TW202304986A

TW202304986A - 靶向cd22及cd79b的抗體

Info

Publication number: TW202304986A
Application number: TW111110766A
Authority: TW
Inventors: 凱爾貝德納; 納雷什庫瑪; 桑加亞辛格; 拉庫瑪爾甘尼桑; 丹青楊
Original assignee: 美商健生生物科技公司
Priority date: 2021-03-24
Filing date: 2022-03-23
Publication date: 2023-02-01
Also published as: IL306103A; CA3214259A1; AR125210A1; US20220306738A1; BR112023019464A2; UY39683A; WO2022201052A1; EP4314055A1; JP2024512035A; CN117098781A; AU2022244453A9; AU2022244453A1; KR20230160314A

Abstract

本文提供結合至CD79b及CD22之多特異性抗體、編碼其之多核苷酸、載體、宿主細胞、製備及使用其之方法。

Description

靶向CD22及CD79B的抗體

相關申請案之交互參照

本申請案主張2021年3月24日申請之美國臨時專利申請案第63/165,416號之優先權，其全文特此以引用方式併入本文中。

以ASCII文字檔提交之「序列表」、表、或電腦程式列表附錄之參照

以ASCII文字檔編寫之序列表：206389-0044-00US_SequenceListing.txt；建立於2022年3月15日，且檔案大小為80,036位元組，特此以引用方式併入。

本揭露提供結合分化簇79B蛋白(CD79B)及分化簇22 (CD22)之多特異性抗體、編碼該等多特異性抗體之多核苷酸、載體、宿主細胞、以及製造及使用該等多特異性抗體之方法。

自體免疫疾病之盛行率係評估為總人口之3至5%，且B細胞、自體反應性B細胞之失調、及自體抗體之存在係許多自體免疫疾病之共同特徵(Wang et al, 2015, J Intern Med 2015; 278: 369– 395)。

B細胞或B淋巴球係適應性免疫之核心組分，藉由生產抗體對不同病原體作出反應，發揮抗原呈現細胞之作用，分泌細胞介素，且活化後發育成記憶B細胞(Packard and Cambier, 2013, F1000Prime Rep, 5:40)。B細胞在血液及淋巴系統中循環。在淋巴器官中，B細胞遇到其同源(cognate)抗原，且與來自輔助T細胞之額外信號一起，B細胞可分化成效應漿細胞。此等細胞分泌特異性抗體，該等特異性抗體將在血液中循環以靶向並消除抗原或病原體(Puri et al., 2013, Int Rev Immunol, 32(4):397-427)。

在健康個體中，免疫耐受性防止免疫系統辨識自體抗原，因此限制B細胞、T細胞、及骨髓細胞對健康細胞及組織的靶向及破壞。然而，自體免疫疾病之特徵在於耐受性中斷，其中免疫細胞辨識自體抗原並與其反應。在此類情況下，B細胞辨識並產生針對自體抗原之抗體（「自體抗體(autoantibody)」），該等抗體於是能夠靶向細胞及組織，以被免疫系統之其他組分（諸如補體、細胞毒性T細胞、及骨髓細胞）破壞。

為了偵測抗原（病原體衍生的或自體抗原），B細胞表現細胞表面受體(BCR)，該等細胞表面受體係由跨膜免疫球蛋白分子(mIg)及CD79a (Igα)與CD79b (Igβ)之雙硫鍵連接之異二聚體構成的多組分受體(Chu et al., 2001, Appl Immunohistochem Mol Morphol, Jun; 9(2):97-106)。CD79b在B細胞譜系內跨B細胞之許多分化狀態選擇性地表現。BCR之活化導致多種免疫活化後果，包括B細胞分化、抗體及自體抗體生產、細胞介素生產、及向T細胞之抗原呈現。

在一些實施例中，本發明提供一種多特異性抗體或多特異性結合片段，其包含： a)結合分化簇79B蛋白(CD79B)之第一抗原結合臂，其包含第一可變重域(VH1)且進一步包含第一可變輕域(VL1)；及 b)結合分化簇22 (CD22)之第二抗原結合臂，其包含第二可變重域(VH2)且進一步包含第二可變輕域(VL2)。

在一些實施例中，結合CD79b之第一抗原結合臂包含 a) SEQ ID NO: 9、17、25、33、41、49、或57之重鏈互補決定區(HCDR)1； b) SEQ ID NO: 10、18、26、34、42、50、或58之HCDR2； c) SEQ ID NO: 11、19、27、35、43、51、或59之HCDR3； d) SEQ ID NO: 12、20、28、36、44、52、或60之輕鏈互補決定區(LCDR)1； e) SEQ ID NO: 13、21、29、37、45、53、或61之LCDR2；或 f) SEQ ID NO: 14、22、30、38、46、54、及62之LCDR3。

在一些實施例中，結合CD79b之第一抗原結合臂包含 (a) SEQ ID NO:9之HCDR1、SEQ ID NO:10之HCDR2、及SEQ ID NO:11之HCDR3；及SEQ ID NO:12之LCDR1、SEQ ID NO:13之LCDR2、及SEQ ID NO:14之LCDR3； (b) SEQ ID NO:17之HCDR1、SEQ ID NO:18之HCDR2、及SEQ ID NO:19之HCDR3；及SEQ ID NO:20之LCDR1、SEQ ID NO:21之LCDR2、及SEQ ID NO:22之LCDR3； (c) SEQ ID NO:25之HCDR1、SEQ ID NO:26之HCDR2、及SEQ ID NO:27之HCDR3；及SEQ ID NO:28之LCDR1、SEQ ID NO:29之LCDR2、及SEQ ID NO:30之LCDR3； (d) SEQ ID NO:33之HCDR1、SEQ ID NO:34之HCDR2、及SEQ ID NO:35之HCDR3；及SEQ ID NO:36之LCDR1、SEQ ID NO:37之LCDR2、及SEQ ID NO:38之LCDR3； (e) SEQ ID NO:41之HCDR1、SEQ ID NO:42之HCDR2、及SEQ ID NO:43之HCDR3；及SEQ ID NO:44之LCDR1、SEQ ID NO:45之LCDR2、及SEQ ID NO:46之LCDR3； (f) SEQ ID NO:49之HCDR1、SEQ ID NO:50之HCDR2、及SEQ ID NO:51之HCDR3；及SEQ ID NO:52之LCDR1、SEQ ID NO:53之LCDR2、及SEQ ID NO:54之LCDR3；或 (g) SEQ ID NO:57之HCDR1、SEQ ID NO:58之HCDR2、及SEQ ID NO:59之HCDR3；及SEQ ID NO:60之LCDR1、SEQ ID NO:61之LCDR2、及SEQ ID NO:62之LCDR3。

在一些實施例中，結合CD79b之第一抗原結合臂包含下列之VH及VL： a) SEQ ID NO: 15之VH及SEQ ID NO: 16之VL； b) SEQ ID NO: 23之VH及SEQ ID NO: 24之VL； c) SEQ ID NO: 31之VH及SEQ ID NO: 32之VL； d) SEQ ID NO: 39之VH及SEQ ID NO: 40之VL； e) SEQ ID NO: 47之VH及SEQ ID NO: 48之VL； f) SEQ ID NO: 55之VH及SEQ ID NO: 56之VL； g) SEQ ID NO: 63之VH及SEQ ID NO: 64之VL；或 h) SEQ ID NO: 80之VH及SEQ ID NO: 81之VL。

在一些實施例中，結合CD79b之抗原結合臂包含：VH1，其包含SEQ ID NO:9之HCDR1、SEQ ID NO:10之HCDR2、及SEQ ID NO:11之HCDR3；及VL1，其包含SEQ ID NO:12之LCDR1、SEQ ID NO:13之LCDR2、及SEQ ID NO:14之LCDR3。

在一些實施例中，結合CD79b之抗原結合臂包含SEQ ID NO: 80之VH1及SEQ ID NO: 81之VL1。

在一些實施例中，結合CD22之第二抗原結合臂包含VH2，其包含SEQ ID NO:1之HCDR1、SEQ ID NO:2之HCDR2、及SEQ ID NO:3之HCDR3；及VL2，其包含SEQ ID NO:4之LCDR1、SEQ ID NO:5之LCDR2、及SEQ ID NO:6之LCDR3。

在一些實施例中，VH2包含SEQ ID NO:7，且VL2包含SEQ ID NO:8。

在一些實施例中，結合CD79b之第一抗原結合臂包含 a) SEQ ID NO: 9、17、25、33、41、49、或57之重鏈互補決定區(HCDR)1； b) SEQ ID NO: 10、18、26、34、42、50、或58之HCDR2； c) SEQ ID NO: 11、19、27、35、43、51、或59之HCDR3； d) SEQ ID NO: 12、20、28、36、44、52、或60之輕鏈互補決定區(LCDR)1； e) SEQ ID NO: 13、21、29、37、45、53、或61之LCDR2；或 f) SEQ ID NO: 14、22、30、38、46、54、及62之LCDR3，且結合CD22之第二抗原結合臂包含VH2，其包含SEQ ID NO:1之HCDR1、SEQ ID NO:2之HCDR2、及SEQ ID NO:3之HCDR3；及VL2，其包含SEQ ID NO:4之LCDR1、SEQ ID NO:5之LCDR2、及SEQ ID NO:6之LCDR3。

在一些實施例中，結合CD79b之第一抗原結合臂包含SEQ ID NO:9之HCDR1、SEQ ID NO:10之HCDR2、及SEQ ID NO:11之HCDR3；及VL1，其包含SEQ ID NO:12之LCDR1、SEQ ID NO:13之LCDR2、及SEQ ID NO:14之LCDR3，且結合CD22之第二抗原結合臂包含VH2，其包含SEQ ID NO:1之HCDR1、SEQ ID NO:2之HCDR2、及SEQ ID NO:3之HCDR3；及VL2，其包含SEQ ID NO:4之LCDR1、SEQ ID NO:5之LCDR2、及SEQ ID NO:6之LCDR3。

在一些實施例中，結合CD79b之第一抗原結合臂包含SEQ ID NO: 80之VH1及SEQ ID NO: 81之VL1，且結合CD22之第二抗原結合臂包含含SEQ ID NO:7之VH2及含SEQ ID NO:8之VL2。

在一些實施例中，第一或第二抗原結合臂包含單鏈可變片段(scFv)、(scFv) ₂、抗原結合片段(Fab)、F(ab’) ₂、Fd、Fv、VHH、或dAB。

在一些實施例中，第一抗原結合臂包含scFv，且第二抗原結合臂包含Fab。

在一些實施例中，第一抗原結合臂包含具有SEQ ID NO:82之胺基酸序列的scFv。

在一些實施例中，結合CD79b之第一抗原結合臂包含或可操作地連接至第一可結晶片段(Fc)域，且結合CD22之第二抗原結合臂包含或可操作地連接至第二Fc域。

在一些實施例中，第一及第二Fc域中之至少一者包含一或多個突變，其促進Fc域之異二聚化、減少Fc與Fcγ受體之結合、減少Fc與蛋白質A之結合、延長多特異性抗體或多特異性結合片段之半衰期、或其任何組合。

在一些實施例中，促進Fc域之異二聚化的一或多個突變係選自T366S、L368A、T366W、及Y407V（EU編號）。

在一些實施例中，第一Fc域包含突變T366W，且第二Fc域包含突變T366S、L368A、及Y407V（EU編號）。

在一些實施例中，減少Fc與Fcγ受體之結合的一或多個突變係選自L234A、L235A、及D265S（EU編號）。

在一些實施例中，第一Fc域及第二Fc域兩者皆包含突變L234A、L235A、及D265S（EU編號）。

在一些實施例中，減少Fc與蛋白質A之結合的一或多個突變係選自H435R及Y436F（EU編號）。

在一些實施例中，第二Fc域包含突變H435R及Y436F（EU編號）。

在一些實施例中，延長多特異性抗體或多特異性結合片段之半衰期的一或多個突變係選自M252Y、S254T、及T256E（EU編號）。

在一些實施例中，第一Fc域及第二Fc域兩者皆包含突變M252Y、S254T、及T256E。

在一些實施例中，第一Fc域包含SEQ ID NO:89，且第二Fc域包含SEQ ID NO:90。

在一些實施例中，多特異性抗體或多特異性結合片段包含SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:83、及SEQ ID NO:84之胺基酸序列。

在一些實施例中，本發明提供一種免疫接合物，其包含接合至治療劑或顯像劑的根據本揭露之多特異性抗體或多特異性結合片段。在一些實施例中，免疫接合物包含SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:83、及SEQ ID NO:84之胺基酸序列，其中SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:83、及SEQ ID NO:84中之至少一種係接合至治療劑或顯像劑。

在一些實施例中，本發明提供一種醫藥組成物，其包含根據本揭露之多特異性抗體或免疫接合物分子及醫藥上可接受之載劑。在一些實施例中，醫藥組成物包含多特異性抗體或免疫接合物分子及醫藥上可接受之載劑，該多特異性抗體或免疫接合物分子包含SEQ ID NO:79、SEQ ID NO: 83、及SEQ ID NO: 84之胺基酸序列。

在一些實施例中，本發明提供至少一種核酸分子，其編碼根據本揭露之多特異性抗體或免疫接合物分子之抗原結合臂或其片段。在一些實施例中，本發明提供核酸分子之組合，其中核酸分子之組合編碼SEQ ID NO:79、SEQ ID NO: 83、及SEQ ID NO: 84中之各者。

在一些實施例中，本發明提供至少一個載體，其包含核酸分子，該核酸分子編碼根據本揭露之多特異性抗體或免疫接合物分子之抗原結合臂或其片段。在一些實施例中，本發明提供載體之組合，其包含核酸分子之組合，其中核酸分子之組合編碼SEQ ID NO:79、SEQ ID NO: 83、及SEQ ID NO: 84中之各者。

在一些實施例中，本發明提供至少一個宿主細胞，其包含至少一個載體，該載體包含核酸分子，該核酸分子編碼根據本揭露之多特異性抗體或免疫接合物分子之至少一個抗原結合臂或片段。在一些實施例中，本發明提供載體之組合，其包含核酸分子之組合，其中核酸分子之組合編碼SEQ ID NO:79、SEQ ID NO: 83、及SEQ ID NO: 84中之各者。

在一些實施例中，本發明提供一種治療對象之自體免疫疾病的方法，其包含向對象投予治療有效量的根據本揭露之多特異性抗體或多特異性結合片段或免疫接合物達足以治療自體免疫疾病之時間。在一些實施例中，本發明提供一種治療對象之自體免疫疾病的方法，其包含投予治療有效量的包含SEQ ID NO:79、SEQ ID NO: 83、及SEQ ID NO: 84之多特異性抗體或多特異性結合片段或免疫接合物。在一些實施例中，本發明提供一種治療對象之自體免疫疾病的方法，其包含投予治療有效量的包含SEQ ID NO:79、SEQ ID NO: 83、及SEQ ID NO: 84且進一步包含醫藥載劑之多特異性抗體或多特異性結合片段或免疫接合物。

在一些實施例中，自體免疫疾病係全身性紅斑性狼瘡(SLE)、休格倫氏症候群(Sjögren’s syndrome, SjS)、類風濕性關節炎、自體免疫性肌肉病變、第I型糖尿病、愛迪生氏病(Addison disease)、惡性貧血、自體免疫性肝炎、原發性膽汁性膽管炎(PBC)、自體免疫性胰臟炎、乳糜瀉、局部節段性腎絲球硬化症、原發性膜性腎病、卵巢衰竭、自體免疫性睾丸炎、乾眼症、特發性間質性肺炎、甲狀腺疾病（例如葛瑞夫茲氏病(Grave’s)）、全身性硬化症（硬皮症）、肌無力症候群、自體免疫性腦炎、大皰性皮膚病、TTP、ITP、AIHA、Anca血管炎、心肌炎/擴張型CM、NMOSD、母體-胎兒同種異體免疫、母體-胎兒自體免疫、抗心磷脂/抗磷脂質症候群、高γ球蛋白血症、移植相關ID、或多灶性運動神經病變。

在一些實施例中，本發明提供一種調節B細胞活化或抑制異常B細胞活化之方法，其包含向對象投予根據本揭露之多特異性抗體或多特異性結合片段或免疫接合物。在一些實施例中，本發明提供一種調節B細胞活化或抑制異常B細胞活化之方法，其包含投予包含SEQ ID NO:79、SEQ ID NO: 83、及SEQ ID NO: 84之多特異性抗體或多特異性結合片段或免疫接合物。

在一些實施例中，本發明提供一種在對象中調節B細胞活化或抑制異常B細胞活化之方法，其包含向對象投予有效量的根據本揭露之多特異性抗體或多特異性結合片段或免疫接合物達足以調節B細胞活化或抑制異常B細胞活化之時間。在一些實施例中，本發明提供一種在對象中調節B細胞活化或抑制異常B細胞活化之方法，其包含向對象投予有效量的包含SEQ ID NO:79、SEQ ID NO: 83、及SEQ ID NO: 84之多特異性抗體或多特異性結合片段或免疫接合物達足以調節B細胞活化或抑制異常B細胞活化之時間。

在一些實施例中，本發明係關於一種有效量的根據本揭露之多特異性抗體或多特異性結合片段或免疫接合物用於在對象中調節B細胞活化、抑制異常B細胞活化、或治療自體免疫疾病之用途。在一些實施例中，本發明係關於一種有效量的多特異性抗體或多特異性結合片段或免疫接合物用於在對象中調節B細胞活化、抑制異常B細胞活化、或治療自體免疫疾病之用途，其中多特異性抗體或多特異性結合片段或免疫接合物包含SEQ ID NO:79、SEQ ID NO: 83、及SEQ ID NO: 84。

在一些實施例中，本發明提供一種在對象中減少B細胞增生、減少細胞介素生產、或降低B細胞活化之方法，其包含向對象投予有效量的根據本揭露之多特異性抗體或多特異性結合片段或免疫接合物達足以減少B細胞增生、減少細胞介素生產、或降低B細胞活化之時間。在一些實施例中，本發明提供一種在對象中減少B細胞增生、減少細胞介素生產、或降低B細胞活化之方法，其包含投予有效量的包含SEQ ID NO:79、SEQ ID NO: 83、及SEQ ID NO: 84之多特異性抗體或多特異性結合片段或免疫接合物。

在一些實施例中，本發明係關於一種有效量的根據本揭露之多特異性抗體或多特異性結合片段或免疫接合物用於減少B細胞增生、減少細胞介素生產、或降低B細胞活化之之用途。在一些實施例中，本發明係關於一種有效量的多特異性抗體或多特異性結合片段或免疫接合物用於減少B細胞增生及細胞介素生產或降低B細胞活化之用途，其中多特異性抗體或多特異性結合片段或免疫接合物包含SEQ ID NO:79、SEQ ID NO: 83、及SEQ ID NO: 84。

所揭示之方法可藉由參考以下實施方式更容易理解。應當理解的是所揭露之方法不限於本文中所描述及/或顯示之特定方法，且本文中使用之用語目的是僅僅以示例的方式描述具體實施例並且不意圖限制所要求保護的方法。

在本文中所引用的所有專利、已公開專利申請案及公開案係以引用方式併入，猶如全文說明於本文中。

當呈現清單時，除非另有陳述，否則應理解該清單之各個別元件及該清單之每種組合皆係分開的實施例。例如，呈現為「A、B、或C」的實施例清單將解讀為包括實施例「A」、「B」、「C」、「A或B」、「A或C」、「B或C」、或「A、B、或C」。

儘管闡明本發明內容之廣域範圍的數值範圍及參數為近似值，仍盡可能精確地報導特定實例中所提出的數值。然而，任何數值固有地包含由在它們的個別測試測量值中發現之標準偏差所必然產生的某些誤差。定義

如於本說明書及隨附的申請專利範圍中所使用，除非內文另有明確規定，否則單數形式的「一(a/an)」及「該(the)」皆包括複數指稱。因此，例如對於「一細胞(a cell)」之指稱包括兩或更多個細胞之組合與類似者。

連接詞「包含(comprising)」、「基本上由…所組成(consisting essentially of)」、及「由…所組成(consisting of)」意欲意味著其等在專利語言中一般公認的意義；亦即，(i)「包含(comprising)」與「包括(including)」、「含有(containing)」、或「其特徵在於(characterized by)」同義，且係包含式或開放式，且不排除額外、未列舉之元件或方法步驟；(ii)「由…所組成」排除申請專利範圍中未指明之任何元件、步驟、或成分；且(iii)「基本上由…所組成」將請求項之範疇限制在所指定之材料或步驟「及不實質影響（所請發明之）（多個）基本及新穎特徵者」。以詞組「包含」（或其等效詞）描述之實施例亦提供以「由…所組成」及「基本上由…所組成」獨立描述之實施例。

「約(about)」意指在特定值的可接受誤差範圍內，如所屬技術領域中具有通常知識者所判定，其將部分地取決於該值是如何測量或判定的，即測量系統的限制。除非在實例或說明書中其他地方在特定檢定、結果、或實施例的上下文中另有明確說明，否則「約」意指依據所屬技術領域之實務在一個標準偏差內、或至多5%之範圍，以較大者為準。

「活化(activation)」、「刺激(stimulation)」、「經活化(activated)」、或「經刺激(stimulated)」係指誘導細胞之生物狀態的變化，從而導致活化標記之表現、細胞介素生產、增生、或介導目標細胞之細胞毒性。細胞可藉由初級刺激信號活化。共刺激信號可放大初級信號之幅度並抑制初始刺激後之細胞死亡，從而導致更持久之活化狀態及因而更高之細胞毒性能力。「共刺激信號(co-stimulatory signal)」係指在與初級信號（諸如TCR/CD3連接）組合時導致T細胞及/或自然殺手(NK)細胞增生及/或關鍵分子之上調或下調的信號。

「替代支架(alternative scaffold)」係指一種單鏈蛋白質架構，其含有與具有高構形容許度之可變域相關聯的結構化核心。該等可變域容許變異引入而不會減損支架完整性，因而該等可變域可經工程改造且經選擇以結合至特定抗原。

「抗體依賴性細胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity)」、「抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)」、或「ADCC」係指誘導細胞死亡的機制，其取決於抗體包覆之目標細胞與具有裂解活性之效應細胞（諸如NK細胞、單核球、巨噬細胞、及嗜中性球）之間經由效應細胞上表現之Fcγ受體(FcgR)的交互作用。

「抗體依賴性細胞吞噬作用(antibody-dependent cellular phagocytosis)」或「ADCP」係指藉由吞噬細胞（諸如巨噬細胞或樹突細胞）內化(internalization)以消滅抗體包覆的目標細胞之機制。

「抗原(antigen)」係指能夠被抗原結合域結合之任何分子（例如蛋白質、肽、多醣、醣蛋白、醣脂、核酸、其部分、或其組合）。抗原可由基因表現、經合成、或純化自生物樣本，生物樣本諸如組織樣本、腫瘤樣本、細胞、或具有其他生物組分、生物體、蛋白質/抗原之次單元、及已殺滅或去活化之全細胞或裂解物(lysate)的流體。

「抗原結合片段(antigen binding fragment)」或「抗原結合域(antigen binding domain)」係指蛋白質結合抗原之部分。抗原結合片段可係合成的、可酶促獲得的、或經基因工程改造之多肽，且包括免疫球蛋白結合抗原之部分，諸如VH、VL、VH及VL、Fab、Fab’、F(ab') ₂、Fd及Fv片段、由一個VH域或一個VL域所組成之域抗體(dAb)、鯊可變IgNAR域(shark variable IgNAR domain)、駱駝化VH域(camelized VH domain)、VHH域、由模擬抗體之CDR（諸如FR3-CDR3-FR4部分、HCDR1、HCDR2、及/或HCDR3、及LCDR1、LCDR2、及/或LCDR3）的胺基酸殘基所組成之最小識別單元、結合抗原之替代支架、及包含該等抗原結合片段之多特異性蛋白質。抗原結合片段（諸如VH及VL）可經由合成連接子連接在一起以形成各種類型的單鏈抗體設計，其中VH/VL域可進行分子內配對，或者在VH及VL域係由分開之單鏈表現的情況下可進行分子間配對，以形成單價抗原結合域，諸如單鏈Fv (scFv)或雙鏈抗體(diabody)。抗原結合片段亦可接合至可為單特異性或多特異性的其他抗體、蛋白質、抗原結合片段、或替代支架，以工程改造雙特異性及多特異性蛋白質。

「抗體(antibody)」係以廣義的方式意指並包括免疫球蛋白分子，其包括單株抗體（包括鼠類、人類、人源化(humanized)及嵌合單株抗體）、抗原結合片段、多特異性抗體（諸如雙特異性、三特異性、四特異性等）、二聚體、四聚體或多聚體抗體、單鏈抗體、域抗體及任何其他包含具有所需特異性之抗原結合部位的免疫球蛋白分子之修飾組態。「全長抗體(full length antibody)」包含藉由雙硫鍵互連之兩條重鏈(HC)及兩條輕鏈(LC)以及其多聚體（例如IgM）。各HC包含重鏈可變區(VH)及重鏈恆定區（包含域CH1、鉸鏈、CH2、及CH3）。每條輕鏈包含輕鏈可變區(VL)及輕鏈恆定區(CL)。VH區及VL區可進一步細分成散佈於架構區(FR)中的多個高度變異區，其被稱為互補決定區(CDR)。各VH及VL係由三個CDR及四個FR區段組成，按照下列順序從胺基至羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、及FR4。免疫球蛋白可被分為下列五大類：IgA、IgD、IgE、IgG、及IgM，取決於重鏈恆定域胺基酸序列。IgA及IgG係進一步被細分為同型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。任何脊椎動物物種的抗體輕鏈可被分為兩種明確不同類型（即kappa (κ)及lambda (λ)）中之一者，其視其恆定域的胺基酸序列而定。

「雙特異性(bispecific)」係指特異性結合兩種不同抗原或在相同抗原內的兩個不同表位之分子（諸如抗體）。雙特異性分子可對於其他相關抗原具有交叉反應性，例如對於來自其他物種（諸如人類或猴）的相同抗原（同源物(homolog)）具有交叉反應性，例如食蟹獼猴( Macaca cynomolgus, cynomolgus, cyno)或黑猩猩( Pan troglodytes)，或者可結合在二或更多種不同抗原之間共有的表位。

如本文中所使用，用語「嵌合(chimeric)」係指抗體或其抗原結合片段具有衍生自非人類哺乳動物、囓齒動物、或爬蟲動物之抗體胺基酸序列的至少一個可變域之至少一些部分，而該抗體或其抗原結合片段之剩餘部分係衍生自人類。

如本文中所使用，「嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor)」(CAR)係定義為包含胞外目標結合域、跨膜域、及胞內信號傳導域的細胞表面受體，所有這些域之組合不會一起天然存在於單一蛋白質上。此包括其中胞外域及胞內信號傳導域不會一起天然存在於單一受體蛋白質上之受體。CAR主要意欲與諸如T細胞及NK細胞之淋巴球搭配使用。

「殖株(clone)」係藉由有絲分裂衍生自單一細胞或共同祖先之細胞群。「細胞系(cell line)」係能夠在體外穩定生長許多代之初代細胞殖株。在本文中所提供之一些實例中，細胞係藉由DNA轉染細胞加以轉形。

「補體依賴性細胞毒性(complement-dependent cytotoxicity)」或「CDC」係指誘導細胞死亡的機制，其中與目標結合之蛋白質的Fc效應域結合並活化補體成分C1q，其轉而活化補體級聯反應而導致目標細胞死亡。補體之活化亦可導致補體成分沉積在目標細胞表面上，其藉由結合白血球上的補體受體（例如CR3）而促進CDC。

「互補決定區(complementarity determining region)」(CDR)係結合抗原之抗體區。VH中有三個CDR（HCDR1、HCDR2、HCDR3），且VL中有三個CDR（LCDR1、LCDR2、LCDR3）。CDR可使用各種描繪定義，諸如Kabat(Wu et al. (1970) J Exp Med 132: 211-50; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991)、Chothia (Chothia et al. (1987) J Mol Biol 196: 901-17)、IMGT (Lefranc et al. (2003) Dev Comp Immunol 27: 55-77)、及AbM (Martin and Thornton J Bmol Biol 263: 800-15, 1996)。描述各種描繪與可變區編號之間的對應（參見例如Lefranc et al. (2003) Dev Comp Immunol 27: 55-77；Honegger and Pluckthun, J Mol Biol (2001) 309:657-70；國際免疫遺傳學(International ImMunoGeneTics, IMGT)資料庫；網路資源，http://www_imgt_org）。可用程式（諸如UCL Business PLC之abYsis）可用於描繪CDR。除非說明書中另有明確說明，否則如本文所使用，用語「CDR」、「HCDR1」、「HCDR2」、「HCDR3」、「LCDR1」、「LCDR2」、及「LCDR3」包括由上述Kabat、Chothia、IMGT、或AbM中之任何方法定義的CDR。

一般而言，CDR形成可被歸類為正則結構之圈環結構。用語「正則結構(canonical structure)」係指抗原結合(CDR)圈環所採取的主鏈構形。從比較性結構研究中，發現六個抗原結合圈環中的五個僅具有有限的可用構形類型(repertoire)。各正則結構可藉由多肽主鏈的扭轉角來表徵。因此，抗體之間的對應圈環可能具有非常類似的三維結構，儘管圈環的大部分中具有高度胺基酸序列變異性（Chothia et al.，「Canonical Structures For the Hypervariable Regions of Immunoglobulins，」 J. Mol. Biol.196:901 (1987)；Chothia et al.，「Conformations of Immunoglobulin Hypervariable Regions，」I 342:877 (1989)；Martin and Thornton，「Structural Families in Loops of Homologous Proteins: Automatic Classification, Modelling and Application to Antibodies，」 J. Mol. Biol.263:800 (1996)，其等各者之全文以引用方式併入）。另外，所採取的圈環結構與其周圍的胺基酸序列之間存在一種關係。特定正則類別的構形係由圈環長度及位於圈環內以及保留性架構內（即在圈環之外）的關鍵位置之胺基酸殘基來判定。因此可基於此等關鍵胺基酸殘基的存在指派特定正則類別。

「減少(decrease)」、「減低(lower)」、「減輕(lessen)」、「降低(reduce)」、或「減弱(abate)」通常係指當相較於由對照組或媒劑介導之反應時，測試分子介導降低之反應（亦即下游效應）的能力。例示性反應係T細胞擴增、T細胞活化或T細胞介導之腫瘤細胞殺滅或蛋白質與其抗原或受體之結合、及增強之與Fcγ之結合或增強之Fc效應功能，諸如增強之ADCC、CDC、及/或ADCP。減少可係測試分子與對照組（或媒劑）之間所測量反應的統計顯著差異、或所測量反應之減少，諸如減少約1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、或30倍或更多，諸如500、600、700、800、900、或1000倍或更多（包括其間且高於1之所有整數及小數，例如1.5、1.6、1.7、1.8等）。

「域抗體(domain antibody)」、「dAb」、或「dAb片段(dAb fragment)」係指由來自抗體之單臂的任一VH域及VL域構成之抗體片段。。

「分化(differentiation)」係指減少細胞之潛能或增生的方法或將細胞移至發育上更受限之狀態的方法。

「編碼(encode/encoding)」係指多核苷酸（諸如基因、cDNA、或mRNA）中核苷酸之特定序列在生物程序中作為合成其他聚合物及巨分子之模板的固有性質，該等聚合物及大分子具有所定義之核苷酸序列（例如rRNA、tRNA、及mRNA）或所定義之胺基酸序列、及自其得到之生物性質。因此，若對應於基因之mRNA的轉錄及轉譯在細胞或其他生物系統中生產蛋白質，則該基因、cDNA、或RNA編碼該蛋白質。核苷酸序列與mRNA序列同一的編碼股及用作基因或cDNA轉錄之模板的非編碼股兩者皆可稱為編碼蛋白質或該基因或cDNA之其他產物。

