KR20180006367A - Ctla4에 결합하는 항체 치료제 - Google Patents

Ctla4에 결합하는 항체 치료제 Download PDF

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Abstract

본 개시는 항-CTLA4 항체와 관련된 조성물 및 방법 및 키트를 제공한다. 보다 구체적으로, CTLA4에 결합하는 완전한 사람 항체, CTLA4-항체 결합 단편 및 이러한 항체의 유도체, 및 이러한 단편을 포함하는 CTLA4-결합 폴리펩타이드가 제공된다. 또한 추가로, 이러한 항체, 항체 단편 및 유도체 및 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 이러한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포, 이러한 항체, 항체 단편 및 유도체 및 폴리펩타이드를 제조하는 방법, 및 면역 반응 또는 억제 중 어느 하나의 자극을 요구하는 질환을 치료하는 방법을 포함하는, 이러한 항체, 항체 단편 및 유도체, 및 폴리펩타이드를 사용하는 방법이 개시된다. 한 양상에서, 본 개시는 적어도 10-6M의 결합 친화도로 CTLA4 에피토프에 결합하는 IgG 부류의 단리된 완전한 사람 항-CTLA4 항체를 제공한다.

Description

CTLA4에 결합하는 항체 치료제
관련 출원
본 출원은 2015년 2월 13일에 출원된 미국 임시 출원 제62/116353호에 대한 우선권을 주장하고, 이의 전문은 본원에 전부 인용에 의해 포함된다.
기술 분야
본 개시는 항-CTLA4 항체와 관련되거나 항-CTLA4 항체로부터 유도된 조성물 및 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 본 개시는 CTLA4에 결합하는 완전한 사람 항체, CTLA4-항체 결합 단편 및 이러한 항체의 유도체, 및 이러한 단편을 포함하는 CTLA4-결합 폴리펩타이드를 제공한다. 또한 추가로, 본 개시는 이러한 항체, 항체 단편 및 유도체 및 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 이러한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포, 이러한 항체, 항체 단편 및 유도체 및 폴리펩타이드를 제조하는 방법, 및 면역 반응 또는 억제 중 어느 하나의 자극을 요구하는 질환을 치료하는 방법을 포함하는, 이러한 항체, 항체 단편 및 유도체, 및 폴리펩타이드를 사용하는 방법을 제공한다. 자극은 사람 B7에 대한 사람 CTLA4의 결합을 차단하는 항체를 이용하여 달성되었고, 면역 반응 연장의 자극 및 증강에 의해 치료될 수 있는 질환으로는 전립선, 신장, 결장, 폐 또는 유방의 암; 병원성 감염; CNS와 관련된 질환, 예를 들면, 알츠하이머 질환을 포함하는 아밀로이드성 질환; 및 염증성 또는 알레르기성 구성요소를 갖는 질환이 포함된다. 치료될 수 있는 질환으로는 이식편 대 숙주 질환, 숙주 대 이식편 질환, 알레르기, 자가면역 질환 및 기타 염증성 질환이 포함된다.
척추동물 면역 시스템은 최적의 면역 활성화를 달성하기 위해 다중 신호를 요구하고; 예를 들면, 문헌[Janeway, Cold Spring Harbor Symp. Quant . Biol . 54:1-14 (1989); Paul William E., ed. Raven Press, N.Y., Fundamental Immunology, 4th edition (1998), 특히 챕터 12 및 13, 411 내지 478페이지]를 참조한다. T 림프구(T 세포)와 항원 제시 세포(APC) 사이의 상호작용은 면역 반응에 필수적이다. T 세포 상에서 발견되는 다수의 응집성(cohesive) 분자의 수준 및 면역 반응 동안의 APC의 증가(Springer et al., A. Rev. Immunol . 5:223-252 (1987); Shaw and Shimuzu, Current Opinion in Immunology, Eds. Kindt and Long, 1:92-97 (1988)); 및 Hemler, Immunology Today 9:109-113 (1988)). 이들 분자의 증가된 수준은 활성화된 APC가 휴지(resting) APC보다 항원-특이적 T 세포 증식을 자극하는데 보다 효과적인 원인을 설명하는 것을 도울 수 있다(Kaiuchi et al., J. Immunol. 131:109-114 (1983); Kreiger et al., J. Immunol . 135:2937-2945 (1985); McKenzie, J. Immunol . 141:2907-2911 (1988); 및 Hawrylowicz and Unanue, J. Immunol . 141:4083-4088 (1988)).
T 세포 면역 반응은 세포-세포(Springer et al., A. Rev. Immunol . 5:223-252 (1987)), 특히 T 세포와 APC와 같은 보조 세포(accessory cell) 사이의 상호작용, 및 가용성 면역 매개인자(사이토카인 또는 림포카인)의 생산(Dinarello (1987) New Engl . Jour. Med . 317:940-945; Sallusto (1997) J. Exp . Med . 179:1109-1118)에 관여하는 복합 프로세스이다. 이러한 반응은 T-세포 수용체 복합체(Weiss (1986) Ann. Rev. Immunol.4:593-619) 및 기타 "보조" 표면 분자(Allison (1994) Curr . Opin . Immunol . 6:414-419; Springer (1987) 상기)를 포함하는 몇몇의 T-세포 표면 수용체에 의해 조절된다. 이들 보조 분자 중 다수는 세포의 표면 상의 모노클로날 항체의 반응성에 의해 정의되는 자연 발생 세포 표면 분화(CD) 항원이다(McMichael, Ed., Leukocyte Typing III, Oxford Univ. Press, Oxford, N.Y. (1987)).
CD28은 단일 세포외 가변 영역(V)-유사 도메인을 갖는다(Aruffo and Seed, 상기). 동종 분자 CTLA4는 뮤린 세포용해성-T 세포 cDNA 라이브러리의 차별적 스크리닝에 의해 확인되어 왔다(Brunet (1987) Nature 328:267-270).
CTLA4는 뮤린 세포용해성 T 세포 cDNA 라이브러리의 차별적 스크리닝에 의해 처음으로 확인된 T 세포 표면 분자이다(Brunet et al., Nature 328:267-270 (1987)). 또한, CTLA4는 면역글로불린(Ig) 상과의 구성원이고; CTLA4는 단일 세포외 Ig 도메인을 포함한다. CTLA4 전사물은 세포독성 활성을 갖는 T 세포 집단에서 발견되어 왔고, 이는 CTLA4가 세포용해성 반응에서 기능할 수도 있음을 시사한다(Brunet et al., supra; Brunet et al., Immunol . Rev. 103-21-36 (1988)). 연구원들은 CD28과 동일한 염색체 영역(2q33-34)에 대한 CTLA4(Dariavach et al., Eur. J. Immunol . 18:1901-1905 (1988))의 사람 대응부(counterpart)에 대한 유전자의 클로닝 및 맵핑을 보고하였다(Lafage-Pochitaloff et al., Immunogenetics 31:198-201 (1990)). 이러한 사람 CTLA4 DNA와 암호화 CD28 단백질 사이의 서열 비교는 막 근접 및 세포질 영역에서 최대 상동성 정도를 갖는 유의한 상동성을 나타내다(Brunet et al., 1988, supra; Dariavach et al., 1988, 상기).
몇몇의 연구는 CTLA4가 2차 공동 자극인자(costimulator)와 유사한 기능을 가짐을 시사하였다(Linsley et al., J. Exp . Med . 176:1595-1604 (1992); Wu et al., J. Exp . Med . 185:1327-1335 (1997) 및 U.S. 특허 5,977,318; 5,968,510; 5,885,796; 및 5,885,579). 그러나, 다른 연구는 CTLA4가 T 세포 활성화의 완충제(dampener)로서 반대되는 역할을 가짐을 보고하였다(Krummel (1995) J. Exp . Med. 182:459-465); Krummel et al., Int'l Immunol . 8:519-523 (1996); Chambers et al., Immunity. 7:885-895 (1997)). CTLA4 결핍 마우스는 거대한 림프 증식을 앓고 있는 것으로 보고되어 왔다(Chambers et al., 상기). CTLA4 차단은 시험관내(Walunas et al., Immunity. 1:405-413 (1994)) 및 생체내(Kearney (1995) J. Immunol. 155:1032-1036) T 세포 반응을 증강시키고, 항종양 면역성을 악화시키고(Leach (1996) Science. 271:1734-1736), 유도된 자가면역 질환을 강화시키는 것(Luhder (1998) J Exp . Med . 187:427-432)으로 보고되어 왔다. 또한, CTLA4는 T 세포 반응의 초기 특징에 대해 대안의 또는 추가의 영향을 갖는 것으로 보고되어 왔다(Chambers (1997) Curr . Opin . Immunol . 9:396-404; Bluestone (1997) J. Immunol. 158:1989-1993; Thompson (1997) Immunity 7:445-450). 이는 몇몇의 자가면역 환자가 CTLA4에 대한 자가항체를 갖는다는 관찰과 일치한다. CTLA4 차단 항체는 이들 환자에서 병원성 역할을 갖는 것이 가능하다(Matsui (1999) J. Immunol. 162:4328-4335).
비-사람 CTLA4 항체는 각종 연구에서 사용되어 왔다. 그러나, 사람에서의 항체에 대한 생체내 치료학적 및 진단학적 적용의 발달에 직면하는 주요 방해들 중 하나는 비-사람 면역글로불린의 본질적인 면역원성이다. 예를 들면, 면역적격(immunocompetent) 사람 환자에게 치료학적 용도의 설치류 모노클로날 항체가 투여되는 경우, 상기 환자는 설치류 면역글로불린 서열에 대해 항체를 생성시키고; 이들 사람 항-마우스 항체(HAMA)는 치료학적 항체를 중화시키고 급성 독성을 야기할 수 있다. 이전의 항체에 있어서 이들 및 기타 결핍은 본 개시에 의한 CTLA4에 대한 완전한 사람 항체의 제공에 의해 극복된다.
요약
본 발명은 항-CTLA4 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함하는 CTLA4에 결합할 수 있는 결합 단백질에 관한 것이다.
한 양상에서, 본 개시는 CTLA4 에피토프에 적어도 10-6M의 결합 친화도로 결합하는 IgG 부류의 단리된 완전한 사람 항-CTLA4 항체를 제공하고, 상기 항체는 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 33, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 41 및 서열번호 43으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 중쇄 가변 도메인 서열을 갖고, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 42 및 서열번호 44로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 경쇄 가변 도메인 서열을 갖는다. 한 실시형태에서, 완전한 사람 항체는 중쇄 및 경쇄 둘 다를 갖고, 여기서, 상기 항체는 서열번호 1/서열번호 2(본원에서 A1이라고 칭함), 서열번호 3/서열번호 4(본원에서 A2라고 칭함), 서열번호 5/서열번호 6(본원에서 A4라고 칭함), 서열번호 7/서열번호 8(본원에서 A7이라고 칭함), 서열번호 9/서열번호 10(본원에서 A12라고 칭함), 서열번호 11/서열번호 12(본원에서 B6이라고 칭함), 서열번호 13/서열번호 14(본원에서 C2라고 칭함), 서열번호 15/서열번호 16(D6이라고 칭함), 서열번호 17/서열번호 18(본원에서 F1이라고 칭함), 서열번호 19/서열번호 20(본원에서 F3이라고 칭함), 서열번호 21/서열번호 22(본원에서 F5라고 칭함), 서열번호 23/서열번호 24(본원에서 F6이라고 칭함), 서열번호 25/서열번호 26(본원에서 F7이라고 칭함), 서열번호 27/서열번호 28(본원에서 G1이라고 칭함), 서열번호 29/서열번호 30(본원에서 G2라고 칭함), 서열번호 31/서열번호 32(본원에서 G3이라고 칭함), 서열번호 33/서열번호 34(본원에서 G5라고 칭함), 서열번호 35/서열번호 36(본원에서 G12라고 칭함), 서열번호 37/서열번호 38(본원에서 D5라고 칭함), 서열번호 39/서열번호 40(본원에서 E7이라고 칭함), 서열번호 41/서열번호 42(본원에서 E8이라고 칭함) 및 서열번호 43/서열번호 44(본원에서 CT1E1이라고 칭함)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 중쇄/경쇄 가변 도메인 서열을 갖는다.
다른 양상에서, 본 개시는 항-CTLA4 Fab 완전한 사람 항체 단편으로서, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 33, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 41 및 서열번호 43으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 42 및 서열번호 44로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 항-CTLA4 Fab 완전한 사람 항체 단편을 제공한다. 한 실시형태에서, 완전한 사람 항체 Fab 단편은 중쇄 가변 도메인 영역 및 경쇄 가변 도메인 영역 둘 다를 갖고, 여기서, 상기 항체는 서열번호 1/서열번호 2, 서열번호 3/서열번호 4, 서열번호 5/서열번호 6, 서열번호 7/서열번호 8, 서열번호 9/서열번호 10, 서열번호 11/서열번호 12, 서열번호 13/서열번호 14, 서열번호 15/서열번호 16, 서열번호 17/서열번호 18, 서열번호 19/서열번호 20, 서열번호 21/서열번호 22, 서열번호 23/서열번호 24, 서열번호 25/서열번호 26, 서열번호 27/서열번호 28, 서열번호 29/서열번호 30, 서열번호 31/서열번호 32, 서열번호 33/서열번호 34, 서열번호 35/서열번호 36, 서열번호 37/서열번호 38, 서열번호 39/서열번호 40, 서열번호 41/서열번호 42, 및 서열번호 43/서열번호 44로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 중쇄/경쇄 가변 도메인 서열을 갖는다.
본 개시는 펩타이드 링커에 의해 연결된 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 갖는 단일쇄 사람 항체를 추가로 제공하고, 여기서, 상기 중쇄 가변 도메인은 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 33, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 41, 및 서열번호 43으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 도메인은 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 42 및 서열번호 44로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 소정 실시형태들에서, 완전한 사람 단일쇄 항체는 중쇄 가변 도메인 영역 및 경쇄 가변 도메인 영역 둘 다를 갖고, 여기서, 상기 단일쇄 완전한 사람 항체는 서열번호 1/서열번호 2, 서열번호 3/서열번호 4, 서열번호 5/서열번호 6, 서열번호 7/서열번호 8, 서열번호 9/서열번호 10, 서열번호 11/서열번호 12, 서열번호 13/서열번호 14, 서열번호 15/서열번호 16, 서열번호 17/서열번호 18, 서열번호 19/서열번호 20, 서열번호 21/서열번호 22, 서열번호 23/서열번호 24, 서열번호 25/서열번호 26, 서열번호 27/서열번호 28, 서열번호 29/서열번호 30, 서열번호 31/서열번호 32, 서열번호 33/서열번호 34, 서열번호 35/서열번호 36, 서열번호 37/서열번호 38, 서열번호 39/서열번호 40, 서열번호 41/서열번호 42, 및 서열번호 43/서열번호 44로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 중쇄/경쇄 가변 도메인 서열을 갖는다.
서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 33, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 39 및 서열번호 43으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 아미노산 서열에 제시되는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 38, 서열번호 40 및 서열번호 44로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 아미노산 서열에 제시되는 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원-결합 단편도 본 발명에 포함된다.
본 개시는 면역 반응 또는 억제 중 어느 하나의 자극을 요구하는 질환을 치료하는 방법을 추가로 제공하고, 여기서, 상기 항-CTLA4 폴리펩타이드는, CTLA4에 결합하고 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하는 IgG 부류의 단리된 완전한 사람 항체; 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항-CTLA4 완전한 사람 항체 Fab 단편; 및 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하는 단일쇄 사람 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 여기서, 상기 중쇄 가변 도메인 및 상기 경쇄 가변 도메인은 펩타이드 링커를 통해 연결되고; 상기 중쇄 가변 도메인은 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 33, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 41 및 서열번호 43으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 도메인은 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 42 및 서열번호 44로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
소정 실시형태들에서, 완전한 사람 항체 또는 항체 단편은 중쇄 및 경쇄 둘 다를 갖고, 여기서, 상기 항체 또는 항체 단편은 서열번호 1/서열번호 2(본원에서 A1이라고 칭함), 서열번호 3/서열번호 4(본원에서 A2라고 칭함), 서열번호 5/서열번호 6(본원에서 A4라고 칭함), 서열번호 7/서열번호 8(본원에서 A7이라고 칭함), 서열번호 9/서열번호 10(본원에서 A12라고 칭함), 서열번호 11/서열번호 12(본원에서 B6이라고 칭함), 서열번호 13/서열번호 14(본원에서 C2라고 칭함), 서열번호 15/서열번호 16(본원에서 D6이라고 칭함), 서열번호 17/서열번호 18(본원에서 F1이라고 칭함), 서열번호 19/서열번호 20(본원에서 F3이라고 칭함), 서열번호 21/서열번호 22(본원에서 F5라고 칭함), 서열번호 23/서열번호 24(본원에서 F6이라고 칭함), 서열번호 25/서열번호 26(본원에서 F7이라고 칭함), 서열번호 27/서열번호 28(본원에서 G1이라고 칭함), 서열번호 29/서열번호 30(본원에서 G2라고 칭함), 서열번호 31/서열번호 32(본원에서 G3이라고 칭함), 서열번호 33/서열번호 34(본원에서 G5라고 칭함), 서열번호 35/서열번호 36(본원에서 G12라고 칭함), 서열번호 37/서열번호 38(본원에서 D5라고 칭함), 서열번호 39/서열번호 40(본원에서 E7이라고 칭함), 서열번호 41/서열번호 42(본원에서 E8이라고 칭함) 및 서열번호 43/서열번호 44(본원에서 CT1E1이라고 칭함)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 중쇄/경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다.
소정 실시형태들에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 적어도 1 x 10-6M의 KD를 갖는다. 다른 실시형태드렝서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 적어도 1 x 10-7M의 KD를 갖는다. 다른 실시형태들에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 적어도 1 x 10-8M의 KD를 갖는다.
소정 실시형태들에서, 상기 항체는 IgG1 이소타입이다. 다른 실시형태들에서, 상기 항체는 IgG4 이소타입이다.
소정 실시형태들에서, 본원에 기술된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 재조합체이다.
또한, 본 발명은 본원에 개시되는 항-CTLA4 항체 또는 단편의 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물을 제공한다.
소정 실시형태들에서, 본 발명은 암의 치료를 필요로 하는 사람 대상체에게 본원에 개시되는 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 유효량을 투여하여 암을 치료함을 포함하는, 암의 치료를 필요로 하는 사람 대상체에서 암을 치료하는 방법을 특징으로 한다.
