ES2823648T3 - Métodos y composiciones para tratar y prevenir enfermedades asociadas con la integrina AVB8 - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo aislado que se une específicamente a la integrina β8 humana e inhibe la adhesión del péptido asociado a latencia (LAP) a ανβ8, en donde el anticuerpo comprende: las regiones determinantes de complementariedad HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de DYYMN (SEQ ID NO: 95), WIDPDNGNTIYDPKFQG (SEQ ID NO: 31) y RLLMDY (SEQ ID NO: 32), respectivamente y las regiones determinantes de complementariedad LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de RSTKSLLHFNGNTYLF (SEQ ID NO: 51), YMSNLAS (SEQ ID NO: 52) y MQSLEYPFT (SEQ ID NO: 53), respectivamente.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y composiciones para tratar y prevenir enfermedades asociadas con la integrina AVB8

Antecedentes de la invención

Los miembros de la familia de las integrinas reconocen una variedad de ligandos extracelulares restringidos espacialmente. Tradicionalmente, la unión de integrinas activa las señales citoplasmáticas en la célula que expresa integrina y contribuye a la adhesión, migración, proliferación y supervivencia celular. Al menos dos miembros de esta familia, avp6 y avp8, realizan una función adicional, la activación de complejos latentes del factor de crecimiento transformante p. En efecto, este proceso permite que las integrinas de una célula activen señales en células adyacentes (en el caso de avp6) o cercanas (en el caso de avp8). Se ha demostrado que la activación de TGFp mediada por integrinas desempeña un papel en, por ejemplo, la modulación de la fibrosis tisular, lesión pulmonar aguda y enfisema pulmonar. Mu et al. (J. Cell Biol. 157(3), 2002, páginas 493-507) describieron el anticuerpo monoclonal 37E1 que es específico de p8 e inhibió la interacción entre avp8 y el péptido asociado a latencia de TGFpl (LAP-p1, por sus siglas en inglés). El documento WO2011/103490 igualmente divulgó el anticuerpo 37E1 y el hecho de que perturba la activación de TGFp mediada por avp8.

Breve sumario

La invención es como se expone en el conjunto de reivindicaciones adjunto. Se considera que las realizaciones y/o ejemplos de la siguiente descripción que no están cubiertos por las reivindicaciones adjuntas no forman parte de la presente invención.

Se divulgan anticuerpos (p. ej., anticuerpos aislados) que se unen específicamente a la integrina p8 humana e inhiben la adhesión del péptido asociado a latencia (LAP) a avp8.

En algunos aspectos de la divulgación, el anticuerpo reacciona de forma cruzada con la integrina p8 de ratón. En algunos aspectos de la divulgación, el anticuerpo bloquea la activación de TGFp. En algunos aspectos de la divulgación, el anticuerpo antagoniza la unión de LAP a avp8 con una CI⁵⁰ por debajo de 5 nM.

En algunos aspectos de la divulgación, el anticuerpo compite por unirse con un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en ADWA-2 (ADWA-2, ADWA-2-1 y ADWA-2-2), ADWA-8 (ADWA-8, ADWA-8-1, ADWA-8-2, ADWA-8-3), ADWA-10, ADWA-11, ADWA-13 (ADWA-13, ADWA-13-1, ADWA-13-2), ADWA-15, ADWA-16, ADWA-25 y ADWA-20.

En algunos aspectos de la divulgación, el anticuerpo comprende las regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) de las regiones variables de cadena pesada y ligera de un anticuerpo seleccionado de ADWA-2 (ADWA-2, ADWA-2-1 y ADWA-2-2), ADWA-8 (ADWA-8, ADWA-8-1, ADWA-8-2, ADWA-8-3), ADWA-10, ADWA-11, ADWA-13 (ADWA-13, ADWA-13-1, ADWA-13-2), ADWA-15, ADWA-16, ADWA-25 y ADWA-20. En algunos aspectos de la divulgación, el anticuerpo comprende la CDR1, CDR2 y CDR3 determinadas por Chothia de las regiones variables de cadena pesada y ligera de un anticuerpo seleccionado de ADWA-2 (ADw A-2, ADWA-2-1 y ADWA-2-2), ADWA-8 (ADWA-8, ADWA-8-1, ADWA-8-2, ADWA-8-3), ADWA-10, ADWA-11, ADWA-13 (ADWA-13, ADWA-13-1, ADWA-13-2), ADWA-15, ADWA-16, ADWA-25 y ADw A-20. En algunos aspectos de la divulgación, el anticuerpo comprende la CDR1, CDR2 y CDR3 determinadas por Kabat de las regiones variables de cadena pesada y ligera de un anticuerpo seleccionado de ADWA-2 (ADWA-2, ADWA-2-1 y ADWA-2-2), ADWA-8 (ADWA-8, ADWA-8-1, ADWA-8-2, ADWA-8-3), ADWA-10, ADWA-11, ADWA-13 (ADWA-13, ADWA-13-1, ADWA-13-2), ADWA-15, ADWA-16, ADWA-25 y ADWA-20.

En algunos aspectos de la divulgación, el anticuerpo comprende las regiones variables de cadena pesada y ligera de un anticuerpo seleccionado de ADWA-2 (ADWA-2, ADWA-2-1 y ADWA-2-2), ADWA-8 (ADWA-8, ADWA-8-1, ADWA-8-2, ADWA-8-3), ADWA-10, ADWA-11, ADWA-13 (ADWA-13, ADWA-13-1, ADWA-13-2), ADWA-15, ADWA-16, ADWA-25 y ADWA-20.

En algunos aspectos de la divulgación, el anticuerpo comprende las CDR de cadena pesada (Chothia o Kabat) mostradas en las SEQ ID NO: 23-25, y las CDR de cadena ligera mostradas en las SEQ ID NO: 46-48. En algunos aspectos de la divulgación, el anticuerpo comprende las CDR de cadena pesada (Chothia o Kabat) mostradas en las SEQ ID NO: 23, 26 y 25 y las CDR de cadena ligera mostradas en las SEQ ID NO: 46-48. En algunos aspectos de la divulgación, el anticuerpo comprende las CDR de cadena pesada (Chothia o Kabat) mostradas en las SEQ ID NO: 27­ 29, y las CDR de cadena ligera mostradas en las SEQ ID NO: 46, 49 y 50. En algunos aspectos de la divulgación, el anticuerpo comprende las CDR de cadena pesada (Chothia o Kabat) mostradas en las SEQ ID NO: 30-32, y las CDR de cadena ligera mostradas en las SEQ ID NO: 51-53. En algunos aspectos de la divulgación, el anticuerpo comprende las CDR de cadena pesada (Chothia o Kabat) mostradas en las SEQ ID NO: 33-35, y las CDR de cadena ligera mostradas en las SEQ ID NO: 54-56. En algunos aspectos de la divulgación, el anticuerpo comprende las CDR de cadena pesada (Chothia o Kabat) mostradas en las SEQ ID NO: 36-38, y las CDR de cadena ligera mostradas en las SEQ ID NO: 57-59. En algunos aspectos de la divulgación, el anticuerpo comprende las CDR de cadena pesada (Chothia o Kabat) mostradas en las SEQ ID NO: 36, 39 y 38 y las CDR de cadena ligera mostradas en las Se Q ID NO: 57-59. En algunos aspectos de la divulgación, el anticuerpo comprende las CDR de cadena pesada (Chothia o Kabat) mostradas en las Se Q ID NO: 40-42, y las CDR de cadena ligera mostradas en las SEQ ID NO: 60-62. En algunos aspectos de la divulgación, el anticuerpo comprende las CDR de cadena pesada (Chothia o Kabat) mostradas en las SEQ ID NO: 43-45, y las CDR de cadena ligera mostradas en las SEQ ID NO: 63.

Cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento puede incluir una o más regiones marco conservadas humanas (p. ej., FR 1, 2, 3 o 4). En algunos aspectos de la divulgación, la una o más regiones marco conservadas humanas incluyen al menos una mutación inversa. También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento.

También se divulgan ácidos nucleicos aislados que codifican cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento (p. ej., SEQ ID NO: 66-87 y variantes conservativas de los mismos). También se proporcionan vectores de expresión que comprenden el ácido nucleico. También se proporcionan células hospedadoras aisladas que comprenden los vectores.

La invención proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a la integrina p8 humana e inhibe la adhesión del péptido asociado a latencia (LAP) a avp8, en donde el anticuerpo comprende:

las regiones determinantes de complementariedad HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 95, 31 y 32, respectivamente y

las regiones determinantes de complementariedad LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de 10 SEQ ID NO: 51, 52 y 53, respectivamente.

También se proporciona el anticuerpo de la invención para su uso en un método para tratar o prevenir una enfermedad seleccionada de asma, esclerosis múltiple, lesión pulmonar aguda, artritis reumatoide, psoriasis y enfermedad pulmonar obstructiva crónica en un ser humano, comprendiendo el método administrar una cantidad suficiente de dicho anticuerpo al ser humano, tratando o previniendo así la enfermedad. En algunas realizaciones, el ser humano tiene una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en asma, esclerosis múltiple o lesión pulmonar aguda y al menos un síntoma de la enfermedad mejora mediante la activación reducida de TGFp. En algunas realizaciones, el ser humano tiene una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en artritis reumatoide, psoriasis y enfermedad pulmonar obstructiva crónica y al menos un síntoma de la enfermedad mejora mediante la activación reducida de TGFp.

