CN114174337A - 针对犬ctla-4的犬源化抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供针对犬CTLA‑4的犬源化鼠抗体，其具有特异性序列和对于犬CTLA‑4的高结合亲和力。本发明进一步提供用于针对犬CTLA‑4的犬源化鼠抗体的犬CTLA‑4的表位。5本发明还涉及这些抗体在治疗犬科动物和其他伴侣动物的癌症中的用途。
Description
相关申请的交叉引用
本申请在35 U.S.C.§119(e)下要求2019年7月15日提交的临时申请美国序列号62/874,287、2019年10月25日提交的美国序列号62/926,047和2020年7月7日提交的美国序列号63/048,873的优先权，将美国序列号62/926,047和美国序列号63/048,873的全部内容通过引用并入本文中。
发明领域
本发明涉及共刺激或共抑制信号传导途径的蛋白质(包括CTLA-4)的抗体。更特别地，本发明进一步涉及针对犬CTLA-4的犬源化抗体(caninized antibodies)，其具有特异性序列和对犬CTLA-4的高结合亲和力。本发明还涉及本发明的抗体在治疗犬科动物的癌症中的用途。
发明内容
免疫应答的起始或终止经由信号传导途径介导，所述信号传导途径由在许多免疫细胞(最值得注意的是T淋巴细胞和抗原呈递细胞(APC))的表面上表达的一组蛋白质之间的复杂相互作用活化。共刺激信号传导途径导致免疫应答的发展，并且已经显示最重要的是通过T细胞表面上的CD28与APC表面上的B7.1(也称为CD80)和B7.2(也称为CD86)家族成员的相互作用介导的。B7.1和B7.2被认为执行类似的功能。
相反，共抑制途径导致免疫应答的抑制或终止，并且已经显示是通过T细胞上的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)和APC上的CD80/CD86蛋白之间的相互作用介导的。已经显示另外的共抑制信号传导途径是通过T细胞上的程序性细胞死亡受体1(PD-1)和APC上的程序性细胞死亡受体配体1或2(PD-L1/PD-L2)蛋白之间的相互作用介导的。此外，还已经显示PD-L1和CD80之间的相互作用也可以在T细胞中产生抑制信号。
CD80和CD86是免疫球蛋白(Ig)超家族的成员[Sharpe和Freeman，NatureReviews，2:116-126(2002)]。CD80在活化的B细胞、活化的T细胞以及巨噬细胞和树突细胞上表达[Swanson and Hall,Eur J.Immunol.,23:295-298(1993)；Razi-Wolfe et al.,PNAS,89:4210-4214(1992)]。CD86在树突状细胞、朗格汉斯细胞和B细胞上组成型表达。此外，CD 86在单核细胞上表达，并且在IFN-γ刺激之后上调[Larsen et al.,Immunol.,152:5208-5219(1994)；Inaba,J.Exp.Med.180:1849-1860(1994)]。
CD80和CD86结合CD 28和CTLA-4，具有不同的功能结果[Linsley et al.,PNAS,87:5031-5035(1990)；Linsley et al.,J.Exp.Med.,173:721-730(1991)；Azuma et al.,Nature 366:76-79(1993)；Freeman et al.,Science 262:909-912(1993)]。CD 80和CD 86与CTLA-4的结合比CD80/CD 86与CD 28的结合具有高得多的亲和力[van der Merwe,J.Exp.Med.185:393-402(1997)]。
CD28是同源二聚体糖蛋白，其是Ig超家族的成员[Aruffo and Seed,PNAS,84:8573-8577(1987)]。成熟蛋白质具有134个氨基酸残基的单个细胞外可变结构域，其包含对反受体(counter receptor)结合必不可少的六肽基序MYPPPY[Riley and June,Blood,105:13–21(2005)]。CD28的41个氨基酸的胞质结构域含有四个酪氨酸残基，其在活化时可以被磷酸化[Sharpe and Freeman,Nat.Rev.Immunol.,2:116–126(2002)]。CD28在大多数CD4+T细胞和约50％的CD8+T细胞上表达[Gross et al.,J.Immunol.,149:380-388(1992)；Riley and June,Blood,105:13–21(2005)]。在T细胞受体(TCR)连接之后，B7.1/B7.2与CD28的结合为T细胞提供了关键的共刺激信号，从而允许T细胞活化和随后的免疫应答发展[Reiser et al.,PNAS,89:271-275(1992)；Jenkins et al.,J.Immunol.,147:2461-2466(1991)]。已经表明，在不存在CD 28信号的情况下，T细胞经历细胞凋亡或进入无应答状态[Jenkins et al.,J.Exp.Med.165:302-319(1987)；Jenkins et al.,PNAS,84:5409-5413(1987)；Schwartz,Science,248:1349-1356(1990)]。CD28-B7.1/B7.2结合可以改变活化所需的TCR连接的阈值水平(例如，抗原-MHC复合物的量)，减少刺激初始细胞所需的时间并增强T细胞应答的幅度[Soskic et al.,Advances in Immunology,124:96-123(2014)]。
CTLA-4(CD152)也是Ig超家族的成员，并且由单个细胞外结构域、跨膜结构域和短胞质尾组成[Swanson,Immunology；1010:169-177(2000)]。另外，CTLA-4与CD28共享约30％的氨基酸同一性。CTLA-4不在初始T细胞上组成型表达，尽管其在CD28连接和T细胞活化之后不久快速上调，其中CTLA-4的峰值表达水平在初始T细胞活化之后约48-96小时[Alegreet al.,J.Immunol.,157:4762-4770(1996)；Freeman et al.,J.Immunol.,149:3795-3801(1992)]。CTLA-4以比CD28高得多的亲和力结合B7.1和B7.2两者[van der Merwe等人，J.Exp.Med.，185:393-402(1997)]。然而，与CD28结合B7.1或B7.2的刺激作用相反，CTLA-4作为抑制性受体起作用，其对于免疫应答的下调是至关重要的[Walnus et al.,Immunity,1:405-413(1994)；Walnus,J.Exp.Med.,183:2541-2550(1996)；Krummel和Allison,J.Exp.Med.,183:2533-2540(1996)]。CTLA-4介导其免疫抑制功能的机制与其充当CD28与CD80/CD86之间相互作用的竞争性抑制剂的能力有关[综述在Swanson,Immunology,1010:169-177(2000)]中。CTLA-4在免疫下调中的关键作用在CTLA-4缺陷的小鼠中得到证实，所述小鼠在3-5周龄时因为发展了以多个器官的T细胞浸润为特征的淋巴增殖性疾病而死亡[Tivol et al.,Immunity,3:541-5417(1995)；Waterhouse et al.,Science,270:985-988(1995)]。还证实CTLA-4敲除的后果取决于CD28与其配体CD80和CD86的相互作用，如在CTLA-4/CD80/CD86三重敲除小鼠中没有疾病所示[Mandelbrot et al.,J.Exp.Med.,189:435-440(1999)]。这也通过在CTLA-4敲除小鼠中重复施用CTLA-4Ig得到的抗淋巴增殖的保护得到证实[Tivol et al.,J Immunol.,158:5091-5094(1997)]。
另外，已经显示用抗体阻断CTLA-4的作用增强体外和体内的T细胞应答，并增加抗肿瘤免疫应答[Leach et al.,Science,271:1734-1736(1996)]。基于这些发现，进行CTLA-4阻断剂如单克隆抗体的开发以提供用于治疗癌症的治疗模态[Hodi et al.,PNAS,100(8):4712-4717(2003)；Phan GQ et al.,PNAS,100(14):8372-8377(2003)；Attia,Journalof Clinical Oncology,23(25):6043-6053(2005)；Comin-Anduix et al.,Journal ofTranslational Medicine,6:22-22(2008)；WO2000037504 A2；U.S.8,017,114 B2；WO2010097597A1；WO2012120125 A1；和Boutros et al.,Nat Rev Clin Oncol.,13(8):473-486(2016)]。
PD-1是CD28/CTLA-4免疫调节受体家族的成员。PD-1也是Ig超家族的成员，并且包含结合其配体的细胞外可变结构域和结合信号传导分子的胞质尾[综述在Zak et al.,Cell Structure,25:1163-1174(2017)]。PD-1的胞质尾包含两个酪氨酸基的信号传导基序[Zhang et al.,Immunity 20:337–347(2004)]。在未刺激的T细胞、B细胞或骨髓细胞上没有发现PD-1表达。然而，在活化之后，PD-1表达在这些细胞上上调[Chemnitz et al.,J.Immunol.,173:945–954(2004)；Petrvas et al.,J.Exp.Med.,203:2281-2292(2006)]。PD-1与CTLA-4最密切相关，共享约24％的氨基酸同一性[Jin et al.,Current Topics inMicrobiology and Immunology,350:17-37(2010)]。当与在APC表面上表达的PD-L1和PD-L2结合时，PD-1减弱T细胞活化。这些配体中的任一种与PD-1的结合负调节经由T细胞受体(TCR)的抗原信号传导。迄今为止，仅发现PD-L1和PD-L2充当PD-1的配体。与CTLA-4一样，PD-1结合似乎传递负免疫调节信号。通过PD-L1或PD-L2连接PD-1导致对TCR介导的增殖和细胞因子产生的抑制[Jin et al.,Current Topics in Microbiology and Immunology,350:17-37(2010)]。与CTLA-4缺陷的动物相反，PD-1缺陷的小鼠在生命中死亡迟得多，并显示自身免疫的迹象，尽管观察到的影响的严重程度不如CTLA-4缺陷的动物显示出的那些严重[Nishimura et al.,Immunity,11(2):141–151(1999)；Nishimura et al.,Science,291(5502):319–322(2001)]。尽管PD-1信号传导途径目前正在进行深入研究，但是迄今为止的研究表明PD-L1/PD-L2/PD-1相互作用参与一些免疫应答的负调节，因为TCR刺激下游的信号减少导致细胞因子分泌减少和T细胞增殖受损以及T细胞产生细胞毒性分子的减少[Freeman et al.,J.Exp.Med.,192(7):1027–1034(2000)]。
PD-L1(CD274)是1型膜蛋白，由IgV样和IgC样细胞外结构域、疏水性跨膜结构域和短胞质尾(由30个氨基酸组成)组成，具有未知的信号转导性质。PD-L1被认为是B7家族的成员，并且与B7家族成员共享约20％的氨基酸同一性。PDL1结合在活化的T细胞、B细胞和骨髓细胞上发现的其受体PD-1。PD-L1还结合共刺激分子CD80，但不结合CD86[Butte et al.,Immunology,45(13):3567–3572(2008)]。CD80对于PD-L1的亲和力介于其对CD28和CTLA-4的亲和力之间。相关分子PD-L2对于CD80或CD86没有亲和力，但共享作为受体的PD-1。PD-L1与T细胞上的其受体PD-1的接合递送抑制TCR介导的IL-2产生和T细胞增殖的信号。PD-L1与PD-1的结合还有助于在向初始T细胞呈递抗原期间配体诱导的TCR下调。另外，PD-L1与T细胞上的CD80结合导致T细胞凋亡。PD1和PD-L1作为T细胞活化抑制剂的作用已经在许多研究中得到证实。基于这些发现，进行PD-1和PD-L1阻断剂如单克隆抗体的开发，以提供用于治疗癌症和感染性疾病的治疗模式。
已经开发了阻断犬PD-1、PDL1和CTLA-4的结合和活性的人源化单克隆抗体，并且目前可用于治疗被诊断患有几种不同类型的癌症之一的人类受试者。类似地，还报道了阻断犬PD-1和PD L1的结合和活性的犬源化单克隆抗体[U.S.9,944,704B2、U.S.10,106,607B2和U.S.2018/0237535A1，将其全部内容通过引用并入本文]。然而，迄今为止还没有阻断犬CTLA-4的结合和活性的犬源化单克隆抗体的任何报道。
本文对任何参考文献的引用不应当被解释为承认这样的参考文献可作为本申请的“现有技术”获得。
发明简述
本发明涉及结合犬CTLA-4的抗犬细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)抗体。在特定的实施方案中，犬CTLA-4的抗体特异性结合犬CTLA-4。在更特定的实施方案中，犬CTLA-4的抗体还具有阻断犬CTLA-4与犬CD80结合的能力。在其它特定实施方案中，犬CTLA-4的抗体还具有阻断犬CTLA-4与犬CD86结合的能力。在仍然其他特定的实施方案中，犬CTLA-4的抗体还同时具有阻断犬CTLA-4与犬CD80结合和阻断犬CTLA-4与犬CD86结合的能力。
此外，本发明涉及由这些抗体所包含的互补决定区(CDR)和这些CDR(例如，从鼠抗犬CTLA-4抗体获得)的组合在犬框架中以形成犬源化抗犬CTLA-4抗体。本发明还涉及这样的抗体在治疗例如癌症的病症中的用途。
因此，本发明提供来自六(6)个示例性的鼠抗犬CTLA-4抗体的独特的CDR组。六种示例性的鼠抗犬CTLA-4抗体具有独特的CDR组，即三个轻链CDR：CDR轻链1(CDRL1)、CDR轻链2(CDRL2)和CDR轻链3(CDRL3)和三个重链CDR：CDR重链1(CDRH1)、CDR重链2(CDRH2)和CDR重链3(CDRH3)。如下详述的，在每组CDR内存在实质性序列同源性，并且甚至存在一些冗余度(例如，参见下表1中的VL CDR-3'组)。因此，本发明不仅提供来自六种示例性的鼠抗犬CTLA-4抗体的六个CDR的氨基酸序列，而且还提供这些CDR的保守修饰的变体，以及与犬CTLA-4的表位所包含的犬CTLA-4包含(例如，共享)相同的规范结构(canonicalstructure)和/或与其一个或多个(例如，1、2、3、4或更多个)氨基酸残基结合的变体。
本发明的一个方面提供结合犬细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)的哺乳动物抗体。在特定的实施方案中，本发明的哺乳动物抗体或其抗原结合片段是鼠抗体。在优选的实施方案中，本发明的哺乳动物抗体(包括本发明的鼠抗体)或其抗原结合片段是犬源化抗体或其犬源化抗原结合片段。
在特定的实施方案中，哺乳动物抗体特异性结合犬CTLA-4。在更特定的实施方案中，犬CTLA-4的哺乳动物抗体还具有阻断犬CTLA-4与犬CD80结合的能力。在其他特定的实施方案中，犬CTLA-4的哺乳动物抗体还具有阻断犬CTLA-4与犬CD86结合的能力。在仍然其它特定实施方案中，犬CTLA-4的哺乳动物抗体具有阻断犬CTLA-4与犬CD 80结合和阻断犬CTLA-4与犬CD 86结合两者的能力。
在某些实施方案中，结合犬CTLA-4的哺乳动物抗体是分离的抗体。本发明还提供结合犬CTLA-4的任何这些哺乳动物抗体的抗原结合片段。在特定的实施方案中，抗体包含三个轻链互补决定区：CDR轻链1(CDRL1)、CDR轻链2(CDRL2)和CDR轻链3(CDRL3)；和三个重链CDR：CDR重链1(CDRH1)、CDR重链2(CDRH2)和CDR重链3(CDRH3)。
在特定的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段包含CDRH3，其包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列、SEQ ID NO:90的氨基酸序列的保守修饰的变体或包含规范结构类别7的SEQ ID NO:90的变体。在更特定的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段进一步包含CDRH2，其包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列、SEQ ID NO:88的氨基酸序列的保守修饰的变体或包含规范结构类别2A的SEQ ID NO:88的变体。在甚至更特定的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段还进一步包含：包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的CDRH1，包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的保守修饰的变体或包含规范结构类别1的SEQID NO:86的变体的CDRH1。在仍然更特定的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段还进一步包含CDRH3，其包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列、SEQ ID NO:96的氨基酸序列的保守修饰的变体或包含规范结构类别1的SEQ ID NO:96的变体。在仍然更特定的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段进一步包含CDRH2，其包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列、SEQ ID NO:94的氨基酸序列的保守修饰的变体或包含规范结构类别1的SEQ ID NO:94的变体。在甚至更特定的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段还进一步包含CDRL1，其包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列，SEQ ID NO:92的氨基酸序列的保守修饰的变体或包含规范结构类别4的SEQ ID NO:92的变体。
在可替代的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段包含CDRH3，其包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列，SEQ ID NO:102的氨基酸序列的保守修饰的变体或包含规范结构类别9的SEQ ID NO:102的变体。在甚至更特定的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段进一步包含CDRH2，其包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列，SEQ ID NO:100的氨基酸序列的保守修饰的变体或包含规范结构类别4的SEQ ID NO:100的变体。在甚至更特定的实施方案中，哺乳动物抗体或其抗原结合片段还进一步包含：包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列的CDRH1，包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列的保守修饰的变体或包含规范结构类别1的SEQ ID NO:98的变体的CDRH1。在仍然更特定的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段还进一步包含CDRL3，其包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列、SEQ ID NO:108的氨基酸序列的保守修饰的变体或包含规范结构类别1的SEQ ID NO:108的变体。在仍然更特定的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段还进一步包含CDRL2，其包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列、SEQ ID NO:106的氨基酸序列的保守修饰的变体或包含规范结构类别1的SEQ ID NO:106的变体。在甚至更特定的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段还进一步包含CDRL1，其包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列，SEQ ID NO:104的氨基酸序列的保守修饰的变体或包含规范结构类别1的SEQ ID NO:104的变体。
