JP2020500179A - 免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせた治療的使用のための抗ｂａｇ３抗体 - Google Patents

Abstract

本発明は、抗ＢＡＧ３抗体および免疫チェックポイント阻害剤を含む組み合わせ、前記組み合わせを含み、任意選択的に薬学的に許容される賦形剤を有する医薬製剤、ならびに新生物疾患の治療におけるその使用に関する。

Description

本発明は、抗ＢＡＧ３抗体および免疫チェックポイント阻害剤を含む組み合わせ、前記組み合わせを含み、任意選択的に薬学的に許容される賦形剤を有する医薬製剤、ならびに新生物疾患の治療におけるその使用に関する。

ＢＡＧ３タンパク質は、７４ｋＤａの細胞質タンパク質であり、ＢＡＧドメイン（アミノ酸１１０〜１２４）として知られている構造ドメインを介してタンパク質ＨＳＰ７０（熱ショックタンパク質）のＡＴＰアーゼドメインと相互作用する、コシャペロンのファミリーに属する。さらに、ＢＡＧ３タンパク質は、ＷＷドメイン（Ｔｒｐ−Ｔｒｐ）、プロリンに富む領域（ＰＸＸＰ）、および２つの保存モチーフＩＰＶ（Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ）を含み、これが他のタンパク質との結合を仲介することができる。多くの機能的ドメインの存在に起因するＢＡＧ３タンパク質のアダプターとしての性質のため、そのようなタンパク質は、したがって、異なるタンパク質と相互作用することが可能である。

ヒトにおいて、ｂａｇ３遺伝子の発現は、筋細胞を含む、数種類の正常な細胞で恒常的であるが、その変異は骨格筋および心筋の疾患と関連する。さらに、ＢＡＧ３タンパク質は、多くのタイプの原発性腫瘍または腫瘍細胞株（リンパ性または骨髄性白血病、神経芽腫、膵がん、甲状腺がん、乳がんおよび前立腺がん、黒色腫、骨肉腫、膠芽腫ならびに腎臓、結腸、卵巣の腫瘍など）において発現する（非特許文献１）。

白血球、上皮細胞およびグリア細胞ならびに網膜の細胞などの正常な細胞種において、ｂａｇ３遺伝子の発現は、酸化体、高温、血清の欠乏、重金属、ＨＩＶ−１感染症などのストレッサーによって誘導される可能性がある。これらの発見は、ｂａｇ３遺伝子の発現制御が、ストレスに対する細胞応答において重要な要素であること、および、ｂａｇ３遺伝子のプロモーター内でさまざまな形態の細胞ストレスにおいて活性化される転写因子ＨＳＦ１（熱ショック転写因子）に対して応答するエレメントの存在と相関していること、を示す。さらに、その構造中の多くのタンパク質間相互作用ドメインの存在により、ＢＡＧ３タンパク質は、さまざまな分子パートナーと相互作用して、さまざまな種類の細胞の細胞生存に影響を与える（非特許文献１）。ＢＡＧ３抗アポトーシス活性に関して報告された第１のメカニズムが骨肉腫細胞および黒色腫細胞において確認され、そこでは、ＢＡＧ３タンパク質が転写因子ＮＦ−ｋＢの活性化および細胞の生存を調節することが観察された（非特許文献２）。膠芽腫細胞においては異なる分子メカニズムが示されている。そこでは、ＢＡＧ３タンパク質がＨＳＰ７０タンパク質と正の方向に協働してＢＡＸタンパク質をサイトゾルに保持し、それらがミトコンドリアへ移動することを妨げる（非特許文献３）。最後に、一部の腫瘍において、ＢＡＧ３は、細胞接着を調節するタンパク質を制御することが示されている。

細胞質ＢＡＧ３タンパク質の存在は多くの異なる細胞系においても示されており、さまざまな腫瘍にだけでなく、一般に細胞生存と関連する病変とも関連づけられている。さらに、特許文献１は、血清中の生化学的マーカーとして一部の細胞種により分泌される細胞外ＢＡＧ３タンパク質について記載しており、これは、心臓病変および膵臓腫瘍などの特定の病態の診断に対して極めて特異的である。

最近、ＢＡＧ３タンパク質が膵管腺癌（ＰＤＡＣ）を有する患者の３４６人中３４６人に発現しており、膵臓腫瘍の細胞により放出されるが、そのようなタンパク質は、周辺の非新生物組織または正常な膵臓のいずれにおいても発現していないことが報告されている。同様に、ＢＡＧ３発現のレベルが患者の生存に関連することが報告されている。研究の結果は、ＢＡＧ３ ｍＲＮＡに特異的なｓｉＲＮＡ分子の使用がｂａｇ３遺伝子の発現を停止させ、細胞死を誘導できることを示しており、ＢＡＧ３タンパク質が膵臓腫瘍細胞にとって重要な生存因子であること、および、その下方制御が、ゲムシタビンと併用された場合に、腫瘍細胞の根絶に寄与し得ることが確認された（非特許文献４）。