También se describe un método para detectar la presencia o cantidad de integrina p8 en una muestra biológica. En algunos casos, el método comprende poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo como se describe en el presente documento y detectar la presencia, ausencia o cantidad del anticuerpo unido específicamente a p8 en la muestra. En algunos casos, el anticuerpo está enlazado a un marcador detectable, donde el marcador es fluorescente.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 proporciona gráficos de citometría de flujo de astrocitos primarios unidos por anticuerpos como se describe en el Ejemplo 1.

La Figura 2 muestra datos de experimentos de bloqueo de la adhesión de LAP como se describe en el Ejemplo 1.

La Figura 3 muestra datos para la activación de TGFp como se describe en el Ejemplo 1.

La Figura 4 muestra datos para el bloqueo de la activación de TGFp por ADWA-2 a las concentraciones indicadas. Los controles mostrados a la derecha incluyen el anticuerpo 1D11 específico para TGFp y sin anticuerpo.

La Figura 5 muestra datos para el bloqueo de la activación de TGFp por ADWA-11 a las concentraciones indicadas. Los controles mostrados a la derecha incluyen el anticuerpo 1D11 específico para TGFp y sin anticuerpo.

La Figura 6 muestra datos para el bloqueo de la activación de TGFp por ADWA-13 a las concentraciones indicadas. Los controles mostrados a la derecha incluyen el anticuerpo 1D11 específico para TGFp y sin anticuerpo.

La Figura 7 muestra datos para el bloqueo de la activación de TGFp por ADWA-15 a las concentraciones indicadas. Los controles mostrados a la derecha incluyen el anticuerpo 1D11 específico para TGFp y sin anticuerpo.

La Figura 8 muestra datos para el bloqueo de la activación de TGFp por ADWA-16 a las concentraciones indicadas. Los controles mostrados a la derecha incluyen el anticuerpo 1D11 específico para TGFp y sin anticuerpo.

La Figura 9 muestra datos para el bloqueo de la adhesión de LAP por ADWA-11. Las concentraciones de LAP para cada muestra son, de izquierda a derecha, 3 ug/ml, 1 ug/ml y 0,3 ug/ml. Los controles son sin anticuerpos (izquierda) y anticuerpo 3G9 específico para p6 (centro).

La Figura 10 muestra datos para el bloqueo de la adhesión de LAP por ADWA-2 (izquierda) y ADWA-16 (derecha) a las concentraciones indicadas. LAP se puso en contacto con células a 1 ug/ml.

La Figura 11 muestra datos para el bloqueo de la adhesión de LAP por ADWA-11. Se muestran las concentraciones de LAP para cada muestra. Los controles son sin anticuerpos (izquierda) y anticuerpo 3G9 específico para p6 (centro) para cada concentración de LAP.

La Figura 12 muestra datos para el bloqueo de la adhesión de LAP por ADWA-2, ADWA-8, ADWA-10, ADWA-11 y ADWA-13 a diversas concentraciones de anticuerpos. LAP se puso en contacto con células a 1 ug/ml. Para cada anticuerpo, de izquierda a derecha, la concentración fue de 10 ug/ml, 1 ug/ml y 0,1 ug/ml. Los resultados para el anticuerpo 3G9 de control se muestran a la derecha.

La Figura 13 muestra datos para el bloqueo de la adhesión de LAP por ADWA-15, ADWA-16, ADWA-20 y ADWA-25 a diversas concentraciones de anticuerpos. LAP se puso en contacto con células a 1 ug/ml. Para cada anticuerpo, de izquierda a derecha, la concentración fue de 10 ug/ml, 1 ug/ml y 0,1 ug/ml. Los resultados para el anticuerpo 3G9 de control se muestran a la derecha.

Descripción detallada de la invención

I. Introducción

Se describen diversos anticuerpos que se unen a la integrina p8 humana y que inhiben la adhesión del péptido asociado a latencia (LAP).

II. Definiciones

Un "antagonista" se refiere a un agente que se une a una integrina (p. ej., Avp8) y bloquea parcial o totalmente la estimulación, disminuye, previene, retrasa la activación, inactiva, desensibiliza o regula negativamente la actividad de la integrina.

Los términos "idéntico" o porcentaje de "identidad", en el contexto de dos o más secuencias de los ácidos nucleicos o polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de restos de aminoácidos o nucleótidos que son los mismos (es decir, aproximadamente un 60 % de identidad, preferentemente un 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o una identidad mayor en una región especificada, cuando se comparan y se alinean para determinar la correspondencia máxima en una ventana de comparación o región designada) como se mide utilizando algoritmos de comparación de secuencias BLAST o BLAST 2.0 con los parámetros predeterminados descritos a continuación, o mediante alineación manual e inspección visual (véase, p. ej., sitio web de NCBI ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ o similares). Por lo tanto, se dice que tales secuencias son "sustancialmente idénticas". La presente divulgación proporciona, p. ej., anticuerpos que tienen secuencias de polinucleótidos o polipéptidos que tienen al menos un 80 % de identidad, p. ej., 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad, con una secuencia de referencia, p. ej., CDR o regiones variables de cualquiera de los anticuerpos ADWA-2, ADWA-8, ADWA-10, ADWA-11, ADWA-13, ADWA-15, ADWA-16, ADWA-25 y ADWA-20. Como se describe a continuación, los algoritmos preferidos pueden tener en cuenta huecos y similares. Preferentemente, existe identidad a lo largo de una región que tiene al menos aproximadamente 25 aminoácidos o nucleótidos de longitud, o más preferentemente, en una región que tiene 50-100 aminoácidos o nucleótidos de longitud.

Para la comparación de secuencias, normalmente una secuencia actúa como secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de prueba y de referencia se introducen en un ordenador, se designan las coordenadas de subsecuencia, si fuera necesario, y se designan los parámetros del programa del algoritmo de secuencias. Preferentemente, se pueden usar los parámetros predeterminados del programa, o se pueden designar parámetros alternativos. El algoritmo de comparación de secuencias calcula entonces el porcentaje de identidades de secuencia para las secuencias de prueba respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa.

Una "ventana de comparación", como se usa en el presente documento, incluye la referencia a un segmento de una cualquiera del número de posiciones contiguas seleccionadas del grupo que consiste en de 20 a 600, habitualmente, de aproximadamente 50 a aproximadamente 200, más habitualmente, de aproximadamente 100 a aproximadamente 150 en el que se puede comparar una secuencia con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias estén alineadas de manera óptima. Los métodos de alineación de secuencias para comparación se conocen bien en la técnica. La alineación óptima de secuencias para la comparación puede realizarse, p. ej., mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Nat'l. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), mediante implementaciones informatizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Paquete de Programa informático de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl), o mediante alineación manual e inspección visual (véase, p. ej., Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 supplement)).

Un algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAsT 2,0., que se describen en Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977) y en Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990), respectivamente. Se usan BLAST y BLAST 2.0, con los parámetros descritos en el presente documento, para determinar el porcentaje de identidad de secuencia para los ácidos nucleicos y proteínas de la invención. El programa informático para realizar análisis BLAST está disponible al público a través del National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica identificar en primer lugar pares de secuencias de alta puntuación (HSP, por sus siglas en inglés) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta, que coinciden o satisfacen alguna puntuación umbral de valor positivo T cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T se refiere al umbral de la puntuación de palabra adyacente (Altschul et al., supra). Estos aciertos de palabra adyacente iniciales actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP más largos que los contengan. Los aciertos de palabra se prolongan en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia todo el tiempo que pueda aumentarse la puntuación de alineación acumulativa. Las puntuaciones acumulativas se calculan usando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de restos coincidentes; siempre > 0) y N (puntuación de penalización para restos no coincidentes; siempre < 0). Para las secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de puntuaciones para calcular la puntuación acumulativa. La prolongación de los aciertos de palabra en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de alineación acumulativa queda fuera por una cantidad X de su valor máximo obtenido; la puntuación acumulativa llega a cero o menos, debido a la acumulación de una o más alineaciones de restos con puntuación negativa; o se alcanza el final de una de las secuencias. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M= 5, N = -4 y una comparación de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza como valores predeterminados una longitud de palabra de 3, y expectativa (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)) alineaciones (B) de 50, expectativa (E) de 10, M= 5, N = -4 y una comparación de ambas cadenas.

"Ácido nucleico" se refiere a desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos en forma de cadena simple o doble y complementos de los mismos. La expresión abarca ácidos nucleicos que contienen análogos de nucleótidos conocidos o restos o enlaces modificados de la cadena principal, que son sintéticos, de origen natural y de origen no natural, que tienen propiedades de unión similares a las del ácido nucleico de referencia y que se metabolizan de forma similar a los nucleótidos de referencia. Ejemplos de dichos análogos incluyen, sin limitación, fosforotioatos, fosforoamidatos, metil fosfonatos, metil fosfonatos quirales, 2-O-metil ribonucleótidos, ácidos nucleicos peptídicos (ANP).

Salvo que se indique lo contrario, una secuencia particular de un ácido nucleico también abarca implícitamente variantes modificadas de manera conservativa de la misma (p. ej., sustituciones de codones degenerados) y secuencias complementarias, así como la secuencia indicada explícitamente. En concreto, las sustituciones de codones degenerados se pueden lograr mediante la generación de secuencias en las que la tercera posición de uno o más (o todos) codones seleccionados se sustituye con restos de base mixta y/o de desoxiinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en el presente documento para referirse a un polímero de restos de aminoácidos. Los términos abarcan polímeros de aminoácidos en los que uno o más restos de aminoácidos son un mimético químico artificial de un aminoácido de origen natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos de origen natural y polímeros de aminoácidos de origen no natural.

