TW201636369A - 結合ｃｔｌａ４之抗體治療劑 - Google Patents

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Abstract

本發明揭示與抗CTLA4抗體相關或來源於抗CTLA4抗體之組合物及方法。更具體而言，本發明揭示結合CTLA4之全人類抗體、CTLA4-抗體結合片段及該等抗體之衍生物，及包含該等片段之CTLA4結合多肽。另外，本發明揭示編碼該等抗體、抗體片段及衍生物及多肽之核酸；包含該等聚核苷酸之細胞；製備該等抗體、抗體片段及衍生物及多肽之方法；及使用該等抗體、抗體片段及衍生物及多肽之方法，包括需要以刺激免疫反應或免疫抑制治療疾病之方法。刺激係使用阻斷人類CTLA4結合至人類B7之抗體實現，且適合藉由刺激及增強免疫反應之延長來治療之疾病包括前列腺癌、腎癌、結腸癌、肺癌或乳癌；病原感染；與CNS相關之疾病，例如生成性澱粉樣疾病，包括阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)；及具有發炎或過敏組分之疾病。適合治療之疾病包括移植物抗宿主疾病、宿主抗移植物疾病、過敏、自體免疫疾病及其他發炎疾病。

Description

結合CTLA4之抗體治療劑 相關申請案
本申請案主張2015年2月13日申請之美國臨時申請案第62/116353號之優先權，該美國臨時申請案之全部內容以全文引用的方式併入本文中。
本發明提供與抗CTLA4抗體相關或來源於抗CTLA4抗體之組合物及方法。更具體而言，本發明提供結合CTLA4之全人類抗體、CTLA4-抗體結合片段及該等抗體之衍生物，及包含該等片段之CTLA4結合多肽。另外，本發明揭示編碼該等抗體、抗體片段及衍生物及多肽之核酸；包含該等聚核苷酸之細胞；製備該等抗體、抗體片段及衍生物及多肽之方法；及使用該等抗體、抗體片段及衍生物及多肽之方法，包括需要以刺激免疫反應或免疫抑制治療疾病之方法。刺激使用阻斷人類CTLA4結合至人類B7之抗體實現，且能夠藉由刺激及增強免疫反應之延長來治療之疾病包括前列腺癌、腎癌、結腸癌、肺癌或乳癌；病原感染；與CNS相關之疾病，例如生成性澱粉樣疾病，包括阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)；及具有發炎或過敏組分之疾病。適合治療之疾病包括移植物抗宿主疾病、宿主抗移植物疾病、過敏、自體免疫疾病及其他發炎疾病。
脊椎動物免疫系統需要多個信號來實現最優免疫活化；參見例 如Janeway,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.54：1-14(1989)；Paul William E.編Raven Press,N.Y.,Fundamental Immunology，第4版(1998)，尤其第12及13章，第411至478頁。T淋巴細胞(T細胞)與抗原呈遞細胞(APC)之間的相互作用為免疫反應所必需。在免疫反應期間，發現於T細胞及APC上之許多內聚分子之水準增加(Springer等人，A.Rev.Immunol.5：223-252(1987)；Shaw及Shimuzu,Current Opinion in Immunology,Kindt及Long編，1：92-97(1988))；及Hemler,Immunology Today 9：109-113(1988))。此等分子之增加水準可有助於闡釋為何經活化APC在刺激抗原特異性T細胞增殖方面比靜息APC更有效(Kaiuchi等人，J.Immunol.131：109-114(1983)；Kreiger等人，J.Immunol.135：2937-2945(1985)；McKenzie,J.Immunol.141：2907-2911(1988)；及Hawrylowicz及Unanue,J.Immunol.141：4083-4088(1988))。
T細胞免疫反應為涉及尤其T與輔助細胞(諸如APC)之間的細胞-細胞相互作用(Springer等人，A.Rev.Immunol.5：223-252(1987))及可溶性免疫介體(細胞因子或淋巴因子)之產生(Dinarello(1987)New Engl.Jour.Med.317：940-945；Sallusto(1997)J.Exp.Med.179：1109-1118)的複雜過程。此反應藉由若干T細胞表面受體調節，該等T細胞表面受體包括T細胞受體複合物(Weiss(1986)Ann.Rev.Immunol.4：593-619)及其他「輔助」表面分子(Allison(1994)Curr.Opin.Immunol.6：414-419；Springer(1987)supra)。許多此等輔助分子為藉由單株抗體在細胞表面上之反應性界定的天然存在之細胞表面分化(CD)抗原(McMichael編，Leukocyte Typing III,Oxford Univ.Press,Oxford,N.Y.(1987))。
CD28具有類似單細胞外可變區(V)之域(Aruffo及Seed，同前文獻)。同源分子CTLA4已藉由鼠溶細胞性T細胞cDNA庫之差示篩檢來 鑑別(Brunet(1987)Nature 328：267-270)。
CTLA4為最初藉由鼠溶細胞性T細胞cDNA庫之差示篩檢來鑑別之T細胞表面分子(Brunet等人，Nature 328：267-270(1987))。CTLA4亦為免疫球蛋白(Ig)超家族之一員；CTLA4包含單細胞外Ig域。已於具有細胞毒性活性之T細胞群中發現CTLA4轉錄物，表明CTLA4可能在溶細胞反應中起作用(Brunet等人，同前文獻；Brunet等人，Immunol.Rev.103-21-36(1988))。研究人員已報導用於CTLA4之人類對應物之基因(Dariavach等人，Eur.J.Immunol.18：1901-1905(1988))對與CD28相同之染色體區域(2q33-34)之選殖及繪製(Lafage-Pochitaloff等人，Immunogenetics 31：198-201(1990))。此人類CTLA4 DNA與編碼CD28蛋白之DNA之間的序列比較顯示顯著序列同源性，其中在近膜及細胞質區域中具有最大程度之同源性(Brunet等人，1988，同前文獻；Dariavach等人，1988，同前文獻)。
一些研究表明CTLA4具有與次級共刺激因子類似之功能(Linsley等人，J.Exp.Med.176：1595-1604(1992)；Wu等人，J.Exp.Med.185：1327-1335(1997)及美國專利5,977,318；5,968,510；5,885,796；及5,885,579)。然而，其他研究已報導CTLA4具有與T細胞活化之抑制子相反之作用(Krummel(1995)J.Exp.Med.182：459-465；Krummel等人，Int'l Immunol.8：519-523(1996)；Chambers等人，Immunity.7：885-895(1997))。已報導CTLA4缺陷型小鼠患有大規模淋巴增殖(Chambers等人，同前文獻)。已報導CTLA4阻斷增強活體外(Walunas等人，Immunity.1：405-413(1994))及活體內(Kearney(1995)J.Immunol.155：1032-1036)之T細胞反應，加劇抗腫瘤免疫性(Leach(1996)Science.271：1734-1736)，且增強經誘導之自體免疫疾病(Luhder(1998)J Exp.Med.187：427-432)。亦已報導CTLA4對T細胞免疫反應之初始特徵具有替代或額外影響(Chambers(1997)Curr.Opin. Immunol.9：396-404；Bluestone(1997)J.Immunol.158：1989-1993；Thompson(1997)Immunity 7：445-450)。此與一些自體免疫患者具有對CTLA4之自體抗體之觀測一致。CTLA4阻斷抗體在此等患者中具有病原作用為有可能的(Matsui(1999)J.Immunol.162：4328-4335)。
非人類CTLA4抗體已用於各種研究。然而，人類中抗體之活體內治療及診斷應用的發展面臨之一個主要阻礙為非人類免疫球蛋白之固有免疫原性。舉例而言，當免疫活性的人類患者經投與治療劑量之嚙齒動物單株抗體時，患者產生針對嚙齒動物免疫球蛋白序列之抗體；此等人類抗小鼠抗體(HAMA)中和治療抗體且可造成急性毒性。先前抗體中之此等及其他缺陷藉由經由本發明提供對CTLA4之全人類抗體來克服。
本發明係關於能夠結合至CTLA4之結合蛋白，包括抗CTLA4抗體及其抗原結合片段。
在一個態樣中，本發明提供一種以至少10-6M之結合親和力結合至CTLA4抗原決定基的IgG類別之經分離全人類抗CTLA4抗體，其具有與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少95%一致的重鏈可變域序列：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41及SEQ ID NO：43，且具有與由以下組成之胺基酸序列至少95%一致之輕鏈可變域序列：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42及SEQ ID NO：44。在一個實施例中，全人類抗體具有重鏈及輕鏈兩者，其中抗體具有選自由以下組成之群之重鏈/輕鏈可變域序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2(本文中稱為A1)、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4(本文中稱為A2)、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6(本文中稱為A4)、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8(本文中稱為A7)、SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10(本文中稱為A12)、SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12(本文中稱為B6)、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14(本文中稱為C2)、SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16(本文中稱為D6)、SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18(本文中稱為F1)、SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20(本文中稱為F3)、SEQ ID NO.21/SEQ ID NO.22(本文中稱為F5)、SEQ ID NO.23/SEQ ID NO.24(本文中稱為F6)、SEQ ID NO.25/SEQ ID NO.26(本文中稱為F7)、SEQ ID NO.27/SEQ ID NO.28(本文中稱為G1)、SEQ ID NO.29/SEQ ID NO.30(本文中稱為G2)、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32(本文中稱為G3)、SEQ ID NO.33/SEQ ID NO.34(本文中稱為G5)、SEQ ID NO.35/SEQ ID NO.36(本文中稱為G12)、SEQ ID NO.37/SEQ ID NO.38(本文中稱為D5)、SEQ ID NO.39/SEQ ID NO.40(本文中稱為E7)、SEQ ID NO.41/SEQ ID NO.42(本文中稱為E8)及SEQ ID NO：43/SEQ ID NO：44(本文中稱為CT1E1)。
在另一態樣中，本發明提供一種抗CTLA4 Fab全人類抗體片段，其包括包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少95%一致的序列之重鏈可變域：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41及SEQ ID NO：43，且包括包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少95%一致的序列之輕鏈可變域：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42及SEQ ID NO：44。在一個實施例中，全人類抗體Fab片段具有重鏈可變域區域及輕鏈可變域區域兩者，其中抗體具有選自由以下組成之群之重鏈/輕鏈可變域序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21/SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23/SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25/SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27/SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29/SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33/SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35/SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37/SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39/SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41/SEQ ID NO.42及SEQ ID NO：43/SEQ ID NO.44。
本發明進一步提供具有藉由肽連接子連接之重鏈可變域及輕鏈可變域之單鏈人類抗體，其中重鏈可變域包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少95%一致的胺基酸序列：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41及SEQ ID NO：43，且其中輕鏈可變域包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少95%一致的胺基酸序列：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42及SEQ ID NO：44。在某些實施例中，全人類單鏈抗體具有重鏈可變域區域及輕鏈可變域區域兩者，其中單鏈全人類抗體具有選自由以下組成之群之重鏈/輕鏈可變域序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21/SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23/SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25/SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27/SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29/SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33/SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35/SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37/SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39/SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41/SEQ ID NO.42及SEQ ID NO.43/SEQ ID NO.44。
本發明中亦包括經分離抗CTLA4抗體或其抗原結合片段，其包 括包含互補決定區(CDR)之重鏈可變域，該等互補決定區(CDR)如選自由以下組成之群之重鏈可變區胺基酸序列中所闡述：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39及SEQ ID NO：43；且包括包含CDR之輕鏈可變區，該等CDR如選自由以下組成之群之輕鏈可變區胺基酸序列中所闡述：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40及SEQ ID NO：44。
本發明進一步提供一種用於需要以刺激免疫反應或免疫抑止制治療疾病之方法，其包含投與抗CTLA4多肽，其中抗CTLA4多肽選自由以下組成之群：結合至CTLA4且包含重鏈可變域及輕鏈可變域之IgG類別之經分離全人類抗體；包含重鏈可變域及輕鏈可變域之抗CTLA4全人類抗體Fab片段；及包含重鏈可變域及輕鏈可變域之單鏈人類抗體，其中重鏈可變域及輕鏈可變域經由肽連接子連接；其中重鏈可變域包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少95%一致的胺基酸序列：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO. 37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41及SEQ ID NO.43，且其中輕鏈可變域包含與選自由以下組成之群之胺基酸至少95%一致的胺基酸序列：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42及SEQ ID NO.44。
