IT201600111877A1 - Anti-BAG3 antibodies in combination with inhibitors of immune check-point for therapeutic use - Google Patents

Description

“Anticorpi Anti-BAG3 in combinazione con inibitori del check-point immunitario per uso terapeutico”

La presente invenzione si riferisce ad una combinazione comprendente anticorpi anti-BAG3 e inibitori del check-point immunitario, ad una formulazione farmaceutica comprendente detta combinazione, eventualmente con un eccipiente farmaceuticamente accettabile e al suo uso nel trattamento di malattie neoplastiche.

Background dell'invenzione

La proteina BAG3 è una proteina citoplasmatica di 74 kDa appartenente alla famiglia di co-chaperoni capaci di interagire con il dominio ATPasico della proteina HSP70 (Heat Shock Protein) attraverso il dominio strutturale noto come dominio BAG (amminoacidi 110-124). Inoltre, la proteina BAG3 contiene un dominio WW (Trp-Trp), una regione ricca di prolina (PXXP), e due motivi conservati IPV (Ile-Pro-Val), capaci di mediare il legame con altre proteine. Grazie alla caratteristica della proteina BAG3 di adattabilità, attribuibile alla presenza di molti domini funzionali, tale proteina può quindi interagire con proteine differenti.

Nell’uomo, l'espressione genica di bag3 è costitutiva per alcuni tipi di cellule normali, compresi miociti, mentre le loro mutazioni sono associate a malattie dei muscoli scheletrici e cardiaci. Inoltre, la proteina BAG3 è espressa in molti tipi di tumori primari o linee cellulari tumorali (leucemie linfoidi o mieloidi, neuroblastoma, tumore al pancreas, alla tiroide, al seno e alla prostata, melanoma, osteosarcoma, glioblastoma, tumori del rene, del colon, dell'ovaio, etc.) (Rosati A. et al., 2011).

Nei tipi cellulari normali, come leucociti, cellule epiteliali e gliali e cellule della retina, l’espressione genica di bag3 può essere indotta da agenti stressanti, come ad esempio ossidanti, alte temperature, deprivazione di siero, metalli pesanti, HIV-1, infezioni etc. Questi risultati indicano che la regolazione dell'espressione genica di bag3 è una componente importante nella risposta cellulare allo stress ed è correlata alla presenza di elementi che rispondono al fattore di trascrizione HSF1 (Heat Shock Transcription Factor), che viene attivato in varie forme di stress cellulare nel promotore del gene bag3. Inoltre, grazie alla presenza di molti domini di interazione proteina-proteina nella sua struttura, la proteina BAG3 influenza la sopravvivenza di differenti tipi di cellule, interagendo con partner molecolari diversi (Rosati A. et al. Cell Death Dis. 2011 Apr 7; 2:e141). Il primo meccanismo riportato in relazione all'attività anti-apoptotica di BAG3 è stato identificato in cellule di osteosarcoma e melanoma, dove si è osservato che la proteina BAG3 modula l'attivazione del fattore di trascrizione NF-kB e la sopravvivenza cellulare (Ammirante M. et al. Proc Natl Acad Sci U S A.2010;107(16):7497-502). Un meccanismo molecolare differente è stato descritto in cellule di glioblastoma, dove la proteina BAG3 coopera in modo positivo con la proteina HSP70 nel trattenere la proteina BAX nel citosol e impedire la sua traslocazione nei mitocondri (Festa M. et al. Am J Pathol. 2011;178(6):2504-12). Infine, in alcuni tumori, è stato dimostrato che BAG3 regola proteine che modulano l’adesione cellulare.

La presenza della proteina BAG3 citoplasmatica è stata descritta anche in molti sistemi cellulari diversi ed è stata associata, non solo a vari tumori, ma anche a patologie associate in generale alla sopravvivenza cellulare. Inoltre, la domanda di brevetto n. WO2011/067377 descrive la proteina BAG3 extracellulare, secreta da alcuni tipi di cellule, come marcatore biochimico nel siero, che è altamente specifica per la diagnosi di alcune condizioni patologiche, come patologie cardiache e tumore pancreatico. Recentemente è stato riportato che la proteina BAG3 è espressa in 346/346 pazienti con adenocarcinoma pancreatico duttale (PDAC) ed è rilasciata dalle cellule del tumore pancreatico, ma tale proteina non è espressa in tessuti non neoplastici circostanti o nel pancreas normale; similmente, è stato riportato che i livelli di espressione di BAG3 sono legati alla sopravvivenza del paziente. I risultati dello studio dimostrano che l'uso di molecole di siRNA specifici per l’RNA messagero di BAG3 può silenziare l’espressione del gene e indurre la morte cellulare, confermando che la proteina BAG3 è un fattore importante di sopravvivenza per le cellule tumorali pancreatiche e che la sua down-regolazione, quando combinata con gemcitabina, può contribuire all'eliminazione delle cellule tumorali (Rosati A. et al. Am J Pathol.2012 Nov; 181(5):1524-9).

