JP2023529203A - ナノリポタンパク質－ポリペプチドコンジュゲート並びにそれを使用する組成物、システム、及び方法 - Google Patents

ナノリポタンパク質－ポリペプチドコンジュゲート並びにそれを使用する組成物、システム、及び方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2023529203A
JP2023529203A JP2022575936A JP2022575936A JP2023529203A JP 2023529203 A JP2023529203 A JP 2023529203A JP 2022575936 A JP2022575936 A JP 2022575936A JP 2022575936 A JP2022575936 A JP 2022575936A JP 2023529203 A JP2023529203 A JP 2023529203A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
conjugate
antigen
peptide
ckp
binding polypeptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2022575936A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2021252803A5 (ja
Inventor
ホイットニー ビンダー，
クレーグ ディー． ブランシェット，
マーティン エー． ダルウィーシュ，
ラミ ハヌーシュ，
シンシン カオ，
Original Assignee
ジェネンテック， インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ジェネンテック， インコーポレイテッド filed Critical ジェネンテック， インコーポレイテッド
Publication of JP2023529203A publication Critical patent/JP2023529203A/ja
Publication of JPWO2021252803A5 publication Critical patent/JPWO2021252803A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/775—Apolipopeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6917—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a lipoprotein vesicle, e.g. HDL or LDL proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本発明は、一般に、少なくとも１つのポリペプチドを含むナノリポタンパク質粒子コンジュゲート、及び長さが２０～６０アミノ酸の少なくとも１つの短いペプチドを含むナノリポタンパク質粒子コンジュゲートに関する。また、関連する組成物及びシステム、並びにそれらを調製及び使用する方法も提供される。特に、抗原結合断片（Ｆａｂ）とのナノリポタンパク質粒子（ＮＬＰ）コンジュゲートが提供され、ここで、ＮＬＰは、足場タンパク質によって取り囲まれた膜形成脂質の二重層を含み、Ｆａｂは、一方又は両方の二重層表面にコンジュゲートしている。いくつかの実施態様では、（ＮＬＰ）コンジュゲートは、長さが２０～６０アミノ酸の短いペプチドをさらに含む。コンジュゲート、並びに関連する組成物及びシステムは、一般に良好な安定性及び製造可能性を示し、抗原結合活性を保持し、抗原結合能を高めることができ、Ｆａｂ及びＦａｂベースの治療薬及び診断薬の送達のための多目的プラットフォームを提供するとともに、他の治療剤及び／又は診断剤の送達のための安定したプラットフォームを提供することができる。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年６月１１日に出願された米国仮出願第６３／０３８，０７５号；２０２１年２月１９日に提出された米国仮出願第６３／１５１，５９１号の優先権を主張し、それぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる：コンピュータ可読形態（ｃｏｍｐｕｔｅｒ ｒｅａｄａｂｌｅ ｆｏｒｍ：ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：１４６３９２０５２８４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録日：２０２１年７月７日、サイズ：１ＫＢ）。
本発明は、一般に、少なくとも１つのコンジュゲートしたポリペプチド（例えば、共有結合的にコンジュゲートしたポリペプチド）を含むナノリポタンパク質粒子コンジュゲート、関連する組成物及びシステム、並びにそれらを調製及び使用する方法に関する。特に、抗原結合断片（Ｆａｂ）とのナノリポタンパク質粒子（ＮＬＰ）コンジュゲートが提供され、ここで、ＮＬＰは、足場タンパク質によって取り囲まれた膜形成脂質の二重層を含み、Ｆａｂは、一方又は両方の二重層表面にコンジュゲートしている。ＮＬＰ－Ｆａｂコンジュゲート、並びに関連する組成物及びシステムは、一般に良好な安定性及び製造可能性を示し、抗原結合活性を保持し、抗原結合能を高めることができ、Ｆａｂ及びＦａｂベースの治療薬及び診断薬の送達のための多目的プラットフォームを提供するとともに、他の治療剤及び／又は診断剤の送達のための安定したプラットフォームを提供することができる。本発明はまた、例えばコンジュゲートしたポリペプチドに加えて、又はコンジュゲートしたポリペプチドの代わりに、少なくとも１つのコンジュゲートしたペプチドを含むナノリポタンパク質粒子コンジュゲートに関する。
過去１０年間、ナノテクノロジー分野の進歩により、従来の薬物送達システムの限界に対処しようとしてきた。また、過去数十年の間に、無機ナノ粒子、高分子ベースナノ粒子、高分子ミセル、デンドリマー、リポソーム、ウイルスナノ粒子、カーボンナノチューブ、ナノリポタンパク質粒子（ＮＬＰ）など、様々なナノ粒子が開発されてきた。
ＮＬＰは、一般に両親媒性脂質とアポリポ蛋白質からなるナノメートルサイズの粒子であり、自己組織化して円盤状の脂質二重層を形成し、ここで円盤の疎水性周辺は、アポリポタンパク質に結合することによって安定化されている。ＮＬＰは、選択されたアプリケーションと薬物積荷について探索されている。それにもかかわらず、これまでの研究では、断片抗体（Ｆａｂ）の送達についてこのプラットフォームを評価していない。
したがって、当技術分野では、抗原結合ポリペプチドを送達するため及び／又は他の治療剤及び診断剤を標的とするための、製造可能性が良好な新規ＮＬＰ送達プラットフォーム、特に安定した組成物及びシステムが必要とされている。本発明は、これら及び他の必要性を満たしている。
本発明は、一般に、ナノリポタンパク質－ポリペプチドコンジュゲート、並びにコンジュゲートを作製及び使用する組成物、システム、及び方法に関し、ここで、ナノリポタンパク質粒子は、抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）又はシステインノットペプチド（ＣＫＰ）などのポリペプチドにコンジュゲートしており、いくつかの実施態様において驚くべき特性を有するコンジュゲートを与える。本発明のコンジュゲートは、低毒性、低免疫原性、良好な安定性（架橋剤なし）、良好な製造可能性（高濃度だが低粘度の製剤の実現可能な生産を含む）、粒子間架橋が最小限から全くないこと、比較的均一なＮＬＰ集団、及び／又は増強された抗原結合能などの利点及び改善を提供することができる。
一態様では、本発明は、足場タンパク質、膜形成脂質、及び抗原結合ポリペプチドを含むコンジュゲートを提供し、ここで、膜形成脂質は脂質二重層に配列され、足場タンパク質は二重層を取り囲み、抗原結合ポリペプチドは、１つ又は複数の膜形成脂質上の官能化基と抗原結合ポリペプチド上のＣ末端に位置する相補的官能基とを介して、二重層の一方又は両方の表面上で膜形成脂質の１つ又は複数にコンジュゲートしている。いくつかの実施態様では、抗原結合ポリペプチドはＦａｂである。いくつかの実施態様では、スペーサーは官能化基を膜形成脂質に接続し、及び／又はスペーサーは相補的官能基を抗原結合ポリペプチドに接続する。いくつかの実施態様では、スペーサーはＧＳＧＳである。
いくつかの実施態様では、官能化基は、マレイミド誘導体、ハロアセトアミド、ピリジルジチオプロピオネート、チオスルフェート、及びそれらのいずれか１つ又は複数の組み合わせからなる群から選択され；いくつかの実施態様では、相補的官能基は、システインチオール基などの遊離チオール基であり、場合によって、システインは、抗原結合ポリペプチドが由来する抗体においてヒンジジスルフィド結合を形成する（例えば、カバット番号付けによると、Ｃｙｓ－２２６又はＣｙｓ－２２７）。いくつかの実施態様では、足場タンパク質は、（ａ）アポリポタンパク質Ａ、（ｂ）アポリポタンパク質Ｂ、（ｃ）アポリポタンパク質Ｃ、（ｄ）アポリポタンパク質Ｄ、（ｅ）アポリポタンパク質Ｈ、（ｆ）アポリポタンパク質Ｅ、（ｇ）前記二重層を安定化することができる（ａ）～（ｆ）の切断型、及び（ｈ）（ａ）～（ｇ）のいずれか１つ又は複数の組み合わせからなる群から選択され；且つ／又は膜形成脂質は、Ｃ４－２８脂肪酸アシル（例えば、Ｃ１６脂肪酸アシル）、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＯＰＳ、ＤＯＰＥ、ＤＰＰＣ、及びそれらのいずれか１つ又は複数の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施態様では、前記膜形成脂質の１つ又は複数はＣ４－２８脂肪酸アシルであり、該脂肪酸アシルは２０～６０アミノ酸の短いペプチドにコンジュゲートしている。
いくつかの実施態様では、足場タンパク質、膜形成脂質、及び２０～６０アミノ酸の短いペプチドを含むコンジュゲートが提供され、ここで、前記膜形成脂質は脂質二重層に配列され、前記足場タンパク質は前記二重層を取り囲み；前記短いペプチドは、前記二重層の一方又は両方の表面上で前記膜形成脂質の１つ又は複数にコンジュゲートしている。いくつかの実施態様では、膜形成脂質は、Ｃ４－２８脂肪酸アシル（例えば、Ｃ１６脂肪酸アシル）、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＯＰＳ、ＤＯＰＥ、ＤＰＰＣ、及びそれらのいずれか１つ又は複数の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施態様では、膜形成脂質はＣ４－２８脂肪酸アシルであり、前記脂肪酸アシルは２０～６０アミノ酸の短いペプチドにコンジュゲートしている。
いくつかの実施態様では、脂肪酸アシルはＣ１６脂肪酸アシルである。いくつかの実施態様では、短いペプチドはシスチンノットペプチド（ＣＫＰ）である。いくつかの実施態様では、ＣＫＰはＥＥＴＩ－ＩＩである。いくつかの実施態様では、短いペプチドは、（ａ）野生型ＣＫＰの対応する１つ若しくは複数のループ配列と比較して、１つ若しくは複数のループ配列における１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／若しくは置換；（ｂ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｎ末端での１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／若しくは置換；（ｃ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｃ末端での１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／若しくは置換；（ｄ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｎ末端での化学修飾；並びに／又は（ｅ）野生型ＣＫＰと比較してＣ末端での化学修飾を含むＣＫＰバリアントである。いくつかの実施態様では、ＣＫＰバリアントは、野生型ＣＫＰと比較して、そのＮ末端に追加のリジン残基を含む。いくつかの実施態様では、野生型ＣＫＰはＥＥＴＩ－ＩＩである。
いくつかの実施態様では、コンジュゲート中（例えば、短いペプチドと抗原結合ポリペプチドを含むＮＬＰコンジュゲート中）の短いペプチドの活性は、抗原結合ポリペプチドを含まないコンジュゲート中のペプチドの活性よりも高い。いくつかの実施態様では、コンジュゲート中のペプチドの活性は、抗原結合ポリペプチドを含まないコンジュゲート中のペプチドの活性よりも２倍から１０倍高い。いくつかの実施態様では、コンジュゲート中のペプチドの活性は、抗原結合ポリペプチドを含まないコンジュゲート中のペプチドの活性よりも約５倍高い。いくつかの実施態様では、短いペプチドは生物学的活性を有するＣＫＰ又はＣＫＰバリアントであり、前記活性の８０～９０％、９０～９５％、又は９５～９９％が前記コンジュゲートにおいて保持される。いくつかの実施態様では、前記コンジュゲートは、前記短いペプチドの活性又は結合活性を増加させる。いくつかの実施態様では、コンジュゲート（例えば、ペプチド－ＮＬＰコンジュゲート）はさらに、前記１つ又は複数の膜形成脂質上の官能化基と前記抗原結合ポリペプチド上のＣ末端に位置する相補的官能基とを介して、前記二重層の一方又は両方の表面上で前記膜形成脂質の１つ又は複数にコンジュゲートしている抗原結合ポリペプチドを含み；場合によって、スペーサーが前記官能化基を前記膜形成脂質に接続し、且つ／又はスペーサーが前記相補的官能基を前記抗原結合ポリペプチドに接続する。いくつかの実施態様では、コンジュゲートは、１～１００分子の前記Ｆａｂを含み；場合によって、前記コンジュゲートは、５～３０、１０～２５、１５～２０、若しくは１８分子の前記ペプチド、及び５～４０、１０～３５、１５～３０、２０～２５、若しくは２３分子の前記抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）を含み；又は場合によって、前記コンジュゲートは、３～３０、５～２０、１０～１５、若しくは１３分子の前記ペプチド、及び１０～６０分子の前記抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）を含み；又は場合によって、前記コンジュゲートは、２０～８０、２５～７０、３０～６０、３５～５０、若しくは４０分子の前記ペプチド、及び１０～６０分子の前記抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）を含む。いくつかの実施態様では、コンジュゲートは、少なくとも２つの異なるペプチド－Ｃ４－２８脂肪酸アシルコンジュゲートを含み、ここで、第１のペプチド－Ｃ４－２８脂肪酸アシルコンジュゲートは第１の短いペプチドを含み、第２のペプチド－Ｃ４－２８脂肪酸アシルは第１の短いペプチドとは異なる第２の短いペプチドを含む。いくつかの実施態様では、少なくとも２つのペプチド（例えば、シスチンノットペプチド）は、異なる標的、場合によって２つ、３つ、４つ、又は８つの異なる標的に結合する。いくつかの実施態様では、２つ以上の短いペプチドは、２つの異なる標的に結合する。いくつかの実施態様では、標的は、ＣＤ３及びＣＤ１９；ＣＤ３及びＥｐＣＡＭ；ＣＤ３及びＣＥＡ；ＣＤ１６及びＣＤ３０；ＣＤ１６及びＣＤ３３；Ａｎｇ－２及びＶＥＧＦ－Ａ；並びに第Ｘ因子及び第ＩＸａ因子からなる群から選択される対である。
いくつかの実施態様では、足場タンパク質と膜形成脂質は、１：６０から１：１００のモル比、例えば、１：８０などのモル比である。いくつかの実施態様では、膜形成脂質の２０～３５％、例えば２０％が官能化基を有する。抗原結合ポリペプチドは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ＶＨ－ＶＨ二量体、ＶＬ－ＶＬ二量体、ＶＨ－ＶＬ二量体、単一ドメイン、ダイアボディ、直鎖状抗体、及びそれらのいずれか１つ又は複数の組み合わせからなる群から選択され得る。特定の実施態様では、抗原結合ポリペプチドは、ヒト又はヒト化ＦａｂなどのＦａｂ又はＦａｂ様分子である。抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）によって結合される抗原は、ＯＸ４０、ＤＲ４、ＧＩＴＲ、Ｔｉｅ２、Ｄ因子、ＶＥＧＦ、ＭｅｒＴＫ、ＣＤ３、及び／又はリンホトキシンベータ受容体であり得る。
コンジュゲートは、多価及び／又は多重特異性構築物のフォーマットを提供することができる。例えば、コンジュゲートは、２～６０分子、２～３２分子、１０～３０分子、又は２０分子など、２つ以上の抗原結合ポリペプチド分子（例えば、２つ以上のＦａｂ分子）を含み得る。いくつかの実施態様では、スペーサーは、ＰＥＧ、又はＧＳＧＳのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様では、コンジュゲートは、１～１６０、１０～１２０、２０～１００、４０～８０、又は６０分子の前記抗原結合ポリペプチドを有し；ここで、前記抗原結合ポリペプチドはＦａｂであり、前記ＦａｂはＰＥＧスペーサーによって前記膜形成脂質に接続されている。いくつかの実施態様では、ＰＥＧスペーサーは、前記官能化基を前記膜形成脂質に接続し、１０００～３０００、１５００～２５００、１９００～２２００、又は２０００のＭＷを有する。
そのようなフォーマットは、抗原結合ポリペプチドの活性及び／又は結合活性、その血清安定性及び／又はその血清半減期を（ナノリポタンパク質粒子（ＮＬＰ）にコンジュゲートしていない抗原結合ポリペプチドと比較して）増加させることができる。いくつかの実施態様では、抗原結合ポリペプチドの血清半減期は、２～２０倍、５～１５倍、又は１０倍増加している。いくつかの実施態様では、前記コンジュゲートは、５～６０、６～４０、又は７～３２分子の前記抗原結合ポリペプチドを有する。
いくつかの実施態様では、コンジュゲートは、２つ、３つ、４つ、又は８つの異なる標的又はエピトープなどの異なる標的又はエピトープに結合する２つ以上の抗原結合ポリペプチド（例えば、２つ以上のＦａｂ）を含む。このようなフォーマットは、二重特異性構築物を提供することができ、例えば、標的は、ＣＤ３及びＣＤ１９；ＣＤ３及びＥｐＣＡＭ；ＣＤ３及びＣＥＡ；ＣＤ１６及びＣＤ３０；ＣＤ１６及びＣＤ３３；Ａｎｇ－２及びＶＥＧＦ－Ａ；並びに第Ｘ因子及び第ＩＸａ因子からなる群から選択される対である。いくつかの実施態様では、抗原結合ポリペプチドは、Ｆａｂ又はＦａｂ様分子、場合によって、ヒト又はヒト化Ｆａｂである。
本発明のコンジュゲートは、コンジュゲート及び薬学的に許容されるビヒクルを含む薬学的組成物において提供され得る。
本発明の別の態様は、１００～３００ｍｇのコンジュゲートを含み、１０～５０ｃＰの粘度を有する液体製剤などの高濃度、低粘度の液体製剤を提供する。いくつかの実施態様では、薬学的組成物又は液体製剤は、皮下投与されるか又は眼球送達を介して投与される。いくつかの実施態様では、コンジュゲート、組成物、又は製剤は、トレハロースの存在下などで凍結乾燥され；且つ場合によって再構成される。特定の実施態様では、凍結乾燥は、８０ｍＭのトレハロースの存在下で、及び／又は５ｍｇのコンジュゲート／ｍＬの濃度で起こる。いくつかの実施態様では、コンジュゲートは、コンジュゲート当たり１８～２０個のＦａｂ分子を含む。有利には、いくつかの実施態様では、凍結乾燥及び再構成後に、抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）の抗原結合活性の８０～９０％、９０～９５％、又は９５～９９％が保持される。
本発明の別の態様は、本発明のコンジュゲートを調製する方法を提供する。いくつかの実施態様では、方法は、ａ）足場タンパク質及び膜形成脂質を、前記足場タンパク質によって取り囲まれた前記膜形成脂質の脂質二重層を含むナノリポタンパク質粒子の組み立てを可能にする条件下で提供することであって、ここで、膜形成脂質の１つ又は複数が、粒子の一方又は両方の表面上に官能化基を提示する、提供すること；ｂ）ｐＨ４．５～６．５の範囲の低ｐＨで官能化基にコンジュゲートする、Ｃ末端に位置する相補的官能基を有する抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）に粒子を接触させること；並びにｃ）場合によって、粒子と抗原結合ポリペプチドとのコンジュゲートを精製することを含む。いくつかの実施態様では、工程ｂ）は、組み立てられていない膜形成脂質の一部又は全てを除去するための介在工程なしで、工程ａ）に続いて行われる。特定の実施態様では、官能化基はマレイミド誘導体であり、官能基はシステインチオール基である（例えばシステインが、抗原結合ポリペプチドが由来する抗体においてヒンジジスルフィド結合を形成する場合（例えば、カバット番号付けによると、Ｃｙｓ－２２６又はＣｙｓ－２２７））。
いくつかの実施態様では、官能化基は、低いｐＨ、例えば、ｐＨ５．５～６．５、５～６、又はｐＨ６では、足場タンパク質にコンジュゲートしない。
本方法のいくつかの実施態様では、スペーサーは前記官能化基を前記膜形成脂質に接続し、且つ／又はスペーサーは前記相補的官能基を前記抗原結合ポリペプチドに接続する。いくつかの実施態様では、スペーサーは、前記官能化基を前記膜形成脂質に接続するＰＥＧスペーサーである。いくつかの実施態様では、ＰＥＧスペーサーは、１０００～３０００、１５００～２５００、１９００～２２００、又は２０００のＭＷを有する。
いくつかの実施態様では、前記膜形成脂質の１つ又は複数はＣ４－２８脂肪酸アシルであり、前記脂肪酸アシルは２０～６０アミノ酸の短いペプチドにコンジュゲートしている。いくつかの実施態様では、脂肪酸アシルはＣ１６脂肪酸アシルである。いくつかの実施態様では、短いペプチドはシスチンノットペプチド（ＣＫＰ）である。いくつかの実施態様では、ＣＫＰはＥＥＴＩ－ＩＩである。いくつかの実施態様では、短いペプチドは、（ａ）野生型ＣＫＰの対応する１つ若しくは複数のループ配列と比較して、１つ若しくは複数のループ配列における１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／若しくは置換；（ｂ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｎ末端での１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／若しくは置換；（ｃ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｃ末端での１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／若しくは置換；（ｄ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｎ末端での化学修飾；並びに／又は（ｅ）野生型ＣＫＰと比較してＣ末端での化学修飾を含むＣＫＰバリアントである。いくつかの実施態様では、ＣＫＰバリアントは、野生型ＣＫＰと比較して、そのＮ末端に追加のリジン残基を含む。いくつかの実施態様では、野生型ＣＫＰはＥＥＴＩ－ＩＩである。いくつかの実施態様では、膜形成脂質は、ペプチド－Ｃ４－２８脂肪酸アシルコンジュゲートと、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＯＰＳ、ＤＯＰＥ、ＤＰＰＣのうちの少なくとも１つ以上（例えば、ペプチド－Ｃ１６脂肪酸アシルコンジュゲートとＤＯＰＣ）を、１：３～１：１５、若しくは１：６～１：１２、若しくは１：９のモル比で含み；且つ／又は前記コンジュゲートは、１～１００、１０～９０、２０～８０、３０～７０、４０～６０、若しくは６０分子の前記短いペプチドを含む。いくつかの実施態様では、コンジュゲート中の短いペプチドの活性は、抗原結合ポリペプチドを含まないコンジュゲート中のペプチドの活性よりも高い。いくつかの実施態様では、コンジュゲート中のペプチドの活性は、抗原結合ポリペプチドを含まないコンジュゲート中のペプチドの活性よりも２倍から１０倍高い。いくつかの実施態様では、コンジュゲート中のペプチドの活性は、抗原結合ポリペプチドを含まないコンジュゲート中のペプチドの活性よりも約５倍高い。いくつかの実施態様では、短いペプチドは生物学的活性を有するＣＫＰ又はＣＫＰバリアントであり、前記活性の８０～９０％、９０～９５％、又は９５～９９％が前記コンジュゲートにおいて保持される。いくつかの実施態様では、コンジュゲートは、１～１００分子の前記Ｆａｂを含み；場合によって、前記コンジュゲートは、５～３０、１０～２５、１５～２０、若しくは１８分子の前記ペプチド、及び５～４０、１０～３５、１５～３０、２０～２５、若しくは２３分子の前記抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）を含み；又は場合によって、前記コンジュゲートは、３～３０、５～２０、１０～１５、若しくは１３分子の前記ペプチド、及び１０～６０分子の前記抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）を含み；又は場合によって、前記コンジュゲートは、２０～８０、２５～７０、３０～６０、３５～５０、若しくは４０分子の前記ペプチド、及び１０～６０分子の前記抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）を含む。いくつかの実施態様では、コンジュゲートは、少なくとも２つの異なるペプチド－Ｃ４－２８脂肪酸アシルコンジュゲートを含み、ここで、第１のペプチド－Ｃ４－２８脂肪酸アシルコンジュゲートは第１の短いペプチドを含み、第２のペプチド－Ｃ４－２８脂肪酸アシルは第１の短いペプチドとは異なる第２の短いペプチドを含む。いくつかの実施態様では、少なくとも２つのペプチド（例えば、シスチンノットペプチド）は、異なる標的、場合によって２つ、３つ、４つ、又は８つの異なる標的に結合する。いくつかの実施態様では、２つ以上の短いペプチドは、２つの異なる標的に結合する。いくつかの実施態様では、標的は、ＣＤ３及びＣＤ１９；ＣＤ３及びＥｐＣＡＭ；ＣＤ３及びＣＥＡ；ＣＤ１６及びＣＤ３０；ＣＤ１６及びＣＤ３３；Ａｎｇ－２及びＶＥＧＦ－Ａ；並びに第Ｘ因子及び第ＩＸａ因子からなる群から選択される対である。
いくつかの実施態様では、提供されるのは、ナノリポタンパク質粒子と２０～６０アミノ酸の短いペプチド（例えば、シスチンノットペプチド）とのコンジュゲートを調製する方法であって、ａ）足場タンパク質及び膜形成脂質を、前記足場タンパク質によって取り囲まれた前記膜形成脂質の脂質二重層を含むナノリポタンパク質粒子の（自己）組織化を可能にする条件下で提供することであって、ここで、前記膜形成脂質の１つ又は複数は、Ｃ４－２８脂肪酸アシル（例えば、Ｃ１６脂肪酸アシル）を含み、脂肪酸アシルは、前記短いペプチドにコンジュゲートしている、提供すること；並びに場合によってペプチドコンジュゲートを精製すること、を含む方法である。いくつかの実施態様では、短いペプチドはシスチンノットペプチド（ＣＫＰ）である。いくつかの実施態様では、ＣＫＰはＥＥＴＩ－ＩＩである。いくつかの実施態様では、短いペプチドは、（ａ）野生型ＣＫＰの対応する１つ若しくは複数のループ配列と比較して、１つ若しくは複数のループ配列における１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／若しくは置換；（ｂ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｎ末端での１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／若しくは置換；（ｃ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｃ末端での１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／若しくは置換；（ｄ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｎ末端での化学修飾；並びに／又は（ｅ）野生型ＣＫＰと比較してＣ末端での化学修飾を含むＣＫＰバリアントである。いくつかの実施態様では、ＣＫＰバリアントは、野生型ＣＫＰと比較して、そのＮ末端に追加のリジン残基を含む。いくつかの実施態様では、野生型ＣＫＰはＥＥＴＩ－ＩＩである。いくつかの実施態様では、前記膜形成脂質は、ペプチド－Ｃ４－２８脂肪酸アシルコンジュゲートと、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＯＰＳ、ＤＯＰＥ、ＤＰＰＣのうちの少なくとも１つ以上（例えば、ペプチド－Ｃ１６脂肪酸アシルコンジュゲートとＤＯＰＣ）を、１：３～１：１５、若しくは１：６～１：１２、若しくは１：９のモル比で含み；且つ／又は前記コンジュゲートは、１～１００、１０～９０、２０～８０、３０～７０、４０～６０、若しくは６０分子の前記短いペプチドを含む。いくつかの実施態様では、コンジュゲートは、少なくとも２つの異なるペプチド－Ｃ４－２８脂肪酸アシルコンジュゲートを含み、ここで、第１のペプチド－Ｃ４－２８脂肪酸アシルコンジュゲートは第１の短いペプチドを含み、第２のペプチド－Ｃ４－２８脂肪酸アシルは第１の短いペプチドとは異なる第２の短いペプチドを含む。いくつかの実施態様では、少なくとも２つのペプチド（例えば、シスチンノットペプチド）は、異なる標的、場合によって２つ、３つ、４つ、又は８つの異なる標的に結合する。いくつかの実施態様では、２つ以上の短いペプチドは、２つの異なる標的に結合する。いくつかの実施態様では、前記標的は、ＣＤ３及びＣＤ１９；ＣＤ３及びＥｐＣＡＭ；ＣＤ３及びＣＥＡ；ＣＤ１６及びＣＤ３０；ＣＤ１６及びＣＤ３３；Ａｎｇ－２及びＶＥＧＦ－Ａ；並びに第Ｘ因子及び第ＩＸａ因子からなる群から選択される対である。いくつかの実施態様では、短いペプチドは生物学的活性を有するＣＫＰ又はＣＫＰバリアントであり、前記活性の８０～９０％、９０～９５％、又は９５～９９％が前記コンジュゲートにおいて保持される。いくつかの実施態様では、前記膜形成脂質の１つ又は複数が、前記粒子の一方又は両方の表面上に官能化基を提示し；さらに、ｂ）ｐＨ４．５～６．５の範囲の低ｐＨで前記官能化基にコンジュゲートする、Ｃ末端に位置する相補的官能基を有する抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）に前記粒子を接触させる工程であって、ここで、前記工程ｂ）は、組み立てられていない膜形成脂質の一部若しくは全てを除去するための介在工程なしで；且つ／又は工程ａ）のペプチドコンジュゲートを濃縮するための介在工程なしで、前記工程ａ）に続いて行われる、接触させる工程を含む。いくつかの実施態様では、前記官能化基はマレイミド誘導体であり、前記官能基はシステインチオール基であり、場合によって、前記システインアミノ酸残基は、抗原結合ポリペプチドが由来する抗体においてヒンジジスルフィド結合を形成する（Ｃｙｓ－２２６又はＣｙｓ－２２７など）。いくつかの実施態様では、前記官能化基は、前記低ｐＨで前記足場タンパク質にコンジュゲートしない。いくつかの実施態様では、前記低ｐＨは、５．５～６．５のｐＨ、５～６のｐＨ、又は６のｐＨである。いくつかの実施態様では、スペーサーは前記官能化基を前記膜形成脂質に接続し、且つ／又はスペーサーは前記相補的官能基を前記抗原結合ポリペプチドに接続する。いくつかの実施態様では、前記スペーサーは、前記官能化基を前記膜形成脂質に接続するＰＥＧスペーサーである。いくつかの実施態様では、前記ＰＥＧスペーサーは、１０００～３０００、１５００～２５００、１９００～２２００、又は２０００のＭＷを有する。いくつかの実施態様では、前記コンジュゲートは、前記短いペプチドの活性又は結合活性を増加させる。いくつかの実施態様では、前記コンジュゲートは、１～１００分子の前記Ｆａｂを含み；場合によって、前記コンジュゲートは、５～３０、１０～２５、１５～２０、若しくは１８分子の前記ペプチド、及び５～４０、１０～３５、１５～３０、２０～２５、若しくは２３分子の前記抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）を含み；又は場合によって、前記コンジュゲートは、３～３０、５～２０、１０～１５、若しくは１３分子の前記ペプチド、及び１０～６０分子の前記抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）を含み；又は場合によって、前記コンジュゲートは、２０～８０、２５～７０、３０～６０、３５～５０、若しくは４０分子の前記ペプチド、及び１０～６０分子の前記抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）を含む。いくつかの実施態様では、コンジュゲート中の短いペプチドの活性は、抗原結合ポリペプチドを含まないコンジュゲート中のペプチドの活性よりも高い。いくつかの実施態様では、コンジュゲート中のペプチドの活性は、抗原結合ポリペプチドを含まないコンジュゲート中のペプチドの活性よりも２倍から１０倍高い。いくつかの実施態様では、コンジュゲート中のペプチドの活性は、抗原結合ポリペプチドを含まないコンジュゲート中のペプチドの活性よりも約５倍高い。
また、本明細書の方法のいずれかによるコンジュゲート生成物も提供される。
したがって、本発明の別の態様は、ナノリポタンパク質粒子と抗原結合ポリペプチドとのコンジュゲートを調製することにおいて脂質－足場タンパク質コンジュゲーションを低減させる方法を提供する。本方法は、ａ）足場タンパク質及び膜形成脂質を、前記足場タンパク質によって取り囲まれた膜形成脂質の脂質二重層を含むナノリポタンパク質粒子の組み立てを可能にする条件下で提供することであって、ここで、膜形成脂質の１つ又は複数が、粒子の一方又は両方の表面上に官能化基を提示する、提供すること；ｂ）足場タンパク質よりもむしろ官能基への官能化基のコンジュゲーションを促進する低ｐＨ（例えば、約５．５５～約６．５、約５～約６、又は約６のｐＨ）で、Ｃ末端に位置する相補的官能基を有する抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）に粒子を接触させること、を含み得る。いくつかの実施態様では、工程ｂ）は、組み立てられていない膜形成脂質の一部又は全てを除去するための介在工程なしで、工程ａ）に続いて行われる。特定の実施態様では、官能化基はマレイミド誘導体であり、官能基はシステインチオール基である（例えばシステインが、抗原結合ポリペプチドが由来する抗体においてヒンジジスルフィド結合を形成する場合（例えば、カバット番号付けによると、Ｃｙｓ－２２６又はＣｙｓ－２２７））。いくつかの実施態様では、前記膜形成脂質はＣ４－２８脂肪酸アシルであり、前記脂肪酸アシルは２０～６０アミノ酸の短いペプチドにコンジュゲートしている。いくつかの実施態様では、前記脂肪酸アシルはＣ１６脂肪酸アシルである。いくつかの実施態様では、前記短いペプチドはシスチンノットペプチド（ＣＫＰ）である。いくつかの実施態様では、ＣＫＰはＥＥＴＩ－ＩＩである。いくつかの実施態様では、短いペプチドは、（ａ）野生型ＣＫＰの対応する１つ若しくは複数のループ配列と比較して、１つ若しくは複数のループ配列における１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／若しくは置換；（ｂ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｎ末端での１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／若しくは置換；（ｃ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｃ末端での１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／若しくは置換；（ｄ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｎ末端での化学修飾；並びに／又は（ｅ）野生型ＣＫＰと比較してＣ末端での化学修飾を含むＣＫＰバリアントである。いくつかの実施態様では、前記膜形成脂質は、ペプチド－Ｃ４－２８脂肪酸アシルコンジュゲートと、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＯＰＳ、ＤＯＰＥ、ＤＰＰＣのうちの少なくとも１つ以上（例えば、ペプチド－Ｃ１６脂肪酸アシルコンジュゲートとＤＯＰＣ）を、１：３～１：１５、若しくは１：６～１：１２、若しくは１：９のモル比で含み；且つ／又は前記コンジュゲートは、１～１００、１０～９０、２０～８０、３０～７０、４０～６０、若しくは６０分子の前記短いペプチドを含む。
本発明の別の態様は、抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）の結合活性、活性、及び／又は効力を（ＮＬＰにコンジュゲートしていない場合の該ポリペプチドの結合活性、活性、及び／又は効力と比較して）増加させる方法を提供する。いくつかの実施態様では、方法は、ａ）足場タンパク質及び膜形成脂質を、前記足場タンパク質によって取り囲まれた前記膜形成脂質の脂質二重層を含むナノリポタンパク質粒子の（自己）組織化を可能にする条件下で提供することであって、ここで、前記膜形成脂質の１つ又は複数が、前記粒子の一方又は両方の表面上に官能化基を提示する、提供すること；ｂ）ｐＨ４．５～６．５の範囲の低ｐＨで前記官能化基にコンジュゲートする、Ｃ末端に位置する相補的官能基を有する抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）に前記粒子を接触させること；並びにｃ）場合によって、前記粒子と前記抗原結合ポリペプチドとのコンジュゲートを精製し、それにより抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）の結合活性、活性、及び／又は効力を（ＮＬＰにコンジュゲートしていない場合のポリペプチドの結合活性、活性、及び／又は効力と比較して）増加させることを含む。特定の実施態様では、抗原結合ポリペプチドはＦａｂ又はＦａｂ様分子である；特定の実施態様では、コンジュゲートは、少なくとも６分子、例えば、１０～６０、１５～３０、又は２０分子の抗原結合ポリペプチドを含む。いくつかの実施態様では、前記抗原結合ポリペプチドは、ＰＥＧスペーサーによって前記膜形成脂質に接続されたＦａｂ又はＦａｂ様分子であり；前記コンジュゲートは、１～１６０、１０～１２０、２０～１００、４０～８０、又は６０分子の前記抗原結合ポリペプチドを含む。いくつかの実施態様では、ＰＥＧスペーサーは、前記官能化基を前記膜形成脂質に接続し、１０００～３０００、１５００～２５００、１９００～２２００、又は２０００のＭＷを有する。いくつかの実施態様では、前記コンジュゲートは安定化されている。いくつかの実施態様では、コンジュゲートは、抗原結合ポリペプチドの数が少ないか又は全く含まない（例えば、７個未満のＦａｂ）コンジュゲートと比較して、７～６０、７～３２、４０～６０、又は５０分子の前記抗原結合ポリペプチドを含むコンジュゲートなど、安定化されている。いくつかの実施態様では、コンジュゲートは、異なる標的に結合する第２の抗原結合ポリペプチドの１つ又は複数の分子をさらに含み；且つ／又はコンジュゲートは、１００～３００ｍｇの前記コンジュゲートを含み、１０～５０ｃＰの粘度を有する液体製剤で提供される。
いくつかの実施態様では、前記膜形成脂質の１つ又は複数はＣ４－２８脂肪酸アシルであり、前記脂肪酸アシルは２０～６０アミノ酸の短いペプチドにコンジュゲートしており、本方法は、短いペプチドの結合活性、活性、及び／又は効力を増加させる。いくつかの実施態様では、前記脂肪酸アシルはＣ１６脂肪酸アシルである。いくつかの実施態様では、前記短いペプチドはシスチンノットペプチド（ＣＫＰ）である。いくつかの実施態様では、ＣＫＰはＥＥＴＩ－ＩＩである。いくつかの実施態様では、短いペプチドは、（ａ）野生型ＣＫＰの対応する１つ若しくは複数のループ配列と比較して、１つ若しくは複数のループ配列における１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／若しくは置換；（ｂ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｎ末端での１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／若しくは置換；（ｃ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｃ末端での１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／若しくは置換；（ｄ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｎ末端での化学修飾；並びに／又は（ｅ）野生型ＣＫＰと比較してＣ末端での化学修飾を含むＣＫＰバリアントである。いくつかの実施態様では、ＣＫＰバリアントは、野生型ＣＫＰと比較して、そのＮ末端に追加のリジン残基を含む。いくつかの実施態様では、野生型ＣＫＰはＥＥＴＩ－ＩＩである。いくつかの実施態様では、前記膜形成脂質は、ペプチド－Ｃ４－２８脂肪酸アシルコンジュゲートと、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＯＰＳ、ＤＯＰＥ、ＤＰＰＣのうちの少なくとも１つ以上（例えば、ペプチド－Ｃ１６脂肪酸アシルコンジュゲートとＤＯＰＣ）を、１：３～１：１５、若しくは１：６～１：１２、若しくは１：９のモル比で含み；且つ／又は前記コンジュゲートは、１～１００、１０～９０、２０～８０、３０～７０、４０～６０、若しくは６０分子の前記短いペプチドを含む。いくつかの実施態様では、コンジュゲートは、少なくとも２つの異なるペプチド－Ｃ４－２８脂肪酸アシルコンジュゲートを含み、ここで、第１のペプチド－Ｃ４－２８脂肪酸アシルコンジュゲートは第１の短いペプチドを含み、第２のペプチド－Ｃ４－２８脂肪酸アシルは第１の短いペプチドとは異なる第２の短いペプチドを含む。いくつかの実施態様では、前記少なくとも２つのペプチド（例えば、シスチンノットペプチド）は、異なる標的、場合によって２つ、３つ、４つ、又は８つの異なる標的に結合する。いくつかの実施態様では、前記２つ以上の短いペプチドは、２つの異なる標的に結合する。いくつかの実施態様では、前記標的は、ＣＤ３及びＣＤ１９；ＣＤ３及びＥｐＣＡＭ；ＣＤ３及びＣＥＡ；ＣＤ１６及びＣＤ３０；ＣＤ１６及びＣＤ３３；Ａｎｇ－２及びＶＥＧＦ－Ａ；並びに第Ｘ因子及び第ＩＸａ因子からなる群から選択される対である。いくつかの実施態様では、前記コンジュゲートは、１～１００分子の前記Ｆａｂを含み；場合によって、前記コンジュゲートは、５～３０、１０～２５、１５～２０、若しくは１８分子の前記ペプチド、及び５～４０、１０～３５、１５～３０、２０～２５、若しくは２３分子の前記抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）を含み；又は場合によって、前記コンジュゲートは、３～３０、５～２０、１０～１５、若しくは１３分子の前記ペプチド、及び１０～６０分子の前記抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）を含み；又は場合によって、前記コンジュゲートは、２０～８０、２５～７０、３０～６０、３５～５０、若しくは４０分子の前記ペプチド、及び１０～６０分子の前記抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）を含む。いくつかの実施態様では、コンジュゲート中の短いペプチドの活性は、抗原結合ポリペプチドを含まないコンジュゲート中のペプチドの活性よりも高い。いくつかの実施態様では、コンジュゲート中のペプチドの活性は、抗原結合ポリペプチドを含まないコンジュゲート中のペプチドの活性よりも２倍から１０倍高い。いくつかの実施態様では、コンジュゲート中のペプチドの活性は、抗原結合ポリペプチドを含まないコンジュゲート中のペプチドの活性よりも約５倍高い。
本発明の別の態様は、抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）の安定性、貯蔵寿命、及び／又は半減期を（ＮＬＰにコンジュゲートしていない場合の該ポリペプチドの結合活性、活性、及び／又は効力と比較して）増加させる方法を提供する。（抗原結合ポリペプチド、例えばＦａｂ又はＦａｂ様分子にコンジュゲートしていない場合のＮＬＰの増加する安定性、貯蔵寿命、及び／又は半減期と比較して）、ＮＬＰの安定性、貯蔵寿命、及び／又は半減期を増加させる方法も提供される。いくつかの実施態様では、方法は、ａ）足場タンパク質及び膜形成脂質を、前記足場タンパク質によって取り囲まれた前記膜形成脂質の脂質二重層を含むナノリポタンパク質粒子の（自己）組織化を可能にする条件下で提供することであって、ここで、前記膜形成脂質の１つ又は複数が、前記粒子の一方又は両方の表面上に官能化基を提示する、提供すること；ｂ）ｐＨ４．５～６．５の範囲の低ｐＨで前記官能化基にコンジュゲートする、Ｃ末端に位置する相補的官能基を有する抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）に前記粒子を接触させること；並びにｃ）場合によって、前記粒子と前記抗原結合ポリペプチドとのコンジュゲートを精製し、それにより抗原結合ポリペプチドの安定性、貯蔵寿命、及び／又は半減期を（ＮＬＰにコンジュゲートしていない場合、又はより少ない抗原結合ポリペプチド（例えば、７個未満のＦａｂ）を有するＮＬＰに結合した場合の該ポリペプチドの安定性、貯蔵寿命、及び／又は半減期と比較して）増加させることを含む。いくつかの実施態様では、コンジュゲートは、５～６０分子の前記抗原結合ポリペプチドを含む。特定の実施態様では、抗原結合ポリペプチドはＦａｂ又はＦａｂ様分子である；特定の実施態様では、コンジュゲートは、７～３２分子の抗原結合ポリペプチドを含む。
いくつかの実施態様では、膜形成脂質の１つ又は複数はＣ４－２８脂肪酸アシルであり、前記脂肪酸アシルは２０～６０アミノ酸の短いペプチドにコンジュゲートしている。いくつかの実施態様では、前記脂肪酸アシルはＣ１６脂肪酸アシルである。
また提供されるのは、長さが２０～６０アミノ酸である短いペプチドの安定性、貯蔵寿命、及び／又は半減期を増加させる方法であって、ａ）足場タンパク質及び膜形成脂質を、前記足場タンパク質によって取り囲まれた前記膜形成脂質の脂質二重層を含むナノリポタンパク質粒子の（自己）組織化を可能にする条件下で提供することであって、前記膜形成脂質の１つ又は複数は、Ｃ４－２８脂肪酸アシル（例えば、Ｃ１６脂肪酸アシル）を含み、脂肪酸アシルは、前記短いペプチドにコンジュゲートしている、提供すること；及び場合によってペプチドコンジュゲートを精製すること；ｂ）前記膜形成脂質の１つ又は複数を、前記粒子の一方又は両方の表面上に存在する官能化基へと修飾すること；ｃ）ｐＨ４．５～６．５の範囲の低ｐＨで前記官能化基にコンジュゲートする、Ｃ末端に位置する相補的官能基を有する抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）に前記粒子を接触させることを含み；ここで、前記工程ｃ）は、組み立てられていない膜形成脂質の一部若しくは全てを除去するための介在工程なしで；且つ／又は工程ｂ）のペプチドコンジュゲートを濃縮するための介在工程なしで、前記工程ｂ）に続いて行われる、方法である。いくつかの実施態様では、スペーサーは前記官能化基を前記膜形成脂質に接続し、且つ／又はスペーサーは前記相補的官能基を前記抗原結合ポリペプチドに接続し、それにより前記短いペプチドの安定性、貯蔵寿命、及び／又は半減期を増加させる。いくつかの実施態様では、脂肪酸アシルはＣ１６脂肪酸アシルである。
いくつかの実施態様では、前記短いペプチドはシスチンノットペプチド（ＣＫＰ）である。いくつかの実施態様では、ＣＫＰはＥＥＴＩ－ＩＩである。いくつかの実施態様では、短いペプチドは、（ａ）野生型ＣＫＰの対応する１つ若しくは複数のループ配列と比較して、１つ若しくは複数のループ配列における１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／若しくは置換；（ｂ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｎ末端での１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／若しくは置換；（ｃ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｃ末端での１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／若しくは置換；（ｄ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｎ末端での化学修飾；並びに／又は（ｅ）野生型ＣＫＰと比較してＣ末端での化学修飾を含むＣＫＰバリアントである。いくつかの実施態様では、ＣＫＰバリアントは、野生型ＣＫＰと比較して、そのＮ末端に追加のリジン残基を含む。いくつかの実施態様では、野生型ＣＫＰはＥＥＴＩ－ＩＩである。
いくつかの実施態様では、前記膜形成脂質は、ペプチド－Ｃ４－２８脂肪酸アシルコンジュゲートと、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＯＰＳ、ＤＯＰＥ、ＤＰＰＣのうちの少なくとも１つ以上（例えば、ペプチド－Ｃ１６脂肪酸アシルコンジュゲートとＤＯＰＣ）を、１：３～１：１５、若しくは１：６～１：１２、若しくは１：９のモル比で含み；且つ／又は前記コンジュゲートは、１～１００、１０～９０、２０～８０、３０～７０、４０～６０、若しくは６０分子の前記短いペプチドを含む。
いくつかの実施態様では、前記抗原結合ポリペプチドは、Ｆａｂ若しくはＦａｂ様分子であり、且つ／又は前記コンジュゲートは、５～６０、６～４０、７～３２、４０～６０、若しくは５０分子の前記抗原結合ポリペプチド（例えば、前記Ｆａｂ）を含む。いくつかの実施態様では、コンジュゲートは、１～１００分子の前記Ｆａｂを含み；場合によって、前記コンジュゲートは、５～３０、１０～２５、１５～２０、若しくは１８分子の前記ペプチド、及び５～４０、１０～３５、１５～３０、２０～２５、若しくは２３分子の前記抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）を含み；又は場合によって、前記コンジュゲートは、３～３０、５～２０、１０～１５、若しくは１３分子の前記ペプチド、及び１０～６０分子の前記抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）を含み；又は場合によって、前記コンジュゲートは、２０～８０、２５～７０、３０～６０、３５～５０、若しくは４０分子の前記ペプチド、及び１０～６０分子の前記抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）を含む。
結合活性、活性、効力、安定性、貯蔵寿命、及び／又は半減期を増加させるための方法のいくつかの実施態様では、コンジュゲートは、生物学的活性剤又は検出可能な薬剤をさらに含む。特定の実施態様では、生物学的活性剤は、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキセート、ビンデシン、放射性核種、ジフテリア毒素、リシン、ゲルダナマイシン、メイタンシノイド、カリケアマイシン、又はそれらのいずれか１つ又は複数の組み合わせからなる群から選択される細胞傷害性剤である。いくつかの実施態様では、検出可能な薬剤は、放射性同位元素、フルオロフォア、化学発光色素、発色団、酵素、金属イオン、ナノ粒子、及びそれらのいずれか１つ又は複数の組み合わせからなる群から選択される標識である。いくつかの実施態様では、コンジュゲートは液体製剤で提供され、前記製剤は、１００～３００ｍｇの前記コンジュゲートを含み、１０～５０ｃＰの粘度を有する。
本発明の他の態様は、医薬としての使用のための；がん又は眼障害の治療における使用のための；がん又は眼障害の治療のための医薬の製造における；並びに／又は血管新生及び／若しくは腫瘍増殖を阻害するための医薬の製造における、本明細書で提供されるコンジュゲート、薬学的組成物又は製剤を提供する。
本発明の別の態様は、抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）及び／又は短いペプチドで個体を治療する方法であって、本明細書で提供されるコンジュゲート、薬学的組成物、又は製剤の有効量を個体に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施態様では、この方法は、追加の治療剤を個体に投与することをさらに含む。
さらに別の態様は、抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）をそれを必要とする個体に送達する方法であって、個体に投与するための本発明のコンジュゲート、薬学的組成物、又は製剤を提供することを含む方法を提供する。有利なことに、抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）は、コンジュゲートが、膜形成脂質上の官能化基と抗原結合ポリペプチド上のＣ末端に位置する相補的官能基とを介して、５～６０分子の抗原結合ポリペプチド（例えば、５～６０のＦａｂ分子）にコンジュゲートしている膜形成脂質を含む場合など、強力で安定した液体製剤で送達することができる。いくつかの実施態様では、スペーサーは官能化基を膜形成脂質に接続し、及び／又はスペーサーは相補的官能基を抗原結合ポリペプチドに接続する。有利なことに、抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）は、１０～５０ｃＰの粘度及び１００～３００ｍｇのコンジュゲート／ｍＬの濃度を有する液体製剤などの強力な低粘度製剤で送達することができる。
抗原結合ポリペプチドを送達するための方法のいくつかの実施態様では、抗原結合ポリペプチドは、Ｄ因子、ＶＥＧＦ、Ｔｉｅ２、ＤＲ４、及びそれらのいずれか１つ又は複数の組み合わせからなる群から選択される標的に結合するＦａｂであり；製剤は眼球送達を介して投与される。抗原結合ポリペプチドを送達するための方法のいくつかの実施態様では、抗原結合ポリペプチドは、ＯＸ４０、ＤＲ４、ＧＩＴＲ、Ｔｉｅ２、Ｄ因子、ＶＥＧＦ、ＭｅｒＴＫ、ＣＤ３、リンホトキシンベータ受容体、及びそれらのいずれか１つ又は複数の組み合わせからなる群から選択される標的に結合するＦａｂである。特定の実施態様では、抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）は、少なくとも２つの異なる標的に結合し、例えば、２つの異なる標的は、ＣＤ３及びＣＤ１９；ＣＤ３及びＥｐＣＡＭ；ＣＤ３及びＣＥＡ；ＣＤ１６及びＣＤ３０；ＣＤ１６及びＣＤ３３；Ａｎｇ－２及びＶＥＧＦ－Ａ；並びに第Ｘ因子及び第ＩＸａ因子からなる群から選択される対である。
また、本明細書で提供されるのは、２０～６０アミノ酸長の短いペプチドを、強力で安定した液体製剤で、それを必要とする個体に送達する方法であって、
前記抗原結合ポリペプチド（例えば、前記Ｆａｂ）とナノリポタンパク質粒子とのコンジュゲートを含む液体製剤を個体に投与することを含み；ここで、前記ナノリポタンパク質粒子は、膜形成脂質の二重脂質層を取り囲む足場タンパク質を含み；前記膜形成脂質の１つ又は複数はＣ４－２８脂肪酸アシルであり、前記脂肪酸アシルは２０～６０アミノ酸の短いペプチドにコンジュゲートしており；前記膜形成脂質は、前記膜形成脂質上の官能化基と前記抗原結合ポリペプチド上のＣ末端に位置する相補的官能基とを介して、５～１００分子の前記抗原結合ポリペプチドにコンジュゲートしており；場合によって、スペーサーが前記官能化基を前記膜形成脂質に接続し、且つ／又はスペーサーが前記相補的官能基を前記抗原結合ポリペプチドに接続し、それにより前記抗原結合ポリペプチドを安定した液体製剤で個体に送達する、方法である。
また、提供されるのは、２０～６０アミノ酸長の短いペプチドを、それを必要とする個体に、強力な低粘度製剤で送達する方法であって、前記抗原結合ポリペプチド（例えば、前記Ｆａｂ）とナノリポタンパク質粒子とのコンジュゲートを含む液体製剤を個体に投与することを含み；ここで、前記ナノリポタンパク質粒子は、膜形成脂質の二重脂質層を取り囲む足場タンパク質を含み；前記膜形成脂質の１つ又は複数はＣ４－２８脂肪酸アシルであり、前記脂肪酸アシルは２０～６０アミノ酸の短いペプチドにコンジュゲートしており；前記膜形成脂質の１つ又は複数は、前記１つ又は複数の膜形成脂質上の官能化基と前記抗原結合ポリペプチド上のＣ末端に位置する相補的官能基とを介して前記抗原結合ポリペプチドにコンジュゲートしており；場合によって、スペーサーが前記官能化基を前記膜形成脂質に接続し、且つ／又はスペーサーが前記相補的官能基を前記抗原結合ポリペプチドに接続し；前記液体製剤は、１０～５０ｃＰの粘度及び１００～３００ｍｇの前記コンジュゲート／ｍＬの濃度を有し、それにより前記抗原結合ポリペプチドを低粘度製剤で個体に送達する、方法である。
送達方法のいくつかの実施態様では、前記脂肪酸アシルはＣ１６脂肪酸アシルである。いくつかの実施態様では、前記短いペプチドはシスチンノットペプチド（ＣＫＰ）である。いくつかの実施態様では、ＣＫＰはＥＥＴＩ－ＩＩである。いくつかの実施態様では、短いペプチドは、（ａ）野生型ＣＫＰの対応する１つ若しくは複数のループ配列と比較して、１つ若しくは複数のループ配列における１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／若しくは置換；（ｂ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｎ末端での１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／若しくは置換；（ｃ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｃ末端での１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／若しくは置換；ｄ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｎ末端での化学修飾；並びに／又は（ｅ）野生型ＣＫＰと比較してＣ末端での化学修飾を含むＣＫＰバリアントである。いくつかの実施態様では、ＣＫＰバリアントは、野生型ＣＫＰと比較して、そのＮ末端に追加のリジン残基を含む。いくつかの実施態様では、野生型ＣＫＰはＥＥＴＩ－ＩＩである。いくつかの実施態様では、前記膜形成脂質は、ペプチド－Ｃ４－２８脂肪酸アシルコンジュゲートと、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＯＰＳ、ＤＯＰＥ、ＤＰＰＣのうちの少なくとも１つ以上（例えば、ペプチド－Ｃ１６脂肪酸アシルコンジュゲートとＤＯＰＣ）を、１：３～１：１５、若しくは１：６～１：１２、若しくは１：９のモル比で含み；且つ／又は前記コンジュゲートは、１～１００、１０～９０、２０～８０、３０～７０、４０～６０、若しくは６０分子の前記短いペプチドを含む。いくつかの実施態様では、コンジュゲート中の短いペプチドの活性は、抗原結合ポリペプチドを含まないコンジュゲート中のペプチドの活性よりも高い。いくつかの実施態様では、コンジュゲート中のペプチドの活性は、抗原結合ポリペプチドを含まないコンジュゲート中のペプチドの活性よりも２倍から１０倍高い。いくつかの実施態様では、コンジュゲート中のペプチドの活性は、抗原結合ポリペプチドを含まないコンジュゲート中のペプチドの活性よりも約５倍高い。いくつかの実施態様では、前記コンジュゲートは、１～１００分子の前記Ｆａｂを含み；場合によって、前記コンジュゲートは、５～３０、１０～２５、１５～２０、若しくは１８分子の前記ペプチド、及び５～４０、１０～３５、１５～３０、２０～２５、若しくは２３分子の前記抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）を含み；又は場合によって、前記コンジュゲートは、３～３０、５～２０、１０～１５、若しくは１３分子の前記ペプチド、及び１０～６０分子の前記抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）を含み；又は場合によって、前記コンジュゲートは、２０～８０、２５～７０、３０～６０、３５～５０、若しくは４０分子の前記ペプチド、及び１０～６０分子の前記抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）を含む。いくつかの実施態様では、前記スペーサーは、前記官能化基を前記膜形成脂質に接続するＰＥＧスペーサーである。いくつかの実施態様では、ＰＥＧスペーサーは、１０００～３０００、１５００～２５００、１９００～２２００、又は２０００のＭＷを有する。いくつかの実施態様では、前記抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）及び前記短いペプチドはそれぞれ同じ標的に結合する。いくつかの実施態様では、前記抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）及び前記シスチンノットペプチドは、それぞれ異なる標的に結合する。いくつかの実施態様では、前記抗原結合ポリペプチドは、Ｄ因子、ＶＥＧＦ、Ｔｉｅ２、ＤＲ４、及びそれらのいずれか１つ又は複数の組み合わせからなる群から選択される標的に結合するＦａｂであり；前記製剤は眼球送達を介して投与される。いくつかの実施態様では、前記短いペプチドは、Ｄ因子、ＶＥＧＦ、Ｔｉｅ２、ＤＲ４、及びそれらのいずれか１つ又は複数の組み合わせからなる群から選択される標的に結合する。いくつかの実施態様では、前記抗原結合ポリペプチドは、ＯＸ４０、ＤＲ４、ＧＩＴＲ、Ｔｉｅ２、Ｄ因子、ＶＥＧＦ、ＭｅｒＴＫ、ＣＤ３、リンホトキシンベータ受容体、及びそれらのいずれか１つ又は複数の組み合わせからなる群から選択される標的に結合するＦａｂである。いくつかの実施態様では、前記短いペプチドは、ＯＸ４０、ＤＲ４、ＧＩＴＲ、Ｔｉｅ２、Ｄ因子、ＶＥＧＦ、ＭｅｒＴＫ、ＣＤ３、リンホトキシンベータ受容体、及びそれらのいずれか１つ又は複数の組み合わせからなる群から選択される標的に結合する。いくつかの実施態様では、前記抗原結合ポリペプチドは、少なくとも２つの異なる標的に結合する。いくつかの実施態様では、前記２つの異なる標的は、ＣＤ３及びＣＤ１９；ＣＤ３及びＥｐＣＡＭ；ＣＤ３及びＣＥＡ；ＣＤ１６及びＣＤ３０；ＣＤ１６及びＣＤ３３；Ａｎｇ－２及びＶＥＧＦ－Ａ；並びに第Ｘ因子及び第ＩＸａ因子からなる群から選択される対である。いくつかの実施態様では、前記短いペプチド及び前記抗原結合ポリペプチドは、少なくとも２つの異なる標的に結合する。いくつかの実施態様では、前記２つの異なる標的は、ＣＤ３及びＣＤ１９；ＣＤ３及びＥｐＣＡＭ；ＣＤ３及びＣＥＡ；ＣＤ１６及びＣＤ３０；ＣＤ１６及びＣＤ３３；Ａｎｇ－２及びＶＥＧＦ－Ａ；並びに第Ｘ因子及び第ＩＸａ因子からなる群から選択される対である。
さらに別の態様は、生物学的活性剤又は検出可能な薬剤を、それを必要とする個体に安定した液体製剤で送達する方法であって、本発明のコンジュゲート及び生物学的活性剤又は検出可能な薬剤を含む液体製剤を個体に投与することを含み、ここで、コンジュゲートは、膜形成脂質上の官能化基と抗原結合ポリペプチドのＣ末端に位置する相補的官能基とを介して、５～６０分子の抗原結合ポリペプチド（例えば、５～６０個のＦａｂ分子）にコンジュゲートしている膜形成脂質を含み；生物学的活性剤又は検出可能な薬剤は、コンジュゲートの足場タンパク質、膜形成脂質及び／又は抗原結合ポリペプチドにコンジュゲートしている、方法を提供する。いくつかの実施態様では、スペーサーは官能化基を膜形成脂質に接続し、及び／又はスペーサーは相補的官能基を抗原結合ポリペプチドに接続する。
さらに別の態様は、生物学的活性剤又は検出可能な薬剤を、それを必要とする個体に低粘度製剤で送達する方法であって、本発明のコンジュゲート及び生物学的活性剤又は検出可能な薬剤を含む液体製剤を個体に投与することを含み、ここで、生物学的活性剤又は検出可能な薬剤は、コンジュゲートの足場タンパク質、膜形成脂質、及び／又は抗原結合ポリペプチドにコンジュゲートしており；液体製剤は１０～５０ｃＰの粘度及び１００～３００ｍｇのコンジュゲート／ｍＬの濃度を有する、方法を提供する。いくつかの実施態様では、スペーサーは官能化基を膜形成脂質に接続し、及び／又はスペーサーは相補的官能基を抗原結合ポリペプチドに接続する。
さらに別の態様は、生物学的活性剤又は検出可能な薬剤を、それを必要とする個体の脳又は中枢神経系に送達する方法であって、本発明のコンジュゲート及び生物学的活性剤又は検出可能な薬剤を含む液体製剤を個体に全身投与することを含み、ここで、生物学的活性剤又は検出可能な薬剤は、足場タンパク質、膜形成脂質、及び／又は抗原結合ポリペプチドにコンジュゲートしており；コンジュゲートは血液脳関門を通過して移動する、方法を提供する。いくつかの実施態様では、スペーサーは官能化基を膜形成脂質に接続し、及び／又はスペーサーは相補的官能基を抗原結合ポリペプチドに接続する。特定の実施態様では、足場タンパク質はａｐｏＥ２及び／又はａｐｏＥ４である。特定の実施態様では、液体製剤は、静脈内投与される。
いくつかの実施態様では、前記膜形成脂質の１つ又は複数はＣ４－２８脂肪酸アシルであり、前記脂肪酸アシルは２０～６０アミノ酸の短いペプチドにコンジュゲートしている。いくつかの実施態様では、前記脂肪酸アシルはＣ１６脂肪酸アシルである。いくつかの実施態様では、前記短いペプチドはシスチンノットペプチド（ＣＫＰ）である。いくつかの実施態様では、ＣＫＰはＥＥＴＩ－ＩＩである。いくつかの実施態様では、短いペプチドは、（ａ）野生型ＣＫＰの対応する１つ若しくは複数のループ配列と比較して、１つ若しくは複数のループ配列における１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／若しくは置換；（ｂ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｎ末端での１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／若しくは置換；（ｃ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｃ末端での１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／若しくは置換；ｄ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｎ末端での化学修飾；並びに／又は（ｅ）野生型ＣＫＰと比較してＣ末端での化学修飾を含むＣＫＰバリアントである。いくつかの実施態様では、ＣＫＰバリアントは、野生型ＣＫＰと比較して、そのＮ末端に追加のリジン残基を含む。いくつかの実施態様では、野生型ＣＫＰはＥＥＴＩ－ＩＩである。いくつかの実施態様では、前記膜形成脂質は、ペプチド－Ｃ４－２８脂肪酸アシルコンジュゲートと、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＯＰＳ、ＤＯＰＥ、ＤＰＰＣのうちの少なくとも１つ以上（例えば、ペプチド－Ｃ１６脂肪酸アシルコンジュゲートとＤＯＰＣ）を、１：３～１：１５、若しくは１：６～１：１２、若しくは１：９のモル比で含み；且つ／又は前記コンジュゲートは、１～１００、１０～９０、２０～８０、３０～７０、４０～６０、若しくは６０分子の前記短いペプチドを含む。いくつかの実施態様では、前記スペーサーは、前記官能化基を前記膜形成脂質に接続するＰＥＧスペーサーである。いくつかの実施態様では、前記ＰＥＧスペーサーは、１０００～３０００、１５００～２５００、１９００～２２００、又は２０００のＭＷを有する。
生物学的活性剤又は検出可能な薬剤を送達するための方法のいくつかの実施態様では、抗原結合ポリペプチドは、Ｆａｂ又はＦａｂ様分子である。特定の実施態様では、生物学的活性剤は、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキセート、ビンデシン、放射性核種、ジフテリア毒素、リシン、ゲルダナマイシン、メイタンシノイド、カリケアマイシン、又はそれらのいずれか１つ又は複数の組み合わせからなる群から選択される細胞傷害性剤である。いくつかの実施態様では、検出可能な薬剤は、放射性同位元素、フルオロフォア、化学発光色素、発色団、酵素、金属イオン、ナノ粒子、及びそれらのいずれか１つ又は複数の組み合わせからなる群から選択される標識である。特定の実施態様では、膜形成脂質は、５～６０分子の抗原結合ポリペプチドにコンジュゲートしている。有利には、液体製剤は、１０～５０ｃＰの粘度及び１００～３００ｍｇのコンジュゲート／ｍＬの濃度を有し得る。
いくつかの実施態様では、液体製剤は、静脈内投与される。いくつかの実施態様では、前記膜形成脂質は、前記膜形成脂質上の官能化基と前記抗原結合ポリペプチド上のＣ末端に位置する相補的官能基とを介して、５～１００分子の前記抗原結合ポリペプチドにコンジュゲートしている。いくつかの実施態様では、前記抗原結合ポリペプチドはＦａｂであり、前記ＦａｂはＰＥＧスペーサーを介して前記膜形成脂質に接続している。いくつかの実施態様では、前記ＰＥＧスペーサーは、前記官能化基を前記膜形成脂質に接続し、１０００～３０００、１５００～２５００、１９００～２２００、又は２０００のＭＷを有する。いくつかの実施態様では、前記液体製剤は、１０～５０ｃＰの粘度及び１００～３００ｍｇの前記コンジュゲート／ｍＬの濃度を有する。
別の態様は、例えば、抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）を標的細胞に送達するための、本明細書に記載の方法を実施するためのシステム又はキットを提供する。いくつかの実施態様では、システム又はキットは、システム又はキットの１つ又は複数のコンパートメントにおいて、本明細書のＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲート又はペプチド－ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲート、本明細書の薬学的組成物、又は本明細書の製剤を調製するための１つ又は複数の成分を含む。いくつかの実施態様では、本発明の方法に従ってコンジュゲート、組成物、若しくは製剤を調製するため、又は抗原結合ポリペプチドを送達する際にそれらを使用するための説明書が提供される。特定の実施態様では、抗原結合タンパク質は、Ｆａｂ又はＦａｂ様分子である。
