PT92758B - Metodo para conceber uma cadeia de imunoglobulina humanizada - Google Patents

Description

EPÍGRAFB: MÉTODO PARA CONCEBER LIMA CADEIA DE IMUNOGLOBUL1NA HUMANIZADA

INVENTORES: Ca r y L. Queen e Haro 1 d E. Sclirk

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 42 da Convenção da União de Parir de 20 de Março de 1883.

de Dezembro de 19SS e em 13 de Fevereiro de 19 89, sob N9s. 290.973 o 310.232, nos Estadas Unidos da América

BAD ORIGINAL

TITULAR:PROTEIN DESIGN LABS, INC.

EPÍGRAFE: MÉTODO PARA CONCEBER UMA CADEIA DE

IMUNOGLOBULINA HUMANIZADA

MEMÓRIA DESCRITIVA

Campo do invento presente invento relaciona-se, de maneira geral, com a combinação das tecnologias do DNA recombinante e dos anticorpos monoclonais, tendo em vista o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos, e, mais particularmente, com a produção de anticorpos nâo imunogenicos , e seus usos.

Antecedentes do invento

Nos mamíferos, a resposta imunológica é mediada por dois tipos de células que interagem especificamente com materiais estranhos, i.e., antigénios. Um destes tipos de células, anticorpos de as células B, é responsável pela produção

A segunda classe de céiulas, as células T, inclui uma larga variedade de subtipos celulares que controlam a funçéo in vivo das células B e de uma grande variedade de outras células hematopoiéticas, incluindo as células T.

Um dos modos pelos quais as células T exercem este

BAD original controlo é através da produção d«> uma Iinfoquina, conhecida como interleuquina-2 (IL-2), origjnalmente denominada factor de crescimento das células T. A fun./âo primária da IL-2 parece ser a estimulação e manutenção das células T. Na verdade, alguns imunólogos acreditam que a IL-2 pode estar no centro de toda a resposta imunitária (ver Farrar, J., et al., Immunol. Rev. £3: 129-166 ( 1982 ), aqui incorporado para referência).

Para exercer estes efeitos biológicos, a IL-2 interage com um receptor de membrana especifico, de alta afinidade (Greene, W., et al., Proqress in Hematology XIV, E. Brown, Ed.,Grune and Statton, Ne'.·. ^,rork ( 1986 ), págs. 283 e seguintes).

receptor da IL-2 huinana é uma gl icoproteina multicatenária complexa, com uma cadeia, conhecida como péptido Tac, que possui uma dimensão de cerca de 55 kD (ver Leonard, W., et al., J.Biol.Chem. 260:1872 (1985), aqui incorporado para referência). Foi isolado um gene codificando para esta proteina, que deixa prever um péptido de 272 aminoácidos, incluindo um péptido de sinalização de 21 aminoácidos (ver Leonard, W., et al., Nature 311: 626 (1984)). Os 219 aminoácidos da extremidade NH₂ da proteina p55Tac compreendem, aparentemente, um dominio extracelular (ver Leonard, W.,et al., Science, 230 : 633-639 ( 1985), aqui i.icorporado para referência).

Bastante da elucidação da estrutura e função do receptor da IL-2 humana é devida ao desenvolvimento de anticorpos monoclonais de reacção e:-.pecif ica . Em particular, um anticorpo monoclonal de rato, conhecido como anti-Tac (Uchyiama, et al., J.Immunol. 126:1393 (1981)), demonstrou que

mas os receptores da IL-2 podem ser detectados em células T, também em células da família dos monôcitos e macrôfagos, nas células de Kupffer do figado, nas células de Langerhans da pele e, evidentemente, nas células T activadas. E importante notar que as células T em repouso, as células B ou os macrôfagos circulantes nào apresentam, tipicamente, o receptor da IL-2 (Herrmann et al., JExp.Med. 162:1111 (1985)).

anticorpo monoclonal anti-Tac foi também usado para definir as funções dos linfócitos qie requerem a interacçào com a IL-2, e foi demonstrado que inibe diversas funções das células T, incluindo a geraçao de linfócitos T citotôxicos e supressores, em cultura celular. Igualmente, com base em estudos realizados com o anti-Tac e outros anticorpos, associam-se agora diversas diversas desordens a uma expressão imprópria do receptor da IL-2 pelas células T, em particular no que toca à leucemia de células T adultas.

Mais recentemente, o receptor da IL-2 tem demonstrado ser um alvo ideal para novas estratégias terapêuticas relativamente às doenças mediadas pelas células T. Foi proposto o uso de anticorpos específicos contra o receptor da IL-2, como o anticorpo monoclonal anti-Tac, isoladamente ou na forma de imunoconjugados (e.g., com ricina A, isótopos ou semelhantes), para remover de forma eficiente as células portadoras do receptor da IL-2. Estes agentes poderào, por exemplo, teoricamente eliminar as células leucémicas que expressam o receptor da IL-2, certas células B, ou células T activadas envolvidas num estado de doença, permitindo, no entanto, a retenção das células T maduras normais, e das suas precursoras,

para assegurar a possibilidade de desencadear uma resposta imunitária normal das células T, quando esta é requerida. Em geral, a maior parte dos outros agentes específicos das células T podem destruir essencialmente todas as células T periféricas, o que limita a eficácia terapêutica desses agentes. Acima de tudo, o uso de anticorpos monoclonais apropriados, para o receptor da IL-2, pode ter utilidade terapêutica nas doenças autoimunes, transplante de orgaos e qualquer resposta indesejável por parte das células T activadas. De facto, foram iniciados ensaios clinicos usando, e.g, anticorpos anti-Tac (ver, genericamente, Waldman, T. et al., Câncer Res. 45:625 (1985) e Waldman, T., Science 232:727-732 (1986), aqui incorporados para referência).

Infelizmente, o uso do anti-Tac e de outros anticorpos monoclonais nao humanou apresenta certos efeitos desfavoráveis, particularmente em regimes terapêuticos repetidos, como abaixo descrito. Os anticorpos monoclonais de rato, por exemplo, nâo fixam completamente o complemento, e n3o apresentam outras importantes caracteristicas funcionais das imunoglobulinas, quando usados em pacientes humanos.

Talvez o aspecto mais importante seja o de que o anti-Tac e outros anticorpos monoclonais nâo humanos contêm extensões substanciais de sequências de aminoácidos que serão imunogénicas quando injectadas num paciente humano. Numerosos estudos demonstraram que, após a injecçâo de um anticorpo estranho, a resposta imunitária desenvolvida por um paciente, contra um anticorpo, pode ser oastante forte, eliminando essencialmente a utilidade terapêutica do anticorpo após um tratamento inicial. Para além diste, uma vez que ê esperado o desenvolvimento de um número crescente de diferentes anticorpos monoclonais, de rato ou outros anticorpos, imunogénicos (para o homem), com vista ao tratamento de várias doenças, após o primeiro e segundo tratamentos com quaisquer anticorpos nãohumanos diferentes, os tratamentos subsequentes, mesmo em terapias não relacionadas, poderão ser ineficazes ou mesmo perigosos em si mesmos.

Se bem que a produção dos chamados anticorpos quiméricos (e.q., regiões variáveis de rato reunidas a regiões constantes humanas) tenha provado possuir um êxito relativo, permanece por resolver um pj-oblema significativo de imunogenicidade. De modo geral, a produção de imunoglobulinas humanas que reajam com o receptor da IL-2 humana, assim como com muitos antigénios humanos, tem sido extremamente dificil, quando são usadas as técnicas tipicas de produção de anticorpos monoclonais humanos. Similarmente, a utilização da tecnologia do DNA recombinante para produzir os chamados anticorpos humanizados (ver, e.q., a publicação EPO no 0239400) proporciona resultados duvidosos, em parte devido à imprevisibilidade das afinidades de ligação.

Assim, há a necessidade de desenvolver formas melhoradas de imunoglobulinas de tipo humano, tais como as especificas para o receptor da IL-2 humana, que sejam substancialmente não imunogénicas em humanos, mas que possam, também, ser facilmente e economicamente produzidas, de uma forma adequada à formulação terapêutica e outros usos. 0 presente invento preenche esta e outras necessidades.

Resumo do invento presente invento proporciona novas composições, úteis, por exemplo, no tratamento de desordens humanas mediadas por células T, contendo as ditas composições imunoglobulinas de tipo humano, especificamente capazes de bloquear a ligação da

IL-2 humana ao seu receptor e/ou capazes de se ligarem à proteina p55Tac nos receptores da IL-2 humana. As imunoglobulinas podem possuir dois pares de complexos de cadeia leve/cadeia pesada, possuindo, tipicamente, pelo menos um par tendo cadeias com regiões determinantes da complementaridade, de rato, reunidas funcionalmente a segmentos de região estrutural do homem. Por exemplo, as regiões determinantes da complementaridade de rato, com ou sem residuos adicionais de aminoácidos de rato, naturalmente associados, podem ser utilizadas para produzir anticorpos de tipo humano, com a capacidade de se ligarem ao receptor da IL-2 humana com niveis 8 — l de afinidade superiores a cerca de 10 M

As imunoglobulinas, incluindo fragmentos de ligaçao e outros seus derivados, do presente invento, podem ser prontamente produzidas através de diversas técnicas do DNA recombinante, com expressão final nas células que sofreram transfecçao, de preferência células eucarióticas imortalizadas, como as células de mieloma ou hibridoma. Podem ser produzidos polinucleótidos, compreendendo uma primeira sequência codificando para regiões estruturais de imunoglobulina de tipo humano, e um segundo conjunto de sequências codificando para as desejadas regiões determinantes da complementaridade da imunoglobulina, sinteticamente ou através da combinação de cDNA apropriado com segmentos de DNA genómico.