「增強(enhance)」、「促進(promote)」、「增加(increase)」、「擴增(expand)」、或「提升(improve)」通常係指當相較於由對照組或媒劑介導之反應時，測試分子介導較大之反應（即，下游效應）的能力。例示性反應係T細胞擴增、T細胞活化或T細胞介導之腫瘤細胞殺滅或蛋白質與其抗原或受體之結合、及增強之與Fcγ之結合或增強之Fc效應功能，諸如增強之ADCC、CDC、及/或ADCP。增強可係測試分子與對照組（或媒劑）之間所測量反應的統計顯著差異、或所測量反應之增加，諸如增加約1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、或30倍或更多，諸如500、600、700、800、900、或1000倍或更多（包括其間且高於1之所有整數及小數，例如1.5、1.6、1.7、1.8等）。

用語「擴增(expansion)」係指細胞分裂及細胞死亡之結果。

「表現(express/expression)」係指發生在細胞中或體外之熟知的轉錄及轉譯。因此，表現產物（例如，蛋白質）係由細胞表現或在體外表現，且可係胞內、胞外、或跨膜蛋白質。

「表現載體(expression vector)」係指可在生物系統或重構生物系統中用以引導多肽轉譯的載體，該多肽係由存在於該表現載體中之多核苷酸序列編碼。表現載體包含足以供表現之順式作用元件(cis-acting element)；其他表現元件可由宿主細胞或在體外表現系統中供應。表現載體包括所屬技術領域中已知之所有表現載體，包括併入重組多核苷酸之黏質體、質體（例如裸露或含於脂質體中）、及病毒（例如慢病毒、反轉錄病毒、腺病毒、及腺相關病毒）。

「dAb」或「dAb片段」係指由VH域構成之抗體片段(Ward et al., Nature 341:544 546 (1989))。

「Fab」或「Fab片段」係指由VH、CH1、VL、及CL域構成之抗體片段。

「F(ab') ₂」或「F(ab') ₂片段」係指含有由鉸鏈區中之雙硫橋連接的兩個Fab片段之抗體片段。

「Fd」或「Fd片段」係指由VH及CH1域構成之抗體片段。

「Fv」或「Fv片段」係指由來自抗體之單臂的VH及VL域構成之抗體片段。

「全長抗體(full length antibody)」包含藉由雙硫鍵互連之兩條重鏈(HC)及兩條輕鏈(LC)以及其多聚體（例如IgM）。各重鏈包含重鏈可變域(VH)及重鏈恆定域，重鏈恆定域包含子域CH1、鉸鏈、CH2、及CH3。各輕鏈包含輕鏈可變域(VL)及輕鏈恆定域(CL)。VH及VL可進一步細分成散佈於架構區(FR)的多個高變區，其被稱為互補決定區(CDR)。各VH及VL係由三個CDR及四個FR區段構成，按照下列順序自胺基至羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、及FR4。

「基因修飾(genetic modification)」係指將「外來」（即，外在或胞外）基因、DNA、或RNA序列引入宿主細胞，使得該宿主細胞將表現所引入之基因或序列以生產所欲之物質，一般是由所引入之基因或序列編碼的蛋白質或酶。所引入之基因或序列亦可稱為「選殖(cloned)」或「外來」基因或序列，可包括可操作地連接至編碼嵌合抗原受體之多核苷酸的調控或控制序列，諸如起始、終止、啟動子、信號、分泌、或細胞遺傳機制(genetic machinery)所使用之其他序列。基因或序列可包括非功能性序列或不具有已知功能的序列。接收並表現所引入之DNA或RNA的宿主細胞已經「基因工程改造(genetically engineered)」。引入宿主細胞之DNA或RNA可來自任何來源（包括與宿主細胞同屬或同種之細胞）或來自不同屬或種。

「異源(heterologous)」係指本質上彼此找不到相同關係的二或更多個多核苷酸或二或更多個多肽。

「異源多核苷酸(heterologous polynucleotide)」係指編碼二或更多種如本文所述之新抗原的非天然存在多核苷酸。

「異源多肽(heterologous polypeptide)」係指包含二或更多種如本文所述之新抗原多肽的非天然存在多肽。

「宿主細胞(host cell)」係指含有異源核酸之任何細胞。例示性異源核酸係載體（例如，表現載體）。

「人類抗體(human antibody)」係指經最佳化以在投予至人類對象時具有最小免疫反應之抗體。人類抗體之可變區係衍生自人類免疫球蛋白序列。若人類抗體含有恆定區或恆定區的一部分，則該恆定區亦衍生自人類免疫球蛋白序列。如果該人類抗體的可變區係得自使用人類生殖系免疫球蛋白或重排(rearranged)免疫球蛋白基因的系統，則人類抗體包含「衍生自(derived from)」人源序列的重及輕鏈可變區。此類例示性系統係經展示在噬菌體上的人類免疫球蛋白基因庫、及基因轉殖非人類動物（諸如帶有人類免疫球蛋白基因座的小鼠或大鼠）。當相較於人類中表現之免疫球蛋白時，「人類抗體」一般含有胺基酸差異，此係由於用於獲得人類抗體及人類免疫球蛋白基因座之系統之間的差異、引入體細胞突變、或向架構或CDR或兩者中刻意引入取代。一般而言，「人類抗體」在胺基酸序列上與由人類生殖系免疫球蛋白或重排免疫球蛋白基因所編碼的胺基酸序列具有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。在一些情況下，「人類抗體」可含有自人類架構序列分析導出的共有架構序列，例如如描述於Knappik et al., (2000) J Mol Biol 296:57-86，或併入展示於噬菌體上之人類免疫球蛋白基因庫的合成HCDR3，例如如描述於Shi et al., (2010) J Mol Biol 397:385-96及國際專利公開案第WO2009/085462號。至少一種CDR係衍生自非人類物種的抗體不包括在「人類抗體」的定義中。

「人源化抗體(humanized antibody)」係指至少一個CDR係衍生自非人類物種且至少一個架構係衍生自人類免疫球蛋白序列的抗體。人源化抗體可在架構中包括取代，所以該等架構可能不是所表現人類免疫球蛋白或人類免疫球蛋白生殖系基因序列的確切複製物。

「與…組合(in combination with)」意指將二或更多種治療劑一起以混合物形式投予至對象，其係並行以單劑投予或以任何順序以單劑依序投予。

「經單離(isolated)」係指已自產出該分子的系統（諸如重組細胞）的其他組分實質上分離及/或純化出之均質分子族群（諸如合成多核苷酸或多肽）、以及已經受至少一次純化或單離步驟的蛋白質。「經單離」係指實質上不含其他細胞材料及/或化學品之分子，且涵蓋單離至較高純度之分子，諸如至80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%純度。「經單離」核酸、肽、及蛋白質可係組成物之一部分且仍為經單離的，只要此組成物並非該核酸、肽、及蛋白質之原生環境的一部分。該用語亦包含藉由在宿主細胞中重組表現所製備之核酸、肽及蛋白質以及化學合成之核酸。如本文中所使用，「經單離(isolated)」抗體或抗原結合片段係意欲指實質上不含其他具有不同抗原特異性之抗體或抗原結合片段的抗體或抗原結合片段（例如，特異性結合至CD79b之經單離抗體係實質上不含特異性結合CD79b以外之抗原的抗體）。然而，特異性結合至CD79b之表位、異構體、或變體的經單離抗體可對其他相關抗原（例如來自其他物種之相關抗原（諸如CD79b物種同源物））具有交叉反應性。

「分化簇CD22蛋白(cluster of Differentiation CD22 protein)」或「CD22」係指亦稱為CD22之已知蛋白質。各種異構體之胺基酸序列可自GenBank擷取，包括例如GenBank存取號NP_001762.2、NP_001172028.1、NP_001172029.1、NP_001172030.1、及NP_001265346.1。

「分化簇CD79B蛋白(cluster of Differentiation CD79B protein)」或「CD79b」係指亦稱為CD79b之已知蛋白質。各種異構體之胺基酸序列可自GenBank存取號AAH32651.1、EAW94232.1、AAH02975.2、NP_000617.1、及NP_001035022.1擷取。全長CD79b序列之胺基酸序列係示於下文中。序列包括胞外域（殘基29至159）及胞質域（殘基181-至229）。 MARLALSPVPSHWMVALLLLLSAEPVPAARSEDRYRNPKGSACSRIWQSPRFIARKRGFTVKMHCYMNSASGNVSWLWKQEMDENPQQLKLEKGRMEESQNESLATLTIQGIRFEDNGIYFCQQKCNNTSEVYQGCGTELRVMGFSTLAQLKQRNTLKDGIIMIQTLLIILFIIVPIFLLLDKDDSKAGMEEDHTYEGLDIDQTATYEDIVTLRTGEVKWSVGEHPGQE (SEQ ID NO:126)

「調節(modulate)」係指當相較於由對照組或媒劑介導之反應時，測試分子介導增強或減少反應（即，下游效應）之能力增強或降低。

「單株抗體(monoclonal antibody)」係指自實質上均一的抗體分子群體獲得之抗體，亦即，除了可能熟知之改變之外包含該群體之個別抗體係同一的，該等改變諸如從抗體重鏈移除C端離胺酸或轉譯後修飾，諸如胺基酸異構化或脫醯胺化、甲硫胺酸氧化或天冬醯胺酸或麩醯胺酸脫醯胺化。單株抗體一般結合一種抗原表位。雙特異性單株抗體會結合兩種不同的抗原表位。單株抗體可在抗體群內具有異質醣基化。單株抗體可係單特異性或多特異性的（諸如雙特異性的）、單價、二價、或多價的。

「微抗體(minibody)」係指經由CH3域連接之scFv片段。

「多特異性(multispecific)」係指特異性結合二或更多種不同抗原或相同抗原內二或更多個不同表位之分子，諸如抗體。多特異性分子可對於其他相關抗原具有交叉反應性，例如與來自其他物種（諸如人類或猴）的相同抗原（同源物）具有交叉反應性，例如食蟹獼猴( Macaca fascicularis, cynomolgus, cyno)或黑猩猩，或者可以結合在二或更多種不同抗原之間共有的表位。

「自然殺手細胞(natural killer cell)」及「NK細胞(NK cell)」在本文中係可互換且同義地使用。NK細胞係指具有CD16 ⁺CD56 ⁺及/或CD57 ⁺TCR ^-表型之分化淋巴球。NK細胞之特徵在於其能夠結合並藉由活化特定溶細胞酶來殺滅無法表現「自體(self)」MHC/HLA抗原之細胞、能夠殺滅腫瘤細胞或其他表現NK活化受體之配體的病變細胞、及能夠釋放刺激或抑制免疫反應之蛋白質分子（稱為細胞介素）。

「操作性連接(operatively linked)」及類似片語當用以指涉核酸或胺基酸時，分別係指彼此處於功能性關係的核酸序列或胺基酸序列之操作性鍵聯。例如，可操作地連接之啟動子、增強子元件、開讀框、5'及3' UTR、及終止子序列導致精確的核酸分子（例如RNA）之生產，且在一些情況下，導致多肽之產生（亦即開讀框之表現）。「可操作地連接之肽(operatively linked peptide)」係指其中肽之功能域彼此以適當距離放置以賦予各域之意欲功能的肽。

「醫藥組成物(pharmaceutical composition)」係指一起或分開投予之二或更多種活性成分的組合。

「醫藥組成物(pharmaceutical composition)」係指組合活性成分及醫藥上可接受載劑所產生之組成物。

「醫藥上可接受之載劑(pharmaceutically acceptable carrier)」或「賦形劑(excipient)」係指活性成分以外之醫藥組成物中的成分，其對對象係無毒的。例示性醫藥上可接受之載劑係緩衝劑、穩定劑、或防腐劑。

「多核苷酸(polynucleotide)」或「核酸(nucleic acid)」係指包含以糖-磷酸主鏈或其他等效共價化學結構所共價連接之核苷酸鏈的合成分子。cDNA係多核苷酸之典型實例。多核苷酸可係DNA或RNA分子。「多核苷酸(polynucleotide)」包括但不限於單股及雙股DNA、為單股及雙股區之混合物的DNA、單股及雙股RNA、及為單股及雙股區之混合物的RNA、包含可為單股或（更典型地）雙股或單股及雙股區之混合物的DNA及RNA之混雜分子。此外，「多核苷酸(polynucleotide)」係指包含RNA或DNA或RNA及DNA兩者的三股區。用語多核苷酸亦包括含有一或多個經修飾鹼基之DNA或RNA及具有為了穩定性或其他理由經修飾之主鏈的DNA或RNA。「經修飾(modified)」鹼基包括例如三苯甲基化(tritylated)鹼基及不常見鹼基諸如肌苷(inosine)。可對於DNA及RNA進行各種修飾；因此，「多核苷酸(polynucleotide)」包含典型在自然界所發現之經化學、酶、或代謝修飾之多核苷酸形式，以及病毒和細胞所特有之DNA及RNA的化學形式。「多核苷酸(polynucleotide)」亦包含相對短之核酸鏈，其通常稱為寡核苷酸。

疾病或病症之「預防(prevent/preventing/prevention)」或「疾病預防(prophylaxis)」意指預防病症在對象中發生。

「增生(proliferation)」係指細胞分裂之增加，對稱或不對稱細胞分裂皆是。

「啟動子(promoter)」係指起始轉錄所需之最小序列。啟動子亦可包括分別增強或抑制轉錄之增強子或抑制子(repressor)元件。

本文中可互換使用之「蛋白質(protein)」或「多肽(polypeptide)」係指包含一或多個各包含至少二個由肽鍵連接之胺基酸殘基的多肽之分子。蛋白質可係單體，或可係二或更多個次單元之蛋白質複合物，該等次單元係相同或不同的。少於50個胺基酸之小型多肽可稱為「肽(peptide)」。蛋白質可係異源融合蛋白質、醣蛋白、或藉由轉譯後修飾（諸如磷酸化、乙醯化、肉荳蔻醯化、棕櫚醯化、醣基化、氧化、甲醯化、醯胺化、瓜胺酸化、聚麩胺醯化、ADP-核糖基化、聚乙二醇化、或生物素化）修飾之蛋白質。蛋白質可經重組表現。

「重組(recombinant)」係指藉由重組方式製備、表現、建立、或單離之多核苷酸、多肽、載體、病毒、及其他巨分子。

「調控元件(regulatory element)」係指控制核酸序列表現之某些方面的任何順式作用(cis-acting)或反式作用(trans-acting)基因元件。

「復發性(relapsed)」係指在先前用治療劑治療之後在一段時間的改善後，疾病或疾病之徵象及症狀的回歸。

「難治性(refractory)」係指對治療沒有反應的疾病。難治性疾病可在治療之前或在開始治療時對該治療具有抗性，或者難治性疾病可在治療期間變成具有抗性。

「單鏈Fv (single chain Fv)」或「scFv」係指一種融合蛋白，其包含至少一個包含輕鏈可變區(VL)之抗體片段及至少一個包含重鏈可變區(VH)之抗體片段，其中VL及VH係經由多肽連接子鄰接地連接，且能夠被表現為單鏈多肽。除非有指明，否則如本文中所使用，scFv可具有呈任一順序之VL及VH可變區，例如就多肽之N端及C端而言，scFv可包含VL-連接子-VH或可包含VH-連接子-VL。scFv可係經釘合單鏈Fv，如實例2中。

「特異性結合(specifically binds/secific binding/specifically binding)」或「結合(bind)」係指蛋白質分子以比對其他抗原更大之親和力結合至抗原或抗原內之表位。一般而言，蛋白質分子以約1x10 ^-7M或更小之平衡解離常數(K _D)結合至抗原或抗原內之表位，例如約5x10 ^-8M或更小、約1x10 ^-8M或更小、約1x10 ^-9M或更小、約1x10 ^-10M或更小、約1x10 ^-11M或更小、或約1x10 ^-12M或更小，一般以較其結合至非特異性抗原（例如BSA、酪蛋白）之K _D小至少一百倍的K _D結合。在此處所述之CD79b抗原之上下文中，「特異性結合(specific binding)」係指蛋白質分子與CD79b抗原之結合，而與野生型蛋白質（該抗原係該野生型蛋白質之變體）沒有可偵測的結合。

「對象(subject)」包括任何人類或非人類動物。「非人類動物(nonhuman animal)」包括所有脊椎動物，例如哺乳動物及非哺乳動物，諸如非人類靈長類、綿羊、狗、貓、馬、牛、雞、兩棲動物、爬蟲動物等。用語「對象(subject)」與「患者(patient)」在本文中可互換使用。

「實質上相同(substantially the same)」之意義可取決於使用該用語之上下文而有所不同。由於在重鏈及輕鏈及編碼彼等之基因中可能存在有天然序列變異，可預期在胺基酸序列或編碼本文所述之抗體或抗原結合片段之基因中發現某種程度的變異，此變異對於彼等之獨特結合特性（例如，特異性及親和力）幾乎沒有影響。此預期一部分是由於基因密碼的簡併性(degeneracy of the genetic code)，以及由於保守性胺基酸序列變異（不會可察覺地改變所編碼之蛋白質的本質）之演化成功所致。因此，在核酸序列之上下文中，「實質上相同」意指在二或更多個序列之間有至少65%同一性。較佳地，該用語係指在二或更多個序列之間有至少70%同一性、更佳地至少75%同一性、更佳地至少80%同一性、更佳地至少85%同一性、更佳地至少90%同一性、更佳地至少91%同一性、更佳地至少92%同一性、更佳地至少93%同一性、更佳地至少94%同一性、更佳地至少95%同一性、更佳地至少96%同一性、更佳地至少97%同一性、更佳地至少98%同一性、且更佳地至少99%或更高的同一性。兩個序列之間的同一性百分比係該等序列所共有之相同位置數目的函數（亦即同源性% =相同位置# /總位置# x 100），並考慮到需要被引入以最佳比對此兩個序列之缺口(gap)數目及各缺口長度。兩個核苷酸或胺基酸序列間的同一性百分比可使用例如E. Meyers and W. Miller, Comput. Appl. Biosci 4, 11-17 (1988)之演算法判定，該演算法已被併入ALIGN程式（2.0版）中，其使用PAM120被併入殘基表(weight residue table)，缺口長度罰分(gap length penalty)為12，且缺口罰分(gap penalty)為4。此外，兩個胺基酸序列間的同一性百分比可使用Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48, 444-453 (1970)演算法判定。

「T細胞(T cell)」及「T淋巴球(T lymphocyte)」在本文中係可互換的且同義地使用。T細胞包括胸腺細胞、初始T淋巴球、記憶T細胞、未成熟T淋巴球、成熟T淋巴球、休止T淋巴球、或活化T淋巴球。T細胞可係輔助T (Th)細胞，例如第1型輔助T (Th1)細胞或第2型輔助T (Th2)細胞。T細胞可係輔助T細胞（HTL；CD4 ⁺T細胞）、CD4 ⁺T細胞、細胞毒性T細胞（CTL；CD8 ⁺T細胞）、腫瘤浸潤細胞毒性T細胞（TIL；CD8 ⁺T細胞）、CD4 ⁺CD8 ⁺T細胞、或T細胞之任何其他子集。亦包括「NKT細胞(NKT cell)」，其係指特化T細胞群，其表現半不變αβ T細胞受體(semi-invariant αβ T-cell receptor)，但亦表現一般與NK細胞相關聯之各種分子標記（諸如NK1.1）。NKT細胞包括NK1.1 ⁺及NK1.1 ^-、以及CD4 ⁺、CD4 ^-、CD8 ⁺、及CD8 ^-細胞。NKT細胞上之TCR的獨特之處在於，其會辨識類MHC I分子CD Id所呈現之醣脂質(glycolipid)抗原。NKT細胞由於其能夠產生促進發炎或免疫耐受性之細胞介素而可具有保護性或有害效應。亦包括「伽瑪-德他T細胞(gamma-delta T cell)（γδ T細胞）」，其係指特化群，即在其表面上具有不同TCR之T細胞小子集，且不像大多數T細胞（其中TCR係由兩條稱為α-TCR鏈及β-TCR鏈之醣蛋白鏈構成），γδ T細胞中之TCR係由γ鏈及δ鏈組成。γδ T細胞可在免疫監視及免疫調控中發揮作用，且發現其係IL-17之重要來源並誘導穩健的CD8 ⁺細胞毒性T細胞反應。亦包括的是「調節性T細胞(regulatory T cell)」或「Treg」，其係指抑制異常或過度免疫反應且在免疫耐受性中發揮作用之T細胞。Treg一般係轉錄因子Foxp3陽性CD4 ⁺T細胞，且亦可包括轉錄因子Foxp3陰性調節性T細胞，其係生產IL-10之CD4 ⁺T細胞。

在本文中可互換使用之「治療有效量(therapeutically effective amount)」或「有效量(effective amount)」係指有效達到所欲治療結果所需之劑量及時間的量。治療有效量可依不同因素而異，諸如對象之疾病狀態、年齡、性別、及體重、以及治療劑或治療劑的組合在對象中引發所欲反應的能力。有效治療劑或治療劑組合之例示性指標包括例如病患幸福感的提升、腫瘤負荷的減少、腫瘤生長的停止或減緩、及/或癌細胞沒有轉移至身體的其他位置。

「轉導(transduction)」係指使用病毒載體將外來核酸引入細胞中。

疾病或病症（諸如癌症）之「治療(treat/treating/treatment)」係指達成下列中之一或多者：減少病症之嚴重性及/或持續時間、抑制所治療病症特有之症狀的惡化、限制或預防病症於先前已患有該病症之對象中復發、或限制或預防症狀於先前已有該病症症狀之對象中復發。

「變體(variant)」、「突變體(mutant)」、或「經改變(altered)」係指因一或多個修飾（例如一或多個取代、插入、或缺失）而與參考多肽或參考多核苷酸不同的多肽或多核苷酸。

整份說明書中抗體恆定區中的胺基酸殘基之編號係根據如Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)中所述的EU索引(EU index)，除非另有明確說明。

Ig恆定區中之突變被稱為如下：L351Y_F405A_Y407V係指一個免疫球蛋白恆定區中之L351Y、F405A、及Y407V突變。L351Y_F405A_Y407V/T394W係指一個多聚體蛋白質中存在之第一Ig恆定區中之L351Y、F405A、及Y407V突變及第二Ig恆定區中之T394W突變。

靶向CD79B之抗體或抗原結合域因此能夠將藥劑遞送至BCR複合體。因此，靶向CD79B之分子可用於產生雙特異性藥劑，以將天然存在的抑制蛋白招募至BCR複合體，以抑制異常B細胞活化。例如，具有辨識CD79B及抑制性Fcγ受體CD32B兩者之抗原結合域的雙特異性雙親和力重靶向(dual-affinity retargeting, DART)分子抑制B細胞活化，藉由減少之B細胞增生及免疫球蛋白分泌來監測。在自體免疫性關節炎之臨床前模型中，辨識CD79b及CD32B兩者之類似雙特異性分子延緩發病並降低疾病嚴重性，此指示CD79b介導之抑制蛋白至BCR之招募可為患有自體免疫疾病之患者提供治療效益(Veri et al., 2010, Arthritis & Rheumatism, 62: 1933-1943)。靶向CD79B之雙特異性抗體或抗原結合域亦可靶向B細胞表面上表現之其他抑制性分子，包括Siglec家族成員，諸如CD22或Siglec-10，其亦已被證明會抑制BCR介導之信號傳導（綜述於Duan & Paulson 2020, Ann. Rev Immunol 38(1):365-369）。

靶向之CD79B抗體或抗原結合域亦可用於治療各種形式的癌症。例如，泊拉妥珠單抗維多汀(polatuzumab vedotin)（一種抗CD79b抗體藥物接合物）經核准用於治療瀰漫性大B細胞淋巴瘤患者(DLBCL)（綜述於Walji 2020, PMID: 32700586; DOI: 10.1080/17474086.2020.1795828）。此外，表現結合至CD79B之嵌合抗原受體的經工程改造之T細胞（CAR T細胞）在體外及體內消除CD79B表現性B細胞淋巴瘤細胞(Ding 2020, PMID: 32495161 DOI: 10.1007/s11523-020-00729-7; Jiang 2020, PMID: 31624374 DOI: 10.1038/s41375-019-0607-5; Ormhøj2019, PMID: 31439577 PMCID: PMC6891163 DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-19-1337)。抗體

在一些實施例中，本揭露提供結合至CD79b之抗體、其結合片段、編碼前述者之多核苷酸、載體、宿主細胞、及製造及使用前述者之方法。在一些實施例中，本揭露提供結合至CD22之抗體、其結合片段、編碼前述者之多核苷酸、載體、宿主細胞、及製造及使用前述者之方法。在一些實施例中，抗體包含結合CD79b或CD22之抗原結合域。在一些實施例中，抗原結合域可經工程改造為scFv（包括釘合scFv (spFv)）、Fab、F(ab’) ₂、Fd、或Fv格式。

在一個態樣中，本揭露提供一種組成物，其包含結合CD22之抗原結合域。例如，在某些實施例中，本揭露包含一種抗體，其包含結合CD22之抗原結合域（亦即CD22結合域）。在一些實施例中，CD22結合域包含重鏈互補決定區(HCDR) 1、HCDR2、及HCDR3。在一個實施例中，CD22結合臂包含SEQ ID NO: 1之HCDR1。在一個實施例中，CD22結合域包含SEQ ID NO: 2之HCDR2。在一個實施例中，CD22結合域包含SEQ ID NO: 3之HCDR3。在一個實施例中，CD22結合域包含分別為SEQ ID NO: 1、2、及3之HCDR1、HCDR、及HCDR3。

在一些實施例中，CD22結合域包含輕鏈互補決定區(LCDR) 1、LCDR2、及LCDR3。在一個實施例中，CD22結合域包含SEQ ID NO: 4之LCDR1。在一個實施例中，CD22結合域包含SEQ ID NO: 5之LCDR2。在一個實施例中，CD22結合域包含SEQ ID NO: 6之LCDR3。在一個實施例中，CD22結合域包含分別為SEQ ID NO: 4、5、及6之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。

在一些實施例中，CD22結合域包含分別為SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、及6之HCDR1、HCDR、HCDR3、LCDR1、LCDR、及LCDR3。

在一些實施例中，CD22結合域包含SEQ ID NO:7之重鏈可變域(VH)。在一些實施例中，CD22結合域包含SEQ ID NO:8之輕鏈可變域(VL)。

在一些實施例中，CD22結合域包含SEQ ID NO:1之HCDR1、SEQ ID NO:2之HCDR2、SEQ ID NO:3之HCDR3、及SEQ ID NO:8之VL。在一些實施例中，CD22結合域包含SEQ ID NO:7之VH、SEQ ID NO:4之LCDR1、SEQ ID NO:5之LCDR2、及SEQ ID NO:6之LCDR3。

在一些實施例中，CD22結合域包含SEQ ID NO:7之VH及SEQ ID NO:8之VL。

在一些實施例中，包含CD22結合域之抗體係scFv。

在一些實施例中，包含CD22結合域之抗體係(scFv) ₂。

在一些實施例中，包含CD22結合域之抗體係Fv。

在一些實施例中，包含CD22結合域之抗體係Fab。

在一些實施例中，包含CD22結合域之抗體係F(ab’) ₂。

在一些實施例中，包含CD22結合域之抗體係Fd。

在一些實施例中，包含CD22結合域之抗體係dAb。

在一些實施例中，包含CD22結合域之抗體係VHH。

在一個態樣中，本揭露提供一種組成物，其包含結合CD79b之抗原結合域。例如，在某些實施例中，本揭露包含一種抗體，其包含結合CD79b之抗原結合域（亦即CD79b結合域）。在一些實施例中，CD79b結合域包含HCDR1、HCDR2、及HCDR3。在一個實施例中，CD79b結合域包含SEQ ID NO: 9、17、25、33、41、49、或57之HCDR1。在一個實施例中，CD79b結合域包含SEQ ID NO: 10、18、26、34、42、50、或58之HCDR2。在一個實施例中，CD79b結合域包含SEQ ID NO: 11、19、27、35、43、51、或59之HCDR3。

在一個實施例中，CD79b結合域包含SEQ ID NO: 9、17、25、33、41、49、或57之HCDR1；SEQ ID NO: 10、18、26、34、42、50、或58之HCDR2；及SEQ ID NO: 11、19、27、35、43、51、或59之HCDR3。在一個實施例中，CD79b結合域包含下列之HCDR1、HCDR2、及HCDR3：分別為SEQ ID NO: 9、10、及11；分別為SEQ ID NO: 17、18、及19；分別為SEQ ID NO: 25、26、及27；分別為SEQ ID NO: 33、34、及35；分別為SEQ ID NO: 41、42、及43；分別為SEQ ID NO: 49、50、及51；或分別為SEQ ID NO: 57、58、及59。

在一些實施例中，CD79b結合域包含LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一個實施例中，CD79b結合域包含SEQ ID NO: 12、20、28、36、44、52、或60之LCDR1。在一個實施例中，CD79b結合域包含SEQ ID NO: 13、21、29、37、45、53、或61之LCDR2。在一個實施例中，CD79b結合域包含SEQ ID NO: 14、22、30、38、46、54、或62之LCDR3。在一個實施例中，CD79b結合域包含下列之LCDR1、LCDR2、及LCDR3：分別為SEQ ID NO: 12、13、及14；分別為SEQ ID NO: 20、21、及22；分別為SEQ ID NO: 28、29、及30；分別為SEQ ID NO: 36、37、及38；分別為SEQ ID NO: 44、45、及46；分別為SEQ ID NO: 52、53、及54；或分別為SEQ ID NO: 60、61、及62。

在一些實施例中，CD79b結合域包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一個實施例中，CD79b結合域包含SEQ ID NO: 9、17、25、33、41、49、或57之HCDR1。在一個實施例中，CD79b結合域包含SEQ ID NO: 10、18、26、34、42、50、或58之HCDR2。在一個實施例中，CD79b結合域包含SEQ ID NO: 11、19、27、35、43、51、或59之HCDR3。在一個實施例中，CD79b結合域包含SEQ ID NO: 12、20、28、36、44、52、或60之LCDR1。在一個實施例中，CD79b結合域包含SEQ ID NO: 13、21、29、37、45、53、或61之LCDR2。在一個實施例中，CD79b結合域包含SEQ ID NO: 14、22、30、38、46、54、或62之LCDR3。在一個實施例中，CD79b結合域包含下列之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3：分別為SEQ ID NO: 9、10、11、12、13、及14；分別為SEQ ID NO: 17、18、19、20、21、及22；分別為SEQ ID NO: 25、26、27、28、29、及30；分別為SEQ ID NO: 33、34、35、36、37、及38；分別為SEQ ID NO: 41、42、43、44、45、及46；分別為SEQ ID NO: 49、50、51、52、53、及54；或分別為SEQ ID NO: 57、58、59、60、61、及62。

在一個實施例中，CD79b結合域包含VH。在一個實施例中，CD79b結合域包含SEQ ID NO: 15、23、31、39、47、55、63、或80之VH。在一個實施例中，CD79b結合域包含VL。在一個實施例中，CD79b結合域包含SEQ ID NO: 16、24、32、40、48、56、64、或81之VL。

在一個實施例中，CD79b結合域包含SEQ ID NO: 9、17、25、33、41、49、或57之HCDR1；SEQ ID NO: 10、18、26、34、42、50、或58之HCDR2；SEQ ID NO: 11、19、27、35、43、51、或59之HCDR3；及SEQ ID NO: 16、24、32、40、48、56、64、或81之VL。

