KR20160145185A - 완전한 인간 ｈｅｒ２ 항체의 돌연변이 항체, 이를 코딩하는 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

완전한 인간 ｈｅｒ２ 항체의 돌연변이 항체, 이를 코딩하는 유전자 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20160145185A
KR20160145185A KR1020167032586A KR20167032586A KR20160145185A KR 20160145185 A KR20160145185 A KR 20160145185A KR 1020167032586 A KR1020167032586 A KR 1020167032586A KR 20167032586 A KR20167032586 A KR 20167032586A KR 20160145185 A KR20160145185 A KR 20160145185A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cancer
antibody
her2
seq
mutated
Prior art date
Application number
KR1020167032586A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101886772B1 (ko
Inventor
칭 져우
멩준 슈
주지 헤
준 린
Original Assignee
제노 바이오파마 컴퍼니 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 제노 바이오파마 컴퍼니 리미티드 filed Critical 제노 바이오파마 컴퍼니 리미티드
Publication of KR20160145185A publication Critical patent/KR20160145185A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101886772B1 publication Critical patent/KR101886772B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3015—Breast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3023—Lung
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/303—Liver or Pancreas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3038—Kidney, bladder
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3046—Stomach, Intestines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3053—Skin, nerves, brain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3061—Blood cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/54—F(ab')2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/71—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for growth factors; for growth regulators

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)

Abstract

본 발명은 완전한 인간 HER2 항체 GB235-019의 돌연변이 항체를 제공하며, 여기서, 돌연변이 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 10 및 SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 11 및 SEQ ID NO: 2; 또는 SEQ ID NO:12 및 SEQ ID NO:2이다. 돌연변이 항체는 GB235-019 항체와 유사하게, 인간 HER2 항원에 대한 특이적인 결합 활성을 가지고 있으며, 이러한 항체는 또한, HER2 양성 종양, HER2 약양성(weakly positive) 종양 또는 HER2 음성 종양의 치료에서 HER2 양성 종양용의 다른 치료제들과 조합하여 사용될 수 있다.

