PL210435B1 - Ludzkie przeciwciała monoklonalne wiążące się z CTLA-4 - Google Patents

Description

Niniejszy wynalazek dotyczy ludzkich przeciwciał monoklonalnych wiążących się z antygenem 4 cytotoksycznych limfocytów T (CTLA-4), lub ich wiążących antygen fragmentów. Przeciwciała te mogą znaleźć zastosowanie w szczególności w chorobach przewlekłych, w których wymagane jest powtarzane podawanie przeciwciał.

Niniejsze zgłoszenie zastrzega pierwszeństwo z tymczasowego zgłoszenia patentowego, nr seryjny US 60/113,647 złożonego 23 grudnia, 1998, którego treść włącza się niniejszym jako odnośnik literaturowy.

Regulacja odpowiedzi immunologicznej u pacjentów umożliwiłaby leczenie wielu chorób u ludzi, które to leczenie charakteryzowałoby się specyficznym działaniem, tak rzadko spotykanym w przypadku stosowania leków konwencjonalnych. Możliwe byłoby zarówno podnoszenie, jak i obniżanie odpowiedzi układu immunologicznego. Rola komórek T i komórek B w regulacji odpowiedzi immunologicznej była niejednokrotnie dogłębnie badana i opisywana. Z badań tych wynika, że w wielu przypadkach w zapobieganiu i leczeniu chorób szczególnie istotna wydaje się być rola komórek T.

Komórki T posiadają bardzo złożone systemy kontrolowania własnych oddziaływań. W procesach oddziaływania między komórkami T wykorzystywane są liczne receptory i czynniki rozpuszczalne. A zatem to, co wpływa na jeden konkretny sygnał, może zmieniać ogólną odpowiedź immunologiczną i zależeć od wielu konkretnych czynników, receptorów i kontrareceptorów, które biorą udział w danym szlaku. Szlaki obniżania odpowiedzi są równie istotne, jak te wymagane do aktywacji. Jednym z mechanizmów zapobiegania odpowiedzi immunologicznej wobec konkretnego antygenu jest proces „edukacji w grasicy, prowadzący do tolerancji komórek T. Znane są również i inne mechanizmy, takie jak wydzielanie cytokin supresyjnych.

Aktywacja komórek T wymaga nie tylko stymulacji poprzez receptor antygenu (receptor komórek T, ang T cell receptor (TCR)), lecz również dodatkowych sygnałów poprzez kostymulujące cząsteczki powierzchniowe, takie jak CD28. Ligandami dla CD28 są biała B7-1 (CD80) i B7-2 (CD86), które są wyrażane na komórkach prezentujących antygen, takich jak komórki dendrytyczne, aktywowane komórki B albo monocyty, które oddziałują z CD28 lub CTLA-4 komórek T w celu dostarczenia sygnału kostymulującego. Rola kostymulującego przekazywania sygnałów była badana w doświadczalnym alergicznym zapaleniu mózgu i rdzenia (ang. experimental allergic encephaloyelitis, EAE) przez Perrin i wsp., Immunol Res 14:189-99 (1995). EAE jest chorobą autoimmunologiczną indukowaną przez komórki Th1 skierowane przeciwko antygenom mielinowym, która dostarcza modelu in vivo do badania roli kostymulacji z udziełem B7 w indukcji patologicznej odpowiedzi immunologicznej. Stosując rozpuszczalne białko fuzyjne jako ligand dla receptora B7, jak również monoklonalne przeciwciała swoiste wobec CD80 albo CD86, Perrin i wsp. wykazali, że kostymulacja B7 odgrywa ważną rolę w EAE warunkując kliniczny efekt choroby.

Oddziaływanie między B7 i CD28 jest jednym z kilku kostymulacyjnych szlaków przekazywania sygnałów, które wydaje się wystarczające do włączenia procesu dojrzewania i namnażania komórek T swoistych wobec antygenu. Brak kostymulacji i związane z tym niewystarczające wytwarzanie IL-2, zapobiega następującej kolejno proliferacji komórek T i indukuje stan braku reaktywności nazwany „anergią. Wiele wirusów i nowotworów może blokować aktywację i proliferację komórek T prowadząc do niewystarczającej aktywności albo braku aktywności układu immunologicznego gospodarza wobec zainfekowanych albo transformowanych komórek. Wśród możliwych zaburzeń funkcjonowania komórek T, anergia może być co najmniej częściowo odpowiedzialna za niezdolność gospodarza do usuwania komórek patogennych albo nowotworowych.

Zastosowanie białka B7 w pośredniczeniu w odporności przeciwnowotworowej została opisana w Chen i wsp., Cell 71:1093-1102 (1992) oraz Townsend and Allison, Science 259:368 (1993). Publikacja przeglądowa Schwartz, Cell 71:1065 (1992) opisuje rolę CD28, CTLA-4 i B7 w wytwarzaniu IL-2 oraz immunoterapii. Harding i wsp., Nature 356:607-609 (1994) wykazali, że przekazywanie sygnałów, w którym poś redniczy CD28, stymuluje mysie komórki T i zapobiega indukcji anergii w klonach komórek T. Patrz również patenty USA nr 5,434,131, 5,770,197 i 5,773,253 oraz międzynarodowe zgłoszenia patentowe nr WO 93/00431, WO 95/01994, WO 95/03408, WO 95/24217 i WO 95/33770.

Z powyższych rozważań jasno wynika, ż e komórki T wymagają dwóch rodzajów sygnałów z komórek prezentujących antygen (ang. antigen presenting cell, APC), aby mogł y być aktywowane i nastę pnie ulegać róż nicowaniu, aby wykazywać funkcje efektorowe. Po pierwsze, istnieje sygnał swoisty wobec antygenu wytwarzany przez oddziaływania pomiędzy TCR na komórkach T i cząstePL 210 435 B1 czkami MHC prezentujących peptydy na APC. Po drugie, istnieje sygnał niezależny od antygenu, w którym poś redniczy oddział ywanie CD28 z przedstawicielami rodziny B7 (B7-1 (CD80) lub B7-2 (CD86)). Dokładne usytuowanie CTLA-4 w procesach związanych z odpowiedzią odpornościową było początkowo nieoczywiste. Mysi CTLA-4 został po raz pierwszy zidentyfikowany i sklonowany przez by Brunet i wsp., Nature 328:267-270 (1987), w ramach poszukiwań cząsteczek, które są preferencyjnie wyrażane na cytotoksycznych limfocytach T. Ludzki CTLA-4 został zidentyfikowany i sklonowany niedługo później przez Dariavach i wsp. Eur. J. Immunol. 18:1901-1905 (1988). Mysie i ludzkie cząsteczki CTLA-4 wykazują około 76% homologię całej sekwencji i identyczność sekwencji w domenach cytoplazmatycznych (Dariavach i wsp. Eur. J. Immunol. 18:1901-1905 (1988)). CTLA-4 jest przedstawicielem białek nadrodziny immunoglobulin (Ig). Nadrodzina Ig stanowi grupę białek, które mają wspólne właściwości strukturalne zmiennych (V) albo stałych (C) domen cząsteczek Ig.

Przedstawiciele tej nadrodziny Ig obejmują między innymi same immunoglobuliny, cząsteczki głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) (tj., MHC klasy I i II) oraz cząsteczki TCR.

W 1991, Linsley i wsp., J. Exp. Med. 174:561-569 (1991), zaproponowali, ż e CTLA-4 jest drugim receptorem dla B7. Podobnie, Harper i wsp., J Immunol 147:1037-44 (1991) wykazali, że cząsteczki CTLA-4 i CD28 są blisko spokrewnione u myszy i człowieka pod względem sekwencji, ekspresji mRNA, struktury genu i położenia na chromosomie. Patrz również Balzano i wsp., Int J Cancer Suppl 7:28-32 (1992). Dalsze dowody na taką rolę przyniosły badania funkcjonalne. Przykładowo, Lenschow i wsp., Science 257:789-79 (1992) wykazali, że CTLA-4-Ig indukowała długotrwałe przeżycie przeszczepów wysepek trzustkowych. Freeman i wsp., Science 262:907-909 (1993) badali rolę CTLA-4 u myszy z niedoborem B7. Badanie ligandów dla CTLA-4 jest opisane w Lenschow i wsp., PNAS 90:11054-11058 (1993). Linsley i wsp., Science 257:792-795 (1992) opisują immunosupresję in vivo wywołaną przez rozpuszczalną postać CTLA-4. Linsley i wsp., J. Exp. Med. 176:1595-604 (1992) przygotowali przeciwciała, które wiązały CTLA-4 i które nie wykazywały reakcji krzyżowej z CD28 oraz doszli do wniosku, ż e CTLA-4 jest wyraż any wspólnie z CD28 na aktywowanych limfocytach T i kooperatywnie reguluje adhezję komórek T i ich aktywację przez B7. Kuchroo i wsp., Cell 80:707-18 (1995) wykazali, że cząsteczki kostymulujące B7-1 i B7-2 aktywowały szlaki rozwojowe Th1/Th2 w zróżnicowany sposób. Yiqun i wsp., Int Immunol 8:37-44 (1996) wykazali, że istnieją zróżnicowane wymagania odnośnie sygnałów kostymulujących od przedstawicieli rodziny B7 dla spoczynkowych komórek pamięci T względem ostatnio aktywowanych komórek pamięci T wobec rozpuszczalnych antygenów przypominających. Patrz również de Boer i wsp. Eur J Immunol 23:3120-5 (1993).

Kilka grup zaproponowało alternatywne albo odrębne oddziaływania receptor/ligand dla CTLA-4 w porównaniu z CD28, a nawet zaproponowano trzeci kompleks B-7, który jest rozpoznawany przez przeciwciała BB1. Patrz, na przykład, Hathcock i wsp. Science 262:905-7 (1993), Freeman i wsp. Science 262:907-9 (1993), Freeman i wsp. J. Exp. Med. 178:2185-92 (1993), Lenschow i wsp. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11054-8 (1993), Razi-Wolf i wsp. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11182-6 (1993) oraz Boussiotis i wsp. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11059-63 (1993). Ale w publikacji Freeman i wsp. J Immunol 161:2708-15 (1998) omówiono odkrycie, ż e przeciwciał o BB1 wiąże się z czą steczką , która jest identyczna z powierzchniową formą CD74, postulując że BB1 mAb wiąże się z białkiem innym niż B7-1, a epitop ten jest również obecny na białku B7-1. Przez co stało się konieczne ponowne rozważenie prowadzenia badań przy zastosowaniu BB1 mAb w analizie ekspresji i funkcji CD80.

Prowadząc badania w latach 1993 - 1995, naukowcy podjęli dalsze próby ustalania roli, jaką odgrywa CTLA-4 w stymulacji komórek T. Najpierw, przez zastosowanie przeciwciał monoklonalnych przeciwko CTLA-4, Walunas i wsp., Immunity 1:405-13 (1994) dostarczyli dowodów, że CTLA-4 może działać jako negatywny regulator aktywacji komórek T. Następnie, Waterhouse i wsp., Science 270:985-988 (1995) pokazali, że myszy z niedoborem CTLA-4 akumulowały w węzłach limfatycznych i śledzionach komórki prekursorowe T (blastocyty, blasty T) z podwyższonym poziomem markerów aktywacyjnych. Komórki prekursorowe naciekały tkankę wątroby, serca, płuc i trzustki, ilości immunoglobuliny w surowicy były podwyższone, a komórki T namnażały się spontanicznie i silnie po stymulacji przez receptor komórki T, jednakże były one podatne na śmierć komórkową indukowaną przez sieciowanie receptora Fas i przez promieniowanie gamma. Waterhouse i wsp. doszli do wniosku, że CTLA-4 działa jako negatywny regulator aktywacji komórek T i jest istotny w kontroli homeostazy limfocytów. Jako komentarz dotyczący tego zagadnienia Allison i Krummel, Science 270:932-933 (1995) omawiali pracę Waterhouse i wsp. jako wykazującą, że CTLA-4 działa obniżając odpowiedź komórek T albo odgrywa rolę w hamowaniu przekazywania sygnał ów przy aktywacji i rozwoju komórek T. Tivol

PL 210 435 B1 i wsp., Immunity 3:541-7 (1995) również otrzymali myszy z niedoborem CTLA-4 i wykazali, ż e u takich myszy szybko rozwija się choroba związana z proliferacją białych krwinek z wielonarządowym limfocytarnym naciekiem i niszczeniem tkanek ze szczególnie ostrym zapaleniem mięśnia sercowego i zapaleniem trzustki. Wywnioskowali oni, że CTLA-4 odrywa kluczową rolę w obniżaniu aktywacji komórek T i utrzymywaniu homeostazy immunologicznej. Ponadto, Krummel i Allison, J. Exp. Med. 182:459-65 (1995) dalej wyjaśnili, że CD28 i CTLA-4 wywierają przeciwny efekt na odpowiedź komórek T na stymulację. Wytworzyli oni przeciwciało przeciwko CTLA-4 i badali wpływ jego wiązania z CTLA-4 w układzie z zastosowaniem wysoko oczyszczonych komórek T. W swoim sprawozdaniu, pokazali oni, że obecność niskich poziomów B7-2 na świeżo eksplantowanych komórkach T może częściowo hamować proliferację komórek T, a w hamowaniu tym pośredniczyły oddziaływania z CTLA-4. Sieciowanie CTLA-4 jednocześ nie z TCR i CD28 mocno hamuje proliferację i wydzielenie IL-2 przez komórki T. Wreszcie, wyniki te wykazały, że CD28 i CTLA-4 dostarczają przeciwstawnych sygnałów, które wydają się być integrowane przez komórki T przy określaniu odpowiedzi na antygen. Zatem, uznali oni, że wynik stymulacji receptora komórek T jest regulowany przez sygnały kostymulacyjne CD28, jak również sygnały hamujące dostarczane przez CTLA-4. Patrz również Krummel i wsp. Int Immunol 8:519-23 (1996) i patent USA nr 5,811,097 oraz międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO 97/20574.

Przeprowadzono rozmaite dodatkowe doświadczenia wyjaśniające dokładniej powyższą funkcję CTLA-4. Przykładowo, Walunas i wsp., J. Exp. Med. 183:2541-50 (1996), przez zastosowanie przeciwciała anty-CTLA-4, zasugerowali, że przekazywanie sygnałów przez CTLA-4 nie reguluje przeżywalności komórek albo odpowiedzi na IL-2, ale hamuje zależne od CD28 wytwarzanie IL-2. Ponadto, Perrin i wsp. J Immunol 157:1333-6 (1996) wykazali, że przeciwciała anty-CTLA-4 w doświadczalnym zapaleniu mózgu i rdzenia (EAE), nasilały chorobę i zwiększały śmiertelność. Nasileniu choroby towarzyszyło zwiększone wytwarzanie cytokin TNF-alpha, IFN-gamma i IL-2 powodujących zapalenie mózgu i rdzenia. Zatem stwierdzili oni, że CTLA-4 reguluje intensywność odpowiedzi immunologicznej w EAE, hamując wytwarzanie zapalnych cytokin i objawy kliniczne choroby. Patrz również Hurwitz i wsp. J Neuroimmunol 73:57-62 (1997) i Cepero i wsp. J. Exp. Med. 188:199-204 (1998) (rybozym anty-CTLA-4 typu „spinki do włosów, który specyficznie znosi ekspresję CTLA-4 po przeniesieniu do mysiego modelu komórek T).

Ponadto Blair i wsp., J Immunol 160:12-5 (1998) badali efekty funkcjonalne zestawu monoklonalnych przeciwciał (mAb) przeciwko CTLA-4 na spoczynkowe ludzkie komórki T CD4+. Ich wyniki pokazały, że niektóre mAb wobec CTLA-4 mogły hamować odpowiedzi proliferacyjne spoczynkowych komórek CD4+ i przejście od G0 do G1 w cyklu komórkowym. Efekty hamujące CTLA-4 były widoczne w cią gu 4 godz., w czasie kiedy ekspresja CTLA-4 na powierzchni komórki pozostawał a niewykrywalna. Jednakże inne mAb wobec CTLA-4, nie dawały żadnych wykrywalnych efektów hamujących, wskazując, że samo wiązanie mAb do CTLA-4 nie wystarcza, aby pośredniczyć w obniżaniu poziomu odpowiedzi komórek T. Co interesujące, po zatrzymaniu wytwarzania IL-2, hamujące mAb anty-CTLA4 pozwalał y na indukcję i ekspresję genu przeż ywalnoś ci komórki, bcl-X(L). Zgodnie z t ą obserwacją , komórki pozostawały żywe i nie obserwowano apoptozy po połączeniu z CTLA-4.

W związku z anergią , Perez i wsp., Immunity 6:411-7 (1997) wykazali, ż e indukcji anergii komórek T przeciwdziałało blokowanie CTLA-4 i wywnioskowali, że wynik rozpoznania antygenu przez komórki T jest uwarunkowany przez oddziaływanie CD28 lub CTLA-4 na komórkach T z cząsteczkami B7. Również, Van Parijs i wsp., J. Exp. Med. 186: 1119-28 (1997) badali rolę interleukiny 12 i kostymulatorów w anergii komórek T in vivo i stwierdzili, że przez hamowanie udziału CTLA-4 w czasie indukcji anergii, zablokowana została proliferacja komórek T i nie następowało pełne różnicowanie Th1. Jednakże, komórki T eksponowane na dające tolerancję antygeny w obecności zarówno IL-12, jak i przeciwciał anty-CTLA-4 nie wykazywały anergii i zachowywały się identycznie, jak komórki T, które zetknęły się z antygenem immunogennym. Wyniki te sugerują, że w indukcji anergii in vivo uczestniczą dwa procesy: udział CTLA-4, który prowadzi do blokowania zdolności komórek T do proliferacji i nieobecność prototypowej zapalnej cytokiny, IL-12, co zapobiega różnicowaniu komórek T w komórki efektorowe Th1. Kombinacja IL-12 i przeciwciał anty-CTLA-4 wystarczał a do przekształ cenia bodźca, który jest normalnie tolerowany w bodziec immunogenny.

W związku z infekcjami, McCoy i wsp., J. Exp. Med. 186: 183-7 (1997) pokazali, ż e przeciwciała anty-CTLA-4 bardzo zwiększały i przyspieszały odpowiedź immunologiczną komórek T na Nippostrongylus brasiliensis, czego wynikiem było znaczne zmniejszenie liczby dorosłych robaków

PL 210 435 B1 i wczesne zakończenie wytwarzania jaj przez pasożyta. Patrz również Murphy i wsp. J. Immunol. 161:4153-4160 (1998) (Leishmania donovani).

W zwią zku z nowotworem, Kwon i wsp., PNAS USA 94:8099-103 (1997) opracowali model syngenicznego mysiego raka prostaty i badali dwa odrębne zabiegi mające na celu wzbudzenie odpowiedzi przeciwko rakowi prostaty poprzez wzmocnioną kostymulację komórek T: (i) dostarczenie bezpośredniej kostymulacji przez komórki raka prostaty transdukowane do uzyskania ekspresji ligandu B7.1 i (ii) blokadę in vivo CTLA-4 komórek T za poś rednictwem przeciwciał, co zapobiega obniżeniu odpowiedzi komórek T. Wykazano, że blokada CTLA-4 in vivo za pośrednictwem przeciwciał wzmocniła odpowiedzi immunologiczne przeciwko rakowi prostaty. Również, Yang i wsp. Cancer Res 57:4036-41 (1997) badali czy blokada funkcji CTLA-4 prowadzi do wzmocnienia antynowotworowych odpowiedzi komórek T w różnych stadiach wzrostu nowotworu. W oparciu o wyniki in vitro i in vivo stwierdzili oni, że blokada CTLA-4 u osób z nowotworem wzmacniała ich zdolność do wytwarzania odpowiedzi przeciwnowotworowych komórek T, ale wystąpienie takiego wzmocnionego efektu w ich modelu ograniczało się do wczesnych stadiów rozwoju nowotworu. Ponadto, Hurwitz i wsp. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10067-71 (1998) badali generowanie odpowiedzi przeciwnowotworowej za pośrednictwem komórek T i stwierdzili, że zależy ona od zaangażowania receptora komórek T przez główny kompleks zgodności tkankowej/antygen, jak również od związania CD28 przez B7. Pewne nowotwory, takie jak rak sutka SM1 były oporne na immunoterapię anty-CTLA-4. Zatem przy zastosowaniu kombinacji blokady CTLA-4 i szczepionki złożonej z komórek SM1 wyrażających czynnik stymulujący kolonie granulocytów-makrofagów, obserwowano regresje rodzicielskich komórek nowotworowych SM1 pomimo nieskuteczności każdego z tych sposobów leczenia osobno. Terapia kombinowana prowadziła do utrzymującej się długo odporności wobec SM1 i zależała zarówno od komórek T CD4(+), jak i CD8(+). Odkrycia te sugerował y, ż e blokada CTLA-4 dział a na poziomie pochodzą cych od gospodarza komórek prezentujących antygen.

W odniesieniu do cukrzycy, Luhder i wsp., J. Exp. Med. 187:427-32 (1998) wstrzykiwali mAb anty-CTLA-4 myszy transgenicznej pod względem TCR, stanowiącej model cukrzycy w różnych stadiach choroby. Stwierdzili oni, że udział CTLA-4 w czasie, kiedy potencjalnie cukrzycogenne komórki T są po raz pierwszy aktywowane, jest zdarzeniem decydującym; jeżeli ich udział jest możliwy, następuje inwazja wysepek, jednakże pozostaje ona całkiem nieszkodliwa miesiącami. Jeżeli nie, zapalenie wysepek trzustkowych z naciekaniem limfocytarnym jest bardziej agresywne i cukrzyca szybko się rozwija.

W odniesieniu do immunizacji szczepionką , Horspool i wsp., J Immunol 160:2706-14 (1998) stwierdzili, że nienaruszone mAb anty-CTLA-4, ale nie fragmenty Fab, hamują pierwotną odpowiedź humoralną wobec pCIA/beta gal bez wpływu na odpowiedzi przypominające, co wskazuje, że aktywacja CTLA-4 hamuje wytwarzanie Ab, ale nie wzbudzanie komórek T. Blokada ligandów dla CD28 i CTLA-4, CD80 (B7-1) i CD86 (B7-2), wykazała odrębne, niezachodzące na siebie funkcje. Blokada CD80 przy początkowej immunizacji całkowicie znosiła pierwszorzędowe i drugorzędowe odpowiedzi immunologiczne przeciwciał, podczas gdy blokada CD86 znosiła odpowiedzi pierwszorzędowe, ale nie drugorzędowe. Jednoczesna blokada CD80 + CD86 była mniej skuteczna w znoszeniu odpowiedzi Ab niż każda z nich osobno. Wzmocnienie kostymulacji przez jednoczesne wstrzyknięcie plazmidów wyrażających B7 zwiększało odpowiedzi CTL, ale nie odpowiedzi Ab i nie wskazywało na przejście od Th1 do Th2. Odkrycia te wskazują na złożoną i odrębną rolę dla CD28, CTLA-4, CD80 i CD86 w kostymulacji komórek T po zaszczepieniu kwasem nukleinowym.

W odniesieniu do odrzucania alloprzeszczepu, Markees i wsp., J. Clin Invest 101:2446-55 (1998) stwierdzili w mysim modelu odrzucania alloprzeszczepu skóry, że przyjęcie się przeszczepu wyjściowo zależy od obecności INF-gamma, CTLA-4 oraz komórek T CD4(+). Dodaniu do protokołu mAb anty-CTLA-4 lub anty-IFN-gamma towarzyszyło szybkie odrzucenie przeszczepu, podczas gdy mAb anty-IL-4 nie miało żadnego wpływu.

W zwią zku z rolą CTLA-4 w odniesieniu do CD28, Fallarino i wsp., J. Exp. Med. 188:205-10 (1998) wytworzyli myszy transgeniczne pod względem TCR/z niedoborem genu aktywującego rekombinazę 2/typu dzikiego pod względem CD 28 albo z niedoborem CD28, które immunizowano nowotworem wyrażającym antygen. Wzbudzone komórki T z obydwu typów myszy wytwarzały cytokiny i namnażały się w odpowiedzi na komórki stymulujące z brakiem ekspresji B7. Jednakż e, podczas gdy odpowiedź komórek T CD28+/+ była zwiększona poprzez kostymulację B7-1, odpowiedź komórek T CD28-/- była silnie zahamowana. Hamowanie to było odwracane przez monoklonalne przeciwciała przeciwko B7-1 albo CTLA-4. Zatem CTLA-4 może silnie hamować aktywację komórek T w nie6

PL 210 435 B1 obecności CD28, wskazując, że antagonizm sygnału, w którym pośredniczy TCR jest wystarczający, aby wyjaśnić efekt hamujący CTLA-4. Również, Lin i wsp., J. Exp. Med. 188: 199-204 (1998) badali odrzucanie alloprzeszczepu serca u myszy z niedoborem CD28. Serca H-2(q) przeszczepiano allogenicznej myszy typu dzikiego albo myszy z niedoborem CD28 (H-2(b)). Odrzucanie przeszczepu było opóźnione u myszy z niedoborem CD28 w porównaniu z myszami typu dzikiego. Traktowanie biorców typu dzikiego immunoglobuliną-CTLA-4 (CTLA-4-Ig), albo mAb anty-B7-1 plus anty-B7-2 znacząco przedłużało przeżycie alloprzeszczepu. Przeciwnie, traktowanie myszy z niedoborem CD28 CTLA-4-Ig, mAb anty-B7-1 plus anty-B7-2 lub blokującymi mAb anty-CTLA-4 indukowało przyspieszenie odrzucenia przeszczepu. U nietraktowanych niczym myszy typu dzikiego i u myszy z niedoborem CD28 traktowanych CTLA-4-Ig lub mAb anty-CTLA-4, zwiększonej szybkości odrzucania przeszczepu towarzyszył silny naciek jednojądrzastych komórek i zwiększony poziom transkryptów IFN-gamma i IL-6 w przeszczepionych sercach. Zatem, negatywna rola regulatorowa CTLA-4 rozcią ga się poza jego potencjalną zdolność przeciwdziałania aktywacji CD28 przez współzawodnictwo ligandów. Nawet w nieobecności CD28, CTLA-4 odgrywa hamującą rolę w regulowaniu odrzucenia alloprzeszczepu.

Podjęto również prace nad dalszym opisem ekspresji CTLA-4. Przykładowo, Alegre i wsp., J Immunol 157:4762-70 (1996) zaproponowali, że powierzchniowy CTLA-4 ulega szybkiej internalizacji, co może wyjaśniać niskie poziomy ekspresji zasadniczo wykrywane na powierzchni komórek. Wywnioskowali oni, że zarówno CD28, jak i IL-2 odgrywają ważną rolę w podwyższaniu ekspresji CTLA-4. Ponadto akumulacja CTLA-4 na powierzchni komórek wydaje się być regulowana przede wszystkim przez jego szybką endocytozę. Również Castan i wsp. Immunology 90:265-71 (1997) w oparciu o analizę immunohistologiczną ekspresji CTLA-4 in situ, wysunęli sugestię, że komórki T w ośrodku namnażania, które były dodatnie względem CTLA-4, powinny być ważne dla regulacji immunologicznej.

Zgodnie z powyższym, w świetle szerokiego zastosowania i kluczowej roli, którą CTLA-4 wydaje się pełnić w mechanizmie odpowiedzi immunologicznej, byłoby pożądane wytworzenie przeciwciał wobec CTLA-4, które mogą być skutecznie stosowane w immunoterapii. Ponadto, byłoby pożądane otrzymanie przeciwciał wobec CTLA-4, które można byłoby wykorzystać w chorobach przewlekłych, w których wymagane jest powtarzane podawanie przeciwciał.

Krótki opis figur

Fig. 1 przedstawia serię sekwencji nukleotydowych i aminokwasowych łańcucha ciężkiego i lekkiego łańcucha kappa cząsteczek immunoglobuliny: 4.1.1 (Fig. 1A), 4.8.1 (Fig. 1B), 4.14.3 (Fig. 1C),

6.1.1 (Fig. 1D), 3.1.1 (Fig. 1E), 4.10.2 (Fig. 1F), 2.1.3 (Fig. 1G), 4.13.1 (Fig. 1H), 11.2.1 (Fig. 1I),

11.6.1 (Fig. 1J), 11.7.1 (Fig. 1K), 12.3.1.1 (Fig. 1L) i 12.9.1.1 (Fig. 1M).