한 바람직한 실시형태에서, 상기 암은 해로운 CTLA4 활성과 관련되어 있다. 이러한 유형의 암의 예로는 방광암, 혈액암, 뇌암, 유방암, 결장암, 섬유육종, 폐암, 난소암, 전립선암, 흑색종, 림프종, 중피종 및 형질세포종이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
다른 실시형태들에서, 상기 질환은 전립선, 신장, 결장, 폐 또는 유방의 암; 병원성 감염; CNS와 관련된 질환, 아밀로이드성 알츠하이머 질환; 및 염증성 또는 알레르기성 구성요소를 갖는 질환, 이식편 대 숙주 질환, 숙주 대 이식편 질환, 알레르기, 자가면역 질환 및 기타 염증성 질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
도 1은 열거된 항-CTLA4 항체의 T 세포 활성화를 증강시키는 능력에 의한 열거된 항-CTLA4 항체의 기능적 활성을 보여준다. CD25 발현의 수준은 항-CTLA4 항체가 부가된 배양물에서 더 높았다. 사용된 대조군 항체(대조군 Ig)는 이소타입 매칭된 비-특이적(즉, CTLA4에 결합하지 않는) 항체이다.
도 2는 배지 대조군에 관한 데이터를 정규화함으로써 항-CTLA4 항체가 투여받은 배양물에서 현저한 수준의 증강이 검출되었음을 보여준다. 사용된 대조군 항체(대조군 Ig)는 이소타입 매칭된 비-특이적(즉, CTLA4에 결합하지 않는) 항체이다.
도 3a 및 도 3b는 항-CTLA4 항체 이필리무맙(여보이(Yervoy))과 비교하여 CD80(도 3a) 및 CD86(도 3b) 기반 검정을 이용한 항체 CT1E1의 IC50 특징을 도표로 도시한다.
도 4는 저용량 초항원(superantigen) 스태필로코커스 장내독소 B(SEB: Staphylococcus enterotoxin B)에의 반응에 대한 항-CTLA4 항체 F7의 효과를 측정하는 실험으로부터의 결과를 도표로 도시한다. 대조군 항체(cIg)는 이소타입 매칭된 비-특이적(즉, CTLA1에 결합하지 않는) 항체이다.
도 5는 항-CTLA4 항체 E8의 기능적 활성 및 T 세포 활성화를 증강시키는 상기 항체의 능력을 보여준다. CD25 발현의 수준은 E8이 부가된 배양물에서 더 높았다. 사용된 대조군 항체(대조군 Ig)는 이소타입 매칭된 비-특이적(즉, CTLA4에 결합하지 않는) 항체이다. 정규화된 데이터는 우측에 있다.
정의
용어 "펩타이드", "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 각각 펩타이드 결합에 의해 서로 연결된 2개 이상의 아미노산 잔기들을 포함하는 분자를 나타낸다. 이들 용어는, 예를 들면, 천연 및 인공 단백질, 단백질 서열의 단백질 단편 및 폴리펩타이드 유사체(예를 들면, 뮤테인, 변이체 및 융합 단백질) 뿐만 아니라 번역-후 또는 그 밖의 공유결합적으로 또는 비공유결합적으로 변형된 단백질도 포함한다. 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질은 단량체성 또는 중합체성일 수 있다.
폴리펩타이드의 "변이체"(예를 들면, 항체의 변이체)는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 폴리펩타이드 서열과 비교하여 상기 아미노산 서열 내에 삽입되고/되거나, 상기 아미노산 서열로부터 결실되고/되거나, 또는 상기 아미노산 서열 내에 치환된다. 개시된 변이체는, 예를 들면, 융합 단백질을 포함한다.
폴리펩타이드의 "유도체"는, 예를 들면, 다른 화학적 모이어티(예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜 또는 알부민, 예를 들면, 사람 혈청 알부민)로의 접합, 인산화 및 글리코실화를 통해 화학적으로 변형된 폴리펩타이드(예를 들면, 항체)이다. 달리 지시되지 않는 한, 용어 "항체"는 2개의 전장 중쇄 및 2개의 전장 경쇄를 포함하는 항체에 추가하여, 이의 유도체, 변이체, 단편, 및 뮤테인을 포함하고, 이의 예는 하기에 기술된다.
"항원 결합 단백질"은 항원에 결합하는 부분, 및 임의로 항원 결합부가 항원에 대한 항원 결합 단백질의 결합을 촉진시키는 입체배좌(conformation)를 채택하는 것을 가능하게 하는 스캐폴드 또는 프레임워크 부분을 포함하는 단백질이다. 항원 결합 단백질의 예로는 항체, 항체 단편(예를 들면, 항체의 항원 결합부), 항체 유도체 및 항체 유사체가 포함된다. 항원 결합 단백질은 예를 들면, 절편이식된 CDR 또는 CDR 유도체를 갖는 대안의 단백질 스캐폴드 또는 인공 스캐폴드를 포함할 수 있다. 이러한 스캐폴드로는 예를 들면, 항원 결합 단백질의 3차원 구조를 안정화시키기 위해 도입된 돌연변이를 포함하는 항체-유도된 스캐폴드 뿐만 아니라, 예를 들면, 생체적합성(biocompatible) 중합체를 포함하는 완전한 합성 스캐폴드도 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 문헌[Korndorfer et al., 2003, Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, Volume 53, Issue 1:121-129; Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654)을 참조한다. 또한, 펩타이드 항체 모방체("PAM": peptide antibody mimetic) 뿐만 아니라 스캐폴드로서 피브로넥션(fibronection) 구성성분을 이용하는 항체 모방체에 기초한 스캐폴드도 사용될 수 있다.
항원 결합 단백질은 예를 들면, 면역글로불린의 구조를 가질 수 있다. "면역글로불린"은 2개의 동일한 쌍의 폴리펩타이드 쇄들로 이루어진 사량체성 분자이고, 각각의 쌍은 하나의 "경쇄"(약 25kDa) 및 하나의 "중쇄"(약 50 내지 70kDa)를 갖는다. 각각의 쇄의 아미노-말단 부분은 항원 인식에 주로 관여하는 약 100 내지 110개 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 각각의 쇄의 카복시-말단 부분은 효과기(effector) 기능에 주로 관여하는 불변 영역을 규정한다. 사람 경쇄는 카파 또는 람다 경쇄로서 분류된다. 중쇄는 뮤, 델타, 감마, 알파 또는 엡실론으로 분류되고, 이는 항체의 이소타입을 각각 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로서 규정한다. 바람직하게는 한 실시형태에서, 본원에 개시된 항-CTLA4 항체는 중쇄(VH) 및 경쇄(VL) 아미노산 서열 내의 이들의 가변 도메인 영역 서열에 의해 특성확인된다. 한 실시형태에서, 바람직한 항체는 카파 IgG 항체인 A6이다. 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 연결되고, 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역도 포함한다. 일반적으로, 문헌[Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989))]을 참조한다. 각각의 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은 온전한 면역글로불린이 2개의 결합 부위를 갖도록 하는 항체 결합 부위를 형성한다.
면역글로불린 쇄의 가변 영역은 상보성 결정 영역 또는 CDR로서도 칭하는 3개의 초가변성 영역(hypervariable region)에 의해 연결된 비교적 보존된 프레임워크 영역(FR)의 동일한 일반 구조를 나타낸다. N-말단으로부터 C-말단까지, 경쇄 및 중쇄 둘 다는 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 각각의 도메인에 대한 아미노산의 할당은 문헌[Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication no. 91-3242, 1991]에서의 카바트 등(Kabat et al.)의 정의에 따른다. 면역글로불린 쇄 내의 아미노산에 대한 다른 번호매김 시스템으로는 IMGT™(국제 ImMunoGeneTics 정보 시스템; Lefranc et al, Dev . Comp. Immunol. 29:185-203; 2005) 및 AHo(Honegger and Pluckthun, J. Mol . Biol . 309(3):657-670; 2001)가 포함된다.
"항체"는, 달리 명시되지 않는 한, 특정 결합에 대해 온전한 항체와 경쟁하는 온전한 면역글로불린 또는 이의 항원 결합부를 나타낸다.
한 실시형태에서, 항체는 중쇄 가변 도메인, 경쇄 가변 도메인, 경쇄 불변 영역(CL), 및 중쇄 불변 영역 CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 서열은 서열번호 1 내지 서열번호 44에서 본원에 기술되는 것들로부터 선택될 수 있다.
항체의 항원 결합부는 재조합 DNA 기술에 의해 또는 온전한 항체의 효소적 또는 화학적 절단(cleavage)에 의해 생성될 수 있다. 항원 결합부는 특히 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 도메인 항체(dAb), 및 상보성 결정 영역(CDR) 단편, 단일쇄 항체(scFv), 키메라 항체, 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody), 및 폴리펩타이드에 특이적 항원 결합을 부여하기에 충분한 면역글로불린의 적어도 일부를 함유하는 폴리펩타이드를 포함한다.
소정 실시형태들에서, 항체는 다양한 항원 특이성을 갖는 면역글로불린을 함유하는 혈청 또는 혈장과 같은 공급원으로부터 수득될 수 있다. 이러한 항체가 친화성 정제에 적용되는 경우, 이는 특정 항원 특이성에 대해 강화될(enriched) 수 있다. 이러한 강화된 항체의 조제(preparation)는 통상적으로 특정 항원에 대한 특이적 결합 활성을 갖는 약 10% 미만의 항체로 구성된다. 이들 조제를 여러 차례 친화성 정제에 적용시켜 항원에 대한 특이적 결합 활성을 갖는 항체의 비율을 증가시킬 수 있다. 이러한 방식으로 조제된 항체는 종종 "단일특이적(monospecific)"으로서 언급된다.
본원에 사용되는 용어 "단일특이적"은 하나의 특정 에피토프에 대한 친화성을 나타내는 항체를 말한다. 단일특이적 항체 조제는 특정 항원에 대한 특이적 결합 활성을 갖는 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 99.9%의 항체로 구성될 수 있다.
"항체 단편" 또는 "항체의 항원 결합 단편"은 온전한 항체의 일부를 포함하고, 바람직하게는 항체 항원 결합 또는 가변 도메인을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab'), F(ab')2, Fv 단편, 및 선형 항체가 포함된다.
Fab 단편은 VL, VH, CL 및 CH1 도메인을 갖는 1가의 단편이고; F(ab')2 단편은 힌지 영역에서 디설파이드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 갖는 2가의 단편이고; Fd 단편은 VH 및 CH1 도메인을 갖고; Fv 단편은 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인을 갖고; dAb 단편은 VH 도메인, VL 도메인, 또는 VH 또는 VL 도메인의 항원-결합 단편을 갖는다(U.S. 특허 제6,846,634호; 제6,696,245호, US App. Pub 2002/02512; 2004/0202995; 2004/0038291; 2004/0009507;2003/0039958, 및 Ward et al., Nature 341:544-546, 1989).
단일-쇄 항체(scFv)는, VL 및 VH 영역이 링커(예를 들면, 아미노산 잔기들의 합성 서열)를 통해 연결되어 연속적 단백질 쇄를 형성하는 항체 단편이고, 여기서, 상기 링커는 단백질 쇄가 자체적으로 다시 폴딩되고 1가의 항원 결합 부위를 형성하는 것을 가능하기 하기에 충분히 길다(예를 들면, 문헌[Bird et al., 1988, Science 242:423-26 및 Huston et al., 1988, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85:5879-83]을 참조한다).
디아바디는 2개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 2가 항체이며, 여기서, 각각의 폴리펩타이드 쇄는 동일 쇄 상의 2개의 도메인 사이에 쌍을 형성하기에 너무 짧아, 각각의 도메인이 다른 폴리펩타이드 쇄 상의 상보성 도메인과 쌍을 이루도록 하는 링커에 의해 연결된 VH 및 VL 도메인을 포함한다(예를 들면, 문헌[Holliger et al., 1993, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90:6444-48, 및 Poljak et al., 1994, Structure 2:1121-23]을 참조한다). 디아바디의 2개의 폴리펩타이드 쇄가 동일한 경우, 이들의 쌍 형성(pairing)으로부터 초래된 디아바디는 2개의 동일한 항원 결합 부위를 가질 것이다. 상이한 서열을 갖는 폴리펩타이드 쇄는 2개의 상이한 항원 결합 부위를 갖는 디아바디를 제조하는데 사용될 수 있다. 유사하게, 트리바디 및 테트라바디는 각각 3개 및 4개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 각각 동일하거나 상이할 수 있는 3개 및 4개의 항원 결합 부위를 각각 형성하는 항체이다.
항원 결합 단백질, 예를 들면, 항체는 하나 이상의 결합 부위를 가질 수 있다. 1개 초과의 결합 부위가 존재하는 경우, 상기 결합 부위는 서로 동일할 수 있거나 상이할 수 있다. 예를 들면, 자연 발생 사람 면역글로불린은 전형적으로 2개의 동일한 결합 부위를 갖지만, "이특이적" 또는 "이기능성" 항체는 2개의 상이한 결합 부위를 갖는다.
용어 "사람 항체"는 사람 면역글로불린 서열로부터 유도된 하나 이상의 가변 및 불변 영역을 갖는 모든 항체를 포함한다. 한 실시형태에서, 모든 가변 및 불변 도메인은 사람 면역글로불린 서열("완전한 사람 항체"로서 나타냄)로부터 유도된다. 이들 항체는 다양한 방식으로 제조될 수 있고, 이의 예는 사람 중쇄 및/또는 경쇄-암호화 유전자로부터 유도된 항체를 발현시키도록 유전적으로 변형된 마우스의 목적하는 항원으로의 면역화를 통한 것을 포함하여, 하기에 기술된다. 바람직한 실시형태에서, 완전한 사람 항체는 재조합 방법을 이용하여, 상기 항체의 글리코실화 패턴은 항체가 자연에 존재하는 것이라면 동일한 서열을 갖는 항체와 상이하도록 제조된다.
"사람화된 항체"는 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 및/또는 부가에 의해 비-사람 종으로부터 유도된 항체의 서열과 상이한 서열을 가져, 상기 사람화된 항체가 사람 대상체에게 투여되는 경우에 비-사람 종 항체와 비교하여 면역 반응을 유도할 가능성이 더 적고/적거나 덜 심각한 면역 반응을 유도하도록 한다. 한 실시형태에서, 비-사람 종 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 프레임워크 및 불변 도메인 내의 소정 아미노산이 돌연변이되어 사람화된 항체가 생성된다. 다른 실시형태에서, 사람 항체 유래의 불변 도메인(들)은 비-사람 종의 가변 도메인(들)에 융합된다. 다른 실시형태에서, 비-사람 항체의 하나 이상의 CDR 서열 내의 하나 이상의 아미노산 잔기들은 사람 대상체에게 투여되는 경우에 비-사람 항체의 유망한 면역원성을 감소시키도록 변경되고, 여기서, 상기 변경된 아미노산 잔기는 항체의 이의 항원에 대한 면역특이적 결합에 중요하지 않거나, 이루어지는 아미노산 서열에 대한 변화가 보존적인 변화여서, 사람화된 항체의 항원에 대한 결합이 비-사람 항체의 항원에 대한 결합보다 유의미하게 악화되지 않게 한다. 사람화된 항체를 제조하는 방법의 예는 미국 특허 6,054,297, 5,886,152 및 5,877,293에서 확인할 수 있다.
용어 "키메라 항체"는 한 항체 유래의 하나 이상의 영역 및 하나 이상의 다른 항체 유래의 하나 이상의 영역을 함유하는 항체를 나타낸다. 한 실시형태에서, 하나 이상의 CDR들은 사람 항-CTLA4 항체로부터 유도된다. 다른 실시형태에서, 모든 CDR은 사람 항-CTLA4 항체로부터 유도된다. 다른 실시형태에서, 1개 초과의 사람 항-CTLA4 항체 유래의 CDR들이 혼합되고, 키메라 항체에서 매칭된다. 예를 들면, 키메라 항체는 제1 사람 항-PAR-2 항체의 경쇄 유래의 CDR1, 제2 사람 항-CTLA4 항체의 경쇄 유래의 CDR2 및 CDR3, 및 제3 항-CTLA4 항체의 중쇄 유래의 CDR을 포함할 수 있다. 다른 조합이 가능하다.
추가로, 프레임워크 영역은 동일한 항-CTLA4 항체 중 하나로부터, 하나 이상의 상이한 항체, 예를 들면, 사람 항체로부터 또는 사람화된 항체로부터 유도될 수 있다. 키메라 항체의 한 예로, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부는 특정 종 유래의 항체와 동일하거나, 이와 상동성이거나, 이로부터 유도되거나, 또는 특정 항체 부류 또는 아부류(subclass)에 속하고, 한편, 나머지 쇄(들)는 다른 종 유래의 항체(들)와 동일하거나, 이와 상동성이거나, 이로부터 유도되거나, 또는 다른 항체 부류 또는 아부류에 속한다. 또한, 목적하는 생물학적 활성(즉, CTLA4에 특이적으로 결합하는 능력)을 나타내는 상기 항체의 단편도 포함된다.
"중화 항체" 또는 "억제성 항체"는 CTLA4 활성을 억제하는, 예를 들면, CTLA4의 단백질분해적 활성화를 억제하는 길항제 항체이다. 한 실시형태에서, CTLA4의 단백질분해적 활성화는 과도한 항-CTLA4 항체가 본원에 실시예에서 기술되는 것과 같은 검정을 이용하여 활성화의 양을 적어도 약 20%만큼 감소시키는 경우에 측정된다. 각종 실시형태들에서, 항원 결합 단백질은 CTLA4의 단백질분해적 활성화의 양을 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 및 99.9%만큼 감소시킨다.
"CDR 절편이식된 항체"는 특정 종 또는 이소타입의 항체로부터 유도된 하나 이상의 CDR, 및 동일하거나 상이한 종 또는 이소타입의 다른 항체의 프레임워크를 포함하는 항체이다.
"다중-특이적 항체"는 하나 이상의 항원 상의 1개 초과의 에피토프를 인식하는 항체이다. 상기 유형의 항체의 아부류는 동일하거나 상이한 항원 상의 2개의 별개의 에피토프를 인식하는 "이-특이적 항체"이다.
항원 결합 단백질이 1 나노몰 이하의 해리 상수로 항원에 결합하는 경우, 항원 결합 단백질은 항원(예를 들면, 사람 CTLA4)에 "특이적으로 결합"한다.