さらに、最近の論文（非特許文献５）において、本発明者らは、ＰＤＡＣが放出するＢＡＧ３がマクロファージと結合し、それらの活性化およびＰＤＡＣ支持因子の分泌を誘導することを報告した。本発明者らはまた、ＢＡＧ３受容体としてＩＦＩＴＭ−２を同定し、それが、ＰＩ３Ｋ経路およびｐ３８ ＭＡＰＫ経路を介してシグナルを送ることを示した。最後に、本発明者らは、マウスモノクローナル抗ＢＡＧ３抗体の使用が、３つの異なるマウスモデルにおいて、腫瘍成長の低減をもたらし、転移形成を妨げることを示した。したがって、本発明者らは、ＰＤＡＣの成長および転移拡散に関与するパラクラインループを特定し、抗ＢＡＧ３抗体が治療的可能性を有することを示した（非特許文献５）。実際に、本発明者らは、抗ＢＡＧ３抗体が、マクロファージのＢＡＧ３活性をブロックしたことを示した。インビボにおいて、本発明者らは、患者由来の異種移植片モデルおよび同系モデルを含む、さまざまな動物モデルにおいて腫瘍成長をブロックするこの抗体の能力を示した。マウスは完全な免疫系を有するため、この最後のモデルは、非常に重要である。

腫瘍病変に対する従来の化学療法処置は、副作用と関連する数々の欠点を呈し、現在のところ、そのような病変を処置する完全な手段ではない。

近年、免疫チェックポイント系を阻害する／ブロックする分子である免疫チェックポイント阻害剤が、進行新生物に対する効果的な治療法として出現した。これらの中には、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）をブロックする治療用抗体があり、いくつかの腫瘍に対して使用されてきた（非特許文献６）。

受容体のＢ７／ＣＤ２８ファミリーのメンバーであるＰＤ−１（プログラム細胞死タンパク質、ＣＤ２７９）は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞および骨髄由来サプレッサー細胞を含む、活性化白血球の細胞表面上に発現する単量体分子であり、その発現は、遺伝的メカニズムと後成的メカニズムの間の相互作用によって精密に制御される。ＰＤ−１の既知のリガンドは、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２である（非特許文献７）。

ＰＤ−Ｌ１（プログラム細胞死タンパク質リガンド１、Ｂ７Ｈ１、ＣＤ２７４）は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、骨髄細胞、および樹状細胞を含む造血細胞、ならびに非造血細胞（肺細胞、心臓細胞、内皮細胞、膵島細胞、ケラチノサイトなど）、特に、がん細胞上に低いレベルで発現しており、細胞活性化時に上方制御される。ＰＤ−Ｌ２（プログラム細胞死タンパク質リガンド２、Ｂ７−ＤＣ、ＣＤ２７３）は、マクロファージ、樹状細胞（ＤＣ）、活性化ＣＤ４＋およびＣＤ８＋リンパ球および一部の固形腫瘍（卵巣癌、小細胞肺がん、食道がん）上に発現している。ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の発現はまた、正常な線維芽細胞およびがん関連線維芽細胞上で検出されている。ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２はともに、さらなる受容体と相互作用する。ＰＤ−Ｌ１は、マクロファージおよび他の細胞種上に発現する、ＣＤ２８のリガンドであるＣＤ８０と相互作用し、ＰＤ−Ｌ２は、反発性誘導分子（ＲＧＭ）ｂと相互作用する。ＰＤ−１の細胞質側末端は、免疫受容体チロシン依存性抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）および免疫受容体チロシン依存性スイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）を含む。Ｔリンパ球において、ＰＤ−１とそのリガンドとの相互作用は、ＰＤ−１の細胞内末端の２つのチロシンのリン酸化をもたらす。ＳＨ２ドメイン含有タンパク質チロシンホスファターゼ（ＳＨＰ−１および／またはＳＨＰ−２）のＰＤ−１のＩＴＳＭ細胞質領域への動員が、Ｔ細胞受容体の下流シグナルを阻害し、それによりＴ細胞増殖およびサイトカイン産生を阻害する。ＰＤ−１は、Ｔ細胞に対して他の影響も及ぼす。例えば、Ａｋｔ経路およびＲａｓ経路を阻害することにより、ＰＤ−１の誘発は、ユビキチンリガーゼ要素であるＳＫＰ２の転写を抑制し、この結果、ＳＫＰ２が仲介するｐ２７（ｋｉｐ１）、サイクリン依存性キナーゼの阻害剤の分解が損なわれ、それにより、細胞周期の進行がブロックされる。さらに、ＰＤ−１は、２つ以上のメカニズムによってアポトーシスを促進することができる。Ｔ細胞の活性化を直接阻害することに加えて、ＰＤ−Ｌ１によるＰＤ−１の誘発は、エフェクターＴ細胞を積極的に抑制する、末梢性免疫寛容の重要なメディエーターである制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の発生を誘導することができる。ＰＤ−１誘発によるＴｒｅｇ誘導は、ホスホ−Ａｋｔなどの重要なシグナル伝達分子の調節によって仲介され、そのレベルは、ＰＤ−１が誘導するＰＴＥＮの活性化によって低く維持される。いくつかのタイプのがん細胞はＰＤ−Ｌ１を発現する。さらに、腫瘍微小環境内の非新生物細胞（内皮細胞、白血球、線維芽細胞）もＰＤ−Ｌ１を発現する場合がある。これは、それらの細胞が、腫瘍浸潤性ＰＤ−１＋Ｔリンパ球（ＴＩＬ）を寛容化でき、かつ／またはＴｒｅｇ発生を誘導することができることを示唆する。実際に増えつつある多くの証拠は、一部のがんのタイプ（黒色腫、腎癌、非小細胞肺がんなど）に冒された患者を抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）で処置することにより、腫瘍増殖を低減することができることを示している。