Description

완전한 인간 ＨＥＲ２ 항체의 돌연변이 항체, 이를 코딩하는 유전자 및 이의 용도{MUTANT ANTIBODY OF FULL HUMAN HER2 ANTIBODY, CODING GENE AND USE THEREOF}
본 발명은 항체 기술 분야에 관한 것이며, 특히, 본 발명은 완전히 인간화된 HER2 항체의 돌연변이화된 항체, 이를 인코딩하는 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.
유방암은 세계적으로 여성에서 가장 흔한 악성 종양이다. HER 패밀리는 정상적인 유선(mammary gland)의 성장 및 발달을 조절하며, HER2의 과발현은 유방암과 연관이 있다. 허셉틴(Herceptin)이라는 상표면을 가진 트라스투주맙(Trastuzumab)은 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER2) 양성 전이성 유방암의 치료에 사용하기 위한 최초의 인간화된 모노클로날 항체 의약이다. 허셉틴이 HER2 양성 악성 종양에 대한 표준 치료 계획이 되긴 하였지만, 환자의 40%는 이 의약에 대해 불응성이다. 더욱이, 약물 내성은 항-HER2 치료 접근법에서 보편적인 심각한 문제로서 발생하였다. 성장 인자의 과잉 및 세포내 신호 전달 경로에서의 방해는 유방암 환자에서 약물 내성을 촉진하는 주요 원인인 것으로 여겨진다. Roche Corporation사와 공동으로 Genentech Corporation(USA)사에 의해 최근 개발된 페르투주맙(Pertuzumab)은 신규 항-HER2 인간화된 항체이다. 허셉틴과 달리, 페르투주맙은 HER2 수용체의 세포외 영역 II에 위치하는 항원 에피토프를 표적으로 한다. 임상 실험 연구 결과, 페르투주맙의 단독 사용은 약한 항-종양 치료 효과를 발휘하는 것으로 나타났다. 그러나, 페르투주맙과 허셉틴의 병용이 이들의 효과 기전의 보완으로 인해 HER 신호 전달을 보다 완벽하게 차단하여, 종양 세포의 성장을 보다 효과적으로 저해할 수 있음을 보여주기 위한 연구가 이루어져 왔다.
단백질의 글리코실화 변형은, 특이적인 다당류 사슬이 소포체 내의 단백질에 첨가되어 올리고당류 사슬을 형성하는 과정이다. 단백질의 글리코실화는 부위 특이적이며, 또한 효소-방향적(enzyme-directed)이다. 단백질 모이어티에의 연결 방식에 따라, 단백질의 글리코실화 변형은 O-연결 또는 N-연결일 수 있으며, 이때, 보존적 N-글리코실화 부위는 Asn-X-Thr/Ser이며, 여기서, X는 Pro 이외의 임의의 아미노산이다. 인간 IgG의 중쇄의 Fc 분절의 CH2 영역 내에 보존적 N-연결 글리코실화 부위 Asn297이 존재한다. Fc 다당류 사슬은, 항체가 다양한 수용체들에 최적으로 결합하고, 병원체가 항체에 의해 효과적으로 제거될 뿐만 아니라 치료용 항체의 임상적 특성을 조절하는 데 필수적이다. 인간 IgG Fab의 N-글리코실화 변형은 항체가 항원에 결합하는 기능에 명백한 촉진 또는 저해 효과를 가질 수 있다. 글리코실화 변형이 발생하는 위치에서의 작은 변화는 다당류 사슬의 후속적인 가공 및 항원에의 항체의 결합 활성에 완전하게 서로 다른 효과를 발휘할 수 있다.
본 출원인은 이전에, 완전히 인간화된 scFV 파지 라이브러리 스크리닝 기술 및 유전자 조작 재조합 발현 기술을 사용함으로써, 완전히 인간화된 항-인간 HER2(Her-2/neu) 모노클로날 항체 GB235-019를 수득하였다(중국 특허 출원 201410705404.0을 참조할 수 있음). 모노클로날 항체는 수혈 반응 및 면역원성을 감소시키고, 약물 안전성을 증가시키며, 보다 양호한 약동학적 프로파일을 제시할 수 있다. 더욱이, GB235-019는 HER2 양성 종양을 치료하기 위해 다른 HER2 양성 종양 치료제들과 병용될 수 있다.
본 발명은 완전히 인간화된 HER2 항체 GB235-019의 돌연변이화된 항체를 제공하며, 여기서, 돌연변이화된 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:2; 또는 SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:2이다.
일 구현예에서, 본 발명의 완전히 인간화된 HER2 항체 GB235-019의 돌연변이화된 항체는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 scFv의 형태이다. Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 scFv는 당업계에 보편적으로 알려진 의미를 가진다.
일 구현예에서, 전술한 본 발명의 완전히 인간화된 HER2 항체 GB235-019의 돌연변이화된 항체는 인간 IgG의 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다. 특정한 구현예에서, 인간 IgG는 IgG1이다. 특정한 구현예에서, 인간 IgG 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:5이고, 인간 IgG 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:6이다.
본 발명은 본 발명의 완전히 인간화된 HER2 항체 GB235-019의 돌연변이화된 항체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 제공한다.
특정한 구현예에서, SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 13이며, SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열의 가진 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 14이며, SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 15이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 가진 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 4이다.
특정한 구현예에서, 본 발명의 완전히 인간화된 HER2 항체 GB235-019의 돌연변이화된 항체가 전장 항체인 경우, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열에서, 중쇄 불변 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 7이고, 경쇄 불변 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 8이다.
본 발명은 본 발명의 뉴클레오타이드 서열이 발현 벡터의 발현 조절 서열에 작동적으로 연결되어 있는 발현 벡터를 제공한다. 특정한 구현예에서, 발현 벡터는 pGEM-T 벡터 또는 293 벡터이다.
본 발명은 본 발명의 발현 벡터를 포함하는 세포를 제공한다. 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있다. 특정한 구현예에서, 세포는 포유류 세포, 예컨대 FreeStyle 293F 세포일 수 있다.
본 발명은 본 발명의 완전히 인간화된 HER2 항체 GB235-019의 돌연변이화된 항체 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 본 발명의 완전히 인간화된 HER2 항체 GB235-019의 돌연변이화된 항체 및 부가적인 HER2 양성 종양 치료제(들)를 포함하는 조합된 의약을 제공하며, HER2 양성 종양 치료제(들)는 허셉틴 및/또는 페르투주맙이다. 조합된 의약은 피험자에게 하기의 용량으로 투여될 수 있다: GB235-019의 돌연변이화된 항체 0.001 mg/kg 내지 500 mg/kg + 허셉틴 및/또는 페르투주맙 0.001 mg/kg 내지 500 mg/kg; GB235-019의 돌연변이화된 항체 0.001 mg/kg 내지 300 mg/kg + 허셉틴 및/또는 페르투주맙 0.001 mg/kg 내지 300 mg/kg; GB235-019의 돌연변이화된 항체 0.001 mg/kg 내지 200 mg/kg + 허셉틴 및/또는 페르투주맙 0.001 mg/kg 내지 200 mg/kg; GB235-019의 돌연변이화된 항체 0.01 mg/kg 내지 200 mg/kg + 허셉틴 및/또는 페르투주맙 0.01 mg/kg 내지 200 mg/kg; GB235-019의 돌연변이화된 항체 0.01 mg/kg 내지 100 mg/kg + 허셉틴 및/또는 페르투주맙 0.01 mg/kg 내지 100 mg/kg; GB235-019의 돌연변이화된 항체 0.1 mg/kg 내지 90 mg/kg + 허셉틴 및/또는 페르투주맙 0.1 mg/kg 내지 90 mg/kg; GB235-019의 돌연변이화된 항체 0.1 mg/kg 내지 70 mg/kg + 허셉틴 및/또는 페르투주맙 0.1 mg/kg 내지 70 mg/kg; GB235-019의 돌연변이화된 항체 0.1 mg/kg 내지 60 mg/kg + 허셉틴 및/또는 페르투주맙 0.1 mg/kg 내지 60 mg/kg; GB235-019의 돌연변이화된 항체 0.1 mg/kg 내지 50 mg/kg + 허셉틴 및/또는 페르투주맙 0.1 mg/kg 내지 50 mg/kg; GB235-019의 돌연변이화된 항체 0.1 mg/kg 내지 40 mg/kg + 허셉틴 및/또는 페르투주맙 0.1 mg/kg 내지 40 mg/kg; GB235-019의 돌연변이화된 항체 1 mg/kg 내지 40 mg/kg + 허셉틴 및/또는 페르투주맙 1 mg/kg 내지 40 mg/kg. 본 발명의 완전히 인간화된 HER2 항체 GB235-019의 돌연변이화된 항체는 피험자에게 부가적인 HER2 양성 종양 치료제(들)와 개별적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 투여 경로는 항체에 대해 당업계에서 보편적으로 사용되는 경로들일 수 있다.
본 발명은 본 발명의 완전히 인간화된 HER2 항체 GB235-019의 돌연변이화된 항체를 포함하는 키트를 제공한다. 본 키트는 검체에서 HER2 단백질을 검출하는 데 사용될 수 있다. 키트는 당업계의 HER2 검출용 키트에서 보편적으로 사용되는 부가적인 구성성분을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 피험자에서 HER2 양성 종양, HER2 약양성(weakly positive) 종양 또는 HER2 음성 종양을 치료하는 데 유용한 의약의 제조에 있어서의, 본 발명의 완전히 인간화된 HER2 항체 GB235-019의 돌연변이화된 항체의 용도를 제공한다.
용어 "HER2 양성 종양"은, IHC(면역조직화학) 분석법의 결과가 플러스 3개 신호(+++)인 경우, 즉, 종양 세포의 30% 초과가 세포질막에서 완전하고 강한 염색을 나타내는 경우, HER2 양성을 가리키며; 그 결과가 플러스 2개 신호(++)인 경우, 즉, 종양 세포의 10% 이상이 세포질막에서 약한 염색 내지 중간 정도의 완전한 염색을 나타내는 경우, FISH(형광 인-시추 혼성화) 또는 CISH(색원체 인-시추 혼성화) 분석법이 추가로 수행되며, 그 결과가 양성(유전자 증폭이 발생함)인 경우, HER2 양성인 것으로 진단될 수 있음을 의미한다. 바람직하게는, HER2 양성 종양의 분석 결과는 중국 식품 의약품국에 의해 승인된 검출 키트(IHC, FISH 또는 CISH 분석법 키트)를 사용하여 수득된 결과이다. 종양이 HER2 양성 종양인지 확인하는 방법은 실험하는 의사에게 잘 알려져 있다.
용어 "HER2 약양성 종양"은, IHC 분석법의 결과가 플러스 2개 신호(++)인 경우, 즉, 종양 세포의 10% 이상이 세포질막에서 약한 염색 내지 중간 정도의 완전한 염색을 나타내는 경우, FISH 또는 CISH 분석법이 추가로 수행되며, 그 결과, 유전자 증폭이 발생하지 않는다면, HER2 약양성을 가리킴을 의미한다. 상응하게는, "HER2 음성 종양"은, IHC 분석법의 결과가 플러스 1개 신호(+) 또는 0인 경우, HER2 음성 종양을 가리킴을 의미한다.
HER2 양성 종양은 HER2 양성 유방암, 위암, 폐암, 비소세포폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문암, 결장암, 팔로피오관 암(fallopian tube cancer), 자궁내막암, 자궁경부암, 질암, 외음부암, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비계 암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직암, 요도암, 음경암, 전립선암, 방광암, 신장 또는 요도 암, 신장세포암, 신우암, 중피종(mesothelioma), 간세포암, 담낭암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 세포 림프종(lymphatic cell lymphoma), 중추신경계(CNS) 암, 척수 종양, 뇌간 신경교종, 다형성 교모세포종(glioblastoma multiforme), 성상세포종, 신경초종, 상의세포종(ependymoma), 수모세포종, 수막종, 편평상피암종 및 뇌하수체 선종으로부터 선택될 수 있다.
바람직하게는, 피험자는 인간이다.
도 1a는 재조합 전장 항-인간 HER2 항체 GB235-019의 중쇄 발현 벡터(293-VH-CH)의 구조의 도해를 보여주고; 도 1b는 재조합 전장 항-인간 HER2 항체 GB235-019의 경쇄 발현 벡터(293-VL-CL)의 구조의 도해를 보여준다. 5'-말단 EcoRI 제한효소 부위를 포함하는 신호 펩타이드 유전자 단편, 중쇄 가변 영역(VH) 유전자 단편, 및 TGA 종결자 코돈 및 3'-말단 BamH I 제한효소 부위를 포함하는 중쇄 불변 영역(CH) 유전자 단편을 각각 상응하는 주형 및 프라이머를 사용하여 PCR 방법에 의해 수득하고(상세한 사항에 대해서는 실시예 5를 참조함), 3개의 단편들을 오버랩핑 PCR(over-lapping PCR) 방법에 의해 연결하여, GB235-019 항체의 중쇄 전장 유전자 단편을 수득하였다. 동일한 접근법에 의해, 신호 펩타이드, 경쇄 가변 영역(VL) 및 경쇄 불변 영역(CL)을 포함하는 GB235-019 항체의 경쇄 전장 유전자 단편을 수득하였다. 중쇄 전장 유전자 단편 및 경쇄 전장 유전자 단편을 각각 EcoR I 및 BamH I을 사용한 제한효소 분해에 의해 형성된 점착성 말단을 사용하여 pGEM-T 벡터 내로 클로닝하였다.
도 2는 재조합 전장 항-인간 HER2 항체 GB235-019의 SDS-PAGE 전기영동 사진을 보여준다. 정제된 GB235-019 및 허셉틴 대조군 검체를 50 mM 다이티오트레이톨의 환원 조건 하에 10% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 상에서 러닝시켰다. 그 결과, GB235-019 항체 및 허셉틴 항체 둘 다 50 KDa 및 25 KDa의 분자량을 가진 2개의 밴드를 보여주었으며, 이들은 각각 항체의 중쇄 및 경쇄였음을 보여주었다.
도 3a 및 도 3b는 GB235-019의 환원 분자량(reduced molecular weight)의 분석 결과를 보여준다. GB235-019 항체를 다이티오트레이톨의 환원 조건 하에 Waters H-Class Bio 초고성능 액체 크로마토그래피 상에서 분석하였으며, 질량 스펙트럼으로부터의 오리지널 신호를 PROMASS 소프트웨어를 사용하여 디콘볼루션(deconvolution)하여, 상응하는 측정된 분자량을 수득하였다. 중쇄(G0F 글리칸 형태를 함유하는 Fc)의 이론학적 분자량을 GPMAW6.0 소프트웨어에 의해 계산하였으며, 이는 50416.7 Da이었고, 경쇄의 이론학적 분자량은 23120.8 Da이었다. 도 3a의 결과는, GB235-019 항체의 경쇄의 측정된 분자량이 이론학적 분자량과 일치하였음을 보여주며, 이는 경쇄에서의 글리코실화의 부재를 가리킨다. 도 3b의 결과는, GB235-019 항체의 중쇄의 측정된 분자량이 이론학적 분자량과 크게 상이하였음을 보여준다(> 1500 Da). 이론학적 서열과 정렬시킴으로써, Fc 영역 외에도, Fab 골격 영역 또한, 이론학적 N-글리코실화 부위(Asn-Thr-Ser)를 가진 것으로 확인되었다.
도 4는 GB235-019 돌연변이화된 항체의 SDS-PAGE 전기영동 사진을 보여준다. 정제된 돌연변이화된 항체 GB235-019N73D, GB235-019N73Q 및 GB235-019S75A, 및 허셉틴 대조군 검체를 50 mM 다이티오트레이톨의 환원 조건 하에 10% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 상에서 러닝시켰다. 그 결과는, GB235-019 돌연변이화된 항체들 및 허셉틴 항체가 모두 50 KDa 및 25 Kda의 분자량을 가진 2개의 밴드를 나타내었으며, 이들은 각각 항체의 중쇄 및 경쇄였음을 보여주었다.
도 5a, 도 5b 및 도 5c는 GB235-019 돌연변이화된 항체의 환원 분자량의 분석 결과를 보여준다. 돌연변이화된 항체 GB235-019N73D, GB235-019N73Q 및 GB235-019S75A를 다이티오트레이톨의 환원 조건 하에 Waters H-Class Bio 초고성능 액체 크로마토그래피 상에서 분석하였으며, 질량 스펙트럼으로부터 검출된 오리지널 신호를 PROMASS 소프트웨어를 사용하여 디콘볼루션하여, 상응하는 측정된 분자량을 수득하였다. 중쇄(G0F 글리칸 형태를 함유하는 Fc)의 이론학적 분자량을 GPMAW6.0 소프트웨어에 의해 계산하였으며, 이는 50416.7 Da이었다. 도 5a는, GB235-019N73D 돌연변이화된 항체의 중쇄의 측정된 분자량이 이론학적 분자량과 일치하였음을 보여주며, 이는 중쇄에서의 글리코실화의 부재를 가리킨다. 도 5b 및 도 5c는, GB235-019N73Q 및 GB235-019S75A의 돌연변이화된 항체의 중쇄의 측정된 분자량이 이론학적 분자량과 거의 일치하였음을 보여주며(차이가 1 Da 미만임), 이는 Fab 골격 영역에서 N-글리코실화 부위가 제거되었음을 가리킨다.
도 6은 재조합 전장 항-인간 HER2 GB235-019 돌연변이화된 항체와 인간 HER2 항원의 결합을 보여준다. ELISA 플레이트를 인간 HER2 항원으로 코팅시키고, GB235-019WT, GB235-019N73D, GB235-019N73Q, GB235-019S75A 항체, 허셉틴 및 페르투주맙을 다양한 농도에서, 플레이트 상에 코팅된 항원 분자에 결합시키고, 결합된 항체를 HRP 표지된 염소 항-인간 IgG Fc 항체를 사용하여 검출하였다. 도 6의 결과는, GB235-019WT 항체뿐만 아니라 돌연변이화된 항체 GB235-019N73D, GB235-019N73Q 및 GB235-019S75A가 인간 HER2 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 가졌음을 보여준다.
도 7a는 재조합 전장 항-인간 HER2 GB235-019 돌연변이화된 항체가 BT-474 세포의 증식에 미치는 시험관내 저해 효과를 보여준다. P-HER2를 높은 수준으로 발현하는 HER2 양성 BT-474 유방암 세포를 헤레굴린-α(Heregulin-α)가 보충된 완전 배지에서 6일 동안 인큐베이션하였다. 세포에 GB235-019WT를 처리하고, GB235-019N73D, GB235-019N73Q 및 GB235-019S75A를 포함하여 GB235-019WT 항체의 돌연변이화된 항체뿐만 아니라 허셉틴을 다양한 농도에서 각각 단독적으로 개별 투여하였다. 세포 생존력을 Alarmar Blue를 사용하여 확인하였다. 그 결과는, 완전 배지에 헤레굴린-α를 첨가하는 것이 BT-474 세포의 증식을 유도하였음을 가리켰다. BT-474 세포는 개별적으로 투여된 허셉틴에 대해 내성을 갖게 되었으며, 개별적으로 투여된 GB235-019WT 항체 및 돌연변이화된 항체 GB235-019N73D, GB235-019N73Q 및 GB235-019S75A의 효과는 각각 단독적으로 사용되었을 때 유의미하지 않았다.
도 7b는, BT-474 세포에서 헤레굴린-α-유도 허셉틴 내성이 재조합 전장 항-인간 HER2 항체에 의해 역전되었음을 가리키는 시험관내 실험 결과를 보여준다. P-HER2를 높은 수준으로 발현하는 HER2 양성 BT-474 유방암 세포를 헤레굴린-α가 보충된 완전 배지에서 6일 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 세포에, GB235-019WT 항체 및 GB235-019N73D, GB235-019N73Q 및 GB235-019S75A를 포함한 돌연변이화된 항체를 각각 허셉틴과 조합하여 병용 투여하여 처리하였다. 세포 생존력을 Alarmar Blue를 사용하여 확인하였다. 그 결과는, 완전 배지에 헤레굴린-α를 첨가하는 것이 BT-474 세포의 증식을 유도하였음을 가리켰다. BT-474 세포는 개별적으로 투여된 허셉틴에 대해 내성을 갖게 된 반면, 허셉틴과 조합된 GB235-019WT 항체 및 돌연변이화된 항체 GB235-019N73D, GB235-019N73Q 및 GB235-019S75A의 병용 투여가 헤레굴린-α-유도 증식을, 주목할만하게는 헤레굴린-α 유도 전보다 낮은 수준까지 농도-의존적인 방식으로 저해하였음을 가리켰다. 돌연변이화된 항체 GB235-019N73D, GB235-019N73Q 및 GB235-019S75A는 GB235-019WT 항체와 동등한 효과를 가졌다.
도 8은 재조합 전장 항-인간 HER2 항체가 유방암 세포주 BT-474에서 신호 전달에 미치는 저해 효과를 보여준다. P-HER2를 도로로 발현하는 HER2 양성 BT-474 유방암 세포를 0.1% 태아 소 혈청 배지에서 24시간 동안 기아 배양(starvation culture)하였다. 그런 다음, GB235-019WT 항체 및 GB235-019N73D 돌연변이화된 항체를 각각 20 ㎍/ml로 첨가하고, 허셉틴 20 ㎍/ml 및 페르투주맙 20 ㎍/ml를 개별적으로 투여하였다. BT-474 세포에 항체를 6시간 동안 처리한 후, 최종 농도 100 ng/ml의 헤레굴린-α를 첨가하여, 10분 동안 유도하였으며, 이때, 검체를 취하였다. 세포 파쇄물을 면역블로팅하였으며, 전체 및 인산화된 HER3, Akt 및 ERK를 상응하는 항체를 사용하여 각각 검출하였다. 도 8의 결과는, 헤레굴린-α를 첨가하지 않은 대조군과 비교하여, 헤레굴린-α가 BT-474 세포에서 HER3 인산화를 상향조절하였음을 보여준다. 개별적으로 투여된 GB235-019WT 및 GB235-019N73D는 BT-474 세포에서 헤레굴린-α-유도 HER3 인산화의 상향조절을 상당히 저해하였으며, 헤레굴린-α에 의해 유도되는 HER3 인산화의 상향조절을 완전히 역전시켰다. GB235-019N73D 돌연변이화된 항체의 효능은 GB235-019WT 항체의 효능과 유사하였다. 페르투주맙 또한, BT-474 세포에서 헤레굴린-α에 의해 유도되는 HER3 인산화의 상향조절을 완전히 저해하였다. BT-474 세포에서 헤레굴린-α에 의해 유도되는 HER3 인산화의 상향조절에 미치는 허셉틴의 저해효과 또한, 상당하다. 또한, 개별적으로 투여된 GB235-019WT 항체 및 GB235-019N73D 돌연변이화된 항체는 헤레굴린-α에 의해 유도되는 Akt 인산화의 상향조절을 저해하지 못한 반면, 페르투주맙은 헤레굴린-α에 의해 유도되는 Akt 인산화의 상향조절을 상당히 저해하였다. 개별적으로 투여된 GB235-019N73D 돌연변이화된 항체 및 GB235-019WT 항체는 헤레굴린-α에 의해 유도되는 ERK1/2 인산화의 상향조절을 상당히 저해하였다. GB235-019N73D 돌연변이화된 항체의 효능은 GB235-019WT 항체의 효능과 유사하다.