El término "aminoácidos" se refiere a aminoácidos de origen natural o sintéticos, así como a análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que funcionan de una manera similar a los aminoácidos de origen natural. Los aminoácidos de origen natural son los codificados mediante el código genético, así como aquellos aminoácidos que se modifican posteriormente, p. ej., hidroxiprolina, Y-carboxiglutamato, y O-fosfoserina. Análogos de aminoácidos se refiere a los compuestos que tienen la misma estructura química básica que la de un aminoácido de origen natural, es decir, un carbono a que está unido a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino, y un grupo R, p. ej., homoserina, norleucina, metionina sulfóxido, metionina metil sulfonio. Dichos análogos pueden tener grupos R modificados (p. ej., norleucina) o cadenas principales peptídicas modificadas, pero conservan la misma estructura química básica que un aminoácido de origen natural. Aminoácidos miméticos se refiere a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funcionan de manera similar a un aminoácido de origen natural.

Los aminoácidos se pueden citar en el presente documento bien por sus símbolos habitualmente conocidos de tres letras, o mediante los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura bioquímica de la IUPAC-IUB. Los nucleótidos, asimismo, se pueden mencionar por sus códigos de una letra habitualmente aceptados.

"Variantes modificadas de forma conservativa" se aplica a secuencias tanto de aminoácidos como de los ácidos nucleicos. Con respecto a secuencias de los ácidos nucleico concretas, variantes modificadas de manera conservativa se refiere a aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o donde el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, a secuencias prácticamente idénticas. A causa de la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican, todos ellos, el aminoácido alanina. Por lo tanto, en cada posición donde una alanina se especifica mediante un codón, el codón se puede alterar a cualquiera de los correspondientes codones descritos sin alterar el polipéptido codificado. Dichas variaciones de ácido nucleico se denominan "variaciones silenciosas", que son un tipo de variaciones modificadas de forma conservativa. Cada secuencia de un ácido nucleico del presente documento que codifica un polipéptido también describe todas las posibles variaciones silenciosas del ácido nucleico. Un experto reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que normalmente es el único codón para metionina, y TGG, que es normalmente el único codón para triptófano) se puede modificar con el fin de conseguir una molécula funcionalmente idéntica. En consecuencia, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un polipéptido está implícita en cada secuencia descrita con respecto al producto de expresión, pero no con respecto a secuencias de sonda reales.

Como secuencias de aminoácidos, un experto reconocerá que las sustituciones, deleciones o adiciones individuales a una secuencia de un ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína que altera, añade o elimina un único aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos de la secuencia codificada es una "variante modificada de manera conservativa" donde la alteración da como resultado la sustitución de un aminoácido por un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustituciones conservativas que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. Dichas variantes modificadas de manera conservativa son adicionales, y no excluyen, las variantes polimórficas, homólogos interespecíficos, y alelos de la invención.

Los ocho grupos siguientes contienen, cada uno, aminoácidos que son sustituciones conservativas entre sí: 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); y 8) Cisteína (C), Metionina (M) (véase, p. ej., Creighton, Proteins (1984)).

Un "marcador" o un "resto detectable" es una composición detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, químicos u otros físicos. Por ejemplo, marcadores útiles incluyen 32P, tintes fluorescentes, reactivos densos en electrones, enzimas (p. ej., como se usa comúnmente en un ELISA), biotina, digoxigenina, o haptenos y proteínas que se pueden volver detectables, p. ej., incorporando un radiomarcador en el péptido o usado para detectar anticuerpos específicamente reactivos con el péptido.

El término "recombinante" cuando se utiliza en referencia, p. ej., a una célula, o ácido nucleico, proteína, o vector, indica que la célula, ácido nucleico, proteína o vector, se ha modificado mediante la introducción de un ácido nucleico o proteína heterólogos o la alteración de un ácido nucleico o proteína natural, o que la célula deriva de una célula modificada de esta forma. Por lo tanto, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran en la forma natural (no recombinante) de la célula o expresan genes naturales que de otra forma se expresarían de forma anómala, expresados en baja cantidad, o no expresados en absoluto.

El término "heterólogo" cuando se utiliza con referencia a las porciones de un ácido nucleico indica que el ácido nucleico comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma relación entre sí en la naturaleza. Por ejemplo, el ácido nucleico se produce, de forma típica, de manera recombinante, teniendo dos o más secuencias de genes no relacionados dispuestos para fabricar un ácido nucleico funcional nuevo, p. ej., un promotor de una fuente y una región codificante procedente de otra fuente. De manera similar, una proteína heteróloga indica que la proteína comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma relación entre sí en la naturaleza (p. ej., una proteína de fusión).

Un anticuerpo como se describe en el presente documento puede consistir en uno o más polipéptidos sustancialmente codificados por genes de inmunoglobulina o fragmentos de genes de inmunoglobulina. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen genes de región constante kappa, lambda, alfa, gamma, delta, épsilon y mu de inmunoglobulina, así como la miríada de genes de región variable de inmunoglobulina. Las cadenas ligeras se clasifican en kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican en gamma, mu, alfa, delta o épsilon, que a su vez definen las clases de inmunoglobulinas, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. En algunos aspectos de la divulgación, el anticuerpo es IgG (p. ej., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA, IgD o IgE.

Se sabe que una unidad estructural de inmunoglobulina (anticuerpo) típica comprende un tetrámero. Cada tetrámero se compone de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kD) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kD). El extremo N de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsable del reconocimiento de antígenos. Los términos cadena ligera variable (VL) y cadena pesada variable (VH) se refieren a estas cadenas ligeras y pesadas respectivamente.

El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, incluye fragmentos de anticuerpos que conservan la especificidad de unión. Por ejemplo, hay varios fragmentos de anticuerpos bien caracterizados. Por lo tanto, por ejemplo, la pepsina digiere un anticuerpo C-terminal en los enlaces disulfuro en la región de bisagra para producir F(ab)'2, un dímero de Fab que es, él mismo, una cadena ligera unida a VH-CH1 mediante un enlace disulfuro. El F(ab)'2 se puede reducir en condiciones suaves para romper el enlace disulfuro en la región de bisagra, convirtiendo, de ese modo, el dímero F(ab')2 en un monómero Fab'. El monómero Fab' es esencialmente un Fab con parte de la región de bisagra (véase, Fundamental Immunology, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993), para una descripción más detallada de otros fragmentos de anticuerpos). Aunque varios fragmentos de anticuerpos se definen en términos de la digestión de un anticuerpo intacto, un experto apreciará que los fragmentos se pueden sintetizar de novo ya sea químicamente o utilizando metodología de ADN recombinante. Por lo tanto, el término "anticuerpo", como se usa en el presente documento también incluye fragmentos de anticuerpos producidos ya sea por la modificación de anticuerpos completos o sintetizados usando metodologías de ADN recombinante.

En un anticuerpo, las variantes de sustitución tienen al menos un resto de aminoácido eliminado y un resto diferente insertado en su lugar. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis de sustitución incluyen las regiones hipervariables, pero se contemplan también alteraciones de las regiones marco conservadas. Ejemplos de sustituciones conservativas se describen anteriormente.

Se logran modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del anticuerpo seleccionando sustituciones que difieren significativamente en su efecto en el mantenimiento (a) de la estructura la cadena principal del polipéptido en la zona de la sustitución, por ejemplo, como una hoja p o una conformación helicoidal, (b) de la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana o (c) del volumen de la cadena lateral. Los restos de origen natural se dividen en grupos basándose en las propiedades comunes de la cadena lateral:

(1) No polares: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) Polares sin carga: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) Ácidos (cargado negativamente): Asp, Glu;

(4) Básicos (cargado positivamente): Lys, Arg;

(5) Restos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro; y

(6) Aromáticos: Trp, Tyr, Phe, His.

Las sustituciones no conservativas se realizan por intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase.

Un tipo de sustitución que se puede realizar es cambiar una o más cisteínas en el anticuerpo, que pueden ser químicamente reactivas, a otro resto, tal como, sin limitación, alanina o serina. Por ejemplo, puede haber una sustitución de una cisteína no canónica. La sustitución se puede realizar en una CDR o región marco conservada de un dominio variable o en la región constante de un anticuerpo. En algunos aspectos de la divulgación, la cisteína es canónica (p. ej., implicada en la formación de enlaces disulfuro). También puede sustituirse cualquier resto de cisteína no implicado en el mantenimiento de la conformación apropiada del anticuerpo, en general con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y evitar entrecruzamiento anómalo. En cambio, pueden añadirse enlaces de cisteína al anticuerpo para mejorar su estabilidad, particularmente cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fv.

Los anticuerpos incluyen dímeros V^h-V^l, incluyendo anticuerpos de cadena sencilla (anticuerpos que existen como una cadena polipeptídica sencilla), tales como anticuerpos Fv de cadena sencilla (sFv o scFv) en los que una región pesada variable y una región ligera variable se unen entre sí (directamente o mediante un enlazador peptídico) para formar un polipéptido continuo. El anticuerpo Fv de cadena sencilla es un V^h-V^l unido covalentemente que puede expresarse a partir de un ácido nucleico que incluye secuencias que codifican V^h- y V^l- unidas directamente o unidas por un enlazador que codifica un péptido (p. ej., Huston, et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883, 1988). Mientras que el V^h y V^l están conectados entre sí como una cadena polipeptídica sencilla, los dominios V^h y V^l se asocian de forma no covalente. Como alternativa, el anticuerpo puede ser otro fragmento. También se pueden generar otros fragmentos, p. ej., usando técnicas recombinantes, como proteínas solubles o como fragmentos obtenidos a partir de métodos de presentación. Los anticuerpos también pueden incluir diaanticuerpos y minianticuerpos. Los anticuerpos de la invención también incluyen dímeros de cadena pesada, tal como los anticuerpos de los camélidos.

