JP2022526340A

JP2022526340A - Ｅｂａｇ９を阻害することによる細胞溶解性ｔ細胞の活性の増強

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Publication number: JP2022526340A
Application number: JP2021557185A
Authority: JP
Inventors: レーム，アーミン; ヴィルゲス，アンテイア; ブンセ，マリオ; ウッケルト，ウルフギャング
Original assignee: マックス－デルブリュック－ツェントルムフューアモレキュラーレメディツィンインデアヘルムホルツ－ゲマインシャフト
Priority date: 2019-03-25
Filing date: 2020-03-25
Publication date: 2022-05-24
Also published as: CN113631184A; EP3946435B1; EP3946435A1; ES2967879T3; US20220154191A1; AU2020247119A1; EP3946435C0; CA3130872A1; WO2020193628A1

Abstract

本発明は、抗原を標的とするトランスジェニック構築物をコードする1種以上の外来性核酸分子を含む遺伝子改変細胞傷害性T細胞であって、上記細胞において、エストロゲン受容体結合断片関連抗原9（EBAG9）の活性が阻害されている、細胞に関する。さらに本発明は、抗原標的化構築物がキメラ抗原受容体（CAR）又はT細胞受容体（TCR）である、改変された細胞傷害性T細胞に関する。さらに本発明は、増殖性疾患の処置における薬剤として使用される改変T細胞、及び特に血液悪性腫瘍の処置のための対応する処置方法に関する。さらに本発明は、改変T細胞を含む医薬組成物、抗原標的化構築物をコードする核酸ベクター、及び好ましくはRNA干渉を使用したEBAG9を阻害する手段、及び細胞傷害性T細胞の細胞溶解活性を増加させるin vitroでの方法に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、細胞治療薬の分野、特に、癌を処置するのに好適な治療用T細胞の細胞傷害活性を増強する手段に関する。

本発明は、抗原標的化（antigen-targeting：抗原を標的とする）トランスジェニック構築物をコードする1種以上の外来性核酸分子を含む遺伝子改変細胞傷害性T細胞であって、上記細胞において、エストロゲン受容体結合断片関連抗原9（estrogen receptor-binding fragment-associated antigen 9）（EBAG9）の活性が阻害されている、細胞に関する。さらに本発明は、抗原標的化構築物がキメラ抗原受容体（CAR）又はT細胞受容体（TCR）である、改変された細胞傷害性T細胞に関する。さらに本発明は、増殖性疾患の処置における薬剤として使用される改変T細胞、及び特に血液悪性腫瘍の処置のための対応する処置方法に関する。さらに本発明は、改変T細胞を含む医薬組成物、抗原標的化構築物をコードする核酸ベクター、及び好ましくはRNA干渉を使用したEBAG9を阻害する手段、及び細胞傷害性T細胞の細胞溶解活性を増加させるin vitroでの方法に関する。

血液腫瘍は異質性があり、急速な経過及び緩徐な経過により区別され得る。標準治療は、多くの場合、自家幹細胞移植、免疫調節薬、放射線照射、プロテアソーム阻害剤、シグナル伝達経路阻害剤、及びごく少数の患者での同種幹細胞移植と組み合わせた、抗体／化学療法の組合せである。多くのB-NHLエンティティにおいて、診断時の年齢の中央値は、66歳超～72歳であるため、併存症も存在し、これにより集中化学療法及び長期化学療法又は同種骨髄移植でさえ除外される。

成熟B細胞リンパ腫におけるBCRシグナル伝達の阻害剤、とりわけイブルチニブ等は、寛解率の大幅な上昇をもたらした。このクラスのキナーゼ阻害剤に対する初期の高い感受性にもかかわらず、腫瘍根絶が達成され得るかどうかは不確かであり、第二に、幾つかの研究は、リンパ腫及び白血病のクローン進化がBTK阻害に対する耐性の出現をもたらすことを明らかにした。したがって、標的療法に対する二次耐性の急速な出現により、数種類の他の化学療法を受け、これにより、臨床成績（IPIスコア）が低下した患者に適用可能な、許容可能なサルベージ療法の解決策を見つけることが求められている。

白血病及びリンパ腫B細胞に広く発現しているCD19抗原を標的とする養子キメラ抗原受容体（CAR）-T細胞療法は、多大な臨床効果をもたらした。腫瘍関連抗原としてのBCMA（特許文献1）及びCXCR5（特許文献2）に対する抗原特異性に基づくCAR-Tアプローチも記載されている。

しかしながら、B-NHLに対して指向された抗CD19抗体又はCAR-T細胞療法では、抗原損失又は発現低下により耐性が出現し得る。最近の研究は、抗CD19 CAR-T細胞療法に際して、選択的にスプライシングされたCD19アイソフォームが選択され、これにより、CD19 CARの同族エピトープが損失することに起因して、エスケープバリアントが出現することを示した。したがって、既存の治療用mAb又はCAR-T細胞療法以外に、他のCAR特異性がB細胞リンパ腫の免疫療法の代替的な標的として浮上する。同様に、多発性骨髄腫に関連するBCMA抗原では、腫瘍細胞膜からのシェディングが認められ、これにより、BCMA CARが標的にできる構造の大幅な減少をもたらした。

効果的な養子T細胞療法（ATT）は、結合活性の高い長命の腫瘍抗原特異的CD8+及び／又はCD4+T細胞の作製に依存する。機能的結合活性は、TCR又はCARのその同族抗原に対する構造的結合活性だけでなく、T細胞の細胞溶解効率にも依存し、これは、エフェクターサイトカイン及び細胞溶解性分子の合成、輸送、及び貯蔵により影響される。加えて、TCR又はCARのいずれかを備えた養子移入されたT細胞は、腫瘍微小環境の存在下で耐性又は機能不全状態を生じやすい。したがって、この機能不全状態を破るか、又はこのような状態を防止するようなT細胞機能が正当化される。

エストロゲン受容体結合断片関連抗原9（EBAG9）の機能がTリンパ球で評価されており、細胞傷害活性を調節することが分かっている。非特許文献1は、EBAG9がマウスCD8+T細胞の細胞溶解能力を負に調節することを教示している。EBAG9の欠失は、グランザイムAのCTL分泌の増加をもたらした。さらに、非特許文献2は、EBAG9がマウスTリンパ球の細胞傷害活性を制御し、これによって、適応免疫応答を負に制御することにより腫瘍成長及び転移を調節することを教示している。これらの発見にもかかわらず、抗原標的化トランスジェニック構築物を含むヒト細胞傷害性T細胞にEBAG9阻害を組み込む提案又は試みはなされていない。現在までに、EBAG9に関する発見は、癌細胞におけるEBAG9発現の調節という観点から考察されている。Miyazakiらによると、EBAG9発現は、癌細胞において上昇し、このことが、その後に宿主の内因性免疫反応を負に調節する。しかしながら、遺伝子操作された抗原特異性を有する、対象に導入する治療用T細胞において、細胞溶解能力を増加させるためにEBAG9を阻害する提案は、当該技術分野においてなされていない。

国際公開第2017/211900号国際公開第2019/038368号

Rueder et al (J. Clin. Invest. 2009, 119:2184-2203) Miyazaki et al (Oncogenesis (2014) 3, e126)

悪性細胞に対する高い結合活性及び細胞傷害活性を示すT細胞を用いた細胞治療薬の開発における上記の欠点及び特有の困難を考慮すると、当該分野は、例えば、腫瘍耐性又は腫瘍抗原シェディングにおける困難を克服するために細胞溶解性T細胞の活性及び最終的に治療有効性を改善する新規の手段の必要に迫られている。

従来技術を考慮すると、本発明の根底にある技術的課題は、治療用T細胞、特にT細胞を特定の腫瘍標的に指向する抗原特異的標的化構築物を有するものの細胞溶解活性を増強する代替的手段又は改善された手段の提供であった。本発明の更なる目的は、CAR-T又はTCR T細胞療法を改善する手段を提供することであった。本発明の別の目的は、コンピテントCAR T細胞の製造を促進する手段を提供することであった。

この課題は、独立請求項の特徴により解決される。本発明の好ましい実施の形態は、従属請求項により提供される。本発明は、従来技術の欠点を回避する一方で上記の課題を解決しようとするものである。

したがって、本発明は、抗原標的化トランスジェニック構築物をコードする1種以上の外来性核酸分子を含む遺伝子改変細胞傷害性T細胞であって、上記細胞においてエストロゲン受容体結合断片関連抗原9（EBAG9）活性が阻害されている、遺伝子改変細胞傷害性T細胞に関する。

本発明者らは、EBAG9欠失又はノックダウンによる細胞溶解性エフェクター分子の放出に対する刺激効果をATTの治療状況に応用するために、EBAG9が阻害されている改変T細胞を開発した。

以下に示すように、好ましい実施の形態及び実施例において、本発明者らは、EBAG9のmiRNA標的化を様々なCAR構築物、とりわけ本明細書においてより詳細に記載されるBCMA CAR、CD19 CAR、及びCXCR5 CARと組み合わせた。レトロウイルスを作製し、ヒトT細胞を形質導入した。これらのT細胞は、in vitroでの細胞溶解性殺傷増強により証明されるように、大幅に改善された細胞溶解活性を賦与された。ヒト多発性骨髄腫細胞を使用したin vivoでのNSGマウスへの異種移植実験が実行され、続いて、少数の遺伝子操作されたCAR T細胞の移植が実行された。

EBAG9発現がサイレンシングされたCAR T細胞は、これにより、一部の実施例において完全な腫瘍根絶として見られる高い細胞溶解効率を賦与された。したがって、好ましくはRNAiにより媒介されるEBAG9阻害は、CAR-T及び細胞療法における同様のアプローチにもたらされる有効性の増加に関して驚くべき効果を引き起こす。この増加は、当業者により予測され得なかった驚くべき効果を示す。

抗原標的化構築物を発現するCTLにおけるEBAG9の阻害を特徴とする本発明は、自己免疫のリスクの増加がないという利点により更に特徴付けられる。T細胞の細胞溶解効率を増強する他の細胞生物学的手法は、エフェクター又は記憶表現型のいずれかの方向に向けて既定の成熟状態をT細胞に賦与することを含む、従来技術に記載されている標準的な細胞培養手順である。しかしながら、T細胞活性化の他の障害物の下方調節、例えば、PD-1又はCbl-bの欠失は、自己免疫の著しく高いリスクに関連する。驚くべきことに、EBAG9-KOマウスにおいて自己免疫は観察されず、したがって、基本的には、本発明の細胞を使用したATT後にこのような疾患を発症するリスクはないか、又は著しく低い。

本発明の更なる利点として、EBAG9は、細胞プロセスにおける翻訳後の工程を標的とし、したがって、T細胞においてのみ有効であるが、他の体細胞では有効でない既定の分泌経路に干渉する。成熟T細胞のin vitro miRNA手法を使用してEBAG9を選択的に標的とすることによるリスクプロファイルは非常に低い。

さらに、追加の利点として、EBAG9サイレンシングは発癌促進要因でないどころか、CD8+T細胞に増強された免疫学的能力を賦与する（しかし、NK細胞には賦与しない）。EBAG9欠失は、腫瘍再発の予防に重要である抗原特異的記憶の形成の増加にも関連する。

EBAG9阻害（好ましくはサイレンシング）の手法の生物学的原理は新規であり、上記の通りであり、以下でより詳細に記載される予想外の利点に関連する。細胞溶解性エフェクター分子の供給を増強するのに役立つ、CTLにおける翻訳後の輸送工程が初めて標的とされる。

このEBAG9阻害は、消耗状態又は機能不全状態に陥れることなく、細胞溶解能力の増強及び腫瘍根絶におけるより高い効率をもたらす。前臨床モデルでは明らかな副作用は観察されず、このことは、シグナル伝達プロセス（PD-1、Cbl-b）を標的とする他の手法とは明らかに対照的である。

したがって、さらに本発明は、in vitro及びin vivoでのより良好な抗腫瘍活性が賦与されている遺伝子操作された（好ましくはCD8+及びCD4+）T細胞のより迅速な作製を可能にする。有効用量のCAR T細胞を得るためには、通常、細胞を投与する準備ができるのに最低12日要する。今やこの期間は、EBAG9阻害を使用することで、顕著に加速することができ、場合によっては、有効用量のCAR T細胞を作製する調製期間は10日未満に低減される。換言すれば、同じ効果を得るために、より少数のCAR T細胞を必要とし、したがって、ex vivo及びin vitroで必要とされる増殖段階がより短くなる。これにより、細胞の作製及びより迅速な処置においてコストが顕著に節約されるであろう。したがって、製造レベル、生物学的レベル、及び処置レベルで改善が認められ、このことは、従来技術からは予測され得なかった一連の利点を提供する。

さらに本発明者らによるin vitro解析は、遺伝子操作されたT細胞が早期に消耗段階を生じる傾向がないことを明らかにした。このことは、EBAG9が遺伝子操作されたCAR T細胞の適用が、幾つかの血液悪性腫瘍のATTを改善する実現可能な戦略であることを示す。幾つかの実施の形態において、本発明の改変CTLは、EBAG9が阻害されていないCTL等の未改変の対照細胞と比較した細胞溶解活性の比較的より緩徐な消耗を特徴とする。

高親和性及び高い結合活性は、CAR-T及びTCR-T細胞が、同族抗原が高度及び中程度に表面発現している標的腫瘍細胞を認識すること、これに対して活性化されること、及びこれを殺傷することを可能にする。しかしながら、結合活性成熟を有するCARは、まだ記載されていない。

したがって、本発明は、これまで当該技術分野において開示又は提唱されていない、CTL活性の改善のブレークスルーコンセプトを示す。本発明者らの知る限り、現在、ATT効率の増加がT細胞における分泌経路の改善により達成される、使用されている匹敵する生物学的原理は存在しない。

EBAG9が細胞溶解活性に対する既知の負の調節機能を有するにもかかわらず、抗原標的化トランスジェニック構築物を含む細胞傷害性T細胞にEBAG9阻害を組み込む提案又は試みは従来技術においてなされていない。EBAG9に関する従来技術は、EBAG9発現が癌細胞において上昇し、このことが、その後に宿主の内因性免疫反応を負に調節することを示す。細胞溶解能力を増加させるために、遺伝子操作された抗原特異性を有する治療用T細胞においてEBAG9を阻害することは、細胞溶解活性の増強が必要とされる細胞におけるEBAG9機能を直接的に操作することを狙った完全に新規な手法である。

したがって、本発明は、EBAG9及び細胞溶解活性に関する従来技術の文献と比較して様々な課題を解決する。すなわち、本発明は、細胞の細胞溶解活性を増強するだけでなく、治療適用に必要な細胞の数を低減することによって細胞の製造方法も改善することにより、CAR-T又はTCRベースの細胞療法を改善しようとするものである。したがって、本発明は、当該技術分野からは導き出され得なかった、これらの課題に対する独自の解決策を提供する。

さらに、抗原標的化構築物及び細胞傷害性T細胞におけるEBAG9阻害の組合せは、相乗効果をもたらす。T細胞の細胞溶解活性を関心対象の標的細胞に指向することにより、EBAG9阻害により増強された細胞溶解活性を局所的かつ効果的に発揮することができ、これにより、予想を上回り、かつ抗原標的化構築物又はEBAG9阻害を単独で組み込むことにより得られる効果の合計を超える細胞溶解効果をもたらす。

本発明では、EBAG9阻害は、多数の考えられるメカニズムにより、及び様々な分子ツール又は化学的ツールを使用して達成され得る。したがって、本明細書において開示されるEBAG9阻害に関する実施の形態は、例示であり、実施の形態を限定することを意図しない。

幾つかの実施の形態において、EBAG9の阻害は、好ましくは、対照の細胞傷害性T細胞、すなわち、例えば、本明細書に記載される手段によりEBAG9の生成又は活性が改変されていない、比較可能な又は同一の供給源から得られた細胞傷害性T細胞と比較して決定される。

幾つかの実施の形態において、EBAG9活性の阻害は、細胞溶解性顆粒及び／又はグランザイムを含有する分泌型リソソームの放出の（好ましくは対照細胞傷害性T細胞と比較した）増加に関連する。細胞溶解性顆粒及び／又はグランザイムを含有する分泌型リソソームの放出が2つの比較細胞集団で過度の労力なしに評価され得る好適なアッセイは、以下に示されており、当業者に既知である。

幾つかの実施の形態において、EBAG9阻害の測定可能な効果は、細胞溶解性顆粒の送達の増強である。幾つかの実施の形態では、EBAG9阻害の測定可能な効果は、抗原特異的CARにより媒介される認識後の標的細胞の殺傷の増加である。当業者は、これらの機能効果を定型的なアッセイ及び確立されたアッセイを使用して決定することができる。

1つの好ましいアッセイは、EBAG9が阻害されたCTL又は阻害されていないCTLのいずれかが、in vitroで標的細胞を殺傷する有効性について比較される「in vitro細胞傷害性アッセイ」である。かかるin vitroアッセイの例は、以下の実施例でより詳細に示される。CTLの有効性に基づいてEBAG9阻害を決定するin vivo手法も利用可能であり、当業者により過度の労力なしに実施され得る。

一実施の形態において、EBAG9が阻害されている、抗原標的化トランスジェニック構築物で改変された単離T細胞は、EBAG9阻害がない細胞溶解性T細胞と比較した場合、5%以上、10%以上、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%、又は300%以上の細胞傷害活性の増加を特徴とする。EBAG9が阻害されているT細胞の細胞溶解活性の増加を定量的又は半定量的に決定する機能アッセイを、当業者は利用可能であり、このうちの幾つかの例は本明細書に記載される。例えば、以下の図7及び図8を作成するために使用されるか、又は実施例に記載されるようなin vitroアッセイは、「未改変」T細胞、すなわち、EBAG9機能を低減／阻害する特定の改変が実施されていないT細胞と比べた細胞溶解活性の増加を決定するために適用され得る。

幾つかの実施の形態において、EBAG9サイレンシングは、T細胞形質導入に使用されるmiRNAベースのレトロウイルスにより達成される。本発明者らは、マウス及びヒト起源の幾つかの初代細胞型において、90%超の範囲でのEBAG9転写物及びタンパク質のサイレンシングを示した。

幾つかの実施の形態において、EBAG9の阻害は、対照CTLと比較して10%以上、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、又は90%以上の阻害を達成する。例えば、EBAG9が欠失されるか、又は発現が、例えばゲノム改変により妨げられる幾つか例では、EBAG9の100%阻害が達成され得る。幾つかの実施の形態では、本発明は、様々なTCR又はCAR抗原特異性を有するレトロウイルス発現構築物に組み込まれた、マウス又はヒトEBAG9を標的とするmiRNAを用いる。

好ましい実施の形態において、本明細書に記載される遺伝子改変CTLは、CD4+及び／又はCD8+T細胞であり、好ましくは、CTLは、CD4+及びCD8+T細胞の混合物である。これらのT細胞集団及び好ましくは、形質転換されたCD4+及びCD8+細胞の両方を含む組成物は、様々な血液系悪性腫瘍に対して、好ましくは、本明細書に記載される細胞及び／又は関連する医学的状態に対して特に効果的な細胞溶解活性を示す。

好ましい実施の形態において、遺伝子改変CTLは、好ましくは、1:10～10:1の比率、より好ましくは、5:1～1:5、2:1～1:2、又は1:1の比率のCD4+及びCD8+T細胞である。記載される比率、好ましくは、1:1のCD4+/CD8+の比率の、CARを発現する改変CAR-T細胞の投与は、本明細書に記載される疾患の処置において有益な特性をもたらす、例えば、これらの比率は、治療反応の改善及び毒性の低減をもたらす。

一実施の形態において、本明細書に記載される遺伝子改変T細胞は、抗原標的化トランスジェニック構築物がキメラ抗原受容体（CAR）であることを特徴とする。

一実施の形態において、本明細書に記載される遺伝子改変T細胞は、抗原標的化トランスジェニック構築物がT細胞受容体（TCR）であることを特徴とする。

抗原標的化構築物の具体的な種類又は形態は、本発明の特徴を限定することを意図しない。本発明の概念は、EBAG9阻害により媒介される細胞溶解活性の増加に基づく。したがって、任意の所与の標的細胞にCTLを送達する具体的な様式は、本発明の態様を限定しない。したがって、本発明のCTLの増強された活性は、抗原標的化構築物に依存せず、これは、単にCTLを標的（例えば、腫瘍）細胞に近接させる手段とみなされる。したがって、以下でより詳細に記載されるCAR及びTCR構築物は、EBAG9阻害の効果が効果的に利用され得る好ましい実施の形態を表す。

更なる実施の形態において、用いられるCAR構築物は、容易に交換することができ、したがって、臨床応用可能なCARのモジュール構成を可能にする。CARの抗原特異性は可変的であり、本発明を限定するものではない。

一実施の形態において、本明細書に記載される遺伝子改変T細胞は、EBAG9活性の阻害が、EBAG9のノックダウンにより、好ましくは、低分子干渉RNA（siRNA）、短鎖ヘアピンRNA（shRNA）、及び／又はマイクロRNA（miRNA）等によるEBAG9発現のRNA干渉により達成されることを特徴とする。遺伝子ノックダウンは、1つ以上の遺伝子の発現を低減する技術である。幾つかの実施の形態において、EBAG9の発現の低減は、遺伝子改変により、又は試薬、例えば、EBAG9の遺伝子又はmRNA転写物のいずれかに相補的な配列を有する短鎖DNA若しくはRNA、又は他の核酸、オリゴヌクレオチドでの処理により生じ得る。

EBAG9阻害（すなわち、「サイレンシング」又は「ノックダウン」）のRNA干渉アプローチが、生物学的系におけるそれらの特有の利点に起因する多くの理由により、好ましい。RNAi技術は、ゲノム構造又は完全性に干渉しないことにより、操作されたゲノムと比較して優れた安全プロファイルを有する。

幾つかの実施の形態において、EBAG9を標的とするために用いられる配列は、以下に記載のものである：
H17（配列番号1；AAATAACCGAAACTGGGTGAT）又は、
H18（配列番号2；TTAAATAACCGAAACTGGGTG）。

EBAG9の代替的部位を標的とする他の配列は、以下の通りである：
TAAATAACCGAAACTGGGTGA（配列番号55）；
TAGGAATGAGAATACTGTTGC（配列番号56）；
CTTAATTTCCGTCCTCTGCCA（配列番号57）；
TTTGGTCTCCACTTAATTTCC（配列番号58）；
TTCAACATCTGTCTGCTTAGG（配列番号59）；
AAGTCCACTCTTCAACATCTG（配列番号60）；
ATCCCAGGAAGTCCACTCTTC（配列番号61）；
TACTAGAGAAACCTGTGCTCC（配列番号62）。

幾つかの実施の形態において、本発明は、以下からなる群から選択される、単離形態又は好ましくはCTL形質移入のためのベクターのいずれかでの核酸分子、及びEBAG9を阻害するためのこのような分子の使用に関する：
a) EBAG9 RNAの安定性若しくは機能に干渉することができる、EBAG9のRNA領域に指向された相補配列若しくはアンチセンス配列を含むヌクレオチド配列を含む核酸分子、又は、
配列番号1、2、若しくは配列番号55～62に記載の配列を含むか、若しくはそれらからなるヌクレオチド配列を含む核酸分子；
b) a）によるヌクレオチド配列に相補的な核酸分子；
c) a）又はb）によるヌクレオチド配列と機能的に類似／同等となるのに十分な配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、好ましくは、a）又はb）によるヌクレオチド配列に対する少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、又は95%の配列同一性を含む核酸分子；
d) 欠失、付加、置換、転座、逆位、及び／又は挿入により改変されており、a）～c）によるヌクレオチド配列と機能的に類似する／同等である、a）～c）のヌクレオチド配列による核酸分子。

幾つかの実施の形態において、RNAi配列は、好ましくは配列番号3～6に記載の、本明細書に記載されるEBAG9転写物のうちの1つ以上を標的とするように設計され得る。

当業者は、標的配列及び当該技術分野における一般的な知識に基づいてRNAを標的とする効果的な配列を設計することができる。EBAG9をサイレンシングするshRNAとして使用される更なる配列を当業者が設計することができる、かかる手法のためのソフトウェアは、一般に入手可能である。例えば、Thermo FisherのプログラムであるBLOCK-iT RNAiが用いられ得る。代替的ソフトウェアが、特定及び使用され得る。

