) -C(O)NR8R8a;
b) -C(O)N(R10)-C1-C6-알킬렌-N(R10a)R10b;
c) -C(O)R12 여기서 R12는 N-치환된 헤테로사이클로알킬이고;
d) -C(O)N(R14)N(R14a)(R14b);
e) -C(O)N(R16)-C1-C6-알킬렌-C(O)OR16a; 또는
f) -C(O)N(R19)-C1-C6-알킬렌-C(O)R19a.
특히, 화학식 11의 중간체는 8 대신 사용된다:
Figure pct00181
화학식 I의 화합물은 반응식 5에 따라서 제조될 수 있으며, B는 R3a로 치환된 페닐이며; 또는 B는 R3으로 치환된 헤테로아릴이고; R3a 및 R3은 -NHC(O)CH2NR7aR7b이며, R7a 및 R7b는 발명의 내용에서 정의한 바와 같다.
반응식 5
Figure pct00182
LG는 브로모 또는 클로로와 같은 이탈기이다. 12는 ACN과 같은 용매 중에서 DIEA와 같은 염기의 존재 하에 NH(R7b)R7a와 반응된다.
화학식 I의 화합물은 반응식 6에 따라서 제조될 수 있다.
반응식 6
Figure pct00183
반응식 6의 LG는 클로로와 같은 이탈기이다. DMA와 같은 용매 중에서 조사함으로써 반응을 수행할 수 있다. 대안적으로, DMA와 같은 용매 중에서 아세트산의 존재 하에 가열에 의해 반응을 수행할 수 있다.
일반적 알킬화 과정 1
Figure pct00184
2-드램 바이알 내로 2-브로모-N-(3-(N-(3-(3,5-다이메톡시-페닐아미노)퀴녹살린-2-일) 설파모일) 페닐) 아세트아마이드(86㎎, 0.15m㏖)를 넣었고, 2㎖의 아세토나이트릴과 함께 표준 과정을 사용하여 제조하였다. 8당량(1.2m㏖)의 원하는 아민, 아닐린, 하이드라진 또는 알콕시아민을 첨가한 후 휘니그 염기(41㎕, 0.25 m㏖)를 첨가하였다. 그 다음에 반응물을 한 시간 동안 50℃에서 교반시켰다(아닐린 시약에 대해 밤새). 분취 역상 HPLC를 사용하여 원하는 생성물을 조질의 반응 혼합물로부터 직접 분리하였다. Waters Fractionlynx 분취 역상 HPLC(Waters SunFire Prep C18, OCD 5μM, 30 X 70㎜ 컬럼을 장착하였고, 물/아세토나이트릴 중에서 25 mM 암모늄 아세테이트의 2상 용매 시스템에 의해 5-100% 구배로 실행함)를 사용하여 정제를 수행하였다.
일반적 라이브러리 아실화 과정 1
Figure pct00185
2-드램 바이알 내로 3-아미노-N-(3-(3,5-다이메톡시-페닐아미노)퀴녹살린-2-일)벤젠설폰아마이드(54㎎, 0.12 m㏖), DMA(2㎖)을 첨가하였고, 표준 과정을 사용하여 원하는 카복실산(0.17 m㏖) 제조하였다. DIEA(70㎕, 0.4m㏖) 다음에 HATU(53㎎, 0.14 m㏖)를 바이알에 첨가하였고, 반응 혼합물을 50℃에서 밤새 교반시켰다. 분취 역상 HPLC를 사용하여 조질의 반응 혼합물로부터 직접 원하는 생성물을 분리하였다. Waters Fractionlynx 분취 역상 HPLC(Waters SunFire Prep C18, OCD 5μM, 30 X 70㎜ 컬럼을 장착하였고, 물/아세토나이트릴 중에서 25 mM 암모늄 아세테이트의 2상 용매 시스템에 의해 5-100% 구배로 실행함)를 사용하여 정제를 수행하였다.
일반적 아미노화 과정 1a
Figure pct00186
CEM 마이크로웨이브 반응 용매를 N-(3-(N-(3-클로로퀴녹살린-2-일)설파모일)페닐)-2-(다이메틸아미노)아세트아마이드(30㎎, 0.071m㏖)로 채웠고, 표준 방법을 사용하여 원하는 아닐린(16㎎, 0.14m㏖, 2 eq), 및 0.5㎖의 다이메틸아세트아마이드를 제조하였다. 용기를 밀봉하였고, 반응 혼합물을 CEM Discover 마이크로웨이브 기기 내 140℃에서 70분 동안 마이크로웨이브 복사 하에 가열하였다. 그 다음에 용매를 회전-증발에 의해 제거하였다. 최종 생성물의 정제를 용리액 25mM 수성 NH4OAc/ACN에 의한 분취 역상 HPLC로 수행하여, 원하는 생성물을 제공하였다.
일반적 아미노화 과정 1b
Figure pct00187
CEM 마이크로웨이브 반응 용기를 N-(3-(N-(3-클로로퀴녹살린-2-일)설파모일)페닐)-2-(다이메틸아미노)아세트아마이드(62㎎, 0.147 m㏖)로 채웠고, 표준 방법을 사용하여 원하는 아닐린(0.567m㏖, 4 eq), 및 1.0㎖의 톨루엔을 제조하였다. 용기를 밀봉하였고, 반응 혼합물을 CEM Discover 마이크로웨이브 기기 내 180℃에서 60분 동안 마이크로웨이브 복사 하에 가열하였다. 용매를 회전-증발기 상에서 제거하였다. 최종 생성물의 정제를 용리액으로서 NH4OAc/ACN에 의해 분취 HPLC로 행하여 원하는 생성물을 수득하였다.
일반적 아실화 과정 2
Figure pct00188
표준 과정을 사용하여 제조한 N-(3-(N-(3-(3,5-다이메톡시-페닐아미노)퀴녹살린-2-일)-설파모일)페닐)아제티딘-3-카복사마이드(125㎎, 0.23 m㏖)를 10㎖ 둥근-바닥 플라스크 내 5㎖ DCE 내로 용해하였다. 그 다음에 DIEA(1.17m㏖, 5.0 당량)을 교반하면서 첨가한 다음, 산 염화물(0.47m㏖, 2.0 당량)을 첨가하였다. 그 다음에 반응물을 1시간 동안 또는 LCMS로 표시되는 바와 같이 완료될 때까지 실온에서 교반시켰다. 용매를 후속하여 회전 증발기 상에서 감압 하에 제거하였다. 그 다음에 조질의 물질을 메탄올 중에서 재용해시켰다. 최종 생성물의 정제를 용리액 25 mM 수성 NH4OAc/CAN로 분취 역상 HPLC로 수행하였다. Waters Fractionlynx 분취 역상 HPLC(Waters SunFire Prep C18, OCD 5μM, 30 X 70㎜ 컬럼을 장착하였고, 물/아세토나이트릴 중에서 25 mM 암모늄 아세테이트의 2상 용매 시스템에 의해 5-100% 구배로 실행함)를 사용하여 정제를 수행하였다.
일반적 환원성 아미노화 과정 1
Figure pct00189
3㎖의 DCE 및 200㎕의 DMF 중에서 표준 과정을 사용하여 제조한 N-(3-(N-(3-(3,5-다이메톡시-페닐아미노)퀴녹살린-2-일)설파모일)페닐)아제티딘-3-카복사마이드(110㎎, 0.19 m㏖)의 용액에 알데하이드(0.77m㏖, 4.0 당량)를 서서히 첨가한 후, 테트라메틸암모늄 트라이아세톡시보로하이드라이드(1.16m㏖, 6.0 eq)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 밤새 교반시켰다. LC/MS는 반응이 완료되었음을 나타내었다. 용매를 후속하여 회전 증발기 상에서 감압하에 제거하였다. 그 다음에 조질의 물질을 메탄올 중에서 재용해하였다. 최종 생성물의 정제를 용리액 25 mM 수성 NH4OAc/CAN으로 분취 역상 HPLC로 수행하였다. Waters Fractionlynx 분취 역상 HPLC(Waters SunFire Prep C18, OCD 5μM, 30 X 70㎜ 컬럼을 장착하였고, 물/아세토나이트릴 중에서 25 mM 암모늄 아세테이트의 2상 용매 시스템에 의해 5-100% 구배로 실행함)를 사용하여 정제를 수행하였다.
일반적 아마이드 형성 과정 1a
Figure pct00190
작은 1 드램 바이알 내로 3-(N-(3-(2-클로로-5-메톡시-페닐아미노)-퀴녹살린-2-일)설파모일)벤조산(61㎎, 0.13m㏖, 1.1 당량)을 첨가하였고, 표준 과정을 사용하여 제조하였다. 산을 DMA(1㎖) 중에 용해하였고, 그 다음에 DIEA(42㎕, 0.24m㏖, 2 당량)를 용액에 첨가하였다. 아민 시약(DMA 중에서 1㎖의 0.12 M 용액)을 교반하면서 용액에 첨가한 후 HATU(64㎎, 0.17m㏖, 1.4 당량)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 밤새 교반시켰다. LCMS 분석에 의해 표시되는 완료 시, 2㎖의 메탄올을 용액에 첨가하였다. 분취 역상 HPLC를 사용하여 원하는 생성물을 분리하였다. Waters Fractionlynx 분취 역상 HPLC(Waters SunFire Prep C18, OCD 5μM, 30 X 70㎜ 컬럼을 장착하였고, 물/아세토나이트릴 중에서 25 mM 암모늄 아세테이트의 2상 용매 시스템에 의해 5-100% 구배로 실행함)를 사용하여 정제를 수행하였다.
일반적 아마이드 형성 과정 1b
일반적 아마이드 형성 과정 1a에서 설명한 과정을 사용하여 tert-뷰틸카바메이트(즉, NHR'R" 내의 R'는 Boc-보호된 아민 기를 함유함)로 보호된 제2 아민 기를 함유한 수많은 아민을 포함하였다. Boc-보호된 전구체의 HPLC 정제 후 탈보호를 수행하였다.
작은 1 드램 바이알 내로 3-(N-(3-(2-클로로-5-메톡시-페닐아미노)퀴녹살린-2-일)설파모일)벤조산(61㎎, 0.13m㏖, 1.1 당량)을 첨가하였다. 산을 1㎖의 DMA 중에서 용해시켰고, 그 다음에 DIEA(42 ㎕, 0.24m㏖, 2 당량)를 용액에 첨가하였다. 모노-Boc-보호된 다이아민 시약(DMA 중의 1㎖의 0.12 M 용액, 1 당량)을 교반하면서 첨가한 후, HATU(64㎎, 0.17m㏖, 1.4 당량)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 밤새 교반시켰다. LCMS로 표시되는 완료 시, 2㎖의 메탄올을 용액에 첨가하였다. 분취 역상 HPLC를 사용하여 직접 조질의 반응 용액으로부터 원하는 생성물을 분리시켰다. Waters Fractionlynx 분취 역상 HPLC(Waters SunFire Prep C18, OCD 5μM, 30 X 70㎜ 컬럼을 장착하였고, 물/아세토나이트릴 중에서 25 mM 암모늄 아세테이트의 2상 용매 시스템에 의해 5-100% 구배로 실행함)를 사용하여 정제를 수행하였다. 생성물 분획을 합하였고, 회전 증발에 의해 감압하에 농축 건조시켰다. 다이옥산(2㎖) 중의 4 N HCl 용액을 첨가하였다. 그 다음에 출발 물질이 검출되지 않을 때까지 용액을 실온에서 교반시켰다. 탈보호 생성물을 HCL 염으로서 용액 밖으로 침전시켰고, 여과로 수집하였으며, 에터로 세척하였고, 진공 하에 건조시켰다.
생물학적 실시예
실시예 1
유방암 세포 내 PI3K 억제를 보상하는 키나제의 확인
본 연구의 목적은 인간 유방암 세포 내 PI3K 억제를 보상하는 키나제 및 키나제-조절 신호처리 경로를 확인하는 것이다. 이것의 마지막에, 특이적 키나제의 하향조절이 화학식 I의 화합물 및 표 1의 화합물인 PI3K 억제제 화합물 A에 대한 HCC1937 인간 유방암 세포의 선택성을 증가시키는지의 여부를 결정하기 위하여, siRNA 스크리닝을 사용하여 779 인간 키나제를 표적화한다. 화합물 A는 39 nM의 시험관내 IC50으로 PI3K의 p110α 촉매 서브유닛을 억제하는 ATP-모방체이다. HCC1937 세포는 PI3K 경로의 네가티브 조절자인 PTEN이 없으며, 10 μM의 IC50으로 화합물 A에 의해 성장이 억제된다. siRNA 라이브러리로 역 트랜스펙션 후, 2.5% 소태아 혈청(도 1a 및 2)을 함유하는 배지 중에서 세포를 DMSO 또는 10μM 화합물 A로 72시간 동안 처리하고, 알라마르 블루 분석을 사용하여 도 1b의 세포 생존력을 측정한다. 동시에, 키나제 및 경로가 PI3K의 억제 시 상향조절되는지의 여부를 결정하기 위하여 RNA 또는 HCC1937 세포 ± 화합물 A로부터의 용해물을 사용하여 마이크로어레이, 포스포-수용체 티로신 키나제(phospho-receptor tyrosine kinase, RTK) 분석 및 포스포-세포내 키나제 분석(도 3 및 도 4)을 사용하여 유전자 발현을 수행한다. 화합물 A 처리는 8-48 시간 내 증가된 발현 및/또는 다수의 RTK의 인산화 및 세포내 키나제를 초래한다. 화합물 A로 8시간 및 24시간 처리는 S473과 T308 둘 다에서 포스포-Akt를 억제하였지만, 48시간에, S473에서 인산화는 부분적으로 회복되었다. 이들 접근으로부터, 화합물 A에 의해 상향조절된 몇몇 키나제 및 경로가 확인되었고, siRNA로 하향조절될 때, 화합물 A에 대한 민감성을 증가시켰다. 이들은 HER3, MSPR 및 Axl와 같은 몇몇 RTK, 및 몇몇 MAP3K/MEKK와 같은 MAP 키나제 신호처리 경로의 구성원을 포함한다. 웨스턴 블롯은 화합물 A 처리가 S473 및 T308에서 포스포-Akt를 감소시키고 포스포- 및 전체 HER3을 증가시킨다는 것을 확인한다. 화합물 A는 또한 MAP 키나제 ERK, JNK 및 p38 MAPK의 인산화를 증가시킨다. HCC1937 세포를 2.5% FBS를 함유하는 배지 내 10 μM 화합물 A로 0, 2, 8 또는 24시간 동안 처리하였다. RNA를 Trizol로 분리시켰고, RNeasy 컬럼(Qiagen)을 사용하여 정제하였다. 3개의 독립 실험으로부터 유전자 발현을 Gene titan 3' 마이크로어레이를 사용하여 측정하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이 0시간에 대해 *, p<0.05; **, p<0.01. 화합물 A와 HER3 siRNA로의 병용 처리는 각 간섭 단독보다 더 큰 정도로 HCC1937 세포 성장을 억제하며(도 5), 이는 포스포-HER3의 상향조절이 PI3K의 약리학적 억제 결과로서 성장 억제를 보충한다는 것을 시사한다. 이들 결과는 PI3K 억제제에 따른 경로 또는 이들 키나제를 억제하는 화합물을 병용하는 것이 PI3K 억제제의 항-종양 활성을 개선시킬 수 있다는 것을 시사한다.
결과를 표 2 및 표 3에 추가로 요약한다.
HCC1937 세포 생존력에 필수적인 키나제
siRNA % 성장(라운드 1) % 성장(라운드 2)
WEE1 7.2 14.2
AURKA 10.4 19.0
PLK1 22.0 17.8
PKN3 26.6 23.2
CHEK1 27.9 20.4
화합물 A로 처리 시 상향조절 또는 인산화된 키나제
siRNA 생존 분획
(라운드 1) 		생존 분획
(라운드 2) 		평균
MAP3K8 23.3% 28.9% 26.1%
MST1R 28.3% 30.0% 29.2%
MAPK8 33.2% 28.3% 30.7%
ERBB3 31.2% 31.0% 31.1%
AXL 43.0% 25.7% 34.4%
MAP3K8 = Cot/Tpl-2
MST1-R = 대식세포 자극 1 수용체; MSPR
MAPK8 = JNK1
ERBB3 = HER3
실시예 2
PI3K 억제제로 처리한 세포 내 HER3 ( ErbB3 )-매개 보상의 siRNA 억제
PI3K 억제제 화합물 A의 항종양 효과를 PI3K/Akt 경로의 돌연변이 활성화로 인간 유방암 세포의 패널에서 시험한다(PIK3CA 돌연변이 결과로서, PTEN 손실 및/또는 HER2 유전자 증폭). 화합물 A-처리 BT-474 세포에 의한 시간 과정은(억제제는 24시간 마다 첨가됨) 6시간에 시작하고 72시간을 통해 증가하는 HER3 RNA 및 단백질의 시간-의존적 상향조절을 나타낸다(도 7). 부위-특이적 항체는 HER3 내 6개의 p85 결합 부위 중 2개인 Y1197 및 Y1289의 HER3 인산화를 나타낸다. P-HER3의 회수는 일시적으로 T308 및 S473 P-Akt(도 7)의 회수와 관련되며, 이는 PI3K가 외인성 억제제에 의해 차단될 때 세포가 상류의 PI3K 메커니즘을 상향조절한다는 것을 시사한다. HER3 RNA 및 단백질의 상향조절 및 P-HER3 및 P-Akt의 부분적 유지는 HER3과 PI3K의 병용 억제가 종양 세포 생존력을 상승적으로 억제할 수 있다는 것을 시사한다. HER3 siRNA으로 트랜스펙션은 화합물 A에 BT-474 세포를 민감하게 한다(도 6a 및 도 6b).
SKBR-3 및 MDA-453 세포로부터 유사한 결과를 얻는다. 세포주는 둘 다 HER2 유전자 증폭을 나타낸다. MDA-453 세포는 또한 PIK3CA 및 PTEN 돌연변이 대립유전자 내 H1047R(엑손 20) 돌연변이를 은닉한다. 세포주 둘 다에서, P-Akt, P-S6의 억제 및 성장은 각 간섭 단독과 비교하여 화합물 A로 처리될 때, 또한 HER3 siRNA로 트랜스펙션될 때 세포 내에서 향상된다. BT-474 세포(도 7) 내에서와 같이, P-Erk는 화합물 A로 처리된 세포 내에서 상향조절되며, 이 상향조절은 SKBR-3 내 HER3 siRNA의 트랜스펙션 시 꺾이지만, MDA-453 세포 내에서는 그렇지 않다(도 8).
