JP2007528721A

JP2007528721A - エンドセリアーゼ−２リガンド

Info

Publication number: JP2007528721A
Application number: JP2006523367A
Authority: JP
Inventors: エドウィンエル．マディソン，; アンドリューニクソン，
Original assignee: ダイアックスコーポレイション
Priority date: 2003-08-14
Filing date: 2004-08-12
Publication date: 2007-10-18
Also published as: WO2005019270A3; US7273610B2; CA2535859A1; EP1660537A2; WO2005019270A2; US20050180977A1; US20080075723A1; AU2004266246A1; US20080019962A1

Abstract

本開示は、とりわけ、エンドセリアーゼ−２（ＥＴ２）に結合するタンパク質、例えば、高い親和性および選択性でＥＴ２を阻害する免疫グロブリンを提供する。ＥＴ２結合タンパク質は、血管新生関連障害を含む種々の障害を治療するために使用され得る。１つの態様において、本発明は、ＥＴ２（本明細書ではＥＴ２リガンドまたはＥＴ２−結合リガンドともいう）に結合するタンパク質リガンドを特徴とする。典型的には、このリガンドは、天然には存在していない。１つの実施形態において、このタンパク質リガンドは、重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列を含む。例えば、このリガンドは、抗体または全長抗体の抗原結合フラグメント（本明細書では抗ＥＴ２抗体ともいう）である。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２００３年８月１４日に出願された米国出願シリアル番号６０／４９５，００５、および２００３年１１月１４日に出願された同６０／５２０，１６４に対する優先権を主張し、これら双方の内容は、その全てが参照として本明細書に組み込まれる。

（背景）
血管新生は、既存の血管から新規な分枝を出芽することによって新規な血管を産生する生物学的なプロセスである。血管新生は正常な発生および増殖のために必須であるが、これは厳密に調節された状況下以外では成人期においては起こることはまれである（例えば、創傷治癒；例えば、Ｍｏｓｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４８：１４０８−１４１０，１９９０）。血管新生はまた、癌などの多数の疾患において起こり、ここでは、新規な血管が、原発性腫瘍と転移性腫瘍の両方の成長および増殖を支持するために形成される。

血管は、基底膜によって取り囲まれた内皮細胞を含む。血管新生の最初の段階の１つは、そこを通って内皮細胞が新規な血管の出芽を形成する膜における切れ目を形成するために、内皮細胞によって産生されるタンパク質分解酵素による基底膜の分解である。この段階は以下のようにして開示され得る。第１に、プラスミノーゲン活性化因子（ＰＡ）−プラスミン系の成分が、血管新生の部位において高濃度のプラスミンおよび活性マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）を生じるプロテアーゼカスケードを活性化する。この増加したタンパク質分解活性は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）および血管基底層の侵襲をもたらす。ＥＣＭ分解生成物の放出は、内皮細胞の走化性をもたらす。

多数の病理学的条件が望ましくない血管新生と関連している。例えば、腫瘍は、最小サイズを超えて増殖し転移するために血管新生を誘導し得る（ＨａｎａｈａｎおよびＦｏｌｋｍａｎＣｅｌｌ１９９６，８６：３５３−６４）。腫瘍発生は、血管新生因子、最も顕著には血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の放出の増加と関連する（ＢｒｏｗｎＬＦら、Ｅｘｓ１９９７，７９：２３３−６９）。望ましくない血管新生によって特徴付けられる他の障害には、例えば、組織炎症、関節炎、糖尿病性網膜症、および網膜の新血管新生による黄斑変性が含まれる（例えば、Ｆｏｌｋｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３５：４４２−４４７，１９８７を参照のこと）。

エンドセリアーゼは、細胞、特に内皮細胞上で発現される膜プロテアーゼのクラスである。

（要旨）
１つの態様において、本発明は、エンドセリアーゼ−２（ＥＴ２）（本明細書ではＥＴ２リガンドまたはＥＴ２−結合リガンドともいう）に結合するタンパク質リガンドを特徴とする。典型的には、このリガンドは、天然には存在していない。１つの実施形態において、このタンパク質リガンドは、重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列を含む。例えば、このリガンドは、抗体または全長抗体の抗原結合フラグメント（本明細書では抗ＥＴ２抗体ともいう）である。

１つの実施形態において、ＥＴ２リガンドは、高い親和性および特異性でヒトＥＴ２に結合し、従って、インビボおよびインビトロにおいて診断剤、予防剤、または治療剤として使用され得る。例えば、リガンドは、ＥＴ２に特異的に結合する。本明細書において使用される場合、「特異的結合」とは、（１）１×１０^−７Ｍよりも良好な（すなわち、数字的にはこれよりも小さな）親和性（Ｋ_ｄ）でＥＴ２、例えば、ヒトＥＴ２に結合すること、および（２）ＥＴ２以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）に結合するその親和性よちも少なくとも２倍、１０倍、５０倍、１００倍またはより良好（より小さなＫ_ｄ）である親和性でＥＴ２、例えば、ヒトＥＴ２に優先的に結合することをいう。

１つの実施形態において、このリガンドは、ＥＴ２の活性、例えば、ＥＴ２のタンパク質分解活性を調節する。１つの実施形態において、このリガンドはＥＴ２を阻害する。例えば、このリガンドは、５ｎＭ、５００ｐＭ、２００ｐＭ、１５０ｐＭ、１００ｐＭ、９２ｐＭ、または７５ｐＭよりも良好なＫ_ｉ（すなわち、数字的にはそれらよりも小さい）、例えば、５０ｎＭとｌｐＭとの間、または２００ｐＭと５ｐＭとの間のＫｉを有し得る。１つの実施形態において、このリガンドは、例えば、別のプロテアーゼ（例えば、プロテアーゼドメインがＥＴ２プロテアーゼドメインに３０〜９０％の同一であるか、または３０〜６０％の同一であるプロテアーゼ）と比較して、ＥＴ２を特異的に阻害する。例えば、このリガンドは、他のプロテアーゼ、例えば、トリプシノーゲン−ＩＶ、膜型セリンプロテアーゼ−１、−６、−７、またはエンドセリアーゼ−１（ＥＴ１）などの非ＥＴ２プロテアーゼを阻害しない。例えば、このリガンドは、別のプロテアーゼ（例えば、このような他のプロテアーゼ）を、ＥＴ２についてのその阻害定数よりも少なくとも２倍、５倍、１０倍、または１００倍劣る（例えば、数字的にはより大きな）阻害定数で阻害する（すなわち、それらがＥＴ２を阻害するのと同様に他のプロテアーゼを阻害しない）。

１つの実施形態において、リガンドは血管新生を阻害し、例えば、インビトロおよびインビボにおいて１つ以上のＥＣＭ成分または血管基底膜成分のタンパク質分解を阻害する。１つの実施形態において、このリガンドは、以下のアッセイ：角膜新血管新生アッセイ；ニワトリ胚絨毛尿膜モデルアッセイ；腫瘍を注入したＳＣＩＤマウスを使用するアッセイ（例えば、Ｊａｎｋｕｎら、Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．，５７：５５９−５６３（１９９７）において記載されたような、ＤＵ１４５またはＬｎＣａＰの注入から生じる腫瘍）；または血管新生を刺激するためにｂＦＧＦを注入されるマウスにおけるアッセイ（例えば、Ｍｉｎら、Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．，５６：２４２８−２４３３（１９９６）によって記載されるようなもの）の１つ以上において統計学的に有意な効果を有する（例えば、血管新生プロセス）。これらのアッセイにおける例示的な効果には、ネガティブコントロール（例えば、抗体なし）と比較して少なくとも１．５倍、２倍、５倍、１０倍、または２０倍の改善が含まれる。

１つの実施形態において、このリガンドはＥＴ２に作動し（例えば、ＥＴ２の活性、例えば、タンパク質分解活性を活性化または増加する）、例えば、少なくとも０．５倍、１．５倍、２倍、５倍、１０倍、または２０倍増加する。

１つの実施形態において、このリガンドは、ＥＴ２の活性部位、例えば、ＥＴ２の活性部位間隙と接触するか、あるいはＥＴ２の触媒３成分中の残基の３０オングストローム、２０オングストローム、もしくは１０オングストローム以内であるアミノ酸残基、例えば、配列番号９４のヒスチジン３６１もしくは配列番号９４のセリン５０６、または配列ＬＴＡＡＨＣ（配列番号９４のアミノ酸３５７−３６２）もしくは配列ＤＳＣＱＧＤＳＧＧＰＬＶ（配列番号９４のアミノ酸５００−５１１）と接触する。

このタンパク質リガンドは、典型的には、ＥＴ２、好ましくはヒトＥＴ２と、高い親和性および特異性で相互作用する（例えば、結合する）。例えば、このタンパク質リガンドは、１０^−７Ｍよりも良好な（すなわち、数字的にはこれよりも小さな）、好ましくは、１０^−８Ｍ、１０^−９Ｍ、または１０^−１０Ｍよりも良好な親和性定数（Ｋ_ｄ）でヒトＥＴ２に結合する。好ましくは、このタンパク質リガンドは、ＥＴ２の細胞外ドメイン、最も好ましくは、ヒトＥＴ２の細胞外ドメイン（例えば、ＥＴ２−Ｓのアミノ酸１６１〜５６２またはＥＴ２−Ｌのアミノ酸１６１〜６８８）と相互作用し、例えば、これに結合する。１つの実施形態において、ＥＴ２リガンドは、本明細書に記載される抗体のエピトープのすべてまたは一部、例えば、Ａ１０、Ｇ３、Ａ６、Ａ７、Ｃ８、Ｈ９、Ｇ１０−Ｒ２、Ｆ３−Ｒ２、Ｃ６−Ｒ２、Ａ４−Ｒ３、Ｃ１−Ｒ３、Ａ２、Ｂ５、Ｄ２、Ｄ５、Ｆ８、Ｈ１０、またはＣ９に結合する。ＥＴ２リガンドは、ヒトＥＴ２への、例えば、本明細書に記載される抗体、例えば、Ａ１０、Ｇ３、Ａ６、Ａ７、Ｃ８、Ｈ９、Ｇ１０−Ｒ２、Ｆ３−Ｒ２、Ｃ６−Ｒ２、Ａ４−Ｒ３、Ｃ１−Ｒ３、Ａ２、Ｂ５、Ｄ２、Ｄ５、Ｆ８、Ｈ１０、またはＣ９の結合を競合的に阻害し得る。ＥＴ２リガンドは、エピトープ、例えば、コンホメーション的エピトープまたは線状エピトープに結合してもよく、このエピトープは、結合したときに、Ａ１０、Ｇ３、Ａ６、Ａ７、Ｃ８、Ｈ９、Ｇ１０−Ｒ２、Ｆ３−Ｒ２、Ｃ６−Ｒ２、Ａ４−Ｒ３、Ｃ１−Ｒ３、Ａ２、Ｂ５、Ｄ２、Ｄ５、Ｆ８、Ｈ１０、またはＣ９の結合を妨害する。このエピトープは、空間的に密接した近接にあり得（例えば、３、５、または１０オングストローム以内）、または機能的に関連し得（例えば、線状配列中の重複もしくは隣接するエピトープ）、または抗体Ａ１０、Ｇ３、Ａ６、Ａ７、Ｃ８、Ｈ９、Ｇ１０−Ｒ２、Ｆ３−Ｒ２、Ｃ６−Ｒ２、Ａ４−Ｒ３、Ｃ１−Ｒ３、Ａ２、Ｂ５、Ｄ２、Ｄ５、Ｆ８、Ｈ１０、もしくはＣ９によって認識されるものとコンホメーション的に類似し得る。１つの実施形態において、ＥＴ２−リガンドは、ＥＴ２のセリンプロテアーゼドメインの領域内に全体的または部分的に位置するエピトープ、例えば、ＥＴ２−Ｓについてはアミノ酸３２１〜５６２およびＥＴ２−Ｌについてはアミノ酸３２１−６８８に結合する。

従って、本発明は、抗ＥＴ２フラグメント、抗体フラグメント、およびその薬学的組成物、ならびにこのような抗体およびフラグメントを作製するための核酸、組換え発現ベクター、および宿主細胞を提供する。例示的な薬学的組成物は、このリガンドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む。インビトロまたはインビボのいずれかで、ＥＴ２発現細胞、例えば、ＥＴ２発現細胞を死滅するため、またはこの増殖を阻害するために、ＥＴ２を検出するための本発明の抗体を使用する方法もまた、本発明によって含まれる。

ヒトＥＴ２は少なくとも内皮細胞上で発現される。１つの実施形態において、ＥＴ２リガンドはこれらの細胞の細胞表面上に、および特に生きている細胞、例えば、生きている内皮細胞の細胞表面に結合する。ある場合において、タンパク質リガンドは、例えば、抗体に結合体化された薬剤、例えば、細胞毒性剤または標識化剤の細胞内送達を可能にするために、細胞内に内部移行され得る。ある態様において、本発明のタンパク質リガンドは、ＥＴ２を発現する、生きている正常な良性の過形成性の細胞、および癌性細胞を標的とするために使用され得る。

１つの実施形態において、ＥＴリガンドはＥＴに結合しそのコンホメーションおよび／または触媒活性を変化させ、例えば、これは触媒活性または基質との相互作用を増強する。

本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメインまたは免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むタンパク質をいう。例えば、抗体は、重（Ｈ）鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略される）および軽（Ｌ）鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略される）を含み得る。別の例において、抗体は、２つの重（Ｈ）鎖可変領域および２つの軽（Ｌ）鎖可変領域を含む。用語「抗体」は、抗体の抗原結合フラグメント（例えば、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、およびｄＡｂフラグメント）、ならびに完全な抗体を含む。

ＶＨ領域およびＶＬ領域は、「「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれるより保存されている領域が散在している、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）」と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分され得る。フレームワーク領域およびＣＤＲの程度は以前に規定されている（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、（１９９１）ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，Ｕ．Ｓ．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＨｅａｌｔｈａｎｄＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎＮｏ．９１−３２４２、およびＣｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ら、（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７を参照のこと）。Ｋａｂａｔの定義が本明細書で使用されている。各ＶＨおよびＶＬは、典型的には、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成され、以下の順番でアミノ末端からカルボキシ末端に配列される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。

「免疫グロブリンドメイン」とは、免疫グロブリン分子の可変ドメインまたは定常ドメインからのドメインをいう。免疫グロブリンドメインは、典型的には、約７個のβ−鎖から形成されるβ−シート、および保存性ジスルフィド結合を含む（例えば、Ａ．Ｆ．ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＡ．Ｎ．Ｂａｒｃｌａｙ１９８８Ａｎｎ．ＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ．６：３８１−４０５を参照のこと）。免疫グロブリン可変ドメインの超可変ループの標準構造は、Ｃｈｏｔｈｉａら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７９９−８１７；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８）およびＴｏｍｌｉｎｓｏｎら（１９９５）ＥＭＢＯＪ．１４（１８）：４６２８−３８において記載されるように、その配列から推測され得る。

本明細書で使用される場合、「免疫グロブリン可変ドメイン配列」とは、免疫グロブリン可変領域の構造を形成し得るアミノ酸配列をいう。例えば、この配列は、天然に存在する可変ドメインのアミノ酸配列のすべてまたは一部を含んでもよい。例えば、この配列は、１つ、２つ、もしくはそれ以上のＮ末端またはＣ末端のアミノ酸、内部のアミノ酸を除外してもよく、１つ以上の挿入または付加的な末端アミノ酸を含んでもよく、または他の変化を含んでもよい。１つの実施形態において、免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むポリペプチドは、別の免疫グロブリンケラチン生成細胞編ドメイン配列と結合して、標的結合構造（すなわち「抗原結合部位」）、例えば、ＥＴ２と相互作用する、例えば、ＥＴ２に結合し、またはこれを阻害する構造を形成し得る。

抗体のＶＨ鎖またはＶＬ鎖は、重鎖または軽鎖の定常領域のすべてまたは一部をさらに含み、それによって、それぞれ重鎖または軽鎖の免疫グロブリン鎖を形成し得る。１つの実施形態において、抗体は、２つの重鎖免疫グロブリン鎖および２つの軽鎖免疫グロブリン鎖のテトラマーであり、ここで、重鎖および軽鎖の免疫グロブリン鎖は、例えば、ジスルフィド結合によって内部連結される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。軽鎖定常領域はＣＬドメインを含む。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、典型的には、宿主の組織または因子（免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的な補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む）への抗体の結合を媒介する。用語「抗体」には、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭの型のインタクトな免疫グロブリン（ならびにそれらのサブタイプ）が含まれる。免疫グロブリンの軽鎖はκ型またはλ型であってもよい。１つの実施形態において、この抗体はグリコシル化される。抗体は、抗体依存性細胞毒性および／または補体媒介細胞毒性について機能的であり得る。

１つの実施形態において、抗体のＨＣまたはＬＣは、ヒト生殖系列配列（例えば、フレームワーク領域）によってコードされ、および／またはＣＤＲにあるアミノ酸配列に対応する（例えば、同一であるか、または閾値の程度の類似性を有する）。例えば、抗体は、ヒトＤＰ４７抗体からの配列を含み得る。１つの実施形態において、抗体についての１つ以上のコドンが、生殖系列核酸配列と比較して変化されるが、同じアミノ酸配列をコードするように選択される。コドンは、例えば、特定の系における発現を最適化するように、制限酵素部位を作製するように、サイレントフィンガープリントを作製するように、などのように選択され得る。ＣＤＲ配列もまた、実質的にヒトであり得、完全にヒトのＣＤＲ（例えば、ヒト生殖系列配列中または成熟ヒト抗体中のＣＤＲ）に対して、少なくとも７０％、８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％同一である。従って、合成核酸配列が、完全なヒトＣＤＲまたは実質的なヒトＣＤＲをコードするために使用され得る。

１つの実施形態において、抗体ＨＣのＣＤＲ２は、ＤＰ４７のＣＤＲ２において見出されるアミノ酸と同一である少なくとも１１、１２、１３、１４、または１５のアミノ酸の位置を含む。

本明細書において使用される場合、用語「免疫グロブリン」とは、免疫グロブリン遺伝子（例えば、天然または合成）によって実質的にコードされる１つ以上のポリペプチドまたはその領域からなるタンパク質をいう。例示的な天然のヒト免疫グロブリン遺伝子には、定常領域遺伝子κ、λ、α（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、γ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、δ、ε、およびμ、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。全長免疫グロブリン「軽鎖」（約２５Ｋｄまたは２１４アミノ酸）は、ＮＨ_２末端における可変領域遺伝子（約１１０アミノ酸）およびＣＯＯＨ末端におけるκまたはλ定常領域遺伝子によってコードされ得る。全長免疫グロブリン「重鎖」（約５０Ｋｄまたは４４６アミノ酸）は、可変領域遺伝子（約１１６アミノ酸）および他の上述の定常領域遺伝子、例えば、γ（約３３０アミノ酸をコードする）の１つによって同様にコードされ得る。

用語抗体の「抗原結合フラグメント」（または単に「抗体部分」もしくは「フラグメント」）は、本明細書において使用される場合、ＥＴ２（例えば、ヒトＥＴ２）に特異的に結合する能力を保持する全長抗体の１つ以上のフラグメントをいう。用語抗体の「抗原結合フラグメント」の範囲に含まれる結合フラグメントの例には、（ｉ）Ｆａｂフラグメント（ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、およびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント）；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント（ヒンジ領域においてジスルフィド結合によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント）；（ｉｉｉ）ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４−５４６）ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によってコードされているが、これらは組換え方法を使用して、合成リンカーによって結合され得、これらのリンカーは、これらのドメインが単一のタンパク質として作製されることを可能にし、このタンパク質では、ＶＬ領域およびＶＨ領域が対合して一価分子を形成する（Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９−５８８３を参照のこと）。このような単鎖抗体のモノマーおよびダイマーもまた、用語抗体の「抗原結合フラグメント」の範囲内に含まれることが意図される。これらの抗体フラグメントは当業者に公知である従来的な技術を使用して得られ、これらのフラグメントは、インタクトな抗体と同じ様式で活性についてスクリーニングされる。

抗体は、好ましくは単一特異的、例えば、モノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメントである。用語「単一特異的抗体」とは、特定の標的（例えば、エピトープ）についての単一の結合特異性および親和性を示す抗体をいう。この用語は、「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」を含み、これらは、本明細書において使用される場合、抗体の調製物または単一の分子組成物のそのフラグメントをいう。

抗ＥＴ２抗体は、全長（例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＧＡ１、ＩｇＡ２）、ＩｇＤ、およびＩｇＥ、しかし好ましくはＩｇＧ）であり得るか、または抗原結合フラグメントのみ（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、またはｓｃＦｖフラグメント）を含み得る。抗体またはその抗原結合フラグメントは、２つの重鎖免疫グロブリンおよび２つの軽鎖免疫グロブリンを含み得るか、または単鎖抗体であり得る。抗体は、任意に、定常領域遺伝子κ、λ、α、γ、δ、ε、またはμから選択される定常領域を含み得る。好ましい抗ＥＴ２抗体は、実質的にヒトからである重鎖または軽鎖の定常領域、例えば、ヒトＩｇＧ１定常領域またはその一部を含む。本明細書において使用される場合、「アイソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体のクラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ１）をいう。

１つの実施形態において、抗体（またはそのフラグメント）は、組換えまたは修飾された抗ＥＴ２抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、脱免疫抗体、またはインビトロ生成抗体である。用語「組換え」または「修飾された」ヒト抗体は、本明細書において使用される場合、組換え手段によって調製、発現、作製、または単離されるすべての抗体、例えば、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体、コンビナトリアル抗体ライブラリー、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体、または他のＤＮＡ配列へのヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングを含む任意の他の手段によって調製、発現、作製、もしくは単離された抗体などを含むことが意図される。このような組換え抗体は、ヒト化抗体、ＣＤＲ移植抗体、キメラ抗体、脱免疫化抗体、インビトロ生成抗体を含み、そして任意に、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する退場領域を含んでもよい。１つの実施形態において、抗体は、ヒトにおいて抗グロブリン応答を誘発しない。

１つの実施形態において、抗ＥＴ２抗体はヒト抗体である。

ＥＴ２への本明細書において開示される抗ＥＴ２抗体の結合の重複するエピトープを結合する、またはＥＴ２への本明細書において開示される抗ＥＴ２抗体の結合を競合的に阻害する抗体またはその抗原結合フラグメント、例えば、単一特異的抗体Ａ１０、Ｇ３、Ａ６、Ａ７、Ｃ８、Ｈ９、Ｇ１０−Ｒ２、Ｆ３−Ｒ２、Ｃ６−Ｒ２、Ａ４−Ｒ３、Ｃ１−Ｒ３、Ａ２、Ｂ５、Ｄ２、Ｄ５、Ｆ８、Ｈ１０、もしくはＣ９のＥＴ２への結合の重複するエピトープを結合する、または単一特異的抗体Ａ１０、Ｇ３、Ａ６、Ａ７、Ｃ８、Ｈ９、Ｇ１０−Ｒ２、Ｆ３−Ｒ２、Ｃ６−Ｒ２、Ａ４−Ｒ３、Ｃ１−Ｒ３、Ａ２、Ｂ５、Ｄ２、Ｄ５、Ｆ８、Ｈ１０、もしくはＣ９のＥＴ２への結合を競合的に阻害する抗体もまた、本発明の範囲内に含まれる。抗ＥＴ２抗体の任意の組み合わせが本発明の範囲内にあり、これは例えば、ＥＴ２の異なる領域に結合する２つ以上の抗体、例えば、ＥＴ２のセリンプロテアーゼドメイン上の２つの異なるエピトープに結合する抗体、例えば、二特異性抗体である。

１つの実施形態において、抗ＥＴ２抗体またはその抗原結合フラグメントには、少なくとも１つの軽鎖または重鎖の可変ドメイン配列（例えば、少なくとも１つの軽鎖免疫グロブリンおよび少なくとも１つの重鎖免疫グロブリン）が含まれる。好ましくは、各免疫グロブリンは、ＥＴ２と相互作用する抗体、例えば、本明細書に記載される抗体、例えば、Ａ１０、Ｇ３、Ａ６、Ａ７、Ｃ８、Ｈ９、Ｇ１０−Ｒ２、Ｆ３−Ｒ２、Ｃ６−Ｒ２、Ａ４−Ｒ３、Ｃ１−Ｒ３、Ａ２、Ｂ５、Ｄ２、Ｄ５、Ｆ８、Ｈ１０、またはＣ９の軽鎖または重鎖可変ドメイン配列からのＣＤＲと実質的に同一である少なくとも１つ、２つ、および好ましくは３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する軽鎖または重鎖可変ドメイン配列を含む。例示的な軽鎖および重鎖の可変領域のアミノ酸配列および核酸配列を表１に示す。ある実施形態において、表１および表２の配列番号１０および配列番号８９において「ｑ」として列挙される残基はリジンである。

（表１：例示的配列）

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１つの実施形態において、抗体（またはそのフラグメント）は、本明細書に開示される抗体、例えば、Ａ１０、Ｇ３、Ａ６、Ａ７、Ｃ８、Ｈ９、Ｇ１０−Ｒ２、Ｆ３−Ｒ２、Ｃ６−Ｒ２、Ａ４−Ｒ３、Ｃ１−Ｒ３、Ａ２、Ｂ５、Ｄ２、Ｄ５、Ｆ８、Ｈ１０、またはＣ９の軽鎖または重鎖可変ドメイン配列からの少なくとも１つ、２つ、および好ましくは３つのＣＤＲ、あるいはそれに対して実質的に同一、例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはそれ以上同一である配列を含む。他の実施形態において、抗体（またはそのフラグメント）は、本明細書に開示される抗体、例えば、Ａ１０、Ｇ３、Ａ６、Ａ７、Ｃ８、Ｈ９、Ｇ１０−Ｒ２、Ｆ３−Ｒ２、Ｃ６−Ｒ２、Ａ４−Ｒ３、Ｃ１−Ｒ３、Ａ２、Ｂ５、Ｄ２、Ｄ５、Ｆ８、Ｈ１０、またはＣ９の軽鎖または重鎖可変ドメイン配列からの少なくとも１つ、２つ、および好ましくは３つのＣＤＲを有し得る。１つの好ましい実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト抗ＥＴ２抗体、例えば、Ａ１０、Ｇ３、Ａ６、Ａ７、Ｃ８、Ｈ９、Ｇ１０−Ｒ２、Ｆ３−Ｒ２、Ｃ６−Ｒ２、Ａ４−Ｒ３、Ｃ１−Ｒ３、Ａ２、Ｂ５、Ｄ２、Ｄ５、Ｆ８、Ｈ１０、またはＣ９からの６つすべてのＣＤＲを含む。

いくつかの例示的な抗体のＣＤＲ配列およびフレームワーク配列を表２および表３に示す。

（表２：ＨＣＣＤＲ）

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（表３：ＬＣＣＤＲ）

。

別の好ましい実施形態において、この抗体（またはそのフラグメント）は、開示された抗体の対応するＣＤＲと比較して、１０アミノ酸毎に３個、２．５個、２個、１．５個、または１個、０．５個を超えない置換、挿入、または欠失が異なる（例えば、違いの数はＣＤＲの長さに比例する）アミノ酸配列を有する、本明細書に開示される抗体、例えば、Ａ１０、Ｇ３、Ａ６、Ａ７、Ｃ８、Ｈ９、Ｇ１０−Ｒ２、Ｆ３−Ｒ２、Ｃ６−Ｒ２、Ａ４−Ｒ３、Ｃ１−Ｒ３、Ａ２、Ｂ５、Ｄ２、Ｄ５、Ｆ８、Ｈ１０、またはＣ９の軽鎖および／または重鎖の可変領域からの少なくとも１つ、２つ、および好ましくは３つのＣＤＲを含む。さらに、抗体またはその抗原結合フラグメントは６つのＣＤＲを含み得、これらの各々は、ヒト抗ＥＴ２抗体の対応するＣＤＲ、例えば、Ａ１０、Ｇ３、Ａ６、Ａ７、Ｃ８、Ｈ９、Ｇ１０−Ｒ２、Ｆ３−Ｒ２、Ｃ６−Ｒ２、Ａ４−Ｒ３、Ｃ１−Ｒ３、Ａ２、Ｂ５、Ｄ２、Ｄ５、Ｆ８、Ｈ１０、またはＣ９と比較して、１０アミノ酸毎に３個、２．５個、２個、１．５個、または１個、０．５個を超えない置換、挿入、または欠失が異なる。

１つの実施形態において、重鎖可変領域は以下のアミノ酸配列：Ｙ−Ｘ−Ｍ−Ｘ−Ｗ（配列番号９５）またはＲ−Ｙ−Ｘ−Ｍ−Ｘ（配列番号９６）またはＲ−Ｙ−（ＳＲＫ）−Ｍ−（ＳＹＷＨ）（配列番号９７）を含むＣＤＲを含み、ここで、Ｘは任意のアミノ酸である。

１つの実施形態において、重鎖可変領域は以下の配列：Ｉ／Ｓ−Ｉ／Ｓ−Ｓ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ^＊−Ｙ−Ａ−Ｄ−Ｓ（配列番号９８）（ここでＸは任意のアミノ酸であり、そしてＸ^＊は存在しなくてもよい）、または（ＧＳＶＹＲ）−Ｉ−（ＧＳＶＹＲ）−（ＳＰ）−Ｓ−（ＧＲ）−Ｇ−（ＳＴＩＭＹＦＫＤ）−Ｔ−（ＡＧＴＦＲＫＮＱ）−Ｙ−Ａ−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｇ（配列番号１１２）または（ＧＳＹ）−Ｉ−（ＳＶＲ）−（ＳＰ）−Ｓ−Ｇ−Ｇ−（ＳＩＹＤ）−Ｔ−（ＧＲＫＮ）−Ｙ−Ａ−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｇ（配列番号１１３）を含むＣＤＲ２を含む。