Como se usa en el presente documento, "Región V" se refiere a un dominio de región variable de anticuerpo que comprende los segmentos de la región marco conservada (FW, por sus siglas en inglés) 1, región determinante de complementariedad (CDR) 1, FW2, CDR2, FW3, CDR3 y Región marco conservada 4. La región V para las cadenas pesada y ligera se denomina comúnmente V^h y V^l, respectivamente, o con términos similares. La región V está incluida en los fragmentos de anticuerpos Fab, F(ab')², Fv y scFv descritos en el presente documento e implicados en el reconocimiento de antígenos específicos.

Como se usa en el presente documento, "región determinante de complementariedad (CDR)" se refiere a las tres regiones hipervariables en cada cadena que interrumpen las cuatro regiones "marco conservadas(FW)" establecidas por las regiones variables de cadena ligera y pesada. Las CDR son responsables principalmente de la unión a un epítopo de un antígeno. Las CDR de cada cadena se denominan normalmente CDR1, CDR2 y CDR3, numeradas secuencialmente a partir del extremo N, y también se identifican normalmente por la cadena en la que está ubicada la CDR particular. Por lo tanto, una CDR3 de V^h está ubicada en el dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo en el que se encuentra, mientras que una CDR1 de V^l es la CDR1 del dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo en el que se encuentra.

Las secuencias de las regiones marco conservadas de diferentes cadenas ligeras o pesadas están relativamente conservadas dentro de una especie. La región marco conservada de un anticuerpo, es decir, las regiones marco conservadas combinadas de las cadenas ligeras y pesadas constituyentes, sirve para colocar y alinear las CDR en el espacio tridimensional.

Las secuencias de aminoácidos de las CDR y las regiones marco conservadas se pueden determinar usando varias definiciones bien conocidas en la técnica, p. ej., Kabat, Chothia, base de datos internacional ImMunoGeneTics (IMGT), y AbM (véase, p. ej., Johnson et al., supra; Chothia & Lesk, 1987, Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins. J. Mol. Biol. 196, 901-917; Chothia C. et al., 1989, Conformations of immunoglobulin hypervariable regions. Nature 342, 877-883; Chothia C. et al., 1992, structural repertoire of the human VH segments J. Mol. Biol.

227, 799-817; Al-Lazikani et al., J.Mol.Biol 1997, 273(4)). Definitions of antigen combining sites are also described in the following: Ruiz et al., IMGT, la base de datos internacional ImMunoGeneTics. Nucleic Acids Res., 28, 219-221 (2000); y Lefranc, M.-P. IMGT, la base de datos internacional ImMunoGeneTics. Nucleic Acids Res. 1 de enero;29(1):207-9, 2001); MacCallum et al, Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography, J. Mol. Biol., 262 (5), 732-745 (1996); y Martin et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 86, 9268-9272 (1989); Martin, et al, Methods Enzymol., 203, 121-153, (1991); Pedersen et al, Immunomethods, 1, 126, (1992); y Rees et al, En Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction. Oxford University Press, Oxford, 141-172 1996).

Como se usa en el presente documento, "anticuerpo quimérico" se refiere a una molécula de inmunoglobulina en la que (a) la región constante, o una porción de la misma, se altera, sustituye o intercambia de forma que el sitio de unión a antígeno (región variable) esté enlazado a una región constante de una clase, función efectora y/o especie diferente o alterada, o una molécula completamente diferente que confiere nuevas propiedades al anticuerpo quimérico, p. ej., una enzima, toxina, hormona, factor de crecimiento, fármaco, etc.; o (b) la región variable, o una porción de la misma, se altera, reemplaza o intercambia con una región variable, o una porción de la misma, que tiene una especificidad antigénica diferente o alterada; o con secuencias correspondientes de otra especie o de otra clase o subclase de anticuerpos.

Como se usa en el presente documento, "anticuerpo humanizado" se refiere a una molécula de inmunoglobulina en la que las CDR de un anticuerpo donante se injertan en secuencias marco conservadas humanas. Los anticuerpos humanizados también pueden comprender restos de origen donante en las secuencias marco conservadas. El anticuerpo humanizado también puede comprender al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina humana. Los anticuerpos humanizados también pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en las secuencias CDR o marco conservadas importadas. La humanización se puede realizar usando métodos conocidos en la técnica (p. ej., Jones et al., Nature 321:522-525; 1986; Riechmann et al., Nature 332:323-327, 1988; Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536, 1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596, 1992; la Patente de EE.UU n.° 4.816.567), que incluyen técnicas tal como los anticuerpos "sobrehumanizantes" (Tan et al., J. Immunol.

169: 1119, 2002) y los anticuerpos "resurgentes" (p. ej., Staelens et al., Mol. Immunol. 43: 1243, 2006; y Roguska et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 91: 969, 1994).

Los términos "antígeno", "inmunógeno", "diana de anticuerpos", "analito diana", y términos similares se usan en el presente documento para referirse a una molécula, compuesto o complejo que es reconocido por un anticuerpo, es decir, puede unirse específicamente al anticuerpo. El término puede referirse a cualquier molécula que pueda ser reconocida específicamente por un anticuerpo, p. ej., un polipéptido, polinucleótido, hidrato de carbono, lípido, resto químico, o combinaciones de los mismos (p. ej., polipéptidos fosforilados o glicosilados, etc.). Un experto comprenderá que el término no indica que la molécula sea inmunogénica en todos los contextos, sino simplemente indica que puede ser dirigido por un anticuerpo.

Los anticuerpos se unen a un "epítopo" de un antígeno. El epítopo es el sitio localizado en el antígeno que se reconoce y une por el anticuerpo. Los epítopos pueden incluir algunos aminoácidos o porciones de algunos aminoácidos, p. ej., 5 o 6, o más, p. ej., 20 o más aminoácidos, o porciones de esos aminoácidos. En algunos casos, el epítopo incluye componentes no proteicos, p. ej., de un carbohidrato, ácido nucleico o lípido. En algunos casos, el epítopo es un resto tridimensional. Por lo tanto, por ejemplo, cuando la diana es una proteína, el epítopo puede estar compuesto por aminoácidos consecutivos, o aminoácidos de diferentes partes de la proteína que se acercan mediante el plegamiento de la proteína (p. ej., un epítopo discontinuo). Lo mismo ocurre con otros tipos de moléculas diana que forman estructuras tridimensionales. Un epítopo normalmente incluye al menos 3, y más habitualmente, al menos 5 u 8-10 aminoácidos en una conformación espacial única. Los métodos para determinar la conformación espacial de los epítopos incluyen, por ejemplo, cristalografía de rayos x y resonancia magnética nuclear en 2 dimensiones. Véase, p. ej., Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed (1996).

Un "marcador'' o un "resto detectable" es un agente o componente diagnóstico detectable por medios espectroscópicos, radiológicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, químicos u otros físicos. Ejemplos de marcadores incluyen radiomarcadores (p. ej., 111In, 99mTc, 131I, 67Ga) y otros agentes de obtención de imágenes aprobados por la FDA. Los marcadores adicionales incluyen 32P, tintes fluorescentes, reactivos densos en electrones, enzimas, biotina, digoxigenina, o haptenos y proteínas u otras entidades que se pueden volver detectables, p. ej., incorporando un radiomarcador en el agente de direccionamiento. Puede emplearse cualquier método conocido en la técnica para conjugar un ácido nucleico o nanotransportador al marcador, p. ej., usando los métodos descritos en Hermanson, Bioconjugate Techniques 1996, Academic Press, Inc., San Diego.

Un anticuerpo o agente "marcado" o "etiquetado" es uno que está unido, bien covalentemente, a través de un conector o un enlace químico, o bien no covalentemente, a través de enlaces iónicos, van der Waals, electrostáticos, o de hidrógeno a un marcador de modo que la presencia del anticuerpo o agente puede detectarse detectando la presencia del marcador unido al anticuerpo o agente.

Las técnicas para conjugar agentes detectables y terapéuticos con anticuerpos son bien conocidas (véase, p. ej., Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), págs. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery"in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), págs. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review" en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), págs. 475-506 (1985); y Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)).

Las expresiones "específico para" "se une de manera específica", y términos similares se refieren a una molécula (p. ej., anticuerpo o fragmento de anticuerpo) que se une a una diana con al menos 2 veces más afinidad que los compuestos que no son diana, p. ej., al menos cualquiera de una afinidad 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 20 veces, 25 veces, 50 veces o 100 veces mayor. Por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a un anticuerpo primario normalmente se unirá al anticuerpo primario con al menos una afinidad 2 veces mayor que una diana de anticuerpo no primario (p. ej., un anticuerpo de una especie diferente o de un isotipo diferente, o una diana que no es de anticuerpo). La especificidad se puede determinar utilizando métodos convencionales, p. ej., inmunoensayos ELISA en fase sólida (véase, p.ej, Harlow y Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual (1998) for a description of immunoassay formats and conditions that can be used to determine specific immunoreactivity).

El término "se une" con respecto a una diana de anticuerpo (p. ej., antígeno, analito, complejo inmunitario), normalmente indica que un anticuerpo se une a la mayoría de las dianas de anticuerpos en una población pura (asumiendo proporciones molares apropiadas). Por ejemplo, un anticuerpo que se une a una diana de anticuerpo dada normalmente se une a al menos 2/3 de las dianas del anticuerpo en una solución (p. ej., al menos cualquiera de un 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 %). Un experto reconocerá que surgirá cierta variabilidad dependiendo del método y/o umbral de determinación de la unión.

