JP2022542808A - イヌｃｔｌａ－４に対するイヌ化抗体 - Google Patents

Abstract

本発明は、イヌＣＴＬＡ－４に対して特異的な配列及び高い結合親和性を有する、イヌＣＴＬＡ－４に対するイヌ化マウス抗体を提供する。本発明は、さらに、イヌＣＴＬＡ－４．５に対するイヌ化マウス抗体のためのイヌＣＴＬＡ－４のエピトープも提供する。本発明は、さらに、イヌ及び他のコンパニオンアニマルにおける癌の治療におけるこれらの抗体の使用にも関する。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ． § １１９（ｅ）に基づいて、２０１９年７月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／８７４，２８７号、２０１９年１０月２５日に出願された、米国仮特許出願第６２／９２６，０４７号及び２０２０年７月７日に出願された米国仮特許出願第６３／０４８，８７３号の優先権を主張するものであり、米国仮特許出願第６２／９２６，０４７号及び米国仮特許出願第６３／０４８，８７３号の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本発明は、共刺激又は共阻害シグナル伝達経路に関与するタンパク質（これは、ＣＴＬＡ－４を包含する）に対する抗体に関する。より特定的には、本発明は、さらに、特定の配列を有し且つイヌＣＴＬＡ－４に対する高い結合親和性を有している、イヌＣＴＬＡ－４に対するイヌ化抗体に関する。本発明は、さらに、イヌの癌の治療における本発明の抗体の使用にも関する。

免疫応答の開始又は終了は、多くの種類の免疫細胞（特に、Ｔリンパ球及び抗原提示細胞（ＡＰＣ））の表面で発現する一連のタンパク質の間の複雑な相互作用によって活性化されるシグナル伝達経路を介して媒介される。共刺激シグナル伝達経路は、免疫応答の発生をもたらし、そして、最も重要にはＴ細胞の表面のＣＤ２８とＡＰＣの表面のＢ７．１（ＣＤ８０としても知られている）及びＢ７．２（ＣＤ８６としても知られている）ファミリーメンバーとの相互作用を介して媒介されることが示されている。Ｂ７．１及びＢ７．２は、同様の機能を果たすと考えられている。

対照的に、共阻害経路は、免疫応答の阻害又は終結をもたらし、そして、Ｔ細胞上の細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）とＡＰＣ上のＣＤ８０／ＣＤ８６タンパク質の間の相互作用を介して媒介されることが示されている。さらなる共阻害シグナル伝達経路は、Ｔ細胞上のプログラム細胞死受容体１（ＰＤ－１）とＡＰＣ上のプログラム細胞死受容体リガンド１又は２（ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２）タンパク質の間の相互作用を介して媒介されることが示されている。さらに、ＰＤ－Ｌ１とＣＤ８０の間の相互作用も、Ｔ細胞内に阻害シグナルをもたらす可能性があることも示されている。

ＣＤ８０及びＣＤ８６は、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのメンバーである［Ｓｈａｒｐｅ ａｎｄ Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ，２：１１６－１２６（２００２）］。ＣＤ８０は、活性化Ｂ細胞、活性化Ｔ細胞、並びに、マクロファージ及び樹状細胞で発現する［Ｓｗａｎｓｏｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ，Ｅｕｒ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２３：２９５－２９８（１９９３）；Ｒａｚｉ－Ｗｏｌｆｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，８９：４２１０－４２１４（１９９２）］。ＣＤ８６は、樹状細胞、ランゲルハンス細胞及びＢ細胞で構成的に発現する。さらに、ＣＤ８６は、単球で発現し、そして、ＩＦＮ－γ刺激後にアップレギュレーションされる［Ｌａｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５２０８－５２１９（１９９４）；Ｉｎａｂａ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：１８４９－１８６０（１９９４）］。

ＣＤ８０及びＣＤ８６は、ＣＤ２８とＣＴＬＡ－４に結合して、異なる機能的結果をもたらす［Ｌｉｎｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，８７：５０３１－５０３５（１９９０）； Ｌｉｎｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．，１７３：７２１－７３０（１９９１）；Ａｚｕｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６６：７６－７９ （１９９３）；Ｆｒｅｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：９０９－９１２（１９９３）］。ＣＤ８０及びＣＤ８６のＣＴＬＡ－４への結合は、ＣＤ８０／ＣＤ８６のＣＤ２８への結合よりも極めて高い親和性を示す［ｖａｎ ｄｅｒ Ｍｅｒｗｅ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：３９３－４０２（１９９７）］。

ＣＤ２８は、Ｉｇスーパーファミリーのメンバーであるホモ二量体糖タンパク質である［Ａｒｕｆｆｏ ａｎｄ Ｓｅｅｄ，ＰＮＡＳ，８４：８５７３－８５７７ （１９８７）］。成熟タンパク質は、カウンター受容体結合に不可欠なヘキサペプチドモチーフＭＹＰＰＰＹを含む１３４アミノ酸残基からなる単一の細胞外可変ドメインを有している［Ｒｉｌｅｙ ａｎｄ Ｊｕｎｅ，Ｂｌｏｏｄ，１０５：１３－２１（２００５）］。ＣＤ２８の４１アミノ酸の細胞質ドメインは、活性化時にリン酸化され得る４つのチロシン残基を含む［Ｓｈａｒｐｅ ａｎｄ Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２：１１６－１２６（２００２）］。ＣＤ２８は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞の大部分とＣＤ８^＋Ｔ細胞の約５０％で発現する［Ｇｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４９：３８０-３８８（１９９２）；Ｒｉｌｅｙ ａｎｄ Ｊｕｎｅ，Ｂｌｏｏｄ，１０５：１３－２１（２００５）］。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ライゲーション後、ＣＤ２８に結合しているＢ７．１／Ｂ７．２は、重要な共刺激シグナルをＴ細胞に提供して、Ｔ細胞の活性化とそれに続く免疫応答の発生を可能にする［Ｒｅｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，８９：２７１－２７５（１９９２）；Ｊｅｎｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：２４６１－２４６６（１９９１）］。ＣＤ２８シグナルの非存在下では、Ｔ細胞はアポトーシスを起こすか又は無反応状態になることが示されている［Ｊｅｎｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６５：３０２－３１９（１９８７）；Ｊｅｎｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，８４：５４０９－５４１３（１９８７）；Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４８：１３４９－１３５６ （１９９０）］。ＣＤ２８－Ｂ７．１／Ｂ７．２結合は、活性化に必要なＴＣＲライゲーションの閾値レベル（例えば、抗原－ＭＨＣ複合体の量）を変化させ、ナイーブ細胞を刺激するのに必要な時間を短縮し、Ｔ細胞応答の大きさを高めることができる［Ｓｏｓｋｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２４：９６－１２３（２０１４）］。

ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）も、Ｉｇスーパーファミリーのメンバーであり、そして、単一の細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び短い細胞質尾部からなる［Ｓｗａｎｓｏｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；１０１０：１６９－１７７（２０００）］。さらに、ＣＴＬＡ－４は、ＣＤ２８と約３０％のアミノ酸同一性を共有している。ＣＴＬＡ－４は、ナイーブＴ細胞では構成的に発現しないが、ＣＤ２８ライゲーションとＴ細胞活性化の直後に急速にアップレギュレーションされ、最初のＴ細胞活性化後約４８～９６時間でＣＴＬＡ－４の発現レベルがピークになる［Ａｌｅｇｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５７：４７６２－４７７０（１９９６）；Ｆｒｅｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４９：３７９５－３８０１（１９９２）］。ＣＴＬＡ－４は、ＣＤ２８よりも極めて高い親和性でＢ７．１及びＢ７．２の両方に結合する［ｖａｎ ｄｅｒ Ｍｅｒｗｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．， １８５：３９３－４０２ （１９９７）］。しかしながら、ＣＤ２８結合Ｂ７．１又はＢ７．２の刺激効果とは対照的に、ＣＴＬＡ－４は、免疫応答のダウンモジュレーションに不可欠な抑制性受容体として機能する［Ｗａｌｎｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１：４０５－４１３（１９９４）； Ｗａｌｎｕｓ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８３：２５４１－２５５０（１９９６）；Ｋｒｕｍｍｅｌ ａｎｄ Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８３：２５３３－２５４０（１９９６）］。ＣＴＬＡ－４がその免疫抑制機能を媒介する機序は、ＣＤ２８とＣＤ８０／ＣＤ８６の間の相互作用の競合的阻害剤として作用する能力に関連している［「Ｓｗａｎｓｏｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１０１０：１６９－１７７ （２０００）」において概説されている］。免疫ダウンレギュレーションにおけるＣＴＬＡ－４の重要な役割は、ＣＴＬＡ－４欠損マウスで実証されており、そのＣＴＬＡ－４欠損マウスは、複数の臓器へのＴ細胞浸潤を特徴とするリンパ増殖性疾患の発症により３～５週齢で死亡する［Ｔｉｖｏｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３：５４１－５４１７（１９９５）；Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７０：９８５－９８８（１９９５）］。ＣＴＬＡ－４ノックアウトの結果は、ＣＴＬＡ－４／ＣＤ８０／ＣＤ８６トリプルノックアウトマウスでは疾患がないことによって示されるように、ＣＤ２８とそのリガンドであるＣＤ８０及びＣＤ８６との相互作用に依存することも実証された［Ｍａｎｄｅｌｂｒｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８９：４３５－４４０（１９９９）］。このことは、ＣＴＬＡ－４ＩｇをＣＴＬＡ－４ノックアウトマウスに繰り返し投与することによってもたらされるリンパ増殖に対する保護によっても確認されている［Ｔｉｖｏｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：５０９１－５０９４（１９９７）］。

さらに、ＣＴＬＡ－４の効果を抗体でブロックすると、インビトロ及びインビボでのＴ細胞応答が増強され、抗腫瘍免疫応答が増大することが示されている［Ｌｅａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７１：１７３４－１７３６ （１９９６）］。これらの知見に基づいて、癌を治療するための治療モダリティを提供するために、モノクローナル抗体のようなＣＴＬＡ－４ブロッカーの開発が行われた［Ｈｏｄｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，１００（８）：４７１２－４７１７（２００３）；Ｐｈａｎ ＧＱ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，１００（１４）：８３７２－８３７７（２００３）；Ａｔｔｉａ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２３（２５）：６０４３－６０５３（２００５）；Ｃｏｍｉｎ－Ａｎｄｕｉｘ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，６：２２－２２（２００８）； ＷＯ２００００３７５０４Ａ２；Ｕ．Ｓ．８，０１７，１１４Ｂ２； ＷＯ２０１００９７５９７Ａ１；ＷＯ２０１２１２０１２５Ａ１；及び、Ｂｏｕｔｒｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．，１３（８）：４７３－４８６（２０１６）］。

ＰＤ－１は、免疫調節受容体のＣＤ２８／ＣＴＬＡ－４ファミリーのメンバーである。ＰＤ－１は、さらに、Ｉｇスーパーファミリーのメンバーでもあり、そして、そのリガンドに結合する細胞外可変ドメイン及びシグナル伝達分子に結合する細胞質尾部を含む［「Ｚａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２５：１１６３－１１７４（２０１７）」において概説されている］。ＰＤ－１の細胞質尾部は、２つのチロシンベースのシグナル伝達モチーフを含む［Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２０：３３７－３４７ （２００４）］。ＰＤ－１の発現は、刺激されていないＴ細胞、Ｂ細胞又は骨髄細胞では見られない。しかしながら、ＰＤ－１の発現は、活性化後にこれらの細胞でアップレギュレーションされる［Ｃｈｅｍｎｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７３：９４５－９５４（２００４）； Ｐｅｔｒｖａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２０３：２２８１－２２９２（２００６）］。ＰＤ－１は、ＣＴＬＡ－４と最も密接に関連しており、約２４％のアミノ酸同一性を共有している［Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３５０：１７－３７（２０１０）］。ＰＤ－１は、ＡＰＣの表面において発現するＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２に結合すると、Ｔ細胞の活性化を低減させる。これらのリガンドのいずれかがＰＤ－１に結合すると、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介した抗原シグナル伝達が負に調節される。今日まで、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－Ｌ２のみがＰＤ－１に対するリガンドとして機能することがわかっている。ＣＴＬＡ－４の場合と同様に、ＰＤ－１ライゲーションは負の免疫調節シグナルを伝達するように見える。ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２によるＰＤ－１のライゲーションは、ＴＣＲを介した増殖及びサイトカイン産生の阻害をもたらす［Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３５０：１７－３７（２０１０）］。ＣＴＬＡ－４欠損動物とは対照的に、ＰＤ－１欠損マウスは、生涯のかなり後のほうで死亡し、そして、自己免疫の兆候を示すが、観察された影響の重症度は、ＣＴＬＡ－４欠損動物が示すほど深刻ではない［Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， １１（２）：１４１－１５１ （１９９９）； Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２９１（５５０２）：３１９－３２２ （２００１）］。ＰＤ－１シグナル伝達経路は現在集中的に研究されているが、これまでの研究は、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２／ＰＤ－１相互作用が、ＴＣＲ刺激の下流のシグナルを減少させ、そのことが、サイトカイン分泌の低減及びＴ細胞増殖の機能障害及びＴ細胞による細胞毒性分子の産生の低減をもたらすので、一部の免疫応答の負の調節に関与していることを示唆している［Ｆｒｅｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９２（７）：１０２７－１０３４（２０００）］。

ＰＤ－Ｌ１（ＣＤ２７４）は、１型膜タンパク質であり、そして、ＩｇＶ様細胞外ドメイン及びＩｇＣ様細胞外ドメイン、疎水性膜貫通ドメイン並びにシグナル伝達特性が不明な３０アミノ酸からなる短い細胞質尾部からなる。ＰＤ－Ｌ１は、Ｂ７ファミリーのメンバーとして認識されており、Ｂ７ファミリーのメンバーと約２０％のアミノ酸同一性を共有している。ＰＤ－Ｌ１は、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞及び骨髄細胞で見られる受容体ＰＤ－１に結合する。ＰＤ－Ｌ１は、共刺激分子ＣＤ８０にも結合するが、ＣＤ８６には結合しない［Ｂｕｔｔｅ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ４５ （１３）：３５６７－３５７２ （２００８）］。ＣＤ８０のＰＤ－Ｌ１に対する親和性は、ＣＤ２８及びＣＴＬＡ－４に対する親和性の中間である。関連分子ＰＤ－Ｌ２は、ＣＤ８０又はＣＤ８６のいずれにも親和性を有さないが、受容体としてＰＤ－１を共有している。ＰＤ－Ｌ１がＴ細胞上のその受容体ＰＤ－１に結合すると、ＴＣＲが介在するＩＬ－２産生とＴ細胞増殖を阻害するシグナルが送達される。ＰＤ－１に結合するＰＤ－Ｌ１は、ナイーブＴ細胞への抗原提示中にリガンド誘導性のＴＣＲダウンモジュレーションにも寄与する。さらに、ＰＤ－Ｌ１がＴ細胞上のＣＤ８０に結合すると、Ｔ細胞のアポトーシスが起こる。Ｔ細胞活性化の阻害剤としてのＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１の役割は、多くの研究で実証されている。これらの知見に基づいて、癌及び感染症を治療するための治療モダリティを提供するために、モノクローナル抗体のようなＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１ブロッカーの開発が行われた。

イヌＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１及びＣＴＬＡ－４の結合と活性をブロックするヒト化モノクローナル抗体が開発され、現在、いくつかの異なるタイプの癌のうちの１つと診断されたヒト対象の治療において使用することが可能である。同様に、イヌＰＤ－１及びＰＤＬ１の結合と活性をブロックするイヌ化モノクローナル抗体も報告されている［Ｕ．Ｓ．９，９４４，７０４Ｂ２、Ｕ．Ｓ．１０，１０６，６０７Ｂ２及びＵ．Ｓ．２０１８／０２３７５３５Ａ１；これらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる］。しかしながら、これまで、イヌＣＴＬＡ－４の結合と活性をブロックするイヌ化モノクローナル抗体は報告されていない。

本明細書中における参考文献の引用は、いずれも、そのような参考文献が本出願に対する「先行技術」として利用可能であることを承認するものと解釈されるべきではない。

ＷＯ２００００３７５０４Ａ２ Ｕ．Ｓ．８，０１７，１１４Ｂ２ ＷＯ２０１００９７５９７Ａ１ ＷＯ２０１２１２０１２５Ａ１ Ｕ．Ｓ．９，９４４，７０４Ｂ２ Ｕ．Ｓ．１０，１０６，６０７Ｂ２ Ｕ．Ｓ．２０１８／０２３７５３５Ａ１

Ｓｈａｒｐｅ ａｎｄ Ｆｒｅｅｍａｎ， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ，２：１１６－１２６（２００２） Ｓｗａｎｓｏｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ，Ｅｕｒ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２３：２９５－２９８（１９９３） Ｒａｚｉ－Ｗｏｌｆｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，８９：４２１０－４２１４（１９９２） Ｌａｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５２０８－５２１９（１９９４） Ｉｎａｂａ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：１８４９－１８６０ （１９９４） Ｌｉｎｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，８７：５０３１－５０３５ （１９９０） Ｌｉｎｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．， １７３：７２１－７３０（１９９１） Ａｚｕｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６６：７６－７９（１９９３） Ｆｒｅｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：９０９－９１２（１９９３） ｖａｎ ｄｅｒ Ｍｅｒｗｅ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：３９３－４０２（１９９７） Ａｒｕｆｆｏ ａｎｄ Ｓｅｅｄ，ＰＮＡＳ，８４：８５７３－８５７７（１９８７） Ｒｉｌｅｙ ａｎｄ Ｊｕｎｅ，Ｂｌｏｏｄ，１０５：１３－２１（２００５） Ｓｈａｒｐｅ ａｎｄ Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２：１１６－１２６ （２００２） Ｇｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４９：３８０-３８８（１９９２） Ｒｉｌｅｙ ａｎｄ Ｊｕｎｅ，Ｂｌｏｏｄ，１０５：１３－２１（２００５） Ｒｅｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，８９：２７１－２７５（１９９２） Ｊｅｎｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４７：２４６１－２４６６ （１９９１） Ｊｅｎｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６５：３０２－３１９ （１９８７） Ｊｅｎｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ， ８４：５４０９－５４１３ （１９８７） Ｓｃｈｗａｒｔｚ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４８：１３４９－１３５６ （１９９０） Ｓｏｓｋｉｃ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １２４：９６－１２３ （２０１４） Ｓｗａｎｓｏｎ， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ； １０１０：１６９－１７７ （２０００） Ａｌｅｇｒｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５７：４７６２－４７７０ （１９９６） Ｆｒｅｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４９：３７９５－３８０１ （１９９２） ｖａｎ ｄｅｒ Ｍｅｒｗｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １８５：３９３－４０２ （１９９７） Ｗａｌｎｕｓ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， １：４０５－４１３ （１９９４） Ｗａｌｎｕｓ， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １８３：２５４１－２５５０ （１９９６） Ｋｒｕｍｍｅｌ ａｎｄ Ａｌｌｉｓｏｎ， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １８３：２５３３－２５４０ （１９９６） Ｓｗａｎｓｏｎ， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １０１０：１６９－１７７ （２０００） Ｔｉｖｏｌ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， ３：５４１－５４１７ （１９９５） Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７０：９８５－９８８ （１９９５） Ｍａｎｄｅｌｂｒｏｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １８９：４３５－４４０ （１９９９） Ｔｉｖｏｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５８：５０９１－５０９４ （１９９７） Ｌｅａｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７１：１７３４－１７３６ （１９９６） Ｈｏｄｉ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ， １００（８）：４７１２－４７１７ （２００３） Ｐｈａｎ ＧＱ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ，１００（１４）：８３７２－８３７７ （２００３） Ａｔｔｉａ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ， ２３（２５）：６０４３－６０５３ （２００５） Ｃｏｍｉｎ－Ａｎｄｕｉｘ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ６：２２－２２ （２００８） Ｂｏｕｔｒｏｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．， １３（８）：４７３－４８６ （２０１６） Ｚａｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ２５：１１６３－１１７４ （２０１７） Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２０：３３７－３４７ （２００４） Ｃｈｅｍｎｉｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １７３：９４５－９５４ （２００４） Ｐｅｔｒｖａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， ２０３：２２８１－２２９２ （２００６） Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ３５０：１７－３７ （２０１０） Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ３５０：１７－３７ （２０１０） Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， １１（２）：１４１－１５１ （１９９９） Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２９１（５５０２）：３１９－３２２ （２００１） Ｆｒｅｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １９２ （７）：１０２７－１０３４ （２０００） Ｂｕｔｔｅ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ４５ （１３）：３５６７－３５７２ （２００８）

本発明は、イヌＣＴＬＡ－４に結合する抗イヌ細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）抗体に関する。特定の実施形態では、イヌＣＴＬＡ－４に対する抗体は、イヌＣＴＬＡ－４に特異的に結合する。より特定の実施形態では、イヌＣＴＬＡ－４に対する抗体は、さらに、イヌＣＴＬＡ－４とイヌＣＤ８０との結合をブロックする能力も有している。別の特定の実施形態では、イヌＣＴＬＡ－４に対する抗体は、さらに、イヌＣＴＬＡ－４とイヌＣＤ８６との結合をブロックする能力も有している。さらに別の特定の実施形態では、イヌＣＴＬＡ－４に対する抗体は、イヌＣＴＬＡ－４とイヌＣＤ８０との結合をブロックすること及びイヌＣＴＬＡ－４とイヌＣＤ８６との結合をブロックすることの両方の能力を有している。

さらに、本発明は、これらの抗体によって構成される相補性決定領域（ＣＤＲ）、及び、イヌ化抗イヌＣＴＬＡ－４抗体を形成させるためのイヌフレーム内のこれらのＣＤＲの組合せ（例えば、マウス抗イヌＣＴＬＡ－４抗体から得られる）に関する。本発明は、さらに、癌のような症状の治療におけるそのような抗体の使用に関する。

従って、本発明は、６つの例示されたマウス抗イヌＣＴＬＡ－４抗体に由来するＣＤＲの独特なセットを提供する。６つの例示されたマウス抗イヌＣＴＬＡ－４抗体は、ＣＤＲの独特なセット、即ち、３つの軽鎖ＣＤＲ〔ＣＤＲ軽１（ＣＤＲＬ１）、ＣＤＲ軽２（ＣＤＲＬ２）及びＣＤＲ軽３（ＣＤＲＬ３）〕及び３つの重鎖ＣＤＲ〔ＣＤＲ重１（ＣＤＲＨ１）、ＣＤＲ重２（ＣＤＲＨ２）及びＣＤＲ重３（ＣＤＲＨ３）〕を有している。以下で詳述されているように、ＣＤＲの各グループ内には実質的な配列相同性が存在し、ある程度の重複性さえ存在している（例えば、下記表１内のＶＬ ＣＤＲ－３のセットを参照されたい）。従って、本発明は、６つの例示されたマウス抗イヌＣＴＬＡ－４抗体に由来する６つのＣＤＲのアミノ酸配列を提供するだけではなく、さらに、これらのＣＤＲの保存的に修飾された変異体、並びに、同じカノニカル構造を含む（例えば、共有している）及び／又はイヌＣＴＬＡ－４のエピトープによって構成されるイヌＣＴＬＡ－４の１以上（例えば、１、２、３、４又はそれ以上）のアミノ酸残基に結合する変異体も提供する。