１つの実施形態において、重鎖可変領域は、（ＧＮ）−（ＡＧ）−（ＲＰ）−Ｒ−（ＡＧ）−（ＦＮ）−（ＫＰ）−（ＳＹ）−（ＭＹ）−（ＦＤ）−（ＶＤ）−Ｙ（配列番号９９）または（ＧＲＮ）−（ＡＧ）−（ＲＰ）−（ＧＲ）−（ＡＧ）−（ＦＮＥ）−（ＶＫＰ）−（ＡＳＹ）−（ＭＹＦ）−（ＦＤ）−（ＩＶＤ）−Ｙ（配列番号１００）または以下の配列の１つ：ＧＰＲＧＮＫＹＹ（配列番号１０１）もしくはＡＲＧＴＳＱ（配列番号１０２）を含むＣＤＲ３を含む。

１つの実施形態において、軽鎖可変領域は、以下の配列：Ｒ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｓ−（ＩＶ）−Ｓ−（ＳＴ）−（ＳＹ）−（ＬＹ）−（ＡＬＮ）−Ａ（配列番号１０３）またはＲ−Ａ−Ｓ−（ＬＱ）−（ＳＴＦＤＰ）−（ＩＶ）−（ＳＴＲＤＮ）−（ＳＴＹＮ）−（ＳＹＷＤ）−（ＬＹＤ）−（ＡＬＮ）−Ａ（配列番号１０４）を含むＣＤＲ１を含む。

１つの実施形態において、軽鎖可変領域は、以下の配列：Ｘ−Ａ−Ｓ−Ｓ−Ｌ−Ｘ−Ｘ（配列番号１０５）または（ＡＧ）−Ａ−Ｓ−（ＳＴＲ）−（ＬＲ）−（ＡＶＫＱ）−（ＳＴＫＤ）（配列番号１０６）を含むＣＤＲ２を含み、ここでＸは任意のアミノ酸である。

１つの実施形態において、軽鎖可変領域は、以下の配列：Ｑ−Ｑ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｐ−Ｘ−Ｔ−Ｘ（配列番号１０７）またはＱ−Ｑ−（ＡＧＳＬＹ）−（ＧＴＶＹＦＮ）−（ＧＳＴＩＮＰ）−（ＳＴＹＦＮ）−（ＳＴＶＰ）−（ＡＧＳＹＷＰ）−（ＴＩＷ）−Ｔ（配列番号１０８）を含むＣＤＲ３を含む。

１つの実施形態において、軽鎖可変領域は、以下の配列：Ｓ−Ｘ−Ｄ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｙ−Ｘ−Ｓ−Ｗ（配列番号１０９）またはＲ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｘ−Ｖ／Ｉ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−（Ｘ）−Ｌ−Ａ／Ｎ−Ｗ（配列番号１１０）を含むＣＤＲ１を含み、ここでＸは任意のアミノ酸であり、そして（Ｘ）は存在しなくてもよい。

１つの実施形態において、軽鎖可変領域は、以下の配列：Ａ−Ｓ−Ｓ／Ｔ−Ｒ／Ｌ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ｒ（配列番号１１１）を含むＣＤＲ２を含み、ここでＸは任意のアミノ酸である。

１つの実施形態において、ＨＣ可変ドメイン配列のＣＤＲの２つまたは３つが本明細書に記載のモチーフに一致し、その結果、これらのモチーフはまた、本明細書に記載の抗体のＨＣ可変ドメインに一致する。同様に、１つの実施形態において、ＬＣ可変ドメイン配列のＣＤＲの２つまたは３つが本明細書に記載のモチーフに一致し、その結果、これらのモチーフはまた、本明細書に記載の抗体のＬＣ可変ドメインに一致する。なお別の実施形態において、ＣＤＲについて一致したモチーフは、本明細書に記載される抗体において対合されるＨＣおよびＬＣに基づいている。

１つの実施形態において、Ｈ１およびＨ２超可変ループは、本明細書に記載される抗体と同じ標準的構造を有する。１つの実施形態において、Ｌ１およびＬ２超可変ループは、本明細書に記載される抗体と同じ標準的構造を有する。

別の実施形態において、抗ＥＴ２抗体またはその抗原結合フラグメントの軽鎖または重鎖の免疫グロブリンは、本明細書に開示される抗体、例えば、Ａ１０、Ｇ３、Ａ６、Ａ７、Ｃ８、Ｈ９、Ｇ１０−Ｒ２、Ｆ３−Ｒ２、Ｃ６−Ｒ２、Ａ４−Ｒ３、Ｃ１−Ｒ３、Ａ２、Ｂ５、Ｄ２、Ｄ５、Ｆ８、Ｈ１０、またはＣ９の対応するフレームワークと比較して、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、またはＦＲ４において、１０アミノ酸毎に３個、２．５個、２個、１．５個、または１個、０．５個を超えない置換、挿入、または欠失を有する軽鎖または重鎖の可変フレームワークをさらに含み得る。１つの実施形態において、抗えＴ２抗体の軽鎖または重鎖の免疫グロブリン、またはその抗原結合フラグメントは、本明細書に開示される抗体、例えば、Ａ１０、Ｇ３、Ａ６、Ａ７、Ｃ８、Ｈ９、Ｇ１０−Ｒ２、Ｆ３−Ｒ２、Ｃ６−Ｒ２、Ａ４−Ｒ３、Ｃ１−Ｒ３、Ａ２、Ｂ５、Ｄ２、Ｄ５、Ｆ８、Ｈ１０、またはＣ９のフレームワークと同一である軽鎖または重鎖の可変フレームワーク、例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、またはＦＲ４をさらに含む。

１つの実施形態において、軽鎖または重鎖の可変フレームワークは以下から選択され得る：（ａ）ヒト軽鎖または重鎖の可変フレームワーク、例えば、ヒト成熟抗体、ヒト生殖系列配列、コンセンサス配列、または本明細書に記載の抗体からの軽鎖または重鎖の可変フレームワークからのアミノ酸残基の少なくとも８０％、９０％、９５％、または好ましくは１００％を含む軽鎖または重鎖の可変フレームワーク；（ｂ）ヒト軽鎖または重鎖の可変フレームワーク、例えば、ヒト成熟抗体、ヒト生殖系列配列、またはコンセンサス配列からの軽鎖または重鎖の可変フレームワークからのアミノ酸残基の２０％〜８０％、４０％〜８０％、または６０％〜９０％を含む軽鎖または重鎖の可変フレームワーク；（ｃ）非ヒトフレームワーク（例えば、齧歯類フレームワーク）；あるいは（ｄ）例えば、脱免疫されているか、または部分的にヒト化されている抗原性または細胞毒性決定基を、例えば除去するために修飾されている非ヒトフレームワーク。１つの実施形態において、ＥＴ２リガンドはヒトにおいて非抗原性である。

１つの実施形態において、重鎖または軽鎖のフレームワークは、本明細書に開示される抗体、例えば、Ａ１０、Ｇ３、Ａ６、Ａ７、Ｃ８、Ｈ９、Ｇ１０−Ｒ２、Ｆ３−Ｒ２、Ｃ６−Ｒ２、Ａ４−Ｒ３、Ｃ１−Ｒ３、Ａ２、Ｂ５、Ｄ２、Ｄ５、Ｆ８、Ｈ１０、またはＣ９の重鎖フレームワークに対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるか；または本明細書に開示される抗体、例えば、Ａ１０、Ｇ３、Ａ６、Ａ７、Ｃ８、Ｈ９、Ｇ１０−Ｒ２、Ｆ３−Ｒ２、Ｃ６−Ｒ２、Ａ４−Ｒ３、Ｃ１−Ｒ３、Ａ２、Ｂ５、Ｄ２、Ｄ５、Ｆ８、Ｈ１０、またはＣ９の可変ドメインのアミノ酸配列とは、少なくとも１残基または５残基であるが、４０残基、３０残基、２０残基、または１０残基未満異なる、アミノ酸配列を含む。

１つの実施形態において、ＥＴ２抗体の重鎖または軽鎖の可変ドメイン配列は、本明細書に開示される抗体、例えば、Ａ１０、Ｇ３、Ａ６、Ａ７、Ｃ８、Ｈ９、Ｇ１０−Ｒ２、Ｆ３−Ｒ２、Ｃ６−Ｒ２、Ａ４−Ｒ３、Ｃ１−Ｒ３、Ａ２、Ｂ５、Ｄ２、Ｄ５、Ｆ８、Ｈ１０、またはＣ９の可変ドメイン配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるか；または本明細書に開示される抗体、例えば、Ａ１０、Ｇ３、Ａ６、Ａ７、Ｃ８、Ｈ９、Ｇ１０−Ｒ２、Ｆ３−Ｒ２、Ｃ６−Ｒ２、Ａ４−Ｒ３、Ｃ１−Ｒ３、Ａ２、Ｂ５、Ｄ２、Ｄ５、Ｆ８、Ｈ１０、またはＣ９の可変ドメイン配列とは、少なくとも１残基または５残基であるが、４０残基、３０残基、２０残基、または１０残基未満異なる、アミノ酸配列を含む。

１つの実施形態において、抗ＥＴ２抗体は、本明細書に開示される抗体、例えば、Ａ１０、Ｇ３、Ａ６、Ａ７、Ｃ８、Ｈ９、Ｇ１０−Ｒ２、Ｆ３−Ｒ２、Ｃ６−Ｒ２、Ａ４−Ｒ３、Ｃ１−Ｒ３、Ａ２、Ｂ５、Ｄ２、Ｄ５、Ｆ８、Ｈ１０、またはＣ９の軽鎖可変ドメイン配列を含む少なくとも１つ、好ましくは２つの軽鎖可変領域、および本明細書に開示される抗体、例えば、Ａ１０、Ｇ３、Ａ６、Ａ７、Ｃ８、Ｈ９、Ｇ１０−Ｒ２、Ｆ３−Ｒ２、Ｃ６−Ｒ２、Ａ４−Ｒ３、Ｃ１−Ｒ３、Ａ２、Ｂ５、Ｄ２、Ｄ５、Ｆ８、Ｈ１０、またはＣ９の重鎖可変ドメイン配列を含む少なくとも１つ、好ましくは２つの重鎖可変領域を含む。

１つの実施形態において、抗ＥＴ２抗体またはその抗原結合フラグメントの軽鎖または重鎖フレームワークは、ヒト軽鎖または重鎖の可変フレームワーク、例えば、ヒト成熟抗体、ヒト生殖系列配列、コンセンサス配列、または本明細書に記載される抗体からの軽鎖または重鎖の可変フレームワーク残基からの少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、１６個、または１７個のアミノ酸残基を含む。１つの実施形態において、ヒト軽鎖または重鎖の可変フレームワーク残基からのアミノ酸残基は、ヒト生殖系列において同じ位置で見出される残基と同じである。好ましくは、ヒト軽鎖または重鎖の可変フレームワークからのアミノ酸残基は、同じ位置でのヒト生殖系列における最も一般的な残基である。

本明細書に記載されるＥＴ２リガンドは単独で使用され得、例えば、非誘導体型または非結合体型で、被験体に投与され得るか、またはインビトロで使用され得る。他の実施形態において、ＥＴ２リガンドは、別の機能的分子、例えば、別の化合物、ペプチド、タンパク質、アイソトープ、細胞、または不溶性支持体に、誘導体化、修飾、または連結され得る。例えば、ＥＴ２リガンドは、１つ以上の他の分子実体、例えば、とりわけ、抗体（例えば、リガンドが二特異性または多特異性抗体を形成するための抗体である場合）、毒素、放射性同位元素、治療剤（例えば、細胞傷害性薬剤もしくは細胞増殖抑制剤）または治療部分などに、機能的に連結され得る（例えば、化学的結合、遺伝子融合、非共有結合的結合、またはその他によって）。例えば、ＥＴ２リガンドは、放射性イオン（例えば、α−、γ−、またはβ−放射体）、例えば、ヨウ素（^１３１Ｉまたは^１２５Ｉ）、イットリウム（^９０Ｙ）、ルテニウム（^１７７Ｌｕ）、アクチニウム（^２２５Ａｃ）、レニウム（^１８６Ｒｅ）、またはビスマス（^２１２Ｂｉまたは^２１３Ｂｉ）にカップリングされ得る。

別の態様において、本発明は、薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤または安定剤、および少なくとも１つの本明細書に記載されるＥＴ２リガンド（例えば、抗体またはそのフラグメント）を含む組成物（例えば、薬学的組成物）を提供する。１つの実施形態において、これらの組成物（例えば、薬学的組成物）は、上述のＥＴ２リガンドの２つ以上の組み合わせを含む。

別の態様において、本発明は、単独、または他の処置様式、例えば、細胞傷害性薬剤または標識化薬剤（例えば、本明細書に記載される細胞傷害性薬剤または標識化薬剤）と組み合わせる使用のための、本明細書に記載されるような抗ＥＴ２抗体（またはそのフラグメント）、例えば、抗ＥＴ２抗体（またはそのフラグメント）を、ＥＴ２抗体またはこのような薬剤の組み合わせをいかにして使用するか（例えば、癌性損傷を処置、予防、または検出するために）についての指示書とともに含むキットを特徴とする。

本発明はまた、本明細書に記載される重鎖および軽鎖の免疫グロブリンまたは免疫グロブリンフラグメントをコードする核酸配列を特徴とする。例えば、本発明は、本明細書に記載される抗ＥＴ２抗体分子の、それぞれ重鎖および軽鎖の可変領域をコードする第１および第２の核酸を特徴とする。別の態様において、本発明は、本発明の核酸を含む宿主細胞およびベクターを特徴とする。

別の態様において、本発明は、抗ＥＴ２抗体、またはその抗原結合フラグメントを産生する方法を特徴とする。この方法は、重鎖可変領域（例えば、本明細書に記載されるような重鎖可変領域）をコードする第１の核酸を提供する工程；軽鎖可変領域（例えば、本明細書に記載されるような軽鎖可変領域）をコードする第２の核酸を提供する工程；および抗原結合タンパク質を形成するために上記軽鎖および重鎖の可変領域のアセンブリーを可能にする条件下で宿主細胞中で上記第１の核酸および第２の核酸を発現させる工程を包含する。これらの第１の核酸および第２の核酸は、関連付けされ得るか、または関連付けされないことも可能であり、例えば、それぞれ同じかまたは異なるベクター上で発現され得る。第１の核酸および第２の核酸は、さらに、重鎖および軽鎖の定常領域をコードし得る。

宿主細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、または原核生物細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）であり得る。例えば、哺乳動物細胞は、培養された細胞または細胞株であり得る。例示的な哺乳動物細胞には、リンパ細胞株（例えば、ＮＳＯ）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＣＯＳ細胞、卵母細胞、およびトランスジェニック動物からの細胞（例えば、哺乳動物上皮細胞）が含まれる。例えば、本発明に記載される抗体をコードする核酸は、トランスジェニック動物において発現され得る、１つの実施形態において、核酸は、組織特異的プロモーター（例えば、哺乳動物特異的プロモーター）の制御下に配置され、抗体はトランスジェニック動物において産生される。例えば、抗体分子は、トランスジェニック動物、例えば、トランスジェニックのウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、または齧歯類などの乳に分泌される。

本発明はまた、細胞活性（例えば、細胞増殖、細胞分化、細胞移動、または細胞組織化）、生理学的活性（例えば、血管の増殖、組織化など）、および／もしくは細胞を処理する（例えば、阻害する）方法、または細胞、例えば、正常な、良性のもしくは過形成の細胞（例えば、肺、胸部、腎臓、尿路上皮、結腸、前立腺、または肝臓の癌および／または転移）を除去もしくは死滅する方法を特徴とする。処理は、例えば、腫瘍細胞を直接的に標的化することによって、または腫瘍の血管新生を阻害し、それによって腫瘍細胞の増殖を間接的に阻害することによって、癌の増殖に対して直接的および／または間接的な効果を有してもよい。本発明の方法は、細胞を処理、例えば、細胞増殖を阻害、または細胞を除去もしくは死滅するために十分な量で、ＥＴ２リガンドと細胞を接触させる工程を包含する。このリガンドは細胞傷害性の実体を含み得る。本発明の方法は、例えば、障害、例えば、癌性障害（例えば、悪性障害もしくは転移性障害）、または非癌性障害（例えば、良性または過形成性の障害）を処置または予防するために有効な量でＥＴ２リガンドを投与することによって、例えば、このような障害を処置または予防するために使用され得る。

ＥＴ２活性を増加するＥＴ２リガンドは、例えば、障害（タンパク質の増加および血管新生の増加が所望される障害）を処置または予防するために使用され得る。例えば、このリガンドは、創傷を処置するため（例えば、創傷治癒を補助するために）使用され得る。例えば、この創傷は、裂傷、熱傷、または外科的切開であり得る。

対象の方法は、培養中の細胞上で、例えば、インビトロまたはエキソビボで使用され得る。例えば、癌性または転移性の細胞（例えば、肺癌、乳癌、腎臓癌、尿路上皮癌、結腸癌、前立腺癌、もしくは肝臓癌、または転移性細胞）が培養培地中でインビトロで培養され得、および接触工程が培養培地にＥＴ２リガンドを加えることによってもたらされ得る。この方法は、インビボ（例えば、治療的または予防的）プロトコールの一部として、被験体中に存在する細胞（例えば、癌細胞または転移性細胞）上で実行され得る。インビボの実施形態のために、接触工程が被験体中でもたらされこれは、細胞へのリガンドの結合、および処置、例えば、細胞増殖および／もしくは細胞分裂の阻害または細胞の死滅もしくは除去の両方を可能にするために有効な条件下で被験体にＥＴ２リガンドを投与する工程を包含する。

本発明の方法は、望ましくない血管新生、例えば、癌性障害（例えば、固形腫瘍、軟部組織腫瘍、および転移病巣を含むがこれらに限定されない）によって特徴付けられる障害を処置または予防するために使用され得る。固形腫瘍の例には、悪性腫瘍、例えば、種々の器官系の肉腫、腺癌、および癌腫、例えば、肺、胸部、リンパ、胃腸（例えば、結腸）、および尿生殖路（例えば、腎臓細胞、尿路上皮細胞）、咽頭に影響を与えるもの、ならびに悪性腫瘍を含む腺癌、例えば、大部分の結腸癌、直腸癌、腎臓細胞癌、肝臓癌、肺の非小細胞癌、小腸の癌、および食道の癌が含まれる。上述の癌の転移病巣はまた、本発明の方法および組成物を使用して処置および予防され得る。

本発明の方法は、例えば、ＥＴ２活性を増加させるＥＴ２リガンドを使用して、血管新生の増加が所望される障害を処置および予防するために使用され得る。

被験体は、哺乳動物、例えば、霊長類、好ましくは高等霊長類、例えば、ヒト（例えば、本明細書に記載される障害、例えば、癌を有する、またはそのリスクがある患者）であり得る。

抗ＥＴ２抗体またはそのフラグメント、例えば、本明細書に記載されるような抗ＥＴ２抗体またはそのフラグメントは、全身的に（例えば、経口的、非経口的、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻内、経皮的、または吸入によって）、局所的に、または粘膜（例えば、鼻、喉、および気管支など）への適用によって投与され得る。１つの実施形態において、タンパク質は、インビボで血管新生および／または腫瘍増殖の部位に蓄積する。

本発明の方法は、被験体を、例えば、以下の減少：腫瘍サイズの減少；癌マーカーの減少；例えば、骨のスキャンにおける新規な障害の出現の減少；新規な疾患関連症候群の出現の減少；または軟部組織塊のサイズの減少もしくは安定化；または臨床的結果の改善に関する任意のパラメーターの１つ以上の減少についてモニターする工程をさらに包含し得る。被験体は、以下の期間の１つ以上においてモニターされ得る：処置の開始前；処置の間；または処置の１つ以上の要素が投与された後。モニタリングは、同じＥＴ２リガンドを用いるさらなる処置についての必要性、またはさらなる薬剤を用いるさらなる処置についての必要性を評価するために使用され得る。一般的に、上記のパラメーターの１つ以上の減少は、被験体の状態の改善の指標である。

ＥＴ２リガンドは、非結合体化で単独で使用され、それによってＥＴ２発現細胞の増殖を除去、死滅、または阻害し得る。例えば、リガンドが抗体である場合、除去、死滅、または増殖の阻害は、補体媒介細胞溶解および／またはエフェクター細胞媒介細胞死滅などの抗体依存性細胞死滅メカニズムによって媒介され得る。他の実施形態において、ＥＴ２リガンドは、ＥＴ２発現細胞を死滅または除去するために有効な物質、例えば、細胞傷害性薬剤または部分に結合され得る。例えば、ＥＴ２リガンドは、放射性イオン（例えば、α−、γ−、またはβ−放射体）、例えば、ヨウ素（^１３１Ｉまたは^１２５Ｉ）、イットリウム（^９０Ｙ）、ルテニウム（^１７７Ｌｕ）、アクチニウム（^２２５Ａｃ）、またはビスマス（^２１３Ｂｉ）にカップリングされ得る。本発明の方法および組成物は、他の処置様式、例えば、他の抗癌治療および／または抗血管新生治療と組み合わせて使用され得る。１つの実施形態において、本発明の方法は、上記障害を処置または予防するために有効な量で、細胞傷害性薬剤と組み合わせて、ＥＴ２リガンド、例えば、抗ＥＴ２抗体またはそのフラグメントを、被験体に投与する工程を包含する。リガンドおよび細胞傷害性薬剤は、同時にまたは連続的に投与され得る。他の実施形態において、本発明の方法および組成物は、外科的手順および／または放射線手順と組み合わせて使用される。

別の態様において、本発明は、サンプル中で、インビトロで（例えば、生物学的サンプル、組織生検、例えば、癌性病巣）ＥＴ２の存在を検出するための方法を特徴とする。対象の方法は、本明細書に記載される障害、例えば、望ましくない血管新生によって特徴付けられる癌性障害または他の障害を、評価、例えば、診断または段階付けするために使用され得る。この方法は以下の工程を包含する：（ｉ）ＥＴ２リガンドとＥＴ２タンパク質との相互作用が起こることを可能にする条件下で、サンプル（および必要に応じて、参照、例えば、コントロール、サンプル）を、本明細書に記載されるようなＥＴ２リガンドと接触させる工程；ならびに（ｉｉ）ＥＴ２リガンドとサンプル（および必要に応じて、参照、例えば、コントロール、サンプル）との間の複合体の形成を検出する工程。複合体の形成は、ＥＴ２タンパク質の存在の指標であり本明細書に記載される処置についての適合性または必要性を示し得る。例えば、参照サンプル、例えば、コントロールサンプルと比較して、サンプル中の複合体の形成の統計学的に有意な変化が、サンプル中のＥＴ２の存在および／またはレベルの指標である。１つの実施形態において、ＥＴ２−リガンドは、活性ＥＴ２を含む複合体と、ＥＴ２の不活性型（例えば、チモーゲン）を含む複合体との間を認識および／または区別してもよい。

なお別の態様において、本発明は、ＥＴ２の存在をインビボで検出するための方法を提供する（例えば、被験体中でのインビボ画像化）。対象の方法は、本明細書に記載される障害、例えば、癌性障害または望ましくない血管新生によって特徴付けられる他の障害を評価するため、例えば、診断、局在化、または段階付けするために使用され得る。この方法は以下の工程を包含する：（ｉ）ＥＴ２リガンドとＥＴ２タンパク質との相互作用が起こることを可能にする条件下で、被験体（および必要に応じて、コントロール被験体）を、ＥＴ２リガンド（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント）と接触させる段階；ならびに（ｉｉ）リガンドとＥＴ２との間の複合体の形成を検出する工程であって、ここで、参照、例えば、コントロール被験体または被験体のベースラインと比較した被験体中の複合体の形成の統計学的に有意な変化が、ＥＴ２の存在および／またはレベルの指標である。他の実施形態において、本明細書に記載されるような障害（例えば、望ましくない血管新生によって特徴付けられる癌性障害または他の障害）を診断または段階付けする方法が提供される。この方法は以下の工程を含む：（ｉ）障害を有する、または障害を有するリスクがある被験体を同定する工程；（ｉｉ）障害の影響を受けた組織または細胞のサンプルを得る工程；（ｉｉｉ）結合剤およびＥＴ２タンパク質の相互作用が起こることを可能にする条件下で、ＥＴ２リガンドと上記サンプルまたはコントロールサンプルを接触させる工程、ならびに（ｉｖ）複合体の形成を検出する工程。参照サンプル（例えば、コントロールサンプル）に関してリガンドとの間の複合体の形成の統計学的に有意な変化は、障害または障害の段階の指標である。

好ましくは、インビボおよびインビトロの診断方法において使用されるＥＴ２リガンドは、結合したかまたは結合していない結合剤の検出を容易にするために検出可能な物質と直接的または間接的に標識される。適切な検出可能な物質には、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、および放射性物質が含まれる。１つの実施形態において、ＥＴ２リガンドは、放射性イオン、例えば、インジウム（^１１１Ｉｎ）、ヨウ素（^１３１Ｉまたは^１２５Ｉ）、イットリウム（^９０Ｙ）、アクチニウム（^２２５Ａｃ）、ビスマス（^２１３Ｂｉ）、硫黄（^３５Ｓ）、炭素（^１４Ｃ）、トリチウム（^３Ｈ）、ロジウム（^１８８Ｒｈ）、またはリン（^３２Ｐ）にカップリングされ得る。別の実施形態において、リガンドはＮＭＲ造影剤で標識される。

本発明はまた、一連のアミノ酸配列および核酸配列を含むポリペプチドおよび核酸を提供する。

ＥＴ２結合リガンドは、血管新生関連障害、特に血管新生依存性癌および腫瘍を処置および妨害するために使用され得る。

血管新生関連障害には、固形腫瘍；白血病などの血液由来腫瘍；腫瘍転移；良性腫瘍（例えば、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫；関節リウマチ）；乾癬；眼の血管新生疾患、例えば、糖尿病性網膜症、未熟児の網膜症、黄斑変性、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖症、ルベオーシス；オースラー‐ウェーバー症候群；心筋血管新生；プラーク新血管新生；毛細血管拡張；血友病性関節；血管線維腫；および創傷肉芽形成が含まれるがこれらに限定されない。

「血管新生依存性癌および腫瘍」は、それらの増殖（体積および／または質量の拡大）のために、それらに血液を供給する血管の数および密度の増加を必要とする癌および腫瘍である。１つの実施形態において、ＥＴ２結合リガンドは、このような癌および腫瘍の退行を引き起こす。「退行」とは、腫瘍の質量およびサイズの減少、例えば、少なくとも２％、５％、１０％、または２５％の減少をいう。

別の態様において、本発明は、癌（例えば、腫瘍）の近傍において、細胞、例えば、内皮細胞、例えば、内皮細胞を接触させる（インビトロ、エキソビボ、またはインビボで）接触させる方法を特徴とする。この方法は、ＥＴ２と相互作用するリガンド、例えば、本明細書に記載されるリガンドを提供する工程、およびこのリガンドを、少なくとも１つの検出可能なリガンド−細胞複合体を形成するのに十分な量で接触させる工程を包含し得る。このリガンドには、標識または細胞傷害性の実体、例えば、免疫グロブリンＦｃドメインまたは細胞傷害性薬物が含まれ得る。

本発明はまた、ＥＴ２のタンパク質リガンド（例えば、抗体リガンド）を同定するための方法を提供する。１つの実施形態において、方法は、ライブラリーを提供する工程およびＥＴ２に結合するタンパク質をコードするメンバーを同定するためにライブラリーをスクリーニングする工程を包含する。スクリーニングは、多数の方法において実行され得る。例えば、ライブラリーは、ディスプレイライブラリー、例えば、ファージディスプレイライブラリーまたはファージミドライブラリーであり得る。ファージ／ファージミドライブラリーは、抗体（例えば、Ｆａｂ）またはＫｕｎｉｔｚドメインライブラリーであり得る。ファージディスプレイライブラリーを利用する方法はさらに以下の工程：ＥＴ２を結合するファージを回収する工程およびこのファージから核酸を単離する工程を含み得、ここでこの核酸はＥＴ２のタンパク質またはポリペプチドリガンドをコードする。このファージは、競合ペプチドを使用して、または緩衝液条件（例えば、ｐＨ）を変化させることによって、ＥＴ２から溶出されてもよい。

ＥＴ２は、組換え的に発現され得るか、またはタグ化され得る。ＥＴ２は、精製され支持体に、例えば、常磁性ビーズまたは他の磁気的に応答性の粒子に結合される。ＥＴ２はまた、細胞の表面上で発現され得る。ディスプレイライブラリーは、細胞に特異的に結合するメンバーを同定するためにスクリーニングされ得る（例えば、ＥＴ２が発現される場合のみに）。ＥＴ２はヒトＥＴ２であり得る。ＥＴ２は、グリコシル化を除去するために処理または変異され得る。また、ＥＴ２のフラグメント、例えば、セリンプロテアーゼドメインが使用されてもよい。

