JP3213314B2 - 幹細胞因子レセプターに対するモノクローナル抗体 - Google Patents
幹細胞因子レセプターに対するモノクローナル抗体Info
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、ヒト幹細胞因子（hSCF）と結合する細胞レ
セプターに特異的であるモノクローナル抗体、並びにこ
のようなモノクローナル抗体を含有する医薬組成物及び
このようなモノクローナル抗体の使用に係わる。
セプターに特異的であるモノクローナル抗体、並びにこ
のようなモノクローナル抗体を含有する医薬組成物及び
このようなモノクローナル抗体の使用に係わる。
幹細胞因子（SCF）は、多分化能性造血前駆細胞の増
殖を刺激する成長因子である。この因子はE.coli及び様
々な哺乳動物細胞において遺伝子組み換え技術で製造さ
れている［Zsebo et al.,Cell 63,pp.195−212（199
0）；並びに1990年10月１日付、1990年８月24日付及び1
990年６月11日付でそれぞれ出願された同時係属米国特
許出願第07/589,701号、同第07/573,616号及び同第07/5
37,198号］。
殖を刺激する成長因子である。この因子はE.coli及び様
々な哺乳動物細胞において遺伝子組み換え技術で製造さ
れている［Zsebo et al.,Cell 63,pp.195−212（199
0）；並びに1990年10月１日付、1990年８月24日付及び1
990年６月11日付でそれぞれ出願された同時係属米国特
許出願第07/589,701号、同第07/573,616号及び同第07/5
37,198号］。
最近、プロトオンコジーンｅ−kitがSCFのレセプター
として同定された［Zsebo et al.,Cell 63,pp.213−224
（1990）］。ｃ−kitがSCFにとってのリガンドとして同
定される以前から、ｃ−kitレセプターの存在は知られ
ていた［Yarden et al.,EMBO J.６,pp.3341−3351（198
7）;Qiu et al.,EMBO J.７,pp.1003−1011（1988）;Fla
nagan and Leder,Cell 63,pp.185−194（1990）］。
として同定された［Zsebo et al.,Cell 63,pp.213−224
（1990）］。ｃ−kitがSCFにとってのリガンドとして同
定される以前から、ｃ−kitレセプターの存在は知られ
ていた［Yarden et al.,EMBO J.６,pp.3341−3351（198
7）;Qiu et al.,EMBO J.７,pp.1003−1011（1988）;Fla
nagan and Leder,Cell 63,pp.185−194（1990）］。
マウスｃ−kitに対するポリクローナル抗体が報告さ
れている［Cellular Biology ８,pp.4896−4903（198
8）］が、この抗体がヒトｃ−kitと交叉反応するかどう
か、SCFのそのレセプターへの結合を阻止するかどう
か、あるいはまた細胞の成長に影響するかどうかは未知
である。ヒトｃ−kitカルボキシル末端ペプチドに対し
て産生されたポリクローナル抗体も報告されている［EM
BO J.６,pp.3341−3351（1987）］が、この抗体はSCFの
レセプターへの結合を阻止しない。ヒトSCFレセプター
を認識するモノクローナル抗体は報告されている［Lern
er et al.,Blood 76（Suppl.）,p.295a（1990）;Ashman
et al.,Leukemia Res.12,pp.923−928（1988）;Cambas
eri et al.,Leukemia Res.12,pp.929−939（1988）;Cad
d and Ashman,Leukemia Res.11,pp.1329−1336（198
5）］。
れている［Cellular Biology ８,pp.4896−4903（198
8）］が、この抗体がヒトｃ−kitと交叉反応するかどう
か、SCFのそのレセプターへの結合を阻止するかどう
か、あるいはまた細胞の成長に影響するかどうかは未知
である。ヒトｃ−kitカルボキシル末端ペプチドに対し
て産生されたポリクローナル抗体も報告されている［EM
BO J.６,pp.3341−3351（1987）］が、この抗体はSCFの
レセプターへの結合を阻止しない。ヒトSCFレセプター
を認識するモノクローナル抗体は報告されている［Lern
er et al.,Blood 76（Suppl.）,p.295a（1990）;Ashman
et al.,Leukemia Res.12,pp.923−928（1988）;Cambas
eri et al.,Leukemia Res.12,pp.929−939（1988）;Cad
d and Ashman,Leukemia Res.11,pp.1329−1336（198
5）］。
このように、本発明が現われるまでの従来技術では、
ｃ−kitレセプターに対するモノクローナル抗体でｃ−k
itリガンドとSCFとの結合を阻止する能力を有すると考
えられるものは全く得ることができなかった。
ｃ−kitレセプターに対するモノクローナル抗体でｃ−k
itリガンドとSCFとの結合を阻止する能力を有すると考
えられるものは全く得ることができなかった。
この研究は、国立衛生研究所認可P01−DK−31232及び
アメリカ癌協会認可JFRA217を介して米国政府より一部
資金提供を受けている。
アメリカ癌協会認可JFRA217を介して米国政府より一部
資金提供を受けている。
発明の概要 本発明は、SCFレセプターに結合する能力を有するモ
ノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体に係わる。
好ましくは、モノクローナル抗体がSCFレセプターに結
合することで当該SCFレセプターへのSCF分子の結合が阻
害されることにもなる。好ましくは、SCF及びSCFレセプ
ターはヒトに由来する。
ノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体に係わる。
好ましくは、モノクローナル抗体がSCFレセプターに結
合することで当該SCFレセプターへのSCF分子の結合が阻
害されることにもなる。好ましくは、SCF及びSCFレセプ
ターはヒトに由来する。
本発明の別の構成では、SCFレセプターモノクローナ
ル抗体を造血細胞精製方法に用い、この方法は （ａ）細胞混合物をSCFレセプターモノクローナル抗体
に暴露するステップと、 （ｂ）前記モノクローナル抗体と結合した細胞を前記モ
ノクローナル抗体と結合しない細胞から分離するステッ
プと を含む。
ル抗体を造血細胞精製方法に用い、この方法は （ａ）細胞混合物をSCFレセプターモノクローナル抗体
に暴露するステップと、 （ｂ）前記モノクローナル抗体と結合した細胞を前記モ
ノクローナル抗体と結合しない細胞から分離するステッ
プと を含む。
本発明の別の構成では、SCFレセプターモノクローナ
ル抗体で精製した造血細胞を、精製細胞へのレトロウイ
ルス媒介遺伝子移入を含む遺伝子療法に用いる。
ル抗体で精製した造血細胞を、精製細胞へのレトロウイ
ルス媒介遺伝子移入を含む遺伝子療法に用いる。
本発明の別の構成は、正常細胞を腫瘍細胞から分離す
る方法に係わり、この方法は （ａ）正常細胞及び腫瘍細胞を含む細胞混合物を本発明
によるモノクローナル抗体に暴露するステップと、 （ｂ）正常細胞及び腫瘍性白血病細胞のSCFレセプター
数の差に基づいて正常細胞を腫瘍性白血病細胞から分離
するステップと を含む。
る方法に係わり、この方法は （ａ）正常細胞及び腫瘍細胞を含む細胞混合物を本発明
によるモノクローナル抗体に暴露するステップと、 （ｂ）正常細胞及び腫瘍性白血病細胞のSCFレセプター
数の差に基づいて正常細胞を腫瘍性白血病細胞から分離
するステップと を含む。
本発明の別の構成は、SCFレセプターモノクローナル
抗体の、該抗体と結合させた抗腫瘍薬の治療有効量での
投与による腫瘍細胞治療への使用に係わる。
抗体の、該抗体と結合させた抗腫瘍薬の治療有効量での
投与による腫瘍細胞治療への使用に係わる。
本発明はまた、本発明のモノクローナル抗体の結合フ
ラグメントと結合させた腫瘍治療薬を治療有効量で投与
することを含む腫瘍細胞治療方法にも係わる。
ラグメントと結合させた腫瘍治療薬を治療有効量で投与
することを含む腫瘍細胞治療方法にも係わる。
本発明の別の構成は、細胞試料においてSCFレセプタ
ーの存在を決定する方法に係わり、この方法は （ａ）細胞試料を本発明のモノクローナル抗体に暴露す
るステップと、 （ｂ）前記モノクローナル抗体のSCFレセプターへの結
合を検出するステップと を含む。
ーの存在を決定する方法に係わり、この方法は （ａ）細胞試料を本発明のモノクローナル抗体に暴露す
るステップと、 （ｂ）前記モノクローナル抗体のSCFレセプターへの結
合を検出するステップと を含む。
本発明のモノクローナル抗体は、細胞周期特異的な化
学療法剤に対する感受性を改変する方法においても有用
であり、この方法は本発明のモノクローナル抗体をSCF
阻害量で投与することを含む。
学療法剤に対する感受性を改変する方法においても有用
であり、この方法は本発明のモノクローナル抗体をSCF
阻害量で投与することを含む。
図面の説明 第１図：ヒト胎児肝細胞に結合する125IhSCFのスキャ
ッチャード分析。0.9×106個の胎児肝細胞を125IhSCF
（５ピコモルから２ナノモル）及び100倍量の未標識hSC
Fと共に15℃で４時間インキュベートした。
ッチャード分析。0.9×106個の胎児肝細胞を125IhSCF
（５ピコモルから２ナノモル）及び100倍量の未標識hSC
Fと共に15℃で４時間インキュベートした。
第２図：組み換え体ヒトSCF（rHuSCF）が単独で、あ
るいはまたインターロイキン３のような他の成長因子と
組み合わせて投与された時に急性非リンパ性白血病細胞
の増殖に及ぼす作用。
るいはまたインターロイキン３のような他の成長因子と
組み合わせて投与された時に急性非リンパ性白血病細胞
の増殖に及ぼす作用。
第３図：急性非リンパ性白血病（ANLL）患者由来の芽
細胞に結合する125IhSCFのスキャッチャードプロット。
細胞に結合する125IhSCFのスキャッチャードプロット。
第４図：ヒト小細胞肺癌細胞に結合する125IhSCFのス
キャッチャード分析。0.2×106個の小細胞肺癌細胞（H6
9細胞系）を125IhSCF（５ピコモルから２ナノモル）及
び100倍量の未標識hSCFと共に15℃で４時間インキュベ
ートした。
キャッチャード分析。0.2×106個の小細胞肺癌細胞（H6
9細胞系）を125IhSCF（５ピコモルから２ナノモル）及
び100倍量の未標識hSCFと共に15℃で４時間インキュベ
ートした。
第５図:OCIM1細胞に結合する125IhSCFのスキャッチャ
ードプロット。
ードプロット。
第６図：正常なヒト骨髄に結合するSCFの間接免疫蛍
光分析。骨髄細胞を抗CD34モノクローナル抗体と、SR−
１（第6B図）またはイソタイプ整合対照モノクローナル
抗体（抗Thy1.1;第6A図）とで同時に標識した。
光分析。骨髄細胞を抗CD34モノクローナル抗体と、SR−
１（第6B図）またはイソタイプ整合対照モノクローナル
抗体（抗Thy1.1;第6A図）とで同時に標識した。
第７図:SCFレセプターｃ−kitのモノクローナル抗体S
R−１による認識。COS−１細胞をV19.8、またはヒトｃ
−kitを含むV19.8でトランスフェクトした。COS細胞膜
を、低温SCFまたは（1:1000に稀釈した）SR−１腹水を
伴い、または伴わない１ナノモルの125IhSCFと共にイン
キュベートし、結合した標識SCFを測定した。
R−１による認識。COS−１細胞をV19.8、またはヒトｃ
−kitを含むV19.8でトランスフェクトした。COS細胞膜
を、低温SCFまたは（1:1000に稀釈した）SR−１腹水を
伴い、または伴わない１ナノモルの125IhSCFと共にイン
キュベートし、結合した標識SCFを測定した。
発明の詳細な説明 本発明は、SCFレセプターに結合する能力を有するモ
ノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体に係わる。
好ましくは、モノクローナル抗体がSCFレセプターに結
合することで当該SCFレセプターへのSCF分子の結合が阻
害されることにもなる。好ましくは、SCF及びSCFレセプ
ターはヒトに由来する。更に好ましくは、モノクローナ
ル抗体はIgG2aイソタイプの抗体である。
ノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体に係わる。
好ましくは、モノクローナル抗体がSCFレセプターに結
合することで当該SCFレセプターへのSCF分子の結合が阻
害されることにもなる。好ましくは、SCF及びSCFレセプ
ターはヒトに由来する。更に好ましくは、モノクローナ
ル抗体はIgG2aイソタイプの抗体である。
上記のようなモノクローナル抗体は、動物を抗原また
は免疫原で免疫もしくは感作し、その結果得られた抗体
産生細胞を安定で長期間生存する細胞系（不死細胞系）
と融合させてハイブリドーマを形成し、ハイブリドーマ
をスクリーニングして、所望抗体を産生する細胞から成
るコロニーを選別し、かつ産生されたモノクローナル抗
体を産生細胞から単離することを含む通常の方法で得る
ことができる。
は免疫原で免疫もしくは感作し、その結果得られた抗体
産生細胞を安定で長期間生存する細胞系（不死細胞系）
と融合させてハイブリドーマを形成し、ハイブリドーマ
をスクリーニングして、所望抗体を産生する細胞から成
るコロニーを選別し、かつ産生されたモノクローナル抗
体を産生細胞から単離することを含む通常の方法で得る
ことができる。
感作は抗原を抗体産生種に注射することによって行な
い得る。好ましくは、上記注射は哺乳動物に、更に好ま
しくはマウスに対して行なう。普通、応答を最大化する
ために、最初の注射の後にブースター注射を行なう。好
ましい注射方式では、BALB/cマウスに対して複数回の注
射を行ない、即ち例えば毎週１回の腹腔内注射を３週間
連続して行なう。注射する抗原の量は、十分検出可能な
量の抗体を産生させるのに十分でなければならない。好
ましい注射抗原量はSCFレセプター保有細胞の数で104〜
108個であり、更に好ましくは105〜107個、最も好まし
くは約106個である。
い得る。好ましくは、上記注射は哺乳動物に、更に好ま
しくはマウスに対して行なう。普通、応答を最大化する
ために、最初の注射の後にブースター注射を行なう。好
ましい注射方式では、BALB/cマウスに対して複数回の注
射を行ない、即ち例えば毎週１回の腹腔内注射を３週間
連続して行なう。注射する抗原の量は、十分検出可能な
量の抗体を産生させるのに十分でなければならない。好
ましい注射抗原量はSCFレセプター保有細胞の数で104〜
108個であり、更に好ましくは105〜107個、最も好まし
くは約106個である。
くわえて、ヒトモノクローナル抗体の発生はin vitro
免疫技術を用いて実現し得る［Ho et al.,J.Immunol.13
5,p.3831（1985）］。マウスモノクローナル抗体の可変
部を、ヒトにおいてヒトへの異種タンパク質投与にしば
しば関連する免疫原性の問題を防止するのに好ましく用
い得るヒト免疫グロブリンの不変部上に遺伝子工学的手
法で配置することも可能である。
免疫技術を用いて実現し得る［Ho et al.,J.Immunol.13
5,p.3831（1985）］。マウスモノクローナル抗体の可変
部を、ヒトにおいてヒトへの異種タンパク質投与にしば
しば関連する免疫原性の問題を防止するのに好ましく用
い得るヒト免疫グロブリンの不変部上に遺伝子工学的手
法で配置することも可能である。
このようないわゆる“キメラ抗体”は、ヒト抗体分子
の可変抗原結合部をコードする遺伝子をヒト抗体分子の
不変部をコードする遺伝子に対してスプライシングする
ことによって得ることができる［Sahagan et al.,J.Imm
unol.137,pp.1066−1074（1986）;Beidler et al.,J.Im
munol.141,pp.4053−4060（1988）;Morrison et al.,An