また、２０～６０アミノ酸の短いペプチド（例えば、シスチンノットペプチド）を標的細胞に送達するためのシステム又はキットであって、本明細書のペプチド－ＮＬＰコンジュゲート、本明細書の薬学的組成物、又は本明細書の製剤を調製するための１つ又は複数の成分を含むシステム又はキットも提供され、ここで、前記成分は、前記キット又はシステムの１つ又は複数のコンパートメント中に提供され、場合によって、前記コンジュゲート又は組成物を調製するための説明書及び／又は前記短いペプチド（例えば、前記シスチンノットペプチド）を送達するための説明書が提供される。
関連する態様では、脂質ベースのナノ粒子の表面に結合した短いペプチドの生物学的活性を増加させる方法であって、（ａ）その表面に結合した短いペプチドを含む脂質ベースのナノ粒子を提供することであって、脂質ベースのナノ粒子の１つ又は複数の脂質が官能化基を提示する、提供すること、及び（ｂ）ナノ粒子を、官能基を有するポリペプチドと、前記官能化基の前記官能基へのコンジュゲーションを促進する条件下で接触させること、を含む方法が提供される。いくつかの実施態様では、方法は、脂質ベースのナノ粒子、短いペプチド、及びポリペプチドを含むコンジュゲートを精製することをさらに含む。いくつかの実施態様では、脂質ベースのナノ粒子は脂質二重層を含む。いくつかの実施態様では、脂質ベースのナノ粒子は、リポソーム、固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）、又はナノ構造脂質担体（ＮＬＣ）である。いくつかの実施態様では、スペーサーは前記官能化基を脂質ベースのナノ粒子の表面上の脂質に接続し、且つ／又はスペーサーは前記相補的官能基を前記ポリペプチドに接続する。いくつかの実施態様では、ポリペプチドは抗原結合ポリペプチドである。いくつかの実施態様では、抗原結合ポリペプチドは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ＶＨ－ＶＨ二量体、ＶＬ－ＶＬ二量体、ＶＨ－ＶＬ二量体、単一ドメイン、ダイアボディ、直鎖状抗体、及びそれらのいずれか１つ又は複数の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施態様では、短いペプチドは、ＣＫＰであるか、又は（ａ）野生型ＣＫＰの対応する１つ若しくは複数のループ配列と比較して、１つ若しくは複数のループ配列における１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／若しくは置換；（ｂ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｎ末端での１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／若しくは置換；（ｃ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｃ末端での１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／若しくは置換；ｄ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｎ末端での化学修飾；並びに／又は（ｅ）野生型ＣＫＰと比較してＣ末端での化学修飾を含むＣＫＰのバリアントである。いくつかの実施態様では、ポリペプチドのコンジュゲーション後の短いペプチドの活性は、ポリペプチドの脂質ベースのナノ粒子へのコンジュゲーション前の短いペプチドの活性と比較して、ポリペプチドの脂質ベースのナノ粒子へのコンジュゲーション後に２倍～１００倍高い。
本特許又は出願ファイルには、カラーで作成された少なくとも１つの図面が含まれている。１つ又は複数のカラー図面を含む本特許又は特許出願公開のコピーは、申請に応じて、必要な手数料を支払うことにより、特許庁から提供されるであろう。
図１Ａ～１Ｄは、ＮＬＰの組み立てに対するＤＯＰＥ－ＭＣＣの効果を示している。図１Ａは、ＤＯＰＥ－ＭＣＣ ＮＬＰの組み立てとＦａｂのコンジュゲーションの模式図を示している。 図１Ａ～１Ｄは、ＮＬＰの組み立てに対するＤＯＰＥ－ＭＣＣの効果を示している。図１Ｂは、ＮＬＰ中のモル％ ＤＯＰＥ－ＭＣＣの関数として、ＮＬＰ ＳＥＣピークを横切るＭＷ及びＲｈのＭＡＬＳ／ＱＥＬＳ分析を示している。 図１Ａ～１Ｄは、ＮＬＰの組み立てに対するＤＯＰＥ－ＭＣＣの効果を示している。図１Ｃは、ａｐｏＥ４２２ｋ単独（丸）、ｐＨ７．４で組み立てられたＮＬＰ（平坦線）、及びｐＨ６．０で組み立てられたＮＬＰ（三角）のＴＩＣクロマトグラムを示している。 図１Ａ～１Ｄは、ＮＬＰの組み立てに対するＤＯＰＥ－ＭＣＣの効果を示している。図１Ｄは、ａｐｏＥ４２２ｋ単独（丸）、ｐＨ７．４で組み立てられたＮＬＰ（平坦線）、及びｐＨ６．０で組み立てられたＮＬＰ（三角）について、１Ｄに示されているピークＴＩＣスペクトルからデコンボリューションされた質量を示している。 図２Ａ～２Ｃは、Ｆａｂ－ＮＬＰコンジュゲーション、精製、及び特徴づけを示している。図２Ａは、Ｆａｂ対ＮＬＰ比が２０でのコンジュゲーション後のＦａｂ－ＮＬＰのＳＥＣ精製を示している。１番目のピークはＦａｂ－ＮＬＰコンジュゲートに対応し、２番目はＦａｂ二量体に対応し、３番目は遊離非コンジュゲートＦａｂに対応する。挿入図は、Ｆａｂ－ＮＬＰピークの拡大図を示しており、ＱＥＬＳからのＲｈがピークを横切って重ねられている。左のｙ軸は吸光度で、右のｙ軸は、ピークを横切るＦａｂ－ＮＬＰコンジュゲートの異なる画分のＲｈである。 図２Ａ～２Ｃは、Ｆａｂ－ＮＬＰコンジュゲーション、精製、及び特徴づけを示している。図２Ｂは、遊離Ｆａｂ（丸）及びＦａｂ－ＮＬＰコンジュゲート（三角）のＴＩＣクロマトグラムを示している。 図２Ａ～２Ｃは、Ｆａｂ－ＮＬＰコンジュゲーション、精製、及び特徴づけを示している。図２Ｃは、遊離Ｆａｂ（丸）及びＦａｂ－ＮＬＰコンジュゲート（三角）について、図２Ｃに示されているピークＴＩＣスペクトルからデコンボリューションされた質量を示している。 図３Ａ～３Ｄは、Ｆａｂ負荷の最適化を示している。図３Ａは、増加するＦａｂ濃度で組み立てられたＦａｂ－ＮＬＰコンジュゲートのＳＥＣ精製クロマトグラムを示している。 図３Ａ～３Ｄは、Ｆａｂ負荷の最適化を示している。図３Ｂは、コンジュゲーション反応におけるＦａｂ濃度の関数として、ＮＬＰ当たりのＦａｂの数（Ｆａｂ：ＮＬＰ）を示している。 図３Ａ～３Ｄは、Ｆａｂ負荷の最適化を示している。図３Ｃは、Ｆａｂ－ＮＬＰコンジュゲートのＭＷを、ＮＬＰ当たりのＦａｂの数（Ｆａｂ：ＮＬＰ）の関数として示している。 図３Ａ～３Ｄは、Ｆａｂ負荷の最適化を示している。図３Ｄは、Ｆａｂ－ＮＬＰコンジュゲートのＲｈを、ＮＬＰ当たりのＦａｂの数（Ｆａｂ：ＮＬＰ）の関数として示している。 図４Ａ～４ＢはＦａｂ－ＮＬＰの製剤を示している。図４Ａは、遊離Ｆａｂ単独（丸）、Ｆａｂ－ＮＬＰコンジュゲート（四角）、及びＦａｂ－ＰＥＧコンジュゲート（三角）の粘度とＦａｂ濃度の関係を示している。 図４Ａ～４ＢはＦａｂ－ＮＬＰの製剤を示している。図４Ｂは、凍結乾燥前後のＦａｂ－ＮＬＰコンジュゲートのＲｈ及びＭＷの分析を示している。左のｙ軸と灰色のバーはＭＷで、右のｙ軸と黒いバーはＲｈである。 図５Ａ～５ＤはＦａｂ－ＮＬＰの活性を示している。図５Ａは、Ｂ因子切断のＤ因子ＦＲＥＴアッセイにおける、抗Ｄ因子Ｆａｂ単独の活性（十字）、ＮＬＰにコンジュゲートした活性（Ｆａｂ－ＮＬＰ、四角）、凍結乾燥及び再構成後にＮＬＰにコンジュゲートした活性（三角）、並びに陰性Ｆａｂ対照（丸）の活性を示している。四通りの平均及び標準偏差が示され、データはｎ＝３の独立した実験を表している。 図５Ａ～５ＤはＦａｂ－ＮＬＰの活性を示している。図５Ｂは、抗ＯＸ４０ｆａｂ濃度の関数としてプロットされた０～２９．４の範囲のＦａｂ価数でＮＬＰプラットフォームにコンジュゲートしたときの抗ＯＸ４０のアゴニスト活性を示している。抗ＯＸ４０ ｈｕＩｇＧ１を陰性対照として使用した。三通りの平均及び標準偏差が示されている。 図５Ａ～５ＤはＦａｂ－ＮＬＰの活性を示している。図５Ｃは、ＮＬＰ濃度の関数としてプロットされた０～２９．４の範囲のＦａｂ価数でＮＬＰプラットフォームにコンジュゲートしたときの抗ＯＸ４０のアゴニスト活性を示している。抗ＯＸ４０ ｈｕＩｇＧ１を陰性対照として使用した。三通りの平均及び標準偏差が示されている。 図５Ａ～５ＤはＦａｂ－ＮＬＰの活性を示している。図５Ｄは、異なるＦａｂ－ＮＬＰ価数で図５Ｃの曲線適合から計算されたＥＣ５０値を示している。 図６Ａ～６Ｂは、５０％血清中のＦａｂ－ＮＬＰコンジュゲートの安定性を示している。図６Ａは、５０％血清中でのインキュベーション後の様々な時点でのＮＬＰのＳＥＣトレースを示している。主要ＮＬＰピークの左側の肩は、血清のバックグラウンド吸光度によるものであり、その後の分析において差し引かれた。 図６Ａ～６Ｂは、５０％血清中のＦａｂ－ＮＬＰコンジュゲートの安定性を示している。図６Ｂは、異なるＦａｂ負荷密度からなるＦａｂ－ＮＬＰコンジュゲートのＦａｂ－ＮＬＰ分解を時間の関数として示している。これらの曲線は、時間０時間でのＦａｂ－ＮＬＰピーク面積に正規化することによって生成された。 図７Ａ～７Ｂは、Ｆａｂ－ＮＬＰコンジュゲートのタンパク質組成の定量化を示している。図７Ａは、Ｆａｂ－ＮＬＰコンジュゲートのＨＰＬＣトレースを示している。ａｐｏＥ４２２ｋとＦａｂにそれぞれ対応する４．９５分と５．１５分に２つのピークが観察された。 図７Ａ～７Ｂは、Ｆａｂ－ＮＬＰコンジュゲートのタンパク質組成の定量化を示している。図７Ｂは、異なる注入量でのａｐｏＥ４２２ｋのＨＰＬＣトレース（左パネル）と対応する標準曲線（右パネル）を示している。ａｐｏＥ４２２ｋ標準曲線を使用して、Ｆａｂ－ＮＬＰコンジュゲートのａｐｏＥ４２２ｋ濃度を決定した。 図８Ａ～８Ｂは、ＮＬＰの組み立てに対するＤＯＰＥ－ＭＣＣの効果を示している。図８Ａは、ＤＯＰＥ－ＭＣＣのモル濃度を増加させて組み立てたＮＬＰのＳＥＣ分析を示している。 図８Ａ～８Ｂは、ＮＬＰの組み立てに対するＤＯＰＥ－ＭＣＣの効果を示している。図８Ｂは、架橋条件（ｐＨ７．４）及び非架橋条件（ｐＨ６）で組み立てられたＮＬＰのＭＷ及びＲｈ分析を示している。 図９Ａ～９Ｄは、Ｃ１６－ＥＥＴＩ－ＩＩの設計及び製造を示している。図９Ａは、野生型ＥＥＴＩ－ＩＩ及びＣ１６－ＥＥＴＩ－ＩＩのアミノ酸配列を示している。パルミチン酸は、Ｎ末端リジンを介してＥＥＴＩ－ＩＩにコンジュゲートしていた。 図９Ａ～９Ｄは、Ｃ１６－ＥＥＴＩ－ＩＩの設計及び製造を示している。図９Ｂは、Ｃ１６－ＥＥＴＩ－ＩＩの製造プロセスのフローチャートを提供する。 図９Ａ～９Ｄは、Ｃ１６－ＥＥＴＩ－ＩＩの設計及び製造を示している。図９Ｃは、ＥＥＴＩ－ＩＩの分析用ＲＰ－ＨＰＬＣ（左パネル）及びＬＣ－ＭＳ（右パネル）を提供する。ＬＣ－ＭＳは、Ｃ１８－ＥＥＴＩ－ＩＩ及びＥＥＴＩ－ＩＩの同一性と純度を検証する。 図９Ａ～９Ｄは、Ｃ１６－ＥＥＴＩ－ＩＩの設計及び製造を示している。図９Ｄは、脂肪酸タグの追加により、Ｃ１６－ＥＥＴＩ－ＩＩがＥＥＴＩ－ＩＩよりも疎水性になる（Ｃ１６－ＥＥＴＩ－ＩＩのより長い保持時間によって示される）ことを示す分析用ＲＰ－ＨＰＬＣ（左パネル）及びＬＣ－ＭＳ（右パネル）を提供する。 図１０Ａ～１０Ｅは、ＣＫＰを負荷したＮＬＰ（ＮＬＰ－ＣＫＰ）の組み立てを示している。図１０Ａは、ＣＫＰ－ＮＬＰの組み立てとＣＫＰのコンジュゲーションの模式図を示している。 図１０Ａ～１０Ｅは、ＣＫＰを負荷したＮＬＰ（ＮＬＰ－ＣＫＰ）の組み立てを示している。図１０Ｂは、ＣＫＰ－ＮＬＰのＳＥＣクロマトグラムを示している（点線は、さらなる分析のためにプールされた画分を示す）。 図１０Ａ～１０Ｅは、ＣＫＰを負荷したＮＬＰ（ＮＬＰ－ＣＫＰ）の組み立てを示している。図１０Ｃは、ＥＬＳＤ（蒸発光散乱検出器）を使用したＣＫＰ－ＮＬＰのＲＰ－ＨＰＬＣクロマトグラムを示している。ＡｐｏＥ４２２ｋ、ＣＫＰ及びＤＯＰＣに対応する３つのピークが観察された。 図１０Ａ～１０Ｅは、ＣＫＰを負荷したＮＬＰ（ＮＬＰ－ＣＫＰ）の組み立てを示している。図１０Ｄは、ＭＷのＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析を示している（ＭＷは矢印で示される）。２８０ｎｍでの吸光度が右軸に示される。 図１０Ａ～１０Ｅは、ＣＫＰを負荷したＮＬＰ（ＮＬＰ－ＣＫＰ）の組み立てを示している。図１０Ｅは、ＲｈのＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析を示している（Ｒｈ（左軸）は、ＣＫＰ－ＮＬＰピークを横切る散在点によって示される）。２８０ｎｍでの吸光度が右軸に示される。 図１１Ａ～１１Ｄは、ＮＬＰのサイズ及び組成、並びにＣＫＰ活性に対するＣＫＰ負荷の効果を示している。図１１Ａは、増加するＣＫＰ－Ｃ１６ ｍｏｌ％で組み立てられたＣＫＰ－ＮＬＰのＳＥＣクロマトグラムを示している。 図１１Ａ～１１Ｄは、ＮＬＰのサイズ及び組成、並びにＣＫＰ活性に対するＣＫＰ負荷の効果を示している。図１１Ｂは、ＣＫＰ－ＮＬＰの組み立てにおけるＣＫＰ ｍｏｌ％の関数として、ＣＫＰ－ＮＬＰ ＳＥＣピークを横切る平均Ｒｈ分析を示している。 図１１Ａ～１１Ｄは、ＮＬＰのサイズ及び組成、並びにＣＫＰ活性に対するＣＫＰ負荷の効果を示している。図１１Ｃは、自己組織化反応に含まれたＮＬＰ当たりのＣＫＰ分子の数の関数として、精製後のＮＬＰ当たりのＣＫＰ分子の数のＨＰＬＣ定量化を示している。組み立ては二重に分析された。 図１１Ａ～１１Ｄは、ＮＬＰのサイズ及び組成、並びにＣＫＰ活性に対するＣＫＰ負荷の効果を示している。図１１Ｄは、異なるレベルのＣＫＰ組み込み（０～６３ＣＫＰ／ＮＬＰ）を含むＣＫＰ－ＮＬＰのＣＫＰ活性アッセイの結果を示している。アッセイは三通りで実施された。 図１２Ａ～１２Ｂは、５０％血清中３７℃で保存した後の異なる時間におけるＮＬＰのＳＥＣクロマトグラムを示している。図１２Ａは、ＮＬＰをＡＦ４８８で標識し、生物学的マトリックスからのバックグラウンドシグナルを制限するために、ＳＥＣトレースにおける吸光度をＡ４９５でモニターした結果を示している。 図１２Ａ～１２Ｂは、５０％血清中３７℃で保存した後の異なる時間におけるＮＬＰのＳＥＣクロマトグラムを示している。図１２Ｂは、５０％血清中で３７℃でインキュベートしたときの、時間の関数としてのＣＫＰ－ＮＬＰの標準化されたピーク面積を示している。 図１３Ａ～１３Ｄは、Ｆａｂ－ＣＫＰ－ＮＬＰコンジュゲートの組み立て及び特徴づけを示している。図１３Ａは、Ｆａｂ－ＣＫＰ－ＮＬＰコンジュゲートを生成するための戦略の模式図を示している。ＣＫＰ－ＮＬＰは反応性ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－Ｍａｌ脂質で組み立てられ、組み立てられたＣＫＰ－ＮＬＰは遊離システインを介してＦａｂにコンジュゲートしている。 図１３Ａ～１３Ｄは、Ｆａｂ－ＣＫＰ－ＮＬＰコンジュゲートの組み立て及び特徴づけを示している。図１３Ｂは、コンジュゲーションが完了した後のＦａｂ－ＣＫＰ－ＮＬＰコンジュゲートのＳＥＣクロマトグラムを示している。Ｆａｂ－ＣＫＰ－ＮＬＰコンジュゲート、Ｆａｂ二量体、及び非コンジュゲートＦａｂに対応する３つのピークが観察される。 図１３Ａ～１３Ｄは、Ｆａｂ－ＣＫＰ－ＮＬＰコンジュゲートの組み立て及び特徴づけを示している。図１３Ｃは、ＳＥＣ精製Ｆａｂ－ＣＫＰ－ＮＬＰコンジュゲートのＨＰＬＣクロマトグラムを示している。Ｆａｂ－ＣＫＰ－ＮＬＰの全ての成分は、それぞれの漫画の表現によって示されるように検出された。 図１３Ａ～１３Ｄは、Ｆａｂ－ＣＫＰ－ＮＬＰコンジュゲートの組み立て及び特徴づけを示している。図１３Ｄは、Ｆａｂ－ＣＫＰ－ＮＬＰコンジュゲートピークを横切るＭＷ（上のパネル）及びＲｈ（下のパネル）のＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析を示している。 図１４Ａ～１４Ｅは、Ｆａｂ－ＣＫＰ－ＮＬＰのＦａｂ負荷及び安定性を示している。図１４Ａは、コンジュゲーション工程中に異なるＦａｂ対ＣＫＰ－ＮＬＰ比（０～１５０）で生成されたＦａｂ－ＣＫＰ－ＮＬＰコンジュゲートのＳＥＣクロマトグラムを示している。Ｆａｂ－ＣＫＰ－ＮＬＰコンジュゲート、Ｆａｂ二量体、及び非コンジュゲートＦａｂに対応する３つのピークが観察される。 図１４Ａ～１４Ｅは、Ｆａｂ－ＣＫＰ－ＮＬＰのＦａｂ負荷及び安定性を示している。図１４Ｂは、低ＣＫＰ－ＮＬＰ及び高ＣＫＰ－ＮＬＰの両方についての反応におけるＦａｂ比の関数としての精製されたＦａｂ－ＣＫＰ－ＮＬＰコンジュゲートにおけるＮＬＰ当たりのＦａｂの数のＨＰＬＣ分析を示している。 図１４Ａ～１４Ｅは、Ｆａｂ－ＣＫＰ－ＮＬＰのＦａｂ負荷及び安定性を示している。図１４Ｃは、低ＣＫＰ－ＮＬＰ及び高ＣＫＰ－ＮＬＰの両方について、Ｆａｂ負荷の関数としてのＦａｂ－ＣＫＰ－ＮＬＰのＲｈを示している。 図１４Ａ～１４Ｅは、Ｆａｂ－ＣＫＰ－ＮＬＰのＦａｂ負荷及び安定性を示している。図１４Ｄは、低ＣＫＰ－ＮＬＰ及び高ＣＫＰ－ＮＬＰの両方について、Ｆａｂ負荷の関数としてのＦａｂ－ＣＫＰ－ＮＬＰについてのＣＫＰ活性アッセイの結果を示している。アッセイは三通りで実施された。 図１４Ａ～１４Ｅは、Ｆａｂ－ＣＫＰ－ＮＬＰのＦａｂ負荷及び安定性を示している。図１４Ｅは、５０％血清中３７℃でインキュベートしたときの時間の関数としてのＣＫＰ－ＮＬＰ及びＦａｂ－ＣＫＰ－ＮＬＰの正規化されたピーク面積を示している。
Ｉ．定義
用語は、以下に他の意味であると定義されていない限り、当該技術分野で一般的に使用されるように本明細書で使用される。
本明細書において「抗体」という用語は、最も広い意味で使用されており、所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、及び抗体断片を含む多様な抗体構造を包含するが、これらに限られない。したがって、本発明の脈絡において、抗体という用語は、完全な免疫グロブリン分子及びこのような免疫グロブリン分子の部分に関する。さらに、本用語は、修飾された及び／又は変更された抗体分子、特に修飾された抗体分子に関する。本用語はまた、組換え又は合成により生成／合成された抗体にも関する。本発明の文脈において、抗体という用語は、免疫グロブリンという用語と交換可能に使用される。
「抗体断片」は、インタクト抗体が結合する抗原を結合するインタクト抗体の一部を含むインタクト抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）、及び単一ドメイン抗体（例えば、ナノボディ、ＩｇＮＡＲ）が含まれる。ある特定の抗体断片の総説としては、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２９－１３４（２００３）を参照されたい。抗体断片の総説については、例えば、Ｐｌuｃｋｔｈｕｎ，ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照されたい；また、国際公開第９３／１６１８５号も参照されたい。ダイアボディは、二価又は二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許第４０４，０９７号、国際公開第１９９３／０１１６１号、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２９－１３４（２００３）、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０，６４４４－６４４８（１９９３）を参照されたい。トリアボディ及びテトラボディも、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２９－１３４（２００３）に説明されている。単一ドメイン抗体とは、抗体の重鎖可変ドメインの全部若しくは一部又は軽鎖可変ドメインの全部若しくは一部を含む抗体断片である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば、米国特許第６，２４８，５１６ Ｂ１号を参照されたい）。様々な抗体断片を含む抗体フォーマットのさらなる例には、ＢｉＴＥ、ＢｉＴＥ－Ｆｃ、ＤＡＲＴ、ＤＡＲＴ－Ｆｃ、ＴｒｉＫＥ、及びＴａｎｄＡｂフォーマットが含まれるがこれらに限定されない（総説については、Ｓｕｕｒｓ，Ｆ．Ｖ．，ｅｔ ａｌ．，Ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ｉｎ ｏｎｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ＆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，２０１（２０１９）１０３－１１９を参照されたい）。抗体断片は、インタクトな抗体のタンパク質分解消化、及び組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による生産を含むがこれらに限定されない様々な技術によって作製することができる。
本明細書で使用される場合、「抗原結合ポリペプチド」という用語は、最も広い意味で、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合ポリペプチドの例は、抗体、免疫グロブリン、及びその誘導体、例えば抗体断片である。抗原結合ポリペプチドはまた、例えば、センチリン、アフィマー、アドネクチン、アビマー、ノッチン、モノボディ、アフィニティークランプなどのタンパク質足場を含むダーピン及び／又はタンパク質バインダーを含み得る。抗原結合ポリペプチドは、抗原決定基に結合する（すなわち、特異的に結合する）。いくつかの実施態様では、抗原結合ポリペプチドは、それが付着している実体（例えば、ナノリポタンパク質粒子）を、標的部位、例えば、抗原決定基を有する特定の種類の腫瘍細胞又は腫瘍間質に向けることができる。いくつかの実施態様では、抗原結合ポリペプチドは、その標的抗原を介してシグナル伝達を活性化することができ、例えば、シグナル伝達は、Ｔ細胞上の抗原結合受容体に抗原決定基が結合すると活性化される。抗原結合ポリペプチドは、典型的には免疫グロブリン重鎖可変領域及び免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む抗原結合ドメインを含み得る。特定の実施態様では、抗原結合ポリペプチドは、当技術分野で知られている免疫グロブリン定常領域を含み得る。有用な重鎖定常領域は、α、δ、ε、γ又はμの５つのアイソタイプのいずれかを含む。有用な軽鎖定常領域は、κ及びλの２つのアイソタイプのいずれかを含む。特定の実施態様では、抗原結合ポリペプチドはＦｃ領域を含まない。特定の実施態様では、抗原結合ポリペプチドは、ヒンジ領域（又は免疫グロブリンのヒンジ領域の一部）を含むが、Ｆｃ領域を含まないか、又はＦｃ領域の全てを含まない。例えば、いくつかの実施態様では、抗原結合ポリペプチドは、ＩｇＧ Ｆｃドメインの１つ又は複数のサブユニットを含まず、例えば、ＩｇＧ ＣＨ２定常ドメインを含まず；及び／又はＩｇＧ ＣＨ３定常ドメインを含まない。
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって直線的に連結されたモノマー（アミノ酸）から構成される分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、２つ以上のアミノ酸の任意の鎖を指し、特定の長さの産物を指さない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、アミノ酸鎖、又は２つ以上のアミノ酸の鎖を指すために使用される任意の他の用語は、ポリペプチドの定義に含まれ、ポリペプチドという用語は、これらのいずれかの用語の代わりに、又は相互に置き換え可能に使用されてもよい。ポリペプチドという用語は、限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解による開裂、又は天然に存在しないアミノ酸による修飾を含め、ポリペプチドの発現後修飾の産物を指すことも意図している。ポリペプチドは、天然の生体源から誘導されてもよく、又は組換え技術によって産生されてもよいが、指定の核酸配列から必ずしも翻訳されなくてもよい。ポリペプチドは、化学合成によるものを含め、任意の様式で生じてもよい。本発明のポリペプチドは、３、５、１０、２０、２５、５０、７５、１００、２００、５００、１，０００、又は２，０００アミノ酸のサイズであり得る。
「抗原結合部位」は、抗原との相互作用を与える抗原結合ポリペプチドの部位、すなわち１つ又は複数のアミノ酸残基を指す。例えば、抗体又は抗原結合受容体の抗原結合部位は、相補性決定領域（ＣＤＲ）からのアミノ酸残基を含む。天然の免疫グロブリン分子は、典型的には、２つの抗原結合部位を有し、Ｆａｂ分子又はｓｃＦｖ分子は、典型的には、単一の抗原結合部位を有する。
「抗原結合ドメイン」という用語は、抗原の一部又は全部に特異的に結合し、且つこれらに相補的である領域を含む、抗体又は抗原結合受容体の一部を指す。抗原結合ドメインは、例えば、１つ以上の免疫グロブリン可変ドメイン（可変領域とも呼ばれる）によって与えられてもよい。典型的には、抗原結合ドメインは、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）と免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）とを含む。
「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、抗原を結合することに関与する免疫グロブリン重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然の抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、一般的に同様の構造を有し、それぞれのドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と、３つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含む。例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第６版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，９１ページ（２００７）を参照されたい。単一のＶＨドメイン又はＶＬドメインは、通常、抗原結合特異性を付与するのに十分である。
抗原結合ポリペプチドの文脈で使用される「に結合する」という用語は、「抗原相互作用部位」と抗原との相互の結合（相互作用）を定義する。「抗原相互作用部位」という用語は、特定の抗原又は抗原の特定の基との特異的相互作用の能力を示すポリペプチドのモチーフを定義する。前記結合／相互作用は、「特異的認識」を定義するとも理解される。「特異的に認識する」という用語は、抗原結合ポリペプチドが抗原と特異的に相互作用及び／又は結合することができることを意味する。抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ又はｓｃＦｖドメイン）が特定の標的抗原決定基に結合する能力は、当技術分野で既知である技術について測定することができる。１つの技術として、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が含まれる。当業者によく知られている他の技術には、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（ＢＩＡｃｏｒｅ機器で分析される）（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏ Ｊ １７，３２３－３２９（２０００））、及び従来の結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ，Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｓ ２８，２１７－２２９（２００２））が含まれる。一実施態様では、無関係なタンパク質／抗原に対する抗原結合ポリペプチドの結合の程度は、特にＳＰＲによって測定されるように、標的抗原への抗原結合ポリペプチドの結合の１０％未満である。特定の実施態様では、標的抗原に結合する抗原結合ポリペプチドは、解離定数（ＫＤ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０－８Ｍ以下、例えば、１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば、１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）である。抗原結合ポリペプチドに関連して使用される「結合」又は「特異的結合」という用語は、抗原結合ポリペプチドが標的抗原の構造と交差反応しない、又は本質的に交差反応しないことを意味する。
「親和性」は、分子（例えば、抗原結合ポリペプチド）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有相互作用の合計の強度を指す。特に示されない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗原結合ポリペプチドと抗原、及び／又は受容体とそのリガンド）のメンバー間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘのその対Ｙに対する親和性は概して、解離定数（ＫＤ）によって表すことができ、解離速度定数と会合速度定数（それぞれｋｏｆｆ及びｋｏｎ）の比である。したがって、速度定数の比率が同じままである限り、等価の親和性は、異なる速度定数を含むことができる。親和性は、本明細書に記載するものを含め、当技術分野で既知の十分に確立された方法によって測定することができる。親和性を測定するための好ましい方法は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）であり、測定についての好ましい温度は２５℃である。
本明細書で採用されるような「ＣＤＲ」という用語は、当技術分野で周知である「相補性決定領域」に関する。ＣＤＲは、分子の特異性を決定し且つ特異的リガンドと接触させる免疫グロブリン又は抗原結合受容体の部分である。ＣＤＲは、典型的には分子の最も可変的な部分であり、これらの分子の抗原結合多様性に寄与する。可変ドメインにおいては３つのＣＤＲ領域、すなわちＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３がある。ＣＤＲ－Ｈは、可変重鎖のＣＤＲ領域を示し、ＣＤＲ－Ｌは、可変軽鎖のＣＤＲ領域に関する。ＶＨは、可変重鎖を意味し、ＶＬは、可変軽鎖を意味する。Ｉｇ由来領域のＣＤＲ領域は、「Ｋａｂａｔ」（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，５ｔｈ ｅｄｉｔ．ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｏ．９１－３２４２ Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）；Ｃｈｏｔｈｉａ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６（１９８７），９０１－９１７）又は「Ｃｈｏｔｈｉａ」（Ｎａｔｕｒｅ ３４２（１９８９），８７７－８８３）に記載されているように決定され得る。
「超可変領域」又は「ＨＶＲ」という用語は、本明細書で使用される場合、配列において超可変性であり、及び／又は構造上規定されたループ（「超可変ループ」）を形成する、抗体可変ドメインの領域の各々を指す。一般に、天然の４本鎖抗体は、６個のＨＶＲを含み、ＶＨにおいては３個（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、ＶＬにおいては３個（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を含む。ＨＶＲは一般に、超可変ループからのアミノ酸残基を含む。ＶＨにおけるＣＤＲ１を除き、ＣＤＲは、一般的に、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。超可変領域（ＨＶＲ）はまた、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれ、これらの用語は、本明細書では、抗原結合領域を形成する可変領域の部分に関して相互交換可能に使用される。この特定の領域は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）及びＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７）によって説明されており、ここで、この定義は、互いに対して比較したときに、アミノ酸残基の重複又はサブセットを含む。上記の引用文献によって定義されるＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基を、比較として以下の表１に示す。特定のＣＤＲを包含する実際の残基数は、ＣＤＲの配列及び大きさによって変わることになる。当業者は、抗体の可変領域のアミノ酸配列を考慮して、どの残基が特定のＣＤＲを含むかを、定められた方法で決定することができる。
Figure 2023529203000001
１表１の全てのＣＤＲ定義の番号付けは、Ｋａｂａｔらによって規定された番号付け規則に従っている。（下記を参照）。
２表１において使用されるような小文字「ｂ」が付いた「ＡｂＭ」は、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒの「ＡｂＭ」抗体モデリングソフトウェアによって定義されるようなＣＤＲを指す。
Ｋａｂａｔらは、任意の抗体に適用可能な可変領域配列の番号付けシステムも定義した。当業者は、任意の可変領域配列に対し、配列自体を超える実験データに頼ることなく、「カバット番号付け」のこのシステムを明確に割り当てることができる。本明細書で使用される場合、「カバット番号付け」は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）に記載される番号付けシステムを指す。特に指定されない限り、抗原結合部分可変領域における特定のアミノ酸残基の位置の番号付けに関する参照は、カバット番号付けシステムによる。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ：ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４の４つのＦＲドメインからなる。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は、一般的に、ＶＨ（又はＶＬ）中において以下の配列で現れる：ＦＲ１－Ｈ１（Ｌ１）－ＦＲ２－Ｈ２（Ｌ２）－ＦＲ３－Ｈ３（Ｌ３）－ＦＲ４。
「Ｆａｂ」又は「Ｆａｂ分子」は、抗原結合ポリペプチドの重鎖（「Ｆａｂ重鎖」）のＶＨ及びＣＨ１ドメインと、軽鎖（「Ｆａｂ軽鎖」）のＶＬ及びＣＬドメインとからなるタンパク質を指す。
単鎖Ｆｖ断片（又はｓｃＦｖ）は、ペプチドリンカーによって接続された抗体ＶＨドメイン及びＶＬドメインからなるポリペプチドである。
「単鎖Ｆａｂ断片」又は「ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであり、前記抗体ドメイン及び前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端への方向で、以下の順序のうちの１つを有する。（ａ）ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＶＬ－ＣＬ、（ｂ）ＶＬ－ＣＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＨ１、（ｃ）ＶＨ－ＣＬ－リンカー－ＶＬ－ＣＨ１、又は（ｄ）ＶＬ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨ－ＣＬ。ここで、前記リンカーは、少なくとも３０アミノ酸、好ましくは３２～５０アミノ酸のポリペプチドである。単鎖Ｆａｂ断片は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然ジスルフィド結合によって安定化される。
「クロスオーバーＦａｂ分子」（「交差Ｆａｂ」又は「クロスオーバーＦａｂフラグメント」とも呼ばれる）が意味するのは、Ｆａｂ分子であり、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のいずれかが交換され、すなわち、交差Ｆａｂフラグメントは、軽鎖可変領域及び重鎖定常領域から構成されるペプチド鎖と、重鎖可変領域及び軽鎖定常領域から構成されるペプチド鎖とを含む。したがって、交差Ｆａｂ断片は、重鎖可変領域及び軽鎖定常領域（ＶＨ－ＣＬ）から構成された重鎖又は軽鎖と、軽鎖可変領域及び重鎖定常領域（ＶＬ－ＣＨ１）から構成された重鎖又は軽鎖とを含む。これとは対照的に、「従来のＦａｂ分子」が意味するのは、すなわち、重鎖可変領域及び定常領域（ＶＨ－ＣＨ１）から構成された重鎖と、軽鎖可変領域及び定常領域（ＶＬ－ＣＬ）から構成された軽鎖とを含むその天然のフォーマットにおけるＦａｂ分子である。
「クロスオーバー単鎖Ｆａｂ断片」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであり、前記抗体ドメイン及び前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端への方向で、以下の（ａ）ＶＨ－ＣＬ－リンカー－ＶＬ－ＣＨ１及び（ｂ）ＶＬ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨ－ＣＬの順序のうちの１つを有し、ＶＨとＶＬは一緒になって、ある抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成する。典型的には、リンカーは、少なくとも３０アミノ酸、例えば３０～４０アミノ酸の長さのポリペプチドである。
「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」という用語は、本明細書において、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。該用語は、天然配列Ｆｃ領域とバリアントＦｃ領域とを含む。ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域の境界は、わずかに変動してもよいが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常、Ｃｙｓ－２２６から、又はＰｒｏ－２３０から、重鎖のカルボキシ末端まで伸長するよう定義されている。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ－４４７）は、存在していてもよく、又は存在していなくてもよい。本明細書で特に明記されない限り、Ｆｃ領域又は定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載されるような、「ＥＵ番号付け」システム（ＥＵインデックスとも呼ばれる）に従う。
「完全長抗体」という用語は、２つの「完全長抗体重鎖」及び２つの「完全長抗体軽鎖」からなる抗体を意味する。「完全長の抗体重鎖」とは、Ｎ末端からＣ末端への方向において、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常重鎖ドメイン１（ＣＨ１）、抗体ヒンジ領域（ＨＲ）、抗体重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、及び抗体重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）からなるポリペプチドであり、ＶＨ－ＣＨ１－ＨＲ－ＣＨ２－ＣＨ３と略記され、並びに場合によって、下位クラスＩｇＥの抗体の場合においては抗体重鎖定常ドメイン４（ＣＨ４）からなる。好ましくは、「完全長の抗体重鎖」とは、Ｎ末端からＣ末端への方向においてＶＨ、ＣＨ１、ＨＲ、ＣＨ２及びＣＨ３からなるポリペプチドである。「完全長の抗体軽鎖」とは、Ｎ末端からＣ末端への方向において、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、及び抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）からなるポリペプチドであり、ＶＬ－ＣＬと略記される。抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）は、κ（カッパ）又はλ（ラムダ）であり得る。２つの完全長抗体鎖は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の、及び完全長抗体重鎖のヒンジ領域間のポリペプチド間ジスルフィド結合を介してまとまって連結される。典型的な完全長抗体の例は、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥのような天然の抗体である。）本発明に従って使用される完全長抗体は、単一の種、例えば、ヒト由来であり得るか、又はキメラ化抗体若しくはヒト化抗体であり得る。
「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物には、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、並びに齧歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれるが、これらに限定されない。特に、個体又は対象はヒトであり、臨床患者／臨床試験ボランティアであってもよい。
本発明によれば、「薬学的組成物」という用語は、調製物に含まれる活性成分の生物学的活性を有効にするような形態の製剤であって、その製剤が投与されるであろう対象にとって許容できないほど毒性が高い付加的成分を含まないものをいう。
「単離されたポリペプチド」又はその断片若しくは誘導体とは、その天然の環境にはないポリペプチドを指す。特定のレベルの精製は、必要とされない。例えば、単離されたポリペプチドは、その生来の環境又は天然環境から取り出し得る。宿主細胞内で発現する組換え産生されたポリペプチド及びタンパク質は、任意の適切な技術によって、分離され、分画され、又は部分的に若しくは実質的に精製された、天然ポリペプチド又は組換えポリペプチドと同様に、本発明の目的のために単離されると考えられる。
本明細書で使用する「シスチンノットペプチド」又は「ＣＫＰ」という用語は、３つのジスルフィド結合を形成する６つの保存されたシステイン残基を含む、２６～６０アミノ酸長のペプチドを指す。ジスルフィドの１つが、他の２つのジスルフィドとそれらの相互接続バックボーンによって形成された大員環を貫通し、それによって、表面に複数のループが露出した特徴的な結び目トポロジーが得られる。ループは、保存された６つのシステイン残基に隣接するアミノ酸領域として定義され、本質的に非常に可変的である。
本明細書で使用される場合、「標的抗原」は、「標的抗原決定基」、「標的エピトープ」及び「標的細胞抗原」と同義であり、抗原結合ポリペプチドが結合して複合体を形成するポリペプチド巨大分子上の部位（例えば、アミノ酸の連続鎖、又は異なる領域の非連続アミノ酸から構成された配座立体配置）を指す。有用な標的抗原は、例えば、腫瘍細胞の表面上に、ウイルス感染した細胞の表面上に、他の疾患細胞の表面上に、免疫細胞の表面上に、血清中で遊離して、及び／又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中に認めることができる。本明細書で抗原と呼ばれるタンパク質（例えば、ＣＤ２０、ＣＥＡ、ＦＡＰ、ＴＮＣ）は、哺乳動物、例えば、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含め、任意の脊椎動物源由来のタンパク質の任意の天然型であり得る。特定の実施態様では、標的抗原は、ヒトタンパク質である。本発明の特定のタンパク質について言及される場合、本用語は、「完全長」の未処理の標的タンパク質、及び標的細胞における処理から結果的に生じる任意の形態の標的タンパク質を包含する。この用語は、標的タンパク質の天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。例示的なヒト標的タンパク質には、以下が含まれるがこれらに限定されない：ＣＤ２０、ＣＥＡ、ＦＡＰ、ＴＮＣ、ＭＳＬＮ、ＦｏｌＲ１、ＨＥＲ１、及びＨＥＲ２。
「がん」及び「がん性」という用語は、制御されない細胞成長／増殖によって典型的に特徴づけられる、哺乳動物における生理的状態を指すか、又は説明する。この定義には、良性がん及び悪性がんが含まれる。がんの例には、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれるが、これらに限定されない。そのようながんのより具体的な例としては、扁平上皮がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜のがん、肝細胞がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）又は胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）（消化管がんを含む）、膵臓がん、膠芽腫、神経膠腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、肝細胞癌、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜癌又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓がん（ｋｉｄｎｅｙ ｃａｎｃｅｒ）（例えば、腎細胞癌）、肝臓がん、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝癌、肛門癌、陰茎癌、メラノーマ、並びに様々な種類の頭頸部がんが挙げられる。「早期がん」とは、浸潤性でも転移性でもないがんを意味し、ステージ０のがん、ステージ１のがん、又はステージＩＩのがんに分類される。「前がん性」という用語は、典型的にがんに先行するか、又はがんに進展する状態又は成長を指す。「非転移性」とは、良性であるか、又は原発部位に留まるがんであり、リンパ系若しくは血管系又は原発部位以外の組織に浸透していないがんを意味する。一般に、非転移性がんは、ステージ０、Ｉ、又はＩＩのがんであり、場合によってはステージＩＩＩのがんである。
本明細書で提供される数値は、正確な数値だけでなく、用語「約」によって限定される値の両方を指すと理解される。「約」という用語は、使用される文脈において、当業者によって理解されるであろう範囲、例えば、記載された数値の±１０％、±５％、±４％、±３％、±２％、±１％、±０．５％、±０．１％、±０．０５％、±０．０１％などによって数値を限定するものである。
ＩＩ．ポリペプチドを含むナノリポタンパク質コンジュゲート
本発明の一態様は、少なくとも１つの共有結合的にコンジュゲートしたポリペプチド（すなわち、足場タンパク質以外のＮＬＰ組み込みポリペプチド）を含むナノリポタンパク質粒子コンジュゲートに関する。本明細書で使用される場合、「ナノリポタンパク質粒子」又はＮＬＰは、脂質及び足場タンパク質を含む超分子複合体、特に膜形成脂質、及びアポリポタンパク質などの足場タンパク質を含む超分子複合体を指す。ＮＬＰは、ナノディスク又は再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）と呼ばれることもあり、内因性高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の模倣物として説明されている（１８）。ＮＬＰは通常、自己組織化プロセスを通じて形成され、ここで、膜形成脂質は円盤状の脂質二重層を形成し（１９）、円盤の疎水性周辺は、二重層円盤を取り囲む足場タンパク質に結合することによって安定化される。この段落で引用されている全ての参考文献は、実施例５の下にある。
「膜形成脂質」は、親水性領域（極性頭部）及び疎水性領域（１つ又は複数の長い炭化水素尾部）を有する両親媒性脂質又は極性脂質を指す。水環境での膜形成脂質の自己組織化により脂質二重層が形成され、各層の疎水性脂肪酸尾部が互いに向き合い、極性頭部が水性環境に露出した状態になっている。極性頭部基は、典型的には誘導体化されたリン酸基又は糖類基である。膜形成脂質は、例えば、アルキルホスホコリン、エーテル脂質、糖脂質、リゾスフィンゴ脂質、リゾグリセロリン脂質、リン脂質、スフィンゴ脂質、及びステロールを含み得る。いくつかの実施態様では、ＮＬＰは、本明細書に記載の膜形成脂質を２つ以上含む。より具体的な例としては、リン脂質ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジオレオイルホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルホスホセリン（ＤＯＰＳ）、及びジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施態様では、膜形成脂質はＤＯＰＥ及び／又はＤＯＰＣである。いくつかの実施態様では、膜形成脂質は、ジグリセロールテトラエーテル、コレステロール、エルゴステロールなどの非脂質両親媒性分子である。いくつかの実施態様では、ＮＬＰは、膜形成脂質としてＣ４－２８脂肪酸アシル（例えば、Ｃ１６脂肪酸アシル）を含む（さらに含むなど）。
いくつかの実施態様では、膜形成脂質は生体分子であり、すなわち生きている生物、例えば細菌、酵母、又は哺乳動物によって産生される分子である。
ＮＬＰでは、膜形成脂質によって形成される二重層は、１つ又は複数の足場タンパク質によって安定化される。本明細書で使用される「足場タンパク質」は、脂質二重層の疎水性コアを（実質的に）包囲又は包含するなど、水性環境下で膜形成脂質と自己組織化できる両親媒性タンパク質である。足場タンパク質は一般にαヘリックス二次構造を有し、いくつかの疎水性アミノ酸が疎水性面を形成し、いくつかの親水性アミノ酸が反対側の親水性面を形成する。粒子自体が水溶性になるため、血液やリンパ液などで運ばれることができる。
いくつかの実施態様では、足場タンパク質は、例えば、アポリポタンパク質、リポフォリン、又はその誘導体若しくは断片のうちの１つ以上、特に、膜形成脂質と自己組織化する能力を維持する誘導体又は断片を含む。いくつかの実施態様では、足場タンパク質は、合理的に設計されたタンパク質又はペプチドである。いくつかの実施態様では、足場タンパク質は、哺乳動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ラット、マウス、ウサギ、又はモルモットなどの生物によって産生される生体分子である。特定の実施態様では、足場タンパク質は、アポリポタンパク質Ａ（例えば、アポＡ－Ｉ、アポＡ－ＩＩ、アポＡ－ＩＶ、アポＡ－Ｖ）、アポリポタンパク質Ｂ（例えば、アポＢ４８、アポＢ１００）、アポリポタンパク質Ｃ（例えば、アポＣ－Ｉ、アポＣ－ＩＩ、アポＣ－ＨＩ、アポＣ－ＩＶ）、アポリポタンパク質Ｄ、アポリポタンパク質Ｈ、アポリポタンパク質Ｅ（例えば、ａｐｏＥ２、ａｐｏＥ４）、及び／又はリポフォリンＩＩＩのうちの少なくとも１つである。いくつかの実施態様では、足場タンパク質は、膜二重層を安定化することができるアポリポタンパク質の切断型であり、例えば、疎水性面及び反対側の親水性面を有する。特定の例では、切断されたａｐｏ４Ｅ、例えば「ＡｐｏＥ４２２ｋ」と呼ばれるａｐｏＥ４の２２Ｋｄ断片が使用される。いくつかの特定の実施態様では、足場タンパク質は、ヒト由来のＡｐｏＥ４２２ｋである。
いくつかの実施態様では、アポリポタンパク質は、ａｐｏＥ３の切断型（例えば、ａｐｏＥ３２２ｋ）、ａｐｏＥ２の切断型（例えば、ａｐｏＥ２２２ｋ）、又はａｐｏＡ１の切断型（例えば、Δ４９ＡｐｏＡ１、ＭＳＰ１、ＭＳＰ１Ｔ２、ＭＳＰ１Ｅ３Ｄ１）である。いくつかの実施態様では、足場タンパク質及び膜形成脂質成分は、両方とも生物によって産生される生体分子であり、非生物学的に由来する物質を含まないＮＬＰを形成する。
当業者は、足場タンパク質及び膜形成脂質を適切なモル比で提供して、ＮＬＰの組み立てを容易にすることができることを理解するであろう。いくつかの実施態様では、足場タンパク質と膜形成脂質は、１：５０から１：１００のモル比；１：６０から１：９０のモル比；又は１：７０から１：８０のモル比である。いくつかの実施態様では、足場タンパク質と膜形成脂質は、１：６０、１：７０、１：７５、１：８０、１：８５、１：９０、又は１：１００のモル比である。特定の実施態様では、足場タンパク質と膜形成脂質は１：８０のモル比である。いくつかの実施態様では、膜形成脂質のほとんど又は全てが二重層として配置され、組み立てられていないままで残るものがないか、又はほとんどないような比率が使用される。いくつかの実施態様では、残った組み立てられていない脂質は、反応容器の壁にくっつき、ポリペプチドの官能基と反応するために利用できるものを全く残さないか、ほとんど残さないか、又はごくわずかしか残さない。
本発明において、ＮＬＰは、例えば抗原結合ポリペプチド上の相補的官能基と相互作用するための１つ又は複数の官能化基を提示する。いくつかの実施態様では、官能化基は、ポリペプチド上の相補的な官能基と反応し、足場タンパク質にコンジュゲートしないなど、ＮＬＰの他の成分にコンジュゲートしない。いくつかの実施態様では、官能化基の２５％未満又は２０～２５％、２０％未満又は１０～２０％、１５％未満又は１０～１５％、１０％未満又は５～１０％、５％未満又は３～５％が、本発明のコンジュゲート中の足場タンパク質にコンジュゲートする。いくつかの実施態様では、官能化基の５％、４％、３％、２％、１％、又は０％が、本発明のコンジュゲート中の足場タンパク質にコンジュゲートする。
通常、膜形成脂質の全てが官能化されているわけではない。当業者は、使用される官能化基を有する脂質の量が、例えば、官能化基及び／又は膜形成脂質、及び／又はそれらとコンジュゲートされるポリペプチドの同一性に依存することを理解するであろう。例えば、いくつかの実施態様では、膜形成脂質の６０％未満、例えば５０～６０％；５０％未満、例えば４０～５０％；４０％未満、例えば、３０～４０％；３０％未満、例えば２０～３０％；又は２０％未満、例えば１０～２０が官能化されている。特定の実施態様では、膜形成脂質の１０～４０％、１５～３５％、２０～３５％、又は１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、又は３５％が官能化されている。特定の例において、膜形成脂質の２０％が官能化基を有する。
「官能」基又は「官能化」基とは、分子構造内にある、その構造に特徴的な化学反応を引き起こす原子のグループを指す。本明細書では簡単にするために、「官能化基」という用語は、ＮＬＰの膜形成脂質上の、又はスペーサーによって接続されたそのような基に関して使用される。「官能基」という用語は、膜形成脂質上の１つ又は複数の対応する官能化基を介してＮＬＰに結合するための、ポリペプチド、例えば抗原結合ポリペプチド上の、又はスペーサーによってそれに接続されたそのような基に関して使用される。官能基／官能化基の例としては、炭化水素、二重結合又は三重結合を有する基、ハロゲン含有基、窒素含有基、酸素含有基などが挙げられる。いくつかの実施態様では、官能化基は、アジド、アミノ、無水物、アルキン、カルボキシ、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、及びホスフェート基から選択される少なくとも１つの基から選択される。典型的には、対応する官能基と官能化基との間の反応は、それぞれの基の結合形成及びコンジュゲーションをもたらす。
ａ．ポリペプチドへのＮＬＰコンジュゲーション
本明細書で使用される「コンジュゲーション」又は「結合」という用語は、基間の安定した結合をもたらす、近接した基間の相互作用を指す。相互作用は、共有結合及び／又は非共有結合、例えば静電相互作用を含み得る。コンジュゲーションは、適切な条件下で成功裏にコンジュゲートすることが知られているＮＬＰ脂質及び抗原結合ポリペプチドのそれぞれにおいて、１つ又は複数の官能化基／官能基のペアを使用することにより、任意の数の官能基化戦略を使用して達成することができる。
本明細書に記載されるように、ポリペプチドのＮＬＰへのコンジュゲーションの成功は、当業者に知られている技術を使用して確認又は定量化することができる。本発明のコンジュゲートを特徴づける技術の例としては、蛍光相関分光法、フーリエ変換赤外分光法、サイズ排除クロマトグラフィー、表面プラズモン共鳴、ラマン分光法、全内部反射蛍光、超スピン濾過が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、実施例２、図８Ａ、及び図１Ｂを参照）。
図１Ａは、本発明のＮＬＰ－Ｆａｂの組み立て及びコンジュゲーションの模式図を示す。本発明の実施態様では、ナノリポタンパク質粒子は、少なくとも１つのポリペプチドにコンジュゲートしており、ポリペプチドは、ＮＬＰの１つ又は複数の成分に共有結合されるか、そうでなければ結合又は連結されて、ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲートを形成する。ポリペプチドは、一般に、二重層の一方又は両方の表面上の極性頭部などの膜形成脂質上の１つ又は複数の官能化基に結合する。官能化基は、上記のように、ポリペプチド上の対応する又は相補的な官能基にコンジュゲートすることができる任意の基であり得る。官能基化膜形成脂質の例には、アジド含有脂質、カルボキシレート含有脂質、マレイミド含有脂質、キレート化金属含有脂質、プロパルギル含有脂質、第四級アミン含有脂質、Ｓタンパク質含有脂質などが挙げられるが、これらに限定されない。典型的には、非官能基化膜形成脂質と比較して、ＮＬＰ組み立ての間に使用される官能基化膜形成脂質の量は、ＮＬＰ二重層表面にコンジュゲートするポリペプチドの量を決定する。
官能化基／官能基のコンジュゲート対の例には、エステルとアミン；カルボン酸とアミン；アジドとアセチレン；二価の金属（例えば、Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋）とポリヒスチジン、イソチオシアネートとアミン；アビジンとビオチン；グルタチオンＳ転移酵素（ＧＳＴ）とグルタチオン；スルフヒドリルとハロセタミド（ｈａｌｏｃｅｔａｍｉｄｅ）；スルフヒドリルとピリジルジスルフィド；スルフヒドリルとチオ硫酸、及びマレイミド（又はマレイミド誘導体）とスルフヒドリルが挙げられるが、これらに限定されない。これらの成分は、当業者が認識するように、既知の技術によって合成することができ、及び／又は市販されている。
特定の実施態様では、官能化基は、マレイミド誘導体、ハロアセトアミド、ピリジルジチオプロピオネート、及びチオスルフェートのうちの１つ又は複数である。相補的な官能基は、還元されたスルフヒドリル部分などの遊離チオール基である。特定の実施態様では、官能化基はマレイミドであり、相補的官能基は還元システイン残基である。マレイミド含有脂質は市販されているか、当業者が合成することができる。チオール反応性膜形成脂質の特定の例は、１，２－ジヘキサデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［４－（ｐ－マレイミドフェニル）ブチルアミド］（ナトリウム塩）を含む。（例えば、実施例１、図７Ａ～７Ｂを参照）。
いくつかの実施態様では、官能化基は、膜形成脂質の極性頭部に直接位置するか、又はその化学構造の一部である。いくつかの実施態様では、スペーサーが官能化基を膜形成脂質に接続する。「スペーサー」又は「リンカー」は、１つ又は複数のリンカー成分から成り得る。スペーサー成分の例としては、６－マレイミドカプロイル（「ＭＣ」）、マレイミドプロパノイル（「ＭＰ」）、ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（「ＰＡＢ」）、Ｎ－スクシンイミジル４－（２－ピリジルチオ）ペンタノエート（「ＳＰＰ」）、Ｎ－スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（「ＳＭＣＣ」）、及びＮ－スクシンイミジル（４－ヨード－アセチル）アミノベンゾエート（「ＳＩＡＢ」）が挙げられる。追加のスペーサー成分は当技術分野で知られており、いくつかは本明細書に記載されている。「リガンドへのコンジュゲーションが可能なモノメチルバリン化合物」、米国出願公開第２００５／０２３８６４９号も参照されたい。この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施態様では、スペーサーは、アミノ酸残基を含み得る。例示的なアミノ鎖スペーサー成分としては、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、又はペンタペプチドが挙げられる。例示的なジペプチドとしては、バリン－シトルリン（ｖｃ又はｖａｌ－ｃｉｔ）、アラニン－フェニルアラニン（ａｆ又はａｌａ－ｐｈｅ）が挙げられる。例示的なトリペプチドとしては、グリシン－バリン－シトルリン（ｇｌｙ－ｖａｌ－ｃｉｔ）及びグリシン－グリシン－グリシン（ｇｌｙ－ｇｌｙ－ｇｌｙ）が挙げられる。いくつかの実施態様では、スペーサーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個のアミノ酸の長さを有するペプチドを含む。いくつかの実施態様では、スペーサーは、２～６アミノ酸、３～５アミノ酸、又は４アミノ酸である。スペーサーは通常、柔軟性のためにグリシンが豊富であり、溶解性のためにセリン又はスレオニンも豊富である。いくつかの実施態様では、グリシン－セリンスペーサー、例えば（ＧＳ）ｎが使用され、ここで、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン、及びｎ＝２、３、４又は５である。特定の実施態様では、Ｆａｂコンジュゲーションに使用されるスペーサーは、アミノ酸配列ＧＳＧＳを含むか、又はそれからなる。いくつかの実施態様では、ＧＳＧＳスペーサーと同様の柔軟性及び溶解性を提供する他のスペーサーが使用される。
ｂ．抗原結合ポリペプチド成分
本発明のＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲートのいくつかの実施態様では、少なくとも１つの抗原結合ポリペプチドが、ＮＬＰの１つ又は複数の成分に共有結合されるか、そうでなければ結合又は連結される。一般に、ポリペプチドは、抗体の断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ＶＨ－ＶＨ二量体、ＶＬ－ＶＬ二量体、ＶＨ－ＶＬ二量体、単一ドメイン、ダイアボディ、又は直鎖状抗体などの抗原結合ポリペプチドである。いくつかの実施態様では、ポリペプチドはＦａｂである。いくつかの実施態様では、抗原結合ポリペプチドは、クロスオーバーＦａｂ又はクロスオーバー単鎖Ｆａｂである。いくつかの実施態様では、ポリペプチドは、「Ｆａｂ様分子」又は「Ｆａｂ様ポリペプチド」であり、これは、必ずしも抗原に結合できるわけではないが、Ｆａｂと同様のサイズ及び／又はコンフォメーション形状を有するポリペプチドである。
特定の実施態様では、抗原結合ポリペプチドは、ヒンジ領域（又は免疫グロブリンのヒンジ領域の一部）を含むが、Ｆｃ領域を含まないか、又は完全なＦｃ領域を含まない。特定の実施態様では、抗原結合ポリペプチドは、ヒンジ領域の少なくとも１つのＣｙｓアミノ酸残基を含む。特定の実施態様では、Ｃｙｓ残基は、官能基を提供する、すなわち、ＮＬＰ脂質上の官能化基とのコンジュゲーションのための遊離チオール基を提供する。特定の実施態様では、抗原結合ポリペプチド、例えばＦａｂは、ヒンジ領域のＣｙｓ－２２６及びＣｙｓ－２２７の少なくとも１つを含む。特定の実施態様では、Ｃｙｓ－２２７はコンジュゲーションのための遊離チオール基を提供する。
上記のように、本発明のＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲートのポリペプチドは、ポリペプチドの１つ又は複数のアミノ酸残基上の官能基によってＮＬＰに共有結合されるか、そうでなければ結合又は連結される。いくつかの実施態様では、官能基はＣ末端に位置する。「Ｃ末端に位置する」とは、官能基がポリペプチドのＣ末端側に位置することを意味する。例えば、官能基は、そのＮ末端からそのＣ末端までを考慮して、ポリペプチド鎖の最後のアミノ酸残基に位置し得る。Ｃ末端に位置する基は、ポリペプチドのＣ末端にある最後から２番目、最後から３番目、最後から４番目、又は最後から５番目のアミノ酸残基に、又は最後の１～２、１～３、２～３、１～４、２～４、１～５、３～５、１～６、２～６、３～６、１～７、３～７、４～７、１～８、３～８、５～８、若しくは１～１０アミノ酸残基のいずれかに位置し得る。
いくつかの実施態様では、官能基はＮ末端に位置する。「Ｎ末端に位置する」とは、官能基がポリペプチドのＮ末端側に位置することを意味する。例えば、官能基は、そのＮ末端からそのＣ末端までを考慮して、ポリペプチド鎖の最初のアミノ酸残基に位置し得る。Ｎ末端に位置する基は、ポリペプチドのＮ末端にある２番目、３番目、４番目、又は５番目のアミノ酸残基に、又は最初の１～２、１～３、２～３、１～４、２～４、１～５、３～５、１～６、２～６、３～６、１～７、３～７、４～７、１～８、３～８、５～８、若しくは１～１０アミノ酸残基のいずれかに位置し得る。
官能基は、上記のように、ＮＬＰの成分、例えばＮＬＰの膜形成脂質上の対応する又は相補的な官能化基と反応するように選択される。いくつかの実施態様では、官能基は、マレイミド誘導体、ハロアセトアミド、ピリジルジチオプロピオネート、及びチオスルフェートからなる群から選択され；前記相補的官能基は遊離チオール基である。特定の実施態様では、官能基は、システインチオール基などのチオール基である。いくつかの特定の実施態様では、システインアミノ酸残基は、抗原結合ポリペプチドが由来する抗体においてヒンジジスルフィド結合を形成した残基である。例えば、チオール基は、Ｃｙｓ－２２６及びＣｙｓ－２２７（カバット番号付けに基づく）から選択される少なくとも１つによって提供され得る。特定の実施態様では、Ｃ末端Ｃｙｓ－２２７、例えばＦａｂのＣ末端Ｃｙｓ－２２７は、ＮＬＰ脂質上の官能化基とのコンジュゲーションのための遊離チオール基を提供する。
いくつかの実施態様では、官能基は、抗原結合ポリペプチドのアミノ酸残基上又はその化学構造の一部に直接位置する。いくつかの実施態様では、スペーサーは、上記のように、官能基を抗原結合ポリペプチドに接続する。いずれのフォーマットにおいても、抗原結合ポリペプチド、例えばＦａｂは、阻害及びアゴニスト設定のいずれにおいても、抗原結合活性を失うことなく、又は実質的に失うことなく、ＮＬＰにコンジュゲートする。実施例４、図５Ｂも参照のこと、ここで、部位特異的Ｆａｂコンジュゲーションは、ＮＬＰの流体力学的半径への影響を最小限に抑えながら約３０Ｆａｂ／ＮＬＰを達成し、これは、粒子サイズがＮＬＰの円盤状の形状によって大きく左右されることを示している。
抗原結合ペプチドは、通常、１つ又は複数の免疫グロブリンクラスの抗体分子に由来する。抗体又は免疫グロブリンの「クラス」は、抗体又は免疫グロブリンの重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。抗体の５つの主要なクラスがあり、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかは、下位クラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２にさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。いくつかの実施態様では、抗原結合ポリペプチドは、ＩｇＧ分子、例えばＩｇＧ分子のＦａｂに由来する。
本発明のいくつかの態様では、抗原結合ポリペプチドは治療剤であり、コンジュゲートは抗原結合ポリペプチドの送達プラットフォームとして使用される。例えば、抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）は、薬物積荷又は生物活性分子として機能し、標的を中和するか、又は経路をブロックする、刺激する若しくはアンタゴナイズするように作用し得る。本発明のいくつかの態様では、抗原結合ポリペプチドは、抗原標的送達プラットフォームを提供する。例えば、標的指向化Ｆａｂの付着は、増強された内在化を介して目的の臓器又は組織での薬物送達を強化することができる（３７、３８、３９）。例えば、抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）は、特定の細胞又は疾患マーカーを認識して、コンジュゲートを特定の標的に向けることができる。抗原結合ポリペプチドのＮＬＰへのコンジュゲーションは、例えば、抗原結合ポリペプチド、又は追加の治療剤若しくは診断剤の標的への送達を促進するためのＮＬＰの標的指向化を媒介することができる。この段落で引用されている全ての参考文献は、実施例５の下にある。
特定の実施態様では、本発明のＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲートは、治療薬（９～１２）、画像診断薬（１３）、並びにワクチン及び免疫調節療法（１４～１７）のインビボ送達のために開発された以前のナノリポタンパク質アプローチの欠点を克服する。過去１０年間、ナノテクノロジーの分野では、非特異的な生体内分布と標的指向化、水溶性の低さ、限られた経口バイオアベイラビリティ、及び低い治療指数を含む、従来の薬物送達システムの限界に取り組む努力がなされてきた（１）。いくつかのアプローチには、無機ナノ粒子（２）、高分子ベースのナノ粒子（３）、高分子ミセル（４）、デンドリマー（５）、リポソーム（６）、ウイルスナノ粒子（７）、及びカーボンナノチューブ（６）の使用が含まれている。他の戦略には、リポソーム（３３－３５）及び高分子ベースのナノ粒子（３６）が含まれている。しかしながら、本発明のＮＬＰコンジュゲートは、低毒性及び低免疫原性を含む、他のナノ粒子ベースの送達技術を超えるいくつかの明確な利点を提供する（２０）。例えば、いくつかの実施態様では、ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲートは、天然に産生される、及び／又は天然に産生される材料に由来する脂質、足場タンパク質、及び抗原結合ポリペプチドを含み、非生物学的に由来する材料を含まず、これにより、非生物学的に由来する成分を必要とする以前の送達プラットフォームよりも、免疫応答が低く、且つ／又は毒性が低くなる。特定の実施態様における他の利点には、本明細書で議論されるように、例えば、架橋剤を使用しない良好な安定性；高濃度だが低粘度の製剤の実現可能な生産、粒子間架橋が最小限から全くないこと、比較的均一なＮＬＰ－ポリペプチド集団、及び／又は増強された抗原結合能を含む、良好な製造可能性が挙げられる。この段落で引用されている全ての参考文献は、実施例５の下にある。
