WO2007072980A1 - アペリンの新規用途 - Google Patents

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WO2007072980A1
WO2007072980A1 PCT/JP2006/325703 JP2006325703W WO2007072980A1 WO 2007072980 A1 WO2007072980 A1 WO 2007072980A1 JP 2006325703 W JP2006325703 W JP 2006325703W WO 2007072980 A1 WO2007072980 A1 WO 2007072980A1
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apelin
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acid sequence
receptor
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PCT/JP2006/325703
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Ryo Fujii
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Takeda Pharmaceutical Company Limited
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Definitions

  • the present invention relates to the use of a substance that promotes the function of APJ, which is a receptor for apelin, which is a physiologically active peptide. More specifically, the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising a substance that promotes the function of the apelin receptor APJ, and a disease characterized by using the pharmaceutical composition, particularly prevention of mood disorders, drug dependence, etc. It relates to therapeutic agents. Background of the Invention
  • Mood disorders refer to mental disorders in which a depressed mood continues or unusual mood ups and abnormalities continue for a certain period of time. Commonly known disease names are classified into bipolar disorder in which both a manic state and a depressed state appear repeatedly, and a depression only in a depressed state. On the other hand, if anxiety persists over a long period of time and interferes with daily life, anxiety is diagnosed, but anxiety and depression are not completely different and are closely related. In addition to mental symptoms such as excessive anxiety, irritability, and difficulty concentrating, physical symptoms such as sleep disturbance, loss of appetite, general malaise, and fatigue are often observed.
  • drugs such as thinners, narcotics, stimulants, hypnotics, and tranquilizers deviate from their legitimate purposes and are used to change moods and enjoy pleasures. And or a state of physical dependence is called drug dependence As a result, mental disorders including hallucinations and delusions are caused.
  • psychotherapy usually individual psychotherapy
  • Apellin is a bioactive peptide isolated as an endogenous ligand of APJ, one of the G protein-coupled receptors (W099 / 33976; Tatemoto et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 251, 471- 476
  • Apellin binds to APJ specifically and with high affinity, and causes intracellular signal transduction (such as suppression of cAMP production) via inhibitory G protein (G i). It has become clear that it has physiological activity.
  • APJ is expressed in the mammalian brain (Hosoya et al., Journal of Biological Chemi stry 275, 21061-21067 (2000)), especially expressed in glial cells (Medhurst et al. , Journal of Neurochemistry 84, 1162-1172 (2003)), but it is known that apelin and its receptor APJ are involved in the development of central disorders such as mood disorders and drug dependence. It wasn't. Disclosure of the invention
  • the present inventors examined in detail the mRNA expression change of APJ in brain samples derived from patients with various central diseases obtained by gene chip analysis. As a result, we found that APJ mRNA expression was decreased in the brains of depressed patients and cocaine abusers, and substances that promote the functions of apelin and APJ (eg, agonists) are mood disorders, drug abuse, etc. It was found that it could be used as a therapeutic drug. The inventors of the present invention have further advanced research based on these findings, and have completed the present invention.
  • a preventive or therapeutic agent for mood disorders or drug dependence containing a substance that promotes the function of the apelin receptor;
  • the apelin receptor is identical or actual to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the agent according to the above (1) which is a protein containing a qualitatively identical amino acid sequence;
  • a substance that promotes the function of the apelin receptor is (a) 'apelin, (b) a apelin derivative having activity equal to or higher than that of apelin, or (c) a small molecule synthesis that promotes the binding of apelin and its receptor.
  • Apelin is SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 1 1, SEQ ID NO: 1 2, SEQ ID NO: 1 3, SEQ ID NO: 1 4 , SEQ ID NO: 1 5, SEQ ID NO: 1 6, SEQ ID NO: 1 7, SEQ ID NO: 1 S, SEQ ID NO .: 1 9, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 2 1, SEQ ID NO: 2 2,
  • the agent according to (5) above which is a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23 or SEQ ID NO: 24;
  • the apelin is a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 2, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 23 ;
  • Apelin or (b) Apelin derivative having activity equal to or higher than that of Apelin, or ( c ) A low molecular weight synthetic compound that promotes binding of Apelin and its receptor.
  • Apelin is SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 1 1, SEQ ID NO: 1 2, SEQ ID NO: 1 3, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 1 5, SEQ ID NO: 1 6, SEQ ID NO: 1 7, SEQ ID NO: 1 8, SEQ ID NO: 1 9, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 Or the above (1) which is a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24
  • FIG. 1 shows the behavioral observation results of wild-type mice (WT) and apelin gene knockout mice (K0) by the open field test.
  • Fig. 1A shows the time (latency, in seconds) required to move to the next adjacent compartment from the moment when the mouse is placed in the centermost compartment on the bottom of the device.
  • the present invention is characterized by using a pharmaceutical composition comprising a substance that promotes the function of apelin receptor AP (hereinafter also referred to as the promoter of the present invention), and using the pharmaceutical composition.
  • a pharmaceutical composition comprising a substance that promotes the function of apelin receptor AP (hereinafter also referred to as the promoter of the present invention), and using the pharmaceutical composition.
  • Examples of the substance that promotes the function of the apelin receptor constituting the pharmaceutical composition of the present invention include compounds having an agonist activity with respect to the receptor, apelin receptor such as a polypeptide, agonist, apelin, and apelin.
  • Apelin derivative having an activity equal to or higher than that for example, an apelin derivative described in WO 0 0/1 8 7 9 3, WO 0 1 7 0 7 6 9, etc.
  • APJ which is a receptor for apelin
  • the substance that promotes the function of the apelin receptor may be, for example, an apelin gene (DNA encoding the apelin) or an expression vector containing the apelin gene, and promotes the function of the apelin receptor.
  • apelin refers to human warm-blooded animals (eg, guinea pigs, Any tissue (eg, pituitary, spleen, brain, kidney, liver, gonad, thyroid, gall bladder, bone marrow, adrenal gland, skin, muscle, lung, gastrointestinal tract) A peptide derived from, for example, a blood vessel, a heart, etc.) or a cell, etc., which contains the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11
  • the peptide containing the amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 1 is the same or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 1.
  • Peptides containing an amino acid sequence and having activity to promote the function of the apelin receptor are preferred.
  • the peptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 1 includes: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 or sequence A peptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by No. 9 is also included.
  • apelin means (1) a peptide containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, and (2) SEQ ID NO: 5 A peptide containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by (3), (3) a peptide comprising an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 (4) including a peptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9.
  • SEQ ID NO: 3 1 or more and 7 or less, preferably 1 or more and 5 or less, more preferably 1 or more and 3 or less in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 9.
  • SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, or 1 to 20 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, preferably 1 to 15 amino acids, more preferably 1 to 10 amino acid sequences added (or inserted), (3) SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 Or 1 to 7 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, preferably 1 or more 5 or less, more preferably peptides of 3 or less amino acids 1 or more contains the amino acid sequence are substituted by other amino acids Etc. .
  • the apelin targeted by the promoter of the present invention is, in particular, an apelin containing an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: -No .: 5, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: _9. (Precursor) is preferred, and apelin containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 (human type apelin (precursor)) is preferred .
  • a peptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 1 is represented by SEQ ID NO: 1 3, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15 Peptides containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence are also included. That is, in this specification, “Abe'lin” means (1) a peptide containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13; (2) SEQ ID NO: (1) a peptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by (4); (3) an amino acid identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15; Including peptides containing sequences.
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 3, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15 is as follows: (1) SEQ ID NO: 13, 1 or more and 7 or less, preferably 1 or more and 5 or less, more preferably 1 or more and 3 or less, particularly preferably 1 or more, in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 4 or SEQ ID NO: 1 5 An amino acid sequence in which one or more and two or less, most preferably one amino acid is deleted.
  • SEQ ID NO: 14 amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 and about 50 to 99.9%. (Preferably 70 to 99.9%, more preferably 80 to 99.9%, further Preferably 90 to 99..9%,-particularly preferably 93 to 99.9%, most preferably 95 to 99.9%). Raise it.
  • the apelin targeted by the promoter of the present invention is particularly preferably a apelin (Apelin 36) containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, or SEQ ID NO: 15; Furthermore, apelin (hyperin 36) containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 is preferred.
  • amino acid sequence of the first to 25th and 35th to 36th amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 3, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15 (1) 1 or more 7 or less, preferably 1 or more and 5 or less, more preferably 1 or more and 3 or less, particularly preferably 1 or more and 2 or less, and most preferably 1 amino acid deleted amino acid sequence, (2 ) 1 or more and 20 or less, preferably 1 or more and 15 or less, more preferably 1 or more and 10 or less, particularly preferably 1 or more and 7 or less, and particularly preferably 1 or more and 5 or less, Most preferably, an amino acid sequence to which amino acids of 1 to 3 amino acids are added (or inserted).
  • amino acids preferably 1 to 5 amino acids, more preferably 1 amino acid. 3 or less, particularly preferably 1 or more and 2 or less, most preferably 1 Well as a peptide of amino acids containing the amino acid sequence are substituted with other amino acids, preferably as "Aperin".
  • the peptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 1 contains an amino acid that is the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12
  • peptides containing acid sequences that is, in this specification, “apelin” includes a peptide containing the amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 or the like.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 is “substantially identical to the amino acid sequence .. (1.). 1 or more in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 7 1 or more, preferably 1 'or more and 5 or less, more preferably 1 or more and 3 or less, particularly preferably 1 or more and 2 or less, and most preferably 1 amino acid deleted amino acid sequence, (.
  • SEQ ID NO: 1 2 1 to 7 in the amino acid sequence preferably 1 to 5 and more preferably Is properly 1 or more 3 or less, particularly preferably 2 on one or more or less, most preferably not base peptide which amino acids 1 value contains Amino acid sequences are substituted by other amino acids.
  • the polypeptide containing an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 is approximately 50 to 99.9% of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 (preferably Homogeneity of 70-99.9%, more preferably 80-99.9%, more preferably 90-99.9%, particularly preferably 93-99.9%). And a polypeptide containing the amino acid sequence.
  • the apelin targeted by the promoter of the present invention is particularly preferably a apelin containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 (Apelin 1 13).
  • SEQ ID NO: 1 2nd to 1st to 3rd SEQ ID NO: 23), 3rd to 1st to 3rd.
  • SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 24
  • 2nd-1 2nd, 3rd-1st 2nd SEQ ID NO: 1 7)-
  • 2nd-1st 1st SEQ ID NO: 1 7)
  • Peptide consisting of amino acid sequence especially 2nd to 1st, 3rd (SEQ ID NO: 23), 3rd to 1st 3rd (SEQ ID NO: 16), 1st ⁇ 1 2nd (SEQ ID NO: 24), 1st ⁇ 1 1st (SEQ ID NO: 1 7), 3rd ⁇ 1 1st (SEQ ID NO: 1 1) Peptide consisting of amino acid sequence, “Apelin” is preferred.
  • the peptide containing the amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 1 includes SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 42 to 77 of the amino acid sequence of 9 (SEQ ID NO: 1 3, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 1 ⁇ 5), 43rd to 77th, 44th to 7th, 45th ⁇ 77th, 46th to 77th, 47th to 77th, 48th to 77th, 49th to 77th, 50th to 77th, 5th 1st to 77th, 52nd -77th, 53rd-77th, 54th-77th, 55th-77th, 56th-77th, 57th-77th, 58th-77th, 59th 6th to 77th, 60th to 77th, 6th 1st to 77th, 62nd to 77th (SEQ ID NO: 20), 63rd to 77th (S
  • SEQ ID NO: 14 As a peptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 1, the 42nd to 77th amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 (SEQ ID NO: 14); SEQ ID NO: 7 from amino acid sequence 42 to 77 of amino acid sequence (SEQ ID NO: 1 3); SEQ ID NO: 9 from amino acid sequence 42 to 77 (SEQ ID NO: 15); SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 9 amino acid sequence, 62nd to 77th (SEQ ID NO: 20), 63rd to 77th (SEQ ID NO: 19), 64th Th to 77th (SEQ ID NO: 18), 65th to 77th (SEQ ID NO: 1 2, Apelin—1 3), 66th to 77th (SEQ ID NO: 23), 6th to 77th (SEQ ID NO: 16), 61st to 76th (SEQ ID NO: 21), 65th
  • the apelin receptor (AP J) targeted by the promoter of the present invention is preferably, for example, a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • substantially identical means SEQ ID NO: About 50 to 99.9% (preferably 70 to 99.9%, more preferably 80 to 99.9%, more preferably 90 to 99.9%) with the amino acid sequence represented by 1. Means that.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is as follows: (1) 1 to 7 amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 An amino acid sequence in which preferably 1 or more and 5 or less, more preferably 1 or more and 3 or less amino acids are deleted. (2) 1 or more and 20 or less in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • amino acids Preferably 1 or more and 15 or less, more preferably 1 or more and 10 or less amino acids added (or inserted), (3) SEQ ID NO: 1 in the amino acid sequence represented by 1 Also included are peptides containing an amino acid sequence in which one or more and seven or less, preferably one or more and five or less, more preferably one or more and three or less amino acids are substituted with other amisic acids.
  • the polypeptide is represented in accordance with the convention of peptide notation by the left end] ⁇ -terminal (amino terminal) and the right end C-terminal (carboxyl terminal).
  • the C-terminus is usually a carboxyl group (one COOH) or a carboxylate (—COO—), but the C-terminus is an amide (—CONH 2 ) or an ester (one COOR). Or a salt may be formed.
  • R in the ester examples include C 1-6 alkyl groups such as methyl, ethyl, n-propyl, 'isopropyl or n_butyl, C 3-8 cycloalkyl groups such as cyclopentyl and cyclohexyl, phenol, ⁇ —C 6-12 aryl groups such as naphthynole, phenyl-C 2 alkyls such as benzinole, phenethyl, benzhydryl or ⁇ -naphthyl mono C, _ 2 alkyls such as naphthylmethyl C 7-14 7 Examples include aralkyl groups and bivalyloxymethyl groups which are widely used as oral esters.
  • the polypeptide of the present invention When the polypeptide of the present invention has a carboxyl group or a carboxylate other than the C-terminus, the polypeptide of the present invention includes those in which these groups are amidated or esterified. It is. As the ester at this time, for example, the above-mentioned C-terminal ester or the like is used.
  • the polypeptides of the present invention also include those in which the N-terminal side of G 1 n is cleaved in vivo and G 1 n is pyroglutamine oxidized.
  • polypeptides of the present invention include those having Met added to the N-terminus. These partial peptides may also be used.
  • a salt of the polypeptide of the present invention a salt with a physiologically acceptable base (for example, alkali metal) or an acid (organic acid, inorganic acid) is used. Salts are preferred. Examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrofluoric acid, sulfuric acid), or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid). And salts with tartaric acid, citrate, lingoic acid, oxalic acid, benzoic acid, 'methanesulfonic acid, and benzenesulfonic acid).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrofluoric acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, for
  • the polypeptide of the present invention can be produced by a method of purifying a polypeptide from human warm-blooded animal tissue or cells, or can be produced according to the polypeptide synthesis method described below. It can also be produced by culturing a transformant containing DNA encoding a polypeptide described below.
  • the tissue or cells of human warm-blooded animals are homogenized and then extracted with acid, etc., and the extract is subjected to salting out, dialysis, gel It can be purified and isolated by combining chromatography such as filtration, reverse phase chromatography, ion exchange chromatography and affinity chromatography.
  • the polypeptide of the present invention can be produced by a known method for synthesizing a polypeptide or by cleaving a polypeptide containing the polypeptide of the present invention with an appropriate peptide.
  • a peptide synthesis method for example, either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method may be used. That is, the partial peptide or amino acid that can constitute the polypeptide of the present invention is condensed with the remaining part, and when the product has a protective group, the target peptide is produced by removing the protective group. can do.
  • Examples of known condensation methods and protecting group removal include the methods described in the following (a) and (e).
  • polypeptide of the present invention can be purified and isolated by combining the above, etc.
  • solvent extraction 'distillation column chromatography, liquid chromatography, recrystallization
  • the polypeptide of the present invention can be purified and isolated by combining the above, etc.
  • the polypeptide obtained by the above method is a mobile body, it can be converted into an appropriate salt by a known method, Conversely, when it is obtained as a salt, it can be converted into a free form by a known method.
  • peptide amide a commercially available peptide synthesis resin suitable for amide formation can be used.
  • resins include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzpyrylamine resin, aminomethyl resin, 4_benzyloxybenzyl alcohol resin, .4-methylbenzhydrylamine resin, PAM Resin, 4-Hydroxymethylmethyl phenylacetamide methyl resin, Polyacrylamide resin, 4_ (2 ', 4'-Dimethoxyphenyl-hydroxymethylenole) Phenoxy resin, 4- (2', 4, 1-dimethoxyphenyl 1 Fmocaminoethyl) and phenoxy resins.
  • an a-amino group and an amino acid having a side chain functional group appropriately protected are condensed on the resin according to various known condensation methods according to the sequence of the desired peptide.
  • the peptide is excised from the resin and at the same time various protecting groups are removed.
  • intramolecular disulfide bond-forming reaction is performed in a highly diluted solution to obtain the desired polypeptide.
  • various activating reagents that can be used for peptide synthesis can be used, and calpositimides are particularly preferable.
  • carbodiimides examples include DCC, N, N'-diisopropyl carbodiimide, N-ethyl-N '-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, and the like.
  • a protected amino acid together with a racemization inhibitor for example, HOB t, HOOB t, etc.
  • a racemization inhibitor for example, HOB t, HOOB t, etc.
  • N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone which acid amides, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform, alcohols such as trifluoroethanol, sulfoxides such as dimethyl sulfoxide, tertiary amines such as pyridine, dioxane, tetrahydrofuran And ethers such as acetonitrile, nitriles such as acetonitrile and propionitryl, esters such as methylol acetate and ethyl acetate, and appropriate mixtures thereof.
  • halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform
  • alcohols such as trifluoroethanol
  • sulfoxides such as dimethyl sulfoxide
  • tertiary amines such as pyridine
  • dioxane dioxane
  • tetrahydrofuran And ethers
  • the reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for peptide bond formation reaction, and is usually selected appropriately from the range of about 120 ° C. to 50 ° C.
  • Activated amino acid derivatives are usually used in an excess of 1.5 to 4 times.
  • ninhydrin reaction if the condensation is insufficient, sufficient condensation can be performed by repeating the condensation reaction without removing the protecting group.
  • unreacted amino acid can be acetylated with succinic anhydride or acetyl imidazole so that it does not affect the subsequent reaction.
  • Examples of the group include Z, B oc, tertiary pentinoreoxycanoleboninole, isobonoreninoreoxycanoleboninole, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, C1-Z, Br- Z, adamantino oxycarboninole, trifonoreoloacetinole, phthaloidore, honoreminore, 2-nitrophenenolesnophenyl, diphenyl .