幾つかの実施の形態において、EBAG9を標的とするmiRNAを作製するために、miRNAが使用される。

miRNAは、折り曲がって、短鎖ヘアピンを形成しているRNA転写物の領域に由来するが、RNA干渉（RNAi）経路の低分子干渉RNA（siRNA）は二本鎖RNAのより長い領域に由来することを除いて、miRNAは、siRNAに似ている。

幾つかの実施の形態において、内因性miRNA、例えば、内因性miRNA-155が用いられ得る。EBAG9配列を特異的に標的とする配列、例えば、H17及びH18のアンチセンス配列は、内因性miRNAに、すなわち、21-ヌクレオチドを含有するヘアピン構造内に挿入され得る。

幾つかの実施の形態において、EBAG9ノックダウンは、miRNAの発現ベクターを用いることにより達成され得る。miRNA遺伝子は、通常、RNAポリメラーゼII（Pol II）により転写されるため、発現ベクターの適切なプロモーターが選択され得る。ポリメラーゼは、多くの場合、プレmiRNAのヘアピンループとなるものをコードするDNA配列の近くに見出されるプロモーターに結合する。結果として生じる転写物は、5'末端にて特別に修飾されたヌクレオチドでキャッピングされ、複数のアデノシンでポリアデニル化され、場合により、スプライシングされる。次いで、成熟miRNAは、Dicer及び多数の関連タンパク質を含有する活性なRNA誘導サイレンシング複合体（RISC）の一部となる。次いで、遺伝子サイレンシングが、EBAG9 mRNAの分解又はEBAG9 mRNAの翻訳を防止することにより起こり得る。

幾つかの実施の形態において、EBAG9を標的とするmiRNAを作製するために、低分子干渉siRNAが用いられる。

siRNAは、例えば、EBAG9をコードするmRNAの領域に対する相補性を有する配列を含む短い（10 bp～50 bp、好ましくは20 bp～25 bp）二本鎖又はヘアピンRNA分子を用いる。

幾つかの実施の形態において、EBAG9阻害は、配列番号3、4、5、又は6のいずれか1つの領域に対して指向されるsiRNA又はmiRNAを用いて達成される。siRNA又はmiRNA（すなわち、標的化領域）は、10個～50個のヌクレオチド、好ましくは15個～40個のヌクレオチド、より好ましくは18個～30個のヌクレオチド、より好ましくは20個～25個のヌクレオチドのものとすることができ、関連する対照と比べてEBAG9発現の低減を引き起こすのに十分な配列番号3、4、5、又は6の転写物に対する配列相補性を示す。短鎖ヘアピンRNAと標的mRNAとの間の相補性は、幾つかの実施の形態において、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、又は好ましくは100%であり得る。相補性は、好ましくは配列同一性と同様に計算され、ここで、配列の全長（例えば、低分子干渉RNAの長さ）にわたる相補的な／同一のヌクレオチドの総数が決定される。

幾つかの実施の形態において、EBAG9ノックダウンは、siRNAの発現ベクターを用いることにより達成され得る。siRNA配列は、2本の鎖の間に短いループを導入するために改変される。結果として生じる転写物は、通常の様式でDicerにより機能的siRNAにプロセシングされ得る短鎖ヘアピンRNA（shRNA）である。EBAG9がノックダウンされるべきT細胞内でsiRNAを発現させる典型的な転写カセットは、核内低分子RNA（snRNA）の転写を導くRNAポリメラーゼIIIプロモーター（例えば、U6又はH1）を使用する（U6は遺伝子スプライシングに関与し、H1はヒトRNアーゼPのRNアーゼ構成要素である）。

当業者は、EBAG9の生成を効果的に低減又は阻害する更なるRNA干渉構築物を過度の労力なしに作製することができる。

一実施の形態において、本明細書に記載される遺伝子改変T細胞は、EBAG9活性の阻害が、外来性核酸分子によるT細胞ゲノムの遺伝子改変により達成され、該外来性核酸分子が、好ましくは抗原標的化トランスジェニック構築物及びEBAG9のノックダウンのためのRNA干渉配列をコードするベクターを含むことを特徴とする。

幾つかの実施の形態において、ウイルスベクターが用いられ、好ましくは、レトロウイルス及びレンチウイルスによる導入が用いられる。

幾つかの実施の形態において、トランスポゾンが、抗原標的化トランスジェニック構築物をコードするベクターとして用いられ得る。

ウイルスベクターは、規制当局により受け入れられていること、細胞の確実な改変等の良好な技術的利点を示すこと、及び許容可能なリスクプロファイルを有すること等の様々な利点に関連する。

幾つかの実施の形態において、本発明のCTLは、好ましくはγレトロウイルス発現系と組み合わせたMP71ベクターを用いる。

この組合せにおいて、著しく高いT細胞の形質導入率が達成され得る。形質導入系は、CAR構築物及びmiRNAのモジュール設計のために可変的であり、このことは、レンチウイルス及びトランスポゾンが代替的に用いられ得ることを意味する。

幾つかの実施の形態において、本発明のCTLは、好ましくはγレトロウイルス発現系と組み合わせた、レトロウイルスSINベクター（例えば、BIONTECH社、イダー＝オーバーシュタインから入手可能）を用いる。

したがって、本発明のこれらの実施の形態は、レトロウイルス、レンチウイルス、又はトランスポゾンにより媒介される（任意の抗原特異性の）TCR又はCARの導入に起因して、単一工程でのレシピエントT細胞の操作がEBAG9の活性又は発現を阻害するのに十分であるため、更に有利である。

一実施の形態において、本明細書に記載される遺伝子改変T細胞は、T細胞ゲノムの遺伝子改変によりEBAG9遺伝子の発現を妨げる及び／又はその配列を破壊することによってEBAG9活性の阻害が得られることを特徴とする。機能の喪失を引き起こすEBAG9の欠失又は部分欠失が想定される。

以下でより詳細に記載されるように、CRISPR/Cas9若しくはTALEN技術又は他の遺伝子工学ツールが用いられ得る。本出願の実施例は、EBAG9のエキソン4を標的とする様々なガイドRNAがCas9タンパク質と共に、EBAG9の良好なノックアウト効率を達成することができることを実証する。一実施の形態において、限定されるものではないが、CRISPR/Cas9により媒介されるEBA9阻害は、EBAG9遺伝子のエキソン4を標的とする。この実施の形態は、CRISPRにより媒介されるノックアウトのためのEBAG9内の有効であるが、非限定的な好ましい標的を示す。EBAG9遺伝子のCRISPRにより媒介される遺伝子操作に好適な代替的標的は、当業者に既知であるか、又は過度の労力なしに評価され得る。

他の実施の形態において、部位特異的変異導入又は組換えベースの遺伝子ターゲティング等の遺伝子工学ツールが当業者に既知であり、また、用いられ得る。しかしながら、遺伝子（ゲノム）操作は、通常、2回又は数回の形質移入又は形質導入を必要とし、これは一般にウイルスによる導入と比べて効率的でない。

幾つかの実施の形態において、CAR又はTCRの導入、及び第2の工程でのEBAG9を標的とする遺伝子情報の導入が、必要な遺伝子改変を導入するために用いられ得る。幾つかの実施の形態では、EBAG9を標的とする遺伝子情報の導入、及び第2の工程でのCAR又はTCRの導入が、必要な遺伝子改変を導入するために用いられ得る。幾つかの実施の形態では、改変は、同一のベクター若しくは外来性核酸分子、又は別個のベクター若しくは外来性核酸分子のいずれかで同時に実施される。

幾つかの実施の形態において、抗原標的化トランスジェニック構築物をコードする外来性核酸分子は、T細胞ゲノム内のEBAG9遺伝子内に、EBAG9遺伝子に隣接して、又はEBAG9遺伝子に結合して配置され、これにより、上記EBAG9遺伝子の発現を妨げる及び／又はその配列を破壊する。

幾つかの実施の形態において、CAR配列は、EBAG9遺伝子座に直接組み込むことができ、これにより、EBAG9遺伝子発現を防止する。

EBAG9遺伝子配列又はmRNAを破壊する様々な代替戦略を、当業者は利用可能であり、過度の労力なしに確立し得る。したがって、本明細書において開示されるEBAG9阻害の好適な態様は、例示であり、限定することを意図しない。

したがって、更なる態様において、本発明は、薬剤として使用される先行請求項のいずれか一項に記載の遺伝子改変T細胞に関する。EBAG9阻害により特徴付けられる新規の所与のT細胞を考慮すると、任意の医学的利用が意図される。当業者は、CAR-T細胞又はTCR T細胞を使用して処置され得る医学的状態を特定することができ、それに応じて改変T細胞を設計することができる。好ましい実施の形態において、医学的用途は、増殖性疾患又は自己免疫疾患である。

更なる態様において、本発明は、抗原標的化トランスジェニック構築物により標的とされる抗原が、病的細胞増殖を起こしている、及び／又はそれに関連する標的細胞で発現している、増殖性疾患の処置において薬剤として使用される、本明細書に記載される遺伝子改変T細胞に関する。したがって、本発明は、投与する必要がある対象に治療上有効量で本明細書に記載されるCTLを投与することを用いる、対応する処置方法を包含する。

一実施の形態において、増殖性疾患は、血液悪性腫瘍であり、ここで、抗原標的化トランスジェニック構築物により標的とされる抗原、例えば、腫瘍関連抗原（TAA）又は腫瘍特異抗原（TSA）は、上記血液悪性腫瘍の癌性細胞で発現している。

血液悪性腫瘍の非限定的な例は、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、及び／又は多発性骨髄腫である。更なる例が以下で提供される。

幾つかの実施の形態において、抗原特異的構築物により標的とされる抗原は、腫瘍関連抗原（TAA）である。TAAは、主に又は好ましくは腫瘍細胞で発現している抗原に関連するが、多くの場合、これらの抗原は、かかる細胞で排他的に発現されていない。CD19は、形質転換B細胞及び良性B細胞の両方で生じ得るため、この定義に該当する。BCMAも正常な形質細胞及び多発性骨髄腫細胞等の形質転換細胞で発現している。

幾つかの実施の形態において、処置される血液悪性腫瘍は、CD19を発現するB細胞癌であり、ここで、抗原標的化トランスジェニック構築物は、CD19に結合する。

CD19に対して指向された抗体が、CD19を発現する細胞を標的とするCAR構築物のための抗原標的化構築物を開発するために用いられ得る。幾つかの実施の形態において、抗原標的化トランスジェニック構築物は、CD19に結合する抗体から得られるアミノ酸配列（抗原結合ドメイン）を含む。CD19抗体としては、限定されるものではないが、ブリナツモマブ、コルツキシマブラブタンシン（Coltuximabravtansine）、MOR208、MEDI-551、デニンツズマブマホドチン（Denintuzumabmafodotin）、B4、Merck社のDI-B4、タピルツモマブパプトックス（Taplitumomabpaptox）、XmAb 5871、MDX-1342、又はAFM11が挙げられる。

CD19を標的とする様々なCAR構築物は、当該技術分野において記載されている。EBAG9のサイレンシングは、基本的に、かかるCAR-T細胞治療薬のうちの任意の1種以上に適用され得る。臨床研究中の既知のCD19 CAR-T細胞は、限定されるものではないが、FMC63又はSJ25C1のScFvを有する抗原結合ドメインを含むCARである。Park et al（Blood, 2016, 127:3312-3320）において概説されるように、4-1BB又はCD28共刺激ドメインのいずれかを有するCAR構築物が既知である。臨床研究中のCAR-T細胞は、限定されるものではないが、Novartis社のチサゲンレクルユーセル、Gilead Sciences社のアキシカブタゲンシロルユーセル、Juno Therapeutics社のJCAR015及びJCAR017、Ziopharm Oncology社のCAR CD19、Cellectis社のUCART19、Allogene社のALLO-501、Bellicum Pharmaceuticals社のBPX-401、PersonGen Biomedicine Suzhou社のPCAR-019、Precision Biosciences社のPBCAR-0191、Hebei Senlang Biotechnology社のSENL-001、UWELL Biopharma社のUWC-19である。

幾つかの実施の形態において、処置される血液悪性腫瘍は、BCMAを発現するB細胞癌であり、ここで、抗原標的化トランスジェニック構築物はBCMAに結合する。

BCMAに対して指向された抗体が、BCMAを発現する細胞を標的とするCAR構築物のための抗原標的化構築物を開発するために用いられ得る。幾つかの実施の形態において、抗原標的化トランスジェニック構築物は、BCMAに結合する抗体から得られるアミノ酸配列（抗原結合ドメイン）を含む。BCMA抗体としては、限定されるものではないが、抗体薬物コンジュゲートであるGSK2857916、HDP-101、若しくはMEDI2228、又は二重特異性抗体であるEM801、Ab-957、AFM26、若しくはTNB383Bに用いられる抗体に加えて、本明細書に記載されるものが挙げられる。

BCMAを標的とする様々なCAR構築物は、当該技術分野において記載されている。EBAG9のサイレンシングは、基本的に、かかるCAR-T細胞治療薬のうちの任意の1種以上に適用され得る。臨床研究中の既知のBCMA CAR-T細胞は、限定されるものではないが、Cho et al（Front Immunol. 2018; 9: 1821）において概説される、Bluebird Bio社のbb2121、Nanjing Legend Biotech社のLCAR-B38M、Novartis社のCART-BCMA、Kite Pharma社のKITE-585及びPfizer/Cellectis SA社のBCMA CAR、Poseida Therapeutics社のP-BCMA-101、Tenebrioas社のFHVH74-CD828Z、FHVH32-CD828Z、FHVH33-CD828Z、FHVH93-CD828Z、Cartesian Therapeutics社のDescartes-08、Poseida Therapeutics社のP-BCMA-ALLO1、並びにJuno社のEGFRt/BCMA-41BBzである。

幾つかの実施の形態において、処置される血液悪性腫瘍は、CXCR5を発現する癌であり、ここで、抗原標的化トランスジェニック構築物はCXCR5に結合する。

抗原特異的構築物、例えば、CAR又はTCR構築物により標的とすることができる更なる腫瘍関連抗原は、以下のものから選択され得る。

CAR-T又はTCR抗原は、限定されるものではないが、血液悪性腫瘍に関連するTAA、例えば、CD30、CD20、CD22、ROR1、CD138、CD70、LeY、CD123、CD16V、CD123、CD33、Igκ、Igλ、IL-1RAP、NKG2Dリガンド、Muc1、GPC3、EpCam、CD38、CD5、IL-13Rα2、CD133、又はCS1（CD319）が含まれる、CAR構築物が開発されており、臨床試験又は前臨床試験中であるものから選択され得る。

固形悪性腫瘍由来のTAAも標的とすることができ、これには、限定されるものではないが、GPC3、HER2、GD2、EGFRバリアントIII（EGFR vIII）、EGFR、CEA、PSMA、FRα、EPCAM、MUC1、ROR1、MUCI16eto、VEGFR2、CD171、PSCA及びEphA2、FAP、CAIX、c-MET、CD171、L1-CAM、メソテリン、Muc1、PD-L1が挙げられる。

MART-1、MAGE-A1、MAGE-A3、MAGE-A4、gp100、CEA、TIL 1383I、P53、HPV-16 E6、HPV-16 E7、及びHBVが含まれる他の腫瘍関連抗原（TAA）もTCR-T又はCARの標的として選択され得る。

キメラ抗原受容体T細胞(CAR-T)及びTCR形質導入T細胞(TCR-T)の公開された臨床試験の詳細な概要は、Mo et al（Journal of Cancer, 2017; 8(9): 1690-1703）、Hartmann et al.（EMBO Molecular Medicine, 2017; 9 (9): 1183-1197）、及びTownsend et al.（Journal of Experimental & Clinical Cancer Research, 2018, 37:163）において開示されている。

血液癌（血液系悪性腫瘍）がT細胞療法により適しているようであるが、固形腫瘍疾患でのCAR-T又はTCR-T細胞の細胞溶解効果を調べている進行中の複数の臨床試験により証明されるように、固形腫瘍も処置され得る。

例えば、肺癌では、候補となるTAAとしては、メソテリン、EGFR、MUC1、RORI、CEA、WT1、NY-ESO-1、又はMAGE-A3/4が挙げられ得る。

上記の抗原のうちの2種以上に対して指向された抗原標的化構築物に基づく、組合せによる手法がまた、例えば、CD19及びCD20を標的とする1種以上の標的化構築物を使用することにより用いられ得る。

さらに、グリア芽細胞腫の養子タンデム-CAR-T療法は、グリア芽細胞腫上に不均一に発現している抗原であるヒト上皮成長因子受容体2（HER2）及びIL13Rα2を標的とすることにより効果的なようである。

腫瘍型特異的かつ多様化したTAAが、標的とされる1つの種類の癌で発現しているだけでなく、1種のTAAが複数種類の癌で発現していることもある。これらのTAAも標的とされ得る。例えば、NY-ESO-1は、黒色腫、多発性骨髄腫、NSCLC、滑膜肉腫、乳癌、腎細胞癌、肝細胞癌、食道癌、卵巣癌、及び膀胱癌で高度に発現している。同様にメソテリンは、中皮腫及び乳癌、子宮頸癌、膵癌、卵巣癌、肺癌、及び子宮内膜癌で高度に発現している。

上記抗原の略語：PD-1：プログラム細胞死1受容体；NSCLC：非小細胞肺癌；HLA：組織適合性白血球抗原；ROR1：チロシンキナーゼ様オーファン受容体1；BCMA：B細胞成熟抗原；LeY：ルイス（Le）-Y；GPC3：グリピカン-3；HER2：ヒト上皮成長因子受容体-2；GD2：腫瘍関連ガングリオシドGD2；EGFR：上皮成長因子受容体；CEA：癌胎児性抗原；PSMA：前立腺特異的膜抗原；FRα：葉酸受容体-α；EPCAM：上皮細胞接着分子；MUC1：ムチン1；VEGFR2：血管内皮細胞成長因子受容体-2；PSCA：前立腺幹細胞抗原；EphA2：エリスロポエチン産生肝細胞癌A2；HPV：ヒトパピローマウイルス；MAGE：黒色腫関連抗原をコードする遺伝子；TNF-α：腫瘍壊死因子-α。

本明細書に記載される特異的TAAは、例示的性質のものであり、本発明の好ましい非限定的な実施の形態を表す。EBAG9阻害の本発明の概念は、T細胞の抗原特異性に関わらず任意の所与の改変T細胞に適用され得る。

更なる態様において、本発明は、薬学的に許容される担体を追加的に含む、増殖性疾患の処置に好適な本明細書に記載される遺伝子改変T細胞を含む医薬組成物に関する。

更なる態様において、本発明は、抗原標的化構築物及びエストロゲン受容体結合断片関連抗原9（EBAG9）のノックダウンのためのRNA干渉配列をコードする配列を含む核酸ベクター又は核酸ベクターの組合せに関する。

更なる態様において、本発明は、遺伝子改変細胞傷害性T細胞の細胞溶解活性を増加させるin vitroでの方法であって、前記T細胞が、抗原標的化トランスジェニック構築物をコードする1種以上の外来性核酸分子を含み、該方法が、上記T細胞におけるエストロゲン受容体結合断片関連抗原9（EBAG9）の活性を阻害することを含む、方法に関する。

更なる態様において、本発明は、in vitroでの方法による製品、すなわち、EBAG9が阻害されている、抗原標的化トランスジェニック構築物で改変された一連の単離T細胞に関する。

一実施の形態において、本発明の方法により作製された、EBAG9が阻害されている、抗原標的化トランスジェニック構築物で改変された単離T細胞は、対照CTLと比較した10%以上、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、又は90%以上のEBAG9の阻害を特徴とする。例えば、EBAG9が欠失されるか、又は発現が例えば、ゲノム改変により妨げられる幾つか例では、EBAG9の100%阻害が達成され得る。

一実施の形態において、本発明の方法により作製される、EBAG9が阻害されている、抗原標的化トランスジェニック構築物で改変された単離T細胞は、EBAG9阻害がない細胞溶解性T細胞と比較した場合、5%以上、10%以上、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%、又は300%以上の細胞傷害活性の増加を特徴とする。EBAG9が阻害されているT細胞の細胞溶解活性の増加を定量的又は半定量的に決定する機能アッセイを、当業者は利用可能であり、このうちの幾つかの例は本明細書に記載される。例えば、以下の図7及び図8を作成するために使用されるか、又は実施例に記載されるようなin vitroアッセイは、「未改変」T細胞、すなわち、EBAG9機能を低減／阻害する特定の改変が実施されていないT細胞と比べた細胞溶解活性の増加を決定するために適用され得る。幾つかの実施の形態において、このアッセイは、本発明の方法が実施されたかどうか決定するために、すなわち、EBAG9機能の任意の減少を判定するために、使用され得る。

細胞の細胞溶解活性を増加させるin vitroでの方法は、T細胞治療薬が、通常、患者への投与前にin vitroでの処理を必要とするため、本発明の重要な側面を示す。典型的な養子T細胞療法（ATT）では、T細胞が患者から単離され、その後に、キメラ抗原受容体（CAR）又はT細胞受容体（TCR）を発現するように遺伝子改変される。この調製プロセスの間に、CTLは、それらの細胞溶解活性を増加させるために更に改変され得る。

したがって、本発明は、細胞を調製するプロセスの間に更に負担又は困難さを増すことなく、細胞治療薬の有効性を増強する方法を可能にする。したがって、幾つかの実施の形態において、EBAG9阻害が、CTLが抗原標的化構築物で改変されるのと同一の遺伝子改変工程で達成され得るため、治療適用を目的とするT細胞は、調製時に過度のストレス下に置かれない。

幾つかの実施の形態において、本明細書に記載されるin vitroでの方法は、EBAG9活性を阻害することが、好ましくはEBAG9発現のRNA干渉、例えば、低分子干渉RNA（siRNA）、短鎖ヘアピンRNA（shRNA）、及び／又はマイクロRNA（miRNA）によるEBAG9のノックダウンを含むことを特徴とする。

幾つかの実施の形態において、本明細書に記載されるin vitroでの方法は、EBAG9活性を阻害することが、好ましくは、CRISPR/Cas9若しくはTALENによりEBAG9遺伝子の発現を妨げる及び／又はその配列を破壊することによるT細胞ゲノムの遺伝子改変を含むことを特徴とする。

本発明の更なる実施の形態において、CAR又はTCRをコードする核酸のCRISPR/Cas及びTALENにより媒介される挿入が用いられ得る。細菌に天然に存在するプロセスから応用される、当業者に既知のCRISPR/Casは、DNAを正確かつ効率的に編集して、適切なコード配列を関心対象の免疫細胞、好ましくはT細胞に挿入するために用いられ得る。1対の分子ハサミとして作用するタンパク質であるCas9は、付随するRNA分子（ガイドRNA）により特異的なDNA配列に誘導される。Cas9がDNA上の標的位置に到着すると、遺伝暗号の局所的な変化を促進し、その遺伝子の機能に影響を及ぼす。CRISPR/Cas9は、T細胞ゲノム内の極めて特異的な部位にCAR又はTCR遺伝子を送達することができ、このことが、不正確な又は望ましくない位置での遺伝子挿入のリスクを低減し得る。

上記のように、本出願の実施例は、EBAG9のエキソン4を標的とする様々なガイドRNAがCas9タンパク質と共に、EBAG9の良好なノックアウト効率を達成することができることを実証する。細胞治療薬の有効性を増強する方法の一実施の形態において、CRISPR/Cas9により媒介されるEBA9阻害が用いられ、これは、好ましくはEBAG9遺伝子のエキソン4を標的とする。この実施の形態は、CRISPRにより媒介されるノックアウトのためのEBAG9内の有効であるが、非限定的な好ましい標的を示す。EBAG9遺伝子のCRISPRにより媒介される遺伝子操作に好適な代替的標的は、当業者に既知であるか、又は過度の労力なしに評価され得る。

さらに本発明は、本明細書に記載される医学的状態の処置方法であって、通常、該処置を必要とする患者への治療上有効量の改変CTLの投与を含む、方法に関する。

幾つかの実施の形態において、本明細書に記載される処置は、増加したCTLの活性に起因して、新規な又は固有の患者群で実施され得る。好ましい実施の形態において、例えば、本明細書に記載されるCTLは、他の治療法に適していない患者の処置に適用可能である。より具体的には、本発明の実施の形態は、以下の患者集団の処置に関する：
i) 多剤耐性を有する患者、
ii) 同種幹細胞移植に適していない患者、
iii) 更なる化学療法が除外される併存症を有する患者、
iv) 化学療法を許容しない老齢の患者、
v) 疾患進行後及び他の複数種類の標準療法が失敗した後であっても、CTLはサルベージ療法に適用可能である、
vi) 抗体が失敗し得る、標的腫瘍細胞上の抗原密度が低い場合であっても、CTLは適用可能である、及び／又は、
vii) CTLは、抗体が当てはまらない単独療法として適用可能である。