도 7 및 도 8의 결과는 활성 PI3K/Akt의 억제가 HER3의 전사를 억제한다는 것을 시사한다. 이들 전사 메커니즘에 추가로, PI3K의 화합물 A-매개된 억제 시 P-HER3의 회수는 상류의 티로신 키나제의 참여가 HER3의 전사를 촉진하며, 이는 결국 PIP3 수준을 부분적으로 유지하게 한다는 것을 시사한다. HER3의 이런 보충적 인산화는 PI3K/Akt를 부분적으로 유지시키며, PI3K 길항제의 완전한 작용에 대응한다.
실시예 3
세포 내 HER3 ( ErbB3 )-매개 보상의 항체 억제의 시험관내 평가를 PI3K 억제제로 처리한다.
항-HER3 Ab이 PI3K 억제제로 처리한 인간 유방암 세포 내 HER3의 피드백 상향조절을 지연시키거나 없앨 수 있는 것을 확고히 하기 위하여, HER2의 과발현이 있거나 없는 인간 유방암 세포를 화합물 A±MM-121과 같은 항-HER3 Ab의 포화 농도로 처리한다. 실험의 종말점은: (1) p85와 HER3의 결합, (2) 3D-Matrigel 내 성장, (3) 연한천 내 콜로니 형성, (4) 무혈청 조건과 현탁액 둘 다에서 아포토시스 분석(아노이키스(anoikis)를 유발), (5) 환부 봉합 및 트랜스웰 분석에서 운동성, (6) 시험관내 PI3K 반응이 실시된 HA 풀 다운(pull down)에서 PI3K 활성 및 (7) 면역블롯에 의한 전체 HER3 및 P-HER3, P-Akt, P-Erk, P-S6, P-4EBP-1.
실시예 4
PI3K 억제제로 처리한 세포 내 HER3 ( ErbB3 )-매개 보충의 항체 억제의 생체 내 평가
무흉선 마우스에서 이종이식을 공지된 방법에 따라서 확립한다. 일단 종양이 용적 ≥250㎜3에 도달하면, 그것들은 4개의 처리군으로 무작위화된다: (1) 대조군 IgG1-(30㎎/㎏ x2/주 i.p.), (2) 화합물 A(구위(orogastric) 위관영양법을 통해 100㎎/㎏/일), (3) MM-121-(30㎎/㎏ x2/주 i.p.) 및 (4) 화합물 A + 항-HER3 Ab, 예컨대 MM-121-(미국 매사추세츠주 캠브릿지에 소재한 Merrimack Pharmaceuticals). 5주까지 동안 치료를 전달하고, 그 후에 종양 성장을 모니터링한다. 치료 1주 및 5주 후, 치료의 중단 후 연구 종말점을 평가한다. 치료 1 주일 후, 일부 종양을 채취하고, 포르말린 중에서 고정시키거나, 액체 N2 중에서 순간 냉동시킨다. 종양 반응의 초기 분자적 예측변수를 확인하기 위하여 이 시점을 사용할 수 있다. ㎣의 종양 부피를 다음의 식으로 계산한다: 용적 = 폭2 x 길이/2. 종양이 완전히 제거된 마우스를 1년까지 따르게 할 것이고, 연속적으로 종양 재발에 대해 평가한다. ≥3 ㎣로 측정하는 재발 종양을 양성으로 스코어링할 것이고, 수집할 것이다.
생화학 및 분자 분석. 포르말린-고정된, 파라핀-포매된 종양 부문을 종양 등급의 평가를 위해 H&E로 염색한다. 종양 부분에 IHC를 실시하여 확립된 방법을 사용하여 전체 HER3, Y1289, Y1197 및 Y1222 P-HER3, T308 P-Akt, S473 P-Akt 및 P-Erk 항체를 검출한다. 추가로, 종양 용해물의 면역블롯을 동일한 항체로 수행할 수 있다. 면역침강 다음에 면역블롯 분석을 사용하여, 이종이식에서 HER3과 p85의 결합 시 항-HER3 Ab의 영향을 결정할 수 있다. 갓 냉동한 종양 알리쿼트(aliquot)로부터의 RNA를 사용하여 HER3 전사 수준을 측정하여 HER3 mRNA 수준의 어떤 증가를 확인한다.
실시예 5
세포주 및 억제제
모든 세포주를 American Type Culture Collection으로부터 구입하였다. 배지 및 소태아혈청(FBS)을 Invitrogen(미국 캘리포니아주 칼스베드에 소재)으로부터 구입하였다. 다음의 성장 배지를 사용하였다: HCC1937, HCC1954: RPMI-1640/10% FBS; BT474에 대해: IMEM/10% FBS; SKBR3: McCoy's 5A/15% FBS; UACC893: DMEM/10% FBS; MDA453: DMEM/F12(1:1)/20% FBS; 및 SUM190: DMEM/F12(1:1)/5% FBS. 모든 세포는 37℃에서 습기가 있는 5% CO2 인큐베이터 내에서 성장시켰다. 다음의 시약을 사용하였다: 라파티닙(GW-572016, LC Laboratories), 트라스투주맙(미국 캘리포니아주 샌프란시스코에 소재한 Genentech), LY294002(Calbiochem), 다른자리입체성 AKT1/2 억제제 5J8, 라파마이신(LC Laboratories) 및 화합물 A, 화학식 I의 화합물(Exelixis, Inc.).
실시예 6
세포 증식 및 크리스탈 바이올렛 분석
2.5% FBS ± 억제제를 함유하는 배지 내 2.5-3.5x104 세포/웰의 밀도에서 세포를 12-웰 플레이트에 씨딩하였다. 배지 및 억제제를 3일마다 대체하였다. 도면에서 표시한 날짜에, 세포를 트립신화하였고, Beckman Coulter 카운터에서 계측하였다. 크리스탈 바이올렛 분석을 위하여, 5x104개 세포/웰을 6-웰 플레이트에 씨딩하였고, 6일 동안 화합물 A의 부재 또는 존재에서 성장시켰으며, 메탄올 중에서 고정하였고, 크리스탈 바이올렛으로 염색하였고, Olympus DP10 카메라를 사용하여 촬영하였다.
실시예 7
세포 주기 분석
2.5% FBS ± 화합물 A를 함유하는 배지 내 100-㎜ 디쉬 내에서 세포를 플레이팅하였다. 3일 후, 떨어진 세포와 밀착된 세포를 둘 다 모았고, 고정시켰으며 APO-BrdU 키트(Phoenix Flow Systems)를 사용하여 프로피디움 요오드화물로 표지하였다. Becton Dickinson FACScalibur 시스템을 사용하여 표지한 세포를 분석하였다.
실시예 8
세포질 및 핵 분획화
세포질 및 핵 추출물을 Active Motif제의 Nuclear Extract Kit를 사용하여 제조하였다. 간략하게, 세포를 100-㎜ 디쉬 내에서 플레이팅하였고, 3-4시간 동안 표시한 농도에서 억제제로 처리하였으며, 빙냉 PBS/포스파타제 억제제로 세척하였고, 저장성 완충제로 용리하였으며, 14,000 rpm에서 4℃로 30초 동안 원심분리시켜 상청액을 수집하였다(세포질 추출물). 펠렛(핵 분획)을 완전한 라이시스 버퍼 중에서 재현탁시켰고, 14,000 rpm에서 4℃로 10분 동안 원심분리시켜 상청액을 수집하였다(핵 분획).
실시예 9
암 세포 내 포스파티딜이노시톨 -3 키나제 ( PI3K ) 신호처리
포스파티딜이노시톨-3 키나제(PI3K)는 리간드-활성화된 수용체 티로신 키나제(RTK)로부터 신호를 세포 성장, 대사, 크기, 운동성 및 생존은 조절하는 세포내 분자에 전송한다. 다양한 PI3K 패밀리가 더 고등의 진핵생물 내에 존재한다. 지금까지, 주로 클래스 IA PI3K는 암에 연루되었다. 클래스 IA PI3K는 조절(p85) 및 p110 촉매 서브유닛으로 이루어진 헤테로다이머이다. PI3K는 인산화된 어댑터 또는 p85의 N-SH2 도메인에 맞물린 YXXM 모티프를 함유하는 수용체에 의해 활성화된다. 이 결합은 p85에 의한 p110의 억제를 없애며, 혈장 막에서 포스파티딜이노시톨-4,5-비스포스페이트(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate, PIP2)에 p85-p110 다이머를 채택한다. PI3K는 PIP2를 인산화하여 제2 전령 포스파티딜이노시톨-3,4,5-트리스포스페이트(PIP3)를 만든다. 이 경로의 음성 조절은 PIP3 지질 포스파타제 PTEN(염색체 10에서 포스파타제 및 텐신 유사체)에 의해 매개된다. AKT 및 PDK1을 포함하는 플렉스트린 상동체(pleckstrin homology, PH) 도메인-함유 단백질의 서브세트는 혈장막에서 PIP3에 결합된다. PDK1에 의한 T308에서 및 mTOR/Rictor(TORC2)을 수반하는 복합체에 의한 S473에서 AKT의 인산화는 이 효소의 완전한 활성화를 초래한다. AKT는 GSK3α, GSK3β, FoxO 전사 인자, MDM2, BAD 및 p27KIP1을 포함하는 세포 단백질의 숙주가 생존 및 세포 주기 유입을 용이하게 하도록 인산화한다. 추가로, AKT는 Ras 동족체 Rheb에 대한 GTPase-활성화 단백질(GTPase-activating protein, GAP)인 Tuberin을 인산화하며 불활성화한다. Tuberin의 불활성화는 GTP 결합-Rheb가 궁극적으로 단백질 합성 및 세포 성장을 조절하는 mTOR/Raptor(TORC1) 복합체를 축적하고 활성화하도록 한다.
풍부한 증거가 거의 틀림없이 PI3K/AKT가 인간 암에서 가장 흔히 변경된 신호처리 경로라는 것을 나타낸다. 우선 p110α를 암호화하는 유전자인 PIK3CA에서 작용 돌연변이의 획득은 다양한 인간 종양에서 높은 빈도로 존재한다. 두 번째로, 포스파타제 PTEN은 돌연변이, 유전자 결실, 마이크로RNA에 의한 표적화, 및 프로모터 메틸화에 의해 빈번하게 불활성화된 종양 억제제 유전자이다. 더 나아가, PI3K는 종양유전자 유사 돌연변이체 Ras 및 다수의 티로신 키나제, 예컨대 그 자체가 돌연변이 활성화 및/또는 유전자 증폭의 표적인 Bcr-Abl, HER2(ErbB2), MET, KIT 등에 의해 강력하게 활성화된다. 난소암, 췌장암, 유방암 및 위암에서, PI3K 경로는 또한 Akt1 또는 Akt2 유전자 증폭에 의해 활성화된다. 혈장막 및 활성화에서 구성적 편재화를 초래하는 AKT1-(E17K)의 PH 도메인 내 형질전환 돌연변이는 적은 %의 유방암, 결장직장암 및 난소암에서 검출되었다. 함께, 이들은 PI3K/AKT 경로 내 분자 변경을 갖는 종양의 거대 레퍼토리가 특이적 억제제에 의해 치료적으로 표적화 가능하다는 것을 나타낸다.
몇몇 PI3K 경로 길항제가 개발되었고, 최근의 검토의 대상이다. 이들 화합물 중 일부는 p110 내 키나제 도메인의 ATP-결합 포켓 내에서 경쟁적으로 및 가역적으로 결합하는 ATP-모방체이며, 이 효소의 종양 유전자 돌연변이체 형태에 대해 활성이다. 본 실시예는 HER2 유전자 증폭, PIK3CA(p110α) 활성화 돌연변이, 및/또는 PTEN의 손실과 같은 PI3K 의존도를 나타내는 분자 변경을 은닉하는 인간 유방암 세포주의 패널에 대해 화합물 A(Exelixis, Inc.제)의 효과를 시험하였다. 화합물 A는 I상 임상 개발이 막 완료된 39nM의 p110α에 대해 IC50에 의한 ATP-경쟁적 가역적 PI3K 억제제이다.
HER2-과발현 인간 유방암 세포주의 패널에서, 화합물 A로 처리는 PI3K/AKT 경로의 2가지 주된 효과기인 AKT 및 S6의 인산화를 없앴다. 이 억제는 또한 HER3 및 다른 RTK의 발현과 인산화 둘 다의 유도와 관련되었다. 이들 RTK의 mRNA 발현 증가는 Forkhead 전사인자 FoxO3a 및 FoxO1에 의한 전사에 의존하며, AKT에 의해 음으로 조절된다. HER2+ 세포에서, 상향조절된 HER3 공동-수용체의 인산화는 결국 pAKT의 부분적 회수를 초래하는 HER2 티로신 키나제에 의해 유지되고, 따라서 PI3K 억제제의 항종양 작용을 제한한다. siRNA로 HER3의 녹다운 또는 HER2 억제제 트라스투주맙 또는 라파티닙으로 동시 처리는 시험관내와 생체내 둘 다에서 화합물 A에 대해 HER2+ 유방암 세포를 민감화하였다. 추가로, HER2/HER3에 대해 표적화된 치료는 PI3K/AKT 신호처리를 최대로 망가뜨리기 위하여 HER2-의존적 세포 내 PI3K 억제제에 첨가되어야 한다.
실시예 10
암 세포 내 상승적 효과
본 실시예는 구성요소 PI3K 활성화에 의한 인간 유방암 세포주에 대해 화합물 A인 포스파티딜이노시톨-3 키나제(PI3K)의 억제제의 세포 및 분자 효과에 대한 통찰을 제공하였다. 화합물 A로 처리는 세포 성장의 용량-의존적 억제 및 pAKT 및 pS6의 수준, PI3K/AKT/TOR 경로에서 신호 변환기를 초래하였다. HER2-과발현 세포에서, PI3K의 억제와 동시에 발현의 상향조절 및 HER3을 포함하는 다양한 RTK의 인산화가 있었다. FoxO1 및 FoxO3a 단백질의 녹다운은 PI3K의 억제 시 HER3, InsR, IGF-IR 및 FGFR-2 mRNA의 유도를 억제하였다. HER2+ 세포에서, siRNA에 의한 HER3의 녹다운 또는 HER2 억제제 트라스투주맙 또는 라파티닙에 의한 공동처리는 pAKT 및 pS6의 화합물 A-유도된 세포사 및 화합물A-매개 억제를 향상시켰다. 트라스투주맙 및 라파티닙은 각각 pAKT의 억제 및 확립된 BT474 이종이식의 성장에 대해 화합물 A에 의해 상승되었다. 이들 데이터는 PI3K 길항제가 AKT를 억제하고 RTK 발현 및 그것의 활성의 억제를 완화할 것이라는 것을 시사한다. 이 피드백의 완화는 경로의 지연된 억제를 제한하며, 이들 약제에 대한 반응을 약화시킨다. HER2+ 유방암이 있는 환자에서, PI3K 억제제는 HER2-HER3 길항제와 병용하여 사용하여야 한다.
실시예 11
3-차원(3D) 성장
세포를 성장-인자 감소된 Matrigel(미국 캘리포니아주 산 호세에 소재한 BD Biosciences) ± 기재된 방법에 따르는 화합물 A에서 8-웰 챔버 슬러이드 내에 씨딩하였다. 신선한 배지 및 약물을 3일마다 보충하였다. 콜로니를 본 명세서의 도면에서 인용한 날짜에 10배 접안렌즈 확대로 반전 광학현미경에 의해 촬영하였다
실시예 12
면역침강 , 면역블롯팅 및 수용체 티로신 키나제 ( RTK ) 분석
면역침강, 면역블롯팅 및 RTK 분석을 기재된 방법에 따라서 수행하였다. 1차 항체는 AKT, pAKTS473, pAKTT308, ERK, pERKT202 / Y204, pHER2Y1248, pHER3Y1197, pHER3Y1222, pHER3Y1289, S6, pS6S240 /244, p27, pRbS780, FoxO1, FoxO3a, MEK1/2(미국 매사추세츠주 댄버스에 소재한 Cell Signaling Technology), p85, 4G10 pTyr(미국 매사추세츠주 빌러리카에 소재한 Millipore), HER3, CyclinD1, RhoA, HDAC3(미국 캘리포니아주 산타 크루즈에 소재한 Santa Cruz Biotechnology), PARP(BD Transduction Laboratories), β-액틴(미국 미주리주 세인트 루이스에 소재한 Sigma) 및 HER2(미국 캘리포니아주 프레몬트에 소재한 Thermo Scientific의 분사인 Neomarkers)를 포함하였다. 종-특이적 호스래디시퍼옥시다아제-컨쥬게이션된 2차 항체를 Promega(미국 위스콘신주 매디슨에 소재)로부터 얻었다. 면역반응 신호를 향상된 화학발광에 의해 검출하였다(미국 일리노이주 락포드에 소재한 Pierce). 포스포-RTK 분석을 R&D Systems(미국 미네소타주 미네아폴리스에 소재)로부터 얻었고, 전체 세포 용해물을 사용하여 제조업자의 설명서에 따라서 어레이에 혼성화하였다.
실시예 13
RNA 간섭
미스매치 대조군 및 인간 HER3에 대한 siRNA 듀플렉스를 앞서 기재하였다(Wang, S.E., et al. (2008) Mol. Cell. Biol. 28:5605-5620, 본 명세서에 전문이 참조로 포함됨); 인간 FoxO1 및 FoxO3a-특이적 Silencer(등록상표) Select siRNA 듀플렉스를 Ambion(미국 텍사스주 오스틴에 소재한 Applied Biosystems)(FoxO1 센스 가닥, 서열번호 19: CCAUGGACAACAACAGUAAtt; FoxO3a 센스 가닥, 서열번호 20: GCCUUGUCGAAUUCUGUCAtt)으로부터 구입하였다. 인간 IGF-IR 및 InsR siRNA 듀플렉스를 Qiagen(미국 캘리포니아주 발렌시아에 소재)(IGF-IR 센스 가닥, 서열번호 21: GGAGAAUAAUCCAGUCCUAtt; InsR 센스 가닥, 서열번호22: GAACGAUGUUGGACUCAUAtt)으로부터 얻었다. 트랜스펙션을 리포펙타민 RNAiMAX(미국 캘리포니아주 칼스베드에 소재한 Invitrogen)로 수행하였다.
실시예 14
이종이식 실험
밴더빌트 대학교 메디컬센터(Vanderbilt University Medical Center, VUMC)의 실험동물관리위원회에 의해 동물 실험을 승인받았다. 마우스를 VUMC의 승인받은 동물 관리 시설에 가두었다. 17β-에스트라다이올 펠렛(Innovative Research of America)을 각각 종양 세포 주사 전 6- 내지 7-주령의 무흉선 암컷 마우스(Harlan Sprague Dawley, Inc.) 내로 피하(s.c.) 주사하였다. Matrigel(BD Biosciences)과 1:1로 혼합된 BT474 세포(3x106)를 각 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하로 주사하였다. 종양 직경을 1주일에 2회 캘리퍼스로 측정하였고, 다음의 식에 의해 용적을 ㎣로 계산하였다: 용적 = 폭2 x 길이/2. 일단 종양이 ≥200 ㎣으로 도달되면, 다음과 같이 단독으로 또는 병용하여 처리를 시작하였다: 트라스투주맙 30㎎/㎏ 1주일에 2회 i.p., 구위 위관영양법을 통해 매일 라파티닙 100㎎/㎏, 구위 위관영양법을 통해 매일 화합물 A 100㎎/㎏. 처리 28일 후 마우스를 안락사시켰다.