在一個實施例中，CD79b結合域包含SEQ ID NO: 15、23、31、39、47、55、63、或80之VH；SEQ ID NO: 12、20、28、36、44、52、或60之LCDR1；SEQ ID NO: 13、21、29、37、45、53、或61之LCDR2；及SEQ ID NO: 14、22、30、38、46、54、或62之LCDR3。

在一個實施例中，CD79b結合域包含VH及VL。在一個實施例中，CD79b結合域包含下列之VH及VL：分別為SEQ ID NO: 15及16；分別為SEQ ID NO: 23及24；分別為SEQ ID NO: 31及32；分別為SEQ ID NO: 39及40；分別為SEQ ID NO: 47及48；分別為SEQ ID NO: 55及56；分別為SEQ ID NO: 63及64；或分別為SEQ ID NO: 80及81。

在一些實施例中，包含CD79b結合域之抗體係scFv。

在一些實施例中，包含CD79b結合域之抗體係(scFv) ₂。

在一些實施例中，包含CD79b結合域之抗體係Fv。

在一些實施例中，包含CD79b結合域之抗體係Fab。

在一些實施例中，包含CD79b結合域之抗體係F(ab’) ₂。

在一些實施例中，包含CD79b結合域之抗體係Fd。

在一些實施例中，包含CD79b結合域之抗體係dAb。

在一些實施例中，包含CD79b結合域之抗體係VHH。

在一些實施例中，包含CD79b結合域之抗體係釘合scFv (spFv)。

在一些實施例中，CD79b結合臂係包含下列之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3的scFv：分別為SEQ ID NO: 9、10、11、12、13、及14；分別為SEQ ID NO: 17、18、19、20、21、及22；分別為SEQ ID NO: 25、26、27、28、29、及30；分別為SEQ ID NO: 33、34、35、36、37、及38；分別為SEQ ID NO: 41、42、43、44、45、及46；分別為SEQ ID NO: 49、50、51、52、53、及54；或分別為SEQ ID NO: 57、58、59、60、61、及62。

在一些實施例中，CD79b結合臂係包含VH之scFv。在一個實施例中，scFv CD79b結合臂包含SEQ ID NO: 15、23、31、39、47、55、63、或80之VH。在一個實施例中，scFv CD79b結合臂包含VL。在一個實施例中，scFv CD79b結合臂包含SEQ ID NO: 16、24、32、40、48、56、64、或81之VL。

在一個實施例中，scFv CD79b結合臂包含SEQ ID NO: 9、17、25、33、41、49、或57之HCDR1；SEQ ID NO: 10、18、26、34、42、50、或58之HCDR2；SEQ ID NO: 11、19、27、35、43、51、或59之HCDR3；及SEQ ID NO: 16、24、32、40、48、56、64、或81之VL。

在一個實施例中，scFv CD79b結合臂包含SEQ ID NO: 15、23、31、39、47、55、63、或80之VH；SEQ ID NO: 12、20、28、36、44、52、或60之LCDR1；SEQ ID NO: 13、21、29、37、45、53、或61之LCDR2；及SEQ ID NO: 14、22、30、38、46、54、或62LCDR3。

在一些實施例中，CD79b結合臂係包含VH及VL之釘合scFv (spFv)。在一個實施例中，spFv CD79b結合臂包含SEQ ID NO: 80之VH及SEQ ID NO: 81之VL。在一個實施例中，spFv CD79b結合臂包含SEQ ID NO:82之VH及VL及連接子。在一個實施例中，spFv CD79b結合臂包含SEQ ID NO:79。

在一個實施例中，本揭露提供結合至CD79b及CD22之多特異性抗體、其多特異性結合片段、編碼前述者之多核苷酸、載體、宿主細胞、及製造及使用前述者之方法。相較於僅靶向一個此等目標，此類抗體或抗體片段可允許更特異性靶向特定細胞亞群。

在一些實施例中，本文提供結合至CD79b及CD22之雙特異性抗體、及其雙特異性結合片段。此可藉由例如製造包含特異性結合至CD79b之第一區及特異性結合至CD22之第二結合區的分子來實現。抗原結合區可採取任何允許特異性辨識目標之形式，例如結合區可係或可包括重鏈可變域、Fv（重鏈可變域及輕鏈可變域之組合）、單鏈fv (scFv)、Fab、基於纖連蛋白素III型域(fibronectin type III domain)之結合域（諸如來自纖連蛋白素、或基於來自纖連蛋白素之III型域的共有序列、或來自腱生蛋白(tenascin)、或基於來自腱生蛋白之III型域的共有序列，諸如來自Janssen Biotech, Inc.之Centyrin分子，參見例如WO2010/051274及WO2010/093627）。因此，提供包含兩個分別結合CD79b及CD22之不同抗原結合區的雙特異性分子。

在一些實施例中，CD79b x CD22多特異性抗體包含：第一抗原結合臂，其包含結合第一抗原之第一抗原結合部位；及第二抗原結合臂，其包含結合第二抗原之第二抗原結合部位。第一及第二抗原結合臂可各包含可結晶片段(Fc)域，其包含CH2-CH3域。

在一些實施例中，CD79b x CD22雙特異性抗體包含CD79b特異性臂，其包含含結合CD79b之第一抗原結合部位的第一抗原結合臂；及CD22特異性臂，其包含含結合CD22之第二抗原結合部位的第二抗原結合臂。在一些實施例中，CD79b x CD22雙特異性抗體包含CD22特異性臂，其包含結合CD22之抗原結合部位；及CD79b特異性臂，其包含結合CD79b之抗原結合部位。

在一些實施例中，第一抗原結合部位包含單鏈可變片段(scFv)。在一些實施例中，第一抗原結合部位包含釘合單鏈可變片段(spFv)。在一些實施例中，第一抗原結合部位包含抗原結合片段(Fab)。在一些實施例中，第二抗原結合部位包含抗原結合片段(Fab)。在一些實施例中，第二抗原結合部位包含單鏈可變片段(scFv)。在一些實施例中，第二抗原結合部位包含釘合單鏈可變片段(spFv)。

在一些實施例中，CD79b x CD22多特異性抗體包含含scFv之第一抗原結合臂，該scFv包含形成結合第一抗原之抗原結合部位的可變重(VH1)及可變輕(VL1)域；及含Fab之第二抗原結合臂，該Fab包含形成結合第二抗原之第二抗原結合部位的可變重(VH2)及可變輕(VL2)域。第一及第二抗原結合臂可各包含可結晶片段(Fc)域。

在一個實施例中，CD79b結合臂包含抗原結合片段(Fab)，且CD22結合臂包含單鏈可變片段(scFv)。

在一個實施例中，CD22結合臂包含抗原結合片段(Fab)，且CD79b結合臂包含單鏈可變片段(scFv)。

在一個實施例中，CD22結合臂包含抗原結合片段(Fab)，且CD79b結合臂包含釘合單鏈可變片段(spFv)。

在一些實施例中，本揭露之多特異性抗體包括具有全長抗體結構之抗體。本文中所用之「全長抗體(full length antibody)」係指具有兩個全長抗體重鏈及兩個全長抗體輕鏈之抗體。全長抗體重鏈(HC)包括重鏈可變域及恆定域VH、CH1、CH2、及CH3。全長抗體輕鏈(LC)包括輕鏈可變域及恆定域VL及CL。全長抗體可在任一或兩個重鏈中缺乏C端離胺酸(K)。用語「Fab臂(Fab-arm)」或「半分子(half molecule)」係指結合抗原之一個重鏈-輕鏈對。在一些實施例中，抗原結合域中之一者係非基於抗體之結合域，例如基於纖連蛋白素3型域之結合域，例如Centyrin。 CD22 結合臂

在一個實施例中，本文所述之多特異性抗體包含對CD22具特異性之抗原結合部位。在一些實施例中，CD22結合臂結合人類CD22。在一些實施例中，CD22結合臂結合至包括來自CD22胞外域(ECD)之一或多個殘基的表位。此類CD22結合臂可以5x10 ^-7M或更低之親和力結合至CD22，諸如1x10 ^-7M或更低、5x10 ^-8M或更低、1x10 ^-8M或更低、5x10 ^-9M或更低、1x10 ^-9M、或5x10 ^-10M或更低。在一個實施例中，CD22結合臂以約1 x10 ^-11M至1 x10 ^-9M之親和力結合至CD22。在一個實施例中，CD22結合臂以下列之親和力結合至CD22：約1 x10 ^-11M、約2 x10 ^-11M、約3 x10 ^-11M、約4 x10 ^-11M、約5 x10 ^-11M、約6 x10 ^-11M、約7 x10 ^-11M、約8 x10 ^-11M、約9x10 ^-11M、1 x10 ^-10M、約2 x10 ^-10M、約3 x10 ^-10M、約4 x10 ^-10M、約5 x10 ^-10M、約6 x10 ^-10M、約7 x10 ^-10M、約8 x10 ^-10M、約9x10 ^-10M、或約1x10 ^-9M。

在一些實施例中，CD22結合臂包含重鏈互補決定區(HCDR) 1、HCDR2、及HCDR3。在一個實施例中，CD22結合臂包含SEQ ID NO: 1之HCDR1。在一個實施例中，CD22結合臂包含SEQ ID NO: 2之HCDR2。在一個實施例中，CD22結合臂包含SEQ ID NO: 3之HCDR3。在一個實施例中，CD22結合臂包含分別為SEQ ID NO: 1、2、及3之HCDR1、HCDR、及HCDR3。

在一些實施例中，CD22結合臂包含輕鏈互補決定區(LCDR) 1、LCDR2、及LCDR3。在一個實施例中，CD22結合臂包含SEQ ID NO: 4之LCDR1。在一個實施例中，CD22結合臂包含SEQ ID NO: 5之LCDR2。在一個實施例中，CD22結合臂包含SEQ ID NO: 6之LCDR3。在一個實施例中，CD22結合臂包含分別為SEQ ID NO: 4、5、及6之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。

在一些實施例中，CD22結合臂包含分別為SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、及6之HCDR1、HCDR、HCDR3、LCDR1、LCDR、及LCDR3。

在一些實施例中，CD22結合臂包含SEQ ID NO:7之重鏈可變域(VH)。在一些實施例中，CD22結合臂包含SEQ ID NO:8之輕鏈可變域(VL)。

在一些實施例中，CD22結合臂包含SEQ ID NO:1之HCDR1、SEQ ID NO:2之HCDR2、SEQ ID NO:3之HCDR3、及SEQ ID NO:8之VL。在一些實施例中，CD22結合臂包含SEQ ID NO:7之VH、SEQ ID NO:4之LCDR1、SEQ ID NO:5之LCDR2、及SEQ ID NO:6之LCDR3。

在一些實施例中，CD22結合臂包含SEQ ID NO:7之VH及SEQ ID NO:8之VL。

在一些實施例中，CD22結合臂係scFv。

在一些實施例中，CD22結合臂係(scFv) ₂。

在一些實施例中，CD22結合臂係Fv。

在一些實施例中，CD22結合臂係Fab。

在一些實施例中，CD22結合臂係F(ab’) ₂。

在一些實施例中，CD22結合臂係Fd。

在一些實施例中，CD22結合臂係dAb。

在一些實施例中，CD22結合臂係VHH。

在一些實施例中，CD22結合臂包含人源化抗原結合片段。人源化抗原結合片段可衍生自含有衍生自非人類免疫球蛋白之最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段（諸如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2、或抗體之其他抗原結合子序列）。在大多數情況下，人源化抗體或抗原結合片段係人類免疫球蛋白（接受者抗體(recipient antibody)）或抗原結合片段，其中來自接受者之互補決定區(CDR)的殘基被來自具有所欲特異性、親和力、及能力之非人類物種（供體抗體）（諸如小鼠、大鼠、或兔）之CDR的殘基置換。通常，人源化抗體抗原結合片段將包含實質上所有至少一個且一般兩個可變域，其中所有或實質上所有CDR區對應於非人類免疫球蛋白之CDR區，且所有或實質上所有架構區係人類免疫球蛋白序列之架構區。人源化抗體抗原結合片段可包括免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分，一般為人類免疫球蛋白之恆定區。

在一些實施例中，CD22結合臂包含scFv。在一些實施例中，CD22結合臂包含(scFv) ₂。在一些實施例中，CD22結合臂包含Fv。在一些實施例中，CD22結合臂包含Fab。在一些實施例中，CD22結合臂包含F(ab’) ₂。在一些實施例中，CD22結合臂包含Fd。在一些實施例中，CD22結合臂包含dAb。在一些實施例中，CD22結合臂包含VHH。

在一些實施例中，CD22結合臂係IgG或其衍生物。在一些實施例中，CD22結合臂係IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4。在CD22結合臂具有IgG4同型之一些實施例中，其在其Fc區中含有S228P、L234A、L235A、F405L、及R409K取代。

在一些實施例中，CD22結合臂包含Fc域。在一個實施例中，Fc域包含至少一個突變，其促進異二聚化、減少Fc與Fcγ受體之結合、減少Fc與蛋白質A之結合、延長多特異性結合分子之半衰期、或其任何組合。促進異二聚化的例示性突變包括但不限於T366W、T366S、L368A、及Y407V。減少Fc與Fcγ受體之結合的例示性突變包括但不限於L234A、L235A、及D265S。減少Fc與蛋白質A之結合的例示性突變包括但不限於H435R及Y436F。延長半衰期的例示性突變包括但不限於M252Y、S254T、及T256E。

在一些實施例中，CD22結合臂包含Fc域，其包含SEQ ID NO:85或其衍生物。在一些實施例中，CD22結合臂包含Fc域之衍生物，其包含L234A、L235A、D265S、M252Y、S254T、T256E、T366S、L368A、Y407V、H435R、及Y436F取代中之至少一者。在一些實施例中，CD22結合臂包含Fc域之衍生物，其包含L234A、L235A、D265S、M252Y、S254T、T256E、T366S、L368A、Y407V、H435R、及Y436F取代中之各者。在一個實施例中，多特異性抗體包含SEQ ID NO:90中所示之變體IgG。 CD79b 結合臂

在一個實施例中，本文所述之多特異性抗體包含對CD79b具特異性之抗原結合部位。在一些實施例中，CD79b結合臂結合人類CD79b。在一些實施例中，CD79b結合臂結合人類CD79b及食蟹獼猴CD79b。在一些實施例中，CD79b結合臂結合人類CD79b但不結合食蟹獼猴CD79b。在一些實施例中，CD79b結合臂結合至包括來自CD79b胞外域(ECD)之一或多個殘基的表位結合。此類CD79b結合臂可以5x10 ^-7M或更低之親和力結合至CD79b，諸如1x10 ^-7M或更低、5x10 ^-8M或更低、1x10 ^-8M或更低、5x10 ^-9M或更低、1x10 ^-9M、或5x10 ^-10M或更低。在一個實施例中，CD79b結合臂以約1 x10 ^-11M至1 x10 ^-9M之親和力結合至CD79。在一個實施例中，CD79b結合臂以下列之親和力結合至CD79b：約1 x10 ^-11M、約2 x10 ^-11M、約3 x10 ^-11M、約4 x10 ^-11M、約5 x10 ^-11M、約6 x10 ^-11M、約7 x10 ^-11M、約8 x10 ^-11M、約9x10 ^-11M、1 x10 ^-10M、約2 x10 ^-10M、約3 x10 ^-10M、約4 x10 ^-10M、約5 x10 ^-10M、約6 x10 ^-10M、約7 x10 ^-10M、約8 x10 ^-10M、約9x10 ^-10M、或約1x10 ^-9M。

在一些實施例中，CD79b結合臂包含HCDR1、HCDR2、及HCDR3。在一個實施例中，CD79b結合臂包含SEQ ID NO: 9、17、25、33、41、49、或57之HCDR1。在一個實施例中，CD79b結合臂包含SEQ ID NO: 10、18、26、34、42、50、或58之HCDR2。在一個實施例中，CD79b結合臂包含SEQ ID NO: 11、19、27、35、43、51、或59之HCDR3。

在一個實施例中，CD79b結合臂包含SEQ ID NO: 9、17、25、33、41、49、或57之HCDR1；SEQ ID NO: 10、18、26、34、42、50、或58之HCDR2；及SEQ ID NO: 11、19、27、35、43、51、或59之HCDR3。在一個實施例中，CD79b結合臂包含下列之HCDR1、HCDR2、及HCDR3：分別為SEQ ID NO: 9、10、及11；分別為SEQ ID NO: 17、18、及19；分別為SEQ ID NO: 25、26、及27；分別為SEQ ID NO: 33、34、及35；分別為SEQ ID NO: 41、42、及43；分別為SEQ ID NO: 49、50、及51；或分別為SEQ ID NO: 57、58、及59。

在一些實施例中，CD79b結合臂包含LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一個實施例中，CD79b結合臂包含SEQ ID NO: 12、20、28、36、44、52、或60之LCDR1。在一個實施例中，CD79b結合臂包含SEQ ID NO: 13、21、29、37、45、53、或61之LCDR2。在一個實施例中，CD79b結合臂包含SEQ ID NO: 14、22、30、38、46、54、或62之LCDR3。在一個實施例中，CD79b結合臂包含下列之LCDR1、LCDR2、及LCDR3：分別為SEQ ID NO: 12、13、及14；分別為SEQ ID NO: 20、21、及22；分別為SEQ ID NO: 28、29、及30；分別為SEQ ID NO: 36、37、及38；分別為SEQ ID NO: 44、45、及46；分別為SEQ ID NO: 52、53、及54；或分別為SEQ ID NO: 60、61、及62。

在一些實施例中，CD79b結合臂包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一個實施例中，CD79b結合臂包含SEQ ID NO: 9、17、25、33、41、49、或57之HCDR1。在一個實施例中，CD79b結合臂包含SEQ ID NO: 10、18、26、34、42、50、或58之HCDR2。在一個實施例中，CD79b結合臂包含SEQ ID NO: 11、19、27、35、43、51、或59之HCDR3。在一個實施例中，CD79b結合臂包含SEQ ID NO: 12、20、28、36、44、52、或60之LCDR1。在一個實施例中，CD79b結合臂包含SEQ ID NO: 13、21、29、37、45、53、或61之LCDR2。在一個實施例中，CD79b結合臂包含SEQ ID NO: 14、22、30、38、46、54、或62之LCDR3。在一個實施例中，CD79b結合臂包含下列之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3：分別為SEQ ID NO: 9、10、11、12、13、及14；分別為SEQ ID NO: 17、18、19、20、21、及22；分別為SEQ ID NO: 25、26、27、28、29、及30；分別為SEQ ID NO: 33、34、35、36、37、及38；分別為SEQ ID NO: 41、42、43、44、45、及46；分別為SEQ ID NO: 49、50、51、52、53、及54；或分別為SEQ ID NO: 57、58、59、60、61、及62。

在一個實施例中，CD79b結合臂包含VH。在一個實施例中，CD79b結合臂包含SEQ ID NO: 15、23、31、39、47、55、63、或80之VH。在一個實施例中，CD79b結合臂包含VL。在一個實施例中，CD79b結合臂包含SEQ ID NO: 16、24、32、40、48、56、64、或81之VL。

在一個實施例中，CD79b結合臂包含SEQ ID NO: 9、17、25、33、41、49、或57之HCDR1；SEQ ID NO: 10、18、26、34、42、50、或58之HCDR2；SEQ ID NO: 11、19、27、35、43、51、或59之HCDR3；及SEQ ID NO: 16、24、32、40、48、56、64、或81之VL。

在一個實施例中，CD79b結合臂包含SEQ ID NO: 15、23、31、39、47、55、63、或80之VH；SEQ ID NO: 12、20、28、36、44、52、或60之LCDR1；SEQ ID NO: 13、21、29、37、45、53、或61之LCDR2；及SEQ ID NO: 14、22、30、38、46、54、或62LCDR3。

在一個實施例中，CD79b結合臂包括VH及VL。在一個實施例中，CD79b結合臂包含下列之VH及VL：分別為SEQ ID NO: 15及16；分別為SEQ ID NO: 23及24；分別為SEQ ID NO: 31及32；分別為SEQ ID NO: 39及40；分別為SEQ ID NO: 47及48；分別為SEQ ID NO: 55及56；分別為SEQ ID NO: 63及64；或分別為SEQ ID NO: 80及81。

在一些實施例中，CD79b結合臂係scFv。

在一些實施例中，CD79b結合臂係(scFv) ₂。

在一些實施例中，CD79b結合臂係Fv。

在一些實施例中，CD79b結合臂係Fab。

在一些實施例中，CD79b結合臂係F(ab’) ₂。

在一些實施例中，CD79b結合臂係Fd。

在一些實施例中，CD79b結合臂係dAb。

在一些實施例中，CD79b結合臂係VHH。

在一些實施例中，CD79b結合臂係釘合scFv (spFv)。

在一些實施例中，CD79b結合臂係包含VH之釘合scFv。在一個實施例中，釘合scFv CD79b結合臂包含SEQ ID NO: 80之VH及SEQ ID NO: 81之VL。在一個實施例中，釘合scFv CD79b結合臂包含SEQ ID NO:82之VH及VL及連接子。在一個實施例中，釘合scFv CD79b結合臂包含SEQ ID NO:79。

在一些實施例中，CD79b結合臂包含人源化抗原結合片段。人源化抗原結合片段可衍生自含有衍生自非人類免疫球蛋白之最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段（諸如Fv、Fab、Fab’、F(ab’) ₂、或抗體之其他抗原結合子序列）。在大多數情況下，人源化抗體或抗原結合片段係人類免疫球蛋白（接受者抗體(recipient antibody)）或抗原結合片段，其中來自接受者之互補決定區(CDR)的殘基被來自具有所欲特異性、親和力、及能力之非人類物種（供體抗體）（諸如小鼠、大鼠、或兔）之CDR的殘基置換。通常，人源化抗體抗原結合片段將包含實質上所有至少一個且一般兩個可變域，其中所有或實質上所有CDR區對應於非人類免疫球蛋白之CDR區，且所有或實質上所有架構區係人類免疫球蛋白序列之架構區。人源化抗體抗原結合片段可包括免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分，一般為人類免疫球蛋白之恆定區。

在一些實施例中，CD79b結合臂包含scFv，例如spFv。在一些實施例中，CD79b結合臂包含(scFv) ₂。在一些實施例中，CD79b結合臂包含Fv。在一些實施例中，CD79b結合臂包含Fab。在一些實施例中，CD79b結合臂包含F(ab’) ₂。在一些實施例中，CD79b結合臂包含Fd。在一些實施例中，CD79b結合臂包含dAb。在一些實施例中，CD79b結合臂包含VHH。

在一些實施例中，CD79b結合臂係IgG或其衍生物。在一些實施例中，CD79b結合臂係IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4。在CD79b結合臂具有IgG4同型之一些實施例中，其在其Fc區中含有S228P、L234A、L235A、F405L、及R409K取代。

在一些實施例中，CD79b結合臂包含Fc域。在一個實施例中，Fc域包含至少一個突變，其促進異二聚化、減少Fc與Fcγ受體之結合、減少Fc與蛋白質A之結合、延長多特異性結合分子之半衰期、或其任何組合。促進異二聚化的例示性突變包括但不限於T366W、T366S、L368A、及Y407V。減少Fc與Fcγ受體之結合的例示性突變包括但不限於L234A、L235A、及D265S。減少Fc與蛋白質A之結合的例示性突變包括但不限於H435R及Y436F。延長半衰期的例示性突變包括但不限於M252Y、S254T、及T256E。

在一些實施例中，CD79b結合臂包含SEQ ID NO:88或其衍生物。在一個實施例中，多特異性抗體包含SEQ ID NO:89中所示之Fc域。 抗體及抗體片段

本揭露之CD79b及/或CD22結合臂可使用標準方法工程改造為各種設計之單特異性或多特異性蛋白質。本揭露亦提供一種單特異性蛋白質，其包含本揭露之結合CD79b及/或CD22之抗原結合域。在一些實施例中，單特異性蛋白質係抗體。在一些實施例中，多特異性蛋白質係抗體。

雖然不受此方法限制，但通常在將抗體建構為多特異性抗體時，針對各目標（第一、第二、第三等）之結合域模組係可選的建構自scFv、Fab、Fab’、F(ab')2、Fv、可變域（例如VH或VL）、雙價抗體、微抗體、或全長抗體。例如，在以下非限制性形式中之一或多者中建立各個所述結合域或模組，其中包含可變域之結合域及/或全長抗體及/或抗體片段係可操作地串聯連接以產生多特異性抗體。在一些實施例中，多特異性蛋白質係雙特異性。

在一個實施例中，提供一種多特異性抗體，其包含至少一個第一抗體衍生之結合域，該結合域靶向CD79b，且係可操作地連接至靶向CD22之至少一個第二抗體結合域。可選地，結合域包含至少一個或多個VH及同源VL結合域、或一或多個VH-CH1-CH2-CH2及同源VL-CL結合域、或一或多個抗體片段結合域。

本文所識別的任何結合CD79b或CD22之VH域及VL域亦可經工程改造為scFv、Fab、F(ab’)2、Fd、或Fv格式，且其等與CD79b或CD22之結合可使用本文所述之檢定評估。

例如，本文所識別的任何結合CD79b或CD22之VH域及VL域可經工程改造為呈VH-連接子-VL或VL-連接子-VH定向之scFv格式。在一些實施例中，scFv格式係呈VH-連接子-VL或VL-連接子-VH定向。本文所識別的任何VH域及VL域亦可用以產生sc(Fv) ₂結構，諸如VH-連接子-VL-連接子-VL-連接子-VH、VH-連接子-VL-連接子-VH-連接子-VL。VH-連接子-VH-連接子-VL-連接子-VL。VL-連接子-VH-連接子-VH-連接子-VL。VL-連接子-VH-連接子-VL-連接子-VH或VL-連接子-VL-連接子-VH-連接子-VH。

可將本文所識別的VH域及VL域併入scFv格式中，且可使用已知方法評估所得scFv對CD79b或CD22之結合及熱穩定性。結合可使用ProteOn XPR36、Biacore 3000、或KinExA儀器設備、ELISA或所屬技術領域中具有通常知識者已知之競爭性結合來評估。結合可使用經純化scFv或含有經表現scFv之大腸桿菌上清液或經裂解細胞來評估。若在不同條件（例如滲透性、pH）下測量，則所測得之測試scFv對CD79b或CD22的親和力可能會有所變化。因此，親和力及其他結合參數（例如，K _D、K _on、K _off）之測量一般係以標準化條件及標準化緩衝液進行。熱穩定性可藉由在升高溫度下，諸如在50℃、55℃、或60℃下，將測試scFv加熱一段時間，諸如5分鐘(min)、10 min、15 min、20 min、25 min、或30min，並測量測試scFv與CD79b或CD22之結合來評估。當相較於未經加熱之scFv樣本時，scFv保留相當的與CD79b或CD22之結合稱為熱穩定。

在重組表現系統中，連接子係肽連接子並可包括任何天然存在的胺基酸。可被包括至連接子中之例示性胺基酸係Gly、Ser、Pro、Thr、Glu、Lys、Arg、Ile、Leu、His、及The。連接子應具有適當之長度，以將VH及VL以使其等相對於彼此形成正確構形之方式連接，使得其等保留所欲活性，諸如與CD79b結合。

連接子可係約5至50個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係約10至40個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係約10至35個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係約10至30個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係約10至25個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係約10至20個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係約15至20個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係6個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係7個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係8個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係9個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係10個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係11個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係12個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係13個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係14個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係15個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係16個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係17個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係18個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係19個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係20個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係21個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係22個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係23個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係24個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係25個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係26個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係27個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係28個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係29個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係30個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係31個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係32個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係33個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係34個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係35個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係36個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係37個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係38個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係39個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係40個胺基酸長。可使用之例示性連接子係富含Gly之連接子、含Gly及Ser之連接子、含Gly及Ala之連接子、含Ala及Ser之連接子、及其他可撓性連接子。

其他連接子序列可包括免疫球蛋白鉸鏈區域、衍生自任何免疫球蛋白重鏈或輕鏈同型之CL或CH1之部分。替代地，各種非蛋白質聚合物（包括聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇及聚丙二醇之共聚物）可用來作為連接子。額外連接子係描述於例如國際專利公開案第WO2019/060695號。

在一些實施例中，scFv自N端至C端包含VH、第一連接子(L1)、及VL (VH-L1-VL)。在一些實施例中，scFv自N端至C端包含VL、L1、及VH (VL-L1-VH)。

在一些實施例中，scFv自N端至C端包含VH、第一連接子(L1)、及VL (VH-L1-VL)或VL、L1、及VH (VL-L1-VH)。在一些實施例中，L1包含約5至50個胺基酸。在一些實施例中，L1包含約5至40個胺基酸。在一些實施例中，L1包含約10至30個胺基酸。在一些實施例中，L1包含約10至20個胺基酸。在一些實施例中，L1包含SEQ ID NO: 91至125之胺基酸序列。 多特異性抗體

在一些實施例中，抗原結合臂可併入雙可變域免疫球蛋白(DVD)中（國際專利公開案第WO2009/134776號；DVD為全長抗體，其包含具有結構VH1-連接子-VH2-CH之重鏈及具有結構VL1-連接子-VL2-CL之輕鏈；連接子係可選的）、包括各種二聚化結構域以連接二個具有不同特異性之抗體臂的結構，諸如白胺酸拉鍊或膠原蛋白二聚化結構域（國際專利公開案第WO2012/022811號、美國專利第5,932,448號；美國專利第6,833,441號）、二或更多個域抗體(dAb)接合在一起、雙價抗體、僅重鏈抗體（諸如駱駝抗體及經工程改造駱駝抗體）、Dual Targeting (DT)-Ig (GSK/Domantis)、二合一抗體(Genentech)、交聯Mab (Karmanos Cancer Center)、mAb2 (F-Star)及CovX-body (CovX/Pfizer)、類IgG雙特異性抗體(InnClone/Eli Lilly)、Ts2Ab (MedImmune/AZ)及BsAb (Zymogenetics)、HERCULES (Biogen Idec)及TvAb (Roche)、ScFv/Fc融合(Academic Institution)、SCORPION (Emergent BioSolutions/Trubion, Zymogenetics/BMS)、雙親和力重靶向技術(Fc-DART) (MacroGenics)、及Dual(ScFv) ₂-Fab (National Research Center for Antibody Medicine--China)、Dual-Action或Bis-Fab (Genentech)、Dock-and-Lock (DNL) (ImmunoMedics)、Bivalent Bispecific (Biotecnol)、及Fab-Fv (UCB-Celltech)。基於ScFv之抗體、基於雙價抗體之抗體及域抗體包括但不限於Bispecific T Cell Engager (BiTE) (Micromet)、Tandem Diabody (Tandab) (Affimed)、Dual Affinity Retargeting Technology (DART) (MacroGenics)、Single-chain Diabody (Academic)、TCR-like Antibodies (AIT, ReceptorLogics)、Human Serum Albumin ScFv Fusion (Merrimack)及COMBODY (Epigen Biotech)、雙靶向奈米抗體(Ablynx)、僅雙靶向重鏈域抗體(dual targeting heavy chain only domain antibody)。

在一些實施例中，本文所述之多特異性抗體可採用所屬技術領域中已描述用於多特異性抗體之任何格式。在一些實施例中，本文所述之多特異性抗體係基於雙特異性抗體格式建構。此可藉由將第三抗原結合區添加至雙特異性抗體達成。已描述雙特異性抗體之不同格式且近來已由下列文獻所綜述：Chames and Baty (2009) Curr Opin Drug Disc Dev 12: 276。在一些實施例中，多特異性抗體包含雙特異性抗體，其係雙價抗體、交叉抗體(cross-body)、或經由如本揭露所述之受控Fab臂交換獲得之雙特異性抗體。