As imunoglobulinas de tipo humano podem ser utilizadas isoladamente, numa forma substancialmente pura, ou complexadas com um agente citotOxico, como um radioisótopo, uma proteina inibidora dos ribossomas ou um agente citotôxico com actividade sobre as superficies celulares. Todos estes compostos serão particularmente úteis no tratamento de desordens mediadas pelas células T. As imunoglobulinas de tipo humano, ou os seus complexos, podem ser preparadas numa forma de dosagem farmaceuticamente aceitável, que variará dependendo do modo de administração.

presente invento proporciona igualmente novos métodos para conceber cadeias de imunoglobulina de tipo humano, possuindo uma ou mais regides determinantes da complementaridade (CDRs), provenientes de uma imunoglobulina dadora, e uma região estrutural proveniente de uma imunoglobulina humana, compreendendo os métodos preferidos, inicialmente, a comparação da sequência de aminoácidos da região estrutural ou da região variável da imunoglobulina dadora com as sequências correspondentes numa colecção de cadeias de imunoglobulinas humanas, seleccionando então como imunoglobulina humana uma que pertença ao grupo das sequências mais homólogas da colecção. A sequência da imunoglobulina humana, ou imunoglobulina aceitadora, é tipicamente seleccionada a partir de uma colecção de pelo menos 10 a 20 sequências de cadeias de imunoglobulinas, e, usualmente, possuirá a mais elevada homoloyia, com a sequência da imunoglobulina dadora, de qualquer ias sequências presentes na

colecçáo. A sequência da região estrutural da imunoglobulina humana terá, tipicamente, uma homologia de cerca de 65% a 70%, ou mais, com as sequências da região estrutural da imunoglobulina dadora. A imunoglobulina dadora pode ser ou uma cadeia leve ou uma cadeia pesada (ou ambas), e a colecção humana conterá o mesmo tipo de cadeia. Uma cadeia leve e uma cadeia pesada, humanizadas, podem ser usadas para formar uma imunoglobulina, ou anticorpo, humo íizada completa, possuindo dois pares de cadeias leves/pesadas, com ou sem regiões constantes humanas parciais ou completas, e outras proteinas.

Noutra forma de realização do presente invento, em conjunção com o passo de comparação acima descrito, ou separadamente, podem substituir-se aminoácidos adicionais, numa cadeia de imunoglobulina aceitadora, por aminoácidos da CDR de uma imunoglobulina dadora. Mais especificamente, serão feitas outras substituições opcionais, de um aminoácido estrutural humano da imunoglobulina aceitadora por um aminoácido correspondente de uma imunoglobulina dadora, em posições nas imunoglobulinas para as quais:

(a) o aminoácido na região estrutural humana de uma imunoglobulina aceitadora é raro naquela posição e o aminoácido correspondente na imunoglobulina dadora é comum naquela posição, em sequências de imunoglobulinas humanas; ou (b) 0 aminoácido está imediatamente adjacente a uma das CDRs; ou (c) prevê-se que o aminoácido esteja a cerca de 3 A das CDRs, num modelo de imunoglobulina a três dimensões, e que tenha a capacidade de interagir com o antigénio ou com as CDRs

da imunoglobulina humanizada.

A cadeia de imunoglobulina humanizada compreenderá, tipicamente, pelo menos cerca de 3 aminoácidos da imunoglobulina dadora juntamente com as CDRs, estando pelo menos um destes aminoácidos imediaramente adjacente a uma CDR na imunoglobulina dadora. As cadeias leves e pesadas podem, cada uma delas, ser concebidas usando qualquer um, ou os três, dos critérios de posição.

Quando combinadas para formar um anticorpo intacto, as cadeias humanizadas, leves e pesadas, do presente invento, serão substancialmente nao imunogénicas em humanos e reterão substancialmente a mesma afinidade que a imunoglobulina dadora apresenta, face ao antigénio (tal como uma proteina, ou outro composto contendo um epitopo) . Este;; niveis de afinidade podem variar desde cerca de 10 m ' ou um valor superior, e podem atingir até cerca de 4 vezes a afinidade original da imunoglobulina dadora para o antigénio.

Breve descrição das figuras

Figura 1. Comparação das sequências da cadeia pesada de anti-Tac (linhas superiores) e da cadeia pesada de Eu (linhas inferiores). E usado o código de uma letra para os aminoácidos. O primeiro aminoácido em cada linha está numerado à esquerda. Aminoácidos idênticos, nas duas sequências, estão ligados por linhas. As 3 CDRs estão sublinhadas. Outras posiçOes de aminoácidos, para as quais o aminoácido do antiTac, no lugar do aminoácido do Eu, foi usado na cadeia pesada humanizada de anti-Tac, estão assinaladas por um *.

Figura 2. Comparação das sequências da cadeia leve de anti-Tac (linhas superiores) e da cadeia leve de Eu (linhas inferiores). Foi usado o código de uma letra para os aminoácidos. 0 primeiro aminoácido em cada linha está numerado à esquerda. Aminoácidos idênticos, nas duas sequências, estão ligados por linhas. As 3 CDRs estão sublinhadas. Outras posições de aminoácidos, para as quais o aminoácido do antiTac, no lugar do aminoácido do Eu, foi usado na cadeia pesada humanizada de anti-Tac, estão assimiladas por um *.

Figura 3. Sequência génica de nucleótidos para o gene da região variável da cadeia pesada humanizada de anti-Tac. A sequência de aminoácidos, traduzida a partir da porção do gene que codifica para a proteína, é mostrada por debaixo da sequência nucleotidica. Os nucleótidos TCTAGA, no inicio e no fim do gene, sao locais de restrição da Xbal. A sequência da cadeia pesada madura começa com o aminoácido Q, #20.

Figura 4. Sequência génica de nucleótidos para o gene da região variável da cadeia leve humanizada de anti-Tac. A sequência de aminoácidos, traduzid.t a partir da porção do gene que codifica para a proteína, é mostrada por debaixo da sequência nucleotidica. Os nucleótidos TCTAGA, no inicio e no fim do gene, s3o locais de restrição da Xbal. A sequência da cadeia leve madura começa com o aminoácido D, #21.

Figura 5. (A) Sequências dos quatro oligonucleôtidos usados para sintetizar o gene da cadeia pesada humanizada de anti-Tac, impressas de 5' para 3'. (B) Posições relativas dos oligonucleôtidos. As setas apontam no sentido 3', em cada ί

oligonucleôtido.

Figura 6. (A) Sequências dos quatro oligonucleótidos usados para sintetizar o gene da cadeia leve humanizada de anti-Tac, impressas de 5' para 3'. (B) Posições relativas dos oligonucleótidos. As setas apontam na direcção 3', em cada oligonucleôtido. E mostrada a posição de um local de restrição da HindIII na zona de complementaçao entre o JFD2 e o JFD3.

Figura 7. Diagrama esquemático do plasmideo pHuGTACl, usado para a expressão da cadeia pesada humanizada de anti-Tac. S3o mostrados locais de restrição relevantes, e as regiões codificantes da cadeia pesada sao apresentadas como caixas. A direcção de transcrição a partir do promotor da imunoglobulina (Ig) é mostrada por uma seta. E^=enhancer da cadeia pesada, Hyg=gene de resistência â higromicina.

Figura 8. Diagrama esquenático do plasmideo pHuLTAC usado para a expressão da cadeia leve humanizada de anti-Tac. S3o mostrados locais de restrição relevantes, e as regiões codificantes de cadeia leve sao apresentadas como caixas. A direcção de transcrição a partir do promotor da Ig é mostrada por uma seta.

Figura 9. Fluorocitometria das células HUT-102 e Jurkat, marcadas com anticorpo anti-Tac ou anticorpo humanizado anti-Tac, seguidos respectivamente por anticorpo de cabra conjugado com fluoresceina, anti-imunoglobulina de rato, ou anticorpo de cabra anti-Ig humana, como indicado. Em cada painel a curva a ponteado mostra os resultados obtidos quando o primeiro anticorpo foi omitido, e a curva a cheio os resultados obtidos quando o primeiro e segunio anticorpos (conjugados) foram incluídos, como descrito.

Figura 10. (A) Fluorocitometria de células HUT-102 marcadas com 0-40 ng de anti-Tac, como indicado, depois com anti-Tac biotinilado, e de seguida com avidina conjugada com ficoeritrina. (B) Fluorocitometria de células HUT-102 marcadas com o anticorpo indicado, depois com anti-Tac biotinilado, e de seguida com avidina conjugada com ficoeritrina.

no receptor

Descrição detalhada do invento De acordo com uma modalidade do presente invento, são proporcionadas imunoglobulinas de tipo humano, que reagem especificamente com epitopos desejados, tais como os existentes da IL-2 das cé.ulas T humanas. Estas imunoglobulinas, que têm afinidader de ligação de pelo menos

10¹⁰M ¹ ou cerca de 10 M , e de preferência, de 10 M c superiores, têm a capacidade de, e.q., bloquear a ligação da IL-2 aos receptores da IL-2 humana. As imunoglobulinas de tipo humano terão uma região estrutural de tipo humano e podem possuir regiões determinantes da complementaridade (CDRs) de uma imunoglobulina, tipicamente uma imunoglobulina de rato, que reaja especificamente com um epitopo na proteína p55Tac. As imunoglobulinas do presente invento, que podem ser produzidas economicamente em grandes quantidades, encontram uso, por exemplo, no tratamento de desorder.!-: mediadas por células T em pacientes humanos, através de uma variedade de técnicas.

