ES2975410T3

ES2975410T3 - Anticuerpos biespecíficos que se unen a HVEM y CD9

Info

Publication number: ES2975410T3
Application number: ES20710425T
Authority: ES
Inventors: David Alan Cook; Helen Margaret Finney; Stephen Edward Rapecki
Original assignee: UCB Biopharma SRL
Current assignee: UCB Biopharma SRL
Priority date: 2020-02-13
Filing date: 2020-02-13
Publication date: 2024-07-05
Anticipated expiration: 2040-02-13
Also published as: EP4103611A1; WO2021160266A1; US20230192900A1; EP4103611C0; EP4103611B1

Abstract

La presente invención se refiere a anticuerpos multiespecíficos contra una combinación de dianas novedosas de HVEM y CD9, y su uso en el tratamiento del cáncer y enfermedades infecciosas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos biespecíficos que se unen a HVEM y CD9

Campo de la invención

La presente invención pertenece al campo de anticuerpos multiespecíficos que se unen al menos a HVEM y CD9, y sus usos en el tratamiento de cáncer y/o enfermedades infecciosas.

Antecedentes de la invención

Las células T son clave para una respuesta inmunitaria mediada por células satisfactoria, necesaria para eliminar células cancerosas, bacterias y virus. Reconocen antígenos presentados en la superficie de células tumorales o antígenos de bacterias y virus que se replican dentro de las células o de patógenos o productos patógenos que experimentan endocitosis a partir del fluido extracelular. Las células T desempeñan dos importantes papeles. Pueden convertirse en células T citotóxicas capaces de destruir células marcadas como extrañas. Las células T citotóxicas tienen una proteína de superficie única denominada CD8, por tanto, a menudo se denominan células T CD8+. Alternativamente, las células T pueden convertirse en células T auxiliares, que funcionan regulando y coordinando el sistema inmunitario. Las células T auxiliares tienen una proteína de superficie única denominada CD4 y, por tanto, se denominan a menudo células T CD4+. Las células T auxiliares desempeñan varios importantes papeles en el sistema inmunitario: 1) responder a la activación por antígenos específicos proliferando rápidamente; 2) señalizar a células B para producir anticuerpos; y 3) activar macrófagos.

El cáncer elude el sistema inmunitario aprovechando mecanismos desarrollados para evitar la autoinmunidad. Sin embargo, el sistema inmunitario está programado para evitar la sobreactivación inmunitaria, que podría dañar el tejido sano. La activación de células T está en el centro de estos mecanismos. Las células T específicas de antígeno normalmente capaces de luchar contra una enfermedad pueden volverse funcionalmente tolerantes (agotarse) a agentes infecciosos o células tumorales por una sobreestimulación o exposición a moléculas supresoras. Por tanto, moléculas que potencian la función natural de las células T o que superan la supresión de células T son de gran utilidad en el tratamiento o la prevención de cáncer y enfermedades infecciosas.

Las células T indiferenciadas son células T inmaduras que aún no han encontrado un antígeno específico para su receptor de células T, mientras que las células T de memoria han encontrado previamente un antígeno específico para su receptor y han madurado convirtiéndose en células efectoras, y como tales pueden responder rápidamente cuando se presenta el mismo antígeno. Un marcador de superficie clave para identificar este cambio es el paso de la expresión de CD45RA en células T indiferenciadas a CD45RO en células T de memoria, y medir el nivel de estas proteínas de superficie celular permite la identificación de las dos poblaciones. El sistema inmunitario puede identificar antígenos tumorales y montar una respuesta, conduciendo a la generación de células T de memoria.

Sin embargo, el microentorno tumoral puede amortiguar esta respuesta a través de múltiples mecanismos, conduciendo a progresión tumoral. La activación de estas células T de memoria, por tanto, ofrece un gran valor terapéutico para revertir la función inmunosupresora del microentorno tumoral.

En los últimos años, la inmunoterapia se ha convertido en una opción de tratamiento establecida para un número creciente de pacientes con cáncer, ejemplificado por el aumento del uso de inhibidores de puntos de control inmunitarios (CPI) basados en anticuerpos terapéuticos. Esto ha surgido de una mayor comprensión inmunológica de cómo las células cancerosas alteran la activación de células inmunitarias secuestrando rutas normalmente implicadas en el mantenimiento de la tolerancia y sesgando del equilibrio entre coestimulación y coinhibición (Chen y Mellman., Immunity. 39:1 -105(2013)). Entre las rutas que han surgido como reguladores clave en este sentido, se incluyen CTLA-4 y las moléculas de puntos de control PD-1/PD-L1 que sirven para regular por disminución la activación de células T y células mieloides en el microentorno tumoral. Ipilimumab (anti-CTLA-4) fue el primer CPI en aprobarse en 2011 como tratamiento para melanoma, seguido de cerca por la aprobación por parte de la FDA de los anticuerpos dirigidos anti-PD1, pembrolizumab y nivolumab, en 2014 (Hargadonet al.,International Immunopharmacol. 62:29-39 (2018)). Todavía hay desafíos significativos en la comprensión de las diferencias en la eficacia a través de los grupos de pacientes, que oscilan entre respuestas completas, recaída del tratamiento e incluso falta de respuesta (Haslam y Prasad. j AMa Network Open. 5:2e192535 (2019)).

A pesar de la prometedora eficacia antitumoral de varios anticuerpos monoclonales, muchos cánceres son resistentes a tratamientos con un único anticuerpo. Actualmente, están sometiéndose a prueba combinaciones de dos o más anticuerpos en pacientes para proporcionar métodos de tratamiento mejorados. El desarrollo de anticuerpos biespecíficos también es una estrategia, véase el documento WO 2014/028560 que da a conocer anticuerpos biespecíficos que se unen a CD3 y CD9 redirigiendo la célula T a células diana y el documento WO 2017/174331 que da a conocer anticuerpos biespecíficos que se unen a CD25 y un punto de control inmunitario para la reducción de tumores, citándose HVEM en la lista de puntos de control inmunitarios. Hasta la fecha, estas terapias dependen solo del diseño racional de mecanismos de acción conocidos y se basan en gran medida en la combinación de especificidades antigénicas que se sabe que son eficaces independientemente en el tratamiento de cáncer, o bien como terapias de combinación o bien en un formato de anticuerpo biespecífico. Este enfoque del estado de la técnica es un factor limitante en el desarrollo de nuevas terapias ya que depende de terapias conocidas.

Por tanto, existe todavía la necesidad de identificar moduladores novedosos de la activación de células T basados en una biología imparcial, que permita la identificación de pares de dianas novedosas capaces de potenciar la activación de células T y la inducción de proliferación de células T para el tratamiento de cáncer y enfermedades infecciosas.

Compendio de la invención

La presente invención aborda la necesidad identificada anteriormente proporcionando, en un primer aspecto, un anticuerpo que comprende una primera porción de unión a antígeno que se une a HVEM y una segunda porción de unión a antígeno que se une a CD9.

En una realización del primer aspecto, cada una de las porciones de unión a antígeno del anticuerpo que comprende una primera porción de unión a antígeno que se une a HVEM y una segunda porción de unión a antígeno que se une CD9 es una porción de unión a antígeno monoclonal.

En otra realización, cada una de las porciones de unión a antígeno se selecciona independientemente de un Fab, un Fab’, un scFv o un VHH. En aún otro aspecto, las porciones de unión a antígeno son las porciones de unión a antígeno de una IgG.

En otra realización, el anticuerpo que comprende una primera porción de unión a antígeno que se une a HVEM y una segunda porción de unión a antígeno que se une a CD9 es quimérico, humano o está humanizado, y preferiblemente el anticuerpo está humanizado.

En otra realización, el anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada seleccionada de un isotipo IgG 1, uno IgG2, uno IgG3 o uno IgG4, o una variante de los mismos.

En otra realización, el anticuerpo comprende además al menos una porción de unión a antígeno adicional. La porción de unión a antígeno adicional puede ser capaz de aumentar la semivida del anticuerpo. Preferiblemente, la porción de unión a antígeno adicional se une a albúmina, más preferiblemente albúmina sérica humana.

En una realización, la segunda porción de unión a antígeno se une a CD9 en el bucle 2 de CD9, en donde, preferiblemente, la segunda porción de unión a antígeno se une dentro de los aminoácidos 112 a 195 de SEQ ID NO: 2. En otra realización, la primera porción de unión a antígeno que se une a HVEM del anticuerpo según la invención comprende una primera región variable de cadena pesada y una primera región variable de cadena ligera y la segunda porción de unión a antígeno que se une a CD9 comprende una segunda región variable de cadena pesada y una segunda región variable de cadena ligera y en donde:

a. la primera región variable de cadena pesada comprende una CDR-H1 que comprende SEQ ID NO: 3, una CDR-H2 que comprende SEQ ID NO: 4 y una CDR-H3 que comprende SEQ ID NO: 5; y

b. la primera región variable de cadena ligera comprende una CDR-L1 que comprende SEQ ID NO: 6, una CDR-L2 que comprende SEQ ID NO: 7 y una CDR-L3 que comprende SEQ ID NO: 8; y

c. la segunda región variable de cadena pesada comprende una CDR-H1 que comprende SEQ ID NO: 9, una CDR-H2 que comprende SEQ ID NO: 10 y una CDR-H3 que comprende SEQ ID NO: 11; y

d. la segunda región variable de cadena ligera comprende una CDR-L1 que comprende SEQ ID NO: 12, una CDR-L2 que comprende SEQ ID NO: 13 y una CDR-L3 que comprende SEQ ID NO: 14;

o

e. la primera región variable de cadena pesada comprende SEQ ID NO: 15 y la primera región variable de cadena ligera comprende SEQ ID NO: 17; y la segunda región variable de cadena pesada comprende SEQ ID NO: 19 y la segunda región variable de cadena ligera comprende SEQ ID NO: 21;

o

f. la primera región variable de cadena pesada está codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 16 y la primera región variable de cadena ligera está codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 18; y la segunda región variable de cadena pesada está codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 20 y la segunda región variable de cadena ligera está codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 22.

En un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo según el primer aspecto de la invención y todas sus realizaciones y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.