Inoltre, in un recente articolo (Rosati A. et al.Nat Commun. 2015 Nov 2;6:8695), noi abbiamo riportato che la proteina BAG3 rilasciata dalle cellule tumorali pancreatiche (PDAC) lega i macrofagi inducendo la loro attivazione e la secrezione di fattori che sostengono la crescita del tumore (PDAC) stesso. Abbiamo anche identificato IFITM-2 come recettore di BAG3 e mostrato che la via di segnalazione agisce attraverso PI3K e p38 MAPK. Infine, abbiamo mostrato che l'uso di un anticorpo murino monoclonale anti-BAG3 riduce la crescita tumorale e previene la formazione di metastasi in tre diversi modelli murini. Abbiamo quindi individuato un loop paracrino coinvolto nella crescita del PDAC e nella diffusione metastatica, e mostrato che un anticorpo anti-BAG3 è un potenziale agente terapeutico (Rosati A. et al., Nat. Commun. 2015 Nov 2;6:8695). Infatti, abbiamo dimostrato che un anticorpo anti-BAG3 ha bloccato l'attività di BAG3 sui macrofagi. In vivo, abbiamo dimostrato la capacità di questo anticorpo di bloccare la crescita del tumore in diversi modelli animali, tra cui un modello di xenotrapianto di tumori derivati da pazienti e in modelli singenici. Quest’ultimo modello è di grande importanza dal momento che i topi hanno un sistema immunitario intatto. I trattamenti chemioterapici convenzionali per le patologie tumorali, pongono numerosi inconvenienti legati agli effetti collaterali e non sono, al momento, i mezzi definitivi di trattamento di tali patologie.

Negli ultimi anni, gli inibitori del checkpoint immunitario, che sono molecole che inibiscono/bloccano il sistema del checkpoint immunitario, sono emersi come terapie efficaci per neoplasie avanzate; tra questi vi sono anticorpi terapeutici che bloccano l’ antigene 4 associato ai linfociti T citotossici (CTLA4) e la proteina della morte cellulare programmata 1 (PD-1) sono stati utilizzati per diversi tumori (Topalian SL et al, Nat Rev Cancer 2016; 16 (5): 275-87).

PD-1 (proteina della morte cellulare programmata 1, CD279), (membro della famiglia dei recettori B7/CD28, è una molecola monomerica espressa sulla superficie dei leucociti attivati, tra cui cellule T, B, NK e cellule mieloidi, la cui espressione è finemente regolata da una interazione tra meccanismi genetici ed epigenetici. I ligandi noti di PD-1 sono PD-L1 e PD-L2 (Farkona S. et al., BMC Med 20165 maggio;14:73).

PD-L1 (ligando della proteina della morte cellulare programmata 1, B7H1, CD274) è espressa a bassi livelli, e up-regolata dopo l'attivazione cellulare, sia sulle cellule ematopoietiche, tra cui cellule T, B, mieloidi, e cellule dendritiche, sia su quelle non ematopoietiche (come ad esempio cellule di polmone, cuore, cellule endoteliali, cellule delle isole pancreatiche, cheratinociti) e specialmente su cellule tumorali. PD-L2 (ligando della proteina della morte cellulare programmata 2, B7-DC, CD273) è espressa su macrofagi, cellule dendritiche (DC), linfociti CD4 e CD8 attivati e alcuni tumori solidi (carcinoma ovarico, carcinoma polmonare a piccole cellule, carcinoma esofageo). L’espressione di PD-L1 e PD-L2 è stata rilevata anche su fibroblasti sia normali sia associati al tumore. Sia PD-L1 sia PD-L2 interagiscono con ulteriori recettori: PD-L1 con CD80, con ligando di CD28, e con PD-L2 con la attraverso RGM espressa sui macrofagi e altri tipi cellulari. La coda citoplasmatica di PD-1 contiene un immunorecettore con motivo inibitorio a tirosina (ITIM) e un immunorecettore con motivo switch a tirosina (ITSM). Nei linfociti T, l’interazione di PD-1 con i suoi ligandi determina la fosforilazione di due tirosine nella coda intracellulare di PD-1; il reclutamento di proteine tirosin fosfatasi contenenti il dominio SH2 (SHP-1 e/o SHP-2) alla regione citoplasmatica ITSM di PD-1 inibisce i segnali a valle del recettore nelle cellule T, inibendo così la proliferazione delle cellule e la produzione di citochine. PD-1 esercita anche altri effetti sulle cellule T: per esempio, inibendo le vie di Akt e Ras, PD-1 sopprime la trascrizione della subunità dell’ubiquitina ligasi, SKP2: questo si traduce nell’inibizione della degradazione di SKP2 mediata da p27 (Kip1), un inibitore delle chinasi ciclina-dipendenti, e quindi bloccando la progressione del ciclo cellulare. Inoltre, PD-1 può promuovere l’apoptosi mediante più di un meccanismo. Oltre a inibire direttamente l'attivazione delle cellule T, l’attivazione di PD-1 mediante PD-L1 può indurre lo sviluppo di cellule T regolatorie (Treg), mediatori chiave dei meccanismi di tolleranza periferica che sopprimono attivamente le cellule T effettrici. L’induzione delle cellule Treg mediante PD-1 è mediata dalla modulazione di molecole di segnalazione chiave, come pAkt, i cui livelli sono mantenuti bassi dall’attività di PTEN indotta da PD-1. PD-L1 è espressa sia in diversi tipi di cellule tumorali che in cellule non neoplastiche (cellule endoteliali, leucociti, fibroblasti) presenti nel microambiente tumorale. Questo suggerisce che queste possono richiamare i linfociti T infiltranti (TIL) il tumore PD-1+, e/o indurre lo sviluppo dei Treg; infatti un crescente numero di evidenze indicano che il trattamento di pazienti affetti da alcuni tipi di carcinoma (melanoma, carcinoma renale, carcinoma polmonare non a piccole cellule, ecc) con anticorpi monoclonali (mAbs) anti-PD-1/PD-L1 può ridurre la crescita tumorale. Attualmente, oltre 100 studi clinici stanno valutando l’efficacia clinica dell’inibizione di PD-1 e PD-L1 in diversi tumori. Tuttavia, nonostante i risultati molto incoraggianti, è chiaro che a) non tutti i tipi di tumore mostrano una risposta significativa agli anticorpi monoclonali anti-PD-1 o anti-PD-L1, e b) nel sottoinsieme dei tumori che rispondono al trattamento, non tutti i pazienti sono sensibili e alcune risposte sono molto parziali. Questi evidenze, in concomitanza con l'incertezza, in questa fase degli studi, sulla durata della risposta, indicano la necessità di combinazioni terapeutiche efficaci tra anticorpi monoclonali anti-PD-1 / PD-L1 e strumenti che agiscano su altre vie (Topalian SL et al., Cancer Cell 2015 13 apr; 27 (4): 450-61).