E sabido que a unidade estrutural básica do anticorpo compreende um tetrámero. Cada tetrámero é composto por dois pares idênticos de cadeias polipeptidicas, possuindo cada par uma cadeia leve (com cerca de 25 kD) e uma cadeia

pesada (com cerca de 50-7 0 kD) . A extremidade NH2 de cada cadeia inicia uma região variável de cerca de 100 a 110, ou mais, aminoácidos, que sao primariamente responsáveis pelo reconhecimento do antigénio. A extremidade COOH de cada cadeia define uma região constante, primariamente responsável pela função efectora.

As cadeias leves sao classificadas como kapa ou lambda. As cadeias pesadas sao classificadas (e subclassifiçadas) como gama, mu, alfa, delta, ou epsilon, e definem o isotipo do anticorpo como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Entre as cadeias leves e pesadas, as regiOes variável e constante sao reunidas por uma região J de cerca de 12, ou mais, aminoácidos, incluindo a cadeia pesada também uma região D de cerca de mais 12 aminoácidos (ver, genericamente, Fundamental Immunolcgy, Paul, W., Ed., Capitulo 7, págs. 131-166, Raven Press, N.Y., (1984), aqui incorporado para referência).

As regiOes variáveis de cada par de cadeias leve/pesada formam o local de ligação do anticorpo. As cadeias exibem todas a mesma estrutura geral de regiOes estruturais relativamente conservadas, reunidas por três regiOes hipervariáveis, também denominadas CDRs (ver Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services (1983); e Cholthia e Lesk, J,Mol.Biol. 196:901-917 (1987), aqui incorporados para referência). As CDRs das duas cadeias de cada par estão alinhadas pelas regiOes estruturais, permitindo a ligaçSo a um epitopo especifico.

Como aqui é usado, o termo imunoglobulina refere-se a uma proteina consistindo em um, ou mais, polipéptidos substancialmente codificados por genes de imunoglobulina. Os genes de imunoglobulina que se conhecera incluem os genes das regiões constantes kapa, lambda, alfa, gama, delta, epsilon e mu, assim como a miriade de genes da região variável das imunoglobulinas. As imunoglobulinas podem existir numa variedade de formas além de anticorpos, incluindo, por exemplo, Fv, Fab, e F(ab)2, assim como em cadeias simples (e.g., Huston, et al., Proc.Nat.Acad.Sei.USA, 85 : 5879-5883 ( 1988) e Bird, et al., Science, 242:423-426 (1988), aqui incorporados para referência). (Ver, genericamente, Hood, et al., Immunology, Benjamin, N.Y., 2a Edição (1984), e Hunkapiller e Hood, Nature, 323:15-16 (1986), aqui incorporados para referência).

Anticorpos quiméricos são anticorpos cujos genes das cadeias pesadas e leves foram construídos, tipicamente por engenharia genética, a partir de segmentos de genes de imunoglobulinas pertencendo a diferentes espécies. Por exemplo, os segmentos variáveis (V) dos genes de um anticorpo monoclonal de rato podem ser reunidos a segmentos constantes (C) humanos, como ογ; e o 3 · Um anticorpo quimérico terapêutico tipico ê, assim, uma proteina hibrida consistindo no dominio V, ou de ligação ao antigénio, de um anticorpo de rato, e no dominio C, ou efector, de um anticorpo humano (e.g., o ATCC, no de acesso CRL 9688, segrega um anticorpo quimérico anti-Tac), se bem que possam ser usadas outras espécies de mamíferos.

Como aqui é usado, o termo região estrutural refere-se àquelas porções das regiões variáveis, das cadeias leves e pesadas da imunoglobulina, que sâo relativamente conservadas (i.e, outras que não as CDRs), nas diferentes imunoglobulinas dentro de uma só espécie, como definido por Kabat, et al., op. cit. . Como aqui é usado, uma região estrutural de tipo humano é uma região estrutural que, em cada cadeia existente, compreende. pelo menos cerca de 70, ou mais, residuos de aminoácidos, tipicamente de 75 a 85 ou mais residuos idênticos aos encontrados numa imunoglobulina humana.

Como aqui é usado, o termo imunoglobulina de tipo humano refere-se a uma imunoglobulina compreendendo uma estrutura de tipo humano, e na qual qualquer região constante presente é substancialmente homóloga de uma região constante de uma imunoglobulina humana, i.e., pelo menos em cerca de 85-90%, sendo, de preferência, idêntica em cerca de 95%. Assim, todas as partes de uma imunoglobulina de tipo humano, excepto, possivelmente, as CDRs, são substancialmente homólogas das partes correspondentes de uma ou mais sequências nativas de imunoglobulinas humanas. Por exemplo, uma imunoglobulina de tipo humano não incluiria um anticorpo quimérico de região variável de rato / região constante humana.

De acordo com outro aspecto geral do presente invento incluem-se, igualmente, critérios pelos quais um número limitado de aminoácidos, na estrutura de uma cadeia de imunoglobulina de tipo humano, ou humanizada, são escolhidos, de maneira a serem os mesmos que os aminoácidos que se encontram nessas mesmas posições na imunoglobulina dadora, e não na aceitadora, de forma a aumentar a afinidade de um anticorpo compreendendo a cadeia de imunoglobulina humanizada.

Este aspecto do presente invento é baseado em parte no modelo para o qual as duas causas que contribuem para a perda de afinidade, nos meios anteriores de produção de anticorpos humanizados (usando como exemplos anticorpos de rato como fontes de CDRs), s3o:

(1) Quando as CDRs de rato são combinadas com a região estrutural humana, os aminoácidos da região estrutural que estão próximos das CDRs tornam-se humanos em vez de de rato. Sem a pretensão de sofrer uma limitação pela teoria, acredita-se que estes aminoácidos modificados podem distorcer ligeiramente as CDRs, porque eles criam forças electrostâticas ou hidrofóbicas diferentes das que existem no anticorpo dador de rato, e as CDRs distorcidas podem nâo efectuar contactos tâo eficazes com o antigénio como as CDRs do anticorpo dador;

(2) Ainda, os aminoácidos no anticorpo de rato original que estão próximos, mas não fazem parte, das CDRs (i.e., fazendo ainda parte da região estrutural), podem efectuar contactos com o antigénio que contribuem para a afinidade. Estes aminoácidos perdem-se quando o anticorpo é humanizado, porque todos os aminoácidos estruturais se tornam humanos.

Para evitar estes prcnlemas, e para produzir anticorpos humanizados que possuam uma afinidade muito forte para um antigénio desejado, o presente invento usa os quatro critérios seguintes para a concepção de imunoglobulinas humanizadas. Estes critérios podem ser usados isoladamente, ou,

quando necessário, em combinação, para atingir a afinidade desejada, ou outras caracteristicas.

Critério I: Como aceitadora, é usada uma região estrutural de uma imunoglobulina humana particular que seja invulgarmente homóloga da imunoglobulina dadora que será humanizada, ou é usada uma região estrutural de consenso proveniente de muitos anticorpos humanos. Por exemplo, a comparação da sequência de uma região variável de cadeia pesada (ou leve) de rato com as regiões variáveis de cadeias pesadas (ou leves) humanas, num banco de dados (por exemplo, o National Biomedical Research Foundation Protein Identification Resource) mostra que a extensão da homologia em relação às diferentes regiões humanas varia bastante, tipicamente entre cerca de 40% a cerca de 60-70%. Ao escolher como a imunoglobulina aceitadora uma das regiões variáveis de cadeia pesada humana (respectivamente, leve) que é mais homóloga da região variável da cadeia pesada (respectivamente, leve) da imunoglobulina dadora, serão modificados menos aminoácidos na passagem da imunoglobulina dadora para a imunoglobulina humanizada. Assim, e de novo sem a intenção de sofrer uma limitação pela teoria, acredita-se que há uma possibilidade mais reduzida de alterar a conformação das CDRs pela mudança de um aminoácido que lhes esteja próximo. Adicionalmente, é forma total, precisa de um anticorpo humanizado, compreendendo a cadeia de imunoglobulina humanizada, pode assemelhar-se mais de perto â forma do anticorpo dador, reduzindo também a possibilidade de distorção das CDRs.

Tipicamente, uma das 3 a 5 sequências mais homólogas de região variável de cadeia pesada, num conjunto representativo de pelo menos cerca de 10 a 20 cadeias pesadas humanas diferentes, será escolhida como aceitadora para proporcionar a região estrutural de cadeia pesada, e similarmente para a cadeia leve. De preferência, é usada uma das 1 a 3 regiões variáveis mais homólogas. A cadeia de imunoglobulina aceitadora seleccionada terá, de preferência, pelo menos cerca de 65% de homologia da região estrutural em relação à imunoglobulina dadora.