"항원 결합 도메인", "항원 결합 영역" 또는 "항원 결합 부위"는 항원과 상호작용하고, 항원에 대한 항원 결합 단백질의 특이성 및 친화성에 기여하는 아미노산 잔기(또는 다른 모이어티(moiety))를 함유하는 항원 결합 단백질의 일부이다. 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 경우, 이는 이의 CDR 도메인 중 적어도 하나의 적어도 일부를 포함할 것이다.
용어 "Fc 폴리펩타이드"는 항체의 Fc 영역으로부터 유도된 폴리펩타이드의 천연 및 뮤테인(mutein) 형태를 포함한다. 또한, 이량체화를 촉진시키는 힌지 영역을 함유하는 이러한 폴리펩타이드의 절단된 형태도 포함된다. Fc 모이어티(및 이로부터 형성된 올리고머)를 포함하는 융합 단백질은 단백질 A 또는 단백질 G 컬럼에 대한 친화성 크로마토그래피에 의한 용이한 정제 이점을 제공한다.
"에피토프"는 항원 결합 단백질에 의해(예를 들면, 항체에 의해) 결합되는 분자의 부분이다. 에피토프는 분자의 비-인접 부분(예를 들면, 폴리펩타이드 내에서, 폴리펩타이드의 1차 서열에 인접하지 않지만, 폴리펩타이드의 3차 및 4차 구조의 상황에서 항원 결합 단백질에 의해 서로 결합되기에 충분히 가까운 아미노산 잔기)을 포함할 수 있다.
2개의 폴리뉴클레오타이드 또는 2개의 폴리펩타이드 서열의 "동일성 백분율" 또는 "상동성 백분율"은 디폴트 파라미터(default parameter)를 사용하는 GAP 컴퓨터 프로그램(GCG Wisconsin Package의 일부, version 10.3(Accelrys, San Diego, Calif.))을 사용하여 서열을 비교함으로써 결정된다.
용어 "폴리뉴클레오타이드", "올리고뉴클레오타이드" 및 "핵산"은 전체에 걸쳐 상호교환적으로 사용되며, 이로는 DNA 분자(예를 들면, cDNA 또는 게놈 DNA), RNA 분자(예를 들면, mRNA), 뉴클레오타이드 유사체를 사용하여 생성된 DNA 또는 RNA의 유사체(예를 들면, 펩타이드 핵산 및 비-자연 발생 뉴클레오타이드 유사체), 및 이들의 하이브리드가 포함된다. 핵산 분자는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 한 실시형태에서, 본 발명의 핵산 분자는 항체, 또는 이의 단편, 유도체, 뮤테인 또는 변이체를 암호화하는 인접 개방 판독 프레임(open reading frame)을 포함한다.
2개의 단일-가닥의 폴리뉴클레오타이드는 이들의 서열이, 하나의 폴리뉴클레오타이드 내의 모든 뉴클레오타이드가, 갭의 도입 없이, 그리고 어느 한 서열의 5' 또는 3' 말단에서 쌍을 이루지 않은 뉴클레오타이드가 없이, 다른 폴리뉴클레오타이드 내의 이의 상보적 뉴클레오타이드와 반대되도록 역-평행(anti-parallel) 배향으로 정렬될 수 있는 경우에 서로 "상보적"이다. 폴리뉴클레오타이드는 2개의 폴리뉴클레오타이드가 적당히 엄격한 조건 하에서 서로 하이브리드화될 수 있는 경우에 다른 폴리뉴클레오타이드에 대해 "상보적"이다. 따라서, 폴리뉴클레오타이드는 이의 보체 없이 다른 폴리뉴클레오타이드에 상보적일 수 있다.
"벡터"는 이에 연결된 다른 핵산을 세포로 도입하는데 사용될 수 있는 핵산이다. 벡터의 한 유형은, 추가의 핵산 절편이 라이게이션될 수 있는 선형 또는 원형 이중 가닥의 DNA 분자를 나타내는 "플라스미드"이다. 다른 유형의 벡터는 바이러스성 벡터(예를 들면, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)이고, 여기서, 추가의 DNA 절편이 바이러스성 게놈 내에 도입될 수 있다. 소정 벡터는 이들이 도입되는 숙주 세포 내에서 자가 복제할 수 있다(예를 들면, 박테리아 복제 기원(origin)을 포함하는 박테리아 벡터 및 에피솜성(episomal) 포유동물 벡터). 다른 벡터(예를 들면, 비-에피솜성 포유동물 벡터)가 숙주 세포 내로 도입시 숙주 세포의 게놈 내로 통합되며, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. "발현 벡터"는 선택된 폴리뉴클레오타이드의 발현을 지시할 수 있는 벡터의 유형이다.
뉴클레오타이드 서열은 조절 서열이 뉴클레오타이드 서열의 발현(예를 들면, 발현의 수준, 시기 또는 위치)에 영향을 미치는 경우에 조절 서열에 "작동가능하게 연결"된다. "조절 서열"은 작동가능하게 연결된 핵산의 발현(예를 들면, 발현의 수준, 시기 또는 위치)에 영향을 미치는 핵산이다. 조절 서열은, 예를 들면, 조절되는 핵산에 직접 이의 효과를 발휘할 수 있거나, 하나 이상의 다른 분자(예를 들면, 조절 서열 및/또는 핵산에 결합하는 폴리펩타이드)의 작용을 통해 이의 효과를 발휘할 수 있다. 조절 서열의 예로는 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 제어 요소(예를 들면, 폴리아데닐화 신호)가 포함된다. 조절 서열의 추가의 예는 예를 들면, 문헌[Goeddel, 1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif.] 및 문헌[Baron et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23:3605-06]에 기술되어 있다.
"숙주 세포"는 핵산, 예를 들면, 본 발명의 핵산을 발현시키는데 사용될 수 있는 세포이다. 숙주 세포는 원핵생물, 예를 들면, 이. 콜라이(E. coli )일 수 있거나, 진핵생물, 예를 들면, 단세포 진핵생물(예를 들면, 효모 또는 다른 진균), 식물 세포(예를 들면, 담배 또는 토마토 식물 세포), 동물 세포(예를 들면, 사람 세포, 원숭이 세포, 햄스터 세포, 래트 세포, 마우스 세포 또는 곤충 세포) 또는 하이브리도마일 수 있다. 숙주 세포의 예로는 원숭이 신장 세포의 COS-7 세포주(ATCC CRL 1651)(참조: Gluzman et al., 1981, Cell 23:175), L 세포, C127 세포, 3T3 세포(ATCC CCL 163), 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 이들의 유도체, 예를 들면, Veggie CHO 및 혈청-비함유 배지에서 성장하는 관련 세포주(참조: Rasmussen et al., 1998, Cytotechnology 28:31) 또는 DHFR이 결핍된 CHO 스트레인 DX-BI1(참조: Urlaub et al., 1980, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 77:4216-20), HeLa 세포, BHK(ATCC CRL 10) 세포주, 아프리카 녹색 원숭이(African green monkey) 신장 세포주 CV1로부터 유도된 CV1/EBNA 세포주(ATCC CCL 70)(참조: McMahan et al., 1991, EMBO J. 10:2821), 사람 배아 신장 세포, 예를 들면, 293,293 EBNA 또는 MSR 293, 사람 표피 A431 세포, 사람 Colo205 세포, 다른 형질전환된 영장류 세포주, 정상 이배체 세포(normal diploid cell), 1차 조직의 시험관내 배양으로부터 유도된 세포 스트레인, 1차 외식편(explant), HL-60, U937, HaK 또는 저캇(Jurkat) 세포가 포함된다. 한 실시형태에서, 숙주 세포는 포유동물 숙주 세포이지만, 사람 숙주 세포는 아니다. 전형적으로, 숙주 세포는, 이후 숙주 세포에서 발현될 수 있는 폴리펩타이드-암호화 핵산으로 형질전환되거나 형질감염될 수 있는 배양된 세포이다. 어구 "재조합 숙주 세포"는 발현될 핵산으로 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포를 나타내는데 사용될 수 있다. 또한, 숙주 세포는 핵산을 포함하지만, 조절 서열이 숙주 세포 내로 도입되어, 핵산과 작동가능하게 연결되지 않는 한 이를 목적하는 수준으로 발현시키지 않는 세포일 수 있다. 용어 숙주 세포는 특정 대상체 세포뿐만 아니라 이러한 세포의 자손(progeny) 또는 잠재적 자손을 나타내는 것으로 이해된다. 소정 변형이, 예를 들면, 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 다음 세대에서 발생할 수 있기 때문에, 상기 자손은 사실상 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 이는 여전히 본원에서 사용된 용어의 범위 내에 포함된다.
용어 "재조합 항체"는 항체의 암호화 서열을 포함하는 발현 벡터(또는 가능하게는 1개 초과의 발현 벡터, 전형적으로는 2개의 발현 벡터)로 형질감염된 세포 또는 세포주로부터 발현되는 항체를 나타내고, 여기서, 상기 암호화 서열은 세포와 자연적으로 관련되어 있지 않다. 한 실시형태에서, 재조합 항체는 자연에 존재하는 것이라면 동일한 서열을 갖는 항체의 글리코실화 패턴과 상이한 글리코실화 패턴을 갖는다. 한 실시형태에서, 재조합 항체는 사람 숙주 세포가 아닌 포유동물 숙주 세포에서 발현된다. 특히, 개별 포유동물 숙주 세포는 고유한 글리코실화 패턴을 갖는다.
본원에서 사용되는 용어 "유효량"은 대상체에게 투여되는 경우, 본원에 기술되는 CTLA4 의존적 신호전달과 관련된 질환의 치료, 예후 또는 진단에 영향을 미치기에 충분한 CTLA4에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합부의 양을 나타낸다. 본원에 제공된 항체의 치료학적 유효량은 단독으로 또는 조합으로 사용되는 경우, 항체 및 조합의 상대적 활성에 따라(예를 들면, 세포 성장 억제시) 그리고 치료되는 대상체 및 질환, 대상체의 체중 및 연령, 질환 상태의 중증도, 투여 등의 방식에 따라 다를 것이고, 이는 당해 분야 숙련가에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
용어 "단리된"은 다른 세포성 물질 및/또는 화합물질을 실질적으로 포함하지 않는 단백질(예를 들면, 항체)을 나타낸다. 한 실시형태에서, 단리된 항체는 동일한 종 유래의 다른 단백질을 실질적으로 포함하지 않는다. 한 실시형태에서, 단리된 항체는 상이한 종 유래의 세포에 의해 발현되고 상이한 종 유래의 다른 단백질을 실질적으로 포함하지 않는다. 단백질은 당해 분야에 익히 공지되어 있는 단백질 정제 기술을 이용하여, 단리에 의해 자연적으로 관련되어 있는 구성성분들(또는 항체를 생산하기 위해 사용되는 세포 발현 시스템과 관련되어 있는 구성성분들)을 실질적으로 포함하지 않도록 이루어질 수 있다. 한 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 단리된다.
CTLA4 항원 결합 단백질
본 발명은 CTLA4에 결합하는 CTLA4 결합 단백질, 특히, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합부 및 이들의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 각종 양상들은 항체 및 항체 단편, 이러한 항체 및 단편을 제조하기 위한 약제학적 조성물, 핵산, 재조합 발현 벡터, 및 숙주 세포에 관한 것이다. 사람 CTLA4를 검출하고, 시험관내에서 또는 생체내에서 CTLA4 활성을 억제하고, 암과 같은 장애를 예방하거나 치료하기 위해 본 발명의 항체의 사용하는 방법도 본 발명에 의해 포함된다.
하기 표 4에 기술되는 바와 같이, CTLA4에 대해 특이적인 신규 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역이 본 발명에 포함된다. 한 실시형태에서, 본 발명은, 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 및 43 중 어느 하나에 제시되는 아미노산 서열을 포함하는 가변 도메인을 갖는 중쇄를 포함하는, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 한 실시형태에서, 본 발명은, 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 및 44 중 어느 하나에 제시되는 아미노산 서열을 포함하는 가변 도메인을 갖는 경쇄를 포함하는, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 및 43에 제시되는 아미노산 서열을 포함하는 가변 도메인을 갖는 중쇄를 포함하고; 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 및 44 중 어느 하나에 제시되는 아미노산 서열을 포함하는 가변 도메인을 갖는 경쇄를 포함하는, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
상보성 결정 영역(CDR)은 경쇄와 중쇄 가변 도메인 둘 다에서의 초가변성 영역으로서 알려져 있다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 프레임워크(FR)라고 칭한다. 주어진 항체의 상보성 결정 영역(CDR) 및 프레임워크 영역(FR)은 문헌[Kabat et al. 상기]; 문헌[Lefranc et al., 상기] 및/또는 문헌[Honegger and Pluckthun, 상기]에 의해 기술된 시스템을 이용하여 확인될 수 있다. 또한, 문헌[Kabat et al. (1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, Va.)]에 기술된 번호매김 시스템도 당해 분야 숙련가들에게 친숙하다. 이와 관련하여, 카바트 등은 임의의 항체에 적용가능한 가변 도메인 서열에 대한 번호매김 시스템을 정의하였다. 당해 분야 숙련가들 중 하나는 서열 자체 이외의 임의의 실험 데이터에 의존하지 않고, 임의의 가변 도메인 아미노산 서열에 "카바트 번호매김(Kabat numbering)" 시스템을 분명하게 할당할 수 있다. 대안의 번호매김은 문헌[Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)] 및 문헌[MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)]에 제시되지만, 카바트에서와 같이 FR 경계는 상기 기술된 각각의 CDR 말단에 의해 분리된다. 또한, 문헌[Chothia et al., Nature 342, pp. 877-883 (1989)] 및 문헌[S. Dubel, Handbook of Therapeutic Antibodies, 3rd ed., WILEY-VCH Verlag GmbH and Co. (2007)]을 참조하고, 여기서, 정의는 서로에 대해 비교될 때 아미노산 잔기의 중첩(overlapping) 또는 서브세트(subset)를 포함한다.
소정 실시형태들에서, 본 발명은 표 4에 기술되는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 CDR(서열번호 1 내지 서열번호 44)을 포함하는 항-CTLA4 항체를 제공한다. 예를 들면, 본 발명은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 및 43 중 어느 하나에 제시되는 아미노산 서열에 기술된 CDR들을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 및 44 중 어느 하나에 제시되는 아미노산 서열에 기술되는 CDR들을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 및 44 중 어느 하나에 제시되는 아미노산 서열에 기술되는 CDR들을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하고; 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 및 43 중 어느 하나에 제시되는 아미노산 서열에 기술되는 CDR들을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
하나 이상의 CDR들은 공유결합적으로 또는 비공유결합적으로 분자에 도입되어 이를 항원 결합 단백질로 만들 수 있다.
항원 결합 단백질은 CDR(들)을 보다 큰 폴리펩타이드 쇄의 부분으로서 도입할 수 있거나, 다른 폴리펩타이드 쇄에 CDR(들)을 공유결합적으로 연결시키거나, 또는 CDR(들)을 비공유결합적으로 도입할 수 있다. CDR들은 항원 결합 단백질이 목적하는 특정 항원에 특이적으로 결합하는 것을 가능하게 한다.
한 실시형태에서, 본 개시는 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 33, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 43으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 중쇄 가변 도메인 서열을 갖고, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 44로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 경쇄 가변 도메인 서열을 갖는, CTLA4 에피토프에 결합하는 IgG 부류의 단리된 완전한 사람 항체를 제공한다.
한 실시형태에서, 단리된 완전한 사람 항체는 중쇄 및 경쇄 둘 다를 갖고, 여기서, 상기 항체는 서열번호 1/서열번호 2(본원에서 A1이라고 칭함), 서열번호 3/서열번호 4(본원에서 A2라고 칭함), 서열번호 5/서열번호 6(본원에서 A4라고 칭함), 서열번호 7/서열번호 8(본원에서 A7이라고 칭함), 서열번호 9/서열번호 10(본원에서 A12라고 칭함), 서열번호 11/서열번호 12(본원에서 B6이라고 칭함), 서열번호 13/서열번호 14(본원에서 C2라고 칭함), 서열번호 15/서열번호 16(본원에서 D6이라고 칭함), 서열번호 17/서열번호 18(본원에서 F1이라고 칭함), 서열번호 19/서열번호 20(본원에서 F3이라고 칭함), 서열번호 21/서열번호 22(본원에서 F5라고 칭함), 서열번호 23/서열번호 24(본원에서 F6이라고 칭함), 서열번호 25/서열번호 26(본원에서 F7이라고 칭함), 서열번호 27/서열번호 28(본원에서 G1이라고 칭함), 서열번호 29/서열번호 30(본원에서 G2라고 칭함), 서열번호 31/서열번호 32(본원에서 G3이라고 칭함), 서열번호 33/서열번호 34(본원에서 G5라고 칭함), 서열번호 35/서열번호 36(본원에서 G12라고 칭함), 서열번호 37/서열번호 38(본원에서 D5라고 칭함), 서열번호 39/서열번호 40(본원에서 E7이라고 칭함), 서열번호 41/서열번호 42(본원에서 E8이라고 칭함), 서열번호 43/서열번호 44(본원에서 CT1E1이라고 칭함)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 중쇄/경쇄 가변 도메인 서열 및 이들의 조합을 갖는다.
한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 및 43을 포함하는 중쇄를 포함하고 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 및 43 중 어느 하나에 제시되는 서열과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 도메인을 포함하는, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 및 44를 포함하는 경쇄를 포함하고 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 및 44 중 어느 하나에 제시되는 서열과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 갖는, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 따라서, 소정 실시형태들에서, CDR3 도메인은 일정하게 유지되고, 한편, 가변성은 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지 CDR들 및/또는 프레임워크 영역에 도입되고, 한편, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CTLA4에 결합하는 능력을 유지하고, 모 항체(the parent)의 기능적 특성, 예를 들면, 결합 친화성을 유지한다.
한 실시형태에서, 적어도 95% 동일한(또는 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한) 중쇄 또는 경쇄 내에서 이루어지는 치환은 보존적 아미노산 치환이다. "보존적 아미노산 치환"은 한 아미노산 잔기가, 유사한 화학적 특성(예를 들면, 전하 또는 소수성)을 갖는 측쇄(R 그룹)를 갖는 다른 아미노산 잔기로 치환되는 것이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능적 특성을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다. 2개 이상의 아미노산 서열이 보존적 치환에 의해 서로 상이한 경우, 서열 동일성 백분율 또는 유사성 정도는 치환의 보존적 특성을 교정하기 위해 상향 조정될 수 있다. 이러한 조정을 이루기 위한 수단은 당해 분야 숙련가들에게 익히 공지되어 있다. 예를 들면, 본원에 인용에 의해 포함된 문헌[Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331]을 참조한다. 유사한 화학적 특성을 갖는 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹의 예로는 (1) 지방족 측쇄: 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신; (2) 지방족-하이드록실 측쇄: 세린 및 트레오닌; (3) 아미드-함유 측쇄: 아스파라긴 및 글루타민; (4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판; (5) 염기성 측쇄: 리신, 아르기닌 및 히스티딘; (6) 산성 측쇄: 아스파르테이트 및 글루타메이트, 및 (7) 황-함유 측쇄: 시스테인 및 메티오닌이 포함된다.