Vi è pertanto la necessità evidente per un nuovo e migliorato trattamento terapeutico che abbia il vantaggio di essere altamente specifico e con pochi o nessun effetto collaterale, rispetto alle convenzionali terapie, comunemente utilizzate per il trattamento delle malattie neoplastiche.

Definizioni

Se non altrimenti specificato, tutti i termini di arte, notazioni e altra terminologia scientifica, utilizzata in questo documento sono destinati ad avere i significati comunemente considerati dalle persone con abilità nella tecnica a cui tale comunicazione si riferisce. In alcuni casi, i termini con significati comunemente intesi sono definiti nel presente documento per chiarezza e / o per una rapida consultazione; pertanto, l'inclusione di tali definizioni nel presente documento non deve essere interpretata rappresentare una differenza sostanziale rispetto a quanto generalmente inteso nella tecnica.

Il termine "eccipiente farmaceuticamente accettabile" si riferisce qui ad una sostanza priva di qualsiasi effetto farmacologico proprio e che non produce effetti indesiderati quando somministrata ad un mammifero, preferibilmente un umano. Eccipienti fisiologicamente accettabili sono ben noti nella tecnica e sono descritti, ad esempio nel Handbook of Pharmaceutical Excipients, sesta edizione 2009, qui incorporati integralmente per riferimento.

Il termine "somministrazione simultanea, separata o sequenziale" si riferisce qui alla somministrazione del primo e secondo composto nello stesso momento o in modo tale che i due composto agiscano nel corpo del paziente nello stesso momento o la somministrazione di un composto dopo l'altro composto in modo tale da fornire un effetto terapeutico. In alcune forme di realizzazione i composti vengono assunti con un pasto. In altre forme di realizzazione, i composti vengono presi dopo un pasto, come ad esempio 30 minuti o 60 minuti dopo il pasto. In alcune forme di realizzazione, un composto viene somministrato ad un paziente per un periodo temporale successivo alla somministrazione dell’altro composto. I termini “approssimativamente” e "circa" si riferiscono qui alle oscillazioni date dall’errore sperimentale, che può verificarsi in una misurazione.

I termini "comprendente", "avente", "che include" e "contenente" devono essere interpretati come termini aperti (cioè con il significato di "incluso, ma non limitato a") e sono da considerarsi a fornire supporto anche per termini come "consistono essenzialmente di", "consistente essenzialmente di", "consistono di" o "consistente di".

I termini "consistono essenzialmente di", "consistente essenzialmente di" devono essere interpretati come termini semi-chiusi, intendendo che non vengono inclusi altri ingredienti che incidono materialmente sulle caratteristiche di base e nuove dell'invenzione (eccipienti opzionali possono pertanto essere inclusi).

I termini "si compone di", "che consiste di" sono da intendersi come termini chiusi.

Il termine "anticorpo" come usato qui comprende "frammenti" o "derivati", che hanno almeno un sito di legame dell'antigene dell'anticorpo e / o mostrano la stessa attività biologica.

Un anticorpo comprende preferibilmente almeno una catena immunoglobulinica pesante e almeno una catena immunoglobulinica leggera. Una catena immunoglobulinica comprende un dominio variabile e opzionalmente un dominio costante. Un dominio variabile può comprendere regioni determinanti la complementarità (CDRs), ad esempio, una regione CDR1, CDR2 e / o una regione CDR3, e regioni strutturali (Framework Regions, FR).

Il termine "anticorpo umanizzato" si riferisce ad un anticorpo di origine umana, la cui regione ipervariabile è stata sostituita dalla regione omologa degli anticorpi monoclonali non umani.

Il termine "anticorpo chimerico" si riferisce ad un anticorpo contenente porzioni derivate da anticorpi diversi.

Il termine "anticorpo ricombinante" si riferisce ad un anticorpo ottenuto con metodi di DNA ricombinante.

Il termine "scFv frammento" (frammento variabile a catena singola) si riferisce a frammenti di immunoglobulina in grado solo di legare con l'antigene in questione. Frammenti scFv possono essere anche sintetizzati in dimeri (diabodies), trimeri (triabodies) e tetrameri (tetrabodies) utilizzando linker peptidici.