  • oils such as F moc and the like as the protecting group for carboxyl group, for example the above-mentioned Flip Bok 6 alkyl group as R, C 3 - 8 cyclo alkyl group, other C 7 _ 14 Ararukiru group, 2 —Adamantyl, 4-nitrobenzil, 4-methoxybenzyl, 4-chlorobenzyl, phenacyl group and benzyloxycarbonyl hydrazide, tertiary-butoxycarbonyl hydrazide, and tritinolehydrazide.
  • Flip Bok 6 alkyl group as R
  • C 3 - 8 cyclo alkyl group other C 7 _ 14 Ararukiru group
  • 2 Adamantyl, 4-nitrobenzil, 4-methoxybenzyl, 4-chlorobenzyl, phenacyl group and benzyloxycarbonyl hydrazide, tertiary-butoxycarbonyl hydrazide, and tritinole
  • the hydroxyl groups of serine and threonine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • groups suitable for esterification include lower alkanol groups such as acetyl groups, aroyl groups such as benzoyl groups, groups derived from carbon such as benzyloxycarbonyl groups and ethoxycarbonyl groups.
  • groups suitable for etherification include a benzyl group, a tetrasyldrobiranyl group, and a tertiary butyl group.
  • Examples of protecting groups for the phenolic hydroxyl group of tyrosine include B z and C 1 2- Bzl, 2-bistrobenzyl, Br-Z, tertiary butyl and the like.
  • Examples of protecting groups for histidine imidazole include Tos, 4-methoxy 2, 3, 6-trimethylbenzenesulphonyl, DNP, benzyloxymethyl, B um, B oc, T rt, and Fmo c. .
  • the activated carboxyl group of the raw material includes, for example, the corresponding acid anhydride, azide, activated ester [alcohol (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2, 4_dinitro Phenol, cyanome alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinide, ---. N-hydroxyphthalimide, ester with HOB t-)] and the like.
  • alcohol eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2, 4_dinitro Phenol, cyanome alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinide, ---. N-hydroxyphthalimide, ester with HOB t-
  • An example of the activated amino group of the raw material is the corresponding phosphate amide.
  • Examples of methods for removing (eliminating) protecting groups include catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd black or Pd carbon, and anhydrous hydrogen fluoride, methanesulfonic acid, trifluoro.
  • a catalyst such as Pd black or Pd carbon
  • anhydrous hydrogen fluoride methanesulfonic acid, trifluoro.
  • Examples include acid treatment with lomethanesulfonic acid, trifluoroacetic acid or a mixture thereof, base treatment with diisopro-pyrutylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., and reduction with sodium in liquid ammonia.
  • the elimination reaction by the acid treatment is generally carried out at a temperature of 20 ° C.
  • the 2,4-dinitrophenyl group used as the imidazole protecting group of the seven stidines is removed by thiophenol treatment
  • the formyl group used as the indole protecting group of tryptophan is the above 1,2_ethanedithiol, 1
  • it can also be removed by alkali treatment with dilute sodium hydroxide or dilute ammonia.
  • the protection of the functional group that should not be involved in the reaction of the raw material and the protection group, the elimination of the protective group, the activation of the functional group involved in the reaction, etc. can be appropriately selected from known groups or known means.
  • an amide form of a polypeptide first, the ⁇ -carboxyl group of the carboxyl-terminal amino acid is amidated, and then the peptide chain is located on the amino group side. After extending to the desired chain length, the peptide (or amino acid) except for the peptide except for the N-terminal amino group protecting group and the C-terminal carboxyl group protecting group of the peptide chain. And the two peptides are condensed in a mixed solvent as described above. The details of the condensation reaction are the same as described above. After purifying the protective peptide obtained by condensation, all the protecting groups are removed by the above-described method to obtain the desired crude polypeptide. 'This crude polypeptide can be purified using various known purification means, and the amide of the desired polypeptide can be obtained by lyophilizing the main fraction.
  • polypeptide of the present invention may be any one as long as it has the same action as the above-described polypeptide (for example, the action of inhibiting the migration / proliferation of vascular endothelial cells, the action of inhibiting angiogenesis, etc.). Even a peptide like this.
  • Examples of such a peptide include one or more peptides from the peptide containing the partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 9 described above.
  • a peptide containing an amino acid sequence lacking amino acids can be mentioned. Specifically, it is represented by SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 9.
  • Peptides having a partial sequence of amino acid sequence are preferred.
  • the polypeptide of the present invention may further be a fusion protein with a protein whose function or property is well known.
  • DNA encoding the polypeptide of the present invention and the polypeptide of the present invention described later may be labeled by a known method, specifically, isotope-labeled or fluorescently-labeled (For example, fluorescent labeling with fluorescein), biotinylated or enzyme-labeled.
  • the DNA encoding the polypeptide of the present invention has the ability to bind to a receptor protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • Any DN can be used as long as it contains a nucleotide sequence that codes for a polypeptide having the above.
  • an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence of the polypeptide of the present invention may contain any sequence as long as it contains a base sequence that encodes a polypeptide.
  • genomic DNA, genomic DNA library, the above-mentioned tissue / cell-derived cDNA, the above-mentioned tissue / cell-derived cDNA, or synthetic DNA may be used.
  • the vector used for the library can be bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid, etc. In addition, it can be directly amplified by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using an RNA fraction prepared from the aforementioned tissue / cell.
  • RT-PCR method Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
  • the DNA encoding the polypeptide of the present invention includes:-(1-) SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 10 DNA containing a DNA having a partial sequence of (2) DNA derived from a mammal that hybridizes with the sequence specified in (1) under stringent conditions, (3) due to degeneracy of the genetic code (1) And DNA that does not form a hybrid with the sequence specified in (2), but encodes a polypeptide having the same amino acid sequence.
  • Hybridization can be performed according to a known method or a method based thereon. Examples of stringent conditions include 4 2.
  • DNA encoding the polypeptide of the present invention can also be produced by the following genetic engineering technique.
  • a synthetic DNA primer having a partial base sequence of the polypeptide of the present invention can be used by a known PCR method.
  • a method of amplifying the target DN A from the first class of the DNA library, or (2) a DN A incorporated into an appropriate vector, for example, a DN A fragment or synthesis having a part or the entire region of the polypeptide of the present invention There is a method of sorting by hybridization with those labeled with DNA. Hybridization is performed according to the method described in, for example, Molecular Cloning (2nd ed .; J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When using a commercially available library, use the attached library. Follow the procedure described in the instructions.
  • the DNA encoding the cloned polypeptide of the present invention can be used as it is, or can be digested with a restriction enzyme or added with a linker if desired.
  • the DN A may have ATG as a translation initiation codon on the 5 ′ end side, and may have TAA, TGA or TAG as a translation termination codon on the 3 ′ end side. These translation initiation codons and translation termination codons can also be added using appropriate synthetic DNA adapters.
  • the polypeptide-expression vector of the present invention can be prepared by, for example, (a) cutting out a DNA fragment of interest from DNA encoding the polypeptide of the present invention, and (b) appropriately using the DNA fragment. It can be produced by ligating downstream of the promoter in a simple expression vector.
  • Vectors include plasmids derived from E. coli (eg, p BR 3 2 2, p BR 3 2 5, p UC 12, pUC 1 3), plasmids derived from Bacillus subtilis (eg, p UB 1 1 0, p TP 5, p C 1 94), yeast-derived plasmids (eg, p SH 19, p SH 15), pacteriophages such as ⁇ phage, retroviruses, vaccinia virus, animal viruses such as baculovirus Is used.
  • E. coli eg, p BR 3 2 2, p BR 3 2 5, p UC 12, pUC 1 3
  • plasmids derived from Bacillus subtilis eg, p UB 1 1 0, p TP 5, p C 1 94
  • yeast-derived plasmids eg, p SH 19, p SH 15
  • pacteriophages such as ⁇ phage
  • retroviruses
  • the promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is suitable for the host used for gene expression.
  • the SV40 promoter Retrowey / Less promoter, meta-thionine promoter, heat shock promoter, cytomegaloinores promoter, SR ct promoter
  • the host is Escherichia, trp promoter, T7 promoter, lac promoter, rec A promoter, ⁇ PL promoter, 1 ⁇ ⁇ promoter, etc.
  • the host is Bacillus
  • yeast such as S PO l promoter, S P02 promoter, pe ⁇ ⁇ promoter, ⁇ 5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH 1 promoter, GAL promoter, etc. are preferable.
  • the expression vector contains enhancer, splicing signal, poly A addition signal, selection marker, SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori), etc. Can be used.
  • the selection marker one, for example, dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dh fr) gene [methotrexate (MTX) resistance], ampicillin phosphorus resistant gene (hereinafter sometimes abbreviated as Am p r ), Neomycin resistance gene (hereinafter sometimes referred to as Neo r , G 4 18 resistance), and the like.
  • the DHFR gene when used as a selection marker using CHO (dhir—) cells, it can be selected by a medium containing no thymidine.
  • a signal sequence suitable for the host When the host is Escherichia, the Pho A signal sequence, Omp A, signal sequence, etc.
  • the host is a Bacillus species, the amylase signal sequence, subtilisin signal sequence, etc.
  • the host is yeast, mating factor a (MF) signal sequence, invertase signal sequence, etc.
  • insulin-sign null sequence, One interferon signal sequence, antibody molecule / signal sequence, etc. can be used.
  • a transformant can be produced using the vector containing the DNA encoding the polypeptide thus constructed.
  • Escherichia for example, Escherichia, Bacillus, yeast, insect or insect cell, animal cell and the like are used.
  • Escherichia coli Escherichia coli K12 ⁇ DH1 [Pro Natl. Acad Sci. USA, 60, 160 (1968)], JM 10 3 [Nucleic Acids Research, 9 ⁇ , 309 ( 1981)], JA 2 2 1 [Journal of Molecular Biology, 120 ⁇ , 517 (1978)], HB 1 0 1 [Journal of Molecular Biology, 41, 459 (1969)], C 600 [Genetics, 39 ⁇ , 440 (1954)].
  • Bacillus spp. include Bacillus subtilis M I 1 1 4 [Gene, 24, 255 (1983)], 20 7-2 1 [Journal of
  • yeast examples include Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae) AH 2 2, AH 2 2 R ', NA8 7-11A, DKD-5D, 20B-12, etc. are used.
  • insects examples include silkworm larvae [Maeda et al., Nature, 315, 592 (1985)] 0
  • insect cells for example, when the virus is Ac NPV, larvae-derived cell lines (Spodoptera frugiperda cell; Sf cells), Trichoplusia ni midgut-derived MG1 cells, Trichoplusia ni eggs High Five TM cells, cells derived from Mamestra brassicae or cells derived from Estigmena acrea are used.
  • Sf cells When the virus is BmNP.V-, cocoon-derived cell lines (Bombyx mori_N; BmN cells) are used.
  • Sf cells include Sf9 cells (ATCC CRL 1711), Sf21 cells [above, Vaughn, J. et al., In Vitro, .13, 213-217 (1977)] and the like. No.
  • animal cells examples include monkey CO S-7 cells, Vero cells, Chinese hamster cells CHO, DHF R gene-deficient Chinese hamster cells CH 0 (dhfr-CHO cells), mouse L cells, mouse 3 T 3 cells, mouse mye Roman cells, human HEK29.3 cells, human FL cells, 2993 cells, C1227 cells, BALB3T3 cells, Sp-20 cells, etc. are used.
  • Prcx ;. Natl. Acad. Sci. USA, 69 ⁇ , 2110 (1972) and Gene, 17 ⁇ , 107 (1982) are used to transform the genus Escherichia.
  • Bacillus for example, Molecular & General
  • Insect cells or insects are transformed according to the method described in, for example, Bio / Technology, 6 ⁇ , pp. 47-55 (1988).
  • Animal cells are transformed according to the method described in, for example, Virology, 52, 456 (1973).
  • Examples of the method for introducing an expression vector into a cell include the ribofusion method.
  • a method for stably expressing the polypeptide of the present invention using animal cells there is a method of selecting a cell in which the expression vector introduced into the animal cell is incorporated into a chromosome by clone selection. Specifically, transformants are selected using the above selection marker as an index. Furthermore, a stable animal cell line having a high expression ability of the polypeptide of the present invention can be obtained by repeatedly performing clonal selection on the animal cells obtained using the selection marker.
  • the dhfr gene is used as a selective force, by gradually increasing the MTX concentration and culturing and selecting resistant strains, DNA encoding the polypeptide 7 ° tide of the present invention can be obtained together with the dhfr gene. It can be amplified in the cell to obtain a higher-expression animal cell line.
  • the above transformant is cultured under conditions capable of expressing the DNA encoding the polypeptide of the present invention, and the polypeptide of the present invention is produced and accumulated, whereby the polypeptide of the present invention is obtained. Can be manufactured.
  • a liquid medium is appropriate as a medium used for the culture, and a carbon source necessary for the growth of the transformant is included therein.
  • Nitrogen sources, inorganic substances, etc. are included. Examples of carbon sources include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose, and examples of nitrogen sources include ammonium salts, nitrates, corn sheep liquor, peptone, force zein, meat extract, soybean meal, potato extract, etc.
  • inorganic or organic substances and inorganic substances include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride.
  • yeast, vitamins, growth promoting factors and the like may be added.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • M 9 medium containing glucose and casamino acid and Miller As a medium for culturing Escherichia, for example, M 9 medium containing glucose and casamino acid and Miller, Journal of Experiments in Molecular
  • the culture is usually carried out at about 15 to 43 for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration or stirring can be added.
  • the culture is usually carried out at about 30 to 40 ° C. for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration or agitation can be added.
  • Insect Medium (Grace, T. C. C., Nature, 195, 788 (1962)), which is appropriately added with additives such as 10% sera serum that has been immobilized, is used.
  • the pH of the medium is approximately 6.2 to 6.
  • 'It is preferable to adjust to 4. Incubate at about 27 ° C for about 3 to 5 days, with aeration and agitation if necessary.
  • the medium When cultivating a transformant whose host is an animal cell, the medium is, for example, about 5
  • MEM medium containing ⁇ 20% fetal J / 3 ⁇ 4 bovine serum [Science, 122 ⁇ , 501 (1952)], DME medium [Virology, 8 ⁇ , 396 (1959)], RPI 1 640 medium [The Jimrnal of the American Medical Association Vol.199, 519 (1967)], 1 99 medium
  • the pH is preferably about 6-8. Culture is usually about 30 ° C ⁇
  • DMEM medium containing dialyzed fetal serum containing almost no thymidine.
  • Separation and purification of the polypeptide of the present invention from the culture can be performed, for example, by the following method.
  • the buffer solution may contain a protein denaturing agent such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton (registered trademark) X-100.
  • the cells or cells and the supernatant are separated by a known method, and the supernatant is collected.
  • Purification of the polypeptide of the present invention contained in the culture supernatant or the extract thus obtained can be performed by appropriately combining known separation and purification methods.
  • known separation and purification methods include methods that utilize solubility, such as salting out, solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • solubility such as salting out, solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • methods that use molecular weight differences methods that use charge differences such as ion-exchange chromatography, methods that use specific affinity such as affinity mouth chromatography, and reverse-phase high-performance liquid chromatography.
  • a method using a difference in hydrophobicity, a method using a difference in isoelectric point such as isoelectric focusing or chromatofocusing, etc. are used.
  • the polypeptide of the present invention when obtained in a free form, it can be converted into a salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely when it is obtained as a salt. It can be converted to a free form or other salt by the method of or similar thereto.
  • polypeptide of the present invention produced by the recombinant may be arbitrarily modified or partially removed by allowing a suitable protein-modifying enzyme to act before or after purification.
  • suitable protein-modifying enzymes include trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase, and the like.
  • the presence of the polypeptide of the present invention produced in this way can be measured by enzyme immunoassay using a specific antibody.
  • substances that promote their binding can be obtained as follows.
  • the substance that promotes the binding between averine and its receptor proposed by the present invention is further described.
  • the apelin receptor agonist agonist of the present invention
  • the apelin receptor agonist as a substance that promotes the function of the apelin receptor will be described in detail.
  • Examples of the agonist of the present invention include peptides, proteins, antibodies, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma and the like.
  • the substance may be a new substance or a known substance.
  • the agonist of the present invention may form a salt.
  • the salt of the agonist the same salt as the aforementioned salt of the polypeptide of the present invention is used. Since the agonist of the present invention can promote the function of the apelin receptor, it can be screened using apelin and its receptor. The following describes the screening method. '
  • the agonist of the present invention is characterized in that the function of the apelin receptor is characterized by comparing (i) the case where the apelin receptor is contacted with the apelin and (ii) the case where the test compound is contacted with the apelin receptor. It can be obtained by using a screening method for substances that promote the process.
  • the apelin receptor # when the apelin receptor # is contacted with apelin and (ii) when the apelin receptor is contacted with avelin and a test compound, for example, the apelin receptor Measure the amount of binding of apelin to, and compare the results; or (b) (i) When contacted with apelin receptor and (ii) When contacted with a test compound Cell stimulating activity via, for example, apelin receptor (eg, racidonic acid release, acetylcholine release, intracellular C a 2+ release, intracellular c AM P production, intracellular c GM P production, inositol phosphate production, Measure cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c_fos activation, pH promoting activity, etc.) and compare the results.
  • apelin receptor eg, racidonic acid release, acetylcholine release, intracellular C a 2+ release, intracellular c AM P production, intracellular c GM P production, inositol
  • the method of screening for agonis moth of the present invention is as follows:
  • the labeled apelin and the test compound contain the apelin receptor. Promote the function of the apelin receptor, characterized by measuring and comparing the amount of labeled apelin bound to the cell or the membrane fraction when it is brought into contact with the cell or the membrane fraction of the cell.
  • the labeled apelin and the test compound are Measure the amount of labeled apelin bound to the apelin receptor when it is brought into contact with the apelin receptor expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing DNA encoding the receptor.
  • a cell containing the apelin receptor or a membrane fraction of the cell is used as a buffer suitable for screening.
  • Receptor preparations are prepared by suspending in The buffer can be any buffer that does not inhibit the binding between apelin and the apelin receptor, such as a phosphate buffer having a pH of 4 to 10 (preferably pH 6 to 8) or a tris monohydrochloride buffer.
  • surfactants such as CHAP S, Tween-80 TM (Kaoichi Atlas), digitonin, and dioxycholate can be added to the buffer.
  • protease inhibitors such as PMS F, leupeptin, E-64 (manufactured by Peptide Institute) and pepstatin can be added for the purpose of suppressing the degradation of the apelin receptor by the protease.
  • a fixed amount (5000 cpm to 500000 cpm) of labeled apelin or a modified form thereof was added to the apelin receptor solution at 0.0 1 m 1 to 1 Om 1 and simultaneously, 10 — 4 to 1 O—M test compound coexists.
  • NBS non-specific binding
  • test compounds include peptides, proteins, antibodies, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, etc. These substances are novel substances. It may be a known substance.
  • the test compound may form a salt.