한 실시형태에서, 본 발명은 항체 A1의 항원 결합 영역을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 1에 제시되는 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열번호 2에 제시되는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 1의 CDR들을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 2의 CDR들을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 갖는 항체에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 1에 제시되는 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 서열번호 2에 제시되는 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 사람 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 특징으로 한다. 상기 항체는 추가로 IgG1 또는 IgG4 이소타입일 수 있다.
한 실시형태에서, 본 발명은 항체 A2의 항원 결합 영역을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 3에 제시되는 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열번호 4에 제시되는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 3의 CDR들을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 4의 CDR들을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 갖는 항체에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 3에 제시되는 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 서열번호 4에 제시되는 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 사람 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 특징으로 한다. 상기 항체는 추가로 IgG1 또는 IgG4 이소타입일 수 있다.
한 실시형태에서, 본 발명은 항체 A4의 항원 결합 영역을 갖는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 5에 제시되는 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열번호 6에 제시되는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 5의 CDR들을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 6의 CDR들을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 갖는 항체에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 5에 제시되는 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 서열번호 6에 제시되는 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 사람 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 특징으로 한다. 상기 항체는 추가로 IgG1 또는 IgG4 이소타입일 수 있다.
한 실시형태에서, 본 발명은 항체 A7의 항원 결합 영역을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 7에 제시되는 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열번호 8에 제시되는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 7의 CDR들을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 8의 CDR들을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 갖는 항체에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 7에 제시되는 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 서열번호 8에 제시되는 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 사람 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 특징으로 한다. 상기 항체는 추가로 IgG1 또는 IgG4 이소타입일 수 있다.
한 실시형태에서, 본 발명은 항체 A12의 항원 결합 영역을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 9에 제시되는 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열번호 10에 제시되는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 9의 CDR들을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 10의 CDR들을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 갖는 항체에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 9에 제시되는 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 서열번호 10에 제시되는 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 사람 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 특징으로 한다. 상기 항체는 추가로 IgG1 또는 IgG4 이소타입일 수 있다.
한 실시형태에서, 본 발명은 항체 B6의 항원 결합 영역을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 11에 제시되는 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열번호 12에 제시되는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 11의 CDR들을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 12의 CDR들을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 갖는 항체에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 11에 제시되는 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 서열번호 12에 제시되는 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 사람 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 특징으로 한다. 상기 항체는 추가로 IgG1 또는 IgG4 이소타입일 수 있다.
한 실시형태에서, 본 발명은 항체 C2의 항원 결합 영역을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 13에 제시되는 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열번호 14에 제시되는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 13의 CDR들을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 14의 CDR들을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 갖는 항체에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 13에 제시되는 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 서열번호 14에 제시되는 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 사람 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 특징으로 한다. 상기 항체는 추가로 IgG1 또는 IgG4 이소타입일 수 있다.
한 실시형태에서, 본 발명은 항체 D6의 항원 결합 영역을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 15에 제시되는 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열번호 16에 제시되는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 15의 CDR들을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 16의 CDR들을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 갖는 항체에 관한 것이다. 상기 D6 및 상기 A1 항체는 동일한 중쇄 및 경쇄 가변 서열을 포함함에 주의해야만 한다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 15에 제시되는 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 서열번호 16에 제시되는 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 사람 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 특징으로 한다. 상기 항체는 추가로 IgG1 또는 IgG4 이소타입일 수 있다.
한 실시형태에서, 본 발명은 항체 F1의 항원 결합 영역을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 17에 제시되는 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열번호 18에 제시되는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 17의 CDR들을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 18의 CDR들을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 갖는 항체에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 17에 제시되는 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 서열번호 18에 제시되는 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 사람 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 특징으로 한다. 상기 항체는 추가로 IgG1 또는 IgG4 이소타입일 수 있다.
한 실시형태에서, 본 발명은 항체 F3의 항원 결합 영역을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 19에 제시되는 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열번호 20에 제시되는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 19의 CDR들을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 20의 CDR들을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 갖는 항체에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 19에 제시되는 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 서열번호 20에 제시되는 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 사람 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 특징으로 한다. 상기 항체는 추가로 IgG1 또는 IgG4 이소타입일 수 있다.
한 실시형태에서, 본 발명은 항체 F5의 항원 결합 영역을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 21에 제시되는 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열번호 22에 제시되는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 21의 CDR들을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 22의 CDR들을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 갖는 항체에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 21에 제시되는 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 서열번호 22에 제시되는 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 사람 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 특징으로 한다. 상기 항체는 추가로 IgG1 또는 IgG4 이소타입일 수 있다.
한 실시형태에서, 본 발명은 항체 F6의 항원 결합 영역을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 23에 제시되는 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열번호 24에 제시되는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 23의 CDR들을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 24의 CDR들을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 갖는 항체에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 23에 제시되는 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 서열번호 24에 제시되는 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 사람 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 특징으로 한다. 상기 항체는 추가로 IgG1 또는 IgG4 이소타입일 수 있다.
한 실시형태에서, 본 발명은 항체 F7의 항원 결합 영역을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 25에 제시되는 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열번호 26에 제시되는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 25의 CDR들을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 26의 CDR들을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 갖는 항체에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 25에 제시되는 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 서열번호 26에 제시되는 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 사람 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 특징으로 한다. 상기 항체는 추가로 IgG1 또는 IgG4 이소타입일 수 있다.
한 실시형태에서, 본 발명은 항체 G1의 항원 결합 영역을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 27에 제시되는 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열번호 28에 제시되는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 27의 CDR들을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 28의 CDR들을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 갖는 항체에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 27에 제시되는 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 서열번호 28에 제시되는 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 사람 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 특징으로 한다. 상기 항체는 추가로 IgG1 또는 IgG4 이소타입일 수 있다.
한 실시형태에서, 본 발명은 항체 G2의 항원 결합 영역을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 29에 제시되는 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열번호 30에 제시되는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 29의 CDR들을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 30의 CDR들을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 갖는 항체에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 29에 제시되는 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 서열번호 30에 제시되는 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 사람 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 특징으로 한다. 상기 항체는 추가로 IgG1 또는 IgG4 이소타입일 수 있다.
한 실시형태에서, 본 발명은 항체 G3의 항원 결합 영역을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 31에 제시되는 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열번호 32에 제시되는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 31의 CDR들을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 32의 CDR들을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 갖는 항체에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 31에 제시되는 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 서열번호 32에 제시되는 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 사람 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 특징으로 한다. 상기 항체는 추가로 IgG1 또는 IgG4 이소타입일 수 있다.
한 실시형태에서, 본 발명은 항체 G5의 항원 결합 영역을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 33에 제시되는 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열번호 34에 제시되는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 33의 CDR들을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 34의 CDR들을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 갖는 항체에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 33에 제시되는 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 서열번호 34에 제시되는 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 사람 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 특징으로 한다. 상기 항체는 추가로 IgG1 또는 IgG4 이소타입일 수 있다.
한 실시형태에서, 본 발명은 항체 G12의 항원 결합 영역을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 35에 제시되는 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열번호 36에 제시되는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 35의 CDR들을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 36의 CDR들을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 갖는 항체에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 35에 제시되는 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 서열번호 36에 제시되는 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 사람 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 특징으로 한다. 상기 항체는 추가로 IgG1 또는 IgG4 이소타입일 수 있다.
한 실시형태에서, 본 발명은 항체 D5의 항원 결합 영역을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 37에 제시되는 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열번호 38에 제시되는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 37의 CDR들을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 38의 CDR들을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 갖는 항체에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 37에 제시되는 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 서열번호 38에 제시되는 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 사람 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 특징으로 한다. 상기 항체는 추가로 IgG1 또는 IgG4 이소타입일 수 있다.
한 실시형태에서, 본 발명은 항체 E7의 항원 결합 영역을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 39에 제시되는 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열번호 40에 제시되는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 39의 CDR들을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 40의 CDR들을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 갖는 항체에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 39에 제시되는 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 서열번호 40에 제시되는 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 사람 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 특징으로 한다. 상기 항체는 추가로 IgG1 또는 IgG4 이소타입일 수 있다.
한 실시형태에서, 본 발명은 항체 E7의 항원 결합 영역을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 39에 제시되는 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열번호 40에 제시되는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 39의 CDR들을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 40의 CDR들을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 갖는 항체에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 39에 제시되는 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 서열번호 40에 제시되는 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 사람 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 특징으로 한다. 상기 항체는 추가로 IgG1 또는 IgG4 이소타입일 수 있다.
한 실시형태에서, 본 발명은 항체 E8의 항원 결합 영역을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 41에 제시되는 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열번호 42에 제시되는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 41의 CDR들을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 42의 CDR들을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 갖는 항체에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 41에 제시되는 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 서열번호 42에 제시되는 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 사람 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 특징으로 한다. 상기 항체는 추가로 IgG1 또는 IgG4 이소타입일 수 있다.
한 실시형태에서, 본 발명은 항체 CT1E1의 항원 결합 영역을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 43에 제시되는 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열번호 44에 제시되는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 43의 CDR들을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 44의 CDR들을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 갖는 항체에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 43에 제시되는 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 서열번호 44에 제시되는 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 사람 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 특징으로 한다. 상기 항체는 추가로 IgG1 또는 IgG4 이소타입일 수 있다.
항원 결합 단백질(예를 들면, 항체, 항체 단편, 항체 유도체, 항체 뮤테인, 및 항체 변이체)는 CTLA4에 결합하는 폴리펩타이드이다.
본 발명의 항원 결합 단백질의 항원-결합 단편은 종래 기술에 의해 생성될 수 있다. 이러한 단편의 예로는 Fab 및 F(ab')2 단편이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
단일쇄 항체는 아미노산 가교(짧은 펩타이드 링커)를 통해 중쇄 및 경쇄 가변 도메인(Fv 영역) 단편을 연결시켜 단일 폴리펩타이드 쇄를 얻음으로써 형성될 수 있다. 이러한 단일쇄 Fv(scFv)는 2개의 가변 도메인 폴리펩타이드(VL 및 VH)를 암호화하는 DNA들 사이에 펩타이드 링커를 암호화하는 DNA를 융합시킴으로써 제조되었다. 수득된 폴리펩타이드는 스스로 다시 폴딩되어 항원-결합 단량체를 형성할 수 있거나, 이들은 2개의 가변 도메인 사이의 가요성 링커의 길이에 따라 다량체(예를 들면, 이량체, 삼량체 또는 사량체)를 형성할 수 있다(Kortt et al., 1997, Prot. Eng. 10:423; Kortt et al., 2001, Biomol. Eng. 18:95-108). 상이한 VL 및 VH-포함 폴리펩타이드를 조합함으로써, 상이한 에피토프에 결합하는 다량체 scFv를 형성할 수 있다(Kriangkum et al., 2001, Biomol. Eng. 18:31-40). 단일쇄 항체의 생산을 위해 개발된 기술은 문헌[U.S. 특허 4,946,778; Bird, 1988, Science 242:423; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879; Ward et al., 1989, Nature 334:544, de Graaf et al., 2002, Methods Mol. Biol. 178:379-87]에 기술된 것들을 포함한다.
소정 실시형태들에서, 본 개시는 중쇄 유래의 가변 도메인 영역 및 경쇄 유래의 가변 도메인 영역을 갖는 Fab 완전한 사람 항체 단편을 제공하고, 여기서, 상기 Fab 완전한 사람 항체 단편은 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 33, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 43 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 중쇄 가변 도메인을 갖고, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 44 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 경쇄 가변 도메인을 갖는다. 바람직하게, 완전한 사람 항체 Fab 단편은 중쇄 가변 도메인 영역 및 경쇄 가변 도메인 영역 둘 다를 갖고, 여기서, 상기 항체는 서열번호 1/서열번호 2, 서열번호 3/서열번호 4, 서열번호 5/서열번호 6, 서열번호 7/서열번호 8, 서열번호 9/서열번호 10, 서열번호 11/서열번호 12, 서열번호 13/서열번호 14, 서열번호 15/서열번호 16, 서열번호 17/서열번호 18, 서열번호 19/서열번호 20, 서열번호 21/서열버노 22, 서열번호 23/서열번호 24, 서열번호 25/서열번호 26, 서열번호 27/서열번호 28, 서열번호 29/서열번호 30, 서열번호 31/서열번호 32, 서열번호 33/서열번호 34, 서열번호 35/서열번호 36, 서열번호 37/서열번호 38, 서열번호 39/서열번호 40, 서열번호 41/서열번호 42, 서열번호 43/서열번호 44 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 중쇄/경쇄 가변 도메인 서열을 갖는다.
한 실시형태에서, 본 개시는 중쇄 유래의 가변 도메인 영역 및 경쇄 유래의 가변 도메인 영역, 및 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 영역을 연결하는 펩타이드 링커를 갖는, 단일쇄 사람 항체를 제공하고, 여기서, 상기 단일쇄 사람 항체는 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 33, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 43 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 중쇄 가변 도메인 서열을 갖고, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 44 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 경쇄 가변 도메인 서열을 갖는다. 바람직하게, 완전한 사람 단일쇄 항체는 중쇄 가변 도메인 영역 및 경쇄 가변 도메인 영역 둘 다를 갖고, 여기서, 상기 단일쇄 완전한 사람 항체는 서열번호 1/서열번호 2, 서열번호 3/서열번호 4, 서열번호 5/서열번호 6, 서열번호 7/서열번호 8, 서열번호 9/서열번호 10, 서열번호 11/서열번호 12, 서열번호 13/서열번호 14, 서열번호 15/서열번호 16, 서열번호 17/서열번호 18, 서열번호 19/서열번호 20, 서열번호 21/서열번호 22, 서열번호 23/서열번호 24, 서열번호 25/서열번호 26, 서열번호 27/서열번호 28, 서열번호 29/서열번호 30, 서열번호 31/서열번호 32, 서열번호 33/서열번호 34, 서열번호 35/서열번호 36, 서열번호 37/서열번호 38, 서열번호 39/서열번호 40, 서열번호 41/서열번호 42, 서열번호 43/서열번호 44 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 중쇄/경쇄 가변 도메인 서열을 갖는다.
목적하는 항체로부터 상이한 아부류 또는 이소타입의 항체를 유도하기 위한 기술, 즉, 아부류 스위칭(subclass switching)이 공지되어 있다. 따라서, IgG 항체는 예를 들면, IgM 항체로부터 유도될 수 있고, 반대로 IgM 항체는 IgG 항체로부터 유도될 수 있다. 이러한 기술은 제공된 항체(모 항체)의 항원-결합 특성을 갖지만, 또한 모 항체의 것과 상이한 항체 이소타입 또는 아부류와 관련된 생물학적 특성을 나타내는 신규한 항체의 제조를 가능하게 한다. 재조합 DNA 기술이 사용될 수 있다. 특정 항체 폴리펩타이드를 암호화하는 클로닝된 DNA, 예를 들면, 목적하는 이소타입의 항체의 불변 도메인을 암호화하는 DNA가 이러한 절차에 사용될 수 있다(Lantto et al., 2002, Methods Mol. Biol. 178:303-16). 더욱이, IgG4가 바람직한 경우, IgG4 항체에서 이질혼합성(heterogeneity)을 유도할 수 있는 H 쇄 내 디설파이드 결합을 형성하는 경향을 완화시키기 위해 힌지 영역에 점 돌연변이(CPSC->CPPC)를 도입하는 것이 또한 바람직할 수 있다(Bloom et al., 1997, Protein Science 6:407). 따라서, 한 실시형태에서, 본 발명의 항체는 사람 IgG1 항체이다. 따라서, 한 실시형태에서, 본 발명의 항체는 사람 IgG4 항체이다.
본 개시는 항체의 가변 도메인 영역의 아미노산 서열에 의해 구조적으로 특성확인되어 있는 다수의 항체를 제공한다. 그러나, 아미노산 서열은 이들의 특이적 표적에 대한 높은 정도의 결합을 유지하면서 몇몇의 변화를 경험할 수 있다. 보다 구체적으로, 가변 도메인 영역 내의 다수의 아미노산은 보존적 치환으로 변화될 수 있고, 얻어진 항체의 결합 특성은 야생형 항체 서열의 결합 특성과 상이하지 않을 것임이 예측가능하다. 항체 가변 도메인에는 항원과 직접적으로 상호작용하지 않거나 항원 결합에 영향을 미치지 않고 항체 구조를 결정하는데 중요하지 않은 다수의 아미노산이 존재한다. 예를 들면, 개시되는 항체 중 어느 하나의 예측된 비필수 아미노산 잔기는 동일한 부류 유래의 다른 아미노산 잔기로 대체되는 것이 바람직하다. 항원 결합을 제거하지 않는 아미노산 보존적 치환을 확인하는 방법은 당해 분야에 익히 공지되어 있다(예를 들면, 문헌[Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); 및 Burks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997)]을 참조한다). 문헌[Near et al. Mol. Immunol. 30:369-377, 1993]은 부위-지시된 돌연변이유발을 통한 결합에 영향을 미치거나 영향을 미치지 않는 방법을 설명한다. Near et al.이 생각한 돌연변이된 잔기들만이 항원 결합을 변화시킬 높은 가능성을 가졌다. 대부분은 결합 친화도(Near et al., 표 3) 및 다양한 형태의 디곡신에 대한 결합에 대해 완만하거나 부정적인 영향을 가졌다(Near et al., 표 2). 따라서, 본 발명은 또한 소정 실시형태들에서 본원에 개시된 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 가변 서열을 포함한다.
소정 실시형태들에서, 본원에서 제공되는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 1 x 10-6M 이하; 5 x 10-7M 이하; 1 x 10-7M 이하; 5 x 10-8M 이하; 1 x 10-8M 이하; 5 x 10-9M 이하; 또는 1 x 10-9M 이하의 해리 상수(KD)를 갖는다. 한 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 1 x 10-7M 내지 1 x 10-10M의 KD를 갖는다. 한 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 1 x 10-8M 내지 1 x 10-10M의 KD를 갖는다.