本発明の一態様は、イヌ細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質（ＣＴＬＡ－４）に結合する哺乳動物抗体を提供する。特定の実施形態では、本発明の哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメントは、マウス抗体である。好ましい実施形態では、本発明の哺乳動物抗体（これは、本発明のマウス抗体を包含する）又はその抗原結合フラグメントは、イヌ化抗体又はそのイヌ化抗原結合フラグメントである。

特定の実施形態では、哺乳動物抗体は、イヌＣＴＬＡ－４に特異的に結合する。より特定の実施形態では、イヌＣＴＬＡ－４に対する哺乳動物抗体は、さらに、イヌＣＴＬＡ－４とイヌＣＤ８０との結合をブロックする能力を有している。別の特定の実施形態では、イヌＣＴＬＡ－４に対する哺乳動物抗体は、さらに、イヌＣＴＬＡ－４とイヌＣＤ８６との結合をブロックする能力を有している。さらに別の特定の実施形態では、イヌＣＴＬＡ－４に対する哺乳動物抗体は、イヌＣＴＬＡ－４とイヌＣＤ８０との結合をブロックすること及びイヌＣＴＬＡ－４とイヌＣＤ８６との結合をブロックすることの両方の能力を有している。

特定の実施形態では、イヌＣＴＬＡ－４に結合する哺乳動物抗体は、単離された抗体である。本発明は、さらに、イヌＣＴＬＡ－４に結合するこれらの哺乳動物抗体の抗原結合フラグメントを提供する。特定の実施形態では、抗体は、３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）〔ＣＤＲ軽１（ＣＤＲＬ１）、ＣＤＲ軽２（ＣＤＲＬ２）及びＣＤＲ軽３（ＣＤＲＬ３）〕及び３つの重鎖ＣＤＲ〔ＣＤＲ重１（ＣＤＲＨ１）、ＣＤＲ重２（ＣＤＲＨ２）及びＣＤＲ重３（ＣＤＲＨ３）〕を含む。

特定の実施形態では、哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号９０のアミノ酸配列、配列番号９０のアミノ酸配列の保存的に修飾された変異体又はカノニカル構造クラス７を含む配列番号９０の変異体を含むＣＤＲＨ３を含む。より特定的な実施形態では、哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号８８のアミノ酸配列、配列番号８８のアミノ酸配列の保存的に修飾された変異体又はカノニカル構造クラス２Ａを含む配列番号８８の変異体を含むＣＤＲＨ２をさらに含む。一層さらに特定の実施形態では、哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメントは、同様に、配列番号８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号８６のアミノ酸配列の保存的に修飾された変異体又はカノニカル構造クラス１を含む配列番号８６の変異体を含むＣＤＲＨ１をさらに含む。一層さらに特定の実施形態では、哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメントは、同様に、配列番号９６のアミノ酸配列、配列番号９６のアミノ酸配列の保存的に修飾された変異体又はカノニカル構造クラス１を含む配列番号９６の変異体を含むＣＤＲＬ３をさらに含む。一層さらに特定の実施形態では、哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号９４のアミノ酸配列、配列番号９４のアミノ酸配列の保存的に修飾された変異体又はカノニカル構造クラス１を含む配列番号９４の変異体を含むＣＤＲＬ２をさらに含む。一層さらに特定の実施形態では、哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメントは、同様に、配列番号９２のアミノ酸配列、配列番号９２のアミノ酸配列の保存的に修飾された変異体又はカノニカル構造クラス４を含む配列番号９２の変異体を含むＣＤＲＬ１をさらに含む。

代替え的な実施形態では、哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１０２のアミノ酸配列、配列番号１０２のアミノ酸配列の保存的に修飾された変異体又はカノニカル構造クラス９を含む配列番号１０２の変異体を含むＣＤＲＨ３を含む。より特定的な実施形態では、哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１００のアミノ酸配列、配列番号１００のアミノ酸配列の保存的に修飾された変異体又はカノニカル構造クラス４を含む配列番号１００の変異体を含むＣＤＲＨ２をさらに含む。一層さらに特定の実施形態では、哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメントは、同様に、配列番号９８のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号９８のアミノ酸配列の保存的に修飾された変異体又はカノニカル構造クラス１を含む配列番号９８の変異体を含むＣＤＲＨ１をさらに含む。一層さらに特定の実施形態では、哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメントは、同様に、配列番号１０８のアミノ酸配列、配列番号１０８のアミノ酸配列の保存的に修飾された変異体又はカノニカル構造クラス１を含む配列番号１０８の変異体を含むＣＤＲＬ３をさらに含む。一層さらに特定の実施形態では、哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメントは、同様に、配列番号１０６のアミノ酸配列、配列番号１０６のアミノ酸配列の保存的に修飾された変異体又はカノニカル構造クラス１を含む配列番号１０６の変異体を含むＣＤＲＬ２をさらに含む。一層さらに特定の実施形態では、哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメントは、同様に、配列番号１０４のアミノ酸配列、配列番号１０４のアミノ酸配列の保存的に修飾された変異体又はカノニカル構造クラス１を含む配列番号１０４の変異体を含むＣＤＲＬ１をさらに含む。

別の代替え的な実施形態では、哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１１３のアミノ酸配列、配列番号１１３のアミノ酸配列の保存的に修飾された変異体又はカノニカル構造クラス７を含む配列番号１１３の変異体を含むＣＤＲＨ３を含む。より特定的な実施形態では、哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号８８のアミノ酸配列、配列番号８８のアミノ酸配列の保存的に修飾された変異体又はカノニカル構造クラス２Ａを含む配列番号８８の変異体を含むＣＤＲＨ２をさらに含む。一層さらに特定の実施形態では、哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメントは、同様に、配列番号８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号８６のアミノ酸配列の保存的に修飾された変異体又はカノニカル構造クラス１を含む配列番号８６の変異体を含むＣＤＲＨ１をさらに含む。一層さらに特定の実施形態では、哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメントは、同様に、配列番号９６のアミノ酸配列、配列番号９６のアミノ酸配列の保存的に修飾された変異体又はカノニカル構造クラス１を含む配列番号９６の変異体を含むＣＤＲＬ３をさらに含む。一層さらに特定の実施形態では、哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメントは、同様に、配列番号９４のアミノ酸配列、配列番号９４のアミノ酸配列の保存的に修飾された変異体又はカノニカル構造クラス１を含む配列番号９４の変異体を含むＣＤＲＬ２をさらに含む。一層さらに特定の実施形態では、哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメントは、同様に、配列番号１１７のアミノ酸配列、配列番号１１７のアミノ酸配列の保存的に修飾された変異体又はカノニカル構造クラス４を含む配列番号１１７の変異体を含むＣＤＲＬ１をさらに含む。

さらに別の代替え的な実施形態では、哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１１５のアミノ酸配列、配列番号１１５のアミノ酸配列の保存的に修飾された変異体又はカノニカル構造クラス７を含む配列番号１１５の変異体を含むＣＤＲＨ３を含む。より特定的な実施形態では、哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号８８のアミノ酸配列、配列番号８８のアミノ酸配列の保存的に修飾された変異体又はカノニカル構造クラス２Ａを含む配列番号８８の変異体を含むＣＤＲＨ２をさらに含む。一層さらに特定の実施形態では、哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメントは、同様に、配列番号８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号８６のアミノ酸配列の保存的に修飾された変異体又はカノニカル構造クラス１を含む配列番号８６の変異体を含むＣＤＲＨ１をさらに含む。一層さらに特定の実施形態では、哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメントは、同様に、配列番号９６のアミノ酸配列、配列番号９６のアミノ酸配列の保存的に修飾された変異体又はカノニカル構造クラス１を含む配列番号９６の変異体を含むＣＤＲＬ３をさらに含む。一層さらに特定の実施形態では、哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメントは、同様に、配列番号１２２のアミノ酸配列、配列番号１２２のアミノ酸配列の保存的に修飾された変異体又はカノニカル構造クラス１を含む配列番号１２２の変異体を含むＣＤＲＬ２をさらに含む。一層さらに特定の実施形態では、哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメントは、同様に、配列番号１１９のアミノ酸配列、配列番号１１９のアミノ酸配列の保存的に修飾された変異体又はカノニカル構造クラス４を含む配列番号１１９の変異体を含むＣＤＲＬ１をさらに含む。

さらに別の代替え的な実施形態では、哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１１４のアミノ酸配列、配列番号１１４のアミノ酸配列の保存的に修飾された変異体又はカノニカル構造クラス７を含む配列番号１１４の変異体を含むＣＤＲＨ３を含む。より特定的な実施形態では、哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１１１のアミノ酸配列、配列番号１１１のアミノ酸配列の保存的に修飾された変異体又はカノニカル構造クラス２Ａを含む配列番号１１１の変異体を含むＣＤＲＨ２をさらに含む。一層さらに特定の実施形態では、哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメントは、同様に、配列番号１０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号１０９のアミノ酸配列の保存的に修飾された変異体又はカノニカル構造クラス１を含む配列番号１０９の変異体を含むＣＤＲＨ１をさらに含む。一層さらに特定の実施形態では、哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメントは、同様に、配列番号９６のアミノ酸配列、配列番号９６のアミノ酸配列の保存的に修飾された変異体又はカノニカル構造クラス１を含む配列番号９６の変異体を含むＣＤＲＬ３をさらに含む。一層さらに特定の実施形態では、哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメントは、同様に、配列番号１２１のアミノ酸配列、配列番号１２１のアミノ酸配列の保存的に修飾された変異体又はカノニカル構造クラス１を含む配列番号１２１の変異体を含むＣＤＲＬ２をさらに含む。一層さらに特定の実施形態では、哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメントは、同様に、配列番号１１８のアミノ酸配列、配列番号１１８のアミノ酸配列の保存的に修飾された変異体又はカノニカル構造クラス４を含む配列番号１１８の変異体を含むＣＤＲＬ１をさらに含む。

さらに別の代替え的な実施形態では、哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１１６のアミノ酸配列、配列番号１１６のアミノ酸配列の保存的に修飾された変異体又はカノニカル構造クラス１２を含む配列番号１１６の変異体を含むＣＤＲＨ３を含む。より特定的な実施形態では、哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１１２のアミノ酸配列、配列番号１１２のアミノ酸配列の保存的に修飾された変異体又はカノニカル構造クラス２Ａを含む配列番号１１２の変異体を含むＣＤＲＨ２をさらに含む。一層さらに特定の実施形態では、哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメントは、同様に、配列番号１１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号１１０のアミノ酸配列の保存的に修飾された変異体又はカノニカル構造クラス１を含む配列番号１１０の変異体を含むＣＤＲＨ１をさらに含む。一層さらに特定の実施形態では、哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメントは、同様に、配列番号１２４のアミノ酸配列、配列番号１２４のアミノ酸配列の保存的に修飾された変異体又はカノニカル構造クラス１を含む配列番号１２４の変異体を含むＣＤＲＬ３をさらに含む。一層さらに特定の実施形態では、哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメントは、同様に、配列番号１２３のアミノ酸配列、配列番号１２３のアミノ酸配列の保存的に修飾された変異体又はカノニカル構造クラス１を含む配列番号１２３の変異体を含むＣＤＲＬ２をさらに含む。一層さらに特定の実施形態では、哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメントは、同様に、配列番号１２０のアミノ酸配列、配列番号１２０のアミノ酸配列の保存的に修飾された変異体又はカノニカル構造クラス２を含む配列番号１２０の変異体を含むＣＤＲＬ１をさらに含む。

上記で示されているように、イヌＣＴＬＡ－４に対するイヌ化抗体又はそのイヌ化抗原結合フラグメントは、本発明の重要な態様であり、そして、本発明は、そのような全ての哺乳動物抗体のイヌ化哺乳動物抗体（これは、イヌ化マウス抗体を包含する）を提供する。従って、本発明は、さらに、イヌＩｇＧ重鎖及びイヌカッパ又はラムダ軽鎖を含むＣＴＬＡ－４に特異的に結合する、単離されたイヌ化抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。このタイプの特定の実施形態では、イヌカッパ又はラムダ軽鎖は、３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）〔ＣＤＲ軽１（ＣＤＲＬ１）、ＣＤＲ軽２（ＣＤＲＬ２）及びＣＤＲ軽３（ＣＤＲＬ３）〕を含み；そして、イヌＩｇＧ重鎖は、マウス抗イヌＣＴＬＡ－４抗体から得られる３つの重鎖ＣＤＲ〔ＣＤＲ重１（ＣＤＲＨ１）、ＣＤＲ重２（ＣＤＲＨ２）及びＣＤＲ重３（ＣＤＲＨ３）〕を含む。本発明のイヌ化抗体及びその抗原結合フラグメントの特定の実施形態は、イヌＣＴＬＡ－４に結合する、及び／又は、イヌＣＴＬＡ－４のイヌＣＤ８０及び／又はイヌＣＤ８６への結合をブロックする。

本発明のイヌ化抗体又はそのイヌ化抗原結合フラグメントは、配列番号１２８のアミノ酸配列を含むヒンジ領域を含むＩｇＧＤを含むことができる。関連する実施形態では、ヒンジ領域は、配列番号１２９のアミノ酸配列を含む。さらに別の関連する実施形態では、ヒンジ領域は、配列番号１３０のアミノ酸配列を含む。さらに別の関連する実施形態では、ヒンジ領域は、配列番号１３１のアミノ酸配列を含む。

代替的な実施形態では、イヌ化抗体は、配列番号６２のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。このタイプの特定の実施形態では、重鎖は、配列番号６１のヌクレオチド配列によってコード化される。別の実施形態では、イヌ化抗体は、配列番号６４のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。このタイプの特定の実施形態では、重鎖は、配列番号６３のヌクレオチド配列によってコード化される。さらに別の実施形態では、イヌ化抗体は、配列番号６６のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。このタイプの特定の実施形態では、重鎖は、配列番号６５のヌクレオチド配列によってコード化される。より特定の実施形態では、イヌ化抗体は、配列番号５０のアミノ酸配列を含む軽鎖をさらに含む。このタイプの特定の実施形態では、軽鎖は、配列番号４９のヌクレオチド配列によってコード化される。別の特定の実施形態では、イヌ化抗体は、配列番号５２のアミノ酸配列を含む軽鎖をさらに含む。このタイプの特定の実施形態では、軽鎖は、配列番号５１のヌクレオチド配列によってコード化される。さらに別の特定の実施形態では、イヌ化抗体は、配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖をさらに含む。このタイプの特定の実施形態では、軽鎖は、配列番号５３のヌクレオチド配列によってコード化される。

代替え的な実施形態では、イヌ化抗体は、配列番号７４のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖を含む。このタイプの特定の実施形態では、修飾された重鎖は、配列番号７３のヌクレオチド配列によってコード化される。別の実施形態では、イヌ化抗体は、配列番号７６のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖を含む。このタイプの特定の実施形態では、修飾された重鎖は、配列番号７５のヌクレオチド配列によってコード化される。さらに別の実施形態では、イヌ化抗体は、配列番号７８のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖を含む。このタイプの特定の実施形態では、修飾された重鎖は、配列番号７７のヌクレオチド配列によってコード化される。さらに特定の実施形態では、イヌ化抗体は、配列番号５０のアミノ酸配列を含む軽鎖をさらに含む。このタイプの特定の実施形態では、軽鎖は、配列番号４９のヌクレオチド配列によってコード化される。別の特定の実施形態では、イヌ化抗体は、配列番号５２のアミノ酸配列を含む軽鎖をさらに含む。このタイプの特定の実施形態では、軽鎖は、配列番号５１のヌクレオチド配列によってコード化される。さらに別の特定の実施形態では、イヌ化抗体は、配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖をさらに含む。このタイプの特定の実施形態では、軽鎖は、配列番号５３のヌクレオチド配列によってコード化される。

特定の実施形態では、イヌ化抗体は、配列番号６６のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号５２のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。別の実施形態では、イヌ化抗体は、配列番号６６のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

代替え的な実施形態では、イヌ化抗体は、配列番号７８のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖及び配列番号５２のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。別の実施形態では、イヌ化抗体は、配列番号７８のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

別の実施形態では、イヌ化抗体は、配列番号６８のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。このタイプの特定の実施形態では、重鎖は、配列番号６７のヌクレオチド配列によってコード化される。別の実施形態では、イヌ化抗体は、配列番号７０のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。このタイプの特定の実施形態では、重鎖は、配列番号６９のヌクレオチド配列によってコード化される。さらに別の実施形態では、イヌ化抗体は、配列番号７２のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。このタイプの特定の実施形態では、重鎖は、配列番号７１のヌクレオチド配列によってコード化される。より特定の実施形態では、イヌ化抗体は、配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖をさらに含む。このタイプの特定の実施形態では、軽鎖は、配列番号５５のヌクレオチド配列によってコード化される。別の特定の実施形態では、イヌ化抗体は、配列番号５８のアミノ酸配列を含む軽鎖をさらに含む。このタイプの特定の実施形態では、軽鎖は、配列番号５７のヌクレオチド配列によってコード化される。さらに別の特定の実施形態では、イヌ化抗体は、配列番号６０のアミノ酸配列を含む軽鎖をさらに含む。このタイプの特定の実施形態では、軽鎖は、配列番号５９のヌクレオチド配列によってコード化される。

代替え的な実施形態では、イヌ化抗体は、配列番号８０のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖を含む。このタイプの特定の実施形態では、修飾された重鎖は、配列番号７９のヌクレオチド配列によってコード化される。別の実施形態では、イヌ化抗体は、配列番号８２のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖を含む。このタイプの特定の実施形態では、修飾された重鎖は、配列番号８１のヌクレオチド配列によってコード化される。さらに別の実施形態では、イヌ化抗体は、配列番号８４のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖を含む。このタイプの特定の実施形態では、修飾された重鎖は、配列番号８３のヌクレオチド配列によってコード化される。さらに特定の実施形態では、イヌ化抗体は、配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖をさらに含む。このタイプの特定の実施形態では、軽鎖は、配列番号５５のヌクレオチド配列によってコード化される。別の特定の実施形態では、イヌ化抗体は、配列番号５８のアミノ酸配列を含む軽鎖をさらに含む。このタイプの特定の実施形態では、軽鎖は、配列番号５７のヌクレオチド配列によってコード化される。さらに別の特定の実施形態では、イヌ化抗体は、配列番号６０のアミノ酸配列を含む軽鎖をさらに含む。このタイプの特定の実施形態では、軽鎖は、配列番号５９のヌクレオチド配列によってコード化される。

特定の実施形態では、イヌ化抗体は、配列番号７２のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖及び配列番号５８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。別の実施形態では、イヌ化抗体は、配列番号７２のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号６０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

代替え的な実施形態では、イヌ化抗体は、配列番号８４のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖及び配列番号５８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。別の実施形態では、イヌ化抗体は、配列番号８４のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖及び配列番号６０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

本発明は、さらに、１×１０^－１２Ｍ未満（例えば、５×１０^－１３Ｍ以下）の解離定数（Ｋｄ）でイヌＣＴＬＡ－４に結合する哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。別の実施形態では、哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメントは、１×１０^－５Ｍ～１×１０^－１２Ｍの解離定数でイヌＣＴＬＡ－４に結合する。より特定的な実施形態では、哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメントは、１×１０^－７Ｍ～１×１０^－１１Ｍの解離定数でイヌＣＴＬＡ－４に結合する。一層さらに特定の実施形態では、哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメントは、１×１０^－８Ｍ～１×１０^－１１Ｍの解離定数でイヌＣＴＬＡ－４に結合する。一層さらに特定の実施形態では、哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメントは、１×１０^－８Ｍ～１×１０^－１０Ｍの解離定数でイヌＣＴＬＡ－４に結合する。

本発明は、さらに、１×１０^７Ｍ^－１ｓ^－１より大きいオン速度（ｋ_ｏｎ）でイヌＣＴＬＡ－４に結合する哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。別の実施形態では、哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメントは、１×１０^２Ｍ^－１ｓ^－１～１×１０^７Ｍ^－１ｓ^－１のオン速度でイヌＣＴＬＡ－４に結合する。より特定の実施形態では、哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメントは、１×１０^３Ｍ^－１ｓ^－１～１×１０^６Ｍ^－１ｓ^－１のオン速度でイヌＣＴＬＡ－４に結合する。一層さらに特定の実施形態では、哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメントは、１×１０^３Ｍ^－１ｓ^－１～１×１０^５Ｍ^－１ｓ^－１のオン速度でイヌＣＴＬＡ－４に結合する。一層さらに特定の実施形態では、哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメントは、１×１０^４Ｍ^－１ｓ^－１～１×１０^５Ｍ^－１ｓ^－１のオン速度でイヌＣＴＬＡ－４に結合する。

本発明は、さらに、１×１０^－７ｓ^－１よりも遅いオフ速度（ｋ_ｏｆｆ）でイヌＣＴＬＡ－４に結合する哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。別の実施形態では、哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメントは、１×１０^－３ｓ^－１～１×１０^－８ｓ^－１のオフ速度でイヌＣＴＬＡ－４に結合する。より特定の実施形態では、哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメントは、１×１０^－４ｓ^－１～１×１０^－７ｓ^－１のオフ速度でイヌＣＴＬＡ－４に結合する。一層さらに特定の実施形態では、哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメントは、１×１０^－５ｓ^－１～１×１０^－７ｓ^－１のオフ速度でイヌＣＴＬＡ－４に結合する。

特定の実施形態では、本発明の哺乳動物抗体（これは、キメラ抗体を包含する）は、イヌＣＤ８０及び／又はイヌＣＤ８６とイヌＣＴＬＡ－４との結合をブロックする。より特定の実施形態では、抗体は、１×１０^－８Ｍ～１×１０^－９Ｍ又はさらに低い濃度の最小ＥＣ５０でイヌＣＤ８０及び／又はイヌＣＤ８６とイヌＣＴＬＡ－４との結合をブロックする。一層さらに特定の実施形態では、ＥＣ５０は、５×１０^－９Ｍ～５×１０^－１３Ｍである。一層さらに特定の実施形態では、ＥＣ５０は、５×１０^－９Ｍ～５×１０^－１１Ｍである。従って、特定の実施形態では、本発明の抗体は、１つ、２つ、３つ、４つ又はこれら全ての特性、即ち、イヌＣＴＬＡ－４との前記解離定数、イヌＣＴＬＡ－４との結合に関する前記オン速度、抗イヌＣＴＬＡ－４結合複合体からの解離に関する前記オフ速度、又は、動物対象における癌の効果的な治療を示すことができる。