n.N.Y.Acad.Sci.507,pp.187−198（1988）］。
の可変抗原結合部をコードする遺伝子をヒト抗体分子の
不変部をコードする遺伝子に対してスプライシングする
ことによって得ることができる［Sahagan et al.,J.Imm
unol.137,pp.1066−1074（1986）;Beidler et al.,J.Im
munol.141,pp.4053−4060（1988）;Morrison et al.,An
n.N.Y.Acad.Sci.507,pp.187−198（1988）］。
本発明に包含されると考えられる別の操作では、ヒト
の不変部及びフレームワーク可変部と結合したマウスの
超可変部を含むキメラ抗体を製造する［Reichman et a
l.,Nature 332,pp.323−327（1988）］。ほとんどの場
合、抗原特異性はＶ領域（超可変部）またはCDR領域
（相補的決定領域）の所定のセグメントに存する。抗原
結合部位は、Ｖ領域の残りのフレームワーク部分から伸
長するCDRループによって構成される。宿主の免疫反応
はキメラ抗体の、さほど可変性でない齧歯動物フレーム
ワークＶ領域に対して生起し得る。ヒトフレームワーク
Ｖ領域を含むキメラ抗体は、マウスCDR領域によって付
与された抗原結合特異性を保持するが、宿主の免疫応答
を惹起するとは考えられない。総合的遺伝子合成は、齧
歯動物抗体由来のCDRをヒトフレームワークに移植したC
DR置換変異細胞を製造する最も実用的な方法である。所
望のＶ領域の配列決定に従って当該配列を化学的に合成
し、クローニングし、その後適当な発現ベクターに挿入
する。
の不変部及びフレームワーク可変部と結合したマウスの
超可変部を含むキメラ抗体を製造する［Reichman et a
l.,Nature 332,pp.323−327（1988）］。ほとんどの場
合、抗原特異性はＶ領域（超可変部）またはCDR領域
（相補的決定領域）の所定のセグメントに存する。抗原
結合部位は、Ｖ領域の残りのフレームワーク部分から伸
長するCDRループによって構成される。宿主の免疫反応
はキメラ抗体の、さほど可変性でない齧歯動物フレーム
ワークＶ領域に対して生起し得る。ヒトフレームワーク
Ｖ領域を含むキメラ抗体は、マウスCDR領域によって付
与された抗原結合特異性を保持するが、宿主の免疫応答
を惹起するとは考えられない。総合的遺伝子合成は、齧
歯動物抗体由来のCDRをヒトフレームワークに移植したC
DR置換変異細胞を製造する最も実用的な方法である。所
望のＶ領域の配列決定に従って当該配列を化学的に合成
し、クローニングし、その後適当な発現ベクターに挿入
する。
本発明のモノクローナル抗体の産生に有用な抗原は、
その表面にSCFレセプターを有する任意の細胞系であ
る。このような細胞系には、ヒト赤白血病細胞系OCIM1
［Papayannopoulou et al.,Blood 72,pp.1029−1038（1
988）］、K562（ATCC CCL 243）；骨髄細胞系もしくは
単球細胞系KG1（ATCC CCL 246）、KG1α（ATCC CCL 24
6.1）、AML−193［Santoli et al.,J.Immunology 139,
p.3348（1987）］、U937（ATCC CRL 1593）；リンパ球
細胞系Daudi（ATCC CCL 213）、IM−９（ATCC CCL 15
9）；肥満細胞系HMC−１［Butterfield et al.,Leukemi
a Research 12,p.345（1988）］；膀胱癌細胞系5637（A
TCC HTB 9）、COS（ATCC CRL 1650）、BHK（ATCC CCL 1
0）；胃癌細胞系KAT03（ATCC HTB 103）；小細胞癌細胞
系H69（ATCC HTB 119）、H128（ATCC HTB 120）；及び
乳癌細胞系DU4475（ATCC HTB 123）が含まれ、これらの
細胞系はthe American Type Culture Collection,Rockv
ille,Marylandに寄託されている。好ましい抗原はヒト
赤白血病細胞系OCIM1である。
その表面にSCFレセプターを有する任意の細胞系であ
る。このような細胞系には、ヒト赤白血病細胞系OCIM1
［Papayannopoulou et al.,Blood 72,pp.1029−1038（1
988）］、K562（ATCC CCL 243）；骨髄細胞系もしくは
単球細胞系KG1（ATCC CCL 246）、KG1α（ATCC CCL 24
6.1）、AML−193［Santoli et al.,J.Immunology 139,
p.3348（1987）］、U937（ATCC CRL 1593）；リンパ球
細胞系Daudi（ATCC CCL 213）、IM−９（ATCC CCL 15
9）；肥満細胞系HMC−１［Butterfield et al.,Leukemi
a Research 12,p.345（1988）］；膀胱癌細胞系5637（A
TCC HTB 9）、COS（ATCC CRL 1650）、BHK（ATCC CCL 1
0）；胃癌細胞系KAT03（ATCC HTB 103）；小細胞癌細胞
系H69（ATCC HTB 119）、H128（ATCC HTB 120）；及び
乳癌細胞系DU4475（ATCC HTB 123）が含まれ、これらの
細胞系はthe American Type Culture Collection,Rockv
ille,Marylandに寄託されている。好ましい抗原はヒト
赤白血病細胞系OCIM1である。
感作を行なうと、感作された動物は抗原に特異的な抗
体を産生及び分泌するＢ細胞を生じさせる。このような
細胞は、免疫マウスの脾臓を取り出すことにより単離し
て後の使用に供することができる。
体を産生及び分泌するＢ細胞を生じさせる。このような
細胞は、免疫マウスの脾臓を取り出すことにより単離し
て後の使用に供することができる。
上記のようにして得られた抗体産生細胞は、安定で長
期間生存する適当な細胞系（不死細胞系）と、当業者に
公知の技術を用いて融合させ得る［Kohler and Milstei
n,Nature 256,pp.495−497（1975）］。抗体産生細胞と
の融合に適した細胞系は抗体合成能に欠ける任意の細胞
系であり、そのうちで好ましいものは選択物質含有培地
上で増殖する能力にも欠け、またきわめて好ましいの
は、活性なヒポキサンチン−グアニジンホスホリボシル
トランスフェラーゼタンパク質をもたらし得ない突然変
異ヒポキサンチン−グアニジンホスホリボシルトランス
フェラーゼ遺伝子（HGPRT−遺伝子）を有する。ヒポキ
サンチン−グアニジンホスホリボシルトランスフェラー
ゼはアミノプテリン含有培地上での増殖に必要である。
上記のような細胞系の好ましい一例に骨髄腫細胞、特に
NS−１マウス骨髄腫細胞系が有る［ATCC T1B 18;Nowins
ki et al.,Virology 93,pp.111−126（1979）］。最近
では、融合相手としてヒト細胞系を用いることにおいて
さえ成果が上げられている［Banchereau et al.,Scienc
e 251,pp.70−72（1991）］。
期間生存する適当な細胞系（不死細胞系）と、当業者に
公知の技術を用いて融合させ得る［Kohler and Milstei
n,Nature 256,pp.495−497（1975）］。抗体産生細胞と
の融合に適した細胞系は抗体合成能に欠ける任意の細胞
系であり、そのうちで好ましいものは選択物質含有培地
上で増殖する能力にも欠け、またきわめて好ましいの
は、活性なヒポキサンチン−グアニジンホスホリボシル
トランスフェラーゼタンパク質をもたらし得ない突然変
異ヒポキサンチン−グアニジンホスホリボシルトランス
フェラーゼ遺伝子（HGPRT−遺伝子）を有する。ヒポキ
サンチン−グアニジンホスホリボシルトランスフェラー
ゼはアミノプテリン含有培地上での増殖に必要である。
上記のような細胞系の好ましい一例に骨髄腫細胞、特に
NS−１マウス骨髄腫細胞系が有る［ATCC T1B 18;Nowins
ki et al.,Virology 93,pp.111−126（1979）］。最近
では、融合相手としてヒト細胞系を用いることにおいて
さえ成果が上げられている［Banchereau et al.,Scienc
e 251,pp.70−72（1991）］。
得られた融合細胞をスクリーニングして、所望抗体を
産生する細胞から成るコロニーを選別し得る。スクリー
ニング技術は当業者に公知であり、普通融合細胞を選択
物質含有培地上で増殖させることを含み、この増殖の際
（１）未融合の不死細胞が前記選択物質を免れる能力に
欠ける場合そのような不死細胞は死滅するが、（２）抗
体産生細胞由来の遺伝物質が前記選択物質を免れる能力
を有する場合そのような遺伝物質を有する細胞は増殖す
る。好ましい不死細胞系はHGPRT−遺伝子を有し、また
好ましい培地はアミノプテリンを含有する培地で、より
好ましくはヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン
（HAT）培地である。従って、抗体産生細胞系由来のHGP
RT＋遺伝子を有し、かつ不死細胞系由来の不死性を具え
た融合細胞のみが培地中で生存及び増殖する。
産生する細胞から成るコロニーを選別し得る。スクリー
ニング技術は当業者に公知であり、普通融合細胞を選択
物質含有培地上で増殖させることを含み、この増殖の際
（１）未融合の不死細胞が前記選択物質を免れる能力に
欠ける場合そのような不死細胞は死滅するが、（２）抗
体産生細胞由来の遺伝物質が前記選択物質を免れる能力
を有する場合そのような遺伝物質を有する細胞は増殖す
る。好ましい不死細胞系はHGPRT−遺伝子を有し、また
好ましい培地はアミノプテリンを含有する培地で、より
好ましくはヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン
（HAT）培地である。従って、抗体産生細胞系由来のHGP
RT＋遺伝子を有し、かつ不死細胞系由来の不死性を具え
た融合細胞のみが培地中で生存及び増殖する。
首尾よく生存及び増殖した融合細胞即ちハイブリドー
マに、これらが感作に用いた抗原に対する抗体を産生す
る能力を有するかどうか決定するべくスクリーニングを
施し得る。SCFの場合、上記のようなスクリーニングは
ハイブリドーマ産生物のSCFレセプターに結合する能力
によってか、ハイブリドーマ産生物の、SCFがSCFレセプ
ターに結合するのを阻害する能力によってか、標準的な
免疫学的技術（例えば放射性標識した精製SCFレセプタ
ーの免疫沈澱）によってか、またはハイブリドーマ産生
物の、ELISAアッセイにおいて精製SCFレセプターを認識
する能力によって可能である。好ましくは、ハイブリド
ーマのスクニーリングはハイブリドーマ産生物の、SCF
がSCFレセプターに結合するのを阻止する能力によって
行ない得る。
マに、これらが感作に用いた抗原に対する抗体を産生す
る能力を有するかどうか決定するべくスクリーニングを
施し得る。SCFの場合、上記のようなスクリーニングは
ハイブリドーマ産生物のSCFレセプターに結合する能力
によってか、ハイブリドーマ産生物の、SCFがSCFレセプ
ターに結合するのを阻害する能力によってか、標準的な
免疫学的技術（例えば放射性標識した精製SCFレセプタ
ーの免疫沈澱）によってか、またはハイブリドーマ産生
物の、ELISAアッセイにおいて精製SCFレセプターを認識
する能力によって可能である。好ましくは、ハイブリド
ーマのスクニーリングはハイブリドーマ産生物の、SCF
がSCFレセプターに結合するのを阻止する能力によって
行ない得る。
上記のようなアッセイで有用な幹細胞阻止（SCF）に
は、様々な種に由来する任意のSCFが含まれる。それら
のSCFは普通適当なアジュバントと共に溶解した状態で
あり、その際アジュバントは緩衝液、塩等を含み得る。
好ましくは、SCFはヒトSCF（HuSCF）であり、更に好ま
しくは組み換え体ヒトSCF（rHuSCF）、最も好ましくは
E.coliにおいて製造されたrHuSCFである。このようなSC
Fは先に述べたようにして得ることができる［Zsebo et
al.,Cell 63,pp.195−212（1990）；並びにその該当教
示に関していずれも本明細書に参考として含まれる、19
90年10月１日付、1990年８月24日付及び1990年６月11日
付でそれぞれ出願された同時係属米国特許出願第07/58
9,701号、同第07/573,616号及び同第07/537,198号］。
は、様々な種に由来する任意のSCFが含まれる。それら
のSCFは普通適当なアジュバントと共に溶解した状態で
あり、その際アジュバントは緩衝液、塩等を含み得る。
好ましくは、SCFはヒトSCF（HuSCF）であり、更に好ま
しくは組み換え体ヒトSCF（rHuSCF）、最も好ましくは
E.coliにおいて製造されたrHuSCFである。このようなSC
Fは先に述べたようにして得ることができる［Zsebo et
al.,Cell 63,pp.195−212（1990）；並びにその該当教
示に関していずれも本明細書に参考として含まれる、19
90年10月１日付、1990年８月24日付及び1990年６月11日
付でそれぞれ出願された同時係属米国特許出願第07/58
9,701号、同第07/573,616号及び同第07/537,198号］。
SCFレセプターに対する抗体の分泌に関して陽性と判
明したハイブリドーマは、サブクローニングして実質的
に無限に維持し得る。選別した上記のようなハイブリド
ーマはまた、該ハイブリドーマが分泌するモノクローナ
ル抗体の製造のために培養することができる。このよう
なハイブリドーマの培養物から所望のモノクローナル抗
体を単離することは、プロテインＡ−セファロースカラ
ムクロマトグラフィーを含めた当業者に公知の技術を用
いて可能である［Ey et al.,Immunochemistry 15,p.429
（1978）］。
明したハイブリドーマは、サブクローニングして実質的
に無限に維持し得る。選別した上記のようなハイブリド
ーマはまた、該ハイブリドーマが分泌するモノクローナ
ル抗体の製造のために培養することができる。このよう
なハイブリドーマの培養物から所望のモノクローナル抗
体を単離することは、プロテインＡ−セファロースカラ
ムクロマトグラフィーを含めた当業者に公知の技術を用
いて可能である［Ey et al.,Immunochemistry 15,p.429
（1978）］。
本発明のモノクローナル抗体は好ましくは、1991年４
月４日付でAmerican Type Culture Collection,Rockvil
le,Maryland,USAにBA7.3C.9として寄託され、受託番号H
B10716を付与された、“SR−1"と表記されるモノクロー
ナル抗体である。
月４日付でAmerican Type Culture Collection,Rockvil
le,Maryland,USAにBA7.3C.9として寄託され、受託番号H
B10716を付与された、“SR−1"と表記されるモノクロー
ナル抗体である。
本発明のモノクローナル抗体は造血細胞精製方法に用
い得、この方法は （ａ）細胞混合物を本発明のモノクローナル抗体に暴露
するステップと、 （ｂ）前記モノクローナル抗体と結合した細胞を前記モ
ノクローナル抗体と結合しない細胞から分離するステッ
プと を含む。
い得、この方法は （ａ）細胞混合物を本発明のモノクローナル抗体に暴露
するステップと、 （ｂ）前記モノクローナル抗体と結合した細胞を前記モ
ノクローナル抗体と結合しない細胞から分離するステッ
プと を含む。
細胞混合物の本発明のモノクローナル抗体への暴露
は、蛍光活性化細胞選別の場合のように溶解状態で行な
っても、あるいはまたカラムクロマトグラフィーや直接
免疫付着の場合のようにモノクローナル抗体を固体支持
体上に固定して行なってもよい。くわえて、抗CD34抗体
と、ビオチニル化した第二の抗体とをアビジンカラムに
通してヒト移植組織中の乳癌細胞を除去する場合に行な
われたように、細胞混合物の本発明のモノクローナル抗
体への暴露を溶解状態のモノクローナル抗体と固定支持
体に固定したモノクローナル抗体との組み合わせを用い
て行なうことも可能である［Bensinger et al.,J.Clin.