在某些實施例中，全人類抗體或抗體片段具有重鏈及輕鏈兩者，其中抗體或抗體片段包含選自由以下組成之群之重鏈/輕鏈可變域序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2(本文中稱為A1)、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4(本文中稱為A2)、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6(本文中稱為A4)、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8(本文中稱為A7)、SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10(本文中稱為A12)、SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12(本文中稱為B6)、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14(本文中稱為C2)、SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16(本文中稱為D6)、SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18(本文中稱為F1)、SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20(本文中稱為F3)、SEQ ID NO.21/SEQ ID NO.22(本文中稱為F5)、SEQ ID NO.23/SEQ ID NO.24(本文中稱為F6)、SEQ ID NO.25/SEQ ID NO.26(本文中稱為F7)、SEQ ID NO.27/SEQ ID NO.28(本文中稱為G1)、SEQ ID NO.29/SEQ ID NO.30(本文中稱為G2)、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32(本文中稱為G3)、SEQ ID NO.33/SEQ ID NO.34(本文中稱為G5)、SEQ ID NO.35/SEQ ID NO.36(本文中稱為G12)、SEQ ID NO.37/SEQ ID NO.38(本文中稱為D5)、SEQ ID NO.39/SEQ ID NO.40(本文中稱為E7)、SEQ ID NO.41/SEQ ID NO.42(本文中稱為E8)及SEQ ID NO.43/SEQ ID NO.44(本文中稱為CT1E1)。
在某些實施例中，本發明抗體或其抗原結合片段之KD為至少1×10-6M。在其他實施例中，本發明抗體或其抗原結合片段之KD為至少1×10-7M。在其他實施例中，本發明抗體或其抗原結合片段之KD為至少1×10-8M。
在某些實施例中，抗體為IgG1同型。在其他實施例中，抗體為IgG4同型。
在某些實施例中，本文中所描述之抗體或抗原結合片段為重組型。
本發明亦提供醫藥組合物，其包含有效量之本文中所揭示之抗CTLA4抗體或片段及醫藥學上可接受之載劑。
在某些實施例中，本發明提供一種治療有其需要人類個體中癌症之方法，其包含向個體投與有效量之本文中所揭示之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段，使得癌症得到治療。
在一較佳實施例中，癌症與不利的CTLA4活性相關。該等類型之癌症之實例包括(但不限於)膀胱癌、血癌、腦癌、乳癌、結腸癌、纖維肉瘤、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、黑素瘤、淋巴瘤、間皮瘤及漿細胞瘤。
在其他實施例中，疾病選自由以下組成之群：前列腺癌、腎癌、結腸癌、肺癌或乳癌；病原感染；與CNS相關之疾病，生成性澱粉樣阿茲海默氏病；及具有發炎或過敏組分之疾病，移植物抗宿主疾病、宿主抗移植物疾病、過敏、自體免疫疾病及其他發炎疾病。
圖1展示藉由所列抗CTLA4抗體增強T細胞活化之能力的其功能活性。CD25表現水準在已添加抗CTLA4抗體之培養基中較高。所使用之對照抗體(對照Ig)為同型匹配、非特異性(亦即不結合CTLA4)抗體。
圖2展示藉由相對於培養基對照標準化資料，在接受抗CTLA4抗體之培養基中偵測到顯著之增強水準。所使用之對照抗體(對照Ig)為同型匹配、非特異性(亦即不結合CTLA4)抗體。
圖3A及圖3B以圖形方式描繪與抗CTLA4抗體伊匹單抗(ipilimumab)(Yervoy)相比，使用基於CD80(圖3A)及CD86(圖3B)之分析的抗體CT1E1之IC50特徵。
圖4以圖形方式描繪來自測定抗CTLA4抗體F7對低劑量超抗原葡萄球菌屬(Staphylococcus)腸毒素B(SEB)之反應之影響的實驗之結果。對照抗體(cIg)為同型匹配、非特異性(亦即不結合CTLA4)抗體。
圖5展示抗CTLA4抗體E8之功能活性及其增強T細胞活化之能力。CD25表現水準在已添加E8之培養基中較高。所使用之對照抗體(對照Ig)為同型匹配、非特異性(亦即不結合CTLA4)抗體。標準化資料在右側。
定義
術語「肽」、「多肽」及「蛋白質」各自指包含兩個或兩個以上藉由肽鍵彼此連接之胺基酸殘基之分子。此等術語涵蓋例如天然及人造蛋白質、蛋白質片段及蛋白質序列之多肽類似物(諸如突變蛋白質、變異體及融合蛋白)，以及轉譯、或另外共價或非共價修飾後之蛋白質。肽、多肽或蛋白質可為單體或聚合物。
多肽之「變異體」(例如抗體之變異體)包含相對於另一多肽序列在胺基酸序列中插入、缺失及/或取代一或多個胺基酸殘基之胺基酸序列。所揭示之變異體包括例如融合蛋白。
多肽之「衍生物」為例如經由與另一化學部分(例如聚乙二醇或白蛋白，例如人血清白蛋白)結合、磷酸化及糖基化經化學修飾的多肽(例如，抗體)。除非另有指示，否則除包含兩條全長重鏈及兩條全 長輕鏈之抗體之外，術語「抗體」包括其衍生物、變異體、片段及突變蛋白質，該等物之實例在下文描述。
「抗原結合蛋白」為包含以下之蛋白質：結合至抗原之部分，及視情況存在之允許抗原結合部分採用促進抗原結合蛋白結合至抗原之構形的骨架或構架部分。抗原結合蛋白之實例包括抗體、抗體片段(例如抗體之抗原結合部分)、抗體衍生物及抗體類似物。抗原結合蛋白可包含例如具有接枝CDR或CDR衍生物之替代蛋白質骨架或人工骨架。該等骨架包括(但不限於)抗體衍生骨架，包含引入以例如穩定抗原結合蛋白之三維結構的突變；以及完全合成骨架，包含例如生物相容性聚合物。參見例如Korndorfer等人，2003,Proteins：Structure,Function,and Bioinformatics，第53卷，第1期：121-129；Roque等人，2004,Biotechnol.Prog.20：639-654。另外，可使用肽抗體模擬物(「PAM」)，以及基於利用纖連蛋白組分之抗體模擬物之骨架作為骨架。
抗原結合蛋白可具有例如免疫球蛋白之結構。「免疫球蛋白」為由兩對相同之多肽鏈構成之四聚分子，各對具有一條「輕」鏈(約25kDa)及一條「重」鏈(約50-70kDa)。各鏈之胺基末端部分包括主要負責抗原識別之約100至110個或110個以上胺基酸之可變區。各鏈之羧基端部分界定主要負責效應功能之恆定區。人類輕鏈分類為κ或λ輕鏈。重鏈分類為μ、δ、γ、α或ε，且抗體之同型分別定義為IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。較佳地，在一個實施例中，本文中所揭示之抗CTLA4抗體的特徵在於重(VH)及輕(VL)胺基酸序列中之其可變域區域序列。在一個實施例中，較佳抗體為A6，其為κ IgG抗體。在輕鏈及重鏈內，可變區及恆定區由具有約12個或12個以上胺基酸之「J」區連接，其中重鏈亦包括具有約10個以上胺基酸之「D」區。通常參見Fundamental Immunology第7章(Paul,W.編，第二版Raven Press, N.Y.(1989))。各輕/重鏈對之可變區形成抗體結合位點，使得完整免疫球蛋白具有兩個結合位點。
免疫球蛋白鏈之可變區展現由三個高變區(亦稱為互補決定區或CDR)連接之相對保守構架區(FR)之相同通式結構。自N-末端至C-末端，輕鏈及重鏈均包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4域。各域之胺基酸分配係根據Kabat等人在Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，US Dept.of Health and Human Services,PHS,NIH,NIH公開案第91-3242號，1991中之定義。免疫球蛋白鏈中之胺基酸之其他編號系統包括IMGTTM(國際免疫遺傳學資訊系統(international ImMunoGeneTics information system)；Lefranc等人，Dev.Comp.Immunol.29：185-203；2005)，及AHo(Honegger及Pluckthun,J.Mol.Biol.309(3)：657-670；2001)。
除非另外規定，否則「抗體」係指與完整抗體為特異性結合而競爭之完整免疫球蛋白或其抗原結合部分。
在一個實施例中，抗體包含重鏈可變域、輕鏈可變域、輕鏈恆定區(CL)及重鏈恆定區CH1、CH2及CH3。重鏈及輕鏈可變域序列可選自本文中SEQ ID No：1至44中所描述之可變域序列。
抗體之抗原結合部分可藉由重組DNA技術或藉由完整抗體之酶促或化學裂解來產生。抗原結合部分尤其包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、域抗體(dAb)及互補決定區(CDR)片段、單鏈抗體(scFv)、嵌合抗體、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體及多肽，其至少含有足以賦予結合至多肽之特異性抗原之免疫球蛋白的一部分。
在某些實施例中，抗體可獲自諸如含有具有變化抗原特異性之免疫球蛋白之血清或血漿的來源。若該等抗體經歷親和純化，則其可針對特定抗原特異性富集。該等經富集之抗體製劑通常由小於約10%之針對特定抗原具有特異性結合活性的抗體製成。使此等製劑經歷若 干輪之親和純化可增加針對抗原具有特異性結合活性之抗體的比例。以此方式製備之抗體通常稱為「單特異性」。
如本文中所使用，術語「單特異性」係指針對一種特定抗原決定基顯示親和力之抗體。單特異性抗體製劑可由約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或99.9%針對特定抗原具有特異性結合活性之抗體製成。
「抗體片段」或「抗體之抗原結合片段」包含完整抗體之一部分，且較佳包含抗體抗原結合域或可變域。抗體片段之實例包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段及線性抗體。
Fab片段為具有VL、VH、CL及CH1域之單價片段；F(ab')2片段為具有兩個在鉸鏈區處由二硫橋鍵鍵聯之Fab片段之二價片段；Fd片段具有VH及CH1域；Fv片段具有抗體單臂之VL及VH域；且dAb片段具有VH域、VL域或VH或VL域之抗原結合片段(美國專利6,846,634；6,696,245；美國申請公開案2002/02512；2004/0202995；2004/0038291；2004/0009507；2003/0039958；及Ward等人，Nature 341：544-546,1989)。
單鏈抗體(scFv)為VL及VH區經由連接子(例如胺基酸殘基之合成序列)連接以形成連續蛋白質鏈之抗體片段，其中連接子足夠長以使得蛋白質鏈能夠折回其自身上且形成單價抗原結合位點(參見例如Bird等人，1988,Science 242：423-26及Huston等人，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-83)。
雙功能抗體為包含兩條多肽鏈之二價抗體，其中各多肽鏈包含由連接子連接之VH及VL域，該連接子太短而不允許同一鏈上之兩個域之間配對，因此允許各域與另一多肽鏈上之互補域配對(參見例如Holliger等人，1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-48，及Poljak等人，1994,Structure 2：1121-23)。若雙功能抗體之兩條多肽鏈一致，則 由其配對產生之雙功能抗體將具有兩個一致抗原結合位點。具有不同序列之多肽鏈可用以製備具有兩個不同抗原結合位點之雙功能抗體。類似地，三功能抗體及四功能抗體為如下抗體：分別包含三條及四條多肽鏈，且分別形成三個及四個可相同或不同之抗原結合位點。
諸如抗體之抗原結合蛋白可具有一或多個結合位點。若存在一個以上結合位點，則結合位點可彼此一致或可不同。舉例而言，天然存在之人類免疫球蛋白典型地具有兩個一致結合位點，而「雙特異性」或「雙功能性」抗體具有兩個不同結合位點。
術語「人類抗體」包括具有一或多個來源於人類免疫球蛋白序列之可變區及恆定區之所有抗體。在一個實施例中，抗體之所有可變域及恆定域來源於人類免疫球蛋白序列(稱為「全人類抗體」)。此等抗體可以各種方式製備，該等方式之實例在下文描述，包括經由用小鼠之經遺傳修飾以表現來源於人類重鏈及/或輕鏈編碼基因之抗體的相關抗原免疫接種。在一較佳實施例中，全人類抗體使用重組方法製備，使得抗體之糖基化模式不同於具有相同序列之天然存在時之抗體。
「人類化抗體」之序列因一或多個胺基酸取代、缺失及/或添加而不同於來源於非人類物種之抗體之序列，使得當將其投與至人類個體時，相比於非人類物種抗體，人類化抗體誘導免疫反應之可能性較小及/或誘導嚴重程度較小之免疫反應。在一個實施例中，非人類物種抗體之重鏈及/或輕鏈之構架及恆定域中的某些胺基酸突變以產生人類化抗體。在另一實施例中，來自人類抗體之恆定域與非人類物種之可變域融合。在另一實施例中，非人類抗體之一或多個CDR序列中之一或多個胺基酸殘基經改變，以便在將非人類抗體投與至人類個體時減小該抗體之可能免疫原性，其中改變之胺基酸殘基對於抗體與其抗原免疫特異性結合並非關鍵，或對胺基酸序列作出之改變為保守性 改變，使得人類化抗體與抗原之結合不比非人類抗體與抗原之結合顯著更糟。如何製備人類化抗體之實例可見於美國專利6,054,297、5,886,152及5,877,293中。
術語「嵌合抗體」係指含有一或多種來自一種抗體之區及一或多種來自一或多種其他抗體之區的抗體。在一個實施例中，CDR中之一或多者來源於人類抗CTLA4抗體。在另一實施例中，所有CDR來源於人類抗CTLA4抗體。在另一實施例中，來自一種以上人類抗CTLA4抗體之CDR混合且匹配為嵌合抗體。舉例而言，嵌合抗體可包含來自第一人類抗PAR-2抗體之輕鏈之CDR1、來自第二人類抗CTLA4抗體之輕鏈之CDR2及CDR3，及來自第三抗CTLA4抗體之重鏈之CDR。其他組合為可能的。
此外，構架區可來源於相同抗CTLA4抗體中之一者、一或多種不同抗體(諸如人類抗體)或人類化抗體。在嵌合抗體之一個實例中，重鏈及/或輕鏈之一部分與來自特定物種或屬於特定抗體類別或子類別之抗體一致、同源或來源於來自特定物種或屬於特定抗體類別或子類別之抗體，而鏈之其餘部分與來自另一物種或屬於另一抗體類別或子類別之抗體一致、同源或來源於來自另一物種或屬於另一抗體類別或子類別之抗體。亦包括該等抗體之展現所需生物活性(亦即特異性結合CTLA4之能力)之片段。
「中和抗體」或「抑制性抗體」為抑制CTLA4活性，例如抑制CTLA4之蛋白水解活化之拮抗性抗體。在一個實施例中，當使用諸如本文中實例中所描述之分析的分析，過量抗CTLA4抗體使CTLA4之蛋白水解活化的量減少至少約20%時，確定活化。在各種實施例中，抗原結合蛋白使CTLA4之蛋白水解活化之量減少至少30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%及99.9%。
「CDR接枝抗體」為包含以下之抗體：來源於特定物種或同型之抗體之一或多個CDR，及相同或不同物種或同型之另一抗體的構架。
「多特異性抗體」為識別一或多種抗原上之一種以上抗原決定基之抗體。此類型抗體之子類別為識別相同或不同抗原上之兩種不同抗原決定基之「雙特異性抗體」。
若抗原結合蛋白以1奈莫耳或1奈莫耳以下之解離常數結合至抗原，則其「特異性結合」至抗原(例如人類CTLA4)。
「抗原結合域」、「抗原結合區」或「抗原結合位點」為抗原結合蛋白之含有胺基酸殘基(或其他部分)之部分，該等胺基酸殘基(或其他部分)與抗原相互作用且促進抗原結合蛋白針對抗原之特異性及親和力。對於特異性結合至其抗原之抗體，此將包括其CDR域中之至少一者之至少一部分。
術語「Fc多肽」包括來源於抗體之Fc區之天然及突變蛋白形式之多肽。亦包括含有促進二聚化之鉸鏈區的該等多肽之截短形式。包含Fc部分(及由其形成之寡聚物)之融合蛋白提供藉由蛋白A或蛋白G管柱親和層析法來進行便捷純化的優勢。
「抗原決定基」為由抗原結合蛋白(例如抗體)結合之分子部分。抗原決定基可包含分子之非相連部分(例如在多肽中，為在多肽一級序列中不相連但在多肽三級及四級結構之情形下足夠接近以彼此由抗原結合蛋白結合之胺基酸殘基)。
兩個聚核苷酸或兩個多肽序列之「一致性百分比」或「同源性百分比」藉由使用GAP電腦程式(GCG Wisconsin Package，10.3版(Accelrys,San Diego,Calif.)之一部分)使用其預設參數比較序列來確定。
術語「聚核苷酸」、「寡核苷酸」及「核酸」通篇可互換使用且包括DNA分子(例如cDNA或基因組DNA)、RNA分子(例如mRNA)、使 用核苷酸類似物(例如肽核酸及非天然存在之核苷酸類似物)產生之DNA或RNA之類似物及其混合物。核酸分子可為單股或雙股的。在一個實施例中，本發明核酸分子包含編碼抗體或其片段、衍生物、突變蛋白或變異體之相連開放閱讀框架。
若兩個單股聚核苷酸之序列可在反平行定向上比對，以使得一個聚核苷酸中之每一核苷酸與另一聚核苷酸中之其互補核苷酸相對，而不引入間隙且在任一序列之5'或3'端無不成對核苷酸，則其彼此互為「補體」。若兩個聚核苷酸在適度嚴格條件下可彼此雜交，則聚核苷酸與另一聚核苷酸「互補」。因此，聚核苷酸可與另一聚核苷酸互補而不為其補體。
「載體」為可用以將與其連接之另一核酸引入細胞中之核酸。載體之一種類型為「質體」，其係指可接合有其他核酸片段之線性或環形雙股DNA分子。載體之另一類型為病毒載體(例如複製缺陷反轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)，其中可將其他DNA片段引入病毒基因組中。某些載體能夠在其被引入之宿主細胞中自主複製(例如，包含細菌複製起點之細菌載體及游離型哺乳動物載體)。其他載體(例如非游離型哺乳動物載體)在引入宿主細胞中時經整合至宿主細胞之基因組中，且藉此與宿主基因組一起複製。「表現載體」為可引導所選聚核苷酸表現之載體類型。