本発明は、さらに、本明細書中に開示されている哺乳動物抗体と交差競合する、イヌ化哺乳動物抗体及び抗原結合フラグメントを提供する。特定の実施形態では、イヌ化哺乳動物抗体は、４５Ａ９の６つのＣＤＲを含む抗体と交差競合する［下記表１を参照されたい］。関連する実施形態では、イヌ化哺乳動物抗体は、２７Ｇ１２の６つのＣＤＲを含む抗体と交差競合する［下記表１を参照されたい］。さらに別の関連する実施形態では、イヌ化哺乳動物抗体は、２２Ａ１１の６つのＣＤＲを含む抗体と交差競合する［下記表１を参照されたい］。さらに別の関連する実施形態では、イヌ化哺乳動物抗体は、１１０Ｅ３の６つのＣＤＲを含む抗体と交差競合する［下記表１を参照されたい］。特定の実施形態では、イヌ化哺乳動物抗体は、１２Ｂ３の６つのＣＤＲを含む抗体と交差競合する［下記表１及び表３を参照されたい］。別の特定の実施形態では、イヌ化哺乳動物抗体は、３９Ａ１１の６つのＣＤＲを含む抗体と交差競合する［下記表１及び３を参照されたい］。特定の実施形態では、アッセイは、標準的な結合アッセイである。そのような一実施形態では、標準的な結合アッセイは、ＢＩＡＣｏｒｅ（登録商標）を用いて実施される。別のそのような実施形態では、標準的な結合アッセイは、ＥＬＩＳＡを用いて実施される。さらに別のそのような実施形態では、標準的な結合アッセイは、フローサイトメトリーによって実施される。

上記で示されているように、前記抗体（及びその抗原結合フラグメント）を包含する本発明の抗体（及びその抗原結合フラグメント）は、モノクローナル抗体（及びその抗原結合フラグメント）、哺乳動物抗体（及びその抗原結合フラグメント）、例えば、マウス（ｍｕｒｉｎｅ）（マウス（ｍｏｕｓｅ））抗体（及びその抗原結合フラグメント）、イヌ化抗体（及びその抗原結合フラグメント）、例えば、イヌ化マウス抗体（及びその抗原結合フラグメント）であることができる。特定の実施形態では、抗体（及びその抗原結合フラグメント）は、単離される。

好ましい実施形態では、本発明のイヌ化抗体又はその抗原性フラグメントは、イヌＣＴＬＡ－４のアミノ酸配列のエピトープに結合する。特定の実施形態では、イヌ化抗体は、配列番号１３８のアミノ酸配列の位置Ｔ３５、Ｒ３８、Ｔ５１、Ｔ５３、Ｙ９０、Ｋ９３、Ｙ９８及びＹ１０２におけるアミノ酸残基のうちの１つ以上と相互作用する。別の実施形態では、イヌ化抗体は、配列番号１３８のアミノ酸配列の位置３５Ｔ、Ｒ３８、Ｓ４２、Ｋ９３及びＹ１０２におけるアミノ酸残基のうちの１つ以上と相互作用する。

本発明は、さらに、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６及び配列番号１３７のアミノ酸配列の１以上のエピトープ又はその部分に結合するイヌ化抗体を提供する。特定の実施形態では、本発明のイヌ化抗体又はその抗原性フラグメントは、配列番号１３２のアミノ酸配列によって構成されるエピトープ又はその一部分に結合する。このタイプのより特定の実施形態では、エピトープ又はその一部分は、配列番号１３４のアミノ酸配列によって構成されている。このタイプの別の実施形態では、エピトープ又はその一部分は、配列番号１３５のアミノ酸配列によって構成されている。特定の実施形態では、エピトープ又はその一部分は、配列番号１３３のアミノ酸配列によって構成されている。このタイプのより特定の実施形態では、エピトープ又はその一部分は、配列番号１３６のアミノ酸配列によって構成されている。関連する実施形態では、イヌ化抗体は、配列番号１３４及び／又は配列番号１３６及び／又は配列番号１３５のアミノ酸配列によって構成される１以上のエピトープ又はその部分に結合する。

本発明は、さらに、本発明のイヌ化抗体の軽鎖のうちのいずれか１つをコード化する核酸（これは、単離された及び／又は組換えられた核酸を包含する）を提供する。同様に、本発明は、本発明のイヌ化抗体の重鎖のうちのいずれか１つをコード化する単離された核酸（これは、単離された及び／又は組換えられた核酸を包含する）を提供する。

本発明は、さらに、本発明の核酸（これは、単離された核酸を包含する）のうちの１以上を含む発現ベクターを提供する。本発明は、さらに、本発明の１以上の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。

特定の実施形態では、抗体は、組換え抗体又はその抗原結合フラグメントである。関連する実施形態では、可変重鎖ドメイン及び可変軽鎖ドメインは、可動性リンカーで連結され、単鎖抗体を形成している。特定の実施形態では、抗体又は抗原結合フラグメントは、Ｆａｂフラグメントである。別の実施形態では、抗体又は抗原結合フラグメントはＦａｂ’フラグメントである。さらに別の実施形態では、抗体又は抗原結合フラグメントは、（Ｆａｂ’）_２フラグメントである。さらに別の実施形態では、抗体又は抗原結合フラグメントはダイアボディである。特定の実施形態では、抗体又は抗原結合フラグメントは、ドメイン抗体である。特定の実施形態では、抗体又は抗原結合フラグメントは、単一ドメイン抗体である。

特定の実施形態では、イヌ化マウス抗イヌＣＴＬＡ－４抗体又は抗原結合フラグメントは、癌の治療を受けている動物対象（例えば、イヌ）においてＣＴＬＡ－４に結合する。より特定の実施形態では、本発明のイヌ化マウス抗イヌＣＴＬＡ－４抗体又は抗原結合フラグメントの投与は、治療されている動物対象（例えば、イヌ）における癌の１つ以上の兆候を改善するのに役立つ。

本発明は、さらに、イヌ化マウス抗イヌＣＴＬＡ－４抗体又はその部分をコード化する単離された核酸を提供する。関連する実施形態では、そのような抗体又は抗原結合フラグメントは、イヌ対象の癌を治療するための薬剤の調製に使用することができる。代替え的に又は組み合わせて、本発明は、診断的使用のための本発明の抗体又は抗体フラグメントのいずれかの使用を提供する。さらに追加の実施形態では、本明細書中に開示されているイヌ化抗体又は抗原結合フラグメントのいずれかを含むキットが提供される。

本発明は、さらに、本発明のイヌ化抗体に結合し、５～２５のアミノ酸残基を含み且つ配列番号１３２のアミノ酸配列と９０％以上同一である、単離されたペプチドを提供する。特定の実施形態では、単離されたペプチドは、配列番号１３２のアミノ酸配列と同一である。より特定的な実施形態では、単離されたペプチドは、１０～２０個のアミノ酸残基を含む。関連する実施形態では、単離されたペプチドは、本発明のイヌ化抗体に結合し、５～２５のアミノ酸残基を含み、且つ、配列番号１３３のアミノ酸配列と９０％以上同一である。特定の実施形態では、単離されたペプチドは、配列番号１３３のアミノ酸配列と同一である。このタイプのより特定の実施形態では、単離されたペプチドは、１０～２０個のアミノ酸残基を含む。

さらに別の実施形態では、本発明のイヌ化抗体に結合する単離されたペプチドは、配列番号１３４のアミノ酸配列と９０％以上同一であるアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、単離されたペプチドは、配列番号１３４のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、本発明のイヌ化抗体に結合する単離されたペプチドは、配列番号１３５のアミノ酸配列と９０％以上同一であるアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、単離されたペプチドは、配列番号１３５のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、本発明のイヌ化抗体に結合する単離されたペプチドは、配列番号１３６のアミノ酸配列と９０％以上同一であるアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、単離されたペプチドは、配列番号１３６のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。

本発明は、さらに、本発明のイヌ化抗体に結合するそのような単離されたペプチドを含む融合タンパク質を提供する。本発明は、さらに、上記ペプチドのいずれかを含む融合タンパク質を提供する。特定の実施形態では、融合タンパク質は、そのような抗原性ペプチド及び非イヌ哺乳動物ＩｇＧ抗体のＦｃ領域を含む。より特定の実施形態では、融合タンパク質は、非イヌ哺乳動物ＩｇＧ抗体のＦｃ領域を含む。特定の実施形態では、非イヌ哺乳動物ＩｇＧ抗体は、マウスＩｇＧである。代替え的な実施形態では、非イヌ哺乳動物ＩｇＧ抗体は、ヒトＩｇＧである。別の実施形態では、非イヌ哺乳動物ＩｇＧ抗体は、ウマＩｇＧである。さらに別の実施形態では、非イヌ哺乳動物ＩｇＧ抗体は、ブタＩｇＧである。さらに別の実施形態では、非イヌ哺乳動物ＩｇＧ抗体は、ウシＩｇＧである。

特定の実施形態では、非イヌ哺乳動物ＩｇＧ抗体は、ＩｇＧ１である。別の実施形態では、非イヌ哺乳動物ＩｇＧ抗体は、ＩｇＧ２ａである。さらに別の実施形態では、非イヌ哺乳動物ＩｇＧ抗体は、ＩｇＧ３である。さらに別の実施形態では、非イヌ哺乳動物ＩｇＧ抗体は、ＩｇＧ４である。別の実施形態では、融合タンパク質は、上記抗原性ペプチドのいずれか及びマルトース結合タンパク質を含む。さらに別の実施形態では、融合タンパク質は、上記抗原性ペプチドのいずれか及びベータ－ガラクトシダーゼを含む。さらに別の実施形態では、融合タンパク質は、上記抗原性ペプチドのいずれか及びグルタチオンＳ－トランスフェラーゼを含む。さらに別の実施形態では、融合タンパク質は、上記抗原性ペプチドのいずれか及びチオレドキシンを含む。さらに別の実施形態では、融合タンパク質は、上記抗原性ペプチドのいずれか及びＧｒｏ ＥＬを含む。さらに別の実施形態では、融合タンパク質は、上記抗原性ペプチドのいずれか及びＮｕｓＡを含む。

本発明は、さらに、本発明の１以上の単離された免疫原性及び／又は抗原性のペプチド及び／又は融合タンパク質をコード化する核酸（これは、単離された及び／又は組換えられた核酸を包含する）を提供する。本発明は、さらに、そのような単離された核酸を含む発現ベクター、及び、本発明の１以上の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。

医薬組成物は、さらに、イヌＣＴＬＡ－４からの抗原性ペプチド（これは、単離された抗原性ペプチドを包含する）、本発明のイヌＣＴＬＡ－４からの抗原性ペプチドを含む融合タンパク質、本発明の抗原性フラグメント及び／若しくは融合タンパク質をコード化する核酸（これは、単離された核酸を包含する）、そのような核酸を含む発現ベクター、又は、それらの任意の組み合わせ、並びに、薬学的に許容される担体若しくは希釈剤を含むことができる。さらに、本発明は、本発明の抗イヌＣＴＬＡ－４抗体（これは、イヌ化マウス抗イヌＣＴＬＡ－４抗体を包含する）又はその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を包含する。そのような医薬組成物は、癌、感染症若しくは感染性疾患を治療するために使用することが可能であり、ワクチンアジュバントとして使用することが可能であり、及び／又は、免疫細胞の活性を増加させる方法において使用することが可能であり、ここで、該方法は、それを必要とする対象に治療有効量の医薬組成物を投与することを含む。

特定の実施形態では、そのような医薬組成物は、さらに、抗イヌＰＤ－１抗体（これは、イヌ化マウス抗イヌＰＤ－１抗体を包含する）又はその抗原結合フラグメントを含む。より特定の実施形態では、抗イヌＰＤ－１抗体は、イヌ化マウス抗イヌＰＤ－１抗体又はイヌ化マウス抗イヌＰＤ－１抗体の抗原結合フラグメントである。

関連する実施形態では、そのような医薬組成物は、さらに、抗イヌＰＤ－Ｌ１抗体（これは、イヌ化マウス抗イヌＰＤ－Ｌ１抗体を包含する）又はその抗原結合フラグメントを含む。特定の実施形態では、抗イヌＰＤ－Ｌ１抗体は、イヌ化マウス抗イヌＰＤ－１抗体又はイヌ化マウス抗イヌＰＤ－１抗体の抗原結合フラグメントである。

従って、本発明は、以下のもののうちの１、２、３又はそれ以上を含む医薬組成物を提供する：抗イヌＰＤ－Ｌ１抗体、抗イヌＰＤ－１抗体、抗イヌＣＴＬＡ－４抗体、抗イヌＰＤ－Ｌ１抗体の抗原結合フラグメント、抗イヌＰＤ－１抗体の抗原結合フラグメント、又は、抗イヌＣＴＬＡ－４抗体の抗原結合フラグメント。特定の実施形態では、そのような抗イヌタンパク質（即ち、抗イヌＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１又はＣＴＬＡ－４）抗体又はその抗原結合フラグメントは、マウス抗イヌタンパク質抗体である。別の実施形態では、そのような抗イヌタンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントは、イヌ化抗イヌタンパク質抗体である。より特定の実施形態では、抗イヌタンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントは、イヌ化マウス抗イヌタンパク質抗体である。

さらに、本発明は、免疫細胞の活性を増大させる方法を提供し、ここで、該方法は、それを必要とする対象に、治療有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含む。特定の実施形態では、該方法は、癌の治療において使用される。別の実施形態では、該方法は、感染症又は感染性疾患の治療において使用される。さらに別の実施形態では、本発明のイヌ化抗体又はその抗原結合フラグメントは、ワクチンアジュバントとして使用される。特定の実施形態では、イヌ化マウス抗イヌＣＴＬＡ－４抗体又はその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物は、イヌ化マウス抗イヌＰＤ－１抗体若しくはその抗原結合フラグメント及び／又はイヌ化マウス抗イヌＰＤ－Ｌ１抗体若しくはその抗原結合フラグメントの前に、後で又は同時に、投与することができる。

本発明のこれらの態様及び別の態様は、以下の「図面の簡単な説明」及び「詳細な説明」を参照することによって、よりよく理解されるであろう。

図１は、６種類の抗体とイヌＣＴＬＡ－４（ｃＣＴＬＡ－４）との結合活性を示している。従って、図１は、ｃＣＴＬＡ－４に対する抗体の結合活性を実証するＥＬＩＳＡにおいてイヌＣＴＬＡ－４に添加された個々のイヌＣＴＬＡ－４抗体の量をｎｇ／ｍＬ（Ａｂ Ｌｏｇ）でプロットしたものを表している。イヌＣＴＬＡ－４に対する個々の抗体は、２７Ｇ１２、１１０Ｅ３、１２Ｂ３、４５Ａ９、３９Ａ１１及び２２Ａ１１として示されている。 図２は、イヌＣＤ８６とＣＴＬＡ－４の相互作用をブロックする抗体を示している。図は、イヌＣＴＬＡ－４のＣＤ８６への結合を妨害するためにｃＣＴＬＡ－４に添加された個々のイヌＣＴＬＡ－４抗体の量をｎｇ／ｍＬ（Ａｂ Ｌｏｇ）でプロットしたものを表している。イヌＣＴＬＡ－４に対する個々の抗体は、３９Ａ１１、２７Ｇ１２、４５Ａ９、１２Ｂ３、１１０Ｅ３及び２２Ａ１１として示されている。図に示されているように、抗体は、イヌのＣＤ８６とＣＴＬＡ－４の相互作用をブロックすることが可能である。 図３は、イヌＣＤ８０とＣＴＬＡ－４の相互作用をブロックする抗体を示している。図は、イヌＣＴＬＡ－４のＣＤ８０への結合を妨害するためにｃＣＴＬＡ－４に添加された個々のイヌＣＴＬＡ－４抗体の量をｎｇ／ｍＬ（Ａｂ Ｌｏｇ）でプロットしたものを表している。イヌＣＴＬＡ－４に対する個々の抗体は、３９Ａ１１、２７Ｇ１２、４５Ａ９、１２Ｂ３、１１０Ｅ３及び２２Ａ１１として示されている。図に示されているように、抗体は、イヌのＣＤ８０とＣＴＬＡ－４の相互作用もブロックすることが可能である。 図４Ａ－図４Ｇは、イヌＣＴＬＡ－４を発現するＣＨＯ細胞に結合する抗体を示している。図４ＡはＩｓｏ対照であり、図４Ｂは３９Ａ１１であり、図４Ｃは２７Ｇ１２であり、図４Ｄは１２Ｂ３であり、図４Ｅは４５Ａ９であり、図４Ｆは１１０Ｅ３であり、そして、図４Ｇは２２Ａ１１である。図に示されているように、抗体は、ｃＣＴＬＡ－４を発現するＣＨＯ細胞に結合することが可能である。 図５は、コンカナバリンＡ（ＣｏＡ）の存在下でイヌＰＢＭＣ細胞を活性化させてＩＦＮγを生成させる、２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ又は１００μｇ／ｍＬ（Ａｂ）で添加された個々のイヌＣＴＬＡ－４抗体の３つの減少濃度を定量化する棒グラフを示している。試験された抗体は横軸にあり、ＣＴＬＡ－４モノクローナル抗体（ｘＣＴＬＡ－４ ｍＡｂ）と表示されている。図に示されているように、抗体は、イヌＰＢＭＣ細胞を活性化させてＩＦＮγを産生させることが可能である。 図６は、親抗体と同じイヌＣＴＬＡ－４との反応性を有するＣＴＬＡ－４モノクローナル抗体（ｘＣＴＬＡ－４； Ａｂ Ｌｏｇ ｎｇ／ｍＬ）の量をプロットしたものを示している。ＥＬＩＳＡの結果は、１２Ｂ３と３９Ａ１１の両方が首尾よくイヌ化されたことを示している。イヌ化ｃ１２Ｂ３Ｌ３Ｈ２及びＬ３Ｈ３は、親１２Ｂ３と同様のｃＣＴＬＡ－４との反応性を有しており、そして、イヌ化ｃ３９Ａ１１Ｌ３Ｈ３は、親３９Ａ１１と同様のｃＣＴＬＡ－４との反応性を有している。 図７Ａ－図７Ｂは、ｃ１２Ｂ３（図７Ａ）及びｃ３９Ａ１１（図７Ｂ）に関するｃＣＴＬＡ－４上の結合エピトープを示している。イヌＣＴＬＡ－４タンパク質の２つの領域が表されており、そして、その２つの領域は、それぞれ、配列番号１３２及び配列番号１３３のアミノ酸配列を有している（下記表８を参照されたい）。両方の抗体は、配列番号１３６のアミノ酸配列（これは、ＭＹＰＰＰＹモチーフ（配列番号１３７）を含む）及び配列番号１３４のアミノ酸配列に結合する。ｃ１２Ｂ３は、さらに、配列番号１３５のアミノ酸配列にも結合する。

略語
本発明の詳細な説明及び実施例を通して、以下の略語が使用される。

定義
本発明をより容易に理解することができるように、特定の技術用語及び科学用語を以下で明確に定義する。本明細書中の別の箇所で明確に定義されていない限り、本明細書中で使用されている他の全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味を有する。

添付されている「特許請求の範囲」を包含する本明細書中で使用されている場合、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」のような単語の単数形は、文脈によって別途明瞭に示されていない限り、それらの対応する複数の言及を包含する。

「ＣＴＬＡ－４」は、免疫チェックポイントとして機能して、免疫応答をダウンレギュレートするタンパク質受容体である、ＣＤ１５２（分化抗原群１５２）としても知られている「細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４」の略語である。イヌＣＴＬＡ－４のアミノ酸配列は、配列番号１２６である。本発明は、さらに、イヌＣＴＬＡ－４に対するイヌ化マウス抗体を提供する。

細胞又は受容体に適用される「活性化」は、文脈によって又は明示的に別途示されていない限り、リガンドによる細胞又は受容体の活性化又は処置を意味する。「活性化」は、内部機構によって調節される細胞活性化並びに外部要因又は環境因子によって調節される細胞活性化を意味することができる。

「リガンド」は、天然リガンド及び合成リガンド、例えば、サイトカイン、サイトカイン変異体、類似体、突然変異タンパク質及び抗体由来の結合化合物を包含する。「リガンド」は、さらに、小分子、例えば、サイトカインのペプチドミメティック及び抗体のペプチドミメティックも包含する。

分子の「活性」は、以下のものについて表すか又は示すことができる：リガンド若しくは受容体への当該分子の結合、触媒活性；遺伝子発現又は細胞のシグナル伝達、分化若しくは成熟を刺激する能力；抗原活性、他の分子の活性の調節など。分子の「活性」は、さらに、以下のものについても示すことができる：細胞間相互作用（例えば、接着）を調節する若しくは維持することにおける活性、又は、細胞の構造（例えば、細胞膜又は細胞骨格）を維持することにおける活性。「活性」は、さらに、以下のものも意味することができる：比活性、例えば、［触媒活性］／［ｍｇタンパク質］又は［免疫学的活性］／［ｍｇタンパク質］、生物学的区画内の濃度など。「活性」は、先天性免疫系又は適応免疫系の成分の調節も示すことができる。

「投与」及び「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、動物（例えば、イヌ対象）、細胞、組織、器官又は生体液に適用される場合、動物（例えば、イヌ対象）、細胞、組織、器官又は生体液への外因性医薬、治療薬、診断薬又は組成物の接触を示している。細胞の処置は、細胞への試薬の接触及び体液への試薬の接触（ここで、体液が細胞と接触する）を包含する。

「投与」及び「処置」は、さらに、試薬、診断薬、結合化合物による、又は、別の細胞による、例えば細胞のインビトロ処置及びエクスビボ処置も意味する。

用語「対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）」は、任意の生物を包含し、好ましくは、動物包含し、より好ましくは、哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ又はヒト）包含し、最も好ましくは、イヌを包含する。

「処置する（ｔｒｅａｔ）」又は「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、治療薬（例えば、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントのいずれかを含む組成物）を、その治療薬が治療活性を有する１以上の疾患兆候を有している又は疾患に罹患していることが疑われる例えばイヌ対象又は患者に、内部に又は外部から投与することを意味する。

典型的には、治療薬は、臨床的に測定可能な程度に兆候（類）の後退を誘導する又は兆候（類）の進行を阻止することによって、処置される対象又は集団におけるそのような１以上の疾患兆候を軽減する及び／又は改善するのに有効な量で投与される。特定の疾患兆候を軽減するのに有効な治療薬の量（「治療有効量」とも称される）は、患者（例えば、イヌ）の疾患の症状、年齢及び体重、並びに、対象において所望の応答を引き出す当該医薬組成物の能力などの因子に応じて異なり得る。疾患兆候が軽減又は改善されたかどうかは、その兆候の重症度又は進行状態を評価するために獣医師又は別の熟達した医療提供者によって典型的に使用される任意の臨床測定によって評価することができる。本発明（例えば、処置方法又は製造品）の実施形態は、全ての対象における標的疾患兆候（類）を軽減させることにおいて有効であるとは限らないかもしれないが、当技術分野で既知の任意の統計的検定（例えば、スチューデントｔ検定、カイ二乗検定、マン－ホイットニーのＵ検定、クラスカル－ウォリス検定（Ｈ検定）、ヨンキー－タプストラ検定及びウィルコクソン検定）によって決定される、統計的に有意の数の対象における標的疾患兆候（類）を軽減するはずである。