En un tercer aspecto, la invención proporciona el anticuerpo según el primer aspecto de la invención y todas sus realizaciones o la composición farmacéutica según el segundo aspecto de la invención y todas sus realizaciones para su uso en terapia.

En una realización de este tercer aspecto, el uso es para el tratamiento de cáncer y/o una enfermedad infecciosa. En otra realización, el anticuerpo o la composición según la invención y todas sus realizaciones son para su uso en el tratamiento de cáncer concomitante o secuencialmente a una o más terapias adicionales contra el cáncer.

En un cuarto aspecto de la presente invención, se proporciona un método para tratar a un sujeto aquejado de cáncer y/o un enfermedad infecciosa, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo según el primer aspecto de la invención y todas sus realizaciones o la composición farmacéutica según el segundo aspecto de la invención y todas sus realizaciones.

En una realización de este cuarto aspecto, el anticuerpo o la composición se administran concomitante o secuencialmente a una o más terapias adicionales contra el cáncer.

En un quinto aspecto, la invención proporciona el uso de un anticuerpo según el primer aspecto de la invención y todas sus realizaciones o la composición farmacéutica según el segundo aspecto de la invención y todas sus realizaciones en la fabricación de un medicamento para tratar el cáncer.

En una realización de este quinto aspecto, el anticuerpo o la composición se administran concomitante o secuencialmente a una o más terapias adicionales contra el cáncer.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Representación esquemática de la resistencia inmunitaria adquirida a través de la activación selectiva de células T de memoria frente a la activación no específica de células T.

Figura 2. Representación general de un Fab-X y Fab-Y que comprende porciones de unión a antígeno y del anticuerpo biespecífico resultante.

Figura 3. Log2 del cambio en veces en la mediana de la intensidad de fluorescencia (MFI) de la expresión de CD25 en células T CD4+ en presencia de estimulación con enterotoxina B deStaphylococcus aureus(SEB) (1 mg/ml). Se trataron cultivos de PBMC con 1 mg/ml durante 48 horas en presencia de o bien los anticuerpos biespecíficos de HVEM-CD9 o bien anticuerpos de control seguido por citometría de flujo para identificar la población de células T CD4+. Se calculó el log2 de los cambios en veces para la MFI de los niveles de CD25 en las muestras tratadas en relación con los controles estimulados con SEB. N=4 donantes, 2 réplicas técnicas ± error estándar de la media (SEM).

Figura 4. Log2 del cambio en veces en la MFI de la expresión de CD25 en células T CD8+ en presencia de estimulación con SEB (1 mg/ml). Se trataron cultivos de PBMC con enterotoxina B deStaphylococcus aureus(SEB) a 1 mg/ml durante 48 horas en presencia de o bien los anticuerpos biespecíficos de HVEM-CD9 o bien anticuerpos de control. Entonces se analizaron las muestras mediante citometría de flujo y se identificó la población de células T CD8+. Se calculó el log2 de los cambios en veces para la MFI de los niveles de CD25 en las muestras tratadas en relación con los controles estimulados con SEB. N=4 donantes, 2 réplicas técnicas ± SEM.

Figura 5. Log2 del cambio en veces en la MFI de la expresión de CD25 en células T CD4+ en ausencia de cualquier estimulación. Se cultivaron PBMC durante 48 horas en presencia de o bien los anticuerpos biespecíficos de HVEM-CD9 o bien anticuerpos de control. Entonces se analizaron las muestras mediante citometría de flujo y se identificó la población de células T CD4+. Se calculó el log2 de los cambios en veces para la MFI de los niveles de CD25 en las muestras tratadas en relación con los controles no estimulados. N=4 donantes, 2 réplicas técnicas ± SEM.

Figura 6. Log2 del cambio en veces en la MFI de la expresión de CD25 en células T CD8+ en ausencia de cualquier estimulación. Se cultivaron PBMC durante 48 horas en presencia de o bien los anticuerpos biespecíficos de HVEM-CD9 o bien anticuerpos de control. Entonces se analizaron las muestras mediante citometría de flujo y se identificó la población de células T CD8+. Se calculó el log2 de los cambios en veces para la MFI de los niveles de CD25 en las muestras tratadas en relación con los controles estimulados con anticuerpo anti-CD3. N=4 donantes, 2 réplicas técnicas ± SEM.

Figura 7. Log2 del cambio en veces en la MFI de la expresión de CD25 en células T CD4+ de memoria en presencia de estimulación con SEB (1 mg/ml). Se trataron cultivos de PBMC con enterotoxina B deStaphylococcus aureusB (SEB) a 1 mg/ml durante 48 horas en presencia de o bien los anticuerpos biespecíficos de HVEM-CD9 o bien anticuerpos de control. Entonces se analizaron las muestras mediante citometría de flujo y se identificó la población de células T CD4+. Se calculó el log2 de los cambios en veces para la MFI de los niveles de CD25 en las muestras tratadas en relación con los controles estimulados con SEB. N=4 donantes, 2 réplicas técnicas ± SEM.

Figura 8. Log2 del cambio en veces en la MFI de la expresión de CD25 en células T CD4+ indiferenciadas en presencia de estimulación con SEB (1 mg/ml). Se trataron cultivos de PBMC con enterotoxina B deStaphylococcus aureusB (SEB) a 1 mg/ml durante 48 horas en presencia de o bien los anticuerpos biespecíficos de HVEM-CD9 o bien anticuerpos de control. Entonces se analizaron las muestras mediante citometría de flujo y se identificó la población de células T CD4+. Se calculó el log2 de los cambios en veces para la MFI de los niveles de CD25 en las muestras tratadas en relación con los controles estimulados con SEB. N=4 donantes, 2 réplicas técnicas ± SEM.

Figura 9. Log2 del cambio en veces en la MFI de la expresión de CD25 en células T CD8+ de memoria en presencia de estimulación con SEB (1 mg/ml). Se trataron cultivos de PBMC con enterotoxina B deStaphylococcus aureus(SEB) a 1 mg/ml durante 48 horas en presencia de o bien los anticuerpos biespecíficos de HVEM-CD9 o bien anticuerpos de control. Entonces se analizaron las muestras mediante citometría de flujo y se identificó la población de células T CD8+. Se calculó el log2 de los cambios en veces para la MFI de los niveles de CD25 en las muestras tratadas en relación con los controles estimulados con SEB. N=4 donantes, 2 réplicas técnicas ± SEM.

Figura 10. Log2 del cambio en veces en la MFI de la expresión de CD25 en células T CD8+ indiferenciadas en presencia de estimulación con SEB (1 mg/ml). Se trataron cultivos de PBMC con enterotoxina B deStaphylococcus aureus(SEB) a 1 mg/ml durante 48 horas en presencia de o bien los anticuerpos biespecíficos de HVEM-CD9 o bien anticuerpos de control. Entonces se analizaron las muestras mediante citometría de flujo y se identificó la población de células T CD8+. Se calculó el log2 de los cambios en veces para la MFI de los niveles de CD25 en las muestras tratadas en relación con los controles estimulados con SEB. N=4 donantes, 2 réplicas técnicas ± SEM.

Figura 11. Log2 del cambio en veces en la MFI de la expresión de CD71 en células T CD4+ de memoria en presencia de estimulación con SEB (1 mg/ml). Se trataron cultivos de PBMC con enterotoxina B deStaphylococcus aureus(SEB) a 1 mg/ml durante 48 horas en presencia de o bien los anticuerpos biespecíficos de HVEM-CD9 o bien anticuerpos de control. Entonces se analizaron las muestras mediante citometría de flujo y se identificó la población de células T CD4+ de memoria. Se calculó el log2 de los cambios en veces para la MFI de los niveles de CD71 en las muestras tratadas en relación con los controles estimulados con SEB. N=4 donantes, 2 réplicas técnicas ± SEM.

Figura 12. Log2 del cambio en veces en la MFI de la expresión de CD71 en células T CD8+ de memoria en presencia de estimulación con SEB (1 mg/ml). Se trataron cultivos de PBMC con enterotoxina B deStaphylococcus aureus(SEB) a 1 mg/ml durante 48 horas en presencia de o bien los anticuerpos biespecíficos de HVEM-CD9 o bien anticuerpos de control. Entonces se analizaron las muestras mediante citometría de flujo y se identificó la población de células T CD8+ de memoria. Se calculó el log2 de los cambios en veces para la MFI de los niveles de CD71 en las muestras tratadas en relación con los controles estimulados con SEB. N=4 donantes, 2 réplicas técnicas ± SEM.

Figura 13. Log2 del cambio en veces en la MFI de la expresión de CD137 en células T CD4+ de memoria en presencia de estimulación con SEB (1 mg/ml). Se trataron cultivos de PBMC con enterotoxina B deStaphylococcus aureus(SEB) a 1 mg/ml durante 48 horas en presencia de o bien los anticuerpos biespecíficos de HVEM-CD9 o bien anticuerpos de control. Entonces se analizaron las muestras mediante citometría de flujo y se identificó la población de células T CD4+ de memoria. Se calculó el log2 de los cambios en veces para la MFI de los niveles de CD137 en las muestras tratadas en relación con los controles estimulados con SEB. N=4 donantes, 2 réplicas técnicas ± SEM.

Figura 14. Log2 del cambio en veces en la MFI de la expresión de CD137 en células T CD8+ de memoria en presencia de estimulación con SEB (1 mg/ml). Se trataron cultivos de PBMC con enterotoxina deStaphylococcus aureus(SEB) a 1 mg/ml durante 48 horas en presencia de o bien los anticuerpos biespecíficos de HVEM-CD9 o bien anticuerpos de control. Entonces se analizaron las muestras mediante citometría de flujo y se identificó la población de células T CD8+ de memoria. Se calculó el log2 de los cambios en veces para la MFI de los niveles de CD137 en las muestras tratadas en relación con los controles estimulados con SEB. N=4 donantes, 2 réplicas técnicas ± SEM.