실시예 15
면역조직화학
모든 종양 샘플(최종 처리 1시간 내에 수집)을 실온에서 24시간 동안 10% 중성 완충 포르말린 중에 고정시킨 다음, 탈수시키고 파라핀 포매시켰다. 면역염색을 5-㎛ 조직 부문 상에서 행하였다. 자일렌 중에서 탈파라핀화하고 알코올을 등급을 매긴 후, 열-유발 항원 회수를 pH 6.0 시트르산 완충제 중에서 수행한 다음 20분 동안 3% 과산화수소와 함께, 단백질 블록(Dako)과 함께 10분 동안 인큐베이션하였고, 최종적으로 4℃에서 밤새 1차 항체와 함께 인큐베이션하였다. Envision Visualization System(미국 캘리포니아주 카핀테리아에 소재한 Dako)을 사용한 후 크로마젠으로서 DAB를 사용하였고, 헤마톡실린으로 대비 염색하였다. 종양 부문을 400 배의 접안렌즈 확대로 광학 현미경 상에서 연구하였다. 종양 세포 염색의 평균 백분율 및 강도를 히스토스코어(H-score)로 계산하였고(본 명세서에 전문이 참조로 포함되는 문헌[Goulding, H., et al. (1995), Hum . Pathol . 26:291-294]에서 기재되는 바와 같음). 부문을 스코어링하는 숙련된 병리학자(MGK)는 처리 유형에 대해 블라인드된다.
실시예 16
HER3 및 pHER3 의 유도와 관련된 PI3K 의 억제
조절장애 PI3K 활성을 갖는 유방암 세포주의 패널을 2- 및 3-차원(2D 및 3D) 성장 조건 하에 화합물 A의 용량을 증가시키면서 처리하였다. 달리 언급되지 않는다면, 모든 실험을 2.5% FBS-함유 배지 중에서 수행하였다. 화합물 A로 처리는 도 9a에서 나타낸 바와 같은 용량-의존적 방식으로 모든 세포주의 2D 성장을 억제하였다. ≤6μM의 유사한 IC50을 도 9b에 나타낸 바와 같이 3D에서 시험한 세포에서 관찰하였으며, 본 실험에서 모든 선택된 세포주가 PI3K 경로 내 분자 변경을 은닉하는 사실과 일치한다. 기준선으로서 처리의 시작 시 초기 세포량을 사용하는 성장 곡선의 분석은 대략 6μM의 IC50에서, 화합물 A의 주된 효과가 세포 증식의 억제라는 것을 나타내었다. 그러나 20μM에서, 화합물 A는 도 10a에서 나타낸 바와 같은 기준선 미만의 세포 수의 감소로 나타나는 바와 같은 세포사를 유발하였다. 이는 도 10b에 나타낸 바와 같이 화합물 A로 24시간 동안 처리한 세포로부터의 용해물 내 G1-S 세포 주기 전이 및 세포사 바이오마커의 면역블롯 분석으로 추가로 확인하였다. 모든 세포주에서, 화합물 A로 처리는 pAKTS473으로 측정되는 바와 같은 PI3K 신호처리의 용량-의존적 억제를 초래하였다. 20μM 미만의 농도에서 세포 증식의 억제와 일치하여, 화합물 A는 사이클린 D1 및 pRB의 감소 및 CDK 억제제 p27KIP1 수준의 증가를 유발하였지만, 전체 또는 절단된 PARP, 세포사의 바이오마커 수준에는 변화가 없었다(도 10b 참조).
실험을 수행하여 PI3K 및 TOR 신호처리 경로에서 분자의 더 포괄적인 패널 상에서 화합물 A의 효과를 시험하였다. 모든 세포주에서, 화합물 A로 처리는 pAKTS473/T308 및 pS6S240 /244에서 용량-의존적 감소를 초래하였다. 놀랍게도, 6/7 세포주에서, 화합물 A는 24시간에 전체 HER3 및/또는 pHER3Y1289 수준의 상향조절을 야기하였다. 5/6 HER2-과발현 세포주에서, 전체 HER2 및/또는 pHER2Y1248은 또한 PI3K의 억제 시 보통으로 상향조절되며, 이것의 결과는 도 11에 도시한다.
실시예 17
HER3 의 화합물 A-유발된 상향조절은 FoxO -매개 전사에 의존한다
화합물 A의 부재 및 존재에서 HER3 단백질의 반감기를 단백질 합성의 억제제인 사이클로헥시미드를 사용하여 결정하였다. HER3의 붕괴 속도는 화합물 A로 BT474 세포의 처리 시 상당히 변경되지 않았다(데이터는 도시하지 않음). 다음에 HER3 mRNA의 수준을 화합물 A의 대략의 IC50을 사용하여(6μM) 시간 과정에 걸쳐 PI3K의 억제시 qPCR로 시험하였다. BT474, SKBR3 및 MDA453 세포는 6시간에 최대로 나타난 HER3 mRNA의 증가를 나타내었고, 도 12a 및 도 12c에서 나타낸 바와 같은 p110α 억제제의 첨가 후 48시간까지 유지하였다. 다른 PI3K 경로 억제제: AKT1/2의 다른자리입체성 억제제인 5J8 및 PI3K 억제제 LY294002는 유사한 효과를 유발하였지만, 또한 mTOR 억제제 라파마이신은 도 12b에 나타낸 바와 같이 HER3 mRNA 수준을 상향조절하였다.
HER3 전사의 상향조절 메커니즘을 기술하기 위하여, Forkhead 전사 인자의 FoxO 패밀리를 시험하였고, 인산화에 의해 이들 분자의 준세포 편재화를 조절함으로써, 핵에 대한 전위 및 전사 조절을 방지하였다. FoxO 패밀리는 표적 유전자의 프로모터에서 공통서열 TTGTTTAC를 통해 모노머와 결합하는 3개의 구성원, 즉 FoxO1, FoxO3a 및 FoxO4(또한 각각 FKHR, FKHR-L1 및 AFX로 알려짐)로 이루어진다. AKT 활성이 없을 때, FoxO는 대부분 핵이 되는 것으로 믿어지며, 따라서 전사를 활성화시킬 수 있다. 추가로, PROMO 데이터베이스를 사용하여(Farre, D., et al., (2003), Nucleic Acids Res. 31:3651-3653, & Messeguer, X., et al., (2002), Bioinformatics 18:333-334), HER3(ERBB3) 프로모터 내 다수의 추정 FoxO-결합 부위(전사 출발 부위의 상류에서 5000 bp 까지)를 확인하였다.
우선, 화합물 A 및 5J8 각각에 의한 PI3K 및 AKT의 억제 후 FoxO 단백질의 준세포 분포를 결정하였다. FoxO4는 거의 검출가능하지 않으며; 따라서 FoxO1 및 FoxO3a에 중점을 두었다. 화합물 A 및 5J8로 처리는 BT474 및 MDA453 세포의 핵에서 FoxO 인자 둘 다의 축적을 초래하였으며, 때때로 도 12에서 증명하는 바와 같은 사이토졸 내 기준선 수준의 감소를 수반하였다. FoxO가 PI3K/AKT의 억제에 후속하여 HER3 전사 증가를 수반하는지의 여부를 결정하기 위하여, 세포를 FoxO1 및 FoxO3a에 특이적인 siRNA 듀플렉스로 트랜스펙션시키거나, 또는 대조군 siRNA 및 HER3 mRNA 수준을 qPCR로 시험하였다. siRNA는 도 12f에 나타낸 바와 같이 모두 3개의 세포주에서 FoxO mRNA 둘 다의 수준을 70-80%로 감소시켰다. 최종적으로, FoxO1 및FoxO3a의 동시 녹다운은 BT474, SKBR3 및 MDA453 세포 내 HER3 mRNA의 화합물 A-유발된 증가를 없앴다(도 12e 참조).
실시예 18
HER3 로 보충적 피드백의 녹다운은 PI3K 억제제에 민감하게 된다
0-72 시간 동안 6 μM 화합물 A로 처리한 BT474 세포의 상세한 시간-과정 분석은 전체 HER3, Y1197 및 Y1289에서 인산화된 HER3, 2개의 PI3K 결합 부위, 및 그것의 PDK1 부위 T308 및 그것의 TORC2 부위 S473에서 인산화된 AKT의 시간-의존적 상향조절을 나타내었다. 전체 증가와 비슷하게, pHER3, pAKT 및 pS6 수준은 또한 도 13a에 나타낸 바와 같이 약물 처리의 6시간 내에 회수되었고, PI3K/AKT/mTOR 신호처리의 부분적 재기를 나타낸다. pHER3이 어댑터 단백질 Shc를 통한 상호작용을 통해 세포 밖의 신호 조절된 키나제(ERK/MAPK)를 활성화하는 것으로 알려진다면, HER3의 피드백 재활성화 시 pERK의 회수는 도 13a에 나타낸 바와 같이 지속적으로 검출되지 않았다. pAKT의 회수가 더 적다고 하더라도, 전체 HER3 및 pHER3의 피드백 상향조절은 20μM의 상기한-약리학적 용량에 의해 더 분명하였고, 이는 PI3K의 억제가 HER3의 피드백 활성화를 야기한다는 것을 추가로 시사하며, 이를 도 13b에 도시한다. 이들 데이터는 p110α의 ATP_모방체로 PI3K의 억제 시, 결국 PI3K/AKT 경로 상에서 화합물 A의 전체 억제 효과에 대응하거나 제한하는 일부 PIP3 수준을 유지하기 위하여 세포가 HER3 인산화를 부분적으로 회복한다는 것을 시사한다.
HER2 과발현 세포에서, 임의의 특정 이론에 구속되지 않고, PI3K의 주된 활성화 메커니즘은 PI3K의 조절 서브유닛인 p85의 N-말단에서 SH2 도메인에 대한 pHER3의 커플링이라는 것이 믿어진다. 이들 세포에서, p85 항체에 의해 침전된 주된 티로신 인산화 단백질은 pHER3이며; HER3과 p85(PI3K) 사이의 이런 관계는 HER2의 촉매적 활성에 의존하는데, 이는 HER2 티로신 키나제 억제제(TKI)에 의해 방해되기 때문이다. 상기 관계가 주어진다면, PI3K의 억제 시 pHER3의 회수와 일치하는지의 여부를 시험하였고, HER3과 p85 사이의 관계의 유지 또는 회복이 있었다. 화합물 A의 농도를 증가시킨 다음 p85 항체로 풀 다운하며, 후속하여 pTyr 및 HER3 면역블롯 분석으로 BT474 세포를 처리하였다. 화합물 A로 처리 후, 도 13c에서 나타나는 바와 같이 대략 200-kDa 주요 pTyr 밴드뿐만 아니라 다른 더 작고 더 풍부한 pTyr 단백질의 용량-의존적 증가가 있었고, 화살표로 표시하였다. 이전의 연구와 일치되게, p85-관련된 대략의 200-kDa 밴드는 도 13d 및 도 13f에서 나타낸 바와 같은 HER3 및 pHER3Y1197 항체로 검출하였다. siRNA에 의한 HER3의 녹다운은 화합물 A-처리 세포로부터 용해물의 p85 풀다운 내 HER3 및 pHER3Y1197 밴드를 제거하였고, 추가로 도 13e 및 13F에 나타낸 바와 같이 p85-관련된 대략의 200-kDa pTyr 밴드로서 HER3을 확인하였다.
PI3K의 억제 시 전체 HER3의 보충적 상향조절 및 pHER3 및 pAKT의 부분적 유지는 PI3K와 HER3의 병용 억제가 종양 세포 증식 및/또는 생존력을 상승적으로 억제한다는 것을 시사한다. 따라서, 본 발명자는 대조군 또는 HER3 siRNA 듀플렉스 중 하나로 BT474 세포를 트랜스펙션시켰고, 화합물 A로 그것들을 처리하였으며, 세포 증식 및 아포토시스를 측정하였다. 도 13g 및 도 13h에 나타낸 바와 같이 단일층에서 세포 증식은 간섭 단독과 비교할 때 HER3 녹다운과 화합물 A의 병용에 의해 상당히 감소되었다. 상승적 프로-아포토시스 효과과 일치되게, 병용물은 도 14a 및 14B에 나타낸 바와 같이 세포사의 바이오마커인 서브-G1 상 DNA 분획(degraded DNA)뿐만 아니라 PARP 절단에서 더 큰 비율의 세포를 유발하였다. 도 15B 및 15D에서 나타내는 단일층에서 플레이팅한 MDA453 및 SKBR3 세포로 유사한 결과를 얻었다. 이들 세포주 둘 다에서, HER3 녹다운과 화합물 A의 병용은 T308 및 S473 pAKT 및 pS6을 각 처리군 단독보다 더 효과적으로 억제하였다(도 15A 및 도 15C).
실시예 19
HER3 인산화의 회복은 HER2 에 의존하며 HER2 억제제에 의해 제한된다
HER2 유전자 증폭(HER2 유방암을 과발현)에 의한 유방암 세포에서, HER2 수용체는 결국 PI3K에 직접 커플링되고 활성화하는 HER3을 인산화하는 주요 티로신 키나제이다. 화합물 A는 촉매적 활성 또는 HER2의 자기인산화에 영향을 미치지 않기 때문에(예를 들어, 도 11 참조), 이는 HER2-과발현 세포 내에서 추측하는 것이 타당하며, HER2는 PI3K의 억제시 HER3의 인산화를 유지하고/하거나 증가시키는 티로신 키나제로 남아있다. 따라서 HER2 항체 트라스투주맙 또는 HER2 가역적 티로신 키나제 억제제 라파티닙과의 병용 화합물 A의 효과를 세포 증식 및 HER3 인산화에 대해 시험하였다. BT474 세포에서, 이들 병용물 중 하나는 도 16a 및 도 16b에 나타낸 바와 같이 화합물 A 또는 HER2 억제제 단독보다 세포 증식을 억제하는데 상당히 더 효과적이었다(도 16에 나타낸 바와 같이, Lap은 라파티닙이고, Tras는 트라스투주맙이다). 이 결과와 일치되게, PARP 절단은 단지 병용물로 처리된 세포 내에서 관찰되었지만, 도 16c에 나타낸 단일 억제제로 처리된 세포 내에서 관찰되지 않았다. 유사한 결과를 MDA453 및 SKBR3 세포로 관찰하였고, 2개의 다른 HER2-과발현 계통을 도 17A 내지 도 17D에 나타낸다.
임의의 특정 이론에 구속되지 않고, 세포 성장에서 라파티닙 또는 트라스투주맙과의 병용 화합물 A의 상승적 작용은 pHER3의 회수의 감소에 기인하지만, HER3 mRNA 전사의 억제에 기인하지 않는다는 것이 믿어졌다. 화합물 A + 라파티닙 또는 화합물 A + 트라스투주맙 또는 각 억제제 단독으로 처리한 BT474 세포로부터 분리된 RNA에서 HER3에 대해 정량적 PCR(qPCR)을 사용하여 실험을 수행하였다. 트라스투주맙 단독으로 처리는 HER3 mRNA 수준을 증가시키지 않았지만, 화합물 A와 병용에서, 이는 도 16d에 나타낸 바와 같이 PI3K 억제제에 의해 유발된 HER3 mRNA의 상향조절을 향상시켰다. 화합물 A에서와 같이 라파티닙 단독이 HER3 mRNA을 현저하게 유발하는 이 작용은 PI3K 억제 후 FoxO-매개 전사의 억제의 결과이다. 라파티닙의 효과는 작용제 단독과 비교하여 PI3K/AKT의 아마도 더 확연한 억제의 결과로서 도 16d에 나타낸 바와 같이 화합물 A와 병용하여 사용될 때 더 우세하였다. mRNA 데이터와 대조적으로, 화합물 A + 라파티닙 또는 화합물 A + 트라스투주맙의 병용물로의 24시간 처리는 도 16e에 나타낸 바와 같이 화합물 A 단독으로 처리한 세포와 비교하여 pHER3의 회복을 약화시켰고, 이는 라파티닙으로 HER2 키나제의 억제 또는 트라스투주맙으로 리간드-의존적 HER2/HER3 다이머의 억제가 HER2 내지 HER3의 투입 활성화를 제한한다는 것을 시사한다.
실시예 20
HER2 와 PI3K 의 병용 억제는 HER2 -의존적 이종이식에 대해 상승적이다
PI3K의 병용 억제 및 pHER3의 피드백 회복이 HER2-의존적 이종이식에 대해 상승적이 되는지의 여부를 결정하기 위하여 실험을 추가로 수행하였다. 따라서, 트라스투주맙 또는 라파티닙의 첨가가 생체내 BT474 이종이식에 대해 화합물 A의 항종양 효과를 향상시키는지의 여부를 시험하기 위하여 실험을 수행하였다. 확립된 BT474 이종이식을 함유하는 무흉선 마우스를 무작위로 4주 동안 화합물 A, 라파티닙, 트라스투주맙 또는 화합물 A + 각각의 HER2 길항제/억제제로 치료하였다. 각 단일치료는 1/8 마우스에서 완전한 종양 반응을 유발한 유일한 작용제가 되는 트라스투주맙에 의해 종양 성장을 상당히 지연시켰다. 병용물은 단독으로 주어진 각 약물에 대해 우수하였다. 라파티닙 + 화합물 A의 병용물은 종양 용적을 상당히 감소시킨 반면, 화합물 A와 트라스투주맙의 병용물은 완전한 종양 퇴보를 유발하였다(도 18a). 처리한 팔 중 어떤 것에서 중요한 약물-관련 독성은 없었다.