Independentemente da forma pela qual a imunoglobulina aceitadora é escolhida, pode conseguir-se uma maior afinidade seleccionando um pequeno número de aminoácidos da região estrutural da cadeia de imunoglobulina humanizada como sendo o mesmo que os aminoácidos que se localizam nessas mesmas posições na imunoglobulina dadora, e nâo os que se localizam na imunoglobulina aceitadora. Os critérios seguintes definem quais os aminoácidos que podem, deste modo, ser seleccionados. De preferência, na maioria, ou em todas as posições de aminoácidos, satisfazendo um destes critérios, o aminoácido dador será, de facto, seleccionado.

Critério II: Se um aminoácido na região estrutural da imunoglobulina aceitadora humana é incomum (i.e., raro, termo que aqui é usado para indicar um aminoácido que ocorre naquela posição em nâo mais do que 10% das sequências da região V das cadeias pesadas (e respectivas cadeias leves) humanas, num banco de dados representativo), e se o aminoácido dador, naquela posição, é tipico nas sequências humanas (i. e., comum, termo que aqui é usado para indicar um aminoácido que

ocorre em pelo menos 25% das sequências num banco de dados representativo), então, pode ser seleccionado o aminoácido dador, no lugar do aceitador. Este critério ajuda a assegurar que um aminoácido atípico na região estrutural humana nao destrua a estrutura do anticorpo. Adicionalmente, ao substituir um aminoácido incomum por um aminoácido do anticorpo dador que seja tipico dos anticorpos humanos, o anticorpo humanizado pode tornar-se menos imunogénico.

Critério III: Para as posiçOes imediatamente adjacentes âs três CDRs na cadeia de imunoglobulina humanizada, pode ser seleccionado o aminoácido dador, no lugar do aminoácido aceitador. Estes aminoácidos são particularmente susceptiveis de interacçâo com os aminoácidos das CDRs e, se escolhidos a partir do aceitador, distorcem as CDRs dadoras e reduzem a afinidade. Adicionalmente, os aminoácidos adjacentes podem interagir directamente com o antigénio (Amit et al., Science, 233:747-753 ( 1986 ), aqui incorporado para referência) e a selecção destes aminoácidos da imunoglobulina dadora pode ser desejável para manter todos os contactos com o antigénio que confiram afinidade ao anticorpo original.

Critério IV: Um modelo tridimensional, tipicamente do anticorpo dador original, mostra que certos aminoácidos que estão fora das CDRs, mas próximos destas, têm uma boa probabilidade de interagir com aminoácidos nas CDRs, através de ligaçóes de hidrogénio, forças de Van der Waals, interacçóes hidrofôbicas, etc. Para estas posiçOes de aminoácidos, pode ser seleccionado o aminoácido dador, no lugar do aminoácido da imunoglobulina aceitadora. Os aminoácidos, de acordo com este critério terSo geralmente um átomo da cadeia lateral situado no espaço de cerca de 3 A em relação a algum local das CDRs, e têm de conter átomos que possam interagir com os átomos das CDRs por meio de forças quimicas estabelecidas, tais como as acima enumeradas. Programas de computador para criar modelos de proteinas, tais como anticorpos, estão geralmente disponíveis e sao bem conhecidos dos peritos na técnica (ver Loew et a 1, Int.J.QuantChem., Quant.Bíol.Symp., £5:55-66 (1988);

Bruccoleri et al,, Nature, 335:564-568 (1988); Chothia et al., Science, 233:755-758 (1986), aqui incorporados para referência). Tais programas não fazem parte deste invento. Na verdade, uma vez que todos os anticorpos têm estruturas semelhantes, as estruturas dos anticorpos conhecidos, que estão disponíveis através do banco de dados Brookhaven Protein Data Bank, podem ser usadas, se necessár;o, como modelos aproximados de outros anticorpos. Os programas de computador comercialmente disponíveis podem ser usados para apresentar estes modelos num monitor de computador, para calcular a distância entre os átomos, e para fazer uma estimativa da probabilidade de interaeção entre diferentes aminoácidos (ver Ferrin et al., J.Mol.Graphics , £:13-27 (1988)).

Os anticorpos de tipo humano ou humanizados possuem, geralmente, pelo menos três vantagens potenciais em relação aos anticorpos de rato ou, em alguns casos, aos anticorpos quiméricos, usados na terapia humara:

1) Uma vez que a porção eícetora é humana, esta pode interagir melhor com as outras partes do sistema imunitário humano (e.q., destruir as células aivo de forma mais eficiente, através de citotoxicidade dependente do complemento (CDC) ou citoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC).

2) 0 sistema imunitário humano não deve reconhecer como estranha a região estrutural, ou região constante, do anticorpo humanizado, e, assim, a resposta dos anticorpos contra um tal anticorpo injectado deve ser menor do que a dirigida contra um anticorpo de rato, totalmente estranho, ou contra um anticorpo quimérico parcialmente estranho.

3) Foi observado que os anticorpos de rato injectados têm uma semi-vida, na circulação humana, muito mais curta do que a semi-vida dos anticorpos normais (D. Shaw et al., J.Immunol., 138:4534-4538 (1987)). Os anticorpos humanizados injectados terão, presumivelmente, uma semi-vida mais semelhante à dos anticorpos humanos de ocorrência natural, permitindo a administração de doses menores e menos frequentes.

Em determinado aspecto, o presente invento é dirigido a segmentos de DNA recombinante, codificando para as CDRs de cadeia pesada e/ou leve de rma imunoglobulina capaz de se ligar a um epitopo desejado, tal como o do receptor da IL-2 humana (e.g., o anticorpo monoclonai anti-Tac). Os segmentos de DNA codificando para estas regiões serão, tipicamente, reunidos a segmentos de DNA codificando para regiões estruturais de tipo humano apropriadas. Por exemplo, as sequências de DNA preferidas, que codificam para as cadeias polipeptidicas que compreendem as regiões hipervariáveis da cadeia pesada e da cadeia leve do anti-Tac (com regiões estruturais de tipo humano), são mostradas nas Figuras 3 e 4, respectivamente. Devido â degeneração de codões e a

substituições não-criticas de aminoácidos, podem substituir-se prontamente outras sequências de DNA por aquelas sequências, como abaixo é descrito em detalhe.

Os segmentos de DNA incluirão ainda, tipicamente, uma sequência de DNA para controlo de expressão, ligada de forma operável às sequências codificantes do anticorpo de tipo humano, incluindo regiOes promotoras heterólogas ou naturalmente associadas. De preferência, as sequências de controlo de expressão serão sistemas promotores eucarióticos em vectores com a capacidade de fazer a transformação ou a transfecção de células eucariótici.s hospedeiras, mas podem usar-se também sequências de controlo para células procarióticas hospedeiras. Uma vez que o vector tenha sido incorporado no hospedeiro apropriado, o hospedeiro é mantido sob condições adequadas à expressão em alto grau das sequências nucleotidicas, e, como desejado, pode seguir-se a recolha e purificação das cadeias leves, cadeias pesadas, dimeros de cadeia leve/cadeia pesada ou anticorpos intactos, fragmentos de ligação ou outras formas de imunoglobulinas.

As sequências de DNA das regiOes constantes humanas podem ser isoladas, de acordo com procedimentos bem conhecidos, a partir de várias células humanes, mas, de preferência, a partir de células B imortalizadas (ver Kabat, op.cit., e WP 87/02671). Por exemplo , os genes c as sequências da região J e constante K da imunoglobulina humana estão descritos em Heiter et al., Cell 22:197-207 (1980) e a mu é descrita em Ellison et al., Nucl, Acid. Res. 10:4071 (1982)

os quais sâo ambos aqui incorporados para referência. As CDRs usadas para produzir as imunoglobulinas do presente invento ser3o, similarmente, derivadas de anticorpos monoclonais, capazes de se ligarem ao antigénio necessário (e.g., ao receptor da IL-2 humana), e produzidos a partir de qualquer fonte mamifera conveniente, tal como ratos, ratazanas, coelhos, ou outro vertebrado capaz de produzir anticorpos por métodos bem conhecidos. Podem ser obtidas cê Lulas - fonte adequadas para as sequências de DNA, e células hospedeiras para expressão e secreção de imunoglobulinas, a partir de variadas fontes, tais como a American Type Culture Collection (Catalogue of Cell Lines and Hybridomas, 5a Ed. (1985), Rockville, Maryland, U.S.A., aqui incorporado para referência).

Para além das imunogiobulinas de Tipo humano aqui especificamente descritas, outras imunogiobulinas modificadas substancialmente homólogas podem ser prontamente concebidas e fabricadas utilizando diversas técnicas do DNA recombinante, bem conhecidas dos peritos na técnica. Por exemplo, para as imunogiobulinas de receptor da IL-2 humana, as regiões estruturais podem variar er relação às sequências das Figuras 3 e 4, ao nivel da estrutura primária , através de diversas substituições de aminoácidos, adições terminais e intermédias e delecções, e semelhantes. Adicionalmente, podem usar-se várias regiões estruturais humanas diferentes, isoladamente ou em combinação, como base para as imunogiobulinas de tipo humano do presente invento. Em geral, podem conseguir-se facilmente modificações dos genes através de diversas técnicas bem conhecidas. tais como a mutagénese

dirigida (ver Gillman e Smith, Geno 8:81-97 (1979) e Roberts, S., et al,, Nature 328:731-734 (1987), ambos aqui incorporados para referência).