加えて、B細胞及び／又は形質細胞を特異的に標的とする能力は、自己免疫疾患の処置に非常に有効である。軽度の自己免疫疾患は、通常最初に非ステロイド性抗炎症薬（NSAID）又は疾患修飾性抗リウマチ薬（DMARD）で処置される。活動性疾患により臓器不全を伴う、より重度の全身性エリテマトーデス（SLE）は、通常、循環細胞を標的とする細胞毒性剤であるシクロホスファミド等の強い免疫抑制剤と併用してステロイドで処置される。

近年、CAR-T細胞は、自己抗体により媒介される疾患を処置する標的化されたアプローチとしても検討された（Ellebrecht et al. (2016) Science 353:179-184）。骨髄の生存適所に存在する長命の定着性形質細胞は、多くの場合、従来の免疫抑制薬及び細胞毒性薬並びにB細胞及びそれらの活性化を標的とする治療法に対する耐性を有する。この治療上の課題は、CAR-T細胞構築物、特にEBAG9阻害を有するものを用いることにより対処され得る。

したがって、さらに本発明は、自己免疫疾患を処置する際の薬剤として使用される本明細書に記載される遺伝子改変T細胞に関する。

したがって、更なる態様では、本発明は、自己抗体依存的な自己免疫疾患の処置において薬剤として使用される、本明細書に記載される遺伝子改変T細胞であって、抗原標的化トランスジェニック構築物により標的とされる抗原が、自己抗体の産生に関連する標的細胞で発現しており、好ましくは、医学的障害が全身性エリテマトーデス（SLE）又は関節リウマチである、遺伝子改変T細胞に関する。自己免疫関連疾患の更なる実施の形態は、以下に提供される。当業者は、本発明のT細胞の抗原標的化構築物に適切な標的抗原を選択することができる。自己抗体を産生する形質細胞を標的とするための1つの関連抗原は、BCMAである。

本明細書及び本明細書における実施例により提供される癌細胞を処置するための技術的指針は、自己免疫疾患の処置を可能にするためにも適用される。遺伝子操作されるT細胞の抗原特異的標的化構築物により標的とされるべき適切な抗原の選択により、自己反応性B細胞は効果的に標的とされ得る。遺伝子操作されたT細胞におけるEBAG9の発現は、最も関心対象となるものであり、EBAG9の発現／活性が低減／阻害されることにより、標的細胞におけるEBAG9発現にかかわらず、T細胞の細胞傷害性が増強される。したがって、任意の所与の標的細胞が、EBAG9阻害により増強された細胞傷害性を有する遺伝子操作されたT細胞により攻撃され得る。

改変T細胞に関する特徴、薬剤としてのそれらの使用、ベクター、医薬組成物、及びin vitroでの方法に関する、関連する実施の形態は、EBAG9が阻害されている、抗原特異的標的化構築物を含む改変細胞溶解性T細胞という新規のコンセプトにより統一される。改変T細胞の任意の一態様に関する本明細書において開示される特徴、薬剤としてのそれらの使用、ベクター、医薬組成物、及びin vitroでの方法に関する、関連する実施の形態は、細胞の特徴が、例えば、本明細書において開示される方法又は組成物を記載するためにも使用され得るように、逆もまた同様であるように、他の本発明の態様の文脈において開示されているとみなされる。

キメラ抗原受容体構築物及びCAR T細胞に関連する実施の形態
一実施の形態において、本発明は、以下を含むキメラ抗原受容体ポリペプチド（CAR）を含む、本明細書に記載されるCTLに関する：
標的抗原に結合する抗体又は抗体断片を含む細胞外抗原結合ドメインであって、上記抗体又は抗体断片が、単鎖抗体断片のVHドメイン及びVLドメインを含み、好ましくは、リンカーポリペプチドが、VHドメインとVLドメインとの間に配置されており、上記リンカーが、好ましくは抗体断片抗原相互作用に干渉しないように構成されている、細胞外抗原結合ドメイン；
細胞外抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に配置されたスペーサーポリペプチド（ヒンジとも称される）であって、上記スペーサーポリペプチドが、好ましくは抗体断片抗原相互作用に干渉しないように、及び／又は上記CARを発現するT細胞で該CARが発現している場合に、T細胞活性化に干渉しないように構成されている、スペーサーポリペプチド；
膜貫通ドメインであって、上記膜貫通ドメインが、好ましくは抗体断片抗原相互作用に干渉しないように、及び／又は上記CARを発現するT細胞で該CARが発現している場合に、T細胞活性化に干渉しないように構成されている、膜貫通ドメイン；
及び、細胞内ドメインであって、上記細胞内ドメインが、共刺激ドメイン及びシグナル伝達ドメインを含み、該細胞内ドメインが、好ましくは、標的抗原への結合に際して、シグナルを発生させて、例えば、サイトカイン産生を増加させること、及び／又はT細胞複製を促進することにより、T細胞活性化を刺激し、これにより、細胞傷害効果をもたらすように構成されている、細胞内ドメイン。

したがって、本発明のCARは、本明細書に記載される機能ドメインの各々について場合により異なるタンパク質配列を含む、様々なフォーマットを用い得る。当業者は、例えば、以下の実施例に示される実験手法に基づいて、CARの所望の機能を選択及び試験し得る。したがって、本明細書において検討される機能ドメインのいずれかにおける、本発明のCARで使用される任意の所与の特定のタンパク質配列の選択は、定型的な方法を使用して当業者により機能的有効性について評価され得る。例えば、VHドメインとVLドメインとの間に配置される様々なリンカーポリペプチド配列、細胞外抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に配置される様々なスペーサーポリペプチド配列（ヒンジとも称される）、様々な膜貫通ドメイン、並びに好ましくは共刺激及びシグナル伝達ドメインを含む様々な細胞内ドメインが、用いられ得る。様々な共刺激ドメインが直列で用いられてもよい（例えば、CD28+4-1BB）。

本発明の実施の形態において、本明細書において言及されるCAR及び各々の要素又はドメインは、抗体断片抗原相互作用を有害に干渉しないように、上記CARを発現するT細胞で該CARが発現している場合に、T細胞活性化を有害に干渉しないように、また標的への結合時にCARがシグナルを発生させて、T細胞活性化を刺激するのを有害に干渉しないように構成されている。好ましい実施の形態において、CARの要素は、EBAG9阻害及び付随する細胞溶解活性の増加に干渉しないように選択される。

CARの抗原結合ドメインに関する実施の形態
非限定的な例として、CARの抗原結合ドメインは、BCMA、CXCR5、又はCD19に対して指向され得る。他の実施の形態において、抗原結合断片は、悪性細胞の標的と考えられる任意の所与の所望の抗原に基づいて選択され得る。CXCR5及びBCMA CARについての幾つかの具体的な非限定的実施の形態が、以下に記載される。これらは本発明者らにより評価され、EBAG9阻害との組合せでT細胞に存在する場合に細胞溶解活性の増強を示すことが示された。

CXCR5特異的抗原結合ドメイン
一実施の形態において、本発明のCTLは、本明細書に記載されるCXCR5特異的キメラ抗原受容体（CAR）ポリペプチドを含み、ここで、抗原結合ドメインは、以下を含む：
配列番号7（GFTFSTSG）によるH-CDR1、
配列番号8（ISSSSGFV）によるH-CDR2、
配列番号9（ARSEAAF）によるH-CDR3、
配列番号10（KSRLSRMGITP）によるL-CDR1、
RMSを含むか、又はそれからなる配列によるL-CDR2、及び、
配列番号11（AQFLEYPPT）によるL-CDR3。

一実施の形態において、CXCR5特異的CARポリペプチドは、以下を含む：
配列番号12（EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTSGMNWFRQAPGKGLEWVSYISSSSGFVYADSVKGRFTISRDNAQNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSEAAFWGQGTLVTVSS）に対する少なくとも80%の配列同一性を有するVHドメイン、
又は配列番号13（EVQLVESGGGLVQPGKSLKLSCSASGFTFSTSGMHWFRQAPGKGLDWVAYISSSSGFVYADAVKGRFTISRDNAQNTLYLQLNSLKSEDTAIYYCARSEAAFWGQGTLVTVSS）に対する少なくとも80%の配列同一性を有するVHドメイン、
及び配列番号14（DIVLTQSPRSLPVTPGEPASISCRSSKSRLSRMGITPLNWYLQKPGQSPQLLIYRMSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISKVETEDVGVYYCAQFLEYPPTFGSGTKLEIK）に対する少なくとも80%の配列同一性を有するVLドメイン、
又は配列番号15（DIVLTQAPRSVSVTPGESASISCRSNKSRLSRMGITPLNWYLQKPGKSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSETDFTLKISKVETEDVGVYYCAQFLEYPPTFGSGTKLEIK）に対する少なくとも80%の配列同一性を有するVLドメイン。

BCMA特異的抗原結合ドメイン
一実施の形態において、本発明のCTLは、本明細書に記載されるBCMA特異的キメラ抗原受容体（CAR）ポリペプチドを含み、ここで、抗原結合ドメインは、以下を含む：
H-CDR1：GFTFSRYW（配列番号16）、
H-CDR2：INPSSSTI（配列番号17）、
H-CDR3：ASLYYDYGDAYDY（配列番号18）、
L-CDR1：QSVESN（配列番号19）、
L-CDR2：SAS、及び、
L-CDR3：QQYNNYPLT（配列番号20）、
又は抗原結合ドメインは、以下を含む：
H-CDR1：RYWFS（配列番号21）、
H-CDR2：EINPSSSTINYAPSLKDK（配列番号22）、
H-CDR3：SLYYDYGDAYDYW（配列番号23）、
L-CDR1：KASQSVESNVA（配列番号24）、
L-CDR2：SASLRFS（配列番号25）、及び、
L-CDR3：QQYNNYPLTFG（配列番号26）。

一実施の形態において、BCMA特異的CARポリペプチドは、
配列番号27（EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWFSWVRQAPGKGLVWVGEINPSSSTINYAPSLKDKFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASLYYDYGDAYDYWGQGTLVTVSS）に対する少なくとも80%の配列同一性を有するVHドメイン；
及び配列番号28（EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCKASQSVESNVAWYQQKPGQAPRALIYSASLRFSGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNYPLTFGAGTKLELK）に対する少なくとも80%の配列同一性を有するVLドメインを含む。

リンカー、スペーサー、膜貫通ドメイン、及びシグナル伝達ドメインに関する実施の形態
実施例において用いられる特定の非抗原特異的CARドメインについて、以下の幾つかの実施の形態が示される。

更なる実施の形態において、本発明は、1つ以上のリンカー、スペーサー、膜貫通ドメイン、及びシグナル伝達ドメインを含む、本明細書に記載されるキメラ抗原受容体（CAR）ポリペプチドを含むCTLに関する。

一実施の形態において、CARは、1つ又は2つの共刺激ドメイン及びシグナル伝達（活性化）ドメインを含む細胞内ドメインを含む。

一実施の形態において、CARは、VHドメインとVLドメインとの間に配置されたリンカーポリペプチドを有する細胞外抗原結合ドメインを含み、ここで、上記リンカーは、好ましくは以下から選択される：
Whitlow（配列番号29；GSTSGSGKPGSGEGSTKG）、又は、
Gly-Ser（配列番号30；SSGGGGSGGGGSGGGGS）リンカー、又は、
配列番号29若しくは30に対する少なくとも80%の配列同一性を有するリンカー。

一実施の形態において、CARは、細胞外抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に配置されたスペーサーポリペプチドを追加的に含み、ここで、上記スペーサーは、以下から選択される：
IgG1スペーサー（配列番号31；PAEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPK）、
IgG1Δスペーサー（配列番号32；PAEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSSLSPGKK）、
IgG4（Hi-CH2-CH3）スペーサー（配列番号33；ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK）、
IgG4（Hi-CH3）スペーサー（配列番号34；ESKYGPPCPPCPGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK）、
IgG4（Hi）スペーサー（配列番号35；ESKYGPPCPPCP）、又は、
配列番号31～35のいずれか1つに対する少なくとも80%の配列同一性を有するスペーサー。

一実施の形態において、膜貫通ドメインは、以下から選択される：
CD8αドメイン（配列番号36；IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC）、又は、
CD28ドメイン（配列番号37；FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV）、又は、
配列番号36又は37に対する少なくとも80%の配列同一性を有する膜貫通ドメイン。

一実施の形態において、細胞内ドメインは、以下を含む：
4-1BB共刺激ドメイン（配列番号38；KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL）、及び／又は、
CD28共刺激ドメイン（配列番号39；RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSL）、又は、
隣接して配置された4-1BB共刺激ドメイン（配列番号38）及びCD28共刺激ドメイン（配列番号39）の両方を含む共刺激ドメイン、又は、
配列番号38又は39に対する少なくとも80%の配列同一性を有する共刺激ドメイン、
から選択される共刺激ドメイン。

一実施の形態において、CARは、シグナル伝達ドメイン（別名、活性化ドメイン）を追加的に含み、ここで、上記シグナル伝達ドメインは、以下である：
CD3ζ（4-1BB又はCD28）シグナル伝達ドメイン（配列番号40；LRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR）、又は、
配列番号40に対する少なくとも80%の配列同一性を有するシグナル伝達ドメイン。

さらに本発明は、以下からなる群から選択される、好ましくはウイルスベクター又はトランスポゾンベクター等のベクター形態の、好ましくはγレトロウイルスベクター形態の、本発明のCTLに使用される（単離）核酸分子に関する：
a)
本明細書に記載されるCARの任意の実施の形態に記載のキメラ抗原受容体（CAR）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、若しくは、
好ましくは配列番号7～41に記載の、細胞外抗原結合ドメイン、リーダー、膜貫通ドメイン、スペーサー、リンカー、若しくは細胞内ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、若しくは、
リーダー、膜貫通ドメイン、スペーサー、リンカー、若しくは細胞内ドメインをコードし、核酸配列が配列番号43～54のうちの1つ以上を含むか、又はそれからなる、ヌクレオチド配列を含む核酸分子；
b) a）によるヌクレオチド配列に相補的な核酸分子；
c) a）若しくはb）によるヌクレオチド配列に対する少なくとも80%の配列同一性、a）若しくはb）によるヌクレオチド配列に対する好ましくは90%若しくは95%の配列同一性を含む、a）若しくはb）によるヌクレオチド配列と機能的に類似する／同等であるのに十分な配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、機能的類似性が、CAR構築物を形成することに関連し、対応するT細胞が上記構築物を発現する場合に、CAR-T細胞の産生物がT細胞に細胞傷害活性を付与する、核酸分子；及び／又は、
d) 遺伝暗号のために、a）～c）によるヌクレオチド配列と縮重する核酸分子。

シグナル伝達ドメインの交換は、強力かつ急速なエフェクター相（CD28共刺激ドメイン）又はT記憶細胞集団により確保される持続性の再発制御（4-1BBシグナル伝達ドメイン）のいずれかの要望を満たす。様々なシグナル伝達ドメインを複数の構成と交換することができ、これにより、有利な結合特性を喪失することなく、設計に柔軟性を有するCARが提供される。

好ましい実施の形態において、MP71ベクター及びγ-レトロウイルス発現系と組み合わせて、ヒトT細胞での著しく高い形質導入率が達成され得る。形質導入系は、TCR又はCAR構築物のモジュール設計のために可変的であり、このことは、本発明を実行する際の必要性及び当業者の選択に応じて、レンチウイルス及びトランスポゾンが用いられ得ることを意味する。TCR、CAR、及びEBAG9阻害のための遺伝子情報／核酸分子の導入としては、CRISPR/Cas及びTALENにより媒介されるCTLへの挿入も挙げられる。

TCR、CAR、及びEBAG9阻害のために遺伝子情報／核酸分子を、該CARを発現する細胞に導入するのに好適な全ての方法が本発明により包含され、好適な方法は、本発明を実行する際に、当業者により選択され得る。例えば、任意の所与のウイルスベースの遺伝子導入方法、例えば、改変レトロウイルス科に基づくもの、及びウイルスを用いない方法、例えば、DNA型トランスポゾン、エピソーマルcDNAベクター、及びエレクトロポレーションによるmRNAの直接導入が含まれる、T細胞を形質転換する複数の方法が、当該技術分野において既知である。

加えて、CAR構築物のシグナル伝達構成要素は、モジュール構成及び当業者による臨床応用可能なCARのテーラーメイド構築を可能にする、単純な3工程のクローニング手順で交換され得る。

本発明の更なる態様は、本明細書に記載される核酸分子を含むベクター、好ましくはウイルスベクター、より好ましくはγレトロウイルスベクターに関する。本発明の他の態様において、本発明は、本発明のTCR、CAR、及び／又はEBAG9阻害をコードし、好ましくは発現することができるトランスポゾンベクター、好ましくはsleeping beautyベクターに関する。

好ましい実施の形態において、本明細書に記載される疾患の処置において投与することを目的とするCTLは、「Sleeping beauty」トランスポゾンシステム、特にsleeping beautyトランスポサーゼを使用して、本明細書に記載されるTCR、CAR、及びEBAG9サイレンシング分子、例えば、miRNAをコード及び発現する核酸で、本明細書に記載されるように遺伝子改変されている。Sleeping Beautyトランスポゾンシステムは、本発明の文脈では、脊椎動物の染色体に既定のDNA配列を正確に導入するように設計されている、本明細書に記載されるCAR又はTCRを発現するように免疫細胞を改変するための、合成DNAトランスポゾンである。sleeping beautyトランスポゾンは、ウイルス及び裸のDNAの利点を併せ持つ。ウイルスは、それらの感染能力及び新規な宿主細胞での複製能力に基づいて進化的に選択されてきた。同時に細胞は、ウイルス感染からそれ自身を保護するために主要な分子防御機構を発達させてきた。ウイルスの使用を回避することは、社会的理由及び規制的理由としても重要である。したがって、sleeping beautyシステム等の非ウイルスベクターの使用により、細胞がベクターに対して用いる防御の全てではないがその多くが回避される。この理由のために、sleeping beautyシステムは、患者に投与する免疫細胞の特に効果的かつ安全な遺伝子改変を可能にする。

表Ａ
本発明の好ましいアミノ酸配列及びヌクレオチド配列：
配列番号配列説明
H17 EBAG9標的化配列1
H18 EBAG9標的化配列2
EBAG9転写物バリアント1
EBAG9転写物バリアント2
EBAG9転写物バリアント3
EBAG9転写物バリアントX1
CXCR5 ヒト化VH
CXCR5 ラットVH
CXCR5 ヒト化VL
CXCR5 ラットVL
Whitlowリンカー
Gly-Serリンカー
IgG1スペーサー
IgG1Δスペーサー
IgG4 (HI-CH2-CH3)スペーサー
IgG4 (HI-CH3)スペーサー
IgG4 (HI)スペーサー
膜貫通ドメインCD8α
膜貫通ドメインCD28
共刺激ドメイン4-1BB
共刺激ドメインCD28
活性化ドメインCD3ζ（4-1BB）又は（CD28）
Lκリーダー
ヒト化Whitlow
ラットWhitlow
ヒト化IgG1スペーサー
ラットIgG1スペーサー
ヒト化IgG1Δスペーサー
ラットIgG1Δスペーサー
膜貫通ドメインCD8α
膜貫通ドメインCD28
共刺激ドメイン4-1BB
共刺激ドメインCD28
活性化ドメインCD3ζ（4-1BB）
活性化ドメインCD3ζ（CD28）
EBAG9標的化配列3
EBAG9標的化配列4
EBAG9標的化配列5
EBAG9標的化配列6
EBAG9標的化配列7
EBAG9標的化配列8
EBAG9標的化配列9
EBAG9標的化配列10

EBAG9を標的とするmiRNA及びGFPをコードするレトロウイルスMP71の作製の図である。異なるEBAG9を標的とするmiRNAをコードするレトロウイルスベクターでの形質導入後のJurkat細胞におけるヒトEBAG9発現の減少の図である。 in vitro機能アッセイ前のヒト一次T細胞のレトロウイルス形質導入の実験タイムラインの図である。 EBAG9下方調節が、活性化ヒトCD8+T細胞からのグランザイムAの抗原非依存的な放出を促進することを示す図である。 MP71ベクターは、EBAG9を標的とするmiRNA及びCARの同時発現に好適であることを示す図である。形質導入されたヒト一次T細胞におけるBCMA及びCD19 CAR発現の図である。同上 BCMA CAR T細胞の抗原特異的細胞溶解活性は、EBAG9の下方調節により増加し得ることを示す図である。 EBAG9のサイレンシングによるCAR T細胞の細胞溶解活性の増加は、普遍的に適用可能な細胞生物学的メカニズムであることを示す図である。サイレンシングされたEBAG9を有するin vivoで遺伝子操作されたBCMA CAR T細胞は、より効率的に多発性骨髄腫細胞を根絶することを示す図である。同上 CRISPRにより媒介されるEBAG9ノックアウトの標的部位の有効性検証の図である。

引用される全ての文書及び米国のそれらの対応物は、引用することにより本明細書の一部をなす。

本発明は、遺伝子操作されたT細胞であって、EBAG機能を阻害し、これにより、細胞の細胞溶解活性を増強することにより改変された、遺伝子操作されたT細胞に関する。TCR-T細胞又はCARを備えたT細胞のいずれかの機能的結合活性の増強は、より高い細胞溶解能力をもたらし、これにより、腫瘍に対するより高い有効性をもたらすであろう。本明細書に記載される通り、より高い細胞溶解能力を賦与された改変T細胞（遺伝子操作されたT細胞）と関連付けられる特異的な利点が存在する。

多くの場合、腫瘍患者は、以前に数種類の治療レジメンを受けており、これにより、強い骨髄抑制並びにそれに続く、ex vivo培養及び形質導入の出発物質としての末梢リンパ球の非能率的な動員を引き起こしている。このプロセスは自家移植と称される。単一細胞ベースでは遺伝子操作されたT細胞がはるかに強く機能するため、少数のT細胞に増強された細胞溶解能力を付与することは、量に関する問題を回避するのに役立つ。換言すれば、T細胞の遺伝子操作は、製造プロセスを改善し、容易にする。

製造プロセスの別の側面は、ex vivo増殖段階の期間である。T細胞がより高い細胞溶解能力を賦与されるのであれば、in vitro増殖はより早く終了され得て、これにより、製造コストの低減、治療法のより早期の利用、及びより未分化なT細胞集団がもたらされる。in vitro培養物由来のT細胞の分化状態がより進んでいると、in vivoでのそれらの持続がより短くなるため、後者の側面は重要である。

同種骨髄移植では、重大なリスク因子は、移植片対宿主病（GvHD）の発症である。この疾患又は症候群は、移植されるT細胞の数と強く相関する。T細胞に改善された細胞溶解能力を賦与することにより、多数のT細胞の必要性が軽減され、したがって、少数の遺伝子操作されたT細胞が、GvHDを媒介することなく同じ治療効果を与える。

遺伝子操作されたT細胞の活性化及びエフェクター機能のための閾値レベルは低い。その結果として、新生抗原、自己抗原、及び非主要組織適合抗原が含まれる弱い腫瘍抗原、並びに提示される少数の抗原でさえ、TCRのみを保有する遺伝子操作されたT細胞、又はCARを備えたもののいずれかからのエフェクター分子放出を既に引き起こすことができる。

腫瘍再発を防止するために、1回目の腫瘍根絶後に記憶T細胞を発生させることは大いに有利である。しかしながら、腫瘍細胞の一部はT細胞の攻撃を回避し得て、結局その後に増殖し始める。しかしながら、本発明者らは、細胞溶解能力が抗原特異的記憶T細胞の形成と相関することを示した。炎症状態を引き起こすために有害であり得るより多くのサイトカインの放出を引き起こさないATTの改善された抗腫瘍効果。

上記を考慮すると、本発明者らは、以下でより詳細に記載される、EBAG9阻害に基づいてT細胞の細胞溶解活性を改善する新規の手段を示した。以下の用語及び定義は、明確性を高めるために提供される。特に定義されない限り、全ての用語は、当業者により理解されるそれらの一般的な意味を保持する。

