JP2003521920A - 膜貫通セリンプロテアーゼをコードしている核酸分子、コードされたタンパク質、およびそれらに基づく方法 - Google Patents

膜貫通セリンプロテアーゼをコードしている核酸分子、コードされたタンパク質、およびそれらに基づく方法

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JP2003521920A JP2001558009A JP2001558009A JP2003521920A JP 2003521920 A JP2003521920 A JP 2003521920A JP 2001558009 A JP2001558009 A JP 2001558009A JP 2001558009 A JP2001558009 A JP 2001558009A JP 2003521920 A JP2003521920 A JP 2003521920A
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Abstract

(57)【要約】 タイプＩＩ膜型セリンプロテアーゼ（ＭＴＳＰ）のプロテアーゼドメインを一本鎖として含むポリペプチドが本明細書中に提供される。ＭＴＳＰのプロテアーゼ活性を調節する化合物を同定するためのポリペプチドを用いる方法が提供される。ＭＴＳＰ３およびＭＴＳＰ４として指定されるＭＴＳＰ、およびＭＴＳＰ６と指定されるＭＴＳＰの形態も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 関連出願 「膜貫通セリンプロテアーゼのヌクレオチド配列およびタンパク質配列および
それらに基づく方法」と題された、２０００年２月３日に出願されたEdwin L. M
adisonおよびEdgar O. OngのU.S.仮出願第60/179,982；「膜貫通セリンプロテア
ーゼのヌクレオチド配列およびタンパク質配列およびそれらに基づく方法」と題
された、２０００年２月１８日に出願されたEdwin L. MadisonおよびEdgar O. O
ngのU.S.仮出願第60/183,542; 「膜貫通セリンプロテアーゼのヌクレオチド配列
およびタンパク質配列およびそれらに基づく方法」と題された、２０００年６月
２２日に出願されたEdwin L. MadisonおよびEdgar O. OngのU.S.仮出願第60/213
,124;「膜貫通セリンプロテアーゼのヌクレオチド配列およびタンパク質配列お
よびそれらに基づく方法」と題された、２０００年７月２６日に出願されたEdwi
n L. MadisonおよびEdgar O.OngのU.S.仮出願第60/220,970;および「膜貫通セリ
ンプロテアーゼをコードしている核酸分子、コードされたタンパク質、およびそ
れらに基づく方法」と題された、２０００年９月２２日に出願されたEdwin L. M
adison, Edgar O. OngおよびJiunn-Chern YehのU.S.仮出願第06/234,840に対す
る優先権の利益を本明細書中に主張する。優先権の利益は、「マトリプターゼま
たはＭＴＳＰ１のセリンプロテアーゼ活性の阻害物質」と題された、２０００年
９月８日に出願されたEdwin L. Madison, Joseph Edward Semple, Gary Samuel
Coombs, John Eugene Reiner, Edgar O. Ong, Gian Luca AraldiのU.S.仮出願第
09/657,968に対しても主張される。本出願は、U.S.出願第09/657,986に部分的に
継続するものである。
【０００２】 本出願は、「エンドセリアーゼのプロテアーゼドメインのヌクレオチド配列お
よびタンパク質配列およびそれらに基づく方法」と題された、１９９９年１１月
１８日に出願されたEdwin L. MadisonおよびEdgar O. OngのU.S.仮出願第60/166
,391に関連する。本出願は、２０００年１１月１７日に出願された国際PCT出願
第PCT/US00/31803にも関連する。 許容される場合、前記の仮出願、特許出願および国際ＰＣＴ出願が、引用によ
り完全に組み込まれる。全特許、出願、公開された出願および他の公開文献およ
びＧｅｎＢａｎｋからの配列および本明細書に引用される他のデータベースが、
完全に引用により組み込まれる。
【０００３】 発明の分野 プロテアーゼおよびその部分、特にプロテアーゼドメインをコードする核酸分
子が提供される。該プロテアーゼおよびそのドメイン、およびコードしている核
酸分子を用いる予測、診断および治療法も提供される。
【０００４】 発明およびその対象の背景 合衆国における主要な死亡原因である癌は、アメリカ人の３人に１人で発症し
、アメリカ人の４人に１人が癌で死ぬ。癌は、増殖して腫瘍塊を形成する異常な
腫瘍細胞数の増加、これらの新形成腫瘍細胞による隣接組織への侵入、および血
液系またはリンパ系を経て局所リンパ節および遠隔部位に転移する悪性細胞の発
生により特徴づけられる。 癌の懸著な特徴は、腫瘍細胞とその周囲の間の連絡に障害が起こることである
。正常な細胞は刺激シグナルがなければ分裂せず、抑制シグナルの存在下では分
裂を停止する。増殖刺激シグナルおよび増殖抑制シグナルは、正常には、組織内
の細胞間で取り交わされる。癌状態または腫瘍状態では、細胞はこれらのシグナ
ルを「無効にする」能力、および正常な細胞が増殖しない条件下で増殖する能力
を獲得している。
【０００５】 増殖するために、腫瘍細胞は遺伝子改変の反映である多くの独特の異常な特徴
を獲得している。一定のよく研究された腫瘍のゲノムは、活性化された腫瘍形成
遺伝子および不活性化された腫瘍抑制遺伝子を含む、いくつかの別個の独立に改
変された遺伝子を有する。これらの遺伝子変化はそれぞれ、総じて完全な腫瘍表
現型を表す特性のいくつかを提供する原因であると考えられる。
【０００６】 種々の生化学的因子が転移の種々の段階に関連している。コラーゲン、ラミニ
ンおよびプロテオグリカンなどの糖タンパクのための細胞表面レセプターは、侵
入および転移における重要な段階である腫瘍細胞の接着を促進する。接着より、
組織の境界を超えた腫瘍細胞の貫通を促進する分解酵素の放出が誘発される。腫
瘍細胞が標的組織に入ると、特異的増殖因子が更なる増殖に必要とされる。腫瘍
の侵入（または進行）には複雑な一連の現象が関与し、その現象において、腫瘍
細胞は一次腫瘍から分離し、それを囲む正常組織を破壊し、次いで血管およびリ
ンパ管に移動して、遠隔部位に運搬される。組織の基底膜および基質成分を作り
上げる細胞外マトリックスのタンパク質を分解する特異的酵素が合成されて、正
常組織の境界が破壊される。
【０００７】 細胞外マトリックス分解酵素のクラスが腫瘍の侵入に関与している。これらの
中には、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）がある。例えば、転移能
力を有する悪性腫瘍には、マトリックスメタロプロテイナーゼストロメリシンの
産生が伴う(例えば、McDonnell et al. (1990) Smnrs. in Cancer Biology 1: 1
07-115; McDonnell et al. (1990) Cancer and Metastasis Reviews 9: 309-319
を参照されたい)。
【０００８】 癌細胞の転移能力および組織侵入能力は、基底膜の破壊により促進される。Ｍ
ＭＰを含むいくつかのプロテイナーゼ酵素は、腫瘍細胞の侵入のプロセスを促進
することが報告されている。ＭＭＰは基底膜の破壊を亢進し、それにより腫瘍細
胞が組織に侵入するのを可能とする。例えば、約７０ｋＤａおよび９２ｋＤａの
分子量を有する２つの主要なメタロプロテイナーゼは、腫瘍細胞が転移する能力
を高めるようである。
【０００９】 タイプＩＩ膜貫通セリンプロテアーゼ（ＴＴＳＰ） ＭＭＰに加えて、セリンプロテアーゼが腫瘍疾患の進行に関与している。分泌
された酵素であるか、または細胞質貯蔵細胞小器官内にあるほとんどのセリンプ
ロテアーゼが、血液凝固、創生治癒、消化、免疫反応、および腫瘍の侵入および
転移に役割を持つ。タイプＩＩ膜貫通セリンプロテアーゼと呼ばれ、Ｎ−末端細
胞外ドメインを持つ膜結合タンパク質である細胞表面タンパク質の一クラスが同
定されている。細胞表面タンパク質として、それらは細胞内シグナル伝達に、お
よび細胞表面タンパク質分解現象を媒介するのに役割を果たすとされている。
【００１０】 細胞表面タンパク質分解は、種々の細胞機能を媒介する生物活性タンパク質の
生成のためのメカニズムである。これらの膜結合タンパク質には、ディスインテ
グリン様およびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭ）および膜型マトリックスメタ
ロプロテイナーゼ（ＭＴ−ＭＭＰ）が含まれる。哺乳動物では、ヒトにおける７
のメンバーを含む、該ファミリーの少なくとも１７のメンバーが公知である(Hoo
per et al. (2001) J. Biol. Chem. 276: 857-860を参照されたい）。これらに
は、コリン(受け入れ番号AF133845およびAB013874; Yan et al. (1999) J. Biol
. Chem. 274:14926-14938; Tomia et al. (1998) J. Biochem. 124:784-789; Ua
n et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:8525-8529)を参照された
い）；エンターペプチダーゼ（エンテロキナーゼとも呼ばれる；ヒトタンパク質
は、受け入れ番号U9860; Kitamoto et al. (1995) Biochem. 27: 4562-4568; Ya
hagi et al. (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun. 219:806-812; Kitamoto
et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:7588-7592; Matsushima et
al. (1994) J. Biol. Chem. 269:19976-19982;を参照されたい）；ヒト気管トリ
プシン様プロテアーゼ（ＨＡＴ；受け入れ番号AB002134; Yamaoka et al. J. B
iol. Chem. 273:11894-11901を参照されたい）；ＭＴＳＰ１およびマトリプター
ゼ（ＴＡＤＧ−１５とも呼ばれる；配列番号１および２を参照されたい；受け入
れ番号AF133086/AF118224, AF04280022; Takeuchi et al. (1999) Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 96:11054-1161; Lin et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:18
231-18236; Takeuchi et al. (2000) J. Biol. Chem. 275:26333-26342;およびK
im et al. (1999) Immunogenetics 49:420-429を参照されたい）；ヘプシン（受
け入れ番号M18930, AF030065, X70900; Leytus et al. (1988) Biochem. 27: 1
1895-11901; Vu et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:31315-31320;および Farle
y et al. (1993) Biochem. Biophys. Acta 1173:350-352を参照されたい;および
、U.S.特許第5,972,616を参照されたい）；ＴＭＰＲＳ２（受け入れ番号U75329
およびAF113596; Paoloni-Giacobino et al. (1997) Genomics 44:309-320; お
よびJacquinet et al. (2000) FEBS Lett. 468: 93-100を参照されたい）；およ
びＴＭＰＲＳＳ４（受け入れ番号NM 016425; Wallrapp et al. (2000) Cancer 6
0:2602-2606を参照されたい）：が含まれる。
【００１１】 膜貫通セリンプロテアーゼを含むセリンプロテアーゼは、腫瘍の発生および進
行に関与するプロセスに関与している。これらのプロテアーゼの正味の役割は未
だ詳細に開示されていないが、セリンプロテアーゼおよびその阻害物質は、腫瘍
の進行に関与する、癌細胞の侵入、転移蔓延、および腫瘍の新血管形成の低下作
用を含む、多くの細胞内および細胞外生理的プロセスのコントロールに関与して
いる。プロテアーゼは細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の破壊に関与し、組織の改
造に関与し、癌の侵入および転移に必要であると考えられている。いくつかのプ
ロテアーゼの活性および／または発現が、腫瘍の進行および発生に関連している
ことが示されている。
【００１２】 例えば、上皮癌および正常組織で発現される(Takeucuhi et al. (1999) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 96(20):11054-61)膜型セリンプロテアーゼＭＴＳＰ１
（マトリプターゼとも呼ばれる；Ｕ．Ｓ．特許第5,972,616からの配列番号１お
よび２；およびGenBank受け入れ番号AF118224; (1999) J. Biol. Chem. 274:182
31-18236; U.S.特許第5,792,616を参照されたい;さらに、Takeuchi (1999) Proc
. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96:11054-1161も参照されたい）が同定されている
。マトリプターゼは、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の一タイプで
ある主要なゼラチナーゼとしてヒト乳癌細胞で最初に同定された（U.S.特許第5,
482,848を参照されたい）。それは、乳癌の転移に役割を果たすと提唱されてい
る。その主たる切断特異性は、Ａｒｇ−Ｌｙｓ残基である。マトリプターゼはま
た、種々の上皮組織でも発現され、ヒトの胃腸管および前立腺で高レベルの活性
および／または発現を有する。
【００１３】 前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、カリクレイン様セリンプロテアーゼはマトリッ
クス糖タンパク質フィブロネクチンおよびラミニンを分解し、そして、前立腺癌
細胞による侵入を助長することが仮定されている(Webber et al. (1995) Clin.
Cancer Res., 1(10):1089-94）。ＰＳＡタンパク質分解活性をＰＳＡ特異的モノ
クローナル抗体でブロックすることにより、再構築された基底膜マトリゲルの、
高いレベルのＰＳＡを分泌するＬＮＣａＰヒト前立腺癌細胞によるの侵入が、イ
ンビトロで投与量依存的に減る。
【００１４】 肝癌細胞で同定される細胞表面セリンタンパク質であるヘプシンは、卵巣癌で
過剰発現される（Tanimoto et al. (1997) Cancer Res., 57(14):2884-7)。癌組
織ではヘプシンの転写が豊富であるようだが、正常な卵巣を含む正常な成人の組
織ではほとんど全く発現されない。ヘプシンは卵巣腫瘍で過剰発現されることが
多く、それゆえ、卵巣腫瘍細胞の侵入プロセスおよび増殖能力に関する候補プロ
テアーゼである可能性があることが提案されている。
【００１５】 正常上皮細胞特異的１（ＮＥＳ１）と指定されるセリンプロテアーゼ様遺伝子
(Liu et al., Cancer Res., 56(14):3371-9 (1996)）が同定されている。ＮＥＳ
１ｍＲＮＡの発現は、全正常上皮細胞系統および不滅化された非腫瘍形成上皮細
胞系統で認められているが、ヒト乳癌細胞系統の大部分はその発現の非常な低下
、またはその発現の完全な欠如を示す。増殖因子の活性を調節することが知られ
ているポリペプチドとＮＥＳ１が構造上類似すること、および乳癌形成とのＮＥ
Ｓ１の発現のネガティブな関連性により、腫瘍形成の抑制におけるこのプロテア
ーゼ様遺伝子産物の直接的または間接的な役割が示唆される。
【００１６】 従って、膜貫通セリンプロテアーゼは腫瘍の原因および腫瘍の病因に関連して
いると考えられる。これらのプロセスにおけるその役割をさらに解明し、さらな
る膜貫通プロテアーゼを同定する必要がある。それゆえ、腫瘍形成および／また
は発癌の調節、または腫瘍形成および／または発癌に関与する膜貫通セリンプロ
テアーゼ（ＭＴＳＰ）タンパク質およびそのようなＭＴＳＰプロテアーゼをコー
ドしている核酸を提供することが本明細書における目的である。そのようなプロ
テアーゼおよびそのようなプロテアーゼをコードしている核酸を用いる、予測、
診断、治療スクリーニング法を提供することも、本発明における対象である。
【００１７】 発明の概要 腫瘍細胞における機能活性が同じ組織における非腫瘍細胞と異なる膜貫通セリ
ンプロテアーゼファミリー、特にタイプＩＩ膜貫通セリンプロテアーゼ（ＴＴＳ
Ｐ）ファミリー（本明細書中、ＭＴＳＰとも呼ばれる）および、より詳細には、
ＴＴＳＰファミリーメンバーの単離プロテアーゼドメインが提供される。例えば
、ＭＴＳＰには、腫瘍細胞において、非腫瘍細胞と異なるレベルで、典型的にや
より高レベルで活性化および／または発現されるもの；および、細胞由来のもの
であって、基質が腫瘍細胞において非腫瘍細胞と異なるもの、またはそうでなけ
れば、ＭＴＳＰの特異性が変化したものが含まれる。
【００１８】 本明細書に意図されるＭＴＳＰファミリーには、内皮細胞で発現される膜に結
合されたプロテアーゼまたは膜につながれているプロテアーゼはいずれも含まれ
ない。ＭＴＳＰに含まれるのは、本明細書中ＭＴＳＰ３およびＭＴＳＰ４として
指定されるいくつかの未同定のＭＴＳＰファミリーメンバー、および本明細書中
ＭＴＳＰ６として指定される新規形態のタンパク質である。ＭＴＳＰ３およびＭ
ＴＳＰ４のそれぞれのプロテアーゼドメインに加えて、スプライス変種から生じ
るものを含む全長タンパク質、酵素前駆体および活性化形態、およびそれらの使
用も提供される。
【００１９】 本明細書に提供されるプロテアーゼドメインは、酵素前駆体が活性化された時
に切断部位（概して、コンセンサス配列Ｒ↓ＶＶＧＧ、Ｒ↓ＩＶＧＧ、Ｒ↓ＩＶ
ＮＧ、Ｒ↓ＩＬＧＧ、Ｒ↓ＶＧＬＬ、Ｒ↓ＩＬＧＧまたはその変種；Ｎ末端Ｒ↓
ＶまたはＲ↓Ｉを有する。ここで、↓は切断点を示す。）で作成されるＮ末端（
ＩＶ、ＶＶ、ＩＬおよびＩＩなど）を有する一本鎖ポリペプチドである。プロテ
アーゼドメインを同定するためには、ＲＩを同定し、次いで、それに続くアミノ
酸が前記のモチーフと比較されるべきである。
【００２０】 本明細書にて作成されるプロテアーゼドメインはしかし、二本鎖の活性化産物
を作成する活性化からは生じず、むしろＮ末端を有する一本鎖ポリペプチドであ
り、Ｎ末端にコンセンサス配列↓ＶＶＧＧ、↓ＩＶＧＧ、↓ＶＧＬＬ、↓ＩＬＧ
Ｇまたは↓ＩＶＮＧまたは他のそのようなモチーフを含む。本明細書に示すよう
に、そのようなポリペプチドは活性化の結果生じたものではなく、また、二本鎖
の形態ではないが、タンパク質分解（触媒）活性を示す。これらのプロテアーゼ
ドメインポリペプチドをアッセイに用いてＭＴＳＰの活性を調節する薬物がスク
リーニングされる。そのようなアッセイも本明細書中に提供される。典型的なア
ッセイにおいては、公知の基質、典型的には蛍光、色素またはその他検出可能な
方法で標識された基質をプロテアーゼドメインがタンパク質分解により切断する
能力に関する試験化合物の影響が評価される。プロテアーゼドメインの活性を調
節する薬物、一般的には化合物、特に小分子は、ＭＴＳＰの活性を調節する候補
化合物である。プロテアーゼドメインは、一本鎖プロテアーゼ特異的抗体を作成
するのに用いられることもできる。本明細書中に提供されるプロテアーゼドメイ
ンには、制限されるものではないが、例えば腫瘍細胞において非腫瘍細胞と異な
るレベルで発現され、および内皮細胞上では発現されない、最も好ましくはヒト
を含む好ましくは哺乳動物由来のＭＴＳＰファミリーメンバーのものであって、
インビトロタンパク質分解アッセイにおいて一本鎖ポリペプチドとしてタンパク
質分解活性を示す、前駆体の活性化のための切断部位のＮ末端からＣ末端、また
はそのＣ末端先端切断(truncated)部位までを有する一本鎖領域が含まれる。こ
れらには、制限されるものではないが、ＭＴＳＰ１（またはマトリプターゼ）、
ＭＴＳＰ３、ＭＴＳＰ４およびＭＴＳＰ６が含まれる。本明細書中の目的の、特
にインビトロ薬物スクリーニングタンパク質分解アッセイにおける使用のための
他のＭＴＳＰプロテアーゼドメインには、制限されるものではないが、コリン（
受け入れ番号AF133845およびAB013874; Yan et al. (1999) J. Biol. Chem. 274
:14926-14938; Tomia et al. (1998) J. Biochem. 124:784-789; Uan et al. (2
000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:8525-8529;ヒトのタンパク質は、配列
番号６１および６２を参照されたい）；エンターペプチダーゼ（エンテロキナー
ゼとも呼ばれる；ヒトのタンパク質は、受け入れ番号U09860; Kitamoto et al.
(1995) Biochem. 27: 4562-4568; Yahagi et al. (1996) Biochem. Biophys. Re
s. Commun. 219:806-812; Kitamoto et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.
S.A. 91:7588-7592; Matsushima et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:19976-199
82を参照されたい。;ヒトのタンパク質は、配列番号６３および６４を参照され
たい）；ヒト気管トリプシン様プロテアーゼ（ＨＡＴ；受け入れ番号AB002134;
Yamaoka et al. J. Biol. Chem. 273:11894-11901;ヒトタンパク質は、配列番
号６５および６６を参照されたい）；へプシン（受け入れ番号M18930, AF030065
, X70900; Leytus et al. (1988) Biochem. 27: 11895-11901; Vu et al. (199
7) J. Biol. Chem. 272:31315-31320; およびFarley et al. (1993) Biochem. B
iophys. Acta 1173:350-352; ヒトのタンパク質は、配列番号６７および６８を
参照されたい）；ＴＭＰＲＳ２（受け入れ番号U75329およびAF113596; Paoloni-
Giacobino et al. (1997) Genomics 44:309-320;および、Jacquinet et al. (20
00) FEBS Lett. 468: 93-100;ヒトタンパク質は、配列番号６９および７０を参
照されたい）；ＴＭＰＲＳＳ４（受け入れ番号NM 016425; Wallrapp et al. (20
00) Cancer 60:2602-2606;ヒトタンパク質は、配列暗号７１および７２を参照さ
れたい）；およびＴＡＤＧ−１２（ＭＴＳＰ６とも呼ばれる。配列番号１１およ
び１２を参照されたい。U.S.特許第09/261,416の優先権を主張する国際ＰＣＴ出
願WO00/52044を参照されたい）が含まれる。
【００２１】 一本鎖プロテーアゼドメインおよびＭＴＳＰのムテイン、特にプロテアーゼド
メイン中の遊離の（すなわち、タンパク質中のいずれかの他のＣｙｓ残基とジス
ルフィド結合を形成しない）Ｃｙｓ残基が他のアミノ酸置換、好ましくは保存的
アミノ酸置換またはその活性を消去しない置換にて置換されているムテイン、お
よびグリコシル化部位が除去されているムテインも提供される。触媒活性が保持
されている他の保存的アミノ酸置換を有するムテインも意図される（例えば、典
型的なアミノ酸置換に関する表１を参照されたい）。ＭＴＳＰ３、ＭＴＳＰ４お
よびＭＴＳＰ６における遊離Ｃｙｓ残基を示す図４も参照されたい。 従って、本明細書中には、膜貫通セリンプロテアーゼ（ＭＴＳＰ）タンパク質
のファミリーのメンバー、および機能ドメイン、特にそのプロテアーゼ（または
触媒）ドメイン、ムテイン、および他のその誘導体および類似体も提供される。
本明細書中、ＭＴＳＰをコードしている核酸も提供される。
【００２２】 典型的なＭＴＳＰ（例えば、配列番号１-１２、４９および５０を参照された
い）が本明細書中に提供され、その一本鎖プロテアーゼドメインは以下のようで
ある：配列番号１、２、４９および５０はＭＴＳＰ１およびそのプロテアーゼド
メインのアミノ酸配列および核酸配列を示す；配列番号３はＭＴＳＰ３核酸配列
を示し、配列番号４はコードされたＭＴＳＰ３アミノ酸を示す；配列番号５はＭ
ＴＳＰ４のプロテアーゼドメイン核酸配列を示し、配列番号６はコードされたＭ
ＴＳＰ４アミノ酸プロテアーゼドメインを示し；配列番号７はＭＴＳＰ４-Ｌ核
酸配列を示し、配列番号８はコードされたＭＴＳＰ４-アミノ酸配列を示し、配
列番号９はＭＴＳＰ４-Ｓをコードしている核酸配列を示し、配列番号１０はコ
ードされたＭＴＳＰ４-Ｓアミノ酸配列を示し、配列番号１１はＭＴＳＰ６をコ
ードしている核酸配列を示し、配列番号１２はコードされたＭＴＳＰ６アミノ酸
配列を示す。それぞれの一本鎖プロテアーゼドメインを、以下に示す。
【００２３】 一本鎖プロテアーゼドメインまたはその触媒活性部分をコードする核酸分子が
提供される。そのようなＭＴＳＰをコードしている核酸に、その全長に渡ってハ
イブリダイズし、プロテアーゼドメインまたはその部分をコードする核酸分子も
提供される。ハイブリダイゼーションは、少なくとも低、一般的には少なくとも
中程度の、およびしばしば高ストリンジェント条件下で好ましくは行われる。
【００２４】 本明細書中、ＭＴＳＰに特異的に結合する抗体、ＭＴＳＰをコードしている核
酸および／またはＭＴＳＰを含む細胞、組み合わせ、キットおよび製品も提供さ
れる。本明細書中、ＭＴＳＰおよびＭＴＳＰをコードしている核酸を用いる予測
、診断、治療スクリーニング法もさらに提供される。ＭＴＳＰをコードしている
不活性化された遺伝子を有する、および非固有のプロモーターコントロール下に
ＭＴＳＰをコードしている遺伝子を有するヒト以外の遺伝子転換動物も提供され
る。そのような動物は腫瘍の発生、増殖および／または進行のモデルの動物モデ
ルに有用である。
【００２５】 本明細書中、肺癌、前立腺癌、大腸癌および乳癌などの一定の腫瘍または癌細
胞で発現される膜セリンプロテアーゼ（ＭＴＳＰ）のファミリーのメンバーが提
供される。特に、本明細書中、ＭＴＳＰ、特にＭＴＳＰ３、ＭＴＳＰ４およびＭ
ＴＳＰ６が肺癌、乳癌、結腸腺癌および／または卵巣癌で、ならびに一定の正常
細胞および組織で発現されることが示される（例えば、本明細書中に例示される
各タンパク質の組織特異的発現特性に関する実施例を参照されたい）。本明細書
中特に興味深いＭＴＳＰは、腫瘍細胞で発現されるもの、例えば、腫瘍細胞にお
いて、正常細胞と異なるレベルで発現されると考えられるもの、または、基質、
それゆえまたはコファクターにおける変化によるなど、腫瘍細胞においてその機
能活性が正常細胞と異なっているものである。ゆえに、本明細書中に提供される
ＭＴＳＰは一定の腫瘍に関する診断マーカーとして役立ち得る。活性化されたＭ
ＴＳＰ３、ＭＴＳＰ４およびＭＴＳＰ６のレベルは前立腺癌を診断するものたり
得る。加えて、ＭＴＳＰ４はリンパ腫、白血病、肺癌、乳癌、前立腺癌および大
腸癌において発現および／または活性化される。ＭＴＳＰ６は乳癌、肺癌、前立
腺癌、大腸癌および卵巣癌において活性化および／または発現される。さらに、
これらのＭＴＳＰの活性を調節する化合物は、本明細書中に提供されるアッセイ
、特に一本鎖プロテアーゼドメインを用いるインビトロタンパク質分解アッセイ
により評価されるように、種々の悪性腫瘍および腫瘍疾患の治療の潜在的な治療
候補である。
【００２６】 本明細書にはさらに、ＭＴＳＰの活性を調節する方法、および、ＭＴＳＰの活
性を阻害する、拮抗する、作動する、またはそうでなければ変更することを含む
、ＭＴＳＰの活性を調節する化合物をスクリーニングする方法も提供される。特
に興味深いのは、タンパク質のタンパク質分解（触媒）部分を含むこれらのＭＴ
ＳＰの細胞外ドメインである。
【００２７】 スプライス変種を含む、ＭＴＳＰ３、ＭＴＳＰ４、およびＭＴＳＰ６を含むが
これらには制限されないＭＴＳＰタンパク質、およびＭＴＳＰをコードしている
核酸およびそのドメイン、誘導体、および類似体が本明細書中に提供される。Ｎ
末端における一本鎖プロテアーゼドメインは、酵素前駆体の活性によりＭＴＳＰ
から作成されるものであり、特に、内皮細胞で発現されず、腫瘍細胞で発現され
るものも提供される。
【００２８】 ＭＴＳＰ、特に一本鎖プロテアーゼドメイン、およびＭＴＳＰ３およびＭＴＳ
Ｐ４のいずれかの形態および全形態に特異的に結合する抗体、およびＭＴＳＰタ
ンパク質、そのドメイン、またはコードしている核酸を含む細胞、組み合わせ、
キットおよび製品も、本明細書中に提供される。ＭＴＳＰをコードしている不活
性化された遺伝子を有する、および非固有のプロモーターのコントロール下にＭ
ＴＳＰをコードしている遺伝子を有するヒト以外の形質転換動物が本明細書中に
さらに提供される。ＭＴＳＰおよびそのドメインのそれぞれをコードしている核
酸分子も提供される。
【００２９】 本明細書に提供される核酸分子を含むプラスミドも提供される。該プラスミド
を含む細胞も提供される。そのような細胞には、制限されるものではないが、細
菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞および動物細胞が含まれる。
【００３０】 ＭＴＳＰが細胞により発現される条件下で前記細胞を増殖させ、次いで発現さ
れたＭＴＳＰタンパク質を回収することによりＭＴＳＰを製造する方法も提供さ
れる。他のＭＴＳＰをコードしている核酸を単離するための方法も提供される。
【００３１】 ＭＴＳＰタンパク質、好ましくはＭＴＳＰ３およびＭＴＳＰ４が細胞表面で発
現される細胞、好ましくは真核細胞、例えば哺乳動物の細胞および酵母細胞など
も提供される。そのような細胞はＭＴＳＰタンパク質の活性を調節する化合物を
同定するための薬物スクリーニングアッセイに用いられる。これらのアッセイに
は、インビトロ結合アッセイ、ＭＴＳＰにより媒介されるシグナル伝達が評価さ
れる転写に基づくアッセイが含まれる。
【００３２】 本明細書中、ＭＴＳＰおよびＭＴＳＰをコードしている核酸を用いる予測、診
断、および治療スクリーニング法がさらに提供される。特に、予測、診断および
治療スクリーニング法は、肺癌、大腸癌、および卵巣癌などの腫瘍または癌を予
防または治療するのに、またはそのような腫瘍または癌を予防または治療するの
に有用な薬物を見出すのに用いられる。
【００３３】 いずれかのＭＴＳＰの活性を調節する化合物をスクリーニングする方法も提供
される。化合物は、それらをＭＴＳＰおよびＭＴＳＰのための基質と接触させる
ことにより同定される。化合物の不在下と比較して、化合物の存在下で切断され
た基質の量の変化が、化合物がＭＴＳＰの活性を調節することを示す。そのよう
な化合物、阻害物質またはアゴニストは、さらなる分析のために、またはＭＴＳ
Ｐの活性を調節するために用いるために選択される。化合物は、ＭＴＳＰまたは
細胞外ドメインまたはそのタンパク質分解活性部分を発現する細胞と基質を接触
させることにより同定されることもできる。細胞外ドメインまたはそのタンパク
質活性部分が用いられるアッセイに関し、ＭＴＳＰは、制限されるものではない
がＭＴＳＰ１、ＭＴＳＰ３、ＭＴＳＰ４およびＭＴＳＰ６を含む、内皮細胞以外
の細胞上で発現されるいずれかのＭＴＳＰである。
【００３４】 ＭＴＳＰの活性のモジュレーター、特に本明細書に提供されるスクリーニング
法に従って得られるモジュレーターも提供される。そのようなモジュレーターは
、癌疾患および他の腫瘍疾患を治療するのに用いられてよい。 ＭＴＳＰタンパク質のプロテアーゼドメインおよびＭＴＳＰタンパク質、ＭＴ
ＳＰ３、ＭＴＳＰ４およびＭＴＳＰ６を含む医薬組成物が、本明細書において、
本明細書中に提供される医薬上許容されるキャリアまたは賦形剤中に提供される
。
【００３５】 ＭＴＳＰタンパク質および一本鎖形態のＭＴＳＰのプロテアーゼドメインを含
む製品も提供される。ａ）パッケージング材料；ｂ）ポリペプチド（またはコー
ドしている核酸）、特にその一本鎖プロテアーゼドメイン；およびｃ）製品がＭ
ＴＳＰタンパク質の活性のモジュレーターを同定するためのアッセイにおいて用
いられるためのものであることを示すラベル：を含む製品が、本明細書中に提供
される。
【００３６】 ａ）一本鎖形態のＭＴＳＰプロテアーゼドメイン；およびｂ）直接またはリン
カーを経由してＭＴＳＰに結合された標的剤、ここで該標的剤はｉ）結合物のア
フィニティ分離または精製；ｉｉ）表面への結合物の結合；ｉｉｉ）結合物の検
出；またはｉｖ）選択された組織または細胞への標的送達を促進する；を含む結
合物が、本明細書中に提供される。結合物はそれに結合された複数の薬剤を含む
ことができる。結合物は化学結合物であり得、およびそれは融合タンパク質であ
り得る。
【００３７】 さらに他の具体例では、標的剤はタンパク質またはペプチドフラグメントであ
る。タンパク質またはペプチドフラグメントには、タンパク質結合配列、核酸結
合配列、脂質結合配列、多糖類結合配列、または金属結合配列が含まれることが
できる。
【００３８】 対象におけるＭＴＳＰ、特にＭＴＳＰ３、ＭＴＳＰ４またはＭＴＳＰ６の異常
なレベルを検出することにより特徴付けられる、病気または疾患を診断する方法
が提供される。該方法は、ＭＴＳＰのＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質または機能活
性のレベルを測定することにより行うことができる。ＭＴＳＰのＤＮＡ、ＲＮＡ
、タンパク質または機能活性のレベルの、病気または疾患を持たない類似サンプ
ル（または他の適当なコントロール）に見出されるＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質
または機能活性のレベルに対する増加または減少は、対象または関連するあらゆ
る他の適当な対照における病気または疾患の存在を示すものである。
【００３９】 組み合わせが、本明細書中に提供される。組み合わせには、ａ）ＭＴＳＰの活
性の阻害物質；およびｂ）抗癌治療剤または治療薬を含めることができる。ＭＴ
ＳＰ阻害物質および抗癌剤は、単一の医薬組成物中に処方されることができ、ま
たはそれぞれ別個の医薬組成物中に処方される。ＭＴＳＰ阻害物質は、ＭＴＳＰ
に対する抗体、またはそのフラグメントまたはその結合部分、例えばプロテアー
ゼドメインに特異的に結合する抗体、ＭＴＳＰ産生の阻害物質、またはＭＴＳＰ
膜局在化の阻害物質、またはＭＴＳＰ活性化の阻害物質であり得る。他のＭＴＳ
Ｐ阻害物質には、制限されるものではないが、ＭＴＳＰ、特にプロテアーゼドメ
インの部分をコードしているアンチセンス核酸；異種核酸配列が生物活性のある
コードされたＭＴＳＰまたはそれをコードしている遺伝子を不活性化するように
異種核酸配列が挿入されている、ＭＴＳＰをコードしている遺伝子の少なくとも
一の部分をコードしている核酸が含まれる。ＭＴＳＰをコードしている遺伝子の
部分は好ましくは異種配列に隣接して、ＭＴＳＰをコードしているゲノム遺伝子
との相同組換えをなす。
【００４０】 さらに、哺乳動物に有効量のＭＴＳＰ３、ＭＴＳＰ４またはＭＴＳＰ６の阻害
物質を投与し、それにより腫瘍または癌を予防または治療する、哺乳動物におい
て腫瘍または癌を治療または予防する方法が提供される。治療に、または予防の
ために用いられるＭＴＳＰ阻害物質は、医薬上許容されるキャリアまたは賦形剤
と共に投与される。治療される哺乳動物はヒトであり得る。治療または予防法に
は、さらに、抗癌治療剤または治療薬を、ＭＴＳＰ阻害物質の投与と同時に、ま
たは投与後、または投与前に投与することが含まれる。
【００４１】 ＭＴＳＰの内在遺伝子が動物またはその子孫の相同組換えまたは挿入遺伝子突
然変異により欠失または不活性化されているヒト以外の組換え動物も本明細書中
に提供される。ヒト以外の組換え動物が本明細書中に提供され、ここで、ＭＴＳ
Ｐの遺伝子は該遺伝子の固有のプロモーターではないプロモーターまたはヒト以
外の動物の該遺伝子の固有のプロモーターではないプロモーターのコントロール
下にあるか、またはＭＴＳＰをコードしている核酸はヒト以外の動物にとって異
種であり、およびプロモーターは固有または非固有のプロモーターである。
【００４２】 腫瘍細胞で発現される、または活性であるＭＴＳＰ、特に腫瘍細胞におけるそ
の機能活性が非腫瘍細胞におけるものよりも大きいものにより活性化されるプロ
ドラッグを投与することにより腫瘍を治療する方法も提供される。プロドラッグ
が投与され、そして投与により、細胞上に発現された活性ＭＴＳＰがプロドラッ
グを切断し、これらの細胞付近で活性薬物が放出される。活性抗癌剤が腫瘍付近
に蓄積される。これは、ＭＴＳＰが他の細胞と比較して腫瘍細胞でより大量に、
高レベルで、または優勢に発現される場合、または活性である場合に特に有用で
ある。
【００４３】 発明の詳細な説明 Ａ．定義 他が定義されない限り、本明細書に用いられる全技術用語および化学用語は、
本発明の属する当該分野の専門家により一般に理解されるものと同じ意味を有す
る。全特許、出願、公開された出願および他の公開文献およびGenBankおよび本
明細書中に言及される他のデータベースからの配列は、その全容が引用により組
み込まれる。
【００４４】 本明細書に用いられるあらゆる保護基、アミノ酸および他の化合物に関する省
略は、他が示されない限り、その一般的な慣用法、認められる省略、または生化
学命名法に関するＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ委員会((1992) Biochem. 11:942-944を参
照されたい）に従うものである。
【００４５】 本明細書に用いられるセリンプロテアーゼは、セリン残基がタンパク質または
ペプチドの加水分解に関与するプロテアーゼの多様なファミリーをいう。セリン
残基は、触媒作用に関するセリン、ヒスチジンおよびアスパラギン酸を含む触媒
三つ組メカニズム、触媒作用に関するセリンおよびリジンを含むヒドロキシル／
ε−アミンまたはヒドロキシル/α-アミン触媒二組(dyad)メカニズムの部分であ
り得る。
【００４６】 本明細書に用いられる「膜貫通セリンプロテアーゼ（ＭＴＳＰ）」は、本明細
書に記載するように、共通の構造特性を有する膜貫通セリンプロテアーゼの一フ
ァミリーをいう(Hooper et al. (2001) J. Biol. Chem.276:857-860も参照され
たい）。ここで、「ＭＴＳＰ」に対する引用は、ＭＴＳＰ１、ＭＴＳＰ３、ＭＴ
ＳＰ４およびＭＴＳＰ６、他のいずれかの源から得られた等価の分子、または合
成により調製された等価の分子、または同じ活性を示す等価の分子には制限され
ないがこれらを含む、ＭＴＳＰ遺伝子ファミリーによりコードされる全タンパク
質が包含される。他のＭＴＳＰには、制限されるものではないが、コリン、エン
ターペプチダーゼ、ヒト気管トリプシン様プロテアーゼ（ＨＡＴ）、ＭＴＳＰ１
、ＴＭＰＲＳＳ２およびＴＭＰＲＳＳ４が含まれる。典型的なＭＴＳＰおよび／
またはそのドメインのコーディング核酸分子の配列およびコードされたアミノ酸
配列を、配列番号１−１２、４９、５０および６１−７２に示す。該用語には、
各メンバーの活性を実質上改変しない保存的アミノ酸置換を有するＭＴＳＰも包
含され、およびそのスプライス変種も包含される。アミノ酸の適当な保存的置換
は当該分野の専門家に公知であり、生じる分子の生物活性を改変することなく一
般に達成され得る。特に興味深いのは、ヒト起源のものを含む、哺乳動物のＭＴ
ＳＰである。当該分野の専門家には、一般に、ポリペプチドの非必須領域におけ
る個々のアミノ酸置換は生物活性を実質的に改変しないことが理解される(例え
ば、Watson et al. Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987, The
Bejacmin/Cummings Pub. co., p.224を参照されたい）。
【００４７】 本明細書に用いられる「ＭＴＳＰのプロテアーゼドメイン」は、ＭＴＳＰの細
胞外ドメイン内に位置し、セリンタンパク質分解活性を示すＭＴＳＰのプロテア
ーゼドメインをいう。それは触媒活性を示す少なくとも最小のそのフラグメント
を一本鎖形態として含む。すなわちそれは、常套のアッセイ、インビトロアッセ
イにより評価されるタンパク質分解活性を示す細胞外ドメインの少なくとも最小
の部分である。当該分野の専門家には、そのようなプロテアーゼドメインが、ト
リプシンまたはキモトリプシンの折りたたみと構造上同等のプロテアーゼの部分
であることが理解される。
【００４８】 記載のプロテアーゼドメインを有する典型的なＭＴＳＰタンパク質を図１−３
に示す。プロテアーゼ活性を保持するその最小の部分が企図される。プロテアー
ゼドメインには、表面ループに挿入および欠失が含まれ、サイズおよび構成が異
なる。それらは、プロテアーゼのセリンプロテアーゼドメインの少なくとも１の
活性部位三つ組、一次(primary)特異性ポケット、オキシアニオンホールおよび
／または他の形態を含む保存された構造を保持する。つまり、本明細書における
目的に関し、プロテアーゼドメインは本明細書に定義するＭＴＳＰの部分であり
、他のＭＴＳＰ、例えばすでに同定されているコリン、エンターペプチダーゼ、
ヒト気道トリプシン様プロテアーゼ（ＨＡＴ）、ＭＴＳＰ１、ＴＭＰＲＳＳ２、
およびＴＭＰＲＳＳ４のドメインと相同であるが、該プロテアーゼドメインの単
離一本鎖形態がインビトロアッセイでタンパク質を分解する機能を持ち得ること
は認められなかった。キモトリプシン（Ｓ１）の折りたたみの酵素のより大きな
クラス同様（例えば、インターネットで入手可能なＭＥＲＯＰＳデータベースを
参照されたい）、ＭＴＳＰプロテアーゼドメインは高程度のアミノ酸配列同一性
を有する。活性に必要なＨｉｓ、ＡｓｐおよびＳｅｒ残基が保存されたモチーフ
に存在する。二本鎖形態の二番目の鎖のＮ末端に生じる活性化部位は保存された
モチーフを有し、容易に同定されることができる（例えば、配列番号６２のアミ
ノ酸８０１−８０６、配列番号６４のアミノ酸４０６−４１０、配列番号６６の
アミノ酸１８６−１９０、配列番号６８のアミノ酸１６１−１６６、配列番号７
０のアミノ酸２５５−２５９、配列番号７２のアミノ酸１９０−１９４を参照さ
れたい）。
【００４９】 本明細書に用いられるＭＴＳＰの触媒活性ドメインは、プロテアーゼドメイン
を意味する。ＭＴＳＰのプロテアーゼドメインなる言及は、あらゆるこれらのタ
ンパク質の一本鎖および二本鎖形態が含まれることを意味する。各タンパク質の
酵素前駆体形態は、切断により活性な二本鎖形態に変換されることができる一本
鎖形態である。プロテアーゼドメインも、二本鎖形態に変換されることができる
。活性化形態は、インビボで活性な形態を意味する。
【００５０】 意義深いことに、少なくともインビトロで、ＭＴＳＰおよびその触媒ドメイン
またはそのタンパク質分解活性部分（典型的には先端Ｃ末端）がプロテアーゼ活
性を示すことが本明細書中に示される。すなわち、本明細書中、ＭＴＳＰのプロ
テアーゼドメインの単離一本鎖形態、およびその活性を調節する薬剤の同定のた
めのインビトロ薬物スクリーニングアッセイにおけるその使用が提供される。 本明細書に用いられるＭＴＳＰ３は、本明細書中に引用する場合は常に、： 配列番号３に示すヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド； 配列番号３に示すヌクレオチドの配列に対して低、中または高ストリンジェン
ト条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチ
ド； 配列番号４のアミノ酸２０５−４３７として示すアミノ酸配列を含むポリペプ
チド； 配列番号４に示すアミノ酸配列と少なくとも約８５％または９０％の配列同一
性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；および／または、 配列番号３および４に示すＭＴＳＰ３のスプライス変種： の少なくとも一つまたは全て、またはそのいずれかの組み合わせが含まれる。
【００５１】 ＭＴＳＰ３はいずれの動物、特に哺乳動物由来であってもよく、制限されるも
のではないが、ヒト、ネズミ、ニワトリ、反芻動物および他の動物が含まれる。
全長の酵素前駆体もしくは二本鎖活性化形態、または二本鎖の活性化形態または
一本鎖形態であり得るプロテアーゼドメインを含むそのあらゆるドメインが企図
される。 本明細書中に用いられるＭＴＳＰ４は、本明細書中に引用する場合は常に、 配列番号５、７、または９のいずれかに示すヌクレオチド配列によりコードさ
れるポリペプチド； 配列番号５、７、または９のいずれかに示すヌクレオチド配列に対して、低、
中、または高ストリンジェントの条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列
によりコードされるポリペプチド； 配列番号６、８、または１０のいずれかに示すアミノ酸配列を含むポリペプチ
ド； 配列番号６、８、または１０に示すアミノ酸配列と少なくとも約８５％または
９０％、または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；
および／または、 配列番号７−１０に示すＭＴＳＰ４のスプライス変種： の少なくとも一つまたは全て、またはそのいずれかの組み合わせが含まれる。
【００５２】 ＭＴＳＰ４はいずれの動物、特に哺乳動物由来であってもよく、制限されるも
のではないが、ヒト、ネズミ、ニワトリ、反芻動物および他の動物が含まれる。
全長の酵素前駆体もしくは二本鎖活性化形態、または二本鎖活性化形態または一
本鎖形態であり得る、プロテアーゼドメインを含むそのあらゆるドメインが企図
される。
【００５３】 本明細書中に用いられるＭＴＳＰ６は、本明細書中に引用する場合は常に、 配列番号１１のいずれかに示すヌクレオチド配列によりコードされるポリペプ
チド； 配列番号１１のいずれかに示すヌクレオチド配列に対して、低、中、または高
ストリンジェントの条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコード
されるポリペプチド； 配列番号１２のいずれかに示すアミノ酸配列を含むポリペプチド； 配列番号１２に示すアミノ酸配列と少なくとも約９０％または９５％、または
９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド； 配列番号１２に示すＭＴＳＰ４のスプライス変種： の少なくとも一つまたは全て、またはそのいずれかの組み合わせが含まれる。
【００５４】 ＭＴＳＰ６はいずれの動物、特に哺乳動物由来であってよく、制限されるもの
ではないが、ヒト、ネズミ、ニワトリ、反芻動物および他の動物が含まれる。全
長の酵素前駆体もしくは二本鎖活性化形態、または二本鎖活性化形態または一本
鎖形態であり得る、プロテアーゼドメインを含むそのあらゆるドメインが企図さ
れる。本明細書中、特に興味深いのは、配列番号１２のＭＴＳＰ６である。
【００５５】 本明細書中に用いられるヒトのタンパク質は、他の哺乳動物に見出される変種
でない限り、全対立変種および保存的変種を含む、ヒトのゲノムに存在するＤＮ
Ａによりコードされるものである。 本明細書中に用いられる「ＭＴＳＰのプロテアーゼドメインまたは触媒活性部
分をコードしている核酸」は、前記の一本鎖プロテアーゼドメインまたはその活
性部分のみをコードしている核酸を意味し、連続する配列としてのＭＴＳＰの他
の連結部分は意味しないと解釈されるべきである。 本明細書に用いられるＣＵＢドメインは、補体成分Ｃ１ｒ/Ｃ１ｓ中のタンパ
ク質-タンパク質相互作用を媒介するモチーフであって、発生のプロセスに関与
する種々のタンパク質にも同定されているモチーフである。
【００５６】 本明細書に用いられる触媒活性は、セリンプロテアーゼとしてのＭＴＳＰの活
性を意味する。ＭＴＳＰの機能は、腫瘍形成、転移、もしくは発癌の促進、また
はそれらにおける関与を含む腫瘍生物学におけるその機能、およびさらにシグナ
ル伝達における役割をも意味する。
【００５７】 本明細書中に使用される「プロペプチド」または「プロ配列」は、成熟した生
物活性ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列である。そのように位
置づけられ、生じるポリペプチドは酵素前駆体と呼ばれる。酵素前駆体は一般に
生物学的に不活性であり、プロペプチドの触媒作用的切断もしくは自己触媒作用
的切断により、酵素前駆体から成熟した活性ポリペプチドへと変換されることが
できる。酵素前駆体は、作用因子の活性によりタンパク質分解酵素へと変換され
る酵素的に不活性なタンパク質である。切断は、自己触媒作用により行われてよ
い。
【００５８】 本明細書に用いられる「病気または疾患」は、例えば感染または遺伝的欠損か
ら生じ、同定可能な症状により特徴づけられる、生物体における病的状態をいう
。 本明細書中に用いられる腫瘍(neoplasm)（腫瘍形成(neoplasia)）は、異常な
新たな増殖をいい、従って、良性または悪性であってよい腫瘍(tumor)と同じも
のを意味する。過形成と異なり、腫瘍性の増殖は、オリジナルな刺激がなくても
持続する。
【００５９】 本明細書に用いられる腫瘍疾患は、腫瘍の発生、増殖、転移および進行を含む
、癌を含む疾患を意味する。 本明細書に用いられる癌は、あらゆるタイプの悪性腫瘍により引き起こされる
疾患に関する一般的用語を意味する。 本明細書に用いられる、腫瘍に対して用いられる悪性なる用語は、増殖コント
ロールおよび位置的コントロールが失われた、転移能力を有する一次腫瘍を意味
する。
【００６０】 本明細書に用いられる（「抗腫瘍(anti-tumor)または抗腫瘍(anti-neoplastic
)剤」と置き換えて用いることができる）抗癌剤なる用語は、抗癌治療に用いら
れる薬物を意味する。これらには、単独または他の化合物と組み合わせて用いら
れる場合、腫瘍疾患、腫瘍および癌に伴う臨床症状または診断マーカーを緩和す
る、減じる、改善する、予防する、またはそれらの鎮静状態に置く、または維持
することができる薬剤であって、本明細書に提供される方法、組み合わせ、およ
び組成物に用いることができる薬剤が含まれる。抗腫瘍剤の無制限の例には、抗
血管形成剤、アルキル化剤、抗代謝物質、一定の天然産物、白金配位錯体、アン
トラセンジオン、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、一定の
ホルモン、アンタゴニスト、および抗癌多糖類が含まれる。
【００６１】 本明細書中に用いられるスプライス変種なる用語は、１以上のタイプのｍＲＮ
Ａを生じる、ゲノムＤＮＡの一次転写産物の異なるプロセシングにより作成され
た変種をいう。ＭＴＳＰのスプライス変種が本明細書中に提供される。 本明細書に用いられる血管形成なる用語は、制限されるものではない、腫瘍に
伴う新血管形成を含む、新規血管構造の確立および維持（新血管形成）に直接、
または間接的に関与するプロセスの全体を広く包含することが意図される。
【００６２】 本明細書に用いられる抗-血管形成治療剤または抗-血管形成剤なる用語は、単
独、または他の治療もしくは化合物と組み合わせて用いられる場合に、望ましく
ないおよび／または非制御性の血管形成に伴う臨床症状または診断マーカーを緩
和する、減じる、改善する、予防する、またはそれらを鎮静状態に置くもしくは
維持することができる治療法および化合物を意味する。つまり、本明細書におけ
る目的に関して、抗血管形成剤なる用語は、血管構造の確立または維持を阻害す
る薬剤を意味する。そのような薬剤には、制限されるものではないが、抗-腫瘍
剤、望ましくない血管形成を伴う他の病気、例えば糖尿病性網膜症、再狭窄、過
剰増殖疾患その他の治療のための薬剤が含まれる。
【００６３】 本明細書中に用いられる非-抗-血管形成抗-腫瘍剤なる用語は、本来的に血管
形成を阻害することによっては作用しない抗-腫瘍剤を意味する。 本明細書中に用いられるプロ-血管形成剤なる用語は、血管構造の確立または
維持を促進する薬剤である。そのような薬剤には、心臓発作および卒中を含む心
血管疾患を治療する薬剤が含まれる。 本明細書に用いられる望ましくない、および／または非制御性の血管形成なる
用語は、血管形成刺激因子の影響が血管形成阻害因子の影響に勝る病的血管形成
を意味する。本明細書に用いられる、不完全な血管形成なる用語は、正常な血管
形成に欠損があり、異常な血管形成を生じるか、または血管形成の欠如または実
質上の低下を生じる病的な血管形成を意味する。
【００６４】 本明細書に用いられるエンドセリアーゼなる用語は、膜貫通ドメインを有し、
内皮細胞上で発現され、プロテアーゼドメイン、特に細胞外プロテアーゼドメイ
ンを含み、および好ましくはセリンプロテアーゼであるヒトを含む哺乳動物のタ
ンパク質を意味する。つまり、例えばエンドセリアーゼに対する引用は、エンド
セリアーゼ遺伝子ファミリーによりコードされる全タンパク質、またはいずれか
の他の源から得られるもしくは合成にて調製されている、または同じ活性を示す
等価の分子を包含する。エンドセリアーゼ遺伝子ファミリーは、内皮細胞中で発
現される膜貫通プロテアーゼである。エンドセリアーゼは、本明細書中に意図さ
れるＭＴＳＰから除かれる。
【００６５】 本明細書に用いられるエンドセリアーゼのプロテアーゼドメインなる用語は、
プロテアーゼ活性を示す細胞外部分である、エンドセリアーゼのポリペプチド部
分を意味する。プロテアーゼドメインは、プロテアーゼ活性に必要とされる少な
くとも最少数の、一般的には５０または１００以上のアミノ酸を含むポリペプチ
ドである。プロテアーゼ活性はプロテアーゼとして作用するその能力に関してポ
リペプチドを試験するなどにより、経験的に評価されてよい。試験化合物の代わ
りに公知の基質を用いる、実施例に記載するアッセイなどのアッセイを用いてよ
い。さらに、プロテアーゼ、特にセリンプロテアーゼは特徴的な構造および配列
またはモチーフを有するので、プロテアーゼドメインはそのような構造および配
列またはモチーフにより容易に同定されることができる。
【００６６】 本明細書に用いるＭＴＳＰタンパク質のプロテアーゼドメインは、ＭＴＳＰの
細胞外ドメイン内に位置する、またはＭＴＳＰの細胞外ドメインである、および
セリンタンパク質分解活性を示すＭＴＳＰのプロテアーゼドメインを意味する。
つまり、インビトロで常套のアッセイにより評価されるタンパク質分解活性を示
す細胞外ドメインの少なくとも最小の部分である。本明細書中では、これまで不
活性であると考えられていた一本鎖形態を言う。
【００６７】 典型的なプロテアーゼドメインには、ＭＴＳＰ１由来の（配列番号１のヌクレ
オチド１８６５−２５８７によりコードされる；配列番号４９および５０も参照
されたい）配列番号２のアミノ酸６１５−８５５、ＭＴＳＰ３由来のＭＴＳＰ４
のアミノ酸２０５−４３７、ＭＴＳＰ４のプロテアーゼドメインを示す配列番号
６、およびＭＴＳＰ６由来の配列番号１１のアミノ酸２１７−４４３として示す
アミノ酸配列の少なくとも十分な部分が含まれる。インビトロタンパク質分解ア
ッセイにおいてタンパク質分解活性を有する、およびＭＴＳＰタンパク質のプロ
テアーゼドメインの全長と少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％の配
列同一性を有するポリペプチドをコードする、または、特に中、一般的には高ス
トリンジェント条件下でプロテアーゼドメインをコードする核酸に、その全長に
沿ってハイブリダイズする核酸分子も意図される。
【００６８】 これらのプロテアーゼドメインのそれぞれに関して、そのようなプロテアーゼ
のＮ末端のＡｓｐはプロテアーゼの酵素前駆体形態の活性化切断の際の触媒的に
活性な構造の形成に不可欠であるので、Ｎ末端の残基が活性に重要であり得る。
本明細書中、プロテアーゼの一本鎖形態のプロテアーゼドメインが触媒的に活性
であることが示される。つまり、プロテアーゼドメインはＮ末端アミノ酸を要し
、Ｃ末端部分は先端切断されていてよい。切除され得る量は、触媒による切断を
評価するインビトロアッセイにおいてプロテアーゼ活性に関してタンパク質を試
験することにより経験的に決定されることができる。
【００６９】 すなわち、プロテアーゼ活性を保持するプロテアーゼドメインのより小さい部
分、特に一本鎖ドメインが企図される。そのような小さいバージョンは一般的に
は、プロテアーゼドメインのＣ末端が先端切断されたバージョンである。プロテ
アーゼドメインは、表面ループに挿入および欠失を含み、サイズおよび構成が異
なる。そのようなドメインは、プロテアーゼのセリンプロテアーゼドメインの活
性部位三つ組、一次特異性ポケット、オキシアニオンホールおよび／または他の
特徴を含む保存された構造を示す。つまり、本明細書中の目的に関して、プロテ
アーゼドメインは本明細書中に定義されるようにＭＴＳＰの一本鎖部分であるが
、キモトリプシンまたはトリプシンのプロテアーゼドメインと構造特性が類似ま
たは相同であり、および配列の保持に関して相同である。最も重要なことには、
ポリペプチドは一本鎖としてタンパク質分解活性を示す。
【００７０】 本明細書中に用いられる相同により、約２５％以上、好ましくは２５％、４０
％、６０％、８０％、９０％または９５％の核酸の配列同一性を意味する。「相
同」および「同一」なる用語は、しばしば互いに交換して用いられる。一般に、
配列は、最高のオーダーの適合が得られるように並べられる（例えば、Computat
ional Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New Y
ork, 1988; Biocomputing: Informatics および Genome Projects, Smith, D.W.
, ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Dat
a, Part I, Griffin, A.M., および Griffin, H.G., eds., Humana Press, New
Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., A
cademic Press, 1987; および Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and D
evereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carillo et al. (198
8) SIAM J Applied Math 48:1073を参照されたい）。
【００７１】 配列同一性により、保存されたアミノ酸の数が、常套の整列アルゴリズムプロ
グラムにより決定され、各供給源により確立されたデフォルトギャップペナルテ
ィを用いて用いられる。実質上相同の核酸分子は、典型的には中程度のストリン
ジェントで、または高ストリンジェントで、目的の核酸の全長に沿って、ハイブ
リダイズする。ハイブリダイズしている核酸分子中のコドンの代わりに縮重コド
ンを含む核酸分子も企図される。
【００７２】 ２つの核酸分子の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７
％、９８％または９９％「同一である」ヌクレオチド配列を持つかどうかは、例
えば「ＦＡＳＴ Ａ」プログラムなどの公知のコンピューターアルゴリズムを用
いて、例えばPearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444に記
載されるデフォルトパラメーターを用いて（他のプログラムには、ＧＣＧプログ
ラムパッケージ（Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(I):387 (
1984)））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Atschul, S.F., et al.
, J Molec Biol 215:403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop
, ed., Academic Press, San Diego, 1994, and Carillo et al. (1988) SIAM J
Applied Math 48:1073）が含まれる）決定されることができる。例えば、the N
ational Center for Biotechnology InformationデータベースのＢＬＡＳＴファ
ンクションを用いて同一性を決定してもよい。他の市場入手可能な、または公的
に利用できるプログラムには、ＤＡＮＳｔａｒ「ＭｅｇＡｌｉｇｎ」プログラム
(Madison, WI)およびthe University of Wisconsin Genetics Computer Group(U
WG)「Ｇａｐ」プログラム（Madison WI)が含まれる。タンパク質および／または
核酸分子のパーセント相同性および同一性は、例えばＧＡＰコンピュータープロ
グラム（例えば、Smith and Waterman ((1981) Adv. Appl. Math. 2:482により
修正されたNeedleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:443）を用いて配列情報
を比較することにより決定されてよい。簡単には、２つの配列の短い方の配列の
記号の総数で割った、類似の、整列した記号の数として類似性を規定する。ＧＡ
Ｐプログラムのデフォルトパラメータには、（１）（同一に関しては１の値を、
非同一に関しては０の値を含む）単一要素から成る比較マトリックスおよびSchw
artz and Dayhoff, eds., タンパク質配列および構造のアトラス, National Bi
omedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)により記載されるGribskov
et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14:6745の加重値を与えた比較マトリックス;
（２）各ギャップに関して３．０のペナルティおよび各ギャップにおける各記号
に関して追加の０．１０のペナルティ；および（３）エンドギャップに関してペ
ナルティなし：が含まれてよい。
【００７３】 それゆえ、本明細書に用いられる「同一性」なる用語は、試験ポリペプチドま
たはポリヌクレオチドと引用ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの間の比較を
表す。例えば試験ポリペプチドは引用ポリペプチドと９０％またはそれ以上同一
であるポリペプチドとして規定されてよい。本明細書に用いられる、少なくとも
「９０％同一」なる用語は、引用ポリペプチドに対して９０〜９９．９９のパー
セント同一性を意味する。９０％またはそれ以上のレベルの同一性は、例示的な
意味を想定すると、１００アミノ酸長の試験ポリヌクレオチドと対照ポリヌクレ
オチド比較されることを示す。試験ポリペプチドの１０％未満（即ち１００分の
１０）のアミノ酸が、引用ポリペプチドのものと異なる。同様の比較を試験ポリ
ヌクレオチドと引用ポリヌクレオチドの間で行ってもよい。そのような違いは、
アミノ酸配列の全長に渡ってランダムに分布する点突然変異として表されてもよ
く、許容される最大の程度、例えば１０／１００アミノ酸の違い（約９０％の同
一性）まで、異なる長さの１またはそれ以上の位置に集中していてよい。違いは
、核酸またはアミノ酸置換、または欠失として規定される。約８５−９０％を越
す相同性または同一性のレベルにおいて、結果はプログラムおよびギャップパラ
メーターから独立であるべきであり、そのような高レベルの同一性は、たいてい
ソフトウェアによらなくとも、容易に評価することができる。
【００７４】 本明細書に用いられるプライマーは、２またはそれ以上の、好ましくは３以上
のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド
を言い、ここからプライマー伸長産物の合成が開始され得る。合成を導く実験条
件には、ヌクレオシド３リン酸、およびポリメライゼーションおよび伸長のため
の薬剤、ＤＮＡポリメラーゼなどの存在および適当なバッファー、温度およびｐ
Ｈが含まれる。
【００７５】 本明細書に用いられる動物には、制限されるものではないが、ヤギ、ウシ、シ
カ、ヒツジ、ネズミ、ブタ、およびヒトなどの動物が含まれる。ヒト以外の動物
には、企図される動物としてヒトが除かれる。本明細書に提供されるＭＴＳＰは
、いずれかの源、動物、植物、原核生物および真菌由来である。好ましいＭＴＳ
Ｐは動物起源のものであり、好ましくは哺乳動物由来のものである。
【００７６】 本明細書に用いられる遺伝子治療には、そのような治療が要求される疾患また
は症状を有する哺乳動物、特にヒトの所定の細胞、標的細胞に、異種ＤＮＡを送
達することが含まれる。異種ＤＮＡが発現されて、それによりコードされる治療
産物が作成されるような方法で、ＤＮＡが選択された標的細胞に導入される。別
法として、異種ＤＮＡは治療産物をコードするＤＮＡの発現を何らかの方法で媒
介してよく、またはそれは、治療産物の発現を何らかの方法で直接的もしくは間
接的に媒介するペプチドまたはＲＮＡなどの産物をコードしてよい。遺伝子治療
を用いて、遺伝子産物をコードしている核酸であって、欠損遺伝子を置きかえる
もの、またそれが導入される哺乳動物または細胞により作成される遺伝子産物を
補うものを送達してもよい。導入される核酸は治療用化合物、例えば哺乳動物の
宿主では通常産生されない、または治療上有効な量で、もしくは治療上有効な時
間に産生されないその増殖因子阻害物質、または腫瘍壊死因子もしくはその阻害
物質、そのレセプターなどをコードしてよい。治療生成物をコードしている異種
ＤＮＡは、生成物またはその発現を増すために、またはそうでなければ生成物ま
たはその発現を変更するために、病気を患っている宿主の細胞に導入される前に
変更されてよい。
【００７７】 本明細書中に用いられる異種ＤＮＡは、インビボで、それが発現される細胞に
より通常は作成されないＲＮＡおよびタンパク質をコードするＤＮＡであるか、
または転写、翻訳または他の調節可能な生化学プロセスに作用することにより内
在ＤＮＡの発現を改変する媒介因子を媒介する、またはコードするＤＮＡである
。異種ＤＮＡは外来ＤＮＡとも呼ばれ得る。当該分野の専門家が、それが発現さ
れる細胞に対して異種または外来であると認識もしくは考えるＤＮＡはいずれも
、本明細書中、異種ＤＨＡにより包含される。異種ＤＮＡの例には、制限される
ものではないが、追跡可能なマーカータンパク質、例えば薬物耐性を付与するタ
ンパク質などをコードするＤＮＡ、治療的に有効な物質、抗癌剤、酵素およびホ
ルモンをコードするＤＮＡ、およびタンパク質の他のタイプ、抗体などをコード
するＤＮＡが含まれる。異種ＤＮＡによりコードされる抗体は、異種ＤＮＡが導
入された細胞の表面上で分泌または発現されてよい。
【００７８】 即ち、本明細書中、異種ＤＮＡまたは外来ＤＮＡには、ゲノムに見出される対
のＤＮＡ分子として正確な方向および位置には存在しないＤＮＡ分子が含まれる
。他の組織または種由来の（すなわち、外来）ＤＮＡ分子を意味してもよい。
【００７９】 本明細書中に用いられる、治療的に有効な産物は、核酸が宿主に導入されたと
き、遺伝性または後天性疾患の症状、徴候を改善もしくは除去する産物が発現さ
れる異種核酸、典型的にはＤＮＡによりコードされる産物である。 本明細書中に用いられる、ポリペプチドが本質的にプロテアーゼドメインから
成るなる用語は、ポリペプチドのまさにＭＴＳＰ部分がプロテアーゼドメインま
たはその触媒活性部分であることを意味する。ポリペプチドは、アミノ酸のさら
なる非ＭＴＳＰ由来配列を任意に含んでよく、および一般にそれらを含む。
【００８０】 本明細書中に用いられる癌または腫瘍治療薬または治療剤は、単独または他の
治療薬または化合物と組み合わせて用いられる場合に、不完全な血管形成に伴う
臨床症状または診断マーカーを緩和、低下、改善、予防またはそれらを鎮静状態
に置くもしくは維持することができる治療法および／または化合物を意味する。 本明細書に用いられる、ドメインは、分子の他の部分から構造的および／また
は機能的に異なる分子の部分、例えばタンパク質または核酸をいう。
【００８１】 本明細書に用いられるプロテアーゼは、タンパク質またはペプチドの加水分解
を触媒する酵素をいう。本明細書の目的に関して、プロテアーゼドメインはＭＴ
ＳＰタンパク質の一本鎖形態である。ＭＴＳＰ３およびＭＴＳＰ４に関し、プロ
テアーゼドメインには二本鎖形態も含まれる。 本明細書中に用いられる触媒活性は、選択された基質のタンパク質分解を検出
するインビトロタンパク質分解アッセイにおいて評価される、プロテアーゼとし
てのＭＴＳＰの活性をいう。
【００８２】 本明細書中に用いられる核酸には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質核酸（
ＰＮＡ）を含むその類似体、およびそれらの混合物が含まれる。核酸は一本鎖ま
たは二本鎖であり得る。検出可能な標識、例えば蛍光または放射能標識で任意に
標識されたプローブまたはプライマーを意味する場合、一本鎖分子が意図される
。そのような分子は典型的には、ライブラリーを検出またはプローブするのに統
計学的に一意的となる長さであり、かつ低コピー数（典型的には、５、好ましく
は３未満）の長さである。一般に、プローブまたはプライマーは、目的の遺伝子
と相補的なまたは同一の、少なくとも１４、１６または３０の連結配列を含む。
プローブおよびプライマーは、１０、２０、３０、５０、１００またはそれ以上
の核酸長であり得る。
【００８３】 本明細書中に用いられる、ＭＴＳＰのフラグメントまたは部分をコードしてい
る核酸は、列挙したＭＴＳＰのフラグメントまたは部分のみをコードする核酸を
意味するが、ＭＴＳＰの他の隣接部分は意味しない。 本明細書中に用いられる異種または外来ＤＮＡおよびＲＮＡは、交換して用い
られることができ、ゲノムの部分として天然には生じないＤＮＡまたはＲＮＡを
言い、ゲノム中、それは天然に生じるゲノムとは異なるゲノム中の位置に存在す
るか、もしくは見出される。異種核酸は一般に、それが導入される細胞に内在し
ないが、他の細胞から得られるか、または合成により調製されているものである
。一般に、必ずしもそうというわけではないが、そのような核酸はそれが発現さ
れる細胞により通常は作成されないＲＮＡおよびタンパク質をコードする。当該
分野の専門家が細胞にとって異種または外来であると認識もしくは考えるＤＮＡ
またはＲＮＡが、本明細書中、異種ＤＮＡにより包含される。異種ＤＮＡおよび
ＲＮＡは、転写、翻訳、または他の調節可能な生化学的プロセスに影響を与える
ことにより、内在ＤＮＡの発現に介在するＲＮＡもしくはタンパク質もしくは内
在ＤＮＡの発現を変更するＲＮＡまたはタンパク質をコードしてもよい。
【００８４】 本明細書に用いられるヌクレオチドの調節配列およびエフェクター配列、例え
ばプロモーター、エンハンサー、転写および翻訳停止部位および他のシグナル配
列への異種ＤＮＡの作用的結合は、そのようなＤＮＡとそのようなヌクレオチド
配列の間の結合を意味する。例えば、異種ＤＮＡのプロモータへの作用的結合は
、リーディングフレーム中のＤＮＡを特異的に認識し、それに結合し、次いでそ
れを転写するＲＮＡポリメラーゼによりそのようなＤＮＡの転写がプロモーター
から開始されるような、ＤＮＡとプロモーター間の物理的結合を意味する。
【００８５】 本明細書中に用いられる、ＲＮＡの少なくとも一部に相補的な配列は、アンチ
センスオリゴヌクレオチドに関し、好ましくは中または高ストリンジェント条件
下でＲＭＡとハイブリダイズして安定な二本鎖を形成することができるのに十分
な相補性を有する配列を意味し、二本鎖ＭＴＳＰアンチセンス核酸の場合は、二
本鎖ＤＮＡの一本鎖が試験されてよく、または三本鎖の形成が評価されてよい。
ハイブリダイズする能力は、アンチセンス核酸の相補性の程度および長さに依存
する。一般には、ハイブリダイズしている核酸が長いほど、より多くの塩基がＭ
ＴＳＰをコードしているＲＮＡとミスマッチし、それは安定な二本鎖（または場
合により三本鎖）を含み、そしてさらに形成し得る。当業者は、ハイブリダイズ
した複合体の融点を決定するための通常の方法を用いることにより、ミスマッチ
の許容される程度を確認することができる。
【００８６】 本明細書中の目的に関して、保存的アミノ酸置換は、生じるタンパク質がプロ
テアーゼ活性を示す限り、あらゆるＭＴＳＰおよびそのプロテアーゼドメインに
おいてなされてもよい。表１に示すもののような保存的アミノ酸置換は、タンパ
ク質分解活性を消去しないものである。アミノ酸の適当な保存的置換は当該分野
の専門家に公知であり、生じる分子の生物活性を改変することなく一般になされ
得る。当該分野の専門家には、一般に、ポリペプチドの非必須領域は生物活性を
実質上改変しないことが分かる（例えば、Watson et al. Molecular Biology of
the Gene, 4th Edition, 1987, The Bejacmin/Cummings Pub. co., p.224を参
照されたい）。さらに、定義中、ＭＴＳＰの触媒活性フラグメント、特に一本鎖
プロテアーゼ部分も含まれる。保存的アミノ酸置換は、例えば、以下の表１に示
すものに従いなされる。
【００８７】
【表１】
【００８８】 他の置換も許容され、経験的に、または公知の保存的置換に従い決定されてよ
い。
【００８９】 本明細書に用いられるＡｂｕは、２−アミノ酪酸である。Ｏｒｎはオルニチン
である。 本明細書に用いられる、本明細書中に表される種々のアミノ酸配列中に生じる
アミノ酸は、周知の３文字または１文字の省略形に従い指定される。種々のＤＮ
Ａフラグメントに現れるヌクレオチドは、当該分野で通常用いられる常套の一文
字表記を用いて指定される。
【００９０】 本明細書に用いられるスプライス変種は、１以上のタイプのｍＲＮＡを生じる
、ゲノムＤＮＡの一次転写の種々のプロセシングにより作成される変種をいう。 本明細書に用いられる、本明細書に開示されるヌクレオチド配列に基づくプロ
ーブまたはプライマーには、配列番号１、３、５、７、９または１１のヌクレオ
チドの少なくとも１０、１４、好ましくは少なくとも１６または３０または１０
０の連結配列が含まれる。 本明細書に用いられる、特定の医薬組成物の投与による特定疾患の症状の緩和
は、組成物の投与によるものとし得る、もしくは組成物の投与に伴う、永続的も
しくは一時的な、継続的または一過性の緩和を意味する。
【００９１】 本明細書中に用いられるアンチセンスポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡまたは二
本鎖ＤＮＡのセンス鎖に相補的なヌクレオチド塩基の合成配列をいう。適当な条
件下でセンスおよびアンチセンスポリヌクレオチドを混合すると２つの分子が結
合し、またはハイブリダイゼーションする。これらのポリヌクレオチドがｍＲＮ
Ａに結合する（またはｍＲＮＡとハイブリダイズする）と、タンパク質合成（翻
訳）の阻害が起こる。これらのポリヌクレオチドが二本鎖のＤＮＡに結合すると
、ＲＮＡ合成（転写）の阻害が起こる。結果的に生じる翻訳および／または転写
の阻害により、センス鎖によりコードされるタンパク質の合成が阻害される。ア
ンチセンス核酸分子は、典型的には、目的の遺伝子をコードする核酸分子のコー
ディング部分、例えばＭＴＳＰの一本鎖プロテアーゼドメインをコードしている
核酸に相補的な、標的核酸に特異的に結合するのに十分な数のヌクレオチド、一
般には少なくとも５の連結ヌクレオチド、しばしば少なくとも１４または１６ま
たは３０の連結ヌクレオチドまたは変更ヌクレオチドを含む。
【００９２】 本明細書中に用いられるアレイは、３またはそれ以上のメンバーを含む、抗体
などのエレメントの集まりをいう。アドレス可能なアレイは、アレイのメンバー
が、典型的には固相担持体上の位置により同定できるものである。つまり、一般
に、アレイのメンバーは固相表面上の別個の同定可能な位置に固定される。 本明細書中に用いられる抗体は、天然のものであろうと、部分的にもしくは完
全に合成されたものであろうと、抗体の特異的結合能力を保持するその誘導体を
含む免疫グロブリンをいう。即ち、抗体には、免疫グロブリン結合ドメインに相
同もしくは実質上相同である結合ドメインを有するタンパク質が含まれる。抗体
には、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを含む免疫グロブリンクレ
イム(immunoglobulin claims)のメンバーも含まれる。
【００９３】 本明細書中に用いられる、抗体フラグメントは、全長の抗体の特異的結合能力
の少なくとも一部を保持する全長未満の抗体の誘導体をいう。抗体フラグメント
の例には、制限されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、一本
鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦＶ）、ＦＶ、ｄｓＦＶディアボディ(diabody)およびＦｄフラ
グメントが含まれる。フラグメントはジスルフィド結合によるなど、結合した複
数の鎖を含むことができる。抗体フラグメントは一般に、少なくとも約５０のア
ミノ酸、典型的には少なくとも２００のアミノ酸を含む。
【００９４】 本明細書中に用いられるＦｖ抗体フラグメントは非共有結合により結合した一
の可変重鎖（ＶＨ）および一の可変軽鎖から成る。 本明細書中に用いられるｄｓＦＶは、ＶＨ−ＶＬ対を安定化する、強化された
分子内ジスルフィド結合を有するＦｖをいう。 本明細書中に用いられるＦ（ａｂ）２フラグメントは、ペプシンをｐＨ４．０
−４．５で用いた免疫グロブリンの消化により生じる抗体フラグメントであり、
組換え産生されてよい。 本明細書に用いられるＦａｂフラグメントは、パパインを用いる免疫グロブリ
ンの消化から生じる抗体フラグメントであり、組換え産生されてよい。
【００９５】 本明細書に用いられるｓｃＦｖｓは、順序を問わずポリペプチドリンカーによ
り連結された可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）を含む抗体フラグメント
をいう。リンカーは、２の可変ドメインが実質上接触することなく架橋される長
さである。好ましいリンカーは、いくつかのＧｌｕまたはＬｙｓを有する（Ｇｌ
ｙ−Ｓｅｒ）ｎ残基であり、これらは分散されて溶解度を増す。
【００９６】 本明細書に用いられるヒト化抗体は、ヒトに投与して免疫反応を刺激しないよ
うにヒトのアミノ酸配列を含むように変更された抗体を言う。そのような抗体の
調製法は公知である。例えば、モノクローナル抗体を発現するハイブリドーマを
組換えＤＮＡ技術により変更し、非可変領域のアミノ酸組成がヒトの抗体に基づ
くものである抗体を発現させる。そのような領域を同定するためのコンピュータ
ープログラムが設計されている。 本明細書に用いられるダイアボディは二量体ｓｃＦＶであり、ダイアボディは
典型的にはｓｃＦｖｓよりも短いペプチドリンカーを持ち、好ましくは二量化さ
れる。
【００９７】 本明細書中に用いられるヒト化抗体は、ヒトに投与して免疫反応を刺激しない
ようにヒトのアミノ酸配列を含むべく変更された抗体を言う。そのような抗体を
調製する方法は公知である。例えば、モノクローナル抗体を発現するハイブリド
ーマを組換えＤＮＡ技術により変更して、非可変領域のアミノ酸組成がヒトの抗
体に基づくものである抗体を発現させる。そのような領域を同定するためのコン
ピュータープログラムが設計されている。 本明細書に用いられる組換えによる産生は、組換えＤＮＡ法を用いることによ
る組換え法による産生を意味し、クローン化されたＤＮＡによりコードされるタ
ンパク質を発現するための分子生物学に関する周知の方法の使用を意味する。
【００９８】 本明細書に用いられる評価なる用語は、サンプル中に存在するＭＴＳＰまたは
そのドメインの活性の絶対的な値を得るという意味での、およびさらに活性のレ
ベルを示すインデックス、比率、パーセント、視覚的な値またはその他の値を得
る意味での定量および質測定を含む。評価は直接的または間接的であってよく、
実際に検出される化学種は、もちろんタンパク質分解生成物そのものでなくても
よく、例えばその誘導体またはいずれかのさらなる物質であってよい。
【００９９】 本明細書に用いられる生物活性なる用語は、化合物のインビボでの活性、また
は化合物、組成物または他の混合物のインビボ投与に際して生じる生理的反応を
言う。生物活性にはつまり、そのような化合物、組成物および混合物の治療的作
用および医薬活性が包含される。生物活性は、そのような活性を試験もしくは使
用するべく設計されたインビトロシステムで観察されてよい。つまり、本明細書
における目的に関して、ルシフェラーゼの生物活性は、物質が酸化されると光を
生じるそのオキシゲナーゼ活性である。 本明細書に用いられる組み合わせなる用語は、２またはそれ以上のものの間の
あらゆる組み合わせをいう。 本明細書に用いられる組成物なる用語は、あらゆる混合物をいう。それは溶液
、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性、非水性のもの、またはそのあらゆる組
み合わせであってよい。
【０１００】 本明細書に用いられる結合物なる用語は、１またはそれ以上のＭＴＳＰ、特に
その一本鎖プロテアーゼドメインおよび１またはそれ以上の標的剤を含む、本明
細書に提供される化合物をいう。これらの結合物には、融合タンパク質などの組
換え方法により産生されるもの、例えばスルフヒドリル基への結合による化学結
合によるなどの化学的方法により産生されるものや、少なくとも１のＭＴＳＰま
たはそのドメインが、直接またはリンカーを介して標的剤に間接的に結合される
いずれかの他の方法により産生されるものが含まれる。
【０１０１】 本明細書に用いられる標的剤は、好ましくは結合物またはそのＭＴＳＰ部分を
内部移行(internalize)させる細胞表面レセプターへの結合物の特異的結合を提
供する、タンパク質またはその有効な部分などの部分である。標的剤は、例えば
結合物のアフィニティ分離または精製、表面への結合物の結合、または結合物も
しくは結合物を含む複合体の検出を増進する、または促進するものであってもよ
い。 本明細書に用いられる抗体結合物は、標的剤が抗体である結合物をいう。 本明細書に用いられるヒト化抗体は、ヒトに投与して免疫反応を刺激しないよ
うにヒトのアミノ酸配列を含むべく変更された抗体をいう。そのような抗体の調
製法は公知である。例えば、モノクローナル抗体を発現するハイブリドーマを組
換えＤＮＡ法により変更して、非可変領域のアミノ酸組成がヒトの抗体に基づく
ものである抗体を発現させる。そのような領域を同定するためにコンピューター
プログラムが設計されている。
【０１０２】 本明細書に用いられる、分子の誘導体または類似体は、該分子から誘導された
部分、または該分子の変更バージョンをいう。 本明細書に用いられる流体物なる用語は、流れることができるあらゆる組成物
をいう。従って、流体物は、半固体、ペースト、溶液、水性混合物、ゲル、ロー
ション、クリームまたは他のそのような組成物の形態である組成物を包含する。 本明細書に用いられる、特定疾患を治療するための化合物の有効量は、疾患に
関連する症状を緩和する、またはいくらかの方法においてはそれを減じるのに十
分な量である。そのような量は、単一投与量として投与されてよく、それが有効
となる方法に従って投与されてよい。該量は、疾患を治療し得るが、典型的には
、疾患の症状を緩和するために投与される。所望される症状の緩和を得るために
、繰り返し投与することが必要とされる可能性がある。
【０１０３】 本明細書に用いられる等価物は、２つの核酸配列に関して言及する場合、問題
の２つの配列がアミノ酸または等価なタンパク質の同じ配列をコードすることを
意味する。等価物を、２つのタンパク質またはペプチドを示すのに用いる場合、
２つのタンパク質またはペプチドが、該タンパク質またはペプチドの活性または
機能を実質上変更しない保存されたアミノ酸置換のみを有する、実質上同じアミ
ノ酸配列を有することを意味する(例えば、前記表１を参照されたい）。等価な
る語が特性を示す場合、該特性は同じ程度で存在しなくてよい（例えば、２つの
ペプチドは同じタイプの酵素活性に関して異なる速度を示すことができる）が、
活性は好ましくは実質上同じである。相補的に、２つのヌクレオチド配列を示す
場合、２つのヌクレオチド配列が対立するヌクレオチド間で２５％未満、より好
ましくは１５％未満、よりいっそう好ましくは５％未満のミスマッチで、最も好
ましくはミスマッチなしでハイブリダイズできることを意味する。好ましくは、
２つの分子は高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする。
【０１０４】 本明細書に用いられるタンパク質の活性または遺伝子もしくは核酸の発現を調
節する薬剤は、タンパク質の活性を低下もしくは増加させる、またはそうでなけ
れば改変し、またはいくらかの方法で細胞中における核酸の発現をアップもしく
はダウンレギュレートする、またはそうでなければ改変する。
【０１０５】 本明細書に用いられるＭＴＳＰ活性の阻害物質は、ＭＴＳＰの産生、翻訳後の
変更、変異、または膜への位置付けを妨げ、または減じる物質、または、特に一
本鎖形態のそのタンパク質分解効力をインビトロで妨害する、または減じる物質
を包含する。 本明細書に用いられる、腫瘍疾患を治療または予防する方法は、腫瘍、その転
移、腫瘍の血管形成、または疾患が特徴づけられる他のパラメータなどの症状が
減じられ、改善され、予防され、鎮静状態に置かれ、または鎮静状態に維持され
ることを意味する。腫瘍疾患および転移の懸著な特徴が治療により除去され、減
じられまたは予防されることも意味する。懸著な特徴の無制限の例には、基底膜
および隣接する細胞外マトリックスの非制御性の破壊、移動、分裂、および内皮
細胞の新たな機能性毛細管への組織化、およびそのような機能性毛細管の維持が
含まれる。
【０１０６】 本明細書に用いられる、作用的に結合する、または作用的に連結するなる用語
は、ヌクレオチドの調節および作動配列、例えばプロモーター、エンハンサー、
転写および翻訳停止部位および他のシグナル配列とのＤＮＡの機能的結合をいう
。例えば、ＤＮＡのプロモーターへの作用的結合は、ＤＮＡを特異的に認識し、
それに結合し、およびそれを転写するＲＮＡポリメラーゼによりプロモーターか
らそのようなＤＮＡの転写が開始されるような、ＤＮＡとプロモーターの間の物
理的および機能的結合をいう。発現および／またはインビトロでの転写を最適化
するために、該クローンの５’非翻訳部分を除去、付加、または変更して、余分
な、不適当である可能性のある別の翻訳開始（即ちスタート）コドンまたは、転
写または翻訳いずれかのレベルで発現を妨害し、または減じ得る他の配列の除去
が必要とされてよい。別法として、コンセンサスリボソーム結合部位（例えば、
Kozak, J. Biol. Chem., 266: 19867-19870(1991)を参照されたい）をスタート
コドンの５’のすぐ隣に挿入することができ、こうして発現を高めてもよい。そ
のような変更に関する所望（または必要性）は、経験的に決定されてよい。
【０１０７】 本明細書に用いられる結合物の医薬上許容される塩、エステルまたは他の誘導
体には、誘導化などの公知方法を用いて当該分野の専門家により容易に調製され
ることができる、および実質上毒性作用なしに、動物またはヒトに投与されるこ
とができる化合物を生じる、および医薬上活性であるか、またはプロドラッグで
ある塩、エステルまたは誘導体が含まれる。
【０１０８】 本明細書に用いられるプロドラッグは、インビボでの投与に際して生物学的に
、医薬的にまたは治療的に活性な形態の化合物に代謝される、または変換される
化合物である。プロドラッグを産生するために、活性化合物が代謝過程により再
生されるように医薬活性化合物が変更される。プロドラッグは、薬物の代謝上の
安定性もしくは移動特性を変更するべく、副作用または毒性を遮断するべく、薬
物の匂いを改善するべく、または薬物の他の特徴または特性を改変するべく設計
されてよい。インビボでの薬物動態プロセスおよび薬物代謝に関する知識を用い
て、当該分野の専門家は、一度医薬活性化合物が分かれば、該化合物のプロドラ
ッグを設計することができる(例えば、Nogrady(1985) Medicinal Chemistry A B
iochemical Approach, Oxford University Press, New York, pages 388-392を
参照されたい）。
【０１０９】 本明細書に用いられる、本明細書に提供されるスクリーニング方法により同定
される薬物は、設計される治療のための治療用化合物またはリード化合物として
用いられるための候補である化合物を言う。そのような化合物は、小さな有機分
子、ペプチド、ペプチド擬似物、アンチセンス分子、抗体、抗体のフラグメント
、組換え抗体、および薬物候補またはリード化合物として役立ち得る他の化合物
を含む小分子であり得る。 本明細書に用いられる、組換えＤＮＡ法を用いることによる組換え法による産
生は、クローン化されたＤＮＡによりコードされるタンパク質を発現するための
分子生物学の周知方法を用いることを意味する。
【０１１０】 本明細書に用いられる、プロモーター領域またはプロモーターエレメントは、
ＤＮＡまたはＲＮＡに作用的に結合する、ＤＮＡまたはＲＮＡの転写を制御する
ＤＮＡまたはＲＮＡのセグメントを言う。プロモーター領域には、ＲＮＡポリメ
ラーゼの認識、結合および転写開始に十分な特定配列が含まれる。プロモーター
領域のこの部分をプロモーターと呼ぶ。加えて、プロモーター領域には、ＲＮＡ
ポリメラーゼのこの認識、結合、および転写開始活性を調節する配列が含まれる
。これらの配列はシス作用性であってよく、トランス作用ファクターに反応性が
あってもよい。プロモーターは、調節の特性により、構成型であっても調節型で
あってもよい。原核生物での使用に企図される典型的なプロモーターには、バク
テリオファージＴ７およびＴ３プロモーターが含まれる。
【０１１１】 本明細書に用いられるレセプターは、所定のリガンドに親和性を有する分子を
言う。レセプターは、天然に生じる分子であっても合成分子であってもよい。レ
セプターは、また、当該分野で抗リガンドとも呼ばれる。本明細書に用いるレセ
プターと抗リガンドは交換して用いることができる。レセプターは、改変されて
いない状態で用いることができ、または他の種との集合物として用いられること
ができる。レセプターは、結合メンバーに、直接的に、または特異的結合物質ま
たはリンカーを介して間接的に、共有または非共有結合されてよい。レセプター
の例には、制限されるものではないが、（例えばウイルス、細胞または他の物質
上の）特異的抗原決定因子と反応する抗体、細胞膜レセプター、表面レセプター
および内部移行レセプター、モノクローナル抗体および抗血清、薬物、ポリヌク
レオチド、核酸、ペプチド、コファクター、レクチン、砂糖、ポリサッカライド
、細胞、細胞膜および細胞小器官が含まれる。
【０１１２】 レセプターおよびそのようなレセプターを用いる適用の例には、制限されるも
のではないが、以下のものが含まれる。 ａ）酵素：抗生物質（リガンド）選択の標的として役立ち得る、微生物の生存に
必要な特異的輸送タンパク質または酵素； ｂ）抗体：目的の抗原のエピトープと結合する、抗体分子上のリガンド結合部位
の同定を調べることができ；抗原性エピトープを擬似する配列の決定により、免
疫原が１またはそれ以上のそのような配列に基づくワクチンの開発が導かれ得、
または自己免疫疾患などの治療処置に有用な関連診断薬または化合物の開発が導
かれ得る。 ｃ）核酸；タンパク質またはＲＮＡなどのリガンドの結合部位の同定； ｄ）触媒ポリペプチド：１またはそれ以上の反応物から１またはそれ以上の生成
物への変換に関与する化学反応を促進することができるポリマー、好ましくはポ
リペプチド；そのようなポリペプチドには、一般に、少なくとも１の反応物また
は反応中間体に特異的な結合部位および結合部位に隣接する活性官能基が含まれ
、ここで官能基は結合した反応物を化学的に変更することができる機能を持つ（
例えば、米国特許Ｎｏ５,２１５,８９９を参照されたい）。 ｅ）ホルモンレセプター：高い親和性でレセプターに結合するリガンドの決定は
、ホルモン置換治療の開発に有用である。例えば、そのようなレセプターに結合
するリガンドの同定により、血圧をコントロールする薬物の開発が導かれる。；
および、 ｆ）オピエートレセプター：脳のオピエートレセプターに結合するリガンドの決
定は、モルヒネおよび関連薬物に置き換わる耽溺性の少ない薬物の開発に有用で
ある。
【０１１３】 本明細書に用いられるサンプルは、分析物アッセイが所望される分析物を含む
可能性のあるものを言う。サンプルは生物サンプル、例えば生物体液または生物
組織などであってよい。生物体液の例には、尿、血液、血漿、血清、唾液、精液
、大便、痰、脳脊髄液、涙、粘液、羊水などが含まれる。生物組織は、結合組織
、上皮組織、筋肉および神経組織を含む、一般に特定の種類の細胞の、ヒト、動
物、植物、細菌、真菌またはウイルス構造の構成物質の一つを構成する細胞内物
質との集合である。生物組織の例には、器官、腫瘍、リンパ節、動脈および個々
の細胞も含まれる。
【０１１４】 本明細書で用いる、パーセントミスマッチを決定することにおけるハイブリダ
イゼーションのストリンジェントは、以下のようである。 １）高ストリンジェント：０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、６５℃ ２）中ストリンジェント：０．２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５０℃ ３）低ストリンジェント：１．０×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５０℃
【０１１５】 当該分野の専門家には、洗浄工程により、安定なハイブリッドが選択されるこ
と、およびさらにＳＳＰＥの成分が分かる（例えば、Sambrook, E.F. Fritsch,
T. Maniatis, in: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Ha
rbor Laboratory Press(1989), vol. 3, p. B.13を参照されたい、また、一般に
用いられる実験溶液を示す多くのカタログも参照されたい。）。ＳＳＰＥはｐＨ
７．４のリン酸緩衝処理された０．１８ＮａＣｌである。さらに、当該分野の専
門家は、ハイブリッドの安定性が、ナトリウムイオン濃度と温度の関数であるＴ
ｍ（Ｔｍ＝８１．５℃−１６．６（ｌｏｇ１０[Ｎａ＋]）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ
）−６００／ｌ）により決定され、ハイブリッドの安定性に重要な洗浄条件の単
一のパラメータはＳＳＰＥ（またはＳＳＣ）中のナトリウムイオン濃度と温度で
あることが分かる。
【０１１６】 等価なストリンジェントは、別のバッファー、塩および温度を用いて達成され
てよい。例として、制限するものではないが、低ストリンジェントの条件を用い
る方法は以下のようである（Shilo and Weinberg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
, 78:6789-6792 (1981)も参照されたい）。ＤＡＮを含むフィルターを６時間４
０℃にて、３５％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．５）、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＰＶＰ、０．１％のＦｉｃｏｌｌ、
１％のＢＳＡおよび５００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ（１０×ＳＳＣは１
．５Ｍ塩化ナトリウムおよび０．１５Ｍクエン酸ナトリウムであり、ｐＨ７に調
整される）を含む溶液中で前処理する。
【０１１７】 ハイブリダイゼーションは、以下の変更を加えた同じ溶液中で行われる。：０
．０２％ＰＶＰ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．２％ＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌ
サケ精子ＤＮＡ、１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）硫酸デキストランおよび５−２０×１
０６ｃｐｍ３２Ｐ標識プローブを用いる。フィルターをハイブリダイゼーション
混合液中で１８−２０時間４０℃にてインキュベートし、次いで１．５時間５５
℃にて、２×ＳＳＣ、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ ＥＤＴ
Ａおよび０．１％ＳＤＳを含む溶液中で洗浄する。洗浄溶液を新鮮な溶液に置き
換え、さらに１．５時間６０℃にてインキュベートする。フィルターをブロット
して乾燥させ、オートラジオグラフィーに露出する。所望によりフィルターを３
回６５−６８℃にて洗浄し、フィルムに再度露出する。用いられてよい低ストリ
ンジェントの他の条件は当該分野で周知である（例えば、他の交差種ハイブリダ
イゼーションに用いられるようなものである）。
【０１１８】 例として、および制限するものでなく、中ストリンジェント条件を用いる方法
が提供される。例えば、制限するものではないが、そのような中スリンジェント
の条件を用いる方法は、以下のようである。：ＤＮＡを含むフィルターを６時間
５５℃にて、６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｔ溶液、０．５％ＳＤＳおよび１０
０μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で前処理する。ハイブリダイゼー
ションを同じ溶液中で行い、５−２０×１０６ｃｐｍ３２Ｐ標識プローブを用い
る。フィルターをハイブリダイゼーション混合液中で１８−２０時間５５℃にて
インキュベートし、次いで３０分間６０℃にて、１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤ
Ｓを含む溶液中で２回洗浄する。フィルターをブロットして乾燥させ、次いでオ
ートラジオグラフィーに露出する。用いられてよい中ストリンジェントの他の条
件は当該分野で周知である。フィルターの洗浄は３７℃にて１時間、２×ＳＳＣ
、０．１％ＳＤＳを含む溶液中で行う。
【０１１９】 例として、および制限するものでなく、高ストリンジェント条件を用いる方法
は、以下のようである。：ＤＮＡを含むフィルターのプレハイブリダイゼーショ
ンを８時間一晩６５℃にて、６×ＳＳＣ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５
）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ＰＶＰ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２
％ＢＳＡおよび５００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含むバッファー中で行う
。フィルターを４８時間６５℃にて、１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡお
よび５−２０×１０６ｃｐｍの３２Ｐ標識プローブを含むプレハイブリダイゼー
ション混合液中でハイブリダイズさせる。フィルターの洗浄を３７℃にて１時間
、２×ＳＳＣ、０．０１％ＰＶＰ、０．０１％Ｆｉｃｏｌｌおよび０．０１％Ｂ
ＳＡを含む溶液中で行う。この後、０．１×ＳＳＣ中で、５０℃にて４５分間洗
浄した後、オートラジオグラフィーにかける。用いられてよい高ストリンジェン
トの他の条件は当該分野で周知である。
【０１２０】 実質上同一または相同または類似なる用語は、関連分野の専門家により理解さ
れるように、状況に応じて変化し、一般に少なくとも７０％を意味し、好ましく
は少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、および最も好ましくは
少なくとも９５％同一であることを意味する。 本明細書に用いられる、生成物に対して実質上同一とは、目的の特性が十分変
化せず、実質上同一の生成物を生成物の代わりに用いることができるほど十分類
似していることを意味する。
【０１２１】 本明細書に用いられる実質上純粋とは、純度を評価するために当該分野の専門
家に用いられる分析に関する常套法、例えば薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）
、ゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定され
る、容易に検出可能な不純物を含まないとみなすのに十分均質であること、また
はさらなる精製により物質の酵素活性および生物活性などの物理的および化学的
特性が明らかには変更されないほどに十分に純粋であることを意味する。実質上
化学的に純粋な化合物を製造するための化合物の精製法は、当該分野の専門家に
公知である。実質上化学的に純粋な化合物は、しかし、構造異性体または異性体
の混合物であってよい。そのような例において、さらなる精製により化合物の特
異的活性を増すことができる。
【０１２２】 本明細書に用いられる標的細胞なる用語は、インビボでＭＴＳＰを発現する細
胞を言う。 本明細書に用いられる試験物質なる用語は、ＭＴＳＰ、特にプロテアーゼドメ
インまたは本明細書中に提供されるアッセイなどのインビトロ法により決定され
る、活性に十分なその部分を含む一本鎖形態に影響を与える、化学的に規定され
る化合物（例えば、有機分子、無機分子、有機／無機分子、タンパク質、ペプチ
ド、核酸、オリゴヌクレオチド、脂質、ポリサッカライド、サッカライド、また
はこれらの分子間のハイブリッド、例えば糖タンパク質など）または化合物の混
合物（例えば、試験化合物、天然抽出物または培養上清などのライブラリー）を
いう。 本明細書に用いられる治療剤、治療処置、放射能保護剤、化学療法薬なる用語
は、当該分野の専門家に公知の、ワクチンを含む常套の薬物および薬物治療を意
味する。放射能治療剤は、当該分野で周知である。 本明細書に用いられる治療なる用語は、症状、疾患または病気の症状が緩和さ
れ、または有益に改変されるあらゆる方法を意味する。治療には、本明細書中の
組成物のあらゆる医薬使用も包含される。
【０１２３】 本明細書に用いられるベクター（またはプラスミド）は、異種ＤＮＡをその発
現または複製いずれかのための細胞に導入するのに用いられる別個のエレメント
を言う。ベクターは典型的には、エピソームも維持するが、遺伝子またはその部
分のゲノムの染色体への統合を達成するべく設計されてよい。また、酵母人工染
色体および哺乳動物人工染色体などの人工染色体であるベクターも企図される。
そのようなビヒクルの選択および使用は、当該分野の専門家に周知である。発現
ベクターには、ＤＮＡフラグメントの発現をもたらすことができる調節配列、プ
ロモーター領域などと作用的に結合されるＤＮＡを発現することができるベクタ
ーが含まれる。つまり、発現ベクターは、適当な宿主細胞に導入された時、クロ
ーン化されたＤＮＡを発現させる組換えＤＮＡまたはＲＮＡ構築物、例えばプラ
スミド、ファージ、組換えウイルスまたは他のベクターを言う。適当な発現ベク
ターは、当該分野の専門家に周知であり、真核細胞および／または原核細胞中で
複製可能なもの、およびエピソームを維持するもの、または宿主細胞ゲノムに統
合するものが含まれる。
【０１２４】 本明細書に用いられるタンパク質結合配列は、一般的には他のタンパク質また
はペプチド配列、タンパク質またはペプチド配列のセット、または特定のタンパ
ク質またはペプチド配列に特異的に結合することができるタンパク質またはペプ
チド配列を言う。 本明細書に用いられるエピトープタグは、エピトープをタグ付けされたタンパ
ク質またはペプチドのその後の生化学的および免疫学的分析が促進される、エピ
トープに付随するアミノ酸残基の短い伸張を言う。エピトープのタグ付けは、エ
ピトープタグの配列を適当な発現ベクター中のタンパク質コーディング配列に付
加することにより達成される。エピトープがタグ付けされたタンパク質は、タグ
に対して産生される高い特異性の抗体を用いてアフィニティ精製されることがで
きる。
【０１２５】 本明細書に用いられる金属結合配列なる用語は、一般に金属イオン、金属イオ
ンのセット、または特定の金属イオンに特異的に結合できるタンパク質またはペ
プチド配列をいう。 本明細書に用いられる組成物なる用語は、あらゆる混合物を言う。それは、溶
液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水様液、非水様液またはそのあらゆる組み
合わせであってよい。 本明細書に用いられる組み合わせなる用語は、２またはそれ以上のもののあら
ゆる組み合わせを言う。 本明細書に用いられる流体物なる用語は、流れることができるいずれかの組成
物を言う。つまり、流体物は、半固体、ペースト、溶液、水様液混合物、ゲル、
ローション、クリームおよび他のそのような組成物の形態である組成物が包含さ
れる。
【０１２６】 本明細書に用いられる細胞抽出物は、溶解されたまたは粉砕された細胞から作
成される調製物またはフラクションをいう。 本明細書に用いられる薬剤は無作為に選択されるべきであり、この場合、薬剤
はタンパク質単独またはその関連基質、結合パートナー(binding partner)など
との結合に関与する特異的配列を考慮せずに無作為に選択される。無作為に選択
される薬剤の例は、化学ライブラリーまたはペプチドコンビナトリアルライブラ
リー、または生物体の生育ブロスの使用である。
【０１２７】 本明細書に用いられる薬剤は、合理的に選択または設計されるべきであり、こ
の場合、薬剤は薬剤の活性と関連する標的部位の配列および／またはその構造を
考慮するランダムでない基礎に基づいて選択される。実施例に記載されるように
、配列番号３または配列番号４を有するタンパク質中に、セリンプロテアーゼに
関して提案される結合部位、および（触媒）部位がある。薬剤は合理的に選択さ
れるか、またはこれらの部位を作るペプチド配列を用いることにより合理的に設
計されることができる。例えば、合理的に選択されるペプチド剤は、そのアミノ
酸配列がＡＴＰ結合部位もしくはカルモジュリン結合部位またはドメインと同一
であるペプチドであり得る。 開示の明確化のために、および制限によるものではないが、詳細な記載を以下
のサブセクションに分けて示す。
【０１２８】 Ｂ．ＭＴＳＰタンパク質、ムテイン、その誘導体およびその類似体 ＭＴＳＰｓ ＭＴＳＰは、タンパク質分解細胞外Ｃ末端ドメイン；Ｎ末端の近くに疎水性ド
メインを有する膜貫通ドメイン；短い細胞質ドメイン；およびモジュラードメイ
ンを含む可変長の基本領域を含む多くの共通の構造特徴を共有する、哺乳動物お
よびさらに他の種に見出される、膜貫通セリンプロテアーゼのファミリーである
。タンパク質分解ドメインは、保存されたモチーフに存在する、触媒活性に必要
な保存されたｈｉｓ、ａｓｐ、およびｓｅｒ残基を含む配列ホモロジーを共有す
る。ＭＴＳＰは酵素前駆体として合成され、切断により二本鎖形態へと活性化さ
れる。本明細書中、一本鎖タンパク質分解ドメインはインビトロで機能し得、す
なわち、このファミリーのメンバーの活性を調節する薬剤を同定するためのイン
ビトロアッセイに有用であることが示される。ＭＴＳＰ３、ＭＴＳＰ４およびＭ
ＴＳＰ６変種と指定されるファミリーメンバーも提供される。
【０１２９】 ＭＴＳＰファミリーは治療的介入の標的であり、また、腫瘍の発生、増殖およ
び／または進行の診断マーカーとして役立ち得る。論じられるように、このファ
ミリーのメンバーは腫瘍の発生、増殖および／または進行に関与するタンパク質
分解プロセスに関与する。この関与は、ＥＣＭ破壊経路に関連するプロセスにお
けるタンパク質分解酵素としてのその機能に基づく。加えて、その発現レベルま
たは活性化のレベル、または基質のレベル、または基質およびそのレベルの変化
から生じるその明らかな活性は、同じ組織中での腫瘍細胞と非腫瘍細胞で異なる
。すなわち、その活性、例えばそのタンパク質分解活性、およびシグナル伝達お
よび／またはその発現における役割を、それらをその活性および／または発現を
調節する化合物と接触させることによるなどして改変するプロトコルおよび処理
が、腫瘍の発生、増殖および／または進行に影響を与え得る。また、いくつかの
場合には、活性化および／または発現のレベルは、肺癌、大腸腺癌および卵巣癌
などの腫瘍で改変されてよい。
【０１３０】 ＭＴＳＰは腫瘍の診断マーカーとして役立ち得る。本明細書中、本明細書中に
提供されるＭＴＳＰ３およびＭＴＳＰ４およびＭＴＳＰ６変種は、一定の腫瘍で
発現および／または活性化され、従って、その活性化または発現を腫瘍な発生、
増殖および／または進行の診断マーカーとして役立てることができる。他の例で
は、ＭＴＳＰタンパク質は、そのコファクターまたはその基質の活性または発現
を変化させることにより改変された活性を示すことができる。加えて、いくつか
の場合には、これらのＭＴＳＰＳおよび／またはその変種は細胞表面から脱離さ
れてよい。脱離されたＭＴＳＰＳ、特に細胞外ドメインの、血清、血液、唾液、
脳脊髄液、滑液および間質液、尿、汗および他のそのような流体物および分泌液
中における検出を、診断腫瘍マーカーとして役立ててよい。特に腫瘍疾患を有し
ないことが分かっている対象と比較した、または同一対象からの初期サンプルと
比較して高レベルのそのような離脱ポリペプチドの検出を、対象における腫瘍疾
患の指標とすることができる。
【０１３１】 本明細書中、一本鎖としてのＭＴＳＰのプロテアーゼドメインを含む、単離さ
れた実質上純粋な一本鎖ポリペプチドが提供される。本明細書に企図されるＭＴ
ＳＰは内皮細胞上では発現されず、および好ましくは腫瘍細胞上で、典型的には
同じタイプの非腫瘍細胞中で発現されるレベルと異なるレベルで発現される。つ
まり、例えば、ＭＴＳＰが卵巣癌に関する本明細書中の対象である卵巣腫瘍細胞
中で発現される場合、それは非腫瘍卵巣細胞中と同じレベルで発現される。ＭＴ
ＳＰプロテアーゼドメインには、ＭＴＳＰ１、ＭＴＳＰ３、ＭＴＳＰ４、ＭＴＳ
Ｐ６、および制限されるものではないが、コリン、エンターペプチダーゼ、ヒト
気道トリプシン様プロテアーゼ（ＨＡＴ）、ＭＴＳＰ１、ＴＭＰＲＳ２、および
ＴＭＰＲＳＳ４を含む他のそのようなプロテアーゼが含まれる。
【０１３２】 いずれかのＭＴＳＰ、特にＭＴＳＰ１、ＭＴＳＰ３、ＭＴＳＰ４およびＭＴＳ
Ｐ６のプロテアーゼドメインであるＭＴＳＰの部分を含むプロテアーゼドメイン
またはタンパク質が提供される。タンパク質は、アミノ酸の他の非ＭＴＳＰ配列
を含むことができるが、プロテアーゼドメイン、または本明細書中に提供される
もののような、そのようなプロテアーゼ活性を評価するいずれかのインビトロア
ッセイにおいて触媒活性を示すその十分な部分が含まれる。