Alternativamente, podem ser produzidos fragmentos polipeptidicos contendo apenas uma porção da estrutura primária do anticorpo, fragmentos esses que possuem uma, ou mais, das actividades da imunoglobulina (e,q., actividade de fixação do complemento). Igualmente, uma vez que, tal como acontece com muitos genes, os genes relacionados com imunoglobulinas contêm regiOes funcionais distintas, cada uma possuindo uma, ou mais, actividades biológicas diferentes, os genes podem ser fundidos em regiOes funcionais de outros genes (e.q., genes de enzimas; ver o pedido de patente norte-amer?cana com o número de série 132.387, de 15 de Dezembro de 1987, aqui incorporado para referência), para produzir proteínas de fusão (e.q., imunotoxinas) possuindo novas propriedades.

As sequências de ácidos nucleicos do presente invento, capazes de, em última análise, expressar os anticorpos de tipo humano desejados, podem ser formadas a partir de uma variedade de diferentes polinucleôtidos (genómicos ou de cDNA, RNA, oligonucleótidos sintéticos, etc.), e componentes ( e q ., regiOes V, J, D e C), e também por uma variedade de técnicas diferentes. A junção de sequência.·, genômicas apropriadas é, presentemente, o método mais comi m de produção, mas podem também ser utilizadas sequências de cDNA (ver a publicação de patente europeia no 0239400, e Reichmann, L,et al., Nature 332:323-327 (1988), ambos aqui incorporados para referência).

Como foi previamente realçado, as sequências de DNA serão expressas em hospedeiros após terem sido ligadas de forma operâvel a (i.e., posicionadas de forma a garantir o funcionamento de) uma sequência de controlo de expressão. Estes vectores de expressão são tipicamente replicáveis nos organismos hospedeiros, ou na forma de epissomas ou como uma parte integrante do DNA cromossômico do hospedeiro. Vulgarmente, os vectores de expressão conterão marcadores de selecçâo, e.g., de tetraciclina ou neomicina, para permitir a detecçâo das células transformadas com as sequências de DNA desejadas (ver, e.g., a patente norte-americana no 4 704 362, aqui incorporada para referência).

A E. coli é uma hospedeira procariôtica particularmente útil na clonagem das sequências de DNA do presente invento. Outros hospedeiros microbianos adequados para uso incluem bacilos, tais como o Bacillus subtilis, e outras enterobacteriáceas, tais como a Salmonella, Serratia, e várias espécies de Pseudomonas. Nestes hospedeiros procariôticos, podem também construir-se vectores de expressão, que conterão, tipicamente, sequências de contro.!'. de expressão compatíveis com a célula hospedeira (e.q., uma origem de replicação). Adicionalmente, estará presente um dado número de uma variedade de promotores bem conhecidos, como o sistema promotor da lactose, um sistema promotor do triptofano (trp), um sistema promotor da beta-lactamase, ou um sistema promotor do fago lambda. Os promotores controlarão, tipicamente, a expressão, opcionalmente com uma sequência operadora, e possuirão sequências do local de ligação ao ribossoma e semelhantes, para iniciar e completar a transcrição e a tradução.

Outros microorganismos, t.ais como as leveduras, podem também ser usados para a expressão. A Saccharomyces é uma hospedeira preferida, com vectores adequados possuindo sequências de controlo da expressão, tais como promotores, incluindo a 3-fosfoglicerato quinase ou outras enzimas glicoliticas, e uma origem de replicação, sequências de terminação e semelhantes, como desejado.

Juntamente com os microorganismos, pode também usarse uma cultura celular de tecido de mamifero para a expressão e produção dos polipéptidos do presente invento (ver Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987), aqui incorporado para referência). De facto, as células eucarióticas são preferidas, dado que foram desenvolvidas pela técnica várias linhas de células hospeoeiras adequadas, com a capacidade de segregar imunoglobulinas intactas, incluindo as linhas celulares CHO, várias linhas celulares COS, células HeLa, linhas celulares de mieloma, etc., mas, de preferência células B transformadas ou hibridomas. Os vectores de expressão para estas células podem incluir sequências de controlo de expressão, tais como uma origem de replicação, um promotor, um enhancer (ver Queen, C., et al., Immunol.Rev. 89:49-68 (1986), aqui incorporado para referência), e locais de processamento de informação necessários, tais como locais de ligação ao ribossoma, locais de splicing do RNA, locais de poliadenilação, e sequências de terminação de transcrição. As sequências preferidas para controlo da expressão são promotores derivados do SV40 com enhancer (veja-se Mulligan and Berg, Science 209:1422-1427 (1980)), um gene de imunoglobulinas, adenovirus, papilomavirus bovino, e semelhantes.

Os vectores contendo os segmentos de DNA com interesse (e.q., as sequências codificantes das cadeias pesadas e das cadeias leves e sequências de controlo da expressão) podem ser transferidas para a célula hospedeira através de métodos bem conhecidos, os quais variam dependendo do tipo de hospedeiro celular. Por exemplo, a transfecção mediada por cloreto de cálcio é vulgarmente utilizada em células procarióticas, enquanto que o tratamento com fosfato de cálcio ou a electroporação podem ser usados em outras células hospedeiras (ver, genericamente, Maniatis, et al, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1982), aqui incorporado para referência).

Uma vez feita a sua expressão, os anticorpos completos, os seus dimeros, as cadeias individuais leves e pesadas, ou outras formas de imunoglobulinas do presente invento podem ser purificados de acordo com procedimentos técnicos padronizados, incluindo a precipitação com sulfato de amónio, colunas de afinidade, cromatografia em coluna, electroforese em gel e semelhantes (ver, genericamente,

Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, (1982)). São preferidas imunoglobulinas substancialmente puras, homogeneidade, sendo a 99%, ou mais, de com, pelo menos, 90 a 95% de particularmente preferidas as de 98 homogeneidade, para usos farmacêuticos, Uma vez purificados, parcialmente ou até atingir a homogeneidade desejada, os polipéptidos podem, então, ser usados com fins terapêuticos (incluindo o uso extracorporal), ou no desenvolvimento e realização de ensaios, marcação por imunofluorescência, e semelhantes (ver, genericamente, Inmunoloqical Methods, vols. I e II, Lefkovits e Pernis, Eds., Acauemic Press, New York, N.Y.

(1979 e 1981)).

Os anticorpos específicos receptores da IL-2 exemplificados no presente invento encontrarão, tipicamente, utilização, em forma individual, no tratamento de um estado de doença mediada por células T. De maneira geral, quando a célula associada a uma doença é identificada como portadora de um receptor da IL-2, então os anticorpos de tipo humano capazes de bloquear a ligação da IL-2 ao receptor da IL-2 humana são adequados (ver o pedido de patente norte-americana com o número de série 087 707, intitulada Tree.ting Human Malignancies and Disorders, aqui incorporada para referência). Por exemplo, os típicos estados de doença adequados para tratamento incluem as doenças enxerto versus hospedeiro, e a rejeição de transplantes em pacientes submetidos a um transplante de orgãos, tais como o coração, pulmões, rins, figado, etc. Outras doenças incluem as doenças autoimunes, tais como diabetes Tipo I, esclerose múltipla, artrite reumatôide, lúpus eritematoso sistémico, e miastenia gravis.

Os anticorpos de tipo humano do presente invento podem também ser usados em combinação com outros anticorpos, particularmente com anticorpos monoclonais humanos, que reajam com outros marcadores em células reuponsáveis pela doença. Por exemplo, os marcadores de células T adequados podem incluir os agrupados nos chamados Agregados de Diferenciação, como denominado pela First Internationa?.. Leukocyte Differentiation diz respeito,

Workshop, Leukocyte Typinq, Bernard, et al., Eds., SpringerVerlag, N.Y. (1984), aqui incorporado para referência.

Os anticorpos podem também ser usados na forma de composições administradas separadamente, e dadas em conjunção com agentes quimioterápicos ou imunosupressores. Tipicamente, os agentes incluirão a ciclosporina A ou um análogo da purina (e.g., metotrexato, 6-mercaptopurina, ou semelhantes), mas podem também ser usados numerosos agentes adicionais (e.g., ciclofosfamida, prednisona, etc.), bem conhecidos dos peritos na técnica.

Uma composição farmacêutica preferida para o presente invento compreende o uso dos anticorpos, aos quais o invento em imunotoxinas. As imunotoxinas sâo caracterizadas por possuírem dois componentes, e sâo particularmente úteis na destruição de células seleccionadas, in vitro ou in vivo. Um dos seus componentes é um agente citotóxico, normalmente fatal para a célula quando a ela se liga ou é por ela absorvido. 0 segundo componente, conhecido como veiculo de libertação, proporciona um meio de libertação do agente tóxico para um tipo ce.inlar particular, tal como células compreendendo um carcinoma. Os dois componentes são, normalmente, ligados quimicamente por qualquer uma das técnicas químicas bem conhecidas. Por exemplo, quando o agente citotóxico é uma proteina e o segundo componente é uma imunoglobulina intacta, a ligação pode ser efectuada através de reticuladores heterobifuncionais, e.g., SPDP, carbodiimida, glutaraldeido, e semelhantes. A produção de diversas imunotoxinas é bem conhecida da técnica, e pode ser encontrada,

por exemplo, em Monoclonal Antibody-Toxin Conjugates: Aiming the Magic Bullet, Thorpe et al., Monoclonal Antibodies in Clinicai Medicine, Academic Press, págs. 168-190 (1982), aqui incorporado para referência.