Figura 15. Números de células T CD8+ y CD4+ en proliferación en presencia de estimulación con anticuerpo anti-CD3 (50 ng/ml; clon UCHT-1). Se marcaron PBMC humanas con CellTrace™ Violet (CTV), luego se incubaron por triplicado durante 4 días con anticuerpo anti-CD3 (clon UCHT-1) más 100 nM de los anticuerpos biespecíficos frente a HVEM-CD9. Se evaluó la proliferación de células T mediante citometría de flujo mediante selección de las poblaciones CD8+ y CD4+ y enumeración de células con baja cantidad de CTV. Los resultados se presentan como la media ± SEM de 5 donantes de PBMC y diferencias estadísticamente significativas con un valor de p < 0,01 resaltado (prueba de Mann-Whitney).

Figura 16. Log2 del cambio en veces en la MFI de la expresión de CD25 en células T CD4+ en presencia de estimulación con SEB (1 mg/ml). Se trataron cultivos de PBMC con enterotoxina B deStaphylococcus aureus(SEB) a 1 pg/ml durante 48 horas en presencia de los anticuerpos biespecíficos de HVEM-CD9. Entonces se analizaron las muestras mediante citometría de flujo y se identificó la población de células T CD4+. Se calculó el log2 de los cambios en veces para la MFI de los niveles de CD25 en las muestras tratadas en relación con los controles estimulados con SEB. N=2 donantes, 2 réplicas técnicas ± SEM.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se describirá ahora con respecto a realizaciones y aspectos no limitativos particulares de la misma y con referencia a ciertas figuras y ejemplos.

Se usan términos técnicos en su sentido común a menos que se indique lo contrario. Si se transmite un significado específico a ciertos términos, se facilitarán definiciones de términos en el contexto en el que se usan los términos.

Cuando se usa el término “que comprende” en la presente descripción y las reivindicaciones, no excluye otros elementos. Para los fines de la presente divulgación, el término “que consiste en” se considera que es una realización preferida del término “compuesto por”.

Cuando se usa un artículo indefinido o definido al hacer referencia a un nombre singular, por ejemplo “un”, “una” o “el/la”, esto incluye un plural de ese nombre a menos que se indique específicamente otra cosa.

Tal como se usan en la presente memoria, los términos “tratamiento”, “que trata” y similares se refieren a obtener un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en cuanto a prevenir completa o parcialmente una enfermedad o un síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en cuanto a una cura parcial o completa para una enfermedad y/o un efecto adverso atribuible a la enfermedad. Tratamiento, por tanto, cubre cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, particularmente en un ser humano, e incluye: (a) prevenir que se produzca la enfermedad en un sujeto, es decir, un ser humano, que puede estar predispuesto a la enfermedad pero al que aún no se le ha diagnosticado que la tiene; (b) inhibir la enfermedad, es decir, detener su desarrollo; y (c) aliviar la enfermedad, es decir, provocar la regresión de la enfermedad.

Una “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a la cantidad de anticuerpo que comprende las distintas porciones de unión a antígeno que se unen a HVEM y CD9 que, cuando se administra a un mamífero u otro sujeto para tratar una enfermedad, es suficiente para efectuar tal tratamiento para la enfermedad.

La presente invención proporciona anticuerpos que comprenden una primera porción de unión a antígeno que se une a HVEM y una segunda porción de unión a antígeno que se une a CD9. Las porciones de unión a antígeno primera y segunda están ubicadas en el mismo anticuerpo, es decir, son parte de la misma cadena polipeptídica y/o se asocian por medio de una o más asociaciones covalentes y/o no covalentes (tal como el formato de examen Fab-Kd-Fab descrito en la presente memoria o la asociación clásica de cadenas pesada y ligera que forman un anticuerpo IgG completo) o se unen covalentemente para formar una única molécula (tal como reticulación de dos cadenas polipeptídicas expresadas por separado, opcionalmente por medio de agentes de reticulación específicos).

El mediador de entrada del virus del herpes (HVEM) es un miembro de la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNFRSF), y también se conoce como TNFRSF14 o CD270 (referencia de registro de Uniprot Q92956). HVEM es un interruptor bidireccional que regula la activación de células T de un modo coestimulador o coinhibidor, cuyo resultado depende de la pareja de unión. HVEM puede actuar como tanto receptor como ligando, la unión del ligando endógeno LIGHT o anticuerpos agonistas a HVEM suministra una señal coestimuladora; mientras que la unión de HVEM a BTLA (IgSF) o CD160 en células T efectoras suministra una señal coinhibidora. La secuencia de HVEM humano, incluido el péptido señal, se muestra como SEQ ID NO: 1 (tabla 1).

CD9 y, en particular, CD9 humano (número de registro de Uniprot P21926) se descubrió como un antígeno de diferenciación de linfocitos B humanos y se ha encontrado que se expresa ampliamente en mucho tejidos no hematopoyéticos incluidos diversos cánceres. Se conoce también como tetraspanina-29, proteína-1 relacionada con motilidad, antígeno 5H9, proteína del gen 2 de inhibición del crecimiento celular, antígeno leucocitario MIC3 y MRP-1 (Rappaet al.,Oncotarget 6:10, 7970-7991 (2015)). CD9 es una tetraspanina que se expresa ampliamente en una variedad de tejidos sólidos y en una multitud de células hematopoyéticas (Nature reviews Cancer (9) 40-55 (2009)). Se ha mostrado la participación de CD9 en la invasividad y tumorigenicidad de células de cáncer de mama humanas (Oncotargets, 6:10 (2015)), la supresión de la motilidad celular y la metástasis (J. Exp. Med 177:5 (1993)) y que desempeña un papel en la activación de células T (J. Exp. Med 184:2 (1994)).

Se ha mostrado también que CD9 está presente en exosomas (Asia-Pac J Clin Oncol, 2018; 1-9). Los exosomas son nanovesículas derivadas de células con un tamaño de 30-120 nm. La composición molecular de los exosomas refleja su origen e incluye una composición única de tetraspaninas. Se cree que los exosomas constituyen un potente modo de comunicación intercelular que es importante en la respuesta inmunitaria, la propagación célula a célula de agentes infecciones y la progresión tumoral.

La secuencia de CD9 humano, incluido el péptido señal, se muestra como SEQ ID NO: 2 (tabla 1).

Tabla 1

Dentro de la presente invención, a menos que se mencione lo contrario, se pretende que se incluyan siempre HVEM y CD9 humanos en el término “HVEM” y CD9”. Sin embargo, a menos que se usen explícitamente “HVEM humano” y/o “CD9 humano”, los términos “HVEM” y/o “CD9” incluyen las mismas dianas en otras especies, especialmente especies distintas de primates (por ejemplo, roedores) y de primates no humanos (tales como macaco cangrejero). La presente invención, por tanto, proporciona un anticuerpo que comprende una primera porción de unión a antígeno que se une a HVEM humano y una segunda porción de unión a antígeno que se une a CD9 humano. Las porciones de unión a antígeno primera y segunda están ubicadas en el mismo anticuerpo, es decir, son parte de la misma cadena polipeptídica, se asocian por medio de una o más asociaciones no covalentes y/o covalentes o se unen para formar una única molécula.

La presente invención también proporciona un anticuerpo que comprende una primera porción de unión a antígeno que se una a una región de dominio extracelular de HVEM humano y una segunda porción de unión a antígeno que se une a una región de dominio extracelular de CD9 humano.

En particular, se proporciona un anticuerpo que comprende una primera porción de unión a antígeno que se une a HVEM humano tal como se define en SEQ ID NO: 1 o del aminoácido 39 al 283 de SEQ ID NO: 1 o del aminoácido 39 al 202 de SEQ ID NO: 1 y una segunda porción de unión a antígeno que se une a CD9 humano tal como se define en SEQ ID NO: 2 o del aminoácido 2 al 228 de SEQ ID NO: 2, alternativamente del aminoácido 34 al 55 de SEQ ID NO: 2 o alternativamente del aminoácido 112-195. Las porciones de unión a antígeno primera y segunda están ubicadas en el mismo anticuerpo, es decir, son parte de la misma cadena polipeptídica, se asocian por medio de una o más asociaciones no covalentes y/o covalentes o se unen para formar una única molécula.

El anticuerpo monoclonal de la presente invención, tras unirse a HVEM y CD9, estimula la activación de células T, es decir, activa adicionalmente células T y potencia la inducción de proliferación de células T y, en particular, el anticuerpo monoclonal que comprende una primera porción de unión a antígeno que se une a HVEM y una segunda porción de unión a antígeno que se une a CD9 activa adicionalmente células T y potencia la inducción de proliferación de células T en presencia de estimulación con SEB. Más específicamente, el anticuerpo monoclonal que comprende una primera porción de unión a antígeno que se une a HVEM y una segunda porción de unión a antígeno que se une a CD9 activa adicionalmente células T y potencia la inducción de proliferación de células T en presencia de estimulación con SEB, pero no activa células T no estimuladas. Más específicamente, la célula T es al menos una célula T CD4+ o al menos una célula T CD8+ o una mezcla de las mismas, más preferiblemente una célula T CD4+ de memoria o una célula T CD8+ de memoria.

El término “activar” (y variaciones gramaticales del mismo) tal como se usa en la presente memoria, al menos incluye la regulación por incremento de marcadores específicos de células T, es decir, aumento de la transcripción y/o traducción de estos marcadores y/o del tráfico de estos marcadores recién transcrito/traducidos o de cualquier marcador ya expresado a la membrana celular, y la inducción de proliferación.

Por tanto, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal que comprende una primera porción de unión a antígeno que se une a HVEM y una segunda porción de unión a antígeno que se une a CD9 capaz de activar células T en presencia de una estimulación con anticuerpo anti-SEB, en donde la activación adicional de células T se mide como una regulación por incremento de marcadores de células T y la potenciación de la proliferación de células T.

Para mantener la capacidad del sistema inmunitario para reconocer y montar una respuesta frente al número casi infinito de posibles antígenos peptídicos extraños, se requiere un gran repertorio de células T indiferenciadas. Cuando se encuentran con un antígeno extraño, por ejemplo, tal como se presenta en células infectadas con virus o células tumorales mutadas, las células T de esa especificidad se expanden selectivamente para permitir la destrucción del virus o el tumor. Como parte de esta expansión selectiva, se forman varias células T de memoria y se conservan con una frecuencia aumentada para permitir una respuesta rápida si vuelven a encontrarse con la misma amenaza. Esta expansión y mantenimiento de células T de memoria es la base de la resistencia inmunitaria adquirida.