Fig. 2 przedstawia dopasowanie przewidywanych sekwencji aminokwasowych łańcucha ciężkiego z klonów 4.1.1, 4.8.1, 4.14.3, 6.1.1, 3.1.1, 4.10.2, 4.13.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 i 12.9.1.1 oraz sekwencji aminokwasowej linii zarodkowej DP-50 (3-33). Różnice między sekwencją linii zarodkowej DP-50 i sekwencją klonów są wytłuszczone. Figura pokazuje również pozycje sekwencji CDR1, CDR2 i CDR3 jako zacieniowanie.

Fig. 3 przedstawia dopasowanie przewidywanej sekwencji aminokwasowej łańcucha ciężkiego klonu 2.1.3 oraz sekwencji aminokwasowej linii zarodkowej DP-65 (4-31). Różnice między sekwencją linii zarodkowej DP-65 i sekwencją klonu są wytłuszczone. Na figurze pozycje sekwencji CDR1, CDR2 i CDR3 przeciwciała zostały podkreślone.

Fig. 4 przedstawia dopasowanie przewidywanej sekwencji aminokwasowej łańcucha lekkiego kappa klonów 4.1.1, 4.8.1, 4.14.3, 6.1.1, 4.10.2 i 4.13.1 oraz sekwencji aminokwasowej linii zarodkowej A27. Różnice między sekwencją linii zarodkowej A27 i sekwencją klonu są wytłuszczone. Na figurze pozycje sekwencji CDR1, CDR2 i CDR3 przeciwciała zostały podkreślone. Delecje obserwowane w CDR1 klonów 4.8.1, 4.14.3 i 6.1.1 są oznaczone jako „0.

Fig. 5 przedstawia dopasowanie przewidywanej sekwencji aminokwasowej łańcucha lekkiego kappa klonów 3.1.1, 11.2.1, 11.6.1 i 11.7.1 oraz sekwencji aminokwasowej linii zarodkowej 012. Różnice między sekwencją linii zarodkowej 012 i sekwencją klonu są wytłuszczone. Na figurze pozycje sekwencji CDR1, CDR2 i CDR3 przeciwciała zostały podkreślone.

Fig. 6 przedstawia dopasowanie przewidywanej sekwencji aminokwasowej łańcucha lekkiego kappa klonu 2.1.3 oraz sekwencji aminokwasowej linii zarodkowej A10/A26. Różnice między sekwencją linii zarodkowej 012 i sekwencją klonu są wytłuszczone. Na figurze pozycje sekwencji CDR1, CDR2 i CDR3 przeciwciała zostały podkreślone.

Fig. 7 przedstawia dopasowanie przewidywanej sekwencji aminokwasowej łańcucha lekkiego kappa klonu 12.3.1 oraz sekwencji aminokwasowej linii zarodkowej A17. Różnice między sekwencją

PL 210 435 B1 linii zarodkowej A17 i sekwencją klonu są wytłuszczone. Na figurze pozycje sekwencji CDR1, CDR2 i CDR3 przeciwciała zostały podkreślone.

Fig. 8 przedstawia dopasowanie przewidywanej sekwencji aminokwasowej łańcucha lekkiego kappa klonu 12.9.1 oraz sekwencji aminokwasowej linii zarodkowej A3/A19. Różnice między sekwencją linii zarodkowej A3/A19 i sekwencją klonu są wytłuszczone. Na figurze pozycje sekwencji CDR1, CDR2 i CDR3 przeciwciała zostały podkreślone.

Fig. 9 przedstawia podsumowanie N-końcowych sekwencji aminokwasowych wytworzonych poprzez bezpośrednie sekwencjonowanie białka ciężkiego i lekkiego łańcucha przeciwciał.

Fig. 10 przedstawia pewne dodatkowe informacje dotyczące charakterystyki niektórych ujawnionych niniejszym przeciwciał. Na Fig. 10A zebrane są dane dotyczące klonów 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.14.3 i 6.1.1. Przedstawione są dane dotyczące stężenia, ogniskowania izoelektrycznego (IEF), SDS-PAGE, chromatografii wykluczania ze względu na wielkość (SEC), chromatografii cieczowej/spektroskopii mas (LCMS), spektroskopii mas (MALDI) N-końcowych sekwencji łańcucha lekkiego. Dodatkowe szczegółowe informacje dotyczące IEF są przedstawione na Fig. 10B; dotyczące SDS-PAGE są przedstawione na 10C; a SEC przeciwciała 4.1.1 na 10D.

Fig. 11 przedstawia ekspresję B7-1 i B7-2 na komórkach Raji z zastosowaniem mAb antyCD80-PE i anty-CD86-PE.

Fig. 12 przedstawia zależne od stężenia wzmocnienie wytwarzania IL-2 w teście blastocyty

T/Raji indukowane przez blokujące przeciwciała anty-CTLA-4 (BNI3, 4.1.1, 4.8.1 i 6.1.1).

Fig. 13 przedstawia zależne od stężenia wzmocnienie wytwarzania IFN-γ w teście blastocyty T/Raji indukowane przez blokujące przeciwciała anty-CTLA-4 (BNI3, 4.1.1, 4.8.1 i 6.1.1) (te same komórki T dawcy).

Fig. 14 przedstawia średnie wzmocnienie wytwarzania IL-2 w komórkach T od 6 dawców indukowane przez blokujące przeciwciała anty-CTLA-4 w teście blastocyty T/Raji.

Fig. 15 przedstawia średnie wzmocnienie wytwarzania IFN-γ w komórkach T od 6 dawców indukowane przez blokujące przeciwciała anty-CTLA-4 w teście blastocyty T/Raji.

Fig. 16 przedstawia wzmocnienie wytwarzania IL-2 w hPBMC od 5 dawców indukowane przez blokujące mAb anty-CTLA-4 mierzone 72 godziny po stymulacji SEA.

Fig. 17 przedstawia wzmocnienie wytwarzania IL-2 w pełnej krwi od 3 dawców indukowane przez blokujące mAb anty-CTLA-4 mierzone 72 i 96 godzin po stymulacji SEA.

Fig. 18 przedstawia hamowanie wzrostu nowotworu przez przeciwciało anty-mysi-CTLA-4 w mysim modelu włókniakomięsaka.

Fig. 19 przedstawia wzmocnienie wytwarzania IL-2 indukowane przez przeciwciała anty-CTLA-4 (4.1.1 i 11.2.1) w 72 godzinnych testach blastocyty T/Raji i Superantygen (pełna krew i jednojądrzaste komórki krwi obwodowej od 6 pacjentów).

Fig. 20 przedstawia zależne od dawki wzmocnienie wytwarzania IL-2 indukowane przez przeciwciała anty-CTLA-4 (4.1.1 i 11.2.1) w 72 godzinnym w teście blastocyty T/Raji.

Fig. 21 przedstawia zależne od dawki wzmocnienie wytwarzania IL-2 indukowane przez przeciwciała anty-CTLA-4 (4.1.1 i 11.2.1) w 72 godzinnym teście Superantygenu dla pełnej krwi stymulowanej 100 ng/ml superantygenu.

Fig. 22 przedstawia serię dodatkowych sekwencji nukleotydowych i aminokwasowych następujących łańcuchów przeciwciała anty-CTLA-4: łańcuch ciężki pełnej długości 4.1.1 (sekwencja cDNA 22(a), sekwencja genomowa 22(b) oraz sekwencja aminokwasowa 22(c)), pełnej długości nieglikozylowany łańcuch ciężki 4.1.1 (sekwencja cDNA 22(d) i sekwencja aminokwasowa 22(e)), łańcuch lekki

4.1.1 (sekwencja cDNA 22(f) i sekwencja aminokwasowa 22(g)), pełnej długości łańcuch ciężki 4.8.1 (sekwencja cDNA 22(h) i sekwencja aminokwasowa 22(i)), łańcuch lekki 4.8.1 (sekwencja cDNA 22(j) i sekwencja aminokwasowa 22(k)), pełnej długości łańcuch ciężki 6.1.1 (sekwencja cDNA 22(1) i sekwencja aminokwasowa 22(m)), łańcuch lekki 6.1.1 (sekwencja cDNA 22(n) i sekwencja aminokwasowa 22(o)), pełnej długości łańcuch ciężki 11.2.1 (sekwencja cDNA 22(p) i sekwencja aminokwasowa 22(q)) oraz łańcuch lekki 11.2.1 (sekwencja cDNA 22(r) i sekwencja aminokwasowa 22(s)).

Zgodnie z pierwszym aspektem niniejszego wynalazku dostarczone jest ludzkie przeciwciało monoklonalne wiążące się z antygenem 4 cytotoksycznych limfocytów T (CTLA-4), lub jego wiążący antygen fragment, przy czym przeciwciało to obejmuje:

a) łańcuch ciężki obejmujący sekwencję aminokwasową z SEK. NR ID.: 9 lub sekwencję aminokwasową co najmniej w 90% z nią identyczną; oraz

PL 210 435 B1

b) łańcuch lekki obejmujący sekwencję aminokwasową z SEK. NR ID.: 22 lub sekwencję aminokwasową co najmniej w 90% z nią identyczną;

przy czym przeciwciało lub fragment ma powinowactwo wiązania wobec CTLA-4 wynoszące 10^-9 M lub większe, oraz przeciwciało lub fragment hamują wiązanie pomiędzy CTLA-4 i B7-1 z IC50 wynoszącym 100 nM lub niższym oraz obniżają lub hamują wiązanie pomiędzy CTLA-4 i B7-2 z IC50 100 nM lub niższym.

Korzystnie łańcuch lekki przeciwciała według wynalazku obejmuje sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha lekkiego przeciwciała 11.2.1 jak przedstawiono na Fig. 5 lub też łańcuch ciężki przeciwciała obejmuje sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 lub CDR3 przeciwciała

11.2.1 jak przedstawiono na Fig. 2.

Zgodnie z inną korzystną postacią wykonania przeciwciało według wynalazku zawiera sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha ciężkiego przeciwciała 11.2.1 jak przedstawiono na Fig. 2 i sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha lekkiego przeciwciała 11.2.1 jak przedstawiono na Fig. 5.

W kolejnych korzystnych postaciach wykonania przeciwciało lub fragment według wynalazku zawiera

- sekwencję aminokwasową domeny zmiennej łańcucha ciężkiego przeciwciała 11.2.1 (nr dostępu ATCC PTA-5169);

- sekwencję aminokwasową domeny zmiennej łańcucha lekkiego przeciwciała 11.2.1 (nr dostępu ATCC PTA-5169); lub

- sekwencje aminokwasowe domeny zmiennej łańcucha ciężkiego i domeny zmiennej łańcucha lekkiego przeciwciała 11.2.1 (nr dostępu ATCC PTA-5169).

Korzystnie, przeciwciało lub jego fragment według wynalazku jest przeciwciałem 11.2.1 (nr dostępu ATCC PTA-5169) lub ma taką samą sekwencję aminokwasową jak przeciwciało 11.2.1.

Równie korzystnie, przeciwciało lub jego fragment według wynalazku zawiera sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha ciężkiego jak przedstawione w SEK. NR ID.: 70 lub sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha lekkiego jak przedstawione w SEK. NR ID.: 71.

W jeszcze innym korzystnym przykładzie wykonania przeciwciało lub jego fragment według wynalazku zawiera sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha ciężkiego jak przedstawione w SEK. NR ID.: 70 i sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha lekkiego jak przedstawione w SEK. NR ID.: 71.

Przeciwciało lub jego fragment według wynalazku równie korzystnie zawiera sekwencję aminokwasową regionu zmiennego łańcucha ciężkiego jak przedstawiona w SEK. NR ID.: 70 albo sekwencję aminokwasową regionu zmiennego łańcucha lekkiego jak przedstawiona w SEK. NR ID.: 71.

W innej korzystnej postaci wykonania przeciwciał o lub jego fragment według wynalazku zawiera sekwencję aminokwasową domeny zmiennej łańcucha ciężkiego z SEK. NR ID.: 70 oraz sekwencję aminokwasową domeny zmiennej łańcucha lekkiego z SEK. NR ID.: 71.

Równie korzystnie przeciwciało lub jego fragment według wynalazku charakteryzuje się tym, że łańcuch lekki obejmuje sekwencję aminokwasową SEK. NR ID.: 22 lub 71 albo sekwencję aminokwasową SEK. NR ID.: 70.

Korzystnie przeciwciało według wynalazku obejmuje sekwencję aminokwasową łańcucha ciężkiego z SEK. NR ID.: 70 oraz sekwencję aminokwasową łańcucha lekkiego z SEK. NR ID.: 71.

Zgodnie z drugim aspektem niniejszego wynalazku dostarczone jest ludzkie przeciwciało monoklonalne wiążące się z CTLA-4, które składa się z sekwencji aminokwasowej łańcucha ciężkiego z SEK. NR ID.: 70 oraz sekwencji aminokwasowej łańcucha lekkiego z SEK. NR ID.: 71.

Szczegółowy opis wynalazku

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, dostarczone są pełne ludzkie monoklonalne przeciwciała przeciwko ludzkiemu CTLA-4. Niniejszym przedstawione zostały także sekwencje nukleotydowe kodujące sekwencje aminokwasowe obejmujące lekki i ciężki łańcuch cząsteczek immunoglobulinowych, a w szczególności sekwencje odpowiadające ciągłym sekwencjom ciężkiego i lekkiego łańcucha od FR1 i CDR1 do CDR3 i FR4. Ponadto ujawniono niniejszym przeciwciała o podobnych właściwościach wiązania i przeciwciała (lub inne czynniki antagonistyczne) o podobnych właściwościach funkcjonalnych do opisanych tu przeciwciał. W niniejszym opisie ujawnione zostały ponadto hybrydomy wyrażające takie cząsteczki immunoglobulin i przeciwciała monoklonalne.

PL 210 435 B1

Definicje

O ile nie określono inaczej, terminy naukowe i techniczne uż yte w odniesieniu do rozwiązań według wynalazku mają znaczenia powszechnie zrozumiałe dla specjalisty w dziedzinie. Dalej, o ile nie wymaga tego kontekst, terminy użyte w liczbie pojedynczej obejmują liczbę mnogą, a użyte w liczbie mnogiej obejmują liczbę pojedynczą. Ogólnie, użyte w niniejszym zgłoszeniu nazewnictwo i techniki dotyczące hodowli komórek i tkanek, biologii molekularnej, chemii białek, oligo- i polinukleotydów oraz hybrydyzacji są powszechnie znane i stosowane w dziedzinie. Do tworzenia rekombinowanych cząsteczek DNA, syntezy oligonukleotydów, hodowli i transformacji (np. przez elektroporację, lipofekcję) tkanek zastosowano standardowe techniki. Reakcje enzymatyczne i procesy oczyszczania przeprowadzano zgodnie z zaleceniami producentów, sposobami powszechnie znanymi w dziedzinie lub jak opisano w niniejszym zgłoszeniu. Opisane niżej techniki i procedury są ogólnie wykonywane zgodnie ze zwykłymi metodami dobrze znanymi w dziedzinie, jak opisano w wielu ogólnych i bardziej szczegółowych publikacjach, cytowanych i omawianych w niniejszym opisie. Patrz np. Sambrook i wsp. Molecular cloning: A Laboratory Manual (wyd. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Nazewnictwo, techniki i procedury laboratoryjne używane niniejszym w odniesieniu do chemii analitycznej, syntezy organicznej, chemii medycznej i farmacji są dobrze znane w dziedzinie i powszechnie używane w dziedzinie. Standardowe techniki stosowano do syntez chemicznych, analiz chemicznych, przygotowywania i dostarczania farmaceutyków oraz leczenia pacjentów.

O ile nie wskazano inaczej, wymienione poniżej terminy stosowane w niniejszym zgłoszeniu, powinny być rozumiane jako posiadające następujące znaczenia:

Stosowany w niniejszym zgłoszeniu termin „wyizolowany polinukleotyd oznacza polinukleotyd z genomu, cDNA, bądź pochodzenia syntetycznego, lub też połączenie powyższych, który ze względu na swoje pochodzenie (1) nie jest złączony z całym lub fragmentem polinukleotydu, w którym „wyizolowany polinukleotyd znajduje się w naturze, (2) jest funkcjonalnie połączony z polinukleotydem z którym nie jest połączony w naturze, lub (3) nie występuje naturalnie jako część większej sekwencji.

Stosowany w niniejszym zgłoszeniu termin „wyizolowane białko odnosi się do białka, którego podstawę stanowi cDNA, rekombinowany RNA lub do białka pochodzenia syntetycznego lub ich połączenia, które ze względu na swoje pochodzenie lub źródło z którego zostało otrzymane (1) nie jest związane z białkami występującymi w naturze, (2) jest wolne od innych białek z tego samego źródła, np. jest wolne od mysich białek, (3) jest wyrażane przez komórki innego gatunku, lub (4) nie występuje naturalnie.

Stosowane w niniejszym opisie określenie „polipeptyd oznacza ogólny termin odnoszący się do natywnego białka, jego fragmentów lub analogów sekwencji polipeptydowej. Zatem natywne białko, części i analogi sekwencji polipeptydowej są podrodzajami (ang. species) ogólnie określonej grupy polipeptydów (ang. genus). Korzystnie peptydy mogą obejmować cząsteczki ciężkiego łańcucha ludzkich immunoglobulin oraz cząsteczki lekkiego łańcucha kappa ludzkich immunoglobulin, przedstawione na Fig. 1, jak również cząsteczki przeciwciał powstałe przez połączenia ciężkich łańcuchów immunoglobulin z lekkimi łańcuchami immunoglobulin, jak np. cząsteczkami lekkiego łańcucha kappa immunoglobulin, i odwrotnie, jak również ich fragmenty i analogi.

Stosowany niniejszym w odniesieniu do przedmiotu termin „naturalnie występujący lub „występujący w naturze dotyczy przedmiotu, który można znaleźć w przyrodzie. Przykładowo, naturalnie występująca jest sekwencja polipeptydowa lub polinukleotydowa, która jest obecna w jakimś organizmie (włączając wirusy), może być wyodrębniona ze źródła w naturze i nie została celowo zmieniona przez człowieka w laboratorium lub w inny sposób.

Stosowany w niniejszym zgłoszeniu termin „funkcjonalnie połączony odnosi się do takiego połączenia opisywanych tym terminem składników, że mogą one działać w zamierzony sposób. Sekwencja kontrolna „połączona funkcjonalnie z sekwencją kodującą jest z nią zligowana w taki sposób, że osiąga się ekspresję sekwencji kodującej w warunkach właściwych dla sekwencji kontrolnej.

Używany w niniejszym zgłoszeniu termin „sekwencja kontrolna odnosi się do sekwencji polinukleotydowych, niezbędnych, aby doprowadzić do ekspresji i obróbki sekwencji kodujących, z którymi są one połączone. Takie sekwencje kontrolne są różne w zależności od organizmu gospodarza; u prokariotów, sekwencje kontrolne zwykle obejmują promotor, miejsce wiązania rybosomu i sekwencję zakończenia (terminacji) transkrypcji; u eukariotów, zazwyczaj, takie sekwencje kontrolne obejmująpromotory i sekwencje zakończenia transkrypcji. Termin „sekwencje kontrolne obejmuje w założeniu przynajmniej wszystkie składniki, których obecność jest niezbędna do ekspresji i obróbki,

PL 210 435 B1 a mo ż e również obejmować dodatkowe składniki, których obecność jest korzystna, jak przykładowo, sekwencje liderowe i sekwencje partnerów fuzji.

Używany w niniejszym zgłoszeniu termin „polinukleotyd odnosi się do polimerycznej postaci nukleotydów, o długości przynajmniej 10 zasad, zarówno rybonukleotydów, jak i deoksyrybonukleotydów lub modyfikowanych postaci któregokolwiek rodzaju nukleotydów. Termin obejmuje jednoi dwuniciową postać DNA.

Stosowany w niniejszym zgłoszeniu termin „oligonukleotyd odnosi się do występujących naturalnie oraz modyfikowanych nukleotydów połączonych występującymi naturalnie oraz niewystępującymi naturalnie wiązaniami oligonukleotydowymi. Oligonukleotydy są podzbiorem polinukleotydów, które zazwyczaj zawierają 200 zasad lub mniej. Korzystnie oligonukleotydy mają długość 10 do 60 zasad, a najkorzystniej długość 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 lub 20 do 40 zasad. Oligonukleotydy zwykle są jednoniciowe, np. jako sondy, choć oligonukleotydy mogą również występować w postaci dwuniciowej, np. stosowane do mutagenezy genu. Oligonukleotydy według wynalazku mogą być zarówno sensowne (tj. niekodujące), jak i antysensowne (tj. kodujące).

Stosowany w niniejszym zgłoszeniu termin „naturalnie występujące nukleotydy obejmuje deoksyrybonukleotydy i rybonukleotydy. Używany w niniejszym zgłoszeniu termin „modyfikowane nukleotydy obejmuje nukleotydy z modyfikowaną lub podstawioną grupą cukrową i tym podobne. Stosowany w niniejszym zgłoszeniu termin „wiązania oligonukleotydowe obejmuje takie wiązania oligonukleotydowe jak wiązanie tiofosforanowe, ditiofosforanowe, selenofosforanowe, diselenofosforanowe, tioanilofosforanowe, anilofosforanowe, amidofosforanowe i tym podobne. Patrz np. LaPlanche i wsp. Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec i wsp. J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984); Stein i wsp., Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988); Zon i wsp., Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon i wsp. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, str. 87-108 (F. Eckstein, wyd. Oxford Uniwersity Press, Oxford England (1991)); Stec i wsp. Patent USA nr 5,151,510; Uhlmann i Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990). Oligonukleotyd może zawierać znacznik pozwalający na jego wykrycie, jeśli jest to pożądane.

Stosowany niniejszym termin „wybiórczo hybrydyzuje odnosi się do wykrywalnego i specyficznego wiązania. Polinukleotydy, oligonukleotydy i ich fragmenty w rozumieniu niniejszego zgłoszenia wybiórczo hybrydyzują z łańcuchami kwasów nukleinowych w warunkach hybrydyzacji i przemywania minimalizujących wykrywalne wiązanie do niespecyficznych kwasów nukleinowych. W celu osią gnię cia wybiórczej hybrydyzacji moż na zastosować znane w dziedzinie i omówione w niniejszym zgł oszeniu ostre warunki hybrydyzacji. Ogólnie, homologia sekwencji pomiędzy polinukleotydami, oligonukleotydami i ich fragmentami a wybraną sekwencją kwasu nukleinowego musi wynosić przynajmniej 80%, a zazwyczaj, korzystnie wraz z wzrastającą homologią, przynajmniej 85%, 90%, 95%, 99% i 100%. Dwie sekwencje aminokwasowe są homologiczne gdy ich sekwencje są częściowo bądź całkowicie identyczne. Przykładowo, 85% homologia oznacza, że 85% aminokwasów jest identyczne przy najlepszym dopasowaniu dwóch sekwencji. Przerwy (w jednej lub obu porównywanych sekwencjach) są dozwolone, aby zmaksymalizować dopasowanie; korzystne są przerwy o długości 5 lub mniej, bardziej korzystne są przerwy długości 2 lub mniej. Alternatywnie i korzystniej, dwie sekwencje białkowe (lub otrzymane z nich sekwencje polipeptydów o długości przynajmniej 30 aminokwasów) są homologiczne, w znaczeniu tu stosowanym, gdy wynik ich przyrównania, otrzymany w programie ALIGN z macierzą danych mutacyjnych i karą za przerwę wynoszącą 6 lub więcej, wynosi przynajmniej 5 (w jednostkach odchylenia standardowego). Patrz, Dayhoff M.O., w Atlas of Protein Sequence and Structure, str. 101-110 (tom 5, National Biomedical Research Foundation (1972)) i dodatek drugi do tego tomu, str. 1-10. Jeszcze korzystniej, dwie sekwencje lub ich części są homologiczne, gdy ich aminokwasy są w 50% lub więcej identyczne przy optymalnym dopasowaniu za pomocą programu ALIGN.

Stosowany niniejszym termin „odpowiada oznacza, że sekwencja polinukleotydu jest homologiczna (tj. identyczna, a niekoniecznie pokrewna ewolucyjnie) do części bądź całej sekwencji polinukleotydowej odniesienia (tj. sekwencji referencyjnej), bądź odnosi się do sekwencji polipeptydowej identycznej z sekwencją polipeptydową odniesienia. Dla odróżnienia, stosowany niniejszym termin „komplementarny dotyczy sekwencji, której sekwencja komplementarna jest homologiczna do całej bądź części sekwencji polinukleotydowej odniesienia. Na przykład, sekwencja nukleotydowa „TATAC odpowiada sekwencji odniesienia „TATAC i jest komplementarna do sekwencji odniesienia „GTATA.

Następujące określenia są stosowane do opisania relacji pomiędzy dwoma lub większą liczbą sekwencji polinukleotydowych bądź aminokwasowych: „sekwencja odniesienia, „okienko porównaPL 210 435 B1 nia, „identyczność sekwencji, „procent identyczności sekwencji i „zasadnicza identyczność. „Sekwencja odniesienia jest określona jako sekwencja będąca podstawą porównania sekwencji; sekwencja odniesienia może być podzbiorem większej sekwencji, przykładowo częścią pełnej długości cDNA lub sekwencji genu podanej w liście sekwencji lub też może zawierać pełny cDNA bądź sekwencję genu. Ogólnie, sekwencja odniesienia ma długość przynajmniej 18 nukleotydów lub 6 aminokwasów, zwykle przynajmniej 24 nukleotydów lub 6 aminokwasów i często przynajmniej 48 nukleotydów lub 16 aminokwasów. Ponieważ dla dwóch polinukleotydów lub sekwencji aminokwasowych każde z nich może (1) zawierać sekwencję (tj. część pełnego polinukleotydu lub sekwencji aminokwasowej) podobną u tych dwóch cząsteczek i (2) może również zawierać sekwencję różną u tych dwóch polinukleotydów lub sekwencji aminokwasowych, porównanie sekwencji dwu lub więcej cząsteczek zwykle wykonuje się w „okienku porównania, aby znaleźć i porównać lokalne obszary podobieństwa sekwencji.

Stosowany niniejszym termin „okienko porównania dotyczy pojęciowego segmentu przynajmniej 18 nukleotydowych lub 6 aminokwasowych następujących po sobie pozycji przy porównywaniu sekwencji polinukleotydowych lub aminokwasowch do sekwencji odniesienia o co najmniej 18 nukleotydach lub 6 aminokwasach następujących po sobie, przy czym część sekwencji polinukleotydowej w okienku porównania moż e zawierać delecje, insercje, podstawienia i tym podobne (np. przerwy) w 20% lub mniej w porównaniu z sekwencją odniesienia (niezwierają c ą insercji lub delecji) w celu optymalnego dopasowania dwóch sekwencji. Optymalne dopasowanie sekwencji w okienku porównania można przeprowadzić zgodnie z algorytmem lokalnej homologii Smitha i Watermana, Adv. Appl. Math 2:482 (1981), zgodnie z algorytmem dopasowania homologii Needlemana i Wunscha J. Mol. Biol. 48:443 (1970), metodą szukania podobieństwa Pearsona i Lipmana Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 85:2444 (1988), przez komputerowe implementacje tych algorytmów (pakiet oprogramowania zawierający GAP, BESTFIT, FASTA i TFASTA z Wisconsin Genetics Software wersja 7.0 (Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wisconsin), pakiet programów Geneworks lub MacVector), lub przez sprawdzenie i najlepsze dopasowanie (tj. dające najwyższy stopień homologii w okienku porównania) otrzymane różnymi metodami jest wybierane.

