PT1141028E

PT1141028E - Anticorpos monoclonais humanos contra ctla-4

Info

Publication number: PT1141028E
Application number: PT99966644T
Authority: PT
Inventors: Douglas Charles Hanson; Mark Joseph Neveu; Eileen Elliot Mueller; Jeffrey Herbert Hanke; Steven Christopher Gilman; C Geoffrey Davis; Jose Ramon Corvalan
Original assignee: Pfizer; Amgen Fremont Inc
Priority date: 1998-12-23
Filing date: 1999-12-23
Publication date: 2010-05-04
Also published as: WO2000037504A9; CZ303703B6; WO2000037504A2; ES2706547T3; LT2112166T; CY1121451T1; IS8950A; EE200100336A; EP3553085A1; HK1041274B; JP3793693B2; ATE458008T1; SI1141028T1; WO2000037504A3; HU229566B1; IS5974A; BRPI9916853B8; PL349266A1; KR100617337B1; PL210435B1

Description

1 ΡΕ1141028

DESCRIÇÃO "ANTICORPOS MONOCLONAIS HUMANOS CONTRA CTLA-4"

FUNDAMENTO DO INVENTO 1. Referência cruzada a pedidos relacionados 0 presente pedido reivindica prioridade para o Pedido de Patente Provisória U.S., N° de Série 60/113647, apresentado em 23 de Dezembro, 1998, cuja divulgação é aqui incluída na sua totalidade. 2. Sumário do invento

De acordo com o presente invento, são proporcionados anticorpos monoclonais totalmente humanos contra o antigénio 4 de linfócitos T citotóxicos (CTLA-4) humano. São proporcionadas sequências nucleotídicas codificadoras e as sequências de aminoácidos compreendendo moléculas das cadeias pesada e leve de imunoglobulina, particularmente sequências contíguas das cadeias pesada e leve abrangendo regiões determinantes de complementaridade (CDRs), especi-ficamente desde FR1 e/ou CDR1 até CDR3 e/ou dentro de FR4. 3. Fundamento da tecnologia A regulação da resposta imune em doentes poderá 2 ΡΕ1141028 constituir um tratamento desejável para muitas doenças humanas, podendo conduzir a uma especificidade da acção raramente encontrada com a utilização dos fármacos convencionais. Será possivel tanto a regulação positiva como a regulação negativa das respostas do sistema imune. Os papéis das células T e das células B têm sido exten- sivamente estudados e caracterizados no que respeita à regulação da resposta imune. Destes estudos, o papel das células T surge, em muitos casos, como particularmente importante na prevenção e tratamento de doenças.

As células T possuem sistemas muito complexos para o controlo das suas interacções. As interacções entre as células T utilizam numerosos receptores e factores solúveis para o processo. Assim, qualquer efeito que um sinal particular possa ter na resposta imune geralmente varia com os factores, receptores e contra-receptores particulares que estejam envolvidos na via e depende deles. As vias para a regulação negativa são tão importantes como as necessárias para a activação. A educação timica que conduz à tolerância das células T é um mecanismo para prevenir uma resposta imune a um antigénio particular. Outros mecanismos, tais como secreção de citocinas supressoras, são igualmente conhecidos. A activação das células T requer não só a estimulação através do receptor do antigénio (receptor das células T (TCR)), como também sinalização adicional através de moléculas de superfície co-estimuladoras, tais como 3 ΡΕ1141028 CD28. Os ligandos para CD28 são as proteínas B7-1 (CD80) e B7-2 (CD86), as quais são expressas em células apresentadoras de antigénio tais como células dendríticas, células B ou monócitos activados que interagem com CD28 ou CTLA-4 das células T para induzir um sinal co-estimulador. 0 papel de sinalização co-estimuladora foi estudado na encefalomielite alérgica experimental (EAE) por Perrin et al., Immunol. Res. 14:189-99 (1995). EAE é um distúrbio auto-imune, induzido por células Thl dirigidas contra antigénios da mielina, que proporciona um modelo in vivo para o estudo do papel da co-estimulação mediada por B7 na indução de uma resposta imune patológica. Usando um ligando solúvel de proteína de fusão para os receptores B7, assim como anticorpos monoclonais específicos para CD80 ou CD86, Perin et al., demonstraram que a co-estimulação de B7 desempenha um papel predominante na determinação do desenlace da doença clínica em EAE. A interacção entre B7 e CD28 é uma de várias vias de sinalização co-estimuladoras que parecem ser suficientes para induzir a maturação e proliferação de células T específicas de antigénio. A ausência de co-estimulação e a concomitante inadequação da produção de IL-2 evitam a subsequente proliferação das células T e induzem um estado de não reactividade designado "anergia". Uma variedade de vírus e tumores podem bloquear a activação e proliferação de células T, conduzindo a actividade insuficiente ou não reactividade do sistema imune do hospedeiro contra as células infectadas ou transformadas. Entre uma série de 4 ΡΕ1141028 possíveis distúrbios das células T, a anergia pode ser, pelo menos parcialmente, responsável pela falência do hospedeiro para eliminar as células patogénicas ou tumori-génicas. A utilização da proteína B7 para mediar a imunidade anti-tumoral foi descrita em Chen et al., Cell 71:1093-1102 (1992) e Townsend e Allison, Science 259:368 (1993). Schwartz, Cell 71:1065 (1992), revê o papel de CD28, CTLA-4 e B7 na produção de IL-2 e na imunoterapia. Harding et al., Nature 356:607-609 (1994) demonstraram que a sinalização mediada por CD28 co-estimula as células T murinas e inibe a indução de anergia em clones de células T. Ver também as Patentes U.S. Nos. 5434131, 5770197 e 5773253 e Pedidos de Patente Internacional Nos. WO 93/00431, WO 95/01994, WO 95/3408, WO 95/24217 e WO 95/33770 .

Do que foi dito, tornou-se claro que as células T requerem dois tipos de sinais das células apresentadoras de antigénio (APC) para activação e subsequente diferenciação para a função efectora. Primeiro, existem sinais específicos de antigénio gerados pelas interacções entre o TCR nas células T e as moléculas de MHC apresentadoras de péptidos nas APCs. Segundo, existe um sinal independente de antigénio que é mediado pela interacção de CD28 com membros da família B7 (B7-1 (CD80) ou B7-2 (CD86) ) . Exactamente onde CTLA-4 se encaixa no meio da resposta imune foi inicialmente evasivo. CTLA-4 foi primeiro identificado e 5 ΡΕ1141028 clonado por Brunet et al., Nature 328:267-270 (1987), como parte de uma pesquisa de moléculas preferencialmente expressas em linfócitos T citotóxicos. CTLA-4 humano foi identificado e clonado pouco depois por Dariavach et al., Eur. J. Immunol. 18:1901-1905 (1988). As moléculas de CTLA-4 murinas e humanas possuem aproximadamente 76% de homo-logia da sequência global e possuem quase identidade completa de sequências nos seus domínios citoplasmáticos (Dariavach et al., Eur. J. Immunol. 18:1901-1905 (1988)). CTLA-4 é um membro da superfamília de proteínas das imunoglobulinas (Ig) . A superfamília Ig é um grupo de proteínas que partilha características estruturais chave de um domínio variável (V) ou constante (C) de moléculas de Ig. Membros da superfamília de Ig incluem, mas não estão limitados às próprias imunoglobulinas, moléculas do complexo major de histocompatibilidade (MHC (i.e., MHC classes I e II) e moléculas de TCR.

Em 1991, Linsley et al., J. Exp. Med. 174:561-569 (1991), propuseram que CTLA-4 seria um segundo receptor para B7. De forma semelhante, Harper et al., J. Immunol. 147:1037-44 (1991), demonstraram que as moléculas de CTLA-4 e CD28 estão estreitamente relacionadas no ratinho e no homem no que respeita à sequência, expressão do mensageiro, estrutura do gene e localização cromossómica. Ver também Balzano et al., Int. J. Câncer Suppl. 7:28-32 (1992). Outra evidência deste papel surgiu através de estudos funcionais. Por exemplo, Lenschow et al., Science 257:789-792 (1992), demonstraram que CTLA-4-Ig induziu sobrevivência a longo 6 ΡΕ1141028 prazo de enxertos dos ilhéus pancreáticos. Freeman et al., Science 262:907-909 (1993), examinaram o papel de CTLA-4 em ratinhos deficientes em B7. A avaliação dos ligandos para CTLA-4 está descrita em Lenschow et al., PNAS 90:11054-11058 (1993). Linsley et al., Science 257:792-795 (1992), descrevem a imunossupressão in vivo por uma forma solúvel de CTLA-4. Linsley et al., J. Exp. Med. 176:1595-604 (1992), prepararam anticorpos que se ligavam a CTLA-4 e que não davam reacção cruzada com CD28 e concluíram que CTLA-4 é co-expressa com CD28 em linfócitos T activados e cooperativamente regula a adesão de células T e a activação por B7. Kuchroo et al., Cell 80:707-18 (1995), demonstraram que as moléculas co-estimuladoras B7-1 e Έ>1-2 activam diferencialmente as vias de desenvolvimento Thl/Th2. Yi-qun et al., Int. Immunol. 8:37-44 (1996), demonstraram que existem requisitos diferentes para os sinais co-esti-muladores dos membros da família B7 nas células T de memória em repouso versus activadas recentemente por antigénios solúveis de reforço. Ver também de Bóer et al., Eur. J. Immunol. 23:3120-5 (1993). Vários grupos propuseram interacções receptor/li-gando alternativas ou distintas para CTLA-4, comparativamente com CD28, e propuseram mesmo um terceiro complexo B7 que foi reconhecido por um anticorpo BB1. Ver, por exemplo, Hathcock et al., Science 262:905-7 (1993), Freeman et al., Science 262:907-9 (1993), Freeman et al., J. Exp. Med. 178 :2185-92 (1993), Lenschow et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:11054-8 (1993), Razi-Wolf et al., Proc. 7 ΡΕ1141028

Natl. Acad. Sei. USA 90:1182-6 (1993) e Boussiotis et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:11059-63 (1993). Mas, ver

Freeman et al., J. Immunol. 161:2708-15 (1998), discutem o facto de o anticorpo BB1 se ligar a uma molécula que é idêntica à forma da superfície celular de CD74 e, portanto, o mAb BB1 se ligar a uma proteina distinta de B7-1 e que este epítopo estará também presente na proteína B7-1. Assim, esta observação requer que na área sejam recon- siderados os estudos que usam o mAb BB1 na análise da expressão e função de CD80.

Começando em 1993 e culminando em 1995, os investigadores começaram a delinear o papel de CTLA-4 na estimulação de células T. Primeiro, através da utilização de anticorpos monoclonais contra CTLA-4, Walunas et al., Immunity 1:405-13 (1994), proporcionaram evidência de que CTLA-4 pode funcionar como regulador negativo da activação das células T. Em seguida, Waterhouse et al., Science 270:985-988 (1995), demonstraram que ratinhos deficientes em CTLA-4 acumularam blastócitos T com regulação positiva de marcadores de activação nos seus nódulos linfáticos e baços: Os blastócitos também se infiltraram no tecido hepático, pulmonar e pancreático, e as quantidades de imunoglobulina sérica foram elevadas e as suas células T proliferaram, espontaneamente e fortemente, quando estimuladas através do receptor das células T, sendo, no entanto, sensíveis à morte celular induzida por ligação cruzada do receptor Fas e por irradiação gama. Waterhouse et al., concluíram que CTLA-4 actua como um regulador negativo da ΡΕ1141028 antigénio.

Assim, eles activação de células T e é vital para o controlo de homeostasia dos linfócitos. Num comentário no mesmo número, Allison e Krummel, Science 270:932-933 (1995), discutiram o trabalho de Waterhouse et al. como demonstrativo de que CTLA-4 actua na regulação negativa da resposta das células T ou de que possui um papel de sinalização inibitório na activação e desenvolvimento de células T. Tivol et al., Immunity 3:541-7 (1995), também geraram ratinhos deficientes em CTLA-4 e demonstraram que tais ratinhos rapidamente desenvolvem doença linfoproliferativa com infiltração linfocitica multi-órgãos e destruição de tecidos, com miocardite e pancreatite particularmente graves. Eles concluíram que CTLA-4 desempenha um papel chave na regulação negativa da activação de células T e manutenção da hosmeostasia imunológica. Igualmente, Kummel e Allison, J. Exp. Med. 182:459-65 (1995), clarificaram ainda que CD28 e CTLA-4 possuem efeitos opostos na resposta das células T à estimulação. Eles geraram um anticorpo contra CTLA-4 e investigaram os efeitos da sua ligação a CTLA-4 num sistema que usa células T altamente purificadas. Na sua descrição, mostraram que a presença de níveis baixos de B7-2 em células T recentemente explantadas pode inibir parcialmente a proliferação de células T e esta inibição é mediada por interacções com CTLA-4. A ligação cruzada de CTLA-4 em conjunto com TCR e CD28 inibe fortemente a proliferação e secreção de IL-2 pelas células T. Finalmente, os resultados mostraram que CD28 e CTLA-4 libertam sinais opostos que parecem ser integrados pela célula T na determinação da resposta ao 9 ΡΕ1141028 concluíram que o desenlace da estimulação do receptor de antigénio das células T é regulado por sinais co-estimuladores de CD28, assim como sinais inibitórios derivados de CTLA-4. Ver também Kummel et al., Int. Immunol. 8:519-23 (1996) e Patente US N° 5811097 e Pedido de Patente Internacional N° WO 97/20574.

Uma variedade de experiências adicionais foi realizada elucidando ainda a referida função de CTLA-4. Por exemplo, Walunas et al., J. Exp. Med. 183:2541-50 (1996), através da utilização de anticorpos anti-CTLA-4, sugeriram que a sinalização de CTLA-4 não regula a sobrevivência das células ou a resposta a IL-2, mas inibe a produção de IL-2 dependente de CD28. Igualmente, Perrin et al., J. Immunol. 157:1333-6 (1996), demonstraram que os anticorpos anti-CTLA-4 em encefalomielite alérgica experimental (EAE), exacerbam a doença e aumentam a mortalidade. A exacerbação da doença foi associada ao aumento de produção das citocinas encefalitogénicas TNF-alfa, IFN-gama e IL-2. Assim, eles concluíram que CTLA-4 regula a intensidade da resposta auto-imune em EAE, atenuando a produção de citocinas inflamatórias e manifestações de doença clínica. Ver também Hurwitz et al., J. Neuroimmunol. 73:57-62 (1997) e Cepero et al., J. Exp. Med. 188:199-204 (1998) (uma ribozima em gancho de cabelo anti-CTLA-4 que especi-ficamente inibe a expressão de CTLA-4 após transferência de genes num modelo de células T murino).

Ainda, Blair et al., J. Immunol. 160 :12-5 10 ΡΕ1141028 (1998), avaliaram os efeitos funcionais de um painel de anticorpos monoclonais (mAbs) contra CTLA-4 em células T CD4+ humanas em repouso. Os seus resultados demonstraram que alguns mAbs anti-CTLA-4 podiam inibir respostas proliferativas de células CD4+ em repouso e a transição do ciclo celular de GO para Gl. Os efeitos inibidores de CTLA-4 foram evidentes dentro de 4 h, numa altura em que a expressão de CTLA-4 na superfície celular permaneceu indetectável. Outros mAbs contra CTLA-4, no entanto, não tiveram efeitos inibitórios detectáveis, indicando que a ligação dos mAbs a CTLA-4 sozinho não foi suficiente para mediar negativamente as respostas de células T. É interessante que, enquanto a produção de IL-2 foi desligada, os mAbs inibitórios anti-CTLA-4 permitiram a indução e expressão do gene de sobrevivência celular bcl-X(L). Consistente com esta observação, as células permaneceram viáveis e a apoptose não foi detectada após ligação de CTLA-4.

Relativamente à anergia, Perez et al., Immunity 6:411-7 (1997), demonstraram que a indução da anergia das células T foi evitada através do bloqueio de CTLA-4 e concluíram que o resultado do reconhecimento do antigénio pelas células T é determinado pela interacção de CD28 ou CTLA-4 nas células com moléculas B7. Também, Van Parijs et al., J. Exp. Med. 186:1119-28 (1997), avaliaram o papel da interleucina 2 e co-estimuladores na anergia das células T In vivo e encontraram que através da inibição do envolvimento de CTLA-4 durante a indução de anergia, a 11 ΡΕ1141028 proliferação de células T foi bloqueada e a diferenciação completa de Thl não foi promovida. No entanto, as células T expostas a antigénio tolerogénico na presença de IL-12 e de anticorpo anti-CTLA-4 não foram anergizadas e comportaram-se de forma idêntica às células T que encontraram antigénio imunogénico. Estes resultados sugeriram que dois processos contribuíram para a indução de anergia in vivo: envolvimento de CTLA-4, que leva a um bloqueio na capacidade das células T para proliferarem e a ausência de uma citocina inflamatória prototípica, IL-12, que inibe a diferenciação das células T em células efectoras Thl. A combinação de IL-12 e do anticorpo anti-CTLA-4 foi suficiente para converter um estímulo normalmente tolerogénico num outro imunogénico.

Relativamente a infecções, McCoy et al., J. Exp. Med. 186:183-7 (1997), demonstraram que os anticorpos anti-CTLA-4 aumentaram grandemente e aceleraram a resposta imune de células T contra Nippostrongylus brasiliensis, resultando numa redução profunda no número de vermes adultos e na terminação precoce da produção de ovos do parasita. Ver também Murphy et al., J. Immunol. 161:4153-4160 (1998) (Leishmania donovani) .

Relativamente ao cancro, Kwon et al., PNAS USA 94:8099-103 (1997), estabeleceram um modelo murino de cancro da próstata singeneico e examinaram duas manipulações distintas destinadas a induzirem uma resposta anti-cancro da próstata através do aumento da co-estimulação de células T: (i) providenciar co-estimulação directa por 12 ΡΕ1141028 células de cancro da próstata transduzidas para expressarem o ligando B7-1 e (ii) bloqueio in vivo das células T mediado por anticorpos contra CTLA-4, os quais inibem a regulação negativa de células T. Foi demonstrado que 0 bloqueio in vivo, mediado por anticorpos contra CTLA- 4,

estimulou as respostas imunes anti-cancro da próstata. Igualmente, Yang et al., Câncer Res. 57:4036-41 (1997), investigaram se o bloqueio da função de CTLA-4 conduz à estimulação de respostas de células T antitumorais em várias fases do crescimento dos tumores. Com base nos resultados in vitro e in vivo encontraram que o bloqueio de CTLA-4 em indivíduos portadores de tumores estimulou a capacidade para gerar respostas de células T antitumorais, mas a expressão de tal efeito estimulador foi restringida às fases iniciais do crescimento tumoral no seu modelo. Ainda, Hurwitz et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95:10067-71 (1998) investigaram a geração de uma resposta antitu-moral, mediada por células T, que depende do envolvimento do receptor de células T através do complexo major de histocompatibilidade/antigénio assim como a ligação de CD28 por B7. Determinados tumores, tais como carcinoma mamário SM1, foram refractários à imunoterapia anti-CTLA-4. Assim, através da utilização de uma combinação do bloqueio de CTLA-4 e de uma vacina consistindo em células SMl expressando o factor de estimulação de colónias de granulócitos-macrófagos, foi observada a regressão de tumores SMl parentais, apesar da ineficácia de qualquer um dos tratamentos por si sós. Esta terapia de combinação resultou em imunidade duradoira contra SMl e dependeu de células T 13 ΡΕ1141028 CD4(+) e CD8(+). Estes resultados sugeriram que o bloqueio de CTLA-4 actue ao nivel de uma célula apresentadora de antigénios derivada do hospedeiro.

Relativamente a diabetes, Luhder et al., J. Exp. Med. 187:427-32 (1998), injectaram um mAb anti-CTLA-4 num modelo de ratinho transgénico para TCR de diabetes em diferentes fases da doença. Eles encontraram que o envolvimento de CTLA-4 na altura em que as células T potencialmente diabetogénicas são primeiro activadas é um acontecimento chave; se for permitido o envolvimento, ocorre a invasão dos ilhéus, mas permanece quase inócua durante vários meses. Caso contrário, a insulite é muito mais agressiva e os diabetes surgem rapidamente.

No que respeita à imunização com uma vacina, Horspool et al., J. Immunol. 160:2706-14 (1998), encontraram que o mAb anti-CTLA-4 intacto, mas não fragmentos Fab, suprimiu a resposta humoral primária a pCIA/beta gal sem afectar respostas de memória, indicando que a activação de CTLA-4 inibiu a produção de Ab mas não a estimulação de células T. O bloqueio dos ligandos de CD28 e CTLA-4, CD80 (B7-1) e CD86 (B7-2), revelou função distinta e não sobreponivel. 0 bloqueio de CD80 na imunização inicial inibiu completamente as respostas de Ab primárias e secundárias, enquanto o bloqueio de CD86 suprimiu as repostas primárias mas não as secundárias. 0 bloqueio simultâneo de CD80 + CD86 foi menos eficaz na supressão das respostas de Ab do que cada um isoladamente. O aumento da 14 ΡΕ1141028 co-estimulação via co-injecção de plasmídeos de expressão de B7 aumentou as respostas de CTL mas não as respostas de Ab e sem evidência de enviesamento de Thl para Th2. Estes resultados sugerem papéis complexos e distintos para CD28, CTLA-4, CD80 e CD86 na co-estimulação de células T após vacinação com ácidos nucleicos.

Em relação à rejeição de aloenxertos, Markees et al., J. Clin. Invest. 101:2446-55 (1998), encontraram, num modelo de ratinho de rejeição de aloenxertos da pele, que a aceitação inicialmente depende da presença de IFN-gama, CTLA-4 e células T CD4 ( + ) . A adição de mAb anti-CTLA-4 ou anti-IFN-gama ao protocolo foi associado à rejeição rápida de enxertos, enquanto o mAb anti-IL-4 não teve qualquer efeito.