도 9는 재조합 전장 항-인간 HER2 항체가 유방암 MCF 7 세포의 신호 전달에 미치는 저해 효과를 보여준다. 낮은 수준의 HER2 및 높은 수준의 HER3를 발현하지만 P-HER2 및 P-HER3는 발현하지 않는 HER2 음성 종양 MCF 7 유방암 세포를 0.1% 태아 소 혈청 배지에서 24시간 동안 기아 배양하였다. 그런 다음, GB235-019WT 항체 및 돌연변이화된 항체 GB235-019N73D, GB235-019N73Q 및 GB235-019S75A를 각각 20 ㎍/ml로 첨가하고, 허셉틴 20 ㎍/ml 및 페르투주맙 20 ㎍/ml를 개별적으로 투여하였다. MCF 7 세포에 항체를 6시간 동안 처리한 후, 최종 농도 100 ng/ml의 헤레굴린-α를 첨가하여, 10분 동안 유도하였으며, 이때, 검체를 취하였다. 세포 파쇄물을 면역블로팅하였으며, 전체 및 인산화된 HER3, Akt 및 ERK를 상응하는 항체를 사용하여 각각 검출하였다. 도 9의 결과는, 헤레굴린-α를 첨가하지 않은 대조군과 비교하여, 헤레굴린-α가 MCF 7 세포에서 HER3 인산화의 상향조절을 유도하였음을 보여준다. 개별적으로 투여된 GB235-019WT 항체 및 돌연변이화된 항체 GB235-019N73D, GB235-019N73Q 및 GB235-019S75A는 MCF 7 세포에서 헤레굴린-α에 의해 유도되는 HER3 인산화의 상향조절을 상당히 저해하였다. 개별적으로 투여된 허셉틴 및 페르투주맙 또한, MCF 7 세포에서 헤레굴린-α에 의해 유도되는 HER3 인산화의 상향조절을 상당히 저해하였다. 개별적으로 투여된 GB235-019WT 항체 및 돌연변이화된 항체 GB235-019N73D, GB235-019N73Q 및 GB235-019S75A는 헤레굴린-α에 의해 유도되는 Akt 인산화의 상향조절을 상당히 저해하였으며, 개별적으로 투여된 페르투주맙은 헤레굴린-α에 의해 유도되는 Akt 인산화의 상향조절을 완전히 역전시켰다. 개별적으로 투여된 돌연변이화된 항체 GB235-019N73D 및 GB235-019N73Q는 MCF 7 세포에서 헤레굴린-α에 의해 유도되는 ERK1/2 인산화의 상향조절을 상당히 저해하였으며, 개별적으로 투여된 GB235-019WT 항체 및 GB235-019S75A 돌연변이화된 항체는 헤레굴린-α에 의해 유도되는 ERK1/2 인산화의 상향조절을 약하게 저해하였다. 개별적으로 투여된 페르투주맙은 헤레굴린-α에 의해 유도되는 ERK1/2 인산화의 상향조절을 완전히 역전시켰다.
도 10은 3개의 돌연변이화된 항체 GB235-019N73D, GB235-019N73Q 및 GB235-019S75A의 분자 크기 배제 크로마토그래피의 크로마토그램을 보여준다. 3개의 돌연변이화된 항체 각각 30 ㎍을 분자 배제 크로마토그래피(SEC-HPLC)로 처리하여, 이들 각각의 순도를 확인하였다. GB235-019N73D 항체의 주요 피크의 순도는 88.3%였으며, GB235-019N73Q 항체의 주요 피크의 순도는 89.7%였고, GB235-019S75A 항체의 주요 피크의 순도는 93.1%였다.
도 11은 3개의 돌연변이화된 항체 GB235-019N73D, GB235-019N73Q 및 GB235-019S75A의 이미징 모세관 등전점 포커싱 전기영동(imaging capillary isoelectric focusing electrophoresis)의 전기영동도(electrophoregram)를 보여준다. 3개의 돌연변이화된 항체들을 각각 이미징 모세관 등전점 포커싱(iCIEF)으로 처리하여, 각각의 주요 피크의 등전점(pI) 및 전하 이성질체의 순도를 확인하였다. 3개의 돌연변이화된 항체들 모두는 상대적으로 높은 측정된 등전점을 가졌으며, 이는 9.4 내지 9.6의 범위였다. GB235-019N73D의 등전점은 GB235-019N73Q 및 GB235-019S75A의 등전점보다 약 0.1 더 낮았으며, 이의 주요 피크 순도는 상대적으로 가장 높았다.
도 12는 3개의 돌연변이화된 항체 GB235-019N73D, GB235-019N73Q 및 GB235-019S75A의 환원 모세관 겔 전기영동의 전기영동도를 보여준다. 3개의 돌연변이화된 항체들을 각각 환원 모세관 겔 전기영동 분석(rCE-SDS)으로 처리하여, 이들의 각각의 순도(경쇄 및 중쇄의 백분율의 합)를 확인하였다. 3개의 돌연변이화된 항체들은 모두 저분자량 및 고분자량의 소정의 불순물을 가졌다. GB235-019N73D는 상대적으로 최소의 불순물 함량을 가졌으며, 경쇄 및 중쇄의 합계(LC+HC)의 면에서 이의 순도는 가장 높았다.
도 13은 3개의 돌연변이화된 항체 GB235-019N73D, GB235-019N73Q 및 GB235-019S75A의 시차 주사 열량계 도해를 보여준다. 3개의 돌연변이화된 항체를 각각 시차 주사 열량계(DSC)로 처리하여, 각각의 Tm 값(생물학적 분자의 50%가 해당 온도에서 접히지 않은 상태였음을 의미하는 상 전이 온도)을 확인하였다. 3개의 분자의 Tm1은 서로 상이하였다. GB235-019N73Q의 Tm1이 상대적으로 가장 낮았으며, 한편, GB235-019N73Q의 Tm1은 GB235-019S75A의 Tm1과 근접하였다. Tm 값이 높을수록, 열적 안정성은 더 양호하다. Tm1의 차이는, 돌연변이가 CH2 도메인에 어느 정도의 효과를 가지는 범위를 가리킨다. GB235-019N73D 및 GB235-019S75A는 GB235-019N73Q보다 더 양호한 열적 안정성을 가졌다.
본 발명의 기술적 해결방안은 하기 특정한 실시예에 의해 추가로 예시될 것이지만; 본 발명은 이에 제한되지 않는다.
실시예 1 완전히 인간화된 scFV 파지 라이브러리로부터, 인간 HER2-Fc에 특이적으로 결합된 클론의 스크리닝
ELISA 기술의 항원-항체 결합의 특이성을 이용하여, 인간 HER2(세포외 도메인)-Fc 융합 단백질(hHER2-Fc로 약칭됨) 항원을 ELISA 플레이트 상에 코팅시키고, 코팅된 항원에 특이적으로 부착된 파지를 세척하고, 패닝(panning)하였다. 인간 HER2-Fc(Sino Biological Inc.사로부터 구매함, 카탈로그 번호: 10004-H02H) 항원을 PBS(0.01 M Na2HPO4·12H2O + 0.002 M KH2PO4 + 0.14 M NaCl + 0.002 M KCl, pH = 8.6)를 사용하여 5 ㎍/ml까지 희석시키고, ELISA 플레이트에 100 ㎕/웰로 첨가하고, 4℃에서 밤새 코팅시켰다. 플레이트를 PBST(0.05% Tween 20을 함유하는 PBS 완충제)로 4회 세척한 다음, 5% BSA(Amresco Inc., USA사로부터 구매함, 카탈로그 번호: 0332-100g, 용액은 PBS임)를 300 ㎕/웰로 첨가하여, 37℃에서 1시간 동안 블라킹(blocking)을 수행하였다. 플레이트를 다시 PBST로 2회 세척하였다. 7x1010개의 독립적인 클론을 함유하는 완전히 인간화된 scFv 파지 항체 라이브러리(EUREKA (Beijing) Biotechnology Ltd.사에 의해, 다수의 건강한 개체들로부터의 림프구 세포 유래의 항체 가변 유전자를 인공적으로 합성된 중쇄 CDR3 유전자와 조합함으로써 구축되었음)의 현탁액을 ELISA 플레이트에 100 ㎕/웰로 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션이 종료된 후, ELISA 플레이트의 웰 내의 파지 현탁액을 흡인하였다. 그런 다음, PBST를 각각의 웰에 300 ㎕/웰로 첨가하고, 웰 내의 내용물을 5분 동안 완전히 블로운(blown)하여, 코팅된 항원에 특이적으로 결합하지 않은 파지를 제거하였다. 0.1% BSA를 함유하는 0.2 M 글리신-HCl(pH = 2.2) 용리제(Amresco Inc., USA사로부터 구매함, 카탈로그 번호: 0332-100g, 용액은 PBS임)를 첨가하여, 실온에서 10분 동안 인큐베이션을 수행하였다. 그런 다음, 웰 내의 내용물을 완전히 블로운하여, 코팅된 항원에 특이적으로 부착된 파지를 용리하였다. 용리된 파지 현탁액을 1 M Tris-HCl(pH 9.1) 완충제를 사용하여 중화시켰다. 용리된 파지를, 로그 기(log phase)(OD600에 의해 약 0.3 내지 0.4인 것으로 가리켜짐)로 성장중인 박테리아 TG1(Lucigen Inc., USA, 카탈로그 번호 60500-0）1 mL에 첨가하고, 생성되는 박테리아 용액을 37℃에서 1시간 동안 감염되도록 방치하였다. 감염된 박테리아 용액 10 ㎕를 10배 단계 희석시키고, 10배, 100배 및 1000배 희석물을 평판배양하고, 계수하였다. 감염된 박테리아 용액 90 ㎕를 글리세린에 글리세린 10%라는 최종 농도로 -80℃에서 보관하였다. 잔여의 감염된 박테리아 용액을 모두 150 mm 2 × YT-A 고체 플레이트(17 g/L의 트립톤, 10 g/L의 효모 추출물, 5 g/L의 소듐 클로라이드, 15 g/L의 한천 및 100 ㎍/ml의 앰피실린) 상에 평판배양하고, 37℃에서 밤새 배양하였다. 2 × YT-A-10% 글리세린 배지 5 ml를 150 mm 플레이트에 밤새 첨가하였다. 플레이트를, 잔여 박테리아 용액이 플레이트 상에 존재하지 않을 때까지, 멸균 스프레딩 로드(sterile spreading rod)를 사용하여 부드럽게 긁어내었다. 증폭 2 라운드에서, 적합한 양의 긁어낸 박테리아 용액을 2 × YT-AMP-글루코스 액체 배지(17 g/L의 트립톤, 10 g/L의 효모 추출물, 5 g/L의 소듐 클로라이드, 2%의 글루코스 및 100 ㎍/ml의 앰피실린)(OD600이 바람직하게는 약 0.05 내지 0.1임) 5 ml에 첨가하고, 로그 기(OD600이 약 0.3 내지 0.4임)까지 37℃, 200 rpm에서 배양하였다. 그런 다음, M13K07 헬퍼 파지(NEB Inc., USA사로부터 구매함, 카탈로그 번호: N0315S)를 박테리아의 총 수의 20배가 되는 양으로 첨가하여, 37℃에서 1시간 동안 감염을 수행하였다. 감염 후, 1500 g에서 5분 동안 수집한 박테리아 펠렛을 2 × YT-AMP-Kana 배지(17 g/L의 트립톤, 10 g/L의 효모 추출물, 5 g/L의 소듐 클로라이드, 50 ㎍/ml의 카나마이신 및 100 ㎍/ml의 앰피실린)에 재현탁하고, 30℃, 200 rpm에서 밤새 배양하여, 재조합 파지의 증폭 및 제조를 완료하였다. 2 라운드의 패닝, 및 3 라운드의 증폭 및 패닝을 동일한 방식으로 수행하였다. 박테리아 콜로니를 5 ml 2 × YT-AMP-글루코스 액체 배지(17 g/L의 트립톤, 10 g/L의 효모 추출물, 5 g/L의 소듐 클로라이드, 2%의 글루코스 및 100 ㎍/ml의 앰피실린)에 찍은(pick) 다음, 37℃, 200 rpm에서 밤새 배양하였다. 플라스미드를 플라스미드 추출 키트(Qiagen Inc., USA사에서 구매함, 카탈로그 번호: 12943)를 사용하여 추출하고, 시퀀싱에 의해 동정한 다음, -80℃에서 보관하였다.
실시예 2 효소-연결 면역흡착 분석법(ELISA)을 사용한, 인간 HER2-Fc에 특이적으로 결합된 파지의 면역반응성의 확인
효소-연결 면역흡착 분석법(ELISA)을 사용하여, 실시예 1에서 수득된, 인간 HER2-Fc에 특이적으로 결합된 파지의 면역반응성을 추가로 확인하였다. 인간 HER2-Fc 항원(Sino Biological Inc.사로부터 구매함, 카탈로그 번호: 10004-H02H)을 PBS(pH = 8.6)를 사용하여 2 ㎍/ml의 농도까지 희석시키고, ELISA 플레이트에 100 ㎕/웰로 첨가하여, 코팅을 4℃에서 밤새 수행하였다. 플레이트를 PBST로 4회 세척한 다음, 5% BSA(Amresco, USA사로부터 구매함, 카탈로그 번호: 0332-100g, 용액은 PBS임)를 300 ㎕/웰로 첨가하여, 37℃에서 1시간 동안 블라킹을 수행하였다. 플레이트를 다시 PBST로 2회 세척한 다음, 파지 클론의 현탁액을 100 ㎕/웰로 첨가하여, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST로 4회 세척하였다. HRP-표지 항-M13K07 파지 항체(GE Inc., USA사로부터 구매함, 카탈로그 번호: 27-9421-01, PBST에서 1:5000으로 희석, 100 ㎕/웰)를 첨가하여, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST로 4회 세척한 다음, 가용성 단일 구성성분 기질 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(Tiangen Co., Ltd.사로부터 구매함, 카탈로그 번호: PA107-01)의 용액을 100 ㎕/웰로 첨가하여, 실온에서 15분 동안 인큐베이션하여, 시각화하였다. 스탑 용액(1 M 황산)을 50 ㎕/웰로 첨가하고, 다기능성 ELISA 플레이트(Bio-Rad, Model 680 Micro reader, USA) 상에서 450/570 nm의 파장에서 흡광도 값을 판독하였다.
그 결과는, 3개 라운드의 반복적인 스크리닝 후, 인간 HER2-Fc 항원에 결합할 수 있었던 총 1312개의 scFV 파지 클론을 수득하였으며, 이중에서 499개의 scFV 파지 클론은 인간 HER2-Fc 항원에 특이적으로 결합할 수 있었음을 가리켰다. DNA 시퀀싱은, 이들 클론 중에서 102개의 scFv가 DNA 서열 및 아미노산 서열 모두가 상이하였음을 보여주었다(표 1에 나타낸 바와 같음).
HER2-Fc에 결합할 수 있는 스크리닝에 의해 수득된 클론의 수 인간 HER2-Fc에 특이적으로 결합할 수 있는 클론의 수 인간 HER2-Fc에 특이적으로 결합할 수 있고 독특한 뉴클레오타이드 서열을 가진 클론의 수
1312 499 102
실시예 3 ELISA를 사용하여, 102개의 인간 HER2-Fc-특이적인 scFv 중에서 종간 교차 반응성, 및 HER 패밀리 구성원들 사이에서의 분자간 교차 반응성의 검출
102개의 인간 HER2-Fc-특이적인 scFv 중에서 종간 교차 반응성, 및 HER 패밀리 구성원들 사이에서의 분자간 교차 반응성을 ELISA를 사용하여 검출하였다. 실시예 2와 동일한 절차를 후속하여 수행하되, 코팅을 위한 인간 HER2-Fc 항원을 원숭이 HER2-Fc(Sino Biological Inc.사로부터 구매함, 카탈로그 번호: 90295-C02H), 마우스 HER2-Fc(Sino Biological Inc.사로부터 구매함, 카탈로그 번호: 50714-M02H), 인간 HER1-Fc(Sino Biological Inc.사로부터 구매함, 카탈로그 번호: 10001-H02H), 인간 HER3-Fc(Sino Biological Inc.사로부터 구매함, 카탈로그 번호: 10201-H05H) 및 인간 HER4-Fc(Sino Biological Inc.사로부터 구매함, 카탈로그 번호: 10363-H02H)로 대체하였다. 각각의 항원을 PBS(pH = 8.6)를 사용하여 2 ㎍/ml까지 희석시키고, ELISA 플레이트에 100 ㎕/웰로 첨가하여, 4℃에서 밤새 코팅을 수행하였다. 플레이트를 PBST로 4회 세척한 다음, 5% BSA(Amresco, USA사로부터 구매함, 카탈로그 번호: 0332-100 g, 용액은 PBS임)를 300 ㎕/웰로 첨가하여, 블라킹을 37℃에서 1시간 동안 수행하였다. 플레이트를 다시 PBST로 2회 세척한 다음, 102개의 ScFv 파지 클론의 현탁액을 100 ㎕/웰로 첨가하여, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST로 4회 세척하였다. HRP-표지 항-M13K07 파지 항체(GE Inc., USA사로부터 구매함, 카탈로그 번호: 27-9421-01, PBST를 사용하여 1:5000으로 희석함, 100 ㎕/웰)를 첨가하여, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST로 4회 세척한 다음, 가용성 단일 구성성분 기질 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(Tiangen Co., Ltd.사로부터 구매함, 카탈로그 번호: PA107-01)의 용액을 100 ㎕/웰로 첨가하여, 실온에서 15분 동안 인큐베이션하여, 시각화하였다. 스탑 용액(1 M 황산)을 50 ㎕/웰로 첨가하고, 다기능성 ELISA 플레이트(Bio-Rad, Model 680 Micro reader, USA) 상에서 450/570 nm의 파장에서 흡광도 값을 판독하였다.
그 결과는, 96개의 scFV 파지 클론이 원숭이 HER2-Fc에 대해 교차 반응성을 가졌으며, 20개의 클론이 마우스 HER2-Fc에 대해 교차 반응성을 가졌음을 가리켰다. 102개의 클론 중 어느 것도 인간 HER1-Fc, 인간 HER3-Fc 및 인간 HER4-Fc에 대해 교차 반응성을 가지지 않았다(표 2에 나타낸 바와 같음).
항원 HER2-Fc 마우스 HER2-Fc 인간 HER1-Fc 인간 HER3-Fc 인간 HER4-Fc
클론의 수 96 20 0 0 0
실시예 4 102개의 ScFv 파지 클론의 친화성 등급화
102개의 ScFv 파지 클론의 등급화를 ELISA에 의해 수행하였다. 25 ㎍/ml로부터 시작하는 인간 HER2-Fc 항원을 PBS 완충제를 사용하여 10배 희석시켜, 8개의 농도 구배를 수득하였다. 희석물을 각각 102개의 ScFv 파지 클론과 함께 실온에서 4시간 동안 인큐베이션하여, 평형화시켰다. 그런 다음, 생성되는 혼합물을, 2 ㎍/ml 인간 HER2-Fc 항원(pH = 8.6 PBS, 4℃ 밤새, 100 ㎕/웰)으로 이미 코팅시킨 ELISA 플레이트에 첨가하고, ELISA 플레이트를 5% BSA(Amresco Inc., USA로부터 구매함, 카탈로그 번호: 0332-100g, 용액은 PBS임)를 사용하여 블라킹하여, 포착되지 않은 ScFv 항체를 결합시켰다. HRP-표지 항-M13 파지 항체(GE Inc., USA사로부터 구매함, 카탈로그 번호: 27-9421-01, PBST를 사용하여 1:5000으로 희석함, 100 ㎕/웰)를 첨가하고, 실시예 2와 동일한 절차에 따라 검출을 수행하였다. IC50 값의 측면에서 102개의 양성 클론의 친화성 등급화를 수행하였다(IC50 값이 낮을수록, 친화성은 더 높음).
그 결과는 102개의 ScFv 파지 클론의 IC50 값의 분포 범위를 보여주었으며, 이중에서 4개의 클론은 허셉틴보다 더 높은 친화성을 가졌다.
IC50(nM) ≤2.0 2.0-10.0 10.0-100.0 ＞100.0 검출되지 않음
클론의 수 4 21 37 25 15
실시예 5 GB235-019 재조합 전장 IgG1 아이소타입 항체용 진핵 발현 벡터의 구축
재조합 전장 IgG1 아이소타입 항체 GB235-019(재조합 전장 항체 서열 019 클론을 GB235-019로 지정하였음)용 진핵 발현 벡터를 102개의 ScFv 파지 클론의 서열로부터 구축하였다. 완전히 인간화된 ScFv 파지 라이브러리로부터 스크리닝에 의해 수득된 WG1-019 단일-사슬 항체 클론의 뉴클레오타이드 서열(ScFv 파지 라이브러리로부터 스크리닝에 의해 수득된 단일-사슬 항체 서열 클론을 WG1-019로 지정하였음)은 SEQ ID NO: 9이었으며, 각각 SEQ ID NO: 3(SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 인코딩함) 및 SEQ ID NO: 4(SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 인코딩함)의 뉴클레오타이드 서열을 가진 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하였다. 신호 펩타이드는 MELGLSWIFLLAILKGVQC의 아미노산 서열, 및 ATGGAGTTGGGACTGTCTTGGATTTTCCTGTTGGCTATTCTGAAAGGTGTGCAGTGT의 뉴클레오타이드 서열(Shanghai Generay Biotech Co, Ltd사에 의해 합성됨)을 가졌다.
GB235-019 재조합 전장 항체는 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 가졌으며, 이들은 각각 SEQ ID NO: 7의 뉴클레오타이드 서열(SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 인코딩함) 및 SEQ ID NO: 8의 뉴클레오타이드 서열(SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 인코딩함)(Shanghai Generay Biotech Co, Ltd사에 의해 합성됨)을 가졌다.
프라이머를, GB235-019 재조합 전장 IgG1 아이소타입 항체의 중쇄 및 경쇄에 대한 진핵 발현 벡터를 구축하기 위해 디자인하였으며, 프라이머는 하기와 같다:
Figure pct00001
합성된 신호 펩타이드 서열을 주형으로 사용하고 1-1 및 2-3을 프라이머로서 사용하여, EcoR I 제한효소 부위를 포함하는 유전자 단편을 PCR 방법에 의한 증폭을 통해 수득하였으며, "SPL-GB235-019"로 지정하였고; 합성된 경쇄 가변 영역 서열 SEQ ID NO: 4를 주형으로 사용하고 3-3 및 4-4를 프라이머로서 사용하여, 경쇄 가변 영역 유전자 단편을 PCR 방법에 의한 증폭을 통해 수득하였으며, "VL-GB235-019"로 지정하였고; 합성된 경쇄 불변 영역 서열 SEQ ID NO: 8을 주형으로 사용하고 5-2 및 6-1을 프라이머로서 사용하여, TGA 정지 코돈 및 BamH I 제한효소 부위를 포함하는 중쇄 불변 영역 유전자 단편을 PCR 방법에 의한 증폭을 통해 수득하였으며, "CL-GB235-019"로 지정하였다. SPL-GB235-019, VL-GB235-019 및 CL-GB235-019 유전자 단편을 주형으로 사용하고 1-1 및 6-1을 프라이머로서 사용하여, GB235-019 항체의 경쇄 전장 유전자 단편을 오버랩핑 PCR 방법에 의한 증폭을 통해 수득하였다(Higuchi R, et al. A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions. Nucleic Acids Research, 1988, 16(15):7351-67).
마찬가지로, 합성된 신호 펩타이드 서열을 주형으로 사용하고 1-1 및 7-7을 프라이머로서 사용하여, EcoR I 제한효소 부위를 포함하는 유전자 단편을 PCR(중합효소 연쇄 반응) 방법에 의한 증폭을 통해 수득하였으며, "SPH-GB235-019"로 지정하였고; 합성된 중쇄 가변 영역 서열 SEQ ID NO: 3을 주형으로 사용하고 8-7 및 9-1을 프라이머로서 사용하여, 중쇄 가변 영역 유전자 단편을 PCR 방법에 의한 증폭을 통해 수득하였으며, "VH-GB235-019"로 지정하였고; 합성된 중쇄 불변 영역 서열 SEQ ID NO: 7을 주형으로 사용하고 10-1 및 11-1을 프라이머로서 사용하여, TGA 정지 코돈 및 BamH I 제한효소 부위를 포함하는 중쇄 불변 영역 유전자 단편을 PCR 방법에 의한 증폭을 통해 수득하였으며, "CH-GB235-019"로 지정하였다. SPH-GB235-019, VH-GB235-019 및 CH-GB235-019 유전자 단편을 주형으로 사용하고 1-1 및 11-1을 프라이머로서 사용하여, GB235-019 항체의 중쇄 전장 유전자 단편을 오버랩핑 PCR 방법에 의한 증폭을 통해 수득하였다.
