JP2023545359A - 抗ｈｅｒ２抗体－薬物複合体治療のためのスコアリング方法 - Google Patents
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Abstract
癌患者が抗体薬物複合体（ＡＤＣ）治療にどのように応答するかを予測する方法は、各癌細胞に対する単一細胞ＡＤＣスコアに基づいて予測応答スコアを計算することを含む。ＡＤＣは、ＡＤＣペイロードと、各癌細胞上のタンパク質を標的とするＡＤＣ抗体とを含み、タンパク質はヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）である。組織試料は、組織試料中の癌細胞上のタンパク質に結合する診断抗体に連結された色素を使用して免疫組織化学的に染色される。組織のデジタル画像中の癌細胞が検出される。各癌細胞について、単一細胞ＡＤＣスコアは、癌細胞の膜及び／又は細胞質並びに／或いは隣接する癌細胞の膜及び細胞質における色素の染色強度に基づいて計算される。ＡＤＣ治療に対する癌患者の応答は、統計的演算を使用して組織試料の全ての単一細胞ＡＤＣスコアを集合することによって予測される。【選択図】図１４
Description
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年９月１２日に提出された米国仮特許出願第６３／０７７，６０４号明細書の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年９月１２日に提出された米国仮特許出願第６３／０７７，６０４号明細書の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
電子的に提出された配列表の参照
電子的に提出された配列表の内容（名称：ＤＳＡＤＣ＿４００＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ：サイズ：２４，６６２バイト；及び作成日：２０２１年９月９日）は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
電子的に提出された配列表の内容（名称：ＤＳＡＤＣ＿４００＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ：サイズ：２４，６６２バイト；及び作成日：２０２１年９月９日）は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、リンカー構造を介して抗ＨＥＲ２抗体にコンジュゲートされた薬物を有する抗体薬物複合体を用いる治療に対して、癌患者がどのように応答するかを示すスコアを算出する方法に関する。
所与の治療に対する癌患者の応答確率を評価することは、癌患者の治療レジメンを決定する上で不可欠な工程である。そのような評価は、多くの場合、癌患者からの組織試料の組織学的分析に基づいており、標準的な等級付けスキームを使用して癌を同定及び分類することを伴う。免疫組織化学（ＩＨＣ）染色を使用して、特定のタンパク質を発現するマーカ陽性細胞を、そのタンパク質を発現しないマーカ陰性細胞と区別することができる。ＩＨＣ染色は、典型的には、タンパク質特異的抗体に連結された１つ以上の色素及び対比染色剤である別の色素を包含する複数の色素を含む。一般的な対比染色はヘマトキシリンであり、これはＤＮＡを標識し、したがって核を染色する。
タンパク質特異的染色又はバイオマーカを使用して、所定の治療に対する応答を示す可能性が高い癌患者の組織の領域を同定することができる。例えば、上皮細胞を染色するバイオマーカは、疑われる腫瘍領域を同定するのに役立ち得る。次いで、他のタンパク質特異的バイオマーカを使用して、癌性組織内の細胞を特性決定する。特定のバイオマーカによって染色された細胞を同定及び定量化することができ、その後、陽性に染色された細胞及び陰性に染色された細胞の数を示すスコアを病理学者が視覚的に推定することができる。次いで、このスコアを、同じ方法で計算された他の癌患者のスコアと比較することができる。所与の癌治療に対するこれらの他の患者の応答が既知である場合、病理学者は、癌患者について計算されたスコアと他の患者のスコアとの比較に基づいて、癌患者が所与の治療に応答する可能性がどの程度あるかを予測することができる。しかしながら、病理学者による視覚的評価は、変動性及び主観が生じやすい。
１つの有望な癌治療は、抗原が癌細胞の表面上に発現される抗体にコンジュゲートされた細胞傷害性を有する薬物を有する抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を含む。ＡＤＣは抗原に結合し、細胞内在化を受けて、薬物を癌細胞に選択的に送達し、それらの癌細胞内に薬物を蓄積し、それらを死滅させる。治療用ＨＥＲ２抗体薬物複合体を含む治療に対する癌患者の応答を示す再現性のある客観的スコアを生成するためのコンピュータベースの方法が求められている。
癌患者が抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を含む治療にどのように応答するかを予測する方法は、各癌細胞に対する単一細胞ＡＤＣスコアに基づいて応答スコアを計算することを含む。ＡＤＣは、ＡＤＣペイロードと、各癌細胞上のタンパク質を標的とするＡＤＣ抗体とを含む。組織試料は、組織試料中の癌細胞上のタンパク質に結合する診断抗体に連結された色素を使用して免疫組織化学的に染色される。組織試料のデジタル画像が取得される。デジタル画像に対して画像解析を行って、畳み込みニューラルネットワークを用いて癌細胞を検出する。各癌細胞について、単一細胞ＡＤＣスコアは、癌細胞の膜及び／又は細胞質並びに／或いは癌細胞に所定の距離より近い他の癌細胞の膜及び細胞質における色素の染色強度に基づいて計算される。統計的演算を使用して組織試料の全ての単一細胞ＡＤＣスコアを集合することによって、ＡＤＣ治療に対する癌患者の応答を予測する応答スコアが生成される。応答スコアが所定の閾値より高い患者は、ＡＤＣを含む治療に推奨される。
一実施形態では、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）で治療された癌患者の生存確率を示すスコアを生成する方法は、単一細胞ＡＤＣスコアを計算することを含む。癌患者の組織試料は、診断抗体に連結された色素を用いて免疫組織化学的に染色される。ＡＤＣは、ＡＤＣペイロードと、癌細胞上のヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）タンパク質を標的とするＡＤＣ抗体とを含む。診断抗体は、組織試料中の癌細胞上のＨＥＲ２タンパク質に結合する。組織試料のデジタル画像を取得し、画像解析を用いてデジタル画像中の癌細胞を検出する。各癌細胞について、膜中の色素の染色強度に基づいて単一細胞ＡＤＣスコアを計算する。単一細胞ＡＤＣスコアはまた、場合により、癌細胞の細胞質中の色素の染色強度、並びに癌細胞に対して所定の距離より近い他の癌細胞の膜及び細胞質中の色素の染色強度に基づいてもよい。得られた癌患者の生存確率を示す定量的連続スコア（ＱＣＳ）は、統計的演算を用いて組織試料の全ての単一細胞ＡＤＣスコアを集合することによって生成される。全ての単一細胞ＡＤＣスコアの集合は、平均を決定すること、中央値を決定すること、又は所定の割合で分位を決定することによって行われる。別の態様では、全ての単一細胞ＡＤＣスコアの集合は、事前に定義された閾値を使用する閾値演算を含む。所定の閾値よりも大きい単一細胞ＡＤＣスコアを有する全ての細胞は、単一細胞ＡＤＣ陽性と標識される。集合は、単一細胞ＡＤＣ陽性細胞の数を全癌細胞の数で除算することによって行われる。
一実施形態では、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）に対する癌患者の応答を予測する方法は、癌細胞を検出することと、各癌細胞について単一細胞ＡＤＣスコアを計算することとを含む。ＡＤＣは、ＡＤＣペイロードと、癌細胞上のタンパク質を標的とするＡＤＣ抗体とを含む。タンパク質は、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）である。組織試料は、診断抗体に連結された色素を使用して免疫組織化学的に染色される。診断抗体は、組織試料中の癌細胞上のタンパク質に結合する。組織試料のデジタル画像が取得され、デジタル画像において癌細胞が検出される。各癌細胞について、膜中の色素の染色強度に基づいて単一細胞ＡＤＣスコアを計算する。単一細胞ＡＤＣスコアはまた、場合により、癌細胞の細胞質中の色素の染色強度に基づいてもよく、且つ癌細胞に対して所定の距離より近い他の癌細胞の膜及び細胞質中の色素の染色強度に基づいてもよい。各膜の染色強度は、膜のピクセルにおける褐色ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）シグナルの平均光学密度に基づいて計算され、各細胞質の染色強度は、細胞質のピクセルにおける褐色ＤＡＢシグナルの平均光学密度に基づいて計算される。統計的演算を用いて、組織試料の全ての単一細胞ＡＤＣスコアの集合に基づいて、ＡＤＣに対する癌患者の応答が予測される。
別の実施形態では、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）に対して所定の応答を示す癌患者を同定する方法は、応答スコアを生成することを含む。ＡＤＣは、ＡＤＣペイロードと、癌細胞上のタンパク質を標的とするＡＤＣ抗体とを含む。癌患者の組織試料は、組織試料中の癌細胞上のタンパク質に結合する診断抗体に連結された色素を使用して免疫組織化学的に染色される。組織試料のデジタル画像を取得し、畳み込みニューラルネットワークを用いてデジタル画像中の癌細胞を検出する。各癌細胞について、膜中の色素の染色強度に基づいて単一細胞ＡＤＣスコアを計算する。単一細胞ＡＤＣスコアはまた、場合により、癌細胞の細胞質中の色素の染色強度に基づいてもよく、且つ単一細胞スコアが計算される癌細胞に対して所定の距離より近い他の癌細胞の膜及び細胞質中の色素の染色強度に基づいてもよい。ＱＣＳスコアは、統計的演算を用いて組織試料の全ての単一細胞ＡＤＣスコアを集合することによって生成された応答スコアである。癌患者は、ＱＣＳスコアが閾値を超えるか否かに基づいて、ＡＤＣに対して所定の応答を示すものとして同定される。閾値よりも大きいＱＣＳスコアを示す患者はＱＣＳ陽性（ＱＣＳ＋）とみなされ、他の全ての患者はＱＣＳ陰性（ＱＣＳ－）とみなされる。所定の応答は、平均腫瘍サイズの減少である。別の態様では、ＱＣＳスコアと閾値との間の差は、癌患者がＡＤＣに対して所定の応答を示すものとして正しく同定される確率を示す。小さな差は確率が低いことを示し、大きな差は癌患者が正確に特定される確率が高いことを示す。別の実施形態において、所定の応答は、予め定義された期間内の患者の死が非応答とみなされるように、患者の生存によって示される。一態様では、所定の期間は、標準治療に従って治療された患者の平均生存時間の２倍である。
一実施形態では、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）で癌患者を治療する方法は、治療スコアの形態でＱＣＳスコアを生成することを含む。ＡＤＣは、ＡＤＣペイロードと、癌細胞上のタンパク質を標的とするＡＤＣ抗体とを含む。タンパク質は、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）である。癌患者の組織試料は、組織試料中の癌細胞上のタンパク質に結合する診断抗体に連結された色素を使用して免疫組織化学的に染色される。組織試料のデジタル画像が取得され、デジタル画像において癌細胞が検出される。各癌細胞について、膜中の色素の染色強度に基づいて単一細胞ＡＤＣスコアが計算される。単一細胞ＡＤＣスコアはまた、場合により、癌細胞の細胞質中の色素の染色強度、並びに癌細胞に対して所定の距離より近い他の癌細胞の膜及び細胞質中の色素の染色強度に基づいてもよい。治療スコアは、統計的演算を用いて組織試料の全ての単一細胞ＡＤＣスコアを集合することによって生成される。治療スコアが所定の閾値を超える場合、ＡＤＣを含む治療が癌患者に投与される。別の態様では、患者の治療前のＨＥＲ２染色組織試料がＱＣＳ陽性（ＱＣＳ＋）としてスコア付けされる場合にのみ、ＡＤＣを含む治療が癌患者に投与される。
別の実施形態では、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）で癌患者を治療する方法は、治療を行う臨床医によって実施される。ＡＤＣは、ＡＤＣペイロードと、癌細胞上のタンパク質を標的とするＡＤＣ抗体とを含む。タンパク質は、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）である。ＡＤＣを含む治療は、応答スコアが所定の閾値を超える場合に癌患者に投与される。ＱＣＳ応答スコアは、統計的演算を使用して癌患者の組織試料の単一細胞ＡＤＣスコアを集合することによって生成された。各単一細胞ＡＤＣスコアは、膜中の色素の染色強度に基づいて各癌細胞について計算された。単一細胞ＡＤＣスコアはまた、場合により、各癌細胞の細胞質中の色素の染色強度に基づいてもよく、且つ単一細胞ＡＤＣスコアが計算された各癌細胞への所定の距離より近い他の癌細胞の膜及び細胞質中の色素の染色強度に基づいてもよい。癌細胞は、癌患者の組織試料のデジタル画像において検出された。組織試料は、組織試料中の癌細胞上のタンパク質に結合する診断抗体に連結された色素を使用して免疫組織化学的に染色された。
他の実施形態及び利点は、以下の詳細な説明に記載されている。この概要は、本発明を定義する趣旨ではない。本発明は、特許請求の範囲によって定義される。
添付の図面は、同様の符号が同様の構成要素を示す場合、本発明の実施形態を示す。
本発明は、癌患者が抗ＨＥＲ２抗体薬物複合体を使用する治療にどのように応答するかを示すスコアを計算するための新規な方法を提供する。本発明の別の態様は、ＡＤＣで治療された癌患者の生存確率を示す癌患者のスコアを計算する方法に関する。本発明の別の態様は、ＡＤＣに対する癌患者の応答を予測するための方法に関する。本発明の別の態様は、ＡＤＣに対して所定の応答を示す癌患者を同定することに関する。本発明の更に別の態様は、治療スコアが所定の閾値を超える場合、ＡＤＣを含む治療を投与することによって癌患者を治療する方法に関する。
Ｉ．定義
本発明の理解を促進するために、多数の用語及び表現が以下に定義される。「癌」という用語は、「腫瘍」という用語の意味と同じ意味を有するように使用される。
本発明の理解を促進するために、多数の用語及び表現が以下に定義される。「癌」という用語は、「腫瘍」という用語の意味と同じ意味を有するように使用される。
本発明において、「ＨＥＲ２」は、ヒト上皮増殖因子受容体２（ｎｅｕ又はＥｒｂＢ－２とも称され得る）と同義であり、ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ又はＥｒｂＢ－１）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ－３）、及びＨＥＲ４（ＥｒｂＢ－４）とともに受容体タンパク質チロシンキナーゼの上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）サブファミリーに属する膜貫通受容体である。ＨＥＲ２は、ＨＥＲ１、ＨＥＲ３、又はＨＥＲ４とのヘテロ二量体形成による細胞間チロシン残基の自己リン酸化によって活性化されることにより、正常細胞及び腫瘍細胞における細胞増殖、分化、及び生存に重要な役割を果たすことが知られている。本発明において、「ＨＥＲ２タンパク質」は、ＨＥＲ２と同じ意味で使用される。ＨＥＲ２タンパク質の発現は、免疫組織化学（ＩＨＣ）又は免疫蛍光（ＩＦ）等の当業者に周知の方法を用いて検出され得る。
図１は、ＨＥＲ２タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）を示す。配列番号１では、アミノ酸残基１～６５２からなるアミノ酸配列は、「ＨＥＲ２タンパク質の細胞外ドメイン」と呼ばれ、アミノ酸残基６５３～６７５からなるアミノ酸配列は、「ＨＥＲ２タンパク質の膜貫通ドメイン」と呼ばれ、アミノ酸残基６７６～１２５５からなるアミノ酸配列は、「ＨＥＲ２タンパク質の細胞間ドメイン」と呼ばれる。
本発明において、「抗ＨＥＲ２抗体」とは、ＨＥＲ２に特異的に結合する抗体を意味する。抗ＨＥＲ２抗体は、ＨＥＲ２に結合する活性を有し、それによってＨＥＲ２発現細胞に内在化され、ＨＥＲ２に結合する活性を示した後、抗体はＨＥＲ２発現細胞に移動する。抗ＨＥＲ２抗体は、腫瘍細胞を標的とし、腫瘍細胞に結合し、腫瘍細胞内に内在化し、腫瘍細胞に対して殺細胞活性を示し、リンカーを介して抗腫瘍活性を有する薬物とコンジュゲートして抗体薬物複合体を形成することができる。
図２は、抗ＨＥＲ２抗体の重鎖のアミノ酸配列（配列番号２）を示し、図３は、抗ＨＥＲ２抗体の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号３）を示す。
図４は、抗ＨＥＲ２抗体のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列（配列番号４）を示し、図５は、抗ＨＥＲ２抗体のＣＤＲＨ２のアミノ酸配列（配列番号５）を示し、図６は、抗ＨＥＲ２抗体のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列（配列番号６）を示す。
図７は、抗ＨＥＲ２抗体のＣＤＲＬ１のアミノ酸配列（配列番号７）を示し、図８は、抗ＨＥＲ２抗体のＣＤＲＬ２（ＳＡＳ）のアミノ酸配列（配列番号８）を示し、図９は、抗ＨＥＲ２抗体のＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（配列番号９）を示す。
図１０は、抗ＨＥＲ２抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１０）を示し、図１１は、抗ＨＥＲ２抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１１）を示す。図１２は、抗ＨＥＲ２抗体の別の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１２）を示す。
本発明で使用される抗ＨＥＲ２抗体薬物複合体の抗ＨＥＲ２抗体は、好ましくは、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１（配列番号２のアミノ酸残基２６～３３からなるアミノ酸配列）と、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２（配列番号２のアミノ酸残基５１～５８からなるアミノ酸配列）と、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３（配列番号２のアミノ酸残基９７～１０９からなるアミノ酸配列）とを含む重鎖と、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１（配列番号３のアミノ酸残基２７～３２からなるアミノ酸配列）と、配列番号８のアミノ酸残基１～３からなるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２（配列番号３のアミノ酸残基５０～５２からなるアミノ酸配列）と、配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３（配列番号３のアミノ酸残基８９～９７からなるアミノ酸配列）とを含む軽鎖とを含む抗体であり、より好ましくは、配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域（配列番号２のアミノ酸残基１～１２０からなるアミノ酸配列）と、配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域（配列番号３のアミノ酸残基１～１０７からなるアミノ酸配列）とを含む抗体であり、更により好ましくは、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖とを含む抗体、又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなる重鎖（配列番号２のアミノ酸残基１～４４９からなるアミノ酸配列）と、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖と、を含む抗体である。