本明細書において使用される場合、用語「実質的に同一」（または「実質的に相同」）は、第１および第２のアミノ酸またはヌクレオチドの配列が同様の活性を有するように、第２のアミノ酸またはヌクレオチド配列に対して、十分な数の同一または等価な（例えば、類似の側鎖、例えば、保存性アミノ酸置換を有する）アミノ酸残基またはヌクレオチドを含む第１のアミノ酸またはヌクレオチド配列をいうために本明細書で使用される。抗体の場合においては、第２の抗体は同じ特異性を有し第１の抗体の少なくとも５％、１０％、２５％、または５０％の親和性を有する。

本明細書に開示される配列に対して、類似または相同である（例えば、少なくとも約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％の配列同一性）配列もまた、本願の一部である。ある実施形態において、配列同一性は、約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上であり得る。代替的には、実質的な同一性は、ＥＴ２リガンドをコードする鎖の相補鎖に対して、選択的ハイブリダイゼーション条件下（例えば、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件）でハイブリダイズする。核酸は、全細胞、細胞溶解物、または部分精製された型もしくは実質的に純粋な型で存在してもよい。

２つの配列間の「相同性」または「配列同一性」（これらの用語は本明細書で交換可能に使用される）の計算は以下のようにして実行される。配列は最適比較の目的のためにアラインされる（例えば、ギャップが、最適アラインメントのために第１および第２のアミノ酸配列または核酸配列の一方または両方に導入され得、そして非相同配列が比較目的のために無視され得る）。１つの実施形態において、比較目的のためにアラインされた参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、およびさらにより好ましくは、少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。次いで、対応するアミノ酸の位置およびヌクレオチドの位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第１の配列の位置が、第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められている場合、それらの分子は、その位置において同一である（本明細書において使用される場合、アミノ酸または核酸の「同一性」は、アミノ酸または核酸の「相同性」と等価である）。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適アラインメントのために導入される必要があるギャップの数、および各ギャップの長さを考慮に入れた、配列によって共有される同一の位置の数の関数である。

配列の比較および２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。１つの実施形態において、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３）アルゴリズムを使用して決定される。これは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）におけるＧＡＰプログラムに組み込まれており、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重みおよび１、２、３、４、５、または６の長さ重みを使用する。なお別の好ましい実施形態において、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰプログラムを使用して、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスならびに４０、５０、６０、７０、または８０のギャップ重みおよび１、２、３、４、５、または６の長さ重みを使用して決定される。特に好ましいパラメーターのセット（および、分子が配列同一性または本明細書の相同性限度の範囲内にあるか否かを決定するためにパラメーターが影響されるべきであることを実施者に確信がない場合に使用されるべきもの）は、１２のギャップペナルティー、４のギャップ拡張ペナルティー、および５のフレームシフトギャップペナルティーを有するＢｌｏｓｓｕｍ６２スコアリングマトリックスである。

本明細書において使用される場合、用語「相同性」は「類似性」の同義語であり目的の配列が、１つ以上のアミノ酸置換の存在によって参照配列とは異なっている（しかし、少しのアミノ酸の挿入または欠失もまた存在してもよい）ことを意味する。参照配列に対する相同性および類似性の程度を計算する現在好ましい手段は、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（ｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ），ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ，ＢｅｔｈｅｓｄａＭＤを通して利用可能）の使用を通してであり、各々の場合において、計算された配列の有意性を決定するためにアルゴリズムのデフォルトパラメーターまたは推奨されるパラメーターを使用する。２つのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列の間の同一性パーセントはまた、Ｅ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ，４：１１−１７）のアルゴリズムを使用して決定され得、これはＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれており、ＰＡＭ１２０重量残基表、１２のギャップ長ペナルティーおよび４のギャップペナルティーを使用する。

本明細書において使用される場合、用語「低ストリンジェンシー、中程度のストリンジェンシー、高ストリンジェンシー、または非常に高いストリンジェンシーの条件の下でハイブリダイズする」は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のための条件を説明する。ハイブリダイゼーション反応を実行するためのガイダンスは、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６において見出され得る。水性および非水性の方法がこの参考文献に記載され、いずれかが使用され得る。本明細書で言及される特異的ハイブリダイゼーション条件は以下の通りである：１）約４５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中の低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、続いて少なくとも５０℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおける２回の洗浄（洗浄の温度は低ストリンジェンシー条件のためには５５℃まで増加され得る）；２）約４５℃での６×ＳＳＣ中での中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、続いて６０℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での１回以上の洗浄；３）約４５℃での６×ＳＳＣにおける高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、続いて６５℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおける１回以上の洗浄；および好ましくは４）非常に高いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、６５℃での０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳ、続いて６５℃における０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、続いて６５℃での０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳにおける１回以上の洗浄である。非常に高いストリンジェンシー条件（４）が好ましい。

本発明の結合剤ポリペプチドことがさらなる保存性または非必須のアミノ酸置換を有してもよく、これがポリペプチドの機能に実質的な効果を有さないことが理解される。特定の置換が許容されるか否か、すなわち、望ましい生物学的特性、例えば、結合活性などに有害内影響を与えないか否かは、Ｂｏｗｉｅら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４７：１３０６−１３１０において記載されるように決定され得る。「保存性アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられているものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族性側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。

「非必須」アミノ酸残基は、生物学的活性を消滅させることなく、またはより好ましくは、生物学的活性を実質的に変化させることなく、野生型配列の結合剤（例えば、抗体）から変化され得る残基であるのに対して、「必須」アミノ酸残基は、このような変化を生じる。

結合親和性は、平衡透析、平衡結合、ゲル濾過、ＥＬＩＳＡ、またはスペクトル分析（例えば、蛍光アッセイを使用する）を含む種々の方法によって決定され得る。これらの技術は、リガンド（または標的）濃度の関数として、結合および遊離のリガンドの濃度を測定するために使用され得る。結合リガンドの濃度（［結合］）は、遊離のリガンドの濃度（［遊離］）および標的上のリガンドについての結合部位の濃度と関連し、ここで（Ｎ）は、以下の等式によって、標的分子あたりの結合部位の数である：
［結合］＝Ｎ・［遊離］／（（１／Ｋ_ａ）＋［遊離］）
。

Ｋａの正確な決定を行うことは常に必要なことではない。しかし、時折、例えば、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳ分析などの方法を使用して決定される親和性の定量的な測定を得ることが十分であり、Ｋ_ａに比例し、従って、比較のために使用され得、例えば、高い親和性、例えば、２倍高いか否かを決定する。より良好な結合は、参照よりもより高い数値のＫａ、またはより低い数値のＫｄによって示され得る。他に注記されない限りは、結合親和性は、ｐＨ７のリン酸緩衝化生理食塩水中で決定される。

本発明の１つ以上の非限定的な実施形態の詳細は、添付の図面および以下の説明に記載される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明および図面から、ならびに特許請求の範囲から明白である。

（詳細な説明）
エンドセリアーゼは、新規な血管新生の間の細胞外マトリックス成分のタンパク質分解性プロセシングにおけるこれらの酵素の役割に起因する望ましくない血管新生によって特徴付けられる疾患の処置のための魅力的な標的である。エンドセリアーゼ−２（ＥＴ２）は、内皮細胞の表面上で発現される膜貫通セリンプロテアーゼである。２つの型のヒトＥＴ２、ＥＴ−２ＳおよびＥＴ−２Ｌ（それぞれ、短型および長型）の例示的な核酸配列およびアミノ酸配列が図１および２に提供される。ＷＯ０１／３６６０４を参照されたい。

この開示は、とりわけ、高い親和性および選択性でＥＴ２を阻害する、ＥＴ２に結合するリガンド（例えば、免疫グロブリン）を提供する。この開示はまた、ＥＴ２に結合するタンパク質（例えば、抗体）を同定するための方法を提供する。多くの場合において、同定されたタンパク質は、少なくとも部分的に特異的である。

ＥＴ２は、ＩＩ型膜型セリンプロテアーゼであり血管新生関連プロテアーゼのエンドセリアーゼクラスのメンバーである。ＥＴ２ＲＮＡは、内皮細胞およびある腫瘍細胞株において発現される（ＷＯ０１／３６６０４）。ＥＴ２ＲＮＡはまた、他の組織においても検出されてきた。ＥＴ２タンパク質は、Ｎ末端に膜貫通領域、続いて単一の低密度リポタンパク質−Ａ（ＬＤＲ−Ａ）レセプタードメインおよび単一のスカベンジャー−レセプターシステインリッチドメインを有する（ＷＯ０１／３６６０４）。このＣ末端は、プロテアーゼドメインの３つの保存性領域において、触媒性３成分残基ヒスチジン、アスパラギン酸、およびセリンの存在によって特徴付けられるトリプシン様セリンプロテアーゼドメインを含む。ＡＳＰＡＧＴＰＰＧＲＡＳＰ配列を有するこれらの反復性配列は、膜貫通性ドメインの近傍に存在し、Ｎミリストイル化のための配列モチーフを含む（ＷＯ０１／３６６０４）。

（ディスプレイライブラリー）
１つの実施形態において、ディスプレイライブラリーが、ＥＴ２に結合するタンパク質を同定するために使用され得る。ディスプレイライブラリーは、実体のコレクションであり；各実体は、アクセス可能なポリペプチド成分およびポリペプチド成分をコードまたは同定する回収可能成分を含む。ポリペプチド成分は、任意の長さ、例えば、３アミノ酸〜３００アミノ酸超までであり得る。選択において、ライブラリーの各メンバーのポリペプチド成分はＥＴ２でプローブされ、このポリペプチド成分がＥＴ２に結合する場合、ディスプレイライブラリーメンバーが、典型的には支持体上での保持によって同定される。

保持されたディスプレイライブラリーメンバーは、支持体から回収され分析される。この分析は、類似のまたは類似でない条件下での、増幅および引き続く選択を含み得る。例えば、ポジティブ選択およびネガティブ選択が交互に行われ得る。この分析はまた、ポリペプチド成分のアミノ酸配列を決定すること、および詳細な特徴付けのためのポリペプチド成分の精製を含み得る。

種々の形式がディスプレイライブラリーのために使用され得る。例は以下を含む。

（ファージディスプレイ）。１つの形式はウイルス、特にバクテリオファージを利用する。この形式は、「ファージディスプレイ」と呼ばれる。ポリペプチド成分は、典型的には、バクテリオファージコートされたタンパク質に共有結合される。連鎖は、コートタンパク質に融合されたポリペプチド成分をコードする核酸の翻訳から生じる。この連鎖は、フレキシブルペプチドリンカー、プロテアーゼ部位、または終止コドンの抑制の結果として取り込まれたアミノ酸を含み得る。ファージディスプレイは、例えば、以下において記載されている：Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第５，２２３，４０９号；Ｓｍｉｔｈ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２８：１３１５−１３１７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９１／１７２７１；ＷＯ９２／２０７９１；ＷＯ９２／１５６７９；ＷＯ９３／０１２８８；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／０９６９０；ＷＯ９０／０２８０９；ｄｅＨａａｒｄら（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ２７４：１８２１８−３０；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ４：１−２０；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（２０００）ＩｍｍｕｎｏｌＴｏｄａｙ２：３７１−８；Ｆｕｃｈｓら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９：１３７０−１３７２；Ｈａｙら（１９９２）ＨｕｍＡｎｔｉｂｏｄＨｙｂｒｉｄｏｍａｓ３：８１−８５；Ｈｕｓｅら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６：１２７５−１２８１；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９３）ＥＭＢＯＪ１２：７２５−７３４；Ｈａｗｋｉｎｓら（１９９２）ＪＭｏｌＢｉｏｌ２２６：８８９−８９６；Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ３５２：６２４−６２８；Ｇｒａｍら（１９９２）ＰＮＡＳ８９：３５７６−３５８０；Ｇａｒｒａｒｄら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９：１３７３−１３７７；Ｒｅｂａｒら（１９９６）ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．２６７：１２９−４９；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９１）ＮｕｃＡｃｉｄＲｅｓ１９：４１３３−４１３７；およびＢａｒｂａｓら（１９９１）ＰＮＡＳ８８：７９７８−７９８２。

ファージディスプレイ系は、糸状ファージ（ファージｆ１、ｆｄ、およびＭ１３）ならびに他のバクテリオファージ（例えば、Ｔ７バクテリオファージおよびλ型ファージ；例えば、Ｓａｎｔｉｎｉ（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８２：１２５−１３５；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら（１９９６）Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ６：１−６；Ｈｏｕｓｈｍｅｔら（１９９９）ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ２６８：３６３−３７０を参照のこと）のために開発されてきた。糸状ファージディスプレイ系は、典型的には、マイナーなコートタンパク質（例えば、遺伝子ＩＩＩタンパク質）、および主要なコートタンパク質である遺伝子ＶＩＩＩタンパク質への融合を使用するが、遺伝子ＶＩタンパク質、遺伝子ＶＩＩタンパク質、遺伝子ＩＸタンパク質などの他のコートタンパク質、またはそれらのドメインへの融合もまた使用され得る（例えば、ＷＯ００／７１６９４を参照のこと）。１つの実施形態において、この融合は、遺伝子ＩＩＩタンパク質、例えば、アンカータンパク質または「基部（ｓｔｕｍｐ）」のドメインに対してである（例えば、遺伝子ＩＩＩタンパク質アンカードメインの記載については米国特許第５，６５８，７２７号を参照されたい）。非ペプチド結合、例えば、非共有結合または非ペプチド共有結合を使用してコートすることが示されるタンパク質を物理的に結合することもまた可能である。例えば、ジスルフィド結合および／またはｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎコイルドコイルが、物理的結合のために使用され得る（例えば、Ｃｒａｍｅｒｉら（１９９３）Ｇｅｎｅ１３７：６９およびＷＯ０１／０５９５０を参照のこと）。

ポリペプチド成分の結合価もまた制御され得る。例えば、ポリペプチド成分をコードする配列の、完全なファージゲノムへのクローニングは、多価ディスプレイを生じる。なぜなら、遺伝子ＩＩＩタンパク質のすべての複製がこのポリペプチド成分に融合されるからである。この系において、遺伝子ＩＩＩに融合されたポリペプチド成分をコードする核酸は、典型的には７０００ヌクレオチド未満の長さのプラスミド上で提供される。このプラスミドはファージの複製基点を含み、その結果、このプラスミドは、このプラスミドを有する細菌細胞がヘルパーファージ（例えば、Ｍ１３Ｋ０１）で感染されるときに、バクテリオファージ粒子に取り込まれる。このヘルパーファージは、遺伝子ＩＩＩおよびファージの複製およびアセンブリーのために必要である他のファージ遺伝子のインタクトなコピーを提供する。このヘルパーファージは欠損性基点を有し、その結果、ヘルパーファージゲノムは、野生型基点を有するプラスミドと比較して、ファージ粒子には効率的に取り込まれない。

ポリペプチド成分を表示するバクテリオファージは、増殖され得、そして標準的なファージ調製方法、例えば、増殖培地からのＰＥＧ沈殿を使用して収集され得る。

個々のディスプレイファージの選択後、選択されたペプチド成分をコードする核酸は、選択されたファージを使用して細胞を感染させることによって増幅される。個々のコロニーまたはプラークは拾い上げられ得、対応する核酸は単離および配列決定され得る。

（細胞ベースのディスプレイ）。なおべつの形式において、ライブラリーは細胞ディスプレイライブラリーである。タンパク質は、細胞、例えば、真核生物細胞または原核生物細胞の表面上でディスプレイされる。例示的な原核生物細胞には、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞、胞子（例えば、Ｌｕら（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１３：３６６を参照のこと）。例示的な真核生物細胞には、酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ、Ｈａｎｓｅｕｌａ、またはＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｓ）が含まれる。酵母表面ディスプレイは、例えば、ＢｏｄｅｒおよびＷｉｔｔｒｕｐ（１９９７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ１５：５５３−５５７ならびにＷＯ０３／０２９，４５６において記載されている。この出願は、Ｆａｂフラグメントなどの免疫グロブリンタンパク質をディスプレイするために使用され得る酵母ディスプレイ系、ならびに重鎖および軽鎖の組み合わせを生成するための接合の使用を記載する。

１つの実施形態において、変化に富んだ核酸配列が、酵母ディスプレイのためにベクターにクローニングされる。クローニングは、変化に富んだ配列を、ドメイン（または全体）の酵母細胞表面タンパク質、例えば、Ａｇａ２、Ａｇａ１、Ｆｌｏ１、またはＧａｓ１と結合する。これらのタンパク質のドメインは、変化に富んだ核酸配列によってコードされるポリペプチドを、膜貫通ドメインによって（例えば、Ｆｌｏ１）またはリン脂質二重層への共有結合によって（例えば、Ｇａｓ１）固着し得る。ベクターは、細胞表面上に２つのポリペプチド鎖を発現するように配置され得、その結果、鎖の一方が酵母細胞表面タンパク質に連結される。例えば、２つの鎖は免疫グロブリン鎖であり得る。

（リボソームディスプレイ）。ＲＮＡおよびＲＮＡによってコードされるポリペプチドは、ＲＮＡを翻訳しているリボソームを安定化することによって物理的に結合され得なお結合される新生ポリペプチドを有する。典型的には、高い二価Ｍｇ^２＋濃度および低温が使用される。例えば、Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：９０２２およびＨａｎｅｓら（２０００）ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：１２８７−９２；Ｈａｎｅｓら（２０００）ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．３２８：４０４−３０ならびにＳｃｈａｆｆｉｔｚｅｌら（１９９９）ＪＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄｓ．２３１（１−２）：１１９−３５を参照のこと。

（ペプチド−核酸融合物）。別の形式はペプチド−核酸融合物を利用する。ペプチド−核酸融合物は、例えば、ＲｏｂｅｒｔｓおよびＳｚｏｓｔａｋ（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４：１２２９７−１２３０２、ならびに米国特許第６，２０７，４４６号に記載されるような共有結合したピューロマイシン基を含むｍＲＮＡのインビトロ翻訳によって生成され得る。次いで、ｍＲＮＡは、ＤＮＡに逆転写され得、そしてポリペプチドに架橋され得る。

（他のディスプレイ形式）。なお別のディスプレイ形式は非生物学的ディスプレイであり、ここでは、ポリペプチド成分がポリペプチドを同定する非核酸タグに結合される。例えば、このタグは、ポリペプチドまたは高周波タグをディスプレイするビーズに結合された化学タグであり得る（例えば、米国特許第５，８７４，２１４号を参照のこと）。

（骨格）。ディスプレイのための骨格には、抗体（例えば、Ｆａｂフラグメント、単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦＶ）、単一ドメイン抗体、ラクダ抗体、およびラクダ化抗体）；Ｔ細胞レセプター；ＭＨＣタンパク質；細胞外ドメイン（例えば、フィブロネクチンＩＩＩ型反復、ＥＧＦ反復）；プロテアーゼインヒビター（例えば、Ｋｕｎｉｔｚドメイン、エコチン、ＢＰＴＩなど）；ＴＰＲ反復；トリホイル構造；ジンクフィンガードメイン；ＤＮＡ結合タンパク質；特にモノマー性ＤＮＡ結合タンパク質；ＲＮＡ結合タンパク質；酵素、例えば、プロテアーゼ（特に不活性化プロテアーゼ）、ＲＮａｓｅ；シャペロン、例えば、チオレドキシン、および熱ショックタンパク質；ならびに細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＳＨ２ドメインおよびＳＨ３ドメインなど）が含まれ得る。

骨格ドメインを評価するための適切な判断基準には以下が含まれ得る：（１）アミノ酸配列、（２）いくつかの相同ドメインの配列、（３）三次元構造、および／または（４）一定の範囲のｐＨ、温度、塩分、有機溶媒、オキシダント濃度に対する安定性データ。１つの実施形態において、骨格ドメインは小さく、安定なタンパク質ドメインであり、例えば、１００アミノ酸、７０アミノ酸、５０アミノ酸、４０アミノ酸、または３０アミノ酸未満のタンパク質である。このドメインは、１つ以上のジスルフィド結合を含んでもよく、または金属（例えば、亜鉛）をキレートしてもよい。

小さな骨格ドメインの例には以下が含まれる：Ｋｕｎｉｔｚドメイン（５８アミノ酸、３ジスルフィド結合）、Ｃｕｃｕｒｂｉｄａｍａｘｉｍａトリプシンインヒビタードメイン（３１アミノ酸、３ジスルフィド結合）、グアニリンに関連するドメイン（１４アミノ酸、２ジスルフィド結合）、グラム陰性細菌からの熱安定性エンテロトキシンＩＡに関連するドメイン（１８アミノ酸、３ジスルフィド結合）、ＥＧＦドメイン（５０アミノ酸、３ジスルフィド結合）、クリングルドメイン（６０アミノ酸、３ジスルフィド結合）、真菌の炭水化物結合ドメイン（３５アミノ酸、２ジスルフィド結合）、エンドセリンドメイン（１８アミノ酸、２ジスルフィド結合）、および連鎖球菌ＧＩｇＧ結合ドメイン（３５アミノ酸、ジスルフィド結合なし）。

小さな細胞内骨格ドメインの例には、ＳＨ２ドメイン、ＳＨ３ドメイン、およびＥＶＨドメインが含まれる。一般的には、任意のモジュラードメイン（細胞内または細胞外）が使用され得る。

別の有用な型の骨格ドメインは、免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインである。ディスプレイのために免疫グロブリンドメインを使用する方法は以下に記載される（例えば、「抗体ディスプレイライブラリー」を参照のこと）。

ディスプレイ技術はまた、標的の特定のエピトープに結合するリガンド（例えば、抗体リガンド）を得るために使用され得る。これは、例えば、特定のエピトープを欠くか、またはエピトープ内で、例えば、アラニンで置換されている非標的分子を競合させることを使用することによって行われ得る。このような非標的分子は、標的にディスプレイライブラリーを結合するときの競合分子として、または例えば、洗浄溶液中で、標的に特異的でない解離しているディスプレイライブラリーメンバーを捕捉するためのプレ溶出剤として、以下に記載されるようなネガティブ選択手順において使用され得る。

（反復選択）。１つの好ましい実施形態において、ディスプレイライブラリー技術は、反復様式で使用される。第１のディスプレイライブラリーは、標的について１つ以上のリガンドを同定するために使用される。次いで、これらの同定されたリガンドは、第２のディスプレイライブラリーを形成するために変異誘発方法を使用して変化される。次いで、高い親和性リガンドが、例えば、より高いストリンジェンシーまたはより反復性の結合および洗浄条件を使用することによって、第２のライブラリーから選択される。

ある実行においては、変異誘発は、知られているか、またはおそらく結合界面にある領域に標的化される。例えば、同定されたリガンドが抗体であるならば、変異誘発は、本明細書に記載されたような重鎖または軽鎖のＣＤＲ領域に指向され得る。さらに、変異誘発は、ＣＤＲの近傍にあるか、またはＣＤＲに隣接するフレームワーク領域に指向され得る。抗体の場合において、変異誘発はまた、例えば、正確な段階的改善を作製するために、１つまたは数個のＣＤＲに限定され得る。同様に、同定されるリガンドが酵素である場合、変異誘発は活性部位および近傍に指向され得る。

いくつかの例示的な変異誘発技術には以下が含まれる：誤りがちのＰＣＲ（Ｌｅｕｎｇら（１９８９）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ１：１１−１５）、組換え、ランダム切断を使用するＤＮＡシャッフリング（Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ３８９−３９１；「核酸シャッフリング」と呼ばれる）、ＲＡＣＨＩＴＴ（商標）（Ｃｏｃｏら（２００１）ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．１９：３５４）、部位特異的変異誘発（Ｚｏｌｌｅｒら（１９８７）ＮｕｃｌＡｃｉｄｓＲｅｓ１０：６４８７−６５０４）、カセット変異誘発（Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ（１９９１）ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．２０８：５６４−５８６）および縮重オリゴヌクレオチドの組み込み（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９４）ＥＭＢＯＪ１３：３２４５）。

反復選択の１つの例において、本明細書に記載される方法は、少なくとも標的についての最小結合特異性または最小活性、例えば、１ｎＭ、１０ｎＭ、または１００ｎＭ未満の結合のための平衡解離定数でＥＴ２を結語ｕｓルウディスプレイライブラリーからのタンパク質リガンドを最初に同定するために使用される。初期の同定されたタンパク質リガンドをコードする核酸配列は、例えば、初期のタンパク質リガンドと比較して増強された特性（例えば、結合親和性、反応速度論、または安定性）を有する第２のタンパク質リガンドを同定するために、バリエーションの導入のための鋳型核酸として使用される。

（オフレート選択）。遅い解離速度は、特にポリペプチドとそれらの標的との間の相互作用に関して高い親和性を予測し得るので、本明細書に記載される方法は、標的に対する結合相互作用について、所望される反応速度論的解離速度（すなわち、減少されている）を用いてリガンドを単離するために使用され得る。

遅く解離するリガンドをディスプレイライブラリーから選択するために、ライブラリーは、固定化された標的に接触される。次いで、固定化された標的は、非特異的にまたは弱く結合した生体分子を除去する第１の溶液で洗浄される。次いで、結合したリガンドは、飽和量の遊離の標的（すなわち、粒子に結合されない標的の複製）を含む第２の溶液で溶出される。この遊離の標的は、標的から解離する生体分子に結合する。再結合は、はるかに低濃度の固定化標的と比較して、飽和量の遊離の標的によって効果的に妨害される。

第２の溶液は、実質的に生理学的であるか、またはストリンジェントである溶液条件を有し得る。典型的には、第２の溶液の溶液条件は、第１の溶液の溶液条件と同一である。第２の溶液の画分は、後期の画分から初期の画分を区別するために時間的な順番で収集される。後期の画分は、初期の画分中の生体分子よりも、標的からより遅い速度で解離する生体分子を含む。

さらに、延長されたインキュベーション後でさえ、標的に結合したままであるディスプレイライブラリーメンバーを回収することもまた可能である。これらは、カオトロピック条件を使用して解離され得るか、または標的に結合したままで増幅され得るかのいずれかである。例えば、標的に結合したファージは、細菌細胞に接触され得る。

（特異性についての選択またはスクリーニング）。本明細書に記載されるディスプレイライブラリースクリーニング方法は、非標的分子に結合するディスプレイライブラリーメンバーを廃棄する選択またはスクリーニングのプロセスを含み得る。非標的分子の例には、例えば、抗ＥＴ２抗体のＦｃドメインが含まれる。

１つの実行において、いわゆる「ネガティブ選択」工程が、標的および関連する非標的分子と、関連するが別個の非標的分子との間を区別するために使用される。ディスプレイライブラリーまたはそのプールは、非標的分子と接触される。非標的に結合しないサンプルのメンバーが収集され、標的分子への結合のための引き続く選択において、または引き続くネガティブ選択のためでさえ、使用される。このネガティブ選択工程は、標的分子に結合するライブラリーメンバーを選択する前、またはその後であり得る。

別の実行において、スクリーニング工程が使用される。ディスプレイライブラリーメンバーが、標的分子への結合について単離され、各単離されたライブラリーメンバーは非標的分子（例えば、上記に列挙された非標的）に結合するその能力について試験される。例えば、高スループットＥＬＩＳＡスクリーニングが、このデータを得るために使用され得る。ＥＬＩＳＡスクリーニングはまた、標的への各ライブラリーメンバーの結合についての定量的データを得るために使用され得る。非標的および標的の結合データが、標的に特異的に結合するライブラリーメンバーを同定するために比較される（例えば、コンピュータおよびソフトウェアを使用して）。

（他の発現ライブラリー）
他の型のタンパク質のコレクション（例えば、発現ライブラリー）が、特定の特性（例えば、ＥＴ２を結合する能力および／またはＥＴ２を阻害する能力）を有するタンパク質を同定するために使用され得、これには、例えば、抗体のタンパク質アレイ（例えば、ＤｅＷｉｌｄｔら（２０００）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｙａｏｌ．１８：９８９−９９４を参照のこと）、λｇｔ１１ライブラリー、ツーハイブリッドライブラリーなどが含まれる。

（タンパク質アレイ）。異なるタンパク質が固体支持体上に、例えば、ビーズまたはアレイ上に固定化され得る。タンパク質アレイについては、各々のタンパク質が支持体上の独自のアドレスに固定化される。典型的には、このアドレスは二次元アドレスである。

ある実行において、タンパク質を発現する細胞またはファージは、アレイとして使用されるフィルター上で直接的に増殖され得る。他の実行において、組換えタンパク質産生が、タンパク質の少なくとも部分精製されたサンプルを産生するために使用される。部分精製されたサンプルまたは純粋なサンプルはアレイ上に配置される。

タンパク質アレイを産生する方法は、例えば、以下において記載されている：ＤｅＷｉｌｄｔら（２０００）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：９８９−９９４；Ｌｕｅｋｉｎｇら（１９９９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：１０３−１１１；Ｇｅ（２０００）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２８，ｅ３，Ｉ−ＶＩＩ；ＭａｃＢｅａｔｈおよびＳｃｈｒｅｉｂｅｒ（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ２８９：１７６０−１７６３；ＷＯ０１／４０８０３およびＷＯ９９／５１７７３Ａ１。アレイのためのタンパク質は、高速で、タンパク質、市販のロボット装置（例えば、ＧｅｎｅｔｉｃＭｉｃｒｏＳｙｓｔｅｍｓまたはＢｉｏＲｏｂｏｔｉｃｓからのもの）を使用してスポットされ得る。アレイ基材は、例えば、ニトロセルロース、プラスチック、ガラス、例えば、表面修飾されたガラスであり得る。例えば、このアレイは、例えば、ＤｅＷｉｌｄｔ、前出において記載されるような抗体のアレイであり得る。