상기 중쇄 및 경쇄 전장 유전자 단편을, 유전자 단편의 5'-말단이 EcoR I 제한효소 부위를 포함하고 단편의 3'-말단이 TGA 정지 코돈 및 BamH I 제한효소 부위를 포함하도록 pGEM-T 벡터(Promega Inc., USA로부터 구매함, 카탈로그 번호: A3600) 내로 클로닝하였다. DNA 시퀀싱 후, 올바르게 시퀀싱된 클론을 EcoR I(NEB Inc., USA로부터 구매함, 카탈로그 번호: R0101S) 및 BamH I(NEB Inc., USA로부터 구매함, 카탈로그 번호: R0136S)을 사용하여 37℃에서 4시간 동안 이중으로 분해하여, 관심 있는 유전자 단편을 회수하였다. 상기 분해에 의해 수득된 항체의 중쇄 전장 유전자 단편 및 경쇄 전장 유전자 단편을 293 벡터(Invitrogen Inc., USA로부터 구매함, 카탈로그 번호: K8300-01) 내로 클로닝하였다. DNA 시퀀싱에 의한 동정 후, 성공적으로 구축된 전장 항체 중쇄 진핵 발현 벡터 또는 전장 항체 경쇄 진핵 발현 벡터를 포함하는 클론을 수득하였다.
도 1a는 재조합 전장 항-인간 HER2 항체 중쇄(293-VH-CH) 발현 벡터의 구조의 도해를 보여주고; 도 1b는 재조합 전장 항-인간 HER2 항체 경쇄(293-VL-CL) 발현 벡터의 구조의 도해를 보여준다.
실시예 6 진핵 세포에서 GB235-019 항체의 일시적인 형질감염 발현 및 이의 정제
FreeStyle 293F 세포(Invitrogen, USA로부터 구매함, 카탈로그 번호: R790-07)의 공동-형질감염 방법은 실시예 5에서 구축된 GB235-019 항체에 대한 재조합 벡터의 발현에 사용될 수 있다. 형질감염하기 24시간 전에, FreeStyle 293F 세포를 6x105개 세포/ml로 계대배양하고, 135 rpm, 37℃, 8% CO2의 조건에서 온도 조절 장치가 장착된 쉐이커(thermostatted shaker) 상에서 배양하여, 형질감염일에 (혈액 세포 플레이트 계수 방법에 따라) 세포 밀도가 1.2-1.5x106개 세포/ml이 되게 하였다. 세포를 FreeStyle 293 배지(Invitrogen, USA로부터 구매함, 카탈로그 번호: 12338-018)를 사용하여 1x106개 세포/ml의 밀도까지 희석시켰다. 최상의 형질감염을 보장하기 위해, (트립판 블루 염색 방법에 따라) 세포의 생존력은 95%가 넘어야 한다.
형질감염용 시약인 FreeStyle Max Reagent(Invitrogen, USA로부터 구매함, 카탈로그 번호: 16447-500)을 균질한 혼합을 위해 부드럽게 4회 뒤집었다. 중쇄 발현 벡터 플라스미드 및 경쇄 발현 벡터 플라스미드를 각각 315 ㎍을 형질감염용 배양 용액인 OptiPRO SFM(Invitrogen, USA로부터 구매함, 카탈로그 번호: 12309-050)에 첨가하였다. OptiPRO SFM을 사용하여 부피를 10 ml까지 보충하였으며, 혼합물을 균질하게 혼합하였다. 또 다른 원심분리 튜브에서, FreeStyle Max Reagent 625 ㎕를, OptiPRO SFM을 사용하여 10 ml까지 희석시켰다. 균질하게 혼합하기 위해 튜브를 부드럽게 뒤집었다. 희석된 플라스미드 및 희석된 FreeStyle Max Reagent를 균질하게 혼합하고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 생성된 20 ml 혼합 용액을, FreeStyle 293F 배지(Invitrogen, USA로부터 구매함, 카탈로그 번호: 12338-018) 500 ml을 함유하는 쉐이크 플라스크에 서서히 첨가하였다. 쉐이크 플라스크를 온도 조절 장치가 장착된 쉐이커 상에서 7일 동안 배양하였다(135 rpm, 37℃, 8% CO2). 배양물을 냉동 원심분리기에서 9000 rpm에서 20분 동안 원심분리하고, 후속적인 단백질 정제를 위해 상층액을 수집하였다.
GB235-019 항체를 포함하는 상기 FreeStyle 293F 세포 상층액을 원심분리하였다. 단백질 A 컬럼(GE Healthcare Bio-Sciences Inc., USA로부터 구매함, 카탈로그 번호: 17-5080-02)을 사용하여 IgG1 아이소타입 항체를 포착하고, 이 항체를 50 mM 시트르산-소듐 시트레이트 완충제(pH 3.3)를 사용하여 용리하였다. 용리제를 수집하고(0.5 ml), 1 M 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄-염산(Tris-HCl) 완충제(pH 11.0) 100 ㎕를 첨가함으로써 중성으로 될 때까지 중화시켰다. 그런 다음, 용리제를 인산염 완충제 용액 PBS(0.01 M Na2HPO4·12H2O + 0.002 M KH2PO4 + 0.14 M NaCl + 0.002 M KCl, pH = 7.2)에서 10K 투석 막(Shanghai Generay Biotech Co, Ltd로부터 구매함, 카탈로그 번호: M1915)에 대해 투석시키고, 단백질 함량을 OD280 nm에서 확인하였다. 생성된 용액을 0.22 ㎛ 필터(Millipore Inc., Germany로부터 구매함, 카탈로그 번호: GVHP01300)를 통해 여과시켜 멸균시키고, 여과물을 -80℃에서 보관하였다. 정제로부터 수득한 GB235-019 항체를, 50 mM의 최종 농도에서 다이티오트레이톨의 환원 조건 하에 10% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 사용하여 이의 순도 및 분자량에 대해 확인하였다.
도 2의 결과는, 완전히 환원 조건 하에, GB235-019 항체가 각각 50 KDa 및 25 KDa의 분자량을 가진 2개의 밴드를 나타내었으며, 이들 밴드는 항체의 중쇄 및 경쇄에 대한 밴드였음을 보여준다(허셉틴은 양성 대조군으로서 작용하였으며, Roche Corp.사로부터 구매하였음). 이들 결과는, 구축된 GB235-019 항체가 올바른 구조를 가졌으며, 이의 분자량이 이론학적 값과 일치함을 가리켰다.
실시예 7 GB235-019 항체의 환원 분자량의 분석
GB235-019 항체 10 ㎍에 다이티오트레이톨을 최종 농도 20 mM로 하여 첨가하고, 혼합물을 수조에서 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하여, 모든 사슬간 이황화 결합을 절단하였다. 분리된 경쇄 및 중쇄를 질량 분광법과 조합된 역상 크로마토그래피를 사용하여 분석하였다. Waters H-Class Bio 초고성능 액체 크로마토그래피(Waters Inc., USA)를 사용하였으며, 크로마토그래피 컬럼: PLRP-S 300 Å, 3.0 ㎛, 2.1x150 mm(Agilent Inc., USA로부터 구매함, 카탈로그 번호: 1912-3301); 이동상: A(물), B(아세토니트릴) 및 C(1% 트리플루오로아세트산)이며, 4분째에 35% B의 구배에서 20분째에 42% B로 변하였고, C 상은 10%에서 유지되었으며, 유속은 0.3 mL/min이었고, 로딩 양은 20 ㎍이었다. Thermo LTQ-Orbitrap Discovery 질량 분광계(Thermo Fisher, USA)를 사용하였으며, 분무 전압(spraying voltage)은 3.7 KV였고, 튜브 렌즈는 230 V였으며, 모세관 온도는 300℃였고, 해상도는 30000이었으며, 질량-대-전하 비율의 범위는 1000 내지 3000이었다. 중쇄(G0F 글리칸 형태를 함유하는 Fc)의 이론학적 분자량을 GPMAW6.0 소프트웨어에 의해 계산하였으며, 이는 50416.7 Da이었고, 경쇄의 이론학적 분자량은 23120.8 Da이었다. 질량 분광법으로부터 발생된 오리지널 신호를 PROMASS 소프트웨어를 사용하여 디콘볼루션하여, 상응하는 측정된 분자량을 수득하였다.
도 3a의 결과는 GB235-019 항체의 경쇄의 측정된 분자량이 이론학적 분자량과 일치하였음을 보여주며, 이는 경쇄에서 글리코실화의 부재를 가리킨다. 도 3b의 결과는, GB235-019 항체의 중쇄의 측정된 분자량이 이론학적 분자량과 크게 상이하였음을 보여준다(>1500 Da). 이론학적 서열과 정렬시킴으로써, Fc 영역 외에도, Fab 골격 영역 또한, 이론학적 N-글리코실화 부위(Asn-Thr-Ser)를 가진 것으로 확인되었으며, 이것이 부가적인 분자량을 초래하였다.
실시예 8 중쇄의 Fab 말단에서 N-연결 글리칸의 돌연변이화된 시그너처 서열을 포함하는 GB235-019에 대한 진핵 발현 벡터의 구축
보존적 N-글리코실화 부위는 Asn-X-Thr/Ser이었으며, 여기서, X는 Pro 이외의 임의의 아미노산이었다. N-연결 글리칸을 Asn-X-Ser/Thr 특징적 서열에서 Asn 잔기에 부착시켰다(Imperiali B, O'Connor SE. Effect of N-linked glycosylation on glycopeptide and glycoprotein structure. Curr Opin Chem Biol　3　(6): 643-649). 실시예 5에서 수득한 전장 항체 GB235-019의 Fab 골격 영역 3에서 Asn73 위치는 N-글리코실화 부위였다. Asn-X-Ser/Thr의 독특한 서열을 돌연변이화시킴으로써 보존적 N-글리코실화 부위를 제거하였다(Walsh G. Biopharmaceutical benchmarks-2003. Nat Biotechnol, 2003, 21:865-870). IgBLAST 정렬은 생식계통 유전자(Germline gene)에서 Asp-Thr-Ser 조합의 존재를 보여주었다. 뉴클레오타이드 서열 정렬에 의해 표시되는 바와 같이, Asn에 상응하는 코돈 "AAC"를 "GAC"로 돌연변이화시켜, Asn을 Asp로 변화시킬 수 있었다. Asn 및 Gln 둘 모두는 아미드-유형 아미노산이고, 이들은, Gln이 Asn보다 측쇄 기에 메틸 라디칼을 하나 더 가진다는 점에서 서로 보존적 치환이다. 유사하게는, Asn에 상응하는 코돈 "AAC"는 Asn을 Gln으로 변화시키기 위해 "CAG"로 돌연변이시킬 수 있었다. IgBLAST는 생식계통 유전자에서 Ser의 위치에 Ala이 존재함을 보여주었다. 생식계통 뉴클레오타이드 서열 정렬은, Ser을 Ala으로 대체하기 위해 Ser에 상응하는 코돈 "TCC"를 "GCC"로 돌연변이화시킬 수 있었음을 가리킨다.
N-연결 글리칸의 돌연변이화된 시그너처 서열을 포함하는 GB235-019 Fab 단편에 대한 돌연변이화된 항체에 대한 중쇄 발현 벡터를, 실시예 5에서 수득한 전장 중쇄 진핵 발현 벡터를 주형으로서 사용하여 점 돌연변이에 의해 생성하였다(Kunkel, T. A, et al. "Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc. Natl. Acad. Sci, 1985(82):488-492). 3개의 돌연변이 계획을 디자인하였으며, 여기서, 각각 GB235-019 항체의 중쇄에서 Asn73(N73)이 Asp73(D73)으로 돌연변이, GB235-019 항체의 중쇄에서 Asn73(N73)이 Gln73(Q73)으로 돌연변이, 및 GB235-019 항체의 중쇄에서 Ser75(S75)가 Ala75(A75)로 돌연변이화되었다. GB235-019 항체의 Fab 말단에 존재하는 N-연결 글리칸의 시그너처 서열에 상기 점 돌연변이를 가진 GB235-019 항체에 대한 중쇄 발현 벡터를 구축하기 위해 프라이머를 디자인하였으며, 상기 프라이머는 하기와 같았다:
Figure pct00002
실시예 5에서 수득한 293-VH-CH 발현 벡터를 주형으로서 사용하고, 12-1 및 12-2를 프라이머로서 사용하여, PCR 생성물을 PCR 방법에 의한 증폭을 통해 수득하였다. Dpn I(NEB Inc., USA로부터 구매함, 카탈로그 번호: 1235A) 2 ㎕를 PCR 생성물 20 ㎕에 첨가하여, 37℃에서 1시간 동안 분해를 수행하였다. PCR 생성물을 PCR 생성물 정제 키트(Axygen Inc., USA로부터 구매함, 카탈로그 번호: AP-PCR-50)를 사용하여 정제하였다. 정제된 PCR 생성물을 열 쇼크 방법(42℃, 90초)에 의해 DH5α E. coli 컴피턴트 세포(competent cell)(Tiangen Co., Ltd.사로부터 구매함, 카탈로그 번호: CB101) 내로 형질변환하였다. DNA 시퀀싱을 통한 동정 후, 돌연변이화된 항체 중쇄의 진핵 발현 벡터를 수득하였으며, 이를 "293-VH-CH-N73D"로 지정하였다(이는 각각 SEQ ID NO: 10 및 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열 및 뉴클레오타이드 서열을 가진 중쇄 가변 영역을 포함하였음). 마찬가지로, 13-1 및 13-2를 프라이머로서 사용하여, PCR 생성물을 PCR 방법에 의한 증폭을 통해 수득하였다. Dpn I(NEB Inc., USA로부터 구매함, 카탈로그 번호: 1235A) 2 ㎕를 PCR 생성물 20 ㎕에 첨가하여, 37℃에서 1시간 동안 분해를 수행하였다. PCR 생성물을 PCR 생성물 정제 키트(Axygen Inc., USA로부터 구매함, 카탈로그 번호: AP-PCR-50)를 사용하여 정제하였다. 정제된 PCR 생성물을 열 쇼크 방법(42℃, 90초)에 의해 DH5α E. coli 컴피턴트 세포(Tiangen Co., Ltd.사로부터 구매함, 카탈로그 번호: CB101) 내로 형질변환하였다. DNA 시퀀싱을 통한 동정 후, 돌연변이화된 항체 중쇄의 진핵 발현 벡터를 수득하였으며, 이를 "293-VH-CH-N73Q"로 지정하였다(이는 각각 SEQ ID NO: 11 및 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열 및 뉴클레오타이드 서열을 가진 중쇄 가변 영역을 포함하였음). 마찬가지로, 14-1 및 14-2를 프라이머로서 사용하여, PCR 생성물을 PCR 방법에 의한 증폭을 통해 수득하였다. Dpn I(NEB Inc., USA로부터 구매함, 카탈로그 번호: 1235A) 2 ㎕를 PCR 생성물 20 ㎕에 첨가하여, 37℃에서 1시간 동안 분해를 수행하였다. PCR 생성물을 PCR 생성물 정제 키트(Axygen Inc., USA로부터 구매함, 카탈로그 번호: AP-PCR-50)를 사용하여 정제하였다. 정제된 PCR 생성물을 열 쇼크 방법(42℃, 90초)에 의해 DH5α E. coli 컴피턴트 세포(Tiangen Co., Ltd.사로부터 구매함, 카탈로그 번호: CB101) 내로 형질변환하였다. DNA 시퀀싱을 통한 동정 후, 돌연변이화된 항체 중쇄의 진핵 발현 벡터를 수득하였으며, 이를 "293-VH-CH-S75A"로 지정하였다(이는 각각 SEQ ID NO: 12 및 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열 및 뉴클레오타이드 서열을 가진 중쇄 가변 영역을 포함하였음).
실시예 9 진핵 세포에서 GB235-019 돌연변이화된 항체의 일시적인 형질감염 발현 및 이의 정제
실시예 8에서 구축한 돌연변이화된 항체에 대한 재조합 벡터의 발현을 실시예 6과 동일한 절차에 따라 수행하였다. 293-VH-CH-N73D, 293-VH-CH-N73Q 및 293-VH-CH-S75A를 각각 293-VL-CL과 함께 사용하여, FreeStyle 293F 세포(Invitrogen, USA로부터 구매함, 카탈로그 번호: R790-07)를 공동-형질감염시켰다.
형질감염용 시약인 FreeStyle Max Reagent(Invitrogen, USA로부터 구매함, 카탈로그 번호: 16447-500)를 균질한 혼합을 위해 부드럽게 4회 뒤집었다. 중쇄 발현 벡터 플라스미드 및 경쇄 발현 벡터 플라스미드를 각각 315 ㎍을 형질감염용 배양 용액인 OptiPRO SFM(Invitrogen, USA로부터 구매함, 카탈로그 번호: 12309-050)에 첨가하였다. OptiPRO SFM을 사용하여 부피를 10 ml까지 보충하였으며, 혼합물을 균질하게 혼합하였다. 또 다른 원심분리 튜브에서, FreeStyle Max Reagent 625 ㎕를, OptiPRO SFM을 사용하여 10 ml까지 희석시켰다. 균질하게 혼합하기 위해 튜브를 부드럽게 뒤집었다. 희석된 플라스미드 및 희석된 FreeStyle Max Reagent를 균질하게 혼합하고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 생성된 20 ml 혼합 용액을, FreeStyle 293F 배지(Invitrogen, USA로부터 구매함, 카탈로그 번호: 12338-018) 500 ml을 함유하는 쉐이크 플라스크에 서서히 첨가하였다. 쉐이크 플라스크를 온도 조절 장치가 장착된 쉐이커 상에서 7일 동안 배양하였다(135 rpm, 37℃, 8% CO2). 배양물을 냉동 원심분리기에서 9000 rpm에서 20분 동안 원심분리하고, 후속적인 단백질 정제를 위해 상층액을 수집하였다. 돌연변이화된 항체의 정제 방법은 실시예 6에서와 동일하였다. 수득된 돌연변이화된 항체를 0.22 ㎛ 필터(Millipore Inc., Germany로부터 구매함, 카탈로그 번호: GVHP01300)를 통해 여과시켜 멸균시키고, 여과물을 -80℃에서 보관하였다. 정제로부터 수득한 돌연변이화된 항체를 각각 GB235-019N73D, GB235-019N73Q 및 GB235-019S75A로 지정하였다. 돌연변이화된 항체들을, 50 mM의 최종 농도에서 다이티오트레이톨의 환원 조건 하에 10% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 사용하여 이들의 순도 및 분자량에 대해 확인하였다.
도 4의 결과는, 완전히 환원 조건 하에, GB235-019N73D, GB235-019N73Q 및 GB235-019S75A 항체가 각각 50 KDa 및 25 KDa의 분자량을 가진 2개의 밴드를 나타내었으며, 이들 밴드는 각각의 항체의 중쇄 및 경쇄에 대한 밴드였음을 보여준다(허셉틴은 양성 대조군으로서 작용하였으며, Roche Corp.사로부터 구매하였음). 이들 결과는, 구축된 GB235-019N73D, GB235-019N73Q 및 GB235-019S75A 항체가 올바른 구조를 가졌으며, 이들의 분자량이 이론학적 값과 일치함을 가리켰다.
실시예 10 재조합 전장 GB235-019 돌연변이화된 항체의 환원 분자량의 분석
실시예 9에서 수득한 돌연변이화된 항체 GB235-019N73D, GB235-019N73Q 및 GB235-019S75A의 환원 분자량을 분석하는 방법은 실시예 7에서와 동일하였다. GB235-019 돌연변이화된 항체 GB235-019N73D, GB235-019N73Q 및 GB235-019S75A 각각 10 ㎍에 다이티오트레이톨을 최종 농도 20 mM로 하여 첨가하고, 돌연변이화된 항체들을 수조에서 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하여, 모든 사슬간 이황화 결합을 절단하였다. 분리된 경쇄 및 중쇄를 질량 분광법과 조합된 역상 크로마토그래피를 사용하여 분석하였다. Waters H-Class Bio 초고성능 액체 크로마토그래피(Waters Inc., USA)를 사용하였으며, 크로마토그래피 컬럼: PLRP-S 300 Å, 3.0 ㎛, 2.1x150 mm(Agilent Inc., USA로부터 구매함, 카탈로그 번호: 1912-3301); 이동상: A(물), B(아세토니트릴) 및 C(1% TFA)이며, 4분째에 35% B의 구배에서 20분째에 42% B로 변하였고, C 상은 10%에서 유지되었으며, 유속은 0.3 mL/min이었고, 로딩 양은 20 ㎍이었다. Thermo LTQ-Orbitrap Discovery 질량 분광계(Thermo Fisher Inc., USA)를 사용하였으며, 분무 전압(spraying voltage)은 3.7 KV였고, 튜브 렌즈는 230 V였으며, 모세관 온도는 300℃였고, 해상도는 30000이었으며, 질량-대-전하 비율의 범위는 1000 내지 3000이었다. 3개의 돌연변이화된 항체의 중쇄(G0F 글리칸 형태를 함유하는 Fc)의 이론학적 분자량을 GPMAW6.0 소프트웨어에 의해 계산하였으며, 이는 GB235-019S75A의 경우 50400.7 Da이었고, GB235-019N73D의 경우 50417.7 Da이었으며 GB235-019 N73Q의 경우 50430.7 Da이었다. 질량 분광법으로부터 수집된 오리지널 신호를 PROMASS 소프트웨어를 사용하여 디콘볼루션하여, 상응하는 측정된 분자량들을 수득하였다.
도 5a는, GB235-019N73D의 중쇄의 측정된 분자량이 이론학적 분자량과 일치하였음을 보여주며, 이는 중쇄에 글리코실화가 부재함을 가리킨다. 도 5b 및 도 5c는, 돌연변이화된 항체 GB235-019N73Q 및 GB235-019S75A의 중쇄의 측정된 분자량이 이론학적 분자량(차이가 1 Da 미만임)과 밀접하게 일치하였음을 보여주며, 이는 Fab 골격 영역에서 N-글리코실화 부위가 제거되었음을 가리킨다.
인간 IgG의 중쇄의 Fc 분절의 CH2 영역 내에 보존적 N-연결 글리코실화 부위 Asn29가 존재한다. Asn297에서 연결된 다당류 사슬은 항체의 4차 구조 및 Fc 분절의 열적 안정성을 유지시킬 수 있으며, FcRs, C1q 및 FcRn에의 IgG 분자의 결합에 영향을 미침으로써, 항체-의존적 세포의 세포독성(ADCC), 보체-의존적 세포독성(CDC) 및 반감기를 각각 조절할 수 있다.
인간 IgG Fab의 N-글리코실화 변형은 항체가 항원에 결합하는 기능에 대해 명백한 촉진 효과 또는 저해 효과를 발휘할 수 있다. 글리코실화 변형이 발생하는 위치에서의 작은 변화는 다당류 사슬의 후속적인 가공 및 항원에의 항체의 결합 활성에 완전하게 서로 다른 효과를 발휘할 수 있으며, 항체 생성 과정에서 품질 조절에 복잡성을 유발할 수 있다. 돌연변이화된 항체 GB235-019N73D, GB235-019N73Q 및 GB235-019S75A를, GB235-019 야생형 항체에 점 돌연변이를 유발한 후에 수득하였다. 3개의 돌연변이화된 항체는 GB235-019 야생형 항체에서 중쇄 Fab의 N-연결 글리칸(Asn-Thr-Ser)에 특이적인 부위를 변화시켰다. 3개의 돌연변이화된 항체의 환원 분자량의 확인은 중쇄 Fab에 글리코실화가 부재함을 보여주었으며, 이는 생성 과정에서 품질 조절에 도움이 될 것이다. 3개의 돌연변이화된 항체를 생물학적 활성 분석 및 생리화학적 분석에 의해 추가로 확인하였다.
실시예 11 재조합 전장 GB235-019 야생형 항체 및 돌연변이화된 항체에 대한 면역원성 활성의 확인