Una muestra o valor "de control" se refiere a una muestra que sirve como referencia, habitualmente una referencia conocida, para comparación con una muestra de prueba. Por ejemplo, una muestra de prueba se puede tomar a partir de una condición de prueba, p. ej., en presencia de un compuesto de prueba, y en comparación con muestras de condiciones conocidas, p. ej., en ausencia del compuesto de prueba (control negativo), o en presencia de un compuesto conocido (control positivo). Un control también puede representar un valor promedio recogido de un número de pruebas o resultados. Un experto en la materia reconocerá que los controles se pueden diseñar para evaluar cualquier número de parámetros. Por ejemplo, se puede diseñar un control para comparar el beneficio terapéutico basándose en datos farmacológicos (p. ej., semivida) o medidas terapéuticas (p. ej., comparación de beneficio y/o efectos secundarios). Los controles pueden diseñarse para aplicaciones in vitro. Un experto en la materia sabrá qué controles son valiosos en una situación dada, y es capaz de analizar los datos basándose en comparaciones con los valores de control. Los controles también son valiosos para determinar la significación de los datos. Por ejemplo, si los valores de un parámetro dado son ampliamente variables en los controles, la variación en las muestras de prueba no se considerará significativa.

Las expresiones "dosis terapéuticamente eficaz", "dosis eficaz", o "cantidad terapéuticamente eficaz" en el presente documento significa una dosis que produce los efectos para los que se administra. La dosis y formulación exactas dependerán del objetivo del tratamiento, y serán discernibles por un experto en la materia utilizando técnicas conocidas (véase, p.ej., Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 20a edición, Gennaro, Editor (2003), y Pickar, Dosage Calculations (1999)). Por ejemplo, para un parámetro dado, una cantidad terapéuticamente eficaz mostrará un aumento o disminución del efecto terapéutico de al menos cualquiera del 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 40 %, 50 %, 60 %, 75 %, 80 %, 90 % o al menos del 100 %. La eficacia terapéutica también puede expresarse como aumento o disminución "del número de veces". Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz puede tener al menos cualquiera de 1,2 veces, 1,5 veces, 2 veces, 5 veces o más de efecto en comparación con un control.

La expresión "sales farmacéuticamente aceptables" o "transportador farmacéuticamente aceptable" está destinado a incluir sales de los compuestos activos que se preparan con ácidos o bases relativamente no tóxicos, dependiendo de los sustituyentes particulares encontrados en los anticuerpos descritos en el presente documento. Ejemplos de sales de adición de bases farmacéuticamente aceptables incluyen sal de sodio, potasio, calcio, amonio, amino orgánico o de magnesio o una sal similar. Cuando los compuestos de la presente invención contienen funcionalidades relativamente básicas, pueden obtenerse sales de adición de ácidos poniendo en contacto la forma neutra de dichos compuestos con una cantidad suficiente del ácido deseado, puro o en un disolvente inerte adecuado. Ejemplos de sales de adición de ácidos farmacéuticamente aceptables incluyen las derivadas de ácidos inorgánicos como ácidos clorhídrico, bromhídrico, nítrico, carbónico, monohidrogenocarbónico, fosfórico, monohidrogenofosfórico, dihidrogenofosfórico, sulfúrico, monohidrogenosulfúrico, yodhídrico o fosforoso, y similares, así como las sales derivadas de ácidos orgánicos relativamente no tóxicos como acético, propiónico, isobutírico, maleico, malónico, benzoico, succínico, subérico, fumárico, láctico, mandélico, ftálico, bencenosulfónico, p-tolilsulfónico, cítrico, tartárico, metanosulfónico y similares. También se incluyen sales de aminoácidos, tales como arginato y similares, y sales de ácidos orgánicos como ácidos glucurónico o galactunórico y similares (véase, p.ej., Berge et al., Journal of Pharmaceutical Science 66:1-19 (1977)). Determinados compuestos específicos de la presente invención contienen funcionalidades tanto básicas como ácidas que permiten que los compuestos se conviertan bien en sales de adición de bases o de ácidos. Otros transportadores farmacéuticamente aceptables conocidos por los expertos en la materia son adecuados para la presente invención.

El término "reducir", "que reduce", o "reducción", cuando se usa en el contexto de la activación de TGFp mediada por avp8 se refiere a cualquier cambio negativo detectable o disminución en la cantidad de un parámetro que refleja la activación de TGFp, en comparación con un valor patrón obtenido en las mismas condiciones, pero en ausencia de un anticuerpo como se describe en el presente documento (p. ej., anticuerpos anti-avp8). El nivel de esta disminución después de la exposición a un anticuerpo como se describe en el presente documento (p. ej., antagonistas anti-avp8, anticuerpos e inmunoconjugados anti-avp8) es, en algunos aspectos de la divulgación, al menos el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 100 %.

El término "competir", como se usa en el presente documento con respecto a un anticuerpo, significa que un primer anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, compite por unirse con un segundo anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, donde la unión del primer anticuerpo con su epítopo afín disminuye de forma detectable en presencia del segundo anticuerpo en comparación con la unión del primer anticuerpo en ausencia del segundo anticuerpo. La alternativa, donde la unión del segundo anticuerpo a su epítopo también disminuye de forma detectable en presencia del primer anticuerpo, puede, pero no tiene por qué ser así. Es decir, un primer anticuerpo puede inhibir la unión de un segundo anticuerpo a su epítopo sin que ese segundo anticuerpo inhiba la unión del primer anticuerpo a su epítopo respectivo. Sin embargo, cuando cada anticuerpo inhibe de forma detectable la unión del otro anticuerpo con su epítopo o ligando afín, ya sea en la misma, mayor o menor medida, se dice que los anticuerpos "compiten de forma cruzada" entre sí para la unión de su(s) epítopo(s) correspondiente(s). La presente invención abarca tanto los anticuerpos competitivos como los competitivos de forma cruzada. Independientemente del mecanismo por el cual se produzca dicha competencia o competencia cruzada (p. ej., impedimento estérico, cambio conformacional, o unión a un epítopo común, o porción del mismo, y similares), el experto apreciaría, basándose en las enseñanzas proporcionadas en el presente documento, que dichos anticuerpos competitivos y/o que competitivos de manera cruzada están abarcados y pueden ser útiles para los métodos divulgados en el presente documento.

Se conocen numerosos tipos de ensayos de unión competitiva, por ejemplo: radioinmunoensayo (RIA, por sus siglas en inglés) directo o indirecto en fase sólida, inmunoensayo enzimático (EIA, por sus siglas en inglés) directo o indirecto en fase sólida, ensayo de competencia en sándwich (véase Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242-253 (1983)); EIA con biotina-avidina directo en fase sólida (véase, Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614-3619 (1986)); ensayo de marcaje directo en fase sólida, ensayo de tipo sándwich de marcaje directo en fase sólida (véase Harlow y Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)); RIA de marcaje directo en fase sólida usando marcador 1-125 (véase Morel et al., Molec. Immunol. 25(1 ):7-15 (1988)); EIA con biotina-avidina directo en fase sólida (Cheung et al., Virology 176:546-552 (1990)); y RIA de marcaje directo (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77-82 (1990)). Normalmente, dicho ensayo implica el uso de antígeno purificado unido a una superficie sólida o a células que portan cualquiera de estos, una inmunoglobulina de ensayo sin marcar y una inmunoglobulina de referencia marcada. La inhibición competitiva se mide determinando la cantidad de marcador unido a la superficie sólida o a las células en presencia de la inmunoglobulina de prueba. Habitualmente, la inmunoglobulina de prueba está presente en exceso. Los anticuerpos identificados por ensayo de competencia (anticuerpos competitivos) incluyen anticuerpos que se unen al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia y anticuerpos que se unen a un epítopo adyacente suficientemente próximo al epítopo unido por el anticuerpo de referencia para que se produzca un impedimento estérico. Habitualmente, cuando un anticuerpo competitivo está presente en exceso, inhibirá la unión específica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común en al menos un 50 o 75 %.

III. Anticuerpos que se unen a la integrina p8

Se proporcionan anticuerpos (incluidos fragmentos de anticuerpos) que se unen específicamente a la integrina p8 humana, así como su uso en métodos para tratar o prevenir enfermedades para las que la disminución de la activación de TGFp tiene un efecto de mejora. "Integrina p8" se usa indistintamente con p8 y beta-8. La secuencia de la proteína integrina p8 humana se puede encontrar en el número de registro de Uniprot P26012, mientras que la secuencia de la integrina p8 murina tiene el número de registro de Uniprot Q0VBD0. Véase, también, Moyle et al. Journal of Biological Chemistry 266:19650-19658 (1991); Nishimura et al., J. Biological Chemistry 269:28708-28715 (1994).

En algunas realizaciones, se proporciona un anticuerpo que se une específicamente a la integrina p8 humana e inhibe (bloquea parcial o completamente) la unión del péptido asociado a latencia (LAP) a avp8. LAP es un ligando de avp8. Véase, p. ej., Sheppard, Cáncer and Metástasis Reviews 24(3):395-402 (2005); Lu et al. J Cell Sci 115:4641-4648 (2002). Como se muestra en la Figura 2, los anticuerpos descritos en el Ejemplo inhiben la unión de LAP a avp8. Los anticuerpos pueden antagonizar la unión de LAP a avp8 con una CI⁵⁰ de, por ejemplo, menos que, p. ej., 10, 5, 1, 0,1 nM o menos.