I termini "frammento Fab" (frammento legante l’antigene) e "frammento Fab2" si riferiscono al frammento di immunoglobulina costituito da una catena leggera legata al frammento Fc della catena pesante adiacente, e tali frammenti sono anticorpi monovalenti. Quando le porzioni Fab sono a coppie, il frammento è chiamato Fab2.

Il termine "ibridoma" si riferisce a una cellula che produce anticorpi monoclonali.

Il termine "anticorpi monospecifici" si riferisce ad anticorpi che tutti hanno affinità per lo stesso antigene.

Il termine "anticorpi multispecifico" si riferisce agli anticorpi che hanno affinità per diversi antigeni.

Il termine "anticorpo bispecifico" si riferisce ad un anticorpo che ha affinità per due antigeni differenti.

Il termine "inibitore checkpoint immunitario" si riferisce ad un tipo di farmaco che blocca alcune proteine fatti da alcuni tipi di cellule del sistema immunitario, come le cellule T, e alcune cellule tumorali.

Il termine "A2A" si riferisce al recettore adenosinico A2A.

Il termine "B7-H3, chiamato anche CD276," si riferisce a una proteina espressa in tumori solidi che partecipano alla regolazione della risposta immunitaria mediata dalle cellule T.

Il termine "B7-H4", detto anche VTCN1, si riferisce ad una molecola espressa dalle cellule tumorali e dai macrofagi associati al tumore, che svolge un ruolo nell’evitare il tumore.

Il termine "BTLA", detto anche CD272, si riferisce all’attenuatore dei linfociti B e T.

Il termine "CTLA-4", chiamato anche CD152, si riferisce alla proteina associata ai linfociti T citotossici-4.

Il termine "IDO" si riferisce all’indoleamina 2,3-diossigenasi, che è un enzima catabolico del triptofano con proprietà immuno-inibitorie.

Il termine "KIR", Killer-cell immunoglobulin-like receptor, si riferisce ad un recettore per molecole MHC di classe I sulle cellule Natural Killer. Il termine "LAG3", si riferisce al gene 3 di attivazione linfocitaria.

Il termine "TIM-3" si riferisce al dominio Immunoglobulinico delle cellule T e dominio Mucina 3.

Il termine "(proteina) VISTA", si riferisce al dominio V delle Ig soppressore dell’ attivazione delle cellule T.

Il termine "identità di sequenza" tra due sequenze polipeptidiche, indica la percentuale di aminoacidi identici tra le sequenze.

Descrizione delle figure

Figura 1. L’anticorpo monoclonale anti-BAG3 induce l'espressione di PD-1 allotrapianti di cellule tumorali pancreatiche in topi immunocompetenti.

Figura 2. L’anticorpo monoclonale anti-BAG3 induce l'espressione di PD-1 in allotrapianti di cellule tumorali pancreatiche in topi immunocompetenti.

Figura 3. La combinazione di anti-BAG3 e anti-PD-1 producono un arresto della crescita tumorale in allotrapianti di cellule tumorali pancreatiche in topi immunocompetenti.

Descrizione dell’invenzione.

Si è sorprendentemente trovato che una combinazione comprendente anticorpi specifici anti-BAG3 e un inibitore del checkpoint immunitario, come per esempio anticorpi anti-PD-1, è efficace nell’arrestare la crescita tumorale del pancreas.

In particolare, è stato per la prima volta osservato che gli anticorpi antiBAG3, oltre a bloccare l'interazione tra la proteina BAG3 e il suo recettore sulle superfici dei macrofagi, sono in grado di indurre la produzione di molecole PD-1 e/o PDL-1 sulla superficie di cellule tumorali e quindi di aumentare l'effetto degli anticorpi anti-PD-1 o-PDL-1 sulle cellule tumorali.

Una ipotesi di meccanismo per quello può essere correlata alla modulazione negativa di parecchie citochine nel microambiente tumorale indotta da anticorpi anti-BAG3 (Rosati A. et al Nat Commun 2 novembre 2015; 6:8695).

I dati sperimentali riportati nella presente invenzione dimostrano quindi che la combinazione rivendicata è particolarmente efficace nel trattamento della malattia neoplastica, in particolare del cancro al pancreas.

Pertanto, una prima forma di realizzazione della presente invenzione riguarda una composizione comprendente un anticorpo anti-BAG3 o un suo frammento e almeno un inibitore del checkpoint immunitario.

Anticorpi anti-BAG3 o loro frammenti secondo l'invenzione possono essere anticorpi policlonali o monoclonali. Anticorpi monoclonali sono preferiti. Preferibilmente, gli anticorpi anti-BAG3 o loro frammenti sono anticorpi umanizzati che comprendono:

a) una sequenza amminoacidica della catena pesante come codificato dalle SEQ ID NO: 12 o almeno il suo dominio variabile o una sequenza amminoacidica avente una identità di sequenza di almeno 80% della stessa, e

b) una sequenza amminoacidica della catena leggera come codificato dalla SEQ ID NO: 20 o almeno lo stesso dominio variabile, o una sequenza amminoacidica avente un'identità di sequenza di almeno il 80% della stessa.