Stosowany niniejszym termin „identyczność sekwencji oznacza dwa polinukleotydy lub sekwencje aminokwasowe identyczne (np., nukleotyd za nukleotydem lub aminokwas za aminokwasem) w okienku porównania. Stosowany niniejszym termin „procent identycznoś ci sekwencji obliczany jest dla porównania dwóch optymalnie dopasowanych (przyrównanych) sekwencji w okienku porównania, przez określenie liczby pozycji, w których występują identyczne w obu sekwencjach zasady kwasów nukleinowych (np. A, T, C, G, U lub I) lub reszty aminokwasowe, z otrzymaniem liczby pasujących do siebie pozycji, podzielenie liczby pasujących do siebie pozycji przez liczbę wszystkich pozycji w okienku porównania (tj., przez rozmiar okienka), a nastę pnie pomnoż enie przez 100 w celu otrzymania procentu identyczności sekwencji. Stosowany niniejszym termin „zasadnicza identyczność oznacza sekwencje polinukleotydowe lub aminokwasowe zawierające sekwencje o przynajmniej 85% identyczności sekwencji, korzystnie przynajmniej 90 do 95% identyczności sekwencji, zwykle przynajmniej 99% identyczności w porównaniu do sekwencji odniesienia w okienku porównania zawierającym przynajmniej 18 pozycji nukleotydowych (6 aminokwasowych), często w okienku o przynajmniej 24-48 pozycjach nukleotydowych (8-16 aminokwasowych), przy czym procent identyczności sekwencji oblicza się przez porównanie sekwencji odniesienia z tą sekwencją, która może zawierać delecje lub insercje, których liczba wynosi 20% lub mniej w sekwencji odniesienia w okienku porównania. Sekwencja odniesienia może być podzbiorem większej sekwencji.

Stosowane w niniejszym opisie nazwy dwudziestu typowych aminokwasów i ich skróty są zgodne z konwencjonalnym użyciem. Patrz Immunology - A synthesis (drugie wydanie, E.S. Golub D.R. Green, red., Sinauer Associates, Sunderland, Mass (1991)). Odpowiednimi składnikami polipeptydów według wynalazku mogą również być stereoizomery (np. aminokwasy D) dwudziestu typowych aminokwasów, niewystępujące w naturze aminokwasy, takie jak α,α-dipodstawione aminokwasy, N-alkiloaminokwasy, kwas mlekowy i inne niekonwencjonalne aminokwasy. Przykłady niekonwencjonalnych aminokwasów obejmują: 4-hydroksyprolinę, γ-karboksyglutaminian, ε-N,N,N-trimetylolizynę, ε-N-acetylolizynę, O-fosfoserynę, N-acetyloserynę, N-formylometioninę, 3-metylohistydynę, 5-hydroksylizynę, σ-N-metyloragininę oraz inne podobne aminokwasy i iminokwasy (np. 4-hydroksyprolinę). W stosowanym tu zapisie aminokwasów lewa strona odpowiada końcowi aminowemu, a prawa strona końcowi karboksylowemu, zgodnie ze standardowym zapisem i zwyczajem.

PL 210 435 B1

Podobnie, o ile nie zaznaczono inaczej, lewy koniec sekwencji pojedynczej nici polinukleotydowej odpowiada końcowi 5'; lewy koniec dwuniciowej sekwencji polinukleotydowej odpowiada końcowi 5'. Kierunek 5'-3' powstającego transkryptu RNA określa się jako kierunek transkrypcji; regiony sekwencji nici DNA o sekwencji takiej samej jak nić RNA i położone w kierunku 5' od końca 5' transkryptu określa się jako „sekwencje powyżej (ang. upstream); regiony sekwencji nici DNA o sekwencji takiej samej jak nić RNA i położone w kierunku 3' od końca 3' transkryptu określa się jako „sekwencje poniżej (ang. downstream).

Stosowany niniejszym termin „zasadnicza identyczność w odniesieniu do polipeptydów oznacza, że dwie sekwencje polipeptydowe, po ich optymalnym dopasowaniu, na przykład uzyskanym za pomocą programu GAP czy BESTFIT z domyślnymi wagami dla przerw, mają przynajmniej 80% identyczność sekwencji, korzystniej przynajmniej 90% identyczność sekwencji, bardziej korzystnie przynajmniej 95% identyczność sekwencji, a najkorzystniej przynajmniej 99% identyczność sekwencji. Korzystnie, pozycje reszt aminokwasowych, które nie są identyczne, różnią się konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi. Konserwatywne podstawienia aminokwasowe odnoszą się do wymiany reszt o podobnych łańcuchach bocznych. Przykładowo, grupę aminokwasów o alifatycznych łańcuchach bocznych stanowią glicyna, alanina, walina, lecucyna i izoleucyna; grupę aminokwasów o alifatyczno-hydroksylowych ł a ńcuchach bocznych stanowią seryna i treonina; grupę aminokwasów zawierających grupę amidową w łańcuchach bocznych stanowią asparaginian i glutaminian; grupę aminokwasów o aromatycznych łańcuchach bocznych stanowią fenyloalanina, tyrozyna i tryptofan; grupę aminokwasów o zasadowych łańcuchach bocznych stanowią lizyna, arginina i histydyna; a grupę aminokwasów o łań cuchach bocznych zawierających siarkę stanowią metionina i cysteina. Grupy walina-leucyna-izoleucyna, fenyloalanina-tyrozyna, lizyna-arginina, alanina-walina, asparaginian-glutaminian i glutamina-asparagina stanowią korzystne konserwatywne grupy podstawień aminokwasowych.

Jak omówiono niniejszym, uważa się, że mniejsze zmiany w sekwencji aminokwasowej przeciwciał lub cząsteczek immunoglobulin są w zasięgu niniejszego wynalazku, sprawiając, że różnice sekwencji aminokwasowej utrzymują się na poziomie przynajmniej 90%, 95% i najkorzystniej 99%. W szczególnoś ci rozważ ane są konserwatywne podstawienia aminokwasowe. Konserwatywne podstawienia aminokwasowe to takie, które mają miejsce w obrębie rodziny aminokwasów spokrewnionych łańcuchem bocznym. Kodowane genetycznie aminokwasy są ogólnie podzielone na rodziny (1) kwasowe= asparaginian, glutaminian; (2) zasadowe= lizyna, arginina, histydyna; (3) niepolarne = alanina, walina, leucyna, izoleucyna, prolina, fenyloalanina, metionina, tryptofan oraz (4) nienaładowane polarne= glicyna, asparagina, glutamina, cysteina, seryna, treonina i tyrozyna. Najkorzystniejszymi rodzinami są: seryna i treonina, które stanowią rodzinę aminokwasów alifatyczno-hydroksylowych; asparagina i glutamina, które stanowią rodzinę aminokwasów zawierających grupę amidową; alanina, walina, leucyna i izoleucyna, które stanowią rodzinę alifatyczną; i fenyloalanina, tryptofan i tyrozyna, które stanowią rodzinę aminokwasów aromatycznych. Przykładowo, można oczekiwać że pojedyncze zastąpienie leucyny izoleucyną lub waliną, asparaginianu glutaminianem, treoniny seryną lub podobne zastąpienie aminokwasu pokrewnym strukturalnie aminokwasem nie wywrze dużego wpływu na właściwości wiązania powstałej cząsteczki, w szczególności, jeśli podstawienie nie dotyczy aminokwasu w miejscu wią zania. Na podstawie oznaczenia specyficznej aktywnoś ci pochodnej polipeptydu moż na bez trudu określić, czy w wyniku zmiany aminokwasu powstaje funkcjonalny polipeptyd. Odpowiednie testy opisano szczegółowo w niniejszym zgłoszeniu. Specjalista w dziedzinie może łatwo przygotować fragmenty bądź analogi przeciwciał lub cząsteczek immunoglobulin. Korzystnie końce aminowe i karboksylowe fragmentów lub analogów przypadają blisko granic domen funkcjonalnych. Domeny strukturalne i funkcjonalne można określić porównując dane sekwencji nukleotydowej i/lub aminokwasowej z publicznymi lub prywatnymi bazami danych. Korzystnie, do określenia motywów sekwencji lub przewidywanych domen konformacji białka występujących w innych białkach o znanej strukturze i/lub funkcji, wykorzystuje się komputerowe metody porównawcze. Znane są metody identyfikacji sekwencji białkowych, które ulegają fałdowaniu w znane struktury trójwymiarowe, Bowie i wsp., Science 253:164 (1991). Zatem, zamieszczone dalej przykłady pokazują, że specjalista w dziedzinie może rozpoznawać motywy sekwencji i konformacji strukturalnej, które można wykorzystać do określania domen strukturalnych i funkcjonalnych.

Korzystnymi podstawieniami aminokwasowymi są takie, które: (1) zmniejszają podatność na proteolizę, (2) zmniejszają podatność na utlenienie, (3) zmieniają powinowactwo wiązania do tworzenia kompleksów białkowych i (4) nadają lub zmieniają inne fizycznochemiczne lub funkcjonalne właPL 210 435 B1 ściwości takich analogów. Analogi mogą obejmować różne muteiny sekwencji, inne niż naturalnie występujące sekwencje peptydowe. Przykładowo, pojedyncze lub wielokrotne podstawienia aminokwasowe (korzystnie podstawienia aminokwasowe konserwatywne) mogą być zrobione w naturalnie występującej sekwencji (korzystnie w części polipeptydu poza domeną (domenami) uczestniczącą w oddziaływaniach między cząsteczkami). Konserwatywne podstawienie aminokwasowe nie powinno istotnie zmieniać strukturalnych właściwości macierzystej cząsteczki (np. zmiana aminokwasu nie powinna przerywać helisy występującej w macierzystej cząsteczce lub zaburzać innego rodzaju struktury drugorzędowe występujące w macierzystej cząsteczce). Przykłady znanych w dziedzinie drugorzędowych i trzeciorzędowych struktur białek opisane są w Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, W. H. Freeeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)) oraz Thornton i wsp., Nature 354:105 (1991).

Stosowany niniejszym termin „fragment polipeptydu odnosi się do polipeptydu o delecji na końcu aminokwasowym i/lub karboksylowym, ale w którym sekwencja pozostałych aminokwasów jest identyczna jak w odpowiednich pozycjach naturalnie występującej sekwencji określanej, przykładowo, na podstawie pełnej długości sekwencji cDNA. Fragmenty zwykle mają długość przynajmniej 5, 6, 8 lub 10 aminokwasów, korzystnie długość przynajmniej 14 aminokwasów, bardziej korzystnie długość przynajmniej 20 aminokwasów, zazwyczaj długość przynajmniej 50 aminokwasów i jeszcze korzystniej długość przynajmniej 70 aminokwasów. Stosowany niniejszym termin „analog dotyczy polipeptydów składających się z odcinka przynajmniej 25 aminokwasów o zasadniczej identyczności do części wydedukowanej sekwencji aminokwasowej i o przynajmniej jednej z następujących właściwości: (1) specyficzne wiązanie do CTLA-4, w odpowiednich warunkach wiązania, (2) zdolność blokowania wiązania CTLA-4 do jego receptorów, lub (3) zdolność hamowania wzrostu komórek wyrażających CTLA-4 in vitro lub in vivo. Zazwyczaj analogi polipeptydów zawierają konserwatywne pod względem naturalnie występującej sekwencji podstawienie aminokwasowe (lub addycję lub delecję). Analogi zazwyczaj mają długość 20 aminokwasów, korzystnie przynajmniej 50 aminokwasów lub więcej i często mogą być równie długie jak naturalnie występujący polipeptyd.

Analogi peptydów są często używane w przemyśle farmaceutycznym jako niepeptydowe leki o właściwościach analogicznych do peptydu będącego ich matrycą. Ten rodzaj związków niepeptydowych nazywa się „mimetykami peptydów lub „peptydomimetykami, Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Vebere i Freidinger TINS str. 392 (1985); Evans i wsp. J. Med. Chem. 30:1229 (1987). Takie związki zwykle są opracowywane przy użyciu komputerowego modelowania cząsteczek. Mimetyki peptydów, które są strukturalnie podobne do użytecznych leczniczo peptydów, mogą być stosowane do wytwarzania ekwiwalentnego skutku profilaktycznego lub terapeutycznego. Ogólnie, peptydomimetyki są strukturalnie podobne do modelowego peptydu (np. polipeptydu o właściwościach biochemicznych lub aktywności farmakologicznej), takiego jak ludzkie przeciwciało, ale jedno lub więcej z ich wiązań peptydowych jest ewentualnie zastąpiona wiązaniem wybranym spośród -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH- (cis i trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2- oraz -CH2SO-, metodami dobrze znanymi w dziedzinie. Do wytworzenia bardziej stabilnego peptydu można wykorzystać uporządkowane podstawienie jednego lub więcej aminokwasów sekwencji konsensusowej (sekwencji najwyższej zgodności) D-aminokwasem tego samego rodzaju (np. podstawiając D-lizynę w miejsce L-lizyny). Ponadto, metodami znanymi w dziedzinie można tworzyć wewnętrznie związane peptydy zawierające sekwencję konsensusową (Rizo i Gierasch Ann Rev. Biochem. 61:387 (1997)); przykładowo, dodając wewnętrzne reszty cysteinowe, pozwalające na tworzenie mostków disiarczkowych, które prowadzą do cyklizacji białka.

„Przeciwciało lub „peptyd(y) przeciwciała odnoszą się do nienaruszonego przeciwciała lub jego wiążącego fragmentu (tj. fragmentu odpowiadającego za wiązanie), który współzawodniczy z nienaruszonym przeciwciałem w swoistym wiązaniu. Fragmenty wiążące wytwarza się technikami rekombinowanego DNA lub przez chemiczne czy też enzymatyczne cięcie nienaruszonych przeciwciał. Fragmenty wiążące obejmują Fab, Fab', F(ab')2, Fv i przeciwciała jednołańcuchowe. Jako przeciwciało inne niż „bispecyficzne lub „bifunkcyjne rozumie się przeciwciało, którego każde miejsce wiążące jest identyczne. Przeciwciało zasadniczo hamuje wiązanie receptora z ligandem, gdy nadmiar przeciwciała zmniejsza ilość receptora związanego z ligandem o co najmniej 20%, 40%, 60%, 80%, a zazwyczaj więcej niż 85% lub więcej (mierzone in vitro w teście wiązania kompetycyjnego).

Termin „epitop obejmuje dowolną determinantę białkową zdolną do specyficznego wiązania z immunoglobuliną lub receptorem komórki T. Determinanty epitopów zwykle składają się z che14

PL 210 435 B1 micznie aktywnych ugrupowań powierzchniowych cząsteczek, takich jak aminokwasy lub boczne łańcuchy cukrowe i zazwyczaj posiadają specyficzne trójwymiarowe właściwości, jak również specyficzny rozkład ładunku. Uważa się, że przeciwciało specyficznie wiąże antygen, jeśli stała dysocjacji jest < 1 μM, korzystnie < 100 nM, a najkorzystniej <10 nM.

Stosowany niniejszym termin „środek dotyczy związku chemicznego, mieszaniny związków chemicznych, makrocząsteczki biologicznej lub wyciągu sporządzonego z materiału biologicznego.

Stosowany niniejszym termin „znacznik lub „wyznakowany dotyczy włączania wykrywalnego markera, np. przez włączenie wyznakowanego radioaktywnie aminokwasu lub dołączenie do polipeptydu ugrupowań blotynylowych, które można wykryć znakowaną awidyną (np. streptawidyną zawierającą marker fluorescencyjny lub marker o aktywności enzymatycznej, który można wykryć metodami optycznymi bądź kolorymetrycznymi). W pewnych sytuacjach znacznik lub marker mogą również być lecznicze. Zastosować można rozmaite metody znakowania polipeptydów i glikoprotein znane w dziedzinie. Przykłady znaczników dla polipeptydów obejmują nieograniczająco następujące: radioizotopy lub radionuklidy (np. ³H, ¹⁴C, ¹⁵N, ³⁵S, ⁹⁰Y, ⁹⁹Tc, ¹¹¹In, ¹²⁵l, ¹³¹I), znaczniki fluorescencyjne (np. FITC, rodamina, luminofory z domieszką lantanowców), znaczniki enzymatyczne (np. peroksydaza chrzanowa, β-galaktozydaza, lucyferaza, fosfataza alkaliczna), chemiluminescencyjne, grupy biotynylowe, wcześniej określone epitopy polipeptydowe rozpoznawane przez drugorzędową grupę reporterową (np. sekwencje suwaka leucynowego, miejsca wiązania dla przeciwciał drugorzędowych, domeny wiązania metali, znaczniki epitopowe). Znaczniki mogą być przyłączone przez ramiona łącznikowe (ang. spacer) różnej długości, aby zmniejszyć potencjalną zawadę steryczną.

Stosowany niniejszym termin „środek farmaceutyczny lub lek dotyczy związku chemicznego lub kompozycji zdolnej do wywołania pożądanego skutku leczniczego przy podaniu w odpowiedni sposób pacjentowi. Inne terminy chemiczne tu używane są zgodnie z konwencjonalnym użyciem i znaczeniem w dziedzinie, jak wskazano przykładowo w The MacGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker S., McGraw-Hill, San Francisco (1985)).

Stosowany niniejszym termin „środek przeciwnowotworowy odnosi się do środków, których funkcjonalną cechą jest hamowanie rozwoju lub progresji nowotworu u człowieka, w szczególności złośliwych zmian nowotworowych (rakowych), takich jak rak, mięsak, chłoniak lub białaczka. Hamowanie przerzutów jest częstą właściwością środków przeciwnowotworowych.

Stosowany niniejszym termin „zasadniczo czysty oznacza, że rodzaj substancji jest obecny w przeważającej mierze (np. jego masa molowa jest większa niż któregokolwiek z pozostałych indywidualnych składników kompozycji) i korzystnie zasadniczo czysta frakcja jest kompozycją, w której dany rodzaj substancji stanowi przynajmniej 50% (na podstawie molowej) wszystkich obecnych rodzajów makrocząsteczek. Zwykle zasadniczo czysta kompozycja zawiera więcej niż około 80% wszystkich rodzajów makrocząsteczek obecnych w kompozycji, bardziej korzystnie więcej niż około 80%, 90%, 95% i 99%. Najkorzystniej, przedmiotowa substancja jest oczyszczona do zasadniczej homogenności (zanieczyszczenia nie mogą być w mieszaninie wykryte konwencjonalnymi sposobami detekcji), przy czym kompozycja składa się zasadniczo z jednego rodzaju makrocząsteczek.

Termin pacjenci obejmuje ludzi i podmioty weterynaryjne.

Struktura przeciwciał

Jak wiadomo, podstawową jednostkę strukturalną przeciwciała stanowi tetramer. Każdy tetramer składa się z dwóch identycznych par łańcuchów polipeptydowych, a każda para z łańcucha „lekkiego (około 25 kDa) i łańcucha „ciężkiego (około 50-70 kDa). Część amino-końcowa każdego łańcucha zawiera region zmienny obejmujący 100 do 110 lub więcej aminokwasów głównie odpowiedzialny za rozpoznanie antygenu. Część karboksy-końcowa każdego łańcucha stanowi region stały głównie odpowiedzialny za funkcje efektorowe. Ludzkie łańcuchy lekkie są zaklasyfikowane jako łańcuchy kappa i lambda. Łańcuchy ciężkie są zaklasyfikowane jako mu, delta, gamma, alfa lub epsilon i definiują izotyp przeciwciała jako IgM, IgD, IgG, IgA i IgE, odpowiednio. W obrębie łańcuchów lekkich i ciężkich, regiony zmienne są połączone regionem „J obejmującym około 12 lub więcej aminokwasów, a łańcuch ciężki zawiera również region „D złożony z około 10 aminokwasów. Patrz, Fundamental Immunology rozdz. 7 (Paul, W., wyd. 2-gie. Raven Press, N. Y. (1989)). Regiony zmienne z każdej pary łańcuchów lekki/ciężki tworzą miejsce wiązania przeciwciała.

A zatem, nienaruszone przeciwciało IgG ma dwa miejsca wiązania. Z wyjątkiem przeciwciał bifunkcjonalnych albo bispecyficznych, dwa miejsca wiązania są takie same.

Wszystkie łańcuchy wykazują taką samą ogólną strukturę stosunkowo konserwatywnych regionów zrębowych (FR, ang. framework region) połączonych trzema regionami superzmiennymi, nazyPL 210 435 B1 wanymi również regionami określającymi komplementarność lub CDR (ang.complementarity determining regions). Regiony CDR z dwóch łańcuchów z każdej pary są dopasowane do siebie poprzez regiony zrębowe, umożliwiając wiązanie specyficznego epitopu. W kierunku od końca N do końca C, zarówno łańcuchy lekkie, jak i ciężkie zawierają domeny FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. Aminokwasy przypisuje się do odpowiedniej domeny zgodnie z definicją Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 i 1991)) lub Chothia i Lesk J., Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia i wsp. Nature 342:878-883 (1989).

Przeciwciała bispecyficzne albo bifunkcjonalne są sztucznymi hybrydowymi przeciwciałami mającymi dwie różne pary ciężkich/lekkich łańcuchów i dwa różne miejsca wiązania. Przeciwciała bispecyficzne można wytworzyć różnymi sposobami, łącznie z fuzją hybrydom albo łączeniem fragmentów Fab'. Patrz np. Songsivilai i Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990), Kostelny i wsp., J. Immunol. 148:1547-1553 (1992). Ponadto bispecyficzne przeciwciała można wytwarzać jako „diciała (ang. diabody) (Holliger i wsp. „Diabodies: small bivalent and bispecific antibody fragments PNAS USA 90:6444-6448 (1993)) albo przeciwciało typu „Janusin (Traunecker i wsp. „Bispecific single chain molecules (Janusins) target cytotoxic lymphocytes on HIV infected cells EMBO J 10:3655-3659 (1991) oraz Traunecker i wsp. „Janusin: new molecular design for bispecific reagents Int J Cancer Suppl 7:51-52 (1992)).

Wytwarzanie bispecyficznych przeciwciał możne być stosunkowo pracochłonnym procesem w porównaniu z wytwarzaniem konwencjonalnych przeciwciał, a wydajność i stopień czystości jest zasadniczo niższy dla przeciwciał bispecyficznych. Przeciwciała bispecyficzne nie istnieją w formie fragmentów mających pojedyncze miejsce wiązania (np. Fab, Fab' i Fv).

Ludzkie przeciwciała i humanizowanie przeciwciał

Ludzkie przeciwciała pozwalają uniknąć pewnych problemów związanych z przeciwciałami posiadającymi mysie i szczurze regiony zmienne i/lub stale. Obecność takich białek pochodzących od myszy i szczurów może prowadzić do szybkiego usuwania przeciwciał z organizmu albo może prowadzić do wywołania u pacjenta odpowiedzi immunologicznej przeciwko przeciwciału. Aby unikać zastosowania przeciwciała pochodzących od myszy lub szczura, postuluje się możliwość uzyskania przeciwciał humanizowanych albo wytworzenia przeciwciał w pełni ludzkich poprzez wprowadzenie funkcji ludzkich przeciwciał do gryzoni, tak aby gryzoń mógł wytwarzać przeciwciała mające całkowicie ludzkie sekwencje.

Ludzkie przeciwciała

Możliwość klonowania i rekonstrukcji ludzkiego loci o rozmiarach milionów par zasad w YAC i wprowadzania ich do linii zarodkowych myszy stanowi potężne narzędzie do identyfikowania funkcjonalnych składników bardzo dużych albo jedynie wstępnie zmapowanych loci, jak również do wytwarzania przydatnych modeli chorób ludzkich. Ponadto, wykorzystywanie takiej technologii do zastąpienia mysich loci ich ludzkimi ekwiwalentami mogłoby stanowić unikalną możliwość badania ekspresji i regulacji produktów genowych w czasie rozwoju, ich komunikowania się z innymi układami oraz ich udziału w indukcji i rozwoju chorób.

Ważnym praktycznym zastosowaniem takiej strategii jest „humanizowanie mysiego humoralnego układu immunologicznego. Wprowadzenie ludzkich loci immunoglobulinowych (Ig) do myszy, w której endogenne geny Ig zostały zinaktywowane, oferuje możliwość badania mechanizmów leżących u podstaw programowanej ekspresji i procesu składania przeciwciał, jak również ich roli w rozwoju komórek B. Ponadto, taka strategia stanowiłaby idealne źródło wytwarzania w pełni ludzkich przeciwciał monoklonalnych (Mab) - milowy krok w stronę spełnienia obietnicy terapii ludzkich chorób przeciwciałami. Oczekuje się, że w pełni ludzkie przeciwciała zminimalizują immunogenne i alergiczne reakcje związane z mysimi i pochodzącymi z myszy Mab, a zatem zwiększą skuteczność i bezpieczeństwo podawanych przeciwciał. Można oczekiwać, że zastosowanie w pełni ludzkich przeciwciał dostarczy istotnych korzyści w leczeniu przewlekłych i nawracających ludzkich chorób, takich jak zapalenie, choroby autoimmunologiczne i nowotwory, które wymagają powtarzającego się podawania przeciwciał.

Jednym z podejść zmierzających do tego celu było otrzymanie myszy niewytwarzających mysich przeciwciał (tj. z niedoborem wytwarzania własnych przeciwciał), z dużymi fragmentami ludzkich loci Ig, spodziewając się, że takie myszy będą wytwarzać szeroki repertuar ludzkich przeciwciał pod nieobecność przeciwciał mysich. Duże fragmenty ludzkich Ig zachowują dużą zmienność genową, jak również odpowiednią regulację wytwarzania i ekspresji przeciwciał. Poprzez wykorzystanie mysiej maszynerii do otrzymywania różnorodności i selekcji przeciwciał oraz brak tolerancji immunologicznej

PL 210 435 B1 wobec ludzkich białek, odtworzony repertuar ludzkich przeciwciał w tych myszach może dawać przeciwciała o wysokim powinowactwie wobec dowolnego antygenu będącego przedmiotem zainteresowania, włączając w to antygeny ludzkie. Stosując technologię hybrydomy można wytworzyć i wyselekcjonować od ręki ludzkie Mab o pożądanej specyficzności wobec antygenu.

Tą ogólną strategię zaprezentowano w związku z opracowaniem przez nas pierwszego rodzaju XenoMouse^TM jak opublikowano w 1994. Patrz Green i wsp. Nature Genetics 7:13-21 (1994). XenoMouse^TM otrzymane przy użyciu sztucznych chromosomów drożdżowych (ang. yeast artificial chromosomes, YAC) zawierających fragmenty o wielkości 245 kb i 190 kb do konfiguracji linii zarodkowej ludzkiego łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego kappa, odpowiednio, które zawierają sekwencje rdzeniowe regionu zmiennego i stałego. Udowodniono, że YAC zawierający ludzką Ig odpowiada mysiemu systemowi zarówno w kwestii re-aranżacji, jak i wyrażania przeciwciał i wykazuje zdolność do zastępowania inaktywowanych genów mysich. Zostało to pokazane przez ich zdolność do indukowania rozwoju komórek B, do tworzenia repertuaru całkowicie ludzkich przeciwciał typu dorosłego i do wytwarzania specyficznych wobec antygenu ludzkich Mab. Wyniki te sugerują również, że wprowadzenie większej porcji loci ludzkiego Ig zawierających większą liczbę genów V, dodatkowe elementy regulatorowe i regiony stałe ludzkich Ig może odtworzyć zasadniczo pełen repertuar, który jest charakterystyczny dla ludzkiej odpowiedzi humoralnej na infekcję i immunizację. Praca Green i wsp. została ostatnio rozszerzona o wprowadzenie ponad 80% repertuaru ludzkich przeciwciał poprzez wprowadzenie fragmentów YAC o wielkości tysięcy par zasad i konfiguracji zarodkowej loci ludzkiego łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego kappa, odpowiednio, z wytworzeniem myszy XenoMouse^TM. Patrz Mendez i wsp. Nature Genetics 15:146-156 (1997), Green i Jakobovits J: Exp. Med. 188:483-495 (1998) oraz zgłoszenie patentowe USA, nr seryjny 08/759,620, złożone 3 grudnia, 1996.

Takie podejście jest dalej omawiane i przedstawione w zgłoszeniach patentowych USA o nr seryjnych: 07/466,008, z 12 stycznia 1990, 07/610,515, z 8 listopada 1990, 07/919,297, z 24 lipca 1992, 07/922,649, z 30 lipca 1992, 08/031,801 z 15 marca 1993, 08/112,848 z 27 sierpnia 1993, 08/234,145 z 28 kwietnia 1994, 08/376,279, z 20 stycznia 1995, 08/430,938 z 27 kwietnia 1995, 08/464,584 z 5 czerwca 1995, 08/464,582 z 5 czerwca 1995, 08/463,191 z 5 czerwca 1995, 08/462,837 z 5 czerwca 1995, 08/486,853 z 5 czerwca 1995, 08/486,857 z 5 czerwca 1995, 08/486,859 z 5 czerwca 1995, 08/462,513 z 5 czerwca 1995, 08/724,752 z 2 października 1996 i 08/759,620 z 3 grudnia 1996. Patrz także Mendez i wsp. Nature Genetics 15:146-156 (1997) oraz Green i Jakobovits J. Exp. Med. 188:483495 (1998). Patrz także europejskie zgłoszenie patentowe nr EP 0463 151 B1, o udzieleniu którego opublikowano 12 czerwca 1996, międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO 94/02602, opublikowane 3 lutego 1994, międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO 96/34096, opublikowane 31 października 1996 i WO 98/24893 opublikowane 11 czerwca 1998.