Apheresis ５,pp.74−76（1990）;Berenson et al.,Blo
od 76,pp.509−515（1986）］。
は、蛍光活性化細胞選別の場合のように溶解状態で行な
っても、あるいはまたカラムクロマトグラフィーや直接
免疫付着の場合のようにモノクローナル抗体を固体支持
体上に固定して行なってもよい。くわえて、抗CD34抗体
と、ビオチニル化した第二の抗体とをアビジンカラムに
通してヒト移植組織中の乳癌細胞を除去する場合に行な
われたように、細胞混合物の本発明のモノクローナル抗
体への暴露を溶解状態のモノクローナル抗体と固定支持
体に固定したモノクローナル抗体との組み合わせを用い
て行なうことも可能である［Bensinger et al.,J.Clin.
Apheresis ５,pp.74−76（1990）;Berenson et al.,Blo
od 76,pp.509−515（1986）］。
モノクローナル抗体に暴露するべき細胞混合物は、骨
髄細胞、血液細胞または組織細胞の任意の溶液であり得
る。好ましくは、細胞混合物は哺乳動物の骨髄、循環血
液または疑似腫瘍組織に由来する。細胞混合物をモノク
ローナル抗体に暴露すると、SCFレセプターを有する細
胞はモノクローナル抗体と結合して抗体−SCFレセプタ
ー細胞複合体を形成する。このように生じたSCFレセプ
ター細胞複合体は複合体とならない細胞から、当業者に
公知の方法で分離することができる。好ましい分離方法
には、カラムクロマトグラフィー、蛍光活性化細胞選
別、磁気ビーズ分離及び直接免疫付着が含まれる。
髄細胞、血液細胞または組織細胞の任意の溶液であり得
る。好ましくは、細胞混合物は哺乳動物の骨髄、循環血
液または疑似腫瘍組織に由来する。細胞混合物をモノク
ローナル抗体に暴露すると、SCFレセプターを有する細
胞はモノクローナル抗体と結合して抗体−SCFレセプタ
ー細胞複合体を形成する。このように生じたSCFレセプ
ター細胞複合体は複合体とならない細胞から、当業者に
公知の方法で分離することができる。好ましい分離方法
には、カラムクロマトグラフィー、蛍光活性化細胞選
別、磁気ビーズ分離及び直接免疫付着が含まれる。
上述のようにして精製した造血細胞は、骨髄移植を含
む造血細胞再構成方法に用い得る。骨髄移植の方法は当
業者に公知である［Hill et al.,Bone Marrow Transpla
nt.４,pp.69−74（1989）］が、SCFレセプターを有する
細胞のこのように同質な集団を移植物質として用いるこ
とはこれまで可能でなかった。上記精製細胞は骨髄移植
組織の長期移植を実現し得、かつ骨髄中に存在する恐れ
の有る汚染性の腫瘍細胞から先に述べた方法を用いて分
離可能である。そのうえ、本発明の精製方法で精製した
SCFレセプター保有細胞は、一層同質な細胞集団を得る
べく更に副次的に分別することができる。例えば、SCF
レセプター保有細胞の集団を、SCFレセプター保有細胞
の或る一定のサブ集団にしか現われない他の細胞表面タ
ンパク質に特異的なモノクローナル抗体に逐次暴露し得
る。このような逐次精製方法に用い得る他のモノクロー
ナル抗体の例に、やはり造血幹細胞において発現するCD
34抗原に対するモノクローナル抗体が含まれる［Andrew
s et al.,J.Exp.Med.169,pp.1721−1731（1989）;Civin
の1990年10月23日付米国特許第4,965,204号;Civinの199
0年10月31日付公開のヨーロッパ特許出願第395355
号］。
む造血細胞再構成方法に用い得る。骨髄移植の方法は当
業者に公知である［Hill et al.,Bone Marrow Transpla
nt.４,pp.69−74（1989）］が、SCFレセプターを有する
細胞のこのように同質な集団を移植物質として用いるこ
とはこれまで可能でなかった。上記精製細胞は骨髄移植
組織の長期移植を実現し得、かつ骨髄中に存在する恐れ
の有る汚染性の腫瘍細胞から先に述べた方法を用いて分
離可能である。そのうえ、本発明の精製方法で精製した
SCFレセプター保有細胞は、一層同質な細胞集団を得る
べく更に副次的に分別することができる。例えば、SCF
レセプター保有細胞の集団を、SCFレセプター保有細胞
の或る一定のサブ集団にしか現われない他の細胞表面タ
ンパク質に特異的なモノクローナル抗体に逐次暴露し得
る。このような逐次精製方法に用い得る他のモノクロー
ナル抗体の例に、やはり造血幹細胞において発現するCD
34抗原に対するモノクローナル抗体が含まれる［Andrew
s et al.,J.Exp.Med.169,pp.1721−1731（1989）;Civin
の1990年10月23日付米国特許第4,965,204号;Civinの199
0年10月31日付公開のヨーロッパ特許出願第395355
号］。
本発明によって精製した造血細胞は、精製細胞へのレ
トロウイルス媒介遺伝子移入を含む遺伝子療法にも用い
得る。レトロウイルス媒介遺伝子移入の方法は当業者に
公知である［Bodine et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8
6,pp.8897−8901（1989）］が、SCFレセプターを有する
細胞のこのように同質な集団をトランスフェクトして用
いることはこれまで可能でなかった。トランスフェクト
した上記精製細胞は骨髄移植に用いることができる。
トロウイルス媒介遺伝子移入を含む遺伝子療法にも用い
得る。レトロウイルス媒介遺伝子移入の方法は当業者に
公知である［Bodine et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8
6,pp.8897−8901（1989）］が、SCFレセプターを有する
細胞のこのように同質な集団をトランスフェクトして用
いることはこれまで可能でなかった。トランスフェクト
した上記精製細胞は骨髄移植に用いることができる。
本発明は、正常細胞を腫瘍細胞から分離する方法にも
係わり、この方法は （ａ）正常細胞及び腫瘍細胞を含む細胞混合物を本発明
によるモノクローナル抗体に暴露するステップと、 （ｂ）正常細胞及び腫瘍性白血病細胞のSCFレセプター
数の差に基づいて正常細胞を腫瘍性白血病細胞から分離
するステップと を含む。骨髄細胞を本発明のモノクローナル抗体で標識
し、次いでビオチニル化したヤギ抗マウス抗体で標識し
てアビジンカラムに通し得る。このアプローチは細胞の
積極的または消極的選択に用い得る。比較的多数のSCF
レセプターを有する細胞はカラム内に留まり、一方比較
的少数のSCFレセプターを有する細胞はカラムを通過す
る。あるいは他の場合には、多数のSCFレセプターを有
する細胞と少数のSCFレセプターを有する細胞との分離
を直接免疫付着及び蛍光活性化細胞選別によって行な
う。蛍光活性化細胞選別（FACS）では、SCFレセプター
を有する細胞をSCFレセプターに特異的なモノクローナ
ル抗体と混合し得る。モノクローナル抗体を、（１）フ
ルオレセインイソチオシアネート（FITC）やフィコエリ
トリン（PE）といった蛍光物質と結合させるか、（２）
第一の生物分子（例えばビオチン）と結合させてから、
第一の生物分子に特異的に結合する第二の生物分子（例
えばアビジンやストレプタビジン）をFITCやPEといった
蛍光物質と結合させたものと混合するか、または（３）
FITCやPEといった蛍光物質と結合させた、抗SCFレセプ
ターモノクローナル抗体の抗体種に特異的な第二の抗体
（例えばヤギまたはヒツジ抗マウス抗体）と更に混合す
る。このように蛍光標識した細胞は標準的技術を用い
て、細胞の呈する蛍光のレベルに従って選別することが
できる。
係わり、この方法は （ａ）正常細胞及び腫瘍細胞を含む細胞混合物を本発明
によるモノクローナル抗体に暴露するステップと、 （ｂ）正常細胞及び腫瘍性白血病細胞のSCFレセプター
数の差に基づいて正常細胞を腫瘍性白血病細胞から分離
するステップと を含む。骨髄細胞を本発明のモノクローナル抗体で標識
し、次いでビオチニル化したヤギ抗マウス抗体で標識し
てアビジンカラムに通し得る。このアプローチは細胞の
積極的または消極的選択に用い得る。比較的多数のSCF
レセプターを有する細胞はカラム内に留まり、一方比較
的少数のSCFレセプターを有する細胞はカラムを通過す
る。あるいは他の場合には、多数のSCFレセプターを有
する細胞と少数のSCFレセプターを有する細胞との分離
を直接免疫付着及び蛍光活性化細胞選別によって行な
う。蛍光活性化細胞選別（FACS）では、SCFレセプター
を有する細胞をSCFレセプターに特異的なモノクローナ
ル抗体と混合し得る。モノクローナル抗体を、（１）フ
ルオレセインイソチオシアネート（FITC）やフィコエリ
トリン（PE）といった蛍光物質と結合させるか、（２）
第一の生物分子（例えばビオチン）と結合させてから、
第一の生物分子に特異的に結合する第二の生物分子（例
えばアビジンやストレプタビジン）をFITCやPEといった
蛍光物質と結合させたものと混合するか、または（３）
FITCやPEといった蛍光物質と結合させた、抗SCFレセプ
ターモノクローナル抗体の抗体種に特異的な第二の抗体
（例えばヤギまたはヒツジ抗マウス抗体）と更に混合す
る。このように蛍光標識した細胞は標準的技術を用い
て、細胞の呈する蛍光のレベルに従って選別することが
できる。
本発明のモノクローナル抗体は腫瘍細胞の治療にも有
用であり得、その際前記治療は、本発明のモノクローナ
ル抗体と結合させた抗腫瘍治療薬を治療有効量で投与す
ることにより行なう。治療有効量の腫瘍治療薬とは任意
量の、腫瘍細胞の増殖及び／または発生を阻害し、好ま
しくは細胞の死滅を惹起して生体中の腫瘍細胞の総数を
減少させる化合物である。このような腫瘍治療薬の例
に、放射性同位体125I［Press et al.,J.Clin.Oncol.
７,pp.1027−1038（1989）］と結合させた、またはリシ
ン［Uhr et al.,Prog.Clin.Biol.Res.288,pp.403−412
（1989）］及びジフテリアトキシン［Moolten,J.Natl.C
on.Inst.55,pp.473−477（1975）］などの毒素結合体と
結合させた抗体が含まれる。
用であり得、その際前記治療は、本発明のモノクローナ
ル抗体と結合させた抗腫瘍治療薬を治療有効量で投与す
ることにより行なう。治療有効量の腫瘍治療薬とは任意
量の、腫瘍細胞の増殖及び／または発生を阻害し、好ま
しくは細胞の死滅を惹起して生体中の腫瘍細胞の総数を
減少させる化合物である。このような腫瘍治療薬の例
に、放射性同位体125I［Press et al.,J.Clin.Oncol.