Vários agentes citotôxicos são adequados para uso em imunotoxinas. Os agentes citotôxicos podem incluir radioisôtopos, como o Iodo-131, Itrio-90, Rénio-188, e Bismuto212; diversos fármacos quimioterápicos, tais como a vindesina, metotrexato, adriamicina, e cisplatina; e proteínas citotóxicas, tais como proteínas inibidoras dos ribossomas, como a proteina antiviral da erva-dos-cachos-da-india (pokeweed), exotoxina A da Pseudomonas, ricina, toxina diftérica, cadeia A da ricina, etc., ou um agente aetivo â superfície da célula, como as fosíolipases (e.g., fosfolipase C). (Ver, genericamente, o pedido oe patente norte-americana com o número de série 07/290.968, de 28 de Dezembro de 1988; Chimeric Toxins, Olsnes e Phil, Pharmac.Ther., 25;355-381 (1982), e Monoclonal Antibodies for Câncer Detection and Therapy, Eds. Baldwin e Byers, págs. 159-179 e 224-266, Academic Press, todos aqui incorporados para referência).

O componente de libertação da imunotoxina incluirá as imunoglobulinas de tipo humano do presente invento. São preferencialmente usadas imunoglobulinas intactas ou os seus fragmentos de ligação, tais como o Fab. Tipicamente, os anticorpos nas imunotoxinas serão c.>, isotipo humano IgM ou IgG, mas podem utilizar-se outras regiõe:· constantes de mamíferos, consoante desejado.

Os anticorpos de tipo humano, e suas composições farmacêuticas, deste invento, são particularmente úteis para administração parentérica, i.e, subcutaneamente, intramuscularmente ou intravenosamente. As composições para administração parentérica compreenderão, vulgarmente, uma solução do anticorpo, ou uma sua mistura, dissolvida num veiculo aceitável, de preferência um veiculo aquoso. Podem usar-se vários veiculos aquosos, e . g . , água, água tamponada, solução salina a 0,4%, glicina a 0,3% e semelhantes. Estas soluções são estéreis e, de maneira geral, livres de partículas. Estas composições podem ser esterilizadas por meio de técnicas de esterilização convencionais, bem conhecidas. Estas composições podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis, consoante desejado, para atingir condições aproximadamente fisiológicas, tais como agentes ajustadores de pH e tamponantes, agentes ajustadores da toxicidade e semelhantes, por exemplo, acetato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, lactato de sódio, etc. A concentração de anticorpo nestas formulações pode variar bastante (i.e., desde menos de cerca de 0,5p%, e, usualmente, desde lp% ou, pelo menos, cerca de lp%, até 15 ou 20p%), e será seleccionado primariamente com base nos volumes de fluido, viscosidades, etc., de acordo com o modo particular de administração seleccionado.

Assim, uma composição farmacêutica tipica para a injecção intramuscular poderia ser fabricada de maneira a conter 1 ml de água tamponada estéril e 50 mg de anticorpo. Uma composição tipica para perfusão intravenosa poderia ser fabricada de modo a conter 250 ml de soluto de Ringer estéril, 'Ή e 150 mg de anticorpo. Os métodos próprios para a preparação de composiçOes administráveis por via parentérica serão conhecidos ou evidentes para os peritos na técnica, e estão descritos com maior detalhe em, por exemplo, Reminqton's Pharmaceutical Science, 15a Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980), aqui incorporado para referência.

Os anticorpos deste invento podem ser liofilizados para armazenamento, e reconstituídos num veiculo apropriado, antes da sua utilização. Esta técnica foi evidenciada como eficaz para as imunoglobulinas convencionais, e podem ser empregues as técnicas de liofilização e reconstituição já conhecidas da técnica. Será tomado em conta pelos peritos na técnica que a liofilização e a reconstituição podem conduzir a diversos graus de perda de actividade do anticorpo (e.g., com imunoglobulinas convencionais, os anticorpos IgM tendem a apresentar uma maior perda de actividade do que os anticorpos IgG) e que as concentrações a usar podem ter que ser ajustadas, para compensação.

As composiçOes contendo os presentes anticorpos de tipo humano, ou suas misturas, podem ser administradas em tratamentos profilácticos e/ou terapêuticos.Em aplicações terapêuticas, as composiçOes são administradas a um paciente, que sofre já de uma doença, numa quantidade suficiente para curar, ou, pelo menos, suster parcialmente, a doença e as suas complicações. Uma quantidade adequada para atingir este fim foi

definida	como	dose	terapeuticamerr.e eficaz.	As quantidades
eficazes	para	tal	utilização dependerão da	severidade da
infecção	e do	estado geral do próprio sistema	imunitário do

paciente, mas encontram-se geralmente entre cerca de 1 a cerca de 200 mg de anticorpo por dose, sendo as dosagens de desde 5 até 25 mg por paciente as mais vulgarmente usadas. Deve ter-se em conta que os materiais deste invento podem ser, geralmente, empregues em estados de doença grave, ou seja, situaçOes que ameaçam, ou que potencialmente ameaçam, a vida. Em tais casos, tendo em vista a minimizaçao das substâncias estranhas e a menor probabilidade de rejeições de substâncias estranhas, fins que sâo atingidos pelo uso do:·· anticorpos de tipo humano deste invento, é possível, e pode- ser considerado desejável pelo médico que prescreve o tratamento, a administração de quantidades substancialmente excessivas destes anticorpos.

Em aplicações profilácticas, as composições contendo os presentes anticorpos, ou uma sua mistura, sâo administrados a um paciente que nâo apresente ainda um estado de doença, para aumentar a resistência do paciente. Uma tal quantidade é definida como sendo uma dose profilacticamente eficaz. Nesta forma de utilização, as quantidades precisas dependem, uma vez mais, do estado de saúde do paciente e do seu grau geral de imunidade, mas geralmente encontrsr.-se entre 0,1 e 25 mg por dose, especialmente entre 0,5 e 2-5 mg por paciente. Um uso profiláctico preferido é o da prevenção da rejeição de um transplante renal.

Podem ser estabelecidas administrações isoladas ou múltiplas das composições,sendo os niveis de dose e o regime seleccionados pelo médico que prescreve o tratamento. Em qualquer caso, as formulações farmacêuticas devem proporcionar uma quantidade do(s) anticorpo(s) deste invento que seja suficiente para tratar eficazniente o paciente.

Os anticorpos de tipo humano do presente invento podem, ainda, encontrar uma larga gama de utilizações in vitro. Por exemplo, os anticorpos exemplificados podem ser utilizados para tipagem de células T, pura isolamento de células portadoras de um receptor especifico da IL-2, ou fragmentos do receptor, para preparaçao de vacinas, ou semelhantes.

Para fins de diagnóstico, os anticorpos podem ser marcados ou n3o marcados. Os anticorpos nao marcados podem ser usados em combinação com outros anticorpos, marcados (segundos anticorpos), que reagem com o anticorpo de tipo humano, tais como anticorpos específicos para regiOes constantes de imunoglobulinas humanas. Alternativamente, os anticorpos podem ser directamente marcados. Pode usar-se uma grande variedade de marcadores, tais como radioisótopoí., substâncias fluorescentes, enzimas, substratos de enzimas, cofactores de enzimas, inibidores de enzimas, ligandos (particularmente haptenos), etc. Estão disponíveis numerosos tipos de imunoensaios, que sao bem conhecidos dos peritos na técnica.

Podem também ser fornecidos kits para uso com os anticorpos em causa, na protecçao contra, ou na detecçao de, uma actividade celular, ou da presença de um antigénio seleccionado. Assim, a composição de anticorpo em causa do presente invento, usualmente sob a forma de liofilizado num recipiente, pode ser fornecida isoladamente ou em conjunção com anticorpos adicionais específicos para o tipo celular desejado. Os anticorpos, que podem estar coniugados com um marcador ou uma toxina, ou nSo-conjugados, sào incluídos nos kits com tampões, como o Tris, fosfato, carbonato, etc., estabilizantes, biocidas, proteínas inertes, e.ς., albumina sérica, ou semelhantes, e com um conjunto de instruções de utilização. Geralmente, estes materiais estarão presentes em menos de cerca de 5 p%, com base na quantidade de anticorpo activo, e estarao usualmente presentes numa quantidade total de, pelo menos, cerca de 0,001 p%, de novo com base na concentração de anticorpo. Frequentemente, será desejável incluir um diluente ou excipiente inerte, para diluir os ingredientes activos, situação em que o excipiente pode estar presente desde la 99 p% da composição total. Quando é empregue no ensaio um segundo anticorpo, capaz de se ligar ao anticorpo quimérico, este estará usualmente presente num recipiente separado. 0 segundo anticorpo é, tipicamente, conjugado com um marcador e formulado de maneira análoga â das formulações de anticorpos atrás descritas.

Os exemplos seguintes são oferecidos para fins de ilustração, e não com fins limitativos.

Experimentação

Concepção de genes para cadeias leves e pesadas de tipo humano

Foi usada a sequência do anticorpo humano Eu (ver Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services, 1983) para fornecer a região estrutural do anticorpo humanizado, porque a sequência de aminoácidos da cadeia pesada do anti-Tac é mais

homóloga da cadeia pesada deste anticorpo do que de qualquer outra sequência de cadeias pesadas encontrada na National

Biomedical Foundation Protein Identification Resource.