No que respeita ao papel de CTLA-4 relativamente a CD28, Fallarino et al., J. Exp. Med. 188:205-10 (1998), geraram ratinhos selvagens para CD28/deficientes no gene 2 de activação da recombinase/transgénicos para TCR ou ratinhos deficientes em CD28 os quais foram imunizados com um tumor que expressa o antigénio. As células T sensibilizadas, de ambos os tipos de ratinhos, produziram cito-cinas e proliferaram em resposta a células estimuladoras sem expressão de B7. No entanto, enquanto a resposta de células T CD28+/+ foi aumentada pela co-estimulação com B7-1, a resposta das células T CD28-/- foi fortemente inibida. Esta inibição foi revertida pelo anticorpo monoclonal contra B7-1 ou contra CTLA-4. Assim, CTLA-4 pode inibir 15 ΡΕ1141028 fortemente a activação de células T na ausência de CD28, indicando que o antagonismo de um sinal mediado por TCR é suficiente para explicar o efeito inibidor de CTLA-4. Igualmente, Lin et ai., Exp. Med. 188:199-204 (1998), estudaram a rejeição de aloenxertos cardiacos em ratinhos deficientes em CD28. Corações H-2(q) foram transplantados para ratinhos alogeneicos selvagens ou deficientes em CD28 (H-2(b)). A rejeição de enxertos foi retardada em ratinhos deficientes em CD28 comparativamente com ratinhos selvagens. 0 tratamento de recipientes selvagens com imunoglo-bulina (Ig) CTLA-4 ou com mAbs anti-B7-l mais anti-B7-2 prolongaram significativamente a sobrevivência de aloenxertos. Pelo contrário, o tratamento de ratinhos deficientes em CD28 com CTLA-4-Ig, mAbs anti-B7-l mais anti-B7-2 ou um mAb bloqueador anti-CTLA-4 induziram a aceleração da rejeição de aloenxertos. Este aumento de velocidade da rejeição de enxertos foi associada a infiltração mais grave de células mononucleadas e a niveis aumentados de IFN-gama e dos transcritos de IL-6 em corações doados de ratinhos selvagens não tratados e ratinhos deficientes em CD28 tratados com CTLA-4-Ig ou com mAb anti-CTLA-4. Assim, o papel regulador negativo de CTLA-4 estende-se para lá da sua potencial capacidade para prevenir a activação de CD28 através da competição de ligandos. Mesmo na ausência de CD28, CTLA-4 desempenha um papel inibidor na regulação da rejeição de enxertos.

Igualmente, foi estudada uma melhor caracterização da expressão de CTLA-4. Por exemplo, Alegre et al., 16 ΡΕ1141028 J. Immunol. 157:4762.70 (1996), propuseram que CTLA-4 na superfície é rapidamente internalizado, o que pode explicar os níveis baixos de expressão geralmente detectados na superfície celular. Concluíram que CD2g e IL-2 desempenham papéis importantes na regulação positiva da expressão de CTLA-4. Ainda, a acumulação na superfície celular de CTLA-4 parece ser principalmente regulada pela sua rápida endocitose. Igualmente, Castan et al., Immunology 90:265-71 (1997), baseado nas análises imuno-histológicas in situ da expressão de CTLA-4, sugeriram que as células T dos centros germinais, as quais eram positivas para CTLA-4, puderam ser importantes para a regulação imune.

Assim, face ao papel lato e chave que CTLA-4 parece possuir na resposta imune, será desejável gerar anticorpos contra CTLA-4 que possam ser utilizados eficazmente em imunoterapia. Ainda, será desejável gerar anticorpos contra CTLA-4 que possam ser utilizados em doenças crónicas, nas quais são necessárias administrações repetidas dos anticorpos.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 apresenta uma série de sequências de nucleótidos e de aminoácidos das moléculas da cadeia pesada e da cadeia leve capa de imunoglobulina 4.1.1 (Figura IA) , 4.8.1 (Figura 1B) , 4.14.3 (Figura 1C), 6.1.1 (Figura 1D) , 3.1.1 (Figura 1D) . 4.10.2 (Figura 1F) , 2.1.3 (Figura 1G) , 4.13.1 (Figura 1H) , 11.2.1 (Figura II de acordo com o 17 ΡΕ1141028 invento), 11.6.1 (Figura 1J) , de acordo com o invento 11.7.1 (Figura 1K), 12.3.1.1 (Figura 1L) e 12.9.1.1 (Figura 1M) . A Figura 2 apresenta um alinhamento de sequências entre as sequências de aminoácidos previstas para a cadeia pesada dos clones 4.1.1, 4.8.1, 4.14.3, 6.1.1, 3.1.1, 4.10.2, 4.13.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 e 12.9.1.1 e a sequência de aminoácidos germinal DP50(3-33). As diferenças entre a sequência germinal DP-50 e a sequência nos clones estão indicadas a cheio. A Figura também mostra as posições das sequências CDR1, CDR2e CDR3 dos anticorpos estão a sombreado. A Figura 3 apresenta um alinhamento de sequências entre a sequência de aminoácidos prevista para a cadeia pesada do clone 2.1.3 e a sequência de aminoácidos germinal DP-65(4-31). As diferenças entre a sequência germinal DP-65 e a sequência no clone estão indicados a cheio. A Figura mostra também as posições das sequências de CDRl, CDR2 e CDR3 do anticorpo sublinhadas. A Figura 4 apresenta um alinhamento de sequências entre a sequência de aminoácidos prevista para a cadeia leve capa dos clones 4.1.1, 4.8.1, 4.14.3, 6.1.1, 3.1.1, 4.10.2 e 4.13.1 e a sequência de aminoácidos germinal A27. As diferenças entre a sequência germinal A27 e a sequência nos clones estão indicadas a negrito. A Figura também mostra as posições das sequências CDRl, CDR2 e CDR3 do 18 ΡΕ1141028 anticorpo sublinhadas. As deleções observadas nas CDRls dos clones 4.8.1, 4.14.3 e 6.1.1 estão indicadas com "Os". A Figura 5 apresenta um alinhamento de sequências entre a sequência de aminoácidos prevista para a cadeia leve capa dos clones 3.1.1, 11.2.1, 11.6.1 e 11.7.1 e a sequência de aminoácidos germinal 012. As diferenças entre a sequência germinal 012 e a sequência no clone estão indicadas a negrito. A Figura também mostra as posições das sequências CDR1, CDR2 e CDR3 do anticorpo sublinhadas. A Figura 6 apresenta um alinhamento de sequências entre a sequência de aminoácidos prevista para a cadeia leve capa do clone 2.1.3 e a sequência de aminoácidos germinal A10/A26. As diferenças entre a sequência germinal A10/A26 e a sequência no clone estão indicadas a negrito. A Figura também mostra as posições das sequências CDR1, CDR2 e CDR3 do anticorpo sublinhadas. A Figura 7 proporciona um alinhamento de sequências entre a sequência de aminoácidos prevista para a cadeia leve capa do clone 12.1.3 e a sequência de aminoácidos germinal A17. As diferenças entre a sequência germinal A17 e a sequência no clone estão indicadas a negrito. A Figura também mostra as posições das sequências CDR1, CDR2 e CDR3 do anticorpo sublinhadas. A Figura 8 proporciona um alinhamento de sequências entre a sequência de aminoácidos prevista para a 19 ΡΕ1141028 cadeia leve capa do clone 12.9.1 e a sequência de amino-ácidos germinal A3/A19. As diferenças entre a sequência germinal A3/A19 e a sequência no clone estão indicadas a negrito. A Figura também mostra as posições das sequências CDR1, CDR2 e CDR3 do anticorpo sublinhadas. A Figura 9 proporciona um sumário das sequências de aminoácidos N-terminais geradas através da sequenciação directa de proteínas das cadeias pesada e leve dos anticorpos . A Figura 10 proporciona determinada informação adicional de caracterização de alguns anticorpos. Na Figura 10A, estão resumidos os dados relacionados com os clones 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.14.3 e 6.1.1. São propor cionados os dados relacionados com a concentração, focagem isoeléctrica (IEF), SDS-PAGE, cromatografia de exclusão por tamanho, cromatografia líquida/espectroscopia de massa (LCMS), espectroscopia de massa (MALDI), sequências N-terminais da cadeia leve. Informação com detalhes adicionais relacionados com IEF está apresentada na Figura 10B; relacionada com SDS-PAGE está apresentada em 10C; e SEC do anticorpo 4.1.1 em 10D. A Figura 11 mostra a expressão de B7-2 em células Raji usando mAbs anti-CD80-PE e anti-CD86-PE. A Figura 12 mostra o aumento, dependente da concentração, da produção de IL-2 no ensaio de blastócitos 20 ΡΕ1141028 /Raji induzido pelos anticorpos bloqueadores anti-CTLA-4 (BNI3, 4.1.1, 4.8.1 e 6.1.1). A Figura 13 mostra o aumento dependente da concentração, da produção de IFN-γ no ensaio de blastócitos /Raji, induzido pelos anticorpos bloqueadores anti-CTLA-4 (BNI3, 4.1.1, 4.8.1 e 6.1.1) (o mesmo dador de células T) . A Figura 14 mostra o aumento médio da produção de IL-12 em células T de 6 dadores induzido pelos anticorpos bloqueadores anti-CTLA-4 no ensaio de blastócitos T/Raji. A Figura 15 mostra o aumento médio da produção de IFN-γ em células T de 6 dadores induzido pelos anticorpos bloqueadores anti-CTLA-4 no ensaio de blastócitos T/Raji. A Figura 16 mostra o aumento médio da produção de IL-12 em hPBMCs de 5 dadores induzido pelos anticorpos bloqueadores anti-CTLA-4 medido às 72 horas após estimulação com SEA. A Figura 17 mostra o aumento médio da produção de IL-12 em sangue total de 3 dadores induzido pelos anticorpos bloqueadores anti-CTLA-4 medido às 72 e 96 horas após estimulação com SEA. A Figura 18 mostra a inibição do crescimento de tumores com o anticorpo anti-CTLA-4 murino num modelo de tumor de fibrossarcoma murino. 21 ΡΕ1141028 A Figura 19 mostra o aumento da produção de IL-2 induzido por anticorpos anti-CTLA-4 (4.1.1 e 11.2.1) em ensaios de 72 horas com blastócitos T/Raji e superantigénio (sangue total e células mononucleadas de sangue periférico de 6 dadores). A Figura 20 mostra o aumento da produção de IL-2 dependente de dose induzido por anticorpos anti-CTLA-4 (4.1.1 e 11.2.1) num ensaio de 72 horas com blastócitos T/Raj i. A Figura 21 mostra o aumento da produção de IL-2 dependente de dose induzido por anticorpos anti-CTLA-4 (4.1.1 e 11.2.1) num ensaio de 72 horas com sangue total e superantigénios, estimulação com 100 ng/ml de superantigénio . A Figura 22 proporciona uma série de sequências de nucleótidos e aminoácidos adicionais das seguintes cadeias de anticorpo anti-CTLA-4: cadeia pesada 4.1.1 completa (cDNA 22 (a), genómico 22 (b) e aminoácidos 22 (c)), cadeia pesada aglicosilada 4.1.1 de tamanho completo (cDNA 22(d) e de aminoácidos 22 (e)), cadeia leve 4.1.1 (cDNA 22 (f) e aminoácidos 22 (g)), cadeia pesada de tamanho completo 4.8.1 (cDNA 22(h) e aminoácidos 22 (i)), cadeia leve 4.8.1 (cDNA 22 (j) e aminoácidos 22(k)), cadeia pesada de tamanho completo 6.1.1 (cDNA 22(i) e aminoácidos 22(m)), cadeias leves 6.1.1 (cDNA 22(n) e aminoácidos 11(o)), 22 ΡΕ1141028 cadeia pesada completa 11.2.1 (cDNA 22(p) e aminoácidos 22(q)) e cadeia leve 11.2.1 (cDNA 22® e aminoácidos 22 (s)) .

SUMÁRIO DO INVENTO

De acordo com o presente invento, é proporcionado um anticorpo capaz de se ligar a CTLA-4, o qual é ainda caracterizado nas reivindicações.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS REALIZAÇÕES PREFERIDAS

De acordo com o presente invento, são proporcionados anticorpos monoclonais totalmente humanos contra CTLA-4 humano. São proporcionadas sequências nucleotidicas codificadoras e as sequências de aminoácidos compreendendo as moléculas da cadeia pesada e leve de imunoglobulina, particularmente sequências correspondendo às sequências contíguas das cadeias pesada e leve de FR1 e CDR1 até CDR3 e FR4. São proporcionados hibridomas que expressam tais moléculas de imunoglobulina e anticorpos monoclonais. A menos que de outra forma seja definido, os termos científicos e técnicos usados em associação com o presente invento deverão ter os significados que normal- mente são atribuídos pelos familiarizados com a matéria. Ainda, a menos que se j a necessário de acordo com o contexto, os termos no singular deverão incluir os plurais 23 ΡΕ1141028 e os termos no plural deverão incluir os singulares. De um modo geral, a nomenclatura utilizada em relação a técnicas de cultura de células e de tecidos, biologia molecular e quimica de proteínas e oligonucleótidos e polinucleótidos e hibridação aqui descritas, são as normalmente conhecidas e utilizadas na área. Técnicas convencionais são usadas para DNA recombinante, síntese de oligonucleótidos e cultura de tecidos e transformação (e.g., electroporação, lipofecção). As reacções enzimáticas e as técnicas de purificação são realizadas de acordo com as especificações do fabricante ou como normalmente são executadas na literatura ou como aqui descritas. As técnicas e procedimentos referidos são geralmente realizados de acordo com métodos convencionais conhecidos na área e como descrito em várias referências gerais e mais específicas que são citadas e discutidas ao longo da presente especificação. Ver e.g., Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)), que aqui é incluído como referência. As nomenclaturas usadas em relação a procedimentos e técnicas laboratoriais de química analítica, química de síntese orgânica e e química médica e farmacêutica aqui descritas são conhecidas e representam as normalmente usadas na área. São usadas técnicas convencionais para as sínteses químicas, análises químicas, preparação farmacêutica, formulação e administração e tratamento de doentes.

Conforme utilizados de acordo com a presente descrição, os termos que se seguem, a menos que de outra - 24 - ΡΕ1141028 forma seja especificado, deverão ser entendidos como tendo os seguintes significados: 0 termo "polinucleótido isolado" como aqui usado deverá significar um polinucleótido de DNA genómico, cDNA ou de origem sintética ou uma combinação destes, pelo que devido à sua origem o "polinucleótido isolado" (1) não está associado com a totalidade ou uma porção de um polinucleótido em que o "polinucleótido isolado" é encontrado na natureza, (2) está operacionalmente ligado a um polinucleótido a que não está ligado na natureza ou (3) não ocorre na natureza como parte de uma sequência maior. 0 termo "proteína isolada" aqui referido significa uma proteína com origem em cDNA, RNA recombinante ou de síntese ou uma combinação das mesmas, pelo que devido à sua origem ou fonte de onde deriva, a "proteína isolada" (1) não está associada a proteínas encontradas na natureza, (2) está livre de outras proteínas da mesma fonte, e.g. sem proteínas murinas, (3) é expressa por uma célula de uma espécie diferente ou (4) não ocorre na natureza. 0 termo "polipéptido", como aqui usado como termo genérico, refere-se a proteína nativa, fragmentos ou análogos de uma sequência polipeptídica. Assim, a proteína nativa, fragmentos e análogos são como espécies do género polipéptido. Polipéptidos preferidos de acordo com o invento compreendem as moléculas da cadeia pesada de imunoglobulina humana e as moléculas da cadeia leve capa de 25 ΡΕ1141028 imunoglobulina humana representadas na Figura 1, assim como moléculas de anticorpo formadas por combinações compreendendo as moléculas de imunoglobulina da cadeia pesada com moléculas de imunoglobulina da cadeia leve, como sejam as moléculas da cadeia leve capa de imunoglobulina e vice versa, assim como fragmentos e análogos das mesmas. 0 termo "natural", como aqui usado quando aplicado a um objecto, refere-se ao facto de um objecto poder ser encontrado na natureza. Por exemplo, um polipéptido ou sequência polinucleotidica que esteja presente num organismo (incluindo virus) que possa ser isolado a partir de uma fonte natural e que não tenha sido intencionalmente modificado pelo homem no laboratório ou de outra forma é natural. 0 termo "ligado operacionalmente" como aqui usado refere-se às posições dos componentes assim descritas que estão numa relação que lhes permite funcionar na forma pretendida. Uma sequência de controlo "operacionalmente ligada" a uma sequência codificadora está ligada de forma que a expressão da sequência codificadora seja conseguida em condições compatíveis com a sequência de controlo. 0 termo "sequência de controlo" como aqui usado refere-se a sequências polinucleotídicas que são necessárias para efectuar a expressão e processamento das sequências codificadoras a que estão ligadas. A natureza de tais sequências de controlo difere dependendo do organismo 26 ΡΕ1141028 hospedeiro; nos procariotas, tais sequências de controlo geralmente incluem um promotor, local de ligação ao ribossoma e sequência de terminação da transcrição; nos eucariotas, de um modo geral, tais sequências de controlo incluem promotores e uma sequência de terminação da transcrição. O termo "sequências de controlo" destina-se a incluir, num minimo, todos os componentes cuja presença é essencial para a expressão e processamento e pode também incluir outros componentes cuja presença é vantajosa, por exemplo sequências lider e sequências de parceiros de fusão. 0 termo "polinucleótido" como aqui referido significa uma forma polimérica do nucleótido de pelo menos 10 bases de comprimento, ribonucleótidos ou desoxinu-cleótidos, ou uma forma modificada de qualquer um dos tipos de nucleótido. 0 termo inclui formas de DNA de cadeia simples e dupla. 0 termo "oligonucleótido" aqui referido inclui nucleótidos, naturais e modificados, ligados uns aos outros através de ligações oligonucleotidicas naturais e não naturais. Os oligonucleótidos são uma sub-série de poli-nucleótidos geralmente compreendendo um comprimento de 200 bases ou menos. De preferência, os oligonucleótidos têm 10 a 60 bases de comprimento e, mais de preferência, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 a 40 bases de comprimento. Os oligonucleótidos são, geralmente, de cadeia simples, e.g. para sondas; no entanto, os oligonucleótidos podem ser de 27 ΡΕ1141028 cadeia dupla, e.g. para usar na construção de um gene mutante. Os oligonucleótidos podem ser oligonucleótidos codificadores ou complementares da sequência codificadora. 0 termo "nucleótidos naturais" aqui referido inclui desoxirribonucleótidos e ribonucleótidos. 0 termo "nucleótidos modificados" aqui referido inclui nucleótidos com grupos modificados ou com açúcar substituido e similares. 0 termo "ligações oligonucleotidicas" aqui referido inclui ligações oligonucleotidicas tais como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforoamidato e similares. Ver e.g., LaPlanche et al., Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al., J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984); Stein et al., Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988); Zon et al., Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al., Oligonucleotides and Analogues : A Praticai Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec et al., Patente U.S. N° 5151510; Uhmann e Peyman, Chemical Reviews 90:543 (1990), as descrições das quais são aqui incluídas como referência. Um oligonucleótido pode incluir, caso se pretenda, uma marca para detecção. O termo "hibrida selectivamente" aqui referido significa que se liga de forma detectável e específica. Polinucleótidos, oligonucleótidos e fragmentos dos mesmos, de acordo com o invento, hibridam selectivamente com as cadeias de ácidos nucleicos, em condições de hibridação e lavagem que minimizam quantidades apreciáveis de ligação 28 ΡΕ1141028 detectável a ácidos nucleicos não específicos. As condições de elevada restrição podem ser usadas para se atingir condições de hibridação selectiva como é do conhecimento na área e aqui discutido. De um modo geral, a homologia de sequências de ácido nucleico entre os polinucleótidos, oligonucleótidos e fragmentos do invento e uma sequência de ácido nucleico com interesse terá pelo menos 80% e, mais tipicamente, de preferência homologias crescentes de pelo menos 85%, 90%, 95%, 99% e 100%. Duas sequências de amino-ácidos são homólogas se existir uma identidade parcial ou completa entre as suas sequências. Por exemplo, 85% de homologia significa que 85% dos aminoácidos são idênticos quando as duas sequências são alinhadas para um máximo de correspondência. São permitidos intervalos (em qualquer uma das duas sequências a serem alinhadas) para maximizar o alinhamento; comprimentos dos intervalos de 5 ou menos são preferidos, sendo ainda mais preferidos 2 ou menos. Como alternativa, e de preferência, duas sequências proteicas (ou sequências polipeptídicas derivadas das mesmas com pelo menos 30 aminoácidos de comprimento) são homólogas, conforme o termo é aqui usado, se tiverem uma pontuação do alinhamento superior a 5 (em unidades de desvio padrão) usando o programa ALIGN com a matriz de dados de mutações e uma penalização dos intervalos de 6 ou mais. Ver Dayhoff, M.O., em "Atlas of Protein Sequence and Structure", pp. 101-110 (Volume 5, National Biomedical Research Foundation (1972)) e Suplemento 2 deste volume, pp. 1-10. As duas sequências ou partes das mesmas são, mais de preferência, homólogas se os seus aminoácidos forem em 50% ou mais 29 ΡΕ1141028 idênticos quando optimamente alinhados usando o programa ALIGN. 0 termo "corresponde" é aqui usado para significar que uma sequência polinucleotidica é homóloga (i.e., é idêntica, não estritamente relacionada em termos evolutivos) com a totalidade ou uma porção de uma sequência polinucleotidica de referência, ou que uma sequência polipeptidica é idêntica a uma sequência polipeptídica de referência. Pelo contrário, o termo "complementar" é aqui usado para significar que a sequência complementar é homóloga da totalidade ou de uma porção de uma sequência polinucleotidica de referência. Para fins ilustrativos, a sequência nucleotidica "TATAC" corresponde a uma sequência de referência "TATAC" e é complementar de uma sequência de referência "GTATA".