７,pp.1027−1038（1989）］と結合させた、またはリシ
ン［Uhr et al.,Prog.Clin.Biol.Res.288,pp.403−412
（1989）］及びジフテリアトキシン［Moolten,J.Natl.C
on.Inst.55,pp.473−477（1975）］などの毒素結合体と
結合させた抗体が含まれる。
白血病治療薬とモノクローナル抗体との結合は、先に
述べたような公知技術を用いて実現し得る［Press et a
l.,J.Clin.Oncol.７,pp.1027−1038（1989）;Uhr et a
l.,Prog.Clin.Biol.res.288,pp.403−412（1989）］。
好ましくは、モノクローナル抗体上の治療薬結合部位は
該モノクローナル抗体のSCFレセプター結合部位とは異
なる場所に位置する。また、腫瘍治療薬上の抗体結合部
位は該治療薬の活性部位とは異なる官能基に位置するこ
とが好ましい。更に好ましくは、治療薬と抗体との結合
の部位はモノクローナル抗体または腫瘍治療薬のコンホ
ーメーション的変化を最小限に留めるようにも位置す
る。
述べたような公知技術を用いて実現し得る［Press et a
l.,J.Clin.Oncol.７,pp.1027−1038（1989）;Uhr et a
l.,Prog.Clin.Biol.res.288,pp.403−412（1989）］。
好ましくは、モノクローナル抗体上の治療薬結合部位は
該モノクローナル抗体のSCFレセプター結合部位とは異
なる場所に位置する。また、腫瘍治療薬上の抗体結合部
位は該治療薬の活性部位とは異なる官能基に位置するこ
とが好ましい。更に好ましくは、治療薬と抗体との結合
の部位はモノクローナル抗体または腫瘍治療薬のコンホ
ーメーション的変化を最小限に留めるようにも位置す
る。
本発明は、本発明のモノクローナル抗体の結合フラグ
メントと結合させた腫瘍治療薬を治療有効量で投与する
ことを含む腫瘍細胞治療方法にも係わる。適当な結合フ
ラグメントは、当該フラグメント自体のSCFレセプター
への結合を可能にする十分な大きさ及び構造を保持する
フラグメントである。このようなフラグメントは、タン
パク質分解消化を含めた多くの方法で製造することがで
きる［Garvey et al.,Methods in Immunology,Chapter
31,W.A.Benjamin,Reading,Massachusetts（1977）］。
製造した結合フラグメントは先に述べた結合アッセイを
用いて、SCFレセプターに結合する能力について評価す
ることが可能である。
メントと結合させた腫瘍治療薬を治療有効量で投与する
ことを含む腫瘍細胞治療方法にも係わる。適当な結合フ
ラグメントは、当該フラグメント自体のSCFレセプター
への結合を可能にする十分な大きさ及び構造を保持する
フラグメントである。このようなフラグメントは、タン
パク質分解消化を含めた多くの方法で製造することがで
きる［Garvey et al.,Methods in Immunology,Chapter
31,W.A.Benjamin,Reading,Massachusetts（1977）］。
製造した結合フラグメントは先に述べた結合アッセイを
用いて、SCFレセプターに結合する能力について評価す
ることが可能である。
本発明のモノクローナル抗体の別の使用は、細胞試料
においてSCFレセプターの存在を決定する方法に係わ
り、この方法は （ａ）細胞試料を本発明のモノクローナル抗体に暴露す
るステップと、 （ｂ）前記モノクローナル抗体のSCFレセプターへの結
合を検出するステップと を含む。
においてSCFレセプターの存在を決定する方法に係わ
り、この方法は （ａ）細胞試料を本発明のモノクローナル抗体に暴露す
るステップと、 （ｂ）前記モノクローナル抗体のSCFレセプターへの結
合を検出するステップと を含む。
細胞混合物の本発明のモノクローナル抗体への暴露
は、蛍光活性化細胞選別の場合のように溶解状態で行な
っても、生検物質などの固体組織材料上で行なっても、
あるいはまたカラムクロマトグラフィーや直接免疫付着
の場合のようにモノクローナル抗体を固体支持体上に固
定して行なってもよい。モノクローナル固体に暴露する
べき細胞混合物は、血液細胞または組織細胞の任意の溶
液であり得る。好ましくは、細胞混合物は正常な哺乳動
物細胞、哺乳動物の骨髄、循環血液または疑似腫瘍組織
に由来し、更に好ましくは正常細胞、白血病細胞及び固
形腫瘍細胞に由来する。細胞混合物をモノクローナル抗
体に暴露すると、SCFレセプターを有する細胞はモノク
ローナル抗体と結合して抗体−SCFレセプター複合体を
形成する。抗体−SCFレセプター複合体の、従ってSCFレ
セプターの存在は当業者に公知の諸方法で検出すること
ができる。それらの方法にはELISA、免疫組織化学的方
法、及び125Cで標識したStaphプロテインＡを用いるオ
ートラジオグラフィーが含まれる。
は、蛍光活性化細胞選別の場合のように溶解状態で行な
っても、生検物質などの固体組織材料上で行なっても、
あるいはまたカラムクロマトグラフィーや直接免疫付着
の場合のようにモノクローナル抗体を固体支持体上に固
定して行なってもよい。モノクローナル固体に暴露する
べき細胞混合物は、血液細胞または組織細胞の任意の溶
液であり得る。好ましくは、細胞混合物は正常な哺乳動
物細胞、哺乳動物の骨髄、循環血液または疑似腫瘍組織
に由来し、更に好ましくは正常細胞、白血病細胞及び固
形腫瘍細胞に由来する。細胞混合物をモノクローナル抗
体に暴露すると、SCFレセプターを有する細胞はモノク
ローナル抗体と結合して抗体−SCFレセプター複合体を
形成する。抗体−SCFレセプター複合体の、従ってSCFレ
セプターの存在は当業者に公知の諸方法で検出すること
ができる。それらの方法にはELISA、免疫組織化学的方
法、及び125Cで標識したStaphプロテインＡを用いるオ
ートラジオグラフィーが含まれる。
本発明のモノクローナル抗体は、細胞周期特異的な化
学療法剤に対する感受性を改変する方法においても有用
であり、その際前記方法は本発明のモノクローナル抗体
をSCF阻害量で投与することを含む。SCF阻害量のモノク
ローナル抗体とは、SCFのそのレセプターへの結合を著
しく阻害するか、または初期多分化能性造血前駆細胞、
白血病細胞、固形腫瘍細胞、骨髄細胞などのSCFレセプ
ター保有細胞の増殖及び発生を著しく低下させるのに十
分な量のモノクローナル抗体のことである。著しい阻害
とは通常、所与の阻害測定方法の下で予想される誤差に
起因する変動を凌駕する阻害のことである。阻害によっ
て、SCFのそのレセプターへの結合を好ましくは少なく
とも50％、更に好ましくは少なくとも75％、更に好まし
くは少なくとも90％減少させ、最も好ましくはSCFのそ
のレセプターへの結合を実質的に総て阻害する。SCFレ
セプター保有細胞の増殖及び／または発生の著しい低下
とは通常、所与の増殖及び／または発生測定方法の下で
予想される誤差に起因する変動を凌駕する低下のことで
ある。SCFレセプター保有細胞の増殖及び／または発生
の低下は、SCFレセプター保有細胞の増殖速度を好まし
くは少なくとも1/2、更に好ましくは少なくとも1/10、
最も好ましくは少なくとも1/100に低下させることによ
り好ましく実現する。
学療法剤に対する感受性を改変する方法においても有用
であり、その際前記方法は本発明のモノクローナル抗体
をSCF阻害量で投与することを含む。SCF阻害量のモノク
ローナル抗体とは、SCFのそのレセプターへの結合を著
しく阻害するか、または初期多分化能性造血前駆細胞、
白血病細胞、固形腫瘍細胞、骨髄細胞などのSCFレセプ
ター保有細胞の増殖及び発生を著しく低下させるのに十
分な量のモノクローナル抗体のことである。著しい阻害
とは通常、所与の阻害測定方法の下で予想される誤差に
起因する変動を凌駕する阻害のことである。阻害によっ
て、SCFのそのレセプターへの結合を好ましくは少なく
とも50％、更に好ましくは少なくとも75％、更に好まし
くは少なくとも90％減少させ、最も好ましくはSCFのそ
のレセプターへの結合を実質的に総て阻害する。SCFレ
セプター保有細胞の増殖及び／または発生の著しい低下
とは通常、所与の増殖及び／または発生測定方法の下で
予想される誤差に起因する変動を凌駕する低下のことで
ある。SCFレセプター保有細胞の増殖及び／または発生
の低下は、SCFレセプター保有細胞の増殖速度を好まし
くは少なくとも1/2、更に好ましくは少なくとも1/10、
最も好ましくは少なくとも1/100に低下させることによ
り好ましく実現する。
本発明のモノクローナル抗体の投与方法には、活性成
分として本発明のモノクローナル抗体を含有する医薬組
成物を適量投与することが含まれる。活性成分に加え
て、上記医薬組成物は適当な緩衝液、稀釈剤及び添加物
も含有し得る。適当な緩衝液にはTris−HCl、酢酸塩、
グリシン及びリン酸塩、好ましくはpH6.5〜7.5のリン酸
塩が含まれる。適当な稀釈剤には、NaCl、ラクトースま
たはマンニトール、好ましくはNaClと等張に調整された
滅菌水溶液が含まれる。適当な添加物には、表面吸着を
防止するアルブミンやヘラチン（helatin）、界面活性
剤（例えばTween 20、Tween 80、Pluronic F68）、可溶
化剤（例えばグリセロール、ポリエチレングリコー
ル）、酸化防止剤（例えばアスコルビン酸、メタ重亜硫
酸ナトリウム）及び防腐剤［例えばチメルソール（Thim
ersol）、ベンジルアルコール、パラベン］が含まれ
る。好ましい添加物はTween 80である。
分として本発明のモノクローナル抗体を含有する医薬組
成物を適量投与することが含まれる。活性成分に加え
て、上記医薬組成物は適当な緩衝液、稀釈剤及び添加物
も含有し得る。適当な緩衝液にはTris−HCl、酢酸塩、
グリシン及びリン酸塩、好ましくはpH6.5〜7.5のリン酸
塩が含まれる。適当な稀釈剤には、NaCl、ラクトースま
たはマンニトール、好ましくはNaClと等張に調整された
滅菌水溶液が含まれる。適当な添加物には、表面吸着を
防止するアルブミンやヘラチン（helatin）、界面活性
剤（例えばTween 20、Tween 80、Pluronic F68）、可溶
化剤（例えばグリセロール、ポリエチレングリコー
ル）、酸化防止剤（例えばアスコルビン酸、メタ重亜硫
酸ナトリウム）及び防腐剤［例えばチメルソール（Thim
ersol）、ベンジルアルコール、パラベン］が含まれ
る。好ましい添加物はTween 80である。
投与は、静脈内、皮下または筋肉内に投与する手段を
含めた任意の通常手段によって行ない得る。好ましい投
与経路は静脈内である。全投与量を１回で投与すること
も、適当な回数で分割投与することも可能である。
含めた任意の通常手段によって行ない得る。好ましい投
与経路は静脈内である。全投与量を１回で投与すること
も、適当な回数で分割投与することも可能である。
好ましくは、医薬調製物は単位投与形態とする。その
ような形態では上記調製物を、十分量、即ち例えば所期
の目的達成に有効な量の活性成分を含有する１回量ずつ
に細分する。
ような形態では上記調製物を、十分量、即ち例えば所期
の目的達成に有効な量の活性成分を含有する１回量ずつ
に細分する。
実際に用いる投与量は、患者の要求及び治療する状態
の重篤度次第で様々となり得る。特定の状況下に適正投
与量を決定することは、当分野の技術の範囲内である。
通常、化合物の最適投与量を下回る比較的少ない投与量
で治療を開始する。その後、投与量を、当面の事情下で
最良の成果に到達するまで少しずつ増してゆく。便宜
上、１日当たりの全投与量を分割して実質的に連続的に
か、または所望であれば１日の間に何回かに分けて投与
することが可能である。投与の量及び頻度は、患者の年
齢、状態及び体格並びに治療する疾病の重篤度を考慮し
て主治医が下した診断に従って調節する。
の重篤度次第で様々となり得る。特定の状況下に適正投
与量を決定することは、当分野の技術の範囲内である。
通常、化合物の最適投与量を下回る比較的少ない投与量
で治療を開始する。その後、投与量を、当面の事情下で
最良の成果に到達するまで少しずつ増してゆく。便宜
上、１日当たりの全投与量を分割して実質的に連続的に
か、または所望であれば１日の間に何回かに分けて投与
することが可能である。投与の量及び頻度は、患者の年
齢、状態及び体格並びに治療する疾病の重篤度を考慮し
て主治医が下した診断に従って調節する。
本発明の使用に関して一般に推奨される投与方式で
は、毎日体重1kgにつき約0.1〜約10mgの活性成分を投与
する。
は、毎日体重1kgにつき約0.1〜約10mgの活性成分を投与
する。
実施例 以下の実施例は、本発明の範囲を制限することなく本
発明の特定の実施態様を示すものである。引用した全て
の参考文献は、関連教示の参照により本明細書の一部を
構成するものとする。
発明の特定の実施態様を示すものである。引用した全て
の参考文献は、関連教示の参照により本明細書の一部を
構成するものとする。
実施例1:動物の感作 感作に使用するのに適した抗原は、SCFレセプターを
発現する任意の細胞であった。SCFレセプターの存在
は、放射性標識SCFを使用して確認した。Zsebo et a
l.,Cell 63:195−212（1990）；並びにそれぞれ1990年
10月１日、1990年９月24日及び1990年６月11日出願の同
時係属米国特許出願第07/538,701号、第07/573,616号及
び第07/537,198号に従って、ヒト及び齧歯動物のSCF
164-165を得た。かかるSCFを、Hunter及びGreenwood〔N
ature 194:495−496（1962）〕のクロラミンＴ法を使
用して125Iで標識した。125IヒトSCF（hSCF）の比活性
は2,000〜2,500Ci/mmolであった。125IhSCF及び125Iラ
ットSCF（rSCF）はいずれもSCFレセプター含有細胞に結
合する能力を保持していた。更に、125IhSCF及び非標識
hSCFによる自己変位分析〔Calvo et al.,Biochem.J.2
12:259−264（1983）〕は、ヨウ素化によって結合親和
性が変性されないことを示した。多数の他の造血増殖因
子の赤白血病細胞系OCIM1〔Papayannopoulou et al.,
Blood 72:1029−1038（1988）〕に結合する能力を試験
した。表１から、100倍モル過剰量の非標識hSCFは結合
において極めて効果的に競合したが、種々の他の増殖因
子は競合しなかったことが判る。
発現する任意の細胞であった。SCFレセプターの存在
は、放射性標識SCFを使用して確認した。Zsebo et a
l.,Cell 63:195−212（1990）；並びにそれぞれ1990年
10月１日、1990年９月24日及び1990年６月11日出願の同
時係属米国特許出願第07/538,701号、第07/573,616号及
び第07/537,198号に従って、ヒト及び齧歯動物のSCF
164-165を得た。かかるSCFを、Hunter及びGreenwood〔N
ature 194:495−496（1962）〕のクロラミンＴ法を使
用して125Iで標識した。125IヒトSCF（hSCF）の比活性
は2,000〜2,500Ci/mmolであった。125IhSCF及び125Iラ