（多様性）
ディスプレイライブラリーは、ディスプレイされたポリペプチド中の１つ以上の位置でバリエーションを含む。所定の位置におけるバリエーションは合成または天然のものであり得る。あるライブラリーについては、合成と天然の両方の多様性が含まれる。

（合成的多様性）。ライブラリーは、人工的に合成された配列から生じる多様な核酸配列の領域を含み得る。典型的には、これらは、各所定の位置におけるヌクレオチドの分布を含む縮重オリゴヌクレオチド集団から形成される。所定の配列の包含は、分布に関してはランダムである。合成的多様性の縮重供給源の１つの例は、ＮＮＮを含むオリゴヌクレオチドであり、ここでＮは等しい割合の４つのヌクレオチドのいずれかである。

合成的多様性はまた、例えば、ＮＮＮよりも小さな分布に所定のトリヌクレオチドにおける核酸配列中のコドンの数を制限するために、より制約され得る。例えば、このような分布は、コドンのある位置において、４ヌクレオチド未満を使用して構築され得る。さらに、トリヌクレオチド付加技術は、分布をさらに制約するために使用され得る。

いわゆる「トリヌクレオチド付加技術」は、例えば、Ｗｅｌｌｓら（１９８５）Ｇｅｎｅ３４：３１５−３２３、米国特許第４，７６０，０２５号および同第５，８６９，６４４号に記載されている。オリゴヌクレオチドは、１度に１コドン（すなわち、トリヌクレオチド）、固体支持体上で合成される。この支持体は、合成のための多くの官能基を含み、その結果、多くのオリゴヌクレオチドが並行して合成される。この支持体は、最初に、第１の位置についてのコドンのセットの混合物を含む溶液に露出される。この単位は保護され、それゆえにさらなる単位が付加されない。第１の混合物を含む溶液は洗い流され、そして固体支持体が脱保護され、それゆえに第２の位置についてのコドンのセットを含む第２の混合物が、結合した第１の単位に付加され得る。このプロセスは、複数のコドンを連続的にアセンブルするために反復される。トリヌクレオチド付加技術は、所定の位置において多数のアミノ酸をコードし得る核酸の合成を可能にする。これらのアミノ酸の頻度は、混合物中のコドンの割合によって調節され得る。所定の位置におけるアミノ酸のさらなる選択は、単一のヌクレオチドの混合物が合成の間に付加される場合と同様に、コドン表の象限に制限されない。

（天然の多様性）。ライブラリーは、異なる天然に存在する配列から生じる（またはそれに基づいて合成される）多様な核酸配列の領域を含み得る。ディスプレイライブラリーに含まれ得る天然の多様性の例は、免疫細胞中に存在する配列の多様性である（以下もまた参照のこと）。核酸はこれらの免疫細胞から調製され、ポリペプチドディスプレイについての形式に操作される。天然に存在する多様性の別の例は、異なる種の生物間の配列の多様性である。例えば、多様な核酸配列が、環境サンプル、例えば、土壌などから増幅され得、そしてディスプレイライブラリーを構築するために使用され得る。

（抗体ディスプレイライブラリー）
１つの実施形態において、ディスプレイライブラリーは、多様なポリペプチドのプールを提示し、これらの各々は、免疫グロブリンドメイン、例えば、免疫グロブリン可変ドメインを含む。ディスプレイライブラリーは、例えば、ヒト抗原を認識するヒト抗体または「ヒト化」抗体を同定するために特に有用である。このような抗体は、癌などのヒト障害を処置するための処置として使用され得る。抗体の定常領域およびフレームワーク領域はヒトであるので、これらの処置用抗体は、それら自体が、抗原として認識されかつ標的化されることを回避する可能性がある。定常領域はまた、ヒト免疫系のエフェクター機能を補充するために最適化されてもよい。インビトロディスプレイ選択プロセスは、自己抗原に対する抗体を生成することの通常のヒト免疫系の不可能性を克服する。他の型の抗体発現ライブラリーが使用され得、これには、例えば、抗体のタンパク質アレイ（例えば、ＤｅＷｉｌｄｔら（２０００）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：９８９−９９４を参照のこと）、λｇｔ１１ライブラリーなどが含まれる。

代表的な抗体ディスプレイライブラリーは、ＶＨドメインおよびＶＬドメインを含むポリペプチドを提示する。「免疫グロブリンドメイン」とは、免疫グロブリン分子の可変ドメインまたは定常ドメインからのドメインをいう。免疫グロブリンドメインは、典型的には、約７個のβ鎖から形成される２つのβシート、および保存性ジスルフィド結合を含む（例えば、Ａ．Ｆ．ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＡ．Ｎ．Ｂａｒｃｌａｙ１９８８Ａｎｎ．ＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ．６：３８１−４０５を参照のこと）。ディスプレイライブラリーは、Ｆａｂフラグメントとして（例えば、２つのポリペプチド鎖を使用して）、または単鎖Ｆｖとして（例えば、単一のポリペプチド鎖を使用して）抗体をディスプレイし得る。他の形式もまた使用され得る。

Ｆａｂおよび他の形式の場合と同様に、ディスプレイされた抗体は、軽鎖および／または重鎖の一部として、１つ以上の定常領域を含み得る。１つの実施形態において、各鎖は、例えば、Ｆａｂの場合と同様に、１つの定常領域を含む。他の実施形態において、さらなる定常領域がディスプレイされる。

抗体ライブラリーは、多数のプロセスによって構築され得る（例えば、ｄｅＨａａｒｄら（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ２７４：１８２１８−３０；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ４：１−２０およびＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（２０００）ＩｍｍｕｎｏｌＴｏｄａｙ２１：３７１−８を参照のこと）。さらに、各プロセスの要素は、他のプロセスの要素と組み合わせられ得る。これらのプロセスは、バリエーションが単一の免疫グロブリンドメイン（例えば、ＶＨまたはＶＬ）、または複数の免疫グロブリンドメイン（例えば、ＶＨおよびＶＬ）に導入される。このバリエーションは、免疫グロブリン可変ドメインに、例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４の１つ以上の領域中に、重鎖および軽鎖の可変ドメインのいずれかおよびその両方のこのような領域を参照して、導入され得る。１つの実施形態において、バリエーションは、所定の可変ドメインの３つすべてのＣＤＲに導入される。別の好ましい実施形態において、このバリエーションは、例えば、重鎖可変ドメインのＣＤＲ１およびＣＤＲ２に導入される。任意の組み合わせが実行可能である。１つのプロセスにおいて、抗体ライブラリーは、核酸の対応する領域にＣＤＲをコードする多様なオリゴヌクレオチドを挿入することによって構築される。これらのオリゴヌクレオチドは、モノマー性ヌクレオチドまたはトリヌクレオチドを使用して合成され得る。例えば、Ｋｎａｐｐｉｋら（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７−８６は、トリヌクレオチド合成およびオリゴヌクレオチドを受容する操作された制限部位を有する鋳型を使用して、オリゴヌクレオチドをコードするＣＤＲを構築するための方法を記載している。

別のプロセスにおいて、動物、例えば、齧歯類がＥＴ２で免疫される。この動物は、必要に応じて、応答をさらに刺激するために抗原でブーストされる。次いで、脾臓細胞が動物から単離され、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインをコードする核酸が、ディスプレイライブラリー中での発現のために増幅およびクローニングされる。

なお別のプロセスにおいて、抗体ライブラリーは、未処置の生殖系列免疫グロブリン遺伝子から増幅された核酸から構築される。増幅された核酸は、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインをコードする核酸を含む。免疫グロブリンをコードする核酸の供給源は以下に記載される。増幅は、例えば、保存性定常領域にアニーリングされるプライマーを用いるＰＣＲ、または別の増幅方法を含み得る。

免疫グロブリンドメインをコードする核酸は、例えば、ヒト、霊長類、マウス、ウサギ、ラクダ、または齧歯類の免疫細胞から得られ得る。１つの例において、細胞は、特定の特性について選択される。成熟の種々の段階のＢ細胞が選択され得る。別の例において、Ｂ細胞は未処置である。

１つの実施形態において、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）が、表面結合したＩｇＭ、ＩｇＤ、またはＩｇＧ分子を発現するＢ細胞を分別するために使用される。さらに、ＩｇＧの異なるアイソタイプを発現するＢ細胞が単離され得る。別の好ましい実施形態において、Ｂ細胞またはＴ細胞がインビトロで培養される。これらの細胞は、例えば、フィーダー細胞と用いる培養によって、またはマイトジェンもしくは他の調節試薬、例えば、ＣＤ４０に対する抗体、ＣＤ４０リガンドもしくはＣＤ２０、ホルボールミリストレート酢酸塩、細菌リポポリサッカリド、コンカナバリンＡ、フィトヘマグルチニンまたはヤマゴボウマイトジェンなどを加えることによってインビトロで刺激され得る。

なお別の実施形態において、細胞は、免疫学的障害、例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ、脈管炎、シェーグレン病、全身性硬化症、または抗リン脂質症候群を有する被験体から単離される。この被験体はヒト、または動物（例えば、ヒト疾患の動物モデル、もしくは類似の障害を有する動物）であり得る。なお別の実施形態において、細胞は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むトランスジェニック非ヒト動物から単離される。

１つの好ましい実施形態において、細胞は、体細胞超変異のプログラムを活性化している。細胞は、例えば、抗免疫グロブリン抗体、抗ＣＤ４０抗体、および抗ＣＤ３８抗体を用いる処理によって、免疫グロブリン遺伝子の体細胞変異誘発を受けるように刺激され得る（例えば、Ｂｅｒｇｔｈｏｒｓｄｏｔｔｉｒら（２００１）ＪＩｍｍｕｎｏｌ．１６６：２２２８を参照のこと）。別の実施形態において、細胞は未処置である。

免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸は、以下の実験方法によって天然のレパートリーから単離され得る。第１に、ＲＮＡが免疫細胞から単離される。全長（すなわち、キャップされている）ｍＲＮＡが単離される（例えば、仔ウシ腸ホスファターゼを用いる未キャップＲＮＡの分解によって）。次いで、キャップが、タバコ酸性ホスファターゼを用いて除去され、そして逆転写が使用されてｃＤＮＡを産生する。

第１（アンチセンス）鎖の逆転写は、任意の適切なプライマーを用いて任意の様式で行われ得る。例えば、ｄｅＨａａｒｄら（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ２７４：１８２１８−３０を参照のこと。プライマー結合領域は、例えば、免疫グロブリンの異なるアイソタイプを逆転写するために、異なる免疫グロブリン間で一定であり得る。プライマー結合領域はまた、免疫グロブリンの特定のアイソタイプに特異的であり得る。典型的には、プライマーは、少なくとも１つのＣＤＲをコードする配列に対して３’である領域について特異的である。別の実施形態において、ポリ−ｄＴプライマーが使用されてもよい（および重鎖遺伝子について好ましいかもしれない）。

合成配列は、逆転写された鎖の３’末端にライゲーションされ得る。合成配列は、逆転写後のＰＣＲ増幅の間にフォワードプライマーの結合のためのプライマー結合部位として使用され得る。合成配列の使用は、利用可能な多様性を十分に捕捉するために、異なるフォワードプライマーのプールを使用する必要性を取り除き得る。

次いで、可変ドメインコード遺伝子が、例えば、１回以上のラウンドを使用して増幅される。複数のラウンドが使用される場合、ネスト化プライマーが、忠実度を増加させるために使用され得る。次いで、増幅された核酸が、ディスプレイライブラリーベクターにクローニングされる。

核酸配列を増幅するための方法が、増幅のために使用されてもよい。多様性を最大化しこれを偏向しない方法が好ましい。種々の技術が核酸増幅のために使用され得る。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号、Ｓａｉｋｉら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３０，１３５０−１３５４）は、核酸合成のラウンドを駆動するために温度を変化させるサイクルを利用する。転写に基づく方法は、核酸を増幅するためにＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ合成を利用する（米国特許第６，０６６，４５７号；同第６，１３２，９９７号；同第５，７１６，７８５号；Ｓａｒｋａｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：３３１−３４；Ｓｔｏｆｌｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２３９：４９１）。ＮＡＳＢＡ（米国特許第５，１３０，２３８号；同第５，４０９，８１８号；および同第５，５５４，５１７号）は、ＤＮＡサンプルを増幅するために、転写、逆転写、およびＲｎａｓｅＨに基づく分解を利用する。なお他の増幅方法には、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ；米国特許第５，８５４，０３３号および同第６，１４３，４９５号）ならびに鎖置換増幅（ＳＤＡ；米国特許第５，４５５，１６６号および同第５，６２４，８２５号）が含まれる。

（二次スクリーニング法）
標的に結合する候補ディスプレイライブラリーメンバーを選択する後で、各候補ディスプレイメンバーは、例えば、標的についてのその結合特性をさらに特徴付けするためにさらに分析され得る。各候補ディスプレイライブラリーメンバーは、１回以上の二次スクリーニングアッセイに供せられ得る。このアッセイは、結合特性、触媒特性、阻害特性、生理学的特性（例えば、細胞傷害性、腎臓クリアランス、免疫原性）、構造的特性（例えば、細胞傷害性、オリゴマー化状態）、または別の機能的特性についてであり得る。同じアッセイが、例えば、ｐＨ、イオン、または熱の感受性を決定するために、種々の条件を用いて反復して使用され得る。

適切な場合、アッセイは、ディスプレイライブラリーメンバーを直接的に使用し得、ディスプレイされたポリペプチドをコードする核酸から産生された組換えポリペプチドを使用し得、またはディスプレイされたペプチドの配列に基づいて合成された合成ペプチドを使用し得る。結合特性についての例示的アッセイには以下が含まれる：
（ＥＬＩＳＡ）。ディスプレイライブラリーによってコードされるポリペプチドはまた、ＥＬＩＳＡアッセイを使用する結合特性についてスクリーニングされ得る。例えば、各ポリペプチドは、マイクロタイタープレートに接触され、その底面は標的（例えば、限定量の標的）でコートされている。このプレートは、非特異的に結合したポリペプチドを除去するために緩衝液で洗浄される。次いで、プレートに結合したポリペプチドの量が、ポリペプチド（例えば、ポリペプチドのタグまたは一定の部分）を認識し得る抗体を用いてプレートをプローブすることによって決定される。この抗体は、アルカリホスファターゼなどの酵素に連結され、これは、適切な基質が供給される場合に、比色分析用生成物を産生する。このポリペプチドは、細胞から精製され得、またはディスプレイライブラリー形式において、例えば、糸状バクテリオファージコートへの融合物として、アッセイされ得る。別のバージョンのＥＬＩＳＡアッセイにおいて、多様な鎖ライブラリーの各ポリペプチドは、マイクロタイタープレートの異なるウェルをコートするために使用される。次いで、ＥＬＩＳＡが、各ウェルを照会するための一定の標的分子を使用して進行する。

（均質結合アッセイ）。候補ポリペプチドの標的との結合相互作用は、均質アッセイを使用して分析され得、すなわち、アッセイのすべての成分が加えられた後で、さらなる液体操作は必要とされない。例えば、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が均質アッセイとして使用され得る（例えば、Ｌａｋｏｗｉｃｚら、米国特許第５，６３１，１６９号；Ｓｔａｖｒｉａｎｏｐｏｕｌｏｓら、米国特許第４，８６８，１０３号を参照のこと）。第１の分子（例えば、画分中で同定された分子）上のフルオロフォア標識は、その発光蛍光エネルギーが、第２の分子が第１の分子に対して近接している場合に、その第２の分子（例えば、標的）上の蛍光標識によって吸収され得るように選択される。第２の分子上の蛍光標識は、それが移動したエネルギーに吸収される場合に、蛍光を発する。標識間のエネルギー移動の効率は分子の間隔をあける距離に関連するので、分子間の空間的な関連性が評価され得る。結合が分子間で起こる状況において、アッセイにおける「アクセプター」分子の蛍光発光は最大であるべきである。ＦＲＥＴによってモニターされるために構成される結合事象は、当該分野において周知である標準的な蛍光検出手段を通して（例えば、蛍光測定装置を使用して）首尾よく測定され得る。第１および第２の結合分子の量を滴定することによって結合曲線が、平衡結合定数を見積もるために生成され得る。

均質アッセイの別の例は、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（ＰａｃｋａｒｄＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＭｅｒｉｄｅｎＣＴ）である。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎは、２つの標識されたビーズを使用する。１つのビーズは、レーザーによって励起されたときにシングレット酸素を生成する。他方のビーズは、シングレット酸素が第１のビーズから発散し、それと衝突するときに光シグナルを生成する。この四Ｇｕａｎルシフェラーゼは、２つのビーズが近接しているときのみに生成する。１つのビーズは、ディスプレイライブラリーメンバーに結合し得、他方は標的に結合し得る。シグナルは、結合の程度を決定するために測定される。

均質アッセイは、候補ポリペプチドがディスプレイライブラリービヒクル、例えば、バクテリオファージに結合される間に実行され得る。

（表面プラズモン共鳴（ＳｕｒｆａｃｅＰｌａｓｍｏｎＲｅｓｏｎａｎｃｅ）（ＳＰＲ））。ディスプレイライブラリーから単離された分子および標的の結合相互作用はＳＰＲを使用して分析され得る。ＳＰＲまたは生体分子相互作用分析（ＢｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎＡｎａｌｙｓｉｓ）（ＢＩＡ）は、いずれの反応体を標識することもなく、リアルタイムで二特異性相互作用を検出する。ＢＩＡチップの結合表面における質量の変化（結合事象の指標である）は、表面の近傍の光の屈折率の変化を生じる（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学的現象）。屈折度の変化は検出可能なシグナルを生成し、これは、生物学的分子間のリアルタイム反応の指標として測定される。ＳＰＲを使用するための方法は、例えば、米国特許第５，６４１，６４０号；Ｒａｅｔｈｅｒ（１９８８）ＳｕｒｆａｃｅＰｌａｓｍｏｎＳｐｒｉｎｇｅｒＶｅｒｌａｇ；ＳｊｏｌａｎｄｅｒおよびＵｒｂａｎｉｃｚｋｙ（１９９１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２３３８−２３４５Ｓｚａｂｏら（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６９９−７０５ならびにＢＩＡｃｏｒｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＡＢ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）によって供給されているオンライン情報源に記載されている。

ＳＰＲからの情報は、標的への生体分子の結合についての平衡解離定数（Ｋ_ｄ）および反応速度論的パラメーター（Ｋ_ｏｎおよびＫ_ｏｆｆを含む）の正確かつ定量的な測定を提供するために使用され得る。このようなデータは、異なる生体分子を比較するために使用され得る。例えば、多様な鎖のライブラリーから選択される核酸によってコードされるタンパク質は、標的に対して高い親和性を有する、または遅いＫ_ｏｆｆを有する個体を同定するために比較され得る。この情報はまた、構造−活性相関（ＳＡＲ）を構築するために使用され得る。例えば、成熟バージョンの親のタンパク質の反応速度論的パラメーターおよび平衡結合パラメーターは、親のタンパク質のパラメーターと比較され得る。特定の結合パラメーター（例えば、高い親和性および遅いＫ_ｏｆｆ）と相関する、所定の位置におけるバリアントアミノ酸が同定され得る。この情報は、構造的モデリングと組み合わせ得る（例えば、相同性モデリング、エネルギー最小化、またはｘ線結晶学もしくはＮＭＲによる構造決定を使用する）。結果として、タンパク質とその標的との間の物理的相互作用の理解は、他の設計プロセスを導くために、考案および使用され得る。

（タンパク質アレイ）。ディスプレイライブラリーから同定されたポリペプチドは、固体支持体上に、例えば、ビーズまたはアレイ上に固定化され得る。タンパク質アレイについては、ポリペプチドの各々が、支持体上の独特のアドレスに固定化される。典型的には、このアドレスは二次元アドレスである。タンパク質アレイは以下に記載される（例えば、診断を参照のこと）。

（細胞アッセイ）。候補ポリペプチドのライブラリー（ディスプレイライブラリーまたは他のライブラリーによって以前に同定されたもの）が、宿主細胞にライブラリーを形質転換することによってスクリーニングされ得る。例えば、このライブラリーは、ポリペプチドをコードし発現を指向し、例えば、その結果、ポリペプチドが細胞内で産生され、細胞から分泌され、または細胞表面に結合される、ベクター核酸配列を含み得る。細胞は、ＥＴ２に結合するポリペプチドについて、例えば、細胞表現型または細胞媒介活性の変化によって検出されるように、スクリーニングされ得る。例えば、ＥＴ２に結合する抗体の場合において、活性は、細胞または補体媒介細胞傷害性であってもよい。

（自動化）
１つの実施形態において、スクリーニング方法の少なくともいくつかの態様が自動化される。自動化方法は、例えば、結合相互作用または酵素相互作用（例えば、ＥＴ２活性の阻害）などの、ＥＴ２との相互作用を検出するために、抗スループットスクリーニングのために使用され得る。例えば、一次スクリーニングから単離され候補リガンドをコードしているクローンは、アレイ化形式で保存される（例えば、マイクロタイタープレート）。ロボットデバイスは、種々の形式で、例えば、ＥＬＩＳＡ（精製されたリガンドまたはリガンドをファージディスプレイすることを使用する）、酵素アッセイ、細胞ベースのアッセイなどで、候補リガンドの各々についてのアッセイを設定するために自動的に制御され得る。酵素活性は、例えば、分光学的に、比色分析的に、質量スペクトル分析法を使用して、などを含む種々の方法のいずれかによって検出され得る。

特定のアッセイ、例えば、結合アッセイ、活性アッセイ、または細胞ベースのアッセイについて各クローンの実行を示すデータは、データベース中に保存され得る。ソフトウェアは、データベースにアクセスするため、および特定の判断基準に合致する、例えば、アッセイについての閾値を超過するクローンを選択するために使用され得る。次いで、ソフトウェアは、保存されたアレイから選択されたクローンを拾い上げ、リガンドをコードする核酸を調製し、リガンドそれ自体を調製し、ならびに／または、それらのメンバーが最初に拾い上げたリガンドの変異されたバリアントである二次ライブラリーを産生およびスクリーニングするようにロボットアームに指示し得る。

オートメーションプロセスにおいて利用され得る種々のロボットデバイスには、μうちウェルプレート運搬システム、磁気ビーズ粒子プロセッサ、液体取り扱いユニット、コロニー拾い上げユニットが含まれる。これらのデバイスは、商業的な供給源、例えば、Ａｕｔｏｇｅｎ（ＦｒａｍｉｎｇｈａｍＭＡ）、ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ（ＵＳＡ）、Ｂｉｏｒｏｂｏｔｉｃｓ（ＷｏｂｕｒｎＭＡ）、Ｇｅｎｅｔｉｘ（ＮｅｗＭｉｌｔｏｎ，ＨａｍｐｓｈｉｒｅＵＫ）、Ｈａｍｉｌｔｏｎ（ＲｅｎｏＮＶ）、Ｈｕｄｓｏｎ（ＳｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄＮＪ）、Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｅｌｓｉｎｋｉ，Ｆｉｎｌａｎｄ）、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＬｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＷｅｌｌｓｅｌｅｙＭＡ）、ＰａｃｋａｒｄＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（ＭｅｒｉｄｅｎＣＴ）、およびＴｅｃａｎ（Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から、特別仕様で構築されるか、または購入され得る。

（ＥＴ２結合抗体を得るための方法）
ディスプレイライブラリーの使用に加えて、他の方法が、ＥＴ２結合抗体を得るために使用され得る。例えば、ＥＴ２タンパク質またはその領域は、非ヒト動物、例えば、齧歯類において抗原として使用され得る。

１つの実施形態において、この非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子の少なくとも一部を含む。例えば、マウス抗体産生において欠損しているマウス株を、ヒトＩｇ遺伝子座の大きなフラグメントを用いて操作ことが可能である。ハイブリドーマ技術を使用して、所望の特異性を有する遺伝子に由来する抗原特異的Ｍａｂが、産生および選択され得る。例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）、Ｇｒｅｅｎら、ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ７：１３−２１（１９９４）、Ｕ．Ｓ．２００３−００７０１８５、ＷＯ９６／３４０９６（１９９６年１０月３１日公開）、およびＰＣＴ公開番号ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５９２８（１９９６年４月２９日出願）を参照のこと。

別の実施形態において、モノクローナル抗体が非ヒト動物から得られ、次いで修飾される（例えば、ヒト化または脱免疫される）。Ｗｉｎｔｅｒは、本明細書のヒト化抗体を調製するために使用されてもよいＣＤＲ移植法を記載している（１９８７年３月２６日に出願されたＵＫ特許出願ＧＢ２１８８６３８Ａ；米国特許第５，２２５，５３９号）。特定のヒト抗体のＣＤＲのすべてが非ヒトＣＤＲの少なくとも一部で置き換えられてもよく、またはＣＤＲのいくつかのみが非ヒトＣＤＲで置き換えられてもよい。所定の抗原へのヒト化抗体の結合のために必要とされる数のＣＤＲを置き換えることのみが必要である。

ヒト化抗体は、ヒトＦｖ可変領域からの等価な配列との抗原結合には直接的には関与しないＦｖ可変領域の配列を置き換えることによって生成され得る。ヒト化抗体を生成するための一般的な方法は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ２２９：１２０２−１２０７によって、Ｏｉら、１９８６，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ４：２１４によって、およびＱｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、および同第５，６９３，７６２号によって提供される。これらの方法は、重鎖または軽鎖の少なくとも１つから、免疫グロブリンＦｖ可変領域のすべてまたは一部をコードする核酸配列を単離、操作、および発現する工程を包含する。このような核酸の供給源は当業者に周知であり、例えば、上記に記載されるように、所定の標的に対する抗体を産生するハイブリドーマから得られてもよい。次いで、ヒト化抗体またはそのフラグメントをコードする組換えＤＮＡは、適切な発現ベクターにクローニングされ得る。

ＥＴ２結合抗体はまた、ＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００／３４３１７（これらの内容は参照として本明細書に具体的に援用される）において開示される方法によって、ヒトＴ細胞エピトープの特異的欠失によって修飾されてもよく、または「脱免疫」されてもよい。手短に述べると、抗体の重鎖および軽鎖の可変領域は、ＭＨＣクラスＩＩに結合するペプチドについて分析され得る；これらのペプチドは、潜在的なＴ細胞エピトープを提示する（ＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００／３４３１７に定義される通りである）。潜在的なＴ細胞エピトープの検出のために、「ペプチドスレッディング」と呼ばれるコンピュータモデリングアプローチが適用され得、さらに、ヒトＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドのデータベースが、ＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００／３４３１７に記載されるように、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌの配列中に存在するモチーフについて検索され得る。これらのモチーフは、１８個の主要なＭＨＣクラスＩＩＤＲアロタイプのいずれかに結合し、従って、潜在的なＴ細胞エピトープを構成する。検出された潜在的なＴ細胞エピトープは、可変領域中の少数のアミノ酸残基を置換することによって、または好ましくは単一アミノ酸置換によって、除去され得る。可能な保存性置換が作製される限り、しばしば、しかし独占的ではなく、ヒト生殖系列抗体配列におけるこの位置で共通のアミノ酸が使用されてもよい。ヒト生殖系列配列は、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ａ．ら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８；Ｃｏｏｋ，Ｇ．Ｐ．ら（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ第１６巻（５）：２３７−２４２；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｄ．ら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２２７：７９９−８１７に開示されている。ＶＢＡＳＥディレクトリは、ヒト免疫グロブリン可変領域配列の包括的なディレクトリを提供する（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ａ．ら、ＭＲＣＣｅｎｔｒｅｆｏｒＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫによって編集されている）。脱免疫変化が同定された後、ＶＨおよびＶＬをコードする核酸は、変異誘発または他の合成方法（例えば、デノボ合成、カセット置換など）によって構築され得る。変異誘発された可変配列は、必要に応じて、ヒト定常領域、例えば、ヒトＩｇＧ１またはκ定常領域に融合され得る。

ある場合において、潜在的なＴ細胞エピトープは、抗体機能のために重要であることが知られているか、またはそのことが予測されている残基を含む。例えば、潜在的なＴ細胞エピトープは、ＣＤＲに向けて通常偏向している。さらに、潜在的なＴ細胞エピトープは、抗体の構造および結合のために重要なフレームワーク残基において存在し得る。これらの潜在的なエピトープを除外するための変化は、ある場合において、例えば、変化を有するかまたは有さない鎖を作製および試験することによって、より多くの精査を必要とする。可能である場合、ＣＤＲと重複するＴ細胞エピトープは、ＣＤＲの外側の置換によって除外された。ある場合において、ＣＤＲ内の変化は任意選択のみであり、従って、この置換を有し、および有さないバリアントが試験されるべきである。他の場合において、潜在的なＴ細胞エピトープを除外するために必要とされる置換は、抗体結合のために決定的であるかもしれないフレームワーク中の残基位置においてである。これらの場合において、この置換を有するバリアント、およびこの置換を有さないバリアントが試験されるべきである。従って、ある場合において、いくつかのバリアントの脱免疫された重鎖および軽鎖の可変領域が設計され、そして種々の重鎖／軽鎖の組み合わせが、最適な脱免疫化抗体を同定するために試験された。次いで、最終的な脱免疫された抗体の選択は、脱免疫化の程度、すなわち、可変領域に残存する潜在的なＴ細胞エピトープの数とともに、異なるバリアントの結合親和性を考慮することによってなされ得る。脱免疫化は、任意の抗体、例えば、ヒト配列を含む抗体、例えば、合成抗体、マウス抗体、他の非ヒトモノクローナル抗体、またはディスプレイライブラリーから単離された抗体を修飾するために使用され得る。