在一些實施例中，多特異性抗體包括具有互補CH3域以迫使異二聚化的類IgG分子；重組類IgG雙靶向分子，其中該分子之兩側各包含至少兩種不同抗體之Fab片段或該Fab片段的一部分；IgG融合分子，其中全長IgG抗體係融合至額外Fab片段或Fab片段之部分；Fc融合分子，其中單鏈Fv分子或穩定化雙價抗體係融合至重鏈恆定域、Fc區、或其部分；Fab融合分子，其中不同之Fab片段係融合在一起；基於ScFv之抗體及基於雙價抗體之抗體及重鏈抗體（例如，域抗體、奈米抗體），其中不同單鏈Fv分子或不同雙價抗體或不同重鏈抗體（例如，域抗體、奈米抗體）係融合至彼此或融合至另一個蛋白質或載劑分子。

在一些實施例中，具有互補CH3域分子之類IgG分子包括Triomab/Quadroma (Trion Pharma/Fresenius Biotech)、鈕扣(Knobs-into-Holes) (Genentech)、CrossMAb (Roche)及靜電匹配者(electrostatically-matched) (Amgen)、LUZ-Y (Genentech)、股交換工程改造域抗體(Strand Exchange Engineered Domain body, SEEDbody) (EMD Serono)、Biclonic (Merus)、DuoBody (Genmab A/S)、及其他不對稱突變（例如Zymeworks）。

在一些實施例中，重組類IgG雙靶向分子包括Dual Targeting (DT)-Ig (GSK/Domantis)、二合一抗體(Two-in-one Antibody) (Genentech)、交聯Mab (Cross-linked Mab) (Karmanos Cancer Center)、mAb2 (F-Star)、及CovX-body (CovX/Pfizer)。

在一些實施例中，IgG融合分子包括雙可變域(Dual Variable Domain, DVD)-Ig (Abbott)、類IgG雙特異性抗體(IgG-like Bispecific) (InnClone/Eli Lilly)、Ts2Ab (MedImmune/AZ)及BsAb (Zymogenetics)、HERCULES (Biogen Idec)、及TvAb (Roche)。

在一些實施例中，Fc融合分子包括ScFv/Fc融合(Academic Institution)、SCORPION (Emergent BioSolutions/Trubion, Zymogenetics/BMS)、雙親和力重靶向技術(Dual Affinity Retargeting Technology) (Fc-DART) (MacroGenics)、及Dual(ScFv) ₂-Fab (National Research Center for Antibody Medicine--China)。

在一些實施例中，Fab融合雙特異性抗體包括F(ab)2 (Medarex/AMGEN)、Dual-Action或Bis-Fab (Genentech)、Dock-and-Lock (DNL) (ImmunoMedics)、Bivalent Bispecific (Biotecnol)、及Fab-Fv (UCB-Celltech)。基於ScFv之抗體、基於雙價抗體之抗體及域抗體包括但不限於Bispecific T Cell Engager (BiTE) (Micromet)、Tandem Diabody (Tandab) (Affimed)、Dual Affinity Retargeting Technology (DART) (MacroGenics)、Single-chain Diabody (Academic)、TCR-like Antibodies (AIT, ReceptorLogics)、Human Serum Albumin ScFv Fusion (Merrimack)及COMBODY (Epigen Biotech)、雙靶向奈米抗體(Ablynx)、僅雙靶向重鏈域抗體(dual targeting heavy chain only domain antibody)。

本揭露之全長多特異性抗體可例如使用兩個單特異性二價抗體之間的Fab臂交換（或半分子交換）來產生，其藉由於各半分子中之重鏈CH3界面引入取代，以利於兩個具有不同特異性之抗體半分子的異二聚體在體外無細胞環境中或使用共表現形成。Fab臂交換反應係雙硫鍵異構化反應及CH3域之解離-締合的結果。親本單特異性抗體之鉸鏈區中的重鏈雙硫鍵經還原。親本單特異性抗體中之一者的所得游離半胱胺酸與第二親本單特異性抗體分子之半胱胺酸殘基形成重鏈間雙硫鍵，同時該等親本抗體之CH3域藉由解離-締合而釋出及重新形成。Fab臂之CH3域可經工程改造以利於異二聚化而非同二聚化。所得產物係具有兩個Fab臂或半分子之雙特異性抗體，該等Fab臂或半分子各結合不同表位，例如CD79b上之表位及CD22上之表位。

如本文中所使用，「同二聚化(homodimerization)」係指具有相同CH3胺基酸序列之兩個重鏈的交互作用。如本文中所使用，「同二聚體(homodimer)」係指具有兩個有相同CH3胺基酸序列之重鏈的抗體。

如本文中所使用，「異二聚化(heterodimerization)」係指具有不同CH3胺基酸序列之兩個重鏈的交互作用。如本文中所使用，「異二聚體(heterodimer)」係指具有兩個有不同CH3胺基酸序列之重鏈的抗體。

「鈕扣(knob-in-hole)」策略（請參見例如PCT國際公開案第WO 2006/028936號）可用於產生全長多特異性抗體。簡言之，在人類IgG中形成CH3域界面之所選胺基酸可在影響CH3域交互作用的位置處突變，以促進異二聚體形成。將具有小側鏈之胺基酸（孔）引入至結合第一抗原之抗體的重鏈中，並將具有大側鏈之胺基酸（鈕）引入至結合第二抗原之抗體的重鏈中。在共表現這兩個抗體之後，具有「孔」之重鏈與具有「鈕」之重鏈優先交互作用而導致異二聚體形成。形成鈕及孔之例示性CH3取代對（表現為第一重鏈之第一CH3域中之經修飾位置/第二重鏈之第二CH3域中之經修飾位置）：T366Y/F405A、T366W/ F405W、F405W/Y407A、T394W/Y407T、T394S/Y407A、T366W/T394S、F405W/T394S、及T366W/T366S_L368A_Y407V。

在本文所述之多特異性抗體或多特異性結合片段之一些實施例中，第一抗原結合臂之Fc域包含突變T366S、L368A、及Y407V，且第二抗原結合臂之Fc域包含突變T366W。在一些實施例中，第二抗原結合臂之Fc域包含突變T366S、L368A、及Y407V，且第一抗原結合臂之Fc域包含突變T366W。

可使用其他策略，諸如使用靜電交互作用促進重鏈異二聚化，其藉由取代一個CH3表面之帶正電荷殘基及第二CH3表面之帶負電荷殘基，如描述於美國專利公開案第US2010/0015133號；美國專利公開案第US2009/0182127號；美國專利公開案第US2010/028637號、或美國專利公開案第US2011/0123532號。在其他策略中，異二聚化可藉由下列取代促進（表現為第一重鏈之第一CH3域中之經修飾位置/第二重鏈之第二CH3域中之經修飾位置）：L351Y_F405AY407V/T394W、T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V、T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V、L351Y_Y407A/T366A_K409F、L351Y_Y407A/T366V K409F Y407A/T366A_K409F、或T350V_L351Y_F405A Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W，如描述於美國專利公開案第US2012/0149876號或美國專利公開案第US2013/0195849號(Zymeworks)。

除了上述方法外，本發明之多特異性抗體可在無細胞環境中體外產生，此係藉由在兩個單特異性同二聚體抗體之CH3區中引入非對稱突變，且在還原條件中（以使雙硫鍵異構化）自兩個親本單特異性同二聚體抗體形成該多特異性異二聚體抗體，其係根據描述於以下文獻中之方法：國際專利公開案第W02011/131746中號。在該等方法中，第一單特異性二價抗體（例如抗CD79b抗體）及第二單特異性二價抗體（例如抗CD3抗體）經工程改造以在CH3域具有某些促進異二聚體穩定性的取代；該等抗體係在足以讓鉸鏈區中之半胱胺酸進行雙硫鍵異構化的還原條件下一起培養；從而藉由Fab臂交換產生多特異性抗體。培養條件可最佳地被回復為非還原性條件。可使用之例示性還原劑係2-巰基乙胺(2-MEA)、二硫蘇糖醇(dithiothreitol, DTT)、二硫赤蘚醇(dithioerythritol, DTE)、麩胱甘肽、參(2-羧乙基)膦(TCEP)、L-半胱胺酸、及β-巰基乙醇，較佳地還原劑係選自由下列所組成之群組：2-巰基乙胺、二硫蘇糖醇、及參(2-羧乙基)膦。例如，可使用在至少20℃之溫度且在至少25 mM 2-MEA之存在下或在至少0.5 mM二硫蘇糖醇之存在下且在5至8之pH下（例如在7.0之pH下或在7.4之pH下）至少90 min的培養。

在一些實施例中，多特異性抗體或抗原結合片段係IgG或其衍生物。IgG類別在人類中分成四種同型：IgG1、IgG2、IgG3、及IgG4。其等的Fc區之胺基酸序列具有超過95%的同源性，但鉸鏈區之胺基酸組成及結構顯示主要差異。Fc區媒介效應功能，諸如抗體依賴性細胞性細胞毒性(ADCC)及補體依賴性細胞毒性(CDC)。在ADCC中，抗體之Fc區結合至免疫效應細胞（諸如自然殺手細胞及巨噬細胞）表面上之Fc受體(FcγR)，導致吞噬或溶解標靶細胞。在CDC中，抗體藉由在細胞表面引發補體級聯反應(complement cascade)來殺滅標靶細胞。本文中所述之抗體包括具有所述可變域特性與任何IgG同型組合的抗體，包括其中Fc序列已經修飾以致使不同效應功能之經修飾版本。

在許多治療性抗體之應用中，Fc媒介之效應功能並非作用機制之一部分。這些Fc媒介之效應功能可能有害並且由於造成偏離機制毒性(off-mechanism toxicity)而可能造成安全風險。修改效應功能可藉由工程改造Fc區以降低其對FcγR或補體因子之結合來達成。IgG與活化性（FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa、及FcγRIIIb）及抑制性(FcγRIIb) FcγR或補體之第一組分(C1q)的結合取決於位在鉸鏈區及CH2域中之殘基。在IgG1、IgG2、及IgG4中已引入突變以降低或靜默Fc功能。本文中所述之抗體可包括這些修飾。

在一個實施例中，抗體包含具有一或多個下列特性之Fc區：(a)在與親系Fc比較時效應功能有所降低；(b)對於FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIb、及/或FcγRIIIa之親和力降低、(c)對於FcγRI之親和力降低、(d)對於FcγRIIa之親和力降低、(e)對於FcγRIIb之親和力降低、(f)對於FcγRIIIb之親和力降低、或(g)對於FcγRIIIa之親和力降低。

在一些實施例中，抗體或抗原結合片段係IgG或其衍生物，例如IgG1、IgG2、IgG3、及IgG4同型。在抗體具有IgG1同型之一些實施例中，抗體之Fc域中含有L234A、L235A、D265S、及/或K409R取代。在抗體具有IgG4同型之一些實施例中，抗體之Fc域中含有S228P、L234A、及L235A取代。本文中所述之抗體可包括這些修飾。

在一些實施例中，本文所述之多特異性抗體之第一及/或第二抗原結合臂之Fc域各包含選自L234A、L235A、及D265S之一或多個突變。在一些實施例中，第一及第二抗原結合臂之Fc域各包含突變L234A、L235A、及D265S。

在一些實施例中，本文所述之多特異性抗體之第一或第二抗原結合臂之Fc域進一步包含減少Fc與蛋白質A之結合的一或多個突變。在一些實施例中，第一及/或第二抗原結合臂之Fc域包含突變H435R及/或Y436F。在一些實施例中，CD22抗原結合臂之Fc域包含突變H435R及/或Y436F。

在各種實施例中，用於本文所述之多特異性抗體中之scFv自N端至C端包含VH、連接子、及VL (VH-L-VL)或VL、L、及VH (VL-L-VH)。在一些實施例中，該scFv自N至C端包含該VL、該連接子、及該VH (VL-L-VH)。在一些實施例中，scFv自N端至C端包含VH、連接子、及VH (VL-L-VH)。

本揭露中所使用之連接子可係約5至50個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係約10至40個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係約10至35個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係約10至30個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係約10至25個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係約10至20個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係約15至20個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係6個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係7個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係8個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係9個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係10個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係11個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係12個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係13個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係14個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係15個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係16個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係17個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係18個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係19個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係20個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係21個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係22個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係23個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係24個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係25個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係26個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係27個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係28個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係29個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係30個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係31個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係32個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係33個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係34個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係35個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係36個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係37個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係38個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係39個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係40個胺基酸長。可使用之例示性連接子係富含Gly之連接子、含Gly及Ser之連接子、含Gly及Ala之連接子、含Ala及Ser之連接子、及其他可撓性連接子。

其他連接子序列可包括免疫球蛋白鉸鏈區域、衍生自任何免疫球蛋白重鏈或輕鏈同型之CL或CH1之部分。可使用之例示性連接子係顯示於表 1。額外連接子係描述於例如國際專利公開案第WO2019/060695號。

在一些實施例中，連接子包含SEQ ID NO:91至125中之一者之胺基酸序列。 表1. 例示性連接子序列

胺基酸序列	SEQ ID NO
GGGSGGSGGCPPCGGSGG	91
GGSEGKSSGSGSESKSTGGS	92
GGGSGGGS	93
GGGSGGGSGGGS	94
GGGSGGGSGGGSGGGS	95
GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS	96
GGGGSGGGGSGGGGS	97
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS	98
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS	99
GSTSGSGKPGSGEGSTKG	100
IRPRAIGGSKPRVA	101
GKGGSGKGGSGKGGS	102
GGKGSGGKGSGGKGS	103
GGGKSGGGKSGGGKS	104
GKGKSGKGKSGKGKS	105
GGGKSGGKGSGKGGS	106
GKPGSGKPGSGKPGS	107
GKPGSGKPGSGKPGSGKPGS	108
GKGKSGKGKSGKGKSGKGKS	109
STAGDTHLGGEDFD	110
GEGGSGEGGSGEGGS	111
GGEGSGGEGSGGEGS	112
GEGESGEGESGEGES	113
GGGESGGEGSGEGGS	114
GEGESGEGESGEGESGEGES	115
GSTSGSGKPGSGEGSTKG	116
PRGASKSGSASQTGSAPGS	117
GTAAAGAGAAGGAAAGAAG	118
GTSGSSGSGSGGSGSGGGG	119
GKPGSGKPGSGKPGSGKPGS	120
GSGS	121
APAPAPAPAP	122
APAPAPAPAPAPAPAPAPAP	123
AEAAAKEAAAKEAAAAKEAAAAKEAAAAKAAA	124
GGGGSGGGGS	125

雙特異性抗體

在一些實施例中，本揭露之雙特異性抗體或雙特異性抗體片段包含CD79b結合臂及CD22結合臂。在一個實施例中，雙特異性抗體或雙特異性抗體片段包含結合第一抗原之第一抗原結合部位及結合第二抗原之第二抗原結合部位。

在一個實施例中，雙特異性抗體或雙特異性抗體片段包含結合CD22之第一抗原結合臂及結合CD79b之第二抗原結合臂。

在一個實施例中，雙特異性抗體或雙特異性抗體片段包含結合CD79b之第一抗原結合臂及結合CD22之第二抗原結合臂。在一個實施例中，結合CD79b之第一抗原結合臂包含SEQ ID NO: 9、17、25、33、41、49、或57之HCDR1；SEQ ID NO: 10、18、26、34、42、50、或58之HCDR2；SEQ ID NO: 11、19、27、35、43、51、或59之HCDR3；SEQ ID NO: 12、20、28、36、44、52、或60之LCDR1；SEQ ID NO: 13、21、29、37、45、53、或61之LCDR2；及SEQ ID NO: 14、22、30、38、46、54、或62LCDR3。在一個實施例中，結合CD79b之抗原結合臂包含下列之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3：分別為SEQ ID NO: 9、10、11、12、13、及14；分別為SEQ ID NO: 17、18、19、20、21、及22；分別為SEQ ID NO: 25、26、27、28、29、及30；分別為SEQ ID NO: 33、34、35、36、37、及38；分別為SEQ ID NO: 41、42、43、44、45、及46；分別為SEQ ID NO: 49、50、51、52、53、及54；或分別為SEQ ID NO: 57、58、59、60、61、及62。

在一個實施例中，結合CD79b之第一抗原結合臂包含SEQ ID NO: 15、23、31、39、47、55、63、或80之VH及SEQ ID NO: 16、24、32、40、48、56、64、或81之VL。在一個實施例中，結合CD79b之第一抗原結合臂包含下列之VH及VL：分別為SEQ ID NO: 15及16；分別為SEQ ID NO: 23及24；分別為SEQ ID NO: 31及32；分別為SEQ ID NO: 39及40；分別為SEQ ID NO: 47及48；分別為SEQ ID NO: 55及56；分別為SEQ ID NO: 63及64；或分別為SEQ ID NO: 80及81。

在一個實施例中，結合CD22之抗原結合臂包含SEQ ID NO: 1之HCDR1、SEQ ID NO: 2之HCDR2、及SEQ ID NO: 3之HCDR3。在一個實施例中，結合CD22之第二抗原結合臂包含SEQ ID NO:7之VH。在一個實施例中，結合CD22之第二抗原結合臂包含SEQ ID NO: 4之LCDR1、SEQ ID NO: 5之LCDR2、及SEQ ID NO: 6之LCDR3。在一個實施例中，結合CD22之第二抗原結合臂包含SEQ ID NO: 8之VL。

在一個實施例中，雙特異性抗體或雙特異性抗體片段包含結合CD79b之抗原結合臂，其包含SEQ ID NO: 9之HCDR1、SEQ ID NO: 10之HCDR2、SEQ ID NO: 11之HCDR3、SEQ ID NO: 12之LCDR1、SEQ ID NO: 13之LCDR2、及SEQ ID NO: 14之LCDR3；及結合CD22之抗原結合臂，其包含SEQ ID NO: 1之HCDR1、SEQ ID NO: 2之HCDR2、及SEQ ID NO: 3之HCDR3；及SEQ ID NO: 4之LCDR1、SEQIDNO: 5之LCDR2、及SEQ ID NO: 6之LCDR3。

在一個實施例中，雙特異性抗體或雙特異性抗體片段包含結合CD79b之抗原結合臂，其包含SEQ ID NO: 9之HCDR1、SEQ ID NO: 10之HCDR2、SEQ ID NO: 11之HCDR3、SEQ ID NO: 12之LCDR1、SEQ ID NO: 13之LCDR2、及SEQ ID NO: 14之LCDR3；及結合CD22之抗原結合臂，其包含SEQ ID NO: 7之VH、及SEQ ID NO: 4之LCDR1、SEQ ID NO: 5之LCDR2、及SEQ ID NO: 6之LCDR3。

在一個實施例中，雙特異性抗體或雙特異性抗體片段包含結合CD79b之抗原結合臂，其包含SEQ ID NO: 9之HCDR1、SEQ ID NO: 10之HCDR2、SEQ ID NO: 11之HCDR3、SEQ ID NO: 12之LCDR1、SEQ ID NO: 13之LCDR2、及SEQ ID NO: 14之LCDR3；及結合CD22之抗原結合臂，其包含SEQ ID NO: 1之HCDR1、SEQ ID NO: 2之HCDR2、及SEQ ID NO: 3之HCDR3；及SEQ ID NO:8之VL。

在一個實施例中，雙特異性抗體或雙特異性抗體片段包含結合CD79b之抗原結合臂，其包含SEQ ID NO: 9之HCDR1、SEQ ID NO: 10之HCDR2、SEQ ID NO: 11之HCDR3、SEQ ID NO: 12之LCDR1、SEQ ID NO: 13之LCDR2、及SEQ ID NO: 14之LCDR3；及結合CD22之抗原結合臂，其包含SEQ ID NO:7之VH及SEQ ID NO:8之VL。

在一個實施例中，雙特異性抗體或雙特異性抗體片段包含結合CD79b之抗原結合臂，其包含SEQ ID NO:80之VH、SEQ ID NO: 12之LCDR1、SEQ ID NO: 13之LCDR2、及SEQ ID NO: 14之LCDR3；及結合CD22之抗原結合臂，其包含SEQ ID NO: 1之HCDR1、SEQ ID NO: 2之HCDR2、SEQ ID NO: 3之HCDR3、SEQ ID NO: 4之LCDR1、SEQ ID NO: 5之LCDR2、及SEQ ID NO: 6之LCDR3。

在一個實施例中，雙特異性抗體或雙特異性抗體片段包含結合CD79b之抗原結合臂，其包含SEQ ID NO: 9之HCDR1、SEQ ID NO: 10之HCDR2、SEQ ID NO: 11之HCDR3、及SEQ ID NO:81之VL；及結合CD22之抗原結合臂，其包含SEQ ID NO: 1之HCDR1、SEQ ID NO: 2之HCDR2、SEQ ID NO: 3之HCDR3、SEQ ID NO: 4之LCDR1、SEQ ID NO: 5之LCDR2、及SEQ ID NO: 6之LCDR3。

在一個實施例中，雙特異性抗體或雙特異性抗體片段包含結合CD79b之抗原結合臂，其包含SEQ ID NO:80之VH及SEQ ID NO:81之VL；及結合CD22之抗原結合臂，其包含SEQ ID NO: 1之HCDR1、SEQ ID NO: 2之HCDR2、SEQ ID NO: 3之HCDR3、SEQ ID NO: 4之LCDR1、SEQ ID NO: 5之LCDR2、及SEQ ID NO: 6之LCDR3。

在一個實施例中，雙特異性抗體或雙特異性抗體片段包含結合CD79b之抗原結合臂，其包含SEQ ID NO:80之VH及SEQ ID NO:81之VL；及結合CD22之抗原結合臂，其包含SEQ ID NO:7之VH及SEQ ID NO:8之VL。同源抗體

包括本文所述之單特異性抗體、多特異性抗體、或抗原結合片段之抗體包括具有單一或多個胺基酸取代、缺失、或添加之變體，且該等變體保留所述多特異性抗體或抗原結合片段之生物性質（例如結合親和力或免疫效應活性）。例如，變體可在結合CD79b及/或CD22之抗原結合域中包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或更多個胺基酸取代，只要當相較於親本抗原結合域時，其保留或具有改善之功能性質即可。在一些實施例中，與本揭露之結合CD79b及/或CD22之抗原結合域的序列同一性可係約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%。在一些實施例中，變異係在架構區中。在一些實施例中，變體係由保守性取代產生。

在本發明之上下文中，下列符號係用來描述突變，除非另有指明；i)取代給定位置之胺基酸係寫成例如K409R，其意指用精胺酸取代位置409之離胺酸；且ii)針對特定變體，使用特定三個或一個字母代碼（包括代碼Xaa及X）指示任何胺基酸殘基。因此，用精胺酸取代位置409之離胺酸係標為：K409R，或用任何胺基酸殘基取代位置409之離胺酸係標為：K409X。在缺失位置409之離胺酸的情況下，其係以K409*指示。具有通常知識者可生產具有單一或多個胺基酸取代、缺失、或添加之變體。

此等變體可包括：(a)其中一或多個胺基酸殘基經保守或非保守胺基酸取代之變體、(b)其中一或多個胺基酸經添加至多肽或自多肽刪除之變體、(c)其中一或多個胺基酸包括取代基之變體、及(d)其中多肽係與另一肽或多肽（諸如融合夥伴、蛋白質標籤、或其他化學部份，其可賦予多肽有用性質，諸如例如抗體之表位、多組胺酸序列、生物素部份、及類似者）融合之變體。本文所述之抗體或抗原結合片段可包括其中來自一個物種之胺基酸殘基在保守性或非保守性位置被另一物種之對應殘基取代之變體。在其他實施例中，非保守性位置之胺基酸殘基係經保守性或非保守性殘基取代。用於獲得此等變體之技術（包括基因（缺失、突變等）、化學、及酶技術）係所屬技術領域中具有通常知識者已知的。產生結合CD79b或CD22之抗原結合片段的方法

本揭露中提供之結合CD79b或CD22之抗原結合域可使用各種技術產生。例如，Kohler及Milstein之融合瘤方法可用以識別結合CD79b或CD22之VH/VL對。在融合瘤方法中，將小鼠或其他宿主動物（諸如倉鼠、大鼠、或雞）用人類及/或食蟹獼猴CD79b或CD22免疫，接著使用標準方法將來自經免疫動物之脾細胞與骨髓瘤細胞融合以形成融合瘤細胞。可對從單一永生化融合瘤細胞而來的殖株，針對生產含有結合CD79b或CD22之抗原結合域且具有所欲性質的抗體進行篩選，所欲性質諸如結合特異性、交叉反應性或缺乏交叉反應性、抗原親和力、及任何所欲功能性。

可將藉由使非人類動物免疫產生的結合CD79b或CD22之抗原結合域人源化。例示性人源化技術（包括人類受體架構選擇）包括CDR移植（美國專利第5,225,539號）、SDR移植（美國專利第6,818,749號）、表面重塑(Resurfacing) (Padlan, (1991) Mol Immunol28:489-499)、特異性決定殘基表面重塑(Specificity Determining Residues Resurfacing)（美國專利公開案第2010/0261620號）、人類架構適應(human framework adaptation)（美國專利第8,748,356號）、或超人源化(superhumanization)（美國專利第7,709,226號）。在此等方法中，親本抗體之CDR或CDR殘基子集被轉移至人類架構上，該人類架構可基於彼等與親本架構的整體同源性、基於CDR長度的相似性、或正則結構(canonical structure)同一性、或其組合來選擇。

可將人源化抗體結合域進一步最佳化以改善其對所欲抗原之選擇性或親和力，此係由諸如在國際專利公開案第WO1990/007861號及第WO1992/22653號中所述之技術藉由併入經修改之架構支撐殘基以保存結合親和力（回復突變(backmutation)），或藉由在任何CDR引入變異以例如改善抗原結合域之親和力。

在其基因體中帶有人體免疫球蛋白(Ig)基因座之基因轉殖動物（諸如小鼠、大鼠、或雞）可用以產生結合CD79b或CD22之抗原結合片段，且係描述於例如美國專利第6,150,584號、國際專利公開案第WO1999/45962號、國際專利公開案第WO2002/066630號、第WO2002/43478號、第WO2002/043478號、及第WO1990/04036號。可將此等動物中之內源性免疫球蛋白基因座破壞或刪除，且可使用同源或非同源重組、使用轉染色體(transchromosome)、或使用袖珍基因(minigene)將至少一個完整或部分人類免疫球蛋白基因座插入動物基因體中。可聘用諸如Regeneron (www_regeneron_com)、Harbour Antibodies (www_harbourantibodies_com)、Open Monoclonal Technology, Inc. (OMT) (www_omtinc_net)、KyMab (www_kymab_com)、Trianni (www.trianni_com)、及Ablexis (www_ablexis_com)之公司使用如上所述之技術提供針對所選抗原之人類抗體。

結合CD79b或CD22之抗原結合域可選自噬菌體展示庫，其中噬菌體經工程改造以表現人類免疫球蛋白或其部分，諸如Fab、單鏈抗體(scFv)、或未配對或配對抗體可變區。結合CD79b或CD22之抗原結合域可例如從噬菌體展示庫（表現抗體重鏈及輕鏈可變區）單離為具有噬菌體pIX外殼蛋白的融合蛋白質，如描述於Shi et al.,(2010) J Mol Biol397:385-96及國際專利公開案第WO09/085462號。該等庫可篩選出結合至人類及/或食蟹獼猴CD79b或CD22之噬菌體，且所得之陽性殖株可經進一步表徵，將Fab從殖株裂解物單離出來並轉換為scFv或抗原結合片段之其他構形。

免疫性抗原(immunogenic antigen)之製備及本揭露之抗原結合域之表現及生產可使用任何合適技術執行，諸如重組蛋白質生產。免疫性抗原可用經純化的蛋白質或包括全細胞或細胞或組織抽出物的蛋白質混合物之形式來投予給動物，或者抗原可由編碼前述抗原或其之一部分的核酸於該動物體內重新地(de novo)形成。同型、同種異型、及Fc工程改造

抗體（包括本文所述之單特異性抗體、多特異性抗體、或抗原結合片段）可體現數種抗體同型，諸如IgM、IgD、IgG、IgA、及IgE。在一些實施例中，抗體同型係IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4同型，較佳IgG1或IgG4同型。抗體或其抗原結合片段之特異性大部分是由CDR之胺基酸序列及排列來決定。因此，一種同型之CDR可轉移到另一種同型而不會改變抗原特異性。或者，已經建立使融合瘤從生產一種抗體同型轉換到生產另一種（同型轉換）而不會改變抗原特異性之技術。因此，此等抗體同型係在所述抗體或抗原結合片段之範疇內。

Ig恆定區或Ig恆定區之片段（諸如存在於本揭露之蛋白質中的Fc區）可係任何同種異型(allotype)或同型(isotype)。

在一些實施例中，Ig恆定區或Ig恆定區之片段係IgG1同型。在一些實施例中，Ig恆定區或Ig恆定區之片段係IgG2同型。在一些實施例中，Ig恆定區或Ig恆定區之片段係IgG3同型。在一些實施例中，Ig恆定區或Ig恆定區之片段係IgG4同型。

Ig恆定區或Ig恆定區之片段可為任何同種異型。預期同種異型對於Ig恆定區之性質沒有影響，諸如結合或Fc介導之效應功能。包含Ig恆定區或其片段之治療性蛋白質的免疫原性與輸注反應之風險增加及治療反應之持續時間減少相關聯(Baert et al.,(2003) N. Engl. J. Med.348:602-08)。包含Ig恆定區或其片段之治療性蛋白質在宿主中誘導免疫反應的程度可部分地由Ig恆定區之同種異型決定(Stickler et al.,(2011) Genes and Immunity12:213-21)。Ig恆定區同種異型係與抗體恆定區序列中之特定位置處的胺基酸序列變異相關。表 2顯示所選之IgG1、IgG2及IgG4同種異型。 表2.