면역조직화학(IHC)을 사용하여, 처리 28일 후 이종이식편에서 표적 불활성화의 약역학적 바이오마커를 시험하기 위하여 실험을 수행하였다. IHC에 의한 HER3은 어떤 처리한 팔에서 변화가 없었다. 그러나, 도 16e에서 나타내는 데이터와 일치되게, 화합물 A는 막 pHER3을 감소시키지 않았고, 라파티닙은 종양 함량에서 pHER3를 감소시키는 것에 트라스투주맙보다 더 효과적이었으며, 화합물 A + 트라스투주맙의 병용물은 도 18b 및 도 18c에 나타낸 바와 같이 단독으로 주어진 각 약물보다 pHER3 수준에 대한 명확하게 더 큰 억제가 있었다. AKT의 종양유전자 작용은 세포질과 핵 pAKTS473 둘 다의 수준과 상관관계가 있는 것으로 나타났다. 따라서, 이종이식편 부문에서 세포질과 핵 구획 내 pAKTS473 발현의 차이를 정량화하는 것을 수행하였다. 처리한 팔 중에서 종양 성장의 차이와 비슷하게, 핵 pAKT는 단일 작용제 억제제로 처리한 각 종양에 비교하여 화합물 A + 라파티닙 또는 화합물 A + 트라스투주맙으로 처리한 이종이식편에서 더 낮았다. 모두 3가지 약물 중에서, 화합물 A만이 핵 pAKT 수준이 통계적으로 억제된 것이었다. 도 18b 및 도 18c에 나타낸 바와 같이 pAKT의 세포질 함량에서 검출가능한 변화가 없었다. 전반적으로, 이 결과는 HER2-과발현 이종이식편에서 HER2와 PI3K의 병용 억제가 PI3K/AKT 경로의 신호처리 출력을 최대로 억제하는데 필요하다는 것을 시사한다. 도 18b의상단 열에 나타낸 바와 같이 처리 28일 후 관찰한 전체 HER3 수준은 더 짧은 기간 분석 후 배양물 내 세포에서 나타난 HER3 mRNA 및 단백질의 상향조절을 재생시키지 않았다. 어떤 특정 이론에 구속되지 않고, 이는 늦은 기간(제28일)의 이종이식 분석 결과일 수 있다.
실시예 21
PI3K 의 억제는 HER3 이외의 RTK 를 유발한다
도 13c는 BT474 세포 내 PI3K의 화합물 A-매개 억제 시 p85-관련 pTyr 단백질의 검출가능산 수준의 증가를 나타낸다. 본 명세서에서 제공된 결과는 또한 p85(PI3K)와 함께 공침되는 현저한 대략 200-kDa pTyr 밴드가 도 13d 내지 도 13f에서 나타나는 것과 같은 HER3 및 pHER3 항체에 의해 인식되며, 도 13e 및 도 13f에서 나타내는 것과 같은 siRNA에 의한 HER3의 녹다운 시 제거된다는 것을 증명한다. 그러나, PI3K가 억제될 때 더 낮은-MW pTyr 밴드의 용량-의존적 증가는(도 13c에서 도시) HER3 이외의 p85-관련 단백질의 증가를 시사한다. 추가로, 도 19a에서 제공되는 결과는 siRNA에 의한 HER3의 녹다운 시, p85-관련된 대략 200-kDa 밴드에서 여전히 증가가 있다는 것을 나타내며, 이는 PI3K 활성을 부분적으로 유지하는 것을 목표로 하는 다른 보충적 p85-관련 티로신 키나제 및/또는 어댑터 존재의 추측을 추가로 유발한다. 이 가설을 시험하기 위하여, 화합물 A로 24시간 과정에 걸쳐 처리한 BT474 세포로부터의 용해물의 2가지 상이한(높은 및 낮은) 농도는 티로신 키나제의 42개의 상이한 수용체(RTK)에 대한 프로브를 함유하는 어레이에 혼성화되었다. 화합물 A로 처리는 도 19b 및 도 19c에 나타낸 바와 같이 HER3뿐만 아니라 EGFR, ERBB4/HER4, 섬유아세포 성장인자 수용체(FGFR)-1, -2, -3 및 -4, 인슐린 수용체(InsR), 인슐린-유사 인자-I 수용체(IGF-IR), 에프린 수용체 A1-(EphA1), 내피세포-특이적 수용체 티로신 키나제 2(Tie2), 신경영양 티로신 키나제 수용체 1형-(TrkA), Fms 유사 티로신 키나제 3 수용체(Flt3), 티로신-단백질 키나제 Mer(MER) 및 대식세포-자극 단백질 수용체(MSPR)를 포함하는 다양한 다른 RTK에서 증가를 초래하였다. 이들 RTK 중 몇몇은 EGFR, ERBB4 및 InsR와 같이 대략 200 kDa에서 이동하며, HER3이 도 19a에 나타낸 바와 같이 녹 다운된 세포 내에서 p85와 관련된 지속적인 높은-MW pTyr를 설명할 수 있다. 이들 RTK의 상향조절이 전사 수준에서 일어나는지의 여부를 결정하기 위하여 qPCR을 수행하고 분석하였다. 화합물 A로 처리 후 BT474 세포에서, 도 19d에 나타낸 바와 같이 ERBB4, IGF-IR, InsR, EphA1, FGFR2 및 FGFR3 mRNA의 증가가 있었고, IGF-IR 및 InsR이 가장 현저하였다.
PROMO 데이터베이스를 사용하여, InsR, IGF-IR 및 FGFR2 유전자 프로모터 내 다수의 추정 FoxO-결합 부위(전사 출발 부위 상류에서 5000 bp까지)를 확인하였다. FoxO-매개 조절과 일치하여, siRNA에 의한 FoxO1 및 FoxO3a의 녹다운은 도 19e에 나타낸 바와 같이 화합물 A로 처리한 BT474 세포 내 IGF-IR, InsR, 및 FGFR2 mRNA의 유발을 제한하였다. 이 피드백의 잠재적인 치료적 타당성을 결정하기 위하여, 이들 RTK의 결실이 PI3K 억제제에 대해 세포를 민감하게 하는지의 여부를 시험하기 위한 실험을 수행하였다. 이 목적을 위하여, HER2-과발현 BT474 및 MDA453 세포 및 PI3K-돌연변이체 MCF7 세포를 IGF-IR 및 InsR에 대해 siRNA 듀플렉스로 트랜스펙션시킨 후 화합물 A로 처리하였다. RTK 둘 다의 녹다운은 도 20a 및 도 20b에 나타낸 바와 같이 모두 3개의 세포주에서 효과적이었다. RTK 중 하나의 결실은 도 20c 내지 도 20e에 나타낸 바와 같이 화합물 A-매개 성장 억제에 대해 3가지의 세포 모두를 민감화하였다. 합쳐서 생각하면, 이들 데이터는 암 세포가 p85와 맞물릴 수 있는 다양한 RTK 또는 어댑터를 상향조절하는 피드백 메커니즘에 의해 PI3K의 억제를 제한하며, 따라서 PI3K를 활성화한다는 것을 시사한다. 결국, 이들 분자는 시간에 걸쳐 PI3K/AKT 신호처리를 부분적으로 유지하며, 단독으로 주어진 PI3K/AKT 경로의 치료적 억제제의 항종양 효과를 제한한다.
실시예 22
화학식 I의 화합물 A 및 HER2 및/또는 HER3 의 억제제를 사용하는 암 치료
본 발명은 특정 메커니즘으로 제한되지 않는다. 게다가, 메커니즘의 이해는 본 발명의 실행에 필수적이지 않다. 암 세포주의 패널에서 소분자 화합물 A에 의한 PI3K 억제의 세포 효과는 PI3K 의존도를 시사한다. 본 명세서에 제공된 예시적 실험은 PI3K 억제 및 HER2 유전자 증폭을 갖는 유방암 세포의 세포 효과를 시험하였다. pAKT, pS6 및 세포 성장을 없애는 용량에서, 화합물 A에 의한 PI3K의 억제는 시간-의존적, HER3 발현의 피드백 상향조절 및 인산화를 초래하였다. 결국, pHER3은 p85와 맞물리고, PI3K를 활성화하며, 도 11, 도 13 및 도 15에 나타낸 바와 같이 pAKT 및 pS6의 부분적 회수를 유발하였다. AKT는 전사 인자의 FoxO 패밀리를 인산화하고, 이에 의해 그것의 핵 전좌를 방지하는 것으로 나타났다. 따라서 AKT의 초기 억제는 도 12d에 나타낸 바와 같이 핵 내 FoxO3a 및 FoxO1 단백질의 축적을 초래하였다. FoxO 단백질 둘 다의 녹다운은 화합물 A에 의한 PI3K/AKT의 억제 시 HER3 mRNA의 유발을 시사하였다(도 12e). 임의의 특정 이론에 구속되지 않고, HER3은 PI3K/AKT에 의해 하향조절되며, PI3K 억제제 GDC-0941이 리간드 헤레귤린을 활성화시키는 HER3로 처리시 HER3 mRNA의 하향조절을 차단하는 난소암 세포에서 최근의 관찰과 일치하는 것으로 믿어진다.
HER3 발현 및 인산화의 상향조절은 PI3K 억제제의 항종양 효과를 제한하였다. 이는 도 14에 나타낸 바와 같이 HER3의 siRNA-매개 녹다운이 화합물 A-유발된 세포사에 민감하게 되며, 도 15A 및 도 15C에 나타낸 바와 같이 pAKT 및 pS6의 화합물 A-매개 억제를 향상시킨다는 사실에 의해 지지된다. 이 결과는 일단 HER2 키나제에 의해 다이머화되고 활성화되면 키나제-결핍 HER3 공동 수용체가 p85와 맞물리고 PI3K를 활성화하는 중요한 메커니즘이 되는 HER2-과발현 세포에 대해 특정 타당성을 가진다. 게다가, HER2 증폭에 의한 유방암 세포는 PI3K 억제제에 의해 유발된 아포토시스에 특히 민감하다. 추가로, p85과 HER2/HER3 다이머의 결합은 HER2-의존적 세포의 생존력에 필수적이 되는 것으로 다른 것들에 의해 발견되었고, 따라서, PI3K에 대한 HER2/HER3의 결과의 지연된 억제는 HER2 억제제의 항종양 효과에 필요하다.
PI3K의 억제가 HER2 키나제나 영향을 미치지 않는다면, HER3 인산화는 유지되었고, 추가로 증가되며, 도 13d 내지 도 13f에 나타낸 바와 같이 화합물 A-처리 세포에서 p85와 결합된 채로 남아있었다. HER3 전사가 억제제 단독과 비교하여 억제제들의 병용물에 의해 추가로 증가되었지만, HER2 항체 트라스투주맙 또는 HER2 TKI 라파티닙의 첨가는 도 16e에 나타낸 바와 같이 화합물 A로 처리 시 pHER3의 리바운드를 약화시켰다(예를 들어, 도 16d 참조). 추가로, 화합물 A와 각 HER2 길항제의 병용물은 둘 다 도 18에 나타낸 바와 같이 HER2-과발현 이종이식편에서 pHER3 및 pAKT 수준의 감소 및 그것의 성장 억제에서 각 억제제 단독보다 더 효과적이었다. 이들 데이터는 HER2-과발현 세포에서, 라파티닙에 의한 HER2 키나제의 억제 또는 트라스투주맙에 의한 리간드-독립적 HER2/HER3 다이머의 붕괴가 PI3K가 억제될 때 상향조절된 HER3 공동-수용체에 대한 HER2 입력의 활성화를 제한한다는 것을 강하게 시사한다.
본 명세서에서 제시한 데이터는 라파마이신 또는 라팔로그에 의한 mTOR의 억제가 IRS-1의 상향조절을 통해 인슐린 및 IGF-I 신호처리의 억제를 완화하고, 이에 의해 PI3K/AKT 및 ERK를 활성화한다는 보고를 연상시킨다. 더 나아가, TORC1 및 PI3K의 이중 억제제는 HER3 발현을 유발하는 것으로 나타났다. 그러나, TORC1 억제제 라파마이신은 화합물 A의 효과 또는 HER3 mRNA 상의 AKT 억제제 5J8을 반영하지 않았다(도 11B). 유사하게, TORC1 억제제 RAD001-(에베로리무스) 및 MEK 억제제 CI-1040으로 처리는 HER3 mRNA/단백질 또는 pHER3을 상향조절하지 않았다(데이터 미제시). 이는 HER3의 FoxO-매개 피드백 상향조절 상의 AKT 억제 효과가 TORC1에 의해 매개되지 않는다는 것을 시사한다.
본 명세서에서 제공되는 실험 데이터는 HER2와 같은 PI3K/AKT 신호처리에 의존하는 RTK의 치료적 억제제를 사용하는 영향을 가진다. 예를 들어, 트라스투주맙은 단독으로 주어질 때 도 18b 및 도 18c에 나타낸 바와 같이 AKT의 약한 억제제가 되며, 따라서 FoxO-유발된 HER3 전사의 AKT-매개 억제를 보조하지 않는다. 다른 한편으로, TKI 라파티닙에 의한 pAKT의 즉각적이고 강한 억제는 도 16d에서 나타나는 바와 같은 BT474, SKBR3 및 SUM225 세포 내 HER3 발현의 강한 상향조절을 초래한다(데이터 미제시). 라파티닙과 화합물 A의 병용물은 도 16a, 도 16a 및 도 16c에 나타낸 바와 같이 시험관 내에서, 도 18a에 나타낸 바와 같이 생체내에서 상승적이지만, 또한 도 16d에 나타낸 바와 같이 HER3 mRNA를 유발하는 것에 가장 강력하였다. 트라스투주맙에 의한 pAKT의 더 약한 억제에도 불구하고, 화합물 A와 트라스투주맙의 병용물은 pAKT 및 BT474 이종이식편의 성장을 억제하는 것에서 화합물 A와 라파티닙의 병용물에 대해 우수하게 되는 것으로 나타났다. 임의의 특정 이론으로 구속되지 않고, 이 차이는 (1) 항체-의존적, 세포-매개 세포독성(ADCC)의 면역 효과기에 맞물리는 트라스투주맙의 능력 및 (2) 보충적 HER3 발현을 활성화하는 트라스투주맙의 상대적 불능에 의해 설명될 수 있다는 것이 믿어진다.
본 명세서에 제공된 실험적 증거는 티로신 인산화된 단백질의 증가가 화합물 A로 PI3K의 억제 시 p85와 관련된다는 것을 시사한다. 게다가, HER3과 함께 이동하는 p85-관련된 대략 200-kDa P-Tyr 밴드는 도 19a에 나타낸 바와 같이 HER3이 siRNA에 의해 녹다운된 후 화합물 A-처리된 BT474 세포에서 여전히 검출가능하였다. 이 결과는 다른 보충적 p85-관련 RTK 및/또는 어댑터의 존재가 PI3K 활성을 부분적으로 유지하는 것을 목표로 한다는 것을 시사한다. RTK 어레이 및 siRNA 녹다운 실험을 사용하여, 데이터는 도 19c 내지 도 19e에 나타낸 바와 같이 화합물 A로 PI3K/AKT의 억제 시 InsR, IGF-IR 및 FGFR2의 FoxO-의존적 상향조절의 발견을 제공하였다. 몇몇 세포주에서, InsR 및 IGF-IR의 녹다운은 도 20c 내지 도 20e에 나타낸 바와 같이 PI3K 억제제에 대해 민감하게 되었다. 이들 중 하나인 MCF-7 세포주는 PIK3CA에서 활성화 돌연변이를 은닉하였지만 HER2 유전자 증폭은 그렇지 않다. 흥미롭게도, 이들 3개의 RTK의 유전자 프로모터는 추정 FoxO-결합 부위(PROMO 분석)를 함유한다. 이들 데이터는 PI3K 억제가 종양 세포의 범위에 걸쳐 RTK 군의 발현 및 인산화 유발과 관련될 수 있었다는 것을 나타낸다.
이들 발견점은 몇몇 임상적 영향을 가진다. 암 세포에서, PI3K 경로의 치료적 길항제는 AKT를 억제할 것이며, RTK 발현 및 그것의 활성 억제를 완화할 것이다. 이 피드백의 완화는 연장된 경로 억제를 제한하며, 이들 작용제에 대한 치료적 반응을 약화시킨다. 이 피드백의 완화는 AKT 억제의 규모 및 강도와 상응하며, 모든 유형의 PI3K 경로 길항제에 적용될 수 없다(즉, 트라스투주맙 대 라파티닙 대 화합물 A). 이 피드백의 완화가 또한 정상 조직에서 일어나고/일어나거나 약물-관련 독성을 개선시키는지의 여부는 추가 연구를 필요로 한다. 임의의 특정 이론으로 구속되지 않지만, HER2-과발현 세포에서 HER3의 HER3 및 HER2-유발된 인산화의 상향조절된 발현은 PI3K/AKT의 억제에 대응하는 주된 메커니즘이다. 따라서, PI3K 억제제는 이들 서브타입의 유방암에서 HER2 길항제와 병용하여 사용하여야 한다. HER2 유전자 증폭 없이 다른 PI3K-의존적 암에서 PI3K/AKT 억제제와 병용되는 가장 적절한 항-암 작용제는 이 경로의 억제시 활성화된 주요 보충적 피드백 메커니즘에 의존할 것이다.
실시예 23
비- HER2 증폭 종양에서 화합물 A와 MM -121의 병용의 평가
비-HER2 증폭 종양에서 화합물 A 및 MM-121의 병용 효능을 평가하기 위하여 본 연구를 설계하였다. 폐암 세포주 A549는 이 연구를 위하여 선택하였다. 이에 대하여, A549 세포는 문헌[Bunn et al., Clinical Cancer Research, 7:3239-3250 (2001)]에 나타낸 바와 같이 높은 HER2 수준을 발현하지 않는다. 폐 A549 세포를 표준 기법을 사용하여 암컷 스위스 누드 마우스에 피하로 이식하였다. 그룹 당 7마리의 마우스를 사용하여 2 용량의 MM-121 및 화합물 A를 사용하여 4개의 병용 조건으로 종양이 152.9 ± 94.7㎜3의 평균 용적에 도달하였을 때 A549 이종이식을 처리하였다. 대조군은 미처리로 남겨두었다. 화합물 A를 매일 PO 투여로 100 또는 30㎎/㎏/투여에서 32일 연속으로 투여하였다(D37 내지 D68: Q1Dx32). MM-121을 3일마다 1회 IP 경로로 5 또는 30㎎/㎏/주사로 투여하였다(D37, D40, D43, D46, D49, D52, D55, D58, D61, D64 및 D67; Q3Dx11). 4개의 병용 조건은 다음과 같다: 화합물 A는 100㎎/㎏/투여로 매일 투여하였고, MM-121은 3일마다 1일 1회 30㎎/㎏로 투여; 화합물 A는 100㎎/㎏/투여로 매일 투여하였고 MM-121은 3일마다 1일 1회 5㎎/㎏로 투여; 화합물 A는 30㎎/㎏/투여로 매일 투여하였고, MM-121는 30㎎/㎏로 3일마다 1일 1회 투여; 및 화합물 A는 30㎎/㎏/투여로 매일 투여하였고, MM-121은 3일마다 1일 1회 5㎎/㎏로 투여.