若調節序列影響核苷酸序列之表現(例如，表現之水準、時序或位置)，則核苷酸序列「可操作地連接」於調節序列。「調節序列」為影響其可操作地連接之核酸之表現(例如表現之水準、時序或位置)的核酸。調節序列可例如直接對經調節核酸或經由一或多種其他分子(例如，結合至調節序列及/或核酸之多肽)之作用發揮其效應。調節序列之實例包括啟動子、增強子及其他表現控制元件(例如，聚腺苷酸化信號)。調節序列之其他實例描述於例如Goeddel,1990,Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,Calif.及Baron等人，1995,Nucleic Acids Res.23：3605-06中。
「宿主細胞」為可用以表現核酸(例如本發明核酸)之細胞。宿主細胞可為原核生物，例如大腸桿菌(E.coli)；或其可為真核生物，例如單細胞真核生物(例如，酵母或其他真菌)、植物細胞(例如，菸草或番茄植物細胞)、動物細胞(例如，人類細胞、猴細胞、倉鼠細胞、大鼠細胞、小鼠細胞或昆蟲細胞)或融合瘤。宿主細胞之實例包括猴腎細胞之COS-7株(ATCC CRL 1651)(參見Gluzman等人，1981,Cell 23：175)、L細胞、C127細胞、3T3細胞(ATCC CCL 163)、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或其衍生物(諸如在無血清培養基中生長之Veggie CHO及相關細胞株(參見Rasmussen等人，1998,Cytotechnology 28：31)，或缺乏DHFR之CHO株DX-B11(參見Urlaub等人，1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-20))、海拉細胞(HeLa cell)、BHK(ATCC CRL10)細胞株、源自非洲綠猴腎細胞株CV1(ATCC CCL 70)之CV1/EBNA細胞株(參見McMahan等人，1991,EMBO J.10：2821)、人胚腎細胞(諸如293、293 EBNA或MSR 293)、人類表皮A431細胞、人類Colo205細胞、其他經轉化靈長類細胞株、普通二倍體細胞、來源於原代組織、原代外植體之活體外培養物之細胞株、HL-60、U937、HaK或Jurkat細胞。在一個實施例中，宿主細胞為哺乳動物宿主細胞，但不為人類宿主細胞。典型地，宿主細胞為可經可隨後在宿主細胞中表現之編碼多肽之核酸轉化或轉染的經培養細胞。片語「重組宿主細胞」可用以指示已經待表現之核酸轉化或轉染之宿主細胞。宿主細胞亦可為以下細胞：其包含核酸但不在所需水準下表現核酸，除非調節序列引入宿主細胞中使得調節序列變得可操作地連接於核酸。應理解，術語宿主細胞不僅係指特定主題細胞且亦指此類細胞之後代或潛在後代。因為 某些修飾可能歸因於例如突變或環境影響而出現在後代中，所以該後代可能實際上與親本細胞不一致，但仍包括在如本文所使用之術語的範疇內。
術語「重組抗體」係指自經包含抗體之編碼序列之一表現載體(或可能一個以上表現載體，典型地兩個表現載體)轉染的細胞或細胞株表現之抗體，其中該編碼序列不天然地與細胞相關。在一個實施例中，重組抗體之糖基化模式不同於具有相同序列之天然存在時之抗體的糖基化模式。在一個實施例中，重組抗體在不為人類宿主細胞之哺乳動物宿主細胞中表現。值得注意地，個別哺乳動物宿主細胞具有獨特之糖基化模式。
如本文中所使用之術語「有效量」係指結合CTLA4之抗體或其抗原結合部分的量，當向個體投與時，該量足以影響如本文中所描述與CTLA4依賴性信號傳導相關之疾病的治療、預後或診斷。當單獨或組合使用時，本文中所提供之抗體之治療有效量將視抗體及組合(例如，在抑制細胞生長方面)之相對活性而變化，且視經治療之個體及疾病病狀、個體體重及年齡、疾病病狀之嚴重性、投藥方式及類似因素而變化，該等治療有效量可由一般熟習此項技術者容易地確定。
術語「經分離」係指大致上不含其他細胞物質及/或化學物質之蛋白質(例如，抗體)。在一個實施例中，經分離抗體大致上不含來自相同物種之其他蛋白質。在一個實施例中，經分離抗體藉由來自不同物種之細胞表現且大致上不含來自不同物種之其他蛋白質。可藉由分離，使用此項技術中熟知之蛋白質純化技術致使蛋白質大致上不含天然相關組分(或與用以產生抗體之細胞表現系統相關之組分)。在一個實施例中，本發明抗體或抗原結合片段係經分離。
CTLA4抗原結合蛋白
本發明係關於結合CTLA4之CTLA4結合蛋白，尤其抗CTLA4抗 體或其抗原結合部分；及其用途。本發明之各種態樣係關於抗體及抗體片段、用於製備該等抗體及片段之醫藥組合物、核酸、重組表現載體及宿主細胞。本發明亦涵蓋使用本發明抗體來偵測人類CTLA4、活體外或活體內抑制CTLA4活性且預防或治療諸如癌症之病症之方法。
如下表4中所描述，本發明中包括對CTLA4具特異性之新穎抗體重鏈及輕鏈可變區。在一個實施例中，本發明提供一種包含具有可變域之重鏈之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段，該可變域包含如SEQ ID No：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41及43中之任一者中所闡述之胺基酸序列。在一個實施例中，本發明提供一種包含具有可變域之輕鏈之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段，該可變域包含如SEQ ID No：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42及44中之任一者中所闡述之胺基酸序列。在一個實施例中，本發明提供一種抗CTLA4抗體或其抗原結合片段，該抗CTLA4抗體或其抗原結合片段包含具有可變域之重鏈，該可變域包含如SEQ ID No：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41及43中之任一者中所闡述之胺基酸序列；且包含具有可變域之輕鏈，該可變域包含如SEQ ID No：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42及44中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
互補決定區(CDR)在輕鏈及重鏈可變域中均稱為高變區。可變域之較高度保守部分稱為構架(FR)。既定抗體之互補決定區(CDR)及構架區(FR)可使用由以下描述之系統鑑別：Kabat等人，同前文獻；Lefranc等人，同前文獻；及/或Honegger及Pluckthun，同前文獻。亦為熟習此項技術者所熟悉的為描述於Kabat等人(1991,NIH公開案91-3242,National Technical Information Service,Springfield,Va.)中之編 號系統。就此而言，Kabat等人定義適用於任何抗體之用於可變域序列之編號系統。一般熟習此項技術者可明確地將「Kabat編號」之此系統用於任何可變域胺基酸序列，而不依賴於超出序列本身之任何實驗資料。替代編號闡述於Chothia等人，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)及MacCallum等人，J.Mol.Biol.262：732-745(1996)中，但如在Kabat中，FR界限由如以上所描述之各別CDR末端分開。亦參見Chothia等人，Nature 342，第877-883頁(1989)及S.Dubel編，Handbook of Therapeutic Antibodies，第3版.,WILEY-VCH Verlag GmbH and Co.(2007)，其中定義包括胺基酸殘基在針對彼此比較時之重疊或子集。
在某些實施例中，本發明提供一種抗CTLA4抗體，其包含描述於表4(SEQ ID No：1-44)中之重鏈及輕鏈可變域之CDR。舉例而言，本發明提供一種抗CTLA4抗體或其抗原結合片段，該抗CTLA4抗體或其抗原結合片段包含具有CDR之重鏈可變區，該等CDR描述於如SEQ ID No：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41及43中之任一者中所闡述之胺基酸序列中。在一個實施例中，本發明提供一種抗CTLA4抗體或其抗原結合片段，該抗CTLA4抗體或其抗原結合片段包含具有CDR之輕鏈可變區，該等CDR描述於如SEQ ID No：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42及44中之任一者中所闡述之胺基酸序列中。在一個實施例中，本發明提供一種抗CTLA4抗體或其抗原結合片段，該抗CTLA4抗體或其抗原結合片段包含具有CDR之輕鏈可變區，該等CDR描述於如SEQ ID No：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42及44中之任一者中所闡述之胺基酸序列中；且其包含具有CDR之重鏈可變區，該等CDR描述於如SEQ ID No：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、 41及43中之任一者中所闡述之胺基酸序列中。
一或多個CDR可共價性地或非共價性地併入分子中以使其成為抗原結合蛋白。
抗原結合蛋白可併有CDR作為較大多肽鏈之一部分、可使CDR共價性地連接於另一多肽鏈，或可非共價性地併有CDR。該等CDR可以使得該抗原結合蛋白特異性地結合至特定相關抗原。
在一個實施例中，本發明提供一種結合至CTLA4抗原決定基的IgG類別之經分離全人類抗體，其具有與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少95%一致的重鏈可變域序列：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.43，且具有與由以下組成之胺基酸序列至少95%一致的輕鏈可變域序列：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44。
在一個實施例中，經分離全人類抗體具有重鏈及輕鏈兩者，其中抗體具有選自由以下組成之群之重鏈/輕鏈可變域序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2(本文中稱為A1)、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4(本文中稱為A2)、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6(本文中稱為A4)、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8(本文中稱為A7)、SEQ ID NO.9/SEQ ID NO. 10(本文中稱為A12)、SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12(本文中稱為B6)、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14(本文中稱為C2)、SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16(本文中稱為D6)、SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18(本文中稱為F1)、SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20(本文中稱為F3)、SEQ ID NO.21/SEQ ID NO.22(本文中稱為F5)、SEQ ID NO.23/SEQ ID NO.24(本文中稱為F6)、SEQ ID NO.25/SEQ ID NO.26(本文中稱為F7)、SEQ ID NO.27/SEQ ID NO.28(本文中稱為G1)、SEQ ID NO.29/SEQ ID NO.30(本文中稱為G2)、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32(本文中稱為G3)、SEQ ID NO.33/SEQ ID NO.34(本文中稱為G5)、SEQ ID NO.35/SEQ ID NO.36(本文中稱為G12)、SEQ ID NO.37/SEQ ID NO.38(本文中稱為D5)、SEQ ID NO.39/SEQ ID NO.40(本文中稱為E7)、SEQ ID NO.41/SEQ ID NO.42(本文中稱為E8)、SEQ ID NO.43/SEQ ID NO.44(本文中稱為CT1E1)及其組合。
在一個實施例中，本發明提供一種包含重鏈之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段，該重鏈包含如SEQ ID No：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41及43中之任一者中所闡述之CDR3域，且包含包括胺基酸序列之可變域，該胺基酸序列與如SEQ ID No：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41及43中之任一者中所闡述之序列至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致。在一個實施例中，本發明提供一種包含輕鏈之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段，該輕鏈包含如SEQ ID No：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42及44中之任一者中所闡述之CDR3域，且具有包含胺基酸序列之輕鏈可變域，該胺基酸序列與如SEQ ID No：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、 42及44中之任一者中所闡述之序列至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致。因此，在某些實施例中，CDR3域保持恆定，同時變化可引入重鏈及/或輕鏈之剩餘CDR區及/或構架區中，同時抗體或其抗原結合片段保持結合至CTLA4之能力且保持功能特徵，例如對親本之結合親和力。
在一個實施例中，在至少95%一致(或至少96%一致，或至少97%一致，或至少98%一致，或至少99%一致)之重鏈或輕鏈內做出之取代為保守性胺基酸取代。「保守性胺基酸取代」為胺基酸殘基經具有化學特性(例如電荷或疏水性)類似之側鏈(R基團)之另一胺基酸殘基取代的一者。一般而言，保守性胺基酸取代實質上不改變蛋白質之功能特性。在兩個或兩個以上胺基酸序列彼此間差異為保守性取代的情況下，可向上調節序列一致性或相似度百分比以根據保守取代性質加以校正。用於做出此調節之方法為熟習此項技術者所熟知。參見例如Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24：307-331，該文獻以引用之方式併入本文中。具有化學特性類似之側鏈的胺基酸基團之實例包括(1)脂族側鏈：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸；(2)脂族羥基側鏈：絲胺酸及蘇胺酸；(3)含醯胺側鏈：天冬醯胺及麩醯胺酸；(4)芳族側鏈：苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸；(5)鹼性側鏈：離胺酸、精胺酸及組胺酸；(6)酸性側鏈：天冬胺酸及麩胺酸；及(7)含硫側鏈為半胱胺酸及甲硫胺酸。
在一個實施例中，本發明係針對一種具有抗體A1之抗原結合區之抗體或其抗原結合片段。在一個實施例中，本發明提供一種抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：1中所闡述之重鏈可變域序列，及如SEQ ID NO：2中所闡述之輕鏈可變域序列。在一個實施例中，本發明係針對一種抗體：具有包含SEQ ID NO：1之CDR之重鏈可變域，及包含SEQ ID NO：2之CDR之輕鏈可變 域。在一個實施例中，本發明提供一種經分離人類抗體或其抗原結合片段，該經分離人類抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO.1中所闡述之序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致的胺基酸序列之重鏈可變區，且包含具有與SEQ ID NO.2中所闡述之序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致的胺基酸序列之輕鏈可變區。抗體可進一步為IgG1或IgG4同型。
在一個實施例中，本發明係針對一種具有抗體A2之抗原結合區之抗體或其抗原結合片段。在一個實施例中，本發明提供一種抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：3中所闡述之重鏈可變域序列，及如SEQ ID NO：4中所闡述之輕鏈可變域序列。在一個實施例中，本發明係針對一種抗體：具有包含SEQ ID NO：3之CDR之重鏈可變域，及包含SEQ ID NO：4之CDR之輕鏈可變域。在一個實施例中，本發明提供一種經分離人類抗體或其抗原結合片段，該經分離人類抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO.3中所闡述之序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致的胺基酸序列之重鏈可變區，且包含具有與SEQ ID NO.4中所闡述之序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致的胺基酸序列之輕鏈可變區。抗體可進一步為IgG1或IgG4同型。