Os termos que se seguem são usados para descrever as relações de sequências entre duas ou mais sequências polinucleotidicas ou de aminoácidos: "sequência de referência", "janela de comparação", "identidade de sequências", "percentagem de identidade de sequências" e "identidade substancial". Uma "sequência de referência" é uma sequência definida, usada como base para uma comparação de sequências; uma sequência de referência pode ser uma sub-série de uma sequência maior, por exemplo, como seja um segmento de um cDNA ou sequência de gene de tamanho completo apresentada numa listagem de sequências ou pode compreender uma sequência de cDNA ou de gene completa. De um modo geral, uma sequência de referência tem pelo menos 18 nucleótidos ou 6 aminoácidos de comprimento, frequen- 30 ΡΕ1141028 temente pelo menos 24 nucleótidos ou 8 aminoácidos de comprimento, e muitas vezes pelo menos 48 nucleótidos ou 16 aminoácidos de comprimento. Uma vez que duas sequências de polinucleótidos ou de aminoácidos podem cada uma (1) compreender uma sequência (i.e., uma porção da sequência polinucleotidica ou de aminoácidos completa) que é semelhante entre as duas moléculas e (2) podem ainda compreender uma sequência que é divergente entre as duas sequências de polinucleótidos ou de aminoácidos; as comparações de sequências entre duas (ou mais) moléculas são tipicamente realizadas por comparação das sequências das duas moléculas ao longo de uma "janela de comparação" para identificar e comparar regiões locais de similaridade de sequências. Uma "janela de comparação", como aqui usado, refere-se a um segmento conceptual de pelo menos 18 posições contíguas de nucleótidos ou de 6 aminoácidos, em que uma sequência polinucleotidica ou uma sequência de aminoácidos pode ser comparada com uma sequência de referência de pelos menos 18 nucleótidos ou 6 aminoácidos contíguos e em que a porção da sequência polinucleotidica na janela de comparação pode compreender adições, deleções, substituições e similares (i.e., intervalos) de 20 por cento ou menos comparativamente com a sequência de referência (a qual não compreende adições ou deleções) para o alinhamento óptimo das duas sequências. 0 alinhamento óptimo de sequências para alinhar uma janela de comparação pode ser conduzida pelo algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), através do algoritmo de alinhamento por homologia de Needleman e 31 ΡΕ1141028

Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1997), através do método de pesquisa de similaridade de Person e Lipman, Proc. Natl. Acad. Sei. (U.S.A.) 85:2444 (1988), através de implementações computarizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0 (Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), ou o pacote de programas Gene Works ou MacVector) ou através da inspecção e é seleccionado o melhor alinhamento (i.e., resultante na percentagem de homologia mais elevada ao longo da janela de comparação) gerado pelos vários métodos. O termo "identidade de sequências" significa que as duas sequências polinucleotídicas ou de aminoácidos são idênticas (i.e., numa base de nucleótido a nucleótido ou resíduo a residuo) ao longo da janela de comparação. O termo "percentagem de identidade de sequências" foi calculado por comparação com duas sequências optimamente alinhadas ao longo da janela da comparação, determinando o número de posições em que ocorre a base de ácido nucleico (e.g., A, T, C, G, U ou I) ou resíduo idêntico em ambas as sequências para dar o número de posições concordantes, dividindo o número de posições concordantes pelo número total de posições na janela de comparação (i.e., o tamanho da janela) e multiplicando o resultado por 100 para dar a percentagem de identidade de sequências. O termo "identidade substancial" como aqui usado significa uma carac-terística de uma sequência polinucleotídica ou de aminoácidos, em que a sequência de polinucleótido ou de ami- 32 ΡΕ1141028 noácidos compreende uma sequência que tem pelo menos 85% de identidade de sequência, de preferência pelo menos 90 a 95 por cento de identidade de sequências, mais qeralmente pelo menos 99 por cento de identidade, comparativamente com uma sequência de referência ao lonqo de uma janela de comparação de pelo menos 18 posições de nucleótidos (6 amino-ácidos), frequentemente ao longo de uma janela de pelo menos 24-48 posições de nucleótidos (8-16 aminoácidos), em que a percentagem de identidade de sequências foi calculada por comparação da sequência de referência com a sequência que pode incluir deleções ou adições que totalizam 20 por cento ou menos da sequência de referência ao longo da janela de comparação. A sequência de referência pode ser uma sub-série de uma sequência maior.

Como aqui usado, os vinte aminoácidos convencionais e as suas abreviaturas seguem a utilização convencional. Ver: "Immunology - A synthesis" (2nd Edition, E.S. Golub e D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), que aqui é incluído como referência. Os estereoisómeros (e.g., D-aminoácidos) dos vinte aminoácidos convencionais, aminoácidos não naturais tais como aminoácidos di-substituídos em α-,α, N-alquilaminoácidos, ácido láctico e outros aminoácidos não convencionais podem também ser componentes adequados para polipéptidos do presente invento. Exemplos de aminoácidos não convencionais incluem: 4-hidroxiprolina, γ-carboxi-glutamato, ε-Ν,N,N-trimetil-lisina; ε-Ν-acetil-lisina, 0-fosfo-serina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metil- 33 ΡΕ1141028 histidina, 5-hidroxilisina, σ-Ν-metilarginina e outros aminoácidos e iminoácidos semelhantes (e.g., 4-hidroxi-prolina). Na notação de polipéptidos aqui usada, a direcção para a esquerda é a direcção do extremo amina e a direcção para a direita é a direcção do extremo carboxilo, de acordo com a utilização convencional.

De forma semelhante, a menos que de outra forma seja especificado, o extremo esquerdo das sequências de polinucleótidos de cadeia simples é o extremo 5'; a direcção para a esquerda das sequências polinucleotídicas de cadeia dupla é referida como a direcção 5'. A direcção de adição de 5' para 3' dos transcritos de RNA nascente é referida como a direcção de transcrição; regiões de sequências na cadeia de DNA tendo a mesma sequência do RNA e que estão 5' no sentido do extremo 5' do transcrito de RNA são referidas como "sequências a montante"; regiões de sequências na cadeia de DNA tendo a mesma sequência do RNA e que estão 3' no sentido do extremo 3' dos transcritos de RNA são referidos como "sequências a jusante".

Conforme aplicado aos polipéptidos, o termo "identidade substancial" significa que as duas sequências peptidicas, quando optimamente alinhadas, como seja pelos programas GAP ou BESTFIT usando os pesos dos intervalos por defeito, partilham pelo menos 80 por cento de identidade de sequências, de preferência pelo menos 90 por centro de identidade de sequências, mais de preferência pelo menos 95 por cento de identidade de sequências e mais de preferência 34 ΡΕ1141028 pelo menos 99 por cento de identidade de sequências. De preferência, as posições de resíduos que não são idênticas diferem nas substituições de aminoácidos conservadas. As substituições de aminoácidos conservadas referem-se à permuta de resíduos tendo cadeias laterais semelhantes. Por exemplo, um grupo de aminoácidos tendo cadeias alifáticas laterais é glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais alifáticas-hidroxilo é serina e treonina; um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais contendo amida é asparagina e glutamina; um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais aromáticas é fenilalanina, tirosina e triptofano; um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais básicas é lisina, arginina e histidina; e um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais contendo enxofre é cisteína e metionina. Grupos de aminoácidos conservados preferidos para substituição são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tiro-sina, lisina-arginina, alanina-valina, ácido glutâmico-aspártico e arparagina-glutamina.

Como aqui discutido, variações menores nas sequências de aminoácidos de anticorpos ou moléculas de imunoglobulina são abrangidas pelo presente invento, desde que as variações na sequência de aminoácidos mantenham pelo menos 90%. Em particular, são consideradas as substituições de aminoácidos conservadas. As substituições conservadas são aquelas que têm lugar dentro de uma família de aminoácidos que estão relacionados nas suas cadeias laterais. Os aminoácidos geneticamente codificados estão genericamente 35 ΡΕ1141028 divididos em famílias: (1) acídicos = aspartato, glutamato; (2) básicos = lisina, arginina, histidina; (3) não polares = alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenil-alanina, metionina, triptofano; e (4) polares sem carga = glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. As famílias mais preferidas são: serina e treonina que são uma família alifática-hidroxilo; asparagina e glutamina são uma família contendo amida; alanina, valina, leucina e isoleucina são uma família alifática; e fenilalanina, triptofano e tirosina são uma família aromática. Por exemplo, é razoável esperar que uma substituição isolada de uma leucina com uma isoleucina ou valina, um aspartato com um glutamato, uma treonina com uma serina, ou um aminoácido semelhante com um aminoácido estruturalmente relacionado não tenha um efeito importante na ligação ou propriedades da molécula resultante, especialmente se a substituição não envolver um aminoácido dentro de sítios estruturais. Se uma alteração de aminoácido resulta ou não num péptido funcional pode facilmente ser determinado testando a actividade específica do polipéptido derivado. Os ensaios estão descritos detalhadamente abaixo. Os fragmentos de anticorpos ou moléculas de imunoglobulinas podem ser facilmente preparados pelos familiarizados com a matéria. Os extremos amina e carboxílicos preferidos de fragmentos ou análogos ocorrem perto das fronteiras dos domínios funcionais. Os domínios estruturais e funcionais podem ser identificados por comparação dos dados de sequências nucleotídicas e/ou de aminoácidos de bases de dados de sequências públicas ou privadas. De preferência, 36 ΡΕ1141028 os métodos de comparação computarizados são usados para identificar motivos de sequências ou domínios conformacio-nais proteicos previstos que ocorrem noutras proteínas de estrutura e/ou função conhecidas. São conhecidos métodos para identificar sequências proteicas que adquirem uma estrutura tridimensional conhecida. Bowie et al., Science 253:164 (1991). Assim, os exemplos anteriores demonstram que os familiarizados com a matéria podem reconhecer motivos da sequência e conformações estruturais que podem ser usadas para definir domínios estruturais e funcionais de acordo com o invento.

As substituições de aminoácidos preferidas são aquelas que: (1) reduzem a susceptibilidade à proteólise, (2) reduzem a susceptibilidade à oxidação, (3) alteram a afinidade de ligação relativamente à formação de complexos proteicos, (4) alteram as afinidades de ligação e (4) conferem ou modificam outras propriedades fisicoquímicas ou funcionais de tais análogos. Os análogos podem incluir várias muteínas de uma sequência diferentes da sequência peptídica natural. Por exemplo, substituições simples ou múltiplas (de preferência substituições de aminoácidos conservadas) podem ser feitas na sequência natural (de preferência na porção do polipéptido fora do(s) domínio(s) formador(es) dos contactos intermoleculares). Uma substituição de aminoácidos conservada não deverá alterar substancialmente as características estruturais da sequência parental (e.g., uma substituição de aminoácido não deverá tender a partir uma hélice que ocorre na sequência 37 ΡΕ1141028 parental ou destruir outros tipos de estrutura secundária que caracterizam a sequência parental) . Exemplos de estruturas secundárias e terciárias polipeptidicas reconhecidas na área estão descritas em "Protein, Structures and Molecular Principies" (Creighton, Ed. W.H. Freeman and Company, New York. (1984); "Introduction to Protein Structure (C. Branden e J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); e Thornton et al., Nature 354:105 (1991), que são aqui incluídas como referência. O termo "fragmento polipeptídico" como aqui usado refere-se a um polipéptido que possui uma deleção no extremo amina e/ou carboxilo, mas em que a restante sequência de aminoácidos é idêntica às posições correspondentes na sequência natural deduzida, por exemplo, a partir de uma sequência de DNA de tamanho completo. Os fragmentos tipicamente têm pelo menos 5, 6, 8 ou 10 aminoácidos de comprimento, de preferência pelo menos 14 aminoácidos de comprimento, mais de preferência pelo menos 20 aminoácidos de comprimento, geralmente pelo menos 50 aminoácidos de comprimento; e mesmo mais de preferência pelo menos 70 aminoácidos de comprimento. "Anticorpo" ou "péptidos de anticorpo" refere-se a um anticorpo intacto ou a um seu fragmento de ligação a antigénio que compete com o anticorpo intacto relativamente à ligação específica. Os fragmentos de ligação são produzidos por técnicas de RNA recombinante ou por clivagem enzimática ou química de anticorpos intactos. Os fragmentos 38 ΡΕ1141028 de ligação incluem Fab, Fab', F(ab')2, Fv e anticorpos de cadeias simples. Um anticorpo que não seja um anticorpo "bispecifico" ou "bifuncional" é entendido como possuindo ambos os locais de ligação idênticos. Um anticorpo inibe substancialmente a adesão de um receptor a um contra-receptor quando um excesso de anticorpo reduz a quantidade de receptor ligado ao contra-receptor em pelo menos cerca de 20%, 40%, 60% ou 80% e mais geralmente mais de 85% (conforme medido num ensaio de ligação competitivo in vitro) . O termo "epitopo" inclui qualquer determinante proteico capaz de ligação especifica a uma imunoglobulina ou receptor de células T. Os determinantes epitópicos geralmente consistem em grupos de moléculas de superfície quimicamente activas, tais como cadeias laterais de amino-ácidos ou de açúcares e, geralmente, possuem caracterís-ticas de estrutura tridimensional específicas, assim como características de carga específicas. Um anticorpo é referido como ligando-se especificamente a um antigénio quando a constante de dissociação é <1 μΜ, de preferência <100 nM e mais de preferência <10 nM. 0 termo "agente" é aqui usado para significar um composto químico, uma mistura de compostos químicos, uma macromolécula biológica ou um extracto preparado a partir de materiais biológicos.

Como aqui usado, o termo "marca" ou "marcado" 39 ΡΕ1141028 refere-se à incorporação de uma marca detectável, e.g., através da incorporação de um aminoácido marcado radioacti-vamente ou ligação a um polipéptido de grupos biotinilo que podem ser detectados por avidina marcada (e.g., estrepta-vidina contendo uma marca fluorescente ou actividade enzimática que pode ser detectada por métodos ópticos ou colorimétricos). Em determinadas situações, a marca ou marcador pode também ser terapêutico. Vários métodos de marcação de polipéptidos e glicoproteinas são conhecidos na área e podem ser usados. Exemplos de marcas para polipéptidos incluem, mas não estão limitados aos seguintes: isótopos radioactivos ou radionuclidos (e.g., 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, inIn, 125I, 131I) , marcas fluorescentes (e.g., FITC, rodamina, lantanido fosforescente) , marcas enzimáti-cas (e.g., peroxidase de rábano silvestre, β-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina), marcas quimiolumines-centes, grupos biotinilo ou epitopos polipeptidicos pré-determinados, reconhecidos por um repórter secundário (e.g., sequências de pares de fechos de leucinas, locais de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação a metais, caudas de epitopos). Nalgumas realizações, a marca é ligada por braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir potencial inibição espacial. 0 termo "agente farmacêutico ou fármaco" como aqui usado refere-se a um composto químico ou composição capaz de induzir um efeito terapêutico pretendido, quando adequadamente administrado a um doente. Outros termos de química aqui usados de acordo com a utilização convencional, conforme exemplificado pelo Dicionário de termos 40 ΡΕ1141028 químicos da McGraw-Hill (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)), aqui incluído como referência). O termo "agente antineoplásico" é aqui usado para referir agentes que possuem a propriedade funcional de inibir o desenvolvimento ou progressão de uma neoplasia num ser humano, particularmente uma lesão maligna (cancerosa), como seja um carcinoma, sarcoma, linfoma; ou leucemia. A inibição das metástases é frequentemente uma característica dos agentes antineoplásicos.

Como aqui usado, "substancialmente puro" significa que a espécie em causa é a espécie predominante presente (i.e., numa base molar é mais abundante do que qualquer outra espécie individual na composição) e, de preferência, uma fracção substancialmente purificada é uma composição em que a espécie em causa constitui pelo menos cerca de 50 por cento (numa base molar) da totalidade das espécies moleculares presentes. De um modo geral, uma composição substancialmente pura compreenderá pelo menos mais do 80 por cento da totalidade das espécies moleculares presentes, mais de preferência mais de cerca de 85%, 90%, 95% e 99%. Mais de preferência, a espécie em causa é purificada até essencialmente à homogeneidade (a espécie contaminante não pode ser detectada na composição por métodos de detecção convencionais) em que a composição consiste essencialmente numa única espécie macromolecular. O termo doente inclui seres humanos e animais. ΡΕ1141028 41

Estrutura dos anticorpos

Sabe-se que a unidade estrutural básica dos anticorpos é constituída por um tetrâmero. Cada um dos tetrâmeros é composto por dois pares idênticos de cadeias polipeptidicas, cada par tendo uma cadeia "leve" (cerca de 25 KDa) e uma cadeia "pesada" (cerca de 50-70 KDa) . A porção terminal amina de cada uma das cadeias inclui uma região variável de aproximadamente 100 a 110 ou mais aminoácidos, principal responsável pelo reconhecimento do antigénio. A porção terminal carboxilo de cada cadeia define uma região constante principal responsável pela função efectora. As cadeias leves humanas são classificadas como cadeias leves capa e lambda. As cadeias pesadas são classificadas como mu, delta, gama, alfa ou épsilon, e definem o isotipo do anticorpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. Dentro das cadeias leves e pesadas, as regiões variáveis e constantes são ligadas por uma região "J" de aproximadamente 12 ou mais aminoácidos, com as cadeias pesadas incluindo ainda uma região "D" de aproximadamente 10 ou mais aminoácidos. Ver na generalidade, "Fundamental Immunology", Ch. 7 (Paul, W., ed., and ed. Raven Press, N.Y. (1989)) (aqui incluido como referência na sua totalidade para todos os fins) . As regiões variáveis de cada par de cadeias leve/pesada formam o local de ligação ao anticorpo.

Assim, um anticorpo intacto IgG possui dois locais de ligação. Exceptuando nos anticorpos bifuncionais ou bispecificos, os dois locais de ligação são os mesmos. 42 ΡΕ1141028

As cadeias apresentam todas a mesma estrutura geral das regiões estruturais (FR) relativamente conservadas, ligadas por três tipos de regiões hipervariáveis, também designadas regiões determinantes de complementaridade ou CDRs. As CDRs das duas cadeias de cada par estão alinhadas pelas regiões estruturais, permitindo a ligação a um epitopo especifico. Do extremo N para o extremo C, as cadeias leve e pesada compreendem os domínios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. A atribuição de aminoácidos a cada um dos domínios é de acordo com as definições de Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987 e 1991)) ou Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989).

Um anticorpo bispecífico ou bifuncional é um anticorpo híbrido artificial tendo dois pares diferentes de cadeias pesada/leve e dois locais de ligação diferentes. Os anticorpos bispecíficos podem ser produzidos por uma variedade de métodos, incluindo fusão de hibridomas ou ligação dos fragmentos Fab'. Ver, e.g., Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553 (1992). Ainda, os anticorpos bispecíficos podem ser formados como "diacorpos" Holliger, P., et al. "Diabodies: Small bivalent and bispecific antibody fragments" PNAS USA 90:6444-6448 (1993)) ou "Janusinas" (Traunecker et al., "Bispecific single chain molecules (Janusins) target cytotoxic lympho- 43 ΡΕ1141028 cytes on HIV infected cells" EMBO J. 10:3655-3659 (1991); e Traunecker et al. "Janusin: New molecular design for bispecific reagents", Int. J. Câncer, Suppl. 7:51- 52(1992)). A produção de anticorpos bispecificos pode ser um processo relativamente trabalhoso comparativamente com a produção de anticorpos convencionais e os rendimentos e grau de pureza são geralmente mais baixos para os anticorpos bispecificos. Os anticorpos bispecificos não existem na forma de fragmentos tendo um único local de ligação (e.g., Fab, Fab' e Fv) .

Anticorpos humanos e humanização de anticorpos

Os anticorpos humanos evitam alguns dos problemas associados a anticorpos que possuem regiões variáveis e/ou constantes murinas ou de rato. A presença de tais proteinas derivadas de ratinho ou de rato pode conduzir à eliminação rápida dos anticorpos ou pode conduzir à geração de uma resposta imune contra o anticorpo por um doente. De forma a evitar a utilização de anticorpos derivados de ratinho ou de rato, foi postulado que se pode desenvolver anticorpos humanizados ou gerar anticorpos totalmente humanos através da introdução da função de anticorpo humano num roedor, de forma que o roedor produza anticorpos tendo sequências totalmente humanas.

Anticorpos humanos A capacidade para clonar e reconstruir loci 44 ΡΕ1141028 humanos com um tamanho da ordem da megabase em YACs e para os introduzir na linha germinal de ratinho proporciona uma abordagem poderosa para elucidar os componentes funcionais de loci muito grandes ou incompletamente mapeados, assim como a geração de modelos úteis de doença humana. Ainda, a utilização de tal tecnologia para a substituição de loci murinos pelos seus equivalente humanos pode proporcionar dados sobre a expressão e regulação dos produtos de genes humanos durante o desenvolvimento, a sua comunicação com outros sistemas e o seu envolvimento na indução e progressão de doença.

Uma aplicação prática importante de tal estratégia é a "humanização" do sistema imune humoral de ratinho. A introdução de loci de imunoglobulina (Ig) humana em ratinhos, nos quais os genes de Ig endógena foram inac-tivados, oferece a oportunidade de estudar os mecanismos subjacentes à expressão e montagem de anticorpos, assim como o seu papel no desenvolvimento de células B. Ainda, tal estratégia poderá proporcionar uma fonte ideal para a produção de anticorpos monoclonais (Mabs) totalmente humanos, um marco importante para a prometida terapia de doenças humanas com anticorpos. Espera-se que os anticorpos totalmente humanos minimizem as respostas imunogénicas e alérgicas intrínsecas aos Mabs de ratinho ou derivados destes e assim aumentem a eficácia e segurança dos anticorpos administrados. Pode-se esperar que a utilização de anticorpos totalmente humanos proporcione uma vantagem substancial no tratamento de doenças crónicas e recor- 45 ΡΕ1141028 rentes, tais como inflamação, auto-imunidade e cancro, as quais requerem administrações repetidas de anticorpos.

Uma abordagem neste sentido foi manipular estirpes de ratinhos deficientes na produção de anticorpos de ratinho com fragmentos grandes dos loci de Ig humana, esperando que tais ratinhos pudessem produzir um grande reportório de anticorpos humanos na ausência de anticorpos de ratinho. Grandes fragmentos de Ig humana conservarão a grande diversidade de genes variáveis, assim como a regulação adequada da produção e expressão dos anticorpos. Ao explorar-se a maquinaria do ratinho para diversificação e selecção de anticorpos e a ausência de tolerância imunológica às proteínas humanas, o reportório humano reproduzido nestas estirpes de ratinho deverá produzir anticorpos de elevada afinidade contra qualquer antigénio de interesse, incluindo antigénios humanos. Usando a tecnologia de hibridomas, os Mabs humanos específicos de antigénio com a especificidade pretendida poderão ser facilmente produzidos e seleccionados.

Esta estratégia geral foi demonstrada em relação à nossa geração das primeiras estirpes XenoMouse™, conforme publicado em 1994. Ver, Green et al., Nature Genetics 7:13-21 (1994). As estirpes XenoMouse™ foram manipuladas com cromossomas artificiais de levedura (YACs) contendo fragmentos com a configuração germinal de 245 Kb e 190 Kb do locus da cadeia pesada humana e do locus da cadeia leve capa, respectivamente, os quais continham 46 ΡΕ1141028 sequências centrais das regiões variável e constante. Id. Demonstrou-se que os YACs com a Ig humana são compatíveis com o sistema de ratinho relativamente ao rearranjo e expressão de anticorpos e foram capazes de substituir os genes de Ig de ratinho inactivados. Isto foi demonstrado pela sua capacidade para induzir o desenvolvimento de células B, para produzir um reportório humano tipo adulto de anticorpos totalmente humanos e para gerar os Mabs humanos específicos de antigénio. Estes resultados também sugeriram que a introdução de porções maiores do loci de Ig humana contendo maiores números de genes V, elementos reguladores adicionais e regiões constantes de Ig humana deverão recapitular substancialmente a totalidade do reportório que é característica da resposta humoral humana à infecção e imunização. 0 trabalho de Green et al. foi recentemente estendido à introdução de mais de aproxima-damente 80% do reportório de anticorpos humanos através da introdução de fragmentos YAC com a configuração germinal, com uma megabase, respectivamente do loci da cadeia pesada humana e do loci da cadeia leve capa, para produzir ratinhos XenoMouse™. Ver, Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997), Green e Jakobovits, J. Exp. Med. 188:483-495 (1998); e Pedido de Patente U.S. N° de Série 08/759620 apresentado em 3 de Dezembro, 1996, cuja descrição é aqui incluída como referência.