La estimulación de la actividad citotóxica de las células T para promover la destrucción de células infectadas con virus o tumores es un enfoque terapéutico deseable, pero no es específico, puede ser catastrófico debido a la masiva liberación de citocinas y la destrucción celular indiscriminada (figura 1). Agentes diseñados para estimular selectivamente estas células T de memoria promoverán una respuesta inmunitaria más específica, localizada y eficaz sin toxicidad ni activación inmunitaria manifiestas.

Por tanto, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal que comprende una primera porción de unión a antígeno que se une a HVEM y una segunda porción de unión a antígeno que se une a CD9 capaz de activar adicionalmente células T de memoria, en donde la activación adicional de células T da como resultado una regulación por incremento de marcadores de células T y la potenciación de la proliferación de células T de memoria.

Los marcadores específicos de la activación y proliferación de células T incluyen, pero no se limitan a, la regulación por incremento de CD25, CD137 y CD71.

En una realización preferida de la presente invención, el anticuerpo monoclonal que comprende una primera porción de unión a antígeno que se une a HVEM y una segunda porción de unión a antígeno que se une a CD9 es capaz de activar células T en presencia de estimulación con SEB, en donde la activación de células T da como resultado una regulación por incremento de CD137, CD71 y CD25.

El término “anticuerpo”, tal como se usa en la presente memoria, incluye moléculas de inmunoglobulina completas y porciones de unión a antígeno de moléculas de inmunoglobulina asociadas por medio de asociaciones no covalentes y/o covalentes o unidas entre sí, opcionalmente por medio de un enlazador.

En una realización, las porciones de unión a antígeno que se unen a HVEM y CD9 son las porciones de unión a antígeno de una IgG, en donde un brazo se une a HVEM y el otro brazo se une a CD9.

En otra realización, las porciones de unión a antígeno comprendidas en el anticuerpo son fragmentos o derivados funcionalmente activos de una inmunoglobulina completa y pueden ser, pero no se limitan a, VH, VL, VHH, Fv, fragmento scFv (incluido dsscFv), fragmentos Fab, fragmentos Fab modificados, fragmentos Fab’, fragmentos F(ab’)<2>, Fv y fragmentos de unión a epítopo de cualquiera de los anteriores.

Otros fragmentos de anticuerpos incluyen los descritos en los documentos WO2005003169, W02005003170, W02005003171, W02009040562 y W02010035012. En la técnica se conocen bien fragmentos o derivados funcionalmente activos de una inmunoglobulina completa y métodos de producción de los mismos, véanse, por ejemplo, Vermaet al.,1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181; Adair y Lawson, 2005. Therapeutic Antibodies. Drug Design Reviews — Online 2(3) :209-217.

En una realización de la invención, cada una de las porciones de unión a antígeno se selecciona independientemente de un Fab, un Fab’, un scFv o un VHH. En una realización, la porción de unión a antígeno que se une a HVEM es un Fab mientras que la porción de unión a antígeno que se une a CD9 es un scFv. En otra realización, la porción de unión a antígeno que se une a CD9 es un Fab mientras que la porción de unión a antígeno que se une a HVEM es un scFv. En otra realización, ambas porciones de unión a antígeno son un Fab o scFv.

En una realización preferida, el anticuerpo es monoclonal, lo que significa que las porciones de unión a antígeno comprendidas en el mismo son todas monoclonales. Por tanto, en una realización preferida de la presente invención, se proporciona un anticuerpo monoclonal que comprende una primera porción de unión a antígeno que se une a HVEM y una segunda porción de unión a antígeno que se une a CD9. Preferiblemente, este anticuerpo es capaz de activar adicionalmente células T y/o potenciar la inducción de proliferación de células T en presencia de estimulación con SEB, en donde la activación de células T da como resultado una regulación por incremento de CD71, CD137 y CD25.

Pueden prepararse anticuerpos monoclonales mediante cualquier método conocido en la técnica tal como la técnica de hibridoma (Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), la técnica de trioma, la técnica de hibridoma de células B humanas (Kozboret al.,1983, Immunology Today, 4:72) y la técnica de hibridoma de EBV (Coleet al.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, págs. 77-96, Alan R Liss, Inc., 1985).

Los anticuerpos para su uso en la invención también pueden generarse usando métodos de anticuerpos de linfocitos individuales clonando y expresando ADNc de regiones variables de inmunoglobulina generados a partir de linfocitos individuales seleccionados para la producción de anticuerpos específicos mediante, por ejemplo, los métodos descritos por Babcook, J.et al,1996, Proc. Natl. Acad. Sci. u Sa 93(15):7843-78481; documentos WO92/02551; WO2004/051268 y WO2004/106377.

Los anticuerpos de la presente invención también pueden generarse usando diversos métodos de presentación en fagos conocidos en la técnica e incluyen los dados a conocer por Brinkmanet al.(en J. Immunol. Methods, 1995, 182: 41-50), Ameset al.(J. Immunol. Methods, 1995, 184: 177-186), Kettleboroughet al.(Eur. J. Immunol. 1994, 24:952-958), Persicet al.(Gene, 19971879-18), Burtonet al.(Advances in Immunology, 1994, 57: 191-280) y los documentos WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; y las patentes de EE. UU. n.os 5.698.426; 5.223.409; 5.403.484; 5.580.717; 5.427.908; 5.750.753; 5.821.047; 5.571.698; 5.427.908; 5.516.637; 5.780.225; 5.658.727; 5.733.743 y 5.969.108. Cuando las porciones de unión a antígeno comprendidas en el anticuerpo son fragmentos o derivados funcionalmente activos de una inmunoglobulina completa tales como anticuerpos de cadena sencilla, pueden prepararse tal como los descritos en la patente de EE. UU. n.° 4.946.778 que también pueden adaptarse para producir anticuerpos de cadena sencilla que se unen a HVEM y CD9. Pueden usarse ratones transgénicos, u otros organismos, incluidos otros mamíferos, para expresar anticuerpos, incluidos aquellos dentro del alcance de la invención.

El anticuerpo de la presente invención puede ser quimérico, humano o humanizado.

Anticuerpos quiméricos son aquellos anticuerpos codificados por genes de inmunoglobulina que se han modificado genéticamente de modo que los genes de cadena ligera y pesada se componen de segmentos de genes de inmunoglobulina que pertenecen a diferentes especies.

Anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpo de especies no humanas que tienen una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la especie no humana y una región marco de una molécula de inmunoglobulina humana (véanse, por ejemplo, los documentos US5.585.089; WO91/09967). Preferiblemente, el anticuerpo de la presente invención está humanizado. En una realización de la presente invención, se proporciona un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo monoclonal, que comprende una primera porción de unión a antígeno que se une a HVEM y una segunda porción de unión a antígeno que se une a CD9, en donde el anticuerpo está humanizado. Más preferiblemente, este anticuerpo es capaz de activar células T y/o potenciar la inducción de proliferación de células T en presencia de estimulación con SEB, en donde la activación de células T da como resultado una regulación por incremento de CD137, CD71 y CD25.

En anticuerpos humanizados, la cadena pesada y/o ligera contiene una o más CDR (incluidas, si se desea, una o más CDR modificadas) de un anticuerpo donador (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal murino) injertadas en un marco de región variable de cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo aceptor (por ejemplo, un anticuerpo humano). Para una revisión, véase Vaughanet al.,Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998. En una realización, en vez de que se transfiera toda la CDR, se transfieren solo uno o más de los residuos determinantes de especificidad de una cualquiera de las CDR descritas anteriormente en la presente memoria al marco de anticuerpo humano (véase, por ejemplo, Kashmiriet al.,2005, Methods, 36, 25-34). Cuando se injertan las CDR o los residuos determinantes de especificidad, puede usarse cualquier secuencia marco de región variable aceptora apropiada teniendo en cuenta la clase/tipo del anticuerpo donador del que se derivan las CDR, incluidas regiones marco de ratón, primate y ser humano. Preferiblemente, el anticuerpo humanizado según la invención comprende un dominio variable que comprende regiones marco aceptoras humanas así como una o más de las CDR o residuos determinantes de especificidad descritos anteriormente. Por tanto, en una realización se proporciona un anticuerpo monoclonal humanizado que comprende un porción de unión a antígeno que se une a HVEM y un porción de unión a antígeno que se une a CD9, en donde cada porción de unión a antígeno comprende un dominio variable que comprende regiones marco aceptoras humanas y CDR donadoras no humanas.

Ejemplos de marcos humanos que pueden usarse en la invención son KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY y POM (Kabatet al.,citado anteriormente). Por ejemplo, pueden usarse KOL y NEWM para la cadena pesada, puede usarse REI para la cadena ligera y pueden usarse EU, LAY y POM para tanto la cadena pesada como la cadena ligera. Alternativamente, pueden usarse secuencias de línea germinal humanas; estas están disponibles en, por ejemplo: http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/. En un anticuerpo injertado con CDR de la invención, no es necesario que las cadenas pesada y ligera aceptoras se deriven del mismo anticuerpo y, si se desea, pueden comprender cadenas compuestas que tienen regiones marco derivadas de diferentes cadenas.

Anticuerpos completamente humanos son aquellos anticuerpos en los que las regiones variables y las regiones constantes (cuando están presentes) de tanto las cadenas pesadas como ligeras son todas de origen humano, o sustancialmente idénticas a secuencias de origen humano, no necesariamente del mismo anticuerpo. Los ejemplos de anticuerpos completamente humanos pueden incluir anticuerpos producidos, por ejemplo, mediante los métodos de presentación en fagos descritos anteriormente y anticuerpos producidos por ratones en los que los genes de regiones variables y constantes de inmunoglobulina murina se han reemplazado por sus homólogos humanos, por ejemplo, tal como se describe en términos generales en el documento EP0546073, la patente de EE. UU. n.° 5.545.806, patente de EE. UU. n.25.569.825, patente de EE. UU. n.25.625.126, patente de EE. UU. n.25.633.425, patente de EE. UU. n.° 5.661.016, patente de EE. UU. n.° 5.770.429, documentos EP 0438474 y EP0463151.