在其它可替代的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段包含CDRH3，其包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列，SEQ ID NO:113的氨基酸序列的保守修饰的变体或包含规范结构类别7的SEQ ID NO:113的变体。在更特定的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段进一步包含CDRH2，其包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列，SEQ ID NO:88的氨基酸序列的保守修饰的变体或包含规范结构类别2A的SEQ ID NO:88的变体。在甚至更特定的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段还进一步包含：包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的CDRH1，包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的保守修饰的变体或包含规范结构类别1的SEQ ID NO:86的变体的CDRH1。在仍然更特定的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段还进一步包含CDRL3，其包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列，SEQ ID NO:96的氨基酸序列的保守修饰的变体或包含规范结构类别1的SEQ ID NO:96的变体。在仍然更特定的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段还进一步包含CDRL2，其包含SEQ IDNO:94的氨基酸序列，SEQ ID NO:94的氨基酸序列的保守修饰的变体或包含规范结构类别1的SEQ ID NO:94的变体。在甚至更特定的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段还进一步包含CDRL1，其包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列，SEQ ID NO:117的氨基酸序列的保守修饰的变体或包含规范结构类别4的SEQ ID NO:117的变体。
在仍然其它可替代的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段包含CDRH3，其包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列，SEQ ID NO:115的氨基酸序列的保守修饰的变体或包含规范结构类别7的SEQ ID NO:115的变体。在更特定的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段进一步包含CDRH2，其包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列，SEQ ID NO:88的氨基酸序列的保守修饰的变体或包含规范结构类别2A的SEQ ID NO:88的变体。在甚至更特定的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段还进一步包含：包含SEQ IDNO:86的氨基酸序列的CDRH1，包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的保守修饰的变体或包含规范结构类别1的SEQ ID NO:86的变体的CDRH1。在仍然更特定的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段还进一步包含CDRL3，其包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列，SEQ IDNO:96的氨基酸序列的保守修饰的变体或包含规范结构类别1的SEQ ID NO:96的变体。在仍然更特定的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段还进一步包含CDRL2，其包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列，SEQ ID NO:122的氨基酸序列的保守修饰的变体或包含规范结构类别1的SEQ ID NO:122的变体。在甚至更特定的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段还进一步包含CDRL1，其包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列，SEQ ID NO:119的氨基酸序列的保守修饰的变体或包含规范结构类别4类的SEQ ID NO:119的变体。
在仍然其它可替代的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段包含CDRH3，其包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列，SEQ ID NO:114的氨基酸序列的保守修饰的变体或包含规范结构类别7的SEQ ID NO:114的变体。在更特定的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段进一步包含CDRH2，其包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列，SEQ IDNO:111的氨基酸序列的保守修饰的变体或包含规范结构类别2A的SEQ ID NO:111的变体。在甚至更特定的实施方案中，哺乳动物抗体或其抗原结合片段还进一步包含：包含SEQ IDNO:109的氨基酸序列的CDRH1，包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列的保守修饰的变体或包含规范结构类别1的SEQ ID NO:109的变体的CDRH1。在仍然更特定的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段还进一步包含CDRL3，其包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列，SEQ IDNO:96的氨基酸序列的保守修饰的变体或包含规范结构类别1的SEQ ID NO:96的变体。在仍然更特定的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段还进一步包含CDRL2，其包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列，SEQ ID NO:121的氨基酸序列的保守修饰的变体或包含规范结构类别1的SEQ ID NO:121的变体。在甚至更特定的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段还进一步包含CDRL1，其包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列，SEQ ID NO:118的氨基酸序列的保守修饰的变体或包含规范结构类别4类的SEQ ID NO:118的变体。
在仍然其它可替代的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段包含CDRH3，其包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列，SEQ ID NO:116的氨基酸序列的保守修饰的变体或包含规范结构类别12的SEQ ID NO:116的变体。在更特定的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段进一步包含CDRH2，其包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列，SEQ IDNO:112的氨基酸序列的保守修饰的变体或包含规范结构类别2A的SEQ ID NO:112的变体。在甚至更特定的实施方案中，哺乳动物抗体或其抗原结合片段还进一步包含：包含SEQ IDNO:110的氨基酸序列的CDRH1，包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列的保守修饰的变体或包含规范结构类别1的SEQ ID NO:110的变体的CDRH1。在仍然更特定的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段还进一步包含CDRL3，其包含SEQ ID NO:124的氨基酸序列，SEQID NO:124的氨基酸序列的保守修饰的变体或包含规范结构类别1的SEQ ID NO:124的变体。在仍然更特定的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段还进一步包含CDRL2，其包含SEQ ID NO:123的氨基酸序列，SEQ ID NO:123的氨基酸序列的保守修饰的变体或包含规范结构类别1的SEQ ID NO:123的变体。在甚至更特定的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段还进一步包含CDRL1，其包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列，SEQID NO:120的氨基酸序列的保守修饰的变体或包含规范结构类别2的SEQ ID NO:120的变体。
如上所述，针对犬CTLA-4的犬源化抗体或其犬源化抗原结合片段是本发明的一个重要方面，并且本发明提供所有这样的哺乳动物抗体的犬源化哺乳动物抗体，包括犬源化鼠抗体。因此，本发明还提供特异性结合CTLA-4的分离的犬源化抗体或其抗原结合片段，其包含犬IgG重链和犬κ或λ轻链。在这种类型的特定实施方案中，所述犬κ或λ轻链包含三个轻链互补决定区(CDR)：CDR轻链1(CDRL1)、CDR轻链2(CDRL2)和CDR轻链3(CDRL3)；并且所述犬IgG重链包含三个重链CDR：CDR重链1(CDRH1)、CDR重链2(CDRH2)和CDR重链3(CDRH3)，其获自鼠抗犬CTLA-4抗体。本发明的犬源化抗体及其抗原结合片段的特定实施方案结合犬CTLA-4和/或阻断犬CTLA-4与犬CD80和/或犬CD86的结合。
本发明的犬源化抗体或其犬源化抗原结合片段可包含含有铰链区的IgGD，所述铰链区包含SEQ ID NO:128的氨基酸序列。在一个相关的实施方案中，铰链区包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列。在仍然另一个相关的实施方案中，铰链区包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列。在仍然另一个相关的实施方案中，铰链区包含SEQ ID NO：131的氨基酸序列。
在可替代的实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的重链。在这种类型的特定实施方案中，所述重链由SEQ ID NO:61的核苷酸序列编码。在其它实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:64的氨基酸序列的重链。在这种类型的特定实施方案中，所述重链由SEQ ID NO:63的核苷酸序列编码。在仍然其它实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链。在这种类型的特定实施方案中，重链由SEQID NO:65的核苷酸序列编码。在更特定的实施方案中，所述犬源化抗体进一步包含含有SEQID NO:50的氨基酸序列的轻链。在这种类型的特定实施方案中，所述轻链由SEQ ID NO:49的核苷酸序列编码。在其它特定实施方案中，所述犬源化抗体还包含含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的轻链。在这种类型的特定实施方案中，所述轻链由SEQ ID NO:51的核苷酸序列编码。在仍然其它特定实施方案中，所述犬源化抗体进一步包含含有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的轻链。在这种类型的特定实施方案中，所述轻链由SEQ ID NO:53的核苷酸序列编码。
在可替代的实施方案中，所述犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的修饰的重链。在这种类型的特定实施方案中，所述修饰的重链由SEQ ID NO:73的核苷酸序列编码。在其它实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:76的氨基酸序列的修饰的重链。在这种类型的特定实施方案中，所述修饰的重链由SEQ ID NO:75的核苷酸序列编码。在仍然其它的实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的修饰的重链。在这种类型的特定实施方案中，所述修饰的重链由SEQ ID NO:77的核苷酸序列编码。在更特定的实施方案中，所述犬源化抗体进一步包含含有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的轻链。在这种类型的特定实施方案中，所述轻链由SEQ ID NO:49的核苷酸序列编码。在其它的特定的实施方案中，所述犬源化抗体进一步包含含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的轻链。在这种类型的特定实施方案中，所述轻链由SEQ ID NO:51的核苷酸序列编码。在仍然其它特定实施方案中，所述犬源化抗体进一步包含含有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的轻链。在这种类型的特定实施方案中，所述轻链由SEQ ID NO:53的核苷酸序列编码。
在特定的实施方案中，所述犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的轻链。在其它实施方案中，所述犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的轻链。
在可替代的实施方案中，所述犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的修饰的重链和含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的轻链。在其它实施方案中，所述犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的修饰的重链和含有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的轻链。
在其它实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的重链。在这种类型的特定实施方案中，所述重链由SEQ ID NO:67的核苷酸序列编码。在其它实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的重链。在这种类型的特定实施方案中，所述重链由SEQ ID NO:69的核苷酸序列编码。在仍然其它的实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的重链。在这种类型的特定实施方案中，所述重链由SEQ ID NO:71的核苷酸序列编码。在更特定的实施方案中，所述犬源化抗体进一步包含含有SEQ ID NO:56的氨基酸序列的轻链。在这种类型的特定实施方案中，所述轻链由SEQ IDNO:55的核苷酸序列编码。在其它特定实施方案中，所述犬源化抗体进一步包含含有SEQ IDNO:58的氨基酸序列的轻链。在这种类型的特定实施方案中，所述轻链由SEQ ID NO:57的核苷酸序列编码。在仍然其它的特定实施方案中，所述犬源化抗体进一步包含含有SEQ IDNO:60的氨基酸序列的轻链。在这种类型的特定实施方案中，所述轻链由SEQ ID NO:59的核苷酸序列编码。
在可替代的实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的修饰的重链。在这种类型的特定实施方案中，所述修饰的重链由SEQ ID NO:79的核苷酸序列编码。在其它实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:82的氨基酸序列的修饰的重链。在这种类型的特定实施方案中，所述修饰的重链由SEQ ID NO:81的核苷酸序列编码。在仍然其它的实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:84的氨基酸序列的修饰的重链。在这种类型的特定实施方案中，所述修饰的重链由SEQ ID NO:83的核苷酸序列编码。在更特定的实施方案中，所述犬源化抗体进一步包含含有SEQ ID NO:56的氨基酸序列的轻链。在这种类型的特定实施方案中，所述轻链由SEQ ID NO:55的核苷酸序列编码。在其它特定实施方案中，所述犬源化抗体进一步包含含有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的轻链。在这种类型的特定实施方案中，所述轻链由SEQ ID NO:57的核苷酸序列编码。在仍然其它特定实施方案中，所述犬源化抗体进一步包含含有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的轻链。在这种类型的特定实施方案中，所述轻链由SEQ ID NO:59的核苷酸序列编码。
在特定的实施方案中，所述犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的修饰的重链和含有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的轻链。在其它实施方案中，所述犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的轻链。
在可替代的实施方案中，所述犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:84的氨基酸序列的修饰的重链和含有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的轻链。在其它实施方案中，所述犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:84的氨基酸序列的修饰的重链和含有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的轻链。
本发明进一步提供以低于1×10-12M(例如，5X 10-13M或更低)的解离常数(Kd)结合犬CTLA-4的哺乳动物抗体或其抗原结合片段。在其它实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段以1×10-5M至1×10-12M的解离常数结合犬CTLA-4。在更特定的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段以1×10-7M至1×10-11M的解离常数结合犬CTLA-4。在仍然更特定的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段以1×10-8M至1×10-11M的解离常数结合犬CTLA-4。在仍然更特定的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段以1×10-8M至1×10-10M的解离常数结合犬CTLA-4。
本发明还提供以大于1×107M-1s-1的结合速率(on rate)(kon)结合犬CTLA-4的哺乳动物抗体或其抗原结合片段。在其它实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段以1×102M-1s-1至1×107M-1s-1的结合速率结合犬CTLA-4。在更特定的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段以1×103M-1s-1至1×106M-1s-1的结合速率结合犬CTLA-4。在更特定的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段以1×103M-1s-1至1×105M-1s-1的结合速率结合犬CTLA-4。在仍然更特定的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段以1×104M-1s-1至1×105M-1s-1的速率结合犬CTLA-4。