인간 HER2 항원에의 GB235-019 야생형 항체(GB235-019WT) 및 돌연변이화된 항체 GB235-019N73D, GB235-019N73Q 및 GB235-019S75A의 결합 능력을 하기와 같은 절차에 따라 ELISA 결합 분석법을 사용하여 확인하였다. 인간 HER2 항원(Sino Biological Inc.사로부터 구매함, 카탈로그 번호: 10004-H08H)을 PBS 완충제를 사용하여 1 ㎍/ml까지 희석시키고, ELISA 플레이트에 100 ㎕/웰로 첨가하여, 4℃에서 밤새 코팅을 수행하였다. 플레이트를 PBST로 4회 세척한 다음, 5% BSA(Amresco, USA사로부터 구매함, 카탈로그 번호: 0332-100g, 용액은 PBS임)를 300 ㎕/웰로 첨가하여, 실온에서 1시간 동안 블라킹시켰다. 플레이트를 PBST로 4회 세척한 다음, 각각 5 ㎍/ml로 시작하는 GB235-019WT 항체 및 돌연변이화된 항체 GB235-019N73D, GB235-019N73Q 및 GB235-019S75A, 및 페르투주맙(Roche Corp.으로부터 구매함) 및 허셉틴(Roche Corp.으로부터 구매함)을 각각 5배 희석시켜, 7개의 농도 구배를 수득하였다. 각각의 희석액을 ELISA 플레이트에 100 ㎕/웰로 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST로 4회 세척한 다음, HRP-표지된 염소 항-인간 IgG Fc 항체(CalBiochem Inc., USA로부터 구매함, 카탈로그 번호: AP113A-K)를 PBS 완충제와 1:10000 희석시키고, ELISA 플레이트에 100 ㎕/웰로 첨가한 다음, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST로 4회 세척한 다음, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 기질(Tiangen Co., Ltd.사로부터 구매함, 카탈로그 번호: PA107-01)의 용액을 100 ㎕/웰로 첨가하여, 실온에서 15분 동안 인큐베이션하여, 시각화하였다. 스탑 용액(1 M 황산)을 50 ㎕/웰로 첨가하고, M5 다기능성 ELISA 플레이트(Bio-Rad, Model 680 Micro reader, USA) 상에서 450/630 nm의 파장에서 흡광도 값을 판독하였다.
도 6의 결과는, 돌연변이화된 항체 GB235-019N73D, GB235-019N73Q 및 GB235-019S75A가 인간 HER2 항원에 농도-의존적이며 포화 가능한 방식으로 특이적으로 결합하는 능력을 가졌음을 보여주었다. 돌연변이화된 항체 GB235-019N73D, GB235-019N73Q 및 GB235-019S75A는 유의미한 차이 없이 GB235-019WT 항체와 유사한 결합 능력을 가졌다.
실시예 12 재조합 전장 GB235-019 돌연변이화된 항체는 시험관내에서 유방암 BT-474 세포의 증식 활성을 저해하였다
유방암 BT-474 세포는 HER2 및 HER3를 중간 수준으로 발현하고 P-HER2를 높은 수준으로 발현하지만, P-HER3는 발현하지 않는다(Richard M. Neve. Acollection of breast cancer cell lines for the study of functionally distinct cancer subtypes. CANCER CELL, 2006, 515-527). 상기 정의된 바와 같이, 유방암 BT-474 세포는 HER2 양성 종양 세포이다. 헤레굴린-α(R&D Inc., USA로부터 구매함, 카탈로그 번호: 296-HR)가 보충된 완전 배지를 사용한 증식 저해 분석법에서, 로그 기의 BT-474 세포를, 10% 태아 소 혈청(Invitrogen, USA로부터 구매함, 카탈로그 번호: 10099-141)을 함유하는 RPMI1640 완전 배지(Invitrogen, USA로부터 구매함, 카탈로그 번호: A10491)가 든 96-웰 배양 플레이트에서 5000개 세포/웰로 37℃, 5% CO2에서 24시간 동안 배양하였다. 저해 분석법은 GB235-019WT 항체 및 돌연변이화된 항체 GB235-019N73D, GB235-019N73Q 및 GB235-019S75A를 개별적으로 투여할 뿐만 아니라 허셉틴과 조합하여 투여함으로써 수행하였다. 개별 투여 그룹에서, GB235-019WT 항체 및 GB235-019N73D, GB235-019N73Q 및 GB235-019S75A 돌연변이화된 항체, 및 페르투주맙 및 허셉틴을 각각 첨가하고(최종 시험 농도가 75 ㎍/ml, 18.8 ㎍/ml, 4.7 ㎍/ml, 1.2 ㎍/ml, 0.29 ㎍/ml, 0.07 ㎍/ml, 0.018 ㎍/ml, 0.005 ㎍/ml, 0.0011 ㎍/ml 및 0 ㎍/ml임); 조합 투여 그룹에서, GB235-019WT, GB235-019N73D, GB235-019N73Q, GB235-019S75A 및 페르투주맙을 각각 상기 용량으로 하여 허셉틴과 조합하여 투여하였다. 상기와 같이 항체를 2시간 동안 처리한 후, 헤레굴린-α 용액을 100 ng/ml의 최종 시험 농도로 첨가하였으며, 헤레굴린-α 용액을 첨가하지 않은 웰도 포함시켰다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 6일 동안 더 배양하였다. BT-474 세포의 생존력을 검출하기 위해 AlamarBlue(Invitrogen, USA로부터 구매함, 카탈로그 번호: DAL1100)를 첨가하고, 형광 값을 M5 다관능성 ELISA 플레이트 판독기(Molecular Devices Inc., USA) 상에서 544/590 nm에서 판독하였다.
분석법의 결과는, 재조합 전장 항-HER2 돌연변이화된 항체 GB235-019N73D, GB235-019N73Q 및 GB235-019S75A가 시험관내에서 헤레굴린-α에 의해 유도되는 HER2 양성 BT-474 세포의 허셉틴에 대한 내성을 역전시켰음을 가리켰다. 도 7a의 결과는, 헤레굴린-α를 완전 배지에 첨가하면, BT-474 세포의 증식을 유도하였음을 보여주었다. BT-474 세포는 개별적으로 투여된 허셉틴에 대해 무감각해지게 되었으며, 돌연변이화된 항체 GB235-019N73D, GB235-019N73Q 및 GB235-019S75A는 개별적으로 투여되었을 때, GB235-019WT 항체의 효과와 유사하게 저해 효과를 갖지 않았다. 도 7b의 결과는, 돌연변이화된 항체 GB235-019N73D, GB235-019N73Q 및 GB235-019S75A가 각각 허셉틴과 조합하여 투여되었을 때, 헤레굴린-α-유도 증식의 저해하였음을 보여주었다. 3개의 돌연변이화된 항체를 각각 허셉틴과 조합하여 투여하면, 헤레굴린-α에 의해 유도되는 BT-474 세포의 증식을 저해하였을 뿐만 아니라, 헤레굴린-α 유도 전보다 더 낮은 수준까지 농도-의존적인 방식으로 확연하게 저해하였다. 돌연변이화된 항체 GB235-019N73D, GB235-019N73Q 및 GB235-019S75A는 유의미한 차이 없이, GB235-019WT 항체와 유사한 효과를 가졌다.
실시예 13 재조합 전장 항-인간 HER2 GB235-019 돌연변이화된 항체에 의한 유방암 BT-474 세포 신호 전달의 시험관내 저해
로그 기의 BT-474 세포를, 10% 태아 소 혈청(Invitrogen, USA로부터 구매함, 카탈로그 번호: 10099-141)를 함유하는 RPMI1640 완전 배지(Invitrogen, USA로부터 구매함, 카탈로그 번호: A10491)가 든 6-웰 배양 플레이트에서 1.8x105개 세포/웰로 37℃, 5% CO2에서 24시간 동안 배양하였다. 다음날, 배지를 버리고, 0.1% 태아 소 혈청(Invitrogen, USA로부터 구매함, 카탈로그 번호: 10099-141)을 함유하는 저 농도의 혈청 배양 배지를 대신 사용하여, 24시간 동안 인큐베이션하였다.
그런 다음, 20 ㎍/ml의 GB235-019WT 및 GB235-019N73D 돌연변이화된 항체, 허셉틴 및 페르투주맙을 각각 개별적으로 투여하였다. BT-474 세포에 항체를 6시간 동안 처리한 후, 헤레굴린-α(R&D Inc., USA로부터 구매함, 카탈로그 번호: 296-HR)를 100 ng/ml의 최종 농도로 첨가한 후 15분 동안 유도시켰으며, 이때 헤레굴린-α가 첨가되지 않은 블랭크 대조군 웰도 포함시켰다. 플레이트를 4℃에서 미리-냉각시킨 PBS로 1회 세척하여, 반응을 중단시켰다. 그런 다음, LDS(Invitrogen, USA로부터 구매함, 카탈로그 번호: NP0007) 120 ㎕를 플레이트에 첨가하고, 플레이트를 얼음 위에 두었다. 세포 파쇄물을 적절하게 수집한 다음, 이후의 사용을 위해 -80℃에 보관하였다.
수집된 세포 파쇄물을, 50 mM의 최종 농도에서 다이티오트레이톨(Sangon Inc.사로부터 구매함, 카탈로그 번호: D0281)의 환원 조건 하에 웨스턴-블로팅 분석하여, SK-BR-3 세포에서 헤레굴린-α(R&D Inc.사로부터 구매함, 카탈로그 번호: 296-HR)에 의해 유도되는 HER-3, Akt 및 ERK1/2 인산화에 미치는 항체의 효과를 확인하였다. 웨스턴-블로팅을 하기와 같이 수행하였다. 전기영동 후 겔 상의 단백질을 전기영동 트랜스퍼 방법(300 mA, 80분)에 의해 NC 막(Pall Inc., USA로부터 구매함, 카탈로그 번호: S80209) 상으로 트랜스퍼하고, 5% 건조된 스킴드 밀크(dried skimmed milk)(Sangon Inc.사로부터 구매함, 카탈로그 번호: NB0669)를 사용하여 블라킹시켰다. 그런 다음, 1:1000으로 희석시킨 토끼 1차 항체 P-HER3 Y1289(Cell Signaling Technology Inc., USA로부터 구매함, 카탈로그 번호: 8017), 1:1000으로 희석시킨 토끼 1차 항체 HER3(Cell Signaling Technology Inc., USA로부터 구매함, 카탈로그 번호: 12708), 1:1000으로 희석시킨 토끼 1차 항체 P-AktS473(Cell Signaling Technology Inc., USA로부터 구매함, 카탈로그 번호: 4060), 1:1000으로 희석시킨 토끼 1차 항체 Akt(Cell Signaling Technology Inc., USA로부터 구매함, 카탈로그 번호: 4691), 1:500으로 희석시킨 토끼 1차 항체 P-ERK1/2(Cell Signaling Technology Inc., USA로부터 구매함, 카탈로그 번호: 4370), 1:1000으로 희석시킨 토끼 1차 항체 ERK1/2(Cell Signaling Technology Inc., USA로부터 구매함, 카탈로그 번호: 4695) 및 1:5000으로 희석시킨 토끼 1차 항체 GAPDH(Cell Signaling Technology Inc., USA, 카탈로그 번호: 5174)를 각각 첨가하여, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. NC 막을 1xTBST로 3회 세척한 다음, 1:10000으로 희석시킨 HRP-표지된 염소 항-토끼 항체(MERCK Inc., USA로부터 구매함, 카탈로그 번호: 401315)를 첨가하였다. NC 막을 다시 1xTBST로 3회 세척한 다음, ECL(PerkinElmer Inc., USA로부터 구매함, 카탈로그 번호: NEL104001EA)을 첨가하여 시각화하였다. 필름(Kodak Inc.로부터 구매함, 카탈로그 번호: FF057)을 노출시켜, 신호를 기록하였다.
유방암 BT-474 세포는 P-HER2를 높은 수준으로 발현하지만, P-HER3를 발현하지 않으며, 허셉틴에 감수성인 세포주이다. 도 8의 결과는, 헤레굴린-α를 첨가하지 않은 대조군과 비교하여, 헤레굴린-α가 BT-474 세포에서 HER3 인산화의 상향조절을 유발하였음을 보여준다. 개별적으로 투여된 GB235-019WT 항체 및 GB235-019N73D 돌연변이화된 항체는 BT-474 세포에서 헤레굴린-α에 의해 유도되는 HER3 인산화의 상향조절을 상당히 저해하였으며, 헤레굴린-α에 의해 유도되는 HER3 인산화의 상향조절을 완전히 역전시켰고, GB235-019N73D 돌연변이화된 항체는 GB235-019WT 항체와 유사한 효과를 가졌다. 페르투주맙 또한, BT-474 세포에서 헤레굴린-α에 의해 유도되는 HER3 인산화의 상향조절을 완전히 저해하였으며, 허셉틴 또한, BT-474 세포에서 헤레굴린-α에 의해 유도되는 HER3 인산화의 상향조절을 상당히 저해하였다.
개별적으로 투여된 GB235-019WT 항체 및 GB235-019N73D 돌연변이화된 항체는 헤레굴린-α에 의해 유도되는 Akt 인산화의 상향조절을 저해하지 못하였다. 개별적으로 투여된 페르투주맙은 헤레굴린-α에 의해 유도되는 Akt 인산화의 상향조절을 저해하였다. 개별적으로 투여된 GB235-019N73D 돌연변이화된 항체 및 GB235-019WT 항체는 헤레굴린-α에 의해 유도되는 ERK1/2 인산화의 상향조절을 상당히 저해하였으며, GB235-019N73D 돌연변이화된 항체는 GB235-019WT 항체와 유사한 효과를 가졌다.
실시예 14 재조합 전장 항-인간 HER2 GB235-019 돌연변이화된 항체에 의한 유방암 MCF7 세포 신호 전달의 시험관내 저해
유방암 MCF 7 세포는 HER2를 낮은 수준으로 발현하고 HER3를 높은 수준으로 발현하지만, P-HER2 및 P-HER3는 발현하지 않는다(Richard M. Neve. A collection of breast cancer cell lines for the study of functionally distinct cancer subtypes. CANCER CELL, 2006: 515-527). 상기 정의된 바와 같이, 유방암 MCF 7 세포는 HER2 음성 종양 세포이다. 로그 기의 MCF 7 세포를, 10% 태아 소 혈청(Invitrogen, USA로부터 구매함, 카탈로그 번호: 10099-141)를 함유하는 RPMI1640 완전 배지(Invitrogen, USA로부터 구매함, 카탈로그 번호: A10491)가 든 6-웰 배양 플레이트에서 1.8x105개 세포/웰로 24시간 동안 배양하였다. 다음날, 배지를 버리고, 0.1% 태아 소 혈청을 함유하는 저 농도의 혈청 배양 배지를 대신 사용하여, 24시간 동안 기아 배양하였다. MCF 7 세포에 20 ㎍/ml의 GB235-019WT 항체 및 돌연변이화된 항체 GB235-019N73D, GB235-019N73Q 및 GB235-019S75A를 각각 처리하고, 페르투주맙 및 허셉틴을 각각 개별적으로 투여하거나 또는 RPMI-0.1% 태아 소 혈청 배양 용액과 조합하여 6시간 동안 투여하였다. 그런 다음, 헤레굴린-α(R&D Inc., USA로부터 구매함, 카탈로그 번호: 296-HR)를 100 ng/ml의 최종 시험 농도로 첨가한 후 10분 동안 유도시켰으며, 이때 헤레굴린-α가 첨가되지 않은 블랭크 대조군 웰도 포함시켰다. 플레이트를 4℃에서 미리-냉각시킨 PBS로 1회 세척하여, 반응을 중단시켰다. 그런 다음, LDS(Invitrogen, USA로부터 구매함, 카탈로그 번호: NP0007) 120 ㎕를 플레이트에 첨가하고, 플레이트를 얼음 위에 두었다. 세포 파쇄물을 적절하게 수집한 다음, 이후의 사용을 위해 -80℃에 보관하였다.
수집된 세포 파쇄물을, 50 mM의 최종 농도에서 다이티오트레이톨의 환원 조건 하에 웨스턴-블로팅 분석하여, MCF 7 세포에서 헤레굴린-α에 의해 유도되는 HER-3 인산화에 미치는 항체의 효과뿐만 아니라 HER3의 다운스트림인 Akt 및 ERK1/2 인산화에 미치는 항체의 효과를 확인하였다. 웨스턴-블로팅 분석을 실시예 13에서와 동일한 절차에 따라 수행하였다.
도 9는 GB235-019 돌연변이화된 항체에 의한 HER2 음성 종양 유방암 MCF 7 세포 신호 전달의 저해를 보여준다. 그 결과는, 헤레굴린-α를 첨가하지 않은 대조군과 비교하여, 헤레굴린-α가 MCF 7 세포에서 HER3 인산화의 상향조절을 유발하였음을 가리켰다. 개별적으로 투여된 GB235-019WT 항체 및 돌연변이화된 항체 GB235-019N73D, GB235-019N73Q 및 GB235-019S75A는 각각 MCF 7 세포에서 헤레굴린-α에 의해 유도되는 HER3 인산화의 상향조절을 확연하게 저해하였으며; GB235-019N73D는 헤레굴린-α에 의해 유도되는 HER3 인산화의 상향조절을 완전히 역전시켰고; 개별적으로 투여된 허셉틴 또한, MCF 7 세포에서 헤레굴린-α에 의해 유도되는 HER3 인산화의 상향조절을 확연하게 저해하였고; 페르투주맙 또한, MCF 7 세포에서 헤레굴린-α에 의해 유도되는 HER3 인산화의 상향조절을 완전히 역전시켰다. 개별적으로 투여된 GB235-019WT 항체 및 돌연변이화된 항체 GB235-019N73D, GB235-019N73Q 및 GB235-019S75A는 각각 MCF 7 세포에서 헤레굴린-α에 의해 유도되는 Akt 인산화의 상향조절을 확연하게 저해하였고; 페르투주맙은 MCF 7 세포에서 헤레굴린-α에 의해 유도되는 Akt 인산화의 상향조절을 완전히 역전시켰다. 개별적으로 투여된 GB235-019WT 항체 및 돌연변이화된 항체 GB235-019N73D, GB235-019N73Q 및 GB235-019S75A는 각각 MCF 7 세포에서 헤레굴린-α에 의해 유도되는 ERK1/2 인산화의 상향조절을 확연하게 저해하였고; 페르투주맙은 MCF 7 세포에서 헤레굴린-α에 의해 유도되는 ERK1/2 인산화의 상향조절을 완전히 역전시켰다. 따라서, 본 발명의 항체 또한, HER2 음성 종양을 치료하는 데 사용될 수 있다.
실시예 15 GB235-019 돌연변이화된 항체의 분자 크기 배제 크로마토그래피 분석
GB235-019 돌연변이화된 항체 GB235-019N73D, GB235-019N73Q 및 GB235-019S75A를 각각 분자 크기 배제 크로마토그래피(SEC-HPLC)로 처리하여, 이들의 순도를 확인하였다. 실험 조건은 하기와 같았다: Waters 2695 액체 크로마토그래프(Waters Inc., USA); TSKgel G3000SWXL 일련의 크로마토그래피 컬럼(2개 컬럼)(Waters Inc., USA로부터 구매함); 이동상은 0.1 M 인산염 완충제, 0.1 M 소듐 클로라이드, pH 7.0, 1.0 mL/min, 이소크라틱 홀드(isocratic hold) 30분; 로딩 양은 각각의 항체 당 30 ㎍; 및 검출 파장은 280 nm임.
도 10은 3개의 돌연변이화된 항체의 분자 크기 배제 크로마토그램을 보여준다. 소량의 중합체 및 단편 분자들은 함량이 낮긴 했어도 3개의 항체에 존재한다. 표 4는 분자 크기 배제 크로마토그래피에 따라 상응하는 항체들의 순도 결과를 요약하였다. GB235-019N73D 항체의 주요 피크의 순도는 88.3%였으며, GB235-019N73Q 항체의 주요 피크의 순도는 89.7%였으며, GB235-019S75A 항체의 주요 피크의 순도는 93.1%였고, 3개의 돌연변이화된 항체들 모두의 주요 피크의 순도는 85%보다 높았다.
표 4 분자 크기 배제 크로마토그래피에 따른 GB235-019 돌연변이화된 항체의 순도 결과
돌연변이화된 항체 % 고분자량 불순물
(HMW)		 % 주요 피크
(주요)
 % 저분자량 불순물
(LMW)
GB235-019S75A 2.7 93.1 4.2
GB235-019N73Q 3.9 89.7 6.4
GB235-019N73D 8.2 88.3 3.5
실시예 16 GB235-019 돌연변이화된 항체의 이미징 모세관 등전점 포커싱 분석
돌연변이화된 항체 GB235-019N73D, GB235-019N73Q 및 GB235-019S75A를 각각 이미징 모세관 등전점 포커싱(iCIEF)으로 처리하여, 각각의 주요 피크의 등전점(pI) 및 전하 이성질체의 순도를 확인하였다. 실험 조건은 하기와 같았다: ProteinSimple iCE280 모세관 등전점 포커싱 장비(Protein Simple Inc., USA); iCIEF 카트리지(Protein Simple Inc., USA로부터 구매함); 양쪽성 전해질 용액을, Pharmalyte 3-10(GE Inc., USA사로부터 구매함, 카탈로그 번호: 17045601) 12 ㎕, pI 마커 5.85(GE Inc., USA사로부터 구매함, 카탈로그 번호: 17-0472-01) 0.5 ㎕, pI 마커 9.77(GE Inc., USA사로부터 구매함, 카탈로그 번호: 17-0473-01) 0.5 ㎕, 500 mM L-아르기닌(Sangon Inc.사로부터 구매함, 카탈로그 번호: AB0205-100g) 2 ㎕, 200 mM 이미노다이아세트산(Sangon Inc.사로부터 구매함, 카탈로그 번호: IB0530-100g) 2 ㎕, 1% 메틸셀룰로스(Sangon Inc.사로부터 구매함, 카탈로그 번호: MB0616-250g) 70 ㎕ 및 5.3 M 우레아(Sangon Inc.사로부터 구매함, 카탈로그 번호: UB0148-500g) 113 ㎕를 혼합함으로써 제조하였다. 로딩 용액은, 양쪽성 전해질 용액 180 ㎕를 2.5 mg/mL 단백질 용액 20 ㎕와 혼합함으로써 제조하였다. 검체 시스템을 1,500 V에서 1분 동안 예비-포커싱하고, 3,000 V에서 10분 동안 포커싱하였다. 포커싱 패턴을 CCD 카메라를 사용하여 포착하였으며, 이때 검출 파장은 280 nm였다.
도 11은 3개의 돌연변이화된 항체들의 이미징 모세관 등전점 포커싱 전기영동의 전기영동도를 보여준다. 표 5는 3개의 돌연변이화된 항체들의 상응하는 주요 피크들의 등전점 및 전하 이성질체들의 순도의 결과를 요약한 것이다. 3개의 돌연변이화된 항체들은 9.4 내지 9.6 범위의 측정된 등전점을 가졌다. GB235-019N73D의 등전점은 GB235-019N73Q 및 GB235-019S75A의 등전점보다 약 0.1 더 낮았으며, 이의 주요 피크 순도는 상대적으로 가장 높았다.
표 5 GB235-019 돌연변이화된 항체의 주요 피크의 등전점 및 전하 이성질체의 순도의 결과
돌연변이화된 항체 pI % 산성 피크
(산성)
 % 주요 피크
(주요)
 % 염기성 피크
(염기성)
GB235-019S75A 9.54 10.5 74.5 15.0
GB235-019N73Q 9.55 10.2 73.3 16.5
GB235-019N73D 9.42 11.9 77.2 10.9
실시예 17 GB235-019 돌연변이화된 항체의 모세관 겔 전기영동 분석
돌연변이화된 항체 GB235-019N73D, GB235-019N73Q 및 GB235-019S75A를 각각 환원 모세관 겔 전기영동 분석(rCE-SDS)으로 처리하여, 이들의 각각의 순도(경쇄 및 중쇄의 백분율의 합계)를 확인하였다. 실험 조건은 하기와 같았다. SDS-MW 분석 키트(Beckman Inc., USA로부터 구매함, 카탈로그 번호: 390953) 및 코팅되지 않은 모세관 튜브(Micro solv Inc.사로부터 구매함)를 분석에 사용하였다. 100 mM Tris-HCl, pH 9.0, 1% SDS(Sangon Inc.사로부터 구매함, 카탈로그 번호: SB0485-100g) 용액을 β-머캅토에탄올(Sigma Inc., USA로부터 구매함, 카탈로그 번호: M6250)과 55:5의 비율로 혼합하였다. 상기 혼합된 용액 60 ㎕를 2.5 mg/mL 검체 용액 40 ㎕와 혼합하고, 70℃ 수조에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 검체 로딩을 5 KV에서 20초 동안 수행하고, 분리를 15 KV에서 30분 동안 수행하였다. UV 검출기를 사용하였으며, 이때 파장은 214 nm로 설정하였다.
도 12는 3개의 돌연변이화된 항체의 환원 모세관 겔 전기영동의 전기영동도를 보여준다. 표 6은 순도 결과를 3개의 돌연변이화된 항체의 경쇄 및 중쇄의 합계의 측면에서 요약한 것이다. 3개의 돌연변이화된 항체들은 모두 저분자량의 불순물 및 고분자량의 불순물을 소량으로 가졌다. GB235-019N73D는 상대적으로 최소의 불순물 함량을 가졌으며, 경쇄 및 중쇄의 합계(LC+HC)의 측면에서 이의 순도는 가장 높았다.
표 6 환원 모세관 겔 전기영동에 따른 GB235-019 돌연변이화된 항체의 순도 결과
돌연변이화된
항체		 % 경쇄 (LC) % 저분자량 불순물 (LMW) % 비-글리코실화된 사슬 (NGHC) % 중쇄 (HC) % 고분자량 불순물 (HMW) % 경쇄와 중쇄의 합계 (LC+HC)
GB235-019S75A 31.1 0.6 0.7 67.0 0.6 98.1
GB235-019N73Q 30.9 1.7 1.0 65.7 0.7 96.6