【０１３３】 本明細書中、ＭＴＳＰタンパク質およびコードされるタンパク質をコードする
核酸分子も提供される。特に、スプライス変種を含む動物由来のＭＴＳＰ−３お
よびＭＴＳＰ−４をコードしている核酸分子が提供される。コードされるタンパ
ク質も提供される。その機能ドメインも提供される。
【０１３４】 特定の態様において、ＭＴＳＰプロテアーゼドメイン、その部分およびそのム
テインは、制限されるものではないが、マウスおよびラットなどの齧歯類；ニワ
トリなどの鳥類；ヤギ、ウシ、シカ、ヒツジなどの反芻動物；ブタなどの家畜(o
vine)；およびヒトを含む動物のＭＴＳＰＳ由来であるか、またはそれに基づく
ものである。
【０１３５】 特にＭＴＳＰ誘導体は、機能的に等価な分子に関して提供される置換、付加ま
たは欠失によりその配列を改変することにより作成されることができる。配列を
コードしているヌクレオチドの縮重ゆえに、ＭＴＳＰ遺伝子と実質上同じアミノ
酸配列をコードする他の核酸配列を用いることができる。これらには、制限され
るものではないが、配列内部のアミノ酸残基をコードする異なるコドンの置換に
より改変されてサイレントな変化を生じている、ＭＴＳＰ遺伝子の全部または部
分を含むヌクレオチド配列が含まれる。同様に、ＭＴＳＰ誘導体には、制限され
るものではないが、機能的に等価なアミノ酸残基が配列内部の残基に関して置換
されてサイレントな変化を生じている改変された配列を含む、ＭＴＳＰのアミノ
酸配列の全部または一部を一次アミノ酸配列として含むものが含まれる。例えば
配列内の１またはそれ以上のアミノ酸残基が、機能的に等価なものとして作用す
る同様の極性の他のアミノ酸により置換されてサイレントな改変を生じていてよ
い。配列内のアミノ酸の置換は、アミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選
択されてよい。例えば非極性（疎水性）アミノ酸には、アラミン、ロイシン、イ
ソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチ
オニンが含まれる。極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、シ
ステイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれる。陽性に荷電
した（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが含まれる
。陰性に荷電した（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が
含まれる（例えば、表１を参照されたい）。
【０１３６】 好ましい具体例では、実質上精製されたＭＴＳＰプロテアーゼは、配列番号１
、３、５、７、９または１１のいずれかに示すヌクレオチド配列によりコードさ
れるプロテアーゼドメインを含む核酸分子に、少なくとも中、一般的には高スト
リンジェント条件下で、そのプロテアーゼドメインをコードしている核酸がその
全長に沿ってハイブリダイズするようハイブリダイズする核酸によりコードされ
る。好ましい具体例では、実質上精製されたＭＴＳＰプロテアーゼは、プロテア
ーゼドメインをコードする配列番号２、４、６、８、１０および１２のいずれか
に示すアミノ酸配列を実質上含む一本鎖ポリペプチドである。以下のヒトＭＴＳ
Ｐおよびそのドメインに関する特異的配列を以下に示す。：配列番号３ＭＴＳＰ
３核酸配列；配列番号４ＭＴＳＰ３アミノ酸配列；配列番号５プロテアーゼドメ
インをコードしているＭＴＳＰ４核酸；配列番号６プロテアーゼドメインのＭＴ
ＳＰ４アミノ酸配列；配列番号７ＭＴＳＰ４−Ｌ核酸配列；配列番号８ＭＴＳＰ
４−Ｌアミノ酸配列；配列番号９ＭＴＳＰ４−Ｓ核酸配列；配列番号１０ＭＴＳ
Ｐ４−Ｓアミノ酸配列；配列番号１１ＭＴＳＰ６核Ｋ酸配列；配列番号１２ＭＴ
ＳＰ６アミノ酸配列。配列番号１は細長い形態のＭＴＳＰ１の核酸配列を示し、
配列番号２はコードされたアミノ酸配列を示し、配列番号４９はＭＴＳＰ１のプ
ロテアーゼドメインの配列を示し、および配列番号５０はそのコードされた一本
鎖プロテアーゼドメインの配列を示す。図１−３は、ＭＴＳＰ３、ＭＴＳＰ４お
よびＭＴＳＰ６の構造組成をそれぞれ示す。
【０１３７】 特に、典型的なプロテアーゼドメインには、ＭＴＳＰ１（マトリプターゼ）由
来の（配列番号１のヌクレオチド１８６５−２５８７によりコードされる；配列
番号４９および５０も参照されたい）配列番号２のアミノ酸６１５−８５５、Ｍ
ＴＳＰ３由来の配列番号４のアミノ酸２０５−４３７、ＭＴＳＰ４のプロテアー
ゼドメインを示す配列番号６、ＭＴＳＰ６由来の配列番号１１のアミノ酸２１７
−４４３として示すアミノ酸配列の少なくとも十分な部分が含まれる。インビト
ロタンパク質分解アッセイでタンパク質分解活性を有し、ＭＴＳＰタンパク質の
プロテアーゼドメインの全長と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９
０％または９５％の配列同一性を有する、またはプロテアーゼドメインをコード
する核酸に、特に中、一般的には高ストリンジェント条件下で、その全長に沿っ
てハイブリダイズする一本鎖ＭＴＳＰプロテアーゼをコードする核酸分子も企図
される。前記のように、コードされるポリペプチドはプロテアーゼを一本鎖とし
て含む。
【０１３８】 単離された核酸は、ＭＴＳＰ配列の少なくとも８のヌクレオチドを含んでよい
。他の具体例では、核酸はＭＴＳＰ配列または全長のＭＴＳＰコーディング配列
の少なくとも２５の（連結）ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、１００ヌクレオ
チド、１５０ヌクレオチド、または２００ヌクレオチドを含んでいてよい。他の
具体例では、核酸は、長さにして３５、２００または５００ヌクレオチドより短
い。核酸は一本鎖または二本鎖であり得る。外来配列にハイブリダイズするまた
は相補的な核酸、特に外来配列にハイブリダイズする、核酸に対する逆相補鎖（
即ち、核酸鎖の逆相補鎖は、鎖に対して逆方向に続いている相補鎖を有し、その
結果、逆相補鎖はミスマッチなく核酸鎖にハイブリダイズし、従って、例えば、
コーディング鎖が、コーディング鎖と該鎖にハイブリダイズするものの間でミス
マッチなく核酸にハイブリダイズするものである場合、該鎖にハイブリダイズす
るものの逆相補鎖はコーディング鎖と同一である）も提供される。特定の態様で
は、ＭＴＳＰをコードしている核酸、特にそのプロテアーゼドメインの少なくと
も１０、２５、５０、１００または２００ヌクレオチドまたは全コーディング領
域（詳細には、その逆相補物である）に相補的な配列を含む核酸が提供される。
ＭＴＳＰ３およびＭＴＳＰ４に関して、全長タンパク質またはそのドメインまた
は活性フラグメントである。
【０１３９】 核酸分子のそれぞれに関して、核酸はＤＮＡまたはＲＮＡまたはＰＮＡまたは
他の核酸類似体であり得、非天然のヌクレオチド塩基が含まれてよい。 ＭＴＳＰをコードしている核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を含む単離核
酸分子も提供される。 核酸分子由来のプローブおよびプライマーが提供され、そのようなプローブお
よびプライマーには、ＭＴＳＰ１、ＭＴＳＰ３、ＭＴＳＰ４およびＭＴＳＰ６を
含むがそれらには制限されないＭＴＳＰの連結ヌクレオチドと同一性を有する少
なくとも８、１４、１６、３０、１００またはそれ以上の連結ヌクレオチドが含
まれる。プローブおよびプライマーは、放射能標識または蛍光タグなどの検出可
能な標識で任意に標識され、マススペクトロメトリーまたは他の方法による検出
につき、質量を同定されることができる。
【０１４０】 核酸分子を含むプラスミドおよびベクターも提供される。コードされるタンパ
ク質を発現する細胞を含む、ベクターを含む細胞が提供される。細胞は細菌細胞
、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞または動物細胞であり得る。ＭＴＳ
Ｐまたはそのプロテアーゼドメインの一本鎖形態を、例えば、コードされるＭＴ
ＳＰが細胞により発現される条件下で細胞を増殖させ、次いで発現されるタンパ
ク質を回収することにより作成する方法が、本明細書中に提供される。ＭＴＳＰ
３およびＭＴＳＰ４に関して記載されるように、全長の酵素前駆体および活性化
されたタンパク質および活性化された（二本鎖の）プロテアーゼおよび一本鎖の
プロテアーゼドメインが提供される。
【０１４１】 未同定の、および本明細書中に提供されるＭＴＳＰタンパク質（ＭＴＳＰ３お
よびＭＴＳＰ４）を除き、単離されるポリペプチドはＭＴＳＰプロテアーゼドメ
インまたはその触媒活性部分を含み、一般的にはさらなるＭＴＳＰを含まない。
すなわち、ＭＴＳＰの一本鎖形態の、単離された、実質上純粋なプロテアーゼ、
そのプロテアーゼドメインまたはその触媒活性部分が提供される。プロテアーゼ
ドメインは、より長いタンパク質に含まれてよいが、そのようなより長いタンパ
ク質は、ＭＴＳＰ酵素前駆体ではない。
【０１４２】 つまり、ＭＴＳＰ３およびＭＴＳＰ４タンパク質が提供される。これらのタン
パク質に関して、機能的に活性な、すなわち、ＭＴＳＰタンパク質に関連する１
またはそれ以上の機能活性、例えばセリンプロテアーゼ活性、免疫原性、および
抗原性を示すことができるドメイン、フラグメント、誘導体または類似体が提供
される。前記のように、そのプロテアーゼドメインも提供される。ＭＴＳＰ３お
よびＭＴＳＰ４に関して、酵素前駆体および活性化形態、およびさらに一本鎖お
よび二本鎖の活性化プロテアーゼドメインも提供される。
【０１４３】 さらに、ＭＴＳＰ３およびＭＴＳＰ４をコードしている前記ヌクレオチド配列
（配列番号３、５、７および９）に、少なくとも低ストリンジェントで、より好
ましくは中ストリンジェントで、および最も好ましくは高ストリンジェントでハ
イブリダイズし、ＭＴＳＰファミリーのメンバー、例えばＭＴＳＰ３、ＭＴＳＰ
４、ＭＴＳＰ６またはそのスプライス変種またはその対立変種、またはＭＴＳＰ
６またはそのスプライス変種またはその対立変種のプロテアーゼドメインおよび
／または全長タンパク質または他のドメインをコードする核酸分子も提供される
。好ましくは、該分子は、そのような条件下で少なくとも一のドメインに関して
その全長に沿ってハイブリダイズし、ポリペプチドの少なくとも一のドメイン、
例えばプロテアーゼまたは細胞外ドメインなどをコードする。特に、そのような
核酸分子には、膜セリンプロテアーゼの少なくとも一のドメインをコードする単
離核酸フラグメントであって、（１）プロテアーゼまたはそのドメインをコード
するヌクレオチドの配列を含み、および（２）（ａ）前記のヌクレオチド配列を
含む、プロテアーゼまたはそのドメインをコードするヌクレオチド配列； （ｂ）そのような部分または全長のプロテアーゼをコードするヌクレオチド配列
であって、好ましくはそのようなタンパク質またはそのフラグメントをコードす
る哺乳動物細胞に存在するｍＲＮＡ転写産物に相補的な核酸に、高ストリンジェ
ント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列； （ｃ）そのような部分または全長のオープンリーディングフレームによりコード
されるアミノ酸配列を含む膜貫通プロテアーゼまたはそのドメインをコードする
ヌクレオチド配列；および、 （ｄ）そのようなサブユニットをコードし、ｍＲＮＡ転写産物に相補的なＤＮＡ
に高ストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコー
ドされるアミノ酸配列を含む、膜貫通プロテアーゼをコードするヌクレオチド配
列： から選択される単離核酸フラグメントが含まれる。
【０１４４】 典型的なＭＴＳＰ 前記記載により、典型的なＭＴＳＰの概要およびいくらかの詳細が提供される
。以下の記載により、さらなる詳細を示す（実施例も参照されたい）。 ＭＴＳＰ１（マトリプターゼ） マトリプターゼは、広域スペクトルの切断活性および２つの潜在的調節モジュ
ールを有するトリプシン様セリンプロテアーゼである。細胞外マトリックスを破
壊するその能力およびそのトリプシン様活性のために、「マトリプターゼ」と名
付けられた。乳癌細胞（またはＴ−４７Ｄ細胞条件培地）から単離される場合、
マトリプターゼは主として非複合体形態であることが報告されている。マトリプ
ターゼはヒトの乳から単離されており、ヒトの乳から単離される場合、マトリプ
ターゼは、９５ｋＤａ（優勢形態）および１１０ｋＤａの２の複合体形態の一つ
であることが報告された。非複合体のマトリプタ−ゼは検出されなかった（Liu,
et al., J. Biol. Chem. 274(26):18237-18242 (1999)）。マトリプターゼは、
活性状態にある場合、非複合体プロテアーゼとして存在することが提唱されてい
る。乳では、マトリプターゼはトリプシン様セリンプロテアーゼに対する活性を
有するKuntz型セリンプロテアーゼ阻害物質であるヘパトサイト増殖因子阻害物
質１（ＨＡＩ−１）との複合体にて存在することが報告されている。
【０１４５】 エコチンおよびエコチンＭ８４Ｒ／Ｍ８５Ｒは、キモトリプシンの折りたたみ
のセリンプロテアーゼの巨大分子阻害物質であり、移植された前立腺の分岐、形
態形成および分化を阻害する。ＰＣ−３は、前立腺癌上皮細胞由来の細胞系統で
ある。エコチンおよびＭ８４Ｒ／Ｍ８５Ｒエコチンは、ＰＣ−３が移植されたヌ
ードマウスにおける腫瘍のサイズおよび転移を減じることが見出された。 マトリプターゼは単離されており、およびそれをコードしている核酸が、Ｔ−
４７Ｄヒト乳癌細胞条件培地からクローンされた（Lin et al. (1999) J. Biol
. Chem. 274:18231-18236）。ｃＤＮＡの分析により、全長のプロテアーゼは６
８３のアミノ酸を有し、３の主要な構造領域：炭素末端領域近くのセリンプロテ
アーゼドメイン、４のタンデムな低密度脂肪タンパク質レセプタードメイン、お
よび２のタンデムな相補サブコンポーネントＣ１ｒおよびＣ１ｓを含むことが決
定された。
【０１４６】 癌細胞により作成された更なるセリンプロテアーゼを同定する研究が、ＰＣ−
３細胞を用いて行われた。膜貫通プロテアーゼであることが報告された「ＭＴ−
ＳＰ１」と名づけられたセリンプロテアーゼがクローン化された(Takeuchi et a
l. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96:11054-11061）。その後、最初
に同定されたマトリプターゼ配列が、ＭＴ−ＳＰ１をコードするｃＤＮＡの翻訳
配列に含まれることが見出された。マトリプターゼｃＤＮＡは、部分的なＭＴ−
ＳＰ１ｃＤＮＡであり、コーディングヌクレオチドの５１６を欠くことが報告さ
れた（Takeuchi, et al., J. Biol. Chem 275:26333-26342 (2000)）。報告され
ているマトリプターゼーをコードしているｃＤＮＡ配列は、潜在的開始メチオニ
ンをコードするので、別のスプライシングによりＭＴＳＰ１のＮ末端領域を欠く
タンパク質を得ることができることが提唱された。
【０１４７】 マトリプターゼおよびＭＴ−ＳＰ１はトリプシン様プロテアーゼ活性を示し、
共通の細胞外プロテアーゼドメインを有するタイプＩＩ膜貫通タンパク質である
。ＭＴ−ＳＰ１の基質特異性の研究により、プロテアーゼ−活性化セレプター２
（ＰＡＲ２）および一本鎖ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子（ｓｃ−ｕ
ＰＡ）がＭＴ−ＳＰ１の巨大分子基質であることが明らかになっている。ＰＡＲ
２は炎症、細胞保護および／または細胞接着に機能し、一方、ｓｕ−ｕＰＡは腫
瘍細胞の侵入および転移に機能する。
【０１４８】 ヒトＭＴＳＰ１をコードしている典型的なヌクレオチド配列を、配列番号１お
よび２に示す（そのプロテアーゼドメインに関しては配列番号４９および５０も
参照されたい）。既に示すように、配列番号１はＭＴＳＰ１をコードしている核
酸配列を示す。この配列はより長いバージョンで、両変種に共通のプロテアーゼ
ドメインを含む。配列番号１に示すヌクレオチド配列にハイブリダイズするＭＴ
ＳＰをコードしている核酸は、（例えば、本明細書中のセクションＣに記載され
るような）配列の３’および５’末端にハイブリダイズする合成プライマーを用
いるＰＣＲ増幅により、および／またはＰＣＲ増幅産物もしくは遺伝子配列に特
異的なオリゴヌクレオチドを用いるｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーからのク
ローニングにより、当該分野で公知のいずれかの方法により得ることができる。
ホモログ（例えばヒト以外の種に関する前記の核酸）または他の関連配列（たと
えばパラログ）およびムテインも、核酸ハイブリダイゼーションおよびクローニ
ングに関する当該分野で周知の方法を用いて、プローブとして提供される特定配
列の全てまたは部分を用いて、低、中または高ストリンジェントハイブリダイゼ
ーションにより得ることができる。
【０１４９】 動物由来のＭＴＳＰ１タンパク質の単離一本鎖プロテアーゼドメインが、本明
細書中に提供される。本明細書中に示されるように、一本鎖プロテアーゼドメイ
ンは触媒活性があり、種々の薬物スクリーニングアッセイ、特にインビトロタン
パク質分解アッセイに用いられることができる。典型的なＭＴＳＰプロテアーゼ
ドメインを、配列番号１のヌクレオチド１８６５−２５８７によりコードされる
アミノ酸（配列番号２の６１５−８５５）として示す（配列番号４９および５０
も参照されたい）。ＭＴＳＰ１一本鎖プロテアーゼドメインは、触媒活性がある
。
【０１５０】 ＭＴＳＰ１タンパク質のムテインが提供される。活性化された二本鎖分子にお
いて、残基７３１は残基６０４のＣｙｓとジスルフィド結合を形成する。一本鎖
形態において、プロテアーゼドメインの７３１の残基は遊離している。Ｃｙｓ残
基、特に遊離Ｃｙｓ残基（配列番号２のアミノ酸７３１）を一本鎖プロテアーゼ
ドメイン中に有するムテインが提供される。保存的アミノ酸置換がなされ、一本
鎖としてタンパク質分解活性を保持する他のムテインも提供される。そのような
変化は、規則的に誘導されてよく、本明細書に提供されるもののようなインビト
ロアッセイで活性を試験されてよい。
【０１５１】 ＭＴＳＰ３ 特定の具体例において、ＭＴＳＰ３と指定されるＭＴＳＰをコードする核酸が
提供される。特に、核酸は配列番号３に示す以下のヌクレオチド配列内にオープ
ンリーディングフレームを含む。特に、タンパク質はヌクレオチド２６１で始ま
り１５７４で終わるオープンリーディングフレームによりコードされる。 少なくとも低ストリンジェントで、好ましくは中ストリンジェントで、より好
ましくは高ストリンジェントで、以下の核酸配列（配列番号３）、特にＭＴＳＰ
３のその一本鎖プロテアーゼドメインまたはいずれかのドメインをコードするヌ
クレオチドにより包含されるオープンリーディングフレームに対してハイブリダ
イズする核酸分子も提供される。
【０１５２】 実質上精製されたＭＴＳＰ３酵素前駆体、活性化された二本鎖のもの、一本鎖
プロテアーゼドメインおよび二本鎖プロテアーゼドメインも含まれる。これらは
、タンパク質分解活性を示す、および、配列番号３に示すヌクレオチド配列を有
する核酸分子に、典型的には中、一般的には高ストリンジェント条件下で、およ
び最も好ましくはプロテアーゼドメインの全長に沿ってハイブリダイズする核酸
によりコードされる。スプライス変種も本明細書中に意図される。
【０１５３】 好ましい具体例では、単離核酸フラグメントは配列番号３に示すヌクレオチド
配列を有する核酸に、高ストリンジェント条件下でハイブリダイズし、および好
ましくは配列番号３のいずれかに示すヌクレオチド配列を含み、または膜貫通ド
メインをコードするその部分を含み、およびさらにＬＤＬＲドメイン、スカベン
ジャー−レセプターシステインリッチ（ＳＲＣＲ）ドメインおよびセリンプロテ
アーゼ触媒ドメインおよびいずれかの他の同定ドメイン（図を参照されたい）を
含んでよく、または配列番号４によりコードされるタンパク質をコードする核酸
分子を含む。
【０１５４】 単離された核酸フラグメントは、ゲノムまたはｃＤＮＡを含むＤＮＡであり、
またはＲＮＡであり、またはタンパク質核酸などの他の成分を含むことができる
。単離核酸は、異種プロモーターまたは固有のプロモーター、および他の転写お
よび翻訳調節配列などのさらなる成分を含んでよく、これらの遺伝子は他の遺伝
子、例えばレポーター遺伝子または他のインジケーター遺伝子またはインジケー
ターをコードする遺伝子などの他の遺伝子に結合されてよい。
【０１５５】 ＭＴＳＰまたはその部分をコードしているヌクレオチド配列に相補的な分子配
列を含む単離核酸分子も提供される。 プローブまたはプライマーとして用いられることができる、および少なくとも
約１０ヌクレオチド、より好ましくは１４ヌクレオチド、より好ましくは少なく
とも約１６ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも約３０ヌクレオチドを含む
そのフラグメントも提供される。
【０１５６】 ここで、本明細書中、そのような核酸分子によりコードされるポリペプチドが
提供される。これらのポリペプチドの中に含まれるのは、特異性およびプロテア
ーゼ活性を実質上変化しないような保存的アミノ酸変化を有するＭＴＳＰ３プロ
テアーゼドメインまたはポリペプチドである。特に、膜貫通ドメインを有する実
質上精製された哺乳動物のＭＴＳＰタンパク質が提供され、さらにＣＵＢドメイ
ン、１またはそれ以上のＬＤＬＲドメイン、スカベンジャー−レセプターシステ
インリッチ（ＳＲＣＲ）ドメインおよびセリンプロテアーゼ触媒ドメインをさら
に含んでよい実質上精製された哺乳動物のＭＴＳＰタンパク質が提供される。
【０１５７】 少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少な
くとも約９５％の同一性をＭＴＳＰ３に対して有するアミノ酸配列を含む、実質
上精製されたタンパク質も提供され、ここでパーセント同一性は、常套のアルゴ
リズム、およびパーセント同一性を最大にするギャップペナルティを用いて決定
される。他の哺乳動物のＭＴＳＰ３タンパク質も企図されるが、ヒトのＭＴＳＰ
３タンパク質が最も好ましい。 ＭＴＳＰ３のムテイン、特に、一本鎖プロテアーゼドメイン中のＣｙｓ３１０
が、活性を消去しない他のアミノ酸と置き換えられているものが提供される。
【０１５８】 ＭＴＳＰ４ ＭＴＳＰ４は、本明細書中に提供されるタンパク質である。ＭＴＳＰ４は肝臓
で高度に発現され、他の組織では実質上低レベルで発現される（実施例を参照さ
れたい）。Burkittのリンパ腫、大腸腺癌（ＳＷ４８０）、肺癌（Ａ５４９）を
含む肝臓由来のものでない腫瘍（実施例を参照されたい）および白血病の細胞で
も発現され、腫瘍の進行、腫瘍の侵入、腫瘍の増殖および腫瘍の転移の１または
それ以上における役割が示される。
【０１５９】 配列番号５、７または９に示す核酸配列に、特にＭＴＳＰ４のその一本鎖プロ
テアーゼドメインまたはいずれかのドメインをコードするヌクレオチドにより包
含されるオープンリーディングフレームに、少なくとも低ストリンジェントで、
好ましくは中ストリンジェントで、より好ましくは高ストリンジェントの条件下
でハイブリダイズする核酸分子も提供される。
【０１６０】 実質上精製されたＭＴＳＰ４酵素前駆体、活性化された二本鎖のもの、一本鎖
プロテアーゼドメインおよび二本鎖プロテアーゼドメインも含まれる。これらは
、タンパク質分解活性を示すプロテアーゼドメインをコードしている配列を含み
、および配列番号５、７、および９に示す核酸配列を有する核酸分子に、典型的
には中、一般的には高ストリンジェント条件下で、および最も好ましくはプロテ
アーゼドメインの全長に沿ってハイブリダイズする核酸によりコードされる。
【０１６１】 好ましい具体例では、単離核酸フラグメントは配列番号５、７、または９に示
すヌクレオチド配列を有する核酸に、高ストリンジェント条件下でハイブリダイ
ズし、および好ましくは配列番号５、７または９のいずれかに示すヌクレオチド
配列を含み、膜貫通領域をコードするその部分を含み、さらにＬＤＬＲドメイン
、スカベンジャー−レセプターシステインリッチ（ＳＲＣＲ）ドメインおよびセ
リンプロテアーゼ触媒ドメインまたはいずれかの他の同定されたドメイン（図を
参照されたい）を含んでよく、または配列番号６、９または１０によりコードさ
れるタンパク質をコードする核酸分子を含む。
【０１６２】 単離核酸フラグメントは、ゲノムまたはｃＤＮＡを含むＤＮＡであり、または
ＲＮＡであり、タンパク質核酸などの他の成分を含むことができる。単離核酸は
、異種プロモーターまたは固有のプロモーター、および他の転写および翻訳調節
配列などの追加成分を含んでよく、これらの遺伝子は他の遺伝子、レポーター遺
伝子または他のインジケーター遺伝子またはインジケーターをコードする遺伝子
などに結合されてよい。
【０１６３】 ＭＴＳＰ４またはその部分をコードしている核酸配列に相補的な分子配列を含
む単離核酸分子も提供される。 プローブまたはプライマーとして用いられることができるフラグメント、およ
び少なくとも約１０ヌクレオチド、より好ましくは１４ヌクレオチド、より好ま
しくは少なくとも約１６ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも約３０ヌクレ
オチドを含むそのフラグメントも提供される。
【０１６４】 特に、ＭＴＳＰ４の２の形態をコードしている核酸分子が提供される。コード
されるタンパク質はマルチドメイン、タイプＩＩ膜型セリンプロテアーゼであり
、Ｎ末端の膜貫通ドメインの後にＣＵＢドメイン、３ＬＤＬＲドメインおよびＣ
末端にトリプシン様セリンプロテアーゼドメインを含む。スプライス変種である
２つの形態間の違いは、膜貫通ドメインおよびＣＵＢドメインの間に４３２−ｂ
ｐのヌクレオチド配列から成るＭＴＳＰ４−Ｓがないことである（図２を参照さ
れたい。さらに、配列番号５−１０も参照されたい）。
【０１６５】 ＭＴＳＰ４の細胞外プロテアーゼドメインをコードする核酸も提供される。本
明細書に例示されるＭＴＳＰ４の両形態には、共通のプロテアーゼドメインが含
まれる（配列番号５および６を参照されたい）。 特に、ＭＴＳＰ４タンパク質の細胞外プロテアーゼドメインは、ヌクレオチド
１で始まり７０８（ＴＧＡ）で終わるオープンリーディングフレームによりコー
ドされる（配列番号５）。このオープンリーディングフレームはＭＴＳＰ４タン
パク質の部分をコードし、プロテアーゼドメインを含む。全長のＭＳＴＰ４タン
パク質（配列番号７および９）は前記ドメインを含む。一本鎖としてのおよびさ
らに二本鎖としての細胞外プロテアーゼドメインはプロテアーゼ活性を示す。Ｍ
ＴＳＰ形態の二本鎖形態を形成するジスルフィド結合は、ＭＴＳＰ４−Ｓに関し
てはＣｙｓ４１５とＣｙｓ５３５の間に、およびＭＴＳＰ４−Ｌに関してはＣｙ
ｓ５５９とＣｙｓ６７９の間にあると考えられる。
【０１６６】 その一本鎖プロテアーゼドメインの使用に関し、プロテアーゼドメイン中の遊
離Ｃｙｓ（すなわち、Ｃｙｓ５３５（Ｃｙｓ６７９））を、機能を改変しないア
ミノ酸（そのような改変であれば、いかなるアミノ酸でもよい）などの他のアミ
ノ酸で置換することは興味深い。つまり、ＭＴＳＰ４のムテイン、特にＣｙｓ残
基、例えば一本鎖プロテアーゼドメイン中のＣｙｓ５３５およびＣｙｓ６７９が
それぞれ置換されたものが提供される。
【０１６７】 ＭＴＳＰ６ 典型的なＭＴＳＰ６の核酸およびコードされるＭＴＳＰ６タンパク質も提供さ
れる。個々の配列を配列番号１１と１２に示す。ＭＴＳＰ６ＤＮＡおよびタンパ
ク質配列は、ＤＮＡ Strider(バージョン１．２）を用いて分析した。本明細書
に提供されるＭＴＳＰ６変種をコードしているＯＲＦは、４５３のアミノ酸タン
パク質に翻訳される、１,３６２ｂｐから成る。ＭＴＳＰ６は、マルチドメイン
の、後にＬＤＬＲａドメイン（ＬＤＬレセプタードメインクラス）（アミノ酸７
２−１０８）、ＳＲドメイン（スカベンジャーレセプターＣｙｓ−リッチドメイ
ン）（アミノ酸１０９−２０５）、およびトリプシン様セリンプロテアーゼドメ
イン（アミノ酸２１６−４４３）が続く（図３を参照されたい）膜貫通ドメイン
（アミノ酸４８−６８）をＮ末端に含むタイプＩＩ膜型セリンプロテアーゼであ
る。ＭＴＳＰ６のムテイン、特にＣｙｓ残基、例えばＭＴＳＰ６の一本鎖プロテ
アーゼドメイン中のＣｙｓ３２４などが置換されたものが提供される。
【０１６８】 国際ＰＣＴ出願第ＷＯ００／５２０４４は、本明細書中に提供されるＭＴＳＰ
６と類似するＭＴＳＰを開示する。本明細書に提供されるポリペプチドは、配列
番号１２中の９０など一のアミノ酸の位置が異なり（ＡｌａがＴｈｒで置換され
る）、１０のアミノ酸（配列番号１２のアミノ酸第４６−５５）が１１のアミノ
酸phe glu val phe ser gln ser ser ser leu gly(配列番号５９）で置換されて
１の４５４アミノ酸長のタンパク質を生じる点で、例のＭＴＳＰ６と有意に異な
る。
【０１６９】 いくつかの他のアミノ酸配列の違いおよび多くの核酸配列の違いが存在する。
懸著には、実質上の違いがプロテアーゼドメインに存在し、（配列番号１２の）
３６８−３９４の違いを示すと、アミノ酸３６８−３９４（３６８ICNHRDVYGGII
SPSMLCAGYLTGGVD----- 394;配列番号１２）が３６９−３９６位にてアミノ酸３
６９DLQPQ----GRVRWHHLPLHALRGLPDGWRWN 396で置換されている。
【０１７０】 加えて、改変されたプロテアーゼドメインを有する第二のＣ末端先端切断変種
が該ＰＣＴ出願中に指定されている。変種は、３３のアミノ酸（本明細書中の配
列番号６０を参照されたい）が後に続く、フレームシフトにより異なるそのアミ
ノ酸２６１（本明細書中配列番号１２の１６０に対応する）による４５４変種と
同じである。
【０１７１】 Ｃ．腫瘍特異性および組織発現特性 各ＭＴＳＰは特徴的な組織発現特性を持つ；ＭＴＳＰは特に、腫瘍で排他的に
発現または活性化されるのではないが、特徴的な腫瘍組織発現または活性化特性
を示す。いくつかの例では、ＭＴＳＰは、基質またはそのコファクター、または
ＭＴＳＰの明らかな機能活性を改変する他の因子の変化により、腫瘍細胞におい
て、非腫瘍細胞から異なる可能性がある。つまり、それぞれは、腫瘍性疾患を有
する対象（即ち哺乳動物、特にヒト）における活性および／または発現または機
能の、腫瘍性疾患を有しない対象と比較したレベルにより、特定の腫瘍の診断マ
ーカーとして役立てることができる。加えて、特定の組織における活性（および
／または発現）の検出は、腫瘍疾患を示すものとなり得る。体液中に脱離したＭ
ＴＳＰは、腫瘍疾患を示すものとなり得る。また、それぞれの活性および／また
は発現特性により、それらは、その活性のモジュレーターの投与による、または
ＭＴＳＰの一つにより特異的に活性化されるプロドラッグの投与によるなど、治
療標的として役立てることができる。
【０１７２】 組織発現特性 ＭＴＳＰ３ ＭＴＳＰ３転写産物は、肺癌（ＬＸ−１）、大腸腺癌（ＣＸ−１）、大腸腺癌
（ＧＩ−１１２）および卵巣癌（ＧＩ−１０２）で検出された。肺癌（ＧＩ−１
１７）、乳癌（ＧＩ−１０１）、膵臓癌（ＧＩ−１０３）および前立腺癌（ＰＣ
３）の他の形態では明らかなシグナルは検出されなかった。ＭＴＳＰ１は乳癌で
発現される。
【０１７３】 ＭＴＳＰ４ ＭＴＳＰ４転写産物、ＬＤＬレセプタードメインおよびプロテアーゼドメイン
の部分をコードしているＤＮＡフラグメントを用いて、７６の異なるヒト組織か
ら成るＲＮＡブロット（カタログ番号７７７５−１；ヒト複合組織発現（ＭＴＥ
）アレイ；CLONTECH)をプローブした。ゲルブロットのノーザン分析におけるよ
うに、非常の強いシグナルが肝臓で認められた。他の組織におけるシグナルは（
シグナルのレベルは低下した）：胎児の肝臓＞心臓＝腎臓＝副腎腺＝精巣＝胎児
心臓および腎臓＝骨格筋＝膀胱＝胎盤＞脳＝脊髄＝大腸＝胃＝脾臓＝リンパ節＝
骨髄＝気管＝子宮＝膵臓＝唾液腺＝乳腺＝肺で認められた。ＭＴＳＰ４は、ヒー
ラーＳ３＝白血病Ｋ−５６２＝バーキットリンパ腫（Raji and Daudi)＝大腸腺
ガン（SW480)＞肺癌（A549)＝白血病ＭＯＬＴ−４＝白血病ＨＬ−６０を含むい
くつかの腫瘍細胞系統でも大量ではないが、発現される。ヌードマウスに異種移
植されたいくつかのヒトの一次腫瘍から作成されたｃＤＮＡライブラリー（ヒト
腫瘍複合組織ｃＤＮＡパネル、カタログ番号Ｋ１５２２−１、CLONTECH)からの
ＸＴＳＰ４転写産物のＰＣＲを、ＭＴＳＰ４特異的プライマーを用いて行った。
ＭＴＳＰ４転写産物が、乳癌（ＧＩ−１０１）、肺癌（ＬＸ−１）、大腸腺癌（
ＧＩ−１１２）および前立腺癌（ＧＩ−１０３）で検出された。肺癌（ＧＩ−１
１７）、大腸腺癌（ＣＸ−１）、卵巣癌（ＧＩ−１０２）および前立腺癌（ＰＣ
３）の他の形態では明らかなシグナルは検出されなかった。ＭＴＳＰ４転写産物
はＬＮＣａＰおよびＰＣ−３前立腺癌細胞系統ならびにＨＴ−１０８０ヒト繊維
肉腫細胞系統でも検出された。
【０１７４】 正常および腫瘍組織におけるＭＴＳＰ６の遺伝子発現特性 ＭＴＳＰ６転写産物の遺伝子発現特性に関する情報を得るために、プライマー
Ｃｈ１７−ＮＳＰ−３およびＮＳＰ−４ＡＳを用いたＰＣＲ反応から得られた４
９５ｂｐのＤＮＡフラグメントを用いて７６の異なるヒト組織から成るＲＮＡブ
ロット（カタログ番号７７７５−１；ヒト複合組織発現（ＭＴＥ）アレイ；CLON
TECH)をプローブした。十二指腸で最強のシグナルが認められた。他の組織にお
いては（シグナルレベルは低下した）シグナルが認められた：胃＞気管＝乳腺＝
甲状腺＝唾液腺＝下垂体＝膵臓＞腎臓＞肺＞空腸＝回腸＝イロセカム(ilocecum)
＝虫垂＝胎児腎臓＞胎児肺。いくつかの他の組織でも、非常に弱いシグナルが検
出され得る。
【０１７５】 ＭＴＳＰ６は、ヒーラーＳ３＞大腸腺癌（ＳＷ４８０）＞白血病ＭＯＬＴ−４
＞白血病Ｋ−５６２を含むいくつかの腫瘍細胞系統でも発現される。ヌードマウ
スに異種移植されたいくつかのヒト一次腫瘍から作成されたｃＤＮＡライブラリ
ー（ヒト腫瘍複合組織ｃＤＮＡパネル、カタログ番号Ｋ１５２２−１、CLONTECH
)からのＭＴＳＰ６転写産物のＰＣＲ分析を、ＭＴＳＰ６特異的プライマー（Ｃ
ｈ１７−ＮＳＰ−３およびＣｈ１７−ＮＳＰ２ＡＳ）を用いて行った。ＭＴＳＰ
６転写産物は、肺癌（ＬＸ−１）で強く検出され、膵臓腺癌（ＧＩ−１０３）で
中程度に検出され、卵巣癌（ＧＩ−１０２）でわずかに検出され、および大腸腺
癌（ＧＩ−１１２およびＣＸ−１）、乳癌（ＧＩ−１０１）、肺癌（ＧＩ−１１
７）および前立腺癌（ＰＣ３）でごくわずかに検出された。ＭＴＳＰ６転写産物
は、乳癌細胞系統ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、前立腺癌細胞系統ＰＣ−３でも検出さ
れたが、ＨＴ−１０８０ヒト繊維肉腫細胞系統では検出されなかった。ＭＴＳＰ
６は、乳癌ｃＤＮＡ（Clontech)でも発現される。ＭＴＳＰ６は卵巣腫瘍細胞で
も過剰発現される。
【０１７６】 Ｄ．ＭＴＳＰタンパク質遺伝子の同定および単離 ＭＴＳＰタンパク質またはそのドメインは、タンパク質の精製および組換えタ
ンパク質の発現に関する当該分野で周知の方法により得られることができる。所
望の遺伝子をコードする核酸の同定に関する当該分野の専門家に公知のあらゆる
方法を用いてよい。当該分野で利用可能なあらゆる方法を用いて、ＭＴＳＰタン
パク質をコードしている全長の（即ち、全コーディング領域を包含している）ｃ
ＤＮＡまたはゲノムＤＮＡクローンを得ることができる。特に、ポリメラーゼ鎖
反応（ＰＣＲ）を用いて、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーにおいて、正常お
よび腫瘍細胞または組織で異なって発現されるとして同定される配列、例えばＭ
ＴＳＰタンパク質をコードしている核酸を増幅することができる。同定された配
列の３’および５’末端の配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライ
マーをプライマーとして用いて、核酸サンプル（ＲＮＡまたはＤＮＡ）、好まし
くはｃＤＮＡライブラリー、適当な源（例えば腫瘍または癌組織）からＰＣＲ配
列により増幅することができる。
【０１７７】 ＰＣＲは、例えばPerki-Elmer Cetus thermal cyclerおよびTaqポリメラーゼG
ene AmpTM)を用いて行われることができる。増幅されるＤＮＡには、真核生物種
由来のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含めることができる。ＰＣ
Ｒ反応における使用に関し、いくつかの異なる縮重(degenerate)プライマーを合
成することを選択することができる。ＰＣＲ反応をプライムするのに用いるため
のハイブリダイゼーション条件のストリンジェントを変更して、公知ヌクレオチ
ド配列と単離される核酸ホモログ間のヌクレオチド配列同一性の程度の多少を許
容することにより、核酸ホモログを増幅する（例えば、ヒト以外の種からＭＴＳ
Ｐタンパク質配列を得る、またはＭＴＳＰタンパク質と相同性を有するヒト配列
を得る）ことも可能である。交差種ハイブリダイゼーションのためには、低スト
リンジェント条件が好ましい。同種ハイブリダイゼーションのためには、中スト
リンジェント条件が好ましい。同定されたＭＴＳＰタンパク質配列の全部または
部分を含む核酸、またはＭＴＳＰタンパク質ホモログの全部または部分をコード
している核酸の増幅が成功したら、そのセグメントを分子クローニングし、次い
で配列決定し、プローブとして用いて完全なｃＤＮＡまたはゲノムクローンが単
離されてよい。これにより、遺伝子の完全なヌクレオチド配列の決定、その発現
の分析および機能分析のためのそのタンパク質産物の産生が可能となる。ヌクレ
オチド配列が決定されたら、ＭＴＳＰタンパク質遺伝子のタンパク質産物をコー
ドしているオープンリーディングフレームを、オープンリーディングフレームを
決定するための当該分野で周知の方法により、例えばヌクレオチド配列分析のた
めに公に利用できるコンピュータープログラムを用いて決定することができる。
オープンリーディングフレームが規定されたら、オープンリーディングフレーム
によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を決定するのが通常である。この
方法において、全ＭＴＳＰタンパク質遺伝子のヌクレオチド配列ならびにＭＴＳ
Ｐタンパク質タンパク質およびその類似体のアミノ酸配列を同定してよい。
【０１７８】 あらゆる真核細胞を、ＭＴＳＰタンパク質遺伝子の分子クローニングの核酸源
として用いることができる。核酸は、脊椎動物、哺乳動物、ヒト、ブタ、ウシ、
ネコ、トリ、ウマ、イヌ、ならびにさらなる霊長類源、昆虫、植物などから単離
することができる。ＤＮＡは、クローン化されたＤＮＡから当該分野で公知の常
套法（例えばＤＮＡ「ライブラリー」）により、化学合成により、ｃＤＮＡクロ
ーニングにより、または所望の細胞から精製されたゲノムＤＮＡもしくはそのフ
ラグメントのクローニングにより得られてよい（例えばSambrook et al., 1989,
Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Labo
ratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Glover, D.M. (ed.), 1985, DN
A Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K. Vol. I, I
Iを参照されたい）。ゲノムＤＮＡ由来のクローンは、コーディング領域に加え
て調節およびイントロンＤＮＡ領域を含んでよく、ｃＤＮＡから誘導されたクロ
ーンは、エキソン配列のみを含む。源が何であろうと、遺伝子は遺伝子の送達の
ための適当なベクターに分子クローニングされなければならない。
【０１７９】 ゲノムＤＮＡからの遺伝子の分子クローニングにおいて、ＤＮＡフラグメント
が作成され、そのいくつかは所望の遺伝子をコードする。ＤＮＡは種々の制限酵
素を用いて特定部位で切断されてよい。別法として、マンガンの存在下でＤＮＡ
ｓｅを用いてＤＮＡを断片化してよく、またはＤＮＡは例えば超音波処理により
物理的に分断されることができる。線状ＤＮＡフラグメントを次いで、制限され
るものではないが、アガロースおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動およびカ
ラムクロマトグラフィーを含む常套法によりサイズに従って分けることができる
。
【０１８０】 ＤＮＡフラグメントが生じたら、所望の遺伝子を含む特定ＤＮＡフラグメント
の同定は、多くの方法で行うことができる。例えば、（全種の）ＭＴＳＰタンパ
ク質遺伝子の部分（例えば、前記のように得られたＰＣＲ増幅産物または公知の
ヌクレオチド配列の一部の配列を有するオリゴヌクレオチド）またはその特定Ｒ
ＮＡまたはそのフラグメント、および作成されたＤＮＡフラグメントを精製およ
び標識し、次いで作成されたＤＮＡフラグメントを、標識プローブに対する核酸
ハイブリダイゼーションによりスクリーニングすることができる（Benton and D
avis, Science 196:180 (1977); Grunstein and Hogness, Proc. Natl. Acad. S
ci. U.S.A. 72:3961 (1975)）。プローブに対して実質上の相同性を有するＤＮ
Ａフラグメントがハイブリダイズする。制限酵素消化、および入手可能な場合、
公知の制限マップに従って期待されるものとのフラグメントサイズの比較により
、またはＤＮＡ配列分析により、およびＭＴＳＰタンパク質の公知ヌクレオチド
配列に対する比較により、適当なフラグメントを同定することもできる。遺伝子
の特性に基づきさらなる選択を行うことができる。別法として、遺伝子の存在は
、その発現された産物の物理的、化学的または免疫学的特性に基づくアッセイに
より検出してもよい。例えば、同様のまたは同一の塩基泳動移動度、等電点、タ
ンパク質消化マップ、抗原性、セリンプロテアーゼ活性を有するタンパク質を産
生する適当なｍＲＮＡをハイブリッド選択するｃＤＮＡクローンまたはＤＮＡク
ローンを選択することができる。抗−ＭＴＳＰタンパク質の抗体が利用できる場
合、タンパク質は、ＭＴＳＰタンパク質を合成していると推定されるクローンへ
の標識抗体の結合により、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）タイプ操作
において同定されてよい。
【０１８１】 ＭＴＳＰタンパク質ゲノムＤＮＡの単離に関する別法には、制限されるもので
はないが、公知の配列から遺伝子配列を化学的に合成すること、またはＭＴＳＰ
タンパク質をコードするｍＲＮＡに対してｃＤＮＡを作成することが含まれる。
例えば、ＭＴＳＰタンパク質遺伝子のｃＤＮＡクローニングのためのＲＮＡが、
タンパク質を発現している細胞から単離されることができる。同定された、およ
び単離された核酸は、次いで適当なクローニングベクターに挿入されることがで
きる。当該分野で公知の多数のベクター−宿主系が用いられてよい。可能なベク
ターには、制限されるものではないが、プラスミドまたは変更されたウイルスが
含まれるが、ベクター系は用いられる宿主細胞と和合できなければならない。そ
のようなベクターには、制限されるものではないが、ラムダ誘導体などのバクテ
リオファージ、またはｐＢＲ３２２またはＰＵＣプラスミド誘導体などのプラス
ミド、またはBluescriptベクター（Stragatene, La Jolla, CA)が含まれる。ク
ローニングベクターへの挿入は、例えば、相補的な相補末端を有するクローニン
グベクターにＤＮＡフラグメントを結合することにより行われることができる。
ＤＮＡを断片化するのに用いられる相補的制限部位がクローニングベクター中に
存在しない場合、ＤＮＡ分子の末端は酵素により変更されてよい。別法として、
ＤＮＡ末端にヌクレオチド配列（リンカー）を結合することにより、所望の部位
を作成することができ、これらの結合されたリンカーは、制限エンドヌクレアー
ゼ認識配列をコードしている特異的化学合成オリゴヌクレオチドを含むことがで
きる。別法として、切断されたベクターおよびＭＴＳＰタンパク質遺伝子はホモ
ポリマーテイリングにより変更することができる。遺伝子配列の多くのコピーが
作成されるように、組換え分子を、形質転換、トランスフォーメーション、感染
、エレクトロポーレーションなどにより宿主細胞に導入することができる。
【０１８２】 別法において、所望の遺伝子は適当なクローニングベクターへの「ショットガ
ン」法における挿入後に同定および単離されてよい。所望の遺伝子を、クローニ
ングベクターへの挿入前に、例えばサイズ断片化により増やすことができる。 特定の具体例では、単離されたＭＴＳＰタンパク質遺伝子、ｃＤＮＡ、または
合成されたＤＮＡ配列が組み込まれた組換えＤＮＡ分子で宿主細胞をトランスフ
ォーメーションすることで、遺伝子の複数のコピーを作成することが可能となる
。つまり、形質転換体を生育させ、組換えＤＮＡ分子を形質転換体から単離し、
次いで必要な場合、挿入された遺伝子を単離された組換えＤＮＡから回収するこ
とにより、遺伝子を大量に得てもよい。
【０１８３】 Ｅ．ＭＴＳＰタンパク質またはそのプロテアーゼドメインをコードしている核酸
を含むベクター、プラスミド、および細胞、およびＭＴＳＰタンパク質の発現 ベクターおよび細胞 １またはそれ以上のＭＴＳＰタンパク質の組換え発現に関して、ＭＴＳＰタン
パク質をコードしている核酸の全部または一部を含む核酸を適当な発現ベクター
、すなわち、挿入されたタンパク質コーディング配列の転写および翻訳に必要な
エレメントを含むベクターに挿入することができる。必要な転写および翻訳シグ
ナルを、ＭＴＳＰ遺伝子に関して固有のプロモーターおよび／またはその隣接領
域により補充することもできる。
【０１８４】 ＭＴＳＰをコードしている核酸を含むベクターも提供される。ベクターを含む
細胞も提供される。細胞には、真核細胞および原核細胞が含まれ、ベクターは本
明細書における使用に関して適当なものである。 ベクターを含む内皮細胞を含む原核および真核細胞が提供される。そのような
細胞には、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞および動物細胞
が含まれる。そのような細胞を用いて、コードされたＭＴＳＰタンパク質または
ＭＴＳＰタンパク質のプロテアーゼドメインが細胞により発現される条件下で前
記細胞を増殖させ、次いで発現されたプロテアーゼドメインタンパク質を回収す
ることにより、ＭＴＳＰタンパク質またはそのプロテアーゼドメインが作成され
る。本明細書の目的に関して、プロテアーゼドメインは、好ましくは培地中に分
泌される。
【０１８５】 一の具体例では、ベクターは、プロテアーゼ活性を有し、ＭＴＳＰタンパク質
のプロテアーゼドメインのみの全部または部分またはその複数のコピーを含むポ
リペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。全長までのＭＴＳＰタンパク
質、および全長のＭＴＳＰタンパク質を含むＭＴＳＰタンパク質のプロテアーゼ
ドメインおよびその追加部分ならびにその複数のコピーをコードするヌクレオチ
ド配列を含むベクターも提供される。ベクターは、細胞中でのＭＴＳＰまたはそ
のプロテアーゼドメインの発現のために選択されてよく、またはＭＴＳＰタンパ
ク質が膜貫通タンパク質として発現されるように選択されてよい。別法として、
ベクターにはコードされるタンパク質の分泌に必要なシグナルが含まれてよい。
プロテアーゼドメインが発現される場合、核酸は好ましくは、サッカロマイセス
・セレビジエα連結因子シグナル配列またはその部分などの分泌シグナルに結合
される。
【０１８６】 種々の宿主−ベクター系を用いてタンパク質コーディング配列を発現させてよ
い。これらには、制限されるものではないが、ウイルス（例えば、ワクシニア・
ウイルス、アデノウイルスなど）で感染した哺乳動物細胞系；ウイルス（例えば
バキュロウイルス）で感染した昆虫細胞系；酵母ベクターを含む酵母などの微生
物；またはバクテリオファージ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤ
ＮＡで形質転換した細菌が含まれる。ベクターの発現エレメントはその長さおよ
び特異性が異なる。用いられる宿主−ベクター系により、多くの適当な転写およ
び翻訳エレメントのいずれを用いてもよい。
【０１８７】 ＤＮＡフラグメントのベクターへの挿入に関する当該分野の専門家に公知の方
法を用いて、適当な転写／翻訳コントロールシグナルおよびタンパク質コーディ
ング配列を含むキメラ遺伝子を含む発現ベクターを構築してよい。これらの方法
には、インビトロ組換えＤＮＡおよび合成法およびインビボ組換え（遺伝子組換
え）が含まれてよい。ＭＴＳＰタンパク質、そのドメイン、誘導体、フラグメン
トまたはホモログをコードしている核酸配列の発現は、第二の核酸配列により調
節されて、遺伝子またはそのフラグメントが組換えＤＮＡ分子で形質転換された
宿主中で発現されてよい。例えば、タンパク質の発現は、当該分野で公知のプロ
モーター／エンハンサーによりコントロールされてよい。特定の具体例では、プ
ロモーターはＭＴＳＰタンパク質の遺伝子に固有のものでなくてよい。用いられ
てよいプロモーターには、制限されるものではないが、ＳＶ４０初期プロモータ
ー（Bernoist and Chambon, Nature 290:304-310(1981))、ラウス肉腫ウイルス
のリピートを３’長末端に含むプロモーター(Yamamoto et al., Cel 22: 787-79
7(1980))、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagner et al., Proc. Natl
. Acad. Sci. USA 78: 1441-1445(1981))、金属結合性タンパク質遺伝子の調節
配列(Brinster et al. Nature 296: 39-42(1982));β−ラクタマーゼプロモータ
ー（Villa-Kamaroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731 1978
)またはｔａｃプロモーター（DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:
21-25(1983))；さらに「組換え細菌からの有用なタンパク質」Scientific Amer
ican 242: 79-94(1980)も参照されたい）などの原核生物発現ベクター；ノパリ
ン合成酵素プロモーター（Herrar-Estrella et al., Nature 303: 209-213(1984
))またはカリフラワーモザイクウイルス３５ＳＲＮＡプロモーター(Garder et a
l., Nucleic Acids Res. 9: 2871(1981))を含む植物発現ベクター、および光合
成酵素リブロース二リン酸カルボキシラーゼのプロモーター(Herrera-Estrella
et al., Nature 310: 115-120(1984))；酵母または他の真菌からのプロモーター
エレメント、例えばＧａｌ４プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモ
ーター、ホスホグリセロールキナーゼプロモーター、アルカリホスファターゼプ
ロモーター、およびそれに続く、組織特異性を示し、形質転換動物で用いられて
いる動物転写コントロール領域：膵臓腺房細胞で活性のあるエステラーゼＩ遺伝
子コントロール領域(Swift et al., Cell 38: 639-646(1984); Ornitz et al.,
Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409(1986); MacDonald, Hepa
tology 7: 425-515(1987))；膵臓ベータ細胞で活性のあるインシュリン遺伝子コ
ントロール領域(Hanahan et al., Nature 315: 115-122(1985))、リンパ球細胞
で活性のある免疫グロブリン遺伝子コントロール領域(Grosschedl et al., Cell
38: 647-658(1984); Adams et al., Nature 318: 533-538(1985); Alexander e
t al., Mol. Cell Biol. 7: 1436-1444(1987))、精巣、乳房、リンパ球およびマ
スト細胞で活性のあるマウス乳癌ウイルスコントロール領域（Leder et al., Ce
ll 45: 485-495(1986))、肝臓で活性のあるアルブミン遺伝子コントロール領域
（Pinckert et al., Genes and Devel. 1: 268-276(1987))、肝臓で活性のある
アルファ−フェトタンパク質遺伝子コントロール領域(Krumlauf et al., Mol. C
ell. Biol. 5: 1639-1648(1985); Hammer et al., Science 235: 53-58 1987))
、肝臓で活性のあるアルファ−１抗トリプシン遺伝子コントロール領域(Kelsey
et al., Genes and Devel. 1: 161-171 (1987))、脊髄細胞で活性のあるベータ
グロビン遺伝子コントロール領域(Mogram et al., nature 315: 338-340(1985))