いくつかの実施態様では、抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）は、１つ又は複数の腫瘍特異的抗原又は腫瘍マーカーに結合し、コンジュゲートを腫瘍に向ける。例えば、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は、特定の腫瘍細胞によって過剰発現される。ＥＧＦＲを過剰発現するインビボ異種移植腫瘍モデルでは、抗ＥＧＦＲイムノリポソームは、単回投与後、注射の２４時間後に測定したところ、非標的リポソームの６倍の細胞取り込みを達成していた。さらに、抗ＥＧＦＲイムノリポソーム－ドキソルビシン（強力な細胞毒素）は、ドキソルビシン単独又は非標的リポソーム－ドキソルビシンよりも大きい有意な腫瘍退縮を示した。
腫瘍細胞の表面に天然に存在する腫瘍マーカーの他の例には、ＦＡＰ（線維芽細胞活性化タンパク質）、ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、ｐ９５（ｐ９５ＨＥＲ２）、ＢＣＭＡ（Ｂ細胞成熟抗原）、ＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）、ＭＳＬＮ（メソテリン）、ＭＣＳＰ（黒色腫コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）、ＨＥＲ－１（ヒト上皮成長因子１）、ＨＥＲ－２（ヒト上皮成長因子２）、ＨＥＲ－３（ヒト上皮成長因子３）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ５２Ｆｌｔ３、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）、ヒト栄養芽層細胞表面抗原２（Ｔｒｏｐ－２）がん抗原１２－５（ＣＡ－１２－５）、ヒト白血球抗原－抗原Ｄ関連（ＨＬＡ－ＤＲ）、ＭＵＣ－１（ムチン－１）、Ａ３３抗原、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ－３）、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）、トランスフェリン受容体、ＴＮＣ（テネイシン）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡ－ＩＸ）、及び／又はヒト主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の分子に結合したペプチドが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
多くのそのような腫瘍抗原は、当技術分野で知られているか、又は当業者によって容易に入手される。例えば、Ａ３３抗原、ＢＣＭＡ（Ｂ細胞成熟抗原）、がん抗原１２－５（ＣＡ－１２－５）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡ－ＩＸ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、ＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）、ＦＡＰ（線維芽細胞活性化タンパク質）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ－３）、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）、ＨＥＲ－１（ヒト上皮成長因子１）、ＨＥＲ－２（ヒト上皮成長因子２）、ＨＥＲ－３（ヒト上皮成長因子３）、ヒト白血球抗原－抗原Ｄ関連（ＨＬＡ－ＤＲ）、ＭＳＬＮ（メソテリン）、ＭＣＳＰ（黒色腫コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）、ＭＵＣ－１（ムチン－１）、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）、ｐ９５（ｐ９５ＨＥＲ２）、トランスフェリン受容体、ＴＮＣ（テネイシン）、ヒト栄養芽層細胞表面抗原２（Ｔｒｏｐ－２）の（ヒト）メンバーの配列はＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔデータベースで利用可能であり、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／？ｑｕｅｒｙ＝ｒｅｖｉｅｗｅｄ％３Ａｙｅｓから取得することができる。当業者は、ゲノムＤＮＡ並びにｍＲＮＡ／ｃＤＮＡも含み得るこれらのデータバンクエントリーにおけるこれらの（タンパク質）配列の関連コード領域を容易に推測し得る。
（ヒト）ＦＡＰ（線維芽細胞活性化タンパク質）の配列はＳｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ１２８８４（エントリーバージョン１６８、配列バージョン５）から得ることができ、（ヒト）ＣＥＡ（癌胎児性抗原）の配列はＳｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ０６７３１（エントリーバージョン１７１、配列バージョン３）から得ることができ、（ヒト）ＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）の配列はＳｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１６４２２（エントリーバージョン１１７、配列バージョン２）から得ることができ、（ヒト）ＭＳＬＮ（メソテリン）の配列はＵｎｉＰｒｔ１０２０３０４０５０（７４）ＪＰ２０２０－５１１９７９Ａ２０２０．４．２３エントリー番号Ｑ１３４２１（バージョン番号１３２、配列バージョン２）から得ることができ、（ヒト）ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ－３）の配列はＳｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ３６８８８（プライマリー引用可能アクセッション番号）又はＱ１３４１４（セカンダリーアクセッション番号）、バージョン番号１６５及び配列バージョン２から得ることができ、（ヒト）ＭＣＳＰ（黒色腫コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）の配列はＵｎｉＰｒｏｔエントリー番号Ｑ６ＵＶＫ１（バージョン番号１１８、配列バージョン２）から得ることができ、（ヒト）葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）の配列はＵｎｉＰｒｏｔエントリー番号Ｐ１５３２８（プライマリー引用可能アクセッション番号）又はＱ５３ＥＷ２（セカンダリーアクセッション番号）、バージョン番号１５３及び配列バージョン３から得ることができ、（ヒト）栄養芽層細胞表面抗原２（Ｔｒｏｐ－２）の配列はＵｎｉＰｒｏｔエントリー番号Ｐ０９７５８（プライマリー引用可能アクセッション番号）又はＱ１５６５８（セカンダリーアクセッション番号）、バージョン番号１７２及び配列バージョン３から得ることができ、（ヒト）ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）の配列はＵｎｉＰｒｏｔエントリー番号Ｏ４３６５３（プライマリー引用可能アクセッション番号）又はＱ６ＵＷ９２（セカンダリーアクセッション番号）、バージョン番号１３４及び配列バージョン１から得ることができ、（ヒト）ＨＥＲ－１（上皮成長因子受容体）の配列はＳｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ００５３３（エントリーバージョン１７７、配列バージョン２）から得ることができ、（ヒト）ＨＥＲ－２（受容体チロシンプロテインキナーゼｅｒｂＢ－２）の配列はＳｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ０４６２６（エントリーバージョン１６１、配列バージョン１）から得ることができ、（ヒト）ＨＥＲ－３（受容体チロシンプロテインキナーゼｅｒｂＢ－３）の配列はＳｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ２１８６０（エントリーバージョン１４０、配列バージョン１）から得ることができ、（ヒト）ＣＤ２０（Ｂリンパ球抗原ＣＤ２０）の配列はＳｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１１８３６（エントリーバージョン１１７、配列バージョン１）から得ることができ、（ヒト）ＣＤ２２（Ｂリンパ球抗原ＣＤ２２）の配列はＳｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ２０２７３（エントリーバージョン１３５、配列バージョン２）から得ることができ、（ヒト）ＣＤ３３（Ｂリンパ球抗原ＣＤ３３）の配列はＳｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ２０１３８（エントリーバージョン１２９、配列バージョン２）から得ることができ、（ヒト）ＣＡ－１２－５（ムチン１６）の配列はＳｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ８ＷＸＩ７（エントリーバージョン６６、配列バージョン２）から得ることができ、（ヒト）ＨＬＡ－ＤＲの配列はＳｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ２９９００（エントリーバージョン５９、配列バージョン１）から得ることができ、（ヒト）ＭＵＣ－１（ムチン－１）の配列はＳｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１５９４１（エントリーバージョン１３５、配列バージョン３）から得ることができ、（ヒト）Ａ３３（細胞表面Ａ３３抗原）の配列はＳｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９９７９５（エントリーバージョン１０４、配列バージョン１）から得ることができ、（ヒト）ＰＳＭＡ（グルタミン酸カルボキシペプチダーゼ２）の配列はＳｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ０４６０９（エントリーバージョン１３３、配列バージョン１）から得ることができ、（ヒト）トランスフェリン受容体の配列はＳｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９ＵＰ５２（エントリーバージョン９９、配列バージョン１）及びＰ０２７８６（エントリーバージョン１５２、配列バージョン２）から得ることができ、（ヒト）ＴＮＣ（テネイシン）の配列はＳｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ２４８２１（エントリーバージョン１４１、配列バージョン３）から得ることができ、（ヒト）ＣＡ－ＩＸ（炭酸脱水酵素ＩＸ）の配列はＳｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ１６７９０（エントリーバージョン１１５、配列バージョン２）から得ることができる。当業者は、ゲノムＤＮＡ並びにｍＲＮＡ／ｃＤＮＡも含み得るこれらのデータバンクエントリーにおけるこれらの（タンパク質）配列の関連コード領域を容易に推測し得る。
本発明のコンジュゲートは、例えば、本明細書に記載の、又は当技術分野で知られている、１つ又は複数の抗原結合ポリペプチドを、以下でより詳細に説明される多量体及び／又は多価フォーマットにおいて提供することができる。
ｃ．多量体フォーマット
本明細書に記載されるように、ポリペプチド（例えば、抗原結合ポリペプチド）のＮＬＰへのコンジュゲーションは、例えば、コンジュゲートが抗原結合ポリペプチドの２分子以上を提供する場合、すなわち、同じ分子の複数のコピーがＮＬＰに付着する場合、抗原結合ポリペプチドの多量体化を促進することができる。このフォーマットは、定義された方法で、抗原結合ポリペプチドの活性又は結合活性を増加させることができる。例えば、特定の抗体治療法では、価数が主な制限となる可能性があり、経路が強力に刺激又はアンタゴナイズされるために２を超える価数を必要とする既知のｍＡｂ標的に新たな焦点が当てられている。そのような標的の例には、活性化のために受容体クラスタリングを必要とする、ＤＲ５及びＯＸ４０などのＴＮＦファミリーメンバーが含まれる（４１、４２）。例えば、トリアボディ、テトラボディ、ペンタボディ、及び自己組織化六量体ＩｇＧ抗体（４３－４５）など、ＩｇＧ様及び非ＩｇＧ様フォーマットの両方を使用して、２を超えて価数を拡大するための様々な工学的戦略が開発されてきたが（４１、４２）、これらのフォーマットには、いくつかの制限がある。例えば、以前に使用されていたフォーマットは、薬物動態に悪影響を与える可能性があり、並びに３～６を超える価数を達成できず（４３）、多くの場合、十分な刺激／アンタゴナイズ活性を達成できない可能性がある。本発明は、特定の態様において、高密度の抗原結合ポリペプチド、例えばＦａｂを送達するためのプラットフォームを提供し、特定の標的に関連して臨床的に関連する治療指数を達成するために必要なインビボ効力を可能にする。この段落で引用されている全ての参考文献は、実施例５の下にある。
本発明の別の態様は、本明細書に記載のコンジュゲートプラットフォームを使用して、抗原結合ポリペプチドの結合活性、活性、又は効力を増加させることに関し、ここで、本発明のＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲートの抗原結合ポリペプチドは、２を超える価数を必要とする標的に向けられる。例えば、標的は、ＴＮＦファミリーメンバー、ＤＲ４、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、Ｔｉｅ２、Ｄ因子、ＶＥＧＦ、ＭｅｒＴＫ、ＣＤ３、及びリンホトキシンベータ受容体からなる群から選択される１つ又は複数であり得る。特定の実施態様では、抗原結合ポリペプチドは、ＯＸ４０に結合するＦａｂである。特定の実施態様では、抗原結合ポリペプチドは、ＤＲ４に結合するＦａｂである。いくつかの実施態様では、抗原結合ポリペプチドは、抗ＯＸ４０、抗ＧＩＴＲ、抗Ｔｉｅ２、抗Ｄ因子、抗ＶＥＧＦ、抗ＭＥＲＴＫ、抗ＣＤ３、抗リンホトキシンベータ受容体、及び抗ＤＲ４ Ｆａｂから選択される少なくとも１つのＦａｂである。
いくつかの実施態様では、本発明のＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲートは、抗原結合ポリペプチドの活性又は結合活性を増加させるために、コンジュゲート当たり２～６０分子など、２分子以上の抗原結合ポリペプチド、例えば、Ｆａｂを提供する。いくつかの実施態様では、コンジュゲートは、２～６０、３～５０、４～４０、５～３５、６～３０、又は７～２０分子の抗原結合ポリペプチド、例えばＦａｂを含む。特定の実施態様では、コンジュゲートは、２～３２、６～３２、１０～３０、１０～６０、１５～３０、又は２０分子の抗原結合ポリペプチド、例えばＦａｂを含む（例えば、実施例２、図３Ａ～３Ｄを参照）。いくつかの特定の実施態様では、コンジュゲートは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２分子の抗原結合ポリペプチド、例えばＦａｂを含む。そのような実施態様は、一般に、抗原結合ポリペプチドの活性及び／又は結合活性を増加させる。例えば、４～８分子の抗ＯＸ４０ Ｆａｂを有するコンジュゲートは、抗ＸＯ４０活性の増加を示す（例えば、実施例４、図５Ｂを参照）。
いくつかの実施態様では、本明細書に記載されるように、ポリペプチド（例えば、Ｆａｂなどの抗原結合ポリペプチド）のＮＬＰへのコンジュゲーションは、抗原結合ポリペプチド及び／又はＮＬＰの安定性を増加させる。例えば、抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ又はＦａｂ様分子）のＮＬＰへのコンジュゲーションは、貯蔵寿命を増加させるなど、インビトロで；及び／又は血清半減期を改善するなど、インビボで、抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ又はＦａｂ様分子）の安定性を改善することができる。いくつかの実施態様では、ＮＬＰの抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ又はＦａｂ様分子）へのコンジュゲーションは、貯蔵寿命を増加させるなど、インビトロで；及び／又は血清半減期を改善するなど、インビボで、ＮＬＰ粒子の安定性を改善する。したがって、本発明の別の態様は、本明細書に記載のコンジュゲートプラットフォームを使用して、抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ又はＦａｂ様分子）又はナノリポタンパク質粒子の安定性及び／又は半減期を増加させることに関する。
いくつかの実施態様では、本明細書に記載されるように、ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ又はＦａｂ様分子などの抗原結合ポリペプチド）のＮＬＰへのコンジュゲーションは、ポリペプチド－ＮＬＰ複合体（例えば、抗原結合ポリペプチド－ＮＬＰ複合体）の安定性を増加させる。いくつかの実施態様では、ポリペプチド－ＮＬＰ複合体（例えば、抗原結合ポリペプチド－ＮＬＰ複合体）の安定性は、ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ又はＦａｂ様分子などの抗原結合ポリペプチド）にコンジュゲートしていないＮＬＰと比較して、３０～４０％、４０～５０％、５０～６０％、６０～７０％、７０～８０％、又は８０～９０％増加する。いくつかの実施態様では、ポリペプチド－ＮＬＰ複合体（例えば、抗原結合ポリペプチド－ＮＬＰ複合体）の安定性は、ＮＬＰにコンジュゲートしていないポリペプチド（例えば、Ｆａｂ又はＦａｂ様分子などの抗原結合ポリペプチド）と比較して、３０～４０％、４０～５０％、５０～６０％、６０～７０％、７０～８０％、又は８０～９０％増加する。いくつかの実施態様では、ＮＬＰ及び抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ又はＦａｂ様分子）を含むコンジュゲートの安定性は、抗原結合ポリペプチドを含まないＮＬＰと比較して、例えば本明細書で測定されるように、３０～４０％、４０～５０％、５０～６０％、６０～７０％、７０～８０％、又は８０～９０％増加する。安定したＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲートは、一般に、コンジュゲート当たり５～６０、１０～６０、１５～３０、又は２０分子の抗原結合ポリペプチドを含み、コンジュゲート当たり７～６０、７～４０、７～３２、又は８～３０個の抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）を含む。特定の例では、ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲートは、６、７、８、９、又は１０個の抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）を含む。特定の実施態様では、抗原結合ポリペプチドは、Ｆａｂ又はＦａｂ様分子である。特定の例では、ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲートは、コンジュゲート当たり７～３２個のＦａｂ分子を含む。（例えば、実施例５、図６Ａ～６Ｂを参照、分析用ＳＥＣによって測定された、生理学的に適切な温度（３７℃）での複雑な生物学的マトリックス（５０％血清）におけるＦａｂ－ＮＬＰ安定性に対するＦａｂ負荷の効果を実証し、ここで、Ｆａｂ－ＮＬＰは安定性の向上を示し、粒子当たりのＦａｂの比率が７以上の場合、２４時間後に６３％を超えるＦａｂ－ＮＬＰがインタクトなままであった）。
したがって、本発明は、いくつかの実施態様において、驚くほど安定であり、他のナノ粒子送達プラットフォームの薬物動態の問題を克服するのに役立つＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲートを提供する。例えば、ナノ粒子のインビボでの半減期は約１～３日であることが知られており（実施例５の下の参考文献４０を参照）、モノクローナル抗体治療薬は、多くの場合、ＦｃＲｎリサイクルを介して半減期を延長するために、Ｆｃ媒介薬物動態に依存している。本発明のＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲートは、いくつかの実施態様において、ＮＬＰ円盤状表面上へのポリペプチド、例えば、Ｆａｂ又はＦａｂ様分子の複数のコピーの組み込みに基づいて、Ｆｃ媒介薬物動態なしで、驚くべきことにＮＬＰ安定性を改善する。
ｄ．多重特異性フォーマット
本発明の別の態様は、多重特異性構築物、すなわち、２つ以上の標的に結合する１つ又は複数の抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ又はＦａｂ様分子）を含むＮＬＰコンジュゲートを提供する。いくつかの実施態様では、標的は異なる抗原を含む。いくつかの実施態様では、標的は同じ抗原を含む。いくつかの実施態様では、標的は、同じ抗原上の異なるエピトープを含む。いくつかの実施態様では、コンジュゲートは、２、３、４、５、６、７、又は８個の異なる抗原結合ポリペプチド、例えば、２、３、４、５、６、７、又は８個の異なる抗原又はエピトープに結合する２、３、４、５、６、７、又は８個の異なるＦａｂを含む。いくつかの実施態様では、コンジュゲートは、１０～１２、１０～１５、１０～２０、１５～２０、１５～２５、１５～３０、又は２０～３０個の異なる抗原結合ポリペプチド、例えば、１０～１２、１０～１５、１０～２０、１５～２０、１５～２５、１５～３０、又は２０～３０個の異なる抗原又はエピトープに結合する１０～１２、１０～１５、１０～２０、１５～２０、１５～２５、１５～３０、又は２０～３０個の異なるＦａｂを含む。いくつかの実施態様では、コンジュゲートは、２５～３０、２５～５０、３０～４５、３０～５０、４０～５０、３０～６０、又は４０～６０個の異なる抗原結合ポリペプチド、例えば、２５～３０、２５～５０、３０～４５、３０～５０、４０～５０、３０～６０、又は４０～６０個の異なる抗原又はエピトープに結合する２５～３０、２５～５０、３０～４５、３０～５０、４０～５０、３０～６０、又は４０～６０個の異なるＦａｂを含む。
いくつかの実施態様では、本発明のＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲートの抗原結合ポリペプチドは、２つの異なる標的に向けられて、二重特異性コンジュゲートを与える。二重特異性抗体のアイデアは６０年以上前のものであるが、設計、安定性、及び製造に関連する課題により、当初は開発が遅れていた。最近では、抗体工学技術の進歩により、二重特異性モダリティへの関心が高まっており、最近ＦＤＡは３つの二重特異性抗体治療薬（ＥｐＣＡＭとＣＤ３を標的とするレモバブ、ＣＤ１９とＣＤ３を標的とするビーリンサイト、第ＩＸａ因子と第Ｘ因子を標的とするヘムライブラ（中外製薬））、並びに臨床試験における１００を超える多重特異性候補（例えば、ＶＥＧＦ－Ａ及びＡｎｇ－２を標的とするファリシマブ）を承認した。二重特異性構築物は、免疫細胞を腫瘍細胞に結合させたり、シグナル伝達経路を遮断したり、ペイロードを腫瘍に特異的に送達したりするなど、独自の作用機序を促進する。
本明細書に開示されるＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲートは、多特異的フォーマット及び／又は高価数に容易に拡張することができる、新規で用途の広い二重特異性プラットフォームを提供する。例えば、いくつかの実施態様では、ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲートは、２つの異なるＦａｂのそれぞれの１つの分子を含み、二価の二重特異性コンジュゲートを提供する。いくつかの実施態様では、ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲートは、２つの異なるＦａｂのそれぞれの２つの分子を含み、四価の二重特異性コンジュゲートを提供する。いくつかの実施態様では、ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲートは、１分子の第１のＦａｂと２分子の第２のＦａｂとを含み、三価の二重特異性コンジュゲートを提供する。いくつかの実施態様では、ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲートは、２つの異なるＦａｂのそれぞれの３つのコピーを含み、六価の二重特異性コンジュゲートを提供する。いくつかの実施態様では、ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲートは、３つの異なるＦａｂのそれぞれの２つのコピーを含み、六価の三重特異性コンジュゲートを提供する。いくつかの実施態様では、ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲートは、第１のＦａｂの２つのコピーと、第２のＦａｂの３つのコピーとを含み、５価の二重特異性コンジュゲートを提供する。いくつかの実施態様では、ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲートは、２つの異なるＦａｂのそれぞれの４つのコピーを含み、８価の二重特異性コンジュゲートを提供する。特定の多価及び多重特異性を提供するための追加の構成は、当業者には明らかであろう。
いくつかの実施態様では、ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲートは、一対の臨床的に関連する標的に結合する２つの抗原結合ポリペプチドのそれぞれの少なくとも１つの分子を含む。「一対の臨床的に関連する標的」、「一対の臨床的に関連する標的抗原」、「１つの臨床的に関連する対」、又は本明細書における同様の表現は、二重特異性抗体又は他の二重特異性構築物による２つの標的への結合が、疾患の治療において有益な効果をもたらすことができるような、特定の疾患の病態生理学において役割を果たす２つの疾患メディエーター（細胞表面受容体、可溶性リガンド、又は他のタンパク質など）を指す。例えば、Ｔ細胞と腫瘍細胞の両方が、例えば、本発明の二重特異性ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲートによって結合されると、細胞溶解性シナプスが形成され、Ｔ細胞が孔形成パーフォリンと細胞傷害性グランザイムＢを放出し、標的細胞の死滅を導く。別の例として、本明細書に記載の二重特異性ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲートは、１つの分子で２つの標的のシグナル伝達経路を同時に遮断することができ、これは血管新生などの複雑な経路を阻害するのに有利である。
いくつかの実施態様では、臨床的に関連する抗原の対は、Ｔ細胞マーカーと、本明細書に開示される及び／又は当技術分野で知られている腫瘍抗原のいずれか１つ又は複数などの腫瘍抗原とを含む。いくつかの実施態様では、臨床的に関連する抗原の対は、共刺激受容体と、本明細書に開示される及び／又は当技術分野で知られている腫瘍抗原のいずれか１つ又は複数などの腫瘍抗原とを含む。いくつかの実施態様では、臨床的に関連する抗原の対は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞マーカーと、本明細書に開示される及び／又は当技術分野で知られている腫瘍抗原のいずれか１つ又は複数などの腫瘍抗原とを含む。
「Ｔ細胞マーカー」とは、対象への抗原結合部分の投与後、抗原結合部分によって認識され、対象の他の細胞又は組織よりも優先的に抗原結合部分をＴ細胞へ誘導する任意の標的を指す。例示的なＴ細胞マーカーは、ＣＤ３を含む。「ＮＫ細胞マーカー」とは、対象への抗原結合部分の投与後、抗原結合部分によって認識され、対象の他の細胞又は組織よりも優先的に抗原結合部分をＴ細胞へ誘導する任意の標的を指す。例示的なＮＫ細胞マーカーは、ＣＤ３１６Ａを含む。
本明細書で提供される二重特異性又は多重特異性コンジュゲート（例えば、ＮＬＰ－Ｆａｂコンジュゲート又はＮＬＰ－Ｆａｂ様分子コンジュゲート）によって標的とされ得る分子の追加の例には、サイトカイン、可溶性血清タンパク質及びそれらの受容体、並びに他の膜結合タンパク質（例えば、アドヘシン）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施態様では、二重特異性又は多重特異性コンジュゲート（例えば、ＮＬＰ－Ｆａｂコンジュゲート又はＮＬＰ－Ｆａｂ様分子コンジュゲート）は、８ＭＰＩ、８ＭＰ２、８ＭＰ３８（ＧＤＦＩＯ）、８ＭＰ４、８ＭＰ６、８ＭＰ８、ＣＳＦＩ（Ｍ－ＣＳＦ）、ＣＳＦ２（ＧＭ－ＣＳＦ）、ＣＳＦ３（Ｇ－ＣＳＦ）、ＥＰＯ、ＦＧＦ１（αＦＧＦ）、ＦＧＦ２（βＦＧＦ）、ＦＧＦ３（ｉｎｔ－２）、ＦＧＦ４（ＨＳＴ）、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６（ＨＳＴ－２）、ＦＧＦ７（ＫＧＦ）、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１２Ｂ、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２３、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮ８１、ＩＦＮＧ、ＩＦＮＷＩ、ＦＥＬ１、ＦＥＬ１（ＥＰＳＩＬＯＮ）、ＦＥＬ１（ＺＥＴＡ）、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ１２Ｂ、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１７Ｂ、ＩＬ１８、ＩＬ１９、ＩＬ２０、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２４、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８Ａ、ＩＬ２８Ｂ、ＩＬ２９、ＩＬ３０、ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＢ、ＴＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢｂ３、ＬＴＡ（ＴＮＦ－β）、ＬＴＢ、ＴＮＦ（ＴＮＦ－α）、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ６（ＦａｓＬ）、ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンド）、ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ３０リガンド）、ＴＮＦＳＦ９（４－１ＢＢリガンド）、ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ）、ＴＮＦＳＦ１１（ＴＲＡＮＣＥ）、ＴＮＦＳＦ１２（ＡＰＯ３Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１３（Ａｐｒｉｌ）、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＳＦ１４（ＨＶＥＭ－Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１５（ＶＥＧＩ）、ＴＮＦＳＦ１８、ＨＧＦ（ＶＥＧＦＤ）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ１Ｒ２、ＩＬ１ＲＬ１、ＩＬ１ＲＬ２、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３ＲＡ、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ５ＲＡ、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ７Ｒ、ＩＬ８ＲＡ、ＩＬ８ＲＢ、ＩＬ９Ｒ、Ｉ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＩＬ１１ＲＡ、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１２ＲＢ２、ＩＬ１３ＲＡ１、ＩＬ１３ＲＡ２、ＩＬ１５ＲＡ、ＩＬ１７Ｒ、ＩＬ１８Ｒ１、ＩＬ２０ＲＡ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２２Ｒ、ＩＬ１ＨＹ１、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＬ１ＲＡＰＬ１、ＩＬ１ＲＡＰＬ２、ＩＬ１ＲＮ、ＩＬ６ＳＴ、ＩＬ１８ＢＰ、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＩＬ２２ＲＡ２、ＡＩＦ１、ＨＧＦ、ＬＥＰ（レプチン）、ＰＴＮ、及びＴＨＰＯからなる群から選択される１つ、２つ、又はそれ以上のサイトカイン、サイトカイン関連タンパク質、及びサイトカイン受容体に結合する。
いくつかの実施態様では、標的抗原は、ケモカイン、ケモカイン受容体、又はケモカイン関連タンパク質である。特定の実施態様では、二重特異性又は多重特異性コンジュゲートは、ＣＣＬ１（１－３０９）、ＣＣＬ２（ＭＣＰ－１／ＭＣＡＦ）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ－Ｉα）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ－Ｉβ）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ７（ＭＣＰ－３）、ＣＣＬ８（ｍｃｐ－２）、ＣＣＬ１１（エオタキシン）、ＣＣＬ１３（ＭＣＰ－４）、ＣＣＬ１５（ＭＩＰ－Ｉδ）、ＣＣＬ１６（ＨＣＣ－４）、ＣＣＬ１７（ＴＡＲＣ）、ＣＣＬ１８（ＰＡＲＣ）、ＣＣＬ１９（ＭＤＰ－３ｂ）、ＣＣＬ２０（ＭＩＰ－３α）、ＣＣＬ２１（ＳＬＣ／エクソダス－２）、ＣＣＬ２２（ＭＤＣ／ＳＴＣ－１）、ＣＣＬ２３（ＭＰＩＦ－１）、ＣＣＬ２４（ＭＰＩＦ－２、エオタキシン－２）、ＣＣＬ２５（ＴＥＣＫ）、ＣＣＬ２６（エオタキシン－３）、ＣＣＬ２７（ＣＴＡＣＫ／ＩＬＣ）、ＣＣＬ２８、ＣＸＣＬＩ（ＧＲＯＩ）、ＣＸＣＬ２（ＧＲ０２）、ＣＸＣＬ３（ＧＲ０３）、ＣＸＣＬ５（ＥＮＡ－７８）、ＣＸＣＬ６（ＧＣＰ－２）、ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ１０）、ＣＸＣＬ１１（１－ＴＡＣ）、ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦＩ）、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１６、ＰＦ４（ＣＸＣＬ４）、ＰＰＢＰ（ＣＸＣＬ７）、ＣＸ３ＣＬ１（ＳＣＹＤＩ）、ＳＣＹＥＩ、ＸＣＬＩ（リンホタクチン）、ＸＣＬ２（ＳＣＭ－Ｉβ）、ＢＬＲＩ（ＭＤＲ１５）、ＣＣＢＰ２（Ｄ６／ＪＡＢ６１）、ＣＣＲＩ（ＣＫＲＩ／ＨＭ１４５）、ＣＣＲ２（ｍｃｐ－ＩＲＢＩＲＡ）、ＣＣＲ３（ＣＫＲ３／ＣＭＫＢＲ３）、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５（ＣＭＫＢＲ５／ＣｈｅｍＲ１３）、ＣＣＲ６（ＣＭＫＢＲ６／ＣＫＲ－Ｌ３／ＳＴＲＬ２２／ＤＲＹ６）、ＣＣＲ７（ＣＫＲ７／ＥＢＩＩ）、ＣＣＲ８（ＣＭＫＢＲ８／ＴＥＲ１／ＣＫＲ－Ｌ１）、ＣＣＲ９（ＧＰＲ－９－６）、ＣＣＲＬ１（ＶＳＨＫ１）、ＣＣＲＬ２（Ｌ－ＣＣＲ）、ＸＣＲ１（ＧＰＲ５／ＣＣＸＣＲ１）、ＣＭＫＬＲ１、ＣＭＫＯＲ１（ＲＤＣ１）、ＣＸ３ＣＲ１（Ｖ２８）、ＣＸＣＲ４、ＧＰＲ２（ＣＣＲ１０）、ＧＰＲ３１、ＧＰＲ８１（ＦＫＳＧ８０）、ＣＸＣＲ３（ＧＰＲ９／ＣＫＲ－Ｌ２）、ＣＸＣＲ６（ＴＹＭＳＴＲ／ＳＴＲＬ３３／Ｂｏｎｚｏ）、ＨＭ７４、ＩＬ８ＲＡ（ＩＬ８Ｒα）、ＩＬ８ＲＢ（ＩＬ８Ｒβ）、ＬＴＢ４Ｒ（ＧＰＲ１６）、ＴＣＰ１０、ＣＫＬＦＳＦ２、ＣＫＬＦＳＦ３、ＣＫＬＦＳＦ４、ＣＫＬＦＳＦ５、ＣＫＬＦＳＦ６、ＣＫＬＦＳＦ７、ＣＫＬＦＳＦ８、ＢＤＮＦ、Ｃ５Ｒ１、ＣＳＦ３、ＧＲＣＣ１０（Ｃ１０）、ＥＰＯ、ＦＹ（ＤＡＲＣ）、ＧＤＦ５、ＨＤＦ１、ＨＤＦ１α、ＤＬ８、ＰＲＬ、ＲＧＳ３、ＲＧＳ１３、ＳＤＦ２、ＳＬ１Ｔ２、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＲＥＭ１、ＴＲＥＭ２、及びＶＨＬからなる群から選択される１つ、２つ、又はそれ以上のケモカイン、ケモカイン受容体、又はケモカイン関連タンパク質に結合する。
いくつかの実施態様では、標的抗原はＣＤタンパク質である。特定の実施態様では、二重特異性又は多重特異性コンジュゲート（例えば、ＮＬＰ－Ｆａｂコンジュゲート又はＮＬＰ－Ｆａｂ様分子コンジュゲート）は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４；ＣＤ６４、ＥｒｂＢ受容体ファミリーのＣＤ２００メンバー、例えば、ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、又はＨＥＲ４受容体など；細胞接着分子、例えば、ＬＦＡ－１、Ｍａｃ１、ｐ１５０．９５、ＶＬＡ－４、ＩＣＡＭ－１、ＶＣＡＭ、アルファ４／ベータ７インテグリン、及びアルファｖ／ベータ３インテグリン、そのアルファ又はベータサブユニットのいずれかを含むもの（例えば、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８、又は抗ＣＤ１１ｂ抗体）など；成長因子、例えば、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｃなど；組織因子（ＴＦ）；アルファインターフェロン（アルファＩＦＮ）；ＴＮＦアルファ、インターロイキン、例えば、ＩＬ－１ベータ、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－Ｓ、ＩＬ－９、ＩＬ－１３、ＩＬ１７ＡＦ、ＩＬ－１Ｓ、ＩＬ－１３Ｒアルファ１、ＩＬ１３Ｒアルファ２、ＩＬ－４Ｒ、ＩＬ－５Ｒ、ＩＬ－９Ｒ、ＩｇＥなど；血液型抗原；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐ１受容体；ＣＴＬＡ－４；ＲＡＮＫＬ、ＲＡＮＫ、ＲＳＶ Ｆタンパク質、プロテインＣなどからなる群から選択される１つ、２つ、又はそれ以上のＣＤタンパク質に結合する。
特定の実施態様では、多重特異性ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲート（例えば、ＮＬＰ－Ｆａｂコンジュゲート又はＮＬＰ－Ｆａｂ様分子コンジュゲート）は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）－１又はＬＲＰ－８又はトランスフェリン受容体、並びに、１）ベータ－セクレターゼ（ＢＡＣＥ１又はＢＡＣＥ２）、２）アルファ－セクレターゼ、３）ガンマ－セクレターゼ、４）タウセクレターゼ、５）アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、６）細胞死受容体６（ＤＲ６）、７）アミロイドベータペプチド、８）アルファ－シヌクレイン、９）パーキン、１０）ハンチンチン、１１）ｐ７５ ＮＴＲ、及び１２）カスパーゼ－６からなる群から選択される少なくとも１つの標的に結合する。
特定の実施態様では、多重特異性ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲート（例えば、ＮＬＰ－Ｆａｂコンジュゲート又はＮＬＰ－Ｆａｂ様分子コンジュゲート）は、ＩＬ－１アルファ及びＩＬ－１ベータ；ＩＬ－１２及びＩＬ－１Ｓ；ＩＬ－１３及びＩＬ－９；ＩＬ－１３及びＩＬ－４；ＩＬ－１３及びＩＬ－５；ＩＬ－５及びＩＬ－４；ＩＬ－１３及びＩＬ－１ベータ；ＩＬ－１３及びＩＬ－２５；ＩＬ－１３及びＴＡＲＣ；ＩＬ－１３及びＭＤＣ；ＩＬ－１３及びＭＥＦ；ＩＬ－１３及びＴＧＦ；ＩＬ－１３及びＬＨＲアゴニスト；ＩＬ－１２及びＴＷＥＡＫ；ＩＬ－１３及びＣＬ２５；ＩＬ－１３及びＳＰＲＲ２ａ；ＩＬ－１３及びＳＰＲＲ２ｂ；ＩＬ－１３及びＡＤＡＭＳ；ＩＬ－１３及びＰＥＤ２；ＩＬ１７Ａ及びＩＬ１７Ｆ；ＣＤ３及びＣＤ１９；ＣＤ１３８及びＣＤ２０；ＣＤ１３８及びＣＤ４０；ＣＤ１９及びＣＤ２０；ＣＤ２０及びＣＤ３；ＣＤ３Ｓ及びＣＤ１３Ｓ；ＣＤ３Ｓ及びＣＤ２０；ＣＤ３Ｓ及びＣＤ４０；ＣＤ４０及びＣＤ２０；ＣＤ－Ｓ及びＩＬ－６；ＣＤ２０及びＢＲ３；ＴＮＦ－アルファ及びＴＧＦ－ベータ；ＴＮＦ－アルファ及びＩＬ－１ベータ；ＴＮＦ－アルファ及びＩＬ－２；ＴＮＦ－アルファ及びＩＬ－３；ＴＮＦ－アルファ及びＩＬ－４；ＴＮＦ－アルファ及びＩＬ－５；ＴＮＦ－アルファ及びＩＬ－６；ＴＮＦ－アルファ及びＩＬ８；ＴＮＦ－アルファ及びＩＬ－９；ＴＮＦ－アルファ及びＩＬ－１０；ＴＮＦ－アルファ及びＩＬ－１１；ＴＮＦ－アルファ及びＩＬ－１２；ＴＮＦ－アルファ及びＩＬ－１３；ＴＮＦ－アルファ及びＩＬ－１４；ＴＮＦ－アルファ及びＩＬ－１５；ＴＮＦ－アルファ及びＩＬ－１６；ＴＮＦ－アルファ及びＩＬ－１７；ＴＮＦ－アルファ及びＩＬ－１８；ＴＮＦ－アルファ及びＩＬ－１９；ＴＮＦ－アルファ及びＩＬ－２０；ＴＮＦ－アルファ及びＩＬ－２３；ＴＮＦ－アルファ及びＩＦＮ－アルファ；ＴＮＦ－アルファ及びＣＤ４；ＴＮＦ－アルファ及びＶＥＧＦ；ＴＮＦ－アルファ及びＭＩＦ；ＴＮＦ－アルファ及びＩＣＡＭ－１；ＴＮＦ－アルファ及びＰＧＥ４；ＴＮＦ－アルファ及びＰＥＧ２；ＴＮＦ－アルファ及びＲＡＮＫリガンド及び；ＴＮＦ－アルファ及びＴｅ３８；ＴＮＦ－アルファ及びＢＡＦＦ；ＴＮＦ－アルファ及びＣＤ２２；ＴＮＦ－アルファ及びＣＴＬＡ－４；ＴＮＦ－アルファ及びＧＰ１３０；ＴＮＦ－アルファ及びＩＬ－１２ｐ４０；ＶＥＧＦ及びＨＥＲ２；ＶＥＧＦ－Ａ及びＨＥＲ２；ＶＥＧＦ－Ａ及びＰＤＧＦ；ＨＥＲ１及びＨＥＲ２；ＶＥＧＦＡ及びＡＮＧ２；ＶＥＧＦ－Ａ及びＶＥＧＦ－Ｃ；ＶＥＧＦ－Ｃ及びＶＥＧＦ－Ｄ；ＨＥＲ２及びＤＲ５；ＶＥＧＦ及びＩＬ－８；ＶＥＧＦ及びＭＥＴ；ＶＥＧＦＲ及びＭＥＴ受容体；ＥＧＦＲ及びＭＥＴ；ＶＥＧＦＲ及びＥＧＦＲ；ＨＥＲ２及びＣＤ６４；ＨＥＲ２及びＣＤ３；ＨＥＲ２及びＣＤ１６；ＨＥＲ２及びＨＥＲ３；ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）及びＨＥＲ２；ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３；ＥＧＦＲ及びＨＥＲ４；ＩＬ－１４及びＩＬ－１３；ＩＬ－１３及びＣＤ４０Ｌ；ＩＬ４及びＣＤ４０Ｌ；ＴＮＦＲ１及びＩＬ－１Ｒ；ＴＮＦＲ１及びＩＬ－６Ｒ；ＴＮＦＲ１及びＩＬ－１８Ｒ；ＥｐＣＡＭ及びＣＤ３；ＭＡＰＧ及びＣＤ２８；ＥＧＦＲ及びＣＤ６４；ＣＳＰＧｓ及びＲＧＭ Ａ；ＣＴＬＡ－４及びＢＴＮ０２；ＩＧＦ１及びＩＧＦ２；ＩＧＦ１／２及びＥｒｂ２Ｂ；ＭＡＧ及びＲＧＭ Ａ；ＮｇＲ及びＲＧＭ Ａ；ＮｏｇｏＡ及びＲＧＭ Ａ；ＯＭＧｐ及びＲＧＭ Ａ；ＰＯＬ－１及びＣＴＬＡ－４；及びＲＧＭ Ａ及びＲＧＭ Ｂからなる群から選択される臨床的に関連する対の１つ又は複数に結合する。
本発明の多重特異性ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲート（例えば、ＮＬＰ－Ｆａｂコンジュゲート又はＮＬＰ－Ｆａｂ様分子コンジュゲート）によって共標的化され得る追加の臨床的に関連する対には、ＣＤ６３及びＣＤ９５（細胞死受容体）；ＨＥＲ２及びＣＤ６３（リソソーム内在化に関与する受容体）；ＣＤ２０又はＣＤ１９及びＣＤ４７（「私を食べないでください」のシグナルを中断する）；ＬＡＧ－３及びＰＤ１；ＣＴＬＡ４及びＰＤ１；並びにＬＡＧ－３及びＰＤ－Ｌ１が含まれる。
特定の実施態様では、ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲートは、ＣＤ３（一般的なＴ細胞マーカー）に結合する第１の抗原結合ポリペプチド（例えば、第１のＦａｂ）と、標的ＣＤ１９（腫瘍抗原）に結合する第２の抗原結合ポリペプチド（例えば、第２のＦａｂ）とを含む。別の特定の実施態様では、ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲートは、ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ポリペプチド（例えば、第１のＦａｂ）と、ＥｐＣＡＭ（腫瘍抗原）に結合する第２の抗原結合ポリペプチド（例えば、第２のＦａｂ）とを含む。さらに別の特定の実施態様では、ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲートは、ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ポリペプチド（例えば、第１のＦａｂ）と、ＣＥＡに結合する第２の抗原結合ポリペプチド（例えば、第２のＦａｂ）とを含む。さらに別の特定の実施態様では、ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲートは、ＣＤ１６Ａ（ＮＫ細胞マーカー）に結合する第１の抗原結合ポリペプチド（例えば、第１のＦａｂ）と、ＣＤ３０又はＣＤ３３に結合する第２の抗原結合ポリペプチド（例えば、第２のＦａｂ）と、場合によって、ＩＬ－１５に結合する第３の抗原結合ポリペプチド（例えば、第３のＦａｂ）とを含む。
１つの特定の例では、ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲートは、Ａｎｇ－２に結合する第１の抗原結合ポリペプチド（例えば、第１のＦａｂ）と、ＶＥＧＦ－Ａに結合する第２の抗原結合ポリペプチド（例えば、第２のＦａｂ）とを含む。別の特定の例では、ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲートは、デルタ様リガンド４に結合する第１の抗原結合ポリペプチド（例えば、第１のＦａｂ）と、ＶＥＧＦに結合する第２の抗原結合ポリペプチド（例えば、第２のＦａｂ）とを含む。さらに別の特定の例では、ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲートは、ＤＲ５に結合する第１の抗原結合ポリペプチド（例えば、第１のＦａｂ）と、ＦＡＰ（線維芽細胞活性化タンパク質）に結合する第２の抗原結合ポリペプチド（例えば、第２のＦａｂ）とを含む。
いくつかの特定の実施態様では、ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲートは、ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ポリペプチド（例えば、第１のＦａｂ）と、ＣＤ３３、ｇｐ１００、ＨＥＲ２、グリピカン－３、及びＴＲＯＰ－２のうちの少なくとも１つに結合する第２の抗原結合ポリペプチド（例えば、第２のＦａｂ）と、場合によって、ＩＬ－２、ＣＤ１３７、及びＣＤ２８から選択される少なくとも１つの共刺激分子に結合する第３の抗原結合ポリペプチド（例えば、第３のＦａｂ）とを含む。いくつかの特定の実施態様では、ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲートは、ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ポリペプチド（例えば、第１のＦａｂ）と、ＣＤ３３、ｇｐ１００、ＨＥＲ２、グリピカン－３、及びＴＲＯＰ－２のうちの少なくとも１つに結合する第２の抗原結合ポリペプチド（例えば、第２のＦａｂ）と、場合によって、ＰＤ１及び／又はＰＤ－Ｌ１に結合する第３の抗原結合ポリペプチド（例えば、第３のＦａｂ）とを含む。特定の実施態様では、ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲートは、ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ポリペプチド（例えば、第１のＦａｂ）と、ＣＥＡに結合する第２の抗原結合ポリペプチド（例えば、第２のＦａｂ）と、ＰＤ１及びＰＤ－Ｌ１の少なくとも１つに結合する第３の抗原結合ポリペプチド（例えば、第３のＦａｂ）とを含む。
いくつかの特定の実施態様では、ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲートは、ＣＤ２８に結合する第１の抗原結合ポリペプチド（例えば、第１のＦａｂ）と、ＣＤ２０に結合する第２の抗原結合ポリペプチド（例えば、第２のＦａｂ）とを含む。いくつかの特定の実施態様では、ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲートは、ＰＤ１に結合する第１の抗原結合ポリペプチド（例えば、第１のＦａｂ）と、ＣＴＬＡ４に結合する第２の抗原結合ポリペプチド（例えば、第２のＦａｂ）とを含む。いくつかの特定の実施態様では、ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲートは、２つの異なるＨＥＲ２エピトープに結合する２つの抗原結合ポリペプチドを含む。
ｄ．短いペプチド成分
いくつかの実施態様では、ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲートは、１～８０、１０～７０、又は２０～６０個のアミノ酸を含む短いペプチド（例えば、ＣＫＰ又はＣＫＰバリアント）に共有結合した少なくとも１つのＣ４－２８脂肪酸アシルを含む（例えば、さらに含むなど）。
いくつかの実施態様では、Ｃ４－２８脂肪酸アシルはＣ１６脂肪酸アシルである。いくつかの実施態様では、Ｃ４－２８脂肪酸アシルは、官能基（例えば、本明細書の他の場所に記載の官能基）を含む。いくつかの実施態様では、官能基は、Ｃ４－２８脂肪酸アシルの炭化水素尾部の化学構造上又はその一部に直接位置する。いくつかの実施態様では、官能基は、短いペプチドの１つ又は複数のアミノ酸残基上の対応する又は相補的な官能基（例えば、本明細書の他の場所に記載されるような）と反応する。いくつかの実施態様では、対応する又は相補的な官能基は、ペプチド（例えば、ＣＫＰ又はＣＫＰバリアント）のＣ末端に位置する。いくつかの実施態様では、対応する又は相補的な官能基は、ペプチド（例えば、ＣＫＰ又はＣＫＰバリアント）のＮ末端に位置する。いくつかの実施態様では、Ｃ４－２８脂肪酸アシルは、短いペプチド（例えば、ＣＫＰ又はＣＫＰバリアント）のＮ末端でリジン側鎖のイプシロンアミノ基にコンジュゲートしている。いくつかの実施態様では、コンジュゲートは、１～１００、１０～９０、２０～８０、３０～７０、４０～６０、又は６０個の短いペプチド（例えば、１～１００、１０～９０、２０～８０、３０～７０、４０～６０、又は６０個のＣ４－２８脂肪酸アシル分子であって、各々が短いペプチド、例えば、ＣＫＰ又はＣＫＰバリアントに共有結合している）を含む（例えば、さらに含むなど）。いくつかの実施態様では、短いペプチド：ＮＬＰのモル比は、１～１００、１０～９０、２０～８０、３０～７０、４０～６０の間、又は６０である。いくつかの実施態様では、ＮＬＰ中の短いペプチド：抗原結合ポリペプチドのモル比は、１～１００、１０～９０、２０～８０、３０～７０、又は４０～６０の間である。いくつかの実施態様では、短いペプチドと抗原結合ポリペプチドの両方を含むＮＬＰの短いペプチド：抗原結合ポリペプチドのモル比は、約１：６０～６０：１の間であり、この範囲内の任意の比を含む。いくつかの実施態様では、短いペプチドと抗原結合ポリペプチドの両方を含むＮＬＰの短いペプチド：抗原結合ポリペプチドのモル比は、約２０である。いくつかの実施態様では、ＮＬＰは、１～５０個の抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ又はＦａｂ様ポリペプチド）及び１～１００個（例えば、約６０個）の短いペプチド（例えば、ＣＫＰ又はＣＫＰバリアント）を含む。いくつかの実施態様では、ペプチド－ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲートは、５～３０、１０～２５、１５～２０、又は１８分子の短いペプチド（例えば、ＣＫＰ又はＣＫＰバリアント）、及び５～４０、１０～３５、１５～３０、２０～２５、又は２３分子の抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ又はＦａｂ様分子）を含む。いくつかの実施態様では、ペプチド－ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲートは、３～３０、５～２０、１０～１５、１３分子の短いペプチド（例えば、ＣＫＰ又はＣＫＰバリアント）、及び１０～６０分子の抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ又はＦａｂ様分子）を含む。いくつかの実施態様では、ペプチド－ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲートは、２０～８０、２５～７０、３０～６０、３５～５０、又は４０分子の短いポリペプチド（例えば、ＣＫＰ又はＣＫＰバリアント）、及び１０～６０分子の抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ又はＦａｂ様分子）を含む。いくつかの実施態様では、ＮＬＰ中の短いペプチド：抗原結合ポリペプチドのモル比は、１～１００、１０～９０、２０～８０、３０～７０、又は４０～６０の間である。いくつかの実施態様では、短いペプチドと抗原結合ポリペプチドの両方を含むＮＬＰの短いペプチド：抗原結合ポリペプチドのモル比は、約１：６０～６０：１の間であり、この範囲内の任意の比を含む。いくつかの実施態様では、短いペプチドと抗原結合ポリペプチドの両方を含むＮＬＰの短いペプチド：抗原結合ポリペプチドのモル比は、約２０である。
いくつかの実施態様では、ペプチド－ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲートへのペプチドコンジュゲートＣ４－２８脂肪酸アシルの組み込みは、例えば、抗原結合ポリペプチドについて上述したように、ペプチド（例えば、ＣＫＰ又はＣＫＰバリアント）の結合活性、活性、又は効力を増加させる。
いくつかの実施態様では、ペプチド－ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲートは、例えば、２つ以上の異なる活性、例えば、異なる標的結合特異性及び／又は異なる治療活性を示す、２つ以上の異なる短いペプチド（例えば、ＣＫＰ又はＣＫＰバリアント）（ＣＫＰ又はＣＫＰバリアントなどの２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の異なる短いペプチドなど）を含む。本明細書に開示されるペプチド－ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲートは、抗原結合ポリペプチド（上記のような）に関してだけでなく、短いペプチド（例えば、ＣＫＰ又はＣＫＰバリアント）に関しても、多重特異性フォーマット及び／又は高価数に拡張することができる多重特異性プラットフォームを提供する。例えば、いくつかの実施態様では、ペプチド－ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲートは、２、３、４、５、６、７、又は８個の異なる短いペプチド（例えば、ＣＫＰ又はＣＫＰバリアント）、例えば、２、３、４、５、６、７、又は８個の異なる抗原又はエピトープに結合する２、３、４、５、６、７、又は８個の異なるペプチドを含む。いくつかの実施態様では、ペプチド－ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲートは、１０～１２、１０～１５、１０～２０、１５～２０、１５～２５、１５～３０、又は２０～３０個の異なる短いペプチド（例えば、ＣＫＰ又はＣＫＰバリアント）、例えば、１０～１２、１０～１５、１０～２０、１５～２０、１５～２５、１５～３０、又は２０～３０個の異なる抗原又はエピトープに結合する１０～１２、１０～１５、１０～２０、１５～２０、１５～２５、１５～３０、又は２０～３０個の異なるペプチドを含む。いくつかの実施態様では、ペプチド－ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲートは、２５～３０、２５～５０、３０～４５、３０～５０、４０～５０、３０～６０、又は４０～６０個の異なる短いペプチド（例えば、ＣＫＰ又はＣＫＰバリアント）、例えば、２５～３０、２５～５０、３０～４５、３０～５０、４０～５０、３０～６０、又は４０～６０個の異なる抗原又はエピトープに結合する２５～３０、２５～５０、３０～４５、３０～５０、４０～５０、３０～６０、又は４０～６０個の異なるペプチドを含む。
いくつかの実施態様では、ペプチド－ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲートは、短いペプチド（例えば、ＣＫＰ又はＣＫＰバリアント）と、抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ又はＦａｂ様分子）とを含む。いくつかの実施態様では、短いペプチドは、抗原結合ポリペプチドと同じ標的に結合する。いくつかの実施態様では、短いペプチドは、抗原結合ポリペプチドとは異なる標的に結合する。いくつかの実施態様では、短いペプチドは、抗原結合ポリペプチドの活性（例えば、治療活性）に相補的又は相乗的な活性（例えば、治療活性）を示す。例えば、いくつかの実施態様では、ペプチド－ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲートは、２つの異なる抗原に結合する２つの短いペプチドを含み、ここで、２つの異なる標的は以下の対：ＣＤ３及びＣＤ１９；ＣＤ３及びＥｐＣＡＭ；ＣＤ３及びＣＥＡ；ＣＤ１６及びＣＤ３０；ＣＤ１６及びＣＤ３３；Ａｎｇ－２及びＶＥＧＦ－Ａ；並びに第Ｘ因子及び第ＩＸａ因子から選択される。いくつかの実施態様では、コンジュゲートは、短いペプチド（例えば、ＣＫＰ又はＣＫＰバリアント）及び抗原結合ポリペプチドを含み、ここで、短いペプチド及び抗原結合ポリペプチドは、２つの異なる抗原に結合し、いくつかの実施態様では、２つの異なる標的は以下の対：ＣＤ３及びＣＤ１９；ＣＤ３及びＥｐＣＡＭ；ＣＤ３及びＣＥＡ；ＣＤ１６及びＣＤ３０；ＣＤ１６及びＣＤ３３；Ａｎｇ－２及びＶＥＧＦ－Ａ；並びに第Ｘ因子及び第ＩＸａ因子から選択される。
いくつかの実施態様では、コンジュゲートは、ＯＸ４０、ＤＲ４、ＧＩＴＲ、Ｔｉｅ２、Ｄ因子、ＶＥＧＦ、ＭｅｒＴＫ、ＣＤ３、及びリンホトキシンベータ受容体から選択される標的に結合する短いペプチド（例えば、ＣＫＰ又はＣＫＰバリアント）を含む。いくつかの実施態様では、コンジュゲートは、前述の標的の任意の組み合わせに結合する、少なくとも２つの異なる短いペプチド（例えば、ＣＫＰ又はＣＫＰバリアント）、又は短いペプチド（例えば、ＣＫＰ又はＣＫＰバリアント）及び抗原結合ペプチド（例えば、Ｆａｂ又はＦａｂ様分子）を含む。いくつかの実施態様では、コンジュゲートは、Ｄ因子、ＶＥＧＦ、Ｔｉｅ２、及びＤＲ４から選択される標的に結合する短いペプチド（例えば、ＣＫＰ又はＣＫＰバリアント）を含む。いくつかの実施態様では、コンジュゲートは、前述の標的の任意の組み合わせに結合する、少なくとも２つの異なる短いペプチド（例えば、ＣＫＰ又はＣＫＰバリアント）、又は短いペプチド（例えば、ＣＫＰ又はＣＫＰバリアント）及び抗原結合ペプチド（例えば、Ｆａｂ又はＦａｂ様分子）を含む。
いくつかの実施態様では、短いペプチドはシスチンノットペプチド（ＣＫＰ）である。シスチンノットペプチドは、典型的には２０～６０個のアミノ酸長であり、シスチンノットモチーフとして知られる結び目のあるコンフォメーション、すなわち、２つのジスルフィド結合によって形成される環に３番目のジスルフィド結合が通されるように配置された３つの分子内ジスルフィド結合を形成する６つの保存されたシステインを含む（Ｃｒａｉｋ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｔｏｘｉｃｏｎ ３９（１）：４３－６０）。さまざまな種からのペプチド及びタンパク質に存在するこのような構造モチーフは、熱的、化学的及び酵素的分解に対する高い安定性をペプチドフレームワークに付与する（Ｃｏｌｇｒａｖｅ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３，５９６５－５９７５）。例示的なＣＫＰには、限定はされないが、例えば、ＥＥＴＩ－ＩＩ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号 Ｐ１２０７１）、ｃｙｃｌｏｐｓｙｃｈｏｔｒｉｄｅ Ａ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号 Ｐ５６８７２）、シクロビオラシンＯ１（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号 Ｐ８２２３０）、シクロビオラシンＯ１２（ＵｎｉＰｒｏｔ アクセッション番号 Ｐ８３８３６）、カラタ（例えば、カラタＢ１（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号 Ｐ５６２５４）、カラタＢ８（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号 Ｐ８５１７５）、など）、ｐａｌｉｃｏｕｒｅｉｎ（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号 Ｐ８４６４５）、ｔｒｉｃｙｃｌｏｎ Ａ（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号 Ｂ６Ｅ６１７）、Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｏｃｈｉｎｃｈｉｎｅｎｓｉｓトリプシン阻害剤、例えば、ＭＣｏＴＩ １（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号 Ｐ８２４０８）、Ｓｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｃｅａトリプシン阻害剤、例えば、ＳＯＴＩ １（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号 Ｐ８４７７９）、サーキュリンＡ（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号 Ｐ５６８７１）、サーキュリンＢ（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号 ５６８７９）、ｃｙｃｌｏｐｓｙｃｈｏｔｒｉｄｅ（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号 Ｐ５６８７２）、及びｖａｒｖペプチドＡ（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号 Ｐ５８４４６）が挙げられる。いくつかの実施態様では、ＣＫＰはＥＥＴＩ－ＩＩである。ＥＥＴＩ－ＩＩのアミノ酸配列は、ＧＣＰＲＩＬＭＲＣＫＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧ（配列番号１）である。
ＣＫＰの保存されたシステイン残基に隣接するループ領域に存在する高いアミノ酸配列の多様性は、これらの領域で非天然配列が許容される可能性があることを示唆している。ＣＫＰバックボーンは、天然のＣＫＰとは大きく異なる構造及び／又は生物学的活性を持つ非常に安定したペプチドを生成するために、ペプチド移植及び親和性成熟のフレームワークとして使用されてきた。例えば、Ｅｃｂａｌｌｉｕｍ ｅｌａｔｅｒｉｕｍトリプシン阻害剤ＩＩ（ＥＥＴＩ－ＩＩ）は、このトリプシン結合ループ（ＰＲＩＬＭＲ）を、エラスターゼ、トロンボポエチン、インテグリンなどの標的に対するグラフト化生物活性ペプチドと合理的に置換することにより、分子足場として使用されている。例えば、Ｋｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ７７，３５９－３６９；Ｇｕｎａｓｅｋｅｒａ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５１：７６９７－７７０４；Ｋｒａｕｓｅ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ７７，３５９－３６９；Ｈｉｌｐｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，２４９８６－２４９９３；及びＫｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（２０１１）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６，ｅ１６１１２）を参照されたい。さらに、対象の標的、例えば、ＶＥＧＦＡ及びＬＲＰ６に結合するＥＥＴＩ－ＩＩのペプチド誘導体は、親和性成熟によって生成されている。国際公開第２０１７／０４９００９号を参照されたい。いくつかの実施態様では、ペプチドはＣＫＰバリアントである。いくつかの実施態様では、ＣＫＰバリアントは、野生型ＣＫＰの対応する１つ又は複数のループ配列と比較して、１つ又は複数のループ配列中に１つ又は複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／又は置換を含む。追加的に、又は代替的に、いくつかの実施態様では、ＣＫＰバリアントは、野生型ＣＫＰと比較して、Ｎ末端に１つ又は複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／又は置換を含む。追加的に、又は代替的に、いくつかの実施態様では、ＣＫＰバリアントは、野生型ＣＫＰと比較して、Ｃ末端に１つ又は複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／又は置換を含む。追加的に、又は代替的に、いくつかの実施態様では、ＣＫＰバリアントは、野生型ＣＫＰと比較して、Ｎ末端に化学修飾を含む。追加的に、又は代替的に、いくつかの実施態様では、ＣＫＰバリアントは、野生型ＣＫＰと比較して、Ｃ末端に化学修飾を含む。いくつかの実施態様では、ＣＫＰバリアントは、（例えば、ＣＫＰバリアントのＮ末端で若しくはその付近で、又はＣＫＰバリアントのＣ末端で若しくはその近傍で）、Ｃ４－２８脂肪酸アシル（例えば、Ｃ１６脂肪酸アシル）のＣＫＰバリアントへの共有結合的コンジュゲーションを可能にする修飾を含む。いくつかの実施態様では、ＣＫＰバリアントは、それが由来した野生型ＣＫＰと比較して、そのＮ末端に追加のリジン残基をさらに含む（例えば、さらに含むように修飾されている）。いくつかの実施態様では、ＣＫＰバリアントは、それが由来する野生型ＣＫＰが結合する標的とは異なる標的に結合する。いくつかの実施態様では、ＣＫＰバリアントは、それが由来する野生型ＣＫＰが結合する標的とは異なる活性（例えば、治療活性）を示す。いくつかの実施態様では、ＣＫＰバリアントは、ＥＥＴＩ－ＴＴ（配列番号１）に由来する。
いくつかの実施態様では、抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ又はＦａｂ様分子）及び短いペプチドを含むコンジュゲート（例えば、ペプチド－ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲート）中の短いペプチドの活性は、短いペプチドを含んでなる、すなわち、抗原結合ポリペプチドを含まないコンジュゲート（例えば、ペプチド－ＮＬＰコンジュゲート）中の短いペプチドの活性よりも高く、例えば、約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、又は１０倍のいずれか高い。いくつかの実施態様では、短いペプチドの活性は、約２倍から２０倍高く、例えば、約５倍高い。いくつかの実施態様では、短いペプチドはＣＫＰ、例えばＥＥＴＩ－ＩＩである。いくつかの実施態様では、短いペプチドは、ＥＥＴＩ－ＩＩに由来するＣＫＰバリアントである。
ＩＩＩ．短いペプチドを含むナノリポタンパク質コンジュゲート
本発明の別の態様は、１～８０、１０～７０、又は２０～６０個のアミノ酸を含む少なくとも１つの短いペプチド（すなわち、足場タンパク質以外のＮＬＰ組み込みペプチド）を含むナノリポタンパク質粒子コンジュゲートに関する。本明細書の他の場所で論じるように、「ナノリポタンパク質粒子」又はＮＬＰは、脂質及び足場タンパク質を含む超分子複合体、特に膜形成脂質、及びアポリポタンパク質などの足場タンパク質を含む超分子複合体を指す。ＮＬＰは通常、自己組織化プロセスを通じて形成され、ここで、膜形成脂質は円盤状の脂質二重層を形成し（実施例５の下の参考文献１９を参照））、円盤の疎水性周辺は、二重層円盤を取り囲む足場タンパク質に結合することによって安定化される。いくつかの実施態様では、膜形成脂質は、Ｃ４－２８脂肪酸アシル（例えば、Ｃ１６脂肪酸アシル）を含む。いくつかの実施態様では、膜形成脂質は、アルキルホスホコリン、エーテル脂質、糖脂質、リゾスフィンゴ脂質、リゾグリセロリン脂質、リン脂質、スフィンゴ脂質、及び／又はステロールを含む。追加的に、又は代替的に、いくつかの実施態様では、膜形成脂質は、リン脂質又は異なるリン脂質の組み合わせである。リン脂質の例としては、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジオレオイルホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルホスホセリン（ＤＯＰＳ）、及びジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、並びにそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施態様では、膜形成脂質はＤＯＰＥ及び／又はＤＯＰＣである。いくつかの実施態様では、膜形成脂質は、ジグリセロールテトラエーテル、コレステロール、エルゴステロールなどの非脂質両親媒性分子である。