細胞傷害性T細胞及び細胞溶解活性
細胞傷害性T細胞（TC、細胞傷害性Tリンパ球、CTL、Tキラー細胞、細胞溶解性T細胞、T細胞、又はキラーT細胞としても既知であり、本明細書において互換的に使用され得る）は、例えば、癌細胞に対する細胞溶解活性を有するT細胞（一種の白血球）である。幾つかの実施形態において、細胞溶解活性は、CD8+及び／又はCD4+T細胞に関連し得る。両方のT細胞亜集団が、グランザイム等の細胞溶解性酵素である溶解性顆粒成分を生成及び放出することができる。

用語「細胞溶解性」は、溶解性顆粒成分の放出により標的細胞を殺傷するT細胞の能力を指し、溶解性顆粒成分は分泌型リソソームとも称される。

適応免疫応答の中心的要素として、T細胞は、感染及び形質転換した腫瘍細胞を除去することができる。CD8⁺T細胞は細胞傷害性Tリンパ球（CTL）に成熟し得て、細胞溶解性顆粒を免疫シナプスに放出することによる感染細胞又は形質転換細胞の破壊に主に関与する。これらの顆粒は、Ca²⁺依存的調節性分泌経路で放出され、標的細胞内でアポトーシスを引き起こすパーフォリン及びグランザイムを含む。

CTLがその標的細胞を認識し、それに結合するとすぐに、分泌型リソソームが微小管形成中心の周辺に移動し、密集する。膜融合後に、パーフォリン及びグランザイムが免疫シナプスに放出される。パーフォリンは、標的細胞の細胞質ゾルへのグランザイムの侵入に重要である膜の透過化が可能な膜孔形成分子である。グランザイムにより標的細胞内でプログラム細胞死経路が開始される。一部の活性化条件下では、CAR受容体を備えたCD4+T細胞も同様にグランザイム放出による細胞溶解特性を得ることができる。したがって、それらは、CD8+細胞溶解性T細胞と同様にEBAG9のサイレンシングにより操作され得る。

グランザイムAは、一本鎖DNAニックの生成を特徴とするカスパーゼ非依存的アポトーシスを引き起こす。グランザイムAの作用により、活性酸素種（ROS）の放出をもたらすミトコンドリア内膜電位の喪失が起きる。結果として、一本鎖DNAニックが引き起こされる。これに対してグランザイムBは、カスパーゼ非依存的細胞死プログラムを活性化させることに加えて、カスパーゼ3、7、8、及び10並びにそれらの下流の基質の幾つかを切断及び活性化させることによりカスパーゼ依存的アポトーシスを引き起こすことができる。さらに、グランザイムBは、ROS生成及びミトコンドリアからのチトクロームcの放出を引き起こす。

EBAG9及びエフェクター分子の調節性分泌におけるその役割
トランスゴルジネットワーク（TGN）から分泌型リソソームへのタンパク質移送は、高度に調節されている。本発明者らは、エフェクター分子のCa²⁺依存的調節性分泌の負の調節因子であるエストロゲン受容体結合断片関連抗原9（EBAG9）等の調節タンパク質の存在を実証した。

ヒトEBAG9は、213アミノ酸を含み、ドメイン構造を示す。C末端コイルドコイル構造により、ヒトEBAG9は、N末端に位置する膜貫通ドメインと共にホモオリゴマーを形成する。EBAG9は、ほとんどの組織で発現しているエストロゲン誘導性タンパク質である。

本発明者らは、EBAG9の欠失が、CD8⁺T細胞からのグランザイムAを含有する分泌型リソソームの放出を促進することによりin vivoでのCTLの細胞溶解活性を増強することを実証した。

メカニズム的には、EBAG9は、AP-1のγ2-サブユニットと相互作用し、AP-1の活性であるクラスリン被覆小胞形成を阻害する。さらにEBAG9は、リソソーム関連オルガネラ複合体-1（BLOC-1）のサブユニットであるsnapin及びBLOS2の相互作用パートナーとしても同定された。分泌経路において、BLOC-1は、エンドソームから分泌型リソソームへのタンパク質ソーティングを調節する。したがって、EBAG9は、TGNから分泌型リソソームへの小胞の移送を負に調節し、養子移入されるT細胞の細胞溶解活性を増加させるための魅力的な標的である。

EBAG9により課される輸送調節の正味効果は、タンパク質分解酵素の前駆型を含有する運搬体の輸送及び融合プロセスを含む分泌型リソソーム成熟の阻害である。あるいは、分泌された溶解性顆粒成分の再取り込みがEBAG9により阻害され得て、再利用される細胞溶解活性のあるグランザイムの利用能の低下がもたらされる。

EBAG9は、エストロゲン応答遺伝子として同定された。エストロゲンによる転写の調節は、この遺伝子の5’側隣接領域に見出されるエストロゲン応答配列に結合するエストロゲン受容体により媒介される。コードされるタンパク質は、種々の癌において高頻度で発現している腫瘍関連抗原である。選択的スプライシングにより複数の転写物バリアントがもたらされる。この遺伝子の偽遺伝子は、第10染色体上に定めされた。

幾つかの実施形態において、本発明は、好ましくは、NCBIデータベースの遺伝子番号：9166によるホモ・サピエンス（Homo sapiens）（ヒト）のエストロゲン受容体結合部位関連抗原9（EBAG9）に関する。この遺伝子は第8染色体上に位置する。EBAG9は、EB9又はPDAFとしても既知であり得る。

したがって、RNAiを使用してEBAG9を阻害するために、配列番号3～6による転写物バリアントが標的とされ得る。当業者は、関心対象の標的配列に基づいて適切な手段、すなわちアンチセンス、siRNA、miRNA、又はshRNAを設計することができる。例示的なEBAG9転写物は、限定されるものではないが、NM_004215.5（EBAG9）、転写物バリアント1、mRNA、配列番号3；NM_198120.2（EBAG9）、転写物バリアント2、mRNA、配列番号4；NM_001278938.1（EBAG9）、転写物バリアント3、mRNA、配列番号5；XM_017013960.1（EBAG9）、転写物バリアントX1、mRNA、配列番号6から選択される。

EBAG9阻害を評価する好ましい方法は、本明細書において開示されるものに関連し、例えば、CD8⁺T細胞からのグランザイムAを含有する分泌型リソソームの放出を定量的又は半定量的に評価することにより、in vivo又はin vitroのいずれかでCTLの細胞溶解活性を評価する方法が挙げられる。本出願のin vitroでの実施例において適用されるように、適切なプロトコルが以下に開示される。

RNA干渉（RNAi）
RNAiは、二本鎖RNA（dsRNA）により引き起こされ、配列特異的翻訳抑制又はmRNA分解を引き起こす転写後遺伝子サイレンシングメカニズムである。歴史的にRNAiは、共抑制、転写後遺伝子サイレンシング（PTGS）、及びクエリングが含まれる他の名称で知られていた。

マイクロRNA（miRNA）遺伝子は、核内でRNAポリメラーゼIIの作用により500～3000ヌクレオチドのプリmiRNAに転写される。これらのプリmiRNAはキャッピング及びポリアデニル化される。加えて、プリmiRNAは、1つ又は複数のステムループ配列を含有し、Drosha-DGCR8複合体により60～100ヌクレオチドの二本鎖プレmiRNAヘアピン構造に切断される。Ran GTPアーゼ及びExportin-5は、核から細胞質へのプレmiRNAの輸出を媒介する。そこで、それらはDicerと称されるRNアーゼIII酵素により22ヌクレオチドの不完全な二重鎖構造に更にプロセシングされる。鎖の一方は、アルゴノート（Ago）タンパク質に結合し、RNA誘導サイレンシング複合体（RISC）に組み込まれる成熟miRNAに似ている。RISCの結合の結果として、mRNA分解又はタンパク質翻訳の抑制が引き起こされる。標的mRNA分子の運命は、標的mRNA分子とmiRNAとの間の相補性の程度次第であるが、組み込まれたAgoタンパク質によっても影響を受ける。Ago 2の組み込みが標的mRNAの直接的な切断をもたらす一方で、他のAgoタンパク質は、mRNA安定性に悪影響を与えるか、又は翻訳を減弱する。

特定の標的の遺伝子操作によるノックダウンでは、RNAi経路に異なる段階で参加する幾つかのdsRNA分子が使用され得る。細胞質ゾルでRNAi経路に参加する低分子干渉RNA（siRNA）分子での形質移入は、一過性のタンパク質ノックダウンをもたらすのみである。遺伝子発現の長期的操作のためには、遺伝子導入ベクターを組み込むことによりdsRNA分子を送達することが必要である。したがって、短鎖ヘアピンRNA（shRNA）又はmiRNA分子が適用され得る。

両方とも核内でRNAi経路に参加し、次いで、siRNA様分子にプロセシングされる。shRNAはプレmiRNAのステムループ構造を模倣する。それらの発現は、高レベルの発現及び安定した遺伝子ノックダウンをもたらす強力なRNAポリメラーゼIIIプロモーターにより駆動される。しかしながら、shRNAの過剰発現は、miRNAプロセシング経路の飽和による毒性を媒介することが示された。

他の選択肢は、一次T細胞内での安定したノックダウンを媒介するための人工miRNAの適用である。これらの人工miRNAはプリmiRNAに類似しており、したがって、自然なmiRNA生物学の模倣に向けた更なる一歩である。これは、臨床適用の選択肢として幾つかの利点を有する。最も重要なことに、内因性のmiRNAプロセシング機構の使用は、インターフェロン誘導等の細胞の自己防御メカニズムを作動させない。

加えて、人工miRNAは、ほとんどの天然miRNAと同様にRNAポリメラーゼIIプロモーターにより転写される。これらのプロモーターは、調節性のかつ組織特異的な発現を媒介し、さらに選択用導入遺伝子又は治療用導入遺伝子の同時発現を可能にする。さらに、同一又は異なるmRNAの領域を標的とする複数のmiRNAを1つの発現カセットに組み込むことが可能であり、これにより、標的の下方調節の相加効果が得られる。かかる標的の下方調節は、本明細書において、例えば、ノックダウン、サイレンシング、又はRNA干渉と称される。

CRISPR技術
幾つかの実施形態において、EBAG9の阻害は、CRISPRによりEBAG9遺伝子の発現を妨げる及び／又はその配列を破壊することによるT細胞ゲノムの遺伝子改変を含む。本発明の更なる実施形態において、CAR又はTCRをコードする核酸のCRISPRにより媒介される挿入が用いられ得る。

CRISPRは、クラスター化された、規則的に間隔が空いた短い回文構造リピート（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）の略語であり、細菌のDNA配列のファミリーである。この配列は、細菌を攻撃したウイルス由来のDNA断片を含有する。これらの断片は、類似するウイルスによる更なる攻撃からDNAを検出し、破壊するために細菌により使用される。これらの配列は、細菌の防御システムにおいて重要な役割を果たし、生物内で遺伝子を効果的かつ特異的に変化させるCRISPR/Casとして既知の技術の基盤を形成する。

CRISPR遺伝子座の配列は、転写され、CRISPR RNA（crRNA）にプロセシングされ、これはトランス活性化crRNA（tracrRNA）と共にCRISPR関連（Cas）タンパク質と複合体を形成して、核酸間のワトソン・クリック型塩基対によりCasヌクレアーゼによるDNA切断の特異性を決定する（Wiedenheft, B et al (2012). Nature 482: 331-338、Horvath, P et al (2010). Science 327: 167-170、Fineran, PC et a. (2012). Virology 434: 202-209）。

II型CRISPRヌクレアーゼシステムに必要とされる3つの構成要素がCas9タンパク質、成熟crRNA、及びtracrRNAであり、これらはcrRNA及びtracrRNAの単一のガイドRNA（sgRNA）への融合により2つの構成要素に減少され得ること、及びgRNAの短い一部の配列を変化させることによりCas9/sgRNA複合体の新たな部位への再標的化が達成され得ることが示された（Garneau, JE et al (2010). Nature 468: 67-71、Deltcheva, E et al. (2011). Nature 471: 602-607, Jinek, M et al (2012) Science 337: 816-821）。

CRISPR-Casシステムは、ウイルス又は他の侵入してくる遺伝物質に対する配列特異的耐性を提供する、細菌及び古細菌のRNA誘導型適応免疫系である。この免疫様反応は、標的認識及び侵入してくる核酸の切断を担うエフェクターモジュールの構造に基づいて2つのクラスに分類された（Makarova KS et al. Nat Rev Microbiol. 2015 Nov; 13(11):722-36）。クラス1は多サブユニットのCasタンパク質エフェクターを含み、クラス2は単一の大きなエフェクタータンパク質からなる。クラス1及び2の両方が、CRISPR RNA（crRNA）を使用して、Casヌクレアーゼ構成要素をその標的部位へ導き、そこでCasヌクレアーゼ構成要素が侵入している核酸を切断する。その単純性のために、クラス2 CRISPR-Casシステムが最も研究されており、ゲノム編集に広く適用されている。最も広く使用されているCRISPR-Casシステムは、CRISPR-Cas9である。CRISPR/Cas9システムは、哺乳動物細胞における効果的な遺伝子改変のために遺伝子操作され得ることが実証された。

本発明の幾つかの実施形態において、RNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼが用いられる。本発明の文脈において、用語「RNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼ」は、少なくとも1種のRNA分子と相互作用するDNAエンドヌクレアーゼを指す。DNAエンドヌクレアーゼは、DNAポリヌクレオチド鎖内のホスホジエステル結合を切断する酵素である。RNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼの場合には、相互作用するRNA分子が、エンドヌクレアーゼが活性になるDNAの部位又は位置にRNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼを誘導し得る。特に、RNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼという用語は、天然に存在するか、又は遺伝子改変されたCasヌクレアーゼ構成要素又はCRISPR-Casシステムを指し、これには、限定されるものではないが、クラス1 CRISPR-Casシステムの多サブユニットのCasタンパク質エフェクター及びクラス2システムの単一の大きなエフェクターCasタンパク質が挙げられる。

CRISPR/Casシステムの技術的応用の詳細及び好適なRNA誘導型エンドヌクレアーゼは当業者に既知であり、例えば、Barrangou R et al.（Nat Biotechnol. 2016 Sep 8;34(9):933-941）、Maeder ML et al.（Mol Ther. 2016 Mar;24(3):430-46）、及びCebrian-Serrano A et al.（Mamm Genome. 2017; 28(7): 247-261）のような文献において詳述されている。本発明は、特定のRNA誘導型エンドヌクレアーゼの使用に限定されず、したがって、本明細書に記載される方法に使用するのに好適な本発明における任意の所与のRNA誘導型エンドヌクレアーゼの使用を含む。

当該技術分野において既知の任意のRNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼが、本発明に従って用いられ得る。RNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼとしては、限定されるものではないが、クラス1 CRISPR-CasシステムのCasタンパク質、例えば、Cas3、Cas8a、Cas5、Cas8b、Cas8c、Cas10d、Cse1、Cse2、Csy1、Csy2、Csy3、GSU0054、Cas10、Csm2、Cmr5、Csx11、Csx10、及びCsf1；クラス2 CRISPR-CasシステムのCasタンパク質、例えば、Cas9、Csn2、Cas4、Cpf1、C2c1、C2c3、及びC2c2；様々な細菌種及び古細菌種由来の対応するオルソロガス酵素/CRISPRエフェクター；例えば、新規のPAM特異性、増加した忠実度（例えば、SpCas9-HF1/eSpCas9）、又は改変された機能（例えば、ニッカーゼ）を有する遺伝子操作されたCRISPRエフェクターが挙げられる。本発明の特に好ましいRNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼは、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）のCas9（SpCas9）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）のCas9、サーモフィラス菌（Streptococcus thermophilus）のCas9、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）のCas9（NmCas9）、フランシセラ・ノビシダ菌（Francisella novicida）のCas9（FnCas9）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）のCas9（CjCas9）、Cas12a（Cpf1）、及びCas13a（C2C2）である（Makarova KS et al. (November 2015). Nature Reviews Microbiology. 13 (11): 722-36）。

本明細書において提供される定義及び説明は、SpCas9 Crispr/Casシステムに主に重点を置いている。しかしながら、当業者は、代替的なCrispr/Casシステムを使用する方法並びにかかる代替的なシステムの詳細に関する情報を提供するか、又はその取得を可能にするツール及び方法を知っている。

本発明の方法によれば、RNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼは、タンパク質として導入され得るが、代替的に、RNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼは、該タンパク質をコードする核酸分子の形態でも導入されてもよい。この核酸分子は、細胞における発現がCas9タンパク質等の機能的なRNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼタンパク質をもたらすように、発現可能な形態で該RNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼをコードすることが理解されよう。機能的なポリペプチドの発現を確実にする手段及び方法は、当該技術分野においてよく知られている。例えば、エンドヌクレアーゼのコード配列は、ベクター、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、又は例えば、遺伝子操作で通常使用される別のベクターに含まれ得る。

さらに、本発明の方法は、少なくとも1種のガイドRNAを細胞に導入することを含む。本発明の文脈において、「ガイドRNA」は、RNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼと相互作用し、これにより、RNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼにより切断される標的配列の認識をもたらすRNA分子を指す。したがって、本発明では、用語「ガイドRNA」は、限定されるものではないが、標的配列特異的CRISPR RNA（crRNA）、トランス活性化crRNA（tracrRNA）、及びキメラ単鎖ガイドRNA（sgRNA）を包含する。

本明細書に記載されるように、例えば、Cas9、tracrRNA、及びcrRNA等のCRISPR/Casシステムの要素をコードする遺伝子は、通常、オペロン（複数の場合もある）に組織化される。他の細菌種のCas9タンパク質等のRNA誘導型エンドヌクレアーゼと共に機能するDR配列は、それぞれのCrispr/Casオペロンに出現する反復配列のバイオインフォマティクス解析により、並びに標的配列と隣接する推定DR配列と組み合わせたCas9タンパク質及びtracrRNAの実験による結合研究により同定され得る。

幾つかの実施形態において、このような標的配列特異的crRNA及びtracrRNAを含むキメラ単鎖ガイドRNA配列が用いられ得る。このようなキメラ（ch）RNAは、Jinekら（Science 337:816-821）により示されるように、DR配列（crRNAの一部として定義される）の一部又は全体を有する20ヌクレオチド（nt）以上の標的特異的配列のtracrRNAの全体又は一部との融合により設計され得る。キメラRNA内のDR及びtracrRNA配列のセグメントは、相補的にハイブリダイズすることができ、ヘアピン構造を形成することができる。

さらに、本発明の少なくとも1種のガイドRNAは、細胞に導入される核酸分子によりコードされてもよい。エンドヌクレアーゼをコードする核酸分子に関して本明細書において述べられる定義及び好ましい実施形態は、これらのRNAをコードする核酸分子にも適用される。RNAを発現させるための調節エレメント、例えば、U6プロモーターは、当業者に既知である。

細胞療法又は養子細胞移植（ATT）
IL-2療法の発見は、Tリンパ球を患者から抽出することができ、in vitroで増やすことができ、癌治療として再投与することができるという仮説を産み出した。これは1988年にヒトで達成され、研究者らは、腫瘍浸潤性リンパ球の増殖系列を使用して、転移性黒色腫を有する患者における退縮をもたらした。ATTは、腫瘍検体を切除し、それを単細胞の懸濁液に消化することによりなされる。これらの手法の開発において、TCR及びキメラ抗原受容体（CAR）アプローチという2つの新たなATTの方法が浮上し、現在これらは両方とも確立されている。

TCR療法では、通常、正常な循環T細胞が患者の血液から単離され、レトロウイルスベクター又はトランスポゾンでの形質移入により腫瘍抗原に対するTCRを発現するように遺伝子改変される。特異的TCRは、関心対象のTAAに対して免疫されたヒト患者又はマウスから集められる。TCR療法の制約は、細胞傷害性を得るための組換えTCRがMHC認識に依然として依存することである。キメラ抗原受容体技術は、この問題を回避するために開発され、2010年に導入された。この方法でも、ウイルスベクターによる形質移入を利用するが、膜上に発現され、細胞内シグナル伝達ドメインに連結している抗体可変領域をT細胞に導入する。以下でより詳細に記載されるように、CD3ζに連結された最初のCAR及び方法は、共刺激受容体、例えば、CD28、OX40等を含むように後に改善された。

外来性核酸
「外来性核酸」、「外来性遺伝的エレメント」、又は「トランスジェニック」核酸若しくは構築物は、細胞「元の」若しくは「天然」ゲノムの構成要素又は非改変T細胞において「自然に」見出される核酸のプールでない、細胞に導入される任意の核酸に関する。外来性核酸は、標的T細胞の遺伝物質に組み込まれても、組み込まれなくてもよく、又は外来性核酸は、安定的に形質導入された核酸に関する。外来性核酸の送達は、元の細胞における外来性核酸分子の永続的な組込みにより元の細胞の遺伝子改変をもたらし得る。しかしながら、外来性核酸の送達は、1つ以上のTFの提供のために送達された遺伝物質が一定時間後に細胞から消失することを意味する一過性であってもよい。核酸分子の送達及び場合により、生体細胞（すなわちT細胞）の遺伝子改変は、一般に利用可能な技術を使用して当業者により実行及び判定され得る。例えば、遺伝子改変を検出するために、細胞のゲノム又はその一部を配列決定し、これにより、外来性核酸が存在する場合に同定することが可能である。あるいは、外来性遺伝物質を同定／増幅するための他の分子生物学的技術、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）が適用され得る。外来性核酸は、ベクター配列又はベクター配列の一部、例えば、遺伝子改変部位に残存するものにより検出され得る。ベクター配列（例えば、治療用導入遺伝子に隣接するベクター配列）がゲノムから除去され得るか、又は例えば、CRISPR技術により改変後に残らない場合であっても、配列決定を試みることにより、ゲノムの「非天然」位置に外来性配列を含む配列を検出することによって導入遺伝子の付加が検出され得る。

本発明の実施形態は、抗原標的化トランスジェニック構築物をコードする1種以上の外来性核酸分子を含む遺伝子改変細胞傷害性T細胞に関する。本発明の実施形態において、外来性核酸は、例えば、未改変のヒトゲノム配列との比較に基づいて、T細胞において天然に見出されない核酸配列を表す。本発明の実施形態において、抗原標的化トランスジェニック構築物は、例えば、未改変のヒトゲノム配列との比較に基づいて、コード配列がT細胞において天然に見出されない抗原標的化構築物をコードする核酸配列である。幾つかの実施形態において、この配列は、ゲノムの「非天然位置」に存在する。幾つかの実施形態において、標的化構築物は、非天然配列、すなわち、組換え技術又は他の分子生物学的技術を使用して設計及び作製された合成配列を含むか、又はそれからなる。本発明によれば、EBAG9活性は、（対照の細胞傷害性T細胞と比較して）阻害される。幾つかの実施形態において、外来性核酸配列が存在することは、EBAG9阻害を更に示すためのEBAG9の機能的評価により補足され得る。

抗原標的化構築物
本明細書において使用する場合、用語「抗原標的化構築物」又は「標的化構築物」は、T細胞を特定の抗原又は抗原群に対して指向させることができる、（外来性核酸分子によりコードされる）トランスジェニック分子を指す。したがって、抗原標的構築物は、好ましくはキメラ抗原受容体（CAR）又はT細胞受容体（TCR）である。遺伝子操作されたT細胞は、精密癌治療における新たな段階として出現した。好ましくは自家T細胞又はドナーT細胞上でのこれらの抗原標的化分子の強制発現により、それらは、特異的な腫瘍抗原の認識をもたらし、治療特異性及び有効性を増強する。

キメラ抗原受容体
本発明によれば、キメラ抗原受容体ポリペプチド（CAR）は、標的抗原に結合する抗体又は抗体断片を含む細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む。CARは、通常、抗体に由来する細胞外エクトドメイン（extracellular ectodomain）（抗原結合ドメイン）及びT細胞のシグナル伝達タンパク質に由来するシグナル伝達モジュールを含むエンドドメインを含むと記載される。