（生殖系列抗体）
１つ以上の生殖系列配列により類似する抗体の可変領域を作製するために、ＥＴ２を結合する抗体、例えば、本明細書に記載される抗体を修飾することが可能である。例えば、抗体は、例えば、フレームワークまたはＣＤＲ領域において、それを参照生殖系列配列により類似させるために、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上のアミノ酸置換を含み得る。１つの例示的な生殖系列法は、単離された抗体の配列に類似する（例えば、特定のデータベースにおいて最も類似する）１つ以上の生殖系列配列を同定する工程を包含し得る。次いで、変異（アミノ酸レベルにおける）が、単離された抗体において、増加的に、組み合わせて、またはその両方のいずれかで作製され得る。例えば、いくつかのまたはすべての可能な生殖系列変異をコードする配列を含む核酸ライブラリーが作製される。次いで、変異した抗体は、例えば、単離された抗体と比較して１つ以上のさらなる生殖系列残基を有しなお有用である（例えば、機能的活性を有する）抗体を同定するために評価される。１つの実施形態において、可能な限り、多くの生殖系列残基が、単離された抗体に導入される。

１つの実施形態において、変異誘発は、ＣＤＲ領域に１つ以上の生殖系列残基を置換または挿入するために使用される。例えば、生殖系列ＣＤＲ残基は、修飾される可変領域に類似する（例えば、最も類似する）生殖系列配列からであり得る。変異誘発後、抗体の活性（例えば、結合活性または他の機能的活性）が、生殖系列残基が許容されるか否かを決定するために評価され得る。類似の変異誘発がフレームワーク領域において実行され得る。

生殖系列配列を選択することは、異なる方法で実行され得る。例えば、生殖系列配列は、これが選択性または類似性についての所定の判断基準（例えば、少なくとも特定の同一性パーセント、例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％の同一性）に合致する場合に、選択され得る。選択は、少なくとも２個、３個、５個、または１０個の生殖系列配列を使用して実行され得る。ＣＤＲ１およびＣＤＲ２の場合において、類似の生殖系列配列を同定することは、１つのこのような配列を選択することを含み得るが、別々にアミノ末端部分およびカルボキシ末端部分に寄与する２つの生殖系列配列を使用することを含んでもよい。他の実行において、１つまたは２つより多くの生殖系列配列が、例えば、コンセンサス配列を形成するために使用される。

１つの実施形態において、特定の参照可変ドメイン配列、例えば、本明細書に記載される配列に関して、関連する可変ドメイン配列は、参照ＣＤＲ配列の残基、ヒト生殖系列配列における対応する位置の残基と同一である残基（すなわち、ヒト生殖系列核酸によってコードされるアミノ酸配列）とは同一ではない、ＣＤＲアミノ酸位置の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％を有する。

１つの実施形態において、特定の参照可変ドメイン配列、例えば、本明細書に記載される配列に関して、関連する可変ドメイン配列は、ヒト生殖系列配列からのＦＲ配列、例えば、参照可変ドメイン配列に関連する生殖系列配列の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％を有する。

従って、目的の所定の抗体に対して類似の活性を有するが、１つ以上の生殖系列配列（特に、１つ以上のヒト生殖系列配列）により類似する抗体を単離することが可能である。例えば、抗体は、ＣＤＲ（例えば、フレームワーク領域）の外側の領域において、生殖系列配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％の同一性であり得る。さらに、抗体は、ＣＤＲ領域中の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの生殖系列残基を含み得、この生殖系列残基は、修飾される可変領域に対して類似する（例えば、最も類似する）生殖系列配列からである。第１の目的の生殖系列配列は、ヒト生殖系列配列である、抗体の活性（例えば、結合活性）は、もともとの抗体の１００、１０、５、２、０．５、０．１、および０．００１の因数内であり得る。

Ｖκについての例示的な生殖系列参照配列には以下が含まれる：０１２／０２、０１８／０８、Ａ２０、Ａ３０、Ｌ１４、ＬＩ、Ｌ１５、Ｌ４／１８ａ、Ｌ５／Ｌ１９、Ｌ８、Ｌ２３、Ｌ９、Ｌ２４、Ｌ１１、Ｌ１２、０１１／０１、Ａ１７、Ａｌ、Ａ１８、Ａ２、Ａ１９／Ａ３、Ａ２３、Ａ２７、Ａｌｌ、Ｌ２／Ｌ１６、Ｌ６、Ｌ２０、Ｌ２５、Ｂ３、Ｂ２、Ａ２６／Ａ１０、およびＡ１４。例えば、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら（１９９５）ＥＭＢＯＪ．１４（１８）：４６２８−３を参照のこと。

ＨＣ可変ドメインについての生殖系列参照配列は、Ｈ１およびＨ２超可変ループにおける特定の標準的構造、例えば、１−３構造を有する配列に基づき得る。免疫グロブリン可変ドメインの超可変ループの標準的構造は、Ｃｈｏｔｈｉａら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７９９−８１７；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８）；およびＴｏｍｌｉｎｓｏｎら（１９９５）ＥＭＢＯＪ．１４（１８）：４６２８−３８に記載されるように、その配列から推測され得る。１−３構造を有する例示的な配列は、ＤＰ−１、ＤＰ−８、ＤＰ−１２、ＤＰ−２、ＤＰ−２５、ＤＰ−１５、ＤＰ−７、ＤＰ−４、ＤＰ−３１、ＤＰ−３２、ＤＰ−３３、ＤＰ−３５、ＤＰ−４０、７−２、ｈｖ３００５、ｈｖ３００５ｆ３、ＤＰ−４６、ＤＰ−４７、ＤＰ−５８、ＤＰ−４９、ＤＰ−５０、ＤＰ−５１、ＤＰ−５３、およびＤＰ−５４を含む。

（リガンド産生）
標準的な組換え核酸方法が、ＥＴ２に結合するタンパク質リガンドを発現するために使用され得る。一般的に、タンパク質リガンドをコードする核酸配列は、核酸発現ベクターにクローニングされる。当然、タンパク質が複数のポリペプチド鎖を含む場合、各鎖は、発現ベクター、例えば、同じ細胞または異なる細胞において発現される同じまたは異なるベクターにクローニングされなければならない。

（抗体産生）。ある抗体（例えば、Ｆａｂ）は、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞）中で産生され得る。例えば、Ｆａｂが、ディスプレイ実体およびバクテリオファージタンパク質（またはそのフラグメント）の間で抑制可能な終止コドンを含むファージディスプレイベクター中の配列によってコードされる場合、ベクター核酸は、終止コドンを抑制可能でない細菌細胞に移動され得る。この場合において、Ｆａｂは遺伝子ＩＩＩタンパク質に融合されず、ペリプラズムおよび／または培地に分泌される。

抗体はまた、真核生物細胞中で産生され得る。１つの実施形態において、抗体（例えば、ｓｃＦｖ）は、Ｐｉｃｈｉａ（例えば、Ｐｏｗｅｒｓら（２００１）ＪｌｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄｓ．２５１：１２３−３５を参照のこと）、Ｈａｎｓｅｕｌａ、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓなどの酵母細胞中で発現される。

１つの好ましい実施形態において、抗体は、哺乳動物細胞中で産生される。クローン抗体またはその抗原結合フラグメントを発現するための好ましい哺乳動物宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（ｄｅｓｃｒｉｂｅｄｉｎＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：４２１６−４２２０によって記載されているｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含み、ＤＨＦＲ選択マーカーとともに、例えば、ＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ（１９８２）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１において記載されるように使用される）、リンパ細胞株、例えば、ＮＳ０ミエローマ細胞およびＳＰ２細胞、ＣＯＳ細胞、およびトランスジェニック動物（例えば、トランスジェニック哺乳動物）からの細胞が含まれる。例えば、この細胞は哺乳動物上皮細胞である。

多様化された免疫グロブリンドメインをコードする核酸配列に加えて、組換え発現ベクターは、さらなる配列、例えば、宿主細胞中でベクターの複製を調節する配列（例えば、複製の起点）および選択マーカー遺伝子などを有してもよい。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，６３４，６６５号、および５，１７９，０１７号を参照のこと）。例えば、典型的には、選択マーカーは、ベクターが導入された宿主細胞に、薬物（例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、またはメトトレキサートなど）に対する耐性を付与する。好ましい選択マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅を用いるｄｈｆｒ宿主細胞における使用のため）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）を含む。

本発明の抗体、またはその抗原結合部分の組換え発現のための例示的な系において、抗体の重鎖と抗体の軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターが、リン酸カルシウム媒介トランスフェクションによって、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞に導入される。組換え発現ベクターにおいて、抗体の重鎖および軽鎖の遺伝子は、各々、エンハンサー／プロモーター調節エレメント（例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、アデノウイルスなどに由来、ＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメントまたはＳＶ４０エンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメントなど）に作動可能に連結され、高いレベルの遺伝子の転写を駆動する。組換え発現ベクターはまた、メトトレキサート選択／増幅を使用して、ベクターでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の選択を可能にする、ＤＨＦＲ遺伝子を有する。選択された形質転換体宿主細胞は、抗体の重鎖および軽鎖の発現を可能にするために培養され、インタクトな抗体が培養培地から回収される。標準的な分子生物学的技術が使用されて、組換え発現ベクターを調製し、宿主細胞をトランスフェクトし、形質転換体を選択し、宿主細胞を培養し、そして培養培地から抗体を回収する。例えば、ある抗体は、プロテインＡまたはプロテインＧがカップリングされた担体を用いるアフィニティークロマトグラフィーによって単離され得る。

Ｆｃドメインを含む抗体について、抗体産生系は、好ましくは、Ｆｃ領域がグリコシル化されている抗体を合成する。例えば、ＩｇＧ分子のＦｃドメインは、ＣＨ２ドメインのアスパラギン２９７でグリコシル化されている。このアスパラギンは、二アンテナ（ｂｉａｎｔｅｎｎａｒｙ）型オリゴサッカリドを用いる修飾のための部位である。このグリコシル化は、Ｆｃγレセプターおよび補体Ｃ１ｑによって媒介されるエフェクター機能のために必要とされることが実証されてきた（ＢｕｒｔｏｎおよびＷｏｏｆ（１９９２）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５１：１−８４；Ｊｅｆｆｅｒｉｓら（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１６３：５９−７６）。１つの実施形態において、Ｆｃドメインは、アスパラギン２９７に対応する残基を適切にグリコシル化する哺乳動物発現系において産生される。Ｆｃドメインはまた、他の真核生物の翻訳後修飾を含み得る。

抗体はまた、トランスジェニック動物によって産生され得る。例えば、米国特許第５，８４９，９９２号は、トランスジェニック動物の乳腺において抗体を発現する方法を記載している。乳特異的プロモーターおよび目的の抗体をコードする核酸および分泌のためのシグナル配列を含む導入遺伝子が構築される。このようなトランスジェニック哺乳動物の雌によって産生される乳は、そこに分泌された目的の抗体を含む。この抗体は、乳から精製され得るか、またはある応用のためには、直接的に使用される。

トランスジェニック動物の生成は当該分野において周知である。トランスジェニックマウスを作製するための１つの方法は以下の通りである。手短に述べると、抗体をコードする標的化構築物は、受精した卵母細胞の雄性前核にマイクロインジェクションされる。この卵母細胞は、生存可能な仔に、発生のために、偽妊娠したフォスターマザーの子宮に注入する。いくつかの子孫は導入遺伝子を組み込んでいた。

（ＥＴ２リガンドについてのアッセイ系）
潜在的なＥＴ２リガンドは、ＥＴ２またはそのフラグメントに向けたそれらの調節活性を測定するアッセイにおいてインビボおよびインビトロでさらに特徴付けされ得る。例えば、ＥＴ２は、基質とのＥＴ２の反応を可能にするアッセイ条件下で、基質と組み合わせられ得る。このアッセイは、潜在的なＥＴ２リガンドの非存在下で、および潜在的なＥＴ２リガンドの濃度の増加の存在下で実行される。ＥＴ２活性の５０％が試験化合物によって阻害されるリガンドの濃度は、この化合物についてのＩＣ_５０値（阻害濃度）およびＥＣ_５０（有効濃度）値である。一連の試験リガンドまたはその群の中において、より低いＩＣ_５０値またはＥＣ_５０値を有するものは、より高いＩＣ_５０値またはＥＣ_５０値を有する化合物よりも、より強力なＥＴ２のインヒビターと見なされる。好ましいリガンドは、ＥＴ２活性の阻害についてのインビトロアッセイにおいて測定される場合に、１００ｎＭ未満のＩＣ_５０値を有する。

これらのリガンドはまた、ＥＴ２に向けた選択性について評価され得る。例えば、潜在的なＥＴ２リガンドは、ＥＴ２およびセリンプロテアーゼおよび他の酵素のパネルに向けたその効力についてアッセイされ得、そしてＩＣ_５０値またはＥＣ_５０値が各酵素標的についえ決定され得る。１つの実施形態において、ＥＴ２についての低いＩＣ_５０値またはＥＣ_５０値、および試験パネル中の他の酵素（例えば、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、トロンビン、第Ｘａ因子）についてより高いＩＣ_５０値またはＥＣ_５０値を実証する化合物は、ＥＴ２に向けて選択性であると見なされる。１つの実施形態において、ＥＴ２について低いＩＣ_５０値またはＥＣ_５０値、およびＥＴ２よりもＥＴ１についてより高いＩＣ_５０値またはＥＣ_５０値を実証する化合物は、ＥＴ２に向けて選択性であると見なされる。

潜在的なＥＴ２リガンドはまた、インビボでそれらの活性について評価され得る。例えば、エンドセリアーゼの阻害を通して腫瘍増殖を減少するリガンドの能力を評価するために、ＰＡＩ−１を評価するためにＪａｎｋｕｎら、Ｃａｎｅ．Ｒｅｓ．，５７：５５９−５６３（１９９７）によって記載される手順が利用され得る。手短に述べると、ＡＴＣＣ細胞株ＤＵ１４５およびＬｎＣａＰがＳＣＩＤマウスに注入される。腫瘍が樹立された後、マウスは試験リガンドを投与される。腫瘍体積測定が約５週間にわたって２回行われる。適切なコントロール化合物（例えば、非特異的抗体分子）を受容する動物と比較して、リガンドが投与された動物が腫瘍体積の減少を示した場合に、このアッセイにおいて活性であると見なされ得る。

転移の出現を減少する、または転移を阻害するリガンドの能力を評価するために、Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃ．，５７：７２７−７３３ｄ（１９９４）によって記載される手順が利用され得る。手短に述べると、マウス異種移植片は、Ｃ５７Ｂ１／６マウスに静脈内に（実験的転移）または腹壁（自発的転移）に皮下的に注射された高度な肺コロニー形成潜在能力について選択される。試験される種々の濃度の化合物が、注射の前にＭａｔｒｉｇｅｌ中で腫瘍細胞と混合され得る。試験化合物の日々の腹腔内注射が、腫瘍接種の１〜６日後または７〜１３日後のいずれかで行われる。動物は、腫瘍接種の約３または４週間後に屠殺され、肺腫瘍コロニーが計数される。得られるデータの評価は、試験化合物の効力、最適用量、および投与の経路に関する決定を可能にする。

腫瘍体積および転移の減少に向けてのリガンドの活性は、Ｒａｂｂａｎｉら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ６３：８４０−８４５（１９９５）において記載されるモデルにおいて評価され得る。Ｘｉｎｇら、Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．，５７：３５８５−３５９３（１９９７）もまた参照のこと。ここでは、ＭａｔＬｙＬｕ腫瘍細胞がコペンハーゲンラットの脇腹に注射された。これらの動物は、種々の用量の試験化合物を、３週間まで、継続して投与するために、浸透ポンプが移植された。実験動物およびコントロール動物の腫瘍の質量および体積は、転移の増殖と同様に、実験の間に評価された。得られるデータの評価は、試験化合物の効力、最適用量、および投与の経路に関する決定を可能にする。これらの著者の何人かは、Ｘｉｎｇら、Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．，５７：３５８５−３５９３（１９９７）において関連するプロトコールを記載した。

新血管新生に向けたリガンドの阻害活性を評価するために、ウサギ角膜新血管新生モデルが利用され得る。例えば、Ａｖｅｒｙら、Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．，１０８：１４７４−１４７５（１９９０）を参照のこと。このモデルにおいて、ニュージーランドアルビノウサギが麻酔される。中心角膜切開が行われ、放射状核膜ポケットを形成する。遅延放出プロスタグランジンペレットが、新血管新生を誘導するためにポケット中に配置される。試験リガンドが５日間腹腔内投与され、次いで動物が屠殺される。試験リガンドの効果が、角膜輪部の定期的に撮影された写真の再調査によって評価される。角膜輪部は、新生血管応答の領域、それゆえに縁部の新生血管新生を計算するために使用され得る。適切なコントロールと比較した場合の新生血管新生の領域の減少は、新生血管新生を減少または阻害する際に試験リガンドが有効であったことを示す。

血管新生を阻害する際に試験化合物の効果を評価するために使用される例示的な血管新生モデルは、Ｍｉｎら、Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．，５６：２４２８−２４３３（１９９６）によって記載されている。このモデルにおいて、Ｃ５７ＢＬ６マウスは、試験化合物ありおよびなしで、血管新生誘導剤として、ｂＦＧＦを含むＭａｔｒｉｇｅｌ混合物の皮下注射を受容する。５日後、動物を屠殺し、新血管新生が可視化され得るＭａｔｒｉｇｅｌプラグが写真撮影される。Ｍａｔｒｉｇｅｌおよび有効用量の試験リガンドを受容する実験動物は、コントロール動物またはより少ないかもしくは有効でない用量のリガンドを受容する実験動物よりも、より少ない血管新生を示す。

原発性腫瘍の伝播を制限するそれらの能力について化合物を試験するために設計されるインビボ系は、Ｃｒｏｗｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９０：５０２１−５０２５（１９９３）によって記載されている。ヌードマウスは、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）を発現するように操作された腫瘍細胞（ＰＣ３）を注射される。腫瘍サイズおよび／または転移を減少するそれらの能力について試験される化合物が動物に投与され、腫瘍サイズおよび／または転移性増殖の引き続く測定が行われる。さらに、種々の器官において検出されたＣＡＴのレベルは、転移を阻害する試験化合物の能力の指標を提供し；コントロール動物に対して、処置された動物の組織中でのより少ないＣＡＴの検出は、その組織に移動したより少ないＣＡＴ発現細胞を示す。

腫瘍細胞株Ｆ３１１を使用する、試験セリンプロテアーゼインヒビターの阻害ポテンシャルを評価するために設計されたインビボ実験様式は、Ａｌｏｎｓｏら、ＢｒｅａｓｔＣａｎｃ．Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．，４０：２０９−２２３（１９９６）によって記載されている。このグループは、毒性の決定、腫瘍増殖、侵襲性、自発的転移、実験的肺転移、および血管新生アッセイについてのインビボ研究を記載している。

最初にＯｓｓｏｗｓｋｉ（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１０７：２４３７−２４４５（１９８８）によって記載されたＣＡＭモデル（ニワトリ胚絨毛尿膜モデル）は、試験化合物のプロテアーゼ阻害活性を評価するための別の方法を提供する。ＣＡＭモデルにおいて、腫瘍細胞はＣＡＭを含む絨毛尿膜を通して浸潤し、いくつかのセリンプロテアーゼインヒビターの存在下での腫瘍細胞は、膜を通しての腫瘍細胞の浸潤がより少ないか、または浸潤がないことを生じる。従って、ＣＡＭアッセイは、種々の濃度の試験化合物の存在下および非存在下でＣＡＭおよび腫瘍細胞を用いて実行される。腫瘍細胞の侵襲性は、化合物の阻害活性の指標を提供するために、このような条件下で測定される。阻害活性を有する化合物は、より少ない腫瘍浸潤と相関する。

ＣＡＭモデルはまた、血管新生をアッセイするために使用され得る（新規な血管の形成に対する効果（Ｂｒｏｏｋｓら、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，１２９：２５７−２６９（１９９９））。このモデルに従うと、血管新生インデューサー（例えば、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＤＧ）など）を含むフィルターディスクがＣＡＭの上に配置される。ＣＡＭへのサイトカインの拡散が局所的血管新生を誘導し、これは、いくつかの方法において、例えば、フィルターディスクのすぐ下のＣＡＭ中の血管分岐点の数を計数することによって測定されてもよい。サイトカイン誘導された血管新生を阻害する、同定された化合物の能力は、このモデルを使用して試験され得る。試験化合物は、血管新生インデューサーを含むフィルターディスクに加えられるか、膜に直接的に配置されるか、または全身的に投与されるかのいずれかであり得る。試験化合物の存在下および／または非存在下での新規な血管新生の程度が、このモデルを使用して比較され得る。試験化合物の存在下でのより少ない新規な血管の形成は、抗血管新生活性の指標である。

内皮細胞増殖。候補ＥＴ２結合リガンドは、生物学的アッセイ（例えば、ウシ毛細血管内皮細胞増殖アッセイ、ニワトリＣＡＭアッセイ、マウス核膜アッセイ、および移植された腫瘍上のリガンドの効果を評価することなど）を使用して、内皮増殖阻害活性について試験され得る。ニワトリＣＡＭアッセイは、例えば、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら「ＡｎｇｉｏｇｅｎｉｃＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＭｅｔａｓｔａｔｉｃＧｒｏｗｔｈ」Ｃｅｌｌ，第７９巻（２），１９９４年１０月２１日，３１５−３２８頁によって記載されている。手短に述べると、インタクトな卵黄を有する３日齢ニワトリ胚が卵から単離され、ペトリ皿に配置される。３日間のインキュベーション後、試験されるタンパク質を含むメチルセルロースディスクが、個々の肺のＣＡＭに適用される。４８時間のインキュベーション後、内皮増殖が阻害されたか否かを決定するために、胚およびＣＡＭが観察される。マウス核膜アッセイは、疑いのある内皮増殖インヒビターを含む別のペレットとともに、増殖因子含有ペレットをマウスの核膜に移植する工程、および核膜において構成される毛細血管のパターンを観察する工程を包含する。

血管新生。血管新生は、例えば、種々のヒト内皮細胞系、例えば、臍静脈、冠状動脈、または真皮細胞などを使用してアッセイされてもよい。適切なアッセイには、増殖を測定するためのＡｌａｍａｒＢｌｕｅアッセイ（ＢｉｏｓｏｕｒｃｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌより利用可能）；蛍光分子を使用する移動アッセイ、例えば、血管新生エンハンサーおよびサプレッサーの存在下または非存在下で膜を通しての細胞の移動を測定するためのＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎＦａｌｃｏｎＨＴＳＦｌｕｏｒｏＢｌｏｃｋ細胞培養挿入物の使用など；およびＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）上での内皮細胞による管状構造の形成に基づく管形成アッセイが含まれる。

細胞接着。細胞接着アッセイは、候補ＥＴ２結合リガンドの存在下または非存在下で、精製接着タンパク質への細胞の接着、または互いへの細胞の接着を測定する。細胞−タンパク質アッセイは、精製タンパク質への細胞の接着を調節する薬剤の能力を測定する。例えば、組換えタンパク質が産生され、ＰＢＳ中で２．５ｇ／ｍＬに希釈され、そしてマイクロタイタープレートのウェルをコートするために使用される。ネガティブコントロールのために使用されるウェルはコートされない。次いで、コートされたウェルは洗浄され、１％ＢＳＡでブロックされ、そして再度洗浄される。化合物は、最終的な試験濃度の２倍まで希釈され、そしてブロックされ、コートされたウェルに加えられる。次いで、細胞がウェルに加えられ、未結合の細胞が洗い流される。保持された細胞は、膜透過性の蛍光色素（例えば、カルセイン−ＡＭ）を加えることによってプレート上で直接的に標識され、そしてシグナルが蛍光マイクロプレートリーダー中で定量される。

細胞−細胞接着アッセイは、互いへの細胞の結合を調節する、候補ＥＴ２結合リガンドの能力を測定するために使用され得る。これらのアッセイは、選択の接着タンパク質を天然にまたは組換え的に発現する細胞を使用し得る。例示的なアッセイにおいて、細胞接着タンパク質を発現する細胞は、他の細胞（より多くの同じ細胞型、またはその細胞が接着する別の型の細胞）と一緒にマルチウェルプレートのウェル中にプレートされる。接着し得る細胞は、膜透過性の蛍光色素（例えば、ＢＣＥＣＦ）で標識され、候補リガンドの存在下で単層に接着することが可能にされる。未結合細胞は洗い流され、結合した細胞は、蛍光プレートリーダーを使用して検出される。高スループット細胞接着アッセイもまた記載されている。例えば、ＦａｌｓｅｙＪＲら、ＢｉｏｃｏｎｊｕｇＣｈｅｒｓ．２００１年５月−６月；１２（３）：３４６−５３を参照のこと。

細管形成。細管形成アッセイは、培養細胞、一般的には内皮細胞の、細胞外マトリックスの環境を一般的にシミュレートする、マトリックス基材上の細管構造を形成する能力をモニターするために使用され得る。例示的な基材には、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ラミニンを含む基底膜タンパク質の抽出物、ＩＶ型コラーゲン、および４℃では液体であり、３７℃では固体ゲルを形成するヘパリン硫酸プロテオグリカンが含まれる。他の適切なマトリックスには、コラーゲン、フィブロネクチン、および／またはフィブリンなどの細胞外成分が含まれる。細胞は、プロ血管新生刺激剤を用いて刺激され、細管を形成するそれらの能力は画像処理によって検出される。細管は、一般的には、刺激との一晩のインキュベーション後に検出され得るが、より長いかまたはより短い時間フレームもまた、使用されてもよい。細管形成アッセイは、当該分野において周知である（例えば、ＪｏｎｅｓＭＫら、１９９９，ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ５：１４１８−１４２３）。これらのアッセイは、伝統的に、血清を用いる、または増殖因子ＦＧＦもしくはＶＥＧＦを用いる刺激を含んでいる。１つの実施形態において、このアッセイは、１種以上のプロ血管新生剤、例えば、炎症性血管新生因子（例えば、ＴＮＦ−α、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ホルボールミリストレート酢酸塩（ＰＭＡ）、ＴＮＦ−アルファ、エフリンなど）の存在下で実行される。

細胞移動。内皮細胞移動についての例示的なアッセイは、ヒト微小血管内皮（ＨＭＶＥＣ）移動アッセイである。例えば、Ｔｏｌｓｍａら、（１９９３）Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ１２２，４９７−５１１を参照のこと。移動アッセイは当該分野において公知である（例えば、ＰａｉｋＪＨら、２００１，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２７６：１１８３０−１１８３７）。１つの例において、培養された内皮細胞は、代表的な細胞サイズよりも一般的に小さなポアサイズを有する、マトリックスコートされた多孔性薄膜に播種される。この薄膜は、典型的には、トランスウェルポリカーボネートメンブレン（ＣｏｒｎｉｎｇＣｏｓｔａｒＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）などのメンブレンであり一般的には、プロ血管新生性刺激を含むより低いチャンバーと接触している液体中にあるより高いチャンバーの一部である。移動は、一般的には、刺激との一晩のインキュベーション後にアッセイされ得るが、より長いかまたはより短い時間フレームもまた、使用されてもよい。移動は、薄膜を横切った細胞の数として評価され、そしてヘモトキシリン溶液（ＶＷＲＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ．）で細胞を染色することによって、または細胞数を決定するためのいずれかの他の方法によって検出されてもよい。別の例示的な設定において、細胞は蛍光標識され、移動は、蛍光の読み取りを使用して、例えば、ＦａｌｃｏｎＨＴＳＦｌｕｏｒｏＢｌｏｋ（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して検出される。刺激の非存在下である程度の移動が観察されるのに対して、移動は、プロ血管新生因子に応答して、非常に増大する。このアッセイは、内皮細胞移動に対するＥＴ２結合リガンドの効果を試験するために使用され得る。

出芽アッセイ。例示的な出芽アッセイは、コラーゲンゲルベースのマトリックス中に包埋された内皮細胞の、細胞数で規定された球状体凝集を使用する、三次元インビトロ血管新生アッセイである。この球状体は、細胞外マトリックスへの侵入によって、毛細管様構造の出芽のため（「細胞出芽」と呼ばれる）、およびネットワークを吻合する複合体の引き続く形成の開始点として働き得る（ＫｏｒｆｆおよびＡｕｇｕｓｔｉｎ，１９９９，ＪＣｅｌｌＳｃｉ１１２：３２４９−５８）。１つの例示的な実験設定において、球状体は、４００個の臍静脈内皮細胞（ＨＵＭＶＥＣ）を、非接着性９６ウェルプレートの個々のウェルにピペッティングし、一晩の球状体凝集を可能にすることによって調製する（ＫｏｒｆｆおよびＡｕｇｕｓｔｉｎ，ＪＣｅｌｌＢｉｏｌ１４３：１３４１−５２，１９９８）。球状体は収集され、９００μｌのメトセル−コラーゲン溶液中に播種され、そして２４ウェルプレートの個々のウェルにピペッティングされ、コラーゲンゲル重合を可能にする。試験薬剤は、ゲルの上端に試験物質の１０倍ワーキング希釈１００μｌをピペッティングすることによって、３０分後に加えられる。プレートは３７℃で２４時間インキュベートされる。ディッシュは、パラホルムアルデヒドの添加により、実験のインキュベーション時間の終わりに固定される。内皮細胞の出芽強度は、自動画像分析システムによって定量され得、球状体あたりの累積的な出芽の長さを決定する。