本発明において、「ＨＥＲ２陽性」及び「ＨＥＲ２過剰発現」という用語は、免疫組織化学的方法でＨＥＲ２の発現について３＋のスコアが与えられた癌組織、並びに免疫組織化学的方法でＨＥＲ２の発現について２＋のスコアが与えられ、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法でＨＥＲ２の発現について陽性と判定される癌組織を指す。本発明のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法として、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ）、及びデュアルカラーｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法（ＤＩＳＨ）が挙げられる。
本発明において、「ＨＥＲ２陰性」とは、免疫組織化学的方法においてＨＥＲ２の発現が０のスコアが与えられた癌組織、免疫組織化学的方法においてＨＥＲ２の発現が１＋のスコアが与えられた癌、及び免疫組織化学的方法においてＨＥＲ２の発現が２＋のスコアが与えられ、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法においてＨＥＲ２の発現が陰性であると決定された癌組織を指す。
本発明において、「ＨＥＲ２－低」とは、免疫組織化学的方法においてＨＥＲ２の発現が０＋のスコア（平均＞０及び＜１＋）が与えられた癌組織、免疫組織化学的方法においてＨＥＲ２の発現が１＋のスコアが与えられた癌、及び免疫組織化学的方法においてＨＥＲ２の発現が２＋のスコアが与えられ、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法においてＨＥＲ２の発現が陰性であると決定された癌組織を指す。０＋として分類される組織は、非常に弱いがノイズのないＨＥＲ２発現を示す。
本発明において、「ＱＣＳ陽性」（ＱＣＳ＋）という用語は、抗ＨＥＲ２ ＡＤＣ治療に対する応答を示す可能性が高い癌を指す。「ＱＣＳ陰性」（ＱＣＳ－）という用語は、抗ＨＥＲ２ ＡＤＣ治療に対する応答を示す可能性が低い癌を指す。頭字語ＱＣＳは、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｓｃｏｒｅの略である。本発明の新規な予測方法の結果は、一般に、定量的連続スコアと呼ばれ、応答スコア、治療スコア又は予測される生存期間の指標であり得る。ＱＣＳスコアは、患者について得られた単一細胞ＡＤＣスコアの全てに対して統計的演算を行うことによって得られる。ＱＣＳスコアに所定の閾値を適用することにより、「ＱＣＳ陽性」患者と「ＱＣＳ陰性」患者とを識別する。癌患者をＱＣＳ陽性群及びＱＣＳ陰性群に層別化することにより、ＡＤＣを含む治療から利益を得る可能性が高いＱＣＳ＋患者の同定が可能になる。
ＩＩ．抗ＨＥＲ２抗体薬物複合体。
本発明において、抗ＨＥＲ２抗体薬物複合体のリンカー及び薬物からなる部分構造は、「薬物－リンカー」と呼ばれる。薬物－リンカーは、チオエーテル結合を介して抗ＨＥＲ２抗体にコンジュゲートされ得る。したがって、薬物－リンカーは、抗体の鎖間ジスルフィド結合部位（重鎖間の２つの部位及び重鎖と軽鎖との間の２つの部位）に形成されたチオール基（システイン残基の硫黄原子）に結合され得る。本発明で用いられる抗ＨＥＲ２抗体薬物複合体は、薬物－リンカーが下記式で表される抗ＨＥＲ２抗体薬物複合体であることが好ましく、
［式１］
式中、Ａは抗ＨＥＲ２抗体との接続位置を表す。
本発明において、抗ＨＥＲ２抗体薬物複合体のリンカー及び薬物からなる部分構造は、「薬物－リンカー」と呼ばれる。薬物－リンカーは、チオエーテル結合を介して抗ＨＥＲ２抗体にコンジュゲートされ得る。したがって、薬物－リンカーは、抗体の鎖間ジスルフィド結合部位（重鎖間の２つの部位及び重鎖と軽鎖との間の２つの部位）に形成されたチオール基（システイン残基の硫黄原子）に結合され得る。本発明で用いられる抗ＨＥＲ２抗体薬物複合体は、薬物－リンカーが下記式で表される抗ＨＥＲ２抗体薬物複合体であることが好ましく、
［式１］
本発明の薬物リンカーは、トポイソメラーゼＩ阻害剤であるエキサテカン（ＩＵＰＡＣ名：（１Ｓ，９Ｓ）－１－アミノ－９－エチル－５－フルオロ－１，２，３，９，１２，１５－ヘキサヒドロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０Ｈ，１３Ｈ－ベンゾ［デ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１０，１３－ジオン（化学名：（１Ｓ，９Ｓ）－１－アミノ－９－エチル－５－フルオロ－２，３－ジヒドロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［デ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１０，１３（９Ｈ，１５Ｈ）－ジオン）としても表される）を含む。エキサテカンは、抗体薬物複合体の細胞傷害性ペイロードであり、抗腫瘍効果を有する。エキサテカンは、下記式によって表されるカンプトテシン誘導体である。
［式２］
［式２］
本発明で使用される抗ＨＥＲ２抗体薬物複合体は、好ましくは、ＤＳ－８２０１としても知られるトラスツズマブデルクステカンである。本発明で使用される抗ＨＥＲ２抗体薬物複合体は、以下の式で表され得る。
［式３］
［式３］
角括弧内に示される薬物－リンカーは、チオエーテル結合を介して抗ＨＥＲ２抗体にコンジュゲートされる。ｎの意味は、いわゆるコンジュゲートした薬物分子の平均数（薬物対コンジュゲート比ＤＡＲ）の意味と同じであり、１つの抗体分子当たりのコンジュゲートした薬物－リンカーの単位の平均数を示す。
本発明で使用される抗ＨＥＲ２抗体薬物複合体における抗体１分子当たりの薬物－リンカーコンジュゲートの平均単位数は、好ましくは２～８、より好ましくは３～８、更に好ましくは７～８、更により好ましくは約８である。
図１３は、「ＤＬ」と命名された８つの薬物－リンカー単位を有する抗ＨＥＲ２抗体薬物複合体であるトラスツズマブデルクステカン（ＤＳ－８２０１）を示す。図１３に示されるトラスツズマブデルクステカンのトラスツズマブ部分はヒト化抗ＨＥＲ２ ＩｇＧ１ ｍＡｂであり、ＩｇＧ１は抗ＨＥＲ２抗体のアイソタイプを示す。
本発明で使用される抗ＨＥＲ２抗体薬物複合体は、癌細胞への細胞内在化を受けた後、リンカー部分で切断され、以下の式で表される化合物を放出する。
［式４］
［式４］
上に示す化合物は、本発明で用いられる抗ＨＥＲ２抗体薬物複合体の抗腫瘍活性の主要な供給源であり、トポイソメラーゼＩ阻害作用を有する。
本発明で用いられる抗ＨＥＲ２抗体薬物複合体はまた、抗ＨＥＲ２抗体薬物複合体が標的タンパク質ＨＥＲ２を発現する癌細胞に内在化し、次いで、上記化合物は、標的タンパク質ＨＥＲ２を発現しない隣接癌細胞に対しても抗腫瘍効果を発揮するバイスタンダー効果を有する。
ＩＩＩ．抗ＨＥＲ２抗体の産生。
本発明で使用される抗ＨＥＲ２抗体薬物複合体は、国際公開第２０１５／１１５０９１号パンフレットに開示されているように製造され得る。
本発明で使用される抗ＨＥＲ２抗体薬物複合体は、国際公開第２０１５／１１５０９１号パンフレットに開示されているように製造され得る。
本発明で用いられる抗ＨＥＲ２抗体は、ＨＥＲ２から選択される任意のポリペプチドを抗原又はＨＥＲ２のアミノ酸配列として動物に免疫し、インビボで産生された抗体を回収した後、抗体を精製することにより得ることができる。この抗原の起源は、ヒトに限定されず、動物を、マウス、ラット、及び同類のもの等の非ヒト動物に由来する抗原で免疫化し得る。この場合には、得られた異種抗原に結合する抗体と、ヒト抗原との交差反応性を試験して、ヒト疾患に適用可能な抗ＨＥＲ２抗体に関してスクリーニングし得る。
或いは、抗原に対する抗体を産生する抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを確立し、そこからモノクローナル抗体が得られる。
抗原は、抗原タンパク質をコードする遺伝子を産生させるように宿主細胞を遺伝子操作することによって得ることができる。具体的には、抗原遺伝子の発現を可能にするベクターを調製し、宿主細胞に導入して、この遺伝子を発現させる。そのようにして発現された抗原は、精製され得る。抗体は、上記の遺伝子操作された抗原発現細胞又は抗原を発現する細胞株で動物に免疫付与する方法によっても得ることができる。
本発明で使用される抗ＨＥＲ２抗体は、キメラ抗体又はヒト化抗体等のヒトに対する異種抗原性を低下させる目的で人工的に修飾された組換え抗体であるか、又はヒト由来の抗体、すなわちヒト抗体の遺伝子配列のみを有する抗体である。キメラ抗体としては、抗体の可変領域及び定常領域が異なる種に由来する抗体、例えばマウス由来又はラット由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に接合したキメラ抗体を例に挙げることができる。
ヒト化抗体について、抗体は、異種抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）のみをヒト由来抗体に組み込むことにとって得られるか、又は抗体は、ＣＤＲグラフティング法により、異種抗体のフレームワークのアミノ酸残基の一部及び異種抗体のＣＤＲ配列をヒト抗体に移植することによって得られるか（国際公開第９０／０７８６１号パンフレット）、又は抗体は、遺伝子変換突然変異誘発戦略を用いてヒト化される（米国特許第５８２１３３７号明細書）。
ヒト抗体について、抗体は、ヒト抗体の重鎖及び軽鎖の遺伝子を含むヒト染色体断片を有するヒト抗体産生マウスを用いて作製される。代替として、抗体はファージディスプレイによって得られ、抗体はヒト抗体ライブラリから選択される。
本発明では、抗ＨＥＲ２抗体の修飾された変異体を用いることもできる。修飾された変異体は、本発明による抗体を化学的又は生物学的修飾に供することによって得られる変異体を指す。化学修飾された変異体の例は、化学部分とアミノ酸骨格との連結を含む変異体、化学部分とＮ連結又はＯ連結した糖鎖との連結を含む変異体を含む。生物学的に修飾された変異体の例は、翻訳後修飾（例えば、Ｎ結合型又はＯ結合型のグリコシル化、Ｎ末端又はＣ末端のプロセシング、脱アミド化、アスパラギン酸の異性化、又はメチオニンの酸化）により得られた変異体、原核生物の宿主細胞で発現させることによりＮ末端にメチオニン残基が付加された変異体を含む。また、本発明で使用される抗ＨＥＲ２抗体又は抗原を検出又は単離可能に標識された抗体、例えば、酵素標識抗体、蛍光標識抗体、及び親和性標識抗体も修飾変異体の意味に含まれる。本発明で使用される抗ＨＥＲ２抗体のこのような修飾変異体は、抗体の安定性及び血中滞留性の向上、それらの抗原性の低減、並びに抗体又は抗原の検出又は単離に有用である。
また、本発明で用いられる抗ＨＥＲ２抗体に連結するグリカン（グリコシル化、脱フコシル化等）の修飾を制御することにより、抗体依存性細胞傷害活性を高めることができる。抗体のグリカンの修飾を調節するための技術は、国際公開第９９／５４３４２号パンフレット、国際公開第００／６１７３９号パンフレット及び国際公開第０２／３１１４０号パンフレットに開示されている。しかしながら、技術はこれらに限定されない。本発明の抗ＨＥＲ２抗体として、グリカンの修飾が制御された抗体を用いることもできる。
培養された哺乳動物細胞中で産生された抗体の重鎖のカルボキシル末端におけるリジン残基が欠失されることは知られており、培養された哺乳動物細胞中で産生された抗体の重鎖のカルボキシル末端における２つのアミノ酸残基（グリシン及びリジン）が欠失され、新たにカルボキシル末端に位置するプロリン残基がアミド化されることも知られている。しかしながら、重鎖のそのような欠失及び修飾は、本抗体の抗原結合親和性及びエフェクター機能（補体の活性化、抗体依存性細胞毒性等）に影響を及ぼさない。従って、本発明で使用される抗ＨＥＲ２抗体には、こうした修飾を受けた抗体及び抗体の機能的フラグメントも含まれ、また、重鎖のカルボキシル末端において１又は２のアミノ酸が欠失した欠失変異体、欠失変異体のアミド化によって得られる変異体（例えば、カルボキシル末端のプロリン残基がアミド化された重鎖）等も含まれる。本発明で使用される抗ＨＥＲ２抗体の重鎖のカルボキシル末端で欠失を有する欠失変異体の種類は、抗原結合親和性及びエフェクター機能が保存されている限り、上記の変異体に限定されない。本発明で使用される抗ＨＥＲ２抗体を構成する２つの重鎖は、完全長重鎖及び上記欠失変異体からなる群から選択される１種類であってもよいし、それらから選択される２種類を組み合わせたものであってもよい。各欠失変異体の量の比は、本発明で使用される抗ＨＥＲ２抗体を産生する培養哺乳動物細胞の種類及び培養条件によって影響され得る。しかしながら、本発明では、抗ＨＥＲ２抗体の２つの重鎖の両方においてカルボキシル末端の１つのアミノ酸残基が欠失した抗体も用いることができる。
ＩＶ．抗ＨＥＲ２抗体薬物複合体の製造。
本発明の抗ＨＥＲ２抗体薬物複合体の製造に用いることができる薬物－リンカー中間体は、下記式で表される。
［式５］
本発明の抗ＨＥＲ２抗体薬物複合体の製造に用いることができる薬物－リンカー中間体は、下記式で表される。
［式５］
薬物－リンカー中間体は、化学名Ｎ－［６－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ヘキサノイル］グリシルグリシル－Ｌ－フェニルアラニル－Ｎ－［（２－｛［（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル］アミノ｝－２－オキソエトキシ）メチル］グリシンアミドとして表すことができ、国際公開第２０１５／１１５０９１号パンフレットの開示に基づいて製造することができる。本発明で用いられる抗ＨＥＲ２抗体薬物複合体は、上記の薬物－リンカー中間体を、チオール基（或いはスルフヒドリル基ともいう）を有する抗ＨＥＲ２抗体と反応させることにより製造することができる。
スルフヒドリル基を有する抗ＨＥＲ２抗体は、当業者に周知の方法により得ることができる。例えば、抗体中の鎖間ジスルフィド当たり０．３～３モル当量のトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンヒドロクロリド（ＴＣＥＰ）等の還元剤を使用し、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤を含有する緩衝液中で抗ＨＥＲ２抗体と反応させることにより、抗体中に部分的又は完全に還元された鎖間ジスルフィドを含むスルフヒドリル基を有する抗ＨＥＲ２抗体を得ることができる。
更に、スルフヒドリル基を有する抗ＨＥＲ２抗体当たり２～２０モル当量の薬物－リンカー中間体を使用することにより、抗体分子当たり２～８の薬物分子がコンジュゲートされた抗ＨＥＲ２抗体薬物複合体が産生され得る。
産生された抗ＨＥＲ２抗体薬物複合体の抗体分子当たりのコンジュゲートされた薬物分子の平均数は、例えば、２８０ｎｍ及び３７０ｎｍの２つの波長における抗ＨＥＲ２抗体薬物複合体及びそのコンジュゲーション前駆体のＵＶ吸光度を測定することに基づき算出する方法（ＵＶ法）又は抗体薬物複合体を還元剤で処理することにより得られたフラグメントをＨＰＬＣ測定によって定量することに基づき計算する方法（ＨＰＬＣ法）によって求めることができる。
抗ＨＥＲ２抗体と薬物－リンカー中間体とのコンジュゲーション、及び抗ＨＥＲ２抗体薬物複合体の抗体分子当たりのコンジュゲートされた薬物分子の平均数の計算は、国際公開第２０１５／１１５０９１号パンフレットの開示に従って行うことができる。
Ｖ．抗ＨＥＲ２抗体薬物複合体の使用。
本発明の抗体薬物複合体は、癌細胞の増殖を遅延させ、その増殖を抑制し、更に癌細胞を破壊することができる。これらの作用により、癌による症状の緩和、癌患者の生活の質（ＱＯＬ）の向上、癌患者の生命の維持が達成され、治療効果が得られる。癌細胞の破壊に至らない場合であっても、癌細胞の増殖を抑制又は制御することにより、癌患者のより長期の生存を達成するとともに、より高いＱＯＬを達成することができる。
本発明の抗体薬物複合体は、癌細胞の増殖を遅延させ、その増殖を抑制し、更に癌細胞を破壊することができる。これらの作用により、癌による症状の緩和、癌患者の生活の質（ＱＯＬ）の向上、癌患者の生命の維持が達成され、治療効果が得られる。癌細胞の破壊に至らない場合であっても、癌細胞の増殖を抑制又は制御することにより、癌患者のより長期の生存を達成するとともに、より高いＱＯＬを達成することができる。
本発明の抗体薬物複合体は、患者への全身治療としての適用、更には癌組織への局所適用による治療効果を発揮することが期待され得る。
抗体薬物複合体は、１つ以上の薬学的に適合性の成分が含有された医薬組成物として投与され得る。薬学的に適合する成分は、抗ＨＥＲ２抗体薬物複合体の投与量、投与濃度等を考慮して、当該技術分野で一般的に用いられている製剤添加剤等から適宜選択することができる。例えば、本発明で使用される抗ＨＥＲ２抗体薬物複合体は、ヒスチジン緩衝剤等の緩衝剤、スクロース等の賦形剤、及びポリソルベート８０等の界面活性剤を含む医薬組成物として投与され得る。本発明で使用される抗ＨＥＲ２抗体薬物複合体を含む医薬組成物は、注射剤として、水性注射剤若しくは凍結乾燥注射剤として、又は更に凍結乾燥注射剤として使用することができる。
本発明で使用される抗ＨＥＲ２抗体薬物複合体を含有する医薬組成物が水性注射剤である場合、それを適切な希釈剤で希釈し、次いで静脈内注入として与えることができる。希釈剤の例は、デキストロース溶液及び生理食塩水を含み得る。
本発明で使用される抗ＨＥＲ２抗体薬物複合体を含有する医薬組成物が凍結乾燥注射剤である場合、それを注射グレードの水で溶解し、次いで適切な希釈剤で必要な量に希釈し、次いで静脈内注入として与えることができる。希釈剤の例は、デキストロース溶液及び生理食塩水を含む。
本発明の医薬組成物を投与するために用いられうる投与経路の例は、静脈内、皮内、皮下、筋肉内、及び腹腔内の経路を含み得る。
本発明で使用される抗ＨＥＲ２抗体薬物複合体は、ヒトに１～１８０日間隔で投与することができ、数週間間隔で投与することができ、好ましくは３週間間隔で投与することができる。本発明で使用される抗ＨＥＲ２抗体薬物複合体を、１回の投与当たり約０．００１～１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与し得、好ましくは、１回の投与当たり０．８～１２．４ｍｇ／ｋｇの用量で投与し得る。抗ＨＥＲ２抗体薬物複合体は、好ましくは０．８ｍｇ／ｋｇ～８ｍｇ／ｋｇの用量で３週間に１回投与され得、より好ましくは３週間に１回の用量で５．４ｍｇ／ｋｇ～６．４ｍｇ／ｋｇで投与される。
ＶＩ．抗ＨＥＲ２抗体薬物複合体に対する患者応答を予測する方法。