Para seleccionar a sequência da cadeia pesada humanizada, a sequência de cadeia pesada do anti-Tac (ver os pedidos de patente norte-americanu com os números de série 186.862 e 223.037, aqui incorporados para referência) foi alinhada com a sequência de cadeia pesada do Eu (Figura 1). Em cada posição, o aminoácido do Eu foi seleccionado para fazer parte da sequência humanizada, salvo quando essa posição se encontrou incluída em qualquer uma das seguintes categorias, caso em que foi seleccionado o aminoácido do anti-Tac.

(1) A posição encontrava-se dentro de uma região determinante da complementaridade (CDR), como definido por Kabat, et al., op. cit. (aminoácidos 31-35, 50-66, 99-106);

(2) O aminoácido do Eu era incomum nessa posição, nas cadeias pesadas humanas, enquanto q.e o aminoácido do anti-Tac era tipico das cadeias pesadas humanas, para essa posição (aminoácidos 27 , 93, 95, 98, 107-109 , 111) ;

(3) A posição estava imediatamente adjacente a uma CDR, na sequência de aminoácidos da cadeia pesada de anti-Tac (aminoácidos 30 e 67);

(4) Um modelo tridimensional do anticorpo anti-Tac sugeriu que o aminoácido estava fisicamente próximo da região de ligação ao antigénio (aminoácidos 48 e 68).

Alguns aminoácidos pertenciam a mais do que uma destas categorias, mas estão regist.oos em apenas uma.

Para seleccionar a sequência da cadeia leve humanizada, a sequência da cadeia leve do anti-Tac foi alinhada com a sequência da cadeia leve do Fu (Figura 2). 0 aminoácido do Eu foi seleccionado para cada posição, salvo quando essa posição se encontrou também incluída em uma das categorias (1) a (4) (com a cadeia leve a substituir a cadeia pesada nas definições de categoria):

(1) CDRs (aminoácidos 24 a 34, 50 a 56, 89 a 97).

(2) Aminoácido do anti-Tac mais tipico do que o do Eu (aminoácidos 48 e 63).

(3) Adjacente âs CDRs (nenhum aminoácido; os anticorpos Eu e anti-Tac eram já idênticos em todas estas posições).

(4) Possivel proximidade tridimensional em relação à região de ligação (aminoácido 60).

As sequências nucleotid^:cas reais dos genes das cadeias pesada (Figura 3) e leve (Figura 4) foram seleccionadas como segue:

(1) As sequências nucleotidicas codificam para as sequências dos aminoácidos escolhidos como acima descrito.

(2) Na extremidade 5' destas sequências codificantes, as sequências nucleotidicas codificam para uma sequência leader (de sinal), nomeadamente, a sequência leader da cadeia leve do anticorpo MOPC 63 e a sequência leader da cadeia pesada do anticorpo PCH 108A (Kabat et al., op. cit.). Estas sequências leader foram es.Olhidas como sendo tipicas dos anticorpos.

(3) Na extremidade 3' das sequências codificantes, as sequências nucleotidicas são as sequências que se seguem ao segmento J5 da cadeia leve de rato e ao segmento J2 da cadeia pesada de rato, as quais formam parte das sequências do antiTac. Estas sequências são incluídas porque elas contêm sinais de splicing do dador.

(4) Em cada extremidade dr? sequência encontra-se um local de restrição da Xbal, para permitir o corte nos locais de restrição da Xbal e a clonagem de um vector nos mesmos.

Construção dos genes das cadeias leve e pesada humanizadas

Para sintetizar a cadeia pesada, foram sintetizados quatro oligonucleótidos HES 12, HES 13, HES 14, HES 15 (Figura 5A), usando um sintetizador de DNA da Applied Biosystems, 380B. Dois dos oligonucleótidos formam parte de cada cadeia de DNA da cadeia pesada, e cada oligonucleótido complementa o seguinte em cerca de 20 nucleótidos, para permitir o emparelhamento (Figura 5B). Reunidos, os oligonucleótidos 'obrem toda a cadeia pesada humanizada (Figura 3), com alguns .nucleótidos extra, em cada extremidade, para permitir o corte ao nivel dos locais de restrição da Xbal. Os oligonucleótidos foram purificados a partir de geles de poliacrilamida.

Cada oligonucleótido foi fosforilado, usando ATP e a polinucleótido quinase T4, através de métodos padronizados (ver

Maniatis, op._cit.) . Para o emparelhamento dos oligonucleótidos fosforildos, estes foram suspensos, em conjunto, em 40 μΐ de TA (33 mM de Tris-acetato, pH 7,9, 66 mM de acetato de potássio, 10 mM de acetato de magnésio), a uma concentração de cerca de 3,75 μΜ còia, aquecidos a 95°C durante α— minutos e arrefecidos lentamente até 4°C. Para sintetizar o gene completo a partir dos oligonucleótidos, sintetizando a cadeia complementar de cada oligonucleôtido (Figura 5B), foram adicionados os seguintes componentes, para um volume final de 100 μ1:

10 μΐ	oligonucleótidos emparelhados
0,16 mM cada	desoxiribonucleôtidos
0,5 mM	ATP
0,5 mM	DTT
100 pg/ml	BSA
3,5 pg/ml	proteína gt3 T4 (DNA polimerase)
25 pg/ml	proteina ç,44/62 T4 (proteína acessória da polimerase)
25 pg/ml	proteina 45 (proteina acessória da polimerase)

A mistura foi incubada a 37°C, durante 30 minutos. Então, adicionou-se 10 U de DNA ligase T4 e a incubação a 37°C continuou por mais 30 minutos. A polimerase e a ligase foram inactivadas por incubação da reacção a 70°C, durante 15 minutos. Para a digestão do gene coa Xbal, adicionou-se ao meio reaccional 50 μΐ de 2 x TA contende BSA a 200 pg/ml, e DTT a 1 mM, 43 μΐ de água, e 50 U da Xbal en> 5 μΐ. A mistura reaccional foi incubada durante 3 horas, a 37°C, e aplicada num gel. 0 fragmento de restrição pela Xbal, com 431 pb, foi purificado a partir de um gel e clonado no local de restrição da Xbal do plasmideo pUC19, através de métodos padronizados. Foram purificados e sequenciados quatro isolados de plasmideos, usando o método de didesoxi. Um destes isolados possuía a sequência correcta (Figura 3).

Para sintetizar a cadeia leve, foram sintetizados quatro oligonucleótidos, JFD1, JFD2, JFD3 e JFD4 (Figura 6A) . Dois dos oligonucleótidos formam parte de cada cadeia de DNA da cadeia leve, e cada oligonucleótido complementa o seguinte em cerca de 20 nucleôtidos, para permitir o emparelhamento (Figura 6B). Reunidos, os oligonucleótidos cobrem toda a cadeia leve humanizada (Figura 4), com alguns nucleôtidos extra em cada extremidade para permitir o corte ao nivel dos locais de restrição da Xbal. Os oligonucleótidos foram purificados a partir de geles de poliacrilamida.

gene da cadeia leve foi sintetizado a partir destes oligonucleótidos, em duas partes. Fez-se a combinação de JFD1 e de JFD2, 0,5 pg de cada, em 20 μΐ de tampão de sequenase (40 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 20 mM de cloreto de magnésio, 50 mM de cloreto de sódio), aquecendo-se a 70°C durante 3 minutos e permitindo o arrefecimento lento da mistura até 23°C, de forma a permitir o emparelhamento dos oligonucleótidos. O JFD3 e o JFD4 foram tratados da mesma forma. Em cada reacção estiveram presentes 10 mM de DTT e 0,5 mM de cada desoxiribonucleôtido, e adicionou-se 6,5 U de sequenase (US Biochemicals), para um volume final de 24 μΐ, fazendo-se a incubação durante 1 hora, a 37°C, para sintetizar as cadeias opostas dos oligonucleótidos. Adicionou-se Xbal e HindIII a cada reacção, para digerir o DNA (há um local de restrição de HindIII na região em que o JFD2 e o JFD3 se sobrepõem, e, portanto, em cada um dos DNAs sintetizados; Figura 6B). As misturas reaccionais foram aplicadas em geles de poliacrilamida, e os fragmentos de '“Ζ-:

restrição por Xbal-HindIII foram purificados e clonados no pUC18, através de métodos padronizados. Foram sequenciados vários isolados de plasmideos, pelo método de didesoxi, e foram escolhidos os isolados correctos.

Construção de plasmideos para expressão de cadeias leves e pesadas humanizadas fragmento de restrição, pela Xba I, da cadeia pesada foi isolado a partir do plasmídeo pUC19, no qual havia sido inserido, sendo então inserido no local de restrição da Xba I no vector pV 1 (ver pedido de patente norte-americano com o número de série 223,037) na orientação correcta, por meio de métodos padronizados, para produzir o plsmideo pHuGTACl (Figura 7). Este plasmídeo expressará elevados níveis de uma cadeia pesada completa, quando transfectado numa célula hospedeira apropriada.