ある実施形態において、ＥＴ２結合リガンドは、本明細書に記載されるアッセイ、例えば、本明細書に記載される細胞アッセイにおいて統計学液に有意な効果を有する。

（薬学的組成物）
別の態様において、本発明は、ＥＴ２リガンド、例えば、ＥＴ２に結合するとして同定されたか、または本明細書に記載される、抗体分子、他のポリペプチド、またはペプチドを含み、薬学的に受容されるキャリアとともに製剤化される組成物（例えば、薬学的組成物）を提供する。本明細書において使用される場合、「薬学的組成物」とは、インビボ加増処理のための標識されたリガンド、ならびに治療用組成物を含む。

本明細書において使用される場合、「薬学的に受容可能なキャリア」には、任意のおよびすべての、溶媒、分散媒体、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれ、これらは生理学的に適合可能である。好ましくは、このキャリアは、静脈内、筋肉内、皮下、非経口的、脊髄、または表皮の投与（例えば、注射または注入によって）のために適切である。投与の経路に依存して、活性化合物、すなわち、タンパク質リガンドは、酸の作用、およびその化合物を不活性化するかもしれない他の天然の条件からその化合物を保護するための物質中でコートされてもよい。

「薬学的に受容可能な塩」とは、親の化合物の所望の生物学的活性を保持しいかなる望ましくない毒性効果をも付与しない塩をいう（例えば、Ｂｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．ら（１９７７）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９を参照のこと）。このような塩の例には、酸付加塩および塩基付加塩が含まれる。酸付加塩には、非毒性無機酸由来のもの、例えば、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸など、ならびに非毒性有機酸由来のもの、例えば、脂肪族モノ−およびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などが含まれる。塩基付加塩には、アルカリ土類金属由来のもの、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなど、ならびに非毒性有機アミン由来のもの、例えば、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカミン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどが含まれる。

本発明の組成物は種々の形態であってもよい。これらには、例えば、液体、半固体、および固体投薬型、例えば、液体溶液（例えば、注射可能溶液および注入可能溶液）、分散液または懸濁液、錠剤、丸薬、散剤、リポソーム、および坐剤が含まれる。好ましい形態は、意図される投与の様式および治療的適用に依存する。代表的な好ましい組成物は、注射可能または注入可能な溶液の形態であり、例えば、抗体を用いるヒト投与のために使用されるものと類似の組成物である。投与の好ましい様式は非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）である。１つの実施形態において、ＥＴ２リガンドは、静脈内注入または静脈内注射によって投与される。別の好ましい実施形態において、ＥＴ２リガンドは、筋肉内注射または皮下注射によって投与される。

語句「非経口投与」および「非経口的に投与される」は、本明細書において使用される場合、経腸投与および局所的投与以外の投与の様式を意味し、通常は注射により非限定的に、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、および胸骨内の注射および注入を含む。

薬学的組成物は、典型的には、製造および保存の条件下で無菌および安定でなくてはならない。薬学的組成物はまた、それが投与のための規制および業界規準に合致することを保証するために試験され得る。例えば、調製物のエンドトキシンレベルは、Ｌｉｍｕｌｕｓアメーバ様細胞溶解物アッセイを使用して（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒロット＃７Ｌ３７９０、感度０．１２５ＥＵ／ｍＬ）、ＵＳＰ２４／ＮＦ１９方法に従って試験され得る。薬学的組成物の無菌性は、ＵＳＰ２４／ＮＦ１９方法に従ってチオグリコレート媒体を使用して決定され得る。例えば、調製物は、チオグリコレート媒体を摂取するために使用され、１４日間以上、３５℃でインキュベートされる。この媒体は、微生物の増殖を検出するために定期的に検査される。

この組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、または高い薬物濃度のために適切である他の次元の構造として製剤化され得る。滅菌注射溶液は、必要に応じて、上記に列挙された成分の１つまたは組み合わせを有する適切な溶媒中で必要とされる量の活性化合物（すなわち、リガンド）を組み込むことによって、続いて濾過滅菌によって調製され得る。一般的に、分散剤は、塩基性分散媒体および上記に列挙されたものからの必要とされる他の成分を含む滅菌菌ビヒクルに活性化合物を組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合において、好ましい調製の方法は、活性成分の粉末および前に濾過滅菌したその溶液からの任意のさらなる所望の成分を生じる、真空乾燥および凍結乾燥である。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散剤の場合においては必要とされる粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持され得る。注射用組成物の吸収の延長は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンをその組成物中に含めることによってもたらされ得る。

本発明の抗ＥＴ２リガンドは、当該分野で公知の種々の方法によって投与され得るが、多くの適用のためには、投与の好ましい経路／様式は、静脈内注射または静脈内注入である。例えば、治療的適用のためには、ＥＴ２リガンドは、約１〜１００ｍｇ／ｍ^２または７〜２５ｍｇ／ｍ^２の用量に到達するために、３０、２０、１０、５、または１ｍｇ／分未満の速度で静脈内注入によって投与され得る。投与の経路および／または様式は、所望の結果に依存して変化する。特定の実施形態において、活性化合物は、急速な放出に対して化合物を保護するキャリア（例えば、移植物を含む制御放出処方物など）、およびマイクロカプセル化送達系を用いて調製されてもよい。生物分解可能な、生体適合性ポリマーが使用され得、これは例えば、エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸である。このような製剤の調製のための多くの方法が特許になり、一般的に知られている。例えば、ＳｕｓｔａｉｎｅｄａｎｄＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＲｅｌｅａｓｅＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＳｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９７８を参照のこと。

特定の実施形態において、リガンドは、例えば、不活性希釈剤または吸収可能な可食性キャリアとともに経口投与されてもよい。化合物（および所望される場合、他の成分）もまた、ハードシェルまたはソフトシェルのゼラチンカプセル中に封入され、錠剤に圧縮され、または被験体の食餌に直接組み込まれてもよい。経口治療剤投与のために、化合物は賦形剤とともに組み込まれてもよく、そして消化可能な錠剤、バッカル錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウェファースなどの形態で使用されてもよい。非経口的投与以外によって本発明の化合物を投与するために、その不活性化を妨害するための物質で化合物をコートする、またはその物質とともに化合物を同時投与することが必要であるかもしれない。

薬学的組成物は、当該分野で公知の医学用デバイスを用いて投与され得る。例えば、１つの実施形態において、本発明の薬学的組成物は、米国特許第５，３９９，１６３号、同第５，３８３，８５１号、同第５，３１２，３３５号、同第５，０６４，４１３号、同第４，９４１，８８０号、同第４，７９０，８２４号、または同第４，５９６，５５６号において開示されるデバイスなどの、針のない皮下注射デバイスを用いて投与され得る。本発明において有用である周知の移植物およびモジュールの例には以下が含まれる：米国特許第４，４８７，６０３号、これは、制御された速度で医薬を分配するための移植可能な微小注入ポンプを開示する；米国特許第４，４８６，１９４号、これは、皮膚を通して医薬を投与するための治療用デバイスを開示する；米国特許第４，４４７，２２４号、これは、連続的薬物送達のための変動流移植可能注入装置を開示する；米国特許第４，４３９，１９６号、これは、マルチチャンバー区画を有する浸透圧薬物送達システムを開示する；および米国特許第４，４７５，１９６号、これは、浸透圧薬物送達システムを開示する。当然、多くの他のこのような移植物、送達システム、およびモジュールもまた公知である。

特定の実施形態において、本発明の化合物は、インビボでの適切な分布を保証するように製剤化され得る。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は、多くの高度に親水性の化合物を排除する。本発明の治療用化合物がＢＢＢを通過することを保証するために（所望される場合）、これらは、例えば、リポソーム中で製剤化され得る。リポソームを製造する方法については、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号；同第５，３７４，５４８号；同第５，３９９，３３１号を参照のこと。リポソームは、特異的な細胞または器官、に選択的に輸送される１つ以上の部分を含んでもよく、従って、標的化された薬物送達を増強してもよい（Ｖ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５）。

投薬レジメンは、最適な所望される応答（例えば、治療的応答）を提供するように調整される。例えば、単回のボーラスが投与されてもよく、数回に分けた用量が時間をかけて投与されてもよく、または用量は治療状況の緊急性によって示されるように比例的に減少または増加されてもよい。投与の容易さおよび投薬量の均一性のために投薬単位形態で非経口組成物を製剤化することがとりわけ有利である。投薬単位形態は、本明細書において使用される場合、処置される被験体のための単位用量として適切な物理的に別々の単位をいい；各単位は、必要とされる薬学的キャリアと共同して、所望の治療効果を産生するように計算された活性化合物の所定の量を含む。本発明の投薬単位形態のための詳細は、（ａ）活性化合物の独特な特徴および達成される特定の治療的効果、ならびに（ｂ）個体における感受性の処理のためにこのような活性化合物を化合物作製する技術分野における固有の制限によって決定され、ならびにこれらに直接的に依存する。

本発明の抗体の、治療的または予防的に有効な量のための例示的な、非限定的な範囲は、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１〜１０ｍｇ／ｋｇである。抗ＥＴ２抗体は、約１〜１００ｍｇ／ｍ^２または約５〜３０ｍｇ／ｍ^２の用量に到達するために、３０、２０、１０、５、または１ｍｇ／分未満の速度の静脈内注入によって投与され得る。抗体よりも分子量が小さいリガンドについては、適切な量は比例的に少なくあり得る。投薬量の値は、緩和される状態の型および重篤度に伴って変化するかもしれないことが注目されるべきである。任意の特定の被験体については、特定の投薬レジメンが、個体の必要性および組成物を投与する人または組成物の投与を監督する人の専門的判断に従って、時間をかけて調製されるべきであること、ならびに本明細書に記載される投薬量範囲は例示のみであって、特許請求される組成物の範囲および実施を制限することを意図するものではないことがさらに理解されるべきである。

本発明の薬学的組成物は、本発明のＥＴ２リガンドの「治療有効量」または「予防有効量」を含んでもよい。「治療有効量」とは、所望の治療的結果を達成するために、必要な投薬量および時間の間で、有効である量をいう。組成物の治療有効量は、疾患の状態、年齢、性別、および個体の体重、ならびに個体において所望の応答を誘発するタンパク質リガンドの能力などの要因に従って変動する可能性がある。治療有効量はまた、組成物のいかなる毒性または有害な効果も、治療的に有益な効果の方が上回るものである。「治療有効投薬量」は、好ましくは、測定可能なパラメーターを阻害し、例えば、未処置の被験体と比較して、少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、なおより好ましくは少なくとも約６０％、およびさらにより好ましくは少なくとも約８０％、腫瘍増殖を阻害する。測定可能なパラメーター（例えば、癌）を阻害する化合物の能力は、ヒト腫瘍における効力を予測する動物モデル系において評価され得る。代替的には、組成物のこの特性は、熟練した実施者に公知のアッセイによってインビトロでこのような阻害を阻害する化合物の能力を試験することによって評価され得る。

「予防有効量」とは、所望の予防的効果を達成するために、必要な投薬量および時間の間で、有効である量をいう。典型的には、予防用量は、疾患の初期段階の前またはその段階にある被験体において使用されるので、予防有効量は治療有効量よりも少ない。

ＥＴ２に結合するタンパク質リガンド、および使用、例えば、治療的、予防的、または診断的な使用のための指示書を含むキットもまた、本発明の範囲内にある。１つの実施形態において、診断的適用のための指示書は、インビトロで、例えば、サンプル、例えば、癌または新生物障害を有する患者からの生検または細胞において、あるいはインビボで、ＥＴ２を検出するためのＥＴ２リガンド（例えば、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または他のポリペプチドもしくはペプチド）の使用を含む。別の実施形態において、治療的適用のための指示書は、癌または新生物障害を有する患者における、示唆される投薬量および／または投与の様式を含む。このキットはさらに、１つ以上の別個の薬学的調製物中に、適切に製剤化された、少なくとも１種のさらなる試薬、例えば、診断剤もしくは治療剤（例えば、本明細書に記載される診断剤もしくは治療剤）、および／または１種以上のさらなるＥＴ２リガンドを含み得る。

（安定化および保持）
１つの実施形態において、ＥＴ２リガンドは、その安定性および／または循環中（例えば、血液、血清、リンパ、もしくは他の組織中）での保持を、少なくとも１．５、２、５、１０、または５０倍改善する部分と物理的に結合される。

例えば、ＥＴ２リガンドは、ポリマー、例えば、ポリアルキレンオキサイドまたはポリエチレンオキサイドなどの実質的に非抗原性ポリマーと結合され得る。適切なポリマーは、実質的に重量によって変動する。約２００〜約３５，０００（または約１，０００〜約１５，０００、および２，０００〜約１２，５００）の範囲の数平均分子量を有するポリマーが使用され得る。

例えば、ＥＴ２リガンドは、水溶性ポリマー、例えば、親水性ポリビニルポリマー、例えば、ポリビニルアルコールおよびポリビニルピロリドンに結合体化され得る。このようなポリマーの非限定的なリストは、ポリアルキレンオキサイドホモポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレン化ポリオール、そのコポリマーおよびそのブロックコポリマー（ブロックコポリマーの水溶性が維持されるという条件で）を含む。さらなる有用なポリマーには、ポリオキシエチレンおよびポリオキシプロピレンなどのポリオキシアルキレン、ならびにポリオキシエチレンおよびポリオキシプロピレンのブロックコポリマー（Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ）；ポリメタクリレート；カルボマー；分枝または分枝でないポリサッカリド、これはサッカリドモノマーＤ−マンノース、Ｄ−およびＬ−ガラクトース、フコース、フルクトース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−グルクロン酸、シアル酸、Ｄ−ガラクツロン酸、Ｄ−マンヌロン酸（例えば、ポリマンヌロン酸またはアルギン酸）、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトサミン、Ｄ−グルコース、およびノイラミン酸が含まれ、ホモポリサッカリドおよびヘテロポリサッカリド、例えば、ラクトース、アミロペクチン、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、アミロース、硫酸デキストラン、デキストラン、デキストリン、グリコーゲン、または酸ムコポリサッカリドのポリサッカリドサブユニット、例えば、ヒアルロン酸；糖アルコールのポリマー、例えば、ポリソルビトールおよびポリマンニトール；ヘパリンまたはヘパロンが含まれる。

他の化合物、例えば、サイトトキシン、標識、または別の標的化薬剤、例えば、別のＥＴ２リガンドまたは関連のないリガンドもまた、同じポリマーに結合される。モノ活性化されたアルコキシ末端を有するポリアルキレンオキサイド（ＰＡＯ）、例えば、モノメトキシ末端を有するポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）；Ｃ_１−４アルキル末端を有するポリマー；およびビス活性化ポリエチレンオキサイド（グリコール）は、架橋のために使用され得る。例えば、米国特許第５，９５１，９７４号を参照のこと。

１つの実施形態において、リガンドへの架橋の前のポリマーは、水溶性である必要はないが、好ましくは水溶性である。一般的に、架橋後、生成物は水溶性であり、例えば、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｍｌ、およびより好ましくは、少なくとも約０．１ｍｇ／ｍｌ、およびなおより好ましくは少なくとも約１ｍｇ／ｍｌの水溶性を示す。さらに、このポリマーは、結合体型で高度に免疫原性であるべきではなく、また、これは、結合体が静脈内経路によって投与されることが意図されるならば、静脈内注入または静脈内注射と適合可能でない粘性を有するべきではない。

１つの実施形態において、ポリマーは、反応性である単一の基のみを含む。このことは、互いに対してのリガンド分子の架橋を回避するように補助する。しかし、リガンド分子間の架橋を減少するように反応条件を最大化すること、または実質的に均質な誘導体を回収するために、ゲル濾過またはイオン交換クロマトグラフィーを通して反応生成物を精製することは、本発明の範囲内にある。他の実施形態において、ポリマーは、ポリマーバックボーンに複数のリガンドを連結することの目的のために、２つ以上の反応基を含む。再度、実質的に均質な型の所望の誘導体を回収するために、ゲル濾過またはイオン交換クロマトグラフィーが使用され得る。

ポリマーの分子量は、約５００，０００Ｄまでの範囲であり得、および好ましくは少なくとも約２０，０００Ｄ、または少なくとも約３０，０００Ｄ、または少なくとも約４０，０００Ｄである。選択された分子量は、達成される結合体の有効サイズ、ポリマーの性質（例えば、直鎖状または分枝状などの構造）、および誘導体化の程度に依存し得る。

共有結合は、ポリマーにＥＴ２リガンドを結合するために使用され得、例えば、リガンドのＮ末端アミノ基、およびリガンドのリジン残基上のεアミノ基、ならびに他のアミノ基、イミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、または他の親水性基に架橋する。ポリマーは、多官能性（通常、二官能性）架橋剤の使用を伴うことなく、ＥＴ２リガンドに直接的に共有結合されてもよい。アミノ基への共有結合は、塩化シアヌル、カルボニルジイミダゾール、アルデヒド反応基（ＰＥＧアルコキシドおよびブロモアセトアルデヒドのジエチルアセタール；ＰＥＧおよびＤＭＳＯおよび無水酢酸、またはＰＥＧクロライドおよび４−ヒドロキシベンズアルデヒドのフェノキシド、活性化スクシミジルエステル、活性化ジチオカルボネートＰＥＧ、２，４，５−トリクロロフェニルクロロホルメートまたはＰ−ニトロフェニルクロロホルメート活性化ＰＥＧ）に基づく既知の化学物質によって達成される。カルボキシル基は、カルボジイミドを使用してＰＥＧ−アミンをカップリングすることによって誘導体化され得る。スルフヒドリル基は、マレイミド置換ＰＥＧにカップリングすることによって誘導体化され得る（例えば、アルコキシ−ＰＥＧアミンおよびスルホスクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）ＷＯ９７／１０８４７またはＳｈｅａｒｗａｔｅｒＰｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａ．から市販されているＰＥＧ−マレイミド）。代替的には、リガンド上の遊離のアミノ基（例えば、リジン残基上のεアミノ基）が、２−イミノ−チオレン（Ｔｒａｕｔ試薬）を用いてチオール化され得、次いで、例えば、Ｐｅｄｌｅｙら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７０：１１２６−１１３０（１９９４）において記載されるように、ＰＥＧのマレイミド含有誘導体にカップリングされ得る。

ＥＴ２リガンドに結合され得る、官能基化されたＰＥＧポリマーは、例えば、ＳｈｅａｒｗａｔｅｒＰｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａ．）から入手可能である。このような市販のＰＥＧ誘導体には例えば以下が含まれる：アミノ−ＰＥＧ、ＰＥＧアミノ酸エステル、ＰＥＧ−ヒドラジド、ＰＥＧ−チオール、ＰＥＧ−スクシネート、カルボキシメチル化ＰＥＧ、ＰＥＧ−プロピオン酸、ＰＥＧアミノ酸、ＰＥＧスクシニミジルスクシネート、ＰＥＧスクシニミジルプロピオネート、カルボキシメチル化ＰＥＧのスクシニミジルエステル、ＰＥＧのスクシニミジルカ−ボネート、アミノ酸ＰＥＧのスクシニミジルエステル、ＰＥＧ−オキシカルボニルイミダゾール、ＰＥＧ−ニトロフェニルカ−ボネート、ＰＥＧトレシレート、ＰＥＧ−グリシジルエーテル、ＰＥＧ−アルデヒド、ＰＥＧビニルスルホン、ＰＥＧ−マレイミド、ＰＥＧ−オルトピリジル−ジスルフィド、ヘテロ官能性ＰＥＧ、ＰＥＧビニル誘導体、ＰＥＧシラン、およびＰＥＧホスホリド。これらのＰＥＧ誘導体をカップリングするための反応条件は、ＥＴ２リガンド、ＰＥＧ化の所望される程度、および利用されるＰＥＧ誘導体に依存して変動する可能性がある。ＰＥＧ誘導体の選択に関連するいくつかの因子には以下が含まれる：結合の所望される点（例えば、リジンまたはシステインのＲ基）、誘導体の加水分解安定性および反応性、安定性、連結の毒性および抗原性、分析のための適合性など。任意の特定の誘導体の使用のための詳細な指示書は、製造業者から利用可能である。

ＥＴ２リガンドおよびポリマーの結合体は、例えば、ゲル濾過またはイオン交換クロマトグラフィー、例えば、ＨＰＬＣによって、未反応の出発物質から単離され得る。異種の結合体は、同じ様式で互いから精製される。異なる種の分解能（例えば、１つまたは２つのＰＥＧ残基を含む）もまた、未反応のアミノ酸のイオン特性の違いに起因して可能である。例えば、ＷＯ９６／３４０１５を参照のこと。

（キット）
本明細書に記載されるＥＴ２リガンドは、キットにおいて、例えば、キットの成分として提供され得る。例えば、このキットは、（ａ）ＥＴ２リガンド、例えば、ＥＴ２リガンドを含む組成物、および必要に応じて（ｂ）情報用資料を含む。この情報用資料は、本明細書に記載される方法および／または本明細書に記載される方法のためのＥＴ２リガンドの使用に関する、説明的、指示的、営業的、または他の資料であり得る。

このキットの情報用資料は、その形態が制限されない。１つの実施形態において、この情報用資料は、化合物の製造、化合物の分子量、濃度、使用期限の日付、バッチまたは製造場所の情報などに関する情報を含み得る。１つの実施形態において、この情報用資料は、本明細書に記載される障害（例えば、血管新生または内皮細胞関連障害）を処置、予防、または診断するためにリガンドを使用することに関する。

１つの実施形態において、情報用資料は、本明細書に記載される方法を実行するために適切な様式で、例えば、適切な用量、投薬形態、または投与の様式（例えば、本明細書に記載される用量、投薬形態、または投与の様式）で、ＥＴ２リガンドを投与するための指示書を含み得る。別の実施形態において、この情報用資料は、適切な被験体、例えば、ヒト、例えば、血管新生の増加（例えば、癌または転移性癌）を有する、またはそのリスクがあるヒトにＥＴ２リガンドを投与するための指示書を含み得る。例えば、この資料は、癌患者、炎症性障害を有する患者、または過度の内皮細胞活性を有する患者にＥＴ２リガンドを投与するための指示書を含み得る。

このキットの情報用資料は、その形態が制限されない。多くの場合において、情報用資料、例えば、指示書は、印刷物、例えば、印刷された文章、図面、および／または写真で、例えば、ラベルまたは印刷シートで提供される。しかし、情報用資料はまた、他の形式、例えば、コンピュータ読み取り可能な資料、ビデオ録画、または音声録音で提供され得る。別の実施形態において、このキットの情報用資料は、連絡先、例えば、実際の住所、Ｅメールアドレス、ウェブサイト、または電話番号であり、ここでこのキットのユーザは、本明細書に記載のＥＴ２リガンドおよび／または方法におけるその使用に関する実質的な情報を入手し得る。当然、この情報用資料はまた、任意の形式の組み合わせで提供され得る。

ＥＴ２リガンドに加えて、このキットの組成物は、他の構成成分、例えば、溶媒または緩衝液、安定剤、保存剤、香料（例えば、苦いアンタゴニストおよび甘味料）、芳香剤もしく他の化粧品成分、および／または本明細書に記載される状態または障害（例えば、癌または炎症）を処置するための第２の薬剤を含み得る。代替的には、他の構成成分はキットに含まれ得るが、ＥＴ２リガンドとは異なる組成物または容器に含まれ得る。このような実施形態において、このキットは、ＥＴ２リガンドおよび他の構成成分を混合するため、または他の構成成分と一緒にＥＴ２リガンドを使用するための指示書を含み得る。

ＥＴ２リガンドは、任意の型、例えば、液体、乾燥型、または凍結乾燥型で提供され得る。ＥＴ２リガンドは、実質的に純粋であり、および／または滅菌されていることが好ましい。ＥＴ２リガンドが液体溶液で提供される場合、この液体溶液は、好ましくは、水溶液であり、滅菌水溶液が好ましい。ＥＴ２リガンドが乾燥型で提供される場合、再構築は、一般的には、適切な溶媒の付加によってである。この溶媒、例えば、滅菌水または緩衝液は、必要に応じてキット中で提供され得る。

このキットは、ＥＴ２リガンドを含む組成物のための１つ以上の容器を含み得る。ある実施形態において、このキットは、組成物および情報用資料のための、別個の容器、仕切り、または区画を含む。例えば、この組成物は、ボトル、バイアル、またはシリンジ中に含まれ得、そして情報用資料は、プラスチックスリーブまたはパケット中に含まれ得る。他の実施形態において、キットの別々の要素は、単一の、分割されていない容器内に含まれる。例えば、組成物はボトル、バイアル、またはシリンジ中に含まれ、これは、そこにラベルの形で付けられた情報用資料を有する。ある実施形態において、このキットは、複数の（例えば、パックの）個別の容器を含み、各々がＥＴ２リガンドの１つ以上の単位投薬形態（例えば、本明細書に記載される投薬形態）を含む。例えば、このキットは、複数のシリンジ、アンプル、ホイルパケット、またはブリスターパックを含み、各々がＥＴ２リガンドの単回の単位用量を含む。キットの容器は、気密性、防水性（例えば、湿度または蒸発の変化に対して透過性でない）、および／または遮光性であり得る。

このキットは、必要に応じて、組成物の投与のために適切なデバイス、例えば、シリンジ、吸入デバイス、ピペット、ピンセット、計量スプーン、滴下デバイス（例えば、点眼デバイス）、綿棒（例えば、綿棒または木製綿棒）、または任意のこのような送達デバイスを含む。好ましい実施形態において、このデバイスは、計量した用量のリガンドを分配する移植可能なデバイスである。

（処置）
ＥＴ２リガンドに結合し本明細書に記載の方法によって同定され、および／または本明細書に詳述されるタンパク質リガンドは、治療的および予防的な有用性を有する。例えば、これらのリガンドは、種々の障害（例えば、望ましくない血管新生によって特徴付けられる疾患（例えば、癌）など）を処置、予防、および／または診断するために、培養中の細胞に（例えば、インビトロもしくはエキソビボで）、または被験体中の細胞に（例えば、インビボ）で投与され得る。

本明細書において使用される場合、用語「処置（処理）する」または「処置（処理）」は、障害、障害の徴候、または障害に向けた素因を治療し、治癒し、緩和し、軽減し、変化させ、修復し、寛解し、改善し、または影響を与える目的で、単独、または第２の薬剤と組み合わせた、被験体（例えば、患者）への抗ＥＴ２抗体の適用または投与として、あるいは、障害（例えば、本明細書に記載されるような障害）、障害の徴候、または障害に向けた素因を有する被験体（例えば、患者）から単離された組織または細胞（例えば、細胞株）の薬剤の適用または投与として定義される。細胞を処理するとは、インビトロおよびインビボでの、細胞の阻害、除去、もしくは死滅、またはそれ以外の場合は、異常な細胞）が障害、例えば、本明細書に記載されるような障害（例えば、癌性の障害）を媒介する能力を減少させることをいう。１つの実施形態において、「細胞を処理する」とは、細胞（例えば、過剰増殖性細胞）の活性および／または増殖の減少をいう。このような減少は、細胞の全体的な除去を必ずしも意味しないが、細胞の活性または増殖速度の減少（例えば、統計学的に有意な減少）を意味する。

本明細書において使用される場合、障害を治療するために有効なＥＴ２リガンドの量、または「治療有効量」とは、細胞、例えば、癌細胞（例えば、ＥＴ２発現癌細胞）を治療するときに、またはこのような治療の非存在下で予測されるものよりも、本明細書に記載されるような障害を有する被験体の寿命を延長し、被験体の状態を治癒し、緩和し、回復し、もしくは改善するときに、被験体への単回または複数回の用量の投与の際に有効であるリガンドの量をいう。本明細書において使用される場合、新生物の「増殖を阻害する」とは、その増殖および転移を遅延、中断、静止、または停止することをいい、新生物増殖の全体的な除去を必ずしも示すものではない。

本明細書において使用される場合、障害を予防するために有効なＥＴ２リガンドの量、またはリガンドの「予防有効量」とは、障害（例えば、癌）の発症または再発の発生を予防または遅延するときの、被験体における単回または複数回の用量投与の際に有効である、ＥＴ２リガンド（例えば、本明細書に記載される抗ＥＴ２抗体）の量をいう。

用語「誘導する」、「阻害する」、「増強する」、「上昇させる」、「増加させる」、「減少させる」などは、例えば、これらが２つの状態の間の定量的な違いを示し、２つの状態の間の違い、例えば、統計学的に有意な違いをいう。例えば、「ＥＴ２発現過剰増殖性細胞の増殖を阻害するために有効な量」は、細胞の増殖の速度が、未処理の細胞とは異なる、（例えば、統計学的に有意に異なる）ことを意味する。

本明細書において使用される場合、用語「被験体」は、ヒトおよび非ヒト動物を含むことを意図する。好ましいヒト動物は、異常な細胞増殖または細胞分化によって特徴付けられる障害を有するヒト患者を含む。用語本発明の「非ヒト動物」は、すべての脊椎動物、例えば、非ヒト哺乳動物（例えば、ニワトリ、両生類、爬虫類）および哺乳動物、例えば、非ヒト類人猿、ヒツジ、イヌ、ウシ、ブタなどを含む。

１つの実施形態において、被験体はヒト被験体である。代替的には、被験体は、本発明の抗体が交差反応するＥＴ２様抗原を発現する哺乳動物であり得る。本発明のタンパク質リガンドは、治療目的のためにヒト被験体に投与され得る（以下でさらに議論される）。さらに、ＥＴ２リガンドは、獣医学的目的のため、またはヒト疾患の動物モデルとして、このリガンドが結合するＥＴ２様抗原を発現する非ヒト哺乳動物に投与され得る。、後者に関して、このような動物モデルは、リガンドの治療的効力（例えば、投薬量の試験および投与の経時変化）を評価するために有用であるかもしれない。