「処置」は、ヒト対象、獣医学対象（例えば、イヌ）又は研究用対象に適用される場合、治療的処置並びに研究用途及び診断用途を示している。「処置」は、ヒト対象、獣医学対象（例えば、イヌ）若しくは研究用対象、又は、細胞、組織若しくは器官に適用される場合、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントを、例えばイヌ若しくは他の動物対象、細胞、組織、生理学的区画又は生理学的流体に接触させることを包含する。

本明細書中で使用されている場合、用語「イヌ」は、別途示されていない限り、全ての家庭イヌ、イエイヌ（Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）又はイヌ科イヌ属（Ｃａｎｉｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）を包含する。

本明細書中で使用されている場合、用語「ネコ」は、ネコ科（Ｆｅｌｉｄａｅ）の任意のメンバーを示している。この科のメンバーとしては、野生、動物園及び家庭内のメンバー、例えば、イエネコ、純血種及び又は雑種のコンパニオンネコ、ショーキャット、実験用ネコ、クローンネコ、並びに、野生ネコ又は野良ネコを含む。

本明細書中で使用されている場合、用語「イヌフレーム」は、本明細書中でＣＤＲ残基として定義されている超可変領域残基以外のイヌ抗体の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を示している。イヌ化抗体に関連して、実施形態の大部分において、天然イヌＣＤＲのアミノ酸配列は、両方の鎖内において、対応する異種ＣＤＲ（例えば、マウス抗体由来のＣＤＲ）で置き換えられている。場合により、イヌ抗体の重鎖及び／又は軽鎖は、例えば、以下で例示されているように、イヌ抗体内の異種ＣＤＲの立体配座を保存するため及び／又はＦｃ機能を改変するために、いくつかの異種非ＣＤＲ残基を含有することができる。

イヌＣＴＬＡ－４は、配列番号１２６のアミノ酸配列（これは、シグナル配列を包含する）を含むことが分かっている。特定の実施形態では、イヌＣＴＬＡ－４は、配列番号１２５のヌクレオチド配列を含む核酸によってコード化される。イヌＣＴＬＡ－４配列は、例えば非保存領域内に保存された変異を有していることによって異なり得るが、イヌＣＴＬＡ－４は、配列番号１２６のアミノ酸配列によって構成されるイヌＣＴＬＡ－４と実質的に同じ生物学的機能を有している。

本明細書中で使用されている場合、例えば抗体のアミノ酸配列内における、別のアミノ酸残基による「アミノ酸残基の置換」は、別のアミノ酸残基で「アミノ酸残基を置き換える」と同等であり、そして、アミノ酸配列内の特定の位置の特定のアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基によって置き換えられている（又は、置換されている）ことを意味する。そのような置換は、特に設計することが可能であり、即ち、例えば、組換えＤＮＡ技術によってアミノ酸配列の特定の位置でアラニンをセリンで意図的に置き換えることができる。あるいは、抗体の特定のアミノ酸残基又は一連のアミノ酸残基を、より自然な選択プロセスを通して、例えば、細胞によって産生された抗体がその抗原の所与の領域（例えば、エピトープ又はその部分を含む領域）に結合する結合する能力に基づいて、及び／又は、抗体が置換しているＣＤＲと同じカノニカル構造を保持する特定のＣＤＲを含有するように、１以上のアミノ酸残基によって置き換えることができる。そのような置換／置き換えは、「変異」ＣＤＲ及び／又は変異抗体をもたらすことができる。

共刺激シグナル伝達経路は免疫応答の発生をもたらし、そして、Ｔ細胞の表面のＣＤ２８とＣＤ８０（Ｂ７．１としても知られている）及びＣＤ８６（Ｂ７．２としても知られている）の相互作用によって媒介されることが示されている。ＣＴＬＡ－４は、ＣＤ２８よりも極めて高い親和性でＣＤ８０とＣＤ８６の両方に結合し、それによって、免疫応答のダウンモジュレーションに不可欠な抑制性受容体として機能する。実際、ＣＴＬＡ－４がその免疫抑制機能を媒介するメカニズムは、ＣＤ２８とＣＤ８０及びＣＤ８６との相互作用の競合的阻害剤として作用する能力に関連している。従って、本発明は、イヌＣＤ８０及びイヌＣＤ８６のＣＴＬＡ－４への結合をブロックし、それにより、イヌＣＤ２８のイヌＣＤ８０及びＣＤ８６への結合による共刺激シグナル伝達を可能にする、モノクローナル抗体の産生及び特徴付けについて記載する。従って、これらの抗体は、本明細書中に開示されているコンパニオンアニマルにおける癌、並びに、別の疾患の治療において有用性を有している。

特定のイヌＣＴＬＡ－４アミノ酸配列は、一般に、シグナル配列を除いて、配列番号１２６のアミノ酸配列を含むイヌＣＴＬＡ－４と少なくとも９０％同一である。特定の場合において、イヌＣＴＬＡ－４は、シグナル配列を除いて、配列番号１２６のアミノ酸配列を含むイヌＣＴＬＡ－４と少なくとも９５％、又は、さらに、少なくとも９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一であることができる。特定の実施形態では、イヌＣＴＬＡ－４アミノ酸配列は、シグナル配列を除いて、配列番号１２６のアミノ酸配列を含むイヌＣＴＬＡ－４と１０以下のアミノ酸の相違を示す。特定の実施形態では、イヌＣＴＬＡ－４アミノ酸配列は、シグナル配列を除いて、配列番号１２６のアミノ酸配列を含むイヌＣＴＬＡ－４と、５以下のアミノ酸、又は、さらに、４以下、３以下、２以下若しくは１以下のアミノ酸の相違を示し得る。パーセント同一性は、本明細書中で以下に記載されているようにして確認することができる。

用語「免疫応答」は、例えば、癌細胞、病原体に感染した細胞若しくは組織又は侵入する病原体への選択的損傷、それらの破壊又はそれらの哺乳動物身体（例えば、イヌ身体）からの除去をもたらす、リンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球及び前記細胞又は肝臓によって産生される可溶性高分子（例えば、抗体、サイトカイン及び補体）の作用を示している。

抗イヌＣＴＬＡ－４抗体
本発明は、イヌＣＴＬＡ－４に結合する単離された抗体（特に、マウス抗イヌＣＴＬＡ－４抗体及びそのイヌ化抗体）又はその抗原結合フラグメント及びそのような抗体又はそのフラグメントの使用を提供する。特定の実施形態では、マウス抗イヌＣＴＬＡ－４抗体に由来するマウス抗イヌＣＴＬＡ－４ ＣＤＲが提供され、ここで、それらは、イヌＣＴＬＡ－４に結合すること及びイヌＣＴＬＡ－４のそのリガンド（イヌＣＤ８６又はＣＤ８０）の一方又は両方への結合をブロックすることの両方が示されている。これらのＣＤＲは、イヌ抗体の改変されたイヌフレームに挿入して、イヌ化マウス抗イヌＣＴＬＡ－４抗体を生成させることができる。

本明細書中で使用されている場合、「抗イヌＣＴＬＡ－４抗体」は、イヌＣＴＬＡ－４に対して（例えば、マウス又はウサギなどの哺乳動物において）惹起されて、イヌＣＴＬＡ－４に特異的に結合する抗体を示している。「イヌＣＴＬＡ－４に特異的に結合する」抗体、及び、特に、イヌＣＴＬＡ－４に特異的に結合する抗体、又は、「イヌＣＴＬＡ－４のアミノ酸配列を含有するポリペプチドに特異的に結合する」抗体は、他のイヌ抗原と比較してイヌＣＴＬＡ－４への優先的な結合を示す抗体であるが、この結合は、絶対的な結合特異性を必要としない。抗イヌＣＴＬＡ－４抗体は、その結合がイヌタンパク質に限定されるサンプルの中のイヌＣＴＬＡ－４の存在を決定する場合、又は、それがイヌサンプル中の他の分子の活性を過度に妨げることなく（例えば、診断状況における偽陽性又は治療状況での副作用などの望ましくない結果を生じさせることなく）イヌＣＴＬＡ－４の活性を変化させることができる場合、イヌＣＴＬＡ－４に「特異的」と見なされる。抗イヌＣＴＬＡ－４抗体に必要な特異性の程度は、その抗体の意図される用途に依存してよく、いずれにせよ、意図される目的のための使用への適切性によって定義される。意図される方法の抗体又は抗体の抗原結合部位に由来する結合性化合物は、その抗原又はその変異体若しくは突然変異タンパク質に、他の任意のイヌ抗原との親和性と比較して、少なくとも２倍大きい、好ましくは少なくとも１０倍大きい、さらに好ましくは少なくとも２０倍大きい、最も好ましくは少なくとも１００倍大きい親和性で結合する。

本明細書中で使用されている場合、抗体は、イヌＣＴＬＡ－４のアミノ酸配列の一部を含むポリペプチドには結合するが、イヌＣＴＬＡ－４の配列のその部分を欠いている別のイヌタンパク質には結合しない場合、所与の抗原配列（この場合、イヌＣＴＬＡ－４のアミノ酸配列の一部）を含むポリペプチドに特異的に結合すると言われる。例えば、イヌＣＴＬＡ－４を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体は、イヌＣＴＬＡ－４のＦＬＡＧ（登録商標）タグ付き形態には結合し得るが、別のＦＬＡＧ（登録商標）タグ付きイヌタンパク質には結合しない。抗体又は抗体の抗原結合部位に由来する結合性化合物は、それがそのイヌ抗原又はその変異体若しくは突然変異タンパク質に対して、試験されている他のイヌ抗原に対するその親和性と比較して、少なくとも１０倍大きい、さらに好ましくは少なくとも２０倍大きい、一層さらに好ましくは少なくとも１００倍大きい親和性を有している場合、そのイヌ抗原又はその変異体若しくは突然変異タンパク質に「特異的に」結合する。

本明細書中で使用されている場合、用語「抗体」は、所望の生物学的活性を示す任意の形態の抗体を示す。従って、それは最も広い意味で使用され、そして、特に、限定するものではないが、モノクローナル抗体（これは、完全長モノクローナル抗体を包含する）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、イヌ化抗体（ｃａｎｏｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、完全イヌ抗体、キメラ抗体及びラクダ化単一ドメイン抗体を包含する。「親抗体」は、意図される用途のための抗体の修飾（例えば，イヌの治療用抗体としての使用のための抗体のイヌ化）に先立つ、抗原への免疫系の暴露によって得られる抗体である。

本明細書中で使用されている場合、別途示されていない限り、「抗体フラグメント」又は「抗原結合フラグメント」は、抗体の抗原結合フラグメント、即ち、完全長抗体によって結合される抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体フラグメント（例えば、１以上のＣＤＲ領域を保持するフラグメント）を示す。抗原結合フラグメントの例としては、限定するものではないが、以下のものを含む：Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２及びＦｖフラグメント；ダイアボディ；線状抗体；一本鎖抗体分子、例えば、ｓｃ－Ｆｖ；ナノボディ、及び、抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体。

「Ｆａｂフラグメント」は、１本の軽鎖並びに１本の重鎖のＣ_Ｈ１領域及び可変領域からなる。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。「Ｆａｂフラグメント」は、抗体のパパイン切断の産物であり得る。

「結晶性フラグメント」（「Ｆｃ」）領域は、抗体のＣ_Ｈ３及びＣ_Ｈ２ドメインを含む２つの重鎖フラグメントを含む。２つの重鎖フラグメントは、２以上のジスルフィド結合によって及びＣ_Ｈ３ドメインの疎水性相互作用によって結び付けられている。

「Ｆａｂ’フラグメント」は、１本の軽鎖、並びに、Ｖ_ＨドメインとＣ_Ｈ１ドメインを含み且つさらにＣ_Ｈ１ドメインとＣ_Ｈ２ドメインとの間の領域も含む１本の重鎖の一部分又はフラグメントを含み、それによって、２つのＦａｂ’フラグメントの２本の重鎖の間に鎖間ジスルフィド結合が形成されてＦ（ａｂ’）_２分子を形成することができる。

「Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント」は、２本の軽鎖、並びに、Ｃ_Ｈ１ドメインとＣ_Ｈ２ドメインとの間の定常領域の一部分を含む２本の重鎖を含み、それによって、２本の重鎖間で鎖間ジスルフィド結合が形成される。Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントは、従って、２本の重鎖の間のジスルフィド結合によって結び付けられている２つのＦａｂ’フラグメントからなる。「Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント」は、抗体のペプシン切断の産物であり得る。

「Ｆｖ領域」は、重鎖及び軽鎖の両方に由来する可変領域を含むが、定常領域を欠いている。

用語「一本鎖Ｆｖ抗体」又は「ｓｃＦｖ抗体」は、抗体のＶ_Ｈドメイン及びＶ_Ｌドメインを含む抗体フラグメントを示しており、ここで、これらのドメインは１本のポリペプチド鎖内に存在している。一般に、Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にするＶ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む［以下のものを参照されたい： Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， ＴＨＥ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＹ ＯＦ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ， ｖｏｌ． １１３ Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． ２６９－３１５ （１９９４）； ＷＯ８８／０１６４９；並びに、Ｕ．Ｓ．４，９４６，７７８、及び、Ｕ．Ｓ．５，２６０，２０３］。

本明細書中で使用されている場合、イヌＣＴＬＡ－４のその結合相手（リガンド）（例えば、イヌＣＤ８０又はイヌＣＤ８６）への結合を「ブロックする」又は「ブロックしている」又は「結合をブロックしている」抗イヌＣＴＬＡ－４抗体又はその抗原結合フラグメントは、標準的な結合アッセイ（例えば、ＢＩＡＣｏｒｅ（登録商標）、ＥＬＩＳＡ、又は、フローサイトメトリー）で確認されるイヌＣＴＬＡ－４のイヌＣＤ８６及び／又はイヌＣＤ８０への結合を（部分的に又は完全に）ブロックする抗イヌＣＴＬＡ－４抗体又はその抗原結合フラグメントである。そのような「ブロックしている」は、ＥＬＩＳＡに基づくブロックアッセイを使用して、以下の実施例４において例示されている。

本明細書中で使用されている場合、用語「カノニカル構造」は、抗体の重鎖及び軽鎖の超可変領域の各々が、それらが存在するフレームワーク内で取ることができる局所立体配座を示している。各々の超可変領域に関して、少数のカノニカル構造（一般に、１又は２などの簡単な整数で表される）が存在し、それらは、対応する超可変領域のアミノ酸配列（特に、対応する抗イヌＣＴＬＡ－４可変ドメインに対するそのフレームワークのアミノ酸配列に照らして）から高い精度で予測することができる。これらのカノニカル構造は、所与のＣＤＲのアミノ酸配列の修飾がその抗原結合相手に結合する能力の保持をもたらすか又は喪失をもたらすかに関して決定的であり得る［以下のものを参照されたい： Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ， Ｃａｎｏｎｉｃａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６：９０１－９１７（１９８７）； Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｈｙｐｅｒｖａｒｉｂａｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ， Ｎａｔｕｒｅ， ３４：８７７－８８３（１９８９）；及び、Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２７３：９２７－９４８ （１９９７）］。

「ドメイン抗体」は、重鎖の可変領域又は軽鎖の可変領域のみを含む免疫学的に機能性の免疫グロブリンフラグメントである。いくつかの例では、２以上のＶ_Ｈ領域がペプチドリンカーで共有結合的に連結されて、二価ドメイン抗体を生成する。二価ドメイン抗体の２つのＶ_Ｈ領域は、同じ抗原又は異なる抗原を標的とすることができる。

「二価抗体」は、２つの抗原結合部位を含む。いくつかの例では、その２つの結合部位は、同じ抗原特異性を有している。しかしながら、二価抗体は二重特異性であることができる（下記を参照されたい）。

特定の実施形態では、本明細書中のモノクローナル抗体は、ラクダ化単一ドメイン抗体も包含する。［以下のものを参照されたい：例えば、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２６：２３０（２００１）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１：２５（１９９９）；ＷＯ９４／０４６７８；ＷＯ９４／２５５９１；Ｕ．Ｓ．６，００５，０７９］。一実施形態では、本発明は、単一ドメイン抗体が形成されるように修飾された２つのＶ_Ｈドメインを含有する単一ドメイン抗体を提供する。

本明細書中で使用されている場合、用語「ダイアボディ」は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントを示しており、フラグメントは、同じポリペプチド鎖内に軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）に連結された重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を含む（Ｖ_Ｈ－Ｖ_Ｌ、又は、Ｖ_Ｌ－Ｖ_Ｈ）。同じ鎖上の２つのドメインの間で対合を可能とするには短すぎるリンカーを使用することにより、ドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対合することを強いられて、２つの抗原結合部位を生成する。［以下のものを参照されたい：ＥＰ０４０４０９７Ｂ１；ＷＯ９３／１１１６１；及び、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４－６４４８（１９９３）］。遺伝子操作された抗体変異体の総説については［概して、以下のものを参照されたい：Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１１２６－１１３６（２００５）］。

典型的には、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、そのイヌＣＴＬＡ－４結合活性がモルベースで表される場合、その活性の少なくとも１０％（その親抗体と比較した場合）を保持している。好ましくは、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、親抗体としてのイヌＣＴＬＡ－４結合親和性の少なくとも２０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％又はそれ以上を保持している。さらにまた、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、その生物学的活性を実質的に変化させない保存的アミノ酸置換又は非保存的アミノ酸置換（抗体の「保存的変異体」又は「機能保存的変異体」とも称される）を含有することができることも意図されている。

「単離された抗体」は、精製状態を示しており、そして、そのような文脈では、当該分子が、別の生物学的分子（例えば、核酸、タンパク質、脂質、炭水化物）又は別の物質（例えば、細胞デブリ及び増殖培地）を実質的に含んでいないことを意味する。一般に、用語「単離された」は、そのような物質又は水、緩衝剤若しくは塩が本明細書中に記載されている結合性化合物の実験的使用又は治療的使用を実質的に妨げる量で存在していない限り、そのような物質が完全に存在しないこと、又は、水、緩衝剤若しくは塩が存在しないことを示すことは意図してしない。

本明細書中で使用されている場合、「キメラ抗体」は、第一抗体に由来する可変ドメイン及び第二抗体に由来する定常ドメインを有している抗体であり、ここで、第一抗体と第二抗体は、異なる種に由来する。［Ｕ．Ｓ．４，８１６，５６７；及び、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１－６８５５（１９８４）］。典型的には、可変ドメインは、齧歯動物などの実験動物に由来する抗体（「親抗体」）から得られ、及び、定常ドメイン配列は、生じるキメラ抗体がそれぞれヒト対象及びイヌ対象において親（例えば、齧歯動物）抗体よりも有害な免疫応答を引き起こす可能性がより低くなるように、動物対象抗体から得られる。

本明細書中で使用されている場合、用語「イヌ化抗体」は、イヌ抗体及び非イヌ（例えば、マウス）抗体の両方に由来する配列を含む抗体の形態を示している。一般に、イヌ化抗体は、超可変ループの全て又は実質的に全てが非イヌ免疫グロブリンのものに対応する（例えば、以下で例示されている６つのマウス抗イヌＣＴＬＡ－４ ＣＤＲを含む）、少なくとも１つ以上、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含有し、そして、フレームワーク（ＦＲ）領域の全て又は実質的に全て（及び、典型的には、残りのフレームの全て又は実質的に全て）は、イヌ免疫グロブリン配列のものである。本明細書中で例示されているように、イヌ化抗体は、イヌフレーム又は改変されたイヌフレームと共に、マウス抗イヌＣＴＬＡ－４抗体に由来する３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲの両方を含む。改変されたイヌフレームは、例えば、イヌＣＴＬＡ－４へのその結合を増大させるために、並びに／又は、イヌＣＴＬＡ－４のイヌＣＤ８６及び／若しくはイヌＣＤ８０への結合をブロックするその能力を増大させるために、イヌ化抗体の有効性をさらに最適化する、本明細書中で例示されている１以上のアミノ酸変化を含む。

用語「完全イヌ抗体」は、イヌ免疫グロブリンタンパク質配列のみを含む抗体を示している。完全イヌ抗体は、マウス体内において、マウス細胞において又はマウス細胞由来のハイブリドーマにおいて生成された場合、マウス糖鎖を含有し得る。同様に、「マウス抗体」は、マウス免疫グロブリン配列のみを含む抗体を示している。あるいは、完全イヌ抗体は、ラット体内において、ラット細胞において又はラット細胞由来のハイブリドーマにおいて生成された場合、ラット糖鎖を含有し得る。同様に、「ラット抗体」は、ラット免疫グロブリン配列のみを含む抗体を示している。

イヌＩｇＧには４種の既知のＩｇＧ重鎖サブタイプが存在し、それらはＩｇＧ－Ａ、ＩｇＧ－Ｂ、ＩｇＧ－Ｃ及びＩｇＧ－Ｄと称される。２種の既知の軽鎖サブタイプは、ラムダ及びカッパと称される。

各軽鎖／重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成する。従って、一般に、完全な抗体は、２つの結合部位を有している。二機能性抗体又は二重特異性抗体における場合を除いて、２つの結合部位は一般に同一である。

典型的には、重鎖と軽鎖の両方の可変ドメインは、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）内に位置している、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも称される３つの超可変領域を含む。ＣＤＲは、通常、フレームワーク領域によって整列され、それによって、特定のエピトープへの結合が可能になる。一般に、Ｎ末端からＣ末端まで、軽鎖変ドメイン及び重鎖可変ドメインは、いずれも、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、一般に、以下の定義に従う：Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．；５^ｔｈ ｅｄ．；ＮＩＨ Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．９１－３２４２（１９９１）；Ｋａｂａｔ，Ａｄｖ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．３２：１－７５（１９７８）；Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：６６０９－６６１６（１９７７）；Ｃｈｏｔｈｉａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７）；又は、Ｃｈｏｔｈｉａ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８－８８３（１９８９）］。

本明細書中で使用されている場合、用語「超可変領域」は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を示している。超可変領域は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」（即ち、軽鎖可変ドメイン内のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３、並びに、重鎖可変ドメイン内のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３）に由来するアミノ酸残基を含む。［配列によって抗体のＣＤＲ領域を定義している「Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ． Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ． （１９９１）」を参照されたい； さらにまた、構造によって抗体のＣＤＲ領域を定義している「Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６： ９０１－９１７ （１９８７）」も参照されたい］。本明細書中で使用されている場合、用語「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、ＣＤＲ残基として本明細書中で定義されている超可変領域残基以外の可変ドメイン残基を示している。

本発明の特定の実施形態では、イヌ免疫細胞の結合及び活性化に加えて、ＣＴＬＡ－４に対するイヌ抗体又はイヌ化抗体は、最適には２つの下記属性を有している：
１． 抗体依存性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞障害作用（ＣＤＣ）のようなエフェクター機能の欠如；及び、
２． プロテインＡクロマトグラフィーに基づくもののような業界標準技術を用いて大規模で容易に精製される。