Come qui usato, "identità di sequenza" tra due sequenze polipeptidiche, indica la percentuale di amminoacidi che sono identici tra le sequenze, preferibilmente su tutta la lunghezza delle sequenze di amminoacidi secondo quanto codificato dalle SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 20 . Le sequenze polipeptidiche preferite dell'invenzione hanno una identità di sequenza di almeno 85%, più preferibilmente 90%, ancora più preferibilmente 93%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%.

In una forma di realizzazione preferita della presente invenzione, detta sequenza amminoacidica avente una identità di sequenza di almeno 80% rispetto alla SEQ ID N. 12 è scelta tra la SEQ ID N.14, la SEQ ID N: 16 o SEQ ID N.18.

In una ulteriore forma di realizzazione preferita detta sequenza amminoacidica avente una identità di sequenza di almeno 80% rispetto alla SEQ ID N. 20 è scelto tra la SEQ ID N. 22, la SEQ ID N: 24 o la SEQ ID N. 26.

In una realizzazione preferita l'anticorpo della presente invenzione è l'anticorpo in cui la sequenza amminoacidica della catena pesante è codificata dalla SEQ ID NO. 18 e la sequenza amminoacidica della catena leggera è codificata dalla SEQ ID NO 22 o dalla SEQ ID N.26.

In una realizzazione preferita, la sequenza della catena pesante amminoacidica o almeno il suo dominio variabile, o una sequenza amminoacidica avente una identità di sequenza di almeno 80% della stessa, comprende le regioni CDR aventi la seguente composizione amminoacidica: H-CDR1 comprende gli aminoacidi GFNIKDTYMY (SEQ ID N. 3), H-CDR2 comprende gli amminoacidi GVDPANGNTRYDPKFQG (SEQ ID N. 4), H-CDR3 comprende gli amminoacidi DGAMDY (SEQ ID N. 5) e la sequenza amminoacidica della catena leggera o almeno il dominio variabile della stessa o una sequenza amminoacidica avente una identità di sequenza di almeno 80% della stessa, comprende le regioni CDRs aventi la seguente composizione amminoacidica: L-CDR1 comprende gli amminoacidi KSSQSLLYSSNQKNYLA (SEQ ID N. 6), L-CDR2 comprende gli amminoacidi WASTRES (SEQ ID N. 7) e L-CDR3 comprende gli amminoacidi QQYYTYPLT (SEQ ID N.8).

Una ulteriore forma di realizzazione della presente invenzione, è un anticorpo o un suo frammento che si lega alla proteina BAG3 e che comprende:

a) una sequenza nucleotidica di catena pesante come codificato dalla SEQ ID NO: 11 o almeno il dominio variabile della stessa o una sequenza di acido nucleotidico avente una identità di sequenza di almeno 80% dello stesso, e

b) una sequenza nucleotidica di catena leggera come codificato dalla SEQ ID NO: 19 o almeno il dominio variabile della stessa o una sequenza nucleotidica avente una identità di sequenza di almeno 80% della stessa. Come qui usato, "identità di sequenza" tra due sequenze nucleotidiche, indica la percentuale di nucleotidi che sono identici tra le sequenze, preferibilmente su tutta la lunghezza delle sequenze nucleotidiche come codificato dalla SEQ ID NO: 11 e / SEQ ID NO: 19. Sequenze nucleotidiche preferite dell'invenzione hanno una identità di sequenza di almeno 85%, più preferibilmente 90%, ancora più preferibilmente 93%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%.

In una forma di realizzazione preferita della presente invenzione, detta sequenza nucleotidica avente una identità di sequenza di almeno 80% rispetto alla SEQ ID N.11 è scelta tra SEQ ID N.13, SEQ ID N: 15 o SEQ ID N.17.

In una ulteriore forma di realizzazione preferita detta sequenza amminoacidica avente una identità di sequenza di almeno 80% rispetto alla SEQ ID N.19 è scelta tra le SEQ ID N.21, SEQ ID N: 23 o SEQ ID N.25. In una realizzazione preferita l'anticorpo della presente invenzione è l'anticorpo in cui la sequenza amminoacidica della catena pesante è codificata dalla SEQ ID NO. 17 e la sequenza amminoacidica della catena leggera è codificata dalla SEQ ID NO 21 o dalla SEQ ID N.25.

Inibitore del checkpoint immunitario secondo la presente invenzione possono essere anticorpi o loro frammenti che si legano alle seguenti molecole del checkpoint immunitario: proteine PD-1, PDL-1, A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, CTLA-4, IDO , KIR, LAG3, TIM-3 o VISTA, preferibilmente alle proteine PD-1, PDL-1 o CTLA-4. In una forma di realizzazione preferita della presente invenzione, detto almeno un inibitore del checkpoint immunitario è scelto tra un anticorpo, una proteina, una piccola molecola e / o si-RNA.

Più preferibilmente, almeno un inibitore del checkpoint immunitario è un anticorpo.

Preferibilmente detti anticorpi sono anticorpi monoclonali selezionati tra Pidilizumab, Atezolizumab, Avelumab, Durvalumab, Ipilimumab, Tremelimumab, Nivolumab e Pembrolizumab.

In una realizzazione preferita la combinazione della presente invenzione comprende un anticorpo anti-BAG3 o un suo frammento ed un anticorpo anti-PD-1 o un suo frammento.

Preferibilmente detto anticorpo anti-PD1 è scelto da Nivolumab e Pembrolizumab, più preferibilmente Nivolumab.