  • the salt of the test compound the same salts as those of the polypeptide of the present invention described above can be used.
  • the agonist obtained in this way can promote the physiological activity of capelin, it is useful as a safe and low-toxic pharmaceutical that promotes the activity of capelid. ⁇
  • the pharmaceutical composition comprising the agonist of the present invention produced based on the above description can be produced and used according to conventional means.
  • tablets, capsules, elixirs, microcapsules, sustained-release agents, etc. with sugar coating or enteric coating as needed, orally with water or other pharmaceutically acceptable liquids Can be used parenterally in the form of an aseptic solution, or an injectable preparation such as a suspension.
  • an injectable preparation such as a suspension.
  • the amount of active ingredient in these preparations is adjusted to obtain an appropriate dose within the indicated range.
  • the agonist of the present invention can be used alone, but when used as a composition, it is contained in an amount of 10% to 90% as an active ingredient.
  • binders such as gelatin, corn starch, gum tragacanth and gum arabic
  • excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid.
  • a swelling agent such as magnesium stearate
  • a sweetening agent such as sucrose, lactose or sacarin
  • a flavoring agent such as peppermint, cocoa oil, or chili
  • a liquid carrier such as fats and oils can be contained.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending active substances in vehicles such as water for injection, naturally produced vegetable oils such as sesame seeds, coconut oil, etc. it can. '
  • aqueous solutions for injection include physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants (eg D_sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.).
  • isotonic solutions containing glucose and other adjuvants eg D_sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.
  • agents such as alcohols (eg ethanol), polyalcohols (eg propylene glycol, polyethylene glycol):, nonionic surfactants (eg polysorbate 80 (TM), HCO -50) May be.
  • alcohols eg ethanol
  • polyalcohols eg propylene glycol, polyethylene glycol
  • nonionic surfactants eg polysorbate 80 (TM), HCO -50
  • oily liquids include sesame oil and soybean oil, which may be used in combination with benzyl benzoate or benzyl alcohol as a solubilizing agent.
  • buffers eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer
  • soothing agents eg, benzalkonium chloride, pro-in hydrochloride, etc.
  • stabilizers eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • blend with preservatives for example, benzyl alcohol, phenol etc.
  • antioxidant etc.
  • the prepared 'injection solution is usually filled into a suitable ampoule.
  • the preparations obtained in this way are safe and have low toxicity.
  • human mammals eg mice, rats, guinea pigs, rabbits, hidges, pigs, cats, cats, dogs, monkeys
  • the dose of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on symptoms, but in the case of oral administration, it is generally effective for adults with bipolar disorder (weight 60 kg) per day.
  • the polypeptide of the present invention or its amide or its ester or its salt is about 0.1 to 10 O mg, preferably about 1.0 to 5 O mg, more preferably about 1.0 to Administer to 2 O mg.
  • the single dose varies depending on the subject of administration, target organ, symptom, administration method, etc.
  • the active ingredient (that is, the polypeptide of the present invention, its amide, its ester or its salt) is about 0.1 to 30 mg, preferably about 0.1 per day. To about 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 O mg, and it is convenient to administer by intravenous injection. other In the case of this animal, an amount converted per 60 kg can be administered.
  • the apelin the apelin derivative having activity equal to or higher than that of apelin, or a low molecular weight compound that activates APJ, which is the apelin receptor, or a substance that promotes the function of the apelin receptor or apelin and its receptor Substances that promote the binding of can be used, for example, as safe or low-toxic, mood disorders, drug-dependent prophylaxis or therapeutic aids.
  • Mood disorders include, for example, bipolar disorder, depression, mania, recurrent depression, persistent mood emotional disorder (eg, mood circulatory disorder, dysthymia), depressive neurosis, anxiety (eg, generality) Anxiety disorder, social anxiety disorder, obsessive-compulsive disorder, panic disorder, post-traumatic stress disorder), sleep disorder, 'eating disorder, autism, senile dementia, schizophrenia, attention deficit hyperactivity disorder, Examples include psychosomatic disorders.
  • the non-human animal with deficient expression of the apelin gene of the present invention (hereinafter sometimes referred to as non-human animal with deficient gene expression) is, for example, derived from a mammalian ES cell in which the apelin gene has been inactivated.
  • non-human animal with deficient gene expression is, for example, derived from a mammalian ES cell in which the apelin gene has been inactivated.
  • it is a non-human animal in which an inactivated apelin gene sequence is introduced into germ cells and somatic cells at the early stage of embryogenesis. .
  • the non-human animal may be any animal as long as it is an animal other than a human having a capelin, but a non-human mammal is preferred.
  • non-human mammals include ushi, pig, hidge, goat, usagi, inu, cat, monoremot, wild, musta, mouse, rat and the like.
  • rodents especially mice (for example, C 57 BL / 6 lines, 2 DBA lines, etc.
  • raccoon eg Wistar, SD, etc.
  • the above-mentioned targeting vector is used for a non-human animal ES cell or a non-human animal egg cell by a known method (for example, an electric mouth).
  • a known method for example, an electric mouth.
  • Non-human ES cells by homologous recombination of the inactivated apellin gene sequence of the targeting vector, such as the trolley method and the microinjection method when introduced into egg cells).
  • it can be performed by replacing the apelin gene on the chromosome of a non-human animal egg cell.
  • Cells in which the apelin gene has been knocked down are identified by the DNA sequence on the Southern Hybridization analysis or targeting vector using the DNA sequence on or near the apelin gene and the mouse used for the targeting vector. It can be determined by PCR analysis using the DNA sequence of the neighboring region other than the apelin gene derived from the mouse.
  • a cell line in which the apelin gene is inactivated by homologous recombination is cloned, and the cells are cloned at an appropriate early stage of embryogenesis, for example, at the 8-cell stage.
  • Injected into human embryos or blastocysts (injection method), or created by sandwiching ES cell mass inactivated with the apelin gene between two 8-cell embryos (aggregation chimera method) The chimeric embryo is transferred to the uterus of the non-human animal pseudopregnant.
  • the created animal is a chimeric animal composed of both cells with normal apelin locus and cells with artificially mutated apelin locus.
  • all tissues were artificially mutated from the population obtained by mating such a chimeric individual with a normal individual. It can be obtained by selecting individuals composed of cells having the apelin locus, for example, by determining the coat color. Individuals thus obtained are usually individuals with deficient expression of hapelin heterozygous, and individuals with deficient expression of apelin or APJ heteroexpression can be bred to obtain individuals with deficient expression of homologous apelin from their offspring.
  • a non-human animal with a deficient expression of the apelin gene can be distinguished from a normal animal by measuring the mRNA level of the animal using a known method and comparing the expression level indirectly. In this way, an individual in which the apelin gene is knocked out can be reared in a normal breeding environment after confirming that the animal individual obtained by mating has also been knocked out.
  • germline acquisition and maintenance can be performed according to conventional methods. That is, by mating male and female animals possessing the inactivated gene sequence, it is possible to obtain homozygous ten animals having the inactivated gene sequence in both homologous chromosomes. The obtained homozygous animals can be efficiently obtained by rearing the mother animal in a state where there are 1 normal individual and multiple homozygous animals. By crossing male and female heterozygous animals, homozygous and hederozygous animals having the inactivated gene sequence can be bred and passaged. The progeny of the animal having the inactivated gene sequence obtained in this manner is also included in the non-human animal deficient in apelin gene expression of the present invention.
  • Mammalian ES cells in which the apelin gene is inactivated in this way are very useful in producing non-human animals with deficient expression of the apne gene.
  • non-human animals or tissues derived from them that are deficient in the expression of the apelin gene are based on diseases caused by the deficiency of apelin, such as the loss of various biological activities that can be induced by apelin.
  • the non-human animal with deficient expression of the apelin gene of the present invention or its tissue or cells derived therefrom can be used for the prevention of the disease and the screening of Z or therapeutic agents.
  • tissue and cells derived therefrom include, for example, the pituitary gland, spleen, brain, kidney, liver, gonad, thyroid gland, bone marrow, bone marrow, adrenal gland, skin, muscle, lung, digestive tract, blood vessel , Heart, or cells derived from them.
  • the gene expression-deficient non-human animal of the present invention or its tissue or cells derived therefrom are characterized by using a homogenate such as brain, liver or kidney.
  • test compound can be administered to a non-human mammal deficient in expression of the apelin gene of the present invention or a tissue thereof or a cell derived therefrom, and used for screening by measuring the activity or the like.
  • An APJ gene transgenic non-human animal (hereinafter sometimes referred to as a transgenic non-human animal) is, for example, by microinjecting an APJ gene or its mutant DNA into a fertilized egg of a mammal. It is a non-human animal created by genetic engineering. Examples of animals include non-human mammals (eg, rat, mouse, rabbit, hidge, puta, ushi, cat, inu, monkey, etc.) (hereinafter sometimes abbreviated as animals). In particular, a mouse, a rabbit and the like are suitable. .
  • non-human mammals eg, rat, mouse, rabbit, hidge, puta, ushi, cat, inu, monkey, etc.
  • animals hereinafter sometimes abbreviated as animals.
  • a mouse, a rabbit and the like are suitable. .
  • the APJ gene or its mutant DNA When introducing the APJ gene or its mutant DNA into a target animal, it is generally advantageous to use it as a gene construct linked downstream of a promoter capable of expressing the APJ gene or its mutant DNA in animal cells.
  • a promoter capable of expressing the APJ gene or its mutant DNA when an APJ gene or its mutant DNA is introduced into a rabbit, a gene construct that binds to the downstream of various promoters that can express animal-derived APJ gene or its mutant DNA with high homology.
  • a DNA-introduced animal that is, the transgenic non-human animal of the present invention
  • a ubiquitous expression promoter such as a metallotine can be used, and preferably, an NGF gene promoter that is specifically expressed in the brain, an enzyme gene promoter, or the like is used.
  • the DNA introduced into all germ cells and somatic cells of the target animal will be present.
  • the presence of APJ in the embryo cell of the animal after introduction of DNA means that all the offspring of the animal have APJ protein and the like in all the germ cells and somatic cells.
  • the offspring of this type of animal that has inherited the gene has APJ protein and the like in all of its germ cells and somatic cells.
  • the transgenic non-human animal having the APJ gene or its mutant DNA thus obtained was confirmed to stably retain the gene by mating, and the normal breeding environment as the DNA-bearing animal was confirmed.
  • a homozygous animal having the transgene in both homologous chromosomes is obtained, and by mating the male and female animals, all the offspring are obtained. It can be propagated to have the DNA.
  • a transgenic non-human animal having an APJ gene or a mutant DNA thereof, a tissue thereof, or a cell derived therefrom can be used for screening for a preventive and / or therapeutic agent for the disease.
  • examples of the above tissues and cells derived therefrom include, for example, the pituitary gland, spleen, brain, kidney, liver, gonad, thyroid, gall bladder, bone marrow, adrenal gland, skin, muscle, lung, digestive tract, Examples thereof include blood vessels, heart, etc., or cells derived therefrom.
  • the transgenic non-human animal of the present invention or a tissue thereof or a cell derived therefrom is measured for a specific activity using a homogenate such as brain, liver or kidney, or a specific product using a peritoneal macrophage. It can be used for screening by measuring activity and production.
  • a test compound is administered to a transgenic non-human mammal having the APJ gene of the present invention or a mutant DNA thereof or a tissue thereof or a cell derived therefrom, and used for screening by measuring the activity or the like. You can also.
  • bases, amino acids, etc. are based on the IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature. The abbreviations are based on common abbreviations in this field. Examples are described below. If there are possible optical isomers of amino acid, L form is indicated unless otherwise specified.
  • Y Thymine or cytosine
  • Thymine Thymine, cytosine, adenine or guanine
  • R adenine or guanine
  • RNA Ribonucleic acid
  • mRNA Messenger-Ribonucleic acid
  • EDTA ethylenediamine tetrasuccinic acid
  • T F A trifluorosuccinic acid
  • Leu or L Leucine.
  • T yr or Y tyrosine T rp or w Trib fan
  • HON B. N—Hydroxy _ 5—Norbornene 2,3—Dicarboximide
  • Trt Trityl SEQ ID Nos in the sequence listing of the present specification indicate the following sequences.
  • G protein-coupled receptor human protein (AP J) Shows the entire amino acid sequence of G protein-coupled receptor protein in cDNA.
  • the amino acid sequence of the 67th to 77th amino acid sequence of human apelin (precursor) is shown.
  • the amino acid sequence of the 60th to 77th amino acid sequence of human apelin (precursor) is shown.
  • the amino acid sequence of the 66th to 77th amino acid sequence of human apelin (precursor) is shown.
  • APJ mRNA expression in RNA samples from male depression patients (16 cases) ', cocaine-dependent patients (14 cases), and brain samples from healthy individuals who did not develop each disorder (32 cases) was measured using Affymetrix's human gene chip set (HG_U133 A, HG_U133 B). Brain logic and gene chip analysis were performed by Gene Logic (Santa Clara, CA). Affimetrix Microarray Software (MAS) is used to standardize the data, and a confidence test is performed for each measured value, and the expression level for the sample that is found to be expressed is calculated as the average of the relative values. It was. As a result, the relative expression level and frequency of expression were 141.5 in the brain from healthy subjects, and 7 out of 32 cases compared to the expression frequency in patients with depression.
  • MAS Affimetrix Microarray Software
  • the expression level was 0 because it was 0 out of 16 cases, and the frequency of occurrence in cocaine abusers was only 1 out of 14 cases, and the level of expression was 80, 7, indicating that depression patients and cocaine abusers were healthy. In contrast, a decrease in the expression level and expression frequency of APJ mRNA was detected.
  • the effect of apelin on the side-ventricular depression can be evaluated by a forced swimming test.
  • Adult male C57BL / 6N mice (9-week-old, Charles Riva Japan Co., Ltd.) were tested. The scalp was incised under ether anesthesia 2 days before and the left ventricular ventricle (Paxinos) was used with a two-stage needle (top). And Breson from AP at Watson (1986) AP: 2 strokes,
  • mice were obtained by crossing the male apelin gene knockout mouse (hereinafter referred to as K0) described in Example 2 of W0 2006/019193, and this K0 mouse and C57BL / 6J mouse (Nippon Claire Co., Ltd.).
  • This test was conducted in a sound insulation room (room temperature 25 ° C) with illuminance set to 180 lux. Prior to the start of the test, the mice were allowed to acclimate for more than an hour in the room. Behavior observation was performed using an open field device.
  • This device has a plastic cylinder covered with black tape on a gray vinyl chloride plate, 50 cm in height and 60 cm in diameter at the bottom.
  • the motor area of the bottom plate is divided into 19 sections of approximately equal area.
  • K0 has a significantly longer latency compared to WT.
  • K0 showed a significant decrease in total momentum compared to the correction.
  • Example 4 Tail suspension test.
  • Example 3 The same animals as in Example 3 were used after 1 week or more after the completion of the test in Example 3. This test was conducted in a sound insulation room (room temperature 25 ° C). Before the test began, the mouse was allowed to acclimate for more than an hour in the room.
  • the tail suspension test system and analysis system is based on NeuroScience's MicroAct tail suspension.
  • the device has a private room for hanging animals, and a hook connected to the weight sensor is hanging from the ceiling. Tape was wrapped around 2 cm from the tip of the animal's tail, and the animal was suspended for 10 minutes with the tape penetrating with a hook. The movement of the animal is detected by a weight sensor, and if the weight fluctuation does not reach 10% of the body weight for more than 1 second, it is judged as a non-moving state, and the total of the non-moving state for 10 minutes is defined as the non-moving time. did. Student's t test was used for statistical analysis of fixed values.
  • K0 significantly increased immobility time compared to WT.
  • the present invention it is possible to provide an excellent preventive or therapeutic agent for mood disorders or drug dependence. Furthermore, it is possible to elucidate the functions of apelin and its receptor APJ in the central nervous system and provide new uses for these functions.