同種異型	多樣性位置的胺基酸殘基（殘基編號：EU索引）
	IgG2	IgG4	IgG1
	189	282	309	422	214	356	358	431
G2m(n)	T	M
G2m(n-)	P	V
G2m(n)/(n-)	T	V
nG4m(a)			L	R
G1m(17)					K	E	M	A
G1m(17,1)					K	D	L	A

C端離胺酸 (C-terminal lysine, CTL)可藉由血流中的內源性循環羧肽酶自 Ig恆定區移除 (Cai et al., (2011) Biotechnol. Bioeng.108:404-412)。在製造期間，可藉由控制胞外Zn ²⁺、EDTA、或EDTA – Fe ³⁺的濃度將CTL移除控制在小於最大水平，如描述於美國專利公開案第US20140273092號。蛋白質之CTL含量可使用已知方法測量。

在一些實施例中，抗體具有約10%至約90%之C端離胺酸含量。在一些實施例中，C端離胺酸含量係約20%至約80%。在一些實施例中，C端離胺酸含量係約40%至約70%。在一些實施例中，C端離胺酸含量係約55%至約70%。在一些實施例中，C端離胺酸含量係約60%。

可對包含Ig恆定區或Ig恆定區之片段的多特異性抗體進行Fc區突變，以調節其效應功能（諸如ADCC、ADCP、及/或ADCP）及/或藥物動力學性質。這可藉由將（多個）突變引入Fc中來達成，該（等）突變調節突變Fc與活化性FcγR（FcγRI、FcγRIIa、FcγRIII）、抑制性FcγRIIb、及/或FcRn之結合。

在一些實施例中，包含Ig恆定區或Ig恆定區之片段的多特異性抗體在Ig恆定區或Ig恆定區之片段中包含至少一個突變。

在一些實施例中，至少一個突變係在Fc區中。

在一些實施例中，包含Ig恆定區或Ig恆定區之片段的多特異性抗體在Fc區中包含至少一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、或十五個突變。

在一些實施例中，包含Ig恆定區或Ig恆定區之片段的多特異性抗體在Fc區中包含調節抗體與FcRn之結合的至少一個突變。

可經突變以調節半衰期（例如與FcRn之結合）的Fc位置包括位置250、252、253、254、256、257、307、376、380、428、434、及435。可單獨或組合進行的例示性突變係突變T250Q、M252Y、I253A、S254T、T256E、P257I、T307A、D376V、E380A、M428L、H433K、N434S、N434A、N434H、N434F、H435A、及H435R。可進行以增加半衰期的例示性單一或組合突變係突變M428L/N434S、M252Y/S254T/T256E、T250Q/M428L、N434A、及T307A/E380A/N434A。可進行以減少半衰期的例示性單一或組合突變係突變H435A、P257I/N434H、D376V/N434H、M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F、T308P/N434A、及H435R。

在一些實施例中，包含Ig恆定區或Ig恆定區之片段的多特異性抗體包含M252Y/S254T/T256E突變。

在一些實施例中，包含Ig恆定區或Ig恆定區之片段的多特異性抗體在Fc區中包含至少一個突變，其減少蛋白質與活化性Fcγ受體(FcγR)之結合且/或降低Fc效應功能（諸如C1q結合、補體依賴性細胞毒性(CDC)、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)或吞噬作用(ADCP)）。

可經突變以減少蛋白質與活化性FcγR之結合並隨後降低效應功能的Fc位置包括位置214、233、234、235、236、237、238、265、267、268、270、295、297、309、327、328、329、330、331、及365。可單獨或組合進行的例示性突變係IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4中之突變K214T、E233P、L234V、L234A、G236之缺失、V234A、F234A、L235A、G237A、P238A、P238S、D265A、S267E、H268A、H268Q、Q268A、N297A、A327Q、P329A、D270A、Q295A、V309L、A327S、L328F、A330S、及P331S之缺失。

導致具有降低之ADCC之蛋白質的例示性組合突變係以下突變：IgG1上之L234A/L235A、IgG1上之L234A/L235A/D265S、IgG2上之V234A/G237A/ P238S/H268A/V309L/A330S/P331S、IgG4上之F234A/L235A、IgG4上之S228P/F234A/ L235A、所有Ig同型上之N297A、IgG2上之V234A/G237A、IgG1上之K214T/E233P/ L234V/L235A/G236-缺失/A327G/P331A/D365E/L358M、IgG2上之H268Q/V309L/A330S/P331S、IgG1上之S267E/L328F、IgG1上之L234F/L235E/D265A、IgG1上之L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S、IgG4上之S228P/F234A/L235A/G237A/P238S、及IgG4上之S228P/F234A/L235A/G236-缺失/G237A/P238S。亦可使用混成IgG2/4 Fc域，諸如具有來自IgG2之殘基117至260、及來自IgG4之殘基261至447的Fc。

導致具有降低之CDC之蛋白質的例示性突變係K322A突變。

熟知的S228P突變可在IgG4中進行以增強IgG4穩定性。

在一些實施例中，包含Ig恆定區或Ig恆定區之片段的多特異性抗體包含選自由下列所組成之群組的至少一個突變：K214T、E233P、L234V、L234A、G236之缺失、V234A、F234A、L235A、G237A、P238A、P238S、M252Y、S254T、T256E、D265A、S267E、H268A、H268Q、Q268A、N297A、A327Q、P329A、D270A、Q295A、V309L、A327S、L328F、K322、A330S、P331S、T366W、T366S、L368A、Y407V、H318R、及Y319F。

在一些實施例中，Ig恆定區或Ig恆定區之片段包含L234A及L235突變。

在一些實施例中，Fc域或Fc域之片段包含至少一個突變以減少Fc與Fcγ受體之結合。在一些實施例中，Fc域或Fc域之片段包含對應於L234A、L235A、及D265S之突變。在一個實施例中，多特異性抗體包含SEQ ID NO:89中所示之變體IgG。在一個實施例中，多特異性抗體包含SEQ ID NO:79。在一個實施例中，多特異性抗體包含SEQ ID NO:90中所示之Fc域。在一個實施例中，多特異性抗體包含SEQ ID NO:83。

在一些實施例中，Fc域或Fc域之片段包含至少一個突變以延長多特異性結合分子之半衰期。在一些實施例中，Fc域或Fc域之片段包含對應於M252Y、S254T、及T256E之突變。在一個實施例中，多特異性抗體包含SEQ ID NO:89中所示之變體IgG。在一個實施例中，多特異性抗體包含SEQ ID NO:79。在一個實施例中，多特異性抗體包含SEQ ID NO:90中所示之Fc域。在一個實施例中，多特異性抗體包含SEQ ID NO:83。

在一些實施例中，Fc域或Fc域之片段包含至少一個突變以促進異二聚化。在一些實施例中，Fc域或Fc域之片段包含對應於T366W之突變。在一個實施例中，多特異性抗體包含SEQ ID NO:89中所示之變體IgG。在一個實施例中，多特異性抗體包含SEQ ID NO:79。在一些實施例中，Fc域或Fc域之片段包含對應於T366S、L368A、及Y407V之突變。在一個實施例中，多特異性抗體包含SEQ ID NO:90中所示之Fc域。在一個實施例中，多特異性抗體包含SEQ ID NO:83。

在一些實施例中，Fc域或Fc域之片段包含至少一個突變以減少Fc與蛋白質A之結合。在一些實施例中，Fc域或Fc域之片段包含對應於H435R及Y436F之突變。在一個實施例中，多特異性抗體包含SEQ ID NO:90中所示之Fc域。在一個實施例中，多特異性抗體包含SEQ ID NO:83。

在一些實施例中，包含Ig恆定區或Ig恆定區之片段的多特異性抗體在Fc區中包含至少一個突變，其增强蛋白質與Fcγ受體(FcγR)之結合且/或增強Fc效應功能（諸如C1q結合、補體依賴性細胞毒性(CDC)、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)及/或吞噬作用(ADCP)）。

可經突變以增加蛋白質與活化性FcγR之結合且/或增強Fc效應功能的Fc位置包括位置236、239、243、256、290,292、298、300、305、312、326、330、332、333、334、345、360、339、378、396、或430（殘基編號係根據EU索引）。可單獨或組合進行的例示性突變係G236A、S239D、F243L、T256A、K290A、R292P、S298A、Y300L、V305L、K326A、A330K、I332E、E333A、K334A、A339T、及P396L。導致具有增加之ADCC或ADCP之蛋白質的例示性組合突變係S239D/I332E、S298A/E333A/K334A、F243L/R292P/Y300L、F243L/R292P/Y300L/P396L、F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L、及G236A/S239D/I332E。

可經突變以增強CDC的Fc位置包括位置267、268、324、326、333、345、及430。可單獨或組合進行的例示性突變係S267E、F1268F、S324T、K326A、K326W、E333A、E345K、E345Q、E345R、E345Y、E430S、E430F、及E430T。導致具有增加之CDC之蛋白質的例示性組合突變係K326A/E333A、K326W/E333A、H268F/S324T、S267E/H268F、S267E/S324T、及S267E/H268F/S324T。 SEQ ID NO:85 –野生型IgG1 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:86 –野生型IgG2 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:87 –野生型IgG4 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK SEQ ID NO:88 – IgG衍生物 EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:89–具有以粗體表示之變體之IgG衍生物 EPKSSDKTHTCPPCPAPE AAGGPSVFLFPPKPKDTL YI TR EPEVTCVVV SVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSL WCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:90–具有以粗體表示之變體之IgG1 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE AAGGPSVFLFPPKPKDTL YI TR EPEVTCVVV SVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSL SC AVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL VSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN RFTQKSLSLSPGK

抗體與FcγR或FcRn之結合可在經工程改造以表現各受體之細胞上使用流動式細胞測量術來評定。在一例示性結合檢定中，將每孔2x10 ⁵個細胞接種於96孔盤中，且在4℃下在BSA染色緩衝液(BD Biosciences, San Jose, USA)中阻斷30 min。將細胞與測試抗體在冰上在4℃下培養1.5小時。用BSA染色緩衝液洗滌兩次之後，將細胞與經R-PE標記之抗人類IgG二級抗體(Jackson Immunoresearch Laboratories)在4℃下培養45 min。將細胞在染色緩衝液中洗滌兩次，且接著再懸浮於150 µL含有1:200稀釋之DRAQ7活/死染色劑之染色緩衝液(Cell Signaling Technology, Danvers, USA)中。經染色細胞之PE及DRAQ7信號係藉由Miltenyi MACSQuant流動式細胞測量儀(Miltenyi Biotec, Auburn, USA)分別使用B2及B4通道來偵測。以DRAQ7排除對活細胞進行閘控(gated)，且判定收集之至少10,000個活事件之幾何平均螢光信號。將FlowJo軟體(Tree Star)用於分析。將數據繪製為抗體濃度之對數對平均螢光信號。執行非線性迴歸分析。多特異性蛋白質之產生

多特異性蛋白質可使用Fab臂交換產生，其中在促進體外Fab臂交換之Ig恆定區CH3域內將取代引入兩個單特異性二價抗體中。在該等方法中，兩個單特異性二價抗體經工程改造以在CH3域具有某些促進異二聚體穩定性之取代；該等抗體係在足以讓鉸鏈區中之半胱胺酸進行雙硫鍵異構化的還原條件下一起培養；從而藉由Fab臂交換來產生該雙特異性抗體。培養條件可最佳地被回復至非還原性(non-reducing)。可使用之例示性還原劑係2-巰基乙胺(2-MEA)、二硫蘇糖醇(dithiothreitol, DTT)、二硫赤蘚醇(dithioerythritol, DTE)、麩胱甘肽、參(2-羧乙基)膦(TCEP)、L-半胱胺酸、及β-巰基乙醇，還原劑較佳係選自由下列所組成之群組：2-巰基乙胺、二硫蘇糖醇、及參(2-羧乙基)膦。舉例而言，可使用在至少20℃之溫度且有至少25 mM之2-MEA存在下或於至少0.5 mM之二硫蘇糖醇存在且在5至8之pH下（例如在7.0之pH下或在7.4之pH下）培養至少90 min。

可使用之CH3突變包括諸如下列之技術：鈕扣(Knob-in-Hole)突變(Genentech)、靜電吸引突變(Chugai, Amgen, NovoNordisk, Oncomed)、鏈交換工程改造之域體(Strand Exchange Engineered Domain body, SEEDbody) (EMD Serono)、Duobody®突變(Genmab)、及其他不對稱突變（例如Zymeworks）。

鈕扣突變係揭示於例如WO1996/027011中且包括在CH3區之界面上的突變，其中具有小側鏈之胺基酸（孔）被導入第一CH3區且具有大側鏈之胺基酸（鈕）被導入第二CH3區，導致在第一CH3區與第二CH3區之間的優先交互作用。形成鈕及孔之例示性CH3區突變係T366Y/F405A、T366W/F405W、F405W/Y407A、T394W/Y407T、T394S/Y407A、T366W/T394S、F405W/T394S及T366W/T366S_L368A_Y407V。

重鏈異二聚體形成可藉由使用藉由取代在第一CH3區上的帶正電殘基及在第二CH3區上的帶負電殘基之靜電交互作用來促進，如US2010/0015133、US2009/0182127、US2010/028637或US2011/0123532中所述。

可用於促進重鏈異二聚化之其他不對稱突變係L351Y_F405A_Y407V/T394W、T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V、T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V、L351Y_Y407A/T366A_K409F、L351Y_Y407A/T366V_K409F、Y407A/T366A_K409F、或T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W，如US2012/0149876或US2013/0195849 (Zymeworks)中所述。

SEEDbody突變涉及用IgA殘基取代選定IgG殘基以促進重鏈異二聚化，如US20070287170中所述。

可使用的其他例示性突變係R409D_K370E/D399K_E357K、S354C_T366W/Y349C_ T366S_L368A_Y407V、Y349C_T366W/S354C_T366S_L368A_Y407V、T366K/L351D、L351K/Y349E、L351K/Y349D、L351K/L368E、L351Y_Y407A/T366A_K409F、L351Y_Y407A/T366V_K409F、K392D/D399K、K392D/ E356K、K253E_D282K_K322D/D239K_E240K_K292D、K392D_K409D/D356K_D399K，如WO2007/147901、WO 2011/143545、WO2013157954、WO2013096291及US2018/0118849中所述。

Duobody®突變(Genmab)係揭示於例如US9150663及US2014/0303356中，且包括突變F405L/K409R、野生型/F405L_R409K、T350I_K370T_F405L/K409R、K370W/K409R、D399AFGHILMNRSTVWY/K409R、T366ADEFGHILMQVY/K409R、L368ADEGHNRSTVQ/K409AGRH、D399FHKRQ/K409AGRH、F405IKLSTVW/K409AGRH、及Y407LWQ/K409AGRH。

額外的雙特異性或多特異性結構包括雙可變域免疫球蛋白(DVD)（國際專利公開案第WO2009/134776號；DVD為全長抗體，其包含具有結構VH1-連接子-VH2-CH之重鏈及具有結構VL1-連接子-VL2-CL之輕鏈；連接子係可選的）、包括各種二聚化結構域以連接二個具有不同特異性之抗體臂的結構，諸如白胺酸拉鍊或膠原蛋白二聚化結構域（國際專利公開案第WO2012/022811號、美國專利第5,932,448號；美國專利第6,833,441號）、二或更多個域抗體(dAb)接合在一起、雙價抗體、僅重鏈抗體（諸如駱駝抗體及經工程改造駱駝抗體）、Dual Targeting (DT)-Ig (GSK/Domantis)、二合一抗體(Genentech)、交聯Mab (Karmanos Cancer Center)、mAb2 (F-Star)及CovX-body (CovX/Pfizer)、類IgG雙特異性抗體(InnClone/Eli Lilly)、Ts2Ab (MedImmune/AZ)及BsAb (Zymogenetics)、HERCULES (Biogen Idec)及TvAb (Roche)、ScFv/Fc融合(Academic Institution)、SCORPION (Emergent BioSolutions/Trubion, Zymogenetics/BMS)、雙親和力重靶向技術(Fc-DART) (MacroGenics)、及Dual(ScFv) ₂-Fab (National Research Center for Antibody Medicine--China)、Dual-Action或Bis-Fab (Genentech)、Dock-and-Lock (DNL) (ImmunoMedics)、Bivalent Bispecific (Biotecnol)、及Fab-Fv (UCB-Celltech)。基於ScFv之抗體、基於雙價抗體之抗體及域抗體包括但不限於Bispecific T Cell Engager (BiTE) (Micromet)、Tandem Diabody (Tandab) (Affimed)、Dual Affinity Retargeting Technology (DART) (MacroGenics)、Single-chain Diabody (Academic)、TCR-like Antibodies (AIT, ReceptorLogics)、Human Serum Albumin ScFv Fusion (Merrimack)及COMBODY (Epigen Biotech)、雙靶向奈米抗體(Ablynx)、僅雙靶向重鏈域抗體(dual targeting heavy chain only domain antibody)。

在一些實施例中，多特異性蛋白質包含三個多肽鏈。在此類設計中，至少一個抗原結合域係呈scFv之形式。例示性設計包括（其中「1」指示第一抗原結合域，「2」指示第二抗原結合域，且「3」指示第三抗原結合域）：設計1：鏈A) scFv1- CH2-CH3；鏈B) VL2-CL；鏈C) VH2-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 設計2：鏈A) scFv1-鉸鏈-CH2-CH3；鏈B) VL2-CL；鏈C) VH2-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 設計3：鏈A) scFv1- CH1-鉸鏈-CH2-CH3；鏈B) VL2-CL；鏈C) VH2-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 設計4：鏈A) CH2-CH3-scFv1；鏈B) VL2-CL；鏈C) VH2-CH1-鉸鏈-CH2-CH3

可將CH3工程改造併入設計1至4中，諸如突變L351Y_F405A_Y407V/T394W、T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V、T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V、L351Y_Y407A/T366A_K409F、L351Y_Y407A/T366V_K409F、Y407A/T366A_K409F、或T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W，如US2012/0149876或US2013/0195849 (Zymeworks)中所述。與免疫球蛋白(Ig)恆定區或Ig恆定區之片段的接合

在一些實施例中，本揭露之CD79b結合臂及/或CD22結合臂係接合至Ig恆定區或Ig恆定區之片段，以賦予類抗體性質，包括Fc效應功能C1q結合、補體依賴性細胞毒性(CDC)、Fc受體結合、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、吞噬作用、或下調細胞表面受體（例如B細胞受體；BCR）。Ig恆定區或Ig恆定區之片段亦作用為如本文所論述之半衰期延長部份。本揭露之結合CD79b之抗原結合域可使用標準方法工程改造為習知全長抗體。包含結合CD79b之抗原結合域的全長抗體可如本文所述經進一步工程改造。

在一些實施例中，免疫球蛋白重鏈恆定區包含子域CH1、鉸鏈、CH2、及CH3。在一些實施例中，在重鏈上，CH1域橫跨殘基A118至V215，CH2域橫跨殘基A231至K340，且CH3域橫跨殘基G341至K447，殘基編號係根據EU索引。在一些情況下，G341被稱為CH2域殘基。鉸鏈通常係定義為包括人類IgG1之E216且終止於P230。在一些實施例中，Ig Fc區至少包含Ig恆定區之CH2及CH3域，且因此包含Ig重鏈恆定區之約A231至K447之至少一個區域。

本發明亦提供一種結合CD79b之抗原結合域，其接合至免疫球蛋白(Ig)恆定區或Ig恆定區之片段。

在一些實施例中，Ig恆定區係重鏈恆定區。

在一些實施例中，Ig恆定區係輕鏈恆定區。

在一些實施例中，Ig恆定區之片段包含Fc區。

在一些實施例中，Ig恆定區之片段包含CH2域。

在一些實施例中，Ig恆定區之片段包含CH3域。

在一些實施例中，Ig恆定區之片段包含CH2域及CH3域。

在一些實施例中，Ig恆定區之片段包含鉸鏈之至少一部分、CH2域、及CH3域。鉸鏈之部分係指Ig鉸鏈之一或多個胺基酸殘基。

在一些實施例中，Ig恆定區之片段包含鉸鏈、CH2域、及CH3域。

在一些實施例中，結合CD79b之抗原結合域係接合至Ig恆定區或Ig恆定區之片段的N端。

在一些實施例中，結合CD79b之抗原結合域係接合至Ig恆定區或Ig恆定區之片段的C端。

在一些實施例中，CD79b結合臂及/或CD22結合臂係經由第二連接子(L2)接合至Ig恆定區或Ig恆定區之片段。

在一些實施例中，L2包含SEQ ID NO: 79至112之胺基酸序列。

接合至Ig恆定區或Ig恆定區之片段的本揭露之結合CD79b之抗原結合域可使用數種已知檢定評估其功能性。與CD79b或CD22之結合可使用本文所述之方法評估。由Ig恆定域或Ig恆定區之片段（諸如Fc區）賦予的經改變性質可在Fc受體結合檢定中使用受體（諸如FcγRI、FcγRII、FcγRIII、或FcRn受體）之可溶形式來檢定，或使用測量例如ADCC、CDC、或ADCP的基於細胞之檢定來檢定。

ADCC可使用體外檢定使用CD79b或CD22表現性細胞作為目標細胞且NK細胞作為效應細胞來評估。細胞裂解可藉由從裂解細胞中釋放標示（例如放射性物質、螢光染料、或天然胞內蛋白質）來偵測。在一例示性檢定中，目標細胞係以1個目標細胞對4個效應細胞之比率使用。將目標細胞用BATDA預標示，並與效應細胞及測試抗體組合。將樣本培養2小時，且藉由測量釋放至上清液中之BATDA來測量細胞裂解。將數據相對於使用0.67% Triton X-100 (Sigma Aldrich)的最大細胞毒性及在沒有任何抗體的情況下由目標細胞自發釋放的BATDA所判定之最小對照值正規化。

ADCP可藉由使用單核球衍生之巨噬細胞作為效應細胞且任何CD79b表現性細胞作為目標細胞來評估，該等目標細胞經工程改造以表現GFP或其他經標示分子。在一例示性檢定中，效應細胞：目標細胞比可為例如4:1。可將效應細胞與目標細胞在存在或不存在本發明之抗體的情況下一起培養4小時。培養後，使用細胞剝離液(accutase)將細胞分離。巨噬細胞可用偶接螢光標記的抗CD11b及抗CD14抗體來鑑定，且吞噬作用百分比可根據在該等CD11 ⁺CD14 ⁺巨噬細胞中的GFP螢光百分比使用標準方法判定。

細胞之CDC可例如藉由下列方式測量：將道迪(Daudi)細胞以1×10 ⁵個細胞/孔（50 µL/孔）接種於RPMI-B（補充有1% BSA之RPMI）中，將50 µL的測試蛋白質添加至孔中使最終濃度在0至100 µg/mL之間，將反應在室溫下培養15 min，將11 µL的匯集人類血清添加至孔中，且將反應在37℃下培養45 min。裂解細胞百分比(%)可使用標準方法以FACS檢定中經碘化丙啶染色的細胞%來偵測。醣基工程改造(glycoengineering)

包含Ig恆定區或Ig恆定區片段的多特異性抗體介導ADCC之能力可藉由工程改造Ig恆定區或Ig恆定區之片段的寡糖組分而增強。人類IgG1或IgG3在Asn297經N-醣基化，其中大部分聚醣呈熟知的雙觸角G0、G0F、G1、G1F、G2、或G2F形式。含Ig恆定區之蛋白質可藉由一般具有約至少85%之聚醣岩藻醣含量的未經工程改造之CHO細胞生產。將核心岩藻醣自附接至包含Ig恆定區或Ig恆定區之片段的多特異性抗體的雙觸角複合型寡醣移除，會經由改善之FcγRIIIa結合而不改變抗原結合或CDC活性來增強蛋白質之ADCC。此類蛋白質可使用已報導會導致成功表現相對高量去岩藻醣基化(defucosylated)免疫球蛋白（帶有雙觸角複合型之Fc寡醣）的不同方法來達成，諸如控制培養滲透壓(Konno et al.,Cytotechnology 64:249-65, 2012)、應用變體CHO系Lec13作為宿主細胞系(Shields et al., J Biol Chem277:26733-26740, 2002)、應用變體CHO系EB66作為宿主細胞系(Olivier et al., MAbs; 2(4): 405-415, 2010; PMID:20562582)、應用大鼠融合瘤細胞系YB2/0作為宿主細胞系(Shinkawa et al., J Biol Chem278:3466-3473, 2003)、引入特異性針對1,6-岩藻醣基轉移酶( FUT8)基因之小干擾RNA (Mori et al., Biotechnol Bioeng88:901-908, 2004)、或共表現β-1,4- N-乙醯葡糖胺基轉移酶III與高基氏α-甘露糖苷酶II或強效α-甘露糖苷酶I抑制劑基夫鹼(kifunensine) (Ferrara et al., J Biol Chem281:5032-5036, 2006, Ferrara et al., Biotechnol Bioeng93:851-861, 2006; Xhou et al., Biotechnol Bioeng99:652-65, 2008)。

在一些實施例中，本揭露之包含Ig恆定區或Ig恆定區之片段的多特異性抗體具有雙觸角聚醣結構，其岩藻醣含量係約在1%至約15%之間，例如約15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、或1%。在一些實施例中，包含Ig恆定區或Ig恆定區之片段的多特異性抗體具有聚醣結構，其岩藻醣含量係約50%、40%、45%、40%、35%、30%、25%、或20%。

「岩藻醣含量(fucose content)」意指Asn297處糖鏈內岩藻醣單醣之量。岩藻醣之相對量係含岩藻醣結構相對於所有醣結構的百分比。此等可藉由多種方法表徵及定量，例如：1)使用經N-醣苷酶F (N-glycosidase F)處理之樣本（例如複合、雜合、及寡及高甘露糖(oligo- and high-mannose)結構）的MALDI-TOF，如描述於國際專利公開案第WO2008/077546 2號）；2)酶促釋放Asn297聚醣、及後續的衍生化及藉由HPLC (UPLC)以螢光偵測及/或HPLC-MS (UPLC-MS)的偵測/定量；3)天然或還原mAb的完整蛋白質分析，將Asn297聚醣用Eno S或其他在第一GlcNAc單醣與第二GlcNAc單醣之間切割而使岩藻醣附接至第一GlcNAc的酶處理或不處理；4)藉由酶消化法(enzymatic digestion)（例如胰蛋白酶或內肽酶Lys-C）將mAb消化成構成分肽(constituent peptide)，且隨後藉由HPLC-MS (UPLC-MS)分離、偵測、及定量；5)藉由以PNGase F在Asn 297處進行特異性酶促去醣基化(specific enzymatic deglycosylation)以將mAb寡醣自mAb蛋白分離。因此釋放之寡醣可用螢光團標示，藉由各種互補技術分離及識別，該等技術允許：藉由基質輔助雷射脫附游離(MALDI)質譜術比較實驗質量與理論質量以精細表徵聚醣結構、藉由離子交換HPLC (GlycoSep C)判定唾液酸化(sialylation)程度、藉由正相HPLC (GlycoSep N)根據親水性標準分離及定量寡醣形式、及藉由高效毛細管電泳-雷射誘導螢光(HPCE-LIF)分離及定量寡醣。

如本文中所使用，「低岩藻醣(low fucose)」或「低岩藻醣含量(low fucose content)」係指包含Ig恆定區或Ig恆定區之片段的多特異性抗體具有約在1%至15%之間的岩藻醣含量。

如本文中所使用，「正常岩藻醣(normal fucose)」或「正常岩藻醣含量(normal fucose content)」係指包含Ig恆定區或Ig恆定區之片段的多特異性抗體具有約超過50%，一般約超過80%、或超過85%的岩藻醣含量。抗獨特型抗體

本文提供抗獨特型，其結合至本揭露之包含CD79b結合臂及/或CD22結合臂之抗體。抗獨特型(Id)抗體係識別抗體之抗原決定位（例如互補位(paratope)或CDR）的抗體。Id抗體可為抗原阻斷或非阻斷的。抗原阻斷Id可用於偵測樣本中之游離抗原結合域（例如本揭露之結合CD79b之抗原結合域）。非阻斷Id可用於偵測樣本中的總抗體（游離的、部分結合至抗原的、或完全結合至抗原的）。Id抗體可藉由以正在製備抗Id的抗體免疫動物來製備。

抗Id抗體亦可用作為免疫原(immunogen)，以在又另一種動物中誘導免疫反應，產生所謂的抗-抗Id抗體(anti-anti-Id antibody)。抗-抗Id之表位可與誘導抗Id的原始抗原結合域之表位同一。因此，藉由使用抗原結合域的獨特型決定位(idiotypic determinant)之抗體，可以識別表現具有相同特異性之抗原結合域的其他殖株。抗Id抗體可藉由任何合適的技術加以變化（藉以生產抗Id抗體變體）及/或衍生化，諸如本文別處所述之技術。免疫接合物

本揭露之抗體、CD79b結合臂、及/或CD22結合臂可接合至異源分子。在一些實施例中，異源分子係可偵測標示或治療劑。

在一些實施例中，本揭露提供一種蛋白質，其包含接合至可偵測標示的CD79b結合臂。在一些實施例中，本揭露提供一種蛋白質，其包含接合至可偵測標示的CD22結合臂。在一些實施例中，本揭露提供一種蛋白質，其包含接合至可偵測標示的CD79b結合臂及CD22結合臂。

在一些實施例中，本揭露提供一種蛋白質，其包含接合至治療劑的CD79b結合臂。在一些實施例中，本揭露提供一種蛋白質，其包含接合至治療劑的CD22結合臂。在一些實施例中，本揭露提供一種蛋白質，其包含接合至治療劑的CD79b結合臂及CD22結合臂。

在一些實施例中，可偵測標示亦係治療劑。

接合至可偵測標示的本揭露之蛋白質可用於評估各種樣本上的CD79b及/或CD22表現。可偵測標示包括當接合至本揭露之包含CD79b結合臂及/或CD22結合臂之蛋白質時使後者變為可偵測（經由光譜學、光化學、生物化學、免疫化學、或化學手段）的組成物。

例示性可偵測標示包括放射性同位素、磁珠、金屬珠、膠態粒子、螢光染料、電子緻密試劑、酶（例如常用於ELISA中）、生物素、長葉毛地黃配質、半抗原(hapten)、發光分子、化學發光分子、螢光染料、螢光團、螢光淬熄劑、有色分子、放射性同位素、閃爍劑(scintillate)、卵白素、鏈黴親和素、蛋白質A、蛋白質G、抗體或其片段、多組胺酸、Ni ²⁺、Flag標籤、myc標籤、重金屬、酶、鹼性磷酸酶、過氧化酶、螢光素酶、電子供體/受體、吖啶酯、及比色受質。

可偵測標示可自發地發射信號，諸如在可偵測標示為放射性同位素時。在其他情況下，可偵測標示由於外部場刺激而發射信號。

例示性放射性同位素可為γ發射性、鄂惹發射性(Auger-emitting)、β發射性、α發射性、或正電子發射性放射性同位素。例示性放射性同位素包括 ³H、 ¹¹C、 ¹³C、 ¹⁵N、 ¹⁸F、 ¹⁹F、 ⁵⁵Co、 ⁵⁷Co、 ⁶⁰Co、 ⁶¹Cu、 ⁶²Cu、 ⁶⁴Cu、 ⁶⁷Cu、 ⁶⁸Ga、 ⁷²As、 ⁷⁵Br、 ⁸⁶Y、 ⁸⁹Zr、 ⁹⁰Sr、 ^94mTc、 ^99mTc、 ¹¹⁵In、 ¹²³1、 ¹²⁴1、 ¹²⁵I、 ¹³¹1、 ²¹¹At、 ²¹²Bi、 ²¹³Bi、 ²²³Ra、 ²²⁶Ra、 ²²⁵Ac、及 ²²⁷Ac。

例示性金屬原子係原子序大於20之金屬，諸如鈣原子、鈧原子、鈦原子、釩原子、鉻原子、錳原子、鐵原子、鈷原子、鎳原子、銅原子、鋅原子、鎵原子、鍺原子、砷原子、硒原子、溴原子、氪原子、銣原子、鍶原子、釔原子、鋯原子、鈮原子、鉬原子、鎝原子、釕原子、銠原子、鈀原子、銀原子、鎘原子、銦原子、錫原子、銻原子、碲原子、碘原子、氙原子、銫原子、鋇原子、鑭原子、鉿原子、鉭原子、鎢原子、錸原子、鋨原子、銥原子、鉑原子、金原子、汞原子、鉈原子、鉛原子、鉍原子、鍅原子、鐳原子、錒原子、鈰原子、鐠原子、釹原子、鉕原子、釤原子、銪原子、釓原子、鋱原子、鏑原子、鈥原子、鉺原子、銩原子、鐿原子、鎦原子、釷原子、鏷原子、鈾原子、錼原子、鈽原子、鋂原子、鋦原子、鉳原子、鉲原子、鑀原子、鐨原子、鍆原子、鍩原子、或鐒原子。