Además, el anticuerpo de la invención puede comprender una región constante de cadena pesada seleccionada de un isotipo IgG1, uno IgG2, uno IgG3 o uno IgG4, o una variante de los mismos. Los dominios de región constante del anticuerpo de la invención, si están presentes, pueden seleccionarse teniendo en cuenta la función propuesta del anticuerpo, y en particular las funciones efectoras que pueden requerirse. Por ejemplo, pueden usarse los dominios de región constante de IgG humana de los isotipos IgG 1 e IgG3 cuando se requieren funciones efectoras del anticuerpo. Alternativamente, pueden usarse los isotipos IgG2 e IgG4 cuando no se requieren las funciones efectoras del anticuerpo. Por ejemplo, pueden usarse moléculas de IgG4 en las que la serina en la posición 241 se ha cambiado a prolina tal como se describe en Angalet al.,Molecular Immunology, 1993, 30 (1), 105-108. Se prefiere particularmente el dominio constante de IgG4 que comprende este cambio.

También debe apreciarse que pueden incorporarse porciones de unión a antígeno comprendidas en el anticuerpo de la invención tales como los fragmentos o derivados funcionalmente activos de fragmentos de inmunoglobulinas completas descritos anteriormente, en otros formatos de anticuerpo distintos de las porciones de unión a antígeno del formato de IgG clásica. Un formato alternativo a la IgG clásica puede incluir los conocidos en la técnica y los descritos en la presente memoria, tales como DVD-Ig, FabFv, por ejemplo, tal como se dan a conocer en los documentos WO2009/040562 y WO2010/035012, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, etc. Otros ejemplos incluyen un diacuerpo, triacuerpo, tetracuerpo, bicuerpos y tricuerpos (véanse, por ejemplo, Holliger y Hudson, 2005, Nature Biotech 23(9): 1 126-1136; Schoonjanset al.2001 , Biomolecular Engineering, 17 (6), 193-202); fragmentos scFv en tándem, scFv-Fc en tándem, FabFv, Fab’Fv, FabdsFv, Fab-scFv, Fab’-scFv, diFab, diFab’, scdiacuerpo, scdiacuerpo-Fc, ScFv-Fc-scFv, scdiacuerpo-CH3, IgG-scFv, scFv-IgG, V-IgG, IgG-V, DVD-Ig, DuoBody, Fab-Fv-Fv, Fab-Fv-Fc y Fab-dsFv-PEG descritos en los documentos WO2009040562, WO2010035012, WO2011/08609, WO2011/030107 y WO2011/061492, respectivamente.

Además, el anticuerpo de la invención puede comprender, junto con las porciones de unión a antígeno que se unen a HVEM y CD9, también al menos una porción de unión a antígeno adicional. Por tanto, en una realización, se proporciona un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo monoclonal, que comprende una primera porción de unión a antígeno que se une a HVEM y una segunda porción de unión a antígeno que se une a CD9, en donde el anticuerpo está humanizado y en donde el anticuerpo comprende además una porción de unión a antígeno adicional. Más preferiblemente, este anticuerpo es capaz de activar células T y/o potenciar la inducción de proliferación de células T. La estimulación puede ser estimulación con SEB en donde la activación de células T puede dar como resultado una regulación por incremento de CD137, CD71 y CD25.

En una realización, la porción de unión a antígeno adicional es capaz de aumentar, es decir, prolongar, la semivida del anticuerpo. Preferiblemente, la porción de unión a antígeno adicional se une a albúmina, más preferiblemente albúmina sérica humana.

En una realización preferida, el anticuerpo comprende una primera porción de unión a antígeno que se une al HVEM y una segunda porción de unión a antígeno que se une a una región de dominio extracelular de CD9 humano, en donde la región de dominio extracelular de CD9 es preferiblemente el bucle 2 de CD9, y en donde más preferiblemente la segunda porción de unión a antígeno se une dentro de los aminoácidos 112 a 195 de SEQ ID NO: 2, en donde las porciones de unión a antígeno primera y segunda están ubicadas en el mismo anticuerpo, es decir, son parte de la misma cadena polipeptídica, se asocian por medio de una o más asociaciones no covalentes y/o covalentes o se unen para formar una única molécula.

En otra realización, la primera porción de unión a antígeno que se une a HVEM del anticuerpo de la presente invención comprende una primera región variable de cadena pesada y una primera región variable de cadena ligera y la segunda porción de unión a antígeno que se une a CD9 comprende una segunda región variable de cadena pesada y una segunda región variable de cadena ligera y en donde:

o

En una realización, el anticuerpo según la presente invención se prepara según la divulgación de los documentos WO2015/181282, WO2016/009030, WO2016/009029, WO2017/093402, WO2017/093404 y WO2017/093406.

Más específicamente, el anticuerpo se prepara mediante la heterodimerización de un Fab-X y un Fab-Y. Fab-X comprende un fragmento Fab que comprende la primera porción de unión a antígeno que se une a HVEM que comprende una primera región variable de cadena pesada y una primera región variable de cadena ligera en donde la primera región variable de cadena pesada comprende una CDR-H1 que comprende SEQ ID NO: 3, una CDR-H2 que comprende SEQ ID NO: 4 y una CDR-H3 que comprende SEQ ID NO: 5; y la primera región variable de cadena ligera comprende una CDR-L1 que comprende SEQ ID NO: 6, una CDR-L2 que comprende SEQ ID NO: 7 y una CDR-L3 que comprende SEQ ID NO: 8. El Fab que comprende la primera porción de unión a antígeno que se une a HVEM se une a un scFv (clon 52SR4), preferiblemente por medio de un enlazador peptídico al extremo C-terminal del dominio CH1 del fragmento Fab y el dominio VL del scFv. El scFv puede contener también por sí mismo un enlazador peptídico ubicado entre sus dominios VL y VH.

Fab-Y también comprende un fragmento Fab que comprende la segunda porción de unión a antígeno que se une a CD9 que comprende una segunda región variable de cadena pesada y una segunda región variable de cadena ligera y en donde la segunda región variable de cadena pesada comprende una CDR-H1 que comprende SEQ ID NO: 9, una CDR-H2 que comprende SEQ ID NO: 10 y una CDR-H3 que comprende SEQ ID NO: 11; y la segunda región variable de cadena ligera comprende una CDR-L1 que comprende SEQ ID NO: 12, una CDR-L2 que comprende SEQ ID NO: 13 y una CDR-L3 que comprende SEQ ID NO: 14. El Fab que comprende la segunda porción de unión a antígeno que se une a CD9 se une a un péptido GCN4 (clon 7P14P), preferiblemente por medio de un enlazador peptídico al dominio CH1 del fragmento Fab.

El scFv de Fab-X es específico para y complementario al péptido GCN4 de Fab-Y. Como resultado, cuando el Fab-X y el Fab-Y se ponen en contacto entre sí, se produce una interacción de unión no covalente entre el scFv y el péptido GCN4, reteniendo de ese modo físicamente las dos porciones de unión a antígeno en forma de un complejo dando como resultado un anticuerpo que comprende dos porciones de unión a antígeno en la misma molécula (figura 1).

En otra realización, el Fab-X comprende la primera porción de unión a antígeno que se une a HVEM que comprende una primera región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 15 y la primera región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 17; y Fab-Y comprende la segunda porción de unión a antígeno que se une a CD9 que comprende la segunda región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 19 y la segunda región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 21.

Las especificidades de unión pueden intercambiarse entre Fab-X y Fab-Y, es decir, en una realización, Fab-X puede comprender la porción de unión a antígeno que se une a HVEM y Fab-Y la porción de unión a antígeno que se une a CD9; en otra realización, Fab-X puede comprender la porción de unión a antígeno que se une a CD9 y Fab-Y la porción de unión a antígeno que se une a HVEM.

El anticuerpo de la presente invención puede estar comprendido en una composición farmacéutica junto con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Por composición farmacéutica está previsto una composición para uso tanto terapéutico como de diagnóstico. En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo monoclonal, que comprende una primera porción de unión a antígeno que se une a HVEM y una segunda porción de unión a antígeno que se une a CD9, en donde el anticuerpo está preferiblemente humanizado y en donde la composición comprende uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.

Los excipientes farmacéuticamente aceptables en composiciones terapéuticas pueden contener adicionalmente líquidos tales como agua, solución salina, glicerol y etanol. Adicionalmente, pueden estar presentes sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes o sustancias tamponantes del pH, en tales composiciones. Tales excipientes permiten que las composiciones farmacéuticas se formulen como comprimidos, píldoras, comprimidos recubiertos de azúcar, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones espesas y suspensiones, para su ingestión por el paciente.

El anticuerpo de la presente invención y la composición farmacéutica que comprende tal anticuerpo pueden usarse en terapia.

Por tanto, en otro aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo monoclonal, o una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo, y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables, en donde el anticuerpo comprende una primera porción de unión a antígeno que se une a HVEM y una segunda porción de unión a antígeno que se une a CD9, en donde el anticuerpo está preferiblemente humanizado y es para su uso en terapia.

En una realización de este aspecto adicional, el anticuerpo o la composición que comprende tal anticuerpo para su uso en terapia es un anticuerpo que comprende una primera porción de unión a antígeno que se une a HVEM y una segunda porción de unión a antígeno que se une a una región de dominio extracelular de CD9 humano, en donde la región de dominio extracelular de CD9 es preferiblemente el bucle 2 de CD9, y en donde más preferiblemente la segunda porción de unión a antígeno se une dentro de los aminoácidos 112 a 195 de SEQ ID NO: 2, en donde las porciones de unión a antígeno primera y segunda están ubicadas en el mismo anticuerpo, es decir, son parte de la misma cadena polipeptídica, se asocian por medio de una o más asociaciones no covalentes y/o covalentes o se unen para formar una única molécula.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo monoclonal, o una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo, y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables, en donde el anticuerpo comprende una primera porción de unión a antígeno que se une a HVEM y una segunda porción de unión a antígeno que se une a CD9, en donde el anticuerpo está preferiblemente humanizado y es para su uso en el tratamiento de cáncer y/o una enfermedad infecciosa.