現在、１００を超える臨床試験が、さまざまながんにおけるＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１ブロックの臨床効果を調査している。しかしながら、非常に有望な結果にもかかわらず、ａ）すべての腫瘍タイプが抗ＰＤ−１または抗ＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂに顕著な応答を示す訳ではないこと、およびｂ）応答するがんの部分集合でも、すべての患者が応答を示す訳ではなく、一部の応答は非常に部分的であること、が明らかである。証拠のこうした部分は、応答の永続性に対する研究のこの段階での不確実性と併せて、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂと他の経路に作用するツールの間の効果的な治療用の組み合わせの必要性を示す（非特許文献８）。

国際公開第２０１１／０６７３７７号 欧州特許第０２３９４００号明細書 国際公開第９０／０７８６１号 国際公開第８９／０９６２２号 国際公開第０３／０５５９０８号

Ｒｏｓａｔｉ Ａ． ｅｔ ａｌ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｓ． ２０１１ Ａｐｒ ７；２：ｅ１４１ Ａｍｍｉｒａｎｔｅ Ｍ． ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ２０１０；１０７（１６）７４９７−５０２ Ｆｅｓｔａ Ｍ． ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ． ２０１１；１７８（６）：２５０４−１２ Ｒｏｓａｔｉ Ａ． ｅｔ ａｌ． Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ． ２０１２ Ｎｏｖ；１８１（５）：１５２４−９ Ｒｏｓａｔｉ Ａ． ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ． ２０１５ Ｎｏｖ ２；６：８６９５ Ｔｏｐａｌｉａｎ ＳＬ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ． ２０１６ Ｍａｙ；１６（５）：２７５−８７ Ｆａｒｋｏｎａ Ｓ． ｅｔ ａｌ．， ＢＭＣ Ｍｅｄ． ２０１６ Ｍａｙ ５；１４：７３ Ｔｏｐａｌｉａｎ ＳＬ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ． ２０１５ Ａｐｒ １３；２７（４）：４５０−６１ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ， ｓｉｘｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ ２００９

したがって、新生物疾患の治療に使用される従来の一般的に知られた治療法と比較した場合に、極めて特異的で、副作用がほとんどないか、またはまったくないという利点を有する、新規の改善された治療的処置が明らかに必要とされている。

定義
別に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語、表記およびその他の科学的術語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有することが意図される。いくつかの場合には、一般的に理解される意味を有する用語は、明確さおよび／またはすぐに参照できるように本明細書において定義される。したがって、本明細書にそのような定義を含めることは、当該技術分野において一般に理解される意味を超える実質的な差異を表わすものと解釈されるべきではない。

本明細書において「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、それ自体の薬理学的効果がまったくない物質を意味し、これは、哺乳動物、好ましくは、ヒトに投与されたときに有害反応をもたらさない。生理学的に許容される賦形剤は、当該技術分野において周知であり、例えば、参照によって本明細書に組み込まれる非特許文献９に開示されている。

本明細書において「同時、個別または連続投与」という用語は、第１の化合物および第２の化合物の同時の投与、または２つの化合物が患者の体内で同時に作用するような方法での投与、または治療効果をもたらすような方法での、一方の化合物の後の他方の化合物の投与を意味する。いくつかの実施形態において、化合物は、食事とともに服用される。他の実施形態において、化合物は、食後３０分または６０分などの食後に服用される。いくつかの実施形態において、一方の化合物は、他方の化合物の投与後のある期間の間に患者に投与される。

本明細書において「およそ」および「約」という用語は、測定値に生じる可能性のある実験誤差の範囲を意味する。

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語は、非限定的用語（すなわち、「含むが、それらに限定されない」を意味する）と解釈されるべきであり、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ、ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ、ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」としての用語にも対応していると見なされるべきである。