好ましい一実施形態において、エクトドメインは、好ましくは、単鎖可変断片（scFv）として構成される免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖からできた可変領域を含む。そのscFvは、好ましくは、柔軟性を与え、かつアンカー型膜貫通部を通じて細胞内シグナル伝達ドメインへとシグナルを伝達するヒンジ領域に結合される。該膜貫通ドメインは、好ましくはCD8α又はCD28に由来する。第一世代のCARにおいては、シグナル伝達ドメインは、TCR複合体のゼータ鎖からなる。用語「世代」とは、細胞内シグナル伝達ドメインの構造に対するものである。第二世代のCARは、CD28又は4-1BBに由来する単一の共刺激ドメインを備えている。第三世代のCARは、既に2個の共刺激ドメイン、例えばCD28、4-1BB、ICOS又はOX40、CD3ζを含む。本発明は、好ましくは第二世代のCAR又は第三世代のCARに関する。

様々な実施形態において、免疫エフェクター細胞の細胞傷害性をB細胞に再方向付け（redirect：リダイレクト）する遺伝子操作された受容体が提供される。これらの遺伝子操作された受容体を、本明細書においてはキメラ抗原受容体（CAR）と呼称した。CARは、所望の抗原についての抗体に基づく特異性と、T細胞受容体活性化細胞内ドメインとを兼ね備える分子であり、抗原特異的細胞免疫活性を示すキメラタンパク質が生成される。本明細書において使用する場合、用語「キメラ」は、異なる起源からの異なるタンパク質又はDNAの部分から構成されることを説明している。

本明細書において検討されるCARは、標的抗原、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメイン、又は細胞内シグナル伝達ドメインに結合する細胞外ドメイン（結合ドメイン又は抗原結合ドメインとも呼ばれる）を含む。CARの抗原結合ドメインが、標的細胞の表面上で嵌り合うことで、CARのクラスター形成がもたらされ、CARを含む細胞に活性化刺激が伝えられる。CARの主要な特性は、CARが免疫エフェクター細胞の特異性を再方向付けする能力であり、それにより増殖、サイトカイン産生、食作用、又は標的抗原発現細胞の細胞死を主要組織適合複合体（MHC）とは独立して媒介し得る分子の産生が惹起され、こうしてモノクローナル抗体、可溶性リガンド、又は細胞特異的補助受容体の細胞特異的標的化能が活用される。

様々な実施形態において、CARは、ヒト化抗原特異的結合ドメインを含む細胞外結合ドメイン、膜貫通ドメイン、1個以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。特定の実施形態において、CARは、ヒト化抗原抗体又はその抗原結合断片を含む細胞外結合ドメイン、1個以上のスペーサードメイン、膜貫通ドメイン、1個以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。

「細胞外抗原結合ドメイン」又は「細胞外結合ドメイン」は、互換的に使用され、関心対象となる標的抗原に特異的に結合する能力をCARに与える。該結合ドメインは、天然源、合成源、半合成源、又は組換え源のいずれかから誘導され得る。好ましくは、scFvドメインである。

「特異的結合」は、結合及び結合特異性の試験に使用することができる様々な実験手順を、当業者であれば明らかに認識するものと当業者には解釈されるべきである。平衡会合定数又は平衡解離定数の測定方法は当該技術分野で知られている。幾つかの交差反応又はバックグラウンド結合は、多くのタンパク質間相互作用において不可避である場合があり、これは、CAR及びエピトープの間の結合の「特異性」から減じられるべきではない。「特異的結合」は、抗体又はその抗原結合断片（又はそれを含むCAR）の標的抗原への、バックグラウンド結合よりも大きな結合親和性での結合を説明している。用語「～に対して指向する（directed against）」は、用語「特異性」を考慮する場合に、抗体及びエピトープの間の相互作用の理解において適用することもできる。

「抗原（Ag）」は、動物における抗体の産生又はT細胞応答を刺激することができる化合物、組成物、又は物質を指す。特定の実施形態において、標的抗原は、所望のポリペプチドのエピトープである。「エピトープ」とは、結合性作用物質が結合する抗原の領域を指す。エピトープは、タンパク質の三次折り畳みにより並置される隣接アミノ酸又は非隣接アミノ酸の両方から形成され得る。

「単鎖Fv」又は「scFv」抗体断片は、抗体のVHドメイン及びVLドメインを含み、その際、これらのドメインは、単独のポリペプチド鎖で、どちらか一方の向き（例えば、VL-VH又はVH-VL）で存在する。一般的に、scFvポリペプチドは、scFvが抗原結合のために望ましい構造を形成可能にするVHドメイン及びVLドメインの間のポリペプチドリンカーを更に含む。好ましい実施形態において、本明細書において意図されるCARは、scFvであり、かつマウス、ヒト又はヒト化されたscFvであり得る抗原特異的結合ドメインを含む。単鎖抗体は、所望の標的に特異的なハイブリドーマのV領域遺伝子からクローニングすることができる。scFvはファージディスプレイライブラリーからも取得され得るため、従来のハイブリドーマ技術が省略される。特定の実施形態において、該抗原特異的結合ドメインは、ヒト標的抗原ポリペプチドに結合するヒト化されたscFvである。

本明細書において意図される抗CXCR5 CARを構築するのに好適な可変重鎖の実例としては、限定されるものではないが、配列番号13に記載されるアミノ酸配列が挙げられる。本明細書において意図される抗CXCR5 CARを構築するのに好適な可変軽鎖の実例としては、限定されるものではないが、配列番号15に記載されるアミノ酸配列が挙げられる。

抗体及び抗体断片
CARは、標的ポリペプチドに結合する抗体又は抗体断片を含む細胞外抗原結合ドメインを含む。したがって、本発明の抗体又は抗体断片としては、限定されるものではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体、単鎖断片（scFv）、単鎖可変断片（ssFv）、単一ドメイン抗体（例えば、ナノボディ由来のVHH断片）、Fab断片、F（ab'）₂断片、Fab発現ライブラリーにより生成される断片、抗イディオタイプ抗体、及び上記のいずれかのエピトープ結合断片又はその組合せが挙げられ、ただし、それらは、好ましくは本明細書に記載される対応するCDR、又はVH及びVL領域を含む本明細書に記載されるCARと同程度の結合特性を保持する。またダイアボディ、トリアボディ、四価抗体、及びペプタボディ（peptabodies）等のミニ抗体及び多価抗体が、本発明の方法において使用され得る。本発明の免疫グロブリン分子は、任意のクラス（すなわちIgG、IgE、IgM、IgD、及びIgA）又はサブクラス免疫のグロブリン分子であり得る。したがって、本明細書において使用する場合、抗体という用語は、全長抗体の改変により生成されたか、又は組換えDNA法を使用して新たに合成されたかのいずれかである、本発明のCARにより含まれる抗体及び抗体断片を包含する。

本明細書において使用する場合、「抗体」は、一般に、免疫グロブリン遺伝子又は免疫グロブリン遺伝子の断片により実質的にコードされる1種以上のポリペプチドからなるタンパク質を指す。用語「抗体」が使用される場合、用語「抗体断片」も指すとみなされ得る。知られている免疫グロブリン遺伝子としては、κ、λ、α、γ、δ、ε、及びμ定常領域遺伝子、並びに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖はκ又はλに分類される。重鎖はγ、μ、α、δ、又はεに分類され、これらはまた、それぞれ、免疫グロブリンクラスであるIgG、IgM、IgA、IgD、及びIgEを規定する。基本的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、四量体又は二量体を含むことが知られている。各四量体は、2対の同一のポリペプチド鎖から構成され、各対が1本の「軽」（L）鎖（約25 kD）及び1本の「重」（H）鎖（約50 kD～70 kD）を有する。各鎖のN末端は、主に抗原認識を担う、約100アミノ酸～110アミノ酸以上の可変領域を規定する。用語「可変軽鎖」及び「可変重鎖」は、それぞれ軽鎖及び重鎖のこれらの可変領域を指す。任意に、抗体又は抗体の免疫学的部分は、他のタンパク質と化学的にコンジュゲートされ得るか、又は他のタンパク質との融合タンパク質として発現され得る。

本発明のCARは、哺乳動物、特にヒトのタンパク質標的に対して結合することを目的とする。使用されるタンパク質名は、マウス又はヒトバージョンのタンパク質のいずれかに対応し得る。

本開示による結合ドメインポリペプチド及びCARタンパク質の親和性は、従来技術を使用して、例えば、競合ELISA（酵素結合免疫吸着測定法）により、又は標識されたリガンドを使用した若しくはBiacore等の表面プラズモン共鳴デバイスを使用した結合会合アッセイ、若しくは置換アッセイにより容易に決定され得る。

本発明の抗体の1つ以上のCDR又は該抗体に由来する1つ以上のCDRを含むヒト化抗体は、当該技術分野で既知の任意の方法を用いて作製することができる。例えば、4つの一般的工程を用いてモノクローナル抗体をヒト化することができる。これらの工程は、（1）出発抗体の軽鎖及び重鎖可変ドメインのヌクレオチド及び予測アミノ酸配列を決定すること、（2）ヒト化抗体を設計すること、すなわちどの抗体フレームワーク領域をヒト化プロセスに使用するかを決定すること、（3）実際のヒト化方法論／技法、並びに（4）ヒト化抗体の形質移入及び発現である。例えば米国特許第4,816,567号、同第5,807,715号、同第5,866,692号、同第6,331,415号、同第5,530,101号、同第5,693,761号、同第5,693,762号、同第5,585,089号、同第6,180,370号、同第5,225,539号、同第6,548,640号を参照のこと。

ヒト化抗体という用語は、免疫グロブリンのフレームワーク領域の少なくとも一部及び任意にCDR領域又は結合に関与する他の領域の一部がヒト免疫グロブリン配列に由来するか、又はヒト免疫グロブリン配列に適合されていることを意味する。ヒト化、キメラ又は部分ヒト化バージョンのマウスモノクローナル抗体は、H鎖及びL鎖をコードするマウス及び／又はヒトゲノムDNA配列、又はH鎖及びL鎖をコードするcDNAクローンから逸脱して、例えば組換えDNA技術を用いて作製することができる。マウス抗体のヒト化形態は、組換えDNA法により非ヒト抗体のCDR領域をヒト定常領域に連結することによって生成することができる（Queen et al., 1989、国際公開第90/07861号）。代替的には、本発明の方法に使用されるモノクローナル抗体はヒトモノクローナル抗体であってもよい。ヒト抗体は例えばファージディスプレイ法（国際公開第91/17271号、国際公開第92/01047号）を用いて得ることができる。

本明細書において使用する場合、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する特定のキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はその断片（Fv、Fab、Fab'、F(ab')₂、又は抗体の他の抗原結合部分配列（subsequences）等）である非ヒト（例えばネズミ、ラクダ、ラマ、サメ）抗体の形態も指す。

本明細書において使用する場合、ヒト抗体若しくはヒト化抗体又はヒト抗体断片若しくはヒト化抗体断片は、ヒトによって産生される抗体に対応するアミノ酸配列を有し、及び／又は当該技術分野で既知の若しくは本明細書に開示されるヒト抗体を作製する技法のいずれかを用いて作製された抗体を意味する。ヒト抗体又はその断片は競合的結合実験又は別の形で、特定のマウス抗体と同じエピトープ特異性を有するように選択することができる。本発明のヒト化抗体は驚くべきことに、マウス抗体とかなりの程度まで共通の有用な機能特性を有する。ヒトポリクローナル抗体は免疫原（immunogenic agent）で免疫化したヒトから血清の形態で得ることもできる。任意に、かかるポリクローナル抗体は、アミロイド原線維及び／又は非線維性ポリペプチド若しくはその断片を親和性試薬として使用した親和性精製によって濃縮することができる。モノクローナル抗体は国際公開第99/60846号に記載の技法に従って血清から得ることができる。

可変領域及びCDR
抗体の可変領域は、単独又は組合せでの抗体軽鎖の可変領域又は抗体重鎖の可変領域を指す。重鎖及び軽鎖の可変領域は各々、超可変領域としても知られる3つの相補性決定領域（CDR）によって接続した4つのフレームワーク領域（FR）からなる。各鎖におけるCDRは、FRによってごく接近して結び付けられ、他の鎖のCDRとともに抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。

CDRを決定するのに利用可能な多数の技法、例えば、種間配列変異性に基づくアプローチ（すなわち、Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.)）、及び抗原抗体複合体の結晶学的研究に基づくアプローチ（Al-lazikani et al. (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948）がある。代替的手法としては、IMGT（国際免疫遺伝学（international ImMunoGeneTics））情報システムが挙げられる（Marie-Paule Lefranc）。Kabat定義は、配列多様性に基づいており、最も一般的に使用される方法である。Chothia定義は、構造ループ領域の位置に基づいており、ここで、AbM定義は、2つの間の折衷案であり、Oxford Molecular社のAbM抗体モデリングソフトウェアにより使用される（www.bioinf.org.uk：Dr. Andrew C.R. Martinのグループを参照のこと）。本明細書において使用する場合、CDRは、1つ以上の手法により、又はこれらの手法の組合せにより定義されるCDRを指すことができる。

幾つかの実施形態において、本発明は、CARに組み込まれる抗体又はその断片を提供し、該抗体又はその断片は、本発明の抗体の少なくとも1つのCDR、少なくとも2つ、少なくとも3つ又はそれ以上のCDRと実質的に同一の少なくとも1つのCDR、少なくとも2つ、少なくとも3つ又はそれ以上のCDRを含む。他の実施形態は、本発明の抗体の又は本発明の抗体に由来する少なくとも2つ、3つ、4つ、5つ又は6つのCDRと実質的に同一の少なくとも2つ、3つ、4つ、5つ又は6つのCDRを有する抗体を含む。幾つかの実施形態において、少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又は6つのCDRは、本発明の抗体の少なくとも1つ、2つ又は3つのCDRと少なくとも約70%、75%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である。本発明の目的上、活性の程度は上記抗体と比較して異なる（より大きい又は小さい）場合があるが、結合特異性及び／又は全体活性は概して保持されることが理解される。

CARの追加的構成要素
或る特定の実施形態において、本明細書において意図されるCARは、様々なドメインの間に、分子の適切な間隔及び立体構造のために追加されるリンカー残基、例えば、VH及びVLドメインを連結し、2つのサブ結合ドメインの相互作用と両立するスペーサー機能を提供するアミノ酸配列を含むリンカーを含み得るため、得られるポリペプチドは、同一の軽鎖及び重鎖可変領域を含む抗体と同一の標的分子に対する特異的な結合親和性を保持する。本明細書において意図されるCARは、1つ、2つ、3つ、4つ、又は5つ以上のリンカーを含み得る。特定の実施形態において、リンカーの長さは、約1アミノ酸～約25アミノ酸、約5アミノ酸～約20アミノ酸、若しくは約10アミノ酸～約20アミノ酸、又は任意の中間の長さのアミノ酸である。

リンカーの実例としては、グリシンポリマー、グリシン－セリンポリマー、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、及び当該技術分野において既知の他の可動性リンカー、例えば、Whitlowリンカーが挙げられる。グリシンポリマー及びグリシン－セリンポリマーは、相対的に不定形であり、したがって、本明細書に記載されるCAR等の融合タンパク質のドメイン間の中立的なテザーとして機能することができ得る。

特定の実施形態において、CARの結合ドメインの後に1つ以上の「スペーサー」又は「スペーサーポリペプチド」が続き、これらは、抗原結合ドメインをエフェクター細胞表面から遠ざけて、適切な細胞間接触、抗原結合、及び活性化を可能にする領域を指す。或る特定の実施形態において、スペーサードメインは、限定されるものではないが、1つ以上の重鎖定常領域、例えば、CH2及びCH3が挙げられる、免疫グロブリンの一部である。スペーサードメインは、天然に存在する免疫グロブリンヒンジ領域又は改変された免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含み得る。一実施形態において、スペーサードメインは、IgG1又はIgG4のCH2及びCH3ドメインを含む。一実施形態において、このようなスペーサー／ヒンジ領域のFc結合ドメインは、マクロファージ及び他の自然免疫細胞上に発現されるFc受容体へのCARの結合を防止するように変異される。

幾つかの実施形態において、CARの結合ドメインの後に1つ以上の「ヒンジドメイン」が続き、これは、抗原結合ドメインをエフェクター細胞表面から離して配置して、適切な細胞間接触、抗原結合、及び活性化を可能にすることに関与する。CARは、結合ドメインと膜貫通ドメイン（TM）との間に1つ以上のヒンジドメインを含み得る。ヒンジドメインは、天然源、合成源、半合成源、又は組換え源のいずれかに由来し得る。ヒンジドメインは、天然に存在する免疫グロブリンヒンジ領域又は改変された免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含み得る。本明細書に記載されるCARに使用するのに好適な例示的なヒンジドメインとしては、1型膜タンパク質、例えば、CD8α、CD4、CD28、PD1、CD 152、及びCD7の細胞外領域に由来するヒンジ領域が挙げられ、これは、これらの分子由来の野生型ヒンジ領域であってもよく、改変されてもよい。別の実施形態において、ヒンジドメインは、PD1、CD 152、又はCD8αのヒンジ領域を含む。

「膜貫通ドメイン」は、細胞外結合部分及び細胞内シグナル伝達ドメインを融合し、CARを免疫エフェクター細胞の形質膜に固定するCARの一部である。TMドメインは、天然源、合成源、半合成源、又は組換え源のいずれかに由来し得る。TMドメインは、T細胞受容体であるCD3ε、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD 16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD 134、CD 137、CD 152、CD 154、及びPD1のα、β、又はζ鎖に由来し得る。一実施形態において、本明細書において意図されるCARは、CD8α又はCD28に由来するTMドメインを含む。

特定の実施形態において、本明細書において意図されるCARは、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、ヒト標的ポリペプチドへの有効な結合の情報を免疫エフェクター細胞の内部に伝達して、エフェクター細胞機能、例えば、活性化、サイトカイン産生、増殖、及びCARに結合した標的細胞への細胞傷害性因子の放出、又はCARの細胞外ドメインへの抗原結合により誘発される他の細胞応答を含む細胞傷害活性の誘発に関与するCARの一部を指す。用語「エフェクター機能」は、免疫エフェクター細胞の特殊な機能を指す。T細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性又はサイトカインの分泌を含む活性の補助であり得る。したがって、用語「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、エフェクター機能シグナルを伝達し、特殊な機能を実行するように細胞に指示するタンパク質の一部を指す。本明細書において意図されるCARは、CAR受容体を発現するT細胞の効力、増殖、及び／又は記憶形成を増強する1つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。本明細書において使用する場合、用語「共刺激シグナル伝達ドメイン」は、共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインを指す。共刺激分子は、抗原に結合する際に、Tリンパ球の効率的な活性化及び機能に必要とされる第2のシグナルを提供する、抗原受容体又はFc受容体以外の細胞表面分子である。

一実施形態において、CARは、共刺激ドメイン及びシグナル伝達（活性化）ドメインを含む細胞内ドメインを含む。したがって、CAR構築物は、天然のT細胞受容体複合体の細胞内シグナル伝達ドメイン（CD3ζ）及び第2のシグナルを提供して、完全なT細胞活性化を刺激する1つ以上の共刺激ドメインを含み得る。共刺激ドメインは、CAR T細胞のサイトカイン産生を増加させ、T細胞の複製及びT細胞の持続性を促進すると考えられている。また共刺激ドメインは、CAR T細胞の消耗を潜在的に防止し、T細胞の抗腫瘍活性を増加させ、患者におけるCAR T細胞の生存を増強することも示された。非限定的な例として、4-1BB共刺激ドメインを有するCAR構築物は、前臨床研究において、緩徐な持続する増殖及びエフェクター機能、持続性の増加、並びにT細胞サブセット組成における豊富な記憶中心細胞（TCM）に関連付けられた。4-1BBは腫瘍壊死因子（TNF）スーパーファミリーに属し、主に抗原活性化CD4及びCD8 T細胞上で発現される、in vivoで誘導性の糖タンパク質受容体である。非限定的な例としてのCD28は、免疫グロブリン（Ig）スーパーファミリーに属している。これは、休止及び活性化CD4及びCD8 T細胞上で恒常的に発現しており、PI3K-AKTシグナル伝達経路を刺激することによりT細胞活性化において決定的な役割を果たす。一実施形態において、細胞内ドメインは、4-1BB及びCD28共刺激ドメインの両方を含む。他の共刺激ドメインとしては、CD3ζシグナル伝達（活性化）ドメインと組み合わせることができるICOS及びOX40が挙げられる。

T細胞受容体
T細胞受容体すなわちTCRは、通常、主要組織適合複合体（MHC）分子に結合されたペプチドとしての抗原断片の認識を担う、T細胞又はTリンパ球の表面に見出される分子である。TCRは、2つの異なるタンパク質鎖から構成される。ヒトにおけるTCRは、95%のT細胞で、アルファ（α）鎖及びベータ（β）鎖（それぞれTRA及びTRBによりコードされる）からなるが、5%のT細胞では、TCRは、ガンマ及びデルタ（γ／δ）鎖（それぞれTRG及びTRDによりコードされる）からなる。各鎖は、可変（V）領域及び定常（C）領域の2つの細胞外ドメインから構成され、両方の免疫グロブリンスーパーファミリー（IgSF）ドメインが逆平行β－シートを形成する。定常領域は細胞膜に近接しており、これの後に膜貫通領域及び短い細胞質尾部が続き、一方で可変領域はペプチド／MHC複合体に結合する。

TCRのα鎖及びβ鎖両方の可変ドメインは、それぞれ3つの超可変領域又は相補性決定領域（CDR）を有する。β鎖（HV4）上には、通常、抗原に接触せず、したがって、CDRとみなされない追加の超可変領域も存在する。

これらの可変ドメイン残基は、α鎖及びβ鎖の界面、並びにCD3シグナル伝達複合体に近接していると考えられているβ鎖フレームワーク領域というTCRの2つの領域に存在する。CDR3はプロセシングされた抗原の認識を担う主なCDRであるが、α鎖のCDR1も抗原ペプチドのN末端部分と相互作用することが示されており、一方で、β鎖のCDR1は、ペプチドのC末端部分と相互作用する。

組換えTCRは、以前に、増殖性疾患の処置を目的とする治療用T細胞に形質移入された。例えば、TCR-T細胞は、好ましくは自家のαβ細胞又はγδ細胞を、関心対象のペプチドを認識するTCR（典型的には、β鎖と非共有結合したα鎖）及びCD3z遺伝子をコードするレトロウイルス又はレンチウイルスベクターで形質導入することにより遺伝子操作される。遺伝子操作されたT細胞が抗原提示細胞又は腫瘍細胞の表面上の主要組織適合複合体（MHC）に結合しているペプチドを認識する場合に、それらは活性化し、増殖し始める。最初のTCR-T細胞療法は、転移性黒色腫の臨床試験において使用され、この療法においてTCRは、メラニン細胞分化抗原であるT細胞により認識される黒色腫抗原1（melanoma antigen recognized by T cells 1）（MART-1）由来のHLA-A2拘束性ペプチドを認識した。

ポリペプチド
「ペプチド」、「ポリペプチド」、「ポリペプチド断片」、及び「タンパク質」は、特に明記しない限り、互換的に使用され、通常の意味に従って、すなわち、アミノ酸の配列として使用される。ポリペプチドは、特定の長さに限定されず、例えば、それらは全長タンパク質配列又は全長タンパク質の断片を含み得て、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化等、並びに当該技術分野において既知の天然に存在する他の修飾及び天然に存在しない他の修飾の両方を含み得る。

様々な実施形態において、本明細書において意図されるCARポリペプチドは、翻訳時又は翻訳後にタンパク質の移送を指示するシグナル（又はリーダー）配列をタンパク質のN末端に含む。ポリペプチドは、種々のよく知られた組換え技術及び／又は合成技術のいずれかを使用して調製され得る。本明細書において意図されるポリペプチドは、具体的には、本開示のCAR、又は本明細書において開示されるCARからの欠失、それへの付加、及び／又はそれの1つ以上のアミノ酸の置換を有する配列を包含する。

本明細書において使用する場合、「単離ペプチド」又は「単離ポリペプチド」等は、細胞環境から、及び細胞の他の成分との会合からの、ペプチド又はポリペプチド分子のin vitroでの単離及び／又は精製を指し、すなわち、それは、in vivoでの物質と著しく会合していない。同様に、「単離細胞」は、組織又は器官からin vivoで得られた細胞を指し、細胞外マトリックスを実質的に含まない。