図１４は、分析システムが癌患者からの組織のデジタル画像を分析し、癌患者が抗ＨＥＲ２抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を含む治療にどのように応答する可能性が高いかを予測する方法７の工程１～６のフローチャートである。一実施形態では、本方法は、乳癌、胃癌、結腸直腸癌、肺癌、食道癌、頭頸部癌、食道胃接合部癌、胆道癌、パジェット病、膵臓癌、卵巣癌、子宮癌肉腫、膀胱癌、前立腺癌、尿路上皮癌、消化管間質腫瘍、子宮頸部癌、扁平上皮癌、腹膜癌、肝臓癌、肝細胞癌、子宮内膜癌、腎臓癌、外陰癌、甲状腺癌、陰茎癌、白血病、悪性リンパ腫、形質細胞腫、骨髄腫、多形性神経膠芽腫、肉腫、骨肉腫、及び黒色腫からなる群から選択される癌を有する患者のＡＤＣに対する応答を予測する。一実施形態では、方法は、乳癌、胃癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、食道癌、頭頸部癌、食道胃接合部腺癌、胆道癌、パジェット病、膵臓癌、卵巣癌、子宮癌肉腫、膀胱癌、及び前立腺癌からなる群から選択される癌を有する患者のＡＤＣに対する応答を予測する。一実施形態では、方法は、乳癌患者のＡＤＣに対する応答を予測する。別の実施形態では、方法は、胃癌患者のＡＤＣ応答を予測する。更に別の実施形態では、方法は、肺癌患者のＡＤＣ応答を予測する。
図１４は、分析システムが癌患者からの組織のデジタル画像を分析し、癌患者が抗ＨＥＲ２抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を含む治療にどのように応答する可能性が高いかを予測する方法７の工程１～６のフローチャートである。一実施形態では、本方法は、乳癌、胃癌、結腸直腸癌、肺癌、食道癌、頭頸部癌、食道胃接合部癌、胆道癌、パジェット病、膵臓癌、卵巣癌、子宮癌肉腫、膀胱癌、前立腺癌、尿路上皮癌、消化管間質腫瘍、子宮頸部癌、扁平上皮癌、腹膜癌、肝臓癌、肝細胞癌、子宮内膜癌、腎臓癌、外陰癌、甲状腺癌、陰茎癌、白血病、悪性リンパ腫、形質細胞腫、骨髄腫、多形性神経膠芽腫、肉腫、骨肉腫、及び黒色腫からなる群から選択される癌を有する患者のＡＤＣに対する応答を予測する。一実施形態では、方法は、乳癌、胃癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、食道癌、頭頸部癌、食道胃接合部腺癌、胆道癌、パジェット病、膵臓癌、卵巣癌、子宮癌肉腫、膀胱癌、及び前立腺癌からなる群から選択される癌を有する患者のＡＤＣに対する応答を予測する。一実施形態では、方法は、乳癌患者のＡＤＣに対する応答を予測する。別の実施形態では、方法は、胃癌患者のＡＤＣ応答を予測する。更に別の実施形態では、方法は、肺癌患者のＡＤＣ応答を予測する。
第１の工程１では、１つ以上のバイオマーカ又は染色を使用して染色された癌患者からの組織切片の高解像度デジタル画像が取得される。
ＡＤＣ治療の有効性を予測するために、ＡＤＣ治療によって標的化されるのと同じタンパク質を標的化する色素が結合した診断バイオマーカが使用される。一実施形態では、抗ＨＥＲ２ ＡＤＣは、チオエーテル結合を介して薬物－リンカーにコンジュゲートした抗ＨＥＲ２抗体を含み、薬物－リンカーは以下の式によって表され、
［式１］
式中、Ａは抗ＨＥＲ２抗体との接続位置を表す。いくつかの実施形態において、抗ＨＥＲ２抗体は、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１と、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２と、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３とを含む重鎖と、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１と、配列番号８のアミノ酸残基１～３からなるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２と、配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３とを含む軽鎖と、を有する抗体である。
［式１］
いくつかの更なる実施形態において、抗ＨＥＲ２抗体は、配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含む抗体である。いくつかの更なる実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体は、配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖とを含む抗体である。特定の実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖とを含む抗体である。一実施形態において、スコアリングが対象とする抗ＨＥＲ２ＡＤＣは、上記の式３によって表されるように、トラスツズマブデルクステカンである。したがって、実施形態では、診断バイオマーカはＨＥＲ２タンパク質も標的とする。
工程２では、予め訓練された畳み込みニューラルネットワークが、３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）等の色素に連結された診断抗体で染色された癌患者の組織のデジタル画像を処理する。癌細胞の膜における色素の染色強度は、対応するセグメント化された膜オブジェクトに関連する全てのピクセルの色素の平均染色強度に基づいて決定される。更に、単一のピクセルにおける色素の染色強度は、ピクセルの赤色成分、緑色成分及び青色成分に基づいて計算される。画像解析処理の結果は、デジタル画像内の各ピクセルについて、ピクセルが細胞核に属する確率及びピクセルが細胞膜に属する確率を表す２つの後方画像層である。
工程２の別の実施形態では、２つの予め訓練された畳み込みネットワークが組織のデジタル画像を処理する。第１のネットワークによる処理の結果は、デジタル画像内の各ピクセルについて、ピクセルが細胞核に属する尤度を表す後方画像層である。第２のネットワークによる処理の結果は、デジタル画像内の各ピクセルについて、ピクセルが細胞膜に属する尤度を表す後方画像層である。
工程３では、核及び膜の後層のヒューリスティック画像解析に基づいて個々の癌細胞が検出される。細胞膜オブジェクト及び任意選択で細胞質オブジェクトも含む癌細胞オブジェクトが生成される。
工程４では、各癌細胞について単一細胞ＡＤＣスコアが決定される。単一細胞ＡＤＣスコアは、（１）細胞膜中のＤＡＢの量、及び（２）ＡＤＣペイロード取込み量の代用測定に基づく。ＤＡＢの量は、膜のピクセルにおける褐色ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）シグナルの平均光学密度に基づく各膜の染色強度によって決定される。ＡＤＣペイロード取込みの量は、細胞膜中及び任意選択でまた細胞の細胞質中のＤＡＢの量に基づいて、更に任意選択でまた、スコアが決定される細胞に隣接する細胞の膜及び細胞質中のＤＡＢの量に基づいて推定される。細胞の細胞質中のＤＡＢの量は、各細胞質の染色強度によって決定され、これは細胞質のピクセルにおける褐色ＤＡＢシグナルの平均光学密度に基づいて計算される。隣接細胞中のＤＡＢの量は、スコアが決定されている細胞の所定の距離内のそれらの癌細胞について決定される。
工程５において、デジタル画像内の全ての癌細胞の単一細胞ＡＤＣスコアに対する統計的演算に基づいて、組織のデジタル画像について患者スコアＱＣＳが計算される。患者スコアは、癌患者が抗ＨＥＲ２ ＡＤＣを含む治療にどのように応答するかを示す。工程４の単一細胞ＡＤＣスコア及び工程５の統計的演算のタイプのパラメータは、ＡＤＣ治療に対する既知の応答を有する患者の訓練コホートを使用して最適化される。最適化目標は、訓練コホートにおけるスコア陽性患者対スコア陰性患者の群のカプラン・マイヤー解析における低いｐ－値である。
工程６において、スコアが所定の閾値よりも大きい場合、抗ＨＥＲ２ ＡＤＣを含む治療がスコア陽性患者に推奨される。
いくつかの実施形態では、腫瘍細胞の少なくとも９０％が５以上の膜光学密度を有する場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞の少なくとも９０％が６以上の膜光学密度を有する場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞の少なくとも９０％が７以上の膜光学密度を有する場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞の少なくとも９０％が８以上の膜光学密度を有する場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞の少なくとも９０％が８．４以上の膜光学密度を有する場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞の少なくとも９０％が９以上の膜光学密度を有する場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞の少なくとも９０％が１０以上の膜光学密度を有する場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞の少なくとも９０％が１５以上の膜光学密度を有する場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞の少なくとも９０％が２０以上の膜光学密度を有する場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞の少なくとも９０％が２５以上の膜光学密度を有する場合、患者はＱＣＳ陽性である。
いくつかの実施形態において、腫瘍細胞の少なくとも５０％が５以上、８以上、又は２５以上の膜光学密度を有する場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞の少なくとも５０％が８以上の膜光学密度を有する場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態において、腫瘍細胞の少なくとも６０％が５以上、８以上、又は２５以上の膜光学密度を有する場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞の少なくとも６０％が８以上の膜光学密度を有する場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態において、腫瘍細胞の少なくとも７０％が５以上、８以上、又は２５以上の膜光学密度を有する場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞の少なくとも７０％が８以上の膜光学密度を有する場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態において、腫瘍細胞の少なくとも８０％が５以上、８以上、又は２５以上の膜光学密度を有する場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞の少なくとも８０％が８以上の膜光学密度を有する場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態において、腫瘍細胞の少なくとも９０％が５以上、８以上、又は２５以上の膜光学密度を有する場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞の少なくとも９０％が８以上の膜光学密度を有する場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態において、腫瘍細胞の少なくとも９５％が５以上、８以上、又は２５以上の膜光学密度を有する場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞の少なくとも９５％が８以上の膜光学密度を有する場合、患者はＱＣＳ陽性である。
いくつかの実施形態では、腫瘍面積内の少なくとも８の膜光学密度を有する腫瘍細胞の密度が５００細胞／ｍｍ２以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、腫瘍面積内の少なくとも８の膜光学密度を有する腫瘍細胞の密度が１０００細胞／ｍｍ２以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、腫瘍面積内の少なくとも８の膜光学密度を有する腫瘍細胞の密度が１２５０細胞／ｍｍ２以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、腫瘍面積内の少なくとも８の膜光学密度を有する腫瘍細胞の密度が１５００細胞／ｍｍ２以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、腫瘍面積内の少なくとも８の膜光学密度を有する腫瘍細胞の密度が１６００細胞／ｍｍ２以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、腫瘍面積内の少なくとも８の膜光学密度を有する腫瘍細胞の密度が１６７０細胞／ｍｍ２以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、腫瘍面積内の少なくとも８の膜光学密度を有する腫瘍細胞の密度が１７００細胞／ｍｍ２以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、腫瘍面積内の少なくとも８の膜光学密度を有する腫瘍細胞の密度が１８００細胞／ｍｍ２以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、腫瘍面積内の少なくとも８の膜光学密度を有する腫瘍細胞の密度が１９００細胞／ｍｍ２以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、腫瘍面積内の少なくとも８の膜光学密度を有する腫瘍細胞の密度が２０００細胞／ｍｍ２以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、腫瘍面積内の少なくとも８の膜光学密度を有する腫瘍細胞の密度が３０００細胞／ｍｍ２以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。
いくつかの実施形態では、腫瘍面積内の少なくとも２０の膜光学密度を有する腫瘍細胞の密度が５００細胞／ｍｍ２以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、腫瘍面積内の少なくとも２０の膜光学密度を有する腫瘍細胞の密度が１０００細胞／ｍｍ２以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、腫瘍面積内の少なくとも２０の膜光学密度を有する腫瘍細胞の密度が１５００細胞／ｍｍ２以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、腫瘍面積内の少なくとも２０の膜光学密度を有する腫瘍細胞の密度が２０００細胞／ｍｍ２以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、腫瘍面積内の少なくとも２０の膜光学密度を有する腫瘍細胞の密度が２５００細胞／ｍｍ２以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、腫瘍面積内の少なくとも２０の膜光学密度を有する腫瘍細胞の密度が２７５０細胞／ｍｍ２以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、腫瘍面積内の少なくとも２０の膜光学密度を有する腫瘍細胞の密度が３０００細胞／ｍｍ２以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、腫瘍面積内の少なくとも２０の膜光学密度を有する腫瘍細胞の密度が３２５０細胞／ｍｍ２以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、腫瘍面積内の少なくとも２０の膜光学密度を有する腫瘍細胞の密度が３５００細胞／ｍｍ２以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、腫瘍面積内の少なくとも２０の膜光学密度を有する腫瘍細胞の密度が４０００細胞／ｍｍ２以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、腫瘍面積内の少なくとも２０の膜光学密度を有する腫瘍細胞の密度が５０００細胞／ｍｍ２以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。
いくつかの実施形態では、バイナリ空間近接スコアが９０以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、バイナリ空間近接スコアが９１以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、バイナリ空間近接スコアが９２以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、バイナリ空間近接スコアが９３以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、バイナリ空間近接スコアが９４以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、バイナリ空間近接スコアが９５以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、バイナリ空間近接スコアが９６以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、バイナリ空間近接スコアが９７以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、バイナリ空間近接スコアが９８以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、バイナリ空間近接スコアが９９以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、バイナリ空間近接スコアが９９．５以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、バイナリ空間近接スコアが９９．８以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。上記の実施形態では、バイナリ空間近接スコアは、以下のように計算される。空間近接スコア＝（［ＯＤ＞８の腫瘍細胞の数］＋［ＯＤ＞８の少なくとも１つの腫瘍細胞の５０μｍ近傍にあるＯＤ＜＝８の腫瘍細胞の数］）／［全腫瘍細胞の数］。
いくつかの実施形態において、連続的な空間近接スコアが２０以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態において、連続的な空間近接スコアが３０以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態において、連続的な空間近接スコアが４０以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態において、連続的な空間近接スコアが５０以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態において、連続的な空間近接スコアが６０以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態において、連続的な空間近接スコアが７０以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態において、連続的な空間近接スコアが８０以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態において、連続的な空間近接スコアが９０以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。上記の実施形態では、連続的な空間近接スコアは、隣接の距離によって重み付けされた、２５μｍ以内の各腫瘍細胞及び任意の隣接腫瘍細胞の累積光学密度の１０％分位点である。