Tal abordagem é ainda discutida e delineada nos Pedidos de Patente U.S. Nos:07/466008, apresentado em 12 de Janeiro, 1990, 07/610515, apresentado em 8 de Novembro, 47 ΡΕ1141028 1990, 07/919297, apresentado em 24 de Julho, 1992, 07/922649, apresentado em 30 de Julho, 1992, 08/031801, apresentado em 15 de Março, 1993, 08/112848, apresentado em 27 de Agosto, 1993, 08/234145, apresentado em 28 de Abril, 1994, 08/376279, apresentado em 20 de Janeiro, 1995, 08/430938, apresentado em 5 de Junho, 1995, 08/464582, apresentado em 5 de Junho, 1995, 08/463191, apresentado em 5 de Junho, 1995, 08/462837, apresentado em 5 de Junho, 1995, 08/486853, apresentado em 5 de Junho, 1995, 08/486857, apresentado em 5 de Junho, 1995, 08/486859, apresentado em 5 de Junho, 1995, 08/462513, apresentado em 5 de Junho, 1995, 08/724752, apresentado em 2 de Outubro, 1996, e 08/759620, apresentado em 3 de Dezembro, 1996. Ver também Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997) e Green e Jakobovits, J. Exp. Med. 188:483-495 (1998). Ver igualmente a Patente Europeia N° EP 0463151 Bl, publicada em 12 de Junho, 1996, Pedido de Patente Internacional N° WO 94/02602, publicado em 3 de Fevereiro, 1994, Pedido de Patente Internacional N° WO 96/34096, publicado em 31 de Outubro, 1996 e WO 98/24893, publicado em 11 de Junho, 1998. A descrição de cada uma das patentes, pedidos de patente e referências atrás citadas são agui incluídas como referência na sua totalidade.

Numa abordagem alternativa, outros, incluindo GenPharm Internacional, Inc., utilizaram uma abordagem de "minilocus". Na abordagem de "minilocus", um locus de Ig exógeno é simulado através da inclusão de pedaços (genes individuais) do locus de Ig. Assim, um ou mais genes VH, um 48 ΡΕ1141028 ou mais genes DH, um ou mais genes JH, uma região constante mu e uma segunda região constante (de preferência uma região constante gama) são incluídos numa construção para inserção num animal. Esta abordagem está descrita na Patente U.S. N° 5545807 de Surani et al.; e Patente U.S. Nos 5545806, 5625825, 5625126, 5633425, 5661016, 5770429 e 5814318 de Lonberg e Kay, Patente U.S. N° 5591669 de Krimpenfort e Berns; Patentes US Nos 5612205, 5721367, 5789215 de Berns et al.; e Patente U.S. N° 5643763 de Choi e Dunn e GenPharm International, Pedidos de Patente U.S. N°s de Séries 07/574748, apresentado em 29 de Agosto, 1990, 07/575962, apresentado em 31 de Agosto, 1990, 07/810279, apresentado em 17 de Dezembro, 1991, 07/853408, apresentado em 18 de Março, 1992, 07/904068, apresentado em 23 de

Junho, 1992, 07/990860, apresentado em 16 de Dezembro, 1992, 08/053131, apresentado em 26 de Abril, 1993, 08/096762, apresentado em 22 de Julho, 1993, 08/155301, apresentado em 18 de Novembro, 1993, 08/161739, apresentado em 3 de Dezembro, 1993, 08/165699, apresentado em 10 de

Dezembro, 1993 e 08/209741, apresentado em 9 de Março,

1994, cujas descrições são aqui incluídas como referência. Ver também Pedido de Patente Europeia n° 0546073 Bl; e Pedido de Patente Internacional Nos. WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852 e WO 98/24884 , cujas descrições são aqui incluídas como referência na sua totalidade . Ver ainda Taylor et al., 1992; Chen et al., 1993; Tuaillon et al., 1993 ; Choi et al., 1993 ; Lonberg et al.r 1994; Taylor et al., 1994 ; Tuaillon et al., 1995; 49 ΡΕ1141028 e Fishwild et al., 1996, cujas descrições são aqui incluídas como referência na sua totalidade.

Os inventores de Surani et al., atrás referidos e afiliados no Medicai Research Counsil (o "MRC"), produziram um ratinho transgénico possuindo um locus de Ig através da utilização da abordagem "minilocus". Os inventores no trabalho da GenPharm International, citados atrás, Lonberg e Kay, retirando a precedência dos presentes inventores, propuseram a inactivação do locus endógeno da Ig de ratinho associado à duplicação substancial do trabalho de Surani et al.

Uma vantagem da abordagem de "minilocus" é a rapidez com que as construções incluindo porções do locus Ig podem ser geradas e introduzidas em animais. Come-nsuravelmente, no entanto, uma desvantagem significativa da abordagem de "minilocus" é que, em teoria, é introduzida diversidade insuficiente através da inclusão de pequenos números de genes V, D e J. De facto, o trabalho publicado parece suportar esta preocupação. 0 desenvolvimento de células B e a produção de anticorpos pelos animais produzidos através da utilização da abordagem de "minilocus" parecem atrofiados. Assim, a pesquisa à volta do presente invento tem sido consistentemente dirigida para a introdução de grandes porções do locus Ig de forma a conseguir maiores diversidades e num esforço para reconstituir o reportório imune dos animais. 50 ΡΕ1141028

As respostas humanas anti-anticorpo de ratinho (HAMA) levaram a que a indústria preparasse anticorpos quiméricos ou de outra forma humanizados. Se bem que os anticorpos quiméricos possuam uma região constante humana e uma região variável murina, espera-se que determinadas respostas anti-anticorpos quiméricos humanos (HACA) sejam observadas, particularmente em utilizações crónicas ou de múltiplas doses do anticorpo. Assim, será desejável obter anticorpos totalmente humanos contra CTLA-4 de forma a ultrapassar as preocupações e/ou efeitos da resposta HAMA ou HACA.

Tecnologias de humanização e apresentação

Como discutido atrás relativamente à geração de anticorpos humanos, existem vantagens na produção de anticorpos com imunogenicidade reduzida. Até certo ponto, isto pode ser conseguido com técnicas de humanização e técnicas de apresentação usando bibliotecas adequadas. Será óbvio que os anticorpos murinos ou os anticorpos de outras espécies podem ser humanizados ou primatizados usando técnicas conhecidas na área. Ver e.g., Winter e Harris, Immunol Today 14:43-46 (1993) e Wright et al., Crit.

Reviews in Immunol. 12:125-168 (1992). 0 anticorpo com interesse pode ser manipulado por técnicas de DNA recombinante para substituir CHI, CH2, CH3, domínios de charneira e/ou o domínio estrutural com a correspondente sequência humana (ver WO 92/02190 e Patente U.S. Nos. 5530101, 5585089, 5693792, 5714350 e 5777085). Igualmente, 51 ΡΕ1141028 a utilização do cDNA de Ig para a construção de genes quiméricos de imunoglobulina é conhecida na área (Liu et et al., P.N.A.S. 84:3439 (1987) e J. Immunol. 139:3521 (1987)). Isola-se mRNA a partir de um hibridoma ou de outra célula produtora do anticorpo e usa-se para produzir cDNA. 0 cDNA com interesse pode ser amplificado pela reacção em cadeia da polimerase usando sequências iniciadoras especificas (Pat. U.S. Nos. 4683195 e 4683202). Como alternativa, prepara-se uma biblioteca e testa-se para isolar a sequência com interesse. A sequência de DNA codificadora da região variável do anticorpo é então fundida com as sequências da região constante humana. As sequências dos genes das regiões constantes humanas podem ser encontradas em Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest", N.I.H. Publication N° 91-3242. Os genes da região C humana são facilmente acedidos a partir de clones conhecidos. A escolha do isotipo será guiada pelas funções efectoras pretendidas, como seja a fixação do complemento ou a actividade de citotoxicidade celular dependente de anticorpo. Os isotipos preferidos são IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4. Os isotipos particularmente preferidos para anticorpos do invento são IgG2 e IgG4. Podem ser usadas regiões constantes da cadeia leve humana capa ou lambda. O anticorpo quimérico humanizado é então expresso por métodos convencionais.

Fragmentos de anticorpos, tais como Fv, F(ab')2 e Fab podem ser preparados por clivagem da proteína intacta, e.g., por clivagem proteolítica ou química. Como alter- 52 ΡΕ1141028 nativa, projecta-se um gene truncado. Por exemplo, um gene quimérico codificador de uma porção do fragmento F(ab')2 incluirá sequências de DNA codificadoras do domínio CHI e da região charneira da cadeia H, seguido de um codão de paragem da tradução para originar a molécula truncada.

Numa abordagem, sequências de consenso codificadoras das regiões J das cadeias leve e pesada podem ser usadas para projectar oligonucleótidos para usar como sequências iniciadoras para introduzir locais de restrição úteis na região J para subsequente ligação dos segmentos da região V aos segmentos da região C humana. 0 cDNA da região C pode ser modificado por mutagénese dirigida para colocar um local de restrição na posição análoga da sequência humana.

Os vectores de expressão incluem plasmídeos, retrovírus, cosmídeos, YACs, episódios derivados de EBV e similares. Um vedor adequado é aquele que codifica uma sequência CH ou CL de imunoglobulina humana funcionalmente completa, com locais de restrição adequados, manipulados de forma que qualquer sequência VH ou VL possa ser facilmente inserida e expressa. Em tais vectores, o "splicing" geralmente ocorre entre o local dador de "splicing" na região J inserida e o local aceitador de "splicing" que precede a região C humana e também nas regiões de "splicing" que ocorrem dentro dos exões CH humanos. A poliadenilação e terminação de transcrição ocorrem em locais cromossómicos nativos a jusante das regiões codificadoras. 0 anticorpo 53 ΡΕ1141028 quimérico resultante pode ser ligado a qualquer promotor forte, incluindo LTRs, e.g., promotor precoce do SV40, (Okayama et al., Mol. Cell. Biol. et al., 3:280 (1983)), LTR do vírus do sarcoma de Rous (Gorman et al., P.N.A.S. 79:6777 (1982)); e LTR do vírus da leucemia murina de Moloney (Grosschedl et al., Cell 41:885 (1985)); promotores de Ig nativa, etc.

Ainda, os anticorpos humanos ou anticorpos de outras espécies podem ser gerados através de tecnologias do tipo apresentação, incluindo, sem limitação, apresentação fágica, apresentação por retrovirus, apresentação por ribossomas e outras técnicas, usando técnicas conhecidas na área e as moléculas resultantes podem ser sujeitas a maturação adicional, como seja maturação por afinidade, uma vez que tais técnicas são conhecidas na área. Wright e Harris, supra., Hanes e Plucthau, PNAS USA 94:4937-4942

(1997) (apresentação ribossómica) ; Parmley e Smith Gene 73:305-318 (1988) (apresentação fágica); Scott, TIBS 17:241-245 (1992); Cwirla et al., PNAS USA 87:6378-6382 (1990); Russel et al., Nucl. Acids Research 21:1081-1085 (1993); Hoganboom et al., Immunol. Reviews 130:43-68 (1992), Chiswell e McCafferty, TIBTECH 10:80-84 (1992); e

Patente U.S. N° 5733743. Se as tecnologias de apresentação forem utilizadas para produzir anticorpos que não sejam humanos, tais anticorpos podem ser humanizados como descrito atrás.

Usando estas técnicas, podem ser gerados anticor- 54 ΡΕ1141028 pos contra células que expressam CTLA-4, o próprio CTLA-4, formas de CTLA-4, epitopos ou péptidos dos mesmos e bibliotecas para a sua expressão (ver e.g., Patente U.S. N° 5703057) que podem ser depois testadas, como descrito atrás, relativamente às actividades descritas.

Critérios adicionais para fármacos anticorpos

Como será óbvio, não é geralmente desejável matar as células que expressam CTLA-4. Pelo contrário, geralmente deseja-se simplesmente inibir a ligação de CTLA-4 ao seu ligando para mitigar a regulação negativa de células T. Um dos principais mecanismos através dos quais os anticorpos matam células é através da fixação do complemento e participação em CDC. A região constante de um anticorpo desempenha um papel importante relativamente à capacidade do anticorpo para fixar o complemento e participar em CDC. Assim, de um modo geral selecciona-se o isotipo de um anticorpo para proporcionar ou não a capacidade de fixação do complemento. No caso do presente invento, de um modo geral, como referido atrás, geralmente não se prefere utilizar um anticorpo que mate as células. Existe uma série de isotipos de anticorpos que são capazes de fixação do complemento e CDC, incluindo, sem limite, o seguinte: IgM murino, IgG2a murino, IgG2b murino, IgG3 murino, IgM humano, IgGl humano; e IgG3 humano. Os isotipos não incluídos, sem limite, IgG2 humano e IgG4 humano.

Será óbvio que os anticorpos que são gerados 55 ΡΕ1141028 inicialmente, não necessitam de possuir um isotipo particular pretendido, mas antes, o anticorpo gerado pode possuir qualquer isotipo e o anticorpo pode mudar subsequentemente de isotipo usando técnicas convencionais que são conhecidas na área. Tais técnicas incluem a utilização de técnicas recombinantes directas (ver e.g., Patente U.S. N° 4816397), técnicas de fusão de células (ver e.g., Pedido de Patente U.S. N° 08/730639, apresentado em 11 de Outubro, 1996), entre outros.

Na técnica de fusão de células, é preparado um mieloma ou outra linha celular que possua uma cadeia pesada com qualquer isotipo pretendido e é preparado um outro mieloma ou outra linha celular que possua a cadeia leve. Tais células podem, assim, ser fundidas e pode ser isolada uma linha celular que expresse um anticorpo intacto.

Como exemplo, a maioria dos anticorpos anti-CTLA-4 aqui discutidos são anticorpos IgG2 anti-CTLA-4. Uma vez que tais anticorpos possuem a ligação pretendida à molécula de CTLA-4, qualquer um destes anticorpos pode mudar de isotipo facilmente para gerar um isotipo IgG4 humano, por exemplo, ainda que possuindo a mesma região variável (a qual define a especificidade do anticorpo e alguma da sua afinidade).

Assim, à medida que são gerados anticorpos candidatos que preenchem os atributos "estruturais" pretendidos como discutido abaixo, eles podem, de um modo geral, ser 56 ΡΕ1141028 dotados com pelo menos um atributo "funcional" adicional pretendido através da mudança de isotipo.

Projecção e geração de outros fármacos

Como discutido atrás, a função efectora dos anticorpos do invento pode ser alterada mudando de isotipo para IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE ou IgM para várias utilizações terapêuticas.

Relativamente à geração de fármacos avançados de anticorpos, em que a fixação do complemento seja um atributo desejável, pode ser possivel evitar a dependência do complemento para a morte celular através da utilização de bispecificos, imunotoxinas ou marcas radioactivas, por exemplo.

Relativamente aos anticorpos bispecificos, podem ser gerados anticorpos bispecíficos que compreendem (i) dois anticorpos, um com uma especificidade contra CTLA-4 e o outro contra uma segunda molécula que são conjugados, (ii) um anticorpo simples que possui uma cadeia especifica contra CTLA-4 e uma segunda cadeia especifica contra uma segunda molécula ou (iii) um anticorpo de cadeia simples que possui especificidade contra CTLA-4 e contra a outra molécula. Tais anticorpos bispecíficos podem ser gerados usando técnicas que são bem conhecidas, por exemplo, relativamente a (i) e (ii) ver e.g., Fanger et al., Immunol. Methods 4:72-81 (1994), e Wright e Harris, supra; e 57 ΡΕ1141028 relativamente a (iii) ver e.g., Traunecker et al., Int. J. Câncer(Suppl.) 7:51-52 (1992).

Ainda, os capacorpos ("Kappabodies") (111 et al., "Design and construction of a hybrid immunoglobulin domain with properties of both heavy and light chain variable regions", Protein Eng. 10:949-57 (1997)), os minicorpos ("Minibodies") (Martin et al., "The affinity-selection of a minibody polypeptide inhibitor of human interleukin-6", EMBO J. 13:5303-9 (1994)), os diacorpos ("Diabodies") (Holliger et al., "'Diabodies': Small bivalent and bispecific antibody fragments", PNAS USA 90:6444-6448 (1993)) ou as Janusinas (Traunecker et al., "Bispecific single chain molecules (Janusins) target cytotoxic lymphocytes on HIV infected cells", EMBO J 10:3655-3659 (1991) e Traunecker et al., "Janusin: New molecular design for bispecific reagents", Int. J. Câncer, Suppl. 7:51-52 (1992)) podem ser igualmente preparados.

Relativamente às imunotoxinas, os anticorpos podem ser modificados para actuarem como imunotoxinas utilizando técnicas bem conhecidas na área. Ver e.g., Vitetta, Immunol. Today 14:252 (1993). Ver também Patente US N° 5194594. Relativamente à preparação de anticorpos marcados radioactivamente, tais anticorpos modificados podem ser facilmente preparados usando técnicas conhecidas na área. Ver e.g., Junghans et al., in Câncer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2d edition, Chafner e Longo, eds.,

Lippincott Raven (1996)). Ver também Patentes U.S. Nos 58 ΡΕ1141028 4681581, 4735210, 5101827, 5102990 (RE35500), 5648471 e 5697902. Cada uma das imunotoxinas e moléculas marcadas radioactivamente provavelmente matará as células que expressam CTLA-4 e, particularmente, as células em que os anticorpos do invento sejam eficazes.

Administração terapêutica e formulações

Será óbvio que a administração de entidades terapêuticas de acordo com o invento seja com veiculos, excipientes e outros aqentes adequados que são incorporados nas formulações para proporcionar melhor transferência, entrega, tolerância e similares. Uma multiplicidade de formulações adequadas pode ser encontrada no formulário conhecido de todos os quimicos farmacêuticos: "Remington's Pharmaceutical Sciences" (15th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975)), particularmente o Capitulo 87 por Blaug, Seymour, ai encontrado. Estas formulações incluem, por exemplo, pós, pastas, pomadas, geleias, ceras, óleos, vesículas contendo lipidos (catiónicos ou aniónicos) (como seja Lipofectin™) , conjugados de DNA, pastas de absorção anidras, emulsões de óleo em água e emulsões de água em óleo, emulsões de "carbowax" (polietilenoglicóis de vários pesos moleculares) , géis semi-sólidos e misturas semi-sólidas contendo polietilenoglicóis. Qualquer uma das misturas anteriores pode ser adequada aos tratamentos e terapias de acordo com o presente invento, desde que o ingrediente activo na formulação não seja inactivado pela formulação e a formulação seja fisiologicamente compatível 59 ΡΕ1141028 e tolerável com a via de administração. Ver também Powell, et al. , "Compendium of excipients for parenteral formulations", PDA J. PDA J. Pharm. Sei. Technol.52:238-311 (1998) e as citações aí incluídas para informação adicional relacionada com excipientes e veículos conhecidos dos químicos farmacêuticos.

Preparação de anticorpos

Os anticorpos de acordo com o invento são, de preferência, preparados através da utilização de um ratinho transgénico que possui uma porção substancial do genoma codificador do anticorpo humano inserido mas que é deficiente na produção de anticorpos murinos endógenos. Tal ratinho será então capaz de produzir moléculas de imunoglobulina e anticorpos humanos e é deficiente na produção de moléculas e anticorpos de imunoglobulina murina. As tecnologias usadas para se conseguir o mesmo estão descritas nas patentes, pedidos de patente e referências aqui descritas na secção "Fundamento". Em particular, no entanto, uma realização preferida para a produção de ratinhos transgénicos e anticorpos pelos mesmos está descrita no Pedido de Patente U.S. N° de Série 08/759620, apresentado em 3 de Dezembro, 1996, cuja divulgação é aqui incluída como referência. Ver também Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997), a divulgação do qual é aqui incluída como referência.

Através de tal tecnologia, produzimos anticorpos 60 ΡΕ1141028 monoclonais totalmente humanos contra uma variedade de antigénios. Essencialmente, imunizámos linhas de ratinhos XenoMouse™ com o antigénio com interesse, recuperámos células linfáticas (tais como células B) dos ratinhos que expressam anticorpos, fundimos tais células recuperadas com uma linha celular tipo mielóide para preparar linhas celulares de hibridoma imortais e tais linhas celulares de hibridoma foram testadas e seleccionadas para identificar linhas celulares de hibridoma produtoras de anticorpos específicos contra o antigénio com interesse. Utilizámos estas técnicas de acordo com o presente invento para a preparação de anticorpos específicos contra CTLA-4. Aqui, descrevemos a produção de múltiplas linhas celulares de hibridoma que produzem anticorpos específicos contra CTLA-4. Ainda, proporcionamos uma caracterização dos anticorpos produzidos por tais linhas celulares, incluindo as análises das sequências de nucleótidos e de aminoácidos das cadeias pesada e leve de tais anticorpos.

Os anticorpos derivados das linhas celulares de hibridoma aqui discutidos são designados como 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.13.1, 4.14.3, 6.1.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 e 12.9.1.1. Cada um dos anticorpos produzidos pelas linhas celulares referidas são cadeias pesadas IgG2 ou IgG4 totalmente humanas com cadeias leves capa humanas. Em geral, os anticorpos de acordo com o invento possuem afinidades muito elevadas, tipicamente possuindo Kds entre cerca de 10~9 e cerca de 10-11 M, quando medidos em fase sólida ou em solução. 61 ΡΕ1141028

Como será apreciado, os anticorpos de acordo com o presente invento podem ser expressos em linhas celulares diferentes das linhas celulares de hibridoma. Sequências codificadoras dos cDNAs ou clones genómicos para anticorpos particulares podem ser usadas para transformação de uma célula hospedeira de mamífero ou não mamífero adequada. A transformação pode ser por qualquer métodos conhecido para introdução de polinucleótidos numa célula hospedeira, incluindo, por exemplo, encapsidação do polinucleótido num vírus (ou num vector virai) e transdução de uma célula hospedeira com o vírus (ou vector) ou por procedimentos de transfecção conhecidos na área, como exemplificado pela Patente U.S. Nos 4399216, 4912040, 470461 e 4959455 (cujas patentes são aqui incluídas como referência) . O procedimento de transformação usado depende do hospedeiro a ser transformado. Métodos para a introdução de polinucleótidos heterólogos em células de mamífero são conhecidos e incluem, mas não estão limitados a transfecção mediada por dextrano, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção mediada por polibreno, fusão de protoplastos, electro-poração, bombardeamento de partículas, encapsulação dos polinucleótidos em lipossomas, conjugados com péptidos, dendrímeros e microinjecção directa do DNA no núcleo.