「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ、ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語は、半限定的用語と解釈されるべきであり、本発明の基本的かつ新規の特徴に実質的に影響を及ぼすその他の成分が含まれない（したがって、任意の賦形剤は含まれてもよい）ことを意味する。

「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ、ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語は、限定的用語と解釈されるべきである。

「抗体」という用語は、本明細書中で使用される場合、「断片」または「誘導体」を含み、これらは、抗体の少なくとも１つの抗原結合部位を有し、かつ／または同じ生物学的活性を示す。

抗体は、好ましくは、少なくとも１つの免疫グロブリン重鎖および少なくとも１つの免疫グロブリン軽鎖を含む。免疫グロブリン鎖は、可変ドメインおよび任意選択的に定常ドメインを含む。可変ドメインは、相補性決定領域（ＣＤＲ）、例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域、ならびにフレームワーク領域を含んでもよい。

「ヒト化抗体」という用語は、ヒト由来の抗体であって、その超可変領域が、非ヒトモノクローナル抗体の相同領域によって置換されたものを意味する。

「キメラ抗体」という用語は、異なる抗体由来の部分を含有する抗体を意味する。

「組換え抗体」という用語は、組換えＤＮＡ法を使用して得られた抗体を意味する。

「ｓｃＦｖ断片」（単鎖可変断片）という用語は、該当する抗原とのみ結合することができる免疫グロブリン断片を意味する。ｓｃＦｖ断片は、ペプチドリンカーを使用して、二量体（ダイアボディ）、三量体（トリアボディ）および四量体（テトラボディ）に合成することも可能である。

「Ｆａｂ断片」（抗原結合断片）および「Ｆａｂ２断片」という用語は、隣接する重鎖のＦｃ断片と結合した軽鎖からなる免疫グロブリン断片を意味し、そのような断片は一価抗体である。Ｆａｂ部分が対になっているとき、断片はＦａｂ２と呼ばれる。

「ハイブリドーマ」という用語は、モノクローナル抗体を産生する細胞を意味する。

「単一特異性抗体」という用語は、すべてが同じ抗原に対して親和性を有する抗体を意味する。

「多重特異性抗体」という用語は、いくつかの抗原に対して親和性を有する抗体を意味する。

「二重特異性抗体」という用語は、２つの異なる抗原に対して親和性を有する抗体を意味する。

「免疫チェックポイント阻害剤」という用語は、Ｔ細胞などの一部の種類の免疫細胞、および一部のがん細胞によって産生される特定のタンパク質をブロックする、薬物の種類を意味する。

「Ａ２Ａ」という用語は、アデノシンＡ２Ａ受容体を意味する。

「Ｂ７−Ｈ３」という用語は、ＣＤ２７６とも呼ばれ、Ｔ細胞が仲介する免疫応答の制御に関与する、固形腫瘍において発現するタンパク質を意味する。

「Ｂ７−Ｈ４」という用語は、ＶＴＣＮ１とも呼ばれ、腫瘍細胞、および腫瘍の回避に関与する腫瘍関連マクロファージが発現する分子を意味する。

「ＢＴＬＡ」という用語は、ＣＤ２７２とも呼ばれ、ＢおよびＴリンパ球アテニュエーターを意味する。

「ＣＴＬＡ−４」という用語は、ＣＤ１５２とも呼ばれ、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４を意味する。

「ＩＤＯ」という用語は、免疫抑制特性を有するトリプトファン異化酵素である、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼを意味する。

「ＫＩＲ」、キラー細胞免疫グロブリン様受容体という用語は、ナチュラルキラー細胞上のＭＨＣクラスＩ分子に対する受容体を意味する。

「ＬＡＧ３」という用語は、リンパ球活性化遺伝子−３を意味する。

「ＴＩＭ−３」という用語は、Ｔ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン３を意味する。

「ＶＩＳＴＡ（タンパク質）」という用語は、Ｔ細胞活性化のＶ−ドメインＩｇサプレッサーを意味する。

２つのポリペプチド配列間における「配列同一性」という用語は、配列間で同一であるアミノ酸のパーセンテージを意味する。

驚くべきことに、特定の抗ＢＡＧ３抗体と、免疫チェックポイント阻害剤、例えば、抗ＰＤ−１抗体とを含む組み合わせが、膵がんにおける腫瘍増殖の阻止に有効であることが分かった。

特に、抗ＢＡＧ３抗体が、ＢＡＧ３タンパク質とマクロファージ表面上のその受容体との間の相互作用をブロックすることに加えて、腫瘍細胞表面上におけるＰＤ−１分子および／またはＰＤＬ−１分子の産生を誘導し、ひいては腫瘍細胞に対する抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤＬ−１抗体の効果を増強させることができることが初めて確認された。

それに関するメカニズムの１つの仮説は、抗ＢＡＧ３抗体によって引き起こされた腫瘍微小環境におけるいくつかのサイトカインのダウンモジュレーションに関連している可能性がある（非特許文献５）。