W alternatywnym podejściu inni, włączając w to GenPharm International, Inc. wykorzystali strategię „minilocus. W strategii minilocus, egzogenny locus Ig jest naśladowany poprzez włączenie kawałków (poszczególnych genów) pochodzących z locus Ig. A zatem jeden lub więcej genów VH, jeden lub więcej genów DH jeden lub więcej genów JH, region stały mu i drugi region stały (korzystnie region stały gamma) tworzy się w konstrukcie do wstawienia do zwierzęcia. Podejście to jest opisane w patencie USA nr 5,545,807 na rzecz Surani i wsp. oraz w patentach USA Nr 5,545,806, 5,625,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016, 5,770,429, 5,789,650 i 5,814,318, każdy na rzecz Lonberg i Kay, w patencie USA nr 5,591,669 na rzecz Krimpenfort i Bems, w patentach USA nr 5,612,205, 5,721,367, 5,789,215 na rzecz Bems i wsp., w patencie USA nr 5,643,763 na rzecz Choi i Dunn oraz w zgłoszeniach patentowych USA GenPharm International o nr seryjnych: 07/574,748 z 29 sierpnia 1990, 07/575,962 z 31 sierpnia 1990, 07/810,279 z 17 grudnia 1991, 07/853,408 z 18 marca 1992, 07/904,068, złożone 23 czerwca, 1992, 07/990,860, złożone 16 grudnia, 1992, 08/053,131 z 26 kwietnia 1993, 08/096,762 z 22 lipca 1993, 08/155,301 z 18 listopada 1993, 08/161,739 z 3 grudnia 1993, 08/165,699 z 10 grudnia 1993, 08/209,741 z 9 marca 1994. Patrz także europejskie zgłoszenie patentowe nr 0 546 073 B1, międzynarodowe zgłoszenia patentowe nr WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852 i WO 98/24884. Patrz ponadto Taylor i wsp., (1992), Chen i wsp., (1993), Tuaillon i wsp., 1993, Choi et al., (1993), Lonberg i wsp., (1994), Taylor i wsp., (1994) oraz Tuaillon i wsp., (1995), Fishwild i wsp., (1996).

Surani i wsp., którzy przenieśli prawa z wynalazku na Medical Research Counsel („MRC), wytworzyli transgeniczną mysz posiadającą locus Ig przez zastosowanie podejścia minilocus. Lonberg i Kay z GenPhann International, idąc ś ladem twórców niniejszego wynalazku, zaproponowali inaktywację endogennego mysiego locus Ig połączoną z powtórzeniem zasadniczo prac Surani i wsp.

PL 210 435 B1

Zaletą podejścia minilocus jest szybkość z jaką można wytworzyć i wprowadzić do zwierząt konstrukty zawierające części locus Ig. Jednakże, z drugiej strony, znaczącą niedogodnością podejścia wykorzystującego minilocus jest to, że w teorii uzyskuje się niedostateczne zróżnicowanie niewielkiej liczby genów V, D i J. Rzeczywiście, opublikowane prace wydają się potwierdzać taką obawę. Uzyskiwanie komórek B i wytwarzanie przeciwciał przez zwierzęta otrzymywane w podejściu minilocus wydaje się być wstrzymane. Dlatego badania skoncentrowane wokół niniejszego wynalazku kierowano stale w stronę wprowadzenia większych części locus Ig w celu uzyskania większego zróżnicowania i w celu zrekonstruowania repertuaru immunologicznego zwierząt.

Odpowiedzi ludzkich przeciwciał anty-mysich (ang. human anti-mouse antibody, HAMA) doprowadziły do przemysłowego otrzymywania chimerowych i w inny sposób humanizowanych przeciwciał. Jakkolwiek chimerowe przeciwciała mają ludzkie regiony stałe i mysie regiony zmienne, można się spodziewać, że będą obserwowane pewne odpowiedzi ludzkich przeciwciał anty-chimerowych (ang. human anti-chimeric antibody, HACA), szczególnie przy długotrwałym lub wielodawkowym stosowaniu przeciwciała. A zatem, będzie pożądane dostarczenie w pełni ludzkich przeciwciał wobec CTLA-4 w celu oddalenia obaw i/lub działań związanych z odpowiedzią HAMA lub HACA.

Technologie humanizowania i prezentacji

Jak omówiono powyżej w odniesieniu do wytwarzania ludzkiego przeciwciała, istnieją zalety wytwarzania przeciwciał o obniżonej immunogenności. Do pewnego stopnia można je uzyskać w powiązaniu z technikami humanizacji i prezentacji stosując odpowiednie biblioteki. Będzie można dostrzec, że mysie przeciwciała albo przeciwciała z innych gatunków można humanizować albo upodobnić do przeciwciał naczelnych (ang. primatize) stosując techniki znane w tej dziedzinie. Patrz na przykład, Winter i Harris Immunol Today 14:43-46 (1993) oraz Wright i wsp. Crit. Reviews in Immunol 12125-168 (1992). Przeciwciało będące przedmiotem zainteresowania można skonstruować techniką rekombinowania DNA w celu zastąpienia domen zawiasowych CH1, CH2 i CH3 i/lub domen zrębowych odpowiednimi sekwencjami ludzkimi (patrz WO 92/02190 i patenty USA nr 5,530,101, 5,585,089, 5,693,761, 5,693,792, 5,714,350 i 5,777,085). Ponadto znane jest w tej dziedzinie stosowanie cDNA Ig w celu rekonstrukcji genów immunoglobulinowych (Liu i wsp. P.N.A.S. 84:3439 (1987) oraz J. Immunol.139:3521 (1987)). mRNA izoluje się z hybrydomy albo innych komórek wytwarzających przeciwciała i używa się do wytworzenia cDNA. cDNA będący przedmiotem zainteresowania można powielać w reakcji łańcuchowej polimerazy stosując specyficzne startery (patenty USA nr 4,683,195 i 4,683,202). Alternatywnie, tworzy się i przeszukuje biblioteki w celu wyizolowania sekwencji będącej przedmiotem zainteresowania. Sekwencja DNA kodująca region zmienny przeciwciała poddawana jest fuzji z sekwencjami ludzkiego regionu stałego. Sekwencje genów ludzkich regionów stałych można znaleźć w Kabat i wsp. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, N.I.H. publikacja nr 91-3242. Geny ludzkich regionów C są łatwo dostępne ze znanych klonów. Przy wyborze izotypu będzie można kierować się pożądanymi funkcjami efektorowymi, takimi jak wiązanie dopełniacza albo aktywność przy zależnej od przeciwciała cytotoksyczności komórkowej. Korzystnymi izotypami są IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. Szczególnie użytecznymi izotypami dla przeciwciał opisanych niniejszym są IgG2 i IgG4. Można zastosować każdy z regionów stałych ludzkiego łańcucha lekkiego, kappa lub lambda. Chimerowe, humanizowane przeciwciała można następnie wyrażać poprzez zastosowanie konwencjonalnych metod.

Fragmenty przeciwciał, takie jak Fv, F(ab')2 i Fab można przygotować poprzez cięcie białka będącego przedmiotem zainteresowania, np. poprzez cięcie proteazą albo cięcie chemiczne. Alternatywnie, projektuje się gen skrócony. Przykładowo, chimerowy gen kodujący część fragmentu F(ab')2 będzie zawierał sekwencje DNA kodujące domenę CH1 i region zawiasowy łańcucha H, po którym następuje kodon stop dla translacji, tak aby otrzymać cząsteczkę skróconą.

W jednym z podejść można zastosować sekwencje najwyższej zgodności kodujące ciężkie i lekkie łańcuchy regionów J w celu zaprojektowania oligonukleotydów do zastosowania jako startery do wprowadzenia przydatnych miejsc restrykcyjnych do regionu J w celu następującego dalej połączenia fragmentów regionu V z odcinkami ludzkiego regionu C. DNA regionu C można zmodyfikować poprzez ukierunkowaną mutagenezę w celu umieszczenia miejsca restrykcyjnego w analogicznej pozycji ludzkiej sekwencji.

Wektory ekspresyjne obejmują plazmidy, retrowirusy, kosmidy, YAC, episomy pochodzące od EBV i tym podobne. Dogodny wektor jest takim wektorem, który koduje funkcjonalnie kompletną sekwencję ludzkiej immunoglobuliny CH lub CL, z odpowiednimi miejscami restrykcyjnymi utworzonymi w taki sposób, aby można było wstawiać i wyrażać dowolną sekwencję VH lub VL. W takich wekto18

PL 210 435 B1 rach, składanie zwykle następuje pomiędzy donorowym miejscem składania we wstawionym regionie J i akceptorowym miejscem składania, które poprzedza ludzki region C, a także w regionie składania, który występuje w obrębie ludzkich eksonów CH. Poliadenylacja i terminacja transkrypcji następują w natywnych miejscach chromosomowych poniżej regionów kodujących. Otrzymane w rezultacie chimerowe przeciwciało można dołączyć do dowolnego silnego promotora, łącznie z retrowirusowym LTR, takiego jak np. wczesny promotor SV-40 (Okayama i wsp. Mol. Cell. Bio. 3:280 (1983)), LTR wirusa mięsaka Rousa (Gorman i wsp. P.N.A.S. 79:6777 (1982) i LTR mysiego wirusa białaczki Moloneya (Grosschedl i wsp. Cell 41:885 (1985)); natywne promotory Ig, itd.

Ponadto, ludzkie przeciwciała lub przeciwciała z innych gatunków można wytworzyć poprzez technologię prezentacji, włączając w to między innymi prezentację na fagach, prezentację na retrowirusach, prezentację na rybosomach i inne techniki, stosowane w tej dziedzinie, a otrzymane w rezultacie cząsteczki można poddawać dalszemu dojrzewaniu, takiemu jak dojrzewanie poprzez powinowactwo, jako że techniki te są dobrze znane w tej dziedzinie. Wright i Harris, jak wyżej., Hanes i Plucthau PNAS USA 94:4937-4942 (1997) (prezentacja na rybosomach), Parmley i Smith, Gene 73:305-318 (1988) (prezentacja na fagach), Scott, TIBS 17:241-245 (1992), Cwirla i wsp., PNAS USA 87:6378-6382 (1990), Russel i wsp. Nucl. Acids Research 21:1081-1085 (1993), Hoganboom i wsp. Immunol. Reviews 130:43-68 (1992), Chiswell i McCafferty TIBTECH 10:80-84 (1992) oraz patent USA nr 5,733,743. Jeżeli technologię prezentacji stosuje się do wytworzenia przeciwciał, które nie są ludzkie, takie przeciwciała mogą być humanizowane jak opisano powyżej.

Stosując te techniki, można wytworzyć przeciwciała wobec komórek wyrażających CTLA-4, samego CTLA-4, form CTLA-4, jego peptydów i epitopów oraz bibliotek ekspresyjnych (patrz np. patent USA nr 5,703,057) które można przeszukiwać następnie jak opisano powyżej pod kątem opisanych powyżej aktywności.

Dodatkowe kryteria dla leków na bazie przeciwciał

Jak będzie to docenione, zasadniczo nie jest pożądane zabijanie komórek wyrażających CTLA-4. Raczej, ogólnie pożądane jest po prostu hamowanie wiązania CTLA-4 z jego ligandami w celu złagodzenia obniżania aktywności komórek T. Jednym z głównych mechanizmów, przez który przeciwciała zabijają komórki jest wiązanie dopełniacza i udział w CDC. Region stały przeciwciała odgrywa ważną rolę z punktu widzenia zdolności przeciwciała do wiązania dopełniacza i udziału w CDC. Zatem, generalnie można tak wybrać izotyp przeciwciała, aby dostarczyć zdolności wiązania dopełniacza albo nie. W przypadku niniejszego wynalazku, ogólnie, jak wspomniano powyżej, nie jest korzystne stosowanie przeciwciała, które zabija komórki. Istnieje wiele izotypów przeciwciał, które mają zdolność wiązania dopełniacza i CDC, obejmujące między innymi: mysią IgM, mysią IgG2a, mysią IgG2b, mysią IgG3, ludzką IgM, ludzką IgG1 i ludzką IgG3. Izotypy takie nie obejmują, między innymi, ludzkiej IgG2 i ludzkiej IgG4.

Będzie docenione, że przeciwciała, które są wytwarzane nie muszą wyjściowo posiadać pożądanego izotypu, ale raczej wytworzone przeciwciało może posiadać dowolny izotyp, który można później przełączyć stosując znane w dziedzinie konwencjonalne techniki. Takie techniki obejmują, między innymi, zastosowanie bezpośrednich technik rekombinowania (patrz np. patent USA nr 4,816,397), techniki fuzji komórka-komórka (patrz np. zgłoszenie patentowe nr 08/730,639 z 11 października 1996).

W technice fuzji komórka-komórka, przygotowywana jest linia komórkowa szpiczaka albo inna, która posiada łańcuch ciężki z pożądanym izotopem oraz inna linia komórkowa szpiczaka albo inna, która posiada łańcuch lekki. Takie komórki można następnie poddać fuzji i wyizolować linię komórkową wrażającą nienaruszone przeciwciało.

Jako przykład, większość omawianych tu przeciwciał przeciwko CTLA-4 to ludzkie przeciwciało anty-CTLA-4 IgG2. Ponieważ takie przeciwciała posiadają pożądaną zdolność wiązania cząsteczki CTLA-4, dowolnemu z takich przeciwciał można łatwo zmienić izotyp w celu wytworzenia, na przykład, ludzkiego izotypu IgG4, jednocześnie posiadającego nadal ten sam region zmienny (który definiuje specyficzność przeciwciała i część jego powinowactwa).

A zatem, po wytworzeniu przeciwciał, które posiadają pożądane atrybuty „strukturalne jak omówiono powyżej, można je zaopatrzyć w najmniej pewne dodatkowe pożądane atrybuty „funkcjonalne poprzez zmianę izotypu.

Projektowanie i wytwarzanie innych leków

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem i na podstawie aktywności przeciwciał, które są wytwarzane i charakteryzowane w odniesieniu do CTLA-4, ułatwione jest projektowanie innych środków terapeuPL 210 435 B1 tycznych, obejmujących inne przeciwciała, innych antagonistów albo cząsteczki chemiczne inne niż przeciwciała. Takie środki obejmują, między innymi, przeciwciała o podobnej aktywności wiązania albo funkcjonalności, zaawansowane leki w oparciu o przeciwciała, takie jak przeciwciała bispecyficzne, immunotoksyny i leki wyznakowane radioaktywnie, wytwarzanie leków peptydowych, terapie genowe, a w szczególności wytwarzanie przeciwciał typu „intrabody wewnątrz komórki, terapie w oparciu o cząsteczki antysensowne i małe cząsteczki. Ponadto, jak omówiono powyżej, funkcje efektorowe przeciwciał według wynalazku można zmieniać przez zmianę izotypu na IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE lub IgM dla różnych zastosowań leczniczych.

W związku z opracowywaniem zaawansowanych terapeutyków w oparciu o przeciwciała, dla których wiązanie dopełniacza jest pożądanym atrybutem, możliwe jest odsunięcie na bok zależności od dopełniacza, na rzecz uśmiercania komórek poprzez zastosowanie, na przykład, przeciwciał bispecyficznych, immunotoksyn i leków wyznakowanych radioaktywnie.

W odniesieniu do przeciwciał bispecyficznych, można wytworzyć przeciwciała bispecyficzne, które zawierają (i) dwa połączone ze sobą przeciwciała: jedno swoiste wobec CTLA-4, a drugie wobec innej cząsteczki, (ii) pojedyncze przeciwciało, które ma jeden łańcuch swoisty wobec CTLA-4, a drugi łańcuch swoisty wobec innej cząsteczki lub (iii) przeciwciało jednołańcuchowe, które wykazuje swoistość względem CTLA-4 i innej cząsteczki. Takie bispecyficzne przeciwciała można wytworzyć przy zastosowaniu dobrze znanych technik, na przykład odnośnie (i) i (ii), patrz Fanger i wsp. Immunol Methods 4:72-81 (1994) oraz Wright i Harris, jak wyżej, a odnośnie (iii) patrz Traunecker i wsp. Int. J. Cancer (Suppl.) 7:51-52 (1992).

Ponadto, można również wytworzyć „kappa-ciała (ang. kappabodies) (lll i wsp. „Design and construction of a hybrid immunoglobulin domain with properties of both heavy and light chain variable regions Protein Eng 10:949-57 (1997)), „mini-ciała (ang. minibodies) (Martin i wsp. „The affmity-selection of a minibody polypeptide inhibitor of human interleukin-6 EMBO J 13:5303-9 (1994)), „di-ciała (Holliger i wsp., “Diabodies: small bivalent and bispecific antibody fragments PNAS USA 90:6444-6448 (1993)), albo przeciwciała typu „Janusin (Traunecker i wsp. „Bispecific single chain molecules (Janusins) target cytotoxic lymphocytes on HIV infected cells EMBO J 10:3655-3659 (1991) oraz Traunecker i wsp. „Janusin: new molecular design for bispecific reagents Int J Cancer Suppl 7:51-52 (1992)).

W odniesieniu do immunotoksyn, przeciwciała można modyfikować tak, aby działały jako immunotoksyny stosując techniki dobrze znane w dziedzinie. Patrz na przykład, Vitetta Immunol Today 14:252 (1993). Patrz również patent USA nr 5,194,594. Jeśli chodzi o wytwarzanie wyznakowanych radioaktywnie przeciwciał, takie zmodyfikowane przeciwciała można łatwo otrzymać stosując techniki dobrze znane w dziedzinie. Patrz np., Junghans i wsp. w Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (wydanie 2, Chafner i Longo, red., Lippincott Raven (1996)). Patrz również patenty USA nr 4,681,581, 4,735,210, 5,101,827, 5,102,990 (RE 35,500), 5,648,471 i 5,697,902. Każda z immunotoksyn i cząsteczek wyznakowanych radioaktywnie będzie prawdopodobnie zabijała komórki wyrażające CTLA-4, a w szczególności te komórki, wobec których przeciwciała tu opisane są skuteczne.

W odniesieniu do wytwarzania leków peptydowych poprzez zastosowanie informacji strukturalnej związanej z CTLA-4 i przeciwciałami skierowanymi wobec niego, takich jak przeciwciała według wynalazku (jak omówiono poniżej w odniesieniu do małych cząsteczek) albo poprzez przeszukiwanie bibliotek peptydowych, można wytworzyć lecznicze peptydy skierowane przeciwko CTLA-4. Projektowanie i przeszukiwanie bibliotek peptydowych jest omówione w Houghten i wsp. Biotechniques 13:412-421 (1992), Houghten PNAS USA 82:5131-5135 (1985), Pinalla i wsp. Biotechniques 13:901-905 (1992), Blake i Litzi-Davis BioConjugate Chem. 3:510-513 (1992). Immunotoksyny i leki wyznakowane radioaktywnie można również wytworzyć, w podobny sposób, w połączeniu z ugrupowaniami peptydów, jak zostało to omówione powyżej w odniesieniu do przeciwciał.

Ważne informacje dotyczące wiązania przeciwciała z antygenem można uzyskać poprzez doświadczenia z prezentacją na fagach. Takie doświadczenia prowadzi się na ogół poprzez przesiewanie biblioteki fagowej z ekspresją losowych peptydów pod kątem wiązania przeciwciał według wynalazku w celu określenia, czy można wyizolować wiążące peptydy. Jeżeli to się uda, na podstawie wiążących peptydów można zdobyć pewne informacje o epitopach.

Zasadniczo, biblioteki fagowe z ekspresją losowych peptydów oparte o system bakteriofaga M13 można nabyć w New England Biolabs (biblioteki 7-merowe i 12-merowe, Ph.D.- 7 Peptide 7-mer Library Kit i Ph.D.-12 Peptide 12-mer Library Kit, odpowiednio). Biblioteka 7-merowa zawiera 2,0 x 10⁹ niezależnych klonów, które reprezentują większość, jeżeli nie wszystkie z 20⁷ = 1.28 x 10⁹ możliwych

PL 210 435 B1 sekwencji 7-merowych. Biblioteka 12-merowa zawiera około 1.9 x 10⁹ niezależnych klonów, reprezentujących jedynie niewielką próbkę możliwych 20¹² = 4.1 x 10¹⁵ sekwencji 12-merowych. Każdą z 7-merowych i 12-merowych bibliotek przesiewa się lub przeszukuje zgodnie z zaleceniami producenta, przy czym płytki są opłaszczane przeciwciałami w celu wyłapania odpowiedniego przeciwciała (na przykład kozie Fc przeciwko ludzkiej IgG dla przeciwciała IgG), a następnie przemywane. Związane fagi wymywa się przy zastosowaniu 0,2 M glicyny-HCl, pH 2,2. Po 3 rundach selekcji/namnażania przy stałej ostrości (0,5% Tween), klony z bibliotek, które wykazują reakcję z jednym albo większą liczbą przeciwciał można scharakteryzować poprzez sekwencjnowanie DNA. Reaktywność peptydów można potwierdzić w teście ELISA. Dodatkowe omówienie dotyczące analizy epitopów w peptydach można znaleźć w Scott, J. K. i Smith, G. P. Science 249:386-390 (1990); Cwirla i wsp. PNAS USA 87:63786382 (1990); Felici i wsp. J. Mol. Biol. 222:301-310 (1991) oraz Kuwabara i wsp. Nature Biotechnology 15:74-78 (1997).

Dzięki niniejszemu wynalazkowi ułatwione jest również projektowanie leków genowych i/lub antysensownych poprzez zastosowanie konwencjonalnych technik. Takie środki można zastosować do modulowania funkcji CTLA-4. W związku z tym przeciwciała według niniejszego wynalazku ułatwiają opracowywanie i zastosowanie testów funkcjonalnych. Projektowanie i strategia terapii w oparciu o czą steczki antysensowne jest szczegół owo omówiona w mię dzynarodowym zgł oszeniu patentowym nr WO 94/29444. Projektowanie i strategie terapii genowej są dobrze znane. Jednakże zastosowanie technik terapii genowej, w których biorą udział przeciwciała typu „intrabody mogłoby okazać się szczególnie korzystne. Patrz np., Chen i wsp. Human Gene Therapy 5:595-601 (1994) oraz Marasco Gene Therapy 4:11-15 (1997). Ogólny obraz i zagadnienia dotyczące leków genowych zostały omówione w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym nr WO 97/38137. Materiał genetyczny kodujący przeciwciało (takie jak 4.1.1, 4.8.1 lub 6.1.1 i inne) może znajdować się w odpowiednim układzie ekspresyjnym (czy to wirusowym, opartym na osłabionych wirusach, nie-wirusowym, nagim DNA albo innych) i podawane gospodarzowi w celu wytworzenia przeciwciał; in vivo w gospodarzu.

Możliwe jest także opracowanie małych cząsteczek leczniczych. W oparciu o niniejszy wynalazek można zaprojektować leki, tak, aby modulowały aktywność CTLA-4. Wiedza zdobyta na podstawie struktury cząsteczki CTLA-4 i jej oddziaływań z innymi cząsteczkami, takimi jak przeciwciała według wynalazku i inne ujawnione niniejszym przeciwciała, CD28, B7, B7-1, B7-2, może być zastosowana do teoretycznego zaprojektowania dodatkowych środków terapeutycznych. W tym aspekcie, w celu skupienia wysił ków na projektowaniu leków moż na zastosować teoretyczne techniki projektowania leków, takie jak krystalografia rentgenowska, modelowanie komputerowe (lub z pomocą komputera) (ang. computer assisted molecular modeling, CAMM), ilościowy lub jakościowy związek struktura-funkcja (ang. quantitative or qualitative structure-activity relationship, QSAR) i podobne technologie. Projektowanie teoretyczne umożliwia przewidywanie struktur białkowych albo syntetycznych, które mogą oddziaływać z cząsteczką albo jej specyficznymi formami, które można zastosować do modyfikowania albo modulowania aktywności CTLA-4. Takie struktury można syntetyzować chemicznie albo wyrażać w układach biologicznych. Podejście takie zostało omówione w Capsey i wsp. Genetically Engineered Human Therapeutic Drugs (Stockton Press, NY (1988)). W rzeczywistości, teoretyczne projektowanie cząsteczek (czy to peptydów, peptydomimetyków, małych cząsteczek czy temu podobnych) w oparciu o znany albo ustalony związek struktura-aktywność z innymi cząsteczkami (takimi jak przeciwciała według wynalazku) staje się rutynowe. Patrz np. Fry i wsp. „Specific, irreversible inactivation of the epidermal growth factor receptor and erbB2, by a new class of tyrosine kinase inhibitor Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:12022-7 (1998); Hoffman i wsp. „A model of Cdc25 phosphatase catalytic domain and Cdk-interaction surface based on the presence of a rhodanese homology domain J. Mol. Biol. 282:195-208 (1998); Ginalski i wsp. „Modelling of active forms of protein kinases: p38-a case study Acta Biochim Pol 44:557-64 (1997); Jouko i wsp. „Identification of csk tyrosine phosphorylation sites and a tyrosine residue important for kinase domain structure Biochem J 322:927-35 (1997); Singh i wsp. „Structure-based design of a potent, selective, and irreversible inhibitor of the catalytic domain of the erbB receptor subfamily of protein tyrosine kinases J. Med. Chem. 40:1130-5 (1997); Mandel i wsp. „ABGEN: a knowledge-based automated approach for antibody structure modeling Nat Biolechnol 14:323-8 (1996); Monfardini i wsp. „Rational design, analysis, and potential utility of GM-CSF antagonists Proc Assoc Am Physicians 108:420-31(1996); Furet i wsp. „Modelling study of protein kinase inhibitors: binding mode of staurosporine and origin of the selectivity of CGP 52411 J Comput Aided Mol Des 9:465-72 (1995).

PL 210 435 B1

Ponadto, można zaprojektować i zsyntetyzować biblioteki kombinatoryczne i zastosować je w programach przeszukiwania, takich jak próby przeszukiwania na dużą skalę.

Podawanie leków i kompozycje farmaceutyczne

Będzie to docenione, że podawanie środków terapeutycznych może być dokonywane poprzez podawanie ich wraz z odpowiednimi nośnikami, zaróbkami i innymi środkami, które wchodzą w skład kompozycji w celu zapewnienia ulepszonego przenoszenia, dostarczenia, tolerancji i tym podobnych. Liczne odpowiednie kompozycje można znaleźć w zbiorze znanym specjalistom z dziedziny chemii farmaceutycznej: Remington's Pharmaceutical Sciences (wyd. 15, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975)), szczególnie w rozdziale 87 autorstwa Blaug, Seymour. Kompozycje te obejmują, na przykład proszki, pasty, maści, żele, woski, oleje, lipidy, pęcherzyki zawierające lipidy (kationowe albo anionowe) (takie jak Lipofectin TM), koniugaty DNA, bezwodne pasty absorpcyjne, emulsje oleju w wodzie albo wody w oleju, emulsje wosków węglowych (glikole polietylenowe o różnych ciężarach cząsteczkowych), żele półpłynne, mieszaniny półpłynne zawierające woski węglowe. Dowolna z powyższych mieszanin może być odpowiednia do leczenia i terapii, zakładając, że składnik aktywny nie jest inaktywowany przez kompozycję i jest ona fizjologicznie dopuszczalna i tolerowana przy danej drodze podawania. Patrz również Powell i wsp. „Compendium of excipients for parenteral fornlulations PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998) i zacytowane tam odnośniki w celu uzyskania dodatkowych informacji dotyczących zaróbek i nośników dobrze znanych w dziedzinie chemii leków. Wytwarzanie przeciwciał

Korzystne jest otrzymywanie przeciwciał poprzez zastosowanie transgenicznej myszy, do której wprowadzono istotną część ludzkiego genomu niezbędną dla wytworzenia przeciwciała, a jednocześnie którą uczyniono niezdolną do wytwarzania endogennych, mysich przeciwciał. Takie myszy są wówczas zdolne do wytwarzania cząsteczek ludzkich immunoglobulin i przeciwciał, a są niezdolne do wytwarzania cząsteczek mysich immunoglobulin i przeciwciał. Technologie zastosowane do osiągnięcia tego celu są ujawnione w patentach, zgłoszeniach patentowych i odnośnikach zamieszczonych w części dotyczącej stanu techniki. Jednakże szczególnie korzystne postacie wykonania dla procesu wytwarzania transgenicznych myszy, a z nich przeciwciał, są ujawnione w zgłoszeniu patentowym USA nr seryjny 08/759,620 z 3 grudnia 1996. Patrz także Mendez i wsp. Nature Genetics 15:146-156 (1997).