Kollias et al., Cell 46: 89-94(1986))、脳のオリゴデンドロサイト細胞で活
性のあるミエリン塩基性タンパク質遺伝子コントロール領域(Readhead et al.,
Cell 48: 703-712(1987))、骨格筋で活性のあるミオシン軽鎖−２遺伝子コント
ロール領域（Sani, Nature 314: 283-286(1985))、および視床下部の性腺製刺激
ホルモン分泌細胞で活性のある性腺刺激放出ホルモン遺伝子コントロール領域(M
ason et al., Science 234: 1372-1378(1986))が含まれる。
【０１８８】 特定の具体例において、ＭＴＳＰタンパク質またはそのドメイン、フラグメン
ト、誘導体またはホモログをコードしている核酸に作用的に結合されるプロモー
ター、１またはそれ以上の複製起点、および任意に１またはそれ以上の選択可能
なマーカー（例えば抗生物質耐性遺伝子）を含むベクターが用いられる。ＭＴＳ
Ｐタンパク質のコーディング配列、またはその部分を含む発現ベクターは、例え
ば、コーディング部分を３つのｐＧＥＸベクター(グルタチオンＳ−トランスフ
ェラーゼ発現ベクター(Smith and Johnson, Gene 7: 31-40(1988))のそれぞれの
ＥｃｏＲＩ制限部位にサブクローニングすることにより作成される。これにより
、正確なリーディングフレームにて生成物が発現される。ＭＴＳＰタンパク質の
プロテアーゼドメインの発現のために好ましいベクターおよび系は、ピキア(Pic
hia)ベクター（例えば、Invitrogen, San Diego, CAから入手可能）、特に、コ
ードされたタンパク質の分泌のために設計されたものである。一の例示的なベク
ターが実施例に記載される。
【０１８９】 Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の形質転換のためのプラスミドには、例えば、ｐＥＴ発現ベ
クター（U.S特許第4,952,496; NOVAGEN, Madison, WIから入手可能; 該系を記載
する、Novagenにより公開された文献も参照されたい）が含まれる。そのような
プラスミドには、Ｔ７ｌａｃプロモーター、Ｔ７ターミネーター、誘導性Ｅ．ｃ
ｏｌｉ ｌａｃオペレーター、およびｌａｃリプレッサー遺伝子を含むｐＥＴ１
１ａ、Ｔ７プロモーター、Ｔ７ターミネーター、およびＥ．ｃｏｌｉ ｏｍｐＴ
分泌シグナルを含むｐＥＴ１２ａ−ｃ、およびＨｉｓカラムを用いる精製に用い
るためのＨｉｓ−ＴａｇＴＭリーダー配列、およびカラムによる精製後の切断を
可能とするトロンビン切断部位、Ｔ７ ｌａｃプロモーター領域およびＴ７ター
ミネーターを含むｐＥＴ１５ｂおよびｐＥＴ１９ｂ（NOVAGEN, Madison, WI)が
含まれる。
【０１９０】 ベクターは、ピキア細胞、および細菌細胞、Ｅ．ｃｏｌｉなどに導入され、次
いでその中でタンパク質が発現される。好ましいピキア株には、例えば、ＧＳ１
１５が含まれる。好ましい細菌株には、誘導性プロモーター、ｌａｃＵＶプロモ
ーターなどに作用的に結合されるＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードしているＤＮ
Ａの染色体コピーが含まれる（U.S.特許第4,952,496を参照されたい）。そのよ
うな宿主には、制限されるものではないが、溶原性のＥ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（
ＤＥ３）が含まれる。
【０１９１】 タンパク質の発現および精製 ＭＴＳＰドメイン、誘導体および類似体は、当該分野で公知の種々の方法によ
り作成される。例えば、ＭＴＳＰタンパク質またはそのドメイン、フラグメント
もしくは誘導体を発現している組換え細胞が同定されたら、個々の遺伝子産物を
単離および分析することができる。これは、制限されるものではないが、ゲル電
気泳動による分析を後で行う生成物の放射能標識、免疫アッセイ、マーカー標識
された生成物に対して行う架橋結合を含む、タンパク質の物理的および／または
機能的特性に基づくアッセイにより達成される。ＭＴＳＰタンパク質タンパク質
は、制限されるものではないが、カラムクロマトグラフィー（例えばイオン交換
、アフィニティ、ゲル排除、逆相高圧、高速タンパク質液体など）、遠心分離差
、溶解度差を含む当該分野で公知の常套法により、またはタンパク質の精製のた
めに用いられるいずれかの他の常套法により、（複合体またはタンパク質を発現
している天然源または組換え宿主細胞いずれかから）単離および精製されてよい
。機能特性は、当該分野で公知の適当なアッセイを用いて評価されてよい。
【０１９２】 別法として、ＭＴＳＰタンパク質またはそのドメインもしくは誘導体が同定さ
れたら、タンパク質のアミノ酸配列を、それをコードする遺伝子のヌクレオチド
配列から導き出すことができる。結果として、タンパク質またはそのドメインも
しくは誘導体を、当該分野で公知の常套の化学的方法（例えば、Hunkapiller et
al, Nature 310:105-111 (1984)を参照されたい）により合成することができる
。
【０１９３】 ＭＴＳＰタンパク質配列の操作は、タンパク質レベルでなされてよい。ＭＴＳ
Ｐタンパク質、そのドメイン、翻訳中または翻訳後に、例えばグリコシル化、ア
セチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロッキング基による誘導、タ
ンパク質分解、抗体分子または他の細胞リガンドへの結合などにより特異的に変
更されたその誘導体または類似体またはフラグメントも本明細書中に企図される
。多くの化学的変更のいずれも、制限されるものではないが、シアン化ブロマイ
ド、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４に
よる特異的化学分解、アセチル化、ホルミル化、酸化、還元、ツニカマイシンの
存在下での代謝合成などを含む公知方法により行われてよい。
【０１９４】 加えて、ＭＴＳＰタンパク質のドメイン、類似物および誘導体は、化学的に合
成されることができる。例えば、所望のドメインを含み、またはインビトロで所
望の活性を媒介するＭＴＳＰタンパク質の一部に対応するペプチドは、ペプチド
シンセサイザーを用いて合成されることができる。さらに、所望により、非標準
アミノ酸または化学的アミノ酸類似物をＭＴＳＰタンパク質配列に、置換または
付加として導入することができる。非標準アミノ酸には、制限されるものではな
いが、一般的なアミノ酸のＤ−異性体、ａ−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、
Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ε−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａ
ｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシ
ン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸
、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシ
ルアラニン、β−アラニン、フルオロアミノ酸、β−メチルアミノ酸、Ｃａ−メ
チルアミノ酸、Ｎａ−メチルアミノ酸などの合成アミノ酸およびアミノ酸類似物
が一般に含まれる。さらに、アミノ酸はＤ（右旋性）またはＬ（左旋性）であり
得る。
【０１９５】 天然の産物が変異体であることが推測されるか、または新規な種から単離され
る場合、天然源から単離されたＭＴＳＰタンパク質、ならびにインビトロで発現
されたもの、またはインビボもしくはインビトロで合成発現ベクターから由来し
たもののアミノ酸配列は、ＤＮＡ配列の分析から、または別法として、単離され
たタンパク質の直接配列決定から決定されることができる。そのような分析は、
手動操作により配列決定することにより、または自動アミノ酸シークエネーター
を用いることにより行われてよい。
【０１９６】 変更 ＭＴＳＰタンパク質およびドメインの種々の変更が本明細書中に企図される。
ＭＴＳＰをコードしている核酸分子は、当該分野で公知の多くの方法のいずれか
により(Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d
ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York)変更さ
れる。配列は制限エンドヌクレアーゼを用いて適当な部位で切断された後、所望
によりさらに酵素で変更され、単離され、ついでインビトロでライゲートされる
ことができる。ＭＴＳＰのドメイン、誘導体または類似体をコードしている遺伝
子の産生においては、変更された遺伝子がもとの翻訳リーディングフレームを保
持し、所望の活性がコードされている遺伝子領域において翻訳停止シグナルによ
り中断されないことを確認しなければならない。
【０１９７】 さらに、ＭＴＳＰをコードしている核酸分子をインビトロまたはインビボで変
異させて、翻訳配列、開始配列、および／または終結配列を作成および／または
破壊することができ、またはコーディング領域中に変異を作成しておよび／また
は新規な制限エンドヌクレアーゼ部位を作成して、または初めから存在している
ものを破壊して、インビボでの変更をさらに為すこともできる。また、本明細書
に記載される、一次配列の改変、例えばＣｙｓ残基の置換およびグリコシル化部
位の消去などを有するムテインも企図される。そのような変更は、制限されるも
のではないが、化学的突然変異誘発およびインビトロ部位指向性突然変異誘発（
Hutchinson et al., J. Biol. Chem. 253:6551-6558 (1978))、ＴＡＢ（登録商
標）リンカー(Pharmacia)の使用を含む当該分野で公知の突然変異誘発に関する
方法により達成されてよい。一具体例では、例えばＭＴＳＰタンパク質またはそ
のドメインを変更して、蛍光標識を含める。他の特定の具体例では、ＭＴＳＰタ
ンパク質は異種機能試薬を有すべく変更され、そのような異種機能試薬は、複合
体のメンバーを架橋結合するのに用いられることができる。
【０１９８】 ＭＴＳＰタンパク質は、制限されるものではないが、カラムクロマトグラフィ
ー（例えばイオン交換、アフィニティ、ゲル排除、逆相高圧、高速タンパク質液
体など）、遠心分離差、溶解度差を含む当該分野で公知の常套法により、または
タンパク質の精製のために用いられるいずれかの他の常套法により、（複合体ま
たはタンパク質を発現している天然源または組換え宿主細胞いずれかから）単離
および精製されてよい。機能特性は、当該分野で公知の適当なアッセイを用いて
評価されてよい。
【０１９９】 別法として、ＭＴＳＰタンパク質またはそのドメインもしくは誘導体が同定さ
れたら、タンパク質のアミノ酸配列を、それをコードする遺伝子のヌクレオチド
配列から導き出すことができる。結果として、タンパク質またはそのドメインも
しくは誘導体を、当該分野で公知の常套の化学的方法（例えば、Hunkapiller et
al, Nature 310:105-111 (1984)を参照されたい）により合成することができる
。
【０２００】 ＭＴＳＰ配列の操作は、タンパク質レベルでなされてよい。ＭＴＳＰタンパク
質、そのドメイン、翻訳中または翻訳後に、グリコシル化、アセチル化、リン酸
化、アミド化、公知の保護基／ブロッキング基よる誘導化、タンパク質分解、抗
体分子または他の細胞リガンドへの結合などにより特異的に変更された、その誘
導体もしくは類似体またはフラグメントも本明細書中に企図される。多くの化学
的変更のいずれも、制限されるものではないが、シアン化ブロマイド、トリプシ
ン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４による特異的化
学分解、アセチル化、ホルミル化、酸化、還元、ツニカマイシンの存在下での代
謝合成などを含む公知方法により行われてよい。
【０２０１】 加えて、ＭＴＳＰタンパク質のドメイン、類似物および誘導体は、化学的に合
成されることができる。例えば、所望のドメインを含み、またはインビトロで所
望の活性を媒介するＭＴＳＰの一部に対応するペプチドは、ペプチドシンセサイ
ザーを用いて合成されることができる。さらに、所望により、非標準アミノ酸ま
たは化学アミノ酸類似物をＭＴＳＰタンパク質配列に、置換または付加として導
入することができる。非標準アミノ酸には、制限されるものではないが、一般的
なアミノ酸のＤ−異性体、ａ−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−
アミノ酪酸、ε−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−ア
ミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリ
ン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ−ブチル
グリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、
β−アラニン、フルオロアミノ酸、β−メチルアミノ酸、Ｃａ−メチルアミノ酸
、Ｎａ−メチルアミノ酸などの合成アミノ酸およびアミノ酸類似物が一般に含ま
れる。さらに、アミノ酸はＤ（右旋性）またはＬ（左旋性）であり得る。
【０２０２】 Ｆ．スクリーニング法 本明細書に示す一本鎖プロテアーゼドメインを種々の方法に用いて、その活性
を調節する化合物を同定することができる。腫瘍細胞で高い活性または発現を示
すＭＴＳＰに関しては、タンパク質分解活性を阻害する化合物が特に興味深い。
腫瘍細胞で低レベルの活性であるＭＴＳＰに関しては、活性を高める化合物また
は薬剤は非常に興味深い。全場合において、同定される化合物には、癌治療の候
補である薬剤が含まれる。
【０２０３】 いくつかのタイプのアッセイが本明細書中に例示および記載される。プロテア
ーゼドメインが他のアッセイに用いられてよいことが理解される。しかし、ここ
で、一本鎖プロテアーゼドメインが触媒活性を示すことが示される。それ自体で
、それらはインビトロスクリーニングアッセイに関して理想的である。それらは
結合アッセイに用いられてよい。
【０２０４】 ＭＴＳＰ３、ＭＴＳＰ４およびＭＴＳＰ６完全長酵素前駆体、活性化酵素、一
本鎖および二本鎖プロテアーゼドメインが、本明細書に提供されるものを含む、
当該分野の専門家に公知のスクリーニングアッセイにおける使用のために企図さ
れる。即ち、タンパク質分解アッセイに対して指向される場合、以下の記載は、
ＭＴＳＰ３、ＭＴＳＰ４またはＭＴＳＰ６を含むＭＴＳＰの一本鎖プロテアーゼ
ドメインまたはその触媒活性部分の使用に適用されることが意図される。結合ア
ッセイなどの他のアッセイが、本明細書中、特にいずれかの変種、例えばそのス
プライス変種を含むＭＴＳＰ、ＭＴＳＰ４またはＭＴＳＰ６を用いる使用に関し
て提供される。ＭＴＳＰ３およびＭＴＳＰ４はそのようなアッセイにおいて最も
重要である。
【０２０５】 １．ＭＴＳＰタンパク質のプロテアーゼ活性を調節する薬剤の同定のための触媒
アッセイ ＭＴＳＰ、特にその一本鎖プロテアーゼドメインまたは触媒活性部分の触媒活
性のモジュレーターを同定する方法が本明細書中に提供される。方法は、ａ）Ｍ
ＴＳＰ、特にその一本鎖ドメインを試験物質の存在下でＭＴＳＰの基質と接触さ
せ、次いで基質のタンパク質分解を検出し、それによりＭＴＳＰの活性を評価し
、次いで対照と活性を比較することにより行われることができる。例えば、対照
は、ＭＴＳＰ、特にその一本鎖ドメインをＭＴＳＰの基質と接触させ、次いで基
質のタンパク質分解を検出し、それによりＭＴＳＰの活性を評価することにより
評価されるＭＴＳＰの活性であり得る。試験化合物の存在および不在下での結果
を比較する。活性の違いが、試験化合物がＭＴＳＰの活性を調節することを示す
。
【０２０６】 一の具体例において、複数の試験物質が前記のスクリーニング法において同時
にスクリーニングされる。他の具体例では、ＭＴＳＰを標的細胞から手段として
単離し、次いで標的細胞に特異的である可能性のある薬剤を同定する。 さらに他の具体例では、試験物質は治療用化合物であり、それにより、試験物
質の存在および不在下で測定されるＭＴＳＰ活性の違いが、標的細胞が治療化合
物に反応することを示す。
【０２０７】 一方法には、(ａ)ＭＴＳＰタンパク質またはそのプロテアーゼドメインを１ま
たは複数の試験化合物と、リガンドおよび化合物間の相互作用に資する条件下で
接触させること、および、(ｂ)リガンドに特異的に結合する１またはそれ以上の
化合物を複数同定することことから成る工程が含まれる。
【０２０８】 本明細書に提供される他の方法には、ａ）ＭＴＳＰタンパク質またはそのプロ
テアーゼドメインをＭＴＳＰタンパク質の基質と接触させ、次いで、基質のタン
パク質切断を検出し、それによりＭＴＳＰの活性を評価すること、ｂ）ＭＴＳＰ
タンパク質をＭＴＳＰタンパク質の基質と、試験物質の存在下で接触させ、次い
で基質のタンパク質分解を検出し、それによりＭＴＳＰタンパク質の活性を評価
すること、およびｃ）ステップａ）およびｂ）で評価されたＭＴＳＰタンパク質
の活性を比較することが含まれ、ここで、ステップａ）で測定された活性がステ
ップｂ）で測定された活性と異なることが、試験物質がＭＴＳＰの活性を調節す
ることを示す。
【０２０９】 他の具体例では、複数の試験物質が同時にスクリーニングされる。試験物質の
存在下または不在下でＭＴＳＰタンパク質の活性を比較して、試験物質がＭＴＳ
Ｐタンパク質のモジュレーターであるかどうかを評価する際、活性はパラレルに
評価されることが必要であり、しかも、そのようなパラレルな測定が好ましい。
ＭＴＳＰタンパク質の活性を一時点で測定し、ＭＴＳＰタンパク質の活性の過去
の値に対して測定された活性を比較することが可能である。
【０２１０】 例えば、試験物質の存在下でＭＴＳＰタンパク質の活性を測定し、次いで、試
験物質の不在下、および存在下でこれまでに測定されたＭＴＳＰタンパク質の活
性の過去の値と比較することができる。これは、例えば、アッセイを行うための
キットと共に提供される折り込み紙またはパンフレットにＭＴＳＰタンパク質の
活性を示すことにより行うことができる。 特定のＭＴＳＰに関する基質を選択する方法を実施例に記載し、そして、特定
のタンパク質分解アッセイを例示する。
【０２１１】 組み合わせ、およびアッセイを行うための説明書を含んでよい組み合わせ含有
キットが提供される。組み合わせには、ＭＴＳＰタンパク質およびアッセイされ
るべきＭＴＳＰタンパク質の基質、および任意に基質のタンパク質分解を検出す
るための試薬が含まれる。特定のＭＴＳＰタンパク質によるタンパク質分解の影
響を受ける典型的なタンパク質である基質は、ＭＴＳＰタンパク質が試験基質を
切断する能力を試験することにより経験的に同定されることができる。最も有効
に（すなわち、最低濃度および／または最も速い速度または所望される条件下で
）切断される基質が同定される。
【０２１２】 さらに、前記の組み合わせを含むキットが本明細書中に提供される。好ましく
は、キットには、ＭＴＳＰタンパク質の活性のモジュレーターを同定するための
説明書が含まれる。いずれかのＭＴＳＰタンパク質が、その活性のモジュレータ
ーを同定するための標的として企図される。
【０２１３】 ２．結合アッセイ 本明細書中、ＭＴＳＰに結合する試薬、特に化合物を同定および単離するため
の方法も提供される。アッセイは、酵素前駆体形態、一本鎖単離プロテアーゼド
メイン（またはＭＴＳＰタンパク質のプロテアーゼドメインを含むＭＴＳＰタン
パク質でないタンパク質）、および全長の酵素前駆体から誘導された、または伸
長されたプロテアーゼドメインから誘導された活性化形態を含むその活性化形態
に結合する薬剤を同定すべく設計される。同定される化合物は、腫瘍および異常
な血管形成に伴う他の病気および疾患の治療のための化合物の同定のための候補
またはリードである。該方法に用いられるＭＴＳＰタンパク質には、本明細書中
に規定されるＭＴＳＰタンパク質が含まれ、および好ましくはそのＭＴＳＰ一本
鎖ドメインまたはそのタンパク質分解活性ドメインを用いる。
【０２１４】 種々の方法が本明細書中に提供される。これらの方法は、溶液中で、またはＭ
ＴＳＰタンパク質もしくはそのプロテアーゼドメインが直接、またはリンカーを
経由して固体担持体に結合されて固相反応液中で行われてよい。スクリーニング
アッセイは実施例中に記載し、これらのアッセイを用いて候補化合物が同定され
た。
【０２１５】 本明細書中の目的に関して、前記の全結合アッセイは、ＭＴＳＰ３、ＭＴＳＰ
４およびＭＴＳＰ６に関して提供される。（その全変種を含む）ＭＴＳＰ１およ
び他のそのようなプロテアーゼに関して、単離された一本鎖プロテアーゼドメイ
ン、またはそのようなドメインを含む（プロテアーゼが誘導されるＭＴＳＰ以外
の）タンパク質を用いる結合アッセイが提供される。
【０２１６】 ＭＴＳＰ一本鎖プロテアーゼドメインまたはＭＴＳＰ、例えばＭＴＳＰ３、Ｍ
ＴＳＰ４またはＭＴＳＰ６などに特異的に結合する化合物などの薬剤を同定する
方法が本明細書中に提供される。方法は、（ａ）ＭＴＳＰを１または複数の試験
薬剤と、ＭＴＳＰと薬剤の間の結合を行う条件下で接触させること、次いで（ｂ
）ＭＴＳＰに特異的に結合する複数の薬剤の中の１またはそれ以上の薬剤を同定
することにより行われることができる。
【０２１７】 例えば、そのような方法を行うにつき、ＭＴＳＰポリペプチドは潜在的な結合
パートナーまたは細胞の抽出物もしくはフラクションと、潜在的な結合パートナ
ーのポリペプチドとの結合を許容する条件下で混合される。混合後、ＭＴＳＰと
結合したペプチド、ポリペプチド、タンパク質または他の分子を混合物から分離
する。ＭＴＳＰに結合した結合パートナーを次いで取り出し、そしてさらに分析
することができる。結合パートナーを同定および単離するために、全タンパク質
、例えば配列番号６、８、１０または１２の全開示タンパク質を用いることがで
きる。別法として、タンパク質のフラグメントを用いることができる。
【０２１８】 種々の方法を用いて細胞抽出物を得ることができる。細胞は、物理的または化
学的破壊法いずれを用いて破壊してもよい。物理的破壊法には、制限されるもの
ではないが、超音波処理および機械的破砕が含まれる。化学的溶解法の例には、
制限されるものではないが、界面活性剤による溶解および酵素による溶解が含ま
れる。本方法に使用するための抽出物を得るために、当業者は細胞抽出物を調製
する方法を容易に適用することができる。
【０２１９】 細胞の抽出物が調製されたら、抽出物をＭＴＳＰと、タンパク質と結合パート
ナーとの結合が起こり得る条件下で混合する。種々の条件を用いることができ、
最も好ましい条件は、ヒトの細胞の細胞質で見出される条件に最も似通った条件
である。用いられる細胞抽出物の浸透性、ｐＨ、温度、および濃度などの特性は
、タンパク質と結合パートナーとの結合を最適化させるべく変更されることがで
きる。
【０２２０】 適当な条件下で混合後、結合した複合体が混合物から分離される。種々の方法
を用いて混合物を分けることができる。例えば、ＭＴＳＰに特異的な抗体を用い
て、結合しているパートナー複合体を免疫沈降することができる。別法として、
クロマトグラフィーおよび密度／沈降遠心分離などの常套の化学分離法を用いる
ことができる。
【０２２１】 抽出物中の非結合細胞成分を除去した後、結合パートナーを複合体から、常套
の方法を用いて分離することができる。例えば、分離は、混合物の塩濃度または
ｐＨを改変することにより達成することができる。
【０２２２】 混合抽出物から結合した結合パートナー対を分離するのを促進するために、Ｍ
ＴＳＰを固体担持体に固定することができる。例えば、タンパク質はニトロセル
ロースマトリックスまたはアクリル性ビーズに結合されることができる。タンパ
ク質またはそのフラグメントを固体担持体へ結合させることにより、抽出物中に
見出される他の成分からペプチド／結合パートナー対を分離するのが促進される
。同定される結合パートナーは、単一のタンパク質、または２またはそれ以上の
タンパク質から成る複合体いずれかであり得る。
【０２２３】 別法として、一本鎖プロテアーゼをコードしている核酸分子を酵母の２ハイブ
リッド系で用いることができる。酵母２‐ハイブリッド系システムを用いて他の
タンパク質パートナー対が同定されているが、これは、本明細書に記載される核
酸分子を用いるのに容易に適合させることができる。
【０２２４】 特にＭＴＳＰ３、ＭＴＳＰ４またはＭＴＳＰ６に関する他のインビトロ結合ア
ッセイは、これらのタンパク質の一つの触媒活性ドメインを少なくとも含むポリ
ペプチドおよび１またはそれ以上の候補結合標的または基質から成る混合物を用
いる。混合物を適当な条件下でインキュベートした後、ＭＴＳＰまたは触媒ドメ
インを含むそのポリペプチドフラグメントが候補基質と結合するかどうかを測定
する。セルフリー結合アッセイに関して、成分の一つは検出可能な標識を含み、
または検出可能な標識に結合される。標識は、放射能活性、発光、光学濃度また
は電子密度など、直接検出のために、またはエピトープタグ、酵素など、間接検
出のために提供されてよい。標識および他のアッセイ成分の特性により、種々の
方法を用いて標識を検出してよい。例えば、固体基質に結合された標識を検出し
てよく、または標識を含む結合された複合体の部分を固体基質から分離して、次
いでその後、標識を検出してよい。
【０２２５】 ３．シグナル伝達の検出 ＭＴＳＰの細胞表面での位置により、シグナル伝達におけるこれらのタンパク
質のいくつかまたは全ての役割が示唆される。シグナル伝達を評価するためのア
ッセイは当該分野の専門家に周知であり、ＭＴＳＰタンパク質を用いる使用のた
めに適合されてよい。 ＭＴＳＰ、特に全長のＭＴＳＰ、もしくは細胞表面上にＭＴＳＰのの細胞外ド
メインまたはその機能的部分に固定するのに十分な部分により媒介されるシグナ
ル伝達を達成する、または改変する薬剤を同定するためのアッセイが提供される
。そのようなアッセイには、例えば、レポーター遺伝子からの発現における影響
を検出することにより伝達されたシグナルの調節が評価される転写に基づくアッ
セイが含まれる（U.S.特許第5,436,128を参照されたい）。
【０２２６】 ４．ＭＴＳＰ、特にＭＴＳＰ３、ＭＴＳＰ４またはＭＴＳＰ６をコードしている
核酸の発現を調節する薬剤を同定するための方法 他の具体例により、ＭＴＳＰ、特にＭＴＳＰ３、ＭＴＳＰ４またはＭＴＳＰを
コードしている核酸の発現を調節する薬剤を同定するための方法が提供される。
そのようなアッセイは、ＭＴＳＰ、例えばＭＴＳＰ３またはＭＴＳＰ４をコード
している核酸の発現レベルにおける変化をモニターするのに利用できる方法を用
いる。
【０２２７】 一のアッセイフォーマットにおいては、ＭＴＳＰ３、ＭＴＳＰ４またはＭＴＳ
Ｐ６またはそのドメイン、特にプロテアーゼドメインのオープンリーディングフ
レームと、アッセイ可能な融合パートナーの間にレポーター遺伝子融合物を含む
細胞系統が調製されてよい。蛍のルシフェラーゼ遺伝子、およびクロラムフェニ
コールアセチルトランスフェラーゼをコードしている遺伝子を含む多くのアッセ
イ可能な融合パートナーが公知であり、容易に入手できる（Alam et al., Anal.
Biochem. 188: 245-54 (1990))。レポーター遺伝子融合物を含む細胞系統を次
いで試験されるべき薬剤に、適当な条件下、および適当な時間に暴露する。薬剤
に暴露されたサンプルと対照サンプルの間のレポーター遺伝子の異なる発現によ
り、ＭＴＳＰ３、ＭＴＳＰ４またはＭＴＳＰ６をコードしている核酸の発現を調
節する薬剤が同定される。
【０２２８】 さらなるアッセイフォーマットを用いて、薬剤がＭＴＳＰ３、ＭＴＳＰ４また
はＭＴＳＰ６をコードしている核酸の発現を調節する能力をモニターしてよい。
例えば、ｍＲＮＡの発現は、核酸へのハイブリダイゼーションにより直接モニタ
ーされてよい。細胞系統を試験されるべき薬剤に、適当な条件下および適当な時
間に暴露し、次いで全ＲＮＡまたはｍＲＮＡを常套法により単離する（例えば、
Sambrook et al. (1989) MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed.
Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照されたい）。薬剤に暴露された細
胞と対照細胞の間のＲＮＡ発現レベルの違いを検出するためのプローブは核酸か
ら調製されてよい。必ずしも必要ではないが、高ストリンジェント条件下で標的
核酸とのみハイブリダイズするプローブを設計することが好ましい。高い相補性
の核酸ハイブリッドのみが高ストリンジェント条件下で生じる。従って、アッセ
イ条件のストリンジェントにより、ハイブリッドを形成するための２の核酸鎖の
間に存在する相補性の量が決定される。ストリンジェントは、プローブ：標的ハ
イブリッドおよび潜在的プローブ：非標的ハイブリッドの間の安定度の違いを最
大にするべく選択されるべきである。
【０２２９】 プローブは当該分野で公知の方法により核酸から設計されてよい。例えば、プ
ローブのＧ＋Ｃ含量およびプローブの長さは、その標的配列へのプローブの結合
に影響を及ぼし得る。プローブの特異性を最適にするための方法が一般に利用で
きる（例えば、Sambrook et al. (1989) MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MA
NUAL, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照されたい）。
【０２３０】 ハイブリダイゼーション条件は、各プローブに要求される公知方法（例えば、
Sambrook et al. (1989) MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed.
Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照されたい）を用いて変更される。
全細胞ＲＮＡ、またはポリＡ ＲＮＡを増したＲＮＡのハイブリダイゼーション
は、あらゆる利用可能な形式にて達成することができる。例えば、全細胞ＲＮＡ
、またはポリＡ ＲＮＡを増したＲＮＡは固体担持体に固定され得、次いで固体
担持体を、少なくとも一つの核酸分子または核酸分子の一つの部分を含む少なく
とも一のプローブに、プローブが特異的にハイブリダイズする条件下で暴露する
。別法として、少なくとも一つの配列、または配列の一つの部分を含む核酸フラ
グメントを極性水ガラスなどの固体担持体に固定することができる。水ガラスを
次いで、サンプル由来の全細胞ＲＮＡまたはポリＡ ＲＮＡに、固定された配列
が特異的にハイブリダイズする条件下で暴露することができる。そのような水ガ
ラスおよびハイブリダイゼーション法は、例えば、Beattie(WO95/11755)により
開示されるものなど、広く利用できる。所定のプローブが未処理の細胞集団およ
び試薬に暴露された細胞集団由来のＲＮＡサンプルに特異的にハイブリダイズす
る能力を試験することにより、配列番号３または配列番号４の配列を有するタン
パク質をコードしている核酸の発現をアップまたはダウンレギュレートする薬剤
が同定される。
【０２３１】 ５．ＭＴＳＰ３、ＭＴＳＰ４またはＭＴＳＰ６などのＭＴＳＰの少なくとも１の
活性を調節する薬剤を同定するための方法 ＭＴＳＰ３、ＭＴＳＰ４またはＭＴＳＰ６などのＭＴＳＰの少なくとも１の活
性を調節する薬剤を同定するための方法が提供される。そのような方法またはア
ッセイは、所望の活性をモニターまたは検出するあらゆる方法を用いてよい。
【０２３２】 一のフォーマットでは、試験されるべき薬剤に暴露された細胞集団間のタンパ
ク質の、暴露されていない対照細胞集団と比較した相対量がアッセイされてよい
（例えば、前立腺癌細胞系統、肺癌細胞系統、大腸癌細胞系統または乳癌細胞系
統）。このフォーマットでは、特異的抗体などのプローブを用いて、個々の細胞
集団におけるタンパク質の異なる発現がモニターされる。細胞系統または集団を
試験されるべき薬剤に、適当な条件下および適当な時間にて暴露する。細胞溶解
物を暴露された細胞系統もしくは細胞集団および対照、暴露されていない細胞系
統もしくは集団から調製してよい。細胞溶解物が次いでプローブを用いて分析さ
れる。
【０２３３】 例えば、ＭＴＳＰのＮ−末端フラグメントおよびＣ−末端フラグメントは細菌
中に発現され得、これらを用いてフラグメントに結合するタンパク質を探索する
ことができる。融合タンパク質、ＭＴＳＰ３、ＭＴＳＰ４またはＭＴＳＰ６など
のＭＴＳＰのＮ−またはＣ−末端領域に対するＨｉｓ−ｔａｇまたはＧＳＴの融
合タンパク質が、基質として用いるために調製されることができる。これらの融
合タンパク質は、例えばグルタチオンセファロースビーズに結合されることがで
き、次いで細胞溶解物を用いてプローブされることができる。溶解前、細胞をＭ
ＴＳＰ３、ＭＴＳＰ４またはＭＴＳＰ６などのＭＴＳＰを調節し得る候補薬剤、
またはそのドメインと相互作用するタンパク質で処理してよい。融合タンパク質
に結合している溶解物タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析され得、当該分
野で公知のように、タンパク質配列決定またはマススペクトロメトリーにより単
離および同定され得る。
【０２３４】 抗体プローブは、十分な長さ（例えば、ＭＴＳＰタンパク質、ＭＴＳＰ３、Ｍ
ＴＳＰ４またはＭＴＳＰ６などの４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、
１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０またはそれ以上の連続アミノ
酸）である場合もしくは免疫原性を高めるのに必要とされる場合、適当なキャリ
アと結合されたペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を用いる適当な免疫
化プロトコルにて、適当な哺乳動物の宿主を免疫化することにより調製される。
キャリア、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カサガイヘモシアニン（ＫＬ
Ｈ）または他のキャリアタンパク質などのキャリアとの免疫原性結合物を調製す
る方法は、当該分野で周知である。例えばカルボジイミド試薬を用いる直接結合
が有効であり得る場合があり、Pierce Chemical CO., Rockford, ILにより供給
されるものなどの結合試薬が、ハプテンへの結合を提供するのに望まれる場合も
ある。ハプテンペプチドは、例えばキャリアとの結合を促進するべく、Ｃｙｓ残
基を用いてアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれにも伸長されることができ
、またはシステイン残基を散在させることができる。免疫原の投与は、一般に、
適当な期間に渡って注射により行われ、当該分野で一般に理解される適当なアジ
ュバントを用いて行われる。免疫化スケジュール中、抗体のタイターを用いて、
抗体形成の適性が決定される。
【０２３５】 抗ペプチド抗体は、例えばＭＴＳＰのカルボキシ末端のアミノ酸に対応する合
成ペプチドを用いて作成されることができる。合成ペプチドは長さにして１−３
アミノ酸であるほど小さいが、好ましくは少なくとも４またはそれ以上のアミノ
酸残基長である。ペプチドは常套法を用いてＫＬＨに結合されることができ、次
いで、動物、例えばウサギまたは有蹄類などの動物に免疫処理されることができ
る。ポリクローナル抗体は次いで、例えば共有結合ペプチドを含むＡｃｔｉｇｅ
ｌビーズを用いて精製されることができる。
【０２３６】 この方法で製造されたポリクローナル抗血清は、医薬組成物に関するいくつか
の適用に十分であり得るが、モノクローナル調製物の使用が好ましい。所望のモ
ノクローナル抗体を分泌する免疫化された細胞系統は、Kohler et al., (Nature
256: 495-7'1975))の常套法、または一般に知られるようなリンパ球または脾臓
細胞の不死化をもたらす変更を用いて調製されてよい。所望の抗体を分泌してい
る不死化された細胞系統は、抗原がペプチドハプテン、ポリペプチドまたはタン
パク質である免疫アッセイによりスクリーニングされる。所望の抗体を分泌して
いる適当な不死化細胞培養物が同定されたら、細胞はインビトロか、またはイン
ビボでの腹水による産生によるかのいずれかにより、培養されることができる。
ＭＴＳＰ３、ＭＴＳＰ４またはＭＴＳＰ６などのＭＴＳＰの触媒ドメインを認識
するモノクローナル抗体が特に興味深い。
【０２３７】 さらに、ＭＴＳＰの酵素前駆体または二本鎖形態を用いて、構造エピトープを
認識するモノクローナル抗体を作成することができる。ペプチド指向性モノクロ
ーナル抗体に関して、Ｃ１ｒ／Ｃ１ｓドメイン由来のペプチドを用いて、ＭＴＳ
Ｐの酵素前駆体から二本鎖形態への活性化をブロックすることができる抗Ｃ１ｒ
／Ｃ１ｓドメインモノクローナル抗体を作成することができる。このドメインは
同様に、ＭＴＳＰ３、ＭＴＳＰ４またはＭＴＳＰ６の一本鎖または二本鎖形態い
ずれかにおけるこれら好ましいドメインに結合し、それによりその活性を調節し
、またはその活性化を妨げる、他の非抗体化合物のための基質であり得る。
【０２３８】 所望のモノクローナル抗体を次いで培養上清または腹水上清から回収する。免
疫上重要な部分を含むモノクローナル抗血清またはポリクローナル抗血清のフラ
グメントは、アンタゴニストならびに未処理の抗体として用いられることができ
る。免疫反応性フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのＦａｂ、Ｆａｂ’
などの使用は、これらのフラグメントは一般に完全な免疫グロブリンよりも免疫
原性が低いために、特に治療において好まれることが多い。
【０２３９】 抗体またはフラグメントも産生されてよい。レセプターの所望の領域に特異的
に結合する領域を、多種起源とのキメラに関して産生することもできる。 前記方法においてアッセイされる薬剤は、ランダムに選択され、または合理的
に選択もしくは設計されることができる。
【０２４０】 薬剤は、実施例のように、ペプチド、小分子、および炭水化物であり得る。当
業者には、薬剤の構造特性についての制限はないことが容易に理解できる。 ペプチド薬剤は、当該分野で公知のように、常套の固相（または液相）ペプチ
ド合成法を用いて調製されることができる。加えて、これらのペプチドをコード
しているＤＮＡは、市場入手可能なオリゴヌクレオチド合成装置を用いて合成さ
れてよく、および常套の組換え産生システムを用いて組換え産生されてよい。固
相ペプチド合成を用いる産生は、遺伝子によりコードされないアミノ酸が含まれ
る場合に必要とされる。
【０２４１】 Ｇ．試験物質のアッセイフォーマットおよび選択 スクリーニングアッセイを行うことに関して種々のフォーマットおよび検出プ
ロトコルが公知である。いずれかのそのようなフォーマットおよびプロトコルを
ＭＴＳＰタンパク質の活性のモジュレーターを同定するのに適用してよい。以下
に、典型的プロトコルの考察を含める。 １．高処理量スクリーニングアッセイ 前記アッセイは、単一のＭＴＳＰタンパク質がスクリーニングされる場合、お
よび／または単一の試験物質が一のアッセイでスクリーニングされる場合に行う
ことができるが、アッセイは、好ましくは高処理量スクリーニング様式で行われ
、こうして、複数のＭＴＳＰタンパク質がスクリーニングされ、および／または
複数の試験物質が同時にスクリーニングされる(一般的に、High Throughput Scr
eening: The Discovery of Bioactive Substances(Devlin, Ed.) Marcel Dekker
, 1997; Sittampalam et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 1(3): 384-918 (1997
); and Silverman et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2(3): 397-403(1998)を
参照されたい）。例えばアッセイは、マルチ−ウェル(例えば、２４−、４８−
、９６−、または３８４−ウェル）、チップまたはアレイフォーマットで行うこ
とができる。
【０２４２】 高処理量スクリーニング（ＴＨＳ）は、多数の異なる化学構造を疾患標的に対
して試験して、「ヒット」するものを同定する方法である(Sittampalam et al.,
Curr. Opin. Chem. Biol., 1(3): 384-91(1997))。当該分野で最新のＨＴＳ操
作は高度に自動化されており、サンプル調製、アッセイ工程および大量のデータ
のその後の加工がコンピューター化されている。
【０２４３】 高処理量スクリーニングで用いられる検出法は、調べられる生化学経路のタイ
プに依存する(Sittampalam et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 1(3): 384-91(1
997))。これらの方法には、種々の酵素アッセイに用いられることができるシン
チレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）などの放射能化学法(Lerner et al., J. B
iomol. Screening, 1: 135-143(1996); Baker et al., Anal. Biochem. 239: 20
-24(1996); Baum et al., Anal. Biochem., 237: 129-134 (1996); and Sulliva
n et al., J. Biomol. Screening, 2: 19-23(1997))およびタンパク質−タンパ
ク質相互作用アッセイ(Braunwalder et al., J. Biomol. Screening, 1: 23-26(
1996); Sonatore et al., Anal. Biochem., 240: 289-297(1996); and Chen et
al., J. Viol. CHem. 271: 25308-2531581996))、および制限されるものではな
いが、比色および発光検出法、共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）法、時間決定蛍光
（ＨＴＲＦ）法、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）法(例えば、Gonzalez et
al., Biophys. J., 69: 1272-1280(1995)を参照されたい）などの細胞に基づく
蛍光アッセイ、蛍光分極または異方性法（例えば、Jameson et al., Methods En
zymol., 246: 283-300(1995); Jolley, J. Biomol, Screening, 1: 33-38(1996)
; Lynch et al., Anal. Biochem., 247: 77-82(1997))、蛍光対比分光化学（Ｇ
ＣＳ）などを含む非アイソトープ度検出法および他のそのような方法が含まれる
。
【０２４４】 ２．試験物質 小分子およびライブリーおよびそのコレクションを含む試験化合物を、前記ア
ッセイおよびＭＴＳＰタンパク質の活性を調節する化合物を同定するために以下
に記載するアッセイにてスクリーニングすることができる。コンピューター化学
による合理的な薬物設計方法を用いて、候補化合物がスクリーニングおよび同定
されてよい。 スクリーニング法により同定される化合物には、アンタゴニストを含む阻害物
質が含まれ、アゴニストであってもよい。スクリーニングのための化合物は、入
手可能な公知の、または調製可能な化合物および化合物のコレクションである。
【０２４５】 ａ．化合物の選択 化合物は、セリンプロテアーゼ、特にＭＴＳＰタンパク質の阻害に関するその
能力および選択性に関して選択することができる。本明細書に記載されるように
、および一般に公知のように、標的セリンプロテアーゼとその基質は、プロテア
ーゼとその基質との反応を許容するアッセイ条件下で結合される。アッセイは試
験化合物の不在下で、および試験化合物の存在下でその濃度を増しながら行われ
る。セリンプロテアーゼの活性の５０％が試験化合物により阻害される試験化合
物濃度が、該化合物のＩＣ５０値（阻害濃度）またはＥＣ５０（有効濃度）値で
ある。試験化合物のシリーズまたはグループの中で、ＩＣ５０またはＥＣ５０値
が低いものほど、ＩＣ５０またはＥＣ５０値がより高い化合物よりもセリンプロ
テアーゼのより強力な阻害物質であると考えられる。ＩＣ５０の測定はより単純
化されたアッセイで用いられることが多く、一方、ＥＣ５０は細胞を用いるもの
など、より複雑なアッセイで用いられることが多い。
【０２４６】 この態様による好ましい化合物は、ＭＴＳＰタンパク質活性の阻害に関するイ
ンビトロアッセイで測定されるような、１００ｎＭまたはそれ未満のＩＣ５０値
を有する。特に好ましい化合物は、１００ｎＭ未満のＩＣ５０値を有する。 試験化合物を、セリンプロテアーゼに対するその選択性に関してさらに評価す
る。本明細書に記載されるように、および一般に公知のように、試験化合物はセ
リンプロテアーゼおよび他の酵素のパネルに対するその効能に関してアッセイさ
れ、ＩＣ５０値またはＥＣ５０値は、各アッセイ系において各試験化合物に関し
て決定される。標的酵素、例えばＭＴＳＰタンパク質に関して低いＩＣ５０値ま
たはＥＣ５０値を示し、そして、試験パネル（例えば、ウロキナーゼ組織プラス
ミノゲン活性化因子、トロンビン、Ｘａ因子）中の他の酵素に関して高いＩＣ５ ０ 値またはＥＣ５０値を示す化合物が、標的酵素に対して選択的であると考えら
れる。一般に、標的酵素アッセイにおいてそのＩＣ５０値またはＥＣ５０値が、
酵素の選択的パネルにおいて測定される二番目に低いＩＣ５０またはＥＣ５０値
よりも少なくとも１オーダーの等級低い場合に、酵素は選択的であると考えられ
る。
【０２４７】 現在好ましい化合物は、ウロキナーゼ活性の阻害に関するインビトロアッセイ
で測定されるように、１００ｎＭまたはそれ未満のＩＣ５０値を有する。特に好
ましい化合物は、インビトロウロキナーゼ阻害アッセイにおいて、インビトロｔ
ＰＡ阻害アッセイで測定されるＩＣ５０値より少なくとも一等級のオーダー低い
ＩＣ５０値を有する。１００以上のＩＣ５０ｕ−ＰＡアッセイ：ＩＣ５０ＭＴＳ
Ｐタンパク質アッセイの選択率を有する化合物が特に好ましい。 化合物を、インビボにおけるその活性に関しても評価される。試験化合物の評
価のために選択されるアッセイのタイプは、化合物の使用により治療または予防
される病的症状、ならびに試験化合物に関して評価されるべき投与経路に依存す
る。
【０２４８】 例えば、ＭＴＳＰタンパク質の阻害により腫瘍の増殖を減じる化合物の活性を
評価するために、Jankun et al., Canc. Res. 57: 559-563(1997)により開示さ
れる、ＰＡＩ−１を評価するための方法を用いることができる。簡単には、ＡＴ
ＣＣ細胞系統ＤＵ１４５およびＬｎＣａＰをＳＣＩＤマウスに注射する。腫瘍が
確立された後、化合物のインビトロ特性から決定される投与法に従い、マウスに
試験化合物を投与する。Jankunらは、化合物を水中に投与した。腫瘍体積の測定
を、週に２回、約５週間行う。化合物が投与された動物で、適当な対照化合物を
投与されている動物と比較して腫瘍体積の低下が示される場合に、化合物は活性
であると考えられる。 ブタのプロテアーゼ阻害物質であるｐ−アミノベンズアミジンの、腫瘍体積を
減じることにおける効果を評価するために設計された他のインビボ実験モデルが
、Billstrom et al., Int. J. Cancer, 61: 542-547(1995)により記載されてい
る。
【０２４９】 腫瘍の発生を減じる、または転移を阻害する化合物の能力を評価するために、
Kobayashi et al., Int. J. Canc. 57: 727-733d (1994)により記載される方法
を用いることができる。簡単には、高い肺のコロニー形成能力に関して選択され
たムレイン異種移植片を、Ｃ５７Ｂ１／６マウスに静脈注射（実験的癌転移）ま
たは皮下注射にて腹腔壁に注射する（自発性癌転移）。試験されるべき種々の濃
度の化合物を注射前に基質ゲル中で腫瘍細胞と混合することができる。試験化合
物の毎日のｉ．ｐ．注射は、腫瘍接種後１−６日または７−１３日のいずれかで
行う。動物は腫瘍接種の約３または４週間後に屠殺し、肺の腫瘍コロニーを数え
る。得られたデータを評価することにより、試験化合物の効力、最適投与量およ
び投与経路を決定することが可能となる。
【０２５０】 腫瘍体積および腫瘍転移を減じることに対する試験化合物の活性は、その阻害
物質を評価するためのRabbani et al., Int. J. Cancer 63: 840-845(1995)に記
載されるモデルにて評価することができる。そこでは、Mat LyLu腫瘍細胞が、コ
ペンハーゲンラットの脇腹に注射された。動物に浸透ミニポンプを差し込み、種
々の投与量の試験化合物を３週間まで継続的に投与した。実験動物および対照動
物の腫瘍質量および体積を、実験中に、転移性の増殖として評価した。生じたデ
ータを評価することにより、試験化合物の効力、最適投与量、および投与経路を
決定することが可能となる。これらの著者らの幾人かが、Xing et al., Canc. R
es., 57: 3585-3595(1997)に関連プロトコルを記載している。
【０２５１】 化合物の阻害活性を評価するために、ウサギの角膜新血管形成モデルを用いる
ことができる。Avery et al., Arch. Ophthalmol., 108: 1474-1475(1990)には
、ニュージーランドアルビノウサギを麻酔すること、および次いで中央角膜切開
を行い、次いで放射線角膜ポケットを形成することが記載されている。徐放性プ
ロスタグランジンペレットをポケットに入れ、新血管形成を誘導した。試験化合
物を５日間、ｉ．ｐ．投与し、５日目に動物を屠殺した。試験化合物の効果は、
新血管形成反応の領域を算定するために用いられることができる、角膜縁を撮影
した定期的撮影写真を再検討することにより評価される。適当な対照と比較して
新血管形成が少ない領域は、試験化合物が新血管形成を低下させるのに、または
阻害させるのに有効であったことを示す。
【０２５２】 血管形成の予防における試験化合物の効果を評価するために用いられる血管形
成モデルは、Min et al., Canc. Res., 56:2428-2433(1996)に記載されている。
Ｃ５７ＢＬ６マウスに、血管形成誘導剤としてｂＦＧＦを含む基質ゲル混合物を
、試験化合物と共に、およびそれを加えずに皮下注射する。５日後、動物を屠殺
し、新血管形成を認めることができるマトリゲルプラグを撮影する。マトリゲル
および有効投与量の試験化合物を投与された実験動物は、対照動物または有効投
与量未満の、または非有効投与量の試験化合物を投与されている実験動物よりも
血管形成の程度が低い。
【０２５３】 試験化合物の初期腫瘍の蔓延を制限する能力に関する試験化合物に対して設計
されたインビボシステムが、Crowley et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90: 50
21-5025(1993)に記載されている。ヌードマウスに、遺伝子操作された腫瘍細胞
（ＰＣ３）を注射して、ＣＡＴ（クロラムフェニコール アセチルトランスフェ
ラーゼ）を発現させる。腫瘍サイズおよび／または転移を減じる化合物の能力を
試験するための化合物を動物に投与し、腫瘍サイズおよび／または転移性の増殖
に関する測定を次いで行う。加えて、種々の器官で検出されたＣＡＴのレベルを
、試験化合物が転移を阻害する能力を示すものとしてとして提供し、処置された
動物の組織において、対照動物に対してＣＡＴが低いことが検出されると、それ
はその組織に移植されたＣＡＴを発現している細胞が少ないことを示す。
【０２５４】 試験セリンプロテアーゼ阻害物質の阻害能力を評価するために設計された、高
侵襲性の腫瘍細胞系統Ｆ３１１を用いるインビボ実験様式が、Alonso et al., B
reast Canc. Res. Treat., 40: 209-223(1996)に記載されている。このグループ
は、毒性決定、腫瘍の増殖、侵襲性、自発性転移、実験的肺転移および血管形成
アッセイに関するインビボ研究を記載している。
【０２５５】 L. Ossowski(J. Cell Biol., 107:2437-2445 (1988))により１９９８年に初め
に記載されたＣＡＭモデル（ニワトリ胎児漿尿膜モデル）により、試験化合物の
ウロキナーゼ阻害活性を評価するためのもう一つの方法が提供される。ＣＡＭモ
デルでは、腫瘍細胞はＣＡＭを含む漿尿膜を通して侵襲し、腫瘍細胞はいくつか
のセリンプロテアーゼ阻害物質の存在下で膜を貫通する腫瘍細胞の侵入が減るか
、またはなくなる。こうして、ＣＡＭアッセイは、種々の濃度の試験化合物の存
在下および不在下で、ＣＡＭおよび腫瘍細胞を用いて行われる。腫瘍細胞の侵襲
性は、化合物の阻害活性の徴候を示す条件下で測定される。阻害活性を有する化
合物は、腫瘍の侵襲の低下と関連する。
【０２５６】 ＣＡＭモデルは、血管形成（即ち、新血管の形成における効果(Brooks et al.