En algunos aspectos de la divulgación, un anticuerpo de la invención se une específicamente a la integrina p8 de ratón, así como humana. Cada uno de los anticuerpos ADWA-2, ADWA-8, ADWA-10, ADWA-11, ADWA-13, ADWA-15, ADWA-16, ADWA-25 y ADWA-20 se une a p8 tanto humana como de ratón. Una ventaja de tales anticuerpos es que se pueden generar datos clínicos para estos anticuerpos tanto en ratones, así como en seres humanos.

Un aspecto del bloqueo de la unión de LAP a avp8 en una célula puede ser que los anticuerpos eviten o reduzcan TGFp activado en la célula. Por lo tanto, en algunos aspectos de la divulgación, los anticuerpos descritos en el presente documento son útiles para disminuir la activación de TGFp en una célula o un animal (p. ej., un ratón, ser humano u otro animal).

En algunos aspectos de la divulgación, los anticuerpos compiten con uno o más anticuerpos seleccionados de ADWA-2, ADWA-8, ADWA-10, ADWA-11, ADWA-13, ADWA-15, ADWA-16, ADWA-25 y ADWA-20. En algunos aspectos de la divulgación, los anticuerpos se unen al mismo epítopo que el unido por ADWA-2, ADWA-8, ADWA-10, ADWA-11, ADWA-13, ADWA-15, AdWa-16, ADWA-25 y ADWA-20. Los anticuerpos monoclonales y quiméricos, y especialmente los anticuerpos humanizados, son de uso particular para usos terapéuticos humanos de los anticuerpos descritos en el presente documento. Por lo tanto, en algunos aspectos de la divulgación, un anticuerpo específico de avp8 como se describe en el presente documento comprende las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera de un anticuerpo seleccionado de ADWA-2, ADWA-8, ADWA-10, ADWA-11, ADWA-13, ADWA-15, ADWA-16, ADWA-25 y ADWA-20. Por ejemplo, el anticuerpo puede tener la CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena pesada y la CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena ligera de un anticuerpo seleccionado de ADWA-2, ADWA-8, ADWA-10, a Dw A-11, ADWA-13, ADWA-15, ADWA-16, ADWA-25 y ADWA-20 y tiene una región marco conservada heteróloga (p. ej., humana o similar a la humana).

En algunos aspectos de la divulgación, los anticuerpos específicos de avp8 como se describen en el presente documento comprenden las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la secuencia de la región variable de cadena pesada y la secuencia de la región variable de cadena ligera seleccionada de:

SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:16, respectivamente;

SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:16, respectivamente;

SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:16, respectivamente;

SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:16, respectivamente;

SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:16, respectivamente;

SEQ ID NO:6 y SEQ ID NO:16, respectivamente;

SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:17, respectivamente;

SEQ ID NO:8 y SEQ ID NO:18, respectivamente;

SEQ ID NO:9 y SEQ ID NO:19, respectivamente;

SEQ ID NO:10 y SEQ ID NO:20, respectivamente;

SEQ ID NO:1 1 y SEQ ID NO:20, respectivamente;

SEQ ID NO:12 y SEQ ID NO:20, respectivamente;

SEQ ID NO:13 y SEQ ID NO:20, respectivamente;

SEQ ID NO:14 y SEQ ID NO:21, respectivamente; y

SEQ ID NO:15 y SEQ ID NO:22, respectivamente.

En algunos aspectos de la divulgación, los anticuerpos específicos de avp8 como se describen en el presente documento comprenden la secuencia de la región variable de cadena pesada y la secuencia de la región variable de cadena ligera seleccionada de:

SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:16, respectivamente;

SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:16, respectivamente;

SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:16, respectivamente;

SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:16, respectivamente;

SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:16, respectivamente;

SEQ ID NO:6 y SEQ ID NO:16, respectivamente;

SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:17, respectivamente;

SEQ ID NO:8 y SEQ ID NO:18, respectivamente;

SEQ ID NO:9 y SEQ ID NO:19, respectivamente;

SEQ ID NO:10 y SEQ ID NO:20; , respectivamente;

SEQ ID NO:1 1 y SEQ ID NO:20, respectivamente;

SEQ ID NO:12 y SEQ ID NO:20, respectivamente;

SEQ ID NO:13 y SEQ ID NO:20, respectivamente;

SEQ ID NO:14 y SEQ ID NO:21, respectivamente; y

SEQ ID NO:15 y SEQ ID NO:22, respectivamente.

En algunos aspectos de la divulgación, el anticuerpo tiene las secuencias de CDR de cadena pesada y las secuencias de CDR de cadena ligera encontradas en la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 16, respectivamente. En algunos aspectos de la divulgación, el anticuerpo tiene las secuencias de CDR de cadena pesada y las secuencias de CDR de cadena ligera encontradas en la SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 16, respectivamente. En algunos aspectos de la divulgación, el anticuerpo tiene las secuencias de CDR de cadena pesada y las secuencias de CDR de cadena ligera encontradas en la SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 17, respectivamente. En algunos aspectos de la divulgación, el anticuerpo tiene las secuencias de CDR de cadena pesada y las secuencias de CDR de cadena ligera encontradas en la SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 18, respectivamente. En algunos aspectos de la divulgación, el anticuerpo tiene las secuencias de CDR de cadena pesada y las secuencias de CDR de cadena ligera encontradas en la SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 19, respectivamente.

Los anticuerpos monoclonales pueden obtenerse mediante diversas técnicas familiares para los expertos en la materia. Brevemente, las células de bazo de un animal inmunizado con un antígeno deseado se inmortalizan, comúnmente mediante fusión con una célula de mieloma (véase, por ejemplo, Kohler y Milstein, Eur. J. Immunol. 6: 511-519 (1976)). Los métodos alternativos de inmortalización incluyen transformación con el virus de Epstein Barr, oncogenes o retrovirus, u otros métodos bien conocidos en la técnica. Las colonias que surgen de células inmortalizadas sueltas se exploran para determinar la producción de anticuerpos de la especificidad y afinidad por el antígeno deseadas y el rendimiento de los anticuerpos monoclonales producidos por dichas células puede potenciarse mediante diversas técnicas, incluyendo inyección en la cavidad peritoneal de un hospedador vertebrado. Como alternativa, se pueden aislar secuencias de ADN que codifican un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión del mismo mediante la exploración de una biblioteca de ADN de linfocitos B humanos de acuerdo con el protocolo general explicado por Huse et al., Science 246: 1275-1281 (1989).

Los anticuerpos monoclonales pueden recogerse y titularse contra un ligando p8 (p. ej., LAP) en un inmunoensayo, por ejemplo, un inmunoensayo en fase sólida con el ligando inmovilizado sobre un soporte sólido. En algunos aspectos de la divulgación, los anticuerpos monoclonales se unirán con una Kd de al menos aproximadamente 0,1 mM, p. ej., al menos aproximadamente 1 pM, p. ej., al menos aproximadamente 0,1 pM o mejor, p. ej., 0,01 pM o menos.

En un aspecto ejemplar de la divulgación, un animal, tal como un conejo o un ratón se inmuniza con un polipéptido p8, o una construcción de ácido nucleico que codifica dicho polipéptido. Los anticuerpos producidos como resultado de la inmunización se pueden aislar usando métodos convencionales. En algunos aspectos de la divulgación, el animal es nuligénico de la integrina p8 y se inmuniza con un polipéptido de la integrina p8 humana o un fragmento del mismo.

Las inmunoglobulinas, incluyendo fragmentos de unión y otros derivados de las mismas, de la presente invención se pueden producir fácilmente mediante una variedad de técnicas de ADN recombinante, incluyendo por expresión en células transfectadas (p. ej., células eucariotas inmortalizadas, tal como células de mieloma o hibridoma) o en ratones, ratas, conejos u otros vertebrados capaces de producir anticuerpos mediante métodos bien conocidos. Pueden obtenerse células fuente adecuadas para las secuencias de ADN y células hospedadoras para la expresión y secreción de inmunoglobulinas a partir de varias fuentes, tales como la American Type Culture Collection (Catalogue of Cell Lines and Hybridomas, Quinta edición (1985) Rockville, MD).

En algunos aspectos de la divulgación, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado, es decir, un anticuerpo que conserva la reactividad de un anticuerpo no humano mientras es menos inmunogénico en seres humanos. Esto puede conseguirse, por ejemplo, conservando las regiones CDR no humanas y reemplazando las partes restantes del anticuerpo con sus homólogas humanas. Véase, p. ej., Morrison et al., PNAs USA, 81:6851-6855 (1984); Morrison y Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun., 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun., 31 (3): 169-217 (1994). Las técnicas para humanizar anticuerpos son bien conocidas en la técnica y se describen en, p. ej.,, las Patentes de EE.UU. N.° 4.816.567; 5.530.101; 5.859.205; 5.585.089; 5.693.761; 5.693.762; 5.777.085; 6.180.370; 6.210.671; y 6.329.511; WO 87/02671; la Solicitud de Patente EP 0173494; Jones et al. (1986) Nature 321:522; y Verhoyen et al. (1988) Science 239:1534. Los anticuerpos humanizados se describen adicionalmente en, p. ej., Winter y Milstein (1991) Nature 349:293. Por ejemplo, los polinucleótidos que comprenden una primera secuencia que codifica regiones marco conservadas de inmunoglobulina humanizada y un segundo conjunto de secuencias que codifica las regiones determinantes de la complementariedad de la inmunoglobulina deseada se pueden producir de forma sintética o combinando los segmentos adecuados de ADNc y ADN genómico. Se pueden aislar secuencias de ADN de región constante humana de acuerdo con procedimientos bien conocido a partir de una variedad de células humanas. Las CDR para producir las inmunoglobulinas de la presente divulgación derivarán de manera similar de anticuerpos monoclonales capaces de unirse específicamente a la integrina avp8 (p. ej., ADWA-2, ADWA-8, ADWA-10, ADWA-11, ADWA-13, ADWA-15, ADWA-16, ADWA-25 y ADWA-20 o anticuerpos que compiten con ADWA-2, ADWA-8, ADWA-10, ADWA-11, ADWA-13, ADWA-15, ADWA-16, ADWA-25 y ADw A-20 para la unión específica a la integrina avp8).