ットSCF（rSCF）はいずれもSCFレセプター含有細胞に結
合する能力を保持していた。更に、125IhSCF及び非標識
hSCFによる自己変位分析〔Calvo et al.,Biochem.J.2
12:259−264（1983）〕は、ヨウ素化によって結合親和
性が変性されないことを示した。多数の他の造血増殖因
子の赤白血病細胞系OCIM1〔Papayannopoulou et al.,
Blood 72:1029−1038（1988）〕に結合する能力を試験
した。表１から、100倍モル過剰量の非標識hSCFは結合
において極めて効果的に競合したが、種々の他の増殖因
子は競合しなかったことが判る。
多数の正常造血細胞、造血細胞系及び腫瘍非造血細胞
を、SCFレセプターの発現についてスクリーニングし
た。正常ヒト骨髄単核細胞はhSCFを結合し、ヒト胎児肝
初期赤芽球も同様であった。抹消血BFU−Ｅを培養し、1
4日後に個々のコロニーを採取することにより得られた
成人後期赤芽球もまたSCFレセプターを発現した。正常
ヒト骨髄細胞におけるSCFレセプターの分布を、オート
ラジオグラフィーによって決定した〔Nicola and Met
calf,J.Cell Physiol.124:313−321（1985）〕。芽細
胞及び前骨髄細胞であると見られる核／細胞質比が高い
大細胞は、１細胞当たり約50〜200グレインという高密
度で標識された。巨核球もまた125I結合を示した。
を、SCFレセプターの発現についてスクリーニングし
た。正常ヒト骨髄単核細胞はhSCFを結合し、ヒト胎児肝
初期赤芽球も同様であった。抹消血BFU−Ｅを培養し、1
4日後に個々のコロニーを採取することにより得られた
成人後期赤芽球もまたSCFレセプターを発現した。正常
ヒト骨髄細胞におけるSCFレセプターの分布を、オート
ラジオグラフィーによって決定した〔Nicola and Met
calf,J.Cell Physiol.124:313−321（1985）〕。芽細
胞及び前骨髄細胞であると見られる核／細胞質比が高い
大細胞は、１細胞当たり約50〜200グレインという高密
度で標識された。巨核球もまた125I結合を示した。
多数のヒト造血細胞系がSCFレセプターを発現した。
赤白血病細胞系OCIM1及びK562はSCFを結合し、骨髄様単
核細胞系KG−１、KG1a、AML−193及びU937も同様であっ
た。リンパ細胞系Daudi及びIM−９並びに肥満細胞系HMC
−１は全てがSCFを結合した。SCFレセプターはまた、膀
胱癌細胞系5367、COS、BHK、胃癌細胞系KATO3、小細胞
癌細胞系H69及びH128、並びに乳癌細胞系DU475を含む非
造血細胞系においても認められた。
赤白血病細胞系OCIM1及びK562はSCFを結合し、骨髄様単
核細胞系KG−１、KG1a、AML−193及びU937も同様であっ
た。リンパ細胞系Daudi及びIM−９並びに肥満細胞系HMC
−１は全てがSCFを結合した。SCFレセプターはまた、膀
胱癌細胞系5367、COS、BHK、胃癌細胞系KATO3、小細胞
癌細胞系H69及びH128、並びに乳癌細胞系DU475を含む非
造血細胞系においても認められた。
正常ヒト胎児肝細胞においてSCFレセプターを定量化
し、コロニーアッセイにおいてそれらのSCFに対する応
答を試験した。ヒト胎児肝細胞（妊娠齢55〜80日）を治
療的流産から得た。かかる組織の使用の承諾を得ると共
に、ワシントン大学のthe Institutional Review Bo
ardに実験許可を得た。細胞を、125IhSCF（5pmol〜2nmo
l）±100倍過剰量の非標識SCFと一緒に代謝阻害剤の存
在下に15℃で４時間インキュベートした。かかる条件下
で、SCFに対する結合が平衡化され、インターナリゼー
ションは最少となった（＜17％）。インキュベーション
終了時に、Broudy et al.,Blood 75:1622−1626（19
90）に記載のごとくフタレート油によって細胞を沈降す
ることにより、細胞に結合した125IhSCFを遊離125IhSCF
から分離した。１または２クラスのレセプターにおける
平衡状態は、リガンドプログラム〔Munson and Rodba
rd,Analyt.Biochem.107:220−239（1980）〕を使用した
データと適合した。ヒト胎児肝細胞は、図１に示したよ
うに２クラスのSCFレセプターを発現することが判っ
た。約1,700レセプター／細胞について、高親和性レセ
プターのKdは14pmolであり、低親和性レセプターのKdは
27nmolであった。
し、コロニーアッセイにおいてそれらのSCFに対する応
答を試験した。ヒト胎児肝細胞（妊娠齢55〜80日）を治
療的流産から得た。かかる組織の使用の承諾を得ると共
に、ワシントン大学のthe Institutional Review Bo
ardに実験許可を得た。細胞を、125IhSCF（5pmol〜2nmo
l）±100倍過剰量の非標識SCFと一緒に代謝阻害剤の存
在下に15℃で４時間インキュベートした。かかる条件下
で、SCFに対する結合が平衡化され、インターナリゼー
ションは最少となった（＜17％）。インキュベーション
終了時に、Broudy et al.,Blood 75:1622−1626（19
90）に記載のごとくフタレート油によって細胞を沈降す
ることにより、細胞に結合した125IhSCFを遊離125IhSCF
から分離した。１または２クラスのレセプターにおける
平衡状態は、リガンドプログラム〔Munson and Rodba
rd,Analyt.Biochem.107:220−239（1980）〕を使用した
データと適合した。ヒト胎児肝細胞は、図１に示したよ
うに２クラスのSCFレセプターを発現することが判っ
た。約1,700レセプター／細胞について、高親和性レセ
プターのKdは14pmolであり、低親和性レセプターのKdは
27nmolであった。
腫瘍造血細胞を、SCFに応答してSCFレセプターを発現
するか決定すべく試験した。急性非リンパ性白血病（AN
LL）の症状出現時の20人の患者と２人の正常成人由来の
骨髄単核細胞を試験した。細胞を、15％ウシ胎児血清及
び組換えヒトIL−３を補充した寒天中で培養した。８、
15及び21日目にコロニー（＞40細胞）及びクラスター
（＜40細胞）をカウントした。125IhSCF±100倍過剰量
の非標識hSCFを用いた平衡結合試験によってSCFレセプ
ターを定量化した。SCFレセプターの細胞分布をオート
ラジオグラフィーによって調査した。試験した20個のAN
LL骨髄のうち７つの骨髄と２つの正常骨髄由来のSCFが
コロニー増殖を刺激した。SCFは、単独ではコロニー増
殖に僅かな作用しか及ぼさなかったが、IL−３と相乗作
用してコロニーの数及びサイズを増大した（図２）。20
人全てのANLL患者の芽細胞においてSCFのレセプターが
同定された。20人のANLL患者のうち10人は骨髄芽細胞上
に２クラスのSCFレセプターを示した。図３に示したよ
うに、ANLL患者の１人に由来する芽細胞に結合した125I
hSCFのスキャッチャードプロットは、１細胞当たり約50
0個の高親和性SCFレセプター（Kd16pmol）及び約7000個
の低親和性レセプター（Kd7.6nmol）を示した。かかる
結合親和性は、正常ヒト胎児肝細胞及び正常ヒト骨髄単
核細胞において認められるものと類似である。20人の患
者のうち６人は単一クラスの高親和性レセプターを示
し、残りの患者は単一の低親和性結合部位を示した。細
胞当たりのレセプターの数及び１または２クラスのレセ
プターの存在はいずれも、ヒトANLL芽細胞におけるIL−
３、GM−CSF及びＧ−CSFレセプター〔Park et al.,Bl
ood 74:56−65（1989）〕に認められているようには、
SCFに応答した増殖との相関を示さなかった。
するか決定すべく試験した。急性非リンパ性白血病（AN
LL）の症状出現時の20人の患者と２人の正常成人由来の
骨髄単核細胞を試験した。細胞を、15％ウシ胎児血清及
び組換えヒトIL−３を補充した寒天中で培養した。８、
15及び21日目にコロニー（＞40細胞）及びクラスター
（＜40細胞）をカウントした。125IhSCF±100倍過剰量
の非標識hSCFを用いた平衡結合試験によってSCFレセプ
ターを定量化した。SCFレセプターの細胞分布をオート
ラジオグラフィーによって調査した。試験した20個のAN
LL骨髄のうち７つの骨髄と２つの正常骨髄由来のSCFが
コロニー増殖を刺激した。SCFは、単独ではコロニー増
殖に僅かな作用しか及ぼさなかったが、IL−３と相乗作
用してコロニーの数及びサイズを増大した（図２）。20
人全てのANLL患者の芽細胞においてSCFのレセプターが
同定された。20人のANLL患者のうち10人は骨髄芽細胞上
に２クラスのSCFレセプターを示した。図３に示したよ
うに、ANLL患者の１人に由来する芽細胞に結合した125I
hSCFのスキャッチャードプロットは、１細胞当たり約50
0個の高親和性SCFレセプター（Kd16pmol）及び約7000個
の低親和性レセプター（Kd7.6nmol）を示した。かかる
結合親和性は、正常ヒト胎児肝細胞及び正常ヒト骨髄単
核細胞において認められるものと類似である。20人の患
者のうち６人は単一クラスの高親和性レセプターを示
し、残りの患者は単一の低親和性結合部位を示した。細
胞当たりのレセプターの数及び１または２クラスのレセ
プターの存在はいずれも、ヒトANLL芽細胞におけるIL−
３、GM−CSF及びＧ−CSFレセプター〔Park et al.,Bl
ood 74:56−65（1989）〕に認められているようには、
SCFに応答した増殖との相関を示さなかった。
上記白血病患者由来の骨髄単核細胞は90％以上が芽細
胞であったが、正常成人由来の骨髄単核細胞の芽細胞面
分ははるかに小さかった。芽細胞の割合の著しい差は、
正常骨髄試料と白血病骨髄試料において１細胞当たりの
平均レセプター数を比較することは厳密でないことを示
唆している。個々の細胞への結合を分析し得るオートラ
ジオグラフィーを使用すると、正常及び白血病芽細胞に
結合したSCFをより正確に比較することができる。８つ
のANLL骨髄試料において、正常ヒト骨髄単核細胞に結合
した125IhSCFのオートラジオグラフィー分析を、直接比
較し得る単一実験において実施した。グレインカウント
から、正常骨髄芽細胞は約50〜200グレイン／芽細胞を
発現し、白血病芽細胞は２〜20グレイン／芽細胞を発現
したことが判った。白血病芽細胞へのSCFの結合は正常
芽細胞へのSCFの結合より著しく低かった。
胞であったが、正常成人由来の骨髄単核細胞の芽細胞面
分ははるかに小さかった。芽細胞の割合の著しい差は、
正常骨髄試料と白血病骨髄試料において１細胞当たりの
平均レセプター数を比較することは厳密でないことを示
唆している。個々の細胞への結合を分析し得るオートラ
ジオグラフィーを使用すると、正常及び白血病芽細胞に
結合したSCFをより正確に比較することができる。８つ
のANLL骨髄試料において、正常ヒト骨髄単核細胞に結合
した125IhSCFのオートラジオグラフィー分析を、直接比
較し得る単一実験において実施した。グレインカウント
から、正常骨髄芽細胞は約50〜200グレイン／芽細胞を
発現し、白血病芽細胞は２〜20グレイン／芽細胞を発現
したことが判った。白血病芽細胞へのSCFの結合は正常
芽細胞へのSCFの結合より著しく低かった。
SCFレセプターは、H69、H128及びDU475を含む非造血
源の腫瘍細胞系においても認められた。H69細胞に結合
した125IhSCFのスキャッチャードプロット（図４）は、
１細胞当たり1650の高親和性レセプター（Kd37pmol）及
び１細胞当たり22,300のレセプター（Kd7.2nmol）を示
した。
源の腫瘍細胞系においても認められた。H69細胞に結合
した125IhSCFのスキャッチャードプロット（図４）は、
１細胞当たり1650の高親和性レセプター（Kd37pmol）及
び１細胞当たり22,300のレセプター（Kd7.2nmol）を示
した。
OCIM1は、エリトロポエチン〔Broudy et al.,Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 85:6513−6517（1988）〕、GM−CS
F及びIL−３に対するレセプターを発現するヒト赤白血
病細胞系である。125IhSCFを用いた平衡結合試験は、図
５に示したように、OCIM1細胞が１細胞当たり約200,000
のSCFレセプターを発現することを示した。単一クラス
の高親和性SCFレセプター（Kd45pmol）は明らかであ
る。hSCFは、浮遊培養においててOCIM1細胞の増殖を刺
激しなかった。MB−02は、エリトロポエチンの存在下で
赤芽球に分化する増殖因子依存性ヒト赤白血病細胞系で
ある〔Perrine et al.,Biochem.Biophys.Res.Comm.16
4:857−862（1989）〕。MB−02はhSCFに応答して増殖し
たが、赤芽球に分化せず、高親和性及び低親和性の両SC
Fレセプターを発現した。
Natl.Acad.Sci.USA 85:6513−6517（1988）〕、GM−CS
F及びIL−３に対するレセプターを発現するヒト赤白血
病細胞系である。125IhSCFを用いた平衡結合試験は、図
５に示したように、OCIM1細胞が１細胞当たり約200,000
のSCFレセプターを発現することを示した。単一クラス
の高親和性SCFレセプター（Kd45pmol）は明らかであ
る。hSCFは、浮遊培養においててOCIM1細胞の増殖を刺
激しなかった。MB−02は、エリトロポエチンの存在下で
赤芽球に分化する増殖因子依存性ヒト赤白血病細胞系で
ある〔Perrine et al.,Biochem.Biophys.Res.Comm.16
4:857−862（1989）〕。MB−02はhSCFに応答して増殖し
たが、赤芽球に分化せず、高親和性及び低親和性の両SC
Fレセプターを発現した。
高親和性SCFレセプターを発現することからOCIM1細胞
を免疫原として使用したが、SCFレセプターを発現する
任意の細胞を、SCFレセプターに対する抗体を誘導する
ための抗体として使用することができる。
を免疫原として使用したが、SCFレセプターを発現する
任意の細胞を、SCFレセプターに対する抗体を誘導する
ための抗体として使用することができる。
８週齢の雌Balb/Cマウスに106個のOCIM1細胞を１週間
間隔で３回、腹腔内注射した。
間隔で３回、腹腔内注射した。
実施例2:SCFレセプターに対するモノクローナル抗体の
生産 ３回目の注射の５日後、脾臓を取り出し、脾細胞をNS
−１ネズミミエローマ細胞と融合した〔Nowinski et
al.,Virology 93:111−126（1979）〕。全部で288個の
ハイブリドーマウェル由来の上清を、後記実施例５に記
載のごとく125IhSCFのOCIM1細胞への結合をブロックす
る能力についてスクリーニングした。陽性ハイブリドー
マを同定し、クローニングし、プリスタン（pristane）
感作Balb/Cマウスにおいて腹水生成腫瘍として増殖させ
た。抗体をIgG2aと同定し、SR−１と命名した〔1991年
４月４付けでthe American Type Culture Collecti