本发明进一步提供以低于1×10-7s-1的解离速率(off rate)(koff)结合犬CTLA-4的哺乳动物抗体或其抗原结合片段。在其它实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段以1×10-3s-1至1×10-8s-1的解离速率结合犬CTLA-4。在更特定的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段以1×10-4s-1至1×10-7s-1的解离速率结合犬CTLA-4。在仍然更特定的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段以1×10-5s-1至1×10-7s-1的解离速率结合犬CTLA-4。
在特定的实施方案中，本发明的哺乳动物抗体(包括嵌合抗体)阻断犬CD80和/或CD86与犬CTLA-4的结合。在更特定的实施方案中，所述抗体以1×10-8M至1×10-9M或甚至更低浓度的最小EC50阻断犬CD80和/或CD86与犬CTLA-4的结合。在仍然更特定的实施方案中，EC50为5×10-9M至5×10-13M。因此，在仍然更特定的实施方案中，EC50在5×10-9M至5×10-11M之间。因此，在特定的实施方案中，本发明的抗体可以显示出一种、两种、三种、四种或所有这些性质，即上述与犬CTLA-4的解离常数、上述与犬CTLA-4结合的结合速率、上述从抗体-犬CTLA-4结合复合物解离的解离速率，或有效治疗动物受试者中的癌症。
本发明进一步提供与本文公开的哺乳动物抗体交叉竞争的犬源化哺乳动物抗体和抗原结合片段。在特定的实施方案中，所述犬源化哺乳动物抗体与包含45A9的6个CDR的抗体交叉竞争[参见下表1]。在相关的实施方案中，所述犬源化哺乳动物抗体与包含27G12的6个CDR的抗体交叉竞争[参见下表1]。在仍然其它相关的实施方案中，所述犬源化哺乳动物抗体与包含22A11的6个CDR的抗体交叉竞争[参见下表1]。在仍然相关的实施方案中，所述犬源化哺乳动物抗体与包含110E3的6个CDR的抗体交叉竞争[参见下表1]。在特定的实施方案中，所述犬源化哺乳动物抗体与包含12B3的6个CDR的抗体交叉竞争[参见下表1和3]。在其它特定实施方案中，所述犬源化哺乳动物抗体与包含39A11的6个CDR的抗体交叉竞争[参见下表1和3]。在特定的实施方案中，测定是标准结合测定。在一个这样的实施方案中，用
进行标准结合测定。在另一个这样的实施方案中，标准结合测定用ELISA进行。在仍然另一个这样的实施方案中，标准结合测定通过流式细胞术进行。
如上所述，本发明的抗体(和其抗原结合片段)，包括前述抗体(和其抗原结合片段)，可以是单克隆抗体(和其抗原结合片段)，哺乳动物抗体(和其抗原结合片段)例如鼠(小鼠)抗体(和其抗原结合片段)，犬源化抗体(和其抗原结合片段)，包括犬源化鼠抗体(和其抗原结合片段)。在某些实施方案中，抗体(和其抗原结合片段)是分离的。
在优选的实施方案中，本发明的犬源化抗体或其抗原性片段结合犬CTLA-4的氨基酸序列的表位。在一个特定的实施方案中，所述犬源化抗体与SEQ ID NO:138的氨基酸序列的位置T35、R38、T51、T53、Y90、K93、Y98和Y102处的一个或多个氨基酸残基相互作用。在另一个实施方案中，所述犬源化抗体与SEQ ID NO:138的氨基酸序列的位置35T、R38、S42、K93和Y102处的氨基酸残基中的一个或多个相互作用。
本发明进一步提供结合SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134、SEQ IDNO:135、SEQ ID NO:136和SEQ ID NO:137的氨基酸序列的一个或多个表位或其部分的犬源化抗体。在特定实施方案中，本发明的犬源化抗体或其抗原片段结合由SEQ ID NO:132的氨基酸序列所包含的表位或其部分。在这种类型的一个更特定的实施方案中，所述表位或其部分由SEQ ID NO:134的氨基酸序列所包含。在这种类型的另一个实施方案中，所述表位或其部分由SEQ ID NO:135的氨基酸序列所包含。在某些实施方案中，所述表位或其部分由SEQ ID NO:133的氨基酸序列所包含。在这种类型的一个更特定的实施方案中，所述表位或其部分由SEQ ID NO:136的氨基酸序列所包含。在相关的实施方案中，所述犬源化抗体结合由SEQ ID NO:134和/或SEQ ID NO:136和/或SEQ ID NO:135的氨基酸序列所包含的一个或多个表位或其部分。
本发明还提供编码本发明的犬源化抗体的任一个轻链的核酸(包括分离的和/或重组的核酸)。类似地，本发明提供编码本发明的犬源化抗体的任一个重链的分离的核酸(包括分离的和/或重组的核酸)。
本发明进一步提供包含一种或多种本发明的核酸(包括分离的核酸)的表达载体。本发明还提供包含一种或多种本发明的表达载体的宿主细胞。
在特定的实施方案中，抗体是重组抗体或其抗原结合片段。在相关的实施方案中，可变重链结构域和可变轻链结构域通过柔性接头连接以形成单链抗体。在特定的实施方案中，抗体或抗原结合片段是Fab片段。在其它实施方案中，抗体或抗原结合片段是Fab'片段。在仍然其它实施方案中，抗体或抗原结合片段是(Fab')2片段。在仍然其它实施方案中，抗体或抗原结合片段是双抗体。在特定的实施方案中，抗体或抗原结合片段是结构域抗体。在特定的实施方案中，抗体或抗原结合片段是单结构域抗体。
在特定的实施方案中，犬源化鼠抗犬CTLA-4抗体或抗原结合片段结合正在治疗癌症的动物受试者(例如，犬)中的CTLA-4。在更特定的实施方案中，施用本发明的犬源化鼠抗犬CTLA-4抗体或抗原结合片段用于改善正在治疗的动物受试者(例如，犬科动物)中癌症的一种或多种症状。
本发明进一步提供编码犬源化鼠抗犬CTLA-4抗体或其部分的分离的核酸。在相关的实施方案中，这样的抗体或抗原结合片段可用于制备治疗犬科动物受试者中的癌症的药物。可替代地或联合地，本发明提供本发明的任何抗体或抗体片段用于诊断用途的用途。在另外的实施方案中，提供包含本文公开的任何犬源化抗体或抗原结合片段的试剂盒。
本发明进一步提供结合本发明的犬源化抗体的分离的肽，其包含5至25个氨基酸残基，且与SEQ ID NO:132的氨基酸序列90％相同或更高。在特定的实施方案中，所述分离的肽与SEQ ID NO:132的氨基酸序列相同。在更特定的实施方案中，所述分离的肽包含10至20个氨基酸残基。在相关的实施方案中，所述分离的肽结合本发明的犬源化抗体，包含5至25个氨基酸残基，且与SEQ ID NO:133的氨基酸序列90％相同或更高。在特定的实施方案中，所述分离的肽与SEQ ID NO:133的氨基酸序列相同。在这种类型的更特定的实施方案中，所述分离的肽包含10至20个氨基酸残基。
在仍然其它实施方案中，结合本发明的犬源化抗体的分离的肽包含与SEQ ID NO:134的氨基酸序列90％相同或更高的氨基酸序列。在仍然其它实施方案中，所述分离的肽包含与SEQ ID NO:134的氨基酸序列相同的氨基酸序列。在其它实施方案中，与本发明的犬源化抗体结合的分离的肽包含与SEQ ID NO:135的氨基酸序列90％相同或更高的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述分离的肽包含与SEQ ID NO:135的氨基酸序列相同的氨基酸序列。在其它实施方案中，结合本发明的犬源化抗体的分离的肽包含与SEQ ID NO:136的氨基酸序列90％相同或更高的氨基酸序列。在仍然其它实施方案中，所述分离的肽包含与SEQID NO:136的氨基酸序列相同的氨基酸序列。
本发明进一步提供融合蛋白，其包含结合本发明的犬源化抗体的这样的分离的肽。本发明进一步提供包含任一种上述肽的融合蛋白。在一个特定的实施方案中，所述融合蛋白包含这样的抗原肽和非犬哺乳动物IgG抗体的Fc区。在一个更特定的实施方案中，融合蛋白包含非犬哺乳动物IgG抗体的Fc区。在某些实施方案中，所述非犬哺乳动物IgG抗体是鼠IgG。在可替代的实施方案中，所述非犬哺乳动物IgG抗体是人IgG。在其它实施方案中，所述非犬哺乳动物IgG抗体是马IgG。在仍然其它实施方案中，所述非犬哺乳动物IgG抗体是猪IgG。在仍然其它实施方案中，所述非犬哺乳动物IgG抗体是牛IgG。
在特定的实施方案中，所述非犬哺乳动物IgG抗体是IgG1。在其它实施方案中，所述非犬哺乳动物IgG抗体是IgG2a。在仍然其它实施方案中，所述非犬哺乳动物IgG抗体是IgG3。在仍然其它实施方案中，所述非犬哺乳动物IgG抗体是IgG4。在其它实施方案中，所述融合蛋白包含任何上述抗原肽和麦芽糖结合蛋白。在仍然其它实施方案中，所述融合蛋白包含任何上述抗原肽和β-半乳糖苷酶。在仍然其它实施方案中，所述融合蛋白包含任何前述抗原肽和谷胱甘肽S转移酶。在仍然其它实施方案中，所述融合蛋白包含任何前述抗原肽和硫氧还蛋白。在仍然其他实施方案中，所述融合蛋白包含任何前述抗原肽和Gro El。在仍然其它实施方案中，所述融合蛋白包含任何前述抗原肽和NusA。
本发明还提供编码本发明的一种或多种分离的免疫原性和/或抗原性肽和/或融合蛋白的核酸(包括分离的和/或重组的核酸)。本发明进一步提供包含这样的分离的核酸的表达载体，以及包含一种或多种本发明的表达载体的宿主细胞。
药物组合物也可以包含来自犬CTLA-4的抗原肽(包括分离的抗原肽)、包含本发明的来自犬CTLA-4的抗原肽的融合蛋白、编码本发明的抗原片段和/或融合蛋白的核酸(包括分离的核酸)、包含这样的核酸的表达载体或其任何组合，以及可药用载体或稀释剂。此外，本发明包括包含本发明的抗犬CTLA-4抗体(包括犬源化鼠抗犬CTLA-4抗体)或其抗原结合片段的药物组合物。这样的药物组合物可用于治疗癌症、感染或感染性疾病，用作疫苗佐剂，和/或用于增加免疫细胞活性的方法中，包括向需要其的受试者施用治疗有效量的所述药物组合物。
在特定的实施方案中，这样的药物组合物进一步包含抗犬PD-1抗体(包括犬源化鼠抗犬PD-1抗体)或其抗原结合片段。在更特定的实施方案中，所述抗犬PD-1抗体是犬源化鼠抗犬PD-1抗体或所述犬源化鼠抗犬PD-1抗体的抗原结合片段。
在相关的实施方案中，这样的药物组合物进一步包含抗犬PD-L1抗体(包括犬源化鼠抗犬PD-L1抗体)或其抗原结合片段。在特定的实施方案中，所述抗犬PD-L1抗体是犬源化鼠抗犬PD-1抗体或犬源化鼠抗犬PD-1抗体的抗原结合片段。
因此，本发明提供包含下述中的一种、两种、三种或更多种的药物组合物：抗犬PD-L1抗体、抗犬PD-1抗体、抗犬CTLA-4抗体、抗犬PD-L1抗体的抗原结合片段、抗犬PD-1抗体的抗原结合片段或抗犬CTLA-4抗体的抗原结合片段。在特定的实施方案中，这样的抗犬蛋白(即，抗犬PD-L1、PD-1或CTLA-4)抗体或其抗原结合片段是鼠抗犬蛋白抗体。在其它实施方案中，这样的抗犬蛋白抗体或其抗原结合片段是犬源化抗犬蛋白抗体。在更特定的实施方案中，所述抗犬蛋白抗体或其抗原结合片段是犬源化鼠抗犬蛋白抗体。
此外，本发明提供增加免疫细胞的活性的方法，其包括向需要其的受试者施用治疗有效量的本发明的药物组合物。在某些实施方案中，所述方法用于治疗癌症。在其它实施方案中，所述方法用于治疗感染或感染性疾病。在仍然其它实施方案中，本发明的犬源化抗体或其抗原结合片段用作疫苗佐剂。在特定的实施方案中，包含犬源化鼠抗犬CTLA-4抗体或其抗原结合片段的药物组合物可以在犬源化鼠抗犬PD-1抗体或其抗原结合片段和/或犬源化鼠抗犬PD-L1抗体或其抗原结合片段之前、之后或同时施用。
通过参考以下附图简述和详细说明将更好地理解本发明的这些和其它方面。
附图简述
图1显示六种抗体与犬CTLA-4(cCTLA-4)的结合活性。因此，图1描绘了在ELISA中加入到犬CTLA-4中的单独犬CTLA-4抗体的量(以ng/mL计)(Ab log)的图，其证实了抗体与cCTLA-4的结合活性。犬CTLA-4的单独抗体表示为27G12、110E3、12B3、45A9、39A11和22A11。
图2描绘了阻断犬CD86与CTLA-4的相互作用的抗体。该图描绘了加入到cCTLA-4中以干扰犬CTLA-4与CD86结合的单独犬CTLA-4抗体的量(以ng/mL计)(Ab log)的图。针对犬CTLA-4的段都抗体表示为39A11、27G12、45A9、12B3、110E3和22A11。如可以看出的，所述抗体可以阻断犬CD86与CTLA-4的相互作用。
图3描绘了阻断犬CD80与CTLA-4的相互作用的抗体。该图描绘了加入到cCTLA-4中以干扰犬CTLA-4与CD80结合的单独犬CTLA-4抗体的量(以ng/mL计)(Ab log)的图。针对犬CTLA-4的单独抗体表示为39A11、27G12、45A9、12B3、110E3和22A11。如可以看出的，所述抗体也可以阻断犬CD80与CTLA-4的相互作用。
图4A-4G描绘结合表达犬CTLA-4的CHO细胞的抗体。图4A是同种型对照(Iso-control)，图4B是39A11，图4C是27G12，图4D是12B3，图4E是45A9，图4F是110E3，并且图4G是22A11。如可以看出的，所述抗体可以结合表达cCTLA-4的CHO细胞。
图5描绘定量在伴刀豆球蛋白A(CoA)存在下活化犬PBMC细胞以产生IFNγ的以25μg/ml、50μg/ml或100μg/ml(Ab)加入的单独犬CTLA-4抗体的三种递减浓度的柱状图。测试的抗体在横坐标上，标记为CTLA-4单克隆抗体(xCTLA-4mAb)。如可以看出的，所述抗体可以活化犬PBMC细胞以产生IFNγ。
图6描绘与亲本抗体具有与犬CTLA-4相同反应性的CTLA-4单克隆抗体(xCTLA-4；Ab log ng/ml)的量的图。ELISA结果表明12B3和39A11均被成功犬源化。犬源化的c12B3L3H2和L3H3与亲本12B3具有与cCTLA-4相似的反应性，并且犬源化的C39A11L3H3与亲本39A11具有与cCTLA-4相似的反应性。
图7A-7B提供cCTLA-4上的C12B3(图7A)和C39A11(图7B)的结合表位。描绘了犬CTLA-4蛋白的两个区域，其分别具有SEQ ID NO:132和SEQ ID NO:133的氨基酸序列(参见下表8)。两种抗体均结合含有MYPPPY基序(SEQ ID NO:137)的氨基酸序列SEQ ID NO:136，并结合SEQ ID NO:134的氨基酸序列。c12B3还结合SEQ ID NO:135的氨基酸序列。
发明详述
缩写
在本发明的整个详细说明和实施例中，将使用以下缩写：
ADCC 抗体依赖性细胞毒性
CDC 补体依赖性细胞毒性
CDR 免疫球蛋白可变区中的互补决定区，使用Kabat编号系统定义
CHO 中国仓鼠卵巢
EC50 导致50％功效或结合的浓度
ELISA 酶联免疫吸附测定
FR 抗体框架区：不包括CDR区的免疫球蛋白可变区。
HRP 辣根过氧化酶
IFN 干扰素
IC50 导致50％抑制的浓度
IgG 免疫球蛋白G
Kabat 由Elvin A.Kabat[Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)]开创的免疫球蛋白比对和编号系统
mAb 单克隆抗体(也称为Mab或MAb)
MES 2-(N-吗啉代)乙磺酸
MOA 作用机制
NHS 正常人血清
PCR 聚合酶链反应
PK 药代动力学
SEB 葡萄球菌肠毒素B
TT 破伤风类毒素
V区 在不同抗体之间在序列上可变的IgG链的区段。其延伸至轻链中的Kabat残基109和重链中的Kabat残基113。
VH 免疫球蛋白重链可变区
VL 免疫球蛋白轻链可变区
VK 免疫球蛋白κ轻链可变区
定义
为了可以更容易地理解本发明，下面特别地定义了某些技术和科学术语。除非在本文中其它地方特别地定义，否则本文中使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。
如本文(包括所附权利要求书)使用的，除非上下文另有明确规定，否则词语的单数形式比如“一”、“一个(种)”和“该”包括其相应的复数指代。
“CTLA-4”是“细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4”的缩写，也称为CD152(分化簇152)，其是起免疫检查点并下调免疫应答作用的蛋白质受体。犬CTLA-4的氨基酸序列是SEQ IDNO:126。本发明进一步提供针对犬CTLA-4的犬源化鼠抗体。
除非上下文另外指出或明确指出，否则“活化”在其应用于细胞或受体时指用配体活化或处理细胞或受体。“活化”可以指由内部机制以及外部或环境因素调节的细胞活化。
“配体”涵盖天然和合成配体，例如细胞因子、细胞因子变体、类似物、突变蛋白和衍生自抗体的结合化合物。“配体”还涵盖小分子，例如细胞因子的肽模拟物和抗体的肽模拟物。
分子的“活性”可以描述或指分子与配体或受体的结合、催化活性；刺激基因表达或细胞信号传导、分化或成熟的能力；抗原活性、其他分子活性的调节等。分子的“活性”还可以指调节或维持细胞与细胞相互作用(例如粘附)的活性，或维持细胞结构(例如细胞膜或细胞骨架)的活性。“活性”还可以意味着比活性，例如[催化活性]/[mg蛋白质]或[免疫活性]/[mg蛋白质]、生物区室中的浓度等。“活性”可以指先天或适应性免疫系统的组分的调节。
“施用”和“处理”在其应用于动物(例如犬科动物受试者)、细胞、组织、器官或生物流体时指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物(例如犬科动物受试者)、细胞、组织、器官或生物流体的接触。细胞的处理涵盖试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中流体与细胞接触。
“施用”和“处理”还指例如通过试剂、诊断剂、结合化合物或通过另一种细胞对细胞的体外和离体处理。
术语“受试者”包括任何生物体，优选动物，更优选哺乳动物(例如犬科动物、猫科动物或人)，最优选犬科动物。
“治疗(treat)”或“处理(treating)”指在内部或外部向例如具有一种或多种疾病症状或疑似患有疾病的犬科动物受试者或患者施用治疗剂，例如含有本发明的任何抗体或抗原结合片段的组合物，所述试剂对所述犬科动物受试者或患者具有治疗活性。
通常，所述试剂以有效地减轻和/或改善受治疗的受试者或群体中的一种或多种疾病症状的量施用，无论是以任何临床上可测量的程度上诱导这样的症状的消退或抑制这样的症状的进展。有效地减轻任何具体疾病症状的治疗剂的量(也被称为“治疗有效量”)可以根据因素比如患者(例如，犬科动物)的疾病状态、年龄和重量以及药物组合物在受试者中引发期望应答的能力而变化。可以通过兽医或其他熟练的卫生保健提供者通常使用的任何临床测量以评估该症状的严重程度或进展状态来评价疾病症状是否已经减轻或改善。尽管本发明的实施方案(例如，治疗方法或制品)可能不会在减轻每个受试者中的靶疾病症状中都有效，但是其应当减轻统计学上显著数目的受试者中的靶疾病症状，如通过本领域已知的任何统计学检验(例如学生t-检验、卡方检验、根据Mann和Whitney的U-检验、Kruskal-Wallis检验(H-检验)、Jonckheere-Terpstra-检验和Wilcoxon-检验)所确定的。
“治疗”在其应用于人、兽医(例如犬科动物)或研究受试者时，指治疗性处理以及研究和诊断应用。当其应用于人、兽医(例如犬科动物)或研究受试者或细胞、组织或器官时，“治疗”涵盖本发明的抗体或抗原结合片段与例如犬科动物或其他动物受试者、细胞、组织、生理区室或生理流体的接触。
除非另有说明，否则如本文使用的术语“犬科动物”包括所有家养狗、家犬(Canislupus familiaris或Canis familiaris)。
如本文使用的术语“猫科动物”指猫科(Felidae)的任何成员。该科的成员包括野生、动物园和家养成员，包括家养猫、纯种和/或杂种的伴侣猫(companion cats)、表演猫(show cats)、实验室猫、克隆猫以及野生或未驯服猫。
如本文使用的术语“犬科动物框架”是指除了本文定义为CDR残基的高变区残基之外的犬科动物抗体的重链和轻链的氨基酸序列。关于犬源化抗体，在大多数实施方案中，天然犬CDR的氨基酸序列在两条链中被相应的外源CDR(例如，来自小鼠抗体的那些)替换。任选地，犬抗体的重链和/或轻链可以含有一些外源非CDR残基，例如以便保留犬抗体内的外源CDR的构象，和/或修饰Fc功能，如下文所示例的。
已经发现犬CTLA-4包含SEQ ID NO：126的氨基酸序列(包括信号序列)。在一个特定的实施方案中，犬CTLA-4由包含SEQ ID NO：125的核苷酸序列的核酸编码。犬CTLA-4序列的不同之处在于例如在非保守区中具有保守变异，但是犬CTLA-4将具有与SEQ ID NO：126的氨基酸序列所包含的犬CTLA-4基本上相同的生物学功能。
如本文使用的例如，在抗体的氨基酸序列中用另一个氨基酸残基“取代氨基酸残基”等同于用另一个氨基酸残基“替换氨基酸残基”，并且表示氨基酸序列中特定位置处的特定氨基酸残基已经被不同的氨基酸残基替换(或取代)。这样的取代可以特别设计，即通过例如重组DNA技术在氨基酸序列中的特定位置有目的地用丝氨酸替换丙氨酸。可替代地，例如，基于由细胞产生的抗体与该抗原上的给定区域(例如含有表位或其部分的区域)结合的能力，和/或使得该抗体包含保留与其替换的CDR相同的规范结构的特定CDR的能力，抗体的特定氨基酸残基或残基串可以通过更自然的选择过程被一个或多个氨基酸残基替换。这样的取代/替换可产生“变体”CDR和/或变体抗体。