核酸
本明細書において使用する場合、用語「ポリヌクレオチド」又は「核酸分子」は、メッセンジャーRNA（mRNA）、RNA、ゲノムRNA（gRNA）、プラス鎖RNA（RNA（+））、マイナス鎖RNA（RNA（-））、ゲノムDNA（gDNA）、相補的DNA（cDNA）、又は組換えDNAを指す。ポリヌクレオチドは、単鎖及び二本鎖ポリヌクレオチドを含む。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載される参照配列のいずれかに対する少なくとも約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するポリヌクレオチド又はバリアントを含み、ここで、該バリアントは、通常、参照配列の少なくとも1つの生物活性を保持する。様々な例示的実施形態において、本発明は、部分的に、発現ベクター、ウイルスベクター、及び導入プラスミドを含むポリヌクレオチド、並びに組成物、並びにそれを含む細胞を意図する。

ポリヌクレオチドは、当該技術分野において既知かつ利用可能な種々の確立されている技術のいずれかを使用して調製、操作、及び／又は発現され得る。所望のポリペプチドを発現させるために、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が適切なベクターに挿入され得る。ベクターの例は、プラスミド、自己複製配列、及び転移因子である。更なる例示的なベクターとしては、限定されるものではないが、プラスミド、ファージミド、コスミド、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC）、又はP1由来の人工染色体（PAC）等の人工染色体、ラムダファージ又はM13ファージ等のバクテリオファージ、及び動物ウイルスが挙げられる。ベクターとして有用な動物ウイルスのカテゴリーの例としては、限定されるものではないが、レトロウイルス（レンチウイルスが含まれる）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、及びパポバウイルス（例えば、SV40）が挙げられる。発現ベクターの例は、哺乳動物細胞での発現のためのpClneoベクター（Promega社）；哺乳動物細胞でのレンチウイルスにより媒介される遺伝子導入及び発現のためのpLenti4/V5-DEST（商標）、pLenti6/V5-DEST（商標）、及びpLenti6.2/V5-GW/lacZ（Invitrogen社）である。特定の実施形態において、本明細書において開示されるキメラタンパク質のコード配列は、哺乳動物細胞におけるキメラタンパク質の発現のためのかかる発現ベクターにライゲーションされ得る。発現ベクターに存在する「調節エレメント」又は「制御配列」は、宿主細胞のタンパク質と相互作用して、転写及び翻訳を実行する、ベクターの非翻訳領域、すなわち、複製開始点、選択カセット、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（シャイン・ダルガーノ配列又はコザック配列）、イントロン、ポリアデニル化配列、5'及び3'非翻訳領域である。かかるエレメントは、それらの強さ及び特異性が異なり得る。利用されるベクターシステム及び宿主に応じて、任意の数の好適な転写及び翻訳エレメント（ユビキタスプロモーター及び誘導性プロモーターが挙げられる）が使用され得る。

ベクター
特定の実施形態において、細胞（例えば、T細胞等の免疫エフェクター細胞）は、レトロウイルスベクター、例えば、CARをコードするレンチウイルスベクターで形質導入される。例えば、T細胞は、標的ポリペプチドに結合するヒト化された抗原特異的ドメイン、抗体、又は抗原結合断片を膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインと共に含むCARをコードするベクターで形質導入され、その結果、これらの形質導入された細胞は、CARにより媒介される細胞傷害反応を誘発し得る。

レトロウイルスは、遺伝子送達の一般的なツールである。特定の実施形態において、レトロウイルスは、キメラ抗原受容体（CAR）をコードするポリヌクレオチドを細胞に送達するために使用される。本明細書において使用する場合、用語「レトロウイルス」は、そのゲノムRNAを線状二本鎖DNAコピーに逆転写し、その後、宿主ゲノムにそのゲノムDNAを共有結合的に組み込むRNAウイルスを指す。一旦ウイルスが宿主ゲノムに組み込まれると、それは「プロウイルス」と称される。プロウイルスは、RNAポリメラーゼIIのテンプレートとして機能し、新たなウイルス粒子を生成するために必要とされる構造タンパク質及び酵素をコードするRNA分子の発現を指示する。

特定の実施形態に使用するのに好適な例示的レトロウイルスとしては、限定されるものではないが、以下が挙げられる：モロニーマウス白血病ウイルス（M-MuLV）、モロニーマウス肉腫ウイルス（MoMSV）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（HaMuSV）、マウス乳癌ウイルス（MuMTV）、テナガザル白血病ウイルス（GaLV）、ネコ白血病ウイルス（FLV）、スプマウイルス、フレンドマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス（MSCV）、及びラウス肉腫ウイルス（RSV）、及びレンチウイルス。

本明細書において使用する場合、用語「レンチウイルス」は、複合レトロウイルスの一群（又は一属）を指す。例示的なレンチウイルスは、限定されるものではないが、以下が挙げられる：HIV（ヒト免疫不全ウイルス；HIV 1型及びHIV 2型が挙げられる）、ビスナ・マエディウイルス（VMV）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（CAEV）、ウマ伝染性貧血ウイルス（EIAV）、ネコ免疫不全ウイルス（FIV）、ウシ免疫不全ウイルス（BIV）、及びサル免疫不全ウイルス（SIV）。一実施形態において、HIVベースのベクター骨格（すなわち、HIVシス作用配列エレメント）が好ましい。特定の実施形態において、CARを含むポリヌクレオチドを細胞に送達するためにレンチウイルスが使用される。

本明細書において使用される用語「ベクター」は、別の核酸分子を導入又は運搬することができる核酸分子を指す。導入される核酸は、一般に、ベクター核酸分子に連結、例えば、挿入される。ベクターは、細胞において自律増殖を指示する配列を含み得るか、又は宿主細胞DNAへの組込みを可能にするのに十分な配列を含み得る。有用なベクターとしては、例えば、プラスミド（例えば、DNAプラスミド又はRNAプラスミド、エピソームの局在化及び持続を可能にするDNAプラスミド）、トランスポゾン、コスミド、細菌人工染色体、及びウイルスベクターが挙げられる。有用なウイルスベクターとしては、例えば、複製欠損レトロウイルス及びレンチウイルスが挙げられる。本発明の更なる実施形態において、CAR又はTCRをコードする核酸のCRISPR/Cas及びTALENにより媒介される挿入が用いられ得る。CRISPR/Cas及びTALENにより媒介される挿入のための適切なベクターは、当業者に既知である。

当業者に明白であるように、用語「ウイルスベクター」は、通常、核酸分子の導入又は細胞のゲノムへの組込みを促進するウイルス由来の核酸エレメントを含む核酸分子（例えば、導入プラスミド）、又は核酸の導入を媒介するウイルス粒子のいずれかを指すために広く使用される。ウイルス粒子は、通常、核酸（複数の場合もある）に加えて、様々なウイルス成分及び場合により、宿主細胞成分も含む。

ウイルスベクターという用語は、細胞に核酸を導入することができるウイルス若しくはウイルス粒子又は導入された核酸自体のいずれかを指し得る。ウイルスベクター及び導入プラスミドは、主にウイルスに由来する構造的及び／又は機能的な遺伝的エレメントを含有する。用語「レトロウイルスベクター」は、主にレトロウイルスに由来する構造的及び機能的な遺伝的エレメント又はその一部を含有するウイルスベクター又はプラスミドを指す。

したがって、好ましい実施形態において、本発明は、CARをコードする発現ベクターで細胞を形質移入する方法に関する。例えば、幾つかの実施形態において、ベクターは、追加の配列、例えば、CARの発現を促進する配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリAシグナル、及び／又は1つ以上のイントロンを含む。好ましい実施形態において、CARをコードする配列は、トランスポゾン配列と隣接しており、その結果、トランスポサーゼの存在が、形質移入された細胞のゲノムにコード配列が組み込まれるのを可能にする。

幾つかの実施形態において、遺伝的に形質転換された細胞は、CARをコードする配列の形質移入された細胞のゲノムへの組込みを促進するトランスポサーゼにより更に形質移入される。幾つかの実施形態において、トランスポサーゼは、DNA発現ベクターとして提供される。しかしながら、好ましい実施形態において、トランスポサーゼは、トランスポサーゼの長期的発現がトランスジェニック細胞で発生しないように、発現可能なRNA又はタンパク質として提供される。例えば、幾つかの実施形態において、トランスポサーゼは、mRNA（例えば、キャップ及びポリA尾部を含むmRNA）として提供される。任意のトランスポサーゼシステムが、本発明の実施形態に従って使用され得る。しかしながら、幾つかの実施形態において、トランスポサーゼは、サケ科型Tel様トランスポサーゼ（SB）である。例えば、トランスポサーゼは、いわゆる「Sleeping beauty」トランスポサーゼであり得る（例えば、引用することにより本明細書の一部をなす米国特許第6,489,458号を参照のこと）。幾つかの実施形態において、トランスポサーゼは、増加した酵素活性を有する遺伝子操作された酵素である。トランスポサーゼの幾つかの具体例としては、限定されるものではないが、SB 10、SB 11、又はSB 100Xトランスポサーゼが挙げられる（例えば、引用することにより本明細書の一部をなす、Mates et al, 2009, Nat Genet. 41(6):753-61又は米国特許第9228180号を参照のこと）。例えば、方法は、SB 10、SB 11、又はSB 100XトランスポサーゼをコードするmRNAと共に細胞をエレクトロポレーションすることを含み得る。

配列バリアント
例えば%配列同一性によって規定され、本発明の類似の結合特性を維持する特許請求される核酸、タンパク質、抗体、抗体断片及び／又はCARの配列バリアントも本発明の範囲内に含まれる。代替配列を示すが、提示される特定の配列と本質的に同じ標的特異性等の結合特性を維持するこのようなバリアントは機能的類似体として、又は機能的に類似しているとして既知である。配列同一性は、配列アラインメントを行った場合の同一のヌクレオチド又はアミノ酸のパーセンテージに関する。

本明細書において使用する場合、「配列同一性」という記載は、ヌクレオチド単位ベース又はアミノ酸単位ベースで比較ウインドウにわたって配列が同一である程度を指す。したがって、「配列同一性のパーセンテージ」は、2つの最適にアラインメントした配列を比較ウインドウにわたって比較すること、同一の核酸塩基（例えば、A、T、C、G、I）又は同一のアミノ酸残基（例えば、Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、He、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gin、Cys、及びMet）が両方の配列に見出される位置の数を決定して、一致した位置の数を得ること、一致した位置の数を比較ウインドウ内の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で割ること、及び結果に100を乗じて、配列同一性のパーセンテージを得ることにより計算され得る。本明細書に記載される参照配列のいずれかに対する少なくとも約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するヌクレオチド及びポリペプチドが含まれ、ここで、ポリペプチドバリアントは、通常、参照ポリペプチドの少なくとも1つの生物活性を保持する。

遺伝暗号の縮重の結果として、本明細書に記載されるポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列が存在することが当業者には理解されるであろう。これらのポリヌクレオチドの一部は、任意のネイティブ遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性又は配列同一性を保有する。それにもかかわらず、コドン使用頻度の差異によって変動するポリヌクレオチドは本発明によって具体的に意図される。記載の配列同一性に該当する欠失、置換及び配列中の他の変化も本発明に包含される。

置換によって生じ得るタンパク質配列修飾も本発明の範囲内に含まれる。本明細書で規定される置換はタンパク質のアミノ酸配列に対して行われる修飾であり、1つ以上のアミノ酸が同じ数の（異なる）アミノ酸で置き換えられ、一次タンパク質とは異なるアミノ酸配列を含有するタンパク質が生じる。好ましくはタンパク質の機能が顕著に変更されることがない置換が行われ得る。付加と同様、置換は天然又は人為的なものであり得る。タンパク質の機能を顕著に変更することなくアミノ酸置換を行うことができることは当該技術分野で知られている。これは修飾が同様の特性の別のアミノ酸への1つのアミノ酸の置換である「保存的」アミノ酸置換に関する場合に特に当てはまる。かかる「保存」アミノ酸はサイズ、電荷、極性及び立体構造のために、タンパク質の構造及び機能に顕著に影響を及ぼすことなく置換され得る天然又は合成アミノ酸であり得る。多くのアミノ酸がタンパク質の機能に有害な影響を及ぼすことなく保存的アミノ酸によって置換され得ることが多い。

概して、非極性アミノ酸Gly、Ala、Val、Ile及びLeu、非極性芳香族アミノ酸Phe、Trp及びTyr、中性極性アミノ酸Ser、Thr、Cys、Gln、Asn及びMet、正電荷アミノ酸Lys、Arg及びHis、負電荷アミノ酸Asp及びGluが保存的アミノ酸群である。このリストは包括的なものではない。例えばAla、Gly、Ser、場合によってCysは異なる群に属するにもかかわらず互いに置き換えることができることが知られている。

置換バリアントでは、抗体分子中の少なくとも1つのアミノ酸残基が除去され、異なる残基がその位置に挿入されている。置換変異導入に最も興味深い部位として超可変領域が挙げられるが、FRの変更も意図される。かかる置換により生物活性の変化が生じる場合、真下の表で「例示的置換」と称されるか、又はアミノ酸クラスに関連して下記で更に説明されるより大きな変化が導入される可能性があり、生成物がスクリーニングされる。

潜在的アミノ酸置換：
元の残基好ましい保存的置換例示的置換の例
ノルロイシン

抗体の生物学的特性の実質的修飾は、（a）置換領域における、例えばシート若しくはヘリカル構造としてのポリペプチド骨格の構造、（b）標的部位での分子の電荷若しくは疎水性、又は（c）側鎖の大きさの維持に対する影響が顕著に異なる置換を選択することによって達成される。

保存的アミノ酸置換は天然のアミノ酸に限定されず、合成アミノ酸も含む。一般に使用される合成アミノ酸は、中性非極性類似体である様々な鎖長のωアミノ酸及びシクロヘキシルアラニン、中性非極性類似体であるシトルリン及びメチオニンスルホキシド、芳香族中性類似体であるフェニルグリシン、負電荷類似体であるシステイン酸、並びに正電荷アミノ酸類似体であるオルニチンである。天然のアミノ酸と同様、このリストは包括的なものではなく、当該技術分野で既知の置換の例示にすぎない。

遺伝子改変細胞及び遺伝子改変T細胞
特定の実施形態において、本発明は、細胞増殖疾患の処置に使用される、本明細書において意図される抗原特異的標的化構築物を発現するように遺伝子改変されたT細胞を意図する。本発明のT細胞としては、CD8+及びCD4+T細胞も挙げられる。

本明細書で使用する場合、用語「遺伝子操作された」又は「遺伝子改変された」は、細胞の遺伝物質全体へのDNA又はRNA形態の余分な遺伝子材料の付加を指す。用語「遺伝子改変細胞」、「改変された細胞」、及び「再方向付けされた細胞」は、互換的に使用される。本明細書で使用する場合、用語「遺伝子治療」は、遺伝子の発現を回復させるか、修正するか、若しくは改変するか、又は治療用ポリペプチド、例えば、CARを発現させるための、DNA又はRNA形態の余分な遺伝子材料の細胞の遺伝物質全体への永続的又は一過的な導入を指す。特定の実施形態において、本明細書において意図されるTCR又はCARは、CTLの特異性を関心対象の標的抗原に再方向付けするためにCTLに導入され、発現される。

免疫エフェクター細胞（本発明のCTL等の）は、自家／自原性（autogeneic）（「自己」）又は非自家（「非自己」、例えば、同種、同系、又は異種）であり得る。本明細書で使用する場合、「自家」は、同一の対象由来の細胞を指し、本発明の好ましい実施形態である。本明細書で使用する場合、「同種」は、比較される細胞と遺伝的に異なる同一の種の細胞を指す。本明細書で使用する場合、「同系」は、比較される細胞と遺伝的に同一である異なる対象の細胞を指す。本明細書で使用する場合、「異種」は、比較される細胞と異なる種の細胞を指す。好ましい実施形態において、本発明の細胞は、自家又は同種である。

用語「T細胞」又は「Tリンパ球」は、当該技術分野において認められており、胸腺細胞、未成熟Tリンパ球、成熟Tリンパ球、休止Tリンパ球、サイトカイン誘導性キラー細胞（CIK細胞）、又は活性化Tリンパ球を包含することを意図する。サイトカイン誘導性キラー（CIK）細胞は、通常、CD3及びCD56陽性の非主要組織適合複合体（MHC）拘束性ナチュラルキラー（NK）様Tリンパ球である。T細胞は、Tヘルパー（Th；CD4+T細胞）細胞、例えば、Tヘルパー1（Th1）又はTヘルパー2（Th2）細胞であり得る。T細胞は、細胞傷害性T細胞（CTL；CD8+T細胞）、CD4+CD8+T細胞、CD4 CD8 T細胞、又は任意の他のサブセットのT細胞であり得る。特定の実施形態に使用するのに好適なT細胞の他の例示的集団としては、ナイーブT細胞並びに記憶T細胞及び幹細胞様記憶細胞（TSCM）が挙げられる。

例えば、自家細胞移植後に患者に再導入される場合、本明細書に記載される本発明の構築物で改変されたT細胞は、腫瘍細胞を認識して、殺傷し得る。

本発明は、本明細書に記載される意図される構築物を発現するCTLを作製する方法を提供する。一実施形態において、本方法は、免疫エフェクター細胞が本明細書に記載される1種以上の抗原特異的構築物（CAR又はTCR）を発現するように、個体から単離されたCTLを形質移入又は形質導入することを含む。特定の実施形態において、CTLは、個体から単離され、遺伝子改変される（in vitroでそれ以上操作されない）。次いで、かかる細胞は、個体に直接再投与され得る。更なる実施形態において、CTLは、場合によりEBAG9サイレンシング剤と共に、CAR又はTCRを発現するように遺伝子改変される前に、in vitroで増殖させるために最初に活性化及び刺激される。この点に関しては、CTLは、遺伝子改変の前及び／又は後に培養され得る。

特定の実施形態において、本明細書に記載される免疫エフェクター細胞のin vitroでの操作又は遺伝子改変の前に、細胞供給源が対象から取得される。特定の実施形態において、T細胞は、限定されるものではないが、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、人工多能性幹細胞（iPSC）、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍が挙げられる多数の供給源から取得され得る。或る特定の実施形態において、T細胞は、対象から採取された血液単位から、当業者に既知の任意の数の技術、例えば、沈降、例えば、FICOLL（商標）分離、抗体コンジュゲートビーズベースの方法、例えば、MACS（商標）分離（Miltenyi社）を使用して取得され得る。一実施形態において、個体の循環血液由来の細胞がアフェレーシスにより取得される。アフェレーシス生成物は、通常、T細胞、単球、顆粒球、B細胞が含まれるリンパ球、他の有核白血球、赤血球、及び血小板を含有する。一実施形態において、アフェレーシスにより採取された細胞は、血漿分画を除去するために、及びその後の処理のために細胞を適切な緩衝液又は培地中に入れるために洗浄され得る。細胞は、PBS又はカルシウム、マグネシウム、及びほぼ全ての他の二価カチオンを欠く別の好適な溶液で洗浄され得る。当業者により認められるように、洗浄工程は、当業者に既知の方法により、例えば、半自動フロースルー遠心分離機を使用することにより達成され得る。例えば、Cobe 2991細胞処理装置、Baxter CytoMate等である。洗浄後、細胞は、種々の生体適合性の緩衝剤又は緩衝剤を含有する若しくは含有しない他の生理食塩液中に再懸濁され得る。或る特定の実施形態において、アフェレーシス試料の望ましくない成分は、細胞が直接再懸濁された培養培地中で除去され得る。

或る特定の実施形態において、T細胞は、赤血球を溶解すること、及び例えば、PERCOLL（商標）勾配遠心分離により単球を除去することにより末梢血単核細胞（PBMC）から単離される。T細胞の特定の亜集団が、ポジティブ又はネガティブセレクション技術により更に単離され得る。本明細書において使用される1つの方法は、負に選択される細胞に存在する細胞表面マーカーに対して指向されたモノクローナル抗体カクテルを使用するネガティブ磁気免疫付着又はフローサイトメトリーによる細胞選別及び／又は細胞選択である。

PBMCは、本明細書において意図される方法を使用して、CARを発現するように直接遺伝子改変され得る。或る特定の実施形態において、PBMCの単離後にTリンパ球が更に単離され、或る特定の実施形態において、細胞傷害性及びヘルパーTリンパ球の両方が、遺伝子改変及び／又は増殖の前又は後のいずれかに、ナイーブ、記憶、及びエフェクターT細胞亜集団に選別され得る。CD8+細胞は、標準的方法を使用することにより取得され得る。幾つかの実施形態において、CD8+細胞は、ナイーブ、中心記憶、及びエフェクター細胞に、これらの種類のCD8+細胞の各々に関連する細胞表面抗原を同定することにより更に選別される。

幾つかの実施形態において、本明細書に記載されるT細胞は、当業者に既知の方法を使用して人工多能性幹細胞（iPSC）から取得され得る。

CAR T細胞を作製する認められた手法は、成熟循環T細胞の遺伝子改変及び増殖に依存する。かかるプロセスは、自家T細胞を利用し、同種T細胞による内因性TCR発現及びMHC不適合による拒絶による移植片対宿主病（GvHD）のリスクを低減する。代替法として、多能性幹細胞、例えば、人工多能性幹細胞からの遺伝子操作されたT細胞へのin vitroでの直接的分化により、本発明のCARを発現するように遺伝子改変され得る細胞の基本的に無制限の供給源が提供される。幾つかの実施形態において、均一な細胞製品を一貫して、かつ繰り返し製造するための再生可能な供給源となる、いわゆるマスターiPSC株が維持され得る。幾つかの実施形態において、増殖及び所望のT細胞への分化前のマスターiPSC細胞株のCARをコードする核酸での形質転換が意図される。例えば、iPSCがCARをコードする核酸で改変された後に患者への投与のために増やされ、T細胞に分化され得るように、iPSCからTリンパ球が作製され得る。CARをコードする核酸での形質転換及び投与前の増殖の前に、適切なT細胞への分化がiPSCから実施されてもよい。iPSC増殖、遺伝子改変、及び投与に好適な数の細胞を得るための増殖の全ての可能な組合せが本発明において意図される。

T細胞は、既知の方法を使用した単離後に遺伝子改変され得るか、又はT細胞は、遺伝子改変前にin vitroで活性化されて、増やされ得る（又は前駆細胞の場合に分化され得る）。特定の実施形態において、T細胞は、本明細書において意図されるキメラ抗原受容体で遺伝子改変され（例えば、CARをコードする核酸を含むウイルスベクターで形質導入される）、次いで、in vitroで活性化され、増やされる。各種の実施形態において、T細胞は、例えば、米国特許第6,352,694号、同第6,534,055号、同第6,905,680号、同第6,692,964号、同第5,858,358号、同第6,887,466号、同第6,905,681号、同第7,144,575号、同第7,067,318号、同第7,172,869号、同第7,232,566号、同第7,175,843号、同第5,883,223号、同第6,905,874号、同第6,797,514号、同第6,867,041号、及び米国特許出願公開第20060121005号に記載の方法を使用して、CARを発現するように遺伝子改変される前又は後に活性化されて、増やされ得る。

更なる実施形態において、例えば、1、2、3、4、5種以上の異なる発現ベクターの混合物を、ドナーT細胞群の遺伝子改変に使用することができ、ここで、各ベクターは、本明細書において意図される異なる抗原標的化構築物をコードする。

一実施形態において、本発明は、EBAG9阻害を示す遺伝子改変T細胞を保存する方法であって、該細胞が解凍される際に生存可能な状態を維持するように、T細胞を凍結保存することを含む、方法を提供する。処置されるべき状態に苦しむ患者の将来の処置のためのかかる細胞の永続的な供給源を提供するために、一部の免疫エフェクター細胞は、当該技術分野において既知の方法により凍結保存され得る。必要とされる場合に、凍結保存された細胞は、解凍し、成長させて、より多くのかかる細胞に増やすことができる。

組成物及び製剤
本明細書において意図される組成物は、本明細書において意図される1種以上のポリペプチド、ポリヌクレオチド、それを含むベクター、遺伝子改変T細胞等を含み得る。組成物としては、限定されるものではないが、医薬組成物が挙げられる。「医薬組成物」は、単独で又は1種以上の他の治療モダリティと組み合わせて細胞又は動物に投与するために、薬学的に許容されるか、又は生理学的に許容される溶液に製剤化された組成物を指す。必要に応じて、本発明の組成物は、他の薬剤、例えば、サイトカイン、成長因子、ホルモン、低分子、化学療法薬、プロドラッグ、薬物、抗体、又は他の様々な薬学的活性薬剤等とも組み合わせて投与され得ることも理解されるであろう。組成物に含まれてもよい他の成分への制限は実質的にないが、追加の薬剤が、意図される治療を送達する組成物の能力に悪影響を与えないこととする。