天然に存在するイヌＩｇＧイソタイプはいずれも、両方の基準は満たさない。例えば、ＩｇＧ－Ｂは、プロテインＡを使用して精製することが可能であるが、高いレベルのＡＤＣＣ活性を有している。他方、ＩｇＧ－Ａは、プロテインＡに弱く結合するが、同様に、ＡＤＣＣ活性を示す。さらに、ＩｇＧ－ＣもＩｇＧ－ＤもプロテインＡカラムで精製できないが、ＩｇＧ－ＤはＡＤＣＣ活性を示さない。（ＩｇＧ－Ｃは、かなりのＡＤＣＣ活性を示す）。本発明がこれらの問題に対処する１つの方法は、ＡＤＣＣのようなエフェクター機能を欠いており且つ業界標準のプロテインＡクロマトグラフィーを使用して容易に精製することが可能な、ＣＴＬＡ－４に対して特異的な改変されたイヌＩｇＧ－Ｂ抗体を提供することによる。

本発明の代替え的な実施形態では、ＣＴＬＡ－４に対して特異的なイヌＩｇＧ－Ｂ又はＩｇＧ－Ｃ抗体は、ＡＤＣＣのようなエフェクター機能を除去するように／実質的に低減させるように意図的に改変されておらず、従って、ＡＤＣＣのようなエフェクター機能を保持している。

「相同性」は、最適に整列させた場合の２つのポリヌクレオチド配列間又は２つのポリペプチド配列間の配列類似性を示している。比較される２つの配列の両方におけるある位置が同じ塩基又はアミノ酸モノマーサブユニットによって占有されている場合、例えば、２つのＤＮＡ分子の各々におけるある位置がアデニンによって占有されている場合、これらの分子はその位置において相同である。相同性のパーセントは、２つの配列によって共有される相同な位置の数を、比較した位置の総数で除して１００を乗じたものである。例えば、２つの配列を最適に整列させた場合に２つの配列中の１０の位置のうち６の位置が一致するか又は相同である場合、その２つの配列は６０％相同である。一般に、そのような比較は、２つの配列を最大の相同性パーセントが得られるように整列させた場合に行われる。

「単離された核酸分子」は、単離されたポリヌクレオチドが自然界で見出されるポリヌクレオチドの全部又は一部分と結合していない、又は、自然界では連結されていないポリヌクレオチドに連結されている、ゲノム、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ若しくは合成起源のＤＮＡ又はＲＮＡ又はそれらの何らかの組合せを意味する。本開示のために、特定のヌクレオチド配列「を含む核酸分子」は無傷の染色体を包含しないことは、理解されるべきである。指定された核酸配列「を含む」単離された核酸分子は、指定された配列に加えて、１０個まで又はさらには２０個まで又はそれ以上の他のタンパク質又はその部分若しくはフラグメントについてのコード配列を含むことができ、又は、記載されている核酸配列のコード領域の発現を制御する作動可能に連結された調節配列を含むことができ、及び／又は、ベクター配列を含むことができる。

語句「制御配列」は、特定の宿主生物において作動可能に連結されたコード配列を発現させるのに必要なＤＮＡ配列を示している。原核生物に適切な制御配列には、例えば、プロモーターが含まれ、場合により、オペレーター配列及びリボソーム結合部位が含まれる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを使用することが知られている。

核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれている場合、「作動可能に連結」されている。例えば、プレ配列又は分泌リーダーに関するＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドについてのＤＮＡに作動可能に連結されている；プロモーター又はエンハンサーは、それがコード配列の転写に影響を及ぼす場合、そのコード配列に作動可能に連結されている；又は、リボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように位置付けられている場合、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、「作動可能に連結された」は、連結されているＤＮＡ配列が隣接していること、及び、分泌リーダーの場合は、隣接しており且つ読み取り相内にあること、を意味する。しかしながら、エンハンサーは隣接している必要はない。連結は、好都合な制限部位でのライゲーションによって達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の慣例に従って合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを使用する。

本明細書中で使用されている場合、「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養物」という表現は交換可能に使用され、そして、全てのそのような呼称は、子孫を包含する。従って、語句「形質転換体」及び「形質転換細胞」は、一次対象細胞及び継代の数を考慮せずにそれに由来する培養物を包含する。さらにまた、意図的な又は偶発的な突然変異に起因して、必ずしも全ての子孫が正確に同じＤＮＡ内容物を有さないことも理解される。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされたのと同じ機能又は生物学的活性を有する突然変異体子孫は包含される。異なる呼称が意図される場合は、それは、その文脈から明らかになる。

本明細書中で使用されている場合、「生殖細胞系配列」は、再構成されていない免疫グロブリンＤＮＡ配列の配列を示している。再構成されていない免疫グロブリン配列の任意の適切な供給源を使用することができる。ヒト生殖細胞系配列は、例えば、アメリカ国立衛生研究所の関節炎及び筋骨格系／皮膚疾患国立研究機構（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔａｌ ａｎｄ Ｓｋｉｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）のウエブサイト上のＪＯＩＮＳＯＬＶＥＲ（登録商標）生殖細胞系データベースから、入手することができる。マウス生殖細胞系配列は、例えば、Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３３：Ｄ２５６－Ｄ２６１ （２００５）］に記載されているようにして入手することができる。

マウス抗イヌＣＴＬＡ－４及びイヌ化マウス抗イヌＣＴＬＡ－４抗体の特性
本発明は、単離されたマウス抗イヌＣＴＬＡ－４抗体及びそのイヌ化抗体、疾患の治療（例えば、イヌにおける癌の治療）における抗体又はその抗原結合フラグメントの使用方法を提供する。イヌにおいては、Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤと称される４つのＩｇＧ重鎖が存在する。これらの重鎖は、ＩｇＧＡ、ＩｇＧＢ、ＩｇＧＣ及びＩｇＧＤと称される、イヌＩｇＧの４つの異なるサブクラスを表す。２つの重鎖のそれぞれは、１つの可変ドメイン（ＶＨ）と、ＣＨ－１、ＣＨ－２及びＣＨ－３と称される３つの定常ドメインからなる。ＣＨ－１ドメインは、「ヒンジ」又は代替え的に「ヒンジ領域」と称されるアミノ酸配列を介してＣＨ－２ドメインに連結されている。

これら４つの重鎖のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列は、Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．［Ｖｅｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ． ８０： ２５９－２７０ （２００１）］によって初めて同定された。これらの重鎖についてのアミノ酸配列及びＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースからも入手可能である。例えば、ＩｇＧＡ重鎖のアミノ酸配列は、受託番号ＡＡＬ３５３０１．１を有し、ＩｇＧＢは、受託番号ＡＡＬ３５３０２．１を有し、ＩｇＧＣは、受託番号ＡＡＬ３５３０３．１を有し、そして、ＩｇＧＤは、受託番号（ＡＡＬ３５３０４．１）を有している。イヌ抗体は、さらに、２種類の軽鎖、カッパ及びラムダも含む。これらの軽鎖のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列も、ＧｅｎＢａｎｋデータベースから入手することができる。例えば、カッパ軽鎖のアミノ酸配列は、受託番号ＡＢＹ５７２８９．１を有し、そして、ラムダ軽鎖は、受託番号ＡＢＹ５５５６９．１を有している。

本発明では、４つのイヌＩｇＧ Ｆｃフラグメントの各々についてのアミノ酸配列は、Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．（上掲）によって決定されたＣＨ１及びＣＨ２ドメインの同定された境界に基づいている。イヌＣＴＬＡ－４に結合するイヌ化マウス抗イヌＣＴＬＡ－４抗体としては、限定するものではないが、以下のものなどがある： マウス抗イヌＣＴＬＡ－４ ＣＤＲと一緒にイヌＩｇＧ－Ａ、ＩｇＧ－Ｂ、ＩｇＧ－Ｃ及びＩｇＧ－Ｄ重鎖及び／又はイヌカッパ軽鎖を含む抗体。従って、本発明は、イヌＣＴＬＡ－４に結合し、イヌＣＴＬＡ－４のイヌＣＤ８６及び／又はイヌＣＤ８０への結合をブロックする、単離されたマウス抗イヌＣＴＬＡ－４及び／又はイヌ化マウス抗イヌＣＴＬＡ－４抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。

本発明は、さらに、対応する軽鎖と組み合わせてイヌ化抗体を作製することが可能な完全長イヌ重鎖を提供する。従って、本発明は、さらに、イヌ化マウス抗イヌ抗原抗体（これは、単離されたイヌ化マウス抗イヌＣＴＬＡ－４抗体を包含する）及び疾患の処置（例えば、イヌの癌の処置）における抗体又はその抗原結合フラグメントの使用方法を提供する。

本発明は、さらに、イヌ結晶性フラグメント領域（ｃＦｃ領域）が１以上のエフェクター機能を増大させる、低減させる又は除去するように遺伝子操作されているｃＦｃ領域を含むイヌ化マウス抗イヌＣＴＬＡ－４抗体を提供する。本発明の一態様においては、遺伝子操作されたｃＦｃは、１以上のエフェクター機能を低減させるか又は除去する。本発明の別の態様においては、遺伝子操作されたｃＦｃは、１以上のエフェクター機能を増大させる。特定の実施形態では、遺伝子操作されたｃＦｃ領域は、遺伝子操作されたイヌＩｇＧＢ Ｆｃ領域である。別のそのような実施形態では、遺伝子操作されたｃＦｃ領域は、遺伝子操作されたイヌＩｇＧＣ Ｆｃ領域である。特定の実施形態では、エフェクター機能は抗体依存性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）であり、これが、増大、低減又は除去される。別の実施形態では、エフェクター機能は補体依存性細胞障害作用（ＣＤＣ）であり、これが、増大、低減又は除去される。さらに別の実施形態では、ｃＦｃ領域は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣの両方を増大させる、低減させる又は除去するように遺伝子操作されている。

エフェクター機能を欠いているイヌＩｇＧの変異体を生成させるために、多数の突然変異体イヌＩｇＧＢ重鎖を作製した。これらの変異体は、重鎖アミノ酸配列のＦｃ部分内に以下の単一の又は複合の置換のうちの１以上を含み得る：Ｐ４Ａ、Ｄ３１Ａ、Ｎ６３Ａ、Ｇ６４Ｐ、Ｔ６５Ａ、Ａ９３Ｇ、及び、Ｐ９５Ａ。変異体重鎖（即ち、そのようなアミノ酸置換を含む重鎖）を発現プラスミドにクローン化し、軽鎖をコード化する遺伝子を含有するプラスミドと共にＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。ＨＥＫ２９３細胞から発現され、精製された無傷抗体を、免疫エフェクター機能の媒介に関するそれらの潜在能を調べるために、Ｆｃ_γＲＩ及びＣ１ｑへの結合について評価した。［Ｕ．Ｓ．１０，１０６，６０７Ｂ２を参照されたい。その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる］。

本発明は、さらに、その天然のＩｇＧＤヒンジ領域の代わりに、下記ヒンジ領域を含む、改変イヌＩｇＧＤを提供する。

あるいは、ＩｇＧＤヒンジ領域は、セリン残基をプロリン残基で置き換えることによって遺伝子改変することができ、即ち、配列番号１３１のＰＫＥＳＴＣＫＣＩＰＰＣＰＶＰＥＳ（天然に存在するセリン残基を置換するプロリン残基（Ｐ）は、太字で下線が付けられている）。そのような改変は、ｆａｂアーム交換を欠いているイヌＩｇＧＤをもたらすことができる。改変されたイヌＩｇＧＤは、組換えＤＮＡ技術の標準的な方法を使用して構築することができる［例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （１９８２）］。これらの変異体を構築するために、イヌＩｇＧＤのアミノ酸配列をコード化する核酸を、改変されたＩｇＧＤをコード化するように改変することができる。次いで、その改変された核酸配列をタンパク質発現のために発現プラスミドにクローン化する。

イヌＣＴＬＡ－４に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントは、本明細書中で記載されているマウス抗イヌ抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）のうちの３、４、５又は６を含有することができる。３、４、５又は６のＣＤＲは、以下で提供されているＣＤＲ配列から独立して選択され得る。さらなる実施形態では、イヌＣＴＬＡ－４に結合する単離された抗体又はその抗原結合フラグメントは、マウス軽鎖ＣＤＲ－１、ＣＤＲ－２及び／又はＣＤＲ－３を含むイヌ抗体カッパ軽鎖又はラムダ軽鎖、並びに、マウス重鎖ＣＤＲ－１、ＣＤＲ－２及び／又はＣＤＲ－３を含むイヌ抗体重鎖ＩｇＧを含む。

別の実施形態では、本発明は、イヌＣＴＬＡ－４に特異的に結合し、且つ、
それぞれ、ＶＬＣＤＲ－１、ＶＬＣＤＲ－２及びＶＬＣＤＲ－３についての配列番号９２、９４及び９６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％の配列同一性を含む３つのＣＤＲの所与のセットを含むイヌ抗体カッパ又はラムダ軽鎖、及び、それぞれ、ＶＨＣＤＲ－１、ＶＨＣＤＲ－２及びＶＨＣＤＲ－３についての配列番号８６、８８及び９０のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％の配列同一性を含む３つのＣＤＲの所与のセットを含むイヌ抗体重鎖ＩｇＧ；又は、
それぞれ、ＶＬＣＤＲ－１、ＶＬＣＤＲ－２及びＶＬＣＤＲ－３についての配列番号１０４、１０６及び１０８のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％の配列同一性を含む３つのＣＤＲの所与のセットを含むイヌ抗体カッパ又はラムダ軽鎖、及び、それぞれ、ＶＨＣＤＲ－１、ＶＨＣＤＲ－２及びＶＨＣＤＲ－３についての配列番号９８、１００及び１０２のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％の配列同一性を含む異なるＣＤＲの所与のセットを含むイヌ抗体重鎖ＩｇＧ；又は、
それぞれ、ＶＬＣＤＲ－１、ＶＬＣＤＲ－２及びＶＬＣＤＲ－３についての配列番号１１７、９４及び９６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％の配列同一性を含む３つのＣＤＲの所与のセットを含むイヌ抗体カッパ又はラムダ軽鎖、及び、それぞれ、ＶＨＣＤＲ－１、ＶＨＣＤＲ－２及びＶＨＣＤＲ－３についての配列番号８６、８８及び１１３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％の配列同一性を含む異なるＣＤＲの所与のセットを含むイヌ抗体重鎖ＩｇＧ；又は、
それぞれ、ＶＬＣＤＲ－１、ＶＬＣＤＲ－２及びＶＬＣＤＲ－３についての配列番号１１９、１２２及び９６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％の配列同一性を含む３つのＣＤＲの所与のセットを含むイヌ抗体カッパ又はラムダ軽鎖、及び、それぞれ、ＶＨＣＤＲ－１、ＶＨＣＤＲ－２及びＶＨＣＤＲ－３についての配列番号８６、８８及び１１５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％の配列同一性を含む異なるＣＤＲの所与のセットを含むイヌ抗体重鎖ＩｇＧ；を有しながら、同時に、好ましい結合特性及び機能特性を依然として示す、抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。別の実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、０、１、２、３、４又は５の保存的又は非保存的なアミノ酸置換を有する３つの軽鎖ＣＤＲと３つの重鎖ＣＤＲの前記セットのうちの１以上を有するカッパ又はラムダ軽鎖とＩｇＧ重鎖配列の組合せを含んでいながら、同時に、好ましい結合特性及び機能特性を依然として示すイヌフレームを含む。

配列同一性は、２つの配列を最適に整列させた場合に２つのポリペプチドのアミノ酸が等しい位置において同一である程度を示している。本明細書中で使用されている場合、１つのアミノ酸配列は、２番目のアミノ酸配列に対して、その両方の配列のアミノ酸残基が同一である場合、１００％「同一」である。従って、あるアミノ酸配列は、２番目のアミノ酸配列に対して、その２つのアミノ酸配列のアミノ酸残基のうちの５０％が同一である場合、５０％「同一」である。配列の比較は、所与のタンパク質（例えば、比較されるポリペプチドの一部分又はタンパク質）に含まれるアミノ酸残基の連続するブロックにわたって実施される。特定の実施形態では、２つのアミノ酸配列の間の対応性を異なるように変化させ得る選択された欠失又は挿入を考慮に入れる。

配列類似性は、同一の残基及び生化学的に関連する非同一のアミノ酸を包含する。類似した特性を共有し、交換可能であり得る生化学的に関連するアミノ酸が考察される。

「保存的に修飾された変異体」又は「保存的置換」は、タンパク質中のアミノ酸を類似した性質（例えば、電荷、側鎖サイズ、疎水性／親水性、骨格立体配座及び剛性など）を有する他のアミノ酸で置換することを示しており、その結果、変更は、多くの場合、そのタンパク質の生物学的活性を変えることなくなされ得る。当業者は、一般に、ポリペプチドの非必須領域内の１つのアミノ酸置換は生物学的活性を実質的に改変しないことを認識する［例えば、「Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂ． Ｃｏ．，ｐ．２２４（４ｔｈ Ｅｄ．；１９８７）」を参照されたい］。加えて、構造的に又は機能的に類似しているアミノ酸の置換は、生物学的活性を破壊する可能性がより低い。例示的な保存的置換が、すぐ下の表Ａに示されている。

本発明の抗体の機能保存的変異体も、本発明によって企図される。「機能保存的変異体」は、本明細書中で使用されている場合、抗原親和性及び／又は特異性のような所望の特性を変えることなく１以上のアミノ酸残基が変更されている抗体又はフラグメントを示している。そのような変異体は、限定するものではないが、特定のアミノ酸が上記表Ａの保存的アミノ酸置換のような類似特性を有するアミノ酸で置き換えられているものを包含する。

核酸
本発明は、さらに、本明細書中で開示されているマウス抗イヌＣＴＬＡ－４及び／又はイヌ化マウス抗イヌＣＴＬＡ－４抗体及びその抗原結合フラグメントの免疫グロブリン鎖をコード化する核酸を包含する（例えば、以下の「実施例」を参照されたい）。

さらにまた、ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって比較を実施した場合に本明細書中で提供されているイヌ化抗体のアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一、好ましくは、少なくとも約８０％同一、さらに好ましくは、少なくとも約９０％同一、及び、最も好ましくは、少なくとも約９５％同一（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）であるアミノ酸配列を含む免疫グロブリンポリペプチドをコード化する核酸も本発明に包含され、ここで、アルゴリズムのパラメータは、それぞれの参照配列の全長にわたってそれぞれの配列の間で最大の一致を与えるように選択される。本発明は、さらに、ＢＬＡＳＴアルゴリズムで比較を実施した場合に参照アミノ酸配列のいずれかと少なくとも約７０％類似、好ましくは、少なくとも約８０％類似、さらに好ましくは、少なくとも約９０％類似、及び、最も好ましくは、少なくとも約９５％類似（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）しているアミノ酸配列を含む免疫グロブリンポリペプチドをコード化する核酸も提供し、ここで、アルゴリズムのパラメータは、それぞれの参照配列の全長にわたってそれぞれの配列の間で最大の一致を与えるように選択され、同様に本発明に包含される。

本明細書中で使用されている場合、ヌクレオチド及びアミノ酸配列の同一性パーセントは、アラインメントのデフォルトパラメータ及び同一性についてのデフォルトパラメータを用いて、Ｃ，ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（ＭａｃＶｅｃｔｏｒ， Ｉｎｃ． Ｃａｒｙ， ＮＣ ２７５１９）、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（Ｉｎｆｏｒｍａｘ， Ｉｎｃ． ＭＤ）、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐ ＰＬＣ（１９９６）及びＣｌｕｓｔａｌ Ｗアルゴリズムを使用して確認することができる。これらの市販されているプログラムは、さらに、同じ又は類似のデフォルトパラメータを用いて配列類似性を確認するためにも使用することができる。あるいは、例えば、デフォルトパラメータを用いたＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ＧＣＧ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｖｅｒｓｉｏｎ ７， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）パイルアッププログラムを使用して、デフォルトフィルター条件下でＡｄｖａｎｃｅｄ Ｂｌａｓｔ検索を用いることも可能である。

以下の参考文献は、配列解析のためにしばしば使用されるＢＬＡＳＴアルゴリズムに関するものである：ＢＬＡＳＴ ＡＬＧＯＲＩＴＨＭＳ：Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０ （１９９０）；Ｇｉｓｈ， Ｗ．， ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６－２７２ （１９９３）；Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．， ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１－１４１（１９９６）； Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９－３４０２ （１９９７）； Ｚｈａｎｇ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ７：６４９－６５６ （１９９７）；Ｗｏｏｔｔｏｎ， Ｊ．Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｍｐｕｔ． Ｃｈｅｍ． １７：１４９－１６３ （１９９３）； Ｈａｎｃｏｃｋ， Ｊ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｓｃｉ． １０：６７－７０ （１９９４）； ＡＬＩＧＮＭＥＮＴ ＳＣＯＲＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭＳ： Ｄａｙｈｏｆｆ， Ｍ．Ｏ．， ｅｔ ａｌ．， “Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．” ｉｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ｖｏｌ． ５， ｓｕｐｐｌ． ３． Ｍ．Ｏ． Ｄａｙｈｏｆｆ （ｅｄ．）， ｐｐ． ３４５－３５２， （１９７８）； Ｎａｔｌ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｒｅｓ． Ｆｏｕｎｄ．， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＤＣ； Ｓｃｈｗａｒｔｚ， Ｒ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， “Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｄｉｓｔａｎｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．” ｉｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ｖｏｌ． ５， ｓｕｐｐｌ． ３．“ （１９７８）， Ｍ．Ｏ． Ｄａｙｈｏｆｆ （ｅｄ．）， ｐｐ． ３５３－３５８ （１９７８）， Ｎａｔｌ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｒｅｓ． Ｆｏｕｎｄ．， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＤＣ； Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１９：５５５－５６５ （１９９１）； Ｓｔａｔｅｓ， Ｄ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ３：６６－７０（１９９１）； Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１０９１５－１０９１９ （１９９２）； Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ． ３６：２９０－３００ （１９９３）； ＡＬＩＧＮＭＥＮＴ ＳＴＡＴＩＳＴＩＣＳ： Ｋａｒｌｉｎ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：２２６４－２２６８ （１９９０）； Ｋａｒｌｉｎ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５８７３－５８７７ （１９９３）； Ｄｅｍｂｏ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｐｒｏｂ． ２２：２０２２－２０３９ （１９９４）；及び、 Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ． “Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ．” ｉｎ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （Ｓ． Ｓｕｈａｉ， ｅｄ．）， ｐｐ． １－１４， Ｐｌｅｎｕｍ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９７）。

本発明は、さらに、本発明の核酸を含む発現ベクターも提供し、ここで、核酸は、宿主細胞をベクターでトランスフェクトしたときに宿主細胞によって認識される制御配列に作動可能に連結されている。さらにまた、本発明の発現ベクターを含む宿主細胞、及び、本明細書中で開示されている抗体又はその抗原結合フラグメントを作製する方法も提供され、ここで、該方法は、抗体又は抗原結合フラグメントをコード化する発現ベクターを保有する宿主細胞を培地内で培養すること、及び、抗原又はその抗原結合フラグメントを宿主細胞又は培地から単離することを含む。