共刺激信号传导途径导致免疫应答的发展，并且已经显示是通过T细胞表面上的CD28与CD80(也称为B7.1)和CD86(也称为B7.2)的相互作用介导的。CTLA-4以比CD28高得多的亲和力结合CD80和CD86两者，从而充当抑制性受体，其对免疫应答的下调至关重要。实际上，CTLA-4介导其免疫抑制功能的机制与其充当CD28与CD80和CD86的相互作用的竞争性抑制剂的能力有关。因此，本发明描述单克隆抗体的产生和表征，所述单克隆抗体阻断犬CD80和犬CD 86与CTLA-4的结合，从而由于犬CD 28与犬CD 80和CD 86的结合而允许共刺激信号传导。因此，这些抗体可用于治疗癌症，以及如本文公开的伴侣动物的其他疾病。
特定的犬CTLA-4氨基酸序列将通常与包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列(不包括信号序列)的犬CTLA-4至少90％相同。在某些情况下，犬CTLA-4可以与包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列(不包括信号序列)的犬CTLA-4至少95％，或甚至至少96％、97％、98％或99％相同。在某些实施方案中，犬CTLA-4氨基酸序列将显示与包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列(不包括信号序列)的犬CTLA-4不超过10个氨基酸差异。在某些实施方案中，犬CTLA-4氨基酸序列可以显示与包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列(不包括信号序列)的犬CTLA-4不超过5个，或甚至不超过4、3、2或1个氨基酸差异。同一性百分比可以如下文所述测定。
术语“免疫应答”是指例如淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和由上述细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用，其导致对来自哺乳动物体(例如犬体)的癌细胞、感染病原体或侵入性病原体的细胞或组织的选择性损伤、破坏或消除。
抗犬CTLA-4抗体
本发明提供结合犬CTLA-4的分离的抗体(特别是鼠抗犬CTLA-4抗体及其犬源化抗体)或其抗原结合片段，以及这样的抗体或其片段的用途。在特定的实施方案中，提供来自鼠抗犬CTLA-4抗体的鼠抗犬CTLA-4CDR，已经显示其既结合犬CTLA-4又阻断犬CTLA-4与其配体(犬CD86或CD80)中的一种或两种的结合。可以将这些CDR插入到犬抗体的修饰的犬框架中以产生犬源化鼠抗犬CTLA-4抗体。
如本文使用的“抗犬CTLA-4抗体”指针对犬CTLA-4(例如，在哺乳动物如小鼠或兔中)产生并且特异性结合犬CTLA-4的抗体。“特异性结合犬CTLA-4”的抗体，“特别是特异性结合犬CTLA-4”的抗体，或“特异性结合包含犬CTLA-4的氨基酸序列的多肽”的这样的抗体：其显示出与其他犬抗原相比，优先结合犬CTLA-4，但这种特异性不需要绝对结合特异性。如果其结合决定了限于犬蛋白的样品中犬CTLA-4的存在，或者如果其能够改变犬CTLA-4的活性而不会过度干扰犬样品中其他分子的活性，例如不会产生不期望的结果，例如在诊断背景中的假阳性或在治疗背景中的副作用，则认为抗犬CTLA-4抗体对犬CTLA-4是“特异性的”。抗犬CTLA-4抗体需要的特异性程度可取决于抗体的预期用途，并且至少由其用于预期目的的适用性来限定。预期方法的抗体或衍生自抗体的抗原结合位点的结合化合物与其抗原或其变体或突变蛋白结合的亲和力比与任何其他犬抗原的亲和力大至少两倍，优选至少10倍，更优选至少20倍，并且最优选至少100倍。
如本文使用的，如果抗体结合包含犬CTLA-4的氨基酸序列的一部分的多肽，但不结合缺乏犬CTLA-4的序列的该部分的其他犬蛋白，则认为抗体特异性结合包含给定抗原序列(在这种情况下，为犬CTLA-4的氨基酸序列的一部分)的多肽。例如，特异性结合包含犬CTLA-4的多肽的抗体可以结合
加标签形式的犬CTLA-4，但是不结合其它
加标签的犬蛋白。当对其犬抗原或其变体或突变蛋白的亲和力比其对任何其他所测试的犬抗原的亲和力大至少10倍、更优选至少20倍、甚至更优选至少100倍时，抗体或衍生自抗体的抗原结合位点的结合化合物结合其犬抗原或其变体或突变蛋白“具有特异性”。
如本文使用的术语“抗体”指显示出期望生物活性的任何形式的抗体。因此，其以最广泛的含义使用，并且特别地涵盖但不限于单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、规范抗体、完全犬抗体、嵌合抗体和骆驼化单结构域抗体。“亲本抗体”是在为了预期用途修饰抗体(例如用作犬治疗性抗体的抗体的犬源化)之前通过将免疫系统暴露于抗原而得到的抗体。
如本文中使用的，除非另有说明，否则“抗体片段”或“抗原结合片段”指抗体的抗原结合片段，即保留特异性地结合被全长抗体所结合的抗原的能力的抗体片段，例如保留一个或多个CDR区域的片段。抗原结合片段的实例包括、但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双体；直链抗体；单链抗体分子，例如，sc-Fv；纳米抗体(nanobodies)和由多个抗体片段形成的多特异性抗体。
“Fab片段”由一个轻链以及一个重链的CH1和可变区组成。Fab分子的重链不可与另一个重链分子形成二硫键。“Fab片段”可以是抗体的木瓜蛋白酶切割的产物。
“可结晶的片段”(“Fc”)区含有两个包含抗体的CH2和CH3结构域的重链片段。所述两个重链片段通过两个或更多个二硫键和通过CH3结构域的疏水相互作用保持在一起。
“Fab'片段”含有一个轻链以及一个重链的部分或片段，其含有VH结构域和CH1结构域且也含有在CH1和CH2结构域之间的区域，使得可以在两个Fab'片段的两个重链之间形成链间二硫键以形成F(ab')2分子。
“F(ab')2片段”含有两个轻链和两个重链，所述重链含有在CH1和CH2结构域之间的恒定区部分，使得在两个重链之间形成链间二硫键。因此，F(ab')2片段由通过两条重链之间的二硫键保持在一起的两个Fab'片段组成。“F(ab')2片段”可以是抗体的胃蛋白酶切割的产物。
“Fv区”包含来自重链和轻链两者的可变区，但缺少恒定区。
术语“单链Fv”或“scFv”抗体指包含抗体的VH和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单个多肽链中。通常，Fv多肽进一步包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，其使scFv能够形成期望的结构用于抗原结合[参见Pluckthun,The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies,vol.113 Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,NewYork,pp.269-315(1994)；WO 88/01649；以及U.S.4,946,778合U.S.5,260,203]。
如本文使用的“阻断”或正在“阻断”或正在“阻断结合”犬CTLA-4与其结合配偶体(配体)(例如，犬CD80或犬CD86)的抗犬CTLA-4抗体或其抗原结合片段是如在标准结合测定(例如，
ELISA或流式细胞术)中所测定的(部分或完全)阻断犬CTLA-4与犬CD86和/或CD80的结合的抗犬CTLA-4抗体或其抗原结合片段。这样的“阻断”是在下面的实施例4中使用基于ELISA的阻断测定举例说明的。
如本文使用的术语“规范结构”指它们所停留的框架内的抗体的重链和轻链的每个高变区可以采用的局部构象。对于每个高变区，存在少量的规范结构(通常由简单的整数表示，例如1或2等)，其可以以大准确度从相应的高变区的氨基酸序列非常准确地预测[特别是在其相应的抗犬CTLA-4可变结构域的框架的氨基酸序列的上下文之内]。关于给定CDR的氨基酸序列的修饰是否导致结合它的抗原结合配偶体的能力的保留或丧失，这些规范结构可以起决定作用[参见，Chothia and Lesk,Canonical Structures for thehypervariable regions of immunoglobulins,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；Chothiaet al.,Conformation of immunoglobulin hypervaribale regions,Nature,34:877-883(1989)；和Al-Lazikani et al.,Standard Conformations for the canonicalstructures of immunoglobulins,J.Mol.Biol.273:927-948(1997)]。
“结构域抗体”是仅含有重链的可变区或轻链的可变区的免疫功能性免疫球蛋白片段。在某些情况下，两个或更多个VH区域用肽接头共价地连接以建立二价结构域抗体。二价结构域抗体的两个VH区域可以靶向相同的或不同的抗原。
“二价抗体”包含两个抗原结合位点。在一些情况下，两个结合位点具有相同的抗原特异性。然而，二价抗体可以是双特异性的(参见下文)。
在某些实施方案中，本文的单克隆抗体还包括骆驼化单结构域抗体[参见例如Muyldermans et al.,Trends Biochem.Sci.26:230(2001)；Reichmann et al.,J.Immunol.Methods 231:25(1999)；WO 94/04678；WO 94/25591；U.S.6,005,079]。在一个实施方案中，本发明提供包含具有修饰的两个VH结构域的单结构域抗体，使得形成单结构域抗体。
如本文使用的术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包含在同一多肽链中与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)(VH-VL或VL-VH)。通过使用太短而不允许在同一链上的两个结构域之间配对的接头，迫使该结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。[参见EP 0 404 097 B1；WO 93/11161；和Holliger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)].对于工程化抗体变体的综述[一般参见Holliger and Hudson Nat.Biotechnol.23:1126-1136(2005)]。
通常，当活性以摩尔为基础表示时，本发明的抗体或抗原结合片段保留其犬CTLA-4结合活性的至少10％(当与亲本抗体相比时)。优选地，本发明的抗体或抗原结合片段保留亲本抗体的犬CTLA-4结合亲和力的至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或100％或更多。还预期本发明的抗体或抗原结合片段可以包括基本上不改变其生物活性的保守或非保守氨基酸取代(称为抗体的“保守变体”或“功能保守变体”)。
“分离的抗体”指纯化状态，并且在这种情况下指分子基本上不含其他生物分子，例如核酸、蛋白质、脂质、碳水化合物或其他材料，例如细胞碎片和生长培养基。通常，术语“分离的”不旨在指完全不存在这种材料或不存在水、缓冲液或盐，除非它们以实质上干扰如本文所述的结合化合物的实验或治疗用途的量存在。
如本文使用的“嵌合抗体”是具有来自第一抗体的可变结构域和来自第二抗体的恒定结构域的抗体，其中所述第一和第二抗体来自不同的物种。[U.S.4,816,567；和Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984)]。通常，可变结构域是从来自实验动物(例如啮齿动物)的抗体(“亲本抗体”)获得的，并且恒定结构域序列是从动物受试者抗体(例如人或犬科动物)获得的，使得得到的嵌合抗体将比亲本(例如啮齿动物)抗体更不可能分别在人或犬科动物受试者中引发不利的免疫应答。
如本文使用的术语“犬源化抗体”指含有来自犬和非犬(例如鼠)抗体的序列的抗体形式。通常，犬源化抗体将基本上包含所有的至少一个或多个，通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的高变环对应于非犬免疫球蛋白的高变环(例如，包含如下示例的6个鼠抗犬CTLA-4CDR)，并且所有或基本上所有的框架(FR)区(和通常所有或基本上所有的剩余框架)是犬免疫球蛋白序列的框架区。如本文示例的，犬源化抗体包含来自鼠抗犬CTLA-4抗体的三个重链CDR和三个轻链CDR以及犬框架或修饰的犬框架。修饰的犬框架包含一个或多个如本文示例的氨基酸变化，其进一步优化犬源化抗体的有效性，例如以增加其与犬CTLA-4的结合和/或其阻断犬CTLA-4与犬CD86和/或CD80结合的能力。
术语“全犬抗体”指仅包含犬免疫球蛋白蛋白序列的抗体。如果在小鼠中、在小鼠细胞中或在衍生自小鼠细胞的杂交瘤中生产，全犬抗体可以含有鼠碳水化合物链。类似地，“小鼠抗体”指仅包含小鼠免疫球蛋白序列的抗体。可替代地，如果在大鼠中、在大鼠细胞中或在衍生自大鼠细胞的杂交瘤中生产，全犬抗体可以含有大鼠碳水化合物链。类似地，“大鼠抗体”指仅包含大鼠免疫球蛋白序列的抗体。
存在四种已知的狗IgG的IgG重链亚型，它们被称为IgG-A、IgG-B、IgG-C和IgG-D。两种已知的轻链亚型称为λ和κ。
每个轻链/重链对的可变区形成抗体结合位点。因此，通常，完整抗体具有两个结合位点。除了在双功能或双特异性抗体中，两个结合位点通常是相同的。
通常，重链和轻链两者的可变结构域包含位于相对保守的框架区(FR)内的三个高变区，也称为互补决定区(CDR)。CDR通常通过框架区比对，使得能够结合特定表位。通常，从N末端到C末端，轻链和重链可变结构域均包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。向每个结构域的氨基酸的分配通常是根据以下文献的定义：Sequences of Proteins ofImmunological Interest,Kabat,et al.；National Institutes of Health,Bethesda,Md.；5th ed.；NIH Publ.No.91-3242(1991)；Kabat,Adv.Prot.Chem.32:1-75(1978)；Kabat,et al.,J.Biol.Chem.252:6609-6616(1977)；Chothia,et al.,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)或Chothia,et al.,Nature 342:878-883(1989)]。
如本文使用的术语“高变区”指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”(即轻链可变结构域中的CDRL1、CDRL2和CDRL3以及重链可变结构域中的CDRH1、CDRH2和CDRH3)的氨基酸残基。[参见Kabat et al.Sequences of Proteinsof Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1991)，通过序列定义抗体的CDR区；还参见Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)通过结构定义抗体的CDR区]。如本文使用的术语“框架”或“FR”残基指除本文定义为CDR残基的高变区残基之外的那些可变结构域残基。
在本发明的特定实施方案中，除了结合和活化犬免疫细胞之外，针对CTLA-4的犬或犬源化抗体最佳地具有两个属性：
1.缺乏效应子功能，如抗体依赖性细胞毒性作用(ADCC)和补体依赖性细胞毒性作用(CDC)，以及
2.易于使用工业标准技术(例如基于蛋白A色谱的技术)大规模纯化。
没有一种天然存在的犬IgG同种型满足这两个标准。例如，IgG-B可以使用蛋白A纯化，但具有高水平的ADCC活性。另一方面，IgG-A弱结合A蛋白，但也显示出ADCC活性。此外，IgG-C和IgG-D都不能在蛋白A柱上纯化，尽管IgG-D不显示ADCC活性。(IgG-C具有相当大的ADCC活性)。本发明解决这些问题的一种方法是提供对CTLA-4具有特异性的修饰的犬IgG-B抗体，其缺乏效应子功能如ADCC，并且可以使用工业标准蛋白A色谱容易地纯化。
在本发明的可替代的实施方案中，对CTLA-4具有特异性的犬IgG-B或IgG-C抗体故意未被修饰以去除/实质上减少效应子功能如ADCC，并因此保留效应子功能如ADCC。
“同源性”指当两个多核苷酸序列或两个多肽序列最佳比对时它们各自之间的序列相似性。当两个比较的序列中的一个位置被相同的碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如，如果两个DNA分子的每一个中的一个位置被腺嘌呤占据，则分子在该位置是同源的。同源性百分比是两个序列共有的同源位置数除以比较的位置总数×100。例如，当将序列最佳地比对时，如果两个序列的10个位置中的6个是匹配的或同源的，则所述两个序列是60％同源的。通常，当比对两个序列以给出最大同源性百分比时，做出所述比较。
“分离的核酸分子”指基因组、mRNA、cDNA或合成来源的DNA或RNA或其一些组合，其与在自然界中其中发现分离的多核苷酸的多核苷酸的全部或部分无关，或与在自然界中没有与其连接的多核苷酸连接。为了本公开的目的，应当理解，“包含特定核苷酸序列的核酸分子”不涵盖完整的染色体。“包含”指定核酸序列的分离的核酸分子除了指定序列之外，还可以包括多达10种或甚至多达20种或更多种其他蛋白质或其部分或片段的编码序列，或者可以包括可操作地连接的调节序列，其控制所列举的核酸序列的编码区的表达，和/或可以包括载体序列。
短语“控制序列”指对于可操作地连接的编码序列在特定宿主生物体中的表达必需的DNA序列。适用于原核生物的控制序列例如包括启动子、任选的操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞使用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。
当核酸与另一个核酸序列发生功能关联时，所述核酸是“可操作地连接的”。例如，如果前序列或分泌前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则其可操作地连接多肽的DNA；如果启动子或增强子影响序列的转录，则其可操作地连接编码序列；或者如果核糖体结合位点被定位以便于翻译，则其可操作地连接编码序列。通常，“可操作地连接”指被连接的DNA序列是连续的，并且在分泌前导序列的情况下，是连续的且处于阅读相。然而，增强子不必是连续的。通过在方便的限制性位点处连接来完成连接。如果不存在这样的位点，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸适体或接头。
如本文使用的表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养”可互换地使用，并且所有这些名称都包括子代。因此，词语“转化子”和“转化的细胞”包括原代受试细胞和由其衍生出的培养物，而不考虑转移的次数。还应当理解，由于有意或无意的突变，并非所有子代都将具有精确相同的DNA含量。包括具有如与在最初转化细胞中筛选的功能或生物活性相同的突变体子代。在预期不同名称的情况下，从上下文中将是清楚的。
如本文使用的“种系序列”指未重排的免疫球蛋白DNA序列的序列。可以使用未重排的免疫球蛋白序列的任何合适的来源。人种系序列可以例如在美国国立卫生研究院(theUnited States National Institutes of Health.)的国家关节炎和肌肉骨骼疾病和皮肤疾病研究所(the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and SkinDiseases)的网站上从
种系数据库得到。小鼠种系序列可以例如如在Giudicelli et al.[Nucleic Acids Res.33:D256-D261(2005)]中描述的得到。
鼠抗犬CTLA-4和犬源化鼠抗犬CTLA-4抗体的性质
本发明提供了分离的鼠抗犬CTLA-4抗体及其犬源化抗体，所述抗体或其抗原结合片段在治疗疾病(例如，治疗犬科动物中癌症)中的使用方法。在犬科动物中，存在四种IgG重链，称为A、B、C和D。这些重链代表犬IgG的四种不同亚类，称为IgGA、IgGB、IgGC和IgGD。两条重链中的每条都由一个可变结构域(VH)和称为CH-1、CH-2和CH-3的三个恒定结构域组成。CH-1结构域经由称为“铰链”或可替代地称为“铰链区”的氨基酸序列与CH-2结构域连接。