いくつかの実施形態では、間質中の腫瘍浸潤リンパ球の密度が５０細胞／ｍｍ２以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、間質中の腫瘍浸潤リンパ球の密度が１００細胞／ｍｍ２以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、間質中の腫瘍浸潤リンパ球の密度が１２５細胞／ｍｍ２以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、間質中の腫瘍浸潤リンパ球の密度が１５０細胞／ｍｍ２以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、間質中の腫瘍浸潤リンパ球の密度が１６０細胞／ｍｍ２以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、間質中の腫瘍浸潤リンパ球の密度が１６５細胞／ｍｍ２以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、間質中の腫瘍浸潤リンパ球の密度が１６８細胞／ｍｍ２以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、間質中の腫瘍浸潤リンパ球の密度が１７０細胞／ｍｍ２以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、間質中の腫瘍浸潤リンパ球の密度が１７５細胞／ｍｍ２以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、間質中の腫瘍浸潤リンパ球の密度が１８０細胞／ｍｍ２以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、間質中の腫瘍浸潤リンパ球の密度が１９０細胞／ｍｍ２以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、間質中の腫瘍浸潤リンパ球の密度が２００細胞／ｍｍ２以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。
いくつかの実施形態では、間質中の腫瘍浸潤リンパ球の密度が３００細胞／ｍｍ２以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、間質中の腫瘍浸潤リンパ球の密度が４００細胞／ｍｍ２以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、間質中の腫瘍浸潤リンパ球の密度が５００細胞／ｍｍ２以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、間質中の腫瘍浸潤リンパ球の密度が６００細胞／ｍｍ２以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、間質中の腫瘍浸潤リンパ球の密度が７００細胞／ｍｍ２以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、間質中の腫瘍浸潤リンパ球の密度が７３５細胞／ｍｍ２以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、間質中の腫瘍浸潤リンパ球の密度が７５０細胞／ｍｍ２以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。
いくつかの実施形態では、間質中の腫瘍浸潤リンパ球の密度が８００細胞／ｍｍ２以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、間質中の腫瘍浸潤リンパ球の密度が９００細胞／ｍｍ２以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、間質中の腫瘍浸潤リンパ球の密度が１０００細胞／ｍｍ２以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、間質中の腫瘍浸潤リンパ球の密度が２０００細胞／ｍｍ２以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、間質中の腫瘍浸潤リンパ球の密度が３０００細胞／ｍｍ２以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、間質中の腫瘍浸潤リンパ球の密度が４０００細胞／ｍｍ２以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、間質中の腫瘍浸潤リンパ球の密度が５０００細胞／ｍｍ２以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。
いくつかの実施形態では、ａ）腫瘍細胞の少なくとも９０％が８．４以上の膜光学密度を有する場合、及びｂ）腫瘍面積内の少なくとも２０の膜光学密度を有する腫瘍細胞の密度が３０００細胞／ｍｍ２以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態では、ａ）腫瘍細胞の少なくとも９０％が８．４以上の膜光学密度を有する場合、及びｂ）バイナリ空間近接スコアが９９．８以上である場合、患者はスコア陽性である。いくつかの実施形態では、ａ）腫瘍細胞の少なくとも９０％が８．４以上の膜光学密度を有する場合、及びｂ）連続空間近接スコアが５０以上である場合、患者はスコア陽性である。いくつかの実施形態では、ａ）腫瘍細胞の少なくとも９０％が８．４以上の膜光学密度を有する場合、及びｂ）間質中の腫瘍浸潤リンパ球の密度が７３５細胞／ｍｍ２以上である場合、患者はスコア陽性である。
いくつかの実施形態において、患者は、ａ）腫瘍細胞の少なくとも９０％が８．４以上の膜光学密度を有する場合；ｂ）腫瘍領域内の少なくとも２０の膜光学密度を有する腫瘍細胞の密度が３０００細胞／ｍｍ２以上である場合；及びｃ）バイナリ空間近接スコアが９９．８以上である場合、又は連続空間近接スコアが５０以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態において、患者は、ａ）腫瘍細胞の少なくとも９０％が８．４以上の膜光学密度を有する場合；ｂ）腫瘍領域内の少なくとも２０の膜光学密度を有する腫瘍細胞の密度が３０００細胞／ｍｍ２以上である場合；ｃ）バイナリ空間近接スコアが９９．８以上である場合；及びｄ）連続空間近接スコアが５０以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態において、ａ）腫瘍細胞の少なくとも９０％が８．４以上の膜光学密度を有する場合；ｂ）腫瘍領域内の少なくとも２０の膜光学密度を有する腫瘍細胞の密度が３０００細胞／ｍｍ２以上である場合；ｃ）バイナリ空間近接スコアが９９．８以上である場合、又は連続空間近接スコアが５０以上である場合；及びｄ）間質中の腫瘍浸潤リンパ球の密度が７３５細胞／ｍｍ２以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。いくつかの実施形態において、ａ）腫瘍細胞の少なくとも９０％が８．４以上の膜光学密度を有する場合；ｂ）腫瘍領域内の少なくとも２０の膜光学密度を有する腫瘍細胞の密度が３０００細胞／ｍｍ２以上である場合；ｃ）バイナリ空間近接スコアが９９．８以上である場合；ｅ）連続空間近接スコアが５０以上である場合；及びｄ）間質中の腫瘍浸潤リンパ球の密度が７３５細胞／ｍｍ２以上である場合、患者はＱＣＳ陽性である。
ＶＩＩ．予測及びスコアリング方法の例。
Ａ．染色された組織の画像分析。
ここで、染色された癌組織の特定の画像に関連して、図１４の方法を説明する。
Ａ．染色された組織の画像分析。
ここで、染色された癌組織の特定の画像に関連して、図１４の方法を説明する。
工程１では、組織試料中の癌細胞上の関連タンパク質に結合する診断抗体に連結された色素を用いて、組織試料を免疫組織化学的に染色する。図１５（左上画像）は、工程１で取得された染色組織の一部のデジタル画像１７である。画像１７は、色素に連結された抗Ｈｅｒ２診断抗体で免疫組織化学的に染色された癌患者からの組織を示す。この実施例では、診断抗体は、タンパク質ＨＥＲ２を標的とするＶｅｎｔａｎａ ＰＡＴＨｗａｙ抗ＨＥＲ－２／ｎｅｕ（４Ｂ５）ウサギモノクローナル一次抗体である。他の例では、診断抗体は、タンパク質ＨＥＲ２も標的とするウサギ抗ヒト抗体であるＤａｋｏ ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ一次抗体であり得る。抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体は、３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）染色が組織試料中のタンパク質Ｈｅｒ２／ｎｅｕの位置を示すように、膜タンパク質Ｈｅｒ２／ｎｅｕに結合する。
工程２では、デジタル画像１７に対して画像解析を行って、畳み込みニューラルネットワークを用いて癌細胞の核及び膜の後方画像層を生成する。画像解析は、核、膜及び細胞質等の癌細胞及びそれらの成分を検出するために使用される。図１５は、工程２の画像解析処理を示す。畳み込みニューラルネットワークは、デジタル画像１７の各ピクセルについて、各ピクセルが細胞の核（図１５右上画像）又は膜（図１５左下画像）のいずれかに属する確率を示す後層（グレー値画像）を生成する。高い確率は黒で、低い確率は白で示されている。
図１６は、工程２の画像解析を実行する方法の別の実施形態を示す。畳み込みニューラルネットワークは、ピクセルごとに、核までの距離（図１６右上画像）又は膜までの距離（図１６左下画像）を示す回帰層（グレー値画像）を生成する。大きい距離は白色で示され、小さい距離は黒色で示されている。図１５と図１６との比較は、図１６の実施形態の画像解析が、図１５の実施形態よりも厚い膜オブジェクトを生成するが、より小さい核オブジェクトを生成することを示す。
一実施形態では、畳み込みニューラルネットワークは、入力画像１７から非常に低い空間サイズ（１～１６ピクセル）を有するボトルネック層に向かう一連の畳み込み層と、入力画像１７と同じサイズを有する後層に向かう一連の逆畳み込み層とを含む。このネットワークアーキテクチャは、Ｕ－Ｎｅｔと呼ばれる。畳み込みニューラルネットワークの重みの訓練は、複数の訓練画像内の核及び膜の手動アノテーション層を生成し、次いで、生成された後層が手動で生成されたアノテーション層に最も類似するようにネットワーク重みを最適化アルゴリズムによって調整することによって実行される。
別の実施形態では、核及び膜のアノテーション層は、複数の訓練画像において自動的に生成され、手動で補正される。上皮領域及び核中心は、それぞれ領域及び点として手動でアノテーションされる。各訓練画像について、膜分割は、アノテーション核中心によって播種され、アノテーション上皮領域の範囲によって制約された領域成長様アルゴリズム（例えば、ウォーターシェッドセグメンテーション）を適用することによって自動的に生成される。訓練画像が与えられると、核セグメント化は、ブロブ検出アルゴリズム（例えば、最大安定極値領域ＭＳＥＲアルゴリズムによって）を適用し、アノテーション核中心を含む検出されたブロブのみを核として選択することによって自動的に生成される。自動的に生成された膜及び核のセグメント化は、視覚的に検討され、必要に応じて手動で修正される。補正工程は、以下の方法：不正確にセグメント化された膜又は核を拒絶すること、正確にアノテーションされた膜又は核を明示的に受け入れること、又は膜又は核の形状を精密化することのうちの１つを含む。アノテーション膜又は核を有する各画像について、アノテーション層が作成される。一実施形態では、アノテーション層の各ピクセルは、アノテーションオブジェクト（膜又は核）に属する場合、「１」が割り当てられ、そうでない場合、「０」が割り当てられる。別の実施形態では、アノテーション層のピクセルは、最も近いアノテーションオブジェクトまでの距離を表す。ネットワーク重みは、生成された後層が自動的に生成された膜及び核アノテーション層に最も類似するように最適化アルゴリズムによって調整される。
図１７は、各々が細胞膜及び細胞質を含む個々の癌細胞対象物が検出される工程３を示す。ヒューリスティック画像解析プロセスは、畳み込みニューラルネットワークによって生成された核後層を使用して細胞核をセグメント化するために、ウォーターシェッドセグメンテーションを使用する。セグメント化は、核オブジェクトを生成する。各核オブジェクトには、固有の識別子（ＵＩＤ）が割り当てられる。個々に識別された核は、図１７に暗いオブジェクトとして示されている（右下の画像）。検出された核は、入力画像１７（左上画像）及び核（右上画像）及び膜（左下画像）の後層にもオーバーレイとして表示される。
一実施形態では、ウォーターシェッドセグメンテーションは、事前定義された第１のサイズ閾値での核後層の閾値化を含む。第１のサイズ閾値を超える全ての単一の接続されたピクセルは、核オブジェクトに属するとみなされる。１６ｕｍ＾２未満の面積を有する核オブジェクトは破棄される。各核オブジェクトにはＵＩＤが割り当てられている。後続の工程では、核オブジェクトは、追加された核後方ピクセルが第２の所定の閾値よりも大きくなければならない、より小さい核後方に向かって成長される。
図１８は、核オブジェクトを使用して膜のセグメント化を検出及び改善する更なるセグメント化工程を示す。領域成長アルゴリズムは、検出された核オブジェクトをシードとして使用して、膜後層の膜の隆起部（おおよその細胞境界）まで成長させる。検出された膜（右下の画像）は、入力画像１７（左上の画像）並びに核（右上の画像）及び膜（左下の画像）の後層にオーバーレイとして示されている。
図１９は、検出された細胞の境界ピクセルの領域を膜確率層及び所定の膜層事後閾値まで外側に成長させることによってセグメント化される膜オブジェクトの検出及びセグメント化を示す。より厚い境界領域は膜オブジェクトになる。各膜オブジェクトには、関連する核オブジェクトのＵＩＤと同じＵＩＤが割り当てられる。
膜と核との間の空間は、核のＵＩＤを用いて細胞質に割り当てられる。各膜（図１９左上画像参照）及び細胞質（図１９左上画像参照）について、ＤＡＢ染色の平均光学密度は、ＵＩＤと共にハードドライブ上のファイルにエクスポートされる。各細胞（核、細胞質及び膜を含むと定義される）について、スライド内の細胞の重心（ｘ、ｙ）の位置もエクスポートされる。ファイルは、ハードディスク、ソリッドステートディスク、又はコンピュータシステム内の専用ＲＡＭの一部に存在し得る。
図２０は、画像解析ソフト環境における画像解析の結果を示す。図２０（左上画像）は、デジタル画像１７上のオーバーレイとして核オブジェクト及び膜オブジェクトのセグメント化を示す。図２０（左下画像）は、画像１７の光学密度提示上のオーバーレイとしての核オブジェクトのセグメント化を示す。暗い光学密度ピクセルは大量のＤＡＢに関連付けられ、明るい光学密度ピクセルは少量のＤＡＢに関連付けられる。各画像ピクセルのＤＡＢ光学密度は、茶色のＤＡＢ成分が独立した色になるように赤－緑－青色空間を変換し、その茶色の色成分の対数をとることによって、画像ピクセルの赤－緑－青表現から計算される。免疫蛍光（ＩＦ）イメージングが染色を決定するために使用される場合、ＨＥＲ２チャネルは、赤－緑－青の色空間を使用するのとは対照的に、１２ビット、１６ビット又は３２ビットのグレースケール画像として取得される。ＩＦでは、第１の色素としてＤＡＰＩ（２－［４－（アミノイミノメチル）フェニル］－１Ｈ－インドール－６－カルボキシイミドアミド塩酸塩）を用いて核をマークする。核の後層は、畳込みニューラルネットワークの入力として第１の色素の画像を使用して生成される。第２の色素が、診断用抗ＨＥＲ２抗体に連結される。第２の色素からの蛍光シグナルの強度は、ＤＡＢの光学密度（ＯＤ）に対応する。図２０（右上の画像）及び図２１（上）は、Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ ＸＤプラットフォーム内でセグメント化画像を生成するために使用される画像解析スクリプトを示す。図２０（右下の画像）及び図２１（下）は、画像１７内の全ての細胞膜オブジェクト及び細胞質オブジェクトについてエクスポートされた測定値を示す。別の実施形態では、画像解析スクリプトは、Ｃ＋＋、Ｃ＃、Ｊａｖａ、Ｐｙｔｈｏｎ又はＲ等の別のプログラミング言語を使用して符号化される。
Ｂ．予測ＡＤＣスコアの計算。
膜オブジェクト及び細胞質オブジェクト内のＤＡＢ染色の光学密度に基づいて、デジタル画像１７内の各癌細胞について単一細胞ＡＤＣスコアが計算される。単一細胞ＡＤＣスコアはまた、単一細胞ＡＤＣスコアが計算されている癌細胞までの所定の距離よりも近い隣接する癌細胞の膜オブジェクト及び細胞質オブジェクトにおけるＤＡＢ色素の染色強度に基づく。スコアは、抗ＨＥＲ２ ＡＤＣ治療に対する癌患者の応答を予測する。
膜オブジェクト及び細胞質オブジェクト内のＤＡＢ染色の光学密度に基づいて、デジタル画像１７内の各癌細胞について単一細胞ＡＤＣスコアが計算される。単一細胞ＡＤＣスコアはまた、単一細胞ＡＤＣスコアが計算されている癌細胞までの所定の距離よりも近い隣接する癌細胞の膜オブジェクト及び細胞質オブジェクトにおけるＤＡＢ色素の染色強度に基づく。スコアは、抗ＨＥＲ２ ＡＤＣ治療に対する癌患者の応答を予測する。
図２２は、膜及び細胞質ピクセルのグレー値を使用した概略図における工程２～３の画像分析からの染色の光学密度の例示的な定量的結果を示す。図１５～図２０に示すヒューリスティック画像解析の工程は、細胞核、細胞膜及び細胞細胞質への図２２の例示的なセグメント化を得るために使用される。図２２の明るいグレー値は、高いＤＡＢ光学密度、したがって診断抗体によって標的化される大量のタンパク質に関連する。暗いグレー値は、低いＤＡＢ光学密度に関連する。より明るいピクセルは、より高いＤＡＢ光学密度に対応する。
図２３は、図２２の画像の膜上及び細胞質内の例示的な定量的染色量を列挙しており、これは図２３に一部再現されている。第１、第２及び第３の細胞の膜からの褐色ＤＡＢ信号の光学密度は、それぞれ０．９４９、０．３６９及び０．４９８である。第１、第２及び第３の細胞の細胞質からの褐色ＤＡＢシグナルの光学密度は、それぞれ０．７９６、０．５３３及び０．３６９である。図２３の模式的な画像において、第１の癌細胞１８は、標的タンパク質ＨＥＲ２を多量に発現しており、ＡＤＣ抗体（図２４の効果１）に連結した細胞に入るＡＤＣペイロードによって殺傷される可能性が非常に高い。第２の癌細胞１９及び第３の癌細胞２０は、抗ＨＥＲ２ ＡＤＣによって直接殺傷されるのに十分な量の標的タンパク質ＨＥＲ２を発現していない。しかしながら、第１の癌細胞１８に対する第２の癌細胞１９の近傍に起因して、第１の癌細胞から放出された毒性ペイロードは、第２の癌細胞１９も死滅させる（図２４の効果３）。第３の癌細胞２０は、活性のままであり、最終的に患者の死を引き起こし得る薬物耐性機構の起源であり得る。