いくつかの実施態様では、膜形成脂質は生体分子であり、すなわち生きている生物、例えば細菌、酵母、又は哺乳動物によって産生される分子である。
そのようなペプチド－ＮＬＰコンジュゲートにおいては、膜形成脂質によって形成された二重層は、１つ又は複数の足場タンパク質、すなわち、本明細書の他の場所で説明されている足場タンパク質によって安定化されている。いくつかの実施態様では、足場タンパク質はアポリポタンパク質である。いくつかの実施態様では、足場タンパク質は、アポリポタンパク質Ａ、アポリポタンパク質Ｂ、アポリポタンパク質Ｃ、アポリポタンパク質Ｄ、アポリポタンパク質Ｈ、アポリポタンパク質Ｅ、又は前述のいずれか１つ若しくは複数の組み合わせである。いくつかの実施態様では、足場タンパク質は、前記二重層を安定化することができる前述のアポリポタンパク質のいずれかの切断型である。いくつかの実施態様では、足場タンパク質は、ａｐｏＥ３の切断型（例えば、ａｐｏＥ３２２ｋ）、ａｐｏＥ２の切断型（例えば、ａｐｏＥ２２２ｋ）、又はａｐｏＡ１の切断型（例えば、Δ４９ＡｐｏＡ１、ＭＳＰ１、ＭＳＰ１Ｔ２、ＭＳＰ１Ｅ３Ｄ１）である。いくつかの実施態様では、足場タンパク質及び膜形成脂質成分は、両方とも生物によって産生される生体分子であり、非生物学的に由来する物質を含まないＮＬＰを形成する。
当業者は、足場タンパク質及び膜形成脂質を適切なモル比で提供して、ペプチド－ＮＬＰコンジュゲートの組み立てを容易にすることができることを理解するであろう。いくつかの実施態様では、足場タンパク質と膜形成脂質は、１：５０から１：１００のモル比；１：６０から１：９０のモル比；又は１：７０から１：８０のモル比である。いくつかの実施態様では、足場タンパク質と膜形成脂質は、１：６０、１：７０、１：７５、１：８０、１：８５、１：９０、又は１：１００のモル比である。特定の実施態様では、足場タンパク質と膜形成脂質は１：８０のモル比である。いくつかの実施態様では、膜形成脂質のほとんど又は全てが二重層として配置され、組み立てられていないままで残るものがないか、又はほとんどないような比率が使用される。
いくつかの実施態様では、ペプチド－ＮＬＰコンジュゲートは、１～８０、１０～７０、又は２０～６０個のアミノ酸を含む短いペプチドに共有結合した少なくとも１つのＣ４－２８脂肪酸アシル膜形成脂質を含む。いくつかの実施態様では、Ｃ４－２８脂肪酸アシルはＣ１６脂肪酸アシルである。いくつかの実施態様では、Ｃ４－２８脂肪酸アシルは、官能基（例えば、本明細書の他の場所に記載の官能基）を含む。いくつかの実施態様では、官能基は、Ｃ４－２８脂肪酸アシルの炭化水素尾部の化学構造上又はその一部に直接位置する。いくつかの実施態様では、官能基は、短いペプチドの１つ又は複数のアミノ酸残基上の対応する又は相補的な官能基（例えば、本明細書の他の場所に記載されるような）と反応する。いくつかの実施態様では、対応する又は相補的な官能基は、ペプチドのＣ末端に位置する。いくつかの実施態様では、対応する又は相補的な官能基は、ペプチドのＮ末端に位置する。いくつかの実施態様では、Ｃ４－２８脂肪酸アシルは、短いペプチドのＮ末端でリジン側鎖のイプシロンアミノ基にコンジュゲートしている。いくつかの実施態様では、ペプチド－ＮＬＰコンジュゲートは、１～１００、１０～９０、２０～８０、３０～７０、４０～６０、又は６０個の短いペプチド（例えば、１～１００、１０～９０、２０～８０、３０～７０、４０～６０、又は６０個のＣ４－２８脂肪酸アシル（例えば、Ｃ１６脂肪酸アシル）膜形成脂質であって、短いペプチドに共有結合しているもの）を含む。いくつかの実施態様では、短いペプチド：ＮＬＰのモル比は、１～１００、１０～９０、２０～８０、３０～７０、４０～６０の間、又は６０である。本明細書に記載されるように、短いペプチドのＮＬＰへの組み込みの成功は、以下の実施例６及び７に記載される技術、例えば、液体クロマトグラフィー－質量分析、ゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、及び核磁気共鳴（ＮＭＲ）を使用して確認及び／又は定量化することができる。図１０Ａは、短いペプチドを含む例示的なＮＬＰの組み立ての模式図を示す。
いくつかの実施態様では、ペプチドコンジュゲートＣ４－２８脂肪酸アシル膜形成脂質の組み込みは、例えば、コンジュゲートが短いペプチドの２分子以上を提供する場合、すなわち、同じペプチドの複数のコピーがペプチド－ＮＬＰコンジュゲートに組み込まれる場合、短いペプチドの多量体化を促進する。このようにして、例えば、抗原結合ポリペプチドについて本明細書の他の場所に記載されているように、ペプチドの結合活性、活性、又は効力が増加する。
いくつかの実施態様では、ペプチド－ＮＬＰコンジュゲートは、例えば、２つ以上の異なる活性、例えば、異なる標的結合特異性及び／又は異なる治療活性を示す、２つ以上の異なる短いペプチド（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の異なる短いペプチドなど）を含む。本明細書に開示されるペプチド－ＮＬＰコンジュゲートは、短いペプチドに関して多重特異性フォーマット及び／又は高価数に拡張することができる多重特異性プラットフォームを提供する。例えば、いくつかの実施態様では、ペプチド－ＮＬＰコンジュゲートは、２、３、４、５、６、７、又は８個の異なる短いペプチド、例えば、２、３、４、５、６、７、又は８個の異なる抗原又はエピトープに結合する２、３、４、５、６、７、又は８個の異なるペプチドを含む。いくつかの実施態様では、ペプチド－ＮＬＰコンジュゲートは、１０～１２、１０～１５、１０～２０、１５～２０、１５～２５、１５～３０、又は２０～３０個の異なる短いペプチド、例えば、１０～１２、１０～１５、１０～２０、１５～２０、１５～２５、１５～３０、又は２０～３０個の異なる抗原又はエピトープに結合する１０～１２、１０～１５、１０～２０、１５～２０、１５～２５、１５～３０、又は２０～３０個の異なるペプチドを含む。いくつかの実施態様では、ペプチド－ＮＬＰコンジュゲートは、２５～３０、２５～５０、３０～４５、３０～５０、４０～５０、３０～６０、又は４０～６０個の異なる短いペプチド、例えば、２５～３０、２５～５０、３０～４５、３０～５０、４０～５０、３０～６０、又は４０～６０個の異なる抗原又はエピトープに結合する２５～３０、２５～５０、３０～４５、３０～５０、４０～５０、３０～６０、又は４０～６０個の異なるペプチドを含む。
短いペプチドに関して特定の多価及び多重特異性を提供するための構成は、当業者には明らかであろう。例えば、いくつかの実施態様では、ペプチド－ＮＬＰコンジュゲートは、２つの異なる抗原に結合する２つの短いペプチドを含み、ここで、２つの異なる標的は以下の対：ＣＤ３及びＣＤ１９；ＣＤ３及びＥｐＣＡＭ；ＣＤ３及びＣＥＡ；ＣＤ１６及びＣＤ３０；ＣＤ１６及びＣＤ３３；Ａｎｇ－２及びＶＥＧＦ－Ａ；並びに第Ｘ因子及び第ＩＸａ因子から選択される。
いくつかの実施態様では、ペプチド－ＮＬＰコンジュゲートは、ＯＸ４０、ＤＲ４、ＧＩＴＲ、Ｔｉｅ２、Ｄ因子、ＶＥＧＦ、ＭｅｒＴＫ、ＣＤ３、及びリンホトキシンベータ受容体から選択される標的に結合する短いペプチドを含む。いくつかの実施態様では、ペプチド－ＮＬＰコンジュゲートは、前述の標的の任意の組み合わせに結合する少なくとも２つの異なる短いペプチドを含む。いくつかの実施態様では、ペプチド－ＮＬＰコンジュゲートは、Ｄ因子、ＶＥＧＦ、Ｔｉｅ２、及びＤＲ４から選択される標的に結合する短いペプチドを含む。いくつかの実施態様では、ペプチド－ＮＬＰコンジュゲートは、前述の標的の任意の組み合わせに結合する少なくとも２つの異なる短いペプチドを含む。
いくつかの実施態様では、短いペプチドはシスチンノットペプチド（ＣＫＰ）である。例示的なＣＫＰには、限定はされないが、例えば、ＥＥＴＩ－ＩＩ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号 Ｐ１２０７１）、ｃｙｃｌｏｐｓｙｃｈｏｔｒｉｄｅ Ａ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号 Ｐ５６８７２）、シクロビオラシンＯ１（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号 Ｐ８２２３０）、シクロビオラシンＯ１２（ＵｎｉＰｒｏｔ アクセッション番号 Ｐ８３８３６）、カラタ（例えば、カラタＢ１（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号 Ｐ５６２５４）、カラタＢ８（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号 Ｐ８５１７５）、など）、ｐａｌｉｃｏｕｒｅｉｎ（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号 Ｐ８４６４５）、ｔｒｉｃｙｃｌｏｎ Ａ（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号 Ｂ６Ｅ６１７）、Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｏｃｈｉｎｃｈｉｎｅｎｓｉｓトリプシン阻害剤、例えば、ＭＣｏＴＩ １（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号 Ｐ８２４０８）、Ｓｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｃｅａトリプシン阻害剤、例えば、ＳＯＴＩ １（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号 Ｐ８４７７９）、サーキュリンＡ（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号 Ｐ５６８７１）、サーキュリンＢ（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号 ５６８７９）、ｃｙｃｌｏｐｓｙｃｈｏｔｒｉｄｅ（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号 Ｐ５６８７２）、及びｖａｒｖペプチドＡ（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号 Ｐ５８４４６）が挙げられる。いくつかの実施態様では、ＣＫＰはＥＥＴＩ－ＩＩである。ＥＥＴＩ－ＩＩのアミノ酸配列は、ＧＣＰＲＩＬＭＲＣＫＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧ（配列番号１）である。
いくつかの実施態様では、ペプチドはＣＫＰバリアントである。いくつかの実施態様では、ＣＫＰバリアントは、野生型ＣＫＰの対応する１つ又は複数のループ配列と比較して、１つ又は複数のループ配列中に１つ又は複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／又は置換を含む。追加的に、又は代替的に、いくつかの実施態様では、ＣＫＰバリアントは、野生型ＣＫＰと比較して、Ｎ末端に１つ又は複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／又は置換を含む。追加的に、又は代替的に、いくつかの実施態様では、ＣＫＰバリアントは、野生型ＣＫＰと比較して、Ｃ末端に１つ又は複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／又は置換を含む。追加的に、又は代替的に、いくつかの実施態様では、ＣＫＰバリアントは、野生型ＣＫＰと比較して、Ｎ末端に化学修飾を含む。追加的に、又は代替的に、いくつかの実施態様では、ＣＫＰバリアントは、野生型ＣＫＰと比較して、Ｃ末端に化学修飾を含む。いくつかの実施態様では、ＣＫＰバリアントは、（例えば、ＣＫＰバリアントのＮ末端で若しくはその付近で、又はＣＫＰバリアントのＣ末端で若しくはその近傍で）、Ｃ４－２８脂肪酸アシル（例えば、Ｃ１６脂肪酸アシル）のＣＫＰバリアントへの共有結合的コンジュゲーションを可能にする修飾を含む。いくつかの実施態様では、ＣＫＰバリアントは、それが由来する野生型ＣＫＰが結合する標的とは異なる標的に結合する。いくつかの実施態様では、ＣＫＰバリアントは、それが由来する野生型ＣＫＰが結合する標的とは異なる活性（例えば、治療活性）を示す。いくつかの実施態様では、ＣＫＰバリアントは、ＥＥＴＩ－ＴＴ（配列番号１）に由来する。
いくつかの実施態様では、短いペプチドを含むペプチド－ＮＬＰコンジュゲート（例えば、ＮＬＰコンジュゲート）中の短いペプチドの活性（例えば、生物学的活性）は、遊離の短いペプチド、すなわち、ペプチド－ＮＬＰコンジュゲートに組み込まれていないペプチドの活性より低く、例えば、約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、又は１０倍のいずれか低い。いくつかの実施態様では、短いペプチドの活性は約５分の１である。いくつかの実施態様では、短いペプチドを含むペプチド－ＮＬＰコンジュゲート中の短いペプチドの活性（例えば、生物学的活性）は、遊離ペプチドの活性の８０～９０％、９０～９５％、又は９５～９９％である。いくつかの実施態様では、短いペプチドはＣＫＰ、例えばＥＥＴＩ－ＩＩである。いくつかの実施態様では、短いペプチドは、ＥＥＴＩ－ＩＩに由来するＣＫＰバリアントである。
ＮＬＰの安定性（例えば、インビトロ安定性又はインビボ半減期）を増加させる方法は、当技術分野で知られており、ペプチド－ＮＫＰコンジュゲートの安定性を増加させるために使用することができる。例えば、Ｇｉｌｍｏｒｅ ＳＦ，Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ＴＳ，Ｉｎｇｏｌｆｓｓｏｎ ＨＩ，Ｐｅｔｅｒｓ ＳＫＧ，Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ ＰＴ，Ｂｌａｎｃｈｅｔｔｅ ＣＤ，Ｆｉｓｃｈｅｒ ＮＯ“Ｌｉｐｉｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｄｉｃｔａｔｅｓ ｓｅｒｕｍ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ ｈｉｇｈ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”Ｎａｎｏｓｃａｌｅ，２０１８，１０（１６）：７４２０－７４３０；及びＧｉｌｍｏｒｅ ＳＦ，Ｂｌａｎｃｈｅｔｔｅ ＣＤ，Ｓｃｈａｒａｄｉｎ ＴＭ，Ｈｕｒａ ＧＬ，Ｒａｓｌｅｙ Ａ，Ｃｏｒｚｅｔｔ Ｍ，Ｐａｎ ＣＸ，Ｆｉｓｃｈｅｒ ＮＯ，Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ ＰＴ．“Ｌｉｐｉｄ Ｃｒｏｓｓ－Ｌｉｎｋｉｎｇ ｏｆ Ｎａｎｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ Ｅｎｈａｎｃｅｓ Ｓｅｒｕｍ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｕｐｔａｋｅ”ＡＣＳ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ，２０１６，８：３２を参照されたい。
本発明のコンジュゲート、例えば、ペプチド－ＮＬＰコンジュゲート、ペプチド－ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲート、及びＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲートは、それ自体で、又は薬学的組成物の一部として、それを必要とする対象に投与され得る。そのような薬学的組成物は以下で議論される。
ＩＶ．薬学的組成物及び投与
別の態様では、本発明は、薬学的組成物、例えば、本発明の少なくとも１つのコンジュゲート（例えば、ペプチド－ＮＬＰコンジュゲート、ペプチド－ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲート、及び／又はＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲート）及び薬学的に許容されるビヒクルを含む薬学的組成物を提供する。薬学的組成物はまた、「医薬」又は「製剤」と呼ばれることもある。本発明のコンジュゲート（例えば、ペプチド－ＮＬＰコンジュゲート、ペプチド－ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲート、及びＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲート）、特にＮＬＰ－Ｆａｂコンジュゲート又はペプチド－ＮＬＰ－Ｆａｂコンジュゲートは、既知の技術に基づいて、薬学的に許容されるビヒクルを含む生理学的に許容される製剤中で調製することができる。例えば、コンジュゲートは、薬学的に許容されるビヒクル又は担体と組み合わされて、薬学的組成物を形成する。
「薬学的に許容されるビヒクル」又は「薬学的に許容される担体」は、対象に対して無毒であり、組成物の他の成分と有害な方法で相互作用しない、活性成分以外の薬学的組成物中の成分を指す。一般に、薬学的に許容されるビヒクルは、薬学的組成物に組み込まれ、活性成分（複数可）の意図する有益な効果を上回る望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、対象に投与される。薬学的に許容されるビヒクルには、緩衝液、溶媒、添加物、安定剤、希釈剤、防腐剤などが含まれるが、これらに限定されない。使用されるビヒクルは、典型的には、薬学的組成物の形態及び／又は意図する投与経路に依存する。薬学的に許容される担体又は添加物は、毒性及び製造試験で必要とされる基準を満たしているのが望ましく、且つ／又は、米国食品医薬品局により準備された不活性成分ガイドに含まれていることが望ましい。
薬学的組成物は、静脈内投与によって、例えば、ボーラスとして、又は一定期間にわたる連続注入によって対象に投与され得る。薬学的組成物は、静脈内投与、皮内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、脳脊髄内投与、関節内投与、滑膜内投与、又は皮下投与によって投与され得る。いくつかの実施態様では、薬学的組成物は、気管内、膣、経口、舌下、又は眼球の投与経路によって投与される。いくつかの実施態様では、薬学的組成物は、脳又は中枢神経系に投与される。
本発明の組成物は、適切な用量で、固体、液体又はエアロゾルの形態で対象に投与され得る。固体組成物の例としては、丸薬、クリーム、及び移植可能な投薬単位が挙げられる。丸薬は経口投与され得る。治療用クリームは、局所的に投与され得る。移植可能な投薬単位は、局所的に、例えば腫瘍部位に投与されてもよく、又は例えば皮下に薬学的組成物を体系的に放出するために移植されてもよい。液体組成物の例には、筋肉内、皮下、静脈内、動脈内への注射に適した製剤、並びに局所及び眼内投与用の製剤が含まれる。エアロゾル製剤の例としては、肺への投与のための吸入製剤が挙げられる。
特定の実施態様では、薬学的組成物は全身投与される。薬学的組成物は、非経口的に又は非非経口的に投与され得る。非経口投与の場合、薬学的組成物は、一般に、無菌の水性又は非水性の溶液、懸濁液、及び乳濁液を含む。いくつかの実施態様では、溶液又は懸濁液は、使用時に、例えば、凍結乾燥形態で提供される粉末組成物を適切な水性液体（例えば、蒸留水）又は非水性溶媒に溶解することによって調製することができる。非水性溶媒には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが挙げられるが、これらに限定されない。水性溶媒は、生理食塩水及び緩衝媒体を含む、水、アルコール／水溶液、乳濁液、又は懸濁液から選択することができる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルブドウ糖、ブドウ糖と塩化ナトリウム、乳酸リンゲル、又は固定油が含まれる。防腐剤、例えば抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤、不活性ガスなども存在し得る。
いくつかの実施態様では、薬学的組成物は、例えば神経疾患の治療において、脳又は中枢神経系に投与される。特定の実施態様では、コンジュゲート（例えば、ＮＬＰ－Ｆａｂコンジュゲート、ＮＬＰ－Ｆａｂ様分子コンジュゲート、ペプチド－ＮＬＰ－Ｆａｂコンジュゲート、又はペプチド－ＮＬＰ－Ｆａｂ様分子コンジュゲート）は血液脳関門を通過することができ、局所的又は全身的投与後の脳（脳実質）又は中枢神経系への送達、例えば標的送達を可能にする。脳又は中枢神経系への送達における使用のための特定の実施態様では、足場タンパク質は、アポリポタンパク質Ｅ、特にａｐｏＥ２及び／又はａｐｏＥ４などのアポリポタンパク質であり、コンジュゲートは、全身送達、例えば静脈内送達の後に脳実質への生体内分布を示す。
ａ．皮下及び眼球用製剤
いくつかの実施態様では、本発明は、以下でより詳細に説明するように、高濃度であるが低粘度の製剤における本発明のコンジュゲートを提供する。このような製剤は、例えば、皮下経路及び眼球経路の投与の場合においてなど、投与経路が送達され得る製剤の量を制限する場合に有利である。
皮下送達のための薬学的組成物は、一般に、糖安定剤（例えば、スクロース又はトレハロース）及び／又は界面活性剤（例えば、ポリソルベート２０又はポリソルベート８０）及び／又はアミノ酸（例えば、ヒスチジン、アルギニン、グリシン、及び／又はアラニン）を含む添加物を含む。皮下送達の場合、製剤は注射器（例えば、充填済み注射器）；自動注射器；注入装置（例えば、ＩＮＪＥＣＴ－ＥＡＳＥＴＭ及びＧＥＮＪＥＣＴＴＭ装置）；注射ペン（ＧＥＮＰＥＮＴＭなど）；針のない装置（ＭｅｄｉＪｅｃｔｏｒＴＭ及びＢｉｏＪｅｃｔｏｒＴＭなど）；皮下パッチ送達システム、又は溶液若しくは懸濁液製剤を皮下投与するのに適した他の装置を介して送達され得る。
眼球送達の場合、薬学的組成物は、組成物を患者への眼球投与に適したものにするために、緩衝液、安定剤、防腐剤及び／又は増量剤を含有するように製剤化され得る。眼球送達のための薬学的組成物には、一般に、ホスフェート、シトレート、及びその他の有機酸等の緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル若しくはベンジルアルコール；メチル若しくはプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール等）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等）；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドン；アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン等）；グルコース、マンノース若しくはデキストリンを含む、単糖類、二糖類その他の糖質；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース若しくはソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体（例えばＺｎ－タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が含まれる。
徐放性製剤が調製されてもよい。徐放性調製物の好適な例としては、コンジュゲートを含有する固体疎水性ポリマーの徐放性マトリクスが含まれ、これらのマトリクスは、成形物品、例えば、フィルム又はマイクロカプセルの形態である。本明細書で使用される徐放性マトリックスは、材料、通常は酵素又は酸／塩基加水分解又は溶解によって分解可能なポリマーで作られたマトリックスである。体内に挿入されると、マトリックスは酵素と体液によって作用を受ける。徐放性マトリックスは、望ましくは、リポソーム、ポリラクチド（ポリラクチド酸）、ポリグリコリド（グリコール酸のポリマー）、ポリラクチドコグリコリド（乳酸とグリコール酸のコポリマー）、ポリ酸無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリペプチド、ヒアルロン酸、コラーゲン、コンドロイチン硫酸、カルボン酸、脂肪酸、リン脂質、多糖類、核酸、ポリアミノ酸、フェニルアラニン、チロシン、イソロイシンなどのアミノ酸、ポリヌクレオチド、ポリビニルプロピレン、ポリビニルピロリドン、及びシリコーンなどの生体適合性材料によって選択される。徐放性マトリックスの非限定的な例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２－ヒドロキシエチル－メタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ－グルタミン酸とγ－Ｌ－グルタミン酸エチルとのコポリマー、非分解性エチレン酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）等の分解性の乳酸－グリコール酸コポリマー（乳酸－グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドから構成される注射用ミクロスフェア）、並びにポリ－Ｄ－（－）－３－ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
特定の実施態様では、薬学的組成物は、本発明のコンジュゲートが角膜に浸透することを可能にする１つ又は複数の透過性エンハンサーを含む。そのような透過性エンハンサーの例としては、例えば、界面活性剤、胆汁酸、キレート剤、防腐剤、シクロデキストリン（すなわち、親油性薬物と複合体を形成する親水性外表面及び親油性内表面を有する円筒形オリゴヌクレオチド）などが挙げられる。このような透過性エンハンサーは、化学的安定性とバイオアベイラビリティを高め、局所刺激を軽減する。特定の実施態様では、本明細書で提供される薬学的組成物は、様々な眼球区画における本発明のコンジュゲートの吸収及び分布を増加させる薬剤をさらに含む。
特定の実施態様では、本明細書で提供される薬学的組成物は、インサイチューゲル化システム、例えば、組成物が涙液と接触すると、特定の物理化学的パラメーター（イオン強度、温度、ｐＨ、又は溶媒交換）の変化により、眼球表面上でゾルからゲルへの相転移を示す粘性ポリマーベースの液体として製剤化される。特定の実施態様では、本明細書で提供される薬学的組成物は、点眼スプレーとして製剤化される。特定の実施態様では、本明細書で提供される薬学的組成物は、マイクロエマルジョンとして製剤化される。様々な眼科用医薬製剤に関するさらなる詳細は、例えば、Ｇａｉｋｗａｄ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｉｎｄｏ Ａｍｅｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．３，３２１６－３２３２；Ａｃｈｏｕｒｉ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ Ｉｎｄｕｓｔ Ｐｈａｒｍ．３９，１５９９－１６１７；Ｌｕ（２０１０）Ｒｅｃｅｎｔ Ｐａｔ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｆｏｒｍｕｌ．４，４９－５７；Ｂａｒａｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｓｃｉ Ｗｏｒｌｄ Ｊ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１５５／２０１４／８６１９０４；Ｌａｎｇ（１９９５）Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．１６，３９－４３；Ｓｈｏｒｔ（２００８）Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃ Ｐａｔｈ．３６，４９－６２；その他において提供される。
眼球送達のために、コンジュゲートは、注射、例えば、結膜下注射、角膜内注射、又は硝子体内注射によって投与され得；又は点眼薬の形態で局所的に投与され；又はコンジュゲートを眼球内に持続的に送達する硝子体内装置によって投与される。
ｂ．投薬量
一般に、薬学的組成物は、本明細書に記載されるＮＬＰコンジュゲートの有効量を含むであろう。薬剤（例えば、抗原結合ポリペプチド又は他の薬物）の「有効量」とは、典型的には、薬学的組成物を受ける対象に有益な効果を生み出すために、薬剤が投与される細胞又は組織に生理学的変化をもたらすのに必要な量を指す。
薬学的組成物の投薬量は、例えば、治療される状態、状態の重症度及び経過、コンジュゲートが予防又は治療目的で投与されるかどうか、対象の体重、サイズ、性別及び一般的な健康状態などの他の臨床的要因、投与される特定のＮＬＰコンジュゲート、同時に投与されている他の薬物、投与経路、以前の治療、対象の病歴、及び主治医の裁量などの様々な要因に依存するであろう。
一般に、薬学的組成物の定期的な投与のためのレジメンは、１日当たり１μｇから５ｇ単位の範囲であるべきである。進展は、定期的な評価によって監視できる。コンジュゲートは、一度に又は一連の治療にわたって適切に投与され、診断時から任意の時点で対象に投与され得る。コンジュゲートは、単独の治療として、又は問題の状態を治療するのに有用な他の治療剤若しくは治療アプローチと組み合わせて投与され得る。
ｃ．低粘度製剤
本発明の別の態様は、本明細書に記載の１つ又は複数のコンジュゲートを含む低粘度液体製剤に関する。「粘度」は、せん断応力又は引張応力のいずれかによって変形する流体の抵抗の尺度を指し；これは粘度計又はレオメーターを使用して評価することができる。特に明記しない限り、粘度測定（センチポアズ、ｃＰ）は２５℃で行われる。
驚くべきことに、いくつかの実施態様では、本明細書に記載のコンジュゲート（例えば、ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲート及び／又はペプチド－ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲート）は、比較的低い粘度を維持する高濃度液体製剤において提供することができる。通常、高タンパク質濃度において、タンパク質間相互作用により粘度の上昇を引き起こす。対照的に、本ＮＬＰコンジュゲート（例えば、ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲート及び／又はペプチド－ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲート）は、粘度が実質的に増加する前に予想外に高いタンパク質濃度を可能にする（例えば、濃度／粘度の関係に対するＦａｂ負荷の影響が評価された実施例３、図４Ａを参照）。この関係は重要な化学、製造及び制御（ＣＭＣ）の考慮事項であり、特定の実施態様では、本発明のＮＬＰコンジュゲートは、低粘度の液体製剤において予想外に高濃度で提供され得る。実際、Ｆａｂ－ＮＬＰコンジュゲートでは、代替の多価フォーマット（Ｆａｂ－ＰＥＧコンジュゲート）と比較して、有意に高いＦａｂ濃度が達成された。
「低粘度製剤」（又は「低粘度液体製剤」）は、通常、５０ｃＰ未満、例えば４０～５０ｃＰ；又は４０ｃＰ未満、例えば３０～４０ｃＰ；又は３０ｃＰ未満、例えば２０～３０ｃＰ；又は２０ｃＰ未満、例えば１０～２０ｃＰの粘度を有する。いくつかの実施態様では、粘度は、１０～５０ｃＰ、１５～４５ｃＰ、２０～４０ｃＰ、２５～３５ｃＰ、又は３０ｃＰである。いくつかの実施態様では、低粘度製剤は、５０ｍｇ／ｍＬを超えるコンジュゲート、例えば５０～７５ｍｇ／ｍＬ；７５ｍｇ／ｍＬを超えるコンジュゲート、例えば７５～１００ｍｇ／ｍＬ；１００ｍｇ／ｍＬを超えるコンジュゲート、例えば１００～１５０ｍｇ／ｍＬ；１５０ｍｇ／ｍＬを超えるコンジュゲート、例えば１５０～２００ｍｇ／ｍＬ；２００ｍｇ／ｍＬを超えるコンジュゲート、例えば２００～２５０ｍｇ／ｍＬ；２５０ｍｇ／ｍＬを超えるコンジュゲート、例えば２５０～３００ｍｇ／ｍＬ；３００ｍｇ／ｍＬを超えるコンジュゲート、例えば３００～３５０ｍｇ／ｍＬ；３５０ｍｇ／ｍＬを超えるコンジュゲート、例えば３５０～４００ｍｇ／ｍＬ；又は４００ｍｇ／ｍＬを超えるコンジュゲート、例えば４００～４５０ｍｇ／ｍＬの濃度を有する。いくつかの実施態様では、低粘度製剤の濃度は、１００～２００、２００～３００、又は１００～３００ｍｇのコンジュゲート／ｍＬである。いくつかの実施態様では、コンジュゲートは、ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲート又はペプチド－ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲートである。特定の実施態様では、低粘度製剤の抗原結合ポリペプチドは、Ｆａｂ又はＦａｂ様分子である。
いくつかの実施態様では、低粘度製剤は、コンジュゲート当たり２０～４０、２５～３５、２０～３０、２５～４０、２５～３０、又は３０個の抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）を有するコンジュゲートを含む。特定の実施態様では、抗原結合ポリペプチドは、Ｆａｂ又はＦａｂ様分子である。特定の実施態様では、コンジュゲートは、コンジュゲート当たり２５、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、又は３５分子の抗原結合ポリペプチド、例えば、Ｆａｂ又はＦａｂ様分子を含む。いくつかの実施態様では、低粘度製剤中のコンジュゲートは、１～１００、１０～９０、２０～８０、３０～７０、４０～６０、又は６０個の短いペプチドをさらに含む。例示的な短いペプチドは、本明細書の他の場所でさらに詳細に議論されている。
当業者であれば、低粘度製剤において高濃度の抗原結合ポリペプチドを提供することにより、投与可能な容量が制限されている経路を介した、有効量の抗原結合ポリペプチドの送達が促進されることを認識するであろう。例えば、眼球送達の場合、注入量は通常１００μｌに制限される（５８）；皮下送達の場合、注入量は通常１～２ｍｌに制限される（５９、６０）。したがって、本発明のコンジュゲート（例えば、ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲート及び／又はペプチド－ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲート）は、例えば、眼球送達及び皮下投与などの容量制限された経路を介する投与のための高濃度で低粘度の製剤において使用される。したがって、いくつかの実施態様では、本発明は、皮下製剤及び眼球製剤、すなわち、それを必要とする対象にそれぞれ皮下投与するか又は眼球送達を介して投与するための本発明の薬学的組成物を提供する。皮下製剤又は眼球製剤は、有利には、本明細書に記載の低粘度製剤に従って、低粘度液体中に高濃度のコンジュゲート（例えば、ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲート及び／又はペプチド－ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲート）を含む。この段落で引用されている全ての参考文献は、実施例５の下にある。
ｄ．凍結乾燥製剤
いくつかの実施態様では、本発明の薬学的組成物、製剤、及びコンジュゲートのいずれか１つを凍結乾燥し、再構成することができる。「凍結乾燥」とは、腐敗しやすい材料を保存するのに役立つ、及び／又は輸送を容易にする凍結乾燥プロセスを指す。凍結乾燥とは、材料を凍結させた後、周囲の圧力を下げながら温度を上げて、材料内の凍結した水を直接気相に昇華させることである。一般に、凍結乾燥は、その水分含有量が５％未満、例えば３～５％、又は３％未満、例えば２～３％、又は２％未満、例えば１～２％である生成物をもたらす。凍結乾燥生成物はその後、使用前に、しばしば凍結乾燥及び保存されたのと同じ容器又はバイアル中で再構成することができる。典型的には、生成物は、水性液体、例えば蒸留水又は水性緩衝液を添加することによって再構成（再水和）される。さらに、凍結乾燥中の治療剤の安定性、及び再構成後に活性を保持するその能力は、重要な化学、製造及び管理（ＣＭＣ）の考慮事項である。例えば、Ｂｊｅｌｏｓｅｖｉｃ ｅｔ ａｌ．“Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｉｎ Ｆｒｅｅｚｅ－Ｄｒｉｅｄ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ Ｔｏｗａｒｄ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｌｙｏｐｈｉｌｉｓａｔｉｏｎ Ｃｙｃｌｅ Ｏｐｔｉｍｉｓａｔｉｏｎ”Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ ２０２０ Ｆｅｂ２５；５７６を参照されたい。
驚くべきことに、いくつかの実施態様では、ＮＬＰコンジュゲート（例えば、ＮＬＰ－抗原結合ポリペプチドコンジュゲート及び／又はペプチド－ＮＬＰ－抗原結合ポリペプチドコンジュゲート）を凍結乾燥し、抗原結合活性を失うことなく再構成することができる（例えば、実施例４、図４Ｂ及び図５Ａ～５Ｄを参照されたい。そこでは、凍結乾燥時のＦａｂ－ＮＬＰ安定性が、Ｆａｂ－ＮＬＰの製造可能性の評価として評価された）。いくつかの実施態様では、抗原結合活性の少なくとも８０％、例えば８０～９０％、少なくとも９０％、例えば９０～９５％、又は少なくとも９５％、例えば９５～９９％が凍結乾燥及び再構成の後に保持されている。いくつかの実施態様では、抗原結合活性の９８％、９９％、又は１００％が保持されている。
凍結乾燥のために、コンジュゲート（例えば、ＮＬＰ－抗原結合ポリペプチドコンジュゲート及び／又はペプチド－ＮＬＰ－抗原結合ポリペプチドコンジュゲート）は、典型的にはコンジュゲートを含むｐＨ緩衝溶液である凍結乾燥前製剤において提供される。ｐＨは４～８、又は５～７であり得る。例示的な緩衝液には、ヒスチジン、リン酸、トリス、クエン酸、コハク酸及び他の有機酸が含まれる。いくつかの実施態様では、凍結保護剤が凍結乾燥前製剤に添加される。凍結保護剤の非限定的な例には、スクロース又はトレハロースなどの非還元糖が含まれる。特定の実施態様では、凍結乾燥される本発明のコンジュゲートを含む溶液にトレハロースが添加される。凍結乾燥前製剤中の凍結保護剤の量は、一般に、再構成時に得られる製剤が等張になるような量である。しかしながら、高張性再構成製剤も好適であり得る。
いくつかの実施態様では、凍結乾燥は、トレハロースの存在下で行われ、例えば、コンジュゲートは、４０～２００ｍＭのトレハロースの存在下にある。特定の実施態様では、トレハロースは、本発明のコンジュゲート、例えば、抗原結合ポリペプチドとしてＦａｂを含むコンジュゲートの凍結乾燥中に、５０～１５０ｍＭ、６０～１００ｍＭ、又は７０～９０ｍＭの濃度で使用される。いくつかの実施態様では、凍結乾燥は、例えばコンジュゲートが抗原結合ポリペプチドとしてＦａｂを含む場合、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、９５ｍＭ、又は１００ｍＭのトレハロースの存在下で起こる。いくつかの実施態様では、凍結乾燥は、８０ｍＭのトレハロースの存在下で起こる。
いくつかの実施態様では、凍結乾燥は、１～１０ｍｇコンジュゲート／ｍＬの濃度で起こる。特定の実施態様では、コンジュゲートは、抗原結合体としてＦａｂを含み、コンジュゲートは、２～８ｍｇコンジュゲート／ｍＬ、３～６ｍｇコンジュゲート／ｍＬ、又は５ｍｇコンジュゲート／ｍＬで凍結乾燥される。いくつかの実施態様では、コンジュゲートはＦａｂを含み、凍結乾燥は、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、又は９０ｍＭのトレハロース；及び２～８ｍｇコンジュゲート／ｍＬ、３～６ｍｇコンジュゲート／ｍＬ、又は５ｍｇコンジュゲート／ｍＬの存在下で起こる。特定の実施態様では、コンジュゲートはＦａｂを含み、凍結乾燥は、８０ｍＭのトレハロースの存在下で、５ｍｇのコンジュゲート／ｍＬで起こる。
いくつかの実施態様では、界面活性剤を凍結乾燥前製剤に添加することが望ましいことが見出された。代替的に、又は追加的に、界面活性剤を凍結乾燥製剤及び／又は再構成製剤に添加してもよい。例示的な界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、例えば、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０又はポリソルベート８０）；ポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）；トリトン；ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）；ラウリル硫酸ナトリウム；オクチルグルコシドナトリウム；ラウリルスルホベタイン、ミリスチルスルホベタイン、リノレイルスルホベタイン、又はステアリルスルホベタイン；ラウリルサルコシン、ミリスチルサルコシン、リノレイルサルコシン、又はステアリルサルコシン；リノレイルベタイン、ミリスチルベタイン、又はセチルベタイン；ラウロアミドプロピルベタイン、コカミドプロピルベタイン、リノールアミドプロピルベタイン、ミリスタミドプロピルベタイン、パルミドプロピルベタイン、又はイソステアラミドプロピルベタイン（例えば、ラウロアミドプロピル）；ミリスタミドプロピルジメチルアミン、パルミドプロピルジメチルアミン、又はイソステアラミドプロピルジメチルアミン；メチルココイルタウリン酸ナトリウム又はメチルオレイルタウリン酸二ナトリウム；並びにＭＯＮＡＱＵＡＴＴＭシリーズ（Ｍｏｎａ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｔｅｒｓｏｎ，Ｎ．Ｊ．）；ポリエチルグリコール、ポリプロピルグリコール、並びにエチレン及びプロピレングリコールのコポリマー（例えばＰｌｕｒｏｎｉｃｓ、ＰＦ６８など）などが挙げられる。添加される界面活性剤の量は、再構成されたコンジュゲートの凝集を減少させ、再構成後の微粒子の形成を最小限に抑えるような量である。例えば、界面活性剤は、凍結乾燥前製剤中に０．００１～０．５％、好ましくは０．００５～０．０５％の量で存在し得る。
特定の実施態様では、凍結乾燥前製剤の調製において、凍結保護剤（例えば、トレハロース）と増量剤（例えば、マンニトール又はグリシン）との混合物が使用される。増量剤は、その中に過剰なポケットなどがない均一な凍結乾燥ケーキの生産を可能にし得る。
コンジュゲート、緩衝液、凍結保護剤、及びその他の任意成分を一緒に混合した後、製剤を凍結乾燥する。この目的のために、Ｈｕｌｌ５０ＴＭ（Ｈｕｌｌ、米国）又はＧＴ２０ＴＭ（Ｌｅｙｂｏｌｄ－Ｈｅｒａｅｕｓ、ドイツ）凍結乾燥機などの多くの異なる凍結乾燥機が利用可能である。いくつかの実施態様では、移送工程を回避するために、コンジュゲートの再構成が実施される容器内でコンジュゲート製剤を凍結乾燥させることが望ましい場合がある。容器は、例えば、３、５、１０、２０、５０、又は１００ｃｃのバイアルであり得る。
所望の後の時点で、典型的にはコンジュゲートを患者に投与するときに、凍結乾燥製剤を希釈剤で再構成して、本明細書で提供されるコンジュゲート濃度のいずれかなど、再構成製剤において所望のコンジュゲート濃度を提供することができる。例えば、所望の濃度は、５０～７５ｍｇ／ｍＬ、７５～１００ｍｇ／ｍＬ、１００～１５０ｍｇ／ｍＬ、１５００～２００ｍｇ／ｍＬ、２００～２５０ｍｇ／ｍＬ；２５０～３００ｍｇ／ｍＬ；３００～３５０ｍｇ／ｍＬ；３５０～４００ｍｇ／ｍＬ；又は４００～４５０ｍｇ／ｍＬであり得る。上述のように、再構成製剤中のそのような高いコンジュゲート濃度は、再構成製剤の皮下又は眼球送達が意図される場合に特に有用である。しかし、静脈内投与などの他の投与経路では、再構成された製剤中のコンジュゲートの濃度がより低いことが望ましい場合がある（例えば、５～５０ｍｇ／ｍＬ、１０～４０ｍｇ／ｍＬ）。
再構成は、一般に、水和を促進する２５℃の温度で行われるが、必要に応じて他の温度を用いてもよい。再構成に必要な時間は、例えば、希釈剤の種類、添加物（複数可）及びポリペプチドの量に依存するであろう。例示的な希釈剤には、滅菌水、注射用の静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝液（例えばリン酸緩衝生理食塩水）、滅菌食塩水溶液、リンゲル液、又はデキストロース溶液が含まれる。希釈剤は、任意に防腐剤を含有する。防腐剤の例としては、芳香族アルコール（ベンジル又はフェノールアルコールなど）が挙げられるが、これらに限定されない。使用される保存剤の量は、コンジュゲートとの適合性について異なる防腐剤濃度を評価することによって決定することができる。
Ｖ．調製方法
ａ．抗原結合ポリペプチドを含むナノリポタンパク質コンジュゲートを調製する方法
本発明の別の態様は、ポリペプチド（例えば、抗原結合ポリペプチド）を含むコンジュゲートを調製する方法に関する。方法は、一般に、ａ）足場タンパク質及び１つ又は複数の膜形成脂質を、前記足場タンパク質によって取り囲まれた前記膜形成脂質の脂質二重層を含むナノリポタンパク質粒子の組み立て（例えば、自己組織化）を可能にする条件下で提供することであって、ここで、膜形成脂質の１つ又は複数が、粒子の一方又は両方の表面上に官能化基を提示する、提供すること；ｂ）低ｐＨで前記官能化基にコンジュゲートする、Ｃ末端に位置する相補的官能基を有する抗原結合ポリペプチドに粒子を接触させること；並びにｃ）場合によって、前記粒子と前記抗原結合ポリペプチドとのコンジュゲートを精製することを含む。
いくつかの実施態様では、膜形成脂質は、Ｃ４－２８脂肪酸アシル（例えば、Ｃ１６脂肪酸アシル）を含む。いくつかの実施態様では、Ｃ４－２８脂肪酸アシルは、短いペプチド（例えば、本明細書に記載の短いペプチド）に共有結合している。このようなペプチドコンジュゲートＣ４－２８脂肪酸アシルは、実施例７に記載のように生成することができる。ペプチドコンジュゲートＣ４－２８脂肪酸アシルを生成する他の方法は、当技術分野で知られている。
いくつかの実施態様では、ＮＬＰ（ペプチド－ＮＬＰを含む）は、足場タンパク質がｍＲＮＡから翻訳されている間にＮＬＰの自己組織化が達成されるインビトロ翻訳法によって組み立てられる。このプロセスでは、発現系ライセートを、膜形成脂質及び足場タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡと混合する。足場タンパク質の発現中に組み立てが起こるまで、反応を進行させる（例えば、約４～２４時間）。
いくつかの実施態様では、本方法は、所定の足場タンパク質：脂質比、及び／又は収量を増加させる条件、又は得られるＮＬＰ（又はペプチド－ＮＬＰ）のサイズ及び組成を制御する条件で実施される。例えば、足場タンパク質：脂質比は、上述の比を有するＮＬＰ（又はペプチド－ＮＬＰ）を提供するように選択され得る。いくつかの実施態様では、この方法は、ペプチドコンジュゲートＣ４－２８脂肪酸アシル：他の膜形成脂質の所定のモル比、例えば、１０％のモル比（すなわち、１０％のペプチドコンジュゲートＣ４－２８脂肪酸アシル及び９０％の他の膜形成脂質）で実施される。
本発明のコンジュゲートを形成するために、ＮＬＰ（例えば、短いペプチドにコンジュゲートしたＮＬＰ又は短いペプチドにコンジュゲートしていないＮＬＰ）と抗原結合ポリペプチドとを、官能化脂質と抗原結合ポリペプチド官能基との間のコンジュゲーションを可能にする時間及び条件下で接触させる。特定の実施態様では、マレイミド官能化脂質（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－エタノールアミン－Ｎ－［４－（ｐ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－カルボキサミド］（ナトリウム塩））（ＤＯＰＥ－ＭＣＣ）で組み立てられたＮＬＰを、Ｃ末端システインを含むＦａｂにコンジュゲートさせた（例えば、実施例１～２、図２Ａ～２Ｃ、及び図８Ａ～８Ｂを参照されたい）。別の実施態様では、マレイミド官能化脂質（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－エタノールアミン－Ｎ－［４－（ｐ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－カルボキサミド］（ナトリウム塩））（ＤＯＰＥ－ＭＣＣ）と組み立てられたペプチドコンジュゲートＣ４－２８脂肪酸アシル（例えば、ペプチドコンジュゲートＣ１６脂肪酸アシル）を含むＮＬＰを、Ｃ末端システインを含むＦａｂにコンジュゲートさせた。実施例１０及び図１３Ａを参照されたい。
通常、マレイミド（又はマレイミド誘導体）は、チオールを含まない緩衝水溶液中、例えば、ｐＨ６．５～０．５で１～２４時間、スルフヒドリルと反応し、共有結合チオエーテル結合を形成する。次いで、マレイミドは、例えば、反応の完了時に、遊離チオールの添加によりクエンチされる。驚くべきことに、いくつかの実施態様では、本方法は、遊離チオールを含む抗原結合ポリペプチドをマレイミド官能化脂質にコンジュゲートするために低ｐＨを利用する。低ｐＨは、４．５～６．５、５．５～６．５、５～６、又は６であり得る。低ｐＨは、ＮＬＰの足場タンパク質ではなく、抗原結合ポリペプチドへの官能化脂質のコンジュゲーションを促進する（例えば、実施例２、図１Ｃ～１Ｄ、三角を参照されたい）。実際、驚くべきことに、ＮＬＰがｐＨ７．４で組み立てられると、マレイミド反応性脂質がアポリポタンパク質にコンジュゲートする（例えば、実施例２、図１Ｂ、図１Ｃ～１Ｄ（丸）及び図８Ａを参照されたい）。ただし、ｐＨ６で組み立てた場合、この望ましくない反応は観察されなかった。これらの組み立て条件は、足場タンパク質（例えば、ａｐｏＥ４２２ｋタンパク質）上の遊離リジンとマレイミド官能化脂質（例えば、ＤＯＰＥ－ＭＣＣ）との間の架橋を制限する。
したがって、上記のいくつかの実施態様では、官能化基は、ポリペプチド（例えば、抗原結合ポリペプチド）上の相補的な官能基と反応し、足場タンパク質にコンジュゲートしないなど、ＮＬＰの他の構成分にコンジュゲートしない。例えば、本方法に記載の低ｐＨ（例えば、ｐＨ４．５～６．５、５．５～６．５、５～６、又は６）を使用して、官能化基の２５％未満又は２０～２５％、２０％未満又は１０～２０％、１５％未満又は１０～１５％、１０％未満又は５～１０％、５％未満又は３～５％が、本発明のコンジュゲートを形成する際に足場タンパク質にコンジュゲートする。いくつかの実施態様では、官能化基の５％、４％、３％、２％、１％、又は０％が、本発明のコンジュゲートを形成する際に足場タンパク質にコンジュゲートする。特定の実施態様では、官能化基はマレイミド又はマレイミド誘導体であり、官能基は遊離チオール基である。
したがって、いくつかの態様では、ナノリポタンパク質粒子と抗原結合ポリペプチドとのコンジュゲートを調製する際に、脂質－足場タンパク質コンジュゲーションを低減させる方法を提供する。
いくつかの実施態様では、方法は、抗原結合ポリペプチドへのコンジュゲーションの前に、未反応成分からＮＬＰを分離することを必要としない。すなわち、工程ｂ）（低ｐＨで前記官能化基にコンジュゲートする、Ｃ末端に位置する相補的官能基を有する抗原結合ポリペプチドに粒子を接触させること）は、工程ａ）（前記足場タンパク質によって取り囲まれた前記膜形成脂質の脂質二重層を含むナノリポタンパク質粒子の組み立てを可能にする条件下で足場タンパク質及び膜形成脂質を提供することであって、ここで、膜形成脂質の１つ又は複数は、粒子の一方又は両方の表面上に官能化基を提示する、提供すること）に続いて行うことができ、組み立てられていない膜形成脂質の一部若しくは全て、又は組み立てられていない足場タンパク質の一部若しくは全てを除去するための介在工程は伴わない。驚くべきことに、足場タンパク質に対する官能化膜形成脂質の特定の比率が使用される場合、本明細書に記載されるように、官能化膜形成脂質がＮＬＰに組み立てられないまま残ることはほとんどなく、そして、組み立てられずに残っているそれらのわずかな脂質は、反応容器壁に付着し、抗原結合ポリペプチドの官能基と反応するために利用できるものを全く残さないか、ほとんど残さないか、又はごくわずかしか残さない。したがって、上記のいくつかの実施態様では、足場タンパク質及び膜形成脂質は、１：５０から１：１００；１：６０から１：９０；又は１：７０から１：８０のモル比で組み合わされ、抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）へのコンジュゲーションの前に、組み立てられていない脂質を除去する工程は必要ないか、又は実行されない。いくつかの実施態様では、足場タンパク質及び膜形成脂質は、１：６０、１：７０、１：７５、１：８０、１：８５、１：９０、又は１：１００のモル比であり、抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）へのコンジュゲーションの前に、組み立てられていない脂質を除去する工程は必要ないか、又は実行されない。特定の実施態様では、足場タンパク質及び膜形成脂質は、１：８０のモル比であり、抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）へのコンジュゲーションの前に、組み立てられていない脂質を除去する工程は必要ないか、又は実行されない。
ＮＬＰがペプチドコンジュゲートＣ４－２８脂肪酸アシルを含むいくつかの実施態様では、ＮＬＰ－ペプチドコンジュゲートは、上記のように、自己組織化の後、抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）へのコンジュゲーションの前に、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーによって精製される。
ｂ．短いペプチドを含むナノリポタンパク質コンジュゲートを調製する方法
関連する態様では、提供されるのは、短いペプチドを含むコンジュゲート（すなわち、ペプチド－ＮＬＰコンジュゲート）を調製する方法である。また、２０～６０アミノ酸の短いペプチドの結合活性、活性、及び／又は効力を増加させる方法も提供される。いくつかの実施態様では、方法は、足場タンパク質によって取り囲まれた膜形成脂質の脂質二重層を含むナノリポタンパク質粒子の組み立て（例えば、自己組織化）を可能にする条件下で、足場タンパク質及び膜形成脂質を提供することを含み；ここで、前記膜形成脂質の１つ又は複数は、前記短いペプチド（例えば、長さが２０～６０アミノ酸のペプチド）にコンジュゲートしたＣ４－２８脂肪酸アシル（例えば、Ｃ１６脂肪酸アシル）を含む。いくつかの実施態様では、方法は、ペプチド－ＮＬＰコンジュゲートを精製すること（例えば、サイズ排除クロマトグラフィーによって）をさらに含む。いくつかの実施態様では、短いペプチドは、シスチンノットペプチド（ＣＫＰ）、例えば、本明細書の他の場所に記載のＣＫＰである。いくつかの実施態様では、短いペプチドはＣＫＰバリアントである。いくつかの実施態様では、ＣＫＰバリアントは、野生型ＣＫＰの対応する１つ又は複数のループ配列と比較して、１つ又は複数のループ配列中に１つ又は複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／又は置換を含む。追加的に、又は代替的に、いくつかの実施態様では、ＣＫＰバリアントは、野生型ＣＫＰと比較して、Ｎ末端に１つ又は複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／又は置換を含む。追加的に、又は代替的に、いくつかの実施態様では、ＣＫＰバリアントは、野生型ＣＫＰと比較して、Ｃ末端に１つ又は複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／又は置換を含む。追加的に、又は代替的に、いくつかの実施態様では、ＣＫＰバリアントは、野生型ＣＫＰと比較して、Ｎ末端に化学修飾を含む。追加的に、又は代替的に、いくつかの実施態様では、ＣＫＰバリアントは、野生型ＣＫＰと比較して、Ｃ末端に化学修飾を含む。いくつかの実施態様では、膜形成脂質は、ペプチド－Ｃ４－２８脂肪酸アシルコンジュゲートと、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＯＰＳ、ＤＯＰＥ、ＤＰＰＣのうちの少なくとも１つ以上（例えば、ペプチド－Ｃ１６脂肪酸アシルコンジュゲートとＤＯＰＣ）を、１：３～１：１５、又は１：６～１：１２、又は１：９のモル比で含む。いくつかの実施態様では、前記コンジュゲートは、１～１００、１０～９０、２０～８０、３０～７０、４０～６０、若しくは６０分子の前記短いペプチドを含む。いくつかの実施態様では、コンジュゲートは、少なくとも２つの異なるペプチドを含む（例えば、本明細書の別の場所でさらに詳細に記載されているように）。図１０Ａは、短いペプチドを含む例示的なＮＬＰの組み立ての模式図を示す。
いくつかの実施態様では、前記膜形成脂質の１つ又は複数は、前記ペプチドコンジュゲートの一方又は両方の表面上に官能化基を提示し、方法はさらに、ペプチド－ＮＬＰコンジュゲートを、ｐＨ４．５～６．５の範囲の低ｐＨで前記官能化基にコンジュゲートする、Ｃ末端に位置する相補的官能基を有するペプチド（例えば、Ｆａｂ又はＦａｂ様分子などの抗原結合ポリペプチド）と接触させる工程を含む。いくつかの実施態様では、ポリペプチド（例えば、抗原結合ポリペプチド）のペプチド－ＮＬＰコンジュゲートへのコンジュゲーションは、組み立てられていない膜形成脂質の一部又は全てを除去するための介在工程を伴わずに、ペプチド－ＮＬＰコンジュゲートの組み立て（例えば、自己組織化）に続いて行われる。いくつかの実施態様では、抗原結合ポリペプチドのペプチドコンジュゲートへのコンジュゲーションは、ペプチドコンジュゲートを濃縮するための介在工程を伴わずに、ペプチドコンジュゲートの組み立て（例えば、自己組織化）に続いて行われる。いくつかの実施態様では、官能化基はマレイミド誘導体であり、前記官能基はシステインチオール基であり、場合によって、前記システインアミノ酸残基は、抗原結合ポリペプチドが由来する抗体においてヒンジジスルフィド結合を形成する（Ｃｙｓ－２２６又はＣｙｓ－２２７など）。いくつかの実施態様では、官能化基は、前記低ｐＨで前記足場タンパク質にコンジュゲートしない。いくつかの実施態様では、前記低ｐＨは、５．５～６．５のｐＨ、５～６のｐＨ、又は６のｐＨである。いくつかの実施態様では、スペーサーは前記官能化基を前記膜形成脂質に接続し、且つ／又はスペーサーは前記相補的官能基を前記抗原結合ポリペプチドに接続する。いくつかの実施態様では、スペーサーは、前記官能化基を前記膜形成脂質に接続するＰＥＧスペーサーである。いくつかの実施態様では、ＰＥＧスペーサーは、１０００～３０００、１５００～２５００、１９００～２２００、又は２０００のＭＷを有する。
本明細書の本方法は、本明細書に記載のコンジュゲート（例えば、ペプチド－ＮＬＰコンジュゲート、ペプチド－ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲート、及びＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲート）の製造において産業上の適用性を見出す。このようなコンジュゲートは、例えば、インビトロ、エクスビボ、及びインビボの治療方法において使用される。本明細書では、本発明のコンジュゲートの１つ又は複数を使用することに基づく様々な方法が提供される。
ＶＩ．治療方法及び使用
本発明の別の態様は、治療のための本明細書に記載のコンジュゲート（例えば、ペプチド－ＮＬＰコンジュゲート、ペプチド－ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲート、及びＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲート）の使用に関する。治療される疾患、障害、病理学的状態は、コンジュゲートにおける使用のための抗原結合ポリペプチド及び／又は短いペプチドの選択を知らせるであろう。より具体的には、特定の疾患、障害、又は状態においては、多価及び／又は多重特異性抗原結合構築物コンジュゲート（例えば、ＮＬＰ－Ｆａｂコンジュゲート、ＮＬＰ－Ｆａｂ様分子コンジュゲート、ペプチド－ＮＬＰ－Ｆａｂコンジュゲート、又はペプチド－ＮＬＰ－Ｆａｂ様分子コンジュゲート）を使用することが必要であるか又は望ましい。本発明のコンジュゲート（例えば、ペプチド－ＮＬＰコンジュゲート、ペプチド－ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲート、及びＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲート）は、上記のように、多価及び／又は多重特異性抗原結合ポリペプチド及び／又は短いペプチドのための用途の広いプラットフォームを提供し、これは、治療、予防、送達、診断など、様々な目的のために使用することができる。
本明細書で使用される場合、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（及びその文法的な変化形、例えば、「治療（ｔｒｅａｔ）する」又は「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」）は、有益な効果をもたらすために、治療を受けている対象における疾患の自然な経過を変えようとする試みにおける臨床的介入を指し、予防的に、又は疾患の経過中に行うことができる。治療の有益な効果には、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の軽減、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減弱、転移を予防すること、疾患進行速度を低下させること、疾患状態の改善又は緩和、寛解、予後の改善などが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様では、抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ又はＦａｂ様分子を含む）及び／又は短いペプチド（例えば、ＣＫＰ又はＣＫＰバリアント）を含むＮＬＰコンジュゲートは、疾患の発症を遅らせるか、疾患の進行を遅らせるか、又は疾患の再発の可能性、頻度、及び／若しくは重症度を低下させるために使用される。
一般に、コンジュゲート（例えば、ペプチド－ＮＬＰコンジュゲート、ペプチド－ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲート、及び／又はＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲート）は、それからの利益を必要とする対象に治療的有効量で提供される。例えば薬学的組成物中の薬剤の「治療的有効量」とは、対象への投与時に、細胞又は組織に生理学的変化をもたらし、それにより、薬学的組成物を受ける対象に有益な効果を生み出すために、有効量の薬剤（例えば、抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ又はＦａｂ様分子）、及び／又は短いペプチド（例えば、ＣＫＰ又はＣＫＰバリアント）、及び／又は他の治療剤若しくは診断剤）を標的細胞又は組織に供給する量を指す。薬学的組成物は、一般に、所望の治療又は予防結果を達成するための投薬量及び期間で投与される。
ａ．悪性疾患の治療
いくつかの実施態様では、抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ又はＦａｂ様分子）は、血管新生及び／又は腫瘍増殖において役割を果たす標的に結合し；コンジュゲート（例えば、ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲート）は、悪性疾患を治療するために血管新生及び／又は腫瘍増殖を阻害することにおける使用を見出す。いくつかの実施態様では、血管新生及び／又は腫瘍増殖の阻害における使用を見出すコンジュゲートは、血管新生及び／又は腫瘍増殖において役割を果たす標的に結合する短いペプチド（すなわち、ペプチド－ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲート）をさらに含む。いくつかの実施態様では、短いペプチドは、抗原結合ポリペプチドと同じ標的に結合する。いくつかの実施態様では、短いペプチドは、抗原結合ポリペプチドとは異なる標的に結合する。いくつかの実施態様では、短いペプチドは、抗原結合ポリペプチドの活性（例えば、治療活性）に相補的又は相乗的な活性（例えば、治療活性）を示す。特定の実施態様では、悪性疾患は、上皮、内皮又は中皮起源のがん及び血液のがんから選択される。本発明のコンジュゲートは、前がん性、非転移性、転移性、及びがん性腫瘍（例えば、初期段階のがん）を含む腫瘍の治療、又はがんを発症するリスクのある対象の治療に使用することができる。さらなる態様では、コンジュゲートの抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）は、標的化又は安定化の役割を果たし、例えば、安定化ＮＬＰ－Ｆａｂコンジュゲート又は安定化ペプチド－ＮＬＰ－Ｆａｂコンジュゲートを、以下にさらに詳細に論じる疾患に関連する抗原に標的化する役割を果たす。
特定の実施態様では、がん又は癌は、消化器がん、膵臓がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、口腔がん、胃がん、子宮頸がん、Ｂ及びＴ細胞リンパ腫、骨髄性白血病、卵巣がん、白血病、リンパ性白血病、上咽頭癌、結腸がん、前立腺がん、腎細胞がん、頭頸部がん、皮膚がん（黒色腫）、泌尿生殖器系のがん、例えば精巣がん、卵巣がん、内皮がん、子宮頸がん、腎臓がん、胆管がん、食道がん、唾液腺がん、甲状腺がん、又は血液腫瘍、神経膠腫、肉腫又は骨肉腫などの他の腫瘍性疾患からなる群から選択される。
腫瘍（例えば、がん性腫瘍）の場合、治療的有効量の薬剤は、細胞の数を低減し、原発腫瘍サイズを低減し、末梢臓器へのがん細胞浸潤を阻害し（すなわち、ある程度遅らせるか又は停止する）、腫瘍転移を阻害し（すなわち、ある程度遅らせるか又は停止する）、腫瘍成長をある程度阻害し；且つ／又は障害に関連する症状のうちの１つ又は複数をある程度軽減し得る。がん療法の場合、インビボでの有効性は、例えば、生存期間から疾患進行までの時間（ＴＴＰ）、応答速度（ＲＲ）、応答期間、及び／又は生活の質を評価することによって測定することができる。
「低減又は阻害する」とは、例えば、２０％、５０％、７５％、８５％、９０％、又は９５％の全体的な減少をもたらす能力を意味する。低減する又は阻害するとは、治療される障害の１つ又は複数の症状、転移の存在又は大きさ、原発腫瘍の大きさ、又は血管新生障害における血管の大きさ若しくは数に対する影響を指すことができる。
腫瘍は、固形腫瘍又は非固形腫瘍若しくは軟部組織腫瘍であり得る。軟組織腫瘍の例としては、白血病（例えば、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、成人急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、成熟Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、前リンパ性白血病、若しくはヘアリー細胞白血病）、又はリンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、若しくはホジキン病）が挙げられる。固形腫瘍は、血液、骨髄又はリンパ系以外の体組織の任意のがんを含む。固形腫瘍は、上皮細胞由来のものと非上皮細胞由来のものにさらに分けることができる。上皮細胞固形腫瘍の例としては、胃腸管、結腸、乳房、前立腺、肺、腎臓、肝臓、膵臓、卵巣、頭頸部、口腔、胃、十二指腸、小腸、大腸、肛門、胆嚢、唇、鼻咽頭、皮膚、子宮、生殖器官、泌尿器、膀胱、及び皮膚の腫瘍が挙げられる。非上皮起源の固形腫瘍としては、肉腫、脳腫瘍、及び骨腫瘍が挙げられる。
いくつかの実施態様では、ＮＬＰコンジュゲートは、上記のように、一対の臨床的に関連する標的に結合する少なくとも２つの抗原結合ポリペプチド（例えば、１つ又は複数のＦａｂ又はＦａｂ様分子を含む）の少なくとも１つの分子を含む。例えば、臨床的に関連する対は、Ｔ細胞マーカー、共刺激受容体、又はＮＫ細胞マーカーのうちの少なくとも１つ；及び腫瘍抗原、例えば、本明細書に開示されている及び／又は当技術分野で知られている腫瘍抗原のいずれか１つ又は複数を含み得る。いくつかの実施態様では、ＮＬＰコンジュゲートは、短いペプチド（例えば、ＣＫＰ又はＣＫＰバリアント）を含む（さらに含むなど）。いくつかの実施態様では、短いペプチドは、コンジュゲート中の抗原結合ポリペプチドと同じ活性（例えば、結合活性及び／又は治療活性）を示す。いくつかの実施態様では、短いペプチドは、コンジュゲート中の抗原結合ポリペプチドとは異なる（例えば、相補的又は相乗的な）活性（例えば、結合活性及び／又は治療活性）を示す。いくつかの実施態様では、コンジュゲートは、少なくとも２つの異なる短いペプチドのそれぞれの少なくとも１つの分子を含む。
特定の例では、ＮＬＰコンジュゲートは、急性リンパ芽球性白血病の治療における使用のための、ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ポリペプチド（例えば、第１のＦａｂ）と、標的ＣＤ１９（腫瘍抗原）に結合する第２の抗原結合ポリペプチド（例えば、第２のＦａｂ）とを含む。別の特定の例では、ＮＬＰコンジュゲートは、結腸、直腸、卵巣、胃、食道、肺、膵臓、乳房、頭頸部を含む様々な起源の癌の治療における使用のための、ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ポリペプチド（例えば、第１のＦａｂ）と、ＥｐＣＡＭ（腫瘍抗原）に結合する第２の抗原結合ポリペプチド（例えば、第２のＦａｂ）とを含む。
特定の実施態様は、消化器がん、膵臓がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん及び／又は口腔がんの治療における使用のための、ＨＥＲ１、好ましくはヒトＨＥＲ１に結合する第１の抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）と、場合によって、ＮＫ細胞マーカー、Ｔ細胞マーカー、又は共刺激受容体のうちの少なくとも１つに結合する第２の抗原結合ポリペプチド（例えば、第２のＦａｂ）とを含む本発明のＮＬＰコンジュゲートを提供する。