在一些實施例中，金屬原子可為原子序大於二十之鹼土金屬。

在一些實施例中，金屬原子可為鑭系元素。

在一些實施例中，金屬原子可為錒系元素。

在一些實施例中，金屬原子可為過渡金屬。

在一些實施例中，金屬原子可為貧金屬(poor metal)。

在一些實施例中，金屬原子可為金原子、鉍原子、鉭原子、及釓原子。

在一些實施例中，金屬原子可係原子序為53（亦即碘）至83（亦即鉍）之金屬。

在一些實施例中，金屬原子可為適用於磁共振成像之原子。

金屬原子可為呈+1、+2、或+3氧化態形式之金屬離子，諸如Ba ²⁺、Bi ³⁺、Cs ⁺、Ca ²⁺、Cr ²⁺、Cr ³⁺、Cr ⁶⁺、Co ²⁺、Co ³⁺、Cu ⁺、Cu ²⁺、Cu ³⁺、Ga ³⁺、Gd ³⁺、Au ⁺、Au ³⁺、Fe ²⁺、Fe ³⁺、F ³⁺、Pb ²⁺、Mn ²⁺、Mn ³⁺、Mn ⁴⁺、Mn ⁷⁺、Hg ²⁺、Ni ²⁺、Ni ³⁺、Ag ⁺、Sr ²⁺、Sn ²⁺、Sn ⁴⁺、及Zn ²⁺。金屬原子可包含金屬氧化物，諸如氧化鐵、氧化錳、或氧化釓。

合適染料包括任何市售可得之染料，諸如例如5(6)-羧基螢光素、IRDye 680RD順丁烯二醯亞胺或IRDye 800CW、多吡啶釕染料、及類似者。

合適螢光團係螢光異硫氰酸鹽(FITC)、螢光素胺基硫脲(fluorescein thiosemicarbazide)、玫瑰紅(rhodamine)、Texas Red、CyDye（例如Cy3、Cy5、Cy5.5）、Alexa Fluor（例如Alexa488、Alexa555、Alexa594；Alexa647）、近紅外(NIR)（700至900 nm）螢光染料、及羰花青(carbocyanine)及胺基苯乙烯基染料。

接合至可偵測標示的本揭露之包含CD79b結合臂及/或CD22結合臂之蛋白質可用作顯像劑。

在一些實施例中，治療劑係細胞毒性劑。在一些實施例中，細胞毒性劑為化學治療劑、藥物、生長抑制劑、毒素（例如細菌、真菌、植物、或動物來源之酶促活性毒素或其片段）、或放射性同位素（即放射接合物(radioconjugate)）。

在一些實施例中，細胞毒性劑為道諾黴素(daunomycin)、多柔比星(doxorubicin)、胺甲喋呤(methotrexate)、長春地辛(vindesine)、細菌毒素諸如白喉毒素、蓖麻毒素、格爾德黴素(geldanamycin)、類美登素(maytansinoid)、或卡奇黴素(calicheamicin)。細胞毒性劑可藉由包括微管蛋白結合、DNA結合、或拓撲異構酶抑制之機制來誘發其細胞毒性效應及細胞生長抑制效應。

在一些實施例中，細胞毒性劑為酶促活性毒素，諸如白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈（來自綠膿桿菌( Pseudomonas aeruginosa)）、蓖麻毒素A鏈、雞母珠毒蛋白A鏈、莫迪素(modeccin) A鏈、α-帚曲霉素(alpha-sarcin)、油桐( Aleurites fordii)蛋白、石竹(dianthin)蛋白、美洲商陸( Phytolacca americana)蛋白（PAPI、PAPII、及PAP-S）、苦瓜( momordica charantia)抑制劑、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草( sapaonaria officinalis)抑制劑、多花白樹毒蛋白(gelonin)、絲林黴素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、伊諾黴素(enomycin)、及新月毒素(tricothecene)。

在一些實施例中，細胞毒性劑係放射性核種，諸如 ²¹²Bi、 ¹³¹I、 ¹³¹In、 ⁹⁰Y、及 ¹⁸⁶Re。

在一些實施例中，細胞毒性劑為尾海兔素(dolastatin)或尾海兔素肽類似物及衍生物、澳瑞他汀(auristatin)或單甲基澳瑞他汀苯丙胺酸。例示性分子係揭示於美國專利第5,635,483號及第5,780,588號中。尾海兔素及澳瑞他汀已顯示會干擾微管動力學、GTP水解、及核及細胞分裂(Woyke et al (2001) Antimicrob Agents and Chemother. 45(12):3580-3584)，且具有抗癌及抗真菌活性。尾海兔素或澳瑞他汀藥物部份可透過肽藥物部份之N（胺基）端或C（羧基）端附接至本發明之抗體(WO02/088172)，或經由任何半胱胺酸工程改造至抗體中。

本揭露之包含CD79b結合臂及/或CD22結合臂之蛋白質可使用已知方法接合至可偵測標示。

在一些實施例中，可偵測標示與螯合劑錯合。

在一些實施例中，可偵測標示係經由連接子接合至本揭露之CD79b結合蛋白質。

可使用已知方法將可偵測標示或細胞毒性部份直接或間接連接至本揭露之CD79b結合蛋白質。合適連接子為所屬技術領域中已知的，且包括例如輔基、非酚連接子（N-琥珀醯亞胺基苯甲酸酯；十二硼酸酯之衍生物）、巨環及非環狀螯合劑兩者之螯合部份，諸如1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10,四乙酸(DOTA)之衍生物、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)之衍生物、S-2-(4-異硫氰基苄基)-1,4,7-三氮雜環壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)之衍生物、及1,4,8,11-四氮雜環十二烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)之衍生物、N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯(SPDP)、亞胺基硫烷(IT)、亞胺酯(imidoester)之雙官能衍生物（諸如己亞胺酸二甲酯(dimethyl adipimidate) HCl）、活性酯（諸如二琥珀醯亞胺基辛二酸酯）、醛（諸如戊二醛）、雙疊氮化合物（諸如雙(對疊氮苯甲醯基)己二胺）、雙重氮衍生物（諸如雙(對重氮苯甲醯基)-乙二胺）、二異氰酸酯（諸如甲苯2,6-二異氰酸酯）、及雙活性氟化合物（諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯）、及其他螯合部份。合適肽連接子為熟知的。多核苷酸、宿主細胞、及載體

除了所述抗體、多特異性抗體、及抗原結合片段外，亦提供能夠編碼所述抗體、多特異性抗體、及抗原結合片段之多核苷酸序列。 編碼CD22 結合臂之多核苷酸

在一些實施例中，本揭露提供一種多核苷酸編碼，其包含編碼CD22結合臂之序列。在一些實施例中，多核苷酸編碼CD22結合臂，該結合臂包含重鏈互補決定區(HCDR) 1、HCDR2、及HCDR3。在一個實施例中，多核苷酸編碼CD22結合臂，該結合臂包含SEQ ID NO: 1之HCDR1。在一個實施例中，多核苷酸編碼CD22結合臂，該結合臂包含SEQ ID NO: 2之HCDR2。在一個實施例中，多核苷酸編碼CD22結合臂，該結合臂包含SEQ ID NO: 3之HCDR3。在一個實施例中，多核苷酸編碼CD22結合臂，該結合臂包含分別為SEQ ID NO: 1、2、及3之HCDR1、HCDR、及HCDR3。

在一些實施例中，多核苷酸編碼CD22結合臂，該結合臂包含輕鏈互補決定區(LCDR) 1、LCDR2、及LCDR3。在一個實施例中，多核苷酸編碼CD22結合臂，該結合臂包含SEQ ID NO: 4之LCDR1。在一個實施例中，多核苷酸編碼CD22結合臂，該結合臂包含SEQ ID NO: 5之LCDR2。在一個實施例中，多核苷酸編碼CD22結合臂，該結合臂包含SEQ ID NO: 6之LCDR3。在一個實施例中，多核苷酸編碼CD22結合臂，該結合臂包含分別為SEQ ID NO: 4、5、及6之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。

在一些實施例中，多核苷酸編碼CD22結合臂，該結合臂包含分別為SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、及6之HCDR1、HCDR、HCDR3、LCDR1、LCDR、及LCDR3。

在一些實施例中，多核苷酸編碼CD22結合臂，該結合臂包含SEQ ID NO:7之重鏈可變域(VH)。在一些實施例中，多核苷酸編碼CD22結合臂，該結合臂包含SEQ ID NO:8之輕鏈可變域(VL)。

在一些實施例中，多核苷酸編碼CD22結合臂，該結合臂包含SEQ ID NO:1之HCDR1、SEQ ID NO:2之HCDR2、SEQ ID NO:3之HCDR3、及SEQ ID NO:8之VL。在一些實施例中，多核苷酸編碼CD22結合臂，該結合臂包含SEQ ID NO:7之VH、SEQ ID NO:4之LCDR1、SEQ ID NO:5之LCDR2、及SEQ ID NO:6之LCDR3。

在一些實施例中，多核苷酸編碼CD22結合臂，該結合臂包含SEQ ID NO:7之VH及SEQ ID NO:8之VL。 編碼CD79b 結合臂之多核苷酸

在一些實施例中，本揭露提供一種多核苷酸編碼，其包含編碼CD79b結合臂之序列。

在一些實施例中，多核苷酸編碼CD79b結合臂，該結合臂包含HCDR1、HCDR2、及HCDR3。在一個實施例中，多核苷酸編碼CD79b結合臂，該結合臂包含SEQ ID NO: 9、17、25、33、41、49、或57之HCDR1。在一個實施例中，多核苷酸編碼CD79b結合臂，該結合臂包含SEQ ID NO: 10、18、26、34、42、50、或58之HCDR2。在一個實施例中，多核苷酸編碼CD79b結合臂，該結合臂包含SEQ ID NO: 11、19、27、35、43、51、或59之HCDR3。

在一個實施例中，多核苷酸編碼CD79b結合臂，該結合臂包含SEQ ID NO: 9、17、25、33、41、49、或57之HCDR1；SEQ ID NO: 10、18、26、34、42、50、或58之HCDR2；及SEQ ID NO: 11、19、27、35、43、51、或59之HCDR3。在一個實施例中，多核苷酸編碼CD79b結合臂，該結合臂包含下列之HCDR1、HCDR2、及HCDR3：分別為SEQ ID NO: 9、10、及11；分別為SEQ ID NO: 17、18、及19；分別為SEQ ID NO: 25、26、及27；分別為SEQ ID NO: 33、34、及35；分別為SEQ ID NO: 41、42、及43；分別為SEQ ID NO: 49、50、及51；或分別為SEQ ID NO: 57、58、及59。

在一些實施例中，多核苷酸編碼CD79b結合臂，該結合臂包含LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一個實施例中，多核苷酸編碼CD79b結合臂，該結合臂包含SEQ ID NO: 12、20、28、36、44、52、或60之LCDR1。在一個實施例中，多核苷酸編碼CD79b結合臂，該結合臂包含SEQ ID NO: 13、21、29、37、45、53、或61之LCDR2。在一個實施例中，多核苷酸編碼CD79b結合臂，該結合臂包含SEQ ID NO: 14、22、30、38、46、54、或62之LCDR3。在一個實施例中，多核苷酸編碼CD79b結合臂，該結合臂包含下列之LCDR1、LCDR2、及LCDR3：分別為SEQ ID NO: 12、13、及14；分別為SEQ ID NO: 20、21、及22；分別為SEQ ID NO: 28、29、及30；分別為SEQ ID NO: 36、37、及38；分別為SEQ ID NO: 44、45、及46；分別為SEQ ID NO: 52、53、及54；或分別為SEQ ID NO: 60、61、及62。

在一些實施例中，多核苷酸編碼CD79b結合臂，該結合臂包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一個實施例中，多核苷酸編碼CD79b結合臂，該結合臂包含SEQ ID NO: 9、17、25、33、41、49、或57之HCDR1。在一個實施例中，多核苷酸編碼CD79b結合臂，該結合臂包含SEQ ID NO: 10、18、26、34、42、50、或58之HCDR2。在一個實施例中，多核苷酸編碼CD79b結合臂，該結合臂包含SEQ ID NO: 11、19、27、35、43、51、或59之HCDR3。在一個實施例中，多核苷酸編碼CD79b結合臂，該結合臂包含SEQ ID NO: 12、20、28、36、44、52、或60之LCDR1。在一個實施例中，多核苷酸編碼CD79b結合臂，該結合臂包含SEQ ID NO: 13、21、29、37、45、53、或61之LCDR2。在一個實施例中，多核苷酸編碼CD79b結合臂，該結合臂包含SEQ ID NO: 14、22、30、38、46、54、或62之LCDR3。在一個實施例中，多核苷酸編碼CD79b結合臂，該結合臂包含下列之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3：分別為SEQ ID NO: 9、10、11、12、13、及14；分別為SEQ ID NO: 17、18、19、20、21、及22；分別為SEQ ID NO: 25、26、27、28、29、及30；分別為SEQ ID NO: 33、34、35、36、37、及38；分別為SEQ ID NO: 41、42、43、44、45、及46；分別為SEQ ID NO: 49、50、51、52、53、及54；或分別為SEQ ID NO: 57、58、59、60、61、及62。

在一些實施例中，多核苷酸編碼包含VH之CD79b結合臂。在一個實施例中，多核苷酸編碼CD79b結合臂，該結合臂包含SEQ ID NO: 15、23、31、39、47、55、63、或80之VH。在一些實施例中，多核苷酸編碼包含VL之CD79b結合臂。在一個實施例中，多核苷酸編碼CD79b結合臂，該結合臂包含SEQ ID NO: 16、24、32、40、48、56、64、或81之VL。

在一個實施例中，多核苷酸編碼CD79b結合臂，該結合臂包含SEQ ID NO: 9、17、25、33、41、49、或57之HCDR1；SEQ ID NO: 10、18、26、34、42、50、或58之HCDR2；SEQ ID NO: 11、19、27、35、43、51、或59之HCDR3；及SEQ ID NO: 16、24、32、40、48、56、64、或81之VL。

在一個實施例中，多核苷酸編碼CD79b結合臂，該結合臂包含SEQ ID NO: 15、23、31、39、47、55、63、或80之VH；SEQ ID NO: 12、20、28、36、44、52、或60之LCDR1；SEQ ID NO: 13、21、29、37、45、53、或61之LCDR2；及SEQ ID NO: 14、22、30、38、46、54、或62LCDR3。

在一個實施例中，多核苷酸編碼包含VH及VL之CD79b結合臂。在一個實施例中，多核苷酸編碼包含下列之VH及VL之CD79b結合臂：分別為SEQ ID NO: 15及16；分別為SEQ ID NO: 23及24；分別為SEQ ID NO: 31及32；分別為SEQ ID NO: 39及40；分別為SEQ ID NO: 47及48；分別為SEQ ID NO: 55及56；分別為SEQ ID NO: 63及64；或分別為SEQ ID NO: 80及81。

在一個實施例中，編碼CD79b結合臂或其片段之多核苷酸包含編碼VH之序列，該VH包含SEQ ID NO:65、68、70、73、75、或77之序列。在一個實施例中，編碼CD79b結合臂或其片段之多核苷酸包含編碼VL之序列，該VL包含SEQ ID NO:66、67、69、71、72、74、76、或78之序列。在一個實施例中，編碼CD79b結合臂之多核苷酸包含編碼VH之序列及編碼VL之序列，其包含：分別為SEQ ID NO: 65及66；分別為SEQ ID NO: 65及67；分別為SEQ ID NO: 68及69；分別為SEQ ID NO: 70及71；分別為SEQ ID NO: 70及72；分別為SEQ ID NO: 73及74；分別為SEQ ID NO: 75及76；或分別為SEQ ID NO: 77及78。 載體及宿主細胞

亦提供包含所述多核苷酸之載體，如表現本文中所提供之抗體、多特異性抗體、或抗原結合片段的細胞。亦描述能夠表現所揭示載體之細胞。此等細胞可係哺乳動物細胞（諸如293F細胞、CHO細胞）、昆蟲細胞（諸如Sf7細胞）、酵母菌細胞、植物細胞、或細菌細胞（諸如大腸桿菌）。所述抗體亦可藉由融合瘤細胞來生產。所述抗體亦可重組生產。

編碼重組抗原結合蛋白質之多核苷酸亦在本揭露之範疇內。在一些實施例中，所述多核苷酸（及彼等所編碼之肽）包括前導序列(leader sequence)。可採用所屬技術領域中所習知的任何前導序列。前導序列可包括但不限於限制部位(restriction site)或轉譯起始部位(translation start site)。

亦提供包含本文中所述之多核苷酸的載體。該等載體可為表現載體(expression vector)。含有編碼所關注之多肽的序列之重組表現載體因而被考慮為在本揭露之範疇內。該表現載體可含有一或多個額外序列，諸如但不限於調節序列（例如，啟動子、增強子）、選擇標記、及多腺核苷酸化信號。用於轉形廣泛各種宿主細胞之載體係廣為周知，並且包括但不限於質體、噬菌體質體(phagemid)、黏質體(cosmid)、桿狀病毒、桿粒(bacmid)、人造細菌染色體(BAC)、人造酵母菌染色體(YAC)、以及其他細菌、酵母及病毒載體。

本實施方式之範疇內的重組表現載體包括編碼至少一種與合適調節元件可操作地連接之重組蛋白質的合成性、基因體性、或cDNA衍生性核酸片段。此類調節元件可包括轉錄啟動子、編碼合適mRNA核糖體結合部位之序列、及控制轉錄及轉譯之終止的序列。表現載體（特別是哺乳動物表現載體）亦可包括一或多個非轉錄元件，諸如複製起點、連接至待表現基因之合適啟動子及增強子、其他5'或3'側翼(flanking)非轉錄序列、5'或3'非轉譯序列（諸如必要的核糖體結合部位）、多腺核苷酸化部位、剪接供體及受體部位、或轉錄終止序列。亦可併入賦予在宿主中複製之能力的複製起源。

在用於轉形脊椎動物細胞之表現載體中的轉錄及轉譯控制序列可由病毒來源提供。例示性載體可如下列文獻所述建構：Okayama and Berg, 3 Mol. Cell. Biol. 280 (1983)。

在一些實施例中，多特異性抗體編碼序列或抗原結合片段編碼序列係置於強大組成性啟動子的控制之下，諸如下列基因的啟動子：次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(HPRT)、腺苷去胺酶、丙酮酸激酶、β肌動蛋白、人類肌凝蛋白、人類血紅素、人類肌肉肌酸、及其他。此外，許多病毒啟動子在真核細胞中組成性地發揮作用，並且適合搭配所述實施例使用。此類病毒啟動子包括但不限於巨細胞病毒(CMV)立即早期啟動子、SV40之早期及晚期啟動子、小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)啟動子、莫洛尼白血病病毒(Maloney leukemia virus)之長末端重複序列(LTR)、人類免疫缺乏病毒(HIV)、艾司坦-巴爾病毒(EBV)、勞氏肉瘤病毒(RSV)、及其他反轉錄病毒、及單純皰疹病毒之胸苷激酶啟動子。在一個實施例中，多特異性抗體編碼序列或多特異性結合片段編碼序列係置於誘導性啟動子的控制之下，諸如金屬硫蛋白啟動子、四環素誘導性啟動子、多西環素(doxycycline)誘導性啟動子、含有一或多種干擾素刺激反應元件(interferon-stimulated response element, ISRE)之啟動子（諸如蛋白激酶R 2',5'-寡腺苷酸合成酶）、Mx基因、ADAR1、及類似者。

本文中所述之載體可含有一或多個內部核糖體進入位點(IRES)。將IRES序列納入融合載體中可有利於增強一些蛋白質之表現。在一些實施例中，載體系統將包括一或多個多腺核苷酸化部位（例如SV40），其可在任何前述核酸序列之上游或下游。載體組分可相鄰地連接，或者以提供用於表現基因產物之最佳間隔的方式來排列（即藉由在ORF之間引入「間隔子(spacer)」核苷酸），或者以其他方式放置。調節元件（諸如IRES模體）亦可經排列以提供用於表現之最佳間隔。

該等載體可包含選擇標記，其為所屬技術領域中所廣為周知。選擇標記包括正選擇及負選擇標記，例如抗生素抗性基因（例如新黴素抗性基因、潮黴素抗性基因、康黴素(kanamycin)抗性基因、四環素抗性基因、青黴素抗性基因、嘌呤黴素抗性基因、殺稻瘟菌素(blasticidin)抗性基因）、麩胺酸合成酶基因、HSV-TK、用於更昔洛威(ganciclovir)選擇之HSV-TK衍生物、或用於6-甲基嘌呤選擇之細菌嘌呤核苷磷酸化酶基因(Gadi et al., 7 Gene Ther. 1738-1743 (2000))。編碼選擇標記或選殖位點之核酸序列可在編碼所關注多肽或選殖位點之核酸序列的上游或下游。

本文中所述之載體可用來以編碼所述抗體或抗原結合片段之基因轉形各種細胞。例如，載體可用於產生多特異性抗體或抗原結合片段生產細胞。因此，另一態樣的特點在於經載體轉形之宿主細胞，該載體包含編碼結合CD79b、CD20、及/或CD3之抗體或其抗原結合片段（諸如本文中所描述及例示之抗體或抗原結合片段）的核酸序列。

許多用於將外來基因引入細胞之技術皆為所屬技術領域所習知，並且可用來建構重組細胞以依據本文中所描述及例示之各式實施例來實施所述之方法。所使用之技術應提供異源基因序列之穩定轉移至宿主細胞，以使該異源基因序列可由細胞後代所繼承及表現，並且使接受者細胞之必要發育及生理功能不受干擾。可使用之技術包括但不限於染色體轉移（例如細胞融合、染色體介導之基因轉移、微細胞介導之基因轉移）、物理方法（例如轉染、球形質體(spheroplast)融合、微注射、電穿孔、脂質體載劑）、病毒載體轉移（例如重組DNA病毒、重組RNA病毒）、及類似者（描述於Cline, 29 Pharmac. Ther. 69-92 (1985)）。磷酸鈣沉澱及聚乙二醇(PEG)誘導之細菌原生質體與哺乳動物細胞融合亦可用來轉形細胞。

適用於表現本文所述之多特異性抗體或抗原結合片段的細胞較佳地係真核細胞，更佳地係植物、囓齒動物、或人類來源之細胞，例如但不限於NSO、CHO、CHOK1、perC.6、Tk-ts13、BHK、HEK293細胞、COS-7、T98G、CV-1/EBNA、L細胞、C127、3T3、HeLa、NS1、Sp2/0骨髓瘤細胞、及BHK細胞系、及其他者。此外，抗體之表現可使用融合瘤細胞來達成。用於生產融合瘤之方法在所屬技術領域中已充分建立。

經本文中所述之表現載體轉形的細胞可針對本文中所述之抗體或抗原結合片段的重組表現來選擇或篩選。重組陽性細胞經擴增並針對展現所欲表型之次殖株(subclone)進行篩選，所欲表型諸如高表現水平、增強之生長性質、或產出例如由於蛋白質修飾或經修改之轉譯後修飾而具有所欲生化特徵之蛋白質的能力。這些表型可能是因為給定次殖株之固有性質或因為突變。突變可透過使用化學品、UV波長光、放射線、病毒、插入型致突變原、抑制DNA不匹配修復、或此等方法之組合來實現。醫藥組成物/投予

本揭露亦提供一種醫藥組成物，其包含本揭露之抗體、多特異性抗體、或結合片段及醫藥上可接受之載劑。

關於治療用途，可將本揭露之抗體或多特異性抗體製備為醫藥組成物，其在醫藥上可接受之載劑中含有有效量的抗體作為活性成分。「載劑(carrier)」係指與本發明之抗體一起投予的稀釋劑、佐劑、賦形劑、或媒劑。此等媒劑可為液體如水及油，包括來自石油、動物、蔬菜或合成來源者，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油及類似者。例如，可使用0.4%鹽水及0.3%甘胺酸。這些溶液係無菌且通常不含顆粒物質。彼等可藉由習用、習知的滅菌技術（如過濾）來滅菌。組成物可含有如用以接近生理條件所需的醫藥上可接受之輔助物質，諸如pH調整及緩衝劑、穩定、增稠、潤滑、及著色劑等。在此類醫藥配方中本發明之抗體或多特異性抗體之濃度可能會有所不同，從小於約0.5重量%、常達至少約1重量%至多達15或20重量%，且可主要基於所需劑量、流體體積、黏度等，根據所選擇之投予模式來選擇。合適的媒劑及配方（包含其他人類蛋白質，例如人類血清白蛋白）例如係描述於例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Troy, D.B. ed., Lipincott Williams and Wilkins, Philadelphia, PA 2006, Part 5, Pharmaceutical Manufacturing pp 691-1092中，特別參見pp. 958-989。

本揭露之抗體或多特異性抗體之投予模式可係任何合適的途徑，諸如腸胃外投予，例如皮內、肌內、腹膜內、靜脈內或皮下、經黏膜（口服、鼻內、陰道內、直腸）、或所屬技術領域中具有通常知識者所理解以及在所屬技術領域中熟知之其他手段。

本發明之揭露之抗體或多特異性抗體亦可疾病預防性地投予，以降低發展疾病（諸如癌症）之風險。

因此，可製備用於肌內注射之本發明之醫藥組成物以含有1 ml無菌緩衝水、及在約1 ng至約100 mg/kg、例如約50 ng至約30 mg/kg、或更佳地約5 mg至約25 mg/kg之間的本發明之揭露之CD79b結合蛋白質。

在本揭露之實施例中，抗體或多特異性抗體表現性細胞可以組成物提供，例如包含抗體或多特異性抗體表現性細胞及醫藥上可接受之載劑的（多種）合適醫藥組成物。在一個態樣中，本揭露提供醫藥組成物，其包含有效量的表現一或多種所述抗體或多特異性抗體之淋巴球及醫藥上可接受之賦形劑。本揭露之醫藥組成物可包含如本文所述之抗體或多特異性抗體表現性細胞（例如複數個抗體或多特異性抗體表現性細胞）與一或多種醫藥上或生理學上可接受之載劑、賦形劑、或稀釋劑的組合。醫藥上可接受之載劑可係活性成分以外之醫藥組成物中的成分，其對對象係無毒的。

醫藥上可接受之載劑可包括緩衝劑、賦形劑、穩定劑、或防腐劑。醫藥上可接受之載劑的實例係生理上相容的溶劑、分散介質、覆膜(coating)、抗細菌劑及抗真菌劑、等滲劑及吸收延遲劑、及類似者，諸如鹽、緩衝劑、抗氧化劑、醣、水性或非水性載劑、防腐劑、潤濕劑、界面活性劑、或乳化劑、或其組合。醫藥組成物中醫藥上可接受之載劑的量可基於載劑之活性及配方之所欲特性（諸如穩定性及/或最小氧化）來實驗判定。

醫藥組成物可包含緩衝劑，諸如乙酸、檸檬酸、甲酸、琥珀酸、磷酸、碳酸、蘋果酸、天冬胺酸、組胺酸、硼酸、Tris緩衝劑、HEPPSO、HEPES、中性緩衝鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、及類似者；碳水化合物，諸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖、或葡聚糖、甘露醇；蛋白質；多肽或胺基酸，諸如甘胺酸；抗氧化劑；螯合劑，諸如EDTA或麩胱甘肽；佐劑（如氫氧化鋁）；抗細菌劑及抗真菌劑；及防腐劑。

本揭露之醫藥組成物可經調配以用於經腸或非腸外投予之各種手段。在一個實施例中，組成物可經調配以用於輸注或靜脈內投予。本文所揭示之醫藥組成物可例如以無菌液體製劑提供，例如等滲水溶液、乳液、懸浮液、分散液、或黏性組成物，其可經緩衝至所欲pH。適合用於口服投予之配方可包括液體溶液、膠囊、囊劑(sachet)、錠劑、口含錠(lozenge)、及口含錠(troche)、於適當液體中之粉末液體懸浮液、及乳化液。

如本文中關於醫藥組成物所使用，用語「醫藥上可接受(pharmaceutically acceptable)」意指經美國聯邦或州政府的管理機構批准，或列在美國藥典(U.S. Pharmacopeia)或其他公認的藥典中以用於動物及/或人類。

本文中所用之用語「醫藥上可接受之載劑(pharmaceutically acceptable carrier)」包括生理相容之任何及所有溶劑、分散介質、塗層、抗菌和抗真菌劑、及類似者。合適載劑、稀釋劑及/或賦形劑之實例包括下列之一或多者：水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇、及類似物，以及其任何組合。在許多情況中，較佳的是將等張劑（諸如糖、多元醇、或氯化鈉）納入該組成物中。具體而言，合適載劑之相關實例包括：(1)達爾伯克(Dulbecco)磷酸鹽緩衝鹽水，pH約7.4，含有或不含約1 mg/mL至25 mg/mL人類血清白蛋白；(2) 0.9%鹽水（0.9% w/v氯化鈉(NaCl)）；及(3) 5% (w/v)右旋糖；且亦可含有抗氧化劑（諸如色胺(tryptamine)）及穩定劑（諸如Tween 20 ^®）。

本文中之組成物亦可包含視需要用於治療特定病症之額外治療劑。在一個實施例中，抗體或多特異性抗體或結合片段及補充性活性化合物將具有不會互相不利影響之互補活性。

本發明之組成物可呈各種形式。這些包括例如液體、半固體、及固體劑量形式，但較佳形式取決於預期投予模式及治療應用。典型較佳組成物係呈可注射或可輸注溶液之形式。較佳投予模式係非經腸（例如，靜脈內、肌肉內、腹膜內、皮下）。在較佳實施例中，本發明之組成物係以推注(bolus)靜脈內投予或藉由在一段時間內連續輸注投予。在另一較佳實施例中，彼等係藉由肌肉內、皮下、關節內、滑膜內、腫瘤內、腫瘤周圍、病灶內、或病灶周圍途徑來注射，以產生局部以及全身性治療效果。

用於非經腸投予之無菌組成物可藉由將本發明之抗體、抗體片段或抗體共軛物(conjugate)以所需量納入適當溶劑中，接著藉由微過濾進行滅菌來製備。在溶劑或媒劑方面，可使用水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇、及類似者，以及其組合。在許多情況中，較佳的是在組成物中包括等滲劑諸如糖、多元醇、或氯化鈉。這些組成物亦可含有佐劑，尤其是潤濕、等張、乳化、分散及穩定劑。用於非經腸投予之無菌組成物亦可製備為無菌固體組成物之形式，其可在使用時溶於無菌水或任何其他注射用無菌介質中。

抗體、多特異性抗體、或抗體片段亦可口服投予。在經口投予之固體組成物方面，可使用錠劑、丸劑、粉劑（明膠膠囊、囊劑(sachet)）、或粒劑。在這些組成物中，依據本發明之活性成分係於氬氣流下與一或多種惰性稀釋劑（諸如澱粉、纖維素、蔗糖、乳糖、或二氧化矽）混合。這些組成物亦可包含非為稀釋劑之物質，例如一或多種潤滑劑（諸如硬脂酸鎂或滑石）、著色劑、塗層（糖衣錠）或糖釉(glaze)。

在經口投予之液體組成物方面，可使用含有惰性稀釋劑（諸如水、乙醇、甘油、植物油或石蠟油）之醫藥上可接受之溶液、懸浮液、乳液、糖漿及酏劑。這些組成物可包含非為稀釋劑之物質，例如潤濕、增甜、增稠、調味或穩定用產品。

劑量取決於所欲之效果、治療持續期間及所使用之投予途徑；成人口服劑量通常在每天5 mg與1000 mg之間，且單位劑量係在1 mg至250 mg的活性物質之範圍內。一般而言，醫師將會視待治療對象之年齡、體重及任何其他特定因素來決定適當劑量。偵測方法

本揭露亦提供一種偵測樣本中之CD79b、CD22、或兩者的方法，其包含獲得樣本，使樣本與本揭露之抗體、多特異性抗體、或結合片段接觸，及偵測樣本中結合的CD79b、CD22、或兩者。

在一些實施例中，樣本可衍生自尿液、血液、血清、血漿、唾液、腹水、循環細胞、滑液、循環細胞、非為組織相關聯之細胞（即游離細胞）、組織（例如手術切除之組織、活體組織切片（包括細針穿刺））、組織標本(histological preparation)、及類似者。