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Abstract

本発明は、気分障害、薬物依存の予防・治療剤などを提供する。本発明のアペリン受容体ＡＰＪの機能を促進する物質を含有してなる医薬組成物などは、気分障害、薬物依存などの予防・治療剤などとして有用である。

Description

明細書
ァペリンの新規用途 技術分野
本発明は、 生理活性ぺプチドであるァペリンの受容体である A P Jの機能を促 進する物質の用途に関する。 さらに詳しくは、 本発明は、 ァペリン受容体 A P J の機能を促進する物質を含有してなる医薬組成物、 該医薬組成物を用いることを 特徴とする疾患、 特に気分障害、 薬物依存などの予防 ·治療剤などに関する。 発明の背景
気分障害は落ち込んだ気分が続いたり、 普通ではない気分の高揚や異常が一定 期間継続する精神障害を指す。 一般的に知られている病名としては躁状態とうつ 状態の両方が繰り返して出現する双極性障害と、 うつ状態だけのうつ病に 類さ れる。 一方不安が長期間にわたり継続し、 生活に支障をきたす場合不安症と診断 されるが、 不安とうつは全く異なるものではなく、 密接に関係しているどされて いる。 これらは過度の心配 ·焦燥感 ·集中困難などの精神的な症状以外にも身体 的な症状、 たとえば、 睡眠障害や食欲不振、 全身の倦怠感、 疲労感などがあらわ れることも多い。 脳内の祌経伝達物質であるセロ トニンの濃度の低下、 ノルアド レナリン、 ドーパミンなどの機能障害、 コルチゾ一ル系の分泌異常などがうつ病 障害発症の原因と考えられているが、 最近では海馬の異常、 前頭葉 *带状回の血 流低下など様々な生物学的要因も示唆されており、 これらの改善を狙った薬物療 法を中心とした治療が行われている。 いくつかの抗ぅ.つ薬で不安症状の改善に効 果が認められるようになり、 不安症の治療にも抗うつ薬 （うつ病障害の治療薬) が使用されている。 特に選択的セロトニン再取込み阻害薬は、 不安症の治療にも 中心的に使用されている。 しかし既存の抗うつ薬 （うつ病障害の治療薬） は、 肝 心の抗うつ作用が現れる前に排尿困難や心臓障害などの副作用が現れることが知 られ、 副作用がなくかつ速効性のある薬剤の開発が望まれている。
一方、 シンナー、 麻薬、 覚せい剤、 睡眠薬、 精神安定剤等の薬物を正当な目的 から逸脱して、 気分の転換や束の間の快楽のために使用した結果、 生体がある薬 物に対して精神依存および または身体依存にある状態を薬物依存とよび、 その 結果として幻覚や妄想を含む精神障害が引き起こされる。 通常は個人精神療法
(カウンセリング） を中心として治療が行われている。 その抑うつ症状などの精 祌障害を治療するための薬物療法は用いられているものの、 直接薬物依存を治療 するための薬剤は未だ皆無で、 早期の開発が望まれている。
ァペリンは、 Gタンパク質共役型受容体の一つである A P Jの内因性リガンド として単離された生理活性べプチドである （W099/33976号； Tatemoto et al.， Biochemical and Biophysical Research Communications 251, 471 - 476
(1998) ) 。 ァペリンは特異的かつ高親和性的に A P Jに結合し、 抑制性 Gタンパ -ク質 （G i ) を-介した細胞内シグナル伝達 （c AM P産生の抑制等） を引き起こ し、 様々な生理活性を有す ¾ことが明らかになつている。
A P Jが哺乳動物の脳に発現していること（Hosoya et al. , Journal of Biological Chemi stry 275、 21061-21067 (2000) )、 とくにグリア細胞に発現し てレ'、ること (Medhurst et al.， Journal of Neurochemistry 84、 1162-1172 (2003) )は明らかにされていたものの、 ァペリンとその受容体 A P Jが気分障害 や、 薬物依存などの中枢性疾患の発症に関与していることは知られていなかった。 発明の開示
本発明はァペリンとその受容体 A P Jの中枢神経系での機能を解明し、 これら を介する新たな用途を提供することを課題とする。
本発明者らはァペリンの機能を解明するためにジーンチップ解析によって得ら れたヒ トの各種中枢性疾患患者由来の脳サンプルにおける A P Jの m R N A発現 変化を詳細に調べた。 その結果、 A P Jの m R N A発現がうつ病患者やコカイン の乱用者の脳で減少していることを見出し、 ァペリンおよび A P Jの機能を促進 する物質 （例、 ァゴニストなど） が気分障害、 薬物乱用等の治療薬として使用で きる可能性を見出した。 本発明者らは、 これらの知見を基に更に研究を進め、 本 発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、
( 1 ) ァペリン受容体の機能を促進する物質を含有する気分障害または薬物依存 の予防 ·治療剤；
( 2 ) ァペリン受容体が、 ..配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一または実 質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質である上記 （1) 記載の剤；
(3) ァペリン受容体が、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するタン パク質である上記 （1) 記載の剤；
(4) ァペリン受容体の機能を促進する物質が、 ァペリン受容体ァゴニス トであ る上記 （1) 記載の剤.；
(5) ァペリン受容体の機能を促進する物質が、 （a)'ァペリン、 （b) ァペリン と同等以上の活性を有するァペリン誘導体または （c) ァペリンとその受容体の 結合を促進させる低分子合成化合物である上記 （1) 記載の剤；
_..(.6) ァペリンが、 配列番号： 1 1で表-される-アミノ酸配列と同一または実質的 に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドである上記 （5).記載の剤；
(7) ァペリンが、 配列番号： 3、 配列番号： 5、 配列番号： 7、 配列番号： 9、 配列番号： · 1 1、 配列番号： 1 2、 配列番号： 1 3、 配列番号： 1 4、 配列番 号： 1 5、 配列番号： 1 6、 配列番号： 1 7、 配列番号： 1 S、 配列番号 .: 1 9、 配列番号： 20、 配列番号： 2 1、 配列番号： 2 2、 配列番号： 2 3または配列 番号： 24で表されるアミノ酸配列を有するポリべプチ,ドである上記 （5) 記載 'の剤；
(8) ァペリンが、 配列番号： 1 2、 配列番号： 1 3、 配列番号： 1 9または配 列番号： 2 3で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである上記 （5) 記 載の剤；
(9) うつ病または不安症の予防 ·治療剤である上記 （1 ) 記載の剤；
( 1 0) 哺乳動物に対してァペリン受容体の機能を促進する物質を有効量投与す ることを特徴とする気分障害または薬物依存の予防 '治療方法；
(1 1 ) ァペリン受容体の機能を促進することを特徴とする気分障害または薬物 依存の予防 ·治療方法；
(1 1 a) ァペリンとその受容体の結合を促進することを特徴とする気分障害ま たは薬物依存の予防 ·治療方法；
(1 2) 気分障害または薬物依存の予防 ·治療剤を製造するためのァペリン受容 体の機能を促進させる物質の使用 ；
(1 3) ァペリン受容体が、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一または 実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質である上記 （1 0) または (1 1) 記載の方法；
(14) ァペリン受容体が、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するタ ンパク質である上記 （ 10) または （1 1) 記載の方法；
(1 5) ァペリン受容体ァゴニストを用いることを特徴とする、 上記 （10) ま たは （1 1) 記載の方法；
(1 6) (a) ァペリン、 あるいは （b) ァペリンと同等以上の活性を有するァぺ リン誘導体または （c) ァペリンとその受容体の結合を促進させる低分子合成化 合物を用いることを特徴とする上記 （1 0) または （1 1) 記載の方法；. (丄-7) ァペリ-ンが、.配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列と同一または実質 的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドである上記 （10) または （1 1 ) 記載の方法；.
(1 8) ァペリンが、 配列番号： 3、 配列番号： 5、 配列番号： 7、 配列番号： 9、 配列番号： 1 1、 配列番号： 1 2、 配列番号： 1 3、 配列番号： 14、. 配列 番号： 1 5、 配列番号： 1 6、 配列番号： 1 7、 配列番号： 1 8、 配列番号： 1 9、 配列番号： 20、 配列番号： 21、 配列番号： 22、 配列番号： 23または '配列番号： 24で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである上記 （1
0) または （1 1) 記載の方法；
(1 9) ァペリンが、 配列番号：：1 2、 配列番号： 1 3、 配列番号： 1 9または 配列番号： 23で表されるァミノ酸酉.己列からなるポリペプチドである上記 （1 0) または （1 1) 記載の方法；
(1 9 a) ァペリン遺伝子またはァペリン遺伝子を含有する発現ベクターを用い ることを特徴とする、 上記 （10) または （1 1) 記載の方法；
(20) うつ病または不安症の予防 ·治療方法である上記 （1 0) または （1
1 ) 記載の方法；
(21) ァペリンおよび Zまたはァペリン受容体を用いることを特徴とする気分 障害または薬物依存の予防 ·治療剤のスクリ一ニング方法；
(22) ァペリン遺伝子発現不全非ヒ ト動物を用いる上記 （2 1) 記載のスクリ 一ユング方法；
(23) 外来性の、 ァペリン受容体遺伝子またはその変異 DNAを有するトラン スジエニック非ヒ ト動物を用いる上記 （21) 記載のスクリーニング方法； ( 2 4 ) ァペリンおよび またはァペリン受容体を含有する気分障害または薬物 依存の治療剤のスクリーニング用キット
等を提供する。 図面の簡単な説明
図 1は、 オープンフィールド試験による野生型マウス （WT) およびァペリン遺 伝子ノックアウトマウス （K0) の行動観察結果を示す。 図 1 Aは、 マウスを装置 の底面の、 一番中央の区画に置いた瞬間を 0秒とし、 そこから完全に隣接区画に 移動するまでに要した時間 （潜時、 単位は秒） を示す。 図 1 Bは、 試験開始か ら 5分間の総カウント数.（総運動量） を.示す。 測定値はいずれも平均値土標準誤 差で表した。. 1群当たり n=10。 *は pく 0. 05、 **は pく 0. 01 (いずれも野生型マウス (WT) と比較） を示す。
図 2は、 尾懸垂試験による野生型マウス （WT) およびァペリン遺伝子ノックァ ゥトマウス （K0) の無動時間 （単位は秒） 測定結果を示す。 測定値はいずれも平 均値土標準誤差で表した。 1群当たり n=10。 *は pく 0. 05 (野生型マウス （WT) と 比較） を示す。 本発明は、 ァペリン受容体 A P. Jの機能を促進する物質 （以下、 本発明の促進 剤ともいう） を含有してなる医薬組成物、 該医薬組成物を用レ、ることを特徴とす る疾患、 特に気分障害、 薬物依存などの予防 ·治療剤などを提供する。 本発明の 医薬組成物を構成するァペリン受容体の機能を促進する物質としては、 例えば受 容体に対してァゴニ ト活性を有する化合物、 ポリぺプチドなどのァペリン受容 Ϊ本ァゴニス ト、 ァペリン、 ァペリンと同等以上の活性を有するァペリン誘導体 (例、 WO 0 0 / 1 8 7 9 3 , WO 0 1 7 0 7 6 9などに記載のァぺリン誘導 体など） 、 もしくはァペリンの受容体である A P Jを活性化する低分子化合物も あげられる。 また、 ァペリン受容体の機能を促進する物質としては、 例えば、 ァ ペリン遺伝子 (ァペリンをコードする D N Aなど） またはァペリン遺伝子を含有 する発現ベクターなどであってもよく、 ァペリン受容体の機能を促進する物質と 同様な目的で、 ァペリンとその受容体の結合を促進する物質を用いてもよい。 本明細書において 「ァペリン」 とは、 ヒ トゃ温血動物 （例えば、 モルモッ ト、 ラット、 マウス、 ブタ、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） のあらゆる組織 （たとえば、 下垂体、 瞵臓、 脳、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管、 血管、 心臓など） または細胞などに由来するペプチドであつ て、 例えば、 配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有するペプチドを意味する。
配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ 酸配列を含有するぺプチドとしては、 配列番号： 1 1で表されるアミン酸配列と 同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有し、 ァペリン受容体の機能を促 進する活性を有する プチドが好ましい.。 配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配 列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含^ Γするぺプチドには、.配列番 号： 3、 配列番号： 5、 配列番号： 7または配列番号： 9で表されるアミノ酸配 列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するぺプチドなども含まれ る。 すなわち、 本明細書において、 「ァペリン」 とは、 ( 1 ) 配列番号： 3で表 されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するぺプ チド、 （2 ) 配列番号： 5で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 'のアミノ酸配列を含有するペプチド、 （3 ) 配列番号： 7で表されるアミノ酸配 列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチド、 （4 ) 配列 番号： 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を 含有するペプチドなどを含む。
ここで、 配列番号： 3、 配列番号： 5、 配列番号.： 7または配列番号： 9で表 されるアミノ酸配列と 「実質的に同一のアミノ酸配列」 としては、 （1 ) 配列番 号： 3、 配列番号： 5、 配列番号： 7または配列番号： 9で表されるアミノ酸配 列中の 1個以上 7個以下、 好ましくは 1個以上 5個以下、 より好ましくは 1個以 上 3個以下のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 （2 ) 配列番号： 3、 配列番 号： 5、 配列番号： 7または配列番号： 9で表されるアミノ酸配列中に 1個以上 2 0個以下、 好ましくは 1個以上 1 5個以下、 より好ましくは 1個以上 1 0個以 下のアミノ酸が付加した （または挿入された） アミノ酸配列、 （3 ) 配列番号： 3、 配列番号： 5、 配列番号： 7または配列番号： 9で表されるアミノ酸配列中 の 1個以上 7個以下、 好ましくは 1個以上 5個以下、 より好ましくは 1個以上 3 個以下のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含有するぺプチド などがあげられる。 .
配列番号： 3、 配列番号： 5、 配列番号： 7または配列番号： 9で表されるァ ミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリべプチドとしては、 配 列番号： 3、 配列番号： 5、 配列番号： 7または配列番号： 9で表されるアミゾ 酸配列と約 5 0〜 9 9 .. 9 % (好ましくは 7 0〜 9 9 . 9 %、 より好ましくは 8 0〜9 9.. 9 %、 さらに好ましくは 9 0〜9 9 . 9 %) の相同性を有するァミノ 酸配列を含有するポリペプチドがあげられる。
本発明の促進剤が対象とするァペリンとしては特に、 配列番号： 3、 配列番 -号-:. 5、 配列番号： 7または配列番号： _9で表 _されるァミノ酸配列を含有するァ ペリン （前駆体） が好ましぐ、 さらには配列番号： 7で表されるアミノ酸配列を 含有するァペリン （ヒ ト型ァペリ ン （前駆体） ） が好ましい ά
また、 配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するペプチドには、 配列番号： 1 3、 配列番号： 1 4または 配列番号： 1 5で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸 配列を含有するペプチドなども含まれる。 すなわち、 本明細書において、 「アベ 'リン」 とは、 （1 ) 配列番号： 1 3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチド、 （2 ) 配列番号： 1 4で表される ァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するぺプチド、 ( 3 ) 配列番号： 1 5で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するペプチドなどを含む。
ここで、 配列番号： 1 3、 配列番号： 1 4または配列番号： 1 5で表されるァ ミノ酸配列と 「実質的に同一のアミノ酸配列」 としては、 （1 ) 配列番号： 1 3、 配列番号： 1 4または配列番号： 1 5で表されるアミノ酸配列中の 1個以上 7個 以下、 好ましくは 1個以上 5個以下、 より好ましくは 1個以上 3個以下、 特に好 ましくは 1個以上 2個以下、 最も好ましくは 1個のアミノ酸が欠失したアミノ酸 配列、 （2 ) 配列番号： 1 3、 配列番号： 1 4または配列番号： 1 5で表される アミノ酸配列中に 1個以上 2 0個以下、 好ましくは 1個以上 1 5個以下、 より好 ましくは 1個以上 1 0個以下、 特に好ましくは 1個以上 7個以下、 とりわけ好ま しくは 1個以上 5個以下、 最も好ましくは 1個以上 3個以下のァミノ酸が付加し た （または挿入された） アミノ酸配列、 （3 ) 配列番号： 1 3、 配列番号： 1 4 'または配列番号.： 1 5で表されるアミノ酸配列中の 1個以上 7個以下、 好ましく は 1個以上 5個以下、 より好ましくは 1個以上 3個以下、 特に好ましくは 1個以 上 2個以下、 最も好ましくは 1個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたァミノ ' 酸配列を含有するぺプチドなどがあげられる。
配列番号： 1 3、 配列番号： 14または配列番号： 1 5で表されるアミノ酸配 列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリべプチドとしては、 配列番号：
1 3、 配列番号： 14または配列番号： 1 5で表されるァミノ酸配列と約 50〜 99. 9%. (好ましくは 70〜99. 9%、 より好ましくは 80〜 99. 9%、 さらに好ましくは 90〜99.. .9%、-特に好ましくは 93〜99. 9%、 最も好 ましくは 95〜 99. 9%) 'の相同性を有するアミノ酸配列を含有するポリぺプ チドがあげられ 。
本発明の促進剤が対象とするァペリンとしては特に、 配列番号： 1 3、 配列番 号： 14または配列番号： 1 5で表されるアミノ酸配列を含有するァペリン （ァ ペリン一 36) が好ましく、 さらには配列番号： 1 3で表されるアミノ酸配列を 含有するァペリン （ヒ トァペリン一 36) が好ましい。
' 配列番号： 1 3、 配列番号： 14または配列番号： 1 5で表されるァミノ酸配 列の第 1番目〜 25番目および第 35番目〜 36番目のアミノ酸配列中、 （1) 1個以上 7個以下、 好ましくは 1·個以上 5個以下、 より好ましくは 1個以上 3個 以下、 特に好ましくは 1個以上 2個以下、 最も好ましくは 1個のアミノ酸が欠失 したアミノ酸配列、 （2) 1個以上 20個以下、 好ましくは 1個以上 1 5個以下、 より好ましくは 1個以上 10個以下、 特に好ましくは 1個以上 7個以下、 とりわ け好ましくは 1個以上 5個以下、 最も好ましくは 1個以上 3個以下のアミノ酸の アミノ酸が付加した （または挿入された） アミノ酸配列、 （3) 1個以上 7個以 下、 好ましくは 1個以上 5個以下、 より好ましくは 1個以上 3個以下、 特に好ま しくは 1個以上 2個以下、 最も好ましくは 1個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換 されたアミノ酸配列を含有するペプチドなども、 「ァペリン」 として好ましい。 さらに、 配列番号： 1 3、 配列番号： 14または配列番号： 1 5の第 2番目〜 36番目、 第 3番目〜 36番目、 第 4番目〜 36番目、 第 5番目〜 36番目、 第 6番目〜 36番目、 第 7番目〜 36番目、 第 8番目〜 36番目、 第 9番目〜 36 番目、 第 10番目〜 36番目、 第 1 1番目〜 36番目、 第 1 2番目〜 36番目、 第 1 3番目〜 3.6番目、 第 1 4番目〜 3 6番目、 第 1 5番目〜 36番目、 第 1 6 番目〜 36番目、 第 1 7番目〜 3 6番目、 第 1 8番目〜 3 6番目、 第 1 9番目〜 36番目、 第 20番目〜 3 6番目、 第 2 1番目〜 36番目 （配列番号： 2 0) 、 第 2 2番目〜 3 6番目 （配列番号： 1 9) 、 第 2 3番目〜 3 6番目 （配列番号： 1 8) 、 第 24番目〜.3 6番目 （配列番号： 1 2、 ァペリン一 1 3) 、 第 2 5番 目〜 36番目 （配列畚号： 2 3) 、 第 2 6番目〜 36番目 （配列番号： 1 6) 、 第 1番目〜 3 5番目、 第 2番目〜 3 5番目、 第 3番目〜 3 5番目、 第 4番目〜 3 5番目、 第 5番目〜 3 5番目、 第 6番目〜 3 5番目、 第 7番目〜 35番目、 第 8 番目〜 3 5番目—、—第 9番目〜 3 5番目、 第 10番目〜 3 5番目、 第 1 1番目〜 3 5番目、 第 1 2番目〜 3 5番目、 第 1 3番目〜 3 5番目、 第 1 4番目〜 3 5番目、 第 1 5番目〜 3 5番目、 第 1 6番目〜 3 5番目、 第 1 7番目 3 5番目、 第 1 8 番目〜 3 5番目、 第 1 9番目〜 3 5番目、 第 20番目〜 3 5番目 （配列番号： 2 1) 、 第 2 1番目〜 3 5番目、 第 2 2番目〜 3 5番目、 第 2 3番目〜 3 5番目、 第 24番目〜 3 5番目 （配列番号： 24) 、 第 2 5番目〜 3 5番目、 第 2 6番目 〜3 5番目、 第 1番目〜 34番目、 第 2番目〜 34番目、 第 3番目〜 34番目、 第 4番目〜 34番目、 第 5番目〜 34番目、 第 6番目〜 34番目、 第 7番目〜 3 4番目、 第 8番目〜 34番目、 第 9番目〜 34番目、 第 1 0番目〜 34番目、 第 1 1番目〜 34番目、 第 1 2番目〜 34番目、 第 1 3番目〜 34番目、 第 1 4番 目〜 34番目、 第 1 5番目〜 34番目、 第 1 6番目〜 34番目、 第 1 7番目〜 3 4番目、 第 1 8番目〜 34番目、 第 1 9番目〜 34番目 （配列番号： 2 2) 、 第 20番目〜 34番目、 第 2 1番目〜 34番目、 第 22番目〜 34番目、 第 2 3番 目〜 34番目、 第 24番目〜 34番目 （配列番号： 1 7) 、 第 25番目〜 34番 目、 第 26番目〜 34番目 （配列番号： 1 1 ) のアミノ酸配列からなるペプチド、 特に、 第 2 1番目〜 3 6番目 （配列番号： 2 0) 、 第 2 2番目〜 36番目 （配列 番号： 1 9) 、 第 2 3番目〜 36番目 （配列番号： 1 8) 、 第 24番目〜 36番 目 （配列番号： 1 2、 ァペリン— 1 3) 、 第 2 5番目〜 36番目 （配列番号： 2 3) 、 第 2 6番目〜 3 6番目 （配列番号： 1 6) 、 第 20番目〜 3 5番目 （配列 番号： 2 1) 、 第 24番目〜 35番目 （配列番号： 24) 、 第 1 9番目〜 34番 目 （配列番号： 2 2) 、 第 24番目〜 34番目 （配列番号： 1 7) 、 第 2 6番目 〜34番目 （配列番号： 1 1 ) のアミノ酸配列からなるペプチドも、 「ァペリ ン」 として好ましい。.