在一個實施例中，本發明係針對一種具有抗體A4之抗原結合區之抗體或其抗原結合片段。在一個實施例中，本發明提供一種抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：5中所闡述之重鏈可變域序列，及如SEQ ID NO：6中所闡述之輕鏈可變域序列。在一個實施例中，本發明係針對一種抗體：具有包含SEQ ID NO：5之CDR之重鏈可變域，及包含SEQ ID NO：6之CDR之輕鏈可變 域。在一個實施例中，本發明提供一種經分離人類抗體或其抗原結合片段，該經分離人類抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO.5中所闡述之序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致的胺基酸序列之重鏈可變區，且包含具有與SEQ ID NO.6中所闡述之序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致的胺基酸序列之輕鏈可變區。抗體可進一步為IgG1或IgG4同型。
在一個實施例中，本發明係針對一種具有抗體A7之抗原結合區之抗體或其抗原結合片段。在一個實施例中，本發明提供一種抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：7中所闡述之重鏈可變域序列，及如SEQ ID NO：8中所闡述之輕鏈可變域序列。在一個實施例中，本發明係針對一種抗體：具有包含SEQ ID NO：7之CDR之重鏈可變域，及包含SEQ ID NO：8之CDR之輕鏈可變域。在一個實施例中，本發明提供一種經分離人類抗體或其抗原結合片段，該經分離人類抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO.7中所闡述之序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致的胺基酸序列之重鏈可變區，且包含具有與SEQ ID NO.8中所闡述之序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致的胺基酸序列之輕鏈可變區。抗體可進一步為IgG1或IgG4同型。
在一個實施例中，本發明係針對一種具有抗體A12之抗原結合區之抗體或其抗原結合片段。在一個實施例中，本發明提供一種抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：9中所闡述之重鏈可變域序列，及如SEQ ID NO：10中所闡述之輕鏈可變域序列。在一個實施例中，本發明係針對一種抗體：具有包含SEQ ID NO：9之CDR之重鏈可變域，及包含SEQ ID NO：10之CDR之輕鏈可變 域。在一個實施例中，本發明提供一種經分離人類抗體或其抗原結合片段，該經分離人類抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO.9中所闡述之序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致的胺基酸序列之重鏈可變區，且包含具有與SEQ ID NO.10中所闡述之序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致的胺基酸序列之輕鏈可變區。抗體可進一步為IgG1或IgG4同型。
在一個實施例中，本發明係針對一種具有抗體B6之抗原結合區之抗體或其抗原結合片段。在一個實施例中，本發明提供一種抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：11中所闡述之重鏈可變域序列，及如SEQ ID NO：12中所闡述之輕鏈可變域序列。在一個實施例中，本發明係針對一種抗體：具有包含SEQ ID NO：11之CDR之重鏈可變域，及包含SEQ ID NO：12之CDR之輕鏈可變域。在一個實施例中，本發明提供一種經分離人類抗體或其抗原結合片段，該經分離人類抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO.11中所闡述之序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致的胺基酸序列之重鏈可變區，且包含具有與SEQ ID NO.12中所闡述之序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致的胺基酸序列之輕鏈可變區。抗體可進一步為IgG1或IgG4同型。
在一個實施例中，本發明係針對一種具有抗體C2之抗原結合區之抗體或其抗原結合片段。在一個實施例中，本發明提供一種抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：13中所闡述之重鏈可變域序列，及如SEQ ID NO：14中所闡述之輕鏈可變域序列。在一個實施例中，本發明係針對一種抗體：具有包含SEQ ID NO：13之CDR之重鏈可變域，及包含SEQ ID NO：14之CDR之輕鏈 可變域。在一個實施例中，本發明提供一種經分離人類抗體或其抗原結合片段，該經分離人類抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO.13中闡述之序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致的胺基酸序列之重鏈可變區，且包含具有與SEQ ID NO.14中闡述之序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致的胺基酸序列之輕鏈可變區。抗體可進一步為IgG1或IgG4同型。
在一個實施例中，本發明係針對一種具有抗體D6之抗原結合區之抗體或其抗原結合片段。在一個實施例中，本發明提供一種抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：15中所闡述之重鏈可變域序列，及如SEQ ID NO：16中所闡述之輕鏈可變域序列。在一個實施例中，本發明係針對一種抗體：具有包含SEQ ID NO：15之CDR之重鏈可變域，及包含SEQ ID NO：16之CDR之輕鏈可變域。應注意，D6及A1抗體包含相同的重鏈及輕鏈可變序列。在一個實施例中，本發明提供一種經分離人類抗體或其抗原結合片段，該經分離人類抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO.15中所闡述之序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致的胺基酸序列之重鏈可變區，且包含具有與SEQ ID NO.16中所闡述之序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致的胺基酸序列之輕鏈可變區。抗體可進一步為IgG1或IgG4同型。
在一個實施例中，本發明係針對一種具有抗體F1之抗原結合區之抗體或其抗原結合片段。在一個實施例中，本發明提供一種抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：17中所闡述之重鏈可變域序列，及如SEQ ID NO：18中所闡述之輕鏈可變域序列。在一個實施例中，本發明係針對一種抗體：具有包含SEQ ID NO：17之CDR之重鏈可變域，及包含SEQ ID NO：18之CDR之輕鏈可變域。在一個實施例中，本發明提供一種經分離人類抗體或其抗原結合片段，該經分離人類抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO.17中所闡述之序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致的胺基酸序列之重鏈可變區，且包含具有與SEQ ID NO.18中所闡述之序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致的胺基酸序列之輕鏈可變區。抗體可進一步為IgG1或IgG4同型。
在一個實施例中，本發明係針對一種具有抗體F3之抗原結合區之抗體或其抗原結合片段。在一個實施例中，本發明提供一種抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：19中所闡述之重鏈可變域序列，及如SEQ ID NO：20中所闡述之輕鏈可變域序列。在一個實施例中，本發明係針對一種抗體：具有包含SEQ ID NO：19之CDR之重鏈可變域，及包含SEQ ID NO：20之CDR之輕鏈可變域。在一個實施例中，本發明提供一種經分離人類抗體或其抗原結合片段，該經分離人類抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO.19中闡述之序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致的胺基酸序列之重鏈可變區，且包含具有與SEQ ID NO.20中闡述之序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致的胺基酸序列之輕鏈可變區。抗體可進一步為IgG1或IgG4同型。
在一個實施例中，本發明係針對一種具有抗體F5之抗原結合區之抗體或其抗原結合片段。在一個實施例中，本發明提供一種抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：21中所闡述之重鏈可變域序列，及如SEQ ID NO：22中所闡述之輕鏈可變域序列。在一個實施例中，本發明係針對一種抗體：具有包含SEQ ID NO：21之CDR之重鏈可變域，及包含SEQ ID NO：22之CDR之輕鏈可變域。在一個實施例中，本發明提供一種經分離人類抗體或其抗原結合片段，該經分離人類抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO.21中闡述之序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致的胺基酸序列之重鏈可變區，且包含具有與SEQ ID NO.22中闡述之序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致的胺基酸序列之輕鏈可變區。抗體可進一步為IgG1或IgG4同型。
在一個實施例中，本發明係針對一種具有抗體F6之抗原結合區之抗體或其抗原結合片段。在一個實施例中，本發明提供一種抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：23中所闡述之重鏈可變域序列，及如SEQ ID NO：24中所闡述之輕鏈可變域序列。在一個實施例中，本發明係針對一種抗體：具有包含SEQ ID NO：23之CDR之重鏈可變域，及包含SEQ ID NO：24之CDR之輕鏈可變域。在一個實施例中，本發明提供一種經分離人類抗體或其抗原結合片段，該經分離人類抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO.23中所闡述之序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致的胺基酸序列之重鏈可變區，且包含具有與SEQ ID NO.24中所闡述之序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致的胺基酸序列之輕鏈可變區。抗體可進一步為IgG1或IgG4同型。
在一個實施例中，本發明係針對一種具有抗體F7之抗原結合區之抗體或其抗原結合片段。在一個實施例中，本發明提供一種抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：25中所闡述之重鏈可變域序列，及如SEQ ID NO：26中所闡述之輕鏈可變域序列。在一個實施例中，本發明係針對一種抗體：具有包含SEQ ID NO：25之CDR之重鏈可變域，及包含SEQ ID NO：26之CDR之輕鏈可變域。在一個實施例中，本發明提供一種經分離人類抗體或其抗原結合片段，該經分離人類抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO.25中所闡述之序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致的胺基酸序列之重鏈可變區，且包含具有與SEQ ID NO.26中所闡述之序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致的胺基酸序列之輕鏈可變區。抗體可進一步為IgG1或IgG4同型。
在一個實施例中，本發明係針對一種具有抗體G1之抗原結合區之抗體或其抗原結合片段。在一個實施例中，本發明提供一種抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：27中所闡述之重鏈可變域序列，及如SEQ ID NO：28中所闡述之輕鏈可變域序列。在一個實施例中，本發明係針對一種抗體：具有包含SEQ ID NO：27之CDR之重鏈可變域，及包含SEQ ID NO：28之CDR之輕鏈可變域。在一個實施例中，本發明提供一種經分離人類抗體或其抗原結合片段，該經分離人類抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO.27中所闡述之序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致的胺基酸序列之重鏈可變區，且包含具有與SEQ ID NO.28中所闡述之序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致的胺基酸序列之輕鏈可變區。抗體可進一步為IgG1或IgG4同型。
在一個實施例中，本發明係針對一種具有抗體G2之抗原結合區之抗體或其抗原結合片段。在一個實施例中，本發明提供一種抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：29中所闡述之重鏈可變域序列，及如SEQ ID NO：30中所闡述之輕鏈可變域序列。在一個實施例中，本發明係針對一種抗體：具有包含SEQ ID NO：29之CDR之重鏈可變域，及包含SEQ ID NO：30之CDR之輕鏈可變域。在一個實施例中，本發明提供一種經分離人類抗體或其抗原結合片段，該經分離人類抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO.29中所闡述之序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致的胺基酸序列之重鏈可變區，且包含具有與SEQ ID NO.30中所闡述之序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致的胺基酸序列之輕鏈可變區。抗體可進一步為IgG1或IgG4同型。
在一個實施例中，本發明係針對一種具有抗體G3之抗原結合區之抗體或其抗原結合片段。在一個實施例中，本發明提供一種抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：31中所闡述之重鏈可變域序列，及如SEQ ID NO：32中所闡述之輕鏈可變域序列。在一個實施例中，本發明係針對一種抗體：具有包含SEQ ID NO：31之CDR之重鏈可變域，及包含SEQ ID NO：32之CDR之輕鏈可變域。在一個實施例中，本發明提供一種經分離人類抗體或其抗原結合片段，該經分離人類抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO.31中所闡述之序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致的胺基酸序列之重鏈可變區，且包含具有與SEQ ID NO.32中所闡述之序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致的胺基酸序列之輕鏈可變區。抗體可進一步為IgG1或IgG4同型。
在一個實施例中，本發明係針對一種具有抗體G5之抗原結合區之抗體或其抗原結合片段。在一個實施例中，本發明提供一種抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：33中所闡述之重鏈可變域序列，及如SEQ ID NO：34中所闡述之輕鏈可變域序列。在一個實施例中，本發明係針對一種抗體：具有包含SEQ ID NO：33之CDR之重鏈可變域，及包含SEQ ID NO：34之CDR之輕鏈可變域。在一個實施例中，本發明提供一種經分離人類抗體或其抗原結合片段，該經分離人類抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO.33中所闡述之序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致的胺基酸序列之重鏈可變區，且包含具有與SEQ ID NO.34中所闡述之序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致的胺基酸序列之輕鏈可變區。抗體可進一步為IgG1或IgG4同型。
在一個實施例中，本發明係針對一種具有抗體G12之抗原結合區之抗體或其抗原結合片段。在一個實施例中，本發明提供一種抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：35中所闡述之重鏈可變域序列，及如SEQ ID NO：36中所闡述之輕鏈可變域序列。在一個實施例中，本發明係針對一種抗體：具有包含SEQ ID NO：35之CDR之重鏈可變域，及包含SEQ ID NO：36之CDR之輕鏈可變域。在一個實施例中，本發明提供一種經分離人類抗體或其抗原結合片段，該經分離人類抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO.35中所闡述之序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致的胺基酸序列之重鏈可變區，且包含具有與SEQ ID NO.36中所闡述之序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致的胺基酸序列之輕鏈可變區。抗體可進一步為IgG1或IgG4同型。