on,Rockville,Maryland USAにBA7.3C.9として寄託し、
ATCC受託番号HB10716を与えられた〕。別のハイブリド
ーマをスクリーニングすると、同様の頻度で別の抗SCF
レセプターモノクローナル抗体が同定された。
生産 ３回目の注射の５日後、脾臓を取り出し、脾細胞をNS
−１ネズミミエローマ細胞と融合した〔Nowinski et
al.,Virology 93:111−126（1979）〕。全部で288個の
ハイブリドーマウェル由来の上清を、後記実施例５に記
載のごとく125IhSCFのOCIM1細胞への結合をブロックす
る能力についてスクリーニングした。陽性ハイブリドー
マを同定し、クローニングし、プリスタン（pristane）
感作Balb/Cマウスにおいて腹水生成腫瘍として増殖させ
た。抗体をIgG2aと同定し、SR−１と命名した〔1991年
４月４付けでthe American Type Culture Collecti
on,Rockville,Maryland USAにBA7.3C.9として寄託し、
ATCC受託番号HB10716を与えられた〕。別のハイブリド
ーマをスクリーニングすると、同様の頻度で別の抗SCF
レセプターモノクローナル抗体が同定された。
実施例3:ネズミ可変域及びヒト不変域を有するキメラモ
ノクローナル抗体の生産 SR−１モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
細胞系からゲノムDNAを調製し、Ｈ鎖及びＬ鎖の可変域
（それぞれVH及びVX）をコードする機能エキソンを、サ
ザン分析によって得られたDNA制限マップによって同定
した。germlineVX遺伝子を再構成し、JX遺伝子セグメン
トに結合すると、結果的に機能VXエキソンが得られる。
同様に、VH遺伝子をJH遺伝子セグメントに並置すると、
機能VHエキソンが生成される。特異的DNAプローブセグ
メントは、再構成された表現型を再構成されていないge
rmlineDNAセグメントから区別する固有の制限酵素部位
によって再構成Ｖ域遺伝子を同定するよう設計される
〔Oi and Morrison,BioTechniques 4:214−221（198
6）〕。組換えDNA技術を使用してゲノムDNAライブラリ
ーを構築し、所望のＶ遺伝子を単離及び配列決定して、
再構成及び発現されたVH及びVLエキソンのアイデンティ
ティを確認した。VHエキソンをpSV2ΔHgptベクター〔Mu
lligan and Berg,Science 209:1422−1427（1980）;
Mulligan and Berg,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:207
2−2076（1981）〕中に挿入した。このベクターは、プ
ラスミドをE.coli中に維持するためにアンピシリン耐性
遺伝子を、また、ヒポキサンチン、ミコフェノール酸及
びキサンチンを含む培地中で増殖する哺乳動物細胞を選
択し得るようミコフェノール酸耐性遺伝子を含む。所望
のVXエキソンを、pACYC184プラスミドから誘導したpSV1
84ΔHneoベクター〔Chang and Cohen,J.Bacteriol.14
3:1141−1156（1978）〕中に挿入した。このベクター
は、プラスミドをE.coli中に維持するために使用される
クロラムフェニコール耐性遺伝子と、このプラスミドベ
クターを用いて形質転換した哺乳動物細胞を選択するた
めに使用されるゲンタマイシン耐性遺伝子とを含む。ゲ
ンタマイシン耐性遺伝子（neo）の転写は、SV40初期領
域プロモーターによって誘導される。免疫グロブリンの
Ｈ鎖及びＬ鎖に周知のDNA調節配列もまた上記トランス
フェクションベクターに含められる〔Calame,Annual R
ev.Immunol.3:159−196（1985）;Morrison and Oi,An
nual Rev.Immunol,2:239−256（1984）〕。両プラスミ
ドを、クロラムフェニコール及びアンピシリン選択培地
中で増殖させたE.coli HB101〔Boyer and Roulland
−Dussoix,J.Mol.Biol.41:459（1989）〕中に維持し
た。
ノクローナル抗体の生産 SR−１モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
細胞系からゲノムDNAを調製し、Ｈ鎖及びＬ鎖の可変域
（それぞれVH及びVX）をコードする機能エキソンを、サ
ザン分析によって得られたDNA制限マップによって同定
した。germlineVX遺伝子を再構成し、JX遺伝子セグメン
トに結合すると、結果的に機能VXエキソンが得られる。
同様に、VH遺伝子をJH遺伝子セグメントに並置すると、
機能VHエキソンが生成される。特異的DNAプローブセグ
メントは、再構成された表現型を再構成されていないge
rmlineDNAセグメントから区別する固有の制限酵素部位
によって再構成Ｖ域遺伝子を同定するよう設計される
〔Oi and Morrison,BioTechniques 4:214−221（198
6）〕。組換えDNA技術を使用してゲノムDNAライブラリ
ーを構築し、所望のＶ遺伝子を単離及び配列決定して、
再構成及び発現されたVH及びVLエキソンのアイデンティ
ティを確認した。VHエキソンをpSV2ΔHgptベクター〔Mu
lligan and Berg,Science 209:1422−1427（1980）;
Mulligan and Berg,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:207
2−2076（1981）〕中に挿入した。このベクターは、プ
ラスミドをE.coli中に維持するためにアンピシリン耐性
遺伝子を、また、ヒポキサンチン、ミコフェノール酸及
びキサンチンを含む培地中で増殖する哺乳動物細胞を選
択し得るようミコフェノール酸耐性遺伝子を含む。所望
のVXエキソンを、pACYC184プラスミドから誘導したpSV1
84ΔHneoベクター〔Chang and Cohen,J.Bacteriol.14
3:1141−1156（1978）〕中に挿入した。このベクター
は、プラスミドをE.coli中に維持するために使用される
クロラムフェニコール耐性遺伝子と、このプラスミドベ
クターを用いて形質転換した哺乳動物細胞を選択するた
めに使用されるゲンタマイシン耐性遺伝子とを含む。ゲ
ンタマイシン耐性遺伝子（neo）の転写は、SV40初期領
域プロモーターによって誘導される。免疫グロブリンの
Ｈ鎖及びＬ鎖に周知のDNA調節配列もまた上記トランス
フェクションベクターに含められる〔Calame,Annual R
ev.Immunol.3:159−196（1985）;Morrison and Oi,An
nual Rev.Immunol,2:239−256（1984）〕。両プラスミ
ドを、クロラムフェニコール及びアンピシリン選択培地
中で増殖させたE.coli HB101〔Boyer and Roulland
−Dussoix,J.Mol.Biol.41:459（1989）〕中に維持し
た。
リゾチーム及びEDTAを用いて処理することにより調製
した上記細菌細胞の原形質体を、ポリエチレングリコー
ル処理またはエレクトロポレーションによって免疫グロ
ブリン非産生マウスSP2/0ミエローマ細胞系〔ATCC CRL
1581〕と融合した。トランスフェクトしたSP2/0細胞
を、ゲンタマイシン、ヒポキサンチン、ミコフェノール
酸及びキサンチンを含む培地を使用して単離した。得ら
れたトランスフェクトーマ（transfectoma）を、実施例
２に記載の技術を使用してマウス：ヒトキメラSR−１抗
体の産生についてスクリーニングした。
した上記細菌細胞の原形質体を、ポリエチレングリコー
ル処理またはエレクトロポレーションによって免疫グロ
ブリン非産生マウスSP2/0ミエローマ細胞系〔ATCC CRL
1581〕と融合した。トランスフェクトしたSP2/0細胞
を、ゲンタマイシン、ヒポキサンチン、ミコフェノール
酸及びキサンチンを含む培地を使用して単離した。得ら
れたトランスフェクトーマ（transfectoma）を、実施例
２に記載の技術を使用してマウス：ヒトキメラSR−１抗
体の産生についてスクリーニングした。
実施例4:モノクローナル抗体のSCFレセプターへの結合
の測定アッセイ COS−１細胞を、ヒトｃ−kit〔Zsebo et al.,Cell
63:213−224（1990）〕の膜貫通ドメイン及び外部ド
メインを含むベクターまたはベクター単独でトランスフ
ェクトした。まずSR−１、次いでFITC結合ヤギ抗マウス
IgGを使用して間接免疫分析すると、SR−１は、ベクタ
ー単独でトランスフェクトした細胞を全く認識せず、ｃ
−kitを用いてトランスフェクトした細胞ではその５〜1
0％を認識したことが判った。これは、SR−１がｃ−kit
に結合することを示している。
の測定アッセイ COS−１細胞を、ヒトｃ−kit〔Zsebo et al.,Cell
63:213−224（1990）〕の膜貫通ドメイン及び外部ド
メインを含むベクターまたはベクター単独でトランスフ
ェクトした。まずSR−１、次いでFITC結合ヤギ抗マウス
IgGを使用して間接免疫分析すると、SR−１は、ベクタ
ー単独でトランスフェクトした細胞を全く認識せず、ｃ
−kitを用いてトランスフェクトした細胞ではその５〜1
0％を認識したことが判った。これは、SR−１がｃ−kit
に結合することを示している。
間接免疫分析から更に、モノクローナル抗体（SR−
１）が、OCIM1細胞及び少量（２〜５％）の骨髄単核細
胞の両方に存在する表面エピトープを認識することが判
った（図6A）。SR−１抗体は、CD34を発現する造血細胞
の一部（50〜75％）を認識した（図6B）。これらの結果
は、骨髄細胞を抗CD34モノクローナル抗体〔抗体12.8,A
ndrews et al.,J.Exp.Med.172:355（1990）;Civin,19
90年10月23日出願米国特許第4,965,204号;Civin,1990年
10月31日公開欧州特許第395355号〕と、SR−１またはイ
ソタイプ適合対照モノクローナル抗体抗Thy1.1,Andrews
et al.,J.Exp.Med.172:355（1990）とで同時に標識
して得られた。かかる実施例は、SR−１及び間接免疫分
析を使用したｃ−kitを発現する細胞を同定し得ること
を示している。SR−１抗体はPEに直接結合することもで
き、この調製物を使用してｃ−kitを発現する細胞が同
定されている。別の方法はSR−１抗体をビオチニル化す
ることであり、この調製物の結合が、FIFCまたはPEに結
合したアビジンまたはストレプトアビジンを使用して検
出される。
１）が、OCIM1細胞及び少量（２〜５％）の骨髄単核細
胞の両方に存在する表面エピトープを認識することが判
った（図6A）。SR−１抗体は、CD34を発現する造血細胞
の一部（50〜75％）を認識した（図6B）。これらの結果
は、骨髄細胞を抗CD34モノクローナル抗体〔抗体12.8,A
ndrews et al.,J.Exp.Med.172:355（1990）;Civin,19
90年10月23日出願米国特許第4,965,204号;Civin,1990年
10月31日公開欧州特許第395355号〕と、SR−１またはイ
ソタイプ適合対照モノクローナル抗体抗Thy1.1,Andrews
et al.,J.Exp.Med.172:355（1990）とで同時に標識
して得られた。かかる実施例は、SR−１及び間接免疫分
析を使用したｃ−kitを発現する細胞を同定し得ること
を示している。SR−１抗体はPEに直接結合することもで
き、この調製物を使用してｃ−kitを発現する細胞が同
定されている。別の方法はSR−１抗体をビオチニル化す
ることであり、この調製物の結合が、FIFCまたはPEに結
合したアビジンまたはストレプトアビジンを使用して検
出される。
実施例5:モノクローナル抗体SR−１によるSCFのSCFレセ
プターへの結合の阻害の測定アッセイ： SCFレセプターを発現する細胞を、125IhSCF（100pmo
l）と一緒に、種々の量のSR−１抗体の存在下または不
在下でインキュベートした。好ましくは、SR−１腹水の
1:1000〜1:100,000希釈液を使用する。インキュベーシ
ョン終了時に、フタレート油によって細胞を沈降するこ
とにより、細胞に結合した125IhSCFを遊離125IhSCFから
分離した〔Broudy et al.,Blood 75:1622−1626（19
90）〕。
プターへの結合の阻害の測定アッセイ： SCFレセプターを発現する細胞を、125IhSCF（100pmo
l）と一緒に、種々の量のSR−１抗体の存在下または不
在下でインキュベートした。好ましくは、SR−１腹水の
1:1000〜1:100,000希釈液を使用する。インキュベーシ
ョン終了時に、フタレート油によって細胞を沈降するこ
とにより、細胞に結合した125IhSCFを遊離125IhSCFから
分離した〔Broudy et al.,Blood 75:1622−1626（19
90）〕。
1:100,000に希釈した腹水が、125IhSCFのOCIM1細胞へ
の結合をブロックする（表２）。このモノクローナル抗
体は、125I−ラットSCFのネズミMC/9細胞系への結合を
ブロックしないことから、ヒトhSCFレセプターに特異的
である。
の結合をブロックする（表２）。このモノクローナル抗
体は、125I−ラットSCFのネズミMC/9細胞系への結合を
ブロックしないことから、ヒトhSCFレセプターに特異的
である。
更に、COS−１細胞をV19.8〔Zsebo et al.,Cell 6
3:213−224（1990）〕またはヒトｃ−kitを含むV19.8を
用いてトランスフェクトした。COS細胞膜を1nmolの125I
hSCFと一緒に、冷たいSCFまたはSR−１腹水（1:1000希
釈液）の存在下または不在下にインキュベートし、結合
した標識SCFを測定した。SR−１は、非標識SCFと同じく
効果的に125IhSCFのｃ−kitへの結合をブロックした
（図７）。
3:213−224（1990）〕またはヒトｃ−kitを含むV19.8を
用いてトランスフェクトした。COS細胞膜を1nmolの125I
hSCFと一緒に、冷たいSCFまたはSR−１腹水（1:1000希
釈液）の存在下または不在下にインキュベートし、結合
した標識SCFを測定した。SR−１は、非標識SCFと同じく
効果的に125IhSCFのｃ−kitへの結合をブロックした
（図７）。
実施例6:SCFの生物学的作用のSR−１による中和 125IhSCFの細胞への結合をブロックすることに加え、
SR−１は、コロニー増殖におけるSCFの生物学的作用を
ブロックする。SCFは初期赤芽球コロニー形成細胞（BFU
−Ｅ）の増殖を刺激するが、SR−１はこの作用をブロッ
クする。SCFは、より成熟した赤芽球コロニー形成細胞
（CFU−Ｅ）の増殖を変化させることはなく、SR−１はC
FU−Ｅ増殖に作用を及ぼさない。
SR−１は、コロニー増殖におけるSCFの生物学的作用を
ブロックする。SCFは初期赤芽球コロニー形成細胞（BFU
−Ｅ）の増殖を刺激するが、SR−１はこの作用をブロッ
クする。SCFは、より成熟した赤芽球コロニー形成細胞