Dzięki zastosowaniu takiej technologii, wytworzyliśmy w pełni ludzkie monoklonalne przeciwciała wobec rozmaitych antygenów. Zasadniczo, immunizujemy linie myszy XenoMouse^TM antygenem będącym przedmiotem zainteresowania, pobieramy komórki limfatyczne (takie jak komórki B) z myszy, które wyrażają przeciwciała, łączymy takie pobrane komórki z liniami komórkowymi typu szpiczaka w celu otrzymania unieśmiertelnionych linii komórkowych hybrydom i takie linie komórkowe hybrydom są przeszukiwane i selekcjonowane w celu zidentyfikowania linii komórkowych hybrydomy, które wytwarzają przeciwciała swoiste wobec antygenu będącego przedmiotem zainteresowania. Zastosowaliśmy te techniki do wytworzenia przeciwciał swoistych wobec CTLA-4. Niniejszym opisujemy wytwarzanie wielu linii komórkowych hybrydom, które wytwarzają przeciwciała swoiste wobec CTLA-4. Ponadto, dostarczyliśmy charakterystykę przeciwciał wytwarzanych przez takie linie komórkowe, włączając w to analizę sekwencji aminokwasowej ciężkich i lekkich łańcuchów takich przeciwciał.

Przeciwciała pochodzące z omawianych niniejszym hybrydom są oznaczone jako 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.13.1, 4.14.3, 6.1.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 i 12.9.1.1. Każde z przeciwciał wytwarzanych przez wymienione uprzednio linie komórkowe obejmuje w pełni ludzkie łańcuchy ciężkie IgG2 bądź IgG4 z ludzkimi łańcuchami lekkimi kappa. Ogólnie, przeciwciała według wynalazku posiadają bardzo wysokie powinowactwo, zazwyczaj wykazują Kd od około 10^-9 do około 10^-11 M, przy pomiarze w fazie stałej bądź w roztworze.

Będzie doceniony fakt, że przeciwciała według wynalazku mogą być wyrażane w liniach komórkowych innych niż linie komórek hybrydomy.

Sekwencje kodujące DNA albo klony genomowe dla poszczególnych przeciwciał można zastosować do transformowania odpowiednich ssaczych albo innych niż ssacze komórek gospodarza. Transformację można przeprowadzić dowolną ze znanych metod do wprowadzania polinukleotydów do komórek gospodarza, włączając w to między innymi pakowanie polinukleotydów do wirusów (albo do wektorów wirusowych) i transdukowanie komórek gospodarza wirusem (albo wektorem) albo procedurę transfekcji znaną w dziedzinie, której przykłady przedstawiono w patentach USA 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461, i 4,959,455. Zastosowane procedury transformacji będą zależały od gospodarza, który ma być transformowany. Sposoby wprowadzania heterologicznych polinukleotydów do komórek ssaków są

PL 210 435 B1 dobrze znane w dziedzinie i obejmują między innymi transfekcję zachodzącą za pośrednictwem dekstranu, precypitację fosforanem wapnia, transfekcję zachodzącą za pośrednictwem polibrenu, fuzję protoplastów, elektroporację, bombardowanie cząstkami, enkapsulacja polinukleotydów w liposomach, koniugaty peptydowe, dendrymery i bezpośrednie wstrzykiwanie DNA do jąder.

Ssacze linie komórkowe dostępne jako gospodarz do ekspresji są dobrze znane w dziedzinie i obejmują wiele unieśmiertelnionych linii komórkowych dostępnych z American Type Culture Collection (ATCC), włączając w to między innymi komórki jajnika chomika chińskiego (ang. Chinese hamster ovary, CHO), NSO0, komórki HeLa, komórki nerki młodego chomika (ang. baby hamster kidney, BHK), komórki małpiej nerki (COS), ludzkie komórki raka wątroby (np., Hep G2) i wiele innych linii komórkowych. Komórki nie-ssacze obejmujące między innymi komórki bakteryjne, drożdżowe, owadzie i roślinne mogą być zastosowane do wyrażania zrekombinowanych przeciwciał. Ukierunkowana metageneza domeny CH2 przeciwciała w celu wyeliminowanie glikozylacji może być korzystna w celu zapobiegania zmianom w immunogenności, farmakokinetyce i/lub funkcjach efektorowych będących wynikiem nie występującej u ludzi glikozylacji. Metody ekspresji są wybrane przez określenie, który system daje najwyższe poziomy ekspresji i wytwarza przeciwciała z konstytutywnymi właściwościami wiązania CTLA-4.

Ponadto, ekspresję przeciwciał według wynalazku (lub innych pochodzących z nich ugrupowań) w wytwarzających je liniach komórkowych można wzmocnić poprzez zastosowanie wielu znanych technik. Przykładowo, układy ekspresji genu syntetazy glutaminowej i DHFR są powszechnie stosowanymi podejściami mającymi na celu wzmocnienie ekspresji w pewnych warunkach. Klony komórkowe do wysokiej ekspresji można zidentyfikować poprzez zastosowanie konwencjonalnych technik, takich jak klonowanie poprzez ograniczone rozcieńczenia i technologia Microdrop. Układ GS jest omówiony w całości albo częściowo w powiązaniu z patentami europejskimi nr 0 216 846, 0 256 055 i 0 323 997 oraz europejskim zgłoszeniem patentowym nr 89303964.4.

Przeciwciała według wynalazku mogą być również wytwarzane transgenicznie poprzez otrzymanie ssaka albo rośliny, która jest transgeniczna pod względem sekwencji łańcucha ciężkiego i lekkiego immunoglobuliny będących przedmiotem zainteresowania i wytwarzanie z nich przeciwciała, w postaci odzyskiwalnej. W powiązaniu z transgenicznym otrzymywaniem w ssakach, przeciwciała mogą być wytwarzane i odzyskiwane z mleka kóz, krów i innych ssaków. Patrz patenty USA nr 5,827,690, 5,756,687, 5,750,172 i 5,741,957.

Przeciwciała według niniejszego wynalazku można analizować strukturalnie i funkcjonalnie.

W powiązaniu ze strukturami przeciwciał, sekwencje aminokwasowe łańcucha ciężkiego i lekkiego kappa przewidziano na podstawie sekwencji cDNA otrzymanych z hybrydom poprzez RTPCR. Patrz Przykłady 3 i 4 oraz Figury 1-8. N-końcowe sekwencjonowanie przeciwciał przeprowadzono również w celu potwierdzenia wyników omówionych w Przykładach 3 i 4. Patrz Przykład 5 i Fig. 9. Analizę kinetyczną przeciwciał przeprowadzono w celu określenia powinowactwa. Patrz Przykład 2. Przeciwciała według wynalazku oparte na przeciwciele 11.2.1 oraz inne opisane tu przeciwciała (a w szczególności przeciwciała 4.1.1, 4.8.1 i 6.1.1) mają wysokie powinowactwo (4.1.1:1,63 X 10¹⁰ 1/M; 4.8.1: 3,54 X 10¹⁰ 1/M; a 6.1.1:7,2 X 10⁹ 1/M). Ponadto przeciwciała analizowano poprzez ogniskowanie izoelektryczne (ang. isoelectric focusing, IEF), elektroforezę w żelu redukującym (SDS-PAGE), chromatografię wykluczania ze względu na wielkość, chromatografię cieczową/spektroskopię mas oraz spektroskopię mas i testowano wytwarzanie przeciwciał przez hybrydomy. Patrz Przykład 6 i Fig. 10.

W powiązaniu z analizą funkcjonalną przeciwciał według wynalazku, udowodniono, że takie przeciwciała są silnymi inhibitorami CTLA-4 i jego wiązania z ligandami z rodziny cząsteczek B7. Przykładowo, wykazano, że przeciwciała według wynalazku blokują wiązanie CTLA-4 bądź z B7-1 bądź B7-2. Patrz Przykład 7. Rzeczywiście przeciwciała według wynalazku i inne ujawnione tu przeciwciała posiadają nanomolowe i subnanomolowe IC50 w odniesieniu do hamowania wiązania CTLA-4 z B7-1 i B7-2. Ponadto, przeciwciała te posiadają znakomitą wybiórczość wobec CTLA-4 w porównaniu z CD28, CD44, B7-2 albo hlgG1. Patrz Przykład 8. Wybiórczość jest stosunkiem, który odzwierciedla stopień preferencyjnego wiązania się cząsteczki z pierwszym czynnikiem w porównaniu z wiązaniem się cząsteczki z drugim i ewentualnie z innymi cząsteczkami. Niniejszym, wybiórczość dotyczy stopnia preferencyjnego wiązania się przeciwciała w porównaniu z wiązaniem się przeciwciała z innymi cząsteczkami, takimi jak CD28, CD44, B7-2 lub hlgG1. Wartości wybiórczości przeciwciał według wynalazku są większe niż 500:1. Wykazano również, że przeciwciała według wynalazku indukują lub zwiększają ekspresję pewnych cytokin (takich jak IL-2 i IFN-γ) poprzez jednoczesne hodowanie komórek T w modelu blastocytów T. Patrz Przykład 9 i 10 oraz Fig. 12-17. Ponadto, można się

PL 210 435 B1 spodziewać, że przeciwciała według wynalazku będą hamowały wzrost nowotworów w odpowiednich modelach in vivo. Projektowanie takich modeli jest omówione w Przykładzie 11 i 12.

Przedstawione niniejszym wyniki wskazują, że przeciwciała według wynalazku i pozostałe ujawnione tu przeciwciała posiadają pewne cechy, które czynią te przeciwciała bardziej skutecznymi niż obecnie znane przeciwciała terapeutyczne wobec CTLA-4.

W szczególności przeciwciała 4.1.1, 4.8.1 i 6.1.1 posiadają wysoce pożądane właściwości. Ich właściwości strukturalne, funkcje i aktywności dostarczają kryteriów, które ułatwiają projektowanie albo wybór dodatkowych przeciwciał albo innych omawianych tu cząsteczek. Takie kryteria obejmują między innymi jedno lub więcej z następujących:

Zdolność do współzawodniczenia o wiązanie z jednym lub większą liczbą przeciwciał według wynalazku;

Podobna specyficzność wiązania z CTLA-4 co jedna lub większa liczba przeciwciał według wynalazku;

Powinowactwo wiązania z CTLA-4 wynoszące około 10^-9 M albo więcej, a korzystnie około 10^-10 M albo więcej;

Brak reakcji krzyżowej z CTLA-4 z gatunków niższych ssaków, włączając w to korzystnie mysz, szczura i królika, a korzystniej mysią i szczurzą CTLA-4;

Reakcja krzyżowa z CTLA-4 z naczelnych, korzystnie CTLA-4 makaków rezusa (Macaca mulatta) i jawajskiego (Macaca fuscata);

Wybiórczość wobec CTLA-4 w stosunku do CD28, B7-2, CD44 i hlgG1 więcej niż około 100:1, a korzystnie około 300, 400 albo 500:1 lub więcej;

IC50 przy blokowaniu wiązania CTLA-4 z B7-2 wynoszące około 100 nM lub mniej, a korzystnie 5, 4, 3, 2, 1, 0,5, lub 0,38 nM lub mniej;

IC50 przy blokowaniu wiązania CTLA-4 z B7-1 wynoszące około 100 nM lub mniej, a korzystnie 5, 4, 3, 2, 1, 0,5, lub 0,50 nM lub mniej;

Zwiększenie wytwarzania cytokin w jednym lub większej liczbie testów in vitro:

Zwiększenie wytwarzania IL-2 w teście blastocytów T/Raji o około 500 pg/ml lub więcej, a korzystnie 750, 1000, 1500, 2000, 3000, lub 3846 pg/ml albo więcej;

Zwiększenie wytwarzania IFN-γ w teście blastocytów T/Raji o około 500 pg/ml lub więcej lub więcej, a korzystnie 750, 1000 albo 1233 pg/ml lub więcej; albo

Zwiększenie wytwarzania IL-2 w hPBMC lub teście z superantygenem dla pełnej krwi o około 500 pg/ml lub więcej, a korzystnie 750, 1000, 1200 lub 1511 pg/ml lub więcej; Innymi słowy, pożądane jest aby wytwarzanie IL-2 było zwiększone w teście o około 30, 35, 40, 45, 50 procent lub więcej w stosunku do kontroli.

Można się spodziewać, że przeciwciała (albo cząsteczki zaprojektowane albo zsyntetyzowane na ich podstawie mające jedną lub więcej z tych właściwości będą posiadały podobną skuteczność, jak przeciwciała opisane w niniejszym opisie.

Pożądane właściwości funkcjonalne omówione powyżej często są wynikiem wiązania się i hamowania CTLA-4 przez cząsteczkę (to jest przeciwciało, fragment przeciwciała, peptyd albo małą cząsteczkę) w podobny sposób jak przeciwciało według wynalazku (tj. wiązanie się z tym samym lub podobnym epitopem cząsteczki CTLA-4). Cząsteczka może być podawana bezpośrednio (tj., przez bezpośrednie podawanie pacjentowi takich cząsteczek). Albo alternatywnie cząsteczka może być „podawana pośrednio (tj. peptyd albo jemu podobny czynnik, który wytwarza odpowiedź immunologiczną u pacjenta (podobną do szczepionki), przy czym odpowiedź immunologiczna obejmuje wytwarzanie przeciwciał, które wiążą się z tym samym albo podobnym epitopem, albo przeciwciało lub jego fragment, który jest wytwarzany in situ po podaniu materiału genetycznego, który koduje takie przeciwciała lub ich fragmenty wiążące się z tym samym lub podobnym epitopem). Zatem będzie docenione, że epitop na CTLA-4, do którego wiążą się przeciwciała według wynalazku może być przydatny w kontekście wytwarzania i/lub projektowania leków. Przy projektowaniu leków przydatna jest również informacja negatywna (tj. przydatny jest fakt, że przeciwciało, które wiąże się z CTLA-4 wydaje się nie wiązać do epitopu, który działa jako inhibitor CTLA-4). Tak więc epitop, do którego wiążą się przeciwciała według wynalazku, nie prowadząc do pożądanej funkcjonalności może być bardzo przydatny. Niniejszym przedstawiono również cząsteczki (a w szczególności przeciwciała), które wiążą się z tymi samymi albo podobnymi epitopami jak przeciwciała według wynalazku.

Ponadto przeprowadziliśmy pewne wstępne badania nad mapowaniem epitopów dla pewnych przeciwciał, a w szczególności przeciwciał 4.1.1 i 11.2.1.

PL 210 435 B1

Jako pierwszy etap przeprowadziliśmy badania współzawodnictwa BIAcore w celu utworzenia wstępnej mapy wiązania pomiędzy niektórymi przeciwciałami na podstawie ich zdolności do współzawodnictwa o wiązanie się z CTLA-4. W tym celu CTLA-4 był wiązany z chipem BIAcore, przyłączano do niego pierwsze przeciwciało w warunkach wysycenia i mierzono następujące po tym wiązanie drugiego przeciwciała z CTLA-4.

Technika ta umożliwia wytworzenie wstępnej mapy, na podstawie której można zaliczyć przeciwciała od odpowiedniej rodziny.

Dzięki temu procesowi określiliśmy, że niektóre przeciwciała, w tym przeciwciała według wynalazku można podzielić na następujące kategorie epitopowe:

Kategoria	Przeciwciała	Współzawodnictwo o wiązanie CTLA-4
A	BO1M*	W pełni dowolne wzajemne współzawodnictwo; współzawodniczy krzyżowo z kategorią B; pewne współzawodnictwo z kategorią D
BO2M**
B	4.1.1	W pełni dowolne wzajemne współzawodnictwo; współzawodniczy krzyżowo z kategorią A, C i D;
4.13.1
C	6.1.1	W pełni dowolne wzajemne współzawodnictwo; współzawodniczy krzyżowo z kategorią B i kategorią D;
3.1.1
4.8.1
11.2.1
11.6.1
11.7.1
D	4.14.3	Współzawodniczy krzyżowo z kategorią B i C; pewne współzawodnictwo z kategorią A
E	4.9.1	BIN3 blokuje wiązanie się 4.9.1 z CTLA4, ale nie odwrotnie
BNI3***

(*)(**) dostępne z Biostride (***) dostępne z Pharmingen

W następnym etapie usiłowaliśmy ustalić czy przeciwciała według wynalazku i inne ujawnione w niniejszym opisie przeciwciała rozpoznają liniowy epitop na CTLA-4 w warunkach redukujących i nieredukujących w analizie Western blot. Zaobserwowaliśmy, że żadne z przeciwciał 4.1.1 11.7.1, 11.6.1 ani 11.2.1 nie wydaje się rozpoznawać zredukowanej postaci CTLA-4 w analizie Western blot. Zatem, wydaje się prawdopodobne, że epitop, do którego wiąże się każde z tych przeciwciał nie jest epitopem liniowym, a bardziej prawdopodobnie było epitopem konformacyjnym, którego struktura mogła ulec zniszczeniu w warunkach redukujących.

Zatem, chcieliśmy stwierdzić, czy możemy określić, które reszty w obrębie cząsteczki CTLA-4 są istotne dla wiązania przeciwciał według wynalazku. Jednym ze sposobów, które zastosowaliśmy było przeprowadzenie pomiarów kinetycznych szybkości dysocjacji pomiędzy ludzkim CTLA-4 i dwiema wysoce konserwowanymi cząsteczkami CTLA-4 naczelnych (CTLA-4 makaka jawajskiego i marmozety). Badania BIAcore pokazały, że przeciwciało 4.1.1 wiąże się z CTLA-4 ludzkim, makaka jawajskiego i marmozety z tą samą szybkością. Jednakże w odniesieniu do szybkości dysocjacji (powinowactwo), przeciwciało 4.1.1 miało najwyższe powinowactwo (najmniejszą szybkość dysocjacji) dla ludzkiego CTLA-4, większą szybkość dysocjacji dla CTLA-4 makaka jawajskiego, a największą szybkość dysocjacji dla CTLA-4 marmozety. Z drugiej strony, przeciwciało 11.2.1 według wynalazku wiąże się z CTLA-4 ludzkim, makaka jawajskiego i marmozety z tą samą szybkością i ma prawie taką samą szybkość dysocjacji dla każdego z nich. Dane te wskazują dodatkowo, że przeciwciała 4.1.1 i 11.2.1 wiążą się z różnymi epitopami na CTLA-4.

W celu dalszego zbadania epitopów, do których wiążą się przeciwciała kategorii B i C, przeprowadziliśmy pewne badania z ukierunkowaną mutagenezą. CTLA-4 marmozety posiada dwie

PL 210 435 B1 ważne zmiany w resztach 105 i 106 w stosunku do ludzkiego CTLA-4. Takie różnice to zmiana leucyny na metioninę w pozycji 105 i zmiana glicyny na serynę w pozycji 106. A zatem mutowaliśmy DNA kodujący ludzki CTLA-4 tak, aby kodował zmutowany CTLA-4 z substytucjami L105M i G106S. Homologiczna wymiana w CTLA-4 nie miała wpływu na wiązanie białka fuzyjnego B7.2-IgG1. Ponadto, wiązanie przeciwciała 11.2.1 nie zostało zmienione. Jednakże cząsteczki miały mocno zahamowaną zdolność do wiązania się z przeciwciałem 4.1.1 (podobnie jak w przypadku CTLA-4 marmozety). Następnie zmutowaliśmy DNA kodujący CTLA-4 marmozety w celu utworzenia mutanta CTLA-4 marmozety zawierającego substytucję S106SG. Taka zmiana prowadzi do odtworzenia stabilnego wiązania między przeciwciałem 4.1.1 i zmutowanym CTLA-4 marmozety. Ponadto, zmutowaliśmy cDNA kodujący CTLA-4 marmozety w celu utworzenia mutanta CTLA-4 marmozety z substytucją M105L. Taka zmiana częściowo przywracała wiązanie pomiędzy przeciwciałem 4.1.1 i zmutowanym CTLA-4 marmozety.

Każde z przeciwciał należących do kategorii od B do D wydaje się posiadać podobne właściwości funkcjonalne i wydaje się posiadać zdolność działania jako silny czynnik leczniczy przeciwko CTLA-4. Ponadto, każda z cząsteczek zapewnia współzawodnictwo krzyżowe w wiązaniu z CTLA-4. Jednakże, jak to będzie widoczne z powyższego omówienia, każda z cząsteczek z różnych kategorii wydaje się wiązać z odrębnymi konformacyjnymi epitopami na CTLA-4.

Na podstawie powyższego będzie można wywnioskować, że omawiane powyżej dane o epitopach wskazują, iż przeciwciała (lub inne cząsteczki, jak omówiono powyżej), które współzawodniczą z przeciwciałami według wynalazku, będą prawdopodobnie miały pewien terapeutyczny potencjał. Ponadto, można się spodziewać, że przeciwciała (lub inne cząsteczki, jak omówiono powyżej), które współzawodniczą krzyżowo z przeciwciałami z kategorii B, C i/lub D będą prawdopodobnie miały pewien potencjał terapeutyczny. Dodatkowo, można się spodziewać, że przeciwciała (lub inne cząsteczki, jak omówiono powyżej), które współzawodniczą krzyżowo z przeciwciałami kategorii B, C i/lub D i które (i) nie wykazują zmniejszonego wiązania z CTLA-4 marmozety (podobne do przeciwciała 11.2.1) albo (ii) wykazują zmniejszone wiązanie z CTLA-4 marmozety (podobne do przeciwciała 4.1.1) będą prawdopodobnie miały pewien potencjał terapeutyczny.

Przeciwciała (lub inne cząsteczki, jak omówiono powyżej), które współzawodniczą krzyżowo z kategoriami A i E mogą mieć również pewien potencjał terapeutyczny.

Przykłady

Następujące przykłady, włączając w to przeprowadzone doświadczenia i uzyskane wyniki są przedstawione jedynie dla celów ilustracji, a nie jako ograniczenie niniejszego wynalazku.

Przykład 1

Otrzymywanie hybrydom wytwarzających przeciwciało anty-CTLA-4

Przeciwciała według wynalazku były przygotowane, wybrane i testowane zgodnie z niniejszym Przykładem.

Otrzymywanie przeciwciał: Wytworzono trzy odrębne immunogeny do immunizacji myszy XenoMouse^TM: (i) białko fuzyjne CTLA-4-Ig, (ii) peptyd CTLA-4 oraz (iii) mysie komórki chłoniaka 300.19 transfekowane zmutowanym CTLA-4 (Y201V) który jest konstytutywnie wyrażany na powierzchni komórki,

Białko fuzyjne CTLA-4-IgG1:

Konstrukcja wektora ekspresyjnego:

cDNA kodujący dojrzałą zewnątrzkomórkową domenę CTLA-4 powielono w reakcji PCR z biblioteki cDNA ludzkiej grasicy (Clontech) stosując startery zaprojektowane na podstawie opublikowanej sekwencji (Eur. J Immunol 18:1901-1905 (1988)). Fragment sklonowano w odpowiedniej orientacji w pSR5, plazmidzie ekspresyjnym z wirusa Sindbis (InVitrogen), pomiędzy peptydem sygnałowym ludzkiej onkostatyny M i domenami ludzkiej IgG gamma 1 (IgG1) CH1/CH2/CH3. Białko fuzyjne nie zawiera domeny zawiasowej, ale zawiera cysteinę 120 w domenie zewnątrzkomórkowej CTLA-4 w celu utworzenia kowalencyjnego dimeru. Otrzymany w rezultacie wektor nazwano CTLA-4-IgG1/pSR5. Sekwencję pełnego cDNA CTLA-4IgG1 w wektorze potwierdzono dla obu nici. Sekwencja aminokwasowa białka CTLA4-Ig jest przedstawiona poniżej. Dojrzałą domenę zewnątrzkomórkową dla CD44 powielono w reakcji PCR z biblioteki ludzkich limfocytów (Clontech) i klonowano w pSinRep5 w celu wytworzenia białka kontrolnego z identycznym ogonem IgG1.

PL 210 435 B1

Białko fuzyjne OM-CTLA4-IgG1:

MGVLL1ORTLLSLVLALLFPSMASMAMHVAQPAVVLASSRGIASFVC

EYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICT

GTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIY

VIDPEPCPDSDLEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE

VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKE

YKCKVSNKALPTPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCL

VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR

WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Podkreślenie: peptyd sygnałowy Wytłuszczenie: domena zewnątrzkomórkowa CTLA-4 cDNA kodujący dojrzałą zewnątrzkomórkową domenę CD28 powielono w reakcji PCR z biblioteki ludzkich limfocytów (Clontech), a następnie sklonowano w pCDM8 (J. Immunol. 151: 5261-71 (1993)) w celu wytworzenia białka fuzyjnego ludzkiej IgG1 zawierającej zarówno miejsce cięcia dla trombiny jak i regiony zawiasowe. CTLA-4 marmozety, makaka jawajskiego i rezusa sklonowano z mRNA wyizolowanego z PBMC stymulowanych PHA przy zastosowaniu standardowych technik zdegenerowanej reakcji PCR. Sekwencjonowanie wykazało, że sekwencja aminokwasowa dla rezusa i makaka jawajskiego była identyczna poza trzema róż nicami w stosunku do zewnątrzkomórkowęj domeny dojrzałej ludzkiego CTLA-4 (S13N, I17T i L105M). Sekwencja dla marmozety wykazywała dziesięć różnic aminokwasowych w stosunku do zewnątrzkomórkowęj domeny dojrzałej ludzkiego CTLA4 (V21A, V331, A41T, A51G, 541, S71F, Q75K, T88M, L105M i G106S). Ukierunkowaną mutagenezę zastosowano, aby otrzymać pojedyncze mutacje wszystkich aminokwasów odmiennych w CTLA-4 marmozety, w celu zmapowania aminokwasów ważnych ze względu na oddziaływania przeciwciał z ludzkim CTLA-4-IgG. Mutacje w celu mapowania epitopu CTLA-IgG ludzkiego i marmozety wytworzono przy zastosowaniu ukierunkowanej mutagenezy za pomocą zestawu „matchmaker site-directed mutagenesis (Promega). Białka fuzyjne z IgG wytworzono poprzez przejściową transfekcję komórek Cos7 i oczyszczono przy zastosowaniu standardowych technik z białkiem A. Zmutowane białka CTLA4-IgG oceniano pod kątem wiązania do przeciwciał w testach immunologicznych na filtrach (ang. immunobloting) i przy zastosowaniu analiz BIAcore.