In una ulteriore forma preferita di realizzazione la suddetta combinazione comprende un anticorpo anti-BAG3 o un suo frammento e un anticorpo anti-PDL-1 e / o un suo frammento.

Preferibilmente detto anticorpo anti-PDL-1 viene selezionato tra Atezolizumab, Avelumab e Durvalumab, più preferibilmente Atezolizumab.

Ai fini della presente invenzione, gli anticorpi sono preferibilmente scelti dal gruppo consistente di un anticorpo murino, un anticorpo ricombinante, un anticorpo umanizzato o completamente umano, un anticorpo chimerico, anticorpi multispecifici, in particolare un anticorpo bispecifico, o un suo frammento.

Gli anticorpi monoclonali possono essere prodotti con qualsiasi metodo adatto, come quella di Köhler e Milstein (1975) o con metodi di DNA ricombinante. Gli anticorpi monoclonali possono anche essere isolati da librerie anticorpali di fago utilizzando tecniche descritte in Clackson et al. (1991).

Forme di anticorpi umanizzati possono essere ottenute secondo i metodi noti nell'arte, (Kettleborough CA et al., 1991), attraverso produzione di una chimera o innesto delle CDR. Metodi alternativi per la produzione di anticorpi umanizzati sono ben noti nella tecnica e sono descritti in, ad esempio, EP 0.239.400 e WO 90/07861. Anticorpi umani possono anche essere derivati da metodi in vitro. Esempi adatti includono ma non sono limitati a “phage display”, “yeast display”, e simili.

Secondo la presente invenzione l’"anticorpo chimerico" si riferisce ad anticorpi comprendenti polipeptidi da diverse specie, come, per esempio, di specie murina e umana. La produzione di anticorpi chimerici è descritto, come esempio, in WO 89/09622.

Il termine anticorpo comprende "frammenti" o "derivati", che hanno nell’anticorpo almeno un sito di legame per l’antigene.

Secondo una forma di realizzazione preferita l'anticorpo o suo frammento può essere un frammento Fab, un frammento Fab', un frammento F (ab'), un frammento Fv, un diabody, un ScFv, una piccolo molecola immunofarmaceutica (SMIP), un affibody, un Avimer, un nanobody, un dominio anticorpale e / o singole catene.

L'anticorpo dell'invenzione può essere preferibilmente una immunoglobulina del tipo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD,e IgE. É da notare che gli anticorpi generati non devono inizialmente possedere tale isotipo, piuttosto l'anticorpo generato può essere di qualsiasi isotipo e l'isotipo dell’anticorpo può essere modificato.

Preferibilmente, gli anticorpi o loro frammenti secondo la presente invenzione sono anticorpi umanizzati.

Una ulteriore forma di realizzazione della presente invenzione è l'uso della suddetta combinazione come medicamento. Preferibilmente nel trattamento delle malattie neoplastiche.In una forma di realizzazione preferita le malattie neoplastiche sono selezionate tra cancro del pancreas, melanoma, cancro della vescica, cancro del polmone a piccole cellule, cancro della testa e del collo, cancro al seno, cancro alla prostata e cancro del colon, preferibilmente cancro del pancreas.

Un'ulteriore forma di realizzazione è una formulazione farmaceutica comprendente la combinazione della presente invenzione, opzionalmente con almeno un eccipiente farmaceuticamente accettabile o “carrier”.

Una ulteriore forma di realizzazione della presente invenzione è l'uso di detta formulazione farmaceutica come medicamento.

Una forma di realizzazione preferita della presente invenzione riguarda l'uso di detta formulazione farmaceutica per il trattamento di malattie neoplastiche, scelte tra cancro pancreatico, melanoma, cancro della vescica, cancro del polmone a piccole cellule, cancro della testa e del collo, cancro al seno, cancro alla prostata e cancro al colon.

Preferibilmente, detta malattia neoplastica è il cancro del pancreas.

La formulazione della presente invenzione può essere formulata in una forma adatta per la somministrazione orale o in una forma adatta per la somministrazione parenterale o topica.

In una forma di realizzazione preferita della presente invenzione, detta forma orale può essere scelta tra le seguenti: compresse, capsule, soluzioni, sospensioni, granuli e capsule oleose.

In una ulteriore forma di realizzazione preferita della presente invenzione, detta forma topica può essere scelta tra le seguenti: crema, unguento, soluzione, sospensione, diaframma, soluzione per nebulizzatore, spray, in polvere o gel.

In una ulteriore forma di realizzazione preferita della presente invenzione, detta forma parenterale può essere sia una soluzione tampone acquosa o una sospensione oleosa.

Detta somministrazione parenterale comprende somministrazione per via intramuscolare, endovenosa, intradermica, sottocutanea, intraperitoneale, intranodale o intrasplenica.

In una ulteriore forma di realizzazione, i principi attivi della combinazione della presente invenzione, che sono gli anticorpi anti-BAG3 o un suo frammento e l'almeno un inibitore del checkpoint immunitario, possono essere somministrati simultaneamente, separatamente o in sequenza, anche seguendo una diversa via di somministrazione per ogni principio attivo. Secondo una ulteriore forma di realizzazione della presente invenzione, i principi attivi della combinazione possono essere somministrati insieme, attraverso la stessa via di somministrazione o attraverso un'altra via di somministrazione, oppure possono essere somministrati separatamente attraverso la stessa via di somministrazione o tramite una via diversa di somministrazione.