Os dois fragmentos de restrição , por Xba I-Hind III, da cadeia leve foram isolados a partir dos plasmideos pUC18, nos quais haviam sido inseridos. O vector plasmídico pV 1 (ver pedido de patente norte-americano com o número de série 223.037) foi cortado pela Xba I, desfosforilado e ligado aos dois fragmentos, por meio de métodos padronizados. 0 produto de reacção desejado tem a forma circulcr: vector-Xbal-fragmento 1HindlII-fragmento 2-XbaI-vector. Foram analisados diversos isolados de plasmideos, por mapeamento de restrição e sequenciaçao, e foi escolhido um com esta forma. Este plasmídeo, o pHuLTAC (Figura 8), contém portanto a cadeia leve humanizada completa (Figura 4), e expressará niveis elevados da cadeia leve quando transfectado numa célula hospedeira apropriada

Síntese e afinidade do anticorpo humanizado

Os plasmideos pHuGTACl e pHuLTAC foram transfectados em células Sp2/0 de rato, e as células que integraram os plasmideos foram seleccionadas com base na resistência ao ácido micofenólico e/ou higromicina B, conferida pelos genes gpt e hyg dos plasmideos (Figuras 7 e 8), por meio de métodos padronizados. Para verificar se estas células segregam um anticorpo que se liga ao receptor da IL-2, o sobrenadante das células foi incubado com as células HUT-102, que se sabe expressarem o receptor da IL-2. Apôs lavagem, as células foram incubadas com anti-corpo de cabra anti-humano conjugado com fluoresceina, lavadas, e analisada a sua fluorescência num citofluorômetro FACSCAN. Os resuliados (Figura 9A) mostram claramente que o anticorpo humanizado se liga a estas células, mas nao a células T Jurkat que não expressam o receptor da IL-2 (Figura 9D) . Como controlo, foi também usado a anticorpo original anti-Tac de rato, para marcaaçiO destas células (Figuras 9B,C), evidenciando resultados similares.

Para uma experimentação mais completa, as células produtoras do anticorpo humanizado foram injectadas em ratos, e as ascites resultantes foram recolhidas. 0 anticorpo humanizado foi purificado, a partir das ascites, até se obter uma homogeneidade substancial, por meio da passagem através de uma coluna de afinidade de anticorpo d·'·: cabra anti-imunoglobulina humana, preparado num suporte de Affigel-10 (Bio-Rad

Laboratories, Inc., Richmond, CA), de acordo com métodos padronizados. Para determinar a afinidade do anticorpo humanizado relativamente ao anticorpo anti-Tac original, foi executado um ensaio de ligação competitiva. Fez-se a incubação 5 de cerca de 5x10 células HUT-102 com quantidades conhecidas (10-40 ng) do anticorpo anti-Tac e do anticorpo anti-Tac humanizado, durante 10 minutos, a 4°C. Adicionou-se então 100 ng de anti-Tac biotinilado às células, fazendo-se a incubação durante 30 minutos a 4°C. Esta quantidade de anti-Tac foi previamente determinada como sendo suficiente para saturar os locais de ligaçao nas células, mas nào para estar presente em grande excesso. As células foram, de seguida, lavadas duas vezes com tampào salino de fosfato PBS) contendo 0,1% de azida de sódio. As células foram incubadas durante 30 minutos, a 4°C, com 250 ng de avidina conjugada com ficoeritrina, que se liga ao anti-Tac biotinilado já ligado âs células. As células foram de novo lavadas, como atrás descrito, fixadas em PBS contendo 1% de paraformaldeido, e foi analisada a sua fluorescência num cito fluorômetro FACSCAN.

O uso de quantidades crescentes (10-40 ng) do anticorpo anti-Tac como competidor, no primeiro passo, diminuiu a quantidade de anti-Tac biotinii.ido que se podia ligar âs células no segundo passo e, portanco, a quantidade de avidina conjugada com ficoeritrina que se ligou no último passo, diminuindo assim a fluorescência (Figura 10A). Quantidades equivalentes (20 ng) do anti-Tac, e do anti-Tac humanizado usado como competidor, diminuiram a fluorescência até aproximadamente o mesmo nivel (Figura 10B). Isto mostra que estes anticorpos possuem aproximadamente a mesma afinidade entre 3 a 4 vezes superior, uma vez que, se um dos corpos tivesse uma afinidade muito ma:.or, ele competiria mais eficazmente com o anti-Tac biotináiado, provocando assim um maior decréscimo de fluorescência.

Propriedades biológicas do anticorpo humanizado

Para uso optimizado no tratamento de uma doença humana, o anticorpo humanizado deveria poder destruir as células T que expressam o receptor da IL-2, no corpo. Um mecanismo pelo qual os anticorpos podem destruir as células alvo é a citotoxicidade dependente do anticorpo mediada por células, abreviadamente, ADCC (y?r Fundamental Immunology, Paul, W., Ed., Raven Press, New York (1984), pág. 681), em que o anticorpo forma uma ponte entre a célula alvo e uma célula efectora, tal como um macrôfago, que pode lisar o alvo. Para determinar se o anticorpo humanizado e o anticorpo anti-Tac original de rato podem mediar a ADCC, foi efectuado um ensaio de libertação de crómio, através de métodos padronizados. Especificamente, fez-se a incubação de células HUT-102 de leucemia humana, que expressam o receptor da IL-2, com ^^Cr, para permitir a absorção deste radioisôtopo pelas células. As células HUT-102 foram então incubadas com um excesso de anticorpo anticorpo anti-Tac ou anti-Tac humanizado. As células HUT-102 foram, de seguida, incubadas durante 4 horas, com uma razão de 30:1 ou de 100:1 de células efectoras, as quais eram células mononucleadas de sangue periférico humano normal, purificadas, que haviam sido activadas por incubação, durante cerca de 20 horas, com IL-2 recombinante humana. A libertação 51 de Cr, que indicou a lise das células alvo HUT-102, foi medida, tendo sido subtraída a radiação de fundo (Tabela 1). Os resultados mostram que, para qualquer das razões de células efectoras, o anti-Tac não lisou um número significativo de células alvo (menos de 5%), enquanto que o anticorpo humanizado o fez (mais de 20%). Assim, o anticorpo humanizado será susceptivel de maior eficiência, jo que o anticorpo de rato original, no tratamento de leucemias de células T, ou de outras doenças mediadas por células T.

Tabela I

Percentagem de libertação de —Cr após a ADCC

Razão efector:alvo

Anticorpo	30: 1	100 : 1
Anti-Tac	4%	<1%
Anti-Tac	24%	23%
humanizado

A partir do que foi exposto, será tomado em conta que as imunoglobulinas de tipo humano u presente invento oferecem numerosas vantagens relativamente a outros anticorpos . Por exemplo, em comparação com os anticorpos monoclonais anti-Tac de rato, as presentes imunoglobulinas de tipo humano do receptor da IL-2 podem ser produzidas de forma mais económica, contendo, por outro lado, substancialmente menos sequências de aminoácidos estranhos. Esta redução da possibilidade de antigenicidade, após injecção num paciente humano, representa um melhoramento terapêutico significativo, para imunoglobulinas concebidas de acordo com os critérios anteriores.

Apesar de o presente invento ter sido descrito com algum detalhe por meio de ilustrações e de exemplos, com o propósito de maior clareza e compreensão, será evidente que se poderão praticar certas alterações, no âmbito das reivindicações anexas.

Claims (5)

1. REIVINDICAÇÕES

   1- Um método para conceber uma cadeia de imunoglobulina humanizada (Ig) que possui uma ou mais regiOes determinantes da complementariedade (CDR), de um dador de Ig, e uma região estrutural de uma Ig humana, caracterizado pelo facto de compreender:

   a comparação da estrutura ou da região variável da sequência de aminoácidos de uma cadeia leve ou pesada do dador de Ig com as sequências correspondentes, numa colecçâo de cadeia humana de Ig;

   - a selecção, de forma a fornecer a estrutura humana de Ig com pelo menos uma das cerca de três das sequências mais homólogas da colecçâo.
2. 2- Um método para conceber uma cadeia de imunoglobulina humanizada, que tem uma região estrutural de uma imunoglobulina receptora humana, e regiOes determinantes da complementariedade (CDR), de uma imunoglobulina dadora, capaz de ligar-se a um antigénio, caracterizado pelo facto de compreender as etapes de substituição de, pelo menos, um aminoácido de estrutura humana da imunoglobulina receptora, com um aminoácido correspondente da imunoglobulina dadora, numa posição das imunoglobulinas, em que:

   a) o aminoácido da região estrutural humana da imunoglobulina receptora é raro na dita posição, e o correspondente aminoácido na imunoglobulina dadora é comum na referida posição, na sequência de imunoglobulinas humanas; ou

   b) o aminoácido está imediatamente adjacente a uma das CDRs; ou

   c) prevê-se que o aminoácido tenha um átomo de cadeia lateral a, aproximadamente, 3 A das CDRs, num modelo de imunoglobulinas tri-dimensionai, e que seja capaz de interagir com o antigénio ou com a CDR da imunoglobulina humanizada.
3. 3- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 2, caracterizado pelo facto da cadeia de imunoglobulina humanizada compreender, além da CDR, pelo menos três aminoácidos da imunoglobulina dadora, escolhidos negundo os critérios a), b) ou c) .
4. 4- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 3, caracterizado pelo facto de pelo menos um dos aminoácidos substituídos do dador se encontrar imediatamente adjacente â

   CDR.

   Lisboa, 28 de Dezembro de 1989 PELO AGENTE OFICIAL da PROPRIEDADE INDUSTRIAL

   4 7
5. 8 FOLHAS - FOLHA 1 “ ΐ ί ι ⁰ ι ι ι ' ' ^{1 A} l ί ί Μ Ϊ í ^M o v Q L v Q £ G A Ε V K K P 6 S S V K V