本揭露之抗體、多特異性抗體、或結合片段可使用已知方法偵測。例示性方法包括使用螢光或化學發光標示或放射性標示直接標示抗體，或將易於偵測的部份（諸如生物素、酶、或表位標籤）附接至本發明之抗體。例示性標示及部份係釕、 ¹¹¹In-DOTA、 ¹¹¹In-二乙烯三乙胺五乙酸(DTPA)、辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶及β-半乳糖苷酶、多組胺酸（HIS標籤）、吖啶染料、花青染料、螢光酮染料、

染料、啡啶染料、玫瑰紅染料、及Alexafluor®染料。

本揭露之抗體、多特異性抗體、或結合片段可用於各種檢定中以偵測樣本中之CD79b、CD22、或兩者。例示性檢定係西方墨點分析、放射免疫檢定、表面電漿共振、免疫沉澱法、平衡透析、免疫擴散法、電致化學發光(ECL)免疫檢定、免疫組織化學法、螢光活化細胞分選(FACS)或ELISA檢定。治療方法及用途

可向有需要之對象投予本揭露之抗體、多特異性抗體、或結合片段，以管理、治療、預防、或改善自體免疫疾病或病症或其一或多種症狀。

本揭露亦提供方法，其包含向患有自體免疫疾病之對象投予治療有效量的本揭露之抗體、多特異性抗體、或結合片段。

本揭露亦提供一種方法，其包含向患有自體免疫疾病之對象投予治療有效量的免疫接合物，該免疫接合物包含本揭露之抗體、多特異性抗體、或結合片段。

本揭露亦提供一種方法，其包含向患有自體免疫疾病之對象投予治療有效量的醫藥組成物，該醫藥組成物包含本揭露之抗體、多特異性抗體、或結合片段。

本揭露亦提供治療對象之自體免疫疾病的方法，其包含向有需要之對象投予治療有效量的本揭露之抗體、多特異性抗體、或結合片段達足以治療自體免疫疾病之時間。

本揭露亦提供一種治療對象之自體免疫疾病的方法，其包含向對象投予治療有效量的免疫接合物達足以治療自體免疫疾病之時間，該免疫接合物包含本揭露之抗體、多特異性抗體、或結合片段。

本揭露亦提供一種治療對象之自體免疫疾病的方法，其包含向對象投予治療有效量的醫藥組成物達足以治療自體免疫疾病之時間，該醫藥組成物包含本揭露之抗體、多特異性抗體、或結合片段。

在一個實施例中，自體免疫疾病與B細胞、自體反應性B細胞之失調或自體抗體之存在相關或以此為特徵。自體免疫疾病之實例包括但不限於全身性紅斑性狼瘡(SLE)、休格倫氏症候群(SjS)、類風濕性關節炎、自體免疫性肌肉病變、第I型糖尿病、愛迪生氏病、惡性貧血、自體免疫性肝炎、原發性膽汁性膽管炎(PBC)、自體免疫性胰臟炎、乳糜瀉、局部節段性腎絲球硬化症、原發性膜性腎病、卵巢衰竭、自體免疫性睾丸炎、乾眼症、特發性間質性肺炎、甲狀腺疾病（例如葛瑞夫茲氏病）、全身性硬化症（硬皮症）、肌無力症候群、自體免疫性腦炎、大皰性皮膚病、TTP、ITP、AIHA、Anca血管炎、心肌炎/擴張型CM、NMOSD、母體-胎兒同種異體免疫、母體-胎兒自體免疫、抗心磷脂/抗磷脂質症候群、高γ球蛋白血症、移植相關ID、多灶性運動神經病變。

本揭露亦提供預防對象之自體免疫疾病的方法，其包含向有需要之對象投予治療有效量的本揭露之抗體、多特異性抗體、或結合片段達足以預防自體免疫疾病之時間。在某些實施例中，預防包含治療無症狀對象。在某些實施例中，預防包含預防對象中自體免疫疾病症狀之發作。

本揭露亦提供預防對象之自體免疫疾病的方法，其包含向對象投予治療有效量的本揭露之抗體、多特異性抗體、或結合片段達足以治療自體免疫疾病之時間。

本揭露亦提供一種預防對象之自體免疫疾病的方法，其包含向對象投予治療有效量的免疫接合物達足以預防自體免疫疾病之時間，該免疫接合物包含本揭露之抗體、多特異性抗體、或結合片段。

本揭露亦提供一種預防對象之自體免疫疾病的方法，其包含向對象投予治療有效量的醫藥組成物達足以預防自體免疫疾病之時間，該醫藥組成物包含本揭露之抗體、多特異性抗體、或結合片段。

在一個實施例中，預防對象之自體免疫疾病的方法進一步包含偵測對象中之自體抗體。

本揭露亦提供在對象中調節B細胞活化之方法，其包含向有需要之對象投予治療有效量的本揭露之抗體、多特異性抗體、或結合片段達足以調節B細胞活化之時間。

本揭露亦提供在對象中調節B細胞活化之方法，其包含向對象投予治療有效量的本揭露之抗體、多特異性抗體、或結合片段達足以調節B細胞活化之時間。

本揭露亦提供一種在對象中調節B細胞活化之方法，其包含向對象投予治療有效量的本揭露之抗體、多特異性抗體、或結合片段達足以調節B細胞活化之時間。

本揭露亦提供一種在對象中調節B細胞活化之方法，其包含向對象投予治療有效量的免疫接合物達足以調節B細胞活化之時間，該免疫接合物包含本揭露之抗體、多特異性抗體、或結合片段。

本揭露亦提供一種在對象中調節B細胞活化之方法，其包含向該對象投予治療有效量之包含本揭露之抗體、多特異性抗體、或結合片段之醫藥組成物持續足以調節B細胞活化之時間。本揭露亦提供一種調節B細胞活化之方法，其包含向對象投予治療有效量的醫藥組成物達足以調節B細胞活化之時間，該醫藥組成物包含本揭露之抗體、多特異性抗體、或結合片段。

本揭露亦提供在對象中抑制異常B細胞活化之方法，其包含向有需要之對象投予治療有效量的本揭露之抗體、多特異性抗體、或結合片段達足以抑制異常B細胞活化之時間。

本揭露亦提供在對象中抑制異常B細胞活化之方法，其包含向對象投予治療有效量的本揭露之抗體、多特異性抗體、或結合片段達足以抑制異常B細胞活化之時間。

本揭露亦提供一種在對象中抑制異常B細胞活化之方法，其包含向對象投予治療有效量的免疫接合物達足以抑制異常B細胞活化之時間，該免疫接合物包含本揭露之抗體、多特異性抗體、或結合片段。

本揭露亦提供一種在對象中抑制異常B細胞活化之方法，其包含向對象投予治療有效量的醫藥組成物達足以抑制異常B細胞活化之時間，該醫藥組成物包含本揭露之抗體、多特異性抗體、或結合片段。

本揭露亦提供治療對象之自體免疫疾病的方法，其包含向有需要之對象投予治療有效量的組成物達足以治療自體免疫疾病之時間，該組成物包含多特異性抗體或多特異性結合片段，其中該多特異性抗體包含CD79b結合臂及CD22結合臂。

本揭露亦提供預防對象之自體免疫疾病的方法，其包含向有需要之對象投予治療有效量的組成物達足以預防自體免疫疾病之時間，該組成物包含多特異性抗體或多特異性結合片段，其中該多特異性抗體包含CD79b結合臂及CD22結合臂。

本揭露亦提供在對象中調節B細胞活化之方法，其包含向有需要之對象投予治療有效量的組成物達足以調節B細胞活化之時間，該組成物包含多特異性抗體或多特異性結合片段，其中該多特異性抗體包含CD79b結合臂及CD22結合臂。

本揭露亦提供在對象中抑制異常B細胞活化之方法，其包含向有需要之對象投予治療有效量的組成物達足以抑制異常B細胞活化之時間，該組成物包含多特異性抗體或多特異性結合片段，其中該多特異性抗體包含CD79b結合臂及CD22結合臂。

本揭露亦提供一種方法，其包含向對象投予包含多特異性抗體或多特異性結合片段之組成物，其中該多特異性抗體包含CD79b結合臂及CD22結合臂。

在一些實施例中，CD22結合臂包含分別為SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、及6之HCDR1、HCDR、HCDR3、LCDR1、LCDR、及LCDR3。在一些實施例中，CD22結合臂包含SEQ ID NO:7之VH及SEQ ID NO:8之VL。

在一些實施例中，CD79b結合臂包含SEQ ID NO: 9、17、25、33、41、49、或57之HCDR1；SEQ ID NO: 10、18、26、34、42、50、或58之HCDR2；SEQ ID NO: 11、19、27、35、43、51、或59之HCDR3；SEQ ID NO: 12、20、28、36、44、52、或60之LCDR1；SEQ ID NO: 13、21、29、37、45、53、或61之LCDR2；及SEQ ID NO: 14、22、30、38、46、54、或62LCDR3。在一些實施例中，CD79b結合臂包含SEQ ID NO: 15、23、31、39、47、55、63、或80之VH及SEQ ID NO: 16、24、32、40、48、56、64、或81之VL。

當指示治療有效量時，待投予的本揭露之抗體、多特異性抗體、或結合片段之精確量可由醫師考慮對象之年齡、體重、及病況之個別差異來判定。

可用於本揭露之抗體、多特異性抗體、或結合片段的背景下之遞送系統可包括延時釋放、延緩釋放、及持續釋放遞送系統，使得本揭露之抗體、多特異性抗體、或結合片段之遞送在待治療部位之敏化之前發生，且具有足夠的時間造成待治療部位之敏化。組成物可與其他治療劑或療法結合使用。此類系統可避免組成物之重複投予，從而增加對對象及醫師的便利性，且可特別適用於本發明之某些組成物實施例。

許多類型的釋放遞送系統為所屬技術領域中具有通常知識者可得且已知的。彼等包括聚合物基底系統(polymer base system)，諸如聚(乳酸交酯-乙交酯)、共聚草酸酯、聚酯醯胺、聚原酸酯、聚己內酯、聚羥基丁酸、及聚酐。含有藥物之前述聚合物的微膠囊係描述於例如美國專利第5,075,109號。遞送系統亦包括非聚合物系統，其係脂質，包括固醇（諸如膽固醇、膽固醇酯）、及脂肪酸或中性脂肪（諸如單酸、二酸、及三酸甘油酯）；矽橡膠系統；基於肽之系統；水凝膠釋放系統；蠟覆膜；使用習知黏合劑及賦形劑之壓製錠；部分融合型植入物；及類似者。具體實例包括但不限於：(a)侵蝕系統(erosional system)，其中活性組成物係以某種形式含於基質內，諸如美國專利第4,452,775號；第4,667,014號；第4,748,034號；及第5,239,660號中所述者；及(b)擴散系統，其中活性組分以受控速率自聚合物滲透出來，諸如美國專利第3,854,480號及第3,832,253號中所述。此外，可使用基於泵之硬體遞送系統，其中一些經調適以用於植入。

本揭露之抗體、多特異性抗體、或結合片段之投予可以任何方式進行，例如藉由腸胃外或非腸胃外投予，包括藉由氣霧劑吸入、注射、輸注、攝食、輸血、植入、或移植。例如，本文所述之CD79b蛋白質及組成物可經動脈、皮內、皮下、腫瘤內、髓內、結內(intranodally)、肌內、藉由靜脈內(i.v.)注射、或腹膜內投予至患者。在一個態樣中，本揭露之組成物係藉由i.v.注射投予。在一個態樣中，本揭露之組成物係藉由皮內或皮下注射投予至對象。本揭露之抗體、多特異性抗體、或結合片段之組成物可例如直接注射至腫瘤、淋巴結、組織、器官、或感染部位中。

在一個實施例中，投予可在一天、兩天、三天、四天、五天、六天、一週、兩週、三週、一個月、五週、六週、七週、兩個月、三個月、四個月、五個月、六個月、或更久之後重覆進行。重複療程亦為可能的，如為慢性投予。重覆投予可在相同劑量或在不同劑量下。組合療法

本揭露之抗體、多特異性抗體、或結合片段可與至少一種額外治療劑組合投予。

本揭露之抗體、多特異性抗體、或結合片段亦可與一或多種其他療法組合投予。在一些實施例中，本揭露之抗體、多特異性抗體、或結合片段可與一或多種可用於預防、管理、治療、或改善自體免疫疾病或病症或其一或多種症狀之其他療法組合投予至有需要之對象，以預防、管理、治療、或改善自體免疫疾病或病症或其一或多種症狀。

在一些實施例中，一種療法之遞送在第二療法之遞送開始時仍存在，使得就投予而言存在重疊。在本文中此有時被稱為「同時(simultaneous)」或「並行遞送(concurrent delivery)」。在其他實施例中，一種療法之遞送在另一種療法之遞送開始之前結束。在任一情況之一些實施例中，療法因組合投予而更有效。舉例而言，第二療法更有效，例如用較少的第二療法見到等效效應，或第二療法減少症狀的程度大於若在不存在第一療法下投予第二療法所見到的程度，或用第一療法見到類似情況。在一些實施例中，遞送使得症狀或與病症相關之其他參數的減少大於在不存在另一療法下用一種療法遞送時所觀測到的減少。兩種療法之效應可係部分相加的、完全相加、的或大於相加的。遞送可使得當遞送第二療法時，仍可偵測到所遞送之第一療法之效應。

在一個實施例中，其他治療劑（諸如因子）可在本揭露之抗體、多特異性抗體、或結合片段之前、之後、或同時間（與其同時）投予。

本揭露之抗體、多特異性抗體、或結合片段（諸如本文所述之CAR表現性細胞）及至少一種額外治療劑可以相同的組成物或以分開的組成物同時投予或依序投予。。針對依序投予，可先投予本文所述之抗體、多特異性抗體、或結合片段，其次可投予額外藥劑，或投予順序可顛倒。

在一個實施例中，可向對象投予增強本揭露之抗體、多特異性抗體、或結合片段之活性的藥劑。舉例而言，在一個實施例中，藥劑可係抑制抑制性分子之藥劑。序列

表3提供CDR、VH、及VL胺基酸序列。 表3.

說明	胺基酸序列	SEQ ID NO:
C22B21	CD22臂	HCDR1	GLPLSTSGM	1
HCDR2	DWDDD	2
HCDR3	MGYSYGWDAFD	3
LCDR1	SQSGSRN	4
LCDR2	GAS	5
LCDR3	YNNWPL	6
VH	QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTLSGLPLSTSGMAVTWIRQPPGKALEWLALIDWDDDKYYSTSLKTRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARMGYSYGWDAFDLWGQGTMVTVSS	7
VL	EVVMTQSPATLSVSPGEGATLSCRASQSGSRNIAWYQQKPGQAPRLLIFGASARATGIPARFTGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWPLTFGGGTKVEIK	8
CD9B337	CD79b臂	HCDR1	GFTLRNY	9
HCDR2	NQDGSE	10
HCDR3	DPIESRFD	11
LCDR1	SQSLVYSDGNTY	12
LCDR2	KVS	13
LCDR3	GTHWPP	14
VH	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLRNYWMSWVRQAPGKGLEWVANINQDGSEKYYVDSVEGRFTISRDNAKKSLWLQMSSLRVEDTAVYYCARDPIESRFDYWGQGTLVTVSS	15
VL	DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVYSDGNTYLSWFQQRPGQSPRRLIYKVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGTHWPPTFGGGTKVEIK	16
CD9B374	CD79b臂	HCDR1	GASISSFYWS	17
HCDR2	RISPSGKTN	18
HCDR3	GEYSGTYSYSFDV	19
LCDR1	RSSESLLDSEDGNTYLD	20
LCDR2	TLSYRAS	21
LCDR3	MQRMEFPLT	22
VH	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVSGASISSFYWSWIRQPADEGLEWIGRISPSGKTNYIPSLKSRIIMSLDASKNQFSLRLNSVTAADTAMYYCARGEYSGTYSYSFDVWGQGTMVTVSS	23
VL	DIVMTQSPLSLSVTPGEPASISCRSSESLLDSEDGNTYLDWFLQKPGQSPQLLIYTLSYRASGVPDRFSGSGSDTDFTLHISSLEAEDVGLYYCMQRMEFPLTFGQGTKVEIK	24
CD9B330	CD79b臂	HCDR1	GDSVSNNSATWN	25
HCDR2	RTYYRSKWYND	26
HCDR3	VDIAFDY	27
LCDR1	SGSSSNIGNHGVN	28
LCDR2	NDDLLPS	29
LCDR3	AAWDDSLNGVV	30
VH	QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSNNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYTVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCTRVDIAFDYWGQGTLVTVSS	31
VL	QTVVTQPPSVSEAPRQRVTISCSGSSSNIGNHGVNWYQQLPGKAPKLLIYNDDLLPSGVSDRFSGSTSGTSGSLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGVVFGGGTKLTVL	32
CD9B643	CD79b臂	HCDR1	GVSISNYYWS	33
HCDR2	RISPSGRTN	34
HCDR3	GEYSGTYSYSFDI	35
LCDR1	RSSQSLFDSDDGNTYLD	36
LCDR2	TLSYRAS	37
LCDR3	MQRMEFPLT	38
VH	QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGVSISNYYWSWIRQPPGKGLEWIGRISPSGRTNYNPSLKSRVTMSLDASKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGEYSGTYSYSFDIWGQGTMVTVSS	39
VL	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLFDSDDGNTYLDWFQQKPGQSPKLLIQTLSYRASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCMQRMEFPLTFGGGTKVEIK	40
CD9B324	CD79b臂	HCDR1	GDSVSNNSATWN	41
HCDR2	RTYYRSKWYND	42
HCDR3	VDIAFDY	43
LCDR1	SGSSSNIGNHGVN	44
LCDR2	NDDLLPS	45
LCDR3	AAWDDSLNGVV	46
VH	QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSNNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYTVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCTRVDIAFDYWGQGTLVTVSS	47
VL	QLVLTQPPSVSEAPRQRVTISCSGSSSNIGNHGVNWYQQLPGKAPKLLIYNDDLLPSGVSDRFSGSTSGTSGSLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGVVFGGGTKLTVL	48
CD9B389	CD79b臂	HCDR1	GVSISNYYWS	49
HCDR2	RISPSGRTN	50
HCDR3	GEYSGTYSYSFDI	51
LCDR1	RSSQSLFDSDDGNTYLD	52
LCDR2	TLSYRAS	53
LCDR3	MQRMEFPLT	54
VH	QVQLQQSGPGLVRPSETLALTCSVSGVSISNYYWSWIRQPAGRGLEWIGRISPSGRTNYNTSLKSRGTMSLDASKNQFSLKVNSVTAADTAVYYCARGEYSGTYSYSFDIWGQGTMVTVSS	55
VL	DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLFDSDDGNTYLDWFLQKPGQSPQLLIQTLSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEADDVGVYYCMQRMEFPLTFGGGTKLEIK	56
CD9B390	CD79b臂	HCDR1	GGSISNYYWS	57
HCDR2	RIFYSGKTN	58
HCDR3	GEYSGEYSYSFDI	59
LCDR1	RSSQSLLDSDDGNTYVD	60
LCDR2	TLSYRAS	61
LCDR3	MQRMEFPLT	62
VH	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVSGGSISNYYWSWIRQPAGKGLEWIGRIFYSGKTNYNSSLKSRVTMSADTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGEYSGEYSYSFDIWGQGTTVTVSS	63
VL	EIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLDSDDGNTYVDWFLQKPGQSPQLLIYTLSYRASGVPDRFSGSGSDTDFTLKISRVEAEDVGIYYCMQRMEFPLTFGGGTKVEIK	64

表4提供VH及VL核苷酸序列。 表4.

說明	核苷酸序列	SEQ ID NO
CD9B374	VH	CAGGTTCAGCTGCAAGAGTCTGGTCCTGGCCTGGTCAAGCCTTCCGAGACACTGTCTCTGACCTGCTCTGTGTCCGGCGCCTCCATCTCTTCCTTCTACTGGTCCTGGATCCGGCAGCCTGCTGACGAAGGACTGGAATGGATCGGCCGGATCAGCCCTTCTGGCAAGACCAACTACATCCCCAGCCTGAAGTCCCGGATCATCATGTCCCTGGACGCCTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCGGCTGAACTCTGTGACCGCTGCCGATACCGCCATGTACTACTGTGCCAGAGGCGAGTACTCCGGCACCTACTCCTACAGCTTTGACGTGTGGGGACAAGGCACCATGGTCACAGTTTCTTCT	65
VL	GACATCGTGATGACCCAGTCTCCACTGAGCCTGTCTGTGACACCTGGCGAGCCTGCCTCCATCTCCTGTAGATCTTCTGAGTCCCTGCTGGACAGCGAGGACGGCAATACCTACCTGGACTGGTTCCTGCAGAAGCCCGGACAGTCTCCTCAGCTGCTGATCTACACCCTGTCCTACAGAGCCTCTGGCGTGCCCGATAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGACACCGACTTTACCCTGCACATCTCCAGCCTGGAAGCCGAGGATGTGGGCCTGTACTACTGTATGCAGCGGATGGAATTTCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAG	66
VL	GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGTCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTGAGAGCCTCTTGGATAGTGAAGATGGAAACACCTATTTGGACTGGTTCCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCTCAGCTCCTGATCTATACGCTTTCCTATCGGGCCTCTGGAGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCGGACACTGATTTCACACTGCACATCAGCAGTCTGGAGGCTGAGGATGTTGGACTTTATTACTGCATGCAACGTATGGAGTTTCCGCTCACTTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA	67
CD9B330	VH	CAAGTGCAACTGCAGCAGTCTGGCCCTGGACTGGTCAAGCCTTCTCAGACCCTGTCTCTGACCTGCGCCATCTCCGGCGACTCCGTGTCCAACAACTCCGCTACCTGGAACTGGATCAGACAGTCCCCTTCCAGAGGCCTGGAATGGCTGGGCAGAACCTACTACCGGTCCAAGTGGTACAACGACTACACCGTGTCCGTGAAGTCCCGGATCACCATCAACCCTGATACCTCTAAGAACCAGTTCTCCCTGCAACTGAACTCTGTGACCCCTGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCACCAGAGTGGACATCGCCTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCTAGC	68
VL	CAGACTGTGGTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCTGAAGCCCCCAGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGTTCTGGAAGTAGCTCCAACATCGGAAATCATGGTGTAAACTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAAAGGCTCCCAAACTCCTCATCTATAATGATGATCTGCTGCCCTCAGGGGTCTCTGACCGATTCTCTGGCTCCACGTCTGGCACCTCAGGTTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCAGTCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAATGGTGTGGTATTCGGCGGAGGGACTAAACTGACCGTCCTA	69
CD9B643	VH	CAGGTTCAGCTGCAAGAGTCTGGCCCTGGCCTGGTCAAGCCCTCTCAGACCCTGTCTCTGACCTGTACCGTGTCCGGCGTGTCCATCTCCAACTACTACTGGTCCTGGATCCGGCAGCCTCCTGGCAAAGGACTGGAATGGATCGGCCGCATCTCTCCTTCTGGTCGCACCAACTACAACCCCAGCCTGAAAAGCAGAGTGACCATGTCTCTGGACGCCTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGTCCTCCGTGACCGCTGCTGATACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGGCGAGTACTCCGGCACCTACTCCTACAGCTTCGACATCTGGGGCCAGGGCACCATGGTCACAGTCTCTTCT	70
VL	GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCTCTGTCCGCCTCTGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTCGGTCCTCTCAGTCCCTGTTCGACTCTGACGACGGCAACACCTACCTGGACTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCCAGTCTCCTAAGCTGCTGATCCAGACACTGTCCTACAGAGCCTCTGGCGTGCCCTCCAGATTTTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGACTTTACCCTGACAATCTCCAGCCTGCAGCCTGAGGACTTCGCCACCTACTACTGTATGCAGCGGATGGAATTTCCCCTGACCTTCGGCGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAG	71
VL	GACATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACCATTACCTGCAGAAGCAGCCAGAGCCTGTTCGACAGCGACGACGGCAATACCTACCTGGACTGGTTCCAGCAGAAGCCTGGCCAGAGCCCTAAGCTGCTGATCCAGACCCTGAGCTACAGAGCCAGCGGCGTGCCTAGCAGATTCTCCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCATGCAGAGAATGGAGTTCCCTCTGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAG	72
CD9B324	VH	CAAGTGCAACTGCAGCAGTCTGGCCCTGGACTGGTCAAGCCTTCTCAGACCCTGTCTCTGACCTGCGCCATCTCCGGCGACTCCGTGTCCAACAACTCCGCTACCTGGAACTGGATCAGACAGTCCCCTTCCAGAGGCCTGGAATGGCTGGGCAGAACCTACTACCGGTCCAAGTGGTACAACGACTACACCGTGTCCGTGAAGTCCCGGATCACCATCAACCCTGATACCTCTAAGAACCAGTTCTCCCTGCAACTGAACTCTGTGACCCCTGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCACCAGAGTGGACATCGCCTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCTAGC	73
VL	CAGCTTGTGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCTGAAGCCCCCAGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGTTCTGGAAGTAGCTCCAACATCGGAAATCATGGTGTAAACTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAAAGGCTCCCAAACTCCTCATCTATAATGATGATCTGCTGCCCTCAGGGGTCTCTGACCGATTCTCTGGCTCCACGTCTGGCACCTCAGGTTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCAGTCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAATGGTGTGGTATTCGGCGGAGGGACTAAACTGACCGTCCTA	74
CD9B389	VH	CAAGTTCAGCTTCAACAATCTGGTCCAGGTCTCGTAAGACCATCAGAAACATTGGCTCTTACATGCTCTGTTAGTGGTGTGTCAATCAGTAACTATTACTGGTCCTGGATCCGCCAACCTGCTGGCCGTGGGCTCGAATGGATCGGACGAATCTCACCTAGCGGTAGGACAAATTACAACACTTCCCTTAAATCACGAGGGACAATGAGCCTCGACGCATCAAAGAACCAGTTCAGCCTTAAAGTAAACTCCGTTACCGCAGCAGATACTGCAGTCTACTATTGTGCCAGGGGTGAATATTCAGGAACATATTCCTATTCTTTTGACATTTGGGGCCAGGGAACCATGGTAACAGTGAGTTCA	75
VL	GATATTGTGATGACTCAGACTCCACTCTCTCTGCCCGTCACCCCTGGAGAACCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCTTTGATAGTGATGATGGAAACACCTATTTGGACTGGTTCCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTAATCCAAACGCTTTCCTATCGGGCCTCTGGAGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCAGGCACCGATTTCACACTGAAAATCAGCAGGGTGGAGGCTGATGATGTTGGAGTTTATTACTGCATGCAACGTATGGAGTTTCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGGAGATCAAA	76
CD9B390	VH	CAGGTACAACTTCAGGAGAGCGGCCCAGGTTTGGTTAAACCAAGTGAAACCTTGTCACTTACCTGTTCCGTGTCAGGTGGGTCAATAAGCAATTACTACTGGTCCTGGATTAGACAACCTGCTGGAAAGGGGCTTGAATGGATCGGGAGGATATTCTACTCAGGGAAGACAAACTACAATAGTAGCCTCAAGTCCAGGGTGACCATGTCCGCTGATACTTCCAAGAATCAATTTAGCCTTAAATTGTCCTCCGTTACAGCCGCTGATACCGCAGTGTACTACTGTGCAAGAGGTGAGTACAGTGGCGAATACTCATATTCCTTTGACATCTGGGGTCAGGGCACTACTGTGACTGTTTCATCT	77
VL	GAAATAGTGATGACGCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATTTCCTGCCGGTCTAGTCAGAGCCTCTTGGATAGTGATGATGGAAACACCTATGTGGACTGGTTCCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAACTCCTGATCTATACGCTTTCCTATCGGGCCTCTGGAGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCAGACACTGATTTCACACTGAAAATCAGCAGGGTGGAGGCTGAAGATGTTGGAATTTATTACTGCATGCAACGTATGGAGTTTCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA	78

表5提供結合至CD79b之釘合scFv之序列表5

說明	胺基酸序列	SEQ ID NO
CD79b	全長	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLRNYWMSWVRQAPGCGLEWVANINQDGSEKYYVDSVEGRFTISRDNAKKSLWLQMSSLRVEDTAVYYCARDPIESRFDYWGQGTLVTVSSGGGSGGSGGCPPCGGSGGDVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVYSDGNTYLSWFQQRPGQSPRRLIYKVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGTHWPPTFGCGTKVEIKEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK	79
VH	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLRNYWMSWVRQAPGCGLEWVANINQDGSEKYYVDSVEGRFTISRDNAKKSLWLQMSSLRVEDTAVYYCARDPIESRFDYWGQGTLVTVSS	80
VL	DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVYSDGNTYLSWFQQRPGQSPRRLIYKVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGTHWPPTFGCGTKVEIK	81
scFv	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLRNYWMSWVRQAPGCGLEWVANINQDGSEKYYVDSVEGRFTISRDNAKKSLWLQMSSLRVEDTAVYYCARDPIESRFDYWGQGTLVTVSS GGGSGGSGGCPPCGGSGGDVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVYSDGNTYLSWFQQRPGQSPRRLIYKVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGTHWPPTFGCGTKVEIK	82

表6提供結合至CD22之Fab之重鏈之序列。表6

說明	胺基酸序列	SEQ ID NO
CD22	全長	QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTLSGLPLSTSGMAVTWIRQPPGKALEWLALIDWDDDKYYSTSLKTRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARMGYSYGWDAFDLWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK	83
VH	QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTLSGLPLSTSGMAVTWIRQPPGKALEWLALIDWDDDKYYSTSLKTRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARMGYSYGWDAFDLWGQGTMVTVSS	7

表7提供結合至CD22之Fab之輕鏈之序列表7

說明	胺基酸序列	SEQ ID NO
CD22	全長	EVVMTQSPATLSVSPGEGATLSCRASQSGSRNIAWYQQKPGQAPRLLIFGASARATGIPARFTGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC	84
VL	EVVMTQSPATLSVSPGEGATLSCRASQSGSRNIAWYQQKPGQAPRLLIFGASARATGIPARFTGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWPLTFGGGTKVEIK	8

提供下列實例以進一步描述一些本文所揭示之實施例。實例意欲說明而非限制所揭示之實施例。實例

下列實例係提供用來增補前述揭露及提供對於本文中所述之申請標的之更佳理解。不應將這些實例視為限制所述之申請標的。應瞭解本文中所述之實例及實施例僅用於說明性之目的，並且根據該等實例及實施例之各式修飾或變化將為所屬領域中具有通常知識者所顯而易知且應被納入本發明之真實範疇內，而且在不偏離本發明之真實範疇下可作出這些修飾或變化。 實例1 ： PBMC B 細胞消耗檢定