１つの実施形態において、本発明は、細胞（例えば、非癌性細胞、例えば、正常、良性、もしくは過形成細胞、または癌性細胞、例えば、悪性相棒、例えば、固形腫瘍、軟部組織腫瘍、または転移性病巣において見出される細胞（例えば、腎臓、尿路上皮、結腸、直腸、肺、乳房、または肝臓の癌および／または転移において見出される細胞））を治療する（例えば、細胞を除去する、細胞を死滅する、細胞の増殖または細胞分裂を減少する）方法を提供する。本発明の方法は、細胞を治療する（例えば、細胞の増殖または分裂を阻害する、または細胞を除去する、または細胞を死滅する）ために十分な量で、ＥＴ２リガンド（例えば、本明細書に記載される抗ＥＴ２抗体）と細胞を接触させる工程を包含する。

対象の方法は、培養中の細胞に対して、例えば、インビトロまたはエキソビボで使用され得る。例えば、癌性細胞または転移性細胞（例えば、腎臓、尿路上皮、結腸、直腸、肺、乳房、卵巣、前立腺、または肝臓の癌性細胞または転移性細胞）が、インビトロで培養培地中で培養され得、そして接触工程は、培養培地にＥＴ２リガンドを加えることによってもたらされ得る。この方法は、インビトロ（例えば、治療的または予防的）プロトコールの一部として、被験体中に存在する細胞（例えば、癌性細胞または転移性細胞）に対して実行され得る。インビボの実施形態のために、接触工程は、被験体中でもたらされ細胞へのリガンドの結合および治療（例えば、増殖もしくは分裂の阻害、または細胞の死滅もしくは除去）の両方を可能にするために有効な条件下で、被験体にＥＴ２リガンドを投与する工程を包含する。

ＥＴ２のインヒビターは、血管新生（例えば、制御されないかまたは望ましくない血管新生）−例えば、血管新生異常および心臓血管障害と関連する血管新生（例えば、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、および動静脈奇形）、慢性炎症性疾患（例えば、糖尿病、炎症性腸疾患、乾癬、および関節リウマチ）、異常な創傷修復（例えば、エキシマレーザー眼手術後に観察されるもの）、循環障害（例えば、Ｒａｙｎａｕｄ現象）、クレスト症候群（例えば、石灰沈着症、食道運動障害）、皮膚科学的障害（例えば、ポートワイン母斑、動脈潰瘍、全身性脈管炎）、または眼の障害（例えば、新生血管疾患によって引き起こされる失明、新生血管緑内障、角膜新血管新生、トラコーマ、糖尿病性網膜症、および近視性変性）などを減少し得る。例えば、ＣａｒｍｅｌｉｅｔおよびＪａｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，４０７：２４９−２５７，２０００を参照のこと。

この方法は、癌を治療するために使用され得る、本明細書において使用される場合、用語「癌」、「過剰増殖性」、「悪性」、および「新生物」は交換可能に使用され、急速な増殖または新生物によって特徴付けられる異常な状態または症状にある細胞をいう。これらの用語は、侵襲性の組織病理学的な型または段階とは無関係な、すべての型の癌性増殖または発癌プロセス、転位組織または悪性に形質転換した細胞、組織、または器官を含む。「病理学的な過剰増殖」細胞は、悪性腫瘍増殖によって特徴付けられる疾患状態において起こる。

用語「新生物」の一般的な医学的意味は、正常な増殖制御に対する応答性の喪失として生じる「新規な細胞増殖」、例えば、新生物細胞増殖をいう。「過形成」とは、非常に高速の増殖を受ける細胞をいう。しかし、本明細書において使用される場合、用語新生物および過形成は、それらの状況が示す場合には、交換可能に使用され得、異常な細胞増殖速度を受ける細胞を一般的にいう。新生物および過形成は、「腫瘍」を含み、これは、良性、前悪性、または悪性である可能性がある。

癌性障害の例には、固形腫瘍、軟部組織腫瘍、および転移病巣が含まれるがこれらに限定されない。固形腫瘍の例には、種々の器官系、例えば、肺、乳房、リンパ、胃腸（例えば、結腸）、および尿生殖路（例えば、腎臓細胞、尿路上皮細胞）、咽頭、前立腺、卵巣に影響を与えるものの悪性腫瘍、例えば、肉腫、腺癌、および癌腫、ならびに悪性腫瘍を含む腺癌、例えば、大部分の結腸癌、直腸癌、腎臓細胞癌、肝臓癌、肺の非小細胞癌、小腸の癌などが含まれる。上述の癌の転移病巣はまた、本発明の方法および組成物を使用して治療および予防され得る。

対象の方法は、種々の器官系、例えば、肺、乳房、リンパ、胃腸（例えば、結腸）、および尿生殖路、前立腺、卵巣、咽頭、に影響を与えるものの悪性腫瘍、ならびに悪性腫瘍を含む腺癌、例えば、大部分の結腸癌、腎臓細胞癌、前立腺癌および／または精巣腫瘍、肺の非小細胞癌、小腸の癌、および食道の癌などを治療する際に有用であり得る。治療され得る例示的な固形腫瘍には以下が含まれる：線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜肉腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌腫、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝臓癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、睾丸癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、および網膜芽細胞腫。

用語「癌腫」は、当業者によって認識され、呼吸系癌腫、胃腸系癌腫、尿生殖器頚癌種、精巣癌腫、乳房癌腫、前立腺癌腫、内分泌系癌腫、および黒色腫を含む、上皮または内分泌組織の悪性腫瘍をいう。例示的な癌腫には、子宮頸部、肺、前立腺、乳房、頭頸部、結腸、および卵巣の組織から掲載されるものが含まれる。この用語はまた癌肉腫を含み、例えば、これは、癌腫組織および肉腫組織から構成される悪性腫瘍を含む。「腺癌」とは、腺組織に由来する癌腫、またはそこで腫瘍組織が認識可能な腺状構造を形成する癌腫をいう。

用語「肉腫」は、当業者に認識され、間葉油対の悪性腫瘍をいう。

対象の方法はまた、造血起源の、例えば、脊髄、リンパ、または赤血球系統、またはその前駆細胞から生じる、過形成／新生物細胞の増殖を阻害するために使用され得る。例えば、本発明は、急性前骨髄性白血病（ＡＰＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）（Ｖａｉｃｋｕｓ，Ｌ．（１９９１）ＣｒｉｔＲｅｖ．ｉｎＯｎｃｏｌ．／Ｈｅｍｏｔｏｌ．１１：２６７−９７において概説されている）の治療を意図する。対照の方法によって治療され得るリンパの悪性腫瘍には、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）（これはＢ系統ＡＬＬおよびＴ系統ＡＬＬを含む）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＬＬ）およびヴァルデンストレームマクログロブリン血症（ＷＭ）が含まれるがこれらに限定されない。本発明の治療方法によって意図される悪性リンパ腫のさらなる型は、非ホジキンリンパ腫およびそのバリアント、末梢Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫（ＣＴＣＬ）、大顆粒リンパ球白血病（ＬＧＦ）、およびホジキン病が含まれるがこれらに限定されない。

アゴニストであるＥＴ２リガンドが、血管新生を刺激するため、例えば、創傷治癒、熱傷、および血管新生の増加を必要とする他の障害を補助するために使用され得る。

ＥＴ２リガンドを投与する方法は、「薬学的組成物」において記載されている、使用される分子の適切な投薬量は、被験体の年齢および体重、ならびに使用される特定の薬物に依存する。これらのリガンドは、例えば、天然のまたは病理学的薬剤とＥＴ２との間の望ましくない相互作用を阻害、減少するための競合剤として使用され得る。

１つの実施形態において、ＥＴ２リガンドは、インビボで、癌性細胞ならびに正常細胞、良性の過形成細胞、および癌性細胞を死滅し、除去し、またはこれらの細胞の増殖を阻害するために使用される。これらのリガンドは、これらだけで使用され得るか、または薬剤、例えば、細胞傷害性薬物、放射性同位元素に結合体化され得る。この方法は：リガンド単独、または細胞傷害性薬物と結合したリガンドを、このような治療を必要とする被験体に投与する工程を包含する。

用語「細胞傷害性薬剤」および「細胞増殖抑制剤」および「抗腫瘍剤」は、本明細書において交換可能に使用され、過剰増殖細胞、例えば、異常な癌細胞の成長もしくは増殖を阻害し（例えば、細胞増殖抑制剤）、またはこれらの細胞の死滅を誘導する特性を有する薬剤をいう。癌治療の実施形態において、用語「細胞傷害性薬剤」は、新生物（特に、固形腫瘍、軟部組織腫瘍、または転移病巣）の発生または進行を阻害する薬剤を意味するために、「抗癌」または「抗腫瘍」を交換可能に使用される。

抗癌剤の非限定的な例には、例えば、微小管阻害剤、トポイソメラーゼインヒビター、代謝拮抗物質、分裂抑制剤、アルキル化剤、インターカレート剤、シグナル伝達経路を妨害可能な薬剤、アポトーシスを促進する薬剤、放射線、および他の腫瘍関連抗原に対する抗体（裸の抗体、イムノトキシン、および放射性結合体を含む）が含まれる。特定のクラスの抗癌剤の例は以下に詳細に提供される：抗チューブリン／抗微小管、例えば、パクリタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、タキソテレ；トポイソメラーゼＩ阻害剤、例えば、トポテカン、カンプトテシン、ドキソルビシン、エトポシド、ミトキサントロン、ダウノルビシン、イダルビシン、テノポシド、アムサクリン、エピルビシン、メルバロン、ピロキサントロン塩酸塩；代謝拮抗物質、例えば、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、リン酸フルダラビン、シタラビン／Ａｒａ−Ｃ、トリメトトレキサート、ゲムシタビン、アクチビン、アラノシン、ピラゾフリン、Ｎ−ホスホルアセチル−Ｌ−アスパレート＝ＰＡＬＡ、ペントスタチン、５−アザシチジン、５−アザ２’−デオキシシチジン、ａｒａ−Ａ、クラドリビン、５−フルオロウリジン、ＦＵＤＲ、チアゾフリン、Ｎ−［５−［Ｎ−（３，４−ジヒドロ−２−メチル−４−オキソキアゾリン−６−イルメチル）−Ｎ−メチルアミノ］−２−セノイル］−Ｌ−グルタミン酸；アルキル化剤、例えば、シスプラチン、カルボプラチン、マイトマイシンＣ、ＢＣＮＵ＝カルムスチン、メルファラン、チオテパ、ブスルファン、クロラムブシル、プリカマイシン、デカルバジン、硫酸イフォスファミド、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、ウラシルマスタード、ピポブロマン、４−イポメアノール；他の作用のメカニズムを介して作用する薬剤、例えば、ジヒドロレンペロン、スピロムスチン、およびデシペプチド；生物学的応答モディファイアー、例えば、抗腫瘍応答を増強するために、インターフェロンなど；アポトーシス剤、アクチノマイシンＤなど；および抗ホルモン、例えば、タモキシフェンなどの抗エストロゲン、または４’−シアノ−３−（４−フルオロフェニルスルホニル）−２−ヒドロキシ−２−メチル−３’−（トリフルオロメチル）プロピオンアニリドなどの抗アンドロゲン。

ＥＴ２リガンドは、通常の内皮細胞を認識する。これらのリガンドはまた、癌性細胞の近傍の細胞に結合し得る。これらのリガンドは、これらの細胞の増殖を阻害し得、および／またはこれらの細胞を死滅し得る。この様式において、リガンドは、栄養、増殖シグナルなどのために周囲の細胞に頼るかもしれない癌性細胞を間接的に攻撃するかもしれない。このように、ＥＴ２リガンド（例えば、細胞毒で修飾されている）は、癌性組織（癌性細胞それ自体を含む）中の細胞を選択的に標的とし得る。

これらのリガンドは、治療薬物、放射線を放射する化合物、植物、真菌、または細菌起源の生物学的タンパク質、およびこれらの混合物を含む種々の細胞傷害性薬物を送達するために使用されてもよい。細胞傷害性薬物は、例えば、本明細書に記載されるような短距離の高エネルギーα放射体を含む、短距離放射線放射体などの細胞内で作用する細胞傷害性薬物であり得る。

酵素的に活性な毒素およびそのフラグメントは、ジフテリア毒素Ａフラグメント、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サクリン、特定のＡｌｅｕｒｉｔｅｓｆｏｒｄｉｉタンパク質、特定のＤｉａｎｔｈｉｎタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、Ｍｏｒｏｄｉｃａｃｈａｒａｎｔｉａインヒビター、クルシン、クロチン、Ｓａｐｏｎａｒｉａｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓインヒビター、ゲロニン、ミトグリン、レストリクトシン、フェノマイシン、およびエノマイシンによって例示される。イムノトキシンの酵素的に活性なポリペプチドを調製するための手順は、Ｗ０８４／０３５０８およびＷ０８５／０３５０８に記載されている。抗体に結合体化され得る細胞傷害性部分の例には、アドリアマイシン、クロラムブシル、ダウノマイシン、メトトレキサート、ネオカルジノスタチン、および白金が含まれる。

ポリペプチド毒素の場合において、組換え核酸技術が、翻訳融合物として、リガンド（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント）をコードする核酸を構築するために使用され得る。次いで、組換え核酸が、例えば、細胞中で発現され、コードされた融合ポリペプチドが単離される。

細胞傷害性薬剤とのタンパク質リガンド（例えば、抗体）の結合体化のための手順は以前に記載されている。クロラムブシルを抗体と結合体化するための手順は、Ｆｌｅｃｈｎｅｒ（１９７３）ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＣａｎｃｅｒ，９：７４１−７４５；Ｇｈｏｓｅら（１９７２）ＢｒｉｔｉｓｈＭｅｄｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌ，３：４９５−４９９；およびＳｚｅｋｅｒｋｅら（１９７２）Ｎｅｏｐｌａｓｍａ，１９：２１１−２１５によって記載されている。ダウノルビシンおよびアドリアマイシンを抗体に結合体化するための手順は、Ｈｕｒｗｉｔｚ，Ｅ．ら（１９７５）ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ，３５：１１７５−１１８１およびＡｒｎｏｎら（１９８２）ＣａｎｃｅｒＳｕｒｖｅｙｓ，１：４２９−４４９によって記載されている。抗体−リシン結合体を調製するための手順は、米国特許第４，４１４，１４８号において、およびＯｓａｗａ，Ｔ．，ら（１９８２）ＣａｎｃｅｒＳｕｒｖｅｙｓ，１：３７３−３８８、およびそこに引用される参考文献によって記載されている。カップリング手順はまた、ＥＰ８６３０９５１６．２に記載されている。

正常細胞、良性の過形成細胞、または癌性細胞を死滅または除去するために、第１のタンパク質リガンドが、プロドラッグアクチベーターと密接に近接した場合にのみ活性化されるプロドラッグと結合体化される。プロドラッグアクチベーターは、第２のタンパク質リガンド、好ましくは、標的分子上の非競合部位に結合するものと結合体化される。２つのタンパク質リガンドが競合結合部位または非競合結合部位に結合するか否かは、首尾よい競合結合アッセイによって決定され得る。本発明の実施における使用のために適切な薬物−プロドラッグ対は、Ｂｌａｋｅｙら（１９９６）ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ，５６：３２８７−３２９２において記載されている。

代替的には、ＥＴ２リガンドは、高エネルギー放射線放射体、例えば、腫瘍部位に配置されたときに、いくつかの細胞直径の死滅を生じる、γ放射体である^１３１Ｉなどの放射性同位元素にカップリングされ得る。例えば、Ｓ．Ｅ．Ｏｒｄｅｒ，「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，ａｎｄＦｕｔｕｒｅＰｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅｏｆｔｈｅＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＵｓｅｏｆＲａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄＡｎｔｉｂｏｄｙｉｎＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐｙ」，ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓｆｏｒＣａｎｃｅｒＤｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄＴｈｅｒａｐｙ，Ｒ．Ｗ．Ｂａｌｄｗｉｎら（編），３０３−３１６頁（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ１９８５）を参照のこと。他の適切な放射性同位元素は、^２１２Ｂｉ、^２１３Ｂｉ、および^２１１Ａｔなどのα放射体、ならびに^１８６Ｒｅおよび^９０Ｙなどのβ放射体が含まれる。さらに、Ｌｕ^１１７もまた、画像化薬剤および細胞傷害性薬剤の療法として使用されてもよい。

^１３１Ｉ、^９０Ｙ、および^１７７Ｌｕで標識された抗体を使用する放射免疫療法（ＲＩＴ）は、強烈な臨床研究が行われている。これらの３種の核種の物理的特徴には顕著な違いが存在し、結果として、放射性核種の選択は、腫瘍に対して最大放射線量を送達するために非常に決定的である。より高いベータエネルギー粒子の^９０Ｙは、かさ高い腫瘍のために良好である可能性がある。比較的低エネルギーのベータ粒子の^１３１Ｉは理想的であるが、放射性ヨード化分子のインビボ脱ハロゲン化が、内部移行抗体についての主要な欠点である。対照的に、^１７７Ｌｕは、０．２〜０．３ｍｍのみの範囲の低エネルギーベータ粒子を有し、^９０Ｙと比較して骨髄にはるかに低い放射線量を送達する。さらに、より長い物理的半減期（^９０Ｙと比較して）に起因して、腫瘍への存在時間がより長い。結果として、^１７７Ｌｕ標識された薬剤のより高い活性（より多いｍＣｉ量）が、骨髄への比較的少ない放射線量を伴って、投与され得る。種々の癌の治療における^１７７Ｌｕ標識抗体の使用を調べているいくつかの臨床研究が既存の（ＭｕｌｌｉｇａｎＴら（１９９５）ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ．１：１４４７−１４５４；ＭｅｒｅｄｉｔｈＲＦら（１９９６）ＪＮｕｃｌＭｅｄ３７：１４９１−１４９６；ＡｌｖａｒｅｚＲＤら（１９９７）ＧｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃＯｎｃｏｌｏｇｙ６５：９４−１０１）。

ＥＴ２リガンドは、天然の補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を介して、抗原発現細胞を除去するためにインビボで直接的に使用され得る。本発明のタンパク質リガンドは、ＩｇＧ１、−２、もしくは−３からのＦｃ部分、または補体を結合するＩｇＭの対応する部分などの補体結合エフェクタードメインを含み得る。１つの実施形態において、標的細胞の集団は、本発明の結合剤および適切なエフェクター細胞でエキソビボ処理される。この処理は、補体および補体を含む血清の添加によって補充され得る。さらに、本発明のタンパク質リガンドでコートされた標的細胞の食作用は、補体タンパク質の結合によって改善され得る。別の実施形態において、補体結合エフェクタードメインを含むタンパク質リガンドでコートされた細胞は、補体によって溶解される。

予防のためにＥＴ２リガンドを使用する工程を含む、死滅または除去のための方法もまた、本発明に含まれる。例えば、これらの物質は、癌の発症または進行を妨害または遅延させるために使用され得る。

癌を治療するための本発明の治療方法の使用は、多数の利点を有する。タンパク質リガンドはＥＴ２を特異的に認識するので、他の組織は傷つけられず、高レベルの薬剤が、治療が必要とされる部位に直接的に送達される。本発明に従う治療は、臨床的パラメーターを用いて効果的にモニターされ得る。代替的には、これらのパラメーターは、このような治療がいつ利用されるべきであるかを示すために使用され得る。

本発明のＥＴ２リガンドは、癌を治療するための既存の様式（外科手術；放射線治療、および化学療法）の１つ以上と組み合わせて投与され得る。

（診断的使用）
ＥＴ２に結合し、および本明細書に記載の方法によって同定され、および／または本明細書に詳述されるタンパク質リガンドは、インビトロおよびインビボで、診断的、治療的、および予防的な有用性を有する。

１つの態様において、本発明は、インビトロで（例えば、組織、生検などの生物学的サンプル（例えば、癌性組織））またはインビボで（例えば、被験体中でのインビボ画像処理）ＥＴ２の存在を検出するための診断方法を提供する。

この方法は以下の工程を包含する：（ｉ）サンプルをＥＴ２リガンドと接触させる工程；および（ｉｉ）ＥＴ２リガンドとサンプルとの間の複合体の形成を検出する工程。この方法はまた、参照サンプル（例えば、コントロールサンプル）をリガンドと接触させる工程、およびリガンドとサンプルとの間の複合体の形成の程度を、参照サンプルについてのそれに対して比較して、決定する工程。コントロールサンプルまたは被験体と比較した、サンプルまたは被験体における複合体の形成の変化（例えば、統計学的に有意な変化）が、サンプル中のＥＴ２の存在の指標であり得る。

別の方法は以下の工程を包含する：（ｉ）被験体にＥＴ２リガンドを投与する工程；および（ｉｉｉ）ＥＴ２リガンドと被験体との間の複合体の形成を検出する工程。この検出する工程は、複合体の形成の位置または時間を決定することを含み得る。

ＥＴ２リガンドは、結合した抗体または未結合の抗体の検出を容易にするために、検出可能な物質で直接的または間接的に標識され得る。適切な検出可能な物質には、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、および放射活性物質が含まれる。

ＥＴ２リガンドとＥＴ２の間の複合体形成は、ＥＴ２に結合したリガンドまたは未結合リガンドのいずれかを測定または可視化することによって検出され得る。従来的な検出アッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、または組織免疫組織化学）が使用され得る。ＥＴ２を標識化することに加えて、ＥＴ２の存在が、サンプル中で、検出可能な基質で標識した標準、および未標識のＥＴ２リガンドを利用する競合イムノアッセイによってアッセイされ得る。このアッセイの１つの例において、生物学的試料、標識された標準、およびＥＴ２結合剤は合わせられ、未標識リガンドに結合した標識された標準の量が決定される。サンプル中のＥＴ２の量は、ＥＴ２結合剤に結合した標識された標準の量に逆比例する。

フルオロフォアおよびクロモフォア標識されたタンパク質リガンドが調製され得る。抗体および他のタンパク質は約３１０ｎｍまでの波長を有する光を吸収するので、蛍光部分は、約３１０ｎｍより上の波長、および好ましくは４００ｎｍより上の波長で実質的な吸収を有するように選択されるべきである。種々の適切な蛍光体およびクロモフォアが、Ｓｔｒｙｅｒ（１９６８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，１６２：５２６およびＢｒａｎｄら（１９７２）ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１：８４３−８６８によって記載されている。タンパク質リガンドは、米国特許第３，９４０，４７５号、同第４，２８９，７４７号、および同第４，３７６，１１０号において開示されているものなどの従来的な手順によって、蛍光クロモフォアで標識され得る。上記の所望の特性の多くを有する蛍光体の１つの群はキサンテン色素であり、これはフルオレセインおよびローダミンを含む。別の群の蛍光化合物はナフチルアミンである。一旦フルオロフォアまたはクロモフォアで標識されると、タンパク質リガンドは、例えば、蛍光顕微鏡（例えば、共焦点顕微鏡または逆重畳積分顕微鏡）を使用して、サンプル中のＥＴ２の存在または局在を検出するために使用され得る。

（組織学的分析）。免疫組織化学が、本明細書に記載されるタンパク質リガンドを使用して実行され得る。例えば、抗体の場合においては、抗体は、標識を伴って合成され得（例えば、精製またはエピトープタグ）、または、例えば、標識もしくは標識結合基によって検出可能に標識され得る。例えば、キレート剤が抗体に結合され得る。次いで、抗体は、組織学的調製物、例えば、顕微鏡スライド上にある、組織の固定化切片に接触される。結合のためのインキュベーション後、この調製物は、未結合の抗体を除去するために洗浄される。次いで、この調製物は、抗体がこの調製物に結合したか否かを同定するために、例えば、顕微鏡を使用して分析される。

当然、抗体（または他のポリペプチドもしくはペプチド）は結合の時点で未標識であり得る。結合および洗浄の後、抗体は、それを検出可能にするために、標識される。

（タンパク質アレイ）。ＥＴ２リガンドはまた、タンパク質アレイ上に固定化され得る。このタンパク質アレイは、例えば、医学的サンプル（例えば、単離された細胞、血液、血清、生検など）をスクリーニングするための診断用ツールとして使用され得る。当然、タンパク質アレイは、例えば、ＥＴ２または他の標的分子に結合する他のリガンドを含み得る。

ポリペプチドを産生する方法は、例えば、ＤｅＷｉｌｄｔら（２０００）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：９８９−９９４；Ｌｕｅｋｉｎｇら（１９９９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：１０３−１１１；Ｇｅ（２０００）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２８，ｅ３，Ｉ−ＶＩＩ；ＭａｃＢｅａｔｈおよびＳｃｈｒｅｉｂｅｒ（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ２８９：１７６０−１７６３；ＷＯ０１／４０８０３およびＷＯ９９／５１７７３Ａ１において記載されている。アレイのためのポリペプチドは、例えば、ＧｅｎｅｔｉｃＭｉｃｒｏＳｙｓｔｅｍｓまたはＢｉｏＲｏｂｏｔｉｃｓからの、例えば、市販のロボット装置を使用して、高速でスポットされ得る。このアレイ基材は、例えば、ニトロセルロース、プラスチック、ガラス、例えば、表面修飾ガラスであり得る。このアレイはまた、多孔性マトリックス、例えば、アクリルアミド、アガロース、または別のポリマーに含まれ得る。

例えば、アレイは、例えば、ＤｅＷｉｌｄｔ、前出によって記載されるような抗体のアレイであり得る。タンパク質リガンドを産生する細胞は、アレイ化形式でフィルター上で増殖され得る。ポリペプチド産生が誘導され、発現したポリペプチドは、細胞の位置でフィルターに固定化される。

タンパク質アレイは、多様な鎖ライブラリーからの各々の固定化ポリペプチドへの標的の結合の程度を決定するために、標識した標的と接触され得る。標的が未標識の場合、未標識標的の結合を検出するために、例えば、標識したプローブを使用するサンドイッチ法が使用され得る。

アレイの各アドレスにおける結合の程度に関する情報は、プロフィールとして、例えば、コンピュータデータベースに保存され得る。タンパク質アレイは、複製中で産生され得、そして結合プロフィールを、例えば、標的および非標的のプロフィールと比較するために使用され得る。従って、タンパク質アレイは、１つ以上の分子に関して所望の結合特性を有する多様な鎖ライブラリーの個々のメンバーを同定するために使用され得る。

（ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞ソーティング））。ＥＴ２リガンドは、細胞、例えば、サンプル（例えば、親のサンプル）中の細胞を標識するために使用され得る。このリガンドはまた、蛍光化合物に結合される（または結合可能である）。次いで、これらの細胞は、蛍光活性化細胞ソーティングを使用して分別され得る（例えば、ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎＩｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙＳｙｓｔｅｍｓ，ＳａｎＪｏｓｅＣＡから入手可能なソーターを使用する；米国特許第５，６２７，０３７号；同第５，０３０，００２号；および同第５，１３７，８０９号もまた参照のこと）。細胞がソーターを通過するときに、レーザービームが蛍光化合物を励起し、そのときに検出器が通過する細胞を計数し、蛍光を検出することによって、蛍光化合物が細胞に結合しているか否かを決定する。各細胞に結合した標識の量が、定量および分析されて、サンプルを特徴付けし得る。

ソーターは、細胞を偏光させ、リガンドによって結合されていない細胞から、リガンドによって結合された細胞を単離し得る。単離された細胞は、培養および／または特徴付けされ得る。

（インビボ画像化）。なお別の実施形態において、本発明は、インビボでＥＴ２発現癌性組織の存在を検出するための方法を提供する。この方法は以下の工程を包含する：（ｉ）被験体（例えば、癌または新生物障害を有する患者）に、検出可能なマーカーに結合体化された抗ＥＴ２抗体を投与する工程；（ｉｉ）ＥＴ２発現組織または細胞へのこの検出可能なマーカーを検出するための手段に、被験体を曝露する工程。例えば、被験体は、例えば、ＮＭＲまたは他の断層撮影手段によって画像化される。

本発明に従う診断的画像化のために有用である標識の例には、^１３１Ｉ、^１１１Ｉｎ、^１２３Ｉ、^９９ｍＴｃ、^３２Ｐ、^１２５Ｉ、^３Ｈ、^１４Ｃ、および^１８８Ｒｈなどの放射性標識、フルオレセインおよびローダミンなどの蛍光標識、核磁気共鳴活性標識、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）スキャナによって検出可能なポジトロン放出アイソトープ、ルシフェリンなどの化学発光剤、およびペルオキシダーゼまたはホスファターゼなどの酵素的マーカーが含まれる。短距離検出器プローブによって検出可能なアイソトープなどの短距離放射線放射体もまた、利用され得る。タンパク質リガンドは、このような試薬を用いて、既知の技術を使用して標識され得る。例えば、ＷｅｎｓｅｌおよびＭｅａｒｅｓ（１９８３）ＲａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｉｍａｇｉｎｇａｎｄＲａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ＮｅｗＹｏｒｋｆｏｒｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｒｅｌａｔｉｎｇｔｏｔｈｅｒａｄｉｏｌａｂｅｌｉｎｇｏｆａｎｔｉｂｏｄｉｅｓならびにＤ．Ｃｏｌｃｈｅｒら（１９８６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２１：８０２−８１６を参照のこと。