당해 분야 숙련가들은 항체 또는 이의 단편의 Kd를 측정하기 위한 공지되어 있는 표준 방법을 이해할 것이다. 예를 들면, 한 실시형태에서, Kd는 방사선 표지된 항원 결합 검정(RIA)에 의해 측정된다. 한 실시형태에서, RIA는 목적하는 항체의 Fab 버전 및 이의 항원으로 수행된다. 예를 들면, 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화도는 비표지된 항원의 일련의 적정의 존재 하에 (125I)-표지된 항원의 최소 농도로 Fab를 평형화하고, 이어서, 항-Fab 항체-코팅된 플레이트로 결합된 항원을 포획함으로써 측정된다(예를 들면, 문헌[Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)]을 참조한다).
다른 실시형태에 따르면, Kd는 BIACORE™ 표면 플라스몬 공명 검정을 이용하여 측정된다. 본원에서 사용되는 용어 "표면 플라스몬 공명"은 예를 들면, BIAcore™ 시스템(Biacore Life Sciences division of GE Healthcare, Piscataway, N.J.)을 이용하여 바이오센서 매트릭스 내의 단백질 농도 변경의 검출에 의해 실시간 상호작용의 분석을 가능하게 하는 광학 현상을 나타낸다.
특정 실시형태들에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 적어도 106의 CTLA4에 대한 결합 친화도(Ka)를 갖는다. 다른 실시형태들에서, 항원 결합 단백질은 적어도 107, 적어도 108, 적어도 109, 또는 적어도 1010의 Ka를 나타낸다. 다른 실시형태에서, 항원 결합 단백질은 실시예에 기술되는 항체의 것과 실질적으로 동일한 Ka를 나타낸다.
다른 실시형태에서, 본 개시는 CTLA4로부터의 낮은 해리 속도를 갖는 항원 결합 단백질을 제공한다. 한 실시형태에서, 항원 결합 단백질은 1 X 10-4 내지 -1 이하의 Koff를 갖는다. 다른 실시형태에서, Koff는 5 X 10-5 내지 -1 이하이다. 다른 실시형태에서, Koff는 본원에 기술된 항체와 실질적으로 동일하다. 다른 실시형태에서, 항원 결합 단백질은 본원에 기술된 항체와 실질적으로 동일한 Koff로 CTLA4에 결합한다.
다른 양상에서, 본 개시는 CTLA4의 활성을 억제하는 항원 결합 단백질, 예를 들면, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 한 실시형태에서, 항원 결합 단백질은 1000nM 이하의 IC50을 갖는다. 다른 실시형태에서, IC50은 100nM 이하이고; 다른 실시형태에서, IC50은 10nM 이하이다. 다른 실시형태에서, IC50은 본원의 실시예에 기술된 항체의 IC50과 실질적으로 동일하다. 다른 실시형태에서, 항원 결합 단백질, 예를 들면, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 본원에 기술된 항체와 실질적으로 동일한 IC50으로 CTLA4의 활성을 억제한다. 한 실시형태에서, 본원에 개시된 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 의해 억제되는 CTLA4의 활성은 CD80 및/또는 CD86에 대한 CTLA4의 결합이다. 한 실시형태에서, 본 발명의 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 1 x 10-9 이하의 IC50으로 CD80의 CTLA4 결합을 억제한다. 한 실시형태에서, 본 발명의 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 5 x 10-10 이하의 IC50으로 CD80의 CTLA4 결합을 억제한다. 한 실시형태에서, 본 발명의 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 1 x 10-10 이하의 IC50으로 CD80의 CTLA4 결합을 억제한다. 한 실시형태에서, 본 발명의 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 1 x 10-9 이하의 IC50으로 CD86의 CTLA4 결합을 억제한다. 한 실시형태에서, 본 발명의 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 5 x 10-10 이하의 IC50으로 CD86의 CTLA4 결합을 억제한다. 한 실시형태에서, 본 발명의 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 1 x 10-10 이하의 IC50으로 CD86의 CTLA4 결합을 억제한다. CD80 또는 CD86의 CTLA4 결합을 억제하기 위해, 항-CTLA4 항체의 능력을 시험하기 위해 사용될 수 있는 검정의 예는 당해 분야에 공지되어 있고, 본원에 제공되는 실시예에도 기술되어 있다.
다른 양상에서, 본 개시는 세포의 표면 상에 발현되는 CTLA4에 결합하는 항원 결합 단백질을 제공하고, 이는 세포에 결합시 세포의 표면 상의 CTLA4의 양의 유의한 감소를 야기하지 않고 세포에서 CTLA4 신호전달 활성을 억제한다. 세포의 표면 상의 그리고/또는 세포의 내부의 CTLA4의 양을 측정하거나 추정하기 위한 임의의 방법이 사용될 수 있다. 다른 실시형태들에서, CTLA4-발현 세포에의 항원 결합 단백질의 결합은 약 75%, 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1% 또는 0.1% 미만의 세포 표면 CTLA4를 내재화(internalized)되게 한다.
다른 양상에서, 본 개시는 시험관내에서 또는 생체내에서(예를 들면, 사람 대상체에게 투여하는 경우) 적어도 1일의 반감기를 갖는 항원 결합 단백질을 제공한다. 한 실시형태에서, 상기 항원 결합 단백질은 적어도 3일의 반감기를 갖는다. 다른 실시형태에서, 상기 항원 결합 단백질은 4일 이상의 반감기를 갖는다. 다른 실시형태에서, 상기 항원 결합 단백질은 8일 이상의 반감기를 갖는다. 다른 실시형태에서, 상기 항원 결합 단백질은, 유도체화되지 않거나 변형되지 않은 항원 결합 단백질과 비교하여 보다 긴 반감기를 갖도록 유도체화되거나 변형된다. 다른 실시형태에서, 상기 항원 결합 단백질은 본원에 인용에 의해 포함되는 문헌[WO00/09560]에 기술된 바와 같은 혈청 반감기를 증가시키기 위한 하나 이상의 점 돌연변이를 포함한다.
본 개시는 추가로 다중-특이적 항원 결합 단백질, 예를 들면, 이특이적 항원 결합 단백질, 예를 들면, 2개의 상이한 항원 결합 부위 또는 영역을 통해 CTLA4의 2개의 상이한 에피토프에, 또는 CTLA4의 에피토프 및 다른 분자의 에피토프에 결합하는 항원 결합 단백질을 제공한다. 더욱이, 본원에 개시된 이특이적 항원 결합 단백질은 본원에 기술된 항체들 중 하나로부터의 CTLA4 결합 부위, 및 다른 공보를 참조하여 본원에 기술된 것들을 포함하는, 본원에 기술된 항체들 중 다른 것으로부터의 제2 CTLA4 결합 영역을 포함할 수 있다. 대안으로, 이특이적 항원 결합 단백질은 본원에 기술된 항체들 중 하나로부터의 항원 결합 부위, 및 당해 분야에 공지되어 있는 다른 CTLA4 항체, 또는 공지된 방법 또는 본원에 기술된 방법에 의해 제조된 항체로부터의 제2 항원 결합 부위를 포함할 수 있다.
이특이적 항체를 제조하는 다수의 방법이 당해 분야에 공지되어 있다. 이러한 방법은 문헌[Milstein et al., 1983, Nature 305:537]에 기술된 하이브리드-하이브리도마, 및 항체 단편의 화학적 커플링[Brennan et al., 1985, Science 229:81; Glennie et al., 1987, J. Immunol . 139:2367; U.S. 특허 6,010,902]의 사용을 포함한다. 더욱이, 이특이적 항체는 재조합 수단을 통해, 예를 들면, 류신 지퍼 모이어티(즉, 이종이량체를 우선적으로 형성하는 Fos 및 Jun 단백질 유래; Kostelny et al., 1992, J. Immunol . 148: 1547) 또는 미국 특허 5,582,996에 기술된 다른 자물쇠-열쇠(lock and key) 상호작용 도메인 구조를 사용함으로써 생성될 수 있다. 추가의 유용한 기술은 미국 특허 5,959,083; 및 5,807,706에 기술된 것들을 포함한다.
다른 양상에서, 항원 결합 단백질은 항체의 유도체를 포함한다. 유도체화된 항체는, 특정 용도에서의 증가된 반감기와 같이 항체에 목적하는 특성을 부여하는 임의의 분자 또는 물질을 포함할 수 있다. 유도체화된 항체는, 예를 들면, 검출가능한(또는 표지된) 모이어티(예를 들면, 방사성, 비색, 항원성 또는 효소 분자), 검출가능한 비드(예를 들면, 자기 또는 전자고밀도(electrodense)(예를 들면, 금) 비드), 또는 다른 분자에 결합하는 분자(예를 들면, 비오틴 또는 스트렙트아비딘), 치료학적 또는 진단학적 모이어티(예를 들면, 방사성, 세포독성, 또는 약제학적 활성 모이어티), 또는 특정 용도(예를 들면, 대상체, 예를 들면, 사람 대상체로의 투여 또는 다른 생체내 또는 시험관내 용도)를 위한 항체의 적합성을 증가시키는 분자를 포함할 수 있다.
항체를 유도체화시키기 위해 사용될 수 있는 분자의 예는 알부민(예를 들면, 사람 혈청 알부민) 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 항체의 알부민-연결된 유도체 및 페길화된(PEGylated) 유도체는 당해 분야에 익히 공지되어 있는 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 한 실시형태에서, 항체는 트랜스티레틴(transthyretin; TTR) 또는 TTR 변이체에 접합되거나 또는 그렇지 않으면 연결된다. TTR 또는 TTR 변이체는, 예를 들면, 덱스트란, 폴리(n-비닐 피롤리돈), 폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 동종중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올 및 폴리비닐 알콜로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 화합물질로 화학적으로 변형될 수 있다.
하나 이상의 항원 결합 단백질을 함유하는 올리고머가 CTLA4 길항제로서 사용될 수 있다. 올리고머는 공유결합적으로 연결되거나 비공유결합적으로 연결된 이량체, 삼량체 또는 보다 고차의 올리고머의 형태일 수 있다. 2개 이상의 항원 결합 단백질을 포함하는 올리고머가 사용에 고려되며, 한 예는 동종이량체이다. 다른 올리고머는 이종이량체, 동종삼량체, 이종삼량체, 동종사량체, 이종사량체 등을 포함한다.
한 실시형태는 항원 결합 단백질에 융합된 펩타이드 모이어티 사이의 공유결합적 또는 비공유결합적 상호작용을 통해 연결된 다수의 항원 결합 단백질을 포함하는 올리고머에 관한 것이다. 이러한 펩타이드는 펩타이드 링커(스페이서), 또는 올리고머화를 촉진시키는 특성을 갖는 펩타이드일 수 있다. 류신 지퍼 및 항체로부터 유도된 소정 폴리펩타이드가 하기에 더욱 상세히 기술되는 바와 같은, 펩타이드에 부착된 항원 결합 단백질의 올리고머화를 촉진할 수 있는 펩타이드이다.
특정 실시형태에서, 올리고머는 2 내지 4개의 항원 결합 단백질을 포함한다. 올리고머의 항원 결합 단백질은 임의의 형태, 예를 들면, 상기 기술된 형태 중 어느 형태, 예를 들면, 변이체 또는 단편일 수 있다. 바람직하게는, 올리고머는 CTLA4 결합 활성을 갖는 항원 결합 단백질을 포함한다.
한 실시형태에서, 올리고머는 면역글로불린으로부터 유도된 폴리펩타이드를 사용하여 제조된다. 항체-유도된 폴리펩타이드의 다양한 부분(Fc 도메인 포함)에 융합된 소정의 이종성 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질의 제조는, 예를 들면, 문헌[Ashkenazi et al., 1991, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 88: 10535; Byrn et al., 1990, Nature 344:677; 및 Hollenbaugh et al., 1992 "Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", in Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, pages 10.19.1-10.19.11]에 기술되어 있다.
한 실시형태는 항체의 Fc 영역에 항-CTLA4 항체의 CTLA4 결합 단편을 융합시킴으로써 생성된 2개의 융합 단백질을 포함하는 이량체에 관한 것이다. 상기 이량체는, 예를 들면, 적절한 발현 벡터 내로 융합 단백질을 암호화하는 유전자 융합물을 삽입하고, 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포에서 유전자 융합물을 발현시키고, 발현된 융합 단백질이 항체 분자와 유사하게 조립되는 것을 가능하게 하여, Fc 모이어티 사이에 쇄간 디설파이드 결합을 형성하여 이량체를 산출함으로써 제조될 수 있다.
올리고머 항원 결합 단백질을 제조하기 위한 다른 방법은 류신 지퍼의 사용을 포함한다. 류신 지퍼 도메인은 이들이 발견되는 단백질의 올리고머화를 촉진시키는 펩타이드이다. 류신 지퍼는 본래 여러 DNA-결합 단백질에서 확인되었고(Landschulz et al., 1988, Science 240:1759), 이는 이후에 다양한 상이한 단백질에서 발견되었다. 공지의 류신 지퍼들 중에서 이량체화되거나 삼량체화되는 자연 발생 펩타이드 및 이의 유도체이다. 가용성 올리고머 단백질을 생성하는데 적합한 류신 지퍼 도메인의 예는 WO 94/10308에 기술되어 있고, 폐 계면활성제 단백질 D(lung surfactant protein D; SPD)로부터 유도된 류신 지퍼는 문헌[Hoppe et al., 1994, FEBS Letters 344:191]에 기술되어 있다. 류신 지퍼에 융합된 이종성 단백질의 안정한 삼량체화를 가능하게 하는 변형된 류신 지퍼의 사용은 문헌[Fanslow et al., 1994, Semin . Immunol . 6:267-78]에 기술되어 있다. 한 접근법에서, 류신 지퍼 펩타이드에 융합된 항-CTLA4 항체 단편 또는 유도체를 포함하는 재조합 융합 단백질은 적합한 숙주 세포에서 발현되고, 형성된 가용성 올리고머 항-CTLA4 항체 단편 또는 유도체는 배양 상청액으로부터 회수된다.
CTLA4에 대해 지시된 항원 결합 단백질은 예를 들면, 시험관내에서 또는 생체내에서 CTLA4 폴리펩타이드의 존재를 검출하기 위한 검정에 사용될 수 있다. 항원 결합 단백질은 또한 면역친화성 크로마토그래피에 의해 CTLA4 단백질을 정제하는데 사용될 수 있다. 항원 결합 단백질을 차단하는 것이 본원에 개시된 방법에서 사용될 수 있다. CTLA4 길항제로서 기능하는 상기 항원 결합 단백질은 다양한 암을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 임의의 CTLA4-유도된 병태를 치료하는데 사용될 수 있다.
항원 결합 단백질은 시험관내 절차에서 사용될 수 있거나, CTLA4-유도된 생물학적 활성을 억제하기 위해 생체내 투여될 수 있다. 따라서, CTLA4의 단백질분해 활성화에 의해 (직접적으로 또는 간접적으로) 야기되거나 악화되는 장애(상기 장애의 예가 본원에 제공됨)가 치료될 수 있다. 한 실시형태에서, 본 발명은 CTLA4-유도된 생물학적 활성을 감소시키는데 효과적인 양의 CTLA4 차단 항원 결합 단백질을 이를 필요로 하는 포유동물에게 생체내 투여하는 것을 포함하는 치료학적 방법을 제공한다.
소정 실시형태들에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 CTLA4의 생물학적 활성을 억제하는 완전한 사람 모노클로날 항체를 포함한다.
항원 결합 단백질은 다수의 종래 기술 중 어느 기술에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 이들은, 이들을 자연스럽게 발현시키는 세포로부터 정제될 수 있거나(예를 들면, 항체는 이를 생성하는 하이브리도마로부터 정제될 수 있다), 당해 분야에 공지된 임의의 기술을 사용하여 재조합 발현 시스템에서 생성될 수 있다. 예를 들면, 문헌[Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet et al. (eds.), Plenum Press, New York (1980); 및 Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Land (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988)]을 참조한다.
당해 분야에 공지된 임의의 발현 시스템이 본 발명의 재조합 폴리펩타이드를 제조하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 숙주 세포는 목적하는 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된다. 사용될 수 있는 숙주 세포 중에는 원핵생물, 효모 또는 보다 고등의 진핵생물 세포가 있다. 원핵생물로는 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들면, 이. 콜라이 또는 바실러 스(bacilli)가 포함된다. 보다 고등의 진핵생물 세포로는 곤충 세포 및 포유동물 기원의 확립된 세포주가 포함된다. 적합한 포유동물 숙주 세포주의 예로는 원숭이 신장 세포의 COS-7 세포주(ATCC CRL 1651)(Gluzman et al., 1981, Cell 23:175), L 세포, 293 세포, C127 세포, 3T3 세포(ATCC CCL 163), 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, HeLa 세포, BHK(ATCC CRL 10) 세포주, 및 문헌[McMahan et al., 1991, EMBO J. 10: 2821]에 의해 기술된 바와 같은 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포주 CV1로부터 유도된 CV1/EBNA 세포주(ATCC CCL 70)가 포함된다. 박테리아, 진균, 효모 및 포유동물 세포 숙주와 함께 사용하기 위한 적절한 클로닝 및 발현 벡터는 문헌[Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y., 1985)]에 기술되어 있다.
형질전환된 세포는 폴리펩타이드의 발현을 촉진시키는 조건 하에 배양될 수 있고, 폴리펩타이드는 통상적인 단백질 정제 절차에 의해 회수될 수 있다. 하나의 상기 정제 절차는, 예를 들면, 매트릭스에 결합된 CTLA4의 전부 또는 일부(예를 들면, 세포외 도메인)를 갖는 매트릭스 상에서의 친화성 크로마토그래피의 사용을 포함한다. 본원에서 사용하기 위해 고려되는 폴리펩타이드는 내인성 오염 물질을 실질적으로 함유하지 않는 실질적으로 균질한 재조합 포유동물 항-CTLA4 항체 폴리펩타이드를 포함한다.
항원 결합 단백질은 다수의 공지된 기술 중 어느 기술에 의해 제조되고, 목적하는 특성에 대해 스크리닝될 수 있다. 소정 기술은 목적하는 항원 결합 단백질(예를 들면, 항-CTLA4 항체)의 폴리펩타이드 쇄(또는 이의 일부)를 암호화하는 핵산을 단리하고, 재조합 DNA 기술을 통해 핵산을 조작하는 것을 포함한다. 핵산은 다른 목적하는 핵산에 융합될 수 있거나, 예를 들면, 하나 이상의 아미노산 잔기를 부가하거나, 결실시키거나, 또는 치환시키기 위해 (예를 들면, 돌연변이유발 또는 다른 통상적 기술에 의해) 변경될 수 있다.