, Methods in Molecular Biology, 129: 257-269(1999))に関する常套のアッセ
イにも用いられる。このモデルによれば、血管形成誘導物質、例えば塩基性繊維
芽細胞増殖因子（ｂＦＤＧ）などを含むフィルターディスクをＣＡＭ上に置く。
サイトカインがＣＡＭに拡散すると局所的血管形成が誘導され、これは、フィル
ターディスクのすぐ下のＣＡＭ中の血管分枝点の数を数えることによるなどの種
々の方法で測定されてよい。同定される化合物がサイトカイン誘導性の血管形成
を阻害する能力が、このモデルを用いて試験されることができる。試験化合物は
、血管形成誘導物質を含むフィルターディスクに添加されるか、直接膜上に置か
れるか、または全身投与されるかすることができる。試験化合物の存在下および
／または不在下での新血管形成の程度を、このモデルを用いて比較することがで
きる。試験化合物の存在下で新血管の形成が少ないことは、抗血管形成活性の指
標である。ＭＴＳＰタンパク質の阻害物質に関する抗血管形成活性の立証により
、ＭＴＳＰタンパク質の血管形成における役割が示される。
【０２５７】 ｂ.公知セリンプロテアーゼ阻害物質 スクリーニングのための化合物は、セリンプロテアーゼ阻害物質であり、これ
は、ＭＴＳＰ、特にＭＴＳＰ３、ＭＴＳＰ４またはＭＴＳＰ６の活性を阻害する
その能力に関して試験されることができる。 典型的な、しかし制限するものではないセリンプロテアーゼは、スクリーニン
グアッセイに用いられる以下の公知セリンプロテアーゼ阻害物質が含まれる。セ
リンプロテアーゼ阻害物質３（ＳＰＩ−３）(Chen, M.C., et al., Citokine, 1
1(11): 856-862(1999));アプロチニン(Iijima, R. et al., J. Biochem. (Tokyo
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【０２５８】 Ｃ．コンビナトリアルライブラリーおよび他のライブラリー スクリーニングアッセイのための化合物の源は、制限されるものではないが、
コンビナトリアルライブラリーを含むライブラリーであり得る。コンビナトリア
ルライブラリーを合成するための方法およびそのようなコンビナトリアルライブ
ラリーの特徴は、当該分野で公知である（一般に、コンビナトリアルライブラリ
ー: 合成、スクリーニングおよび適用の可能性(Cortese Ed.) Walter de Gruyte
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【０２５９】 異なるライブライリー、主にペプチドおよびヌクレオチドに基づくオリゴマー
ライブラリーを作成するための方法および戦略は、分子生物学法および／または
同時化学合成法（Dower et al., Annu. Rep. Med. Chem., 26:271-280 (1991);
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try, 37:1233-1251 (1994)を参照されたい）を用いて開発されている。生じるコ
ンビナトリアルライブラリーは潜在的に数百万の化合物を含み、それをスクリー
ニングして、選り抜きの活性を示す化合物を同定することができる。
【０２６０】 ライブラリーは、およそ３つのカテゴリーに入る。ランダムペプチドまたはタ
ンパク質が、プラスミドから発現されるファージ粒子またはタンパク質の表面に
提示される融合タンパク質提示系ペプチドライブラリー；個々の化合物または化
合物の混合物が樹脂ビーズ（例えば、Lam et al., Nature, 354:82-84 (1991)を
参照されたい）および綿の担持体（例えばEichler et al., Biochemistry 32:11
035-11041 (1993)を参照されたい）などの不溶性基質上に示される担持体結合合
成化学ライブラリー、および化合物が溶液中で用いられる方法（例えば、Hought
en et al., Nature, 354:84-86 (1991); Houghten et al., BioTechniques, 313
:412-421 (1992); and Scott et al., Curr. Opin. Biotechnol., 5:40-48 (199
4)を参照されたい）。合成ペプチドおよびオリゴヌクレオチドコンビナトリアル
ライブラリーの多くの例があり、非ペプチド性小有機分子を含むライブラリーを
作成するための多くの方法が存在する。そのようなライブラリーは、組み合わさ
れて異なる有機分子の混合物を形成するモノマーから成る基本的セット、または
組み合わされて選択されたファルマコフォアモノマーに基づくライブラリーを形
成することができるモノマーの基本セットに基づくことができる。
【０２６１】 ランダムまたは決定論的(deterministic)コンビナトリアルライブラリーのい
ずれかを、ここに開示した、および／または権利主張されるスクリーニング法に
よりスクリーニングすることができる。これらの２つのライブラリーのいずれに
おいても、ライブラリーの各ユニットは単離され、および／または固体担持体上
に固定される。決定論的ライブラリーでは、各固体担持体上の特定のユニットの
位置は演繹的に分かる。ランダムライブラリーでは、特定ユニットの位置は、各
部位は単一のユニークなユニットを含むが、演繹的には分からない。ライブラリ
ーを調製するための多くの方法が当該分野の専門家に公知である（例えば、Geys
en et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:3998-4002 (1984), Houghten et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:5131-5135 (1985)を参照されたい）。
【０２６２】 当該分野の専門家に公知の方法により作成されたコンビナトリアルライブラリ
ーがスクリーニングのために企図される（例えば、スクリーニングに関するSchu
ltz and Schultz, Biotechnol. Prog., 12(6):729-43 (1996))の表１を参照され
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92)を参照されたい）。
【０２６３】 例えば、ＭＴＳＰタンパク質またはＭＴＳＰタンパク質のプロテアーゼドメイ
ンに結合するペプチドは、ファージ提示ライブラリーを用いて同定されることが
できる。典型的な具体例では、この方法には、ａ）ファージライブラリー由来の
ファージをＭＴＳＰタンパク質またはそのプロテアーゼドメインと接触させるこ
と、（ｂ）タンパク質に結合するファージを単離すること；および（ｃ）単離さ
れたファージによりコードされる少なくとも一つのペプチドの同一性を決定し、
ＭＴＳＰタンパク質に結合するペプチドを同定することが含まれることができる
。
【０２６４】 Ｈ．ＭＴＳＰタンパク質の活性のモジュレーター 本明細書中、スクリーニングにより同定される、または他のスクリーニング法
においてＭＴＳＰタンパク質またはプロテアーゼドメインを用いて作成される、
ＭＴＳＰの活性を調節する化合物が提供される。これらの化合物は、ＭＴＳＰタ
ンパク質と直接接触させることにより、またはその転写または翻訳を変更するこ
とにより作用する。そのような分子には、制限されるものではないが、ＭＴＳＰ
タンパク質と、特にそのプロテアーゼドメインと特異的に反応する抗体、ＭＴＳ
Ｐタンパク質の発現を改変するアンチセンス核酸、抗体、ペプチドミメティクス
、および他のそのような分子が含まれる。
【０２６５】 １．抗体 本明細書中に提供されるＭＴＳＰタンパク質、好ましくはその一本鎖プロテア
ーゼドメインに特異的に結合するポリクローナルおよびモノクローナル抗体を含
む抗体が提供される。好ましくは、抗体はモノクローナル抗体であり、および好
ましくは、抗体は、ＭＴＳＰタンパク質のプロテアーゼドメインに特異的に結合
する。特定の具体例では、ＭＴＳＰ１、ＭＴＳＰ３、ＭＴＳＰ４およびＭＴＳＰ
６のプロテアーゼドメインの一本鎖のそれぞれに対する抗体が提供される。ＭＴ
ＳＰ３またはＭＴＳＰ４のいずれかのドメインまたはその二本鎖形態に特異的に
結合する抗体も提供される。
【０２６６】 ＭＴＳＰタンパク質およびドメイン、そのフラグメント、ホモログおよび誘導
体を免疫原として用いて、そのような免疫原に特異的に結合する抗体が作成され
てよい。そのような抗体には、制限されるものではないが、ポリクローナル、モ
ノクローナル、キメラ、一本鎖、Ｆａｂフラグメント、およびＦａｂ発現ライブ
ラリーが含まれる。特定の具体例では、ヒトのＭＴＳＰタンパク質に対する抗体
が産生される。他の具体例では、ＭＴＳＰタンパク質のフラグメントから形成さ
れ、フラグメントがセリンプロテアーゼドメインを含む複合体が、抗体産生のた
めの免疫原として用いられる。
【０２６７】 当該分野で公知の種々の方法を、ＭＴＳＰタンパク質、そのドメイン、誘導体
、フラグメントまたは類似体に対するポリクローナル抗体の産生に用いてよい。
抗体の産生に関して、種々の宿主動物を天然のＭＴＳＰタンパク質またはその合
成体、または前記誘導体、例えば架橋結合ＭＴＳＰタンパク質などを用いて注射
により免疫化することができる。そのような宿主動物には、制限されるものでは
ないが、ウサギ、マウス、ラットなどが含まれる。宿主種により、種々のアジュ
バントを用いて免疫反応を増すことができ、それらには、制限されるものではな
いが、Freund'の(完全および不完全）アジュバント、水酸化アルミニウムなどの
ミネラルゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、ポ
リアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、ジニトロフェノール、およびカル
メット−ゲラン菌（ＢＣＧ）およびコリネバクテリアパルバムなどの潜在的に有
用なヒトアジュバントが含まれる。
【０２６８】 ＭＴＳＰタンパク質またはそのドメイン、誘導体、フラグメントまたは類似体
に対して指向されるモノクローナル抗体の調製のために、培地中の継代細胞系統
による抗体分子の産生を提供するあらゆる方法を用いてよい。そのような方法に
は、制限されるものではないが、KohlerおよびMilsteinにより初めて開発された
ハイブリドーマ法(Nature 256:495-497 (1975))、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハ
イブリドーマ法（Kozbor et al., Immunology Today 4:72 (1983)）およびヒト
モノクローナル抗体を産生するためのハイブリドーマ法（Cole et al., in Mono
clonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 (198
5)）が含まれる。さらなる具体例では、モノクローナル抗体は、最近の技術を用
いて無菌動物中に産生されることができる（ＰＣＴ／ＵＳ９０／０２５４５）。
ヒト抗体が用いられてよく、これはヒトハイブリドーマを用いることにより（Co
te et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030 (1983)）、または、ヒ
トＢ細胞をインビトロでＥＢＶウイルスで形質転換することにより（Cole et al
., in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp.
77-96 (1985)）得ることができる。ＭＴＳＰタンパク質に特異的なマウス抗体分
子由来の遺伝子を適当な生物活性を持つヒト抗体分子由来の遺伝子とともにスプ
ライシングすることによる、「キメラ抗体」の産生のために開発された方法（Mo
rrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984); Neuberger
et al., Nature 312:604-608 (1984); Takeda et al., Nature 314:452-454 (1
985)）を用いることができる。
【０２６９】 一本鎖抗体の産生のために記載された方法（Ｕ．Ｓ．特許４,９４６,７７８）
を、ＭＴＳＰタンパク質特異的一本鎖抗体を産生するために適合することができ
る。さらなる具体例は、ＭＴＳＰタンパク質またはＭＴＳＰタンパク質、そのド
メイン、誘導体または類似体に対する所望の特異性を有するモノクローナルＦａ
ｂフラグメントの迅速かつ容易な同定を可能とするＦａｂ発現ライブラリーの構
築物に関して記載された方法（Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989)）
を用いるものである。ヒト以外の抗体を、公知方法を用いて「ヒト化」すること
ができる（例えば、Ｕ．Ｓ．特許第５,２２５,５３９を参照されたい）。
【０２７０】 ＭＴＳＰタンパク質のイディオタイプを含む抗体フラグメントは、当該分野で
公知の技術により作成されることができる。例えば、そのようなフラグメントに
は、制限されるものではないが、抗体分子のペプシン消化により作成されること
ができるＦ(ａｂ')２フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィ
ド結合を還元することにより作成されることができるＦａｂ’フラグメント、抗
体分子をパパインおよび還元剤で処理することにより作成されることができるＦ
ａｂフラグメント、およびＦｖフラグメントが含まれる。
【０２７１】 抗体の産生において、所望の抗体のスクリーニングは、例えばＥＬＩＳＡ（酵
素結合免疫吸着アッセイ）などの当該分野で公知の技術により行うことができる
。ＭＴＳＰタンパク質の特定ドメインに特異的な抗体を選択するために、そのよ
うなドメインを含むＭＴＳＰタンパク質のフラグメントに結合する生成物のため
に作成されたハイブリドーマをアッセイしてよい。
【０２７２】 前記抗体は、例えば診断法などにおいて、これらのタンパク質を画像処理し、
適当な生理サンプルにおいてそのレベルを測定することに関する、ＭＴＳＰタン
パク質タンパク質の同定および／または定量に関する当該分野で公知の方法に用
いることができる。 他の具体例では、（前記を参照されたい）抗ＭＴＳＰタンパク質抗体、または
結合ドメインを含むそのフラグメントが治療剤として用いられる。
【０２７３】 ２．ペプチドおよびペプチドミメティクス 本明細書中、ＭＴＳＰタンパク質に結合し、その活性を調節する分子を同定す
るための方法が提供される。ＭＴＳＰ、特に一本鎖プロテアーゼドメインまたは
その触媒活性フラグメントに結合する分子の中には、ペプチドおよびペプチドミ
メティクスが含まれる。ペプチドミメティクスは、標的分子、例えばＭＴＳＰタ
ンパク質などへの特異的結合に必要なリガンド分子組成またはポリペプチド分子
組成を擬似する分子または化合物である。典型的な具体例では、ペプチドまたは
ペプチドミメティクスはＭＴＳＰタンパク質のプロテアーゼドメインに結合する
。そのようなペプチドおよびペプチドミメティクスには、ＭＴＳＰタンパク質に
特異的に結合する、および好ましくはＭＴＳＰタンパク質のプロテアーゼドメイ
ンに特異的に結合する抗体のペプチドおよびペプチドミメティクスが含まれる。
本明細書に提供される方法により同定されるペプチドおよびペプチドミメティク
スは、ＭＴＳＰタンパク質のアゴニストまたはアンタゴニストであり得る。
【０２７４】 そのようなペプチドおよびペプチドミメティクスは、哺乳動物におけるＭＴＳ
Ｐタンパク質の活性に関連する病気または疾患を診断する、治療する、予防する
、およびスクリーニングするのに有用である。加えて、該ペプチドおよびペプチ
ドミメティクスは、ＭＴＳＰタンパク質の活性を調節する、またはＭＴＳＰタン
パク質またはＭＴＳＰタンパク質のプロテアーゼドメインに特異的に結合する分
子または化合物を同定、単離、および精製するのに有用である。低分子量のペプ
チドおよびペプチドミメティクスは、標的分子、例えばＭＴＳＰタンパク質また
は好ましくはＭＴＳＰタンパク質のプロテアーゼドメインに強い結合特性を有し
得る。
【０２７５】 本明細書に記載されるＭＴＳＰタンパク質に結合するペプチドおよびペプチド
ミメティクスをヒトを含む哺乳動物に投与して、ＭＴＳＰタンパク質の活性を調
節することができる。つまり、そのような活性を調節するのに十分な量でペプチ
ドまたはペプチドミメティクス化合物を投与することを含む、血管形成に伴う病
気または疾患の治療的処置および予防のための方法が提供される。つまり、本明
細書中、ペプチドまたはペプチドミメティクス化合物を治療的に有効な投与量ま
たは治療的有効量で対象に投与する、そのような病気または疾患を有する対象を
治療するための方法も提供される。
【０２７６】 ペプチドまたはペプチドミメティクスを含む組成物は、予防および／または治
療処置のために投与することができる。治療適用において、組成物は、すでに前
記の疾患に罹患している対象に、疾患およびその合併症の症状を治療する、また
は少なくとも部分的にそれらを抑えるのに十分な量で投与されることができる。
この使用に有効な量は、疾患の重篤度、対象の体重および一般症状に依存する。
【０２７７】 予防的適用において、ペプチドおよびペプチドミメティクスを含む組成物が、
特定疾患に罹りやすいまたはその危険性のある対象に投与される。そのような量
は、「予防的有効投与量」と定義される。この使用において、詳細な量はここで
も、対象の健康状態および体重に依存する。
【０２７８】 従って、ＭＴＳＰタンパク質に結合するペプチドおよびペプチドミメティクス
を、活性成分として少なくとも一つのペプチドまたはペプチドミメティクスを医
薬担体または希釈剤と組み合わせて含む医薬組成物を作成するのに用いることが
できる。化合物は、例えば、経口、肺、非経口（筋肉内、腹腔内、静脈内（ＩＶ
）または皮下注射）、吸入（精製粉末製剤による）、経皮、鼻腔、経膣、直腸、
または舌下投与経路で投与することができ、投与の各経路に適した投与形態に製
剤化することができる（例えば、国際特許出願第WO 93/25221およびWO 94/17784
;およびヨーロッパ特許出願第613,683号)を参照されたい）。
【０２７９】 ＭＴＳＰタンパク質に結合するペプチドおよびペプチドミメティクスは、ＭＴ
ＳＰタンパク質の産生に影響を与えると考えられる、およびそれにより影響をう
けると考えられる多くの因子の評価を含む、ＭＴＳＰタンパク質の生物学的役割
を理解するためのユニークな手段として、インビトロで有用である。そのような
ペプチドおよびペプチドミメティクスは、ＭＴＳＰタンパク質に結合する、およ
びその活性を調節する他の化合物の開発にも有用である。これは、このような化
合物が、そのような開発を促進する、構造と活性の間の関連性に関する重要な情
報を提供するからである。
【０２８０】 ペプチドおよびペプチドミメティクスは、新規なＭＴＳＰタンパク質またはＭ
ＴＳＰタンパク質アゴニストをスクリーニングするアッセイにおける競合的な結
合物質としても有用である。そのようなアッセイ具体例において、化合物は変更
されることなく用いられることができ、または、例えば検出可能なシグナルを直
接または間接的に提供する部分を共有結合または非共有結合で結合させるなど、
標識することにより、種々の方法で変更されることができる。これらのアッセイ
のいずれにおいても、それに対する物質は、直接または間接的いずれにても標識
されることができる。直接標識の可能性のあるものには、ぺルオキシダーゼおよ
びアルカリホスファターゼのような１２５Ｉ酵素（米国特許第３,６４５,０９０
）などの放射能標識、および蛍光強度、波長シフト、または蛍光偏光の変化をモ
ニターすることができる蛍光標識（米国特許第３,９４０,４７５）が含まれる。
直接標識が可能なものには、１の較正成分をビオチン化した後、前記標識群の一
つと結合させたアビジンに結合させることが含まれる。化合物を固体担持体に結
合させる場合、化合物にはスペーサーやリンカーも含まれる。
【０２８１】 さらに、ＭＴＳＰタンパク質に結合するその能力に基づき、ペプチドおよびペ
プチドミメティクスを生きている細胞、固定細胞、生物学的流体物、組織ホモジ
ェネート、精製された天然生物物質などの中のＭＴＳＰタンパク質を検出するた
めの試薬として用いることができる。例えば、そのようなペプチドおよびペプチ
ドミメティクスを標識することにより、ＭＴＳＰタンパク質を有する細胞を同定
することができる。加えて、ＭＴＳＰタンパク質に結合するその能力に基づき、
ペプチドおよびペプチドミメティクスはインサイチュ染色、ＦＡＣＳ（蛍光活性
化細胞分類）、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡなどに用いることができ
る。加えて、ＭＴＳＰタンパク質に結合するその能力に基づき、ペプチドおよび
ペプチドミメティクスはＭＴＳＰタンパク質ポリペプチドの精製に、またはＭＴ
ＳＰタンパク質ポリペプチド、例えばＭＴＳＰタンパク質のプロテアーゼドメイ
ンをコードしているポリペプチドを発現している細胞を精製するのに用いること
ができる。 ペプチドおよびペプチドミメティクスは、種々の医学研究および診断的使用の
ための市販の試薬として用いることもできる。 ペプチドおよびペプチドミメティクスの活性は、引用として本明細書に組み込
まれるMcDonald (1992) Am. J. of Pediatric Hematology/Oncology, 14:8-21に
記載される多くのモデルの一つにて、インビトロまたはインビボいずれかで評価
されることができる。
【０２８２】 ３．ペプチドおよびペプチドミメティクス治療 ＭＴＳＰタンパク質またはＭＴＳＰタンパク質のプロテアーゼドメインに結合
することができる、およびその活性を調節することができる、またはＭＴＳＰタ
ンパク質活性を有するペプチドおよびペプチドミメティクスを、腫瘍疾患の治療
のために用いることができる。ペプチドおよびペプチドミメティクスをインビボ
またはエキソビボで、治療を必要としている対象の細胞に送達してよい。さらに
、ＭＴＳＰタンパク質活性を有するペプチドは、インビボまたはエキソビボで、
ＭＴＳＰタンパク質遺伝子をコードしている変異体またはミッシング(missing)
対立遺伝子を有する細胞に送達されることができる。本明細書に記載されるまた
は当業者に公知の方法を、他のヒトタンパク質を実質上含まないそのようなペプ
チドおよびペプチドミメティクスの調製およびインビボまたはエキソビボ送達の
ために用いることができる。例えば、ペプチドは、微生物中での発現またはイン
ビトロでの合成により、容易に合成されることができる。
【０２８３】 ペプチドまたはペプチドミメティクスは、インビボまたはエキソビボで、例え
ばマイクロインジェクションにより、またはリポソームの使用により細胞に導入
されることができる。別法として、ペプチドまたはペプチドミメティクスはイン
ビボまたはエキソビボで能動的に、または拡散により取りこまれることができる
。加えて、ペプチドまたはペプチドミメティクスの細胞外での適用が、腫瘍疾患
の有効な処置に十分であり得る。１）ＭＴＳＰタンパク質またはそのプロテアー
ゼドメインに結合する、または２）ＭＴＳＰタンパク質またはそのプロテアーゼ
ドメインと同じ機能または活性を有する薬物または有機化合物などの他の分子が
治療法に用いられてよい。
【０２８４】 ４．合理的薬物設計 合理的薬物設計の目的は、目的の生物学的に活性なポリペプチドまたはペプチ
ド、またはそれらが相互作用する小分子またはペプチドミメティクス（例えば、
アゴニスト、アンタゴニスト、阻害物質）の構造類似体を、例えばより活性のあ
るまたは安定な形態の薬物、または例えばインビボでポリペプチド（例えばＭＴ
ＳＰタンパク質）の機能を高めるまたは妨害する薬物を作成するために製造する
ことである。一手段では、まず目的のタンパク質（例えばＭＴＳＰタンパク質ま
たはプロテアーゼドメインを有するポリペプチド）、または例えばＭＴＳＰタン
パク質リガンド複合体の三次元構造を、Ｘ線結晶構造解析により、コンピュータ
ーモデル化、または最も典型的には、手段を組み合わせたものにより決定する（
例えば、Erickson et al. 1990を参照されたい）。また、ポリペプチドの構造に
関して有用な情報は、相同タンパク質の構造に基づくモデル化により得られてよ
い。加えて、ペプチドは、アラニンスキャンで分析することができる。この方法
では、アミノ酸残基はＡｌａにより置換され、ペプチドの活性におけるその効果
が決定される。ペプチドのアミノ酸残基のそれぞれをこの方法で分析して、ペプ
チドの重要な領域が決定される。
【０２８５】 さらに、ＭＴＳＰタンパク質、または好ましくはＭＴＳＰタンパク質のプロテ
アーゼドメインに結合するポリペプチドまたはペプチドは、機能アッセイにより
選択されることができ、次いで、このポリペプチドまたはペプチドの結晶構造を
決定することができる。ポリペプチドは、例えば、ＭＴＳＰタンパク質またはＭ
ＴＳＰタンパク質のプロテアーゼドメインに特異的な抗体であり得る。この手段
により、その後の薬物設計の基礎とすることができる薬核を得ることができる。
さらに、ＭＴＳＰタンパク質またはＭＴＳＰタンパク質のプロテアーゼドメイン
に結合する機能的な、薬理学的に活性なポリペプチドまたはペプチドに対する抗
イディオタイプポリペプチドまたはペプチド、（抗−ｉｄｓ）を作成することに
より、結晶構造解析を全く回避することができる。鏡像の鏡像として、抗−ｉｄ
ｓの結合部位は、本来の標的分子、例えばＭＴＳＰタンパク質またはＭＴＳＰタ
ンパク質を有するポリペプチドの類似体であることが期待される。抗−ｉｄを次
いで用いて、化学的または生物学的に生成されたペプチドバンクのバンクからペ
プチドを同定および単離することができた。選択されたペプチドは次いで薬核と
して作用する。
【０２８６】 このように、例えば活性または安定性が改善された薬物、またはＭＴＳＰタン
パク質の活性のモジュレーター（例えば、阻害物質、アゴニスト、アンタゴニス
トなど）として作用する、および本発明の方法、特に腫瘍疾患の診断、治療、予
防およびスクリーニングに関する方法に有用な薬物を設計することができる。ク
ローン化されたＭＴＳＰタンパク質配列を利用して、Ｘ線結晶解析などのそのよ
うな分析試験行うのに十分な量のＭＴＳＰタンパク質ポリペプチドが作成されて
よい。加えて、ＭＴＳＰタンパク質またはそのプロテアーゼドメイン、例えば配
列番号２のアミノ酸配列によりコードされるプロテアーゼドメインのアミノ酸配
列に関する知識により、Ｘ線結晶解析に代えて、またはそれに加えてコンピュー
ターモデル法において指標となるものが提供される。
【０２８７】 ＭＴＳＰタンパク質に結合するペプチドおよびペプチドミメティクスを同定する
方法 本明細書中に提供されるＭＴＳＰタンパク質ポリペプチドに対して結合親和力
を有するペプチド（例えばＭＴＳＰタンパク質またはＭＴＳＰタンパク質のプロ
テアーゼドメインを有するポリペプチド）は、例えば、親和性濃縮法と組み合わ
されたランダムペプチド多様性発生システムにより容易に同定されることができ
る。詳細には、ランダムペプチド多様性発生システムには、「プラスミド上ペプ
チド」システム（例えば、Ｕ.Ｓ.特許第５,２７０,１７０および５,３３８,６６
５を参照されたい）；「ファージ上ペプチド」システム（例えば、Ｕ．Ｓ．特許
第６,１２１,２３８およびCwirla,et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.
A. 87:6378-6382を参照されたい）；「ポリソームシステム」；「コードされた
合成ライブラリー（ＥＳＬ）」システム；および「巨大スケールの固定化された
ポリマー合成」システム（Ｕ．Ｓ．特許第６,１２１,２３８、およびDower et a
l. (1991) Ann. Rep. Med. Chem. 26:271-280を参照されたい）が含まれる。
【０２８８】 例えば、前記の方法を用いて、規定された数のアミノ酸残基長（例えば、１２
）を有するランダムペプチドを一般に設計することができる。ランダムペプチド
をコードしているオリゴヌクレオチドのコレクションを作成するために、Ｎがヌ
クレオチドＡ、Ｃ、ＧまたはＴ（等モル；用いられる方法により、他のヌクレオ
チドを用いることができる）、ＫがＧまたはＴ（等モル）、およびｘがペプチド
中のアミノ酸の数に対応する整数（例えば１２）であるコドンモチーフ（ＮＮＫ
）ｘを用いて、ＮＮＫモチーフから生じる３２の可能なコドンのいずれか一つを
特定することができる；１２のアミノ酸のそれぞれに関しては１、５のアミノ酸
のそれぞれに関しては２、３アミノ酸のそれぞれに関しては３、および３つのス
トップコドンの一つのみがコードされる。つまり、ＮＮＫモチーフはアミノ酸の
全てをコードし、１のストップコドンのみをコードし、コドンバイアスが減る。
【０２８９】 ランダムペプチドは例えば、ファージｆｄ誘導体のｐＩＩＩまたはｐＶＩＩＩ
コートタンパク質いずれかを含む融合タンパク質の部分として（ファージ上ペプ
チド）、またはプラスミドに結合したＬａｃＩペプチド融合タンパク質との融合
タンパク質として（プラスミド上ペプチド）、ファージ粒子の表面上に提示され
ることができる。ペプチドをコードしているＤＮＡを含むファージまたはプラス
ミドは、プロテアーゼドメインを有する固定化されたＭＴＳＰタンパク質ポリペ
プチドを用いる親和性濃縮法により同定および単離されることができる。「パニ
ング」と時に呼ばれる親和性濃縮法は、典型的に、ファージ、プラスミド、また
はポリソームを固定されたＭＴＳＰタンパク質ポリペプチドと共にインキュベー
トし、ＭＴＳＰタンパク質ポリペプチドに結合するファージ、プラスミドまたは
ポリソームを（付随するＤＮＡまたはｍＲＮＡと共に）収集し、次いで収集され
たファージまたはプラスミドの多くを（付随するＬａｃＩ−ペプチド融合タンパ
ク質と共に）製造することから成る複合的な経路が関与する。
【０２９０】 ペプチドおよびペプチドミメティクスの特性 典型的には、好ましいペプチドおよびペプチドミメティクスの分子量は、約２
５０から約８,０００ダルトンである。ペプチドが（例えば化合物の親和性およ
び／または活性を増すために）オリゴマー化され、ダイマー化され、および／ま
たは親水性ポリマーを用いて誘導される場合、そのようなペプチドの分子量は、
実質上もっと大きい可能性があり、約５００から約１２０,０００ダルトン、よ
り好ましくは約８,０００から約８０,０００ダルトンいずれかの範囲であり得る
。そのようなペプチドは９またはそれ以上のアミノ酸から構成され得、ここでア
ミノ酸は天然に生じるアミノ酸か、または合成（天然に生じない）アミノ酸であ
る。当該分野の専門家には、治療および／または診断上の目的に適したペプチド
およびペプチドミメティクスの親和性および分子量の決定法が分かるであろう（
例えば、Dower et al., U.S. Patent No. 6,121,238を参照されたい）。
【０２９１】 ペプチドは、種々の親水性ポリマーの１またはそれ以上に共有結合されてよい
。適当な親水性ポリマーには、制限されるものではないが、ポリエチレングリコ
ールおよびポリプロピレングリコールにより例示されるポリアルキルエーテル、
ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリオキシアルケン、ポリビニルアルコール、ポ
リビニルピロリドン、セルロースおよびセルロース誘導体、デキストランおよび
デキストラン誘導体などが含まれる。ペプチド化合物がそのようなポリマーを用
いて誘導される場合、その溶解度および循環半減期は、結合活性の低下はわずか
にして増すことができる。ペプチド化合物はダイマー化されてよく、ダイマーサ
ブユニットのそれぞれは、親水性ポリマーに共有結合されることができる。ペプ
チド化合物はＰＥＧ化(PEGylate)される、すなわち、ポリエチレングリコール（
ＰＥＧ）に共有結合されることができる。
【０２９２】 ペプチド類似体は一般に、テンプレートのペプチドの特性に類似する特性を有
する非ペプチド薬物として、製薬業において用いられる。これらのタイプの非ペ
プチド化合物は、「ペプチドミメティクス」または「ペプチドミメティクス」と
呼ばれる（Luthman et al., A Textbook of Drug Design and Development, 14:
386-406, 2nd Ed., Harwood Academic Publishers (1996); Joachim Grante (19
94) Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 33:1699-1720; Fauchere (1986) J. Adv. D
rug Res., 15:29; Veber and Freidinger (1985) TINS, p. 392; and Evans et
al. (1987) J. Med. Chem. 30:1229）。治療上有用なペプチドに構造上類似する
ペプチドミメティクスを用いて、等価な、または高められた治療または予防効果
を得ることができる。ペプチドミメティクスおよびその構造の調製は、当該分野
の専門家には公知である。
【０２９３】 同じタイプのＤ−アミノ酸と、コンセンサス配列の１またはそれ以上のアミノ
酸を系統的に置換して（例えばＬ−リジンの代わりにＤ−リジン）、より安定な
ペプチドが作成されてよい。加えて、コンセンサス配列または実質上同一のコン
センサス配列変種を含む制約付き(constrained)ペプチドは、当該分野で公知の
方法（Rizo et al. (1992) Ann. Rev. Biochem., 61:387）、例えばペプチドを
環化する分子内ジスルフィド結合を形成することができる内部システイン残基を
添加することにより作成されることができる。
【０２９４】 当該分野の専門家には、ペプチドの生物学的活性または機能的活性に有害な影
響を与えることなく、ペプチドおよびペプチドミメティクスに変更がなされてよ
いことが分かるであろう。さらに、当業者には、標的分子、例えばＭＴＳＰタン
パク質、または好ましくはＭＴＳＰタンパク質のプロテアーゼドメインに結合す
るペプチドを擬態する、３次元の非ペプチド構造を設計する方法が分かるであろ
う（例えば、Eck and Sprang (1989) J. Biol. Chem., 26: 17605-18795)を参
照されたい）。
【０２９５】 診断上の目的に用いる場合、ペプチドおよびペプチドミメティクスは検出可能
な標識で標識されてよく、従って、そのような標識を有さないペプチドおよびペ
プチドミメティクスは、標識されたペプチドおよびペプチドミメティクスの調製
における中間体として役立てることができる。検出可能な標識は、ペプチドおよ
びペプチドミメティクスに共有結合された場合に、インビボで、例えばペプチド
またはペプチドミメティクスが投与された対象において、またはインビトロで、
例えばサンプルまたは細胞中で、ペプチドおよびペプチドミメティクスの検出を
可能とする分子または化合物であり得る。適当な検出可能な標識は当業者に周知
であり、例としては、ラジオアイソトープ、蛍光標識（例えばフルオレセイン）
などが含まれる。用いられる特定の検出可能な標識は重要ではなく、用いられる
標識の量ならびに用いられる標識量での標識の毒性に関して選択される。そのよ
うな要因に関して標識の選択は、十分当該分野の技術範囲内にある。
【０２９６】 ペプチドまたはペプチドミメティクスに対する検出可能な標識の共有結合は、
当該分野で周知の常套法により行われる。例えば、１２５Ｉラジオアイソトープ
が検出可能な標識として用いられる場合、１２５Ｉのペプチドまたはペプチドミ
メティクスへの共有結合は、アミノ酸チロシンをペプチドまたはペプチドミメテ
ィクスに組込み、次いでそのペプチドをヨード化することにより達成されること
ができる（例えば、Weaner et al. (1994) Synthesis and Applications of Iso
topically Labelled Compounds, pp. 137-140を参照されたい）。チロシンがペ
プチドまたはペプチドミメティクスに存在しない場合、ペプチドまたはペプチド
ミメティクスのＮ末端またはＣ末端へのチロシンの組込みは、周知の化学法によ
り達成することができる。同様に、３２Ｐは、例えばペプチドまたはペプチドミ
メティクス上のヒドロキシル基を通じてリン酸基として、常套化学法を用いてペ
プチドまたはペプチドミメティクスに組み込まれることができる。
【０２９７】 ペプチドミメティクスの標識化には通常、１またはそれ以上の標識の、直接的
、またはスペーサー（例えばアミド基）を介した、定量構造活性データおよび／
または分子モデル化により予測されるペプチドミメティクス上の障害のない位置
への共有結合が関与する。そのような、障害のない位置は一般に、ペプチドミメ
ティクスが結合して治療効果を生む巨大分子と直接的な接触を形成しない位置で
ある。ペプチドミメティクスの誘導（例えば標識化）は、ペプチドミメティクス
の所望の生物学的または薬理学的活性を実質上妨害しないものであるべきである
。
【０２９８】 ６．ペプチドおよびペプチドミメティクスの調製法 ＭＴＳＰタンパク質に結合するペプチドは、当該分野で公知の常套法により、
例えば通常の固相法を用いることにより調製されることができる。常套法には、
排除固相合成、部分固相合成法、フラグメント濃縮、常套の溶液合成が含まれ、
組換えＤＮＡ技術によるものも含まれる（例えば、Merrifield (1963) J. Am. C
hem. Soc., 85:2149, incorporated herein by referenceを参照されたい）。
【０２９９】 「コードされた合成ライブラリー」または「巨大規模の固定化されたポリマー
合成」システム（例えば、Ｕ．Ｓ．特許第５,９２９,５２５および５,９０２,７
２３を参照されたい）を用いて、目的の活性を有するペプチドの最小のサイズを
決定することができるのみならず、好ましいモチーフ（またはそのモチーフの最
小のサイズ）と、１、２またはそれ以上の残基が異なるペプチドのグループを形
成するペプチドの全てを作成することもできる。ペプチドのこのコレクションを
、次いで標的分子、たとえばＭＴＳＰタンパク質または好ましくはＭＴＳＰタン
パク質のプロテアーゼドメインに結合する能力に関してスクリーニングすること
ができる。この固定化されたポリマー合成システムまたは他のペプチド合成法を
用いて、ペプチド化合物の先端が切断された類似体および欠失された類似体およ
び先端切断と欠失が組み合わさった類似体を合成することもできる。
【０３００】 これらの方法を用いて、２０の天然の、遺伝的にコードされるアミノ酸以外の
アミノ酸が、ペプチドの１、２またはそれ以上の位置で置換されているペプチド
を合成することもできる。例えば、ナフチルアラニンを、トリプトファンに置換
して、合成を促進することができる。ペプチド中で置換されることができる他の
合成アミノ酸には、Ｌ−ヒドロキシプロピル、Ｌ−３,４−ジヒドロキシ−フェ
ニルアラニル、Ｌ−ｄ−ヒドロキシリジルおよびＤ−ｄ−メチルアラニルなどの
ｄアミノ酸、Ｌ−α−メチルアラニル、βアミノ酸、およびイシキノリルなどの
が含まれる。Ｄアミノ酸および非天然の合成アミノ酸をペプチドに組み込むこと
もできる（例えば、Roberts et al. (1983) Unusual Amino/Acids in Peptide S
ynthesis, 5(6):341-449を参照されたい）。
【０３０１】 ペプチドは、リン酸化（例えば、W. Bannwarth et al. (1996) Biorganic and
Medicinal Chemistry Letters, 6(17):2141-2146を参照されたい）、およびペ
プチド誘導体を作成するための他の方法（例えば、Hruby et al. (1990) Bioche
m. J., 268(2):249-262を参照されたい）により変更されてもよい。つまり、ペ
プチド化合物は、同様の生物活性を持つペプチドミメティクスを調製するための
基礎としても役立つ。 当業者には、対応するペプチド化合物と同一または類似の、所望の生物活性を
持つが、溶解性、安定性、および加水分解およびタンパク質分解の受けやすさに
関して該ペプチドよりも好ましい活性を有するペプチドミメティクスを構築する
ために、種々の方法が利用できることが分かる（例えば、Morgan et al. (1989)
Ann. Rep. Med. Chem., 24:243-252を参照されたい）。Ｎ−末端アミノ基、Ｃ
−末端カルボキシル基で変更されたペプチドミメティクスを調製するための、お
よび／またはペプチド中のアミド結合の１またはそれ以上を非−アミド結合に変
えるための方法が当該分野の専門家に公知である。
【０３０２】 アミノ末端の変更には、アルキル化、アセチル化、カルボベンゾイル基の付加
、スクシンイミド基の形成などが含まれる（例えば、Murray et al. (1995) Bur
ger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery, 5th ed., Vol. 1, Manfred E
. Wolf, ed., John Wiley and Sons, Inc.を参照されたい）。Ｃ末端の変更には
、Ｃ末端カルボキシル基がエステル、アミド、または変更により置きかえられて
環状ペプチドを形成するミメティクスが含まれる。 Ｎ−末端およびＣ−末端の変更に加えて、ペプチドミメティクスを含むペプチ
ド化合物は、好都合には、１またはそれ以上の種々の親水性ポリマーを用いて変
更され、またはそれらと共有結合されることができる。ペプチド化合物が親水性
ポリマーを用いて誘導される場合、結合能力の低下はわずかにして、その溶解性
および循環半減期が増すことができ、その免疫原性は遮断される。適当な非タン
パク質性ポリマーには、制限されるものではないが、ポリエチレングリコールお
よびポリプロピレングリコールにより例示されるポリアルキルエーテル、ポリア
クティック酸、ポリグリコール酸、ポリオキシアルケン、ポリビニルアルコール
、ポリビニルピロリドン、セルロースおよびセルロース誘導体、デキストランお
よびデキストラン誘導体などが含まれる。一般にそのような親水性ポリマーは、
約５００から約１００,０００ダルトン、より好ましくは約２,０００から約４０
,０００ダルトン、およびよりいっそう好ましくは約５,０００から約２０,００
０ダルトンの範囲の平均分子量を有する。親水性ポリマーは、約５,０００ダル
トン、１０,０００ダルトンおよび２０,０００ダルトンの平均分子量を有するこ
ともできる。
【０３０３】 ペプチド化合物を誘導するための、またはペプチドをそのようなポリマーに結
合させるための方法が記載されている（例えば、Zallipsky (1995) Bioconjugat
e Chem., 6:150-165; Monfardini et al. (1995) Bioconjugate Chem., 6:62-69
; U.S. Pat. No. 4,640,835; U.S. Pat. No. 4,496,689; U.S. Pat. No. 4,301,
144; U.S. Pat. No. 4,670,417; U.S. Pat. No. 4,791,192; U.S. Pat. No. 4,1
79,337 and WO 95/34326,これら全ては、本明細書中、その全体が引用により組
み込まれる、を参照されたい）。
【０３０４】 ペプチド誘導体を作成するための他の方法は、例えば引用により本明細書中に
組み込まれるHruby et al. (1990), Biochem J., 268(2):249-262に記載されて
いる。つまり、ペプチド化合物は同様の生物学的活性を持つ非ペプチド性化合物
の構造モデルとしても役立つ。当業者には、特定のペプチド化合物と同一または
類似する所望の生物活性を有するが、溶解性、安定性および、加水分解およびタ
ンパク質分解の受けやすさに関してはより好ましい活性を持つ化合物を構築する
のに種々の方法が利用できることが分かる（例えば、本明細書中に引用により組
み込まれるMorgan et al. (1989) Ann. Rep. Med. Chem., 24:243-252を参照さ
れたい）。これらの技術には、ペプチド骨格を、ホスホネート、アミデート、カ
ルバメート、スルホアミド、第二アミンおよびＮ−メチルアミノ酸からなる骨格
で置きかえることが含まれる。
【０３０５】 ペプチド化合物は、システインのチオール基間の分子内ジスルフィド結合で環
状化された形態で存在してよい。別法として、システインのチオール基間の分子
内ジスルフィド結合を用いて二量体（または高重合体）化合物を得ることができ
る。１またはそれ以上のシステイン残基は、ホモシステインで置換されてもよい
。
【０３０６】 Ｉ．結合物 ａ）ＭＴＳＰタンパク質の一本鎖プロテアーゼドメイン（またはそのタンパク
質活性部分）、またはＭＴＳＰ３、ＭＴＳＰ４またはＭＴＳＰ６全長酵素前駆体
、その活性化形態、またはその二本鎖もしくは一本鎖プロテアーゼドメイン、お
よびｂ）ＭＴＳＰタンパク質に直接またはリンカーを介して結合する標的剤であ
って、ｉ）結合物のアフィニティ分離または精製；ｉｉ）表面への結合物の結合
；ｉｉｉ）結合物の検出；またはｉｖ）選択された組織または細胞への標的化さ
れた送達を助長する標的剤を含む結合物が、本明細書中に提供される。結合物は
、化学結合物またはその融合タンパク質混合物であり得る。
【０３０７】 標的剤は、好ましくはタンパク質またはペプチドフラグメント、例えば組織特
異的または腫瘍特異的モノクローナル抗体または増殖因子、または直接またはリ
ンカーを介してＭＴＳＰタンパク質またはそのプロテアーゼドメインに結合する
そのフラグメントなどである。標的剤は、タンパク質結合配列、核酸結合配列、
脂質結合配列、多糖類結合配列、または金属結合配列、または固体担持体への結
合のためのリンカーを含むタンパク質またはペプチドフラグメントであってもよ
い。特定の具体例では、結合物にはａ）本明細書に記載されるようなＭＴＳＰま
たはその部分；およびｂ）ＭＴＳＰタンパク質に直接、またはリンカーを介して
結合する標的剤が含まれる。
【０３０８】 ＭＴＳＰタンパク質ドメインのアフィニティ分離または精製、ＭＴＳＰタンパ
ク質ドメインの表面への結合、またはＭＴＳＰタンパク質ドメインの検出を促進
するべく機能するタンパク質またはペプチドフラグメント（またはその複数）と
のＭＴＳＰタンパク質の融合タンパク質および化学結合物などの結合物が提供さ
れる。結合物は、化学結合、例えばチオール結合などにより作成されることがで
きるが、好ましくは融合タンパク質のように組換え法により作成される。融合タ
ンパク質では、ペプチドまたはそのフラグメントはＭＴＳＰタンパク質ドメイン
のＮ−末端かＣ−末端いずれかに結合する。化学結合では、ペプチドまたはその
フラグメントは、結合が達成され得るあらゆる場所で結合されてよく、そして、
単一のＭＴＳＰタンパク質ドメインまたは複数のＭＴＳＰタンパク質ドメインに
結合された多数のそのようなペプチドまたはフラグメントが存在してよい。
【０３０９】 標的剤は、好ましくは細胞または組織へのインビトロ送達のために好ましく、
細胞または組織特異的抗体、増殖因子および特定細胞で発現される他の因子など
の薬剤、および結合されたタンパク質の方向性をもった送達を促進する、他の細
胞または組織特異的薬剤が含まれる。 もっとも好ましくは、標的剤により、細胞表面タンパク質との相互作用、およ
び結合物またはそのＭＴＳＰタンパク質部分の内部移行により、選択された細胞
にＭＴＳＰタンパク質が特異的に送達される。これらの結合物は種々の方法で用
いられ、特に、特定のＭＴＳＰタンパク質により分解された場合に細胞毒性であ
るプロドラッグなどのプロドラッグを活性化する方法に用いるのに特に適してい
る。プロドラッグは、結合物の前、同時、またはその後、投与される。標的細胞
へ送達されると、プロテアーゼがプロドラッグを活性化し、これが次いで、細胞
毒効果などの治療効果を示す。
【０３１０】 １．結合 結合されるＭＴＳＰタンパク質ドメインとの結合物は、化学結合、組換えＤＮ
Ａ技術、または組換え発現および化学結合の組み合わせのいずれによっても調製
されることができる。ＭＴＳＰタンパク質ドメインと標的剤は、いずれの配向で
結合されてもよく、１以上の標的剤および／またはＭＴＳＰタンパク質ドメイン
が結合物中に存在してよい。 ａ．融合タンパク質 融合タンパク質が、本明細書中に提供される。融合タンパク質は、ａ）ＭＴＳ
Ｐタンパク質の１または複数のドメインおよびｂ）標的剤を含む。融合タンパク
質は、好ましくは融合タンパク質をコードする核酸の組換え発現により作成され
る。 ｂ．化学結合 本明細書中の化学結合を達成するために、ＭＴＳＰタンパク質ドメインは、１
またはそれ以上の選択されたリンカーを介して、または直接、標的剤に結合され
る。化学結合は、標的剤がペプチドまたはタンパク質以外のもの、例えば核酸ま
たは非ペプチド薬物である場合に用いられなければならない。化学結合している
選択された部分に関して、当業者に公知のあらゆる方法を用いてよい。
【０３１１】 ２．リンカー ２つの目的のためのリンカーが、本明細書中に意図される。結合物には、ＭＴ
ＳＰタンパク質部分と標的剤の間に１またはそれ以上のリンカーが含まれる。さ
らに、リンカーは、高処理量固相スクリーニングプロトコルなどのために、固体
担持体、例えばマイクロタイタープレート、シリコン、またはシリコンコートチ
ップ、ガラスまたはプラスチック担持体などの上へのＭＴＳＰタンパク質または
その部分の固定化を促進または高めるために用いられる。 結合物の調製のための、当該分野の専門家に公知のあらゆるリンカーを、本明
細書中に用いてよい。これらのリンカーは、典型的には、化学結合物の調製に用
いられ、ペプチドリンカーが融合タンパク質に組み込まれてもよい。
【０３１２】 リンカーは、ＭＴＳＰタンパク質のドメインおよび標的剤を結合させるのに適
したあらゆる部分であり得る。そのようなリンカーおよび結合には、制限される
ものではないが、典型的には１から約６０のアミノ酸、より一般的には約１０か
ら３０のアミノ酸を含むペプチド結合、アミノ酸とペプチドの結合、化学結合、
例えば制限されるものではないが、Ｎ−スクシニミジル（４−ヨードアセチル）
−アミノベンゾエート、スルホスクシニミジル（４−ヨードアセチル）−アミノ
ベンゾエート、４−スクシニミジル−オキシカルボニル−ａ−（２−ピリジルジ
チオ）トルエン、スルホスクシニミジル−６−[ａ−メチル−ａ−（ピリジルジ
チオール）−トルアミド]ヘキサノエート、Ｎ−スクシニミジル−３−（−２−
ピリジルジチオ）−プロプリオネート、スクシニミジル６[３（−（−２−ピリ
ジルジチオ）−プロピオンアミド]ヘキサノエート、スルホスクシニミジル６[３
（−（−２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド]ヘキサノエート、３−（２
−ピリジルジチオ）−プロピオニルヒドラジド、エルマンズ試薬、ジクロロトリ
アジン酸およびＳ−（２−チオピリジル）−Ｌ−システインを含む異種機能を持
つ切断可能な架橋結合などが含まれる。他のリンカーには、制限されるものでは
ないが、ＭＴＳＰタンパク質のドメインと標的剤の間の立体障害を減じるペプチ
ドおよびその他の部分、細胞内酵素基質、結合物の柔軟性を増すリンカー、結合
物の溶解性を増すリンカー、結合物の血清安定性を増すリンカー、光で分解され
るリンカー、および酸で分解されるリンカーが含まれる。
【０３１３】 化学結合される結合物に適した他の典型的なリンカーおよび結合には、制限さ
れるものではないが、ジスルフィド結合、チオエーテル結合、妨害されたジスル
フィド結合、および遊離反応基、例えばアミンおよびチオール基などの間の共有
結合が含まれる。これらの結合は、異種二機能性試薬を用いてポリペプチドの一
または両方に反応性のチオール基を作成し、次いで１のポリペプチド上のチオー
ル基を他方の、反応性マレイミド基またはチオール基が互いに結合され得る反応
性チオール基またはアミン基と反応させて作成される。他のリンカーには、ビス
マレイミデオトキシプロパンなどの分解可能なリンカー、より酸性の高い細胞内
成分で分解される酸に不安定なトランスフェリン結合物およびアジピン酸ジヒド
ラジド、ＵＶまたは可視光線に曝されると分解する架橋結合、およびＣＨ１、Ｃ Ｈ ２およびＣＨ３などの、ヒトＩｇＧ１の不変領域由来の種々のドメインなどの
リンカー（Batra et al. Molecular Immunol., 30:379-386 (1993)を参照された
い）が含まれる。いくらかの具体例では、各リンカーの所望の特性の利点を得る
ために、いくつかのリンカーが含まれてよい。
【０３１４】 化学リンカーおよびペプチドリンカーは、ＭＴＳＰタンパク質のドメインに対
するリンカーと標的剤を共有結合させることにより挿入されてよい。以下に記載
の異種二機能性の薬剤を用いてそのような共有結合を達成してもよい。ペプチド
リンカーは、リンカーおよびＴＡ、リンカーおよび標的剤、またはリンカー、標
的剤およびＴＡを融合タンパク質としてコードしているＤＮＡを発現することに
より結合されてよい。結合物の溶解性を増す柔軟なリンカーが、単独または他の
リンカーと共に、本明細書に企図される。
【０３１５】 ａ）酸で分解される、光で分解される、および熱に感受性のあるリンカー 酸で分解されるリンカー、光で分解されるリンカー、および熱に感受性のある
リンカーも用いられてよく、ここで特に、より反応に利用しやすくするために、
ＭＴＳＰタンパク質のドメインを切断することが必要である可能性がある。酸で
分解されるリンカーには、制限されるものではないが、ビスマエイミデオチオキ
シプロパンおよびアジピン酸ジヒドラジドリンカー（例えば、Fattom et al. (1
992) Infection & Immun. 60:584-589を参照されたい）、および細胞内トランス
フェリン循環経路に入ることを可能とするのに十分なトランスフェリンの部分を
含む、酸に不安定なトランスフェリン結合物（例えば、Welh ner et al. (1991)
J. Biol. Chem. 266:4309-4314を参照されたい）が含まれる。
【０３１６】 光で分解されるリンカーは、光に曝されると分解し（例えば、リンカーを引用
により本明細書中に組み込むGoldmacher et al. (1992) Bioconj. Chem. 3:104-
107を参照されたい）、それにより光に曝されたときに標的剤を放出するリンカ
ーである。光に曝されたときに分解する光により分解されるリンカーは公知であ
る（例えば、システインに関する光分解可能な保護基としてのニトロベンジル基
の使用を記載するHazum et al. (1981) in Pept., Proc. Eur. Pept. Symp., 16
th, Brunfeldt, K (Ed), pp. 105-110；ヒドロキシプロピルメタクリルアミド
コポリマー、グリシンコポリマー、フルオレセインコポリマーおよびメチルロー
ダミンコポリマーを含む水溶性光分解可能コポリマーを記載するYen et al. (19
89) Makromol. Chem 190:69-82；近ＵＶ光（３５０ｎｍ）に曝されると光分解崩
壊を被る架橋結合と試薬を記載するGoldmacher et al. (1992) Bioconj. Chem.
3:104-107；光分解可能な結合を生成するニトロベンジルオキシカルボニルクロ
ライド架橋結合試薬を記載するSenter et al. (1985) Photochem. Photobiol 42
:231-237を参照されたい）。そのようなリンカーは、光に曝されることのできる
皮膚または眼の症状を光ファイバーを用いて治療するのに特に用いられる。結合
物を投与後、眼または皮膚または体の他の部分は光に曝すことができ、その結果
、結合物から標的された部分が放出される。そのような光分解可能なリンカーは
診断プロトコルと合わせて用いられ、ここで、標的剤を除去して動物の体から迅
速に除去されることが望ましい。
【０３１７】 ｂ）化学結合のための他のリンカー 他のリンカーには、トリチルリンカー、特に、種々の程度の酸性またはアルカ
リ性で治療薬を放出し得る結合物類を作成するための誘導されたトリチル基が含
まれる。こうして提供される治療剤が放出されるｐＨ範囲を予め選択できること
による融通性により、治療剤の送達を必要とする組織間の公知の生理学的違いに
基づくリンカーが選択され得る（例えば、Ｕ．Ｓ．特許第５，６１２，４７４を
参照されたい）。例えば、腫瘍組織の酸性は、正常組織のものよりも低いと考え
られる。
【０３１８】 ｃ）ペプチドリンカー リンカー部分はペプチドであることができる。ペプチドリンカーは融合タンパ
ク質にて用いられることができ、また、化学結合結合物にて用いられることもで
きる。ペプチドは典型的には約２から約６０のアミノ酸残基、例えば約５から約
４０、または約１０から約３０のアミノ酸残基を有する。選択される長さは、リ
ンカーが含まれる使用などの要因に依存する。
【０３１９】 ペプチドリンカーは、標的剤がタンパク質である場合に好都合である。例えば
、リンカー部分は柔軟なスペーサーアミノ酸配列、例えば一本鎖抗体研究で知ら
れるものなどであり得る。そのような公知のリンカー部分の例には、制限される
ものではないが、（ＧｌｙｍＳｅｒ）ｎおよび（ＳｅｒｍＧｌｙ）ｎ、ここでｎ
は１から６、好ましくは１から４、よりこのましくは２から４、およびｍは１か
ら６、好ましくは１から４、より好ましくは２から４である、などのペプチド、
酵素分解性リンカーおよびその他などが含まれる。
【０３２０】 さらなる結合部分が、例えば、Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.