在一個實施例中，本發明係針對一種具有抗體D5之抗原結合區之抗體或其抗原結合片段。在一個實施例中，本發明提供一種抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：37中所闡述之重鏈可變域序列，及如SEQ ID NO：38中所闡述之輕鏈可變域序列。在一個實施例中，本發明係針對一種抗體：具有包含SEQ ID NO：37之CDR之重鏈可變域，及包含SEQ ID NO：38之CDR之輕鏈可變域。在一個實施例中，本發明提供一種經分離人類抗體或其抗原結合片段，該經分離人類抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO.37中所闡述之序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致的胺基酸序列之重鏈可變區，且包含具有與SEQ ID NO.38中所闡述之序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致的胺基酸序列之輕鏈可變區。抗體可進一步為IgG1或IgG4同型。
在一個實施例中，本發明係針對一種具有抗體E7之抗原結合區之抗體或其抗原結合片段。在一個實施例中，本發明提供一種抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：39中所闡述之重鏈可變域序列，及如SEQ ID NO：40中所闡述之輕鏈可變域序列。在一個實施例中，本發明係針對一種抗體：具有包含SEQ ID NO：39之CDR之重鏈可變域，及包含SEQ ID NO：40之CDR之輕鏈可變域。在一個實施例中，本發明提供一種經分離人類抗體或其抗原結合片段，該經分離人類抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO.39中所闡述之序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致的胺基酸序列之重鏈可變區，且包含具有與SEQ ID NO.40中所闡述之序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致的胺基酸序列之輕鏈可變區。抗體可進一步為IgG1或IgG4同型。
在一個實施例中，本發明係針對一種具有抗體E8之抗原結合區之抗體或其抗原結合片段。在一個實施例中，本發明提供一種抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：41中所闡述之重鏈可變域序列，及如SEQ ID NO：42中所闡述之輕鏈可變域序列。在一個實施例中，本發明係針對一種抗體：具有包含SEQ ID NO：41之CDR之重鏈可變域，及包含SEQ ID NO：42之CDR之輕鏈可變域。在一個實施例中，本發明提供一種經分離人類抗體或其抗原結合片段，該經分離人類抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO.41中所闡述之序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致的胺基酸序列之重鏈可變區，且包含具有與SEQ ID NO.42中所闡述之序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致的胺基酸序列之輕鏈可變區。抗體可進一步為IgG1或IgG4同型。
在一個實施例中，本發明係針對一種具有抗體CT1E1之抗原結合區之抗體或其抗原結合片段。在一個實施例中，本發明提供一種抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：43中所闡述之重鏈可變域序列，及如SEQ ID NO：44中所闡述之輕鏈可變域序列。在一個實施例中，本發明係針對一種抗體：具有包含SEQ ID NO：43之CDR之重鏈可變域，及包含SEQ ID NO：44之CDR之輕鏈可變域。在一個實施例中，本發明提供一種經分離人類抗體或其抗原結合片段，該經分離人類抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO.43中闡述之序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致的胺基酸序列之重鏈可變區，且包含具有與SEQ ID NO.44中闡述之序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致的胺基酸序列之輕鏈可變區。抗體可進一步為IgG1或IgG4同型。
抗原結合蛋白(例如，抗體、抗體片段、抗體衍生物、抗體突變蛋白質及抗體變異體)為結合至CTLA4之多肽。
本發明抗原結合蛋白之抗原結合片段可藉由習知技術產生。該等片段之實例包括(但不限於)Fab及F(ab')2片段。
單鏈抗體可藉由經由胺基酸橋(短肽連接子)連接重鏈及輕鏈可變 域(Fv區)片段，產生單多肽鏈來形成。該等單鏈Fv(scFv)已藉由使編碼DNA(該等DNA編碼兩個可變域多肽(VL及VH))之間的肽連接子之DNA融合來製備。所得多肽可折回其自身上以形成抗原結合單體，或其可形成多聚體(例如，二聚體、三聚體或四聚體)，此視兩個可變域之間的可撓性連接子之長度而定(Kortt等人，1997,Prot.Eng.10：423；Kortt等人，2001,Biomol.Eng.18：95-108)。藉由組合不同包含VL及VH之多肽，可形成結合至不同抗原決定基之多聚scFv(Kriangkum等人，2001,Biomol.Eng.18：31-40)。用於產生單鏈抗體之所開發技術包括描述於美國專利4,946,778；Bird,1988,Science 242：423；Huston等人，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879；Ward等人，1989,Nature 334：544；de Graaf等人，2002,Methods Mol.Biol.178：379-87中之技術。
在某些實施例中，本發明提供一種Fab全人類抗體片段，其具有來自重鏈之可變域區及來自輕鏈之可變域區，其中重鏈可變域序列與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.43及其組合，且具有與由以下組成之胺基酸序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致的輕鏈可變域序列：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO. 22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44及其組合。較佳地，全人類抗體Fab片段具有重鏈可變域區及輕鏈可變域區兩者，其中抗體具有選自由以下組成之群之重鏈/輕鏈可變域序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21/SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23/SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25/SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27/SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29/SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33/SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35/SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37/SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39/SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41/SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.43/SEQ ID NO.44及其組合。
在一個實施例中，本發明提供一種單鏈人類抗體，其具有來自重鏈之可變域區及來自輕鏈之可變域區，及連接重鏈及輕鏈可變域區之肽連接子，其中重鏈可變域序列與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.43及其組合，且 具有與由以下組成之胺基酸序列至少95%一致的輕鏈可變域序列：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44及其組合。較佳地，全人類單鏈抗體具有重鏈可變域區及輕鏈可變域區兩者，其中單鏈全人類抗體具有選自由以下組成之群之重鏈/輕鏈可變域序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21/SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23/SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25/SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27/SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29/SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33/SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35/SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37/SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39/SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41/SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.43/SEQ ID NO.44及其組合。
技術已知用於自相關抗體導出不同子類別或同型之抗體，亦即子類別切換。因此，例如IgG抗體可來源於IgM抗體，且反之亦然。該等技術允許製備具有既定抗體(親本抗體)之抗原結合特性且亦展現與親本抗體不同之抗體同型或子類別相關之生物特性的新穎抗體。可採用重組DNA技術。編碼特定抗體多肽之選殖DNA可用於該等程序中，例如編碼所需同型之抗體之恆定域的DNA(Lantto等人，2002, Methods Mol.Biol.178：303-16)。此外，若IgG4為所需的，則亦可能需要將點突變(CPSC->CPPC)引入鉸鏈區中(Bloom等人，1997,Protein Science 6：407)，以減輕形成可引起IgG4抗體中之異質性之H鏈內二硫鍵的傾向。因此，在一個實施例中，本發明抗體為人類IgG1抗體。因此，在一個實施例中，本發明抗體為人類IgG4抗體。
本發明提供多種抗體，其結構上藉由其可變域區之胺基酸序列表徵。然而，胺基酸序列可經歷一些變化，同時保留其與其特異性標靶之較高結合程度。更具體而言，可變域區中之許多胺基酸可隨保守取代而改變，且可預測地，所得抗體之結合特徵將不不同於野生型抗體序列之結合特徵。在抗體可變域中存在不直接與抗原相互作用或影響抗原結合且對確定抗體結構不關鍵之許多胺基酸。舉例而言，所揭示抗體中之任一者之經預測非必需胺基酸殘基較佳經來自相同類別之另一胺基酸殘基置換。鑑別不消除抗原結合之胺基酸保守取代的方法在此項技術中熟知(參見例如Brummell等人，Biochem.32：1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10)：879-884(1999)；及Burks等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：412-417(1997))。Near等人Mol.Immunol.30：369-377,1993解釋如何經由定點突變誘發影響或不影響結合。Near等人其認為僅突變殘基具有高度的改變抗原結合之機率。大多數對結合親和力(Near等人 表3)及對與地高辛(digoxin)之不同形式之結合(Near等人 表2)具有適中或負面影響。因此，在某些實施例中，本發明亦包括與本文中所揭示之彼等序列具有至少95%一致性之可變序列。
在某些實施例中，本文中所提供之抗體或其抗原結合片段之解離常數(KD)為1×10-6M或小於1×10-6M；5×10-7M或小於5×10-7M；1×10-7M或小於1×10-7M；5×10-8M或小於5×10-8M；1×10-8M或小於1×10-8M；5×10-9M或小於5×10-9M；或1×10-9M或小於1× 10-9M。在一個實施例中，本發明抗體或其抗原結合片段具有1×10-7M至1×10-10M之KD。在一個實施例中，本發明抗體或其抗原結合片段具有1×10-8M至1×10-10M之KD。
一般熟習此項技術者將瞭解已知用於測定抗體或其片段之Kd的標準方法。舉例而言，在一個實施例中，Kd藉由放射性標記抗原結合分析(RIA)量測。在一個實施例中，用相關抗體之Fab型式及其抗原進行RIA。舉例而言，藉由以下方式量測Fab針對抗原之溶液結合親和力：在滴定系列之未標記抗原存在下使用最小濃度之(125I)標記抗原平衡Fab，隨後用抗Fab抗體塗佈之培養盤獲取經結合抗原(參見例如Chen等人，J.Mol.Biol.293：865-881(1999))。
根據另一實施例，Kd使用BIACORETM表面電漿子共振分析來量測。如本文中所使用，術語「表面電漿子共振」係指允許藉由例如使用BIAcoreTM系統(GE Healthcare之Biacore生命科學事業部(Life Sciences division),Piscataway,N.J.)偵測生物感測器基質內之蛋白濃度變化來分析即時相互作用的光學現象。
在特定實施例中，本發明抗原結合蛋白針對CTLA4之結合親和力(Ka)為至少106。在其他實施例中，抗原結合蛋白展現至少107、至少108、至少109或至少1010之Ka。在另一實施例中，抗原結合蛋白展現與本文實例中所描述之抗體之Ka基本上相同的Ka。
在另一實施例中，本發明提供一種具有與CTLA4之低解離速率之抗原結合蛋白。在一個實施例中，抗原結合蛋白之Koff為1×10-4至1×10-1或更低。在另一實施例中，Koff為5×10-5至5×10-1或更低。在另一實施例中，Koff與本文中所描述之抗體基本上相同。在另一實施例中，抗原結合蛋白以與本文中所描述之抗體基本上相同之Koff結合至CTLA4。
在另一態樣中，本發明提供一種抑制CTLA4活性之抗原結合蛋 白，例如抗CTLA4抗體或其抗原結合片段。在一個實施例中，抗原結合蛋白之IC50為1000nM或小於1000nM。在另一實施例中，IC50為100nM或小於100nM；在另一實施例中，IC50為10nM或小於10nM。在另一實施例中，IC50與本文實例中所描述之抗體之IC50基本上相同。在另一實施例中，抗原結合蛋白，例如抗CTLA4抗體或其抗原結合部分以與本文中所描述之抗體基本上相同之IC50抑制CTLA4之活性。在一個實施例中，由如本文中所揭示之抗體或其抗原結合片段抑制之CTLA4活性為CTLA4結合至CD80及/或CD86。在一個實施例中，本發明之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段以1×10-9或小於1×10-9之IC50抑制CD80之CTLA4結合。在一個實施例中，本發明之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段以5×10-10或小於5×10-10之IC50抑制CD80之CTLA4結合。在一個實施例中，本發明之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段以1×10-10或小於1×10-10之IC50抑制CD80之CTLA4結合。在一個實施例中，本發明之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段以1×10-9或小於1×10-9之IC50抑制CD86之CTLA4結合。在一個實施例中，本發明之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段以5×10-10或小於5×10-10之IC50抑制CD86之CTLA4結合。在一個實施例中，本發明之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段以1×10-10或小於1×10-10之IC50抑制CD86之CTLA4結合。可用以測試抗CTLA4抗體抑制CD80或CD86之CTLA4結合之能力的分析之實例在此項技術中已知，且亦描述於本文中所提供之實例中。
在另一態樣中，本發明提供一種如下抗原結合蛋白，其結合至在細胞表面上表現之CTLA4，且當因此結合時在不導致細胞表面上之CTLA4之量顯著減少的情況下抑制細胞中之CTLA4信號傳導活性。可使用用於測定或估計細胞表面上及/或細胞內部之CTLA4之量的任何方法。在其他實施例中，抗原結合蛋白與表現CTLA4的細胞之結合導 致少於約75%、50%、40%、30%、20%、15%、10%、5%、1%或0.1%之細胞表面CTLA4內化。
在另一態樣中，本發明提供一種具有至少一天活體外或活體內半衰期(例如當投與至人類個體時)之抗原結合蛋白。在一個實施例中，抗原結合蛋白之半衰期為至少三天。在另一實施例中，抗原結合蛋白之半衰期為四天或更長。在另一實施例中，抗原結合蛋白之半衰期為八天或更長。在另一實施例中，抗原結合蛋白經衍生或經修飾，使得其半衰期與未經衍生或未經修飾之抗原結合蛋白相比更長。在另一實施例中，抗原結合蛋白含有一或多個點突變，以增加血清半衰期，諸如描述於以引用方式併入本文中之WO00/09560中。
本發明進一步提供多特異性抗原結合蛋白，例如雙特異性抗原結合蛋白，例如經由兩個不同抗原結合位點或抗原結合區結合至CTLA4之兩個不同抗原決定基或結合至CTLA4之抗原決定基及另一分子之抗原決定基的抗原結合蛋白。此外，如本文中所揭示之雙特異性抗原結合蛋白可包含來自本文中所描述抗體中之一者之CTLA4結合位點，及來自本文中所描述抗體中之另一者之第二CTLA4結合區，包括參照其他公開案之本文中所描述之彼等者。或者，雙特異性抗原結合蛋白可包含來自本文中所描述抗體中之一者之抗原結合位點，及第二抗原結合位點，該第二抗原結合位點來自此項技術中已知之另一CTLA4抗體，或來自藉由已知方法或本文中所描述方法製備之抗體。