본 개시의 폴리펩타이드는 당해 분야에 공지된 임의의 표준 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 한 예로, 폴리펩타이드는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열(예를 들면, cDNA)을 재조합 발현 벡터 내에 삽입하고, 발현을 촉진시키는 조건 하에 DNA 서열을 발현시킴에 의한 재조합 DNA 방법에 의해 생성된다.
본원에 개시된 다양한 폴리펩타이드 중 임의의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 화학적으로 합성될 수 있다. 코돈 사용은 세포에서의 발현을 개선시키도록 선택될 수 있다. 이러한 코돈 사용은 선택된 세포 유형에 의존적일 것이다. 이. 콜라이 및 다른 박테리아뿐만 아니라 포유동물 세포, 식물 세포, 효모 세포 및 곤충 세포에 대해 특수화된 코돈 사용 패턴이 개발되어 왔다. 예를 들면, 문헌[Mayfield et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA. 2003 100(2):438-42; Sinclair et al. Protein Expr . Purif . 2002 (1):96-105; Connell N D. Curr . Opin . Biotechnol. 2001 12(5):446-9; Makrides et al. Microbiol . Rev. 1996 60(3):512-38; 및 Sharp et al. Yeast. 1991 7(7):657-78]을 참조한다.
핵산 조작을 위한 일반적인 기술은 예를 들면, 본원에 인용에 의해 포함된 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2 ed., 1989, 또는 F. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing and Wiley-Interscience: New York, 1987)] 및 주기적 업데이트에 기술되어 있다. 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA는 포유동물, 바이러스 또는 곤충 유전자로부터 유도된 적합한 전사 또는 번역 조절 요소에 작동가능하게 연결된다. 이러한 조절 요소로는 전사 프로모터, 전사를 제어하기 위한 임의의 작동자(operator) 서열, 적합한 mRNA 리보솜 결합 부위를 암호화하는 서열, 및 전사 및 번역의 종료를 제어하는 서열이 포함된다. 통상적으로 복제 기점에 의해 부여되는 숙주에서 복제하는 능력, 및 형질전환체(transformant)의 인식을 용이하게 하는 선택 유전자가 추가로 포함된다.
재조합 DNA는 또한 단백질을 정제하는데 유용할 수 있는 임의의 유형의 단백질 태그 서열을 포함할 수 있다. 단백질 태그의 예로는 히스티딘 태그, FLAG 태그, myc 태그, HA 태그 또는 GST 태그가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 박테리아, 진균, 효모 및 포유동물 세포 숙주와 함께 사용하기에 적절한 클로닝 및 발현 벡터는 문헌[Cloning Vectors: A Laboratory Manual, (Elsevier, N.Y., 1985)]에서 확인할 수 있다.
발현 작제물은 숙주 세포에 대해 적절한 방법을 사용하여 숙주 세포 내로 도입된다. 전기천공; 염화칼슘, 염화루비듐, 인산칼슘, DEAE-덱스트란, 또는 다른 물질을 사용한 형질감염; 미세사출법(microprojectile bombardment); 리포펙션; 및 감염(벡터가 감염원(infectious agent)인 경우)을 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아닌, 숙주 세포 내로 핵산을 도입시키기 위한 다양한 방법이 당해 분야에 공지되어 있다. 적합한 숙주 세포로는 원핵생물, 효모, 포유동물 세포 또는 박테리아 세포가 포함된다.
적합한 박테리아는 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들면, 이. 콜라이 또는 바실러스 종(Bacillus spp .)을 포함한다. 효모, 바람직하게는 사카로마이세스(Saccharomyces) 종으로부터의 효모, 예를 들면, 에스 . 세레비시아에(S. cerevisiae)가 또한 폴리펩타이드의 생성에 사용될 수 있다. 다양한 포유동물 또는 곤충 세포 배양 시스템이 또한 재조합 단백질을 발현시키는데 사용될 수 있다. 곤충 세포에서 이종성 단백질의 생성을 위한 바큘로바이러스( Baculovirus ) 시스템은 문헌[Luckow and Summers, (Bio/Technology, 6:47, 1988)]에서 검토된다. 적합한 포유동물 숙주 세포주의 예로는 내피 세포, COS-7 원숭이 신장 세포, CV-1, L 세포, C127, 3T3, 차이니즈 햄스터 난소(CHO), 사람 배아 신장 세포, HeLa, 293, 293T 및 BHK 세포주가 포함된다. 정제된 폴리펩타이드는 재조합 단백질을 발현시키는데 적합한 숙주/벡터 시스템을 배양함으로써 제조된다. 다수의 적용에서, 본원에 개시된 작은 크기의 다수의 폴리펩타이드는 발현을 위한 바람직한 방법으로서 이. 콜라이에서 발현될 것이다. 이후, 단백질은 배양 배지 또는 세포 추출물로부터 정제된다.
본원에 개시된 단백질은 또한 세포-번역 시스템을 사용하여 생성될 수 있다. 상기 목적을 위해, 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 시험관내 전사에서 mRNA를 생성시키는 것을 가능하게 하고, 사용되는 특정 세포-비함유 시스템(진핵생물 세포, 예를 들면, 포유동물 또는 효모 세포-비함유 번역 시스템 또는 원핵생물 세포, 예를 들면, 박테리아 세포-비함유 번역 시스템)에서의 mRNA의 세포-비함유 번역을 가능하게 하도록 변형되어야 한다.
CTLA4-결합 폴리펩타이드는 또한 화학적 합성(예를 들면, 문헌[Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., 1984, The Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.]에 기술된 방법에 의한 화학적 합성)에 의해 생성될 수 있다. 단백질에 대한 변형은 또한 화학적 합성에 의해 생성될 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드는 단백질 화학의 분야에서 일반적으로 공지되어 있는 단백질에 대한 단리/정제 방법에 의해 정제될 수 있다. 비제한적인 예로는 추출, 재결정화, 염석(salting out)(예를 들면, 황산암모늄 또는 황산나트륨을 사용한 염석), 원심분리, 투석, 초미세여과, 흡착 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 정상상(normal phase) 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 겔 여과, 겔 투과 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 전기천공, 역류 분배(countercurrent distribution) 또는 이들의 임의의 조합이 포함된다. 정제 후, 폴리펩타이드는 상이한 완충제로 교환될 수 있고/있거나, 여과 및 투석을 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아닌, 당해 분야에 공지되어 있는 다양한 방법 중 임의의 방법에 의해 농축될 수 있다.
정제된 폴리펩타이드는 바람직하게는 적어도 85% 순도, 더 바람직하게는 적어도 95% 순도, 가장 바람직하게는 적어도 98% 순도를 갖는다. 순도의 정확한 수치 값과 상관없이, 폴리펩타이드는 약제학적 제품으로 사용하기에 충분히 순수하다.
소정 실시형태들에서, 본 개시는 CTLA4에 결합하는 모노클로날 항체를 제공한다. 모노클로날 항체는 당해 분야에 공지되어 있는 임의의 기술을 사용하여, 예를 들면, 면역화 스케줄의 완료 후에 형질전환(transgenic) 동물로부터 수거된 비장 세포를 불멸화(immortalizing)시킴으로써 생성될 수 있다. 비장 세포는 당해 분야에 공지되어 있는 임의의 기술을 사용하여, 예를 들면, 이들을 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마를 생성시킴으로써 불멸화될 수 있다. 하이브리도마-생성 융합 절차에서 사용하기 위한 골수종 세포는 바람직하게는 비-항체-생성 골수종 세포이고, 높은 융합 효율을 가지며, 이들을 목적하는 융합된 세포(하이브리도마)만의 성장을 지지하는 소정의 선택 배지에서 성장할 수 없게 만드는 효소 결핍을 갖는다. 마우스 융합에 사용하기 위한 적합한 세포주의 예로는 Sp-20, P3-X63/Ag8, P3-X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Agl4, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 및 S194/5XX0 Bul이 포함되고; 래트 융합물에 사용된 세포주의 예로는 R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F 및 48210을 포함한다. 세포 융합물에 유용한 다른 세포주는 U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 및 UC729-6이다.
항체의 단편 또는 유사체는 본 명세서의 교시에 따라서 당해 분야에 공지된 기술을 사용하여 당업자에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 단편 또는 유사체의 바람직한 아미노-말단 및 카복시-말단은 기능적 도메인의 경계 근처에서 발생한다. 구조적 및 기능적 도메인은 공공의(public) 또는 사유(proprietary) 서열 데이터베이스에 대한 뉴클레오타이드 및/또는 아미노산 서열 데이터의 비교에 의해 확인될 수 있다. 공지된 구조 및/또는 기능의 다른 단백질에서 발생하는 서열 모티프 또는 예측된 단백질 입체형태 도메인을 확인하기 위해 컴퓨터화된 비교 방법이 사용될 수 있다. 공지된 3차원 구조로 폴딩되는 단백질 서열을 확인하는 방법이 공지되어 있다. 문헌[Bowie et al., 1991, Science 253:164]을 참조한다.
폴리펩타이드의 번역-후 변형
소정 실시형태들에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 번역-후 변형을 추가로 포함할 수 있다. 예시적인 번역-후 단백질 변형은 인산화, 아세틸화, 메틸화, ADP-리보실화, 유비퀴틴화, 글리코실화, 카보닐화, 수모화(sumoylation), 비오티닐화 또는 폴리펩타이드 측쇄 또는 소수성 그룹의 부가를 포함한다. 그 결과, 변형된 가용성 폴리펩타이드는 비-아미노산 요소, 예를 들면, 지질, 다당류 또는 단당류 및 포스페이트를 함유할 수 있다. 글리코실화의 바람직한 형태는 하나 이상의 시알산 모이어티를 폴리펩타이드에 접합시키는 시알화(sialylation)이다. 시알산 모이어티는 용해도 및 혈청 반감기를 개선시키는 한편, 또한 단백질의 가능한 면역원성(immunogeneticity)을 감소시킨다. 문헌[Raju et al. Biochemistry. 2001 31; 40(30):8868-76]을 참조한다.
한 실시형태에서, 본 발명의 가용성 폴리펩타이드의 변형된 형태는 본 발명의 가용성 폴리펩타이드를 비단백질성 중합체에 연결시키는 것을 포함한다. 한 실시형태에서, 중합체는 미국 특허 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 또는 4,179,337에 제시되는 방식의 폴리에틸렌 글리콜("PEG"), 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌이다.
PEG는 상업적으로 이용가능하거나 당해 분야에 익히 공지된 방법에 따라 에틸렌 글리콜의 개환 중합에 의해 제조될 수 있는 수용성 중합체이다(Sandler and Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, Vol. 3, pages 138-161). 용어 "PEG"는 PEG의 말단에서의 변형 또는 크기와 상관없이 임의의 폴리에틸렌 글리콜 분자를 포함하도록 광범위하게 사용되며, 이는 화학식 X--O(CH2CH2O)n-CH2CH2OH (1)로 표시될 수 있으며, 상기 화학식에서 n은 20 내지 2300이고, X는 H 또는 말단 변형, 예를 들면, C1 -4 알킬이다. 한 실시형태에서, 본 발명의 PEG는 한쪽 말단에서 하이드록시 또는 메톡시로 종료되며, 즉, X는 H 또는 CH3("메톡시 PEG")이다. PEG는 결합 반응에 필요하거나, 분자의 화학적 합성으로부터 발생하거나, 분자의 부분들의 최적 거리를 위한 스페이서인 추가의 화학적 그룹을 함유할 수 있다. 또한, 이러한 PEG는 함께 연결되는 하나 이상의 PEG 측쇄로 구성될 수 있다. 하나 초과의 PEG 쇄를 갖는 PEG는 다중아암(multiarmed) 또는 분지된 PEG로 지칭된다. 분지된 PEG는, 예를 들면, 글리세롤, 펜타에리트리올 및 소르비톨을 포함하는 다양한 폴리올로의 폴리에틸렌 옥사이드의 부가에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 4-아암의 분지된 PEG는 펜타에리트리올 및 에틸렌 옥사이드로부터 제조될 수 있다. 분지된 PEG는, 예를 들면, EP-A 0 473 084 및 미국 특허 5,932,462에 기술되어 있다. PEG의 한 형태는 리신의 일차 아미노 그룹을 통해 연결된 2개의 PEG 측쇄(PEG2)를 포함한다(Monfardini et al., Bioconjugate Chem . 6 (1995) 62-69).
PEG-변형된 폴리펩타이드의 혈청 청소율(clearance rate)은 변형되지 않은 결합 폴리펩타이드의 청소율에 비해 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 심지어 90%까지 감소될 수 있다. PEG-변형된 폴리펩타이드는 변형되지 않은 단백질의 반감기에 비해 향상된 반감기(t1 /2)를 가질 수 있다. PEG-결합 폴리펩타이드의 반감기는 변형되지 않은 결합 폴리펩타이드의 반감기에 비해 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 400% 또는 500%, 또는 심지어 1000%까지 향상될 수 있다. 일부 실시형태에서, 단백질 반감기는 시험관 내에서, 예를 들면, 완충된 염수 용액에서 또는 혈청에서 결정된다. 다른 실시형태에서, 단백질 반감기는 생체내 반감기, 예를 들면, 동물의 혈청 또는 다른 체액 내의 단백질의 반감기이다.
치료학적 방법, 제형 및 투여 방식
본 개시는, 항-CTLA4 폴리펩타이드의 투여를 포함하는, 면역 반응의 자극 또는 억제를 요구하는 질환의 치료 방법을 추가로 제공한다. 본원에 개시된 항체들 중 임의의 것은 이러한 방법에 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 방법은 항-CTLA4 폴리펩타이드를 이용하여 수행할 수 있고, 이는 적어도 10-6M의 결합 친화도로 CTLA4 에피토프에 결합하는 IgG 부류의 완전한 사람 항체, 중쇄 유래의 가변 도메인 영역 및 경쇄 유래의 가변 도메인 영역을 갖는 Fab 완전한 사람 항체 단편, 중쇄 유래의 가변 도메인 영역 및 경쇄 유래의 가변 도메인 영역을 갖는 단일쇄 사람 항체 및 서열번호 1 내지 44(표 4)에 기술된 중쇄 및 경쇄 가변 영역(및 상기 서열 내의 CDR)을 포함하는, 중쇄와 경쇄 가변 도메인 영역을 연결하는 펩타이드 링커로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
예를 들면, 한 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 33, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 41 및 서열번호 43으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 중쇄 가변 도메인 서열을 갖고, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 42 및 서열번호 44로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 경쇄 가변 도메인 서열을 갖는, 완전한 사람 항체의 사용을 포함한다.
한 실시형태에서, 본원에 기술된 방법은 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 33, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 41 및 서열번호 43으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 중쇄 가변 도메인 서열을 갖고, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 42 및 서열번호 44로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 경쇄 가변 도메인 서열을 갖는, 완전한 사람 항체 Fab 단편의 사용을 포함한다.
한 실시형태에서, 본원에 기술된 방법은 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 33, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 41 및 서열번호 43으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 중쇄 가변 도메인 서열을 포함하고, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 42 및 서열번호 44로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는, 단일쇄 사람 항체의 사용을 포함한다.
한 실시형태에서, 상기 완전한 사람 항체는 중쇄 및 경쇄 둘 다를 갖고, 여기서, 상기 항체는 서열번호 1/서열번호 2, 서열번호 3/서열번호 4, 서열번호 5/서열번호 6, 서열번호 7/서열번호 8, 서열번호 9/서열번호 10, 서열번호 11/서열번호 12, 서열번호 13/서열번호 14, 서열번호 15/서열번호 16, 서열번호 17/서열번호 18, 서열번호 19/서열번호 20, 서열번호 21/서열번호 22, 서열번호 23/서열번호 24, 서열번호 25/서열번호 26, 서열번호 27/서열번호 28, 서열번호 29/서열번호 30, 서열번호 31/서열번호 32, 서열번호 33/서열번호 34, 서열번호 35/서열번호 36, 서열번호 37/서열번호 38, 서열번호 39/서열번호 40, 서열번호 41/서열번호 42 및 서열번호 43/서열번호 44로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 중쇄/경쇄 가변 도메인 서열을 갖는다.
한 실시형태에서, 완전한 사람 항체 Fab 단편은 중쇄 가변 도메인 영역 및 경쇄 가변 도메인 영역 둘 다를 갖고, 여기서, 상기 항체는 서열번호 1/서열번호 2, 서열번호 3/서열번호 4, 서열번호 5/서열번호 6, 서열번호 7/서열번호 8, 서열번호 9/서열번호 10, 서열번호 11/서열번호 12, 서열번호 13/서열번호 14, 서열번호 15/서열번호 16, 서열번호 17/서열번호 18, 서열번호 19/서열번호 20, 서열번호 21/서열번호 22, 서열번호 23/서열번호 24, 서열번호 25/서열번호 26, 서열번호 27/서열번호 28, 서열번호 29/서열번호 30, 서열번호 31/서열번호 32, 서열번호 33/서열번호 34, 서열번호 35/서열번호 36, 서열번호 37/서열번호 38, 서열번호 39/서열번호 40, 서열번호 41/서열번호 42 및 서열번호 43/서열번호 44로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 중쇄/경쇄 가변 도메인 서열을 갖는다.
한 실시형태에서, 완전한 사람 단일쇄 항체는 중쇄 가변 도메인 영역 및 경쇄 가변 도메인 영역 둘 다를 갖고, 여기서, 상기 단일쇄 완전한 사람 항체는 서열번호 1/서열번호 2, 서열번호 3/서열번호 4, 서열번호 5/서열번호 6, 서열번호 7/서열번호 8, 서열번호 9/서열번호 10, 서열번호 11/서열번호 12, 서열번호 13/서열번호 14, 서열번호 15/서열번호 16, 서열번호 17/서열번호 18, 서열번호 19/서열번호 20, 서열번호 21/서열번호 22, 서열번호 23/서열번호 24, 서열번호 25/서열번호 26, 서열번호 27/서열번호 28, 서열번호 29/서열번호 30, 서열번호 31/서열번호 32, 서열번호 33/서열번호 34, 서열번호 35/서열번호 36, 서열번호 37/서열번호 38, 서열번호 39/서열번호 40, 서열번호 41/서열번호 42 및 서열번호 43/서열번호 44로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 중쇄/경쇄 가변 도메인 서열을 갖는다.