イヌ化マウス抗イヌＣＴＬＡ－４抗体は、当分野で既知の方法によって組換え技術で作製することができる。本明細書中で開示されている抗体又はフラグメントの発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当分野でよく知られており、そして、アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株を包含する。これらには、とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳＯ、ＳＰ２細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、Ａ５４９細胞、３Ｔ３細胞、ＨＥＫ－２９３細胞及び多くの他の細胞株が包含される。哺乳動物宿主細胞としては、ヒト、マウス、ラット、イヌ、サル、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ及びハムスターの細胞を含む。特に好ましい細胞株は、どの細胞株が高い発現レベルを有しているかを確認することによって選択される。使用し得る他の細胞株は、昆虫細胞株、例えば、Ｓｆ９細胞、両生類細胞、細菌細胞、植物細胞及び真菌細胞である。重鎖又はその抗原結合部分若しくはフラグメント、軽鎖及び／又はその抗原結合フラグメントをコード化する組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入する場合、その宿主細胞において抗体の発現を可能にするのに充分な期間、又は、さらに好ましくは、その宿主細胞がその中で増殖する培地の中に抗体の分泌を可能にするのに充分な期間、宿主細胞を培養することによって抗体が産生される。

抗体は、標準的なタンパク質精製方法を用いて、その培地から回収することができる。さらに、産生細胞株からの本発明の抗体（又は、それに由来する他の成分）の発現は、多くの既知技術を用いて増強することができる。例えば、グルタミンシンテターゼ遺伝子発現系（ＧＳ系）は、特定の条件下で発現を増強するための一般的なアプローチである。ＧＳ系は、欧州特許第０２１６８４６号、欧州特許第０２５６０５５号及び欧州特許第０３２３９９７号並びに欧州特許出願第８９３０３９６４．４号に関連して全体的に又は部分的に考察される。

一般に、特定の細胞株又はトランスジェニック動物において産生される糖タンパク質は、その細胞株又はトランスジェニック動物で産生される糖タンパク質に特徴的なグリコシル化パターンを有する。従って、抗体の特定のグリコシル化パターンは、その抗体を産生させるのに使用される特定の細胞株又はトランスジェニック動物に依存する。しかしながら、本明細書中において提供されている核酸分子によってコード化される又は本明細書において提供されているアミノ酸配列を含む全ての抗体は、その抗体が有し得るグリコシル化パターンに関係なく本発明を構成する。同様に、特定の実施形態では、非フコシル化Ｎ－グリカンのみを含むグリコシル化パターンを有する抗体は、これらの抗体が典型的にはインビトロ及びインビボの両方でそれらのフコシル化対応物よりも強力な効力を発揮することが示されているので、有利であり得る［例えば、以下のものを参照されたい：Ｓｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３４６６－３４７３（２００３）；米国特許第６，９４６，２９２号及び米国特許第７，２１４，７７５号］。

本発明は、さらに、本明細書中で開示されているマウス抗イヌＣＴＬＡ－４抗体の抗体フラグメントを包含する。抗体フラグメントには、例えばペプシンによるＩｇＧの酵素的切断によって生成され得る、Ｆ（ａｂ）_２フラグメントが包含される。Ｆａｂフラグメントは、例えばジチオトレイトール又はメルカプトエチルアミンでＦ（ａｂ）_２を還元することによって生成させることができる。Ｆａｂフラグメントは、ジスルフィド架橋によってＶ_Ｈ－Ｃ_Ｈ１鎖に付加されたＶ_Ｌ－Ｃ_Ｌ鎖である。Ｆ（ａｂ）_２フラグメントは、２つのジスルフィド架橋によって付加された２つのＦａｂフラグメントである。Ｆ（ａｂ）_２分子のＦａｂ部分は、その間にジスルフィド架橋が位置するＦ_ｃ領域の一部分を含む。Ｆ_Ｖフラグメントは、Ｖ_Ｌ領域又はＶ_Ｈ領域である。

一実施形態では、抗体又は抗原結合フラグメントは、重鎖定常領域、例えば、イヌ定常領域、例えば、ＩｇＧＡ、ＩｇＧＢ、ＩｇＧＣ及びＩｇＧＤイヌ重鎖定常領域又はその変異体を含む。別の実施形態では、抗体又は抗原結合フラグメントは、軽鎖定常領域、例えば、イヌ軽鎖定常領域、例えば、ラムダ又はカッパイヌ軽鎖領域又はその変異体を含む。例として、及び、限定するものではないが、イヌ重鎖定常領域は、ＩｇＧ－Ｂに由来することができ、そして、イヌ軽鎖定常領域は、カッパに由来することができる。

抗体工学
本発明のイヌ化マウス抗イヌＣＴＬＡ－４抗体は、例えば、その抗体の特性を改善するために、親（即ち、イヌ）モノクローナル抗体の可変ドメイン内のイヌフレームワーク及び／又はイヌフレーム残基への修飾を含むように操作することができる。

エピトープ結合及び結合親和性
本発明は、さらに、本明細書中で開示されているマウス抗イヌＣＴＬＡ－４抗体と同じイヌＣＴＬＡ－４のエピトープのアミノ酸残基に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。特定の実施形態では、マウス抗イヌＣＴＬＡ－４抗体又はその抗原結合フラグメントは、さらに、イヌＣＴＬＡ－４のイヌＣＤ８６及び／又はＣＤ８０への結合を阻害／ブロックすることができる。関連する実施形態では、イヌ化マウス抗イヌＣＴＬＡ－４抗体又はその抗原結合フラグメントも、イヌＣＴＬＡ－４のイヌＣＤ８６及び／又はＣＤ８０への結合を阻害／ブロックすることができる。

実験的及び診断的用途
本発明のマウス抗イヌＣＴＬＡ－４及び／又はイヌ化マウス抗イヌＣＴＬＡ－４抗体又はその抗原結合フラグメントは、さらに、イヌＣＴＬＡ－４タンパク質に関する診断アッセイにおいて、例えば、癌と連動した及び／又は関連したその発現の検出において有用であり得る。

例えば、そのような方法は、以下の段階を含む：
（ａ） 基質（例えば、マイクロタイタープレートウェルの表面、例えば、プラスチック製プレートの表面）を、マウス抗イヌＣＴＬＡ－４抗体又はその抗原結合フラグメントでコーティングする段階；
（ｂ） イヌＣＴＬＡ－４の存在について試験されるサンプルを基質に適用する段階；
（ｃ） そのプレートを洗浄して、サンプル中の未結合の物質を除去する段階；
（ｄ） ＣＴＬＡ－４抗原に対しても特異的である検出可能な標識化抗体（例えば、酵素結合抗体）を適用する段階；
（ｅ） 基質を洗浄して、結合していない標識化抗体を除去する段階；
（ｆ） 標識化抗体が酵素結合している場合、酵素によって蛍光シグナルに変換される化学物質を適用する段階；及び、
（ｇ） 標識化抗体の存在を検出する段階。

さらなる実施形態では、標識化抗体は、ＡＢＴＳ［例えば、２，２’－アジノ－ビス（３－エチルベンズチアゾリン－６－スルホン酸）］又は３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）と反応して検出可能な色の変化を生じるペルオキシダーゼで標識されている。あるいは、標識化抗体は、シンチラントの存在下でシンチレーションカウンターによって検出することができる検出可能な放射性同位元素（例えば、^３Ｈ）で標識されている。本発明のマウス抗イヌＣＴＬＡ－４抗体は、ウエスタンブロット手順又はイムノプロテインブロット手順で使用することができる。

そのような手順は、本発明の一部を形成し、そして、例えば、以下を含む：
（ｉ） 結合したイヌＣＴＬＡ－４又はそのフラグメントの存在について試験される膜又は別の固体基質を、本発明のイヌ化マウス抗イヌＣＴＬＡ－４抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させる。そのような膜は、非変性ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）ゲル又はＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）ゲルの中のイヌＣＴＬＡ－４の存在が試験されるタンパク質が（例えば、ゲル中で電気泳動分離された後で）移されたニトロセルロース又はビニル系［例えば、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）］膜の形態であることができる。膜にイヌ化マウス抗イヌＣＴＬＡ－４抗体又はその抗原結合フラグメントを接触させる前に、膜を、場合により、その膜上の非特異的タンパク質結合部位が結合するように例えば無脂乾燥乳などでブロックする；
（ｉｉ） 未結合のイヌ化マウス抗イヌＣＴＬＡ－４抗体又はその抗原結合フラグメント及び他の未結合物質を除去するために、膜を１回以上洗浄すること；及び
（ｉｉｉ） 結合したイヌ化マウス抗イヌＣＴＬＡ－４抗体又はその抗原結合フラグメントを検出すること。

結合した抗体又は抗原結合フラグメントの検出は、その抗体又は抗原結合フラグメントを検出可能に標識された二次抗体（抗免疫グロブリン抗体）と結合させ、次いで、その二次抗体の存在を検出することによって行うことができる。

本明細書中で開示されているマウス抗イヌＣＴＬＡ－４抗体、イヌ化マウス抗イヌＣＴＬＡ－４抗体及び／又はその抗原結合フラグメントは、さらに、免疫組織化学に使用することができる。そのような方法は、本発明の一部を形成し、そして、例えば、以下を含む：（１）イヌＣＴＬＡ－４の存在について試験される細胞を、例えば、本発明のマウス抗イヌＣＴＬＡ－４抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させること；及び、（２）その細胞の表面上又は内部の抗体又はフラグメントを検出すること。抗体又は抗原結合フラグメント自体が検出可能に標識されている場合は、それは、直接検出することが可能である。あるいは、抗体又は抗原結合フラグメントに、検出可能に標識された二次抗体を結合させることができ、それを検出する。

イメージング技術としては、ＳＰＥＣＴイメージング（単一光子放射型コンピュータ断層撮影）又はＰＥＴイメージング（ポジトロン放射型断層撮影）を含む。標識としては、例えば、以下のものを含む：例えばＳＰＥＣＴイメージングと組み合わせた、ヨウ素－１２３（^１２３Ｉ）及びテクネチウム－９９ｍ（^９９ｍＴｃ）、又は、例えばＰＥＴイメージングと組み合わせた、^１１Ｃ、^１３Ｎ、^１５Ｏ若しくは^１８Ｆ、又は、インジウム－１１１［例えば、「Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． ６７：３８５－４４０ （２００５）」を参照されたい］。

交差ブロッキング抗体
さらに、本発明の抗イヌＣＴＬＡ－４抗体又はその抗原結合フラグメントには、以下のものも包含される：本明細書中で論じられている抗体及びフラグメントが結合するイヌＣＴＬＡ－４と同じエピトープに結合する任意の抗体又はその抗原結合フラグメント、並びに、イヌＣＴＬＡ－４結合について本明細書中で論じられている抗体若しくはフラグメントを（部分的に又は完全に）交差ブロックする又はイヌＣＴＬＡ－４結合について本明細書中で論じられている抗体若しくはフラグメントによって（部分的に又は完全に）交差ブロックされる任意の抗体若しくは抗原結合フラグメント；並びに、それらの任意の変異体。

本明細書中で論じられている交差ブロッキング抗体及びその抗原結合フラグメントは、標準的な結合アッセイ（例えば、ＢＩＡＣｏｒｅ（登録商標）、以下で例示されているＥＬＩＳＡ、又は、フローサイトメトリー）において、本明細書中で開示されている抗体（以下の実施例５において提供されているＣＤＲに基づく）（即ち、４５Ａ９、２７Ｇ１２、２２Ａ１１、１１０Ｅ３；及び、より特定的には、１２Ｂ３及び／又は３９Ａ１１）と交差競合するそれらの能力に基づいて確認することができる。例えば、標準的なＥＬＩＳＡアッセイを使用することが可能であり、ここで、アッセイでは、組換えイヌＣＴＬＡ－４タンパク質をプレート上に固定化し、当該抗体のうちの１つを蛍光標識し、そして、標識化抗体の結合と競合する非標識化抗体の能力を評価する。追加的に又は代替的に、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）分析を使用して、抗体が交差競合するその能力を評価することが可能である。例えば、２７Ｇ１２、４５Ａ９、１１０Ｅ３及び／又は２２Ａ１１；並びに、さらに特定的には、１２Ｂ３及び／又は３９Ａ１１のイヌＣＴＬＡ－４への結合を阻害する被験抗体の能力は、被験抗体が、イヌＣＴＬＡ－４への結合について２７Ｇ１２、４５Ａ９、１１０Ｅ３及び／若しくは２２Ａ１１並びに／又は１２Ｂ３及び／若しくは３９Ａ１１と競合することができること、従って、場合によっては、２７Ｇ１２、４５Ａ９、１１０Ｅ３及び／若しくは２２Ａ１１並びに／又は１２Ｂ３及び／若しくは３９Ａ１１と同じイヌＣＴＬＡ－４上のエピトープに結合することができることを示している。上記で記載したように、本発明の抗イヌＣＴＬＡ－４抗体又はフラグメントのいずれかと同じエピトープに結合する抗体及びフラグメントも本発明の一部を形成する。

医薬組成物及び投与
イヌ化マウス抗イヌＣＴＬＡ－４抗体又はその抗原結合フラグメントの医薬組成物又は滅菌組成物を調製するために、それを医薬的に許容される担体又は賦形剤と混合させることができる。［例えば、以下のものを参照されたい：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｕ．Ｓ． Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ： Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ （１９８４）］。

治療薬及び診断薬の製剤は、例えば凍結乾燥粉末、スラリー、水溶液又は懸濁液の形態にある許容される担体、賦形剤又は安定化剤と混合させることによって調製することができる［例えば、以下のものを参照されたい：Ｈａｒｄｍａｎ， ｅｔ ａｌ．（２００１） Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ； Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００） Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ， ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ａｖｉｓ，ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．） （１９９３） Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ： Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．） （１９９０） Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．） （１９９０） Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｗｅｉｎｅｒ ａｎｄ Ｋｏｔｋｏｓｋｉｅ（２０００） Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ］。一実施形態では、本発明の抗ＣＴＬＡ－４抗体を酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５～６）の中で適切な濃度に希釈し、そして、張度のためにＮａＣｌ又はスクロースを添加する。安定性を高めるために、ポリソルベート２０又はポリソルベート８０などの付加的な作用物質を添加することができる。

単独で又は別の作用物質と組み合わせて投与される抗体組成物の毒性及び治療効果は、例えばＬＤ_５０（母集団の５０％に致死的な用量）及びＥＤ_５０（母集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するための細胞培養物又は実験動物における標準的な薬学手順によって確認することができる。毒性作用と治療効果の間の用量比が治療指数（ＬＤ_５０／ＥＤ_５０）である。特定の態様においては、高い治療指数を示す抗体が望ましい。これらの細胞培養アッセイ及び動物試験から得られるデータは、イヌにおける使用のための投与量範囲を設定するのに使用することができる。そのような化合物の投与量は、好ましくは、殆ど又は全く毒性を伴わないＥＤ_５０を包含する循環濃度の範囲内にある。投与量は、使用される投与形態及び投与経路に応じてこの範囲内で変化し得る。

投与の方法はさまざまであり得る。適切な投与経路としては、以下の経路を含む：経口、直腸、経粘膜、腸、非経口；筋肉内、皮下、皮内、髄内、髄腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、鼻内、眼内、吸入、吹送、局所、皮膚、経皮又は動脈内。特定の実施形態では、イヌ化マウス抗イヌＣＴＬＡ－４抗体又はその抗原結合フラグメントは、注射のような侵襲的経路によって投与することができる。本発明のさらなる実施形態では、イヌ化マウス抗イヌＣＴＬＡ－４抗体若しくはその抗原結合フラグメント又はその医薬組成物は、静脈内、皮下、筋肉内、動脈内に、又は、吸入、エアロゾル送達によって投与される。非侵襲的経路（例えば、経口的に；例えば、丸剤、カプセル剤又は錠剤中で）による投与も本発明の範囲内である。

組成物は、当技術分野で知られている医療機器を用いて投与することができる。例えば、本発明の医薬組成物は、皮下注射針（これは、例えば、プレフィルドシリンジ又は自己注射器を包含する）による注射によって投与することができる。本明細書中で開示されている医薬組成物は、さらに、無針皮下注射装置（例えば、米国特許：第６，６２０，１３５号；第６，０９６，００２号；第５，３９９，１６３号；第５，３８３，８５１号；第５，３１２，３３５号；第５，０６４，４１３号；第４，９４１，８８０号；第４，７９０，８２４号又は第４，５９６，５５６号に開示されている装置）を用いて投与することもできる。

本明細書中で開示されている医薬組成物は、注入によって投与することもできる。医薬組成物を投与するためのよく知られているインプラント及びモジュールの例としては、以下のものを含む：米国特許第４，４８７，６０３号、これは、薬剤を制御された速度で投与するための移植可能なマイクロ注入ポンプを開示している；米国特許第４，４４７，２３３号、これは、薬剤を正確な注入速度で送達するための薬剤注入ポンプを開示している；米国特許第４，４４７，２２４号、これは、持続的な薬剤送達のための可変流量の移植可能な注入装置を開示している；米国特許第４，４３９，１９６号、これは、マルチチャンバー区画を有する浸透圧薬物送達システムを開示している。多くの他のそのようなインプラント、送達システム及びモジュールは、当業者にはよく知られている。

あるいは、例えば、多くの場合、デポー製剤又は持続放出製剤で、免疫病理学によって特徴付けられる病原体誘発性病変又は関節炎の関節の内部に抗体を直接注入することによって、マウス抗イヌＣＴＬＡ－４抗体又はイヌ化マウス抗イヌＣＴＬＡ－４抗体を全身的にではなく局所的に投与することができる。さらに、例えば、免疫病理学によって特徴付けられる病原体誘発性病変又は関節炎の関節を標的とする標的化薬物送達システムで、例えば、組織特異的抗体で被覆されたリポソームに入れて抗体を投与することができる。リポソームは、罹患組織を標的とし、罹患組織によって選択的に取り込まれる。

投与レジメンは、治療用抗体の血清又は組織代謝回転速度、兆候のレベル、治療用抗体の免疫原性及び生物学的マトリックス中の標的細胞の接近可能性を包含するいくつかの因子に依存する。好ましくは、投与レジメンは、同時に望ましくない副作用を最小限に抑えながら、標的疾患部位において改善をもたらすのに充分な治療用抗体を送達する。従って、送達される生物学的製剤の量は、一部には特定の治療用抗体及び処置される状態の重症度に依存する。治療用抗体の適切な用量の選択における指針を入手することが可能である［例えば、以下のものを参照されたい：Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂｉｏｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂ．Ｌｔｄ，Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ（１９９６）；Ｋｒｅｓｉｎａ （ｅｄ．） Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９１）；Ｂａｃｈ （ｅｄ．） Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９３）；Ｂａｅｒｔ，ｅｔ ａｌ．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：６０１－６０８（２００３）；Ｍｉｌｇｒｏｍ ｅｔ ａｌ．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４１：１９６６－１９７３（１９９９）；Ｓｌａｍｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４：７８３－７９２（２００１）；Ｂｅｎｉａｍｉｎｏｖｉｔｚ ｅｔ ａｌ．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４２：６１３－６１９（２０００）；Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：２４－３２（２００３）；Ｌｉｐｓｋｙ ｅｔ ａｌ．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４３：１５９４－１６０２（２０００）］。

適切な用量の決定は、獣医によって、例えば処置に影響を及ぼすことが当分野で既知である又は推測されるパラメータ又は因子を使用して行われる。一般に、投与は、最適用量よりいくぶん低い量から開始し、その後、負の副作用と比較して所望の又は最適の効果が達成されるまで少しずつ増量する。重要な診断基準としては、腫瘍サイズなどの兆候の診断基準を含む。

本明細書中で開示されている抗体又はその抗原結合フラグメントは、連続注入によって提供され得るか、又は、例えば、１日１回、週に１～７回、週１回、隔週に１回、月１回、隔月に１回、３ヶ月に１回、半年に１回、年１回などで投与される用量によって提供され得る。用量は、例えば、静脈内、皮下、局所、経口、鼻腔、直腸、筋肉内、脳内、脊髄内に、又は、吸入によって提供され得る。１週間の総用量は、一般に、少なくとも０．０５μｇ／ｋｇ体重であり、より一般的には、少なくとも０．２μｇ／ｋｇ、０．５μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上である［例えば、以下のものを参照されたい：Ｙａｎｇ，ｅｔ ａｌ．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４９：４２７－４３４ （２００３）；Ｈｅｒｏｌｄ，ｅｔ ａｌ．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ． Ｊ．Ｍｅｄ．３４６：１６９２－１６９８（２００２）；Ｌｉｕ，ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈ．６７：４５１－４５６ （１９９９）；Ｐｏｒｔｉｅｌｊｉ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５２：１３３－１４４（２００３）］。用量は、さらにまた、対象の血清中におけるイヌ化マウス抗イヌＣＴＬＡ－４抗体のあらかじめ定められた目標濃度（例えば、０．１、０．３、１、３、１０、３０、１００、３００μｇ／ｍＬ又はそれ以上）を達成するように提供され得る。別の実施形態では、本発明のイヌ化マウス抗イヌＣＴＬＡ－４抗体は、週１回、隔週に１回、「４週間に１回」、月１回、隔月に１回又は３ヶ月に１回に基づいて、１０、２０、５０、８０、１００、２００、５００、１０００又は２５００ｍｇ／対象で、皮下投与又は静脈内投与される。

抗イヌＣＴＬＡ－４ ｍＡｂによって認識される抗原性ペプチド（例えば、ＣＴＬＡ－４からのエピトープ又はその一部を含むペプチド）も、イヌＣＴＬＡ－４のイヌＣＤ８０及び／又はＣＤ８６への結合をブロックする抗体を誘発させるためのワクチンとして使用することができる。そのようなワクチンは、癌のような疾患に対する治療ワクチンとして有用であり得る。これらの抗原性ペプチドをワクチンとして使用するために、これらのペプチドの免疫原性を増大させ、ペプチド特異的抗体を誘発させるために、これらのペプチドの１以上を化学的に又は組換えＤＮＡ技術の技術を介して別の担体タンパク質に結合させることができる。ペプチドを担体タンパク質に結合させるための技術は、当業者に知られている。ペプチドワクチンは、ＩＭ、Ｓ／Ｃ、経口、スプレー又は卵内（ｉｎ ｏｖｏ）経路で動物にワクチン接種するために使用することができる。ペプチドワクチンは、細菌、ウイルス、酵母又はバキュロウイルスウイルスシステムから発現されるサブユニットタンパク質として使用することができる。あるいは、そのようなペプチドワクチンは、当業者に知られている方法によって実施することが可能なペプチドワクチンを発現する種々のウイルス又は細菌ベクターを投与した後で送達することができる。ペプチドワクチンは、１－１０００μｇの用量で投与することができ、そして、場合により、アジュバント及び許容可能な医薬用担体を含むことができる。