語句「薬学的に許容される」は、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、又は他の問題若しくは合併症を伴わずにヒト及び動物の組織と接触させて使用するのに好適であり、妥当な利益／リスク比に見合う化合物、物質、組成物、及び／又は剤形を指すために本明細書において用いられる。

本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤」としては、限定されるものではないが、ヒト又は飼育動物での使用が許容可能であるとアメリカ食品医薬品局（United States Food and Drug Administration）により認められている、任意の補助剤、担体、賦形剤、流動促進剤、甘味剤、希釈剤、防腐剤、色素／着色剤、調味料、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、安定剤、等張剤、溶媒、界面活性剤、又は乳化剤が挙げられる。例示的な薬学的に許容される担体としては、限定されるものではないが、糖、例えば、ラクトース、グルコース、及びスクロース；デンプン、例えば、トウモロコシデンプン及びジャガイモデンプン；セルロース及びその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、及び酢酸セルロース；トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；ココアバター、蝋、動物性及び植物性脂肪、パラフィン、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、酸化亜鉛；油、例えば、落花生油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、及び大豆油；グリコール、例えば、プロピレングリコール；ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、及びポリエチレングリコール；エステル、例えば、オレイン酸エチル及びラウリン酸エチル；寒天；緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム；アルギン酸；発熱物質を含まない水；等張食塩水；リンガー液；エチルアルコール；リン酸緩衝液；並びに医薬製剤に用いられる任意の他の適合可能な物質が挙げられる。

特定の実施形態において、本発明の組成物は、本明細書において意図される量のT細胞を含む。本明細書で使用する場合、用語「量」は、臨床結果を含む、有益な又は所望の予防成果又は治療成果を達成するための、遺伝子改変治療細胞、例えば、T細胞の「効果的な量」又は「有効量」を指す。

「予防上有効量」は、所望の予防結果を達成するのに有効な遺伝子改変治療細胞の量を指す。予防用量は、疾患の早期段階の前に又は早期段階で対象に使用されるため、予防上有効量は、典型的には、治療上有効量未満であるが、必ずしも治療上有効量未満ではない。予防上という用語は、必ずしも特定の医学的障害の完全な阻止又は防止を指すわけではない。予防上という用語は、或る特定の医学的障害を発症するリスク又はその症状が悪化するリスクの低減も指す。

遺伝子改変治療細胞の「治療上有効量」は、個体の病態、年齢、性別、及び体重、並びに幹細胞及び前駆細胞が個体において所望の反応を誘発する能力等の因子により異なり得る。また治療上有効量は、治療上有益な効果がウイルス又は形質導入された治療細胞の任意の毒性又は有害作用を上回るものでもある。用語「治療上有効量」は、対象（例えば、患者）を「処置」するのに有効な量を包含する。治療量が示される場合、投与される本発明の組成物の正確な量は、年齢、体重、腫瘍サイズ、感染又は転移の程度、及び患者（対象）の状態の個体差を考慮して医師により決定され得る。

一般に、本明細書に記載されるT細胞を含む医薬組成物は、10²個細胞／kg体重～10¹⁰個細胞／kg体重、好ましくは10⁵個細胞／kg体重～10⁷個細胞／kg体重の投与量（それらの範囲内の全ての整数値が含まれる）で投与され得ると述べることができる。細胞数は、組成物が意図される最終的な用途及びそれに含まれる細胞の種類に依存する。本明細書において提供される用途では、細胞は、一般に1リットル以下の容量であり、500 ml以下、更には250 ml又は100 ml以下であり得る。したがって、所望の細胞密度は、典型的には、10⁶個細胞／mlより高く、一般に、10⁷個細胞／mlより高く、一般に、10⁸個細胞／ml以上である。臨床的に関連する数の細胞は、累積的に10⁵個細胞、10⁶個細胞、10⁷個細胞、10⁸個細胞、10⁹個細胞、10¹⁰個細胞、10¹¹個細胞、又は10¹²個細胞に等しいか、又はそれを超える複数回注入に分割され得る。本発明の幾つかの態様では、特に全ての注入される細胞が特定の標的抗原に対して再方向付けされている場合、より少数の細胞が投与され得る。細胞組成物は、これらの範囲内の投与量で複数回投与され得る。細胞は、治療を受けている患者に対して同種、同系、異種、又は自家であり得る。

一般に、本明細書に記載されるように活性化され、増やされた細胞を含む組成物は、免疫不全状態である個体において生じる疾患の処置及び予防において利用され得る。特に、本明細書において意図される改変T細胞を含む組成物は、血液系悪性腫瘍の処置に使用される。本発明の改変T細胞は、単独で、又は担体、希釈剤、賦形剤、及び／又は他の成分、例えば、IL-2若しくは他のサイトカイン若しくは細胞集団と組み合わせた医薬組成物として投与され得る。特定の実施形態において、本明細書において意図される医薬組成物は、1種以上の薬学的又は生理学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤と組み合わされたいくらかの量の遺伝子改変T細胞を含む。

T細胞を含む本発明の医薬組成物は、緩衝剤、例えば、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水等；炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、スクロース、又はデキストラン、マンニトール；タンパク質；ポリペプチド又はアミノ酸、例えば、グリシン；酸化防止剤；キレート剤、例えば、EDTA又はグルタチオン；補助剤（例えば、水酸化アルミニウム）；及び防腐剤を含み得る。本発明の組成物は、好ましくは非経口投与、例えば、血管内（静脈内又は動脈内）、腹腔内、又は筋肉内投与用に製剤化される。

液体医薬組成物（それらが溶液、懸濁液等の形態であるかに関わらず）は以下の1つ以上を含み得る：滅菌希釈剤、例えば注射用水、食塩水、好ましくは生理食塩水、リンガー液、等張塩化ナトリウム、溶媒若しくは懸濁媒として働くことができる合成モノグリセリド若しくはジグリセリド等の不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又は他の溶媒；ベンジルアルコール又はメチルパラベン等の抗菌剤；アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウム等の酸化防止剤；エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩等の緩衝剤、及び塩化ナトリウム又はデキストロース等の等張化剤。非経口調製物は、ガラス又はプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器、複数回投与バイアル又は袋に封入することができる。注射用医薬組成物は無菌であるのが好ましい。

特定の実施形態において、本明細書において意図される組成物は、単独の又は1種以上の治療薬と組み合わされた有効量のT細胞を含む。したがって、T細胞組成物は、単独で又は他の既知の癌処置、例えば、放射線療法、化学療法、移植、免疫療法、ホルモン療法、光線力学療法等と組み合わせて投与され得る。組成物は、抗生物質と組み合わせて投与され得る。かかる治療薬は、本明細書に記載される特定の病態、例えば、特定の癌の標準的な処置として当該技術分野において認められていてもよい。意図される例示的な治療薬としては、サイトカイン、成長因子、ステロイド、NSAID、DMARD、抗炎症薬、化学療法薬、放射線療法、治療用抗体、又は他の活性薬剤及び補助薬剤が挙げられる。

T細胞製品は、患者の移植前処置が実施されるまで、液体窒素の気相中のジメチルスルホキシド（DMSO）／ヒト血清アルブミン（10%/90% vol/vol）中に凍結保存され得る。かかる保存は、T細胞製品の生存率及び機能を阻害しない。

治療方法
本明細書において意図される遺伝子改変細胞は、望ましくない細胞増殖の存在に関連する医学的障害の処置、好ましくは血液系悪性腫瘍に使用する養子免疫療法の改善された方法を提供する。

特定の実施形態において、本明細書において意図される改変T細胞を含む組成物は、限定されるものではないが、例えば、非ホジキンリンパ腫（NHL）、例えば、B細胞NHL又はT細胞非ホジキンリンパ腫等の白血病腫瘍細胞播種を有するか、又は有さないB細胞悪性腫瘍が挙げられる血液悪性腫瘍の処置に使用される。

更なる実施形態において、本方法は、非ホジキンリンパ腫（NHL）、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、及び／又は多発性骨髄腫から選択される血液系悪性腫瘍の処置に関する。

非ホジキンリンパ腫は、リンパ球（白血球）の癌の大きな集まりを包含する。非ホジキンリンパ腫は、任意の年齢で発症し得て、多くの場合、正常より大きなリンパ節、熱、及び体重減少により特徴付けられる。非ホジキンリンパ腫は、リンパ節外部位、例えば、中枢神経系、肺、腸管、結腸、及び消化管を含む粘膜組織にも存在し得る。多数の異なる型の非ホジキンリンパ腫が存在する。例えば、非ホジキンリンパ腫は、侵攻（急速成長）型及び緩徐（緩徐成長）型に分類され得る。

非ホジキンリンパ腫は、B細胞及びT細胞に由来し得る。本明細書で使用する場合、用語「非ホジキンリンパ腫」は、「B細胞」及び「T細胞」非ホジキンリンパ腫の両方を包含する。B細胞非ホジキンリンパ腫（NHL）としては、バーキットリンパ腫、慢性リンパ性白血病／小リンパ球性リンパ腫（CLL/SLL）、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Bリンパ芽球性リンパ腫、及びマントル細胞リンパ腫が挙げられる。骨髄移植又は幹細胞移植後に発症するリンパ腫は、通常、B細胞非ホジキンリンパ腫である。

T細胞リンパ腫は、米国における全てのNHLの約15パーセントを占める。血液又はリンパ管の免疫芽球の成熟T細胞リンパ腫である血管免疫芽球性T細胞リンパ腫（AITL）等の多数の異なる型のT細胞リンパ腫が存在する。更なる型のT細胞リンパ腫は、皮膚T細胞リンパ腫及び白血病播種を有するT細胞リンパ腫に関する。

また、慢性リンパ性白血病（CLL）は、本発明のCARで処置することができ、未成熟白血球（Bリンパ球）の緩やかな増加を引き起こす緩徐性（緩徐成長性）の癌である。癌細胞は、血液及び骨髄を通して拡散し、リンパ節又は肝臓及び脾臓等の他の器官を冒し得る。CLLは最終的に骨髄不全を引き起こす。異なる症状の疾患は、小リンパ球性リンパ腫と称され、主に二次リンパ器官、例えば、リンパ節及び脾臓に局在する。

多発性骨髄腫は、形質細胞の単一クローンの悪性形質転換を特徴とする成熟形質細胞形態のB細胞悪性腫瘍である。これらの形質細胞はBMで増殖し、隣接する骨、場合により血液に侵入し得る。異型多発性骨髄腫としては、顕性多発性骨髄腫（overt multiple myeloma）、くすぶり型多発性骨髄腫、形質細胞白血病、非分泌骨髄腫、IgD骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、及び髄外性形質細胞腫が挙げられる。

急性骨髄性白血病（AML）は、骨髄及び血液に蓄積し、正常な血液細胞を妨害する異常細胞の急速成長を特徴とする、骨髄系列の血液細胞の癌である。AMLの遺伝的リスクが存在するようである。AMLにおける悪性細胞は骨髄芽球である。正常な造血において、骨髄芽球は、骨髄性白血球の未成熟な前駆細胞である。正常な骨髄芽球は、徐々に成熟白血球に成熟する。AMLでは、単一の骨髄芽球が遺伝子変化を蓄積し、このことが、細胞を未成熟な状態に維持し、分化を防止する。このような変異は単独では白血病を引き起こさないが、他の変異と組み合わさると、増殖を制御する遺伝子を破壊し、細胞の未成熟なクローンの制御されない増殖をもたらし、AMLを引き起こす。

急性リンパ芽球性白血病（ALL）は、多数の未成熟リンパ球の発生を特徴とする、リンパ球系列の血液細胞の癌である。ほとんどの場合、原因は不明である。遺伝的リスク因子が存在し得て、環境的リスク因子としては、放射線被曝又は化学療法が挙げられ得る。ALLにおける癌性細胞はリンパ芽球である。正常なリンパ芽球は、リンパ球とも称される成熟した感染防御B細胞又はT細胞へと発達する。ALLでは、リンパ球の正常な発生及びリンパ系細胞の数の制御の両方が不完全になる。

更なる血液系悪性腫瘍としては、基本的には血液、血液細胞、又は前駆血液細胞の任意の他の新生物、例えば、任意の所与の白血病、リンパ腫、又は骨髄腫が挙げられる。

本明細書において意図される遺伝子改変細胞は、望ましくない免疫細胞増殖の存在に関連する医学的障害、好ましくは自己抗体の産生に関連する自己免疫疾患の処置に使用する養子免疫療法の改善された方法も提供する。

本発明の一実施形態において、サイレンシングされたEBAG9を有する、本明細書に記載されるT細胞は、自己免疫疾患、好ましくは、自己抗体依存的な自己免疫疾患、好ましくは炎症性の構成要素での自己免疫疾患の処置での使用を意図するものであり、自己免疫疾患は、好ましくは高安動脈炎、巨細胞性動脈炎、家族性地中海熱、川崎病、結節性多発性動脈炎、皮膚型結節性多発動脈炎、肝炎関連動脈炎、ベーチェット症候群、ヴェーゲナー肉芽腫症、ANCA-血管炎、チャーグ－ストラウス症候群、顕微鏡的多発性血管炎、結合組織疾患の脈管炎、ヘノッホ－シェーンライン紫斑病、クリオグロブリン血症性脈管炎、皮膚白血球破砕性血管炎、熱帯大動脈炎（Tropical aortitis）、類肉腫症、コーガン症候群、ウィスコット－アルドリッチ症候群、癩腫の動脈炎、CNSの原発性血管炎、閉塞性血栓性血管炎、腫瘍随伴性動脈炎、蕁麻疹、デゴス病、骨髄異形成症候群、持久性隆起性紅斑、高免疫グロブリンD、アレルギー性鼻炎、気管支喘息、慢性閉塞性肺疾患、歯周炎、リウマチ様関節炎、アテローム性動脈硬化症、アミロイドーシス、クローン病（Morbus Chron）、潰瘍性大腸炎、自己免疫性筋炎、真性糖尿病、ギラン－バレー症候群、組織球症、骨関節炎、アトピー性皮膚炎、歯周炎、慢性副鼻腔炎、乾癬、関節リウマチ、顕微鏡的大腸炎、肺線維症、糸球体腎炎、ホイップル病、スティル病、結節性紅斑、耳炎、クリオグロブリン血症、シェーグレン症候群、エリテマトーデス、好ましくは全身性エリテマトーデス（SLE）、再生不良性貧血、骨髄線維症、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、木村病、全身性硬化症、慢性大動脈周囲炎、慢性前立腺炎、特発性肺線維症、慢性肉芽腫症、特発性アカラシア、ブレオマイシン誘導肺炎症、シタラビン誘導肺炎症、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性好中球減少症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性リンパ球減少症、シャガス病、慢性自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性肝炎、橋本甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎、グレーブス病、多腺性自己免疫症候群、自己免疫性アディソン症候群、尋常性天疱瘡、落葉性天疱瘡、疱疹状皮膚炎、自己免疫性脱毛症、白斑症、抗リン脂質症候群、重症筋無力症、スティッフ－マン症候群、グッドパスチャー症候群、交感性眼炎、毛包炎、シャープ症候群（Sharp syndrome）及び／又はエバンス症候群、特に花粉症、歯周炎、アテローム性動脈硬化症、関節リウマチ、最も好ましくはSLEから選択されることが好ましい。

ループスとしても知られる全身性エリテマトーデス（SLE）は、身体の免疫系が身体の様々な部分の健常組織を攻撃する自己免疫疾患である。症状はヒトによって異なり、軽度から重度であり得る。一般的な症状としては、関節痛及び関節腫脹、発熱、胸痛、脱毛、口腔内潰瘍、リンパ節腫脹、疲労感、並びに最も一般的には顔面の赤い発疹が挙げられる。

本明細書で使用する場合、用語「個体」及び「対象」は、多くの場合、互換的に使用され、遺伝子治療ベクター、細胞ベースの治療薬、及び本明細書の他箇所で開示される方法で処置され得る疾患、障害、又は病態の症状を示す任意の動物を指す。好ましい実施形態において、対象としては、細胞ベースの治療薬及び本明細書において開示される方法で処置され得る造血系の疾患、障害、又は病態、例えば、B細胞悪性腫瘍の症状を示す任意の動物が挙げられる。好適な対象としては、実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、又はモルモット）、家畜、及び飼育動物又はペット（例えば、ネコ又はイヌ）が挙げられる。非ヒト霊長類及び好ましくはヒト患者が挙げられる。典型的な対象としては、癌、血液系悪性腫瘍を有するか、血液系悪性腫瘍と診断されたか、又は血液系悪性腫瘍を有するリスクがあるヒト患者が挙げられる。

本明細書で使用する場合、「処置」又は「処置すること」は、疾患又は病態の症状又は病理に対する任意の有益な又は所望の効果を含み、処置されている疾患又は病態の1つ以上の測定可能なマーカーにおけるわずかな減少でさえ含み得る。処置は、任意に、疾患若しくは病態の症状の低減若しくは改善、又は疾患若しくは病態の進行の遅延を含み得る。「処置」は、必ずしも疾患若しくは病態又はそれらの随伴症状の完全な根絶又は治癒を意味するわけではない。

本明細書で使用する場合、「予防」及び同様の語、例えば、「予防した」、「予防すること」、又は「予防上」等は、疾患又は病態の発症又は再発を予防するか、阻害するか、又はその可能性を低減する手法を意味する。これは、疾患若しくは病態の発症若しくは再発を遅延させること、又は疾患若しくは病態の症状の発症若しくは再発を遅延させることも指す。本明細書で使用する場合、「予防」及び同様の語は、疾患又は病態の強度、影響、症状、及び／又は負荷を、疾患又は病態の発症又は再発前に低減することも含む。

図
本発明は、添付の図による例示により実証される。これらの図は、本発明の1つ以上の非限定的実施形態の裏付けを強化する潜在的に好ましい実施形態の更なる説明を提供するとみなされるべきである。

図面の詳細な説明
図1：EBAG9を標的とするmiRNA及びGFPをコードするレトロウイルスMP71の作製の図である。EBAG9を標的とするmiRNAは、内因性miRNA-155のヘアピンアンチセンス配列を予測されるEBAG9標的部位配列と交換することにより作製された。得られたmiRNAをコードする配列は、GFPをコードするレトロウイルスMP71ベクターにイントロン位置で挿入された（LTR：末端反復配列、PRE：翻訳後調節エレメント、Amp R：アンピシリン耐性、GFP：緑色蛍光タンパク質）。

図2：異なるEBAG9を標的とするmiRNAをコードするγレトロウイルスベクターでの形質導入後のJurkat細胞におけるヒトEBAG9発現の減少の図である。ヒトEBAG9に対して指向された異なるmiRNAを発現する異なるGFPコードベクターを用いたヒトJurkat細胞のレトロウイルス形質導入。陽性に形質導入されたGFP+細胞が蛍光活性化セルソーティング（FACS）により濃縮され、ウェスタンブロットにより解析された。カルネキシンはローディングコントロールとして使用された。1×10e6個のJurkat細胞の可溶化液が解析された。UT：非形質導入。

図3：in vitro機能アッセイ前のヒト一次T細胞のレトロウイルス形質導入の実験タイムラインの図である。

図4：EBAG9下方調節が、活性化ヒトCD8+T細胞からのグランザイムAの抗原非依存的な放出を促進することを示す図である。活性化ヒトCD8+T細胞は、SP6若しくはBCMA CARを、EBAG9を標的とするmiRNA H18と共にコードするか、又はBCMA CARのみをコードするベクターで形質導入された。上澄みにおける酵素活性がCD8+T細胞活性化後の15日目に測定された。グランザイムAの放出は、抗ヒトCD3及び抗CD28抗体による4時間のT細胞の再刺激により誘導された。値は総容量に対する百分率での放出を示す。バーは、群当たりn＝4の独立したドナーでのn＝3の実験の平均値±SEMを表す。^＊p＜0.05、^＊＊p＜0.01、^＊p＜0.001；ns：有意でない。対応のあるt検定が実行された。

図5：MP71ベクターは、EBAG9を標的とするmiRNA及びCARの同時発現に好適であることを示す図である。SP6、BCMA、又はCD19 CARのいずれかが、miRNAを含有するMP71ベクターに、NotI及びEcoRI制限部位を使用して示される位置で導入された（LTR：末端反復配列；PRE：翻訳後調節エレメント；Amp R：アンピシリン耐性；CAR：キメラ抗原受容体）。

図6：形質導入されたヒト一次T細胞におけるBCMA及びCD19 CAR発現の図である。ヒト一次T細胞が、抗ヒトCD3及び抗ヒトCD28抗体による刺激により48時間活性化された。BCMA CAR（A又はB）又はCD19 CAR（C又はD）を、それぞれEBAG9を標的とするmiRNA H18又はH17と共にコードするベクターでのヒトT細胞の形質導入が2回実行された。細胞は、IL-7/IL-15を補足して培養された。FACSが培養の6日目に実行された。群毎の1つの代表例を示す。形質導入率は、ゲートについての百分率として示される。

図7：BCMA CAR T細胞の抗原特異的細胞溶解活性は、EBAG9の下方調節により増加し得ることを示す図である。（A又はB）ヒトCD8+T細胞が、抗ヒトCD3及び抗ヒトCD28抗体による刺激により48時間活性化された。SP6若しくはBCMA CARのいずれかのみをコードするか、又はEBAG9を標的とするmiRNA H18と共にコードするベクターでのヒトCD8+T細胞の形質導入が2回実行された。細胞は、高濃度のIL-2を補足して13日間培養された。in vitro細胞傷害性アッセイの前に、CAR T細胞は、低濃度のIL-2を補足して48時間培養された。in vitro細胞傷害性アッセイは、CAR T細胞培養の15日目に実行された。形質導入率は、UTを加えることにより20%～30%に調整された。[51Cr]クロム標識されたMM細胞株（A）及びB-NHL細胞株（B）は、形質導入されたヒトT細胞と共に異なるエフェクター対標的比率で4時間共培養された。データは平均±SEMエラーバーを示す。群当たり4人～8人の異なるドナーでn＝5の実験が二重反復で実行された。^＊p＜0.05、^＊＊p＜0.01、^＊＊＊p＜0.00.1；ns：有意でない。マン－ホウィットニーU検定が用いられた。

図8：EBAG9のサイレンシングによるCAR T細胞の細胞溶解活性の増加は、普遍的に適用可能な細胞生物学的メカニズムであることを示す図である。ヒトCD8+T細胞が、抗ヒトCD3及び抗ヒトCD28抗体による刺激により48時間活性化された。SP6 CAR若しくはCD19 CARのいずれかをコードするか、又はEBAG9を標的とするmiRNA H17と共にコードするベクターでのヒトCD8+T細胞の形質導入が2回実行された。細胞は、高濃度のIL-2を補足して13日間培養された。in vitro細胞傷害性アッセイの前に、CAR T細胞は、低濃度のIL-2を補足して48時間培養された。in vitro細胞傷害性アッセイは、CAR T細胞培養の15日目に実行された。形質導入率は、UTの添加により15%に調整された。[51Cr]クロム標識されたJeko-1細胞株が、形質導入されたヒトT細胞と共に異なるエフェクター対標的比率で4時間共培養された。データは平均±SEMエラーバーを示す。群当たり3人～6人の異なるドナーでn＝3の実験が二重反復で実行された。^＊p＜0.05、^＊＊p＜0.01、^＊＊＊p＜0.00.1；ns：有意でない。マン－ホウィットニーU検定が用いられた。

図9：サイレンシングされたEBAG9を有するin vivoで遺伝子操作されたBCMA CAR T細胞は、より効率的に多発性骨髄腫細胞を根絶することを示す図である。（A）NSGマウスには、GFP及びホタルルシフェラーゼを安定的に発現する1×10e7個のMM.1S細胞が移植された。6日目に腫瘍接種がIVISにより150 sの照射で可視化された。1日後に、1×10e6個のCAR+細胞（Il-7/IL-15を補足した培養の10日目～13日目）が移植され、処置効率がIVISにより60 sの照射で観察された。（B）身体全体を網羅する関心対象の領域から得られた生物発光シグナル強度の平均値±SEMが、1つの実験において各群及び時点についてプロットされた。（C）15日目及び16日目に、動物が屠殺され、骨髄におけるCD138+GFP+腫瘍細胞がフローサイトメトリーにより定量された。n＝2の実験の平均値±SEMがプロットされている。^＊p＜0.05、^＊＊p＜0.01、^＊＊＊p＜0.00.1；ns：有意でない。マン－ホウィットニーU検定が用いられた。