Linhas celulares de mamífero disponíveis como hospedeiros para expressão são conhecidas na área e incluem muitas linhas celulares imortalizadas disponíveis na American Type Culture Collection (ATCC), incluindo mas não 62 ΡΕ1141028 estando limitadas a células de ovário de hamster chinês (CHO), células NSOo, células HeLa, células de rim de hamster bebé (BHK), células de rim de macaco (COS), células de carcinoma hepatocelular (e.g., Hep G2) e uma série de outras linhas celulares. Células que não sejam de mamífero, incluem mas não estão limitadas a bactérias, leveduras, células de insecto e células vegetais, podem também ser usadas para expressar anticorpos recombinantes. A muta-génese dirigida do domínio CH2 do anticorpo para eliminar glicosilação pode ser preferida para evitar alterações na imunogenicidade, farmacocinética e/ou funções efectoras resultantes de glicosilação não humana. Os métodos de expressão são seleccionados determinando qual o sistema que gera níveis de expressão mais elevados e produz anticorpos com propriedades de ligação a CTLA-4 constitutivas.

Ainda, a expressão de anticorpos do invento (ou outras porções dos mesmos) a partir de linhas celulares produtoras pode ser aumentada usando uma série de técnicas conhecidas. Por exemplo, os sistemas de expressão dos genes da sintetase de glutamina e DHFR são abordagens comuns para aumentar a expressão em determinadas condições. Clones celulares com elevada expressão podem ser identificados usando técnicas convencionais, como seja clonagem por diluição limite e tecnologia Microdrop. 0 sistema GS está discutido na sua totalidade ou em parte em associação com as Patentes Europeias Nos. 0216846, 0256055 e 0323997 e Pedido de Patente Europeia No. 89303964.4. 63 ΡΕ1141028

Os anticorpos do invento podem também ser produzidos transgenicamente através da geração de um mamífero ou planta que é transgénico relativamente às sequências das cadeias pesada e leve de imunoglobulina com interesse e produção do anticorpo numa forma recuperável a partir do mesmo. Relativamente à produção transgénica em mamíferos, os anticorpos podem ser produzidos e recuperados a partir do leite de cabras, vacas ou outros mamíferos. Ver e.g., Patentes U.S. Nos. 5827690, 5756687, 5750172 e 5741957.

Os anticorpos de acordo com o presente invento foram analisados estruturalmente e funcionalmente. Relativamente às estruturas dos anticorpos, as sequências de aminoácidos das cadeias pesada e leve capa foram previstas com base na sequência do cDNA obtido por RT-PCR dos hibri-domas. Ver Exemplos 3 e 4 e Figuras 1-8. A sequenciação N-terminal dos anticorpos foi também conduzida para confirmação dos resultados discutidos nos Exemplos 3 e 4. Ver Exemplo 5 e Figura 9. As análises cinéticas dos anticorpos foram realizadas para determinar afinidades. Ver os Exemplos 2. Ainda, os anticorpos foram analisados por focagem isoeléctrica (IEF), electroforese em gel redutor (SDS-PAGE), cromatografia de exclusão por tamanho, croma-tografia líquida/espectroscopia de massa e espectroscopia de massa e avaliada a produção de anticorpos pelos hibri-domas. Ver o Exemplo 6 e Figura 10.

Relativamente à análise funcional de anticorpos 64 ΡΕ1141028 de acordo com o presente invento, tais anticorpos provaram ser inibidores potentes de CTLA-4 e a sua ligação aos seus ligandos moléculas da familia B7. Por exemplo, demonstrou-se que os anticorpos de acordo com o presente invento bloqueiam a ligação de CTLA-4 a B7-1 ou a B7-2. Ver Exemplo 7. De facto, muitos dos anticorpos de acordo com invento possuem IC50S nanomolares e subnanomolares relativamente à inibição da ligação de CTLA-4 a B7-1 e B7-2. Ainda, os anticorpos do presente invento possuem excelente selec-tividade para CTLA-4 comparativamente com CD28, CD44, B7-2 ou hlgGl. Ver Exemplo 8. A selectividade é uma razão que reflecte o grau de ligação preferencial de uma molécula a um primeiro agente comparativamente com a ligação da molécula a uma segunda molécula e, facultativamente, outras moléculas. Aqui, a selectividade refere-se ao grau de ligação preferencial de um anticorpo do invento a CTLA-4 comparativamente com a ligação do anticorpo a outras moléculas tais como CD28, CD44, B7-2 ou hlgGl. Os valores de selectividade dos anticorpos do invento superiores a 500:1 são comuns. Também se demonstrou que os anticorpos do invento induzem ou aumentam a expressão de determinadas citocinas (tais como IL-2 e IFN-γ) por células T em cultura num modelo de blastócitos T. Ver exemplos 9 e 10 e as Figuras 12-17. Ainda, espera-se que os anticorpos do invento inibam o crescimento de tumores em modelos tumorais in vivo adequados. A projecção de tais modelos está discutida no Exemplo 11 e 12.

Os resultados demonstrados de acordo com o 65 ΡΕ1141028 presente invento indicam que os anticorpos do presente invento possuem determinadas qualidades que podem tornar os presentes anticorpos mais eficazes do que os anticorpos terapêuticos existentes contra CTLA-4.

Em particular, os anticorpos 4.1.1, 4.8-1 e 6.1.1 possuem propriedades altamente desejáveis. As suas carac-terísticas estruturais, funções ou actividades proporcionam critérios que facilitam a projecção ou selecção de anticorpos adicionais ou outras moléculas como discutido atrás. Tais critérios incluem um ou mais dos seguintes:

Capacidade para competir com a ligação a CTLA-4 com um ou mais anticorpos do invento;

Especificidade de ligação semelhante a CTLA-4 de um ou mais dos anticorpos do invento;

Uma afinidade de ligação para CTLA-4 de cerca de 10“9M ou superior e, de preferência, de cerca de 10~10M ou superior; Não reagem de forma cruzada com CTLA-4 de mamíferos inferiores, incluindo, de preferência, ratinho, rato ou coelho e, de preferência ratinho ou CTLA-4 de ratinho;

Reagem de forma cruzada com CTLA-4 de primata, incluindo, de preferência, CTLA-4 de macaco cinomolgo e de macaco-rhesus;

Uma selectividade para CTLA-4 relativamente a CD28, B7-2, CD44 ou hlgGl de pelo menos cerca de 100:1 ou 66 ΡΕ1141028 mais e, de preferência, de cerca de 300, 400 ou 500:1 ou superior,

Um IC5o no bloqueio da ligação de CTLA-4 a B7-2 de cerca de 100 nM ou menos e, de preferência, 5, 4, 3, 2, 1, 0,5 ou 0,38 nM ou inferior,

Um IC50 no bloqueio da ligação de CTLA-4 a B7-1 de cerca de 100 nM ou menos e, de preferência, 5, 4, 3, 2, 1, 0,5 ou 0,50 nM ou inferior.

Um aumento da produção de citocinas num ou mais ensaios in vitro, por exemplo:

Um aumento da produção de IL-2 num ensaio de blas- tócitos T/Raji de cerca de 500 pg/ml ou superior e, de preferência, 750, 1000, 1500, 2000, 3000 ou 3846 pg/ml ou superior;

Um aumento da produção de IFN-γ num ensaio de blastócitos T/Raji de cerca de 500 pg/ml ou superior e, de preferência, 750, 1000 ou 1233 pg/ml ou supe rior;

Um aumento da produção de IL-2, num ensaio de hPBMCs ou sangue total com super-antigénio, de cerca de 500 pg/ml ou superior e, de preferência 750, 1000, 1200 ou 511 pg/ml ou superior. De outra forma expresso, é desejável que a produção de IL-2 seja aumentada em cerca de 30, 35, 40, 45, 50 por cento ou mais relativamente ao controlo no ensaio. 67 ΡΕ1141028

Espera-se que os anticorpos (ou moléculas pro-jectadas ou sintetizadas a partir deles) possuindo uma ou mais destas propriedades tenham eficácia semelhante à dos anticorpos descritos no presente invento.

As propriedades funcionais pretendidas discutidas atrás podem muitas vezes resultar da ligação a CTLA-4 e sua inibição por uma molécula (i.e., anticorpo, fragmentos de anticorpos, péptidos ou moléculas pequenas) de forma semelhante a um anticorpo do invento (i.e. ligação ao mesmo epitopo ou a um semelhante da molécula de CTLA-4). A molécula pode ser administrada directamente (i.e., administração directa a um doente de tais moléculas) . Ou, em alternativa, a molécula pode ser "administrada" indirectamente (i.e., um péptido ou similar que produza uma resposta imune num doente (semelhante a uma vacina) em que a resposta imune inclui a geração de anticorpos que se ligam ao mesmo epitopo, a outro semelhante ou um anticorpo ou fragmento que seja produzido in situ após administração de materiais genéticos que codificam tais anticorpos ou fragmentos dos mesmos que se ligam ao mesmo epitopo ou a outro semelhante). Assim, será apreciado que o epitopo em CTLA-4 a que os anticorpos do invento se ligam pode ser útil relativamente à preparação e/ou projecção de fármacos de acordo com o invento. Na projecção de fármacos, a informação negativa é muitas vezes igualmente útil (i.e., é útil o facto de um anticorpo que se liga a CTLA-4 não parecer ligar-se a um epitopo que actua como um inibidor de 68 ΡΕ1141028 CTLA-4). Assim, o epitopo a que os anticorpos do invento se ligam que não conduz à funcionalidade pretendida pode ser igualmente útil. Assim, são igualmente contempladas de acordo com o presente invento moléculas (e particularmente anticorpos) que se ligam ao mesmo epitopo, ou a um semelhante, que os anticorpos do invento.

Para além do facto dos anticorpos do invento e dos epitopos a que se ligam serem contemplados de acordo com o invento, conduzimos alguns estudos preliminares de mapeamento de epitopos de determinados anticorpos de acordo com o invento e particularmente do anticorpo 4.1.1 e do anticorpo 11.2.1 do invento.

Como um primeiro passo, realizámos estudos de competição BIAcore para gerar um mapa grosseiro de ligação de determinados anticorpos do invento relativamente à sua capacidade para competir na ligação a CTLA-4. Com este objectivo, CTLA-4 foi ligado a um "chip" BIAcore e um primeiro anticorpo, em condições saturantes, foi ligado ao mesmo e medida a competição subsequente de anticorpos secundários que se ligam a CTLA-4. Esta técnica permitiu a geração de um mapa grosseiro no qual podem ser classificadas as famílias de anticorpos.

Através deste processo, determinámos que alguns anticorpos podiam ser classificados nas seguintes categorias epitópicas: 69 ΡΕ1141028

Categoria Anticorpos Competição na ligação a CTLA-4 A B01M* Competem cruzadamente um com o outro livremente; competem cruzadamente com a categoria B; alguma competição cruzada com a categoria D B02M* * B 4.1.1 Competem cruzadamente um com o outro livremente; competem cruzadamente com as categorias A, C e D 4.13.1 C 6.1.1 Competem cruzadamente um com o outro livremente; competem cruzadamente com as categorias B e D 3.1.1 4.8.1 11.2.1 11.6.1 11.7.1 D 4.14.3 Compete cruzadamente com as categorias C e B; alguma competição cruzada com a categoria A E 4.9.1 BNI3 bloqueia a ligação de 4.9.1 a CTLA-4 mas não se verifica o contrário BNI3*** (*) (**) Disponíveis na Biostride. (***) Disponiveis na Pharmingen.

Como passo seguinte, pretendemos determinar se os anticorpos reconheciam um epitopo linear em CTLA-4, em condições redutoras e em condições não redutoras, nas transferências Western. Observámos que um dos anticorpos 4.1.1, 3.1.1, 11.7.1, 11.6.1 ou 11.2.1 reconhecia uma forma 70 ΡΕ1141028 reduzida de CTLA-4 nas transferências Western. Assim, pareceu provável que o epitopo a que cada um destes anticorpos se ligava não era um epitopo linear mas provavelmente era um epitopo conformacional, a estrutura do qual era eliminada em condições redutoras.

Assim, projectámos determinar se poderíamos concluir sobre resíduos na molécula de CTLA-4 que fossem importantes para a ligação dos anticorpos do invento. Uma forma que utilizámos foi conduzir análises de cinética de velocidade de dissociação por exemplo entre CTLA-4 humana e duas moléculas altamente conservadas de CTLA-4 de primatas (CTLA-4 de macaco cinomolgo e de saguim). Os estudos de BIAcore demonstraram que o anticorpo 4.1.1 se ligava com a mesma velocidade a CTLA-4 humana, de macaco cinomolgo e de saguim. No entanto, relativamente às velocidades de dissociação (afinidade), o anticorpo 4.1.1 tinha a afinidade mais elevada (velocidade de dissociação mais baixa) para CTLA-4 humana, um maior velocidade de dissociação para CTLA-4 de macaco cinomolgo e uma velocidade de dissociação muito mais rápida para a de saguim. O anticorpo 11.2.1 do invento, por outro lado, liga-se a CTLA-4 humana, cinomolga e de saguim com aproximadamente a mesma velocidade e possui aproximadamente a mesma velocidade de dissociação relativa para cada um dos três. Esta informação indica ainda que os anticorpos 4.1.1 e 11.2.1 se ligam a diferentes epitopos em CTLA-4. 71 ΡΕ1141028

Para estudar mais detalhadamente o epitopo a que os anticorpos das categorias B e C do invento se ligam, realizámos estudos de mutagénese dirigida. CTLA-4 de saguim possui duas alterações importantes nos resíduos 105 e 106 relativamente a CTLA-4 humano. Tais diferenças são uma mudança de leucina para metionina no residuo 105 e de glicina para serina no residuo 106. Assim, alterámos o cDNA codificador de CTLA-4 humana para codificar uma CTLA-4 mutada tendo as alterações L105M e G106S. A CTLA-4 mutante com a substituição homóloga não afectou a ligação de uma proteina de fusão B7.2-IgGl. Ainda, a ligação com o anticorpo 11.2.1 do invento não foi afectada. No entanto, tal molécula foi significativamente inibida na sua capacidade para se ligar ao anticorpo 4.1.1 (semelhante à de saguim). Em seguida, alterámos um cDNA codificador de CTLA-4 de saguim para criar um CTLA-4 mutante de saguim tendo uma carga S106G. Tal alteração resultou na restauração de ligação estável entre o anticorpo 4.1.1 e o mutante de CTLA-4 de saguim. Ainda, alterámos um cDNA codificador de CTLA-4 de saguim para criar uma CTLA-4 de saguim mutante tendo uma carga M105L. Tal alteração restaurou parcialmente a ligação entre o anticorpo 4.1.1 e o CTLA-4 mutante.

Cada um dos anticorpos das categorias B a D do invento parecem possuir propriedades funcionais semelhantes e parecem possuir o potencial para actuarem como fortes agentes terapêuticos anti-CTLA-4. Ainda, cada uma das moléculas apresentou alguma competição cruzada na sua 72 ΡΕ1141028 ligação a CTLA-4. No entanto, como será observado a partir da discussão atrás, cada uma das moléculas nas diferentes categorias parece ligar-se a epitopos conformacionais separados em CTLA-4.

Do que foi referido, será óbvio que a informação sobre epitopos atrás discutida indica que os anticorpos (ou outras moléculas, como discutido atrás) que competem de forma cruzada com anticorpos do invento terão provavelmente determinado potencial terapêutico de acordo com o presente invento. Ainda, espera-se que os anticorpos (ou outras moléculas, como discutido atrás) que reagem cruzadamente com anticorpos do invento (i.e., competem de forma cruzada com os anticorpos das categorias B, C e/ou D) tenham algum potencial terapêutico adicional de acordo com o presente invento. Ainda, espera-se que os anticorpos (ou outras moléculas, como discutido atrás) que reagem cruzadamente com anticorpos do invento (i.e., competem de forma cruzada com os anticorpos das categorias B, C e/ou D) e que (i) não têm diminuída a sua ligação a CTLA-4 de saguim (semelhante ao anticorpo 11.2.1) ou (ii) têm diminuída a sua capacidade de ligação a CTLA-4 de saguim (semelhante ao anticorpo 4.1.1) terão certamente algum potencial terapêutico adicional de acordo com o presente invento. Os anticorpos (ou outras moléculas, como discutido atrás) que competem com as categorias A e E podem também possuir algum potencial terapêutico. 73 ΡΕ1141028

EXEMPLOS

Os exemplos que se seguem, incluindo as experiências realizadas e os resultados conseguidos são apresentados com fins ilustrativos e não pretendem ser limitantes do presente invento. EXEMPLO 1

Geração de hibridomas produtores de anticorpos anti-CTLA-4

Anticorpos do invento foram preparados, selec-cionados e testados de acordo com o presente Exemplo.

Preparação de antlqénio: Três imunogénios diferentes foram preparados para imunização de ratinhos XenoMouse™: (i) uma proteína de fusão CTLA-4-IgG, (ii) um péptido CTLA-4 e (iii) células de linfoma murino 300.19 transfectadas com um mutante de CTLA-4 (Y201V) que é expresso constitutivamente na superfície celular. (i) Proteína de fusão CTLA-4-IgGl:

Construção do vector de expressão: O cDNA codifiador dos domínios extracelulares maduros de CTLA-4 foi amplificado por PCR a partir de uma biblioteca de cDNA de timo humano (Clontech), usando 74 ΡΕ1141028 sequências iniciadoras projectadas de acordo com a sequência publicada (Eur. J. Immunol. 18:1901-1905 (1988)). 0 fragmento foi direccionalmente subclonado em pSR5, um plasmideo de expressão do virus Sindbis (InVitrogen), entre o péptido sinal da oncostatina M humana e os dominios CH1/CH2/CH3 de IgG gama 1 (IgGl) humana. A proteina de fusão não possui um domínio de charneira mas possui uma cisterna 120 no domínio extracelular de CTLA-4 para formar um dímero covalente. 0 vector resultante foi designado CTLA-4-IgGl/pSR5. O cDNA completo de CTLA-4-IgGl no vector foi confirmado por sequenciação em ambas as cadeias. A sequência de aminoácidos da proteína CTLA-4-IgGl está apresentada abaixo. O domínio extracelular maduro de CD44 foi amplificado por PCR a partir de uma biblioteca de linfócitos humanos (Clontech) e subclonado em pSinRep5 para gerar uma proteína controlo com uma cauda de IgGl idêntica.

Proteína de fusão OM-CTLA-4-IgGl:

Sublinhado: péptido sinal

Negrito: domínio extracelular de CTLA-4 75 ΡΕ1141028

Os cDNAs para o domínio extracelular maduro de CD28 foram amplificados por PCR a partir da biblioteca de linfócitos humanos (Clontech) e depois subclonados em pCDM8 (J. Immunol. 151:5261-71 (1993)) para produzir uma proteína de fusão IgGl humana contendo regiões de hidrólise pela trombina e de charneira. CTLA-4 de saguim, de macaco cino-molgo e de macaco-rhesus foram clonados a partir do mRNA isolado de PBMCs estimulados com PHA usando técnicas convencionais de PCR degenerado. A sequenciação demonstrou que as sequências de aminoácidos de macaco-rhesus e macaco cinomolgo eram idênticas, com três diferenças relativamente ao domínio extracelular de CTLA-4 humana madura (S13N, 117T e L105M). CTLA-4 de saguim demonstrou dez diferenças nos aminoácidos relativamente ao domínio extracelular de CTLA-4 humana madura (V21A, V33I, A41T, A51G, 541, S71F, Q75K, T88M, L105M e G106S). A mutagénese dirigida foi usada para fazer mutações pontuais de todos os aminoácidos diferentes em CTLA-4 de saguim para mapear os aminoácidos importantes para a interacção dos anticorpos com CTLA-4-IgG humana. As mutações de CTLA-4-IgG humana para mapeamento de epitopos foram geradas por mutagénese dirigida Matchmaker (Promega). As proteínas de fusão com IgG foram produzidas por trans-fecção transitória de células C0S7 e purificadas usando técnicas convencionais com Proteína A. As proteínas mutantes CTLA-4-IgG foram avaliadas relativamente à ligação a anticorpos por imunotransferência e usando análises BIAcore. ΡΕ1141028 76

Expressão/purificação de proteínas recombinantes: Vírus Sindbis recombinantes foram gerados por electroporação (Gibco) de células de rim de hamster bebé com mRNA de CTLA-4-IgGl/pSR5 e mRNA de DH-26S auxiliar transcrito in vitro com SP6, como descrito por InVitrogen. Quarenta e oito horas mais tarde, colheu-se o vírus recombinante e titulou-se relativamente à expressão óptima de proteína em células de ovário de hamster chinês (CHO-Kl) . As células CH0-K1 foram cultivadas em suspensão em DMEM/F12 (Gibco) contendo 10% de soro fetal bovino inactivado pelo calor (Gibco), aminoácidos não essenciais (Gibco), glutamina 4 mM (Gibco), penicilina/estreptomicina (Gibco), HEPES 10 mM pH 7.5 (Gibco). Para produzir CTLA4-IgG, as células CHO-K1 foram suspensas a 1 x 107 células/ml em DMEM/F12 e incubadas com o vírus Sindbis durante uma hora à temperatura ambiente. As células foram então diluídas para 1 x 106/ml em DMEM/F12 contendo 1% de soro fetal bovino ao qual foi retirada a IgG bovina com Proteína A Sepharose (Pharmacia), aminoácidos não essneciais, glutamina 4 mM, HEPES 12,5 mM, pH 7,5 e penicilina/estreptomicina. Quarenta e oito horas pós-infecção, as células foram sedimentadas e o meio condicionado foi colhido e suplementado com comprimidos de inibidores de proteases (Boehringer, Mannheim), o pH ajustado a 7,5 e filtrado através de 0,2 μ (Nalgene). FPLC (Pharmacia) foi usada para purificar por afinidade a proteína de fusão usando uma coluna HiTrap de 5 ml de Proteína A (Pharmacia) a um fluxo de 10 ml/min. A coluna foi lavada com 30 volumes de PBS e 77 ΡΕ1141028 eluída com glicina/HCl 0,1M, pH 2,8 a lml/min. As fracções (1 ml) foram imediatamente neutralizadas a pH 7,5 com Tris, pH 9. As fracções contendo CTLA-4-IgGl foram identificadas por SDS-PAGE e depois concentradas usando Centriplus 50 (Amicon) antes da aplicação numa coluna de Sepharose 200 (Pharmacia) a 1 ml/min, usando PBS como solvente. As fracções contendo CTLA-4-IgGl foram reunidas, esterilizadas por filtração através de 0,2 μ (Millipore) , distribuídas e congeladas a -80°C. CD44-IgGl foi expressa e purificada usando os mesmos métodos. CD28-IgG foi purificada a partir do meio condicionado de células COS transitoriamente transfectadas.