したがって、本発明において報告される実験データは、特許請求される組み合わせが、新生物疾患、特に膵がんの治療に特に効果的であることを示す。

抗ＢＡＧ３ ｍＡｂは、免疫適格（ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）マウス中の膵がん同種移植片においてＰＤ−１発現を誘導する。 対照および抗ＢＡＧ３処置腫瘍におけるＰＤ−１染色の代表的な画像である。 抗ＢＡＧ３ ｍＡｂは、免疫適格マウス中の膵がん同種移植片においてＰＤ−１発現を誘導する。 対照および抗ＢＡＧ３処置腫瘍におけるＰＤＬ−１染色の代表的な画像である。 抗ＢＡＧ３および抗ＰＤ−１の組み合わせは、免疫適格マウス中の膵がん同種移植片における腫瘍増殖を阻止する。

したがって、本発明の第１の実施形態は、抗ＢＡＧ３抗体またはその断片と、少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤とを含む組み合わせに関する。

本発明による抗ＢＡＧ３抗体またはその断片は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体でもよい。好ましくは、モノクローナル抗体である。

好ましくは、抗ＢＡＧ３抗体またはその断片は、
ａ）配列番号１２もしくは少なくともその可変ドメイン、またはそれらの少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる重鎖アミノ酸配列と、
ｂ）配列番号２０もしくは少なくともその可変ドメイン、またはそれらの少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる軽鎖アミノ酸配列と、
を含むヒト化抗体である。

本明細書中で使用される場合、２つのポリペプチド配列間の配列同一性は、配列間、好ましくは、配列番号１２および配列番号２０によってコードされるアミノ酸配列の全長にわたる配列間で同一であるアミノ酸のパーセンテージを示す。

本発明の好ましいポリペプチド配列は、少なくとも８５％、より好ましくは、９０％、さらにより好ましくは、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。

本発明の好適な実施形態において、配列番号１２に関して少なくとも８０％の配列同一性を有する前記アミノ酸配列は、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８から選択される。

さらに好適な実施形態において、配列番号２０に関して少なくとも８０％の配列同一性を有する前記アミノ酸配列は、配列番号２２、配列番号２４または配列番号２６から選択される。

好適な実施形態において、本発明の抗体は、重鎖アミノ酸配列が配列番号１８によってコードされ、軽鎖アミノ酸配列が配列番号２２または配列番号２６によってコードされる抗体である。

好適な実施形態において、重鎖アミノ酸配列もしくは少なくともその可変ドメイン、またはそれらの少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列は、以下のアミノ酸組成を有するＣＤＲ領域を含む：Ｈ−ＣＤＲ１は、アミノ酸ＧＦＮＩＫＤＴＹＭＹ（配列番号３）を含み、Ｈ−ＣＤＲ２は、アミノ酸ＧＶＤＰＡＮＧＮＴＲＹＤＰＫＦＱＧ（配列番号４）を含み、Ｈ−ＣＤＲ３は、アミノ酸ＤＧＡＭＤＹ（配列番号５）を含む。さらに、軽鎖アミノ酸配列もしくは少なくともその可変ドメイン、またはそれらの少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列は、以下のアミノ酸組成を有するＣＤＲ領域を含む：Ｌ−ＣＤＲ１は、アミノ酸ＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡ（配列番号６）を含み、Ｌ−ＣＤＲ２は、アミノ酸ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号７）を含み、Ｌ−ＣＤＲ３は、アミノ酸ＱＱＹＹＴＹＰＬＴ（配列番号８）を含む。

本発明のさらなる実施形態は、ＢＡＧ３タンパク質と結合する抗体またはその断片であって、
ａ）配列番号１１もしくは少なくともその可変ドメイン、またはそれらの少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる重鎖ヌクレオチド配列と、
ｂ）配列番号１９もしくは少なくともその可変ドメイン、またはそれらの少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖ヌクレオチド配列と
を含む。

本明細書中で使用される場合、２つのヌクレオチド配列間における「配列同一性」は、配列間、好ましくは、配列番号１１および配列番号１９によってコードされるヌクレオチド配列の全長にわたる配列間の同一のヌクレオチドのパーセンテージを示す。本発明の好ましいヌクレオチド配列は、少なくとも８５％、より好ましくは９０％、さらにより好ましくは、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。

本発明の好適な実施形態において、配列番号１１に関して少なくとも８０％の配列同一性を有する前記ヌクレオチド配列は、配列番号１３、配列番号１５または配列番号１７から選択される。

さらに好適な実施形態において、配列番号１９に関して少なくとも８０％の配列同一性を有する前記アミノ酸配列は、配列番号２１、配列番号２３または配列番号２５から選択される。

好適な実施形態において、本発明の抗体は、重鎖アミノ酸配列が配列番号１７によってコードされ、軽鎖アミノ酸配列が配列番号２１または配列番号２５によってコードされる抗体である。