En otra realización, el anticuerpo o la composición que comprende tal anticuerpo para su uso en el tratamiento de cáncer y/o una enfermedad infecciosa es un anticuerpo que comprende una primera porción de unión a antígeno que se une a HVEM y una segunda porción de unión a antígeno que se une a una región de dominio extracelular de CD9 humano, en donde la región de dominio extracelular de CD9 es preferiblemente el bucle 2 de CD9, y en donde más preferiblemente la segunda porción de unión a antígeno se une dentro de los aminoácidos 112 a 195 de SEQ ID NO: 2, en donde las porciones de unión a antígeno primera y segunda están ubicadas en el mismo anticuerpo, es decir, son parte de la misma cadena polipeptídica, se asocian por medio de una o más asociaciones no covalentes y/o covalentes o se unen para formar una única molécula.

En aún otro aspecto, la presente invención proporciona un método para tratar a un sujeto aquejado de cáncer y/o una enfermedad infecciosa, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo monoclonal, o una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo, y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables, en donde el anticuerpo comprende una primera porción de unión a antígeno que se une a HVEM y una segunda porción de unión a antígeno que se une a CD9, en donde el anticuerpo está preferiblemente humanizado.

Los sujetos que van a tratarse son preferiblemente sujetos humanos. En una realización, se proporciona un método para tratar a un sujeto humano aquejado de cáncer y/o una enfermedad infecciosa, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo monoclonal, o una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables, en donde el anticuerpo comprende una primera porción de unión a antígeno que se une a HVEM y una segunda porción de unión a antígeno que se une a CD9, en donde el anticuerpo está preferiblemente humanizado.

En aún otra realización, el método para tratar a un sujeto humano aquejado de cáncer y/o una enfermedad infecciosa comprende administrar un anticuerpo o una composición que comprende tal anticuerpo que comprende una primera porción de unión a antígeno que se une a HVEM y una segunda porción de unión a antígeno que se une a una región de dominio extracelular de CD9 humano, en donde la región de dominio extracelular de CD9 es preferiblemente el bucle 2 de CD9, y en donde más preferiblemente la segunda porción de unión a antígeno se une dentro de los aminoácidos 112 a 195 de SEQ ID NO: 2, en donde las porciones de unión a antígeno primera y segunda están ubicadas en el mismo anticuerpo, es decir, son parte de la misma cadena polipeptídica, se asocian por medio de una o más asociaciones no covalentes y/o covalentes o se unen para formar una única molécula.

En otro aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo monoclonal, o una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo, y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables, en donde el anticuerpo comprende una primera porción de unión a antígeno que se une a HVEM y una segunda porción de unión a antígeno que se une a CD9, en donde el anticuerpo está preferiblemente humanizado, en la fabricación de un medicamento para tratar cáncer y/o una enfermedad infecciosa.

Los ejemplos de cánceres que pueden tratarse usando el anticuerpo, o una composición farmacéutica que comprende tal anticuerpo, incluyen, pero no se limitan a, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloide aguda, carcinoma corticosuprarrenal, cánceres de sarcoma de Kaposi relacionados con SIDA (sarcoma de tejidos blandos), linfoma relacionado con SIDA, linfoma primario del SNC, cáncer anal, cáncer de apéndice, astrocitomas, tumor teratoide/rabdoide atípico, cáncer cerebral, carcinoma basocelular de la piel, cáncer del conducto biliar, cáncer de vejiga, cáncer de huesos (incluye sarcoma de Ewing y osteosarcoma e histiocitoma fibroso maligno), cáncer de mama, tumores bronquiales, linfoma de Burkitt, tumor carcinoide, tumores cardíacos (del corazón), tumores embrionarios, tumor de células germinales, linfoma primario del SNC, cáncer de cuello uterino, colangiocarcinoma, cordoma, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, neoplasias mieloproliferativas crónicas, cáncer colorrectal, craneofaringioma, linfoma cutáneo de células T, carcinoma ductalin situ,cáncer de endometrio (cáncer de útero), ependimoma, cáncer de esófago, estesioneuroblastoma (cáncer de cabeza y cuello), sarcoma de Ewing (cáncer de huesos), tumor extracraneal de células germinales, tumor extragonadal de células germinales, cáncer ocular, melanoma intraocular, retinoblastoma, cáncer de trompas de Falopio, histiocitoma fibroso óseo, maligno y osteosarcoma, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico (de estómago), tumor carcinoide gastrointestinal, tumores del estroma gastrointestinal (sarcoma de tejidos blandos), tumores de células germinales de ovario, cáncer testicular, enfermedad trofoblástica gestacional, tricoleucemia, cáncer de cabeza y cuello, cáncer hepatocelular (de hígado), histiocitosis, linfoma de Hodgkin de células de Langerhans, cáncer hipofaríngeo, melanoma intraocular, tumores de células T de los islotes, tumores neuroendocrinos pancreáticos, sarcoma de Kaposi (sarcoma de tejidos blandos), cáncer de riñón (de células renales), histiocitosis de células de Langerhans, cáncer de laringe, leucemia, cáncer de labios y de la cavidad oral, cáncer de hígado, cáncer de pulmón (células no pequeñas y células pequeñas), cáncer de mama masculino, histiocitoma fibroso maligno óseo y osteosarcoma, melanoma, cáncer intraocular (de ojo) infantil, carcinoma de células de Merkel, mesotelioma, cáncer metastásico, cáncer escamoso metastásico del cuello con sitio primario oculto, carcinoma del tracto medio con cambios en el gen NUT, cáncer de boca, síndromes de neoplasia endocrina múltiple, mieloma múltiple/neoplasias de células plasmáticas, micosis fungoide (linfoma), síndromes mielodisplásicos, neoplasias mielodisplásicas/mieloproliferativas, leucemia mielógena crónica, leucemia mieloide aguda, neoplasias mieloproliferativas, cáncer de la cavidad nasal y el seno paranasal, cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma, linfoma no Hodgkin, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer oral, cáncer de labios y de la cavidad oral y cáncer orofaríngeo, osteosarcoma e histiocitoma fibroso maligno óseo, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, tumores neuroendocrinos pancreáticos (tumores de células T de los islotes), papilomatosis, paraganglioma, cáncer del seno paranasal y la cavidad nasal, cáncer de paratiroides, cáncer de pene, cáncer de faringe, feocromocitoma, tumor hipofisario, neoplasia de células plasmáticas/mieloma múltiple, blastoma pleuropulmonar, embarazo y cáncer de mama, linfoma primario del sistema nervioso central (SNC), cáncer peritoneal primario, cáncer de próstata, cáncer rectal, cáncer recurrente, cáncer renal (de riñón), retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de glándulas salivares, sarcoma, rabdomiosarcoma infantil, tumores vasculares infantiles, sarcoma de Ewing, sarcoma de Kaposi, osteosarcoma, sarcoma de tejidos blandos, sarcoma uterino, síndrome de Sézary, cáncer de piel, cáncer de intestino delgado, carcinoma de células escamosas de la piel, cáncer de cuello escamoso con sitio primario oculto, cáncer de estómago (gástrico), linfoma cutáneo de células T, cáncer testicular, cáncer de garganta, cáncer nasofaríngeo, cáncer orofaríngeo, cáncer hipofaríngeo, timoma y carcinoma tímico, cáncer de tiroides, cáncer de células de transición de pelvis renal y uréter, cáncer de uretra, cáncer de útero, sarcoma uterino endometrial, cáncer de vagina, tumores vasculares, cáncer de vulva y tumor de Wilms, y cualquier combinación de dichos cánceres. La presente invención también es aplicable al tratamiento de cánceres metastásicos.

El anticuerpo según la presente invención, o la composición farmacéutica que comprende tal anticuerpo, puede administrarse concomitante o secuencialmente a una o más terapias adicionales contra el cáncer. Por terapias contra el cáncer están previstas terapias basadas en fármacos así como otro tipo de terapias contra el cáncer tales como radioterapias.

La invención se describirá ahora adicionalmente por medio de ejemplos con referencias a realizaciones ilustradas en los dibujos adjuntos

Ejemplos

Ejemplo 1: Examen primario de activación de células T

El estado de activación de las células T puede evaluarse a través de su expresión de marcadores de superficie celular y citocinas secretadas que desempeñan importantes papeles en la función celular. Las células T activadas, por ejemplo, regulan por incremento CD25, CD71 y CD137 en su superficie. Las células T en el microentorno tumoral a menudo se mantienen en un estado suprimido y expresan solo bajos niveles de estas proteínas. Agentes que superan esta supresión e inducen la activación y proliferación de células T tienen un enorme potencial terapéutico ya que pueden desencadenar respuestas de células T antitumorales eficaces y promover la eliminación del cáncer.

Para identificar moduladores novedosos de la activación de células T, se emprendió un gran examen mediante el cual se combinaron 49 especificidades antigénicas para generar una parrilla de anticuerpos biespecíficos con un tamaño teórico de 1.176 posibles combinaciones biespecíficas. Las especificidades se seleccionaron de la bibliografía tal como se expresan en células T o se expresan en otros tipos de células implicadas en interacciones con células T. De esta posible parrilla, se sometieron a prueba 969 constructos biespecíficos de antígenos novedosos, cubriendo el 82,4 % de las posibles combinaciones. Se sometieron a prueba entre 1 y 4 anticuerpos diferentes para cada especificidad, y todos se sometieron a prueba en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de donantes en combinación con una rama de control negativo para identificar el efecto de las formas monovalentes del constructo.

Las PBMC representan las clases de leucocitos principales implicadas tanto en la inmunidad innata como adaptativa, aparte de los granulocitos. Las PBMC comprenden una población heterogénea de células que, cuando se manipulanin vitro,proporcionan un entorno fisiológico relativamente más relevante en comparación con tipos de células componentes aisladas tales como tipos de células T tales como células T y monocitos, que ya no son capaces de responder a las señales paracrinas y autocrinas proporcionadas por otras células. Como tal, la identificación de moléculas que modulan subconjuntos específicos de células dentro de la población de PBMC más amplia tiene un mayor potencial de traslación a sistemas biológicos más complejos, aumentando en última instancia las tasas de éxito para modular las interacciones de células inmunitarias en una enfermedad.

Cada combinación biespecífica se sometió a prueba en dos donantes de PBMC. La rama de control negativo es un Fab de un anticuerpo generado frente a un antígeno no expresado en PBMC.

Se prepararon proteínas de fusión según la divulgación de los documentos WO2015/181282, WO2016/009030, WO2016/009029, WO2017/093402, WO2017/093404 y WO2017/093406.