컨쥬게이트의 항-종양 활성 평가를 위하여, 동물을 매일 칭량하였고, 종양을 캘리퍼로 1주일에 2회 측정하였다. 3회 연속으로 최악의 순간에 20% 체중 손실(그룹의 평균) 또는 15% 체중 손실(그룹의 평균) 또는 약물 사망을 만드는 투약량은 과량으로 독성인 투약량으로 생각하였다. 동물 체중은 종양 중량을 포함하였다. 종양 중량은 다음의 식 질량(㎎) = [길이(㎜)×폭(㎜)2]/2를 사용하여 계산하였다. 1차 효능 종말점은 ΔT/ΔC, 중앙값 퇴보%, 부분적 및 완전한 퇴보(partial egression, PR 및 complete regression, CR) 및 무종양 생존자(Tumor free survivor, TFS)이었다. 각 종양에 대해 특정 관찰일에 종양 용적으로부터 제1 처리일(스테이징 일)의 종양 부피를 차감함으로써 각각의 처리군(T) 및 대조군(C)에 대한 종양 용적의 변화를 계산하였다. 중앙값 ΔT를 처리군에 대해 계산하였고, 중앙값 ΔC를 대조군에 대해 계산하였다. 그 다음에 비 ΔT/ΔC를 계산하였고, 백분율:ΔT/ΔC=(델타 T/델타 C) x 100으로 표현하였다. ΔT/ΔC가 40%보다 더 낮을 때 용량은 치료적 활성으로 고려하였고, ΔT/ΔC가 10% 보다 더 낮을 때 매우 활성인 것으로 고려하였다. ΔT/ΔC가 0보다 더 낮다면, 용량은 매우 활성인 것으로 고려하였고, 퇴보%를 추정하였다. 종양 퇴보%는 제1 처리군의 제1일에 용적과 비교하여 특정된 관찰일에 처리군에서 종양 용적의 백분율로 정의한다. 특정 시점 및 각 동물에 대해, 퇴보%를 계산하였다. 그 다음에 중앙값 퇴보%를 그룹에 대해 계산한다. 퇴보%(t)= [용적t0 - 용적t/용적t0] x 100. 부분적 퇴보(PR): 종양 용적이 처리의 시작 시 종양 부피의 50%로 감소된다면 퇴보는 부분적인 것으로 정의된다. 완전한 퇴보(CR): 종양 용적= 0㎣(종양 용적이 기록되지 않았을 때 CR은 고려된다)일 때 완전한 퇴보가 달성된다. TFS: 무종양은 연구의 마지막에 검출가능한 종양을 갖는 동물로 정의된다(마지막 처리 후 >100일).
결과를 표 4에 제시한다. D37과 D68 사이에 계산한 평균 체중 변화를 기반으로, 30 및 100㎎/㎏에서 화합물 A로 처리한 마우스에 대해 용량 의존적 체중 손실을 관찰하였다(각각 최악의 순간에 -7.3 및 -10.3%). 동일한 방식으로, 용량 의존적 체중 손실을 5 및 30㎎/㎏(최악의 순간 각각 -3.9 및 -6.2 %)에서 MM-121로 처리한 다음 완전히 회복되 마우스에 대해 관찰하였다. 동일한 각 용량에서(최악의 순간 각각 -8.4, -11.4, -12.4 및 -12.9%) 단독으로 투여된 화합물 A 또는 MM-121로 처리한 마우스와 비교할 때 30 및 100㎎/㎏에서 화합물 A를 5 또는 30㎎/㎏에서 MM-121과 병용하여 처리한 마우스에 대해 용량 의존적 체중 손실을 관찰하였다. 5 또는 30㎎/㎏에서 MM-121과 병용한 100㎎/㎏에서 화합물 A에 대해 화합물 A의 동일 용량 단독과 비교하여 체중 손실에서 유의한 차이가 없다는 것을 관찰하였다. 화합물 A와 MM-121의 병용물은 추가된 독성을 유발하지 않았다.
MM-121은 31%의 ΔT/ΔC와 함께 30㎎/㎏에서 조금 활성이었고, 66%의 ΔT/ΔC와 함께 5㎎/㎏에서 불활성이었다. 화합물 A는 5%의 ΔT/ΔC와 함께 30㎎/㎏에서 매우 활성이고(대조군에 대해 p<0.05) -4%(p<0.001)의 ΔT/ΔC와 함께 100㎎/㎏에서 고도로 활성이며, 15%의 종양 퇴보가 있었다. 30㎎/㎏의 MM-121과 병용된 100㎎/㎏의 화합물 A는 -20%의 ΔT/ΔC와 함께 고도로 활성이며(대조군에 대해 p<0.001) 39%의 종양 퇴보가 있다. 이 병용물은 이들 병용 조건에서 치료적 상승 작용을 나타내는 최상의 단일 작용제(100㎎/㎏에서 화합물 A, p<0.01)보다 더 활성이었다. 5mg/kg에서 MM-121와 100㎎/㎏에서 화합물 A의 병용물은 -17%의 ΔT/ΔC(대조군에 대해 p<0.001) 및 41%의 종양 퇴보와 함께 고도로 활성이었다. 30㎎/㎏에서 화합물 A와 30㎎/㎏에서 MM-121의 병용물은 -7%의 ΔT/ΔC(대조군에 대해 p<0.001) 및 15%의 종양 퇴보와 함께 고도로 활성이었다. 이 병용물은 최상의 단일 작용제(30㎎/㎏에서 화합물 A, p<0.01)보다 더 활성이며, 이들 병용 조건에서 치료적 상승 작용을 표시한다. 30㎎/㎏에서 화합물 A와 5㎎/㎏에서 MM-121의 병용물은 16%의 ΔT/ΔC로 활성이었다(대조군에 대해 p<0.01).
결론적으로, 증폭 또는 과발현된 HER2를 가지지 않는 A549 종양 이종이식편을 함유하는 마우스에서 치료적 용량으로 공동투여된 2개의 작용제의 병용물은 사망률 및 체중 변화로 평가되는 추가된 독성을 나타내지 않았다. MM-121 단일 작용제는 30㎎/㎏에서 무의미한 활성을 나타내었으며, 화합물 A 단일 작용제는 30 및 100㎎/㎏에서 고활성을 나타내었다. 100㎎/㎏의 화합물 A와 30㎎/㎏의 MM-121의 병용물 및 30㎎/㎏의 화합물 A와 30㎎/㎏의 MM-121의 병용물은 두 조건에 대한 최상의 단일 작용제(각각 100㎎/㎏에서 화합물 A, p<0.01 및 30mg/kg에서 화합물 A, p<0.01)와 비교하여 치료적 상승 작용이 관찰되었다.
추가로, 암컷 스위스 누드 마우스에 피하로 이식한 측정가능한 폐 A549 종양 상에서 화합물 A 및 MM-121에 의한 HER3 조절을 2 용량에서 및 하나의 병용 조건에 대해 각 화합물에 대패 평가하였다. 간략하게, 피하로 이식한 측정가능한 폐 A549 종양을 함유하는 마우스는 단일 작용제로서 MM121(5㎎/㎏ 또는 30㎎/㎏ 용량에서 1회 투여) 또는 단일 작용제로서 화합물 A에 의해(30mg/kg 또는 100mg/kg의 용량에서 매일 투여) 또는 둘 다의 병용물에 의해(MM121에 대해 30mg/kg 및 화합물 A에 대해 100㎎/㎏) 미처리 또는 처리된 채로 남아있었다. 이종이식된 종양 내 HER3 발현 수준은 96시간까지 따랐다.
표 5의 결과는 화합물 A에 의한 PI3K 억제가 A549 폐 모델에서 HER3 발현의 약간 증가를 유발하는 한편, MM-121 처리가 HER3 발현을 상당히 감소시킨다는 것을 나타낸다. 화합물 A와 MM-121로의 병용 처리는 HER3의 상당한 감소를 초래하였다. HER3 수준을 하향조절함으로써, MM-121은 PI3K-AKT 경로의 억제를 향상시키고, 따라서 화합물 A의 항-종양 활성을 향상시킨다.
Figure pct00191
Figure pct00192
실시형태
1. 화학식 I의 화합물의 치료적 유효량 및 HER2 및/또는 HER3 억제제의 치료적 유효량을 상기 환자에게 공동-투여하는 단계를 포함하는, 환자에서의 암 치료 방법.
2. 실시형태 1에 있어서, 상기 화학식 I의 화합물은 하기 화합물 또는 이것의 단일 이성질체이며:
[화학식 I]
Figure pct00193
상기 화합물은 선택적으로 이것의 약제학적으로 허용가능한 염, 추가로 선택적으로 수화물, 및 추가로 선택적으로 용매화물이고; 또는 약제학적 조성물을 투여하는 단계는 화학식 I의 화합물 및 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제의 치료적 유효량을 HER3, HER2, MSPR, Axl, MAP3K(ERK, JNK 및 p38 MAPK), MEKK 키나제들/키나제 수용체, INSR, IGF-IR 및 FGFR2 중 하나 이상의 억제제와 병용된 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하며, 화학식 I의 화합물은,
W1, W2, W3 및 W4는 -C(R1)=이며; 또는 W1, W2, W3 및 W4 중 1 또는 2개는 독립적으로 -N=이고 나머지는 -C(R1)=이며; 각각의 R1은 독립적으로 수소, 알킬, 할로알킬, 나이트로, 알콕시, 할로알콕시, 할로, 하이드록시, 시아노, 아미노, 알킬아미노 또는 다이알킬아미노이고;
R51은 수소 또는 알킬이며;
R52는 수소 또는 할로이고;
R50, R53 및 R54는 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 할로, 할로알킬, 할로알케닐, 하이드록시, 알콕시, 알케닐옥시, 할로알콕시, 나이트로, 아미노, 알킬아미노, 다이알킬아미노, -N(R55)C(O)-C1-C6-알킬렌-N(R55a)R55b, 알킬카보닐, 알케닐카보닐, 카복시, 알콕시카보닐, 시아노, 알킬티오, -S(O)2NR55R55a 또는 알킬카보닐아미노이며, R55 및 R55b는 독립적으로 수소, 알킬 또는 알케닐이고, R55a는 수소, 알킬, 알케닐, 하이드록시 또는 알콕시이며; 또는 R53 및 R54는 그것들이 부착된 탄소와 함께 5- 또는 6-원 헤테로아릴 또는 5- 또는 6-원 헤테로사이클로알킬을 형성하고;
B는 R3a로 치환되고 선택적으로 1, 2 또는 3개의 R3으로 추가로 치환된 페닐이며; 또는
B는 1, 2 또는 3개의 R3으로 선택적으로 치환된 헤테로아릴이고;
R3a는 시아노, 하이드록시아미노, 카복시, 알콕시카보닐, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 알킬카보닐, 할로알콕시, 알킬설포닐, 아미노알킬옥시, 알킬아미노알킬옥시 또는 다이알킬아미노알킬옥시이며; 또는
a) -N(R7)C(O)-C1-C6-알킬렌-N(R7a)(R7b), 여기서 R7 수소, 알킬 또는 알케닐이며, R7a 및 R7b는 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 하이드록시알킬, 할로알킬, 알콕시, 알콕시알킬, 아미노알킬, 알킬아미노알킬, 다이알킬아미노알킬, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬알킬, 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 아릴, 아릴알킬 또는 아릴알킬옥시이고, R7a 및 R7b(아릴알킬, 사이클로알킬알킬, 헤테로사이클로알킬알킬 및 헤테로아릴알킬의 부분으로서 또는 단독으로)의 아릴, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬 및 헤테로아릴 고리는 독립적으로 알킬, 아미노, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 하이드록시, 할로, 알콕시, 알킬티오 및 옥소로부터 독립적으로 선택되는 1, 2 또는 3개의 기로 선택적으로 치환되고;
b) -C(O)NR8R8a, 여기서 R8은 수소, 하이드록시, 알콕시, 알킬, 알케닐, 할로알킬 또는 할로알콕시이며, R8a는 수소, 알킬, 알케닐, 하이드록시알킬, 시아노알킬, 알콕시알킬, 알킬티오알킬, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬알킬, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬, 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 아릴 또는 아릴알킬이며, R8a의 아릴, 사이클로알킬, 헤테로아릴 및 헤테로사이클로알킬 고리(아릴알킬, 사이클로알킬알킬, 헤테로사이클로알킬알킬 및 헤테로아릴알킬의 부분으로서 또는 단독으로)는 독립적으로 알킬, 알케닐, 알콕시, 할로, 할로알킬, 할로알콕시, 하이드록시, 하이드록시알킬, 옥소, 아미노, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 알킬카보닐, 아미노알킬, 알킬아미노알킬, 다이알킬아미노알킬, 알콕시카보닐 및 -C(O)H로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 기로 선택적으로 치환되며;
c) -NR9C(O)R9a, 여기서 R9는 수소, 하이드록시, 알콕시, 알킬, 알케닐, 할로알킬 또는 할로알콕시이고, R9a는 수소, C2-C6-알킬, 알케닐, 하이드록시알킬, 알콕시알킬, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬알킬, 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 아릴 또는 아릴알킬이며, R9a의 아릴, 사이클로알킬, 헤테로아릴 및 헤테로사이클로알킬 고리(아릴알킬, 사이클로알킬알킬, 헤테로사이클로알킬알킬 및 헤테로아릴알킬의 부분으로서 또는 단독으로)는 독립적으로 알킬, 알케닐, 알콕시, 하이드록시, 하이드록시알킬, 할로, 할로알킬, 할로알콕시, 옥소, 아미노, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 알킬카보닐, 알콕시카보닐, -C(O)H, 아릴(1 또는 2개의 할로로 선택적으로 치환됨), 아릴알킬, 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬알킬, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬 및 사이클로알킬카보닐로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 기로 선택적으로 치환되고;
d) -C(O)N(R10)-C1-C6-알킬렌-N(R10a)R10b, 여기서 R10a는 수소, 하이드록시, 알콕시, 알킬, 알케닐, 할로알킬, 아미노알킬, 알킬아미노알킬, 다이알킬아미노알킬 또는 하이드록시알킬이며, R10 및 R10b는 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 할로알킬, 아미노알킬, 알킬아미노알킬, 다이알킬아미노알킬 또는 하이드록시알킬이고;
e) -NR11C(O)NR11aR11b, 여기서 R11a는 수소, 알킬, 알케닐, 하이드록시 또는 알콕시이며, R11 및 R11b는 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 아미노알킬, 알킬아미노알킬 또는 다이알킬아미노알킬이고;
f) -C(O)R12, 여기서 R12는 알킬, 옥소, 아미노, 알킬아미노 및 헤테로사이클로알킬알킬로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 기로 선택적으로 치환된 헤테로사이클로알킬이며;
g) -NR13C(O)OR13a, 여기서 R13은 수소, 알킬 또는 알케닐이며, R13a는 아미노알킬, 알킬아미노알킬, 다이알킬아미노알킬, 아릴 또는 아릴알킬이고;
h) -C(O)N(R14)N(R14a)(R14b), 여기서 R14, R14a 및 R14b는 독립적으로 수소, 알킬 또는 알케닐이며;
i) -S(O)2N(R15)-C1-C6-알킬렌-N(R15a)R15b, 여기서 R15, R15a 및 R15b는 독립적으로 수소, 알킬 또는 알케닐이고;
j) -C(O)N(R16)-C1-C6-알킬렌-C(O)OR16a, 여기서 R16은 수소, 알킬 또는 알케닐이며, R16a는 알킬 또는 알케닐이고;
k) 1 또는 2개의 아미노알킬, 알킬아미노알킬 또는 다이알킬아미노알킬로 선택적으로 치환된 헤테로아릴;
l) -N(R17)-C(=N(R17b)(R17a))(NR17cR17d), 여기서 R17, R17a, R17b, R17c 및 R17d는 독립적으로 수소, 알킬 또는 알케닐이며;
m) -N(R18)C(O)-C1-C6-알킬렌-N(R18b)C(O)R18a, 여기서 R18a는 수소, 알킬, 알케닐 또는 알콕시이고, R18 및 R18b는 독립적으로 수소, 알킬 또는 알케닐이고;
n) -C(O)N(R19)-C1-C6-알킬렌-C(O)R19a, 여기서 R19는 수소, 알킬 또는 알케닐이며, R19a는 아미노, 알킬아미노, 다이알킬아미노 또는 헤테로사이클로알킬이고;
o) -N(R20)C(O)-C1-C6-알킬렌-C(O)R20a, 여기서 R20은 수소, 알킬 또는 알케닐이며, R20a는 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬이며;
p) -NR21S(O)2-C1-C6-알킬렌-N(R21b)R21a, 여기서 R21은 수소, 알킬 또는 알케닐이고, R21a 및 R21b는 독립적으로 수소, 알킬 또는 알케닐이며;
q) -N(R22)C(O)-C1-C6-알킬렌-N(R22b)-N(R22c)(R22a), 여기서 R22, R22a 및 R22b는 독립적으로 수소, 알킬 또는 알케닐이고;
r) -C0 -C6-알킬렌-N(R23)-C1-C6-알킬렌-N(R23b)R23a, 여기서 R23, R23a 및 R23b는 독립적으로 수소, 알킬 또는 알케닐이며; 또는
s) -NR24C(O)-C1 -C6-알킬렌-OR24a, 여기서 R24는 수소, 알킬 또는 알케닐이고, R24a는 1 또는 2개의 할로 또는 알킬로 선택적으로 치환된 알콕시알킬 또는 아릴이며;
R3a의 각각의 알킬렌은 독립적으로 할로, 하이드록시, 아미노, 알킬아미노 및 다이알킬아미노로부터 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5개의 기로 선택적으로 추가로 치환되고;
각각의 R3(R3이 존재할 때)은 독립적으로 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로, 하이드록시, 옥소, 알콕시, 시아노, 하이드록시아미노, 카복시, 알콕시카보닐, 아미노, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 알킬카보닐, 할로알콕시, 알킬설포닐, 아미노알킬옥시, 알킬아미노알킬옥시 또는 다이알킬아미노알킬옥시이며; 또는
a) -N(R7)C(O)-C1-C6-알킬렌-N(R7a)(R7b), 여기서 R7은 수소, 알킬 또는 알케닐이고, R7a 및 R7b는 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 하이드록시알킬, 할로알킬, 알콕시, 알콕시알킬, 아미노알킬, 알킬아미노알킬, 다이알킬아미노알킬, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬알킬, 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 아릴, 아릴알킬 또는 아릴알킬옥시이며, R7a 및 R7b 내 아릴, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬 및 헤테로아릴 고리(아릴알킬, 사이클로알킬알킬, 헤테로사이클로알킬알킬 및 헤테로아릴알킬의 부분으로서 또는 단독으로)는 독립적으로 알킬, 아미노, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 하이드록시, 할로, 알콕시, 알킬티오 및 옥소로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 기로 선택적으로 치환되고;
b) -C(O)NR8R8a, 여기서 R8은 수소, 하이드록시, 알콕시, 알킬, 알케닐, 할로알킬 또는 할로알콕시이며, R8a는 수소, 알킬, 알케닐, 하이드록시알킬, 시아노알킬, 알콕시알킬, 알킬티오알킬, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬알킬, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬, 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 아릴 또는 아릴알킬이며, R8a 내 아릴, 사이클로알킬, 헤테로아릴 및 헤테로사이클로알킬 고리(아릴알킬, 사이클로알킬알킬, 헤테로사이클로알킬알킬 및 헤테로아릴알킬의 부분으로서 또는 단독으로)는 독립적으로 알킬, 알케닐, 알콕시, 할로, 할로알킬, 할로알콕시, 하이드록시, 하이드록시알킬, 옥소, 아미노, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 알킬카보닐, 아미노알킬, 알킬아미노알킬, 다이알킬아미노알킬, 알콕시카보닐 및 -C(O)H로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 기로 선택적으로 치환되며;
c) -NR9C(O)R9a, 여기서 R9는 수소, 하이드록시, 알콕시, 알킬, 알케닐, 할로알킬 또는 할로알콕시이고, R9a는 수소, C2-C6-알킬, 알케닐, 하이드록시알킬, 알콕시알킬, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬알킬, 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 아릴 또는 아릴알킬이며, R9a 내 아릴, 사이클로알킬, 헤테로아릴 및 헤테로사이클로알킬 고리(아릴알킬, 사이클로알킬알킬, 헤테로사이클로알킬알킬 및 헤테로아릴알킬의 부분으로서 또는 단독으로)는 독립적으로 알킬, 알케닐, 알콕시, 하이드록시, 하이드록시알킬, 할로, 할로알킬, 할로알콕시, 옥소, 아미노, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 알킬카보닐, 알콕시카보닐, -C(O)H, 아릴(선택적으로 1 또는 2개의 할로로 치환됨), 아릴알킬, 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬알킬, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬 및 사이클로알킬카보닐로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 기로 선택적으로 치환되고;
d) -C(O)N(R10)-C1-C6-알킬렌-N(R10a)R10b, 여기서 R10a는 수소, 하이드록시, 알콕시, 알킬, 알케닐, 할로알킬 또는 하이드록시알킬이며, R10 및 R10b는 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 할로알킬 또는 하이드록시알킬이고;
e) -NR11C(O)NR11aR11b, 여기서 R11a는 수소, 알킬, 알케닐, 하이드록시 또는 알콕시이며, R11 및 R11b는 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 아미노알킬, 알킬아미노알킬 또는 다이알킬아미노알킬이고;
f) -C(O)R12, R12는 알킬, 옥소, 아미노, 알킬아미노 및 헤테로사이클로알킬알킬로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 기로 선택적으로 치환된 헤테로사이클로알킬이고;
g) -NR13C(O)OR13a, 여기서 R13은 수소, 알킬 또는 알케닐이고 R13a는 아미노알킬, 알킬아미노알킬, 다이알킬아미노알킬, 아릴 또는 아릴알킬이며;
h) -C(O)N(R14)N(R14a)(R14b), 여기서 R14, R14a 및 R14b는 독립적으로 수소, 알킬 또는 알케닐이고;
i) -S(O)2N(R15)-C1-C6-알킬렌-N(R15a)R15b, 여기서 R15, R15a 및 R15b는 독립적으로 수소, 알킬 또는 알케닐이며;
j) -C(O)N(R16)-C1-C6-알킬렌-C(O)OR16a, 여기서 R16은 수소, 알킬 또는 알케닐이고, R16a는 알킬 또는 알케닐이며;
k) 1 또는 2개의 아미노알킬, 알킬아미노알킬 또는 다이알킬아미노알킬로 선택적으로 치환된 헤테로아릴;
l) -N(R17)-C(=N(R17b)(R17a))(NR17cR17d), 여기서 R17, R17a, R17b, R17c 및 R17d는 독립적으로 수소, 알킬 또는 알케닐이고;
m) -N(R18)C(O)-C1-C6-알킬렌-N(R18b)C(O)R18a, 여기서 R18a는 수소, 알킬, 알케닐 또는 알콕시이며, R18 및 R18b는 독립적으로 수소, 알킬 또는 알케닐이며;
n) -C(O)N(R19)-C1-C6-알킬렌-C(O)R19a, 여기서 R19는 수소, 알킬 또는 알케닐이고, R19a는 아미노, 알킬아미노, 다이알킬아미노 또는 헤테로사이클로알킬이고;
o) -N(R20)C(O)-C1-C6-알킬렌-C(O)R20a, 여기서 R20은 수소, 알킬 또는 알케닐이며, R20a는 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬이고;
p) -NR21S(O)2-C1-C6-알킬렌-N(R21b)R21a, 여기서 R21은 수소, 알킬 또는 알케닐이며, R21a 및 R21b는 독립적으로 수소, 알킬 또는 알케닐이고;
q) -N(R22)C(O)-C1-C6-알킬렌-N(R22b)-N(R22c)(R22a), 여기서 R22, R22a 및 R22b는 독립적으로 수소, 알킬 또는 알케닐이며;
r) -C0 -C6-알킬렌-N(R23)-C1-C6-알킬렌-N(R23b)R23a, 여기서 R23, R23a 및 R23b는 독립적으로 수소, 알킬 또는 알케닐이고; 또는
s) -NR24C(O)-C1 -C6-알킬렌-OR24a, 여기서 R24는 수소, 알킬 또는 알케닐이며, R24a는 1 또는 2개의 할로 또는 알킬로 선택적으로 치환된 알콕시알킬 또는 아릴이고;
R3의 각각의 알킬렌은 독립적으로 할로, 하이드록시, 아미노, 알킬아미노 및 다이알킬아미노로부터 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5개의 기로 선택적으로 추가로 치환되며;
단, R50 및 R52가 수소이고, R51이 수소 또는 메틸이며, R53은 수소 또는 메톡시이고, R54는 수소 또는 메톡시이면, B는 하나의 R3으로 치환된 2,3-다이하이드로-1,4-벤조다이옥신일, 티엔-2-일 또는 티엔-2-일이 아니며, R3은 할로인, 방법.