本明細書中で使用されている場合、「阻害する」又は「処置する」又は「処置」は、障害に関連する兆候の発現の先送り及び／又はそのような障害の兆候の重症度の軽減を包含する。これらの用語は、さらに、既存の制御されていない又は望ましくない兆候を改善すること、付加的な兆候を予防すること及びそのような兆候の基礎となる原因を改善又は予防することを包含する。従って、これらの用語は、障害、疾患若しくは兆候を有している又はそのような障害、疾患若しくは兆候を発現する可能性を有している脊椎動物対象に有益な結果が与えられていることを意味する。

本明細書中で使用されている場合、用語「治療有効量」、「治療有効用量」及び「有効量」は、単独で又は付加的な治療薬と組み合わせて、細胞、組織又は対象に投与された場合に、疾患若しくは症状の１以上の兆候における又はそのような疾患若しくは症状の進行における測定可能な改善を生じさせるのに有効な、本発明のイヌ化マウス抗イヌＣＴＬＡ－４抗体又はその抗原結合フラグメントの量を示している。治療有効用量は、さらに、兆候の少なくとも部分的な改善、例えば、関連する医学的状態の処置、治癒、予防若しくは改善又はそのような症状の処置、治癒、予防若しくは改善の速度の増大をもたらすのに充分な結合化合物の量を示している。単独で投与される個々の活性成分に対して適用される場合、治療有効用量は、その成分単独を示している。組合せに対して適用される場合、治療有効用量は、組み合わせて、連続的に又は同時に投与されるかどうかにかかわらず、治療効果をもたらす有効成分の合計量を示している。治療薬の有効量は、診断基準又はパラメータの少なくとも１０％、通常は少なくとも２０％、好ましくは少なくとも約３０％、さらに好ましくは少なくとも４０％、最も好ましくは少なくとも５０％の改善をもたらす。有効量は、さらにまた、疾患の重症度を評価するのに主観的基準を用いる場合は、主観的基準の改善ももたらすことができる。

他の併用療法
先に記載したように、本発明のイヌ化マウス抗イヌＣＴＬＡ－４抗体若しくはその抗原結合フラグメント及び／又は抗原性ペプチドは、１種類以上の別の治療薬（例えば、次の段落で論じられている阻害薬）及び／又はイヌ化マウス抗イヌＰＤ－１抗体［例えば、Ｕ．Ｓ．９，９４４，７０４Ｂ２及びＵ．Ｓ．１０，１０６，１０７Ｂ２を参照されたい、これらの両方の内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる］及び／又はイヌ化マウス抗イヌＰＤ－Ｌ１抗体［例えば、Ｕ．Ｓ．２０１８０２３７５３５Ａ１を参照されたい、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる］と同時投与することができる。抗体（類）は、薬剤に（免疫複合体として）連結させることができ、及び／又は、薬剤又は別の抗体とは別に投与することができる。後者（別々の投与）の場合、抗体は、薬剤の前に、後で若しくは同時に投与することが可能であり、又は、別の既知療法と同時投与することができる。

キット
さらに、１種類以上の成分（これは、限定するものではないが、ＣＴＬＡ－４に特異的に結合する、本明細書で論じられている抗体又は抗原結合フラグメント（例えば、イヌ化マウス抗イヌＣＴＬＡ－４抗体又はその抗原結合フラグメント）を包含する）を、１種類以上の付加的な成分（これは、イヌ化マウス抗イヌＰＤ－１抗体及び／又はイヌ化マウス抗イヌＰＤ－Ｌ１抗体を包含する）と一緒に含むキットが提供される。直前に記載されている結合組成物は、純粋な組成物として又は医薬的に許容される担体と組み合わせて、医薬組成物に製剤することができる。

一実施形態では、キットは、本発明の結合組成物（例えば、イヌ化マウス抗イヌＣＴＬＡ－４又はその医薬組成物）を１つの容器（例えば、ガラス製又はプラスチック製の滅菌バイアル）の中に含み、イヌ化マウス抗イヌＰＤ－１抗体及び／若しくはイヌ化マウス抗イヌＰＤ－Ｌ１抗体又はそれらの医薬組成物を別の容器（例えば、ガラス製又はプラスチック製の滅菌バイアル）の中に含む。

キットが対象への非経口投与用の医薬組成物を含む場合、そのキットは、そのような投与を実施するための装置も含むことができる。例えば、キットは、上記で論じた１以上の皮下注射用針又は他の注射装置を含むことができる。キットは、さらに、そのキットの中の医薬組成物及び投与形態に関する情報を含む添付文書も含むことができる。一般に、そのような情報は、ペットの飼い主及び獣医が同封されている医薬組成物及び投与形態を有効かつ安全に使用するのに役立つ。例えば、本発明の組合せに関する以下の情報が添付文書中で提供され得る：薬物動態学、薬力学、臨床試験、効力パラメータ、適応症及び用法、禁忌、警告、注意、有害反応、過量、適切な投与量及び投与、供給方法、適切な保存条件、参考文献、製造業者／配給業者情報、及び、特許情報。

便宜上、本明細書中で開示されている抗体又は特定の結合物質は、キット中で、即ち、診断又は検出アッセイを実施するための指示書と共に所定量の試薬の包装された組合せで提供され得る。抗体（類）が酵素で標識されている場合、キットは、基質及び当該酵素が必要とする補因子（例えば、検出可能な発色団又は発蛍光団を提供する基質前駆体）を含有する。加えて、他の添加物、例えば、安定化剤、緩衝液（例えば、ブロック緩衝液又は溶解緩衝液）なども含まれる。さまざまな試薬の相対的な量は、アッセイの感受性を実質的に最適化する試薬の溶液中の濃度を提供するように広範囲に変えることができる。特に、試薬は、溶解した際に適切な濃度を有する試薬溶液を提供する賦形剤を含有する、通常は凍結乾燥された、乾燥粉末として提供され得る。

実施例
実施例１
イヌＣＴＬＡ－４に対するマウスモノクローナル抗体及び対応するマウス－イヌキメラ抗体の生成
マウスモノクローナル抗体は、免疫原としてイヌＣＴＬＡ－４（ｃＣＴＬＡ－４）組換えタンパク質を用いたマウスハイブリドーマ技術を使用して生成させた。陽性ハイブリドーマクローンは、ｃＣＴＬＡ－４との抗体反応性並びにＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳアッセイによるイヌＣＤ８６又はＣＤ８０とｃＣＴＬＡ－４との相互作用のブロック（ブロック活性）に基づいて選択した。選択されたハイブリドーマクローンは、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列の抗体フラグメントに関してｃＤＮＡ末端の迅速増幅（ＲＡＣＥ）によって配列決定した。選択された６つのモノクローナル抗体は、それぞれ、１２Ｂ３、２７Ｇ１２、３９Ａ１１、４５Ａ９、１１０Ｅ３及び２２Ａ１１として示されている。その６つの抗体のアミノ酸配列は、重鎖可変領域については、それぞれ、配列番号２、４、６、８、１０及び１２であり、そして、軽鎖可変領域については、それぞれ、配列番号１４、１６、１８、２０、２２及び２４である。ＣＤＲは、以下に提供されている配列の中で下線が引かれている［下記の表１も参照されたい］。上記で確認されたアミノ酸配列をコード化する対応するヌクレオチド配列は、重鎖可変領域については、それぞれ、配列番号１、３、５、７、９及び１１として記載されており、そして、軽鎖可変領域については、それぞれ、配列番号１３、１５、１７、１９、２１及び２３として記載されている。重鎖可変領域のヌクレオチド配列を、改変されたイヌ定常重鎖（ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）のヌクレオチド配列にそれぞれ融合させて、配列番号２５、２７、２９、３１、３３及び３５と称されるキメラマウス－イヌ重鎖ヌクレオチド配列を生成させた。可変領域は太字で示されている。軽鎖可変領域のヌクレオチド配列を、イヌ定常カッパ軽鎖ドメインのヌクレオチド配列にそれぞれ融合させて、配列番号３７、３９、４１、４３、４５及び４７と称されるキメラマウス－イヌ軽鎖ヌクレオチド配列を生成させた。可変領域は太字で示されている。キメラマウス－イヌ重鎖ヌクレオチド配列によってコード化されるアミノ酸配列は、配列番号２６、２８、３０、３２、３４及び３６と称された。キメラマウス－イヌ軽鎖ヌクレオチド配列によってコード化されるアミノ酸配列は、配列番号３８、４０、４２、４４、４６及び４８と称された。可変領域は太字であり、ＣＤＲは下線が引かれている。キメラヒト－イヌ重鎖及び軽鎖を、標準的な分子生物学技術を使用して別々の発現プラスミドにクローン化した。重鎖及び軽鎖遺伝子を含むプラスミドをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、発現した抗体をプロテインＡを使用してＨＥＫ２９３細胞上清から精製した。

実施例２
マウスＣＤＲのアミノ酸配列
マウス抗イヌＣＴＬＡ－４モノクローナル抗体のＣＤＲが、以下の表１記載されている。

６つの抗体のそれぞれの６つのＣＤＲの個々のカノニカル構造の割り当てが、以下の表２に示されている。

実施例３
キメラ抗体のイヌＣＴＬＡ－４との反応性
キメラ抗体は、通常、その親マウス抗体と同じ反応性を有している。６つの抗体のｃＣＴＬＡ－４との反応性を確認するために、マウス－イヌキメラ抗体を作成し、以下のようにＥＬＩＳＡによってｃＣＴＬＡ－４との反応性について試験した。

１． イムノプレートに２００ｎｇ／ウェルのｃＣＴＬＡ－４をコーティングし、そのプレートを４℃で一晩インキュベートした；
２． プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳで３回洗浄した；
３． プレートを、室温で４５～６０分間、ＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡでブロッキングした；
４． プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した；
５． 希釈プレートの各列又は行で、抗体を３倍に希釈した；
６． 希釈した抗体をプレートの各列又は行に移し、そのプレートを室温で４５～６０分間インキュベートした；
７． プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した；
８． プレートの各ウェルに、１：２０００希釈の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗イヌＩｇＧ Ｆｃを添加し、そのプレートを室温で４５～６０分間インキュベートした；
９． プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した；
１０． プレートの各ウェルにＴＭＢ基質を添加し、そのプレートを室温で１０～１５分間インキュベートして、発色させた；
１１． 各ウェルに１００μＬの１．５Ｍリン酸を加えて反応を停止させた；
１２． プレートを５４０ｎｍの参照波長を用いて４５０ｎｍで読み取った。

ＥＬＩＳＡの結果は、キメラ抗体がｃＣＴＬＡ－４に結合することができることを示している［図１を参照されたい］。

実施例４
イヌＣＤ８６又はＣＤ８０とイヌＣＴＬＡ－４との相互作用に対するキメラ抗体のブロッキング活性
キメラ抗体のブロッキング活性を調べるために、ＥＬＩＳＡベースのブロッキングアッセイを以下のように実施した：
１． イムノプレートに２００ｎｇ／ウェルのｃＣＴＬＡ－４をコーティングし、そのプレートを４℃で一晩インキュベートする；
２． プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳで３回洗浄する；
３． プレートを、室温で４５～６０分間、ＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡでブロッキングする；
４． プレートをＰＢＳＴで３回洗浄する；
５． 希釈プレートの各列又は行で、抗体を３倍に希釈し、次いで、１００ｎｇ／ウェルのビオチン化ＣＤ８６又はＣＤ８０を添加した。次に、抗体と混合させた；
６． 混合物をイムノプレートの各列又は行に移し、そのプレートを室温で４５～６０分間インキュベートした；
７． プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した；
８． プレートの各ウェルに、１：２０００希釈の西洋ワサビペルオキシダーゼがコンジュゲートしたストレプトアビジンを添加し、そのプレートを室温で４５～６０分間インキュベートした；
９． プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した；
１０． プレートの各ウェルにＴＭＢ基質を添加し、そのプレートを室温で１０～１５分間インキュベートして、発色させた；
１１． 各ウェルに１００μＬの１．５Ｍリン酸を加えて反応を停止させた；
１２． プレートを５４０ｎｍの参照波長を用いて４５０ｎｍで読み取った。

キメラ抗体は、ｃＣＴＬＡ－４とＣＤ８６との相互作用［図２］及びＣＤ８０との相互作用［図３］をブロックすることが分かった。

実施例５
ＣＨＯ－ｃＣＴＬＡ－４に対するキメラ抗体の結合活性を試験するためのめのＦＡＣＳアッセイ
ｃＣＴＬＡ－４を安定的に発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞株を作製した。その細胞を使用して、ＦＡＣＳフローアッセイにおいて抗体の結合活性及びブロッキング活性について試験した。キメラ抗体のｃＣＴＬＡ－４結合活性を試験するために、ＦＡＣＳアッセイを以下のように実施した：
１． Ｔ－７５フラスコ内の培地で、ＣＨＯ－Ｋ１－ｃＣＴＬＡ－４細胞を増殖させた。その細胞は、細胞のコンフルエンシーが９０％に達したときに継代させた；
培地：Ｆ１２Ｋ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２１１２７－０２２）、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１００９９－１４１）、及び、４μｇ／ｍＬピューロマイシン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号Ａ１１１３８０３）；
２． トリプシン－ＥＤＴＡ溶液で細胞を分離し、その細胞を培地に再懸濁させ、９５％以上の生存率で生存細胞をカウントした；
３． 細胞をスピンダウンし、上清を吸引し、次いで、その細胞をＦＡＣＳ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＢＤＢ５５４６５６）に再懸濁させて、１×１０^７細胞／ｍＬとした；
４． １００μＬの細胞に抗体を加え、穏やかに振盪しながら室温で３０分間インキュベートした；
５． 細胞を３×２５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、そして、その細胞を１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させた；
６． 細胞を、ＦＩＴＣがコンジュゲートした抗イヌＩｇＧで染色し、穏やかに振盪しながら室温で３０分間インキュベートした；
７． 細胞を３×２５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、その細胞を５００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させた；
８． フローサイトメトリーで１０，０００個の細胞を読み取った。

ＦＡＣＳの結果は、キメラ抗体がＣＨＯ－ｃＣＴＬＡ－４細胞に結合することができることを示している［図４Ａ－図４Ｇを参照されたい］。

実施例６
キメラ抗体によって活性化されるイヌＰＢＭＣのインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）の生成
イヌ末梢血単核細胞の分離
１． ＥＤＴＡ又はナトリウムヘパリン管に約２０ｍＬの全血を採取した；
２． 血液を５０ｍＬ容ポリスチレン管に移し、ＨＢＳＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号２１０２２ＣＭ）で５０：５０に希釈した；
３． １５ｍＬのＦｉｃｏｌｌ－ＰｌａｑｕｅＰｌｕｓを４×５０ｍＬ ＳｅｐＭａｔｅ^ＴＭ管（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１５４６０）に添加した。次いで、約１０ｍＬの５０：５０に希釈した血液を、ゆっくりとＦｉｃｏｌｌを含む各ＳｅｐＭａｔｅ^ＴＭ管の側面に添加した；
４． 管を１２００×ｇで２０分間遠心分離した；
５． 勾配界面から細胞を回収し、その細胞を５０ｍＬ容ポリプロピレン管に移した。４０～４５ｍＬのマークまでＨＢＳＳを添加し、そして、細胞を８００×ｇで１０分間遠心分離した；
６． 上清を廃棄し、細胞を４０～４５ｍＬ ＨＢＳＳに再懸濁させ、そして、管を再度８００×ｇで１０分間遠心分離した；
７． 上清を廃棄し、そして、各管からの細胞を２ｍＬのイヌリンパ球培地（ＲＰＭＩ培地、Ｌｏｎｚａ、カタログ番号１２－１６７Ｑ）で再懸濁させた。細胞を、同じ動物からプールした；
８． 細胞懸濁液の少量アリコートを取り、０．０４％トリパンブルーと混合させ、細胞数をカウントした；
９． 細胞懸濁液は、使用するまで２－７℃で保存したが、使用する２４時間前からは２～７℃で保存しなかった。

イヌ末梢血単核細胞に関する細胞増殖アッセイ
１． 抗体をイヌリンパ球培地内で希釈して、最終濃度を４０μｇ／ｍＬとし（調製は１６０μｇ／ｍＬ）、そして、０．２μｍシリンジフィルターを使用して滅菌した。抗体を滅菌希釈プレートで２倍希釈し、置いておいた；
２． 細胞をイヌリンパ球培地内で２．５×１０^６細胞／ｍＬに希釈し、９６ウェル組織培養プレート全体のウェルあたり１００μＬを分注した；
３． Ｃｏｎ Ａをイヌリンパ球培地内で希釈して、最終濃度を２５０ｎｇ／ｍＬとし（調製は１０００ｎｇ／ｍＬ）、０．２μｍシリンジフィルターを使用して滅菌し、そして、５０μＬを全てのウェルに加えた。（細胞のみ対照用の８つのウェルの１つ列及び細胞＋ｍＡｂのみ対照用のウェルには、Ｃｏｎ Ａを加えなかった）；
４． ウェルあたり１００μＬのイヌリンパ球培地を、細胞のみのウェルに添加し、そして、５０μＬの培地をＣｏｎ Ａ対照ウェル（ｍＡｂ処理なしのＣｏｎ Ａ＋細胞）を含む列に添加した；
５． ５０μＬの希釈ｍＡｂを複製ウェルに添加した；
６． プレートを、加湿インキュベーター内で、３６±２℃、４．０－６．０％ＣＯ_２で、６８～１２４時間インキュベートした。

ＩＦＮγＥＬＩＳＡ
１． ６８～１２４時間のインキュベーション後、プレートを８００×ｇで１０分間遠心分離した；
２． 各ウェル及びプール複製から上清を収集した。これらのサンプルは、後で使用するために－５０℃以下で凍結することができるか、又は、すぐに試験することができる；
３． 必要に応じて上清サンプルを適切に希釈し、Ｃａｎｉｎｅ ＩＦＮ－γＱｕａｎｔｉｋｉｎｅＥＬＩＳＡキット［Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ カタログ番号ＣＡＩＦ００］の指示に従ってＩＦＮ－γＥＬＩＳＡを実施した。

結果は、１２Ｂ３を包含する選択された抗体が、イヌＴ細胞を活性化してＩＦＮγを産生させることができることを示している［以下の図５を参照されたい］。

実施例７
イヌ化抗ｃＣＴＬＡ－４モノクローナル抗体１２Ｂ３及び３９Ａ１１の構築
ｃＣＴＬＡ－４に対するそれらの強い結合親和性並びにｃＣＴＬＡ－４とそのリガンドＣＤ８６及びＣＤ８０に対するそれらのブロッキング活性により、マウス抗体１２Ｂ３及び３９Ａ１１が最初のイヌ化抗体の作製用に選択された。イヌ化のプロセスを実行するために、イヌＩｇＧの重鎖及び軽鎖をコード化するＤＮＡ配列を決定した。イヌ重鎖及び軽鎖のＤＮＡ配列及びタンパク質配列は、当技術分野で知られており、ＮＣＢＩ遺伝子及びタンパク質データベースを検索することによって得ることができる。イヌＩｇＧの４つの既知ＩｇＧサブタイプがあり、それらはＩｇＧＡ、ＩｇＧＢ、ＩｇＧＣ及びＩｇＧＤと称される。ヒトＩｇＧ１と同様に、イヌＩｇＧＢは、強力なエフェクター機能を有している。ＩｇＧＢのエフェクター機能をノックアウトするために、改変ＩｇＧＢを構築し（ＩｇＧＢｍ）、天然のＡＤＣＣ及びＣＤＣ機能を除去した［Ｕ．Ｓ．１０，１０６，１０７Ｂ２を参照されたい、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる］。イヌ抗体には、カッパ及びラムダと称される２種類の軽鎖が存在する。特定のアプローチに拘束されるものではないが、さまざまな組み合わせで混合させてイヌ化抗イヌＣＴＬＡ－４ｍＡｂを産生させることできるイヌ化重鎖及び軽鎖を産生させる全プロセスは、以下のプロトコルを包含し得る：
（ｉ） 選択された抗体のＨ鎖とＬ鎖のＣＤＲを特定した。ＣＤＲのアミノ酸配列を適切なＤＮＡ配列に逆翻訳させた；
（ｉｉ） イヌＩｇＧのＨ鎖及びＬ鎖（例えば、ＩｇＧＢの重鎖及び軽カッパ鎖）に対する適切なＤＮＡ配列を特定した；
（ｉｉｉ） 上記配列のイヌＩｇＧＨ鎖及びＬ鎖ＤＮＡの内因性ＣＤＲをコード化するＤＮＡ配列を特定した；
（ｉｖ） 内因性のイヌＨ鎖及びＬ鎖ＣＤＲをコード化するＤＮＡ配列を、選択された抗体のＣＤＲをコード化するＤＮＡ配列で置き換えた。さらにまた、場合により、いくつかのイヌフレームワークアミノ酸残基をコード化するＤＮＡを、選択された抗体フレームワーク領域からの選択されたアミノ酸残基をコード化するＤＮＡに置き換えた；
（ｖ） 段階（ｉｖ）からのＤＮＡを合成し、そして、それを適切な発現プラスミドにクローン化した；
（ｖｉ） 合成されたプラスミドをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした；
（ｖｉｉ） 発現されたイヌ化抗体をＨＥＫ２９３上清から精製した；
（ｖｉｉｉ） 精製されたイヌ化抗体をイヌＣＴＬＡ－４への結合について試験した。

１２Ｂ３及び３９Ａ１１のＣＤＲのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列が、以下の表３に記載されている。

イヌ化軽鎖及び重鎖配列のセットを構築した。それらの配列識別番号は、以下の表４－６に記載されている。

本発明は、上記表中に列挙された各抗体のイヌ化重鎖及び軽鎖の組み合わせによって形成された１２Ｂ３及び３９Ａ１１のイヌ化された抗体を提供し；そのような抗体は、ｃＣＴＬＡ－４との特に緊密な結合を示す。図６に示されているように、ＥＬＩＳＡの結果は、１２Ｂ３と３９Ａ１１の両方が首尾よくイヌ化されたことを示している。イヌ化ｃ１２Ｂ３Ｌ３Ｈ２及びＬ３Ｈ３は、親１２Ｂ３と同様のｃＣＴＬＡ－４との反応性を有しており；イヌ化ｃ３９Ａ１１Ｌ３Ｈ３は、親３９Ａ１１と同様のｃＣＴＬＡ－４との反応性を有している。１２Ｂ３と３９Ａ１１のキメラは、それらの親抗体を表している。

実施例８
イヌ化抗ｃＣＴＬＡ－４モノクローナル抗体１２Ｂ３及び３９Ａ１１のエピトープマッピング
抗体とそれらの同種タンパク質抗原との相互作用は、抗体の特定アミノ酸（パラトープ）と標的抗原の特定アミノ酸（エピトープ）との結合を通して媒介される。エピトープは、免疫グロブリンによる特異的反応を生じさせる抗原決定基である。エピトープは、抗原の表面の一群のアミノ酸からなる。関心対象のタンパク質は、異なる抗体によって認識されるいくつかのエピトープを含有し得る。抗体によって認識されるエピトープは、線状エピトープ又は配座エピトープとして分類される。線状エピトープは、タンパク質中のアミノ酸の一続きの連続配列によって形成され、一方、配座エピトープは一次アミノ酸配列中の不連続な（例えば、遠く離れた）アミノ酸で構成されるが、三次元タンパク質フォールディング後に一緒になる。