A. 85:5879-5883, 1988; Whitlow, M., et al., Protein Engineering 6:989-99
5, 1993; Newton et al., Biochemistry 35:545-553, 1996; A. J. Cumber et a
l., Bioconj. Chem. 3:397-401, 1992; Ladurner et al., J. Mol. Biol. 273:3
30-337, 1997; and U.S. Patent. No. 4,894,443に記載されている。いくつかの
具体例では、数個のリンカーが、各リンカーの所望の特性の利点を得るために含
められてよい。 ３．標的剤 結合物の検出、固定または精製を促進するあらゆる薬剤が、本明細書における
使用のために企図される。化学結合物に関して、そのような特性を有するあらゆ
る部分が企図される。融合タンパク質に関しては、標的剤は、タンパク質、ペプ
チド、または標的活性を作用させるのに十分なそのフラグメントである。好まし
い標的剤は、選択された細胞および組織にＭＴＳＰタンパク質またはその部分を
送達するものである。そのような薬剤には、腫瘍特異的モノクローナル抗体およ
びその部分、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ケモカインを含むサイトカ
インなどの増殖因子、および他のそのような薬剤が含まれる。
【０３２１】 ４．核酸、プラスミド、および細胞 融合タンパク質をコードしている単離核酸フラグメントが提供される。融合タ
ンパク質をコードする核酸フラグメントには、ａ）配列番号：１示すヌクレオチ
ド配列を有する核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされるＭＴＳＰタン
パク質のプロテアーゼドメインをコードしている核酸；およびｂ）ｉ）融合タン
パク質のアフィニティ分離または精製；ｉｉ）表面への融合タンパク質の結合；
またはｉｉｉ）融合タンパク質の検出を促進するタンパク質、ペプチドまたはそ
の有効なフラグメントをコードしている核酸が含まれる。好ましくは、核酸はＤ
ＮＡである。
【０３２２】 前記核酸フラグメントを含む、複製のためのプラスミドおよび発現のためのベ
クターも提供される。該プラスミドおよび該ベクターを含む細胞も提供される。
細胞は、制限されるものではないが、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞
、昆虫細胞および動物細胞を含むいずれかの適当な宿主であり得る。核酸、プラ
スミド、およびプラスミドを含む細胞は、本明細書に記載ものを含む当該分野で
公知の方法に従い調製されることができる。
【０３２３】 前記融合タンパク質を製造するための方法も提供される。典型的な方法には、
融合タンパク質をコードしているプラスミドを含む細胞すなわち、増殖細胞を、
融合タンパク質が細胞により発現される条件下で増殖させること、すなわち培養
すること、次いで発現された融合タンパク質を回収することからなるステップが
含まれる。組換えタンパク質を発現させる、および回収する方法は、当該分野で
周知であり（一般に、Current Protocols in Molecular Biology (1998) 16,
John Wiley & Sons, Inc.を参照されたい）、およびそのような方法は、発現さ
れた融合タンパク質を発現させるおよび回収するために用いることができる。好
ましくは、セクションＢに開示される組換え発現および回収法を用いることがで
きる。
【０３２４】 回収された融合タンパク質は、遠心分離、濾過、クロマトグラフィー、電気泳
動、免疫沈降などの当該分野で公知の方法により、またはそれらの組み合わせに
より単離または精製されることができる（一般には、Current Protocols in Mol
ecular Biology (1998) 10, John Wiley & Sons, Inc.を参照されたい）。好
ましくは、回収された融合タンパク質は、融合タンパク質のタンパク質またはペ
プチドフラグメントと親和性結合部分の間の親和性結合により単離または精製さ
れる。融合タンパク質の構築に関して前のセクションで論じられているように、
あらゆる親和性結合対が、融合タンパク質の単離または精製において構築され、
次いで用いられることができる。例えば、アフィニティ結合対は、タンパク質結
合配列／タンパク質、ＤＮＡ結合配列／ＤＮＡ配列、ＲＮＡ結合配列／ＲＮＡ配
列、脂質結合配列／脂質、多糖類結合配列／ポリサッカライド、または金属結合
配列／金属であり得る。
【０３２５】 ５．固定化および担持体またはそのための基質 標的剤が表面への結合のために設計される所定の具体例では、ＭＴＳＰタンパ
ク質はイオンまたは共有、非共有または他の化学相互作用などの結合により、担
持体またはマトリックス物質の表面に結合されることができる。固定化は、直接
またはリンカーを介して行われてよい。ＭＴＳＰタンパク質は、制限されるもの
ではないが、シリコンチップおよび前記および当業者に公知の他の担持体を含む
適当な担持体に固定されてよい。複数のＭＴＳＰタンパク質またはそのプロテア
ーゼドメインが、シリコンチップ、または高処理量プロトコルおよびフォーマッ
トに用いるための他のチップの表面上の結合物のアレイ（即ち、２またはそれ以
上のパターン）などの担持体に結合されてよい。
【０３２６】 ＭＴＳＰタンパク質のドメインは、表面に直接、または標的剤をそれに結合さ
せずにリンカーを介して結合されることができる。ここで、チップは、ＭＴＳＰ
タンパク質のドメインのアレイを含む。 本明細書に企図されるマトリックス物質または固体担持体は一般に、リガンド
および他の分子に対して固定するための当該分野の専門家に公知の不溶性物質で
あり、多くの化学合成および分離に用いられるものである。そのような担持体は
、例えばアフィニティクロマトグラフィー、生物活性物質の固定、タンパク質、
アミノ酸および他の有機分子を含む生物分子およびポリマーの化学合成中に用い
られる。担持体の調製および使用は、当該分野の専門家に周知であり、公知の多
くのそのような物質およびその調製が存在する。例えば、アガロースおよびセル
ロースなどの天然に生じる担持体物質は、そのそれぞれの源から単離されてよく
、公知のプロトコルに従い加工されてよく、そして合成物質は、公知のプロトコ
ルに従い調製されてよい。
【０３２７】 担持体は、典型的には固体、多孔性の、変形可能な、または硬質の溶解性物質
であり、制限されるものではないが、ビーズ、ペレット、ディスク、毛細管、中
が空洞のファイバー、針、固体ファイバー、ランダム形、薄膜および膜を含む、
所望の構造および結合構造を有する溶解性物質である。つまり、該部材はマトリ
ックス物質から作成されてよく、表面の全部または一部をコートする、または粒
子を浸透させることによるなどして、それと組み合わされてよい。
【０３２８】 典型的には、マトリックスが粒子の場合、粒子は少なくとも約１０−２０００
μＭであるが、選択される適用により、もっと小さいかもっと大きくてもよい。
マトリックスの選択は少なくとも部分的には、溶解性、官能基、機構的安定性、
表面領域膨張性、疎水性または親水性などのその物理的および化学的特性、およ
び企図される使用により決定される。
【０３２９】 所望の場合、担持体マトリックス物質は、適当な反応基を含むべく処理される
ことができる。いくらかの場合には、すでに反応部分を含んでいる担持体マトリ
ックス物質を市場入手してよい。反応基を含む担持体マトリックス物質は、分子
が結合されるマトリックス担持体として役立ち得る。アミノシラン結合、ヒドロ
キシル結合またはカルボキシシラン結合などの反応性表面部分を含む物質は、シ
ラン化反応などを含む、十分に確立されている表面化学法により作成されてよい
。これらの物質の例には、ガンマ−アミノ−プロピルシランに共有結合する表面
酸化シリコン部分および他の有機部分；Ｎ−[３−（トリエチオキシシリル）プ
ロピル]フテラミックアシッド；およびビス−（２−ヒドロキシエチル）アミノ
プロピルトリエトキシシランを有するものがある。アミノ基反応性官能基を含む
利用しやすい物質の例としては、制限されるものではないが、パラ−アミノフェ
ニルトリエトキシシランが含まれる。また、誘導性ポリスチレンおよび他のその
ようなポリマーが周知であり、当業者に容易に入手される（例えば、テンタゲル
(Tentagel）(登録商標)樹脂が、多数の官能基途ともに利用でき、Rapp Polymere
, Tubingen, Germanyにより販売されている。; U.S.特許第4,908,405およびU.S.
特許第5,292,814を参照されたい。;さらに、Butz et al., Peptide Res., 7:20-
23 (1994); およびKleine et al., Immunobiol., 190:53-66 (1994)も参照され
たい）。
【０３３０】 これらのマトリックス物質には、目的の分子の結合のための担持体マトリック
スとして作用することができるあらゆる物質が含まれる。そのような物質は当業
者に公知であり、担持体マトリックスとして用いられるものが含まれる。これら
の物質には、制限されるものではないが、セルロース、セルロース誘導体、アク
リル性樹脂、ガラス、シリカゲル、ポリスチレン、ゼラチン、ポリビニルピロリ
ドン、ビニルおよびアクリルアミドから成るコポリマー、ジビニルベンゼンなど
と架橋結合したポリスチレン（Merrifield, Biochemistry, 3:1385-1390 (1964)
を参照されたい）、ポリアクリルアミド、ラテックスゲル、ポリスチレン、デキ
ストラン、ポリアクリルアミド、ゴム、シリコン、プラスチック、ニトロセルロ
ース、セルロース、天然スポンジを含む、制限されるものではないが、無機、天
然ポリマー、および合成ポリマーが含まれる。本明細書中、非常に孔の多いガラ
ス（例えば、Ｕ．Ｓ．特許第４，２４４，７２１を参照されたい）およびボロシ
リケート、アルコールおよび水を混合することにより調製される他のものが特に
興味深い。
【０３３１】 合成担持体には、制限されるものではないが、アクリルアミド、デキストラン
誘導体およびデキストランコポリマー、アガロース−ポリアクリルアミド混合物
、種々の官能基を有する他のポリマーおよびコポリマー、メタクリレート誘導体
およびコポリマー、ポリスチレンおよびポリスチレンコポリマー（例えば、Merr
ifield, Biochemistry, 3:1385-1390 (1964); Berg et al., in Innovation Per
spect. Solid Phase Synth. Collect. Pap., Int. Symp., 1st, Epton, Roger (
Ed), pp. 453-459 (1990); Berg et al., Pept., Proc. Eur. Pept. Symp., 20t
h, Jung, G. et al. (Eds), pp. 196-198 (1989); Berg et al., J. Am. Chem.
Soc., 111:8024-8026 (1989); Kent et al., Isr. J. Chem., 17:243-247 (1979
); Kent et al., J. Org. Chem., 43:2845-2852 (1978); Mitchell et al., Tet
rahedron Lett., 42:3795-3798 (1976); U.S. Patent No. 4,507,230; U.S. Pat
ent No. 4,006,117; およびU.S. Patent No. 5,389,449)を参照されたい）が含
まれる。そのような物質には、ポリビニルアルコールなどのポリマーとコポリマ
ーから成るもの、ポリエチレン−コ−アクリル酸、ポリエチレン−コ−メタクリ
ル酸、ポリエチレン−コ−エチルアクリレート、ポリエチレン−コ−メチルアク
リレート、ポリプロピレン−コ−アクリル酸、ポリプロピレン−コ−メチル−ア
クリル酸、ポリプロピレン−コ−エチルアクリレート、ポリプロピレン−コ−メ
チルアクリレート、ポリエチレン−コ−ビニルアセテート、ポリプロピレン−コ
−ビニルアセテートなどのアクリレートおよびアクリル酸から作成されるもの、
ポリエチレン−コ−マレイン酸無水物およびポリプロピレン−コ−マレイン酸無
水物などの無水基を含むものが含まれる。リポソームも、アフィニティ精製のた
めの固体担持体として用いられている（Powell et al. Biotechnol. Bioeng., 3
3:173 (1989)を参照されたい）。
【０３３２】 固体または液体担持体上でのタンパク質および他の生物分子の固定のための多
くの方法が開発されている（例えば、Mosbach, Methods in Enzymology, 44 (19
76); Weetall, Immobilized Enzymes, Antigens, Antibodies, and Peptides, (
1975); Kennedy et al., Solid Phase Biochemistry, Analytical and Syntheti
c Aspects, Scouten, ed., pp. 253-391 (1983)を参照されたい。; 一般に、Aff
inity Techniques. Enzyme Purification: Part B. Methods in Enzymology, Vo
l. 34, ed. W. B. Jakoby, M. Wilchek, Acad. Press, N.Y. (1974)を参照され
たい）。 担持体に対する、直接的な、または多くのジスルフィド結合、チオエーテル結
合、障害ジスルフィド結合、および遊離反応基、例えばアミンおよびチオール基
などの間の共有結合など、当該分野の専門家に公知のリンカーを介した吸収およ
び吸着または共有結合が最も一般に用いられる方法である（例えば、そのような
試薬の調製と使用を記載し、そのような試薬の市販源を提供するPIERCE CATALOG
, ImmunoTechnology Catalog & Handbook, 1992-1993; Wong, Chemistry of Pro
tein Conjugation and Cross Linking, CRC Press (1993)を参照されたい。; 光
感受性リンカーを記載するDeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90
:6909 (1993); Zuckermann et al., J. Am. Chem. Soc., 114:10646 (1992); Ku
rth et al., J. Am. Chem. Soc., 116:2661 (1994); Ellman et al., Proc. Nat
l. Acad. Sci. U.S.A., 91:4708 (1994); Sucholeiki, Tetrahedron Lttrs., 35
:7307 (1994); Su-Sun Wang, J. Org. Chem., 41:3258 (1976); Padwa et al.,
J. Org. Chem., 41:3550 (1971); and Vedejs et al., J. Org. Chem., 49:575
(1984)も参照されたい）。
【０３３３】 固定化を達成するために、タンパク質または他の生物分子を含む組成物を、ア
ルミナ、炭素、イオン交換樹脂、セルロース、ガラス、またはセラミックなどの
担持体マトリックスと接触させる。過フッ化炭素ポリマーが、生物分子が吸着に
より結合されている担持体として用いられている（Ｕ．Ｓ．特許第３、６４３、
４４３；公開された国際ＰＣＴ出願ＷＯ／８６０３８４０を参照されたい）。
【０３３４】 Ｊ．予防および診断 ＭＴＳＰタンパク質タンパク質、そのドメイン、類似体および誘導体、および
コードしている核酸（およびそれに相補的な配列）、および抗ＭＴＳＰタンパク
質抗体を診断に用いることができる。そのような分子をイムノアッセイなどのア
ッセイで用いて、ＭＴＳＰタンパク質の発現に影響を及ぼす種々の症状、病気、
および障害を検出、予防、診断、またはモニターすること、またはその治療をモ
ニターすることができる。本明細書における目的に関して、生物体液または腫瘍
組織におけるＭＴＳＰの存在は特に興味深い。
【０３３５】 特に、そのようなイムノアッセイは、対象由来のサンプルを、特異的結合が起
こり得る条件下で抗ＭＴＳＰタンパク質抗体と接触させること、次いで抗体によ
る免疫特異的結合の量を検出または測定することを含む方法により行われる。特
定の態様では、組織小片におけるそのような抗体の結合を用いて、異常なＭＴＳ
Ｐタンパク質の同定またはＭＴＳＰタンパク質の異常な（例えば、低い、または
存在しない）レベルを検出することができる。特定の具体例では、ＭＴＳＰタン
パク質に対する抗体を用いて、対象の組織または血清サンプル中のＭＴＳＰタン
パク質の存在をアッセイすることができ、ここで、ＭＴＳＰタンパク質の異常な
レベルが、疾患症状の指標である。
【０３３６】 用いることができるイムノアッセイには、制限されるものではないが、ウエス
タンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ
）、「サンドウィッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル
拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、捕体−固定アッセイ、免疫
放射線分析アッセイ、蛍光イムノアッセイ、タンパク質Ａ免疫アッセイなどの方
法を用いる競合および非競合アッセイシステムが含まれる。
【０３３７】 相補配列を含むＭＴＳＰタンパク質遺伝子および関連する核酸配列および配列
も、ハイブリダイゼーションアッセイに用いることができる。ＭＴＳＰタンパク
質核酸配列、少なくとも約８ヌクレオチド、好ましくは１４または１６またはそ
れ以上の連続ヌクレオチドを含むそのサブ配列をハイブリダイゼーションプロー
ブとして用いることができる。ハイブリダイゼーションアッセイを用いて、ＭＴ
ＳＰタンパク質の発現および／または活性の前記のような異常な変化に伴う症状
、疾患または状病を検出、予防、診断またはモニターすることができる。特に、
そのようなハイブリダイゼーションアッセイは、核酸を含むサンプルを、ＤＮＡ
またはＲＮＡをコードしているＭＴＳＰタンパク質にハイブリダイズすることが
できる核酸プローブと、ハイブリダイゼーションが起こり得るような条件下で接
触させ、ついで、生じる全ハイブリダイゼーションを検出または測定することに
よる方法により行われる。
【０３３８】 特定の具体例では、対象におけるＭＴＳＰタンパク質の異常なレベルを検出す
ることにより特徴づけられる病気または疾患を診断する方法が、配列番号：１に
示すヌクレオチド配列を有する核酸にハイブリダイズする核酸により少なくとも
部分的にコードされる上皮ＭＴＳＰタンパク質のＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質ま
たは機能活性の対象由来のサンプル中のレベルを測定することにより本明細書中
に提供され、ここで、ＭＴＳＰタンパク質のＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質または
機能活性の、病気または疾患を有しない類似サンプルに見出されるＤＮＡ、ＲＮ
Ａ、タンパク質または機能活性のレベルに対する増加または低下が、対象に病気
または疾患が存在していることを示すものである。
【０３３９】 １またはそれ以上のコンテナに抗−ＭＴＳＰタンパク質抗体、特に抗-ＭＴＳ
Ｐ３または抗＝ＭＴＳＰ４、および任意に、抗体に対する標識結合対を含む診断
用キットも提供される。別法として、抗−ＭＴＳＰタンパク質抗体は（検出可能
なマーカー、例えば、化学発光、酵素、蛍光、または放射能活性部分で）標識さ
れることができる。１またはそれ以上のコンテナ中、ＭＴＳＰタンパク質をコー
ドしているＲＮＡにハイブリダイズすることができる核酸プローブを含むキット
も提供される。特定の具体例では、キットには、[例えば、ＭＴＳＰタンパク質
をコードしている核酸の少なくとも一部に関して適当な反応条件下でのポリメラ
ーゼ鎖反応（例えば、Innis et al., 1990, PCR Protocols, Academic Press, I
nc., San Diego, CAを参照されたい）、Ｑβレプリカーゼを用いるリガーゼ鎖反
応（ＥＰ３２０,３０８を参照されたい）、サイクリックプローブ反応、および
当該分野で公知の他の方法により]増幅を開始することができるプライマー対（
例えば、それぞれ６−３０ヌクレオチドのサイズ範囲の）を、１またはそれ以上
のコンテナ中に含めることができる。キットは、コンテナ中、標準または対照と
して使用するための予め決定された量の精製ＭＴＳＰタンパク質または核酸をさ
らに含むことができる。
【０３４０】 Ｋ．医薬組成物および投与様式 １．組成物の成分 ＭＴＳＰタンパク質の活性を調節する、同定された化合物を含む医薬組成物が
、本明細書中に提供される。ＭＴＳＰタンパク質の活性を調節する化合物と、腫
瘍疾患の治療のための他の治療薬または化合物、例えば化学療法用化合物などの
組み合わせも提供される。
【０３４１】 ＭＴＳＰタンパク質モジュレーターおよび抗腫瘍剤は、同時、または連続、ま
たは断続投与のために、別個の組成物として封入されることができる。別法とし
て、それらは投与用単一組成物、または投与用２組成物として提供されることが
できる。組み合わせはキットとして封入されることができる。
【０３４２】 ａ．ＭＴＳＰタンパク質阻害物質 本明細書に記載されるものを含む、単独または他の化合物と組み合わせて用い
られた場合に、望ましくないおよび／または制御できない血管形成に伴う臨床症
状または診断マーカーを緩和する、減じる、改善する、予防する、またはその鎮
静状態におく、または維持することができるあらゆるＭＴＳＰタンパク質阻害物
質を、本組み合わせに用いることができる。
【０３４３】 一の具体例では、ＭＴＳＰタンパク質阻害物質は、ＭＴＳＰタンパク質または
そのプロテアーゼドメインと特異的に反応する抗体またはそのフラグメント、Ｍ
ＴＳＰタンパク質産生の阻害物質、上皮ＭＴＳＰタンパク質の膜−局在性の阻害
物質、またはＭＴＳＰタンパク質の発現または特に活性のいずれかの阻害物質で
ある。
【０３４４】 ｂ.抗−血管形成剤および抗腫瘍剤 単独または他の化合物と組み合わせて用いられた場合に、望ましくないおよび
／または制御できない血管形成に伴う臨床症状または診断マーカー、および／ま
たは腫瘍の増殖および転移、特に充実性腫瘍、血管奇形および心血管障害、慢性
炎症性疾患および異常な創傷治癒、循環疾患、クレストシンドローム、皮膚疾患
または眼病を緩和、減じる、改善する、予防するまたはその鎮静状態におくまた
は維持することができるあらゆる抗血管形成剤および抗腫瘍剤を、組み合わせに
用いることができる。ＭＴＳＰタンパク質の阻害物質との組み合わせに使用する
ための抗腫瘍剤も企図される。
【０３４５】 ｃ.抗腫瘍剤および抗血管形成剤 本明細書に提供される方法により同定される、または本明細書に提供される化
合物は、抗腫瘍剤および／または抗血管形成剤と組み合わせて用いられることが
できる。 ２．製剤および投与経路 本明細書中の化合物および薬剤は、好ましくは単一投与量投与のための医薬組
成物として調製される。製剤中の化合物の濃度は、投与に際し、送達に有効な量
、意図される治療に有効な量である。典型的には、組成物は、単一投与量投与の
ために処方される。組成物を処方するために、化合物またはその混合物の重量フ
ラクションを、治療される症状が軽減または緩和するような有効濃度で、選択さ
れたビヒクル中に溶解、懸濁、分散、またはそのほか、混合される。本明細書に
提供される化合物の投与に適した医薬キャリアまたはビヒクルには、特定の投与
様式に適した、当該分野の専門家に公知のいずれかのそのようなキャリアが含ま
れる。
【０３４６】 加えて、化合物は、組成物中に単独の医薬活性成分として処方されてよく、ま
たは他の活性成分と組み合わされてよい。組織標的リポソームを含むリポソーム
懸濁液が、医薬上許容されるキャリアとして適している可能性もある。これらは
、当該分野の専門家に公知の方法に従い調製されることができる。例えば、リポ
ソーム製剤は、Ｕ．Ｓ．特許第４,５２２,８１１に記載のように調製されること
ができる。
【０３４７】 活性化合物は、治療される対象に望ましくない副作用を起こさずに治療上有効
な効果を発揮するのに十分な量で、医薬上許容されるキャリア中に含まれる。治
療上有効な濃度は、公知のインビトロおよびインビボ系で、例えば本明細書に提
供されるアッセイにおいて、化合物を試験することにより経験的に決定されるこ
とができる。
【０３４８】 薬物組成物中の活性化合物の濃度は、活性化合物の吸収、不活性化および排出
速度、化合物の物理化学的特性、投与スケジュールおよび投与量ならびに当該分
野の専門家に公知の他の要因に依存する。 典型的には、治療有効投与量が意図される。投与される量は、血液容積の０．
００１から１ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．００５−０．０５ｍｇ／ｍｌ、より
好ましくは約０．０１ｍｇ／ｍｌのオーダーであってよい。医薬投与単位製剤は
、投与単位製剤当たり、約１ｍｇから約１０００ｍｇ、および好ましくは約１０
から約５００ｍｇ、より好ましくは約２５−７５ｍｇの必須活性成分または必須
活性成分の組み合わせを提供するべく調製される。詳細な投与量は、経験的に決
定され得る。
【０３４９】 活性成分は一度に投与されてよく、または、数回の少量の投与に分けて、間隔
を置いて投与されてよい。厳密な投与量および治療期間は、治療される疾患に相
関するものであり、公知の試験プロトコルを用いて、またはインビボもしくはイ
ンビトロ試験データから外挿により経験的に決定されてよい。濃度および投与量
の値は、緩和されるべき疾患の重篤度とともに変えてもよい。いずれの特定の対
象に関しても、特定の投与法は、個人の必要性および組成物を投与している主治
医または組成物の投与を管理している主治医の専門的な判断により、時間をかけ
て調整されるべきこと、および本明細書に示した濃度範囲は例にすぎず、権利が
要求される組成物およびそれらを含む組み合わせの範囲または使用を制限するも
のではないことがさらに理解されるべきである。
【０３５０】 好ましい医薬上許容される誘導体には、酸、塩、エステル、水和物、溶媒化合
物およびプロドラッグ形態が含まれる。誘導体は典型的には、その薬物動態特性
が、対応する中性化合物よりも優れるように選択される。 こうして、全身、局所、または局部投与のために適した医薬上許容されるキャ
リアまたはビヒクルと、有効濃度または有効量の１またはそれ以上の本明細書に
提供される化合物またはその医薬上許容される誘導体を組み合わせて、医薬組成
物が形成される。化合物は、治療が意図される疾患を緩和または治療するのに有
効な量で含まれる。組成物中の活性化合物の濃度は、活性化合物の吸収、不活性
化、排出速度、投与スケジュール、投与量、特定の形態ならびに当該分野の専門
家に公知の他の要因に依存する。
【０３５１】 非経口、皮内、皮下、または局所適用に用いられる溶液または懸濁液には、以
下の成分のいずれかを含めることができる：滅菌希釈液、例えば注射用水、塩水
溶液、固定オイル、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコー
ルまたは他の合成溶媒、抗微生物剤、例えばベンジルアルコールおよびメチルパ
ラベン；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸および重亜硫酸ナトリウム；キレート
剤、例えばエテレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）；バッファー、例えばアセ
テート、シトレートおよびホスフェート等；および強壮調整剤、例えば塩化ナト
リウムまたはデキストロースなどを含めることができる。非経口調製物は、アン
プル、使い捨て注射器、または、ガラス、プラスチックまたは他の適当な物質か
ら成る単一または複数投与バイアルであり得る。
【０３５２】 化合物が不充分な溶解性を示す物質の場合、化合物の溶解度を高める方法を用
いてよい。そのような方法は、本分野の専門家に公知であり、および、制限され
るものではないが、補助溶媒、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を用い
ること、界面活性剤、例えばトゥイーン（登録商標）を用いること、または重炭
酸ナトリウム水溶液に溶解することが含まれる。化合物のプロドラッグなどの化
合物の誘導体も、有効な医薬組成物を調製するのに用いてよい。目の症状に関し
ては、組成物は、目に許容されるキャリア中に処方される。本明細書における目
における使用のためには、局所投与または注射のいずれかによる局部投与が好ま
しい。時間徐放製剤も望ましい。典型的には、組成物は、単一投与により有効量
が投与されるように、単一投与量投与のために処方される。
【０３５３】 化合物をビヒクルと混合して、または化合物にビヒクルを添加した場合、生じ
る混合物は、溶液、懸濁液、エマルジョンまたは他の組成物であってよい。生じ
る混合物の形態は、投与に関して意図される様式、および選択されるキャリアま
たはビヒクル中の化合物の溶解度を含む多くの要因に依存する。所望により、化
合物の医薬上許容される塩または他の誘導体が調製されてよい。
【０３５４】 化合物は、治療される対象に望ましくない副作用を起こさない、治療上有効な
効果を発揮するのに十分な量で医薬上許容されるキャリアに含まれる。副作用の
数および程度は、化合物が投与される疾患に依存することが理解される。例えば
、重篤度の低い疾患を治療する場合には許容されない一定の毒性および望ましく
ない副作用が、生命を脅かす病気を治療する場合には許容される。
【０３５５】 化合物は、所望の活性を損なわない他の活性物質と、または、当該分野で公知
の所望の活性を補足する物質と混合されることもできる。本明細書における使用
のための化合物および薬剤の調製には、経口、直腸、局所、吸入、頬面（例えば
舌下）、非経口（例えば、皮下、筋肉内、皮内または静脈内）、経皮投与または
あらゆる経路に適したものが含まれる。いずれかの所定の場合に最も適した経路
は、治療される疾患の性質および重篤度、用いられる特定活性化合物の性質に依
存する。製剤は、適当な量の化合物または医薬上許容されるその誘導体を含む単
一投与製剤、例えば錠剤、カプセル、ピル、粉末、顆粒、滅菌非経口溶液または
懸濁液および経口溶液または懸濁液およびオイル−水エマルジョンにて、ヒトお
よび動物に投与するために提供される。医薬治療活性化合物およびその誘導体は
、典型的には単位投与製剤または多投与製剤に製剤化され、および投与される。
本明細書に用いられる単位投与製剤は、ヒトおよび動物対象に適した、および当
該分野で公知のように個々に封入される物理的に別個の単位を言う。各単位投与
製剤は、所望の医薬キャリア、ビヒクルまたは希釈剤と共に、所望の治療効果を
生じるのに十分な、予め決定された量の治療活性化合物を含む。単位投与製剤の
例には、アンプルおよび注射器、および個々に封入された錠剤またはカプセルが
含まれる。単位投与製剤は、フラクションで、または多重にて投与されてよい。
多重投与製剤は、分離された単位投与製剤にて投与されるべく単一の容器に封入
された、複数の同一単位投与製剤である。多重投与製剤の例には、バイアル、錠
剤のボトル、またはカプセルまたはパイントまたはガロンのボトルが含まれる。
つまり、多重投与製剤は、包装において分離されない多重の単位投与である。
【０３５６】 組成物は、活性成分：ラクトース、スクロース、リン酸二カルシウムまたはカ
ルボキシメチルセルロースなどの希釈剤、ステアリン酸マグネシウム、ステアリ
ン酸カルシウムおよびタルクなどの潤滑剤、およびスターチなどの結合剤、アカ
シアゼラチンなどの天然ガム、グルコース、糖蜜、ポリビニルピロリジン、セル
ロースおよびその誘導体、ポビドン、クロスポビドン、および当該分野で公知の
他の結合剤を含むことができる。液体の医薬投与可能組成物は、例えば、前記活
性化合物と任意の医薬アジュバントを、例えば水、塩水、デキストロース水溶液
、グリセロール、グリコール、エタノールなどのキャリア中に溶解、分散しまた
は別に混合することにより調製されて、溶液または懸濁液が形成される。所望の
場合、投与されるべき医薬組成物は、少量の非毒性補助物質、例えば湿剤、乳化
剤、または溶解剤、ｐＨ緩衝剤など、例えばアセテート、クエン酸ナトリウム、
シクロデキストリン誘導体、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミン
ナトリウムアセテート、トリエタノールアミンオレエート、および他のそのよう
な剤も含むことができる。そのような投与製剤を調製する方法は、当該分野の専
門家には公知であり、明らかであろう(例えば、Remington's Pharmaceutical Sc
iences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 15th Edition, 1975を参照さ
れたい)。投与されるべき組成物または製剤は、治療される対象の症状を緩和す
るのに十分な量の活性化合物を含む。
【０３５７】 非毒性キャリアから成るバランスに関して、０．００５％から１００％の範囲
で活性成分を含む組成物の投与製剤を調製することができる。経口投与のために
は、医薬組成物は例えば、結合剤（例えば、予めゼラチン化されたトウモロコシ
スターチ、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）
、充填剤（例えば、ラクトース、ミクロクリスタリンセルロース、またはリン酸
水素カルシウム）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたは
シリカ）；崩壊剤（例えば、ポテトスターチまたはナトリウムスターチグリコレ
ート）；または湿剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）などの医薬上許容される
賦形剤を用いて、常套の方法により調製される、例えば錠剤またはカプセルの形
態をとってよい。錠剤は、当該分野で周知の方法によりコートされてよい。
【０３５８】 医薬調製物は、液体形態、例えば溶液、シロップまたは懸濁液であってもよく
、または水または他の適当なビヒクルで、使用前に復元するための薬品として存
在してよい。そのような液体調製物は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ
、セルロース誘導体または硬化食用脂肪）；乳化剤（例えば、レシチンまたはア
カシア）：非水性ビヒクル（例えば、アーモンドオイル、油状エステルまたは分
別植物油）；および保存剤（例えば、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシベ
ンゾエートまたはソルビン酸）などの医薬上許容される添加剤を用いて常套法に
より調製されてよい。
【０３５９】 直腸投与に適した製剤は、好ましくは単位投与坐薬として存在する。これらは
、活性化合物を１またはそれ以上の常套の固体キャリア、例えばココアバターと
混合し、次いで生じる混合物を成形することにより調製されてよい。
【０３６０】 皮膚または目への局所適用に適した製剤は、好ましくは軟膏、クリーム、ロー
ション、ペースト、ゲル、スプレー、エアゾルまたはオイルの形態をとる。用い
てよいキャリアには、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコー
ル、およびそれらの２またはそれ以上の組み合わせが含まれる。局所製剤は、好
都合には、さらに０．０５から１５％重量の、ヒドロキシプロピルメチルセルロ
ース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ
（アルキレングリコール）、ポリ/ヒドロキシアルキル、（メチル）アクリレー
トまたはポリ（メチル）アクリルアミドから選択される濃縮剤を含んでよい。局
所製剤は、点滴により、または軟膏として、結膜嚢に適用されることが最も多い
。しかし、目、顔洞、および外部耳道の洗浄または潤滑のためにも用いることが
できる。前眼房およびその他の場所に注射されてもよい。液体状態の局所製剤は
、小片、コンタクトレンズなどの形態の親水性の三次元ポリマーマトリックスで
存在してもよく、そこから活性成分が放出される。
【０３６１】 吸入による投与のために、本明細書に用いられる化合物は、加圧されたパック
またはネブライザーからのエアゾールスプレー形態で、適当な推進剤、例えばジ
クロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロ
エタン、二酸化炭素または他の適当なガスを用いて送達されることができる。加
圧されたエラゾルの場合、投与ユニットは、測定量を送達するためのバルブを提
供することにより決定されてよい。吸入器または吹き入れ器に使用するための、
例えば、ゼラチンのカプセルおよびカートリッジを、化合物の粉末混合物および
ラクトースまたはスターチなどの適当な基材の粉末混合物を含めて調製してよい
。
【０３６２】 頬面（舌下）投与に適した製剤には、風味基材、たいてい蔗糖およびアカシア
またはトラガカント中に活性化合物を含むトローチ剤、およびゼラチンおよびグ
リセリンまたは蔗糖およびアカシアなどの不可性基材中に化合物を含む錠剤が含
まれる。 化合物は、例えばボーラス注射または継続点滴による注射による非経口投与の
ために調製されてよい。注射のための製剤は、単一投与製剤、例えば、アンプル
または多重投与コンテナ中に、添加保存剤と共に存在してよい。組成物は、油性
または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンなどの形態をとってよ
く、および懸濁剤、安定剤および／または分散剤などの成形剤を含んでよい。別
法として、活性成分は、適当なビヒクル、例えば滅菌性の発熱物質を含まない水
または他の溶媒で使用前に復元させるための粉末形態であってよい。
【０３６３】 経皮投与に適した製剤は、長期間、対象の表皮に密着させるのに適した別々の
パッチとして存在してよい。そのようなパッチは適切には、活性化合物に対して
例えば０．１から０．２Ｍの濃度の任意に緩衝処理された水溶液として活性化合
物を含む。経皮投与に適した製剤は、イオン投入法（例えばPharmaceutical Res
earch 3 (6), 318 (1986)を参照されたい）により送達されてもよく、典型的に
は、任意に緩衝処理された活性化合物水溶液の形態をとる。
【０３６４】 医薬組成物は、制御放出法および／または送達装置により投与されてもよい（
例えば、U.S. Patent Nos. 3,536,809; 3,598,123; 3,630,200; 3,845,770; 3,8
47,770; 3,916,899; 4,008,719; 4,687,610; 4,769,027; 5,059,595; 5,073,543
; 5,120,548; 5,354,566; 5,591,767; 5,639,476; 5,674,533 and 5,733,566を
参照されたい）。 血漿レベルにより確認されるように、所望のレベルは、活性剤を継続注入する
ことにより維持されることができる。主治医には、毒性、または骨髄、肝臓また
は腎臓の機能不全のために治療を終結させ、中断させ、または低投与量に調製す
る方法および時期が分かるであろう。逆に、主治医には、臨床反応が適切でない
場合に（毒性の副作用を持たない）より高いレベルに治療を調整する方法と時期
も分かるであろう。
【０３６５】 単独または他の薬剤と組み合わせたＭＴＳＰタンパク質阻害物質の効力および
／または毒性は、当該分野で公知の方法によりさらに評価することができる（一
般に、O'Reilly, Investigational New Drugs, 15:5-13 (1997)を参照されたい
）。
【０３６６】 活性化合物または医薬上許容される誘導体は、時間徐放製剤またはコーティン
グなど、化合物が体から早く排出されるのを防ぐキャリアを用いて調製されてよ
い。 組成物および／またはその投与に関する説明書と合わせたものを含むキットが
提供される。キットにはさらに、好ましくは滅菌形態で封入された、複合体を注
射するための注射針または注射器および／または封入されたアルコールパッドを
含めてよい。説明書は、臨床医または対象による活性剤の投与のために含められ
てよい。
【０３６７】 最終的に、化合物またはＭＴＳＰタンパク質またはそのプロテアーゼドメイン
または前記薬剤のいずれかを含む組成物が、パッケージング材料、パッケージン
グ材料中、本明細書で意図される病気または疾患の治療に有効な本明細書に提供
される化合物、および化合物またはその適当な誘導体が本明細書に意図される病
気または疾患の治療のためのものであることを示すラベルを含む製品として封入
されてよい。ラベルには、治療が保証される疾患を含めることができる。
【０３６８】 Ｌ．治療法 本明細書中の方法により同定される化合物は、動物、特にヒトを含む哺乳動物
における腫瘍疾患を治療または予防するために用いられる。一具体例では、該方
法には、哺乳動物に病気または疾患が治療または予防される有効量のＭＴＳＰタ
ンパク質の阻害物質を投与することが含まれる。好ましい具体例では、治療また
は予防に用いられるＭＴＳＰタンパク質阻害物質は、医薬上許容されるキャリア
または賦形剤と共に投与される。治療される哺乳動物はヒトであり得る。 本明細書中に提供される阻害物質は、スクリーニングアッセイにより同定され
るものである。加えて、抗体およびアンチセンス核酸が企図される。
【０３６９】 治療または予防法には、さらに抗‐血管形成治療薬もしくは治療剤または抗腫
瘍剤を、ＭＴＳＰタンパク質阻害物質と同時に、ＭＴＳＰタンパク質阻害物質の
前にまたはＭＴＳＰタンパク質の後で投与することが含まれ得、ここでＭＴＳＰ
タンパク質阻害物質は、ＭＴＳＰタンパク質の活性を阻害する化合物であり、Ｍ
ＴＳＰタンパク質に対する抗体またはそれに対する結合領域を含むそのフラグメ
ントまたは誘導体、ＭＴＳＰタンパク質をコードしているアンチセンス核酸、お
よびＭＴＳＰタンパク質をコードしている遺伝子の少なくとも一部を含む核酸で
あって、異種配列がＭＴＳＰタンパク質をコードしている少なくとも一部の生物
活性を不活性化させるべく異種核酸配列が挿入されており、ＭＴＳＰタンパク質
をコードしている遺伝子の部分が、ＭＴＳＰタンパク質をコードしているゲノム
遺伝子との相同組換えを促進するように異種配列に隣接している核酸を含む化合
物であり得る。
【０３７０】 １．アンチセンス治療 前記のような特定の具体例において、ＭＴＳＰタンパク質の機能がＭＴＳＰタ
ンパク質アンチセンス核酸により減じられ、または阻害されて、腫瘍疾患が治療
または予防される。ＭＴＳＰタンパク質またはその部分をコードしている遺伝子
またはｃＤＮＡに対するアンチセンスである少なくとも６のヌクレオチドから成
る核酸の治療的または予防的使用である。本明細書に用いられるＭＴＳＰタンパ
ク質「アンチセンス」核酸は、いくらかの配列相補性によりＭＴＳＰタンパク質
ＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）の一部にハイブリダイズすることができる核酸を
言う。アンチセンス核酸は、ＭＴＳＰタンパク質ｍＲＮＡのコーディングおよび
／または非コーディング領域に相補的であってもよい。そのようなアンチセンス
核酸は、ＭＴＳＰタンパク質の機能を減じるまたは阻害する治療薬として有用で
あり、前記の疾患の治療または予防に用いられることができる。
【０３７１】 ＭＴＳＰタンパク質アンチセンス核酸は、少なくとも６ヌクレオチドからなり
、および好ましくはオリゴヌクレオチド（６から約１５０ヌクレオチド、または
より好ましくは６から５０ヌクレオチド）である。特定の態様では、オリゴヌク
レオチドは少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、少なく
とも１００ヌクレオチド、または少なくとも１２５ヌクレオチドである。オリゴ
ヌクレオチドは、１本鎖または２本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡまたはキメラ混合物
またはその誘導体またはその変更形態であり得る。オリゴヌクレオチドは、塩基
部分、糖部分またはリン酸骨格で変更されることができる。オリゴヌクレオチド
には、ペプチドなどの他の付加基または細胞膜（Letsinger et al., Proc. Natl
. Acad. Sci. U.S.A. 86:6553-6556 (1989); Lemaitre et al., Proc. Natl. Ac
ad. Sci. U.S.A. 84:648-652 (1987); PCT Publication No. WO 88/09810, publ
ished December 15, 1988を参照されたい）または血−脳関門（PCT Publication
No. WO 89/10134, published April 25, 1988を参照されたい）を横切る輸送を
促進する薬剤、ハイブリダイゼーション誘発切断剤（Krol et al., BioTechniqu
es 6:958-976 (1988)を参照されたい）または層間剤（例えば、Zon, Pharm. Res
. 5:539-549 (1988)を参照されたい）が含まれてよい。
【０３７２】 ＭＴＳＰタンパク質アンチセンス核酸は、好ましくはオリゴヌクレオチド、よ
り好ましくは１本鎖ＤＮＡのオリゴヌクレオチドである。好ましい態様では、オ
リゴヌクレオチドには、ヒトＭＴＳＰタンパク質の一部に対する配列アンチセン
スが含まれる。オリゴヌクレオチドは、その構造上、当該分野で一般に知られる
置換基で、いずれかの位置で変更されてよい。
【０３７３】 ＭＴＳＰタンパク質アンチセンスオリゴヌクレオチドは、制限されるものでは
ないが、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５
−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−
（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル
−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウ
ラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルクエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニ
ルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２,２−ジメチルグア
ニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メ
チルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチル
ウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノ
シルクエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラ
シル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ
酢酸（ｖ）、イブトキソシン、シュードウラシル、クエオシン、２−チオシトシ
ン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５
−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−
オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ
−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２,６−ジアミ
ノプリンが含まれる。
【０３７４】 他の具体例では、オリゴヌクレオチドには、制限されるものではないが、アラ
ビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロースおよびヘキソースを含む群
から選択される少なくとも一つの変更された糖部分が含まれる。オリゴヌクレオ
チドには、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミドチオエ
ート、ホルホルアミデート、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アル
キルホスホトリエステルおよびホルムアセタールまたはその類似体から選択され
る少なくとも一つの修飾されたリン酸骨格が含まれ得る。
【０３７５】 オリゴヌクレオチドは、α−芳香族オリゴヌクレオチドであり得る。α−芳香
族オリゴヌクレオチドは、鎖が互いに平行に並んでいる相補的ＲＮＡと特定の二
本鎖ハイブリッドを形成する（Gautier et al., Nucl. Acids Res. 15:6625-664
1 (1987)）。 オリゴヌクレオチドは他の分子、例えばペプチド、ハイブリダイゼーション誘
発架橋結合剤、輸送剤およびハイブリゼーション誘発切断剤と結合されてよい。 オリゴヌクレオチドは当該分野で公知の常套法により、例えば自動ＤＮＡシン
セサイザー（Bioserch, Applied Biosystems etcから市場で入手可能なものなど
）の使用により、合成されてよい。例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレ
オチドは、Stein et al.(Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988))の方法により合成
されてよく、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは制御性細孔ガラスポリマ
ー坦持体を用いることにより調製されることができる(Sarin et al., Proc. Nat
l. Acad. Sci. U.S.A. 85:7448-7451 (1988)）。
【０３７６】 特定の具体例では、ＭＴＳＰタンパク質アンチセンスオリゴヌクレオチドには
、触媒ＲＮＡまたはリボザイム（例えば、PCT 国際公開 WO 90/11364, publishe
d October 4, 1990; Sarver et al., Science 247:1222-1225 (1990)を参照され
たい）が含まれる。他の具体例では、オリゴヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルリ
ボヌクレオチド（Inoue et al., Nucl. Acids Res. 15:6131-6148 (1987)）また
はキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体（Inoue et al., FEBS Lett. 215:327-330 (1987
)）である。
【０３７７】 別の具体例では、ＭＴＳＰタンパク質アンチセンス核酸は、外来配列からの転
写により細胞内で作成される。例えば、ベクターを、それが細胞により摂りこま
れるようにインビボ導入することができ、その細胞内でベクターまたはその部分
は転写され、アンチセンス核酸（ＲＮＡ）が生成される。そのようなベクターは
、ＭＴＳＰタンパク質アンチセンス核酸をコードしている配列を含む。そのよう
なベクターはエピソームに留まるか、または染色体に統合され、その限りで、転
写されて所望のアンチセンスＲＮＡを生成することができる。そのようなベクタ
ーは、当該分野で常套の組換えＤＮＡ技術法により構築され得る。ベクターは、
当該分野で公知のプラスミド、ウイルスまたはその他であり、哺乳動物細胞中で
複製および発現のために用いられる。ＭＴＳＰタンパク質アンチセンスＲＮＡを
コードしている配列の発現は、哺乳動物、好ましくはヒトの細胞で作用すること
が当該分野で公知であるプロモーターによるものであり得る。そのようなプロモ
ーターは、誘導型のものか、または構成型のものであり得る。そのようなプロモ
ーターには、制限されるものではないが、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Bern
oist and Chambon, Nature 290:304-310 (1981)）、ラウス肉腫ウイルスの３’
長の末端繰り返しに含まれるプロモーター（Yamamoto et al., Cell 22:787-797
(1980)）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Wagner et al., Proc. Na
tl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445 (1981)）、メタロチオネイン遺伝子の調
節配列（Brinster et al., Nature 296:39-42 (1982)）などが含まれる。
【０３７８】 アンチセンス核酸には、ＭＴＳＰタンパク質遺伝子、好ましくはヒトＭＴＳＰ
タンパク質遺伝子のＲＮＡ転写産物の少なくとも一部に相補的な配列が含まれる
。絶対的な相補性が望ましいが、必ずしも必要ではない。 腫瘍疾患の治療または予防に有効なＭＴＳＰタンパク質アンチセンス核酸の量
は、病気の性質に依存し、常套の臨床技術により経験的に決定されることができ
る。可能な場合、ヒトで試験および使用する前にインビトロ細胞内で、および次
いで有用な動物モデル系でアンチセンスの細胞毒性を決定することが望ましい。
２．遺伝子治療 典型的な具体例では、遺伝子治療としてＭＴＳＰタンパク質またはその機能ド
メインまたはその誘導体をコードしている核酸の配列を含む核酸が、ＭＴＳＰタ
ンパク質タンパク質の機能を促進するために投与される。遺伝子治療とは、対象
に核酸を投与することにより行われる治療を言う。この具体例では、核酸は、Ｍ
ＴＳＰタンパク質の機能を促進することにより治療作用を媒介する、そのコード
されたタンパク質を生成する。当該分野で利用可能な遺伝子治療に関する方法の
いずれを用いてもよい（Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 12:488-505 (19
93); Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmac
ol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); an
d Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993); TIBTECH 11(
5):155-215 (1993)を参照されたい）。例えば、遺伝子治療のための一治療組成
物には、ＭＴＳＰタンパク質またはそのドメイン、そのフラグメントまたはキメ
ラタンパク質を適当な宿主中で発現する発現ベクターの部分であるＭＴＳＰタン
パク質をコードしている核酸が含まれる。特に、そのような核酸はＭＴＳＰタン
パク質をコードしている領域に作用的に結合されたプロモーター、誘導型または
構成型の、および任意に組織特異性のプロモーターを有する。他の特定の具体例
では、配列をコードしているＭＴＳＰタンパク質およびいずれかの他の所望の配
列が、ゲノム中所望の位置にて、相同組換えを促進する領域と隣接して、ＭＴＳ
Ｐタンパク質核酸の染色体内での発現を提供している核酸分子が用いられる（Ko
ller and Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935 (1989); Zijls
tra et al., Nature 342:435-438 (1989)）。
【０３７９】 対象への核酸の送達は、直接的であっても、この場合、対象は核酸または核酸
を運搬しているベクターに直接曝される、または間接的であってもよく、この場
合、細胞はまずインビトロで核酸を用いて形質転換され、次いで対象に移植され
る。これらの２つの手段はそれぞれインビボまたはエキソビボ遺伝子治療として
知られる。
【０３８０】 特定の具体例では、核酸はインビボで直接投与され、発現されてコードされた
産物を生成する。これは、当該分野で公知の多くの方法のいずれかにより、例え
ば、それを適当な核酸発現ベクターの部分として構築し、次いで、不完全または
弱毒化されたレトロウイルスまたは他のウイルスベクターを用いて感染させるこ
とにより細胞内のものとなるよう投与されることにより（Ｕ．Ｓ．特許第４,９
８０,２８６を参照されたい）、または裸のＤＮＡを直接注射することにより、
または微細粒子衝撃（例えば遺伝子銃、Biolistic, Dupont）、または脂質また
は細胞表面レセプターまたは形質移入剤でのコーティング、またはリポソーム、
微粒子、または微小カプセル内への封入を用いることにより、または核に入るこ
とが知られているペプチドに結合させてそれを投与することにより、レセプター
媒介性エンドサイトーシスを受けるリガンドに結合させてそれを投与することに
よる（例えば、Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)を参照された
い）（これらは、レセプターを特異的に発現している細胞タイプを標的するのに
用いられることができる）などにより達成されることができる。他の具体例では
、リガンドが粉砕されたエンドソームに対して融合を形成する(fusiogenic)ウイ
ルスペプチドである核酸-リガンド複合体を作成することができ、これにより核
酸のリソソームによる分解が回避される。さらに他の具体例では、核酸をインビ
ボで、特異的レセプターを標的化することにより細胞特異的な取り込みおよび発
現を指向させることができる（PCT 公開WO 92/06180 dated April 16, 1992 (Wu
et al.); WO 92/22635 dated December 23, 1992 (Wilson et al.); WO92/2031
6 dated November 26, 1992 (Findeis et al.); WO93/14188 dated July 22, 19
93 (Clarke et al.), WO 93/20221 dated October 14, 1993 (Young)を参照され
たい）。別法として、核酸を細胞内に導入し、発現のための宿主細胞ＤＮＡに、
相同組換えにより組み込むことができる（Koller and Smithies, Proc. Natl. A
cad. Sci. USA 86:8932-8935 (1989); Zijlstra et al., Nature 342:435-438 (
1989)）。
【０３８１】 特定の具体例では、ＭＴＳＰタンパク質核酸を含むウイルスベクターが用いら
れる。例えば、レトロウイルスベクターを用いることができる（Miller et al.,
Meth. Enzymol. 217:581-599 (1993)を参照されたい）。これらのレトロウイル
スベクターは、ウイルスゲノムの封入および宿主細胞ＤＮＡへの統合に必要でな
いレトロウイルス配列を削除すべく変更されている。遺伝子治療に用いられるＭ
ＴＳＰタンパク質核酸は、遺伝子の対象への送達を促進するベクターにクローニ
ングされる。レトロウイルスベクターについてのさらなる詳細はBoesen et al.,
Biotherapy 6:291-302 (1994)に見出すことができ、ここには、化学治療にもっ
と耐性のある幹細胞を作成するためにｍｄｒ１遺伝子を血液生成幹細胞に送達す
るレトロウイルスベクターの使用が記載されている。遺伝子治療におけるレトロ
ウイルスベクターの使用を説明している他の参考文献は、Clowes et al., J. Cl
in. Invest. 93:644-651 (1994); Kiem et al., Blood 83:1467-1473 (1994); S
almons and Gunzberg, Human Gene Therapy 4:129-141 (1993); and Grossman a
nd Wilson, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114 (1993)である。
【０３８２】 アデノウイルスは、遺伝子治療に用いられることができる他のウイルスベクタ
ーである。アデノウイルスは、呼吸器上皮に遺伝子を送達するのに特に魅力的な
ビヒクルである。アデノウイルスは、自然には、呼吸器上皮に感染し、そこで穏
やかな疾患を引き起こす。アデノウイルスに基づく送達系のための他の標的は、
肝臓、中枢神経系、内皮細胞および筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞
に感染することができるという利点を持つ。Kozarsky and Wilson, Current Opi
nion in Genetics and Development 3:499-503 (1993)は、アデノウイルスに基
づく遺伝子治療の総説を示す。Bout et al., Human Gene Therapy 5:3-10 (1994
)は、アカゲザルの呼吸器上皮に遺伝子を輸送するためのアデノウイルスベクタ
ーの使用を示した。遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用に関する他の例は
、Rosenfeld et al., Science 252:431-434 (1991); Rosenfeld et al., Cell 6
8:143-155 (1992); and Mastrangeli et al., J. Clin. Invest. 91:225-234 (1
993)に見出すことができる。
【０３８３】 アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）が、遺伝子治療における使用のためにさらに提
案されている（Walsh et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300 (1993
)）。 遺伝子治療に対する他の手段は、遺伝子を組織培養物中の細胞に、エレクトロ
ポーレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクショ
ン、またはウイルス感染などの方法により形質移入することが含まれる。たいて
い、形質移入の方法には、適当なマーカーの細胞への輸送が含まれる。細胞は次
いで、摂りこまれたおよび形質移入された遺伝子を発現している細胞を単離する
ための選択下に置かれる。これらの細胞は、次いで対象に送達される。
【０３８４】 この具体例では、核酸は、生じた組換え細胞のインビボ投与の前に細胞に導入
される。そのような導入は、制限されるものではないが、トランスフェクション
、エレクトロポーレイション、マイクロインジェクション、核酸配列を含むウイ
ルスまたはバクテリオファージベクターを用いる感染、細胞融合、染色体媒介性
遺伝子輸送、マイクロセル媒介遺伝子輸送、スフェロプラスト融合などを含む当
該分野で公知の方法により行われることができる。外来遺伝子の細胞への導入に
関する多くの技術が当該分野で公知であり（例えば、Loeffler and Behr, Meth.
Enzymol. 217:599-618 (1993); Cohen et al., Meth. Enzymol. 217:618-644 (
1993); Cline, Pharmac. Ther. 29:69-92 (1985)を参照されたい）、レシピエン
ト細胞に関して必要な発生機能および生理機能が破壊されない限り用いられてよ
い。該技術は、核酸が細胞により発現され、その細胞継代により好ましくは遺伝
され、および発現されるように、核酸の細胞への適当な輸送を提供すべきである
。
【０３８５】 生じた組換え細胞は、当該分野で公知の種々の方法により対象に送達されるこ
とができる。好ましい具体例では、上皮細胞は例えば皮下に注射される。他の具
体例では、組換え皮膚細胞を対象への皮膚移植片として適用してよい。組換え血
液細胞（例えば、血液生成幹細胞または継代細胞）は、好ましくは静脈内に投与
される。使用が想定される細胞の量は、所望される効果、対象の状態などに依存
し、当該分野の専門家により決定されることができる。
【０３８６】 核酸を遺伝子治療の目的のために導入することができる細胞には、所望の、入
手可能な細胞型が含まれ、制限されるものではないが、上皮細胞、内皮細胞、ケ
ラチノサイト、繊維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球
、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球などの血液細胞、種々の幹
細胞または継代細胞、特に例えば骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝臓などから得ら
れる血液生成幹細胞または継代細胞が含まれる。
【０３８７】 好ましい具体例では、遺伝子治療に用いられる細胞は、対象自身のものである
。組換え細胞が遺伝子治療に用いられる具体例では、ＭＴＳＰタンパク質核酸が
、細胞またはその継代により発現され得るよう細胞に導入され、組換え細胞は、
次いでインビボで治療効果を得るべく投与される。特定の具体例では、幹細胞ま
たは継代細胞が用いられる。インビトロで単離および維持することができる幹細
胞および／または継代細胞は、この具体例に従い潜在的に用いられることができ
る。そのような幹細胞には、制限されるものではないが、血液生成幹細胞（ＨＳ
Ｃ）、皮膚および消化管の内層などの上皮組織の幹細胞、胎児心筋細胞、肝臓幹
細胞（ＰＣＴ公開ＷＯ９４／０８５９８、１９９４年４月２８日出願）および神
経幹細胞（Stemple and Anderson, Cell 71:973-985 (1992)）が含まれる。
【０３８８】 上皮幹細胞（ＥＳＣ）またはケラチノサイトは、皮膚および消化管内層などの
組織から、公知の方法（Rheinwald, Meth. Cell Bio. 21A:229 (1980)）により
得ることができる。皮膚などの層状上皮組織では、基底層に最も近い胚細胞層内
部の幹細胞の有糸分裂により再生が起こる。消化管の内層内の幹細胞により、こ
の組織再生の速度が速まる。対象の皮膚または消化管の内層から得られるＥＳＣ
またはケラチノサイトは、組織培地中で増殖することができる（Rheinwald, Met
h. Cell Bio. 21A:229 (1980); Pittelkow and Scott, Mayo Clinic Proc. 61:7
71 (1986)）。ドナーによりＥＳＣが提供される場合、宿主対移植片反応の抑制
のための方法（例えば、照射、穏やかな免疫抑制を促進するための薬物または抗
体の投与）を用いることもできる。
【０３８９】 血液新生幹細胞（ＨＳＣ）に関して、ＨＳＣのインビトロでの単離、増殖、お
よび維持を提供するあらゆる方法を、この具体例において用いることができる。
これを行うことができる方法には、（ａ）将来予定される宿主、またはドナーか
ら単離された骨髄細胞からのＨＳＣ培養物の単離および確立、または、（ｂ）同
種または異種であってよい、すでに確立された長期ＨＳＣ培養物の使用が含まれ
る。好ましくは非自己ＨＳＣが、予定される宿主／対象の移植免疫反応を抑制す
る方法と組み合わせて用いられる。特定の具体例では、ヒト骨髄細胞は、針吸引
により後部腸骨稜から得られることができる（例えば、Kodo et al., J. Clin.
Invest. 73:1377-1384 (1984)を参照されたい）。好ましい具体例では、ＨＳＣ
は、かなり濃縮することができ、または実質上純粋な形態にすることができる。
濃縮は、長期培養前、長期培養中、または長期培養後に行うことができ、当該分
野で公知の方法により行うことができる。骨髄細胞の長期培養は、例えば、変更
されたＤｅｘｔｅｒ細胞培養法（Dexter et al., J. Cell Physiol. 91:335 (19
77)）またはＷｉｔｌｏｃｋ−Ｗｉｔｔｅ培養法（Witlock and Witte, Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 79:3608-3612 (1982)）を用いることにより、確立および維
持されることができる。 特定の具体例では、遺伝子治療のために導入される核酸には、核酸の発現が、
適当な転写誘導因子の存在または不在を制御することにより制御されるようにコ
ーディング領域に作用的に結合される誘導型プロモーターが含まれる。
【０３９０】 ３．プロドラッグ 腫瘍を治療するための方法が提供される。該方法は、ＭＴＳＰにより特異的に
切断されるプロドラッグを投与して、活性薬物を放出させることにより行われる
。ＭＴＳＰ活性を発現する細胞と接触させた際、プロドラッグは活性薬物に変換
される。プロドラッグは、結合物にては賦活性であるか、または細胞に入ること
ができないが、切断されると活性化されるよう、標的化されるＭＴＳＰのための
基質に結合された抗腫瘍薬、細胞毒性剤または他の治療剤を含む結合物であり得
る。例えばプロドラッグは、好ましくは比較的短い、約１０アミノ酸ペプチド未
満の、標的化されるＭＴＳＰにより選択的にタンパク質分解切断されるオロゴペ
プチドを含むことができる。細胞毒性剤には、制限されるものではないが、アル
キル化剤、抗増殖剤およびチューブリン結合剤が含まれる。他には、ビンカ薬、
ミトマイシン、ブレオマイシンおよびタキサンが含まれる。
【０３９１】 Ｍ．動物モデル 形質転換動物モデルが、本明細書中に提供される。そのような動物は、まず、
染色体中のＭＴＳＰタンパク質遺伝子と生物学的に不活性化された外来ＭＴＳＰ
タンパク質遺伝子の間の相同性組換えを（好ましくは異種配列、例えば抗生物質
耐性遺伝子などの挿入により）起こすことにより作成されることができる。好ま
しい態様では、この相同性組換えは、胎児由来の幹（ＥＳ）細胞に、挿入不活性
化ＭＴＳＰタンパク質遺伝子を、相同性組換えが起こるように形質移入した後、
ＥＳ細胞を胚盤に注射し、次いで胚盤胞をフォスターマザーに移植し、その後Ｍ
ＴＳＰタンパク質遺伝子が不活性化されているキメラ動物（「ノックアウト動物
」）を誕生させることにより行われる（Capecchi, Science 244:1288-1292 (198
9)を参照されたい）。キメラ動物はさらなるノックアウト動物を作成するべく繁
殖させることができる。そのような動物は、マウス、ハムスター、ヒツジ、ブタ
、ウシなどが含まれ得、好ましくはヒト以外の動物である。特定の具体例では、
ノックアウトマウスが作成される。
【０３９２】 そのようなノックアウト動物は、不完全な腫瘍疾患を進行させる、またはそれ
らの疾患に罹患しやすいことが予想され、そのため、そのような病気の動物モデ
ルとして用いて、例えばそのような病気または疾患を治療または予防する能力に
関して試験分子をスクリーニングすることができる。従って動物モデルが提供さ
れる。そのような動物は、まず、その染色体中のＭＴＳＰ遺伝子と、過剰発現さ
れる、もしくは誤発現される（好ましくは強いプロモーター下での発現により）
外来ＭＴＳＰタンパク質遺伝子の間の相同性組換えを促進することによりまず作
成されることができる。好ましい態様では、この相同性組換えは、胎児由来の幹
（ＥＳ）細胞に、相同組換えが起こるように、過剰発現または誤発現されるＭＴ
ＳＰタンパク質遺伝子を含むベクターを形質移入し、次いでそのＥＳ細胞を胚盤
胞に注射し、次いで胚盤胞をフォスターマザーに移植した後、ＭＴＳＰタンパク
質遺伝子が過剰発現または誤発現されるキメラ動物を誕生させることにより行わ
れる(Capecchi, Science 244:1288-1292 (1989)を参照されたい。）。キメラ動
物は、ＭＴＳＰタンパク質が過剰発現または誤発現された動物をさらに作成する
べく繁殖させることができる。そのような動物はマウス、ハムスター、ヒツジ、
ブタ、ウシなどであり得、好ましくはヒト以外の動物である。特定の具体例では
、ＭＴＳＰタンパク質が過剰発現した、または誤発現したマウスが作成される。
【０３９３】 以下の実施例は、説明目的のためだけに添付したものであり、発明の範囲を制
限しようとするものではない。 実施例1 MTSP3のクローニング、プロテアーゼドメインMTSP3のクローニングおよび変異誘
発 1. MTSP3の同定およびクローニング a. AI924527およびAI924182のESTクローンの、セリンプロテアーゼMTSP3の一部
としての同定 ヒト前立腺癌セルラインPC-3からプロテアーゼMTSP1と命名されたプロテアー
ゼドメインをコードするDNAを、変性オリゴヌクレオチドプライマーを用いて独
立にクローン化し、配列および性質を確認した（実施例6参照）。MTSP1のクロー
ニングに用いたセンス変性プライマーの配列は5'-TGGRT（I）VT（I）WS（I）GC
（I）RC（I）CAYTG-3' （配列番号： 13）であり、アンチセンスプライマーの配
列は5'-（I）GG（I）CC（I）CC（I）SWRTC（I）CCYT（I）RCA（I）GHRTC-3' （
配列番号：14）である。上記配列において、R＝A、G、V＝G、A、C；W＝A、T; S
＝G、C; Y＝C、T; H＝A、T、Cである。これらのプライマー配列は全セリンプロ
テアーゼにおいて非常に良く保存されている領域に対応するものであり、400か
ら500塩基対のPCR産物を増幅させる。MTSP1は、その後マトリプターゼ(Matripta
se)と同一であると確認された（Genbank 識別番号AF118224; Takeuchi et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA、96（20）:11054-61 （1999）およびLin et al.,
J. Biol. Chem.,274（26）:18231-6 1999も参照のこと）。
【０３９４】 セリンプロテアーゼMTSP1のプロテアーゼドメインのタンパク質配列を用いて
、ナショナル・センター・フォア・バイオテクノロジー・インフォメーション（
the National Center for Biotechnology Information）（Bethesda、MD; www.n
cbi.nlm.nih.gov）のESTデータベース（dbEST）において、MTSP1と同一もしくは
類似の配列を含有するESTクローンを検索アルゴリズム「tblastn」を用いて検索
した。この「tblastn」アルゴリズムはタンパク質の配列をヌクレオチド配列デ
ータベースに対して入力し、これを６つのリーディングフレーム全てについて（
両鎖）ヌクレオチド配列に翻訳するものである。ヒト肺腫瘍組織より誘導された
、同一の２つのESTクローンの配列（NCI_CGAP_Lu19 AI924527およびAI924182）
は43%の相同性をMTSP1 タンパク質配列に対して示した。続いてGenBankおよびSw
issProtデータベースを用いてこのEST配列AI924527およびAI924182を検索したが
、MTSP1のマッチング配列は見出されなかった。このことは、ESTクローンAI9245
27およびAI924182に含まれる配列は、新規セリンプロテアーゼの一部である可能
性を示唆する。
【０３９５】 b. 別の膜型セリンプロテアーゼMTSP3のcDNAフラグメントのPCRクローニング ヒト肺癌(LX-1）由来の二本鎖Marathon-Ready（商標）cDNAライブラリーをClo
ntech（Palo Alto、CA; カタログ番号7495-1）から得、テンプレートとして用い
た。２つのプライマー、5'-TCACCGAGAAGATGATGTGTGCAGGCATCC-3' （配列番号：1
5） （センスプライマー）、および5'-GGGACAGGGGCTGTAAGGCAGGGAATGAG-3' （配
列番号：16） （アンチセンスプライマー）を用いて〜360bpのDNAフラグメント
を増幅した。PCR産物を2% アガロースゲル上で分離し、ゲル抽出キット（カタロ
グ番号 28706; QIAquick gel extraction kit; Qiagen）を用いて精製した。精
製したDNAフラグメントをTAベクター（カタログ番号 K4500-01; TOPO-TA クロー
ニングキット、Invitrogen, Carlsbad, CA）へライゲートした。大腸菌細胞をこ
れにて形質転換し、プラスミドを単離しEcoRI制限酵素にて分析した。挿入され
たDNAを含むクローンをさらに蛍光染色DNA配列決法（カタログ番号 4303149; Am
pliTaq DNAポリメラーゼを用いるBigDyeターミネーターサイクル配列決定キット
; Perkin Elmer, Lincoln, CA）にてさらに分析した。
【０３９６】 得られたDNA配列を分析し、MTSP1 タンパク質配列に対して43%の相同性を有す
ることを見出した。この結果はLX-1 cDNAライブラリーが所望の核酸分子を含有
することを示す。これを用いて、プロテアーゼ全長を含むcDNAを単離した。
【０３９７】 c. 5'-および3'- cDNA末端の迅速増幅（Rapid amplification of cDNA ends：R
ACE） このセリンプロテアーゼ（以下、MTSP3という）をコードする全長cDNAを得る
ために、5'-および3'-RACE反応を行った。ヒト肺癌（LX-1）由来のMarathon-Rea
dy cDNAライブラリー をMTSP3をコードするcDNA の5'および3'末端を決定するた
めに用いた。Marathon-Ready cDNA は特にRACE反応のために調製されたものであ
る。２つの遺伝子特異的プライマー、5'-CCCGCAGCCATAGCCCCAGCTAACG-3' （配列
番号17）を5'-RACE 反応へ、そして5'-GCAGACGATGCGTACCAGGGGGAAGTC-3' （配列
番号18）を3'-RACE反応へ用いた。それぞれ欠損5'および3'末端配列に対応する
およそ1.8 kbpおよび0.85 kbpの二つのフラグメントを単離した。これらのフラ
グメントを上述のごとくサブクローンニングした。得られたクローンをさらに、
RACE反応に用いた2つのプライマーを含む内部cDNAフラグメントとのサザン分析
、およびDNA配列分析により解析した。
【０３９８】 d. MTSP3の全長プロテアーゼドメインをコードするcDNAのPCR増幅 プロテアーゼドメインMTSP3をコードするcDNAフラグメントを、遺伝子特異的
プライマーを用いた端−端PCR増幅法にて増幅させた。5'末端用として5'-CTCGAG
AAAAGAGTGGTGGGTGGGGAGGAGGCCTCTGTG-3' （配列番号19）を、および3'末端用と
して5'-GCGGCCGCATTACAGCTCAGCCTTCCAGAC-3' （配列番号20）を用いた。5'プラ
イマー はMTSP3 プロテアーゼドメインの開始部（VVGGEEASV）をコードする配列
（下線部）を含有する。3'プライマーはMTSP3のストップコドンを含有する。約7
00-bpのフラグメントが増幅され、これをピチア・パストリス(Pichia pastoris)
発現ベクター、pPIC9Kへサブクローン化した。
【０３９９】 ｅ. MTSP3のC310S変異誘発 MTSP3 タンパク質のプロテアーゼドメインが発現した際またはザイモゲンが活
性化された場合に存在する遊離のシステイン（配列番号4中310位）を除くため、
310位の遊離システイン（配列番号3参照）（キモトリプシン番号付法によればCy
s122 ）をセリンと置き換えた。得られたベクターをpPIC9K:MTSP3C122Sと名づけ
た。
【０４００】 プロテアーゼドメインMTSP3をコードする遺伝子の変異をPCR SOE 法（オーバ
ーラップ延長によるPCR下スプライシング法:PCR-based splicing by overlap ex
tension）にて誘発し、310位（キモトリプシン番号付システムによれば122位）
の不対システインをセリンと置換した。それぞれが310位にセリンをコードするT
CTコドンを含む２つのオーバーラップ遺伝子フラグメントをPCRにより以下のプ
ライマーを用いて増幅した:5'遺伝子フラグメント用として、TCTCTCGAGAAAAGAGT
GGTGGGTGGGTGGGGAGGAGGCCTCTGTG（配列番号51）、およびGCTCCTCATCAAAGAAGGGCA
GAGAGATGGGCCTGACTGTGCC（配列番号52）;3'遺伝子フラグメント用として、ATTCG
CGGCCGCATTACAGCTCAGCCTTCCAGAC （配列番号53）およびGGCACAGTCAGGCCCATCTCTC
TGCCCTTCTTTGATGAGGAGC （配列番号54）。増幅された遺伝子フラグメントを1%
アガロースゲル上で精製し、混合し、再度PCR増幅してMTSP3C122Sの全長コーデ
ィング配列を得た。次いでこの配列を制限酵素 NotIおよびXhoIにより切断し、
ベクター pPic9K中へライゲートした。
【０４０１】 2. 配列分析 Macベクター （バージョン6.5; Oxford Molecular Ltd., Madison, WI）を用
いて得られた全てのDNAおよびタンパク質配列を分析した。MTSP3をコードする全
長cDNAは2,137塩基対から成り、最も長いものが1,314塩基対というオープン・リ
ーディング・フレームを有し、これは437-アミノ酸タンパク質配列へと翻訳され
る。プロテアーゼドメインMTSP3をコードするcDNAフラグメント（nt 873-1,574
）は702塩基対から成り、233-アミノ酸タンパク質配列へと翻訳され、さらにス
トップコドンを含む。MTSP3のDNA配列および翻訳されるタンパク質配列を配列番
号3および4へそれぞれ示した。
【０４０２】 3. 発現ベクターの構築 MTSP3全長タンパク質をコードするDNAであって、C310Sポイントミューテーシ
ョンを含むもの（即ち、MTSP3C122S）をpPIC9K:MTSP3C122Sよりクローン化した
。プライマー MTSP3: 5' GAATTCCATATGCCGCGCTTTAAAGTGGTGGGTGGGGAGGAGGCC 配列番号47 （NdeI 制限
部位含有）および MTSP3- 3' GGGATACCCGTTACAGCTCAGCCTTCCAGAC 5' 配列番号4
8 （BamHI制限部位含有）を用いて、ザイモゲン活性化に際してプラスミン認識
配列配列（PRFK）を用いるヒトMTSP3C122S プロテアーゼドメインのPCR増幅を行
った。増幅は、50μｌ中に10 mM KCl、20 mMのトリス-HCl （25℃でpH 8.8）、1
0 mM （NH4）2SO4、2.0 mM MgSO4 、0.1% トリトンX-100、0.3 mM dNTPs、5.0ユ
ニットのベント（vent）DNAポリメラーゼ、および100 pmolのプライマーを含有
する中で行った。反応混合物を95℃で5分加熱し、続いて95、60、および75℃そ
れぞれ30秒ずつの温度サイクルを2530サイクル実施し、最後に75℃で2分間、最
終延長を行った。
【０４０３】 QIAquick PCR精製キット（QIAGEN Inc., Chatsworth、CA）を用いてPCR産物を
精製した。全長オリゴヌクレオチドを10ユニットのBamHIおよび20ユニットのNde
Iの二つで2時間、37℃にて消化させた。消化フラグメントを1.3%アガロースゲル
上で精製し、エチジウムブロマイドで染色した。MTSP3C122SをコードするDNAの
バンドを切りだし、QIAEX II ゲル抽出キットを用いて精製した。
【０４０４】 MTSP3C122SをコードするDNAを、次いでpET19b ベクター（Novagen）のNdeIお
よびBamHI部位へ、標準的な方法を用いてクローン化した。このベクターは金属
アフィニティクロマトグラフィー（MAC）による精製におけるHIS6 タグを許容す
るものである。コンピテントXL1 Blue細胞（Stratagene）をpET19b-MTSP3C122S
ベクターにて形質転換し、 プラスミドストックを得るために用いた。確実な挿
入およびDNA配列を蛍光熱色素DNA配列決定方法および制限酵素処理により確認し
た。
【０４０５】 4. タンパク質発現、精製およびリフォールディング 遺伝子産物の過発現を希少コドン最適化（rare codon optimization)(例えばG
arcia ら（1986） Cell 45:.453-459参照）に用いられるDNAYプラスミドを含有
する大腸菌BL21株（DE3）（Novagen、Madison WI）を用いて行った。細胞を、37
℃にてカルベニシリンおよびカナマイシンをそれぞれ最終濃度が50μg/mlおよび
34μg/mlとなるように添加した（2xYT）培地にて培養した。１リットルの培地中
へ、10mlの同培地における一晩培養物を添加した。細胞を、その密度が0.6 1.0
OD600 となるまで増殖させ、次いでIPTG（最終濃度1.0 mM）を添加した。細胞
をさらに4時間増殖させた後、回収した。
【０４０６】 細胞のペレットを20 mLのリシスバッファー（50 mM Na2HPO4、300 mM NaCl、p
H 7.4）中へ再懸濁させた。細胞懸濁物を10-20 mgのリソザイムで処理し、37℃
で１時間インキュベートした。次いでDNaseI（1-2mg）を添加し、溶液の粘稠性
が無くなるまで混合した。溶液を次いでロゼットフラスコへ移し、氷上に保持し
て強い超音波を15分間当てた。20K rpm （〜48,000g）、4℃にて30分間遠心分離
して封入体のペレットを得た。
【０４０７】 封入体をダウンシング（douncing）により洗浄した、２回、50 mM Na2HPO4、3
00 mM NaCl、5% LADO、pH 7.4 中で洗浄し、次いで２回、50 mM Na2HPO4、300 m
M NaCl、pH 7.4中で洗浄した。封入体（〜 500 mg）は25 mLの6M GuHCl、100 mM
のトリス-HCl、20 mM βMe、pH 8.0中で安定化される。この溶液を20K rpmにて
３０分間回転させ、全ての粒子状成分を下へ落とした。得られた溶液は0.2 μM
のフィルターを通し、100 mLとなるよう可溶化バッファーで希釈した。
【０４０８】 MTSP3C122Sのリフォールディングは、封入体混合物を8 Lのリフォールディン
グバッファー（100 mMのトリス-HCl、150 mM NaCl、5 mM GSH、0.05 mM GSSG、1
M アルギニン、pH 8.0）へペリスタルティックポンプを用いてゆっくりと添加
することによって行った。リフォールディング混合物を４℃で７日間、あるいは
エルマン（Ellman's）試薬により測定されるチオール濃度が１ｍM以下となるま
で攪拌した。溶液を5 μMフィルターへ通し、限外濾過で濃縮し、バッファーをM
AC平衡バッファー（50 mM Na2HPO4、300 mM NaCl、10 mMイミダゾール、pH 8.0
）と、クロスフロー濾過により交換した。得られた溶液を0.2 μMのフィルター
へ通し、FPLC （Amersham-Pharmacia）上にてファルマシア・キレーティング・
セファロースを用いて精製した。溶液をニッケルをロードしたMACへ導入し、流
速1.0mL/minにて50 mM Na2HPO4、300 mM NaCl、pH 8.0中1.0 mM〜1.0 M イミダ
ゾールの直線勾配を用いて溶離した。タンパク質含有フラクションをSDS-PAGEで
調べ、次いでこれを集めて−80℃にて凍結させた。
【０４０９】 少量の精製MTSP3C122Sをプラスミンセファロースを用いて30分間、37℃にて活
性化した。樹脂を14K rpm5分間の遠心分離により沈降させ、タンパク質溶液を取
り出した。得られた溶液の、一連のプロテアーゼ基質、spec-tpa、spec-pl、spe
c-UK、spec-fXIIa （American Diagnostica）、S-2238、S-2266 （Kabi Diagnos
tica）、S-2586、S-2366、S-2444、S-2288、S-2251、S-2302、S-2765、S-2222、
spec-THE （Chromogenix）、spec-fVIIa （Pentapharm）対する活性についてス
クリーニングした。MTSP3C122Sは上記基質のいくつかを切断したが、最も活性が
高かったのはSpec-fXIIa、Spec-tPA、S-2765、Spec-fVIIaおよびS-2444の各基質
に対しての場合であった。
【０４１０】 5. セリンプロテアーゼMTSP3の正常組織および腫瘍組織内における遺伝子発現
プロファイル MTSP3転写物の組織中の分布についての情報を得るため、MTSP3 プロテアーゼ
ドメインをコードするDNA挿入物をプローブとして、７６種類のヒト組織のRNAブ
ロットを行った。（カタログ番号 7775-1;ヒト多組織発現（MTE） 配列; CLONTE
CH, Palo Alto, CA）。認められた発現パターンは、減少していく順に：気管＝
結腸（下行）＝食道＞結腸（上行）＞結腸（横行）＝直腸＞回腸>十二指腸＞空
腸＞膀胱＞イロセカム（ilocecum）＞胃＞腎臓＞盲腸であった。胎児腎臓、およ
び２つの腫瘍セルライン、HeLa S3および 白血病K-562中での発現の頻度はこれ
より低かった。RNAブロット（カタログ番号7780-1、7765-1 & 7782-1;ヒト12-レ
ーン、ヒト筋肉およびヒト消化器系多組織ノーザン（MTN）ブロット; CLONTECH
）を用いてノーザン分析を行い、発現量は回腸において最も豊富であり、食道に
おいて中程度であり、小腸、膀胱および腎臓において低く、胃と直腸においてよ
り少ないことを確認した。〜2.2 kbの単一転写物が検出された。
【０４１１】 マウスへ異種移植したヒト原発腫瘍数種におけるMTSP3転写物を、遺伝子特異
的プライマーを用いて増幅した。MTSP3転写物は肺癌（LX-1）、回腸腺癌（CX-1
）、回腸腺癌（GI-112）および子宮癌（GI-102）において検出された。他の形態
の肺癌（GI-117）、乳癌（GI-101）、膵臓腺癌（GI-103）および前立腺癌（PC3
）においては明確なシグナルは認められなかった。
【０４１２】 実施例2 MTSP4の遺伝子クローンの同定 セリンプロテアーゼMTSP1（マトリプターゼとも呼ばれる）のプロテアーゼド
メインをコードするヌクレオチド配列を用いて、ナショナル・センター・フォア
・バイオテクノロジー・インフォメーション（Bethesda、MD; ＜http://www.ncb
i.nlm.nih.gov＞）の提供するタンパク質データベース（SWISSPROT）中のMTSP1
と同様あるいは同一の配列を検索アルゴリズムブラストックス（blastx）を用い
て検索した。ブラストックス（blastx）アルゴリズムはクエリーヌクレオチド配
列（両鎖）の６−フレームの概念的な翻訳産物 をタンパク質配列データベース
と比較するものである。MTSP1 タンパク質配列と37％の相同性を示すタンパク質
をコードする配列（CAA18442）であって、推定LDL-レセプタードメインおよびト
リプシン様セリンプロテアーゼドメインを含むものが同定された。このタンパク
質をコードする配列（以下、MTSP4とする）は、ヒトクロモソーム22から誘導さ
れ、サンガー・センター・クロモゾーム２２・マッピング・グループ（Sanger C
entre Chromosome 22 Mapping Group）が配列を決定し、公的データベースにヒ
トゲノム解析プロジェクトの一環として提出された遺伝子クローン（AL022314）
によりコードされることが認められた。続いてGenBankデータベースを検索して
、同一配列が無い事を確認した。ESTデータベースを検索したが、ここでもヒト
配列とのマッチングは全く認められず、ヒトESTクローンが公的データベースに
は無いことが認められた。マウスのESTクローン（AI391417およびAA208793）が
存在し、これらはヌクレオチドレベルで88%の相同性をセリンプロテアーゼに対
して示した。
【０４１３】 ハイブリダイゼーションプローブとして用いるための、MTSP4のゲノムDNAフラ
グメントのPCRクローニング MTSP4の組織中での分布プロファイルおよびcDNAのクローニングのための組織
ソースを同定するため、ゲノムフラグメントを２つの遺伝子特異的プライマー、
5'-CCTCCACGGTGCTGTGGACCGTGTTCC-3'（5'プライマー）配列番号21および5'-CCTC
GCGCAAGGCGCCCCAGCCCG-3'（3'プライマー）配列番号22を用いてヒトゲノムDNAか
ら増幅した。これらの２つのプライマーはMTSP4の単一エクソン内の、265塩基対
フラグメントを増幅するものである。フラグメントを次いでヒト組織ノーザンブ
ロット（ヒト12-レーン多組織ノーザン（MTN）ブロット（カタログ番号 7780-1
）; CLONTECH, Palo Alto, CA）上でプローブとして用いた。顕著なバンド（〜2
.6kb）が肝臓内で検出された。比較的弱いシグナルが脳、心臓、骨格筋および腎
臓で得られた。ヒト肝臓が非常に強いシグナルを示したことから、この組織を用
いてMTSP4cDNAの増幅を行った。
【０４１４】 5'-および3'-迅速cDNA末端増幅法（RACE） MTSP4をコードする全長クローンを得るため、5'-および3'-RACE反応を行った
。ヒト肝臓由来Marathon-Ready cDNAライブラリ（CLONTECH）を用いてMTSP4をコ
ードするcDNAの5'および3'末端を得た。Marathon-Ready cDNA クローンは、特に
RACE反応のために作成されたクローンである。２つの遺伝子特異的プライマーを
用いた。5'-GCGTGGCGTCACCTGGTAGCGATAGACCTCGC-3'（配列番号23）は5'-RACE反
応、および5'-CCTCCACGGTGCTGTGGACCGTGTTCC-3'（配列番号24）は3'-RACE反応用
である。最初の5'-RACE反応からはフラグメントが得られなかった。
【０４１５】 その一方で3'-RACE反応は〜1.5 kbpフラグメントを産生した。ネステッドPCR
反応を用いて、最初の5'-RACE反応生成物を得、MTSP4の5'末端部分を得た。ネス
ト化された5'遺伝子-特異的プライマー、5'-CCTCGCGCAAGGCGCCCCAGCCCG-3'（配
列番号25）を用い、〜0.8 kbp フラグメントを産生させた。フラグメントをpCR2
.1-TOPO TAクローニングベクター（Invitrogen, Carlsbad, CA）内へサブクロー
ン化した。得られたクローンをRACE反応において用いられたプライマーを含有す
る内部遺伝子フラグメントをプローブとして用いるサザン分析およびDNA配列分
析により分析した。5'-RACE産物の配列分析により、開始コドンと成り得ると考
えられるコドンが依然として欠損していることがわかった。
【０４１６】 MTSP4のＮ末端をコードする5'cDNA末端を得るため、一般にに入手可能なゲノ
ム配列であるクロモゾーム２２上で、5'-RACEクローンにおいて得られた配列に
対応する配列を検索した。得られたゲノム配列を翻訳し、そのタンパク質配列を
5'RACEクローン配列を翻訳して得た配列と比較した。重複配列を決定した後、開
始コドンと目されるコドンの上流配列に対応する遺伝子特異的オリゴヌクレオチ
ドプライマー、（CGGCCAGAGGGTGATCAGTGAG-3'）配列番号26および、重複領域内
の別の配列に対応する遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマー（5'-CCTCCTC
AGTGCATAGGCATCAAACCAG-3'）配列番号27を用いてヒト肝臓cDNAライブラリーから
ヒトMTSP4の5'cDNAを増幅させた。
【０４１７】 MTSP4のスプライスバリアントおよびドメイン組成 ＰＣＲ増幅においては、常に少なくとも２つのcDNAフラグメントが得られるが
、これはMTSP4のバリアントが複数あることを示すものである。サブクローニン
グおよび配列分析によって、比較的長く、より豊富に得られる型であるMTSP4-L
、および比較的短い型であるMTSP4-Sがあることが示された。コードしたタンパ
ク質は複数-ドメイン、タイプＩＩ膜型セリンプロテアーゼであり、膜通過ドメ
インをＮ末端に有しており、続いてCUBドメイン、3LDLRドメインがあり、Ｃ末端
にトリプシン様セリンプロテアーゼドメインがある。ＭＴＳＰ4のこれら二つの
型の間の相違は、MTSP4-Sには膜貫通およびＣＵＢドメインの間の432-bpのヌク
レオチド配列が無い点である（図２参照）。
【０４１８】 MTSP4の全長プロテアーゼドメインをコードするcDNAのPCR増幅 MTSP4プロテアーゼドメインをコードするcDNAフラグメントを得るために、端
−端PCR増幅を遺伝子特異的プライマーおよびヒト肝臓由来Marathon-Ready cDNA
ライブラリーを用いて行った。用いた２つのプライマーは、5'末端様として5'-T
CTCTCGAGAAAAGAATTGTTGGTGGAGCTGTGTCCTCCGAG-3'（配列番号28）および3'末端用
として5'-AGGTGGGCCTTGCTTTGCAGGGGGGCAGTTC-3'（配列番号29）である。5'プラ
イマーはMTSP4プロテアーゼドメインの開始部分（IVGGAVSSE）を含有する。3'プ
ライマーはストップコドンのすぐ下流の配列に対応する。〜740-bpフラグメント
が増幅され、これをpCR2.1-TOPO TAクローニングベクター中へサブクローン化し
、配列を決定した。
【０４１９】 正常および腫瘍組織におけるMTSP4の遺伝子発現プロファイル MTSP4転写物の遺伝子発現プロファイルを得るため、ＬＤＬ受容体ドメインお
よびプロテアーゼドメインの一部をコードするDNAフラグメントをプローブとし
て用いて76種のヒト組織からなるRNAブロット76 （カタログ番号 7775-1;ヒト多
組織発現（MTE）アレイ; CLONTECH）を得た。ゲルブロットのノーザン分析の場
合のごとく、肝臓に強いシグナルが出た。別の組織のシグナルについて、検索し
た。別組織中のシグナルは、以下の通りである（順にシグナルのレベルが下がる
）:胎児肝臓>心臓＝腎臓＝副腎＝精巣＝胎児心臓および腎臓＝骨格筋＝膀胱＝胎
盤＞脳＝脊髄＝直腸＝胃＝脾臓＝リンパ節＝骨髄＝気管＝子宮＝膵臓＝唾液腺＝
乳腺＝肺。MTSP4は以下の数種の腫瘍セルライン中ではより少ない量しか発現し
ていなかった：HeLa S3＝白血病K-562＝ブルキット（Burkitt's）リンパ腫（Raj
iおよびDaudi）＝結腸直腸腺癌（SW480）>肺癌（A549）＝白血病MOLT-4＝白血病
HL-60。ヌードマウスに異種移植した数種のヒト原発腫瘍由来のcDNAライブラリ
ー（ヒト腫瘍多組織cDNAパネル、カタログ番号 K1522-1、CLONTECH）上でMTSP4
転写物のPCRをMTSP4特異的プライマーを用いて実施した。MTSP4転写物は乳癌（G
I-101）、肺癌（LX-1）、大腸癌（GI-112）および膵臓癌（GI-103）中に検出さ
れた。しかしながらこれらとは別の肺癌（GI-117）、大腸癌（CX-1）、卵巣癌（
GI-102）および前立腺癌（PC3）には認められなかった。MTSP4転写物はまた、癌
セルラインLNCaPおよびPC-3プロテアーゼ、およびHT-1080ヒト繊維芽細胞腫セル
ラインにも認められた。
【０４２０】 配列分析 MTSP4のDNAおよびタンパク質配列をMacVecotr（バージョン6.5; Oxford Molec
ular Ltd., Madison, WI）を用いて配列を分析した。MTSP4-LのORFは 2,409 bp
を含有し、これは802-アミノ酸タンパク質に翻訳される。一方、MTSP4-SのORFは
1,977 bpを含有し、これは658-アミノ酸タンパク質へと翻訳される。両方の形に
おいてプロテアーゼドメインをコードするcDNAは、708 bpを含み、これは235-ア
ミノ酸のタンパク質配列へ翻訳される（配列番号6参考）。MTSP4-L、MTSP4-Sお
よびMTSP4プロテアーゼドメインのDNA配列および翻訳されたタンパク質配列を配
列番号8、10および6にそれぞれ示した。
【０４２１】 実施例3 MTSP6のクローニング MTSP6のゲノムクローンの同定 セリンプロテアーゼMTSP4のプロテアーゼドメインのタンパク質配列（実施例2
参照）、非重複性データベース（全非重複性GenBank CDS翻訳+ PDB + SwissProt
+ PIR + PRF）ナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォ
メーション（Bethesda、MD; ＜http://www.ncbi.nlm.nih.gov＞）上を、MTSP4と
類似もしくは同一のものをtblastn検索アルゴリズムを用いて検索した。「tblas
tn」アルゴリズムは、タンパク質のクエリー配列をヌクレオチド配列データベー
スを全てのリーデイングフレームと対応させて翻訳したものと比較するものであ
る。クエリーMTSP4配列（55 アミノ酸）との60％相同性を有するタンパク質（55
アミノ酸）を、AC015555（ヌクレオチド番号15553〜15717）のゲノム配列殻得
た。このタンパク質を以降はMTSP6と呼ぶ。GenBankデータベースを続いて検索し
たが、MTSP6をコードするcDNAを含んでいなかった。
【０４２２】 MTSP6と最も高いホモロジーを示した遺伝子はヒト膜貫通セリンプロテアーゼ
２（GenBank識別番号U75329; Swissprot識別番号O15393）であり、これは比較し
た45アミノ酸領域内においてMTSP6と66%の相同性を有していた。結果として、MT
SP6プロテアーゼドメインをコードするヌクレオチド配列が、ヒト膜貫通セリン
プロテアーゼ2のプロテアーゼドメインのタンパク質配列とAC015555ヌクレオチ
ド配列の６つの読み取り枠での翻訳物とを比較することによって、得られた。翻
訳されたMTSP6ヌクレオチド配列から得られたタンパク質配列は全体で50%の相同
性をヒト膜貫通セリンプロテアーゼ２に対して示した。ESTデータベースの検索
により、7つのMTSP6 ESTクローン（AA883068、AW591433、AI978874、AI469095、
AI935487、AA534591およびAI758271）の存在が明らかとなった。
【０４２３】 ヒトMTSP6全長cDNAのクローニング 上述のデータベース検索により同定された、MTSP6プロテアーゼドメイン領域
をコードするcDNAを得るため、２つの遺伝子特異的プライマー、Ch17-NSP-1、5'
-TCACGCATCGTGGGTGGAACATGTCC-3'（5'プライマー）配列番号30およびCh17-NSP-2
AS、5'-ACCCACCTCCATCTGCTCGTGGATCC-3'配列番号31（3'プライマー）を用いてPC
Rを行った。これらの２つのプライマーは708-塩基対フラグメントをヒト乳腺癌c
DNA（Clontech Marathon-Ready cDNA、Cat. No. 7493-1）から増幅させた。
【０４２４】 MTSP6の残りの、未知cDNAを得るために、5'-および3'-RACE反応をヒト乳腺癌
上で実施した。Marathon-Ready cDNAは特にRACE反応用に作成されたものである
。最初のRACE反応は、Marathon cDNAアダプタープライマー1（AP1）および遺伝
子特異的プライマーCh17-NSP-2AS（5'-RACE反応用）5'- ACCCACCTCCATCTGCTCGTG
GATCC-3'配列番号31およびCh17-NSP-1（3'-RACE反応用）5'-TCACGCATCGTGGGTGGA
ACATGTCC-3'配列番号30を用いたPCRにて行った。PCR産物をアガロースゲルより
精製した。第2のネステッドPCRを続いてMarathon cDNA アダプタープライマー 2
（AP2）、および遺伝子特異的プライマーCh17-NSP-3AS（5'-RACE反応用）5'-CCA
CAGCCTCCTCTCTTGACACACCAG-3'配列番号32（最初の5'-RACE産物をテンプレートと
して使用）およびCh17-NSP-3（3'-RACE反応用）5'-ACGCCCCTGTGGATCATCACTGCTGC
-3'配列番号33（最初の3'-RACE産物をテンプレートとして使用）を用いて行った
。最初の5'-および3'-RACE産物はプライマーCh17-NSP-3およびCh17-NSP-4ASを用
いるPCR反応のテンプレートとしても用いられ、プローブとして使用するためのc
DNAフラグメントを得る。RACE反応によるPCR産物のうち700 bpより大きい物は切
り捨て、およびアガロースゲルから精製し、そしてpCR2.1-TOPOクローニングベ
クター（Invitrogen, Carlsbad, CA）へサブクローニングした。コロニーハイブ
リダイゼーションを行ってMTSP6配列を含む陽性クローンを同定した。陽性クロ
ーンの同定は、PCR反応（プライマーCh17-NSP-3およびCh17-NSP-4AS）およびDNA
配列決定によって得られた495 bp DNAフラグメントにより行った。
【０４２５】 5'-RACE産物の配列分析により、さらに420 bpの上流配列を得た。開始コドン
となりうるコドンは5'-RACE配列には含まれていなかった。ネステッド5'-RACE反
応を、AP2および遺伝子特異的プライマー（新RACE配列に基づきデザインした）C
h17-NSP-5AS 5'-TCCCTCCCTCACATATACTGAGTGGTG-3'配列番号34により、最初の5'
-RACEにより得られたPCR産物をテンプレートとして再度行った。Ch17-NSP-6 5'-
CGACTGCTCAGGGAAGTCAGATGTCG-3'配列番号35（新たな5'-RACE配列をもとにデザイ
ンした）およびCh17-NSP-5ASを用いて得た367 bpのPCR産物を陽性クローンを同
定するために用いた。さらに480 bpの配列を第2の5'-RACE産物より得た。ATG開
始コドンと成り得るコドンが配列：GTCACCATGG（配列番号12のヌクレオチド262-
272、明らかにコザック（Kozak）配列（GCC （A/G） CCAUGG）であり、このATG
がMTSP6の開始コドンであることが推測される。
【０４２６】 3'-RACE反応を、Marathon Readyヒト乳腺癌cDNAを用いてMTSP6の残りの3'末端
を得るために行ったが、成功しなかった。得られた3'-RACE産物の配列はもっぱ
らMTSP6のコード領域がMarathon AP2プライマー配列で切断されたcDNAである。
【０４２７】 MTSP6の3'末端配列は、Ch17-NSP-3（5'-ACGCCCCTGTGGATCATCACTGCTGC-3';配列
番号33）およびCh17-NSP-4（5'-CTGGTGTGTCAAGAGAGGAGGCTGTGG-3';配列番号37）
を、ESTクローンAA883068の配列をもとにデザインされ、明らかにMTSP6配列の3'
末端をカバーするアンチセンスプライマーCh17-NSP-7AS（5'-ACTCAGGTGGCTACTTA
TCCCCTTCCTC-3'; 配列番号38）およびヒト小腸cDNA（Clontech）をテンプレート
として用いて得た。２つのPCR産物（それぞれ650bpおよび182bp）を得、DNA配列
分析により両方のPCR産物がストップコドンを含有することを確認した。
【０４２８】 MTSP6の配列分析およびドメイン配置 MTSP6のDNAおよびタンパク質配列をDNAストライダー（Strider）（バージョン
1.2）を用いて分析した。MTSP6のORFは1,362 bpで構成され、これは453-アミノ
酸タンパク質へと翻訳される。http://smart.embl-heidelberg.de predictsにあ
るSMART（Simple Modular Architecture Research Tool）プログラムを用いたタ
ンパク質配列解析により、MTSP6がマルチドメインのタイプII膜型セリンプロテ
アーゼであって、Ｎ末端に膜貫通ドメイン（アミノ酸48-68）を有し、次いでLDL
Raドメイン（LDLレセプタードメインクラスa）（アミノ酸72-108）、SRドメイン
（スカベンジャーレセプターCys-リッチドメイン）（アミノ酸109-205）、およ
びトリプシン様セリンプロテアーゼドメイン（アミノ酸216-443）（参照 図３
）を有するものであると推測された。
【０４２９】 MTSP6の正常組織および腫瘍組織における遺伝子発現プロファイル MTSP6転写物の遺伝子発現プロファイルを得るため、プライマーCh17-NSP-3お
よびNSP-4ASを用いたPCR反応によって得られた495 bpのDNAフラグメントを７６
種のヒト組織から構成されるＲＮＡブロット（カタログ番号 7775-1;ヒト多組織
発現（MTE）アレイ; CLONTECH）のプローブとして用いた。最も強いシグナルは
十二指腸に認められた。他のシグナルの認められた組織は以下の通りである（以
下の順にシグナルレベルが減少する）：胃＞気管＝乳腺＝甲状腺＝唾液腺＝脳下
垂体＝膵臓>腎臓>肺>空腸＝回腸＝イロセカム（ilocecum）＝盲腸＝胎児腎臓>胎
児肺。非常に弱いシグナルが他の複数の組織で認められた。MTSP6は数種の腫瘍
セルライン、即ちHeLa S3>大腸癌（SW480）>白血病MOLT-4>白血病K-562にも認め
られた。数種のヒト原発腫瘍をヌードマウスへ異種移植して得られたcDNAライブ
ラリー（ヒト腫瘍多組織cDNAパネル、カタログ番号 K1522-1、CLONTECH）上のMT
SP6転写物のＰＣＲ分析を、 MTSP6-特異的プライマー（Ch17-NSP-3およびCh17-N
SP2AS）を用いて行った。MTSP6転写物は肺癌（LX-1）において強く検出され、膵
臓癌（GI-103）では中程度に検出され、卵巣癌（GI-102）では弱く;および直腸
癌（GI-112およびCX-1）、乳癌（GI-101）、肺癌（GI-117）および前立腺癌（PC
3）では非常に弱く検出された。MTSP6転写物はまた、乳癌セルラインMDA-MB-231
、前立腺癌セルラインPC-3では検出されたが、HT-1080ヒト繊維肉腫セルライン
では認められなかった。MTSP6は、乳腺癌DNA（Clontech）中にも発現される。
【０４３０】 実施例4 プロテアーゼMTSPドメインの発現 MTSP3および4プロテアーゼドメインそれぞれをコードするDNAをピチアパスト
リス（Pchia pastoris）ベクターpPIC9Kの誘導体（Invitrogenより入手可能; 配
列番号45参照）へとクローン化した。プラスミドpPIC9kの特徴としては、5'AOX1
プロモーターフラグメントが1-948位;5'AOX1プライマーサイトが855-875位;アル
ファ因子選択シグナルが949-1218位;アルファ因子プライマー部位が1152-1172位
; マルチプル・クローニング部位が1192-1241位; 3' AOX1プライマーサイトが13
27-1347位; 3' AOX1転写終結領域が1253-1586位; HIS4 ORFが4514-1980; カナマ
イシン抵抗性遺伝子が5743-4928位; 3' AOX1フラグメントが6122-6879位; ColE1
起点が7961-7288位;およびアンピシリン抵抗性遺伝子が8966-8106位にある。こ
こで用いたプラスミドはpPIC9Kからカナマイシン抵抗性遺伝子中のXhoI部位を除
去して得たものであり、こうして得られるベクターをここではｐPIC9KXと命名す
る。
【０４３１】 プロテアーゼドメインのＰＣＲ増幅のためのプライマーおよびPichiaベクター
のXhoI/NotI部位へのサブクローニング MTSP3 5'プライマー（XhoI サイト含有[下線部]）配列番号39 5' TCTCTCGAGAAAAGAGTGGTGGGTGGGGAGGAGGCCTCTGTG 3' 3'プライマー（NotIサイト含有[下線部]） 配列番号40 5' ATTCGCGGCCGCATTACAGCTCAGCCTTCCAGAC 3'
【０４３２】 MTSP4-SおよびMTSP4-L 5'プライマー（XhoI サイト含有[下線部]）配列番号41 5' TCTCTCGAGAAAAGAATTGTTGGTGGAGCTGTGTCCTCCGAG 3'プライマー (NotIサイト含有 配列番号42） 5' ATTCGCGGCCGCTCAGGTCACCACTTGCTGGATCCAG 3'
【０４３３】 MTSP6 MTSP6を大腸菌TOPOベクター（pcR（登録商標）2.1 TOPO(商標)、配列番号46、
Invitrogen, Carlsbad, CA; TOPO（登録商標） TA クローニング（登録商標）キ
ットTaq-増幅PRCR産物のデザインされた形である。）へクローン化した。 5'プライマー （XhoIサイト含有[下線部]） 配列番号43 5' CTCGAGAAACGCATCGTGGGTGGAAACATGTCCTTG 3' 3'プライマー のNotI部位は、E. coli TOPO ベクター配列番号44: 5' ACTCAGGTGGCTACTTATCCCCTTCCTC 3' から得られたものである。
【０４３４】 実施例5 MTSP活性を調節する候補化合物の同定のためのアッセイ 阻害剤同定のためのアッセイ 試験化合物の、MTSP1、MTSP3、MTSP4、MTSP6を含む MTSPの触媒活性のインヒ
ビターとしての能力は、アミド溶解アッセイ（amidelytic assay）によって調べ
ることができる。インヒビターに誘導される組換MTSPもしくはそのプロテアーゼ
ドメイン部分によるアミド溶解に対する阻害活性はIC50値としてこのアッセイに
おいて検出される。
【０４３５】 代表的なアッセイバッファーはHBSA （10 mM ヘペス、150mM 円かナトリウム
、pH 7.4、 0.1% ウシ血清アルブミン）である。特に別の指定が無い限り、全て
の試薬はシグマケミカル社（Sigma Chemical Co. （St. Louis, MO））から得
たものである。IC50アッセイは、30分 （被検化合物と酵素を30分プレインキュ
ベーション）および0分（被検化合物と酵素のプレインキュベーションは行わな
い）にて行った。３０分のIC50アッセイにおいては、以下の試薬をコーニング製
マイクロタイタープレートの適当なウエル中で合わせた:50マイクロリットルのH
BSA、50マイクロリットルのHBSA中の被検化合物（希釈により広い濃度幅とする
）（またはHBSA単独で阻害剤無しの場合の速度測定を行う）、および50マイクロ
リットルのバッファーで希釈し、最終酵素濃度を約100から500ｐＭとなるように
したMTSPもしくはそのプロテアーゼドメイン。常温にて30分インキュベーション
した後、特定のＭＴＳＰのための基質（以下の表および考察の記載参照）50マイ
クロリットルを添加してアッセイを開始させる。基質は脱イオン水中で再構成し
、次いでアッセイ前にＨＢＳＡ希釈し、ウエルへ添加して最終体積200マイクロ
リットル、最終基質濃度300μＭ（Ｋｍの約1.5倍）とする。
【０４３６】 ０分におけるIC50アッセイにおいても、同じ試薬を合わせて用いる：即ち５０
マイクロリットルのＨＢＳＡ、50マイクロリットルの被検化合物を、同じ濃度と
なるようにHBSAにて希釈したもの（またはHBSA単独で希釈剤無しの場合の速度測
定を行う）、および50マイクロリットルの基質、例えば色素生産性基質である。
アッセイは、50マイクロリットルのMTSPを添加することによって開始する。全成
分の最終濃度は３０分及び０分の両方のIC50アッセイにおいて同じである。
【０４３７】 両方のアッセイにおいて、基質加水分解の初速度を測定した。例えば色素生産
性基質を用いる場合は、特定波長の吸収をサーモマックスカイネティックマイク
ロプレートリーダー（モレキュラーデバイスMolecular Devices）により、添加
した基質の5% 未満が用いられる５分間にわたって測定した。３０分および０分
のアッセイいずれにおいても、加水分解の初速度を50%減少させる阻害剤の濃度
をIC50値とした。
【０４３８】 阻害剤同定のための別のアッセイ プロテアーゼドメインのプロテアーゼ活性に対する阻害剤としての被検化合物
を、コスター（Costar）96ウエル組織培養プレート（Corning NY）中でアッセイ
した。およそ2-3 nMのMTSPまたはそのプロテアーゼドメインを、29.2 mMのトリ
ス、pH 8.4、29.2 mMのイミダゾール、217 mM NaCl （最終体積100ｍL）中の各
種濃度の阻害剤と混合し、室温で３０分間インキュベートさせた。400 mMの基質
を添加し、反応をSpectraMAX Plusマイクロプレートリーダー（Molecular Devic
es、Sunnyvale CA）にて加水分解と相関するパラメーター、例えば色素産生性基
質の吸収など、を１時間の間、３７℃にて観察した。
【０４３９】 MTSP6スクリーニングのためのアッセイ ピチア・パストリス（Pichia pastoris）内に発現させたMTSP6プロテアーゼド
メインが様々な化合物によって阻害されるかどうかのアッセイを、コースター（
Costar） 96ウエル組織培養プレート（Corning NY）中で行う。およそ1-20 nMの
MTSP6を29.2 mMのトリス、pH 8.4、29.2 mMのイミダゾール、217 mM NaCl （最
終体積100μｌ）中に含まれる種々の濃度の阻害剤と混合し、室温で３０分間イ
ンキュベートさせる。500 μMの基質スペクトロザイム t-PA （American Diagno
stica, Greenwich, CT）を添加し、反応をSpectraMAX Plusマイクロプレートリ
ーダー（Molecular Devices、Sunnyvale CA）にて405 nm における吸収を30分間
、37℃にて測定することによってモニターした。
【０４４０】 基質の同定 アッセイに用いるための基質は、基質を試験することによって経験的に同定す
ることができる。以下の基質リストは試験することのできる基質の例を示すもの
である。
【０４４１】
【表２】
【０４４２】
【表２のつづき】 pNA＝パラ−ニトロアニリド （色素産生性） AMC＝アミノメチルクマリン （蛍光）
【０４４３】 上記基質のいずれもが切断されない場合、上記の連結アッセイを用いることが
できる。簡単に説明すると、プロテアーゼのプラスミノーゲンおよびトリプシノ
ーゲンのごとき酵素に対する活性化能を試験するものである。このアッセイを行
うには、一本鎖プロテアーゼをプラスミノーゲンもしくはトリプシノーゲンのご
ときザイモゲンと共に、lys-プラスミノーゲンのようなザイモゲンのための既知
基質の存在下でインキュベートする。１本鎖がこのザイモゲンを活性化すれば、
活性化された酵素、例えばプラスミンおよびトリプシン、がその基質を分解する
、というものである。
【０４４４】 実施例6 マトリプターゼ(Matriptase)の単離およびクローニング A. 細胞タイプおよび細胞増殖 ヒト前立腺癌セルラインPC-3、をATCC （カタログ番号 CRL-1435; Manassas、
VA）より購入した。細胞を37℃、5% CO2 にて2 mM L-グルタミンおよび10%ウシ
胎児血清を添加したHam's F-12K 増殖培地（カタログ番号 9077; Irvine）中で
培養した。続く細胞操作は、製造者による指示書どおりに行った。PC-3 細胞を
およそ90%コンフルエントとなるまで増殖させ、次いで１xリン酸緩衝生理食塩水
で軽く洗浄した。
【０４４５】 B. 全RNAの単離、精製およびポリA+ RNAの濃縮 PC-3 細胞をトリゾール試薬（カタログ番号 15596; Life Technologies, Rock
ville, MD）で溶菌させ、全RNAを製造者の指示書に沿って単離した。全RNAの濃
度を、260 nmにおける吸光度により推測した。オリゴ-dTビーズ（カタログ番号
70061; Oligotex, Qiagen, Valencia, CA）を用いてポリA+ RNAを精製、濃縮し
た。
【０４４６】 C. 逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応（PCR） PC-3より誘導したポリA+ RNAより1本鎖cDNA （sscDNA）を、ProSTARファース
トストランドRT-PCRキット（カタログ番号 200420; Stratagene, La Jolla, CA
）およびSuperScript II RNase H- 逆転写酵素 （カタログ番号 18064-022; Lif
e Technologies）を用いる逆転写により合成した。逆転写の後、anPC-3 sscDNA
（4μL）のアリコートを、それぞれ2 mMのセンスおよびアンチセンス縮重オリゴ
ヌクレオチドプライマーおよびTaqポリメラーゼ （カタログ番号 201203; Qiage
n）を用いるPCR反応へ供した。全反応体積を100μLとした。センスプライマー配
列は、5'-TGGRT（I）VT（I）WS（I）GC（I）RC（I）CAYTG-3' （配列番号13）お
よびアンチセンスプライマー配列は5'-（I）GG（I）CC（I）CC（I）SWRTC（I）C
CYT（I）RCA（I）GHRTC-3' （配列番号14）である。上記において、R＝A,G; V＝
G,A,C; W＝A,T; S＝G,C; Y＝C,T; H＝A,T,Cである。プライマー配列は全てのキ
モトリプシン様セリンプロテアーゼの２つの高保存領域に対応し、およそ400か
ら500 塩基対のPCR産物を増幅する。
【０４４７】 D. クローンスクリーニングおよび配列決定 PCR産物を2% アガロースゲル上で分離し、ゲル抽出キット（カタログ番号 287
06; QIAquick ゲル抽出キット; Qiagen）を用いて精製した。精製したDNAフラグ
メントをpCR2.1-TOPO （カタログ番号 K4500-01; Invitrogen, Carlsbad, CA）
中へライゲートした。これをE. coli 細胞へ形質転換した後、プラスミドDNAを
単離し、EcoRI制限酵素により消化させて分析した。核酸が導入されたクローン
はさらにその配列を蛍光染料によるDNA配列決定法（カタログ番号 4303149; Big
Dye ターミネーターサイクル配列決定キット、AmpliTaq DNAポリメラーゼ付き;
Perkin Elmer、Lincoln、CA）を用いて決定した。全部で31クローンの配列を決
定し、分析した。全ての配列の分析は、多ヌクレオチド配列アライメントアルゴ
リズム（blastn）（www.ncbi.nlm.nih.gov/blast） を用いて同一もしくは非常
に類似するDNAをGenBank（NCBI、Bethesda、MD）のリストから検索して行った。
有意なホモロジーを示さなかった配列については、さらにヌクレオチド配列（両
鎖）の理論上の６つのフレームの転写産物をタンパク質配列データベース（Swis
sProt）と比較するblastxを用いて分析した。同一のcDNAフラグメントを有する8
つのクローンがMTSP1をコードした。MTSP1は次いでマトリプターゼ（GenBank識
別番号 AF118224）と同一であることが見出された。
【０４４８】 E. cDNA末端の迅速増幅（Rapid amplification of cDNA ends：RACE）およびMT
SP1の遺伝子特異的増幅 完全なMTSP1プロテアーゼドメインをコードするDNAを得るため、RACEおよび遺
伝子特異的増幅反応を行った。ヒトプロテアーゼMarathon-Ready cDNA （カタロ
グ番号7418-1; Clontech）を用いて、MTSP1をコードするcDNAの一部を単離する
のに用いた。Marathon-Ready cDNAはsscDNAの5'および3'末端の既知のハイブリ
ダイゼーション配列を含有するよう調製されたものである。MTSP1 cDNAの3'領域
は、遺伝子特異的プライマー、5'-CACCCCTTCTTCAATGACTTCACCTTCG-3' （配列番
号55）を用いた3'-RACE反応により得た。MTSP1プロテアーゼドメインの5'末端配
列は、MTSP1-特異的プライマーとして5'-TACCTCTCCTACGACTCC-3' （配列番号56
）をセンスプライマーと、および5'-GAGGTTCTCGCAGGTGGTCTGGTTG-3' （配列番号
57）をアンチセンスプライマーとして用いる遺伝子-特異的増幅反応によって得
た。これらの2つのプライマーはヒトSNC19 mRNA配列から得たものである。3'-RA
CE反応および遺伝子-特異的 PCRで得たDNAフラグメントのサイズは>1 kbpであっ
た。これらのフラグメントをpCR2.1-TOPO （Invitrogen, San Diego, CA）内へ
サブクローニングした。大腸菌細胞内へ形質転換した後、プラスミドDNAを単離
し、EcoRI制限酵素消化によって分析した。挿入物を有していたクローンの性質
をサザンブロット分析（内部cDNAフラグメントをプローブとして用いる）および
DNA配列分析により調べた。
【０４４９】 F. MTSP1のプロテアーゼドメインをコードするcDNAのPCR増幅 MTSP1のプロテアーゼドメインをコードするcDNAフラグメントを得るため、遺
伝子特異的プライマーを用いる端-端PCR増幅を行った。用いた２つのプライマー
は、5'-CTCGAGAAAAGAGTTGTTGGGGGCACGGATGCGGATGAG-3' （配列番号58、5'末端用
）および5'-GCGGCCGCACTATACCCCAGTGTTCTCTTTGATCCA-3' （配列番号36、3'末端
用）。5'プライマーはMTSP1 プロテアーゼドメインの開始配列（VVGGTDADE） （
配列番号10）をコードする配列を有する。3'プライマーはMTSP1のストップコド
ンを有する。〜800-bpフラグメントを増幅し、精製し、およびPichia pastoris
発現ベクターpPIC9K内へサブクローニングし、pPIC9K-MTSP1を得た。
【０４５０】 G. 正常組織、癌細胞および癌組織内MTSP1遺伝子発現プロファイル MTSP1の組織分布および遺伝子発現レベルに関する情報を得るために、pPIC9K-
MTSP1からのDNA挿入物をプローブとして76種類のヒト組織 （カタログ番号 7775
-1;ヒト多組織発現（MTE）アレイ; CLONTECH, Palo Alto, CA）からのRNAブロッ
トを調べた。顕著な発現が結腸（上行、横行および下行）、直腸、気管、食道お
よび十二指腸に認められた。中程度の発現レベルが空腸、回腸、イロセカム（il
ocecum）、胃、前立腺、脳下垂体、盲腸、腎臓、肺、胎盤、膵臓、甲状腺、唾液
腺、乳腺、胎児腎臓、および胎児肺に認められた。より低い発現レベルが脾臓、
胸腺、末梢血リンパ球、リンパ節、骨髄、膀胱、子宮、肝臓、副腎、胎児心臓、
胎児肝臓、胎児脾臓、および胎児胸腺に認められた。顕著な量のMTSP1転写物は
また、直腸結腸腺癌（colorectal adenocarcinoma）セルライン （SW480）、Bur
kitt'sリンパ腫セルライン（Daudi）、および白血病セルライン（HL-60）にも認
められた。MTSP1転写物のRT-PCRを、数種のヒト原発腫瘍を無胸腺ヌードマウス
へ異種移植したものについて遺伝子特異的プライマーを用いて行った。高レベル
のMTSP1転写物が結腸腺癌（CX-1）および膵臓癌（GI-103）に認められた。中レ
ベルの転写物が、別の結腸腺癌（GI-112）、卵巣癌（GI-102）、肺癌（LX-1）、
および乳癌（GI-101）において認められた。別の肺癌（GI-117）は低レベルのMT
SP1転写物を発言していた。同様のRT-PCRによりMTSP1転写物がPC-3およびLNCaP
セルライン中に含まれるかどうかを調べた。両方のセルラインは顕著な量のMTSP
1転写物を発現していた。
【０４５１】 H. 配列分析 Macベクター （バージョン 6.5; Oxford Molecular Ltd., Madison, WI）を用
いて誘導されたDNAおよびタンパク質配列の分析を行った。MTSP1のプロテアーゼ
ドメインをコードするcDNAは726塩基対で構成されており、241-アミノ酸タンパ
ク質配列（rMAP）に翻訳される（配列番号1、2、49および50参照）。
【０４５２】 実施例7 マトリプターゼもしくはMTSP1の組換セリンプロテアーゼドメイン（rMAP）の
調製 A. 発酵 数ミリグラム量のrMAPを、SMD1168/pPIC9K:MTSP1 Sac SC1クローンを用い、3.
3 L容のバイオリアクターを備えたBioFlo 3000培養器（New Brunswick Scientif
ic, NJ）中で発酵させて調製した。ZA001複合培地（10 g/L イースト抽出物、20
g/L ペプトン、40 g/L グリセロール、5 g/L 硫酸アンモニウム、0.2 g/L硫酸
カルシウムニ水和物、2 g/L 硫酸マグネシウム五水和物、2 g/L 硫酸カリウム、
25 g/Lヘキサメタリン酸ナトリウム、4.35 ml/L PTM1）へ100 mlのピチア・パス
トリス形質転換物の一晩培養物を接種した。培養物は、50%グリセロールを流加
相（fed-batch phase）により添加し、および18-24時間 0.025%にコントロール
されたメタノールにより誘導された。
【０４５３】 B. マトリプターゼもしくはMTSP1の組換セリンプロテアーゼドメイン（rMAP）
の精製 rMAPは培地中に分泌される、したがって精製の第1段階では細胞および細胞残
渣を5000 g 、30遠心分離によって除去した。得られた上清をデカンテーション
により取り、pH 8.0へ10 N NaOHにて調節し、SartoBran 300 0.45 + 0.2 μMカ
プセルにて濾過した。上清を10 kDa限外濾過カートリッジ（NC SRT UF システム
と AG/Technologies UFP-10-C-5Aフィルター使用）による限外濾過により濃縮し
て1Lとし、バッファーをクロスフロー濾過により50 mM トリス-HCl、50 mM NaC
l、0.05% トゥイーン80、pH 8.0 （バッファー A）と交換した。濾過ユニットを
1LのバッファーAでゆすぎ、これを濃縮物と合わせた。
【０４５４】 濃縮したrMAP-含有溶液をバッファーAで平衡化した150 mlのベンザミジン（be
nzamidine）カラムを、流速8 ml/minにて通した。カラムをカラムの3倍の体積の
50 mM トリス-HCl、1.0 M NaCl、0.05% トゥイーン-80、pH 8.0（バッファー B
）で洗浄し、およびカラムの3倍の体積の50 mM トリス-HCl、1.0 M L-アルギニ
ン、0.05% トゥイーン80、pH 8.0 （バッファー C）にて溶離させた。rMAPを含
むフラクションを活性のアッセイで同定し、プールした。このプールした物質を
JumboSep濃縮器（Pall Gelman）および10 kDa カットオフ膜を用いて10 mlへと
濃縮した。一旦10 mlへと濃縮した後、バッファーを50 mM Na2HPO4、125 mM NaC
l、pH 5.5 （バッファー D）と交換し、およびその体積を5-10 mlに調節した。
保持物を除去し、濃縮器をバッファーDで洗浄し、洗浄液を濃縮物へ添加した。
全サンプル体積を15 mlとした。
【０４５５】 この一部精製rMAPを5 ml のQ-セファロースFast Flow HiTrapカラム（Amersha
m-Pharmacia Biotech）を15 mlのバッファーDで平衡化したものへ通した。貫流
物を保持した。HiTrapカラムをさらに10 mlのバッファーDで洗浄した。両方の貫
流物をプールし、タンパク質濃度をOD280の測定（減数係数2.012 mg/OD280）に
より求めた。精製したrMAPは次いで、タンパク質１ｍｇあたり0.1μｌのエンド
グリコシダーゼＨ（Endoglycosidase H）（ProZyme、5 U/ml）を添加し、4℃に
て一晩やさしく振とうしながらインキュベートして脱グリコシル化した。
【０４５６】 脱グリコシル化したプール物の伝導性を2.0-3.0 mS/cmへ、ナノポア（Nanopur
e）H2Oを用いて調節し、およびpHを 6.5へと調節した （最終体積-200-3OO mL）
。rMAPを次いで7mL ソース（Source） 15Q アニオン交換カラム（Amersham--Pha
rmacia Biotech）を用いるファルマシアアクタエクスプローラシステム（Pharma
cia Akta Explorer system）へ直接かけ、アニオン交換クロマトグラフィーによ
りさらに精製した。タンパク質はバッファー50 mM ヘペス、pH 6.5を含有し、10
カラム体積にかけて0-0.33 M NaClのグラジエント、流速6 ml/分により溶出させ
た。タンパク質含有フラクションをプールし、ベンズアミジンを添加してその最
終濃度を10 mMとした。タンパク質の純度を、SDS-PAGEで調べ、タンパク質濃度
をOD280を計測し、および理論吸光率2.012 mg/OD280を用いて得た。
【０４５７】 実施例8 アッセイ マトリプターゼまたはMTSP1のセリンプロテアーゼ活性の阻害を測定するための
アミド溶解アッセイ 被検化合物がrMAP触媒活性の阻害剤として働く能力を、阻害剤誘導性ＭＡＰア
ミド溶解活性の阻害を、IC50値として測定して評価した。アッセイバッファーは
HBSA（10 mM ヘペス、150mM 塩化ナトリウム、pH 7.4、0.1% ウシ胎児血清）で
ある。特に記したもの以外の全ての試薬はSigma Chemical Co. （St. Louis, MO
）より購入した。
【０４５８】 以下の２つのIC50アッセイ（a）30分もしくは60分（被検化合物および酵素を3
0分もしくは60分プレインキュベーション）いずれかの時点、および（b）0分時
点（被検化合物および酵素のプレインキュベーション無し）を行った。30分また
は60分いずれかの時点のIC50アッセイにおいては、以下の試薬をコーニング製マ
イクロタイタープレートの適当なウエル中で合わせた：50マイクロリットルのHB
SA、50マイクロリットルの被検化合物（HBSA中で希釈、広い濃度範囲をカバー）
、（または阻害剤無しの速度測定のためにはHBSA単独）、および50マイクロリッ
トルのrMAP（コルバス・インターナショナル）をバッファーで希釈して最終酵素
濃度を250 pM （活性部位濾過により測定）とした。30分または60分のインキュ
ベーションを常温下で行った後、 50マイクロリットルの基質S-2765 （N-α-ベ
ンジルオキシカルボニルD-アルギニル-L-グリシル-L-アルギニン-p-ニトロアリ
ニンジヒドロクロライド; DiaPharma Group, Inc.; Franklin, OH）を各ウエル
へ添加して最終アッセイ体積を200マイクロリットルとし、および最終基質濃度
を100μM （Kmの約４倍）とした。アッセイ混合物へ添加する前に、S-2765は脱
イオン水中で再構成し、HBSAで希釈した。０分におけるIC50アッセイでは、同じ
試薬を50マイクロリットルのHBSA、50マイクロリットルの被検化合物のHBSA希釈
物（同じ濃度幅をカバー）もしくは阻害剤無しの場合の速度の測定のためのHBSA
単独、および50マイクロリットルの基質S-2765を合わせた。50マイクロリットル
のrMAPを添加してアッセイを開始した。各成分の最終濃度はいずれのIC50アッセ
イ（30- または60-分および0分）においても同一である。
【０４５９】 両方のアッセイにおいて色素発生基質加水分解の初速度は、405 nM における
吸収の変化をThermo Max（登録商標）カイネティックマイクロプレートリーダー
（Molecular Devices）を用いて5 分間かけて測定することにより得た。ここで
、添加した基質の5%未満の量が消費される。加水分解の初速度の50%減少を導く
時の阻害剤の添加濃度をそれぞれの（30、または60分および0分）アッセイにお
けるIC50 値とした。
【０４６０】 特異性分析のためのインビトロ酵素アッセイ 化合物がマトリプターゼ活性に対する選択的阻害剤として作用する能力を、マ
トリプターゼ活性を50%阻害する該化合物の濃度（IC50）を上記の実施例に沿っ
て決定することにより評価し、マトリプターゼに対するIC50 値を以下のセリン
プロテアーゼの全てもしくは一部に対する値と比較した: トロンビン、組換組織
プラスミノーゲン活性化剤（rt-PA）、プラスミン、活性化タンパク質C、キモト
リプシン、第Xa因子およびトリプシン。
【０４６１】 全てのアッセイにおいて用いたバッファーはHBSA（10 mM ヘペス、pH 7.5、15
0 mM 塩化ナトリウム、0.1% ウシ胎児血清）である。IC50測定のためのアッセイ
は、コーニングマイクロタイタープレートの適当なウエル内で50マイクロリット
ルのHBSA、特定濃度にHBSA内で希釈した50マイクロリットルの被検化合物（広い
濃度幅をカバーする）（またはV0測定のためのHBSA単独（阻害剤無しの速度）、
および50マイクロリットルのHBSAに希釈した酵素を合わせて行う。常温で30 分
インキュベーションした後、以下に特定した濃度の50マイクロリットルの基質を
ウエルへ添加し、最終全体積を200マイクロリットルとする。色素生成基質の加
水分解の初速度は、405 nmにおける吸収をThermo Max（登録商標）カイネティッ
ク・マイクロプレート・リーダーによって5 分間測定して得た。ここで、添加し
た基質の5%未満の量が消費される。加水分解の初速度の50%減少を導く時の阻害
剤の添加濃度をIC50 値とした。
【０４６２】 トロンビン（fIIa）アッセイ 色素産生性基質ペファクロム t-PA （CH3SO2-D-ヘキサヒドロチロシン-グリシ
ル-L-アルギニン-p-ニトロアニリン、Pentapharm Ltd.より入手）を用いて酵素
活性を測定した。基質は使用前に脱イオン水中で再構成させた。精製ヒトα-ト
ロンビンはEnzyme Research Laboratories, Incより入手した。全アッセイに用
いたバッファーはHBSA （10 mM ヘペス、pH 7.5、150 mM 塩化ナトリウム、0.1%
ウシ胎児血清）である。
【０４６３】 IC50測定は、HBSA （50μｌ）、α-トロンビン （50μl）（最終酵素濃度は0.
5 nM）および阻害剤（50μｌ）（幅広い濃度をカバーする）、を適当なウエル内
で合わせ、30 分間室温でインキュベートした後に基質ペファクロム-t-PA （50
μｌ）（基質の最終濃度は250μMで、これはKmのおよそ５倍である）を加えて行
った。ペファクロムt-PA加水分解の初速度は、405 nmにおける吸収をThermo Max
（登録商標） カイネティック・マイクロプレート・リーダーによって5分間測定
して得た。ここで、添加した基質の5%未満の量が消費される。加水分解の初速度
の50%減少を導く時の阻害剤の添加濃度をIC50 値とした。
【０４６４】 第Ｘａ因子 第Ｘａ因子触媒活性を、色素発生性基質S-2765（N-ベンジルオキシカルボニル
-D-アルギニン-L-グリシン-L-アルギニン-p-ニトロアニリン、DiaPharma Group
（Franklin、OH）より購入）を用いて測定した。全ての基質は使用前に脱イオン
水で再構成した。S-2765の最終濃度は250μM （Kmの約５倍）である。精製した
ヒト第Ｘ因子は、Enzyme Research Laboratories, Inc. （South Bend、IN）よ
り入手し、第Ｘａ因子（FXa）はBock、P.E., Craig, P.A., Olson, S.T., and S
ingh, P. Arch. Biochem. Biophys. 273:375-388 （1989）記載の方法によって
これを活性化して得た。酵素はアッセイの前にHBSAにて最終濃度が0.25 nMとな
るように希釈した。
【０４６５】 組換組織プラスミノーゲンアクチベーター（rt-PA）アッセイ rt-PA触媒活性を基質ペファクロム t-PA（CH3SO2-D-ヘキサヒドロチロシン-グ
リシル-L-アルギニン-p-ニトロ-アニリン、Pentapharm Ltd.より購入）を用いて
調べた。基質は脱イオン水中で調製し、アッセイ前にHBSAにて最終濃度が500マ
イクロモルとなるよう（Kmの約３倍）希釈した。ヒトrt-PA（Activase（登録商
標）をGenentech Incより入手した。酵素を脱イオン水中で再構成し、アッセイ
前にHBSAにて希釈して最終濃度が1.0 nMとなるようにした。
【０４６６】 プラスミンアッセイ プラスミン触媒活性を色素産生性基質、S-2366 [L-ピログルタミル-L-プロリ
ル-L-アルギニン-p-ニトロアニリンハイドロクロライド]（DiaPharmaグループよ
り入手）を用いて測定した。基質を脱イオン水中で調製し、続いてアッセイの前
にHBSA中へ、最終濃度が300マイクロモル（Kmのおよそ2.5倍）となるよう希釈し
た。精製したヒトプラスミンは、Enzyme Research Laboratories, Incより入手
した。酵素をアッセイ前にHBSA中、最終濃度が1.0 nMとなるよう希釈した。
【０４６７】 活性化タンパク質C（aPC）アッセイ aPC触媒活性を色素産生性基質、ペファクロムPC（デルタ-カルボベンジルオキ
シ-D-リジン-L-プロリル-L-アルギニン-p-ニトロアリニンジヒドロクロライド）
、Pentapharm Ltd.より入手）を用いて測定した。基質は脱イオン水中で調製し
、アッセイ前にHBSA中へ、最終濃度が400マイクロモル（Kmの約３倍）となるよ
う希釈した。精製ヒトaPCはHematologic Technologies,Incより入手した。酵素
はアッセイ前にHBSAで希釈して最終濃度が1.0 nMとなるようにした。
【０４６８】 キモトリプシンアッセイ キモトリプシン触媒活性は、色素産生性基質S-2586（メトキシ-スクシニル-L-
アルギニン-L-プロリル-L-チロシル-p-ニトロアニリド）、（DiaPharma Groupよ
り入手）を用いて測定した。基質は脱イオン水中で調製し、次いでアッセイの前
にHBSAにて、最終濃度100マイクロモル（Kmの約９倍）となるよう希釈した。精
製した（3X-結晶化; CDI）ウシ膵臓キモトリプシンをWorthington Biochemical
Corpより入手した。酵素を脱イオン水中で調製し、およびアッセイの前にHBSA中
へ最終濃度が0.5 nMとなるよう希釈した。
【０４６９】 トリプシンアッセイ トリプシン触媒活性を色素産生性基質、S-2222（ベンゾイル-L-イソロイシン-
L-グルタミン酸-[ガンマ-メチルエステル]-L-アルギニン-p-ニトロアニリド）（
DiaPharma Groupより入手）を用いて測定した。基質は脱イオン水中で調製し、
次いでアッセイ前にHBSAで希釈して最終濃度が250マイクロモルとなるようにし
た（Kmの約４倍）。精製した（3X-結晶化; TRL3）ウシ膵臓トリプシンは、Worth
ington Biochemical Corpより入手した。酵素は脱イオン水中で再構成し、アッ
セイ前にHBSAで希釈して最終濃度が0.5nMとなるようにした。
【０４７０】 当業者にとって、改変することは自明であることから、本発明は添付のクレー
ムに記載した範囲によってのみ限定される。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ＭＴＳＰ３のドメイン構成を示す。
【図２】 図２は、ＭＴＳＰ４スプライス変種およびそのドメインのドメイン構
成を示す；ＭＴＳＰ４−Ｌには、膜貫通ドメイン、ＣＵＢドメイン、低密度リポ
タンパク質レセプター（ＬＤＬＲ）ドメイン、およびセリンプロテアーゼ触媒ド
メイン；アミノ酸１３６−２７９の部分を欠くＭＴＳＰ４−Ｓが含まれる。
【図３】 図３は、ＭＴＳＰ６のドメイン構成を示す。
【図４】 図４は、ＭＴＳＰ３のＣ末端、ＭＴＳＰ４の２のスプライス変種コー
ド形態、およびプロテアーゼドメインを含むＭＴＳＰ６を並べたものを示す；図
は各タンパク質のプロテアーゼドメインのＮ末端を形成する切断部位を示す；潜
在的なグリコシル化部位を示し、それぞれのプロテアーゼドメインの遊離Ｃｙｓ
残基を示す（＊）。各タンパク質のムテインは、グリコシル化部位にて残基、特
にＮ残基、および遊離Ｃｙｓ残基を好ましくは保存アミノ酸残基で置きかえるこ
とにより調製されてよい。そのようなムテインも本明細書中に提供される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｐ 9/14 ４Ｂ０６４ 48/00 35/00 ４Ｂ０６５ Ａ６１Ｐ 9/14 35/04 ４Ｃ０８４ 35/00 43/00 １２１ ４Ｃ０８５ 35/04 １２３ ４Ｈ０４５ 43/00 １２１ Ｃ０７Ｋ 16/40 １２３ Ｃ１２Ｍ 1/34 Ｅ Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｍ 1/34 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 9/64 Ｚ 1/21 9/99 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/37 9/64 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 9/99 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/37 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/15 37/00 １０２ 33/50 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/53 Ｃ１２Ｒ 1:84 37/00 １０２ 1:19 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 1/19 5/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:84） Ａ６１Ｋ 37/547 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (31)優先権主張番号 ６０／２１３，１２４ (32)優先日 平成12年６月22日(2000．6．22) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／２２０，９７０ (32)優先日 平成12年７月26日(2000．7．26) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０９／６５７，９８６ (32)優先日 平成12年９月８日(2000．9．8) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／２３４，８４０ (32)優先日 平成12年９月22日(2000．9．22) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 エドガー・オー・オン アメリカ合衆国92126カリフォルニア州サ ンディエゴ、グレンドーバー・レイン 10738番 (72)発明者 ジュン−チャーン・イェー アメリカ合衆国92126カリフォルニア州サ ンディエゴ、ウエストビュー・パークウェ イ11629番 Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 BB05 BB14 BB41 BB51 CB01 DA13 DA36 FB01 FB02 FB03 FB12 GC15 4B024 AA01 AA12 BA14 CA04 DA02 DA05 DA06 DA11 DA12 EA02 EA04 GA11 HA12 HA15 4B029 AA07 BB16 CC03 FA15 4B050 CC02 DD07 LL01 LL03 4B063 QA19 QA20 QQ08 QQ13 QQ36 QS02 QX02 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA06 DA14 4B065 AA26X AA77X AA90X AB01 BA02 CA33 CA44 CA46 4C084 AA02 AA07 AA13 AA17 AA19 AA20 BA02 BA08 BA22 BA23 CA18 DC03 NA14 NA15 ZA441 ZB212 ZB261 ZC202 ZC751 ZC752 4C085 AA13 AA14 BB01 BB11 CC03 DD62 EE01 EE03 4H045 AA11 AA30 CA40 DA75 DA89 EA28 EA51 FA72 FA74

Claims (142)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 タイプＩＩ膜型セリンプロテアーゼ（ＭＴＳＰ）のプロテア
    ーゼドメインまたはその触媒活性部分を含む実質上精製された一本鎖ポリペプチ
    ドであって、タンパク質のＭＴＳＰ部分が、ＭＴＳＰのプロテアーゼドメインま
    たはその触媒活性部分から本質的に成る、実質上精製された一本鎖ポリペプチド
    。
  2. 【請求項２】 ＭＴＳＰが内皮細胞で発現されるものではない、請求項１記
    載の実質上精製されたポリペプチド。
  3. 【請求項３】 ＭＴＳＰがインビボで正常な内皮細胞で発現されるものでは
    ない、請求項１記載の実質上精製されたポリペプチド。
  4. 【請求項４】 ＭＴＳＰがヒトのタンパク質である、請求項１記載の実質上
    精製されたポリペプチド。
  5. 【請求項５】 ＭＴＳＰのプロテアーゼドメインまたはプロテアーゼドメイ
    ンの触媒活性部分から本質的に成る、請求項１記載の実質上精製されたポリペプ
    チド。
  6. 【請求項６】 腫瘍細胞におけるＭＴＳＰの発現および／または活性が、非
    腫瘍細胞における発現および／または活性のレベルと異なる、請求項１記載の実
    質上精製されたポリペプチド。
  7. 【請求項７】 ＭＴＳＰが、腫瘍を有しない対象における体液中のレベルと
    異なるレベルで体液中に検出される、請求項１記載の実質上精製されたポリペプ
    チド。
  8. 【請求項８】 ＭＴＳＰが腫瘍中に存在し、かつ、ＭＴＳＰのための基質ま
    たはコファクターが、同じ組織の非腫瘍細胞と異なるレベルで発現される、請求
    項１記載の実質上精製されたポリペプチド。
  9. 【請求項９】 ＭＴＳＰが腫瘍において、同じ組織の非腫瘍細胞における特
    異性と比較して変化した基質特異性を示す、請求項１記載の実質上精製されたポ
    リペプチド。
  10. 【請求項１０】 ＭＴＳＰがＩＶＮＧ、ＩＬＧＧ、ＶＧＬＬまたはＩＬＧＧ
    を含むＮ末端を有する、請求項１記載の実質上精製されたポリペプチド。
  11. 【請求項１１】 ＭＴＳＰが、ＭＴＳＰ１、ＭＴＳＰ３、ＭＴＳＰ４および
    ＭＴＳＰ６から選択される、請求項１記載の実質上精製されたポリペプチド。
  12. 【請求項１２】 プロテアーゼドメインが配列番号２のアミノ酸６１５−８
    ５５として、配列番号４のアミノ酸２０５−４３７として、配列番号６のアミノ
    酸として、または配列番号１２のアミノ酸２１７−４４３として示されるアミノ
    酸配列を含む、請求項１記載の実質上精製されたポリペプチド。
  13. 【請求項１３】 配列番号２のアミノ酸６１５−８５５として、配列番号４
    のアミノ酸２０５−４３７として、配列番号６のアミノ酸として、または配列番
    号１２のアミノ酸２１７−４４３として示されるアミノ酸配列を含むプロテアー
    ゼドメインと、少なくとも約４０％、６０％、８０％、９０％または９５％の配
    列同一性を有する、請求項１記載の実質上精製されたポリペプチド。
  14. 【請求項１４】 配列番号１、３、５、７、９、または１１に示すヌクレオ
    チド配列を含む核酸分子に、または配列番号２、４、６、８、１０または１２に
    示すタンパク質をコードする分子または少なくともその一ドメインに、高ストリ
    ンジェント条件下でその全長に沿ってハイブリダイズする核酸分子によりプロテ
    アーゼドメイン部分がコードされる、請求項１記載のポリペプチド。
  15. 【請求項１５】 請求項１記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配
    列を含む核酸分子。
  16. 【請求項１６】 アミノ酸の約９０％までが他のアミノ酸で置き換えられて
    おり、および生じるポリペプチドが一本鎖であり、および非変異ポリペプチドの
    少なくとも１０％の触媒活性を有する、請求項１記載のポリペプチドのムテイン
    。
  17. 【請求項１７】 アミノ酸の約９５％までが置き換えられている、請求項１
    ６記載のムテイン。
  18. 【請求項１８】 生じるポリペプチドが一本鎖であり、および非変異ポリペ
    プチドの少なくとも５０％の触媒活性を有する、請求項１６記載のムテイン。
  19. 【請求項１９】 プロテアーゼドメイン中の遊離Ｃｙｓが他のアミノ酸で置
    き換えられ、それによって生じるポリペプチドがタンパク質分解活性を示す、請
    求項１記載のポリペプチドのムテイン。
  20. 【請求項２０】 プロテアーゼドメイン中の遊離Ｃｙｓがセリンで置き換え
    られている、請求項１記載のポリペプチドのムテイン。
  21. 【請求項２１】 請求項１５の核酸分子を含むベクター。
  22. 【請求項２２】 発現ベクターである、請求項２１記載のベクター。
  23. 【請求項２３】 コードされたタンパク質の分泌が作用的に結合されたヌク
    レオチド配列により指向される、ヌクレオチド配列を含む請求項２１記載のベク
    ター。
  24. 【請求項２４】 ピキアベクターまたはイー.コリベクターである、請求項
    ２１記載のベクター。
  25. 【請求項２５】 請求項２１記載のベクターを含む細胞。
  26. 【請求項２６】 原核細胞である、請求項２５記載の細胞。
  27. 【請求項２７】 真核細胞である、請求項２５記載の細胞。
  28. 【請求項２８】 細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞、および動物細
    胞から選択される、請求項２５記載の細胞。
  29. 【請求項２９】 哺乳動物の細胞である、請求項２５記載の細胞。
  30. 【請求項３０】 コードされたタンパク質が細胞により発現される条件下で
    請求項２５記載の細胞を培養すること；次いで発現されたタンパク質を回収する
    ことを含む、ＭＴＳＰのプロテアーゼドメインを含むポリペプチドを製造する方
    法。
  31. 【請求項３１】 細胞がピキア細胞であり、タンパク質が培養培地中に分泌
    される、請求項３０記載の方法。
  32. 【請求項３２】 請求項１記載のＭＴＳＰのプロテアーゼドメイン中のヌク
    レオチドの連結配列に相補的な、少なくとも１４の連結ヌクレオチドまたは変更
    ヌクレオチドを含み、請求項１のＭＴＳＰのプロテアーゼドメイン中のヌクレオ
    チドの連結配列に相補的な少なくとも１６の連結ヌクレオチドまたは変更ヌクレ
    オチドを含む、アンチセンス核酸分子。
  33. 【請求項３３】 請求項１記載のポリペプチドのプロテアーゼドメインの一
    本鎖形態に特異的に結合する抗体、その結合ドメインを含む抗体のフラグメント
    または誘導体であって、抗体がポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体で
    あるもの。
  34. 【請求項３４】 ＭＴＳＰが、コリン、ＭＴＳＰ１、エンターペプチダーゼ
    、ヒト気道トリプシン様プロテアーゼ（ＨＡＴ）、ＭＴＳＰ１、ＴＭＰＲＳＳ２
    およびＴＭＰＲＳＳ４から選択される、請求項１記載のポリペプチド。
  35. 【請求項３５】 ａ）請求項１記載のタンパク質、およびｂ）直接またはリ
    ンカーを経由してタンパク質に結合される標的剤を含む結合物。
  36. 【請求項３６】 ａ）請求項１記載のポリペプチドの触媒活性の阻害物質、
    および、ｂ）抗腫瘍および抗血管形成治療薬または治療剤から選択される他の治
    療薬または他の治療剤：を含む組み合わせ。
  37. 【請求項３７】 阻害物質および抗腫瘍剤および／または抗血管形成剤が単
    一の医薬組成物中に処方されるか、またはそれぞれが別個の医薬組成物中に処方
    される、請求項３６記載の組み合わせ。
  38. 【請求項３８】 阻害物質が抗体およびアンチセンスオリゴヌクレオチドか
    ら選択される、請求項３６記載の組み合わせ。
  39. 【請求項３９】 固体担持体に直接またはリンカーを介して結合される２ま
    たはそれ以上の請求項１記載のポリペプチドを含む、固体担持体。
  40. 【請求項４０】 ポリペプチドがアレイを含む、請求項３９記載の担持体。
  41. 【請求項４１】 ポリペプチドが複数の異なるＭＴＳＰプロテアーゼドメイ
    ンを含む、請求項３９記載の担持体。
  42. 【請求項４２】 １または複数の試験化合物の添加と同時に、添加前に、ま
    たは添加後に、請求項１記載のポリペプチドをＭＴＳＰによりタンパク質分解さ
    れる基質と接触させること；試験化合物の存在下で切断された基質の量を測定す
    ること；次いで、対照と比較して、切断量を変化させる化合物を選択すること、
    これによりＭＴＳＰの活性を調節する化合物が同定される；を含む、ＭＴＳＰの
    プロテアーゼ活性を調節する化合物を同定する方法。
  43. 【請求項４３】 試験化合物が、小分子、ペプチド、ペプチドミメティクス
    、天然産物、抗体またはそのフラグメントである、請求項４２記載の方法。
  44. 【請求項４４】 複数の試験物質が同時にスクリーニングされる、請求項４
    ２記載の方法。
  45. 【請求項４５】 試験化合物の存在下での切断量を試験化合物の不在下での
    量と比較することにより、切断量の変化が評価される、請求項４２記載の方法。
  46. 【請求項４６】 複数の試験物質が同時にスクリーニングされる、請求項４
    ２記載の方法。
  47. 【請求項４７】 複数のポリペプチドが直接またはリンカーを経由して固体
    担持体に結合される、請求項４２記載の方法。
  48. 【請求項４８】 ポリペプチドがアレイを含む、請求項４２記載の方法。
  49. 【請求項４９】 ポリペプチドが複数の異なるＭＴＳＰプロテアーゼを含む
    、請求項４２記載の方法。
  50. 【請求項５０】 ＭＴＳＰの一本鎖プロテアーゼドメインに特異的に結合す
    る化合物を同定する方法であって、請求項１記載のポリペプチドを一または複数
    の試験化合物と、その結合がなされる条件下で接触させること；およびＭＴＳＰ
    一本鎖プロテアーゼドメインに特異的に結合する化合物、またはＭＴＰＳ一本鎖
    プロテアーゼドメインに結合することが公知である化合物の結合を阻害する化合
    物を同定すること、ここで公知化合物は、試験化合物の前に、試験化合物と同時
    に、または試験化合物の後で、ポリペプチドと接触させる；を含む方法。
  51. 【請求項５１】 ポリペプチドが直接的またはリンカーを経由して間接的に
    固体担持体に結合される、請求項５０記載の方法。
  52. 【請求項５２】 試験化合物が小分子、ペプチド、ペプチドミメティクス、
    天然産物、抗体またはそのフラグメントである、請求項５０記載の方法。
  53. 【請求項５３】 複数の試験物質が同時にスクリーニングされる、請求項５
    ０記載の方法。
  54. 【請求項５４】 複数のポリペプチドが固体担持体に結合される、請求項５
    １記載の方法。
  55. 【請求項５５】 実質上精製された膜型セリンプロテアーゼ３（ＭＴＳＰ３
    ）。
  56. 【請求項５６】 配列番号３に示すヌクレオチド配列によりコードされるポ
    リペプチド；配列番号３に示すヌクレオチド配列に対して高ストリンジェント条
    件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド；
    配列番号４のアミノ酸２０５−４３７に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；
    配列番号４に示すアミノ酸配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミ
    ノ酸配列を含むポリペプチド；配列番号３に示すヌクレオチド配列のスプライス
    変種によりコードされるポリペプチド：から成る群から選択される、請求項４３
    記載のＭＴＳＰ３。
  57. 【請求項５７】 請求項５６記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド
    配列を含む核酸分子。
  58. 【請求項５８】 請求項５７記載の核酸分子を含むベクター。
  59. 【請求項５９】 請求項５８記載のベクターを含む細胞。
  60. 【請求項６０】 表面上でＭＴＳＰ３を発現する請求項５９記載の細胞。
  61. 【請求項６１】 原核細胞である、請求項５９記載の細胞。
  62. 【請求項６２】 真核細胞である、請求項５９記載の細胞。
  63. 【請求項６３】 細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞および動物細胞
    から選択される、請求項５９記載の細胞。
  64. 【請求項６４】 哺乳動物細胞である、請求項５９記載の細胞。
  65. 【請求項６５】 ＭＴＳＰ３が、配列番号４に示すアミノ酸配列；または配
    列番号３に示すヌクレオチド配列に対して高ストリンジェント条件下でハイブリ
    ダイズするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列；または配列番号
    ４に示すアミノ酸配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有し、かつプロテア
    ーゼ活性を保持しているタンパク質を含む、請求項５９記載の細胞。
  66. 【請求項６６】 コードされたタンパク質が細胞により発現される条件下で
    請求項５９記載の細胞を培養すること、次いで、発現されたタンパク質を回収す
    ることを含む、ＭＴＳＰ３を製造する方法。
  67. 【請求項６７】 請求項５７記載の核酸分子中のヌクレオチドの連結配列に
    相補的な少なくとも１４の連結ヌクレオチドまたは変更ヌクレオチドを含む、ま
    たは、請求項５７記載の核酸分子中のヌクレオチドの連結配列に相補的な少なく
    とも１６の連結ヌクレオチドまたは変更ヌクレオチドを含む、アンチセンス核酸
    分子。
  68. 【請求項６８】 請求項５７記載のＭＴＳＰに特異的に結合する抗体、また
    はその結合ドメインを含む抗体のフラグメントまたは誘導体であって、抗体がポ
    リクローナル抗体またはモノクローナル抗体であるもの。
  69. 【請求項６９】 哺乳動物に、有効量の請求項５５記載のＭＴＳＰ３の阻害
    物質を投与することを含む、哺乳動物における腫瘍疾患を治療または予防するた
    めの方法。
  70. 【請求項７０】 阻害物質がＭＴＳＰ３に特異的に結合する抗体、またはそ
    の結合ドメインを含む抗体のフラグメントまたは誘導体であって、抗体がポリク
    ローナル抗体またはモノクローナル抗体である、請求項６９記載の方法。
  71. 【請求項７１】 実質上精製された膜型セリンプロテアーゼ４（ＭＴＳＰ４
    ）。
  72. 【請求項７２】 ＭＴＳＰ４−ＬまたはＭＴＳＰ４−Ｓである、実質上精製
    されたＭＴＳＰ４。
  73. 【請求項７３】 配列番号７または９に示すヌクレオチド配列によりコード
    されるポリペプチド；配列番号７または９に示すヌクレオチド配列に対して高ス
    トリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされ
    るポリペプチド；配列番号６、８または１０に示すアミノ酸配列を含むポリペプ
    チド；配列番号７または９に示すヌクレオチド配列のスプライス変種によりコー
    ドされるポリペプチド：から成る群から選択される、請求項７１記載のＭＴＳＰ
    ４。
  74. 【請求項７４】 ＭＴＳＰ４−ＬまたはＭＴＳＰ４−Ｓである、請求項７３
    記載のＭＴＳＰ４。
  75. 【請求項７５】 請求項７３記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド
    配列を含む核酸分子。
  76. 【請求項７６】 請求項７４記載の核酸分子を含むベクター。
  77. 【請求項７７】 請求項７６記載のベクターを含む細胞。
  78. 【請求項７８】 ＭＴＳＰ４をその表面に発現する、請求項７７記載の細胞
    。
  79. 【請求項７９】 原核細胞である、請求項７７記載の細胞。
  80. 【請求項８０】 真核細胞である、請求項７７記載の細胞。
  81. 【請求項８１】 細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞および動物細胞
    から選択される、請求項７７記載の細胞。
  82. 【請求項８２】 哺乳動物細胞である、請求項７７記載の細胞。
  83. 【請求項８３】 ＭＴＳＰ４が、配列番号６、８、または１０に示すアミノ
    酸配列；または配列番号７または９に示すヌクレオチド配列に対して高ストリン
    ジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされるアミ
    ノ酸配列；または配列番号８または１０に示すアミノ酸配列と少なくとも約９０
    ％の配列同一性を有し、かつタンパク質分解活性を保持するタンパク質を含む、
    請求項７７記載の細胞。
  84. 【請求項８４】 請求項７７記載の細胞を、コードされるタンパク質が細胞
    により発現される条件下で培養すること；次いで、発現されたタンパク質を回収
    することを含む、ＭＴＳＰ４を製造する方法。
  85. 【請求項８５】 請求項７５記載の核酸分子中のヌクレオチドの連結配列に
    相補的な少なくとも１４の連結ヌクレオチドまたは変更ヌクレオチドを含む、ま
    たは請求項７５記載の核酸分子中のヌクレオチドの連結配列に相補的な少なくと
    も１６の連結ヌクレオチドまたは変更ヌクレオチドを含む、アンチセンス核酸分
    子。
  86. 【請求項８６】 請求項７２記載のＭＴＳＰに特異的に結合する抗体、また
    はその結合ドメインを含む抗体のフラグメントまたは誘導体であって、抗体がポ
    リクローナル抗体またはモノクローナル抗体であるもの。
  87. 【請求項８７】 請求項７３記載のＭＴＳＰに特異的に結合する抗体、また
    はその結合ドメインを含む抗体のフラグメントまたは誘導体であって、抗体がポ
    リクローナル抗体またはモノクローナル抗体であるもの。
  88. 【請求項８８】 哺乳動物に有効量の請求項７１記載のＭＴＳＰ４の阻害物
    質を投与することを含む、哺乳動物における腫瘍疾患を治療または予防する方法
    。
  89. 【請求項８９】 阻害物質が、ＭＴＳＰ４に特異的に結合する抗体、または
    その結合ドメインを含む抗体のフラグメントまたは誘導体であって、抗体がポリ
    クローナル抗体またはモノクローナル抗体である、請求項８８記載の方法。
  90. 【請求項９０】 配列番号１１に示すヌクレオチド配列によりコードされる
    ポリペプチド；配列番号１１に示すヌクレオチド配列に対して高ストリンジェン
    ト条件下で全長に渡ってハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされ
    るポリペプチド；配列番号１２のアミノ酸２１７−４４３に示すアミノ酸配列を
    含むポリペプチド；配列番号１１に示すヌクレオチド配列のスプライス変種によ
    りコードされるポリペプチド：から成る群から選択される、実質上精製された膜
    型セリンプロテアーゼ６（ＭＴＳＰ６）。
  91. 【請求項９１】 請求項９０記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド
    配列を含む核酸分子。
  92. 【請求項９２】 請求項９１記載の核酸分子を含むベクター。
  93. 【請求項９３】 請求項９２記載のベクターを含む細胞。
  94. 【請求項９４】 表面上にＭＴＳＰ６を発現する、請求項９３記載の細胞。
  95. 【請求項９５】 原核細胞である、請求項９３記載の細胞。
  96. 【請求項９６】 真核細胞である、請求項９３記載の細胞。
  97. 【請求項９７】 細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞および動物細胞
    から選択される、請求項９３記載の細胞。
  98. 【請求項９８】 哺乳動物細胞である、請求項９３記載の細胞。
  99. 【請求項９９】 ＭＴＳＰ６が、配列番号１２に示すアミノ酸配列；または
    配列番号１１に示すヌクレオチド配列に高ストリンジェント条件下でその全長に
    沿ってハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列；
    または配列番号１２に示すアミノ酸配列と少なくとも約９５％の配列同一性を有
    し、かつプロテアーゼ活性を保持するタンパク質を含む、請求項９３記載の細胞
    。
  100. 【請求項１００】 コードされるタンパク質が細胞により発現される条件下
    で請求項９３の細胞を培養すること、次いで、発現されたタンパク質を回収する
    ことを含む、ＭＴＳＰ６を製造する方法。
  101. 【請求項１０１】 請求項９１記載の核酸分子中のヌクレオチドの連結配列
    に相補的な少なくとも１４の連結ヌクレオチドまたは変更ヌクレオチドを含む、
    または請求項９１記載の核酸分子中のヌクレオチドの連結配列に相補的な少なく
    とも１６の連結ヌクレオチドまたは変更ヌクレオチドを含む、アンチセンス核酸
    分子。
  102. 【請求項１０２】 請求項９０記載のＭＴＳＰに特異的に結合する抗体、ま
    たはその結合ドメインを含む抗体のフラグメントまたは誘導体であって、抗体が
    ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であるもの。
  103. 【請求項１０３】 哺乳動物に有効量の請求項９０記載のＭＴＳＰ６の阻害
    物質を投与することを含む、哺乳動物における腫瘍疾患を治療または予防する方
    法。
  104. 【請求項１０４】 阻害物質がＭＴＳＰ６に特異的に結合する抗体、または
    その結合ドメインを含む抗体のフラグメントまたは誘導体であり、抗体がポリク
    ローナル抗体またはモノクローナル抗体である、請求項１０３記載の方法。
  105. 【請求項１０５】 ＭＴＳＰの内在遺伝子が、相同組換えまたは挿入遺伝子
    突然変異により欠失または不活性化されている、ヒト以外の組換え動物またはそ
    の子孫。
  106. 【請求項１０６】 ＭＴＳＰがＭＴＳＰ１、ＭＴＳＰ３、ＭＴＳＰ４または
    ＭＴＳＰ６である、請求項１０５記載のヒト以外の組換え動物。
  107. 【請求項１０７】 ａ）ＭＴＳＰ３またはＭＴＳＰ４または請求項９０記載
    のＭＴＳＰ６；およびｂ）直接またはリンカーを介してタンパク質に結合される
    標的剤；を含む結合物。
  108. 【請求項１０８】 標的剤が、ｉ）結合物のアフィニティ分離または精製；
    ｉｉ）表面への結合物の結合；ｉｉｉ）結合物の検出；またはｉｖ）選択された
    組織または細胞への標的送達；を可能とするものである、請求項１０６記載の結
    合物。
  109. 【請求項１０９】 ａ）ＭＴＳＰ３またはＭＴＳＰ４または請求項９０記載
    のＭＴＳＰ６の触媒活性の阻害物質；および、ｂ）抗腫瘍および抗血管形成治療
    または治療剤から選択される他の治療または治療剤：を含む組み合わせ。
  110. 【請求項１１０】 阻害物質および抗腫瘍剤および／または抗血管形成剤が
    単一の医薬組成物中に処方され、またはそれぞれが別個の医薬組成物中に処方さ
    れる、請求項１０９記載の組み合わせ。
  111. 【請求項１１１】 阻害物質が、抗体およびアンチセンスオリゴヌクレオチ
    ドから選択される、請求項１０９記載の組み合わせ。
  112. 【請求項１１２】 直接またはリンカーを介して結合される、２またはそれ
    以上のＭＴＳＰ３ポリペプチドおよび／またはＭＴＳＰ４ポリペプチドおよび／
    または請求項９０記載のＭＴＳＰ６ポリペプチドを含む固体担持体。
  113. 【請求項１１３】 ポリペプチドがアレイを含む、請求項１１２記載の担持
    体。
  114. 【請求項１１４】 ＭＴＳＰ３、ＭＴＳＰ４または請求項９０記載のＭＴＳ
    Ｐ６から選択されるＭＴＳＰのプロテアーゼ活性を調節する化合物を同定するた
    めの方法であって、ＭＴＳＰをＭＴＳＰによりタンパク質分解される基質と、一
    または複数の試験化合物の添加と同時に、添加前に、または添加後に接触させる
    こと；試験化合物の存在下で切断される基質の量を測定すること；および対照と
    比較して、切断量を変化させる化合物を選択すること、これにより、ＭＴＳＰの
    活性を調節する化合物が同定される；を含む方法。
  115. 【請求項１１５】 試験化合物が小分子、ペプチド、ペプチドミメティクス
    、天然産物、抗体またはそのフラグメントである、請求項１１４記載の方法。
  116. 【請求項１１６】 複数の試験物質が同時にスクリーニングされる、請求項
    １１４記載の方法。
  117. 【請求項１１７】 試験化合物の存在下での切断量を試験化合物の不在下で
    の量と比較することにより切断量の変化が評価される、請求項１１４記載の方法
    。
  118. 【請求項１１８】 複数の試験物質が同時にスクリーニングされる、請求項
    １１４記載の方法。
  119. 【請求項１１９】 複数のポリペプチドが固体担持体に結合される、請求項
    １１８記載の方法。
  120. 【請求項１２０】 ＭＴＳＰ３、ＭＴＳＰ４および請求項９０記載のＭＴＳ
    Ｐ６から選択されるＭＴＳＰに特異的に結合する化合物を同定する方法であって
    、ＭＴＳＰポリペプチドを一または複数の試験化合物と、その結合が成される条
    件下で接触させること；次いで、ＭＴＳＰに特異的に結合する化合物を同定する
    ことを含む方法。
  121. 【請求項１２１】 ＭＴＳＰ３、ＭＴＳＰ４および請求項９０記載のＭＴＳ
    Ｐ６から選択されるＭＴＳＰに特異的に結合する化合物を同定する方法であって
    、ＭＴＳＰポリペプチドを一または複数の試験化合物とその結合が成される条件
    下で接触させること；次いで、ＭＴＳＰに特異的に結合する化合物を同定するこ
    とを含む方法。
  122. 【請求項１２２】 ポリペプチドが直接的またはリンカーを介して間接的に
    固体担持体に結合される、請求項１２１記載の方法。
  123. 【請求項１２３】 試験化合物が小分子、ペプチド、ペプチドミメティクス
    、天然産物、抗体またはそのフラグメントである、請求項１２１記載の方法。
  124. 【請求項１２４】 複数の試験物質が同時にスクリーニングされる、請求項
    １２１記載の方法。
  125. 【請求項１２５】 複数のポリペプチドが固体担持体に結合される、請求項
    １２４記載の方法。
  126. 【請求項１２６】 配列番号１２のアミノ酸４６−５５および／または配列
    番号１２のアミノ酸３６８−３９４として示すアミノ酸を含む、および配列番号
    １２に示すポリペプチドをコードしている核酸に中ストリンジェント下でハイブ
    リダイズする核酸配列によりコードされる、ＭＴＳＰ６ポリペプチド。
  127. 【請求項１２７】 配列番号１２のアミノ酸４６−５５および／または配列
    番号１２のアミノ酸３６８−３９４として示すアミノ酸を含む、および配列番号
    １２に示すポリペプチドをコードしている核酸に高ストリンジェント下でその全
    長に沿って、またはプロテアーゼドメインの全長に沿ってハイブリダイズする核
    酸配列によりコードされる、請求項１２６記載のポリペプチド。
  128. 【請求項１２８】 配列番号１２に示すアミノ酸配列を含む、請求項１２６
    記載のポリペプチド。
  129. 【請求項１２９】 請求項１２６のポリペプチドをコードする核酸配列を含
    む、単離核酸分子。
  130. 【請求項１３０】 ＭＴＳＰにより特異的に切断されるプロドラッグを投与
    することを含み、それにより、ＭＴＳＰ活性を発現する細胞と接触したときに、
    プロドラッグが活性薬に変換される、腫瘍を治療するための方法。
  131. 【請求項１３１】 ＭＴＳＰがＭＴＳＰ３、ＭＴＳＰ４および請求項９０記
    載のＭＴＳＰ６から選択される、請求項１３０記載の方法。
  132. 【請求項１３２】 ＭＴＳＰが、コリン、エンターペプチダーゼ、ヒト気道
    トリプシン様プロテアーゼ（ＨＡＴ）、ＭＴＳＰ１、ＴＭＰＲＳＳ２およびＴＭ
    ＰＲＳＳ４から選択される、請求項１３０記載の方法。
  133. 【請求項１３３】 生物サンプル中のＭＴＳＰ３、ＭＴＰＳ４または請求項
    ９０記載のＭＴＳＰ６を検出することを含み、検出される量が、腫瘍疾患を有し
    ない対象における量と異なる、腫瘍疾患を検出する方法。
  134. 【請求項１３４】 生物サンプルが、血液、尿、唾液、涙、間質液、脳脊髄
    液、腹水液、腫瘍組織検査液、および循環腫瘍細胞から成る群から選択される、
    請求項１３３記載の方法。
  135. 【請求項１３５】 ＭＴＳＰ３、ＭＴＳＰ４またはＭＴＳＰ６の細胞外ドメ
    インがサンプル中に存在する、請求項１３３記載の方法。
  136. 【請求項１３６】 モジュレーターが、請求項４２および１１４のいずれか
    一項記載の方法により同定される、ＭＴＳＰの活性のモジュレーター。
  137. 【請求項１３７】 ＭＴＳＰの活性を調節する化合物を同定するための、請
    求項１記載のポリペプチドの使用。
  138. 【請求項１３８】 化合物がタンパク質分解活性を阻害するものである、請
    求項１３７記載の使用。
  139. 【請求項１３９】 ＭＴＳＰが、ＭＴＳＰ１、ＭＴＳＰ３、ＭＴＳＰ４、Ｍ
    ＴＳＰ６、コリン、エンターペプチダーゼ、ヒト気道トリプシン様プロテアーゼ
    （ＨＡＴ）、ＴＭＰＲＳＳ２およびＴＭＰＲＳＳ４から選択される、請求項１３
    ７記載の使用。
  140. 【請求項１４０】 腫瘍疾患の治療のための、請求項５５、７１および９０
    のいずれか一項記載のポリペプチドの使用。
  141. 【請求項１４１】 腫瘍疾患治療の医薬の処方のための、請求項５５、７１
    および９０記載のポリペプチドの使用。
  142. 【請求項１４２】 標的剤が、ｉ）結合物のアフィニティ分離または精製；
    ｉｉ）表面への結合物の結合；ｉｉｉ）結合物の検出；またはｉｖ）選択された
    組織または細胞への標的送達；を可能とするものである、請求項３５記載の結合
    物。
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