En algunos casos, la transferencia de una CDR a un marco humano conduce a una pérdida de especificidad por el anticuerpo humanizado. En estos casos, la mutación inversa se puede introducir en las regiones marco conservadas de la porción humana del anticuerpo. Los métodos para realizar mutaciones inversas son bien conocidos en la técnica y se describen en, p. ej., Co et al., PNAS USA 88;2269-2273 (1991) and WO 90/07861.

En algunos aspectos de la divulgación, los anticuerpos son fragmentos de anticuerpos como Fab, F(ab')², Fv o scFv. Los fragmentos de anticuerpos se pueden generar usando cualquier medio conocido en la técnica, incluyendo, digestión química (p. ej., papaína o pepsina) y métodos recombinantes. Los métodos para aislar y preparar ácidos nucleicos recombinantes son conocidos por los expertos en la materia (véase, Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual (2a ed. 1989); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995)). Los anticuerpos se pueden expresar en una variedad de células hospedadoras, incluyendo E. coli., otros hospedadores bacterianos, levaduras y diversas células eucariotas superiores tales como las líneas celulares COS, CHO y HeLa y líneas celulares de mieloma.

Pueden usarse ensayos de unión competitiva para identificar anticuerpos que compiten con un anticuerpo descrito en el presente documento por la unión específica a la integrina avp8. Puede usarse cualquiera de varios ensayos de unión competitiva conocidos en la técnica para medir la competencia entre dos anticuerpos para el mismo antígeno. Brevemente, se prueba la capacidad de diferentes anticuerpos para inhibir la unión de otro anticuerpo. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden diferenciar por el epítopo al que se unen usando un ensayo ELISA tipo sándwich. Esto se lleva a cabo utilizando un anticuerpo de captura para recubrir la superficie de un pocillo. A continuación, se añade una concentración subsaturante de antígeno marcado a la superficie de captura. Esta proteína se unirá al anticuerpo a través de una interacción anticuerpo:epítopo específica. Después de lavar un segundo anticuerpo, que se ha enlazado covalentemente a un resto detectable (p. ej., HRP, siendo el anticuerpo marcado definido como el anticuerpo de detección) se añade a ELISA. Si este anticuerpo reconoce el mismo epítopo que el anticuerpo de captura, no podrá unirse a la proteína diana ya que ese epítopo particular ya no estará disponible para unirse. Sin embargo, si este segundo anticuerpo reconoce un epítopo diferente en la proteína diana, será capaz de unirse y esta unión puede detectarse cuantificando el nivel de actividad (y, por lo tanto, el anticuerpo unido) usando un sustrato relevante. El fondo se define mediante el uso de un solo anticuerpo como anticuerpo tanto de captura como de detección, mientras que la señal máxima se puede establecer capturando con un anticuerpo específico de antígeno y detectando con un anticuerpo la etiqueta en el antígeno. Al usar las señales de fondo y máxima como referencias, los anticuerpos se pueden evaluar por pares para determinar la especificidad del epítopo.

Se considera que un primer anticuerpo inhibe competitivamente la unión de un segundo anticuerpo, si la unión del segundo anticuerpo al antígeno se reduce en al menos un 30 %, habitualmente en al menos aproximadamente un 40 %, 50 %, 60% o 75%, y con frecuencia en al menos alrededor de un 90 %, en presencia del primer anticuerpo usando cualquiera de los ensayos descritos anteriormente.

IV. Tratamiento terapéutico

Como se analiza anteriormente, los anticuerpos (incluidos los fragmentos de anticuerpos) descritos en el presente documento se pueden usar para reducir la activación de TGFp en una célula o un animal. En consecuencia, los anticuerpos se pueden administrar a un animal (p. ej., un animal humano o no humano) que lo necesite, reduciendo así la activación de TGFp en el animal. Las enfermedades para las que la reducción de TGFp al mejoran incluyen, pero sin limitación, asma, esclerosis múltiple, lesión pulmonar aguda, artritis reumatoide, psoriasis y enfermedad pulmonar obstructiva crónica. Por ejemplo, los inventores han descubierto que los ratones nuligénicos para p8 han mejorado los síntomas en modelos de ratón de asma, esclerosis múltiple y lesión pulmonar aguda en comparación con los modelos de ratones que expresan la integrina p8 natural.

En consecuencia, se proporcionan composiciones, incluyendo composiciones farmacéuticas, que comprenden uno o más anticuerpos descritos en el presente documento. Por ejemplo, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo ADWA-2, ADWA-8, ADWA-10, ADWA-11, ADWA-13, ADWA-15, ADWA-16, ADWA-25 o AdWa -20 humanizado.

En algunos aspectos de la divulgación, la composición farmacéutica comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende las secuencias CDR de cadena pesada (CDR1, CDR2 y CDR3, y las secuencias CDR de cadena ligera (CDR1, CDR2 y CDR3) seleccionadas del grupo que consiste en:

SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:16, respectivamente;

SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:16, respectivamente;

SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:16, respectivamente;

SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:16, respectivamente;

SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:16, respectivamente;

SEQ ID NO:6 y SEQ ID NO:16, respectivamente;

SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:17, respectivamente;

SEQ ID NO:8 y SEQ ID NO:18, respectivamente;

SEQ ID NO:9 y SEQ ID NO:19, respectivamente;

SEQ ID NO:10 y SEQ ID NO:20, respectivamente;

SEQ ID NO:1 1 y SEQ ID NO:20, respectivamente;

SEQ ID NO:12 y SEQ ID NO:20, respectivamente;

SEQ ID NO:13 y SEQ ID NO:20, respectivamente;

SEQ ID NO:14 y SEQ ID NO:21, respectivamente; y

SEQ ID NO:15 y SEQ ID NO:22, respectivamente.

En algunos aspectos de la divulgación, el anticuerpo tiene las secuencias de CDR de cadena pesada y las secuencias de CDR de cadena ligera encontradas en la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 16, respectivamente. En algunos aspectos de la divulgación, el anticuerpo tiene las secuencias de CDR de cadena pesada y las secuencias de CDR de cadena ligera encontradas en la SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 16, respectivamente. En algunos aspectos de la divulgación, el anticuerpo tiene las secuencias de CDR de cadena pesada y las secuencias de CDR de cadena ligera encontradas en la SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 17, respectivamente. En algunos aspectos de la divulgación, el anticuerpo tiene las secuencias de CDR de cadena pesada y las secuencias de CDR de cadena ligera encontradas en la SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 18, respectivamente. En algunos aspectos de la divulgación, el anticuerpo tiene las secuencias de CDR de cadena pesada y las secuencias de CDR de cadena ligera encontradas en la SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 19, respectivamente.

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender un transportador farmacéuticamente aceptable. Los transportadores farmacéuticamente aceptables se determinan en parte por la composición particular que se va a administrar, así como por el método particular usado para administrar la composición. En consecuencia, existe una amplia variedad de formulaciones de composiciones farmacéuticas de la presente invención adecuadas (véase, p. ej., Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a ed., 1989).

Las composiciones de la invención, solas o en combinación con otros componentes, se pueden preparar en formulaciones de aerosol (es decir, se pueden "nebulizar") para administrar por inhalación. Las formulaciones de aerosol pueden colocarse en propulsores aceptables a presión, tal como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno y similares.

Las formulaciones adecuadas para la administración incluyen soluciones acuosas y no acuosas, soluciones isotónicas estériles, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen la formulación isotónica, y las suspensiones estériles acuosas y no acuosas que puede incluir agentes de suspensión, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizantes y conservantes. En la práctica de esta invención, se pueden administrar composiciones, por ejemplo, por vía oral, por vía nasal, por vía tópica, por vía intravenosa, por vía intraperitoneal o por vía intratecal. Las formulaciones de compuestos se pueden presentar en envases precintados de dosis unitaria o multidosis, tales como ampollas y viales. Las soluciones y suspensiones pueden prepararse a partir de polvos estériles, gránulos y comprimidos del tipo descrito anteriormente. Los moduladores también se pueden administrar como parte de un alimento o fármaco preparado.

Las formulaciones adecuadas para la administración oral pueden comprender: (a) soluciones líquidas, tal como una cantidad eficaz del ácido nucleico empaquetado suspendido en diluyentes, tal como agua, solución salina o PEG 400; (b) cápsulas, sobrecitos o comprimidos, conteniendo cada uno una cantidad predeterminada del principio activo, como líquidos, sólidos, gránulos o gelatina; (c) suspensiones en un líquido apropiado; y (d) emulsiones adecuadas. Las formas de comprimido pueden incluir uno o más de lactosa, sacarosa, manitol, sorbitol, fosfatos de calcio, almidón de maíz, almidón de patata, celulosa microcristalina, gelatina, dióxido de silicio coloidal, talco, estearato de magnesio, ácido esteárico, y otros excipientes, colorantes, cargas, aglutinantes, diluyentes, agentes tamponantes, agentes humectantes, conservantes, agentes aromatizantes, tintes, agentes disgregantes y transportadores farmacéuticamente compatibles. Las formas de pastillas para chupar pueden comprender el principio activo en un sabor, p. ej., sacarosa, así como pastillas que comprenden el principio activo en una base inerte, tales como emulsiones de gelatina y glicerina o sacarosa y goma arábiga, geles, y similares que contienen, además del principio activo, transportadores conocidos en la técnica.