（CFU−Ｅ）の増殖を変化させることはなく、SR−１はC
FU−Ｅ増殖に作用を及ぼさない。
ヒト骨髄単核細胞を、半固形培地において組換えヒト
エリトロポエチン（１単位/ml,Amgen Inc.,Thousand
Oaks,California）及びhSCF（50ng/ml）中で、SR−１腹
水（1:1000希釈液）の存在下または不在下で培養した。
７日目にCFU−Ｅをカウントし、14日目にBFU−Ｅをカウ
ントした。二重反復試験プレートを用いて３回実験し、
１つの実験結果を表３に示す。
エリトロポエチン（１単位/ml,Amgen Inc.,Thousand
Oaks,California）及びhSCF（50ng/ml）中で、SR−１腹
水（1:1000希釈液）の存在下または不在下で培養した。
７日目にCFU−Ｅをカウントし、14日目にBFU−Ｅをカウ
ントした。二重反復試験プレートを用いて３回実験し、
１つの実験結果を表３に示す。
実施例7:モノクローナル抗体SR−１の治療薬への結合 得られた結合体を治療及び診断に使用するよう、SR−
１は種々の薬剤にカップリングまたは結合される〔Sche
inberg et al.,Oncology 1,31−37（1987）〕。
１は種々の薬剤にカップリングまたは結合される〔Sche
inberg et al.,Oncology 1,31−37（1987）〕。
ｃ−kitレセプターを発現する細胞を含む腫瘍及び腫
瘍塊のin vivo造影に使用するためには、抗体または抗
体フラグメントは123I、131I、111In、90Y、99Tcといっ
た放射性同位元素に結合される。また、上記腫瘍の治
療、及び白血病のような分散型悪性病態の治療に使用す
るためには、抗体または抗体フラグメントは32P、
131I、90Y、186Re、212Pb、212Biといった放射性同位元
素に結合される〔Scheinberg et al.,Oncology 1,31
−37（1987）及びHumm,J.L.,J.Nuclear Medicine 27,
1490−1497（1986）〕。放射性同位元素の抗体への結合
は、pertinning法〔Schwartz J.,Nuclear Medicine
28,721（1987）及びRhodes et al.,J.Nuclear Medic
ine 21,54（1980）〕を含む方法によって放射性同位元
素を抗体に直接結合させるか、または、抗体と放射性同
位元素を結合する、ジエチレントリアミン五酢酸（DTP
A）〔Hnatowich et al.,J.Nuclear Medicine 26:50
3−509（1985）〕、N2S2〔Fritzberg et al.,Proc.Na
tl.Acad.Sciences.U.S.A.85:4025（1988）〕もしくは大
員環キレート化剤〔Moi et al.,Cancer Research
（前出）50:7895−7935（1990）〕を使用するような二
官能性キレートリンカーを介して行なわれる。
瘍塊のin vivo造影に使用するためには、抗体または抗
体フラグメントは123I、131I、111In、90Y、99Tcといっ
た放射性同位元素に結合される。また、上記腫瘍の治
療、及び白血病のような分散型悪性病態の治療に使用す
るためには、抗体または抗体フラグメントは32P、
131I、90Y、186Re、212Pb、212Biといった放射性同位元
素に結合される〔Scheinberg et al.,Oncology 1,31
−37（1987）及びHumm,J.L.,J.Nuclear Medicine 27,
1490−1497（1986）〕。放射性同位元素の抗体への結合
は、pertinning法〔Schwartz J.,Nuclear Medicine
28,721（1987）及びRhodes et al.,J.Nuclear Medic
ine 21,54（1980）〕を含む方法によって放射性同位元
素を抗体に直接結合させるか、または、抗体と放射性同
位元素を結合する、ジエチレントリアミン五酢酸（DTP
A）〔Hnatowich et al.,J.Nuclear Medicine 26:50
3−509（1985）〕、N2S2〔Fritzberg et al.,Proc.Na
tl.Acad.Sciences.U.S.A.85:4025（1988）〕もしくは大
員環キレート化剤〔Moi et al.,Cancer Research
（前出）50:7895−7935（1990）〕を使用するような二
官能性キレートリンカーを介して行なわれる。
治療に使用するため、種々の他の毒性物質も抗体に結
合される。その例としては、インターカレーション（例
えばダウノマイシン、アドリアマイシン、アクラシノマ
イシン（aclacinomycin））またはDNA切断（例えばエス
ペラマイシン（esperamycin）、カリケアマイシン（cal
icheamycin）、ネオカルチノスタチン）によってDNAと
相互作用することで毒性である抗腫瘍剤及び抗生物質、
並びに、シスプラチナ、ビンブラスチン及びメトレキサ
ートといった他の毒性細胞増殖抑制剤を挙げることがで
きる〔Scheinberg et al.,Oncology 1:31−37（198
7）;Greenfield et al.,Antibody,Immunoconjugates,
and Radiopharmaceuticals 4:107−119（1991）;Dill
man et al.,Cancer Research 48:6097−6101（198
8）;Hamann et al.,Abstracts of 19th American
Chemical Society National Meeting,Dallas,Texa
s,U.S.A.,April ９−14,1989,Abstract No.71A;Y.Sug
iura et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:7672−76
76（1989）〕。上記物質は、該物質の適当な誘導体と反
応したときに共有結合を含むように結合される。
合される。その例としては、インターカレーション（例
えばダウノマイシン、アドリアマイシン、アクラシノマ
イシン（aclacinomycin））またはDNA切断（例えばエス
ペラマイシン（esperamycin）、カリケアマイシン（cal
icheamycin）、ネオカルチノスタチン）によってDNAと
相互作用することで毒性である抗腫瘍剤及び抗生物質、
並びに、シスプラチナ、ビンブラスチン及びメトレキサ
ートといった他の毒性細胞増殖抑制剤を挙げることがで
きる〔Scheinberg et al.,Oncology 1:31−37（198
7）;Greenfield et al.,Antibody,Immunoconjugates,
and Radiopharmaceuticals 4:107−119（1991）;Dill
man et al.,Cancer Research 48:6097−6101（198
8）;Hamann et al.,Abstracts of 19th American
Chemical Society National Meeting,Dallas,Texa
s,U.S.A.,April ９−14,1989,Abstract No.71A;Y.Sug
iura et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:7672−76
76（1989）〕。上記物質は、該物質の適当な誘導体と反
応したときに共有結合を含むように結合される。
治療に使用するため、多数のタンパク質及び糖タンパ
ク質毒素が抗体に結合されている〔Blttler et a
l.,Cancer Cells 1:50−55（1989）;Immunotoxins,Ed
ited by A.E.Frankel Kluwer Academic Publisher
s,Boston（1989）〕。かかる例としては、ジフテリア毒
素、赤痢菌毒素及びシュードモナス外毒素といった細菌
毒素、並びに、リシン、アブリン、モデシン（modecci
n）、ビスクミン（viscumin）、ポークウィード抗ウイ
ルスタンパク質、サポニン、モモルジン（momordin）及
びゲロニン（gelonin）といった植物毒素を挙げること
ができる。毒素は触媒フラグメントを含むと共に、場合
によっては、細胞表面構造を認識したり細胞膜を横切っ
ての転位を促進するフラグメントまたはドメインを含
む。効力を失うことなく特異性を向上し得る、適当に変
性された毒素または毒素フラグメント（例えば、結合さ
れた抗体によってのみ細胞表面認識が行われるよう認識
能は欠失しているが、効力を増強する膜貫通転位能は保
持している変性毒素）が使用される〔Hnatowich et a
l.,J.Nuclear Medicine 26:503−509（1985）〕。毒
素の抗体への結合は、Ｎ−スクシンイミジル ３−（２
−ピリジルジチオ）プロピオネート（SPDP）または２−
イミノチオランといったヘテロバイオ官能性（heterobi
ofunctional）架橋リンカーによって行われる〔Cawley
et al.,Cell 22:563−570（1980）;Goff et al.,
Bioconjugate Chemistry 1:381−386（1990）；及びT
horpe et al.,J.Natl.Cancer Inst.,79:1011〕。更
に、抗体のｃ−kit結合成分に融合した毒素は、連続遺
伝子エレメントとして結合された毒素遺伝子及び抗体遺
伝子からなる遺伝子工作エレメントの組換え発現によっ
て生成される。
ク質毒素が抗体に結合されている〔Blttler et a
l.,Cancer Cells 1:50−55（1989）;Immunotoxins,Ed
ited by A.E.Frankel Kluwer Academic Publisher
s,Boston（1989）〕。かかる例としては、ジフテリア毒
素、赤痢菌毒素及びシュードモナス外毒素といった細菌
毒素、並びに、リシン、アブリン、モデシン（modecci
n）、ビスクミン（viscumin）、ポークウィード抗ウイ
ルスタンパク質、サポニン、モモルジン（momordin）及
びゲロニン（gelonin）といった植物毒素を挙げること
ができる。毒素は触媒フラグメントを含むと共に、場合
によっては、細胞表面構造を認識したり細胞膜を横切っ
ての転位を促進するフラグメントまたはドメインを含
む。効力を失うことなく特異性を向上し得る、適当に変
性された毒素または毒素フラグメント（例えば、結合さ
れた抗体によってのみ細胞表面認識が行われるよう認識
能は欠失しているが、効力を増強する膜貫通転位能は保
持している変性毒素）が使用される〔Hnatowich et a
l.,J.Nuclear Medicine 26:503−509（1985）〕。毒
素の抗体への結合は、Ｎ−スクシンイミジル ３−（２
−ピリジルジチオ）プロピオネート（SPDP）または２−
イミノチオランといったヘテロバイオ官能性（heterobi
ofunctional）架橋リンカーによって行われる〔Cawley
et al.,Cell 22:563−570（1980）;Goff et al.,
Bioconjugate Chemistry 1:381−386（1990）；及びT
horpe et al.,J.Natl.Cancer Inst.,79:1011〕。更
に、抗体のｃ−kit結合成分に融合した毒素は、連続遺
伝子エレメントとして結合された毒素遺伝子及び抗体遺
伝子からなる遺伝子工作エレメントの組換え発現によっ
て生成される。
診断または治療に使用する前に、毒素効力、ターゲッ
ト特異性、in vitro及びin vivo安定性、並びに他の
特性を判定すべく、結合抗体を試験する〔Blttler e
t al.,Cancer Cells 1:50−55（1989）及びImmunoto
xins,Edited by A.E.Frankel Kluwer Academic Pu
blishers,Boston（1988）〕。毒素薬剤の毒性並びに抗
体の結合親和性及び特異性は、使用した結合方法に最少
限にしか影響されないことが望ましい。次いで、SCFレ
セプターに対する結合（実施例３参照）、SCFのSCFレセ
プターへの結合の阻害（実施例４参照）について結合体
を試験する。赤白血病細胞系OCIM1のようなターゲット
細胞に対する毒性は、処理した細胞培養液と未処理の細
胞細胞液とにおいて高分子中に取り込まれた標識化合物
を測定することにより、またより直接的には、クロノジ
ェニックアッセイ（clonogenic assay）及び細胞増殖
戻し外挿アッセイ（cell growth back−extrapolatio
n assay）において、処理した培養液中と未処理の培養
液中の増殖し得る細胞の数を測定することにより試験さ
れる。in vivo安定性、クリアランス及び比毒性（spec
ific toxicity）は、結合体を適当な被検動物に投与す
ることにより判定される。かかる被検動物としては、正
常マウス、並びに、ヌードマウスまたはSCIDマウスとい
った免疫不全種マウスに導入されたヒト腫瘍細胞を含む
in vivo腫瘍及び白血病異種移植モデルを挙げることが
できる。
ト特異性、in vitro及びin vivo安定性、並びに他の
特性を判定すべく、結合抗体を試験する〔Blttler e
t al.,Cancer Cells 1:50−55（1989）及びImmunoto
xins,Edited by A.E.Frankel Kluwer Academic Pu
blishers,Boston（1988）〕。毒素薬剤の毒性並びに抗
体の結合親和性及び特異性は、使用した結合方法に最少
限にしか影響されないことが望ましい。次いで、SCFレ
セプターに対する結合（実施例３参照）、SCFのSCFレセ
プターへの結合の阻害（実施例４参照）について結合体
を試験する。赤白血病細胞系OCIM1のようなターゲット
細胞に対する毒性は、処理した細胞培養液と未処理の細
胞細胞液とにおいて高分子中に取り込まれた標識化合物
を測定することにより、またより直接的には、クロノジ
ェニックアッセイ（clonogenic assay）及び細胞増殖
戻し外挿アッセイ（cell growth back−extrapolatio
n assay）において、処理した培養液中と未処理の培養
液中の増殖し得る細胞の数を測定することにより試験さ
れる。in vivo安定性、クリアランス及び比毒性（spec
ific toxicity）は、結合体を適当な被検動物に投与す
ることにより判定される。かかる被検動物としては、正
常マウス、並びに、ヌードマウスまたはSCIDマウスとい
った免疫不全種マウスに導入されたヒト腫瘍細胞を含む
in vivo腫瘍及び白血病異種移植モデルを挙げることが
できる。
実施例8:モノクローナル抗体SR−１を含む医薬組成物の
調製 本発明の医薬組成物は、有効量の有効成分SR−１を、
単独でまたは適当な緩衝剤、希釈剤及び／もしくは添加
剤と組み合わせて含む。かかる組成物は、無菌水溶液と
してまたは凍結乾燥もしくは他の方法で乾燥した製剤と
して提供される。典型的には、抗体はかかるビヒクル中
に約1mg/ml〜10mg/mlの濃度で配合される。