GB235-019N73D 31.2 0.1 0.5 67.6 0.6 98.8
실시예 18 GB235-019 돌연변이화된 항체의 시차 주사 열량계 분석
돌연변이화된 항체 GB235-019N73D, GB235-019N73Q 및 GB235-019S75A를 각각 시차 주사 열량계(DSC)로 처리하여, 각각의 Tm 값(생물학적 분자의 50%가 해당 온도에서 접히지 않은 상태였음을 의미하는 상 전이 온도)을 확인하였다. 실험 조건은 하기와 같았다. 검출 세포 부피가 130 ㎕인 MicroCal VP-Capillary DSC 시차 주사 열량계(GE Inc., USA)를 사용하였다. 3개의 돌연변이화된 항체를 각각 PBS (0.01 M Na2HPO4·12H2O + 0.002 M KH2PO4 + 0.14 M NaCl + 0.002 M KCl，pH=8.6)를 사용하여 0.9 mg/mL까지 희석시켰다. PBS를 블랭크 대조군으로서 사용하였으며, 온도 변화를 30℃ 내지 95℃로 설정하였고, 스캐닝 속도(scanning speeding)는 60℃/h이었다.
도 13은 3개의 GB235-019 돌연변이화된 항체의 시차 주사 열량계 도해를 보여준다. 상기 3개의 분자의 Tm1은 서로 상이하였다. GB235-019N73Q의 Tm1이 상대적으로 가장 낮았으며, 한편, GB235-019N73Q의 Tm1은 GB235-019S75A의 Tm1과 근접하였다. Tm 값이 높을수록, 열적 안정성은 더 양호하다. Tm1의 차이는, 돌연변이가 CH2 도메인에 어느 정도의 효과를 가지는 범위를 가리킨다. GB235-019N73D 및 GB235-019S75A는 GB235-019N73Q보다 더 양호한 열적 안정성을 가졌다.
본 발명자들은은 이전에, 완전히 인간화된 scFV 파지 라이브러리 스크리닝 기술 및 유전자 조작 재조합 발현 기술을 사용함으로써, 완전히 인간화된 항-인간 HER2(Her-2/neu) 모노클로날 항체 GB235-019를 수득하였다(중국 특허 출원 201410705404.0을 참조할 수 있음). GB235-019는 인간 HER2, 원숭이 HER2 및 마우스 HER2에 농도-의존적이며 포화 가능한 방식으로 결합할 수 있었으나, 인간 HER1, HER3 및 HER4 항원에는 결합할 수 없었다. GB235-019를 허셉틴과 조합하여 투여하면, HER3 리간드 헤레굴린-α에 의해 유도되는 BT-474 세포의 허셉틴에 대한 내성을 역전시킬 수 있었으며, GB235-019의 개별적인 투여는 BT-474 세포에서 HER3 리간드 헤레굴린-α에 의해 유도되는 HER3 인산화의 상향조절을 저해하였다. 또한, GB235-019를 허셉틴과 조합하여 투여하면, HER3 리간드 헤레굴린-α에 의해 유발되는 SK-BR-3 세포의 허셉틴에 대한 내성을 역전시킬 수 있었으며, 이는 페르투주맙과 유사하다. GB235-019를 허셉틴과 조합하여 투여하면, 마우스에서 인간 유방암(KPL-4) 이종 이식물의 성장을 상당히 저해시킬 수 있었다. GB235-019의 Fab 골격 영역 3에 존재하는 Asn73은 N-글리코실화 부위였으며, 환원 분자량의 확인을 통해, GB235-019 Fab 상에 복잡한 다당류 사슬이 존재하였음이 확인되었다. 인간 IgG Fab의 N-글리코실화 변형은 항원에의 항체의 결합 기능에 명백한 촉진 효과 또는 저해 효과를 가질 수 있다. 글리코실화 변형이 발생하는 위치에서의 작은 변화는 다당류 사슬의 후속적인 가공 및 항원에의 항체의 결합 활성에 완전하게 서로 다른 효과를 발휘할 수 있으며, 항체 생성 과정에서 품질 조절에 복잡성을 유발할 수 있다. 3개의 돌연변이화된 항체 GB235-019N73D, GB235-019N73Q 및 GB235-019S75A를, GB235-019 야생형 항체에 점 돌연변이를 유발한 후에 수득하였다. 3개의 돌연변이화된 항체는 GB235-019 야생형 항체에서 중쇄 Fab의 N-연결 글리칸(Asn-Thr-Ser)에 대한 시그너처 서열을 변화시켰다. 환원 분자량의 확인을 통해, 3개의 돌연변이화된 항체가 중쇄 Fab에서 글리코실화되지 않았음이 확인되었다.
면역학적 활성의 확인은, 돌연변이화된 항체 GB235-019N73D, GB235-019N73Q 및 GB235-019S75A가 인간 HER2 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 농도-의존적이며 포화 가능한 방식으로 가졌음을 보여주었다. 돌연변이화된 항체 GB235-019N73D, GB235-019N73Q 및 GB235-019S75A는 유의미한 차이 없이 GB235-019WT 항체와 유사한 결합 능력을 가졌다. 돌연변이화된 항체 GB235-019N73D, GB235-019N73Q 및 GB235-019S75A를 각각 허셉틴과 조합하여 투여하면, 헤레굴린-α에 의해 유도되는 증식을 저해하였다. 3개의 돌연변이화된 항체를 각각 허셉틴과 조합하여 투여하면, 헤레굴린-α에 의해 유도되는 BT-474 세포의 증식을 저해할 뿐만 아니라, 헤레굴린-α 유도 전보다 더 낮은 수준까지 농도-의존적인 방식으로 확연하게 저해하였다. 3개의 돌연변이화된 항체는 또한, 유의미한 차이 없이 GB235-019WT 항체와 유사한 효과를 가졌다. GB235-019N73D 돌연변이화된 항체의 개별 투여는 BT-474 세포에서 헤레굴린-α에 의해 유도되는 HER3 인산화의 상향조절을 상당히 저해하였으며, GB235-019N73D 돌연변이화된 항체의 효과는 GB235-019WT 항체와 유사하였다. GB235-019N73D 돌연변이화된 항체 및 GB235-019WT 항체를 각각 개별 투여하면, BT-474 세포에서 헤레굴린-α에 의해 유도되는 ERK1/2 인산화의 상향조절을 상당히 저해하였으며, GB235-019N73D 돌연변이화된 항체의 효과는 GB235-019WT 항체와 유사하였다. GB235-019WT 항체 및 돌연변이화된 항체 GB235-019N73D, GB235-019N73Q 및 GB235-019S75A를 각각 개별 투여하면, MCF 7 세포에서 헤레굴린-α에 의해 유도되는 HER3 인산화의 상향조절을 확연하게 저해하였고, GB235-019N73D는 MCF 7 세포에서 헤레굴린-α에 의해 유도되는 HER3 인산화의 상향조절을 완전히 역전시켰다. GB235-019WT 항체 및 돌연변이화된 항체 GB235-019N73D, GB235-019N73Q 및 GB235-019S75A를 각각 개별 투여하면, MCF 7 세포에서 헤레굴린-α에 의해 유도되는 Akt 인산화의 상향조절을 확연하게 저해하였다. GB235-019WT 항체 및 돌연변이화된 항체 GB235-019N73D, GB235-019N73Q 및 GB235-019S75A를 각각 개별 투여하면, MCF 7 세포에서 헤레굴린-α에 의해 유도되는 ERK1/2 인산화의 상향조절을 확연하게 저해하였으며, 이는 3개의 돌연변이화된 항체의 생물학적 활성을 추가로 확인시켜 주었다. 상기 요약에서, 본 발명의 항체는 HER2 양성 종양을 치료하는 데 사용될 수 있을 뿐만 아니라 HER2 음성 종양을 치료하는 데에도 사용될 수 있다.
본 발명자들은 돌연변이화된 항체 GB235-019N73D, GB235-019N73Q 및 GB235-019S75A의 물리학적 특성 및 화학적 특성을 분석하였다. 분자 크기 배제 크로마토그래피에 의한 3개의 돌연변이화된 항체의 분석은, GB235-019N73D 항체의 주요 피크의 순도가 88.3%였으며, GB235-019N73Q 항체의 주요 피크의 순도가 89.7%였으며, GB235-019S75A 항체의 주요 피크의 순도가 93.1%였고, 3개의 돌연변이화된 항체들 모두의 주요 피크의 순도가 85%보다 높았음을 보여주었다. 이미징 모세관 등전점 포커싱(iCIEF)은 3개의 돌연변이화된 항체의 각각의 주요 피크의 등전점(pI) 및 전하 이성질체의 순도를 보여주었다. 3개의 돌연변이화된 항체는 약 9.4 내지 9.6 범위의 측정된 등전점을 가졌다. GB235-019N73D의 등전점은 GB235-019N73Q 및 GB235-019S75A의 등전점보다 약 0.1 더 낮았으며, 이의 주요 피크 순도는 상대적으로 가장 높았다. 환원 모세관 겔 전기영동 분석(rCE-SDS)은 3개의 돌연변이화된 항체의 각각의 순도(경쇄 및 중쇄의 백분율의 합계)를 보여주었다. 3개의 돌연변이화된 항체들은 모두 저분자량의 불순물 및 고분자량의 불순물을 소량으로 가졌다. GB235-019N73D는 상대적으로 최소의 불순물 함량을 가졌으며, 경쇄 및 중쇄의 합계(LC+HC)의 측면에서 이의 순도는 가장 높았다. 시차 주사 열량계(DSC)는 3개의 돌연변이화된 항체의 각각의 Tm 값(생물학적 분자의 50%가 해당 온도에서 접히지 않은 상태였음을 의미하는 상 전이 온도)을 보여주었다. 3개의 분자의 Tm1은 서로 상이하였다. GB235-019N73Q의 Tm1이 상대적으로 가장 낮았으며, 한편, GB235-019N73Q의 Tm1은 GB235-019S75A의 Tm1과 근접하였다. Tm 값이 높을수록, 열적 안정성은 더 양호하다. Tm1의 차이는, 돌연변이가 CH2 도메인에 어느 정도의 효과를 가지는 범위를 가리킨다. GB235-019N73D 및 GB235-019S75A는 GB235-019N73Q보다 더 양호한 열적 안정성을 가졌다.
<110> Genor Biopharma Co.,Ltd. <120> Mutated antibody of Fully Humanized HER2 Antibody, and Encoding Gene and use thereof <130> FPCH15160172P <160> 15 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial sequence <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Pro Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asn Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Tyr Leu Ser Arg Gly Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial sequence <400> 2 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 3 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 3 gaggtccagc tggtacagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcccc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcacc agctatgata tcaactgggt gcgacaggcc 120 actggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atgaacccta acagtggtaa cacaggctat 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accaggaaca cctccataag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gcgcggttac 300 tacctgtctc gtggtgattt ctggggtcaa ggtactctgg tgaccgtctc ctca 354 <210> 4 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 4 gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc gtgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttacta ttgtcaacag gctaacagtt tccctctcac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa acgt 324 <210> 5 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial sequence <400> 5 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 6 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial sequence <400> 6 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 1 5 10 15 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 20 25 30 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 35 40 45 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 50 55 60 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 65 70 75 80 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 85 90 95 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 7 <211> 989 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 7 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtct 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540 agcacgtacc gggtggtcac gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg 600 agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca 660 aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc 720 tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg 780 ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc 840 tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc 900 agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc 960 agaagagcct ctccctgtct cccggtaaa 989 <210> 8 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 8 actgtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 60 actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg 120 aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc 180 aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa 240 cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc 300 ttcaacaggg gagagtgt 318 <210> 9 <211> 1217 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 9 gtggggggcc gggatacaat tgaattcagg aggaatttaa aatgaaaaag acagctatcg 60 cgattgcagt ggcactggct ggtttcgcta ccgtggccca ggcggccgag ctcgacatcc 120 agatgaccca gtctccatct tccgtgtctg catctgtagg agacagagtc accatcactt 180 gtcgggcgag tcagggtatt agcagctggt tagcctggta tcagcagaaa ccagggaaag 240 cccctaagct cctgatctat gctgcatcca gtttgcaaag tggggtccca tcaaggttca 300 gcggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagcctgcag cctgaagatt 360 ttgcaactta ctattgtcaa caggctaaca gtttccctct cactttcggc ggagggacca 420 aggtggagat caaacgttct agaggtggtg gtggtagcgg cggcggcggc tctggtggtg 480 gtggatccct cgagatggcc gaggtccagc tggtacagtc tggagctgag gtgaagaagc 540 ctggggcccc agtgaaggtc tcctgcaagg cttctggata caccttcacc agctatgata 600 tcaactgggt gcgacaggcc actggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atgaacccta 660 acagtggtaa cacaggctat gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accaggaaca 720 cctccataag cacagcctac atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt 780 attactgtgc gcgcggttac tacctgtctc gtggtgattt ctggggtcaa ggtactctgg 840 tgaccgtctc ctcaactagt ggccaggccg gccagcacca tcaccatcac catggcgcat 900 acccgtacga cgttccggac tacgcttctt aggagggtgg tggctctgag ggtggcggtt 960 ctgagggtgg cggctctgag ggaggcggtt ccggtggtgg ctctgggttc cggtgatttt 1020 gattatgaaa gatggcaaac gctaataagg gggctatgac cgaaaatgcc gatgaaacgt 1080 gctacagtct gacgctaaag caactgattc tgtcgctact gatacgtgct gctatcgatg 1140 gttcattgct gacgtttcag ctgctaatgg tatgggtgct cactgggtgg taattttggc 1200 tgggctctct aattcga 1217 <210> 10 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial sequence <400> 10 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Pro Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Tyr Leu Ser Arg Gly Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 11 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial sequence <400> 11 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Pro Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Gln Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Tyr Leu Ser Arg Gly Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 12 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial sequence <400> 12 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Pro Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asn Thr Ala Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Tyr Leu Ser Arg Gly Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 13 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 13 gaggtccagc tggtacagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcccc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcacc agctatgata tcaactgggt gcgacaggcc 120 actggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atgaacccta acagtggtaa cacaggctat 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cctccataag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gcgcggttac 300 tacctgtctc gtggtgattt ctggggtcaa ggtactctgg tgaccgtctc ctca 354 <210> 14 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 14 gaggtccagc tggtacagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcccc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcacc agctatgata tcaactgggt gcgacaggcc 120 actggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atgaacccta acagtggtaa cacaggctat 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accaggcaga cctccataag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gcgcggttac 300 tacctgtctc gtggtgattt ctggggtcaa ggtactctgg tgaccgtctc ctca 354 <210> 15 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 15 gaggtccagc tggtacagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcccc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcacc agctatgata tcaactgggt gcgacaggcc 120 actggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atgaacccta acagtggtaa cacaggctat 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accaggaaca ccgccataag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gcgcggttac 300 tacctgtctc gtggtgattt ctggggtcaa ggtactctgg tgaccgtctc ctca 354