La primera proteína de fusión (A-X) incluye un fragmento Fab (A del A-X) con especificidad frente a un antígeno, que está unido a X, un scFv (clon 52SR4) por medio de un enlazador peptídico al extremo C-terminal del dominio CH1 del fragmento Fab y el dominio VL del scFv. El propio scFv también contiene un enlazador peptídico ubicado entre sus<dominios VL y>V<h>.

La segunda proteína de fusión (B-Y) incluye un fragmento Fab (B del B-Y) con especificidad frente a otro antígeno. Sin embargo, en comparación con la primera proteína, el fragmento Fab B está unido a Y, un péptido GCN4 (clon 7P14P) por medio de un enlazador peptídico al dominio CH1 del fragmento Fab.

El scFv, X, es específico para y complementario frente al péptido GCN4, Y. Como resultado, cuando las dos proteínas de fusión se ponen en contacto entre sí, se produce una interacción de unión no covalente entre el scFv y el péptido GCN4, reteniendo de ese modo físicamente las dos proteínas de fusión en forma de un complejo que imita un anticuerpo que comprende dos porciones de unión a antígeno diferentes en la misma molécula (figura 2).

Se incubaron juntos Fab-X y Fab-Y purificados con especificidades variables durante 60 minutos (en un entorno de 37 °C/el 5 % de CO<2>) a una concentración equimolar. La molaridad final de cada complejo sometido a prueba fue de 100 nM. En placas de cultivo tisular de 384 pocillos, se añadieron 1,0E+05 PBMC a los pocillos, a los que se añadieron anticuerpos biespecíficos Fab-X/Fab-Y preformados. Tras la adición de los anticuerpos biespecíficos, se incubaron las células durante 48 horas a 37 °C/el 5 % de CO<2>, con o sin superantígeno de enterotoxina-B estafilocócica (SEB) 1 mg/ml (concentración final). Después de 48 horas, se centrifugaron las placas a 500 x g durante 5 minutos a 4 °C. Se transfirió medio condicionado de cultivo celular de los sedimentos celulares a placas nuevas y se congelaron a -80 °C. Se lavaron las células con 60 ml de tampón FACS dos veces mediante centrifugación, seguido por resuspensión de los sedimentos agitando las placas a 2200 rpm durante 30 segundos. Se tiñeron las células con un panel de anticuerpos marcados fluorescentemente tal como se enumeran en la tabla 2 y se incubaron a 4 °C en la oscuridad durante 1 hora.

Tabla 2

Después de este tiempo, se lavaron las células dos veces con tampón FACS, antes de la fijación con paraformaldehído al 2 % (BD CellFix™, diluido en dH<2>O) y se almacenaron durante la noche a 4 °C. Se centrifugaron las placas a 500 x g durante 5 minutos, se aspiró el tampón de fijación para desecharlo y se resuspendieron las células en un volumen residual de 10 pl para la adquisición en el instrumento iQue® Screener Plus (IntelliCyt®). Se usó el paquete de software de análisis de datos ForeCyt™ (IntelliCyt®) para seleccionar monocitos CD14+, células NK CD56+, células B CD19+, células T de memoria e indiferenciadas CD4+ y CD8+. Para cada población celular, se midió la expresión celular de CD25 y CD71 como valores de mediana de la intensidad de fluorescencia notificados. Entonces se usaron los datos para calcular el log2 de los cambios en veces de la expresión en relación con los valores de pocillos de control.

Los datos de citometría de flujo resultantes se analizaron mediante la identificación de las células T de memoria e indiferenciadas CD4+ y CD8+ así como las células B, células NK y monocitos. Entonces se determinaron los valores de MFI de los 3 marcadores de activación CD71, CD137 y CD25 y se calculó el log2 de los cambios en veces en relación con los pocillos de control para cada población celular. Estos resultados se depositaron en el software de visualización Spotfire®, donde fue posible identificar pares de antígenos capaces de inducir un aumento en la activación de células T.

Cuando se consideran pares de antígenos capaces de regular por incremento los marcadores de activación CD25, CD137 y CD71 en células T en presencia de una estimulación con SEB, pero no en condiciones no estimuladas, se identificó el par biespecífico HVEM-CD9.

Por tanto, se tomó el anticuerpo biespecífico frente a HVEM-CD9 en ensayos posteriores para mostrar que este efecto era reproducible a través de un mayor número de donantes.

Ejemplo 2: Ensayo de seguimiento de HVEM-CD9

Para confirmar el efecto de HVEM-CD9 sobre la estimulación de células T, se sometieron a ensayo 4 donantes de PBMC adicionales en condiciones estimuladas y no estimuladas con SEB.

Se creó una parrilla de proteínas de fusión Fab-X y Fab-Y diluyendo cantidades equimolares (1 pM) de Fab-X (FabscFv) y Fab-Y (Fab-péptido) con especificidad para HVEM y CD9 en medio TexMACS™ (Miltenyi Biotec®) que contenía 100 U/ml de penicilina/100 pg/ml de estreptomicina. También se generaron mezclas de proteínas Fab-Y equimolares (1 pM) de la misma manera. Las proteínas de fusión Fab-X y Fab-Y se incubaron juntas durante 1 hora (en un entorno de 37 °C/el 5 % de CO<2>), a una concentración final de 500 nM. También se generaron pocillos de control negativo que contenían medio TexMACSTM solo junto a los pocillos de Fab-X y Fab-Y.

Durante este tiempo, se descongelaron PBMC humanas crioconservadas aisladas de conos de leucaféresis de plaquetas y se lavaron en medio TexMACS™ y se resuspendieron a 3,33 x 106 células/ml. Las PBMC se sembraron entonces en placas de cultivo tisular de fondo plano de 384 pocillos (Greiner Bio-one®) a 30 pl/pocillo (1x106 PBMC).

Se transfirieron un total de 10 pl de complejos de Fab-X y Fab-Y a las placas que contenían 30 pl de PBMC. Entonces, las PBMC o bien se dejaron sin estimular mediante la adición de 10 pl de medio TexMACS™, o bien se estimularon con 10 pl de SEB (concentración final de 1 pg/ml). Esto dio como resultado una concentración de ensayo final de complejos de Fab-X y Fab-Y de 100 nM. Entonces se devolvieron las placas a un entorno de 37 °C/el 5 % de CO<2>durante 48 horas.

Después de 48 horas, se centrifugaron las placas a 500 x g durante 5 minutos a 4 °C. Se transfirió medio condicionado de los sedimentos celulares a placas nuevas y se congelaron a -80 °C. Se lavaron las células con 60 pl de tampón FACS dos veces mediante centrifugación, seguido por resuspensión de los sedimentos agitando las placas a 2200 rpm durante 30 segundos. Se tiñeron las células con un panel de anticuerpos marcados fluorescentemente tal como se enumeran en la tabla 2 y se incubaron a 4 °C en la oscuridad durante 1 hora. Después de este tiempo, se lavaron las células dos veces con tampón FACS, antes de la fijación con paraformaldehído al 2 % (BD CellFix™ diluido en dH<2>O) y se almacenaron durante la noche a 4 °C. Se centrifugaron las placas a 500 x g durante 5 minutos, se aspiró el tampón de fijación para desecharlo y se resuspendieron las células en un volumen residual de 10 pl para la adquisición en el instrumento iQue® Screener Plus (IntelliCyt®).

Se usó el paquete de software de análisis de datos ForeCyt™ (IntelliCyt®) para seleccionar monocitos CD14+, células NK CD56+, células B CD19+, células T de memoria e indiferenciadas CD4+ y CD8+. Para cada población celular, se midió la expresión celular de CD25, CD71 y CD137 como valores de mediana de intensidad de fluorescencia notificados. Entonces se usaron los datos para calcular el log2 de los cambios en veces de la expresión en relación con los valores de pocillos de control.

Veinticuatro anticuerpos biespecíficos frente a Fab-X/Fab-Y mostraron un aumento de la expresión del marcador de activación CD25 en células T CD4+ (figura 3) y CD8+ (figura 4) con estimulación con SEB, mientras que los constructos de control no condujeron a este aumento. Los anticuerpos bivalentes (es decir, formados por una fusión donde ambos Fab en el Fab-X y Fab-Y son específicos para CD9 o HVEM tal como puede ser el caso) y monovalentes para CD9 o HVEM (es decir, formados por una fusión donde el Fab es específico para CD9 o HVEM pero el otro Fab componente es un control negativo) no condujeron a un aumento similar en la intensidad de fluorescencia del marcador de activación en cualquiera de las poblaciones celulares, lo que sugiere que un anticuerpo monoespecífico que se une a CD9 solo o HVEM solo, ya sea de un modo monovalente o bivalente, es incapaz de estimular la activación en ausencia de la unión al otro antígeno. Los pequeños aumentos en la expresión de CD25 detectados por los controles bivalentes y monovalentes frente a HVEM en células T CD4+ fueron sin embargo pequeños aumentos solo, que solo podrían potenciarse en gran medida mediante la selección como diana conjunta de CD9. Además, la mezcla de un anticuerpo que se une únicamente a HVEM y un anticuerpo que se une únicamente a CD9 (mezcla de Fab-Y) tampoco tenía un efecto estimulador potenciado sobre las poblaciones de células T en comparación con los controles de HVEM, lo que implica el requisito de que las porciones de unión a antígeno que se unen a HVEM y CD9 estén en la misma cadena, asociadas por medio de asociaciones no covalentes o unidas para que se produzca la función estimuladora.

Cuando se estudiaron en condiciones no estimuladas, los anticuerpos biespecíficos frente a HVEM/CD9 no condujeron a ningún aumento en la intensidad de fluorescencia del marcador de activación en o bien células CD4+ (figura 5) o bien células CD8+ (figura 6). Esto confirma que la unión de tanto HVEM como CD9 no conduce a la activación no deseada de células T en reposo.

Además, fue posible medir el nivel de expresión de CD25 en poblaciones de células T indiferenciadas frente a de memoria mediante la separación de las células de memoria que expresan CD45RO de las poblaciones de células T indiferenciadas que no expresan CD45RO. Tras el análisis de estas subpoblaciones, se identificó una preferencia por la regulación por incremente de CD25 en las poblaciones de células T CD4+ y CD8+ de memoria en comparación con las poblaciones indiferenciadas (figuras 7-10). Esto sugiere que los anticuerpos biespecíficos frente a HVEM-CD9 podrían seleccionar como diana preferentemente las poblaciones de células T de memoria, mejorando su potencial terapéutico.