調製 本発明の医薬組成物は、有効量の有効成分SR−１を、
単独でまたは適当な緩衝剤、希釈剤及び／もしくは添加
剤と組み合わせて含む。かかる組成物は、無菌水溶液と
してまたは凍結乾燥もしくは他の方法で乾燥した製剤と
して提供される。典型的には、抗体はかかるビヒクル中
に約1mg/ml〜10mg/mlの濃度で配合される。
注射に適した医薬組成物の１つの実施態様は、無菌水
中に一塩基リン酸ナトリウム（0.45mg/ml）及びTween 8
0（0.2mg/ml）を含む緩衝液（pH7.0±0.5）中にモノク
ローナル抗体SR−１（1mg/ml）を含む。
中に一塩基リン酸ナトリウム（0.45mg/ml）及びTween 8
0（0.2mg/ml）を含む緩衝液（pH7.0±0.5）中にモノク
ローナル抗体SR−１（1mg/ml）を含む。
実施例9:SCFレセプターを含む細胞の選択 a.SR−１を用いた直接免疫付着によるSCFレセプターを
含む細胞の選択 SCFレセプターを発現する細胞を直接免疫付着によっ
て選択し、かかる細胞の増殖可能性をコロニーアッセイ
において判定した。単球欠失正常ヒト骨髄単核細胞をSR
−１を用いた直接免疫付着によって単離し、半固形培地
においてエリトロポエチン及びIL−３中で14日間培養し
た。データは、３回の実験のうちの１回の二重反復試験
プレートの平均をとったものである。
含む細胞の選択 SCFレセプターを発現する細胞を直接免疫付着によっ
て選択し、かかる細胞の増殖可能性をコロニーアッセイ
において判定した。単球欠失正常ヒト骨髄単核細胞をSR
−１を用いた直接免疫付着によって単離し、半固形培地
においてエリトロポエチン及びIL−３中で14日間培養し
た。データは、３回の実験のうちの１回の二重反復試験
プレートの平均をとったものである。
結果（表４）から、SR−１付着細胞集団においてはBF
U−Ｅが50倍高いことが判る。BFU−Ｅのフラクションは
４〜７％に広がり、SR−１付着細胞集団のBFU−Ｅの全
回収率は70％であった。これらの結果は、SR−１を使用
して、直接免疫付着によって前駆細胞集団を精製し得る
ことを示している。
U−Ｅが50倍高いことが判る。BFU−Ｅのフラクションは
４〜７％に広がり、SR−１付着細胞集団のBFU−Ｅの全
回収率は70％であった。これらの結果は、SR−１を使用
して、直接免疫付着によって前駆細胞集団を精製し得る
ことを示している。
SR−１付着細胞集団中により原始的な造血細胞が認め
られるか判定するため、細胞を12日間浮遊培養した。３
日おきに細胞アリコートを取り出し、メチルセルロース
コロニーアッセイにおいて再度平板培養して前駆細胞を
定量化した。結果は、SR−１付着細胞が12日間の浮遊培
養中に大量の（初期値より３倍高い）BFU−Ｅ及びCFU−
GMを生成したことを示している。SR−１非付着細胞集団
中のBFU−Ｅ及びCFU−GMの数は初期値を上回ることな
く、継続的に減少した。このことは、SR−１付着細胞集
団が、前記細胞を生成し得るより原始的な造血細胞を含
んでいることを示唆している。
られるか判定するため、細胞を12日間浮遊培養した。３
日おきに細胞アリコートを取り出し、メチルセルロース
コロニーアッセイにおいて再度平板培養して前駆細胞を
定量化した。結果は、SR−１付着細胞が12日間の浮遊培
養中に大量の（初期値より３倍高い）BFU−Ｅ及びCFU−
GMを生成したことを示している。SR−１非付着細胞集団
中のBFU−Ｅ及びCFU−GMの数は初期値を上回ることな
く、継続的に減少した。このことは、SR−１付着細胞集
団が、前記細胞を生成し得るより原始的な造血細胞を含
んでいることを示唆している。
b.SR−１を用いた蛍光活性化細胞選別によるSCFレセプ
ターを含む細胞の選択 正常なヒト骨髄単核細胞を抗CD34（モノクローナル抗
体12.8〔Andrews et al.,J.Exp.med.172−355（199
0）〕及びSR−１で同時に標識し、実施例10に記載のご
とくFACS上で分離した。メチルセルロース中のコロニー
アッセイによって前駆細胞フラクションを測定した。結
果から、CD34陽性SR−１陽性細胞集団は80％のBFU−Ｅ
及び96％のCFU−GMを含んでいたことが判った。CD34陽
性SR−１陰性細胞集団は20％のBFU−Ｅ及び４％のCFU−
GMを含んでいた。このことは、SR−１が、大半の骨髄前
駆細胞及び赤芽球前駆細胞を含むCD34陽性細胞のサブセ
ットを同定することを示している。更に上記前駆細胞
は、SR−１を用いた細胞選別によって明確に選択するこ
とができる。
ターを含む細胞の選択 正常なヒト骨髄単核細胞を抗CD34（モノクローナル抗
体12.8〔Andrews et al.,J.Exp.med.172−355（199
0）〕及びSR−１で同時に標識し、実施例10に記載のご
とくFACS上で分離した。メチルセルロース中のコロニー
アッセイによって前駆細胞フラクションを測定した。結
果から、CD34陽性SR−１陽性細胞集団は80％のBFU−Ｅ
及び96％のCFU−GMを含んでいたことが判った。CD34陽
性SR−１陰性細胞集団は20％のBFU−Ｅ及び４％のCFU−
GMを含んでいた。このことは、SR−１が、大半の骨髄前
駆細胞及び赤芽球前駆細胞を含むCD34陽性細胞のサブセ
ットを同定することを示している。更に上記前駆細胞
は、SR−１を用いた細胞選別によって明確に選択するこ
とができる。
実施例10:SCFレセプターを発現する細胞の蛍光活性化細
胞選別 蛍光活性化細胞選別（FACS）において、SCFレセプタ
ーを発現する細胞をモノクローナル抗体SR−１と混合し
た。SR−１モノクローナル抗体は、（１）蛍光ラベルFI
TCまたはPEに結合する、（２）ビオチンに結合し、FITC
もしくはPEに結合したアビジンまたはストレプトアビジ
ンと混合する、または（３）抗マウスFITCもしくはヒツ
ジ抗マウスFITCと更に混合する、のいずれかとした。
胞選別 蛍光活性化細胞選別（FACS）において、SCFレセプタ
ーを発現する細胞をモノクローナル抗体SR−１と混合し
た。SR−１モノクローナル抗体は、（１）蛍光ラベルFI
TCまたはPEに結合する、（２）ビオチンに結合し、FITC
もしくはPEに結合したアビジンまたはストレプトアビジ
ンと混合する、または（３）抗マウスFITCもしくはヒツ
ジ抗マウスFITCと更に混合する、のいずれかとした。
上記直接標識または間接標識したSCFレセプター含有
細胞を、標準FACS法を使用し、蛍光レベルに基づいて単
離した。
細胞を、標準FACS法を使用し、蛍光レベルに基づいて単
離した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｐ 35/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｙ Ｃ１２Ｐ 21/08 33/574 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/577 Ｂ 33/574 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ 33/577 5/00 Ｂ (72)発明者 ブルーデイ，バージニア・シー アメリカ合衆国、ワシントン・98144、 シアトル、サーテイセカンド・アベニユ ー・サウス・2231 (56)参考文献 Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｒｅｓｅａｒｃ ｈ，Ｖｏｌ．12［11／12］（1988）ｐ. 923−928 Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｒｅｓｅａｒｃ ｈ，Ｖｏｌ．12［11／12］（1988）ｐ. 929−939 Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｒｅｓｅａｒｃ ｈ，Ｖｏｌ．９［11］（1985）ｐ．1329 −1336 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/02 - 15/90 A61K 35/28 A61K 39/395 A61K 48/00 A61P 35/02 C12N 5/10 - 5/28 C12P 21/08 G01N 33/53 G01N 33/574 G01N 33/577 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (25)
- 【請求項１】SCFレセプターに結合する能力を有し、且
つ、モノクローナル抗体SR−１（受託番号HB 10716）に
より認識されるSCFレセプター上のエピトープと結合す
るモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体。 - 【請求項２】前記SCFレセプターがヒトSCFレセプターで
あることを特徴とする請求項１に記載のモノクローナル
抗体。 - 【請求項３】前記モノクローナル抗体がSR−１（受託番
号HB 10716）であることを特徴とする請求項２に記載の
モノクローナル抗体。 - 【請求項４】SCFレセプターにSCF分子が結合するのを抑
制する能力も有することを特徴とする請求項１に記載の
モノクローナル抗体。 - 【請求項５】前記SCF分子がヒトSCF分子であることを特
徴とする請求項４に記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項６】前記SCFレセプターがヒトSCFレセプターで
あることを特徴とする請求項５に記載のモノクローナル
抗体。 - 【請求項７】造血細胞を精製する方法であって、 （ａ）細胞混合物を請求項１に記載のモノクローナル抗
体に暴露するステップと、 （ｂ）前記モノクローナル抗体と結合した細胞を前記モ
ノクローナル抗体と結合しない細胞から分離するステッ
プと を含む方法。 - 【請求項８】前記分離がカラムクロマトグラフィーによ
ることを特徴とする請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】前記分離が蛍光活性化細胞選別によること
を特徴とする請求項７に記載の方法。 - 【請求項１０】前記分離が直接免疫付着によることを特
徴とする請求項７に記載の方法。 - 【請求項１１】請求項７に記載の方法で精製した造血細
胞より成る骨髄移植を含む造血細胞再構成用組成物。 - 【請求項１２】レトロウイルス媒介遺伝子が移入され
た、請求項７に記載の方法で精製した細胞より成る遺伝
子療法用組成物。 - 【請求項１３】正常細胞を腫瘍性白血病細胞から分離す
る方法であって、 （ａ）正常細胞及び腫瘍性白血病細胞を含む細胞混合物
を請求項１に記載のモノクローナル抗体に暴露するステ
ップと、 （ｂ）正常細胞及び腫瘍性白血病細胞のSCFレセプター
数の差に基づいて正常細胞を腫瘍性白血病細胞から分離
するステップと を含む方法。 - 【請求項１４】請求項１に記載のモノクローナル抗体と
結合させた白血病治療薬を治療有効量で含有する白血病
細胞治療用組成物。 - 【請求項１５】白血病細胞を治療する方法であって、請
求項１に記載のモノクローナル抗体の結合フラグメント
と結合させた白血病治療薬を治療有効量で含有する白血
病細胞治療用組成物。 - 【請求項１６】請求項１に記載のモノクローナル抗体と
結合させた固型腫瘍治療薬を治療有効量で含有する固型
腫瘍治療用組成物。 - 【請求項１７】請求項１に記載のモノクローナル抗体の
結合フラグメントと結合させた固型腫瘍治療薬を治療有
効量で含有する固型腫瘍治療用組成物。 - 【請求項１８】細胞試料においてSCFレセプターの存在
を決定する方法であって、 （ａ）細胞試料を請求項１に記載のモノクローナル抗体
に暴露するステップと、 （ｂ）前記モノクローナル抗体のSCFレセプターへの結
合を検出するステップと を含む方法。 - 【請求項１９】前記検出を標識したモノクローナル抗体
の使用によって行なうことを特徴とする請求項18に記載
の方法。 - 【請求項２０】細胞試料を正常細胞、白血病細胞及び固
型腫瘍細胞の中から選択することを特徴とする請求項18
に記載の方法。 - 【請求項２１】請求項１に記載のモノクローナル抗体を
SCF阻害量で含有する細胞周期特異的な化学療法剤に対
する感受性改変用組成物。 - 【請求項２２】前記モノクローナル抗体がマウス−ヒト
ハイブリッド抗体であることを特徴とする請求項１に記
載のモノクローナル抗体。 - 【請求項２３】前記抗体がIgG2aイソタイプの抗体であ
ることを特徴とする請求項１に記載のモノクローナル抗
体。 - 【請求項２４】請求項１に記載のモノクローナル抗体を
産生し得るハイブリドーマ。 - 【請求項２５】モノクローナル抗体SR−１（受託番号HB
10716）を産生し得ることを特徴とする請求項24に記載
のハイブリドーマ。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US68124591A | 1991-04-05 | 1991-04-05 | |
| US681,245 | 1991-04-05 | ||
| PCT/US1992/002674 WO1992017505A1 (en) | 1991-04-05 | 1992-04-03 | Monoclonal antibodies to stem cell factor receptors |
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|---|---|
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Family
ID=24734435
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP51001792A Expired - Fee Related JP3213314B2 (ja) | 1991-04-05 | 1992-04-03 | 幹細胞因子レセプターに対するモノクローナル抗体 |
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|---|---|
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| EP (1) | EP0578774B1 (ja) |
| JP (1) | JP3213314B2 (ja) |
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| DE (1) | DE69226431T2 (ja) |
| DK (1) | DK0578774T3 (ja) |
| ES (1) | ES2118820T3 (ja) |
| HK (1) | HK1008827A1 (ja) |
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| JP3213314B2 (ja) * | 1991-04-05 | 2001-10-02 | ボード・オブ・リージエンツ・オブ・ザ・ユニバーシテイー・オブ・ワシントン | 幹細胞因子レセプターに対するモノクローナル抗体 |
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