Claims (10)

  1. 완전히 인간화된 HER2 항체로서,
    항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 각각 SEQ ID NO: 10 및 SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 11 및 SEQ ID NO: 2; 또는 SEQ ID NO: 12 및 SEQ ID NO: 2인, 완전히 인간화된 HER2 항체.
  2. 제1항에 있어서,
    Fab, Fab', F(ab') 2, Fv 또는 scFv 형태인, 완전히 인간화된 HER2 항체.
  3. 제1항에 있어서,
    인간 IgG의 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하며;
    바람직하게는, 상기 인간 IgG이 IgG1이고, 보다 바람직하게는, 인간 IgG 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 5이고, 인간 IgG 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 6인, 완전히 인간화된 HER2 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 완전히 인간화된 HER2 항체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로서,
    바람직하게는, 상기 뉴클레오타이드 서열에서, 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 또는 SEQ ID NO: 15이고, 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 4인, 뉴클레오타이드 서열.
  5. 제4항에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로서,
    상기 뉴클레오타이드 서열은 상기 발현 벡터의 발현 조절 서열에 작동적으로 연결되어 있으며;
    바람직하게는, 상기 발현 벡터는 pGEM-T 벡터 또는 293 벡터인, 발현 벡터.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 완전히 인간화된 HER2 항체 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 완전히 인간화된 HER2 항체 및 부가적인 HER2 양성 종양 치료제(들)를 포함하는 조합된 의약으로서,
    상기 부가적인 HER2 양성 종양 치료제(들)는 허셉틴(Herceptin) 또는 페르투주맙(Pertuzumab)인, 조합된 의약.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 완전히 인간화된 HER2 항체를 포함하는, 인간 HER2를 검출하기 위한 키트.
  9. 피험자에서 HER2 양성 종양, HER2 약양성(weakly positive) 종양 또는 HER2 음성 종양을 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서의, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 완전히 인간화된 HER2 항체의 용도로서,
    바람직하게는, 상기 HER2 양성 종양은 HER2 양성 유방암, 위암, 폐암, 비소세포폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문암, 결장암, 팔로피오관 암(fallopian tube cancer), 자궁내막암, 자궁경부암, 질암, 외음부암, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비계 암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직암, 요도암, 음경암, 전립선암, 방광암, 신장 또는 요도 암, 신장세포암, 신우암, 중피종(mesothelioma), 간세포암, 담낭암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 세포 림프종(lymphatic cell lymphoma), 중추신경계(CNS) 암, 척수 종양, 뇌간 신경교종, 다형성 교모세포종(glioblastoma multiforme), 성상세포종, 신경초종, 상의세포종(ependymoma), 수모세포종, 수막종, 편평상피암종 및 뇌하수체 선종으로부터 선택되는, 완전히 인간화된 HER2 항체의 용도.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 피험자가 HER2 양성 종양, HER2 약양성 종양 또는 HER2 음성 종양을 앓고 있는 인간인, 완전히 인간화된 HER2 항체의 용도.
KR1020167032586A 2015-01-30 2015-12-08 완전한 인간 ｈｅｒ２ 항체의 돌연변이화된 항체, 이를 인코딩하는 유전자 및 이의 용도 KR101886772B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510051280.3 2015-01-30
CN201510051280.3A CN105985435B (zh) 2015-01-30 2015-01-30 全人源her2抗体的突变抗体及其编码基因和应用
PCT/CN2015/096674 WO2016119523A1 (zh) 2015-01-30 2015-12-08 全人源her2抗体的突变抗体及其编码基因和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20160145185A true KR20160145185A (ko) 2016-12-19
KR101886772B1 KR101886772B1 (ko) 2018-08-08