製備雙特異性抗體之眾多方法在此項技術中已知。該等方法包括使用如由Milstein等人，1983,Nature 305：537描述之雜合-融合瘤，及抗體片段之化學偶合(Brennan等人，1985,Science 229：81；Glennie等人，1987,J.Immunol.139：2367；美國專利6,010,902)。此外，雙特異性抗體可經由重組方式產生，例如藉由使用白胺酸拉鏈部分(亦即，來自Fos及Jun蛋白，其優先形成雜二聚體；Kostelny等人，1992, J.Immunol.148：1547)或如美國專利5,582,996中所描述之其他鎖鑰相互作用之域結構。其他適用技術包括描述於美國專利5,959,083及5,807,706中之技術。
在另一態樣中，抗原結合蛋白包含抗體之衍生物。經衍生抗體可包含賦予抗體所需特性(諸如特定用途中之增加的半衰期)之任何分子或物質。經衍生抗體可包含例如可偵測(或標記)部分(例如放射性、比色、抗原或酶分子、可偵測珠粒(諸如磁性或電子緻密(例如金)珠粒)、或結合至另一分子之分子(例如生物素或抗生蛋白鏈菌素)、治療或診斷部分(例如放射性、細胞毒性或醫藥學活性部分)，或增加抗體用於特定用途(例如向諸如人類個體之個體投與，或其他活體內或活體外用途)之適合性的分子。
可用以衍生抗體之分子之實例包括白蛋白(例如，人血清白蛋白)及聚乙二醇(PEG)。可使用此項技術中熟知之技術製備抗體之連接白蛋白及聚乙二醇化衍生物。在一個實施例中，抗體結合或以其他方式連接至甲狀腺素運載蛋白(TTR)或TTR變異體。TTR或TTR變異體可用例如選自由以下組成之群的化學物質進行化學修飾：聚葡萄糖、聚(n-乙烯基吡咯啶酮)、聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇及聚乙烯醇。
含有一或多種抗原結合蛋白之寡聚物可用作CTLA4拮抗劑。寡聚物可呈共價性連接或非共價性連接二聚體、三聚體或更高寡聚物形式。考慮使用包含兩種或兩種以上抗原結合蛋白之寡聚物，其中一個實例為均二聚體。其他寡聚物包括雜二聚體、均三聚體、雜三聚體、均四聚體、雜四聚體等。
一個實施例係針對包含在與抗原結合蛋白融合之肽部分之間經由共價或非共價相互作用接合的多種抗原結合蛋白之寡聚物。該等肽可為肽連接子(間隔子)或具有促進寡聚化之特性的肽。如下文中更詳 細描述，白胺酸拉鏈及來源於抗體之某些多肽屬於可促進連接於其上之抗原結合蛋白之寡聚化的肽。
在特定實施例中，寡聚物包含兩種至四種抗原結合蛋白。寡聚物之抗原結合蛋白可呈任何形式，諸如任何以上所描述之形式，例如變異體或片段。較佳地，寡聚物包含具有CTLA4結合活性之抗原結合蛋白。
在一個實施例中，使用來源於免疫球蛋白之多肽製備寡聚物。包含與抗體衍生之多肽之各個部分(包括Fc域)融合的某些異源多肽之融合蛋白的製備已由例如以下描述：Ashkenazi等人，1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10535；Byrn等人，1990,Nature 344：677；及Hollenbaugh等人，1992「Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins」,Current Protocols in Immunology，增刊4，第10.19.1-10.19.11頁。
一個實施例係針對包含兩個融合蛋白之二聚體，其係藉由將抗CTLA4抗體之CTLA4結合片段融合至抗體之Fc區而生成的。二聚體可如下製得：例如將編碼融合蛋白之基因融合體插入至適當表現載體中，在經該重組表現載體轉形之宿主細胞中表現該基因融合體，並使所表現之融合蛋白像抗體分子般組裝，隨後Fc部分之間形成鏈間二硫鍵以得到二聚體。
用於製備寡聚抗原結合蛋白之另一方法涉及使用白胺酸拉鏈。白胺酸拉鏈域為促進發現該等白胺酸拉鏈域之蛋白質之寡聚化的肽。白胺酸拉鏈最初在數種DNA結合蛋白中鑑別出(Landschulz等人，1988,Science 240：1759)，且此後曾在多種不同蛋白質中發現。已知白胺酸拉鏈包括二聚或三聚之天然存在之肽及其衍生物。適用於製備可溶性寡聚蛋白質之白胺酸拉鏈域之實例描述於WO 94/10308中，且來源於肺界面活性蛋白D(SPD)之白胺酸拉鏈描述於Hoppe等人，1994,FEBS Letters 344：191中。經修飾白胺酸拉鏈允許使與其融合之異源蛋白質穩定地三聚之用途描述於Fanslow等人，1994,Semin.Immunol.6：267-78中。在一種方法中，包含與白胺酸拉鏈肽融合之抗CTLA4抗體片段或衍生物之重組融合蛋白可於適合宿主細胞中表現，且所形成之可溶性寡聚抗CTLA4抗體片段或衍生物係自培養上清液中回收。
針對CTLA4之抗原結合蛋白可用於例如活體外或活體內偵測CTLA4多肽之存在之分析。抗原結合蛋白亦可用於藉由免疫親和層析法純化CTLA4蛋白。阻斷抗原結合蛋白可用於本文中所揭示之方法中。充當CTLA4拮抗劑之該等抗原結合蛋白可用於治療任何CTLA4誘導之病狀，包括(但不限於)各種癌症。
抗原結合蛋白可用於活體外程序，或活體內投與以抑制CTLA4誘導之生物活性。因此可治療因CTLA4之蛋白水解活化(直接或間接)引起或加劇之病症，本文提供該等病症之實例。在一個實施例中，本發明提供一種治療方法，其包含以有效降低CTLA4誘導之生物活性的量向有其需要之哺乳動物活體內投與CTLA4阻斷抗原結合蛋白。
在某些實施例中，本發明之抗原結合蛋白包括抑制CTLA4之生物活性之全人類單株抗體。
抗原結合蛋白可藉由多種習知技術中之任一者製備。舉例而言，其可使用此項技術中已知之任何技術自天然表現其之細胞純化(例如，抗體可自產生其之融合瘤純化)，或在重組表現系統中產生。參見例如Monoclonal Antibodies,Hybridomas：A New Dimension in Biological Analyses,Kennet等人(編)，Plenum Press,New York(1980)；及Antibodies：A Laboratory Manual,Harlow及Land(編)，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1988)。
此項技術中已知之任何表現可用以製備本發明之重組多肽。一般而言，宿主細胞用包含編碼所需多肽之DNA之重組表現載體轉化。 其中，可採用之宿主細胞為原核生物、酵母或高等真核細胞。原核生物包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物，例如大腸桿菌或桿菌(bacilli)。高等真核細胞包括昆蟲細胞及已確立之哺乳動物來源的細胞株。適合哺乳動物宿主細胞株之實例包括猴腎細胞之COS-7株(ATCC CRL 1651)(Gluzman等人，1981,Cell 23：175)、L細胞、293細胞、C127細胞、3T3細胞(ATCC CCL 163)、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、海拉細胞、BHK(ATCC CRL 10)細胞株，及如McMahan等人，1991,EMBO J.10：2821所描述之源自非洲綠猴腎細胞株CV1(ATCC CCL 70)之CV1/EBNA細胞株。用於細菌、真菌、酵母及哺乳動物細胞宿主之適當選殖及表現載體由Pouwels等人描述(Cloning Vectors：A Laboratory Manual,Elsevier,N.Y.,1985)。
經轉化之細胞可在促進多肽表現之條件下培養，且多肽藉由習知蛋白質純化程序回收。一種該純化程序包括例如在具有結合有CTLA4中之所有者或部分(例如細胞外域)之基質上使用親和層析法。本文中考慮使用之多肽包括基本上均質的重組哺乳動物抗CTLA4抗體多肽，其基本上不含污染性內源性物質。
抗原結合蛋白可藉由多種已知技術中之任一者製備且針對所需特性篩檢。某些技術涉及分離編碼相關抗原結合蛋白(例如抗CTLA4抗體)之多肽鏈(或其部分)之核酸，及經由重組DNA技術操作核酸。該核酸可與另一相關核酸融合，或經改變(例如，藉由突變誘發或其他習知技術)以添加、缺失或取代例如一或多個胺基酸殘基。
本發明多肽可使用此項技術中已知之任何標準方法產生。在一個實例中，多肽藉由重組DNA方法藉由將編碼多肽之核酸序列(例如cDNA)插入重組表現載體中且在促進表現之條件下表現DNA序列來產生。
編碼本文中所揭示之各種多肽中之任一者的核酸可以化學方式 合成。可選擇密碼子使用以便改良細胞中之表現。該密碼子使用將視所選細胞類型而定。已開發專門的密碼子使用模式，以用於大腸桿菌及其他細菌，以及哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞及昆蟲細胞。參見例如：Mayfield等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2003 100(2)：438-42；Sinclair等人Protein Expr.Purif.2002(1)：96-105；Connell N D.Curr.Opin.Biotechnol.2001 12(5)：446-9；Makrides等人Microbiol.Rev.1996 60(3)：512-38；及Sharp等人Yeast.1991 7(7)：657-78。
用於核酸操作之通用技術描述於例如以下中：Sambrook等人，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版，1989，或F.Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(Green Publishing and Wiley-Interscience：New York,1987)，及定期更新，本文中以引用方式併入。編碼多肽之DNA可操作地連接至來源於哺乳動物、病毒或昆蟲基因之適合轉錄或轉譯調節元件。該等調節元件包括轉錄啟動子、視情況選用之控制轉錄之操縱序列、編碼適合mRNA核糖體結合位點之序列，及控制轉錄及轉譯之終止之序列。另外併入通常由複製起點賦予之在宿主中複製之能力及促進轉化體識別之選擇基因。
重組DNA亦可包括可適用於純化蛋白質之任何類型之蛋白質標籤序列。蛋白質標籤之實例包括(但不限於)組胺酸標籤、FLAG標籤、myc標籤、HA標籤或GST標籤。用於細菌、真菌、酵母及哺乳動物細胞宿主之適當選殖及表現載體可見於Cloning Vectors：A Laboratory Manual,(Elsevier,N.Y.,1985)中。
表現構築體使用對宿主細胞適當之方法引入宿主細胞中。用於將核酸引入宿主細胞中之各種方法在此項技術中已知，包括(但不限於)電穿孔、採用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-聚葡萄糖或其他 物質之轉染；微彈轟擊；脂質體轉染；及感染(其中載體為感染物)。適合之宿主細胞包括原核生物、酵母、哺乳動物細胞或細菌細胞。
適合之細菌包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物，例如大腸桿菌或芽孢桿菌屬(Bacillus spp.)。酵母，較佳來自酵母屬(Saccharomyces)，諸如釀酒酵母(S.cerevisiae)，亦可用於產生多肽。各種哺乳動物或昆蟲細胞培養系統亦可用以表現重組蛋白。Luckow及Summers綜述用於在昆蟲細胞中產生異源蛋白質之桿狀病毒(Baculovirus)系統(Bio/Technology,6：47,1988)。適合之哺乳動物宿主細胞株之實例包括內皮細胞、COS-7猴腎細胞、CV-1、L細胞、C127、3T3、中國倉鼠卵巢(CHO)、人胚腎細胞、海拉、293、293T及BHK細胞株。經純化多肽藉由培養適合之宿主/載體系統以表現重組蛋白來製備。對於許多應用，本文中所揭示多種多肽之較小大小使得在大腸桿菌中表現成為較佳表現方法。隨後蛋白質自培養基或細胞提取物純化。
本文中所揭示之蛋白質亦可使用細胞轉譯系統產生。針對該等目的，編碼多肽之核酸必須經修飾以允許活體外轉錄來產生mRNA，且允許mRNA在所用無特定細胞系統(無真核(諸如哺乳動物或酵母)細胞轉譯系統或無原核(諸如細菌)細胞轉譯系統)中之無細胞轉譯。
CTLA4結合多肽亦可藉由化學合成產生(例如藉由描述於Solid Phase Peptide Synthesis，第2版，1984,The Pierce Chemical Co.,Rockford,Ill.中之方法)。對蛋白質之修飾亦可藉由化學合成產生。
本發明多肽可藉由用於蛋白質之在蛋白質化學領域中通常已知的分離/純化方法來純化。非限制性實例包括萃取、再結晶、鹽析出(例如，用硫酸銨或硫酸鈉)、離心、透析、超濾、吸附層析法、離子交換層析法、疏水性層析法、正相層析法、反相層析法、凝膠過濾、凝膠滲透層析法、親和層析法、電泳、逆流分佈或此等方法之任何組 合。純化後，多肽可交換至不同緩衝區中及/或藉由此項技術已知之各種方法中之任一者(包括但不限於過濾及透析)濃縮。
經純化多肽較佳至少85%純，更佳至少95%純，且最佳至少98%純。不管純度之確切數值，多肽足夠純以用作醫藥產品。
在某些實施例中，本發明提供結合至CTLA4之單株抗體。可使用此項技術中已知之任何技術來產生單株抗體，該任何技術例如藉由在完成免疫接種時程之後使自轉殖基因動物收穫之脾細胞永生化。可使用此項技術中已知的任何技術使脾細胞永生化，例如藉由使其與骨髓瘤細胞融合以產生融合瘤。用於產生融合瘤之融合程序之骨髓瘤細胞較佳不產生抗體，具有高融合效率且酶不足，使得其不能在僅支持所需融合細胞(融合瘤)生長之某些選擇性培養基中生長。用於小鼠融合之適合細胞株之實例包括Sp-20、P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NS1/1.Ag 4 1、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7及S194/5XX0 Bul；用於大鼠融合之細胞株之實例包括R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983F及48210。適用於細胞融合之其他細胞株為U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2及UC729-6。
根據本說明書之教示且使用此項技術中已知之技術，一般熟習此項技術者可易於製備抗體之片段或類似物。片段或類似物之較佳胺基-及羧基-末端接近功能域之界限出現。結構域及功能域可藉由將核苷酸及/或胺基酸序列資料與公共或專有序列資料庫比較來鑑別。電腦化比較方法可用以鑑別出現在已知結構及/或功能之其他蛋白質中之序列基元或經預測蛋白質構形域。鑑別折成已知三維結構之蛋白質序列之方法為已知的。參見Bowie等人，1991,Science 253：164。
多肽之轉譯後修飾
在某些實施例中，本發明之結合多肽可進一步包含轉譯後修飾。例示性轉譯後蛋白質修飾包括對多肽側鏈或疏水性基團之磷酸 化、乙醯化、甲基化、ADP核糖基化、泛素化、糖基化、羰基化、蘇素化、生物素化或添加。因此，經修飾可溶性多肽可含有非胺基酸元件，諸如脂質、聚醣或單醣及磷酸酯。糖基化之較佳形式為唾液酸化，其使一或多個唾液酸部分結合至多肽。唾液酸部分改良溶解度及血清半衰期，同時亦降低蛋白質之可能的免疫原性。參見Raju等人Biochemistry.2001 31；40(30)：8868-76。
在一個實施例中，主題可溶性多肽之修飾形式包含將主題可溶性多肽連接至非蛋白性聚合物。在一個實施例中，聚合物為聚乙二醇(「PEG」)、聚丙二醇或聚氧化烯，呈如美國專利4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337中所闡述之方式。
PEG為市售或可根據此項技術中熟知之方法藉由使乙二醇開環聚合來製備之水溶性聚合物(Sandler及Karo,Polymer Synthesis,Academic Press,New York，第3卷，第138-161頁)。在不考慮PEG之大小或末端修飾的情況下，廣泛地使用術語「PEG」以涵蓋任何聚乙二醇分子，且其可由式：X--O(CH2CH2O)n-CH2CH2OH(1)表示，其中n為20至2300且X為H或末端修飾，例如C1-4烷基。在一個實施例中，本發明之PEG用羥基或甲氧基在一個末端上封端，亦即X為H或CH3(「甲氧基PEG」)。PEG可含有為結合反應所需之其他化學基團；其由分子之化學合成產生；或其為分子之部分之最優距離的間隔子。另外，此類PEG可由一或多個連接在一起之PEG側鏈組成。具有一個以上PEG鏈之PEG稱為多臂或分枝PEG。分枝PEG可例如藉由將聚氧化乙烯添加至各種多元醇(包括丙三醇、異戊四醇及山梨糖醇)來製備。舉例而言，四臂分枝PEG可由異戊四醇及氧化乙烯來製備。分枝PEG描述於例如EP-A 0 473 084及美國專利5,932,462中。PEG之一種形式包括兩個經由離胺酸之一級胺基連接之PEG側鏈(PEG2)(Monfardini 等人，Bioconjugate Chem.6(1995)62-69)。
相對於未經修飾之結合多肽之清除速率，經PEG修飾之多肽之血清清除速率可降低約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或甚至90%。經PEG修飾之多肽可具有相對於未經修飾之蛋白質的半衰期增加之半衰期(t1/2)。相對於未經修飾之結合多肽之半衰期，PEG結合多肽之半衰期可增加至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、400%或500%或甚至1000%。在一些實施例中，蛋白質半衰期在活體外，諸如在緩衝生理食鹽水溶液中或在血清中測定。在其他實施例中，蛋白質半衰期為活體內半衰期，諸如蛋白質在動物之血清或其他體液中之半衰期。
治療方法、調配物及投藥模式
本發明進一步提供一種用於需要以刺激免疫反應或免疫抑制治療疾病之方法，其包含投與抗CTLA4多肽。本文中所揭示之抗體中之任一者可用於該等方法。舉例而言，該等方法可使用選自由以下組成之群之抗CTLA4多肽進行：以至少10-6M之結合親和力結合至CTLA4抗原決定基的IgG類別之全人類抗體；Fab全人類抗體片段，其具有來自重鏈之可變域區及來自輕鏈之可變域區；單鏈人類抗體，其具有來自重鏈之可變域區及來自輕鏈之可變域區及連接重鏈與輕鏈可變域區的肽連接子，包括描述於SEQ ID No.1-44(表4)中之重鏈及輕鏈可變區(及該等序列內之CDR)。