También se investigaron los niveles de expresión en células T CD4+ y CD8+ de memoria de CD71 (figuras 11 y 12, respectivamente) y CD137 (figuras 13 y 14, respectivamente). Los anticuerpos biespecíficos frente a HVEM/CD9 mostraron un efecto que dio como resultado niveles aumentados de expresión de los marcadores CD71 y CD137, independientemente de la orientación del anticuerpo biespecífico Fab-X/Fab-Y.

Los anticuerpos bivalentes (es decir, formados por una fusión donde ambos Fab en el Fab-X y Fab-Y son específicos para CD9 o HVEM tal como puede ser el caso) y monovalentes para CD9 o HVEM (es decir, formados por una fusión donde el Fab es específico para CD9 o HVEM pero el otro Fab componente es un control negativo) no condujeron a un aumento similar en la intensidad de fluorescencia del marcador de activación en cualquiera de las poblaciones celulares, lo que sugiere que un anticuerpo monoespecífico que se une a CD9 solo o HVEM solo, ya sea de un modo monovalente o bivalente, es incapaz de estimular la activación en ausencia de la unión al otro antígeno.

Ejemplo 3: Efecto de un anticuerpo biespecífico frente a HVEM-CD9 sobre la proliferación de células T

Se evaluó el efecto de un anticuerpo biespecífico anti-HVEM-CD9 sobre la proliferación de células T CD4+ y CD8+ en 5 donantes de PBMC. Se crearon mezclas de proteínas de fusión Fab-X y Fab-Y diluyendo cantidades equimolares (1 mM) de Fab-X y Fab-Y con especificidad por HVEM y CD9 en DMEM (Thermo Fisher) que contenía suero bovino fetal al 10 % (FBS) y 100 U/ml de penicilina/100 mg/ml de estreptomicina. También se generaron mezclas de proteínas Fab-Y equimolares (1 mM) de la misma manera. Las proteínas de fusión Fab-X y Fab-Y se incubaron juntas durante 1 hora (en un entorno de 37 °C/el 5 % de CO<2>) para generar anticuerpos biespecíficos.

Durante este tiempo, se descongelaron PBMC humanas crioconservadas de conos de leucaféresis de plaquetas, se lavaron en medio DMEM y se resuspendieron a aproximadamente 2 x106 células/ml en PBS. Entonces se añadió CellTrace™ Violet (CTV; ThermoFisher) hasta una concentración final de 1 mM (2 ml de CTV 5 mM en DMSO añadidos a 10 ml de células), se incubó en la oscuridad a temperatura ambiente durante 20 minutos, las células se lavaron dos veces con DMEM y se resuspendieron en medio hasta una concentración final de 1 x106 células/ml.

Se diluyeron anticuerpos biespecíficos Fab-X/Fab-Y hasta una concentración de 400 nM en DMEM y se transfirieron 50 ml por triplicado a pocillos de una placa de cultivo tisular de fondo en U de 96 pocillos. Entonces se añadió anticuerpo anti-CD3 (clon UCHT-1), 50 ml de una disolución 200 ng/ml en DMEM. A 3 pocillos, se les añadieron 100 ml de DMEM solo como control negativo de la proliferación. Finalmente, se añadieron 100 ml de PBMC marcadas con CTV a cada pocillo. Esto dio como resultado una concentración final del ensayo de anticuerpos biespecíficos Fab-X/Fab-Y de 100 nM, anticuerpo anti-CD3 50 ng/ml y 1 x 105 células/pocillo. Entonces se devolvieron las placas a un entorno de 37 °C/el 5 % de CO<2>durante 96 horas.

Después de 96 horas, se centrifugaron las placas a 300 x g durante 5 minutos. Se eliminó el medio condicionado de cultivo celular, se lavaron las células dos veces con tampón FACS (FBS al 2 % en PBS) y luego se resuspendieron en 50 ml de tampón FACS que contenía anticuerpos marcados fluorescentemente, tal como se enumeran en la tabla 3. Se incubaron las células a temperatura ambiente en la oscuridad durante 20 minutos, se lavaron dos veces con tampón FACS, se resuspendieron en 100 pi/por pocilio de tampón FACS y se analizaron mediante citometría de flujo (BD FACS Canto IITM). Se recogieron ios eventos totales de 50 pi (50 % de volumen) de cada pocilio.

Se usó el paquete de software de análisis de datos FiowJo® para seleccionar células CD8+ y CD4+. Se evaluó la proliferación celular enumerando células con tinción de CTV reducida en relación con células no estimuladas. Los datos se presentan como media ± SEM para pocilios por triplicado.

Tabla 3

Tai como se muestra en la figura 15, la proliferación de células T CD8+ y CD4+ en presencia de estimulación con anticuerpo anti-CD3 (50 ng/mi) fue mayor de manera estadísticamente significativa cuando se trataron PBMC humanas con el anticuerpo biespecífico frente a HVEM/CD9 con respecto ai control negativo (anticuerpo no específico) p<0,01 (prueba de Mann-Whitney).

Ejemplo 4: Análisis de la unión del anticuerpo anti-CD9 mediante interferometría de biocapa

CD9 contiene dos bucles extracelulares: un bucle extraceiuiar corto (bucle 1: 34-55 en SEQ ID NO: 2) y un bucle extraceiuiar largo (bucle 2: 112-195 en SEQ ID NO: 2). Se usó interferometría de biocapa para evaluar la unión del presente panel de anticuerpos Fab-Y frente a CD9 (seleccionados por su capacidad para unirse a CD9 de longitud completa expresado por células) ai péptido de bucle extraceiuiar largo 2, usando el sistema Octet<®>RED384 (FortéBio) con biosensores Anti-hlgG Fc Capture (AHC) (FortéBio) a temperatura ambiente. En primer lugar, se sumergió una serie de 8 sensores en tampón cinético (PBS ai 0,1%, BSA ai 0,02%, Tween 20) durante 120 segundos para proporcionar una señal basai. Entonces se desplazaron ios sensores a pocilios que contenían 200 pi de proteína de fusión de bucle extraceiuiar largo 2 de CD9 humano recombinante-Fc humano (10015-CD, R&D Systems<®>) a 2 pg/mi en tampón cinético para inmovilizar la proteína en el biosensor (100 segundos), seguido por una segunda etapa basai (180 segundos) en tampón cinético para equilibrar ios biosensores ahora recubiertos con la proteína de fusión de bucle extraceiuiar largo 2 de CD9-Fc humano. No se observó desprendimiento del péptido durante esta etapa. Entonces se sumergieron ios sensores en pocilios que contenían uno del Fab anti-CD9 (10 pg/mi) para evaluar la asociación de cada anticuerpo con el bucle 2 de CD9 (120 segundos), seguido por disociación en tampón cinético (600 segundos). Se usó Fab-Y anti-CD137 (11175) como control negativo durante la etapa de asociación del anticuerpo. Se usó un nuevo conjunto de 8 biosensores para repetir este proceso para cada uno de ios anticuerpos anti-CD9 (7270, 7271, 7272, 7485, 7486, 7489, 7491).

Tal como se muestra en la tabla 4, todos los anticuerpos anti-CD9 sometidos a prueba se unen al bucle extracelular largo 2 de CD9 y son todos funcionales cuando se combinan con ios anticuerpos anti-HVEM 7660 y 7817. Una respuesta funcional positiva se considera que es la capacidad de aumentar la expresión de CD25 en células T más de 0,5 log2 del cambio en veces de MFI en 2 donantes cuando se añadieron como Fab-K<D>-Fab con anticuerpos anti-HVEM tai como se muestra en lo generado como en el ejemplo 2 y mostrado en la figura 17.

Tabla 4

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo que comprende una primera porción de unión a antígeno que se une a HVEM y una segunda porción de unión a antígeno que se une a CD9.

2. El anticuerpo según la reivindicación 1, en donde cada una de las porciones de unión a antígeno es una porción de unión a antígeno monoclonal.

3. El anticuerpo según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde cada una de las porciones de unión a antígeno se selecciona independientemente de un Fab, un Fab’, un scFv o un VHH.

4. El anticuerpo según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde las porciones de unión a antígeno son las porciones de unión a antígeno de una IgG.

5. El anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el anticuerpo es quimérico, humano o está humanizado, preferiblemente el anticuerpo está humanizado.

6. El anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada seleccionada de un isotipo IgG1, uno IgG2, IgG3 o uno IgG4.

7. El anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el anticuerpo comprende además al menos una porción de unión a antígeno adicional; en donde, preferiblemente, la porción de unión a antígeno adicional es capaz de aumentar la semivida del anticuerpo.

8. El anticuerpo según la reivindicación 7, en donde la porción de unión a antígeno adicional se une a albúmina, preferiblemente albúmina sérica humana.

9. El anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la segunda porción de unión a antígeno se une a CD9 en el bucle 2 de CD9, en donde, preferiblemente, la segunda porción de unión a antígeno se une dentro de los aminoácidos 112 a 195 de SEQ ID NO: 2.

10. El anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la primera porción de unión a antígeno que se une a HVEM comprende una primera región variable de cadena pesada y una primera región variable de cadena ligera y la segunda porción de unión a antígeno que se une a CD9 comprende una segunda región variable de cadena pesada y una segunda región variable de cadena ligera y en donde:

d. la segunda región variable de cadena ligera comprende una CDR-L1 que comprende SEQ ID NO: 12, una<CDR-L2 que comprende SEQ ID NO: 13 y una CDR-L3 que comprende SEQ ID n>O:<14;>

o

11. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.

12. El anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o la composición farmacéutica según la reivindicación 11 para su uso en terapia.

13. El anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o la composición farmacéutica según la reivindicación 11 para su uso en el tratamiento de cáncer y/o una enfermedad infecciosa.

14. El anticuerpo para su uso según la reivindicación 13, en donde el anticuerpo o la composición se administran concomitante o secuencialmente a una o más terapias adicionales contra el cáncer.