本発明による免疫チェックポイント阻害剤は、以下の免疫チェックポイント分子：ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ−３またはＶＩＳＴＡタンパク質、好ましくは、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１もしくはＣＴＬＡ−４タンパク質と結合する抗体またはその断片でもよい。

本発明の好適な実施形態において、少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤は、抗体、タンパク質、小分子および／またはｓｉ−ＲＮＡから選択される。

より好ましくは、前記少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤は、抗体である。

好ましくは、前記抗体は、ピジリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、イピリムマブ、トレメリムマブ、ニボルマブおよびペンブロリズマブから選択されるモノクローナル抗体である。

好適な実施形態において、本発明の組み合わせは、１つの抗ＢＡＧ３抗体またはその断片、および１つの抗ＰＤ−１抗体またはその断片を含む。

好ましくは、前記抗ＰＤ−１抗体は、ニボルマブおよびペンブロリズマブから選択され、より好ましくは、ニボルマブである。

さらに好適な実施形態において、前述の組み合わせは、１つの抗ＢＡＧ３抗体またはその断片、ならびに１つの抗ＰＤＬ−１抗体および／またはその断片を含む。

好ましくは、前記抗ＰＤＬ−１抗体は、アテゾリズマブ、アベルマブおよびデュルバルマブから選択され、より好ましくは、アテゾリズマブである。

本発明の目的のために、抗体は、好ましくは、マウス抗体、組換え抗体、ヒト化抗体もしくは完全ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、特に、二重特異性抗体、またはそれらの断片からなる群から選択される。

モノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５年）の方法などの任意の適した方法によって、または組換えＤＮＡ法によって作製されてもよい。モノクローナル抗体はまた、Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１年）に記載されている技術を使用してファージ抗体ライブラリーから単離されてもよい。

抗体のヒト化形態は、キメラ化またはＣＤＲ移植などの、当該技術分野において既知の方法（Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ Ｃ．Ａ．ら、１９９１年）に従って生成されてもよい。ヒト化抗体の作製に関する代替的な方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、特許文献２および特許文献３に記載されている。ヒト抗体はまた、インビトロ法によって誘導されてもよい。好適な例としては、ファージディスプレイ法、イーストディスプレイ法などが挙げられるが、これらに限定されない。

本発明によれば、「キメラ抗体」は、例えば、マウスおよびヒトなどの、異なる種に由来するポリペプチドを含む抗体に関する。キメラ抗体の作製については、例えば、特許文献４に記載されている。

抗体という用語は、その抗体の少なくとも１つの抗原結合部位を有する「断片」または「誘導体」を含む。

好ましい実施形態によれば、抗体またはその断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ、ＳｃＦｖ、小モジュラー免疫医薬（ｓｍａｌｌ ｍｏｄｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）（ＳＭＩＰ）、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）、アヴィマー（ａｖｉｍｅｒ）、ナノボディ、ドメイン抗体および／または単鎖でもよい。

本発明の抗体は、好ましくは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ抗体種でもよい。生成される抗体は、最初からそのようなアイソタイプを持つ必要はなく、むしろ生成されたままの抗体は任意のアイソタイプを有することができ、その抗体はアイソタイプスイッチが行われてもよいことが理解されるであろう。

好ましくは、本発明による抗体またはその断片は、ヒト化抗体である。

本発明のさらなる実施形態は、薬剤としての前述の組み合わせの使用、好ましくは、新生物疾患の治療における使用である。

好ましい実施形態において、新生物疾患は、膵がん、黒色腫、膀胱がん、小細胞肺がん、頭頸部がん、乳がん、前立腺がんおよび結腸がんから選択され、好ましくは、膵がんである。

さらなる実施形態は、本発明の組み合わせを含み、任意選択的に少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤または担体を有する医薬製剤である。

本発明のさらなる実施形態は、前記医薬製剤の薬剤としての使用である。

本発明の好ましい実施形態は、膵がん、黒色腫、膀胱がん、小細胞肺がん、頭頸部がん、乳がん、前立腺がんおよび結腸がんから選択される新生物疾患の治療における、前記医薬製剤の使用である。

好ましくは、前記新生物疾患は、膵がんである。

本発明の製剤は、経口投与に適した形態、または非経口投与もしくは局所投与に適した形態に製剤化されてもよい。

本発明の好ましい実施形態において、前記経口形態は、錠剤、カプセル剤、溶液、懸濁液、顆粒および油性カプセル剤から選択され得る。

本発明のさらに好ましい実施形態において、前記局所形態は、クリーム、軟膏、溶液、懸濁液、ペッサリー、ネブライザー溶液、スプレー、粉末、またはゲルから選択され得る。

本発明のさらに好ましい実施形態において、前記非経口形態は、水性緩衝溶液または油性懸濁液のいずれかでもよい。

前記非経口投与としては、筋肉内、静脈内、皮内、皮下、腹腔内、節内、または脾臓内手段による投与が挙げられる。

さらなる実施形態において、抗ＢＡＧ３抗体またはその断片および少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤である、本発明の組み合わせの活性成分は、同時に、個別にまたは連続的に投与されてもよく、それぞれの活性成分に対して異なる投与経路で投与されてもよい。

