ES2638649T3 - Composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de disfunciones asociadas al envejecimiento - Google Patents

Composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de disfunciones asociadas al envejecimiento Download PDF

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Cédric DRAY
Claude KNAUF
Oksana KUNDUZOVA
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Universite Toulouse III Paul Sabatier
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Universite Toulouse III Paul Sabatier
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Abstract

Un agonista del receptor APJ para su uso en el tratamiento o la prevención de la sarcopenia.

Description

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La invención se ilustra adicionalmente mediante las siguientes figuras y ejemplos. No obstante, estos ejemplos y figuras no deben interpretarse en modo alguno como limitantes del alcance de la presente invención.
Descripción de las figuras
5
Figura 1 A y B: Consecuencias de un tratamiento crónico con apelina sobre la expresión de genes musculares.
Los ratones se trataron o no con apelina (0,1 µmol/kg/día) o con TFS (control) durante 28 días. Después de la eutanasia, cada músculo se congeló rápidamente en nitrógeno líquido. La expresión de ARNm se cuantificó como se describe en Material y métodos.
Figura 2: Expresión de ARNm muscular de factores implicados en la miogénesis en ratones tratados conapelina TS o CMV-KO de 80 semanas.
Después de 80 semanas, los ratones se eutanasiaron y el músculo cuádriceps se congeló rápidamente en 15 nitrógeno líquido. La expresión de ARNm se cuantificó como se describe en Material y métodos.
Figura 3: Variación de apelina en plasma en individuos sarcopénicos.
Figura 4: Efecto del tratamiento crónico con apelina en la partición de palmitato en el músculo de ratones resistentes a la insulina.
A: niveles de TG y DAG en los homogeneizados del músculo de ratones tratados con TFS (n = 7) y tratados con apelina (n = 8). Los resultados son medias ± EEM. B: Medida de la incorporación de [14C]palmitato en TG en el músculo de ratones tratados con TFS (n = 11) y tratados con apelina (n = 12). Los resultados son
25 medias ± EEM. C: OAG completa (izquierda) e incompleta (derecha) medida como se describe en el diseño y métodos de investigación. Los resultados son medias ± EEM de ratones tratados con TFS (n = 11) y tratados con apelina (n = 9). ** P <0,01.
Figura 5: El tratamiento crónico de apelina en ratones DRG aumentó las capacidades oxidativas mitocondriales y la biogénesis en el músculo.
A: la respiración del estado 2 y estado 3 se midió en fibras permeabilizadas recientes preparadas a partir de músculo esquelético sóleo de ratones tratados con TFS (n = 7) y tratados con apelina (n = 7) como se describe en el diseño y métodos de investigación. B: transferencia Western representativa de los diferentes
35 complejos mitocondriales (izquierda) y cuantificación (derecha) en ratones tratados con TFS (n = 6) y tratados con apelina (n = 7). Los resultados son medias ± EEM. * P <0,05. C: Expresión de genes en el músculo sóleo de ratones tratados con TFS (n = 5) y tratados con apelina (n = 5). Los resultados son medias ± EEM. * P <0,05. D: cantidad de ADNmt calculada como la relación de los niveles de ADN de COX1 a ciclofilina A determinados por PCR en tiempo real en el sóleo de ratones tratados con TFS (n = 4) y tratados con apelina (n = 4). ** P <0,01. Imágenes por microscopía electrónica de transmisión en aumentos de x6.000 y x25.000 en las mitocondrias SS e IMF (izquierda): E. Cuantificación del número de mitocondrias en relación con el área de la sección (análisis de tres imágenes para cada ratón) del sóleo de ratones tratados con TFS (n = 4) y tratados con apelina (n = 5) (derecha).
45 Figura 6: Los efectos de apelina en OAG y la biogénesis mitocondrial en el músculo son dependientes de la activación de AMPK.