図２４は、抗ＨＥＲ２ ＡＤＣ治療が癌細胞を死滅させる機構を示す。例えば、トラスツズマブデルクステカンもこの機構を使用する。第１の工程では、ＡＤＣ抗体（例えば、トラスツズマブ）が標的タンパク質ＨＥＲ２に結合し、標的タンパク質の天然の機能を阻害し、細胞死をもたらし得る。第２の工程では、ペイロード（例えば、Ｉ型トポイソメラーゼ阻害剤）が細胞内に内在化され、ペイロードの毒性によって細胞を死滅させる。このペイロードの取込みは、膜上の標的タンパク質の量、並びに膜上及び細胞質内の標的タンパク質の量の差に依存する。取込み後、ペイロードは、細胞から周囲の組織に放出され得る。第３の工程では、ペイロードは近くの細胞に入ることができ、それらを死滅させることもできる。組織内のペイロードの空間分布は受動拡散によって広がる。
伝統的なＨＥＲ２スコアリングは、ＡＤＣ結合による標的タンパク質ＨＥＲ２の阻害の効果、並びにＡＤＣ抗体と共に癌細胞に入る細胞傷害性ペイロードの効果の両方を反映する。したがって、トラスツズマブ治療の従来のスコアリングは、細胞質中のＨＥＲ２タンパク質の存在の重要性、及び最初に死滅した癌細胞から放出された後に組織中に拡散する細胞傷害性ペイロードの効果を反映していない。比較すると、新規予測ＡＤＣスコアは、隣接する癌細胞に対する細胞傷害性ペイロードの放出の影響を測定する。
図１４の方法の工程４では、各癌細胞について単一細胞ＡＤＣスコアが決定される。図２５は、図２３に示す３つの細胞の各々についての単一細胞ＡＤＣスコアの計算を示し、隣接細胞へのＡＤＣペイロードの取込みを説明するために、細胞分離に基づく指数重み付け係数を組み込む。単一細胞スコアは、図２６に示す式又は請求項４に記載の式に基づいて算出することができる。細胞膜（０．９４９、０．３６９及び０．４９８）及び細胞質（０．７９６、０．５３３及び０．３６９）からのＤＡＢシグナルについて図２３に列挙した光学密度は、図２５に示す計算への入力である。第１、第２及び第３の細胞１８～２０は、それぞれ０．１４５、０．０１２及び０．０６４の単一細胞スコアを有する。
したがって、単一細胞ＡＤＣスコアは、ＤＡＢ光学密度を使用した細胞膜上の標的タンパク質の量の測定及びＡＤＣペイロード取込み量の推定を組み込んでいる。図２４に示すように、第１の細胞に対するＡＤＣペイロードの取込みは、その膜及びその細胞質中の色素の量、並びに第１の細胞の近傍の第２の細胞の膜及び細胞質中の色素の量の両方に依存する。より具体的には、近傍は、第１の癌細胞の周りに所定の半径を有する円板であってもよい。一実施形態では、第１の癌細胞の単一細胞ＡＤＣスコアは、関連する癌細胞中心が所定の距離よりも第１の癌細胞中心に近い膜及び細胞質対象のＤＡＢ光学密度の数乗の距離加重和によって決定される。一実施形態では、図２５の計算で使用されるように、所定の距離は５０ｕｍである。別の実施形態では、距離重み付けは、第１の癌細胞中心から他の癌細胞中心までのスケーリングされた負のユークリッド距離の指数を合計で計算することを含む。別の実施形態では、合計の累乗は、０、１、及び２に制限される（定数、線形項、二乗）。
図２６は、単一細胞ＡＤＣスコアを計算するための式の一実施形態を示す。式中の関数ａｋｌは、細胞ｊから細胞ｉまでの距離｜ｒｊ－ｒｉ｜に依存する。ＯＤＭｊは、細胞ｊの膜のＤＡＢ光学密度であり、ＯＤＣｊは、細胞ｊの細胞質のＤＡＢ光学密度である。定数Ａ＿ｉｊ、ｒ＿ｎｏｒｍ及びｄは、全てのタイプの癌について同じである。しかしながら、患者がＡＤＣ治療に適格であるかどうかを判定するためのスコアの閾値は、異なる種類の癌に対して同じではない。
特定の癌患者がＡＤＣ治療にどのように応答するかを示す方法の工程５において、標的タンパク質ＨＥＲ２の染色に基づいて、癌患者からの組織のデジタル画像１７について応答スコアが計算されて、スコアは、癌患者が抗ＨＥＲ２ ＡＤＣ治療にどのように応答するかを示す。応答スコアは、統計的演算を使用して組織試料の全ての単一細胞ＡＤＣスコアを集合することによって生成される。したがって、スコアは、デジタル画像で検出された全ての癌細胞に対する単一細胞ＡＤＣスコアの統計に基づいて計算される。一実施形態では、統計量は、画像１７の全ての癌細胞のＡＤＣペイロード取込み推定値の所定の分位である。
本方法の工程６において、応答スコアが所定の閾値よりも大きい場合、抗ＨＥＲ２ ＡＤＣ治療が癌患者に推奨される。工程６の所定の閾値及び工程５の分位点は、既知の単一－細胞ＡＤＣスコア及び治療応答パラメータを有する患者のコホートを使用して陽性的中率、陰性的中率、及び陽性推奨の有病率を最適化することによって決定される。
工程５における応答スコアの計算の別の例では、癌患者の組織試料のデジタル画像ｓが取得され、診断抗体（ｄＡＢ）で染色される。デジタル画像ｓに対して画像解析を行い、Ｎ個の癌細胞（ｃｉ）０≦ｉ≦Ｎを検出する。診断抗体（ｄＡＢ）は、Ｖｅｎｔａｎａ ＰＡＴＨＷＡＹ抗ＨＥＲ－２／ｎｅｕ（４Ｂ５）である。細胞ｃｉのセグメント化された膜における光学密度は、
として示され、セグメント化された細胞質における光学密度は、
として示される。デジタル画像ｓに関連する応答スコアｓｓは、癌患者が抗ＨＥＲ２ＡＤＣ治療に応答する可能性を示す。ＡＤＣは、診断抗体と同じＨＥＲ２タンパク質に特異的に結合する。応答スコアｓｓは、以下のように表すことができ、
［式６］
式中、
は、デジタル画像ｓで検出された細胞のセットに対する集合演算子である。集合演算は、検出された細胞に関連する陽性値ｐ（ｃｉ）を表す単一の数である。一例では、集合演算は算術平均である。別の例では、集合演算は、調和平均又は幾何平均等のいくつかの種類の平均のうちの１つである。別の例では、集合動作は、検出された細胞のサブグループの周波数である。別の例では、集合演算は和である。一実施形態では、集合演算は、細胞のサブセットのいくつかの種類の平均のうちの１つである。更に別の例では、集合演算は分位点である。
［式６］
この用語
は、各細胞について抗ＨＥＲ２ ＡＤＣ治療に応答する確率を表す陽性関数を表す。細胞の陽性関数は、細胞の隣接細胞に関連するｄＡＢ陽性値の集合に対して陽性である。細胞ｃｉに関連する陽性値ｐ（ｃｉ）は、以下のように表される。
［式７］
式中、πｉは、細胞ｃｉとの距離が所定の定数よりも小さい癌細胞として定義される、細胞ｃｉを含む、細胞ｃｉに近接する隣接癌細胞のセットである。一例では、ｃｉとｃｊとの間の距離は、２つの細胞中心間のユークリッド距離である。別の例では、距離はｃｉ及びｃｊの膜間の最小距離である。式７中、ｐｄＡＢ（ｃｊ）は、膜内の光学密度と細胞質内の光学密度とに基づく、細胞ｃｊに関する陽性値である。一例では、ｐｄＡＢ（ｃｊ）は、１を細胞に連結させる関数として規定され、
［式８］
その他の場合は０である。式８において、α１、α２、α３、γ１、γ２、γ３及びＴｐは、予め定義された定数であり、
は、
及び
の間の差を測定する関数である。所定の定数は、抗ＨＥＲ２ ＡＤＣ治療に対する既知の治療応答を有する癌患者のコホートの統計分析によって決定される。別の例では、ｐｄＡＢ（ｃｊ）は次のように表される。
［式９］
［式７］
［式８］
［式９］
一例では、関数
は、
として表される
と
との差に等しい。別の例では、関数
は、
として表される
と
との間の正の差のみを考慮する。更に別の例では、関数
は、
として表される
と
との間のコントラストに等しい。
式７において、
は、隣接する癌細胞のセットに対する集合演算子である。集合演算は、隣接細胞に関連付けられたｄＡＢ陽性値を表す単一の数である。一例では、集合演算は、以下のように表される、ｄＡＢ陽性の重み付けされた算術平均であり、
［式１０］
式中、
は、隣接細胞ｃｊによって影響を受ける細胞ｃｉの尤度を計算する重み関数を表す。別の例では、集合動作は、その隣接細胞のｄＡＢ陽性値の合計が任意の実定数Ｔｎを上回る場合に１を細胞ｃｉに関連付け、そうでない場合に０を細胞に関連付ける。別の例では、集合演算は、分位数、周波数尺度、又は調和平均若しくは幾何平均等のいくつかの種類の平均のうちの１つである。一例では、重み関数
は、以下のように表される、細胞ｃｉと細胞ｃｊとの間の空間距離のガウス関数ｄ（ｃｉ，ｃｊ）であり、
［式１１］
式中、σ及びαは所定の定数である。別の例では、重み関数は、空間距離のシグモイドであり、
［式１２］
式中、σ、α及びβは所定の定数である。別の例では、重み関数は、細胞ｃｉと細胞ｃｊとの間のユークリッド距離の減少関数である。更に別の例では、重み関数は、細胞ｃｉと細胞ｃｊとの間の距離のＨｅａｖｉｓｉｄｅ関数であり、距離が所定の定数Ｔｄよりも小さい場合には１を関連付け、そうでない場合には０を関連付ける。
［式１０］
［式１１］
［式１２］
陽性関数ｐ（ｃｉ）の１つの特定の例は、１を細胞ｃｉに関連付け、
［式１３］
その他の場合は０である。
［式１３］
Ｃ．乳癌患者に基づく予測方法の検証。
図１４の方法に従って生成された新規予測ＡＤＣスコアの精度は、トラスツズマブデルクステカン（ＤＳ－８２０１）を用いた第Ｉ相臨床試験である患者試験（Ｊ１０１ ＮＣＴ０２５６４９００）に基づいて検証された。Ｊ１０１患者試験のデータセットは、乳癌及び胃癌を含む複数の癌タイプを有する患者の染色組織画像及び治療応答率を含む。予測ＡＤＣスコアの最初の検証は、様々なＨＥＲ２発現レベル（１＋、２＋、３＋）を有する１５１名の乳癌患者からのデータに基づいていた。応答スコアは病理学者のアノテーションを使用して訓練され、スコアリング方法の性能は、その一般化及び堅牢性を確実にするために未確認のデータで検証された。応答スコアをＪ１０１データに盲目的に適用した。光学密度ＯＤ（褐色ＤＡＢ染色強度のレベル）を検出された膜で計算して、生存予測に関連する特徴を導き出した。奏効スコアの特徴を、陽性群の患者において客観的奏効率（ＯＲＲ）を最大化し、陰性群の患者において（ＯＲＲ）を最小化するように選択した。客観的奏効率は、治療に対して部分奏効又は完全奏効のいずれかを示す群の患者の割合である。部分奏効は、３０％～１００％の腫瘍縮小として定義される。完全奏効は、１００％の腫瘍縮小及び腫瘍の排除である。
図１４の方法に従って生成された新規予測ＡＤＣスコアの精度は、トラスツズマブデルクステカン（ＤＳ－８２０１）を用いた第Ｉ相臨床試験である患者試験（Ｊ１０１ ＮＣＴ０２５６４９００）に基づいて検証された。Ｊ１０１患者試験のデータセットは、乳癌及び胃癌を含む複数の癌タイプを有する患者の染色組織画像及び治療応答率を含む。予測ＡＤＣスコアの最初の検証は、様々なＨＥＲ２発現レベル（１＋、２＋、３＋）を有する１５１名の乳癌患者からのデータに基づいていた。応答スコアは病理学者のアノテーションを使用して訓練され、スコアリング方法の性能は、その一般化及び堅牢性を確実にするために未確認のデータで検証された。応答スコアをＪ１０１データに盲目的に適用した。光学密度ＯＤ（褐色ＤＡＢ染色強度のレベル）を検出された膜で計算して、生存予測に関連する特徴を導き出した。奏効スコアの特徴を、陽性群の患者において客観的奏効率（ＯＲＲ）を最大化し、陰性群の患者において（ＯＲＲ）を最小化するように選択した。客観的奏効率は、治療に対して部分奏効又は完全奏効のいずれかを示す群の患者の割合である。部分奏効は、３０％～１００％の腫瘍縮小として定義される。完全奏効は、１００％の腫瘍縮小及び腫瘍の排除である。
以下に説明する分析検証は、図１４の方法に従って画像分析を使用して検出された膜で測定された光学密度値（Ｒ＝０．９９３）と、病理学者がアノテーションした強化膜で測定された光学密度値（Ｒ＝０．９９５）との高い相関を実証する。図２７は、どのように一貫して病理学者が互いに比較して膜にアノテーションを行うかを示す図である。この図は、第１の病理学者によって特定された膜染色の光学密度を第２の病理学者によって特定された光学密度に対して示す。図中の光学密度のスケールは０から３００まで記載されているが、実際の光学密度は０から２２０までの範囲で測定される。光学密度は、測定された光学密度を２２０で割ることによって０～１の範囲で本出願において代替的に示されることがある。図２８は、画像解析を使用して検出された膜が病理学者によって同定された膜とどのように相関するかを比較する図である。両図の散布プロットの比較は、図１４の方法の画像分析が病理学者とほぼ一貫して膜を検出することを実証している。更に、画像解析から得られた応答スコアは、病理学者のＨＥＲ２ ＩＨＣ検査スコアリングとほぼ一致していたが、ＩＨＣ染色カテゴリーとＩＳＨ染色カテゴリーとの間の広範な定量的重複も示した。図１４の方法を用いたスコアリングは、客観的奏効率ＯＲＲとアッセイの全範囲にわたるＨＥＲ２発現増加との間の直接的な線形関係を示した。
現在、ＨＥＲ２標的治療は、癌が、（ｉ）免疫組織化学（ＩＨＣ）染色からのＨＥＲ２の発現について＞０及び＜１＋、（ｉｉ）免疫組織化学染色からのＨＥＲ２の発現について１＋、並びに（ｉｉｉ）免疫組織化学（ＩＳＨ）染色からのＨＥＲ２の発現について２＋及びｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション染色からのＨＥＲ２の発現について陰性（－）の両方のスコアが割り当てられている「ＨＥＲ２低」患者について承認されていない。
図２９は、ＨＥＲ２ ＩＨＣ１＋スコアを有するのとは対照的に、応答の質とＨＥＲ２ ＩＨＣ２＋スコアを有することとの間の低い相関を示す。ＩＨＣ２＋のスコアを有するＨＥＲ２陰性コホートにおけるＪ１０１試験からの乳癌患者は全て、ＩＨＣ１＋のスコアを有するコホートの患者よりも一貫して良好な応答を有するわけではなかった。図の右側により長いバーで表される患者は、左側の患者よりも腫瘍サイズの大きな減少を示した。腫瘍サイズが３０％を超えて縮小した右の患者は、抗ＨＥＲ２ ＡＤＣ治療に対する応答を示したと考えられる。腫瘍が３０％未満だけ縮小し、３０％未満だけ増大した患者は、安定状態を有すると考えられる。そして、腫瘍サイズが３０％を超えて増加した患者は、進行性疾患を有すると考えられる。図２９の図に示される治療に対する応答を示した２２名の患者のうち、９人がＩＨＣ １＋のスコアを有し、１３人がＩＨＣ ２＋のスコアを有する。したがって、ＨＥＲ２ ＩＨＣスコアは、患者が治療に対する応答を示すかどうかの良好な予測因子ではない。
図３０は、ＨＥＲ２陽性応答スコアを有したＤＥＳＴＩＮＹ－Ｂｒｅａｓｔ０１試験の１６８名の患者の応答（腫瘍サイズの変化）を示す。図３０は、ＨＥＲ２陽性とスコア付けされた患者の約８５％が治療に対する応答（＞３０％の腫瘍縮小）を示し、１５％が安定状態を有し、１名の患者のみが進行性疾患を有したことを示す。したがって、ＩＳＨ＋による３＋及び２＋のＨＥＲ２ ＩＨＣスコアは、２＋及び１＋のスコアよりも抗ＨＥＲ２ ＡＤＣ治療に対する応答の良好な予測因子であり、抗ＨＥＲ２ ＡＤＣ治療に対する無応答の予測因子であった。
図３１は、ＩＨＣスコアリングのＨＥＲ２陰性カテゴリーに含まれた１５１名のＪ１０１乳癌患者のうち６５名のコホートが、抗ＨＥＲ２ ＡＤＣ治療に対して４２％の良好な客観的奏効率ＯＲＲを依然として示したことを示す。ＨＥＲ２標的化治療が現在承認されていないＪ１０１患者（ｎ＝６５）のこのＨＥＲ２陰性コホートでは、患者の４２％が依然として抗ＨＥＲ２ ＡＤＣ治療に応答し、無増悪生存期間（ｍＰＦＳ）の中央値は１１ヶ月であった。したがって、図１４の方法を用いたスコアリングを使用して、抗ＨＥＲ２ ＡＤＣ治療に対して好ましい応答を示すＨＥＲ２陰性カテゴリーの患者を同定することができる。図３１はまた、客観的奏効率が、ＩＨＣスコアリングを使用してＨＥＲ陽性として分類された７２名の患者のコホートについて５６％であり、それらの患者が１４．１ヶ月のｍＰＦＳを有する治療に応答したことを示す。
図３２は、図１４の方法を用いたスコアリングを用いた従来のＨＥＲ２陰性カテゴリーの乳癌患者６５名の更なる層別化を示す。新規予測ＡＤＣスコアのカットオフを調整することによって、６５名のＨＥＲ２陰性群の４０名の患者を「ＱＣＳ陽性」として分類した。４０名の患者のこのコホートは５２％のＯＲＲを有し、患者は１４．５ヶ月のｍＰＦＳを有して、抗ＨＥＲ２ ＡＤＣ治療に応答した。したがって、図１４の方法を用いたスコアリングは、新規応答スコアが抗ＨＥＲ２ ＡＤＣ治療に対する良好な応答を示す所定の閾値を上回る（所定のカットオフを上回る染色強度に基づく）ＨＥＲ２陰性患者のサブグループを同定することができた。
図３３は、図１４の方法を用いて１５１名のＪ１０１乳癌患者全員のスコアリングを行った結果を示す。左上図は、各上皮細胞の細胞中心（小さな点）、核の境界、及び各細胞（膜）の境界を検出したＱＣＳ画像解析の結果の一例を示す。核の境界と細胞の境界との間の空間は、細胞質と呼ばれる。
図３３の右上のグラフは、１５１名のＪ１０１患者の膜染色の分布を示す。各バーの高さは、各患者のＨＥＲ２染色組織画像の中央腫瘍細胞膜光学密度を表す。バーの陰影は、病理学者による各患者の視覚的ＨＥＲ２スコアリングを表す。膜光学密度の＞８．０４での示された「カットオフ」は、患者のＪ１０１コホート全体の生存分析に基づいて決定された。図３３の下のグラフは、単一の患者についての細胞ＯＤスコア及びそれらの分布を表すヒストグラムである。
図３４Ａは、１５１名のＪ１０１患者の１２０名の「ＱＣＳ陽性」（ＱＣＳ＋）患者と３１名の「ＱＣＳ陰性」（ＱＣＳ－）患者への層別化を示す図３３の右上のグラフのより詳細なバージョンである。１２０名の患者の群は、それらの組織試料中の細胞の少なくとも９０％が０．０３６５（８．０４／２２０）の所定の閾値を超えるＨＥＲ２膜染色の光学密度を示したので、「ＱＣＳ陽性」（ＱＣＳ＋）としてスコア付けされた。１２０名の「ＱＣＳ陽性」（ＱＣＳ＋）患者の群は、図３４Ｂの表に示されるように、５６％の客観的奏効率ＯＲＲ及び１４．１ヶ月の平均無増悪生存期間（ｍＰＦＳ）を示した。
新規応答スコアはまた、２６％の客観的奏効率ＯＲＲ及び９ヶ月の平均無増悪生存期間（ｍＰＦＳ）を有した３１名の患者の「ＱＣＳ陰性」群を特定した。したがって、図１４のスコアリング方法は、病理学者による従来のＨＥＲ２ ＩＨＣスコアリングよりも、抗ＨＥＲ２ ＡＤＣ治療から利益を得ることができる１５１名のＪ１０１乳癌患者の大部分を特定した。それにもかかわらず抗ＨＥＲ２ ＡＤＣ治療から利益を得ることができる従来のＨＥＲ２陰性ＩＨＣスコアリング群から患者を同定する能力は、このＨＥＲ２陰性群の患者による有効な治療に対する満たされていないニーズが高いため重要である。
応答スコアを生成するために使用される単一細胞スコアの染色強度カットオフは、Ｊ１０１患者を、高いＯＲＲを有する第１の群と低いＯＲＲを有する第２の群とに分割するように調整される。Ｊ１０１患者のＯＲＲが最も高い第１群とＯＲＲが最も低い第２群への最良の層別化は、少なくとも最小量のＨＥＲ２を発現する腫瘍細胞の大部分を含むように単一細胞スコアの染色強度閾値を０．０３６５（８．０４／２２０）に下げることによって達成された。８．０４／２２０のこの染色強度閾値は、より高いレベルのＨＥＲ２を発現する細胞のごく一部のみを含むようにより高い染色カットオフを設定した現在の臨床ガイドラインとは対照的である。
図３４Ａの棒グラフは、１５１名のＪ１０１乳癌患者のそれぞれについての従来のＨＥＲ２ ＩＨＣスコアを示し、これはバーの網掛けによって示されている。例えば、ＩＨＣ３＋のスコアを有する患者のバーは２番目に濃い灰色であり、ＩＨＣ１＋のスコアを有する患者のバーは白色である。最も高い膜光学密度に対応するＨＥＲ２ ＩＨＣ３＋スコアを有する患者を除いて、同じＨＥＲ２ ＩＨＣスコアを有する全ての患者が一緒にグループ化されていないことは明らかである。しかしながら、はるかに低い膜光学密度を有する患者もまた、抗ＨＥＲ２ ＡＤＣ治療に良好に応答する可能性があった。ＯＲＲが５６％（ｎ＝１２０）の患者群を「ＨＥＲ陽性」と定義する。この群の患者は、組織スライド中の細胞の少なくとも９０％が、２＋の従来のＨＥＲ２ ＩＨＣスコアに使用される強度閾値よりも低い０．０３６５（８．０４／２２０）の所定の強度閾値よりも大きいＨＥＲ２染色の光学密度を示すと同定された。
別の実施形態では、染色強度の少なくとも所定の閾値を有するとカウントされる細胞はまた、閾値を超える染色を有する細胞の近傍内にあるが、それ自体は閾値未満の染色を有する細胞を含む。したがって、応答スコアはまた、所定の光学密度閾値を超える膜染色を示す（陽性細胞）又は陽性細胞から所定の距離内にあるとして細胞を特徴付けることによって、染色された細胞の空間的不均一性を考慮に入れる。