这四个重链的DNA和氨基酸序列首先是由Tang et al.[Vet.Immunol.Immunopathol.80:259-270(2001)]鉴定的。这些重链的氨基酸和DNA序列也可以从GenBank数据库获得。例如，IgGA重链的氨基酸序列具有登录号AAL35301.1，IgGB具有登录号AAL35302.1，IgGC具有登录号AAL35303.1，和IgGD具有登录号(AAL35304.1)。犬抗体还含有两种类型的轻链，κ和λ。这些轻链的DNA和氨基酸序列可以从GenBank数据库获得。例如，κ轻链氨基酸序列具有登录号ABY 57289.1，λ轻链具有登录号ABY 55569.1。
在本发明中，四种犬IgG Fc片段中各自的氨基酸序列都是基于如Tang等人(同上)所确定的CH1和CH2结构域的鉴定边界。结合犬CTLA-4的犬源化鼠抗犬CTLA-4抗体包括，但不限于：包含犬IgG-A、IgG-B、IgG-C和IgG-D重链和/或犬κ轻链以及鼠抗犬CTLA-4 CDR的抗体。因此，本发明提供分离的鼠抗犬CTLA-4和/或犬源化鼠抗犬CTLA-4抗体或其抗原结合片段，其结合犬CTLA-4并阻断犬CTLA-4与犬CD86和/或犬CD80的结合。
本发明进一步提供全长犬重链，其可以与相应的轻链匹配以制备犬源化抗体。因此，本发明还提供犬源化鼠抗犬抗原抗体(包括分离的犬源化鼠抗犬PD-1抗体)和所述抗体或其抗原结合片段在治疗疾病(例如，治疗犬科动物中的癌症)中的使用方法。
本发明还提供犬源化鼠抗犬-CTLA-4抗体，其包含犬片段可结晶区(cFc区)，其中cFc已被遗传修饰以增强、降低或消除一种或多种效应子功能。在本发明的一个方面，遗传修饰的cFc降低或消除一种或多种效应子功能。在本发明的另一方面，遗传修饰的cFc增强一种或多种效应子功能。在某些实施方案中，遗传修饰的cFc区是遗传修饰的犬IgGb Fc区。在另一个这样的实施方案中，遗传修饰的cFc区是遗传修饰的犬IgGC Fc区。在一个特定的实施方案中，效应子功能是被增强、降低或消除的抗体依赖性细胞毒性作用(ADCC)。在另一个实施方案中，效应子功能是被增强、降低或消除的补体依赖性细胞毒性作用(CDC)。在仍然另一个实施方案中，cFc区已被遗传修饰以增强、降低或消除ADCC和CDC两者。
为了产生缺乏效应子功能的犬IgG的变体，产生了许多突变犬IgGb重链。这些变体可以在重链氨基酸序列的Fc部分中包括以下单个或组合取代中的一个或多个：P4A、D31A、N63A、G64P、T65A、A93G和P95A。将变体重链(即，含有这样的氨基酸取代)克隆到表达质粒中，并与含有编码轻链的基因的质粒一起转染到HEK 293细胞中。对从HEK 293细胞表达和纯化的完整抗体评估与FcγRI和C1q的结合，以评估它们介导免疫效应子功能的潜力。[参见U.S.10,106,607B2，将其全部内容通过引用并入本文]。
本发明还提供修饰的犬IgGD，其包含来自以下的铰链区代替其天然IgGD铰链区：
IgGA:fnecrctdtppcpvpep, SEQ ID NO:128；
IgGB:pkrengrvprppdcpkcpapem, SEQ ID NO:129；或
IgGC:akececkcncnncpcpgcgl, SEQ ID NO:130。
可替代地，可以通过用脯氨酸残基替换丝氨酸残基来遗传修饰IgGD铰链区，即
(脯氨酸残基(P)加下划线，且粗体取代天然存在的丝氨酸残基)。这样的修饰可以产生缺乏fab臂交换的犬IgGD。使用重组DNA技术的标准方法[例如，Maniatis等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(1982)]，可以构建经修饰的犬IgGD。为了构建这些变体，可以修饰编码犬IgGD的氨基酸序列的核酸，使得它们编码经修饰的IgGD。然后，将经修饰的核酸序列克隆到表达质粒中用于蛋白表达。
结合犬CTLA-4的抗体或其抗原结合片段可以包含如本文中所述的鼠抗犬抗体的1、2、3、4、5或6个互补性决定区(CDR)。1、2、3、4、5或6个CDR可以独立地选自在下面提供的那些的CDR序列。在一个进一步的实施方案中，结合犬CTLA-4的分离的抗体或其抗原结合片段包含含有鼠轻链CDR-1、CDR-2和/或CDR-3的犬抗体κ或λ轻链和含有鼠重链CDR-1、CDR-2和/或CDR-3的犬抗体重链IgG。
在其他实施方案中，本发明提供抗体或其抗原结合片段，其特异性结合犬CTLA-4，并具有犬抗体κ或λ轻链，其包含含有分别与用于VLCDR-1、VLCDR-2和VLCDR-3的氨基酸序列SEQ ID NO:92、94和96具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性的给定组的三个CDR，和犬抗体重链IgG，其包含含有分别与用于VLCDR-1、VLCDR-2和VLCDR-3的氨基酸序列SEQ ID NO:86、88和90具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性的给定组的三个CDR；或犬抗体κ或λ轻链，其包含含有分别与用于VLCDR-1、VLCDR-2和VLCDR-3的氨基酸序列SEQ ID NO:104、106和108具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性的给定组的三个CDR，和犬抗体重链IgG，其包含含有分别与用于VLCDR-1、VLCDR-2和VLCDR-3的氨基酸序列SEQ ID NO:98、100和102具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性的一组不同的CDR；或犬抗体κ或λ轻链，其包含含有分别与用于VLCDR-1、VLCDR-2和VLCDR-3的氨基酸序列SEQ ID NO:117、94和96具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性的给定组的三个CDR，和犬抗体重链IgG，其包含含有分别与用于VLCDR-1、VLCDR-2和VLCDR-3的氨基酸序列SEQ ID NO:86、88和113具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性的一组不同的CDR；或犬抗体κ或λ轻链，其包含含有分别与用于VLCDR-1、VLCDR-2和VLCDR-3的氨基酸序列SEQ ID NO:119、122和96具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性的给定组的三个CDR，和犬抗体重链IgG，其包含含有分别与用于VLCDR-1、VLCDR-2和VLCDR-3的氨基酸序列SEQ ID NO:86、88和115具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性的一组不同的CDR；同时仍然显示出期望的结合和功能特性。在另一个实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段包含犬框架，所述犬框架包含IgG重链序列与κ或λ轻链的组合，其具有上述三个轻链CDR和具有0、1、2、3、4或5个保守或非保守氨基酸取代的三个重链CDR组中的一个或多个，同时仍然显示出期望的结合和功能特性。
序列同一性指当两个序列最佳比对时，两个多肽的氨基酸在等同位置处相同的程度。如本文使用的，当两个序列的氨基酸残基相同时，一个氨基酸序列与第二氨基酸序列100％“相同”。因此，当两个氨基酸序列的50％的氨基酸残基相同时，一个氨基酸序列与第二个氨基酸序列50％“相同”。在给定蛋白包含的连续氨基酸残基段中执行序列对比，例如，对比蛋白或多肽的部分。在一个特定的实施方案中，考虑选择的缺失或插入，其否则会改变两个氨基酸序列之间的对应性。
序列相似性包括相同的残基和不相同的生化相关的氨基酸。讨论了共有类似的性质且可以互换的生化相关的氨基酸。
“保守修饰的变体”或“保守取代”指蛋白质中的氨基酸被具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、骨架构象和刚性等)的其它氨基酸取代，使得可以经常进行变化而不改变蛋白质的生物活性。本领域技术人员认识到，一般而言，多肽的非必需区中的单个氨基酸取代基本上不改变生物活性[参见，例如Watson et al.,Molecular Biologyof the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,p.224(4th Ed.；1987)]。另外，在结构上或在功能上类似的氨基酸的取代不太可能破坏生物活性。示例性的保守取代在下表A中直接列出。
表A
示例性的保守氨基酸取代
本发明还考虑了本发明抗体的功能保守变体。如本文使用的“功能保守变体”指其中一个或多个氨基酸残基已经被改变而不改变期望性质(如抗原亲和力和/或特异性)的抗体或片段。这样的变体包括，但不限于用具有相似性质的氨基酸替换氨基酸，比如上表A的保守氨基酸取代。
核酸
本发明还包括核酸，其编码本文中公开的鼠抗犬CTLA-4和/或犬源化鼠抗犬CTLA-4抗体和其抗原结合片段的免疫球蛋白链(参见下面的实施例)。
本发明还包括编码免疫球蛋白多肽的核酸，当通过BLAST算法(其中选择算法的参数以在相应参照序列的整个长度上给出相应序列之间的最大匹配)执行对比时，所述免疫球蛋白多肽包含与本文提供的犬源化抗体的氨基酸序列至少约70％相同，优选地至少约80％相同，更优选地至少约90％相同和最优选地至少约95％相同(例如，95％、96％、97％、98％、99％、100％)的氨基酸序列。本发明进一步提供编码免疫球蛋白多肽的核酸，当与BLAST算法(其中选择算法的参数以在相应参照序列的整个长度上给出相应序列之间的最大匹配)执行对比时，所述免疫球蛋白多肽包含与任何参考氨基酸序列至少约70％相似，优选至少约80％相似，更优选至少约90％相似，最优选至少约95％相似(例如，95％、96％、97％、98％、99％、100％)的氨基酸序列，也包括在本发明中。
如本文中使用的，使用C,MacVector(MacVector,Inc.Cary,NC 27519),VectorNTI(Informax,Inc.MD),Oxford Molecular Group PLC(1996)和Clustal W算法(具有比对默认参数和关于同一性的默认参数)，可以确定核苷酸和氨基酸序列同一性百分比。这些市售可获得的程序还可以用于使用相同的或类似的默认参数确定序列相似性。可替代地，可以使用在默认过滤条件下的Advanced Blast检索，例如，使用GCG(Genetics ComputerGroup,Program Manual for the GCG Package,第7版,Madison,Wisconsin)累积程序(pileup program)使用默认参数。
以下参考文献涉及经常用于序列分析的BLAST算法：BLAST ALGORITHMS:Altschul,S.F.,et al.,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)；Gish,W.,et al.,NatureGenet.3:266-272(1993)；Madden,T.L.,et al.,Meth.Enzymol.266:131-141(1996)；Altschul,S.F.,et al.,Nucleic Acids Res.25:3389-3402(1997)；Zhang,J.,et al.,Genome Res.7:649-656(1997)；Wootton,J.C.,et al.,Comput.Chem.17:149-163(1993)；Hancock,J.M.et al.,Comput.Appl.Biosci.10:67-70(1994)；ALIGNMENT SCORINGSYSTEMS:Dayhoff,M.O.,et al.,"A model of evolutionary change in proteins."inAtlas of Protein Sequence and Structure,第5卷，增刊3，M.O.Dayhoff(编著),pp.345-352,(1978)；Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,DC；Schwartz,R.M.,et al.,"Matrices for detecting distant relationships."in Atlas of Protein Sequenceand Structure,vol.5,suppl.3."(1978),M.O.Dayhoff(ed.),pp.353-358(1978),Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,DC；Altschul,S.F.,J.Mol.Biol.219:555-565(1991)；States,D.J.,et al.,Methods3:66-70(1991)；Henikoff,S.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-10919(1992)；Altschul,S.F.,et al.,J.Mol.Evol.36:290-300(1993)；ALIGNMENT STATISTICS:Karlin,S.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268(1990)；Karlin,S.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877(1993)；Dembo,A.,et al.,Ann.Prob.22:2022-2039(1994)；和Altschul,S.F."Evaluating the statistical significance ofmultiple distinct local alignments."，在Theoretical and Computational Methodsin Genome Research(S.Suhai,ed.),pp.1-14,Plenum,New York(1997)中。
本发明还提供了包含本发明核酸的表达载体，其中核酸可操作地连接控制序列，当宿主细胞用载体转染时，所述控制序列被宿主细胞识别。还提供了包含本发明的表达载体的宿主细胞和用于产生本文公开的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：在培养基中培养携带编码抗体或抗原结合片段的表达载体的宿主细胞，和从所述宿主细胞或培养基分离所述抗原或其抗原结合片段。
犬源化鼠抗犬CTLA-4抗体可以通过本领域已知的方法重组产生。可以用作表达本文公开的抗体或片段的宿主的哺乳动物细胞系是本领域熟知的，并且包括许多可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的永生化细胞系。这些尤其包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO、SP2细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，HepG2)、A549细胞、3T3细胞、HEK-293细胞和许多其它细胞系。哺乳动物宿主细胞包括人、小鼠、大鼠、狗、猴、猪、山羊、牛、马和仓鼠细胞。通过确定哪些细胞系具有高表达水平，选择特别优选的细胞系。可以使用的其他细胞系是昆虫细胞系例如Sf9细胞、两栖动物细胞、细菌细胞、植物细胞和真菌细胞。当将编码重链或其抗原结合部分或片段、轻链和/或其抗原结合片段的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞中时，通过将宿主细胞培养足以允许抗体在宿主细胞中表达或更优选地允许抗体分泌到宿主细胞生长的培养基中的一段时间来产生抗体。
可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体。此外，可以使用许多已知技术增强本发明的抗体(或来自其的其他部分)从生产细胞系的表达。例如，谷氨酰胺合成酶基因表达系统(GS系统)是在某些条件下增强表达的常用方法。全部或部分地结合欧洲专利号0 216 846、0 256 055和0 323 997以及欧洲专利申请号89303964.4讨论GS系统。
一般而言，在特定细胞系或转基因动物中生产的糖蛋白将具有在所述细胞系或转基因动物中生产的糖蛋白所特有的糖基化模式。因此，抗体的特定糖基化模式将取决于用于生产所述抗体的特定的细胞系或转基因动物。然而，由本文提供的核酸分子编码或包含本文提供的氨基酸序列的所有抗体构成本发明，与抗体可能具有的糖基化模式无关。类似地，在特定实施方案中，具有仅包含非岩藻糖基化N-聚糖的糖基化模式的抗体可能是有利的，因为已经显示这些抗体在体外和体内均通常显示出比其岩藻糖基化对应物更有效的功效[参见例如，Shinkawa等人，J.Biol.Chem.278:3466-3473(2003)；美国专利号6,946,292和7,214,775]。
本发明还包括本文公开的鼠抗犬CTLA-4抗体的抗体片段。所述抗体片段包括F(ab)2片段，其可以通过例如胃蛋白酶酶促切割IgG来产生。Fab片段可以通过例如用二硫苏糖醇或巯基乙胺还原F(ab)2来产生。Fab片段是通过二硫键附加至VH-CH1链的VL-CL链。F(ab)2片段是又通过两个二硫键附加的两个Fab片段。F(ab)2分子的Fab部分包括二硫桥位于其之间的Fc区的一部分。Fv片段是VL或VH区域。
在一个实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含重链恒定区，例如，犬恒定区，比如IgGA、IgGB、IgGC和IgGD犬重链恒定区或其变体。在另一个实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含轻链恒定区，例如，犬轻链恒定区，比如λ或κ犬轻链区域或其变体。作为举例，且非限制性地，所述犬重链恒定区可以来自IgG-B，并且所述犬轻链恒定区可以来自κ。
抗体工程
本发明的犬源化鼠抗犬CTLA-4抗体可以经过工程化以包括对亲本(即，犬)单克隆抗体的可变结构域内的犬框架和/或犬框架残基的修饰，例如以改善抗体的性质。
表位结合和结合亲和力
本发明进一步提供与本文中公开的鼠抗犬CTLA-4抗体结合相同犬CTLA-4表位的氨基酸残基的抗体或其抗原结合片段。在特定的实施方案中，所述鼠抗犬CTLA-4或其抗原结合片段也能够抑制/阻断犬CTLA-4与犬CD86和/或CD80的结合。在相关的实施方案中，所述犬源化鼠抗犬CTLA-4抗体或其抗原结合片段还能够抑制/阻断犬CTLA-4与犬CD86和/或CD80的结合。
实验和诊断用途
本发明的鼠抗犬CTLA-4和/或犬源化鼠抗犬CTLA-4抗体或其抗原结合片段也可以用在犬CTLA-4蛋白的诊断测定中，例如，检测其与癌症关联和/或相关的表达。
例如，这种方法包括以下步骤：
(a)用鼠抗犬CTLA-4抗体或其抗原结合片段包被基质(例如，微孔滴定板孔的表面，例如，塑料板)；
(b)向所述基质施加待测试犬CTLA-4的存在的样品；
(c)洗涤所述板，使得所述样品中未结合的物质被去除；
(d)施加可检测地标记的抗体(例如，酶连接的抗体)，其也对CTLA-4抗原具有特异性；
(e)洗涤所述基质，使得未结合的、标记的抗体被去除；
(f)如果标记的抗体是酶连接的，则施加被所述酶转化成荧光信号的化学物质；和
(g)检测所述标记的抗体的存在。
在一个进一步的实施方案中，标记的抗体用过氧化物酶标记，所述过氧化物酶与ABTS[例如，2,2'-联氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)]或3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)反应以产生可检测的颜色变化。可替代地，所述标记的抗体用可检测的放射性同位素(例如，3H)标记，所述放射性同位素可以在闪烁剂存在下用闪烁计数器检测。本发明的鼠抗犬PD-1抗体可以用在蛋白质印迹或免疫蛋白印迹程序中。
这样的程序形成本发明的一部分，且包括例如：
(i)使待测试结合的犬CTLA-4或其片段的存在的膜或其他固体基质与本发明的犬源化鼠抗犬CTLA-4抗体或其抗原结合片段接触。这样的膜可以采用基于硝酸纤维素或乙烯基[例如，聚偏二氟乙烯(PVDF)]膜的形式，在非变性PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)凝胶或SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)凝胶中待测试犬CTLA-4存在的蛋白质已经转移到该膜上(例如，在凝胶中电泳分离之后)。在膜与犬源化鼠抗犬CTLA-4抗体或其抗原结合片段接触之前，任选地用例如脱脂奶粉等封闭膜，以便结合膜上的非特异性蛋白质结合位点。
(ii)将所述膜洗涤一次或多次以除去未结合的犬源化鼠抗犬CTLA-4抗体或其抗原结合片段和其他未结合的物质；和
(iii)检测结合的犬源化鼠抗犬CTLA-4抗体或其抗原结合片段。
可以通过将抗体或抗原结合片段与可检测标记的第二抗体(抗免疫球蛋白抗体)结合，然后检测第二抗体的存在来检测结合的抗体或抗原结合片段。