舉例而言，在一個實施例中，本文中所揭示之方法包括使用全人類抗體，其具有與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致的重鏈可變域序列：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41及SEQ ID NO.43，且具有與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致的輕鏈可變域序列：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42及SEQ ID NO.44。
在一個實施例中，本文中所描述之方法包括使用全人類抗體Fab片段，其具有與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致的重鏈可變域序列：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41及SEQ ID NO.43，且具有與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致的輕鏈可變域序列：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO. 26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42及SEQ ID NO.44。
在一個實施例中，本文中所描述之方法包括使用單鏈人類抗體，其包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致的重鏈可變域序列：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41及SEQ ID NO.43，且包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致的輕鏈可變域序列：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42及SEQ ID NO.44。
在一個實施例中，全人類抗體具有重鏈及輕鏈兩者，其中抗體具有選自由以下組成之群之重鏈/輕鏈可變域序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17/SEQ ID NO. 18、SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21/SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23/SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25/SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27/SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29/SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33/SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35/SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37/SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39/SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41/SEQ ID NO.42及SEQ ID NO.43/SEQ ID NO.44。
在一個實施例中，全人類抗體Fab片段具有重鏈可變域區及輕鏈可變域區兩者，其中抗體具有選自由以下組成之群之重鏈/輕鏈可變域序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21/SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23/SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25/SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27/SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29/SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33/SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35/SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37/SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39/SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41/SEQ ID NO.42及SEQ ID NO.43/SEQ ID NO.44。
在一個實施例中，全人類單鏈抗體具有重鏈可變域區及輕鏈可變域區兩者，其中單鏈全人類抗體具有選自由以下組成之群之重鏈/輕鏈可變域序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21/SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23/SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25/SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27/SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29/SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33/SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35/SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37/SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39/SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41/SEQ ID NO.42及SEQ ID NO.43/SEQ ID NO.44。
在一個實施例中，本發明抗體及抗體片段用以治療選自由以下組成之群之疾病：前列腺癌、腎癌、結腸癌、肺癌或乳癌；病原感染；與CNS相關之疾病，生成性澱粉樣阿茲海默氏病；及具有發炎或過敏組分之疾病，移植物抗宿主疾病、宿主抗移植物疾病、過敏、自體免疫疾病及其他發炎疾病。
本發明抗體及其抗原結合片段可用以治療諸如癌症之疾病。在一個實施例中，本發明提供治療為CTLA4相關癌症之癌症之方法。片語「CTLA4相關癌症」係指與異常CTLA4表現或活性(例如增加之CTLA4表現或活性)相關之癌症或惡性細胞轉化。CTLA4相關癌症之實例包括(但不限於)膀胱癌、血癌、腦癌、乳癌、結腸直腸癌、纖維肉瘤、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、黑素瘤、淋巴瘤、間皮瘤及漿細胞瘤(參見例如Grosso等人，Cancer Immun.2013；13：5；Postow等人，JCO 2015年1月20日；Kvistborg等人，Science Translational Medicine 2014年9月17日：第6卷，第254期，第254頁；Hersh等人，J Clin Oncol.2008；26：摘要9022)。在某些實施例中，CTLA4相關癌症為個人中之任何癌症，其中偵測與抗CTLA-4臨床活性相關之生物指標，例如絕對淋巴細胞數之上升、T細胞上之持續誘導性T細胞共刺激因子(ICOS)表現(Liakou等人Proc Natl Acad Sci U S A.2008；105：14987-14992)或T細胞上HLA-DR/CD45RO之上調(Comin-Anduix B等人J Transl Med.2008；6：22)。
如本文中所揭示之人類CTLA4之全人類抗體可用於需要以刺激免疫反應或免疫抑制加以治療之方法。刺激使用阻斷人類CTLA4結合至人類B7之抗體實現，且能夠藉由刺激及增強免疫反應之延長來治療之疾病包括前列腺癌、腎癌、結腸癌、肺癌或乳癌；病原感染；與CNS相關之疾病，例如生成性澱粉樣疾病，包括阿茲海默氏病；及具有發炎或過敏組分之疾病。免疫抑止亦可使用人類CTLA4之抗體例如經由誘導調節性T細胞實現(Coquerelle等人，Gut 2009；58：1363-1373)。能夠治療之疾病包括移植物抗宿主疾病、宿主抗移植物疾病、過敏、自體免疫疾病及其他發炎疾病。
本發明之抗CTLA4抗體(及其片段)亦適用於治療自體免疫疾病及細胞、器官或組織移植物移植之排斥反應。在某些態樣中，抗CTLA4抗體(及其片段)適用於治療選自類風濕性關節炎及青少年特發性關節炎之自體免疫疾病。
本發明提供用於治療或預防金黃色葡萄球菌(S.aureus)感染之方法，其包含投與抗CTLA4多肽。用於投與之技術及劑量視特定多肽之類型及待治療之特定病狀而變化，但可易於由熟練的業內人士確定。一般而言，監管機構要求待用作治療劑之蛋白質試劑係經調配成致具可接受地低水準之熱原質。因此，治療調配物通常可與其他調配物加以區別，因為治療調配物基本上無熱原質，或至少含有不超過如適當監管機構(例如FDA)所確定之可接受水準之熱原質。
本發明之治療組合物可與醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑或賦形劑以單位劑型投與。作為非限制性實例，投藥可為非經腸(例如，靜脈內、皮下)、口服或局部的。另外，可採用使用編碼本發明之多肽之核酸的任何基因療法技術，諸如裸DNA遞送、基於重組基因及載體、細胞之遞送，包括離體操作患者細胞，及其類似技術。
組合物可呈以下形式：用於口服投藥之丸劑、錠劑、膠囊、液體或持續釋放錠劑；或用於靜脈內、皮下或非經腸投藥之液體；用於局部投藥之凝膠、乳液、軟膏、乳膏或聚合物或其他持續釋放媒劑。
用於製備調配物之此項技術中熟知之方法見於例如「Remington：The Science and Practice of Pharmacy」(第20版，A.R.Gennaro A R.編，2000,Lippincott Williams & Wilkins,Philadelphia,Pa.)。用於非經腸投藥之調配物可例如含有賦形劑、無菌水、生理食鹽水、諸如聚乙二醇之聚烷二醇、植物來源之油或氫化萘。生物相容性、生物可降解丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可用以控制化合物之釋放。奈米粒子調配物(例如，生物可降解奈米粒子、固體脂質奈米粒子、脂質體)可用以控制化合物之生物分佈。其他可能適用之非經腸遞送系統包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物粒子、滲透泵、可植入輸注系統及脂質體。調配物中之化合物之濃度視多種因素而變化，該等因素包括待投與之藥物之劑量及投藥途徑。
多肽可視情況投與為醫藥學上可接受之鹽，諸如通常用於醫藥工業之無毒酸加成鹽或金屬錯合物。酸加成鹽之實例包括有機酸，諸如乙酸、乳酸、雙羥萘酸、順丁烯二酸、檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、丁二酸、苯甲酸、棕櫚酸、辛二酸、水楊酸、酒石酸、甲磺酸、甲苯磺酸或三氟乙酸或其類似物；聚合酸，諸如鞣酸、羧甲基纖維素或其類似物；及無機酸，諸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸或其類似物。金屬錯合物包括鋅、鐵及其類似物。在一個實例中，多肽在乙酸鈉存在下調配以增加熱穩定性。
用於口服使用之調配物包括含有與無毒的醫藥學上可接受之賦形劑混合的活性成分之錠劑。此等賦形劑可為例如惰性稀釋劑或填充劑(例如，蔗糖及山梨糖醇)、潤滑劑、滑動劑及抗黏劑(例如，硬脂酸鎂、硬脂酸鋅、硬脂酸、二氧化矽、氫化植物油或滑石)。
用於口服使用之調配物亦可提供為咀嚼錠劑，或活性成分與惰性固體稀釋劑混合之硬明膠膠囊，或活性成分與水或油介質混合之軟明膠膠囊。
較佳地，在某些實施例中，所揭示抗體藉由吸入投與，但全IgG抗體之氣溶膠化歸因於其分子大小(約150kDa)證明為有限制的。為使商用氣溶膠化裝置最大化，較小之Fab片段可能為所需的。在此情況下，亦可需要自親本IgG分子生成Fab片段。因此，將使用用於生成Fab片段之標準基於酶的消化方法來進行初始研究，該等Fab片段隨後將與全IgG分子並行表徵。
治療有效劑量係指產生其投藥所欲治療效應之劑量。確切劑量將視待治療之病症而定，且可由熟習此項技術者使用已知技術確定。一般而言，多肽以約0.01μg/kg至約50mg/kg/天、較佳0.01mg/kg至約30mg/kg/天、最佳0.1mg/kg至約20mg/kg/天投與。多肽可每天(例如，每天一次、兩次、三次或四次)或較佳頻率更低地(例如，每週、每兩週、每三週、每月或每季度一次)給出。另外，如此項技術中已知，針對年齡以及體重、整體健康、性別、飲食、投藥時間、藥物相互作用及疾病嚴重性之調節可能為需要的，且將可由熟習此項技術者用常規實驗確定。
如本文中所揭示之CTLA4結合多肽可單獨投與或與一或多種其他療法組合投與，該一或多種其他療法諸如化學療法、放射線療法、免疫療法、手術干預或此等療法之任何組合。如以上所描述，如其他治療策略之情形下之輔助療法一般，長期療法同樣為可能的。
在該等方法之某些實施例中，一或多種多肽治療劑可一起(同時)或在不同時間(依序)投與。另外，多肽治療劑可與用於治療癌症或用於抑制血管生成之另一類型化合物一起投與。
在某些實施例中，本發明之主題抗CTLA4抗體劑可單獨使用。
在某些實施例中，其片段之結合多肽出於診斷目的可經標記或未經標記。典型地，診斷分析需要偵測由將結合多肽結合至CTLA4產生之複合物之形成。類似於抗體，可直接標記結合多肽或片段。可採用各種標記，包括(但不限於)放射性核素、螢光劑、酶、酶受質、酶輔因子、酶抑制劑及配位體(例如，生物素、半抗原)。眾多適當之免疫分析為熟練的業內人士所已知(參見例如美國專利3,817,827；3,850,752；3,901,654及4,098,876)。當未經標記時，結合多肽可用於分析，諸如凝集分析。未經標記之結合多肽亦可與可用以偵測結合多肽之另一(一或多種)適合試劑組合使用，該另一(一或多種)適合試劑諸如與結合多肽反應之標記抗體或其他適合試劑(例如，標記蛋白A)。
在一個實施例中，本發明之結合多肽可用於酶免疫分析，其中主題多肽結合至酶。當包含CTLA4蛋白之生物樣品與主題結合多肽組合時，在結合多肽與CTLA4蛋白之間發生結合。在一個實施例中，含有表現CTLA4蛋白之細胞(例如內皮細胞)之樣品與主題抗體組合，且在結合多肽與攜帶由結合多肽識別之CTLA4蛋白的細胞之間發生結合。此等結合細胞可自未結合試劑分離，且可例如藉由使樣品與當經酶作用時產生顏色或其他可偵測變化之酶受質接觸，來確定特異性地結合至細胞之結合多肽-酶結合物之存在。在另一實施例中，可不標記主題結合多肽，且可添加識別主題結合多肽之第二標記多肽(例如抗體)。
在某些態樣中，亦可製備用於偵測生物樣品中CTLA4蛋白之存在之套組。該等套組將包括CTLA4結合多肽，其結合至該受體之CTLA4蛋白或部分；以及一或多種輔助試劑，其適用於偵測結合多肽與其受體蛋白質或部分之間的複合物之存在。本發明之多肽組合物可以凍乾形式，單獨或與對其他抗原決定基具有特異性之其他抗體組合 提供。可經標記或未經標記之結合多肽及/或抗體可包括於具有佐劑成分(例如，緩衝劑，諸如Tris、磷酸鹽及碳酸鹽；穩定劑；賦形劑；殺生物劑及/或惰性蛋白，例如牛血清白蛋白)之套組中。舉例而言，結合多肽及/或抗體可以與佐劑成分之凍乾混合物形式提供，或佐劑成分可單獨提供以由使用者組合。大體而言，此等佐劑物質將以按活性結合多肽或抗體之量計小於約5重量%存在，且通常將以按多肽或抗體濃度計至少約0.001重量%之總量存在。在採用能夠結合至結合多肽之第二抗體時，可在套組中，例如在單獨小瓶或容器中提供該抗體。第二抗體(若存在)典型地經標記，且可以與以上所描述之抗體調配物類似之方式調配。
多肽序列使用標準的一或三字母縮寫來指示。除非另有指示，否則各多肽序列在左側具有胺基端且在右側具有羧基端；各單股核酸序列及各雙股核酸序列之頂股在左側具有5'端且在右側具有3'端。特定多肽序列亦可藉由解釋其如何不同於參考序列來描述。
現已詳細描述了本發明，參考以下實例將更清楚理解本發明，該等實例僅出於說明之目的包括在內且不意欲限制本發明。
實例1
針對治療特徵，鑑別且選擇對人類CTLA4具有特異性之人類抗體，該等治療特徵包括對CTLA4之特異性及對CTLA4之高度親和力(例如，至少10-6M)。鑑別之抗體描述於表4中。
為判定抗CTLA4抗體是否具有功能活性，測定其增強T細胞活化之能力。使用生物素化抗CD14抗體自周邊血液單核細胞(PBMC)中消除單核細胞，隨後與抗生物素塗佈之磁性珠粒反應且使用磁性管柱分離。收集自維持於磁場中之管柱溶離之細胞溶離份，得到含有<1%單核細胞之淋巴細胞群體。將淋巴細胞添加至用固定抗CD3(5mg/ml)預塗佈之孔中。將測試抗體以10mg/ml添加至此等孔中。培養三天 後，針對細胞活化，藉由量測CD25之表現來分析細胞。確切而言，培養三天後，收集細胞且作為細胞活化之量度用抗人類CD25染色。CD25表現水準在已添加抗CTLA4抗體之培養物中較高(圖1)。對照抗體為同型匹配、非特異性(亦即不結合至CTLA4)抗體。藉由相對於培養基對照標準化資料，在接受抗CTLA4抗體之培養物中偵測到顯著之增強水準(圖2)。
實例2