特定の実施態様は、胃がん、乳がん、及び／又は子宮頚がんの治療における使用のための、ＨＥＲ２、好ましくはヒトＨＥＲ２に結合する第１の抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）と、場合によって、ＮＫ細胞マーカー、Ｔ細胞マーカー、又は共刺激受容体のうちの少なくとも１つに結合する第２の抗原結合ポリペプチド（例えば、第２のＦａｂ）とを含む本発明のＮＬＰコンジュゲートを提供する。
特定の実施態様は、胃がん及び／又は肺がんの治療における使用のための、ＨＥＲ３、好ましくはヒトＨＥＲ３に結合する第１の抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）と、場合によって、ＮＫ細胞マーカー、Ｔ細胞マーカー、又は共刺激受容体のうちの少なくとも１つに結合する第２の抗原結合ポリペプチド（例えば、第２のＦａｂ）とを含む本発明のＮＬＰコンジュゲートを提供する。
特定の実施態様は、上皮、内皮、又は中皮起源のがん及び血液のがんの治療における使用のための、ＣＥＡ、好ましくはヒトＣＥＡに結合する第１の抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）と、場合によって、ＮＫ細胞マーカー、Ｔ細胞マーカー、又は共刺激受容体のうちの少なくとも１つに結合する第２の抗原結合ポリペプチド（例えば、第２のＦａｂ）とを含む本発明のＮＬＰコンジュゲートを提供する。
特定の実施態様は、上皮、内皮、又は中皮起源のがん及び血液のがんの治療における使用のための、ｐ９５、好ましくはヒトｐ９５に結合する第１の抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）と、場合によって、ＮＫ細胞マーカー、Ｔ細胞マーカー、又は共刺激受容体のうちの少なくとも１つに結合する第２の抗原結合ポリペプチド（例えば、第２のＦａｂ）とを含む本発明のＮＬＰコンジュゲートを提供する。
特定の実施態様は、上皮、内皮、又は中皮起源のがん及び血液のがんの治療における使用のための、ＢＣＭＡ、好ましくはヒトＢＣＭＡに結合する第１の抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）と、場合によって、ＮＫ細胞マーカー、Ｔ細胞マーカー、又は共刺激受容体のうちの少なくとも１つに結合する第２の抗原結合ポリペプチド（例えば、第２のＦａｂ）とを含む本発明のＮＬＰコンジュゲートを提供する。
特定の実施態様は、上皮、内皮、又は中皮起源のがん及び血液のがんの治療における使用のための、ＭＳＬＮ、好ましくはヒトＭＳＬＮに結合する第１の抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）と、場合によって、ＮＫ細胞マーカー、Ｔ細胞マーカー、又は共刺激受容体のうちの少なくとも１つに結合する第２の抗原結合ポリペプチド（例えば、第２のＦａｂ）とを含む本発明のＮＬＰコンジュゲートを提供する。
特定の実施態様は、上皮、内皮、又は中皮起源のがん及び血液のがんの治療における使用のための、ＭＣＳＰ、好ましくはヒトＭＣＳＰに結合する第１の抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）と、場合によって、ＮＫ細胞マーカー、Ｔ細胞マーカー、又は共刺激受容体のうちの少なくとも１つに結合する第２の抗原結合ポリペプチド（例えば、第２のＦａｂ）とを含む本発明のＮＬＰコンジュゲートを提供する。
特定の実施態様は、上皮、内皮、又は中皮起源のがん及び血液のがんの治療における使用のための、ＣＤ１９、好ましくはヒトＣＤ１９に結合する第１の抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）と、場合によって、ＮＫ細胞マーカー、Ｔ細胞マーカー、又は共刺激受容体のうちの少なくとも１つに結合する第２の抗原結合ポリペプチド（例えば、第２のＦａｂ）とを含む本発明のＮＬＰコンジュゲートを提供する。
特定の実施態様は、Ｂ細胞リンパ腫及び／又はＴ細胞リンパ腫の治療における使用のための、ＣＤ２０、好ましくはヒトＣＤ２０に結合する第１の抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）と、場合によって、ＮＫ細胞マーカー、Ｔ細胞マーカー、又は共刺激受容体のうちの少なくとも１つに結合する第２の抗原結合ポリペプチド（例えば、第２のＦａｂ）とを含む本発明のＮＬＰコンジュゲートを提供する。
特定の実施態様は、Ｂ細胞リンパ腫及び／又はＴ細胞リンパ腫の治療における使用のための、ＣＤ２２、好ましくはヒトＣＤ２２に結合する第１の抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）と、場合によって、ＮＫ細胞マーカー、Ｔ細胞マーカー、又は共刺激受容体のうちの少なくとも１つに結合する第２の抗原結合ポリペプチド（例えば、第２のＦａｂ）とを含む本発明のＮＬＰコンジュゲートを提供する。
特定の実施態様は、上皮、内皮、又は中皮起源のがん及び血液のがんの治療における使用のための、ＣＤ３８、好ましくはヒトＣＤ３８に結合する第１の抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）と、場合によって、ＮＫ細胞マーカー、Ｔ細胞マーカー、又は共刺激受容体のうちの少なくとも１つに結合する第２の抗原結合ポリペプチド（例えば、第２のＦａｂ）とを含む本発明のＮＬＰコンジュゲートを提供する。
特定の実施態様は、上皮、内皮、又は中皮起源のがん及び血液のがんの治療における使用のための、ＣＤ５２Ｆｌｔ３、好ましくはヒトＣＤ５２Ｆｌｔ３に結合する第１の抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）と、場合によって、ＮＫ細胞マーカー、Ｔ細胞マーカー、又は共刺激受容体のうちの少なくとも１つに結合する第２の抗原結合ポリペプチド（例えば、第２のＦａｂ）とを含む本発明のＮＬＰコンジュゲートを提供する。
特定の実施態様は、上皮、内皮、又は中皮起源のがん及び血液のがんの治療における使用のための、ＦｏｌＲ１、好ましくはヒトＦｏｌＲ１に結合する第１の抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）と、場合によって、ＮＫ細胞マーカー、Ｔ細胞マーカー、又は共刺激受容体のうちの少なくとも１つに結合する第２の抗原結合ポリペプチド（例えば、第２のＦａｂ）とを含む本発明のＮＬＰコンジュゲートを提供する。
特定の実施態様は、消化器がん、膵臓がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、膠芽腫及び／又は口腔がんの治療における使用のための、Ｔｒｏｐ－２、好ましくはヒトＴｒｏｐ－２に結合する第１の抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）と、場合によって、ＮＫ細胞マーカー、Ｔ細胞マーカー、又は共刺激受容体のうちの少なくとも１つに結合する第２の抗原結合ポリペプチド（例えば、第２のＦａｂ）とを含む本発明のＮＬＰコンジュゲートを提供する。
特定の実施態様は、卵巣がん、肺がん、乳がん及び／又は消化器がんの治療における使用のための、ＣＡ－１２－５、好ましくはヒトＣＡ－１２－５に結合する第１の抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）と、場合によって、ＮＫ細胞マーカー、Ｔ細胞マーカー、又は共刺激受容体のうちの少なくとも１つに結合する第２の抗原結合ポリペプチド（例えば、第２のＦａｂ）とを含む本発明のＮＬＰコンジュゲートを提供する。
特定の実施態様は、消化器がん、白血病及び／又は上咽頭癌の治療における使用のための、ＨＬＡ－ＤＲ、好ましくはヒトＨＬＡ－ＤＲに結合する第１の抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）と、場合によって、ＮＫ細胞マーカー、Ｔ細胞マーカー、又は共刺激受容体のうちの少なくとも１つに結合する第２の抗原結合ポリペプチド（例えば、第２のＦａｂ）とを含む本発明のＮＬＰコンジュゲートを提供する。
特定の実施態様は、結腸がん、乳がん、卵巣がん、肺がん、及び／又は膵臓がんの治療における使用のための、ＭＵＣ－１、好ましくはヒトＭＵＣ－１に結合する第１の抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）と、場合によって、ＮＫ細胞マーカー、Ｔ細胞マーカー、又は共刺激受容体のうちの少なくとも１つに結合する第２の抗原結合ポリペプチド（例えば、第２のＦａｂ）とを含む本発明のＮＬＰコンジュゲートを提供する。
特定の実施態様は、結腸がんの治療における使用のための、Ａ３３、好ましくはヒトＡ３３に結合する第１の抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）と、場合によって、ＮＫ細胞マーカー、Ｔ細胞マーカー、又は共刺激受容体のうちの少なくとも１つに結合する第２の抗原結合ポリペプチド（例えば、第２のＦａｂ）とを含む本発明のＮＬＰコンジュゲートを提供する。
特定の実施態様は、前立腺がんの治療における使用のための、ＰＳＭＡ、好ましくはヒトＰＳＭＡに結合する第１の抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）と、場合によって、ＮＫ細胞マーカー、Ｔ細胞マーカー、又は共刺激受容体のうちの少なくとも１つに結合する第２の抗原結合ポリペプチド（例えば、第２のＦａｂ）とを含む本発明のＮＬＰコンジュゲートを提供する。
特定の実施態様は、上皮、内皮、又は中皮起源のがん及び血液のがんの治療における使用のための、ＰＳＣＡ、好ましくはヒトＰＳＣＡに結合する第１の抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）と、場合によって、ＮＫ細胞マーカー、Ｔ細胞マーカー、又は共刺激受容体のうちの少なくとも１つに結合する第２の抗原結合ポリペプチド（例えば、第２のＦａｂ）とを含む本発明のＮＬＰコンジュゲートを提供する。
特定の実施態様は、上皮、内皮、又は中皮起源のがん及び血液のがんの治療における使用のための、トランスフェリン受容体（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、好ましくはヒトトランスフェリン受容体（ｈｕｍａｎ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ－ｒｅｃｅｐｔｏｒ）に結合する第１の抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）と、場合によって、ＮＫ細胞マーカー、Ｔ細胞マーカー、又は共刺激受容体のうちの少なくとも１つに結合する第２の抗原結合ポリペプチド（例えば、第２のＦａｂ）とを含む本発明のＮＬＰコンジュゲートを提供する。
特定の実施態様は、上皮、内皮、又は中皮起源のがん及び血液のがんの治療における使用のための、テネイシン、好ましくはヒトテネイシンに結合する第１の抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）と、場合によって、ＮＫ細胞マーカー、Ｔ細胞マーカー、又は共刺激受容体のうちの少なくとも１つに結合する第２の抗原結合ポリペプチド（例えば、第２のＦａｂ）とを含む本発明のＮＬＰコンジュゲートを提供する。
特定の実施態様は、腎がんの治療における使用のための、ＣＡ－ＩＸ、好ましくはヒトＣＡ－ＩＸに結合する第１の抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）と、場合によって、ＮＫ細胞マーカー、Ｔ細胞マーカー、又は共刺激受容体のうちの少なくとも１つに結合する第２の抗原結合ポリペプチド（例えば、第２のＦａｂ）とを含む本発明のＮＬＰコンジュゲートを提供する。
本発明のコンジュゲート（例えば、ペプチド－ＮＬＰコンジュゲート、ペプチド－ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲート、及び／又はＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲート）、薬学的組成物、又は製剤は、単独で、又は別の治療剤若しくは検出可能な薬剤／標識と組み合わせて投与することができる。「組み合わせて」という用語は、治療レジメンの成分が対象に投与される順序を限定しない。例えば、薬学的組成物又は医薬は、他の療法の投与前、投与と同時に、又は投与後に投与され得る。また、「組み合わせて」は投与間のタイミングを制限しない。したがって、２つの成分が同時に（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）又は同時に（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔｌｙ）投与されない場合、投与は、１分、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間若しくは７２時間で隔てられてもよく、又は当業者によって容易に決定され、且つ／若しくは本明細書に記載されている任意の適切な時間差によって隔てられてもよい。
追加の療法は、本明細書に記載されるか、又は当技術分野で知られているように、疾患又はその症状の治療又は予防に適した１つ又は複数の治療プロトコルを含むことができる。そのような治療プロトコルの例には、鎮痛剤の投与、化学療法剤の投与、疾患又はその症状の外科的処置が含まれるが、これらに限定されない。本発明のコンジュゲートと組み合わせて投与するための追加の治療薬の例には、例えば、悪性疾患の治療に関連して、胃腸系に作用する薬物、細胞増殖抑制剤として作用する薬物、高尿酸血症を予防する薬物、免疫反応を阻害する薬物（例えばコルチコステロイド）、循環系に作用する薬物、及び／又は当技術分野で知られているＴ細胞共刺激分子又はサイトカインなどの薬剤が挙げられる。
本発明はさらに、免疫エフェクター細胞、細胞増殖、又は細胞刺激のための活性化シグナルを提供することができる分子との同時投与プロトコルを想定している。前記分子は、例えば、Ｔ細胞の一次活性化シグナル（例えば共刺激分子：Ｂ７ファミリーの分子、Ｏｘ４０Ｌ、４．１ＢＢＬ、ＣＤ４０Ｌ、抗ＣＴＬＡ－４、抗ＰＤ－１）、又はサイトカインインターロイキン（例えば、ＩＬ－２）であり得る。
ｂ．眼疾患の治療
特定の実施態様では、本発明のコンジュゲート（例えば、ペプチド－ＮＬＰコンジュゲート、ペプチド－ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲート、及び／又はＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲート）は、対象における眼の疾患又は障害の治療に使用される。特定の実施態様では、対象は、異常な血管新生及び／又は異常な血管透過性を特徴とする眼の疾患又は障害を有する疑いがあるか、又は有するリスクがある。特定の実施態様では、対象は、異常な血管新生及び／又は異常な血管透過性を特徴とする眼の疾患又は障害と診断されている。
いくつかの実施態様では、眼の疾患又は障害は、糖尿病性失明、網膜症、主に糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・リッペル・リンダウ病（ｖｏｎ Ｒｉｐｐｅｌ－Ｌｉｎｄａｕ ｄｉｓｅａｓｅ）、眼のヒストプラスマ症、網膜静脈閉塞症（網膜静脈分枝閉塞症（ＢＲＶＯ）及び網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）の両方）、角膜血管新生、網膜血管新生、及びルベオーシスからなる群から選択される眼血管増殖性疾患などの眼血管増殖性疾患である。特定の実施態様では、角膜血管新生は、眼の感染、眼の炎症、眼の外傷（化学熱傷を含む）、又は角膜縁幹細胞バリアの喪失をもたらす。特定の実施態様では、角膜血管新生は、ヘルペス性角膜炎、トラコーマ、又はオンコセルカ症に起因する。
特定の実施態様では、眼疾患の治療のためのコンジュゲートは、ＶＥＧＦ（好ましくはヒトＶＥＧＦ）、Ｄ因子（好ましくはヒトＤ因子）、Ｔｉｅ２（好ましくはヒトＴｉｅ２）、及びＤＲ４（好ましくはヒトＤＲ４）のうちの少なくとも１つに結合する、抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）を含む。より具体的な実施態様では、眼疾患の治療のためのコンジュゲートは、ＶＥＧＦ、例えばＶＥＧＦ－Ａ、好ましくはヒトＶＥＧＦ－Ａに結合する抗原結合ポリペプチド（例えばＦａｂ）を含む。さらに特定の実施態様では、眼疾患の治療のためのコンジュゲートは、ＶＥＧＦ（例えば、ＶＥＧＦ－Ａ、好ましくはヒトＶＥＧＦ－Ａ）に結合する第１の抗原結合ポリペプチド（例えば、第１のＦａｂ）と、Ｄ因子（好ましくはヒトＤ因子）、Ｔｉｅ２（好ましくはヒトＴｉｅ２）、及びＤＲ４（好ましくはヒトＤＲ４）のうちの１つ又は複数に結合する第２の抗原結合ポリペプチド（例えば、第２のＦａｂ）とを含む。特定の例では、コンジュゲートは、例えば、糖尿病性黄斑浮腫の治療のための、ＶＥＧＦ－Ａに結合する第１の抗原結合ポリペプチド（例えば、第１のＦａｂ）と、Ａｎｇ－２に結合する第２の抗原結合ポリペプチド（例えば、第２のＦａｂ）とを含む。いくつかの実施態様では、そのようなコンジュゲートは、上に挙げた標的に結合する少なくとも１つの短いペプチド（例えば、ＣＫＰ又はＣＫＰバリアント）を含む（例えば、さらに含む）。いくつかの実施態様では、Ｆａｂ及び短いペプチドは同じ標的に結合する。いくつかの実施態様では、Ｆａｂ及び短いペプチドは異なる標的に結合する。いくつかの実施態様では、Ｆａｂ及び短いペプチドは、相補的又は相乗的な治療活性を示す。
特定の実施態様では、眼疾患障害を治療するための本発明のコンジュゲートは、第２の治療剤と組み合わせて投与される。眼の疾患又は障害が炎症反応によって引き起こされる患者の場合、抗炎症剤との併用療法を考慮することができる。細菌、ウイルス、真菌又はアカントアメーバ感染に続発する眼の疾患又は障害に罹患した患者の併用療法は、抗菌剤及び任意に抗炎症剤の投与を含み得る。
特定の実施態様では、眼疾患障害を治療するための本発明のコンジュゲートは、例えば、レーザー光凝固療法（ＬＰＴ）及び／又は光線力学療法（ＰＤＴ）などの第２の療法と組み合わせて投与され、ここでは光活性化分子（例えば、ベルテポルフィン）が、光活性化によって新生血管内皮を局所的に損傷するように作製され得る（例えば、国際公開第２０１４／０３３１８４号を参照されたい）。特定の実施態様では、第２の療法はジアテルミー及び焼灼であり、ユニポーラジアテルミーユニットを通して凝固電流を印加することによって、又は電解針を使用する熱焼灼によって血管が閉塞される。
ｃ．他の疾患の治療
本発明のコンジュゲートは、例えば、治療上の利益が、抗原結合ポリペプチド（及び、いくつかの実施態様では短いペプチド）の多量体及び／又は多重特異性フォーマット、特に安定した高結合活性フォーマットを使用することを必要とするか、又はそれらを使用して増強される場合、及び／又は、本明細書に記載のように、高濃度の抗原結合ポリペプチド（及び、いくつかの実施態様では短いペプチド）が少量で投与される場合、他の疾患の治療においても使用され得る。
例えば、本発明のコンジュゲートは、アレルギー性又は炎症性疾患の治療のために、自己免疫疾患の治療のために、又はアレルギー性若しくは炎症性疾患、又は自己免疫疾患を発症するリスクのある対象の治療のために使用することができる。
本明細書で提供される組成物を受ける候補である他の対象は、血管結合組織の異常増殖、酒土性挫創、後天性免疫不全症候群、動脈閉塞、アトピー性角膜炎、細菌性潰瘍、ベーチェット病、血液媒介腫瘍、頸動脈閉塞性疾患、脈絡膜新生血管、慢性炎症、慢性網膜剥離、慢性ブドウ膜炎、慢性硝子体炎、コンタクトレンズオーバーウェア、角膜移植後拒絶反応、角膜血管新生、角膜移植血管新生、クローン病、イールズ病、流行性角結膜炎、真菌性潰瘍、単純ヘルペス感染、帯状疱疹感染、過粘着性症候群、カポジ肉腫、白血病、脂肪変性、ライム病、辺縁部表皮剥離、モーレン潰瘍、ハンセン病以外のマイコバクテリア感染、近視、眼血管新生疾患、眼陥没、オスラー・ウェーバー症候群（オスラー・ウェーバー・ランデュ）、変形性関節症、パジェット病、扁平部炎、類天疱瘡、糸球体炎、多発性動脈炎、ポストレーザー合併症、原虫症、弾力線維性仮性黄色腫、乾燥翼状片角膜炎、放射状角膜切開術、網膜血管新生、未熟児網膜症、後水晶体線維増殖症、サルコイド、強膜炎、鎌状赤血球貧血、シェーグレン症候群、固形腫瘍、スターガルト（Ｓｔａｒｇａｒｔ’ｓ）病、スティーブンス・ジョンソン病、上輪部角膜炎、梅毒、全身性狼瘡、テリエン周辺角膜変性症、トキソプラズマ症、ユーイング肉腫の腫瘍、神経芽細胞腫の腫瘍、骨肉腫の腫瘍、網膜芽細胞腫の腫瘍、横紋筋肉腫の腫瘍、潰瘍性大腸炎、静脈閉塞、ビタミンＡ欠乏、ウェゲナーのサルコイドーシス、糖尿病に関連付けられる望ましくない血管新生、寄生虫病、異常創傷治癒、手術後肥大、損傷又は外傷（例えば、急性肺損傷／ＡＲＤＳ）、発毛阻害、排卵及び黄体形成の阻害、着床（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）の阻害、及び子宮内胚発生の阻害を有するか、又はそれらを発生する危険がある。
特定の実施態様は、第ＩＸａ因子、好ましくはヒト第ＩＸａ因子に結合する第１の抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）と、血友病、例えば、血友病Ａの治療における使用のための第Ｘ因子に結合する第２の抗原結合ポリペプチド（例えば、第２のＦａｂ）とを含む本発明のコンジュゲートを提供する。血友病Ａは重度の遺伝性出血性疾患であり、患者は凝固促進補助因子タンパク質である第ＶＩＩＩ因子の欠乏又は機能不全のために大量の出血を起こす。いくつかの実施態様では、第ＩＸａ因子及び第Ｘ因子の両方への本発明の二重特異性コンジュゲートの結合は、活性化第ＶＩＩＩ因子の機能の一部を模倣し、疾患の治療に使用できる。例えば、Ｎｏｇａｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ｎｏｎｆａｃｔｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｏｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ；Ｂｌｏｏｄ；２０１９；１３３（５）：３９９－４０６を参照されたい。いくつかの実施態様では、そのようなコンジュゲートは、上に挙げた標的に結合する短いペプチド（例えば、ＣＫＰ又はＣＫＰバリアント）を含む（例えば、さらに含む）。いくつかの実施態様では、Ｆａｂ及び短いペプチドは同じ標的に結合する。いくつかの実施態様では、Ｆａｂ及び短いペプチドは異なる標的に結合する。いくつかの実施態様では、Ｆａｂ及び短いペプチドは、相補的又は相乗的な治療活性を示す。
ＶＩＩ．送達方法及び使用
本発明の別の態様は、１つ又は複数の追加の治療剤又は診断剤の送達における使用のためのコンジュゲート（例えば、ペプチド－ＮＬＰコンジュゲート、ペプチド－ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲート、及び／又はＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲート）を提供する。コンジュゲートは、組成物において、例えば、本明細書に記載の薬学的組成物として送達され得る。いくつかの実施態様では、コンジュゲートは、例えば上記のように、高濃度のＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲート又はペプチド－ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲートを提供する低粘度製剤において提供される。いくつかの実施態様では、抗原結合ポリペプチドは安定化剤として機能し、例えば、貯蔵寿命及び／又は血清半減期を増加させるために、例えば、短いペプチド、及び／又は１つ以上の他の治療剤又は診断剤を含むコンジュゲートを安定化させ、特に、例えば、コンジュゲートの凍結乾燥を促進し（活性を実質的に失うことなく）、及び／又は、例えば上記で議論したように、高濃度のコンジュゲートを含む低粘度製剤の製造を促進する。特定の実施態様では、本発明のコンジュゲートは、血液脳関門を通過する特異的又は標的化された送達を可能にし、その積荷（例えば、１つ以上の短いペプチド及び／又は１つ以上の追加の治療剤若しくは診断剤）が、例えば上記で議論したように、脳又は中枢神経系の標的にアクセスできるようにする。特定の実施態様では、特定の治療剤又は診断剤を送達するため、並びに血液脳関門の移行をもたらすための本発明のコンジュゲートの使用は、以下により詳細に記載される。
ａ．治療剤の送達
いくつかの実施態様では、抗原結合ポリペプチドは、上記の治療剤を含む。いくつかの実施態様では、抗原結合ポリペプチドは、特定の抗原に対する親和性に基づいてコンジュゲートを特定の細胞又は組織に誘導する標的指向化部分としてより多くの役割を果たし、コンジュゲートはさらに、抗原結合ポリペプチドに加えて、例えば生物学的活性剤又は検出可能な薬剤などの１つ又は複数の治療剤又は診断剤をそれぞれ含む。ＮＬＰは、膜タンパク質の可溶化（２１～２６）、タンパク質細孔複合体の生成（２７）、疎水性薬物（１４、２８、２９）、タンパク質（１４、２０、３０、３１）、がん新生抗原（３２）、及び免疫調節薬（１７）を含む、選択的適用と薬物積荷について探索されているが、本開示は、本明細書で議論されるように、生理学的条件下での安定性、良好な製造可能性、活性を失うことなく（又は有意な損失なしに）凍結乾燥及び再構成される能力、及び低粘度製剤において濃縮される能力を含む、驚くべき特徴を有する抗原結合ポリペプチド（特に、Ｆａｂ）とのコンジュゲートを提供する。いくつかの実施態様では、コンジュゲートは、短いペプチド（例えば、ＣＫＰ又はＣＫＰバリアント）を含む（さらに含むなど）。いくつかの実施態様では、短いペプチドは、コンジュゲート中の抗原結合ポリペプチドと同じ活性（例えば、結合活性及び／又は治療活性）を示す。いくつかの実施態様では、短いペプチドは、コンジュゲート中の抗原結合ポリペプチドとは異なる（例えば、相補的又は相乗的な）活性（例えば、結合活性及び／又は治療活性）を示す。いくつかの実施態様では、コンジュゲートは、少なくとも２つの異なる短いペプチドのそれぞれの少なくとも１つの分子を含む。この段落で引用されている全ての参考文献は、実施例５の下にある。
したがって、いくつかの態様では、本発明は、生物学的活性剤又は検出可能な薬剤を、安定した及び／又は低粘度の液体製剤において、それを必要とする個体に送達する方法であって、生物学的活性剤及び／又は検出可能な薬剤をさらに含む本発明のコンジュゲートを含む液体製剤を個体に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施態様では、抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）は、本明細書に列挙される機能のうちの１つ又は複数を提供し、例えば、標的指向化剤及び安定化剤の両方として、抗原結合ポリペプチドを別の治療剤又は診断剤と共に含むコンジュゲートに対して機能する。いくつかの実施態様では、抗原結合ポリペプチドはＦａｂである。いくつかの実施態様では、抗原結合ポリペプチドは、Ｆａｂ様分子、すなわち、必ずしも抗原に結合できるわけではないが、Ｆａｂと同様のサイズ及び／又はコンフォメーション形状を有するポリペプチドである。いくつかの実施態様では、コンジュゲートは、短いペプチド（例えば、ＣＫＰ又はＣＫＰバリアント）を含む（さらに含むなど）。いくつかの実施態様では、短いペプチドは、コンジュゲート中の抗原結合ポリペプチドと同じ活性（例えば、結合活性及び／又は治療活性）を示す。いくつかの実施態様では、短いペプチドは、コンジュゲート中の抗原結合ポリペプチドとは異なる（例えば、相補的又は相乗的な）活性（例えば、結合活性及び／又は治療活性）を示す。いくつかの実施態様では、コンジュゲートは、少なくとも２つの異なる短いペプチドのそれぞれの少なくとも１つの分子を含む。
追加の治療剤又は診断剤は、共有結合又は非共有結合によって、本明細書に記載のコンジュゲートと結合するであろう。例えば、疎水性の治療剤又は診断剤は、脂質二重層の非極性領域と結合することができるが、親水性部分は内部領域及び外部領域のいずれか又は両方にまで及ぶ。いくつかの実施態様では、治療剤又は診断剤は、例えば本明細書に記載されるように、直接並びに／又は薬剤及び／若しくは脂質上のスペーサーを介して、ＮＬＰの膜形成脂質上の同じ又は異なる官能化基と相互作用するように官能化される（例えば、ＵＳ２００９／０３１１２７６Ａ１、ＵＳ２０１９／０１４２７５２Ａ１、ＵＳ２０１８／０３１８２１８Ａ１、ＵＳ２０１９／０３０７６９２Ａ１、ＵＳ２０１０／００９２５６７Ａ１、及びＵＳ２０１１／００５９５４９Ａ１も参照されたい）。いくつかの実施態様では、治療剤又は診断剤は、例えば本明細書に記載されるように、直接及び／又はスペーサーを介してコンジュゲートの抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）と結合し得る。代替的に、又は追加的に、コンジュゲートは、治療剤又は診断剤に結合する（又は治療剤若しくは診断剤のハプテンに結合する）１つ又は複数の抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）をさらに含み得、事前標的化送達を可能にする。事前標的化送達では、本発明のコンジュゲートが対象に投与され、コンジュゲートは、腫瘍マーカー（例えば、ＣＥＡ、ＣＤ３８）に結合する抗原結合ポリペプチドを含み、続いて治療剤又は診断剤が投与される。コンジュゲートが短いペプチドを含むいくつかの実施態様では、治療剤又は診断剤は、コンジュゲートの短いペプチドと結合し得る。
特定の実施態様では、本発明のコンジュゲート（例えば、ペプチド－ＮＬＰコンジュゲート、ペプチド－ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲート、及び／又はＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲート）は、特定の種類のがんを標的とする。例えば、胃腸がん、膵臓がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、及び／又は口腔がんは、１つ又は複数の抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）及び／又は（ヒト）ＥｐＣＡＭ（腫瘍細胞の表面上に天然に存在する腫瘍特異的抗原として）に結合する１つ又は複数の短いペプチドを含むコンジュゲートにより標的とされ得る。胃腸がん、膵臓がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、及び／又は口腔がんは、１つ又は複数の抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）及び／又はＨＥＲ１、好ましくはヒトＨＥＲ１又はＴｒｏｐ－２、好ましくはヒトＴｒｏｐ－２に結合する１つ又は複数の短いペプチドを含むコンジュゲートにより標的とされ得る。さらに、胃腸がん、膵臓がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、膠芽細胞腫及び／又は口腔がんは、ＭＣＳＰ、好ましくはヒトＭＣＳＰ；ＦＯＬＲ１、好ましくはヒトＦＯＬＲ１；ＰＳＣＡ、好ましくはヒトＰＳＣＡ；ＥＧＦＲｖＩＩＩ、好ましくはヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ；又はＭＳＬＮ、好ましくはヒトＭＳＬＮに結合する１つ又は複数の抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）を含むコンジュゲートにより標的とされ得る。いくつかの実施態様では、そのようなコンジュゲートは、上に挙げた標的に結合する短いペプチド（例えば、ＣＫＰ又はＣＫＰバリアント）を含む（例えば、さらに含む）。いくつかの実施態様では、Ｆａｂ及び短いペプチドは同じ標的に結合する。いくつかの実施態様では、Ｆａｂ及び短いペプチドは異なる標的に結合する。いくつかの実施態様では、Ｆａｂ及び短いペプチドは、相補的又は相乗的な治療活性を示す。
胃がん、乳がん、及び／又は子宮頚がんは、ＨＥＲ２、好ましくはヒトＨＥＲ２に結合する１つ又は複数の抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）を含むコンジュゲートにより標的とされ得る。胃がん及び／又は肺がんは、ＨＥＲ３、好ましくはヒトＨＥＲ３に結合する１つ又は複数の抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）を含むコンジュゲートにより標的とされ得る。Ｂ細胞リンパ腫及び／又はＴ細胞リンパ腫は、ＣＤ２０、好ましくはヒトＣＤ２０及び／又はＣＤ２２、好ましくはヒトＣＤ２２に結合する１つ又は複数の抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）を含むコンジュゲートにより標的とされ得る。骨髄性白血病は、ＣＤ３３、好ましくはヒトＣＤ３３に結合する１つ又は複数の抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）を含むコンジュゲートにより標的とされ得る。卵巣がん、肺がん、乳がん及び／又は消化器がんは、ＣＡ１２－５、好ましくはヒトＣＡ１２－５に結合する１つ又は複数の抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）を含むコンジュゲートにより標的とされ得る。消化器がん、白血病及び／又は上咽頭癌は、ＨＬＡ－ＤＲ、好ましくはヒトＨＬＡ－ＤＲに結合する１つ又は複数の抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）を含むコンジュゲートにより標的とされ得る。いくつかの実施態様では、そのようなコンジュゲートは、上に挙げた標的に結合する短いペプチド（例えば、ＣＫＰ又はＣＫＰバリアント）を含む（例えば、さらに含む）。いくつかの実施態様では、Ｆａｂ及び短いペプチドは同じ標的に結合する。いくつかの実施態様では、Ｆａｂ及び短いペプチドは異なる標的に結合する。いくつかの実施態様では、Ｆａｂ及び短いペプチドは、相補的又は相乗的な治療活性を示す。
結腸がん、乳がん、卵巣がん、肺がん、及び／又は膵臓がんは、ＭＵＣ－１、好ましくはヒトＭＵＣ－１に結合する１つ又は複数の抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）を含むコンジュゲートにより標的とされ得る。結腸がんは、Ａ３３、好ましくはヒトＡ３３に結合する１つ又は複数の抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）を含むコンジュゲートにより標的とされ得る。前立腺がんは、ＰＳＭＡ、好ましくはヒトＰＳＭＡに結合する１つ又は複数の抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）を含むコンジュゲートにより標的とされ得る。胃腸がん、膵臓がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、及び／又は口腔がんは、トランスフェリン受容体、好ましくはヒトトランスフェリン受容体（ｈｕｍａｎ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ－ｒｅｃｅｐｔｏｒ）に結合する１つ又は複数の短いペプチドを含むコンジュゲートにより標的とされ得る。膵臓がん、肺がん、及び／又は乳がんは、トランスフェリン受容体、好ましくはヒトトランスフェリン受容体（ｈｕｍａｎ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ－ｒｅｃｅｐｔｏｒ）に結合する１つ又は複数の抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）を含むコンジュゲートにより標的とされ得る。腎がんは、ＣＡ－ＩＸ、好ましくはヒトＣＡ－ＩＸに結合する１つ又は複数の抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）を含むコンジュゲートにより標的とされ得る。いくつかの実施態様では、そのようなコンジュゲートは、上に挙げた標的に結合する短いペプチド（例えば、ＣＫＰ又はＣＫＰバリアント）を含む（例えば、さらに含む）。いくつかの実施態様では、Ｆａｂ及び短いペプチドは同じ標的に結合する。いくつかの実施態様では、Ｆａｂ及び短いペプチドは異なる標的に結合する。いくつかの実施態様では、Ｆａｂ及び短いペプチドは、相補的又は相乗的な治療活性を示す。
標的組織への送達のための治療剤は、例えば、上記で提供されるように、腫瘍細胞を死滅させるか又は阻害する細胞傷害性剤又は細胞増殖抑制剤であり得るが（Ｓｙｒｉｇｏｓ ａｎｄ Ｅｐｅｎｅｔｏｓ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９：６０５－６１４（１９９９）；Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ－Ｄｕｖａｚ ａｎｄ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ａｄｖ．Ｄｒｇ．Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．２６：１５１－１７２（１９９７）；米国特許第４，９７５，２７８号）、一方、これらの薬剤の全身投与は、排除しようとしている腫瘍細胞だけでなく、正常細胞に対しても許容できないレベルの毒性をもたらす可能性がある。細胞傷害性剤は、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキセート、及びビンデシン、放射性核種、ジフテリア毒素などの細菌毒素、リシンなどの植物毒素、ゲルダナマイシン、メイタンシノイド、及びカリケアマイシンなどの小分子毒素から選択される１つ又は複数であり得る。毒素は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合、又はトポイソメラーゼ阻害などのメカニズムによって、細胞毒性及び細胞増殖抑制効果に影響を与え得る。
細胞傷害性剤又は細胞増殖抑制剤には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ－サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ－Ｓ）、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン、及びトリコテセンを含む、酵素的に活性な毒素及びそれらの断片も含まれる場合がある。例えば、国際公開第９３／２１２３２号を参照されたい。使用可能な放射性核種の例としては、２１２Ｂｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、２１１Ａｔ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、３２Ｐ、２１２Ｐｂ、Ｌｕの放射性同位体などが挙げられる。
特定の例では、本発明のコンジュゲートは、インジウム－１１１の事前標的化送達のための、ＣＥＡに結合する第１の抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）と、例えば、インジウム－１１１標識ペプチドに結合する第２の抗原結合ポリペプチド（例えば、第２のＦａｂ）とを含む。別の特定の例では、本発明のコンジュゲートは、例えば、９０Ｙの事前標的化送達のための、ＣＤ３８に結合する第１の抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）と、９０Ｙ複合体に結合する第２の抗原結合ポリペプチド（例えば、第２のＦａｂ）とを含む。さらに別の特定の例では、本発明のコンジュゲートは、ＣＤ２２に結合する第１の抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）と、ＣＤ１９に結合する第２の抗原結合ポリペプチド（例えば、第２のＦａｂ）とを含み；第１及び／又は第２の抗原結合ポリペプチドに直接結合したジフテリアをさらに含む。いくつかの実施態様では、そのようなコンジュゲートは、短いペプチド（例えば、ＣＫＰ又はＣＫＰバリアント）を含む（例えば、さらに含む）。いくつかの実施態様では、Ｆａｂ及び短いペプチドは同じ標的に結合する。いくつかの実施態様では、Ｆａｂ及び短いペプチドは異なる標的に結合する。いくつかの実施態様では、Ｆａｂ及び短いペプチドは、相補的又は相乗的な治療活性を示す。
いくつかの実施態様では、細胞傷害性剤は、例えば既知のタンパク質カップリング剤を使用して、本発明のコンジュゲートの抗原結合ポリペプチド（又は、存在する場合、１つ又は複数の短いペプチド）の１つ又は複数に結合される。タンパク質カップリング剤の例としては、限定されないが、Ｎ－サクシニミジル－３－（２－ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（アジプイミド酸ジメチルＨＣＬなど）、活性エステル（スベリン酸ジサクシニミジルなど）、アルデヒド（グルタレルデヒド（ｇｌｕｔａｒｅｌｄｅｈｙｄｅ）など）、ビス－アジド化合物（ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス－ジアゾニウム誘導体（ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トルエン２，６－ジイソシアネートなど）、及びビス－活性フッ素化合物（１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼンなど）が挙げられる。一実施態様では、炭素－１４－標識１－イソチオシアナトベンジル－３－メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗原結合ポリペプチドへのコンジュゲーションのための例示的キレート剤である。例えば、国際公開第９４／１１０２６号を参照されたい。
特定の実施態様では、細胞傷害性剤は、カリケアマイシン、メイタンシノイド、ドラスタチン、オーロスタチン、トリコテセン、及びＣＣ１０６５、並びに毒素活性を有するこれらの毒素の誘導体からなる群から選択される。本発明のコンジュゲートに使用できる他の抗腫瘍剤には、ＢＣＮＵ、ストレプトゾトシン、ビンクリスチン、及び５－フルオロウラシル、米国特許第５，０５３，３９４号及び第５，７７０，７１０号に記載されるＬＬ－Ｅ３３２８８複合体として知られている薬剤のファミリー、並びにエスペラミシン（米国特許第５，８７７，２９６号）が含まれる。
いくつかの実施態様では、治療剤はヌクレオチド、例えばｓｉＲＮＡ、干渉ＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アプタマー、又はリボザイムである。
ａ．診断剤の送達
本発明のコンジュゲート（例えば、ペプチド－ＮＬＰコンジュゲート、ペプチド－ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲート、及び／又はＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲート）は、例えば、診断又は基礎研究における使用のための、疾患の進行及び／又は治療剤の有効性を監視するための、患者の特定の亜集団、例えば治療剤に反応する可能性が高い患者などを同定するための、検出可能な薬剤を含む。
検出可能な薬剤は、一般に標識から発せられるシグナルを介して、薬剤が送達された細胞又は組織に局在するものとして視覚化又は検出できる標識である。シグナルは、例えば、放射能、蛍光、化学発光、酵素反応の結果としての化合物の生成などであり得る。本発明のコンジュゲートと共に使用するための検出可能な薬剤の例には、限定されないが、放射性同位体、フルオロフォア、化学発光色素、発色団、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、色素、金属イオン、ナノ粒子、金属ゾル、配位子（ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ハプテンなど）などが挙げられる。いくつかの実施態様では、放射性原子は、シンチグラフィー研究などの検出可能な薬剤として使用される。放射性原子の例には、例えば、ｔｃ９９ｍ又はＩ１２３が含まれる。いくつかの実施態様では、スピン標識は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージング又は磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）などのための検出可能な薬剤として使用され、その例には、再びヨウ素－１２３、ヨウ素－１３１、インジウム－１１１、フッ素－１９、炭素－１３、窒素－１５、酸素－１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄が含まれる。
いくつかの実施態様では、検出可能な薬剤はフルオロフォアである。「フルオロフォア」という用語は、検出可能な画像において蛍光を示すことができる物質又はその部分を指す。例えば、いくつかの実施態様では、膜脂質は、蛍光標識された、（１－オレオイル－２－［１２－［（７－ニトロ－２－１，３－ベンゾキサジアゾール－４－イル）アミノ］ドデカノイル］－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）などであり得る。当業者は、そのような実施態様において、検出可能な薬剤からのシグナルが、ＮＬＰコンジュゲートを組み立てる際に使用される蛍光標識脂質の量によって増強され得ることを認識するであろう。
検出可能な薬剤は、上記のように、又は当技術分野で知られている他の方法でコンジュゲートに組み込むことができる。例えば、抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）は、例えば、水素の代わりにフッ素－１９を含むアミノ酸前駆体を使用する化学的アミノ酸合成によって生合成又は合成され得る。ｔｃ９９ｍ、１２３Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、及び１１１Ｉｎなどの検出可能な試薬は、ペプチドのシステイン残基を介して結合することができる。イットリウム－９０はリジン残基を介して結合することができる。ＩＯＤＯＧＥＮ法（Ｆｒａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．８０：４９－５７（１９７８））を、ヨウ素－１２３を取り込むために使用することができる。「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ」（Ｃｈａｔａｌ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９８９）には、他の方法が詳細に記載されている。追加的又は代替的に、そのような改変は、コンジュゲートが短いペプチドを含む短いペプチドに対して行うことができる。
ｃ．血液脳関門を通過する送達
本発明の別の態様は、例えば神経疾患の治療において、生物学的活性剤又は検出可能な薬剤を脳又は中枢神経系に送達する方法に関する。脳と中枢神経系を標的とする治療法は、特定の課題に直面しており、特に血液脳関門（ＢＢＢ）は分子輸送を制御しており、薬物が脳実質に到達するのを妨げる可能性がある。したがって、ＢＢＢを通過する薬物の能力は、脳疾患の薬理学的治療において最も重要である（Ｄａｌ Ｍａｒｇｏ，ｅｔ ａｌ．，“Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｒｏｎａ ｅｎａｂｌｅｓ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｒａｉｎ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ”Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１４（２０１８）４２９－４３８）。
いくつかの実施態様では、本発明は、生物学的活性剤又は検出可能な薬剤を脳又は中枢神経系に送達するためのコンジュゲート、薬学的組成物、製剤、方法、システム及びキットを提供する。一般に、本発明のコンジュゲートは、例えば静脈内経路によって個体に全身投与され、コンジュゲートが循環し、最終的にＢＢＢを移動させる。例えば、薬学的に許容されるビヒクル及び抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ又はＦａｂ様分子）、ナノリポタンパク質粒子、及び生物学的活性剤又は検出可能な薬剤のコンジュゲートを含む液体製剤を使用することができる。いくつかの実施態様では、コンジュゲートは、短いペプチド（例えば、ＣＫＰ又はＣＫＰバリアントをさらに含む。製剤は、静脈内注射、又は他の適切な全身若しくは局所経路によって投与され得る。
脳／ＣＮＳ送達のために、コンジュゲートのナノリポタンパク質は、ＢＢＢを通過するコンジュゲートの移動を可能にする足場タンパク質を含む。いくつかの実施態様では、足場タンパク質は、アポリポタンパク質、特に、ａｐｏＥ４、ａｐｏＥ２、いずれかの切断型、又はａｐｏＥ２、ａｐｏＥ２の切断型、ａｐｏＥ４、及びａｐｏＥ４の切断型のうちの１つ若しくは複数の組み合わせである。例えば、ＡｐｏＥは、ＢＢＢを通過するナノ粒子結合薬物の送達において重要な役割を果たすことが示されている（Ｄａｌ Ｍａｒｇｏ，ｅｔ ａｌ．，“Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｒｏｎａ ｅｎａｂｌｅｓ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｒａｉｎ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ”Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１４（２０１８）４２９－４３８）。いくつかの実施態様では、薬学的組成物は、界面活性剤、例えば、ポリソルベート８０をさらに含む。コンジュゲートは、本発明のコンジュゲートに結合していない場合（例えば、ＮＬＰ－Ｆａｂコンジュゲート又はＮＬＰ－Ｆａｂ－短いペプチドコンジュゲートと結合していない／共有結合していない場合）と比較して、ＢＢＢを通過する移動の増加、及び脳又は中枢神経系への生物学的活性剤又は検出可能な薬剤の送達の増加（例えば、有意に増加する）を示し得る。
本発明に従って治療することができる神経疾患には、中枢及び末梢神経系の任意の疾患が含まれる。非限定的な例には、脳、脊髄、脳神経、末梢神経、神経根、自律神経系、神経筋接合部、及び筋肉の疾患が含まれる。特定の実施態様では、本発明のコンジュゲートは、脳及び中枢神経系の神経疾患の治療に使用することができる。特定の例では、本発明のコンジュゲートは、例えば、アルツハイマー病、その他の認知症、脳腫瘍、脳血管疾患、てんかん、片頭痛、その他の頭痛障害、多発性硬化症、神経感染症、栄養失調による神経障害、パーキンソン病、脳卒中、頭部外傷による神経系の外傷性障害などの治療に使用されることが見出される。
ＶＩＩＩ．システム及びキット
本発明の別の態様は、本明細書に記載のプロセス又は使用方法の１つ又複数の実行を容易にするように設計されたシステム及びキットなどのシステム及び／又はキットに関する。一般に、システム又はキットは、本発明のコンジュゲート（例えば、ペプチド－ＮＬＰコンジュゲート、ペプチド－ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲート、及び／又はＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲート）、薬学的組成物、又は製剤、及び／又は関連成分を含み、コンジュゲート、組成物、及び成分は、異なるコンパートメント又は容器内に提供される。適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル（例えば、デュアルチャンバーバイアル）、注射器（デュアルチャンバー注射器など）及び試験管が含まれる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。コンパートメントは、例えば、所与の容器内に別個の異なる成分を保持するための、容器内の区画を指し、容器と同じ材料で構成されていても、異なる材料で構成されていてもよい。
いくつかの実施態様では、膜形成脂質、足場タンパク質、抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）、及びいくつかの実施態様では、ペプチドコンジュゲートＣ４－２８脂肪酸アシルが、本発明のコンジュゲートを調製するための説明書と共に、キットの１つ又は複数の異なるコンパートメント又は容器内に提供される。説明書は添付文書に含まれていてもよい。添付文書はまた、例えば、治療、予防、又は診断適応症における使用のための、本発明のコンジュゲートに関する適応症、使用法、投与量、投与、併用療法、禁忌、及び／又は警告についての情報を含み得る。
いくつかの実施態様では、ＮＬＰ及び抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）、並びにいくつかの実施態様では、ペプチドコンジュゲートＣ４－２８脂肪酸アシルは、キットの別個のコンパートメント又は容器内に提供される。いくつかの実施態様では、キットは、本明細書に記載されるように、薬学的組成物を調製するために、キットの別個のコンパートメント又は容器内に、ペプチド－ＮＬＰコンジュゲート、ペプチド－ＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲート、及び／又はＮＬＰ－ポリペプチドコンジュゲート並びに薬学的に許容される担体を提供する。例えば、キットは、コンジュゲートの低粘度製剤を作製するため、例えば、少量で高濃度のコンジュゲートの皮下又は眼球送達のための説明書を含み得る。いくつかの実施態様では、コンジュゲートは、追加の治療剤又は検出可能な薬剤（標識）をさらに含み、又は、キットは、追加の治療剤及び／又は検出可能な薬剤（標識）を、１つ又は複数のさらなるコンパートメント又は容器内に、任意でコンジュゲートと共に使用するための説明書と共に提供する。
いくつかの実施態様では、本発明のコンジュゲートは、キット中の凍結乾燥製剤で提供され、場合によって、材料を再構成するための説明書及び／又は使用ための説明書を含む。例えば、容器は凍結乾燥製剤を保持することができ、再構成及び／又は使用の指示を示すラベルを容器上に、又は容器に関連させてもよい。ラベルは、上記のように、凍結乾燥製剤がコンジュゲート濃度に再構成されることを示し得る。ラベルは、製剤が、皮下又は眼球投与に有用であるか、又は意図していることをさらに示し得る。製剤を保持する容器は、再構成製剤の反復投与（例えば、２～６回の投与）を可能にする多目的バイアルであり得る。キットは、適切な希釈剤（例えば、ＢＷＦＩ）を含む第２の容器又はコンパートメントをさらに含み得る。キットは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、注射器、及び使用に関する説明を有する添付文書を含む、商業的観点及び使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含み得る。
ＩＸ．ナノ粒子の表面に結合した短いペプチドの生物学的活性を増加させる方法。
脂質ベースのナノ粒子の表面に結合した短いペプチド（例えば、長さが２０～６０アミノ酸のペプチド）の活性（例えば、生物学的活性）を増加させる方法もまた、本明細書において提供される。いくつかの実施態様では、方法は、ナノ粒子の表面に結合した（例えば、共有結合した）短いペプチドを含む脂質ベースのナノ粒子を提供することを含み、ここで、ナノ粒子の１つ又は複数の脂質は官能化基を提示し、ナノ粒子を、官能基を有するポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）に、前記官能化基の前記官能基へのコンジュゲーションを促進する条件下で接触させる。いくつかの実施態様では、方法は、脂質ベースのナノ粒子、短いペプチド、及びポリペプチドを含むコンジュゲートを精製することをさらに含む。いくつかの実施態様では、ナノ粒子はリポソームである。いくつかの実施態様では、ナノ粒子は脂質二重層を含む。いくつかの実施態様では、脂質ベースのナノ粒子は固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）である。いくつかの実施態様では、脂質ベースのナノ粒子は、ナノ構造脂質担体（ＮＬＣ）である。いくつかの実施態様では、スペーサーは前記官能化基を脂質ベースのナノ粒子の表面上の脂質に接続する。いくつかの実施態様では、スペーサーは、前記相補的官能基を前記ポリペプチドに接続する。ポリペプチドを脂質にコンジュゲートするための例示的な官能化基及び相補的官能基は、本明細書の別の箇所で詳細に記載されている。いくつかの実施態様では、ポリペプチドは抗原結合ポリペプチドである。脂質二重層を含むリポソーム又はナノ粒子中の脂質へのコンジュゲーションのための例示的な抗原結合ポリペプチドは、本明細書の別の箇所で詳細に説明されている。いくつかの実施態様では、ペプチドはＣＫＰである。いくつかの実施態様では、ペプチドはＣＫＰバリアントである。いくつかの実施態様では、ナノ粒子へのポリペプチドのコンジュゲーションは、ポリペプチドを含まない脂質ベースのナノ粒子上の短いペプチドの活性（例えば、生物学的活性）と比較して、約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、又は１５０倍のいずれか１つだけ、短いペプチドの活性（例えば生物学的活性）を増加させる。
例えば本明細書に開示された全ての参考文献、刊行物、及び特許出願は、それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
以下は、本発明の方法及び組成物の例である。上に提供された一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施され得ることが理解される。
実施例１：ＮＬＰ－Ｆａｂコンジュゲートの製造
材料
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）及びＤＯＰＥ－ＭＣＣは、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）から購入した。ヒト血清、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ ＮＨＳ Ｅｓｔｅｒ（ＡＦ４８８）は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から入手した。他の全ての試薬は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に注文した。
ａｐｏＥ４２２ｋ及びＦａｂのタンパク質発現と精製
ＡｐｏＥ４２２ｋは、確立された発現プラスミドと方法を使用して、振とうフラスコ条件下で大腸菌細胞内で生成された（４６、４７）。収集後、細胞を破裂させ、スピンダウンし、上清を回収した。ＡｐｏＥ４２２ｋは、Ｎｉ－ＮＴＡカラム（ＸＫ１６／２０ ３ｍｌ）、続いてＳＥＣ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １６／６０）で精製した。Ｎｉ－ＮＴＡ精製のために、カラムを洗浄し、５０ｍＭリン酸緩衝液、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８（緩衝液Ａ）でタンパク質を結合させた。タンパク質を緩衝液Ａ＋０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１１４＋０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００でよく（２０カラム容量）洗浄し、５０ｍＭリン酸緩衝液、２００ｍＭ ＮａＣｌ、４００ｍＭイミダゾール、ｐＨ８で溶出した。プールされた画分を濾過し、３ｋＤａ分子量カットオフスピン濃縮器で濃縮した。次に、Ｔｏｂａｃｃｏ Ｅｔｃｈ Ｖｉｒｕｓ Ｎｕｃｌｅａｒ－ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ－ａ ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ（ＴＥＶ ｐｒｏｔｅａｓｅ）消化によってＨｉｓタグを除去した（ＴＥＶタグは、Ｈｉｓタグとタンパク質配列の間のＮ末端に追加された）。精製タンパク質にＴＥＶプロテアーゼをタンパク質重量対ＴＥＶ重量比が１００対１になるように添加した。反応混合物をＮｉ－ＮＴＡカラム（ＸＫ １６／２０ ３ｍｌ）に通すことにより、切断されたタンパク質を、Ｈｉｓタグを含むＴＥＶプロテアーゼから精製した。プールされたタンパク質を濃縮し、ＰＢＳ中でＳＥＣ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １６／６０）にかけた。ＳＥＣ画分を収集し、質量分析法を使用して同一性について分析し、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって凝集について分析した。正しい分子量（ＭＷ）を有し、凝集体レベルが５％未満の画分をプールし、タンパク質濃度を２８０での吸光度によって決定した。
この実験では、ＮＬＰとの部位特異的なコンジュゲーションを可能にするために、Ｃ末端システインを有するＦａｂ構築物（簡単にするためにＦａｂと呼ぶ）を設計した。Ｆａｂコンジュゲーション及びＦａｂ－ＮＬＰ安定性に対するコンジュゲーションの効果を評価する実験は、無関係なサイトゾル抗原（ｃＭＥＴ）に特異的な、種が一致した非標的指向化ウサギＦａｂを使用して行った。ウサギＦａｂの発現及び精製は、以前に記載されたように行った（４７、４８）。ＮＬＰプラットフォームへのコンジュゲーション後のＦａｂ活性を評価する実験は、以前に記載されたように精製されたヒト抗ＯＸ４０ Ｆａｂ及びヒト抗Ｄ因子（ＡＦＤ）Ｆａｂを用いて行った（４５）。精製された全てのＦａｂは、２０ｍＭ ＤＴＴを使用して脱システイン化され、システインコンジュゲートを還元し、６．５ｍＭグルタチオン（ＧＳＨ）で再酸化された。次いで、試料を緩衝液交換し、洗浄し、さらなるシステイン化を制限するために、２００ｍＭのコハク酸アルギニン（ｐＨ５）中で保存した。
ＮＬＰの組み立て
ＮＬＰは、以前に報告された手順（２０）に従って組み立てられた。全てのＮＬＰ組み立てについて、ａｐｏＥ４２２ｋに対する総脂質のモル比は８０：１であり、これは比較的均一なＮＬＰ集団をもたらすことが以前に示されていた（１６、１９、３１、４６）。ＮＬＰは、結果のセクションで説明したように、ＤＯＰＣとＤＯＰＥ－ＭＣＣ脂質の組み合わせで組み立てられた。これらの脂質は、クロロホルム中で調製又は取得され、ガラスバイアルに等分された。次いで、クロロホルムを撹拌しながらＮ２の気流を使用して除去し、薄い脂質フィルムを形成させた。脂質は、８０ｍＭコール酸ナトリウムを使用して、ＰＢＳ緩衝液（１３７ｍＭ塩化ナトリウム、２．７ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）又は５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌのいずれかに可溶化した。ａｐｏＥ４２２ｋ（最終の組み立て体積で１５０μＭ）を添加した後、試料を２２℃で少なくとも１時間インキュベートした。コール酸を除去するために、５００μＬのｃｏｓｔａｒ ０．２２スピンフィルターで揺動させながら、試料を界面活性剤除去バイオビーズ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に２時間インキュベートした。２時間揺動させた後、試料を２００ｇで５分間遠心分離し、ＮＬＰを含む濾液を収集した。その後Ｆａｂコンジュゲーションに使用されない試料は、ＡＫＴＡ ＡｖａｎｔシステムとＳ２００ １０／３００ Ｉｎｃｒｅａｓｅカラムを使用してＳＥＣで精製した。対照的に、Ｆａｂにコンジュゲートさせようとした試料は、この段階では精製されず、以下に記載するようにすぐにコンジュゲートさせた。
Ｆａｂ－ＮＬＰコンジュゲーションと精製
上記の透析工程の後、ＤＯＰＥ－ＭＣＣを含むＮＬＰ中のａｐｏＥ４２２ｋ濃度を測定し、ＮＬＰを５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中、Ｆａｂ：ＮＬＰのモル比０～６０でＦａｂと共にインキュベートした。コンジュゲーションは、マレイミドの加水分解を制限するためにＮＬＰが組み立てられた同じ日に行われた。試料をロッカーの上に置き、２～４時間インキュベートした。２～４時間の反応インキュベーション期間の後、ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）をＤＯＰＥ－ＭＣＣに対して２倍モル過剰で添加して、未反応のマレイミドをクエンチした。得られたＦａｂ－ＮＬＰコンジュゲートは、ＡＫＴＡ ＡｖａｎｔシステムとＳ２００ １０／３００ Ｉｎｃｒｅａｓｅカラムを使用して精製された。Ｆａｂ－ＮＬＰピークを横切る各画分を、以下に説明するようにＳＥＣ－ＭＡＬＳによって分析し、ＭＷ及び流体力学的半径（Ｒｈ）分析に基づいて画分をプールして、均一なＦａｂ－ＮＬＰ試料を得た。
実施例１の結果と考察
Ｆａｂ－ＮＬＰコンジュゲーション条件の最適化
この研究は、ＮＬＰをＦａｂ送達ビヒクルとして利用することの適合性を確立した。図１Ａは、Ｆａｂ－ＮＬＰコンジュゲートを生成するために開発された戦略の概略図を示している。大まかに言えば、このアプローチには、直交反応基を含むＦａｂ分子とコンジュゲーションさせるために、二重層形成脂質（ヘルパー脂質）と官能化脂質（官能化頭部基を持つ脂質）でＮＬＰを組み立てることが含まれる。これらの実験では、ＤＭＰＣを含むＮＬＰよりも安定した粒子を形成することが以前に示されていたため、ＤＯＰＣがヘルパー脂質として選択された（２０）。
ＦａｂをＮＬＰにコンジュゲートするための適切な官能化脂質を選択する際の重要な考慮事項は、ａｐｏＥ４２２ｋ足場タンパク質に存在する天然の官能基（アミノ基やカルボキシル基など）との反応性を避けるための化学選択的反応対の選択であった。ａｐｏＥ４２２ｋタンパク質にはシステイン（チオール反応基）が含まれていないため、Ｆａｂコンジュゲーションのためにマレイミド頭部基を含む脂質、ＤＯＰＥ－ＭＣＣを使用するチオール－マレイミド化学を選択した。Ｆａｂの部位特異的コンジュゲーションは、全長ＩｇＧの鎖間ヒンジジスルフィド結合に通常関与する残基であるＣｙｓ－２２７をＦａｂのＣ末端残基として保持することによって実現された（実施例では簡単にするためにＦａｂと呼ばれる）。得られたＦａｂは、遊離の反応性チオールを有するこの対になっていないＣｙｓを含んでいた（４８）。この戦略により、ＮＬＰ表面を装飾するマレイミド反応性基を備えたＮＬＰの組み立てが可能になり、続いてチオール反応性Ｆａｂへの部位特異的コンジュゲーションが可能になった（図１Ａ）。
実施例２：ＮＬＰ－Ｆａｂコンジュゲートの分析
ＮＬＰ及びＦａｂ－ＮＬＰコンジュゲートのＳＥＣ－ＭＡＬＳ／ＱＥＬＳ分析
ＭＷ及びＲｈは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）のアイソクラティック勾配（追加の１５０ｍＭ ＮａＣｌスパイクを含む）で、多角度光散乱システム（ＭＡＬＳ）（Ｗｙａｔｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に結合された、Ａｃｃｌａｉｍ ＳＥＣ－１０００分析用ＳＥＣカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して決定した。さらに、拡散係数（Ｄ）は、準弾性光散乱（ＱＥＬＳ）を使用して測定され、ここでは、９９．０°の角度で検出する単一光子計数モジュールを使用して、散乱されたレーザー光の強度の変動が捕捉された。球形を仮定して、ストークス－アインシュタインの関係を使用して、ＤからＲｈを計算した。
ＮＬＰ及びＦａｂ－ＮＬＰコンジュゲートのＬＣＭＳ分析
ＮＬＰ及びＮＬＰ－ＦａｂコンジュゲートのＬＣＭＳ分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ ６２３０ ＥＳＩ－ＴＯＦＬＣ／ＭＳを使用して行った。８０℃に加熱したＫｉｎｅｔｅｘ ２．６μｍ ＸＢ－Ｃ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を使用して、注入されたＮＬＰ試料を分析した。溶媒は、３０％メタノールと７０％水との混合物から１００％ ２－プロパノールまでの勾配として流した。全ての溶媒には０．０５％のトリフルオロ酢酸が含まれていた。ＡｐｏＥ４２２ｋとＦａｂを単独で注入し、ベースライン質量を提供した。
ＮＬＰ、Ｆａｂ－ＮＬＰ、及びＦａｂ負荷のＨＰＬＣ分析
Ｆａｂ－ＮＬＰコンジュゲート中のＡｐｏＥ４２２ｋ及びＦａｂの濃度は、ＨＰＬＣ分析及び２８０ｎｍでの吸光度の組み合わせを使用して分析した。ａｐｏＥ４２２ｋ濃度は、ＬＣＭＳ分析で前述したのと同じカラムと勾配を使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏ－ｉｎｅｒｔ ＨＰＬＣで測定した。ＮＬＰ－Ｆａｂコンジュゲートの試料のＡ２８０ ＨＰＬＣ クロマトグラムを図７Ａに示す。ａｐｏＥ４２２ｋ（４．９５分）及びＤＯＰＥ－ＭＣＣにコンジュゲートしたＦａｂ（約５．１５分）に対応する２つのピークが観察された。ａｐｏＥ４２２ｋ濃度は、１～８μｇのａｐｏＥ４２２ｋを注入し、曲線下の面積を積分することによって生成された標準曲線に基づいて決定された（図７Ｂ）。Ｆａｂ－ＤＯＰＥ－ＭＣＣ試薬の生成には、主に脂質とタンパク質の不適合な溶解性に起因する課題があることを考慮し、以下の式を用いたＨＰＬＣ標準曲線ではなく、ａｐｏＥ４２２ｋ濃度とＡ２８０総吸光度を使用して、Ｆａｂ－ＤＯＰＥ－ＭＣＣコンジュゲートを定量化した。
［Ｆａｂ］＝（Ａｂｓ２８０－［ａｐｏＥ４２２ｋ］・εａｐｏＥ４２２ｋ）／εＦａｂ