本文公开的鼠抗犬CTLA-4抗体、犬源化鼠抗犬CTLA-4抗体和/或其抗原结合片段也可用于免疫组织化学。这样的方法形成本发明的一部分，并且包括例如(1)使待测试犬CTLA-4的存在的细胞与例如本发明的鼠抗犬CTLA-4抗体或其抗原结合片段接触；和(2)检测细胞上或细胞中的抗体或片段。如果抗体或抗原结合片段本身被可检测地标记，则可以直接检测。可替代地，抗体或抗原结合片段可以被得到检测的可检测标记的第二抗体结合。
成像技术包括SPECT成像(单光子发射计算机断层扫描)或PET成像(正电子发射断层扫描)。标记包括例如碘-123(123I)和锝-99m(99mTc)，例如与SPECT成像结合，或11C、13N、15O或18F，例如与PET成像结合，或铟-111[参见例如Gordon et al.,InternationalRev.Neurobiol.67:385-440(2005)]。
交叉阻断抗体
此外，本发明的抗犬CTLA-4抗体或其抗原结合片段包括与本文所讨论的抗体和片段结合的犬CTLA-4中的相同表位结合的任何抗体或其抗原结合片段，以及交叉阻断(部分或完全)本文讨论的抗体或片段或被本文讨论的抗体或片段交叉阻断(部分或完全)用于犬CTLA-4结合的任何抗体或抗原结合片段；以及其任何变体。
本文讨论的交叉阻断抗体及其抗原结合片段可以基于在标准结合测定(例如，
ELISA，如下文示例的，或流式细胞术)中它们与本文公开的抗体(基于如下文实施例5中提供的CDR)，即45A9、27G12、22A11、110E3；并且更具体地，12B3和/或39A11的交叉竞争的能力进行鉴别。例如，可以使用标准ELISA测定，其中将重组犬CTLA-4蛋白固定在板上，对抗体之一进行荧光标记，并评估未标记抗体竞争掉标记抗体的结合的能力。另外或可替代地，可以使用
分析来评估抗体交叉竞争的能力。测试抗体抑制例如27G12、45A9、110E3和/或22A11的结合的能力；并且甚至更特别地，12B3和/或39A11对犬CTLA-4抗体的能力来证实，所测试抗体可以与27G12、45A9、110E3和/或22A11和/或12B3和/或39A11竞争结合犬CTLA-4，因此，在一些情况下，可以与27G12、45A9、110E3和/或22A11和/或12B3和/或39A11结合犬CTLA-4上的相同表位。如上所述，与本发明的任何抗犬CTLA-4抗体或片段结合相同表位的抗体和片段也形成本发明的一部分。
药物组合物和施用
为了制备犬源化鼠抗犬CTLA-4抗体或其抗原结合片段的药物或无菌组合物，可以将其与可药用载体或赋形剂混合[参见例如，Remington's Pharmaceutical Sciences andU.S.Pharmacopeia:National Formulary,Mack Publishing Company,Easton,PA(1984)]。
治疗剂和诊断剂的制剂可以通过与可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合以制备成例如冻干粉末、浆液、水溶液或悬浮液的形式[参见，例如Hardman,et al.(2001)Goodmanand Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics,McGraw-Hill,New York,NY；Gennaro(2000)Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott,Williams,and Wilkins,New York,NY；Avis,et al.(eds.)(1993)Pharmaceutical DosageForms:Parenteral Medications,Marcel Dekker,NY；Lieberman,et al.(eds.)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets,Marcel Dekker,NY；Lieberman,et al.(eds.)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems,Marcel Dekker,NY；Weiner和Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety,Marcel Dekker,Inc.,New York,NY]。在一个实施方案中，将本发明的抗CTLA-4抗体在pH 5-6的乙酸钠溶液中稀释至合适的浓度，并加入NaCl或蔗糖以改善张力。可以加入另外的试剂，例如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80以增强稳定性。
单独或与另一种试剂组合施用的抗体组合物的毒性和治疗功效可以通过标准药物操作在细胞培养物或实验动物中确定，例如用于确定LD50(对50％群体致死的剂量)和ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数(LD50/ED50)。在特定方面，显示出高治疗指数的抗体是期望的。从这些细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制用于犬科动物的剂量范围。这样的化合物的剂量优选在包括ED50且几乎没有或没有毒性的循环浓度范围内。剂量可以在该范围内变化，这取决于所用的剂型和施用途径。
施用模式可以变化。合适的施用途径包括口服、直肠、经粘膜、肠内、肠胃外；肌内、皮下、皮内、髓内、鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内、眼内、吸入、吹入、局部、皮肤、透皮或动脉内。在特定的实施方案中，犬源化鼠抗犬CTLA-4抗体或其抗原结合片段可以通过侵入性途径例如通过注射施用。在本发明的进一步的实施方案中，犬源化鼠抗犬CTLA-4抗体或其抗原结合片段或其药物组合物通过静脉内、皮下、肌内、动脉内或通过吸入、气溶胶递送施用。通过非侵入性途径(例如口服，例如以丸剂、胶囊或片剂)施用也在本发明的范围内。
可以用本领域已知的医疗装置施用组合物。例如，本发明的药物组合物可以通过用皮下注射针(包括例如预填充注射器或自动注射器)注射来施用。本文公开的药物组合物也可以用无针皮下注射装置施用；比如美国专利号：6,620,135；6,096,002；5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824或4,596,556中公开的装置。
本文公开的药物组合物也可以通过输注施用。用于施用药物组合物的熟知的植入物和模块形式的实例包括：美国专利号4,487,603，其公开了用于以受控速率分配药物的可植入微输注泵；美国专利号4,447,233，其公开了一种用于以精确输注速率递送药物的药物输注泵；美国专利号4,447,224，其公开了用于连续药物递送的可变流量的可植入输注装置；美国专利号4,439,196，其公开了一种具有多室隔室的渗透药物递送系统。许多其他这样的植入物、递送系统和模块是本领域技术人员熟知的。
可替代地，可以以局部而不是全身方式施用鼠抗犬或犬源化鼠抗犬CTLA-4抗体，例如，通过将抗体直接注射到特征在于免疫病理学的关节炎关节或病原体诱导的病变中，经常以贮库或持续释放制剂。而且，可以以靶向药物递送系统施用所述抗体，例如，在用组织特异性抗体包被的脂质体中，所述组织特异性抗体靶向例如特征在于免疫病理学的关节炎关节或病原体诱导的病变。所述脂质体将选择性地靶向患病组织和被患病组织摄入。
施用方案取决于若干因素，包括治疗性抗体的血清或组织周转率、症状水平、治疗性抗体的免疫原性和生物基质中靶细胞的可及性。优选地，施用方案递送足够的治疗性抗体以实现目标疾病状态的改善，同时使不期望的副作用最小化。因此，递送的生物制剂的量部分取决于特定的治疗性抗体和所治疗病症的严重程度。选择治疗性抗体的适当剂量的指导是可获得的[参见，例如，Wawrzynczak Antibody Therapy,Bios Scientific Pub.Ltd,Oxfordshire,UK(1996)；Kresina(ed.)Monoclonal Antibodies,Cytokines andArthritis,Marcel Dekker,New York,NY(1991)；Bach(ed.)Monoclonal Antibodies andPeptide Therapy in Autoimmune Diseases,Marcel Dekker,New York,NY(1993)；Baert,et al.New Engl.J.Med.348:601-608(2003)；Milgrom et al.New Engl.J.Med.341:1966-1973(1999)；Slamon et al.New Engl.J.Med.344:783-792(2001)；Beniaminovitz etal.New Engl.J.Med.342:613-619(2000)；Ghosh et al.New Engl.J.Med.348:24-32(2003)；Lipsky et al.New Engl.J.Med.343:1594-1602(2000)]。
适当剂量的确定由兽医进行，例如使用本领域已知或疑似影响治疗的参数或因素。通常，剂量以稍微小于最佳剂量的量开始，并且此后以小增量增加，直到相对于任何负面副作用获得期望或最佳的效果。重要的诊断措施包括例如肿瘤大小的症状的那些。
本文公开的抗体或其抗原结合片段可以通过连续输注或通过例如每天、每周1-7次、每周、每两周、每月、每两月、每季度、每半年、每年等施用的剂量提供。可以例如静脉内、皮下、局部、口服、经鼻、经直肠、肌内、脑内、脊柱内或通过吸入提供剂量。总每周剂量通常为至少0.05μg/kg体重，更通常为至少0.2μg/kg、0.5μg/kg、1μg/kg、10μg/kg、100μg/kg、0.25mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/ml、10mg/kg、25mg/kg、50mg/kg或更多[参见，例如，Yang,et al.New Engl.J.Med.349:427-434(2003)；Herold,et al.New Engl.J.Med.346:1692-1698(2002)；Liu,et al.J.Neurol.Neurosurg.Psych.67:451-456(1999)；Portielji,et al.Cancer Immunol.Immunother.52:133-144(2003)]。还可以提供剂量以实现受试者血清中犬源化鼠抗犬CTLA-4抗体的预定目标浓度，例如0.1、0.3、1、3、10、30、100、300μg/ml或更多。在其它实施方案中，本发明的犬源化鼠抗犬CTLA-4抗体每周、每两周、“每4周”、每月、每两月或每季度以10、20、50、80、100、200、500、1000或2500mg/受试者皮下或静脉内施用。
被抗犬CTLA-4mAb识别的抗原肽(例如，包含来自CTLA-4的表位或其部分的肽)也可以用作疫苗以引发阻断犬CTLA-4与犬CD80和/或CD86结合的抗体。这样的疫苗可用作疾病如癌症的治疗性疫苗。为了使用这些抗原肽作为疫苗，可以将这些肽中的一种或多种化学偶联或通过重组DNA技术与另一种载体蛋白偶联，以增强这些肽的免疫原性并引发肽特异性抗体。用于将肽偶联至载体蛋白的技术是本领域技术人员已知的。肽疫苗可用于通过IM、S/C、口服、喷雾或卵内途径接种动物。肽疫苗可以用作从细菌、病毒、酵母或杆状病毒系统表达的亚基蛋白。可替代地，可以在施用表达这样的肽疫苗的多种病毒或细菌载体之后递送这样的肽疫苗，如可以通过本领域技术人员已知的方法实施的。肽疫苗可以以1-1000μg的剂量施用，并且可以任选地含有助剂和可接受的药物载体。
如本文使用的“抑制(inhibit)”或“治疗(treat)”或“处理(treatment)”包括与病症有关的症状的发展的延迟和/或这样的病症的症状的严重程度的减少。该术语还包括改善现有的不受控制的或不想要的症状，预防另外的症状，以及改善或预防这些症状的潜在原因。因此，该术语表示已经赋予具有病症、疾病或症状或具有发展这种病症、疾病或症状的潜力的脊椎动物受试者(例如，犬科动物)有益的结果。
如本文使用的术语“治疗有效量”、“治疗有效剂量”和“有效量”指本发明的犬源化鼠抗犬CTLA-4抗体或其抗原结合片段的量，当单独或与另外的治疗剂组合施用于细胞、组织或受试者时，所述量有效引起疾病或病症的一种或多种症状或这样的疾病或病症的进展的可测量的改善。治疗有效剂量进一步指足以导致症状的至少部分改善，例如相关医学病症的治疗、愈合、预防或改善，或这样的病症的治疗、愈合、预防或改善速率的增加的结合化合物的量。当应用于单独施用的单个活性成分时，治疗有效剂量是指单独的该成分。当应用于组合时，治疗有效剂量指产生治疗效果的活性成分的组合量，无论是组合施用、连续施用还是同时施用。有效量的治疗剂将导致诊断量度或参数改善至少10％；通常至少20％；优选至少约30％；更优选至少40％，和最优选至少50％。在使用主观测量来评估疾病严重程度的情况下，有效量还可以导致主观测量的改善。
其它组合疗法
如前所述，本发明的犬源化鼠抗犬CTLA-4抗体或其抗原结合片段和/或抗原肽可以与一种或多种其他治疗剂(例如下一段中讨论的抑制剂)和/或犬源化鼠抗犬PD-1抗体[参见例如，U.S.9,944,704 B2和U.S.10,106,107B2，将这两篇的全部内容通过引用并入本文]和/或犬源化鼠抗犬PD-L1抗体[参见例如U.S.20180237535 A1，将其全部内容通过引用并入本文]共同施用。抗体可以连接至所述试剂(作为免疫复合物)，和/或可以与所述试剂或其它抗体分开施用。在后一种情况(分开施用)下，抗体可以在所述试剂之前、之后或同时施用，或可以与其它已知的疗法一起共同施用。
试剂盒
进一步提供试剂盒，其包含一种或多种组分，所述组分包括但不限于与一种或多种另外的组分(包括犬源化鼠抗犬PD-1抗体和/或犬源化鼠抗犬PD-L1抗体)联合的如本文讨论的特异性结合CTLA-4的抗体或抗原结合片段(例如，犬源化鼠抗犬CTLA-4抗体或其抗原结合片段)。如刚刚上文描述的结合组合物可以配制为纯组合物或与可药用载体组合在药物组合物中。
在一个实施方案中，试剂盒包括本发明的结合组合物(例如，在一个容器中(例如，在无菌玻璃或塑料小瓶中)的犬源化鼠抗犬CTLA-4或其药物组合物，在另一个容器中(例如，在无菌玻璃或塑料小瓶中)的犬源化鼠抗犬PD-1抗体和/或犬源化鼠抗犬PD-L1抗体或其药物组合物)。
如果试剂盒包括用于向受试者肠胃外施用的药物组合物，则试剂盒还可以包括用于进行这种施用的装置。例如，试剂盒可以包括一个或多个皮下注射针或如上所述的其他注射装置。试剂盒还可以包括包装插页，其包括关于试剂盒中的药物组合物和剂型的信息。通常，这样的信息有助于宠物主人和兽医有效且安全地使用包封的药物组合物和剂型。例如，可以在插页中提供关于本发明的组合的以下信息：药代动力学、药效学、临床研究、功效参数、适应症和用法、禁忌症、警告、注意事项、不良反应、过量用药、适当剂量和施用、供应规格、适当储存条件、参考文献、生产商/分销商信息和专利信息。
为了方便起见，本文公开的抗体或特异性结合剂可以在试剂盒中提供，即预定量的试剂与用于进行诊断或检测测定的说明书的包装组合。当一种或多种抗体用酶标记时，试剂盒将包括酶所需的底物和辅因子(例如，提供可检测发色团或荧光团的底物前体)。另外，可能包括其它添加剂，比如稳定剂、缓冲剂(例如，封闭缓冲液或裂解缓冲液)等。各种试剂的相对量可以广泛变化，以提供实质上优化测定的灵敏度的试剂在溶液中的浓度。特别地，试剂可以作为干粉提供，通常是冻干的，包括赋形剂，其在溶解时将提供具有适当浓度的试剂溶液。
实施例
实施例1
针对犬CTLA-4的小鼠单克隆抗体和相应的小鼠-犬嵌合抗体的生成
使用小鼠杂交瘤技术，用犬CTLA-4(cCTLA-4)重组蛋白作为免疫原生成小鼠单克隆抗体。通过ELISA和FACS测定，基于用cCTLA-4的抗体反应性和犬CD86或CD80与cCTLA-4的相互作用的阻断(阻断活性)来选择阳性杂交瘤克隆。通过cDNA末端快速扩增(RACE)对选择的杂交瘤克隆进行VH和VL序列的抗体片段的测序。选择的六种单克隆抗体分别表示为：12B3、27G12、39A11、45A9、110E3和22A11。六种抗体的氨基酸序列对于重链可变区分别为SEQ ID NO:2、4、6、8、10和12，并且对于轻链可变区分别为SEQ ID NO:14、16、18、20、22和24。在下文提供的序列中对CDR加下划线[还参见下表1]。编码上述氨基酸序列的相应核苷酸序列对于重链可变区分别列为SEQ ID NO：1、3、5、7、9和11，对于轻链可变区分别列为SEQID NO：13、15、17、19、21和23。将重链可变区的核苷酸序列分别与修饰的犬恒定重链(CH1-铰链-CH2-CH3)的核苷酸序列融合，以产生命名为SEQ ID NO:25、27、29、31、33和35的嵌合小鼠-犬重链核苷酸序列。可变区以粗体显示。将轻链可变区的核苷酸序列分别融合到犬恒定κ轻链结构域的核苷酸序列，以产生命名为SEQ ID NO:37、39、41、43、45和47的嵌合小鼠-犬轻链核苷酸序列。可变区以粗体显示。将由嵌合小鼠-犬重链核苷酸序列编码的氨基酸序列命名为SEQ ID NO:26、28、30、32、34和36。将由嵌合小鼠-犬轻链核苷酸序列编码的氨基酸序列命名为SEQ ID NO:38、40、42、44、46和48。可变区以粗体显示，且CDR加下划线。使用标准分子生物学技术将嵌合人-犬重链和轻链克隆到单独的表达质粒中。将含有重链和轻链基因的质粒转染到HEK 293细胞中，并使用蛋白A从HEK 293细胞上清液中纯化表达的抗体。
实施例2
小鼠CDR的氨基酸序列
将来自小鼠抗犬CTLA-4单克隆抗体的CDR列在下表1中。
表1
小鼠CDR的氨基酸序列
将六种抗体各自的六个CDR的各个规范结构分配提供在下表2中。
表2
小鼠CDR的规范结构
| 抗体 | L1 | L2 | L3 | H1 | H2 | H3 |
| 12B3 | 4 | 1 | 1 | 1 | 2A | 7 |
| 27G12 | 4 | 1 | 1 | 1 | 2A | 7 |
| 39A11 | 1 | 1 | 1 | 1 | 4 | 9 |
| 45A9 | 4 | 1 | 1 | 1 | 2A | 7 |
| 22A11 | 2 | 1 | 1 | 1 | 2A | 12 |
| 110E3 | 4 | 1 | 1 | 1 | 2A | 7 |
实施例3
嵌合抗体与犬CTLA-4的反应性
嵌合抗体通常具有与其亲本小鼠抗体相同的反应性。为了证实六种抗体与cCTLA-4的反应性，产生小鼠-犬嵌合抗体，并如下通过ELISA测试其与cCTLA-4的反应性：
1.在免疫板中包被200ng/孔的cCTLA-4，并在4℃下，将所述板孵育过夜。
2.用含有0.05％的吐温20的PBS(PBST)洗涤所述板3次。
3.在室温下，用PBS中的0.5％BSA封闭所述板45-60分钟。
4.用PBST洗涤所述板3次。
5.将稀释板的每列或每行中的抗体三倍稀释。
6.将稀释的抗体转移到板的每列或每行中，并在室温下，将所述板孵育45-60分钟。
7.用PBST洗涤所述板3次。
8.将1:2000稀释的辣根过氧化物酶标记的抗犬IgG Fc加入所述板的每个孔中，并在室温下，将所述板孵育45-60分钟。
9.用PBST洗涤所述板3次。
10.将TMB底物加入所述板的每个孔中，并在室温下，将所述板孵育10至15分钟以允许显色。
11.将100μL的1.5M磷酸加入到每个孔中以终止反应。
12.用540nm的参考波长在450nm读板。
ELISA结果表明嵌合抗体可以结合cCTLA-4[参见图1]。
实施例4
嵌合抗体犬CD86或CD80与犬CTLA-4的相互作用的阻断活性
为了研究嵌合抗体的阻断活性，如下进行基于ELISA的阻断测定：
1.在免疫板中包被200ng/孔的cCTLA-4，并在4℃下，将所述板孵育过夜。
2.用含有0.05％的吐温20的PBS(PBST)洗涤所述板3次。
3.在室温下，用PBS中的0.5％BSA封闭所述板45-60分钟。
4.用PBST洗涤所述板3次。
5.将稀释板的每列或每行中的抗体三倍稀释，然后加入100ng/孔生物素化的CD86或CD80。接着，与抗体混合。
6.将该混合物转移到免疫板的每列或每行中，并在室温下，将所述板孵育45-60分钟。
7.与PBST洗涤所述板3次。
8.将1:2000稀释的辣根过氧化物酶缀合的链亲和素加入到所述板的每个孔中，并在室温下，将所述板孵育45-60分钟。
9.与PBST洗涤所述板3次。
10.将TMB底物加入所述板的每个孔中，并在室温下，将所述板培养10至15分钟以允许显色。
11.将100μL的1.5M磷酸加入到每个孔中以终止反应。
12.用540nm的参考波长在450nm读板。
发现嵌合抗体阻断cCTLA-4与CD86[图2]和与CD80[图3]的相互作用。
实施例5
用于测试嵌合抗体对CHO-cCTLA-4的结合活性的FACS测定
生成稳定表达cCTLA-4的CHO-K1细胞系。使用细胞在FACS流式测定中测试抗体结合和阻断活性。为了测试嵌合抗体的cCTLA-4结合活性，如下进行FACS测定：
1.在T-75烧瓶中的培养基中使CHO-K1-CCTLA-4细胞生长。当细胞融合达到90％时，将细胞传代。
培养基∶F12K(Gibco,目录号21127-022)、10％FBS(Gibco,目录号10099-141)，和4μg/ml的嘌呤霉素(Gibco，目录号A1113803).