また、 配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するペプチドには、 配列番号： 1 2で表されるアミノ酸配列 と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するぺプチドなども含まれる。 すなわち、 本明細書において、 「ァペリン」 とは、 配列番号： 1 2で表されるァ ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するぺプチドなど を含む。
ここで、 配列番号： 1 2で表されるアミノ酸配列と 「実質的に同一のアミノ酸 配列丄 としては、 . （1. ) .配列番号： 1 2で表されるアミノ酸配列中の 1個以上 7 個以下、 好ましくは 1個'以上 5個以下、 より好ましくは 1個以上 3個以下、 特に 好ましくは 1個以上 2個以下、 最も好ましくは 1個のアミノ酸が欠失したァミノ 酸配列、 （.2 ) 配列番号： 1 2で表されるアミノ酸配列中に 1個以上 2 0個以下、 好ましくは 1個以上 1 5個以下、 より好ましくは 1個以上 1 0個以下、 特 好ま しくは 1個以上 7個以下、 とりわけ好ましくは 1個以上 5個以下、 最も好ましく は 1個以上 3個以下のアミノ酸が付加した （または挿入された） アミノ酸配列、 ( 3 ) 配列番号： 1 2で表されるアミノ酸配列中の 1個以上 7個以下、 好ましく は 1個以上 5個以下、 より好ましくは 1個以上 3個以下、 特に好ましくは 1個以 上 2個以下、 最も好ましくは 1値のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたァミノ 酸配列を含有するべプチドなどがあげられる。
配列番号： 1 2で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有 するポリペプチドとしては、 配列番号： 1 2で表されるアミノ酸配列と約 5 0〜 9 9 . 9 % (好ましくは 7 0〜9 9 . 9 %、 より好ましくは 8 0〜9 9 . 9 %、 さらに好ましくは 9 0〜9 9 . 9 %、 特に好ましくは 9 3〜9 9 . 9 %) の相同 性を有するアミノ酸配列を含有するポリべプチドがあげられる。
本発明の促進剤が対象とするァペリンとしては特に、 配列番号： 1 2で表され るアミノ酸配列を含有するァペリン （ァペリン一 1 3 ) が好ましい。
配列番号： 1 2で表されるアミノ酸配列の第 1番目〜 2番目および第 1 2番目 〜1 3番目のアミノ酸配列中、 （1 ) 1個以上 4個以下、 好ましくは 1個以上.3 個以下、 より好ましくは 1個以上 2個以下、 特に好ましくは 1個のアミノ酸が欠 失したアミノ酸配列、 （2 ) 1個以上 2 0個以下、 好ましくは 1個以上 1 5個以 下、 より好ましくは 1個以上 1 0個以下、 特に好ましくは 1個以上 7個以下、 と りわけ好ましくは 1個以上 5個以下、 最も好ましくは 1個以上 3個以下のァミノ 酸が付加した （または挿入された） アミノ酸配列、 （3) 1個以上 4個以下、 好 ましくは 1個以上 3個以下、 より好ましくは 1個以上 2個以下、 特に好ましくは 1個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含有するぺプチドな ども、 「ァペリン」 として好ましい。
さらに、 配列番号： 1 2の第 2番目〜 1 3番目 （配列番号： 23) 、 第 3番目 〜1 3番目.（配列番号： 1 6) 、 第 1番目〜 1 2番目 （配列番号： 24) 、 第 2 番目〜 1 2.番目、 第 3番目〜 1 2番目、 第 1番目〜 1 1番目 （配列番号： 1 7)-、 第 2番目〜 1 1番目、 第 3番目〜 1 1番目 （配列番号： 1 1) のアミノ酸配列か らなるペプチド、 特に、 第 2番目〜, 1 3番目 （配列番号： 23) 、 第 3番目〜 1 3番目 （配列番号： 1 6) 、 第 1番目〜 1 2番目 （配列番号： 24) 、 第 1番目 〜1 1番目 （配列番号： 1 7) 、 第 3番目〜 1 1番目 （配列番号： 1 1) アミ ノ酸配列からなるペプチドも、 「ァペリン」 として好ましい。
配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ 酸配列を含有するペプチドには、 配列番号： 3、 配列審号： 5、 配列番号： 7ま たは配列番号： 9のアミノ酸配列の第 42番目〜 77番目 （配列番号： 1 3、 配 列番号： 14または配列番号： 1·5) 、 第 43番目〜 77番目、 第 44番目〜 7 7番目、 第 45番目〜 77番目、 第 46番目〜 77番目、 第 47番目〜 77番目、 第 48番目〜 77番目、 第 49番目〜 77番目、 第.50番目〜 77番目、 第 5 1 番目〜 77番目、 第 52番目〜 77番目、 第 53番目〜 77番目、 第 54番目〜 77番目、 第 55番目〜 77番目、 第 56番目〜 77番目、 第 57番目〜 77番 目、 第 58番目〜 77番目、 第 59番目〜 77番目、 第 60番目〜 77番目、 第 6 1番目〜 77番目、 第 62番目〜 77番目 （配列番号： 20) 、 第 63番目〜 77番目 （配列番号： 1 9) 、 第 64番目〜 77番目 （配列番号： 1 8) 、 第 6 5番目〜 77番目 （配列番号： 1 2、 ァペリン一 1 3) 、 第 66番目〜 77番目 (配列番号： 23) 、 第 67番目〜 77番目 （配列番号： 1 6) 、 第 42番目〜 76番目、 第 43番目〜 76番目、 第 44番目〜 76番目、 第 45番目〜 76番 目、 第 46番目〜 76番目、 第 47番目〜 76番目、 第 48番目〜 76番目、 第 49番目〜 76番目、 第 50番目〜 76番目、 第 5 1番目〜 76番目、 第 52番 目〜 76番目、 第 53番目〜 76番目、 第 54番目〜 76番目、 第 55番目〜 7 6番目、 第 56番目〜 76番目、 第 57番目〜 76番目、 第 58番目〜 76番目、 第 59番目〜 76番目、 第 60番目〜 76番目、 第 6 1番目〜 76番目 （配列番 号： 21) 、 第 62番目〜 76番目、 第 63番目〜 76番目、 第 64番目〜 76' 番目、 第 65番目〜 76番目 （配列番号： 24) 、 第 66番目〜 76番目、 第 6 7番目〜 76番目、 第 42番目〜 75番目、 第 43番目〜 75番目、 第 44番目 〜75番目、 第 45番目〜 75番目、 第 46番目〜 75番目、 第 47番目〜 75 番目、 第 48番目〜 75番目、 第 49番目〜 75番目、 第 50番目〜 75番目、 第 5— 1番目〜 75番目、 第 52番目〜 75番目、 第 53番目〜 75番目、 第 54 番目〜 75番目、 第 55番目〜 75番目、 第 56番目〜 75番目、 第 57番目〜 75番目、 第 58番目〜 75番目、 第 59番目〜 75番目、 第 60番目〜 75番 目 （配列番号： 22) 、 第 6 1番目〜 75番目、 第 62番目〜 75番目、 第 63 番目〜 75番目、 第 64番目〜 75番目、 第 65番目〜 75番目 （配列番号： 1 7) 、 第 66番目〜 75番目、 第 67番目〜 75番目 （配列番号： 1 1) のアミ ノ酸配列からなるペプチドが含まれる。 配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列 と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するぺプチドとしては、 配列 番号： 3のアミノ酸配列の第 42番目〜 77番目 （配列番号： 14) ；配列番 号： 7のァミノ酸配列の第 42番目〜 77番目 （配列番号： 1 3) ；配列番号： 9のアミノ酸配列の第 42番目〜 77 目 （配列番号： 1 5) ；配列番号： 3、 配列番号： 5、 配列番号： 7または配列番号： 9のァミノ酸配列の、 第 62番目 〜 77番目 （配列番号： 20) 、 第 63番目〜 77番目 （配列番号： 1 9) 、 第 64番目〜 77番目 （配列番号： 18) 、 第 65番目〜 77番目 （配列番号： 1 2、 ァペリン— 1 3) 、 第 66番目〜 77番目 （配列番号： 23) 、 第 6 7番目 〜 77番目 （配列番号： 1 6) 、 第 61番目〜 76番目 （配列番号： 21 ) 、 第 65番目〜 76番目 （配列番号： 24) 、 第 60番目〜 75番目 （配列番号： 2 2) 、 第 65番目〜 75番目 （配列番号： 1 7) 、 第 67番目〜 75番目 （配列 番号： 1 1) のアミノ酸配列からなるペプチドが好ましい。
本発明の促進剤が対象とするァペリンの受容体 （AP J) としては、 例えば、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列 を含有するタンパク質が好ましい。 ここで、 「実質的に同一」 とは、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と約 50〜 99. 9% (好ましくは 70〜99. 9%、 より好ましくは 80〜99. 9%、 さらに好ましくは 90〜99. 9%) の相同 性を有することを意味する。
また、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と 「実質的に同一のアミノ酸配' ' 列」 としては、 （1) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列中の 1個以上 7個以 下、 好ましくは 1個以上 5個以下、 より好ましくは 1個以上 3個以下のアミノ酸 が欠失したアミノ酸配列、 （2) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列中に 1個 以上 20個以下、 好ましくは 1個以上 1 5個以下、 より好ましくは 1個以上 10 個以下のアミノ酸が付加した （または挿入された） アミノ酸配列、 （3) 配列番 号： 1で表されるアミノ酸配列中の 1個以上 7個以下、 好ましくは 1個以上 5個 以下、 より好ましくは 1個以上 3個以下のアミノ酸が他のアミソ酸で置換された アミノ酸配列を含有するぺプチドなども含まれる。
本明細書におけるポリべプチドは、 ぺプチド標記の慣例に従って左端が]^末端. (ァミノ末端） 、 右端が C末端 （カルボキシル末端） を示す。 本発明のポリぺプ チドは C末端が通常カルボキシル基 （一 COOH) またはカルボキシレート （― COO— ) であるが、 C末端がアミ ド （― CONH2) またはエステル （一 COO R) であってもよく、 塩を形成していてもよい。 エステルの Rとしては、 例えば メチル、 ェチル、 n—プロピル、'イソプロピルもしくは n _ブチルなどの C1-6 アルキル基、 シクロペンチル、 シクロへキシルなどの C3-8シクロアルキル基、 フエ-ル、 α—ナフチノレなどの C6-12ァリール基、 ベンジノレ、 フエネチル、 ベン ズヒ ドリルなどのフエニル一 Cい 2アルキル もしくは ひ一ナフチルメチルなど の α—ナフチル一 C,_2アルキルなどの C7-147ラルキル基、 経口用エステルとし て汎用されるビバロイルォキシメチル基などがあげられる。 本発明のポリべプチ ドが C末端以外にカルボキシル基またはカルボキシレ一トを有している場合、 そ れらの基がアミ ド化またはエステル化されているものも本発明のポリペプチドに 含まれる。 この時のエステルとしては、 例えば上記した C末端のエステルなどが 用いられる。 本発明のポリペプチドにはまた、 G 1 nの N端側が生体内で切断さ れ、 該 G 1 nがピログルタミン酸化したものなども含まれる。
さらに本発明のポリペプチドは N末端に Me tが付加したものも含まれる。 ま た、 これらの部分ペプチドであってもよい。 本発明のポリペプチドの塩としては、 生理学的に許容される塩基 （例えばアル カリ金属など） や酸 （有機酸、 無機酸） との塩が用いられるが、 とりわけ生理学 的に許容される酸付加塩が好ましい。 このような塩としては例えば無機酸 （例え ば、 塩酸、 リン酸、 矣化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リ ンゴ酸、 シユウ酸、 安息香酸、'メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸） との塩 などが用いられる。
本発明のポリペプチドは、 ヒ トゃ温血動物の組織または細胞からポリペプチド を精製する方法によって製造することもできるし、 後述のポリぺプチド合成法に 準じて製造することもできる。 また、 後述するポリペプチドをコードする D N A を含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。
ヒ トゃ温血動物の組織または細胞から製造する場合、 ヒ トゃ温血動物の組織ま たは細胞をホモジナイズした後、 酸などで抽出を行い、 該抽出液を、 塩析、 透析、 ゲル濾過、 逆相クロマトグラフィー、 イオン交換クロマトグラフィー、 ァフィ二 ティ一クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより '精製単離することができる。
上記したように本発明のポリペプチドは、 公知のポリペプチドの合成法に従つ て、 あるいは本発明のポリべプチドを含有するポリべプチドを適当なぺプチダー ゼで切断することによって製造することができる。 ペプチドの合成法としては、 例えば固相合成法、 液相合成法のいずれによっても良い。 すなわち、 本発明のポ リぺプチドを構成し得る部分べプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、 生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のぺプチドを製 造することができる。 公知の縮合方法や保護基の脱離としてはたとえば、 以下の ( a ) （e ) に記載された方法があげられる。
( a ) M. Bodanszky および h. A. 0ndett i Peptide Synthes i s, Interscience Publ i shers, New York (1966年）
( b ) Schroederおよび Luebke The Pept ide, Academic Press, New York (1965年）
( c ) 泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 （株） （1975年）
( d ) 矢島治明 および榊原俊平、 生化学実験講座 1、 タン ク質の化学 IV 205、 （1977年）
( e ) 矢島治明監修、 続医薬品の開発 第 14巻 へフチト" 合成 広川書店 また、 反応後は通常の精製法、 たとえば、 溶媒抽出 '蒸留 ·カラムクロマトグ ラフィー ·液体ク口マトグラフィー ·再結晶などを組み合わせて本発明のポリぺ プチドを精製単離することができる。 上記方法で得られるポリぺプチドが遊 体 である場合は、 公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、 逆に塩 で得られた場合は、 公知の方法によって遊離体に変換することができる。
ポリぺプチドのァミ ド体は、 ァミ ド形成に適した市販のぺプチド合成用樹脂を 用いることができる。.そのような樹脂と.しては例えば、 クロ-ロメチル樹脂、 ヒ ド ロキシメチル樹脂、 ベンズピドリルァミン樹脂、 アミノメチル樹脂、 4 _ベンジ ルォキシベンジルアルコール樹脂、 .4—メチルベンズヒ ドリルァミン樹脂、 P A M樹脂、 4—ヒ ドロキシメチルメチルフエニルァセトアミ ドメチル樹脂、 ポリア ク リルアミ ド樹脂、 4 _ ( 2 ' ， 4 ' —ジメ トキシフエ二ル一ヒ ドロキシメチ ノレ） フエノキシ樹脂、 4— ( 2 ' , 4， 一ジメ トキシフエニル一 F m o cァミノ ェチル） フエノキシ樹脂などをあげることができる。 このような樹脂を用い、 a —アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、 目的とするぺプチドの配 列通りに、 公知の各種縮合方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後に樹脂 からべプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、 必要に応じて高希釈溶液 中で分子内ジスルフィ ド結合形成反応を実施し、 目的のポリペプチドを取得する。 上記した保護されたアミノ酸の縮合に関しては、 ペプチド合成に使用できる各 種活性化試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミ ド類がよい。 カルボ ジイミ ド類としては D C C、 N , N ' —ジイソプロピルカルポジイミ ド、 N—ェ チルー N ' - ( 3—ジメチルァミノプロピル） カルポジイミ ドなどがあげられる。 これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 H O B t、 H O O B tな ど） とともに保護されたアミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、 対称酸無水物 または H O B tエステルあるいは H O O B tエステルとしてあらかじめ保護され たァミノ酸の活性化を行つたのちに樹脂に添加することができる。 保護されたァ ミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、 ぺプチド縮合反応に 使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。 たとえば N， N—ジ メチルホルムアミ ド、 N， N—ジメチルァセ トアミ ド、 N—メチルピロリ ドンな どの酸アミ ド類、 塩化メチレン、 クロ口ホルムなどのハロゲン化炭化水素類、 ト リフルォロエタノールなどのアルコール類、 ジメチルスルホキシドなどのスルホ キシド類、 ピリジンなどの三級ァミン類、 ジォキサン、 テトラヒ ドロフランなど のエーテル類、 ァセトニトリル、 プロピオ二トリルなどの二トリル類、 酢酸メチ ノレ、 酢酸ェチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられ る。 反応温度はペプチド結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲か ら適宜選択され、 通常約一 2 0 °C〜 5 0 °Cの範囲から適宜選択される。 活性化さ れたアミノ酸誘導体は通常 1 . 5ないし 4倍過剰で用いられる。 ニンヒ ドリン反 „応を用いたテス の結果、 縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく 縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行うことができる。 反応を繰り返し ても十分な縮合が得られないときには、 無水醉酸またはァセチルイミダゾールを 用いて未反応アミノ酸をァセチル化して、 後の反応に影響を及ぼさないようにす ることができる。 . 原料アミノ酸のァミノ基の保護基としては、 たとえば、 Z、 B o c、 タ一シャ リ一ペンチノレォキシカノレボニノレ、 イソボノレニノレオキシカノレボニノレ、 4—メ トキシ ベンジルォキシカルボニル、 C 1— Z、 B r— Z、 ァダマンチノレオキシカルボ二 ノレ、 ト リ フノレオロアセチノレ、 フタロイノレ、 ホノレミノレ、 2—ニ ト ロフエニノレスノレフ ェニル、 ジフヱニルホスフイノチオイル、 F m o cなどがあげられる。 カルボキ シル基の保護基としては、 たとえば Rとして上記したじ卜6アルキル基、 C3— 8シ クロアルキル基、 C7_14ァラルキル基の他、 2—ァダマンチル、 4—ニトロベン ジル、 4—メ トキシベンジル、 4—クロ口ベンジル、 フエナシル基およびべンジ ルォキシカルボニルヒ ドラジド、 ターシャリ一ブトキ.シカルボニルヒ ドラジド、 トリチノレヒ ドラジドなどがあげられる。