図10：CRISPRにより媒介されるEBAG9ノックアウトの標的部位の有効性検証の図である。（A）7つのエキソンからなるヒトEBAG9遺伝子の図式的概観。エキソン4の異なる領域を標的とする6つのガイドRNA（E1～E6）が設計された。（B及びC）ヒト一次T細胞が、様々なガイドRNA（E1～E6）及びCas9タンパク質と共にエレクトロポレーションされる前に、ヒトCD3/CD28 Dynabeadによる刺激により48時間活性化された。活性化後の9日目に、ゲノムDNA及びタンパク質試料が、それぞれ遺伝子編集効率（B）又はEBAG9タンパク質発現レベル（C）の解析のために採取された。3つの実験のうちの1つの代表的なウェスタンブロットを示す。

本発明は、以下に開示される実施例により実証される。実施例は、本発明の潜在的に好ましい非限定的実施形態のより詳細な説明の技術的裏付けを提供する。

実施例の要約
1．マウス又はヒトEBAG9を標的とするmiRNAをレトロウイルス発現ベクターにクローニングし、続いて、ヒト又はマウスCD8+T細胞の形質導入を行った。ウェスタンブロット解析により可視化されるように、ヒト及びマウスCD138+T細胞における90%超のEBAG9のノックダウンが達成された。
2．抗原特異的マウスT細胞（ポリクローナル）の形質導入を、EBAG9を標的とするmiRNAをコードするγ-レトロウイルスを用いて実施し、その後に、RAG2-KOマウスへのそれらの養子移入を達成した。これらのマウスを、SV40ラージT抗原（ペプチドIV）でパルスした脾細胞に曝露した。in vivo殺傷アッセイにおいて、EBAG9ノックダウンを有する遺伝子操作されたT細胞は、未改変T細胞又は対照T細胞と比べて殺傷においてより効果的だった。
3．ヒトT細胞を、様々なCARと組み合わせたEBAG9を標的とするmiRNAをコードするγ-レトロウイルスで形質導入した。これらの細胞をin vitro細胞傷害性アッセイに使用し、ここで、標的細胞は選択されたCARの同族抗原を発現した。本発明者らは、CAR陽性T細胞の頻度が低い（30%未満）場合に、BCMA又はCD19のいずれかを発現する標的細胞の細胞溶解の増強を達成した。
4．ヒトT細胞を、抗BCMA CARと組み合わせたEBAG9を標的とするmiRNAをコードするγ-レトロウイルスで形質導入した。NSGマウスに多発性骨髄腫細胞株MM.1Sを移植し、腫瘍の発生をIVISイメージングにより測定した。次いで、これらのマウスを、対照のCARを発現するT細胞、標準的なBCMA CARを発現するT細胞、及びヒトEBAG9を標的とするmiRNAを共発現する遺伝子操作されたBCMA CARを発現するT細胞で処置した。CAR T細胞投与の14日後に腫瘍の進行を測定した。増強された細胞溶解力を有する少数のT細胞の性能をより良く同定するために、CAR T細胞を少数に維持した。EBAG9をサイレンシングしたmiRNAを賦与した抗BCMA CAR T細胞は、腫瘍制御において優れており、骨髄からの腫瘍細胞の完全な根絶をもたらした。

レトロウイルスベクター設計
クローニング及びmiRNA配列
ヒトEBAG9のサイレンシングのために、ヒトEBAG9遺伝子のオープンリーディングフレーム内の領域を標的とする異なるmiRNAを作製した。内因性RNAi機構の要件を反映するmiRNA設計のために4つの異なる標的部位予測プログラムを使用して、好適な標的部位を同定した（WIsiRNA、BlockIT、siDESIGN、OligoWalk）。miRNAの二次構造は、RNAi機構による認識及びプロセシングに重要である。miRNA構造の特徴は、或る程度不定形の骨格及びアンチセンス配列をコードする高度に塩基対を形成したヘアピンである。

Ebag9を標的とするmiRNAを作製するために、内因性miRNA-155を使用した。ヘアピン構造内のアンチセンス配列を含有する21個のヌクレオチドを、予測されるEBAG9標的部位配列と交換した（表1）。

表1：ヒトEBAG9遺伝子に対して指向されるヘアピン配列。
EBAG9を標的とするアンチセンス配列
配列番号

得られたmiRNAをコードする配列を、GFPをコードするレトロウイルスMP71ベクターにMluI及びNsiI制限部位を使用してイントロン位置で挿入した。MP71ベクターは、高い形質導入効率及び一次T細胞での導入遺伝子の安定した発現で知られている。miRNAの転写はポリメラーゼIIプロモーターにより調節されるため、MP71の高活性な5'LTRがmiRNA及び導入遺伝子の発現を駆動するために使用され得る。

EBAG9を標的とするmiRNAのノックダウン効率
タンパク質レベルでのmiRNAにより媒介されるEBAG9下方調節の効率を、ヒト急性T細胞白血病細胞株Jurkat J76で試験した。非形質導入T細胞（UT）と比較して、約80%のEBAG9ノックダウン効率を、H16、H17、及びH18で検出することができた。対照的にH19は、EBAG9タンパク質の下方調節を達成しなかった。miRNAを含まないMP71-GFPベクターは、対照として機能した。最も効果的なmiRNAであるH17及びH18を、ヒト一次T細胞での更なる解析のために選択した。

適用例
ヒト末梢血単核細胞（PBMC）を健常なボランティアドナーから単離し、CD8+T細胞を磁気細胞分離（ネガティブセレクション）により濃縮した。CD8+T細胞を、抗ヒトCD3及び抗ヒトCD28抗体による刺激により48時間活性化した。次いで、活性化したヒトCD8+T細胞を、2ラウンドのレトロウイルス形質導入に供し、高濃度のIL-2（100 IU/ml）及びIL-15（10 ng/ml）を補足して培養した。CD8+T細胞活性化の13日後に、サイトカインの補足を、10 IU/mlのIL-2及び1 ng/mlのIL-15に減少させた。機能アッセイを48時間後に実行した（図3）。グランザイムAの活性を決定するために、ヒトCAR T細胞（活性化後の15日目）を、プレートに結合した抗ヒトCD3抗体及び抗ヒトCD28抗体で4時間再刺激した。上澄みをグランザイムA基質溶液とインキュベーションすることによりグランザイムA活性について解析した。生成物濃度は酵素活性と相関する。コーティングされていないプレートに移されたCAR T細胞の上澄みを、グランザイムAの基底分泌の対照として使用した。

EBAG9サイレンシングが、活性化T細胞からのグランザイムAのようなエフェクター分子の放出を増加させることを証明するために、in vitro放出アッセイを実行した。CD8+T細胞を健常なドナーから単離し、2回形質導入し、高濃度のIL-2を補足して13日間培養した。15日目のin vitro機能アッセイの前に、IL-2の補足を48時間減らした。培養の15日目に、T細胞を抗ヒトCD3/CD28抗体で4時間再刺激することによりグランザイムA放出を誘導した。BCMA CARで形質導入されたT細胞から放出されたグランザイムAの量は、UTのものと同程度であった。対照的に、H18-BCMA CAR構築物で形質導入されたT細胞は、2倍高い量のグランザイムAを放出した。同様に、H18 miRNAもSP6 CAR T細胞に増強された細胞溶解性エフェクター分子の分泌を賦与した（図4）。

EBAG9を標的とするmiRNA及びCARの同時発現
クローニング
EBAG9に特異的なmiRNA及びCARの同時発現を可能にするレトロウイルスベクターを作製するために、miRNAをコードするMP71-GFPベクターのGFP遺伝子を、GFPと隣接するNotI及びEcoRI制限部位を使用してCARカセットに交換した。この戦略を使用して、EBAG9に特異的なmiRNA H18及びBCMA CARをコードするレトロウイルスベクター並びにEBAG9に特異的なmiRNA H17及びCD19 CARをコードするレトロウイルスベクターをクローニングした（図5）。機能アッセイの陰性対照として、いずれの天然に存在するリガンドも有さないSP6 CARを、EBAG9を標的とするmiRNA H17及びH18と組み合わせた。

CARの発現
BCMA若しくはCD19 CARのみをコードするか、又はそれぞれEBAG9に特異的なmiRNA H18若しくはH17と併用したMP71ベクターを使用して、抗ヒトCD3/CD28活性化ヒト一次T細胞のレトロウイルス形質導入を2回実行した。IL-7及びIL-15を補足して細胞を培養した。6日目にIgGヒンジ領域の染色を実行して、CAR発現を解析し、形質導入効率を決定した（図6）。

in vitro適用例
CAR T細胞の抗原特異的細胞溶解能力に対するEBAG9下方調節の効果を調べるために、in vitro細胞傷害性アッセイを実行した。in vitro細胞溶解活性は、EBAG9により制御される分泌プロセスであるグランザイム及びパーフォリンの放出について報告する。

CD8+T細胞を健常なドナーから単離し、抗ヒトCD3及び抗CD28抗体で48時間活性化し、2回形質導入し、高濃度のIL-2を補足して13日間培養した。15日目のin vitro細胞傷害性アッセイの前に、IL-2の補足を48時間減らした。15日目に、CAR T細胞を標的細胞株と4時間共培養した。アッセイの上澄みを、溶解された標的細胞により放出される[⁵¹Cr]クロムのカウント数について測定した。標的細胞の最大の放出を、標識された細胞を直接計数することにより決定した。標的細胞を単独でインキュベートすることにより自然的放出を測定した。

BCMA^high発現多発性骨髄腫（MM）細胞株OPM-2、及びBCMA^low発現B細胞非ホジキンリンパ腫（B-NHL）細胞株DOHH-2を、BCMA CAR T細胞の標的細胞として使用した。培養の15日目でのCAR T細胞との共培養の前に、標的細胞を[⁵¹Cr]クロムと共にインキュベートした。異なる標的対エフェクター比率での4時間の共培養後に、BCMA CARで形質導入したCD8⁺T細胞において細胞溶解活性が観察されたが、UT又はSP6 CAR T細胞では、活性を全く又はほとんど検出することができなかった。したがって、EBAG9の下方調節による非特異的なT細胞活性化は発生しなかった。80:1の最も高いエフェクター対標的比率では、BCMA CAR T細胞の標的細胞溶解は約30%であった。H18-BCMA CAR T細胞におけるBCMA CARとEBAG9サイレンシングとの組合せは、試験された全ての細胞株においてCAR T細胞による細胞溶解効率の有意な増加をもたらした。例えば、MM細胞株OPM-2では、H18-BCMA CAR T細胞は、BCMA CARのみと比べて約1.5倍高い溶解率を有した。異なる計算では、BCMA CARで形質導入したT細胞の最大殺傷率（E:T 80:1）を、わずか1/4～1/8のEBAG9ノックダウンBCMA CAR T細胞により達成することができた。したがって、有効用量レベルが大幅に減少した。

CAR T細胞の細胞傷害活性のRNAiにより媒介される増加を確認するために、別のmiRNA配列（H17）をCD19 CARにおいて使用した。H17は、EBAG9遺伝子のオープンリーディングフレーム内のH18と同じ領域を標的とする。BCMA CARと同様にin vitro細胞傷害性アッセイを実行した。レトロウイルス形質導入されたCD8+T細胞の形質導入率を、UTを使用して約15%に調整した。CD19^high発現B-NHL細胞株JeKo-1を標的細胞としてクロム放出アッセイにおいて使用した。4時間の共培養後、UT及び対照のH17-SP6 CAR T細胞では溶解活性をほとんど検出することができなかった。Jeko-1細胞において、CD19 CARで形質導入したT細胞は、約20%の特異的標的細胞溶解を達成した（E:T 80:1）。以前の結果と一貫して、EBAG9サイレンシングは、CAR T細胞に殺傷活性の大幅な増加を賦与した。RNAiにより媒介されるT細胞の遺伝子操作は、細胞傷害性の2倍の増加をもたらした。さらに、CD19 CAR T細胞によるJeKo-1細胞の最大溶解を達成するのに、わずか1/5～1/8のH17-CD19 CAR T細胞が必要とされた（図8）。

in vivo適用例
in vitro機能的アッセイの知見をin vivoモデルに応用するために、多発性骨髄腫異種移植モデルを確立した。ヒト多発性骨髄腫細胞株及びヒト一次CAR T細胞の異種移植に好適な動物モデルは、NOD/scid γ鎖欠損免疫不全マウス（NSG）系統である。これらのマウスは成熟T又はB細胞を有さない。加えて、NK細胞分化が阻害される。NSGマウスにBCMAを発現する多発性骨髄腫細胞株MM.1Sを接種した。腫瘍の進行を、ホタルルシフェラーゼ－eGFP構築物を安定的に発現するMM.1S細胞株の生物発光イメージングによりモニタリングした。腫瘍細胞生着が移植の6日後にIVISイメージングにより検出された。IL-7/IL-15を補足した培養の10日目～13日目の1×10e6個のCAR+T細胞の単回用量を、1日後に静脈内注射した。腫瘍成長をIVIS連続イメージングにより移植後の14日目まで追跡した。マウスを15日目～16日目に屠殺した。残存する腫瘍細胞及びCAR T細胞の数について骨髄をフローサイトメトリーにより解析した。

IVIS連続イメージングにより、6日目と14日目との間の急速な腫瘍成長が明らかとなった。腫瘍活動性と相関する最も強い特異的なルシフェラーゼシグナルを、骨髄に限局することができた。非標的化H18-SP6 CAR T細胞での処置は、腫瘍成長を制御することができなかった。最も大きい腫瘍負荷がこの群のマウスにおいて観察された。したがって、EBAG9サイレンシング及びそれに続くエフェクター分子放出能力の増加に起因する抗原非依存的なT細胞活性化は起きなかった。BCMA CAR T細胞で処置されたマウスは、より小さい腫瘍の進行を示した。しかしながら、この少数のエフェクターCAR T細胞での臨床的有効性は、中程度であった。対照的に、H18-BCMA CAR T細胞が投与されたマウスは、ほとんど腫瘍シグナルを示さなかった（図9A及び図9B）。これに対応して、骨髄腫細胞がホーミングする主要な適所である骨髄における腫瘍細胞数（GFP+CD138+）を解析すると、H18-SP6 CAR対照群での腫瘍細胞の定量化は、BCMA CAR群と比較して2倍高い数を示した。注目すべきことに、BCMA CAR T細胞におけるRNAiにより媒介されるEBAG9サイレンシングで処置されたマウスでは、腫瘍細胞はほとんど存在しなかった。まとめると、RNAiにより媒介されるEBAG9の下方調節は、少数のエフェクター細胞であっても抗腫瘍効率の強い増加をもたらした（図9C）。

CRISPRにより媒介されるEBAG9ノックアウト
上記の実施例において、EBAG9に特異的なmiRNAの発現を可能にするレトロウイルスベクターで細胞を形質導入することによるEBAG9下方調節が実証された。かかるベクターは、形質導入されたT細胞におけるEBAG9 miRNAの抗原特異的CAR構築物との同時発現でも用いられる。下方調節されたEBAG9によるCAR T細胞の細胞溶解能力の増強が、in vitro及びin vivoの両方で実証された。

上記の実施例を補足するために、EBAG9を下方調節する追加の手段を評価した。以下の実施例は、CRISPRにより媒介されるEBAG9ノックアウトを用い、EBAG9が、CRISPRにより処理されたT細胞から効果的に除去され得るか、又は低減され得ることを実証し、これにより、細胞傷害性T細胞におけるEBAG9を阻害する追加の手段を可能にする。

ヒト一次T細胞においてEBAG9をノックアウトするために、ヒトEBAG9遺伝子のエキソン4を標的とする異なるガイドRNA（gRNA）を作製した（E1～E4）。ヒト末梢血単核細胞（PBMC）を健常なボランティアドナーから単離し、CD3⁺T細胞をヒト抗CD3/CD28 Dynabeadによる刺激により活性化させた。次いで、活性化ヒトCD3⁺T細胞を、gRNA及びCas9タンパク質とのエレクトロポレーションに供し、IL-2補足下で培養した。CD3⁺T細胞活性化後の9日目に、ゲノムDNAを単離し、タンパク質可溶化液を作製した。TIDE解析（分解によるインデルの追跡（tracking of Indels by decomposition））及びEBAG9タンパク質レベルのウェスタンブロット解析による、EBAG9遺伝子座における遺伝子編集効率の解析は、gRNA E2、E4、及びE6での50%のノックアウト効率を明らかにした。対照的に、gRNA E1、E3、及びE5は、内因性EBAG9発現レベルのほんの軽微な減少を示す。非標的化gRNAと共に電気穿孔されたCD3⁺T細胞は、対照（ctl）として機能した。結果を図10に示す。したがって、CRISPRにより媒介される遺伝子編集は、ヒトEBAG9遺伝子座を標的とすることができ、抗原標的化トランスジェニック構築物を発現する細胞傷害性T細胞におけるEBAG9阻害の実行可能な手段である。

CRISPRにより媒介されるEBAG9遺伝子編集のCAR T細胞の抗原特異的細胞溶解能力に対する効果を調べるためのin vitro細胞傷害性アッセイは、進行中であり、上記のようなmiRNAにより媒介されるEBAG9の下方調節について示されるように、かかるEBAG9がCRISPR編集されたCAR T細胞のグランザイム及びパーフォリンの放出による増強された細胞溶解活性を実証すると期待される。

図面訳
図1
Intron イントロン
miR155 back bone miR155骨格
EBAG9-specific sequence EBAG9特異的配列

図2
Calnexin カルネキシン
unspecific 非特異的

図3
high IL-2 高濃度IL-2
low IL-2 低濃度IL-2
Day 0 0日目
stimulation of CD8⁺ with anti-CD3/28 抗CD3/28でのCD8⁺の刺激
Day 2 2日目
Day 3 3日目
retroviral transduction レトロウイルス形質導入
Day 13 13日目
Day 15 15日目
functional in vitro assays in vitro機能アッセイ

図4
Granzyme A secreted (% of total) 分泌されたグランザイムA（総量のうちの%）

図5
Intron イントロン
miR155 back bone miR155骨格
EBAG9-specific sequence EBAG9特異的配列

図6B
Counts カウント数

図6D
Counts カウント数

図7A
Lysis (%) 溶解（%）
Effector:Target エフェクター：標的

図7B
Lysis (%) 溶解（%）
Effector:Target エフェクター：標的

図8
Lysis (%) 溶解（%）
Effector:Target エフェクター：標的

図9A
H18-SP6 CAR T cells H18-SP6 CAR T細胞
BCMA CAR T cells BCMA CAR T細胞
H18-BCMA CAR T cells H18-BCMA CAR T細胞
Day 6 after tumor cells i.v. 腫瘍細胞静脈内注入後の6日目
Days after T cell transfer T細胞移入後の日数
Day -1 -1日目
Day 6 6日目
Day 14 14日目
150 s exposure 150 sの照射
60 s exposure 60 sの照射

図9B
Whole body tumor burden 全身の腫瘍負荷
Avg Radiance [p/s/cm²/sr] 平均輝度[p/s/cm²/sr]
Time [d] 時間[d]

図9C
Tumor load bone marrow 骨髄の腫瘍負荷
% of CD138⁺GFP⁺cells CD138⁺GFP⁺細胞のうちの%

図10A
EBAG9 potential sgRNA sites EBAG9のsgRNA部位候補
Translated region 翻訳される領域

図10B
genomic EBAG9 analysis ゲノムのEBAG9解析
Total gene editing efficiency 遺伝子編集総合効率

図10C
EBAG9 protein level EBAG9タンパク質レベル
different target sites 異なる標的部位
Calnexin カルネキシン

Claims

抗原標的化トランスジェニック構築物をコードする1種以上の外来性核酸分子を含む遺伝子改変細胞傷害性T細胞であって、前記細胞においてエストロゲン受容体結合断片関連抗原9（EBAG9）活性が（対照細胞傷害性T細胞と比較して）阻害されている、遺伝子改変細胞傷害性T細胞。
EBAG9活性の阻害が、細胞溶解性顆粒及び／又はグランザイムを含有する分泌型リソソームの放出の（対照細胞傷害性T細胞と比較した）増加に関連する、請求項1に記載の遺伝子改変T細胞。
抗原標的化トランスジェニック構築物がキメラ抗原受容体（CAR）である、請求項1又は2に記載の遺伝子改変T細胞。
抗原標的化トランスジェニック構築物がT細胞受容体（TCR）である、請求項1～3のいずれか一項に記載の遺伝子改変T細胞。
EBAG9活性の阻害が、EBAG9のノックダウンにより、又は、低分子干渉RNA（siRNA）、短鎖ヘアピンRNA（shRNA）、及び／又はマイクロRNA（miRNA）によるEBAG9発現のRNA干渉により達成される、請求項1～4のいずれか一項に記載の遺伝子改変T細胞。
EBAG9活性の阻害が、1種以上の外来性核酸分子によるT細胞ゲノムの遺伝子改変により達成され、該外来性核酸分子が、抗原標的化トランスジェニック構築物及びEBAG9のノックダウンのためのRNA干渉配列をコードするベクターを含む、請求項5に記載の遺伝子改変T細胞。
EBAG9活性の阻害が、EBAG9遺伝子の発現を妨げる及び／又はその配列を破壊することによるT細胞ゲノムの遺伝子改変により達成され、又は、抗原標的化トランスジェニック構築物をコードする外来性核酸分子が、T細胞ゲノム内のEBAG9遺伝子内に、EBAG9遺伝子に隣接して、又はEBAG9遺伝子に結合して配置され、これにより、前記EBAG9遺伝子の発現を妨げる及び／又はその配列を破壊する、請求項1～6のいずれか一項に記載の遺伝子改変T細胞。
薬剤として使用される請求項1～7のいずれか一項に記載の遺伝子改変T細胞。
抗原標的化トランスジェニック構築物により標的とされる抗原が、病的細胞増殖を起こしている、及び／又はそれに関連する標的細胞で発現している、増殖性疾患の処置において薬剤として使用される請求項1～8のいずれか一項に記載の遺伝子改変T細胞。
増殖性疾患が、血液悪性腫瘍、又は、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、及び／若しくは多発性骨髄腫であり、抗原標的化トランスジェニック構築物により標的とされる抗原若しくは腫瘍関連抗原（TAA）が、前記血液悪性腫瘍の癌性細胞で発現している、請求項9に記載の使用のための遺伝子改変T細胞。
血液悪性腫瘍がCD19を発現するB細胞癌であり、抗原標的化トランスジェニック構築物がCD19に結合するか、又は血液悪性腫瘍がBCMAを発現するB細胞癌であり、抗原標的化トランスジェニック構築物がBCMAに結合するか、又は血液悪性腫瘍がCXCR5を発現する癌であり、抗原標的化トランスジェニック構築物がCXCR5に結合する、請求項10に記載の使用のための遺伝子改変T細胞。
抗原標的化トランスジェニック構築物により標的とされる抗原が自己抗体産生に関連する標的細胞で発現しており、又は、医学的障害が全身性エリテマトーデス（SLE）又は関節リウマチである、自己抗体依存的な自己免疫疾患の処置において薬剤として使用される請求項9に記載の遺伝子改変T細胞。
薬学的に許容される担体を追加的に含む、増殖性疾患の処置に好適な請求項1～12のいずれか一項に記載の遺伝子改変T細胞を含む医薬組成物。
抗原標的化構築物及びエストロゲン受容体結合断片関連抗原9（EBAG9）のノックダウンのためのRNA干渉配列をコードする配列を含む核酸ベクター又は核酸ベクターの組合せ。
遺伝子改変細胞傷害性T細胞の細胞溶解活性を増加させるin vitroでの方法であって、前記T細胞が、抗原標的化トランスジェニック構築物をコードする1種以上の外来性核酸分子を含み、該方法が、前記T細胞におけるエストロゲン受容体結合断片関連抗原9（EBAG9）の活性を阻害することを含み、又は、EBAG9活性を阻害することが、
a. EBAG9発現のRNA干渉、又は、低分子干渉RNA（siRNA）、短鎖ヘアピンRNA（shRNA）、及び／又はマイクロRNA（miRNA）によるEBAG9のノックダウン、又は、
b. CRISPR/Cas9若しくはTALENによりEBAG9遺伝子の発現を妨げる及び／又はその配列を破壊することによるT細胞ゲノムの遺伝子改変を含む、方法。