本発明のさらなる実施形態によれば、組み合わせの活性成分は、同じ投与経路により、もしくは異なる投与経路により一緒に投与されてもよく、またはそれらは、同じ投与経路によりもしくは異なる投与経路により個別に投与されてもよい。

本発明の好ましい態様において、抗ＢＡＧ３抗体またはその断片は、経口形態、好ましくは、錠剤、カプセル剤、溶液、懸濁液、顆粒および油性カプセル剤の形態で製剤化される一方で、少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤は、非経口的に、好ましくは、水性緩衝溶液または油性懸濁液に製剤化される。

本発明の好ましい実施形態によれば、抗ＢＡＧ３抗体またはその断片を含有する製剤は、毎日、好ましくは１日に１回以上投与される一方で、少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤を含有する製剤は、非経口経路により、好ましくは、週に１回から数回投与される。

以下の実施例は、本発明の理解を高めるために含まれ、本発明のいかなる限定的な効果も有するものではない。

（実施例１）
ＡＣ２抗体のキメラ化およびヒト化
ＡＣ−２マウス抗体は、２００２年１２月１７日にＣｅｎｔｒｏ Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｉｅ Ａｖａｎｚａｔｅ ｄｉ Ｇｅｎｏｖａに寄託され、特許文献５に開示されている、ハイブリドーママザークローン番号ＰＤ０２００９から単離されたハイブリドーマによって作製する。全ＲＮＡを抽出し、従来の手順を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）ＲＴ−ＰＣＲを実施し、抗体の可変領域をクローン化し、配列決定した。

ＡＣ−２マウス抗体（アミノ酸配列に関しては配列番号１および配列番号２、ならびにヌクレオチド配列に関しては配列番号９および配列番号１０）の可変領域、重鎖および軽鎖の配列情報に基づいて、前述の領域のさまざまなヒト化変異体を、標準的な手順を用いた遺伝子合成によって得た。

抗体変異体をコードしている配列を、Ｅｖｉ−５発現ベクター（Ｅｖｉｔｒｉａ ＡＧ、スイス）にクローンニングし、ＣＨＯ−Ｋ１細胞において発現させた。

抗体キメラ化に関して、マウス定常領域をヒト定常領域で置換した。重鎖（ＨＣ）の１つのキメラバージョンをＩｇＧ１コンテキスト中に作製した。

抗体のヒト化に関して、マウス由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト抗体フレームワークにグラフト化した。

２４個のヒト化バージョンの重鎖（ＨＣ）をＩｇＧ１およびＬＣ−カッパコンテキスト中に作製した。それぞれのバージョンは、ＦＲ中の特異的な点変異によって特徴づけた。

（実施例２）
抗ＢＡＧ３ ｍＡｂは、免疫適格（ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）マウスにおける膵がん同種移植片のＰＤ−１発現を誘導する
抗ＢＡＧ３抗体で処置した腫瘍は、ＰＤ−１タンパク質の有意に高い発現を示した（図１Ａ）。図１Ｂに代表的な画像を示す。

（実施例３）
抗ＢＡＧ３ ｍＡｂは、免疫適格マウスにおける膵がん同種移植片のＰＤＬ−１発現を誘導する
抗ＢＡＧ３抗体で処置した腫瘍は、ＰＤＬ−１タンパク質の有意に高い発現を示した（図２Ａ）。図２Ｂに代表的な画像を示す。

（実施例４）
抗ＢＡＧ３および抗ＰＤ１の組み合わせは免疫適格マウスにおける膵がん同種移植片の腫瘍増殖を阻止する
膵がんの同系マウスモデルにおいて、本発明者らは、抗ＢＡＧ３ ｍＡｂおよび抗ＰＤ−１ ｍＡｂでの併用処置が腫瘍増殖を阻止できることを示した。

材料および方法（実施例２〜４を参照）
インビボモデル：ｍｔ４−２Ｄマウス細胞（０．２０×１０⁶）を、１：１ ＰＢＳ １×／マトリゲル溶液に懸濁させ、雌のＣ５７ＢＬ６マウス（６週齢；Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、イタリア）の左右の脇腹に注入した。１０日後に、マウスをそれぞれ１０匹のマウスからなる４つの群に分け、その腫瘍体積平均はおよそ１００ｍｍ³であった。３週間、１つの群には、ＰＢＳ中２０ｍｇ Ｋｇ^-1の抗ＢＡＧ３ ｍＡｂのｉ．ｐ．注射を週に３回、単独で、または抗ＰＤ−１抗体（１０ｍｇ Ｋｇ^-1 週に２回、Ｂｉｏｘｃｅｌｌ Ｃｌｏｎｅ：Ｊ−４３）と組み合わせて受けさせ、他の群は、関係のないＩｇＧ（Ｂｉｏｘｃｅｌｌ Ｃｌｏｎｅ：ＭＯＰＣ−２１）を受けさせた。また別の群は、抗ＰＤ−１抗体の投与を受けさせた。動物は、週に２回、計量し、腫瘍体積をノギスにより測定した。実験の終わりに、すべての動物を屠殺し、その後の分析のために腫瘍サンプルを採取した。