セリンおよびスレオニンの水酸基は、 たとえばエステル化またはエーテル化に よって保護することができる。 このエステル化に適する基としては例えばァセチ ル基などの低級アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジルォキ シカルボニル基、 ェトキシカルボニル基などの炭素から誘導される基などがあげ られる。 また、 エーテル化に適する基としては、 たとえばベンジル基、 テトラ七 ドロビラニル基、 ターシャリーブチル基などである。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 たとえば B z し C 1 2- B z l、 2—二.トロベンジル、 B r— Z、 ターシャリーブチルなどがあげられる。 ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、 To s、 4ーメ トキシー 2, 3， 6— トリメチルベンゼンスノレホニル、 DNP、 ベンジルォキシメチル、 B um, B o c、 T r t、 Fmo cなどがあげられる。 ' 原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、 たとえば対応する酸無水 物、 アジド、 活性エステル [アルコール （たとえば、 ペンタクロロフエノ一ノレ、 2, 4， 5—トリクロロフエノール、 2 , 4 _ジニトロフエノール、 シァノメチ ノレアルコール、 パラニ トロフエノーノレ、 HONB、 N—ヒ ドロキシスクシミ ド、 ― -.N—ヒ ドロキシフタルイミ ド、 HOB t-) とのエステル] などがあげられる。 原 料のアミノ基の活性化されだものとしては、 たとえば対応するリン酸アミ ドがぁ げられる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 たとえば P d黒あるいは P d炭素などの 触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メタンス ルホン酸、 トリフルォロメタンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるいはこれらの 混合液などによる酸処理や、 ジィソプロ.ピルェチルァミン、 トリェチルァミン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体アンモニア中ナトリウム による還元などもあげられる。 上記酸処理による脱離反応は一般に— 20°C〜 4 0°Cの温度で行われるが、. 酸処理においてはァニソール、 フエノール、 チオア二 ソ一ノレ、 メタクレゾ一ノレ、 ノ ラクレゾ一ノレ、 ジメチノレスノレフイ ド、 1， 4—ブタ ンジチオール、 1， 2 _エタンジチオールのようなカチオン捕捉剤の添加が有効 である。 また、 七スチジンのイミダゾール保護基として用いられる 2, 4—ジニ トロブェニル基はチオフエノ一ル処理により除去され、 トリプトファンのィンド ール保護基として用いられるホルミル基は上記の 1 , 2 _エタンジチオール、 1， 4—ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、 希水酸化ナト リウム、 希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護および保護基、 ならびにその保護 基の脱離、 反応に関与する官能基の活性化などは公知の基あるいは公知の手段か ら適宜選択しうる。
ポリペプチドのアミ ド体を得る別の方法としては、 まず、 カルボキシル末端ァ ミノ酸の α—カルボキシル基をァミ ド化した後、 ァミノ基側にぺプチド鎖を所 望の鎖長まで延ばした後、 該ぺプチド鎖の N末端の ひーァミノ基の保護基のみ を除いたぺプチドと C末端のカルボキシル基の保護基のみを除いたぺプチド （ま たはァミノ酸） とを製造し、 この両ぺプチドを上記したような混合溶媒中で縮合 ' させる。 縮合反応の詳細については上記と同様である。 縮合により得られた ί呆護 ペプチドを精製した後、 上記方法によりすベての保護基を除去し、 所望の粗ポリ ぺプチドを得ることができる。 'この粗ポリべプチドは既知の各種精製手段を駆使 して精製し、 主要画分を凍結乾燥することで所望のポリペプチドのアミ ド体を得 ることができる。
- ポリべプチ-ドのエステル体を得るには -力ノレボキシ末端アミノ酸の α—カルボ キシル基を所望のアル ー 類と縮合しアミノ酸エステルとした後、 ポリべプチ ドのァミ ド体と同様にして所望のポリぺプチドめエステル体を得ることができる。 本発明のポリぺプチドとしては、 上記したポリぺプチドと同様の作用. （例、 血 管内皮細胞の遊走 ·増殖阻害作用、 血管新生阻害作用など） を有しているもので あれば、 どのようなぺプチドであってもよレ、。 このようなぺプチドとしては例え ば、 上記した配列番号： 3、 配列番号： 5、 配列番号： 7または配列番号： 9で 表されるアミノ酸配列の部分配列などを含有するペプチドから 1個以上のァミノ 酸が欠失したアミノ酸配列を含有するべプチドをあげることができる。 具体的に は、 配列番号： 3、 配列番号： 5、 配列番号： 7または配列番号： 9で表される. ァミノ酸配列の部分配列を有するぺプチドなどが好ましい。
本発明のポリペプチドはさらに、 機能あるいは性質がよく知られているタンパ ク質との融合タンパク質であってもよレ、。
本発明のポリべプチドおよび後述の本発明のポリべプチドをコ一ドする D N A は、 公知の方法で標識化されていてもよく、 具体的にはアイソトープ標識化され たもの、 蛍光標識されたもの （例えば、 フルォレセインなどによる蛍光標識） 、 ビォチン化されたものまたは酵素標識されたものなどがあげられる。
本発明のポリペプチド （中でもァペリン受容体） をコードする D N Aとしては、 配列番号： 1で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配 列を含有する受容体タンパク質に対する結合能を有するポリべプチドをコ一ドす る塩基配列を含有する D N Αであればいかなるものであってもよい。 具体的には、 本発明のポリべプチドのアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配 列を含有する.ポリぺプチド^コードする塩基配列を含有するものであればいかな るものであってもよい。 また、 ゲノム DNA、 ゲノム DNAライブラリー、 前記 した組織 ·細胞由来の c DN A、 前記した組織 ·細胞由来の c DN Aライブラリ 一、 合成 DN Aのいずれでもよい。 ライブラリーに使用するベクターはバクテリ' オファージ、 プラスミド、 コスミ ド、 ファージミ ドなどいずれであってもよレ、。 また、 前記した組織 ·細胞より RN A画分を調製した'ものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (以下、 RT— PCR法と略称す る） によって増幅することもできる。
. 本発明のポリペプチドをコードする DNA—としては、 - .( 1-) 配列番号： 4、 配 列番号： 6、 配列番号： 8または配列番号： 1 0で表される塩基配列、 またはそ の部分配列を有する DNAを含有する DNA、 (2) ストリンジヱン卜な条件下 で （1) で規定された配列とハイブリダィズする哺乳動物由来の DNA、 (3) 遺伝コードの縮重のため （1) および （2) に定められている配列とハイブリツ ド形成しないが、 同一アミノ酸配列をもつポリべプチドをコ一ドする DNAなど が用いられる。 ハイブリダィゼーシヨンは、 公知の方法あるいはそれに準じた方 '法に従って行うことができる。 上記ストリンジェン卜な条件としては、 例えば 4 2。C、 50%ホルムアミ ド、 4 X S S PE (1 X S S PE= 1 50 mMN a C 1 ; l OmM N a H2PO H20, ·1 mM EDTA, p H 7. 4) 、 5 Xデンハ —ト溶液、 0. 1%SDSである。
本発明のポリペプチドをコードする DNAは以下の遺伝子工学的手法によって も製造することができる。
本発明のポリべプチドを完全にコ一ドする DNAのクロ一ユングの手段として は、 （1) 本発明のポリペプチドの部分塩基配列を有する合成 DN Aプライマー を用いて公知の P CR法によって前記 DN Aライブラリ一等から目的とする DN Aを増幅する方法、 または （2) 適当なベクターに組み込んだ DN Aを例えば本 発明のポリべプチドの一部あるいは全領域を有する DN A断片もしくは合成 DN Aを用いて標識したものとのハイブリダイゼーシヨンによつて選別する方法があ げられる。 ハイブリダィゼーシヨンの方法は、 例えば Molecular Cloning (2nd ed.； J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). に記載の方 法などに従って行われる。 また、 市販のライブラリーを使用する場合、 添付の使 用説明書に記載の方法に従って行う。
クローン化された本発明のポリべプチドをコ一ドする DN Aは目的によりその まま、 または所望により制限酵素で消化したり、 リンカ一を付加したりして使用 することができる。 該 DN Aはその 5 ' 末端側に翻訳開始コドンとしての ATG を有し、 また 3 ' 末端側には翻訳終止コドンとしての TAA、 TGAまたは TA Gを有していてもよい。 これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コ ドンは、 適当な合 成 DNAアダプターを用いて付加することも
できる。
本発明のポリ -ぺプチドの発現べクタ一-は、 例えば、 （ a ) 本発明のポリぺプチ ドをコードする DNAから目的とする DNA断片を切り出し、 '（b) 該 DNA断 片を適当な発現ベクター中のプロモータ一の下流に連結することにより製造する ことができる。
ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミ ド （例、 p B R 3 2 2 , p BR 3 2 5， p UC 1 2, pUC 1 3) 、 枯草菌由来のプラスミ ド （例、 p UB 1 1 0, p T P 5, p C 1 94) 、 酵母由来プラスミ ド （例、 p SH 1 9, p S H 1 5 ) 、λ ファージなどのパクテリオファージ、 レトロゥイノレス， ワクシニアゥイノレス， バキュ口ウィルスなどの動物ウィルスなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、 遺伝子の発現に用いる宿主に対応 レて適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。
形質転換する際の宿主が動物細胞である場合には、 SV40由来のプロモータ 一、 レトロウイ；/レスのプロモーター、 メタ ϋチォネインプロモータ一、 ヒートシ ョックプロモーター、 サイ トメガロウイノレスプロモーター、 S R ct プロモータ 一などが利用できる。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 t r pプロモータ ―、 T 7プロモータ一、 l a cプロモータ一、 r e c Aプロモーター、 λ P Lプ 口モーター、 1 ρ ρプロモーターなどが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 S PO lプロモーター、 S P02プロモーター、 p e η Ρプロモ一ターなど、 宿主 が酵母である場合は、 ΡΗΟ 5プロモーター、 PGKプロモーター、 GAPプロ モーター、 ADH 1プロモーター、 G A Lプロモータ一などが好ましい。 宿主が 昆虫細胞である場合は、 ポリヘドリンプロモーター、 P 1 0プロモーターなどが 好ましい。 発現べクタ一 は、 以上の他に、 所望によりェンハンサー、 スプライシングシ ダナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカ一、 SV40複製オリジン （以下、 S V40 o r i と略称する場合がある） などを含有しているものを用いることがで きる。 選択マーカ一としては、 例えば、 ジヒ ドロ葉酸還元酵素 （以下、 d h fr と略称する場合がある） 遺伝子 〔メソトレキセート （MTX) 耐性〕 、 アンピシ リン耐性遺伝子 （以下、 Am prと略称する場合がある） 、 ネオマイシン耐性遺 伝子 （以下、 N e orと略称する場合がある、 G 4 1 8耐性） 等があげられる。 特に、 CHO (d h i r— ) 細胞を用いて DHFR遺伝子を選択マーカーとして 使用する場合、 チミジンを含まない培地によつ-ても選択できる。 - また、 必要に応じて、 '宿主に合ったシグナル配列を、 ポリペプチドの N端末側 に付加する。 宿主がェシヱリヒア属菌である場合は、 P h o A ·シグナル配列、 Omp A ·.シグナル配列などが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 ひ—アミラ ーゼ ·シグナル配列、 サブチリシン ·シグナル配列などが、 宿主が酵母で る場 合は、 メイティングファクター a (MFひ） 'シグナル配列、 インベルタ一ゼ ' シグナル配列など、 宿主が動物細胞である場合には、 例えばィンシュリン ·シグ ：ナル配列、 ひ 一インターフェロン ' シグナル配列、 抗体分子 · シグナル配列など がそれぞれ利用できる。
このようにして構築されたポリ 'ぺプチドをコ一ドする DNAを含有するべクタ 一を用いて、 形質転換体を製造することができる。
宿主としては、 たとえばェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫または 昆虫細胞、 動物細胞などが用いられる。
ェシエリ ヒア属菌としては、 ェシエリ ヒア ' コリ （Escherichia coli)K12 · DH1 〔Pro Natl. Acad Sci. USA, 60巻， 160(1968)〕 ， J M 1 0 3 [Nucleic Acids Research, 9卷， 309 (1981)〕 ， J A 2 2 1 [Journal of Molecular Biology, 120 卷， 517(1978)〕 ， HB 1 0 1 [Journal of Molecular Biology, 41巻， 459 (1969)〕 ， C 60 0 [Genetics, 39卷， 440(1954)〕 などが用いられる。
バチルス属菌としては、 たとえばバチルス 'サチルス （Bacillus subtilis) M I 1 1 4 〔Gene, 24卷， 255(1983)〕 ， 20 7— 2 1 [Journal of
Biochemistry, 95巻， 87 (1984) 〕 などが用いられる。
酵母としては、 たとえばサッカロマイセス セレピシェ （Saccharomyces cerevisiae) AH 2 2, AH 2 2 R', NA8 7— 1 1 A, DKD— 5D， 20 B— 1 2などが用いられる。
昆虫としては、 例えばカイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、 Nature, 315 巻， 592(1985)〕 0
昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが A c NPVの場合は、 夜盗蛾の幼虫由 来株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell； Sf細胞） 、 Trichoplusia niの中腸 由来の MG1細胞、 Trichoplusia niの卵由来の High Five™細胞、 Mamestra brassicae由来の細胞または Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。 ゥ ィルスが BmNP.V-の場合は、 蚕由来株化細胞 （Bombyx mori_ N;BmN細胞） などが用 いられる。 該 Sf細胞としては、 例えば、 Sf9細胞 （ATCC CRL1711) 、 Sf21細胞 〔以上、 Vaughn, J.しら、 In Vitro, .13巻， 213-217頁（1977年）〕 などが用いられ る。 ノ .
動物細胞としては、 たとえばサル CO S— 7細胞， V e r o細胞， チヤィニー ズハムスター細胞 CHO， DHF R遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞 CH 0 (d h f r— C H O細胞） ， マウス L細胞， マウス 3 T 3細胞、 マウスミエ ローマ細胞， ヒ ト HEK29.3細胞、 ヒ ト F L細胞、 2 9 3細胞、 C 1 2 7細胞、 BALB 3 T 3細胞、 S p— 2 0細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌を形質転換するには、 たとえば Prcx;. Natl. Acad. Sci.USA, 69 卷， 2110 (1972)や Gene, 17卷， 107 (1982)などに記載の方法に従って行なわれる。 バチルス属菌を形質転換するには、 たとえば Molecular & General
Genetics, 168巻， 111 (1979)などに記載の方法に従って行われる。
酵母を形質転換するには、 たとえば Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 75卷， 1929 (1978)に記載の方法に従って行なわれる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、 たとえば Bio/Technology, 6卷， 47 - 55頁（1988)などに記載の方法に従って行なわれる。
動物細胞を形質転換するには、 たとえば Virology, 52巻， 456(1973)に記載の方 法に従って行なわれる。
発現ベクターの細胞への導入方法としては、 例えば、 リボフヱクシヨン法
[Feigner, P. L. et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of Africa, 84卷， 7413頁（1987年）〕 、 リン酸カルシウム法 [Graham, F. L. and van der Eb, A. J. Virology, 52卷， 456 - 467頁（1973年） i 、 電気穿孔法 (Nuemann, E. et al. EMBO J.， 1卷， 841- 845頁（1982年）〕 等があげ られる。
このようにして、 本発明のポリべプチドをコ一ドする D N Aを含有する発現-ベ クタ一で形質転換された形質転換体が得られる。
なお、 動物細胞を用いて、 本発明のポリペプチドを安定に発現させる方法とし ては、 上記の動物細胞に導入された発現ベクターが染色体に組み込まれた細胞を クローン選択によって選択する方法がある。 具体的には、 上記の選択マーカーを 指標にして形質転換体を選択する。 さらに、 このように選択マーカーを用いて得- られた動物細胞に対して、 繰り返しクローン選択を行うことにより本発明のポリ ペプチドの高発現能を有する安定な動物細胞株を得ることができる。 また、 d h f r遺伝子を選択マ一力一として用いた場合、 M T X濃度を徐々に上げて培養し、 耐性株を選択することにより、 d h f r遺伝子とともに、 本発明のポリぺ 7°チド をコードする D N Aを細胞内で増幅させて、 さらに高発現の動物細胞株を得るこ ともできる。
上記の形質転換体を本発明のポリべプチドをコ一ドする D N Aが発現可能な条 件下で培養し、 本発明のポリペプチドを生成、 蓄積せしめることによって、 本発 明のポリべプチドを製造することができる。
宿主がェシエリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培養 に使用される培地としては液体培地が適当であり、 その中には該形質転換体の生 育に必要な炭素源、 窒素源、 無機物その他が含有せしめられる。 炭素源としては、 たとえばグルコース、 デキストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖など、 窒素源としては、 たとえばアンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 コーンスチープ ' リカー、 ペプトン、 力 ゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液などの無機または有機物質、 無機 物としてはたとえば塩化カルシウム、 リン酸二水素ナトリウム、 塩化マグネシゥ ムなどがあげられる。 また、 酵母、 ビタミン類、 生長促進因子などを添加しても よい。 培地の p Hは約 5〜8が望ましい。
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えばグルコース、 カザミノ 酸を含む M 9培地 し Mi l ler, Journal of Experiments in Molecular
Genetics, 431-433, Cold Spri ng Harbor Laboratory, New York 1972] 力 子ましレヽ。 ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、 たとえば 3 ]3—イン ドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がェシエリヒア属菌の場合、 培養は通常約 1 5〜4 3でで約3〜24時間 行い、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、 培養は通常約 3 0〜40°Cで約 6〜24時間行い、 必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 たとえばバークホ 一ルダー （Burkholder) 最小培地 〔Bostian, K.しら、
Pro Natl. Acad. Sci.-USA, 77卷， 4505(1980)〕 や 0. 5 °/oカザミノ酸を含有する- S D培地 [Bitter, G. A.ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81卷， 5330(1984)〕 があげ られる。 培地の pHは約 5〜 8に調整するのが好ましい。 培養は通常約 20°C〜
3 5°Cで約 24〜 72時間行い、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 Grace s
Insect Medium (Grace, T. C. C. , Nature, 195, 788 (1962) ) に非動化した 1 0%ゥシ 血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。 培地の pHは約 6. 2〜6.