Caracterização de CTLA-4-IgGl: A CTLA-4-IgGl migrou como uma banda única em SDS-PAGE usando uma coloração com Coomassie coloidal (Novex). Em condições não redutoras, CTLA-4-IgGl era um dimero (100 KDa) , que se reduziu a um monómero de 50 KDa quando tratado com DTT 50 mM. A sequenciação de aminoácidos da CTLA-4-IgGl purificado em solução confirmou o extremo N de CTLA-4 (MHVAQPAVVLAS), e que o péptido sinal de oncostatina-M foi clivado da proteína de fusão madura. A CTLA-4-IgGl ligou-se a (B7-l-IgG) imobilizada numa forma dependente de concentração e a ligação foi bloqueada por um anticorpo de hamster anti-anticorpo humano anti-CTLA-4 (BNI3: Pharmigen). A CTLA-4-IgG estéril não tinha endotoxinas e foi quantificada por DO280 usando 1,4 78 ΡΕ1141028 como coeficiente de extinção. O rendimento de CTLA-4-IgG estéril purificada variou entre 0,5-3mg/litro de células CH0-K1. (ii) Péptido CTLA-4:

Preparou-se o péptido CTLA-4 que se segue como descrito abaixo:

NH^MHVAQPAWLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVT evcaatymmgneltflddsictgtssgnqvní^qglramdtglyick. ^LMYPPPYYLGIGNGTQIYVIPPEPC-C0NH2

Abreviaturas/Materiais NMP, N-metilpirrolidona; TFE, 2,2,2-trifluoro-etanol; DCM, diclorometano; FMOC, fluorecnilmetoxicarbo-nilo. Todos os reagentes foram fornecidos pela Perkin Elmer, com as seguintes excepções: TFE, Aldrich Chemical. Resina FMOC-PAL-PEG, Perspective Biosystems. Fmoc-Arg(PMC)-OH, FMOC-Asn(Trt)-OH, FMOC-Asp(tBu)-OH, FMOC-Cys(Trt)-OH, FMOC-Glu(tBu)-OH, FMOC-Gln(Trt)-OH, FMOC-His(Boc)-OH, FMOC-Lis (BOC)-OH, FMOC-Ser(tBu)-OH, FMOC-Thr(tBu)-OH e FMOC-Tyr(tBu)-OH foram usados para os aminoácidos que necessitaram de grupos protectores das cadeias laterais. Síntese de péptidos: A síntese de pétidos foi realizada num Perkin- 79 ΡΕ1141028

Elmer 431a, retroajustado com monitorização de retorno via absorvância de UV a 301 nm (detector Perkin-Elmer Modelo 759a). A sequência peptidica foi montada numa resina FMOC-PAL-PEG usando ciclos de acoplagem dupla condicionada. As acoplagens duplas forçadas foram efectuadas nos ciclos 10, 11, 18, 19, 20 e 28 a 33. A resina foi lavada com uma mistura de 50% de DCM e TFE no final de cada ciclo de acilação , seguido de protecção dos grupos amina que não reagiram com anidrido acético em NMP. A resina foi removida do reactor após completado o ciclo 49 e o restante continuou até terminada a clivagem do péptido da resina, realizada usando o Reagente K (King et al., International Journal of protein and Peptide Research 36:255-266 (1990)) durante 6 horas em 415 mg de resina, dando origem a 186 mg de péptido CTLA-4 bruto.

Caracterização do péptido:

Aliquotas de 25 mg do péptido CTLA-4 bruto foram dissolvidas em 5 ml de guanidina-HCl 6 M/K2PO3 100 mM a pH 6,4 e eluidas através de uma coluna Pharmacia HiLoad Superdex 75 16/60 (16 mm x 600 mm, 120 ml de volume) com guanidina-HCl 2M/ K2PO3 100 mM a pH 6,4 a ml/min durante 180 minutos, colhendo fracções de 5 ml. As fracções foram analisadas através da aplicação de 1,7 μΐ das fracções num gel de Laemmli NuPAGE que correu com o tampão de corrida MES e visualização via protocolo de coloração com prata Daichii. As fracções que apresentaram um peso molecular de 12 KDa, conforme avaliado em função dos padrões de peso 80 ΡΕ1141028 molecular, foram reunidas e guardadas a 4°C. As fracçoes combinadas foram analisadas por UV e electroforese em gel. A sequenciação de aminoácidos foi realizada por absorção de uma amostra de 100 microlitros numa cassete ProSorb (absorvida numa membrana PVDF) e lavagem para remover os sais do tampão. A sequenciação foi realizada num sequen-ciador Applied Biosystems 420. Foi observada a sequência N-terminal esperada (MHVAQPAVVLA). A imunotransferência demonstrou que o péptido era reconhecido por BNI3 anti-CTLA-4 humano (Pharmingen). Para remover o sal, uma alíquo-ta contendo 648 μρ de material foi colocada em tubo de diálise MWCO 3500 Da e dialisado contra 0,1% TFA/H20, a 4°C, durante 9 dias com agitação. O conteúdo total do saco de diálise foi liofilizado para se obter um pó. (iii) Células 300.19 transfectadas com CTLA-4 (Y201V) O cDNA de CTLA-4 de tamanho completo foi amplificado por PCR a partir de uma biblioteca de cDNA de timo humano (Stratagene) e subclonado em pIRESneo (Clontech). Uma mutação de CTLA-4, que resulta na expressão constituiva de CTLA-4 na superfície celular, foi introduzida com o MatchMaker Mutagenesis System (Promega). A mutação de tirosina, Y201, para valina inibe a ligação da proteína Adaptina, AP50, que é responsável pela internalização rápida de CTLA-4 (Chuag et al., J. Immunol. 159:144-151 (1997)). Células de linfoma murino 300.19 sem micoplasmas foram cultivadas em RPMI-1640 10% de soro fetal de vitela, 81 ΡΕ1141028 aminoácidos não essenciais; penicilina/estreptomicina, glutamina 2 mM, HEPES 12,5 mM e beta-mercaptoetanol 25μΜ. As células foram electroporadas (3 x 106/0,4 ml de RPMI sem soro) numa câmara de 1 ml com 20 μρ de CTLA-4-Y201V/ pIRESneo usando 200ν/118μΕ (Gibco CellPorator). As células foram mantidas em repouso durante 10 minutos e depois adicionou-se 8 ml de meio RPMI completo pré-aquecido. Às 48 horas, as células foram diluídas para 0,5 x 106/ml em meio RPMI completo contendo 1 mg/ml de G418 (Gibco). As células resistentes foram expandidas e mostraram expressar CTLA-4 na superfície celular usando o anticorpo BNI3 conjugado com ficoeritrina (Pharmingen). Células com elevado nível de expressão foram isoladas por separação asséptica.

Imunização e geração de hibridomas: Ratinhos XenoMouse™ (8 a 10 semanas de idade) foram imunizados (i) subcutaneamente na base da cauda com 1 x 107 células 300.19 que foram transfectadas para expressarem CTLA-4 como descrito atrás, ressuspensas em soro fisológico tamponado com fosfatos (PBS) com adjuvante completo de Freund ou (ii) subcutaneamente na base da cauda com (a) 10 μρ da proteína de fusão CTLA-4 ou (b) 10 μρ do péptido CTLA-4, emulsionado com adjuvante completo de Freund. Em cada um dos casos, a dose foi repetida três a quatro vezes em adjuvante incompleto de Freund. Quatro dias antes da fusão, os ratinhos receberam uma injecção final de imunogénio ou células em PBS. Os linfócitos do baço e/ou nódulos linfáticos dos ratinhos imunizados foram fundidos com a linha celular P3 de mieloma murino não secretória e foram sujeitos a 82 ΡΕ1141028 selecção com HAT como anteriormente descrito (Galfre, G e Milstein, C., "Preparation of monoclonal antibodies: stra-tegies and procedures", Methods Enzymol. 73:3-46 (1981)). Foi recuperado um painel grande de hibridomas todos secretores de anticorpos humanos IgG2K ou IgG4K específicos de CTLA-4 (conforme detectado abaixo).

Ensaio de ELISA: ELISA para a determinação de anticorpos específicos de antigénio em soro de ratinho e em sobrenadantes de hibridoma foi realizado como descrito (Coligan et al., "Enzume-linked immunosorbent assays" em "Current Protocols in immunology (1994)) usando a proteína de fusão CTLA-4-Ig para a captura dos anticorpos. Para animais que foram imunizados com a proteína de fusão CTLA-4-Ig, testámos ainda a reactividade não específica contra a porção de Ig humana da proteína de fusão. Isto foi conseguido usando placas de ELISA revestidas com IgGl humano como um controlo negativo para a especificidade.

Num ensaio de ELISA preferido, foram usadas as seguintes técnicas:

As placas de ELISA foram revestidas com 100 μΐ/alvéolo do antigénio no tampão de revestimento da placa (tampão carbonato 0,1M, pH 9,6 e NaHC03 (PM 84), 8,4 g/1. As placas foram então incubadas a 4°C durante a noite. Após incubação, o tampão de revestimento foi removido e as placas bloqueadas com 200 μΐ/alvéolo de tampão de bloqueio 83 ΡΕ1141028 (0,5% BSA, Tween-20, 0,01% Thimerosal em PBS IX) e incubadas à temperatura ambiente durante 1 hora. Como alternativa, as placas foram guardadas no frigorifico com tampão de bloqueio e selante de placas. O tampão de bloqueio foi removido e adicionado 50 μΐ/alvéolo de sobrenadante de hibridoma, soro ou outro sobrenadante de hibridoma (controlo positivo) e meio HAT ou tampão de bloqueio (controlo negativo). As placas foram incubadas à temperatura ambiente durante 2 horas. Após incubação, as placas foram lavadas com tampão de lavagem (IX PBS). O anticorpo detector (i.e., anticorpo de ratinho anti-IgG2 humana-HRP (SB, #9070-05) para anticorpos IgG2 ou anticorpos de ratinho anti-IgG4 humana-HRP (SB #9200-05) para anticorpos IgG4) foi adicionado a 100 μΐ/alvéolo (anticorpos de ratinho anti-IgG2 humana-HRP 1:2000 ou anticorpos de ratinho anti-IgG4 humana-HRP 1:1000 (cada um deles em tampão de bloqueio)). As placas foram incubadas à temperatura ambiente durante 1 hora e depois lavadas com tampão de lavagem. Subsequentemente, foram adicionados aos alvéolos 100 μΐ/alvéolo de solução de revelação preparada de fresco (10 ml de tampão substrato, 5 mg de OPD (o-fenilenodiamina; Sigma, Cat. N° P-7288) e 10 μΐ de H2O2 a 30% (Sigma). As placas foram deixadas a revelar 10-20 minutos, até os alvéolos do controlo negativo começarem a mostrar cor. Em seguida, adicionou-se 100 μΐ/alvéolo de solução de paragem (H2S04 2M) e as placas foram lidas num leitor de placas de ELISA num comprimento de onda de 490 nm. 84 ΡΕ1141028

Determinação das constantes de afinidade de Mabs totalmente humanos por BIAcore: A medição da afinidade dos anticorpos monoclonais purificados, fragmentos Fab ou sobrenadantes de hibridoma por ressonância de plasmões foi realizada com o instrumento BIAcore 2000, usando procedimentos gerais descritos pelo fabricante. A análise cinética dos anticorpos foi realizada com antigénios imobilizados na superfície do sensor numa densidade baixa. Três superfícies do "chip" sensor da BIAcore foram imobilizadas com a proteína de fusão CTLA-4-Ig numa densidade que varia entre aproximadamente 390-900 com a proteína de fusão CTLA-4-Ig em 20 ou 50 μρ/ιηΐ em acetato de sódio 10 mM a pH 5,0 usando o kit de acoplagem de aminas fornecido pelo fabricante (BIAcore, Inc.) . A quarta superfície do "chip" sensor BIAcore foi imobilizada com IgGl (900 RU) e foi usada como superfície de controlo negativo para a ligação não específica. A análise cinética foi realizada num fluxo de 25 ou 50 microlitros por minuto e as velocidades de dissociação (Kd ou K0ff) e associação (Ka ou Kon) foram determinadas usando o programa fornecido pelo fabricante (BLA evaluation 3.0) que permite cálculos globais. EXEMPLO 2

Medição de afinidade de anticorpos anti-CTLA-4 85 ΡΕ1141028

Na Tabela que se segue, estão apresentadas as medições de afinidade para alguns anticorpos seleccionados desta forma: TABELA 1

Fase Sólida i por BIAcore) Hibridoma Veloc. assoe Veloc. dissoc Constante Assoe. Constante Dissoc. Densidade Su- K. (W1^1 xlO6) ig (M^xlO6) KA(l/to)^/Kícl0“ KA(1/M) =fqJ/E^cl(rU) perfícde [KJ] MoábOl 0,68 1,01 0,67 1,48 878,7 0,70 4, 66 0,15 6,68 504,5 0,77 6,49 0,19 8,41 457,2 0,60 3,08 0,20 5,11 397,8 4.1.1 1,85 0,72 2,58 0,39 878,7 1,88 1,21 1,55 0,64 504,5 1,73 1,54 1,13 0,88 457,2 1,86 1,47 1,26 0,79 397,8 4.8.1 0,32 0,07 4,46 0,22 878,7 0,31 0,23 1,33 0,75 504,5 0,28 0,06 4,82 0,21 397,8 4.14.3 2,81 3,04 0,92 1,08 878,7 2,88 3,97 0,73 1,38 504,5 2,84 6, 66 0,43 2,35 457,2 3,17 5,03 0,63 1,58 397,8 6.1.1 0,43 0,35 1,21 0,83 878,7 0,46 0,90 0,51 1,98 504,5 0,31 0,51 0,61 1,63 457,2 0,45 0,79 0,57 1,76 397,8 3.1.1 1,04 0,96 1,07 0,93 878,7 0,95 1,72 0,55 1,82 504,5 0,73 1,65 0,44 2,27 457,2 0,91 2,07 0,44 2,28 397,8 4.9.1 1,55 13,80 0,11 8,94 878,7 86 ΡΕ1141028 (continuação)

Fase Sólida (por BIAcore) Hibridcma \feloc. assoe Veloc. dissoc Constante Assoe. Constante Dissoc. Densidade Su- ις (M^s-1 xio6) Kd (M^S-1 xlO6) KA(l/ty =^/1^010 KA (1/M) =Kd/Kaxl0-1D perfície [KU] 1,43 19,00 0,08 13,20 504,5 1,35 20,50 0,07 15,20 397,8 4.10.2 1,00 2,53 0,39 2,54 878,7 0,94 4,30 0,22 4,55 504,5 0,70 5, 05 0,14 7,21 457,2 1,00 5,24 0,19 5,25 397,8 2.1.3 1,24 9,59 0,13 7,72 878,7 1,17 13,10 0,09 11,20 504,5 \—1 \—1 \—1 13,00 0,09 11,70 397,8 4.13.1 1,22 5,83 0,21 4,78 878,7 1,29 6, 65 0,19 5,17 504,5 1,23 7,25 0,17 5,88 397,8 anticorpos preparados de elevadas afinidades e

Como será observado, os acordo com o invento possuem constantes de ligação. EXEMPLO 3

Estruturas de anticorpos anti-CTLA-4 preparados de acordo com o invento

Na discussão que se segue, é proporcionada informação estrutural relacionada com anticorpos preparados de acordo com o invento.

De forma a analisar estruturas de anticorpos produzidos de acordo com o invento, clonámos genes codi- 87 ΡΕ1141028 ficadores de fragmentos das cadeias pesada e leve do hibridoma particular. A clonagem e sequenciação dos genes foram conseguidas como se segue: mRNA poli (A) + foi isolado, com um kit Fast-Track (Invitrogen), a partir de aproximadamente 2 x 105 células de hibridoma derivadas de XenoMouse imunizados. A geração de cDNA sintetizado com sequências iniciadoras ao acaso foi seguida de PCR. Sequências iniciadoras da região variável especificas da família VH humana ou Vk humana (Marks et al., "Oligonucleotide primers for polymerase chain reaction amplification of humana immunoglobulin variable genes and design of family-specific oligonucleotides probes", Eur. J. Immunol. 21:985-991 (1991)) ou uma sequência iniciadora universal para VH humana, (CAGGTGCAGCTGGAGCAGTCIGG) foram usadas conjuntamente com sequências iniciadoras específicas para a região constante Cy2 humana (MG-40d; 5'-GCTGAGGGAGTAGAGTCCTGAGGA-3') ou para a região constante Ck (hKP2; como anteriormente descrito em Green et al., 1994). Sequências de transcritos das cadeias pesada e capa derivadas de Mabs humanos derivados de hibridomas foram obtidos por sequenciação directa dos produtos de PCR gerados a partir de RNA poli(A+) usando as sequências iniciadoras descritas atrás. Produtos de PCR foram igualmente clonados em pCRII usando um kit de clonagem TA (Invitrogen) e ambas as cadeias foram sequenciadas usando kits de sequenciação "Prism dye-terminator" e um sequenciador ABI 377. Todas as sequências foram analisadas ΡΕ1141028 por alinhamento com ο "V BASE sequence directory" (Tomlinson et al., MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK) usando os programas informáticos MacVector e Geneworks.

Ainda, cada um dos anticorpos 4.1.1, 4.8.1, 11.2.1 e 6.1.1 foram sujeitos a sequenciação do DNA de tamanho completo. Para tal sequenciação, mRNA poli(A+) foi isolado a partir de aproximadamente 4 x 106 células de hibridoma usando o kit mRNA Direct (Dynal) . 0 RNA foi sujeito a transcrição reversa usando oligo-dT(18) e o kit Advantage RT/PCR (Clonetech). A base de dados para a região variável (V Base) foi usada para projectar as sequências iniciadoras de amplificação começando no codão de iniciação ATG do gene DP50 da cadeia pesada (5'-TATCTAAGCTCTAGAC-TCGACCGCCACCATGGAGTTTGGGCTGAGC TG-3'). Uma sequência Kozak óptima (ACCGCCACC) foi adicionada 5' relativamente ao codão de iniciação ATG. 0 mesmo método foi usado para projectar uma sequência iniciadora para o local do codão de iniciação do gene 27 da cadeia capa (5'-TCTTCAAGCTTGCCCGGGCCCG-CCACCATGGAAACCCCAGCGCAG-3') e o codão de paragem da região constante capa (5'-TTCTTTGATCAGAATTCTCACTAACACTCTCCCCTGT-TGAAGC-3'). 0 cDNA 012 foi clonado usando uma sequência iniciadora para o local de iniciação ATG (5'-TCTTCAAGCTT-GCCCGGGCCCGCCACCATGGACATGAGGGTCCCCGC T-3') e a sequência iniciadora do codão de paragem da região constante capa atrás. Os cDNAs da cadeia pesada foram igualmente clonados como construções genómicas por mutagénese dirigida para adicionar um local Nhel no extremo do dominio J variável e 89 ΡΕ1141028 subclonagem de um fragmento Nhel contendo as regiões genómicas CHI/charneira/CH2/CH3 de IgG2. A mutação pontual para gerar o local Nhel não altera a sequência de aminoácidos germinal. Os pares de sequências iniciadoras foram usados para amplificar os cDNAs usando o kit Advantage High Fidelity PCR (Clonetech). Foi obtida a sequência do produto de PCR usando os kits de sequenciação com terminadores corados e um sequenciador ABI. 0 produto de PCR foi clonado nos vectores de expressão da sintetase de glutamina pEE (Lonza) e três clones foram sequenciados para confirmar mutações somáticas. Para cada um dos clones, a sequência foi verificada em ambas as cadeias em pelo menos três reacções. Um anticorpo aglicosilado 4.1.1 foi gerado por mutagénese dirigida de N294Q no domínio CH2. Os anticorpos recombinantes foram produzidos por transfecção transitória de células Cos7 em FCS a que foi removida IgG e purificados usando técnicas convencionais de Proteína A Sepharose. Transfectantes estáveis foram gerados por electroporação de células NSO murinas e selecção no meio sem glutamina. 4.1.1 recombinante com ou sem glicosilação apresentou especificidade e afinidade idênticas para CTLA-4 nos ensaios in vitro ELISA e BIAcore.

Análise da utilização de genes A Tabela que se segue descreve a utilização de genes evidenciada pelos clones de hibridoma seleccionados dos anticorpos de acordo com o invento: 90 ΡΕ1141028

TABELA II

Utilização de genes das cadeias pesada e leve Clone Cadeia pesada Cadeia leve capa VH D JH VK JK \—1 \—1 ^J1 DP-50 DIR4 ou DIR3 JH4 A27 JK1 4.8.1 DP-50 7-27 JH4 A27 JK4 4.14.3 DP-50 7-27 JH4 A27 JK4 JK3 6.1.1 DP-50 DIR5 ou DIR5rc JH4 A27 JK3 3.1.1. DP-50 3-3 JH6 012 JK3 4.10.2 DP-50 7-27 JH4 A27 JK3 2.1.3 DP-65 1-26 JH6 A10/A26 JK4 4.13.1 DP-50 7-27 JH4 A27 JK3 11.2.1 DP-50 Dl-26 JH6 012 JK3 11.6.1 DP-50 D2-2 ou D4 JH6 012 JK3 11.7.1 DP-50 D3-22 ou D21-9 JH4 012 JK3 12.3.1.1 DP-50 D3-3 ou DXP4 JH6 AI 7 JK1 12.9.1.1 DP-50 D6-19 JH4 A3/A19 JK4 4.9.1 DP-47 5-24 e/ou 6-19 JH4 L5 JK1

Como será observado, foram gerados anticorpos com um forte enviesamento no sentido da utilização da região variável da cadeia pesada DP-50. O gene DP-50 é também referido como um gene da familia VH3-33. Apenas um anticorpo que foi seleccionado com base na ligação de CTLA-4 e os ensaios funcionais in vitro preliminares mostrou uma utilização do gene da cadeia pesada diferente de DP-50. Aquele clone, 2.1.3, utiliza uma região variável da cadeia pesada DP-65 e é do isotipo IgG4. O gene DP-65 é igualmente referido como um gene da familia Vh4-31. Por outro lado, o clone 4.9.1, que possui uma região variável da cadeia 91 ΡΕ1141028 pesada DP-47 liga-se a CTLA-4 mas não inibe a ligação a B7-1 ou a B7-2. Nos ratinhos XenoMouse, existem mais de 30 genes variáveis da cadeia pesada diferentes e funcionais com os quais podem ser gerados anticorpos. Assim, o enviesamento é indicativo de um motivo de ligação preferido da interacção anticorpo-antigénio relativamente às propriedades combinadas de ligação ao antigénio e actividade funcional.