3. 실시형태 1 및 실시형태 2 중 어느 하나에 있어서, 화학식 I의 화합물은 표 1에 구체적으로 나열된 화합물인, 방법.
4. 실시형태 1, 실시형태 2 및 실시형태 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 HER2 및/또는 HER3 억제제는 라파티닙, 기능성 핵산, 항-HER2 또는 항-HER3 항체인, 방법.
5. 실시형태 1, 실시형태 2 및 실시형태 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 HER3 억제제는 항-HER3 항체인, 방법.
6. 실시형태 1, 실시형태 2 및 실시형태 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 암이 HER2 비-과발현 암을 포함하는 것인 방법.
7. 실시형태 1, 실시형태 2 및 실시형태 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 암이 비-HER2 증폭 종양을 포함하는 것인 방법.
8. 실시형태 1, 실시형태 2 및 실시형태 3 중 어느 하나에 있어서, 화합물 A의 치료적 유효량이 MM-121의 치료적 유효량과 공동투여되는 것인 방법.
9. 실시형태 1, 실시형태 2 및 실시형태 3 중 어느 하나에 있어서, 병용물이 암 치료에서 치료적 상승 작용을 나타내는 것인 방법.
10. 실시형태 9에 있어서, 병용물이 적어도 2.8, 적어도 2.9 또는 적어도 3.0의 log10 세포 사멸을 달성하는 것인 방법.
11. 실시형태 1, 실시형태 2 및 실시형태 3 중 어느 하나에 있어서, 암은 폐암인, 방법.
12. 실시형태 1, 실시형태 2, 실시형태 3 및 실시형태 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 기능성 핵산은 siRNA 분자, shRNA 분자, miRNA 분자 또는 안티센스 핵산 분자인, 방법.
13. 실시형태 1, 실시형태 2, 실시형태 3, 실시형태 4 및 실시형태 5 중 어느 하나에 있어서, siRNA는 18 내지 30개의 뉴클레오타이드를 가지는 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, HER2 및/또는 HER3 mRNA에 결합되도록 작용 가능한 것인 방법.
14. 실시형태 12에 있어서, 상기 mRNA는 서열번호 1에서 제공되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인 방법.
15. 실시형태 12에 있어서, siRNA는 서열번호 3, 4, 6, 7 또는 8의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인 방법.
16. 실시형태 12에 있어서, siRNA는 네이키드된, 연결된 또는 캡슐화된 것인 방법.
17. 실시형태 5에 있어서, 안티센스 핵산은 이중가닥 cDNA 분자에 상보적이거나 HER2 및/또는 HER3 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA 서열에 상보적인, 방법.
18. 실시형태 17에 있어서, 이중 가닥 cDNA 분자가 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 HER2 폴리펩타이드, 이것의 단편, 또는 이것의 변이체를 작용 가능하게 암호화하는 것인 방법.
19. 실시형태 17에 있어서, HER2 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA 서열은 서열번호 1의 폴리뉴크렐오타이드 서열, 이것의 단편, 또는 이것의 변이체를 가지는 것인 방법.
20. 실시형태 5 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 기능성 핵산은 재조합 벡터로 피험체에 투여되고, 해당 벡터는 종양 내 또는 종양 부의의 근처에서 기능성 핵산을 작용 가능하게 발현시키며, 종양 내 HER2 및/또는 HER3의 발현 및/또는 활성을 억제하는 것인 방법.
21. 실시형태 4에 있어서, 항-HER2 항체는 트라스투주맙, 퍼투주맙, 4D5, 520C9, 452F2, 736G9, 741F8, 758G5, 761B10, huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7, 4D5-8, 또는 이들의 병용물을 포함하는 것인 방법.
22. 실시형태 21에 있어서, 항-HER2 항체는 트라스투주맙인, 방법.
23. 실시형태 1에 있어서, 화학식 I의 화합물의 치료적 유효량 및 HER2 및/또는 HER3 억제제의 치료적 유효량을 상기 환자에게 공동-투여하는 단계는 HER2 및/또는 HER3 억제제와 동시에, 또는 HER2 및/또는 HER3 억제제의 투여 전 또는 투여 후 화학식 I의 화합물을 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
24. 실시형태 23에 있어서, 환자에게 투여되는 화학식 I의 화합물의 양이 화학식 I의 화합물의 1일 당 약 0.01 내지 약 1,000㎎을 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
25. 실시형태 24에 있어서, 투여되는 화학식 I의 화합물의 양은 1일 당 체중의 킬로그램 당 약 0.01 내지 약 100㎎의 범위에서 화학식 I의 화합물의 양을 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
26. 실시형태 25에 있어서, HER2 및/또는 HER3 억제제를 투여하는 단계는 HER2 및/또는 HER3 억제제의 1일 당 체중의 킬로그램 당 약 0.001 내지 약 100㎎을 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
27. 실시형태 1 내지 실시형태 26 중 어느 하나에 있어서, 상기 암은 심장: 육종(혈관육종, 섬유육종, 횡문근육종, 지방육종), 점액종, 횡문근종, 섬유종, 지방종 및 기형종; 폐: 기관지원성암종(편평상피 세포, 미분화성 소세포, 미분화성 거대 세포, 선암종), 폐포(세기관지) 암종, 기관지 선종, 육종, 림프종, 폐과오종, 중피종; 유방: 유관 상피내암종, 침윤성 유관암종, 수질암, 침윤성 소엽 암종, 관상 암종, 점액 암종, 염증성 유방암; 위장: 식도(편평상피 세포 암종, 선암종, 평활근육종, 림프종), 위(암종, 림프종, 평활근육종), 췌장(췌관 선암종, 인슐린종, 글루카곤종, 가스트린종, 유암종, 비포마), 소장(선암종, 림프종, 유암종, 카포시 육종, 평활근종, 혈관종, 지방종, 신경섬유종, 섬유종), 대장(선암종, 관상 선종, 융모 선종, 과오종, 평활근종); 비뇨생식관: 신장(선암종, 빌름스 종양[신아세포종], 림프종, 백혈병), 방광 및 요도(편평상피 세포 암종, 이행세포 암종, 선암종), 전립선(선암종, 육종), 고환(정상피종, 기형종, 태생기암, 기형암종, 융모막암종, 육종, 간질세포 암종, 섬유종, 섬유선종, 유선종성 종양, 지방종); 간: 간암(간세포암), 담관암, 간아세포종, 혈관육종, 간세포 선종, 혈관종; 뼈: 골원성 육종(골육종), 섬유육종, 악성 섬유성 조직구종, 연골육종, 유윙 육종, 악성 림프종(세망세포 육종), 다발성 골수종, 악성 거세포종 척색종, 골연골종(골연골성 외골증), 양성 연골종, 연골모세포종, 연골점액섬유종, 유골종 및 거세포 종양; 신경계: 두개골(골종, 혈관종, 육아종, 황색종, 변형성 골염), 수막(뇌수막종, 뇌수막육종, 신경교종증), 뇌(성상세포종, 수모세포종, 신경교종, 상의세포종, 배아세포종[송과체종], 다형성 교모세포증, 핍지교종, 신경초종, 망막아세포종, 선천성 종양), 척수 신경섬유종, 뇌수막종, 신경교종, 육종); 부인과: 자궁(자궁 내막 암종), 자궁경부(자궁경부 암종, 종양전 자궁경부 이형성증), 난소(난소 암종[장액성 낭선암종, 점액성 낭선암종, 미분류 암종 암종], 과립막-난포막 세포 종양, 세르톨리-라이디히 세포 종양, 미분화 배세포종, 악성 기형종), 외음부(편평상피 세포 암종, 상피내 암종, 선암종, 섬유육종, 흑색종), 질(투명 세포 암종, 편평상피 세포 암종, 포도상 육종(배아 횡문근육종], 나팔관(암종); 혈액학: 혈액(골수성 백혈병[급성 및 만성], 급성 림프아구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 골수증식성 질환, 다발성 골수종, 골수이형성 증후군), 호지킨병, 비호지킨 림프종[악성 림프종]; 피부: 악성 흑색종, 기저 세포 암종, 편평상피 세포 암종, 카포시 육종, 이형성 모반, 지방종, 맥관종, 피부섬유종, 켈로이드, 건선; 부신: 신경아세포종을 포함하는 것인 방법.
27. 실시형태 26에 있어서, 상기 암은 유방암, 결장암, 직장암, 자궁내막암, 위 암종(위장 유암종 및 위장 기질 종양을 포함), 교모세포종, 간세포 암종, 소 세포 폐암, 비-소 세포 폐암(NSCLC), 흑색종, 난소암, 자궁경부암, 췌장암, 전립선 암종, 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병(CML), 비호지킨 림프종 및 갑상선 암종인, 방법.
28. 실시형태 26에 있어서, 상기 암은 HER2 과발현 암인, 방법.
29. 실시형태 28에 있어서, HER2 과발현 암은 HER2 과발현 유방암인, 방법.
30. 실시형태 1에 있어서, 화합물은 화학식 I(a)에 따른 화합물 또는 이것의 단일 입체이성질체 또는 입체이성질체의 혼합물 및 선택적으로 이것의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 이것의 단일 입체이성질체 또는 입체이성질체의 혼합물 및 선택적으로 이것의 약제학적으로 허용가능한 염인 방법:
[화학식 I(a)]
Figure pct00194
상기 식에서
W1, W2, W3 및 W4는 -C(H)-이고;
R50은 수소이며;
R51은 메틸이고;
R52는 수소이며;
R53은 수소 또는 알콕시이고;
R54는 수소, 알킬, 알콕시 또는 할로이고; 또는 R53 및 R54는 그것이 부착된 탄소와 함께 6-원 헤테로아릴을 형성하며;
R3은 할로 또는 메틸이고;
R3a는 -N(R7)C(O)-C1-C6-알킬렌-N(R7a)(R7b)이며, R7은 수소이고, R7a 및 R7b는 독립적으로 수소, 알킬, 아미노알킬, 알킬아미노알킬 또는 다이알킬아미노알킬이다.
실시형태 30에 있어서, R51은 메틸이고; R50, R52 및 R53은 수소이며, R54는 할로 또는 알콕시이거나, 또는 R50, R52 및 R54는 수소이고, R53은 알콕시인 화합물 또는 이것의 단일 입체이성질체 또는 입체이성질체의 혼합물 및 선택적으로 이것의 약제학적으로 허용가능한 염.
실시형태 31에 있어서, R3a는 -NHC(O)CH2NH(CH3),
-NHC(O)CH(CH3)NH2, -NHC(O)C(CH3)2NH2, -NHC(O)-CH2N(CH3)2,
-NHC(O)CH2N(CH3)CH2CH2N(CH3)2, -NHC(O)CH(NH2)CH2CH3,
-NHC(O)CH2N(CH3)CH2CH2N(CH3)2 또는 -NHC(O)CH(CH3)NH(CH3)인 화합물, 또는 이것의 기하학적 이성질체 및 선택적으로 이것의 약제학적으로 허용가능한 염.
실시형태 31에 있어서,
Figure pct00195
Figure pct00196
Figure pct00197
인 화합물 또는 이들의 약제학적으로 허용가능한 염.
실시형태 31에 있어서,
Figure pct00198
인 화합물 또는 이것의 약제학적으로 허용가능한 염.