Family

ID=56542351

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020167032586A KR101886772B1 (ko) 2015-01-30 2015-12-08 완전한 인간 ｈｅｒ２ 항체의 돌연변이화된 항체, 이를 인코딩하는 유전자 및 이의 용도

Country Status (7)

Country Link
US (1) US10253108B2 (ko)
EP (1) EP3115377B1 (ko)
JP (1) JP6263778B2 (ko)
KR (1) KR101886772B1 (ko)
CN (1) CN105985435B (ko)
RU (1) RU2639531C1 (ko)
WO (1) WO2016119523A1 (ko)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102665867B1 (ko) * 2015-04-06 2024-05-10 메소 스케일 테크놀러지즈, 엘엘시 소모성 진탕 장치를 포함하는, 전기화학발광을 이용하여 검정법을 수행하기 위한 고처리율 시스템
EP3509622A4 (en) 2016-09-08 2020-06-17 Regenerative Research Foundation BI-FUNCTIONAL ANTI-TAU POLYPEPTIDES AND THEIR USE
JP7069476B2 (ja) * 2017-01-06 2022-05-18 博奥信生物技▲術▼（南京）有限公司 ＥｒｂＢ２抗体およびその使用
CN110790840A (zh) * 2018-08-01 2020-02-14 三生国健药业（上海）股份有限公司 结合人her2的抗体、其制备方法和用途
AU2020247828A1 (en) * 2019-03-22 2021-11-18 Certis Therapeutics Pty Ltd Anti-HER2 binding molecules

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20130098301A (ko) * 2010-07-09 2013-09-04 엑셀리시스, 인코포레이티드 암 치료를 위한 키나제 억제제들의 병용물

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8823869D0 (en) * 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5661016A (en) * 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5714350A (en) * 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
US7625859B1 (en) * 2000-02-16 2009-12-01 Oregon Health & Science University HER-2 binding antagonists
CA2481515C (en) * 2002-04-10 2013-10-01 Genentech, Inc. Anti-her2 antibody variants
DK2263691T3 (da) 2002-07-15 2012-10-22 Hoffmann La Roche Behandling af cancer med det rekombinante humaniserede monoklonale anti-ErbB2-antistof 2C4 (rhuMAb-2C4)
JP2008507520A (ja) * 2004-07-22 2008-03-13 ジェネンテック・インコーポレーテッド Ｈｅｒ２抗体組成物
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
BRPI0906309A2 (pt) * 2008-04-02 2020-05-26 Macrogenics, Inc Imunoglobulina, anticorpo, uso do anticorpo e composição farmacêutica
CN102167742B (zh) * 2010-02-25 2014-05-14 上海百迈博制药有限公司 一种全人源抗her2单克隆抗体、其制备方法及用途
JP6082344B2 (ja) * 2010-05-27 2017-02-15 ゲンマブ エー／エス Ｈｅｒ２エピトープに対するモノクローナル抗体
AU2012335247A1 (en) * 2011-11-08 2014-05-29 Pfizer Inc. Methods of treating inflammatory disorders using anti-M-CSF antibodies
CN104530236B (zh) * 2014-11-26 2018-02-23 嘉和生物药业有限公司 一种全人源her2抗体、其编码基因及应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20130098301A (ko) * 2010-07-09 2013-09-04 엑셀리시스, 인코포레이티드 암 치료를 위한 키나제 억제제들의 병용물

Also Published As

Publication number Publication date
KR101886772B1 (ko) 2018-08-08
EP3115377A1 (en) 2017-01-11
EP3115377B1 (en) 2020-02-26
EP3115377A4 (en) 2017-11-15
JP2017518038A (ja) 2017-07-06
WO2016119523A1 (zh) 2016-08-04
US10253108B2 (en) 2019-04-09
CN105985435B (zh) 2019-10-15
JP6263778B2 (ja) 2018-01-24
US20170037146A1 (en) 2017-02-09
CN105985435A (zh) 2016-10-05
RU2639531C1 (ru) 2017-12-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110650976B (zh) 抗SIRPα抗体
JP6779299B2 (ja) 抗ｐｄ−ｌ１抗体およびその使用
JP7046973B2 (ja) 抗ｏｘ４０抗体およびその使用
KR101886772B1 (ko) 완전한 인간 ｈｅｒ２ 항체의 돌연변이화된 항체, 이를 인코딩하는 유전자 및 이의 용도
JP2023075294A (ja) 抗ｃｄ４７抗体及びその応用
KR20190059958A (ko) 항-lag-3 항체 및 조성물
US20240092937A1 (en) Her3 antigen-binding molecules
CN110799540B (zh) 多特异性抗体及其制备和使用方法
CN111094352A (zh) B7-h4抗体及其使用方法
CN102167740B (zh) 一种全人源抗vegf单克隆抗体、其制备方法及用途
CN102046195A (zh) HER2/neu-特异性抗体和其使用方法
KR20160131061A (ko) 항-mcam 항체 및 관련된 사용 방법
JP2022507679A (ja) Ｈｅｒ２／ｐｄ１二重特異性抗体
AU2021284273A1 (en) Antibodies to TIGIT
KR20160131073A (ko) Lg4-5에 대해 특이적인 항-라미닌4 항체
CN106795223B (zh) 针对Fcγ受体IIB及Fcε受体的抗体
AU2021296168A1 (en) LAIR-1-binding agents and methods of use thereof
JP2021519088A (ja) 抗ｃｄ２７抗体、その抗原結合フラグメント及びその医学的使用
CN114685660A (zh) 抗cldn18.2抗体及其制备方法和应用
KR20160131082A (ko) Lg1-3에 특이적인 항-라미닌4 항체
CN108948193B (zh) 针对tim-3的抗体分子,抗原结合片段及其医药用途
CN117940461A (zh) 一种双特异性抗体及其用途
CN113135994A (zh) 一种激活型抗ox40抗体、生产方法及应用
CN116323666A (zh) Fgfr3抗体和使用方法
RU2811477C2 (ru) Мультиспецифические антитела и способы их получения и применения

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant