JP2003514524A - エントセリアーゼをコードしている核酸、エンドセリアーゼおよびその使用 - Google Patents

エントセリアーゼをコードしている核酸、エンドセリアーゼおよびその使用

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Abstract

(57)【要約】 本明細書中、エンドセリアーゼおよびその部分、特にプロテアーゼドメイン、およびエンドセリアーゼをコードする核酸が提供される。エンドセリアーゼは内皮細胞で発現される膜貫通プロテアーゼである。核酸およびコードされるタンパク質およびそのプロテアーゼドメイン部分は、種々の予防、診断、治療、および血管形成を調節する化合物のスクリーニング方法を含むスクリーニング方法に用いられる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （関連出願） 以下の出願に関する優先権の利益をここに主張する。： 「エンドヌクレアーゼのプロテアーゼドメインの核酸およびタンパク質配列、
およびそれらに基づく方法」と題された、１９９９年１１月１８日出願の、Edwi
n L. Madison and Edgar O. Ongの米国仮出願連続Ｎｏ．６０／１６６,３９１、
および「膜貫通セリンプロテアーゼをコードしている核酸分子、コードされたタ
ンパク質、およびそれらに基づく方法」と題された、２０００年９月２２日出願
の、Edwin L. Madison, Edgar O. Ong and Jiunn-Chern Yehの米国仮出願連続Ｎ
ｏ．０６／２３４,８４０。
【０００２】 本出願は、「膜貫通セリンプロテアーゼの核酸およびタンパク質配列、および
それらに基づく方法」と題された、２０００年２月３日出願の、Edwin L. Madis
on and Edgar O. Ongの米国仮出願連続Ｎｏ．６０／１７９,９８２；「膜貫通セ
リンプロテアーゼの核酸およびタンパク質配列、およびそれらに基づく方法」と
題された、２０００年２月１８日出願の、Edwin L. Madison and Edgar O. Ong
and Jiunn-Chern Yehの米国仮出願連続Ｎｏ．６０／１８３,５４２；「膜貫通セ
リンプロテアーゼの核酸およびタンパク質配列、およびそれらに基づく方法」と
題された、２０００年６月２２日出願の、Edwin L. Madison and Edgar O. Ong
の米国仮出願連続Ｎｏ．６０／２１３,１２４；「膜貫通セリンプロテアーゼの
核酸およびタンパク質配列、およびそれらに基づく方法」と題された、２０００
年７月２６日出願の、Edwin L. Madison and Edgar O. Ong and Edgar O. Ongの
米国仮出願連続Ｎｏ．６０／２２０,９７０にも関連する。 許容される場合、前記の仮出願は、引用により完全に組み込まれる。
【０００３】 （発明の分野） 内皮細胞で発現されるプロテアーゼおよびその部分、特にプロテアーゼドメイ
ンをコードする核酸分子および、スクリーニング方法における該プロテアーゼお
よび核酸の使用。また、該プロテアーゼおよびそのドメイン、およびコードして
いる核酸分子を用いる予防、診断および治療法が提供される。
【０００４】 （発明の背景） 血管形成は、親微細血管から新しい血管が形成されることである。制御性の血
管形成も非制御性の血管形成も同様の様式で進行する。基底膜に囲まれた内皮細
胞および周皮細胞が毛細血管を形成する。血管形成は、内皮細胞および白血球に
より放出される酵素による基底膜の侵食で始まる。血管内腔に並ぶ内皮細胞がそ
の後、基底膜から突き出す。血管形成刺激物質が、侵食された膜を貫通して細胞
が移動するのを誘導する。移動細胞は、内皮細胞が有糸分裂および増殖を受ける
親血管の「芽」を形成する。内皮芽は互いに融合し、キャピラリーループを形成
し、新たな血管が作成される。
【０００５】 血管形成、モジュレーター、および関連疾患 血管形成は、血管形成刺激物質と阻害物質のシステムにより高度に調節されて
いる。血管形成刺激物質の公知の例には、一定の成長因子、サイトカイン、タン
パク質、ペプチド、炭水化物および脂質が含まれる(Norrby, APMIS, 105: 417-4
37(1997); Polverini, Crit. Rev. Oral. Biol. Med., 6: 230-247(1995))。種
々の内在および外来血管形成阻害物質が当該分野で公知である(Jackson et al.,
FASEB, 11: 457-465(1997); Norrby, APMIS, 105: 417-437(1997); and O'Reil
ly, Investigational New Drugs, 15: 5-13(1997))。
【０００６】 成長しきった生物体では、毛細内皮細胞は比較的わずかしか分裂しない。適当
なシグナルで誘発されると、例えば月経中または細胞外マトリックス中に吸収さ
れる前血管形成媒介物質の放出後、ホルモンシグナルに応答して、小静脈に並ん
でいる内皮細胞がその基底膜および隣接する細胞外マトリックスから脱落し、数
日の間に定方向移動し、分裂し、新たな機能毛細管に組織化される(Polverini,
Crit. Rev. Oral. Biol. Med., 6: 230-247(1995))。しかし、微小血管のこの劇
的な増幅は一時的なものである。というのは、新しい毛細管が形成されるやいな
や、それらは実際には数日または数週間以内に消滅し、組織の微小血管系は元の
状態に戻るからである。生理的血管形成を病的な血管形成から分かつのは、微小
血管のこの一時的な成長と退行の態様である(Polverini, Crit. Rev. Oral. Bio
l. Med., 6: 230-247(1995))。これに対し、病的な血管形成は、例えば正常また
は異常形態の血管形成媒介物質の過剰産生、またはこのプロセスの阻害物質が相
対的に欠損していることによる、血管形成の刺激物質と阻害物質の間の正味のバ
ランスが変化していることによるものである(Polverini, Crit. Rev. Oral. Bio
l. med., 6: 230-247(1995))。
【０００７】 血管形成は、正常な胎盤、胚、胎児および出生後の発生および成長に重要であ
るが、非常に特異的な限定された状況を除き、成人では生理的にはほとんど起こ
らない。例えば、血管形成は、創傷治癒、胎児および胚の発生および黄体、子宮
内膜および胎盤の形成において通常見られる。成人における血管形成は、疾患状
態と関連していることが多い。 永続性の、非調節性血管形成は、種々の疾患状態、腫瘍の転移、および内皮細
胞による異常な成長において生じ、これらの疾患に見られる生理学的な損傷を支
える。非調節性の血管形成が存在する種々の生理的疾患状態は、血管形成依存性
疾患および血管形成関連疾患として分類されている。
【０００８】 一定の疾患状態では血管形成の制御性が変化しており、多くの場合、疾患に伴
う病的損傷が、非制御性の血管形成に関連している(Norrby, APMIS, 105: 417-4
37(1997); and O'Reilly, Investigational New Drugs, 15: 5-13(1997)を参照
されたい）。つまり、血管形成は種々の疾患、例えば、リューマチ性関節炎、乾
癬、糖尿病性網膜症、翼状片(pterygii)の再発、傷を残すエキシマーレーザー手
術および緑内障フィルター手術(scarring excimer laser surgery and glaucoma
filtering surgery)を含む一定の眼病、眼球前部の種々の疾患、心血管障害、
慢性炎症性疾患、傷の修復、循環疾患、クレストシンドローム、皮膚疾患などの
種々の炎症性疾患(米国特許第5,593,990、5,629,327および5,712,291を参照され
たい）および懸著には、充実性腫瘍および血管腫瘍を含む癌の発症または進行に
関与する。直接的な証拠を示すいくつかの家系から、血管形成が充実性腫瘍の成
長および永続およびその転移に本質的なものであることが示されている。
【０００９】 つまり、血管形成は癌の転移および種々の他の疾患の病理に主要な役割を果た
すことが明らかである。この作用を抑制すること、除くことまたは変更すること
はこれらの疾患の病因に影響を与え、そして治療的介入点として役立つ。疾患状
態において、血管形成を予防することで、新規な微小血管系の侵入により引き起
こされる障害を防ぐことができた。血管形成過程の制御を指向した治療により、
これらの疾患が排除され、または緩和された。 つまり、血管形成を標的および変更する、特に、異常性または非制御性の血管
形成を阻害する治療法を開発する必要がある。それゆえ、そのような試薬の同定
のための方法を提供することが本発明における目的である。さらに、該タンパク
質およびポリペプチドをコードしている核酸を提供すること、およびさらに血管
形成の調節に関与するタンパク質およびポリペプチドを提供することも本発明の
目的である。
【００１０】 （発明の概要） 細胞、特に内皮細胞上で発現され、そして血管形成に関与する、膜プロテアー
ゼのクラスが本発明において提供される。さらに、その活性を調節する方法、お
よびその活性を調節する化合物をスクリーニングする方法も提供される。そのよ
うな調節には、プロテアーゼの活性を阻害すること、プロテアーゼの活性に拮抗
すること、作用すること、およびその他、プロテアーゼの活性を変更することが
含まれる。特に重要なのは、該タンパク質のタンパク質切断部分を含む、これら
のプロテアーゼの細胞外ドメインである。
【００１１】 特に、エンドセリアーゼとして本発明において指定されるタンパク質であるプ
ロテアーゼ、特にそのプロテアーゼドメインが提供される。また、本発明におい
て、エンドセリアーゼのプロテアーゼドメインおよびさらに全長のエンドセリア
ーゼをコードしている核酸も提供される。典型的な具体例では、１および２と指
定されるエンドセリアーゼ、特にそのプロテアーゼドメインが提供される。全長
のエンドセリアーゼ２変種も提供される。エンドセリアーゼをコードしている核
酸分子は、核酸を含むベクターおよびベクターを含む細胞として提供される。好
ましいエンドセリアーゼは、配列番号２、４、６または２２に示すアミノ酸配列
、および特にプロテアーゼドメインをコードしている部分（配列番号２、配列番
号４のアミノ酸３２１−６８８、および配列番号６のアミノ酸３２１−５２０；
各配列番号のアミノ酸３２０は、プロテアーゼドメインの部分として含まれても
よい）を含むものである。また、配列番号１、３、５または２２に示すヌクレオ
チド配列またはその部分、好ましくはプロテアーゼドメインをコードしている部
分、またはコードされたタンパク質がプロテアーゼ活性を示すのに十分なその部
分を有する核酸分子に対してその全長に渡ってハイブリダイズする核酸分子も提
供される。
【００１２】 好ましい具体例では、単離核酸分子は、高ストリンジェント条件下で、配列番
号１、３または５に示すヌクレオチド配列を有する核酸にハイブリダイズする。
他の好ましい具体例では、単離核酸分子は、配列番号１、３または５に示すヌク
レオチド配列を含む。 １の具体例では、単離核酸分子は、配列番号１、３または５に示すヌクレオチ
ド配列、または１４、１６、３０、１００またはその全長配列までを含む分子を
含むその部分の配列のみを含む。他の具体例では、単離核酸分子は、エンドセリ
アーゼのプロテアーゼドメインをコードしている核酸配列に相補的なヌクレオチ
ド配列を有する。
【００１３】 前記核酸分子を含むベクターおよびプラスミドが提供される。該プラスミドま
たはベクターを含む細胞が本明細書中に提供される。より好ましくは、細胞は、
細菌細胞、酵母細胞、真核細胞、植物細胞、昆虫細胞または動物細胞である。 核酸を含む細胞、および好ましくはコードされたエンドセリアーゼまたはその
部分、好ましくはそのプロテアーゼドメインを発現する細胞も提供される。細胞
およびベクターは操作されて、表面上でエンドセリアーゼを発現することが可能
であり、そのような細胞は好ましくはエンドセリアーゼの全長コーディング部分
を含む。他の具体例では、細胞およびベクターは、分泌を指向するヌクレオチド
配列を含めることによるなどして、コードしているエンドセリアーゼまたはその
プロテアーゼドメインを分泌するように設計される。
【００１４】 コードされたエンドセリアーゼプロテアーゼドメインが細胞により発現される
条件下で前記細胞を生育させ、次いで、発現されたプロテアーゼドメインタンパ
ク質を回収することにより、エンドセリアーゼプロテアーゼドメインまたはエン
ドセリアーゼを製造する方法が本明細書中に提供される。 さらに本明細書中、エンドセリアーゼに、好ましくはエンドセリアーゼのプロ
テアーゼドメインに、特異的に、特に免疫特異的に結合する抗体が提供される。
【００１５】 エンドセリアーゼまたはエンドセリアーゼのプロテアーゼドメインを含む医薬
を含む組成物が提供される。組み合わせ、組み合わせを含むキット、および組成
物またはタンパク質を含む製品も提供される。一具体例では、エンドセリアーゼ
の阻害物質またはそのプロテアーゼ活性の阻害物質、および他の抗血管形成治療
薬または抗血管形成剤を含む組み合わせが、本明細書中に提供される。エンドセ
リアーゼ阻害物質および抗血管形成剤は単一の医薬組成物中に処方されることが
でき、またはそれぞれ別個の医薬組成物中に処方されることができる。組み合わ
せを含むキットが提供される。 エンドセリアーゼをコードしている不活性化された遺伝子を有する、および、
好ましくは非固有のプロモーターコントロールのコントロール下でエンドセリア
ーゼをコードしている遺伝子を有する、ヒト以外の形質転換動物が提供される。
【００１６】 エンドセリアーゼまたはそのプロテアーゼドメイン部分の結合物、例えばエン
ドセリアーゼを特定細胞または組織に向かわせる標的剤とのエンドセリアーゼの
結合物、および固体支持体への結合および検出のためのリンカーまたは検出部分
との結合物がそれぞれ提供される。結合物を用いる方法も提供される。例えば、
エンドセリアーゼまたはそのプロテアーゼドメインは、細胞特異的標的剤、特に
、細胞表面タンパク質に結合して結合物またはそのエンドセリアーゼ部分のイン
ターナリゼーションを生じた成長因子またはモノクローナル抗体などの剤に結合
されてよい。これらの結合物は、プロドラッグ、例えばダウノマイシンまたは他
の細胞毒性剤の投与と共に、その前に、またはその投与後に投与される。プロド
ラッグは、エンドセリアーゼにより活性化されるように設計される。標的細胞へ
の結合およびインターナリゼーションと同時にエンドセリアーゼによりプロドラ
ッグが活性化され、それにより薬物が標的特異的に活性化され、次いで標的細胞
が選択的に死滅または阻害される。さらに、エンドセリアーゼまたはプロテアー
ゼドメインの活性のモジュレーターも提供される。
【００１７】 さらに本明細書中、エンドセリアーゼのプロテアーゼドメインおよびそのよう
なドメインをコードしている核酸を用いる、予防的、診断的および治療的スクリ
ーニング方法が提供される。特に、該予防的、診断的および治療的スクリーニン
グ方法は、異常なレベルの血管形成に伴う病気または疾患を予防もしくは治療す
るのに、またはそれらの予防もしくは治療に有用な薬剤を見出すのに用いられる
。
【００１８】 エンドセリアーゼの活性を調節する化合物をスクリーニングする方法が提供さ
れる。化合物をエンドセリアーゼまたはそのプロテアーゼドメインおよびエンド
セリアーゼの基質と接触させることにより化合物を同定するインビトロアッセイ
が提供される。化合物の存在下で切断された基質の量の、化合物の不在下での量
と比較した変化が、化合物がエンドセリアーゼの活性を調節することを示す。そ
のような化合物、阻害物質またはアゴニストなどは、さらなる分析のため、もし
くは使用してエンドセリアーゼの活性を阻害するために選択される。インビトロ
アッセイは、液相中、またはエンドセリアーゼまたはそのプロテアーゼドメイン
を直接的に、もしくはリンカーを介して固体支持体に結合させることにより固相
基質上で行うことができる。細胞に基づくスクリーニングアッセイも提供される
。化合物は、エンドセリアーゼまたはその細胞外ドメインもしくはそのタンパク
質分解活性部分を発現する細胞と基質を接触させることにより同定されることも
できる。
【００１９】 一具体例では、エンドセリアーゼのモジュレーターを同定する方法には、ａ）
エンドセリアーゼをエンドセリアーゼの基質と接触させ、次いで基質のタンパク
質分解を検出し、それによりエンドセリアーゼの活性を評価すること；ｂ）エン
ドセリアーゼを試験物質の存在下でエンドセリアーゼの基質と接触させ、次いで
基質のタンパク質分解を検出し、それによりエンドセリアーゼの活性を評価する
こと；および、ｃ）ステップａ）およびｂ）で評価されたエンドセリアーゼの活
性を比較すること、ここで、ステップａ）で測定された活性のステップｂ）で測
定された活性からの違いは試験物質がエンドセリアーゼの活性を調節することを
示す、ことが含まれる。好ましい具体例では、複数の試験物質が前記スクリーニ
ング方法にて同時にスクリーニングされる。
【００２０】 他の具体例では、スクリーニングされるべきエンドセリアーゼが標的細胞から
単離され、試験物質は治療用化合物である。試験物質の存在下または不在下で測
定されたエンドセリアーゼ活性が異なることは、標的細胞が治療化合物に反応し
たことを示す。例えば、血液または他の体液におけるプロテアーゼドメインの検
出は、癌、特に転移癌を示す可能性がある。
【００２１】 体組織および体液におけるエンドセリアーゼもしくはそのプロテアーゼドメイ
ンまたはコードしている核酸のレベルを検出することにより、病気または疾患を
診断する方法が提供される。該方法には、体液または組織を、エンドセリアーゼ
またはそのプロテアーゼドメインの存在またはレベルに関して試験し、次いで、
そのレベルが非病的状態におけるものより高いか低いかを評価することが必要で
ある。例えば、患者におけるエンドセリアーゼの異常なレベルを検出することに
より、病気または疾患を診断する方法。該方法には、患者から誘導されたサンプ
ルにおける内皮細胞エンドセリアーゼのＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質または機能
活性のレベルを測定するステップが含まれ、ここでエンドセリアーゼのＤＮＡ、
ＲＮＡ、タンパク質またはその機能活性のレベルの、病気または疾患を患ってい
ない類似サンプルにおいて見出されるＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質またはその機
能活性のレベルに対する増加または減少が、対象における病気または疾患の存在
を示す。
【００２２】 もう一つの具体例では、対象における望ましくないおよび／または制御できな
い血管形成に伴う病気または疾患を進行させる素因の存在を診断またはスクリー
ニングする方法が提供される。この方法には、対象由来のサンプル中のエンドセ
リアーゼのＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質またはその機能活性のレベルを測定する
ステップが含まれ、ここで、サンプル中のＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質または機
能活性の、望ましくないおよび／または制御できない血管形成を有しない類似サ
ンプルに見出されるＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質または機能活性のレベルに対す
る増加が、望ましくないおよび／または制御できない血管形成の存在を示す。
【００２３】 他の具体例では、対象における不完全な血管形成に伴う病気または疾患を進行
させる素因の存在を診断またはスクリーニングする方法が、本明細書中に提供さ
れる。この方法には、対象由来のサンプルにおけるエンドセリアーゼのＤＮＡ、
ＲＮＡ、タンパク質またはその機能活性のレベルを測定することが含まれ、ここ
で、サンプルにおけるＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質または機能活性のレベルの、
不完全な血管形成を有しない類似サンプルに見出されるＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパ
ク質または機能活性のレベルに対する減少が、不完全な血管形成の存在を示す。
【００２４】 さらに、哺乳動物に病気または疾患が治療または予防される有効量のエンドセ
リアーゼ阻害物質を投与することにより、哺乳動物における望ましくないおよび
／または制御できない血管形成に伴う病気または疾患を治療または予防するため
の方法も提供される。治療または予防に用いられるエンドセリアーゼ阻害物質は
、好ましくは医薬上許容される担体または賦形剤と共に投与され、治療される哺
乳動物はヒトである。本明細書中好ましい阻害物質は、エンドセリアーゼまたは
そのプロテアーゼドメインに特異的に結合する抗体であり、アンチセンス核酸分
子を含むコードしているｍＲＮＡの翻訳阻害物質およびｍＲＮＡの転写阻害物質
である。
【００２５】 他の具体例では、治療または予防法には、さらなる抗血管形成治療薬または治
療剤をそれと組み合わせて投与することも含まれる。さらなる抗血管形成剤また
は治療薬は、エンドセリアーゼ阻害物質の投与と同時に、投与後、または投与前
に投与されてよく、ここで、エンドセリアーゼ阻害物質は、例えば抗体、または
エンドセリアーゼに対するその結合領域を含むそのフラグメントもしくは誘導体
、エンドセリアーゼをコードしているアンチセンス核酸、またはエンドセリアー
ゼをコードしている遺伝子の少なくとも一部の生物活性を不活性化させるべく異
種核酸配列が挿入されており、エンドセリアーゼをコードしている遺伝子部分が
異種配列に隣接してエンドセリアーゼをコードしているゲノム遺伝子との相同的
組換えが達成されている、エンドセリアーゼをコードしている遺伝子の少なくと
も一部を含む核酸であり得る。
【００２６】 治療または予防されるべき望ましくない血管形成は、制限されるものではない
が、充実性腫瘍、血管奇形、および心血管障害、慢性炎症性疾患、緑内障フィル
ター手術およびエキシマーレーザー眼球手術後に認められる異常な創傷治癒、循
環疾患、クレストシンドローム、皮膚疾患および眼病を含む病気および疾患に関
連する。治療または予防されるべき血管奇形および心血管障害には、血管繊維腫
、血管脂肪腫、アテローム性動脈硬化症、再狭窄／再潅流障害、動静脈奇形、血
管腫および血管癒着、血管過誤腫を伴う半側型軟骨形成障害(dyschondroplasia
with vascular hamartomas)（ファフィッチ(Fafucci's)シンドローム）、遺伝性
出血性毛細管拡張症(ランデュ−オスラー−ウェーバー(Rendu-Osler-Weber)シン
ドローム）、またはフォン・ヒッペル・リンダウ(Von Hipple Lindau)シンドロ
ームが含まれ、治療または予防されるべき慢性炎症性疾患には、真性糖尿病、血
友病性関節炎、炎症性腸疾患、進行性骨折、歯周炎（進行の早い、および若年性
の）、乾癬、リューマチ性関節炎、静脈鬱血性潰瘍、顆粒熱傷(granulation-bur
ns)、瘢痕性蟹足腫(hypertrophic scars)、肝硬変、骨放射線壊死、術後癒着、
化膿性肉芽腫、または全身性硬化症であり、治療または予防されるべき循環疾患
は、レイノー現象(Raynaud's phenomenon)であり、治療または予防されるべきク
レストシンドロームは、石灰症、食道、dyomotiloty、手指硬化症(sclerodactyl
y)およびteangiectasisであり、治療または予防されるべき皮膚疾患は全身性血
管炎、硬皮症、壊疸性膿皮症、血管傷害、静脈、動脈潰瘍、スタージ・ウェーバ
ー(Sturge-Wever)シンドローム、赤酒しみ様血管腫(Port-wine stains)、青色ゴ
ム乳首様母斑(blue rubber bleb nevus syndrome)、クリッペル-トレノーレイ-
ウェーバー(Klippel-Trenaunay-Weber)シンドロームまたはオスラー-ウェーバー
-ランデュ(Osler-Wever-Rendu)シンドロームであり、および、治療または予防さ
れるべき眼病は、眼新血管新生病により引き起こされる失明、角膜移植新血管新
生、眼の黄斑変性症、新血管新生緑内障、トラコーマ、糖尿病性網膜症、近視性
変性症(myopic degeneration)、未熟児網膜症、水晶体後部繊維増殖症、または
角膜新血管新生である。
【００２７】 他の具体例では、哺乳動物において不完全な血管形成に伴う病気または疾患を
治療または予防する方法が、本明細書中に提供される。該方法には、哺乳動物に
有効量のエンドセリアーゼタンパク質、該タンパク質をコードしている核酸、お
よび血管形成を引き起こす活性のあるタンパク質の誘導体または類似体をコード
している核酸を投与し、それにより、病気または疾患を治療または予防すること
が含まれる。好ましい具体例では、エンドセリンタンパク質、該タンパク質の誘
導体または類似体、該タンパク質をコードしている核酸、および該タンパク質の
誘導体または類似体をコードしている核酸は、医薬上許容される担体または賦形
剤と投与される。治療されるべき哺乳動物は、好ましくはヒトである。他の具体
例において、治療または予防法には、さらに、前-血管形成治療薬または治療剤
を投与することが含まれる。
【００２８】 さらに、哺乳動物に、病気または疾患を治療もしくは予防し、または症状を改
善する有効量のエンドセリアーゼまたは触媒的または機能的に活性なその部分、
例えばそのプロテアーゼドメインを投与することにより、哺乳動物、例えばヒト
における不完全な、または欠陥のある血管形成に伴う病気または疾患を治療また
は予防する方法も提供される。該方法には、さらに、血管形成を引き起こす前-
血管形成治療薬または治療剤を、エンドセリアーゼまたはその部分の投与と同時
に、その前に、またはその投与後に投与することを含めることもできる。
【００２９】 本明細書中に提供されるエンドセリアーゼは、その活性が血管形成中にアップ
レギュレートされるものである。そのようなエンドセリアーゼは、これらのエン
ドセリアーゼにより選択的に活性化されるように設計されるプロドラッグの活性
化のための標的をつとめ得る。つまり、そのようにアップレギュレートされたエ
ンドセリアーゼを発現する内皮細胞が関与する疾患を治療するための方法が提供
される。
【００３０】 さらに、本明細書中、ヒト以外の形質転換動物も提供される。これらの動物に
おいて、エンドセリアーゼの内生遺伝子が、相同的組換え、または動物もしくは
その祖先の挿入突然変異誘発により欠失または不活性化される。
【００３１】 本明細書中、ａ）パッケージング材料；ｂ）エンドセリアーゼまたはそのプロ
テアーゼドメイン、またはエンドセリアーゼまたはそのプロテアーゼドメインを
含む組成物；およびｃ）製品が、サンプル中のエンドセリアーゼの活性のモジュ
レーターを同定するのに用いられるためのものであること、または診断、治療ま
たは薬物のスクリーニングに用いるためのものであることを示すラベル；を含む
製品も提供される。
【００３２】 （発明の詳細な記載） Ａ．定義 他が示されない限り、本明細書に用いられる全技術的および化学的用語は、本
発明の属する分野の通常の技術者により一般に理解されるものと同じ意味を有す
る。本明細書中に引用される全特許、出願、公開出願および他の公開文献および
GenBankおよび他のデータベースからの配列は、その全容を引用により組み込む
。 本明細書中に用いるように、全保護基、アミノ酸および他の化合物に関する省
略は、他が示されない限り、その一般的慣用法、一般的に認識される省略、また
はBiochemical Nomenclature((1972)Biochem. 11: 942-944を参照されたい）に
基づくＩＵＰＡＣ−ＩＵＢコミッションに従う。
【００３３】 本明細書中に使用される血管形成なる用語は、新血管形成（新血管新生）の確
立および維持に直接的に、または間接的に関与するプロセスの全体を広く含み、
制限されるものではないが、腫瘍に伴う新血管新生が含まれる。 本明細書に使用する抗血管形成薬または剤は、単独または他の治療薬または化
合物と組み合わせて用いた場合、臨床症状を緩和し、減じ、改善し、予防し、ま
たは臨床症状が鎮静している場合はそれを保ち(place)または維持するいずれか
の治療措置および化合物、または望ましくないおよび／または非制御性血管形成
に関連する診断マーカーをいう。そのような剤には、制限されるものではないが
、抗腫瘍剤、および望ましくない血管形成に伴う他の疾患、例えば糖尿病性網膜
症、再狭窄、高増殖疾患(hyperproliferative disorders)などの治療のための剤
が含まれる。
【００３４】 本明細書中に用いるように、前-血管形成(pro-angiogenic)剤は、血管構造の
確立または維持を促進する剤である。そのような剤には、心臓発作および脳卒中
を含む心血管障害を治療するための剤が含まれる。 本明細書に用いられる望ましくないおよび／または非制御性の血管形成は、血
管形成刺激物質の作用が血管形成阻害剤の作用に勝っている病的な血管形成をい
う。 本明細書中用いられる不完全な血管形成は、異常な血管形成、または血管形成
の不在または実質的な減少に至る正常な血管形成の欠陥が存在する疾患に関連す
る病的血管形成をいう。
【００３５】 本明細書に用いられるエンドセリアーゼは、ヒトを含む哺乳動物のタンパク質
であって、膜貫通ドメインを有し、内皮細胞の表面上に発現され、プロテアーゼ
ドメイン、特に細胞外プロテアーゼドメインを含み、好ましくはセリンプロテア
ーゼである哺乳動物のタンパク質をいう。つまり、例えばエンドセリアーゼなる
用語には、エンドセリアーゼ遺伝子ファミリーによりコードされる全タンパク質
、またはいずれかの他の源から得られた、もしくは合成調製された、または同じ
活性を示す同等の分子が包含される。エンドセリアーゼ遺伝子ファミリーは、内
皮細胞中で発現される膜貫通プロテアーゼである。これらのプロテアーゼには、
セリンプロテアーゼが含まれる。より詳細な説明が必要ならば、これらの特徴を
有し、さらに本明細書中に例示したエンドセリアーゼ１および２と配列相同性を
示すプロテアーゼドメインを含むタンパク質を言う。エンドセリアーゼ１と２は
、例えば、約４０％または４５％の同一性を示す。配列相同性は、同一性を最大
にするべく並べた場合に、その全長に沿って残基の少なくとも約２５％、４０％
、６０％、８０％、９０％またはそれ以上の配列同一性を意味する。配列相同性
はまた、核酸のコーディング配列が、少なくとも中程度の条件下で、またはより
密接に関連したタンパク質に関しては高ストリンジェント条件下で、本明細書中
に提供される核酸分子または同じタンパク質をコードするが遺伝子コードの縮重
により配列が異なる核酸分子にハイブリダイズするかどうかを決定することによ
っても評価される。加えて、エンドセリアーゼには、プロテアーゼ活性を実質上
変更しないで、表１に示すような保存されたアミノ酸置換を有するエンドセリア
ーゼが包含される。アミノ酸の適当な保存的置換は、当該分野の専門家には公知
であり、生じる分子の生物活性を変更することなく一般に作成されることができ
る。当該分野の専門家には、一般にポリペプチドの非必須領域の個々のアミノ酸
置換では、実質上生物活性は変更されないことが認識される(例えば、Watson et
al. Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987, The Benjamin/Cumm
ings Pub. co., p.224を参照されたい）。また、エンドセリアーゼの触媒活性を
有するフラグメントも定義の中に含まれる。
【００３６】 本明細書に用いるエンドセリアーゼのプロテアーゼドメインは、プロテアーゼ
活性を示す細胞外部分であるエンドセリアーゼのポリペプチド部分をいう。プロ
テアーゼドメインは、一般に、プロテアーゼ活性に必要とされる最小数、一般的
には５０または１００以上のアミノ酸を含むポリペプチドである。プロテアーゼ
活性は、ポリペプチドを、プロテアーゼとして作用するその能力に関して試験す
るなどにより経験的に評価することができる。実施例に記載した試験化合物の代
わりに公知物質を用いる以外は実施例に記載したアッセイにおけるものと同様の
アッセイを用いてよい。さらに、プロテアーゼ、特にセリンプロテアーゼは特徴
的な構造および配列またはモチーフを有するので、プロテアーゼドメインはその
ような構造および配列またはモチーフにより容易に同定されることができる。
【００３７】 本明細書中に用いられるように、エンドセリアーゼのプロテアーゼドメイン部
分は、エンドセリアーゼの細胞外ドメイン内に位置しているか、もしくはエンド
セリアーゼの細胞外ドメインである、およびセリンプロテアーゼ活性を示すエン
ドセリアーゼのプロテアーゼドメインをいう。つまり、それは通常のアッセイに
より評価されるプロテアーゼ活性を示す細胞外ドメインの少なくとも最小の部分
である。典型的なエンドセリアーゼプロテアーゼドメインは配列番号２に示し、
配列番号４および６のアミノ酸３２１−６８８および３２１−５６２として示す
。プロテアーゼ活性を保持するそのより小さな部分が企図される。プロテアーゼ
ドメインは細部および構成が多様であり、表面ループに挿入と欠失が含まれる。
そのようなドメインは、３つ組の活性部位、基本的特異性ポケット、オキシアニ
オンホールおよび／またはプロテアーゼのセリンプロテアーゼドメインの他の形
態を含む保存された構造を示す。つまり、本明細書の目的に関し、プロテアーゼ
ドメインは本明細書中に定義されるエンドセリアーゼの部分であるが、キモトリ
プシンまたはトリプシンの構造特性、およびそれらのプロテアーゼドメインと類
似または相同の配列の保持に関して相同である。
【００３８】 本明細書に用いる相同なる用語は、約２５％以上の配列同一性を意味する。配
列同一性により、通常の配列アルゴリズムプログラムにより決定され、そして各
提供物により確立される欠如ギャップペナルティ(default gap penalty)と共に
用いられる保存されたアミノ酸の数。また相同性は、少なくとも低ストリンジェ
ント条件下でハイブリダイズし、そしてドメインをコードするあらゆるものを含
む保存された核酸配列により評価されてよい。同様に、核酸配列整列プログラム
が市場入手可能である(DNAStar "MegAlign" program (Madison, WI) and the Un
iversity of Wisconsin Genetics Computer Group (UWG) "Gap" program (Madis
on WI))。実質上、相同核酸分子は典型的には中ストリンジェントで、または高
ストリンジェントで、目的の核酸の全長に沿ってハイブリダイズする。また、ハ
イブリダイズしている核酸分子中のコドンの代わりに縮重コドンを含む核酸分子
も意図される。
【００３９】 本明細書中に用いる、ポリペプチドが本質的にプロテアーゼドメインから成る
なる語句は、ポリペプチドのエンドセリアーゼ部分のみがプロテアーゼドメイン
であるか、その触媒活性部分であることを意味する。ポリペプチドは、エンドセ
リアーゼに由来しないさらなるアミノ酸の配列を含んでもよい。 本明細書に用いる、前(pro)-血管形成治療薬または治療剤なる語は、単独また
は他の治療薬または化合物と組み合わせて用いた場合、臨床症状を緩和し、減じ
、改善し、予防し、または臨床症状が緩和した場合にはその状態を保ちまたは維
持するあらゆる治療措置および化合物、または不完全血管形成に関連する診断マ
ーカーをいう。
【００４０】 本明細書に用いるドメインなる用語は、分子の他の部分から構造的に、および
／または機能的に異なる分子の部分、例えばタンパク質または核酸の部分をいう
。 本明細書に用いるプロテアーゼなる用語は、タンパク質またはペプチドの加水
分解を触媒する酵素をいう。
【００４１】 本明細書に用いるセリンプロテアーゼなる用語は、セリン残基がタンパク質ま
たはペプチドの加水分解に関与しているプロテアーゼの種々のファミリーをいう
。セリン残基は触媒作用に関するセリン、ヒスチジンおよびアスパラギン酸を含
む触媒三つ組機構の部分であり得、または触媒作用にセリンおよびリジンが関与
するヒドロキシル／ε−アミンまたはヒドロキシル／α−アミン触媒二組機構の
部分であり得る。セリンプロテアーゼの例には、制限されるものではないが、キ
モトリプシン、トリプシン、プラスミン、トロンビンおよびエラスターゼが含ま
れる。
【００４２】 本明細書に用いる触媒活性なる用語は、プロテアーゼとしてのエンドセリアー
ゼの活性をいう。エンドセリアーゼの機能は、血管形成の促進または血管形成に
おける関与を含む、内皮細胞生物学におけるその機能をいう。 本明細書に用いる核酸には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および、タンパク質核酸（ＰＮ
Ａ）およびそれらの混合物を含むその類似体が含まれる。核酸は一本鎖または二
本鎖であり得る。プローブまたはプライマーに関して言及する場合、一本鎖分子
が意図される。 本明細書に用いる、エンドセリアーゼのフラグメントまたは部分をコードして
いる核酸なる用語は、記載されるエンドセリアーゼタンパク質のフラグメントま
たは部分のみをコードしている核酸を言い、連続配列としてのエンドセリアーゼ
の他の隣接部分は言わない。
【００４３】 本明細書に用いる、異種ＤＮＡおよびＲＮＡまたは外来ＤＮＡおよびＲＮＡは
、交換して用いられ、ゲノムの部分として天然には生じないＤＮＡまたはＲＮＡ
であって、天然に生じるものと異なるゲノムの位置（複数も）に存在するまたは
見出されるものをいう。異種核酸は一般に、それが導入される細胞に内在するも
のではなく、他の細胞から得られたものであるか、合成調製されたものである。
一般に、必ずしもそうとは言えないが、そのような核酸は、それが発現される細
胞によっては通常は産生されないＲＮＡおよびタンパク質をコードする。当該分
野の専門家が、それが発現される細胞に対して異種または外来であると認める、
または考えるあらゆるＤＮＡまたはＲＮＡが、本明細書中、異種ＤＮＡにより包
含される。異種ＤＮＡおよびＲＮＡは、転写、翻訳または他の調節可能な生化学
的プロセスに影響を与えることにより内在ＤＮＡの発現を媒介または変更するＲ
ＮＡまたはタンパク質もコードし得る。
【００４４】 本明細書に用いる、核酸の調節および作動配列、例えばプロモーター、エンハ
ンサー、転写および翻訳停止部位および他のシグナル配列に対する異種ＤＮＡの
作用的結合は、そのようなＤＮＡとそのような核酸配列間の関連をいう。例えば
プロモーターに対する異種ＤＮＡの作用的結合は、リーディングフレーム中のＤ
ＮＡを特異的に認識し、それに結合し、および翻訳するＲＮＡポリメラーゼによ
りそのようなＤＮＡの翻訳がプロモーターから開始されるような、ＤＮＡとプロ
モーター間の物理的関連性を言う。
【００４５】 本明細書中で用いる、ＲＮＡの少なくとも一部に相補的な配列は、アンチセン
スオリゴヌクレオチドに関して、好ましくは中程度の、または高ストリンジェン
ト条件下でＲＮＡとハイブリダイズして安定な二本鎖を形成することができるほ
ど十分な相補正を有する配列を意味する。二本鎖のエンドセリアーゼアンチセン
ス核酸の場合、二本鎖のＤＮＡの一本鎖を次いで試験してよく、または三本鎖の
形成をアッセイしてよい。ハイブリダイズする能力は、アンチセンス核酸の相補
性および長さの程度に依存する。一般に、ハイブリダイズしている核酸が長いほ
ど、より多くの塩基がエンドセリアーゼをコードしているＲＮＡとミスマッチ形
成し、それは安定な二本鎖（または、ケースにより三本鎖）を含み得、および形
成することさえできる。当該分野の専門家は、通常の方法を用いて許容されるミ
スマッチの程度を確認し、ハイブリダイズした複合体の融点を決定することがで
きる。
【００４６】 本明細書における目的に関し、保存的アミノ酸置換は、結果的に生じるタンパ
ク質がプロテアーゼ活性を示す限り、エンドセリアーゼまたはそのプロテアーゼ
ドメインのいずれにおいてなされてもよい。アミノ酸置換は、好ましくは以下の
表１に示すものに従ってなされる。
【００４７】
【表１】
【００４８】 他の置換も、経験的に、または公知の保存的置換に従って許容され、および決
定されることができる。 本明細書中に用いられるように、本明細書に現れる種々のアミノ酸配列に存在
するアミノ酸は、その周知の、３文字または１文字の省略に従い同定される。種
々のＤＮＡフラグメントに生じるヌクレオチドは、当該分野で通常用いられる常
套の１文字指定により指定される。 本明細書に用いるスプライス変種なる用語は、１タイプ以上のｍＲＮＡを生じ
る、ゲノムＤＮＡの一次転写の異なるプロセッシングにより作成される変種をい
う。
【００４９】 本明細書に用いる、本明細書に開示される核酸配列に基づくプローブまたはプ
ライマーには、配列番号１、３または５のヌクレオチドの少なくとも１０、１４
、好ましくは１６、３０または１００の連続配列が含まれる。 本明細書に用いる特定の医薬組成物の投与による特定疾患の症状の改善は、組
成物の投与によると考えることができる、または組成物の投与に関連し得る、恒
常的または一時的なあらゆる軽減、継続または経過をいう。
【００５０】 本明細書に用いるアンチセンスポリヌクレオチドなる用語は、ｍＲＮＡまたは
二本鎖ＤＮＡのセンス鎖に相補的なヌクレオチド塩基の合成配列をいう。適当な
条件下でセンスポリヌクレオチドおよびアンチセンスポリヌクレオチドを混合す
ると、２つの分子が結合し、またはハイブリダイズする。これらのポリヌクレオ
チドがｍＲＮＡに結合する（ハイブリダイズする）と、ＲＮＡ合成（転写）が阻
害される。これらのポリヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡに結合すると、ＲＮＡ合成
（転写）が阻害される。生じた翻訳の阻害および／または転写の阻害により、セ
ンス鎖によりコードされるタンパク質の合成が阻害される。
【００５１】 本明細書中に用いられるアレイは、３またはそれ以上のメンバーを含む、抗体
などのエレメントの集まりをいう。アドレス可能なアレイは、アレイのメンバー
が、典型的には固相支持体上の位置により同定可能であるものである。つまり、
一般に、アレイのメンバーは固相表面上の別個の同定可能な位置に固定される。 本明細書に用いる抗体なる用語は、天然のまたは部分的もしくは完全に合成製
造されたものいずれかの免疫グロブリンを言い、抗体に対して特異的結合能力を
保持するいずれかのその誘導体が含まれる。つまり、抗体には、免疫グロブリン
結合ドメインと相同な、または実質上相同な結合ドメインを有するあらゆるタン
パク質が含まれる。抗体には、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを
含む、全免疫グロブリンクレイムのメンバーが含まれる。
【００５２】 本明細書に用いる抗体フラグメントなる用語は、全長の抗体特異的結合能力の
少なくとも一部を保持している、全長未満の抗体のいずれかの誘導体をいう。抗
体フラグメントの例には、制限されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（
ａｂ）２、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦＶ）、ＦＶ、ｄｓＦｖダイアボディ(diabody)
およびＦｄフラグメントが含まれる。フラグメントには、ジスルフィド架橋によ
るなどの、共に結合した複数の鎖を含めることができる。抗体フラグメントには
一般に、少なくとも約５０のアミノ酸、および典型的には少なくとも２００のア
ミノ酸が含まれる。 本明細書に用いるＦｖ抗体フラグメントは、非共有結合性相互作用により結合
した１の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）および１の可変軽鎖から成る。
【００５３】 本明細書に用いるｄｓＦｖなる用語は、ＶＨ−ＶＬ対を安定化する加工された
細胞内ジスルフィド結合を有するＦｖを言う。 本明細書に用いるＦ（ａｂ）２フラグメントなる用語は、ペプシンをｐＨ４．
０−４．５で用いた免疫グロブリンの消化から生じる抗体フラグメントであり、
それは組換えて産生されてよい。 本明細書に用いるＦａｂフラグメントは、パパインを用いた免疫グロブリンの
消化から生じる抗体フラグメントであり、それは組換えて産生されてよい。
【００５４】 本明細書に用いるｓｃＦＶｓは、いずれかの順序でポリペプチドリンカーによ
り共有結合された可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）を含む抗体フラグメ
ントをいう。リンカーは２つの可変ドメインが実質上妨害されることなく架橋さ
れる長さである。好ましいリンカーは、溶解度を増すべく散在されたＧｌｕまた
はＬｙｓ残基を有する（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ残基である。
【００５５】 本明細書に用いるヒト化抗体は、ヒトに投与して免疫反応を刺激しないように
ヒトのアミノ酸配列を含むように変更された抗体を言う。そのような抗体の調製
法は公知である。例えば、モノクローナル抗体を発現するハイブリドーマを組換
えＤＮＡ技術により変更し、非可変領域のアミノ酸組成がヒトの抗体に基づくも
のである抗体を発現させる。そのような領域を同定するためのコンピュータープ
ログラムが設計されている。 本明細書に用いるダイアボディは二量体ｓｃＦＶであり、ダイアボディは典型
的にはｓｃＦｖｓよりも短いペプチドリンカーを持ち、好ましくは二量化する。
【００５６】 本明細書中に用いるヒト化抗体は、ヒトに投与して免疫反応を刺激しないよう
にヒトのアミノ酸配列を含むべく変更された抗体を言う。そのような抗体を調製
する方法は公知である。例えば、モノクローナル抗体を発現するハイブリドーマ
を、組換えＤＮＡ技術により変更して非可変領域のアミノ酸組成がヒトの抗体に
基づくものである抗体を発現させる。そのような領域を同定するためのコンピュ
ータープログラムが設計されている。 本明細書に用いる、組換えによる産生は、組換えＤＮＡ法を用いることによる
組換え法による産生を意味し、クローン化されたＤＮＡによりコードされるタン
パク質を発現するための分子生物学に関する周知の方法の使用を意味する。
【００５７】 本明細書に用いる評価なる用語は、サンプル中に存在するエンドセリアーゼま
たはそのドメインの活性の絶対的な値を得るという意味での、およびさらに活性
のレベルを示すインデックス、比率、パーセント、視覚的または他の値を得る意
味での定量および質決定を含む。評価は直接的または間接的であってよく、実際
に検出される化学種は、もちろんタンパク質分解生成物そのものでなくてもよく
、例えばその誘導体またはいずれかのさらなる物質であってよい。
【００５８】 本明細書に用いる生物活性なる用語は、化合物のインビボでの活性、または化
合物、組成物または他の混合物のインビボ投与に際して生じる生理的反応を言う
。生物活性はつまり、そのような化合物、組成物および混合物の治療的作用およ
び医薬活性が包含される。生物活性は、そのような活性を試験もしくは使用する
べく設計されたインビトロシステムで認めることができる。つまり、本明細書に
おける目的に関して、ルシフェラーゼの生物活性は、物質が酸化されると光を生
じるそのオキシゲナーゼ活性である。 本明細書に用いる組み合わせなる用語は、２またはそれ以上のものの間のいず
れかの組み合わせをいう。 本明細書に用いる組成物なる用語は、いずれかの混合物をいう。それは溶液、
懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性、非水性のもの、またはそのいずれかの組
み合わせであってよい。
【００５９】 本明細書に用いる結合物なる用語は、１またはそれ以上のエンドセリアーゼま
たはそのドメインおよび１またはそれ以上の標的剤を含む、本明細書に提供され
る化合物をいう。これらの結合物には、例えばスルフヒドリル基に結合すること
による化学結合によるなどの化学的方法により産生されるものや、少なくとも１
のエンドセリアーゼまたはそのドメインが、リンカーを介して標的剤に直接また
は間接的に結合されるいずれかの他の方法により産生されるものが含まれる。
【００６０】 本明細書に用いる標的剤は、結合物の細胞表面レセプターへの特異的結合を提
供し、好ましくは結合物またはそのエンドセリアーゼ部分を内部移行(internali
ze)させるタンパク質またはその有効な部分などのいずれかの部分である。標的
剤は、例えば結合物のアフィニティ単離または精製、表面への結合物の結合、ま
たは結合物または結合物を含む複合体の検出を促進する、または容易にするもの
であってもよい。 本明細書に用いる抗体結合物は、標的剤が抗体である結合物をいう。 本明細書に用いるヒト化抗体は、ヒトに投与して免疫反応を刺激しないように
ヒトのアミノ酸配列を含むべく変更された抗体をいう。そのような抗体の調製法
は公知である。例えば、モノクローナル抗体を発現するハイブリドーマを、組換
えＤＮＡ法により変更して非可変領域のアミノ酸組成がヒトの抗体に基づくもの
である抗体を発現させる。そのような領域を同定するためにコンピュータープロ
グラムが設計されている。
【００６１】 本明細書に用いる分子の誘導体または類似体は、該分子から誘導された部分、
または該分子の変更体をいう。 本明細書に用いる流体なる用語は、流れることができるあらゆる組成物をいう
。従って、流体は、半固体、ペースト、溶液、水性混合物、ゲル、ローション、
クリームまたは他のそのような組成物の形態である組成物を包含する。 本明細書に用いる特定疾患を治療するための化合物の有効量は、疾患に関連す
る症状を緩和する、またはいくらかの方法においてはそれを減じるのに十分な量
である。そのような量は、単一投与量として投与してよく、有効な方法に従って
投与されてよい。該量は、疾患を治療し得るが、典型的には、疾患の症状を緩和
するために投与される。所望される症状の緩和を得るために、繰り返し投与する
ことが必要とされてよい。
【００６２】 本明細書に用いる同等物は、２つの核酸配列に関して言及する場合、問題の２
つの配列がアミノ酸または同等のタンパク質の同じ配列をコードすることを意味
する。同等物を、２つのタンパク質またはペプチドを示すのに用いる場合、２つ
のタンパク質またはペプチドが、該タンパク質またはペプチドの活性または機能
を実質上変更しない保存されたアミノ酸置換を有する、実質上同じアミノ酸配列
を有することを意味する(例えば、前記表１を参照されたい）。同等なる語が特
性を示す場合、該特性は同じ程度で存在しなくてよい（例えば、２つのペプチド
は同じタイプの酵素活性の異なる速度を示すことができる）が、活性は好ましく
は実質上同じである。相補的に、２つのヌクレオチド配列を示す場合、２つのヌ
クレオチド配列が対立するヌクレオチド間で２５％未満、より好ましくは１５％
未満、よりいっそう好ましくは５％未満のミスマッチで、最も好ましくはミスマ
ッチなしでハイブリダイズできることを意味する。好ましくは、２つの分子は高
ストリンジェント条件下でハイブリダイズする。
【００６３】 本明細書に用いるエンドセリアーゼ阻害物質は、産生、翻訳後の変更、変異、
またはエンドセリアーゼの膜への位置付けを妨げ、または減じる、またはエンド
セリアーゼのプロテアーゼ効力を減じるあらゆる物質を包含する。 本明細書に用いる、望ましくないおよび／または非制御性の血管形成に伴う病
気または疾患を治療または予防する方法は、望ましくないおよび／または非制御
性の血管形成に伴う病気および症状が緩和され、減じられ、改善され、緩和した
場合にはそれを保たれる、またはそれが維持されることを意味する。病的血管形
成の証拠が、治療により排除され、減じられ、または予防されることも意味する
。病的血管形成の証拠の無制限の例には、基底膜、および内皮細胞の隣接細胞外
マトリックスの非制御性の脱落、移動、分裂、および内皮細胞の新たな機能性毛
細管への組織化、およびそのような機能性毛細管の維持が含まれる。
【００６４】 本明細書に用いられる不完全な血管形成に伴う病気または疾患を治療または予
防する方法は、不完全な血管形成に伴う病気または疾患が、緩和され、減じられ
、改善され、予防され、緩和状態に保たれ、または緩和状態に維持されることを
意味する。
【００６５】 本明細書に用いる、作用的に結合する、または作用的に連結するなる用語は、
ヌクレオチドの調節および作動配列、例えばプロモーター、エンハンサー、転写
および翻訳停止部位および他のシグナル配列とのＤＮＡの機能的関連性をいう。
例えば、ＤＮＡのプロモーターへの作用的結合は、ＤＮＡを特異的に認識し、そ
れに結合し、およびそれを転写するＲＮＡポリメラーゼによりプロモーターから
そのようなＤＮＡの転写が開始されるような、ＤＮＡとプロモーターの間の物理
的および機能的関連性をいう。発現および／またはインビトロでの転写を最適化
するために、該クローンの５’非翻訳部分を除去、付加、または変更して、余分
な、潜在的に不適当な別の翻訳開始（即ちスタート）コドンまたは、発現を転写
または翻訳いずれかのレベルで妨害し、または減じる他の配列を除くことが必要
となり得る。別法として、コンセンサスリボソーム結合部位（例えば、Kozak, J
. Biol. Chem., 266: 19867-19870(1991)を参照されたい）をスタートコドンの
５％のすぐ隣に挿入することができ、こうして発現を高めてもよい。そのような
変更に関する所望（または必要性）は、経験的に決定されてよい。
【００６６】 本明細書に用いる結合物の医薬上許容される塩、エステルまたは他の誘導体に
は、誘導化などの公知方法を用いて当該分野の専門家により容易に調製されるこ
とができる、および実質上毒性作用なしに、動物またはヒトに投与されることが
できる化合物を生じる、および医薬上活性であるか、またはプロドラッグである
いずれかの酸、エステルまたは誘導体が含まれる。
【００６７】 本明細書に使用するプロドラッグは、インビボでの投与に際して生物学的に、
医薬的にまたは治療的に活性な形態の化合物に代謝される、または変換される化
合物である。プロドラッグを産生するために、活性化合物が代謝過程により再生
されるように医薬活性化合物が変更される。プロドラッグは、薬物の代謝上の安
定性、または移動特性を変更するべく、副作用または毒性を遮断するべく、薬物
の匂いを改善するべく、または薬物の他の特徴または特性を変更するべく設計さ
れてよい。インビボでの薬物動態プロセスおよび薬物代謝に関する知識を用いて
、当該分野の専門家は、一度医薬活性化合物が分かれば、該化合物のプロドラッ
グを設計することができる(例えば、Nogrady(1985) Medicinal Chemistry A Bio
chemical Approach, Oxford University Press, New York, pages 388-392を参
照されたい）。
【００６８】 本明細書に用いられる、本明細書に提供されるスクリーニング方法により同定
される薬物は、設計される治療のための治療用化合物またはリード化合物として
用いられるための候補であるあらゆる化合物を言う。そのような化合物は、小さ
な有機分子、ペプチド、ペプチド擬似物、アンチセンス分子、抗体、抗体のフラ
グメント、組換え抗体、および薬物候補またはリード化合物として役立ち得る他
の化合物を含む小分子であり得る。 本明細書に用いる、組換えＤＮＡ法を用いることによる組換え法による産生は
、クローン化されたＤＮＡによりコードされるタンパク質を発現するための分子
生物学の周知方法を用いることを意味する。
【００６９】 本明細書に用いる、プロモーター領域またはプロモーターエレメントは、ＤＮ
ＡまたはＲＮＡに作用的に結合する、ＤＮＡまたはＲＮＡの転写を制御するＤＮ
ＡまたはＲＮＡのセグメントを言う。プロモーター領域には、ＲＮＡポリメラー
ゼの認識、結合よび転写開始に十分な特定配列が含まれる。プロモーター領域の
この部分をプロモーターと呼ぶ。加えて、プロモーター領域には、ＲＮＡポリメ
ラーゼのこの認識、結合、および転写開始活性を調節する配列が含まれる。これ
らの配列はシス作用性であってよく、トランス作用ファクターに反応性がある可
能性もある。プロモーターは、調節の特性により、構造性であっても調節性であ
ってもよい。原核生物での使用に企図される典型的なプロモーターには、バクテ
リオファージＴ７およびＴ３プロモーターが含まれる。
【００７０】 本明細書に用いる、レセプターは、所定のリガンドにアフィニティを有する分
子を言う。レセプターは、天然に生じる分子であっても合成分子であってもよい
。レセプターは、また、当該分野で抗リガンドとも呼ばれる。本明細書に用いる
レセプターと抗リガンドは交換して用いることができる。レセプターは、その変
更されていない状態で用いることができ、または他の種との集合物として用いる
ことができる。レセプターは、結合メンバーに、直接的に、または特異的結合物
質またはリンカーを介して間接的に結合されてよい。レセプターの例には、制限
されるものではないが、抗体、細胞膜レセプター、表面レセプターおよび内部移
行レセプター、モノクローナル抗体および（例えばウイルス、細胞または他の物
質上で）特異的抗原決定因子と反応する抗血清、薬物、ポリヌクレオチド、核酸
、ペプチド、補助因子、レクチン、砂糖、ポリサッカライド、細胞、細胞膜およ
び細胞小器官が含まれる。
【００７１】 レセプターおよびそのようなレセプターを用いる適用の例には、制限されるも
のではないが、以下のものが含まれる。 ａ）酵素：抗生物質（リガンド）選択の標的として役立つことができる、微生物
の生存に必要な特異的輸送タンパク質または酵素； ｂ）抗体：目的の抗原のエピトープと結合する、抗体分子上のリガンド結合部位
の同定を調べることができる。；抗原性エピトープを擬似する配列の決定により
、免疫原が１またはそれ以上のそのような配列に基づくワクチンの開発が導かれ
得、または自己免疫疾患などの治療処置に有用な関連診断薬または化合物の開発
が導かれ得る。 ｃ）核酸；タンパク質またはＲＮＡなどのリガンドの結合部位の同定； ｄ）触媒ポリペプチド：１またはそれ以上の反応物から１またはそれ以上の生成
物への変換に関与する化学反応を促進することができるポリマー、好ましくはポ
リペプチド；そのようなポリペプチドには、一般に、少なくとも１の反応物また
は反応中間体、およびその官能基により結合反応物が化学的に修飾され得る、結
合部位に連結する活性官能基に特異的な結合部位が含まれる（例えば、米国特許
Ｎｏ５,２１５,８９９を参照されたい）。 ｅ）ホルモンレセプター：高アフィニティでレセプターに結合するリガンドの決
定は、ホルモン置換治療の開発に有用である。例えば、そのようなレセプターに
結合するリガンドの同定により、血圧をコントロールする薬物の開発が導かれる
。；および、 ｆ）オピエートレセプター：脳のオピエートレセプターに結合するリガンドの決
定は、モルヒネおよび関連薬物の耽溺性の少ない置換物の開発に有用である。
【００７２】 本明細書に用いられるサンプルは、分析物アッセイが所望される分析物を含む
可能性のあるあらゆるものを言う。サンプルは生物サンプル、例えば生物体液ま
たは生物組織などであってよい。生物学的流体物の例には、尿、血液、血漿、血
清、唾液、精液、大便、痰、脳脊髄液、涙、粘液、羊水などが含まれる。生物組
織は細胞の集合であり、器官、腫瘍、リンパ節、動脈および個々の細胞をさらに
含むヒト、動物、植物、細菌、真菌またはウイルスの構造物質の一つを形成する
その細胞内物質と共に、通常特定の種類の細胞の集合物である。
【００７３】 本明細書で用いる、パーセントミスマッチを決定することにおけるハイブリダ
イゼーションのストリンジェントは、以下のようである。 １）高ストリンジェント：０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、６５℃ ２）中ストリンジェント：０．２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５０℃ ３）低ストリンジェント：１．０×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５０℃ 別のバッファー、塩および温度を用いて同等のストリンジェントを達成してよい
ことが理解される。
【００７４】 関連分野で、および一般的に当業者により理解される内容と同一または相同の
、または同様の値なる用語は、少なくとも７０％を意味し、好ましくは少なくと
も８０％、より好ましくは少なくとも９０％、およびもっとも好ましくは少なく
とも９５％同一であることを意味する。 本明細書に用いる、生成物に対して実質上同一とは、純度を評価するために当
該分野の専門家に用いられる分析に関する常套法、例えば薄層クロマトグラフィ
ー（ＴＬＣ）、ゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に
より決定されるような容易に検出可能な不純物を含まないと考えられるほど十分
均質であること、またはさらなる精製により物質の酵素活性および生物活性など
の物理的および化学的特性が明らかには変更しないほどに十分に純粋であること
を意味する。実質上化学的に純粋な化合物を製造するための化合物の精製法は、
当該分野の専門家に公知である。実質上化学的に純粋な化合物は、しかし、構造
異性体または異性体の混合物であってよい。そのような例において、さらなる精
製により化合物の特異的活性を増すことができる。
【００７５】 本明細書に用いられる標的細胞なる用語は、天然にエンドセリアーゼを発現す
る細胞を言う。 本明細書に用いられる試験物質なる用語は、エンドセリアーゼまたはそのドメ
インにおける効果が、本明細書に開示されていない方法および／または請求項に
記載された方法により決定される、化学的に規定される化合物（例えば、有機分
子、無機分子、有機／無機分子、タンパク質、ペプチド、核酸、オリゴヌクレオ
チド、脂質、ポリサッカライド、サッカライド、またはこれらの分子間のハイブ
リッド、例えば糖タンパク質など）をいう。 本明細書に用いる治療薬、治療措置、放射能保護剤、化学療法薬なる用語は、
当該分野の専門家に公知のワクチンを含む通常の薬物および薬物治療を意味する
。放射能治療薬は、当該分野で周知である。
【００７６】 本明細書に用いる治療は、症状、疾患または病気の症状が緩和され、または有
益に変更されるあらゆる方法を意味する。治療は、本明細書中の組成物のあらゆ
る医薬使用も包含する。
【００７７】 本明細書に用いるベクター（またはプラスミド）は、異種ＤＮＡをその発現ま
たは複製いずれかのための細胞に導入するのに用いられる別個のエレメントを言
う。ベクターは典型的には、エピソームであってよいが、遺伝子またはその部分
のゲノムの染色体への統合を達成するべく設計されることができる。また、酵母
人工染色体および哺乳動物人工染色体などの人工染色体であるベクターも企図さ
れる。そのようなビヒクルの選択および使用は、当該分野の専門家に周知である
。発現ベクターには、ＤＮＡフラグメントの発現をもたらすことができる調節配
列、プロモーター領域などと作用的に結合されるＤＮＡを発現することができる
ベクターが含まれる。つまり、発現ベクターは、適当な宿主細胞に導入された時
、クローン化されたＤＮＡを発現させる組換えＤＮＡまたはＲＮＡ構築物、例え
ばプラスミド、ファージ、組換えウイルスまたは他のベクターを言う。適当な発
現ベクターは、当該分野の専門家に周知であり、真核細胞および／または原核細
胞中で複製可能なもの、およびエピソームであるもの、または宿主細胞ゲノムに
統合するものが含まれる。
【００７８】 本明細書に用いられるタンパク質結合配列は、一般的には他のタンパク質また
はペプチド配列、タンパク質またはペプチド配列のセット、または特定のタンパ
ク質またはペプチド配列に特異的に結合することができるタンパク質またはペプ
チド配列を言う。 本明細書に用いるエピトープタグは、エピトープタグされたタンパク質または
ペプチドのさらなる生化学的および免疫学的分析を促進する、エピトープに対応
するアミノ酸残基の短い伸張を言う。エピトープのタギングは、エピトープタグ
の配列を適当な発現ベクター中のタンパク質コーディング配列に付加することに
より達成される。エピトープタグされたタンパク質は、タグに対して産生された
特異性の高い抗体を用いてアフィニティ精製することができる。
【００７９】 本明細書に用いる金属結合配列なる用語は、一般に金属イオン、金属イオンの
セット、または特定の金属イオンに特異的に結合できるタンパク質またはペプチ
ド配列をいう。 本明細書に用いる組成物なる用語は、あらゆる混合物を言う。それは、溶液、
懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性、非水性またはそのあらゆる組み合わせで
あってよい。 本明細書に用いる組み合わせなる用語は、２またはそれ以上のもののあらゆる
組み合わせを言う。 本明細書に用いる流体なる用語は、流れることができるいずれかの組成物を言
う。つまり、流体は、半固体、ペースト、溶液、水性混合物、ゲル、ローション
、クリームおよび他のそのような組成物の形態のものが包含される。 開示の明確化のために、および制限によるものではないが、詳細な記載を以下
のサブセクションに分けて示す。
【００８０】 Ｂ．エンドセリアーゼタンパク質、および誘導体と類似体 血管形成におけるプロテアーゼの関与 血管形成の初期の段階では、初めから存在している血管の微小血管内皮細胞が
、その下の基底層を部分的に脱落させ、血管形成される組織のストロマに侵入す
る。このプロセスには多くの脱落酵素が必要であることが示されている(Mignatt
i and Rifkin, Enzyme Protein, 49(1-3): 117-37(1996))。プラスミノゲン活性
化（ＰＡ）−プラスミン系およびマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）
ファミリーの成分が重要な役割を果たす。ＰＡは、高局所濃度のプラスミンと活
性ＭＭＰを生成するプロテイナーゼカスケードを誘発する。タンパク質分解活性
のこの増加は以下の３つの主用効果を有する。細胞外マトリックスが脱落し、次
いで血管基底層が侵入し、内皮細胞に対して走化性のある細胞外マトリックス（
ＥＣＭ）脱落生成物が生じ、次いでＥＣＭに局在する成長因子が活性化され、そ
して流動化される。これらのプロセスに関与し得る５つのプロテアーゼ、ウロキ
ナーゼ型プラスミノゲン活性化因子、ファクターＸＩＩ、タンパク質Ｃ、トリプ
シノゲンＩＦおよび膜タイプセリンプロテアーゼ１（ＭＴＳＰ１）が同定されて
いる。
【００８１】 少なくとも９の異なるＭＭＰが同定されている。これらの中には、コラーゲン
タイプＩＶおよびＶ、エラスチンおよびラミニンを分解し、悪性腫瘍のストロマ
細胞でしばしば過剰発現されるゼラチナーゼＡがある(Vassalli and Pepper, Na
ture, 370: 14-5(1994)を参照されたい）。ポテンシャル膜貫通ドメインを有す
るマトリックスメタロプロテイナーゼをコードしている核酸が同定されている(S
ato et al., Nature, 370: 61-5(1994))。クローン遺伝子産物の細胞表面におけ
る発現により、インビトロでのプロ−ゼラチナーゼＡの特異的活性化が誘導され
、再構築された基底膜の細胞性侵入が亢進する。ゼラチナーゼＡの活性化形態を
含む侵入性肺癌の腫瘍細胞が、該転写産物および該遺伝子産物を発現することが
見出された。野生型エコチンおよび加工型エコチンを用いるプロテアーゼ活性の
阻害におり、ラットの前立腺の分化が阻害され、ヒトＰＣ−３前立腺癌腫瘍の成
長が遅延する(Takeuchi et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 96(20): 11054
-61(1999)を参照されたい）。 つまり、内皮細胞およびプロテアーゼは、血管形成および関連プロセスに重要
な役割を果たす。さらに、プロテアーゼは治療の標的として、およびプロテアー
ゼ活性に依存するプロセスにおける干渉点となり得る。
【００８２】 前記のように、異常な血管形成およびそれに関連するプロセスは、癌、糖尿病
性網膜症、高増殖性疾患、再狭窄およびその他を含む種々の疾患に重要な影響を
持つ。本明細書に提供されるように、プロテアーゼは、種々の疾患において異常
である血管形成に直接的または間接的に関与しているので、血管形成に関与する
プロテアーゼの活性を変更することにより、血管形成の結果発症する疾患を治療
することが出来る。つまり、血管形成に関与するプロテアーゼは、治療の標的と
なり得、血管形成を調節する、特に阻害する化合物を同定するための薬物スクリ
ーニング法にも用いることができる。
【００８３】 本明細書中、エンドセリアーゼとして指定されるプロテアーゼのクラスが本明
細書中に提供される。該プロテアーゼは内皮細胞膜貫通タンパク質タンパク質で
あり、血管形成および関連プロセスにおける内皮細胞およびプロテアーゼの作用
が、血管形成のプロセスまたはそれに関連するプロセスに直接的または間接的に
関与する。従って、これらのプロテアーゼは血管形成のプロセスにおける干渉、
その阻害または活性化いずれかのための治療的、診断的、予測的標的となる。加
えて、これらのプロテアーゼ、特にプロテアーゼドメイン（細胞外ドメイン）に
より、血管形成を調節する化合物をスクリーニングする方法が提供される。
【００８４】 本明細書に提供されるエンドセリアーゼおよび本明細書に提供されるスクリー
ニング方法により、血管構造の確立および維持に関与するプロセスを調節する候
補化合物の開発が可能となる。これらの方法により、エンドセリアーゼに選択的
に結合し、またはそれと結合してエンドセリアーゼのプロテアーゼ活性を増加ま
たは低下させる化合物を選択する方法が提供される。エンドセリアーゼは、血管
構造の確立および維持に関連するプロセスに密接に関連する内皮細胞上に生じる
ので、本明細書中の方法により同定された化合物は、抗血管形成剤または前−血
管形成剤としての活性を持つことができる。
【００８５】 エンドセリアーゼ こうして、プロテアーゼドメインを含むエンドセリアーゼが本明細書中に提供
される。記載のごとく、エンドセリアーゼはプロテアーゼ活性を示す細胞外ドメ
インを含む内皮細胞膜貫通タンパク質である。内皮細胞上でのその発現により、
これらのタンパク質は血管形成に関与するプロセスに直接的に、または関節的に
関与する。 エンドセリアーゼタンパク質、およびプロテアーゼドメインに対して指向され
た抗体により結合され得るその誘導体または類似体の実質上精製されたプロテア
ーゼドメインが提供される。本明細書に例示されるエンドセリアーゼのプロテア
ーゼドメインに対して少なくとも４０％、より好ましくは６０％またはそれ以上
の同一性を有するアミノ酸配列を含む実質上精製されたタンパク質も含まれ、こ
こで、同一性の割合は、プロテアーゼドメインと同じ大きさのアミノ酸配列に対
して決定される。より好ましくは、配列同一性は少なくとも９０％同一である。
【００８６】 例示的具体例で、変種形態を含む２つの異なるエンドセリアーゼが提供される
。これらには、エンドセリアーゼ１、およびエンドセリアーゼ２の２つのスプラ
イス変種が含まれる。該ファミリーの他のメンバーは、本明細書中に同定される
エンドセリアーゼのプロテアーゼドメインと配列同一性、特に少なくとも４０％
、６０％、８０％、９０％またはそれ以上の配列同一性を有する、または本明細
書に提供されるエンドセリアーゼのプロテアーゼドメインをコードしている核酸
の全長に対して、高ストリンジェントの条件下でハイブリダイズする遺伝子に関
して遺伝子をプローブし、またはライブラリーを検索することにより同定するこ
とができる。
【００８７】 別法として、および低い配列同一性を有する可能性のあるエンドセリアーゼを
同定する方法として、エンドセリアーゼは、本明細書に例示される方法により、
例えばＥＳＴまたはプロテアーゼに対して配列同一性を有する他の核酸フラグメ
ントを同定し、次いでそのようなフラグメントをプローブとして用いて全長のプ
ロテアーゼまたはそのプロテアーゼドメインをコードしているｃＤＮＡクローン
を同定および選択し、膜タンパク質の性質を有するものを同定し、次いで遺伝子
発現特性を測定して内皮細胞表面上で発現されるものを同定することにより同定
されることができる。プロテアーゼ活性を有し、膜貫通ドメインおよび細胞外ド
メインを含み、かつ内皮細胞内で発現されるコードされたタンパク質がエンドセ
リアーゼである。内皮細胞上で発現される膜貫通プロテアーゼをコードする、タ
ンパク質をコードしている遺伝子（またはタンパク質）を同定するためのあらゆ
る方法が、本明細書中に企図される。
【００８８】 以下に記載するように、本明細書中のエンドセリアーゼおよび／またはプロテ
アーゼドメインをコードしている例示的な核酸分子が提供される。エンドセリア
ーゼまたはそのプロテアーゼドメインをコードしている全長クローンは、制限さ
れるものではないが、エンドセリアーゼの３’および５’末端にハイブリダイズ
する合成プライマーを用いるＰＣＲ増幅を含む当該分野で公知のいずれかの方法
により、および／または該遺伝子配列に特異的なＰＣＲ増幅産物またはオリゴヌ
クレオチドを用いてｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーからクローニングするこ
とにより得ることができる。相同体（例えばヒト以外の種の前記遺伝子の核酸）
または他の関連配列（例えばパラログ）を、プローブとして提供される特定配列
全部またはその一部を用いる低、中または高ストリンジェントハイブリダイゼー
ションにより、核酸ハイブリダイゼーションおよびクローニングに関する当該分
野で周知の方法を用いて得ることができる。
【００８９】 １またはそれ以上のタンパク質の組換え発現に関して、タンパク質をコードし
ている核酸の全部または一部を含む核酸を、適当な発現ベクター、即ち、挿入さ
れたタンパク質コーディング配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含むベ
クターに挿入することができる。必要な転写および翻訳シグナルを、エンドセリ
アーゼ遺伝子のための未変性プロモーター、および／またはその隣接領域により
提供することもできる。
【００９０】 全長エンドセリアーゼおよびそのドメイン、特にエンドセリアーゼのプロテア
ーゼドメインが本明細書中に提供される。エンドセリアーゼのドメインまたはそ
の部分は、エンドセリアーゼの少なくとも１０、２０、３０、４０、または５０
の連続するアミノ酸を含む。特定の具体例において、そのようなドメインまたは
フラグメントは３５、１００、２００または５００アミノ酸以下である。エンド
セリアーゼの誘導体または類似体には、制限されるものではないが、種々の具体
例において、同一サイズのアミノ酸配列に対して、または当該分野で公知のコン
ピューター相同性プログラムにより整列化を行って整列化された配列と比較して
、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または
９５％の同一性で実質上相同な、またはそのコーディング核酸が、高、中ストリ
ンジェントまたは非ストリンジェント条件下でエンドセリアーゼをコードしてい
る配列にハイブリダイズすることができる領域を含む分子が含まれる。
【００９１】 エンドセリアーゼ誘導体は、機能的に等価な分子を提供する置換、付加または
欠失によりその配列を変更することにより作成されることができる。ヌクレオチ
ドコーディング配列の縮重により、エンドセリアーゼ遺伝子と同じアミノ酸配列
を実質上コードする他のＤＮＡ配列を本発明において用いることができる。これ
らには、制限されるものではないが、アミノ酸残基をコードする異なるコドンの
配列内での置換により変更され、その結果サイレントな変化を生じている、エン
ドセリアーゼ遺伝子の全部または部分を含むヌクレオチド配列が含まれる。エン
ドセリアーゼ誘導体には、制限されるものではないが、機能的に等価なアミノ酸
残基が残基で置換され、配列内でサイレントな変化を生じている変更された配列
を含む、エンドセリアーゼのアミノ酸配列の全部または部分を一次アミノ酸配列
として含むものが含まれる。例えば、配列内の１またはそれ以上のアミノ酸残基
を、機能的等価なものとして作用してサイレントな変化を生じる、同様の極性の
他のアミノ酸で置換することができる。配列内のアミノ酸を置換するものは、ア
ミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択することができる。例えば、非極
性の（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プ
ロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが含まれる。極性
中性アミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、ア
スパラギン、およびグルタミンが含まれる。陽性に荷電した（塩基性）アミノ酸
には、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが含まれる。陰性に荷電した（酸性
）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。 本明細書中に提供されるエンドセリアーゼの例には、エンドセリアーゼ１とエ
ンドセリアーゼ２がある。
【００９２】 エンドセリアーゼ１およびエンドセリアーゼ１をコードしている核酸 核酸 エンドセリアーゼ１のプロテアーゼドメインをコードしている核酸の同定およ
びクローニングを実施例１に記載する。本明細書に提供されるのは、エンドセリ
アーゼ１のプロテアーゼドメインをコードする核酸である。そのような核酸分子
は、配列番号２に示すアミノ酸配列をコードする。それはさらに配列番号２２の
配列のアミノ酸１９０−または１９１−４２４を含み、Ａｒｇが含まれても良い
。本明細書には、配列番号１に示すヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイ
ズする核酸も提供される。ハイブリダイゼーションは、好ましくは中程度の条件
下で、およびより好ましくは高ストリンジェント条件下で行われ、その結果、目
的の核酸は全長に渡ってエンドセリアーゼ１のプロテアーゼドメインをコードす
る核酸にハイブリダイズし、内皮細胞におけるその発現、プロテアーゼとしての
活性およびハイブリダイゼーションにより、または本明細書中に例示されるエン
ドセリアーゼ１のプロテアーゼドメインに対して少なくとも約６０％、より好ま
しくは約７５％以上の、より好ましくは約９０％以上の配列同一性を有すること
により評価される同一性によりエンドセリアーゼ１と考えられる。そのようなタ
ンパク質は、さらにプロテアーゼ活性を阻害する。また、本明細書に企図される
のは、前記表１に示すもののような、保存的アミノ酸配列変化を含み、およびプ
ロテアーゼ活性を保持するタンパク質である。
【００９３】 エンドセリアーゼ１プロテアーゼドメインおよびコードしている核酸が、本明
細書に開示される方法および細胞およびベクターにおける使用に企図される。プ
ロテアーゼドメインは、精製タンパク質として用いられることができ、全長エン
ドセリアーゼ１などの、もっと大きなタンパク質の部分であってよい。 また、該方法、ベクターおよび細胞における使用に企図されるのは、全長のエ
ンドセリアーゼ１である。全長エンドセリアーゼの例には、全長のエンドセリア
ーゼを提供する配列番号２２に示すアミノ酸配列を含むエンドセリアーゼがある
（国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ００／５００６を参照されたい）。国際ＰＣＴ出願番
号ＷＯ００／５００６には、扁平上皮細胞癌または前立腺癌の診断に用いられる
、ＤＥＳＣ１と指定される遺伝子が提供される。この中でＤＥＳＣ１が、エンド
セリアーゼ１をコードすることが示されている。ＤＥＳＣ１およびコードされた
タンパク質（配列番号２２を参照されたい）は、本明細書に提供される本方法、
細胞およびベクターにおける使用が企図される。ＰＣＴ出願は、いずれの目的に
関してもそのプロテアーゼドメインを用いることは示唆していない。
【００９４】 タンパク質 エンドセリアーゼ１を含む、エンドセリアーゼのプロテアーゼドメインが本明
細書中に提供される。核酸をコードする核酸分子によりコードされるエンドセリ
アーゼタンパク質の、実質上精製されたプロテアーゼドメインが提供される。特
に、プロテアーゼドメインは、配列番号２に示すアミノ酸配列、またはプロテア
ーゼ活性を示す、もしくは配列番号２のタンパク質をコードする核酸分子にハイ
ブリダイズするアミノ酸配列を含むそのフラグメントが含まれる。
【００９５】 一の例示的具体例では、実質上精製されたプロテアーゼドメインは、配列番号
１に示す核酸配列によりコードされ、または高ストリンジェント条件下でその全
長に渡ってそれにハイブリダイズし、そしてプロテアーゼとしての活性を持つ。
他の具体例では、エンドセリアーゼタンパク質のプロテアーゼドメインの実質上
精製された誘導体または類似体が提供され、その誘導体または類似体はそのよう
なプロテアーゼドメインに対して指向された抗体により結合されることができる
。
【００９６】 他の具体例では、エンドセリアーゼ１タンパク質のプロテアーゼドメインに対
して少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む実質上精製されたタ
ンパク質が提供され、ここで、同一性の割合は、プロテアーゼドメインと同じサ
イズのアミノ酸配列に対して決定される。より好ましくは、配列同一性は少なく
とも９０％同一である。
【００９７】 特定の態様では、エンドセリアーゼタンパク質のプロテアーゼドメインのプロ
テアーゼドメインペプチド、誘導体または類似体は、哺乳動物、例えば制限され
るものではないが、マウス、ラット、ニワトリおよびヒト起源を含む動物由来の
ものであり、例えばドメインに関連する１またはそれ以上の機能活性、例えばセ
リンプロテアーゼ活性、免疫原性または抗原性を示すことができるなど、機能的
に活性である。
【００９８】 エンドセリアーゼ２およびエンドセリアーゼ２をコードしている核酸 エンドセリアーゼ２のクローニングおよびその発現特性を実施例２に示す。エ
ンドセリアーゼ２−Ｓおよびエンドセリアーゼ２−Ｌと指定されるエンドセリア
ーゼ２の２つのスプライス変種形態も提供される（例えば、そのドメイン構成に
関しては、図１を参照されたい；実施例２も参照されたい）。エンドセリアーゼ
２−Ｓをコードしている核酸（配列番号３）のオープンリーディングフレームは
、５６２のアミノ酸タンパク質（配列番号４）に翻訳される１．６８９ｂｐから
成り、一方、エンドセリアーゼ２−ＬのＯＲＦは、６８８のアミノ酸タンパク質
（配列番号６）に翻訳される２,０６７ｂｐ（配列番号５）から成る。
【００９９】 エンドセリアーゼ２−Ｓのプロテアーゼドメインをコードしている核酸は、２
４２のアミノ酸タンパク質（配列番号３および４のアミノ酸３２１−５６２）に
翻訳される７２９ｂｐから成り、一方、エンドセリアーゼ２−Ｌのプロテアーゼ
ドメインをコードしている核酸は、３６８のアミノ酸タンパク質（配列番号５お
よび６のアミノ酸３２１−６８８）に翻訳される１,１０７ｂｐから成る。各形
態のドメイン構成を図１に示す。 エンドセリアーゼ２の全長およびプロテアーゼドメインならびに他のドメイン
（図１を参照されたい）は、該タンパク質および／またはコーディング核酸を用
いる細胞、ベクターおよび方法として本明細書中に提供される。
【０１００】 本明細書中、配列番号３または５に示すヌクレオチド配列を含む核酸にハイブ
リダイズする核酸も提供される。ハイブリダイゼーションは、好ましくは中程度
の条件下で、およびより好ましくは高ストリンジェント条件下で行われ、その結
果、目的の核酸は、エンドセリアーゼ２のプロテアーゼドメインをコードする核
酸にその全長に渡ってハイブリダイズし、そして、内皮細胞におけるタンパク質
の内因性の発現、プロテアーゼとしての活性、およびハイブリダイゼーションも
しくは本明細書中に例示されるエンドセリアーゼ２のプロテアーゼドメインに対
して少なくとも約６０％、より好ましくは約８５％以上の、より好ましくは９０
％以上の配列同一性を有することにより評価される同一性により、エンドセリア
ーゼ２をコードすると考えられる。そのようなコードされたタンパク質は、プロ
テアーゼ活性も示す。核酸は、本明細書に提供されるベクター、細胞、および方
法に関して企図される。
【０１０１】 エンドセリアーゼ−２タンパク質 前記エンドセリアーゼおよび／またはそのプロテアーゼドメインのいずれかお
よび全て、例えば配列番号２、４、６および２２のアミノ酸配列を含むもの、ま
たは前記の条件下でそれにハイブリダイズする核酸によりコードされるものなど
が、本明細書における方法における使用のために企図される。さらに本明細書中
、前記表１に示すもののような、保存的アミノ酸配列変化を含み、かつプロテア
ーゼ活性を保持するタンパク質が企図される。
【０１０２】 エンドセリアーゼまたはそのプロテアーゼドメインをコードしている核酸を含む
ベクター、プラスミドおよび細胞 エンドセリアーゼをコードしている核酸を含むベクターも提供される。ベクタ
ーを含む細胞も提供される。細胞には真核および原核細胞が含まれ、ベクターは
本明細書における使用に適している。 ベクターを含む、内皮細胞を含む原核細胞および真核細胞が提供される。その
ような細胞には、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞および動
物細胞が含まれる。該細胞を用いて、コードされるエンドセリアーゼまたはエン
ドセリアーゼのプロテアーゼドメインが細胞により発現される条件下で前記細胞
を生育させ、次いで発現されたプロテアーゼドメインタンパク質を回収すること
により、エンドセリアーゼまたはそのプロテアーゼドメインを製造する。本明細
書の目的に関して、プロテアーゼドメインは好ましくは培地に分泌される。
【０１０３】 一具体例において、ベクターは、プロテアーゼ活性を有し、およびエンドセリ
アーゼのプロテアーゼドメインのみの全部または一部、またはその複数のコピー
を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。また、プロテアーゼ
ドメインおよび全長のエンドセリアーゼまで、およびそれを含むエンドセリアー
ゼの追加部分、ならびにその複数のコピーをコードするヌクレオチド配列を含む
ベクターも提供される。ベクターは、細胞中でのエンドセリアーゼまたはそのプ
ロテアーゼドメインの発現に関して選択され得、またはエンドセリアーゼが膜貫
通タンパク質として発現されるように選択されてよい。別法として、ベクターは
コードされるタンパク質の分泌に必要なシグナルを含んで良い。プロテアーゼド
メインが発現される場合、核酸は好ましくは、サッカロマイセス セレビジエ結
合因子シグナル配列またはその部分などの分泌シグナルに結合される。
【０１０４】 種々の宿主−ベクター系を用いてタンパク質コーディング配列を発現させるこ
とができる。これらには、制限されるものではないが、ウイルス（例えばワクシ
ニアウイルス、アデノウイルスなど）で感染させた哺乳動物細胞系、ウイルス（
例えば、バキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞系；酵母ベクターを含んでい
る酵母などの微生物、またはバクテリオファージ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、
またはコスミドＤＮＡで感染させた細菌が含まれる。ベクターの発現エレメント
は、その効果および特異性が異なる。用いられる宿主−ベクター系により、多く
の適当な転写および翻訳エレメントのいずれか一つを用いて良い。
【０１０５】 ＤＮＡフラグメントのベクターへの挿入に関する当該分野で公知のいずれかの
方法を用いて、適当な転写／翻訳コントロールシグナルおよびタンパク質コーデ
ィング配列を含むキメラ遺伝子を含む発現ベクターを構築することができる。こ
れらの方法には、インビトロ組換えＤＮＡおよび合成法およびインビボでの組換
え（遺伝子組換え）が含まれ得る。エンドセリアーゼまたはそのドメイン、誘導
体、フラグメントまたは相同物をコードしている核酸配列の発現は、遺伝子また
はそのフラグメントが組換えＤＮＡ分子で形質転換された宿主において発現され
るように二次的核酸配列により調節されてよい。例えば、タンパク質の発現は、
当該分野で公知のいずれかのプロモーター／エンハンサーによりコントロールさ
れ得る。特定の具体例では、プロモーターはエンドセリアーゼの遺伝子に始めか
ら存在していたものではない。用いられてよいプロモーターには、制限されるも
のではないが、ＳＶ４０初期プロモーター（Bernoist and Chambon, Nature 290
:304-310(1981))、ラウス肉腫ウイルスのリピートを３’長末端に含むプロモー
ター(Yamamoto et al., Cel 22: 787-797(1980))、ヘルペスチミジンキナーゼプ
ロモーター(Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1441-1445(1981)
)、金属結合性タンパク質遺伝子の調節配列(Brinster et al. Nature 296: 39-4
2(1982));β−ラクタマーゼプロモーターなどの原核生物発現ベクター（Villa-K
amaroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731 1978)またはｔａ
ｃプロモーター（DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25(1983
))；さらに「組換え細菌からの有用なタンパク質」Scientific American 242: 7
9-94(1980)も参照されたい）；ノパリン合成酵素プロモーターを含む植物発現ベ
クター（Herrar-Estrella et al., Nature 303: 209-213(1984))またはカリフラ
ワーモザイクウイルス３５ＳＲＮＡプロモーター(Garder et al., Nucleic Acid
s Res. 9: 2871(1981))、および光合成酵素リブロース二リン酸カルボキシラー
ゼのプロモーター(Herrera-Estrella et al., Nature 310: 115-120(1984))；酵
母または他の真菌からのプロモーターエレメント、例えばＧａｌ４プロモーター
、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼプロ
モーター、アルカリホスファターゼプロモーター、およびそれに続く、組織特異
性を示し、形質転換動物で有用な動物転写コントロール領域：膵臓腺房細胞で活
性のあるエステラーゼＩ遺伝子コントロール領域(Swift et al., Cell 38: 639-
646(1984); Ornitz et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-
409(1986); MacDonald, Hepatology 7: 425-515(1987))；膵臓ベータ細胞で活性
のあるインシュリン遺伝子コントロール領域(Hanahan et al., Nature 315: 115
-122(1985))、リンパ球細胞で活性のある免疫グロブリン遺伝子コントロール領
域(Grosschedl et al., Cell 38: 647-658(1984); Adams et al., Nature 318:
533-538(1985); Alexander et al., Mol. Cell Biol. 7: 1436-1444(1987))、精
巣、乳房、リンパ球およびマスト細胞で活性のあるマウス乳癌ウイルスコントロ
ール領域（Leder et al., Cell 45: 485-495(1986))、肝臓で活性のあるアルブ
ミン遺伝子コントロール領域（Pinckert et al., Genes and Devel. 1: 268-276
(1987))、肝臓で活性のあるアルファ−フェトタンパク質遺伝子コントロール領
域(Krumlauf et al., Mol. Cell. Biol. 5: 1639-1648(1985); Hammer et al.,
Science 235: 53-58 1987))、肝臓で活性のあるアルファ−１抗トリプシン遺伝
子コントロール領域(Kelsey et al., Genes and Devel. 1: 161-171 (1987))、
脊髄細胞で活性のあるベータグロビン遺伝子コントロール領域(Mogram et al.,
nature 315: 338-340(1985)) Kollias et al., Cell 46: 89-94(1986))、脳のオ
リゴデンドロサイト細胞で活性のあるミエリン塩基性タンパク質遺伝子コントロ
ール領域(Readhead et al., Cell 48: 703-712(1987))、骨格筋で活性のあるミ
オシン軽鎖−２遺伝子コントロール領域（Sani, Nature 314: 283-286(1985))、
および視床下部の性腺製刺激ホルモン分泌細胞で活性のある性腺刺激放出ホルモ
ン遺伝子コントロール領域(Mason et al., Science 234: 1372-1378(1986))が含
まれる。
【０１０６】 特定の具体例において、エンドセリアーゼまたはそのドメイン、フラグメント
、誘導体または相同物を含む核酸、１またはそれ以上の複製起点、および任意に
１またはそれ以上の選択可能なマーカー（例えば抗生物質耐性遺伝子）に作用的
に結合しているプロモーターを含むベクターが用いられる。エンドセリアーゼの
コーディング配列、またはその部分を含む発現ベクターは、例えば、コーディン
グ部分を３つのｐＧＥＸベクター(グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ発現ベ
クター(Smith and Johnson, Gene 7: 31-40(1988))のそれぞれのＥｃｏＲＩ制限
部位にサブクローニングすることにより作成される。これにより、正確なリーデ
ィングフレームにて生成物が発現される。エンドセリアーゼのプロテアーゼドメ
インの発現のために好ましいベクターおよび系は、ピキア(Pichia)ベクター、特
に、コードされたタンパク質の分泌のために設計されたものである。一の例示的
なベクターが実施例に記載される。
【０１０７】 ベクターは、宿主細胞に導入され、次いでその中でタンパク質が発現される。
エンドセリアーゼタンパク質またはそのドメイン、フラグメントまたは誘導体を
発現している組換え細胞が同定されたら、個々の遺伝子産物を単離し、次いで分
析することができる。これは、制限されるものではないが、生成物を放射能標識
した後、ゲル電気泳動、イムノアッセイ、マーカー標識された産物に対する架橋
結合による分析を行うことを含む、タンパク質の生理特性および／または機能特
性に基づくアッセイにより達成される。
【０１０８】 エンドセリアーゼタンパク質は、制限されるものではないが、カラムクロマト
グラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティ、ゲル排除、逆相高圧、高速タ
ンパク質液体クロマトグラフィーなど）、分画遠心、分画溶解を含む当該分野で
公知の方法、またはタンパク質の精製に用いられるいずれかの他の常套法により
、（複合体またはタンパク質を発現している天然源または組換え宿主細胞いずれ
かから）単離し、次いで精製されることができる。機能特性は,当該分野で公知
のいずれかの適当なアッセイを用いて評価されてよい。
【０１０９】 別法として、エンドセリアーゼまたはそのドメインもしくは誘導体が同定され
たら、該タンパク質のアミノ酸配列を、それをコードする遺伝子のヌクレオチド
配列から導き出すことができる。結果として、タンパク質またはそのドメインま
たは誘導体は、当該分野で公知の常套の化学的方法により合成されることができ
る（例えば、Hunkapiller et al, Nature 310: 105-111(1984)を参照されたい）
。
【０１１０】 エンドセリアーゼ配列操作は、タンパク質レベルで行われてもよい。エンドセ
リアーゼタンパク質、そのドメイン、翻訳中または翻訳後に、グリコシル化、ア
セチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロッキング基、タンパク質分
解、抗体分子または他の細胞リガンドへの結合などによる誘導化により特異的に
変更された、その誘導体または類似体またはフラグメントも本明細書中に企図さ
れる。多くの化学的変更のいずれも、制限されるものではないが、シアン化ブロ
マイド、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ
４による特異的化学分解、アセチル化、ホルミル化、酸化、還元、ツニカマイシ
ンの存在下での代謝合成などを含む公知方法により行われてよい。
【０１１１】 特定の具体例において、エンドセリアーゼは蛍光標識を含むべく変更される。
他の特定の具体例では、エンドセリアーゼは異なる機能を持つ試薬を保持するべ
く変更されるが、そのような異なる機能を持つ試薬は、複合体のメンバーを架橋
させるべく用いられることができる。
【０１１２】 加えて、エンドセリアーゼのドメイン、類似物および誘導体は、化学的に合成
されることができる。例えば、所望のドメインを含み、またはインビトロで所望
の活性を媒介するエンドセリアーゼの一部に対応するペプチドが、ペプチドシン
セサイザーを用いて合成されることができる。さらに、所望により、標準的でな
いアミノ酸または化学アミノ酸類似物をエンドセリアーゼ配列に、置換体または
付加体として導入することができる。標準的でないアミノ酸には、制限されるも
のではないが、一般的なアミノ酸のＤ−異性体、ａ−アミノイソ酪酸、４−アミ
ノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ε−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６−アミノヘキサ
ン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノ
ルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、シス
テイック酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シ
クロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロアミノ酸、β−メチルアミノ酸
、Ｃａ−メチルアミノ酸、Ｎａ−メチルアミノ酸などの設計アミノ酸およびアミ
ノ酸類似物が一般に含まれる。さらに、アミノ酸はＤ（右旋性）またはＬ（左旋
性）であり得る。
【０１１３】 天然の産物が変異体であることが疑われるか、または新規な種から単離される
場合、天然源から単離されたエンドセリアーゼ、ならびにインビとロで発現され
たもの、またはインビボまたはインビトロで合成発現ベクターから由来したもの
のアミノ酸配列は、ＤＮＡ配列の分析から、または別法として、単離されたタン
パク質を直接配列決定することにより決定されることができる。そのような分析
は、手動操作で配列決定することにより、または自動アミノ酸シークエンサーを
用いることにより行われてよい。
【０１１４】 Ｃ．エンドセリアーゼ遺伝子の同定および単離 所望される遺伝子をコードする核酸の同定のための、当該分野の専門家に公知
のあらゆる方法を用いてよい。当該分野で利用できるいずれの方法を用いても、
エンドセリアーゼをコードしている全長（すなわち、全コーディング領域を含ん
でいる）ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡクローンを得ることができる。特に、ポリ
メラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーにて血
管形成が異常なレベルで起こっている組織で特異的に発現されると認められた配
列、例えばエンドセリアーゼの核酸配列を含む核酸（配列番号１、３、５または
２２）を増幅することができる。同定された配列の３’および５’末端の配列に
ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーをプライマーとして用いて、
ＰＣＲにより、核酸サンプル（ＲＮＡまたはＤＮＡ）、好ましくはｃＤＮＡライ
ブラリーから、適当な源（例えば腫瘍または癌組織）からの配列を増幅すること
ができる。
【０１１５】 ＰＣＲは、例えばPerkin-Elmer CetusサーマルサイクラーおよびＴａｑポリメ
ラーゼ（Gene AmpTM)を用いることにより行うことができる。増幅されるＤＮＡ
には、いずれかの真核生物種由来のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ、またはゲノムＤＮ
Ａを含めることができる。ＰＣＲ反応で使用するために、いくつかの異なる変性
プライマーを合成することを選択することができる。ＰＣＲ反応を開始するのに
用いられるハイブリダイゼーション条件のストリンジェントを変更して、公知の
ヌクレオチド配列と単離された核酸相同物の間の核酸配列類似性の程度をより大
きくするか、またはより小さくすることにより、核酸相同物を増幅することもで
きる（例えば、ヒト以外の種からエンドセリアーゼ配列を得ることができる、ま
たはエンドセリアーゼと相同性を有するヒトの配列を得ることができる）。交雑
種ハイブリダイゼーションのためには、低ストリンジェント条件が好ましい。同
種ハイブリダイゼーションのためには、中程度のストリンジェント条件が好まし
い。同定されたエンドセリアーゼ配列の全部または一部を含んでいる核酸、また
はエンドセリアーゼ相同物の全部または一部をコードしている核酸の増幅が成功
したら、その後、そのセグメントを分子クローニングおよび配列決定し、次いで
それをプローブとして用いて完全なｃＤＮＡまたはゲノムクローンを単離するこ
とができる。これにより、次いで遺伝子の完全な配列の決定、その発現の分析、
および機能分析のためのそのタンパク質生成物の製造が可能となる。核酸配列が
決定されたら、エンドセリアーゼ遺伝子タンパク質産物をコードしているオープ
ンリーディングフレームを、オープンリーディングフレームを決定するための当
業者で周知のいずれかの方法により、例えばヌクレオチド配列分析のための公衆
に利用可能なコンピュータープログラムを用いて決定することができる。オープ
ンリーディングフレームが規定されたら、そのオープンリーディングフレームに
よりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を決定するのが普通である。この方
法にて、全エンドセリアーゼ遺伝子のヌクレオチド配列ならびにエンドセリアー
ゼタンパク質およびその類似体のアミノ酸配列を同定することができる。
【０１１６】 いずれかの真核細胞を、エンドセリアーゼ遺伝子の分子クローニングのための
核酸源として用いることができる。核酸は、脊椎動物、哺乳動物、ヒト、ブタ、
ウシ、ネコ、トリ、ウマ、イヌ、ならびにその他の霊長類源、昆虫、植物などか
ら単離されることができる。ＤＮＡは、クローニングされたＤＮＡ（例えばＤＮ
Ａ「ライブラリー」）から、当該分野で公知の常套法により、化学合成により、
ｃＤＮＡクローニングにより、または所望の細胞から精製されたゲノムＤＮＡま
たはそのフラグメントのクローニングにより得ることができる(例えば、Sambroo
k et al., 1989, Molecular Coning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spri
ng Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Glover, D.M. (
ed.), 1985, DNA cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford,
U.K. Vol. I, II)。ゲノムＤＮＡから誘導されたクローンは、コーディング領域
に加えて調節およびイントロンＤＮＡ領域を含み得、ｃＤＮＡから誘導されたク
ローンはエキソン配列のみを含む。源が何であっても、遺伝子は、遺伝子の伝達
に適したベクター中に分子クローニングされるべきである。
【０１１７】 ゲノムＤＮＡからの遺伝子の分子クローニングで、ＤＮＡフラグメントが生じ
、そのいくらかは所望の遺伝子をコードする。ＤＮＡは種々の制限酵素を用いて
特定部位で切断されてよい。別法として、マンガンの存在下でＤＭＡｓｅを用い
てＤＮＡを断片化してよく、またはＤＮＡは例えば超音波処理により物理的に切
断することができる。次いで線状のＤＮＡフラグメントを、制限されるものでは
ないが、アガロースおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動およびカラムクロマ
トグラフィーを含む常套法によりサイズによって分離することができる。
【０１１８】 ＤＮＡフラグメントが生じたら、所望される遺伝子を含む特定のＤＮＡフラグ
メントの単離は、多くの方法で行うことができる。例えば、（いずれかの種の）
エンドセリアーゼ遺伝子の一部（例えば、前記のように得られたＰＣＲ増幅産物
または公知ヌクレオチド配列の一部の配列を有するオリゴヌクレオチド）または
その特定ＲＮＡ、または精製および標識されたそのフラグメント、および生じた
ＤＮＡフラグメントを、標識されたプローブに対する核酸ハイブリダイゼーショ
ンによりスクリーニングすることができる(Benton and Davis, Science 196: 18
0 (1977); Grunstein and Hogness, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72: 3961(
1975))。プローブに対して実質上相同性を有するＤＮＡフラグメントがハイブリ
ダイズする。適当なフラグメントを、制限酵素消化および、公知の制限酵素マッ
プが入手可能であればそれに従って期待されるサイズとのフラグメントサイズの
比較により、またはＤＮＡ配列分析およびエンドセリアーゼの公知ヌクレオチド
配列との比較により同定することもできる。さらなる選択を、遺伝子の特性に基
づいて行うことができる。別法として、遺伝子の存在は、その発現された産物の
物理的、化学的、または免疫学的特性に基づくアッセイにより検出されることが
できる。例えば、例えばエンドセリアーゼに関して知られるものと類似もしくは
同一の電気泳動移動度、等電点電気泳動での反応、タンパク質分解消化マップ、
抗原特性、セリンプロテアーゼ活性または血管形成を促進する能力を有するタン
パク質を生成する、適当なｍＲＮＡをハイブリッド選択するｃＤＮＡクローンま
たはＤＮＡクローンが選択され得る。抗−エンドセリアーゼ抗体が利用できる場
合、タンパク質は、推定エンドセリアーゼ合成クローンに対する標識抗体を結合
することにより、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）タイプの方法で同定
されることができる。
【０１１９】 エンドセリアーゼゲノムＤＮＡを単離する別法には、制限されるのものではな
いが、公知配列から遺伝子配列を化学的に合成すること、エンドセリアーゼタン
パク質をコードするｍＲＮＡに対してｃＤＮＡを作成することが含まれる。例え
ば、エンドセリアーゼ遺伝子のｃＤＮＡクローニングのためのＲＮＡを、タンパ
ク質を発現している細胞から単離することができる。同定および単離された核酸
は、適当なクローニングベクターに次いで挿入されることができる。当該分野で
公知の多数のベクター−宿主系を用いることができる。用いることができるベク
ターには、制限されるものではないが、プラスミドまたは変更ウイルスが含まれ
るが、ベクター系は、用いられる宿主細胞と和合可能なものでなければならない
。そのようなベクターには、制限されるものではないが、ラムダ誘導体などのバ
クテリオファージ、またはｐＢＲ３２２またはｐＵＣプラスミド誘導体、または
ブルースクリプトベクター(Stratagene, La Jolla, CA)などのプラスミドが含ま
れる。クローニングベクターへの挿入は、例えばＤＮＡフラグメントを相補的付
着末端を持つクローニングベクターに結合させることにより行われることができ
る。しかし、ＤＮＡを断片化するのに用いられる相補的な制限酵素部位がクロー
ニングベクター中に存在しない場合、ＤＮＡ分子の末端を酵素変性することがで
きる。別法として、所望されるいずれの部位も、核酸配列（リンカー）をＤＮＡ
末端に結合させることにより生成することができ、これら結合されたリンカーは
、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードしている特定の化学合成されたオリ
ゴヌクレオチドを含んでよい。別法において、切断されたベクターとエンドセリ
アーゼ遺伝子を、ホモポリマー化テーリングにより修飾してよい。組換え分子は
宿主細胞に、遺伝子配列の多くのコピーが生じるように、形質転換、形質移入、
感染、エレクトロポーレーションなどにより導入されることができる。
【０１２０】 別法において、所望される遺伝子は、「ショットガン」法にて適当なクローニ
ングベクターに挿入した後、同定および単離されることができる。所望される遺
伝子の、例えばサイズフラクショネーションによる濃縮は、クローニングベクタ
ーへの挿入前に行うことができる。 特定の具体例では、単離されたエンドセリアーゼ遺伝子、ｃＤＮＡまたは合成
されたＤＮＡ配列を組み込む組換えＤＮＡ分子での宿主細胞の形質移入により、
遺伝子の複数のコピーを得ることができる。つまり、形質転換体を生育させ、形
質転換体から組換えＤＮＡ分子を単離し、必要な場合は挿入された遺伝子を単離
された組換えＤＮＡから回収することにより、遺伝子を大量に得ることができる
。
【０１２１】 Ｄ．スクリーニング法 １．エンドセリアーゼの活性を調節する化合物のスクリーニング法 エンドセリアーゼ、特にそのプロテアーゼドメインと結合または相互作用する
化合物を同定するための方法が提供される。同定される化合物は、腫瘍および他
の疾患、および異常な血管形成に伴う疾患の治療のための化合物を同定するため
の候補またはリード化合物である。本方法に用いられるエンドセリアーゼには、
本明細書に定義したいずれかのエンドセリアーゼおよび好ましくは本明細書に提
供されるエンドセリアーゼ１および２、および好ましくはそのプロテアーゼドメ
インが含まれる。種々の方法が本明細書中に提供される。これらの方法は、溶液
中で、またはリンカーを介して固体支持体にエンドセリアーゼまたはそのプロテ
アーゼドメインを直接または間接的に結合させた固相反応物において行ってよい
。スクリーニングアッセイは実施例に記載され、これらのアッセイを用いて候補
化合物を同定された。
【０１２２】 一方法には、(ａ)エンドセリアーゼまたはそのプロテアーゼドメインを１また
は複数の試験化合物と、リガンドと化合物間の相互作用に資する条件下で接触さ
せること、および、(ｂ)リガンドに特異的に結合する１またはそれ以上の化合物
を多く同定することが含まれる。
【０１２３】 本明細書に提供される他の方法には、ａ）エンドセリアーゼまたはそのプロテ
アーゼドメインをエンドセリアーゼの基質と接触させ、次いで、基質のタンパク
質切断を検出し、それによりエンドセリアーゼの活性を評価すること、ｂ）エン
ドセリアーゼをエンドセリアーゼの基質と、試験物質の存在下で接触させ、次い
で基質のタンパク質切断を検出し、それによりエンドセリアーゼの活性を評価す
ること、およびｃ）ステップａ）およびｂ）で評価されたエンドセリアーゼの活
性を比較することが含まれ、ここで、ステップａ）で測定された活性がステップ
ｂ）で測定された活性と異なることは、試験物質がエンドセリアーゼの活性を変
化させることを示す。
【０１２４】 他の具体例では、複数の試験物質が前記スクリーニング法で同時にスクリーニ
ングされる。他の具体例では、スクリーニングされるべきエンドセリアーゼは、
標的細胞から単離される。他の具体例では、試験物質は治療用化合物であり、試
験物質の存在下または不在下で測定されたエンドセリアーゼ活性の違いが、標的
細胞が治療用化合物に反応することを示す。
【０１２５】 試験物質がエンドセリアーゼのモジュレーターであるかどうかを評価するため
に試験物質の存在下および不在下でエンドセリアーゼの活性を比較することに関
して、活性を対比アッセイすることは必要ではないが、そのような対比測定が好
ましい。エンドセリアーゼの活性を１時点で測定し、次いで、測定された活性を
エンドセリアーゼの活性の歴史的な値に対して比較することができる。例えば、
試験物質の存在下でエンドセリアーゼの活性を測定し、次いで、試験物質の不在
下、および存在下でこれまでに測定されたエンドセリアーゼの活性の歴史的な値
と比較することができる。これは、例えば、アッセイを行うためのキットを用い
て提供されたインサートまたはパンフレットにエンドセリアーゼの活性を示すこ
とにより行うことができる。
【０１２６】 好ましくは、スクリーニングされるべきエンドセリアーゼは標的細胞から単離
される。より好ましくは、スクリーニングされるべき試験物質は治療用化合物で
あり、それにより、試験物質の存在下または不在下で測定されたエンドセリアー
ゼの違いが、標的細胞が試験物質に反応するかどうかを示す。 組み合わせ、およびアッセイを行うための説明書を含む組み合わせ含有キット
が提供される。組み合わせには、エンドセリアーゼおよびアッセイされるべきエ
ンドセリアーゼの基質、および任意に基質のタンパク質切断を検出するための試
薬が含まれる。特定のエンドセリアーゼによるタンパク質切断の影響を受ける典
型的なタンパク質である基質は、エンドセリアーゼが試験基質を切断する能力を
試験することにより経験的に同定されることができる。最も有効に（すなわち、
最低濃度および／または最も速い速度または所望される条件下で）切断される基
質が同定される。
【０１２７】 さらに、前記の組み合わせを含むキットが本明細書中に提供される。好ましく
は、キットには、エンドセリアーゼの活性のモジュレーターを同定するための説
明書が含まれる。いずれかのエンドセリアーゼが、その活性のモジュレーターを
同定するための標的として企図される。 スクリーニングアッセイを行うことに関して種々のフォーマットおよび検出プ
ロトコルが公知である。いずれかのそのようなフォーマットおよびプロトコルを
エンドセリアーゼの活性のモジュレーターを同定するのに適用してよい。以下に
、典型的プロトコルの考察を含める。
【０１２８】 １．高処理量スクリーニングアッセイ 前記アッセイは、単一のエンドセリアーゼがスクリーニングされる場合、およ
び／または単一の試験物質が一のアッセイでスクリーニングされる場合に行うこ
とができるが、アッセイは、好ましくは高処理量スクリーニング様式で行われ、
こうして、複数のエンドセリアーゼが、および／または複数の試験物質が同時に
スクリーニングされる(一般的に、High Throughput Screening: The Discovery
of Bioactive Substances(Devlin, Ed.) Marcel Dekker, 1997; Sittampalam et
al., Curr. Opin. Chem. Biol., 1(3): 384-918 (1997); and Silverman et al
., Curr. Opin. Chem. Biol., 2(3): 397-403(1998)を参照されたい）。例えば
アッセイは、マルチ−ウェル(例えば、２４−、４８−、９６−、または３８４
−ウェル）、チップまたはアレイフォーマットで行うことができる。
【０１２９】 高処理量スクリーニング（ＴＨＳ）は、多数の異なる化学構造を疾患標的に対
して試験して、「ヒット」するものを同定する方法である(Sittampalam et al.,
Curr. Opin. Chem. Biol., 1(3): 384-91(1997))。当該分野で最新のＨＴＳ操
作は高度に自動化されており、サンプル調製、アッセイ工程および大量のデータ
のその後の加工を行うことがコンピューター化されている。
【０１３０】 高処理量スクリーニングで用いられる検出法は、調べられる生化学経路のタイ
プに依存する(Sittampalam et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 1(3): 384-91(1
997))。これらの方法には、種々の酵素アッセイに用いられることができるシン
チレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）などの放射能化学法(Lerner et al., J. B
iomol. Screening, 1: 135-143(1996); Baker et al., Anal. Biochem. 239: 20
-24(1996); Baum et al., Anal. Biochem., 237: 129-134 (1996); and Sulliva
n et al., J. Biomol. Screening, 2: 19-23(1997))およびタンパク質−タンパ
ク質相互作用アッセイ(Braunwalder et al., J. Biomol. Screening, 1: 23-26(
1996); Sonatore et al., Anal. Biochem., 240: 289-297(1996); and Chen et
al., J. Viol. CHem. 271: 25308-2531581996))、および制限されるものではな
いが、比色および発光検出法、共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）法、時間決定蛍光
（ＨＴＲＦ）法、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）法(例えば、Gonzalez et
al., Biophys. J., 69: 1272-1280(1995)を参照されたい）などの細胞に基づく
蛍光アッセイ、蛍光分極または異方性法（例えば、Jameson et al., Methods En
zymol., 246: 283-300(1995); Jolley, J. Biomol, Screening, 1: 33-38(1996)
; Lynch et al., Anal. Biochem., 247: 77-82(1997))、蛍光対比分光化学（Ｇ
ＣＳ）などを含む非アイソトープ度検出法および他のそのような方法が含まれる
。
【０１３１】 ２．試験物質 小分子およびライブリーおよびそのコレクションを含む試験化合物を、前記ア
ッセイおよびエンドセリアーゼの活性を調節する化合物を同定するために以下に
記載するアッセイにてスクリーニングすることができる。コンピューター化学に
よる合理的な薬物設計方法を用いて候補化合物をスクリーニングおよび同定する
ことができる。 該スクリーニング法により同定される化合物には、アンタゴニストを含む阻害
物質が含まれ、アゴニストであってもよい。スクリーニングのための化合物は、
入手可能な公知の、または調製可能ないずれかの化合物および化合物のコレクシ
ョンである。
【０１３２】 ａ．化合物の選択 化合物は、セリンプロテアーゼ、特にエンドセリアーゼの阻害に関するその能
力および選択性に関して選択することができる。本明細書に記載されるように、
および一般に公知のように、標的セリンプロテアーゼとその基質は、プロテアー
ゼとその基質との反応を許容するアッセイ条件下で結合される。アッセイは試験
化合物の不在下で、および試験化合物の存在下でその濃度を増しながら行われる
。セリンプロテアーゼの活性の５０％が試験化合物により阻害される試験化合物
濃度が、該化合物のＩＣ５０値（阻害濃度）またはＥＣ５０（有効濃度）値であ
る。試験化合物のシリーズまたはグループの中で、ＩＣ５０またはＥＣ５０値が
低いものほど、ＩＣ５０またはＥＣ５０値がより高い化合物よりもセリンプロテ
アーゼのより強力な阻害物質であると考えられる。ＩＣ５０の測定はより単純化
されたアッセイで用いられることが多く、一方、ＥＣ５０は細胞を用いるものな
ど、より複雑なアッセイで用いられることが多い。
【０１３３】 この態様による好ましい化合物は、エンドセリアーゼ活性の阻害に関するイン
ビトロアッセイで測定されるような、１００ｎＭまたはそれ未満のＩＣ５０値を
有する。特に好ましい化合物は、１００ｎＭ未満のＩＣ５０値を有する。 試験化合物を、セリンプロテアーゼに対するその選択性に関してさらに評価す
る。本明細書に記載されるように、および一般に公知のように、試験化合物はセ
リンプロテアーゼおよび他の酵素のパネルに対するその効能に関してアッセイさ
れ、ＩＣ５０値またはＥＣ５０値は、各アッセイ系における各試験化合物に関し
て決定される。標的酵素、例えばエンドセリアーゼに関して低いＩＣ５０値また
はＥＣ５０値を示し、そして、試験パネル（例えば、ウロキナーゼ組織プラスミ
ノゲン活性化因子、トロンビン、Ｘａ因子）中の他の酵素に関して高いＩＣ５０ 値またはＥＣ５０値を示す化合物が、標的酵素に対して選択的であると考えられ
る。一般に、標的酵素アッセイにおいてそのＩＣ５０値またはＥＣ５０値が、酵
素の選択的パネルにおいて測定される二番目に低いＩＣ５０またはＥＣ５０値未
満の等級の少なくとも１オーダーである場合に、酵素は選択的であると考えられ
る。
【０１３４】 現在好ましい化合物は、ウロキナーゼ活性の阻害に関するインビトロアッセイ
で測定される１００ｎＭまたはそれ未満のＩＣ５０値を有する。特に好ましい化
合物は、インビトロｔＰＡ阻害アッセイで測定されるＩＣ５０値より低い等級の
少なくとも一オーダーである、インビトロウロキナーゼ阻害アッセイにおけるＩ
Ｃ５０値を有する。１００以上のＩＣ５０ｕ−ＰＡアッセイ：ＩＣ５０エンドセ
リアーゼアッセイの選択比を有する化合物が特に好ましい。 化合物を、インビボにおけるその活性に関してさらに評価する。試験化合物の
評価のために選択されるアッセイのタイプは、化合物の使用により治療または予
防される病的症状、ならびに試験化合物に関して評価される投与経路に依存する
。
【０１３５】 例えば、エンドセリアーゼの阻害により腫瘍の生育を減じる化合物の活性を評
価するために、Jankun et al., Canc. Res. 57: 559-563(1997)により開示され
る、ＰＡＩ−１を評価するための方法を用いることができる。簡単には、ＡＴＣ
Ｃ細胞系統ＤＵ１４５およびＬｎＣａＰをＳＣＩＤマウスに注射する。腫瘍が確
立された後、化合物のインビトロ特性から決定される投与法に従い、マウスに試
験化合物を投与する。Jankunらは、化合物を水中に投与した。腫瘍体積の測定は
、週に２回、約５週間行う。化合物が投与された動物で、適当な対照化合物を投
与された動物と比較して腫瘍体積が低下した場合に、化合物は活性であると考え
られる。 ブタのプロテアーゼ阻害物質であるｐ−アミノベンズアミジンの、腫瘍体積を
減じることにおける効果を評価するために設計された他のインビボ実験モデルが
、Billstrom et al., Int. J. Cancer, 61: 542-547(1995)により記載されてい
る。
【０１３６】 化合物が腫瘍転移の発症を減じる、またはそれを阻害する能力を評価するため
に、Kobayashi et al., Int. J. Canc. 57: 727-733d (1994)により記載される
方法を用いることができる。簡単には、高い肺のコロニー形成能力に関して選択
されたムレイン異種移植片を、Ｃ５７Ｂ１／６マウスに静脈注射（実験的癌転移
）または皮下注射にて腹腔壁に注射する（自発性癌転移）。試験されるべき種々
の濃度の化合物を注射前に基質ゲル中で腫瘍細胞と混合することができる。試験
化合物の毎日のｉ．ｐ．注射は、腫瘍接種１−６日後または７−１３日後のいず
れかで行う。動物は腫瘍接種の約３または４週間後に屠殺し、肺の腫瘍コロニー
を数える。得られたデータを評価することにより、試験化合物の効力、最適投与
量および投与経路を決定することが可能となる。
【０１３７】 腫瘍体積および腫瘍転移を減じることに対する試験化合物の活性は、その阻害
物質を評価するためのRabbani et al., Int. J. Cancer 63: 840-845(1995)に記
載されるモデルにて評価することができる。そこでは、Mat LyLu腫瘍細胞が、コ
ペンハーゲンラットの脇腹に注射された。動物に浸透ミニポンプを差し込み、種
々の投与量の試験化合物を３週間まで継続的に投与した。実験動物および対照動
物の腫瘍質量および容積を、実験中に、転移腫瘍の成長として評価した。生じた
データを評価することにより、試験化合物の効力、最適投与量、および投与経路
を決定することが可能となる。これらの著者らの幾人かが、Xing et al., Canc.
Res., 57: 3585-3595(1997)に関連プロトコルを記載している。
【０１３８】 新血管形成に対する化合物の阻害活性を評価するために、ウサギの角膜新血管
形成モデルを用いることができる。Avery et al., Arch. Ophthalmol., 108: 14
74-1475(1990)には、ニュージーランドアルビノウサギを麻酔すること、および
次いで中央角膜切開を行い、次いで放射線角膜ポケットを形成することが記載さ
れている。徐放性プロスタグランジンペレットをポケットに入れ、新血管形成を
誘導した。試験化合物を５日間、腹腔に投与し、５日目に動物を屠殺した。試験
化合物の効果は、新血管形成反応の領域を算定するために用いることができる、
角膜縁を撮影した定期的撮影写真を再検討することにより評価される。適当な対
照と比較して新血管形成が少ない領域は、試験化合物が新血管形成を低下させる
、または阻害させるのに有効であったことを示す。
【０１３９】 血管形成の予防における試験化合物の効果を評価するために用いられた血管形
成モデルは、Min et al., Canc. Res., 56:2428-2433(1996)に記載されている。
Ｃ５７ＢＬ６マウスに、血管形成誘導剤としてｂＦＧＦを含む基質ゲル混合物を
、試験化合物と共に、およびそれを加えずに皮下注射する。５日後、動物を屠殺
し、新血管形成を認めることができる基質ゲルプラグを撮影する。基質ゲルおよ
び有効投与量の試験化合物を投与された実験動物は、対照動物または有効投与量
未満の、または非有効投与量の試験化合物を投与された実験動物よりも血管形成
の程度が低い。
【０１４０】 試験化合物の初期腫瘍の拡大を抑制する能力に関してその試験化合物に対して
設計されたインビボ系は、Crowley et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90: 5021
-5025(1993)に記載されている。ヌードマウスに、遺伝子操作された腫瘍細胞（
ＰＣ３）を注射して、ＣＡＴ（クロラムフェニコール アセチルトランスフェラ
ーゼ）を発現させる。腫瘍サイズおよび／または転移を減じる化合物の能力を試
験するための化合物を動物に投与し、腫瘍サイズおよび／または転移成長に関す
る測定を次いで行う。次いで、種々の器官で検出されたＣＡＴのレベルを、試験
化合物が転移を阻害する能力を示すものとしてとして提供し、処置された動物の
組織における、対照動物に対してＣＡＴが低いことが検出されると、それはその
組織に移植されたＣＡＴを発現している細胞が少ないことを示す。
【０１４１】 試験セリンプロテアーゼ阻害物質の阻害能力を評価するために設計された、高
度に侵襲性の腫瘍細胞系Ｆ３１１を用いるインビボ実験様式が、Alonso et al.,
Breast Canc. Res. Treat., 40: 209-223(1996)に記載されている。このグルー
プは、毒性決定、腫瘍の成長、侵襲性、自発性転移、実験的肺転移および血管形
成アッセイに関するインビボ研究を記載している。
【０１４２】 L. Ossowski(J. Cell Biol., 107:2437-2445 (1988))により１９８８年に初め
に記載されたＣＡＭモデル（ニワトリ胎児漿尿膜モデル）により、試験化合物の
ウロキナーゼ阻害活性を評価するためのもう一つの方法が提供される。ＣＡＭモ
デルでは、腫瘍細胞はＣＡＭを含む漿尿膜を通して侵襲し、腫瘍細胞はいくつか
のセリンプロテアーゼ阻害物質の存在下で膜を貫通する腫瘍細胞の侵入を減らす
か、またはなくす。こうして、ＣＡＭアッセイを、種々の濃度の試験化合物の存
在下および不在下でＣＡＭおよび腫瘍細胞を用いて行う。腫瘍細胞の侵襲性は、
化合物の阻害活性を示すような条件下で測定される。阻害活性を有する化合物は
、腫瘍の侵襲の低下と関連する。
【０１４３】 ＣＡＭモデルは、血管形成（即ち、新血管の形成における効果）に関する常套
のアッセイにも用いられる(Brooks et al., Methods in Molecular Biology, 12
9: 257-269(1999))。このモデルに従い、血管形成誘導物質、例えば塩基性繊維
目細胞成長因子（ｂＦＤＧ）などをＣＡＭに与える。サイトカインがＣＡＭに拡
散すると局所的血管形成が誘導され、これは、フィルターディスクのすぐ下のＣ
ＡＭ内の血管分枝点の数を数えることによるなどの種々の方法で測定することが
できる。同定される化合物がサイトカイン誘導性の血管形成を阻害する能力は、
このモデルを用いて試験することができる。試験化合物は、血管形成誘導物質を
含むフィルターディスクに添加される、直接膜上に置かれる、または全身投与さ
れるかすることができる。試験化合物の存在下および／または不在下での新血管
形成の程度を、このモデルを用いて比較することができる。試験化合物の存在下
で新血管の形成が少ないことは、抗血管形成活性の指標である。エンドセリアー
ゼの阻害物質に関する抗血管形成活性は、エンドセリアーゼが血管形成に重要な
役割を果たすことを示す。
【０１４４】 ｂ.公知セリンプロテアーゼ阻害物質 スクリーニングのための化合物は、セリンプロテアーゼ阻害物質であり、これ
を、配列番号１に示すヌクレオチド配列を有するＤＮＡにハイブリダイズする核
酸により少なくとも部分的にコードされるエンドセリアーゼの活性を阻害するそ
の能力に関して試験することができる。 典型的な、しかし制限するものではないセリンプロテアーゼは、スクリーニン
グアッセイに用いられる以下の公知セリンプロテアーゼ阻害物質である。セリン
プロテアーゼ阻害物質３（ＳＰＩ−３）(Chen, M.C., et al., Citokine, 11(11
): 856-862(1999));アプロチニン(Iijima, R. et al., J. Biochem. (Tokyo), 1
26(5): 912-916(1999)); カザル型セリンプロテアーゼ阻害物質様タンパク質(Ni
imi, T., et al., Eur. J. Biochem., 266(1): 282-292(1999)); クニッツ型セ
リンプロテアーゼ阻害物質(Ravichandran, S., et al., Acta Crystallogr. D.
Biol. Crystallogr. 55(11): 1814-1821(1999)); 組織因子経路阻害物質２/マト
リックス関連セリンプロテアーゼ阻害物質(TFPI-2/MSPI)、(Liu, Y., et al., A
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(Nafmostat mesilate)(Ryo, R., et al., Vox Sang., 76(4):241-6 (1999)); TP
CK (Huang, Y., et al., Oncogene, 18(23):3431-9 (1999)); 合成綿−結合セリ
ンプロテアーゼ阻害物質(Edwards, J.V., et al., Wound Repair Regen., 7(2):
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阻害物質ＯＫＹ−０４６の組み合わせ(Kaminogo, M., et al., Neurol. Med. Ch
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【０１４５】 Ｃ．コンビナトリアルライブラリーおよび他のライブラリー スクリーニングアッセイのための化合物の源は、制限されるものではないが、
コンビナトリアルライブラリーを含むライブラリーであり得る。コンビナトリア
ルライブラリーを合成するための方法およびそのようなコンビナトリアルライブ
ラリーの特徴は、当該分野で公知である（一般に、コンビナトリアルライブラリ
ー: 合成、スクリーニングおよび適用の可能性(Cortese Ed.) Walter de Gruyte
r, Inc., 1995; Tietze and Lieb, Curr. Opin. Chem. Biol., 2(3):363-71 (19
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echnol. Prog., 12(6):729-43 (1996)を参照されたい）。
【０１４６】 異なるライブライリー、主にペプチドおよびヌクレオチドに基づくオリゴマー
ライブラリーを作成するための方法および戦略は、分子生物学法および／または
同時化学合成法（Dower et al., Annu. Rep. Med. Chem., 26:271-280 (1991);
Fodor et al., Science, 251:767-773 (1991); Jung et al., Angew. Chem. Ind
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d. Sci. USA, 87:6378-6382 (1990); and Gallop et al., J. Medicinal Chemis
try, 37:1233-1251 (1994)を参照されたい）を用いて開発されている。生じたコ
ンビナトリアルライブラリーは潜在的に数百万の化合物を含み、選択される活性
を示す化合物を同定するのにスクリーニングすることができる。
【０１４７】 ライブラリーは、大体３つのカテゴリーに入る。ランダムペプチドまたはタン
パク質が、ファージ粒子の表面またはプラスミドから発現されたタンパク質の表
面に提示される融合タンパク質提示性ペプチドライブラリー；個々の化合物また
は化合物の混合物が樹脂ビーズ（例えば、Lam et al., Nature, 354:82-84 (199
1)を参照されたい）および綿の支持体（例えばEichler et al., Biochemistry 3
2:11035-11041 (1993)を参照されたい）などの不溶性基質上に示される支持体結
合合成化学ライブラリー、および化合物が溶液中で用いられる方法（例えば、Ho
ughten et al., Nature, 354:84-86 (1991); Houghten et al., BioTechniques,
313:412-421 (1992); and Scott et al., Curr. Opin. Biotechnol., 5:40-48
(1994)を参照されたい）。合成ペプチドおよびオリゴヌクレオチドコンビナトリ
アルライブラリーに関する多くの例があり、非ペプチド性小有機分子を含むライ
ブラリーを作成するための多くの方法が存在する。そのようなライブラリーは、
組み合わされて異なる有機分子を形成するモノマーの基礎的セット、または組み
合わされて選択されたファルマコフォアモノマーに基づくライブラリーを形成す
ることができるモノマーの基礎的セットに基づくことができる。
【０１４８】 ランダムまたは決定コンビナトリアルライブラリーのいずれかを、ここに開示
した、および／または権利主張されるスクリーニング法によりスクリーニングす
ることができる。これらの２つのライブラリーのいずれかにおいて、ライブラリ
ーの各ユニットは別々であり、および／または固体支持体に固定される。決定ラ
イブラリーでは、各固体支持体上の特定のユニットの位置は演繹的に分かる。ラ
ンダムライブラリーでは、特定ユニットの位置は、各部位は単一のユニークなユ
ニットを含むが、演繹的には分からない。ライブラリーを調製するための多くの
方法が当該分野の専門家に公知である（例えば、Geysen et al., Proc. Natl. A
cad. Sci. USA, 81:3998-4002 (1984), Houghten et al., Proc. Natl. Acad. S
ci. USA, 81:5131-5135 (1985)を参照されたい）。
【０１４９】 当該分野の専門家に公知のいずれかの方法により作成されたコンビナトリアル
ライブラリーがスクリーニングのために企図される（例えば、Table 1 of Schul
tz and Schultz, Biotechnol. Prog., 12(6):729-43 (1996)) for screening; B
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otic Synthesis, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89:4505-4509 (1992)を参照
されたい）。
【０１５０】 例えば、エンドセリアーゼまたはエンドセリアーゼのプロテアーゼドメインに
結合するペプチドは、ファージ提示ライブラリーを用いて同定することができる
。典型的な具体例では、この方法には、ａ）ファージライブラリーからのファー
ジをエンドセリアーゼタンパク質またはそのプロテアーゼドメインと接触させる
こと、（ｂ）タンパク質に結合したファージを単離すること；および（ｃ）単離
されたファージによりコードされる少なくとも一つのペプチドの同一性を決定し
、エンドセリアーゼに結合するペプチドを同定することを含むことができる。
【０１５１】 Ｅ．エンドセリアーゼの活性のモジュレーター 本明細書中、スクリーニングにより同定されるまたは他のスクリーニング法に
おいてエンドセリアーゼまたはプロテアーゼドメインを用いて作成される化合物
が提供される。これらの化合物は、エンドセリアーゼと直接接触させることによ
り、またはその転写または翻訳を変更することにより作用する。そのような分子
には、制限されるものではないが、エンドセリアーゼと、特にそのプロテアーゼ
ドメインと特異的に反応する抗体、エンドセリアーゼの発現を変化させるアンチ
センス核酸、抗体、ペプチドミメティクス、および他のような分子が含まれる。
【０１５２】 １．抗体 本明細書中、エンドセリアーゼ、好ましくはエンドセリアーゼタンパク質のプ
ロテアーゼドメインに特異的に結合する抗体が提供される。好ましくは、抗体は
モノクローナル抗体であり、および好ましくは、抗体は、エンドセリアーゼタン
パク質のプロテアーゼドメインに免疫特異的に結合する。特定の具体例では、エ
ンドセリアーゼ１のプロテアーゼドメインに対する抗体が提供される。エンドセ
リアーゼ２およびそのプロテアーゼドメインに対する抗体も提供される。
【０１５３】 エンドセリアーゼタンパク質およびドメイン、そのフラグメント、ホモログお
よびその誘導体を免疫原として用いて、そのような免疫原に特異的に結合する抗
体を作成することができる。そのような抗体には、制限されるものではないが、
ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、Ｆａｂフラグメント、およ
びＦａｂ発現ライブラリーが含まれる。特定の具体例では、ヒトのエンドセリア
ーゼに対する抗体が作成される。他の具体例では、エンドセリアーゼのフラグメ
ントから形成され、フラグメントがセリンプロテアーゼドメインを含む複合体が
、抗体産生のための免疫原として用いられる。
【０１５４】 当該分野で公知の種々の方法を、エンドセリアーゼタンパク質、そのドメイン
、誘導体、フラグメントまたは類似体に対するポリクローナル抗体の産生に用い
てよい。抗体の産生に関して、種々の宿主動物をネイティブなエンドセリアーゼ
タンパク質またはその合成体、または前記誘導体、例えば架橋結合エンドセリア
ーゼなどを用いる注射により免疫化することができる。そのような宿主動物には
、制限されるものではないが、ウサギ、マウス、ラットなどが含まれる。宿主種
により種々のアジュバントを用いて、免疫反応を増すことができ、それらには、
制限されるものではないが、Freund's(完全および不完全）、水酸化アルミニウ
ムなどの鉱物ゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プロロニックポリオール
、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、ジニトロフェノール、および
カルメット−ゲラン菌（ＢＣＧ）およびコリネバクテリアパルバムなどの潜在的
に有用なヒトアジュバントが含まれる。
【０１５５】 エンドセリアーゼまたはそのドメイン、誘導体、フラグメントまたは類似体に
対して指向されるモノクローナル抗体の調製のために、培地中の継代細胞系統に
より抗体分子の産生を提供するいずれかの方法を用いてよい。そのような方法に
は、制限されるものではないが、Kohler and Milstein(Nature 256:495-497 (19
75))により初めて開発されたハイブリドーマ法、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイ
ブリドーマ法（Kozbor et al., Immunology Today 4:72 (1983)）およびヒトモ
ノクローナル抗体を産生するためのハイブリドーマ法（Cole et al., in Monocl
onal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 (1985)
）が含まれる。さらなる具体例では、モノクローナル抗体は、最近の技術を用い
て無菌動物にて産生することができる（ＰＣＴ／ＵＳ９０／０２５４５）。ヒト
抗体を用いてよく、これはヒトハイブリドーマを用いることにより（Cote et al
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をインビトロでＥＢＶウイルスで形質転換することにより（Cole et al., in Mo
noclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 (1
985)）得ることができる。「キメラ抗体」（Morrison et al., Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 81:6851-6855 (1984); Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1
984); Takeda et al., Nature 314:452-454 (1985)）の産生のために開発された
、エンドセリアーゼタンパク質に特異的なマウス抗体分子由来の遺伝子を、適当
な生物活性を持つヒト抗体分子由来の遺伝子でスプライシングすることによる方
法（Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984); Neu
berger et al., Nature 312:604-608 (1984); Takeda et al., Nature 314:452-
454 (1985)）を用いることができる。
【０１５６】 一本鎖抗体の産生のために記載された方法（Ｕ．Ｓ．特許４,９４６,７７８）
を用いて、エンドセリアーゼ特異的一本鎖抗体を産生することができる。さらな
る具体例は、エンドセリアーゼまたはエンドセリアーゼドメイン、その誘導体ま
たは類似体に対して所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの
迅速かつ容易な同定を可能とするＦａｂ発現ライブラリーの構築物に関して記載
された方法（Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989)）を用いるものであ
る。ヒト以外の抗体を、公知方法を用いて「ヒト化」することができる（例えば
、Ｕ．Ｓ．特許第５,２２５,５３９を参照されたい）。
【０１５７】 エンドセリアーゼの遺伝子型を含む抗体フラグメントを、当該分野で公知の技
術により作成することができる。例えば、そのようなフラグメントには、制限さ
れるものではないが、抗体分子のペプシン消化により作成されるＦ(ａｂ')２フ
ラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド結合を還元することに
より作成されることができるＦａｂ’フラグメント、抗体分子をパパインおよび
還元剤で処理することにより作成することができるＦａｂフラグメント、および
Ｆｖフラグメントが含まれる。
【０１５８】 抗体の産生において、所望の抗体のスクリーニングは、例えばＥＬＩＳＡ（酵
素結合免疫吸着アッセイ）などの当該分野で公知の技術により行うことができる
。エンドセリアーゼの特定ドメインに特異的な抗体を選択するために、そのよう
なドメインを含むエンドセリアーゼのフラグメントに結合する生成物のために作
成されたハイブリドーマをアッセイすることができる。
【０１５９】 前記抗体を、例えば診断法などにおいてこれらのタンパク質を画像処理し、適
当な生理サンプルにおけるそのレベルを測定するための、エンドセリアーゼタン
パク質の同定および／または定量に関連する当該分野で公知の方法に用いること
ができる。 他の具体例では、（前記を参照されたい）抗エンドセリアーゼ抗体、または結
合ドメインを含むそのフラグメントが治療薬として用いられる。
【０１６０】 ２．ペプチドおよびペプチドミメティクス 本明細書中、エンドセリアーゼに結合し、その活性を調節する分子を同定する
ための方法が提供される。エンドセリアーゼに結合する分子の中には、ペプチド
およびペプチドミメティクスが含まれる。ペプチドミメティクスは、標的分子、
例えばエンドセリアーゼなどへの特異的結合に必要なリガンドまたはポリペプチ
ドの分子組成を擬似する分子または化合物である。典型的な具体例では、ペプチ
ドまたはペプチドミメティクスはエンドセリアーゼのプロテアーゼドメインに結
合する。そのようなペプチドおよびペプチドミメティクスには、エンドセリアー
ゼに特異的に結合する、および好ましくはエンドセリアーゼのプロテアーゼドメ
インに特異的に結合する抗体のものが含まれる。本明細書に提供される方法によ
り同定されるペプチドおよびペプチドミメティクスは、エンドセリアーゼのアゴ
ニストまたはアンタゴニストであり得る。
【０１６１】 そのようなペプチドおよびペプチドミメティクスは、哺乳動物におけるエンド
セリアーゼの活性に関連する病気または疾患を診断する、治療する、予防する、
およびスクリーニングするのに有用である。加えて、該ペプチドおよびペプチド
ミメティクスは、エンドセリアーゼの活性を調節する、またはエンドセリアーゼ
またはエンドセリアーゼのプロテアーゼドメインに特異的に結合する分子または
化合物を同定、単離、および精製するのに有用である。低分子量のペプチドおよ
びペプチドミメティクスは、標的分子、例えばエンドセリアーゼまたは好ましく
はエンドセリアーゼのプロテアーゼドメインに強い結合特性を有し得る。
【０１６２】 本明細書に記載されるエンドセリアーゼに結合するペプチドおよびペプチドミ
メティクスをヒトを含む哺乳動物に投与して、エンドセリアーゼの活性を調節す
ることができる。つまり、そのような活性を調節するのに十分な量でペプチドま
たはペプチドミメティクス化合物を投与することを含む、血管形成に伴う病気ま
たは疾患の治療的処置および予防のための方法が提供される。つまり、本明細書
中、ペプチドまたはペプチドミメティクス化合物を治療的に有効な投与量または
治療的有効量で患者に投与する、そのような病気または疾患を有する患者を治療
するための方法も提供される。
【０１６３】 ペプチドまたはペプチドミメティクスを含む組成物は、予防および／または治
療処置のために投与することができる。治療適用において、組成物は、すでに前
記の疾患に罹患している患者に、疾患およびその合併症の症状を治療する、また
は少なくとも部分的にそれらを抑えるのに十分な量で投与することができる。こ
の使用に有効な量は、疾患の重篤度、患者の体重および一般症状に依存する。
【０１６４】 予防適用において、ペプチドおよびペプチドミメティクスを含む組成物が、特
定疾患に罹りやすいまたはその危険性のある患者に投与される。そのような量は
、「予防的有効投与量」と定義される。この使用において、詳細な量はここでも
、患者の健康状態および体重に依存する。
【０１６５】 従って、エンドセリアーゼに結合するペプチドおよびペプチドミメティクスを
、活性成分として少なくとも一つのペプチドまたはペプチドミメティクスを医薬
担体または希釈剤と組み合わせて含む医薬組成物を作成するのに用いることがで
きる。化合物は、例えば、経口、肺、非経口（筋肉内、腹腔内、静脈内（ＩＶ）
または皮下注射）、吸入（精製粉末製剤）、経皮、鼻腔、経膣、直腸、または舌
下投与経路で投与することができ、投与の各経路に適した投与形態に製剤化する
ことができる（例えば、国際特許出願第WO 93/25221およびWO 94/17784;および
ヨーロッパ特許出願第613,683号)を参照されたい）。
【０１６６】 エンドセリアーゼに結合するペプチドおよびペプチドミメティクスは、エンド
セリアーゼの産生に影響を与えると考えられる、およびそれにより影響をうける
と考えられる多くの因子の評価を含む、エンドセリアーゼの生物学的役割を理解
するための特有の道具として、インビトロで有用である。そのようなペプチドお
よびペプチドミメティクスは、エンドセリアーゼに結合する、およびその活性を
調節する他の化合物の開発にも有用である。これは、このような化合物が、その
ような開発を促進する、構造と活性の間の関連性に関する重要な情報を提供する
からである。
【０１６７】 ペプチドおよびペプチドミメティクスは、新規なエンドセリアーゼまたはエン
ドセリアーゼアゴニストをスクリーニングするアッセイにおける競合的な結合物
質としても有用である。そのようなアッセイ具体例において、化合物は変更せず
に用いられることができ、または、例えば直接または間接的に検出可能なシグナ
ルを提供する部分を共有結合または非共有結合で結合させるなど、標識すること
により、種々の方法で変更することができる。これらのアッセイのいずれにおい
ても、それに対する物質は、直接または間接的に標識されることができる。直接
標識できるものには、ぺルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼのような １２５ Ｉ酵素（米国特許第３,６４５,０９０）などの放射能標識、および蛍光強
度、波長シフト、または蛍光の局在性の変化をモニターすることができる蛍光標
識（米国特許第３,９４０,４７５）が含まれる。直接標識が可能なものには、１
の較正成分をビオチン化した後、前記標識群の一つと結合させたアビジンに結合
させることが含まれる。化合物には、化合物を固体支持体に結合させる場合、ス
ペーサーやリンカーも含まれる。
【０１６８】 さらに、エンドセリアーゼに結合するその能力に基づき、ペプチドおよびペプ
チドミメティクスを生きている細胞、固定細胞、体液、組織均質物、精製天然生
物物質などの中にエンドセリアーゼを検出するための試薬として用いることがで
きる。例えば、そのようなペプチドおよびペプチドミメティクスを標識すること
により、エンドセリアーゼを有する細胞を同定することができる。加えて、エン
ドセリアーゼに結合するその能力に基づき、ペプチドおよびペプチドミメティク
スをインサイチュ染色、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞分類）、ウェスタンブロッテ
ィング、ＥＬＩＳＡなどに用いることができる。加えて、エンドセリアーゼに結
合するその能力に基づき、ペプチドおよびペプチドミメティクスをエンドセリア
ーゼポリペプチドの精製に、またはエンドセリアーゼポリペプチド、例えばエン
ドセリアーゼのプロテアーゼドメインをコードしているポリペプチドを発現して
いる細胞を精製するのに用いることができる。 ペプチドおよびペプチドミメティクスは、種々の医学研究および診断的使用の
ための市販の試薬として用いることもできる。 ペプチドおよびペプチドミメティクスの活性は、引用として本明細書に組み込
まれるMcDonald (1992) Am. J. of Pediatric Hematology/Oncology, 14:8-21に
記載される多くのモデルの一つにて、インビトロまたはインビボいずれかで評価
することができる。
【０１６９】 ペプチドおよびペプチドミメティクス治療 エンドセリアーゼまたはエンドセリアーゼのプロテアーゼドメインに結合する
ことができる、およびその活性を調節することができる、またはエンドセリアー
ゼ活性を有するペプチドおよびペプチドミメティクスを、血管形成に伴う病気お
よび疾患の治療のために用いることができる。ペプチドおよびペプチドミメティ
クスをインビボまたはエキソビボで、治療を必要としている患者の細胞に送達し
てよい。さらに、エンドセリアーゼ活性を有するペプチドは、インビボまたはエ
キソビボで、エンドセリアーゼ遺伝子をコードしている変異体またはミッシング
対立遺伝子を運ぶ細胞に送達することができる。本明細書に記載されるまたは当
業者に公知の方法のいずれかを、他のヒトタンパク質を実質上含まないそのよう
なペプチドおよびペプチドミメティクスの調製およびインビボまたはエキソビボ
送達のために用いることができる。例えば、ペプチドは、微生物中での発現また
はインビトロでの合成により、容易に合成することができる。
【０１７０】 ペプチドまたはペプチドミメティクスは、インビボまたはエキソビボで、例え
ば極微注射により、またはリポソームの使用により細胞に導入することができる
。別法として、ペプチドまたはペプチドミメティクスはインビボまたはエキソビ
ボで積極的に、または拡散により取りこまれることができる。加えて、ペプチド
またはペプチドミメティクスの細胞外適用が、血管形成に伴う病気または疾患の
有効な処置に十分であり得る。１）エンドセリアーゼまたはそのプロテアーゼド
メインに結合する、または２）エンドセリアーゼまたはそのプロテアーゼドメイ
ンと同じ機能または活性を有する薬物または有機化合物などの他の分子を治療法
に用いてよい。
【０１７１】 合理的薬物設計 合理的薬物設計の目的は、目的の生物学的に活性なポリペプチドまたはペプチ
ド、またはそれらが相互作用する小分子またはペプチドミメティクス（例えば、
アゴニスト、アンタゴニスト、阻害物質）の構造類似体を、例えばより活性のあ
るまたは安定な形態の薬物、または例えばインビボでポリペプチド（例えばエン
ドセリアーゼ）の機能を高めるまたは妨害する薬物を作成するために製造するこ
とである。一手段では、まず目的のタンパク質（例えばエンドセリアーゼまたは
プロテアーゼドメインを有するポリペプチド）、または例えばエンドセリアーゼ
−リガンド複合体の三次元構造が、Ｘ線結晶構造解析により、コンピューターモ
デル化、または最も典型的には、複数の手段を組み合わせたものにより決定され
る（例えば、Erickson et al. 1990を参照されたい）。また、ポリペプチドの構
造に関して有用な情報は、相同タンパク質の構造に基づくモデル化により得るこ
とができる。加えて、ペプチドは、アラニンスキャンで分析することができる。
この方法では、アミノ酸残基はＡｌａにより置換され、ペプチドの活性における
その効果が決定される。ペプチドのアミノ酸残基のそれぞれをこの方法で分析し
て、ペプチドの重要な領域が決定される。
【０１７２】 さらに、エンドセリアーゼ、または好ましくはエンドセリアーゼのプロテアー
ゼドメインに結合するポリペプチドまたはペプチドは、機能アッセイにより選択
されることができ、次いで、このポリペプチドまたはペプチドの結晶構造が決定
され得る。ポリエプチドは、例えば、エンドセリアーゼまたはエンドセリアーゼ
のプロテアーゼドメインに特異的な抗体であり得る。この手段により、その後の
薬物設計の基礎とすることができる薬核を得ることができる。さらに、エンドセ
リアーゼまたはエンドセリアーゼのプロテアーゼドメインに結合する機能的な、
薬理学的に活性なポリペプチドまたはペプチドに対する抗遺伝子型ポリペプチド
またはペプチド、（抗−ｉｄｓ）を作成することにより、結晶構造解析を全く回
避することができる。鏡像の鏡像として、抗−ｉｄｓの結合部位は、本来の標的
分子、例えばエンドセリアーゼまたはエンドセリアーゼを有するポリペプチドの
類似体であることが期待される。抗−ｉｄを次いで用いて、化学的または生物学
的に生成されたペプチドのバンクのバンクからペプチドを同定および単離するこ
とができた。選択されるペプチドは次いで薬核として作用し得る。
【０１７３】 このように、活性または安定性が改善された薬物、またはエンドセリアーゼの
活性のモジュレーター（例えば、阻害物質、アゴニスト、アンタゴニストなど）
として作用する、および本発明の方法、特に血管形成に伴う病気または疾患の診
断、治療、予防およびスクリーニングのための方法に有用な薬物を設計すること
ができる。クローニングされたエンドセリアーゼ配列を利用して、Ｘ線結晶解析
などの分析試験などを行うのに、十分な量のエンドセリアーゼポリペプチドを作
成することができる。加えて、エンドセリアーゼまたはそのプロテアーゼドメイ
ン、例えば配列番号２のアミノ酸配列によりコードされるプロテアーゼドメイン
のアミノ酸配列に関する知識により、Ｘ線結晶解析に変わる、またはそれに加え
られるコンピューターモデル法に方向性を与えるものが提供される。
【０１７４】 エンドセリアーゼに結合するペプチドおよびペプチドミメティクスを同定する
方法 本明細書中に提供されるエンドセリアーゼポリペプチドに結合アフィティを有
するペプチド（例えばエンドセリアーゼまたはエンドセリアーゼのプロテアーゼ
ドメインを有するポリペプチド）は、例えば、ランダムペプチド変異発生システ
ムをアフィニティ強化法と組み合わせることにより容易に同定することができる
。詳細には、ランダムペプチド変異発生システムには、「プラスミド上ペプチド
」システム（例えば、Ｕ.Ｓ.特許第５,２７０,１７０および５,３３８,６６５を
参照されたい）；「ファージ上ペプチド」システム（例えば、Ｕ．Ｓ．特許第６
,１２１,２３８およびCwirla,et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 8
7:6378-6382を参照されたい）；「ポリソームシステム」；「コードされた合成
ライブラリー（ＥＳＬ）」システム；および「非常に大きなスケールの固定ポリ
マー合成」システム（Ｕ．Ｓ．特許第６,１２１,２３８、およびDower et al. (
1991) Ann. Rep. Med. Chem. 26:271-280を参照されたい）が含まれる。
【０１７５】 例えば、前記の方法を用いて、長さに関して規定された数のアミノ酸残基を有
するように、ランダムペプチドを一般的に設計することができる。ランダムペプ
チドをコードしているオリゴヌクレオチドのコレクションを作成するために、Ｎ
がヌクレオチドＡ、Ｃ、ＧまたはＴ（等モル；用いられる方法により、他のヌク
レオチドを用いることができる）、ＫがＧまたはＴ（等モル）、およびｘがペプ
チド中のアミノ酸の数に対応する整数（例えば１２）であるコドンモチーフ（Ｎ
ＮＫ）ｘを用いて、ＮＮＫモチーフから生じる３２の可能なコドンのいずれか一
つを特定することができる；１２のアミノ酸のそれぞれに関しては１、５のアミ
ノ酸のそれぞれに関しては２、３アミノ酸のそれぞれに関しては３、および３つ
のストップコドンの一つのみ。つまり、ＮＮＫモチーフはアミノ酸全てをコード
し、１のストップコドンのみをコードし、コドンバイアスが減る。
【０１７６】 ランダムペプチドは例えば、ファージｆｄ誘導体のｐＩＩＩまたはｐＶＩＩＩ
コートタンパク質いずれかを含む融合タンパク質の部分としてファージ粒子の表
面上に（ファージ上ペプチド）、またはプラスミドに結合したＬａｃＩペプチド
融合タンパク質との融合タンパク質として（プラスミド上ペプチド）提示される
ことができる。ペプチドをコードしているＤＮＡを含むファージまたはプラスミ
ドは、プロテアーゼドメインを有する固定されたエンドセリアーゼポリペプチド
を用いるアフィニティ濃縮法により同定および単離されることができる。「パン
ニング」と時に呼ばれるアフィニティ濃縮法は、典型的に、ファージ、プラスミ
ド、またはポリソームを固定されたエンドセリアーゼポリペプチドと共にインキ
ュベートし、エンドセリアーゼポリペプチドに（付随するＤＮＡまたはｍＲＮＡ
と共に）結合するファージ、プラスミドまたはポリソームを収集し、そして集め
られたファージまたはプラスミドの多くを（ＬａｃＩ−ペプチド融合タンパク質
と共に）製造することから成る複数の経路が関与する。
【０１７７】 ペプチドおよびペプチドミメティクスの特性 典型的には、好ましいペプチドおよびペプチドミメティクスの分子量は、約２
５０から約８,０００ダルトンである。ペプチドがオリゴマー化され、ダイマー
化され、および／または親水性ポリマーを用いて誘導される場合（例えば化合物
のアフィニティおよび／または活性を増すために）、そのようなペプチドの分子
量は、実質上もっと大きい可能性があり、約５００から約１２０,０００ダルト
ン、より好ましくは約８,０００から約８０,０００ダルトンいずれかの範囲であ
り得る。そのようなペプチドは９またはそれ以上のアミノ酸から構成され得、こ
こでアミノ酸は天然に生じるアミノ酸か、または合成（天然に生じない）アミノ
酸である。当該分野の専門家には、治療および／または診断上の目的に適したペ
プチドおよびペプチドミメティクスのアフィニティおよび分子量の決定法が分か
るであろう（例えば、Dower et al., U.S. Patent No. 6,121,238を参照された
い）。
【０１７８】 ペプチドは、種々の親水性ポリマーの１またはそれ以上に共有結合されてよい
。適当な親水性ポリマーには、制限されるものではないが、ポリエチレングリコ
ールおよびポリプロピレングリコールにより例示されるポリアルキルエーテル、
ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリオキシアルケン、ポリビニルアルコール、ポ
リビニルピロリドン、セルロースおよびセルロース誘導体、デキストランおよび
デキストラン誘導体などが含まれる。ペプチド化合物がそのようなポリマーを用
いて誘導される場合、その溶解度および循環半減期は、結合活性をわずかに低下
させるのみで増すことができる。ペプチド化合物はダイマー化されてよく、ダイ
マーサブユニットのそれぞれは、親水性ポリマーに共有結合されることができる
。ペプチド化合物はＰＥＧ化(PEGylate)する、すなわち、ポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ）に共有結合されることができる。
【０１７９】 ペプチド類似物は、鋳型ペプチドのものに類似する特性を有する非ペプチド薬
物として、製薬業に一般に用いられる。これらのタイプの非ペプチド化合物は、
「ペプチドミメティクス」または「ペプチドミメティクス」と呼ばれる（Luthma
n et al., A Textbook of Drug Design and Development, 14:386-406, 2nd Ed.
, Harwood Academic Publishers (1996); Joachim Grante (1994) Angew. Chem.
Int. Ed. Engl., 33:1699-1720; Fauchere (1986) J. Adv. Drug Res., 15:29;
Veber and Freidinger (1985) TINS, p. 392; and Evans et al. (1987) J. Me
d. Chem. 30:1229）。治療上有用なペプチドに構造上類似するペプチドミメティ
クスを用いて、同等のまたは高められた治療または予防効果を得ることができる
。ペプチドミメティクスおよびその構造の調製は、当該分野の専門家には公知で
ある。
【０１８０】 同じタイプのＤ−アミノ酸との共通配列の１またはそれ以上のアミノ酸を系統
的に置換して（例えばＬ−リジンの代わりにＤ−リジン）、より安定なペプチド
を作成することができる。加えて、共通配列または実質上同一の共通配列変種を
含む束縛されたペプチドを、当該分野で公知の方法（Rizo et al. (1992) Ann.
Rev. Biochem., 61:387）、例えばペプチドを環化する分子内ジスルフィド結合
を形成することができる内部システイン残基を添加することにより作成すること
ができる。
【０１８１】 当該分野の専門家には、ペプチドの生物学的活性または機能的活性に有害な影
響を与えることなく、ペプチドおよびペプチドミメティクスに変更を成すことが
できることが分かるであろう。さらに、当業者には、標的分子、例えばエンドセ
リアーゼ、または好ましくはエンドセリアーゼのプロテアーゼドメインに結合す
るペプチドを擬似する、３次元の非ペプチド構造を設計する方法が分かるであろ
う（例えば、Eck and Sprang (1989) J. Biol. Chem., 26: 17605-18795)を参
照されたい）。
【０１８２】 診断上の目的に用いる場合、ペプチドおよびペプチドミメティクスは検出可能
な標識で標識されてよく、従って、そのような標識を有さないペプチドおよびペ
プチドミメティクスは、標識されたペプチドおよびペプチドミメティクスの調製
における中間体として役立てることができる。検出可能な標識は、ペプチドおよ
びペプチドミメティクスに共有結合する場合に、インビボで、例えばペプチドま
たはペプチドミメティクスが投与された患者において、またはインビトロ、例え
ばサンプルまたは細胞中で、ペプチドおよびペプチドミメティクスの検出を可能
とする分子または化合物であり得る。適当な検出可能な標識は当業者に周知であ
り、例としては、ラジオアイソトープ、蛍光標識（例えばフルオレセイン）など
が含まれる。用いられる特定の検出可能な標識は重要ではなく、用いられる標識
の量ならびに用いられる標識の量での標識の毒性に関連して選択される。そのよ
うな要因に関連する標識の選択は、十分当該分野の技術範囲内にある。
【０１８３】 ペプチドまたはペプチドミメティクスに対する検出可能な標識の共有結合は、
当該分野で周知の常套法により行われる。例えば、１２５Ｉラジオアイソトープ
が検出可能な標識として用いられる場合、１２５Ｉのペプチドまたはペプチドミ
メティクスへの共有結合は、アミノ酸チロシンをペプチドまたはペプチドミメテ
ィクスに組込み、次いでそのペプチドをヨード化することにより達成することが
できる（たとえばWeaner et al. (1994) Synthesis and Applications of Isoto
pically Labelled Compounds, pp. 137-140を参照されたい）。チロシンがペプ
チドまたはペプチドミメティクスに存在しない場合、ペプチドまたはペプチドミ
メティクスのＮまたはＣ末端へのチロシンの組込みは、周知の化学法により達成
することができる。同様に、３２Ｐを例えばペプチドまたはペプチドミメティク
ス上のヒドロキシル基によりリン酸基として常套化学法を用いてペプチドまたは
ペプチドミメティクスに組み込むことができる。
【０１８４】 ペプチドミメティクスの標識は、一般に、１またはそれ以上の標識の、直接的
、またはスペーサー（例えばアミド基）を介した、定量構造活性データおよび／
または分子モデル化により予測されるペプチドミメティクス上の障害のない位置
への共有結合が関与する。そのような、障害のない位置は一般に、ペプチドミメ
ティクスが結合して治療効果を生じる巨大分子との直接的な接触を形成しないい
ずれかの位置である。ペプチドミメティクスの誘導（例えば標識）は、ペプチド
ミメティクスの所望の生物学的または薬理学的活性を実質上妨害しないものであ
るべきである。
【０１８５】 ペプチドおよびペプチドミメティクスの調製法 エンドセリアーゼに結合するペプチドは、当該分野で公知の伝統的な方法によ
り、例えば常套の固相法を用いることにより調製することができる。常套法には
、排除固相合成、部分固相合成法、フラグメント濃縮、伝統的溶液合成が含まれ
、組換えＤＮＡ技術によるものも含まれる（例えば、Merrifield (1963) J. Am.
Chem. Soc., 85:2149, incorporated herein by referenceを参照されたい）。
【０１８６】 「コードされた合成ライブラリー」または「非常に大きな規模の固定ポリマー
合成」システム（例えば、Ｕ．Ｓ．特許第５,９２９,５２５および５,９０２,７
２３を参照されたい）を用いて、目的の活性を有するペプチドの最小のサイズを
決定することができるのみならず、好ましいモチーフ（またはそのモチーフの最
小のサイズ）と、１、２またはそれ以上の残基が異なるペプチドのグループを形
成するペプチドの全てを作成することもできる。ペプチドのこのコレクションを
、次いで標的分子、たとえばエンドセリアーゼまたは好ましくはエンドセリアー
ゼのプロテアーゼドメインに結合する能力に関してスクリーニングすることがで
きる。この固定されたポリマー合成システムまたは他のペプチド合成法を用いて
、ペプチド化合物の先端が切断された類似体および欠失された類似体および先端
の切断と欠失が組み合わさった類似体を合成することもできる。
【０１８７】 これらの方法を用いて、２０の天然に生じる、遺伝的にコードされたアミノ酸
以外のアミノ酸が、ペプチドの１、２またはそれ以上の位置で置換されているペ
プチドを合成することもできる。例えば、ナフタルアラニンは、合成を促進する
トリプトファンに置換することができる。ペプチド中で置換されることができる
他の合成アミノ酸には、Ｌ−ヒドロキシプロピル、Ｌ−３,４−ジヒドロキシ−
フェニルアラニル、Ｌ−ｄ−ヒドロキシリジルおよびＤ−ｄ−メチルアラニルな
どのｄアミノ酸、Ｌ−α−メチルアラニル、βアミノ酸、およびイシキノリルな
どのが含まれる。Ｄアミノ酸および天然に生じない合成アミノ酸をペプチドに組
み込むこともできる（例えば、Roberts et al. (1983) Unusual Amino/Acids in
Peptide Synthesis, 5(6):341-449を参照されたい）。
【０１８８】 ペプチドは、リン酸化（例えば、W. Bannwarth et al. (1996) Biorganic and
Medicinal Chemistry Letters, 6(17):2141-2146を参照されたい）、およびペ
プチド誘導体を作成するための他の方法（例えば、Hruby et al. (1990) Bioche
m. J., 268(2):249-262を参照されたい）により修飾されてもよい。つまり、ペ
プチド化合物は、同様の生物活性を持つペプチドミメティクスを調製するための
基本となるものとしても役立つ。 当業者には、対応するペプチド化合物と同一または類似の、所望の生物活性を
持つが、溶解性、安定性、および加水分解およびタンパク質分解の受けやすさに
関しては該ペプチドよりも好ましい活性を有するペプチドミメティクスを構築す
るために、種々の方法が利用できることが分かる（例えば、Morgan et al. (198
9) Ann. Rep. Med. Chem., 24:243-252を参照されたい）。Ｎ−末端アミノ基、
Ｃ−末端カルボキシル基で修飾されるペプチドミメティクスを調製するための、
および／またはペプチド中のアミド結合の１またはそれ以上を非−アミド結合に
変化させるための方法が当該分野の専門家に公知である。
【０１８９】 アミノ末端の修飾には、アルキル化、アセチル化、カルボベンゾイル基の付加
、スクシンイミド基の形成などが含まれる（例えば、Murray et al. (1995) Bur
ger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery, 5th ed., Vol. 1, Manfred E
. Wolf, ed., John Wiley and Sons, Inc.を参照されたい）。Ｃ末端の修飾には
、Ｃ末端カルボキシル基がエステル、アミド、または変更により置きかえられて
環状ペプチドを形成するミメティクスが含まれる。 Ｎ−末端およびＣ−末端の修飾に加えて、ペプチドミメティクスを含むペプチ
ド化合物は、好都合には、１またはそれ以上の種々の親水性ポリマーを用いて修
飾され、またはそれらと共有結合されることができる。ペプチド化合物が親水性
ポリマーを用いて誘導される場合、その溶解度および循環半減期が増す可能性が
あり、その免疫原性は遮断され、そしてあるとしても、その結合能力の低下はわ
ずかである。適当な非タンパク質性ポリマーには、制限されるものではないが、
ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールにより例示されるポリ
アルキルエステル、ポリアクティック酸、ポリグリコール酸、ポリオキシアルケ
ン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、セルロースおよびセルロー
ス誘導体、デキストランおよびデキストラン誘導体などが含まれる。一般にその
ような親水性ポリマーは、約５００から約１００,０００ダルトン、より好まし
くは約２,０００から約４０,０００ダルトン、およびよりいっそう好ましくは約
５,０００から約２０,０００ダルトンの範囲の平均分子量を有する。親水性ポリ
マーは、約５,０００ダルトン、１０,０００ダルトンおよび２０,０００ダルト
ンの平均分子量を有することもできる。
【０１９０】 ペプチド化合物を誘導するための、またはペプチドをそのようなポリマーに結
合させるための方法が記載されている（例えば、Zallipsky (1995) Bioconjugat
e Chem., 6:150-165; Monfardini et al. (1995) Bioconjugate Chem., 6:62-69
; U.S. Pat. No. 4,640,835; U.S. Pat. No. 4,496,689; U.S. Pat. No. 4,301,
144; U.S. Pat. No. 4,670,417; U.S. Pat. No. 4,791,192; U.S. Pat. No. 4,1
79,337 and WO 95/34326,これら全ては、本明細書中、その全体が引用により組
み込まれる、を参照されたい）。
【０１９１】 ペプチド誘導体を作成するための他の方法は、例えば引用により本明細書中に
組み込まれるHruby et al. (1990), Biochem J., 268(2):249-262に記載されて
いる。つまり、ペプチド化合物は同様の生物学的活性を持つ非ペプチド性化合物
の構造モデルとしても役立つ。当業者には、特定のペプチド化合物と同一または
類似する所望の生物活性を有するが、溶解性、安定性および、加水分解およびタ
ンパク質分解の受けやすさに関してはより好ましい活性を持つ化合物を構築する
のに種々の方法が利用できることが分かる（例えば、本明細書中に引用により組
み込まれるMorgan et al. (1989) Ann. Rep. Med. Chem., 24:243-252を参照さ
れたい）。これらの技術には、ペプチド骨格を、ホスホネート、アミデート、カ
ルバメート、スルホアミド、第二アミンおよびＮ−メチルアミノ酸からなる骨格
で置きかえることが含まれる。
【０１９２】 ペプチド化合物は、システインのチオール基間の分子内ジスルフィド結合で環
状化された形態で存在してよい。別法として、システインのチオール基間の分子
内ジスルフィド結合を用いて二量体（または高重合体）化合物を得ることができ
る。１またはそれ以上のシステイン残基は、ホモシステインで置換されてもよい
。
【０１９３】 Ｆ．結合物 ａ）配列番号：１に記載したヌクレオチド配列を有する核酸にハイブリダイズ
する核酸によりコードされるエンドセリアーゼタンパク質のプロテーゼドメイン
、およびｂ）エンドセリアーゼに直接またはリンカーを介して結合する標的剤で
あって、ｉ）結合物のアフィニティ単離または精製；ｉｉ）表面への結合物の結
合；ｉｉｉ）結合物の検出；またはｉｖ）選択された組織または細胞への標的化
された送達を達成する標的剤を含む結合物が本明細書中に提供される。結合物は
、化学結合物またはその融合タンパク質混合物であり得る。
【０１９４】 標的剤は、好ましくはタンパク質またはペプチドフラグメント、例えば組織特
異的または腫瘍特異的モノクローナル抗体または成長因子、または直接またはリ
ンカーを介してエンドセリアーゼまたはそのプロテアーゼドメインに結合するそ
のフラグメントなどである。標的剤は、タンパク質結合配列、核酸結合配列、脂
質結合配列、多糖類結合配列、または金属結合配列、または固体支持体への結合
のためのリンカーを含むタンパク質またはペプチドフラグメントであってもよい
。
【０１９５】 特定の具体例では、結合物にはａ）配列番号：１、３、５または２２に示すヌ
クレオチド配列を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸によりコードされる
エンドセリアーゼまたはエンドセリアーゼタンパク質のプロテアーゼドメイン；
およびｂ）エンドセリアーゼに直接、またはリンカーを介して結合する標的剤が
含まれる。
【０１９６】 エンドセリアーゼと、例えばエンドセリアーゼドメインのアフィニティ単離ま
たは精製、エンドセリアーゼドメインの表面への結合、またはエンドセリアーゼ
ドメインの検出を促進するべく機能するタンパク質またはペプチドフラグメント
（またはその複数）との融合タンパク質および化学結合物などの結合物が提供さ
れる。該結合物は、化学結合、例えばチオール結合などにより作成されることが
できるが、好ましくは融合タンパク質のように組換え法により作成される。融合
タンパク質では、ペプチドまたはそのフラグメントはエンドセリアーゼドメイン
のＮ−末端かＣ−末端いずれかに結合する。化学結合では、ペプチドまたはその
フラグメントは、結合が達成され得る、およびそのようなペプチドまたはフラグ
メントがた単一のエンドセリアーゼドメインまたは複数のエンドセリアーゼドメ
インに結合され得るいずれかの場所で結合されることができる。
【０１９７】 標的剤は、好ましくは細胞または組織へのインビトロ送達のために好ましく、
細胞または組織特異的抗体、成長因子および特定細胞で発現される他の因子など
の剤、および結合タンパク質の指向性送達を達成する、他の細胞または組織特異
的剤が含まれる。 もっとも好ましくは、標的剤により、細胞表面タンパク質との相互作用、およ
び複合物またはそのエンドセリアーゼ部分の内在化により、選択された細胞にエ
ンドセリアーゼが送達される。これらの結合物は種々の方法で用いられ、特に、
特定のエンドセリアーゼにより分解されて細胞毒性となるプロドラッグなどのプ
ロドラッグを活性化する方法に用いるのに特に適している。プロドラッグは、複
合物の前、同時、またはその後、投与される。標的細胞へ送達されると、プロテ
アーゼはプロドラッグを活性化し、これがその後、細胞毒効果としての治療効果
を示す。
【０１９８】 １．結合 結合されたエンドセリアーゼドメインとの結合物は、化学結合、組換えＤＮＡ
技術、または組換え発現および化学結合の組み合わせのいずれかにより調製され
ることができる。エンドセリアーゼドメインと標的剤は、いずれの配向で結合さ
れてもよく、１以上の標的剤および／またはエンドセリアーゼドメインが結合物
中に存在してよい。 ａ．融合タンパク質 融合タンパク質が、本明細書中に提供される。融合タンパク質は、ａ）エンド
セリアーゼの１または複数のドメインおよびｂ）標的剤を含む。融合タンパク質
は、好ましくは融合タンパク質をコードする核酸の組換え発現により作成される
。 ｂ．化学結合 本明細書中の化学結合を達成するために、エンドセリアーゼドエインは、１ま
たはそれ以上の選択されたリンカーを介して、または直接、標的剤に結合される
。化学結合は、標的剤がペプチドまたはタンパク質以外のもの、例えば核酸また
は非ペプチド薬物である場合に用いられなければならない。化学結合している選
択された部分に関して、当業者に公知のいずれの方法を用いてもよい。
【０１９９】 ２．リンカー ２つの目的のためのリンカーが、本明細書中に意図される。結合物には、エン
ドセリアーゼ部分と標的剤の間に１またはそれ以上のリンカーが含まれる。さら
に、リンカーは、高処理量固相スクリーニングプロトコルなどのために、固体支
持体、例えばマイクロタイタープレート、シリコン、またはシリコンコートチッ
プ、ガラスまたはプラスチック支持体など上へのエンドセリアーゼまたはその部
分の固定化を促進するために、またはそれを高めるために用いられる。
【０２００】 ａ．リンカーの例 結合物の調製のための、当該分野の専門家に公知のあらゆるリンカーを、本明
細書中に用いてよい。これらのリンカーは、典型的には、化学結合の調製に用い
られ、ペプチドリンカーが融合タンパク質に組み込まれてもよい。 リンカーは、エンドセリアーゼのドメインおよび標的剤を結合させるのに適し
たいずれかの部分であり得る。そのようなリンカーおよび結合には、制限される
ものではないが、典型的には１から約６０のアミノ酸、より一般的には約１０か
ら３０のアミノ酸を含むペプチド間の結合、アミノ酸とペプチドの結合、化学結
合、例えば制限されるものではないが、Ｎ−スクシニミジル（４−ヨードアセチ
ル）−アミノベンゾエート、スルホスクシニミジル（４−ヨードアセチル）−ア
ミノベンゾエート、４−スクシニミジル−オキシカルボニル−ａ−（２−ピリジ
ルジチオ）トルエン、スルホスクシニミジル−６−[ａ−メチル−ａ−（ピリジ
ルジチオール）−トルアミド]ヘキサノエート、Ｎ−スクシニミジル−３−（−
２−ピリジルジチオ）−プロプリオネート、スクシニミジル６[３（−（−２−
ピリジルジチオ）−プロピオンアミド]ヘキサノエート、スルホスクシニミジル
６[３（−（−２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド]ヘキサノエート、３−
（２−ピリジルジチオ）−プロピオニルヒドラジド、エルマンズ試薬、ジクロロ
トリアジン酸およびＳ−（２−チオピリジル）−Ｌ−システインを含む２つの異
種機能を持つ切断可能な架橋結合などが含まれる。他のリンカーには、制限され
るものではないが、エンドセリアーゼのドメインと標的剤、細胞内酵素基質、複
合物の柔軟性を増すリンカー、複合物の溶解性を増すリンカー、結合物の血清安
定性を増すリンカー、光で分解されるリンカー、および酸で分解されるリンカー
の間のステアリン酸障害を減じるペプチドおよびその他の部分が含まれる。
【０２０１】 他の例となる化学結合複合物に適したリンカーおよび結合には、制限されるも
のではないが、ジスルフィド結合、チオエーテル結合、妨害されたジスルフィド
結合、および遊離反応基、例えばアミンおよびチオール基などの間の共有結合が
含まれる。これらの結合は、異種二機能性試薬を用いてポリペプチドの一または
両方に反応性のチオール基を作成し、次いで１ポリペプチド上のチオール基を反
応性マレイミド基またはチオール基が互いに結合され得る反応性チオール基また
はアミン基と反応させて作成される。他のリンカーには、ビスマレイミデオトキ
シプロパンなどの分解可能なリンカー、酸に不安定なトランスフェリン結合、お
よびより酸性の高い細胞内成分で分解されるアジピン酸ジヒドラジド、ＵＶまた
は可視光線に曝されると分解する架橋結合、およびＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３
などの、ヒトＩｇＧ１の不変領域からの種々のドメインなどのリンカー（Batra
et al. Molecular Immunol., 30:379-386 (1993)を参照されたい）が含まれる。
いくらかの具体例では、各リンカーの所望の特性の利点を得るために、種々のリ
ンカーを含めてよい。
【０２０２】 化学リンカーおよびペプチドリンカーは、エンドセリアーゼのドメインに対す
るリンカーと標的剤を共有結合させることにより挿入されてよい。以下に記載の
異種二機能剤を用いてそのような共有結合を達成してもよい。ペプチドリンカー
は、リンカーおよびＴＡ、リンカーおよび標的剤、またはリンカー、標的剤およ
びＴＡを融合タンパク質としてコードしているＤＮＡを発現することにより結合
されてよい。結合物の溶解性を増す柔軟なリンカーおよびリンカー（複数）も、
単独または他のリンカーと共に、本明細書に意図される。
【０２０３】 １）酸で分解される、光で分解される、および熱に感受性のあるリンカー 酸で分解されるリンカー、光で分解されるリンカー、および熱に感受性のある
リンカーも用いてよく、ここで特に、より反応に利用しやすくするために、エン
ドセリアーゼのドメインを切断することが必要である可能性がある。酸で分解さ
れるリンカーには、制限されるものではないが、ビスマエイミデオチオキシプロ
パンおよびアジピン酸ジヒドラジドリンカー（例えば、Fattom et al. (1992) I
nfection & Immun. 60:584-589を参照されたい）、および細胞内トランスフェリ
ン周期経路に入ることを可能とするのに十分なトランスフェリンの部分を含む、
酸に不安定なトランスフェリン結合物（例えば、Welh ner et al. (1991) J. Bi
ol. Chem. 266:4309-4314を参照されたい）が含まれる。
【０２０４】 光で分解されるリンカーは、光に曝されると分解し（例えば、そのリンカーが
引用により本明細書中に組み込まれるGoldmacher et al. (1992) Bioconj. Chem
. 3:104-107を参照されたい）、それにより光に曝されたときに標的剤を放出す
るリンカーである。光に曝されたときに分解する光により分解されるリンカーは
公知である（例えば、システインに関する光分解可能な保護基としてのニトロベ
ンジル基の使用を記載するHazum et al. (1981) in Pept., Proc. Eur. Pept. S
ymp., 16th, Brunfeldt, K (Ed), pp. 105-110；ヒドロキシプロピルメタクリ
ルアミドコポリマー、グリシンコポリマー、フルオレセインコポリマーおよびメ
チルローダミンコポリマーを含む水溶性光分解可能コポリマーを記載するYen et
al. (1989) Makromol. Chem 190:69-82；近ＵＶ光（３５０ｎｍ）に曝されると
光分解崩壊を被る架橋結合と試薬を記載するGoldmacher et al. (1992) Bioconj
. Chem. 3:104-107；光分解可能な結合を生成するニトロベンジルオキシカルボ
ニルクロライド架橋結合試薬を記載するSenter et al. (1985) Photochem. Phot
obiol 42:231-237を参照されたい）。そのようなリンカーは、光に曝される可能
性のある皮膚または眼の症状を光ファイバーを用いて治療するのに特に用いられ
る。結合物を投与後、眼または皮膚または体の他の部分は光に曝されることがで
き、その結果、結合物から標的された部分が放出される。そのような光分解可能
なリンカーは、動物の体からの迅速なクリアランスを可能とする標的剤を放出す
ることが望ましい診断プロトコルと合わせて用いられる。
【０２０５】 ２）化学結合のための他のリンカー 他のリンカーには、トリチルリンカー、特に、種々の程度の酸性またはアルカ
リ性で治療薬を放出することを可能とする結合物類を作成するための誘導性トリ
チル基が含まれる。治療剤が放出されるｐＨ範囲を予め選択できることにより、
こうして融通性が得られ、治療剤の送達に必要な組織間の公知の生理学的違いに
基づくリンカーの選択が可能となる（例えば、Ｕ．Ｓ．特許第５，６１２，４７
４を参照されたい）。例えば、腫瘍組織の酸性は、正常組織のものよりも低いこ
とが考えられる。
【０２０６】 ３）ペプチドリンカー リンカー部分はペプチドであることができる。ペプチドリンカーは融合タンパ
ク質中に用いることができ、また、化学結合結合物にも用いることもできる。ペ
プチドは典型的には約２から約６０のアミノ酸残基、例えば約５から約４０、ま
たは約１０から約３０のアミノ酸残基を有する。選択される長さは、リンカーが
含まれる使用などの要因に依存する。
【０２０７】 ペプチドリンカーは、標的剤がタンパク質性である場合に有利である。例えば
、リンカー部分は柔軟なスペーサーアミノ酸配列、例えば一本鎖抗体研究で知ら
れるものなどであり得る。そのような公知のリンカー部分の例には、制限される
ものではないが、（ＧｌｙｍＳｅｒ）ｎおよび（ＳｅｒｍＧｌｙ）ｎ、ここでｎ
は１から６、好ましくは１から４、よりこのましくは２から４、およびｍは１か
ら６、好ましくは１から４、より好ましくは２から４である、などのペプチド、
酵素分解性リンカーなどが含まれる。
【０２０８】 さらなる結合部分が、例えば、Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.
A. 85:5879-5883, 1988; Whitlow, M., et al., Protein Engineering 6:989-99
5, 1993; Newton et al., Biochemistry 35:545-553, 1996; A. J. Cumber et a
l., Bioconj. Chem. 3:397-401, 1992; Ladurner et al., J. Mol. Biol. 273:3
30-337, 1997; and U.S. Patent. No. 4,894,443に記載されている。いくつかの
具体例では、数個のリンカーが、各リンカーの所望の特性の利点を得るために含
むめられてよい。 ３．標的剤 結合物の検出、固定または精製を促進するあらゆる剤が、本明細書における使
用のために意図される。化学結合物に関して、そのような部分を有するあらゆる
部分が意図される。融合タンパク質に関しては、標的剤は、タンパク質、ペプチ
ド、または標的活性を作用させるのに十分なそのフラグメントである。好ましい
標的剤は、選択された細胞および組織にエンドセリアーゼまたはその部分を送達
するものである。そのような剤には、腫瘍特異的モノクローナル抗体およびその
部分、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ケモカインを含むサイトカインな
どの成長因子、および他のそのような剤が含まれる。
【０２０９】 ４．核酸、プラスミド、および細胞 融合タンパク質をコードしている単離核酸フラグメントが提供される。融合タ
ンパク質をコードする核酸フラグメントには、ａ）配列番号：１示すヌクレオチ
ド配列を有する核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされるエンドセリア
ーゼタンパク質のプロテアーゼドメインをコードしている核酸；およびｂ）ｉ）
融合タンパク質のアフィニティ単離または精製；ｉｉ）表面への融合タンパク質
の結合；またはｉｉｉ）融合タンパク質の検出を促進するタンパク質、ペプチド
またはその有効なフラグメントをコードしている核酸が含まれる。好ましくは、
核酸はＤＮＡである。
【０２１０】 前記核酸フラグメントを含む、複製のためのプラスミドおよび発現のためのベ
クターも提供される。該プラスミドおよび該ベクターを含む細胞も提供される。
細胞は、制限されるものではないが、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞
、昆虫細胞および動物細胞を含むいずれかの適当な宿主であり得る。核酸、プラ
スミド、およびプラスミドを含む細胞は、本明細書に記載されるいずれかを含む
当該分野で公知の方法に従い調製されることができる。
【０２１１】 前記融合タンパク質を製造するための方法も提供される。例示的方法には、融
合タンパク質をコードしているプラスミドを含む細胞すなわち、増殖細胞を、融
合タンパク質が細胞により発現される条件下で生育させること、すなわち培養す
ること、次いで発現された融合タンパク質を回収することからなるステップが含
まれる。組換えタンパク質を発現させる、および回収する方法は、当該分野で周
知であり（一般に、Current Protocols in Molecular Biology (1998) 16, Jo
hn Wiley & Sons, Inc.を参照されたい）、およびそのような方法は、発現され
た融合タンパク質を発現させるおよび回収するために用いることができる。好ま
しくは、セクションＢに開示される組換え発現および回収法を用いることができ
る。
【０２１２】 回収された融合タンパク質は、遠心分離、濾過、クロマトグラフィー、電気泳
動、免疫沈降などの当該分野で公知の方法により、またはそれらの組み合わせに
より単離または精製されることができる（一般には、Current Protocols in Mol
ecular Biology (1998) 10, John Wiley & Sons, Inc.を参照されたい）。好
ましくは、回収された融合タンパク質は、融合タンパク質のタンパク質またはペ
プチドフラグメントとアフィニティ結合部分の間のアフィニティ結合により単離
または精製される。融合タンパク質の構築に関して前のセクションで論じられて
いるように、あらゆるアフィニティ結合対を、融合タンパク質の単離または精製
において構築し、および用いることができる。例えば、アフィニティ結合対は、
タンパク質結合配列／タンパク質、ＤＮＡ結合配列／ＤＮＡ配列、ＲＮＡ結合配
列／ＲＮＡ配列、脂質結合配列／脂質、多糖類結合配列／ポリサッカライド、ま
たは金属結合配列／金属であり得る。
【０２１３】 ６．固定化および支持体またはそのための基質 標的剤が表面への結合のために設計される所定の具体例では、エンドセリアー
ゼはイオンまたは共有、非共有または他の化学相互作用などの結合により、支持
体またはマトリックス物質の表面に結合されることができる。固定化は、直接ま
たはリンカーを介して行うことができる。エンドセリアーゼは、制限されるもの
ではないが、シリコンチップおよび前記のおよび当業者に公知の他の支持体を含
むいずれかの適当な支持体に固定されてよい。複数のエンドセリアーゼまたはそ
のプロテアーゼドメインを、シリコンチップ、または高処理量プロトコルおよび
フォーマットに用いるための他のチップの表面上の結合体のアレイ（即ち、２ま
たはそれ以上のパターン）などの支持体に結合されてよい。
【０２１４】 エンドセリアーゼのドメインは、表面に直接、または標的剤をそれに結合させ
ずにリンカーを介して結合されることができる。ここで、チップは、エンドセリ
アーゼのドメインのアレイを含む。 本明細書に意図されるマトリックス物質または固体支持体は一般に、リガンド
および他の分子に対して固定するための当該分野の専門家に公知の物質の不溶性
物質のいずれかであり、多くの化学合成および分離に用いられるものである。そ
のような支持体は、例えばアフィニティクロマトグラフィー、生物活性物質の固
定、タンパク質、アミノ酸および他の有機分子を含む生物分子およびポリマーの
化学合成中に用いられる。支持体の調製および使用は、当該分野の専門家に周知
であり、公知の多くのそのような物質およびその調製が存在する。例えば、アガ
ロースおよびセルロースなどの天然に生じる支持体物質が、そのそれぞれの源か
ら単離され得、公知のプロトコルに従い加工されてよく、そして合成物質は、公
知のプロトコルに従い調製されてよい。
【０２１５】 支持体は、典型的には固体、多孔性の、変形可能な、または硬質の溶解性物質
であり，制限されるものではないが、ビーズ、ペレット、ディスク、毛細管、中
が空洞のファイバー、針、固体ファイバー、ランダムシェイプ、薄いフィルムお
よび膜を含む、いずれかの所望の構造および結合構造を持つ。つまり、該部材は
マトリックス物質から組み立てられ得、表面の全部または一部をコートする、ま
たは粒子を注入することによるなどして、それと組み合わされてよい。
【０２１６】 典型的には、マトリックスが粒子の場合、粒子は少なくとも約１０−２０００
μＭであるが、選択される適用により、もっと小さいかもっと大きくてもよい。
マトリックスの選択は少なくとも部分的には、溶解性、官能基、機構的安定性、
表面領域膨張性、親水性または疎水性などのその物理的および化学的特性、およ
び意図される使用により決定される。
【０２１７】 所望の場合、支持マトリックス物質は、適当な反応基を含むべく処理されるこ
とができる。いくらかの場合には、すでに反応部分を含んでいる支持体マトリッ
クス物質を市場で得てもよい。反応部分を含む支持マトリックス物質は、それに
より、分子が結合されるマトリックス支持体として役立ち得る。アミノシラン結
合、ヒドロキシル結合またはカルボキシシラン結合などの反応性表面部分を含む
物質を、シラン化反応などを含む、十分に確立されている表面化学法により作成
することができる。これらの物質の例には、ガンマ−アミノ−プロピルシランに
共有結合する表面酸化シリコン部分および他の有機部分；Ｎ−[３−（トリエチ
オキシシリル）プロピル]フテラミックアシッド；およびビス−（２−ヒドロキ
シエチル）アミノプロピルトリエトキシシランを有するものがある。アミノ基反
応性官能基を含む利用しやすい物質の例としては、制限されるものではないが、
パラ−アミノフェニルトリエトキシシランが含まれる。また、誘導性ポリスチレ
ンおよび他のそのようなポリマーが周知であり、当業者に容易に入手される（例
えば、テンタゲル(Tentagel）(登録商標)樹脂が、多数の官能基途ともに利用で
き、Rapp Polymere, Tubingen, Germanyにより販売されている。; U.S.特許第4,
908,405およびU.S.特許第5,292,814を参照されたい。;さらに、Butz et al., Pe
ptide Res., 7:20-23 (1994); およびKleine et al., Immunobiol., 190:53-66
(1994)も参照されたい）。
【０２１８】 これらのマトリックス物質には、目的の分子の結合のための支持マトリックス
として作用することができるあらゆる物質が含まれる。そのような物質は当業者
に公知であり、支持体マトリックスとして用いられるものが含まれる。これらの
物質には、制限されるものではないが、セルロース、セルロース誘導体、アクリ
ル性樹脂、ガラス、シリカゲル、ポリスチレン、ゼラチン、ポリビニルピロリド
ン、ビニルおよびアクリルアミドから成るコポリマー、ジビニルベンゼンなどと
架橋結合したポリスチレン（Merrifield, Biochemistry, 3:1385-1390 (1964)を
参照されたい）、ポリアクリルアミド、ラテックスゲル、ポリスチレン、デキス
トラン、ポリアクリルアミド、ゴム、シリコン、プラスチック、ニトロセルロー
ス、セルロース、天然スポンジを含む、制限されるものではないが、無機、天然
ポリマー、および合成ポリマーが含まれる。本明細書中、非常に孔の多いガラス
（例えば、Ｕ．Ｓ．特許第４，２４４，７２１を参照されたい）およびボロシリ
ケート、アルコールおよび水を混合することにより調製される他のものが特に興
味深い。
【０２１９】 合成支持体には、制限されるものではないが、アクリルアミド、デキストラン
誘導体およびデキストランコポリマー、アガロース−ポリアクリルアミド混合物
、種々の官能基を有する他のポリマーおよびコポリマー、メタクリレート誘導体
およびコポリマー、ポリスチレンおよびポリスチレンコポリマー（例えば、Merr
ifield, Biochemistry, 3:1385-1390 (1964); Berg et al., in Innovation Per
spect. Solid Phase Synth. Collect. Pap., Int. Symp., 1st, Epton, Roger (
Ed), pp. 453-459 (1990); Berg et al., Pept., Proc. Eur. Pept. Symp., 20t
h, Jung, G. et al. (Eds), pp. 196-198 (1989); Berg et al., J. Am. Chem.
Soc., 111:8024-8026 (1989); Kent et al., Isr. J. Chem., 17:243-247 (1979
); Kent et al., J. Org. Chem., 43:2845-2852 (1978); Mitchell et al., Tet
rahedron Lett., 42:3795-3798 (1976); U.S. Patent No. 4,507,230; U.S. Pat
ent No. 4,006,117; およびU.S. Patent No. 5,389,449)を参照されたい）が含
まれる。そのような物質には、ポリビニルアルコールなどのポリマーとコポリマ
ーから成るもの、ポリエチレン−コ−アクリル酸、ポリエチレン−コ−メタクリ
ル酸、ポリエチレン−コ−エチルアクリレート、ポリエチレン−コ−メチルアク
リレート、ポリプロピレン−コ−アクリル酸、ポリプロピレン−コ−メチル−ア
クリル酸、ポリプロピレン−コ−エチルアクリレート、ポリプロピレン−コ−メ
チルアクリレート、ポリエチレン−コ−ビニルアセテート、ポリプロピレン−コ
−ビニルアセテートなどのアクリレートおよびアクリル酸、ポリエチレン−コ−
マレイン酸無水物およびポリプロピレン−コ−マレイン酸無水物などの無水基を
含むものが含まれる。リポソームも、アフィニティ精製のための固体支持体とし
て用いられている（Powell et al. Biotechnol. Bioeng., 33:173 (1989)を参照
されたい）。
【０２２０】 固体または液体支持体上でのタンパク質および他の生物分子の固定のための多
くの方法が開発されている（例えば、Mosbach, Methods in Enzymology, 44 (19
76); Weetall, Immobilized Enzymes, Antigens, Antibodies, and Peptides, (
1975); Kennedy et al., Solid Phase Biochemistry, Analytical and Syntheti
c Aspects, Scouten, ed., pp. 253-391 (1983)を参照されたい。; 一般に、Aff
inity Techniques. Enzyme Purification: Part B. Methods in Enzymology, Vo
l. 34, ed. W. B. Jakoby, M. Wilchek, Acad. Press, N.Y. (1974)を参照され
たい）。 支持体に対する、直接的な、または多くのジスルフィド結合、チオエーテル結
合、妨害ジスルフィド結合、および遊離反応基、例えばアミンおよびチオール基
などの間の共有結合など、当該分野の専門家に公知のリンカーを介した吸収およ
び吸着または共有結合が最も一般に用いられる方法である（例えば、そのような
試薬の調製と使用を記載し、そのような試薬の市販源を提供するPIERCE CATALOG
, ImmunoTechnology Catalog & Handbook, 1992-1993; Wong, Chemistry of Pro
tein Conjugation and Cross Linking, CRC Press (1993)を参照されたい。; 光
感受性リンカーを記載するDeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90
:6909 (1993); Zuckermann et al., J. Am. Chem. Soc., 114:10646 (1992); Ku
rth et al., J. Am. Chem. Soc., 116:2661 (1994); Ellman et al., Proc. Nat
l. Acad. Sci. U.S.A., 91:4708 (1994); Sucholeiki, Tetrahedron Lttrs., 35
:7307 (1994); Su-Sun Wang, J. Org. Chem., 41:3258 (1976); Padwa et al.,
J. Org. Chem., 41:3550 (1971); and Vedejs et al., J. Org. Chem., 49:575
(1984)も参照されたい）。
【０２２１】 固定化を達成するために、タンパク質または他の生物分子を含む組成物を、ア
ルミナ、炭素、イオン交換樹脂、セルロース、ガラス、またはセラミックなどの
支持マトリックスと接触させる。フッ化炭素ポリマーが、生物分子が吸着により
結合された支持体として用いられている（Ｕ．Ｓ．特許第３、６４３、４４３；
公開された国際ＰＣＴ出願ＷＯ／８６０３８４０を参照されたい）。
【０２２２】 Ｇ．予防および診断 エンドセリアーゼタンパク質、そのドメイン、類似体および誘導体、エンドセ
リアーゼ核酸（およびそれに相補的な配列）、および抗エンドセリアーゼ抗体が
診断に用いられる。そのような分子をイムノアッセイなどのアッセイで用いて、
エンドセリアーゼの発現を冒す種々の症状、病気、および障害を検出、予防、診
断、またはモニターすること、またはその治療をモニターすることができる。特
に、そのようなイムノアッセイは、患者由来のサンプルを、免疫特異的結合が起
こり得る条件下で抗エンドセリアーゼ抗体と接触させること、次いで抗体による
免疫特異的結合の量を検出または測定することを含む方法により行われる。特定
の態様では、組織小片におけるそのような抗体の結合を用いて、異常なエンドセ
リアーゼの同定またはエンドセリアーゼタンパク質の異常な（例えば、低い、ま
たは存在しない）レベルを検出することができる。特定の具体例では、エンドセ
リアーゼタンパク質に対する抗体を用いて、患者の組織または血清サンプル中の
エンドセリアーゼタンパク質の存在をアッセイすることができ、ここで、エンド
セリアーゼタンパク質の異常なレベルが、疾患症状の指標である。
【０２２３】 用いることができるイムノアッセイには、制限されるものではないが、ウエス
タンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ
）、「サンドウィッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル
拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、捕体−固定アッセイ、免疫
放射線分析アッセイ、蛍光イムノアッセイ、タンパク質Ａ免疫アッセイなどの方
法を用いる競合および非競合アッセイシステムが含まれる。
【０２２４】 相補配列を含むエンドセリアーゼ遺伝子および関連する核酸配列および配列も
、ハイブリダイゼーションアッセイに用いることができる。エンドセリアーゼ核
酸配列、少なくとも約８ヌクレオチド、好ましくは１４または１６またはそれ以
上の連続ヌクレオチドを含むそのサブ配列をハイブリダイゼーションプローブと
して用いることができる。ハイブリダイゼーションアッセイを用いて、エンドセ
リアーゼの発現および／または活性の前記のような異常な変化に伴う症状、疾患
または状病を検出、予防、診断またはモニターすることができる。特に、そのよ
うなハイブリダイゼーションアッセイは、核酸を含むサンプルを、エンドセリア
ーゼＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイズすることができる核酸プローブとハイ
ブリダイゼーションが起こり得るような条件下で接触させ、ついで、生じる全ハ
イブリダイゼーションを検出または測定することによる方法により行われる。
【０２２５】 特定の具体例では、患者におけるエンドセリアーゼの異常なレベルを検出する
ことにより特徴づけられる病気または疾患のための方法が、患者由来のサンプル
中の、配列番号：１に示すヌクレオチド配列を有する核酸にハイブリダイズする
核酸により少なくとも部分的にコードされる内皮エンドセリアーゼのＤＮＡ、Ｒ
ＮＡ、タンパク質または機能活性のレベルを測定することにより本明細書中に提
供され、ここで、エンドセリアーゼのＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質または機能活
性の、病気または疾患を有しない類似サンプルに見出されるＤＮＡ、ＲＮＡ、タ
ンパク質または機能活性のレベルに対する増加または低下が、患者に病気または
疾患が存在していることを示すものである。
【０２２６】 他の特定の具体例では、患者における望ましくないおよび／または制御できな
い血管形成に伴う病気または疾患を進行させる疾病素因の存在を診断する、また
はスクリーニングする方法が、患者由来のサンプル中で、配列番号：１に示す核
酸配列を有する核酸にハイブリダイズする核酸により少なくとも部分的にコード
されるエンドセリアーゼのＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、または機能活性のレベ
ルを測定することにより提供され、ここで、該サンプルにおけるＤＮＡ、ＲＮＡ
、タンパク質または機能活性の、望ましくないおよび／または制御できない血管
形成を有しない相同サンプルに見出されるＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質または機
能活性のレベルに対する増加が望ましくないおよび／または制御できない血管形
成の存在を示すものである。
【０２２７】 さらに別の特定の具体例では、患者において不完全な血管形成に伴う病気また
は疾患を進行させる疾病素因の存在を診断またはスクリーニングする方法であっ
て、患者由来のサンプル中で、配列番号：１に示すヌクレオチド配列を有する核
酸にハイブリダイズする核酸により少なくとも部分的にコードされるエンドセリ
アーゼのＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、または機能活性のレベルを測定すること
による方法が本明細書中に提供され、ここで、該サンプルにおけるＤＮＡ、ＲＮ
Ａ、タンパク質または機能活性の、不完全な血管形成を有しない類似サンプルに
見出されるＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質または機能活性のレベルに対する減少が
、不完全な血管形成の存在を示すものである。
【０２２８】 １またはそれ以上のコンテナに抗−エンドセリアーゼ抗体および任意に、抗体
に対する標識結合対を含む診断用キットも提供される。別法として、抗−エンド
セリアーゼ抗体は（検出可能なマーカー、例えば、化学発光、酵素、蛍光、また
は放射能活性部分で）標識されることができる。１またはそれ以上のコンテナ中
、エンドセリアーゼをコードしているＲＮＡにハイブリダイズすることができる
核酸プローブを含むキットも提供される。特定の具体例では、キットには、[例
えば、エンドセリアーゼをコードしている核酸の少なくとも一部に関して適当な
反応条件下でのポリメラーゼ鎖反応（例えば、Innis et al., 1990, PCR Protoc
ols, Academic Press, Inc., San Diego, CAを参照されたい）、Ｑβレプリカー
ゼを用いるリガーゼ鎖反応（ＥＰ３２０,３０８を参照されたい）、サイクリッ
クプローブ反応、および当該分野で公知の他の方法により]増幅を開始すること
ができるプライマー対（例えば、それぞれ６−３０ヌクレオチドのサイズ範囲の
）を、１またはそれ以上のコンテナ中に含めることができる。キットは、コンテ
ナ中、スタンダードまたはコントロールとして使用するための予め決定された量
の精製エンドセリアーゼタンパク質または核酸をさらに含むことができる。
【０２２９】 Ｈ．医薬組成物および投与様式 １．組成物の成分 同定されたエンドセリアーゼの活性を調節する化合物を含む医薬組成物が、本
明細書中に提供される。エンドセリアーゼの活性を調節する化合物と、異常な血
管形成が関与する疾患の治療のための他の治療薬または化合物、例えば前−脈潅
形成治療薬または治療剤、または抗−血管形成治療薬または治療剤との組み合わ
せも提供される。所定の具体例では、エンドセリアーゼの活性を調節する化合物
は、その活性を阻害し、他の化合物は抗血管形成治療薬または治療剤である。
【０２３０】 エンドセリアーゼモジュレーターおよび抗血管形成または前−血管形成剤は、
同時、または連続、または断続投与のために、別個の組成物として封入されるこ
とができる。別法として、それらは単一組成物としての投与のための単一組成物
中に含めることができる。組み合わせはキットとして封入されることができる。
【０２３１】 ａ．エンドセリアーゼ阻害物質 本明細書に記載されるものを含む、単独または他の化合物と組み合わせて用い
られた場合に、望ましくないおよび／または制御できない血管形成に伴う臨床症
状または診断マーカー、特に血管奇形および心血管障害、慢性炎症性疾患および
異常な創傷治癒、循環疾患、クレストシンドローム、皮膚疾患または眼病を緩和
、減じ、改善、予防する、またはその鎮静状態におく、または維持することがで
きるあらゆるエンドセリアーゼ阻害物質を、本組み合わせに用いることができる
。
【０２３２】 一の具体例では、エンドセリアーゼ阻害物質は、抗体、またはエンドセリアー
ゼまたはそのプロテアーゼドメインと特異的に反応するそのフラグメント、エン
ドセリアーゼ産生の阻害物質、上皮エンドセリアーゼの膜−局在性の阻害物質、
またはエンドセリアーゼの発現または活性のいずれかの阻害物質である。
【０２３３】 ｂ.抗−血管形成剤 本明細書に記載されるものを含む、単独または他の化合物と組み合わせて用い
られた場合に、望ましくないおよび／または制御できない血管形成に伴う臨床症
状または診断マーカー、特に充実性腫瘍、血管奇形および心血管障害、慢性炎症
性疾患および異常な創傷治癒、循環疾患、クレストシンドローム、皮膚疾患また
は眼病を緩和、減じる、改善する、予防するまたはその鎮静状態におくまたは維
持することができるあらゆる抗血管形成剤を、組み合わせに用いることができる
。
【０２３４】 特定の具体例では、組み合わせに用いられる抗血管形成剤は、基底膜の脱落の
阻害物質、細胞移動の阻害物質、内皮細胞増殖の阻害物質、開存性の三次元組成
および確立の阻害物質、または生理的または物理的抗血管形成治療薬である。
【０２３５】 抗血管形成剤の例には、制限されるものではないが、阻害物質、エンドスタチ
ン、タキソール、ＴＧＦ−β、ＦＧＦ阻害物質（周知の抗血管形成剤の総合的な
リストに関しては、Auerbach and Auerbach, Pharmacol. Ther., 63(3):265-311
(1994)を参照されたい）が含まれる。組み合わせに使用される特定の抗血管形
成剤には、ＡＧＭ−１４７０（ＴＮＰ−４７０）、アンジオスタティックステロ
イド、アンジオスタチン、ａｖβ３に対する抗体、ｂＦＧＦに対する抗体、ＩＬ
−１に対する抗体、ＴＮＦ−αに対する抗体、ＶＥＧＦに対する抗体、アウラノ
フィン、アザチオプリン、ＢＢ−９４、ＢＢ−２５１６、塩基性ＦＧＦ−可溶性
レセプター、カルボキシアミド−トリゾール（ＣＡＩ）、軟骨誘導性阻害物質（
ＣＤＩ）、キチン、クロロキン、シスプラチン、ＣＭ１０１、コルチソン/ヘパ
リン、コルチソン／ヒアルロフラン、コルテキソロン／ヘパリン、ＣＴ−２５８
４、シクロホスファミド、シクロスポリンＡ、デクスアメタソン、ジクロフェナ
ック／ヒアルロナン、好酸球主要塩基性タンパク質、フィブロネクチンペプチド
、グリオーム誘導性血管形成阻害因子（ＧＤ−ＡＩＦ）、ＧＭ１４７４、塩化金
、硫黄金、ヘパリナーゼ、ヒアルロナン（高分子量種および低分子量種）、ヒド
ロコルチソン／ベータ−シクロデキストラン、イブプロフェン、インドメタシン
、インターフェロン−アルファ、インターフェロンガンマ誘導性タンパク質１０
、インターフェロン−ガンマ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ラ
ミニン、レバミソール、リノミド、ＬＭ６０９、マリマスタット（ＢＢ−２５１
６）、メドロキシプロゲステロン、Ｍｅｔａｓｔａｔ（Ｃｏｌ−３）、メトトレ
キシエート、ミノシクリン、酸化窒素、オクトレオチド（ソマトスタチン類似体
）、Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ、Ｄ−ペニシルラミン、ペントサンポリスルフェート
、胎盤プロリフェリン関連タンパク質、胎盤Ｒｎａｓｅ阻害物質、プラスミドゲ
ンアクチベーター阻害物質（ＰＡＩｓ）、血小板因子−４（ＰＦ４）、プレドニ
ソロン、プロラクチン（１６−Ｋｄａフラグメント）、プロリフェリン関連タン
パク質、プロスタグランジンシンターゼ阻害物質、プロタミン、レチノイド、Ｒ
ｏｑｕｉｎｉｍｅｘ（ＬＳ−２６１６、リノミド）、ソマトスタチン、物質Ｐ、
スラミン、ＳＵ１０１、テコガランナトリウム（ＤＳ−４１５２）、テトラヒド
ロコルチゾール−トロンボスポンジン（ＴＳＰｓ）、メタロプロテイナーゼの組
織阻害物質（ＴＩＭＰ１、２、３）、血管内皮成長因子阻害物質、ビタミンＡ，
ビタキシン、硝子液、タリドミド、３−アミノタリドミド、３−ヒドロキシタリ
ドミドおよびタリドミドの代謝産物または加水分解生成物、３−アミノタリドミ
ドまたは３−ヒドロキシタリドミドが含まれる（O'Reilly, Investigational Ne
w Drugs, 15:5-13 (1997); J. Nat'l Cancer Instit., 88:786-788 (1996); U.S
. Patent Nos. 5,593,990, 5,629,327 および 5,712,291を参照されたい）。
【０２３６】 Ｃ．前−抗血管形成剤 本明細書に記載されるものを含む、単独または他の化合物と組み合わせて用い
られた場合に、生理的血管形成、特に正常な胎盤、胚、胎児および出生後の発生
および成長、卵巣、黄体および月経後の子宮内膜の生理的な周期性の発達または
創傷治癒に関与する血管形成を促進することができるあらゆる前−血管形成剤を
、本組み合わせに用いることができる。
【０２３７】 組み合わせに用いられる前−血管形成剤は、前−血管形成サイトカインであり
得る（Desai and Libutti, J. Immunother., 22(3):186-211 (1999)）。より好
ましくは、用いられる前−血管形成サイトカインは、ｂＦＧＦおよびＦＧＦ−２
などの塩基性繊維芽細胞成長因子、ＶＥＧＦ／ＶＰＦおよびバスクロトロピンな
どの血管内皮成長因子／血管透過因子、ＰＤ−ＥＤＧＦおよびチミジンホスホリ
ラーゼなどの血小板誘導性内皮細胞成長因子、形質移入成長因子−ベータ（ＴＧ
Ｆ−β）またはアンジオポイエチン−１（Ａｎｇ−１）である。
【０２３８】 ２．製剤および投与経路 本明細書中の化合物および剤は、好ましくは単一投与量投与のための医薬組成
物として調製される。製剤中の化合物の濃度は、投与に際し、送達に有効な量、
意図される治療に有効な量である。典型的には、組成物は、単一投与量投与のた
めに処方される。組成物を処方するために、化合物またはその混合物の重量フラ
クションを、治療される症状が軽減または緩和するような有効濃度で、選択され
たビヒクル中に溶解、懸濁、分散、またはそのほか、混合される。本明細書に提
供される化合物の投与に適した医薬キャリアまたはビヒクルには、特定の投与様
式に適した、当該分野の専門家に公知のいずれかのそのようなキャリアが含まれ
る。
【０２３９】 加えて、化合物は、組成物中に単独の医薬活性成分として処方されてよく、ま
たは他の活性成分と組み合わされてよい。組織標的リポソームを含むリポソーム
懸濁液が、医薬上許容されるキャリアとして適している可能性もある。これらは
、当該分野の専門家に公知の方法に従い調製されることができる。例えば、リポ
ソーム製剤は、Ｕ．Ｓ．特許第４,５２２,８１１に記載のように調製されること
ができる。
【０２４０】 活性化合物は、治療される患者に望ましくない副作用を起こさずに治療上有効
な効果を発揮するのに十分な量で、医薬上許容されるキャリア中に含まれる。治
療上有効な濃度は、公知のインビトロおよびインビボ系で、例えば本明細書に提
供されるアッセイにおいて、化合物を試験することにより経験的に決定されるこ
とができる。
【０２４１】 薬物組成物中の活性化合物の濃度は、活性化合物の吸収、不活性化および排出
速度、化合物の物理化学的特性、投与スケジュールおよび投与量ならびに当該分
野の専門家に公知の他の要因に依存する。 典型的には、治療有効投与量が意図される。投与される量は、血液容積の０．
００１から１ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．００５−０．０５ｍｇ／ｍｌ、より
好ましくは約０．０１ｍｇ／ｍｌのオーダーであってよい。医薬投与単位製剤は
、投与単位製剤当たり、約１ｍｇから約１００ｍｇ、および好ましくは約１０か
ら約５００ｍｇ、より好ましくは約２５−７５ｍｇの必須活性成分または必須活
性成分の組み合わせを提供するべく調製される。詳細な投与量は、経験的に決定
され得る。
【０２４２】 活性成分は一度に投与されてよく、または間隔を置いて投与されるべく、多く
の少量の投与量に分けられてよい。正確な投与量および治療期間が、治療される
疾患に作用し、公知の試験プロトコルを用いて、またはインビボまたはインビト
ロ試験データから外挿により経験的に決定されてよい。濃度および投与値は、疾
患の重篤度が緩和される範囲で変化させてもよい。いずれの特定の対象に関して
も、特定の投与管理は、個人の必要性および組成物を投与している主治医または
組成物の投与を管理している主治医の専門的な判断により、時間をかけて調整さ
れるべきこと、および本明細書に示した濃度範囲は例にすぎず、権利が要求され
る組成物およびそれらを含む組み合わせの範囲または使用を制限するものではな
いことがさらに理解されるべきである。
【０２４３】 好ましい医薬上許容される誘導体には、酸、塩、エステル、水和物、溶媒化合
物およびプロドラッグ形態が含まれる。誘導体は典型的には、その薬物動態特性
が対応する中性化合物よりも優れるように選択される。 こうして、全身、局所、または局部投与のために適した医薬上許容されるキャ
リアまたはビヒクルと、有効濃度または有効量の１またはそれ以上の本明細書に
提供される化合物、またはその医薬上許容される誘導体を組み合わせて、医薬組
成物が形成される。化合物は、治療が意図される疾患を緩和または治療するのに
有効な量で含まれる。組成物中の活性化合物の濃度は、活性化合物の吸収、不活
性化、排出速度、投与スケジュール、投与量、特定の形態ならびに当該分野の専
門家に公知の他の要因に依存する。
【０２４４】 非経口、皮内、皮下、または局所適用に用いられる溶液または懸濁液には、以
下の成分のいずれかを含めることができる：滅菌希釈液、例えば注射用水、塩水
溶液、固定オイル、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコー
ルまたは他の合成溶媒、抗微生物剤、例えばベンジルアルコールおよびメチルパ
ラベン；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸および重亜硫酸ナトリウム；キレート
剤、例えばエテレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）；バッファー、例えばアセ
テート、シトレートおよびホスフェート等；および強壮調整剤、例えば塩化ナト
リウムまたはデキストロースなどを含めることができる。非経口調製物は、アン
プル、使い捨て注射器、または、ガラス、プラスチックまたは他の適当な物質か
ら成る単一または複数投与バイアルであり得る。
【０２４５】 化合物が不充分な溶解度を示す物質に関して、化合物を溶解する方法を用いて
よい。そのような方法は、本分野の専門家に公知であり、および、制限されるも
のではないが、補溶媒、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を用いること
、界面活性剤、例えばトゥイーン（登録商標）を用いること、または重炭酸ナト
リウム水溶液に溶解することが含まれる。化合物のプロドラッグなどの化合物の
誘導体も、有効な医薬組成物を調製するのに用いてよい。
【０２４６】 目の症状に関しては、組成物は、目に許容されるキャリア中に処方される。本
明細書における目における使用のためには、局所投与または注射のいずれかによ
る局部投与が好ましい。時間徐放製剤も望ましい。典型的には、組成物は、単一
投与により有効量が投与される単一投与量投与のために処方される。 化合物をビヒクルと混合して、または化合物にビヒクルを添加して生じる混合
物は、溶液、懸濁液、エマルジョンまたは他の組成物であってよい。生じる混合
物の形態は、投与に関して意図される様式、および選択されるキャリアまたはビ
ヒクル中の化合物の溶解度を含む多くの要因に依存する。所望により、化合物の
医薬上許容される塩または他の誘導体が調製されてよい。
【０２４７】 化合物は、治療される患者に望ましくない副作用を起こさない、治療上有効な
効果を発揮するのに十分な量で医薬上許容されるキャリアに含まれる。副作用の
数および程度は、化合物が投与される疾患に依存することが理解される。例えば
、重篤度の低い疾患を治療する場合には許容されない一定の毒性および望ましく
ない副作用が、生命を脅かす病気を治療する場合には許容される。
【０２４８】 化合物は、所望の活性を損なわない他の活性物質と、または、本明細書にて提
供される治療が意図される異常な血管形成および他の疾患に伴う病気または疾患
を治療するための当該分野で公知の所望の、所望の活性を補足する物質と混合さ
れることもできる。
【０２４９】 本明細書における使用のための化合物および剤の調製には、経口、直腸、局所
、吸入、頬面（例えば舌下）、非経口（例えば、皮下、筋肉内、皮内または静脈
内）、経皮投与またはいずれかの経路に適したものが含まれる。いずれかの所定
の場合に最も適した経路は、治療される疾患の性質および重篤度、用いられる特
定活性化合物の性質に依存する。 製剤は、単一投与製剤、例えば錠剤、カプセル、ピル、粉末、顆粒、滅菌非経
口溶液または懸濁液および経口溶液または懸濁液および化合物または医薬上許容
されるその誘導体の適当な量を含むオイル−水エマルジョンで、ヒトおよび動物
に投与するために提供される。医薬治療活性化合物およびその誘導体は、典型的
には単位投与製剤または多投与製剤に製剤化され、および投与される。本明細書
に用いられる単位投与製剤は、ヒトおよび動物対象に適した、および当該分野で
公知のように個々に封入される物理的に別個の単位を言う。各単位投与製剤は、
所望の医薬キャリア、ビヒクルまたは希釈剤と共に、所望の治療効果を生じるの
に十分な、予め決定された量の治療活性化合物を含む。単位投与製剤の例には、
アンプルおよび注射器、および個々に封入された錠剤またはカプセルが含まれる
。単位投与製剤は、そのフラクションで、または多数で投与されてよい。多投与
製剤は、隔離された単位投与製剤にて投与される、単一容器に封入された、複数
の同一単位投与製剤である。多投与製剤の例には、バイアル、錠剤のボトル、ま
たはカプセルまたはパイントまたはガロンのボトルが含まれる。つまり、多投与
製剤は、パッケージ中で分離されない複数の単位投与である。
【０２５０】 組成物は、活性成分と共に、ラクトース、スクロース、リン酸二カルシウムま
たはカルボキシメチルセルロースなどの希釈剤、ステアリン酸マグネシウム、ス
テアリン酸マグネシウムおよびタルクなどの潤滑剤、およびスターチなどの結合
剤、アカシアゼラチンなどの天然ガム、グルコース、糖蜜、ポリビニルピロリジ
ン、セルロースおよびその誘導体、ポビドン、クロスポビドン、および当該分野
で公知の他の結合剤を含むことができる。液体の医薬投与可能組成物は、例えば
、前記活性化合物と任意に医薬アジュバントを、例えば水、塩水、デキストロー
ス水溶液、グリセロール、グリコール、エタノールなどのキャリア中に溶解、分
散しまたは別に混合することにより調製されて、溶液または懸濁液が形成される
。所望の場合、投与されるべき医薬組成物は、少量の非毒性補助物質、例えば湿
剤、乳化剤、または溶解剤、ｐＨ緩衝剤など、例えばアセテート、クエン酸ナト
リウム、シクロデキストリン誘導体、ソルビタンモノラウレート、トリエタノー
ルアミンナトリウムアセテート、トリエタノールアミンオレエート、および他の
そのような剤も含むことができる。そのような投与製剤を調製する実際の方法は
、当該分野の専門家には公知であり、明らかであろう。例えば、Remington's Ph
armaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 15th Editio
n, 1975を参照されたい。投与されるべき組成物または製剤はいずれの場合も、
治療される対象の症状を緩和するのに十分な量の活性化合物を含む。
【０２５１】 非毒性キャリアから成る、０．００５％から１００％の範囲のバランスで活性
成分を含む組成物の投与製剤を調製することができる。 経口投与のためには、医薬組成物は例えば、結合剤（例えば、予めゼラチン化
されたトウモロコシスターチ、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピル
メチルセルロース）、充填剤（例えば、ラクト−ス、ミクロクリスタリンセルロ
ース、またはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシ
ウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えば、ポテトスターチまたはナトリウ
ムスターチグリコレート）；または湿剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）など
の医薬上許容される賦形剤を用いて、常套の方法により調製される、例えば錠剤
またはカプセルの形態をとってよい。錠剤は、当該分野で周知の方法によりコー
トされてよい。
【０２５２】 医薬調製物は、液体形態、例えば溶液、シロップまたは懸濁液であってもよく
、または水または他の適当なビヒクルで、使用前に復元するための薬品として存
在してよい。そのような液体調製物は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ
、セルロース誘導体または水素化食用脂肪）などの医薬上許容される添加剤；乳
化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）：非水性ビヒクル（例えば、アーモン
ドオイル、油状エステルまたは分別植物油）；および保存剤（例えば、メチルま
たはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）を用いて常套放
により調製されてよい。
【０２５３】 直腸投与に適した製剤は、好ましくは単位投与坐薬として存在する。これらは
、活性化合物を１またはそれ以上の常套の固体キャリア、例えばココアバターと
混合し、次いで生じる混合物を成形することにより調製されてよい。
【０２５４】 皮膚または目への局所適用に適した製剤は、好ましくは軟膏、クリーム、ロー
ション、ペースト、ゲル、スプレー、エアゾルまたはオイルの形態をとる。用い
てよいキャリアには、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコー
ル、およびそれらの２またはそれ以上の組み合わせが含まれる。局所製剤は、好
都合には、さらに０．０５から１５％重量の、ヒドロキシプロピルメチルセルロ
ース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ
（アルキレングリコール）、ポリ/ヒドロキシアルキル、（メチル）アクリレー
トまたはポリ（メチル）アクリルアミドから選択される濃縮剤を含んでよい。局
所製剤は、点滴により、または軟膏として、結膜嚢に適用されることが最も多い
。しかし、目、顔洞、および外部耳道の洗浄または潤滑のためにも用いることが
できる。前眼房およびその他の場所にも注射することができる。液体状態の局所
製剤は、小片、コンタクトレンズなどの形態の親水性の三次元ポリマーマトリッ
クスで存在してもよく、そこから活性成分が放出される。
【０２５５】 吸入による投与のために、本明細書に用いられる化合物は、加圧されたパック
またはネブライザーからのエアゾールスプレー形態で、適当な推進剤、例えばジ
クロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロ
エタン、二酸化炭素または他の適当なガスを用いて送達されることができる。加
圧されたエラゾルの場合、投与ユニットは、測定量を送達するためのバルブを提
供することにより決定されてよい。吸入器または吹き入れ器に使用するための、
例えば、ゼラチンのカプセルおよびカートリッジを、化合物の粉末混合物および
ラクトースまたはスターチなどの適当な基材の粉末混合物を含めて調製してよい
。
【０２５６】 頬面（舌下）投与に適した製剤には、風味基材、たいてい蔗糖およびアカシア
またはトラガカント中に活性化合物を含むトローチ剤、およびゼラチンおよびグ
リセリンまたは蔗糖およびアカシアなどの不可性基材中に化合物を含む錠剤が含
まれる。 化合物は、例えばボーラス注射または継続点滴による注射による非経口投与の
ために調製されてよい。注射のための製剤は、単一投与製剤、例えば、アンプル
または多投与コンテナ中に、添加保存剤と共に存在してよい。組成物は、油性ま
たは水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンなどの形態をとってよく
、および懸濁剤、安定剤および／または分散剤などの成形剤を含んでよい。別法
として、活性成分は、適当なビヒクル、例えば滅菌性の発熱物質を含まない水ま
たは他の溶媒で使用前に構築させるための粉末形態であってよい。
【０２５７】 経皮投与に適した製剤は、長期間、患者の表皮に密着させるのに適した別々の
パッチとして存在してよい。そのようなパッチは適切には、活性化合物に対して
例えば０．１から０．２Ｍの濃度の任意に緩衝処理された水溶液として活性化合
物を含む。経皮投与に適した製剤は、イオン投入法（例えばPharmaceutical Res
earch 3 (6), 318 (1986)を参照されたい）により送達されてもよく、典型的に
は、任意に緩衝処理された活性化合物水溶液の形態をとる。
【０２５８】 前記の一般的投与形態に加えて、医薬組成物は、制御放出法および／または送
達装置により投与されてもよい（例えば、U.S. Patent Nos. 3,536,809; 3,598,
123; 3,630,200; 3,845,770; 3,847,770; 3,916,899; 4,008,719; 4,687,610; 4
,769,027; 5,059,595; 5,073,543; 5,120,548; 5,354,566; 5,591,767; 5,639,4
76; 5,674,533 and 5,733,566を参照されたい）。 血漿レベルにより確認されるように、所望のレベルは、活性剤を継続注入する
ことにより維持されることができる。主治医には、毒性、または骨髄、肝臓また
は腎臓の機能不全のために治療を終結させ、中断させ、または低投与量に調製す
る方法および時期が分かるであろう。逆に、主治医には、臨床反応が適切でない
場合に（毒性の副作用を持たない）より高いレベルに治療を調整する方法と時期
も分かるであろう。
【０２５９】 単独または抗血管形成剤または前−血管形成剤と組み合わせてエンドセリアー
ゼ阻害物質の効力および／または毒性は、当該分野で公知の方法によりさらに評
価することができる（一般に、O'Reilly, Investigational New Drugs, 15:5-13
(1997)を参照されたい）。例えば、インビトロでの内皮細胞増殖、移動および
管形成を阻害する標的化合物の能力に基づくインビトロ血管形成アッセイを用い
ることができる。別法として、ニワトリ漿尿膜（ＣＡＭ）アッセイおよびディス
ク血管形成アッセイなどのインビボ血管形成アッセイを用いることができる。好
ましくは、角膜血管形成アッセイなどのインビボで血管形成阻害物質を評価する
ために確立されている前臨床モデル、目の血管形成の霊長類モデル、転移モデル
、一次腫瘍成長モデルおよび腫瘍成長の遺伝子組換えマウスモデルを用いること
ができる。
【０２６０】 活性化合物または医薬上許容される誘導体は、時間徐放製剤またはコーティン
グなど、体から早く排出されることから化合物を保護するキャリアを用いて調製
されてよい。 組成物および／またはその投与に関する説明書と合わせたものを含むキットが
提供される。キットにはさらに、好ましくは滅菌形態で封入された、複合体を注
射するための注射針または注射器および／または封入されたアルコールパッドを
含めてよい。説明書は、臨床医または患者による活性剤の投与のために含められ
てよい。
【０２６１】 最終的に、化合物またはエンドセリアーゼまたはそのプロテアーゼドメインま
たは前記剤のいずれか一つを含む組成物が、パッケージング材料、パッケージン
グ材料中、本明細書で意図される病気または疾患の治療に有効な本明細書に提供
される化合物、および化合物またはその適当な誘導体が本明細書に意図される病
気または疾患の治療のためのものであることを示すラベルを含む製品として封入
されてよい。ラベルには、治療が保証される疾患を含めることができる。
【０２６２】 １．治療法 １．望ましくない血管形成の治療 哺乳動物における望ましくないおよび／または制御できない血管形成に伴う病
気または疾患を治療または予防するために用いられる化合物および組み合わせが
本明細書中に提供される。一具体例では、該方法には、哺乳動物に病気または疾
患を治療または予防する有効量のエンドセリアーゼの阻害物質を投与することが
含まれる。好ましい具体例では、治療または予防に用いられるエンドセリアーゼ
阻害物質は、医薬上許容されるキャリアまたは賦形剤と共に投与される。治療さ
れる哺乳動物はヒトであり得る。
【０２６３】 他の具体例では、治療または予防法には、エンドセリアーゼの活性を阻害する
ことが認められたいずれかの化合物であり得、抗体、またはエンドセリアーゼに
対するその結合領域を含むそのフラグメントもしくは誘導体、エンドセリアーゼ
をコードしているアンチセンス核酸、および異種ヌクレオチド配列がエンドセリ
アーゼをコードしている遺伝子の少なくとも一部の生物活性を不活性化するよう
に異種ヌクレオチド配列が挿入されている、エンドセリアーゼをコードしている
遺伝子の少なくとも一部を含む核酸が含まれるエンドセリアーゼ阻害物質と同時
に、その前に、またはその後に、抗血管形成治療薬または治療剤を投与をするこ
とがさらに含まれる。
【０２６４】 治療または予防されるべき望ましくないまたは異常な血管形成は、充実性腫瘍
、血管奇形および心血管障害、慢性炎症性疾患および異常な創傷治癒、循環障害
、クレストシンドローム、皮膚疾患、または眼病に関連する。治療または予防さ
れるべき血管奇形および心血管障害には、血管繊維腫、血管脂肪腫、アテローム
性動脈硬化症、再狭窄／再潅流障害、動静脈奇形、血管腫(hemangiomatosis)お
よび血管癒着、血管過誤腫を伴う半側型軟骨形成障害（ファフィッチシンドロー
ム）(dyschondroplasia with vascular hamartomas(Fafucci's syndrome)、遺伝
性出血性毛細血管拡張症(ランデュ−オスラー−ウェーバーシンドローム)または
フォン・ヒッペル・リンダウシンドロームが含まれる。治療または予防されるべ
き慢性炎症性疾患は、真性糖尿病、血友病性関節炎、炎症性腸疾患、進行性骨折
、（迅速に進行する、および若年性の）歯周炎、乾癬、リューマチ性関節炎静脈
鬱血性潰瘍、顆粒熱傷(granulations-burns)、瘢痕性蟹足腫、肝硬変、骨放射線
壊死、術後癒着、化膿性肉芽腫または全身性硬化症である。治療または予防され
るべき循環障害は、レイノー現象である。治療または予防されるべきクレストシ
ンドロームは、石灰症、食道、ディオモティロティ(dyomotiloty)、手指硬化症
およびティーンジエクタシス(teangiectasis)である。治療または予防されるべ
き皮膚疾患は、全身性血管炎、硬皮症、壊疸性膿皮症、血管障害、静脈潰瘍、動
脈潰瘍、スタージ・ウェーバー(Sturge-Wever)シンドローム、赤酒しみ様血管腫
、青色ゴム乳首様母斑、クリッペル−トレノーレイ−ウェーバー(Klippel-Trena
unay-Weber)シンドロームおよびオスラー-ウェーバー−ランデュ(Osler-Weber-R
endu)シンドロームである。治療または予防されるべき眼病は、眼新血管新生病
により引き起こされる失明、角膜移植新血管新生、目の黄斑変性症、新血管新生
緑内障、トラコーマ、糖尿病性網膜症、近視性変性症、未熟児網膜症、水晶体後
部繊維増殖症または角膜新血管新生病である。
【０２６５】 ａ．アンチセンス治療 前記のような特定の具体例では、エンドセリアーゼの機能がエンドセリアーゼ
アンチセンス核酸により減じられ、または阻害されて、望ましくないおよび／ま
たは制御できない血管形成に伴う病気または疾患が治療または予防される。エン
ドセリアーゼまたはその部分をコードしている遺伝子またはｃＤＮＡに対するア
ンチセンスである少なくとも６のヌクレオチドから成る核酸の治療的または予防
的使用である。本明細書に用いられるエンドセリアーゼ「アンチセンス」核酸は
、いくらかの配列相補性によりエンドセリアーゼＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）
の一部にハイブリダイズすることができる核酸を言う。アンチセンス核酸は、エ
ンドセリアーゼｍＲＮＡのコーディングおよび／または非コーディング領域に相
補的であり得る。そのようなアンチセンス核酸は、エンドセリアーゼの機能を減
じるまたは阻害する治療薬として有用であり、前記の疾患の治療または予防に用
いられることができる。
【０２６６】 エンドセリアーゼアンチセンス核酸は、少なくとも６ヌクレオチドからなり、
および好ましくはオリゴヌクレオチド（６から約１５０ヌクレオチド、または好
ましくは６から５０ヌクレオチド）である。特定の態様では、オリゴヌクレオチ
ドは少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも１
００ヌクレオチド、または少なくとも１２５ヌクレオチドである。オリゴヌクレ
オチドは、１本鎖または２本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡまたはキメラ混合物または
その誘導体またはその変更形態であり得る。オリゴヌクレオチドは、塩基部分、
糖部分またはリン酸骨格で修飾することができる。オリゴヌクレオチドには、ペ
プチドなどの他の付加基または細胞膜（Letsinger et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A. 86:6553-6556 (1989); Lemaitre et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 84:648-652 (1987); PCT Publication No. WO 88/09810, published De
cember 15, 1988を参照されたい）または血−脳関門（PCT Publication No. WO
89/10134, published April 25, 1988を参照されたい）を横切る輸送を促進する
剤、ハイブリダイゼーション誘発切断剤（Krol et al., BioTechniques 6:958-9
76 (1988)を参照されたい）または介在剤（例えば、Zon, Pharm. Res. 5:539-54
9 (1988)を参照されたい）が含まれてよい。
【０２６７】 エンドセリアーゼアンチセンス核酸は、好ましくはオリゴヌクレオチド、より
好ましくは１本鎖ＤＮＡのオリゴヌクレオチドである。好ましい態様では、オリ
ゴヌクレオチドには、ヒトエンドセリアーゼの一部に対する配列アンチセンスが
含まれる。オリゴヌクレオチドは、その構造上、当該分野で一般に知られる置換
基で、いずれかの位置で修飾されてよい。
【０２６８】 エンドセリアーゼアンチセンスオリゴヌクレオチドは、制限されるものではな
いが、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−
ヨードウラスル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（
カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−
２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラ
シル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルクエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニル
アデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２,２−ジメチルグアニ
ン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチ
ルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウ
ラスル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシ
ルクエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシ
ル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢
酸（ｖ）、イブトキソシン、シュードウラシル、クエオシン、２−チオシトシン
、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−
メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オ
キシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−
２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２,６−ジアミノ
プリンが含まれる。
【０２６９】 他の具体例では、オリゴヌクレオチドには、制限されるものではないが、アラ
ビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロースおよびヘキソースを含む群
から選択される少なくとも一つの修飾された糖部分が含まれる。オリゴヌクレオ
チドには、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミドチオエ
ート、ホルホルアミデート、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アル
キルホスホトリエステルおよびホルムアセタールまたはその類似体から選択され
る少なくとも一つの修飾されたリン酸骨格が含まれ得る。
【０２７０】 オリゴヌクレオチドは、α−芳香族オリゴヌクレオチドであり得る。α−芳香
族オリゴヌクレオチドは、鎖が互いに平衡に並んでいる相補的ＲＮＡと特定の二
本鎖ハイブリッドを形成する（Gautier et al., Nucl. Acids Res. 15:6625-664
1 (1987)）。 オリゴヌクレオチドは他の分子、例えばペプチド、ハイブリダイゼーション誘
発架橋結合剤、輸送剤およびハイブリゼーション誘発切断剤と結合されてよい。 オリゴヌクレオチドは当該分野で公知の常套法により、例えば自動ＤＮＡシン
セサイザー（Bioserch, Applied Biosystems etcから市場で入手可能なものなど
）の使用により、合成されてよい。例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレ
オチドは、Stein et al.(Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988))の方法により合成
されてよく、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは制御性細孔ガラスポリマ
ー坦持体を用いることにより調製されることができる(Sarin et al., Proc. Nat
l. Acad. Sci. U.S.A. 85:7448-7451 (1988)）。
【０２７１】 特定の具体例では、エンドセリアーゼアンチセンスオリゴヌクレオチドには、
触媒ＲＮＡまたはリボザイム（例えば、PCT 国際公開 WO 90/11364, published
October 4, 1990; Sarver et al., Science 247:1222-1225 (1990)を参照された
い）が含まれる。他の具体例では、オリゴヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルリボ
ヌクレオチド（Inoue et al., Nucl. Acids Res. 15:6131-6148 (1987)）または
キメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体（Inoue et al., FEBS Lett. 215:327-330 (1987)
）である。
【０２７２】 別の具体例では、エンドセリアーゼアンチセンス核酸は、外来配列からの転写
により細胞内で作成される。例えば、ベクターを細胞により摂りこまれるように
インビボ導入することができ、その細胞内でベクターまたはその部分は転写され
、アンチセンス核酸（ＲＮＡ）が生成される。そのようなベクターは、エンドセ
リアーゼアンチセンス核酸をコードしている配列を含む。そのようなベクターは
エピソームに留まるか、または染色体に統合され、その限りで、転写されて所望
のアンチセンスＲＮＡを生成することができる。そのようなベクターは、当該分
野で常套の組換えＤＮＡ技術法により構築され得る。ベクターは、当該分野で公
知のプラスミド、ウイルスまたはその他であり、哺乳動物細胞中で複製および発
現のために用いられる。エンドセリアーゼアンチセンスＲＮＡをコードしている
配列の発現は、哺乳動物、好ましくはヒトの細胞で作用することが当該分野で公
知であるいずれかのプロモーターによるものであり得る。そのようなプロモータ
ーは、誘導性のものか、または構造性のものであり得る。そのようなプロモータ
ーには、制限されるものではないが、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Bernoist
and Chambon, Nature 290:304-310 (1981)）、ラウス肉腫ウイルスの３’長の
末端繰り返しに含まれるプロモーター（Yamamoto et al., Cell 22:787-797 (19
80)）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Wagner et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445 (1981)）、メタロチオネイン遺伝子の調節配
列（Brinster et al., Nature 296:39-42 (1982)）などが含まれる。
【０２７３】 アンチセンス核酸には、エンドセリアーゼ遺伝子、好ましくはヒトエンドセリ
アーゼ遺伝子のＲＮＡ転写産物の少なくとも一部に相補的な配列が含まれる。絶
対的な相補性が望ましいが、必ずしも必要ではない。 望ましくないおよび／または制御できない血管形成に伴う病気または疾患の治
療または予防に有効なエンドセリアーゼアンチセンス核酸の量は、病気の性性質
に依存し、常套の臨床技術により経験的に決定されることができる。可能な場合
、ヒトで試験および使用する前にインビトロ細胞内で、および次いで有用な動物
モデル系でアンチセンスの細胞毒性を決定することが望ましい。
【０２７４】 ２．不完全な血管形成の治療 他の特定の具体例では、哺乳動物における不完全な血管形成に伴う病気または
疾患を、哺乳動物に、病気または疾患を治療または予防する、配列番号１に示す
ヌクレオチド配列を有する核酸にハイブリダイズする核酸により少なくとも部分
的にコードされるエンドセリアーゼタンパク質、血管形成を促進する活性のある
タンパク質のドメイン、誘導体または類似体、該タンパク質をコードしている核
酸、および血管形成を促進する活性のあるタンパク質のドメイン、誘導体または
類似体をコードしている核酸を投与することによる方法が提供される。
【０２７５】 好ましい具体例では、エンドセリアーゼタンパク質、該タンパク質のドメイン
、誘導体または類似体、該タンパク質をコードしている核酸、および、該タンパ
ク質のドメイン、誘導体または類似体をコードしている核酸は、医薬上許容され
るキャリアまたは賦形剤と共に投与される。
【０２７６】 さらに他の、好ましい具体例では、治療されるべき哺乳動物はヒトである。治
療または予防法には、さらに、前血管形成治療薬または治療剤を投与することが
含まれ得る。さらに他の好ましい具体例では、該治療は、生理的血管形成、特に
正常な胎盤、胚、胎児および出生後の発生および生育、卵巣、黄体および月経後
の子宮内膜の生理的な周期的進行または創傷治癒に関与する血管形成を促進する
ために用いられる。
【０２７７】 治療に用いられる前−血管形成剤は、例えば、ｂＦＧＦおよびＦＧＦ−２など
の塩基性繊維芽細胞成長因子、ＶＥＧＦ／ＶＰＦおよびバスキュロトロピンなど
の血管内皮成長因子／血管浸透因子、ＰＤ−ＥＤＧＦおよびチミジンホスホリラ
ーゼなどの血小板誘導性内皮細胞成長因子、形質転換成長因子−ベータ（ＴＧＦ
−β）またはアンジオポイエチン−１（Ａｎｇ−１）であり得る。
【０２７８】 遺伝子治療 典型的な具体例では、遺伝子治療としてエンドセリアーゼタンパク質またはそ
の機能ドメインまたはその誘導体をコードしている核酸の配列を含む核酸が、エ
ンドセリアーゼタンパク質の機能を促進するために投与される。遺伝子治療とは
、対象に核酸を投与することにより行われる治療を言う。この具体例では、核酸
は、エンドセリアーゼタンパク質の機能を促進することにより治療作用を媒介す
る、そのコードされたタンパク質を生成する。当該分野で利用可能な遺伝子治療
に関する方法のいずれを用いてもよい（Goldspiel et al., Clinical Pharmacy
12:488-505 (1993); Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann
. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-
932 (1993); and Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993
); TIBTECH 11(5):155-215 (1993)を参照されたい）。例えば、遺伝子治療のた
めの一治療組成物には、エンドセリアーゼタンパク質またはそのドメイン、その
フラグメントまたはキメラタンパク質を適当な宿主中で発現する発現ベクターの
部分であるエンドセリアーゼをコードしている核酸が含まれる。特に、そのよう
な核酸はエンドセリアーゼをコードしている領域に作用的に結合されたプロモー
ター、誘導性または構造性の、および任意に組織特異性のプロモーターを有する
。他の特定の具体例では、配列をコードしているエンドセリアーゼおよびいずれ
かの他の所望の配列が、ゲノム中所望の位置にて、相同組換えを促進する領域と
隣接して、エンドセリアーゼ核酸の染色体内での発現を提供している核酸分子が
用いられる（Koller and Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935
(1989); Zijlstra et al., Nature 342:435-438 (1989)）。
【０２７９】 患者への核酸の送達は、直接的であってよく、この場合、患者は核酸または核
酸を運搬しているベクターに直接曝され、または間接的であってよく、この場合
、細胞はまずインビトロで核酸を用いて形質転換され,次いで患者に移植される
。これらの２つの手段はそれぞれインビボまたはエキソビボ遺伝子治療として知
られる。
【０２８０】 特定の具体例では、核酸はインビボで直接投与され、発現されてコードされた
産物を生成する。これは、当該分野で公知の多くの方法のいずれかにより、例え
ば、それを適当な核酸発現ベクターの部分として構築し、次いで、不完全または
弱毒化されたレトロウイルスまたは他のウイルスベクターを用いて感染させるこ
とにより細胞内のものとなるよう、投与されることにより（Ｕ．Ｓ．特許第４,
９８０,２８６を参照されたい）、または裸のＤＮＡを直接注射することにより
、または微細粒子衝撃（例えば遺伝子銃、Biolistic, Dupont）、または脂質ま
たは細胞表面レセプターまたは形質移入剤でのコーティング、または微小カプセ
ル内への封入を用いることにより、または核に入ることが知られているペプチド
に結合させてそれを投与することにより、レセプター媒介性エンドサイトーシス
を受けるリガンドに結合させてそれを投与することによる（例えば、Wu and Wu,
J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)を参照されたい）（これらは、レセプタ
ーを特異的に発現している細胞タイプを標的するのに用いられることができる）
などにより達成されることができる。他の具体例では、リガンドが粉砕されたエ
ンドソームに対してフュージョジェニックなウイルスペプチドである核酸-リガ
ンド複合体を作成することができ、これにより核酸のリソソームによる崩壊が回
避される。さらに他の具体例では、核酸をインビボで、特異的レセプターを標的
化することにより細胞特異的な取り込みおよび発現を指向させることができる（
PCT 公開WO 92/06180 dated April 16, 1992 (Wu et al.); WO 92/22635 dated
December 23, 1992 (Wilson et al.); WO92/20316 dated November 26, 1992 (F
indeis et al.); WO93/14188 dated July 22, 1993 (Clarke et al.), WO 93/20
221 dated October 14, 1993 (Young)を参照されたい）。別に、核酸を細胞内に
導入し、発現のための宿主細胞ＤＮＡに、相同組換えにより組み込むことができ
る（Koller and Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935 (1989);
Zijlstra et al., Nature 342:435-438 (1989)）。
【０２８１】 特定の具体例では、エンドセリアーゼ核酸を含むウイルスベクターが用いられ
る。例えば、レトロウイルスベクターを用いることができる（Miller et al., M
eth. Enzymol. 217:581-599 (1993)を参照されたい）。これらのレトロウイルス
ベクターを変更して、ウイルスゲノムの封入および宿主細胞ＤＮＡへの統合に必
要でないレトロウイルス配列が欠失されている。遺伝子治療に用いられるエンド
セリアーゼ核酸は、遺伝子の患者への送達を促進するベクターにクローニングさ
れる。レトロウイルスベクターについての詳細はBoesen et al., Biotherapy 6:
291-302 (1994)に見出すことができ、ここには、化学治療にもっと耐性のある幹
細胞を作成するためにｍｄｒ１遺伝子を血液生成幹細胞に送達するレトロウイル
スベクターの使用が記載されている。遺伝子治療におけるレトロウイルスベクタ
ーの使用を説明している他の参考文献は、Clowes et al., J. Clin. Invest. 93
:644-651 (1994); Kiem et al., Blood 83:1467-1473 (1994); Salmons and Gun
zberg, Human Gene Therapy 4:129-141 (1993); and Grossman and Wilson, Cur
r. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114 (1993)である。
【０２８２】 アデノウイルスは、遺伝子治療に用いることができる他のウイルスベクターで
ある。アデノウイルスは呼吸器上皮に遺伝子を送達するのに特に魅力的なビヒク
ルである。アデノウイルスは、自然には、呼吸器上皮に感染し、そこで穏やかな
疾患を引き起こす。アデノウイルスに基づく送達系のための他の標的は、肝臓、
中枢神経系、内皮細胞および筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞に感染
することができるという利点を持つ。Kozarsky and Wilson, Current Opinion i
n Genetics and Development 3:499-503 (1993)は、アデノウイルスに基づく遺
伝子治療の総説を示す。Bout et al., Human Gene Therapy 5:3-10 (1994)は、
アカゲザルの呼吸器上皮に遺伝子を輸送するためのアデノウイルスベクターの使
用を示した。遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用に関する他の例は、Rose
nfeld et al., Science 252:431-434 (1991); Rosenfeld et al., Cell 68:143-
155 (1992); and Mastrangeli et al., J. Clin. Invest. 91:225-234 (1993)に
見出すことができる。
【０２８３】 アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）が、遺伝子治療における使用のためにさらに提
案されている（Walsh et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300 (1993
)）。 遺伝子治療に対する他の手段は、遺伝子を組織培養物中の細胞に、エレクトロ
ポーレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介形質移入、またはウ
イルス感染などの方法により形質移入することが含まれる。たいてい、形質移入
の方法には、適当なマーカーの細胞への輸送が含まれる。細胞は次いで、摂りこ
まれたおよび形質移入された細胞を単離するために選択下に置かれる。
【０２８４】 この具体例では、核酸は、生じた組換え細胞のインビボ投与の前に細胞に導入
される。そのような導入は、制限されるものではないが、形質移入、エレクトロ
ポーレイション、マイクロインジェクション、核酸配列を含むウイルスまたはバ
クテリオファージベクターを用いる感染、細胞融合、染色体媒介性遺伝子輸送、
マイクロセル媒介遺伝子輸送、スフェロプラスト融合などを含む当該分野で公知
のいずれかの方法により行われることができる。外来遺伝子の細胞への導入に関
する多くの技術が当該分野で公知であり（例えば、Loeffler and Behr, Meth. E
nzymol. 217:599-618 (1993); Cohen et al., Meth. Enzymol. 217:618-644 (19
93); Cline, Pharmac. Ther. 29:69-92 (1985)を参照されたい）、レシピエント
細胞の必要的発生的および生理的機能が壊されない限り用いられてよい。該技術
は、核酸が細胞により発現され、その細胞継代により好ましくは遺伝され、およ
び発現されるように、核酸の細胞への適当な輸送を提供すべきである。
【０２８５】 生じた組換え細胞は、当該分野で公知の種々の方法により患者に送達されるこ
とができる。好ましい具体例では、内皮細胞は例えば皮下に注射される。他の具
体例では、組換え皮膚細胞を患者への皮膚移植片として適用してよい。組換え血
液細胞（例えば、血液生成幹細胞または継代細胞）は、好ましくは静脈内に投与
される。使用が想定される細胞の量は、所望される効果、患者の状態などに依存
し、当該分野の専門家により決定されることができる。
【０２８６】 核酸を遺伝子治療の目的のために導入することができる細胞には、いずれかの
所望の、入手可能な細胞型が含まれ、制限されるものではないが、上皮細胞、内
皮細胞、ケラチノサイト、繊維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞、Ｔリンパ球、Ｂリン
パ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球などの血液細胞
、種々の幹細胞または継代細胞、特に例えば骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝臓な
どから得られた血液生成幹細胞または継代細胞が含まれる。
【０２８７】 好ましい具体例では、遺伝子治療に用いられる細胞は、患者自身のものである
。組換え細胞が遺伝子治療に用いられる具体例では、エンドセリアーゼ核酸が細
胞またはその継代により発現可能となるように細胞に導入され、組換え細胞は、
次いでインビボで治療効果を得るべく投与される。特定の具体例では、幹細胞ま
たは継代細胞が用いられる。インビトロで単離および維持することができるいず
れかの幹細胞および／または継代細胞は、この具体例に従い潜在的に用いること
ができる。そのような幹細胞には、制限されるものではないが、血液生成幹細胞
（ＨＳＣ）、皮膚および消化管の内層などの内皮組織の幹細胞、胎児心筋細胞、
肝臓幹細胞（ＰＣＴ公開ＷＯ９４／０８５９８、１９９４年４月２８日出願）お
よび天然幹細胞（Stemple and Anderson, Cell 71:973-985 (1992)）が含まれる
。
【０２８８】 上皮幹細胞（ＥＳＣ）またはケラチノサイトは、皮膚および消化管内層などの
組織から、公知の方法により得ることができる（Rheinwald, Meth. Cell Bio. 2
1A:229 (1980)）。皮膚などの層状上皮組織では、基底層に最も近い胚細胞層内
部の幹細胞の有糸分裂により再生が起こる。消化管の内層内の幹細胞により、こ
の組織再生の速度が迅速になる。患者の皮膚または消化管の内層から得られるＥ
ＳＣまたはケラチノサイトは、組織培地中で生育させることができる（Rheinwal
d, Meth. Cell Bio. 21A:229 (1980); Pittelkow and Scott, Mayo Clinic Proc
. 61:771 (1986)）。ドナーによりＥＳＣが提供される場合、宿主対移植片反応
の抑制のための方法（例えば、照射、穏やかな免疫抑制を促進するための薬物ま
たは抗体の投与）を用いることもできる。
【０２８９】 血液新生幹細胞（ＨＳＣ）に関して、ＨＳＣのインビトロでの単離、増殖、お
よび維持を提供するあらゆる方法を、この具体例において用いることができる。
これを行うことができる方法には、（ａ）将来予定される宿主、またはドナーか
ら単離された骨髄細胞からのＨＳＣ培養物の単離および確立、または、（ｂ）同
種または異種であってよい、すでに確立された長期ＨＳＣ培養物の使用が含まれ
る。好ましくは非自己ＨＳＣを、予定される宿主／患者の移植免疫反応が抑制す
る方法と組み合わせて用いられる。特定の具体例では、ヒト骨髄細胞は、針吸引
により後部腸骨クレストから得られることができる（例えば、Kodo et al., J.
Clin. Invest. 73:1377-1384 (1984)を参照されたい）。好ましい具体例では、
ＨＳＣは、かなり濃縮することができ、または実質上純粋な形態にすることがで
きる。濃縮は、長期培養前、長期培養中、または長期培養後に成し遂げることが
でき、当該分野で公知のいずれかの方法により行うことができる。骨髄細胞の長
期培養は、例えば、変更されたＤｅｘｔｅｒ細胞培養法（Dexter et al., J. Ce
ll Physiol. 91:335 (1977)）またはＷｉｔｌｏｃｋ−Ｗｉｔｔｅ培養法（Witlo
ck and Witte, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:3608-3612 (1982)）を用いるこ
とにより、確立および維持することができる。 特定の具体例では、遺伝子治療のために導入される核酸には、核酸の発現が、
適当な転写誘導因子の存在または不在を制御することにより制御されるようにコ
ーディング領域に作用的に結合される誘導性プロモーターが含まれる。
【０２９０】 Ｊ．動物モデル 形質転換動物モデルが、本明細書中に提供される。一具体例では、不完全な血
管形成が関与する病気および疾患のための動物モデルが提供される。そのような
動物は、まず、染色体中のエンドセリアーゼ遺伝子と生物学的に不活性化された
外来エンドセリアーゼ遺伝子の間の相同性組換えを起こすことにより（好ましく
は異種配列、例えば抗生物質耐性遺伝子などの挿入により）、作成することがで
きる。好ましい態様では、この相同性組換えは、胎児由来の幹（ＥＳ）細胞に、
挿入不活性化エンドセリアーゼ遺伝子を、相同性組換えが起こるように形質移入
した後、ＥＳ細胞を胚盤に注射し、次いで胚盤をフォスターマザーに移植し、そ
の後エンドセリアーゼ遺伝子が不活性化されているキメラ動物（「ノックアウト
動物」）を誕生させることにより行われる（Capecchi, Science 244:1288-1292
(1989)を参照されたい）。キメラ動物はさらなるノックアウト動物を作成するべ
く繁殖させることができる。そのような動物は、マウス、ハムスター、ヒツジ、
ブタ、ウシなどが含まれ得、好ましくはヒト以外の動物である。特定の具体例で
は、ノックアウトマウスが製造される。
【０２９１】 そのようなノックアウト動物は、不完全な血管形成に関与する病気または疾患
を進行させる、またはそれらの病気または疾患に罹患しやすいことが予想され、
そのため、そのような病気および疾患の動物モデルとして用いて、例えばそのよ
うな病気または疾患を治療または予防する能力に関して試験分子をスクリーニン
グすることができる。 特定の具体例では、コントロールできないおよびまたは望ましくない血管形成
が関与する病気および疾患のための動物モデルが提供される。そのような動物は
、その染色体と過剰発現される、または誤発現される（好ましくは強いプロモー
ター下での発現により）外来エンドセリアーゼ遺伝子の間の相同性組換えを促進
することによりまず作成されることができる。好ましい態様では、この相同性組
換えは、胎児由来の幹（ＥＳ）細胞に、相同組換えが起こるように、過剰発現さ
れる、または誤発現されるエンドセリアーゼ遺伝子を含むベクターを形質移入し
、次いでそのＥＳ細胞を胚盤胞に注射し、次いで胚盤胞をフォスターマザーに移
植した後、エンドセリアーゼ遺伝子が過剰発現された、または誤発現されたキメ
ラ動物を誕生させることにより行われる(Capecchi, Science 244:1288-1292 (19
89)を参照されたい。）。キメラ動物は、エンドセリアーゼが過剰発現される、
または誤発現される動物をさらに作成するべく繁殖させることができる。そのよ
うな動物はマウス、ハムスター、ヒツジ、ブタ、ウシなどであり得、好ましくは
ヒト以外の動物である。特定の具体例では、エンドセリアーゼが過剰発現した、
または誤発現したマウスが作成される。
【０２９２】 そのような動物は、制御できないおよび／または望ましくない血管形成が関与
する病気または疾患に関与する、進行している病気または疾患を発症するまたは
罹患しやすいことが期待され、従って、そのような病気および疾患の動物モデル
として用いて、例えばエンドセリアーゼ遺伝子およびタンパク質の機能を阻害し
、そのような病気または疾患を治療または予防する能力に関して試験分子をスク
リーニングすることができる。 以下の実施例は、説明のために含まれ、本発明の範囲を制限するものではない
。
【０２９３】 実施例１ エンドセリアーゼ−１のクローニングおよび発現 細胞タイプおよび細胞の成長 ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ Ｐ１４５、以後、ＨＵＶＥＣと呼ぶ）は
、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ（カタログナンバーＣＣ−２５１９；BioWhittaker Inc.,
Walkersville, MD）から購入した。細胞は、３７℃、５％ＣＯ２にて、ヘパリ
ン、２％子牛血清、１μｇ／ｍＬヒドロコルチソン、１０ｎｇ／ｍＬ表皮成長因
子、５０ｎｇ／ｍＬアンフォテリシン−Ｂおよび５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン
スルフェートを含むｕ０．４％ウシ脳抽出物で希釈した内皮細胞生育倍地中（Ｅ
ＧＭ；カタログナンバーＣＣ−３１２４；Clonetics)で培養した。その後の全細
胞操作は、製造業者の指示に従い行った。ＨＵＶＥＣを約９０％のコンフルエン
トまで生育させ、次いで、１×リン酸緩衝塩水で簡単に洗浄した。
【０２９４】 全ＲＮＡの単離、およびポリＡ＋ＲＮＡの精製および濃縮 ＨＵＶＥＣはＴｒｉｚｏｌ試薬（カタログナンバー１５５９６；Life Technol
ogies, Rockville, MD）および全ＲＮＡを、製造業者のプロトコルに従い単離し
た。全ＲＮＡの濃度は、２６０ｎｍでの吸光度から評価した。ポリＡ＋ＲＮＡを
オリゴ−ｄＴビーズ（カタログナンバー７００６１；Oligotex, Qiagen, Chatsw
orth, CA）を用いて単離および濃縮した。
【０２９５】 逆転写およびポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ） ＨＵＶＥＣポリＡ＋ＲＮＡを、ＰｒｏＳＴＡＲ第１鎖ＲＴ−ＰＣＲキット（カ
タログナンバー２００４２０；Stratagene, La Jolla, CA）およびスーパースク
リプトＩＩＲＮａｓｅＨ逆転写酵素（カタログナンバー１８０６４−０２２；Li
fe Technologies）を用いて逆転写により変換した。ＨＵＶＥＣｓｓｃＤＮＡの
一部（４μＬ）を、それぞれ２μＭのセンスおよびアンチセンス変性オリゴヌク
レオチドプライマーおよびＴａｑポリメラーゼを用いてＰＣＲに供した。センス
プライマーの配列は、5'-TGGRT(I)VT(I)WS(I)GC(I)RC(I)CAYTG-3' 配列番号９で
あり、アンチセンスの配列は、5'-(I)GG(I)CC(I)CC(I)SWRTC(I)CCYT(I)RCA(I)GH
RTC-3' 配列番号１０、ここで、R=A,G; V=G,A,C; W=A,T; S=G,C; Y=C,T; H=A,T,
Cであった。プライマー配列は、全セリンプロテアーゼ中の２つの高度に保存さ
れた領域に対応し、４００〜５００塩基対の範囲のＰＣＲ産物を増幅する。
【０２９６】 クローンのスクリーニングおよび配列決定 ＰＣＲ生成物を２％アガロースゲル上に分け、ゲル抽出キット（カタログナン
バー２８７０６；QIAquick gel extraction kit; Qiagen）を用いて精製した。
精製されたＤＮＡフラグメントをＴＡベクター（カタログナンバーＫ４５００−
０１；ＴＯＰＯ−ＴＡクローニングキット、Invitrogen, Carlsbad, CA）に結合
した。イー.コリ細胞に形質移入した後、プラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩ制限酵
素での消化により単離および分析した。インサートＤＮＡを持つクローンを、蛍
光染色に基づくＤＮＡ配列決定法（カタログナンバー４３０３１４９；Ａｍｐｌ
ｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含むＢｉｇＤｙｅ終結サイクル配列決定キット；
Perkin Elmer, Lincoln, CA）を用いて配列決定することによりさらに特徴付け
た。１７０クローンの全部を配列決定および分析した。全配列を複数ヌクレオチ
ド配列整列アルゴリズム（blastn)により分析し、ＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ、
Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）に寄託された同一または密接に関連するｃＤＮＡクロ
ーンを同定した。有意な相同性を示さなかったものを、ヌクレオチド配列の６フ
レームの概念翻訳産物をタンパク質配列データベース（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ）に
対して比較するｂｌａｓｔｘを用いてさらに分析した。２つのクローンが、セリ
ンプロテアーゼをコードするｃＤＮＡフラグメントを明らかにした。これらのク
ローンの一つ（Ｈ１１７）は、本明細書中でエンドセリアーゼ１と指定されるタ
ンパク質である内皮細胞セリンプロテアーゼのプロテアーゼドメインをコードす
る。
【０２９７】 内皮細胞セリンプロテアーゼエンドセリアーゼ１の遺伝子発現特性 エンドセリアーゼ１の組織分布に関する情報を得るために、クローンＨ１１７
のＤＮＡインサートを用いて、７６の異なるヒト組織から成るＲＮＡブロット（
カタログナンバー７７７５−１；ヒト複合組織発現（ＭＴＥ）アレイ；ＣＬＯＮ
ＴＥＣＨ、Palo Alto, CA)をプローブした。有意な発現が、食道で認められ、胃
、唾液腺、膵臓、前立腺、膀胱、気管および子宮では発現レベルがわずかであっ
た。ＲＮＡブロット（カタログナンバー７７６５−１＆７７８２−１；ヒト筋肉
および消化系複合組織ノーザン（ＭＴＮ）ブロット；ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を用い
るノーザン分析により、発現が食道に限られていることが確認された。２つの転
写産物（約１．７および２ｋｂ）が食道で検出された。
【０２９８】 ヒト臍帯静脈内皮細胞におけるエンドセリアーゼ１の存在 一本鎖ｃＤＮＡクローンを、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）からスーパ
ースクリプトＩＩ（Life Technologies, Rockville, MD）およびオリゴ−ｄＴプ
ライマーを用いて単離および精製されたポリＡ＋ＲＮＡから逆転写した。エンド
セリアーゼ１特異的プライマー（センスプライマー：5'-CCTGCCAGATGGACTGCTTCC
TTTG-3'（配列番号７）アンチセンスプライマー：5'-GGCATGCATCTGTTTTTCCTTCTA
AGG-3'（配列番号８）を用いて、ＨＵＶＥＣのｓｓｃＤＮＡから３９０ｂｐのフ
ラグメントを増幅した。他のセリンプロテアーゼの非特異的増幅を予防するため
に、プライマーが全トリプシン様セリンプロテアーゼに共通する高度に保存され
た配列の外部にハイブリダイズするようにプライマーが設計された。ＨＵＶＥＣ
細胞からのエンドセリアーゼ１転写産物のＲＴ−ＰＣＲは〜４００ｂｐのＤＮＡ
フラグメントと他のもっと小さな非特異的結合を、２％アガロースゲル上での分
離の後で示した。ゲルをポジティブに荷電したナイロン膜にブロットし、Ｈ１１
７クローンから単離されたエンドセリアーゼ１ｃＤＮＡフラグメントと６０℃で
、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ（ｔｍ）ハイブリダイゼーション溶液（ＣＬＯＮＴＥＣ
Ｈ）を用いてハイブリダイズさせた。高ストリンジェント（０．１×ＳＳＣ；０
．１％ＳＤＳ中６８℃）で洗浄後、強いポジティブなシグナルが〜４００ｂｐの
フラグメント上でのみ認められ、これは、このバンドがエンドセリアーゼ１ｃＤ
ＮＡに対応すること、およびＨＵＶＥＣ細胞がエンドセリアーゼ１を発現するこ
とを示すものであった。
【０２９９】 ｃＤＮＡ末端の５’−および３’−高速増幅（ＲＡＣＥ） エンドセリアーゼ１の全プロテアーゼドメインをコードしているｃＤＮＡを得
るために、５’−および３’−ＲＡＣＥ反応を行った。転写産物の存在が前立腺
で検出されたので、非と前立腺Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙｃＤＮＡ（カタロ
グ＃７４１８−１；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、エンドセリアーゼ１をコード
しているｃＤＮＡの５’および３’末端を単離した。Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａ
ｄｙｃＤＮＡはＲＡＣＥ反応のために特別に作成された。２つの遺伝子特異的プ
ライマーを用いた。５’−ＲＡＣＥ反応に関しては、5'-GGCATGCATCTGTTTTTCCTT
CTAAGG-3'（配列番号８）、および３’−ＲＡＣＥ反応に関しては5'-CCTGCCAGAT
GGACTGCTTCCTTTG-3'（配列番号７）。 ミッシング５’および３’末端配列に対応する約１．２ｋｂｐおよび１．４ｋ
ｂｐの２つのフラグメントが単離された。これらのフラグメントを、内部ｃＤＮ
Ａフラグメントをプローブとして用いるサザン分析により、およびＤＮＡ配列分
析により確認した。
【０３００】 配列分析 誘導された全ＤＮＡおよびタンパク質配列を、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（バージョ
ン６．５；Oxford Molecular Ltd., Madison, WI）を用いて分析した。エンドセ
リアーゼ１のプロテアーゼドメインをコードしているｃＤＮＡは、２３２のアミ
ノ酸タンパク質配列（配列番号２）に翻訳される６９６塩基対（配列番号１）か
ら成る。
【０３０１】 このタンパク質をコードしているｃＤＮＡをピキア パストリス（Pichia pas
toris)ベクターｐＰＩＣ９Ｋ（Invitrogen;配列番号２１を参照されたい）の誘
導体にクローン化した。プラスミドｐＰＩＣ９Ｋには、１−９４８に５’ＡＯＸ
１プロモーターフラグメントが、８５５−８７５に５’ＡＯＸ１プライマー部位
が；９４９−１２１８にアルファ−ファクター分泌シグナル（複数）が：１１５
２−１１７２にアルファ−ファクタープライマー部位が；１１９２−１２４１に
複数のクローニング部位が；１３２７−１３４７に３’ＡＯＸ１プライマー部位
が；１２５３−１５８６に３’ＡＯＸ１転写終結領域が；４５１４−１９８０に
ＨＩＳ４ＯＲＦが；５７４３−４９２８にカナマイシン耐性遺伝子が；６１２２
−６８７９に３’ＡＯＸ１フラグメントが；７９６１−７２８８にＣｏｌＥ１開
始点が；および８９６６−８１０６にアンピシリン耐性遺伝子が含まれる。本明
細書に用いられるプラスミドは、カナマイシン耐性遺伝子中のＸｈｏＩ部位を排
除することによりｐＰＩＣ９Ｋから誘導され、生じたベクターは、本明細書中、
ｐＰＩＣ９ＫＸと指定される。
【０３０２】 ピキア パストリスの発現に関して、ピキアベクター、ｐＰＩＣ９ＫＸへのク
ローニングを達成するために、各プライマーの５’末端に制限部位を導入する以
外は遺伝子特異的プライマーの同じ対を用いて、プロテアーゼドメインをコード
しているｃＤＮＡを増幅した。プライマーは、以下のようであった。 前方（配列番号２３） 5'-TCTCTCGAGAAAAGAATCGTTGGTGGGACAGAAGTAGAAGAG-3';および、 逆（配列番号２４） 5'-ATTCGCGGCCGCTTAGATACCAGTTTTTGAAGTAATCCA-3'。
【０３０３】 実施例２ エンドセリアーゼ２のクローニングおよび発現 エンドセリアーゼ２の同定 バイオテクノロジー情報に関する国立センターに埋もれているデータのための
ＵｎｉＧｅｎｅ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene）ツールを、セリンプ
ロテアーゼ配列クラスターのために検索した。ＵｎｉＧｅｎｅクラスターはユニ
ークなヒト、マウス、またはラット遺伝子を表す配列の非重複性のセットである
。データベースには、組織分布および染色体マップでの位置に関する情報を含む
よく特徴付けられた遺伝子および発現配列タグ（ＥＳＴ）が含まれる。
【０３０４】 ＵｎｉＧｅｎｅクラスター（Hs.245327/Hs.266308）は、ヒトセリンプロテア
ーゼ、ヘプシン（受入番号Ｐ０５９８１）にわずかに類似するＥＳＴを有するこ
とが同定された。このクラスターは、卵巣、胎盤、子宮、乳房および大腸で発現
された１２のＥＳＴ配列を含む。ヒト乳癌由来の一のＥＳＴ配列（ＡＩ９０９８
４２）を用いて、この新規なセリンプロテアーゼ（以後、エンドセリアーゼ２と
呼ぶ）をコードしている全長ｃＤＮＡを単離した。ＡＩ９０９８４２に含まれる
配列は、ＧｅｎＢａｎｋに寄託されたいずれかの公知セリンプロテアーゼ配列と
も１００％の同一性を示さなかった。タンパク質データベースに寄託された相同
タンパク質配列を同定するためにｂｌａｓｔｘを用いて、密接なマッチが、ヘプ
シン（５３〜５５％）、ヒトＴＭＰＲＳＳ２（４７％）、ヒトＭＴＳＰ２（４７
％）およびヒト血漿カリクレイン(kallikrein)Ｂ１プレカーサー（４７％）であ
ることが認められた。ｂｌａｓｔｎを用いる未完成ヒトゲノムデータベース（高
処理量遺伝子配列（ＨＴＧＳ））の検索により、エンドセリアーゼ２をコードし
ている遺伝子が染色体１１上（１１ｑ２３）に位置することが示された。
【０３０５】 ｃＤＮＡ末端の５’−および３’高速増幅(ＲＡＣＥ） エンドセリアーゼ２をコードしている全長ｃＤＮＡクローンを得るために、５
’−および３’ＲＡＣＥ反応を行った。ヒト乳癌由来のＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅ
ａｄｙｃＤＮＡライブラリー（ＧＩ−１０１；ＣＬＯＮＴＥＣＨ；カタログナン
バー７４９３−１）を用いて、エンドセリアーゼ２をコードしているｃＤＮＡの
５’および３’末端を単離した。Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙｃＤＮＡは、Ｒ
ＡＣＥ反応のために特別に作成される。２つの遺伝子特異的プライマーを用いた
。５’ＲＡＣＥ反応のためには5'-GGAGGCAAGCAGGGTGGATGTGAGCGGAC-3'（配列番
号１１）および３’−ＲＡＣＥ反応のためには5'-CGGATCGTGGGAGGGGCGCTGGCCTC-
3'（配列番号１２）。〜１．５ｋｂｐのｃＤＮＡフラグメントが５’−ＲＡＣＥ
反応から得られた。しかし、初めの３’−ＲＡＣＥ反応はいずれのフラグメント
も生じなかった。初めの３’−ＲＡＣＥ反応に入れ子ＰＣＲを用いて、エンドセ
リアーゼ２の３’末端の残りを得た。用いられた入れ子３’遺伝子特異的プライ
マーは5'-CAAGTGAGTCTGCACTTCGGCACCACC-3'配列番号１３であり、〜１．２ｋｂ
ｐのｃＤＮＡフラグメントが生じた。フラグメントはｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯＴ
Ａクローングベクター（Invitrogen, Carlsbad, CA）にサブクローニングされた
。生じたクローンをＥＳＴクローンＡＩ９０９８４２のｃＤＮＡインサートをプ
ローブとして用いるサザン分析により、およびＤＮＡ配列分析により分析した。
【０３０６】 エンドセリアーゼ２のドメイン組成 翻訳されるエンドセリアーゼ２コーディング配列の配列分析により、エンドセ
リアーゼ２がタイプＩＩ膜型セリンプロテアーゼであることが示された。それは
Ｎ末端に膜貫通ドメインを有し、その後に単一の低密度リポタンパク質Ａレセプ
タードメインと単一のスカベンジャーレセプターシステインリッチドメインが続
く。Ｃ末端は、触媒ドメインの３つの高度に保存された領域に、触媒三つ組み残
基（ヒスチジン、アスパルテート、およびセリン）の存在により特徴付けられる
トリプシン様セリンプロテアーゼドメインを含む。加えて、ASPAGTPPGRASP（配
列番号１４）から成る３つの反復配列が膜貫通ドメインの直前に見出され、Ｎ−
ミリストイル化の修飾に関する配列モチーフを表す。
【０３０７】 エンドセリアーゼ２の全長プロテアーゼドメインをコードしているｃＤＮＡのＰ
ＣＲ増幅 エンドセリアーゼ２のプロテアーゼドメインをコードしているｃＤＮＡフラグ
メントを得るために、遺伝子特異的プライマーおよびヒト乳癌由来のMarathon-R
eadyｃＤＮＡライブラリーを用いるエンド−トゥ−エンドのＰＣＲ増幅を用いた
。２つのプライマーを用いた。５’末端のために5'-CGGATCGTGGGAGGGGCGCTGGCCT
CG -3'（配列番号１５）、および３’末端のために5'-CAGCAGGCCAGCTGGTTAGGATT
TTATGAATCGCAC-3'（配列番号１６）。５’プライマーは、エンドセリアーゼ２プ
ロテアーゼドメインの開始点をコードする配列（ＲＩＶＧＧＡＬＡＳ配列番号１
７）を含んだ。３’プライマーはストップコドンに隣接している配列（下線を引
いた）に対応する。〜７３０ｂｐのフラグメントを増幅し、ｐＣＲ２．１−ＴＯ
ＰＯＴＡクローニングベクターにサブクローニングし、次いで配列決定した。
【０３０８】 ピキア パストリスの発現に関して、ピキアベクターｐＰＩＣ９ＫＸへのクロ
ーニングを達成するために制限部位（５’および３’プライマーのために、それ
ぞれＸｈｏＩ部位およびＮｏｔＩ部位）を各プライマーの５’末端に導入する以
外は遺伝子特異的プライマーの同じ対を用いて、プロテアーゼドメインをコード
しているｃＤＮＡを増幅した。プライマーは以下のようであった。 前方（配列番号２５） 5'-TCTCTCGAGAAAAGAATCGTGGGAGGGGCGCTGGCCTCG-3' 逆（配列番号２６） 5'-ATAGCGGCCGCTGGTTAGGATTTTATGAATCGCACCTCGC-3'。
【０３０９】 正常および腫瘍組織におけるエンドセリアーゼ２の遺伝子発現特性および転写サ
イズ エンドセリアーゼ２転写産物の遺伝子発現特性に関する情報を得るために、Ｅ
ＳＴクローンＡＩ９０９８４２のｃＤＮＡインサートを用いて、７６の異なるヒ
ト組織から成るＲＮＡドットブロット（ヒト複合組織発現（ＭＴＥ）アレイ；カ
タログナンバー７７７５−１；CLONTECH, Palo Alto, CA）、およびヒト組織ノ
ーザンブロット（ヒト１２−レーン複合組織ノーザン（ＭＴＮ）ブロット；カタ
ログナンバー７７８０−１；ＣＬＯＮＴＥＣＨ）をプローブした。ＲＮＡドット
ブロットは、胎盤、膵臓、甲状腺、肝臓および肺で強いシグナルを示した。乳腺
、唾液線、腎臓、気管、食道、虫垂、心臓および胎児の肺で中程度のシグナルが
認められた。いくつかの他の組織で弱いシグナルが認められた。エンドセリアー
ゼ２は、白血病Ｋ−５６２＞ヒーラーＳ３＝バーキットのリンパ腫（Raji and D
audi)＝結腸直腸腺癌（ＳＷ４８０）＝肺癌（Ａ５４９）＝白血病ＭＯＬＴ−４
＝白血病ＨＬ−６０を含むいくつかの腫瘍細胞でも発現される。
【０３１０】 ノーザン分析により、試験された組織でいくつかの転写産物が検出され、強い
シグナルが心臓、骨格筋、腎臓、肝臓および胎盤で認められた。優勢な転写産物
は〜３ｋｂのサイズを有し、一方他の転写産物は約２．８ｋｂ、１．５ｋｂおよ
び１ｋｂであった。
【０３１１】 ヌードマウスに異種移植されたいくつかのヒト一次腫瘍から作成されたｃＤＮ
Ａライブラリー（ヒト腫瘍複合組織ｃＤＮＡパネル、カタログナンバーＫ１５２
２−１、ＣＬＯＮＴＥＣＨ）からのエンドセリアーゼ２転写産物のＰＣＲ増幅を
、エンドセリアーゼ２−特異的プライマーを用いて行った。エンドセリアーゼ２
転写産物が、乳癌（Ｇ１−１０１）、肺癌（ＬＸ−１＞ＧＩ−１１７）、結腸腺
癌（ＧＩ−１１２＞ＣＸ−１）、膵臓腺癌（ＧＩ−１０３）、および卵巣腺癌（
ＧＩ−１０２）で検出された。エンドセリアーゼ２の転写産物は、ＬＮＣａＰお
よびＰＣ−３前立腺癌細胞系統ならびにＨＴ−１０８０ヒト繊維肉腫細胞系統で
も検出された。
【０３１２】 内皮細胞におけるエンドセリアーゼ２の存在 一本鎖ｃＤＮＡを、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）およびヒト肺毛細血
管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ−Ｌ）からスーパースクリプトＩＩ（Life Technologie
s, Rockville, MD）とオリゴ−ｄＴプライマーを用いて単離および精製されたポ
リＡ＋ＲＮＡから逆転写した。エンドセリアーゼ２特異的プライマー（センスプ
ライマー：5'-TCCAGGAAAGCCTCCACAGGTC-3'配列番号１８；アンチセンスプライマ
ー：5'-GGAGGCAAGCAGGGTGGATGTGAGCGGAC-3'配列番号：１９）を用いて、内皮細
胞のｓｓｃＤＮＡから４２２ｂｐのフラグメントを増幅した。この４２２ｂｐの
フラグメントはスカベンジャーレセプターシステインリッチドメインおよびセリ
ンプロテアーゼドメインに及ぶ。ＨＵＶＥＣおよびＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞由来のエ
ンドセリアーゼ２のＲＴ−ＰＣＲは、２％アガロースゲルにおける分離の後で、
〜４２０ｂｐＤＮＡフラグメントと他の非特異的結合を示した。ポジティブに荷
電したナイロン膜にゲルをブロットし、ヒト乳腺癌からオリジナルに単離された
エンドセリアーゼ２ｃＤＮＡを用いて、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ（ｔｍ）ハイブリ
ダイゼーション溶液（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を用いて６０℃にてハイブリダイズさ
せた。高ストリンジェント（６８℃、０．１×ＳＳＣ；０．１％ＳＤＳ中）で洗
浄した後、強いポジティブなシグナルが、〜４２０ｂｐフラグメント上でのみ認
められ、このＤＮＡフラグメントがエンドセリアーゼ２ｃＤＮＡに対応すること
、およびＨＵＶＥＣおよびＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞がエンドセリアーゼ２を発現する
ことが示された。
【０３１３】 胎盤およびＬＮＣａＰ細胞におけるエンドセリアーゼ２の他の形態の存在 多くのエンドセリアーゼ２ｍＲＮＡが胎盤に存在しているので、別の３’−Ｒ
ＡＣＥ反応を、エンドセリアーゼ２特異的プライマー（5'-TTCCTCCGGGAGGTGCAGG
TCAATC-3'配列番号２０）を用いて行った。いくつかの産物が認められたが、２
つのフラグメントの（〜２．２ｋｂｐおよび〜１ｋｂｐ）のみがエンドセリアー
ゼ２プローブと強いハイブリダイゼーションを示した。サブクローニングおよび
配列分析に際して、長い方のフラグメントは、ヒト乳癌から最初に単離されたエ
ンドセリアーゼ２ｃＤＮＡに対する配列同一性を示した。短い方のフラグメント
の配列は、コーディング領域の最後の２４ｂｐ以外を除く全てにおいて、ヒト乳
癌由来のエンドセリアーゼ２のものに対して配列同一性を示した。これらの２４
ｂｐに置き代わっているのは、コーディング領域をさらに１３４アミノ酸拡張す
る４０２ｂｐのフラグメントであった。興味深いことに、別の膜貫通ドメインが
この追加のタンパク質配列内に見出される。エンドセリアーゼ２プライマー（両
形態に共通の一プライマーおよび各形態に特異的な他の一つ）のセットを用いて
、ヒトの乳癌およびＬＮＣａＰｃＤＮＡライブラリーをどちらかの、または両方
の形態の存在に関してスクリーニングした。サブクローニングおよび配列分析の
後、結果は、哺乳動物の乳癌は短い方のタンパク質（エンドセリアーゼ２−Ｓ）
をコードしているｍＲＮＡのみを発現したが、ＬＮＣａＰは長い方の形態（エン
ドセリアーゼ２−Ｌ）にみを発現したことを示した。
【０３１４】 配列分析 エンドセリアーゼ２をコードしているＤＮＡおよびコードされたタンパク質を
、Ｍａｃベクター（バージョン６．５；Oxford Molecular Ltd., Madison, WI）
を用いて分析した。エンドセリアーゼ２−ＳのＯＲＦは、５６２のアミノ酸タン
パク質に翻訳される１，６８９ｂｐから成り、一方、エンドセリアーゼ２−Ｌの
ＯＲＦは、６８８のアミノ酸タンパク質に翻訳される２,０６７ｂｐからなる。
エンドセリアーゼ２−ＳのプロテアーゼドメインをコードしているｃＤＮＡは、
２４２のアミノ酸タンパク質配列に翻訳される７２９ｂｐから成り、一方、エン
ドセリアーゼ２−Ｌのそれは、３６８のアミノ酸タンパク質配列に翻訳される１
,１０７ｂｐから成る。エンドセリアーゼ２−Ｓおよびエンドセリアーゼ２−Ｌ
の核酸配列およびタンパク質配列は、配列番号３−６に示す。配列番号３は、エ
ンドセリアーゼ２−Ｓの核酸配列を示す。配列番号４は、エンドセリアーゼ２−
Ｓコードタンパク質を示す。配列番号５は、エンドセリアーゼ２−Ｌの核酸配列
を示す。および配列番号６は、エンドセリアーゼ２−Ｌコードタンパク質を示す
。
【０３１５】 実施例３ 候補血管形成モジュレーターの同定のための高処理量アッセイ エンドセリアーゼ１の阻害物質を同定するためのアッセイ 試験化合物がエンドセリアーゼ−１（ＥＴ１）触媒活性の阻害物質として作用
する能力をアミド分解(amidolytic)アッセイにおいて評価した。ピキアにおいて
発現される組換え（ｒＥＴ１）によるアミド分解活性の阻害物質誘導性阻害を、
ＩＣ５０値により測定されるように評価した。
【０３１６】 アッセイバッファーは、ＨＢＳＡ（１０ｍＭへぺス、１５０ｍＭ塩化ナトリウ
ム、ｐＨ７．４、０．１％ウシ血清アルブミン）であった。全試薬は、特に示さ
ない限り、Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO)から得た。３０分（試験化合物
と酵素の３０分の前インキュベーション）および０分（試験化合物および酵素の
前インキュベーションなし）での２つのＩＣ５０アッセイを行った。３０分での
ＩＣ５０アッセイに関して、以下の試薬をコーニング(Croning)マイクロタイタ
ープレートの適当なウェル中で合わせた：２５０ｐＭの最終酵素濃度となる、５
０μリットルのＨＢＳＡ、ＨＢＳＡ（または非阻害速度測定に関してＨＢＳＡ単
独）に（広い濃度範囲で）希釈された５０μリットルの試験化合物、およびバッ
ファーに希釈された５０マイクロリットルのｒＥＴ−１(Corvas International)
。室温での３０分のインキュベーションの後、基質スペクトロザイムｔＰＡ（Am
erican Diagnostica, Inc. (Greenwich, CT)から得た後、脱イオン水で復元し、
次いでアッセイ前にＨＢＳＡに希釈したメチルスルホニル−Ｄ−シクロヘキシル
チロシル−Ｌ−グリシル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリンアセテート）を
ウエルに添加し、２００マイクロリットルの最終容積および３００μＭの最終基
質濃度を得る（約１．５倍Ｋｍ）ことによりアッセイを開始した。
【０３１７】 ０分でのＩＣ５０値に関しては、同じ試薬を合わせた。５０μリットルのＨＢ
ＳＡ、ＨＢＳＡ（または非阻害速度測定に関してＨＢＳＡ単独）に（同じ濃度範
囲で）希釈された５０μリットルの試験化合物、および５０μリットルの基質ス
ペクトロザイムｔＰＡ。アッセイは、５０マイクロリットルのｒＥＴ−１を添加
することにより開始した。全成分の最終濃度は、両ＩＣ５０アッセイ（３０分お
よび０分のインキュベーション）で同一であった。
【０３１８】 発色基質加水分解の初期速度を、Thermo Max Kinetic Microplate Reader (M
olecular Devices)を５分間用いて、５％未満の添加基質を用いる４０５ｎＭで
の吸収の変化による両アッセイにて測定した。加水分解の初期速度の５０％の低
下を引き起こした添加された濃度を、２つのアッセイ（３０および０分）のそれ
ぞれにおけるそれぞれのＩＣ５０値と定義した。
【０３１９】 エンドセリアーゼ２の阻害物質を同定するためのアッセイ エンドセリアーゼ２のプロテアーゼドメインのプロテアーゼ活性を阻害するた
めの試験化合物を、コスター９６ウェル組織培養プレート中(Corning NY)でアッ
セイした。約２−３ｎＭのエンドセリアーゼ２を、２９．２ｍＭトリス、ｐＨ８
．４、２９．２ｍＭイミダゾール、２１７ｍＭのＮａＣｌ（最終容積１００ｍＬ
）中種々の濃度の阻害物質と混合し、室温で３０分間インキュベートした。４０
０ｍＭの基質Ｓ２７６５（DiaPharma, Westchester, OH）を添加し、反応を、１
時間３７℃、４０５ｎＭでの吸収の変化により、ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸプラスマ
イクロプレート中でモニターした。 変更は当業者には明らかであろうから、本発明は添付した請求の範囲によって
のみ限定されることが意図される。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、エンドセリアーゼ２スプライス変種のドメイン組成を示
す。各変種は、膜貫通ドメイン直前に、Ｎ−ミリストイル化修飾のための配列モ
チーフである、ＡＳＰＡＧＴＰＰＧＲＡＳＰ（配列番号１４）から成る３つの反
復配列を含む。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 38/48 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｎ ４Ｂ０６５ 39/395 45/00 ４Ｃ０７６ 47/48 ４Ｃ０８４ 45/00 48/00 ４Ｃ０８５ 47/48 Ａ６１Ｐ 1/02 ４Ｃ０８６ 48/00 1/04 ４Ｃ０８７ Ａ６１Ｐ 1/02 1/16 ４Ｈ０４５ 1/04 3/10 1/16 7/02 3/10 9/00 7/02 9/10 9/00 17/02 9/10 17/06 17/02 19/02 17/06 27/06 19/02 29/00 １０１ 27/06 35/00 29/00 １０１ 41/00 35/00 Ｃ０７Ｋ 16/40 41/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ０７Ｋ 16/40 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 9/50 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/37 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 9/50 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/37 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ 33/50 5/00 Ａ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/547 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 エドガー・オー・オング アメリカ合衆国92126カリフォルニア州サ ンディエゴ、カリェ・クリストバル7270 番、ナンバー56 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA12 DA13 FB01 FB02 4B024 AA01 AA11 BA14 BA44 CA04 CA11 DA01 DA02 DA05 DA11 EA01 EA02 EA03 EA04 FA02 GA01 GA11 HA01 HA11 4B050 CC01 CC03 CC07 DD11 LL01 LL03 4B063 QA01 QA18 QQ30 QR16 QR33 QR57 QR59 QR80 QR82 QS05 QS15 QS25 QS26 QS36 QX02 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA01 DA13 4B065 AA01X AA57X AA87X AA93Y AB01 AB02 BA01 BA08 CA25 CA33 CA44 CA46 4C076 AA95 CC01 CC03 CC10 CC11 CC15 CC16 CC18 CC27 EE59 4C084 AA01 AA02 AA07 AA13 AA16 BA01 BA02 BA08 BA22 CA53 DC03 MA02 MA17 MA22 MA23 MA24 MA35 MA37 MA41 MA43 MA52 MA55 MA60 MA66 NA14 ZA332 ZA362 ZA452 ZA682 ZA752 ZA892 ZA962 ZB152 ZB262 ZC352 4C085 AA13 AA14 BB11 EE01 EE03 GG02 GG04 GG05 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 MA02 MA04 MA05 MA17 MA22 MA23 MA24 MA35 MA37 MA41 MA43 MA52 MA55 MA60 MA66 NA14 ZA33 ZA36 ZA45 ZA68 ZA75 ZA89 ZA96 ZB15 ZB26 ZC35 4C087 AA01 AA02 BB33 MA17 MA22 MA23 MA24 MA35 MA37 MA41 MA43 MA52 MA55 MA60 MA66 4H045 AA11 AA30 BA10 CA40 DA76 EA20 EA50 FA72 FA74

Claims (60)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 エンドセリアーゼタンパク質または触媒的に活性なその部分
    であるタンパク質のプロテアーゼドメインを含む実質上精製されたタンパク質で
    あって、タンパク質のエンドセリアーゼプロテアーゼドメイン部分が、プロテア
    ーゼドメインまたは触媒的に活性なその部分を構成するアミノ酸配列から本質的
    に成り、そしてエンドセリアーゼが内皮細胞膜貫通プロテアーゼである、実質上
    精製されたタンパク質。
  2. 【請求項２】 エンドセリアーゼタンパク質または触媒的に活性なその部分
    のプロテアーゼドメインから本質的に成る、請求項１記載の実質上精製されたタ
    ンパク質。
  3. 【請求項３】 エンドセリアーゼがエンドセリアーゼ１または２である、請
    求項１または２記載の実質上精製されたタンパク質。
  4. 【請求項４】 プロテアーゼドメインが、配列番号２に示すアミノ酸または
    配列番号４のアミノ酸３２０−６８８、または配列番号６のアミノ酸３２０−５
    ６２または配列番号２２のアミノ酸１９０−４２４の配列、またはプロテアーゼ
    活性を示すその連結部分を含む、請求項３記載の実質上精製されたタンパク質。
  5. 【請求項５】 実質上精製されたエンドセリアーゼ２タンパク質、または触
    媒的に活性なその部分であるタンパク質。
  6. 【請求項６】 エンドセリアーゼ２−Ｌであるか、またはエンドセリアーゼ
    ２−Ｓである、請求項５記載のエンドセリアーゼタンパク質または触媒的に活性
    なその部分。
  7. 【請求項７】 配列番号２、４または６に示すアミノ酸配列を含むタンパク
    質のプロテアーゼドメインに特異的に結合する抗体に特異的に結合する請求項１
    −６のいずれか一項記載のタンパク質。
  8. 【請求項８】 配列番号２に示すアミノ酸または配列番号４のアミノ酸３２
    ０−６８８、または配列番号６のアミノ酸３２０−５６２、または配列番号２２
    のアミノ酸１９０−４２４の配列、またはプロテアーゼ活性を示すその連結部分
    を含むプロテアーゼドメインタンパク質と、少なくとも約４０％、６０％、８０
    ％または９０％の配列同一性を有する請求項１記載のタンパク質。
  9. 【請求項９】 請求項１−９のいずれか一項のタンパク質をコードするヌク
    レオチド配列を含む核酸分子。
  10. 【請求項１０】 エンドセリアーゼタンパク質またはエンドセリアーゼのプ
    ロテアーゼドメインもしくはプロテアーゼドメインの触媒的に活性な部分をコー
    ドする核酸分子であって、その全長に渡って請求項９記載の核酸分子に中ストリ
    ンジェント条件下でハイブリダイズする核酸分子。
  11. 【請求項１１】 エンドセリアーゼタンパク質または触媒的に活性なその部
    分をコードする核酸分子であって、その全長に渡って請求項８記載の核酸分子に
    高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸分子。
  12. 【請求項１２】 請求項９−１１のいずれか一項記載の核酸分子を含むベク
    ター。
  13. 【請求項１３】 発現ベクターである、請求項１２記載のベクター。
  14. 【請求項１４】 ベクターに作用的に結合されたヌクレオチド配列によりコ
    ードされるタンパク質の分泌を指向するヌクレオチド配列を含む、請求項１２ま
    たは１３記載のベクター。
  15. 【請求項１５】 ピキアベクターである、請求項１２−１４のいずれか一項
    記載のベクター。
  16. 【請求項１６】 請求項１２−１４のいずれか一項記載のベクターを含む細
    胞。
  17. 【請求項１７】 原核細胞である、請求項１６記載の細胞。
  18. 【請求項１８】 真核細胞である、請求項１６記載の細胞。
  19. 【請求項１９】 細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞、および動物細
    胞から選択される、請求項１６記載の細胞。
  20. 【請求項２０】 哺乳動物細胞である、請求項１６記載の細胞。
  21. 【請求項２１】 エンドセリアーゼが膜貫通ドメインおよびプロテアーゼド
    メインを含み、細胞中で膜貫通タンパク質として発現され、細胞が内皮細胞であ
    る場合、エンドセリアーゼがそれに対して異種構造である、請求項１６−２０の
    いずれか一項記載の細胞。
  22. 【請求項２２】 エンドセリアーゼが、配列番号２、４、６および２２のい
    ずれか一つに示すアミノ酸配列を含む、請求項２１記載の細胞。
  23. 【請求項２３】 エンドセリアーゼが、配列番号２、４、６、および２２の
    いずれか一つに示すアミノ酸配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有する、
    請求項２１記載の細胞。
  24. 【請求項２４】 エンドセリアーゼタンパク質またはエンドセリアーゼプロ
    テアーゼドメインタンパク質を製造するための方法であって、コードされたエン
    ドセリアーゼタンパク質またはエンドセリアーゼプロテアーゼドメインタンパク
    質が細胞により発現される条件下で請求項１６−１９のいずれか一項記載の細胞
    を培養すること、および発現されたタンパク質を回収することを含む方法。
  25. 【請求項２５】 請求項９記載の核酸分子のコーディング部分に相補的な、
    少なくとも１４の連結ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドを含む、アンチセン
    ス核酸分子。
  26. 【請求項２６】 連結ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドが、エンドセリ
    アーゼのプロテアーゼドメインのヌクレオチドの連結配列と相補的である、請求
    項１記載のアンチセンス核酸分子。
  27. 【請求項２７】 エンドセリアーゼがエンドセリアーゼ１またはエンドセリ
    アーゼ２である、請求項２６記載のアンチセンス核酸分子。
  28. 【請求項２８】 請求項１−８のいずれか一項記載のエンドセリアーゼのプ
    ロテアーゼドメインに特異的に結合する抗体、またはその結合ドメインを含む抗
    体のフラグメントまたは誘導体であって、抗体がポリクローナル抗体またはモノ
    クローナル抗体である、抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体。
  29. 【請求項２９】 請求項１−８のいずれか一項記載のタンパク質、または該
    タンパク質をコードしている核酸、または該核酸を含むベクター、または該ベク
    ターを含む細胞と、および診断、治療もしくは薬物スクリーニングのための試薬
    とを含むキット。
  30. 【請求項３０】 ａ）請求項１−８のいずれか一項記載のタンパク質、およ
    び、 ｂ）直接、またはリンカーを介してタンパク質に結合される標的剤、 を含む結合物。
  31. 【請求項３１】 標的剤が、 ｉ）結合物のアフィニティ単離または精製； ｉｉ）表面への結合物の結合； ｉｉｉ）結合物の検出；または ｉｖ）選択された組織または細胞への標的とする送達 を可能とするものである、請求項３０記載の結合物。
  32. 【請求項３２】 ａ）エンドセリアーゼまたはそのプロテアーゼドメインの活性の阻害物質；およ
    び、 ｂ）抗腫瘍および抗血管形成治療薬または治療剤から選択される他の治療薬また
    は治療剤 を含む組み合わせ。
  33. 【請求項３３】 エンドセリアーゼまたはそのプロテアーゼドメインが、請
    求項１−８のいずれか一項記載のタンパク質を含む、請求項３２記載の組み合わ
    せ。
  34. 【請求項３４】 エンドセリアーゼ阻害物質および抗血管形成剤を、単一の
    医薬組成物に処方するか、またはそれぞれを別個の医薬組成物に処方する、請求
    項３２または請求項３３記載の組み合わせ。
  35. 【請求項３５】 エンドセリアーゼ阻害物質が、抗体およびアンチセンスオ
    リゴヌクレオチドから選択される、請求項３２−３４のいずれか一項記載の組み
    合わせ。
  36. 【請求項３６】 直接、またはリンカーを介して結合される２またはそれ以
    上の請求項１記載のタンパク質を含む固体支持体。
  37. 【請求項３７】 タンパク質が一のアレイを含む請求項３２記載の支持体。
  38. 【請求項３８】 エンドセリアーゼの活性を調節する化合物を同定するため
    の方法であって、エンドセリアーゼまたはエンドセリアーゼのプロテアーゼドメ
    インを、一の試験化合物または複数の試験化合物の添加と同時に、添加前に、ま
    たは添加後に、エンドセリアーゼによりタンパク質分解的に切断される基質と接
    触させること、試験化合物の存在下で切断された基質の量を測定すること、およ
    び対照と比較して切断された量が異なる化合物を選択し、それにより、エンドセ
    リアーゼの活性を調節する化合物を同定することを含む方法。
  39. 【請求項３９】 エンドセリアーゼまたはそのプロテアーゼドメインに特異
    的に結合する化合物を同定する方法であって、エンドセリアーゼまたはプロテア
    ーゼドメインを一の試験化合物または複数の試験化合物と、それらの結合に資す
    る条件下で接触させること、次いでエンドセリアーゼまたはそのプロテアーゼド
    メインに特異的に結合する化合物を同定することを含む方法。
  40. 【請求項４０】 エンドセリアーゼまたはそのプロテアーゼドメインが請求
    項１−８のいずれか一項記載のタンパク質である、請求項３８または請求項３９
    記載の方法。
  41. 【請求項４１】 エンドセリアーゼまたはエンドセリアーゼのプロテアーゼ
    ドメインが細胞表面上で発現される、請求項３８−４０のいずれか一項に記載の
    方法。
  42. 【請求項４２】 エンドセリアーゼまたはそのプロテアーゼドメインが、直
    接またはリンカーを介して固体支持体に結合される、請求項３８−４０のいずれ
    か一項記載の方法。
  43. 【請求項４３】 化合物が小分子、ペプチド、ペプチドミメティクス、天然
    生成物、抗体またはそのフラグメントである、請求項３８−４０のいずれか一項
    記載の方法。
  44. 【請求項４４】 複数の試験物質が同時にスクリーニングされる、請求項３
    ８−４３のいずれか一項記載の方法。
  45. 【請求項４５】 試験化合物の存在下で切断された基質の量を試験化合物の
    不在下で切断された基質の量と比較することにより、切断された量の変化が評価
    される、請求項３８−４４のいずれか一項記載の方法。
  46. 【請求項４６】 複数のエンドセリアーゼまたはそのプロテアーゼドメイン
    が固体支持体に結合される、請求項３８−４５のいずれか一項記載の方法。
  47. 【請求項４７】 異常な血管形成または望ましくない新血管新生に伴う疾患
    の治療または診断のための、エンドセリアーゼタンパク質またはそのプロテアー
    ゼドメインの使用。
  48. 【請求項４８】 エンドセリアーゼまたはそのプロテアーゼドメインが請求
    項１−８のいずれか１項記載のタンパク質である、請求項４７記載の使用。
  49. 【請求項４９】 哺乳動物における望ましくないおよび／または制御できな
    い血管形成または新血管新生に伴う病気または疾患を治療または予防するための
    方法であって、哺乳動物に有効量のエンドセリアーゼ阻害物質を投与することを
    含む方法。
  50. 【請求項５０】 エンドセリアーゼが請求項１−８のいずれか一項記載のタ
    ンパク質を含む、請求項４９記載の方法。
  51. 【請求項５１】 哺乳動物がヒトである、請求項４９または５０記載の方法
    。
  52. 【請求項５２】 抗血管形成治療薬または治療剤を投与することをさらに含
    む請求項４９−５１のいずれか一項に記載の方法であって、抗血管形成治療薬ま
    たは治療剤がエンドセリアーゼの投与前、その投与後、または同時に投与される
    方法。
  53. 【請求項５３】 エンドセリアーゼ阻害物質が、エンドセリアーゼに拮抗す
    る抗体、またはその結合領域を含むそのフラグメントもしくは誘導体、エンドセ
    リアーゼをコードしているアンチセンス核酸、異種構造配列がエンドセリアーゼ
    をコードしている遺伝子の少なくとも一部の生物学的な活性を不活性化するよう
    に異種構造ヌクレオチド配列がその中に挿入されている核酸から成る群より選択
    され、エンドセリアーゼをコードしている遺伝子の部分が異種構造配列に隣接し
    、そしてエンドセリアーゼをコードしている遺伝子との相同的組換えを起こして
    いる、請求項４９−５２のいずれか一項記載の方法。
  54. 【請求項５４】 望ましくない血管形成が、充実性腫瘍、血管奇形および心
    血管障害、慢性炎症性疾患および異常な創傷治癒、循環疾患、クレストシンドロ
    ーム、皮膚疾患および眼病から成る群から選択される疾患に付随する、請求項４
    ９−５３のいずれか一項記載の方法。
  55. 【請求項５５】 血管奇形および心血管障害が、血管繊維腫、血管脂肪腫、
    アテローム性動脈硬化症、再狭窄/再潅流障害、動静脈奇形、血管腫および血管
    癒着、血管過誤腫を伴う半側型軟骨形成障害（ファフィッチシンドローム）、遺
    伝性出血性毛細血管拡張症(ランデュ−オスラー−ウェーバーシンドローム)およ
    びフォン・ヒッペル・リンダウシンドロームから成る群から選択され、慢性炎症
    性疾患が、真性糖尿病、血友病性関節炎、炎症性腸疾患、進行性骨折、（進行性
    および若年性の）歯周炎、乾癬、リューマチ性関節炎、静脈鬱血性潰瘍、顆粒熱
    傷、瘢痕性蟹足腫、肝硬変、骨放射線壊死、術後癒着、化膿性肉芽腫、および全
    身性硬化症から成る群から選択され、循環疾患がレイノー現象であり、クレスト
    シンドロームが、石灰症、食道、ディオモティロティ、手指硬化症およびティー
    ンジエクタシスから成る群から選択され、皮膚疾患が、全身性血管炎、硬皮症、
    壊疽性膿皮症、血管障害、静脈、動脈潰瘍、スタージ・ウェーバーシンドローム
    、赤酒しみ様血管腫、青色ゴム乳首様母斑、クリッペル−トレノーレイ−ウェー
    バーシンドロームおよびオスラー-ウェーバー−ランデュシンドロームから成る
    群から選択され、眼病が、眼新血管新生病により引き起こされる失明、角膜移植
    新血管新生、眼の黄班変性症、新血管新生緑内障、トラコーマ、糖尿病性網膜症
    、近視性変性症、未熟児網膜症、水晶体後部繊維増殖症および角膜新血管新生病
    から成る群から選択される、請求項５４記載の方法。
  56. 【請求項５６】 エンドセリアーゼの内生遺伝子が欠失されている、または
    相同的組換え、または動物もしくはその先祖の挿入突然変異により不活性化され
    ているヒト以外の組換え動物。
  57. 【請求項５７】 エンドセリアーゼが請求項１−８のいずれか一項記載のタ
    ンパク質を含む、請求項５６記載のヒト以外の組換え動物。
  58. 【請求項５８】 欠失、挿入または他の変異により修飾されている請求項９
    −１１のいずれか一項の核酸分子を用いる組換えにより不活性化が達成され、組
    換えに際して内因性エンドセリアーゼが不活性化される、請求項５６または５７
    記載のヒト以外の組換え動物。
  59. 【請求項５９】 エンドセリアーゼまたはそのプロテアーゼドメインをコー
    ドしている遺伝子が、その固有のプロモーターのコントロール下にある、請求項
    ５６−５８のいずれか一項記載のヒト以外の組換え動物。
  60. 【請求項６０】 エンドセリアーゼがエンドセリアーゼ１またはエンドセリ
    アーゼ２である、請求項２１記載の細胞。
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