In un aspetto preferito della presente invenzione, l'anticorpo anti-BAG3 o un suo frammento è formulato in forma orale, preferibilmente in forma di compresse, capsule, soluzioni, sospensioni, granuli e capsule oleose, mentre l'almeno un inibitore del checkpoint immunitario è formulato per somministrazione parenterale, preferibilmente una soluzione di tampone acquoso o una sospensione oleosa.

Secondo una realizzazione preferita della presente invenzione, la formulazione contenente gli anticorpi anti-BAG3 o un suo frammento sono somministrati quotidianamente, preferibilmente una o più volte al giorno, mentre la formulazione contenente almeno un inibitore del checkpoint immunitario sono somministrati attraverso via parenterale, preferibilmente da una a più volte alla settimana.

I seguenti esempi sono inclusi per aumentare la comprensione dell'invenzione, senza avere alcun effetto limitativo sull’invenzione.

ESEMPI

Esempio 1 - Chimerizazzione e umanizzazione dell’anticorpo AC2. L’anticorpo murino AC-2 è prodotto da un ibridoma isolato dall’ibridoma clone madre n°PD02009 depositato il 17/12/2002 presso il Centro di Biotecnologie Avanzate di Genova e pubblicato nel documento WO03/055908. L’RNA totale è stato estratto e una RT-PCR è stata eseguita per clonare e sequenziare le regioni variabili dell'anticorpo utilizzando procedure convenzionali (ad esempio, utilizzando sonde oligonucleotidiche che sono in grado di legarsi specificamente a geni che codificano per le catene pesanti e leggere di anticorpi murini).

Sulla base delle informazioni della sequenza della regione variabile, sulle catene pesanti e leggere dell’anticorpo murino AC-2 (SEQ ID No.1 e SEQ ID N. 2 per le sequenze amminoacidiche e SEQ ID 9 e SEQ ID N. 10 per le sequenze nucleotidiche ), diverse varianti umanizzate di detta regione sono state ottenute per sintesi genica utilizzando procedure standard.

Sequenze codificanti per le varianti di anticorpi sono statei clonate nel vettore di espressione Evi-5 (Evitria AG, Svizzera) ed espressi in cellule CHO-K1.

Per la chimerizzazione dell’anticorpo, le regioni costanti murine sono state sostituite con le regioni costanti umane. Una versione chimerica della catena pesante (HC) è stata prodotta nel sottotipo IgG1.

Per l’umanizzazione degli anticorpi, le regioni determinanti la complementarità (CDR) dal murino sono state innestate dal murino in una struttura di un anticorpo umano.

Sono state prodotte ventiquattro versioni umanizzate della catena pesante (HC) in un contesto IgG1 e LC-kappa. Ogni versione è caratterizzata da specifiche mutazioni puntiformi in FR (Framework Regions).

Esempio 2 – L’anticorpo monoclonale anti-BAG3 induce l’espressione di PD-1 in allotrapianti di tumore pancreatico in topi immunocompetenti.

Tumori trattati con l’anticorpo anti-BAG3 hanno mostrato una significativa più alta espressione della proteina PD-1 (Figura 1A). In figura 1B sono mostrate immagini rappresentative.

Esempio 3 - L’anticorpo monoclonale anti-BAG3 induce l’espressione di PD-L1 in allotrapianti di tumore pancreatico in topi immunocompetenti.

Tumori trattati con l’anticorpo anti-BAG3 hanno mostrato una significativa più alta espressione della proteina PD-L1 (Figura 2A). Nella figura 2B sono mostrate immagini rappresentative.

Esempio 4 – La combinazione degli anticorpi anti-BAG3 e anti-PD1 inducono l’arresto della crescita tumorale in allotrapianti di tumore pancreatico in topi immunocompetenti.

In un modello murino singenico di cancro pancreatico abbiamo mostrato che il trattamento combinato con un anticorpo monoclonale anti-BAG3 mAb e un anticorpo monoclonale anti-PD-1 è in grado di arrestare la crescita tumorale.

Materiali e Metodi (riferiti agli esempi 2-4)

Modello in vivo: cellule murine mt4-2D (0,20 × 10<6>) sono state sospese in una soluzione 1: 1 di PBS 1X / matrigel e iniettate nel fianco destro di topi femmina C57BL6 (6 settimane, Harlan Laboratories, Italia). Dopo 10 giorni i topi sono stati divisi in due bracci composti da 10 topi ciascuno in cui la media del volume del tumore era di circa 100 mm<3>. Un gruppo ha ricevuto per via intraperitoneale l’iniezione di 20 mg kg-1 di anticorpo monoclonale anti-BAG3 in PBS 3 volte a settimana da solo o in combinazione con l’anticorpo anti-PD-1 (10 mg kg-1 due volte alla settimana, Bioxcell Clone: J-43), mentre l'altro ha ricevuto IgG aspecifiche (Bioxcell Clone: MOPC-21) per 3 settimane. Gli animali sono stati pesati e il volume del tumore misurati con un calibro due volte alla settimana. Alla fine dell'esperimento tutti gli animali sono stati sacrificati e i campioni tumorali sono stati raccolti per le analisi successive.