図３５は、隣接染色された細胞も考慮する実施形態について、図１４の方法を使用して同定されたＨＥＲ２陰性コホートにおけるＪ１０１乳癌患者の２つの群についての無増悪生存期間のカプラン・マイヤー曲線のグラフである。方法は、ＨＥＲ２陰性コホートにおける６５名の乳癌患者の生存確率を示すスコアを生成する。上の曲線は、より良好な生存転帰を有する患者群を示し、これは、細胞の９５％が（ｉ）少なくとも最小閾値のＨＥＲ２染色の光学密度を示したか、又は（ｉｉ）最小染色を示す細胞から最小距離内に位置した患者に対応する。
この方法では、０．０４０７７（８．９７／２２０）を超える膜上の平均光学密度を示した各組織試料中の全ての上皮細胞が同定され、それらの細胞は「ｐ１」と呼ばれる。次いで、０．０４０７７未満の平均光学密度を膜上で示したが、ｐ１細胞から２０ｕｍ（ミクロン）の距離内にある、組織試料中の全ての上皮細胞が同定され、それらの細胞は「ｐ２」と呼ばれる。次いで、「ｐ１２」細胞のパーセンテージは、（ｐ１の数＋ｐ２の数）／（組織試料中の全ての上皮細胞の数）として計算される。患者は、より高い生存確率を有し、ｐ１２細胞のパーセンテージが９５％より大きい場合、上側カプラン・マイヤー曲線上にある。
上の曲線の患者は１６ヶ月の平均無増悪生存期間を有し、下の曲線の患者は９ヶ月の平均無増悪生存期間を有した。より長い生存率及び抗ＨＥＲ２ ＡＤＣ治療に対するより良好な応答を有する上の曲線の患者は、ＨＥＲ２陰性細胞間のＨＥＲ２陽性細胞のより均一な分布を有する。ＨＥＲ２陽性細胞の大部分が集合しており、ＨＥＲ２陰性細胞から閾値最小距離（この実施例では２０μｍ）以内で腫瘍組織に分布していない場合、ＨＥＲ２陽性細胞を標的とする抗ＨＥＲ２ＡＤＣは、有意なバイスタンダー効果を有するほどＨＥＲ２陰性細胞に十分接近していない。新規予測ＱＣＳスコアは、その細胞傷害性ペイロードをＨＥＲ２陽性細胞に放出するＡＤＣの隣接癌細胞に対する効果から改善された応答を示す、均質なＨＥＲ２発現を有する患者を同定する。上側カプラン・マイヤー曲線に示されるものと同様の抗ＨＥＲ２ ＡＤＣ治療に対する応答を達成するために、臨床医は、新規応答スコアが組織試料中の９５％のｐ１２細胞を超える各患者に抗ＨＥＲ２ ＡＤＣ治療を投与するであろう。
図３６は、ｐ１細胞の最小距離内のｐ２細胞も考慮する実施形態について、図１４の方法を使用した１５１名のＪ１０１患者全体からの患者の２つの群についての無増悪生存期間のカプラン・マイヤー曲線のグラフである。本方法は、Ｊ１０１試験の１５１名の乳癌患者の生存確率を示すスコアを生成する。上の曲線は、より良好な生存転帰を有する患者群を示し、これは、細胞の９５％が、（ｉ）少なくとも０．０４８１の最小閾値（１０．５９２４４／２２０）のＨＥＲ２染色の光学密度を示したか、又は（ｉｉ）最小染色を示す細胞から２０ｕｍの最小距離内に位置した患者に対応する。上の曲線の患者は１９ヶ月の平均無増悪生存期間を有し、下の曲線の患者は１１ヶ月の平均無増悪生存期間を有した。
図３７は、組織試料の全ての単一細胞ＡＤＣスコアを集合することによって各癌患者の生存確率を示すスコアを生成するために図１４の方法で使用される他のパラメータ及び特徴を示す。図３７の下部１０の特徴は、ラベル付き特徴の特定のパラメータを使用して得られた２つの曲線間の最良の層別化（ログランクｐ値によって測定）に従ってランク付けされる。
図３７の上の９つの特徴は、ラベル付き特徴の特定のパラメータを使用して得られた上の曲線における患者の平均客観的奏効率に従ってランク付けされる。特徴＃１は、陽性腫瘍細胞のパーセンテージに基づいて患者を分類し、陽性は５を超える膜光学密度によって定義される。特徴＃２は、陽性腫瘍細胞のパーセンテージに基づいて患者をランク付けし、陽性は、５を超える細胞光学密度（細胞質及び膜の両方の平均光学密度）によって定義される。特徴＃３は、陽性／陰性細胞分類を使用して患者を層別化するバイスタンダースコアであり、陽性細胞は２５を超える膜光学密度を有し、スコアは半径１００ｕｍ内の全ての細胞を考慮する。特徴＃４は、陽性／陰性細胞分類を使用して患者を分類するバイスタンダースコアであり、陽性細胞は１０を超える膜光学密度を有し、スコアは半径５０ｕｍ内の全ての細胞を考慮する。特徴＃５は、陽性／陰性細胞分類を使用して患者を分類するバイスタンダースコアであり、陽性細胞は２５を超える膜光学密度を有し、スコアは半径５０ｕｍ内の全ての細胞を考慮する。特徴＃６は、各腫瘍細胞の細胞質光学密度に対する膜光学密度の差を計算し、次いで得られたヒストグラムの１５％分位値をとることによって患者をランク付けする。特徴＃７は、陽性／陰性細胞分類を使用して患者を分類するバイスタンダースコアであり、陽性細胞は１０を超える膜光学密度を有し、スコアは半径１０ｕｍ内の全ての細胞を考慮する。特徴＃８は、各腫瘍細胞について、膜光学密度＊（膜光学密度－細胞質光学密度）を計算し、次いで、得られたヒストグラムの１０％分位値をとることによって、患者を層別化する。特徴＃９は、各腫瘍細胞について、膜光学密度＊（ｍａｘ（０、膜ＯＤ－細胞質ＯＤ））を計算し、次いで得られたヒストグラムの１０％分位値をとることによって患者をランク付けする。
抗ＨＥＲ２ ＡＤＣ治療に対する患者の応答を予測するための図１４の方法は、場合により、癌細胞対象物の染色特性に加えて、間質腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の存在に基づく可能性がある。以下に説明する検証は、同じくＴＩＬに基づく図１４の修正スコアリング方法が、客観的奏効率（ＯＲＲ）とＨＥＲ２発現＋ＴＩＬ有病率の増加との間の更に良好な対応を示したことを実証している。腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）は、主に細胞傷害性（ＣＤ８＋）Ｔ細胞及びヘルパー（ＣＤ４＋）Ｔ細胞から構成される。ＣＤ８＋Ｔリンパ球は好ましい臨床転帰と相関しており、乳房病変中の間質ＴＩＬの数が多い患者は、トラスツズマブで治療した場合、より良好な生存を示す。ＴＩＬ有病率をＨＥＲ２染色から抽出された画像分析に基づく特徴と組み合わせることにより、特にＨＥＲ２の発現レベルが低い腫瘍を有する乳癌患者について、癌患者が抗ＨＥＲ２ ＡＤＣ治療にどのように応答するかを予測するために図１４の方法によって生成される患者スコアの精度が改善される。
図１４の方法の更なる工程において、深層学習ベースの画像解析が、色素に連結された抗Ｈｅｒ２診断抗体で免疫組織化学的に染色された組織のデジタル画像に対して行われる。畳み込みニューラルネットワークは、ＨＥＲ２染色ＩＨＣ画像においてＴＩＬを検出するように訓練される。ＴＩＬ自体はＨＥＲ２染色されていないが、ＨＥＲ２染色ＩＨＣ画像から直接ＴＩＬＳを検出するための深層学習ベースのモデルが開発された。ＴＩＬ検出モデルについては、関心領域の別個のサブセットをＴＩＬについてアノテーションした。機能的染色の非存在下では、細胞質がほとんどなく核が均一な質感を有する円形から多角形の比較的小さな細胞として特徴付けられるＴＩＬを示すために点アノテーションを使用した。腫瘍関連間質及び上皮内ＴＩＬに位置するＴＩＬのみにアノテーションし、検出した。ＴＩＬ検出モデルを、アノテーション腫瘍コア領域内の非上皮領域に適用した。得られた後部マップを閾値化し、続いて非最大抑制を行うことによって、ＴＩＬ中心を検出した。
図１４の方法における別の更なる工程では、各ＨＥＲ２染色ＩＨＣ画像についてＴＩＬスコアを計算する。したがって、この方法は、ＨＥＲ２染色に基づくスコアに加えて、染色された組織において検出されたＴＩＬの密度をバイオマーカとして使用する。モデルは、以下の３つの密度を計算する。（ｉ）アノテーション腫瘍領域全体内の全てのＴＩＬの密度、（ｉｉ）セグメント化された腫瘍関連間質におけるＴＩＬの密度、及び（ｉｉｉ）上皮内ＴＩＬ密度。
予測ＡＤＣスコアの精度を改善するために、ＴＩＬに基づく特徴をＨＥＲ２染色に基づく特徴と組み合わせて使用した。特徴の最適な組合わせは、コホート内の全ての患者のカプラン・マイヤー曲線に対するログランク検定ｐ値によって示されるように、患者コホートを無増悪生存期間（ＰＦＳ）がより長い群とＰＦＳがより短い群とに最もよく分けるものである。図３７の下の表は、ログランクｐ値によって示されるカプラン・マイヤーグラフの２つの曲線の間で各特徴が個別に達成する層別化によってランク付けされた、３つのＴＩＬベースの特徴及び７つのＨＥＲ２染色特徴を含む。
図３８は、３つの更なる特徴の表であり、より長い生存患者及びより短い生存患者についてのそれらのログランク検定ｐ値及びそれらの予測客観的奏効率（ＯＲＲ）を比較する。図３８の表は、ＴＩＬに基づく特徴、ＨＥＲ２＋腫瘍細胞の密度に基づく特徴、及び１５１名の乳癌患者のコホートのＪ１０１データセットで計算された定義された近隣内のＨＥＲ２＋細胞に基づく特徴を含む。表中のｐ値は、モデルカットオフを訓練セットで訓練し、次いで検証セットに適用する交差検証によって決定した。得られた交差検証モデルをＣＭと略す。例えば、ＴＩＬ密度特徴について、患者を高（ＱＣＳ＋）ＣＭ群及び低（ＱＣＳ－）ＣＭ群に層別化するためのカットオフは１６８である。これは、間質中のＴＩＬの数を腫瘍コアの面積（ｍｍ＾２）で割って測定した腫瘍浸潤リンパ球の密度が１６８／ｍｍ＾２を超える場合、患者がＣＭ－ｈｉｇｈ群に属することを意味する。ＨＥＲ２＋細胞密度の特徴について、カットオフは１６７２である。この特徴のために、１５を超える膜光学密度を有する腫瘍細胞の数を腫瘍コアの面積（ｍｍ＾２）で割って測定した陽性腫瘍細胞の密度が１６７２／ｍｍ＾２を超える場合、患者はＣＭ－高群に属する。ＨＥＲ２＋近傍スコアの場合、カットオフは３７である。カットオフは、最初に、全ての腫瘍細胞について、２５ｕｍの半径を使用して連続バイスタンダースコアを計算してヒストグラムを生成することによって適用される。次いで、全細胞のヒストグラムの５％分位点が３７より大きい場合、患者はＣＭ－高群に属する。ＴＩＬ密度特徴は、１５１名の患者の最良の層別化を達成し、０．００７のログランク検定ｐ値をもたらした。ＨＥＲ２＋細胞密度の特徴から、カプラン・マイヤー、ログランクｐ値０．０１１が得られ、ＨＥＲ２＋近傍スコアの特徴から、ｐ値０．０１４が得られた。
図３９Ａ～Ｃは、図３８の表に列挙された３つの特徴のカプラン・マイヤー曲線を示す。図３９Ａは、ＴＩＬ密度のカプラン・マイヤー曲線である。図３９Ｂは、ＨＥＲ２＋細胞密度のカプラン・マイヤー曲線である。３９Ｃは、ＨＥＲ２＋近傍スコアのカプラン・マイヤー曲線である。ｐ値及びカプラン・マイヤー曲線によって示されるように、ＴＩＬ密度特徴は、１５１名の乳癌患者全体に適用した場合、より長い及びより短い無増悪生存期間（ＰＦＳ）を有する患者間の最良の層別化を提供する。ＨＥＲ２＋近傍スコア特徴についての図３９Ｃのカプラン・マイヤー曲線は、特徴ｂｙｓｔａｎｄｅｒ＿ｐｏｔ＿ｃｕｔ１＿２０についての図３６のＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ曲線と同様であり、これは、各ＨＥＲ２染色腫瘍細胞の半径２０ｕｍ内の染色されていないバイスタンダー細胞を考慮する。ＨＥＲ２＋近傍スコア特徴は、２５ｕｍの近傍半径を使用する。比較すると、図３６の連続バイスタンダー特徴「ｂｙｓｔａｎｄｅｒ＿ｐｏｔ＿ｃｕｔ１＿２０」は、シグマ＝２０ｕｍの半径及びアルファ＝２を使用し、所与の細胞自体を含む所与の細胞の周りの全ての腫瘍細胞の膜光学密度の加重和を決定する。距離依存重み付けは、「ｅｘｐ（－０．５＊（ｄｉｓｔ／ｓｉｇｍａ）＾２）」により算出される。
図４０Ａ、図４０Ｂ及び図４０Ｃは、１５１名の乳癌患者の中からＨＥＲ２陽性と指定された７２名の患者のみに適用した場合の、図３８の表に列挙した３つの特徴のカプラン・マイヤー曲線を示す。ここでも、ＴＩＬ密度特徴は、０．０００９５のｐ値で最良の層別化を達成した。ＨＥＲ２＋細胞密度特徴のｐ値は０．０９２であり、ＨＥＲ２＋近傍スコア特徴のｐ値は０．０４６であった。
図４１Ａ、図４１Ｂ、及び図４１Ｃは、１５１名の乳癌患者の中からＨＥＲ２陰性と指定された６５名の患者のみに適用した場合の、図３８の表に列挙した３つの特徴のカプラン・マイヤー曲線を示す。しかしながら、ＨＥＲ２陰性コホートの場合、ＴＩＬ密度の特徴は、より長い無増悪生存期間（ＰＦＳ）とより短い無増悪生存期間との間の最悪の層別化を提供した。ＴＩＬ密度カプラン・マイヤー曲線のｐ値は０．３１である。ＨＥＲ２＋近傍スコアは最良の層別化を達成し、ｐ値は０．００６１であった。ＨＥＲ２＋細胞密度特徴によって達成された層別化は、０．００６４のｐ－値でほぼ良好であった。ＨＥＲ２＋近傍スコア特徴に関する図４１Ｃのカプラン・マイヤー曲線は、図３５のカプラン・マイヤー曲線と同様である。
図３９～４１のカプラン・マイヤー曲線の結果は、ＴＩＬベースの特徴をＨＥＲ２染色に基づく特徴と組み合わせて使用することにより、抗ＨＥＲ２ ＡＤＣ治療に有利に応答する患者を同定するための図１４の方法の精度が改善されることを示している。しかしながら、ＴＩＬベースの特徴を使用しても、ＨＥＲ２陰性患者のサブグループの中から、抗ＨＥＲ２ ＡＤＣ治療に対して良好な応答を示す可能性が高い患者を同定する精度は改善されない。これは、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）が抗ＨＥＲ２ ＡＤＣ治療に対する患者の即時の好ましい応答を達成するために必須ではないが、ＴＩＬの存在が癌の全体的な進行を遅延させることを示唆する。
Ｄ．胃癌患者に基づく予測方法の検証。
トラスツズマブデルクステカン（ＤＳ－８２０１）を用いたＪ１０１試験には、胃癌患者も含まれた。Ｊ１０１試験のデータセットの分析は、抗ＨＥＲ２ ＡＤＣ治療に対する応答の質と従来のＨＥＲ２ ＩＨＣスコアリングとの間に低い相関があることを示した。図１４の方法のＱＣＳスコアリングを使用した予測応答は、従来のＨＥＲ２ ＩＨＣスコアリングの結果から有意に逸脱していた。
トラスツズマブデルクステカン（ＤＳ－８２０１）を用いたＪ１０１試験には、胃癌患者も含まれた。Ｊ１０１試験のデータセットの分析は、抗ＨＥＲ２ ＡＤＣ治療に対する応答の質と従来のＨＥＲ２ ＩＨＣスコアリングとの間に低い相関があることを示した。図１４の方法のＱＣＳスコアリングを使用した予測応答は、従来のＨＥＲ２ ＩＨＣスコアリングの結果から有意に逸脱していた。
図４２は、図１４の方法を用いた３２名のＪ１０１胃癌患者のコホートのスコアリングの結果を示す。この実施形態におけるＱＣＳスコアは、試料中の全ての腫瘍細胞の平均膜光学密度の中央値に基づく。単一細胞ＡＤＣスコアを集合するための統計的演算は「中央値」である。各単一細胞ＡＤＣスコアは、細胞膜におけるＤＡＢ光学密度の平均（ａｖｅｒａｇｅ、ｍｅａｎ）によって生成される。患者は、増加するＱＣＳスコアに従って順序付けられる。図４２は、０、１＋、２＋及び３＋のＨＥＲ２ ＩＨＣスコアがＱＣＳスコアと良好に対応しないことを示す。図４２の棒グラフはまた、３２名の胃癌患者の臨床転帰を示しており、これを各棒グラフの上に完全奏効（ＣＲ）、部分奏効（ＰＲ）、安定状態（ＳＤ）、及び進行性疾患（ＰＤ）として列挙している。図４２は、図３４Ａの乳癌患者と同様の胃癌患者についての結果を示す。
図４３は、組織試料の単一細胞ＡＤＣスコアを集合することによって、抗ＨＥＲ２ ＡＤＣ治療を受けた各胃癌患者の生存確率を示すスコアを生成するために図１４の方法で使用される６つの特徴の表である。図４３の表は、無増悪生存期間（ＰＦＳ）に基づいて患者を層別化する際の特徴によって達成されたログランク検定ｐ値を比較する。この表はまた、より長い生存患者（カプラン・マイヤー曲線の上の分岐における患者）のコホートに対する予測された客観的奏効率（ＯＲＲ）を示す。ＯＲＲは、ＯＲＲに対する陽性的中率（ＰＰＶ）として表される。陽性的中率（ＰＰＶ）は、（観察されたＯＲＲによって）応答者として正しく予測された患者の数を全ての応答者で割ったものである。ＯＲＲは、応答カテゴリーＣＲ、ＰＲ（ＯＲＲ＝真）及びＳＤ、ＰＤ（ＯＲＲ＝偽）を使用してＲＥＣＩＳＴによって測定される。図４３は、乳癌患者を層別化するために使用される図３７～３８の特徴と同様の、胃癌患者を層別化するために使用される特徴を示す。より長い生存患者及びより短い生存患者の最良の層別化を提供した特徴は、ｍｅｍｂＯＤ＿ｄｅｎｓｉｔｙ＿１０（腫瘍面積の平方ｍｍ当たり１０より大きい膜光学密度（ｍｅｍｂＯＤ）を有する腫瘍細胞の密度）であり、これは上皮細胞の膜染色の光学密度に基づいていた。ｍｅｍｂＯＤ＿ｄｅｎｓｉｔｙ＿１０特徴は、０．００５９４のｐ値で層別化を達成した。
図４４は、無増悪生存期間（ＰＦＳ）とは対照的に全生存期間（ＯＳ）に基づいて抗ＨＥＲ２ ＡＤＣ治療を受けた患者を層別化するために使用されるモデルの７つのＨＥＲ２染色に基づく特徴の表である。したがって、機能のリストは、ＰＦＳとは対照的に、ＯＳに基づくｐ－値に対して最適化される。尖度及び歪度の特徴は、全生存率及び達成されたｐ－値０．０００２に基づいて患者の最良の層別化を提供した。
図４５は、図４３の表に列挙された特徴ｍｅｍｂＯＤ＿ｄｅｎｓｉｔｙ＿１０のカプラン・マイヤー曲線である。この特徴に基づいて、患者はＱＣＳ陽性であり、上皮において１０を超える膜光学密度を有する腫瘍細胞の密度が８１０／ｍｍ＾２を超える場合、ＨＥＲ２ ＡＤＣ治療から利益を得る可能性がより高い。特徴ｍｅｍｂＯＤ＿ｄｅｎｓｉｔｙ＿１０は、ＰＦＳに基づく３２名の胃癌患者を、２３名の患者のより長い生存コホート及び９名の患者のより短い生存コホートに分割し、ｐ値は０．００５９４であった。
図４６は、図４４の表に列挙された特徴ｍｅｍｂＯＤ＿ｄｅｎｓｉｔｙ＿１０のカプラン・マイヤー曲線である。特徴ｍｅｍｂＯＤ＿ｄｅｎｓｉｔｙ＿１０は、ＯＳに基づく３２名の胃癌患者を、２３名の患者のより長い生存コホート及び９名の患者のより短い生存コホートに分割し、ｐ値は０．００７３１であった。
本発明は、説明のために特定の実施形態に関連して説明されたが、本発明はこれに限定されない。記載された実施形態の様々な変更、適合、及び様々な特徴の組合わせは、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲から逸脱することなく実施することができる。
Claims (123)
- ＡＤＣペイロードと、癌細胞上のタンパク質を標的とするＡＤＣ抗体とを含む抗体薬物複合体（ＡＤＣ）に対する癌患者の応答を予測するための応答スコアを生成する方法であって、前記タンパク質は、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）であり、
診断抗体に連結された色素を使用して組織試料を免疫組織化学的に染色することであって、前記診断抗体は、前記組織試料中の前記癌細胞上の前記タンパク質に結合する、染色することと、
前記組織試料のデジタル画像を取得することと、
前記デジタル画像において癌細胞を検出することと、
各癌細胞について、前記癌細胞の膜及び細胞質における前記色素の染色強度に基づいて、並びに前記癌細胞に対して、所定の距離より近い他の癌細胞の前記膜及び前記細胞質における前記色素の前記染色強度に基づいて、単一細胞ＡＤＣスコアを計算することと、
統計的演算を用いて前記組織試料の全ての単一細胞ＡＤＣスコアを集合することによって前記応答スコアを生成することと、を含む、方法。 - 前記癌細胞の検出が、各癌細胞について、前記膜に属するピクセル及び前記細胞質に属するピクセルを検出することを含む、請求項１に記載の方法。
- 各膜の前記染色強度が、前記膜のピクセルにおける褐色ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）シグナルの平均光学密度に基づいて計算され、各細胞質の前記染色強度が、前記細胞質のピクセルにおける前記褐色ＤＡＢシグナルの前記平均光学密度に基づいて計算される、請求項１に記載の方法。
- 細胞ｉについての前記単一細胞ＡＤＣスコアが、
｜ｒｊ－ｒｉ｜＜ｄ｛ａ２０（｜ｒｊ－ｒｉ｜）ｘＯＤＭｊ ２＋ａ１１（｜ｒｊ－ｒｉ｜）ｘＯＤＭｊｘＯＤＣｊ＋ａ０２（｜ｒｊ－ｒｉ｜）ｘＯＤＣｊ ２＋ａ００（｜ｒｊ－ｒｉ｜）｝による全ての細胞ｊの合計として計算され、