ここで、［Ｆａｂ］、Ａｂｓ２８０、［ａｐｏＥ４２２ｋ］、εａｐｏＥ４２２ｋ及びεＦａｂはそれぞれ、Ｆａｂ濃度、２８０ｎｍでの吸光度、ＨＰＬＣ分析によって決定されたａｐｏＥ４２２ｋ濃度、ａｐｏＥ４２２ｋの吸光係数、及びＦａｂの吸光係数である。
実施例２の結果と考察
Ｆａｂ－ＮＬＰコンジュゲーション条件のさらなる最適化
マレイミドチオール反応性を組み込むことの影響を評価するために、ＮＬＰの組み立てに対するＤＯＰＥ－ＭＣＣの効果を評価した。ＮＬＰは、ＰＢＳ ｐＨ７．４で様々なＤＯＰＥ－ＭＣＣ濃度（０、１０、２０、３０ｍｏｌ％）で組み立てられ、ＳＥＣ－ＭＡＬＳ／ＱＥＬＳによって分析された（図１Ｂ及び８Ａ）。様々なＤＯＰＥ－ＭＣＣ濃度で得られたＳＥＣクロマトグラム（図８Ａ）と、測定されたＭＷ及びＲｈ（図１Ｂ；黒い点のＭＷ、灰色の四角のＲｈ）は、全てほぼ同じ結果をもたらし、機能性脂質が全体的なＮＬＰの形状とサイズに大きな影響を与えなかったことを示している。しかし、ＬＣＭＳによるさらなる分析により、ネイティブ分析では捉えられなかった生成物の複雑さが明らかになった（図１Ｃ－１Ｄ）。約４．９分の溶出時間で単一のＴＩＣピークがａｐｏＥ４２２ｋ単独で観察されたのに対し（図１Ｃの丸）、デコンボリューションされた質量（約２２ｋＤａ）（図１Ｄの丸）は、ａｐｏＥ４２２ｋの予想される質量と一致しており、ＰＢＳ ｐＨ７．４で組み立てられたＮＬＰでは、優勢なａｐｏＥ４２２２ｋピークは観察されなかった。代わりに、４．８～６．５分（図１Ｃの直線）の範囲の保持時間を持つ複数のＴＩＣピークが、全てのＭＣＣ濃度で存在しており（データ非表示）、ここで、デコンボリューション時に約２３ｋＤａ、２４ｋＤａ、及び２５ｋＤａの３つの主要なピークのパターンが観察された（図１Ｄの平らな線）。
興味深いことに、これらの質量増加はＤＯＰＥ－ＭＣＣ脂質の分子量（９６０ｋＤａ）に対応しており、ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液中での組み立てと精製プロセス中において、ＤＯＰＥ－ＭＣＣがａｐｏＥ４２２ｋ足場タンパク質にコンジュゲートし脂質化したこと、２３ｋＤａ、２４ｋＤａ、２５ｋＤａはそれぞれ１、２、３つの脂質にコンジュゲートしたａｐｏＥ４２２ｋに対応していることが示唆された。チオールに対するマレイミドの反応性はｐＨ６．５～７．５で高度に特異的であるが、アルカリ性のｐＨ値ではタンパク質のアミノ基と反応するとの報告もある（５０）。露出したリジン残基に近接した高濃度のマレイミドと、この段階でスルフヒドリルが存在しないことは、以前に観察されたように、この副反応が進行する機会を増加させる（５１）。この問題に対処するために、反応はｐＨ６．０で行われた。これらの条件は、マレイミド－チオール化学にはあまり最適ではなく、Ｆａｂコンジュゲーションのための長時間の反応時間を必要とするが、プロトン化されていない求核性アミンの可能性を低減する。ｐＨ６．０での組み立ては、ｐＨ値が高いほど速く起こり、不可逆的で非反応性のマレイン酸になるマレイミドの加水分解を最小限に抑えるのにも役立つ場合がある（５２）。したがって、ＮＬＰは、ｐＨ６．０の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中の２０ｍｏｌ％ ＤＯＰＥ－ＭＣＣで組み立てられ、ＳＥＣ精製後にＬＣＭＳによって分析された。これらの組み立て条件を使用すると、ＬＣクロマトグラム（図１Ｃの三角）には単一のピークのみが観察され、このピークはａｐｏＥ４２２ｋの予想質量（約２２ｋＤａ）にデコンボリューションされた（図１Ｄの三角）。これらの組み合わせた知見は、ＤＯＰＥ－ＭＣＣ脂質がａｐｏＥ４２２ｋ上の露出したリジンにコンジュゲートしていたことを強く示唆している。
興味深いことに、有意なアポＥ４２２ｋ－ＤＯＰＥ－ＭＣＣコンジュゲーションが検出されたどの組み立てにおいても凝集は存在しなかった（図８Ａ）。このことは、架橋が粒子間ではなく、粒子内のイベントであることを示唆している。ａｐｏＥ４２２ｋ－ＤＯＰＥ－ＭＣＣコンジュゲーションがＮＬＰの凝集に及ぼす影響をさらに評価するために、同じ組成のＮＬＰ（２０ｍｏｌ％ ＤＯＰＥ－ＭＣＣ）をｐＨ７．４及び６．０で調製し、ＳＥＣ－ＭＡＬＳで分析した。以前の観察結果に沿って、ｐＨ７．４で調製した試料の広範なａｐｏＥ４２２ｋ脂質化にもかかわらず、両方の試料のＭＷとＲｈは同一であった（図８Ｂ）。これらのデータは、ＤＯＰＥ－ＭＣＣ：ａｐｏＥ４２２ｋコンジュゲーションが粒子間架橋ではなく粒子内架橋をもたらすというさらなる証拠を提供する。
足場タンパク質と脂質コアとの界面に存在するリジン残基は、ｐＨ７．４で脱プロトン化され、隣接するマレイミドと反応できるようになるｐＫａのシフトを経験すると仮定する。ａｐｏＥ４２２ｋタンパク質の８つのリジンのうち、７つは脂質二重層を包むヘリックスドメイン上に位置し（５３）、脂質二重層中のＤＯＰＥ－ＭＣＣに容易にアクセス可能である。さらに、疎水性環境におけるリジン側鎖のｐＫａの減少は、タンパク質やＤＯＰＣ二重膜に埋もれたリジン残基で以前に報告されている（５４、５５）。これらの研究では、水にアクセスできないリジン残基は、通常のｐＫａ≧１０を下回り、それぞれ５．２及び６という低いｐＫａ値まで低下させたことが示された。ＮＬＰ脂質二重層に面しているリジン残基のみのｐＫａ値の選択的な減少は、その求核性アミンが近くのＮＬＰの頭部基と相互作用できない可能性が高いため、観察された分子間凝集体の欠如を説明する可能性がある。ＤＯＰＥ－ＭＣＣによるａｐｏＥ４２２Ｋ脂質化の検出は、新しい治療薬送達プラットフォームを評価するために、ＬＣＭＳなどの高度な分析技術を使用することの重要性を強調している。プロセスに関連する不純物を早期に検出し、プラットフォームの懸念事項を特定することで、新規プラットフォーム技術の開発を成功させることができる。この架橋イベントは、従来の分析用ＳＥＣ法を使用して検出されなかった。この副産物が安定性や活性に意味のある違いをもたらすかどうかは不明であるが、変動性を制御することはできず、そうでなければ製造上の困難を引き起こす可能性がある。
Ｆａｂ－ＮＬＰコンジュゲートの精製とＦａｂ負荷
ＤＯＰＥ－ＭＣＣ：ａｐｏＥ４２２ｋ架橋が最小限から全くなく、比較的均一なＮＬＰ集団であるという組み立て条件が確立されると、Ｆａｂ－ＮＬＰコンジュゲーション法はさらに最適化された。無関係な細胞質ゾル標的（ｃＭＥＴ）に特異的なウサギＦａｂ分子を、これらの実験のサロゲート試薬として使用した。Ｆａｂ－ＮＬＰコンジュゲートの製造と精製は、ＮＬＰの組み立てとコンジュゲーションの連続した工程を使用して、ＮＬＰの精製工程なしで、ＮＬＰからのバイオビーズベースのコール酸除去の直後にＦａｂの添加が行われた。このプロトコルは、コンジュゲーション前のマレイミド加水分解の可能性を最小限に抑えるために選択された。２０～３５ｍｏｌ％の範囲の機能性脂質組成物に対する最大結合効率を報告した以前の研究に基づいて、２０ｍｏｌ％のＤＯＰＥ－ＭＣＣをスケールアップ用に選択した（３１）。精製プロトコルは、当初、Ｆａｂ：ＮＬＰモル反応比２０で開発された。ＦａｂをＮＬＰと共に２～３時間インキュベートし、ＮＡＣをＤＯＰＥ－ＭＣＣの２倍モル濃度で添加して、未反応のマレイミドをクエンチし、ＤＯＰＥ－ＭＣＣ：ａｐｏＥ４２２ｋ架橋を防止した。
次に、Ｆａｂ－ＮＬＰをＳ２００ＳＥＣカラムで精製し、ＳＥＣプロファイルにおいて３つの主要なピークが観察された；ＮＬＰ－Ｆａｂコンジュゲート（ｒｔ～１０分）、Ｆａｂ二量体（ｒｔ～１４分）、非コンジュゲートＦａｂ（ｒｔ～１６分）（図２Ａ）。Ｆａｂ二量体の出現は、コンジュゲーション工程の間のＦａｂのＣ末端チオールでのジスルフィド形成による二量体化によって引き起こされた。興味深いことに、出発物質にはＦａｂ二量体が含まれていなかったため（データ非表示）、これはコンジュゲーション工程中に発生したようであり、他のＦａｂ全体で一貫して観察されたわけではなく、この現象を誘発する固有の特性（ローカルＰＩ）が存在する可能性があることを示唆している。いずれにせよ、ＮＬＰへのＦａｂのコンジュゲーションが成功したことを示すことができた。
ＮＬＰピークを横切るＳＥＣ－ＭＡＬＳによる詳細な分析により、プーリング戦略が導かれた（図２Ａの挿入図）。一般に、ＮＬＰピークは比較的対称的であり、Ｒｈ値はピークを横切ってわずかに変化し、ピークの前端（保持時間９～９．５分）で最大の変動（１２．９～１０．５ｎｍ）があり、ピークの中間と終点を横切って（保持時間９．５～１０．２５分）で最小の変動（１０．３～９．６ｎｍ）であった。（図２Ａの挿入図）。したがって、最も均一なＮＬＰ－Ｆａｂ製剤を生成するために、９．５～１０．２５分の試料画分をプールし、ＬＣＭＳ分析に供した。Ｆａｂ単独のＬＣＭＳ分析では、ＴＩＣクロマトグラムに保持時間が約５．４分である単一のピークが得られた（図２Ｂの丸）。このピークのデコンボリューションされた質量は約４５．７ｋＤａであり、これはＦａｂの予想質量に対応している。この保持時間内にＮＬＰ－ＦａｂコンジュゲートプールのＴＩＣクロマトグラムで２つのピークが観察され（図２Ｂの三角）、これらのピークのデコンボリューションされた質量はＤＯＰＥ－ＭＣＣ：Ｆａｂコンジュゲート（約４６．７ｋＤａ）及びａｐｏＥ４２２ｋ（図２Ｃの三角）に対応していた。組み合わせると、これらの結果は、ＦａｂがＤＯＰＥ－ＭＣＣ脂質を介してＮＬＰにうまくコンジュゲートしたことを示唆している。
ＮＬＰプラットフォームのＦａｂ負荷容量をさらに調査するために、ＮＬＰをＦａｂ濃度を増加させながらコンジュゲートさせ、材料と方法で説明されているように、ＮＬＰ当たりのＦａｂの数を精製工程の後に測定した。これらの実験では、Ｆａｂ反応濃度は０～２７０μＭの範囲で変化し、これは０～５０Ｆａｂ／ＮＬＰに相当する。図３Ａに示すように、ＮＬＰピークは、２１６μＭの飽和レベルまで、Ｆａｂ濃度の増加に伴って徐々に増加した。２１６μＭの飽和点までＦａｂ二量体と非コンジュゲートＦａｂピークの緩やかな増加も観察され、その後、より高い濃度（２７０μＭ）で劇的な増加が続き、このことはＮＬＰへのコンジュゲーションが飽和し、２１６μＭを超えて追加された全ての追加試薬がＮＬＰにコンジュゲートしていないことを示している。
各条件下でコンジュゲートされたＦａｂの量は、上記のように定量化された（図３Ｂ）。より低いＦａｂ濃度（０～２００μＭ）では、０～３０Ｆａｂ／ＮＬＰからのＦａｂ負荷の直線的な増加が観察された。ただし、この傾向はより高いＦａｂ濃度（＞２００μＭ）では平坦化し、追加のＦａｂは約３０Ｆａｂ／ＮＬＰを超えてＮＬＰ上に負荷できなかった。公表された結晶構造に基づくと、典型的なＦａｂの断面直径は約４ｎｍ（５６）であり、これは表面積が約１２．６ｎｍ２に相当し、一方、ＳＥＣ－ＱＥＬＳ分析に基づいて、ＮＬＰのＲｈは約７．５ｎｍであると決定され、これは３５０ｎｍ２の総結合表面積に相当し、約３０Ｆａｂ／ＮＬＰとなる。この最大負荷容量は、我々の結果を裏付けており、Ｆａｂ及びＮＬＰ結合表面の寸法を考慮すると、理論上の最大負荷容量と一致している。
ＮＬＰ構造に対するＦａｂ負荷の効果をさらに特徴づけるために、Ｆａｂ負荷の関数としてＦａｂ－ＮＬＰコンジュゲートのＭＷ及びＲｈを測定した。Ｆａｂ－ＮＬＰコンジュゲートピークを横切るＭＡＬＳ分析に基づいて、Ｆａｂ－ＮＬＰコンジュゲートのＭＷは、より高いＦａｂ負荷で増加し、ここで、ＭＷは０個のＦａｂ負荷での約２２５ｋＤａからＦａｂ：ＮＬＰ比３０での約９００ｋＤａまで増加した（図３Ｃ）。興味深いことに、このＭＷの増加は、ＨＰＬＣ分析と比較して約１６Ｆａｂ／ＮＬＰというより低い負荷容量を意味する。この不一致は、計算に影響を与えた可能性のある、遊離Ｆａｂに対するＦａｂ－ＮＬＰコンジュゲートのｄｎ／ｄｃ値の変化に起因し得る。ＨＰＬＣ法が、ａｐｏＥ４２２ｋとＦａｂ濃度の独立した測定値であることを考えると、これらの値はＦａｂの負荷をより正確に反映していると考えられる。
この不一致にもかかわらず、ＭＡＬＳ分析は、予想通り、Ｆａｂ負荷を伴ってＭＷが直線的に増加することを明確に示している。ＭＷ分析とは対照的に、ＲｈはＦａｂ負荷が増加してもあまり変化しなかった（図３Ｄ）。これらの結果は、ＮＬＰの円盤状の性質と一致しており、ＮＬＰの表面積がＦａｂの価数を制御する支配的な要因であることを示している。この現象は、球状タンパク質がＮＬＰにコンジュゲートされた２つの以前の研究で観察されている（２０、３１）。どちらの例でも、Ｈｉｓタグ付きタンパク質はニッケルキレート脂質を含むＮＬＰに結合され、達成された最大負荷は、タンパク質サイズとＮＬＰ表面積に基づく理論上の結合容量と一致する数であった。Ｒｈ分析は球形を仮定していることに注意のこと。これは、これらの推定された円盤状ナノ粒子について完全に正確ではない可能性がある。しかし、溶液中のＮＬＰの形状は動的であり、ＮＬＰは、球状の粒子をより反映する静的な円盤状の形状を超えて、様々な異なるコンフォメーションを採用できることが以前に報告されていた（５７）。したがって、上記のＭＡＬＳ分析にはかなりの自信がある。
実施例３：ＮＬＰ－Ｆａｂコンジュゲートの製造可能性
Ｆａｂ－ＮＬＰコンジュゲートのレオロジー分析
粘度は、Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ Ｐｈｙｓｉｃａ ＭＣＲ ５０１ロータリーレオメーターを使用して、ＣＰ２０－０．５ｏコーンとプレートの構成で測定した。ＣＰ２０－０．５のジオメトリーは、直径２０ｍｍ、角度０．５°である。測定は、レオメーター温度コントローラー（ウォーターバスからの循環流体を備えたペルチェプレート）を使用して２５℃で行われた。各試料約２０μＬを測定用の底板上に負荷した後、コーンをゆっくりと目的のギャップ幅まで下げた。前述のように、測定されたトルクからせん断応力が決定され、そこから粘度が計算された。
ＮＬＰ及びＦａｂ－ＮＬＰコンジュゲートの凍結乾燥
添加物として８０ｍＭのトレハロースを使用して、Ｆａｂ－ＮＬＰコンジュゲートを凍結乾燥した。これは、タンパク質及びリポソーム製剤の両方に一般的に使用される添加物である。これらの実験では、Ｆａｂ－ＮＬＰコンジュゲートをＰＢＳ中で精製した。トレハロースを最終濃度８０ｍＭまで添加した。凍結前のＦａｂ－ＮＬＰタンパク質濃度は２ｍｇ／ｍｌであった。３００μＬのＦａｂ－ＮＬＰ試料を、ドライアイス上で６０分間インキュベートして凍結した。次いで、試料をＬａｂｃｏｎｃｏ凍結乾燥機で一晩凍結乾燥した。凍結乾燥が完了した後、試料を水で再構成し、ＳＥＣで分析した。
実施例３の結果と考察
Ｆａｂ－ＮＬＰ製剤
ナノ粒子－タンパク質コンジュゲートの製造に関する既知の課題は、製造中の製剤化である。特に、タンパク質濃度と粘度の関係は、医薬品製造の重要なパラメーターに大きな影響を与える可能性がある。これは、注入量がそれぞれ１００μｌ（５８）及び１～２ｍｌ（５９，６０）に制限されている眼球送達及び皮下投与など、容量制限のために高濃度の薬物又はタンパク質製剤が必要な場合に特に重要になる。タンパク質濃度が高いと、タンパク質間相互作用により粘度が上昇する可能性があり、これは排除体積が増加するため、他のコンジュゲート部分の存在によって悪化する可能性がある（６１）。したがって、粘度に対するＮＬＰベースの送達の効果を評価するために、ネイキッドＦａｂ、Ｆａｂ－ＮＬＰコンジュゲート、及びＦａｂ－ＰＥＧコンジュゲートの間でＦａｂ濃度と粘度の関係を比較した（４７）（図４Ａ）。これらの実験は、翻訳可能性を改善するために生物学的に活性なヒト抗Ｄ因子Ｆａｂを使用して行われた。Ｆａｂの価数に関してより直接的な比較を可能にするために、市販のＰＥＧ足場を選択した。この足場は、８つのＦａｂ／ＰＥＧのコンジュゲーションを可能にするマレイミド反応性末端を含む８つのＰＥＧアームを有していた。８アームＰＥＧコンジュゲートの生成と特徴づけの詳細は、別の場所で説明されている（４７）。Ｆａｂ－ＮＬＰコンジュゲートの場合、Ｆａｂ負荷は約３０Ｆａｂ／ＮＬＰであり、これはＮＬＰ上のＦａｂ密度を最大化するために選択された。
これらの実験では、Ｆａｂ単独の粘度は、試験した濃度範囲全体で比較的一定のままであった（図４Ａの丸）。対照的に、Ｆａｂ－ＰＥＧコンジュゲートの粘度プロファイルは、Ｆａｂ濃度が８０～１００ｍｇ／ｍｌに達すると、急激に約１０００ｃＰに増加した（図４Ａの三角）。同様のプロファイルがＦａｂ－ＮＬＰコンジュゲートで観察されたが、粘度の指数関数的増加が発生したＦａｂ濃度ははるかに高かった（＞３００ｍｇ／ｍｌ）（図４Ａの四角）。これらの結果は、従来のＰＥＧベースのアプローチと比較して、ＮＬＰプラットフォームを使用すると、はるかに高いＦａｂ製剤濃度を達成できることを示している。ＮＬＰ製剤では、Ｆａｂが製剤全体の質量で約３０％を構成しているのに対し、Ｆａｂ－ＰＥＧコンジュゲートのＦａｂ含有量は質量で約９０％であることを考えると、この結果は驚くべきものであった。この観察された現象の考えられる理由の１つは、ＮＬＰ表面上でのＦａｂの秩序化である。高タンパク質濃度での粘度は、分子内タンパク質相互作用とタンパク質の充填能力によって駆動されるため、ＮＬＰ表面への高密度でのＦａｂのコンジュゲーションが、ＰＥＧ八量体形式では達成できない秩序化を誘導するというのはもっともらしいことである。
高濃度製剤との適合性に加えて、Ｆａｂ－ＮＬＰコンジュゲートは凍結乾燥時に堅牢な挙動を示した。これらの実験では、Ｆａｂ－ＮＬＰコンジュゲートを約１８Ｆａｂ／ＮＬＰのＦａｂ負荷で生成し、濃度５ｍｇ／ｍｌの８０ｍＭトレハロースの存在下で凍結乾燥し、ＳＥＣ－ＭＡＬＳによって分析した。トレハロースが添加物として選択されたのは、赤血球だけでなくリポソームの凍結乾燥にも広く使用されているためである（６２、６３）。図４Ｂに示すように、凍結乾燥前後のＭＷとＲｈはほとんど変化せず、Ｆａｂ－ＮＬＰコンジュゲートが非常に安定しているという考えを支持している。凍結乾燥時の安定性は、保存期間の延長に加えて、確立された製造プロセスとの適合性により、望ましい製剤特性である（６４）。これらの結果は、トレハロースが脂質ベースのナノ粒子製剤の優れた添加物であるという以前の報告と一致しており、Ｆａｂ－ＮＬＰコンジュゲートが凍結乾燥ベースの製剤を必要とする製造プロセスに適合できることを確認している。
実施例４：ＮＬＰ－Ｆａｂコンジュゲートの活性
抗Ｄ因子Ｆａｂブロッキング活性アッセイ
Ｆａｂ－ＮＬＰコンジュゲートの活性は、以前に記載されたように（４７、４９）、Ｂ因子切断ＴＲ－ＦＲＥＴアッセイで決定した。コンジュゲートのモル濃度は、Ｆａｂ阻害Ｄ因子の予想される１：１の化学量論を考慮して、多量体のＭＷの代わりにＦａｂのＭＷを使用して計算した。
抗ＯＸ４０Ｆａｂアゴニスト活性アッセイ
ＯＸ４０アゴニストアッセイは、以前に記載されたように行った（４５）。手短か言えば、ＮＦκＢルシフェラーゼレポーターで操作されたＯＸ４０過剰発現Ｊｕｒｋａｔ細胞を、３８４ウェル組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．，カタログ番号３９８５ＢＣ）において、１０％ＦＢＳを含む２０μｌＲＰＭＩ１６４０培地に８０，０００細胞／ウェルで播種した。抗ＯＸ４０フォーマットを培地で４倍濃度に連続希釈し、１０μｌの濃縮抗体を各ウェルに加えた。全てのウェル容量を４０μｌにし、３７℃、５％ＣＯ２のＣＯ２インキュベーター中で１６～１８時間インキュベートした。次いで、４０μｌのＢｒｉｇｈｔ Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ ｃａｔ＃Ｅ２６１０）を各ウェルに添加し、振盪しながら室温で１０分間インキュベートした。Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーを使用して発光を検出した。
実施例４の結果と考察
Ｆａｂ－ＮＬＰコンジュゲートの阻害活性とアゴニスト活性
ナノ粒子へのタンパク質のコンジュゲーション及び固定化は、場合によってはタンパク質の活性に悪影響を与える可能性がある（６５、６６）。これらの悪影響は、コンジュゲーションによるコンフォメーション変化、運動の自由の喪失、及びタンパク質の変性を含むがこれらに限定されない、様々な要因に起因する可能性がある。Ｆａｂ－ＮＬＰコンジュゲーションについては、部位特異的化学を使用してランダムな方向でのコンジュゲーションを防ぎ、コンジュゲーションハンドルをＦａｂの活性領域（重鎖及び軽鎖の可変ドメイン）の反対端（重鎖のＣ末端領域）に配置することにより、これらの問題を軽減することを目的とした。ただし、これは、ＮＬＰへのＦａｂのコンジュゲーションが活性に影響を与えないことを保証するものではない。したがって、Ｆａｂコンジュゲーションの効果を評価するために、抗Ｄ因子Ｆａｂの阻害活性を、補体Ｄ因子依存性Ｂ因子切断の時間分解蛍光エネルギー移動（ＴＲ－ＦＲＥＴ）アッセイを使用して測定した。最大のＴＲ－ＦＲＥＴシグナルは、Ｂ因子がＤ因子活性の非存在下でインタクトなままである場合に発生する。このアッセイでは、抗Ｄ因子Ｆａｂ単独、Ｆａｂ－ＮＬＰコンジュゲート、及び凍結乾燥して再構成したＦａｂ－ＮＬＰコンジュゲートによるＤ因子阻害を測定した（図５Ａ）。３つの試薬の全てで阻害活性に有意差は観察されず、コンジュゲーションと凍結乾燥による阻害の損失がないことが実証された。これらの知見は、一般に、Ｃ末端システインタグを介したＦａｂのコンジュゲーションが、重鎖及び軽鎖のＣＤＲ領域の活性に有意な影響を及ぼさないことを示している。
コンジュゲーションがＦａｂの阻害活性に及ぼす影響を評価することに加えて、このプラットフォームを使用して、より高い価数によってアゴニストＦａｂ活性を増強する可能性も評価した。ＴＮＦファミリーメンバーを含むいくつかの臨床的に価値のあるアゴニスト経路は、強力な活性のために２を超える価数を必要とする（４１、４２）。ｍＡｂの分野では、トリアボディ、テトラボディ、ペンタボディ、並びに自己組織化６量体ＩｇＧ１の開発など、様々な工学的戦略を使用してこの制限に対処しようと試みてきた（４３～４５）。しかし、これらの工学的戦略はＰＫに悪影響を与えることが報告されており、３～６を超える価数を達成することは困難であり（４３）、目的の経路を刺激する／アンタゴナイズするのに十分ではない可能性がある。
したがって、次に、Ｆａｂ－ＮＬＰコンジュゲートプラットフォームを使用して、より高い価数を必要とすることが知られている経路を刺激する可能性を試験したいと考えた。ＯＸ４０ ＴＮＦファミリー受容体は、アゴニスト活性を誘導するために、より高い価数を必要とすることが報告されている。最近の出版物では、中程度のアゴニスト活性が４価で報告され、非常に強力な活性は１２価の６量体ＩｇＧフォーマットでのみ観察された（４５）。したがって、ＯＸ４０受容体を、アゴニスト活性に対するＦａｂ－ＮＬＰの価数の効果を評価するためのモデル系として使用した。Ｆａｂ－ＮＬＰコンジュゲートは、ＯＸ４０ ＦａｂとＮＬＰのモル比が０～３０の範囲で生成され、アゴニスト活性は、ＯＸ４０を過剰発現するＪｕｒｋａｔＮＦκＢルシフェラーゼレポーターアッセイで測定された（図５Ｂ）。完全長抗ＯＸ４０ ｈｕＩｇＧ１ ｍＡｂ（価数２）を陰性対照として使用した。予想通り、試験した全濃度範囲で、抗ＯＸ４０ ｈｕＩｇＧ又はＮＬＰ単独のいずれについても活性は見られなかった（図５Ｂ－それぞれ三角と十字）。Ｆａｂ－ＮＬＰコンジュゲートについては、Ｆａｂ価数が３．８で低レベルのアゴニスト活性が観察された（図５Ｂ－星）。対照的に、価数が８．３Ｆａｂ／ＮＬＰにまで増加すると非常に強力な活性が観察され（図５Ｂ－四角）、それよりも高い価数では活性のわずかな増加のみが観察された。これらの結果は、強力な効力の最小価数は約８であることを示唆しており、４と１２の価数を持つ分子のアゴニスト活性を比較した前述の研究と一致している（４５）。図５Ｂのデータは、ＮＬＰ濃度ではなくＦａｂ濃度に対して表示されていることに注意のこと。ＮＬＰの濃度に基づいてデータを解析すると、Ｆａｂ／ＮＬＰ複合体の曲線（図５Ｃ）及び対応するＥＣ５０（図５Ｄ）は、Ｆａｂの価数が３．８から２９．４まで増加すると約４分の１に減少することが判明した。これらの知見は、Ｆａｂ－ＮＬＰコンジュゲートの全体的な効力が、価数の増加と共に増加したことを示唆している。結論として、これらの知見は、操作されたｍＡｂプラットフォームを使用することでは達成され得ない、高い価数を必要とする経路を強力に活性化するために、このプラットフォームの使用が成功したことを示している。
実施例５：ＮＬＰ－Ｆａｂコンジュゲートの血清安定性
ＡＦ４８８によるＮＬＰ及びＦａｂ－ＮＬＰの標識化
ＮＬＰ及びＦａｂ－ＮＬＰコンジュゲートは、上記のように生成された。ネイキッドＮＬＰ又はＦａｂ－ＮＬＰコンジュゲートのＳＥＣ精製の前に、試料は、ＮＨＳ－ＡＦ４８８：総タンパク質比５で、ＮＨＳ活性化ＡＦ４８８と２～４時間インキュベートすることにより、遊離リジンを介してＡＦ４８８で標識した。このインキュベーション期間の後、未反応のＮＨＳ－ＡＦ４８８を、反応中の全ＮＨＳ－ＡＦ４８８に対して２倍モル過剰のＴｒｉｓを添加してクエンチした。次に、Ｓ２００ １０／３００Ｉｎｃｒｅａｓｅカラムを使用するＡＫＴＡ ＡｖａｎｔシステムでのＳＥＣにより、未反応のＡＦ４８８からＡＦ４８８標識ＮＬＰを精製した。
５０％血清中のＮＬＰ及びＦａｂ－ＮＬＰコンジュゲートのＳＥＣ分析
ＡＦ４８８標識ＮＬＰ及びＦａｂ－ＮＬＰコンジュゲートを５０％血清を含むＰＢＳ緩衝液中でインキュベートし、ＰＢＳ緩衝液中でのインキュベート後の様々な時点でＳＥＣ（Ａｃｃｌａｉｍ ＳＥＣ １０００，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって分析した。標識されたＮＬＰ試料の吸光度は、血清タンパク質及び成分からの吸光度の干渉を避けるために、４９５ｎｍの波長でモニターされた。６～９分間に観察されたピークはＮＬＰとＮＬＰ－Ｆａｂコンジュゲートに起因し、１０～１３分間のピークはＮＬＰから解離した遊離の非コンジュゲートＦａｂ又はａｐｏＥ４２２ｋに起因していた。試験された様々な時点でのＮＬＰピーク下の面積は、時間０ｈｒのピーク面積に対して正規化され、これらの正規化された値を使用して、ＮＬＰ分解の動力学を決定した。
実施例５の結果と考察
Ｆａｂ－ＮＬＰの血清安定性
ここでのＮＬＰプラットフォームは、複雑な生物学的マトリックスにおいて安定性が低い他のＮＬＰ構造体の報告にもかかわらず（２０、６７、６８）、インビボ送達ビヒクルとして使用することができる。以前のある研究では、３７℃で５０％血清中におけるＤＯＰＣ ＮＬＰの半減期は３～６時間であると報告されており（２０）、これはナノ粒子の全身半減期（２４～４８時間）よりも著しく短い。この制限に対処するために、以前の研究は、架橋可能な脂質成分がＮＬＰ全体の安定性に及ぼす影響を評価し、二重層のコアを架橋することで安定性が著しく向上することを実証した（６８）。より具体的には、１００％血清中では４８時間にわたってＮＬＰの分解は観察されなかったが、架橋の非存在下では非常に急速な分解（約１０分）が観察された（６８）。有望ではあるが、この方法の欠点の１つは、既知の自然な分解又は生体内変換経路を持たない非天然の架橋脂質の添加による安全性のリスクの増加である。
インビボ送達ビヒクルとしての適用におけるＮＬＰ安定性の重要性を考慮して、ＮＬＰ－Ｆａｂコンジュゲートの安定性は、ウサギＦａｂサロゲート分子を使用して、インビボ条件を模倣するように選択された５０％血清中で評価された。ＮＬＰの安定性と完全性を評価するために、Ｆａｂ－ＮＬＰコンジュゲートをＡＦ４８８で標識し、４９５ｎｍの吸光度でＳＥＣによって分析した。この吸光度は、血清／ＮＬＰ－Ｆａｂ試料中の血清タンパク質及び成分の固有の吸光度と重複しない分光測光特性のために選択された。ＮＬＰ単独のＳＥＣトレースの例を図６Ａに示す。インタクトなＮＬＰの保持時間（約８分）は、解離したＮＬＰから放出された遊離ａｐｏＥ４２２ｋとは異なり（それぞれ８分対１１．７５分）、したがって、ＮＬＰの安定性と完全性は、ＳＥＣによって経時的に容易に追跡することができた。注意すべき点は、約６．２５分の保持時間で観察されたマイナーショルダーピークは、血清中の凝集体に起因するものであり、分析のためにバックグラウンド除去された。
安定性に対するＦａｂ負荷の効果を評価するために、様々な量のＦａｂ（０、２、７、１６、及び３２Ｆａｂ／ＮＬＰ）を含むＦａｂ－ＮＬＰコンジュゲートをＡＦ４８８で標識し、５０％血清中３７℃でインキュベートし、０～２４時間の異なる時点でＳＥＣにより分析した。Ｆａｂ－ＮＬＰのＳＥＣピーク面積は、異なるＦａｂ－ＮＬＰコンジュゲート間での比較を可能にするために、時間０ｈのピーク面積に対して正規化された。以前に発表された研究（２０、６７）と一致して、ＮＬＰ単独（図６Ｂの三角）は最初は急速に分解し、３時間後には材料の５０％しか残っていなかったが、残りの２４時間のインキュベーション期間では分解が遅くなった。非常によく似た傾向が、Ｆａｂ：ＮＬＰの負荷密度２のＦａｂ－ＮＬＰコンジュゲートでも観察された（図６Ｂの丸）。しかしながら、Ｆａｂ：ＮＬＰの負荷密度が７に増加すると、ＮＬＰの安定性において著しい改善が観察された（図６Ｂ、四角）。ここでは最初の特徴である安定性の急速な減少は観察されず、代わりにゆっくりとした漸進的な減少が２４時間全体を支配し、５０％血清中３７℃でのインキュベーション後、Ｆａｂ－ＮＬＰの６３％がインタクトなままであった。同様の傾向は、Ｆａｂ：ＮＬＰの負荷密度が１６と３２においても観察され（それぞれ図６Ｂの星とダイヤモンド）、安定性のさらなる増加が検出され、２４時間のインキュベーション期間の終了時に７０％以上のＦａｂ－ＮＬＰコンジュゲートがインタクトなままであった。
Ｆａｂ－ＮＬＰコンジュゲートの安定性の向上は、ＮＬＰ表面へのアクセスが分解に関連しており、コンジュゲートしたＦａｂがＮＬＰを血清タンパク質から保護している可能性があることを示唆している。ＮＬＰの疎水性脂質二重層コアとアルブミンなどの血清タンパク質、並びに天然のＨＤＬ及びＬＤＬ粒子との相互作用は、インビボ又はインビトロ血清条件下でのＮＬＰの分解の主な要因であると考えられている。これらの相互作用は、ＮＬＰを組み立ててインタクトに維持する脂質－脂質及び脂質－アポリポ蛋白質の疎水性ファンデルワールス相互作用を破壊すると考えられている。この仮説は、脂質二重層コア（６８）又はアポリポタンパク質（６９）のいずれかを架橋することで、ＮＬＰの安定性が著しく向上することが示された過去の研究によってさらに支持されている。これらの知見にもかかわらず、ＮＬＰの安定性に対する血清プロテアーゼ活性の影響についてはほとんど知られていない。アポリポタンパク質が血清タンパク質によって切断され、ナノ粒子の分解を引き起こす可能性がある。しかし、ＮＬＰ表面へのＦａｂコンジュゲーション、及び脂質二重層コアとアポリポタンパク質の架橋が安定性を向上させることが示されていることを考えると、ＮＬＰ分解の主な原因は、アポリポタンパク質の血清プロテアーゼ切断ではなく、ファンデルワールス相互作用の破壊であると思われる。驚くべきことに、比較的低いＦａｂ密度７で（これは、約２５％の表面積カバレッジに相当する（Ｆａｂの表面積を約２．２ｎｍ２であると仮定））で安定性の有意な改善が観察された。これらのデータは、最小限の数の表面保護タンパク質で、ＮＬＰの安定性に対して有意な影響を与えるのに十分であることを示唆している。重要なことに、これは非天然の架橋剤を使用せずに達成される。
ＮＬＰをインビボ薬物送達ビヒクルとして使用する際に予想される困難の１つは、血清などの複雑な生物学的マトリックスにおける粒子の全体的な安定性であった。しかし、上記の結果に基づくと、驚くべきことに、この問題は、約７Ｆａｂ：ＮＬＰの閾値よりも高いＦａｂ負荷密度でＦａｂ－ＮＬＰコンジュゲートとして組み立てると軽減されるようである。したがって、Ｆａｂ－ＮＬＰコンジュゲートの送達中に安定性を達成するために、付加的な毒性障害を導入する可能性がある脂質架橋などの修飾は必要ない。
まとめ：
この研究では、Ｆａｂ－ＮＬＰコンジュゲートの開発、最適化、及び特徴づけについて記述する。ＮＬＰは、Ｃ末端システインを有するＦａｂへのコンジュゲーションのためにマレイミド反応性脂質を用いて生成された。マレイミド反応性脂質は、ｐＨ７．４で組み立てられた場合、おそらくリジン残基を介してアポリポタンパク質にコンジュゲートすることが示された。ただし、この望ましくない反応は、ＮＬＰがｐＨ６で組み立てられた場合には観察されなかった。部位特異的なＦａｂコンジュゲーション条件が最適化され、ＮＬＰ当たり最大３０のＦａｂのコンジュゲーションが実証された。興味深いことに、より多くのＦａｂのコンジュゲーションでも、ＮＬＰの流体力学的半径（つまり、ＮＬＰの直径）に対してわずかな影響しか及ぼさず、ＮＬＰ分子量に対しては大きな影響を与え、このことは、粒子サイズがＮＬＰの円盤状の形状によって大きく左右されることを示している。
Ｆａｂ－ＮＬＰの粘度及び凍結乾燥時のその安定性も、Ｆａｂ－ＮＬＰの製造可能性の評価として評価した。すなわち、Ｆａｂ－ＮＬＰプラットフォームと確立された製造プロセスとの適合性は、次の２つの方法：製造中に関連するＦａｂ濃度の範囲にわたって、その粘弾性挙動を別の多量体化技術（Ｆａｂ－ＰＥＧ八量体コンジュゲート）と比較することによって、及び凍結乾燥時の安定性を評価することによって評価された。Ｆａｂ－ＮＬＰコンジュゲートは、別の多価フォーマット（Ｆａｂ－ＰＥＧコンジュゲート）と比較して有意に高いＦａｂ濃度が達成され、凍結乾燥では安定性や活性の障害は認められなかった。さらに、ＮＬＰへのＦａｂコンジュゲーションは、阻害及びアゴニスト設定のいずれにおいても、Ｆａｂ活性に影響を与えないことが確認され、Ｆａｂ負荷容量を活用して、効力に高い価数を必要とするアゴニスト経路を活性化することができた。最後に、Ｆａｂ－ＮＬＰコンジュゲートの安定性を５０％血清で評価したところ、Ｆａｂ－ＮＬＰは安定性の向上を示し、粒子当たりのＦａｂの比率が７以上の場合、２４時間後に６３％を超えるＦａｂ－ＮＬＰがインタクトなままであった。我々の知見は、Ｆａｂ－ＮＬＰが多価フォーマットでのＦａｂ標的化送達のためのプラットフォームであること、そしてＦａｂ－ＮＬＰが確立された製造プロセスに適合することを立証するものである。
この研究の総合的な結果は、ＮＬＰが、Ｆａｂ又はＦａｂ様分子の多量体化に非常に適した、挙動の良好な汎用プラットフォームであることを示している。これらの結果は、Ｆａｂ－ＮＬＰが多価フォーマットでのＦａｂ標的化送達のための驚くほど有用なプラットフォームであること、確立された製造プロセスに適合することを証明している。
実施例１～５の参考文献
(1) Cho, K., Wang, X., Nie, S., Chen, Z. G., and Shin, D. M. (2008) Therapeutic nanoparticles for drug delivery in cancer. Clin Cancer Res 14, 1310-6.
(2) Mareeva, T., Wanjalla, C., Schnell, M. J., and Sykulev, Y. (2010) A novel composite immunotoxin that suppresses rabies virus production by the infected cells. J Immunol Methods 353, 78-86.
(3) Bhatt, R., de Vries, P., Tulinsky, J., Bellamy, G., Baker, B., Singer, J. W., and Klein, P. (2003) Synthesis and in vivo antitumor activity of poly(l-glutamic acid) conjugates of 20S-camptothecin. J Med Chem 46, 190-3.
(4) Kim, T. Y., Kim, D. W., Chung, J. Y., Shin, S. G., Kim, S. C., Heo, D. S., Kim, N. K., and Bang, Y. J. (2004) Phase I and pharmacokinetic study of Genexol-PM, a cremophor-free, polymeric micelle-formulated paclitaxel, in patients with advanced malignancies. Clin Cancer Res10, 3708-16.
(5) Malik, N., Evagorou, E. G., and Duncan, R. (1999) Dendrimer-platinate: a novel approach to cancer chemotherapy. Anticancer Drugs 10, 767-76.
(6) Markman, M. (2006) Pegylated liposomal doxorubicin in the treatment of cancers of the breast and ovary. Expert Opin Pharmacother 7, 1469-74.
(7) Manchester, M., and Singh, P. (2006) Virus-based nanoparticles (VNPs): platform technologies for diagnostic imaging. Adv Drug Deliv Rev 58, 1505-22.
(8) Wu, W., Wieckowski, S., Pastorin, G., Benincasa, M., Klumpp, C., Briand, J. P., Gennaro, R., Prato, M., and Bianco, A. (2005) Targeted delivery of amphotericin B to cells by using functionalized carbon nanotubes. Angew Chem Int Ed Engl 44, 6358-62.
(9) Tufteland, M., Ren, G., and Ryan, R. O. (2008) Nanodisks derived from amphotericin B lipid complex. J Pharm Sci97, 4425-32.
(10) Yuan, Y., Wang, W., Wang, B., Zhu, H., Zhang, B., and Feng, M. (2013) Delivery of hydrophilic drug doxorubicin hydrochloride-targeted liver using apoAI as carrier. J Drug Target 21, 367-74.
(11) Ding, Y., Wang, W., Feng, M., Wang, Y., Zhou, J., Ding, X., Zhou, X., Liu, C., Wang, R., and Zhang, Q. (2012) A biomimetic nanovector-mediated targeted cholesterol-conjugated siRNA delivery for tumor gene therapy. Biomaterials 33, 8893-905.
(12) Gaidukov, L., Bar, D., Yacobson, S., Naftali, E., Kaufman, O., Tabakman, R., Tawfik, D. S., and Levy-Nissenbaum, E. (2009) In vivo administration of BL-3050: highly stable engineered PON1-HDL complexes. BMC Clin Pharmacol 9, 18.
(13) Frias, J. C., Ma, Y., Williams, K. J., Fayad, Z. A., and Fisher, E. A. (2006) Properties of a versatile nanoparticle platform contrast agent to image and characterize atherosclerotic plaques by magnetic resonance imaging. Nano Lett 6, 2220-4.
(14) Fischer, N. O., Rasley, A., Corzett, M., Hwang, M. H., Hoeprich, P. D., and Blanchette, C. D. (2013) Colocalized delivery of adjuvant and antigen using nanolipoprotein particles enhances the immune response to recombinant antigens. J Am Chem Soc 135, 2044-7.
(15) Bhattacharya, P., Grimme, S., Ganesh, B., Gopisetty, A., Sheng, J. R., Martinez, O., Jayarama, S., Artinger, M., Meriggioli, M., and Prabhakar, B. S. (2010) Nanodisc-incorporated hemagglutinin provides protective immunity against influenza virus infection. J Virol 84, 361-71.
(16) Fischer, N. O., Infante, E., Ishikawa, T., Blanchette, C. D., Bourne, N., Hoeprich, P. D., and Mason, P. W. (2010) Conjugation to nickel-chelating nanolipoprotein particles increases the potency and efficacy of subunit vaccines to prevent West Nile encephalitis. Bioconjug Chem 21, 1018-22.
(17) Weilhammer, D. R., Blanchette, C. D., Fischer, N. O., Alam, S., Loots, G. G., Corzett, M., Thomas, C., Lychak, C., Dunkle, A. D., Ruitenberg, J. J., Ghanekar, S. A., Sant, A. J., and Rasley, A. (2013) The use of nanolipoprotein particles to enhance the immunostimulatory properties of innate immune agonists against lethal influenza challenge. Biomaterials34, 10305-18.
(18) Fischer, N. O., Blanchette, C. D., Segelke, B. W., Corzett, M., Chromy, B. A., Kuhn, E. A., Bench, G., and Hoeprich, P. D. (2010) Isolation, characterization, and stability of discretely-sized nanolipoprotein particles assembled with apolipophorin-III. PLoS One 5, e11643.
(19) Blanchette, C. D., Law, R., Benner, W. H., Pesavento, J. B., Cappuccio, J. A., Walsworth, V., Kuhn, E. A., Corzett, M., Chromy, B. A., Segelke, B. W., Coleman, M. A., Bench, G., Hoeprich, P. D., and Sulchek, T. A. (2008) Quantifying size distributions of nanolipoprotein particles with single-particle analysis and molecular dynamic simulations. J Lipid Res 49, 1420-30.
(20) Fischer, N. O., Weilhammer, D. R., Dunkle, A., Thomas, C., Hwang, M., Corzett, M., Lychak, C., Mayer, W., Urbin, S., Collette, N., Chiun Chang, J., Loots, G. G., Rasley, A., and Blanchette, C. D. (2014) Evaluation of nanolipoprotein particles (NLPs) as an in vivo delivery platform. PLoS One 9, e93342.
(21) Cappuccio, J. A., Blanchette, C. D., Sulchek, T. A., Arroyo, E. S., Kralj, J. M., Hinz, A. K., Kuhn, E. A., Chromy, B. A., Segelke, B. W., Rothschild, K. J., Fletcher, J. E., Katzen, F., Peterson, T. C., Kudlicki, W. A., Bench, G., Hoeprich, P. D., and Coleman, M. A. (2008) Cell-free co-expression of functional membrane proteins and apolipoprotein, forming soluble nanolipoprotein particles. Mol Cell Proteomics 7, 2246-53.
(22) Cappuccio, J. A., Hinz, A. K., Kuhn, E. A., Fletcher, J. E., Arroyo, E. S., Henderson, P. T., Blanchette, C. D., Walsworth, V. L., Corzett, M. H., Law, R. J., Pesavento, J. B., Segelke, B. W., Sulchek, T. A., Chromy, B. A., Katzen, F., Peterson, T., Bench, G., Kudlicki, W., Hoeprich, P. D., Jr., and Coleman, M. A. (2009) Cell-free expression for nanolipoprotein particles: building a high-throughput membrane protein solubility platform. Methods Mol Biol 498, 273-96.
(23) Wadsater, M., Laursen, T., Singha, A., Hatzakis, N. S., Stamou, D., Barker, R., Mortensen, K., Feidenhans’l, R., Moller, B. L., and Cardenas, M. (2012) Monitoring shifts in the conformation equilibrium of the membrane protein cytochrome P450 reductase (POR) in nanodiscs. J Biol Chem 287, 34596-603.
(24) Justesen, B. H., Laursen, T., Weber, G., Fuglsang, A. T., Moller, B. L., and Pomorski, T. G. (2013) Isolation of monodisperse nanodisc-reconstituted membrane proteins using free flow electrophoresis. Anal Chem 85, 3497-500.
(25) Baylon, J. L., Lenov, I. L., Sligar, S. G., and Tajkhorshid, E. (2013) Characterizing the membrane-bound state of cytochrome P450 3A4: structure, depth of insertion, and orientation. J Am Chem Soc 135, 8542-51.
(26) Gao, T., Petrlova, J., He, W., Huser, T., Kudlick, W., Voss, J., and Coleman, M. A. (2012) Characterization of de novo synthesized GPCRs supported in nanolipoprotein discs. PLoS One 7, e44911.
(27) Akkaladevi, N., Hinton-Chollet, L., Katayama, H., Mitchell, J., Szerszen, L., Mukherjee, S., Gogol, E. P., Pentelute, B. L., Collier, R. J., and Fisher, M. T. (2013) Assembly of anthrax toxin pore: lethal-factor complexes into lipid nanodiscs. Protein Sci 22, 492-501.
(28) Tufteland, M., Pesavento, J. B., Bermingham, R. L., Hoeprich, P. D., Jr., and Ryan, R. O. (2007) Peptide stabilized amphotericin B nanodisks. Peptides 28, 741-6.
(29) Jia, J., Xiao, Y., Liu, J., Zhang, W., He, H., Chen, L., and Zhang, M. (2012) Preparation, characterizations, and in vitro metabolic processes of paclitaxel-loaded discoidal recombinant high-density lipoproteins. J Pharm Sci 101, 2900-8.
(30) Weilhammer, D., Dunkle, A. D., Blanchette, C. D., Fischer, N. O., Corzett, M., Lehmann, D., Boone, T., Hoeprich, P., Driks, A., and Rasley, A. (2017) Enhancement of antigen-specific CD4(+) and CD8(+) T cell responses using a self-assembled biologic nanolipoprotein particle vaccine. Vaccine 35, 1475-1481.
(31) Blanchette, C. D., Fischer, N. O., Corzett, M., Bench, G., and Hoeprich, P. D. (2010) Kinetic analysis of his-tagged protein binding to nickel-chelating nanolipoprotein particles. Bioconjug Chem21, 1321-30.
(32) Kuai, R., Sun, X., Yuan, W., Xu, Y., Schwendeman, A., and Moon, J. J. (2018) Subcutaneous Nanodisc Vaccination with Neoantigens for Combination Cancer Immunotherapy. Bioconjug Chem 29, 771-775.
(33) Merino, M., Zalba, S., and Garrido, M. J. (2018) Immunoliposomes in clinical oncology: State of the art and future perspectives. J Control Release 275, 162-176.
(34) Eloy, J. O., Petrilli, R., Trevizan, L. N. F., and Chorilli, M. (2017) Immunoliposomes: A review on functionalization strategies and targets for drug delivery. Colloids Surf B Biointerfaces159, 454-467.
(35) Noble, G. T., Stefanick, J. F., Ashley, J. D., Kiziltepe, T., and Bilgicer, B. (2014) Ligand-targeted liposome design: challenges and fundamental considerations. Trends Biotechnol 32, 32-45.
(36) Alibakhshi, A., Abarghooi Kahaki, F., Ahangarzadeh, S., Yaghoobi, H., Yarian, F., Arezumand, R., Ranjbari, J., Mokhtarzadeh, A., and de la Guardia, M. (2017) Targeted cancer therapy through antibody fragments-decorated nanomedicines. J Control Release 268, 323-334.
(37) Ohradanova-Repic, A., Nogueira, E., Hartl, I., Gomes, A. C., Preto, A., Steinhuber, E., Muhlgrabner, V., Repic, M., Kuttke, M., Zwirzitz, A., Prouza, M., Suchanek, M., Wozniak-Knopp, G., Horejsi, V., Schabbauer, G., Cavaco-Paulo, A., and Stockinger, H. (2018) Fab antibody fragment-functionalized liposomes for specific targeting of antigen-positive cells. Nanomedicine 14, 123-130.
(38) Hoang, B., Ekdawi, S. N., Reilly, R. M., and Allen, C. (2013) Active targeting of block copolymer micelles with trastuzumab Fab fragments and nuclear localization signal leads to increased tumor uptake and nuclear localization in HER2-overexpressing xenografts. Mol Pharm10, 4229-41.
(39) Mamot, C., Drummond, D. C., Noble, C. O., Kallab, V., Guo, Z., Hong, K., Kirpotin, D. B., and Park, J. W. (2005) Epidermal growth factor receptor-targeted immunoliposomes significantly enhance the efficacy of multiple anticancer drugs in vivo. Cancer Res 65, 11631-8.
(40) Hoshyar, N., Gray, S., Han, H., and Bao, G. (2016) The effect of nanoparticle size on in vivo pharmacokinetics and cellular interaction. Nanomedicine (Lond) 11, 673-92.
(41) Steeland, S., Vandenbroucke, R. E., and Libert, C. (2016) Nanobodies as therapeutics: big opportunities for small antibodies. Drug Discov Today 21, 1076-113.
(42) Redmond, W. L., and Weinberg, A. D. (2007) Targeting OX40 and OX40L for the treatment of autoimmunity and cancer. Crit Rev Immunol 27, 415-36.
(43) Cuesta, A. M., Sainz-Pastor, N., Bonet, J., Oliva, B., and Alvarez-Vallina, L. (2010) Multivalent antibodies: when design surpasses evolution. Trends Biotechnol 28, 355-62.
(44) Nunez-Prado, N., Compte, M., Harwood, S., Alvarez-Mendez, A., Lykkemark, S., Sanz, L., and Alvarez-Vallina, L. (2015) The coming of age of engineered multivalent antibodies. Drug Discov Today 20, 588-94.
(45) Yang, Y., Yeh, S. H., Madireddi, S., Matochko, W. L., Gu, C., Pacheco Sanchez, P., Ultsch, M., De Leon Boenig, G., Harris, S. F., Leonard, B., Scales, S. J., Zhu, J. W., Christensen, E., Hang, J. Q., Brezski, R. J., Marsters, S., Ashkenazi, A., Sukumaran, S., Chiu, H., Cubas, R., Kim, J. M., and Lazar, G. A. (2019) Tetravalent biepitopic targeting enables intrinsic antibody agonism of tumor necrosis factor receptor superfamily members. MAbs 11, 996-1011.
(46) Fischer, N. O., Blanchette, C. D., Chromy, B. A., Kuhn, E. A., Segelke, B. W., Corzett, M., Bench, G., Mason, P. W., and Hoeprich, P. D. (2009) Immobilization of His-tagged proteins on nickel-chelating nanolipoprotein particles. Bioconjug Chem 20, 460-5.
(47) Shatz, W., Hass, P. E., Peer, N., Paluch, M. T., Blanchette, C., Han, G., Sandoval, W., Morando, A., Loyet, K. M., Bantseev, V., Booler, H., Crowell, S., Kamath, A., Scheer, J. M., and Kelley, R. F. (2019) Identification and characterization of an octameric PEG-protein conjugate system for intravitreal long-acting delivery to the back of the eye. PLoS One 14, e0218613.
(48) Shatz, W., Hass, P. E., Mathieu, M., Kim, H. S., Leach, K., Zhou, M., Crawford, Y., Shen, A., Wang, K., Chang, D. P., Maia, M., Crowell, S. R., Dickmann, L., Scheer, J. M., and Kelley, R. F. (2016) Contribution of Antibody Hydrodynamic Size to Vitreal Clearance Revealed through Rabbit Studies Using a Species-Matched Fab. Mol Pharm 13, 2996-3003.
(49) Tesar, D., Luoma, J., Wyatt, E. A., Shi, C., Shatz, W., Hass, P. E., Mathieu, M., Yi, L., Corn, J. E., Maass, K. F., Wang, K., Dion, M. Z., Andersen, N., Loyet, K. M., van Lookeren Campagne, M., Rajagopal, K., Dickmann, L., Scheer, J. M., and Kelley, R. F. (2017) Protein engineering to increase the potential of a therapeutic antibody Fab for long-acting delivery to the eye. MAbs 9, 1297-1305.
(50) Hermanson, G. T. (2008) Bioconjugate Techniques, pp 283.
(51) Partis, M. D., Griffiths, D. G., Roberts, G. C., and Beechey, R. B. (1983) Cross-Linking of Protein by Omega-Maleimido Alkanoyl N-Hydroxysuccinimido Esters. J Protein Chem 2, 263-277.
(52) Hermanson, G. T. (2008) Bioconjugate Techniques, pp 767.
(53) Dong, J., Peters-Libeu, C. A., Weisgraber, K. H., Segelke, B. W., Rupp, B., Capila, I., Hernaiz, M. J., LeBrun, L. A., and Linhardt, R. J. (2001) Interaction of the N-terminal domain of apolipoprotein E4 with heparin. Biochemistry 40, 2826-34.
(54) Isom, D. G., Castaneda, C. A., Cannon, B. R., and Garcia-Moreno, B. (2011) Large shifts in pKa values of lysine residues buried inside a protein. Proc Natl Acad Sci U S A 108, 5260-5.
(55) Panahi, A., and Brooks, C. L., 3rd. (2015) Membrane environment modulates the pKa values of transmembrane helices. J Phys Chem B 119, 4601-7.
(56) Strong, R. K., Campbell, R., Rose, D. R., Petsko, G. A., Sharon, J., and Margolies, M. N. (1991) Three-dimensional structure of murine anti-p-azophenylarsonate Fab 36-71. 1. X-ray crystallography, site-directed mutagenesis, and modeling of the complex with hapten. Biochemistry30, 3739-48.
(57) Gao, T., Blanchette, C. D., He, W., Bourguet, F., Ly, S., Katzen, F., Kudlicki, W. A., Henderson, P. T., Laurence, T. A., Huser, T., and Coleman, M. A. (2011) Characterizing diffusion dynamics of a membrane protein associated with nanolipoproteins using fluorescence correlation spectroscopy. Protein Sci 20, 437-47.
(58) Henein, C., Awwad, S., Ibeanu, N., Vlatakis, S., Brocchini, S., Tee Khaw, P., and Bouremel, Y. (2019) Hydrodynamics of Intravitreal Injections into Liquid Vitreous Substitutes. Pharmaceutics 11.
(59) Dias, C., Abosaleem, B., Crispino, C., Gao, B., and Shaywitz, A. (2015) Tolerability of High-Volume Subcutaneous Injections of a Viscous Placebo Buffer: A Randomized, Crossover Study in Healthy Subjects. AAPS PharmSciTech 16, 1101-7.
(60) Mathaes, R., Koulov, A., Joerg, S., and Mahler, H. C. (2016) Subcutaneous Injection Volume of Biopharmaceuticals-Pushing the Boundaries. J Pharm Sci 105, 2255-9.
(61) Zarzar, J., Shatz, W., Peer, N., Taing, R., McGarry, B., Liu, Y., Greene, D. G., and Zarraga, I. E. (2018) Impact of polymer geometry on the interactions of protein-PEG conjugates. Biophys Chem 236, 22-30.
(62) Chen, C., Han, D., Cai, C., and Tang, X. (2010) An overview of liposome lyophilization and its future potential. J Control Release 142, 299-311.
(63) Fernandez-Moure, J., Maisha, N., Lavik, E. B., and Cannon, J. W. (2018) The Chemistry of Lyophilized Blood Products. Bioconjug Chem 29, 2150-2160.
(64) Franze, S., Selmin, F., Samaritani, E., Minghetti, P., and Cilurzo, F. (2018) Lyophilization of Liposomal Formulations: Still Necessary, Still Challenging. Pharmaceutics 10.
(65) Rusmini, F., Zhong, Z., and Feijen, J. (2007) Protein immobilization strategies for protein biochips. Biomacromolecules8, 1775-89.
(66) Abad, J. M., Mertens, S. F., Pita, M., Fernandez, V. M., and Schiffrin, D. J. (2005) Functionalization of thioctic acid-capped gold nanoparticles for specific immobilization of histidine-tagged proteins. J Am Chem Soc 127, 5689-94.
(67) Gilmore, S. F., Carpenter, T. S., Ingolfsson, H. I., Peters, S. K. G., Henderson, P. T., Blanchette, C. D., and Fischer, N. O. (2018) Lipid composition dictates serum stability of reconstituted high-density lipoproteins: implications for in vivo applications. Nanoscale 10, 7420-7430.
(68) Gilmore, S. F., Blanchette, C. D., Scharadin, T. M., Hura, G. L., Rasley, A., Corzett, M., Pan, C. X., Fischer, N. O., and Henderson, P. T. (2016) Lipid Cross-Linking of Nanolipoprotein Particles Substantially Enhances Serum Stability and Cellular Uptake. ACS Appl Mater Interfaces 8, 20549-57.
(69) Nasr, M. L., and Wagner, G. (2018) Covalently circularized nanodiscs; challenges and applications. Curr Opin Struct Biol 51, 129-134.