상기 명세서에서 언급한 모든 간행물 및 특허는 본 명세서에 참조로 포함된다. 본 발명이 구체적인 바람직한 실시형태와 함께 기재되었지만, 청구하는 본 발명은 이러한 구체적 실시형태로 제한되지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 게다가, 관련 분야의 당업자에게 명백한 본 발명을 수행하기 위한 기재된 방식의 다양한 변형은 다음의 특허청구범위의 범주 내인 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> EXELIXIS, INC. SANOFI VANDERBILT UNIVERSITY <120> COMBINATIONS OF KINASE INHIBITORS FOR THE TREATMENT OF CANCER <130> 224990/10-009C-PC/313618 <150> US 61/363,074 <151> 2010-07-09 <150> US 61/421,929 <151> 2010-12-10 <160> 22 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 4624 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ggaggaggtg gaggaggagg gctgcttgag gaagtataag aatgaagttg tgaagctgag 60 attcccctcc attgggaccg gagaaaccag gggagccccc cgggcagccg cgcgcccctt 120 cccacggggc cctttactgc gccgcgcgcc cggcccccac ccctcgcagc accccgcgcc 180 ccgcgccctc ccagccgggt ccagccggag ccatggggcc ggagccgcag tgagcaccat 240 ggagctggcg gccttgtgcc gctgggggct cctcctcgcc ctcttgcccc ccggagccgc 300 gagcacccaa gtgtgcaccg gcacagacat gaagctgcgg ctccctgcca gtcccgagac 360 ccacctggac atgctccgcc acctctacca gggctgccag gtggtgcagg gaaacctgga 420 actcacctac ctgcccacca atgccagcct gtccttcctg caggatatcc aggaggtgca 480 gggctacgtg ctcatcgctc acaaccaagt gaggcaggtc ccactgcaga ggctgcggat 540 tgtgcgaggc acccagctct ttgaggacaa ctatgccctg gccgtgctag acaatggaga 600 cccgctgaac aataccaccc ctgtcacagg ggcctcccca ggaggcctgc gggagctgca 660 gcttcgaagc ctcacagaga tcttgaaagg aggggtcttg atccagcgga acccccagct 720 ctgctaccag gacacgattt tgtggaagga catcttccac aagaacaacc agctggctct 780 cacactgata gacaccaacc gctctcgggc ctgccacccc tgttctccga tgtgtaaggg 840 ctcccgctgc tggggagaga gttctgagga ttgtcagagc ctgacgcgca ctgtctgtgc 900 cggtggctgt gcccgctgca aggggccact gcccactgac tgctgccatg agcagtgtgc 960 tgccggctgc acgggcccca agcactctga ctgcctggcc tgcctccact tcaaccacag 1020 tggcatctgt gagctgcact gcccagccct ggtcacctac aacacagaca cgtttgagtc 1080 catgcccaat cccgagggcc ggtatacatt cggcgccagc tgtgtgactg cctgtcccta 1140 caactacctt tctacggacg tgggatcctg caccctcgtc tgccccctgc acaaccaaga 1200 ggtgacagca gaggatggaa cacagcggtg tgagaagtgc agcaagccct gtgcccgagt 1260 gtgctatggt ctgggcatgg agcacttgcg agaggtgagg gcagttacca gtgccaatat 1320 ccaggagttt gctggctgca agaagatctt tgggagcctg gcatttctgc cggagagctt 1380 tgatggggac ccagcctcca acactgcccc gctccagcca gagcagctcc aagtgtttga 1440 gactctggaa gagatcacag gttacctata catctcagca tggccggaca gcctgcctga 1500 cctcagcgtc ttccagaacc tgcaagtaat ccggggacga attctgcaca atggcgccta 1560 ctcgctgacc ctgcaagggc tgggcatcag ctggctgggg ctgcgctcac tgagggaact 1620 gggcagtgga ctggccctca tccaccataa cacccacctc tgcttcgtgc acacggtgcc 1680 ctgggaccag ctctttcgga acccgcacca agctctgctc cacactgcca accggccaga 1740 ggacgagtgt gtgggcgagg gcctggcctg ccaccagctg tgcgcccgag ggcactgctg 1800 gggtccaggg cccacccagt gtgtcaactg cagccagttc cttcggggcc aggagtgcgt 1860 ggaggaatgc cgagtactgc aggggctccc cagggagtat gtgaatgcca ggcactgttt 1920 gccgtgccac cctgagtgtc agccccagaa tggctcagtg acctgttttg gaccggaggc 1980 tgaccagtgt gtggcctgtg cccactataa ggaccctccc ttctgcgtgg cccgctgccc 2040 cagcggtgtg aaacctgacc tctcctacat gcccatctgg aagtttccag atgaggaggg 2100 cgcatgccag ccttgcccca tcaactgcac ccactcctgt gtggacctgg atgacaaggg 2160 ctgccccgcc gagcagagag ccagccctct gacgtccatc atctctgcgg tggttggcat 2220 tctgctggtc gtggtcttgg gggtggtctt tgggatcctc atcaagcgac ggcagcagaa 2280 gatccggaag tacacgatgc ggagactgct gcaggaaacg gagctggtgg agccgctgac 2340 acctagcgga gcgatgccca accaggcgca gatgcggatc ctgaaagaga cggagctgag 2400 gaaggtgaag gtgcttggat ctggcgcttt tggcacagtc tacaagggca tctggatccc 2460 tgatggggag aatgtgaaaa ttccagtggc catcaaagtg ttgagggaaa acacatcccc 2520 caaagccaac aaagaaatct tagacgaagc atacgtgatg gctggtgtgg gctccccata 2580 tgtctcccgc cttctgggca tctgcctgac atccacggtg cagctggtga cacagcttat 2640 gccctatggc tgcctcttag accatgtccg ggaaaaccgc ggacgcctgg gctcccagga 2700 cctgctgaac tggtgtatgc agattgccaa ggggatgagc tacctggagg atgtgcggct 2760 cgtacacagg gacttggccg ctcggaacgt gctggtcaag agtcccaacc atgtcaaaat 2820 tacagacttc gggctggctc ggctgctgga cattgacgag acagagtacc atgcagatgg 2880 gggcaaggtg cccatcaagt ggatggcgct ggagtccatt ctccgccggc ggttcaccca 2940 ccagagtgat gtgtggagtt atggtgtgac tgtgtgggag ctgatgactt ttggggccaa 3000 accttacgat gggatcccag cccgggagat ccctgacctg ctggaaaagg gggagcggct 3060 gccccagccc cccatctgca ccattgatgt ctacatgatc atggtcaaat gttggatgat 3120 tgactctgaa tgtcggccaa gattccggga gttggtgtct gaattctccc gcatggccag 3180 ggacccccag cgctttgtgg tcatccagaa tgaggacttg ggcccagcca gtcccttgga 3240 cagcaccttc taccgctcac tgctggagga cgatgacatg ggggacctgg tggatgctga 3300 ggagtatctg gtaccccagc agggcttctt ctgtccagac cctgccccgg gcgctggggg 3360 catggtccac cacaggcacc gcagctcatc taccaggagt ggcggtgggg acctgacact 3420 agggctggag ccctctgaag aggaggcccc caggtctcca ctggcaccct ccgaaggggc 3480 tggctccgat gtatttgatg gtgacctggg aatgggggca gccaaggggc tgcaaagcct 3540 ccccacacat gaccccagcc ctctacagcg gtacagtgag gaccccacag tacccctgcc 3600 ctctgagact gatggctacg ttgcccccct gacctgcagc ccccagcctg aatatgtgaa 3660 ccagccagat gttcggcccc agcccccttc gccccgagag ggccctctgc ctgctgcccg 3720 acctgctggt gccactctgg aaaggcccaa gactctctcc ccagggaaga atggggtcgt 3780 caaagacgtt tttgcctttg ggggtgccgt ggagaacccc gagtacttga caccccaggg 3840 aggagctgcc cctcagcccc accctcctcc tgccttcagc ccagccttcg acaacctcta 3900 ttactgggac caggacccac cagagcgggg ggctccaccc agcaccttca aagggacacc 3960 tacggcagag aacccagagt acctgggtct ggacgtgcca gtgtgaacca gaaggccaag 4020 tccgcagaag ccctgatgtg tcctcaggga gcagggaagg cctgacttct gctggcatca 4080 agaggtggga gggccctccg accacttcca ggggaacctg ccatgccagg aacctgtcct 4140 aaggaacctt ccttcctgct tgagttccca gatggctgga aggggtccag cctcgttgga 4200 agaggaacag cactggggag tctttgtgga ttctgaggcc ctgcccaatg agactctagg 4260 gtccagtgga tgccacagcc cagcttggcc ctttccttcc agatcctggg tactgaaagc 4320 cttagggaag ctggcctgag aggggaagcg gccctaaggg agtgtctaag aacaaaagcg 4380 acccattcag agactgtccc tgaaacctag tactgccccc catgaggaag gaacagcaat 4440 ggtgtcagta tccaggcttt gtacagagtg cttttctgtt tagtttttac tttttttgtt 4500 ttgttttttt aaagatgaaa taaagaccca gggggagaat gggtgttgta tggggaggca 4560 agtgtggggg gtccttctcc acacccactt tgtccatttg caaatatatt ttggaaaaca 4620 gcta 4624 <210> 2 <211> 1254 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu 1 5 10 15 Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys 20 25 30 Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His 35 40 45 Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr 50 55 60 Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val 65 70 75 80 Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu 85 90 95 Gln Arg Leu Arg Ile Val Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr Ala 100 105 110 Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro Val 115 120 125 Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser Leu 130 135 140 Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln Leu 145 150 155 160 Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn Asn 165 170 175 Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys His 180 185 190 Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser Ser 195 200 205 Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys Ala 210 215 220 Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys Ala 225 230 235 240 Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu His 245 250 255 Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val Thr 260 265 270 Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg Tyr 275 280 285 Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu Ser 290 295 300 Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln Glu 305 310 315 320 Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys Pro 325 330 335 Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu Val 340 345 350 Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys Lys 355 360 365 Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro 370 375 380 Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu 385 390 395 400 Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro Asp 405 410 415 Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg Gly 420 425 430 Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu Gly 435 440 445 Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly Leu 450 455 460 Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val Pro 465 470 475 480 Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr Ala 485 490 495 Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His Gln 500 505 510 Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys Val 515 520 525 Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys Arg 530 535 540 Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys Leu 545 550 555 560 Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys Phe 565 570 575 Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp Pro 580 585 590 Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu Ser 595 600 605 Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro 610 615 620 Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys Gly 625 630 635 640 Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Ile Ser Ala 645 650 655 Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly Ile 660 665 670 Leu Ile Lys Arg Arg Gln Gln Lys Ile Arg Lys Tyr Thr Met Arg Arg 675 680 685 Leu Leu Gln Glu Thr Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Ala 690 695 700 Met Pro Asn Gln Ala Gln Met Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Leu Arg 705 710 715 720 Lys Val Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly 725 730 735 Ile Trp Ile Pro Asp Gly Glu Asn Val Lys Ile Pro Val Ala Ile Lys 740 745 750 Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu Asp 755 760 765 Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg Leu 770 775 780 Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Val Thr Gln Leu Met 785 790 795 800 Pro Tyr Gly Cys Leu Leu Asp His Val Arg Glu Asn Arg Gly Arg Leu 805 810 815 Gly Ser Gln Asp Leu Leu Asn Trp Cys Met Gln Ile Ala Lys Gly Met 820 825 830 Ser Tyr Leu Glu Asp Val Arg Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg 835 840 845 Asn Val Leu Val Lys Ser Pro Asn His Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly 850 855 860 Leu Ala Arg Leu Leu Asp Ile Asp Glu Thr Glu Tyr His Ala Asp Gly 865 870 875 880 Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu Arg Arg 885 890 895 Arg Phe Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val Trp 900 905 910 Glu Leu Met Thr Phe Gly Ala Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala Arg 915 920 925 Glu Ile Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro Pro 930 935 940 Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met Ile 945 950 955 960 Asp Ser Glu Cys Arg Pro Arg Phe Arg Glu Leu Val Ser Glu Phe Ser 965 970 975 Arg Met Ala Arg Asp Pro Gln Arg Phe Val Val Ile Gln Asn Glu Asp 980 985 990 Leu Gly Pro Ala Ser Pro Leu Asp Ser Thr Phe Tyr Arg Ser Leu Leu 995 1000 1005 Glu Asp Asp Asp Met Gly Asp Leu Val Asp Ala Glu Glu Tyr Leu 1010 1015 1020 Val Pro Gln Gln Gly Phe Phe Cys Pro Asp Pro Ala Pro Gly Ala 1025 1030 1035 Gly Gly Met Val His His Arg His Arg Ser Ser Ser Thr Arg Ser 1040 1045 1050 Gly Gly Gly Asp Leu Thr Leu Gly Leu Glu Pro Ser Glu Glu Glu 1055 1060 1065 Ala Pro Arg Ser Pro Leu Ala Pro Ser Glu Gly Ala Gly Ser Asp 1070 1075 1080 Val Phe Asp Gly Asp Leu Gly Met Gly Ala Ala Lys Gly Leu Gln 1085 1090 1095 Ser Leu Pro Thr His Asp Pro Ser Pro Leu Gln Arg Tyr Ser Glu 1100 1105 1110 Asp Pro Thr Val Pro Leu Pro Ser Glu Thr Asp Gly Tyr Val Ala 1115 1120 1125 Pro Leu Thr Cys Ser Pro Gln Pro Glu Tyr Val Asn Gln Pro Asp 1130 1135 1140 Val Arg Pro Gln Pro Pro Ser Pro Arg Glu Gly Pro Leu Pro Ala 1145 1150 1155 Ala Arg Pro Ala Gly Ala Thr Leu Glu Arg Pro Lys Thr Leu Ser 1160 1165 1170 Pro Gly Lys Asn Gly Val Val Lys Asp Val Phe Ala Phe Gly Gly 1175 1180 1185 Ala Val Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Thr Pro Gln Gly Gly Ala Ala 1190 1195 1200 Pro Gln Pro His Pro Pro Pro Ala Phe Ser Pro Ala Phe Asp Asn 1205 1210 1215 Leu Tyr Tyr Trp Asp Gln Asp Pro Pro Glu Arg Gly Ala Pro Pro 1220 1225 1230 Ser Thr Phe Lys Gly Thr Pro Thr Ala Glu Asn Pro Glu Tyr Leu 1235 1240 1245 Gly Leu Asp Val Pro Val 1250 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HER2 siRNA inhibitor forward sequence <400> 3 ccuggaacuc accuaccugd tdt 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HER2 siRNA inhibitor reverse sequence <400> 4 cagguaggug aguuccaggd tdt 23 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HER2 siRNA inhibitor forward sequence <400> 5 cuaccuuucu acggacgugd tdt 23 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HER2 siRNA inhibitor reverse sequence <400> 6 cacguccgua gaaagguagd tdt 23 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HER2 siRNA inhibitor forward sequence <400> 7 gauccggaag uacacgaugd tdt 23 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HER2 siRNA inhibitor reverse sequence <400> 8 caucguguac uuccggaucd tdt 23 <210> 9 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-ErbB3 antibody VH CDR1 <400> 9 His Tyr Val Met Ala 1 5 <210> 10 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-ErbB3 antibody VH CDR2 <400> 10 Ser Ile Ser Ser Ser Gly Gly Trp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-ErbB3 antibody VH CDR3 <400> 11 Gly Leu Lys Met Ala Thr Ile Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 12 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-ErbB3 antibody VL CDR1 <400> 12 Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ser Tyr Asn Val Val Ser 1 5 10 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-ErbB3 antibody VL CDR2 <400> 13 Glu Val Ser Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-ErbB3 antibody VL CDR3 <400> 14 Cys Ser Tyr Ala Gly Ser Ser Ile Phe Val Ile 1 5 10 <210> 15 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH anti-ErbB3 antibody <400> 15 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ala Tyr 20 25 30 Asn Met Arg Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ala Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 16 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL anti-ErbB3 antibody of SEQ ID No: 15 <400> 16 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Asp Ser Asn Ile Gly Arg Asn 20 25 30 Tyr Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Ile Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Glu Tyr His Cys Gly Thr Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 17 <211> 445 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MM-121 antibody - heavy chain <400> 17 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr 20 25 30 Val Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Ser Gly Gly Trp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Leu Lys Met Ala Thr Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 18 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MM-121 antibody - light chain <400> 18 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ser Tyr 20 25 30 Asn Val Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Ile Ile Tyr Glu Val Ser Gln Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Ser 85 90 95 Ser Ile Phe Val Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly 100 105 110 Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 115 120 125 Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Val Ser Asp Phe 130 135 140 Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val 145 150 155 160 Lys Val Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys 165 170 175 Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser 180 185 190 His Arg Ser Tyr Ser Cys Arg Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu 195 200 205 Lys Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 210 215 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FoxO1 sense strand <400> 19 ccauggacaa caacaguaat t 21 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FoxO3a sense strand <400> 20 gccuugucga auucugucat t 21 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF-IR sense strand <400> 21 ggagaauaau ccaguccuat t 21 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> InsR sense strand <400> 22 gaacgauguu ggacucauat t 21

Claims (35)

  1. 환자에서의 암 치료 방법으로서, 화학식 I의 화합물의 치료적 유효량 및 HER3을 표적화하는 기능성 핵산의 치료적 유효량을 상기 환자에게 공동-투여하는 단계를 포함하는, 암 치료 방법.
  2. 환자에서의 암 치료 방법으로서, 화학식 I의 화합물의 치료적 유효량 및 HER2 및/또는 HER3 억제제의 치료적 유효량을 상기 환자에게 공동-투여하는 단계를 포함하는, 암 치료 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 화학식 I의 화합물은 표 1에 구체적으로 나열된 화합물인, 암 치료 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 I의 화합물은 화합물 A인, 암 치료 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HER2 및/또는 HER3 억제제는 라파티닙, 기능성 핵산, 항-HER2 항체 또는 항-HER3 항체인, 암 치료 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능성 핵산은 siRNA 분자, shRNA 분자, miRNA 분자 또는 안티센스 핵산 분자인, 암 치료 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 siRNA는 18 내지 30개의 뉴클레오타이드를 가지는 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 상기 siRNA는 HER2 및/또는 HER3 mRNA에 결합되도록 작용 가능한 것인, 암 치료 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 mRNA는 서열번호 1로 제공된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인, 암 치료 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 siRNA는 서열번호 3, 4, 6, 7 또는 8의 상기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인 암 치료 방법.
  10. 제6항에 있어서, 상기 siRNA는 네이키드된(naked), 연결된 또는 캡슐화된 것인, 암 치료 방법.
  11. 제6항에 있어서, 상기 안티센스 핵산은 이중 가닥 cDNA 분자에 상보적이거나 또는 HER2 및/또는 HER3 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA 서열에 상보적인 것인, 암 치료 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 이중 가닥 cDNA 분자는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 HER2 폴리펩타이드, 또는 이것의 단편 또는 이것의 변이체를 암호화하도록 작용 가능한 것인, 암 치료 방법.
  13. 제11항에 있어서, HER2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 mRNA 서열은 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이것의 단편 또는 이것의 변이체를 가지는 것인, 암 치료 방법.
  14. 제5항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능성 핵산은 재조합 벡터로 상기 환자에게 투여되며, 상기 벡터는 상기 종양 내에서 또는 상기 종양의 부위 근처에서 상기 기능성 핵산을 발현하도록 작용 가능하고, 상기 기능성 핵산은 상기 종양 내 HER2 및/또는 HER3의 발현 및/또는 활성을 억제하는, 암 치료 방법.
  15. 제5항에 있어서, 상기 항-HER2 항체는 트라스투주맙, 퍼투주맙, 4D5, 520C9, 452F2, 736G9, 741F8, 758G5, 761B10, huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7, 4D5-8 또는 이들의 병용물을 포함하는 것인 암 치료 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 항-HER2 항체는 트라스투주맙인, 암 치료 방법.
  17. 제2항에 있어서, HER3 억제제가 투여되며 상기 HER3 억제제는 항-HER3 항체인, 암 치료 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 항-HER3 항체는 서열번호 9를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열번호 10을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열번호 11을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열번호 12를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열번호 13을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열번호 14를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 것인, 암 치료 방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기 항-HER3 항체는 서열번호 15를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 16을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인, 암 치료 방법.
  20. 제17항에 있어서, 상기 항-HER3 항체는 MM-121인, 암 치료 방법.
  21. 제17항에 있어서, 상기 항-HER3 항체는 MM-121이고, 상기 화학식 I의 화합물은 화합물 A인, 암 치료 방법.
  22. 제1항에 있어서, 화학식 I의 화합물의 치료적 유효량 및 HER2 및/또는 HER3 억제제의 치료적 유효량을 상기 환자에게 공동 투여하는 단계는 HER2 및/또는 HER3 억제제와 동시에, 또는 HER2 및/또는 HER3 억제제의 투여 전 또는 투여 후에 화학식 I의 화합물을 투여함을 포함하는 것인, 암 치료 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 환자에게 투여되는 화학식 I의 화합물의 상기 양은, 화학식 I의 화합물을 1일 당 약 0.01 내지 약 1,000㎎으로 투여하는 것을 포함하는, 암 치료 방법.
  24. 제22항에 있어서, 투여되는 화학식 I의 화합물의 상기 양은, 1일 당 체중의 킬로그램 당 약 0.01 내지 약 100㎎의 범위에 있는 화학식 I의 화합물의 양을 투여하는 것을 포함하는, 암 치료 방법.