Ekspresja/oczyszczanie zrekombinowanego białka

Zrekombinowany wirus sindbis otrzymano poprzez elektroporację (Gibco) komórek nerki chomika BHK mRNA CTLA-4-IgG1/pSRS uzyskanym w transkrypcji in vitro w układzie SP6 oraz mRNA pomocniczym DH-26S, jak opisano przez InVitrogen. Czterdzieści osiem godzin później zrekombinowanego wirusa zbierano i miareczkowano w celu uzyskania optymalnej ekspresji w komórkach jajnika chomika chińskiego (CHO-K1). Komórki CHO-K1 hodowano w zawiesinie w DMEM/F12 (Gibco) zawierającej 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (Gibco), nie-niezbędne aminokwasy (Gibco), 4 mM glutaminy (Gibco), penicylinę/streptomycynę (Gibco), 10 mM Hepes pH 7,5 (Gibco). W celu wytworzenia CTLA-4-IgG, komórki CHO-K1 zawieszano w stężeniu 1x10⁷ komórek/ml w DMEM/F12 i inkubowano z wirusem sindbis przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Komórki rozcieńczano następnie do 1 x 10⁶/ml w DMEM/F12 zawierającym 1% płodowej surowicy bydlęcej pozbawionej bydlęcych IgG przy użyciu złoża Białko A - sepharose (Pharmacia), nie-niezbędnych aminokwasów (Gibco), 4 mM glutaminy (Gibco), 10 mM Hepes pH 7,5 (Gibco), penicylinę/streptomycynę. Czterdzieści osiem godzin po infekcji komórki zwirowywano, a kondycjonowaną pożywkę zbierano i dodawano do niej tabletki z inhibitorem proteaz (Boehringer Mannheim), doprowadzano pH do 7,5, i filtrowano przez filtr 0,2 μ (Nalgene). FPLC (Pharmacia) zastosowano do oczyszczenia poprzez powinowactwo białka fuzyjnego przy użyciu 5 ml kolumny z białkiem A HiTrap (Pharmacia) przy szybkości przepływu 10 ml/min. Kolumnę przemywano PBS 30 objętościami złoża i wymywano 0,1 M glicyna/HCl pH 2,8 przy przepływie 1 ml/min. Frakcje (1 ml) natychmiast neutralizowano do pH 7,5 przy użyciu Tris pH 9. Frakcje zawierające CTLA-4-lgG1 identyfikowano przez SDS-PAGE, a następnie zatężano przy zastosowaniu Centriplus 50 (Amicon) przed nałożeniem na kolumnę sepharose 200 (Pharmacia) przy przepływie 1 ml/min przy użyciu PBS jako rozpuszczalnika. Frakcje zawierające CTLA-4-IgG1 łączono, filtrowano sterylnie przez filtr 0,2 μ (Millipore), porcjowano i zamrażano w -80°C. CD44-IgG1 wyrażano i oczyszczano przy zastosowaniu tych samych metod. CD28-IgG oczyszczano z kondycjonowanej pożywki z przejściowo transfekowanych komórek Cos7. Charakterystyka CTLA-4-IgG1:

PL 210 435 B1

Oczyszczone CTLA-4-IgG1 migruje jako pojedynczy prążek na SDS-PAGE przy użyciu koloidalnego barwienia Coommassie (Novex). W warunkach nieredukujących CTLA-4-IgG1 jest dimerem (100 kDa), który ulega redukcji do monomeru o wielkości 50 kDa monomer po potraktowaniu 50 mM DTT. Ustalenie sekwencji aminokwasowej oczyszczonego CTLA-4-IgG1 w roztworze potwierdziło prawidłowy N-koniec CTLA-4 (MHVAQPAWLAS) i że peptyd sygnałowy onkostatyny został odcięty od dojrzałego białka fuzyjnego.

CTLA-4-IgG1 wiąże się z unieruchomioną B7.1-IgG w sposób zależny od stężenia, a wiązanie było blokowane przez chomicze-anty-ludzkie przeciwciało anty-CTLA-4 (BNI3: PharMingen). Sterylne CTLA-4-IgG było wolne od endotoksyny i oznaczone ilościowo poprzez OD280 stosując 1,4 jako współczynnik ekstynkcji. Wydajność oczyszczania CTLA-4-IgG wynosiła między 0,5-3 mg/litr komórek

CHO-K1.

(ii) Peptyd CTLA-4

Następujący peptyd CTLA-4 przygotowano jak opisano poniżej:

NH2:MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVT

EVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICK

VELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPC-CONH2

Oznaczenia/Materiały:

NMP, N-metylopirolidinon; TFE, 2,2,2-trifluoroetanol; DCM, dichlorometan; FMOC, Fluorenylometoksykarbonyl. Wszystkie odczynniki były dostarczone przez Perkin Elmer, z następującymi wyjątkami: TFE, Aldrich Chemical, żywica FMOC-PAL-PEG, Perseptive Biosystems. Fmoc-Arg(pMC)OH, FMOC-Asn(Trt)-OH, FMOC-Asp(tBu)-OH, FMOC-Cys(Trt)-OH, FMOCGlu(tBu)-OH, FMOC-Gln(Trt)OH, FMOC-His(Boc)-OH, FMOC-Lys(BOC)OH, FMOC-Ser(tBu)-OH, FMOC-Tr(tBu)-OH i FMOCTyr(tBu)-OH zastosowano do aminokwasów wymagających bocznych grup ochronnych.

Synteza peptydów:

Syntezę peptydów przeprowadzano na Perkin-Elmer 431A, z zamontowaną przystawką do śledzenia sprzężenia zwrotnego poprzez absorbancję UV przy 301 mn (detektor Perkin-Elmer Model 759A). Sekwencje peptydu składano na żywicy FMOC-PAL-PEG z zastosowaniem warunkowych podwójnych cykli łączenia. Wymuszone podwójne połączenia przeprowadzano w cyklach 10, 11, 18, 19, 20 i od 28 do 33. Żywicę przemywano 50% mieszaniną DCM i TFE na zakończenie każdego cyklu acylacji, a następnie przeprowadzano blokowanie nieprzereagowanych grup aminowych bezwodnikiem octowym w NMP. Żywice usuwano z reaktora po zakończeniu 49 cyklu, a dla pozostałości kontynuowano reakcję do zakończenia. Odcięcie peptydu od żywicy przeprowadzano przy zastosowaniu odczynnika K (King i wsp. International Journal of Protein and Peptide Research 36:255-266 (1990)) przez 6 godzin na 415 mg żywicy uzyskując 186 mg surowego peptydu CTLA-4.

Charakterystyka peptydu:

Próbki 25 mg surowego peptydu CTLA-4 rozpuszczano w 5 ml 6M chlorowodorku guanidyny/100 mM K2PO3 przy pH 6,4 i wymywano na kolumnie Pharmacia Hi Load Superdex 75 16/60 (16 mm x 600 mm, objętość złoża 120 ml) 2 M HCl guanidyny/100 mM K2PO3 przy pH 6,4 i szybkości 2 ml/min. przez 180 minut zbierając 5 ml frakcje. Frakcje analizowano poprzez nakładanie 1,7 μl frakcji na żel Laemeli NuPAGE, żel w buforze MES i uwidaczniano przy zastosowaniu protokołu barwienia srebrem Daichii. Frakcje wykazujące ciężar cząsteczkowy 12 kDa, jak oszacowano poprzez porównanie z standardem masy molekularnej, łączono razem i przechowywano w 4°C. Połączone frakcje analizowano przez UV i elektroforezę żelową. Sekwencjonowanie aminokwasów przeprowadzono poprzez absorbowanie 100 mikrolitrowej próbki na wkładzie ProSorb (absorbowanym na membranie PVDF). Całość przemywano w celu usunięcia soli buforu. Sekwencjonowanie przeprowadzano na urządzeniu Applied Biosystems 420. Obserwowano spodziewaną sekwencję końca N (M H V A Q P A V V L A). Immunoblotting pokazał, że peptyd był rozpoznawany przez BNI3 anty-ludzki CTLA-4 (PharMingen). W celu odsolenia próbkę zawierającą 648 μg materiału umieszczono w probówce dializacyjnej 3500 Da MWCO i dializowano z mieszaniem wobec 0,1% TFA/H2O w 4°C przez 9 dni. Całą zawartość woreczka dializacyjnego liofilizowno do uzyskania proszku.

(iii) komórki 300.19 transfekowane CTLA-4 (Y201V) cDNA CTLA-4 pełnej długości oczyszczano w PCR z biblioteki cDNA ludzkiej grasicy (Stratagene) i subkłonowano w pIRESneo (Clontech). Mutację CTLA-4, której wynikiem jest konstytutywna ekspresja na powierzchni komórki wprowadzono przy zastosowaniu MatchMaker Mutagenesis System (Promega). Mutacja tyrozyny, Y201 do waliny hamuje wiązanie białka adaptyny AP50, które jest odpowiedzialne za gwałtowną intenalizację CTLA-4 (Chuang i wsp. J. Immunol. 159:144-151 (1997)).

PL 210 435 B1

Wolne od mikoplazmy mysie komórki chłoniaka 300.19 hodowano w RPMI-1640 zawierającym 10% płodową surowicę cielęcą, nie-niezbędne aminokwasy, penicylinę/streptomycynę, 2 mM glutaminę,

12,5 mM Hepes pH 7,5 i 25 μΜ beta-merkaptoetanol. Komórki poddawano elektroporacji (3x10⁶/0,4 ml wolnego od surowicy RPMI) w 1 ml komorze z 20 μg CTLA-4-Y201V/pIRESneo stosując 200 V/1180 uF (Gibco CellPorator). Komórki pozostawiano na 10 minut, a następnie dodawano 8 ml ogrzanej uprzednio pożywki RPMI. Po 48 godzinach komórki rozcieńczano do 0,5 x10⁶/ml w kompletnej pożywce RPMI zawierającej 1 mg/ml G418 (Gibco). Komórki oporne namnażano i wykazano, że wyrażają CTLA-4 na powierzchni komórki przy zastosowaniu przeciwciała BNI3 skoniugowanego z fikoerytryną (PharMingen). Komórki o wysokiej ekspresji izolowano poprzez sterylne sortowanie.

Immunizacja i wytwarzanie hybrydomy: myszy XenoMouse (w wieku od 8 do 10 tygodni) immunizowano (i) podskórnie przy podstawie ogona 1x10⁶ komórek 300.19, które transfekowano w celu wyrażania CTLA-4, jak opisano powyżej, zawieszano w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem z kompletnym adiuwantem Freunda albo (ii) podskórnie przy podstawie ogona (a) 10 μg białka fuzyjnego CTLA-4 albo (b) 10 μg peptydu CTLA-4 zemulgowanego z kompletnym adiuwantem Freunda. W każdym przypadku dawkę powtarzano trzy lub czterokrotnie w niekompletnym adiuwancie Freunda. Cztery dni przed fuzją myszy otrzymywały ostatni zastrzyk immunogenu albo komórek w PBS. Limfocyty ze śledziony i/lub węzłów limfatycznych z immunizowanych myszy poddawano fuzji z mysią nie wydzielającą linią komórkową szpiczaka P3 i poddano selekcji HAT jak opisano uprzednio (Galfre. G. i Milstein, C, „Preparation of monoclonal antibodies: strategies and Procedures. Methods Enzymol. 73:3-46 (1981)). Otrzymano obszerny panel hybrydom, z których wszystkie wydzielały ludzkie przeciwciała IgG₂K lub IgG₄K, jak wykrywano poniżej) specyficzne wobec CTLA-4, które odzyskiwano.

Test ELISA: Test ELISA przeprowadzano do wykrywania przeciwciał swoistych wobec antygenu w surowicy mysiej i supernatantach hybrydomy, jak opisano (Coligan i wsp., Rozdział 2.1, „Enzyme-linked immunosorbent assays w Current protocols in immunology (1994)) stosując białko fuzyjne CTLA-4-Ig do wyłapywania przeciwciał. Dla zwierząt, które są immunizowane białkiem fuzyjnym CTLA-4-Ig, przeprowadziliśmy dodatkowo test na niespecyficzną reaktywność względem części ludzkiej Ig białka fuzyjnego. Dokonano tego przy zastosowaniu płytek ELISA opłaszczonych ludzką IgG1 służących jako kontrola negatywna dla specyficzności.

W korzystnym teście ELISA zastosowano następujące techniki:

Płytki ELISA opłaszczano antygenem w ilości 100 μg/studzienkę w buforze do opłaszczania płytek (0,1 M bufor węglanowy, pH 9,6 i NaHCO3 (MW 84) 8,4 g/l). Płytki inkubowano następnie w 4°C przez noc. Po inkubacji bufor do opłaszczania płytek usuwa się, a płytki blokuje się buforem blokującym (0,5% BSA, 0,1% Tween 20, 0,01% tiomersal w 1 x PBS) w ilości 200 μl/studzienkę i inkubuje w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Alternatywnie, płytki przechowuje się w lodówce z buforem blokującym i uszczelniaczem płytek. Bufor blokujący usuwa się i dodaje 50 μl/studzienkę supernatantu znad hybrydomy, surowicy lub supernatantu znad innej hybrydowy (kontrola pozytywna) lub pożywkę HAT lub bufor blokujący (kontrola negatywna). Płytki inkubuje się przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Po inkubacji, płytki przemywa się buforem do przemywania (1 x PBS). Przeciwciało wykrywające (tj. mysie anty-ludzkie IgG2-HRP (SB, #9070-05) dla przeciwciał IgG2 lub mysie anty ludzkie IgG4-HRP (SB #9200-05) dla przeciwciał IgG4) dodaje się w ilości 100 gl/studzienkę (mysie anty-ludzkie IgG2-HRP przy rozcieńczeniu 1:2000 lub mysie anty-ludzkie IgG4HRP przy rozcieńczeniu 1:1000 (każde z nich rozcieńczone w buforze blokującym)). Płytki inkubuje się przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po inkubacji, płytki przemywa się buforem do przemywania. Następnie do studzienek dodaje się 100 gg/studzienkę świeżo przygotowanego roztworu do wywoływania (10 ml buforu podstawowego, 5 mg OPD (o-fenylenodiamina, Sigma Nr kat. P-7288) i 10 gg 30% H₂O₂ (Sigma)). Płytki pozostawia się do wywołania na 10-20 minut, aż w studzienki kontroli negatywnej zaczynają nabierać barwy. Następnie, dodaje się 100 gg/studzienkę roztworu hamującego (2M H2SO4) i płytki sczytuje się w czytniku płytek ELISA przy długości fali 490 nm.

Pomiar stałych powinowactwa w pełni ludzkich monoklonalnych przeciwciał przy użyciu BIAcore:

Pomiar powinowactwa oczyszczonych ludzkich monoklonalnych przeciwciał, fragmentów Fab albo supernatantów hybrydom poprzez rezonans plazmonów przeprowadzono przy zastosowaniu urządzenia BIAcore 2000, stosując ogólne, opisane przez producenta procedury.

Analizę kinetyczną przeciwciał przeprowadzono przy zastosowaniu antygenów unieruchomionych na powierzchni czujnika przy małej gęstości. Do trzech powierzchni mikropłytki czujnika było przytwierdzane białko fuzyjne przy gęstości w zakresie od około 390 do 900 stosując białko fuzyjne

PL 210 435 B1

CTLA-4-Ig w stężeniu 20 lub 50 μg/ml w 10 mM octanie sodu pH 5,0 z użyciem zestawu wiążącego aminy dostarczonego przez producenta (BIAcore, Inc.). Do czwartej powierzchni mikropłytki czujnika było unieruchomione IgG1 (900 RU) i używano ją jako kontrolę negatywną dla niespecyficznego wiązania. Analizę kinetyczną przeprowadzano przy szybkości przepływu 25 lub 50 mikrolitrów na minutę, a szybkości dysocjacji (kd lub koff) i asocjacji (ka lub kon) określano przy zastosowaniu oprogramowania dostarczonego przez producenta (ocena BIA 3,0) co umożliwia globalne kalkulacje dopasowania. Przykład 2

Pomiar powinowactwa przeciwciał anty-CTLA-4

W następującej tabeli dostarczony jest wynik pomiaru powinowactwa dla pewnych przeciwciał:

T a b e l a I

Hybrydoma	Faza stała (BiAcore)
Szybkość wiązania Ka (M-1S-1x106)	Szybkość dysocjacji Kd (S-1x10-4)	Stała asocjacji KA (1/M)= ka/kdx1010	Stała dysocjacji KD(M)=Kd/kax10-10	Gęstość powierzchniowa [RU]
	0.68	1.01	0.67	1.48	878.7
Moab01	0.70	4.66	0.15	6.68	504.5
0.77	6.49	0.19	8.41	457.2
	0.60	3.08	0.20	5.11	397.8
	1.85	0.72	2.58	0.39	878.7
4.1.1	1.88	1.21	1.55	0.64	504.5
1.73	1.54	1.13	0.88	457.2
	1.86	1.47	1.26	0.79	397.8
	0.32	0.07	4.46	0.22	878.7
4.8.1	0.31	0.23	1.33	0.75	504.5
	0.28	0.06	4.82	0.21	397.8
	2.81	3.04	0.92	1.08	878.7
4.14.3	2.88	3.97	0.73	1.38	504.5
2.84	6.66	0.43	2.35	457.2
	3.17	5.03	0.63	1.58	397.8
	0.43	0.35	1.21	0.83	878.7
6.1.1	0.46	0.90	0.51	1.98	504.5
0.31	0.51	0.61	1.63	457.2
	0.45	0.79	0.57	1.76	397.8
	1.04	0.96	1.07	0.93	878.7
3.1.1	0.95	1.72	0.55	1.82	504.5
0.73	1.65	0.44	2.27	457.2
	0.91	2.07	0.44	2.28	397.8
	1.55	13.80	0.11	8.94	878.7
4.9.1	1.43	19.00	0.08	13.20	504.5
	1.35	20.50	0.07	15.20	397.8
	1.00	2.53	0.39	2.54	878.7
4.10.2	0.94	4.30	0.22	4.55	504.5
0.70	5.05	0.14	7.21	457.2
	1.00	5.24	0.19	5.25	397.8
	1.24	9.59	0.13	7.72	878.7
2.1.3	1.17	13.10	0.09	11.20	504.5
	1.11	13.00	0.09	11.70	397.8
	1.22	5.83	0.21	4.78	878.7
4.13.1	1.29	6.65	0.19	5.17	504.5
	1.23	7.25	0.17	5.88	397.8

Co będzie można zaobserwować, przeciwciała wykazują wysokie powinowactwo i stałe wiązania.

PL 210 435 B1

Przykład 3

Struktura przeciwciał anty-CTLA-4

W następującym dalej omówieniu dostarczone są informacje strukturalne dotyczące przeciwciał według wynalazku.

W celu dokonania analizy struktur przeciwciał sklonowaliśmy geny kodujące fragmenty ciężkich i lekkich łańcuchów z niektórych hybrydom. Klonowanie i sekwencjonowanie przeprowadzono jak następuje:

mRNA poli(A)⁺ izolowano przy użyciu zestawu Fast-Track kit (Invitrogen) z około 2 x 10⁵ komórek hybrydomy pochodzących z immunizowanej myszy XenoMouse. Otrzymywanie cDNA z zastosowaniem losowych starterów monitorowano przez PCR. Startery specyficzne dla regionów zmiennych rodziny ludzkich V_H lub V_K (Marks i wsp., oligonucleotide primers for polymerase chain reaction amplification of human immunoglobulin variable genes and design of family-specific oligonucleotide probes. Eur. J. Immunol. 21:985-991(1991)) albo uniwersalny starter dla ludzkiego VH, MG-30 (CAGGTGCAGCTGGAGCAGTCIGG) zastosowano w połączeniu ze starterami specyficznymi wobec ludzkiego regionu stałego Cy2 (MG-40d; 5'-GCTGAGGGAGTAGAGTCCTGAGGA-3') albo regionu stałego Ck (hKP2; jak opisano uprzednio w Green i wsp., 1994). Sekwencje transkryptów pochodzących z łańcuchów ciężkich i kappa z hybrydom otrzymano poprzez bezpośrednie sekwencjonowanie produktów PCR wytworzonych z RNA poli(A⁺) przy użyciu opisanych powyżej starterów. Produkty PCR sklonowano również w pCRII przy użyciu zestawu do klonowania TA (Invitrogen) i obydwie nici sekwencjonowano przy użyciu zestawu do sekwencjonowania Prism z barwnymi terminatorami oraz urządzenia do sekwencjonowania ABI 377. Wszystkie sekwencje analizowano poprzez dopasowanie „V BASE sequence directory (Tomlinson i wsp., MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK) stosując oprogramowanie MacVector i Geneworks.

Ponadto, każde z przeciwciał 4.1.1, 4.8.1, 11.2.1 i 6.1.1 poddawano sekwencjonowaniu na całej długości. Do takiego sekwencjonowania izolowano mRNA poly(A)⁺ z około 4 X 10⁶ komórek hybrydoma przy użyciu zestawu mRNA Direct (Dynal). mRNA poddawano odwrotnej transkrypcji przy użyciu oligo-dT(18) i zestawu Advantage do RT/PCR (Clonetech). Bazę danych dla regionu zmiennego (V Base) zastosowano w celu zaprojektowania starterów do amplifikacji rozpoczynających się w miejscu startu ATG łańcucha ciężkiego genu DP50 (5'-TATCTAAGCTTCTAGACTCGACCGCCACCATGGAGTTTGGGCTGATG-3') i do kodonu stop regionu stałego IgG2 (5'-TTCTCTGATCAGAATTCCTATCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGCT-3'). Po stronie 5' miejsca startu ATG dodano optymalną sekwencję Kozaka (ACCGCCACC). Tą samą metodę zastosowano do zaprojektowania startera dla miejsca startu ATG łańcucha kappa genu A27 (5' TCTTCAAGCTTGCCCGGGCCCGCCACCATGGAAACCCCAGCGCA-3') i do kodonu stop regionu stałego kappa (5'-TTCTTTGATCAGAATTCTCACTAACACTCTCCCCTGTTGAAGC-3'). cDNA 012 sklonowano przy użyciu startera dla miejsca startu ATG (5'-TCTTCAAGCTTGCCCGGGCCCGCCACCATGGACATGAGGGTCCCCG T-3) i kodonu stop regionu stałego kappa jak opisano powyżej. Łańcuch ciężki DNA sklonowano również jako genomowe konstrukty poprzez ukierunkowana mutagenezę w celu dodania miejsca Nhel na końcu domeny zmiennej J i subklonowanie fragmentu Nhel zawierającego genomowe regiony IgG2 CH1/-Zawias/CH2/CH3. Mutacje punktowe do wytworzenia miejsca Nhel nie zmieniają sekwencji aminokwasowej w stosunku do linii zarodkowej. Pary starterów zastosowano do powielenia DNA przy zastosowaniu zestawu Advantage High Fidelity PCR (Clonetech). Sekwencję produktów PCR otrzymano przez bezpośrednie sekwencjonowanie przy użyciu zestawu do sekwencjonowania z barwnymi terminatorami oraz urządzenia do sekwencjonowania ABI. Produkt PCR sklonowano w ssaczych wektorach ekspresyjnych pEE syntetazy glutaminianowęj (Lonza) i trzy klony sekwencjonowano w celu potwierdzenia mutacji somatycznych. Dla każdego klonu sekwencja była sprawdzana z dwóch nici w co najmniej trzech reakcjach. Nieglikozylowane przeciwciało 4.1.1 wytworzono poprzez ukierunkowaną mutagenezę N294Q w domenie CH2. Zrekombinowane przeciwciała wytworzono poprzez przejściową transfekcję komórek Cos7 w FCS pozbawionej IgG i oczyszczano przy zastosowaniu standardowych technik z białkiem A - sepharose. Stabilne transfektanty wytwarzano poprzez elektroporację mysich komórek NSO i selekcję na pożywce wolnej od glutaminy. Zrekombinowane przeciwciała 4.1.1 z albo bez glikozylacji wykazywały identyczną specyficzność i powinowactwo wobec CTLA-4 w teście ELISA in vitro i teście BIAcore.

PL 210 435 B1

Analiza wykorzystania genu

Następująca Tabela przedstawia wykorzystanie genu wykazane poprzez wyselekcjonowane klony przeciwciał hybrydom:

T a b e l a II

Wykorzystanie łańcucha lekkiego i ciężkiego

Klon	Łańcuch ciężki	Łańcuch lekki kappa
VH	D	JH	VK	JK
4.1.1	DP-50	DIR4 lub DIR3	JH4	A27	JK1
4.8.1	DP-50	7-27	JH4	A27	JK4
4.14.3	DP-50	7-27	JH4	A27	JK3
6.1.1	DP-50	DIR5 lub DIR5rc	JH4	A27	JK3
3.1.1	DP-50	3-3	JH6	012	JK3
4.10.2	DP-50	7-27	JH4	A27	JK3
2.1.3	DP-65	1-26	JH6	A10/A26	JK4
4.13.1	DP-50	7-27	JH4	A27	JK3
11.2.1	DP-50	D1-26	JH6	012	JK3
11.6.1	DP-50	D2-2 lub D4	JH6	012	JK3
11.7.1	DP-50	D3-22 lub D21-9	JH4	012	JK3
12.3.1.1	DP-50	D3-3 lub DXP4	JH6	A17	JK1
12.9.1.1	DP-50	D6-19	JH4	A3/A19	JK4
4.9.1	DP-47	5- 24 i/lub 6- 19	JH4	L5	JK1

Jak będzie można to zobaczyć, przeciwciała zostały wytworzone z silną tendencją do wykorzystania regionów zmiennych łańcucha ciężkiego DP-50. Gen DP-50 jest również określany jako rodzina genu VH 3-33. Tylko jedno przeciwciało, które zostało wyselekcjonowane na podstawie wiązania z CTLA-4 i wstępnych analiz funkcjonalnych in vitro wykazało wykorzystanie łańcucha ciężkiego inne niż DP-50. Klon ten, 2.1.3 wykorzystuje region łańcucha ciężkiego i izotyp IgG4. Gen DP-65 jest również określany jako rodzina genowa VH 4-31. Z drugiej strony, klon 4.9.1, który posiada region zmienny łańcucha ciężkiego DP-47 wiąże się z CTLA-4, ale nie hamuje wiązania z B7-1, ani B7-2. U myszy XenoMouse istnieje ponad 30 odrębnych funkcjonalnych zmiennych genów łańcuchów ciężkich, z którymi wytwarza przeciwciała. Tendencja wskazuje zatem na preferowane wiązanie motywu oddziaływania antygen-antygen w odniesieniu do połączonych właściwości wiązania antygenu i aktywności funkcjonalnej.

Analiza przez mutacje

Jak będzie to docenione, analiza wykorzystania genu dostarcza jedynie ogólnej wiedzy na temat struktury przeciwciała. Ponieważ komórki B zwierząt XenoMouse losowo wytwarzają transkrypty łańcucha ciężkiego V-D-J albo łańcucha lekkiego V-J kappa, następuje wiele procesów drugorzędowych, włączając w to między innymi hipermutacje somatyczne, addycje końca N i wydłużanie CDR3. Patrz na przykład Mendez i wsp. Nature Genetics 15:146-156 (1997) i zgłoszenie patentowe USA o nr seryjnym 08/759,620 z 3 grudnia 1996. Zatem, aby dalej zbadać strukturę przeciwciała uzyskano

PL 210 435 B1 przewidywane sekwencje aminokwasowe przeciwciał z cDNA otrzymanego z tych klonów. Ponadto, ustalono N-końcowe sekwencje aminokwasowe poprzez zsekwencjonowanie białka.

Fig. 1 przedstawia sekwencje nukleotydowe i przewidywane sekwencje aminokwasowe łańcucha ciężkiego i lekkiego łańcucha kappa klonów 4.1.1 (Fig. 1A), 4.8.1 (Fig. 1B), 4.14.3 (Fig. 1C), 6.1.1 (Fig. 1D), 3.1.1 (Fig. 1E), 4.10.2 (Fig. 1F), 2.1.3 (Fig. 1G), 4.13.1 (Fig. 1H), 11.2.1 (Fig. 11), 11.6.1 (Fig. 1J), 11.7.1 (Fig. 1K), 12.3.1.1 (Fig. 1L) i 12.9.1.1 (Fig. 1M). Na figurach 1A, 1B i 1D wydłużone sekwencje dla przeciwciał 4.1.1, 4.8.1 i 6.1.1 uzyskano poprzez klonowanie pełnej długości cDNA, jak opisano powyżej. Na tych figurach sekwencje peptydu sygnałowego (albo kodujących je zasad) są wytłuszczone, a sekwencje wykorzystane w reakcji 5'PCR są podkreślone.

Fig. 2 przedstawia dopasowanie przewidywanych sekwencji aminokwasowych łańcucha ciężkiego z klonów 4.1.1, 4.8.1, 4.14.3, 6.1.1, 3.1.1, 4.10.2, 4.13.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 i 12.9.1.1 oraz sekwencji aminokwasowej linii zarodkowej DP-50 (3-33). Różnice pomiędzy sekwencją linii zarodkowej DP-50 i sekwencją klonów są wytłuszczone. Figura pokazuje również pozycje sekwencji CDR1, CDR2 i CDR3 jako zacieniowanie.