周邊血液單核細胞(PBMC)係按照人類樣本獲取之機構規程，透過HemaCare (Northridge, CA)購買。根據製造商之規程將細胞解凍。將PBMC與RPMI在96孔U底盤中以1×10 ⁶個細胞/孔培養，RPMI含有：10% FBS、2%青黴素及鏈黴素、1% L-麩醯胺酸、MEM非必需胺基酸(NEAA)、及丙酮酸鈉[ThermoFisher]。接著將PBMC與90nM的C192B30、對照抗體或作為陽性對照之抗人類CD20 mAb培養。接著將細胞在37℃下培養48小時。在與抗體培養後，將盤離心(300 RCF, 5min)，並將細胞再懸浮於DPBS中。接著使用LIVE/DEAD™可固定水性死亡細胞染色套組[Invitrogen目錄號L34957]在室溫下將細胞針對活力染色5min。將盤離心(300 RCF, 5min)，並將細胞再懸浮於含有Human TruStain FcX™（Fc受體阻斷溶液）[Biolegend目錄號422302]之FAC緩衝液中並在室溫下培養15分鐘。在15分鐘之後，將細胞用抗CD3 PerCp-Cy5.5 [殖株HIT3a Biolegend目錄號300328]、抗CD19-PE [殖株4G7 Biolegend目錄號392506]、抗CD22-PE [殖株HIB22 Biolegend目錄號302506]、及抗CD20-PE [殖株2H7 Biolegend目錄號302306]在4℃下以製造商推薦濃度染色30分鐘。將盤離心(300 RCF, 5min)，用FAC緩衝液洗滌兩次，按照製造商的推薦用Cytofix緩衝液[BD Biosciences目錄號554655]固定，並在獲取用於分析前再懸浮於FAC緩衝液中。流動式細胞測量術數據係在具有至多十種螢光染料之CantoII流動式細胞測量儀(BD Biosciences)上獲得，並使用FlowJo軟體(TreeStar)分析。分析著眼於B細胞(CD22, CD19, CD20)對CD3群，以判定總B細胞消耗%。 下游BCR 信號傳導級聯評估

經純化之人類B細胞係按照人類樣本獲取之機構規程，透過HemaCare (Northridge, CA)購買。根據製造商之規程將細胞解凍。將B細胞計數並接種於96孔U底盤中，其濃度係1.5x10 ⁵細胞/孔。在接種之後，將B細胞與C192B30或對照分子在4℃下培養30分鐘。在30分鐘培養時間後，將抗IgM F(ab’ ₂) (20 µg/mL) [Jackson Immunoresearch laboratories目錄號109-006-129]在溫熱培養基中稀釋並添加至含有C192B30、對照分子、或單獨培養基（刺激對照）的孔中。同時，將不含抗IgM之溫熱培養基添加至孔中作為無刺激對照。在指示時間點（0至30分鐘），將B細胞轉移至已含有固定緩衝液I [ BD Bioscience目錄號557870]之單獨U底盤中。在最終時間點之後，將盤離心(300 RCF, 5min)並用染色緩衝液[DPBS + 2% HIFCS +1 mM EDTA]洗滌/再懸浮。在將細胞洗滌之後，再次將盤離心(300 RCF, 5min)並按照製造商規程在冰上用冷卻的透化(perm)緩衝液II [ BD Bioscience目錄號558052]透化。在透化後，將盤離心(300 RCF, 5min)並用染色緩衝液洗滌兩次，用Human TruStain FcX™（Fc受體阻斷溶液）[Biolegend目錄號422302]阻斷15分鐘，接著用抗pSyk (Y352)-PE抗體[BD Bioscience目錄號557881]及抗pPLCg2(Y759)-Alexa 647 [ThermoFisher目錄號17-9866-42]在冰上標示1小時。將盤離心(300 RCF, 5min)，用FAC緩衝液洗滌兩次，按照製造商的推薦用Cytofix緩衝液[BD Biosciences目錄號554655]固定，並在獲取用於分析前再懸浮於FAC緩衝液中。流動式細胞測量術數據係在具有至多十種螢光染料之CantoII流動式細胞測量儀(BD Biosciences)上獲得，並使用FlowJo軟體(TreeStar)分析。判定MFI，並將其與由方程式定義的抑制%=100*(1-((經刺激平均值-化合物孔(經化合物處理之所關注的孔之原始數據)) / (經刺激平均值-未經刺激平均值)))一起用圖表示。 B 細胞增生及細胞介素生產

經純化之人類B細胞係按照人類樣本獲取之機構規程，透過HemaCare (Northridge, CA)購買。根據製造商之規程將細胞解凍。將經純化之B細胞PBMC與DMEM在384孔不透明壁盤中以3×10 ⁴個細胞/孔培養，DMEM含有：10% FBS、2%青黴素及鏈黴素、1% L-麩醯胺酸、MEM非必需胺基酸(NEAA)、及丙酮酸鈉[ThermoFisher]。在接種之後，將B細胞與C192B30或對照分子在4℃下培養30分鐘。在30分鐘培養時間後，將抗IgM F(ab’ ₂) (10 µg/mL) [Jackson Immunoresearch laboratories目錄號109-006-129]及CPG (0.3125 µM) [Invivogen目錄號tlrl-2006-5]添加至含有C192B30、對照分子、或單獨培養基（刺激對照）的孔中。同時，將不含抗IgM或CPG之溫熱培養基添加至孔中作為無刺激對照。在72小時之後，將50 µL的上清液轉移至單獨的384孔盤中以用於進一步分析，並儲存在-80℃下。藉由按照製造商規程向孔中添加50 µL的CellTiterGlo2.0 [Promega目錄號G9241]，立即分析含有B細胞之原始盤的增生。接著分析樣本的發光。簡言之，將盤置於迴轉式振盪器上2分鐘，在室溫下培養10分鐘，接著在PheraStar [BMGLabTech]上記錄發光。接著亦經由MSD [MesoScale Diagonsitics目錄號K151TXK]按照製造商規程分析在先前步驟中保存之上清液的IL-6生產。計算增生及細胞介素生產兩者之由方程式定義的抑制百分比=100*(1-((經刺激平均值-化合物孔(經化合物處理之所關注的孔之原始數據)) / (經刺激平均值-未經刺激平均值)))。 體內功效模型

Janssen Pharmaceutical, LLC機構動物照護及使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee)核准所有涉及小鼠的實驗程序。雌性NSG (NOD-scid IL2Rγ ^null)小鼠係在6至12週齡時自Jackson laboratory獲得。在人類PBMC轉移前，小鼠接受全身輻照1天。周邊血液單核細胞(PBMC)係按照人類樣本獲取之機構規程，透過HemaCare (Northridge, CA)購買。根據製造商之規程將細胞解凍。將PBMC濃度在RPMI‐1640中調整至15x10 ⁷/mL，並在注射前短暫儲存在冰上。使用具有25‐G × ⅝吋針頭之1‐cc結核菌素注射器，經由腹膜內(IP)注射將0.1 ml (15x10 ⁶PBMC)注射至腹膜中。在注射人類PBMC後，經由IP途徑給予抗體：同型(5 mg/kg)、C192B30（以指示劑量）、或PBS。根據IACUC規程監測動物的臨床症狀並記錄體重。在植入後7天之後，將動物安樂死，並執行心臟穿刺以收集全血。在離心(17,000 RCF, 1 min)後獲得血清。將血清等分並儲存在−80℃，以用於分析人類抗體生產。經由MilliPlex人類同型磁珠組[Millipore Sigma目錄號HGAMMAG-301k]按照製造商規程測量人類抗體生產。以1:100稀釋度使用小鼠血清之稀釋液。 實驗結果

進行實驗以檢驗CD22 x CD79b雙特異性抗體之非消耗能力（圖1）。將PBMC與下列培養48小時：單獨培養基、CD22 x CD79b雙特異性抗體（C192B30，包含SEQ ID NO: 1至6及9至14之CDR）、CD22 x同型雙特異性抗體(C192B36)、同型x CD79b雙特異性抗體(C192B2)、或抗CD20消耗mAb。在48小時之後，將細胞針對活細胞(Zombie Dye Aqua)、T細胞(CD3)、及B細胞（CD22、CD20、CD19）進行染色。接著相較於單獨的培養基孔，計算b細胞百分比。如圖1所示，雙特異性抗體在任何雙特異性形式下幾乎不消耗B細胞，而抗CD20消耗mAb之陽性對照顯示PBMC中之B細胞顯著減少。

亦進行實驗以檢驗B細胞近端信號（圖2）。B細胞近端信號（p-Syk、p-PLCγ2）被CD22 x CD79b雙特異性抗體抑制。在刺激前將經純化之B細胞與下列培養30分鐘：單獨培養基、CD22 x CD79b雙特異性抗體（C192B30，包含SEQ ID NO: 1至6及9至14之CDR）、CD22 x同型雙特異性抗體(C192B36)、及同型x CD79b雙特異性抗體(C192B2)。在經過30分鐘之後，將B細胞用抗IgM F(ab)’2 (20 µg/mL)刺激，以避免任何可能已涉及FcγR結合之干擾因子。接著在給定時間點（0、5、8、10、15、及30分鐘）將B細胞固定數分鐘。在固定後，將細胞針對B細胞受體(BCR)複合物之下游磷蛋白信號傳導分子（p-Syk、p-PLCγ2）進行染色。圖2中之數據顯示相較於經刺激對照或同型對照臂對照，CD22 x CD79b雙特異性抗體藉由抑制p-Syk及p-PLCγ2來顯著影響B細胞透過BCR複合物信號傳導之能力。

亦進行實驗以檢驗增生及細胞介素分泌之B細胞遠端讀出（圖3）。B細胞遠端讀出（增生、細胞介素分泌）被CD22 x CD79b雙特異性抗體顯著抑制。在刺激前將經純化之B細胞與下列培養30分鐘：CD22 x CD79b雙特異性抗體（C192B30，包含SEQ ID NO: 1至6及9至14之CDR）、CD22 x同型雙特異性抗體(C192B36)、及同型x CD79b雙特異性抗體(C192B2)。在30分鐘之後，將B細胞用協同劑量的抗IgM F(ab)’2 (2.5 µg/mL)及CPG (0.3125 µM)刺激。如圖3所示，相較於同型對照臂，CD22 x CD79b抗體能夠回應於BCR+TLR刺激而顯著降低B細胞增生。此外，B細胞IL-6生產受到顯著影響，而同型對照臂再次顯示幾乎沒有效果。

亦進行實驗以檢驗IgM抗體生產（圖4）。CD22 x CD79b雙特異性抗體抑制自NSG-人類PBMC轉移模型之體內IgM抗體生產。將人類PBMC轉移至經輻照免疫缺陷小鼠- NSG (NOD-scid IL2Rγ ^null)。接著將小鼠用不同劑量的CD22 x CD79b雙特異性抗體（包含SEQ ID NO: 1至6及9至14之CDR；0.2 mg/kg、1 mg/kg、及5 mg/kg）或同型對照抗體(5 mg/kg)處理。接著使細胞植入7天。在此時間期間，B細胞開始在體內生產人類抗體。在7天之後，將動物犧牲，取脾細胞進行流動式細胞測量術，並取血清進行分析。相較於對照（PBS及同型），用CD22 x CD79b雙特異性抗體處理之5 mg/kg組中的血清顯示人類IgM顯著降低。 實例2 ：

開發釘合CD22 x CD79b scFv結合分子。如表5至表7中提供之序列所示，兩個Fc域中之L234A、L235A、及D265S (AAS)之雙特異性抗體特徵突變降低與Fc受體之交互作用，且兩個Fc域中之M252Y、S254T、T256E (YTE)之突變延長分子之半衰期。雙特異性抗體之異二聚化係藉由使用鈕扣平台突變增強。具體而言，CD79b結合臂包含融合至「鈕」(T366W) Fc域之N端的scFv，且CD22結合臂包含融合至「孔」（T366S、L368A、及Y407V）Fc域之N端的Fab。此外，CD22結合臂包含「RF」突變（H435R及Y436F）以破壞蛋白質A結合。

相較於實例1中所用之雙特異性分子，CD79b結合臂之釘合（圖5）係藉由誘導VH、VL、及連接子區中之胺基酸變化來達成，如具有SEQ ID NO:82之胺基酸序列之釘合scFv中所示。釘合雙特異性分子(scFv)包含SEQ ID NO:79、SEQ ID NO: 83、及SEQ ID NO: 84之胺基酸序列。

以下描述實驗方法及結果。聚集實驗

使用具有30 kDa MWCO膜之Amicon離心超濾裝置實現高濃度的分子。起初將各蛋白質之等分試樣稀釋至相同的起始濃度，並以4000xg以10分鍾間隔離心。在各10分鍾離心步驟結束時，將濃縮器從離心機中取出，並記錄剩餘樣本體積之目視估計值。針對所有樣本重複濃縮步驟，直到達到下列結果中之一者：(1)基於目標濃度達到目標體積（例如針對30 mg初始蛋白質為200 µL）之樣本、及(2)從溶液中沉澱出來之樣本。

在離心程序結束時，回收濃縮樣本，並使用斜率光譜法(slope spectroscopy)判定蛋白質含量。接著將最大程度濃縮之蛋白質之等分試樣稀釋至預定中間濃度（例如50及100 mg/mL）。接著將樣本在其各種濃度狀態下儲存在4℃、25℃、及40℃下2週。藉由分析型SEC判定聚集，其中將由濃度及儲存溫度定義之各個樣本在分析前立即稀釋至1 mg/mL。

如圖5所示，引入釘合幾乎完全廢除在所有溫度及濃度下高分子量聚集體的形成。 B細胞增生及細胞介素生產

經純化之人類B細胞係按照人類樣本獲取之機構規程，透過HemaCare (Northridge, CA)購買。根據製造商之規程將細胞解凍。將經純化之B細胞與DMEM在384孔不透明壁盤中以3×104個細胞/孔培養，DMEM含有：10% FBS、2%青黴素及鏈黴素、1% L-麩醯胺酸、MEM非必需胺基酸(NEAA)、丙酮酸鈉[ThermoFisher]、及0.05 mMβ-巰基乙醇。在接種之後，將B細胞與WT（未釘合對照分子，其具有(1)兩個Fc域中之L234A、L235A、及D265S (AAS)；(2) CD79b Fc域中之鈕(T366W)及CD22 Fc域中之孔（T366S、L368A、及Y407V）；及(3) CD22 Fc域中之H435R及Y436F (RF)）、YTE（與WT相同但在兩個Fc域中額外具有M252Y、S254T、及T256E (YTE)）、及釘合YTE（與YTE相同的CDR及Fc突變，但具有釘合scFv）分子在4℃下培養30分鐘。在30分鐘培養時間後，將抗IgM F(ab’2) (10 µg/mL) [Jackson Immunoresearch laboratories目錄號109-006-129]或抗IgM F(ab’2) (2,5 µg/mL)及CPG (0.3125 µM) [Invivogen目錄號tlrl-2006-5]添加至孔中、或單獨培養基（刺激對照）。同時，將不含抗IgM或CPG之溫熱培養基添加至孔中作為無刺激對照。在72小時之後，將50 µL的上清液轉移至單獨的384孔盤中以用於進一步分析，並儲存在-80℃下。藉由按照製造商規程向孔中添加50 µL的CellTiterGlo2.0 [Promega目錄號G9241]，立即分析含有B細胞之原始盤的增生。接著分析樣本的發光。簡言之，將盤置於迴轉式振盪器上2分鐘，在室溫下培養10分鐘，接著在PheraStar [BMGLabTech]上記錄發光。接著亦經由MSD [MesoScale Diagonsitics目錄號K15067L]按照製造商規程分析在先前步驟中保存之上清液的IL-6生產。計算增生及細胞介素生產兩者之由方程式定義的抑制百分比=100*(1-((經刺激平均值-化合物孔(經化合物處理之所關注的孔之原始數據)) / (經刺激平均值-未經刺激平均值)))。 B細胞活化標記表現

PBMC係按照人類樣本獲取之機構規程，透過HemaCare (Northridge, CA)購買。根據製造商之規程將細胞解凍。將PBMC與RPMI在96孔盤中以3×105個細胞/孔培養，RPMI含有：10% FBS、2%青黴素及鏈黴素，[ThermoFisher]。在接種之後，將PBMC與分子在4℃下培養30分鐘。在30分鐘培養時間後，將抗IgM F(ab’2) (10 µg/mL) [Jackson Immunoresearch laboratories目錄號109-006-129]添加至孔中。在對照孔中，將不含抗IgM之培養基添加至孔中作為無刺激對照。在24小時之後，將細胞用PBS洗滌並與可固定活力染料(Fixable Viability Dye) eFluo 506 (Ebioscience)在冰上培養30分鐘。接著將細胞用FAC緩衝液（具有1% FBS及1 mM EDTA之PBS）洗滌，接著按照製造商之推薦濃度用抗CD20-PE [殖株2H7 Biolegend，目錄號302348]、抗CD69 AF700 [殖株FN50 Biolegend，目錄號310922]、及抗CD83 APC/Cy7 [殖株HB15 Biolegend，目錄號305330]在4℃下表面染色30分鐘。將盤離心(300 RCF, 5min)，用FAC緩衝液洗滌兩次，接著按照製造商推薦用Cytofix緩衝液[BD Biosciences目錄號554655]固定。接著在被獲取用於分析之前，將細胞再懸浮於FAC緩衝液中。流動式細胞測量術數據係在CantoII流動式細胞測量儀(BD Biosciences)上獲得，並使用FlowJo軟體(TreeStar)分析。在活細胞、淋巴球、及CD20陽性B細胞上圈選細胞。判定表現活化標記CD69或CD83之B細胞之百分比。由方程式定義的抑制百分比=100*(1-((經刺激平均值-經藥物處理之孔(經藥物處理之所關注的孔之原始數據)) / (經刺激平均值-未經刺激平均值)。實驗結果

CD22 x CD79b雙特異性抗體影響增生及細胞介素生產之B細胞遠端讀出（圖6）。B細胞遠端讀出（增生、細胞介素分泌）被釘合CD22 x CD79b雙特異性抗體強烈抑制。在刺激前將經純化之B細胞與下列培養30分鐘：CD22 x CD79b雙特異性抗體、CD22 x同型雙特異性抗體(C192B36)、及同型x CD79b雙特異性抗體(C192B2)。在30分鐘培養之後，接著將B細胞用協同劑量的抗IgM F(ab)’2 (2.5 µg/mL)及CPG (0.3125 µM)刺激。如圖6所示，相較於同型對照臂，CD22 x CD79b抗體（WT、YTE、及釘合YTE）能夠回應於BCR及+TLR刺激而顯著降低B細胞增生。此外，在WT、YTE、及釘合YTE分子存在下，B細胞IL-6的IL-6生產減少（圖6），而同型對照臂再次顯示幾乎沒有效果。

為了探索CD22 x CD79b雙特異性抗體對B細胞活化之影響，在周邊血液單核細胞(PBMC)檢定中執行實驗。CD22 x CD79b雙特異性抗體降低B細胞活化，如由活化標記CD69及CD83之表現減少所展示。在添加抗IgM F(ab)’2 (10 µg/mL)之前，將PBMC與WT及釘合YTE、或同型x CD79b雙特異性抗體(C192B2)預培養30分鐘。如圖7所示，相較於同型x CD79b雙特異性抗體，CD22 x CD79b抗體（WT及釘合YTE）能夠回應於IgM BCR刺激而降低B細胞活化。

〔圖1 〕描繪實驗結果，其展示CD22 x CD79b雙特異性抗體之非消耗能力(non-depleting capacity)。將PBMC與下列培養48小時：單獨培養基、CD22 x CD79b雙特異性抗體(C192B30)、CD22 x同型雙特異性抗體(C192B36)、同型x CD79b雙特異性抗體(C192B2)、或抗CD20消耗mAb。在48小時之後，將細胞針對活細胞(Zombie Dye Aqua)、T細胞(CD3)、及B細胞（CD22、CD20、CD19）進行染色。接著相較於單獨的培養基孔，計算b細胞百分比。雙特異性抗體在任何雙特異性形式下幾乎不消耗B細胞，而抗CD20消耗mAb之陽性對照顯示PBMC中之B細胞顯著減少。 〔圖2 〕描繪實驗結果，其展示B細胞近端信號（p-Syk、p-PLCγ2）被CD22 x CD79b雙特異性抗體抑制。在刺激前將經純化之B細胞與下列培養30分鐘：單獨培養基、CD22 x CD79b雙特異性抗體(C192B30)、CD22 x同型雙特異性抗體(C192B36)、及同型x CD79b雙特異性抗體(C192B2)。在經過30分鐘之後，將B細胞用抗IgM F(ab)’2 (20 µg/mL)刺激，以避免任何可能已涉及FcγR結合之干擾因子。接著在給定時間點（0、5、8、10、15、及30分鐘）將B細胞固定數分鐘。在固定後，將細胞針對B細胞受體(BCR)複合物之下游磷蛋白信號傳導分子（p-Syk、p-PLCγ2）進行染色。相較於經刺激對照或同型對照臂對照，CD22 x CD79b雙特異性抗體藉由抑制p-Syk及p-PLCγ2來顯著影響B細胞透過BCR複合物信號傳導之能力。 〔圖3 〕描繪實驗結果，其展示B細胞遠端讀出（增生、細胞介素分泌）被CD22 x CD79b雙特異性抗體顯著抑制。在刺激前將經純化之B細胞與下列培養30分鐘：CD22 x CD79b雙特異性抗體(C192B30)、CD22 x同型雙特異性抗體(C192B36)、及同型x CD79b雙特異性抗體(C192B2)。在30分鐘之後，將B細胞用協同劑量的抗IgM F(ab)’2 (2.5 µg/mL)及CPG (0.3125 µM)刺激。如所示，相較於同型對照臂，CD22 x CD79b抗體能夠回應於BCR+TLR刺激而顯著降低B細胞增生。此外，B細胞IL-6生產受到顯著影響，而同型對照臂再次顯示幾乎沒有效果。 〔圖4 〕描繪實驗結果，其展示CD22 x CD79b雙特異性抗體抑制自NSG-人類PBMC轉移模型之體內IgM抗體生產。將人類PBMC轉移至經輻照免疫缺陷小鼠- NSG (NOD-scid IL2Rγ ^null)。接著將小鼠用不同劑量的CD22 x CD79b雙特異性抗體（0.2 mg/kg、1 mg/kg、及5 mg/kg）或同型對照抗體(5 mg/kg)處理。接著使細胞植入7天。在此時間期間，B細胞開始在體內生產人類抗體。在7天之後，將動物犧牲，取脾細胞進行流動式細胞測量術，並取血清進行分析。相較於對照（PBS及同型），用CD22 x CD79b雙特異性抗體處理之5 mg/kg組中的血清顯示人類IgM顯著降低。 〔圖5 〕描繪實驗結果，其展示將CD79b-scFv臂釘合(stapling)減輕聚集。 〔圖6 〕描繪實驗結果，其展示經釘合之雙特異性分子抑制B細胞功能。 〔圖7 〕描繪實驗結果，其展示CD22 x CD79b雙特異性抗體降低B細胞活化，如由活化標記CD69及CD83之表現減少所展示。

Claims

一種多特異性抗體或多特異性結合片段，其包含： a) 結合分化簇79B蛋白(CD79B)之第一抗原結合臂，其包含第一可變重域(VH1)且進一步包含第一可變輕域(VL1)；及 b) 結合分化簇22 (CD22)之第二抗原結合臂，其包含第二可變重域(VH2)且進一步包含第二可變輕域(VL2)。
如請求項1所述之多特異性抗體或多特異性結合片段，其中： (a) 該VH1包含SEQ ID NO:9之HCDR1、SEQ ID NO:10之HCDR2、及SEQ ID NO:11之HCDR3；且該VL1包含SEQ ID NO:12之LCDR1、SEQ ID NO:13之LCDR2、及SEQ ID NO:14之LCDR3； (b) 該VH1包含SEQ ID NO:17之HCDR1、SEQ ID NO:18之HCDR2、及SEQ ID NO:19之HCDR3；且該VL1包含SEQ ID NO:20之LCDR1、SEQ ID NO:21之LCDR2、及SEQ ID NO:22之LCDR3； (c) 該VH1包含SEQ ID NO:25之HCDR1、SEQ ID NO:26之HCDR2、及SEQ ID NO:27之HCDR3；且該VL1包含SEQ ID NO:28之LCDR1、SEQ ID NO:29之LCDR2、及SEQ ID NO:30之LCDR3； (d) 該VH1包含SEQ ID NO:33之HCDR1、SEQ ID NO:34之HCDR2、及SEQ ID NO:35之HCDR3；且該VL1包含SEQ ID NO:36之LCDR1、SEQ ID NO:37之LCDR2、及SEQ ID NO:38之LCDR3； (e) 該VH1包含SEQ ID NO:41之HCDR1、SEQ ID NO:42之HCDR2、及SEQ ID NO:43之HCDR3；且該VL1包含SEQ ID NO:44之LCDR1、SEQ ID NO:45之LCDR2、及SEQ ID NO:46之LCDR3； (f) 該VH1包含SEQ ID NO:49之HCDR1、SEQ ID NO:50之HCDR2、及SEQ ID NO:51之HCDR3；且該VL1包含SEQ ID NO:52之LCDR1、SEQ ID NO:53之LCDR2、及SEQ ID NO:54之LCDR3；或 (g) 該VH1包含SEQ ID NO:57之HCDR1、SEQ ID NO:58之HCDR2、及SEQ ID NO:59之HCDR3；且該VL1包含SEQ ID NO:60之LCDR1、SEQ ID NO:61之LCDR2、及SEQ ID NO:62之LCDR3。
如請求項1或請求項2所述之多特異性抗體或多特異性結合片段，其中結合CD79b之該第一抗原結合臂包含選自由下列所組成之群組的VH及VL： a) SEQ ID NO: 15之VH及SEQ ID NO: 16之VL； b) SEQ ID NO: 23之VH及SEQ ID NO: 24之VL； c) SEQ ID NO: 31之VH及SEQ ID NO: 32之VL； d) SEQ ID NO: 39之VH及SEQ ID NO: 40之VL； e) SEQ ID NO: 47之VH及SEQ ID NO: 48之VL； f) SEQ ID NO: 55之VH及SEQ ID NO: 56之VL； g) SEQ ID NO: 63之VH及SEQ ID NO: 64之VL；及 h) SEQ ID NO: 80之VH及SEQ ID NO: 81之VL。
如請求項1至3中任一項所述之多特異性抗體或多特異性結合片段，其中結合CD79b之該抗原結合臂包含：VH1，其包含SEQ ID NO:9之HCDR1、SEQ ID NO:10之HCDR2、及SEQ ID NO:11之HCDR3；及VL1，其包含SEQ ID NO:12之LCDR1、SEQ ID NO:13之LCDR2、及SEQ ID NO:14之LCDR3。
如請求項1至4中任一項所述之多特異性抗體或多特異性結合片段，其中結合CD79b之該抗原結合臂包含SEQ ID NO: 80之VH1及SEQ ID NO: 81之VL1。
如請求項1至5中任一項所述之多特異性抗體或多特異性結合片段，其中結合CD22之該第二抗原結合臂包含VH2，其包含SEQ ID NO:1之HCDR1、SEQ ID NO:2之HCDR2、及SEQ ID NO:3之HCDR3；及VL2，其包含SEQ ID NO:4之LCDR1、SEQ ID NO:5之LCDR2、及SEQ ID NO:6之LCDR3。
如請求項1至6中任一項所述之多特異性抗體或多特異性結合片段，其中該VH2包含SEQ ID NO:7，且該VL2包含SEQ ID NO:8。
如請求項1至7中任一項所述之多特異性抗體或多特異性結合片段，其中該第一或第二抗原結合臂包含選自由下列所組成之群組的至少一者：單鏈可變片段(scFv)、(scFv) ₂、抗原結合片段(Fab)、F(ab’) ₂、Fd、Fv、VHH、及dAB。
如請求項8所述之多特異性抗體或多特異性結合片段，其中該第一抗原結合臂包含scFv，且該第二抗原結合臂包含Fab。
如請求項1至9中任一項所述之多特異性抗體或多特異性結合片段，其中該第一抗原結合臂包含具有SEQ ID NO:82之胺基酸序列的scFv。
如請求項1至10中任一項所述之多特異性抗體或多特異性結合片段，其中結合CD79b之該第一抗原結合臂包含或可操作地連接至第一可結晶片段(Fc)域，且其中結合CD22之該第二抗原結合臂包含或可操作地連接至第二Fc域。
如請求項11所述之多特異性抗體或多特異性結合片段，其中該第一及第二Fc域中之至少一者包含一或多個突變，其促進該等Fc域之異二聚化、減少Fc與Fcγ受體之結合、減少Fc與蛋白質A之結合、延長該多特異性抗體或多特異性結合片段之半衰期、或其任何組合。
如請求項12所述之多特異性抗體或多特異性結合片段，其中促進該等Fc域之異二聚化的該一或多個突變係選自T366S、L368A、T366W、及Y407V（EU編號）。
如請求項13所述之多特異性抗體或多特異性結合片段，其中該第一Fc域包含突變T366W，且其中該第二Fc域包含突變T366S、L368A、及Y407V。
如請求項12至14中任一項所述之多特異性抗體或多特異性結合片段，其中減少Fc與Fcγ受體之結合的該一或多個突變係選自L234A、L235A、及D265S（EU編號）。
如請求項15所述之多特異性抗體或多特異性結合片段，其中該第一Fc域及該第二Fc域兩者皆包含突變L234A、L235A、及D265S。
如請求項12至16中任一項所述之多特異性抗體或多特異性結合片段，其中減少Fc與蛋白質A之結合的該一或多個突變係選自H435R及Y436F（EU編號）。
如請求項17所述之多特異性抗體或多特異性結合片段，其中該第二Fc域包含突變H435R及Y436F。
如請求項12至18中任一項所述之多特異性抗體或多特異性結合片段，其中延長該多特異性抗體或多特異性結合片段之半衰期的該一或多個突變係選自M252Y、S254T、及T256E（EU編號）。
如請求項19所述之多特異性抗體或多特異性結合片段，其中該第一Fc域及該第二Fc域兩者皆包含突變M252Y、S254T、及T256E。
如請求項11至20中任一項所述之多特異性抗體或多特異性結合片段，其中該第一Fc域包含SEQ ID NO:89，且其中該第二Fc域包含SEQ ID NO:90。
如請求項1至21中任一項所述之多特異性抗體或多特異性結合片段，其包含SEQ ID NO:79、SEQ ID NO: 83、及SEQ ID NO: 84之胺基酸序列。
一種免疫接合物，其包含接合至治療劑或顯像劑的如請求項1至22中任一項所述之多特異性抗體或多特異性結合片段。
一種醫藥組成物，其包含如請求項1至22中任一項所述之多特異性抗體或多特異性結合片段及醫藥上可接受之載劑。
一種多核苷酸，其編碼如請求項1至22中任一項所述之多特異性抗體或多特異性結合片段。
一種載體，其包含如請求項25所述之多核苷酸。
一種宿主細胞，其包含如請求項27所述之載體。
一種如請求項1至22中任一項所述之多特異性抗體或多特異性結合片段用於製備調節B細胞活化、抑制異常B細胞活化、或治療自體免疫疾病之藥物之用途。
如請求項28所述之用途，其中該自體免疫疾病係全身性紅斑性狼瘡(SLE)、休格倫氏症候群(Sjögren’s syndrome, SjS)、類風濕性關節炎、自體免疫性肌肉病變、第I型糖尿病、愛迪生氏病(Addison disease)、惡性貧血、自體免疫性肝炎、原發性膽汁性膽管炎(PBC)、自體免疫性胰臟炎、乳糜瀉、局部節段性腎絲球硬化症、原發性膜性腎病、卵巢衰竭、自體免疫性睾丸炎、乾眼症、特發性間質性肺炎、甲狀腺疾病（例如葛瑞夫茲氏病(Grave’s)）、全身性硬化症（硬皮症）、肌無力症候群、自體免疫性腦炎、大皰性皮膚病、TTP、ITP、AIHA、Anca血管炎、心肌炎/擴張型CM、NMOSD、母體-胎兒同種異體免疫、母體-胎兒自體免疫、抗心磷脂/抗磷脂質症候群、高γ球蛋白血症、移植相關ID、或多灶性運動神經病變。
一種如請求項1至22中任一項所述之多特異性抗體或多特異性結合片段用於製備減少B細胞增生、減少細胞介素生產、或降低B細胞活化之藥物之用途。