한 실시형태에서, 본 발명의 항체 및 항체 단편은 전립선, 신장, 결장, 폐 또는 유방의 암; 병원성 감염; CNS와 관련된 질환, 예를 들면, 아밀로이드성 알츠하이머 질환; 및 염증성 또는 알레르기성 구성요소를 갖는 질환, 이식편 대 숙주 질환, 숙주 대 이식편 질환, 알레르기, 자가면역 질환 및 기타 염증성 질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 질환을 치료하는데 사용된다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 암과 같은 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 한 실시형태에서, 본 발명은 CTLA4-관련 암인 암을 치료하는 방법을 특징으로 한다. 어구 "CTLA4 관련 암"은 비정상 CTLA4 발현 또는 활성, 예를 들면, 증가된 CTLA4 발현 또는 활성과 관련되어 있는 암 또는 악성 세포 형질전환을 나타낸다. CTLA4-관련 암의 예로는 방광암, 혈액암, 뇌암, 유방암, 결장직장암, 섬유육종, 폐암, 난소암, 전립선암, 흑색종, 림프종, 중피종 및 형질세포종이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다(예를 들면, 문헌[Grosso et al., Cancer Immun. 2013; 13:5; Postow et al., JCO January 20, 2015, Kvistborg et al., Science Translational Medicine 17 Sep 2014: Vol. 6, Issue 254, pp. 254; Hersh et al., J Clin Oncol. 2008; 26:abstract 9022]을 참조한다). 소정 실시형태들에서, CTLA4 관련 암은 항-CTLA-4 임상학적 활성, 예를 들면, 절대 림프구 수의 상승, T 세포 상에서의 지속적으로 유도가능한 T 세포 공동-자극인자(ICOS) 발현(Liakou et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008;105:14987-14992) 또는 T 세포 상의 HLA-DR/CD45RO의 상향조절과 상호관련되어 있는 바이오마커가 검출되는 개체에서의 임의의 암이다(Comin-Anduix B, et al.. J Transl Med. 2008;6:22).
본원에 개시된 사람 CTLA4에 대한 완전한 사람 항체는 면역 반응의 자극 또는 억제를 요구하는 치료 방법에 사용할 수 있다. 자극은 사람 B7에 대한 사람 CTLA4의 결합을 차단하는 항체를 사용하여 달성되고, 면역 반응의 연장의 자극 및 증강에 의해 치료될 수 있는 질환으로는 전립선, 신장, 결장, 폐 또는 유방의 암; 병원성 감염; CNS와 관련된 질환, 예를 들면, 알츠하이머 질환을 포함하는 아밀로이드성 질환; 및 염증성 또는 알레르기성 구성성분을 갖는 질환이 포함된다. 면역억제는 또한 사람 CTLA4에 대한 항체를 이용하여, 예를 들면, 조절성 T 세포의 유도를 통해 달성될 수 있다(Coquerelle et al., Gut 2009;58: 1363-1373). 치료될 수 있는 질환으로는 이식편 대 숙주 질환, 숙주 대 이식편 질환, 알레르기, 자가면역 질환 및 기타 염증성 질환이 포함된다.
본 개시의 항-CTLA4 항체(및 이들의 단편)는 또한 자가면역 질환의 치료 및 세포, 기관 또는 조직 이식편 이식물의 거부의 치료에 유용하다. 소정 양상에서, 항-CTLA4 항체(및 이들의 단편)는 류마티스 관절염 및 연소성 특발성 관절염으로부터 선택되는 자가면역 질환을 치료하는데 유용하다.
본 개시는, 항-CTLA4 폴리펩타이드의 투여를 포함하는, 에스 . 아우레우스(S. aureus) 감염을 치료하거나 예방하는 방법을 특징으로 한다. 투여 기술 및 용량은 특정 폴리펩타이드의 유형 및 치료되는 특정 병태에 따라 다르지만, 숙련가에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 관리 기관은, 치료제로서 사용되는 단백질 시약이 허용가능하게 낮은 수준의 발열원(pyrogen)을 갖도록 제형화되는 것을 요구한다. 따라서, 치료학적 제형은 일반적으로 이들이 적절한 관리 기관(예를 들면, FDA)에 의해 결정될 때 실질적으로 발열원을 함유하지 않거나, 적어도 허용가능한 수준을 초과하지 않는 발열원을 함유한다는 점에서 다른 제형과 구별될 것이다.
본 개시의 치료학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 희석제, 담체 또는 부형제와 함께 단일 투약형(unit dosage form)으로 투여될 수 있다. 투여는 비제한적 예로서 비경구(예를 들면, 정맥내, 피하), 경구, 또는 국소 투여일 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 사용한 임의의 유전자 치료요법 기술, 예를 들면, 네이키드(naked) DNA 전달, 재조합 유전자 및 벡터, 세포-기반 전달, 예를 들면, 환자의 세포의 생체외 조작 등이 사용될 수 있다.
상기 조성물은 경구 투여를 위한 환제, 정제, 캡슐제, 액제, 또는 지속 방출 정제; 또는 정맥내, 피하 또는 비경구 투여를 위한 액제; 국소 투여를 위한 겔, 로션, 연고, 크림, 또는 중합체 또는 다른 지속 방출 비히클의 형태일 수 있다.
제형의 제조를 위한 당해 분야에 익히 공지된 방법은, 예를 들면, 문헌["Remington: The Science and Practice of Pharmacy" (20th ed., ed. A. R. Gennaro A R., 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa.)]에서 확인된다. 비경구 투여를 위한 제형은, 예를 들면, 부형제, 멸균수, 염수, 폴리알킬렌 글리콜, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜, 식물 기원 오일, 또는 수소화된 나프탈렌을 함유할 수 있다. 생체적합성, 생분해성 락타이드 중합체, 락타이드/글리콜라이드 공중합체, 또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체가 화합물의 방출을 제어하기 위해 사용될 수 있다. 나노입자 제형(예를 들면, 생분해성 나노입자, 고체 지질 나노입자, 리포솜)이 화합물의 생체분포(biodistribution)를 제어하기 위해 사용될 수 있다. 다른 잠재적으로 유용한 비경구 전달 시스템으로는 에틸렌-비닐 아세테이트 공중합체 입자, 삼투 펌프(osmotic pump), 이식가능한 주입 시스템 및 리포솜이 포함된다. 제형 내의 화합물의 농도는 투여될 약물의 용량 및 투여 경로를 포함하는 다수의 요인에 따라 달라진다.
폴리펩타이드는 임의로 제약 업계에서 통상적으로 사용되는 약제학적으로 허용되는 염, 예를 들면, 비-독성 산 부가염 또는 금속 복합체로 투여될 수 있다. 산 부가염의 예로는 유기산, 예를 들면, 아세트산, 락트산, 파모산, 말레산, 시트르산, 말산, 아스코르브산, 석신산, 벤조산, 팔미트산, 수베르산, 살리실산, 타르타르산, 메탄설폰산, 톨루엔설폰산 또는 트리플루오로아세트산 등; 중합체 산, 예를 들면, 탄닌산, 카복시메틸 셀룰로스 등; 및 무기산, 예를 들면, 염산, 브롬화수소산, 황산, 또는 인산 등이 포함된다. 금속 복합체로는 아연 및 철 등이 포함된다. 한 예로, 상기 폴리펩타이드는 열 안정성을 증가시키기 위해 아세트산나트륨의 존재 하에 제형화된다.
경구용 제형으로는 활성 성분(들)을 비-독성 약제학적으로 허용되는 부형제와의 혼합물로 함유하는 정제이 포함된다. 이들 부형제는, 예를 들면, 불활성 희석제 또는 충전제(예를 들면, 슈크로스 및 소르비톨), 윤활제, 활택제 및 접착방지제(예를 들면, 마그네슘 스테아레이트, 아연 스테아레이트, 스테아르산, 실리카, 수소화된 식물성 오일 또는 탈크)일 수 있다.
경구용 제형은 또한 츄어블(chewable) 정제, 또는 활성 성분이 불활성 고체 희석제와 혼합된 경질 젤라틴 캡슐 또는 활성 성분이 물 또는 오일 매질과 혼합된 연질 젤라틴 캡슐로서 제공될 수 있다.
바람직하게는, 소정 실시형태들에서, 개시된 항체는 흡입에 의해 투여되지만, 완전한 IgG 항체의 에어로졸화는 이들의 분자 크기(약 150kDa)로 인해 제한적인 것으로 입증될 수 있다. 이용가능한 상업적 에어로졸화 디바이스를 최대화하기 위해, 더 작은 Fab 단편을 필요로 할 수 있다. 이러한 경우에, 본 발명자들은 또한 모 IgG 분자로부터 Fab 단편을 생성할 필요가 있을 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 Fab 단편의 생성을 위한 표준 효소-기반 소화 방법을 사용하여 초기 연구를 수행할 것이며, 이어서 이는 완전한 IgG 분자와 병행하여 특성확인될 것이다.
치료학적 유효 용량은 치료학적 효과를 생성시키는 투여되는 용량을 나타낸다. 정확한 용량은 치료될 장애에 의존적일 것이며, 공지된 기술을 사용하여 당해 분야 숙련가에 의해 확인될 수 있다. 일반적으로, 폴리펩타이드는 1일 체중 1kg당 약 0.01μg 내지 약 50mg, 바람직하게는 1일 체중 1kg당 0.01mg 내지 약 30mg, 가장 바람직하게는 1일 체중 1kg당 0.1mg 내지 약 20mg으로 투여된다. 폴리펩타이드는 매일(예를 들면, 1일 1회, 2회, 3회 또는 4회) 또는 바람직하게는 더 적은 빈도(예를 들면, 매주, 격주, 3주마다, 매월, 또는 연 4회)로 제공될 수 있다. 또한, 당해 분야에 공지된 바와 같이, 연령뿐만 아니라 체중, 전반적 건강, 성별, 식이, 투여 시기, 약물 상호작용 및 질환의 중증도에 대한 조정이 필요할 수 있고, 이는 당해 분야 숙련가들에 의한 일상적인 실험으로 확인가능할 것이다.
CTLA4 결합 폴리펩타이드는 단독으로 또는 하나 이상의 추가의 치료요법, 예를 들면, 화학 치료요법, 방사선 치료요법, 면역 치료요법, 외과적 개재 또는 이들의 임의의 조합과 함께 투여될 수 있다. 장기간 치료요법은 상기 기술된 바와 같이 다른 치료 전략의 상황에서 보조 요법과 동일하게 가능하다.
상기 방법의 소정 실시형태에서, 하나 이상의 폴리펩타이드 치료학적 제제는 함께(동시에) 또는 상이한 시점에(순차적으로) 투여될 수 있다. 또한, 폴리펩타이드 치료학적 제제는 암을 치료하거나 혈관신생을 억제하기 위한 다른 유형의 화합물과 함께 투여될 수 있다.
소정 실시형태들에서, 본 발명의 대상 항-CTLA4 항체 제제는 단독으로 사용될 수 있다.
소정 실시형태들에서, 결합 폴리펩타이드 또는 이의 단편은 진단학적 목적을 위해 표지되거나 표지되지 않을 수 있다. 전형적으로, 진단학적 검정은 CTLA4에 대한 결합 폴리펩타이드의 결합으로부터 초래되는 복합체의 형성을 검출하는 것을 수반한다. 결합 폴리펩타이드 또는 단편은 항체와 유사하게 직접 표지될 수 있다. 방사성핵종, 형광물질, 효소, 효소 기질, 효소 보조인자, 효소 억제제 및 리간드(예를 들면, 비오틴, 합텐)을 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아닌, 다양한 표지가 사용될 수 있다. 다수의 적절한 면역검정은 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있다(예를 들면, 미국 특허 3,817,827; 3,850,752; 3,901,654; 및 4,098,876을 참조한다). 표지되지 않는 경우, 결합 폴리펩타이드는 검정, 예를 들면, 응집 검정(agglutination assay)에 사용될 수 있다. 표지되지 않은 결합 폴리펩타이드는 또한, 결합 폴리펩타이드를 검출하는데 사용될 수 있는 다른 (하나 이상의) 적합한 시약, 예를 들면, 결합 폴리펩타이드 또는 다른 적합한 시약(예를 들면, 표지된 단백질 A)과 반응성인 표지된 항체와 함께 사용될 수 있다.
한 실시형태에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 효소 면역검정에서 사용될 수 있으며, 여기서, 대상 폴리펩타이드는 효소에 접합된다. CTLA4 단백질을 포함하는 생물학적 샘플이 대상 결합 폴리펩타이드와 배합되는 경우, 결합 폴리펩타이드와 CTLA4 단백질 사이에서 결합이 일어난다. 한 실시형태에서, CTLA4 단백질을 발현시키는 세포(예를 들면, 내피 세포)를 함유하는 샘플은 대상 항체와 배합되고, 결합 폴리펩타이드와 결합 폴리펩타이드에 의해 인식되는 CTLA4 단백질을 보유하는 세포 사이에 결합이 일어난다. 이들 결합된 세포는 결합되지 않은 시약으로부터 분리될 수 있고, 세포에 특이적으로 결합된 결합 폴리펩타이드-효소 접합체의 존재는, 예를 들면, 샘플을, 효소에 의해 작용될 때 색 또는 기타 검출가능한 변화를 초래하는 효소의 기질과 접촉시킴으로써 결정될 수 있다. 다른 실시형태에서, 대상 결합 폴리펩타이드는 표지되지 않을 수 있으며, 대상 결합 폴리펩타이드를 인식하는 제2 표지된 폴리펩타이드(예를 들면, 항체)가 부가될 수 있다.
소정 양상에서, 생물학적 샘플에서 CTLA4 단백질의 존재를 검출하는데 사용하기 위한 키트가 또한 제조될 수 있다. 이러한 키트는 CTLA4 단백질 또는 상기 수용체의 일부에 결합하는 CTLA4 결합 폴리펩타이드뿐만 아니라 결합 폴리펩타이드와 수용체 단백질 또는 이의 일부 간의 복합체의 존재를 검출하는데 적합한 하나 이상의 보조적인 시약을 포함할 것이다. 본 발명의 폴리펩타이드 조성물은 단독으로 또는 다른 에피토프에 대해 특이적인 추가의 항체와 함께 동결건조된 형태로 제공될 수 있다. 표지되거나 표지되지 않을 수 있는 결합 폴리펩타이드 및/또는 항체는 보조 성분(예를 들면, 완충제, 예를 들면, Tris, 포스페이트 및 카보네이트, 안정화제, 부형제, 살생물제 및/또는 불활성 단백질, 예를 들면, 소 혈청 알부민)과 함께 키트 내에 포함될 수 있다. 예를 들면, 결합 폴리펩타이드 및/또는 항체는 보조 성분과 함께 동결건조된 혼합물로서 제공될 수 있거나, 보조 성분은 사용자에 의한 배합을 위해 별도로 제공될 수 있다. 일반적으로 이들 보조 물질은 활성 결합 폴리펩타이드 또는 항체의 양을 기준으로 약 5중량% 미만으로 존재할 것이며, 통상적으로는 폴리펩타이드 또는 항체 농도를 기준으로 적어도 약 0.001중량%의 총량으로 존재할 것이다. 결합 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 제2 항체가 사용되는 경우, 이러한 항체는 키트 내에, 예를 들면, 별도의 바이알 또는 컨테이너로 제공될 수 있다. 제2 항체는, 존재하는 경우, 전형적으로 표지되고 상기 기술된 항체 제형과 유사한 방식으로 제형화될 수 있다.
폴리펩타이드 서열은 표준 1-글자 또는 3-글자 약어를 사용하여 표시된다. 달리 지시되지 않는 한, 각각의 폴리펩타이드 서열은 왼쪽에 아미노 말단을 가지며 오른쪽에 카복시 말단을 가지며; 각각의 단일 가닥 핵산 서열, 및 각각의 이중 가닥 핵산 서열의 상부 가닥은 왼쪽에 5' 말단을 가지며 오른쪽에 3' 말단을 갖는다. 특정 폴리펩타이드 서열은 또한 이것이 기준 서열과 어떻게 상이한지를 설명함으로써 기술될 수 있다.
본 발명을 하기에 상세하게 기재하면서, 동일한 것이 하기 실시예를 참조하여 보다 명확하게 이해될 것이고, 이는 단지 본 발명을 설명하기 위해 포함되고 본 발명을 제한하는 것으로 의도되는 것은 아니다.
실시예 1
사람 CTLA4에 대해 특이적인 사람 항체는
CTLA4에 대한 특이성 및 CTLA4에 대한 높은 정도의 친화성(예를 들면, 적어도 10-6M)을 포함하는, 치료학적 특성에 대해 확인되고 선택되었다.
항-CTLA4 항체들이 기능적 활성을 갖는지 여부를 결정하기 위해, 이들의 T 세포 활성화를 증강시키는 능력을 측정하였다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에는 비오티닐화된 항-CD14 항체를 사용하여 단핵구를 고갈시켰고, 이어서, 항-비오틴 코팅된 자기 비드와의 반응시켰고, 자기 컬럼을 이용하여 분리하였다. 자기장 내에 유지된 컬럼으로부터 용출된 세포의 분획을 수집하였고, 이는 1% 미만의 단핵구를 함유하는 림프구 집단을 수득하였다. 림프구를 고정화된 항-CD3으로 사전-코팅된 웰에 부가하였다(5mg/ml). 시험 항체를 이들 웰에 10mg/ml로 부가하였다. 3일의 배양 후, 상기 세포는 CD25의 발현을 측정함으로써 세포 활성화에 대해 검정하였다. 구체적으로, 3일의 배양 후, 세포를 수거하였고, 세포 활성화의 수단으로서 항-사람 CD25로 염색하였다. CD25 발현의 수준은 항-CTLA4 항체가 부가된 배양물에서 더 높았다(도 1). 대조군 항체는 이소타입 매칭된 비특이적(즉, CTLA4에 결합하지 않는) 항체였다. 배지 대조군에 대한 데이터를 정규화함으로써, 항-CTLA4 항체를 투여받은 배양물에서 유의한 수준의 증강이 검출되었다(도 2).
실시예 2
본 실시예는 본원에 개시된 예시의 항체(F7)에 대한 친화성 역학(affinity kinetics)을 측정한다. 표 1은 항체 F7에 대한 친화성 역학을 나타낸다.