' 4に調整するのが好ましい。 培養は通常約 2 7 °Cで約 3〜 5日間行い、 必窭に応 じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 たとえば約 5
〜 20%の胎 J/¾牛血清を含む MEM培地 [Science, 122卷， 501(1952)〕 , DME M培地 [Virology, 8卷， 396 (1959)〕 ， R P I 1 640培地 〔The Jimrnal of the American Medical Association 199巻， 519 (1967)〕 ， 1 99培地
[Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73巻, 1 (1950)〕 などが用いられる。 pHは約 6〜8であるのが好ましい。 培養は通常約 3 0°C〜
40°Cで約 1 5〜60時間行い、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
特に CHO (d h f r—) 細胞および d h f r遺伝子を選択マ一カーとして用 いる場合には、 チミジンをほとんど含まない透析ゥシ胎児血清を含む D M E M培 地を用いるのが好ましい。
上記培養物から本発明のポリべプチドを分離精製するには、 例えば下記の方法 により行なうことができる。
本発明のポリペプチドを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、 培養 後、 公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これを適当な緩衝液に懸濁し、 超音 波、 リゾチームおよび または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊し たのち、 遠心分離やろ過によりポリべプチドの粗抽出液を得る方法などが適宜用 い得る。 緩衝液の中に尿素や塩酸グァニジンなどのタンパク変性剤や、 T r i t o n (登録商標） X— 1 0 0などの界面活性剤が含まれていてもよい。
培養液中にポリペプチドが分泌される場合には、 培養終了後、 公知の方法で菌 体あるいは細胞と上清とを分離し、 上清を集める。
このようにして得られた培養上清、 あるいは抽出液中に含まれる本発明のポリ プチドの精製は、 公知の分離 ·精製法を適切に組み合わせて行うことができる。 これらの公知の分離、 精製法としては、 塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を利用す る方法、 透析法、 限外ろ過法、 ゲルろ過法、 および S D S—ポリアクリルアミ ド ゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、 イオン交換クロマト グラフィーなどの荷電の差を利用する方法、 ァフィ二ティーク口マトダラ ィー などの特異的親和性を利用する方法、 逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎 水性の差を利用する方法、 等電点電気泳動法やクロマトフォーカシングなどの等 電点の差を利用する方法などが用いられる。
このようにして得られる本発明のポリべプチドが遊離体で得られた場合には、 公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、 逆に塩 で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、 遊離体または 他の塩に変換することができる。
なお、 組換え体が産生する本発明のポリペプチドを、 精製前または精製後に適 当なタンパク修飾酵素を作用させることにより、 任意に修飾を加えたり、 ポリべ プチドを部分的に除去することもできる。 タンパク修飾酵素としては、 例えば、 トリプシン、 キモトリブシン、 アルギニルエンドべプチダーゼ、 プロテインキナ —ゼ、 グリコシダーゼなどが用いられる。
このようにして生成する本発明のポリべプチドの存在は特異抗体を用いたェン ザィムィムノアッセィなどにより測定することができる。
上記のようにして得られたァペリンおよび Zまたはその受容体を用いて、 それ らの結合を促進する物質を以下のようにして取得することができる。
本発明が提^¾するアベリンとその受容体の結合を促進する物質について、 さら にァペリン受容体の機能を促進する物質としてのァペリン受容体ァゴニスト （本 発明のァゴニスト） について、 詳細に説明する。
本発明のァゴニストとしては、 例えばペプチド、 タンパク質、 抗体、 非ぺプチ ' ド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出 液、 血漿などが挙げられ、 これらの物質は新規物質であってもよいし、 公知の物 質であってもよい。 本発明のァゴニストは塩を形成していてもよい。 該ァゴニス トの塩としては、 前記した本発明のポリべプチドの塩と同様のものが用いられる。 本発明のァゴニストは、 ァペリン受容体の機能を促進することができるので、 —アペリンとその受容体を用いてスクリーニングすることができる。 以下に、 スグ リーニング方法について説明する。 '
本発明のァゴニストは、 （ i ) ァペリン受容体にァペリンを接触させた場合と (i i) ァペリン受容体に試験化合物を接触させた場合との比較を行なうことを特 徴とするァペリン受容体の機能を促進する物質のスクリーニング方法を用いて得 ることができる。 本発明のスクリーニング方法においては、 ( a ) ( i ) ァペリ ン受容 #：にァペリンを接触させた場合と （i i) ァペリン受容体にアベリンおよび '試験化合物を接触させた場合における、 例えばァペリン受容体に対するァペリン の結合量などを測定して、 その結果を比較する ；または、 （b ) ( i ) ァペリン 受容体にァペリンを接触させた場合と （i i) ァペリン受容体に試験化合物を接触 させた場合における、 例えばァペリン受容体を介した細胞刺激活性 （例えば、 了 ラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2+遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質 のリン酸化、 c _ f o sの活性化、 p Hの変化などを促進する活性など） などを 測定して、 その結果を比較する。
本発明のァゴニス卜のスクリーニング方法は、 具体的には、
( 1 ) 標識したァペリンをァペリン受容体に接触させた場合と、 標識したァペリ ンおよび試験化合物をァペリン受容体に接触させた場合における、 標識したァぺ リンのァペリン受容体に対する結合量を測定し、 比較することを特徴とするァぺ リン受容体の機能を促進する物質のスクリ一ユング方法；
( 2 ) 標識したァペリンをァペリン受容体を含有する細胞または該細胞の膜画分 に接触させた場合と、 標識したァペリンおよび試験化合物をァペリン受容体を含 有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、 標識したァペリン の該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、 比較することを特徴とするァ ペリン受容体の機能を促進する物質のスクリーニング方法；
(3) 標識したァペリンを、 ァペリン受容体をコードする DN Aを含有する形質 転換体を培養することによって細胞膜上に発現したァペリン受容体に接触させた 場合と、 標識したァペリンおよび試験化合物をァペリン受容体をコードする DN Aを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したァペリン受 容体に接触させた場合における、 標識したァペリンの該ァペリン受容体に対する 結合量を測定し、—比較することを特徴とするァペリ-ン受容体の機能を促進する物 質のスクリーニング方法； ' '
などがあげられる,。
さらに具体的には、 ァペリンとァペリン受容体との結合を促進する物質のスク リ一ニングを行うには、 まずァペリン受容体を含有する細胞または細胞の膜画分 を、 スクリーニングに適したバッファ一に懸濁することにより レセプタ一標品を 調製する。 ノくッファーには、 p H4〜 1 0 (望ましくは pH6〜8) のリン酸バ 'ッファー、 トリス一塩酸バッファーなどのァペリンとァペリン受容体との結合を 阻害しないバッファ一であればいずれでもよい。 また、 非特異的結合を低減させ る目的で、 CHAP S、 Twe e n— 80™ (花王一アトラス社） 、 ジギトニン、 デォキシコレ一トなどの界面活性剤をバッファーに加えることもできる。 さらに、 プロテアーゼによるァペリン受容体ゃァペリンの分解を抑える目的で PMS F、 ロイぺプチン、 E—64 (ペプチド研究所製） 、 ぺプスタチンなどのプロテア一 ゼ阻害剤を添加することもできる。 0.0 1 m 1〜 1 Om 1の該ァペリン受容体 溶液に、 一定量 （5000 c pm〜500000 c pm) の標識したァぺリンま たはその修飾体を添加し、 同時に 1 0— 4〜1 O— Mの試験化合物を共存させる。 非特異的結合量 （NSB) を知るために大過剰の未標識のァペリンまたはその修 飾体を加えた反応チューブも用意する。 反応は約 0 °C〜約 50 °C、 望ましくは約 4 °C〜約 37 °Cで約 20分〜約 24時間、 望ましくは約 30分〜約 3時間行う。 反応後、 ガラス繊維濾紙等で濾過し、 適量の同バッファーで洗浄した後、 ガラス 繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーシヨンカウンタ一または 力 ゥンタ一で計測する。 拮抗する物質がない場合のカウント （B。） から非特異的 結合量 （N S B ) を引いたカウント （B。一 N S B ) を 1 0 0 %としたとき、 特 異的結合量 （B— N S B ) 力 S、 例えば 1 0 0 %以上になる試験化合物を候補物質 として選択することができる。
試験化合物としては、 例えばペプチド、 タンパク質、 抗体、 非ペプチド性化合 物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿 などが挙げられ、 これらの物質は新規物質であってもよいし、 公知の物質であつ てもよい。 試験化合物は塩を形成していてもよい。 試験化合物の塩としては、 前 記した本発明のポリペプチドの塩と同様のものが用いられる。
このよ.うにして得られたァゴニストは、 ァペリンが有する生理活性を促進する ことができるので、 ァペリジの活性を促進する安全で低毒性な医薬として有用で ある。 ■
[本発明のァゴニストを含有してなる医薬組成物] .
上記の記載に基づいて製造される本発明のァゴニス トを含有してなる医薬組成 物は、 常套手段に従って製造 ·使用することができる。 例えば、 必要に応じて糖 衣や腸溶性被膜を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤、 徐放剤などとして経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る 液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤ゃ徐放剤の形で非経口的に使用 できる。 例えば、 該化合物またはその塩を生理学的に認められる担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に認められる単位 用量形態で混和することによつて製造することができる。 これら製剤における有 効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるように調整する。 本発明のァ ゴニストは単独でも用いられるが、 組成物として用いる場合、 有効成分として製 剤中に 1 0 %から 9 0 %配合される。
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えばゼラチ ン、 コーンスターチ、 トラガントガム、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セ ノレロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような 膨化剤、 ステアリン酸マグネシゥムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサヅカ リンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチヱリ一のような香味剤 などが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 前記タイプの材料 にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成 物は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻^、 椰子油などのような天然 産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施にしたがって処方 することができる。 '
注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を 含む等張液 （例えば、 D _ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナトリウムな ど） などがあげられ、 適当な溶解補助剤、 たとえばアルコール （たとえばェタノ —ル） 、 ポリアルコール （たとえばプロピレングリ ール、 ポリエチレングリコ —ル)： 、 非イオン性界面活性剤 （たとえばポリソルベート 8 0 ( TM) 、 H C O —5 0 ) などと併用してもよい。 油性液としてはゴマ油、 大豆油などがあげられ、 溶解補助剤として安息香酸べンジル.、 ベンジルアルコールなどと併用してもよレ、。 また、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸ナトリウム緩衝液） 、 無痛化剤 (例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロ力インなど） 、 安定剤 （例え 、 ヒ ト血清アルブミン、 ポリエチレングリコールなど） 、 保存剤 （例えば、 ベンジル アルコール、 フエノールなど） 、 酸化防止剤などと配合してもよい。 調製された '注射液は通常、 適当なアンプルに充填される。 このようにして得られる製剤は安 全で低毒性であるので、 例えばヒ トゃ哺乳動物 （例えば、 マウス、 ラット、 モル モット、 ゥサギ、 ヒッジ、.ブタ、 ·ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） に対して投与することができる。
本発明の医薬組成物の投与量は、 症状などにより差異はあるが、 経口投与の場 合、 一般的に成人の双極性障害患者 （体重 6 0 k gとして） においては、 一日に つき有効成分 （すなわち本発明のポリペプチドもしぐはそのアミ ドもしくはその エステルまたはその塩） を約 0 . 1から 1 0 O m g、 好ましくは約 1 . 0から 5 O m g、 より好ましくは約 1 . 0から 2 O m gとなるよう投与する。 非経口的に 投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などに よっても異なるが、 たとえば注射剤の形では成人の双極性障害患者 （体重 6 O k gとして） への投与においては、 一日につき有効成分 （すなわち本発明のポリべ プチドもしくはそのアミ ドもしくはそのエステルまたはその塩） を約 0 . 0 1か ら 3 0 m g程度、 好ましくは約 0 . 1から 2 0 m g程度、 より好ましくは約 0 . 1から 1 O m g程度となるように静脈注射により投与するのが好都合である。 他 の動物の場合も、 60 k g当たりに換算した量を投与することができる。 ' 本発明のァペリン、 ァペリンと同等以上の活性を有するァペリン誘導体あるい はァペリン受容体である A P Jを活性化する低分子化合物などのァペリン受容体 の機能を促進する物貲またはァペリンとその受容体の結合を促進する物質は、 例 えば、 安全で低毒性な、 気分障害、 薬物依存の予防 '治療薬または治療補助薬と して使用することができる。
気分障害としては、 例えば、 双極性障害、 うつ病、 躁病、 反復性うつ病、 持続 性気分感情障害 （例、 気分循環症、 気分変調症など） 、 抑うつ神経症、 不安症 (例、 全般性不安障害、 社会不安障害、 -強迫性障害、 パニック障害、 外傷後スト レス障害など） 、 睡眠障害、'摂食障害、 自閉症、 老人性痴呆、 統合失調症、 注意 欠陥多動性障害、 心身症などが挙げられる。
[ァペリン遺伝子発現不全動物、 AP J遺伝子トランスジエニック動物] .
本発明のァペリン遺伝子発現不全非ヒ ト動物 （以下、 遺伝子発現不全非ヒ ト動 物と称す場合がある） とは、 例えば、 前記のァペリン遺伝子が不活性化ざれた哺 乳動物 E S細胞由来の細胞を用いて遺伝子工学的に作出されたものであり、 例え ば、 生殖細胞および体細胞に胚形成初期に不活性化ァぺリン遺伝子配列を導入さ れた非ヒ ト動物である。 . ·
. 該非ヒ ト動物としては、 ァペリンを有するヒ ト以外の動物ならば、 いかなる動 物でもよいが、 非ヒ ト哺乳動物が好ましい。 非ヒ ト哺乳動物としては、 例えば、 ゥシ、 ブタ、 ヒッジ、 ャギ、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モノレモット、 ノ、ムスタ一、 マ ウス、 ラットなどが用いられる。 非ヒ ト哺乳動物のなかでも.、 病態動物モデル系 の作製の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、 また繁殖が容易なゲ ッ歯動物、 とりわけマウス （例えば純系として、 C 57 B L/6系統， DBA 2 系統など、 交雑系として、 B 6 C 3 F 1系統， BDF 1系統， B 6 D 2 F 1系統, BALBZc系統， I CR系統など （なかでも好ましくは、 純系として、 C 57 BL/6系統など、 交雑系として、 BDF 1系統または I CR系統など） ） また はラッ卜 （例えば、 W i s t a r, SDなど） などが特に好ましい。
ァペリン遺伝子をノックァゥトさせるには、 前記のタ一ゲティングベクターを 非ヒ ト動物 ES細胞または非ヒ ト動物卵細胞に公知の方法 （例えば、 エレク ト口 ポレーシヨン法、 マイクロインジェクション法、 リン酸カルシウム法、 リ λフエ クシヨン法、 凝集法、 パ ティクルガン法、 D E A E—デキス トラン法など） に よって導入し （好ましい導入法としては、 E S細胞に導入する場合にはエレク ト ロボレ一シヨン法、 卵細胞に導入する場合にはマイクロインジェクション法な-ど があげられる） 、 タ一ゲティングベクターの不活性化されたァペリン遺伝子 己列 を相同組換えにより、 非ヒ ト動物 E S細胞または非ヒ ト動物卵細胞の染色体上の ァペリン遺伝子と入れ換えることにより行うことができる。
ァペリン遺伝子がノックァゥ卜された細胞は、 ァペリン遺伝子上またはその近 傍の D N A配列をプローブとしたサザンハイブ—リダィゼーション解析またはター ゲティングベクター上の D NA配列と、 タ一ゲティングベクタ一に使用したマウ ス由来のァペリン遺伝子以外の近傍領域の D N A配列とをプライマーとした P C R法による解析で判定することができる。
非ヒ ト動物 E S細胞を用いた場合は、 相同組換えにより、 ァペリン遺伝子が不 活性化された細胞株をクローニングし、 その細胞を胚形成の初期の適当な時期、 例えば、 8細胞期の非ヒ ト動物胚または胚盤胞に注入し （注入法） 、 またはァぺ リン遺伝子が不活性化された E S細胞塊を 2個の 8細胞期胚ではさみ込む （集合 キメラ法） ことにより作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒ ト動物の子宮に移 植する。 ·
. 作出されだ動物は正常なァペリン遺伝子座をもつ細胞と人為的に変異したァぺ リン遺伝子座をもつ細胞どの両者から構成されるキメラ動物である。
該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異したァペリン遺伝子座をもつ場合、 この ようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、 全ての 組織が人為的に変異を加えたァペリン遺伝子座をもつ細胞で構成された個体を、 例えば、 コートカラーの判定等により選別することにより得られる。 このように して得られた個体は、 通常、 ァペリンへテロ発現不全個体であり、 ァペリンまた は A P Jヘテロ発現不全個体同志を交配し、 それらの産仔からァペリンホモ発現 不全個体を得ることができる。
ァペリン遺伝子発現不全非ヒ ト動物は、 該動物の m R N A量を公知の方法を用 いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、 正常動物と区別するこ とが可能である。 このようにしてァペリン遺伝子がノックァゥ卜されている個体は、 交配により 得られた動物個体も該遺伝子がノックアウトされていることを確認して通常の飼 育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、 生殖系列の取得および保持についても常法に従って行うことができる。 即ち、 該不活化遺伝子配列の保有する雌雄の動物を交配することにより、 該不活 化遺伝子配列を相同染色体の両方に持つホモザィゴ一十動物を取得することがで きる。 得られたホモザィゴート動物は、 母親動物に対して、 正常個体 1 , ホモザ ィゴート複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。 ヘテロザィゴート動物の雌雄を交配する.ことにより、 該不活化遺伝子配列を有す るホモザィゴ一トおよびへデロザィゴート動物を繁殖継代することができる。 こ のようにして得られた該不活化遺伝子配列を有する動物の子孫も本発明のァペリ ン遺伝子発現不全非ヒ ト動物に含まれる。
このようにァペリン遺伝子が不活性化された哺乳動物 E S細胞は、 ァぺ yン遺 伝子発現不全非ヒ ト動物を作出する上で、 非常に有用である。 また、 ァペリン遺 伝子発現不全非ヒ ト動物もしくはその組織またはそれらに由来する細胞は、 ァぺ リンの欠損に起因する疾病、 例えば、 ァペリンにより誘導され得る種々の生物活 性の欠失に基づく、 ァペリンの生物活性の不活性化に起因する疾病 （例えば、 気 分障害 （例えば、 双極性障害、 うつ病、 躁病、 反復性うつ病、 持続性気分感情障 害 （例、 気分循環症、 気分変調症など） 、 抑うつ神経症、 不安症 （例、 全般性不 安障害、 社会不安障害、 強迫性障害、 パニック障害、 外傷後ス トレス障害など） 、 睡眠障害、 摂食障害、 自閉症、 老人性痴呆、 統合失調症、 注意欠陥多動性障害、 心身症など） ；薬物依存など） のより良いモデルとなり得るので、 これらの疾病 の原因究明および治療法の検討に有用である。
このように、 本発明のァペリン遺伝子発現不全非ヒ ト動物もしくはその組織ま たはそれらに由来する細胞を、 該疾病の予防および Zまたは治療薬などのスクリ —ニングに用いることができる。 ここで、 上記組織やそれに由来する細胞の例と しては、 たとえば、 下垂体、 脾臓、 脳、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管、 血管、 心臓など、 またはそれらに由来す る細胞などが挙げられる。 本発明の遺伝子発現不全非ヒ ト動物もレくはその組織 またはそれらに由来する細胞は、 脳、 肝臓や腎臓などのホモジネートを用いて特 定の活性を測定する、. あるいは、 腹腔マクロファージを用いて特定産物の活性や 産生量を測定することでスクリーニングに用いることができる。 また、 本発明の ァペリン遺伝子発現不全非ヒ ト哺乳動物もしくはその組織またはそれらに由来す る細胞に試験化合物を投与し、 活性等を測定することでスクリーニングに用いる こともできる。
A P J遺伝子トランスジエニック非ヒ ト動物 （以下、 トランスジエニック非ヒ ト動物と称す場合がある） とは、 例えば、 A P J遺伝子またはその変異 D N Aを 哺乳動物の受精卵へマイクロインジェクションすることによつて遺伝子工学的に 作出した非ヒ ト動物である。 動物としては、 非ヒ ト哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 プタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど）.など （以下、 動 物と略記する場合がある） が挙げられる、 特に、 マウス、 ゥサギなどが好適であ る。 .