A: expresión de la proteína fosfo-AMPK y fosfo-ACC después del tratamiento con TFS (n = 3) o apelina (n = 4) en el músculo de los ratones resistentes a la insulina. El gráfico muestra los datos cuantificados (n = 4). B: concentración de malonil-CoA en el músculo sóleo de ratones tratados con TFS (n = 6) o tratados con apelina (n = 6). C: OAG total se midió como se describe en el diseño y métodos de investigación en ratones TS y AMPK-DN tratados con TFS y con apelina DRG. Los resultados son medias ± EEM; n = 4 en cada grupo. D: cantidad de ADNmt calculado como la relación de los niveles de ADN de COX1 a ciclofilina A determinados por PCR en tiempo real en el sóleo de los diferentes ratones; n = 4 en cada grupo. E: expresión de genes en
55 el músculo sóleo de ratones TS y AMPK-DN tratados con TFS y con apelina. Los resultados son medias ± EEM; n = 4 en cada grupo. * P <0,05. ** P <0,01.
Figura 7: Efecto del tratamiento crónico con apelina en el músculo de los ratones resistentes a la insulinaen niveles de acilcarnitina y la captación de glucosa estimulada por insulina.
A: los niveles de acilcarnitina de especies de cadena larga se midieron en ratones alimentados con DN (n = 5) y en ratones alimentados con DRG tratados con apelina (n = 8) o con TFS (n = 7). Los resultados son medias ± EEM. * P <0,05. B: captación de glucosa inducida por insulina en el músculo sóleo de ratones tratados con TFS (n = 7) y tratados con apelina (n = 6). Los resultados son medias ± EEM. * P <0,05, ** P
65 <0,01. 2-DG, 2- desoxiglucosa; Prot, proteína.
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Mundolsheim, Francia) que se utilizan en una dilución 1/1.000. Las membranas se sondaron con β-actina o AMPK o anticuerpos ACC para las proteínas totales.
Prueba de proteínas.
5 La concentración de las muestras se determinó utilizando el kit de ensayo de proteínas DC (Bio-Rad) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
PCR en tiempo real.
ARN totales (1 µg) se aislaron a partir del músculo utilizando RNA STAT (AMS Technology, Lutterworth, R.U.) y se transcribieron de forma inversa utilizando hexámeros aleatorios y transcriptasa inversa Superscript II (Invitrogen, Paisley, R.U.). PCR en tiempo real se realizó como se ha descrito previamente (1). El análisis de ARN ribosómico 18S se realizó utilizando el control de ARN ribosomal del kit de ensayo TaqMan (Applied Biosystems) para
15 normalizar la expresión génica.
Captación de glucosa.
Los músculos se aislaron y se preincubaron durante 10 min en tampón Krebs-Henseleit (pH 7,4) que contiene 2 mg/ml de ASB, 2 mmol/l de piruvato de sodio, y 20 mmol/l de HEPES. Los músculos se incubaron durante 45 min en ausencia o presencia de 100 nmol/l de insulina como se ha notificado previamente (4).
Análisis estadístico.
25 Los datos se presentan como medias ± EEM. Las comparaciones entre grupos se llevaron a cabo para diferentes parámetros utilizando software 5.0 (GraphPad Software) Prism. Una ANOVA bidireccional se aplicó para detectar la interacción entre el tratamiento y el tiempo. Cuando proceda, se aplicó el ensayo t de Student para datos apareados
o no apareados. Diferencias a P <0,05 se consideraron estadísticamente significativas.
Resultados y discusión
Efecto del tratamiento crónico con apelina en ratones con DRG (dieta rica en grasas) en el metabolismo lipídico del músculo esquelético ex vivo.
35 El tratamiento con apelina en ratones con DRG no reduce la cantidad de IMTG y DAG en comparación con el tratamiento con TFS (Fig. 4A). El tratamiento con apelina tampoco tuvo efecto alguno sobre la tasa de incorporación de palmitato en TG (Fig. 4B). Para investigar más el destino de los lípidos, se evaluaron tanto la oxidación completa como incompleta de [14C]palmitato. El tratamiento crónico con apelina aumentó significativamente la oxidación completa de [14C]palmitato a CO2 en el músculo sóleo en comparación con el tratamiento con TFS (Fig. 4C). De interés, la oxidación incompleta no se aumentó significativamente por el tratamiento crónico con apelina (Fig. 4C). Además, en el sóleo de ratones con apelina con DRG-/-, no se aumentó la oxidación completa (243,5 ± 9,6 vs. 198,4 ± 59,9 nmol de CO2 liberado por gramo de proteína en ratones con apelina-/-, n = 3-4). En conjunto, estos resultados muestran que el tratamiento con apelina promueve la OAG (oxidación de ácidos grasos) completa en el músculo esquelético de ratones obesos y resistentes a la insulina.