2.通过胰蛋白酶-EDTA溶液脱离细胞，将细胞再悬浮在培养基中，并计数具有超过95％的存活力的活细胞。
3.使细胞离心下降，抽吸出上清液，然后将细胞再悬浮到FACS缓冲液(ThermoFisher Scientific，目录号BDB554656)中至1×107个细胞/ml。
4.将抗体加入到100μL的细胞中，在室温下培养30分钟，同时轻轻振荡。
5.将细胞用3×250μL的FACS缓冲液洗涤，并将细胞再悬浮到100μL的FACS缓冲液中。
6.用FITC缀合的抗犬IgG染色细胞，在室温下孵育30分钟，同时轻轻振摇。
7.将细胞与3×250μL的FACS缓冲液洗涤，并将细胞再悬浮到500μL的FACS缓冲液中。
8.通过流式细胞仪读取10,000个细胞。
FACS结果显示嵌合抗体可以结合CHO-CCTLA-4细胞[参见图4A-4G]。
实施例6
嵌合抗体活化的犬PBMC的干扰素γ(IFNγ)生成犬外周血单核细胞的分离
1.将～20ml的全血收集在EDTA或肝素钠管中。
2.将血液转移到50mL的聚苯乙烯管中，并用HBSS(Thermo Fisher Scientific目录号21022CM)以50：50稀释。
3.将15ml的Ficoll-Plaque Plus加入到4×50ml的SepMateTM管(StemcellTechnologies，目录号15460)中。然后，缓慢加入～10ml的50：50稀释的血液，并加入到含有Ficoll的各个SepmateTM管的一侧。
4.以1200×g离心管20分钟。
5.从梯度界面收集细胞，并将细胞转移到50mL的聚丙烯管中。将HBSS加入到40-45ml的标记物，并将细胞以800×g离心10分钟。
6.弃去上清液，将细胞再悬浮在40-45ml的HBSS中，并将管再次以800×g离心10分钟。
7.弃去上清液，并用2ml的犬淋巴细胞培养基(RPMI培养基，Lonza，目录号12-167Q)再悬浮来自每个管的细胞。将来自同一动物的细胞合并。
8.取小等分试样的细胞悬浮液，将其与0.04％的台盼蓝混合并计数细胞数。
9.将细胞悬浮液储存在2-7℃直至使用，但在使用前不超过24小时。
犬外周血单核细胞的细胞增殖测定
1.在犬淋巴细胞培养基中稀释抗体，得到40μg/mL的终浓度(制备160μg/mL)，并使用0.2μm针筒式过滤器灭菌。将两倍稀释的抗体置于无菌稀释板上，并将其放在一边。
2.将细胞在犬淋巴细胞培养基中稀释至2.5×106个细胞/mL，并以100μL/孔分配在整个96孔组织培养板中。
3.将Con A稀释在犬淋巴细胞培养基中，得到最终浓度250ng/mL(制备1000ng/mL)，使用0.2μm针筒式过滤器灭菌，并向所有孔中加入50μL。(不将Con A加入到用于仅细胞对照的八个孔的一列和用于仅细胞+mAb对照的各孔中)。
4.将100μL的犬淋巴细胞培养基/孔加入到仅细胞孔中，并将50μL的培养基加入到含有Con A的对照孔的列中(没有mAb处理的Con A+细胞)。
5.向一式两份的孔中加入50μL稀释的mAb。
6.在湿润的培养箱中，在36±2℃，4.0-6.0％CO2下孵育板68至124小时。
IFNγELISA
1.在68-124小时孵育之后，将板以800×g离心10分钟。
2.从每个孔收集上清液并合并重复。可以将这些样品冷冻在≤-50
℃下，供以后使用或立即测试。
3.如果需要，适当地稀释上清液样品，并根据犬IFN-γQuantikine ELISA试剂盒[R&D Systems，目录号CAIF00]的说明书进行IFN-γELISA。
结果证实所选择的抗体(包括12B3)可以活化犬T细胞产生IFN[参见下图5]。
实施例7
犬源化抗-cCTLA-4单克隆抗体12B3和39A11的构建
由于它们对cCTLA-4的强结合亲和力和它们对cCTLA-4与其配体CD86和CD80的阻断活性，选择鼠抗体12B3和39A11用于制备初始犬源化抗体。为了执行犬源化的过程，确定了编码犬IgG的重链和轻链的DNA序列。犬重链和轻链的DNA和蛋白质序列是本领域已知的，并且可以通过搜索NCBI基因和蛋白质数据库获得。存在狗IgG的四种已知IgG亚型，它们被称为IgGA、IgGB、IgGC和IgGD。与人IgG1一样，犬IgGB具有强效应子功能。为了敲除IgGB的效应子功能，构建了经修饰的IgGB(IgGBm)，其去除天然ADCC和CDC功能[参见U.S.10,106,107B2，将其全部内容通过引用并入本文]。犬抗体中存在两种类型的轻链，称为κ和λ。不受任何特定方法的束缚，产生可以不同组合混合以产生犬源化抗犬CTLA-4mAb的犬源化重链和轻链的整个过程可包括以下方案：
i)鉴定选择的抗体的H链和L链的CDR。将CDR的氨基酸序列翻译回成合适的DNA序列。
ii)鉴定犬IgG的H和L链(例如IgGB的重链和轻κ链)的合适DNA序列。
iii)鉴定编码上述序列的犬IgG H和L链DNA的内源性CDR的DNA序列。
iv)用编码选择的抗体的CDR的DNA序列替换编码内源性犬H和L链CDR的DNA序列。此外，任选地用编码来自选择的抗体框架区的选择的氨基酸残基的DNA替换编码一些犬框架氨基酸残基的DNA。
v)合成来自步骤(iv)的DNA，并将其克隆到合适的表达质粒中。
vi)将合成的质粒转染到HEK 293细胞中。
vii)从HEK 293上清液纯化表达的犬源化抗体。
viii)测试纯化的犬源化抗体与犬CTLA-4的结合。
将12B3和39A11的CDR的核苷酸和氨基酸序列列在下表3中。
表3
用于犬源化抗体的CDR的核苷酸和氨基酸序列
构建了一组犬源化轻链和重链序列。它们的序列标识号提供在下表4-6中。
表4
12B3和39A11的犬源化轻链的SEQ ID编号
1.对CDR加下划线；2.在随后的序列中可变区以粗体表示。
表5
具有野生型IgGb(天然)的12B3和39A11的犬源化重链的SEQ ID NO
1.对CDR加下划线；2.在随后的序列中可变区以粗体表示。
表6
具有IgGBm(修饰的IgGB)的12B3和39A11的犬源化重链的SEQ ID NO
1.对CDR加下划线；2.在随后的序列中可变区以粗体表示。
表7
相关现有技术序列
本发明提供由上表中列出的每种抗体的犬源化重链和轻链的组合形成的12B3和39A11的犬源化抗体；这样的抗体证实与cCTLA-4的特别强结合。如图6所示，ELISA结果指示12B3和39A11均被成功犬源化。犬源化C12B3L3H2和L3H3具有与亲本12B3类似的与cCTLA-4的反应性；犬源化c39A11L3H3具有与亲本39A11类似的与cCTLA-4的反应性。12B3和39A11的嵌合体代表其亲本抗体。
核苷酸(NA)和氨基酸(AA)序列
SEQ ID NO:1：小鼠单克隆抗体12B3重链可变区NA序列
cagatccagttggtgcagtctggacctgagctgaagaagcctggagagacagtcaagatctcctgcaaggcttctgggtataccttcacaaactatggaatgaactgggtgaagcaggctccaggaaagggtttaaagtggatgggctggataaacacctacactggagagccaacatatgctgatgacttcaagggacggtttgccttctctttggaaacctctgccagcactgcctatttgcagatcaacaacctcaaaaatgaggacatggctacatatttctgtgcaagacggtcaatttattacccgtactggggccaaggcaccactctcacagtctcctca
SEQ ID NO:2：小鼠单克隆抗体12B3重链可变区AA序列
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDMATYFCARRSIYYPYWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO:3：小鼠单克隆抗体27G12重链可变区NA序列
cagatccagttggtacagtctggacctgagctgaagaagcctggagagacagtcaagatctcctgcaaggcttctgggtataccttcacaacctatggagtgagctgggtgaaacaggctccaggaaagggtttaaggtggatgggctggataaacacctactctggaatgccaacatatgttgatgacttcaagggacggtttgccttctctttggaaacctctgccagcactgcctttttgcagatcaacaacctcaaaaatgaggacacggctatatatttctgtgcaagacggggtatctcctttgactactggggccaaggcaccactctcacagtctcctca
SEQ ID NO:4：小鼠单克隆抗体27G12重链可变区AA序列
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTTYGVSWVKQAPGKGLRWMGWINTYSGMPTYVDDFKGRFAFSLETSASTAFLQINNLKNEDTAIYFCARRGISFDYWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO:5：小鼠单克隆抗体39A11重链可变区NA序列
gaggtgaagctggtggagtctggaggaggcttggtacagcctgggggttccctgagtctctcctgtgcaacttctggattcaccttcagtgattactacatgagctgggtccgccagtctccggggaaggcacttgagtggatgggttttattagaaacaaagctaatggttacacaacagagtacagcgcatctctgaagggtcggttcaccatctccagagataattcccaaagcatcctctatcttcaaatgaatgtcctgagagctgaggacagtgccacttattactgtgtaagatttgggttaatgtactactttgactactggggccaaggcaccactctcacagtctcctca
SEQ ID NO:6：小鼠单克隆抗体39A11重链可变区AA序列
EVKLVESGGGLVQPGGSLSLSCATSGFTFSDYYMSWVRQSPGKALEWMGFIRNKANGYTTEYSASLKGRFTISRDNSQSILYLQMNVLRAEDSATYYCVRFGLMYYFDYWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO:7：小鼠单克隆抗体45A9重链可变区NA序列
cagatccagttggtgcagtctggacctgagctgaagaagcctggagagacagtcaagatctcctgcaaggcttctgggtataccttcacaaactatggaatgaactgggtgaagcaggctccaggaaagggtttaaagtggatgggctggataaacacctacactggagagccaacatatgctgatgacttcaagggacggtttgccttctctttggaaacctctgccagcactgcctatttgcagatcaacaacctcaaaaatgaggacacggctacatatttctgtgcaagaagggggacctactataggccctggggccaaggcaccactctcacagtctcctca
SEQ ID NO:8：小鼠单克隆抗体45A9重链可变区AA序列
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCARRGTYYRPWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO:9：小鼠单克隆抗体110E3重链可变区NA序列
cagatccagttggtgcagtctggacctgagctgaagaagcctggagagacagtcaagatctcctgcaaggcttctggatataccttcacaaactatggaatgaactgggtgaagcaggctccaggaaagggtttaaagtggatgggctggataaacacctacactggagagccaacatatgctgatgacttcaagggacgggttgccttctctttggaaacctctgccagcactgcctttttgcagatcaacaacctcaaaaatgaggacacggctacatatttctgtgcaaggcggggggtacgactggactactggggccaaggcaccactctcacagtctcctca
SEQ ID NO:10：小鼠单克隆抗体110E3重链可变区AA序列
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRVAFSLETSASTAFLQINNLKNEDTATYFCARRGVRLDYWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO:11:小鼠单克隆抗体22A11重链可变区NA序列
caggtccaactgcagcagcctgggactgaactggtgaagcctggggcttcagtgaagctgtcctgcaaggcctctggctataccttcaccagctactggatgcactgggtgaagcagaggcctggacaaggccttgagtggattggaaatatcaatcctagcaatggtggtactaggttcaatgagaagttcaagaacaaggccacactgactgaagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcagtagcctgacatctgaggactctgcggtctattattgtgcaagatcgaactacggtagtggctgggcctggtttgcttactggggccaagggactctggtcactgtctctgca
SEQ ID NO:12：小鼠单克隆抗体22A11重链可变区AA序列
QVQLQQPGTELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGNINPSNGGTRFNEKFKNKATLTEDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSNYGSGWAWFAYWGQGTLVTVSA
SEQ ID NO:13：小鼠单克隆抗体12B3轻链可变区NA序列
gatgttttgatgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgcagatctagtcagagcattgtatatagtaatggaaacacctatttagaatggtacctgcagaaaccaggccagtctccaaagctcctgatctacaaagtttccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttattactgctttcaaggttcacatgttccgtggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaa
SEQ ID NO:14：小鼠单克隆抗体12B3轻链可变区AA序列
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPWTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO:15：小鼠单克隆抗体27G12轻链可变区NA序列
Gatgttttgatgacccagactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcacgcctccatctcttgcaaatctagtcagagcattgtatatattaatggaaacacctatttagaatggtacctgcagaagccaggccagtctccaaagctcctgatctacaaagtttccaaacgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttattactgctttcaaggttcacatgttccgtggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaa
SEQ ID NO:16：小鼠单克隆抗体27G12轻链可变区AA序列
DVLMTQTPLSLPVSLGDHASISCKSSQSIVYINGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPWTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO:17：小鼠单克隆抗体39A11轻链可变区NA序列
gaaaatgtgctcatccagtctccagcaatcatgtctgcttctccaggggaaaaggtcaccatgacctgcagggccagctcaagtgtaagttccagttacttgcactggtaccagcagaagtcaggtgcctcccccaaactctggatttttagcacatccaacttggcttctggagtccctgctcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcttattctctcacaatcaacagtgtggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtacagtggtctcccactcacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaa
SEQ ID NO:18：小鼠单克隆抗体39A11轻链可变区AA序列
ENVLIQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSSSYLHWYQQKSGASPKLWIFSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTINSVEAEDAATYYCQQYSGLPLTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO:19：小鼠单克隆抗体45A9轻链可变区NA序列
gatgttttgatgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgcagatctagtcagagtattgtatatagtcatggaaacacctatttagaatggtacctgcagaaaccaggccagtctccaaaggtcctgatctacaaagtttccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttattactgctttcaaggttcacatgttccgtggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaa
SEQ ID NO:20：小鼠单克隆抗体45A9轻链可变区AA序列
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVYSHGNTYLEWYLQKPGQSPKVLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPWTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO:21：小鼠单克隆抗体110E3轻链可变区NA序列
gatgttttgatgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgcagatctagtcagagcattgtatatattagtggaagcacctatttagaatggtatctgcagaaaccaggccagtctccaaagctcctgatctacaaagtttccagtcgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttattactgctttcaaggttcacatgttccgtggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaa
SEQ ID NO:22：小鼠单克隆抗体110E3轻链可变区AA序列
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVYISGSTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSSRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPWTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO:23：小鼠单克隆抗体22A11轻链可变区NA序列
gacatccagatgaaccagtctccatccagtctgtctgcatcccttggagacacaattaccatcacttgccatgccagtcagaacattaatgtttggttaagctggtaccagcagaaaccaggaaatattcctaaacttttgatctataagtcttccaacttgcacacaggcgtcccatcaaggtttagtggcagtggatctggaacaggtttcacattaaccatcagcagcctgcagcctgaagacattgccacttactactgtcaacagggtcaaagttatccgtggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaa
SEQ ID NO:24：小鼠单克隆抗体22A11轻链可变区AA序列
DIQMNQSPSSLSASLGDTITITCHASQNINVWLSWYQQKPGNIPKLLIYKSSNLHTGVPSRFSGSGSGTGFTLTISSLQPEDIATYYCQQGQSYPWTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO:25：小鼠-犬嵌合抗体12B3重链NA序列
SEQ ID NO:26：小鼠-犬嵌合抗体12B3重链AA序列
SEQ ID NO:27：小鼠-犬嵌合抗体27G12重链NA序列
SEQ ID NO:28：小鼠-犬嵌合抗体27G12重链AA序列
SEQ ID NO:29：小鼠-犬嵌合抗体39A11重链NA序列
SEQ ID NO:30：小鼠-犬嵌合抗体39A11重链AA序列
SEQ ID NO:31：小鼠-犬嵌合抗体45A9重链NA序列
SEQ ID NO:32:小鼠-犬嵌合抗体45A9重链AA序列
SEQ ID NO:33：小鼠-犬嵌合抗体110E3重链NA序列
SEQ ID NO:34：小鼠-犬嵌合抗体110E3重链AA序列
SEQ ID NO:35：小鼠-犬嵌合抗体22A11重链NA序列
SEQ ID NO:36：小鼠-犬嵌合抗体22A11重链AA序列
SEQ ID NO:37：小鼠-犬嵌合抗体12B3轻链NA序列
SEQ ID NO:38：小鼠-犬嵌合抗体12B3轻链AA序列
SEQ ID NO:39:小鼠-犬嵌合抗体27G12轻链NA序列
SEQ ID NO:40：小鼠-犬嵌合抗体27G12轻链AA序列
SEQ ID NO:41：小鼠-犬嵌合抗体39A11轻链NA序列
SEQ ID NO:42：小鼠-犬嵌合抗体39A11轻链AA序列
SEQ ID NO:43：小鼠-犬嵌合抗体45A9轻链NA序列
SEQ ID NO:44：小鼠-犬嵌合抗体45A9轻链AA序列
SEQ ID NO:45：小鼠-犬嵌合抗体110E3轻链NA序列
SEQ ID NO:46：小鼠-犬嵌合抗体110E3轻链AA序列
SEQ ID NO:47：小鼠-犬嵌合单克隆抗体22A11轻链NA序列
SEQ ID NO:48：小鼠-犬嵌合抗体22A11轻链AA序列
SEQ ID NO:49：犬源化12B3轻链NA序列(VL1)
SEQ ID NO:50：犬源化12B3轻链AA序列(VL1)
SEQ ID NO:51：犬源化12B3轻链NA序列(VL2)
SEQ ID NO:52：犬源化12B3轻链AA序列(VL2)
SEQ ID NO:53：犬源化12B3轻链NA序列(VL3)
SEQ ID NO:54：犬源化12B3轻链AA序列(VL3)
SEQ ID NO:55:犬源化39A11轻链NA序列(VL1)
SEQ ID NO:56：犬源化39A11轻链AA序列(VL1)
SEQ ID NO:57：犬源化39A11轻链NA序列(VL2)
SEQ ID NO:58：犬源化39A11轻链AA序列(VL2)
SEQ ID NO:59：犬源化39A11轻链NA序列(VL3)
SEQ ID NO:60：犬源化39A11轻链AA序列(VL3)
SEQ ID NO:61：具有IgGB的犬源化12B3重链NA序列(VH1)
SEQ ID NO:62：具有IgGB的犬源化12B3重链AA序列(VH1)
SEQ ID NO:63：具有IgGB的犬源化12B3重链NA序列(VH2)
SEQ ID NO:64：具有IgGB的犬源化12B3重链AA序列(VH2)
SEQ ID NO:65：具有IgGB的犬源化12B3重链NA序列(VH3)
SEQ ID NO:66：具有IgGB的犬源化12B3重链AA序列(VH3)
SEQ ID NO:67：具有IgGB的犬源化39A11重链NA序列(VH1)
SEQ ID NO:68：具有IgGB的犬源化39A11重链AA序列(VH1)
SEQ ID NO:69：具有IgGB的犬源化39A11重链NA序列(VH2)
SEQ ID NO:70：具有IgGB的犬源化39A11重链AA序列(VH2)
SEQ ID NO:71：具有IgGB的犬源化39A11重链NA序列(VH3)
SEQ ID NO:72：具有IgGB的犬源化39A11重链AA序列(VH3)
SEQ ID NO:73：具有IgGBm的犬源化12B3重链NA序列(VH1)
SEQ ID NO:74：具有IgGBm的犬源化12B3重链AA序列(VH1)
SEQ ID NO:75：具有IgGBm的犬源化12B3重链NA序列(VH2)
SEQ ID NO:76：具有IgGBm的犬源化12B3重链AA序列(VH2)
SEQ ID NO:77.具有IgGBm的犬源化12B3重链NA序列(VH3)
SEQ ID NO:78：具有IgGBm的犬源化12B3重链AA序列(VH3)
SEQ ID NO:79：具有IgGBm的犬源化39A11重链NA序列(VH1)
SEQ ID NO:80：具有IgGBm的犬源化39A11重链AA序列(VH1)
SEQ ID NO:81：具有IgGBm的犬源化39A11重链NA序列(VH2)
SEQ ID NO:82：具有IgGBm的犬源化39A11重链AA序列(VH2)
SEQ ID NO:83：具有IgGBm的犬源化39A11重链NA序列(VH3)
SEQ ID NO:84：具有IgGBm的犬源化39A11重链AA序列(VH3)
SEQ ID NO:125：犬CTLA-4NA序列(NCBI参照序列：NP_001003106).