  25. 제22항에 있어서, 상기 HER2 및/또는 HER3 억제제를 투여하는 단계는 HER2 및/또는 HER3 억제제를 1일 당 체중의 킬로그램 당 약 0.001 내지 약 100㎎으로 투여하는 것을 포함하는, 암 치료 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 심장: 육종(혈관육종, 섬유육종, 횡문근육종, 지방육종), 점액종, 횡문근종, 섬유종, 지방종 및 기형종; 폐: 기관지원성암종(편평상피 세포, 미분화성 소세포, 미분화성 거대 세포, 선암종), 폐포(세기관지) 암종, 기관지 선종, 육종, 림프종, 폐과오종, 중피종; 유방: 유관 상피내암종, 침윤성 유관암종, 수질암, 침윤성 소엽 암종, 관상 암종, 점액 암종, 염증성 유방암; 위장: 식도(편평상피 세포 암종, 선암종, 평활근육종, 림프종), 위(암종, 림프종, 평활근육종), 췌장(췌관 선암종, 인슐린종, 글루카곤종, 가스트린종, 유암종, 비포마(vipoma)), 소장(선암종, 림프종, 유암종, 카포시 육종, 평활근종, 혈관종, 지방종, 신경섬유종, 섬유종), 대장(선암종, 관상 선종, 융모 선종, 과오종, 평활근종); 비뇨생식관: 신장(선암종, 빌름스 종양[신아세포종], 림프종, 백혈병), 방광 및 요도(편평상피 세포 암종, 이행세포 암종, 선암종), 전립선(선암종, 육종), 고환(정상피종, 기형종, 태생기암, 기형암종, 융모막암종, 육종, 간질세포 암종, 섬유종, 섬유선종, 유선종성 종양, 지방종); 간: 간암(간세포암), 담관암, 간아세포종, 혈관육종, 간세포 선종, 혈관종; 뼈: 골원성 육종(골육종), 섬유육종, 악성 섬유성 조직구종, 연골육종, 유윙 육종, 악성 림프종(세망세포 육종), 다발성 골수종, 악성 거세포종 척색종, 골연골종(골연골성 외골증), 양성 연골종, 연골모세포종, 연골점액섬유종, 유골종 및 거세포 종양; 신경계: 두개골(골종, 혈관종, 육아종, 황색종, 변형성 골염), 수막(뇌수막종, 뇌수막육종, 신경교종증), 뇌(성상세포종, 수모세포종, 신경교종, 상의세포종, 배아세포종[송과체종], 다형성 교모세포증, 핍지교종, 신경초종, 망막아세포종, 선천성 종양), 척수 신경섬유종, 뇌수막종, 신경교종, 육종); 부인과: 자궁(자궁 내막 암종), 자궁경부(자궁경부 암종, 종양전 자궁경부 이형성증), 난소(난소 암종 [장액성 낭선암종, 점액성 낭선암종, 미분류 암종], 과립막-난포막 세포 종양, 세르톨리-라이디히 세포 종양, 미분화 배세포종, 악성 기형종), 외음부(편평상피 세포 암종, 상피내 암종, 선암종, 섬유육종, 흑색종), 질(투명 세포 암종, 편평상피 세포 암종, 포도상 육종(배아 횡문근육종], 나팔관(암종); 혈액학: 혈액(골수성 백혈병[급성 및 만성], 급성 림프아구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 골수증식성 질환, 다발성 골수종, 골수이형성 증후군), 호지킨병, 비호지킨 림프종[악성 림프종]; 피부: 악성 흑색종, 기저 세포 암종, 편평상피 세포 암종, 카포시 육종, 이형성 모반, 지방종, 맥관종, 피부섬유종, 켈로이드, 건선; 부신: 신경아세포종을 포함하는, 암 치료 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 암은 유방암, 결장암, 직장암, 자궁내막암, 위 암종(위장 유암종 및 위장 기질종양을 포함함), 교모세포종, 간세포 암종, 소 세포 폐암, 비-소 세포 폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC), 흑색종, 난소암, 자궁경부암, 췌장암, 전립선 암종, 급성 골수성 백혈병(acute myelogenous leukemia, AML), 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia, CML), 비-호지킨 림프종 및 갑상선 암종인, 암 치료 방법.
  28. 제26항에 있어서, 상기 암은 HER2 과발현 암인, 암 치료 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 HER2 과발현 암은 HER2 과발현 유방암인, 암 치료 방법.
  30. 제26항에 있어서, 상기 암은 HER2 비-과발현 암을 포함하는, 암 치료 방법.
  31. 제26항에 있어서, 상기 암은 비-HER2 증폭 종양인, 암 치료 방법.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 화합물 A의 치료적 유효량이 MM-121의 치료적 유효량과 공동 투여되는, 암 치료 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 병용은 상기 암 치료에서 치료적 상승 작용(therapeutic synergy)을 나타내는, 암 치료 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 병용은 적어도 2.8, 적어도 2.9 또는 적어도 3.0의 log10 세포 사멸을 달성하는, 암 치료 방법.
  35. 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 폐암인, 암 치료 방법.
KR1020137003497A 2010-07-09 2011-07-08 암 치료를 위한 키나제 억제제들의 병용물 KR20130098301A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US36307410P 2010-07-09 2010-07-09
US61/363,074 2010-07-09
US42192910P 2010-12-10 2010-12-10
US61/421,929 2010-12-10
PCT/US2011/043401 WO2012006552A1 (en) 2010-07-09 2011-07-08 Combinations of kinase inhibitors for the treatment of cancer

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20130098301A true KR20130098301A (ko) 2013-09-04

Family

ID=44343802

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020137003497A KR20130098301A (ko) 2010-07-09 2011-07-08 암 치료를 위한 키나제 억제제들의 병용물

Country Status (14)

Country Link
US (1) US9011863B2 (ko)
EP (1) EP2590654B1 (ko)
JP (1) JP2013539453A (ko)
KR (1) KR20130098301A (ko)
AR (1) AR084469A1 (ko)
AU (1) AU2011274510A1 (ko)
BR (1) BR112013000651A2 (ko)
CA (1) CA2803900A1 (ko)
EA (1) EA201390085A1 (ko)
SG (1) SG186889A1 (ko)
TN (1) TN2012000622A1 (ko)
TW (1) TW201244719A (ko)
UY (1) UY33498A (ko)
WO (1) WO2012006552A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160145185A (ko) * 2015-01-30 2016-12-19 제노 바이오파마 컴퍼니 리미티드 완전한 인간 ｈｅｒ２ 항체의 돌연변이 항체, 이를 코딩하는 유전자 및 이의 용도

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG178789A1 (en) * 2007-02-16 2012-03-29 Merrimack Pharmaceuticals Inc Antibodies against erbb3 and uses thereof
KR101798679B1 (ko) 2010-03-11 2017-11-16 메리맥 파마슈티컬즈, 인크. ３중 음성 및 기저형 유방암 치료 시의 ｅｒｂｂ３ 저해제의 용도
AU2011302196B2 (en) 2010-09-14 2016-04-28 Exelixis, Inc. Inhibitors of PI3K-delta and methods of their use and manufacture
JP2014508782A (ja) * 2011-03-11 2014-04-10 メリマック ファーマシューティカルズ インコーポレーティッド ホルモン不応性乳癌の治療におけるｅｇｆｒファミリー受容体の阻害剤の使用
CN107375289A (zh) 2011-11-01 2017-11-24 埃克塞利希斯股份有限公司 用于治疗淋巴组织增生性恶性肿瘤的作为磷脂酰肌醇3‑激酶抑制剂的化合物
EP2841102B1 (en) * 2012-04-23 2018-06-27 Ramot at Tel Aviv University, Ltd. Methods and compositions for treating cancer
US20150140036A1 (en) 2013-11-13 2015-05-21 Novartis Institutes For Biomedical Research, Inc. Low, immune enhancing, dose mtor inhibitors and uses thereof
CN116478927A (zh) 2013-12-19 2023-07-25 诺华股份有限公司 人间皮素嵌合抗原受体及其用途
EP3087101B1 (en) 2013-12-20 2024-06-05 Novartis AG Regulatable chimeric antigen receptor
EP3087394A2 (en) 2013-12-27 2016-11-02 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Biomarker profiles for predicting outcomes of cancer therapy with erbb3 inhibitors and/or chemotherapies
EP3593812A3 (en) 2014-03-15 2020-05-27 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric antigen receptor
SG10202109752XA (en) 2014-04-07 2021-10-28 Novartis Ag Treatment of cancer using anti-cd19 chimeric antigen receptor
EP3193915A1 (en) 2014-07-21 2017-07-26 Novartis AG Combinations of low, immune enhancing. doses of mtor inhibitors and cars
WO2016014576A1 (en) 2014-07-21 2016-01-28 Novartis Ag Treatment of cancer using a cd33 chimeric antigen receptor
US11542488B2 (en) 2014-07-21 2023-01-03 Novartis Ag Sortase synthesized chimeric antigen receptors
EP4205749A1 (en) 2014-07-31 2023-07-05 Novartis AG Subset-optimized chimeric antigen receptor-containing cells
JP6919118B2 (ja) 2014-08-14 2021-08-18 ノバルティス アーゲー ＧＦＲα−４キメラ抗原受容体を用いる癌の治療
RU2724999C2 (ru) 2014-08-19 2020-06-29 Новартис Аг Химерный антигенный рецептор (car) против cd123 для использования в лечении злокачественных опухолей
WO2016044605A1 (en) 2014-09-17 2016-03-24 Beatty, Gregory Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
WO2016057705A1 (en) 2014-10-08 2016-04-14 Novartis Ag Biomarkers predictive of therapeutic responsiveness to chimeric antigen receptor therapy and uses thereof
US20180140602A1 (en) 2015-04-07 2018-05-24 Novartis Ag Combination of chimeric antigen receptor therapy and amino pyrimidine derivatives
AU2016249005B2 (en) 2015-04-17 2022-06-16 Novartis Ag Methods for improving the efficacy and expansion of chimeric antigen receptor-expressing cells
KR20170137886A (ko) * 2015-04-17 2017-12-13 메리맥 파마슈티컬즈, 인크. 세리반투맙에 의한 병용 치료
US20180298068A1 (en) 2015-04-23 2018-10-18 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric antigen receptor and protein kinase a blocker
US10184006B2 (en) 2015-06-04 2019-01-22 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Biomarkers for predicting outcomes of cancer therapy with ErbB3 inhibitors
CA3031542A1 (en) 2016-07-20 2018-01-25 University Of Utah Research Foundation Cd229 car t cells and methods of use thereof
TW202340473A (zh) 2016-10-07 2023-10-16 瑞士商諾華公司 利用嵌合抗原受體之癌症治療
MA47696A (fr) * 2017-02-28 2020-01-08 Taiho Pharmaceutical Co Ltd Activateur d'effet antitumoral utilisant un composé pyrazolo[3,4-d]pyrimidine
EP3615055A1 (en) 2017-04-28 2020-03-04 Novartis AG Cells expressing a bcma-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
WO2019013981A1 (en) * 2017-07-09 2019-01-17 Jiangsu Yingkebeita Yiyaokeji Co. Ltd. FLUORINATED COMPOUNDS, USE AND PREPARATION THEREOF
WO2019210153A1 (en) 2018-04-27 2019-10-31 Novartis Ag Car t cell therapies with enhanced efficacy
EP3788369A1 (en) 2018-05-01 2021-03-10 Novartis Ag Biomarkers for evaluating car-t cells to predict clinical outcome
MA53661A (fr) * 2018-09-18 2021-07-28 Metacrine Inc Agonistes du récepteur farnésoïde x pour le traitement d'une maladie
CN115989030A (zh) * 2020-05-29 2023-04-18 康涅狄格大学 猪繁殖与呼吸综合征病毒的抑制剂

Family Cites Families (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US30985A (en) 1860-12-18 Thomas l
US4107288A (en) 1974-09-18 1978-08-15 Pharmaceutical Society Of Victoria Injectable compositions, nanoparticles useful therein, and process of manufacturing same
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4501728A (en) 1983-01-06 1985-02-26 Technology Unlimited, Inc. Masking of liposomes from RES recognition
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
WO1985003357A1 (en) 1984-01-30 1985-08-01 Icrf Patents Ltd. Improvements relating to growth factors
US6054561A (en) 1984-02-08 2000-04-25 Chiron Corporation Antigen-binding sites of antibody molecules specific for cancer antigens
US5019369A (en) 1984-10-22 1991-05-28 Vestar, Inc. Method of targeting tumors in humans
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
US5401638A (en) 1986-06-04 1995-03-28 Oncogene Science, Inc. Detection and quantification of neu related proteins in the biological fluids of humans
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4920016A (en) 1986-12-24 1990-04-24 Linear Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
WO1989006692A1 (en) 1988-01-12 1989-07-27 Genentech, Inc. Method of treating tumor cells by inhibiting growth factor receptor function
EP0435911B1 (en) 1988-09-23 1996-03-13 Cetus Oncology Corporation Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity and product expression
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
WO1991005264A1 (en) 1989-09-29 1991-04-18 Oncogenetics Partners Detection and quantification of neu related proteins in the biological fluids of humans
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
US5145684A (en) 1991-01-25 1992-09-08 Sterling Drug Inc. Surface modified drug nanoparticles
WO1992022653A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
US5252479A (en) 1991-11-08 1993-10-12 Research Corporation Technologies, Inc. Safe vector for gene therapy
AU4025193A (en) 1992-04-08 1993-11-18 Cetus Oncology Corporation Humanized C-erbB-2 specific antibodies
US5587308A (en) 1992-06-02 1996-12-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Modified adeno-associated virus vector capable of expression from a novel promoter
AU5670194A (en) 1992-11-20 1994-06-22 Enzon, Inc. Linker for linked fusion polypeptides
US5478745A (en) 1992-12-04 1995-12-26 University Of Pittsburgh Recombinant viral vector system
IL126303A0 (en) 1996-03-27 1999-05-09 Genentech Inc Erbb3 antibodies
US5994071A (en) 1997-04-04 1999-11-30 Albany Medical College Assessment of prostate cancer
JP2002512624A (ja) 1997-05-21 2002-04-23 バイオベーション リミテッド 非免疫原性タンパク質の製造方法
DK1309726T4 (en) 2000-03-30 2019-01-28 Whitehead Inst Biomedical Res RNA Sequence-Specific Mediators of RNA Interference
EP1283053A1 (en) 2001-08-09 2003-02-12 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Inhibitors of HER3 activity
BRPI0518104B8 (pt) 2005-01-21 2021-05-25 Genentech Inc artigo industrializado e uso de anticorpo her2
KR20140033237A (ko) 2005-10-07 2014-03-17 엑셀리시스, 인코포레이티드 포스파티딜이노시톨 3-키나아제 억제제 및 이의 사용 방법
AR056857A1 (es) 2005-12-30 2007-10-24 U3 Pharma Ag Anticuerpos dirigidos hacia her-3 (receptor del factor de crecimiento epidérmico humano-3) y sus usos
EP2518508A1 (en) 2006-11-28 2012-10-31 U3 Pharma GmbH Activated HER3 as a marker for predicting therapeutic efficacy
SG178789A1 (en) 2007-02-16 2012-03-29 Merrimack Pharmaceuticals Inc Antibodies against erbb3 and uses thereof
DK2139483T3 (da) 2007-04-11 2014-01-13 Exelixis Inc Kombinationsterapier, der omfatter en quinoxalin-inhibitor af PI3K-alfa, til anvendelse til behandling af cancer

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160145185A (ko) * 2015-01-30 2016-12-19 제노 바이오파마 컴퍼니 리미티드 완전한 인간 ｈｅｒ２ 항체의 돌연변이 항체, 이를 코딩하는 유전자 및 이의 용도

Also Published As

Publication number Publication date
US9011863B2 (en) 2015-04-21
BR112013000651A2 (pt) 2016-05-31
WO2012006552A1 (en) 2012-01-12
UY33498A (es) 2013-01-03
EP2590654A1 (en) 2013-05-15
EA201390085A1 (ru) 2013-06-28
SG186889A1 (en) 2013-02-28
TN2012000622A1 (en) 2014-04-01
CA2803900A1 (en) 2012-01-12
JP2013539453A (ja) 2013-10-24
AU2011274510A8 (en) 2013-04-18
TW201244719A (en) 2012-11-16
EP2590654B1 (en) 2016-12-21
US20140271665A1 (en) 2014-09-18
AU2011274510A1 (en) 2013-01-24
AR084469A1 (es) 2013-05-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20130098301A (ko) 암 치료를 위한 키나제 억제제들의 병용물
JP7212902B2 (ja) 疾患および障害の処置においてレナラーゼを制御する組成物および方法
Lee et al. Periostin-binding DNA aptamer inhibits breast cancer growth and metastasis
JP7410211B2 (ja) 望ましくない細胞増殖に関係する疾患の処置のための薬剤
KR20180119632A (ko) 암에 대한 치료 및 진단 방법
Chao et al. Expression of TweakR in breast cancer and preclinical activity of enavatuzumab, a humanized anti-TweakR mAb
JP2022527825A (ja) 薬物送達のためのイオン液体
JP2022512744A (ja) 肉腫様腎臓がんのための診断および治療方法
Luca et al. In vitro combined treatment with cetuximab and trastuzumab inhibits growth of colon cancer cells
JP6467604B2 (ja) ネトリン−１干渉薬および化学療法薬による併用治療
US20150037354A1 (en) Combination therapies including inhibitors of the extracellular domain of e-cadherin
WO2017139468A1 (en) Combination of ifn-gamma with erbb inhibitor for the treatment of cancers
JP2019527697A (ja) 癌を治療するためのグルカゴン受容体アンタゴニストとｐｉ３ｋ経路阻害剤との組み合わせ
EP3030268B1 (en) Combination of ifn-gamma with anti-erbb antibody for the treatment of cancers
JP6998657B2 (ja) 幹細胞調節ｉｉ
US20210353639A1 (en) Mast1 and uses for diagnosing and treating cancer
JP2007517763A (ja) Ｈｅｒ２アンタゴニストを用いた治療への感受性を回復させる組成物および方法
JP2022501332A (ja) 膀胱がんの治療方法および診断方法
US20200023038A1 (en) Method of treating neoplasias
CN110603447A (zh) 用抗肾酶抗体和抗pd1抗体治疗癌症的组合物和方法
TW202216209A (zh) 抗體-藥物結合物及atm抑制劑之組合
KR20190040585A (ko) Human Stm1 (hStm1) 유전자의 발현 또는 hSTM1 단백질의 활성을 억제하는 물질을 포함하는, 위암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
Weekes et al. Targeted Therapeutics in Cancer Treatment
Rettew Specific Receptor Tyrosine Kinases Promote the Metastatic Phenotype of Osteosarcoma

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid