ES2492815T3 - Procedimiento para la producción de inmunoglobulinas humanizadas - Google Patents

Abstract

El uso de primeras secuencias de nucleótidos que codifican regiones de marco de las cadenas ligera y pesada de Ig aceptora humana y de segundas secuencias de nucleótidos que codifican RDC de una Ig donante en la producción de polinucleótidos expresables que codifican una inmunoglobulina humanizada; inmunoglobulina que es una obtenible por un procedimiento que comprende: (a) comparar las secuencias de aminoácidos de la región de marco o variable de las cadenas ligera y pesada de Ig donante con secuencias correspondientes de una colección de cadenas de Ig humana; (b) seleccionar, para proporcionar marcos de cadena ligera y pesada de Ig aceptora humana, secuencias de la colección que tienen al menos el 65 % de identidad con las secuencias de marco donantes respectivas; y (c) combinar las RDC de la Ig donante y marcos de las secuencias aceptoras seleccionadas

Description

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DESCRIPCIÓN

Procedimiento para la producción de inmunoglobulinas humanizadas

Campo de la invención

La presente invención se refiere generalmente a la combinación de tecnologías de ADN recombinante y 5 anticuerpos monoclonales para desarrollar nuevos agentes terapéuticos y más particularmente, a la producción de anticuerpos no inmunógenos y a sus usos.

Antecedentes de la invención

En los mamíferos, la respuesta inmunitaria está mediada por dos tipos de células que interaccionan específicamente con material extraño, es decir, antígenos. Uno de estos tipos de células, las células B, es

10 responsable de la producción de anticuerpos. La segunda clase de células, las células T, incluyen una gran diversidad de subconjuntos celulares que controlan la función in vivo tanto de las células B como de una gran diversidad de otras células hematopoyéticas, incluidas las células T.

Una manera en la que las células T ejercen este control es mediante la producción de una linfocina conocida como interleucina-2 (IL-2), denominada originalmente factor de crecimiento de las células T. La función primaria de IL-2

15 parece ser la estimulación y el mantenimiento de las células T. De hecho, algunos inmunólogos creen que IL-2 puede encontrarse en el centro de la respuesta inmunitaria completa (véase, Farrar, J. y col., Immunol. Rev. 63: 129-166 (1982), que se incorpora el presente documento por referencia).

Para ejercer sus efectos biológicos, IL-2 interacciona con un receptor de membrana específico de alta afinidad (Greene, W. y col., Progress in Hematology XIV, E. Brown, compilador, Grune y Statton, Nueva York (1986), en las 20 páginas 283 y siguientes). El receptor de IL-2 humana es una glucoproteína compleja de cadenas múltiples, teniendo una de las cadenas, conocida como el péptido Tac, aproximadamente 55 kD de tamaño (véase, Leonard,

W. y col., J. Biol. Chem., 260: 1872 (1985), que se incorpora en el presente documento mediante referencia). Se ha aislado un gen que codifica esta proteína y predice un péptido de 272 aminoácidos, con inclusión de un péptido señal de 21 aminoácidos (véase, Leonard, W. y col., Nature 311: 626 (1984)). Los 219 aminoácidos NH2

25 terminales de la proteína p55 Tac comprenden aparentemente un dominio extracelular (véase, Leonard, W. y col., Science, 230: 633-639 (1985), que se incorpora el presente documento por referencia).

Gran parte de la dilucidación de la estructura y función del receptor de IL-2 humana y su función se debe al desarrollo de anticuerpos monoclonales específicamente reactivos. En particular, un anticuerpo monoclonal de ratón, conocido como anti-Tac (Uchiyama y col., J. Immunol. 126: 1393 (1981)) ha demostrado que se pueden

30 detectar receptores de IL-2 en las células T, pero también en células de la familia monocitos-macrófagos, células Kupffer del hígado, células Langerhans de la piel y por supuesto, células T activadas. De forma importante, las células T inactivas, las células B o los macrófagos circulantes no presentan típicamente el receptor de IL-2 (Herrmann y col., J. Exp. Med. 162: 1111 (1985)).

El anticuerpo monoclonal anti-Tac se ha utilizado también para definir funciones de los linfocitos que requieren

35 interacción con IL-2 y se ha demostrado que inhibe diversas funciones de las células T, oncluyendo la generación de linfocitos T citotóxicos y supresores en la estructura de la célula. Asimismo, sobre la base de estudios con anti-Tac y otros anticuerpos, se asocian actualmente una diversidad de trastornos con la expresión impropia de receptor de IL-2 por las células T, en particular la leucemia de las células T de los adultos.

Más recientemente, el receptor de IL-2 ha mostrado ser una diana ideal para nuevos enfoques terapéuticos a las

40 enfermedades mediadas por las células T. Se ha propuesto que anticuerpos específicos del receptor de IL-2, tales como el anticuerpo monoclonal anti-Tac, se pueden utilizar bien sea solos o bien como un inmunoconjugado (p ej., con Ricina A, isótopos y similares) para separar eficazmente las células que llevan el receptor de IL-2. Estos agentes pueden, por ejemplo, eliminar teóricamente las células leucémicas que expresan el receptor de IL-2, ciertas células B, o células T activadas implicadas en un estado de enfermedad, permitir aun la retención de las

45 células T normales maduras y sus precursores para asegurar la capacidad de montar una respuesta inmunitaria de las células T normales en caso necesario. En general, la mayoría de otros agentes específicos de las células T pueden destruir esencialmente todas las células T periféricas, lo que limita la eficacia terapéutica de los agentes. Globalmente, el uso de anticuerpos monoclonales apropiados específicos para el receptor de IL-2 puede tener utilidad terapéutica en enfermedades autoinmunes, trasplantes de órganos y cualquier respuesta no deseada por

50 las células T activadas. De hecho, se han iniciado pruebas clínicas utilizando, p ej., anticuerpos anti-Tac (véase, en general, Waldman, T. y col., Cancer Res. 45: 625 (1985) y Waldman, T., Science 232: 727-732 (1986), ambos incorporados en el presente documento por referencia).

Desafortunadamente, el uso del anticuerpo anti-Tac y otros anticuerpos monoclonales no humanos presenta ciertos inconvenientes, en particular en regímenes terapéuticos repetidos como se explica más adelante. Los anticuerpos monoclonales de ratón, por ejemplo, no fijan bien el complemento humano y carecen de otras características funcionales importantes de inmunoglobulinas cuando se utilizan en seres humanos.

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Quizás de manera más importante, el anticuerpo anti-Tac y otros anticuerpos monoclonales no humanos contienen

5 tramos sustanciales de secuencias de aminoácidos que serán inmunógenos cuando se inyectan a un paciente humano. Numerosos estudios han demostrado que, después de la inyección de un anticuerpo extraño, la respuesta inmunitaria provocada por un paciente contra un anticuerpo puede ser muy fuerte, eliminando esencialmente la utilidad terapéutica del anticuerpo después de un tratamiento inicial. Además, dado que puede esperarse que se desarrollen números crecientes de anticuerpos monoclonales diferentes de ratón u otros anticuerpos monocloneles

10 antigénicos (para los seres humanos) para tratar diversas enfermedades, después de los tratamientos primero y segundo con cualesquiera anticuerpos no humanos diferentes, los tratamientos subsiguientes incluso para terapias no semejantes pueden ser ineficaces o incluso peligrosos en sí mismos.

Si bien la producción de los denominados "anticuerpos quiméricos" (p ej., regiones variables de ratón unidas a regiones constantes humanas) (véase, por ejemplo, el documento WO89/09622) ha alcanzado un éxito relativo, 15 persiste un problema importante de inmunogenicidad. En general, la producción de inmunoglobulinas humanas reactivas con el receptor de IL-2 humana, como con muchos antígenos humanos, ha resultado extremadamente difícil utilizando técnicas de producción de anticuerpos monoclonales humanos típicas. Análogamente, los intentos pasados que utilizan tecnología de ADN recombinante para producir los denominados anticuerpos "humanizados" (véase p ej., la publicación EPO N.º: 0239400), proporcionan resultados inciertos, debido en parte a afinidades de

20 unión no predecibles.

Así pues, existe necesidad de formas mejoradas de inmunoglobulinas análogas a las humanas, tales como las específicas para el receptor de IL-2 humana, que sean sustancialmente no inmunógenas en seres humanos, sin embargo se producen fácil y económicamente de una manera adecuada para formulación terapéutica y otros usos. La presente invención satisface estas y otras necesidades.

25 Riechmann y col. ("Reshaping human antibodies for therapy", Nature, vol. 332, páginas 323-326, (marzo de 1988)) describen un trabajo en el que precisamente las CDR de Kabat se transfirieron a un marco humano predeterminado (NEW de nuevo para la cadena pesada y REI para la cadena ligera). Sin embargo, dichos autores encontraron que un anticuerpo que contenía la cadena pesada humanizada perdía la mayor parte de su afinidad de unión y aptitud para lisar las células diana. Por esta razón, dichos investigadores produjeron un nuevo anticuerpo

30 humanizado que contenía las CDR de Kabat a partir del anticuerpo de ratón y dos cambios de aminoácidos en el bucle hipervariable H1 de Chothia, pero ningún otro aminoácido de ratón.

Sumario de la invención

La invención proporciona el uso de primeras secuencias nucleotídicas que codifican para regiones marco de cadenas ligeras y pesadas de Ig aceptoras humanas y segundas secuencias nucleotídicas que codifican para CDR

35 de Kabat de una Ig donante en la producción de polinucleótidos expresables que codifican una inmunoglobulina humanizada, inmunoglobulina en la que:

(a) los marcos de las cadenas ligera y pesada de Ig aceptora humana son secuencias seleccionadas de un conjunto de cadenas de Ig humanas y tienen al menos un 65% de identidad con las respectivas secuencias marco donantes; y

40 (b) CDR de la Ig donante se combinan con marcos de las secuencias aceptoras seleccionadas.

En otro aspecto, la invención proporciona el uso de primeras secuencias nucleotídicas que codifican para regiones marco de las cadenas ligera y pesada de Ig aceptoras humanas y segundas secuencias nucleotídicas que codifican para CDR de Kabat de una Ig donante en la producción de una inmunoglobulina humanizada, inmunoglobulina en la que:

45 (a) los marcos de las cadenas ligera y pesada de Ig aceptoras humanas son secuencias seleccionadas de un conjunto de cadenas de Ig humanas y tienen al menos un 65% de identidad con las respectivas secuencias marco donantes; y

(b) CDR de la Ig donante se combinan con marcos de las secuencias aceptoras seleccionadas.

Un procedimiento para la producción de una inmunoglobulina humanizada que comprende:

50 (a) comparar las secuencias de aminoácidos de la región marco o variable de las cadenas ligeras y pesadas de la Ig donante con las correspondientes secuencias en un conjunto de cadenas de Ig humanas;

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(b)

seleccionar, para proporcionar marcos de las cadenas ligeras y pesadas de Ig aceptora, secuencias del conjunto que tiene al menos un 65% de identidad con las respectivas secuencias marco donantes; y

(c)

combinar CDR de Kabat de la Ig donante y marcos de las secuencias aceptoras seleccionadas, mediante

el uso de primeras secuencias nucleotídicas que codifican las regiones marco de las cadenas ligeras y pesadas de 5 las Ig aceptoras humanas y segundas secuencias nucleotídicas que codifican las CD de la Ig donante,

inmunoglobulina con un aminoácido correspondiente de la inmunoglobulina donante en una posición en las inmunoglobulinas, en la que:

(a) el aminoácido en la región marco humana de la inmunoglobulina aceptora es raro para dicha posición y el

aminoácido correspondiente en la inmunoglobulina donante es común para dicha posición en secuencias de 10 inmunoglobulina humana; o

(b)

el aminoácido está inmediatamente adyacente a una de las CDR; o

(c)

se predice que el aminoácido es capaz de interaccionar con las CDR de la inmunoglobulina humanizada.

Las inmunoglobulinas humanizadas se pueden producir según los principios de la invención para usar como productos farmacéuticos, y en la fabricación de medicamentos.

15 La presente solicitud permite nuevas composiciones útiles, por ejemplo, en el tratamiento de trastornos humanos mediados por las células T, conteniendo las composiciones inmunoglobulinas semejantes a las humanas capaces específicamente de bloquear la unión de IL-2 humana a su receptor y/o capaces de unirse a la proteína p55 Tac en receptores de IL-2 humana. Las inmunoglobulinas pueden tener dos pares de complejos cadena ligera/cadena pesada, teniendo típicamente al menos un par de cadenas que comprenden regiones determinantes de la

20 complementariedad de ratón unidas funcionalmente a segmentos de región de marco humana. Por ejemplo, las regiones determinantes de la complementariedad de ratón, con o sin restos de aminoácidos de ratón adicionales asociados naturalmente, se pueden utilizar para producir anticuerpos semejantes a los humanos capaces de unirse al receptor de IL-2 humana con niveles de afinidad más fuertes que aproximadamente 108 M-1 .

Dichas composiciones se pueden usar como productos farmacéuticos en la fabricación de medicamentos.

25 Las inmunoglobulinas, incluidos los fragmentos de unión y otros derivados de los mismos, permitidas por la presente invención se pueden producir fácilmente mediante una diversidad de técnicas de ADN recombinante, con expresión última en células transfectadas, preferentemente células eucariotas inmortalizadas, tales como células de mieloma o de hibridoma. Polinucleótidos que comprenden una primera secuencia que codifica regiones marco de inmunoglobulina semejantes a las humanas y un segundo conjunto de secuencias que codifica las regiones

30 determinantes de la complementariedad de inmunoglobulinas deseadas pueden producirse sintéticamente o por combinación de segmentos de ADNc y ADN genómico apropiados.

Las inmunoglobulinas semejantes a las humanas se pueden utilizar solas en forma sustancialmente pura, o complejadas con un agente citotóxico, tal como un radionucleido, una proteína inhibidora de ribosomas o un agente citotóxico activo en las superficies celulares. Todos estos compuestos serán particularmente útiles en el

35 tratamiento de trastornos mediados por las células T. Las inmunoglobulinas semejantes a las humanas o sus complejos se pueden preparar en una forma de dosificación farmacéuticamente aceptada, que variará dependiendo del modo de administración.

En los procedimientos de la presente invención, se pueden diseñar cadenas de inmunoglobulina semejantes a las humanas que tienen una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de una inmunoglobulina 40 donante y una región marco de una inmunoglobulina humana, implicando los procedimientos comparar primero la secuencia de aminoácidos de la región marco o de la región variable de la inmunoglobulina donante con secuencias correspondientes en un conjunto de cadenas de inmunoglobulina humana y seleccionar como inmunoglobulina humana una de las secuencias más homólogas de la colección. La secuencia de la inmunoglobulina humana, o de la inmunoglobulina aceptora, se selecciona típicamente de un conjunto de al menos 45 10 a 20 secuencias de cadena de inmunoglobulina y usualmente tendrán la homología más alta con la secuencia de inmunoglobulina donante de cualquier secuencia de la colección. La secuencia marco de la inmunoglobulina humana tendrá normalmente aproximadamente del 65 al 70 % o más de homología con las secuencias marco de la inmunoglobulina donante. La inmunoglobulina donante puede ser una cadena pesada o cadena ligera (o ambas) y el conjunto humano contendrá la misma clase de cadena. Se puede utilizar una cadena ligera y una pesada

50 humanizadas para formar una inmunoglobulina o anticuerpo humanizado completo, que tenga dos pares de cadena ligera/pesada, con o sin regiones constantes de longitud parcial o total humanas y otras proteínas.

Conjuntamente con la etapa de comparación anterior o no, pueden reemplazarse aminoácidos adicionales en una cadena de inmunoglobulina aceptora por aminoácidos de la cadena de inmunoglobulina donante de CDR. Más específicamente, se realizarán sustituciones opcionales adicionales de un aminoácido de marco humano de la inmunoglobulina aceptora por un aminoácido correspondiente de una inmunoglobulina donante en posiciones en las inmunoglobulinas en las que:

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a) el aminoácido en la región de marco humana de una inmunoglobulina aceptora es raro para dicha posición y el 5 aminoácido correspondiente en la inmunoglobulina donante es común para dicha posición en secuencias de inmunoglobulina humana; o

b) el aminoácido está inmediatamente adyacente a una de las CDR; o

c) se predice que el aminoácido tiene un átomo de la cadena lateral capaz de interactuar con el antígeno o con las CDR de la inmunoglobulina humanizada, opcionalmente dentro de aproximadamente 3 Å de las CDR en un modelo

10 de inmunoglobulina tridimensional.

La cadena de inmunoglobulina humanizada comprenderá típicamente al menos aproximadamente 3 aminoácidos de la inmunoglobulina donante además de las CDR, usualmente al menos uno de los cuales está inmediatamente adyacente a una CDR en la inmunoglobulina donante. Las cadenas pesada y ligera pueden diseñarse cada una utilizando uno cualquiera o la totalidad de los tres criterios de posición.

15 Cuando se combinan en un anticuerpo intacto, las cadenas ligera y pesada humanizadas de la presente invención serán sustancialmente no inmunógenas en seres humanos y retendrán sustancialmente la misma afinidad que la inmunoglobulina donante para el antígeno (tal como una proteína u otro compuesto que contenga un epítopo). Estos niveles de afinidad pueden variar desde aproximadamente 108 M-1 o mayor y pueden estar comprendidos dentro de aproximadamente el cuádruple de la afinidad original de la inmunoglobulina donante para el antígeno.

20 Breve descripción de las figuras

Figura 1. Comparación de secuencias de cadena pesada de anti-Tac (líneas superiores) y cadena pesada de Eu (líneas inferiores). Se utiliza el código de una sola letra para los aminoácidos. El primer aminoácido de cada línea se numera a la izquierda. Los aminoácidos idénticos en las dos secuencias están conectados por líneas. Las tres CDR están subrayadas. Otras posiciones de aminoácidos para las que se utilizó el aminoácido de anti-Tac más

25 bien que el aminoácido de Eu en la cadena pesada de anti-Tac humanizada se designan con un *.

Figura 2. Comparación de secuencias de cadena ligera de anti-Tac (líneas superiores) y cadena ligera de Eu (líneas inferiores). Se utiliza el código de una sola letra para los aminoácidos. El primer aminoácido en cada línea se numera a la izquierda. Los aminoácidos idénticos en las dos secuencias están conectados por líneas. Se subrayan las tres CDR. Otras posiciones de aminoácidos para las que se utilizó el aminoácido de anti-Tac en lugar

30 del aminoácido de Eu en la cadena pesada de anti-Tac humanizada se designa con un *.

Figura 3. Secuencia de nucleótidos del gen para el gen de la región variable de la cadena pesada de anti-Tac humanizada. La secuencia de aminoácidos traducida para la parte del gen codificante de la proteína se muestra bajo la secuencia de nucleótidos. Los nucleótidos TCTAGA al principio y final del gen son sitios Xba I. La secuencia de la cadena pesada madura comienza con el aminoácido n.º: 20 Q.

35 Figura 4. Secuencia de nucleótidos del gen para el gen de la región variable de la cadena ligera de anti-Tac humanizada. La secuencia de aminoácidos traducida para la parte del gen que codifica la proteína se muestra bajo la secuencia de nucleótidos. Los nucleótidos TCTAGA al comienzo y final del gen son sitios Xba I. La secuencia de la cadena ligera madura comienza con el aminoácido n.º: 21 D.

Figura 5. A. Secuencias de los cuatro oligonucleótidos utilizados para sintetizar el gen de la cadena pesada de anti

40 Tac humanizada, impresa en sentido 5' a 3'. B. Posiciones relativas de los oligonucleótidos. Las flechas apuntan en la dirección 3' para cada oligonucleótido.

Figura 6. (A) Secuencias de los cuatro oligonucleótidos utilizados para sintetizar el gen de la cadena ligera anti-Tac humanizada, impresa en el sentido 5' a 3'. (B) Posiciones relativas de los oligonucleótidos. Las flechas apuntan en la dirección 3' para cada oligonucleótido. Se muestra la posición de un sitio Hind III en la superposición de JFD2 y

45 JFD3.

Figura 7. Diagrama esquemático del plásmido pHuGTAC1 utilizado para expresar la cadena pesada de anti-Tac humanizada. Se muestran los sitios de restricción relevantes y las regiones codificantes de la cadena pesada se presentan como cajas. La dirección de transcripción a partir del promotor de inmunoglobulina (Ig) se muestra por una flecha. EH = intensificador de la cadena pesada, Hyg = gen de resistencia a la higromicina.

50 Figura 8. Diagrama esquemático del plásmido pHuLTAC utilizado para expresar la cadena ligera de anti-Tac humanizada. Se muestran los sitios de restricción relevantes y las regiones codificantes de la cadena ligera se presentan como cajas. La dirección de transcripción desde el promotor Ig se muestra por una flecha.

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Figura 9. Fluorocitometría de células HUT-102 y células Jurkat teñidas con anticuerpo anti-Tac o anticuerpo anti-Tac humanizado seguidos respectivamente por anticuerpo Ig anti-ratón de cabra conjugado con fluoresceína o anticuerpo Ig anti-humano de cabra conjugado con fluoresceína, conforme se etiqueta. En cada panel, la curva de

5 puntos muestra los resultados cuando se omitió el primer anticuerpo y la curva sólida continua los resultados cuando se incluyeron los anticuerpos primero y segundo (conjugados) como se describe.

Figura 10. (A) Fluorocitometría de células HUT-102 teñidas con 0-40 ng de anti-Tac como se indica, luego con anti-Tac biotinilado y posteriormente con avidina conjugada con ficoeritrina. (B) Fluorocitometría de células HUT102 teñidas con el anticuerpo indicado, luego con anti-Tac biotinilado y después con avidina conjugada con

10 ficoeritrina.

Descripción detallada de la invención

De acuerdo con una realización de la presente invención, las inmunoglobulinas semejantes a las humanas reactivas específicamente con epítopos deseados, tales como los del receptor de IL-2 en células T humanas, se

M-1

permiten. Estas inmunoglobulinas, que tienen afinidades de unión de al menos aproximadamente 108 y

15 preferentemente 109 M-1 a 1010 M-1 o más fuertes, son capaces de, p ej., bloquear la unión de IL-2 a receptores de IL-2 humana. Las inmunoglobulinas semejantes a las humanas tendrán un marco semejante al humano y pueden tener regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de una inmunoglobulina, típicamente una inmunoglobulina de ratón, específicamente reactiva con un epítopo de la proteína p55 Tac. Las inmunoglobulinas permitidas por la presente invención que se pueden producir económicamente en grandes cantidades, encuentran

20 uso, por ejemplo, en el tratamiento de trastornos mediados por las células T en pacientes humanos por una diversidad de técnicas.

Se sabe que la unidad estructural del anticuerpo básico comprende un tetrámero. Cada tetrámero se compone de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kD) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kD). El extremo NH2 de cada cadena comienza con una región

25 variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos responsables fundamentalmente del reconocimiento del antígeno. El extremo COOH de cada cadena define una región constante fundamentalmente responsable de la función efectora.

Las cadenas ligeras se clasifican bien como kappa o bien como lambda. Las cadenas pesadas se clasifican (y subclasifican) como gamma, mu, alfa, delta, o épsilon y definen el isotipo del anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgD e

30 IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligera y pesada, las regiones variables y constantes se unen por una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, incluyendo también la cadena pesada una región "D" de aproximadamente 12 aminoácidos más. (Véase, generalmente, Fundamental Immunology, Paul, W., Ed., capítulo 7, páginas 131-166, Raven Press, Nueva York (1984), que se incorpora en el presente documento por referencia.)

Las regiones variables de cada par de cadenas ligera/pesada forman el sitio de unión de anticuerpo. La totalidad

35 de las cadenas exhiben la misma estructura general de regiones marco relativamente conservadas unidas por tres regiones hipervariables, denominadas también CDR (véase, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", Kabat, E. y col., Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, (1983); y Chothia y Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901-917 (1987), que se incorporan en el presente documento por referencia). Las CDR de las dos cadenas de cada par están alineadas por las regiones marco, permitiendo la unión a un epítopo específico.

40 Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "inmunoglobulina" se refiere a una proteína que consiste en uno o más polipéptidos codificados sustancialmente por genes de inmunoglobulina. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de la región constante kappa, lambda, alfa, gamma, delta, épsilon y mu, así como los genes de la región variable de inmunoglobulina que constituyen una miríada. Las inmunoglobulinas pueden existir en una diversidad de formas además de anticuerpos; con inclusión, por ejemplo, de Fv, Fab y F(ab)2, así

45 como en cadenas simples (p ej., Huston y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 85: 5879-5883 (1988) y Bird y col., Science, 242: 423-426 (1988), que se incorporan en el presente documento por referencia). (Véanse, en general, Hood y col., "Immunology", Benjamin, N.Y., segunda edición (1984) y Hunkapiller y Hood, Nature, 323:15-16 (1986), que se incorporan en el presente documento por referencia).

Los anticuerpos quiméricos son anticuerpos cuyos genes de cadena ligera y pesada se han construido,

50 típicamente por ingeniería genética, a partir de segmentos de gen de inmunoglobulina pertenecientes a especies diferentes. Por ejemplo, los segmentos variables (V) de los genes de un anticuerpo monoclonal de ratón pueden unirse a segmentos constantes (C) humanos, tales como γ1 y γ3. Un anticuerpo quimérico terapéutico típico es por consiguiente una proteína híbrida que consiste en el dominio V o de unión de antígeno de un anticuerpo de ratón y el dominio C o efector de un anticuerpo humano (p ej., A.T.C.C. N.º de Acceso CRL 9688 secreta un anticuerpo

55 quimérico anti-Tac), aunque pueden utilizarse otras especies de mamíferos.

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Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "región marco" se refiere a aquellas porciones de regiones variables de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina que están conservadas relativamente (es decir, distintas de las regiones CDR) entre inmunoglobulinas diferentes en una sola especie, según se define por Kabat y col., op. cit. Tal como se utiliza en la presente memoria, una "región de marco semejante a la humana" es una región de

5 marco que en cada cadena existente comprende al menos aproximadamente 70 o más restos de aminoácidos, típicamente 75 a 85 o más restos, idénticos a los existentes en una inmunoglobulina humana.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "inmunoglobulina semejante a la humana" se refiere a una inmunoglobulina que comprende un marco semejante al humano y en la que cualquier región constante presente es sustancialmente homogénea a una región constante de inmunoglobulina humana, es decir, tiene al menos

10 aproximadamente un 85-90 %, preferentemente al menos un 95 % de identidad con esta última. Por tanto, todas las partes de una inmunoglobulina semejante a la humana, salvo posiblemente las CDR, son sustancialmente homólogas a partes correspondientes de una o más secuencias de inmunoglobulina humana nativas. Por ejemplo, una inmunoglobulina semejante a la humana no abarcaría un anticuerpo quimérico de región variable de ratón/región constante humana.

15 De acuerdo con otro aspecto general de la presente invención, también se incluyen criterios mediante los que se selecciona un número limitado de aminoácidos en el marco de una cadena de inmunoglobulina semejante a la humana o humanizada de modo que sean los mismos que los aminoácidos en las posiciones en la Ig donante en lugar de encontrarse en la Ig aceptora, con objeto de incrementar la afinidad de un anticuerpo que comprende la cadena de inmunoglobulina humanizada.

20 Este aspecto de la presente invención está basado en parte en el modelo de que dos causas contribuyentes a la pérdida de afinidad en los medios de producción de anticuerpos humanizados de la técnica anterior (utilizando como ejemplos anticuerpos de ratón como la fuente de CDR) son:

(1) cuando las CDR de ratón se combinan con el marco humano, los aminoácidos en el marco próximos a las CDR se vuelven humanos en lugar de de ratón. Sin pretender quedar ligados a ninguna teoría, se cree que estos

25 aminoácidos cambiados pueden distorsionar ligeramente las CDR, debido a que los mismos crean fuerzas electrostáticas o hidrófobas diferentes que en el anticuerpo de ratón donante y las CDR distorsionadas pueden no establecer contactos tan eficaces con el antígeno como lo hacían las CDR en el anticuerpo donante;

(2) asimismo, los aminoácidos en el anticuerpo de ratón original que están próximos a, pero no forman parte de las CDR (es decir, parte fija del marco), pueden establecer contactos con el antígeno que contribuyen a la afinidad.

30 Estos aminoácidos se pierden cuando se humaniza el anticuerpo, debido a que todos los aminoácidos del marco se vuelven humanos.

Para evitar estos problemas y con objeto de producir anticuerpos humanizados que tengan una afinidad muy fuerte por un antígeno deseado, los cuatro criterios siguientes se pueden usar para designar inmunoglobulinas humanizadas. Estos criterios se pueden utilizar aisladamente, o en caso necesario en combinación, para alcanzar

35 la afinidad deseada u otras características.

Criterio I: como aceptor, se utiliza un marco de una inmunoglobulina humana particular que es inusualmente homóloga para la inmunoglobulina del donante a humanizar, o se utiliza un marco de consenso de muchos anticuerpos humanos. Por ejemplo, la comparación de la secuencia de una región variable de cadena pesada (o ligera) de ratón con las regiones variables pesadas (o ligeras) humanas en un banco de datos (por ejemplo, el 40 National Biomedical Research Foundation Protein Identification Resource) muestra que el grado de homología con regiones humanas diferentes varía notablemente, de manera típica desde aproximadamente un 40 % a aproximadamente un 60-70 %. Eligiendo como la inmunoglobulina aceptora una de las regiones variables de la cadena pesada (o ligera, respectivamente) humana que es más homóloga a la región variable de la cadena pesada (o ligera, respectivamente) de la inmunoglobulina donante, menos aminoácidos se cambiarán al pasar desde la

45 inmunoglobulina donante a la inmunoglobulina humanizada. Por consiguiente y de nuevo sin pretender quedar ligados por la teoría, se cree que existe una probabilidad menor de cambiar un aminoácido próximo a las CDR que distorsione su conformación. Además, la forma global precisa de un anticuerpo humanizado que comprende la cadena de inmunoglobulina humanizada puede asemejarse más estrechamente a la forma del anticuerpo donante, reduciendo también la probabilidad de distorsionar las CDR.

50 Típicamente, una de las 3-5 secuencias de la región variable de la cadena pesada más homólogas en un conjunto representativo de al menos aproximadamente 10 a 20 cadenas pesadas humanas distintas se seleccionará como aceptor para proporcionar el marco de la cadena pesada y análogamente para la cadena ligera. Preferentemente, se utilizará una de las 1-3 regiones variables más homólogas. La cadena de inmunoglobulina aceptora seleccionada tendrá de modo muy preferible al menos aproximadamente el 65 % de homología en la región marco

55 con la inmunoglobulina donante.

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Sin tener en cuenta cómo se seleccione la inmunoglobulina aceptora, se puede alcanzar una afinidad mayor seleccionando un número pequeño de aminoácidos en el marco de la cadena de inmunoglobulina humanizada de modo que sean los mismos que los aminoácidos en aquellas posiciones en el donante en vez del aceptor. Los criterios siguientes definen qué aminoácidos pueden seleccionarse de este modo. Preferentemente, en la mayoría

5 o la totalidad de las posiciones de aminoácidos que satisfacen uno de estos criterios, se seleccionará de hecho el aminoácido donante.

Criterio II: si un aminoácido en el marco de la inmunoglobulina aceptora humana es inusual (es decir, "raro"), lo que tal como se utiliza en la presente memoria indica un aminoácido que existe en dicha posición en no más de aproximadamente el 10 % de las secuencias de región V de cadena pesada (o ligera, respectivamente) humana en 10 un banco de datos representativo) y si el aminoácido donante en dicha posición es típico para secuencias humanas (es decir, "común", que tal como se utiliza en la presente memoria indica un aminoácido que existe en al menos aproximadamente el 25 % de las secuencias en un banco de datos representativo), entonces puede seleccionarse el aminoácido donante en lugar del aceptor. Este criterio contribuye a asegurar que un aminoácido atípico en el marco humano no interrumpa la estructura del anticuerpo. Además, reemplazando un aminoácido

15 inusual con un aminoácido del anticuerpo del donante que es típico para anticuerpos humanos, el anticuerpo humanizado puede hacerse menos inmunógeno.

Criterio III: en las posiciones inmediatamente adyacentes a las 3 CDR en la cadena de inmunoglobulina humanizada, puede seleccionarse el aminoácido donante en lugar del aminoácido aceptor. Estos aminoácidos son particularmente propensos a interaccionar con los aminoácidos en las CDR y si son seleccionados del aceptor,

20 distorsionan la CDR del donante y reducen la afinidad. Además, los aminoácidos adyacentes pueden interaccionar directamente con el antígeno (Amit y col., Science, 233, 747-753 (1986), que se incorpora en el presente documento por referencia) y la selección de estos aminoácidos del donante puede ser deseable para mantener la totalidad de los contactos del antígeno que proporcionan afinidad en el anticuerpo original.

Criterio IV: un modelo tridimensional, típicamente del anticuerpo donante original, muestra que ciertos

25 aminoácidos no pertenecientes a las CDR están próximos a las CDR y tienen una probabilidad considerable de interaccionar con aminoácidos en las CDR mediante enlaces de hidrógeno, fuerzas de Van der Waals, interacciones hidrófobas, etc. En dichas posiciones de aminoácidos, se puede seleccionar el aminoácido donante más bien que el aminoácido de la inmunoglobulina aceptora. Aminoácidos de acuerdo con este criterio tendrán generalmente un átomo de cadena lateral situado dentro de aproximadamente 3 unidades angstrom de algún sitio

30 en las CDR y tienen que contener átomos que puedan interaccionar con los átomos de las CDR conforme a fuerzas químicas establecidas, tales como las enumeradas anteriormente. Programas de ordenador para crear modelos de proteínas tales como anticuerpos están disponibles generalmente y son bien conocidos por los expertos en la técnica (véanse, Loew y col., Int. J. Quant. Chem., Quant. Biol. Symp., 15:55-56 (1988); Bruccoleri y col., Nature, 335, 564-568 (1988); Chothia y col., Science, 233:755-758 (1986)). Estos no forman parte de la

35 invención. De hecho, dado que todos los anticuerpos tienen estructuras similares, las estructuras de anticuerpos conocidas, que están asequibles del Brookhaven Protein Data Bank, se pueden utilizar en caso necesario como modelos aproximados de otros anticuerpos. Programas de ordenador comercialmente asequibles pueden utilizarse para presentar estos modelos en un monitor de ordenador, a fin de calcular de distancia entre los átomos y estimar la probabilidad de interacción entre aminoácidos diferentes (véase, Ferrin y col., J. Mol. Graphics, 6:13-27 (1988)).

40 Anticuerpos humanizados o análogos a los humanos tienen generalmente al menos tres ventajas potenciales sobre los anticuerpos de ratón o en algunos casos anticuerpos quiméricos para uso en terapia humana:

1) Debido a que la porción efectora es humana, la misma puede interaccionar mejor con las otras partes del sistema inmunológico humano (p ej., destruir las células diana más eficientemente por citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC))

45 2) El sistema inmunológico humano no debería reconocer la región de marco o constante del anticuerpo humanizado como extraña y por consiguiente la respuesta de anticuerpos contra dicho anticuerpo inyectado debería ser menor que contra un anticuerpo de ratón totalmente extraño o un anticuerpo quimérico parcialmente extraño.

3) Se ha informado que anticuerpos de ratón inyectados tienen una semivida en la circulación humana

50 mucho más corta que la semivida de los anticuerpos normales (D. Shaw y col., J. Immunol., 138: 4534-4538 (1987)). Los anticuerpos humanizados inyectados tendrán probablemente una semivida más similar a los anticuerpos humanos existentes naturalmente, haciendo posible que se administren dosis más pequeñas y menos frecuentes.

Los procedimientos de la presente invención están específicamente dirigidos a la producción de inmunoglobulinas

55 humanizadas mejoradas (p. ej., capaces de unirse al receptor de IL-2 humana) con respecto a las descritas en la publicación EPA N.º: 0239400. Dicha solicitud, cuya divulgación queda fuera del campo de la presente invención,

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describe, para ciertas inmunoglobulinas, sustituir regiones de CDR en los dominios variables de la cadena ligera o pesada de un anticuerpo aceptor por partes análogas de CDR (típicamente accesibles mediante disolventes) de un anticuerpo de especificidad diferente. Asimismo, dicha solicitud expone, para ciertas inmunoglobulinas, la posibilidad de transferir únicamente restos que son accesibles (mediante disolventes) desde el sitio de unión del 5 antígeno, pudiendo incluir aparentemente dichos restos ciertas regiones marco (específicamente, restos que se sabe que están implicados en la unión del antígeno como se describe en Amit y col., Science 233: 747-753 (1986)

o quizá restos esenciales para interacciones entre cadenas, pero para cuya selección se dan orientaciones insuficientes en dicha solicitud). Así, por ejemplo, una realización preferida de la presente invención implica sustituir CDR completas y aminoácidos de la región marco inmediatamente adyacentes a una (o preferentemente a

10 cada una) de las CDR. En general, cualquier resto de la región marco que entre también en contacto con las CDR para, por ejemplo, mantener su conformación (y usualmente su especificidad de unión al antígeno) está incluidos específicamente dentro de las realizaciones preferidas de la presente invención como se ha descrito en detalle anteriormente.

En un aspecto, la presente solicitud describe segmentos de ADN recombinante que codifican para las CDR de

15 cadena pesada y/o ligera (típicamente con otros restos de aminoácidos como se ha descrito anteriormente) de una inmunoglobulina capaz de unirse a un epítopo deseado, tal como al receptor de la IL-2 humana (p ej., el anticuerpo monoclonal anti-Tac). Los segmentos de ADN que codifican estas regiones se unirán típicamente a segmentos de ADN que codifican para regiones marco semejantes a las humanas apropiadas. Por ejemplo, las secuencias de ADN preferidas, que con la expresión codifican las cadenas de polipéptidos que comprenden las regiones

20 hipervariables de la cadena pesada y ligera anti-Tac (con regiones marco semejantes a las humanas), se muestran en las Figuras 3 y 4, respectivamente. Debido a la degeneración de los codones y a las sustituciones de aminoácidos no críticos, otras secuencias de ADN pueden emplearse fácilmente en sustitución de dichas secuencias, como se detalla más adelante.

Los segmentos de ADN incluirán típicamente además una secuencia de ADN de control de la expresión enlazada

25 operativamente a las secuencias codificantes de anticuerpos semejantes a los humanos, con inclusión de regiones promotoras naturalmente asociadas o heterólogas. Preferentemente, las secuencias de control de la expresión serán sistemas promotores de eucariotas en vectores capaces de transformar o transfectar células huéspedes eucariotas, pero también se pueden utilizar secuencias de control para huéspedes procariotas. Una vez que el vector se ha incorporado al huésped apropiado, el huésped se mantiene en condiciones adecuadas para un nivel

30 de expresión alto de las secuencias de nucleótidos y en caso deseado, pueden seguir la recogida y purificación de las cadenas ligeras, cadenas pesadas, dímeros de cadena ligera/pesada o anticuerpos intactos, fragmentos de unión u otras formas de inmunoglobulina.

Las secuencias de ADN de la región constante humana se pueden aislar de acuerdo con procedimientos bien conocidos a partir de una diversidad de células humanas, pero preferentemente células B inmortalizadas (véanse, 35 Kabat, op. cit. y documento WP87/02671). Por ejemplo, los genes y secuencias de la región constante y de la región J de inmunoglobulina kappa humana se describen en Heiter y col., Cell 22: 197-207 (1990) y la secuencia de nucleótidos de un gen Cγ1 de inmunoglobulina humana se describe en Ellison y col., Nucl. Acid. Res. 10: 4071 (1982), ambas incorporadas en el presente documento por referencia. Las CDR para producir las inmunoglobulinas de la presente invención se derivarán de un modo similar a partir de anticuerpos monoclonales capaces de unirse 40 al antígeno deseado (p ej., el receptor de IL-2 humana) y se producirán a partir de cualquier fuente de mamífero conveniente, incluidos ratones, ratas, conejos, u otros vertebrados capaces de producir anticuerpos por procedimientos bien conocidos. Células fuente adecuadas para las secuencias de ADN y las células huésped para la expresión y secreción de inmunoglobulinas se pueden obtener a partir de diversas fuentes, tales como la Colección Americana de Cultivos Tipo ("Catalogue of Cell Lines and Hybridomas," 5ª edición (1985) Rockville,

45 Maryland, Estados Unidos, que se incorpora en el presente documento por referencia).

Además de las inmunoglobulinas semejantes a las humanas descritas específicamente en la presente memoria, otras inmunoglobulinas modificadas "sustancialmente homólogas" se pueden diseñar y fabricar fácilmente utilizando diversas técnicas de ADN recombinante bien conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, para las inmunoglobulinas receptoras de IL-2 las regiones marco pueden variar de las secuencias representadas en las 50 Figuras 3 y 4 al nivel de la estructura primaria por varias sustituciones, adiciones y deleciones terminales e intermedias de aminoácidos, etcétera. Además, una diversidad de diferentes regiones marco humanas pueden utilizarse aisladamente o en combinación como base para las inmunoglobulinas semejantes a las humanas de la presente invención. En general, modificaciones de los genes pueden realizarse fácilmente por una diversidad de técnicas bien conocidas, tales como mutagénesis dirigida al sitio (véanse, Gillman y Smith, Gen 8: 81-97 (1979) y

55 Roberts, S. y col., Nature 328: 731-734 (1987), ambos incorporados en el presente documento por referencia).

Como alternativa, se pueden producir fragmentos de polipéptidos que comprenden únicamente una porción de la estructura del anticuerpo primario, fragmentos que poseen una o más actividades de inmunoglobulina (p ej., actividad de unión del complemento). Asimismo dado que al igual que muchos genes, los genes relacionados con las inmunoglobulinas contienen regiones funcionales separadas, cada una de las cuales tiene una o más actividades biológicas distintas, los genes pueden fusionarse a regiones funcionales de otros genes (p ej., enzimas, véase, el documento de asignación común U.S.S.N. 132.387, presentado el 15 de diciembre de 1987, que se incorpora en el presente documento por referencia) para producir proteínas de fusión (p ej., inmunotoxinas) que

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5 tienen propiedades nuevas.

Las secuencias de ácido nucleico capaces de expresar finalmente los anticuerpos deseados semejantes a los humanos pueden formarse a partir de una diversidad de polinucleótidos (ADN genómico o ADNc, ARN, oligonucleótidos sintéticos, etc.) y componentes (p ej., regiones V, J, D y C) diferentes, así como por una diversidad de técnicas diferentes. La unión de secuencias genómicas apropiadas es actualmente el procedimiento

10 más común de producción, pero también se pueden utilizar secuencias de ADNc (véanse, la Publicación de Patente Europea N.º: 0239400 y Reichmann, L. y col., Nature 332: 323-327 (1988), ambos incorporados en el presente documento por referencia).

Como se ha indicado previamente, las secuencias de ADN se expresarán en huéspedes después que las secuencias se han enlazado operativamente a (es decir, posicionado para asegurar el funcionamiento de) una

15 secuencia de control de la expresión. Estos vectores de expresión son típicamente replicables en los organismos huéspedes, sea como episomas o como una parte integral del ADN cromosómico del huésped. Habitualmente, los vectores de expresión contendrán marcadores de selección, p ej., tetraciclina o neomicina, para permitir la detección de aquellas células transformadas con las secuencias de ADN deseadas (véase, p ej., la Patente de EE.UU. 4.704.362, que se incorpora en el presente documento por referencia).

20 E. coli es un huésped procariota particularmente útil para clonación de las secuencias de ADN de la presente invención. Otros huéspedes microbianos adecuados para uso incluyen bacilos, tales como Bacillus subtilis y otras enterobacteriáceas, tales como Salmonella, Serratia y diversas especies de Pseudomonas. En estos huéspedes procariotas, pueden producirse también vectores de expresión, que contendrán típicamente secuencias de control de la expresión compatibles con la célula huésped (p ej., un origen de replicación). Adicionalmente, estarán

25 presentes cualquier número de una diversidad de promotores bien conocidos, tales como el sistema promotor de lactosa, un sistema promotor de triptófano (trp), un sistema promotor de β-lactamasa, o un sistema promotor del fago λ. Los promotores controlarán típicamente la expresión, opcionalmente con una secuencia de operador y tendrán secuencias de sitios de unión de ribosomas y análogas, para iniciar y completar la transcripción y la traducción.

30 Otros microbios, tales como levaduras, pueden utilizarse también para la expresión. Saccharomyces es un huésped preferido, con vectores adecuados que tienen secuencias de control de la expresión, tales como promotores, con inclusión de 3-fosfoglicerato-cinasa u otras enzimas glucolíticas y un origen de replicación, secuencias de terminación y análogas en caso deseado.

Además de microorganismos, también se pueden utilizar cultivos de células de tejidos de mamífero para expresar

35 y producir los polipéptidos de la presente invención (véase, Winnacker, "From Genes to Clones," VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987), que se incorpora en el presente documento por referencia). De hecho, se prefieren células eucariotas, debido a que se han desarrollado en la técnica varias líneas de células huéspedes adecuadas capaces de secretar inmunoglobulinas intactas e incluyen las líneas de células CHO, diversas líneas de células COS, células HeLa, líneas de células de mieloma, etc, pero preferentemente células B transformadas o hibridomas.

40 Vectores de expresión para estas células pueden incluir secuencias de control de la expresión, tales como un origen de replicación, un promotor, un intensificador (Queen, C. y col., Immunol. Rev., 89: 49-68 (1986), que se incorpora en el presente documento por referencia) y sitios de información de la elaboración necesarios, tales como sitios de unión de ribosomas, sitios de corte y empalme de ARN, sitios de poliadenilación y secuencias terminadoras de la transcripción. Las secuencias de control de la expresión preferidas son promotores derivados

45 de SV40 con intensificador (véase, Mulligan y Berg, Science 209: 1422-1427 (1980)), un gen de inmunoglobulina, Adenovirus, Virus del Papiloma de los Bovinos y similares.

Los vectores que contienen los segmentos de ADN de interés (p ej., las secuencias codificantes de las cadenas pesada y ligera y secuencias de control de la expresión) pueden transferirse a la célula huésped por procedimientos bien conocidos, que varían dependiendo del tipo de huésped celular. Por ejemplo, se utiliza

50 habitualmente la transfección con cloruro de calcio para células procariotas, mientras que pueden utilizarse tratamiento con fosfato de calcio o electroporación para otros huéspedes celulares. (Véase, en general, Maniatis y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, (1982), que se incorpora en el presente documento por referencia).

Una vez expresados, los anticuerpos enteros, sus dímeros, las cadenas ligera y pesada individuales, u otras

55 formas de inmunoglobulina de la presente invención se pueden purificar de acuerdo con procedimientos estándar de la técnica, con inclusión de precipitación con sulfato de amonio, columnas de afinidad, cromatografía en columna, electroforesis en gel y similares (véase, en general, Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag,

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N.Y. (1982)). Se prefieren inmunoglobulinas sustancialmente puras de al menos aproximadamente el 90 a 95 % de homogeneidad y es muy preferido el 98 a 99 % o más de homogeneidad, para usos farmacéuticos. Una vez purificados, parcialmente o hasta homogeneidad en caso deseado, los polipéptidos se pueden utilizar luego

5 terapéuticamente (con inclusión de la vía extracorpórea) o en el desarrollo y realización de procedimientos de ensayo, tinciones inmunofluorescentes y similares. (Véase, en general, Immunological Methods, Vols. I y II, Lefkovits y Pernis, compiladores, Academic Press, Nueva York, N.Y. (1979 y 1981)).

Los anticuerpos específicos del receptor de IL-2 ejemplificados en la presente invención encontrarán típicamente uso a título individual en el tratamiento de un estado de enfermedad mediado por las células T. Generalmente, en 10 los casos en que la célula ligada a una enfermedad se ha identificado como portadora del receptor de IL-2, son adecuados los anticuerpos semejantes a los humanos capaces de bloquear la unión de IL-2 al receptor de IL-2 humana (véase, el documento U.S.S. N.º: 085.707, titulado “Tratamiento de neoplasias malignas y trastornos humanos”, que se incorpora en el presente documento por referencia). Por ejemplo, estados de enfermedad típicos adecuados para tratamiento incluyen la enfermedad del injerto frente al huésped y el rechace de trasplantes en

15 pacientes que se someten a un trasplante de órganos, tal como corazón, pulmones, riñones, hígado, etc. Otras enfermedades incluyen enfermedades autoinmunes, tales como diabetes de Tipo I, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico y miastenia gravis.

Los anticuerpos semejantes a los humanos permitidos por la presente invención se pueden utilizar también en combinación con otros anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales humanos reactivos con otros

20 marcadores en células responsables de la enfermedad. Por ejemplo, marcadores de las células T adecuados pueden incluir los agrupados en los denominados "Racimos de Diferenciación", tal como han sido definidos por el First International Leukocyte Differentiation Workshop, Leukocyte Typing, Bernard y col., compiladores, Springer-Verlag, N.Y. (1984), que se incorpora por referencia en el presente documento.

Los anticuerpos se pueden utilizar también como composiciones administradas por separado que se suministran

25 en asociación con agentes quimioterapéuticos o inmunosupresores. Típicamente, los agentes incluirán ciclosporina A o un análogo de purina (p ej., metotrexato, 6-mercaptopurina, o análogos), pero se pueden utilizar también numerosos agentes adicionales (p ej., ciclofosfamida, prednisona, etc.) bien conocidos por los expertos en la técnica.

Una composición farmacéutica preferida comprende el uso de los presentes anticuerpos en inmunotoxinas. Las

30 inmunotoxinas se caracterizan por dos componentes y son particularmente útiles para destruir células seleccionadas in vitro o in vivo. Un componente es un agente citotóxico que es usualmente fatal para una célula cuando se fija o se absorbe. El segundo componente, conocido como el "vehículo de suministros", proporciona un medio para suministrar el agente tóxico a un tipo de célula particular, tal como células que comprenden un carcinoma. Los dos componentes están unidos de manera habitual químicamente entre sí por cualquiera de una

35 diversidad de procedimientos químicos bien conocidos. Por ejemplo, cuando el agente citotóxico es una proteína y el segundo componente es una inmunoglobulina intacta, la unión puede tener lugar por la vía de reticuladores heterobifuncionales, p ej., SPDP, carbodiimida, aldehído glutárico, o análogos. La producción de diversas inmunotoxinas es bien conocida en la técnica y se puede encontrar, por ejemplo, en "Monoclonal Antibody-Toxin Conjugates: Aiming the Magic Bullet," Thorpe y col., Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine, Academic Press,

40 págs. 168-190 (1982), que se incorpora en el presente documento por referencia.

Una diversidad de agentes citotóxicos son adecuados para uso en inmunotoxinas. Los agentes citotóxicos pueden incluir radionucleidos tales como yodo-131, itrio-90, renio-188 y bismuto-212; varios fármacos quimioterapéuticos, tales como vindesina, metotrexato, adriamicina y cisplatino; y proteínas citotóxicas tales como proteínas inhibidoras de ribosomas como proteína antivírica carmín, exotoxina A de Pseudomonas, ricina, toxina de la

45 difteria, cadena A de ricina, etc., o un agente activo en la superficie celular, tal como las enzimas fosfolipasas (p ej., fosfolipasa C). (Véanse, generalmente, el documento U.S.S.N. de asignación común presentado el 28 de diciembre de 1988), "Chimeric Toxins," Olsnes y Phil, Pharmac. Ther., 25: 355-381 (1982) y "Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy", compiladores Baldwin y Byers, páginas 159-179, 224-266, Academic Press (1985), incorporados todos ellos en el presente documento por referencia).

50 El componente de suministro de la inmunotoxina incluirá las inmunoglobulinas semejantes a las humanas. Preferentemente se utilizan inmunoglobulinas intactas o sus fragmentos de unión, tales como Fab. Típicamente, los anticuerpos de las inmunotoxinas serán del isotipo humano IgM o IgG, pero se pueden utilizar en caso deseado otras regiones constantes de mamífero.

Los anticuerpos semejantes a los humanos y sus composiciones farmacéuticas permitidas por la presente

55 invención son particularmente útiles para administración parenteral, es decir, por vías subcutánea, intramuscular o intravenosa. Las composiciones para administración parenteral comprenderán comúnmente una solución del

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anticuerpo o un cóctel del mismo disuelto en un vehículo aceptable, preferentemente un vehículo acuoso. Se pueden utilizar una diversidad de vehículos acuosos, p ej., agua, agua tamponada, solución salina al 0,4 %, glicina al 0,3 % y similares. Estas soluciones son estériles y están generalmente exentas de materia constituida por partículas. Dichas composiciones pueden esterilizarse por técnicas de esterilización convencionales, bien 5 conocidas. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables en caso requerido para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes de ajuste del pH y tampones, agentes de ajuste de la toxicidad y similares, por ejemplo acetato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, lactato de sodio, etc. La concentración de anticuerpo en estas formulaciones puede variar ampliamente, a saber, desde menos de aproximadamente el 0,5 %, usualmente de o al menos aproximadamente

10 el 1 % hasta tanto como el 15 o el 20 % en peso y se seleccionarán fundamentalmente sobre la base de volúmenes de fluido, viscosidades, etc., de acuerdo con el modo de administración particular seleccionado.

Así, una composición farmacéutica típica para inyección intramuscular podría prepararse de modo que contuviera 1 ml de agua tamponada estéril y 50 mg de anticuerpo. Una composición típica para infusión intravenosa podría prepararse de modo que contuviera 250 ml de solución de Ringer estéril y 150 mg de anticuerpo. Los

15 procedimientos reales para preparar composiciones administrables por vía parenteral serán conocidos o evidentes para los expertos en la técnica y se describen con mayor detalle, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Science, edición 15ª, Mack Publishing Company, Easton, Pensilvania (1980), que se incorpora en el presente documento por referencia.

Los anticuerpos se pueden liofilizar para almacenamiento y pueden reconstituirse en un vehículo adecuado antes

20 de su empleo. Se ha demostrado que esta técnica es eficaz con inmunoglobulinas convencionales y se pueden emplear procedimientos de liofilización y reconstitución conocidos en la técnica. Será reconocido por los expertos en la técnica que la liofilización y reconstitución pueden conducir a grados variables de pérdidas de actividad del anticuerpo (p ej., con inmunoglobulinas convencionales, los anticuerpos IgM tienden a sufrir una pérdida mayor de actividad que los anticuerpos IgG) y que los niveles de uso pueden tener que ajustarse en compensación.

25 Las composiciones que contienen los presentes anticuerpos semejantes a los humanos o un cóctel de los mismos se pueden administrar para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. En la aplicación terapéutica, las composiciones se administran a un paciente que sufre ya una enfermedad, en una cantidad suficiente para curar o al menos detener parcialmente la enfermedad y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para conseguir esto se define como una "dosis terapéuticamente eficaz". Las cantidades eficaces para este uso dependerán de la

30 gravedad de la infección y del estado general del propio sistema inmunológico del paciente, pero generalmente están comprendidas entre aproximadamente 1 y aproximadamente 200 mg de anticuerpo por dosis, utilizándose más comúnmente dosificaciones que van desde 5 a 25 mg por paciente. Es necesario tener en cuenta que los materiales permitidos por la presente invención pueden emplearse generalmente en estados de enfermedad graves, es decir situaciones amenazantes para la vida o potencialmente amenazantes para la vida. En tales casos,

35 debido a la minimización de sustancias extrañas y a la menor probabilidad de rechazos de "sustancia extraña" que se alcanzan por los presentes anticuerpos semejantes a los humanos, es posible y puede sentirse deseable por el médico que tiene a su cargo el tratamiento administrar excesos sustanciales de estos anticuerpos.

En aplicaciones profilácticas, las composiciones que contienen los presentes anticuerpos o un cóctel de los mismos se administran a un paciente que no se encuentra todavía en un estado de enfermedad para aumentar la

40 resistencia del paciente. Dicha cantidad se define como una "dosis profilácticamente eficaz." En este uso, las cantidades precisas dependen nuevamente del estado de salud y nivel general de inmunidad del paciente, pero generalmente varían entre 0,1 y 25 mg por dosis, especialmente entre 0,5 a 2,5 mg por paciente. Un uso profiláctico preferido es para la prevención del rechazo de trasplantes de riñón.

Se pueden llevar a cabo administraciones simples o múltiples de las composiciones, siendo seleccionados los

45 niveles y el patrón de dosificación por el médico que tiene a su cargo el tratamiento. En cualquier caso, las formulaciones farmacéuticas deben proporcionar una cantidad del o de los anticuerpos suficiente para tratar de manera eficaz al paciente.

Anticuerpos semejantes a los humanos pueden encontrar adicionalmente una gran diversidad de utilidades in vitro. A manera de ejemplo, los anticuerpos ilustrativos se pueden utilizar para tipificación de las células T, para

50 aislamiento de células que llevan receptor de IL-2 específico o fragmentos del receptor, para preparación de vacunas, o similares.

Para fines de diagnóstico, los anticuerpos pueden estar marcados o sin marcar. Se pueden utilizar anticuerpos sin marcar en combinación con otros anticuerpos marcados (segundos anticuerpos) que son reactivos con el anticuerpo semejante al humano, tales como anticuerpos específicos para regiones constantes de inmunoglobulina 55 humana. Alternativamente, los anticuerpos pueden estar marcados directamente. Se pueden emplear una gran diversidad de marcadores, tales como radionucleidos, agentes fluorescentes, enzimas, sustratos de enzimas,

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cofactores de enzimas, inhibidores de enzimas, ligandos (particularmente haptenos), etc. Están asequibles numerosos tipos de inmunoensayos, que son bien conocidos por los expertos en la técnica.

Se pueden suministrar también kits para uso con los anticuerpos objeto en la protección contra o la detección de una actividad celular o en lo que se refiere a la presencia de un antígeno seleccionado. Así, la composición de 5 anticuerpos objeto puede proporcionarse, usualmente en una forma liofilizada en un envase, sea sola o en asociación con anticuerpos adicionales específicos para el tipo de células deseado. Los anticuerpos, que pueden estar conjugados con un marcador o toxina, o no conjugados, se incluyen en los kits con tampones, tales como Tris, fosfato, carbonato, etc., estabilizadores, biocidas, proteínas inertes, p ej., seroalbúmina, o análogos y una serie de instrucciones para su empleo. Generalmente, estos materiales estarán presentes en cantidad menor que 10 aproximadamente el 5 % en peso basada en la cantidad de anticuerpo activo y usualmente estarán presentes en una cantidad total de al menos aproximadamente el 0,001 % en peso, basada de nuevo en la concentración de anticuerpo. Frecuentemente, será deseable incluir un diluyente o excipiente inerte para diluir los ingredientes activos, donde el excipiente puede estar presente en una proporción comprendida entre aproximadamente el 1 y el 99 % en peso de la composición total. En los casos en que se emplea en un ensayo un segundo anticuerpo capaz

15 de unirse al anticuerpo quimérico, este estará presente usualmente en un vial separado. El segundo anticuerpo está conjugado típicamente a un marcador y se formula de una manera análoga a las formulaciones de anticuerpos descritas anteriormente.

Los ejemplos siguientes se ofrecen a manera de ilustración y no de limitación.

PARTE EXPERIMENTAL

20 Diseño de genes para cadenas ligera y pesada semejantes a las humanas

La secuencia del anticuerpo humano Eu (Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat, E. y col., Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, 1983) se utilizó para proporcionar el marco del anticuerpo humanizado, debido a que la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de anti-Tac es más homóloga a la cadena pesada de este anticuerpo que a cualquier otra secuencia de cadena pesada disponible en

25 el National Biomedical Foundation Protein Identification Resource.

Para seleccionar la secuencia de la cadena pesada humanizada, se alineó la secuencia de la cadena pesada de anti-Tac (véanse los documentos de asignación común U.S.S.N. 186.862 y 223.037, que se incorporan en el presente documento por referencia) con la secuencia de la cadena pesada de Eu (Figura 1). En cada posición, se seleccionó el aminoácido de Eu para la secuencia humanizada, a no ser que la posición cayera en una cualquiera

30 de las categorías siguientes, en cuyo caso se seleccionó el aminoácido de anti-Tac.

(1) La posición estaba incluida en una región determinante de la complementariedad (CDR), como ha sido definido por Kabat y col., op. cit. (aminoácidos 31-35, 50-66, 99-106);

(2) El aminoácido de Eu era inusual para cadenas pesadas humanas en dicha posición, mientras

que el aminoácido de anti-Tac era típico para cadenas pesadas humanas en dicha posición (aminoácidos 27, 93, 35 95, 98, 107-109, 111);

(3)

La posición era inmediatamente adyacente a una CDR en la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de anti-Tac (aminoácidos 30 y 67);

(4)

El modelo tridimensional del anticuerpo anti-Tac sugería que el aminoácido estaba físicamente muy próximo a la región de unión del antígeno (aminoácidos 48 y 68).

40 Algunos aminoácidos entraban dentro de más de una de estas categorías, pero se incluyen únicamente en una de ellas.

Para seleccionar la secuencia de la cadena ligera humanizada, la secuencia de cadena ligera de anti-Tac se alineó con la secuencia de la cadena ligera de Eu (Figura 2). Se seleccionó en cada posición el aminoácido de Eu, a no ser que la posición cayera de nuevo en una de las categorías (1) -(4), (reemplazando la cadena ligera a la cadena

45 pesada en las definiciones de categoría):

(1)

CDR (aminoácidos 24-34, 50-56, 89-97).

(2)

Aminoácido de anti-Tac más típico que el de Eu (aminoácidos 48 y 63).

(3) Adyacente a CDR (ausencia de aminoácidos; Eu y anti-Tac eran ya iguales en todas estas posiciones).

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(4) Posible proximidad tridimensional a la región de unión (aminoácido 60).

La secuencia de nucleótidos real de los genes de la cadena pesada (Figura 3) y la cadena ligera (Figura 4) se seleccionaron como sigue:

(1) Las secuencias de nucleótidos codifican las secuencias de aminoácidos seleccionadas como se 5 ha descrito anteriormente.

(2) En la dirección 5' de estas secuencias codificantes, las secuencias de nucleótidos codifican una secuencia conductora (señal), a saber el conductor de la cadena ligera del anticuerpo MOPC 63 y el conductor de la cadena pesada del anticuerpo PCH 108A (Kabat y col., op. cit.). Estas secuencias conductoras se seleccionaron como típicas de anticuerpos.

10 (3) En la dirección 3' de las secuencias codificantes, las secuencias de nucleótidos son las secuencias que siguen al segmento J5 de la cadena ligera de ratón y al segmento J2 de la cadena pesada de ratón, que forman parte de las secuencias de anti-Tac. Estas secuencias se incluyen debido a que las mismas contienen señales donantes de corte y empalme.

(4) En cada extremo de la secuencia existe un sitio Xba I que permite el corte en los sitios Xba I y la 15 clonación en el sitio Xba I de un vector.

Construcción de genes de cadena ligera y pesada humanizados

Para sintetizar la cadena pesada, se sintetizaron cuatro oligonucleótidos HES12, HES13, HES14, HES15 (Figura 5A) utilizando un sintetizador de ADN de Applied Biosystems 380B. Dos de los oligonucleótidos forman parte de cada hebra de la cadena pesada y cada oligonucleótido se superpone con el siguiente en aproximadamente 20

20 nucleótidos para permitir la reasociación (Figura 5B). Juntos, los oligonucleótidos abarcan la cadena pesada humanizada completa (Figura 3) con un pequeño número de nucleótidos adicionales en cada extremo que permiten el corte en los sitios Xba I. Los oligonucleótidos se purificaron a partir de geles de poliacrilamida.

Cada oligonucleótido se fosforiló utilizando ATP y polinucleótido-cinasa T4 por procedimientos estándar (véase, Maniatis, op. cit.). Para reasociar los oligonucleótidos fosforilados, se suspendieron los mismos juntos en 40 μl de

25 TA (Tris-acetato 33 mM, pH 7,9, acetato de potasio 66 mM, acetato de magnesio 10 mM) a una concentración de aproximadamente 3,75 μM cada uno, se calentaron a 95 C durante 4 min y se enfriaron lentamente a 4C. Para sintetizar el gen completo a partir de los oligonucleótidos por síntesis de la hebra opuesta de cada oligonucleótido (Figura 5B), se añadieron los componentes siguientes en un volumen final de 100 μl:

10 μl

oligonucleótidos reasociados

0,16 μM cada uno

desoxirribonucleótido

0,5 mM

ATP

0,5 mM

DTT

100 μg/ml

BSA

3,5 μg/ml

proteína T4 g43 (ADN-polimerasa)

25 μg/ml

proteína T4 g44/62 (proteína accesoria de polimerasa)

25 μg/ml

proteína 45 (proteína accesoria de polimerasa)

La mezcla se incubó a 37 C durante 30 min. Se añadieron luego 10 U de ADN-ligasa T4 y se reanudó la

30 incubación a 37 C durante 30 min. La polimerasa y la ligasa se inactivaron por incubación de la reacción a 70 C durante 15 min. Para digerir el gen con Xba I, se añadieron a la reacción 50 μl de BAS que contenía 2x TA a 200 μg/ml de DTT a 1 mM, 43 μl de agua y 50 U de Xba I en 5 μl. La reacción se incubó durante 3 h a 37 C y se aplicó sobre un gel. El fragmento Xba I de 431 pares de bases (bp) se purificó a partir de un gel y se clonó al sitio Xba I del plásmido pUC19 por procedimientos estándar. Cuatro materiales aislados de plásmido se purificaron y se

35 secuenciaron utilizando el procedimiento didesoxi. Uno de estos tenía la secuencia correcta (Figura 3).

Para sintetizar la cadena ligera, se sintetizaron cuatro oligonucleótidos JFD1, JFD2, JFD3, JFD4 (Figura 6A). Dos de los oligonucleótidos forman parte de cada hebra de la cadena ligera y cada oligonucleótido se superpone al siguiente en aproximadamente 20 nucleótidos para permitir la reasociación (Figura 6B). Juntos, los oligonucleótidos abarcan la cadena ligera humanizada entera (Figura 4) con un pequeño número de nucleótidos 40 adicionales en cada extremo para permitir el corte en los sitios Xba I. Los oligonucleótidos se purificaron a partir de

imagen14

geles de poliacrilamida.

El gen de la cadena ligera se sintetizó a partir de estos oligonucleótidos en dos partes. Se combinaron 0,5 μg cada uno de JFD1 y JFD2 en 20 μl de tampón secuenasa (Tris-HCl 40 mM, pH 7,5, cloruro de magnesio 20 mM, cloruro de sodio 50 mM), se calentaron a 70C durante 3 min y se dejaron enfriar lentamente a 23 C a fin de que los 5 oligonucleótidos se reasociaran. Se trataron de la misma manera JFD3 y JFD4. Cada reacción se hizo 10 mM en DTT y 0,5 mM en cada desoxirribonucleótido y se añadieron 6,5 U de secuenasa (US Biochemicals), en un volumen final de 24 μl y se incubó durante 1 h a 37 C para sintetizar las hebras opuestas de los oligonucleótidos. Se añadieron Xba I y Hind III a cada reacción para digerir el ADN (hay un sitio Hind III en la región en la que se superponen JFD2 y JFD3 y por consiguiente en cada uno de los ADN sintetizados; Figura 6B). Las reacciones se

10 aplicaron sobre geles de poliacrilamida y los fragmentos Xba I -Hind III se purificaron y se clonaron a pUC18 por procedimientos estándar. Varios materiales aislados de plásmido para cada fragmento se secuenciaron por el procedimiento didesoxi y se seleccionaron los correctos.

Construcción de plásmidos que expresan las cadenas ligera y pesada humanizadas

El fragmento Xba I de la cadena pesada se aisló a partir del plásmido pUC19 en el que se había insertado y se

15 insertó luego en el sitio Xba I del vector pVγ1 (véase, el documento U.S.S.N. de asignación común 223.037) en la orientación correcta por procedimientos estándar, para producir el plásmido pHuGTAC1 (Figura 7). Este plásmido expresará altos niveles de una cadena pesada completa cuando se transfecte a una célula huésped apropiada.

Los dos fragmentos de cadena ligera Xba I -Hind III se aislaron a partir de los plásmidos pUC18 en los que se habían insertado. El plásmido vector pVκ1 (véase, el documento U.S.S.N. de asignación común 223.037) se cortó

20 con Xba I, se desfosforiló y se ligó con los dos fragmentos por procedimientos estándar. El producto de reacción deseado tiene la forma circular: vector -Xba I -fragmento 1 -Hind III -fragmento 2 -Xba I -vector. Se analizaron varios materiales aislados de plásmido por mapeado de restricción y secuenciación y se seleccionó uno que tenía esta forma. Este plásmido, pHuLTAC (Figura 8), contiene por consiguiente la cadena ligera humanizada completa (Figura 4) y expresará niveles altos de la cadena ligera cuando se transfecte a una célula huésped apropiada.

25 Síntesis y afinidad del anticuerpo humanizado

Los plásmidos pHuGTAC1 y pHuLTAC se transfectaron a células Sp2/0 de ratón y las células que integraban los plásmidos se seleccionaron sobre la base de resistencia al ácido micofenólico y/o higromicina B conferida por los genes gpt y hyg en los plásmidos (Figuras 7,8) por procedimientos estándar. Para comprobar que estas células secretaban anticuerpo que se fija al receptor de IL-2, el sobrenadante de las células se incubó con células HUT30 102 que se sabe expresan el receptor de IL-2. Después del lavado, las células se incubaron con anticuerpo antihumano de cabra conjugado con fluoresceína, se lavaron y se analizaron en cuanto a fluorescencia en un citofluorímetro FACSCAN. Los resultados (Figura 9A), demuestran claramente que el anticuerpo humanizado se fija a estas células, pero no a las células T de Jurkat que no expresan el receptor de IL-2 (Figura 9D). Como testigos, se utilizó también el anticuerpo anti-Tac de ratón original para teñir estas células (Figura 9B, C) dando

35 resultados similares.

Para experimentos adicionales, células que producían el anticuerpo humanizado se inyectaron en ratones y se recogió la ascitis resultante. El anticuerpo humanizado se purificó hasta homogeneidad sustancial a partir de la ascitis por paso a través de una columna de afinidad de anticuerpo de inmunoglobulina anti-humana de cabra, preparado sobre un soporte Affigel-10 (Bio-Rad Laboratories Inc., Richmond, CA) de acuerdo con técnicas 40 estándar. Para determinar la afinidad del anticuerpo humanizado con relación al anticuerpo anti-Tac original, se realizó un experimento de unión competitiva. Aproximadamente 5 x 105 células HUT-102 se incubaron con cantidades conocidas (10-40 ng) del anticuerpo anti-Tac y el anticuerpo anti-Tac humanizado durante 10 min a 4

C. Se añadieron luego 100 ng de anti-Tac biotinilado a las células y se incubaron durante 30 min a 4 C. Previamente se había determinado que esta cantidad de anti-Tac era suficiente para saturar los sitios de unión en

45 las células, pero que no se encontraba en gran exceso. Después de ello se lavaron dos veces las células con 2 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía un 0,1 % de azida de sodio. Las células se incubaron luego durante 30 min a 4 C con 250 ng de avidina conjugada con ficoeritrina, que se fijaba al anti-Tac biotinilado ya fijado a las células. Las células se lavaron de nuevo como anteriormente, se fijaron en PBS que contenía un 1 % de paraformaldehído y se analizaron en cuanto a fluorescencia en un citofluorímetro FACSCAN.

50 El uso de cantidades crecientes (10-40 ng) del anticuerpo anti-Tac como competidor en la primera etapa disminuía la cantidad de anti-Tac biotinilado que podía unirse a las células en la segunda etapa y por consiguiente la cantidad de avidina conjugada con ficoeritrina que se fijaba en la última etapa, disminuyendo así la fluorescencia (Figura 10A). Cantidades equivalentes (20 ng) de anti-Tac y anti-Tac humanizado utilizado como competidor reducían la fluorescencia aproximadamente en el mismo grado (Figura 10B). Esto demuestra que estos

55 anticuerpos tienen aproximadamente la misma afinidad (dentro de 3 a 4 veces), dado que si uno de ellos tuviera una afinidad mucho mayor, el mismo habría competido más eficazmente con el anti-Tac biotinilado, reduciendo por consiguiente más la fluorescencia.

imagen15

Propiedades biológicas del anticuerpo humanizado

Para uso óptimo en el tratamiento de la enfermedad humana, el anticuerpo humanizado debería ser capaz de

5 destruir las células T en el cuerpo que expresan el receptor de IL-2. Un mecanismo por el que los anticuerpos pueden destruir las células diana es la citotoxicidad mediada por células dependientes de los anticuerpos, abreviada ADCC (Fundamental Immunology, Paul, W., compilador, Raven Press, Nueva York (1984), en la página 681), en la que el anticuerpo forma un puente entre la célula diana y una célula efectora tal como un macrófago que puede lisar la diana. Para determinar si el anticuerpo humanizado y el anticuerpo anti-Tac de ratón original

10 pueden mediar en la ADCC, se llevó a cabo un ensayo de liberación de cromo por procedimientos estándar. Específicamente, células HUT-102 de la leucemia humana, que expresan el receptor de IL-2, se incubaron con 51Cr para permitir que las mismas absorbieran este radionucleido. Las células HUT-102 se incubaron luego con un exceso de anticuerpo anti-Tac o anti-Tac humanizado. A continuación, las células HUT-102 se incubaron durante 4 horas con una relación 30:1 o 100:1 de células efectoras, que eran células mononucleares de sangre periférica

15 humana purificada normal que se habían activado por incubación durante aproximadamente 20 horas con IL-2 recombinante humana. La liberación de 51Cr, que indicaba la lisis de las células HUT-102 diana, se midió y se restó el ruido de fondo (Tabla 1). Los resultados muestran que para cualquier relación de células efectoras, anti-Tac no lisaba un número significativo de las células diana (menos del 5 %), mientras que el anticuerpo humanizado sí lo hacía (más del 20 %). Por tanto, el anticuerpo humanizado será probablemente más eficaz que el

20 anticuerpo de ratón original en el tratamiento de la leucemia de las células T u otras enfermedades mediadas por las células T.

TABLA 1

Porcentaje de liberación de 51Cr después de ADCC

Relación efector:diana

30:1 100:1

Anticuerpo

Anti-Tac 4% < 1%

Anti-Tac humanizada 24 % 23 %

A partir de lo anterior se apreciará que las inmunoglobulinas semejantes a las humanas ofrecen numerosas

25 ventajas sobre otros anticuerpos. Por ejemplo, en comparación con los anticuerpos monoclonales anti-Tac de ratón, las presentes inmunoglobulinas receptoras de IL-2 semejantes a las humanas se pueden producir más económicamente y contienen una cantidad sustancialmente menor de secuencias de aminoácidos extrañas. Esta probabilidad reducida de antigenicidad después de la inyección a un paciente humano representa una mejora terapéutica significativa para las inmunoglobulinas diseñadas de acuerdo con los criterios indicados anteriormente.

30 Aunque se ha descrito la presente invención con detalle a modo de ilustración y ejemplo con fines de claridad y entendimiento, será patente que pueden practicarse determinados cambios y modificaciones dentro del ámbito de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (6)

1. imagen1

   REIVINDICACIONES

   1. El uso de primeras secuencias nucleotídicas que codifican para regiones marco de cadenas ligeras y pesadas de Ig aceptoras humanas y segundas secuencias nucleotídicas que codifican para CDR de Kabat de una Ig donante en la producción de polinucleótidos expresables que codifican una inmunoglobulina humanizada,

   5 inmunoglobulina en la que:

   (a)

   los marcos de las cadenas ligera y pesada de Ig aceptoras humanas son secuencias seleccionadas de un conjunto de cadenas de Ig humanas y tienen al menos un 65% de identidad con las respectivas secuencias marco donantes; y

   (b)

   CDR de la Ig donante se combinan con marcos de las secuencias aceptoras seleccionadas.

   10 2. El uso de primeras secuencias nucleotídicas que codifican para marcos de cadenas ligeras y pesadas de Ig aceptoras humanas y segundas secuencias nucleotídicas que codifican para CDR de Kabat de una Ig donante en la producción de una inmunoglobulina humanizada, inmunoglobulina en la que:

   (a) los marcos de las cadenas ligeras y pesadas de Ig aceptora humana son secuencias seleccionadas de un

   conjunto de cadenas de Ig humanas y tienen al menos un 65% de identidad con las respectivas secuencias marco 15 donantes; y

   (b) las CDR de la Ig donante se combinan con marcos de las secuencias aceptoras seleccionadas.

2. 3.

   El uso de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la inmunoglobulina humanizada tiene una afinidad por un antígeno de al menos aproximadamente 108 M-1 .

3. 4.

   Un procedimiento para la producción de una inmunoglobulina humanizada, que comprende:

   20 (a) comparar las secuencias de aminoácidos de la región marco o variable de las cadenas ligeras y pesadas de las Ig donantes con las correspondientes secuencias en un conjunto de cadenas de Ig humanas;

   (b)

   seleccionar, para proporcionar marcos de las cadenas ligeras y pesadas de Ig aceptoras humanas, secuencias del conjunto que tiene al menos un 65% de identidad con las respectivas secuencias marco donantes; y

   (c)

   combinar CDR de Kabat de la Ig donante y marcos de las secuencias aceptoras seleccionadas, mediante el uso

   25 de primeras secuencias nucleotídicas que codifican las regiones marco de las cadenas ligeras y pesadas de las Ig aceptoras humanas y segundas secuencias nucleotídicas que codifican para las CDR de la Ig donante.
4. 5. Un uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o un procedimiento de la reivindicación 4, en el que dicha Ig donante es una Ig de ratón.

   6 Un procedimiento de la reivindicación 4 o 5, en el que dicha inmunoglobulina humanizada es un tetrámero de 30 anticuerpo compuesto por un par idéntico de polipéptidos de cadena pesada y un par idéntico de polipéptidos de cadena ligera.
5. 7. Un procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en el que dicha inmunoglobulina humanizada tiene una región constante de la cadena ligera codificada por un gen de la región constante kappa.
6. 8. Un procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en el que dicha inmunoglobulina humanizada 35 tiene una región constante de la cadena pesada codificada por un gen de la región constante gamma.

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