A P J遺伝子またはその変異 D N Aを対象動物に導入するにあたっては、. A P J遺伝子またはその変異 D N Aを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に 結合した遺伝子コンス トラク トとして用いるのが一般に有利である。 例えば、 A P J遺伝子またはその変異 D N Aをゥサギに導入する場合、 これと相同性が高い 動物由来の A P J遺伝子またはその変異 D N Aを動物細胞で発現させうる各種プ 口モーターの下流に結合した遺伝子コンス トラク トを、 例えば、 ゥサギ受精卵へ マイクロインジェクシヨンすることによって A P Jタンパク質等を高産生する D N A導入動物 （すなわち、 本発明のトランスジエニック非ヒ ト動物） を作出でき る。 このプロモーターとしては、 例えば、 ウィルス由来プロモーター、 メタロチ ォネィン等のュビキアスな発現プロモーターも使用しうるが、 好ましくは脳で特 異的に発現する N G F遺伝子プロモーターゃェノラーゼ遺伝子プロモーターなど が用いられる。
受精卵細胞段階における A P J遺伝子またはその変異 D N Aの導入により、 対 象動物の胚芽細胞および体細胞の全てに導入した D N Aが存在することとなる。 D N A導入後の作出動物の胚芽細胞において A P Jが存在することは、 作出動物 の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに A P Jタンパク質等を有する.こ とを意味する。 遺伝子を受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体 細胞の全てに A P Jタンパク質等を有する。 このようにして得られた A P J遺伝子またはその変異 D N Aを有するトランス ジェ-ッグ非ヒ ト動物は、.交配により遺伝子を安定に保持することを確認して、 該 D N A保有動物として通常の飼育環境で飼育継代を行うことができる。 さらに 、 目的 D N Aを保有する雌雄の動物を交配することにより、 導入遺伝子を相同染 色体の両方に持つホモザィゴ一ト動物を取得し、 この雌雄の動物を交配すること によりすベての子孫が該 D N Aを有するように繁殖継^;することができる。 このように、 A P J遺伝子またはその変異 D N Aを有するトランスジエニック 非ヒ ト動物もしくはその組織またはそれらに由来する細胞を、 該疾病の予防およ び/または治療薬などのスクリーニングに用いることができる。 ここで、 上記組 織やそれに由来する細胞の例としては、 たとえば、 下垂体、 鸱臓、 脳、 腎臓、 肝 臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管、 血管、 心 臓など、 またはそれらに由来する細胞などが挙げられる。 本発明のトランスジェ ニック非ヒ ト動物もしくはその組織またはそれらに由来する細胞は、 脳、 肝臓や 腎臓などのホモジネートを用いて特定の活性を測定する、 あるいは、 腹腔マクロ ファージを用いて特定産物の活性や産生量を測定することでスクリーニングに用 'いることができる。 また、 本発明の A P J遺伝子またはその変異 D N Aを有する トランスジヱニック非ヒ ト哺乳動物もしくはその組織またはそれらに由来する細 胞に試験化合物を投与し、.活性等を測定することでスクリーニングに用いること もできる。 本明細書および図面において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature.による.略 めるレヽは当 g 分野における慣用略号に基づくものである。 その例を以下に記載する。 またアミ ノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示すものと する。
D N A デォキシリボ核酸
c D N A 相補的デォキシリボ核酸
A アデニン
T チミン
G グァニン C ： シトシン
Y ：チミンまたはシトシン
Ν ：チミン、 シトシン、 アデニンまたはグァニン
R ： ァデニンまたはグァニン
： シトシンまたはアデニン
W ：チミンまたはアデニン
S ： シトシンまたはグァニン
RNA ： リボ核酸
mRNA ：.メッセンジャ—リボ核酸..
AT P ：アデノ'シン三リン酸
EDTA ： エチレンジァミン四醉酸
S D S ： ドデシル硫酸ナトリウム
T F A ： トリフルォロ醉酸
E I A ：ェンザィムィムノアッセィ
G 1 yまたは G ： ダリシン
A l aまたは A ：ァラニン
V a 1または. V ： ノくリン
L e uまたは L ： ロイシン .
I 1 eまたは I ： ィソロイシン
S e rまたは S ：セリン
T h rまたは T ： スレオニン
C y sまたは C ： システィン
Me tまたは M ： メチォニン
G 1 uまたは E ： グルタミン酸
A s pまたは D ： ァスパラギン酸
L y sまたは K ： リジン
A r gまたは R ： アルギニン
H i sまたは H ： ヒスチジン
P h eまたは F ： フエ二ルァラニン
T y rまたは Y ：チロシン T r pまたは w トリブトファン
P r oまたは P プロリン
A s nまたは N
G 1 nまたは Q グノレタミ ン
p G 1 u ピログノレタ
B om
P AM フエ二ルァセトアミ ドメチル
_ また、 本明細書中で繁用される置換基、 保-護基および試薬を下記の記号で表記 する。
T o s ： p―トノレエンスノレフォニノレ
HON B . ： N—ヒ ドロキシ _ 5—ノルボルネンー 2 , 3—ジカルボキ シィミ ド
B z 1 ベンジノレ
Z ベンジノレオキシカノレボニノレ
B r -Z 2—ブロモべン ルォキシカルボニル
C 1一 Z
B o c tーブチノレオキシカノレボニノレ
HOB t 1ーヒ ドロキシベンズトリァゾーノレ
DCC N N'—ジシク口へキシルカルボジィミ ド
m o c N— 9—フノレオレニノレメ トキシカノレボニノレ
DN P ジニトロフエ二ノレ
B um ターシャリーブトキシメチル
T r t トリチル 本願明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
〔配列番号： 1〕
Gタンパク質共役型受容体ヒ ト型タンパク質 （AP J) cDNAにコ る Gタンパク質共役型受容体タンパク質の全アミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 2〕 Gタンパク質共役型受容体ヒ ト型タンパク質 （AP J) c DNAの全塩基配列 を示す。
〔配列番号： 3〕
マウス型ァペリン （前駆体） のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 4〕
マウス型ァペリン （前駆体） をコードする c DNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 5〕 .
ラット型アベリン （前駆体） のァミノ酸配列を示す。
—〔配列番号： 6〕 , - —.
ラット型ァペリン （前駆体） をコードする c DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 7〕 ，
ヒ ト型ァペリン （前駆体） のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 8〕
ヒ ト型ァペリン （前駆体） をコードする c DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 9〕
' ゥシ型ァペリン （前駆体） のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 10〕
ゥシ型ァペリン （前駆体） をコードする c DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 1〕
ヒ ト型ァペリン （前駆体） のアミノ酸配列の第 67番目〜 75番目のァ 配列を示す。
〔配列番号： 1 2〕
ヒ ト型ァペリン （前駆体） のアミノ酸配列の第 65番目〜 77番目のアミノ酸 配列を示す。 （ァペリン一 1 3 ； ヒ トァペリン一 1 3、 マウスァペリン一 1 3、 ラッ トァペリン一 1 3、 ゥシァペリン一 1 3)
〔配列番号： 13〕
ヒ ト型ァペリン （前駆体） のアミノ酸配列の第 42番目〜 77番目のアミノ酸 配列を示す。 （ヒ トァペリン一 36)
〔配列番号： 14〕
マウス型ァペリン （前駆体） のアミノ酸配列の第 42番目〜 77番目のァミノ 酸配列を示す。 （マウスァペリン一 36、 ラットァペリン一 36)
〔配列番号： 1 5〕 ·
ゥシ型ァペリン （前駆体） のアミノ酸配列の第 42番目〜 77番目のアミノ酸 配列を示す。 （ゥシァペリン— 36)
〔配列番号： 1 6〕 .
ヒ ト型ァペリン （前駆体） のアミノ酸配列の第 67番目〜 77番目のアミノ酸 配列を示す。
〔配列番号： 1 7〕
ヒ ト型ァペリン （前駆体） .のアミノ酸配列の第 65番目〜 75番目のアミノ酸 配列を示す。 '
〔配列番号： 1 8〕
ヒ ト型ァペリン （前駆体） のアミノ酸配列の第 64番目〜 77番目のアミノ酸 配列を示す。 . 〔配列番号： 1 9〕
ヒ ト型ァペリン （前駆体） のアミノ酸配列の第 63番目〜 77番目のアミノ酸 配列を示す。
〔配列番号： 20〕
ヒ ト型ァペリン （前駆体） のアミノ酸配列の第 62番目〜 77番目のアミノ酸 配列を示す。
〔配列番号： 2 1〕
ヒ ト型ァペリン （前駆体） のアミノ酸配列の第 6 1番目〜 77番目のアミノ酸 配列を示す。
〔配列番号： 22〕
ヒ ト型ァペリン （前駆体） のアミノ酸配列の第 60番目〜 77番目のアミノ酸 配列を示す。
〔配列番号： 23〕
ヒ ト型ァペリン （前駆体） のアミノ酸配列の第 66番目〜 77番目のアミノ酸 配列を示す。
〔配列番号： 24〕
ヒ ト型ァペリン （前駆体） のアミノ酸配列の第 65番目〜 76番目のアミノ酸 配列を示す, 実施例
以下に実施例を示して、 本発明をより詳細に説明するが、 これらは本発明の範 囲を限定するものではない。 実施例 1
うつ病患者およびコカイン乱用者のブロードマン領域 10野における APJの mRNA発現低下
男性のうつ病患者 （16例）'、 コカイン依存症患者 （14例） 、 およびそれぞれ の障害を発症していない健常者の脳のサンプル （32例） 由来の RNAサンプルに おける APJの mRNA発現量は、 ァフィメ トリクス社のヒ ト用ジーンチップセット (HG_U133 A, HG_U133 B) を用いて測定した。 脳サンプルの取得、 ジーンチップ による解析はジーンロジック社 （Santa Clara, CA) が実施した。 データの標準 化には Affimetrix Microarray Sui t software (MAS) を用いて、 それぞれの測 定値についての信頼度検定を実施し、 発現ありと認められたサンプルについての 発現量を相対値の平均値として求めた。 その結果、 相対的な発現量と発現の頻度 は、 健常者由来の脳では発現量が 141. 5、 発現頻度は 32例中の 7例であつたの に対し、 うつ病患者では発現頻度が 16例中 0例であったため発現量は 0であり、 またコカイン乱用者では発現頻度が 14例中 1例のみでその発現量は 80, 7となり、 うつ病患者とコカイン乱用者で健常者に対じて APJ mRNAの発現量と発現頻度の 低下が検出された。 実施例 2
ァペリンの抗うつ作用の評価
ァペリンの側脳室内投与によるうつに及ぼす影響は強制水泳試験にて評価でき る。 成熟雄性 C57BL/6Nマウス （9週齢、 日本チャールズリバ一社） を試験 2日 前にエーテル麻酔下で頭皮を切開し、 2段針 （ （株） トップ） を用いて左側室脳 室 （Paxinosと Watson (1986)のァトラスに従いブレダマより AP : 2画，
lateral : lmm) に向けて頭蓋骨へ穴を開ける。 試験の 1時間前にエーテル麻酔下 にて測定用マグネットをマウス両前肢にビニールテープおよび瞬間接着剤ァロン アルファ一 （株東亜合成) を用いて接着し、 試験の 20分前に 2段針と 250 しシ リンジを用いて、 リン酸緩衝生理食塩水またはァペリン （0. 3， l, 3nmol/マウス） を約 2秒間で投与する。 透明なシリンダー（高さ ： 18cm, 直径： 11. 5cm)内に、 高 さ 10cmまで水（24 士 1 °C)の入った水槽にマウスを入れて 6分間強制水泳試験 を行い、 6分間のうち後半 4分間の無動時間およびもがき時間の長さで評価する。 実施例 3
オープンフィールド試験' . .. . . ―一
動物は、 W0 2006/019193号公報の実施例 2記載の雄性ァペリン遺伝子ノック アウトマウス （以下、 K0) 、 およびこの K0マウスと C57BL/6J系マウス （日本ク レア株式会社） を交配させ得られた雄性野生型マウス （以下、 WT) (18週齢、 体重 27- 34 g、 1群当たり n=10) を使用した。 本試験は、 照度を 180ルク に設 定した遮音室 （室温 25°C) 内で行った。 試験開始前に、 マウスをその部屋で一 時間以上馴化させておいた。 行動観察は、 オープンフィールド装置を用いて行つ 'た。 この装置は、 灰色塩化ビニール製のプレートに、 黒いテープで覆ったプラス チックの円筒を載せたもので、 高さ 50 cm、 底面の直径は 60 cmになっている。 底面のプレートの運動野はほぼ等面積の 19区画に分けられている。 マウスがあ る区画から隣の区画へ移動した時、 すなわち、 四肢がすべて隣の区画に入った (これを完全に隣接区画に移動した、 と定義する） .とき、 運動量 1カウントとし た。 マウスを装置の底面の、 一番中央の区画に置いた瞬間を 0秒 （これを試験開 始とする） とし、 そこから完全に隣接区画に移動するまでに要した時間 （以下、 潜時） をストップウォッチで測定し、 また、 試験開始から 5分間の運動量の総力 ゥント数 （以下、 総運動量） を算出した。 平均値の差の検定には student' s t test を用いた。
結果を図 1に示す。
図 1 Aに示すように、 K0は WTに比較して潜時が有意に延長した。 また、 図 1 Bに示すように、 K0は訂に比較して総運動量が有意に減少した。 実施例 4 尾懸垂試験 .
動物は実施例 3と全く同じ動物を、 実施例 3の試験終了後 1週間以上経過して から使用した。 本試験は遮音室 （室温 25°C) 内で行った。 試験開始前に、 マウ スをその部屋で一時間以上馴化させておいた。 尾懸垂試験装置および解析シスチ ムは、 ニューロサイエンス 'イデア社の Mi croActテールサスペンション
Ver. 4. 1を用いて行った。 装置には動物を吊り下げるための個室があり天井から 重量センサ一に連結したフックがぶら下がつている。 動物の尾の先端より約 2 cmの部位にテープを巻き、 テープをフックで貫通させて動物を 10分間吊り下げ _た。 動物の動きは重量センサーで検出し、 重量の変動が体重の 10 %に満たない 状態が 1秒以上続いた場合を無動状態と判断し、 10分間の無動状態の総和を無 動時間とした。 定値の統計解析には student' s t test を用いた。
結果を図 2に示す。
図 2に示されるように、 K0は WTに比較して無動時間が有意に延長した。. 産業上の利用可能性
本発明によれば、 優れた気分障害または薬物依存の予防 ·治療剤を提供できる。 さらには、 ァペリンとその受容体 A P Jの中枢神経系での機能の解明および、 こ れらを介する新たな用途を提供することができる。

Claims

請求の範囲
I . ァペリン受容体の機能を促進する物質を含有する気分障害または薬物依存 の予防 ·治療剤。
2. ァペリン受容体が、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一または実 質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質である請求項 1記載の剤。
3. ァペリン受容体が、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するタン パク質である請求項 1記載の剤。
.
4. ァペリン受容体の機能を促進する物質が、 ァペリン受容体ァゴニス トであ る請求項 1記載の剤。 "
5, ァペリン受容体の機能を促進する物質が、 （a) ァペリン、 （b) ァペリン と同等以上の活性を有するァペリン誘導体または （c) ァペリンとその受容体の 結合を促進させる低分子合成化合物である請求項 1記載の剤。 .
6. ァペリンが、 配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列と同一または実質的 に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドである請求項 5記載の剤。
:7. ァペリンが、 配列番号： 3、 配列番号： 5、 配列番号： 7、 配列番号： 9、 配列番号： 1 1、 配列番号： 1 2、 配列番号： 1 3、 配列番号： 14、 配列番 号： 1 5、 配列番号： 16、 g己列番号： 1 7、 配列番号： 1 8、 配列番号： 1 9、 配列番号： 20、 配列番号： 21、 配列番号： 22、 配列番号： 23または配列 番号： 24で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである請求項 5記載の 剤。
8. ァペリンが、 配列番号： 1 2、 配列番号： 1 3.、 配列番号： 1 9または配 列番号： 23で表されるアミノ酸配列からなるポリべプチドである請求項 5記載 の剤。
9. うつ病または不安症の予防 ·治療剤である請求項 1記載の剤。
10. 哺乳動物に対してァペリン受容体の機能を促進する物質を有効量投与す ることを特徴とする気分障害または薬物依存の予防 ·治療方法。
I I . ァペリン受容体の機能を促進することを特徴とする気分障害または薬物 依存の予防 ·治療方法。
1 2. 気分障害または薬物依存の予防 ·治療剤を製造するためのァペリン受容 体の機能を促進させる物質の使用。
1 3. ァペリン受容体が、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一または実 質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質である請求項 1 0または 1 1記 載の方法。 '
14. ァペリン受容体が、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するタ ンパク質である請求項 10または 1 1記載の方法。
15. ァペリン受容体ァゴニス トを用いることを特徴とする、 請求項 1 0また は 1 1記載の方法。
1 6. (a) ァペリン、 （b) ァペリンと同等以上の活性を有するァペリン誘導 体または （c) ァペリンとその受容体の結合を促進させる低分子合成化合物を用 いることを特徴とする請求項 10または 1 1記載の方法。
1 7. ァペリンが、 配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列と同一または実質 的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドである請求項 1 0または 1記 載の方法。
18. ァペリンが、 配列番号： 3、 配列番号： 5、 配列番号： 7、 配列番号： 9、 配列番号： 1 1、 配列番号： 12、 配列番号： 1 3、 配列番号： 14、 配列 番号： 1 5、 配列番号： 1 6、 配列番号： 1 7、 配列番号： 1 8、 配列番号： 1 9、 配列番号： 20、 配列番号 :;21, 配列番号： 22、 配列番号： 23または 配列番号： 24で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである請求項 10 または 1 1記載の方法。
1 9. ァペリンが、 配列番号： 1 2、 配列番号： 1 3、 配列番号： 1 9または 配列番号： 23で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである請求項 10 または 1 1記載の方法。
20. うつ病または不安症の予防 ·治療方法である請求項 10または 1 1記載 の方法。
21. ァペリンおよび またはァペリン受容体を用いることを特徴とする気分 障害または薬物依存の予防 ·治療剤のスクリ一ユング方法。
22. ァペリン遺伝子発現不全非ヒ ト動物を用いる請求項 2 1記載のスクリー ニング方法。
23. 外来性の、 ァペリン受容体遺伝子またはその変異 DNAを有するトラン スジエニック非ヒ ト動物を用いる請求項 2 1記載のスクリーニング方法。
2 4 . ァペリンおよび /またはァペリン受容体を含有する気分障害または薬物 依存の治療剤のスクリーニング用キッ ト。
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