atggcgggctttggctttcgccgccatggcgcgcagccggatctggcgagccgcacctggccgtgcaccgcgctgtttagcctgctgtttattccggtgtttagcaaaggcatgcatgtggcgcagccggcggtggtgctggcgagcagccgcggcgtggcgagctttgtgtgcgaatatggcagcagcggcaacgcggcggaagtgcgcgtgaccgtgctgcgccaggcgggcagccagatgaccgaagtgtgcgcggcgacctataccgtggaagatgaactggcgtttctggatgatagcacctgcaccggcaccagcagcggcaacaaagtgaacctgaccattcagggcctgcgcgcgatggataccggcctgtatatttgcaaagtggaactgatgtatccgccgccgtattatgtgggcatgggcaacggcacccagatttatgtgattgatccggaaccgtgcccggatagcgattttctgctgtggattctggcggcggtgagcagcggcctgtttttttatagctttctgattaccgcggtgagcctgagcaaaatgctgaaaaaacgcagcccgctgaccaccggcgtgtatgtgaaaatgccgccgaccgaaccggaatgcgaaaaacagtttcagccgtattttattccgattaac
SEQ ID NO:126：犬CTLA-4AA序列(NCBI参照序列：NP_001003106)
SEQ ID NO:138，成熟序列(即，减去信号序列)，粗体：
SEQ ID NO:127：遗传修饰的犬IgG B的cFc区域(来自U.S.10,106,107 B2)
LGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVALDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFAGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPGK
实施例8
犬源化抗-cCTLA-4单克隆抗体12B3和39A11的表位定位
抗体与其同源蛋白抗原的相互作用是通过抗体的特定氨基酸(互补位)与靶抗原的特定氨基酸(表位)的结合介导的。表位是通过免疫球蛋白引起特定反应的抗原决定簇。表位由抗原表面上的一组氨基酸组成。感兴趣的蛋白可以含有被不同抗体识别的几个表位。由抗体识别的表位被分为线性表位或构象表位。线性表位由蛋白中的一段连续氨基酸序列形成，而构象表位由在一级氨基酸序列中不连续的(例如，相距远)，但在三维蛋白折叠后汇聚在一起的氨基酸构成。
表位定位指鉴定由抗体在其靶抗原上识别的氨基酸序列(即表位)的过程。鉴定单克隆抗体(mAb)在靶抗原上识别的表位具有重要的应用。例如，它可以帮助开发新的治疗剂、诊断剂和疫苗。表位定位还可以帮助选择优化的治疗性mAb，并帮助阐明其作用机制。犬CTLA-4上的表位信息也可以阐明独特的表位，并定义疫苗的保护或致病作用。表位鉴定还可以导致基于鉴定的肽表位与载体蛋白或其它免疫刺激剂的化学或遗传偶联的亚单位疫苗的开发。
可以使用多克隆或单克隆抗体进行表位定位，并且根据表位的疑似性质(即，线性相对于构象)，采用几种方法进行表位鉴定。定位线性表位更直接且相对更容易执行。为此目的，线性表位定位的商业服务经常采用肽扫描。在这种情况下，化学合成一组重叠的靶蛋白短肽序列，并测试其结合感兴趣的抗体的能力。该策略是快速、高通量的，并且执行起来相对便宜。另一方面，不连续表位的定位在技术上更具挑战性，并且需要更专门的技术，例如单克隆抗体连同其靶蛋白的X射线共晶体学、氢-氘(H/D)交换、与酶促消化偶联的质谱法以及本领域技术人员已知的几种其它方法。
使用质谱法定位犬CTLA-4受体α表位：
为了确定犬源化12B3(由12B3L2H3示例)和39A11(由39A11L3H3示例)在犬CTLA-4上的表位，将cCTLA-4/c12B3L2H3和cCTLA-4/c39A11L2H3的每种复合物与氘代交联剂一起孵育，并进行多酶促切割。在富集交联的肽之后，通过高分辨率质谱(NLC-LTQ-OrbitrapMS)分析样品，并使用Xquest和Stavrox软件分析生成的数据。
分析表明c12B3L2H3与包含氨基酸序列SEQ ID NO:138的cCTLA-4上第35、38、51、53、90、93、98和102位的氨基酸残基相互作用(图7A)；c39A11L2H3与包含氨基酸序列SEQ IDNO:138的cCTLA-4上的第35、38、42、93和102位的氨基酸残基相互作用(图7B)。犬CTLA-4蛋白的两个特定区域描绘在图7A和7B中：分别为氨基酸序列SEQ ID NO:132和SEQ ID NO:133(参见下表8)。值得注意的是，两种抗体结合cCTLA-4上的SEQ ID NO:134和SEQ ID NO:136，其包含MYPPPY基序(SEQ ID NO:137)。MYPPPY基序与CD80和CD86形成环结合，这是CTLA-4跨物种(accross species)的保守基序。C12B3似乎还结合犬CTLA-4上包含氨基酸序列SEQ IDNO:135的一个另外的区域。结合实施例4的结果，表位定位结果进一步证实C12B3和C39A11都是具有阻断犬CTLA-4与其配体CD80和CD86相互作用的能力的功能性抗体。此外，与SEQID NO:134和SEQ ID NO:136中的表位结合的犬源化抗体也是本发明的一部分。
表8
THE 12B3和C39A1结合的犬CTLA-4的氨基酸区域
SEQ ID NO:132:AEVRVTVLRQAGSQMTEVCAATYTVEDELAF
SEQ ID NO:133:YICKVELMYPPPYYVGMGNGT
SEQ ID NO:134:TVLRQAGS
SEQ ID NO:135:ATYTV
SEQ ID NO:136:YICKVELMYPPPY
SEQ ID NO:137:MYPPPY。
Claims (45)
1.一种分离的哺乳动物抗体或抗原结合片段，其结合犬细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)并阻断犬CTLA-4与犬CD80的结合、阻断犬CTLA-4与犬CD86的结合、或阻断犬CTLA-4与犬CD80的结合和犬CTLA-4与犬CD86的结合两者；
其中所述抗体包含一组六个互补决定区(CDR)，其中三个是轻链CDR：CDR轻链1(CDRL1)、CDR轻链2(CDRL2)和CDR轻链3(CDRL3)；其中三个是重链CDR：CDR重链1(CDRH1)、CDR重链2(CDRH2)和CDR重链3(CDRH3)；
其中所述六个CDR的组选自组(i)、组(ii)、组(iii)、组(iv)、组(v)和组(vi)；
其中对于组(i)：
CDRL1包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:92的保守修饰的变体和包含规范结构类别4的SEQ ID NO:92的变体；
CDRL2包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:94的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的SEQ ID NO:94的变体；
CDRL3包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:96的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的SEQ ID NO:96的变体；
CDRH1包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:86的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的SEQ ID NO:86的变体；
CDRH2包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:88的保守修饰的变体和包含规范结构类别2A的SEQ ID NO:88的变体；和
CDRH3包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:90的保守修饰的变体和包含规范结构类别7的SEQ ID NO:90的变体；
其中对于组(ii)，
CDRL1包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:104的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的SEQ ID NO:104的变体；
CDRL2包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:106的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的SEQ ID NO:106的变体；
CDRL3包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:108的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的SEQ ID NO:108的变体；
CDRH1包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:98的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的SEQ ID NO:98的变体；
CDRH2包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:100的保守修饰的变体和包含规范结构类别4的SEQ ID NO:100的变体；和
CDRH3包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:102的保守修饰的变体和包含规范结构类别9的SEQ ID NO:102的变体；
其中对于组(iii)，
CDRL1包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:117的保守修饰的变体和包含规范结构类别4的SEQ ID NO:117的变体；
CDRL2包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:94的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的SEQ ID NO:94的变体；
CDRL3包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:96的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的SEQ ID NO:96的变体；
CDRH1包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:86的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的SEQ ID NO:86的变体；
CDRH2包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:88的保守修饰的变体和包含规范结构类别2A的SEQ ID NO:88的变体；和
CDRH3包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:113的保守修饰的变体和包含规范结构类别7的SEQ ID NO:113的变体；
其中对于组(iv)，
CDRL1包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:119的保守修饰的变体和包含规范结构类别4的SEQ ID NO:119的变体；
CDRL2包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:122的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的SEQ ID NO:122的变体；
CDRL3包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:96的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的SEQ ID NO:96的变体；
CDRH1包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:86的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的SEQ ID NO:86的变体；
CDRH2包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:88的保守修饰的变体和包含规范结构类别2A的SEQ ID NO:88的变体；和
CDRH3包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:115的保守修饰的变体和包含规范结构类别7的SEQ ID NO:115的变体；
其中对于组(v)，
CDRL1包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:118的保守修饰的变体和包含规范结构类别4的SEQ ID NO:118的变体；
CDRL2包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:121的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的SEQ ID NO:121的变体；
CDRL3包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:96的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的SEQ ID NO:96的变体；
CDRH1包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:109的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的SEQ ID NO:109的变体；
CDRH2包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:111的保守修饰的变体和包含规范结构类别2A的SEQ ID NO:111的变体；和
CDRH3包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:114的保守修饰的变体和包含规范结构类别7的SEQ ID NO:114的变体；和
其中对于组(vi)，
CDRL1包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:120的保守修饰的变体和包含规范结构类别2的SEQ ID NO:120的变体；和
CDRL2包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:123的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的SEQ ID NO:123的变体；
CDRL3包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:124的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的SEQ ID NO:124的变体；
CDRH1包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:110的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的SEQ ID NO:110的变体；
CDRH2包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:112的保守修饰的变体和包含规范结构类别2A的SEQ ID NO:112的变体；和
CDRH3包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:116的保守修饰的变体和包含规范结构类别12的SEQ ID NO:116的变体。
2.权利要求1的分离的哺乳动物抗体或其抗原结合片段，其中
(a)CDRL1包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:92的保守修饰的变体和包含规范结构类别4的SEQ ID NO:92的变体；
(b)CDRL2包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:94的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的SEQ ID NO:94的变体；
(c)CDRL3包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:96的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的SEQ ID NO:96的变体；
(d)CDRH1包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:86的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的SEQ ID NO:86的变体；
(e)CDRH2包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:88的保守修饰的变体和包含规范结构类别2A的SEQ ID NO:88的变体；和
(f)CDRH3包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:90的保守修饰的变体和包含规范结构类别7的SEQ ID NO:90的变体。
3.权利要求1的分离的哺乳动物抗体或其抗原结合片段，其中
(a)CDRL1包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:104的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的SEQ ID NO:104的变体；
(b)CDRL2包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:106的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的SEQ ID NO:106的变体；
(c)CDRL3包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:108的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的SEQ ID NO:108的变体；
(d)CDRH1包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:98的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的SEQ ID NO:98的变体；
(e)CDRH2包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:100的保守修饰的变体和包含规范结构类别4的SEQ ID NO:100的变体；和
(f)CDRH3包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:102的保守修饰的变体和包含规范结构类别9的SEQ ID NO:102的变体。
4.权利要求1的分离的哺乳动物抗体或其抗原结合片段，其中
(a)CDRL1包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:117的保守修饰的变体和包含规范结构类别4的SEQ ID NO:117的变体；
(b)CDRL2包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:94的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的SEQ ID NO:94的变体；
(c)CDRL3包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:96的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的SEQ ID NO:96的变体；
(d)CDRH1包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:86的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的SEQ ID NO:86的变体；
(e)CDRH2包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:88的保守修饰的变体和包含规范结构类别2A的SEQ ID NO:88的变体；和
(f)CDRH3包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:113的保守修饰的变体和包含规范结构类别7的SEQ ID NO:113的变体。
5.权利要求1的分离的哺乳动物抗体或其抗原结合片段，其中
(a)CDRL1包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:119的保守修饰的变体和包含规范结构类别4的SEQ ID NO:119的变体；
(b)CDRL2包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:122的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的SEQ ID NO:122的变体；
(c)CDRL3包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:96的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的SEQ ID NO:96的变体；
(d)CDRH1包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:86的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的SEQ ID NO:86的变体；
(e)CDRH2包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:88的保守修饰的变体和包含规范结构类别2A的SEQ ID NO:88的变体；和
(f)CDRH3包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:115的保守修饰的变体和包含规范结构类别7的SEQ ID NO:115的变体。
6.权利要求1的分离的哺乳动物抗体或其抗原结合片段，其中
(a)CDRL1包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:118的保守修饰的变体和包含规范结构类别4的SEQ ID NO:118的变体；
(b)CDRL2包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:121的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的SEQ ID NO:121的变体；
(c)CDRL3包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:96的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的SEQ ID NO:96的变体；
(d)CDRH1包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:109的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的SEQ ID NO:109的变体；
(e)CDRH2包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:111的保守修饰的变体和包含规范结构类别2A的SEQ ID NO:111的变体；和
(f)CDRH3包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:114的保守修饰的变体和包含规范结构类别7的SEQ ID NO:114的变体。
7.权利要求1的分离的哺乳动物抗体或其抗原结合片段，其中
(a)CDRL1包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:120的保守修饰的变体和包含规范结构类别2的SEQ ID NO:120的变体；
(b)CDRL2包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:123的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的SEQ ID NO:123的变体；
(c)CDRL3包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:124的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的SEQ ID NO:124的变体；
(d)CDRH1包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:110的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的SEQ ID NO:110的变体；
(e)CDRH2包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:112的保守修饰的变体和包含规范结构类别2A的SEQ ID NO:112的变体；和
(f)CDRH3包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:116的保守修饰的变体和包含规范结构类别12的SEQ ID NO:116的变体。
8.权利要求1、2、3、4、5、6或7的分离的哺乳动物抗体或其抗原结合片段，其中所述哺乳动物抗体是鼠抗体。
9.权利要求1、2、3、4、5、6或7的分离的哺乳动物抗体或其抗原结合片段，或权利要求8所述的鼠抗体，其是犬源化抗体或其犬源化抗原结合片段。
10.权利要求9的犬源化抗体或其犬源化抗原结合片段，其包含铰链区，所述铰链区包含选自SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:130和SEQ ID NO:131的氨基酸序列。
11.权利要求2的分离的哺乳动物抗体或其抗原结合片段，其是犬源化抗体或其犬源化抗原结合片段。
12.权利要求11的犬源化抗体或其抗原结合片段，其包含含有选自SEQ ID NO:62、SEQID NO:64和SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链，含有选自SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76和SEQ ID NO:78的氨基酸序列的修饰的重链，或含有选自SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52和SEQID NO:54的氨基酸序列的轻链，或所述重链或所述修饰的重链与所述轻链的组合。
13.权利要求12的犬源化抗体或其抗原结合片段，其包含由选自SEQ ID NO:61、SEQ IDNO:63和SEQ ID NO:65的核苷酸序列编码的重链，由选自SEQ ID NO：73、SEQ ID NO:75和SEQ ID NO：77的核苷酸序列编码的修饰的重链，和由选自SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51和SEQ ID NO：53的核苷酸序列编码的轻链，或所述重链或所述修饰的重链与所述轻链的组合。
14.权利要求12的犬源化抗体或其抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链。
15.权利要求12的犬源化抗体或其抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的修饰的重链。
16.权利要求14或15的犬源化抗体或其抗原结合片段，其进一步包含含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的轻链。
17.权利要求14或15的犬源化抗体或其抗原结合片段，其进一步包含含有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的轻链。
18.权利要求3的分离的哺乳动物抗体或其抗原结合片段，其是犬源化抗体或其犬源化抗原结合片段。
19.权利要求18的犬源化抗体或其抗原结合片段，其包含含有选自SEQ ID NO：68、SEQID NO：70和SEQ ID NO：72的氨基酸序列的重链，含有选自SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82和SEQ ID NO：84的氨基酸序列的修饰的重链，和含有选自SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58和SEQID NO：60的氨基酸序列的轻链，或所述重链或所述修饰的重链与所述轻链的组合。
20.权利要求19的犬源化抗体或其抗原结合片段，其包含由选自SEQ ID NO:67、SEQ IDNO:69和SEQ ID NO:71的核苷酸序列编码的重链，由选自SEQ ID NO：79、SEQ ID NO:81和SEQ ID NO：83的核苷酸序列编码的修饰的重链，和由选自SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57和SEQ ID NO：59的核苷酸序列编码的轻链，或所述重链或所述修饰的重链与所述轻链的组合。
21.权利要求19的犬源化抗体或其抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的重链。
22.权利要求19的犬源化抗体或其抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO:84的氨基酸序列的修饰的重链。
23.权利要求21或22的犬源化抗体或其抗原结合片段，其进一步包含含有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的轻链。
24.权利要求21或22的犬源化抗体或其抗原结合片段，其进一步包含含有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的轻链。
25.权利要求9-24中任一项的犬源化抗体或其抗原结合片段，其中所述犬源化抗体或其抗原结合片段显示出以下性质中的一种、两种、三种、四种或全部五种：
(i)以1×10-5M至1×10-12M的解离常数(Kd)结合犬CTLA-4；
(ii)以1×102M-1s-1至1×107M-1s-1的结合速率(kon)结合犬CTLA-4；
(iii)以1×10-3s-1至1×10-8s-1的解离速率(koff)结合犬CTLA-4；
(iv)阻断犬CTLA-4与犬CD80的结合；和
(v)阻断犬CTLA-4与犬CD86的结合。
26.犬源化单克隆抗体或其抗原结合片段，其与权利要求9-25中任一项的交叉竞争结合犬CTLA-4；其中所述犬源化单克隆抗体和其抗原结合片段结合犬CTLA-4，并且阻断犬CTLA-4与犬CD80和/或犬CD86的结合。
27.权利要求9-26中任一项的犬源化抗体，其中所述犬源化抗体结合选自SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136和SEQ ID NO:137的任一个或多个氨基酸序列。
28.权利要求27的犬源化抗体，其结合选自SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:135和SEQ IDNO:136的任一个或多个氨基酸序列。
29.权利要求28的犬源化抗体，其结合SEQ ID NO:134和SEQ ID NO:136的氨基酸序列。
30.权利要求29的犬源化抗体，其进一步结合SEQ ID NO：135。
31.分离的核酸，其编码权利要求9-30中任一项的犬源化抗体或其抗原结合片段的重链。
32.分离的核酸，其编码权利要求9-30中任一项的犬源化抗体或其抗原结合片段的轻链。
33.表达载体，其包含权利要求31和/或权利要求32的分离的核酸。
34.宿主细胞，其包含权利要求33的表达载体。
35.药物组合物，其包含权利要求9-30中任一项的犬源化抗体和可药用载体或稀释剂。
36.一种增加免疫细胞的活性的方法，其包括向需要其的受试者施用治疗有效量的权利要求35的药物组合物。
37.权利要求36的方法，其中所述方法用于：
(i)治疗癌症；
(ii)治疗感染或感染性疾病；
(iii)作为疫苗佐剂；或
(iv)其任意组合。
38.分离的肽，其包含5至25个氨基酸残基，所述氨基酸残基与选自SEQ ID NO:132和SEQ ID NO:133的氨基酸序列90％相同或更高，并且结合权利要求9-26中任一项的犬源化抗体。
39.权利要求38的分离的肽，其中所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:135和SEQ ID NO:136的氨基酸序列90％相同或更高。
40.权利要求39的分离的肽，其中所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:135和SEQ ID NO:136的氨基酸序列相同。
41.融合蛋白，其包含权利要求40的肽。
42.权利要求41的融合蛋白，其进一步包含非犬哺乳动物IgG的Fc区。
43.分离的核酸，其编码权利要求38、39或40的分离的肽、或权利要求41或权利要求42的融合蛋白、或其任何组合。
44.表达载体，其包含权利要求43的分离的核酸。
45.宿主细胞，其包含权利要求44的表达载体。
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