Fig. 3 przedstawia dopasowanie przewidywanych sekwencji aminokwasowych łańcucha ciężkiego kłonu 2.1.3 oraz sekwencji aminokwasowej linii zarodkowej DP-65 (4-31). Różnice pomiędzy sekwencją linii zarodkowej DP-65 i sekwencją klonu są wytłuszczone. Figura pokazuje również pozycje sekwencji CDR1, CDR2 i CDR3 przeciwciała poprzez podkreślenie.

Fig. 4 przedstawia dopasowanie przewidywanych sekwencji aminokwasowych łańcucha lekkiego kappa klonów 4.1.1, 4.8.1, 4.14.3, 6.1.1, 4.10.2 i 4.13.1 oraz sekwencji aminokwasowej linii zarodkowej A27. Różnice pomiędzy sekwencją linii zarodkowej A27 i sekwencją klonu są wytłuszczone. Figura pokazuje również pozycje sekwencji CDR1, CDR2 i CDR3 przeciwciała poprzez podkreślenie. Obserwowane delecje w CDR1 klonów 4.8.1, 4.14.3 i 6.1.1 są oznaczone jako „0.

Fig. 5 przedstawia dopasowanie przewidywanych sekwencji aminokwasowych łańcucha lekkiego kappa klonów 3.1.1, 11.2.1, 11.6.1 i 11.7.1 oraz sekwencji aminokwasowej linii zarodkowej 012. Różnice pomiędzy sekwencją linii zarodkowej 012 i sekwencją klonu są wytłuszczone. Figura pokazuje również pozycje sekwencji CDR1, CDR2 i CDR3 przeciwciała poprzez podkreślenie.

Fig. 6 przedstawia dopasowanie przewidywanych sekwencji aminokwasowych łańcucha lekkiego kappa klonu 2.1.3 oraz sekwencji aminokwasowej linii zarodkowej A10/A26. Różnice pomiędzy sekwencją linii zarodkowej A10/A26 i sekwencją klonu są wytłuszczone. Figura pokazuje również pozycje sekwencji CDR1, CDR2 i CDR3 przeciwciała poprzez podkreślenie.

Fig. 7 przedstawia dopasowanie przewidywanych sekwencji aminokwasowych łańcucha lekkiego kappa klonu 12.3.1 oraz sekwencji aminokwasowej linii zarodkowej A17. Różnice pomiędzy sekwencją linii zarodkowej A17 i sekwencją klonu są wytłuszczone. Figura pokazuje również pozycje sekwencji CDR1, CDR2 i CDR3 przeciwciała poprzez podkreślenie.

Fig. 8 przedstawia dopasowanie przewidywanych sekwencji aminokwasowych łańcucha lekkiego kappa klonu 12.9.1 oraz sekwencji aminokwasowej linii zarodkowej A3/A19. Różnice pomiędzy sekwencją linii zarodkowej A3/A19 i sekwencją klonu są wytłuszczone. Figura pokazuje również pozycje sekwencji CDR1, CDR2 i CDR3 przeciwciała poprzez podkreślenie.

Fig. 22 przedstawia serię dodatkowych sekwencji nukleotydowych i aminokwasowych następujących łańcuchów przeciwciał anty-CTLA-4:

4.1.1:

łańcuch ciężki pełnej długości 4.1.1 (sekwencja cDNA 22(a), genomowa 22(b) i aminokwasowa (c));

łańcuch ciężki pełnej długości 4.1.1 nieglikozylowany (sekwencja cDNA 22(d) i aminokwasowa (e));

łańcuch lekki 4.1.1 (sekwencja cDNA 22(f) i aminokwasowa 22(g));

4.8.1:

łańcuch ciężki pełnej długości 4.8.1 (sekwencja cDNA 22(h) i aminokwasowa 22 (i)); łańcuch lekki 4.8.1 (sekwencja cDNA 22(j) i sekwencja aminokwasowa 22(k));

6.1.1:

łańcuch ciężki pełnej długości 6.1.1 (sekwencja cDNA 22(1) i sekwencja aminokwasowa 22(m)); łańcuch lekki 6.1.1 (sekwencja cDNA 22(n) i aminokwasowa 22(o));

11.2.1:

łańcuch ciężki pełnej długości 11.2.1 (sekwencja cDNA 22(p) i aminokwasowa 22(q)); i łańcuch lekki 11.2.1 (sekwencja cDNA 22(r) i aminokwasowa 22(s)).

PL 210 435 B1

Sekwencje peptydów sygnałowych są pokazane poprzez wytłuszczenie i powiększone litery. Otwarte ramki odczytu w genomowej sekwencji pełnej długości (Fig 22(b)) są podkreślone. Mutacje wprowadzone w celu wytworzenia nieglikozylowanego łańcucha ciężkiego 4.1.1 i uzyskana w rezultacie zmiana (N294Q) jest pokazana jako podwójne podkreślenie i wytłuszczenie (sekwencja cDNA (Fig. 22(b)) i aminokwasowa (Fig. 22(c))).

Przykład 4

Analiza podstawień aminokwasowych w łańcuchu ciężkim i lekkim

Z Fig. 2, która przedstawia dopasowanie przewidywanych sekwencji aminokwasowych łańcucha ciężkiego z klonów 4.1.1, 4.8.1, 4.14.3, 6.1.1, 3.1.1, 4.10.2, 4.13.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 i 12.9.1.1 oraz sekwencji aminokwasowej linii zarodkowej DP-50 (3-33), wyłania się interesująca zależność. Poza tendencją do wykorzystania łańcucha ciężkiego DP-50 w większości klonów, istnieje stosunkowo ograniczona hipermutacja w przeciwciałach w stosunku do linii zarodkowej DP-50. Przykładowo, klony 3.1.1 i 11.2.1 nie mają mutacji. Ponadto, mutacje w innych klonach są zazwyczaj zmianami konserwatywnymi, obejmującymi podstawienia aminokwasami o podobnych właściwościach co aminokwasy w linii zarodkowej. Mutacje w obrębie wielu sekwencji CDR1 i CDR2 są szczególnie konserwowane w naturze. Trzy spośród łańcuchów ciężkich przedstawionych na Fig. 2, 4.10.2, 4.13.1, 4.14.3 wyraźnie pochodzą z jednego zdarzenia rekombinacyjnego (tj. pochodzą z identycznego ośrodka zarodkowego) i mają prawie identyczną sekwencję. Jeżeli traktować je jako pojedynczą sekwencję, wówczas wśród 10 różnych przeciwciał zawierających łańcuch ciężki DP-50, w CDR1 i CDR2 są 3 pozycje, w których niepolarna reszta jest zamieniona na inną niepolarną resztę, 12, w których polarna nienaładowana reszta jest zamieniona na inną polarną nienaładowaną resztę i 1, w której polarna reszta jest zamieniona na inną polarną resztę. Ponadto, istnieją dwie pozycje, w których dwie reszty, które są bardzo podobne strukturalnie, glicyna i alanina są zamienione jedna na drugą. Jedyne mutacje niecałkowicie konserwatywne obejmują 3 podstawienia polarnych naładowanych reszt polarnymi nieładowanymi resztami, i 1 podstawienie niepolarnej reszty resztą polarną.

Łańcuchy lekkie tych przeciwciał pochodzą z 5 różnych genów Vk. Gen A27 jest najsilniej reprezentowany i jest źródłem 6 różnych łańcuchów lekkich. Porównanie tych 6 sekwencji wykazuje dwie warte wspomnienia właściwości. Po pierwsze, trzy z nich, 4.8.1, 4.14.3 i 6.1.1, zawierają delecje jednej albo dwóch reszt w CDR1, co jest rzadkim zdarzeniem. Po drugie, istnieje silne uprzedzenie wobec zarodkowej seryny w pozycji szóstej w CDR3, co przejawia się tym, że seryna ta została zastąpiona w każdej sekwencji. Sugeruje to, że seryna w tej pozycji jest niekompatybilna z wiązaniem CTLA-4.

Będzie można dostrzec, że wiele ze zidentyfikowanych powyżej podstawień znajduje się w bliskości albo w obrębie CDR. Takie podstawienia będą mogły mieć pewien wpływ na wiązanie się przeciwciała cząsteczką CTLA-4. Ponadto, takie podstawienia będą miały znaczący wpływ na powinowactwo przeciwciał.

Przykład 5

Analiza N-końcowej sekwencji aminokwasowej przeciwciał według wynalazku

W celu dalszego zweryfikowania składu i struktury zidentyfikowanych powyżej przeciwciał według wynalazku zsekwencjonowaliśmy niektóre z przeciwciał przy zastosowaniu sekwenatora Perkin-Elmer. Zarówno łańcuch ciężki jak i lekki przeciwciał wyizolowano i oczyszczono poprzez zastosowanie preparatywnej elektroforezy żelowej i technik elektrotransferu na filtr, a następnie bezpośrednio sekwencjonowano jak opisano w Przykładzie 6. Większość sekwencji łańcucha ciężkiego była blokowana na końcu aminowym. Zatem takie przeciwciała traktowano najpierw aminopeptydazą piroglutaminianową, a następnie sekwencjonowano.

Wynik takiego doświadczenia jest pokazany na Fig. 9. Fig. 9 przedstawia również masy cząsteczkowe ciężkich i lekkich łańcuchów jak oznaczono poprzez spektroskopię mas (MALDI).

Przykład 6

Dodatkowa charakterystyka przeciwciał

Fig. 10 przedstawia pewne dodatkowe informacje dotyczące charakterystyki niektórych przeciwciał. Na Figurze 10A, zebrane są dane dotyczące klonów 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.14.3 i 6.1.1. Przedstawione są dane dotyczące: stężenia, ogniskowania izoelektrycznego (IEF), SDS-PAGE, chromatografii wykluczania zależnej od wielkości, spektroskopii mas (MALDI) i N-końcowych sekwencji łańcucha lekkiego.

PL 210 435 B1

Zasadniczo dane uzyskano jak opisano poniżej:

Materiały i Metody

Stężenie białka oznaczono przy 280 nm poprzez skan UV (200-350 nm), przy czym absorbancja wynosząca 1,58 jednostki przy 280 nm odpowiada 1 mg/ml.

SDS-PAGE przeprowadzono przy zastosowaniu systemu elektroforezy Novex NuPAGE z użyciem 10% żelu NuPAGE i buforu do elektroforezy MES. Próbki przygotowano poprzez rozcieńczenie 3:1 w buforze do próbek 4 x NuPAGE (+/-) beta-merkaptoetanol, podgrzewano i ~ 5 μg białka nakładano na żel. Żel barwiono następnie roztworem do barwienia Brilliant Blue R (Sigma cat.# B6529) i masę cząsteczkową oszacowano poprzez porównanie wybarwionych prążków z markerem „Perfect Protein Markers (Novagen cat#69149-3).

W celu N-końcowego sekwencjonowania, próbki przepuszczono jak wyżej na żelu NuPAGE, przenoszono na filtr Pro Blot (Applied Biosystems), a następnie barwiono roztworem do barwienia Coomassie Blue R-250. Wybarwione prążki białkowe wycinano i poddawano analizie sekwencyjnej poprzez automatyczną degradację Edmana w sekwenatorze Applied Biosystems 494 Procise HT Sequencer.

Ogniskowanie izoelektryczne (JEF) przeprowadzono przy zastosowaniu żeli Pharmacia IEF 3-9 pHast gels (kat. # 17-0543-01). Próbki rozcieńczano w 10% glicerolu do ~ 0,8 mg/ml i 1 μl nakładano na żel a następnie barwiono srebrem. Oszacowania pl dokonywano poprzez porównywanie wybarwionych prążków ze standardami IEF o szerokim zakresie (pH 3-10) (Pharmacia kat. # 17-0471-01).

Chromatografię wykluczania zależną od wielkości (SEC) przeprowadzano w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) w systemie Pharmacia SMART przy użyciu kolumny Superdex 75 PC 3,2/30. Oszacowania masy cząsteczkowej dokonywano poprzez porównanie piku czasu zatrzymania z czasem zatrzymania żelu.

Do badań FACS, otrzymano ludzkie obwodowe komórki T i stymulowano je przez 48 godzin. Komórki T przemywano jeden raz, zawieszano w buforze FACS w stężeniu 1x10⁶ komórek/100 μl i barwiono pod kątem ekspresji powierzchniowego CD3 10 μl przeciwciał anty-CD3-FITC (Immunotech, Marseille, France) przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Komórki dwukrotnie przemywano, a następnie utrwalano, permeabilizowano (zwiększano przepuszczalność błony komórkowej) (Fix and Penn, Caltag) i barwiono pod kątem ekspresji powierzchniowego CTLA-4 przy użyciu 10 μl antyCD1S2-PE (Pharmingen). Cytometric przepływową przeprowadzono przy zastosowaniu Becton Dickinson FACSort. Kwadranty ustalano poprzez analizę przeciwciał kontrolnych o odpowiednich izotypach (Caltag).

Jak omówiono powyżej, wykazano że przeciwciała anty-CTLA-4 posiadają pewne silne właściwości modulowania układu immunologicznego. Przeprowadzono następujące doświadczenia w celu stwierdzenia, czy przeciwciała według wynalazku posiadają takie aktywności. Generalnie, doświadczenia zaprojektowano tak, aby zbadać zdolność przeciwciał do hamowania oddziaływań pomiędzy cząsteczkami CTLA-4 i B7, do bycia wybiórczymi dla CTLA-4 względem cząsteczek B7 i CD28 oraz promowania wytwarzania cytokin dla komórek T, włączając w to między innymi ekspresję IL-2 i/lub IFN-γ. Ponadto podjęto badania nad reakcją krzyżową przeciwciał z niektórymi tkankami ludzkimi i cząsteczkami CTLA-4 z innych gatunków (np. myszy i naczelnych).

Przykład 7

Kompetycyjny test ELISA: hamowanie oddziaływań CTLA-4/B7-1 lub B7-2 przez przeciwciała

Przeprowadzono test in vitro w celu określenia czy przeciwciała według wynalazku mają zdolność do hamowania wiązania CTLA-4 bądź z B7-1 bądź z B7-2. Jak będzie można to ocenić, przeciwciała które mają zdolność do hamowania wiązania CTLA-4 z cząsteczkami B7 będą mogły być kandydatami do regulowania odpowiedzi immunologicznej poprzez szlak CTLA-4. W teście, zastosowano następujące materiały i metody:

Materiały i metody nM B7.1-Ig(G1) lub B7.2-Ig(G1) (Repligen, Inc. Needham, MA) w PBS Dulbecco zastosowano do opłaszczenia 96-studzienkowych płytek MaxiSorp (Nunc, Denmark, #439454) i inkubowano przez noc w 4°C. Dnia 2, B7-Ig usunięto i płytki blokowano 1% BSA plus 0,05% Tween-20 w D-PBS przez dwie godziny. Płytki przemywano 3X buforem do przemywania (0,05% Tween-20 w D-PBS). Przeciwciała w odpowiednich stężeniach i CTLA-4-Ig(G4) (stężenie końcowe 0,3 nM) (Repligen, Inc. Needham, MA) mieszano wstępnie przez 15 minut, a następnie dodawano do płytek opłaszczonych B7-Ig (60 μl całkowitej objętości) i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1,5 godziny. Płytki przemywano 3X i dodawano 50 μl rozcieńczenia 1 do 1000 wyznakowanego HRP mysiego anty-ludzkiego

PL 210 435 B1 przeciwciała IgG4 (Zymed, San Francisco, CA, #05-3820) i inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT). Płytki przemywano 3X i dodawano 50 μl substratu peroksydazy TMB Microwell (Kirkegaard & Peuy, Gaithersburg, MD, #50-76-04) inkubowano w RT przez 20 minut, a następnie do płytki dodawano 50 μl 1N H₂SO₄. Płytki sczytywano przy 450 nm przy użyciu czytnika płytek Molecular Device (Sunnyvale, CA). Wszystkie płytki testowano w dwóch powtórzeniach. Maksymalny sygnał był zdefiniowany jako wiązanie CTLA-4-Ig w nieobecności przeciwciała. Wiązanie niespecyficzne było zdefiniowane w nieobecności CTLA-4-Ig i testowego przeciwciała.

Wyniki z tego testu są przedstawione w tabeli IIIA i IIIB. W Tabeli IIIA, wyniki są pokazane dla różnych przeciwciał. W Tabeli IIIB, pokazano wyniki porównujące przeciwciało 4.1.1 z przeciwciałem 11.2.1 według wynalazku z odrębnego doświadczenia.

T a b e l a IIIA

Klon CTLA-4-Ig	Izotyp	CTLA4/B7.2 Komp. ELISA IC50 (nM)	CTLA4/B7.1 Komp. ELISA IC50 (nM)
CT3.1.1	IgG2	0.45 ± 0.07 (n=3)	0.63 ± 0.10 (n=2)
CT4.1.1	IgG2	0.38 ± 0.06 (n=5)	0.50 ± 0.05 (n=2)
CT4.8.1	IgG2	0.57 ± 0.03 (n=3)	0.17 ± 0.28 (n=2)
CT4.9.1	lgG2	Niekompetycyjny (n=3)	Niekompetycyjny (n=2)
CT4.10.2	IgG2	1.50 ± 0.37 (n=3)	3.39 ± 0.31 (n=2)
CT4.13.1	IgG2	0.49 ± 0.05 (n=3)	0.98 ± 0.11 (n=2)
CT4.14.3	IgG2	0.69 ± 0.11 (n=3)	1.04 ± 0.15 (n-2)
CT6.1.1	IgG2	0.39 ± 0.06 (n=3)	0.67 ± 0.07 (n=2)

T a b e l a IIIB

Klon CTLA-4-Ig	Izotyp	CTLA4/B7.2 Komp. ELISA IC50 (nM)	CTLA4/B7.1 Komp. ELISA IC50 (nM)
CT4.1.1	IgG2	0.55 ± 0.08 (n=4)	0.87 ± 0.14 (n=2)
CT11.2.1	ISG2	0.56 ± 0.05 (n=4)	0.81 ± 0.24 (n=2)

Przykład 8

Stosunek wybiórczości przeciwciał dla CTLA-4 względem CD28 bądź B7-2

Inny test in vitro został przeprowadzony w celu określenia wybiórczości przeciwciał dla CTLA-4 względem CD28 bądź B7-2. W związku z doświadczeniami zastosowano następujące materiały i metody:

Test ELISA stwierdzający wybiórczość dla CTLA-4:

Materiały i metody

96-studzienkową płytkę FluroNUNC (Nunc nr kat. 475515) opłaszczono wstępnie czterema antygenami: CTLA-4/Ig, CD44/Ig, CD28/Ig i B7.2/Ig (antygeny wytworzone na miejscu). Płytki powlekano antygenami przez noc w temperaturze +4°C w stężeniu 1 μg/ml i w ilości 100 μl/studzienkę w 0,1 M fosforanie sodowym, pH 9,6. Płytkę przemywano następnie trzykrotnie PBST (PBS + 0,1% Tween-20) stosując zmywarkę płytek NUNC. Płytki blokowano PBST+ 0,5% BSA w stężeniu 150 μl/studzienkę. Płytki inkubowano w RT przez 1 godzinę, a następnie przemywano trzykrotnie PBST. Następnie przeciwciała anty-CTLA-4 rozcieńczano do stężenia 1 μg/ml i dodawano na płytkę. Płytki inkubowano w RT przez 1 godzinę, a następnie przemywano trzykrotnie PBST. Płytki, które zawierały przeciwciała traktowano następnie w 100 μl/studzienkę anty-ludzkimi IgG2-HRP (Southern Biotech nr kat. 9070-05) w rozcieńczeniu 1:4000. Ponadto, jeden rząd traktowano anty-ludzkimi IgG (Jackson Cat Nr 209-035-088) w celu znormalizowania wstępnego opłaszczenia. Przeciwciało rozcieńczono 1:5000 i dodawano w ilości 100 μl/studzienkę. Jeden rząd traktowano również anty-ludzkimi CTLA-4-HRP (Pharmingen

PL 210 435 B1

Cat No. 345815/skoniugowanymi z HRP) jako kontrolę pozytywną. Przeciwciało to zastosowano jako rozcieńczone w bloku do 0,05 gg/ml. Płytki inkubowano w RT przez 1 godzinę, a następnie przemywano trzykrotnie PBST. Dodawano chemiluminescencyjny substrat LBA (Pierce) w stężeniu 100 gl/studzienkę i płytki inkubowano na wytrząsarce płytek przez 5 min. Płytki sczytywano następnie przy użyciu urządzenia do wykrywania fluorescencji przez 2 min. ekspozycji.

Test wybiórczości wiązania IGEN CTLA-4-Ig: Materiały i Metody

Kulki Dynabeads M-450 (Dynal A.S, Oslo, Norway #140.02) przemywano 3X buforem fosforanowym Na, pH 7,4 i zawieszano w buforze fosforanowym. 1,0 gg CTLA-4-lg(G1), 1,0 gg CD28-Ig(G1) lub 1,0 do 3,0 gg B7.2-lg(G1) (Repligen, Inc. Needham, MA) dodawano do 100 gl kulek i inkubowano przez noc na wytrząsarce rotacyjnej w 4°C. Drugiego dnia kulki przemywano 3X 1% BSA plus 0,05% Tween-20 w PBS Dulbecco i blokowano przez 30 minut. Kulki rozcieńczano 1 to 10 buforem blokującym i 25 gl powleczonych kulek dodawano do probówek polipropylenowych 12x75 mm. Wszystkie próbki testowano w dwóch powtórzeniach. 50 gl przeciwciała testowego (końcowe stężenie 1 gg/ml) lub buforu blokującego dodawano do probówek i inkubowano przez 30 minut na karuzeli Origen 1.5 Analyzer (IGEN International, Inc., Gaithersburg, MD) w RT, mieszając z prędkością 100 rpm. Do probówek dodawano 25 gl rutenylowanych mysich anty-ludzkich IgG1, IgG2 lub IgG4 (Zymed, Inc. San Francisco, CA #05-3300, 05-3500 i 05-3800) (końcowe stężenie 3 gg/ml w całkowitej objętości 100 gl). Probówki inkubowano przez 30 minut w RT na karuzeli mieszając je z prędkością 100 rpm. Do każdej probówki dodawano 200 gl buforu Origen (IGEN International, Inc., Gaithersburg, MD #402-050-03) krótko mieszano, a następnie probówki zliczano w analizatorze Origen Analyzer i dla każdej probówki oznaczano jednostki ECL (elektrochemiluminescencji). Określano współczynnik normalizacji w celu skorygowania różnic wiązania białek fuzyjnych do Dynabeads i jednostki ECL korygowano pod kątem niespecyficznego wiązania przed obliczeniem stosunków wybiórczości.

Wyniki tych testów są przedstawione w Tabelach IV A i IVB.

T a b e l a IVA

Klon	Izotyp	CTLA4/CD28 ELISA	CTLA4/B7.2 ELISA	CTLA4/CD44 ELISA	CTLA4/CD28 IGEN	CTLA4/B7.2 IGEN
3.1.1	IgG2	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=2)	>500:1 (n=1) 193:1 (n=1)
4.1.1	IgG2	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=2) 485:1 (n=1)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=1) 261:1 (n=1)	>500:1 (n=1) 107:1 (n=1)
4.8.1	IgG2	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=2) 190:1 (n=1)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=2)	>500:1 (n=2)
4.9.1	IgC2	>500:1 (n=2) 244:1 (n=1)	>500:1 (n=2) 33:1 (n=1)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=1)	>500:1 (n=1)
4.10.2	IgG2	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=1)	>500:1 (n=1)
4.13.1	IgC2	>500:1 (n=2) 46:1 (n=1)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=1) 329:1 (n=1)	>500:1 (n=2)
4.14.3	IgG2	>500:1 (n=2) 80:1 (n=1)	>500:1 (n=2) 10:1 (n=1)	>500:1 (n=2) 126:1 (n=1)	>413:1 (n=1)	>234:1 (n=1)
6.1.1	IgG2	>500:1 (n=2) 52:1 (n=1)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=2)	>500:1 (n=2)

T a b e l a IVB

Kton	Izotyp	CTLA4/CD28 ELISA	CTLA4/B7.2 ELISA	CTLA4/hIgG ELISA
4.1.1	IgG2	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=2)	>500:1 (n=3)
11.2.1	IgG2	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=3)

PL 210 435 B1

Przykład 9

Ludzki model przekazywania sygnału przez komórki T

W celu dalszego zdefiniowania aktywności przeciwciał w działaniu jako regulatorów aktywności immunologicznej, opracowaliśmy pewne testy dla komórek T w celu oceny ilościowej wzmocnienia wytwarzania IL-2 przez komórki T przy blokadzie sygnału CTLA-4 przez przeciwciała.

Następujące materiały i metody zastosowano w związku z doświadczeniami:

Materiały i metody

Świeżo izolowane komórki T otrzymano przez zastosowanie Histopaque (Sigma, St. Louis, M O #A-70543) i T-kwik (Lympho-Kwik, One Lambda, Canoga Park, CA, #LK-50- T) i stymulowano PHA (1 μg/ml) (oczyszczona fitohemaglutynina, Murex Diagnostics Ltd. Dartford, England, #HA 16) w pożywce (RPMI 1640 zawierającej L-glutaminę, nieniezbędne aminokwasy MEM, penicylinę, streptomycynę, 25 mM Hepes i 10% FBS) w stężeniu 1x10⁶ komórek/ml i inkubowano w 37°C przez dwa dni. Komórki przemywano następnie i rozcieńczano w pożywce do 2x10⁶ komórek/ml. Komórki Raji (chłoniak Burkitta, Ludzkie nr ATCC: CCL 86 Class I,I American Type Culture Collection Rockville, MD) traktowano następnie mitomycyną C (Sigma St. Louis, MO, # M-4287) (25 μg/ml) przez 1 godzinę w 37°C. Komórki Raji przemywano potem 4X w PBS i zawieszano w stężeniu 2x10⁶ komórek/ml. Ludzkie komórki blastyczne T (5x10⁵/ml), komórki Raji (5x10⁵/ml) i przeciwciała anty-CTLA-4 albo izotypowe pasujące kontrolne przeciwciało w różnych stężeniach dodawano do 96-studzienkowych płytek mikrotitracyjnych i płytki inkubowano w 37°C przez 72 godziny. Całkowita objętość na studzienkę wynosiła 200 gl. Siedemdziesiąt dwie godziny po stymulacji, płytki zwirowywano, a supernatant pobierano i zamrażano w celu dalszego oznaczania IL-2 (Quantikine IL-2 ELISA kit, R&D Systems, Minneapolis, MN, #D2050) i IFN-γ (Quantikine IFN-g ELISA kit, R&D Systems). Wzmocnienie cytokin zdefiniowano jako różnice pomiędzy poziomem cytokin w hodowlach zawierających blokujące mAb anty-CTLA-4 versus przeciwciało kontrolne o pasującym izotypie. Dla doświadczeń z cytometrią przepływową, komórki Raji przemywano 1x buforem FACS (bufor PBS zawierający 2% inaktywowaną termicznie FCS, 0,025% azydek sodu). Osady komórkowe zawieszano w buforze FACS w stężeniu 1x10⁶ komórek/100 gl i inkubowano z 10 gl anty-CD80-PE (Becton Dickinson, San Jose, CA) lub anty-CD86-PE (Pharmingen, San Diego, CA) przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Komórki przemywano następnie dwukrotnie i zawieszano w 1 ml buforu FACS. Cytometrię przepływową przeprowadzono stosując Becton Dickinson FACSort. Markery histogramowe ustalono poprzez analizę odpowiednich izotypowych przeciwciał kontrolnych (Caltag, Burlingame, CA).

Ogólnie, opracowaliśmy test, który można zastosować do szybkiego określania podwyższenia poziomu wydzielania IL-2 przez komórki T. Jak będzie to można ocenić, stymulacja komórek T jest zależna od B7 i CD28. Ponadto, przemywane komórki blastyczne T nie wytwarzają IL-2 i komórki Raji nie wytwarzają wykrywalnych ilości IL-2 nawet po stymulacji LPS lub PWM. Jednakże, w kombinacji, komórki blastyczne T hodowane jednocześnie z komórkami Raji mogą modelować przekazywanie sygnałów przez B7, CTLA-4 i CD28 i dzięki temu można oceniać wpływ przeciwciał taką sygnalizację.

Fig. 11 pokazuje ekspresję B7-1 i B7-2 na komórkach Raji przy zastosowaniu mAb anty-CD80-PE i anty-CD86-PE przy zastosowaniu cytometrii przepływowej (FASC) jak opisano w Przykładzie 6.