La dosis administrada a un paciente, en el contexto de la presente invención, debe ser suficiente para efectuar una respuesta beneficiosa en el sujeto en el tiempo. El nivel de dosis óptimo para cualquier paciente dependerá de una variedad de factores, incluida la eficacia del modulador específico empleado, la edad, peso corporal, actividad física y dieta del paciente, sobre una posible combinación con otros fármacos y de la gravedad de la EP. El tamaño de la dosis se determinará también según la existencia, naturaleza y grado de cualquier efecto adverso que acompañe a la administración de un compuesto particular en un sujeto particular.

Para determinar la cantidad eficaz de antagonistas de la integrina avp8 que se van a administrar, un médico puede evaluar los niveles en plasma circulantes del antagonista y la toxicidad del antagonista. En general, la dosis equivalente de un antagonista es de aproximadamente 1 ng/kg a 10 mg/kg para un sujeto típico.

Para la administración, los antagonistas de la integrina avp8 se pueden administrar a una velocidad determinada por la DL⁵⁰ del antagonista, y los efectos secundarios del antagonista a diversas concentraciones, aplicado a la masa y la salud general del sujeto. La administración se puede realizar mediante dosis únicas o divididas.

Las composiciones se pueden administrar de forma regular (p. ej., diariamente) durante un período de tiempo (p. ej., 2, 3, 4, 5, 6, días o 1-3 semanas o más). Las composiciones se pueden administrar directamente al sujeto mamífero para reducir la activación de TGFp usando cualquier ruta conocida en la técnica, incluyendo, p. ej., por inyección (p. ej., intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular o intradérmica), inhalación, aplicación transdérmica, administración rectal o administración oral.

Ejemplos

Ejemplo 1

Se identificaron nueve anticuerpos (denominados ADWA-2, ADWA-8, ADWA-10, ADWA-11, ADWA-13, ADWA-15, ADWA-16, ADWA-20 y ADWA-25) que bloquean la adhesión de LAP a TGFp 1, reaccionan de forma cruzada con p8 murina (como se determina con citometría de flujo en astrocitos murinos) y bloquean la activación de TGFp (como se determina con diluciones en serie de p83.7.12 - en un bioensayo de cocultivo con células epiteliales de pulmón de visón). El anticuerpo más potente, ADWA11, parece tener una CI50 para inhibir la activación de TGFp de menos de 5 nM (basado en una inhibición casi completa por una concentración de anticuerpo de 1 microgramo/ml (~ 6,3 nM)).

Los anticuerpos se prepararon inmunizando ratones raros con el gen de p8 desactivado que sobreviven hasta la edad adulta joven con avp8 humana purificada. Los gráficos de citometría de flujo son con astrocitos murinos primarios y muestran que ADWA-2, ADWA-8, ADWA-10, ADWA-11, ADWA-13, ADWA-15, ADWA-16, ADWA-20 y ADWA-25 reconocen la integrina de ratón, mientras que otros varios no lo hacen. Véase, La Figura 1. Los mismos anticuerpos bloquean la adhesión de las células SW480 transfectadas con p8 a LAP y la activación de TGFp por las mismas células. Véanse, las Figuras 2 y 3, respectivamente. Debido a que las células utilizadas también expresaron la integrina avp6, los resultados de estos ensayos también incluyen el anticuerpo de bloqueo de p6, 3G9.

Se llevaron a cabo estudios de activación de TGFp adicionales con anticuerpos individuales para determinar su capacidad para bloquear la activación de células SNB-19 transfectadas con p8 a diversas concentraciones. Los resultados se muestran en las Figuras 4-8 para ADWA-2, ADWA-11, ADWA-13, ADWA-15 y ADWA-16. También se llevaron a cabo ensayos de bloqueo de LAP adicionales en células SNB-19 transfectadas con p8. Los resultados se muestran en las Figura 9-13.

Los resultados demuestran que ADWA-2, ADWA-16, ADWA-15, ADWA-11, ADWA-13 y ADWA-10 son más eficaces para bloquear la adhesión de LAP e inhibir la activación de TGFp.

Ejemplo 2

Para caracterizar aún más las secuencias de los anticuerpos ADWA-2, ADWA-8, ADWA-10, ADWA-11, ADWA-13, ADWA-15, ADWA-16, ADWA-20 y ADWA-25, se recogió el ARN total de la línea celular de hibridoma que expresaba cada anticuerpo. El ARN se aisló usando el kit Rneasy® y QIAshredder de Qiagen®. La PCR con transcriptasa inversa se llevó a cabo utilizando oligo dT y oligo Clonetech® SMART™ IIa. La PCR se llevó a cabo utilizando oligonucleótidos en sentido SMART e IgG1 u oligos de dominio constante kappa de ratón.

Cada uno de los productos de PCR de 500 pb (de cada clon de anticuerpo) se separó usando electroforesis en gel y se clonó en el kit de clonación Zero Blunt® TOPO® de Invitrogen™ y se transformó en células. Para cada clon de hibridoma de anticuerpo, se seleccionaron 16 colonias (288 colonias en total).

El ADN clonado se secuenció mediante amplificación por círculo rodante (RCA, por sus siglas en inglés) y se analizó con AlignX® y TIBCO® Spotfire® de Invitrogen™. Las secuencias de la región V y CDR se analizaron inicialmente para determinar la variabilidad dentro de cada clon de anticuerpo, y después se compararon entre los clones.

Casi todas las secuencias de VH de ADWA16 y ADWA2 eran idénticas (SEQ ID NO: 1), encontrándose 2 variantes en las 16 muestras de ADWA2 (SEQ ID NO: 2 y 3). La secuencia primaria de ADWA13 se muestra en la SEQ ID NO: 4, con 2 variantes mostradas en las SEQ ID NO: 5 y 6. Las secuencias de VH de estos tres anticuerpos fueron bastante similares, con 2 cambios de aminoácidos en la CDR2 (posiciones 60 y 66) y 3 en las regiones fW (posiciones 19, 45 y 78).

Las secuencias de VH para ADWA10, ADWA11, ADWA15, ADWA20 y ADWA25 eran idénticas dentro de cada clon, pero distintas de otros clones. Las secuencias de VH se muestran en las SEQ ID NO: 7 (ADWA15), 8 (ADWA11), 9 (ADWA10), 14 (ADWA20) y 15 (ADWA25). Se encontraron tres variantes de secuencia de VH entre las 16 muestras de ADWA8 (SEQ ID NO: 11-13), con la secuencia primaria mostrada como la SEQ ID NO: 10.

En cuanto a las cadenas ligeras, se encontró que ADWA2, ADWA13 y ADWA16 compartían la misma secuencia de Vkappa (SEQ ID NO: 16). Las secuencias de Vkappa para ADWA15, ADWA11 y ADWA10 se muestran en las SEQ ID nO: 17, 18 y 19, respectivamente. Las secuencias de Vkappa para ADWA8, ADWA20 y ADWA25 se muestran en las SEQ ID NO: 20, 21 y 22, respectivamente.

Las secuencias de anticuerpos se confirmaron y se muestran en la Tabla 1 a continuación. La Tabla 1 muestra las secuencias para la región variable de cadena pesada (V^h), región variable de cadena ligera (V^l), CDR de cadena pesada (HCDR), CDR de cadena ligera (LCDR), nucleótidos que codifican VHy nucleótidos que codifican V^l. Las CDR se muestran de acuerdo con las designaciones de Chothia (subrayado) y Kabat (negrita).

Tabla 1

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Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo aislado que se une específicamente a la integrina p8 humana e inhibe la adhesión del péptido asociado a latencia (LAP) a avp8, en donde el anticuerpo comprende:

las regiones determinantes de complementariedad HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de DYYMN (SEQ ID NO: 95), WIDPDNGNTIYDPKFQG (SEQ ID NO: 31) y RLLMDY (SEQ ID NO: 32), respectivamente y

las regiones determinantes de complementariedad LCDR1, LCDR2 y lCd r 3 de RSTKSLLHFNGNTYLF (SEQ ID NO: 51), YMSNLAS (SEQ ID NO: 52) y MQSLEYPFT (SEQ ID NO: 53), respectivamente.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende una o más regiones marco conservadas humanas.

3. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de la reivindicación 1.

4. Un ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo de la reivindicación 1.

5. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 4.

6. Una célula hospedadora aislada que comprende el vector de la reivindicación 5.

7. El anticuerpo de la reivindicación 1 o 2 para su uso en un método para tratar o prevenir una enfermedad seleccionada de asma, esclerosis múltiple, lesión pulmonar aguda, artritis reumatoide, psoriasis y enfermedad pulmonar obstructiva crónica en un ser humano, comprendiendo el método administrar una cantidad suficiente de dicho anticuerpo al ser humano, tratando o previniendo así la enfermedad.

8. El anticuerpo para el uso de la reivindicación 7, en donde el ser humano tiene una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en asma, esclerosis múltiple y lesión pulmonar aguda y al menos un síntoma de la enfermedad mejora mediante la activación reducida de TGFp.

9. El anticuerpo para el uso de la reivindicación 7, en donde el ser humano tiene una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en artritis reumatoide, psoriasis y enfermedad pulmonar obstructiva crónica y al menos un síntoma de la enfermedad mejora mediante la activación reducida de TGFp.