Figure pct00001
본 실시예는 본원에 개시되는 예시의 항-CTLA4 항체의 결합 친화도를 설명한다. 친화도는 표면 플라스몬 공명(Biacore)을 이용하여 측정하였다. 간략하게, 항-사람 Fc 항체(GE, BR-1008-39)를, 표준 NHS/EDC 커플링 방법을 이용하여 CM5 센서 칩 상에 대략 1000RU로 고정화시켰다. 항체(약 10㎍/ml)를 10㎕/분의 유속으로 60초 동안 포획하였다. 재조합 사람 CTLA4/His를 러닝 완충액(HBS-EP)에 일련 희석시켰다. 모든 측정을 30㎕/분의 유속으로 수행하였다. 표면을 60초 동안 3M의 MgCl2로 재생시켰다. 1:1(Langmuir) 결합 모델을 사용하여 데이터를 핏팅하였다.
실시예 3
하기 실시예는 사람 항-CTLA4 항체 CT1E1의 특성확인을 기술한다. CT1E1의 가변 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열은 각각 서열번호 43 및 서열번호 44에 제공된다.
항-CTLA4 항체 CT1E1의 교차-반응성 연구는 CT1E1은 사람 CTLA4에 대해 특이적인 것뿐만 아니라 사이노몰거스 및 뮤린 CTLA4 둘 다와 교차-반응하였음을 밝혔다. 96-웰 Ni-NTA 플레이트를 이용하여, 1㎍/mL에서 재조합 사람 CTLA4/His, 사이노몰거스 CTLA4/His 또는 마우스 CTLA4/His를 포획하였다. 상기 플레이트를 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였고, PBS-Tween(PBST)로 3회 세척하였고, 이어서, 카세인 중에 희석된 항-CTLA4 항체(약 1㎍/mL)를 부가하고 진탕하면서 30분 동안 인큐베이션하였다. 상기 플레이트를 PBST로 3회 세척하였고, 서양 고추냉이 퍼옥시다제(HRP)-접합된 염소 항-사람 Fc(카세인 중에 1:500)를 부가하였고, 이어서, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)을 기질로서 부가하였고, 약 5분 동안 전개시켰다. 2M의 H2SO4를 사용하여 반응을 정지시켰고, 450nm에서 OD를 판독하였다.
또한, 사람 CTLA4에 대한 항체 CT1E1의 친화성은 표면 플라스몬 공명(BiaCore)을 이용하여 측정하였다. 항-사람 Fc 항체(GE, BR-1008-39)를, 표준 NHS/EDC 커플링 방법을 이용하여 CM5 센서 칩 상에 대략 1000RU로 고정화시켰다. 항체(약 10㎍/ml)를 10㎕/분의 유속으로 60초 동안 포획하였다. 재조합 사람 PD-L1/His를 러닝 완충액(HBS-EP)에 일련 희석시켰다. 모든 측정을 30㎕/분의 유속으로 HBS-EP 완충액 중에서 수행하였다. 상기 항체를 적절하게 희석하여 일련의 농도를 수득하였다. 1:1(Langmuir) 결합 모델을 사용하여 데이터를 핏팅하였다. Chi2(카이-제곱) 값을 핏팅 품질에 대한 가이드라인으로서 사용하였다. 친화성 연구로부터의 결과는 하기 표 2에 제공된다.
Figure pct00002
CD80 및 CD86 활성을 억제하는 항체 CT1E1의 능력을 측정하기 위한 검정을 수행하였다. 96-웰 Ni-NTA 플레이트를 헥사히스티딘 태그를 갖는 1㎍/mL의 재조합 사람 CD80 또는 CD86으로 실온에서 1시간 동안 코팅하였다. 30㎕의 일련의 3배 희석된 IgG(25㎍/mL로부터 시작됨) 및 30㎕의 0.006㎕/mL의 재조합 사람 CTLA4(사람 Fc 융합으로서)를 사전혼합하였고, 상기 혼합물을 30분 동안 인큐베이션하였고, 이어서, 상기 플레이트를 PBS-Tween(PBST)으로 3회 세척하였다. 상기 혼합물 50㎕를 ELISA 플레이트로 이동시켰고, 진탕시키면서 30분 동안 인큐베이션하였다. 상기 플레이트를 PBST로 3회 세척하였고, 이어서, 서양 고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)-접합된 염소 항-사람 Fc(카세인 중에 1:500)를 부가하였고, 이어서, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)을 기질로서 부가하였고, 약 30분 동안 전개시켰다. 2M의 H2SO4를 사용하여 반응을 정지시켰고, 450nm에서 OD를 판독하였다.
연구로부터의 결과를 도 3a(CD80) 및 도 3b(CD86)에 기술한다. CT1E1의 IC50 값은 CD80에 대해 약 0.31 x 10-9, 그리고 CD86에 대해 약 0.32 x 10-9인 것으로 측정되었다. 놀랍게도, 항체 CT1E1은 대조군 항체 이필리무맙(여보이(Yervoy))의 계산된 IC50에 비하여 CD80 및 CD86에 대해 보다 우수한 IC50 값을 갖고, 이는 세포독성 T 세포가 예를 들면, 암 세포를 파괴할 수 있도록 CTLA4 활성을 억제할 수 있는 사람 항-CTLA4 항체이다. 이필리무맙 및 CT1E1 둘 다에 대한 CD80 및 CD86에 대해 계산된 IC50 값은 도 3a 및 도 3b에 기술된다.
실시예 4
본 실시예는 저용량 초항원 스태필로코커스 장내독소 B(SEB: Staphylococcus enterotoxin B)에의 반응에 대한 항-CTLA4 항체 F7의 효과를 시험하는 실험을 기술한다. 자극으로서의 SEB의 사용은 항원에 대한 반응시 T 세포 활성화를 연구하기 위한 수단을 제공한다. 항-CD3은 폴리클로날 T 세포 활성화인자이지만, SEB는 올리고클로날 활성화인자이다.
항-사람 CD25가 세포 활성화 수단으로서 사용된 실험을 수행하였다. F7 항체의 2개의 상이한 농도를 사용하였다(30㎍ 및 10㎍). 또한, 음성 대조군을 사용하였고, 이는 CTLA4에 결합하지 않는 이소타입 매칭된 항체였다. 3일 후, CD25 세포의 활성화 백분율을 측정하였다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 활성화된 CD25 세포의 백분율은 항-CTLA4 F7 항체의 농도 둘 다(30㎍ 및 10㎍)로 치료된 세포에서 증가되었다. 데이터를 배지 대조군에 대해 정규화함으로써, F7 항-CTLA4 항체를 투여받은 배양물에서 (CD25 세포의 방식에 의한) 현저한 수준의 활성화가 검출되었다(도 4).
실시예 5
항체 E8은 추가의 친화성 및 기능성 연구에서 추가로 연구되었다. 사람 CTLA4에 대한 항체 E8의 친화도는 표면 플라스몬 공명(BiaCore)을 이용하여 측정하였다. 연구 결과는 하기 표 3에 제공된다.
Figure pct00003
친화성 연구 이외에도, 도 5는 항체 E8의 기능적 활성을 보여주는 결과를 제공한다. 도 5에 기술된 기능적 검정은 실시예 1의 CD26 검정에서 사용된 방법과 유사하다.
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
SEQUENCE LISTING <110> SORRENTO THERAPEUTICS, INC. <120> ANTIBODY THERAPEUTICS THAT BIND CTLA4 <130> 126036-04320 <150> US 62/116,353 <151> 2015-02-13 <160> 46 <170> KopatentIn 3.0 <210> 1 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Arg Gly Ser Asn Phe Asn Phe Asp Asp Leu 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Phe Val Arg Ser Lys Ala Tyr Gly Glu Thr Thr Asp Tyr Val Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Phe Ile 65 70 75 80 Ala Trp Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Thr Asp Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Thr Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 2 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 2 Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Ser Cys Gly Gly Asn Asn Ile Ala Ser Glu Ala Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Asp Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Arg Thr Thr Asp Gln 85 90 95 Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 3 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 3 Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Met Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Ser Phe Thr Thr His 20 25 30 Phe Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Met Asn Pro Asn Thr Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Glu Arg Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Pro Ala Glu Ser Gly Arg Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 4 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 4 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Asn Asn Val Gly Gly Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Glu Val Thr Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Gly Ser 85 90 95 Leu Asn Ala Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 110 <210> 5 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 5 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly 1 5 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Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Ile Leu Tyr Arg 20 25 30 Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Ala Asp Arg Phe Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 33 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 33 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala 50 55 60 Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80 Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Trp Glu Leu Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 34 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 34 Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Ser Gly Gln 1 5 10 15 Lys Val Ile Ile Ser Cys Ser Gly Ser Asn Ser Asn Ile Val Asn Asn 20 25 30 Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Ala Ala Pro Lys Val Leu 35 40 45 Ile Tyr Ala Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Phe Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln 65 70 75 80 Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Gly Ser Leu 85 90 95 Asp Val Asp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 35 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 35 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Pro Gly Ile Leu Thr Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 36 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 36 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asn Tyr His 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ala Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Thr Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Thr Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 37 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 37 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala 50 55 60 Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80 Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95 Tyr Tyr Cys Ala Met His Ser Gly Tyr Arg Asn Tyr Gly Met Asp Val 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 38 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 38 Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser 85 90 95 Leu Ser Gly Ala Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 39 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 39 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Thr Val Lys Val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Pro Phe Arg Asn Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Trp Ile Asp Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Thr Phe 50 55 60 His Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Leu Leu Trp Pro Tyr Leu Val Thr Ser Gly Gly Ala Phe 100 105 110 Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 40 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 40 Ser Tyr Glu Leu Met Gln Pro Pro Ser Thr Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser His 20 25 30 Ile Val Asn Gly Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Ala Ala Pro Gln Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Asp Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Ala Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala His Tyr Tyr Cys Ser Ala Trp Asp Asp Ile Leu 85 90 95 Lys Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 110 <210> 41 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 41 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Glu Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Thr Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Ile Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Asp Cys Arg Gly Pro Ser Cys Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 42 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 42 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 43 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 43 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Arg Gly Ser Asn Phe Asn Phe Asp Asp Leu 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Phe Val Arg Ser Lys Ala Tyr Gly Glu Thr Thr Asp Tyr Val Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Phe Ile 65 70 75 80 Ala Trp Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Thr Asp Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Thr Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 44 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 44 Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Ser Cys Gly Gly Asn Asn Ile Ala Ser Glu Ala Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Asp Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Arg Thr Thr Asp Gln 85 90 95 Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 45 <211> 4 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Hinge region sequence <400> 45 Cys Pro Ser Cys 1 <210> 46 <211> 4 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Hinge region sequence <400> 46 Cys Pro Pro Cys 1

Claims (19)

  1. 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 33, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 39 및 서열번호 43으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인; 및
    서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 38, 서열번호 40 및 서열번호 44로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인
    을 포함하는, IgG 부류의 단리된 완전한 사람 항-CTLA4 항체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체가 서열번호 1/서열번호 2(본원에서 A1이라고 칭함), 서열번호 3/서열번호 4(본원에서 A2라고 칭함), 서열번호 5/서열번호 6(본원에서 A4라고 칭함), 서열번호 7/서열번호 8(본원에서 A7이라고 칭함), 서열번호 9/서열번호 10(본원에서 A12라고 칭함), 서열번호 11/서열번호 12(본원에서 B6이라고 칭함), 서열번호 13/서열번호 14(본원에서 C2라고 칭함), 서열번호 15/서열번호 16(본원에서 D6이라고 칭함), 서열번호 17/서열번호 18(본원에서 F1이라고 칭함), 서열번호 19/서열번호 20(본원에서 F3이라고 칭함), 서열번호 21/서열번호 22(본원에서 F5라고 칭함), 서열번호 23/서열번호 24(본원에서 F6이라고 칭함), 서열번호 25/서열번호 26(본원에서 F7이라고 칭함), 서열번호 27/서열번호 28(본원에서 G1이라고 칭함), 서열번호 29/서열번호 30(본원에서 G2라고 칭함), 서열번호 31/서열번호 32(본원에서 G3이라고 칭함), 서열번호 33/서열번호 34(본원에서 G5라고 칭함), 서열번호 35/서열번호 36(본원에서 G12라고 칭함), 서열번호 37/서열번호 38(본원에서 D5라고 칭함), 서열번호 39/서열번호 40(본원에서 E7이라고 칭함) 및 서열번호 43/서열번호 44(본원에서 CT1E1이라고 칭함)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 중쇄/경쇄 가변 도메인 서열을 갖는, 완전한 사람 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체가 적어도 1 x 10-6M의 KD를 갖는, 완전한 사람 항체.
  4. 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 33, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 39 및 서열번호 43으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인; 및
    서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 38, 서열번호 40 및 서열번호 44로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인
    을 포함하는, 항-CTLA4 완전한 사람 항체 Fab 단편.
  5. 제4항에 있어서, 상기 항체 단편이 서열번호 1/서열번호 2, 서열번호 3/서열번호 4, 서열번호 5/서열번호 6, 서열번호 7/서열번호 8, 서열번호 9/서열번호 10, 서열번호 11/서열번호 12, 서열번호 13/서열번호 14, 서열번호 15/서열번호 16, 서열번호 17/서열번호 18, 서열번호 19/서열번호 20, 서열번호 21/서열번호 22, 서열번호 23/서열번호 24, 서열번호 25/서열번호 26, 서열번호 27/서열번호 28, 서열번호 29/서열번호 30, 서열번호 31/서열번호 32, 서열번호 33/서열번호 34, 서열번호 35/서열번호 36, 서열번호 37/서열번호 38, 서열번호 39/서열번호 40 및 서열번호 43/서열번호 44로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 중쇄/경쇄 가변 도메인 서열을 갖는, 완전한 사람 항체 Fab 단편.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 항체가 적어도 1 x 10-6M의 KD를 갖는, 완전한 사람 항체 Fab 단편.
  7. 펩타이드 링커에 의해 연결되는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항-CTLA4 단일쇄 사람 항체로서, 상기 중쇄 가변 도메인은 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 33, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 39 및 서열번호 43으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 상기 경쇄 가변 도메인은 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 38, 서열번호 40 및 서열번호 44로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 펩타이드 링커에 의해 연결되는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항-CTLA4 단일쇄 사람 항체.
  8. 제7항에 있어서, 상기 완전한 사람 단일쇄 항체가 서열번호 1/서열번호 2, 서열번호 3/서열번호 4, 서열번호 5/서열번호 6, 서열번호 7/서열번호 8, 서열번호 9/서열번호 10, 서열번호 11/서열번호 12, 서열번호 13/서열번호 14, 서열번호 15/서열번호 16, 서열번호 17/서열번호 18, 서열번호 19/서열번호 20, 서열번호 21/서열번호 22, 서열번호 23/서열번호 24, 서열번호 25/서열번호 26, 서열번호 27/서열번호 28, 서열번호 29/서열번호 30, 서열번호 31/서열번호 32, 서열번호 33/서열번호 34, 서열번호 35/서열번호 36, 서열번호 37/서열번호 38, 서열번호 39/서열번호 40 및 서열번호 43/서열번호 44로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 중쇄/경쇄 가변 도메인 서열을 갖는, 단일쇄 사람 항체.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 항체가 적어도 1 x 10-6M의 KD를 갖는, 완전한 사람 단일쇄 항체.
  10. 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 암의 치료 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 항체 또는 항체 단편의 유효량을 투여하여 암을 치료함을 포함하는, 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 암의 치료 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 암이 방광암, 혈액암, 뇌암, 유방암, 결장암, 섬유육종, 폐암, 난소암, 전립선암, 흑색종, 림프종, 중피종, 및 형질세포종으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  12. 항-CTLA4 폴리펩타이드의 유효량을 투여함을 포함하는 면역 반응 또는 억제 중 어느 하나의 자극을 요구하는 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 항-CTLA4 폴리펩타이드는
    중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하는 IgG 부류의 단리된 항-CTLA4 완전한 사람 항체,
    중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항-CTLA4 완전한 사람 항체 Fab 단편, 및
    중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 갖는 단일 쇄 사람 항체(여기서, 상기 중쇄 가변 도메인 및 상기 경쇄 가변 도메인은 펩타이드 링커를 통해 연결된다)로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
    상기 중쇄 가변 도메인은 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 33, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 39, 및 서열번호 43으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
    상기 경쇄 가변 도메인은 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 38, 서열번호 40 및 서열번호 44로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 항-CTLA4 폴리펩타이드의 유효량을 투여함을 포함하는 면역 반응 또는 억제 중 어느 하나의 자극을 요구하는 질환을 치료하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 서열번호 1/서열번호 2, 서열번호 3/서열번호 4, 서열번호 5/서열번호 6, 서열번호 7/서열번호 8, 서열번호 9/서열번호 10, 서열번호 11/서열번호 12, 서열번호 13/서열번호 14, 서열번호 15/서열번호 16, 서열번호 17/서열번호 18, 서열번호 19/서열번호 20, 서열번호 21/서열번호 22, 서열번호 23/서열번호 24, 서열번호 25/서열번호 26, 서열번호 27/서열번호 28, 서열번호 29/서열번호 30, 서열번호 31/서열번호 32, 서열번호 33/서열번호 34, 서열번호 35/서열번호 36, 서열번호 37/서열번호 38, 서열번호 39/서열번호 40, 및 서열번호 43/서열번호 44로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 중쇄/경쇄 가변 도메인 서열을 갖는, 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 질환이 전립선, 신장, 결장, 폐 또는 유방의 암; 병원성 감염; CNS와 관련된 질환, 아밀로이드성 알츠하이머 질환; 및 염증성 또는 알레르기성 구성요소를 갖는 질환, 이식편 대 숙주 질환, 숙주 대 이식편 질환, 알레르기, 자가면역 질환 및 기타 염증성 질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  15. 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 33, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 39, 및 서열번호 43으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 아미노산 서열에 제시되는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하고; 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 38, 서열번호 40 및 서열번호 44로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 아미노산 서열에 제시되는 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  16. 제15항에 있어서, 적어도 1 x 10-6M의 KD를 갖는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  17. 제15항 또는 제16항의 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  18. 암의 치료를 필요로 하는 사람 대상체에게 제15항 또는 제16항의 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 유효량을 투여하여 암을 치료함을 포함하는, 암의 치료를 필요로 하는 사람 대상체에서의 암의 치료 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 암이 유방암, 혈액암, 뇌암, 유방암, 결장암, 섬유육종, 폐암, 난소암, 전립선암, 흑색종, 림프종, 중피종 및 형질세포종으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
KR1020177025857A 2015-02-13 2016-02-12 Ctla4에 결합하는 항체 치료제 KR20180006367A (ko)

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