Análise de mutações

Como será apreciado, a análise de utilização de genes proporciona apenas uma visão limitada da estrutura do anticorpo. Uma vez que as células B em animais XenoMouse estocasticamente geram transcritos da cadeia pesada V-D-J ou leve capa V-J, existe uma série de processos secundários que ocorrem, incluindo, sem limitações, hipermutações somáticas, adições e extensões CDR3. Ver, por exemplo, Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997) e Pedido de Patente U.S. N° de Série 08/759620, apresentado em 3 de Dezembro, 1996. Assim, para examinar mais detalhadamente a estrutura dos anticorpos, foram geradas previsões das sequências de aminoácidos dos anticorpos a partir dos cDNAs obtidos dos clones. Ainda, as sequências de aminoácidos N-terminais foram obtidas através da sequenciação de proteínas . A Figura 1 apresenta sequências de nucleótidos e de aminoácidos previstas das cadeias pesada e leve capa dos 92 ΡΕ1141028 clones 4.1.1 (Figura IA), 4.8.1 (Figura 1B), 4.14.3 (Figura 1C) , 6.1.1 (Figura 1D) , 3.1. (Figura 1E) , 4.10.2 (Figura 1F) , 2.1.3 (Figura 1G), 4.13.1 (Figura 1H), 11.2.1 (Figura II), 11.6.1 (Figura 1J) , 11.7.1 (Figura 1K) , 12.3.1.1 (Figua 1L) e 12.9.1.1 (Figura 1M). Nas Figuras ΙΑ, 1B e 1D, sequências prolongadas dos anticorpos 4.1.1, 4.8.1 e 6.1.1 foram obtidas por clonagem de tamanho completo dos cDNAs como descrito atrás. Em tais Figuras, a sequência do péptido sinal (ou as bases codificadores da mesma) está indicada a negrito e as sequências utilizadas para a reacção de PCR 5' estão sublinhadas. A Figura 2 apresenta um alinhamento de sequências entre as sequências de aminoácidos previstas para a cadeia pesada dos clones 4.1.1, 4.8.1, 4.14.3, 6.1.1, 3.1.1, 4.10.2, 4.13.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 e 12.9.1.1 e a sequência de aminoácidos germinal DP-50 (3-33) . As diferenças entre a sequência germinal DP-50 e a sequência nos clones estão indicadas a cheio. A Figura também mostra as posições das sequências CDR1, CDR2e CDR3 dos anticorpos estão a sombreado. A Figura 3 apresenta um alinhamento de sequências entre a sequência de aminoácidos prevista para a cadeia pesada do clone 2.1.3 e a sequência de aminoácidos germinal DP-65(4-31). As diferenças entre a sequência germinal DP-65 e a sequência no clone estão indicados a cheio. A Figura mostra também as posições das sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 do anticorpo sublinhadas. 93 ΡΕ1141028 A Figura 4 apresenta um alinhamento de sequências entre a sequência de aminoácidos prevista para a cadeia leve capa dos clones 4.1.1, 4.8.1, 4.14.3, 6.1.1, 3.1.1, 4.10.2 e 4.13.1 e a sequência de aminoácidos germinal A27. As diferenças entre a sequência germinal A27 e a sequência nos clones estão indicadas a negrito. A Figura também mostra as posições das sequências CDRl, CDR2 e CDR3 do anticorpo sublinhadas. As deleções observadas nas CDRls dos clones 4.8.1, 4.14.3 e 6.1.1 estão indicadas com "Os". A Figura 5 apresenta um alinhamento de sequências entre a sequência de aminoácidos prevista para a cadeia leve capa dos clones 3.1.1, 11.2.1, 11.6.1 e 11.7.1 e a sequência de aminoácidos germinal 012. As diferenças entre a sequência germinal 012 e a sequência no clone estão indicadas a negrito. A Figura também mostra as posições das sequências CDRl, CDR2 e CDR3 do anticorpo sublinhadas. A Figura 6 apresenta um alinhamento de sequências entre a sequência de aminoácidos prevista para a cadeia leve capa do clone 2.1.3 e a sequência de aminoácidos germinal A10/A26. As diferenças entre a sequência germinal A10/A26 e a sequência no clone estão indicadas a negrito. A Figura também mostra as posições das sequências CDRl, CDR2 e CDR3 do anticorpo sublinhadas. A Figura 7 apresenta um alinhamento de sequências entre a sequência de aminoácidos prevista para a cadeia 94 ΡΕ1141028 leve capa do clone 12.1.3 e a sequência de aminoácidos germinal A17. As diferenças entre a sequência germinal AI7 e a sequência no clone estão indicadas a negrito. A Figura também mostra as posições das sequências CDR1, CDR2 e CDR3 do anticorpo sublinhadas. A Figura 8 apresenta um alinhamento de sequências entre a sequência de aminoácidos prevista para a cadeia leve capa do clone 12.9.1 e a sequência de aminoácidos germinal A3/A19. As diferenças entre a sequência germinal A3/A19 e a sequência no clone estão indicadas a negrito. A Figura também mostra as posições das sequências CDR1, CDR2 e CDR3 do anticorpo sublinhadas. A Figura 22 apresenta uma série de sequências de nucleótidos e de aminoácidos adicionais das seguintes cadeias de anticorpo anti-CTLA-4: 4.1.1: cadeia pesada 4.1.1 completa (cDNA 22 (a), genómico 22 (b) e aminoácidos 22 (c)); cadeia pesada aglicosilada 4.1.1 de tamanho completo (cDNA 22(d) e de aminoácidos 22 (e)); cadeia leve 4.1.1 (cDNA 22(f) e aminoácidos 22 (g)); 4.8.1:

cadeia pesada de tamanho completo 4.8.1 (cDNA 95 ΡΕ1141028 22 (h) e aminoácidos 22 (i)) ; cadeia leve 4.8.1 (cDNA 22 (j) e aminoácidos 22 (k)); 6.1.1: cadeia pesada de tamanho completo 6.1.1 (cDNA 22(1) e aminoácidos 22(m)); cadeia leve 6.1.1 (cDNA 22(n) e aminoácidos 22(o)); 11.2.1: cadeia pesada completa 11.2.1 (cDNA 22 (p) e aminoácidos 22(q)); e cadeia leve 11.2.1 (cDNA 22(r) e aminoácidos 22 (s)) .

As sequências do péptido sinal estão apresentadas a negrito e maiúsculas. As grelhas de leitura abertas na sequência de DNA genómico 4.1.1 completa (Fig. 22(b)) estão sublinhadas. As mutações introduzidas para produzir a cadeia pesada 4.1.1 aglicosilada e a alteração resultante (N294Q) estão apresentadas a duplo sublinhado e texto a negrito (cDNA (Fig. 22 (b)) e aminoácido (Fig. 22 (c)) . EXEMPLO 4

Análise das substituições de aminoácidos nas cadeias pesada e leve

Na Figura 2, a qual mostra um alinhamento de 96 ΡΕ1141028 sequências entre as sequências de aminoácidos previstas para a cadeia pesada dos clones 4.1.1, 4.8.1, 4.14.3, 6.1.1, 3.1.1, 4.10.2, 4.13.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 e 12.9.1.1 e a sequência de aminoácidos germinal DP-50(3-33), surge um interessante padrão. Para além do facto do enviesamento para a cadeia pesada DP-50 na maioria dos clones, existe relativamente limitada hipermutação nos anticorpos relativamente ao gene germinal DP-50. Por exemplo os clones 3.1.1 e 11.2.1 não possuem mutações. Ainda, as mutações noutros clones são, de um modo geral mutações conservadas, envolvendo substituições de aminoácidos com propriedades semelhantes aos aminoácidos na linha germinal. As mutações dentro de muitas sequências CDR1 e CDR2 são particularmente conservadas na natureza. Três das cadeias pesadas representadas na Figura 2, 4.10.2, 4.13.1 e 4.14.3 derivam claramente de um único evento de recombinação (i.e., derivam de um centro terminal idêntico) e são quase idênticas em termos de sequência. Se estas três forem consideradas como uma única sequência, então, entre os 10 anticorpos diferentes contendo a cadeia pesada DP-50, em CDR1 e CDR2 existem 3 posições em que um resíduo não polar é substituído por um outro resíduo não polar, 12 em que um resíduo polar não carregado é substituído por um outro resíduo polar não carregado e 1 em que um resíduo polar carregado é substituído por um outro resíduo polar carregado. Ainda, existem duas posições em que dois resíduos que são muito semelhantes estruturalmente, glicina e alanina, são substituídos um pelo outro. As únicas mutações não estritamente conservadas envolvem 3 substituições de um 97 ΡΕ1141028 resíduo polar carregado por um resíduo não carregado e uma substituição de um resíduo não polar por um resíduo polar.

As cadeias leves destes anticorpos derivam de 5 genes Vk diferentes. 0 gene A27 é o mais fortemente representado e é a fonte de 6 cadeias leves diferentes. A comparação destas 6 sequências revela duas características importantes. Primeiro, três delas, 4.8.1, 4.14.3 e 6.1.1 possuem deleções de um ou mais resíduos em CDR1, um evento raro. Segundo, existe um forte detrimento relativamente à serina germinal na posição seis em CDR3 pelo que a serina foi substituída em todas as sequências. Isto sugere que uma serina nesta posição é incompatível com a ligação a CTLA-4.

Será apreciado que muitas das substituições de aminoácidos atrás identificadas existem em estreita proximidade ou dentro de uma CDR. Tais substituições parecem ter algum efeito na ligação do anticorpo à molécula de CTLA-4. Ainda, tais substituições poderão ter efeito significativo na afinidade dos anticorpos. EXEMPLO 5

Análise da sequência de aminoácidos N-terminal dos anticorpos de acordo com o invento

De forma a verificar a composição e estrutura dos anticorpos de acordo com o invento, atrás identificados, sequenciámos alguns dos anticorpos com um sequenciador 98 ΡΕ1141028

Perkin-Elmer. As cadeias pesada e leve capa dos anticorpos foram isoladas e purificadas através do uso de técnicas de electroforese em gel preparativo e electrotransferência e depois sequenciadas directamente como descrito no Exemplo 6. Uma maioria das sequências da cadeia pesada foi bloqueada no seu extremo amina. Assim, tais anticorpos foram primeiro tratados com aminopeptidase de piroglutamato e depois sequenciadas.

Os resultados desta experiência estão apresentados na Figura 9. A Figura 8 também mostra os pesos moleculares das cadeias pesada e leve, conforme determinado pela espectroscopia de massa (MALDI). EXEMPLO 6

Caracterização adicional dos anticorpos A Figura 10 proporciona alguma informação de caracterização adicional acerca de alguns anticorpos. Na Figura estão resumidos os dados relacionados com os cones 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.14.3 e 6.1.1. São proporcionados os dados que se seguem: concentração, isoelectrofoca-gem (IEF), SDS-PAGE, cromatografia de exclusão por tamanho, FACS, espectroscopia de massa (MALDI) e sequências N-terminais da cadeia leve.

De um modo geral, os dados foram gerados como se segue: 99 ΡΕ1141028

Materiais e métodos A concentração proteica foi determinada a 280 nm a partir de varrimento de UV (200-350), em que 1,58 unidades de absorvância a 280 nm é igual a 1 mg/ml. SDS-PAGE foi realizado usando o sistema de electroforese Novex NuPAGE com um gel NuPAGE a 10% e tampão de corrida MES. As amostras foram preparadas através da diluição 3:1 com tampão de amostra NuPAGE 4x ( + /- beta-mercaptoetanol), aquecidas e ~5 μρ de proteína foi aplicado no gel. 0 gel foi então corado com solução de coloração Brilliant Blue R (Sigma, Cat#B-6529) e as estimativas de peso molecular foram feitas por comparação das bandas coradas com "Perfect Protein Markers" Novagen, Cat#69149-3).

Para a sequenciação N-terminal, as amostras migraram como atrás descrito em géis NuPAGE, foram transferidas para membrana de imobilização ProBlot (Applied Biosystems) depois coradas com Coomassie Blue R-250. As bandas de proteína coradas foram removidas e sujeitas a análise de sequência por degradação automática de Edman num sequenciador Applied Biosystems 494 Precise HT.

Focagem isoeléctrica (IEF) foi realizada usando géis Pharmacia IEF 3-9 Phast Gels (Cat# 17-0543-01) . As amostras foram diluídas em 10% de glicerol para 0,8 mg/ml e 1 μΐ foi aplicado no gel e depois corado com prata. As 100 ΡΕ1141028 estimativas do pi foram feitas por comparação das bandas coradas com uma gama larga (pH3-10) de padrões de IEF (Pharmacia, Cat, # 17-0471-01).

Cromatografia de exclusão pelo tamanho (SEC) foi realizada em soro fisiológico tamponado com fosfatos (PBS) no sistema SMART da Pharmacia com a coluna Superdex 75 PC 3.2/30. As estimativas dos tamanhos moleculares foram feitas por comparação do tempo de retenção do pico com os tempos de retenção no gel.

Para os estudos FACS, células T periféricas humanas foram preparadas e estimuladas durante 48 horas. As células T foram lavadas uma vez, suspensas em tampão FACS a 1 x 106 células/100 μΐ e coradas relativamente à expressão de CD3 na superfície com 10 μΐ de anti-CD3-FITC (Immuno-tech, Marseille, France), durante 30 minutos à temperatura ambiente. As células foram lavadas duas vezes, depois fixadas, permeabilizadas (Fix and Perm, Caltag) e coradas relativamente à expressão intracelular de CTLA-4 com 10 μΐ de anti-CD152-PE (Pharmingen). A citometria de fluxo foi realizada com um Becton Dickinson FACSort. Os quadrantes foram estabelecidos por análise de anticorpos controlos com os isotipos relevantes (Caltag).

Como discutido atrás, demonstrou-se que os anticorpos anti-CTLA-4 possuem algumas actividades de modulação imune importantes. As experiências que se seguem foram realizadas de forma a determinar se os anticorpos de acordo com o presente invento possuem tais actividades. Em geral, 101 ΡΕ1141028 as experiências foram projectadas para avaliar a capacidade dos anticorpos para inibirem a interacção entre moléculas CTLA-4 e B7, serem selectivos como acontece para as moléculas CTLA-4 e B7 e CD28 e promoverem a produção de citocinas pelas células T, incluindo mas não estando limitado à expressão de IL-2 e/ou IFN-γ. Ainda, foi efectuada a análise da reactividade cruzada dos anticorpos do invento com determinados tecidos humanos e moléculas CTLA-4 noutras espécies (e.g., ratinho e primata). EXEMPLO 7 ELISA de competição: inibição da interacção CTLA— 4/B7—1 ou B7-2 por anticorpos de acordo com o invento

Um ensaio in vitro foi realizado para determinar se os anticorpos de acordo com o presente invento foram capazes de inibir a ligação de CTLA-4 a B7 -1 ou a B7-2. Como será apreciado, os anticorpos do invento que são capazes de inibir a ligação de CTLA-4 a moléculas B7 espera-se que sejam candidatos à regulação imune através da via CTLA-4. No ensaio, foram utilizados os materiais e métodos que se seguem:

Materiais e Métodos B7-l-Ig(Gl) ou B7-2-Ig(Gl) 3 nM (Repligen, Inc.,

Needham, MA) em PBS de Dulbecco foi usado para revestir placas de 96 alvéolos MaxiSorp (Nunc, Denmark, #439454) e incubado a 4°C durante a noite. No dia 2, B7-Ig foi 102 ΡΕ1141028 removido e as placas foram bloqueadas com 1% BSA mais 0,05% Tween-20 em D-PBS durante duas horas. As placas foram lavadas 3X com tampão de lavagem (0,05% Tween-20 em D-PBS). Os anticorpos nas concentrações apropriadas a testar e CTLA-4-Ig(G4) (0,3 nm concentração final) (Repligen, Inc., Needham, MA) foram pré-misturados durante 15 minutos e depois adicionados à placa revestida com B7-Ig (60 μΐ volume total) e incubados à t.a. durante 1,5 horas. As placas foram lavadas 3X e 50 μΐ de uma diluição de 1 para 1000 de anticorpo de ratinho anti-IgG4 humana marcado com HRP (Zymed, San Francisco, CA, #05-3820) foi adicionado e incubado à t.a. durante 1 hora. As placas foram lavadas 3X e 50 μΐ de substrato da peroxidase TMB Microwell (Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, MD, #50-76-04) foi adicionado e incubado à t.a. durante 20 minutos, e depois adicionou-se às placas 50 μΐ de H2SO4 IN. As placas foram lidas a 450 nm usando um leitor de placas Molecular Devices (Sunnyvale, CA). Todas as amostras foram testadas em duplicado. O máximo de sinal foi definido como a ligação de CTLA-4-Ig na ausência do anticorpo a testar. A ligação não específica foi definida como absorvância na ausência de CTLA-4-Ig e do anticorpo a testar.

Os resultados do ensaio estão apresentados na Tabela IIIA e IIIB. Na Tabela IIIA são apresentados os resultados para uma variedade de anticorpos. Na Tabela IIIB, são apresentados os resultados da comparação do anticorpo 4.1.1 com o anticorpo 11.2.1 do invento de uma experiência separada. ΡΕ1141028 103 TABELA IIΙΑ

Clone Isotipo CTLA-4/B7.2 CTLA-4/B7.1 CTLA-4-Ig Comp. ELISA Comp. ELISA IC50 (nM) IC50 (nM) CT3.1.1 IgG2 0,45 ± 0,07 (n=3) 0,63 ± 0,10 (n=2) CT4.1.1 IgG2 038 ± 0,06 (n=5) 0,50 ± 0,05 (n=2) CT4.8.1 IgG2 0,57 ± 0,03 (n=3) 0,17 ± 0,28 (n=2) CT4.9.1 IgG2 Não competitivo (n=3) Não competitivo (n=2) CT4.10.2 IgG2 1,50 ± 037 (n=3) 3,39 ± 0,31 (n=2) CT4.13.1 IgG2 0,49 ± 0,05 (n=3) 0,98 ± 0,11 (n=2) CT4.14.3 IgG2 0,69 ± 0,11 (n=3) 1,04 ± 0,15 (n=2) CT6.1.1 IgG2 0,39 ± 0,06 (n=3) 0,67 ± 0,07 (n=2)

TABELA IIIB

Clone Isotipo CTLA-4/B7.2 CTLA-4/B7.1 CTLA-4-Ig Conp. ELISA Comp. ELISA IC50 (nM) IC50 (nM) CT4.1.1 IgG2 0,55 ± 0,08 (n=4) 0,87 ± 0,14 (n=2) CT11.2.1 IgG2 0,56 ± 0,05 (n=4) 0,81 ± 0,24 (n=2) EXEMPLO 8

Taxas de selectividade dos anticorpos do invento relativamente a CTLA-4 versus CD28 ou B7-2

Um outro ensaio in vitro foi conduzido para determinar a selectividade dos anticorpos do invento relativamente a CTLA-4 versus CD28 ou B7-2. Os materiais e métodos que se seguem foram utilizados nas experiências: 104 ΡΕ1141028 ELISA da selectividade para CTLA-4: Materiais e Métodos

Uma placa de 96 alvéolos Fluoro-NUNC (Nunc, Cat.475515) foi revestida com quatro antigénios: CTLA-4/Ig, CD44/Ig, CD28/Ig e B7-2/Ig (antigénios produzidos no laboratório). Os antigénios fora usados para revestir as placas durante a noite, a +4°C, a 1 μρ/ιηΐ, 100 μΐ/alvéolo em tampão bicarbonato de sódio 0,1M, pH 9,6. A placa foi então lavada com PBST (PBS + 0,1% Tween-20) três vezes, usando um lavador de placas NUNC. A placa foi bloqueada com PBST + 0,5% BSA a 150 μΐ/alvéolo. A placa foi incubada à t.a. durante uma hora, depois lavada com PBST três vezes. Em seguida os anticorpos anti-CTLA-4 do invento foram diluídos em tampão de bloqueio a 1 μρ/ιηΐ e foram adicionados à placa. A placa foi incubada à t.a. durante 1 hora, depois lavada com PBST três vezes. Os alvéolos que continham os anticorpos do invento foram então tratados com 100 μΐ/alvéolo de anticorpo anti-IgG2 humana-HRP (Southern Biotech Cat N° 9070-05) numa diluição de 1:4000 em tampão de bloqueio. Igualmente uma fila foi tratada com anticorpo anti-IgG2 humana (Jackson Cat N° 209-035-088) para normalizar o revestimento da placa. Este anticorpo foi diluído a 1:5000 em tampão de bloqueio e adicionado a 100 μΐ/alvéolo. Igualmente, uma fila foi tratada com anticorpo anti-CTLA-4 humana-HRP (Pharmingen Cat N° 345815/Custom HRP conjugated) como controlo positivo. Este anticorpo foi usado a 0,05 μρ/ιηΐ em tampão de bloqueio. A placa foi incubada à t.a. durante 1 hora, depois lavada com PBST três vezes. O substrato quimioluminescente LBA (Pierce) foi 105 ΡΕ1141028 adicionado a 100 μΐ/alvéolo e a placa foi incubada num agitador de placas durante 5 min. A placa foi então lida usando um aparelho de imagiologia com luminescência durante uma exposição de 2 min.

Ensaio de ligação IGEN para selectividade de CTLA-4-Ig: Materiais e Métodos

Dynabeads M-450 (Dynal A.S., Oslo, Norway, #140.02) foram lavadas 3X com tampão Na-fosfato, pH 7,4, e ressuspensas em tampão Na-fosfato. 1,0 μρ de CTLA-4-Ig(Gl), 1,0 μρ de CD28-Ig(Gl) ou 1,0 a 3,0 μρ de B7-2-Ig(Gl) (Repligen, Inc., Needham, MA) foram adicionados a 100 μΐ de esferas e incubados durante a noite num agitador a 4°C. No dia 2 as esferas foram lavadas 3X em 1% BSA mais 0,05% Tween-20 em PBS de Dulbecco e bloqueadas durante 30 minutos. As esferas foram diluídas a 1 para 10 com tampão de bloqueio e adicionados 25 μΐ de esferas revestidas a tubos de polipropileno 12x75 mm. Todas as amostras foram testadas em duplicado. 50 μΐ do anticorpo a testar (1 μρ/ml concentração final) ou tampão de bloqueio foi adicionado aos tubos e incubados durante 30 minutos no carrossel Origen 1.5 Analyzer (IGEN International, Inc., Gaithers-burg, MD) à t.a., com agitação por vortex a 100 rpm. 25 μΐ de anticorpo murino rutenilado anti-IgGl, IgG2 ou IgG4 humana (Zymed, Inc., San Francisco, CA, #05-3300, 05-3500 e 05-3800) (concentração final de 3 μρ/ιηΐ em 100 μΐ de volume total) foi adicionado aos tubos. Os tubos foram incubados durante 30 minutos à t.a. no carrossel, com agitação por vortex a 100 rpm. 200 μΐ de tampão do ensaio Origen (IGEN 106 ΡΕ1141028

International, Inc., Gaithersburg, MD, #402-050-03) por tubo foram adicionados e agitados brevemente com vortex e depois os tubos foram contados no Origen Analyzer e as unidades ECL (electroquimioluminescência) foram determinadas para cada um dos tubos. Os factores de normalização foram determinados para corrigir diferenças na ligação das proteínas de fusão a Dynabeads e as unidades ECL foram corrigidas relativamente a ligação não especifica antes do cálculo das taxas de selectividade.