45 Efecto del tratamiento crónico con apelina en ratones con DRG sobre la actividad mitocondrial muscular y la densidad.
Para conseguir la mayor comprensión hacia el efecto de apelina, la respiración mitocondrial se evaluó primero en las fibras musculares recién permeabilizadas. No se encontró diferencia alguna en la respiración mitocondrial estimulada por glutamato/malato entre ratones tratados con TFS y con apelina, lo que sugiere que la actividad del complejo I no se vio afectada por el tratamiento con apelina (datos no mostrados). No obstante, la respiración mitocondrial estimulada por succinato fue significativamente mayor en las fibras de los ratones tratados con apelina en comparación con el control, lo que sugiere un aumento de la capacidad oxidativa del complejo II que utiliza 55 coenzimas derivadas de la OAG (Fig. 5A). La respiración estimulada por succinato y adenilato también fue significativamente mayor en los ratones tratados con apelina, lo que indica que la capacidad de fosforilación oxidativa aumentó en el sóleo después del tratamiento con apelina. La expresión de proteínas del complejo II, III y V también aumentó significativamente en los ratones tratados con apelina (Fig. 5B). Además, un aumento de la actividad de la citrato sintasa, un marcador cuantitativo del contenido de mitocondrias, también se descubrió en los homogeneizados del músculo de ratones tratados con apelina en comparación con el control (2,62 ± 0,02 vs. 2,91 ± 0,07 µmol/min/mg de proteínas, n = 7-9; P <0,001). La expresión del receptor γ coactivador 1-α activado por el proliferador de peroxisoma (PGC1-α), un coactivador transcripcional que media la biogénesis mitocondrial, también fue significativamente mayor en el músculo de ratones tratados con apelina, mientras que la expresión de PGC1-β no se modificó (Fig. 5C). Además, la expresión del factor nuclear respiratorio 1 (NRF1) y el factor de transcripción 65 mitocondrial A (TFAM), que actúan concertadamente para aumentar la fosforilación oxidativa mitocondrial y la biogénesis mitocondrial, también se regularon positivamente. En conjunto, estos resultados sugieren fuertemente
20
que en respuesta al tratamiento con apelina, la biogénesis mitocondrial aumentó en el músculo esquelético de ratones resistentes a la insulina. Para poner a prueba esta hipótesis, se midió el ADNmt muscular y la densidad. La relación de ADNmt a ADN nuclear fue significativamente mayor en el músculo sóleo de ratones tratados con apelina que en los ratones tratados con TFS (Fig. 5D). Además, la microscopía electrónica demostró que el tratamiento con
5 apelina aumentó significativamente la densidad de mitocondria intramiofibrilar (IMF) (Fig. 5E), la mayor fracción del contenido total de mitocondrias. Menos alteraciones adversas de la ultraestructura mitocondrial (densidad de electrones reducida de la matriz y la pérdida de crestas) también se observaron en ambas mitocondrias IMF y subsarcolemales (SS) del músculo sóleo de ratones tratados con apelina (Fig. 5E), fortaleciendo el efecto de apelina en la función mitocondrial y la biogénesis.
Para estudiar más a fondo el mecanismo de acción de apelina, se determinó primero la implicación del receptor APJ en los efectos de apelina. Para este fin, los ratones se trataron durante el mismo periodo con apelina solo o apelina y un antagonista del receptor APJ específico (F13A), el antagonista F13A se comportó como un antagonista funcional. En el músculo de ratones tratados con F13A/apelina, la OAG y la biogénesis mitocondrial se abrogaron en
15 comparación con los ratones tratados con apelina (datos no mostrados), indicando que la apelina ejerce sus efectos beneficiosos a través de la activación de APJ.