免疫蛍光法：実験の終わりに、腫瘍をパラフィン包埋し、切片を、抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤＬ−１（Ａｂｃａｍ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国 １：１００）を用いた免疫蛍光法によって分析した。免疫蛍光プロトコルは、Ｃｌｅａｒ−Ｒｉｔｅ（商標）３（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、ＭＡ 米国）における脱パラフィン、アルコール度を水まで下降させることによる再水和、クエン酸ナトリウムバッファー１０ｍＭ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ、ｐＨ６．０中での７００ワットのマイクロ波における３分間の非酵素的な抗原賦活化を含む。洗浄後、非特異的な結合を、ＰＢＳ １×中の１０％ＦＢＳを用いてブロックした。その後、切片を、一次抗体である抗−ＰＤ１または抗ＰＤＬ−１とともに加湿されたチャンバー内において４℃で一晩インキュベートした。もう１回の洗浄ステップの後、切片を、二次抗体とともにインキュベーションした。核を１μｇ ｍｌ−１ ＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン、米国）で対比染色した。陰性対照は、一次抗体を除くすべての試薬を使用して行った。実験材料と対照材料を比較する際、同じ取得パラメータ（レーザー強度、ゲイン、光電子増倍管、ピンホール径、対物レンズ×６３、ズーム１）を用い、連続スキャンモードで画像を得た。図の作成に関して、最も低い蛍光強度特性を視覚的に識別するために淡い細胞蛍光バックグラウンドを残すように、かつ異なる実験群間の比較に役立つように注意することによって、画像の明るさおよびコントラストを調節した。ＰＤ−１陽性細胞またはＰＤＬ−１陽性細胞を、×６３視野倍率の少なくとも１０枚の画像からＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用してＤＡＰＩ染色に対する比として算出した。

Claims (11)

1. 抗ＢＡＧ３抗体またはその断片と、少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤とを含む組み合わせ。
2. 前記少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤は、抗体、タンパク質、小分子および／またはｓｉ−ＲＮＡであることを特徴とする、請求項１に記載の組み合わせ。
3. 前記抗ＢＡＧ３抗体またはその断片は、
   ａ）配列番号１２もしくは少なくともその可変ドメイン、またはそれらの少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる重鎖アミノ酸配列と、
   ｂ）配列番号２０もしくは少なくともその可変ドメイン、またはそれらの少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる軽鎖アミノ酸配列と、
   を含むヒト化抗体であることを特徴とする、請求項１に記載の組み合わせ。
4. 前記免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ−３またはＶＩＳＴＡタンパク質、好ましくは、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１もしくはＣＴＬＡ−４タンパク質と結合する抗体またはその断片であることを特徴とする、請求項１に記載の組み合わせ。
5. １つの抗ＢＡＧ３抗体またはその断片、ならびに１つの抗ＰＤ−１抗体および／または１つの抗ＰＤＬ−１抗体もしくはそれらの断片を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の組み合わせ。
6. 前記抗ＰＤ−１抗体は、ニボルマブおよびペンブロリズマブから選択され、好ましくは、ニボルマブであり、前記抗ＰＤＬ−１抗体は、アテゾリズマブ、アベルマブおよびデュルバルマブから選択され、好ましくは、アテゾリズマブであることを特徴とする、請求項５に記載の組み合わせ。
7. 前記抗ＢＡＧ３抗体または前記少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤は、マウス抗体、組換え抗体、ヒト化抗体もしくは完全ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、特に二重特異性抗体またはその断片から選択されるモノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の組み合わせ。
8. 請求項１から６に記載の組み合わせおよび任意選択的に少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤または担体を含む医薬製剤。
9. 薬剤としての使用のための請求項１から８のいずれか一項に記載の組み合わせ／医薬製剤。
10. 膵がん、黒色腫、膀胱がん、小細胞肺がん、頭頸部がん、乳がん、前立腺がんおよび結腸がんから選択される新生物疾患、好ましくは、膵がんの治療における、請求項８に記載の使用のための組み合わせ／医薬製剤。
11. 前記抗ＢＡＧ３抗体またはその断片および前記少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤は、同時に、個別にまたは連続的に投与されることを特徴とする、請求項９に記載の使用のための組み合わせ／医薬製剤。

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