Immunofluorescenza: alla fine dell’esperimento i tumori sono stati inclusi in paraffina e le sezioni sono state analizzate mediante immunofluorescenza usando un anticorpo anti-PD-1 o anti-PD-L1 (Abcam Cambridge, UK a 1: 100). Il protocollo di immunofluorescenza includeva la deparaffinazione con Clear-Rite™ 3 (ThermoScientific, Waltham, MA USA), la reidratazione attraverso gradi discendenti di alcol fino ad acqua, il recupero non enzimatico dell’antigene in in tampone citrato di sodio 10 mM, 0,05% di Tween, pH 6,0, per 3 minuti nel forno a microonde a 700Watt. Dopo il lavaggio, interazioni non specifiche sono state bloccate con una soluzione al 10% di FBS in PBS 1X. Le sezioni sono state poi incubate con gli anticorpi primari anti- PD1 e anti- PC-L1 per una notte a 4 ° C in una camera umidificata. Dopo un ulteriore lavaggio, le sezioni sono state incubate con l'anticorpo secondario. I nuclei sono stati colorati con 1 ug ml-1 di Hoechst 33342 (Molecular Probes, Oregon, Stati Uniti d'America). I controlli negativi sono stati eseguiti utilizzando tutti i reagenti tranne l'anticorpo primario o utilizzando IgG aspecifiche dello stesso isotipo . Le immagini sono state acquisite in modalità di scansione sequenziale utilizzando gli stessi parametri di acquisizione tra i diversi campioni (intensità del laser, guadagno dei fotomoltiplicatori, apertura a foro stenopeico, obiettivo × 63, zoom 1). Per la preparazione delle immagini, la luminosità e il contrasto sono stati rettificati dall’avere cura di lasciare una luce di fondo per apprezzare visivamente le caratteristiche di intensità di fluorescenza e per aiutare il confronto tra i diversi gruppi sperimentali. La quantità di positività per PD-1 o PD-L1 è stata calcolata come rapporto di fluorescenza rispetto al colorante nucleare utilizzando il software ImageJ su almeno una decina di immagini con ingrandimento 63X.

Claims (11)

1. RIVENDICAZIONI 1. Combinazione comprendente un anticorpo anti-BAG3 o un suo frammento e almeno un inibitore del checkpoint immunitario.
2. 2. Combinazione secondo la rivendicazione 1, caratterizzata dal fatto che almeno un inibitore del checkpoint immunitario è un anticorpo, un proteina, una piccola molecola e / o un si-RNA.
3. 3. Combinazione secondo la rivendicazione 1, caratterizzata dal fatto che l'anticorpo anti-BAG3 o un suo frammento è un anticorpo umanizzato che comprende: a) una catena pesante con sequenza amminoacidica codificata dalla SEQ ID NO: 12 o almeno il dominio variabile della stessa, o una sequenza amminoacidica avente una identità di sequenza di almeno l’80% della stessa, e b) una catena leggera con sequenza amminoacidica codificata dalla SEQ ID NO: 20 o almeno il dominio variabile della stessa, o una sequenza amminoacidica avente una identità di sequenza di almeno l’80% della stessa.
4. 4. Combinazione secondo la rivendicazione 1, caratterizzata dal fatto che l'inibitore del check-point immunitario è un anticorpo o un suo frammento che si lega a PD-1, PD-L1, A2AR, B7-H3, H4-B7, BTLA, CTLA- 4, IDO, KIR, LAG3, TIM-3 o alla proteina VISTA, preferibilmente alle proteine PD-1, PD-L1 o CTLA-4.
5. 5. Combinazione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, comprendente un anticorpo anti-BAG3 o un suo frammento ed un anticorpo anti-PD-1 e / o un anti-PD-L1 o un suo frammento.
6. 6. Combinazione secondo la rivendicazione 5, caratterizzata dal fatto che detto anticorpo anti-PD-1 viene scelto tra Nivolumab e Pembrolizumab, preferibilmente Nivolumab e detto anticorpo anti-PD-L1 è scelto tra Atezolizumab, Avelumab e Durvalumab, preferibilmente Atezolizumab.
7. 7. Combinazione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che l'anticorpo anti-BAG3 o almeno un inibitore del check-point immunitario è un anticorpo monoclonale selezionato tra un anticorpo murino, un anticorpo ricombinante, umanizzato o anticorpi totalmente umano, un anticorpo chimerico, anticorpi multispecifici, in particolare un anticorpo bispecifico o un suo frammento.
8. 8. Formulazione farmaceutica comprendente la combinazione secondo le rivendicazioni da 1 a 6, e opzionalmente almeno un eccipiente farmaceuticamente accettabile o un carrier.
9. 9. Combinazione /formulazione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti per uso come medicamento.
10. 10. Combinazione/formulazione farmaceutica per uso secondo la rivendicazione 8 nel trattamento di malattia neoplastica scelta tra cancro al pancreas, melanoma, cancro della vescica, cancro del polmone a piccole cellule, tumori a testa e collo, cancro al seno, cancro alla prostata e cancro del colon, preferibilmente cancro al pancreas.
11. 11. Combinazione/formulazione farmaceutica per uso secondo la rivendicazione 9, caratterizzato dal fatto che l'anticorpo anti-BAG3 o un suo frammento e l'almeno un inibitore del check-point immunitario sono somministrati simultaneamente, separatamente o in sequenza.