此實例測定本文中所揭示之例示性抗體(F7)之親和力動力學。表1展示抗體F7之親和力動力學。
此實例說明本文中所揭示之例示性抗CTLA4抗體之結合親和力。使用表面電漿子共振(Biacore)測定親和力。簡言之，使用標準NHS/EDC偶合方法將抗人類Fc抗體(GE，BR-1008-39)固定於CM5感測器晶片上至大約1000RU。以10μl/min之流動速率收集抗體(約10μg/ml)，持續60秒。在操作緩衝液(HBS-EP)中連續稀釋重組人類CTLA4/His。在30μL/min之流動速率下進行所有量測。用3M MgCl2再生表面，持續60秒。使用1：1(Langmuir)結合模型來擬合資料。
實例3
以下實例描述人類抗CTLA4抗體CT1E1之特徵。CT1E1之可變重鏈及輕鏈之胺基酸序列分別提供於SEQ ID No：43及44中。
抗CTLA4抗體CT1E1之交叉反應性研究揭示，CT1E1不僅對人類CTLA4具有特異性，且與獼猴及鼠類CTLA4兩者交叉反應。使用96孔Ni-NTA培養盤，收集1μg/mL之重組人類CTLA4/His、獼猴CTLA4/His或小鼠CTLA4/His。在室溫下將培養盤培育30分鐘，用 PBS-Tween(PBST)洗滌3次，隨後添加在酪蛋白中稀釋之抗CTLA4抗體(約1μg/mL)，且在振盪下培育30分鐘。用PBST洗滌培養盤3次，添加辣根過氧化酶(HRP)結合之山羊抗人類Fc(1：500於酪蛋白中)，隨後添加3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)作為受質且培育約5分鐘。使用2M H2SO4來停止反應且在450nm下讀取OD。
亦使用表面電漿子共振(BiaCore)測定抗體CT1E1針對人類CTLA4之親和力。使用標準NHS/EDC偶合方法將抗人類Fc抗體(GE，BR-1008-39)固定於CM5感測器晶片上至大約1000RU。以10μl/min之流動速率收集抗體(約10μg/ml)，持續60秒。在操作緩衝液(HBS-EP)中連續稀釋重組人類PD-L1/His。在HBS-EP緩衝液中在30μL/min之流動速率下進行所有量測。適當地稀釋抗體以獲得一系列濃度。使用1：1(Langmuir)結合模型來擬合資料。Chi2(卡方)值用作擬合品質之指南。親和力研究之結果提供於下表2中。
進行分析以測定抗體CT1E1抑制CD80及CD86活性之能力。在室溫下用1μg/mL具有六組胺酸標籤之重組人類CD80或CD86塗佈96孔Ni-NTA培養盤，持續1小時。預混合30μL連續3倍稀釋之IgG(自25μg/mL開始)及30μL 0.006μL/mL重組人類CTLA4(如人類Fc融合體)，且培育混合物30分鐘，隨後用PBS-Tween(PBST)洗滌培養盤3次。將混合物轉移50μL至ELISA培養盤且在振盪下培育30分鐘。用PBST洗滌培養盤3次，隨後添加辣根過氧化酶(HRP)結合之山羊抗人類Fc(1：500於酪蛋白中)，隨後添加3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)作為受質且培育30分鐘。使用2M H2SO4來停止反應且在450nm下讀取OD。
研究結果描述於圖3A(CD80)及圖3B(CD86)中。CT1E1之IC50值 針對CD80測定為約0.31×10-9，且針對CD86為約0.32×10-9。出人意料地，相較於對照抗體伊匹單抗(Yervoy)之計算IC50，抗體CT1E1針對CD80及CD86具有較好IC50值，該對照抗體為能夠抑制CTLA4活性之人類抗CTLA4抗體，使得細胞毒性T細胞可例如殺滅癌細胞。對於伊匹單抗及CT1E1，針對CD80及CD86之計算IC50值描述於圖3A及3B中。
實例4
此實例描述檢查抗CTLA4抗體F7對低劑量超抗原葡萄球菌屬腸毒素B(SEB)之反應之作用的實驗。使用SEB作為刺激物提供研究回應於抗原之T細胞活化之方法。而抗CD3為多株T細胞活化劑，SEB為寡株活化劑。
進行實驗，其中抗人類CD25用作細胞活化之量度。使用兩種不同濃度之F7抗體(30μg及10μg)。亦使用陰性對照，其為不結合至CTLA4之同型匹配抗體。三天後，量測CD25細胞之活化百分比。
如圖4中所示，在用兩種濃度之抗CTLA4 F7抗體(30μg及10μg)處理之細胞中，經活化CD25細胞之百分比增加。藉由相對於培養基對照標準化資料，在接受F7抗CTLA4抗體之培養物中(藉助於CD25細胞)偵測到顯著的活化水準(圖4)。
實例5
在其他親和力及功能研究中進一步研究抗體E8。使用表面電漿子共振(BiaCore)測定抗體E8針對人類CTLA4之親和力。研究結果提供於下表3中。
除親和力研究之外，圖5提供展示抗體E8之功能活性之結果。圖 5中所描述之功能分析類似於實例1之CD26分析中所使用的方法。
<110> 美商索倫多醫療公司
<120> 結合CTLA4之抗體治療劑
<130> 126036-04320
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<213> 人工序列
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Claims (19)

  1. 一種IgG類別之經分離全人類抗CTLA4抗體，其包含包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少95%一致的胺基酸序列之重鏈可變域：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39及SEQ ID NO：43；及包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少95%一致的胺基酸序列之輕鏈可變域：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40及SEQ ID NO.44。
  2. 如請求項1之全人類抗體，其中該抗體具有選自由以下組成之群之重鏈/輕鏈可變域序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2(本文中稱為A1)、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4(本文中稱為A2)、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6(本文中稱為A4)、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8(本文中稱為A7)、SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10(本文中稱為A12)、SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12(本文中稱為B6)、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14(本文中稱為C2)、SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16(本文中稱為D6)、SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18(本 文中稱為F1)、SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20(本文中稱為F3)、SEQ ID NO.21/SEQ ID NO.22(本文中稱為F5)、SEQ ID NO.23/SEQ ID NO.24(本文中稱為F6)、SEQ ID NO.25/SEQ ID NO.26(本文中稱為F7)、SEQ ID NO.27/SEQ ID NO.28(本文中稱為G1)、SEQ ID NO.29/SEQ ID NO.30(本文中稱為G2)、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32(本文中稱為G3)、SEQ ID NO.33/SEQ ID NO.34(本文中稱為G5)、SEQ ID NO.35/SEQ ID NO.36(本文中稱為G12)、SEQ ID NO.37/SEQ ID NO.38(本文中稱為D5)、SEQ ID NO.39/SEQ ID NO.40(本文中稱為E7)及SEQ ID NO：43/SEQ ID NO：44(本文中稱為CT1E1)。
  3. 如請求項1或2之全人類抗體，其中該抗體具有至少1×10-6M之KD。
  4. 一種抗CTLA4全人類抗體Fab片段，其包含包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少95%一致的胺基酸序列之重鏈可變域：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39及SEQ ID NO：43；及包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少95%一致的胺基酸序列之輕鏈可變域：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO. 28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40及SEQ ID NO：44。
  5. 如請求項4之全人類抗體Fab片段，其中該抗體片段具有選自由以下組成之群之重鏈/輕鏈可變域序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21/SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23/SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25/SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27/SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29/SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33/SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35/SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37/SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39/SEQ ID NO.40及SEQ ID NO：43/SEQ ID NO：44。
  6. 如請求項4或5之全人類抗體Fab片段，其中該抗體具有至少1×10-6M之KD。
  7. 一種包含藉由肽連接子連接之重鏈可變域及輕鏈可變域之抗CTLA4單鏈人類抗體，其中該重鏈可變域包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少95%一致的胺基酸序列：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39及SEQ ID NO：43；且該輕鏈可變域包含 與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少95%一致的胺基酸序列：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40及SEQ ID NO：44。
  8. 如請求項7之單鏈人類抗體，其中該全人類單鏈抗體具有選自由以下組成之群之重鏈/輕鏈可變域序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21/SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23/SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25/SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27/SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29/SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33/SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35/SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37/SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39/SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41/SEQ ID NO.42及SEQ ID NO：43/SEQ ID NO：44。
  9. 如請求項7或8之全人類單鏈抗體，其中該抗體具有至少1×10-6M之KD。
  10. 一種治療有其需要個體中癌症之方法，該方法包含投與有效量之如請求項1至9中任一項之抗體或抗體片段，使得該癌症得到治療。
  11. 如請求項10之方法，其中該癌症選自由以下組成之群：膀胱 癌、血癌、腦癌、乳癌、結腸癌、纖維肉瘤、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、黑素瘤、淋巴瘤、間皮瘤及漿細胞瘤。
  12. 一種用於需要以刺激免疫反應或免疫抑制治療疾病之方法，其包含投與有效量之抗CTLA4多肽，其中該抗CTLA4多肽選自由以下組成之群：一IgG類別之經分離抗CTLA4全人類抗體，其包含重鏈可變域及輕鏈可變域，一抗CTLA4全人類抗體Fab片段，其包含重鏈可變域及輕鏈可變域，及一單鏈人類抗體，其具有重鏈可變域及輕鏈可變域，其中該重鏈可變域及該輕鏈可變域係經由肽連接子連接；其中該重鏈可變域包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少95%一致的胺基酸序列：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39及SEQ ID NO：43，且其中該輕鏈可變域包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少95%一致的胺基酸序列：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40及SEQ ID NO：44。
  13. 如請求項12之方法，其中該抗體或抗體片段具有選自由以下組成之群之重鏈/輕鏈可變域序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21/SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23/SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25/SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27/SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29/SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33/SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35/SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37/SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39/SEQ ID NO.40及SEQ ID NO：43/SEQ ID NO：44。
  14. 如請求項12或13之方法，其中該疾病選自由以下組成之群：前列腺癌、腎癌、結腸癌、肺癌或乳癌；病原感染；與CNS相關之疾病，生成性澱粉樣阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)；及具有發炎或過敏組分之疾病，移植物抗宿主疾病、宿主抗移植物疾病、過敏、自體免疫疾病及其他發炎疾病。
  15. 一種經分離抗CTLA4抗體或其抗原結合片段，該經分離抗CTLA4抗體或其抗原結合片段包括包含如選自由以下組成之群之重鏈可變區胺基酸序列中所闡述的互補決定區(CDR)之重鏈可變域：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO. 27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39及SEQ ID NO：43；且包括包含如選自由以下組成之群之輕鏈可變區胺基酸序列中所闡述的CDR之輕鏈可變區：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40及SEQ ID NO：44。
  16. 如請求項15之抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段具有至少1×10-6M之KD。
  17. 一種醫藥組合物，其包含如請求項15或16之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段；及醫藥學上可接受之載劑。
  18. 一種治療有其需要人類個體中癌症之方法，其包含向該個體投與有效量之如請求項15或16之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段，使得癌症得到治療。
  19. 如請求項18之方法，其中該癌症選自由以下組成之群：膀胱癌、血癌、腦癌、乳癌、結腸癌、纖維肉瘤、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、黑素瘤、淋巴瘤、間皮瘤及漿細胞瘤。
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