式中、関数ａｋｌは、各細胞ｉに対する各細胞ｊの距離｜ｒｊ－ｒｉ｜に依存し、ＯＤＭｊは、細胞ｊの膜における褐色ＤＡＢシグナルの光学密度であり、ＯＤＣｊは、細胞ｊの細胞質における褐色ＤＡＢシグナルの光学密度である、
請求項３に記載の方法。 - 前記関数ａｋｌは、前記細胞ｉに対する前記細胞ｊの前記距離｜ｒｊ－ｒｉ｜に、以下の関係：予め定義された定数係数Ａｏｏ、Ａ１ｏ、Ａｏ１、Ａ１１、Ａ２０、Ａｏ２による、ａｋｌ（｜ｒｊ－ｒｉ｜）＝Ａｋｌｘ ｅｘｐ（－｜ｒｊ－ｒｉ｜／ｒｎｏｒｍ）
において依存する、請求項４に記載の方法。 - 前記係数Ａｏｏ、Ａ１ｏ、Ａｏ１、Ａ１１、Ａ２０、Ａｏ２、ｄ及びｒｎｏｒｍが、訓練患者のコホートの治療応答との前記応答スコアの前記相関を最適化することによって決定される、請求項５に記載の方法。
- 全ての単一細胞ＡＤＣスコアの前記集合が、平均を決定することと、中央値を決定することと、予め定義されたパーセンテージを有する分位点を決定することと、からなる群から取得される、請求項１に記載の方法。
- 所定の閾値より高い応答スコアを有する患者が、前記ＡＤＣを含む治療に推奨される、請求項１に記載の方法。
- 前記ＡＤＣがトラスツズマブデルクステカン（ＤＳ－８２０１）である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＡＤＣ抗体がトラスツズマブである、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＡＤＣペイロードがトポイソメラーゼＩ阻害剤である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記診断抗体が、Ｖｅｎｔａｎａ抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ ４Ｂ５である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記色素が３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記癌患者が、乳癌、胃癌、結腸直腸癌、肺癌、食道癌、頭頸部癌、食道胃接合部癌、胆道癌、パジェット病、膵臓癌、卵巣癌、子宮癌肉腫、膀胱癌、前立腺癌、尿路上皮癌、消化管間質腫瘍、子宮頸部癌、扁平上皮癌、腹膜癌、肝臓癌、肝細胞癌、子宮内膜癌、腎臓癌、外陰癌、甲状腺癌、陰茎癌、白血病、悪性リンパ腫、形質細胞腫、骨髄腫、多形性神経膠芽腫、肉腫、骨肉腫、及び黒色腫からなる群から選択される癌を有する、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記癌患者が、乳癌、胃癌、結腸直腸癌及び肺癌からなる群から選択される癌を有する、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＡＤＣが、チオエーテル結合を介して薬物－リンカーにコンジュゲートされた抗ＨＥＲ２抗体であり、前記薬物－リンカーが、以下の式によって表され、
請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。 - 前記ＡＤＣが、
配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖と、
配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号８のアミノ酸残基１～３からなるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖と、
を含む抗ＨＥＲ２抗体を含む、請求項１６に記載の方法。 - 前記ＡＤＣが、
配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、
配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域と、
を含む抗ＨＥＲ２抗体を含む、請求項１６に記載の方法。 - 前記ＡＤＣが、
配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなる重鎖と、
配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖と、
を含む抗ＨＥＲ２抗体を含む、請求項１６に記載の方法。 - 前記ＡＤＣが、
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる重鎖と、
配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖と、
を含む抗ＨＥＲ２抗体を含む、請求項１６に記載の方法。 - 抗体薬物複合体（ＡＤＣ）で治療された癌患者の生存確率を示すスコアを生成する方法であって、
診断抗体に連結された色素を用いて前記癌患者の組織試料を免疫組織化学的に染色することであって、前記ＡＤＣは、ＡＤＣペイロードと、癌細胞上のヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）タンパク質を標的とするＡＤＣ抗体とを含み、前記診断抗体は、前記組織試料中の癌細胞上の前記ＨＥＲ２タンパク質に結合する、染色することと、
前記組織試料のデジタル画像を取得することと、
前記デジタル画像において癌細胞を検出することと、
各癌細胞について、前記癌細胞の膜及び細胞質における前記色素の染色強度に基づいて、並びに前記癌細胞に対して、所定の距離より近い他の癌細胞の前記膜及び前記細胞質における前記色素の前記染色強度に基づいて、単一細胞ＡＤＣスコアを計算することと、
統計的演算を用いて前記組織試料の全ての単一細胞ＡＤＣスコアを集合することによって、前記癌患者の前記生存確率を示す前記スコアを生成することと、
を含む、方法。 - 前記癌細胞の検出が、各癌細胞について、前記膜に属するピクセル及び前記細胞質に属するピクセルを検出することを含む、請求項２１に記載の方法。
- 各膜の前記染色強度が、前記膜のピクセルにおける褐色ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）シグナルの平均光学密度に基づいて計算され、各細胞質の前記染色強度が、前記細胞質のピクセルにおける前記褐色ＤＡＢシグナルの前記平均光学密度に基づいて計算される、請求項２１に記載の方法。
- 細胞ｉについての前記単一細胞ＡＤＣスコアが、
｜ｒｊ－ｒｉ｜＜ｄ｛ａ２０（｜ｒｊ－ｒｉ｜）ｘＯＤＭｊ ２＋ａ１１（｜ｒｊ－ｒｉ｜）ｘＯＤＭｊｘＯＤＣｊ＋ａ０２（｜ｒｊ－ｒｉ｜）ｘＯＤＣｊ ２＋ａ００（｜ｒｊ－ｒｉ｜）｝による全ての細胞ｊの合計として計算され、
式中、関数ａｋｌは、各細胞ｉに対する各細胞ｊの距離｜ｒｊ－ｒｉ｜に依存し、ＯＤＭｊは、細胞ｊの膜における褐色ＤＡＢシグナルの光学密度であり、ＯＤＣｊは、細胞ｊの細胞質における褐色ＤＡＢシグナルの光学密度である、
請求項２３に記載の方法。 - 前記関数ａｋｌが、前記細胞ｉに対する前記細胞ｊの前記距離｜ｒｊ－ｒｉ｜に、以下の関係：予め定義された定数係数Ａｏｏ、Ａ１ｏ、Ａｏ１、Ａ１１、Ａ２０、Ａｏ２による、ａｋｌ（｜ｒｊ－ｒｉ｜）＝Ａｋｌｘ ｅｘｐ（－｜ｒｊ－ｒｉ｜／ｒｎｏｒｍ）
において依存する、請求項２４に記載の方法。 - 前記係数Ａｏｏ、Ａ１ｏ、Ａｏ１、Ａ１１、Ａ２０、Ａｏ２、ｄ及びｒｎｏｒｍが、訓練患者のコホートの治療応答との前記応答スコアの前記相関を最適化することによって決定される、請求項２５に記載の方法。
- 全ての単一細胞ＡＤＣスコアの前記集合が、平均を決定することと、中央値を決定することと、所定のパーセンテージを有する分位点を決定することと、からなる群から取得される、請求項２１に記載の方法。
- 前記癌患者の前記生存確率が所定の閾値を超えることを前記スコアが示す場合、前記ＡＤＣを含む治療が前記癌患者に推奨される、請求項２１に記載の方法。
- 前記ＡＤＣがトラスツズマブデルクステカン（ＤＳ－８２０１）である、請求項２１～２８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＡＤＣ抗体がトラスツズマブである、請求項２１～２８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＡＤＣペイロードがトポイソメラーゼＩ阻害剤である、請求項２１～２８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記診断抗体が、Ｖｅｎｔａｎａ抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ ４Ｂ５である、請求項２１～２８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記色素が３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）である、請求項２１～２８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記癌患者が、乳癌、胃癌、結腸直腸癌、肺癌、食道癌、頭頸部癌、食道胃接合部癌、胆道癌、パジェット病、膵臓癌、卵巣癌、子宮癌肉腫、膀胱癌、前立腺癌、尿路上皮癌、消化管間質腫瘍、子宮頸部癌、扁平上皮癌、腹膜癌、肝臓癌、肝細胞癌、子宮内膜癌、腎臓癌、外陰癌、甲状腺癌、陰茎癌、白血病、悪性リンパ腫、形質細胞腫、骨髄腫、多形性神経膠芽腫、肉腫、骨肉腫、及び黒色腫からなる群から選択される癌を有する、請求項２１～３３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記癌患者が、乳癌、胃癌、結腸直腸癌及び肺癌からなる群から選択される癌を有する、請求項２１～３３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＡＤＣが、チオエーテル結合を介して薬物－リンカーにコンジュゲートされた抗ＨＥＲ２抗体であり、前記薬物－リンカーが、以下の式によって表され、
請求項２１～３５のいずれか一項に記載の方法。 - 前記ＡＤＣが、
配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖と、
配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号８のアミノ酸残基１～３からなるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖と、
を含む抗ＨＥＲ２抗体を含む、請求項３６に記載の方法。 - 前記ＡＤＣが、
配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、
配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域と、
を含む抗ＨＥＲ２抗体を含む、請求項３６に記載の方法。 - 前記ＡＤＣが、
配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなる重鎖と、
配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖と、
を含む抗ＨＥＲ２抗体を含む、請求項３６に記載の方法。 - 前記ＡＤＣが、
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる重鎖と、
配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖と、
を含む抗ＨＥＲ２抗体を含む、請求項３６に記載の方法。 - 抗体薬物複合体（ＡＤＣ）抗体と、ＡＤＣペイロードとを含み、そのＡＤＣ抗体が癌細胞上のタンパク質を標的とする、抗体薬物複合体に対する癌患者の応答を予測する方法であって、
診断抗体に連結された色素を使用して組織試料を免疫組織化学的に染色することであって、前記診断抗体が前記組織試料中の前記癌細胞上の前記タンパク質に結合し、前記タンパク質がヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）である、染色することと、
前記組織試料のデジタル画像を取得することと、
前記デジタル画像において癌細胞を検出することと、
各癌細胞について、膜中の色素の染色強度に基づいて単一細胞ＡＤＣスコアを計算することと、
統計的演算を用いて、前記組織試料の全ての単一細胞ＡＤＣスコアの集合に基づいて、前記ＡＤＣに対する前記癌患者の応答を予測することと、
を含む、方法。 - 各癌細胞の前記単一細胞ＡＤＣスコアがまた、前記細胞質中の前記色素の染色強度並びに／或いは前記癌細胞への所定の距離より近い他の癌細胞の前記膜及び／又は細胞質中の前記色素の染色強度に基づいて計算される、請求項４１に記載の方法。
- 前記癌細胞の検出が、各癌細胞について、前記膜に属するピクセル及び／又は前記細胞質に属するピクセルを検出することを含む、請求項４２に記載の方法。
- 各膜の前記染色強度が、前記膜のピクセルにおける褐色ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）シグナルの平均光学密度に基づいて計算され、且つ／又は各細胞質の前記染色強度が、前記細胞質のピクセルにおける前記褐色ＤＡＢシグナルの前記平均光学密度に基づいて計算される、請求項４１に記載の方法。
- 細胞ｉについての前記単一細胞ＡＤＣスコアが、
｜ｒｊ－ｒｉ｜＜ｄ｛ａ２０（｜ｒｊ－ｒｉ｜）ｘＯＤＭｊ ２＋ａ１１（｜ｒｊ－ｒｉ｜）ｘＯＤＭｊｘＯＤＣｊ＋ａ０２（｜ｒｊ－ｒｉ｜）ｘＯＤＣｊ ２＋ａ００（｜ｒｊ－ｒｉ｜）｝による全ての細胞ｊの合計として計算され、
式中、関数ａｋｌは、各細胞ｉに対する各細胞ｊの距離｜ｒｊ－ｒｉ｜に依存し、ＯＤＭｊは、細胞ｊの膜における褐色ＤＡＢシグナルの光学密度であり、ＯＤＣｊは、細胞ｊの細胞質における褐色ＤＡＢシグナルの光学密度である、
請求項４４に記載の方法。 - 前記関数ａｋｌは、前記細胞ｉに対する前記細胞ｊの前記距離｜ｒｊ－ｒｉ｜に、以下の関係：予め定義された定数係数Ａｏｏ、Ａ１ｏ、Ａｏ１、Ａ１１、Ａ２０、Ａｏ２による、ａｋｌ（｜ｒｊ－ｒｉ｜）＝Ａｋｌｘ ｅｘｐ（－｜ｒｊ－ｒｉ｜／ｒｎｏｒｍ）
において依存する、請求項４５に記載の方法。 - 前記係数Ａｏｏ、Ａ１ｏ、Ａｏ１、Ａ１１、Ａ２０、Ａｏ２、ｄ及びｒｎｏｒｍが、訓練患者のコホートの治療応答との前記応答スコアの前記相関を最適化することによって決定される、請求項４６に記載の方法。
- 全ての単一細胞ＡＤＣスコアの前記集合が、平均を決定することと、中央値を決定することと、所定のパーセンテージを有する分位点を決定することと、からなる群から取得される演算によって行われる、請求項４１に記載の方法。
- 前記癌患者の前記生存確率が所定の閾値を超えることを前記スコアが示す場合、前記ＡＤＣを含む治療が前記癌患者に推奨される、請求項４１に記載の方法。
- 前記ＡＤＣがトラスツズマブデルクステカン（ＤＳ－８２０１）である、請求項４１～４９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＡＤＣ抗体がトラスツズマブである、請求項４１～４９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＡＤＣペイロードがトポイソメラーゼＩ阻害剤である、請求項４１～４９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記診断抗体が、Ｖｅｎｔａｎａ抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ ４Ｂ５である、請求項４１～４９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記色素が３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）である、請求項４１～４９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記癌患者が、乳癌、胃癌、結腸直腸癌、肺癌、食道癌、頭頸部癌、食道胃接合部癌、胆道癌、パジェット病、膵臓癌、卵巣癌、子宮癌肉腫、膀胱癌、前立腺癌、尿路上皮癌、消化管間質腫瘍、子宮頸部癌、扁平上皮癌、腹膜癌、肝臓癌、肝細胞癌、子宮内膜癌、腎臓癌、外陰癌、甲状腺癌、陰茎癌、白血病、悪性リンパ腫、形質細胞腫、骨髄腫、多形性神経膠芽腫、肉腫、骨肉腫、及び黒色腫からなる群から選択される癌を有する、請求項４１～５４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記癌患者が、乳癌、胃癌、結腸直腸癌及び肺癌からなる群から選択される癌を有する、請求項４１～５４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＡＤＣが、チオエーテル結合を介して薬物－リンカーにコンジュゲートされた抗ＨＥＲ２抗体であり、前記薬物－リンカーが、以下の式によって表され、
請求項４１～５６のいずれか一項に記載の方法。 - 前記ＡＤＣが、
配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖と、
配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号８のアミノ酸残基１～３からなるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖と、
を含む抗ＨＥＲ２抗体を含む、請求項５７に記載の方法。 - 前記ＡＤＣが、
配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、
配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域と、
を含む抗ＨＥＲ２抗体を含む、請求項５７に記載の方法。 - 前記ＡＤＣが、
配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなる重鎖と、
配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖と、
を含む抗ＨＥＲ２抗体を含む、請求項５７に記載の方法。 - 前記ＡＤＣが、
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる重鎖と、
配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖と、
を含む抗ＨＥＲ２抗体を含む、請求項５７に記載の方法。 - ＡＤＣペイロードと、癌細胞上のタンパク質を標的とするＡＤＣ抗体とを含む抗ＨＥＲ２抗体薬物複合体（ＡＤＣ）による治療のための癌患者を同定する方法であって、
診断抗体に連結された色素を使用して前記癌患者の組織試料を免疫組織化学的に染色することであって、前記診断抗体が前記組織試料中の前記癌細胞上の前記タンパク質に結合し、前記タンパク質がヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）である、染色することと、
前記組織試料のデジタル画像を取得することと、
前記デジタル画像において癌細胞を検出することと、
各癌細胞について、膜中の色素の染色強度に基づいて単一細胞ＡＤＣスコアを計算することと、
統計的演算を用いて前記組織試料の全ての単一細胞ＡＤＣスコアを集合することによって応答スコアを生成することと、
前記応答スコアが閾値を超える場合、前記ＡＤＣの投与から利益を得る可能性が高い者として前記癌患者を同定することと、
を含む、方法。 - 前記有望な利益が、平均腫瘍サイズの減少である、請求項６２に記載の方法。