実施例６：実施例７～１１の材料及び方法
材料
実施例７～１１で使用される試薬は、実施例１で議論されたように得られた。
ａｐｏＥ４２２ｋ及びＦａｂのタンパク質発現と精製
ＡｐｏＥ４２２ｋは、確立された発現プラスミド及び方法を使用して、以前に記載されたように（以下の参考文献１８及び１９を参照）振盪フラスコ条件下で大腸菌細胞において発現された。簡潔には、ａｐｏＥ４２２ｋを６ｘ Ｈｉｓタグ付きで発現させ、Ｎｉ－ＮＴＡカラム（ＸＫ１６／２０ ３ｍｌ）で精製し、サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １６／６０）で精製した。カラムを洗浄し、タンパク質を５０ｍＭリン酸緩衝液、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８（緩衝液Ａ）中で結合させた。カラムに結合したタンパク質を緩衝液Ａ＋０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１１４＋０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００でよく（２０カラム容量）洗浄し、５０ｍＭリン酸緩衝液、２００ｍＭ ＮａＣｌ、４００ｍＭイミダゾール、ｐＨ８で溶出した。溶出ピークから収集した画分を濾過し、３ｋＤａ分子量カットオフスピン濃縮器で濃縮した。Ｔｏｂａｃｃｏ Ｅｔｃｈ Ｖｉｒｕｓ Ｎｕｃｌｅａｒ－ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ－ａ ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ（ＴＥＶ ｐｒｏｔｅａｓｅ）消化によってＨｉｓタグを除去した（ＴＥＶタグは、Ｈｉｓタグとタンパク質配列の間のＮ末端に追加された）。ＴＥＶプロテアーゼは、ａｐｏＥ４２２ｋ：ＴＥＶ重量比１００：１で添加された。反応混合物をＮｉ－ＮＴＡカラム（ＸＫ １６／２０ ３ｍｌ）に通すことにより、切断されたタンパク質を、Ｈｉｓタグを含むＴＥＶプロテアーゼから精製した。プールされたタンパク質を濃縮し、ＰＢＳ中でＳＥＣ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １６／６０）にかけた。ＳＥＣ画分を収集し、タンパク質の同一性と凝集について、それぞれ質量分析とＳＥＣで分析した。正しい分子量（ＭＷ）と凝集体（＜５％）を有する画分をプールし、タンパク質濃度を２８０での吸光度によって決定した。
ＣＫＰ－ＮＬＰへの部位特異的なコンジュゲーションを可能にするために、Ｃ末端システインを有するＦａｂ構築物（簡単にするためにＦａｂと呼ぶ）を設計した。ＣＫＰ－ＮＬＰへのＦａｂコンジュゲーションは、以前に記載されたように精製したヒト抗Ｄ因子（ＡＦＤ）Ｆａｂをサロゲートとして使用して評価した（以下の参考文献１８を参照）。精製された全てのＦａｂは、２０ｍＭ ＤＴＴを使用して脱システイン化され、システインコンジュゲートを還元し、６．５ｍＭグルタチオン（ＧＳＨ）で再酸化された。次いで、試料を緩衝液交換し、洗浄し、さらなるシステイン化を制限するために、２００ｍＭのコハク酸アルギニン（ｐＨ５）中で保存した。
Ｃ１６－ＥＥＴＩ－ＩＩの合成と特徴づけ
直鎖状ＥＥＴＩ－ＩＩ又はＥＥＴＩ－ＩＩ－Ｃ１６ペプチドは、以下の参考文献２０に記載されているように、固相上で標準的な９－フルオレニルメトキシカルボニルプロトコルを使用して化学的に合成された。最適なフォールディング条件は、小規模なフォールディングアッセイとＬＣ－ＭＳ分析を使用して特定された。得られた粗直鎖状ペプチドを、最適フォールディング緩衝液（０．１Ｍ炭酸水素アンモニウム、ｐＨ９．０、２ｍＭ還元型グルタチオン、０．５ｍＭ酸化型グルタチオン、４％ＤＭＳＯ（ＥＥＴＩ－ＩＩ用）；０．１Ｍ炭酸水素アンモニウム、ｐＨ９．０、１ｍＭ還元型グルタチオン、５０％ＤＭＳＯ（Ｃ１６－ＥＥＴＩ－ＩＩ用））中、０．５ｍｇ／ｍｌで室温で２４時間、振盪しながら酸化させた。Ｃ１８ Ｓｅｐ－Ｐａｋ（Ｗａｔｅｒｓ、カタログ番号ＷＡＴ０４３３４５）を使用して過剰な塩を除去し、凍結乾燥生成物を、ＥＥＴＩ－ＩＩ（簡単にするために「ＣＫＰ」と呼ぶ）にはＣ１８カラムを使用し、ＥＥＴＩ－ＩＩ－Ｃ１６（簡単にするために「ＣＫＰ－Ｃ１６」と呼ぶ）にはＣ４カラムを使用して、ＲＰ－ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）により精製した。精製されたペプチドの同一性は、ＬＣ－ＭＳシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使用して確認され、その純度は＞９５％であることが確認された。
ＣＫＰ－ＮＬＰの組み立てと精製
ＮＬＰへのＣＫＰの組み込みを可能にするために、ＣＫＰは、上記のようにＣ１６脂肪酸タグ（ＣＫＰ－Ｃ１６）を付加された。以前に記載されたように、疎水性タグを用いて合成された分子とのＮＬＰの組み込みは、分子をＮＬＰ表面に効果的に固定する脂質二重層のコア内での疎水性タグの分配に基づいている（下記の参考文献９、１０を参照）。ＣＫＰ－ＮＬＰは、若干の変更を加えて以前に記載されたように組み立てた（以下の参考文献９、１０、１８を参照）。簡潔には、ａｐｏＥ４２２ｋに対する総脂質のモル比は８０：１であり、これは比較的均一なＮＬＰ集団をもたらすことが以前に示されていた（以下の参考文献６、１１、１９、２１を参照）。ＣＫＰ－ＮＬＰは、以下の実施例に記載されるように、ＤＯＰＣ及びＣＫＰ－Ｃ１６（Ｆａｂコンジュゲーションなし）又はＤＯＰＣ、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－Ｍａｌ（Ｆａｂコンジュゲーション）及びＣＫＰ－Ｃ１６の示されたモル比で組み立てられた。これらの脂質は、クロロホルム又はメタノール中で調製又は取得され、エッペンドルフチューブにアリコートとして保存した。クロロホルムを撹拌しながらＮ２の気流下で除去し、薄い脂質フィルムを形成させた。脂質は、８０ｍＭコール酸ナトリウムを使用して、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌに可溶化した。ａｐｏＥ４２２ｋ（最終の組み立て体積で１５０μＭ）を添加した後、試料を室温で少なくとも１時間インキュベートした。コール酸を、５００μＬのｃｏｓｔａｒ ０．２２μＭスピンフィルターで揺動させながら、バイオビーズ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と共にインキュベートすることにより除去した。２時間揺動させた後、試料を２００ｇで５分間遠心分離し、ＮＬＰを含む濾液を収集した。Ｆａｂコンジュゲーションに使用されないＣＫＰ－ＮＬＰは、ＡＫＴＡ ＡｖａｎｔシステムとＳ２００ １０／３００ Ｉｎｃｒｅａｓｅカラムを使用してＳＥＣで精製した。Ｆａｂ－ＣＫＰ－ＮＬＰコンジュゲートを生成するために使用されるＣＫＰ－ＮＬＰは、ＳＥＣ精製の前に、以下に記載されるように最初にＦａｂにコンジュゲートさせた。
Ｆａｂ－ＣＫＰ－ＮＬＰコンジュゲーションと精製
Ｆａｂは、若干の変更を加えて、以前に記載されたようにＣＫＰ－ＮＬＰにコンジュゲートさせた（下記の参考文献１８を参照）。簡潔には、コール酸除去工程の後、ＣＫＰ－ＮＬＰのａｐｏＥ４２２ｋ濃度を、以下に記載するようにＨＰＬＣによって決定した。チオール含有Ｆａｂは、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中で、Ｆａｂ：ＮＬＰモル比が０～１６０の範囲で、マレイミド官能化ＣＫＰ－ＮＬＰにコンジュゲートさせたが、これは、ａｐｏＥ４２２ｋ濃度と４ａｐｏＥ４２２ｋ／ＮＬＰの仮定に基づいて計算した（以下の参考文献６を参照）。このコンジュゲーション緩衝液は、以前に記載されたように、マレイミドとａｐｏＥ４２２ｋの間のＮＬＰ内架橋を制限するために選択された（以下の参考文献１８を参照）。コンジュゲーション反応は、常に、マレイミドの加水分解を制限するために、ＣＫＰ－ＮＬＰが組み立てられた同じ日に行われた。２～４時間の反応インキュベーション期間の後、ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）をＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＭＣＣに対して２倍モル過剰で添加して、未反応のマレイミドをクエンチした。得られたＦａｂ－ＣＫＰ－ＮＬＰコンジュゲートは、ＡＫＴＡ ＡｖａｎｔシステムとＳ２００ １０／３００ Ｉｎｃｒｅａｓｅカラムを使用して精製された。Ｆａｂ－ＣＫＰ－ＮＬＰピークを横切る各画分を、以下に記載するようにＳＥＣ－ＭＡＬＳにより分析した。分子量及び流体力学的半径（Ｒｈ）分析に基づいて画分をプールし、最も均一なＦａｂ－ＣＫＰ－ＮＬＰ試料を得た。
ＣＫＰ－ＮＬＰへの部位特異的コンジュゲーションを可能にするためにＣ末端システインで操作されたヒト抗Ｄ因子（ＡＦＤ）Ｆａｂ（簡単にするために「Ｆａｂ」と呼ぶ）をモデルＦａｂとして使用した。Ｆａｂは、以前に記載されたように発現及び精製された（以下の参考文献１８、２２）。精製されたＦａｂを２０ｍＭ ＤＴＴで還元して、発現及び精製中に形成されるシステイン又はＧＳＨコンジュゲートを除去し、６．５ｍＭグルタチオン（ＧＳＨ）を使用して再酸化して、システインがマレイミド官能化ＣＫＰ－ＮＬＰへのコンジュゲーションのためにフリーであることを確認した。試料を緩衝液交換し、洗浄し、さらなるシステイン化を制限するために、２００ｍＭのコハク酸アルギニン（ｐＨ５）中で保存した。
ＣＫＰ－ＮＬＰ及びＦａｂ－ＣＫＰ－ＮＬＰコンジュゲートのＨＰＬＣ分析
ＣＫＰ－ＮＬＰ及びＦａｂ－ＣＫＰ－ＮＬＰコンジュゲート中のＡｐｏＥ４２２ｋ、ＣＫＰ、及びＦａｂ濃度を、Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏ－ｉｎｅｒｔ ＨＰＬＣを使用したＨＰＬＣにより分析した。８０℃に加熱したＫｉｎｅｔｅｘ ２．６μｍ ＸＢ－Ｃ１６カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を使用して、注入されたＮＬＰ試料を分析した。溶媒は、３０％メタノール、７０％水、及び０％ ２－プロパノールの混合物から１００％ ２－プロパノールまでの勾配として流した。全ての溶媒には０．０５％のトリフルオロ酢酸が含まれていた。勾配は、全ての成分の分離を可能にするために最適化された。Ｆａｂ－ＣＫＰ－ＮＬＰコンジュゲートの場合、インタクトなＦａｂはこれらの勾配及び緩衝液条件では遊離ａｐｏＥ４２２ｋから分離できなかったため、還元型条件が必要であった。ＡｐｏＥ４２２ｋ、Ｆａｂ、及びＣＫＰ－Ｃ１６の濃度は、各成分を１～１６μｇ注入し、曲線下の面積を積分して作成した標準曲線に基づいて決定した。標準曲線は、Ａ２８０ＵＶシグナルと蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ）シグナルの両方に基づいて作成された。
ＣＫＰ－ＮＬＰ及びＦａｂ－ＣＫＰ－ＮＬＰコンジュゲートのＬＣＭＳ分析
ＣＫＰ－ＮＬＰ及びＦａｂ－ＣＫＰ－ＮＬＰコンジュゲートのＬＣＭＳ分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ ６２３０ ＥＳＩ－ＴＯＦＬＣ／ＭＳを使用して行った。８０℃に加熱したＫｉｎｅｔｅｘ ２．６μｍ ＸＢ－Ｃ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）を使用して、注入されたＮＬＰ試料を分析した。溶媒は、３０％メタノールと７０％水との混合物から１００％ ２－プロパノールまでの勾配として流した。全ての溶媒には０．０５％のトリフルオロ酢酸が含まれていた。
ＣＫＰ－ＮＬＰ及びＦａｂ－ＣＫＰ－ＮＬＰコンジュゲートのＳＥＣ－ＭＡＬＳ／ＱＥＬＳ分析
ＭＷ及びＲｈは、以前に記載されたように決定された（以下の参考文献１８）。簡潔には、試料を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）のアイソクラティック勾配（追加の１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で、多角度光散乱システム（ＭＡＬＳ）（Ｗｙａｔｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）に結合された、Ａｃｃｌａｉｍ ＳＥＣ－１０００分析用ＳＥＣカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）に注入した。拡散係数（Ｄ）は、準弾性光散乱（ＱＥＬＳ）を使用して測定され、ここでは、９９．０°の角度で検出する単一光子計数モジュールを使用して、散乱されたレーザー光の強度の変動が捕捉された。Ｓｔｏｋｅｓ－Ｅｉｎｓｔｅｉｎの関係を使用して、ＤからＲｈを計算した。Ｓｔｏｋｅｓ－Ｅｉｎｓｔｅｉｎの関係は球形を仮定しているが、ＮＬＰは、ＴＥＭ及びＡＦＭ分析では円盤状であり、球形ではない（以下の参考文献６を参照）。したがって、推定されたＲｈは、ＮＬＰと同じ拡散係数を持つ球に対応する。しかし、溶液中のＮＬＰの形状は非常に動的であることが最近報告されており、ＮＬＰは、球状の粒子をより反映する静的な円盤状の形状を超えて、様々な異なるコンフォメーションを採用することができる（以下の参考文献１８、２３）。これらの理由から、この分析から得られたＲｈ値は正確であると推定される。
トリプシン酵素アッセイ
ＣＫＰ－ＮＬＰは、若干の変更を加えて以前に記載されたようにアッセイを実施した（以下の参考文献２を参照）。簡潔には、ペプチドＮＬＰコンジュゲートを指定濃度でトリプシン（２ｎＭ）と共に室温で３０分間インキュベートした。基質のＬ－アルギニン－７－アミド－４－メチルクマリン（Ｌ－Ａｒｇ－ＡＭＣ）（７５μＭ）を混合物に添加し、タンパク質分解活性を直ちに測定した。試料は三通りで実行され、２回繰り返された。ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈソフトウェアを使用してデータを分析した。
ＡＦ４８８によるＣＫＰ－ＮＬＰ及びＦａｂ－ＣＫＰ－ＮＬＰコンジュゲートの標識化
ＣＫＰ－ＮＬＰ及びＦａｂ－ＣＫＰ－ＮＬＰコンジュゲートは、上記のように生成され、ＳＥＣ精製の前（コール酸除去後）、試料は、ＮＨＳ－ＡＦ４８８：総タンパク質比５で２～４時間、ＮＨＳ活性化ＡＦ４８８と共にインキュベートすることにより、遊離リジンを介してＡＦ４８８で標識した。次いで、未反応のＮＨＳ－ＡＦ４８８を、反応中の全ＮＨＳ－ＡＦ４８８に対して１０倍モル過剰のＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８）を添加してクエンチした。次に、上記のようにＳ２００ １０／３００Ｉｎｃｒｅａｓｅカラムを使用するＡＫＴＡ ＡｖａｎｔシステムでのＳＥＣにより、未反応のＡＦ４８８からＡＦ４８８標識ＮＬＰを精製した。
５０％血清中のＣＫＰ－ＮＬＰ及びＦａｂ－ＣＫＰ－ＮＬＰコンジュゲートのＳＥＣ分析
ＡＦ４８８標識ＣＫＰ－ＮＬＰ及びＦａｂ－ＣＫＰ－ＮＬＰの分解を、以前に記載されたように分析した（以下の参考文献９、１８、２４、及び２５を参照）。ＡＦ４８８標識ＣＫＰ－ＮＬＰ及びＦａｂ－ＣＫＰ－ＮＬＰコンジュゲートを５０％血清（ｐＨ７．４）を含むＰＢＳ緩衝液中でインキュベートし、ＳＥＣ（Ａｃｃｌａｉｍ ＳＥＣ １０００，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）によって分析した。標識されたＮＬＰ試料の吸光度は、血清タンパク質及び成分からの吸光度の干渉を避けるために、４９５ｎｍの波長でモニターされた。５～５．５分間に観察されたピークはＣＫＰ－ＮＬＰとＦａｂ－ＣＫＰ－ＮＬＰコンジュゲートに起因し、６～６．５分間のピークはＮＬＰから解離した遊離の非コンジュゲートＦａｂ又はａｐｏＥ４２２ｋに起因していた。試験された様々な時点でのＮＬＰピーク下の面積は、時間０ｈｒのピーク面積に対して正規化され、これらの正規化された値を使用して、ＣＫＰ－ＮＬＰ及びＦａｂ－ＣＫＰ－ＮＬＰ分解の動力学を決定した。
実施例７：ＣＫＰ－ＮＬＰの組み立て、精製、及び特徴づけ
シスチンノットペプチドＥＥＴＩ－ＩＩ（Ｅｃｂａｌｌｉｕｍ ｅｌａｔｅｒｉｕｍトリプシン阻害剤－ＩＩ）は、テッポウウリから見つかった強力なトリプシン阻害剤である。ＣＫＰ－ＮＬＰを生成するために、ＥＥＴＩ－ＩＩのＮ末端で操作されたリジン側鎖のイプシロンアミノ基にパルミチン酸がコンジュゲートしたＥＥＴＩ－ＩＩの脂肪酸アシル化バージョンが設計された（図９Ａ）。最初に、直鎖状のＣ１６－ＥＥＴＩ－ＩＩが固相ペプチド合成によって生成された。脂肪酸は、その後の樹脂からのペプチド切断及び脱保護の前に、ペプチド合成中の最後の工程として組み込まれた。得られた直鎖状の粗生成物を異なる緩衝液でスクリーニングし、分析用ＬＣ－ＭＳで評価したところ、３つのジスルフィド結合生成物を生成するための最適なフォールディング条件を特定した。この生産戦略により、（ＣＫＰフォールディング後に脂肪酸をコンジュゲートする代わりに）精製プロセスが単純化される。図９Ｂを参照。ＥＥＴＩ－ＩＩ－Ｃ１６は折り畳まれ、ほぼ均一になるまで精製され、ＥＥＴＩ－ＩＩ－Ｃ１６が数ミリグラムのスケールで生成された。ＥＥＴＩ－ＩＩ－Ｃ１６の同一性と純度は、ＬＣ－ＭＳによって確認された（図９Ｃ）。分析用ＲＰ－ＨＰＬＣトレースは、天然ＥＥＴＩ－ＩＩと比較してより長い保持時間によって反映されるように、ＥＥＴＩ－ＩＩ－Ｃ１６がＥＥＴＩ－ＩＩよりも疎水性であることを示している（図９Ｄ）。これは、脂肪酸部分のコンジュゲーションによるものである。ＥＥＴＩ－ＩＩ－Ｃ１６は、水性緩衝液中で依然として溶解性を示す（６０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．４において＞０．５ｍＭ）。精製されたＥＥＴＩ－ＩＩ－１６は、トリプシンに対する阻害効力を示した。これは、Ｎ末端での化学修飾がＥＥＴＩ－ＩＩの活性を最小限に悪影響を及ぼすはずであるという構造研究からの予測と一致している。簡単にするために、本明細書では、ＥＥＴＩ－ＩＩ及びＥＥＴＩ－ＩＩ－Ｃ１６をそれぞれ「ＣＫＰ」及び「ＣＫＰ－Ｃ１６」と呼ぶ。
図１０Ａに示す模式図に示すように、ＣＫＰ－ＮＬＰは、ＤＯＰＣをヘルパー脂質として使用し、コール酸を脂質可溶化のために使用して、自発的な自己組織化によって生成された。コール酸を除去すると、自己組織化されたＣＫＰ－ＮＬＰがＳＥＣによって精製された。ＣＫＰ－ＮＬＰの典型的なＳＥＣクロマトグラムを図１０Ｂに示す。このＣＫＰ－ＮＬＰ試料は、ＤＯＰＣに対するＣＫＰ－Ｃ１６のモル比が１０％（例えば９０ｍｏｌ％ ＤＯＰＣ、１０ｍｏｌ％ ＣＫＰ－Ｃ１６）で組み立てられた（以下の参考文献６を参照）。ＳＥＣピークのセンターカットに対応する画分を収集し、プールして、逆相ＨＰＬＣ分析に供した。図１０Ｃは、ＳＥＣ精製後の１０ｍｏｌ％ ＣＫＰ－Ｃ１６で組み立てられたＣＫＰ－ＮＬＰ試料のＨＰＬＣ ＥＬＳＤクロマトグラムを示している。４．８、５．３、及び８．５分に対応する保持時間に３つのピークが観察された。標準曲線とＬＣ／ＭＳ分析を使用して、４．８、５．３、及び８．５分で観察されたピークがそれぞれａｐｏＥ４２２ｋ（２２．３ｋＤａ）、ＣＫＰ－Ｃ１６（３．７ｋＤａ）、及びＤＯＰＣ（０．７９ｋＤａ）に対応することを確認した。これらの知見は、上記の戦略がＣＫＰ－Ｃ１６のＮＬＰへの組み込みをもたらすことを示している。各成分の標準曲線が生成され、精製されたＣＫＰ－ＮＬＰに組み込まれたＣＫＰ－Ｃ１６の量を計算するために使用された。１０ｍｏｌ％ ＣＫＰ－Ｃ１６試料の場合、ＣＫＰ－Ｃ１６の組み込みは８．４ｍｏｌ％と計算された。これは、組み立て及び精製プロセス中に材料がわずかに失われたことを示している。ＣＫＰ－ＮＬＰ組成物のＨＰＬＣ分析に加えて、ＮＬＰ分子量もＳＥＣ－ＭＡＬＳによって測定した（図１０Ｄ～１０Ｅ）。ＣＫＰ－ＮＬＰピークのＭＷは２００から４００ｋＤａまで変化し、ピーク全体の平均ＭＷは２６６ｋＤａであった（保持時間９～１０分）（図１０Ｄ）。同様に、ＣＫＰ－ＮＬＰピークの流体力学的サイズ（Ｒｈ）は５．８から７．３ｎｍまで変化し、ピークを横切る平均Ｒｈは６．２ｎｍであった（保持時間９～１０分）（図１０Ｅ）。これらの組み合わせた結果は、ＣＫＰ－ＮＬＰ粒子が多分散であることを示唆している。これらの調査結果は、バルク及び単一分子測定の両方からＮＬＰサイズを評価した以前の報告と一致している。例えば、下記の参考文献６を参照されたい。参考文献６では、ＮＬＰの多分散性は、ＮＬＰに結合するａｐｏＥ４２２ｋ足場タンパク質の数（これは４～７の範囲で変化する）によって決まる複数の離散的なＮＬＰサイズによって駆動されていることが判明し、ＮＬＰ多分散性はこれらの離散的サイズの確率的ガウス分布を示していると報告されている。ＳＥＣ分析に基づくと、保持時間、Ｒｈ、及びＭＷは、平均４つのａｐｏＥ４２２ｋ／ＮＬＰを含むＮＬＰと一致している。これらの組み合わせた知見は、モデル脂質ペプチドであるＣＫＰ－Ｃ１６によって例示されるように、ＣＫＰ－ＮＬＰの生成、精製、特徴づけに成功したことを示すものである。
実施例８：ＮＬＰサイズ、負荷効率、及びＣＫＰ活性に対するＣＫＰ組み込みの効果の分析
次に、ＮＬＰサイズに対するＣＫＰ組み込みの効果を以下のように評価した。前駆体有機相において０～４０％の範囲のＣＫＰ－Ｃ１６モル％でＣＫＰ－ＮＬＰを組み立てることにより、最大ＣＫＰ負荷が測定された。０、５％、１０％、２０％、及び４０％のＣＫＰ－Ｃ１６で組み立てられたＣＫＰ－ＮＬＰの正規化された分析用ＳＥＣクロマトグラムを図１１Ａに示す。ＣＫＰ含有量が０～２０％に増加するにつれて、保持時間のわずかな増加が観察され、粒子サイズのわずかな減少が示された。ＣＫＰ－Ｃ１６濃度が２０％から４０％に増加すると、保持時間の大幅な増加と、遊離ａｐｏＥ４２２ｋタンパク質に対応する大きなピークの出現が観察された。これらの結果は、ＳＥＣ－ＭＡＬＳトレースにおけるＣＫＰ－ＮＬＰのピークのＲｈ分析にも反映されている（図１１Ｂ）。ＣＫＰの非存在下でのＮＬＰのＲｈは約７ｎｍで、５％のＣＫＰでは約６．３ｎｍに減少した。ＣＫＰ－Ｃ１６含有量が５％から２０％に増加しても、Ｒｈのそれ以上の変化は観察されなかった。ただし、ＣＫＰ－Ｃ１６濃度が４０％に増加すると、４．５ｎｍへの急激な低下が観察された。上記のように、ＮＬＰのサイズ分布は、離散的なサイズがａｐｏＥ４２２ｋ／ＮＬＰの数によって決定される離散的なサイズのＮＬＰの確率的ガウス分布によって大きく規定されることが以前に報告されていた（以下の参考文献６を参照）。経験的な単一分子測定と分子動力学シミュレーションに基づいて、ＮＬＰにａｐｏＥ４２２ｋタンパク質を追加すると、直径が約２．５ｎｍ増加する（下記の参考文献６を参照）。理論に拘束されるものではないが、ＣＫＰ－Ｃ１６含有量が０から２０％に増加したときに観察された直径の約０．７ｎｍの減少は、この変化がａｐｏＥ４２２ｋ／ＮＬＰの平均数の違いによるものではないことを示唆している。また、特定の離散的なサイズのＮＬＰについて、組成物によって決定できるＮＬＰサイズにある程度の柔軟性があることも報告されている（以下の参考文献６を参照）。理論に拘束されるものではないが、ＮＬＰサイズのこのわずかな減少は、ＮＬＰ組成物の変化によるものである可能性がある。ＣＫＰ－Ｃ１６は脂肪酸アシル鎖を１つしか含まず、ＤＯＰＣより表面積が小さく、ＣＫＰ－Ｃ１６含有量の増加に伴うＮＬＰ直径のこのわずかな減少は、ＤＯＰＣと比較してＣＫＰ－Ｃ１６の断面積が小さいためである可能性がある。この理論的根拠は、Ｒｈの急速な低下と、４０％ ＣＫＰ－Ｃ１６組成物で観察される遊離ａｐｏＥ４２２ｋピークの出現を説明できない可能性がある。この直径の変化は、ａｐｏＥ４２２ｋ／ＮＬＰの平均数が１つ減少したときに予想される変化と密接に一致する（以下の参考文献６を参照）。これらの知見は、ＣＫＰ－Ｃ１６含有量が４０％に増加すると、ＣＫＰ－Ｃ１６含有量が低いＮＬＰで観察された４つのａｐｏＥ４２２ｋ／ＮＬＰを収容するのに十分な脂質含有量／表面積がなくなること、及び粒子が３つのａｐｏＥ４２２ｋ／ＮＬＰで構成されていることを示唆している。しかし、もしそうであれば、遊離ａｐｏＥ４２２ｋは、ＳＥＣクロマトグラムの曲線下の面積に基づいて観察された５０％の増加ではなく、２５％増加すると予想される。別の説明として、ＣＫＰ－ＮＬＰがもはや形成されない可能性があり、ＣＫＰ－Ｃ１６－ＤＯＰＣ混合物が球状ミセルを形成している可能性がある。二重層形成脂質を界面活性剤とより高い界面活性剤比で混合すると、ミセルを形成することができる（以下の参考文献２６を参照）。同様の現象が、ＣＫＰ－Ｃ１６濃度が高いＣＫＰ－ＮＬＰでも発生している可能性がある。ＣＫＰ－Ｃ１６は、より大きな極性頭部基と単一の脂肪酸アシル鎖を持つ界面活性剤分子と同様の構造を持っているので、ＣＫＰ－Ｃ１６の比率が高いほど、ＮＬＰの形成に必要な二重層ではなくミセルの形成を誘導する可能性がある。より高いＣＫＰモル比では、ＮＬＰの基本構造と生物物理学的特性が変化している。
ＣＫＰがＮＬＰプラットフォームに組み込まれる効率を評価するために、精製されたＣＫＰ－ＮＬＰに組み込まれたＣＫＰの量を逆相ＨＰＬＣによって定量化した。図１１Ｃは、４ａｐｏＥ４２２ｋ／ＮＬＰを仮定して、ＣＫＰ－ＮＬＰ組み立て中に加えられたＣＫＰ含有量（Ｘ軸）の関数として、精製されたＣＫＰ－ＮＬＰにおいて定量化されたＣＫＰ／ＮＬＰ比（Ｙ軸）を示している。破線は、反応中の全てのＣＫＰがＮＬＰに組み込まれた場合の理論上の限界を表す。より低いＣＫＰ濃度（１６及び３２ＣＫＰ／ＮＬＰ、それぞれ５及び１０ｍｏｌ％ ＣＫＰに対応）では、点が破線（理論的限界）にどれだけ近いかによって証明されるように、反応に加えられたほぼ全てのＣＫＰが取り込まれた（それぞれ１３．３及び２７．６ＣＫＰ／ＮＬＰ）。しかし、より高い濃度では、ＣＫＰの負荷効率は理論上の上限から逸脱し始める（図１１Ｃ）。理論に拘束されるものではないが、これらの知見は、ＣＫＰ濃度が高くなると負荷効率が低下することを示唆している。ＮＬＰは、ＮＬＰ組み立てプロセスに影響を与えることなく、最大６０個のＣＫＰ－Ｃ１６分子を収容することができた。（図１１Ｃ）。この結論に到達するために、４０％ ＣＫＰ濃度（１２８ＣＫＰ／ＮＬＰ）で４つのａｐｏＥ４２２ｋ／ＮＬＰが存在すると仮定した。しかし、ＣＫＰ濃度が高くなるとａｐｏＥ４２２ｋ／ＮＬＰの数が変化するか、ミセル／ＮＬＰハイブリッドの形成が誘導されるため、そうではない可能性もある。この潜在的な矛盾にもかかわらず、これらの組み合わせた結果は、より高いＣＫＰ負荷条件では組み込み効率が低下することを示唆している。
ＣＫＰ活性に対するＣＫＰ－ＮＬＰへのＣＫＰ組み込みの効果を、以下のように評価した。この分析では、トリプシンベースのアッセイを使用して、様々なＣＫＰ：ＮＬＰモル比（０、１３．４、２８．６、及び６３）で、遊離ＣＫＰ、ＣＫＰ－Ｃ１６、及びＣＫＰ－ＮＬＰの様々な濃度でＣＫＰ活性を測定した（図１１Ｄ）。ＮＬＰ－ＣＫＰの組み立ては比較的再現性があるが、最終的な組成物間のばらつきが一般的に観察される。本調製物のＣＫＰ：ＮＬＰモル比は、上記の試料とはわずかに異なっていた。遊離ＣＫＰ（三角、図１１Ｄ）及びＣＫＰ－Ｃ１６（丸、図１１Ｄ）分子はほぼ同等のＫｉａｐｐ（０．１６）で同等の効力を有し、ＣＫＰが０のＣＫＰ－ＮＬＰ試料は活性がなかった（十字、図１１Ｄ）。また、ＣＫＰ－ＮＬＰは、ＣＫＰ負荷密度に関係なく、ほぼ同等の効力を有していた（星及び四角、図１１Ｄ）。しかし、ＣＫＰ－ＮＬＰにおけるＣＫＰの全体的な効力は、遊離ＣＫＰ及びＣＫＰ－Ｃ１６の約５分の１であった。理論に拘束されるものではないが、これは、（Ｋｉａｐｐ～０．４ｎＭ）又はＮＬＰ表面に固定されたＣＫＰを有することからの立体障害効果によるものであり得る。活性リガンドの固定化が立体効果のために活性に影響を与える可能性があることはよく知られている（以下の参考文献２７、２８を参照）。あるいは、ＣＫＰ－Ｃ１６は、脂質とＣＫＰ－Ｃ１６の間の化学ポテンシャルの違いによりクラスターへの相分離プロセスを経る可能性があり、これらのクラスターはＣＫＰ活性に悪影響を及ぼす。このような活性に対する悪影響にもかかわらず、ＣＫＰはＮＬＰプラットフォームに負荷された場合でも依然として極めて強力であった。
実施例９：ＣＫＰ－ＮＬＰ安定性に対するＣＫＰ負荷の効果
薬物送達プラットフォームとしてのＮＬＰの注意点の１つは、複雑な生物学的環境における安定性の低さである（以下の参考文献９、２４、２５を参照）。例えば、３７℃での５０％血清中のＤＯＰＣ ＮＬＰの半減期は、３～６時間であると報告されており（以下の参考文献９を参照）、これは、ナノ粒子の潜在的な全身半減期（２４～４８時間）よりも短い。最近、二重層コアを架橋すると安定性が著しく向上することが実証され（下記の参考文献２４を参照）、架橋ＮＬＰについては１００％血清中で４８時間にわたってＮＬＰの分解は観察されず、架橋の非存在下では非常に急速な分解（約１０分）が観察された（以下の参考文献２４を参照）。しかし、このアプローチは、既知の自然な分解又は生体内分解経路を持たない非天然の架橋脂質の添加に起因した安全性のリスクの増加と関連する可能性がある。最近、ＮＬＰプラットフォームへのＦａｂのコンジュゲーションがＮＬＰの安定性を劇的に改善することが報告されたことが報告された（以下の参考文献１８を参照）。ＣＫＰ ＮＬＰ安定性に対するＣＫＰ組み込みの効果を以下のように評価した。ＣＫＰ－ＮＬＰの安定性は、フルオロフォアタグを使用して５０％血清中で評価し、ＳＥＣによる時間の関数としての分解をモニターした。インビボ条件を模倣するために、５０％血清を選択した。これらの研究では、ＡＦ４８８標識ＣＫＰ－ＮＬＰを異なる時間間隔でＳＥＣに注入し、ＣＫＰ－ＮＬＰの溶出を４９５ｎｍの吸光度でモニターした。このフルオロフォア及び吸光度特性は、血清／ＣＫＰ－ＮＬＰ試料中の血清タンパク質及び成分の固有の吸光度と重複しない分光測光特性のために選択された。図１２Ａは、異なる時点におけるＣＫＰを含まないネイキッドＮＬＰのＳＥＣクロマトグラムを示す。ＳＥＣクロマトグラムで最初に観測された保持時間５．２５分のピークはＣＫＰ－ＮＬＰに対応し、保持時間７．１分の３番目のピークは遊離ａｐｏＥ４２２ｋに対応した。インキュベーション時間が増加するにつれ、ＣＫＰ－ＮＬＰピークの減少と遊離ａｐｏＥ４２２ｋピークの増加が観察された。ＮＬＰピークの減少は、ＮＬＰ分解の直接的な尺度であり、曲線下の面積を計算することによって定量化された。全ての試料で、保持時間６．２分の中間ピークが観察され、このピークはインキュベーション時間によって変化しなかった。全ての試料と時点でこのピークの一貫性を考えると、ピークは血清中のバックグラウンド汚染物質が原因である可能性がある。
安定性に対するＣＫＰ負荷の効果を体系的に評価するために、様々な量のＣＫＰ－Ｃ１６を含むＣＫＰ－ＮＬＰ（０、１０、及び３６ＣＫＰ／ＮＬＰ）を使用してこれらの実験を行った。ＣＫＰ－ＮＬＰのＳＥＣピーク面積は、異なるＣＫＰ－ＮＬＰコンジュゲート間での比較を可能にするために、時間０ｈのピーク面積に対して正規化された。ＮＬＰへのＦａｂコンジュゲーションについて報告された効果とは対照的に、ＣＫＰ－Ｃ１６の組み込みは、ＮＬＰの全体的な安定性に影響を与えないように見えた（図１２Ｂ）。全てのＣＫＰ－ＮＬＰ試料は、３７℃で２～４時間後にはわずか５０％の材料しか残っていない初期の急速な分解を示し、その後、残りの２４時間のインキュベーション期間でゆっくりと分解された。この分解パターンは、ＮＬＰに関する以前の報告と非常に一致している（以下の参考文献１８、２４を参照）。これらの知見は、実施例５に記載されるように、ＮＬＰ表面へのＦａｂコンジュゲーションについて以前に観察された安定化効果が、より小さなサイズの分子（Ｆａｂは約４５ｋＤａであり、ＣＫＰは約３ｋＤａである）には適用されないことを示唆している。理論に拘束されるものではないが、Ｆａｂは、両親媒性ナノ粒子を不安定にする可能性がある血清タンパク質との相互作用を防ぐ物理的障壁を形成する可能性がある（Ｄａｒｗｉｓｈ Ｍ，Ｓｈａｔｚ Ｗ，Ｌｅｏｎａｒｄ Ｂ，Ｌｏｙｅｔ Ｋ，Ｂａｒｒｅｔｔ Ｋ，Ｗｏｎｇ ＪＬ，Ｌｉ Ｈ，Ａｂｒａｈａｍ Ｒ，Ｌｉｎ Ｍ，Ｆｒａｎｋｅ Ｙ，Ｔａｍ Ｃ，Ｍｏｒｔａｒａ Ｋ，Ｚｉｌｂｅｒｌｅｙｂ Ｉ，Ｂｌａｎｃｈｅｔｔｅ ＣＤ，“Ｎａｎｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｓ ａ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ Ｆａｂ Ｂａｓｅｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０２０，３１，８ １９９５－２００７）。Ｆａｂコンジュゲーションの安定化効果を観察する前に、７のＦａｂモル負荷が必要であることが以前に報告されており、これは、ＮＬＰ表面に付加された約３１５ｋＤａのＭＷに相当する。対照的に、８６ＣＫＰ／ＮＬＰの最高のＣＫＰ負荷は、約２６０ｋＤａの付加的なＭＷしか構成しなかった。したがって、Ｆａｂコンジュゲーションによる安定化の増加が主にＮＬＰ表面に追加されたＭＷによって促進される場合、そのＮＬＰを安定させるために必要なＭＷの量は、最高のＣＫＰ負荷でも達成されなかった。これは、ＣＫＰの組み込みで安定化効果が観察されなかった理由を説明している可能性がある。あるいは、安定化効果は付加された分子量だけでなく、コンジュゲート実体の流体力学的サイズにも起因している。全体的なＮＬＰ構造を破壊することなく、表面上により多くのＣＫＰを負荷することができたとしても、安定化効果が観察されなかった可能性がある。これらの組み合わせた知見は、ＣＫＰのインビボ投与には循環半減期と安定性に制限があり、この技術を疾患治療に適用する際には、これらの制限を考慮しなければならないことを示唆する。
実施例１０：Ｆａｂ－ＣＫＰ－ＮＬＰコンジュゲートの組み立て、精製及び特徴づけ
ＣＫＰとＦａｂの両方をＮＬＰに組み込むことで、複数の機能的活性を持つナノ粒子プラットフォームの開発が可能になるであろう。例えば、ＮＬＰは、標的指向化活性（例えば、ＨＥＲ２、ＣＤ２０など）を示すＦａｂ及び治療活性を示すＣＫＰを含み得る。あるいは、ＮＬＰは、相乗的な治療活性又は相補的な治療活性を示すＦａｂ及びＣＫＰを含み得る。ＣＫＰとＦａｂの両方をＮＬＰに組み込む可能性は、次のように評価された。ＣＫＰとＦａｂの両方をＮＬＰプラットフォームに組み込むために開発された戦略を図１３Ａに示す。ＣＫＰ－ＮＬＰ組み立ての同じ方法を採用し、機能性反応タグを含むＦａｂへのその後のコンジュゲーションのために官能化ＰＥＧ脂質を加えた（図１３Ａ）。ＰＥＧ脂質頭部基が末端反応性マレイミドを有し、ＦａｂがＣ末端システインアミノ酸を含有するマレイミド－チオールバイオコンジュゲーション戦略を使用して、ＦａｂをＮＬＰにコンジュゲートさせた（以下の参考文献１８を参照）。マレイミドメチルシクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ＭＣＣ）頭部基で官能化されたＤＯＰＥ脂質を使用したチオール－マレイミド化学によるＦａｂのコンジュゲーション戦略は、実施例１に記載されている。ＤＯＰＥ－ＭＣＣ脂質を用いて最初のパイロットＮＬＰ組み立てを実施したところ、脂質混合物にＣＫＰ－Ｃ１６を添加すると沈殿が一貫して観察されたが、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－Ｍａｌを使用した場合には観察されなかった。したがって、ＮＬＰプラットフォームへのＦａｂコンジュゲーションのさらなる最適化のために、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－Ｍａｌを使用した。ＣＫＰ－ＮＬＰは、１０％モルのＤＳＰＥ－ＰＥＧ－Ｍａｌ脂質で組み立てられ、ＦａｂコンジュゲーションのためにＮＬＰ表面上で十分なマレイミドリガンド密度を確実にした。Ｃ末端システインを含むヒト抗Ｄ因子Ｆａｂが、この分子が以前にチオール－マレイミドコンジュゲーションを介してＰＥＧポリマー足場（下記の参考文献２２を参照）及びＮＬＰ（下記の参考文献１８を参照）に首尾よくコンジュゲートしていたため、サロゲートＦａｂとして使用された。Ｆａｂは、ＣＫＰ－ＮＬＰ精製工程なしで、バイオビーズベースのコール酸除去工程の直後に、マレイミド官能化ＣＫＰ－ＮＬＰにコンジュゲートされた。このアプローチは、コンジュゲーション前にマレイミドが加水分解される可能性を最小限に抑えるために用いられた。最初のパイロットコンジュゲーションは、Ｆａｂ：ＣＫＰ－ＮＬＰモル比を２０で行われた。ＦａｂをＣＫＰ－ＮＬＰと共に２～３時間インキュベートし、ＮＡＣをＤＳＰＥ－ＰＥＧ－Ｍａｌの２倍モル濃度で添加して、未反応のマレイミドをクエンチし、以前に記載されたようにＤＯＰＥ－ＭＣＣ：ａｐｏＥ４２２ｋ架橋を防止した（以下の参考文献１６を参照）。Ｆａｂ－ＣＫＰ－ＮＬＰをＳＥＣによって精製し、ＳＥＣクロマトグラムにおいて３つの主要なピークが観察された：Ｆａｂ－ＣＫＰ－ＮＬＰコンジュゲート（ｒｔ～１０分）、Ｆａｂ二量体（ｒｔ～１４分）、及び非コンジュゲートＦａｂ（ｒｔ～１６分）（図１３Ｂ）。コンジュゲーション反応後のＦａｂ二量体の存在は、以前に記載されたように、コンジュゲーション工程中のＦａｂのＣ末端チオールでのジスルフィド形成による二量体化によるものであった（以下の参考文献１８を参照）。ＮＬＰピークの中心を横切る画分を収集し、プールして、ＨＰＬＣ及びＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析に供した。精製され還元されたＦａｂ－ＣＫＰ－ＮＬＰ試料の例示的なＨＰＬＣクロマトグラムを図１３Ｃに示す。ピークが保持時間１．７５、２．０５、２．８、３．１、３．４、及び３．９５分で観察され、それぞれ、Ｆａｂ軽鎖、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－Ｍａｌ、ａｐｏＥ４２２ｋ、ＣＫＰ－Ｃ１６、Ｆａｂ重鎖－ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－Ｍａｌコンジュゲート、及びＤＯＰＣに対応した。各成分の検量線を作成し、ＣＫＰ－Ｃ１６の組み込みとＦａｂのコンジュゲーションの定量化に使用した。図１３Ｃに示される典型的なＨＰＬＣクロマトグラムは、１８ＣＫＰ／ＮＬＰ及び２３Ｆａｂ／ＮＬＰに対応するものである。ＣＫＰ－ＮＬＰについて説明したように、粒子径もＳＥＣ－ＭＡＬＳによって測定した（図１３Ｄ～１３Ｅ）。Ｆａｂ－ＣＫＰ－ＮＬＰピークのＭＷの変動性（２２０ｋＤａ～１５００ｋＤａ、平均ＭＷは７００ｋＤａ）は、ＣＫＰ－ＮＬＰ（２００～４００ｋＤａ、ピークを横切る平均ＭＷは２６６ｋＤａ）よりも著しく広かった（図１３Ｄ）。また、Ｆａｂ－ＣＫＰ－ＮＬＰピークを横切るＲｈの変動性にも、同様の傾向が見られた。理論に拘束されるものではないが、Ｆａｂ－ＣＫＰ－ＮＬＰのＭＷ及びＲｈの変動性の増加は、コンジュゲートしたＦａｂ／ＮＬＰの数の分布による可能性がある。このＦａｂ－ＣＫＰ－ＮＬＰ試料のＨＰＬＣ分析に基づくと、平均で２０Ｆａｂ／ＮＬＰが存在した；しかしながら、Ｆａｂ／ＮＬＰの分布はガウス分布であり、０（ＭＷ約３００ｋＤａ）から３０（ＭＷ約１５００ｋＤａ）まで変化するＦａｂを持つＣＫＰ－ＮＬＰが見られると予想される。Ｆａｂ－ＣＫＰ－ＮＬＰピークを横切るＲｈの変動性（図１３Ｅ）は、ＣＫＰ－ＮＬＰと類似していた（約２倍）（図１０Ｅ）。ＮＬＰへのＦａｂ及びタンパク質のコンジュゲーションは、ＭＷよりもＲｈへの影響が著しく小さいことが以前に報告された。これは、円盤状のＮＬＰのサイズが、ＮＬＰ表面へのタンパク質コンジュゲーションによって最も影響を受ける二重層の高さではなく、直径によって大きく左右されるためである（以下の参考文献１８を参照）。これらの知見はこの仮説と一致している。
実施例１１：最大Ｆａｂコンジュゲーション、Ｆａｂ－ＣＫＰ－ＮＬＰサイズ、ＣＫＰ活性、及びＦａｂ－ＣＫＰ－ＮＬＰ安定性に対するＣＫＰ及びＦａｂ負荷の効果
Ｆａｂ－ＣＫＰ－ＮＬＰのサイズ、活性及び血清安定性に対するＣＫＰ負荷密度及びＦａｂ負荷密度の影響を以下のように調べた。ＣＫＰ－ＮＬＰは、２つのＣＫＰ負荷密度、１２．７ＣＫＰ／ＮＬＰ（「低ＣＫＰ－ＮＬＰ」と呼ばれる）及び４０ＣＫＰ／ＮＬＰ（「高ＣＫＰ－ＮＬＰ」と呼ばれる）で１０ｍｏｌ％ ＤＯＰＥ－ＰＥＧ－Ｍａｌを用いて組み立てられ、異なるＦａｂ対ＣＫＰ－ＮＬＰ比でＦａｂとコンジュゲートした。図１４Ａは、Ｆａｂ対ＣＫＰ－ＮＬＰ比が０～１５０の範囲でＦａｂにコンジュゲートした低ＣＫＰ－ＮＬＰのＳＥＣクロマトグラムを示している。１５０という最高のＦａｂ：ＮＬＰ比は、約１Ｆａｂ：１ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－Ｍａｌに相当した。ＣＫＰ－ＮＬＰピークは、約１５０の飽和レベルまでＦａｂ濃度の増加に伴って徐々に増加した。Ｆａｂコンジュゲーション率の増加に伴い、Ｆａｂ二量体と非コンジュゲートＦａｂピークが徐々に増加することが観察された。これを高ＣＫＰ－ＮＬＰについて繰り返し、コンジュゲートしたＦａｂの量を実施例６に記載のように定量化した（図１４Ｂ）。両方のＣＫＰ組成物について、反応中のＦａｂ：ＮＬＰ比が０から１００に増加すると、コンジュゲートＦａｂ負荷（ＮＬＰに実際に付着した量）の直線的な増加が観察された。しかし、より高い比率では、Ｆａｂ負荷の増加は最小限から全く観察されず、ＮＬＰ表面にコンジュゲートしたＦａｂの飽和量は、約５０Ｆａｂ／ＮＬＰであると決定された（図１４Ｂ）。対照的に、１０ｍｏｌ％ ＤＯＰＥ－ＭＣＣ脂質組成でＤＯＰＥ－ＭＣＣ脂質を介してＮＬＰ表面に直接コンジュゲートした場合、最大Ｆａｂ負荷容量は３０であると以前に報告されていた。この最大負荷容量は、利用可能なＮＬＰ表面積によって駆動されることが示唆されており、ＮＬＰ表面積と３０Ｆａｂが占める全体の表面積との間に強い相関関係があった。ＣＫＰ－ＮＬＰの表面積は、Ｄａｒｗｉｓｈ Ｍ，Ｓｈａｔｚ Ｗ，Ｌｅｏｎａｒｄ Ｂ，Ｌｏｙｅｔ Ｋ，Ｂａｒｒｅｔｔ Ｋ，Ｗｏｎｇ ＪＬ，Ｌｉ Ｈ，Ａｂｒａｈａｍ Ｒ，Ｌｉｎ Ｍ，Ｆｒａｎｋｅ Ｙ，Ｔａｍ Ｃ，Ｍｏｒｔａｒａ Ｋ，Ｚｉｌｂｅｒｌｅｙｂ Ｉ，Ｂｌａｎｃｈｅｔｔｅ ＣＤ，“Ｎａｎｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｓ ａ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ Ｆａｂ Ｂａｓｅｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０２０，３１，８ １９９５－２００７に記載されているものと同様であったため、Ｆａｂ負荷の増加は表面積の増加に起因するものではない可能性がある。ＣＫＰの非存在下において同様のＦａｂ結合容量の増加が観察され、この効果がＮＬＰ表面上のＣＫＰの存在によるものではないことを示唆している。この研究において、Ｆａｂは表面に直接コンジュゲートしていたのではなく、ＮＬＰ表面から伸びるＰＥＧ２０００リンカーにコンジュゲートしていた。したがって、ＮＬＰ表面への直接コンジュゲーションと比較した場合、スペーサーが全体的なコンジュゲーション体積を増加させ、立体障害を制限して、より多くのＦａｂをＮＬＰにコンジュゲートさせることができたと考えられる。ＣＫＰ密度は、Ｆａｂ負荷に大きな影響を与えなかった（図１４Ｂ）。したがって、この結果は、ＣＫＰ負荷が高いほど立体障害が大きくなる可能性があることを考えると、予想外であった。理論に拘束されるものではないが、ＰＥＧリンカーは、ＮＬＰ表面とＦａｂ負荷のためのコンジュゲーションハンドルとの間にスペーサーを作るので、ＣＫＰからの立体的な影響を排除することができる。
ＮＬＰサイズに対するＦａｂ負荷の影響をさらに評価するために、Ｒｈは高ＣＫＰ ＮＬＰ及び低ＣＫＰ ＮＬＰの両方について異なるＦａｂ負荷でＳＥＣ－ＭＡＬＳによって測定された（図１４Ｃ）。Ｆａｂ負荷を０から１０Ｆａｂ／ＮＬＰまで増加させるとＲｈの増加が観察され、Ｆａｂ負荷を１０から５０Ｆａｂ／ＮＬＰまで増加させると最小限の増加しか観察されなかった。これらの結果は、以前の知見（以下の参考文献９、１１、１８を参照）と一致しており、ＦａｂコンジュゲーションはＮＬＰの円盤状の性質を変更せず、Ｆａｂの負荷ではなくＮＬＰの直径と表面積がＲｈのドライバーであることを示唆している。
ＦａｂのＮＬＰ表面へのコンジュゲーションは、分析物とＣＫＰとの相互作用に対して潜在的な物理的障壁を作り出す可能性がある。したがって、ＣＫＰ活性に対するＦａｂ負荷の影響を評価するために、様々なＦａｂ密度を有する低ＣＫＰ－ＮＬＰ及び高ＣＫＰ－ＮＬＰの両方におけるＣＫＰ活性を評価した（図１４Ｄ）。Ｆａｂ密度は、高ＣＫＰ－ＮＬＰ製剤及び低ＣＫＰ－ＮＬＰ製剤の両方に対してＣＫＰ活性に影響を与えず、試料間の基質阻害定数（Ｋｉ ａｐｐ）の差はアッセイの誤差内（０．３～０．０５ｎＭ）であった。対照的に、実施例８で論じたように、ＣＫＰ活性の減少は、Ｆａｂコンジュゲーションの非存在下で観察された。Ｆａｂ－ＣＫＰ－ＮＫＰにおいて観察されたこれらの予想外の結果は、非常に再現性が高かった。これらの結果は、Ｆａｂ負荷を１～５０Ｆａｂ／ＣＫＰ－ＮＬＰにおいて確実に制御できること、Ｆａｂ負荷の程度がＣＫＰ密度に依存しないこと、及びＦａｂコンジュゲーションは、Ｆａｂ密度に関係なく、ＣＫＰ活性に影響を与えないようであることを示している。理論に拘束されるものではないが、Ｆａｂがトリプシンに非特異的に結合し、ＮＬＰ表面で有効なトリプシン濃度を増加させる可能性がある。ＣＫＰ－Ｃ１６がパッチに相分離し、Ｆａｂコンジュゲーションの非存在下で活性の低下をもたらす場合、この効果はＦａｂコンジュゲーション後に軽減され、活性が回復したと考えることができる。
実施例５に記載されるように、Ｆａｂコンジュゲーションは、おそらく血清タンパク質に対する立体障壁を提供することによって、ＮＬＰの安定性に劇的な影響を与えることができる。これらの知見がＣＫＰ－ＮＬＰプラットフォームに拡張できるかどうかを判断するために、Ｆａｂ－ＣＫＰ－ＮＬＰ（５０Ｆａｂ／ＮＬＰ及び２０ＣＫＰ／ＮＬＰ）の安定性を５０％血清中のＣＫＰ－ＮＬＰ（２０ＣＫＰ／ＮＬＰ）と比較した（図１４Ｅ）。「空の」ＮＬＰ（すなわち、ＣＫＰ及び／又はＦａｂが負荷されていないＮＬＰ）で観察されたように、ＦａｂコンジュゲーションはＣＫＰ－ＮＬＰの安定性に大きな影響を与えた。ＣＫＰ－ＮＬＰは急速に分解し、最初の４時間以内に粒子の５０％以上が分解された。対照的に、Ｆａｂ－ＣＫＰ－ＮＬＰは驚くほど安定しており、材料の７５％以上が２４時間にわたってインタクトなままであった。理論に拘束されるものではないが、これらの知見は、ＦａｂがＰＥＧスペーサーを介して結合し、ＮＬＰ表面上に付加的分子ペプチド実体が存在する場合でも、Ｆａｂ層の安定化効果が維持されることを示唆している。
実施例７～１１からの結論
実施例７～１１は、ＣＫＰ－ＮＬＰ及びＦａｂ－ＣＫＰ－ＮＬＰコンジュゲートの両方の開発及び特徴づけを記載する。ＣＫＰを組み込むために、ＣＫＰにＣ１６炭化水素テールを追加する自己組織化戦略が開発され、これにより、組み立てプロセス中に二重層コアに分配し、ＮＬＰ表面にＣＫＰを提示することができる。ＮＬＰは、ＮＬＰ組み立てプロセスに影響を与えることなく、最大６０個のＣＫＰ－Ｃ１６分子を収容することができた。ＮＬＰへのＣＫＰ－Ｃ１６の組み込みは、ＣＫＰトリプシン阻害活性をわずかに低下させたが、分子は依然として非常に強力であった（サブナノモルバインダー）。ＣＫＰ－ＮＬＰの安定性は、ＮＬＰ単独と同等であり、３７℃の５０％血清中で比較的短い半減期（～１時間）を持つことがわかった。ＮＬＰプラットフォームへのＦａｂコンジュゲーションは、マレイミド基がＰＥＧスペーサーに結合したチオール反応性マレイミド脂質を導入することによって達成された。このコンジュゲーション戦略を使用すると、Ｆａｂ負荷は１～５０Ｆａｂ／ＣＫＰ－ＮＬＰの範囲で確実に制御でき、Ｆａｂ負荷の程度はＣＫＰ密度に依存しなかった。Ｆａｂコンジュゲーションも、Ｆａｂ密度に関係なくＣＫＰ活性に影響を与えなかった。最後に、ＦａｂコンジュゲーションはＣＫＰ－ＮＬＰの安定性の改善に大きな影響を与え、３７℃で２４時間インキュベーションした後もＦａｂ－ＣＫＰ－ＮＬＰの７５％以上がインタクトなままであった。これらの組み合わせた知見は、ＮＬＰがペプチド様薬物候補の潜在的な送達のための有望なプラットフォームであることを示唆している。さらに、標的化又は多剤送達は、ＣＫＰ－ＮＬＰへの標的指向化又は治療用Ｆａｂのコンジュゲーションを通じて達成することができる。
実施例６～１１の参考文献
(1) Ackerman, S. E., Currier, N. V., Bergen, J. M., and Cochran, J. R. (2014) Cystine-knot peptides: emerging tools for cancer imaging and therapy. Expert Rev Proteomics 11, 561-72.
(2) Gao, X., Stanger, K., Kaluarachchi, H., Maurer, T., Ciepla, P., Chalouni, C., Franke, Y., and Hannoush, R. N. (2016) Cellular uptake of a cystine-knot peptide and modulation of its intracellular trafficking. Sci Rep 6, 35179.
(3) Reinwarth, M., Nasu, D., Kolmar, H., and Avrutina, O. (2012) Chemical synthesis, backbone cyclization and oxidative folding of cystine-knot peptides: promising scaffolds for applications in drug design. Molecules 17, 12533-52.
(4) Bazak, R., Houri, M., El Achy, S., Kamel, S., and Refaat, T. (2015) Cancer active targeting by nanoparticles: a comprehensive review of literature. J Cancer Res Clin Oncol 141, 769-84.
(5) Fischer, N. O., Blanchette, C. D., Segelke, B. W., Corzett, M., Chromy, B. A., Kuhn, E. A., Bench, G., and Hoeprich, P. D. (2010) Isolation, characterization, and stability of discretely-sized nanolipoprotein particles assembled with apolipophorin-III. PLoS One 5, e11643.
(6) Blanchette, C. D., Law, R., Benner, W. H., Pesavento, J. B., Cappuccio, J. A., Walsworth, V., Kuhn, E. A., Corzett, M., Chromy, B. A., Segelke, B. W., Coleman, M. A., Bench, G., Hoeprich, P. D., and Sulchek, T. A. (2008) Quantifying size distributions of nanolipoprotein particles with single-particle analysis and molecular dynamic simulations. J Lipid Res 49, 1420-30.
(7) Martinez, D., Decossas, M., Kowal, J., Frey, L., Stahlberg, H., Dufourc, E. J., Riek, R., Habenstein, B., Bibow, S., and Loquet, A. (2017) Lipid Internal Dynamics Probed in Nanodiscs. Chemphyschem 18, 2651-2657.
(8) Mors, K., Roos, C., Scholz, F., Wachtveitl, J., Dotsch, V., Bernhard, F., and Glaubitz, C. (2013) Modified lipid and protein dynamics in nanodiscs. Biochim Biophys Acta 1828, 1222-9.
(9) Fischer, N. O., Weilhammer, D. R., Dunkle, A., Thomas, C., Hwang, M., Corzett, M., Lychak, C., Mayer, W., Urbin, S., Collette, N., Chiun Chang, J., Loots, G. G., Rasley, A., and Blanchette, C. D. (2014) Evaluation of nanolipoprotein particles (NLPs) as an in vivo delivery platform. PLoS One 9, e93342.
(10) Fischer, N. O., Rasley, A., Corzett, M., Hwang, M. H., Hoeprich, P. D., and Blanchette, C. D. (2013) Colocalized delivery of adjuvant and antigen using nanolipoprotein particles enhances the immune response to recombinant antigens. J Am Chem Soc 135, 2044-7.
(11) Blanchette, C. D., Fischer, N. O., Corzett, M., Bench, G., and Hoeprich, P. D. (2010) Kinetic analysis of his-tagged protein binding to nickel-chelating nanolipoprotein particles. Bioconjug Chem 21, 1321-30.
(12) He, W., Felderman, M., Evans, A. C., Geng, J., Homan, D., Bourguet, F., Fischer, N. O., Li, Y., Lam, K. S., Noy, A., Xing, L., Cheng, R. H., Rasley, A., Blanchette, C. D., Kamrud, K., Wang, N., Gouvis, H., Peterson, T. C., Hubby, B., and Coleman, M. A. (2017) Cell-free production of a functional oligomeric form of a Chlamydia major outer-membrane protein (MOMP) for vaccine development. J Biol Chem 292, 15121-15132.
(13) Tufteland, M., Pesavento, J. B., Bermingham, R. L., Hoeprich, P. D., Jr., and Ryan, R. O. (2007) Peptide stabilized amphotericin B nanodisks. Peptides28, 741-6.
(14) Jia, J., Xiao, Y., Liu, J., Zhang, W., He, H., Chen, L., and Zhang, M. (2012) Preparation, characterizations, and in vitro metabolic processes of paclitaxel-loaded discoidal recombinant high-density lipoproteins. J Pharm Sci101, 2900-8.
(15) Weilhammer, D., Dunkle, A. D., Blanchette, C. D., Fischer, N. O., Corzett, M., Lehmann, D., Boone, T., Hoeprich, P., Driks, A., and Rasley, A. (2017) Enhancement of antigen-specific CD4(+) and CD8(+) T cell responses using a self-assembled biologic nanolipoprotein particle vaccine. Vaccine35, 1475-1481.
(16) Kuai, R., Sun, X., Yuan, W., Xu, Y., Schwendeman, A., and Moon, J. J. (2018) Subcutaneous Nanodisc Vaccination with Neoantigens for Combination Cancer Immunotherapy. Bioconjug Chem 29, 771-775.
(17) Weilhammer, D. R., Blanchette, C. D., Fischer, N. O., Alam, S., Loots, G. G., Corzett, M., Thomas, C., Lychak, C., Dunkle, A. D., Ruitenberg, J. J., Ghanekar, S. A., Sant, A. J., and Rasley, A. (2013) The use of nanolipoprotein particles to enhance the immunostimulatory properties of innate immune agonists against lethal influenza challenge. Biomaterials 34, 10305-18.
(18) Darwish, M., Shatz, W., Leonard, B., Loyet, K., Barrett, K., Wong, J. L., Li, H., Abraham, R., Lin, M., Franke, Y., Tam, C., Mortara, K., Zilberleyb, I., and Blanchette, C. (2020) Nanolipoprotein Particles as a Delivery Platform for Fab Based Therapeutics. Bioconjug Chem 31, 1995-2007.
(19) Fischer, N. O., Blanchette, C. D., Chromy, B. A., Kuhn, E. A., Segelke, B. W., Corzett, M., Bench, G., Mason, P. W., and Hoeprich, P. D. (2009) Immobilization of His-tagged proteins on nickel-chelating nanolipoprotein particles. Bioconjug Chem 20, 460-5.
(20) Zhang, Y. N., Appleton, B. A., Wiesmann, C., Lau, T., Costa, M., Hannoush, R. N., and Sidhu, S. S. (2009) Inhibition of Wnt signaling by Dishevelled PDZ peptides. Nat Chem Biol 5, 217-219.
(21) Fischer, N. O., Infante, E., Ishikawa, T., Blanchette, C. D., Bourne, N., Hoeprich, P. D., and Mason, P. W. (2010) Conjugation to nickel-chelating nanolipoprotein particles increases the potency and efficacy of subunit vaccines to prevent West Nile encephalitis. Bioconjug Chem 21, 1018-22.
(22) Shatz, W., Hass, P. E., Peer, N., Paluch, M. T., Blanchette, C., Han, G., Sandoval, W., Morando, A., Loyet, K. M., Bantseev, V., Booler, H., Crowell, S., Kamath, A., Scheer, J. M., and Kelley, R. F. (2019) Identification and characterization of an octameric PEG-protein conjugate system for intravitreal long-acting delivery to the back of the eye. PLoS One 14, e0218613.
(23) Gao, T., Blanchette, C. D., He, W., Bourguet, F., Ly, S., Katzen, F., Kudlicki, W. A., Henderson, P. T., Laurence, T. A., Huser, T., and Coleman, M. A. (2011) Characterizing diffusion dynamics of a membrane protein associated with nanolipoproteins using fluorescence correlation spectroscopy. Protein Sci20, 437-47.
(24) Gilmore, S. F., Blanchette, C. D., Scharadin, T. M., Hura, G. L., Rasley, A., Corzett, M., Pan, C. X., Fischer, N. O., and Henderson, P. T. (2016) Lipid Cross-Linking of Nanolipoprotein Particles Substantially Enhances Serum Stability and Cellular Uptake. ACS Appl Mater Interfaces 8, 20549-57.
(25) Gilmore, S. F., Carpenter, T. S., Ingolfsson, H. I., Peters, S. K. G., Henderson, P. T., Blanchette, C. D., and Fischer, N. O. (2018) Lipid composition dictates serum stability of reconstituted high-density lipoproteins: implications for in vivo applications. Nanoscale 10, 7420-7430.
(26) Lichtenberg, D., Ahyayauch, H., and Goni, F. M. (2013) The mechanism of detergent solubilization of lipid bilayers. Biophys J 105, 289-99.
(27) Shuai, W., Das, R. K., Naghdi, M., Brar, S. K., and Verma, M. (2017) A review on the important aspects of lipase immobilization on nanomaterials. Biotechnol Appl Biochem 64, 496-508.