Os resultados dos ensaios estão apresentados nas Tabelas IVA e IVB.

TABELA IVA

Clone Isotipo CTLA-4/CD28 CTLA-4/B7.2 CTLA-4/CD44 CTLA-4/CD28 CTLA-4/B7.2 ELISA ELISA ELISA IGEN IGEN 3.1.1 IgG2 >500:1 (n=3) >500:1 (n=3) >500:1 (n=3) >500:1 (n=2) >500:1 (n=l) 195:1 (n=l) 4.1.1 IgG2 >500:1 (n=3) >500:1 (n=2) >500:1 (n=3) >500:1 (n=l) >500:1 (n=l) 485:1 (n=l) 261:1 (n=l) 107:1 (n=l) 4.8.1 IgG2 >500:1 (n=3) >500:1 (n=2) >500:1 (n=3) >500:1 (n=2) >500:1 (n=2) 190:1 (n=l) 4.9.1 IgG2 >500:1 (n=2) >500:1 (n=2) >500:1 (n=3) >500:1 (n=l) >500:1 (n=l) 244:1 (n=l) 33:1 (n=l) 4.10.2 IgG2 >500:1 (n=3) >500:1 (n=3) >500:1 (n=3) >500:1 (n=l) >500:1 (n=l) 4.13.1 IgG2 >500:1 (n=2) >500:1 (n=3) >500:1 (n=3) >500:1 (n=l) >500:1 (n=2) 46:1 (n=l) 329:1 (n=l) 4.14.3 IgG2 >500:1 (n=2) >500:1 (n=2) >500:1 (n=2) >413:1 (n=l) >234:1 (n=l) 80:1 (n=l) 10:1 (n=l) 126:1 (n=l) 6.1.1 IgG2 >500:1 (n=2) >500:1 (n=3) >500:1 (n=3) >500:1 (n=2) >500:1 (n=2) 52:1 (n=l) 107 ΡΕ1141028

TABELA IVB

Clone Isotipo CTLA4/CD26 CTLA4/B7-2 CTLA-4/hlgG ELISA ELISA ELISA 4.1.1 IgG2 >500:1 (n=3) >500:1 (n-2) >500:1 (n=3) 11.2.1 IgG2 >500:1 (n=3) >500:1 (n=3) >500:1 (n=3) EXEMPLO 9

Modelo do sinal de células T humanas

De forma a melhor definir a actividade dos anticorpos de acordo com o invento para actuar como reguladores imunes, desenvolvemos alguns ensaios de células T de forma a quantificar o aumento da produção de IL-2 pelas células T quando do bloqueio do sinal CTLA-4 com os anticorpos. Os materiais e métodos que se seguem foram utilizados nas experiências:

Materiais e Métodos Células T humanas isoladas de fresco foram preparada usando Histopaque (Sigma, St. Louis, MO, #A-70543) e T-Kwik (Lympho-Kwik, One Lambda, Canoga Park, CA, #LK-50-T) e estimuladas com PHA (1 μg/ml) (fito-hema-glutinina purificada, Murex Diagnostics, Ltd., Dartford, England, #HA 16) em meio (RPMI-1640 contendo L-glutamina, aminoácidos não essenciais MEM, penicilina, estreptomicina, HEPES 25 mM e 10% FBS) numa concentração de 1 x 106 108 ΡΕ1141028 células/ml e incubadas a 37°C, durante 2 dias. As células foram lavadas e diluidas em meio para 2 x 106 células/ml. As células Raji (linfoma de Burkitt, Humano ATCC N°: CCL86 Classe II, American Type Culture Collection, Rockville, MD) foram tratadas com mitomicina C (Sigma, St. Louis, MO, #M-4287) (25 μρ/ιηΐ) durante uma hora a 37°C. As células Raj i foram lavadas 4X em PBS e ressuspensas O \—1 X CM (ΰ células/ml. Os blastócitos T humanos (5 x 105/ml), as células Raji (5 X 105/ml) e anticorpos anti- -CTLA-4 ou o anticorpo controlo do mesmo isotipo em várias concentrações foram adicionados a placas de microtitulação de 96 alvéolos e as placas foram incubadas a 37°C durante 72 horas. O volume total por alvéolo foi de 200 μΐ. Setenta e duas horas após a estimulação, as placas foram centrifugadas e o sobrenadante foi removido e congelado para determinação posterior de IL-2 (Quantikine IL-2 ELISA kit, R&D Systems, Minneapolis, MN, #D2050) e IFN-γ (Quantikine IFN-γ ELISA kit, R&D Systems). O aumento das citocinas foi definido como a diferença entre os níveis de citocinas em culturas contendo o mAb bloqueador anti-CTLA-4 versus um anticorpo controlo do mesmo isotipo. Para as experiências de citometria de fluxo, as células Raj i foram lavadas IX com tampão FACS (PBS contendo 2% FCS inactivado, 0,025% azida de sódio). Os sedimentos celulares foram suspensos em tampão FACS a 1 x 106 células/100 μΐ e incubados com 10 μΐ de anti-CD80-PE (Becton Dickinson, Sam José, CA) ou anti.-CD86-PE (Pharmingen, San Diego, CA) durante 30 minutos à temperatura ambiente. As células foram lavadas duas vezes e suspensas em 1 ml de tampão FACS. Realizou-se citometria de 109 ΡΕ1141028 fluxo usando um Becton Dickinson FACSort. Os marcadores de histogramas foram estabelecidos por análise dos anticorpos controlo com isotipos relevantes (Caltag, Burlingame, CA).

Em geral, desenvolvemos um ensaio que pode ser usado para a determinação rápida da regulação positiva de IL-2 nas células T. Como será apreciado, a estimulação de células T é dependente de B7 e CD28. Ainda, os blastócitos lavados não produzem IL-2 detectável e as células Raji não produzem IL-2 detectável mesmo quando estimuladas com LPS ou PWM. No entanto, em combinação, os blastócitos co-cultivados com células Raji podem modelar os eventos de sinalização de B7, CTLA-4 e CD28 e os efeitos dos anticorpos sobre os mesmos podem ser avaliados. A figura 11 mostra a expressão de B7-1 e B7-2 em células Raji usando mAbs anti-CD80-PE e anti-CD86-PE com citometria de fluxo (FACS) como descrito no Exemplo 6. A Figura 12 mostra o aumento dependente da concentração da produção de IL-2 no ensaio de blastócitos T /Raji induzido pelos anticorpos bloqueadores anti-CTLA-4 (BNI3 (Pharmingen) e os anticorpos 4.1.1, 4.8.1 e 6.1.1 do invento). A Figura 13 mostra o aumento dependente da concentração da produção de IFN-γ no ensaio de blastócitos T/Raji induzido pelos anticorpos bloqueadores anti-CTLA-4 (BNI3 (Pharmingen) e os anticorpos 4.1.1, 4.8.1 e 6.1.1 do invento) (o mesmo dador de células T). 110 ΡΕ1141028 A Figura 14 mostra o aumento médio da produção de IL-12 em células T de 6 dadores induzido pelos anticorpos bloqueadores anti-CTLA-4 no ensaio de blastócitos T/Raji. É interessante considerar que o mAb CT4.9.1 se liga a CTLA-4 mas não bloqueia a ligação de B7. Assim, a ligação a CTLA-4 é insuficiente por si só para proporcionar um anticorpo funcional do invento. A Figura 15 mostra o aumento médio da produção de IFN-γ em células T de 6 dadores induzido pelos anticorpos bloqueadores anti-CTLA-4 no ensaio de blastócitos T/Raji. A Figura 19 mostra uma comparação entre os anticorpos 4.1.1 e 11.2.1 do invento numa concentração de 30 μρ/ιηΐ no ensaio de 72 horas com blastócitos T/Raji, como descrito neste Exemplo 9 e o ensaio de superantigénio descrito no Exemplo 10. A Figura 20 mostra o aumento da produção de IL-2 dependente de concentração no ensaio com blastócitos T/Raji induzido pelos anticorpos anti-CTLA-4 4.1.1 e 11.2.1 do invento. A Tabela IVc que se segue proporciona informação relacionada com o aumento médio e gama de aumento da resposta de citocinas nos ensaios Ra j i e SEA do invento. Cada uma das experiências incluídas nos resultados é baseada no anticorpo numa dose de 30 μρ/ml e medição às 72 111 ΡΕ1141028 horas. Estão apresentados o número de dadores usados nas experiências assim como as respostas.

TABELA IVC

Ensaio mAb citocina Aumento médio pg/ml SEM Gama de aumento Pg/ml n Resposta do dador Blastócitos T/Raji \—1 \—1 IL-2 3329 408 0 a 8861 42 19 de 21 Blastócitos T/Raji 4.1.1 IFN-y 3630 980 600 a 13939 17 13 de 13 Blastócitos T/Raji 11.2.1 IL-2 3509 488 369 a 6424 18 14 de 14 SEA (PBMC) \—1 \—1 IL-2 2800 312 330 a 6699 42 17 de 17 SEA (PBMC) 11.2.1 IL-2 2438 366 147 a 8360 25 15 de 15 SEA (Sangue total) \—1 \—1 ^P IL-2 6089 665 -168 a 18417 46 15 de 17 SEA (Sangue total) 11.2.1 IL-2 6935 700 -111 a 11803 25 12 de 14 EXEMPLO 10

Modelo do sinal de células T humanas

Desenvolvemos um segundo ensaio celular de forma a quantificar o aumento da regulação positiva de IL-2 em células T quando do bloqueio do sinal CTLA-4 com os anticorpos. Os materiais e métodos que se seguem foram utilizados nas experiências:

Materiais e métodos

Prepararam-se PBMCs humanos usando Accuspin. Placas de microtitulação foram pré-revestidas com um anticorpo anti-CD3 (Leu4, Becton Dickinson) (60 ng/ml) e 112 ΡΕ1141028 incubadas durante 2 horas a 37°C. hPBMCs foram adicionados aos alvéolos a 200000 células por alvéolo. Adicionou-se Enterotoxina A de Staphylococcus (SEA) (Sigma) aos alvéolos a 100 ng/ml. Os anticorpos foram adicionados aos alvéolos, geralmente a 30 μg/ml. As células foram então estimuladas durante 48, 72 ou 96 horas. As placas foram centrifugadas na altura pretendida e os sobrenadantes foram removidos dos alvéolos. Em seguida, os sobrenadantes foram testados relativamente a produção de IL-2 usando ELISA (R&D Systems).

Os resultados destas experiências estão apresentados nas Figuras 16, 17 e 21. Na Figura 16, a indução da produção de IL-2 em hPBMCs de 5 dadores foi medida 72 horas após estimulação. Na Figura 17, os resultados estão apresentados para medição de sangue total, analisando a diferença na indução da produção de 11-2 no sangue de 3 dadores conforme medido às 72 e 96 horas após estimulação.

Na Figura 21, o aumento da produção de IL-2 no sangue total de 2 dadores medido às 72 horas após a estimulação. EXEMPLO 11

Modelo animal de tumor análise

Estabelecemos um modelo animal de tumor para a in vivo de anticorpos anti-CTLA-4 murino na inibição do crescimento de tumores. No modelo, um tumor 113 ΡΕ1141028 fibrossarcoma murino foi crescido e os animais foram tratados com anticorpos anti-CTLA-4 murinoa. Os materiais e métodos para o estabelecimento do modelo estão apresentados abaixo:

Materiais e métodos

Ratinhos fêmeas A/J (6-8 semanas de idade) foram injectados no lado dorsal do pescoço com 0,2 ml de células tumorais SalN (1 x 106) (Baskar, 1995) . Anticorpo anti-CTLA-4 murino ou um anticorpo controlo do mesmo isotipo (Pharmingen, San Diego, CA, 200 μg/animal) foram injectados intraperitonealmente nos dias 0, 4, 7 e 14 após a injecção das células tumorais. As medições do tumor foram feitas no decurso das 3-4 semanas, nas experiências usou-se um compasso electrónico Starrett SPC Plus (Athol, MA) e o tamanho do tumor foi expresso como a área de superficie coberta pelo cresimento do tumor (nm2) . A Figura 18 mostra a inibição do crescimento de tumores com o anticorpo anti-CTLA-4 murino num modelo de tumor de fibrossarcoma murino. Como se mostra na Figura 18, os animais tratados com anti-CTLA-4 tiveram uma redução no crescimento do tumor comparativamente com os animais tratados com um anticorpo controlo do mesmo isotipo. Assim, os mAbs anti-CTLA-4 murino são capazes de inibir o crescimento de um fibrossarcoma num modelo de tumor murino.

Espera-se que os anticorpos que dão reacção 114 ΡΕ1141028 cruzada com CTLA-4 murino tenham um desempenho semelhante no modelo. No entanto, dos anticorpos do invento que foram testados relativamente à reactividade cruzada, nenhum deu reacção cruzada com CTLA-4 murino. EXEMPLO 12

Modelo animal de tumor

De forma a investigar a actividade dos anticorpos de acordo com o invento, um modelo de ratinho SCID com xenotransplante foi projectado para testar a erradicação de tumores estabelecidos e das metástases derivadas dos mesmos. No modelo, os ratinhos SCID recebem células T humanas e foram implantados com células de cancro do pulmão não pequenas (NSCC) ou células de carcinoma colo-rectal (CC) derivadas de doentes. 0 implante foi feito nos corpos de gordura das gónadas de ratinhos SCID. Os tumores foram deixados crescer e depois removidos. Os ratinhos desenvolveram tumores do tipo humano e metástases no figado. Tal modelo está descrito em Bumpers et al., J. Surgical Res. 61:282-288 (1996).

Espera-se que os anticorpos do invento inibam o crescimento de tumores formados em tais ratinhos.

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Pedido de Patente U. S. No. de Série 07/466,008, apresentado em 12 de Janeiro de 1990 Pedido de Patente U. S. No. de Série 07/574,748, apresentado em 29 de Agosto > de 1990 Pedido de Patente U. S . No. de Série 07/575,962, apresentado em 31 de Agosto > de 1990 Pedido de Patente U. S . No. de Série 07/610,515, apresentado em 8 de Novembro de 1990 Pedido de Patente U. S . No. de Série 07/810,279, apresentado em 17 de Dezembro de 1991 Pedido de Patente U. S . No. de Série 07/853,408, apresentado em 18 de Março de 1992 Pedido de Patente U. S . No. de Série 07/904,068, apresentado em 23 de Junho de 1992 Pedido de Patente U. S . No. de Série 07/919,297, apresentado em 24 de Julho de 1992 Pedido de Patente U. S . No. de Série 07/922,649, apresentado em 30 de Julho de 1992 Pedido de Patente U. S . No. de Série 07/990,860, apresentado em 16 de Dezembro de 1992 125 ΡΕ1141028

Pedido de Patente U. S . No. de Série 08/031,801 apresentado em 15 de Março de 1993 Pedido de Patente U. S . No. de Série 08/053,131 apresentado em 26 de Abril de 1993 Pedido de Patente U. S . No. de Série 08/096,762 apresentado em 22 de Julho de 1993 Pedido de Patente U. S . No. de Série 08/112,848 apresentado em 27 de Agostc ) de 1993. Pedido de Patente U. S . No. de Série 08/155,301 apresentado em 18 de Novembro de 1993 Pedido de Patente U. S . No. de Série 08/161,739 apresentado em 3 de Dezembro de 1993 Pedido de Patente U. S . No. de Série 08/165,699 apresentado em 10 de Dezembro de 1993 Pedido de Patente U. S . No. de Série 08/209,741 apresentado em 9 de Março de 1994 Pedido de Patente U. S . No. de Série 08/234,145 apresentado em 28 de Abril de 1994 Pedido de Patente U. S . No. de Série 08/724,752 apresentado em 2 de Outubrc ) de 1996 Pedido de Patente U. S . No. de Série 08/730,639 apresentado em 11 de Outubro de 1996 Pedido de Patente U. S . No. de Série 08/759,620 apresentado em 3 de Dezembro de 1996 Pedido de Patente U. S . No. de Série 08/759,620 apresentado em 3 de Dezembro de 1996 ΡΕ1141028

Patente U.S. No . Patente U.S. No. Patente U.S. No . Patente U.S. No . Patente U.S. No . Patente U.S. No . Patente U.S. No . Patente U.S. No . Patente U.S. No . Patente U.S. No . Patente U.S. No. Patente U.S. No . Patente U.S. No . Patente U.S. No . Patente U.S. No . Patente U.S. No . Patente U.S. No . Patente U.S. No . Patente U.S. No . Patente U.S . No. Patente U.S. No. Patente U.S. No. - 126 - ,399,216 ,681,581 ,683,195 ,683,202 , 735,210 , 740,461 , 816,397 ,912,040 ,959,455 ,101,827 ,102,990 (RE 35,500) ,151,510 ,194,594 ,434,131 ,530,101 ,545,806 ,545,807 ,585,089 ,591,669 ,612,205 ,625,126 ,625,825

Patente U.S. No. 5,633,425 ΡΕ1141028 - 127 -

Patente U. S . No . 5,643,763 Patente U. S . No . 5,648,471 Patente U. S . No . 5,661,016 Patente U. S . No . 5,693,761 Patente U. S . No . 5,693,792 Patente U. S . No . 5,697,902 Patente U. S . No . 5,703,057 Patente U. S . No . 5,714,350 Patente U. S . No . 5,721,367 Patente U. S . No . 5,733,743 Patente U. S . No . 5,770,197 Patente U. S . No . 5,770,429 Patente U. S . No . 5,773,253 Patente u. s. No . 5,777,085 Patente u. s. No . 5,789,215 Patente u. s. No . 5,789,650 Patente u. s. No . 5,811,097

Patente Europeia No. EP 0 546 073 BI

Patente Europeia No. EP 0 463 151 Bl, concessão publicada em 12 de Junho de 1996

Pedido de Patente Internacional No. WO 92/02190

Pedido de Patente Internacional No. WO 92/03918

Pedido de Patente Internacional No. WO 92/22645

Pedido de Patente Internacional No. WO 92/22647 128 ΡΕ1141028

Pedido de Patente Internacional No. WO 92/22670 Pedido de Patente Internacional No. wo 93/00431 Pedido de Patente Internacional No. WO 93/12227 Pedido de Patente Internacional No. wo 94/00569 Pedido de : Patente Internacional No . WO 94/02602 publicado em 3 de Fevereiro de : 1994 Pedido de Patente Internacional No. wo 94/25585 Pedido de Patente Internacional No. WO 94/29444 Pedido de Patente Internacional No. WO 95/01994 Pedido de Patente Internacional No. WO 95/03408 Pedido de Patente Internacional No. WO 95/24217 Pedido de Patente Internacional No. WO 95/33770 Pedido de Patente Internacional No. WO 96/14436 Pedido de : Patente Internacional No . WO 96/34096 publicado em 31 de Outubro de 1996 Pedido de Patente Internacional No . WO 97/13852 Pedido de Patente Internacional No . wo 97/20574 Pedido de Patente Internacional No . wo 97/38137 Pedido de Patente Internacional No . wo 98/24884 Pedido de : Patente Internacional No . WO 98/24893 publicado em 11 de Junho de 1998

Lisboa, 27 de Abril de 2010

Claims

ΡΕ1141028 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um anticorpo monoclonal humano que se liga a CTLA-4, ou um seu fragmento de ligação a antigénio, em que a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:9 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica e a cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:22 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica, anticorpo ou fragmento esse que possui as seguintes propriedades: (a) uma afinidade de ligação a CTLA-4 de 10“9 ou superior; (b) inibe a ligação entre CTLA-4 e B7-1 com um IC50 de 100 nM ou inferior; (c) inibe a ligação entre CTLA-4 e B7-2 com um IC50 de 100 nM ou inferior; e (d) aumenta a produção de citocinas num ensaio de células T humanas a 500 pg/ml ou superior.
2. O anticorpo, ou seu fragmento de ligação ao antigénio, de acordo com a reivindicação 1, em que a sequência de aminoácidos da cadeia pesada compreende as sequências de aminoácidos CDR1, CDR2 e CDR3 do anticorpo 11.2.1 como se mostra na Figura 2.
3. O anticorpo, ou seu fragmento de ligação ao antigénio, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a 2 ΡΕ1141028 sequência de aminoácidos da cadeia leve compreende as sequências de aminoácidos CDR1, CDR2 e CDR3 do anticorpo 11.2.1 como se mostra na Figura 5.
4. 0 anticorpo, ou seu fragmento de ligação ao antigénio, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos do anticorpo 11.2.1 como se mostra na Figura 2.
5. 0 anticorpo, ou seu fragmento de ligação ao antigénio, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que a cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:22.
6. Um anticorpo monoclonal que se liga a CTLA4, em que a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos do anticorpo 11.2.1, como se mostra na Figura 2, e a cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos do anticorpo 11.2.1, como se mostra na Figura 5.
7. Um anticorpo monoclonal humano que se liga a CTLA4, em que a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:70 e a cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:71.
8. Um anticorpo monoclonal humano que se liga a CTLA-4, ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, em que a cadeia pesada do referido anticorpo compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:5 e a cadeia leve do 3 ΡΕ1141028 referido anticorpo compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:18.
9. Um anticorpo monoclonal humano que se liga a CTLA-4, ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, em que a cadeia pesada do referido anticorpo compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:10 e a cadeia leve do referido anticorpo compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:23.
10. Uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antigénio, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9 e um veiculo farmaceuticamente aceitável.
11. Uma linha celular que produz o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antigénio, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9.
12. A linha celular da reivindicação 11 que é uma linha celular de mamifero.
13. A linha celular da reivindicação 12 que é uma linha celular CHO ou uma linha celular NSO.
14. Um ácido nucleico que codifica a cadeia leve e/ou pesada do anticorpo, ou fragmento de ligação ao antigénio, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9. 4 ΡΕ1141028
15. Uma composição farmacêutica, compreendendo o anticorpo, ou fragmentos de ligação ao antigénio, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9 e veiculo farmaceuticamente aceitável, para o tratamento de cancro.
16. Um método para a produção do anticorpo anti-CTLA-4 humano, ou fragmento de ligação ao antigénio, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9 compreendendo a expressão do referido anticorpo, ou fragmento de ligação ao antigénio, numa linha celular hospedeira e recuperação do referido anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio.
17. O método de acordo com a reivindicação 16, em que a referida linha celular hospedeira é uma linha celular de mamífero.
18. 0 método de acordo com a reivindicação 17, em que a referida linha celular de mamífero é uma linha celular CHO ou uma linha celular NSO.
19. O anticorpo, ou fragmento de ligação ao antigénio, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9 para usar no tratamento de cancro. Lisboa, 27 de Abril de 2010