- 各癌細胞の前記単一細胞ＡＤＣスコアがまた、前記細胞質中の前記色素の染色強度並びに／或いは前記癌細胞への所定の距離より近い他の癌細胞の前記膜及び／又は細胞質中の前記色素の染色強度に基づいて計算される、請求項６２に記載の方法。
- 前記癌細胞の検出が、各癌細胞について、前記膜に属するピクセル及び／又は前記細胞質に属するピクセルを検出することを含む、請求項６４に記載の方法。
- 各膜の前記染色強度が、前記膜のピクセルにおける褐色ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）シグナルの平均光学密度に基づいて計算され、且つ／又は各細胞質の前記染色強度が、前記細胞質のピクセルにおける前記褐色ＤＡＢシグナルの前記平均光学密度に基づいて計算される、請求項６２に記載の方法。
- 細胞ｉについての前記単一細胞ＡＤＣスコアが、
｜ｒｊ－ｒｉ｜＜ｄ｛ａ２０（｜ｒｊ－ｒｉ｜）ｘＯＤＭｊ ２＋ａ１１（｜ｒｊ－ｒｉ｜）ｘＯＤＭｊｘＯＤＣｊ＋ａ０２（｜ｒｊ－ｒｉ｜）ｘＯＤＣｊ ２＋ａ００（｜ｒｊ－ｒｉ｜）｝による全ての細胞ｊの合計として計算され、
式中、関数ａｋｌは、各細胞ｉに対する各細胞ｊの距離｜ｒｊ－ｒｉ｜に依存し、ＯＤＭｊは、細胞ｊの膜における褐色ＤＡＢシグナルの光学密度であり、ＯＤＣｊは、細胞ｊの細胞質における褐色ＤＡＢシグナルの光学密度である、
請求項６６に記載の方法。 - 前記関数ａｋｌは、前記細胞ｉに対する前記細胞ｊの前記距離｜ｒｊ－ｒｉ｜に、以下の関係：予め定義された定数係数Ａｏｏ、Ａ１ｏ、Ａｏ１、Ａ１１、Ａ２０、Ａｏ２による、ａｋｌ（｜ｒｊ－ｒｉ｜）＝Ａｋｌｘ ｅｘｐ（－｜ｒｊ－ｒｉ｜／ｒｎｏｒｍ）
において依存する、請求項６７に記載の方法。 - 前記係数Ａｏｏ、Ａ１ｏ、Ａｏ１、Ａ１１、Ａ２０、Ａｏ２、ｄ及びｒｎｏｒｍが、訓練患者のコホートの治療応答との前記応答スコアの前記相関を最適化することによって決定される、請求項６８に記載の方法。
- 全ての単一細胞ＡＤＣスコアの前記集合が、平均を決定することと、中央値を決定することと、所定のパーセンテージを有する分位点を決定することと、からなる群から取得される、請求項６２に記載の方法。
- 所定の閾値より高い応答スコアを有する患者が、前記ＡＤＣを含む治療に推奨される、請求項６２に記載の方法。
- 前記ＡＤＣがトラスツズマブデルクステカン（ＤＳ－８２０１）である、請求項６２～７１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＡＤＣ抗体がトラスツズマブである、請求項６２～７１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＡＤＣペイロードがトポイソメラーゼＩ阻害剤である、請求項６２～７１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記診断抗体が、Ｖｅｎｔａｎａ抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ ４Ｂ５である、請求項６２～７１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記色素が３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）である、請求項６２～７１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記癌患者が、乳癌、胃癌、結腸直腸癌、肺癌、食道癌、頭頸部癌、食道胃接合部癌、胆道癌、パジェット病、膵臓癌、卵巣癌、子宮癌肉腫、膀胱癌、前立腺癌、尿路上皮癌、消化管間質腫瘍、子宮頸部癌、扁平上皮癌、腹膜癌、肝臓癌、肝細胞癌、子宮内膜癌、腎臓癌、外陰癌、甲状腺癌、陰茎癌、白血病、悪性リンパ腫、形質細胞腫、骨髄腫、多形性神経膠芽腫、肉腫、骨肉腫、及び黒色腫からなる群から選択される癌を有する、請求項６２～７６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記癌患者が、乳癌、胃癌、結腸直腸癌及び肺癌からなる群から選択される癌を有する、請求項６２～７６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＡＤＣが、チオエーテル結合を介して薬物－リンカーにコンジュゲートされた抗ＨＥＲ２抗体であり、前記薬物－リンカーが、以下の式によって表され、
請求項６２～７８のいずれか一項に記載の方法。 - 前記ＡＤＣが、
配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖と、
配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号８のアミノ酸残基１～３からなるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖と、
を含む抗ＨＥＲ２抗体を含む、請求項７９に記載の方法。 - 前記ＡＤＣが、
配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、
配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域と、
を含む抗ＨＥＲ２抗体を含む、請求項７９に記載の方法。 - 前記ＡＤＣが、
配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなる重鎖と、
配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖と、
を含む抗ＨＥＲ２抗体を含む、請求項７９に記載の方法。 - 前記ＡＤＣが、
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる重鎖と、
配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖と、
を含む抗ＨＥＲ２抗体を含む、請求項７９に記載の方法。 - 癌を治療する方法であって、ＡＤＣペイロードと、癌細胞上のタンパク質を標的とするＡＤＣ抗体とを含む抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を癌患者に投与することを含み、前記タンパク質がヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）であり、前記方法が、
診断抗体に連結された色素を使用して前記癌患者の組織試料を免疫組織化学的に染色することであって、前記診断抗体は、前記組織試料中の前記癌細胞上の前記タンパク質に結合する、染色することと、
前記組織試料のデジタル画像を取得することと、
前記デジタル画像において癌細胞を検出することと、
各癌細胞について、膜中の色素の染色強度に基づいて単一細胞ＡＤＣスコアを計算することと、
統計的演算を用いて前記組織試料の全ての単一細胞ＡＤＣスコアを集合することによって治療スコアを生成することと、
前記治療スコアが所定の閾値を超える場合、前記ＡＤＣを含む治療を前記癌患者に投与することと、
を含む、方法。 - 各癌細胞の前記単一細胞ＡＤＣスコアがまた、前記細胞質中の前記色素の染色強度並びに／或いは前記癌細胞への所定の距離より近い他の癌細胞の前記膜及び／又は細胞質中の前記色素の染色強度に基づいて計算される、請求項８４に記載の方法。
- 前記癌細胞の検出が、各癌細胞について、前記膜に属するピクセル及び／又は前記細胞質に属するピクセルを検出することを含む、請求項８５に記載の方法。
- 各膜の前記染色強度が、前記膜のピクセルにおける褐色ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）シグナルの平均光学密度に基づいて計算され、且つ／又は各細胞質の前記染色強度が、前記細胞質のピクセルにおける前記褐色ＤＡＢシグナルの前記平均光学密度に基づいて計算される、請求項８４に記載の方法。
- 細胞ｉについての前記単一細胞ＡＤＣスコアが、
｜ｒｊ－ｒｉ｜＜ｄ｛ａ２０（｜ｒｊ－ｒｉ｜）ｘＯＤＭｊ ２＋ａ１１（｜ｒｊ－ｒｉ｜）ｘＯＤＭｊｘＯＤＣｊ＋ａ０２（｜ｒｊ－ｒｉ｜）ｘＯＤＣｊ ２＋ａ００（｜ｒｊ－ｒｉ｜）｝による全ての細胞ｊの合計として計算され、
式中、関数ａｋｌは、各細胞ｉに対する各細胞ｊの距離｜ｒｊ－ｒｉ｜に依存し、ＯＤＭｊは、細胞ｊの膜における褐色ＤＡＢシグナルの光学密度であり、ＯＤＣｊは、細胞ｊの細胞質における褐色ＤＡＢシグナルの光学密度である、
請求項８７に記載の方法。 - 前記関数ａｋｌは、前記細胞ｉに対する前記細胞ｊの前記距離｜ｒｊ－ｒｉ｜に、以下の関係：予め定義された定数係数Ａｏｏ、Ａ１ｏ、Ａｏ１、Ａ１１、Ａ２０、Ａｏ２による、ａｋｌ（｜ｒｊ－ｒｉ｜）＝Ａｋｌｘ ｅｘｐ（－｜ｒｊ－ｒｉ｜／ｒｎｏｒｍ）
において依存する、請求項８８に記載の方法。 - 前記係数Ａｏｏ、Ａ１ｏ、Ａｏ１、Ａ１１、Ａ２０、Ａｏ２、ｄ及びｒｎｏｒｍが、訓練患者のコホートの治療応答との前記応答スコアの前記相関を最適化することによって決定される、請求項８９に記載の方法。
- 全ての単一細胞ＡＤＣスコアの前記集合が、平均を決定することと、中央値を決定することと、所定のパーセンテージを有する分位点を決定することと、からなる群から取得される、請求項８４に記載の方法。
- 前記ＡＤＣがトラスツズマブデルクステカン（ＤＳ－８２０１）である、請求項８４～９１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＡＤＣ抗体がトラスツズマブである、請求項８４～９１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＡＤＣペイロードがトポイソメラーゼＩ阻害剤である、請求項８４～９１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記診断抗体が、Ｖｅｎｔａｎａ抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ ４Ｂ５である、請求項８４～９１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記色素が３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）である、請求項８４～９１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記癌患者が、乳癌、胃癌、結腸直腸癌、肺癌、食道癌、頭頸部癌、食道胃接合部癌、胆道癌、パジェット病、膵臓癌、卵巣癌、子宮癌肉腫、膀胱癌、前立腺癌、尿路上皮癌、消化管間質腫瘍、子宮頸部癌、扁平上皮癌、腹膜癌、肝臓癌、肝細胞癌、子宮内膜癌、腎臓癌、外陰癌、甲状腺癌、陰茎癌、白血病、悪性リンパ腫、形質細胞腫、骨髄腫、多形性神経膠芽腫、肉腫、骨肉腫、及び黒色腫からなる群から選択される癌を有する、請求項８４～９６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記癌患者が、乳癌、胃癌、結腸直腸癌及び肺癌からなる群から選択される癌を有する、請求項８４～９６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＡＤＣが、チオエーテル結合を介して薬物－リンカーにコンジュゲートされた抗ＨＥＲ２抗体であり、前記薬物－リンカーが、以下の式によって表され、
請求項８４～９８のいずれか一項に記載の方法。 - 前記ＡＤＣが、
配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖と、
配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号８のアミノ酸残基１～３からなるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖と、
を含む抗ＨＥＲ２抗体を含む、請求項９９に記載の方法。 - 前記ＡＤＣが、
配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、
配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域と、
を含む抗ＨＥＲ２抗体を含む、請求項９９に記載の方法。 - 前記ＡＤＣが、
配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなる重鎖と、
配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖と、
を含む抗ＨＥＲ２抗体を含む、請求項９９に記載の方法。 - 前記ＡＤＣが、
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる重鎖と、
配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖と、
を含む抗ＨＥＲ２抗体を含む、請求項９９に記載の方法。 - 癌を治療する方法であって、ＡＤＣペイロードと、癌細胞上のタンパク質を標的とするＡＤＣ抗体とを含む抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を癌患者に投与することを含み、前記タンパク質がヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）であり、前記方法が、
応答スコアが所定の閾値を超える場合、前記ＡＤＣを含む治療を前記癌患者に投与することを含み、前記応答スコアは、統計的演算を使用して前記癌患者の組織試料の単一細胞ＡＤＣスコアを集合することによって生成され、各単一細胞ＡＤＣスコアは、膜中の色素の染色強度に基づいて各癌細胞について計算され、前記癌細胞は、前記癌患者の前記組織試料のデジタル画像において検出され、前記組織試料は、診断抗体に連結された前記色素を使用して免疫組織化学的に染色され、前記診断抗体は、前記組織試料中の前記癌細胞上の前記タンパク質に結合する、方法。 - 各癌細胞の前記単一細胞ＡＤＣスコアがまた、前記細胞質中の前記色素の染色強度及び／又は前記癌細胞への所定の距離より近い他の癌細胞の前記膜及び細胞質中の前記色素の前記染色強度に基づいて計算される、請求項１０４に記載の方法。
- 前記癌細胞の検出が、各癌細胞について、前記膜に属するピクセル及び／又は前記細胞質に属するピクセルを検出することを含む、請求項１０５に記載の方法。
- 各膜の前記染色強度が、前記膜のピクセルにおける褐色ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）シグナルの平均光学密度に基づいて計算され、且つ／又は各細胞質の前記染色強度が、前記細胞質のピクセルにおける前記褐色ＤＡＢシグナルの前記平均光学密度に基づいて計算される、請求項１０５に記載の方法。
- 細胞ｉについての前記単一細胞ＡＤＣスコアが、
｜ｒｊ－ｒｉ｜＜ｄ｛ａ２０（｜ｒｊ－ｒｉ｜）ｘＯＤＭｊ ２＋ａ１１（｜ｒｊ－ｒｉ｜）ｘＯＤＭｊｘＯＤＣｊ＋ａ０２（｜ｒｊ－ｒｉ｜）ｘＯＤＣｊ ２＋ａ００（｜ｒｊ－ｒｉ｜）｝による全ての細胞ｊの合計として計算され、
式中、関数ａｋｌは、各細胞ｉに対する各細胞ｊの距離｜ｒｊ－ｒｉ｜に依存し、ＯＤＭｊは、細胞ｊの膜における褐色ＤＡＢシグナルの光学密度であり、ＯＤＣｊは、細胞ｊの細胞質における褐色ＤＡＢシグナルの光学密度である、
請求項１０４に記載の方法。 - 前記関数ａｋｌは、前記細胞ｉに対する前記細胞ｊの前記距離｜ｒｊ－ｒｉ｜に、以下の関係：予め定義された定数係数Ａｏｏ、Ａ１ｏ、Ａｏ１、Ａ１１、Ａ２０、Ａｏ２による、ａｋｌ（｜ｒｊ－ｒｉ｜）＝Ａｋｌｘ ｅｘｐ（－｜ｒｊ－ｒｉ｜／ｒｎｏｒｍ）
において依存する、請求項１０８に記載の方法。 - 前記係数Ａｏｏ、Ａ１ｏ、Ａｏ１、Ａ１１、Ａ２０、Ａｏ２、ｄ及びｒｎｏｒｍが、訓練患者のコホートの治療応答との前記応答スコアの前記相関を最適化することによって決定される、請求項１０９に記載の方法。
- 全ての単一細胞ＡＤＣスコアの前記集合が、平均を決定することと、中央値を決定することと、所定のパーセンテージを有する分位点を決定することと、からなる群から取得される、請求項１０４に記載の方法。
- 前記ＡＤＣがトラスツズマブデルクステカン（ＤＳ－８２０１）である、請求項１０４～１１１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＡＤＣ抗体がトラスツズマブである、請求項１０４～１１１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＡＤＣペイロードがトポイソメラーゼＩ阻害剤である、請求項１０４～１１１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記診断抗体が、Ｖｅｎｔａｎａ抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ ４Ｂ５である、請求項１０４～１１１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記色素が３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）である、請求項１０４～１１１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記癌患者が、乳癌、胃癌、結腸直腸癌、肺癌、食道癌、頭頸部癌、食道胃接合部癌、胆道癌、パジェット病、膵臓癌、卵巣癌、子宮癌肉腫、膀胱癌、前立腺癌、尿路上皮癌、消化管間質腫瘍、子宮頸部癌、扁平上皮癌、腹膜癌、肝臓癌、肝細胞癌、子宮内膜癌、腎臓癌、外陰癌、甲状腺癌、陰茎癌、白血病、悪性リンパ腫、形質細胞腫、骨髄腫、多形性神経膠芽腫、肉腫、骨肉腫、及び黒色腫からなる群から選択される癌を有する、請求項１０４～１１６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記癌患者が、乳癌、胃癌、結腸直腸癌及び肺癌からなる群から選択される癌を有する、請求項１０４～１１６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＡＤＣが、チオエーテル結合を介して薬物－リンカーにコンジュゲートされた抗ＨＥＲ２抗体であり、前記薬物－リンカーが、以下の式によって表され、
請求項１０４～１１８のいずれか一項に記載の方法。 - 前記ＡＤＣが、
配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖と、
配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号８のアミノ酸残基１～３からなるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖と、
を含む抗ＨＥＲ２抗体を含む、請求項１１９に記載の方法。 - 前記ＡＤＣが、
配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、
配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域と、
を含む抗ＨＥＲ２抗体を含む、請求項１１９に記載の方法。 - 前記ＡＤＣが、
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を含む抗ＨＥＲ２抗体を含む、請求項１１９に記載の方法。 - 前記ＡＤＣが、
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる重鎖と、
配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖と、
を含む抗ＨＥＲ２抗体を含む、請求項１１９に記載の方法。
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