(28) Bagheri, M., Beyermann, M., and Dathe, M. (2009) Immobilization reduces the activity of surface-bound cationic antimicrobial peptides with no influence upon the activity spectrum. Antimicrob Agents Chemother 53, 1132-41．

Claims (217)

  1. 足場タンパク質、膜形成脂質、及び抗原結合ポリペプチドを含む、コンジュゲートであって、
    ここで、前記膜形成脂質が脂質二重層に配列され、前記足場タンパク質が前記二重層を取り囲み；
    前記抗原結合ポリペプチドが、前記１つ又は複数の膜形成脂質上の官能化基と前記抗原結合ポリペプチド上のＣ末端に位置する相補的官能基とを介して、前記二重層の一方又は両方の表面上で前記膜形成脂質の１つ又は複数にコンジュゲートしており；
    場合によって、スペーサーが前記官能化基を前記膜形成脂質に接続し、且つ／又はスペーサーが前記相補的官能基を前記抗原結合ポリペプチドに接続する、コンジュゲート。
  2. 前記官能化基が、マレイミド誘導体、ハロアセトアミド、ピリジルジチオプロピオネート、チオスルフェート、及びそれらのいずれか１つ又は複数の組み合わせからなる群から選択され；前記相補的官能基が、遊離チオール基である、請求項１に記載のコンジュゲート。
  3. 前記チオール基がシステインチオール基であり、場合によって、前記システインアミノ酸残基が、抗原結合ポリペプチドが由来する抗体においてヒンジジスルフィド結合を形成する（例えば、Ｃｙｓ－２２６又はＣｙｓ－２２７）、請求項２に記載のコンジュゲート。
  4. 前記官能化基が、前記足場タンパク質にコンジュゲートしない、請求項１～３のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  5. 前記足場タンパク質が、（ａ）アポリポタンパク質Ａ、（ｂ）アポリポタンパク質Ｂ、（ｃ）アポリポタンパク質Ｃ、（ｄ）アポリポタンパク質Ｄ、（ｅ）アポリポタンパク質Ｈ、（ｆ）アポリポタンパク質Ｅ、（ｇ）前記二重層を安定化することができる（ａ）～（ｆ）の切断型、及び（ｈ）（ａ）～（ｇ）のいずれか１つ又は複数の組み合わせからなる群から選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  6. 前記膜形成脂質が、Ｃ４－２８脂肪酸アシル（例えば、Ｃ１６脂肪酸アシル）、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＯＰＳ、ＤＯＰＥ、ＤＰＰＣ、及びそれらのいずれか１つ又は複数の組み合わせからなる群から選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  7. 前記膜形成脂質の１つ又は複数がＣ４－２８脂肪酸アシルであり、前記脂肪酸アシルが２０～６０アミノ酸の短いペプチドにコンジュゲートしている、請求項１～６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  8. 足場タンパク質、膜形成脂質、及び２０～６０アミノ酸の短いペプチドを含むコンジュゲートであって、
    ここで、前記膜形成脂質が脂質二重層に配列され、前記足場タンパク質が前記二重層を取り囲み；
    前記短いペプチドが、前記二重層の一方又は両方の表面上で前記膜形成脂質の１つ又は複数にコンジュゲートしている、コンジュゲート。
  9. 前記膜形成脂質が、Ｃ４－２８脂肪酸アシル（例えば、Ｃ１６脂肪酸アシル）、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＯＰＳ、ＤＯＰＥ、ＤＰＰＣ、及びそれらのいずれか１つ又は複数の組み合わせからなる群から選択される、請求項８に記載のコンジュゲート。
  10. 前記膜形成脂質の１つ又は複数がＣ４－２８脂肪酸アシルであり、前記脂肪酸アシルが２０～６０アミノ酸の短いペプチドにコンジュゲートしている、請求項８又は９に記載のコンジュゲート。
  11. 前記脂肪酸アシルがＣ１６脂肪酸アシルである、請求項７又は１０に記載のコンジュゲート。
  12. 前記短いペプチドがシスチンノットペプチド（ＣＫＰ）である、請求項７～１１のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  13. ＣＫＰが、ＥＥＴＩ－ＩＩ、サーキュリンＡ、ｃｙｃｌｏｐｓｙｃｈｏｔｒｉｄｅ Ａ、シクロビオラシンＯ１、シクロビオラシンＯ１２、カラタＢ１、カラタＢ８、ｐａｌｉｃｏｕｒｅｉｎ、ｔｒｉｃｙｃｌｏｎ Ａ、ＭＣｏＴＩ １、ＳＯＴＩ １、サーキュリンＢ、ｃｙｃｌｏｐｓｙｃｈｏｔｒｉｄｅ、又はｖａｒｖペプチドＡである、請求項１２に記載のコンジュゲート。
  14. 短いペプチドが、ＣＫＰバリアントであって、
    （ａ）野生型ＣＫＰの対応する１つ若しくは複数のループ配列と比較して、１つ若しくは複数のループ配列中に１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／若しくは置換；
    （ｂ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｎ末端に１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／若しくは置換；
    （ｃ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｃ末端に１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／若しくは置換；
    （ｄ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｎ末端に化学修飾；並びに／又は
    （ｅ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｃ末端に化学修飾
    を含むＣＫＰバリアントである、請求項７～１１のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  15. ＣＫＰバリアントが、野生型ＣＫＰと比較して、そのＮ末端に追加のリジン残基を含む、請求項１４に記載のコンジュゲート。
  16. 野生型ＣＫＰがＥＥＴＩ－ＩＩである、請求項１４又は１５に記載のコンジュゲート。
  17. コンジュゲート中の短いペプチドの活性が、抗原結合ポリペプチドを含まないコンジュゲート中のペプチドの活性よりも高い、請求項７～１６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  18. コンジュゲート中のペプチドの活性が、抗原結合ポリペプチドを含まないコンジュゲート中のペプチドの活性よりも２倍から１０倍高い、請求項１７に記載のコンジュゲート。
  19. コンジュゲート中のペプチドの活性が、抗原結合ポリペプチドを含まないコンジュゲート中のペプチドの活性よりも約５倍高い、請求項１５に記載のコンジュゲート。
  20. 前記短いペプチドが生物学的活性を有するＣＫＰ又はＣＫＰバリアントであり、前記活性の８０～９０％、９０～９５％、又は９５～９９％が前記コンジュゲートにおいて保持される、請求項１２～１６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  21. 前記コンジュゲートが、前記短いペプチドの活性又は結合活性を増加させる、請求項７～２０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  22. 前記１つ又は複数の膜形成脂質上の官能化基と前記抗原結合ポリペプチド上のＣ末端に位置する相補的官能基とを介して、前記二重層の一方又は両方の表面上で前記膜形成脂質の１つ又は複数にコンジュゲートしている抗原結合ポリペプチドをさらに含み；
    場合によって、スペーサーが前記官能化基を前記膜形成脂質に接続し、且つ／又はスペーサーが前記相補的官能基を前記抗原結合ポリペプチドに接続する、請求項７～２１のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  23. 前記コンジュゲートが、１～１００分子の前記Ｆａｂを含み；
    場合によって、前記コンジュゲートが、５～３０、１０～２５、１５～２０、若しくは１８分子の前記ペプチド、及び５～４０、１０～３５、１５～３０、２０～２５、若しくは２３分子の前記抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）を含み；又は
    場合によって、前記コンジュゲートが、３～３０、５～２０、１０～１５、若しくは１３分子の前記ペプチド、及び１０～６０分子の前記抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）を含み；又は
    場合によって、前記コンジュゲートが、２０～８０、２５～７０、３０～６０、３５～５０、若しくは４０分子の前記ペプチド、及び１０～６０分子の前記抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）を含む、請求項７～２２のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  24. 少なくとも２つの異なるペプチド－Ｃ４－２８脂肪酸アシルコンジュゲートを含み、ここで、第１のペプチド－Ｃ４－２８脂肪酸アシルコンジュゲートが第１の短いペプチドを含み、第２のペプチド－Ｃ４－２８脂肪酸アシルが第１の短いペプチドとは異なる第２の短いペプチドを含む、請求項７～２３のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  25. 前記少なくとも２つのペプチド（例えば、シスチンノットペプチド）が、異なる標的、場合によって２つ、３つ、４つ、又は８つの異なる標的に結合する、請求項２４に記載のコンジュゲート。
  26. 前記２つ以上の短いペプチドが、２つの異なる標的に結合する、請求項２５に記載のコンジュゲート。
  27. 前記標的が、ＣＤ３及びＣＤ１９；ＣＤ３及びＥｐＣＡＭ；ＣＤ３及びＣＥＡ；ＣＤ１６及びＣＤ３０；ＣＤ１６及びＣＤ３３；Ａｎｇ－２及びＶＥＧＦ－Ａ；並びに第Ｘ因子及び第ＩＸａ因子からなる群から選択される対である、請求項２６に記載のコンジュゲート。
  28. 前記足場タンパク質と前記膜形成脂質が、１：６０から１：１００のモル比、例えば、１：８０などのモル比であり；且つ／又は前記膜形成脂質の２０～３５％、例えば２０％が官能化基を有する、請求項１～２７のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  29. 前記抗原結合ポリペプチドが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ＶＨ－ＶＨ二量体、ＶＬ－ＶＬ二量体、ＶＨ－ＶＬ二量体、単一ドメイン、ダイアボディ、直鎖状抗体、及びそれらのいずれか１つ又は複数の組み合わせからなる群から選択され、特に前記抗原結合ポリペプチドがＦａｂであり；
    場合によって、前記Ｆａｂが、ＯＸ４０、ＤＲ４、ＧＩＴＲ、Ｔｉｅ２、Ｄ因子、ＶＥＧＦ、ＭｅｒＴＫ、ＣＤ３、リンホトキシンベータ受容体、及びそれらのいずれか１つ又は複数の組み合わせからなる群から選択される標的に結合する、請求項１～２８のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  30. 前記コンジュゲートが、２分子以上の前記抗原結合ポリペプチド、場合によって、２～６０、２～３２、１０～３０、又は２０分子の前記抗原結合ポリペプチドを含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  31. 前記コンジュゲートが、１～１６０、１０～１２０、２０～１００、４０～８０、又は６０分子の前記抗原結合ポリペプチドを有し；ここで、前記抗原結合ポリペプチドがＦａｂであり、前記ＦａｂがＰＥＧスペーサーによって前記膜形成脂質に接続されている、請求項３０に記載のコンジュゲート。
  32. 前記ＰＥＧスペーサーが、前記官能化基を前記膜形成脂質に接続し、１０００～３０００、１５００～２５００、１９００～２２００、又は２０００のＭＷを有する、請求項３１に記載のコンジュゲート。
  33. 前記コンジュゲートが、前記抗原結合ポリペプチドの活性又は結合活性を増加させる、請求項３０～３２のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  34. 前記活性がＯＸ４０結合であり、前記コンジュゲートがＦａｂなどの前記抗原結合ポリペプチドの４～８分子を有する、請求項３２に記載のコンジュゲート。
  35. 前記抗原結合ポリペプチドが前記コンジュゲートの血清安定性及び／又は血清半減期を増加させ、
    場合によって、前記血清半減期が、２～２０倍、５～１５倍、又は１０倍増加している、請求項３０～３４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  36. 前記コンジュゲートが、５～６０、６～４０、又は７～３２分子の前記抗原結合ポリペプチドを有する、請求項３５に記載のコンジュゲート。
  37. 前記２つ以上の抗原結合ポリペプチドが、異なる標的又はエピトープ、場合によって、２、３、４、又は８つの異なる標的又はエピトープに結合する、請求項３０～３６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  38. 前記２つ以上の抗原結合ポリペプチドが、２つの異なる標的又はエピトープに結合する、請求項３７に記載のコンジュゲート。
  39. 前記標的が、ＣＤ３及びＣＤ１９；ＣＤ３及びＥｐＣＡＭ；ＣＤ３及びＣＥＡ；ＣＤ１６及びＣＤ３０；ＣＤ１６及びＣＤ３３；Ａｎｇ－２及びＶＥＧＦ－Ａ；並びに第Ｘ因子及び第ＩＸａ因子からなる群から選択される対である、請求項３７に記載のコンジュゲート。
  40. 抗原結合ポリペプチドが、Ｆａｂ又はＦａｂ様分子、場合によって、ヒト又はヒト化Ｆａｂである、請求項１～３９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  41. スペーサーが、ＰＥＧ、又はＧＳＧＳのアミノ酸配列を含む、請求項１～４０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  42. 請求項１～４１のいずれか一項に記載のコンジュゲート及び薬学的に許容されるビヒクルを含む薬学的組成物。
  43. 前記組成物が、１０～５０ｃＰの粘度及び１００～３００ｍｇの前記コンジュゲート／ｍＬの濃度を有する、請求項４２に記載の薬学的組成物。
  44. 請求項１～４１のいずれか一項に記載のコンジュゲート又は請求項４２若しくは４３に記載の薬学的組成物であって、前記コンジュゲート又は組成物が皮下投与されるか又は眼球送達を介して投与される、コンジュゲート又は薬学的組成物。
  45. トレハロースの存在下などで凍結乾燥され；且つ場合によって再構成される、請求項４４に記載のコンジュゲート又は薬学的組成物。
  46. 請求項４５に記載のコンジュゲート又は薬学的組成物であって、前記コンジュゲートがコンジュゲート当たり１８～２０個のＦａｂ分子を含み；且つ／又は
    凍結乾燥が、８０ｍＭのトレハロースの存在下で起こり；且つ／又は
    凍結乾燥が、５ｍｇのコンジュゲート／ｍＬの濃度で起こる
    コンジュゲート又は薬学的組成物。
  47. 凍結乾燥及び再構成後に、前記抗原結合ポリペプチドの抗原結合活性の８０～９０％、９０～９５％、又は９５～９９％が保持される、請求項４５又は４６に記載のコンジュゲート又は薬学的組成物。
  48. 請求項１～４１のいずれか一項に記載のコンジュゲートを１００～３００ｍｇ含み、１０～５０ｃＰの粘度を有する液体製剤であって、場合によって、前記製剤が皮下投与されるか又は眼球送達を介して投与される、液体製剤。
  49. ナノリポタンパク質粒子と抗原結合ポリペプチドとのコンジュゲートを調製する方法であって、
    ａ）足場タンパク質及び膜形成脂質を、前記足場タンパク質によって取り囲まれた前記膜形成脂質の脂質二重層を含むナノリポタンパク質粒子の（自己）組織化を可能にする条件下で提供することであって、ここで、前記膜形成脂質の１つ又は複数が、前記粒子の一方又は両方の表面上に官能化基を提示する、提供すること；
    ｂ）ｐＨ４．５～６．５の範囲の低ｐＨで前記官能化基にコンジュゲートする、Ｃ末端に位置する相補的官能基を有する抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）に前記粒子を接触させること；並びに
    ｃ）場合によって、前記粒子と前記抗原結合ポリペプチドとのコンジュゲートを精製すること
    を含む、方法。
  50. 前記工程ｂ）が、組み立てられていない膜形成脂質の一部又は全てを除去するための介在工程なしで、前記工程ａ）に続いて行われる、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記官能化基がマレイミド誘導体であり、前記官能基がシステインチオール基であり、場合によって、前記システインアミノ酸残基が、抗原結合ポリペプチドが由来する抗体においてヒンジジスルフィド結合を形成する（Ｃｙｓ－２２６又はＣｙｓ－２２７など）、請求項４９又は５０に記載の方法。
  52. 前記官能化基が、前記低ｐＨで前記足場タンパク質にコンジュゲートしない、請求項４９～５１のいずれか一項に記載の方法。
  53. 前記低ｐＨが、５．５～６．５のｐＨ、５～６のｐＨ、又は６のｐＨである、請求項５２に記載の方法。
  54. スペーサーが前記官能化基を前記膜形成脂質に接続し、且つ／又はスペーサーが前記相補的官能基を前記抗原結合ポリペプチドに接続する、請求項４９～５３のいずれか一項に記載の方法。
  55. 前記スペーサーが、前記官能化基を前記膜形成脂質に接続するＰＥＧスペーサーである、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記ＰＥＧスペーサーが、１０００～３０００、１５００～２５００、１９００～２２００、又は２０００のＭＷを有する、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記膜形成脂質の１つ又は複数がＣ４－２８脂肪酸アシルであり、前記脂肪酸アシルが２０～６０アミノ酸の短いペプチドにコンジュゲートしている、請求項４９～５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. 前記脂肪酸アシルがＣ１６脂肪酸アシルである、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記短いペプチドがシスチンノットペプチド（ＣＫＰ）である、請求項５７又は５８に記載の方法。
  60. ＣＫＰが、ＥＥＴＩ－ＩＩ、サーキュリンＡ、ｃｙｃｌｏｐｓｙｃｈｏｔｒｉｄｅ Ａ、シクロビオラシンＯ１、シクロビオラシンＯ１２、カラタＢ１、カラタＢ８、ｐａｌｉｃｏｕｒｅｉｎ、ｔｒｉｃｙｃｌｏｎ Ａ、ＭＣｏＴＩ １、ＳＯＴＩ １、サーキュリンＢ、ｃｙｃｌｏｐｓｙｃｈｏｔｒｉｄｅ、又はｖａｒｖペプチドＡである、請求項５９に記載の方法。
  61. 短いペプチドが、ＣＫＰバリアントであって、
    （ａ）野生型ＣＫＰの対応する１つ若しくは複数のループ配列と比較して、１つ若しくは複数のループ配列中に１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／若しくは置換；
    （ｂ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｎ末端に１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／若しくは置換；
    （ｃ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｃ末端に１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／若しくは置換；
    （ｄ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｎ末端に化学修飾；並びに／又は
    （ｅ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｃ末端に化学修飾
    を含むＣＫＰバリアントである、請求項５７又は５８に記載の方法。
  62. ＣＫＰバリアントが、野生型ＣＫＰと比較して、そのＮ末端に追加のリジン残基を含む、請求項６１に記載の方法。
  63. 野生型ＣＫＰがＥＥＴＩ－ＩＩである、請求項６１又は６２に記載の方法。
  64. 前記膜形成脂質が、ペプチド－Ｃ４－２８脂肪酸アシルコンジュゲートと、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＯＰＳ、ＤＯＰＥ、ＤＰＰＣのうちの少なくとも１つ以上（例えば、ペプチド－Ｃ１６脂肪酸アシルコンジュゲートとＤＯＰＣ）を、１：３～１：１５、若しくは１：６～１：１２、若しくは１：９のモル比で含み；且つ／又は前記コンジュゲートが、１～１００、１０～９０、２０～８０、３０～７０、４０～６０、若しくは６０分子の前記短いペプチドを含む、請求項５７～６３のいずれか一項に記載の方法。
  65. コンジュゲート中の短いペプチドの活性が、抗原結合ポリペプチドを含まないコンジュゲート中のペプチドの活性よりも高い、請求項５７～６４のいずれか一項に記載の方法。
  66. コンジュゲート中のペプチドの活性が、抗原結合ポリペプチドを含まないコンジュゲート中のペプチドの活性よりも２倍から１０倍高い、請求項６５に記載の方法。
  67. コンジュゲート中のペプチドの活性が、抗原結合ポリペプチドを含まないコンジュゲート中のペプチドの活性よりも約５倍高い、請求項６６に記載の方法。
  68. 前記短いペプチドが生物学的活性を有するＣＫＰ又はＣＫＰバリアントであり、前記活性の８０～９０％、９０～９５％、又は９５～９９％が前記コンジュゲートにおいて保持される、請求項５７～６４のいずれか一項に記載の方法。
  69. 前記コンジュゲートが、１～１００分子の前記Ｆａｂを含み；
    場合によって、前記コンジュゲートが、５～３０、１０～２５、１５～２０、若しくは１８分子の前記ペプチド、及び５～４０、１０～３５、１５～３０、２０～２５、若しくは２３分子の前記抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）を含み；又は
    場合によって、前記コンジュゲートが、３～３０、５～２０、１０～１５、若しくは１３分子の前記ペプチド、及び１０～６０分子の前記抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）を含み；又は
    場合によって、前記コンジュゲートが、２０～８０、２５～７０、３０～６０、３５～５０、若しくは４０分子の前記ペプチド、及び１０～６０分子の前記抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）を含む、請求項５７～６８のいずれか一項に記載の方法。
  70. Ｆａｂ及び短いペプチドが２つの異なる標的に結合する、請求項６９に記載の方法。
  71. 少なくとも２つの異なるペプチド－Ｃ４－２８脂肪酸アシルコンジュゲートを含み、ここで、第１のペプチド－Ｃ４－２８脂肪酸アシルコンジュゲートが第１の短いペプチドを含み、第２のペプチド－Ｃ４－２８脂肪酸アシルが第１の短いペプチドとは異なる第２の短いペプチドを含む、請求項５７～７０のいずれか一項に記載の方法。
  72. 前記少なくとも２つのペプチド（例えば、シスチンノットペプチド）が、異なる標的、場合によって２つ、３つ、４つ、又は８つの異なる標的に結合する、請求項７１に記載の方法。
  73. 前記２つ以上の短いペプチドが、２つの異なる標的に結合する、請求項７２に記載の方法。
  74. 前記標的が、ＣＤ３及びＣＤ１９；ＣＤ３及びＥｐＣＡＭ；ＣＤ３及びＣＥＡ；ＣＤ１６及びＣＤ３０；ＣＤ１６及びＣＤ３３；Ａｎｇ－２及びＶＥＧＦ－Ａ；並びに第Ｘ因子及び第ＩＸａ因子からなる群から選択される対である、請求項７０又は７３に記載の方法。
  75. ナノリポタンパク質粒子と２０～６０アミノ酸の短いペプチド（例えば、シスチンノットペプチド）とのコンジュゲートを調製する方法であって、
    ａ）足場タンパク質及び膜形成脂質を、前記足場タンパク質によって取り囲まれた前記膜形成脂質の脂質二重層を含むナノリポタンパク質粒子の（自己）組織化を可能にする条件下で提供することであって；
    ここで、前記膜形成脂質の１つ又は複数が、Ｃ４－２８脂肪酸アシル（例えば、Ｃ１６脂肪酸アシル）を含み、脂肪酸アシルが、前記短いペプチドにコンジュゲートしている、提供すること；並びに
    場合によってペプチドコンジュゲートを精製すること、を含む方法。
  76. 前記短いペプチドがシスチンノットペプチド（ＣＫＰ）である、請求項７５に記載の方法。
  77. ＣＫＰが、ＥＥＴＩ－ＩＩ、サーキュリンＡ、ｃｙｃｌｏｐｓｙｃｈｏｔｒｉｄｅ Ａ、シクロビオラシンＯ１、シクロビオラシンＯ１２、カラタＢ１、カラタＢ８、ｐａｌｉｃｏｕｒｅｉｎ、ｔｒｉｃｙｃｌｏｎ Ａ、ＭＣｏＴＩ １、ＳＯＴＩ １、サーキュリンＢ、ｃｙｃｌｏｐｓｙｃｈｏｔｒｉｄｅ、又はｖａｒｖペプチドＡである、請求項７６に記載の方法。
  78. 短いペプチドが、ＣＫＰバリアントであって、
    （ａ）野生型ＣＫＰの対応する１つ若しくは複数のループ配列と比較して、１つ若しくは複数のループ配列中に１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／若しくは置換；
    （ｂ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｎ末端に１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／若しくは置換；
    （ｃ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｃ末端に１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／若しくは置換；
    （ｄ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｎ末端に化学修飾；並びに／又は
    （ｅ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｃ末端に化学修飾
    を含むＣＫＰバリアントである、請求項７７に記載の方法。
  79. ＣＫＰバリアントが、野生型ＣＫＰと比較して、そのＮ末端に追加のリジン残基を含む、請求項７８に記載の方法。
  80. 野生型ＣＫＰがＥＥＴＩ－ＩＩである、請求項７８又は７９に記載の方法。
  81. 前記膜形成脂質が、ペプチド－Ｃ４－２８脂肪酸アシルコンジュゲートと、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＯＰＳ、ＤＯＰＥ、ＤＰＰＣのうちの少なくとも１つ以上（例えば、ペプチド－Ｃ１６脂肪酸アシルコンジュゲートとＤＯＰＣ）を、１：３～１：１５、若しくは１：６～１：１２、若しくは１：９のモル比で含み；且つ／又は前記コンジュゲートが、１～１００、１０～９０、２０～８０、３０～７０、４０～６０、若しくは６０分子の前記短いペプチドを含む、請求項７５～８０のいずれか一項に記載の方法。
  82. 少なくとも２つの異なるペプチド－Ｃ４－２８脂肪酸アシルコンジュゲートを含み、ここで、第１のペプチド－Ｃ４－２８脂肪酸アシルコンジュゲートが第１の短いペプチドを含み、第２のペプチド－Ｃ４－２８脂肪酸アシルが第１の短いペプチドとは異なる第２の短いペプチドを含む、請求項７５～８１のいずれか一項に記載の方法。
  83. 前記少なくとも２つのペプチド（例えば、シスチンノットペプチド）が、異なる標的、場合によって２つ、３つ、４つ、又は８つの異なる標的に結合する、請求項８２に記載の方法。
  84. 前記２つ以上の短いペプチドが、２つの異なる標的に結合する、請求項８２に記載の方法。
  85. 前記標的が、ＣＤ３及びＣＤ１９；ＣＤ３及びＥｐＣＡＭ；ＣＤ３及びＣＥＡ；ＣＤ１６及びＣＤ３０；ＣＤ１６及びＣＤ３３；Ａｎｇ－２及びＶＥＧＦ－Ａ；並びに第Ｘ因子及び第ＩＸａ因子からなる群から選択される対である、請求項８４に記載の方法。
  86. 前記短いペプチドが生物学的活性を有するＣＫＰ又はＣＫＰバリアントであり、前記活性の８０～９０％、９０～９５％、又は９５～９９％が前記コンジュゲートにおいて保持される、請求項７５～８５のいずれか一項に記載の方法。
  87. 前記膜形成脂質の１つ又は複数が、前記粒子の一方又は両方の表面上に官能化基を提示し；さらに
    ｂ）ｐＨ４．５～６．５の範囲の低ｐＨで前記官能化基にコンジュゲートする、Ｃ末端に位置する相補的官能基を有する抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）に前記粒子を接触させる工程であって；
    ここで、前記工程ｂ）が、組み立てられていない膜形成脂質の一部若しくは全てを除去するための介在工程なしで；且つ／又は工程ａ）のペプチドコンジュゲートを濃縮するための介在工程なしで、前記工程ａ）に続いて行われる、接触させる工程を含む、請求項７５～８６のいずれか一項に記載の方法。
  88. 前記官能化基がマレイミド誘導体であり、前記官能基がシステインチオール基であり、場合によって、前記システインアミノ酸残基が、抗原結合ポリペプチドが由来する抗体においてヒンジジスルフィド結合を形成する（Ｃｙｓ－２２６又はＣｙｓ－２２７など）、請求項８７に記載の方法。
  89. 前記官能化基が、前記低ｐＨで前記足場タンパク質にコンジュゲートしない、請求項８７又は８８に記載の方法。
  90. 前記低ｐＨが、５．５～６．５のｐＨ、５～６のｐＨ、又は６のｐＨである、請求項８９に記載の方法。
  91. スペーサーが前記官能化基を前記膜形成脂質に接続し、且つ／又はスペーサーが前記相補的官能基を前記抗原結合ポリペプチドに接続する、請求項８７～９０のいずれか一項に記載の方法。
  92. 前記スペーサーが、前記官能化基を前記膜形成脂質に接続するＰＥＧスペーサーである、請求項９１に記載の方法。
  93. 前記ＰＥＧスペーサーが、１０００～３０００、１５００～２５００、１９００～２２００、又は２０００のＭＷを有する、請求項９２に記載の方法。
  94. 前記コンジュゲートが、前記短いペプチドの活性又は結合活性を増加させる、請求項８７～９３のいずれか一項に記載の方法。
  95. 前記コンジュゲートが、１～１００分子の前記Ｆａｂを含み；
    場合によって、前記コンジュゲートが、５～３０、１０～２５、１５～２０、若しくは１８分子の前記ペプチド、及び５～４０、１０～３５、１５～３０、２０～２５、若しくは２３分子の前記抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）を含み；又は
    場合によって、前記コンジュゲートが、３～３０、５～２０、１０～１５、若しくは１３分子の前記ペプチド、及び１０～６０分子の前記抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）を含み；又は
    場合によって、前記コンジュゲートが、２０～８０、２５～７０、３０～６０、３５～５０、若しくは４０分子の前記ペプチド、及び１０～６０分子の前記抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）を含む、請求項８７～９４のいずれか一項に記載の方法。
  96. Ｆａｂ及び短いペプチドが２つの異なる標的に結合する、請求項９５に記載の方法。
  97. 前記標的が、ＣＤ３及びＣＤ１９；ＣＤ３及びＥｐＣＡＭ；ＣＤ３及びＣＥＡ；ＣＤ１６及びＣＤ３０；ＣＤ１６及びＣＤ３３；Ａｎｇ－２及びＶＥＧＦ－Ａ；並びに第Ｘ因子及び第ＩＸａ因子からなる群から選択される対である、請求項９６に記載の方法。
  98. コンジュゲート中の短いペプチドの活性が、抗原結合ポリペプチドを含まないコンジュゲート中のペプチドの活性よりも高い、請求項８７～９７のいずれか一項に記載の方法。
  99. コンジュゲート中のペプチドの活性が、抗原結合ポリペプチドを含まないコンジュゲート中のペプチドの活性よりも２倍から１０倍高い、請求項９８に記載の方法。
  100. コンジュゲート中のペプチドの活性が、抗原結合ポリペプチドを含まないコンジュゲート中のペプチドの活性よりも約５倍高い、請求項９９に記載の方法。
  101. 請求項４９～１００のいずれか一項に記載の方法によって生成されたコンジュゲート。
  102. 抗原結合ポリペプチドの結合活性、活性、及び／又は効力を増加させる方法であって、
    ａ）足場タンパク質及び膜形成脂質を、前記足場タンパク質によって取り囲まれた前記膜形成脂質の脂質二重層を含むナノリポタンパク質粒子の（自己）組織化を可能にする条件下で提供することであって、ここで、前記膜形成脂質の１つ又は複数が、前記粒子の一方又は両方の表面上に官能化基を提示する、提供すること；
    ｂ）ｐＨ４．５～６．５の範囲の低ｐＨで前記官能化基にコンジュゲートする、Ｃ末端に位置する相補的官能基を有する抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）に前記粒子を接触させること；並びに
    ｃ）場合によって、前記粒子と前記抗原結合ポリペプチドとのコンジュゲートを精製し、
    それにより前記抗原結合ポリペプチドの結合活性、活性、及び／又は効力を増加させること、を含む方法。
  103. 前記抗原結合ポリペプチドが、Ｆａｂ若しくはＦａｂ様分子であり、且つ／又は前記コンジュゲートが、１０～６０、１５～３０、若しくは２０分子の前記抗原結合ポリペプチドを含む、請求項１０２に記載の方法。
  104. 前記抗原結合ポリペプチドが、ＰＥＧスペーサーによって前記膜形成脂質に接続されたＦａｂ又はＦａｂ様分子であり；且つ
    前記コンジュゲートが、１～１６０、１０～１２０、２０～１００、４０～８０、又は６０分子の前記抗原結合ポリペプチドを含む、請求項１０３に記載の方法。
  105. 前記ＰＥＧスペーサーが、前記官能化基を前記膜形成脂質に接続し、１０００～３０００、１５００～２５００、１９００～２２００、又は２０００のＭＷを有する、請求項１０４に記載の方法。
  106. 前記コンジュゲートが安定化されており、
    場合によって、前記コンジュゲートが、７～６０、７～３２、４０～６０、又は５０分子の前記抗原結合ポリペプチドを含む、請求項１０２～１０５のいずれか一項に記載の方法。
  107. 前記コンジュゲートが、異なる標的に結合する第２の抗原結合ポリペプチドの１つ又は複数の分子をさらに含む、請求項１０２～１０６のいずれか一項に記載の方法。
  108. 前記コンジュゲートが液体製剤で提供され、前記製剤が１００～３００ｍｇの前記コンジュゲートを含み、１０～５０ｃＰの粘度を有する、請求項１０２～１０７のいずれか一項に記載の方法。
  109. 前記膜形成脂質の１つ又は複数がＣ４－２８脂肪酸アシルであり、前記脂肪酸アシルが２０～６０アミノ酸の短いペプチドにコンジュゲートしている請求項１０２～１０８のいずれか一項に記載の方法であって、短いペプチドの結合活性、活性、及び／又は効力を増加させる、方法。
  110. 前記脂肪酸アシルがＣ１６脂肪酸アシルである、請求項１０９に記載の方法。
  111. 前記短いペプチドがシスチンノットペプチド（ＣＫＰ）である、請求項１０９又は１１０に記載の方法。
  112. ＣＫＰが、ＥＥＴＩ－ＩＩ、サーキュリンＡ、ｃｙｃｌｏｐｓｙｃｈｏｔｒｉｄｅ Ａ、シクロビオラシンＯ１、シクロビオラシンＯ１２、カラタＢ１、カラタＢ８、ｐａｌｉｃｏｕｒｅｉｎ、ｔｒｉｃｙｃｌｏｎ Ａ、ＭＣｏＴＩ １、ＳＯＴＩ １、サーキュリンＢ、ｃｙｃｌｏｐｓｙｃｈｏｔｒｉｄｅ、又はｖａｒｖペプチドＡである、請求項１１１に記載の方法。
  113. 短いペプチドが、ＣＫＰバリアントであって、
    （ａ）野生型ＣＫＰの対応する１つ若しくは複数のループ配列と比較して、１つ若しくは複数のループ配列中に１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／若しくは置換；
    （ｂ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｎ末端に１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／若しくは置換；
    （ｃ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｃ末端に１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／若しくは置換；
    （ｄ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｎ末端に化学修飾；並びに／又は
    （ｅ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｃ末端に化学修飾
    を含むＣＫＰバリアントである、請求項１０９又は１１０に記載の方法。
  114. ＣＫＰバリアントが、野生型ＣＫＰと比較して、そのＮ末端に追加のリジン残基を含む、請求項１１３に記載の方法。
  115. 野生型ＣＫＰがＥＥＴＩ－ＩＩである、請求項１１３又は１１４に記載の方法。
  116. 前記膜形成脂質が、ペプチド－Ｃ４－２８脂肪酸アシルコンジュゲートと、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＯＰＳ、ＤＯＰＥ、ＤＰＰＣのうちの少なくとも１つ以上（例えば、ペプチド－Ｃ１６脂肪酸アシルコンジュゲートとＤＯＰＣ）を、１：３～１：１５、若しくは１：６～１：１２、若しくは１：９のモル比で含み；且つ／又は前記コンジュゲートが、１～１００、１０～９０、２０～８０、３０～７０、４０～６０、若しくは６０分子の前記短いペプチドを含む、請求項１０９～１１５のいずれか一項に記載の方法。
  117. 少なくとも２つの異なるペプチド－Ｃ４－２８脂肪酸アシルコンジュゲートを含み、ここで、第１のペプチド－Ｃ４－２８脂肪酸アシルコンジュゲートが第１の短いペプチドを含み、第２のペプチド－Ｃ４－２８脂肪酸アシルが第１の短いペプチドとは異なる第２の短いペプチドを含む、請求項１０９～１１６のいずれか一項に記載の方法。
  118. 前記少なくとも２つのペプチド（例えば、シスチンノットペプチド）が、異なる標的、場合によって２つ、３つ、４つ、又は８つの異なる標的に結合する、請求項１１７に記載の方法。
  119. 前記２つ以上の短いペプチドが、２つの異なる標的に結合する、請求項１１８に記載の方法。
  120. 前記標的が、ＣＤ３及びＣＤ１９；ＣＤ３及びＥｐＣＡＭ；ＣＤ３及びＣＥＡ；ＣＤ１６及びＣＤ３０；ＣＤ１６及びＣＤ３３；Ａｎｇ－２及びＶＥＧＦ－Ａ；並びに第Ｘ因子及び第ＩＸａ因子からなる群から選択される対である、請求項１１９に記載の方法。
  121. 前記コンジュゲートが、１～１００分子の前記Ｆａｂを含み；
    場合によって、前記コンジュゲートが、５～３０、１０～２５、１５～２０、若しくは１８分子の前記ペプチド、及び５～４０、１０～３５、１５～３０、２０～２５、若しくは２３分子の前記抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）を含み；又は
    場合によって、前記コンジュゲートが、３～３０、５～２０、１０～１５、若しくは１３分子の前記ペプチド、及び１０～６０分子の前記抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）を含み；又は
    場合によって、前記コンジュゲートが、２０～８０、２５～７０、３０～６０、３５～５０、若しくは４０分子の前記ペプチド、及び１０～６０分子の前記抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）を含む、請求項１０９～１２０のいずれか一項に記載の方法。
  122. コンジュゲート中の短いペプチドの活性が、抗原結合ポリペプチドを含まないコンジュゲート中のペプチドの活性よりも高い、請求項１１０～１２１のいずれか一項に記載の方法。
  123. コンジュゲート中のペプチドの活性が、抗原結合ポリペプチドを含まないコンジュゲート中のペプチドの活性よりも２倍から１０倍高い、請求項１２２に記載の方法。
  124. コンジュゲート中のペプチドの活性が、抗原結合ポリペプチドを含まないコンジュゲート中のペプチドの活性よりも約５倍高い、請求項１２３に記載の方法。
  125. 抗原結合ポリペプチドの安定性、貯蔵寿命、及び／又は半減期を増加させる方法であって、
    ａ）足場タンパク質及び膜形成脂質を、前記足場タンパク質によって取り囲まれた前記膜形成脂質の脂質二重層を含むナノリポタンパク質粒子の（自己）組織化を可能にする条件下で提供することであって、ここで、前記膜形成脂質の１つ又は複数が、前記粒子の一方又は両方の表面上に官能化基を提示する、提供すること；
    ｂ）ｐＨ４．５～６．５の範囲の低ｐＨで前記官能化基にコンジュゲートする、Ｃ末端に位置する相補的官能基を有する抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）に前記粒子を接触させること；並びに
    ｃ）場合によって、前記粒子と前記抗原結合ポリペプチドとのコンジュゲートを精製し、
    それにより前記抗原結合ポリペプチドの安定性、貯蔵寿命、及び／又は半減期を増加させること、を含む方法。
  126. ナノリポタンパク質粒子の安定性、貯蔵寿命、及び／又は半減期を増加させる方法であって、
    ａ）足場タンパク質及び膜形成脂質を、前記足場タンパク質によって取り囲まれた前記膜形成脂質の脂質二重層を含むナノリポタンパク質粒子の（自己）組織化を可能にする条件下で提供することであって、ここで、前記膜形成脂質の１つ又は複数が、前記粒子の一方又は両方の表面上に官能化基を提示する、提供すること；
    ｂ）ｐＨ４．５～６．５の範囲の低ｐＨで前記官能化基にコンジュゲートする、Ｃ末端に位置する相補的官能基を有する抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）に前記粒子を接触させること；並びに
    ｃ）場合によって、前記粒子と前記抗原結合ポリペプチドとのコンジュゲートを精製し、
    それにより前記ナノリポタンパク質粒子の安定性、貯蔵寿命、及び／又は半減期を増加させること、を含む方法。
  127. 前記膜形成脂質の１つ又は複数がＣ４－２８脂肪酸アシルであり、前記脂肪酸アシルが２０～６０アミノ酸の短いペプチドにコンジュゲートしている、請求項１２５又は１２６に記載の方法。
  128. 前記脂肪酸アシルがＣ１６脂肪酸アシルである、請求項１２７に記載の方法。
  129. 長さが２０～６０アミノ酸である短いペプチドの安定性、貯蔵寿命、及び／又は半減期を増加させる方法であって、
    ａ）足場タンパク質及び膜形成脂質を、前記足場タンパク質によって取り囲まれた前記膜形成脂質の脂質二重層を含むナノリポタンパク質粒子の（自己）組織化を可能にする条件下で提供することであって、
    ここで、前記膜形成脂質の１つ又は複数が、Ｃ４－２８脂肪酸アシル（例えば、Ｃ１６脂肪酸アシル）を含み、脂肪酸アシルが、前記短いペプチドにコンジュゲートしている、提供すること；並びに
    場合によってペプチドコンジュゲートを精製すること；
    ｂ）前記膜形成脂質の１つ又は複数を、前記粒子の一方又は両方の表面上に存在する官能化基へと修飾すること、及び
    ｃ）ｐＨ４．５～６．５の範囲の低ｐＨで前記官能化基にコンジュゲートする、Ｃ末端に位置する相補的官能基を有する抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）に前記粒子を接触させること
    を含み；
    ここで、前記工程ｃ）が、組み立てられていない膜形成脂質の一部若しくは全てを除去するための介在工程なしで；且つ／又は工程ｂ）のペプチドコンジュゲートを濃縮するための介在工程なしで、前記工程ｂ）に続いて行われ、
    場合によって、スペーサーが前記官能化基を前記膜形成脂質に接続し、且つ／又はスペーサーが前記相補的官能基を前記抗原結合ポリペプチドに接続し、
    それにより前記短いペプチドの安定性、貯蔵寿命、及び／又は半減期を増加させる、方法。
  130. 前記脂肪酸アシルがＣ１６脂肪酸アシルである、請求項１２７～１２９のいずれか一項に記載の方法。
  131. 前記短いペプチドがシスチンノットペプチド（ＣＫＰ）である、請求項１２７～１３０のいずれか一項に記載の方法。
  132. ＣＫＰが、ＥＥＴＩ－ＩＩ、サーキュリンＡ、ｃｙｃｌｏｐｓｙｃｈｏｔｒｉｄｅ Ａ、シクロビオラシンＯ１、シクロビオラシンＯ１２、カラタＢ１、カラタＢ８、ｐａｌｉｃｏｕｒｅｉｎ、ｔｒｉｃｙｃｌｏｎ Ａ、ＭＣｏＴＩ １、ＳＯＴＩ １、サーキュリンＢ、ｃｙｃｌｏｐｓｙｃｈｏｔｒｉｄｅ、又はｖａｒｖペプチドＡである、請求項１３１に記載の方法。
  133. 短いペプチドが、ＣＫＰバリアントであって、
    （ａ）野生型ＣＫＰの対応する１つ若しくは複数のループ配列と比較して、１つ若しくは複数のループ配列中に１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／若しくは置換；
    （ｂ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｎ末端に１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／若しくは置換；
    （ｃ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｃ末端に１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／若しくは置換；
    （ｄ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｎ末端に化学修飾；並びに／又は
    （ｅ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｃ末端に化学修飾
    を含むＣＫＰバリアントである、請求項１２７～１３０のいずれか一項に記載の方法。
  134. ＣＫＰバリアントが、野生型ＣＫＰと比較して、そのＮ末端に追加のリジン残基を含む、請求項１３３に記載の方法。
  135. 野生型ＣＫＰがＥＥＴＩ－ＩＩである請求項１３３又は１３４に記載の方法。
  136. 前記膜形成脂質が、ペプチド－Ｃ４－２８脂肪酸アシルコンジュゲートと、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＯＰＳ、ＤＯＰＥ、ＤＰＰＣのうちの少なくとも１つ以上（例えば、ペプチド－Ｃ１６脂肪酸アシルコンジュゲートとＤＯＰＣ）を、１：３～１：１５、若しくは１：６～１：１２、若しくは１：９のモル比で含み；且つ／又は前記コンジュゲートが、１～１００、１０～９０、２０～８０、３０～７０、４０～６０、若しくは６０分子の前記短いペプチドを含む、請求項１２７～１３５のいずれか一項に記載の方法。
  137. 前記抗原結合ポリペプチドが、Ｆａｂ若しくはＦａｂ様分子であり、且つ／又は前記コンジュゲートが、５～６０、６～４０、７～３２、４０～６０、若しくは５０分子の前記抗原結合ポリペプチド（例えば、前記Ｆａｂ）を含む、請求項１２５～１３６のいずれか一項に記載の方法。
  138. 前記コンジュゲートが、１～１００分子の前記Ｆａｂを含み；
    場合によって、前記コンジュゲートが、５～３０、１０～２５、１５～２０、若しくは１８分子の前記ペプチド、及び５～４０、１０～３５、１５～３０、２０～２５、若しくは２３分子の前記抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）を含み；又は
    場合によって、前記コンジュゲートが、３～３０、５～２０、１０～１５、若しくは１３分子の前記ペプチド、及び１０～６０分子の前記抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）を含み；又は
    場合によって、前記コンジュゲートが、２０～８０、２５～７０、３０～６０、３５～５０、若しくは４０分子の前記ペプチド、及び１０～６０分子の前記抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）を含む、請求項１２７～１３６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  139. 前記コンジュゲートが、生物学的活性剤又は検出可能な薬剤をさらに含み、
    場合によって、前記生物学的活性剤が、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキセート、ビンデシン、放射性核種、ジフテリア毒素、リシン、ゲルダナマイシン、メイタンシノイド、カリケアマイシン、及びそれらのいずれか１つ若しくは複数の組み合わせからなる群から選択される細胞傷害性剤であり；且つ／又は
    場合によって、前記検出可能な薬剤が、放射性同位元素、フルオロフォア、化学発光色素、発色団、酵素、金属イオン、ナノ粒子、及びそれらのいずれか１つ若しくは複数の組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの標識である
    請求項１２５～１３８のいずれか一項に記載の方法。
  140. 前記コンジュゲートが液体製剤で提供され、前記製剤が１００～３００ｍｇの前記コンジュゲートを含み、１０～５０ｃＰの粘度を有する、請求項１２５～１３９のいずれか一項に記載の方法。
  141. 医薬としての使用のための、請求項１～４１及び１０１のいずれか一項に記載のコンジュゲート、又は請求項４２～４７のいずれか一項に記載のコンジュゲート若しくは薬学的組成物、又は請求項４８に記載の製剤。
  142. がん又は眼障害の治療における使用のための、請求項１～４１及び１０１のいずれか一項に記載のコンジュゲート、又は請求項４２～４７のいずれか一項に記載のコンジュゲート若しくは薬学的組成物、又は請求項４８に記載の製剤。
  143. がん又は眼障害の治療のための医薬の製造における、請求項１～４１及び１０１のいずれか一項に記載のコンジュゲート、又は請求項４２～４７のいずれか一項に記載のコンジュゲート若しくは薬学的組成物、又は請求項４８に記載の製剤、の使用。
  144. 血管新生及び／若しくは腫瘍増殖を阻害するための医薬の製造における、請求項１～４１及び１０１のいずれか一項に記載のコンジュゲート、又は請求項４２～４７のいずれか一項に記載のコンジュゲート若しくは薬学的組成物、又は請求項４８に記載の製剤、の使用。
  145. 抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）で個体を治療する方法であって、請求項１～４１及び１０１のいずれか一項に記載のコンジュゲート、又は請求項４２～４７のいずれか一項に記載のコンジュゲート若しくは薬学的組成物、又は請求項４８に記載の製剤の有効量を個体に投与することを含み；
    場合によって、追加の治療剤を個体に投与することをさらに含む、方法。
  146. 抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）をそれを必要とする個体に送達する方法であって、
    請求項１～４１及び１０１のいずれか一項に記載のコンジュゲート、又は請求項４２～４７のいずれか一項に記載のコンジュゲート若しくは薬学的組成物、又は請求項４８に記載の製剤を提供することと；
    前記コンジュゲート、組成物、又は製剤を前記個体に投与し、それにより前記抗原結合ポリペプチドを前記個体に送達することと
    を含む、方法。
  147. 抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）を、それを必要とする個体に、強力で安定した液体製剤で送達する方法であって、
    前記抗原結合ポリペプチド（例えば、前記Ｆａｂ）とナノリポタンパク質粒子とのコンジュゲートを含む液体製剤を個体に投与することを含み；
    ここで、前記ナノリポタンパク質粒子が、膜形成脂質の二重脂質層を取り囲む足場タンパク質を含み；
    前記膜形成脂質が、前記膜形成脂質上の官能化基と前記抗原結合ポリペプチド上のＣ末端に位置する相補的官能基とを介して、５～１００分子の前記抗原結合ポリペプチドにコンジュゲートしており；
    場合によって、スペーサーが前記官能化基を前記膜形成脂質に接続し、且つ／又はスペーサーが前記相補的官能基を前記抗原結合ポリペプチドに接続し、
    それにより前記抗原結合ポリペプチドを安定した液体製剤で個体に送達する、方法。
  148. 抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）を、それを必要とする個体に、強力な低粘度製剤で送達する方法であって、
    前記抗原結合ポリペプチド（例えば、前記Ｆａｂ）とナノリポタンパク質粒子とのコンジュゲートを含む液体製剤を個体に投与することを含み；
    ここで、前記ナノリポタンパク質粒子が、膜形成脂質の二重脂質層を取り囲む足場タンパク質を含み；
    前記膜形成脂質の１つ又は複数が、前記１つ又は複数の膜形成脂質上の官能化基と前記抗原結合ポリペプチド上のＣ末端に位置する相補的官能基とを介して前記抗原結合ポリペプチドにコンジュゲートしており；
    場合によって、スペーサーが前記官能化基を前記膜形成脂質に接続し、且つ／又はスペーサーが前記相補的官能基を前記抗原結合ポリペプチドに接続し；
    前記液体製剤が、１０～５０ｃＰの粘度及び１００～３００ｍｇの前記コンジュゲート／ｍＬの濃度を有し、
    それにより前記抗原結合ポリペプチドを低粘度製剤で個体に送達する、方法。
  149. 前記膜形成脂質の１つ又は複数がＣ４－２８脂肪酸アシルであり、前記脂肪酸アシルが２０～６０アミノ酸の短いペプチドにコンジュゲートしている、請求項１４７又は１４８に記載の方法。
  150. ２０～６０アミノ酸長の短いペプチドを、強力で安定した液体製剤で、それを必要とする個体に送達する方法であって、
    前記抗原結合ポリペプチド（例えば、前記Ｆａｂ）とナノリポタンパク質粒子とのコンジュゲートを含む液体製剤を個体に投与することを含み；
    ここで、前記ナノリポタンパク質粒子が、膜形成脂質の二重脂質層を取り囲む足場タンパク質を含み；
    前記膜形成脂質の１つ又は複数がＣ４－２８脂肪酸アシルであり、前記脂肪酸アシルが２０～６０アミノ酸の短いペプチドにコンジュゲートしており
    前記膜形成脂質が、前記膜形成脂質上の官能化基と前記抗原結合ポリペプチド上のＣ末端に位置する相補的官能基とを介して、５～１００分子の前記抗原結合ポリペプチドにコンジュゲートしており；
    場合によって、スペーサーが前記官能化基を前記膜形成脂質に接続し、且つ／又はスペーサーが前記相補的官能基を前記抗原結合ポリペプチドに接続し、
    それにより前記抗原結合ポリペプチドを安定した液体製剤で個体に送達する、方法。
  151. ２０～６０アミノ酸長の短いペプチドを、それを必要とする個体に、強力な低粘度製剤で送達する方法であって、
    前記抗原結合ポリペプチド（例えば、前記Ｆａｂ）とナノリポタンパク質粒子とのコンジュゲートを含む液体製剤を個体に投与することを含み；
    ここで、前記ナノリポタンパク質粒子が、膜形成脂質の二重脂質層を取り囲む足場タンパク質を含み；
    前記膜形成脂質の１つ又は複数がＣ４－２８脂肪酸アシルであり、前記脂肪酸アシルが２０～６０アミノ酸の短いペプチドにコンジュゲートしており；
    前記膜形成脂質の１つ又は複数が、前記１つ又は複数の膜形成脂質上の官能化基と前記抗原結合ポリペプチド上のＣ末端に位置する相補的官能基とを介して前記抗原結合ポリペプチドにコンジュゲートしており；
    場合によって、スペーサーが前記官能化基を前記膜形成脂質に接続し、且つ／又はスペーサーが前記相補的官能基を前記抗原結合ポリペプチドに接続し；
    前記液体製剤が、１０～５０ｃＰの粘度及び１００～３００ｍｇの前記コンジュゲート／ｍＬの濃度を有し、
    それにより前記抗原結合ポリペプチドを低粘度製剤で個体に送達する、方法。
  152. 前記脂肪酸アシルがＣ１６脂肪酸アシルである、請求項１４９～１５１のいずれか一項に記載の方法。
  153. 前記短いペプチドがシスチンノットペプチド（ＣＫＰ）である、請求項１４９～１５２のいずれか一項に記載の方法。
  154. ＣＫＰが、ＥＥＴＩ－ＩＩ、サーキュリンＡ、ｃｙｃｌｏｐｓｙｃｈｏｔｒｉｄｅ Ａ、シクロビオラシンＯ１、シクロビオラシンＯ１２、カラタＢ１、カラタＢ８、ｐａｌｉｃｏｕｒｅｉｎ、ｔｒｉｃｙｃｌｏｎ Ａ、ＭＣｏＴＩ １、ＳＯＴＩ １、サーキュリンＢ、ｃｙｃｌｏｐｓｙｃｈｏｔｒｉｄｅ、又はｖａｒｖペプチドＡである、請求項１５３に記載の方法。
  155. 短いペプチドが、ＣＫＰバリアントであって、
    （ａ）野生型ＣＫＰの対応する１つ若しくは複数のループ配列と比較して、１つ若しくは複数のループ配列中に１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／若しくは置換；
    （ｂ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｎ末端に１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／若しくは置換；
    （ｃ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｃ末端に１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／若しくは置換；
    （ｄ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｎ末端に化学修飾；並びに／又は
    （ｅ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｃ末端に化学修飾
    を含むＣＫＰバリアントである、請求項１４９～１５２のいずれか一項に記載の方法。
  156. ＣＫＰバリアントが、野生型ＣＫＰと比較して、そのＮ末端に追加のリジン残基を含む、請求項１５５に記載の方法。
  157. 野生型ＣＫＰがＥＥＴＩ－ＩＩである、請求項１５５又は１５６に記載の方法。
  158. 前記膜形成脂質が、ペプチド－Ｃ４－２８脂肪酸アシルコンジュゲートと、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＯＰＳ、ＤＯＰＥ、ＤＰＰＣのうちの少なくとも１つ以上（例えば、ペプチド－Ｃ１６脂肪酸アシルコンジュゲートとＤＯＰＣ）を、１：３～１：１５、若しくは１：６～１：１２、若しくは１：９のモル比で含み；且つ／又は前記コンジュゲートが、１～１００、１０～９０、２０～８０、３０～７０、４０～６０、若しくは６０分子の前記短いペプチドを含む、請求項１４９～１５７のいずれか一項に記載の方法。
  159. コンジュゲート中の短いペプチドの活性が、抗原結合ポリペプチドを含まないコンジュゲート中のペプチドの活性よりも高い、請求項１４９～１５８のいずれか一項に記載の方法。
  160. コンジュゲート中のペプチドの活性が、抗原結合ポリペプチドを含まないコンジュゲート中のペプチドの活性よりも２倍から１０倍高い、請求項１５９に記載の方法。
  161. コンジュゲート中のペプチドの活性が、抗原結合ポリペプチドを含まないコンジュゲート中のペプチドの活性よりも約５倍高い、請求項１６０に記載の方法。
  162. 前記コンジュゲートが、１～１００分子の前記Ｆａｂを含み；
    場合によって、前記コンジュゲートが、５～３０、１０～２５、１５～２０、若しくは１８分子の前記ペプチド、及び５～４０、１０～３５、１５～３０、２０～２５、若しくは２３分子の前記抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）を含み；又は
    場合によって、前記コンジュゲートが、３～３０、５～２０、１０～１５、若しくは１３分子の前記ペプチド、及び１０～６０分子の前記抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）を含み；又は
    場合によって、前記コンジュゲートが、２０～８０、２５～７０、３０～６０、３５～５０、若しくは４０分子の前記ペプチド、及び１０～６０分子の前記抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）を含む、請求項１４９～１６１のいずれか一項に記載の方法。
  163. 前記スペーサーが、前記官能化基を前記膜形成脂質に接続するＰＥＧスペーサーである、請求項１４７～１６２のいずれか一項に記載の方法。
  164. 前記ＰＥＧスペーサーが、１０００～３０００、１５００～２５００、１９００～２２００、又は２０００のＭＷを有する、請求項１６３に記載の方法。
  165. 前記抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）及び前記短いペプチドがそれぞれ同じ標的に結合する、請求項１４９～１６４のいずれか一項に記載の方法。
  166. 前記抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）及び前記短いペプチドがそれぞれ異なる標的に結合する、請求項１４９～１６４のいずれか一項に記載の方法。
  167. 前記抗原結合ポリペプチドが、Ｄ因子、ＶＥＧＦ、Ｔｉｅ２、ＤＲ４、及びそれらのいずれか１つ又は複数の組み合わせからなる群から選択される標的に結合するＦａｂであり；前記製剤が眼球送達を介して投与される、請求項１４７～１６６のいずれか一項に記載の方法。
  168. 前記短いペプチドが、Ｄ因子、ＶＥＧＦ、Ｔｉｅ２、ＤＲ４、及びそれらのいずれか１つ又は複数の組み合わせからなる群から選択される標的に結合する、請求項１４９～１６７のいずれか一項に記載の方法。
  169. 前記抗原結合ポリペプチドが、ＯＸ４０、ＤＲ４、ＧＩＴＲ、Ｔｉｅ２、Ｄ因子、ＶＥＧＦ、ＭｅｒＴＫ、ＣＤ３、リンホトキシンベータ受容体、及びそれらのいずれか１つ又は複数の組み合わせからなる群から選択される標的に結合するＦａｂである、請求項１４７～１６６のいずれか一項に記載の方法。
  170. 前記短いペプチドが、ＯＸ４０、ＤＲ４、ＧＩＴＲ、Ｔｉｅ２、Ｄ因子、ＶＥＧＦ、ＭｅｒＴＫ、ＣＤ３、リンホトキシンベータ受容体、及びそれらのいずれか１つ又は複数の組み合わせからなる群から選択される標的に結合する、請求項１５０～１６６及び１６９のいずれか一項に記載の方法。
  171. 前記抗原結合ポリペプチドが、少なくとも２つの異なる標的に結合する、請求項１４７～１６６のいずれか一項に記載の方法。
  172. 前記２つの異なる標的が、ＣＤ３及びＣＤ１９；ＣＤ３及びＥｐＣＡＭ；ＣＤ３及びＣＥＡ；ＣＤ１６及びＣＤ３０；ＣＤ１６及びＣＤ３３；Ａｎｇ－２及びＶＥＧＦ－Ａ；並びに第Ｘ因子及び第ＩＸａ因子からなる群から選択される対である、請求項１７１に記載の方法。
  173. 前記短いペプチド及び前記抗原結合ポリペプチドが、少なくとも２つの異なる標的に結合する、請求項１４９～１６４のいずれか一項に記載の方法。
  174. 前記２つの異なる標的が、ＣＤ３及びＣＤ１９；ＣＤ３及びＥｐＣＡＭ；ＣＤ３及びＣＥＡ；ＣＤ１６及びＣＤ３０；ＣＤ１６及びＣＤ３３；Ａｎｇ－２及びＶＥＧＦ－Ａ；並びに第Ｘ因子及び第ＩＸａ因子からなる群から選択される対である、請求項１７３に記載の方法。
  175. 生物学的活性剤又は検出可能な薬剤を、それを必要とする個体に、安定した液体製剤で送達する方法であって、
    抗原結合ポリペプチド（例えば、前記Ｆａｂ）と、ナノリポタンパク質粒子と、生物学的活性剤又は検出可能な薬剤とのコンジュゲートを含む液体製剤を個体に投与することを含み；
    ここで、前記ナノリポタンパク質粒子が、膜形成脂質の二重脂質層を取り囲む足場タンパク質を含み；
    前記膜形成脂質が、前記膜形成脂質上の官能化基と前記抗原結合ポリペプチド上のＣ末端に位置する相補的官能基とを介して、５～１００分子の前記抗原結合ポリペプチドにコンジュゲートしており；
    前記生物学的活性剤又は前記検出可能な薬剤が、前記足場タンパク質、前記膜形成脂質、又は前記抗原結合ポリペプチドのうちの少なくとも１つにコンジュゲートしており；
    場合によって、スペーサーが前記官能化基を前記膜形成脂質に接続し、且つ／又はスペーサーが前記相補的官能基を前記抗原結合ポリペプチドに接続し、
    それにより前記生物学的活性剤又は前記検出可能な薬剤を、それを必要とする個体に安定した液体製剤で送達する、方法。
  176. 生物学的活性剤又は検出可能な薬剤を、それを必要とする個体に、低粘度製剤で送達する方法であって、
    抗原結合ポリペプチド（例えば、前記Ｆａｂ）と、ナノリポタンパク質粒子と、生物学的活性剤又は検出可能な薬剤とのコンジュゲートを含む液体製剤を個体に投与することを含み；
    ここで、前記ナノリポタンパク質粒子が、膜形成脂質の二重脂質層を取り囲む足場タンパク質を含み；
    前記膜形成脂質の１つ又は複数が、前記１つ又は複数の膜形成脂質上の官能化基と前記抗原結合ポリペプチド上のＣ末端に位置する相補的官能基とを介して前記抗原結合ポリペプチドにコンジュゲートしており；
    前記生物学的活性剤又は前記検出可能な薬剤が、前記足場タンパク質、前記膜形成脂質、又は前記抗原結合ポリペプチドのうちの少なくとも１つにコンジュゲートしており；
    場合によって、スペーサーが前記官能化基を前記膜形成脂質に接続し、且つ／又はスペーサーが前記相補的官能基を前記抗原結合ポリペプチドに接続し；
    前記液体製剤が、１０～５０ｃＰの粘度及び１００～３００ｍｇの前記コンジュゲート／ｍＬの濃度を有し、
    それにより前記生物学的活性剤又は前記検出可能な薬剤を、それを必要とする個体に低粘度製剤で送達する、方法。
  177. 生物学的活性剤又は検出可能な薬剤を、それを必要とする個体の脳又は中枢神経系に送達する方法であって、
    抗原結合ポリペプチド（例えば、前記Ｆａｂ）と、ナノリポタンパク質粒子と、生物学的活性剤又は検出可能な薬剤とのコンジュゲートを含む液体製剤を個体に全身投与することを含み；
    ここで、前記ナノリポタンパク質粒子が、膜形成脂質の二重脂質層を取り囲む足場タンパク質を含み；
    前記膜形成脂質の１つ又は複数が、前記１つ又は複数の膜形成脂質上の官能化基と前記抗原結合ポリペプチド上のＣ末端に位置する相補的官能基とを介して前記抗原結合ポリペプチドにコンジュゲートしており；
    前記生物学的活性剤又は前記検出可能な薬剤が、前記足場タンパク質、前記膜形成脂質、又は前記抗原結合ポリペプチドのうちの少なくとも１つにコンジュゲートしており；
    場合によって、スペーサーが前記官能化基を前記膜形成脂質に接続し、且つ／又はスペーサーが前記相補的官能基を前記抗原結合ポリペプチドに接続し；
    前記コンジュゲートが血液脳関門を通過して移動し、
    それにより前記生物学的活性剤又は前記検出可能な薬剤を、それを必要とする個体の脳又は中枢神経系に送達する、方法。
  178. 前記足場タンパク質がａｐｏＥ２及び／又はａｐｏＥ４である、請求項１７５～１７７のいずれか一項に記載の方法。
  179. 前記抗原結合ポリペプチドがＦａｂ又はＦａｂ様分子である、請求項１７５～１７８のいずれか一項に記載の方法。
  180. 前記膜形成脂質の１つ又は複数がＣ４－２８脂肪酸アシルであり、前記脂肪酸アシルが２０～６０アミノ酸の短いペプチドにコンジュゲートしている、請求項１７５～１７９のいずれか一項に記載の方法。
  181. 前記脂肪酸アシルがＣ１６脂肪酸アシルである、請求項１８０に記載の方法。
  182. 前記短いペプチドがシスチンノットペプチド（ＣＫＰ）である、請求項１８０又は１８１に記載の方法。
  183. ＣＫＰが、ＥＥＴＩ－ＩＩ、サーキュリンＡ、ｃｙｃｌｏｐｓｙｃｈｏｔｒｉｄｅ Ａ、シクロビオラシンＯ１、シクロビオラシンＯ１２、カラタＢ１、カラタＢ８、ｐａｌｉｃｏｕｒｅｉｎ、ｔｒｉｃｙｃｌｏｎ Ａ、ＭＣｏＴＩ １、ＳＯＴＩ １、サーキュリンＢ、ｃｙｃｌｏｐｓｙｃｈｏｔｒｉｄｅ、又はｖａｒｖペプチドＡである、請求項１８２に記載の方法。
  184. 短いペプチドが、ＣＫＰバリアントであって、
    （ａ）野生型ＣＫＰの対応する１つ若しくは複数のループ配列と比較して、１つ若しくは複数のループ配列中に１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／若しくは置換；
    （ｂ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｎ末端に１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／若しくは置換；
    （ｃ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｃ末端に１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／若しくは置換；
    （ｄ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｎ末端に化学修飾；並びに／又は
    （ｅ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｃ末端に化学修飾
    を含むＣＫＰバリアントである、請求項１８０又は１８１に記載の方法。
  185. ＣＫＰバリアントが、野生型ＣＫＰと比較して、そのＮ末端に追加のリジン残基を含む、請求項１８４に記載の方法。
  186. 野生型ＣＫＰがＥＥＴＩ－ＩＩである、請求項１８４又は１８５に記載の方法。
  187. 前記膜形成脂質が、ペプチド－Ｃ４－２８脂肪酸アシルコンジュゲートと、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＯＰＳ、ＤＯＰＥ、ＤＰＰＣのうちの少なくとも１つ以上（例えば、ペプチド－Ｃ１６脂肪酸アシルコンジュゲートとＤＯＰＣ）を、１：３～１：１５、若しくは１：６～１：１２、若しくは１：９のモル比で含み；且つ／又は前記コンジュゲートが、１～１００、１０～９０、２０～８０、３０～７０、４０～６０、若しくは６０分子の前記短いペプチドを含む、請求項１７５～１８６のいずれか一項に記載の方法。
  188. 前記スペーサーが、前記官能化基を前記膜形成脂質に接続するＰＥＧスペーサーである、請求項１７５～１８７のいずれか一項に記載の方法。
  189. 前記ＰＥＧスペーサーが、１０００～３０００、１５００～２５００、１９００～２２００、又は２０００のＭＷを有する、請求項１８８に記載の方法。
  190. 前記生物学的活性剤が、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキセート、ビンデシン、放射性核種、ジフテリア毒素、リシン、ゲルダナマイシン、メイタンシノイド、カリケアマイシン、及びそれらのいずれか１つ又は複数の組み合わせからなる群から選択される細胞傷害性剤である、請求項１７５～１８９のいずれか一項に記載の方法。
  191. 前記診断剤が、放射性同位元素、フルオロフォア、化学発光色素、発色団、酵素、金属イオン、ナノ粒子、及びそれらのいずれか１つ又は複数の組み合わせからなる群から選択される標識である、請求項１７５～１９０のいずれか一項に記載の方法。
  192. 液体製剤が、静脈内投与される、請求項１７５～１９１のいずれか一項に記載の方法。
  193. 前記膜形成脂質が、前記膜形成脂質上の官能化基と前記抗原結合ポリペプチド上のＣ末端に位置する相補的官能基とを介して、５～１００分子の前記抗原結合ポリペプチドにコンジュゲートしている、請求項１７５～１９２のいずれか一項に記載の方法。
  194. 前記抗原結合ポリペプチドがＦａｂであり、前記ＦａｂがＰＥＧスペーサーを介して前記膜形成脂質に接続しており、
    場合によって、前記ＰＥＧスペーサーが、前記官能化基を前記膜形成脂質に接続し、１０００～３０００、１５００～２５００、１９００～２２００、又は２０００のＭＷを有する、請求項１７５～１９３のいずれか一項に記載の方法。
  195. 前記液体製剤が、１０～５０ｃＰの粘度及び１００～３００ｍｇの前記コンジュゲート／ｍＬの濃度を有する、請求項１７５～１９４のいずれか一項に記載の方法。
  196. 抗原結合ポリペプチドを標的細胞に送達するための、システム又はキットであって、
    請求項１～７、１１～４１のいずれか１項に記載のコンジュゲート、又は請求項４２～４６のいずれか１項に記載のコンジュゲート若しくは薬学的組成物、又は請求項４７に記載の製剤を調製するための１つ又は複数の成分であって、前記キット又はシステムの１つ又は複数のコンパートメント中に提供される１つ又は複数の成分、並びに
    場合によって、前記コンジュゲート、組成物若しくは製剤を調製するための説明書及び／又は前記抗原結合ポリペプチドを送達するための説明書
    を含む、システム又はキット。
  197. ２０～６０アミノ酸の短いペプチド（例えば、シスチンノットペプチド）を標的細胞に送達するためのシステム又はキットであって、
    請求項８～４１のいずれか１項に記載のコンジュゲート、又は請求項４２～４６のいずれか１項に記載のコンジュゲート若しくは薬学的組成物、又は請求項４７に記載の製剤を調製するための１つ又は複数の成分であって、前記キット又はシステムの１つ又は複数のコンパートメント中に提供される１つ又は複数の成分、並びに
    場合によって、前記コンジュゲート又は組成物を調製するための説明書及び／又は前記短いペプチド（例えば、前記シスチンノットペプチド）を送達するための説明書
    を含む、システム又はキット。
  198. ナノリポタンパク質粒子と抗原結合ポリペプチドとのコンジュゲートを調製することにおいて脂質－足場タンパク質コンジュゲーションを低減させる方法であって、
    ａ）足場タンパク質及び膜形成脂質を、前記足場タンパク質によって取り囲まれた前記膜形成脂質の脂質二重層を含むナノリポタンパク質粒子の組み立てを可能にする条件下で提供することであって、ここで、前記膜形成脂質の１つ又は複数が、前記粒子の一方又は両方の表面上に官能化基を提示する、提供すること；
    ｂ）前記足場タンパク質よりもむしろ前記官能基への前記官能化基のコンジュゲーションを促進する低ｐＨで、Ｃ末端に位置する相補的官能基を有する抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｆａｂ）に前記粒子を接触させること；並びに
    ｃ）場合によって、前記粒子と前記抗原結合ポリペプチドとのコンジュゲートを精製すること
    を含む、方法。
  199. 前記官能化基が、前記低ｐＨで前記足場タンパク質にコンジュゲートしない、請求項１９８に記載の方法。
  200. 前記低ｐＨが、５．５～６．５のｐＨ、５～６のｐＨ、又は６のｐＨである、請求項１９８又は１９９に記載の方法。
  201. 前記工程ｂ）が、組み立てられていない膜形成脂質の一部又は全てを除去するための介在工程なしで、前記工程ａ）に続いて行われる、請求項１９８～２００のいずれか一項に記載の方法。
  202. 前記官能化基がマレイミド誘導体であり、前記官能基がシステインチオール基であり、場合によって、前記システインアミノ酸残基が、抗原結合ポリペプチドが由来する抗体においてヒンジジスルフィド結合を形成する（Ｃｙｓ－２２６又はＣｙｓ－２２７など）、請求項１９８～２０１のいずれか一項に記載の方法。
  203. 前記膜形成脂質の１つ又は複数がＣ４－２８脂肪酸アシルであり、前記脂肪酸アシルが２０～６０アミノ酸の短いペプチドにコンジュゲートしている、請求項１９８～２０２のいずれか一項に記載の方法。
  204. 前記脂肪酸アシルがＣ１６脂肪酸アシルである、請求項２０３に記載の方法。
  205. 前記短いペプチドがシスチンノットペプチド（ＣＫＰ）である、請求項２０３又は２０４に記載の方法。
  206. ＣＫＰが、ＥＥＴＩ－ＩＩ、サーキュリンＡ、ｃｙｃｌｏｐｓｙｃｈｏｔｒｉｄｅ Ａ、シクロビオラシンＯ１、シクロビオラシンＯ１２、カラタＢ１、カラタＢ８、ｐａｌｉｃｏｕｒｅｉｎ、ｔｒｉｃｙｃｌｏｎ Ａ、ＭＣｏＴＩ １、ＳＯＴＩ １、サーキュリンＢ、ｃｙｃｌｏｐｓｙｃｈｏｔｒｉｄｅ、又はｖａｒｖペプチドＡである、請求項２０３に記載の方法。
  207. 短いペプチドが、ＣＫＰバリアントであって、
    （ａ）野生型ＣＫＰの対応する１つ若しくは複数のループ配列と比較して、１つ若しくは複数のループ配列中に１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／若しくは置換；
    （ｂ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｎ末端に１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／若しくは置換；
    （ｃ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｃ末端に１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／若しくは置換；
    （ｄ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｎ末端に化学修飾；並びに／又は
    （ｅ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｃ末端に化学修飾
    を含むＣＫＰバリアントである、請求項２０３又は２０４に記載の方法。
  208. 前記膜形成脂質が、ペプチド－Ｃ４－２８脂肪酸アシルコンジュゲートと、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＯＰＳ、ＤＯＰＥ、ＤＰＰＣのうちの少なくとも１つ以上（例えば、ペプチド－Ｃ１６脂肪酸アシルコンジュゲートとＤＯＰＣ）を、１：３～１：１５、若しくは１：６～１：１２、若しくは１：９のモル比で含み；且つ／又は前記コンジュゲートが、１～１００、１０～９０、２０～８０、３０～７０、４０～６０、若しくは６０分子の前記短いペプチドを含む、請求項２０３～２０７のいずれか一項に記載の方法。
  209. 脂質ベースのナノ粒子の表面に結合した短いペプチドの生物学的活性を増加させる方法であって、
    （ａ）その表面に結合した短いペプチドを含む脂質ベースのナノ粒子を提供することであって、脂質ベースのナノ粒子の１つ又は複数の脂質が官能化基を提示する、提供すること、及び
    （ｂ）ナノ粒子を、官能基を有するポリペプチドと、前記官能化基の前記官能基へのコンジュゲーションを促進する条件下で接触させること、を含む方法。
  210. 脂質ベースのナノ粒子、短いペプチド、及びポリペプチドを含むコンジュゲートを精製することをさらに含む、請求項２０９に記載の方法。
  211. 脂質ベースのナノ粒子が脂質二重層を含む、請求項２０９又は２１０に記載の方法。
  212. 脂質ベースのナノ粒子が、リポソーム、固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）、又はナノ構造脂質担体（ＮＬＣ）である、請求項２０９又は２１０に記載の方法。
  213. スペーサーが前記官能化基を脂質ベースのナノ粒子の表面上の脂質に接続し、且つ／又はスペーサーが前記相補的官能基を前記ポリペプチドに接続する、請求項２０９～２１２のいずれか一項に記載の方法。
  214. ポリペプチドが抗原結合ポリペプチドである、請求項２０９～２１３のいずれか一項に記載の方法。
  215. 抗原結合ポリペプチドが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ＶＨ－ＶＨ二量体、ＶＬ－ＶＬ二量体、ＶＨ－ＶＬ二量体、単一ドメイン、ダイアボディ、直鎖状抗体、及びそれらのいずれか１つ又は複数の組み合わせからなる群から選択される、請求項２１４に記載の方法。
  216. 短いペプチドが、ＣＫＰであるか、又は
    （ａ）野生型ＣＫＰの対応する１つ若しくは複数のループ配列と比較して、１つ若しくは複数のループ配列中に１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／若しくは置換；
    （ｂ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｎ末端に１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／若しくは置換；
    （ｃ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｃ末端に１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、欠失、及び／若しくは置換；
    （ｄ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｎ末端に化学修飾；並びに／又は
    （ｅ）野生型ＣＫＰと比較して、Ｃ末端に化学修飾
    を含むＣＫＰバリアントである、請求項２０９～２１５のいずれか一項に記載の方法。
  217. ポリペプチドのコンジュゲーション後の短いペプチドの活性が、ポリペプチドの脂質ベースのナノ粒子へのコンジュゲーション前の短いペプチドの活性と比較して、ポリペプチドの脂質ベースのナノ粒子へのコンジュゲーション後に２倍～１００倍高い、請求項２０９～２１６のいずれか一項に記載の方法。
JP2022575936A 2020-06-11 2021-06-10 ナノリポタンパク質－ポリペプチドコンジュゲート並びにそれを使用する組成物、システム、及び方法 Pending JP2023529203A (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063038075P 2020-06-11 2020-06-11
US63/038,075 2020-06-11
US202163151591P 2021-02-19 2021-02-19
US63/151,591 2021-02-19
PCT/US2021/036878 WO2021252803A1 (en) 2020-06-11 2021-06-10 Nanolipoprotein-polypeptide conjugates and compositions, systems, and methods using same

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2023529203A true JP2023529203A (ja) 2023-07-07
JPWO2021252803A5 JPWO2021252803A5 (ja) 2024-06-18

Family

ID=76744974

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022575936A Pending JP2023529203A (ja) 2020-06-11 2021-06-10 ナノリポタンパク質－ポリペプチドコンジュゲート並びにそれを使用する組成物、システム、及び方法

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20240059755A1 (ja)
EP (1) EP4164693A1 (ja)
JP (1) JP2023529203A (ja)
KR (1) KR20230023727A (ja)
CN (1) CN115803063A (ja)
AU (1) AU2021289738A1 (ja)
BR (1) BR112022025227A2 (ja)
CA (1) CA3183808A1 (ja)
IL (1) IL298878A (ja)
MX (1) MX2022015651A (ja)
TW (1) TW202214307A (ja)
WO (1) WO2021252803A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023220387A2 (en) * 2022-05-13 2023-11-16 Kisbee Therapeutics, Inc. Apoe lipoprotein systems

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
US5053394A (en) 1988-09-21 1991-10-01 American Cyanamid Company Targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
ES2052027T5 (es) 1988-11-11 2005-04-16 Medical Research Council Clonacion de secuencias de dominio variable de inmunoglobulina.
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
DE69334351D1 (de) 1992-02-06 2011-05-12 Novartis Vaccines & Diagnostic Biosynthetisches Bindeprotein für Tumormarker
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
DE69329503T2 (de) 1992-11-13 2001-05-03 Idec Pharma Corp Therapeutische Verwendung von chimerischen und markierten Antikörpern, die gegen ein Differenzierung-Antigen gerichtet sind, dessen Expression auf menschliche B Lymphozyt beschränkt ist, für die Behandlung von B-Zell-Lymphoma
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
KR101438983B1 (ko) 2003-11-06 2014-09-05 시애틀 지네틱스, 인크. 리간드에 접합될 수 있는 모노메틸발린 화합물
US20090136937A1 (en) 2007-05-09 2009-05-28 Coleman Matthew A Methods and systems for monitoring production of a target protein in a nanolipoprotein particle
US8883729B2 (en) 2008-05-22 2014-11-11 Lawrence Livermore National Security, Llc Nanolipoprotein particles and related compositions, methods and systems
EP2890389A1 (en) 2012-08-28 2015-07-08 Novartis AG Use of a vegf antagonist in treating ocular vascular proliferative diseases
US20190142752A1 (en) 2015-08-25 2019-05-16 Lawrence Livermore National Security, Llc Stable nanolipoprotein particles and related compositions methods and systems
TWI799366B (zh) 2015-09-15 2023-04-21 美商建南德克公司 胱胺酸結骨架平臺
US20190307692A1 (en) 2016-03-07 2019-10-10 Lawrence Livermore National Security, Llc Nanolipoprotein particles and related compositions methods and systems for improved drug loading
US12083223B2 (en) 2017-05-02 2024-09-10 Lawrence Livermore National Security, Llc Nanolipoprotein particles and related compositions methods and systems for loading RNA

Also Published As

Publication number Publication date
WO2021252803A1 (en) 2021-12-16
TW202214307A (zh) 2022-04-16
IL298878A (en) 2023-02-01
AU2021289738A1 (en) 2022-12-15
US20240059755A1 (en) 2024-02-22
EP4164693A1 (en) 2023-04-19
BR112022025227A2 (pt) 2023-01-03
KR20230023727A (ko) 2023-02-17
CN115803063A (zh) 2023-03-14
CA3183808A1 (en) 2021-12-16
MX2022015651A (es) 2023-01-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI703160B (zh) 用於部位專一性接合之抗體和抗體片段
AU2018370853A1 (en) Trispecific binding molecules against tumor-associated antigens and uses thereof
EP2550297B1 (en) Disulfide stabilized dvd-lg molecules
CA3062962C (en) Multispecific protein drug and library thereof, preparing method therefor and application thereof
US20200071380A1 (en) Combination therapies comprising sirp alpha-based chimeric proteins
US20240059755A1 (en) Nanolipoprotein-polypeptide conjugates and compositions, systems, and methods using same
US20210379153A1 (en) Combination therapies comprising sirp alpha-based chimeric proteins
US20210324041A1 (en) Combination therapies
JP7386318B2 (ja) 体液性免疫抑制疾患の治療のための、体液性免疫抑制因子の拮抗薬の組成物および使用
WO2024026340A1 (en) Combination therapy for treatment of ovarian cancer
Collins Development of bispecific antibody mimetics
WO2024173352A2 (en) Methods of treating cancer with a sirp1a-based chimeric protein
TW202228789A (zh) 用於長效遞送治療劑之多能蛋白聚醣（ｖｇ１）的玻尿酸結合衍生物
JP2023524444A (ja) 医薬製剤
JPWO2019176866A1 (ja) ウテログロビンを構造基盤とする二重特異性ポリペプチド

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20240610

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20240610