エピトープマッピングは、抗体の標的抗原上で抗体によって認識されるアミノ酸配列（即ち、エピトープ）を特定するプロセスを示している。標的抗原上でモノクローナル抗体（ｍＡｂ）によって認識されるエピトープの特定は、重要な適用を有する。例えば、新しい治療薬、診断薬及びワクチンの開発に役立ち得る。エピトープマッピングは、さらに、最適化された治療用ｍＡｂの選択にも役立ち、それらの作用機構を解明するのを助けることができる。イヌＣＴＬＡ－４に関するエピトープ情報は、さらに、固有のエピトープを解明し、ワクチンの防御効果又は病原性効果を定義することもできる。エピトープの特定は、さらに、特定されたペプチドエピトープの担体タンパク質又は別の免疫刺激剤への化学的又は遺伝的結合に基づくサブユニットワクチンの開発につながる可能性がある。

エピトープマッピングは、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を使用して実施することができ、そして、エピトープの推測される性質（即ち、線状対配座）に応じて、エピトープ特定のためにいくつかの方法が用いられる。線状エピトープをマッピングすることはより直接的であり、比較的実施しやすい。この目的のために、線状エピトープマッピングのための商業サービスは、多くの場合、ペプチドスキャニングを用いる。この場合、標的タンパク質の短いペプチド配列のオーバーラップするセットを化学的に合成し、関心対象の抗体に結合するそれらの能力に関して試験する。この戦略は、迅速で高スループットであり、比較的安価に実施される。他方、不連続エピトープのマッピングは技術的により難易度が高く、そして、より専門的な技術、例えば、モノクローナル抗体をその標的タンパク質と一緒にＸ線共結晶構造解析すること、水素－重水素（Ｈ／Ｄ）交換、酵素消化と組み合わせた質量分析法、並びに、当業者に知られているいくつかの別の方法などを必要とする。

質量分析を使用するイヌＣＴＬＡ－４受容体アルファエピトープのマッピング：
イヌＣＴＬＡ－４上のイヌ化１２Ｂ３（１２Ｂ３Ｌ２Ｈ３によって例示されている）及び３９Ａ１１（３９Ａ１１Ｌ３Ｈ３によって例示されている）のエピトープを特定するために、ｃＣＴＬＡ－４／ｃ１２Ｂ３Ｌ２Ｈ３及びｃＣＴＬＡ－４／ｃ３９Ａ１１Ｌ２Ｈ３の複合体のそれぞれを重水素化架橋剤と一緒にインキュベートし、多酵素的切断に付した。架橋ペプチドを濃縮した後、サンプルを高分解能質量分析（ｎＬＣ－ＬＴＱ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＭＳ）で分析し、生成されたデータをＸＱｕｅｓｔ及びＳｔａｖｒｏｘソフトウェアを使用して解析した。

分析は、ｃ１２Ｂ３Ｌ２Ｈ３が配列番号１３８のアミノ酸配列を含むｃＣＴＬＡ－４の位置３５、３８、５１、５３、９０、９３、９８及び１０２のアミノ酸残基と相互作用することを示しており（図７Ａ）；ｃ３９Ａ１１Ｌ２Ｈ３が配列番号１３８のアミノ酸配列を含むｃＣＴＬＡ－４の位置３５、３８、４２、９３及び１０２のアミノ酸残基と相互作用することを示している（図７Ｂ）。イヌＣＴＬＡ－４タンパク質の２つの特定の領域が、図７Ａ及び図７Ｂに示されている：それぞれ、配列番号１３２及び配列番号１３３のアミノ酸配列（以下の表８を参照されたい）。特に、両方の抗体は、ｃＣＴＬＡ－４上のＭＹＰＰＰＹモチーフ（配列番号１３７）を含む配列番号１３４及び配列番号１３６に結合する。ＭＹＰＰＰＹモチーフは、ＣＤ８０及びＣＤ８６とのループ結合を形成し、これは、種を超えたＣＴＬＡ－４に関する保存モチーフである。ｃ１２Ｂ３は、さらに、配列番号１３５のアミノ酸配列を含むイヌＣＴＬＡ－４上の１つのさらなる領域にも結合するようにみえる。実施例４の結果と組み合わせると、エピトープマッピングの結果は、ｃ１２Ｂ３及びｃ３９Ａ１１の両方が、イヌＣＴＬＡ－４とそのリガンドＣＤ８０及びＣＤ８６との相互作用をブロックする能力を有する機能的抗体であることをさらに裏付ける。さらに、配列番号１３４及び配列番号１３６のエピトープに結合するイヌ化抗体も、本発明の一部である。

Claims (45)

1. イヌ細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）に結合し、そして、イヌＣＴＬＡ－４とイヌＣＤ８０の結合をブロックするか、イヌＣＴＬＡ－４とイヌＣＤ８６の結合をブロックするか、又は、イヌＣＴＬＡ－４とイヌＣＤ８０の結合及びイヌＣＴＬＡ－４とイヌＣＤ８６の結合の両方をブロックする、単離された哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
   ここで、該抗体は、６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）のセットを含み、そのうちの３つは、軽鎖ＣＤＲ〔ＣＤＲ軽１（ＣＤＲＬ１）、ＣＤＲ軽２（ＣＤＲＬ２）及びＣＤＲ軽３（ＣＤＲＬ３）〕であり；そして、そのうちの３つは、重鎖ＣＤＲ〔ＣＤＲ重１（ＣＤＲＨ１）、ＣＤＲ重２（ＣＤＲＨ２）及びＣＤＲ重３（ＣＤＲＨ３）〕であり；
   ここで、６つのＣＤＲのセットは、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）及び（ｖｉ）からなるセットの群から選択され；
   ここで、セット（ｉ）の場合、
   ＣＤＲＬ１は、配列番号９２、配列番号９２の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス４を含む配列番号９２の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   ＣＤＲＬ２は、配列番号９４、配列番号９４の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス１を含む配列番号９４の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   ＣＤＲＬ３は、配列番号９６、配列番号９６の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス１を含む配列番号９６の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   ＣＤＲＨ１は、配列番号８６、配列番号８６の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス１を含む配列番号８６の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   ＣＤＲＨ２は、配列番号８８、配列番号８８の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス２Ａを含む配列番号８８の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；及び、
   ＣＤＲＨ３は、配列番号９０、配列番号９０の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス７を含む配列番号９０の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   ここで、セット（ｉｉ）の場合、
   ＣＤＲＬ１は、配列番号１０４、配列番号１０４の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス１を含む配列番号１０４の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   ＣＤＲＬ２は、配列番号１０６、配列番号１０６の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス１を含む配列番号１０６の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   ＣＤＲＬ３は、配列番号１０８、配列番号１０８の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス１を含む配列番号１０８の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   ＣＤＲＨ１は、配列番号９８、配列番号９８の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス１を含む配列番号９８の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   ＣＤＲＨ２は、配列番号１００、配列番号１００の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス４を含む配列番号１００の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；及び、
   ＣＤＲＨ３は、配列番号１０２、配列番号１０２の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス９を含む配列番号１０２の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   ここで、セット（ｉｉｉ）の場合、
   ＣＤＲＬ１は、配列番号１１７、配列番号１１７の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス４を含む配列番号１１７の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   ＣＤＲＬ２は、配列番号９４、配列番号９４の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス１を含む配列番号９４の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   ＣＤＲＬ３は、配列番号９６、配列番号９６の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス１を含む配列番号９６の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   ＣＤＲＨ１は、配列番号８６、配列番号８６の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス１を含む配列番号８６の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   ＣＤＲＨ２は、配列番号８８、配列番号８８の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス２Ａを含む配列番号８８の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；及び、
   ＣＤＲＨ３は、配列番号１１３、配列番号１１３の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス７を含む配列番号１１３の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   ここで、セット（ｉｖ）の場合、
   ＣＤＲＬ１は、配列番号１１９、配列番号１１９の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス４を含む配列番号１１９の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   ＣＤＲＬ２は、配列番号１２２、配列番号１２２の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス１を含む配列番号１２２の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   ＣＤＲＬ３は、配列番号９６、配列番号９６の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス１を含む配列番号９６の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   ＣＤＲＨ１は、配列番号８６、配列番号８６の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス１を含む配列番号８６の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   ＣＤＲＨ２は、配列番号８８、配列番号８８の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス２Ａを含む配列番号８８の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；及び、
   ＣＤＲＨ３は、配列番号１１５、配列番号１１５の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス７を含む配列番号１１５の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   ここで、セット（ｖ）の場合、
   ＣＤＲＬ１は、配列番号１１８、配列番号１１８の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス４を含む配列番号１１８の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   ＣＤＲＬ２は、配列番号１２１、配列番号１２１の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス１を含む配列番号１２１の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   ＣＤＲＬ３は、配列番号９６、配列番号９６の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス１を含む配列番号９６の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   ＣＤＲＨ１は、配列番号１０９、配列番号１０９の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス１を含む配列番号１０９の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   ＣＤＲＨ２は、配列番号１１１、配列番号１１１の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス２Ａを含む配列番号１１１の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；及び、
   ＣＤＲＨ３は、配列番号１１４、配列番号１１４の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス７を含む配列番号１１４の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；並びに、
   ここで、セット（ｖｉ）の場合、
   ＣＤＲＬ１は、配列番号１２０、配列番号１２０の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス２を含む配列番号１２０の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   ＣＤＲＬ２は、配列番号１２３、配列番号１２３の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス１を含む配列番号１２３の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   ＣＤＲＬ３は、配列番号１２４、配列番号１２４の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス１を含む配列番号１２４の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   ＣＤＲＨ１は、配列番号１１０、配列番号１１０の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス１を含む配列番号１１０の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   ＣＤＲＨ２は、配列番号１１２、配列番号１１２の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス２Ａを含む配列番号１１２の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；及び、
   ＣＤＲＨ３は、配列番号１１６、配列番号１１６の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス１２を含む配列番号１１６の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   前記単離された哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメント。
2. （ａ） ＣＤＲＬ１は、配列番号９２、配列番号９２の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス４を含む配列番号９２の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   （ｂ） ＣＤＲＬ２は、配列番号９４、配列番号９４の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス１を含む配列番号９４の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   （ｃ） ＣＤＲＬ３は、配列番号９６、配列番号９６の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス１を含む配列番号９６の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   （ｄ） ＣＤＲＨ１は、配列番号８６、配列番号８６の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス１を含む配列番号８６の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   （ｅ） ＣＤＲＨ２は、配列番号８８、配列番号８８の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス２Ａを含む配列番号８８の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；及び、
   （ｆ） ＣＤＲＨ３は、配列番号９０、配列番号９０の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス７を含む配列番号９０の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   請求項１に記載の単離された哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメント。
3. （ａ） ＣＤＲＬ１は、配列番号１０４、配列番号１０４の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス１を含む配列番号１０４の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   （ｂ） ＣＤＲＬ２は、配列番号１０６、配列番号１０６の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス１を含む配列番号１０６の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   （ｃ） ＣＤＲＬ３は、配列番号１０８、配列番号１０８の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス１を含む配列番号１０８の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   （ｄ） ＣＤＲＨ１は、配列番号９８、配列番号９８の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス１を含む配列番号９８の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   （ｅ） ＣＤＲＨ２は、配列番号１００、配列番号１００の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス４を含む配列番号１００の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；及び、
   （ｆ） ＣＤＲＨ３は、配列番号１０２、配列番号１０２の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス９を含む配列番号１０２の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   請求項１に記載の単離された哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメント。
4. （ａ） ＣＤＲＬ１は、配列番号１１７、配列番号１１７の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス４を含む配列番号１１７の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   （ｂ） ＣＤＲＬ２は、配列番号９４、配列番号９４の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス１を含む配列番号９４の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   （ｃ） ＣＤＲＬ３は、配列番号９６、配列番号９６の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス１を含む配列番号９６の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   （ｄ） ＣＤＲＨ１は、配列番号８６、配列番号８６の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス１を含む配列番号８６の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   （ｅ） ＣＤＲＨ２は、配列番号８８、配列番号８８の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス２Ａを含む配列番号８８の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む：及び、
   （ｆ） ＣＤＲＨ３は、配列番号１１３、配列番号１１３の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス７を含む配列番号１１３の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   請求項１に記載の単離された哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメント。
5. （ａ） ＣＤＲＬ１は、配列番号１１９、配列番号１１９の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス４を含む配列番号１１９の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   （ｂ） ＣＤＲＬ２は、配列番号１２２、配列番号１２２の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス１を含む配列番号１２２の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   （ｃ） ＣＤＲＬ３は、配列番号９６、配列番号９６の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス１を含む配列番号９６の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   （ｄ） ＣＤＲＨ１は、配列番号８６、配列番号８６の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス１を含む配列番号８６の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   （ｅ） ＣＤＲＨ２は、配列番号８８、配列番号８８の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス２Ａを含む配列番号８８の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；及び、
   （ｆ） ＣＤＲＨ３は、配列番号１１５、配列番号１１５の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス７を含む配列番号１１５の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   請求項１に記載の単離された哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメント。
6. （ａ） ＣＤＲＬ１は、配列番号１１８、配列番号１１８の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス４を含む配列番号１１８の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   （ｂ） ＣＤＲＬ２は、配列番号１２１、配列番号１２１の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス１を含む配列番号１２１の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   （ｃ） ＣＤＲＬ３は、配列番号９６、配列番号９６の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス１を含む配列番号９６の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   （ｄ） ＣＤＲＨ１は、配列番号１０９、配列番号１０９の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス１を含む配列番号１０９の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   （ｅ） ＣＤＲＨ２は、配列番号１１１、配列番号１１１の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス２Ａを含む配列番号１１１の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；及び、
   （ｆ） ＣＤＲＨ３は、配列番号１１４、配列番号１１４の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス７を含む配列番号１１４の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   請求項１に記載の単離された哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメント。
7. （ａ） ＣＤＲＬ１は、配列番号１２０、配列番号１２０の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス２を含む配列番号１２０の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   （ｂ） ＣＤＲＬ２は、配列番号１２３、配列番号１２３の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス１を含む配列番号１２３の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   （ｃ） ＣＤＲＬ３は、配列番号１２４、配列番号１２４の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス１を含む配列番号１２４の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   （ｄ） ＣＤＲＨ１は、配列番号１１０、配列番号１１０の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス１を含む配列番号１１０の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   （ｅ） ＣＤＲＨ２は、配列番号１１２、配列番号１１２の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス２Ａを含む配列番号１１２の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；及び、
   （ｆ） ＣＤＲＨ３は、配列番号１１６、配列番号１１６の保存的に修飾された変異体及びカノニカル構造クラス１２を含む配列番号１１６の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
   請求項１に記載の単離された哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメント。
8. 前記哺乳動物抗体がマウス抗体である、請求項１、２、３、４、５、６又は７に記載の単離された哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメント。
9. イヌ化抗体又はそのイヌ化抗原結合フラグメントである、請求項１、２、３、４、５、６若しくは７に記載の単離された哺乳動物抗体若しくはその抗原結合フラグメント又は請求項８に記載のマウス抗体。
10. 配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０及び配列番号１３１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むヒンジ領域を含む、請求項９に記載のイヌ化抗体又はそのイヌ化抗原結合フラグメント。
11. イヌ化抗体又はそのイヌ化抗原結合フラグメントである、請求項２に記載の単離された哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメント。
12. 配列番号６２、配列番号６４及び配列番号６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号７４、配列番号７６及び配列番号７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む改変された重鎖、又は、配列番号５０、配列番号５２及び配列番号５４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖、又は、前記重鎖若しくは前記改変された重鎖と前記軽鎖との組み合わせを含む、請求項１１に記載のイヌ化抗体又はその抗原結合フラグメント。
13. 配列番号６１、配列番号６３及び配列番号６５からなる群から選択されるヌクレオチド酸配列によってコード化される重鎖、配列番号７３、配列番号７５及び配列番号７７からなる群から選択されるヌクレオチド酸配列によってコード化される改変された重鎖、及び、配列番号４９、配列番号５１及び配列番号５３からなる群から選択されるヌクレオチド酸配列によってコード化される軽鎖、又は、前記重鎖若しくは前記改変された重鎖と前記軽鎖との組み合わせを含む、請求項１２に記載のイヌ化抗体又はその抗原結合フラグメント。
14. 配列番号６６のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１２に記載のイヌ化抗体又はその抗原結合フラグメント。
15. 配列番号７８のアミノ酸配列を含む改変された重鎖を含む、請求項１２に記載のイヌ化抗体又はその抗原結合フラグメント。
16. 配列番号５２のアミノ酸配列を含む軽鎖をさらに含む、請求項１４又は１５に記載のイヌ化抗体又はその抗原結合フラグメント。
17. 配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖をさらに含む、請求項１４又は１５に記載のイヌ化抗体又はその抗原結合フラグメント。
18. イヌ化抗体又はそのイヌ化抗原結合フラグメントである、請求項３に記載の単離された哺乳動物抗体又はその抗原結合フラグメント。
19. 配列番号６８、配列番号７０及び配列番号７２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号８０、配列番号８２及び配列番号８４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む改変された重鎖、及び、配列番号５６、配列番号５８及び配列番号６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖、又は、前記重鎖若しくは前記改変された重鎖と前記軽鎖との組み合わせを含む、請求項１８に記載のイヌ化抗体又はその抗原結合フラグメント。
20. 配列番号６７、配列番号６９及び配列番号７１からなる群から選択されるヌクレオチド酸配列によってコード化される重鎖、配列番号７９、配列番号８１及び配列番号８３からなる群から選択されるヌクレオチド酸配列によってコード化される改変された重鎖、及び、配列番号５５、配列番号５７及び配列番号５９からなる群から選択されるヌクレオチド酸配列によってコード化される軽鎖、又は、前記重鎖若しくは前記改変された重鎖と前記軽鎖との組み合わせを含む、請求項１９に記載のイヌ化抗体又はその抗原結合フラグメント。
21. 配列番号７２のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１９に記載のイヌ化抗体又はその抗原結合フラグメント。
22. 配列番号８４のアミノ酸配列を含む改変された重鎖を含む、請求項１９に記載のイヌ化抗体又はその抗原結合フラグメント。
23. 配列番号５８のアミノ酸配列を含む軽鎖をさらに含む、請求項２１又は２２に記載のイヌ化抗体又はその抗原結合フラグメント。
24. 配列番号６０のアミノ酸配列を含む軽鎖をさらに含む、請求項２１又は２２に記載のイヌ化抗体又はその抗原結合フラグメント。
25. 前記イヌ化抗体又はその抗原結合フラグメントが、以下の特性：
    （ｉ） １×１０^－５Ｍ～１×１０^－１２Ｍの解離定数（Ｋｄ）でイヌＣＴＬＡ－４に結合する；
    （ｉｉ） １×１０^２Ｍ^－１ｓ^－１～１×１０^７Ｍ^－１ｓ^－１のオン速度（ｋ_ｏｎ）でイヌＣＴＬＡ－４に結合する；
    （ｉｉｉ） １×１０^－３ｓ^－１～１×１０^－８ｓ^－１のオフ速度（ｋ_ｏｆｆ）でイヌＣＴＬＡ－４に結合する；
    （ｉｖ） イヌＣＴＬＡ－４のイヌＣＤ８０への結合をブロックする；及び、
    （ｖ） イヌＣＴＬＡ－４のイヌＣＤ８６への結合をブロックする；
    のうちの１つ、２つ、３つ、４つ又は５つ全てを示す、請求項９～２４のいずれか１項に記載のイヌ化抗体又はその抗原結合フラグメント。
26. イヌＣＴＬＡ－４との結合について請求項９～２５のいずれか１項と交差競合するイヌ化モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントであって、ここで、イヌ化モノクローナル抗体及びその抗原結合フラグメントは、イヌＣＴＬＡ－４に結合し、そして、イヌＣＴＬＡ－４のイヌＣＤ８０及び／又はイヌＣＤ８６への結合をブロックする、前記イヌ化モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。
27. 前記イヌ化抗体が、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６及び配列番号１３７からなる群から選択されるいずれか１以上のアミノ酸配列に結合する、請求項９～２６のいずれか１項に記載のイヌ化抗体。
28. 配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６からなる群から選択されるいずれか１以上のアミノ酸配列に結合する、請求項２７に記載のイヌ化抗体。
29. 配列番号１３４及び配列番号１３６のアミノ酸配列に結合する、請求項２８記載のイヌ化抗体。
30. 配列番号１３５にさらに結合する、請求項２９に記載のイヌ化抗体。
31. 請求項９～３０のいずれか１項に記載のイヌ化抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖をコード化する、単離された核酸。
32. 請求項９～３０のいずれか１項に記載のイヌ化抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖をコード化する、単離された核酸。
33. 請求項３１及び／又は請求項３２に記載の単離された核酸を含む、発現ベクター。
34. 請求項３３に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
35. 請求項９～３０のいずれか１項に記載のイヌ化抗体及び薬学的に許容される担体又は希釈剤を含む、医薬組成物。
36. 免疫細胞の活性を増大させる方法であって、それを必要とする対象に治療有効量の請求項３５に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
37. 前記方法が、
    （ｉ） 癌を治療するために；
    （ｉｉ） 感染症又は感染性疾患を治療するために；
    （ｉｉｉ） ワクチンアジュバントとして；又は、
    （ｉｖ） それらの任意の組み合わせのために；
    使用される、請求項３６に記載の方法。
38. 配列番号１３２及び配列番号１３３からなる群から選択されるアミノ酸配列と９０％以上同一であり、して、請求項９～２６のイヌ化抗体のいずれか１つに結合する５～２５のアミノ酸残基を含む、単離されたペプチド。
39. 前記アミノ酸配列が、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６からなる群から選択されるアミノ酸配列と９０％以上同一である、請求項３８に記載の単離されたペプチド。
40. 前記アミノ酸配列が、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６からなる群から選択されるアミノ酸配列と同一である、請求項３９に記載の単離されたペプチド。
41. 請求項４０に記載のペプチドを含む、融合タンパク質。
42. 非イヌ哺乳動物ＩｇＧのＦｃ領域をさらに含む、請求項４１に記載の融合タンパク質。
43. 請求項３８、３９若しくは４０に記載の単離されたペプチド又は請求項４１若しくは請求項４２に記載の融合タンパク質又はそれらの任意の組み合わせをコード化する、単離された核酸。
44. 請求項４３に記載の単離された核酸を含む、発現ベクター。
45. 請求項４４に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。

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