放射性標識された本発明のリガンドはまた、インビトロ診断試験のために使用され得る。アイソトープ標識されたリガンドの比活性は、半減期、放射活性標識のアイソトープ純度、および標識がどのようにして抗体に組み込まれたかに依存する。

放射活性アイソトープ（例えば、^１４Ｃ、^３Ｈ、^３５Ｓ、^１２５Ｉ、^３２Ｐ、^１３１Ｉ）を有するポリペプチドを標識するための手順は一般的に知られている。例えば、トリチウム標識手順は、米国特許第４，３０２，４３８号に記載されている。ヨウ素化、トリチウム標識、および^３５Ｓ標識手順は、例えば、マウスモノクローナル抗体について適合されるように、例えば、Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｗ．（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄｐｒａｃｔｉｃｅ：ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｉｎｃｅｌｌｂｉｏｌｏｇｙ，ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｓｙ，ａｎｄｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ第２版Ｌｏｎｄｏｎ；Ｏｒｌａｎｄｏ：ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，１９８６．１２４−１２６頁およびそこに引用される参考文献によって記載されている。ヨウ素化ポリペプチド（例えば、抗体など）についての他の手順は、ＨｕｎｔｅｒおよびＧｒｅｅｎｗｏｏｄ（１９６２）Ｎａｔｕｒｅ１４４：９４５，Ｄａｖｉｄら（１９７４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１３：１０１４−１０２１、ならびに米国特許第３，８６７，５１７号および同第４，３７６，１１０号によって記載されている。画像化において有用である放射性標識元素は、例えば、^１２３Ｉ、^１３１Ｉ、^１１１Ｉｎ、および^９９ｍＴｃを含む。抗体をヨウ素化するための手順は、Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ，Ｆ．ら（１９６３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．８９：１１４−１２３；Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓ，Ｊ．（１９６９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１１３：２９９−３０５；およびＭｏｒｒｉｓｏｎ，Ｍ．ら（１９７１）Ｉｆｎｆｎｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２８９−２９７によって記載されている。^９９ｍＴｃ標識のための手順は、Ｒｈｏｄｅｓ，Ｂ．らＢｕｒｃｈｉｅｌ，Ｓ．ら（編）ＴｕｍｏｒＩｍａｇｉｎｇ：ＴｈｅＲａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＣａｎｃｅｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ：Ｍａｓｓｏｎ１１１−１２３（１９８２）およびそこに引用される参考文献によって記載されている。^１１１Ｉｎ標識抗体のために適切な手順は、Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ，Ｄ．Ｊ．ら（１９８３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６５：１４７−１５７、Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ，Ｄ．ら（１９８４）ＪＡｐｐｌｉｅｄＲａｄｉａｔｉｏｎ，３５：５５４−５５７、およびＢｕｃｋｌｅｙ，Ｒ．Ｇ．ら（１９８４）Ｆ．Ｅ．Ｂ．Ｓ．１６６：２０２−２０４によって記載されている。

放射性標識リガンドの場合において、リガンドは患者に投与され、リガンドが反応する抗原を有する腫瘍に局在化され、そして例えば、ガンマカメラまたは放出断層撮影法を使用する放射核スキャニングなどの公知の技術を使用して、インビトロで検出されるかまたは「画像化」される。例えば、Ａ．Ｒ．Ｂｒａｄｗｅｌｌら「ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓｉｎＡｎｔｉｂｏｄｙＩｍａｇｉｎｇ」、ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓｆｏｒＣａｎｃｅｒＤｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄＴｈｅｒａｐｙ，Ｒ．Ｗ．Ｂａｌｄｗｉｎら（編），６５−８５頁（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ１９８５）を参照のこと。代替的には、ポジトロン放出軸横断断層撮影スキャナ、例えば、ＢｒｏｏｋｈａｖｅｎＮａｔｉｏｎａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙに配置されているＰｅｔＶＩと呼ばれるものが使用され得、ここでは、放射性標識がポジトロンを放出する（例えば、^１１Ｃ、^１８Ｆ、^１５Ｏ、および^１３Ｎ）。

（ＭＲＩ造影剤）。磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）は、生きている被験体の内部の特徴を可視化するためにＮＭＲを使用し、予後診断、診断、治療、および外科手術のために有用である。ＭＲＩは、明白な利点のために放射活性トレーサー化合物なしで使用され得る。いくつかのＭＲＩ技術が、ＥＰ−Ａ−０５０２８１４に要約されている。一般的には、異なる環境における水プロトンの緩和時間定数Ｔ１およびＴ２に関する差異が画像を生成するために使用される。しかし、これらの違いは、鋭敏な高解像度画像を提供するには不十分であり得る。

これらの緩和時間定数における差異は、造影剤によって増強され得る。このような造影剤の例には、多数の磁性体、常磁性体（これは主としてＴ１を変化させる）、および強磁性体または超磁性体（これは主としてＴ２応答を変化させる）が含まれる。キレート剤（例えば、キレート剤ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、およびＮＴＡ）は、いくつかの常磁性物質（例えば、Ｆｅ^＋３、Ｍｎ^＋２、Ｇｄ^＋３）に結合するために（および毒性を減少するために）使用され得る。他の薬剤は、例えば、１０μｍ未満〜約１０ｍＭの直径の粒子の形態であり得る。粒子は、強磁性、反強磁性、または超磁性特性を有し得る。粒子は、例えば、マグネタイト（Ｆｅ_３Ｏ_４）、γ−Ｆｅ_２Ｏ_３、フェライト、および他の遷移元素の磁性鉱物性化合物を含み得る。磁気粒子は、非磁気物質を有するかまたは有さない、１つ以上の磁気結晶を含んでもよい。非磁気物質は、合成または天然のポリマー（例えば、セファロース、デキストラン、デキストリン、デンプンなど）を含み得る。

ＥＴ２リガンドはまた、ＮＭＲ活性^１９Ｆ原子または複数のこのような原子を含む表示基で標識され得、このような原子は、以下と同程度である：（ｉ）実質的にすべての天然に豊富なフッ素原子は^１９Ｆアイソトープであり、従って、実質的にすべてのフッ素含有化合物はＮＭＲ活性である；（ｉｉ）多くの化学的に活性なポリフッ化化合物（例えば、トリフルオロ酢酸無水物）は比較的低いコストで市販されており、および（ｉｉｉ）多くのフッ化化合物はヒトにおける使用のために医学的に受容可能であることが見出されており、例えば、ペルフルオロポリエーテルは、ヘモグロビン置換物として酸素を運ぶために利用される。インキュベーションのためのこのような時間の許容後、癌性組織を位置決めおよび画像化するために、全身ＭＲＩが、Ｐｙｋｅｔｔ（１９８２）ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＡｍｅｒｉｃａｎ，２４６：７８−８８によって記載されたもののうちの１つなどの装置を使用して実行される。

ＥＴ２に結合するタンパク質リガンドおよび診断的使用のための指示書を含むキットもまた、本発明の範囲内にあり、この使用は、例えば、インビトロで、例えばサンプル（例えば、癌または新生物障害を有する患者からの生検または細胞）中で、あるいはインビボで、例えば、被験体を画像化することによって、ＥＴ２を検出するための使用である。このキットはさらに、少なくとも１種の試薬、例えば、標識またはさらなる診断剤を含み得る。インビボ使用のために、リガンドは、薬学的組成物として製剤化され得る。

以下の本発明は、さらなる限定とは見なされるべきではない以下の実施例によってさらに例証される。本願を通して引用される、すべての参考文献、係属中の特許出願、および公開された特許は、参照として明白に本明細書に援用される。

（実施例１：選択および一次スクリーニング）
ＥＴ２を結合する抗体を単離するために、ファージミドＦａｂライブラリーを、ＥＴ２のプロテアーゼドメインに対してスクリーニングした。

ＥＴ２のビオチン化プロテアーゼドメインを、ストレプトアビジンコートした磁気ビーズ（Ｍ２８０−ＤＹＮＡＬ）上で捕捉した。ＥＴ２コートされたビーズを、ライブラリーファージの付加の前に、ＰＢＳ中２％ノンファットミルクで３回洗浄した。ライブラリーファージ（１０^１２粒子）を、１００μｌの最終容量で磁気ビーズに加えた。この混合物を、端をひっくり返して混合しながら、２時間室温でインキュベートした。この時点で、上清を除去し、ビーズを、ＰＢＳ中０．１％Ｔｗｅｅｎ、２％ノンファットミルクで３回洗浄した。最終洗浄後、ビーズを、新たなチューブに移した。ファージを、１ｍｌの１００ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ＴＥＡ）の付加によって、ビーズから溶出した。室温で１０分間のインキュベーション後、上清を取り出し、５００μｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５に加えた。次いで、溶出したファージを増幅し、さらなる選択のラウンドのために使用した。３回の選択のラウンド後、産物を以下のように分析した（方法については、Ｃｈａｍｅｓら（２００２）ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌＢｉｏｌ．１７８：１４７−５７もまた参照のこと）。

選択から回収したライブラリーメンバーを、ファージＥＬＩＳＡによってＥＴ２結合について試験した（図３）。各単離物を、ＥＴ２、およびブランクのストレプトアビジンウェルへの結合について試験した。ストレプトアビジン結合に対して２倍のＥＴ２についてのＥＬＩＳＡシグナルを与えた単離物を「ポジティブ」と見なして、小スケール可溶性Ｆａｂ産生のために選択した。全部で１８４個の単離物をファージＥＬＩＳＡにおいて試験し、この方法に従うと、このうちの１７１個がポジティブと試験された。例示的なデータを以下の表４に示す。

（表４：例示的なファージＥＬＩＳＡデータ）

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（実施例２：Ｆａｂ産生およびスクリーニング）
小スケール量の可溶性Ｆａｂを、９６ウェル形式で産生し、ＥＴ２への結合について試験した。Ｆａｂを特徴付けすることをさらに補助するために、ＥＬＩＳＡｗ、ＥＴ２の活性部位に結合する競合リガンドの存在下および非存在下で実行した。ＦａｂＥＬＩＳＡシグナルが競合リガンドの存在下で減少する場合、これらのＦａｂは活性部位にまたはその近傍に結合する可能性が高い。例示的なデータを以下の表５に示す。

（表５：例示的な可溶性ＥＬＩＳＡデータ）

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このアッセイにおいて、全部で６４個のＥＴ２結合可溶性Ｆａｂを同定した。これらのうち、３１個がペプチドによって強力に競合され、さらに８個がペプチドの存在下で弱い競合を示した。本発明者らは、ペプチドインヒビターによる、標的酵素へのＦａｂ結合の競合が、インヒビターを同定するための有用な方法であることを見出した。これは、別の型のアッセイによって、Ｆａｂによる阻害を試験することによって行った。ＥＴ２を結合する可溶性Ｆａｂを、大スケール（４５０ｍｌ培養）で調製し、そして連続するインビトロ酵素アッセイにおいてＥＴ２の阻害を決定するために使用した。

ＥＴ２のインヒビターを評価するためのアッセイを、以下のように実行し得る：ＥＴ２のプロテアーゼドメインのプロテアーゼ活性の阻害のための試験化合物を、Ｃｏｓｔａｒ９６ウェル組織培養プレート（ＣｏｒｎｉｎｇＮＹ）においてアッセイする。約２〜３ｎＭＥＴ２を、２９．２ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．４、２９．２ｍＭイミダゾール、２１７ｍＭＮａＣｌ（１００ｍＬ最終容量）中で、様々な濃度のインヒビターとともに混合し、３０分間、室温でのインキュベーションに供する。４００ｍＭ基質Ｓ２７６５（ＤｉａＰｈａｒｍａ，Ｗｅｓｔｃｈｅｓｔｅｒ，ＯＨ）を加え、反応を、ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸＰｌｕｓマイクロプレートリーダー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ，ＳｕｎｎｙｖａｌｅＣＡ）中で、４０５ｎｍにおける吸収の変化を１時間、３７℃で追跡することによってモニターする。他に示されない限り、すべての試薬はＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。ＥＴ１アッセイに従って、さらなる詳細は以下にさらに提供され得る。

Ｓ２７６５の例示的な構造は、以下：

である。

本発明者らは、ペプチドによる強力な競合を示すＦａｂがＥＴ２の良好な酵素インヒビターであることを示した。最良のインヒビターについてのＫ_ｉ値を表６に示す。これらのクローンは引き続いて配列決定した。

（表６：Ｆａｂインヒビターについての阻害データ）

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以下は、ＥＴ１活性についてのアッセイである。ＥＴ１活性をアッセイするためのアッセイ緩衝液はＨＢＳＡ（１０ｍＭＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４、０．１％ウシ血清アルブミン）であった。すべての試薬は、他に示されない限り、ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。３０分（試験Ｆａｂおよび酵素の３０分間のプレインキュベーション）および０分（試験Ｆａｂおよび酵素のプレインキュベーションなし）での２回のＩＣ_５０アッセイを行った。３０分でのＩＣ_５０アッセイについては、以下の試薬をＣｏｒｎｉｎｇマイクロタイタープレートの適切なウェル中で合わせた：５０μｌのＨＢＳＡ、５０μｌの試験化合物、ＨＢＳＡ中で希釈（広範な濃度範囲を網羅する）（または阻害されていない速度測定のためにはＨＢＳＡ単独）、および緩衝液中で希釈した５０μｌのｒＥＴ１（ＣｏｒｖａｓＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、２５０ｐＭの最終濃度を生じる。大気温度における３０分間のインキュベーション後、アッセイを、５０μｌの基質ＳｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅｔＰＡ（メチルスルホニル−Ｄ−シクロヘキシル−Ｌ−グリシル−Ｌ−アルギニン−Ｐ−ニトロアニリンアセテート、ＡｍｅｒｉｃａｎＤｉａｇｎｏｓｔｉｃａ，Ｉｎｃ．（Ｇｒｅｅｎｗｉｃｈ，ＣＴ）より入手、脱イオン水中で再構成、続いてアッセイの前にＨＢＳＡ中で希釈）の付加によって開始し、これをウェルに加え、２００μｌの最終容量および３００μＭの最終基質濃度（Ｋｍの約１．５倍）を生じた。

０分でのＩＣ５０アッセイのために、同じ試薬を合わせた：５０μｌのＨＢＳＡ、５０μｌの試験化合物、ＨＢＳＡ中で希釈（同一の濃度範囲を網羅する）（または阻害されていない速度測定のためにはＨＢＳＡ単独）、および５０μｌの基質ＳｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅｔＰＡ。アッセイを、５０μｌのｒＥＴ２の付加によって開始した。すべての成分の最終濃度は、両方のＩＣ_５０アッセイ（３０分インキュベーションおよび０分インキュベーション）において同一であった。

発色性基質加水分解の初期速度を、ＴｈｅｒｍｏＭａｘＫｉｎｅｔｉｃマイクロプレートリーダー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）を使用して、４０５ｎｍにおける吸収の変化によって両方のアッセイにおいて、５分間の時間にわたって測定し、この時間では、加えられた基質の５％未満が使用された。加水分解の初期の速度を５０％減少する、加えられたインヒビターの濃度を、２回のアッセイ（３０分および０分）の各々において、それぞれのＩＣ_５０値として定義した。

（実施例３．Ｆａｂインヒビターの選択性）
Ｆａｂインヒビターについての配列データを表１に示す（上記、要約の節）。４個のクローン（Ａ２、Ｂ５、Ｄ２、およびＨ１０）は、同じ重鎖配列を共有する。この配列は、リジンからアンバー終止コドンへの変異を含む。このような変異は、重鎖の短縮を生じ、結果として非機能的Ｆａｂを生じることが通常予測されるが、すべての増殖が、Ｅ．ｃｏｌｉのｓｕｐＥ変異体において実行された。この変異体株は、アンバー終止コドンにおいて、配列データにおいてｑで示されるグルタミン残基を挿入し、従って、成熟Ｆａｂの産生を可能にする。

上記の７個のＦａｂをＩｇＧ１抗体に再編成した。Ｆａｂ再編成は２段階プロセスであり、ここでは、Ｆａｂは最初に、重鎖および軽鎖ならびに重鎖定常配列の発現を駆動する真核生物プロモーターを提供するＩｇＧ１発現ベクター（ｐＲＲＶ）にクローニングされる。第２の段階において、重鎖の発現を駆動するために使用されるＥ．ｃｏｌｉプロモーターを、真核生物内部リボソームエントリー配列（ＩＲＥＳ）で置換する。アンバー終止コドンを有する４個のクローンが哺乳動物系における発現を可能にするために、Ａ２、Ｂ５、Ｄ２、およびＨ１０は、アンバー終止コドンを、この位置に天然に存在するアミノ酸であるリジンで置換した。

一旦、発現ベクター構築が完了すると、抗体はＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で一過性に発現され、引き続いて、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して細胞培養培地から精製される。精製された抗体を、Ｆａｂの分析のために以前に使用された同じ連続的インビトロアッセイにおいて試験した。Ｋｉ値を表７に示す。

選択性スクリーニングにおいて、すべてのＩｇＧは、プロテアーゼトリプシノーゲＩＶ、ＭＴＳＰ−１、ＭＴＳＰ−６、ＭＴＳＰ−７、ＭＴＳＰ−１０、およびＥＴ１に対して、１００ｎＭで＜５％活性を実証した。

（表７：ＦａｂおよびＩｇＧインヒビターについての阻害データの比較）

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（実施例４．腫瘍増殖の減少）
ＥＴ−２に結合する１つの抗体を、小動物効力研究において評価した。

ＤＵ−１４５腫瘍細胞を、６〜８週齢のＳＣＩＤマウス（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒ）の動物の脇腹に皮下注射した。腫瘍移植の５〜１０日後、動物を１０〜１５匹の動物の群にランダムに分けた。処置は、ＩＰ注射により、Ｆａｂを１日１回（０、２００、もしくは４００μｇ／動物）、またはＩｇＧを１日毎に１回（０、１０、５０、もしくは５００μｇ／動物）のいずれかであった。この研究は、腫瘍が許容可能な最大サイズに達するまで、継続させた。腫瘍サイズは、バーニアキャリパー（Ｍｉｔｕｔｏｙｏモデル５７３）で測定し、腫瘍体積を計算した。研究の最後に、腫瘍を切除し、秤量した。研究の間の動物の健康状態を、規則的な秤量によって評価した。４００μｇのＦａｂＨ１０を用いる処置は、コントロール処置を与えられた動物の速度と比較して、腫瘍増殖の速度を減少した。例えば、初回用量の３５日後に、平均腫瘍体積（図３Ａ）および腫瘍重量（図３Ｂ）は、４００μｇのＦａｂＨ１０で処置した動物については減少した。他の有用な抗体も同様に、例えば、３５日後に、コントロールと比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、腫瘍増殖を減少、例えば、腫瘍重量を減少し得る。

（実施例５．例示的配列−Ａ１０）

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（実施例６．例示的配列−Ｇ３）

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（実施例７．例示的配列−Ａ６）

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（実施例８．例示的配列−Ａ７）

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（実施例９．例示的配列−Ｃ８）

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（実施例１０．例示的配列−Ｈ９）

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（実施例１１．例示的配列−Ｇ１０−Ｒ２）

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（実施例１２．例示的配列−Ｆ３−Ｒ２）

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（実施例１３．例示的配列−Ｃ６−Ｒ２）

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（実施例１４．例示的配列−Ａ４−Ｒ３）

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（実施例１５．例示的配列−Ｃ１−Ｒ３）

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（実施例１６．例示的配列−Ａ２）

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（実施例１７．例示的配列−Ｂ５）

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（実施例１８．例示的配列−Ｄ２）

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（実施例１９．例示的配列−Ｄ５）

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（実施例２０．例示的配列−Ｆ８）

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（実施例２１．例示的配列−Ｈ１０）

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ＨＣコード核酸中の終止コドンは、別のコドン、例えば、リジンをコードするコドンで置換され得る。代替的には、ｔＲＮＡサプレッサーを有する細菌株は、この位置にリジンまたは他のアミノ酸を導入するために使用され得る。

本発明の多数の実施形態は記載されてきた。それにも関わらず、種々の修飾が、本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされ得ることが理解される。従って、他の実施形態は、添付の特許請求の範囲の範囲内にある。

図１Ａおよび１Ｂは、ヒトＥＴ−２Ｓのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を提供する（それぞれ配列番号９３および配列番号９４）。図１Ａおよび１Ｂは、ヒトＥＴ−２Ｓのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を提供する（それぞれ配列番号９３および配列番号９４）。図２Ａおよび２Ｂは、ヒトＥＴ−２Ｌのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を提供する（それぞれ配列番号１および配列番号２）。図２Ａおよび２Ｂは、ヒトＥＴ−２Ｌのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を提供する（それぞれ配列番号１および配列番号２）。図３Ａおよび３Ｂは、マウスモデルにおいてＨ１０抗体を用いる治療について３９日目での腫瘍体積（５Ａ）および腫瘍重量（５Ｂ）の分布を示す。

Claims

重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列および軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む単離されたタンパク質であって、ここで、
（１）該第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列および第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列が、ヒトエンドセリアーゼ−２（ＥＴ２）に特異的に結合する抗原結合部位を形成し；かつ
（２）該タンパク質が以下の特徴：
（ａ）該タンパク質が３００ｎＭ未満の阻害定数（Ｋｉ）でＥＴ２を阻害する；
（ｂ）該ＨＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列が、Ａ１０、Ｇ３、Ａ６、Ａ７、Ｃ８、Ｈ９、Ｇ１０−Ｒ２、Ｆ３−Ｒ２、Ｃ６−Ｒ２、Ａ４−Ｒ３、Ｃ１−Ｒ３、Ａ２、Ｂ５、Ｄ２、Ｄ５、Ｆ８、Ｈ１０、またはＣ９のＬＣ可変ドメインのＣＤＲと少なくとも８５％同一である１つ以上のＣＤＲを含む；
（ｃ）該ＬＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列が、Ａ１０、Ｇ３、Ａ６、Ａ７、Ｃ８、Ｈ９、Ｇ１０−Ｒ２、Ｆ３−Ｒ２、Ｃ６−Ｒ２、Ａ４−Ｒ３、Ｃ１−Ｒ３、Ａ２、Ｂ５、Ｄ２、Ｄ５、Ｆ８、Ｈ１０、またはＣ９のＨＣ可変ドメインのＣＤＲと少なくとも８５％同一である１つ以上のＣＤＲを含む；
（ｄ）該ＬＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列が、Ａ１０、Ｇ３、Ａ６、Ａ７、Ｃ８、Ｈ９、Ｇ１０−Ｒ２、Ｆ３−Ｒ２、Ｃ６−Ｒ２、Ａ４−Ｒ３、Ｃ１−Ｒ３、Ａ２、Ｂ５、Ｄ２、Ｄ５、Ｆ８、Ｈ１０、またはＣ９のＬＣ可変ドメインと少なくとも８５％同一である；
（ｅ）該ＨＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列が、Ａ１０、Ｇ３、Ａ６、Ａ７、Ｃ８、Ｈ９、Ｇ１０−Ｒ２、Ｆ３−Ｒ２、Ｃ６−Ｒ２、Ａ４−Ｒ３、Ｃ１−Ｒ３、Ａ２、Ｂ５、Ｄ２、Ｄ５、Ｆ８、Ｈ１０、またはＣ９のＨＣ可変ドメインと少なくとも８５％同一である；および
（ｆ）該タンパク質が、Ａ１０、Ｇ３、Ａ６、Ａ７、Ｃ８、Ｈ９、Ｇ１０−Ｒ２、Ｆ３−Ｒ２、Ｃ６−Ｒ２、Ａ４−Ｒ３、Ｃ１−Ｒ３、Ａ２、Ｂ５、Ｄ２、Ｄ５、Ｆ８、Ｈ１０、またはＣ９によって結合されるエピトープと重複するエピトープに結合する、
のうちの１つ以上を有する、タンパク質。
前記タンパク質が、ＥＴ２活性部位に結合する、請求項１に記載のタンパク質。
前記タンパク質が、ＥＴ２酵素活性を阻害する、請求項１に記載のタンパク質。
前記タンパク質が、インビボで血管新生の部位に蓄積する、請求項１に記載のタンパク質。
前記タンパク質が、血管基底膜のタンパク質分解を阻害する、請求項１に記載のタンパク質。
前記タンパク質が、インビトロまたはインビボで血管新生を阻害する、請求項１に記載のタンパク質。
前記ＨＣ可変ドメイン配列およびＬＣ可変ドメイン配列が、同じポリペプチド鎖の成分である、請求項１に記載のタンパク質。
前記ＨＣ可変ドメイン配列およびＬＣ可変ドメイン配列が、異なるポリペプチド鎖の成分である、請求項１に記載のタンパク質。
前記タンパク質が、全長抗体である、請求項１に記載のタンパク質。
前記抗体がヒト抗体またはヒト化抗体である、請求項１に記載のタンパク質。
前記タンパク質が、ヒト抗体フレームワーク領域を含む、請求項１に記載のタンパク質。
前記タンパク質が、Ｆｃドメインを含む、請求項１に記載のタンパク質。
前記ＨＣ可変ドメイン配列が配列番号８９を含み、前記ＬＣ可変ドメイン配列が配列番号９０を含む、請求項１に記載のタンパク質。
前記タンパク質が、ＳＣＩＤマウスモデルにおいて腫瘍増殖を減少する、請求項１に記載のタンパク質。
請求項１に記載のタンパク質および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
ＥＴ２に特異的に結合するタンパク質を同定する方法であって、該方法は：
ＥＴ２抗原を提供する工程；
ディスプレイライブラリーを提供する工程；
ＥＴ２抗原に特異的に結合する、該ライブラリー中に存在するメンバーを同定する工程であって、ここで該ライブラリーの各メンバーは、その表面上に異種タンパク質成分を提示し、各メンバーは該異種タンパク質成分をコードする核酸を含み、該異種タンパク質成分は多様なタンパク質成分のセットのメンバーである、工程；および
該同定されたメンバーから核酸分子を単離する工程であって、ここで、該核酸分子がＥＴ２抗原に特異的に結合するポリペプチドをコードする、工程
を包含する、方法。
前記ライブラリーがファージライブラリーである、請求項１６に記載の方法。
前記同定されたファージが、ＥＴ２に結合する競合リガンドを使用して溶出される、請求項１７に記載の方法。
サンプル中のエンドセリアーゼまたはエンドセリアーゼ活性を検出する方法であって、該方法は、請求項１に記載のタンパク質とサンプルを接触させる工程、および標識を検出する工程を包含する、方法。
ＥＴ２発現細胞の活性を調節する方法であって、該方法は、請求項１に記載のタンパク質とＥＴ２発現細胞を接触させ、それによってＥＴ２発現細胞の活性を調節する工程を包含する、方法。
前記ＥＴ２発現細胞は、ヒト被験体におけるものである、請求項２０に記載の方法。
前記タンパク質が、ＥＴ２発現細胞の基質への結合を妨害する、請求項２０に記載の方法。
前記細胞が癌細胞である、請求項２０に記載の方法。
タンパク質分解を調節する方法であって、該方法は、基質のタンパク質分解を阻害するために十分な量で請求項１に記載のタンパク質を与える工程を包含する、方法。
前記基質が、増殖促進因子（ｐｒｏ−ｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）または血管新生促進因子（ｐｒｏ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃｆａｃｔｏｒ）である、請求項２４に記載の方法。
前記タンパク質分解の調節が、血管新生および／または細胞増殖を減少する、請求項２４に記載の方法。
細胞を死滅させるかまたは細胞の増殖を阻害する方法であって、該方法は、該細胞を死滅させるかまたは該細胞の増殖を阻害するために十分な量で、該細胞を請求項１に記載のタンパク質と接触させる工程を包含する、方法。
前記細胞が癌細胞である、請求項２７に記載の方法。
被験体においてエンドセリアーゼを検出する方法であって、該方法は、検出可能な標識をさらに含む請求項１に記載のタンパク質を被験体に投与する工程；および該被験体において該標識を検出する工程を包含する、方法。
被験体においてエンドセリアーゼの活性を調節する方法であって、該方法は、エンドセリアーゼ活性の減少の必要がある被験体を同定する工程；および該被験体においてＥＴ２活性を調節するために有効な量で、請求項１に記載のタンパク質を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
前記被験体がヒトである、請求項３０に記載の方法。
前記タンパク質が、別の処置、または抗癌剤および／もしくは抗血管新生剤から選択される薬剤と組み合わせて投与される、請求項３０に記載の方法。
被験体における望ましくない血管新生によって特徴付けられる障害を処置または予防する方法であって、該方法は、該障害を有するかまたは該障害に対する素因を有する被験体に、請求項１に記載されるタンパク質を投与する工程を包含する、方法。
前記障害が、関節リウマチ、乾癬、糖尿病網膜症、翼状片の再発のような眼の障害、瘢痕エキシマレーザー手術および緑内障濾過手術、心臓血管障害、慢性炎症性障害、創傷修復、循環障害、クレスト症候群、皮膚科学的障害、および癌からなる群より選択される障害である、請求項３３に記載の方法。
配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、または配列番号２４に対して少なくとも８０％同一である配列を含むポリペプチドをコードする配列を含む、単離された核酸。
請求項１に記載の第１の免疫グロブリンドメイン含有タンパク質および／または第２の免疫グロブリンドメイン含有タンパク質を含むポリペプチドをコードする配列を含む、単離された核酸。
請求項３６に記載の核酸配列を含む、ベクター。
請求項３６に記載の核酸を含む、宿主細胞。