A continuación, se investigó el papel de la AMPK en la mediación de los efectos de apelina ya que la apelina es conocida por activar AMPK en el músculo esquelético y la AMPK está implicada tanto en la OAG como en la biogénesis mitocondrial. El tratamiento con apelina aumentó significativamente tanto la fosforilación de AMPK como de ACC en el músculo de los ratones resistentes a la insulina (Fig. 6A). La inhibición de la actividad de la ACC (como resultado del aumento de la fosforilación) tuvo por consecuencia una reducción significativa de las concentraciones de malonil-CoA en el músculo de ratones tratados con apelina (Fig. 6B). Además, el aumento de la OAG y la biogénesis mitocondrial observada en ratones tratados con apelina TS con DRG fue completamente
25 mitigado en el músculo de ratones tratados con apelina AMPK-DN con DRG, y la sobreexpresión de PGC1-α, TFAM, y NRF1 se redujo (Fig. 6C-E). De este modo, la AMPK es una diana directa de apelina y se requiere para el efecto de apelina en OAG y la biogénesis mitocondrial.
El tratamiento crónico con apelina en ratones con DRG mejora la sensibilidad a la insulina del músculo.
Las acilcarnitinas representan subproductos de catabolismo de sustratos procedentes de OAG incompleta. El aumento de los niveles de acilcarnitina ha demostrado estar asociado con la obesidad y resistencia a la insulina. Las acilcarnitinas de cadena larga se incrementaron en los homogeneizados de músculo sóleo de ratones resistentes a la insulina con DRG en comparación con los ratones de control con DN (Fig. 7A). Es interesante que en los ratones
35 tratados con apelina con DRG, los niveles de acilcarnitina, especialmente las especies C16:1 y C18:1, se redujeron cuando se compara con los ratones tratados con TFS con DRG. Dado que el tratamiento crónico con apelina aumentó la OAG completa pero no incompleta en el sóleo, la hipótesis era que los niveles más bajos resultantes de acilcarnitinas se correlacionan con una mejor sensibilidad a la insulina en el músculo. De hecho, la captación de glucosa estimulada por la insulina, fue significativamente superior en el músculo de ratones tratados con apelina en comparación con los ratones tratados con TFS (Fig. 7B).
Conclusión:
Los inventores muestran que el tratamiento crónico con apelina aumenta la OAG completa, la capacidad respiratoria
45 mitocondrial, y la biogénesis mitocondrial en el músculo esquelético de los ratones resistentes a la insulina. La afluencia de lípidos en las mitocondrias se asoció con una disminución de los niveles de acilcarnitina, lo que sugiere un acoplamiento más duro entre la OAG y el ciclo del ácido tricarboxílico. Tal acoplamiento más duro parece importante para mejorar la sensibilidad a la insulina ya que se observa un aumento del transporte de glucosa estimulado por insulina en el músculo de ratones tratados con apelina. Un aumento de OAG y la biogénesis mitocondrial en el músculo y la disminución de la adiposidad total podrían contribuir a la mejora general de la sensibilidad a la insulina observada con el tratamiento crónico con apelina.
El tratamiento crónico con apelina activa una mejora tanto del metabolismo de lípidos como de la glucosa. El tratamiento crónico con apelina optimiza el rendimiento mitocondrial del músculo mediante el aumento de la
55 biogénesis mitocondrial y una coincidencia estrecha entre la OAG y el ciclo del ácido tricarboxílico. De este modo, el agonista del receptor APJ similar a apelina o un apelinomimético se debe utilizar en el tratamiento o la prevención de problemas asociados con la enfermedad en el mecanismo energético en las mitocondrias similar a una disfunción asociada con el envejecimiento y más particularmente en el tratamiento o la prevención de la disfunción del músculo esquelético (similar a sarcopenia) o músculo cardíaco.
Referencias
A lo largo de la presente solicitud, diversas referencias describen el estado de la técnica a la que pertenece la presente invención. 65
21

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