Fig. 12 pokazuje zależne od stężenia wzmocnienie wytwarzania IL-2 w teście blastocytów T/komórki Raji indukowane poprzez blokujące przeciwciała anty-CTLA-4 (BNI3 (PharMingen) oraz przeciwciała 4.1.1, 4.8.1 i 6.1.1).

Fig. 13 pokazuje zależne od stężenia wzmocnienie wytwarzania IFN-γ w teście blastocyty T/komórki Raji indukowane poprzez blokujące przeciwciała anty-CTLA-4 (BNI3, 4.1.1, 4.8.1 i 6.1.1) (te same donorowe komórki T).

Fig. 14 pokazuje średnie wzmocnienie wytwarzania IL-2 w komórkach T od 6 dawców indukowane poprzez blokujące przeciwciała anty-CTLA-4 w teście blastocyty T/komórki Raji. Interesujący jest fakt, że mAb, CT4.9.1, wiążą się z CTLA-4, ale nie blokują wiązania z B7. A zatem, proste wiązanie z CTLA-4 jest samo niewystarczające, aby dostarczyć funkcjonalne przeciwciało według wynalazku.

Fig. 15 pokazuje średnie wzmocnienie wytwarzania IFN-γ w komórkach T od 6 dawców indukowane poprzez blokujące przeciwciała anty-CTLA-4 w teście blastocyty T/komórki Raji.

Fig. 19 pokazuje porównanie między przeciwciałami 4.1.1 i 11.2.1 według wynalazku w stężeniu 30 gg/ml w 72 godzinnym teście blastocyty T /komórki Raji jak opisano w Przykładzie 9 i teście z superantygenem opisanym w Przekładzie 10.

PL 210 435 B1

Fig. 20 pokazuje zależne od stężenia wzmocnienie wytwarzania IL-2 w teście blastocyty T/komórki Raji indukowane poprzez przeciwciała anty-CTLA-4 4.1.1 i 11.2.1 według wynalazku.

Przedstawiona poniżej Tabela IVc dostarcza informacji dotyczących średniego wzmocnienia i zakresu wytwarzania odpowiedzi cytokinowej w testach Raji i SEA. Każde z doświadczeń włączonych do wyników opiera się na przeciwciałach w dawce 30 μg/ml i pomiarach w 72 godzinie. Pokazane są liczby dawców zastosowanych w tych doświadczeniach jak również odpowiedzi.

T a b e l a IVc

Test	mAb	Cytokina	Średnie wzmocnienie pg/ml	SEM	Zakres wzmacniania pg/ml	n	Odpowiedź donora
T blastocyty/Raji	4.1.1	IL-2	3329	408	0 do 8861	42	19 z 21
T blastocyty/Raji	4.1.1	IFN-γ	3630	980	600 do 13939	17	13 z 13
T blastocyty/Raji	11.2.1	IL-2	3509	488	369 do 6424	18	14 z 14
SEA (PBMC)	4.1.1	IL-2	2800	312	330 do 6699	42	17 z 17
SEA (PMBC)	11.2.1	IL-2	2438	366	147 do 8360	25	15 z 15
SEA (krew pełna)	4.1.1	IL-2	6089	665	-168 do 18417	46	15 z 17
SEA (krew pełna)	11.2.1	IL-2	6935	700	-111 do 11803	25	12 z 14

Przykład 10

Model przekazywania sygnału przez ludzkie komórki T

Opracowaliśmy drugi test komórkowy w celu oceny ilościowej wzmocnienia wytwarzania IL-2 przez komórki T przy blokadzie sygnału CTL-4 przez przeciwciała. Następujące materiały i metody zastosowano w związku z doświadczeniami:

Materiały i metody

Ludzkie PBMC przygotowano przy użyciu Accuspin. Płytki do mikromiareczkowania opłaszczono przeciwciałem anty-CD3 (leu4, Becton Dickinson) (60 ng/ml) i inkubowano przez 2 godziny w 37°C. hPBMC dodawano do studzienek w stężeniu 200000 komórek na studzienkę. Enterotoksynę A Staphylcoccus (SEA) (Sigma) dodawano do studzienek w stężeniu 100 ng/ml. Przeciwciała dodawano do studzienek zwykle w stężeniu 30 μg/ml. Komórki stymulowano następnie przez 48, 72 lub 96 godzin. Płytki zwirowywano w odpowiednich punktach czasowych i supernatanty pobierano ze studzienek. Następnie, supernatanty sprawdzano pod kątem wytwarzania IL-2 stosując test ELISA (R&D Systems).

Wyniki tych doświadczeń są pokazane na Fig. 16, 17 i 21.

Na Fig. 16 indukcję wytwarzania IL-2 w hPBMC od 5 dawców mierzono 72 godziny po stymulacji. Na Fig. 17 pokazane są wyniki pomiarów dla pełnej krwi, analizujące różnice w indukcji wytwarzania IL-2 we krwi od 3 dawców mierzone po 72 i 96 godzinach po stymulacji SEA.

Na Fig. 21 wzmocnienie wytwarzania IL-2 dla pełnej krwi od 2 dawców mierzono 72 godziny po stymulacji.

Przykład 11

Zwierzęcy model nowotworu

Opracowaliśmy zwierzęcy model nowotworu do analizy przeciwciał anty-mysie-CTLA-4 in vivo pod kątem ich aktywności hamującej wzrost nowotworu. W tym modelu, hodowano u myszy włókniakomięsak, a zwierzęta traktowano przeciwciałami anty-mysie-CTLA-4. Materiały i metody do opracowania modelu są przedstawione poniżej:

Materiały i metody

Samicom myszy A/J (6-8 tygodniowym) wstrzykiwano podskórnie po stronie grzbietowej szyi 0,2 ml komórek nowotworowych Sa1N (1x10⁶) (Baskar 1995). Przeciwciało anty-mysi CTLA-4 albo kontrolne o pasującym izotypie (PharMingen, San Diego, CA, 200 μg/zwierzę) wstrzyknięto dootrzewnowo dnia 0, 4, 7 i 14 po wstrzyknięciu komórek nowotworowych. Pomiarów nowotworu dokonywano w okresie 3-4 tygodniowych doświadczeń przy użyciu elektronicznego przyrządu do kaliPL 210 435 B1 bracji Starrett SPC Plus (Athol, MA), a rozmiar nowotworu wyrażano jako powierzchnię pokrytą przez nowotwór (mm²).

Fig. 18 pokazuje hamowanie wzrostu nowotworu przez przeciwciało anty-mysi CTLA-4 w mysim modelu włókniakomięsaka. Jak pokazano na Fig. 18 zwierzęta traktowane anty-CTLA-4 wykazują zmniejszenie wzrostu nowotworu w porównaniu ze zwierzętami traktowanymi izotypowym przeciwciałem kontrolnym. A zatem, mAb antymysi CTLA-4 są zdolne do hamowania wzrostu włókniakomięsaka w mysim modelu nowotworu.

Można się spodziewać, że przeciwciała, które wykazują reakcje krzyżową z mysim CTLA-4 będą zachowywały się podobnie w tym modelu. Jednakże, przeciwciała według wynalazku, które sprawdzano pod kątem reakcji krzyżowej, nie wykazują jej z mysim CTLA-4.

Przykład 12

Zwierzęcy model nowotworu

Zaprojektowano mysi model heteroprzeszczepu u myszy SCID w celu dalszego zbadania aktywności przeciwciał wobec ustalonych nowotworów i pochodzących od nich przerzutów. W tym modelu, dostarczone są myszy SCID z przeszczepionymi ludzkimi komórkami T, którym wszczepiono pochodzące od pacjenta komórki nie-małokomórkowego raka płuc (ang. non-small cell lung, NSCL) albo raka jelita grubego i okrężnicy (ang. colorectal carcinoma, CC). Wszczepienia dokonuje się do gonadalnych poduszek tłuszczowych myszy SCID. Umożliwia się wzrost nowotworu, a następnie usuwa się go. U myszy rozwija się nowotwór typu ludzkiego i przerzuty do wątroby. Taki model jest opisany w (Bumpers i wsp. J. Surgical Res. 61:282-288 (1996).

Oczekuje się, że opisane tu przeciwciała będą hamować wzrost nowotworów powstałych u takich myszy.

Literatura

Alegre i wsp. J Immunol 157: 4762-70 (1996)

Allison i Krummel Science 270: 932-933 (1995)

Balzano i wsp. Int J Cancer Suppl 7: 28-32 (1992)

Blair i wsp. J Immunol 160: 12-5 (1998)

Blake i Litzi-Davis BioConjugate Chem. 3:510-513 (1992)

Boussiotis i wsp. Proc Natl. Acad. Sci. USA 90: 11059-63 (1993)

Bowie i wsp. Science 253: 164 (1991)

Bruggeman i wsp. PNAS USA 86: 6709-6713 (1989)

Bruggeman, M. i Neuberger, M. S. w Methods: A companion to Methods in Enzymology 2: 159-165 (Lerner i wsp. red. Academic Press (1991))

Bruggemann i wsp. “Human antibody production in transgenic mice: expression from 100 kb of the human IgH locus. Eur. J. Immunol. 21: 1323-1326 (1991)

Bruggemann, M. i Neuberger, M. S. Strategies for expressing human antibody repertoires in transgenic mice. Immunology Today 17: 391-397 (1996)

Brunet i wsp. Nature 328: 267-270 (1987)

Bumpersetal J. Surgical Res. 61: 282-288 (1996)

Capsey i wsp. Genetically Engineered Human Therapeutic Drugs (Stockton Press, NY (1988))

Castan i wsp. Immunology 90: 265-71 (1997)

Cepero i wsp. J. Exp. Med. 188: 199-204 (1998)

Chen i wsp. Immunoglobulin gene rearrangement in B-cell deficient mice generated by targeted deletion of the JH locus International Immunology 5: 647656 (1993)

Chen i wsp. Cell 71: 1093-1102 (1992)

Chen i wsp. Human Gene Therapy 5: 595-601 (1994)

Chiswell i McCafferty TIBTECH 10: 80-84 (1992)

Choi i wsp. Transgenic mice containing a human heavy chain immunoglobulin gene fragment cloned in a yeast artificial chromosome Nature Genetics 4: 117123 (1993)

Chothia i Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)

Chothia i wsp. Nature 342: 878-883 (1989)

Chuang i wsp. J. Immunol. 159: 144-151 (1997)

Coligan i wsp., Unit 2.1,Enzyme-linked immunosorbent assays, in Current protocols in immunology (1994)

Cwirla i wsp. PNAS USA 87: 6378-6382 (1990)

PL 210 435 B1

Dariavachi wsp. Eur. J. Immunol. 18: 1901-1905 (1988)

Dayhoff, M. O., w Atlas of Protein Sequence and Structure, str. 101-110 (Vol. 5, National Biomedical Research Foundation (1972)) oraz dodatek nr 2 do tego tomu, str. 1-10 de Boer i wsp. Eur J Immunol 23: 3120-5 (1993)

Eckstein, Red., Oxford University Press, Oxford England (1991)

Evans i wsp. J. Med. Chem. 30: 1229 (1987)

Fallarino i wsp. J. Exp. Med. 188: 205-10 (1998)

Fanger i wsp. Immunol Methods 4: 72-81 (1994)

Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15: 29 (1986)

Fishwild i wsp.,High-avidity human IgGy monoclonal antibodies from a novel strain of minilocus transgenic mice. Nature Biotech. 14: 845-851 (1996).

Freeman i wsp. J. Exp. Med. 178: 2185-92 (1993)

Freeman i wsp. J Immunol 161: 2708-15 (1998)

Freeman i wsp. Science 262: 907-9 (1993)

Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., red., wyd. 2, Raven Press, N. Y. (1989))

Galfre, G. i Milstein, C, Preparation of monoclonal antibodies: strategies and procedures. Methods Enzymol. 73: 3-46 (1981)

Gorman i wsp. P. N. A. S. 79: 6777 (1982)

Green and Jakobovits J. Exp. Med. 188: 483-495 (1998)

Green i wsp. Nature Genetics 7: 13-21 (1994)

Grosschedl i wsp. Cell 41: 885 (1985)

Hanes and Plucthau PNAS USA 94: 4937-4942 (1997)

Harding i wsp. Nature 356: 607-609 (1994)

Harper i wsp. J Immunol 147: 1037-44 (1991)

Hathcock i wsp. Science 262: 905-7 (1993)

Hoganboom i wsp. Immunol. Reviews 130: 43-68 (1992)

Horspool i wsp. J Immunol 160: 2706-14 (1998)

Houghten i wsp. Biotechniques 13: 412-421 (1992)

Houghten PNAS USA 82: 5131-5135 (1985)

Hurwitz i wsp. J Neuroimmunol 73: 57-62 (1997)

Hurwitz i wsp. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10067-71 (1998)

Immunology-A Synthesis (wyd. 2, E. S. Golub i D. R. Gren, red., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991))

Introduction to Protein Structure (C. Branden i J. Tooze, red., Garland Publishing, New York, N. Y. (1991))

Jakobovits i wsp., Germ-line transmission and expression of a human-derived yeast artificial-chromosome. Nature 362: 255-258 (1993)

Jakobovits, A. i wsp., Analysis of homozygous mutant chimeric mice: Deletion of the immunoglobulin heavy-chain joining region blocks B-cell development and antibody production. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551-2555 (1993)

Jakobovits, A., Humanizing the mouse genome. Current Biology 4: 761-763 (1994)

Jakobovits, A., Production of fully human antibodies by transgenic mice. Current Opinion in Biotechnology 6: 561-566 (1995)

Junghans i wsp. in Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2 wyd., Chafner i Longo, red., Lippincott Raven (1996))

Kabat i wsp. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, N. I. H. publication no. 91-3242 Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991))

Kostelny i wsp. J. Immunol. 148: 1547-1553 (1992)

Krummel and Allison J. Exp. Med. 182: 459-65 (1995)

Krummel i wsp. Intlmmunol 8: 519-23 (1996)

Kuchroo i wsp. Cell 80: 707-18 (1995)

Kwon i wsp. PNAS USA 94: 8099-103 (1997)

LaPlanche i wsp. Nucl. Acids Res. 14: 9081 (1986)

Lenschow i wsp. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11054-8 (1993)

Lenschow i wsp. Science 257: 789-792 (1992)

PL 210 435 B1

Lin i wsp. J. Exp. Med. 188: 199-204 (1998)

Linsley i wsp. J. Exp. Med. 176: 1595-604 (1992)

Linsley i wsp. J. Exp. Med. 174: 561-569 (1991)

Linsley i wsp. Science 257: 792-795 (1992)

Liu i wsp. J. Immunol. 139: 3521 (1987)

Liu i wsp. P. N. A. S. 84: 3439 (1987)

Lonberg i wsp., Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications. Nature 368: 856-859 (1994).

Luhder i wsp. J. Exp. Med. 187: 427-32 (1998)

Marasco Gene Therapy 4: 11-15 (1997)

Markees i wsp. J Clin Invest 101: 2446-55 (1998)

Marks i wsp., Oligonucleotide primers for polymerase chain reaction amplification of human immunoglobulin variable genes and design of family-specific oligonucleotide probes. Eur. J. Immunol. 21: 985-991 (1991)

McCoy i wsp. J. Exp. Med. 186: 183-7 (1997)

Mendez i wsp. Nature Genetics 15: 146-156 (1997)

Needleman i Wunsch J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)

Okayama i wsp. Mol. Cell. Bio. 3: 280 (1983)

Parmley and Smith Gene 73: 305-318 (1988)

Pearson and Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85: 2444 (1988)

Perez i wsp. Immunity 6: 411-7 (1997)

Perrin i wsp. Immunol Res 14: 189-99 (1995)

Perrin i wsp. J Immunol 157: 1333-6 (1996)

Pinalla i wsp. Biotechniques 13: 901-905 (1992)

Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, red., W. H. Freeman and Company, New York (1984))

Razi-Wolf i wsp. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11182-6 (1993)

Remington's Pharmaceutical Sciences (15th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975)), szczególnie rozdział 87 napisany przez Blaug, Seymour Rizo i Gierasch, Ann. Rev. Biochem. 61: 387 (1992)

Russel i wsp. Nucl. Acids Research 21: 1081-1085 (1993)

Schwartz Cell 71: 1065 (1992)

Scott TIBS 17: 241-245 (1992)

Smith i Waterman Adv Appl. Math. 2: 482 (1981)

Songsivilai i Lachmann Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990)

Stec i wsp. J. Am. Chem. Soc. 106: 6077 (1984)

Stein i wsp. Nucl. Acids Res. 16: 3209 (1988)

Taylor i wsp., A transgenic mouse that expresses a diversity of human sequence heavy and light chain immunoglobulins. Nucleic Acids Research 20: 6287-6295 (1992)

Taylor i wsp., Human immunoglobulin transgenes undergo rearrangement, somatic mutation and class switching in mice that lack endogenous IgM. International Immunology 6: 579-591 (1994)

The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., red., McGraw-Hill, San Francisco (1985)) Thornton et at. Nature 354: 105 (1991)

Tivol i wsp. Immunity 3: 541-7 (1995)

Townsend i Allison Science 259: 368 (1993)

Traunecker i wsp. Int. J. Cancer (Suppl.) 7:51-52 (1992)

Tuaillon i wsp. Analysis of direct and inverted DJH rearrangements in a human Ig heavy chain transgenic minilocus J. Immunol. 154: 6453-6465 (1995)

Tuaillon i wsp.,Human immunoglobulin heavy-chain minilocus recombination in transgenic mice: gene-segment use in p and y transcripts.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 3720-3724 (1993)

Uhlmann i Peyman, Chemical Reviews 90: 543 (1990)

Van Parijs i wsp. J. Exp. Med. 186: 1119-28 (1997)

Veber i Freidinger TINS str. 392 (1985)

Vitetta Immunol Today 14: 252 (1993)

Walunas i wsp. Immunity 1: 405-13 (1994)

Walunas i wsp. J. Exp. Med. 183: 2541-50 (1996)

PL 210 435 B1

Waterhouse i wsp. Science 270: 985-988 (1995)

Winter and Harris Immunol Today 14: 43-46 (1993)

Wright i wsp. Crit. Reviews in Im77lunol. 12125-168 (1992)

Yang i wsp. CancerRes 57: 4036-41 (1997)

Yi-qun i wsp. Int Immunol 8: 37-44 (1996)

Zon i wsp. Anti-Cancer Drug Design 6: 539 (1991)

Zon i wsp. Oligonucleotides and Analogues. A Practical Approach, str. 87-108 (F. Eckstein, red., Oxford University Press, Oxford England (1991))

Fry i wsp. Specific, irreversible inactivation of the epidermal growth factor receptor and erbB2, by a new class of tyrosine kinase inhibitor Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 12022-7 (1998)

Hoffman i wsp. A model of Cdc25 phosphatase catalytic domain and Cdkinteraction surface based on the presence of a rhodanese homology domain J. Mol. Biol. 282: 195-208 (1998)

Ginalski i wsp. Modelling of active forms of protein kinases: p38-a case study Acta Biochim Pol 44: 557-64 (1997)

Jouko i wsp.Identification of csk tyrosine phosphorylation sites and a tyrosine residue important for kinase domain structure Biochem J 322: 927-35 (1997)

Singh i wsp. Structure-based design of a potent, selective, and irreversible inhibitor of the catalytic domain of the erbB receptor subfamily of protein tyrosine kinases J. Med. Chem. 40: 1130-5 (1997) Mandel i wsp. ABGEN: a knowledge-based automated approach for antibody structure modeling Nat Biotechnol 14: 323-8 (1996)

Monfardini i wsp. Rational design, analysis, and potential utility of GM-CSF antagonists Proc Assoc Am Physicians 108: 420-31 (1996)

Furet i wsp. Modelling study of protein kinase inhibitors: binding mode of staurosporine and origin of the selectivity of CGP 52411 J Comput Aided Mol Des 9: 465-72 (1995)

Ill i wsp. Design and construction of a hybrid immunoglobulin domain with properties of both heavy and light chain variable regions Protein Eng 10: 94957 (1997)

Martin i wsp. The affinity-selection of a minibody polypeptide inhibitor of human interleukin-6 EMBO J 13: 5303-9 (1994)

Zgłoszenie patentowe nr seryjny 07/466,008, złożone 12 stycznia, 1990

Zgłoszenie patentowe nr seryjny 07/574,748, złożone 29 sierpnia, 1990

Zgłoszenie patentowe nr seryjny 07/575,962, złożone 31 sierpnia, 1990

Zgłoszenie patentowe USA nr seryjny 07/610,515, złożone 8 listopada, 1990

Zgłoszenie patentowe USA nr seryjny 07/810,279, złożone 17 grudnia, 1991

Zgłoszenie patentowe USA nr seryjny 07/853,408, złożone 18 marca, 1992

Zgłoszenie patentowe USA nr seryjny 07/904,068, złożone 23 czerwca, 1992

Zgłoszenie patentowe USA nr seryjny 07/919,297, złożone 24 lipca 1992

Zgłoszenie patentowe USA nr seryjny 07/990,860, złożone 16 grudnia 1992

Zgłoszenie patentowe USA nr seryjny 08/031,801, złożone 15 marca 1993

Zgłoszenie patentowe USA nr seryjny 08/053,131, złożone 26 kwietnia, 1993

Zgłoszenie patentowe USA nr seryjny 08/096,762, złożone 22 lipca, 1993

Zgłoszenie patentowe USA nr seryjny 08/112,848, złożone 27 sierpnia, 1993

Zgłoszenie patentowe USA nr seryjny 08/155,301, złożone 18 listopada, 1993

Zgłoszenie patentowe USA nr seryjny 08/161,739, złożone 3 grudnia, 1993

Zgłoszenie patentowe USA nr seryjny 08/165,699, złożone 10 grudnia, 1993

Zgłoszenie patentowe USA nr seryjny 08/209,741, złożone 9 marca, 1994

Zgłoszenie patentowe USA nr seryjny 08/234,145, złożone 28 kwietnia, 1994

Zgłoszenie patentowe USA nr seryjny 08/724,752, złożone 2 października, 1996

Zgłoszenie patentowe USA nr seryjny 08/730,639 złożone 11 października, 1996

Zgłoszenie patentowe USA nr seryjny 08/759,620, złożone 3 grudnia, 1996

Patent USA nr 4,399,216

Patent USA nr 4,681,581

Patent USA nr 4,683,195

Patent USA nr 4,683,202

Patent USA nr 4,753,210

Patent USA nr 4,740,461

Patent USA nr 4,816,397

PL 210 435 B1

Patent USA nr 4,912,040

Patent USA nr 4,959,455

Patent USA nr 5,101,827

Patent USA nr 5,102,990 (RE 35,500)

Patent USA nr 5,151,510

Patent USA nr 5,194,594

Patent USA nr 5,434,131

Patent USA nr 5,530,101

Patent USA nr 5,545,806

Patent USA nr 5,545,807

Patent USA nr 5,585,089

Patent USA nr 5,591,669

Patent USA nr 5,612,205

Patent USA nr 5,625,126

Patent USA nr 5,625,825

Patent USA nr 5,633,425

Patent USA nr 5,643,763

Patent USA nr 5,648,471

Patent USA nr 5,661,016

Patent USA nr 5,693,761

Patent USA nr 5,693,792

Patent USA nr 5,697,902

Patent USA nr 5,703,057

Patent USA nr 5,714,350

Patent USA nr 5,721,367

Patent USA nr 5,733,743

Patent USA nr 5,770,197

Patent USA nr 5,770,429

Patent USA nr 5,773,253

Patent USA nr 5,777,085

Patent USA nr 5,789,215

Patent USA nr 5,789,650

Patent USA nr 5,811,097

Europejskie zgłoszenie patentowe nr EP 0 546

Europejskie zgłoszenie patentowe nr EP 0 463

Międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO

Międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO

Międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO

Międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO

Międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO

Międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO

Międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO

Międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO

Międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO

Międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO

Międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO

Międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO

Międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO

Międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO

Międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO

Międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO

Międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO

Międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO

Międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO

Międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO

Międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO

073 B1

151 B1, opublikowane 12 czerwca 1996 92/02190

92/03918

92/22645

92/22647

92/22670

93/00431

93/12227

94/00569

94/02602 opublikowane 3 lutego 1994

94/25585

96/14436

97/13852

98/24884

94/25585

94/29444

95/01994

95/03408

95/24217

95/33770

96/14436

96/34096, opublikowane 31 października 1996

PL 210 435 B1

Międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO 97/13852

Międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO 97/20574

Międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO 97/38137

Międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO 98/24884

Międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO 98/24893, opublikowane 11 czerwca 1998

Lista sekwencji <110> ABGENIX, INC.

PFIZER INC.

<120> Monoklonalne przeciwciało przeciwko CTLA-4 <130> ΑΒΧ-PFl PCT <140> PCT/US99/30895 <141> 1999-12-23 <150> 60/113,647 <151> 1998-12-23 <160> 147 <170> Patentln wer. 2.1 <210> 1 <211> 463 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1

Met 1

Glu

Phe

Gly

Leu 5

Ser

Trp

Val

Phe

Leu 10

Val

Ala

Leu

Leu

Arg 15

Gly

Val

Gin

Cys

Gin 20

Val

Gin

Leu

Val

Glu 25

Ser

Gly

Gly

Gly

Val 30

Val

Gin

Pro

Gly

Arg 35

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser 40

Cys

Val

Ala

Ser

Gly 45

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser 50

His

Gly

Met

His

Trp 55

Val

Arg

Gin

Ala

Pro 60

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu 65

Trp

Val

Ala

Val

Ile 70

Trp

Tyr

Asp

Gly

Arg 75

Asn

Lys

Tyr

Tyr

Ala 80

Asp

Ser

Val

Lys

Gly 85

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser 90

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys 95

Asn

Thr

Leu

Phe

Leu 100

Gin

Met

Asn

Ser

Leu 105

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr 110

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys 115

Ala

Arg

Gly

Gly

His 120

Phe

Gly

Pro

Phe

Asp 125

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly 130

Thr

Leu

Val

Thr

Val 135

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr 140

Lys

Gly

Pro

Ser

Val 145

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro 150

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr 155

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala 160

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu 165

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe 170

Pro

Glu

Pro

Val

Thr 175

Val

PL 210 435 B1

Ser

Trp Asn

Ser 180

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser 185

Gly

Val

His

Thr

Phe 190

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

195

200

205

Pro

Ser

Ser

Asn

Phe

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

Thr

Cys

Asn

Val

Asp

His

210

215

220

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Thr

Val

Glu

Arg

Lys

Cys

Cys

225

230

235

240

Val

Glu

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Pro

Val

Ala

Gly

Pro

Ser

Val

245

250

255

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

260

265

270

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

275

280

285

Val

Gin

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

290

295

300

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Phe

Asn

Ser

Thr

Phe

Arg

Val

Val

Ser

305

310

315

320

Val

Leu

Thr

Val

Val

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

325

330

335

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Gly

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

340

345

350

Ser

Lys

Thr

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

355

360

365

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

370

375

380

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

385

390

395

400

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Met

Leu

Asp

Ser

405

410

415

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

420

425

430

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

435

440

445

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

450 455 460 <210> 2 <211> 464

PL 210 435 B1 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val 1 5

Val Gin Cys Gin Val Gin Leu Val 20

Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser 35 40

Ser Asn Tyr Gly Met His Trp Val 50 55

Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr 65 70

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 85

Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser 100

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Glu Arg 115 120

Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val 130 135

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys 145 150

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys 165

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu 180

Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu 195 200

Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr 210 215

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val 225 230

Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro 245

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 260

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 275 280

Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly 10 15

Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin 25 30

Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe 45

Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 60

Asp Gly Ser Asn Lys His Tyr Gly 75 80

Ile Ser Ser Asp Asn Ser Lys Asn 90 95

Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 105 110

Leu Gly Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp 125

Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 140

Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr 155 160

Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 170 175

Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 185 190

Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 205

Gin Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp 220

Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys 235 240

Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser 250 255

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 265 270

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 285

PL 210 435 B1

Glu

Val 290

Gin

Phe

Asn

Trp

Tyr 295

Val

Asp

Gly

Val

Glu 300

Val

His

Asn

Ala

Lys 305

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu 310

Glu

Gin

Phe

Asn

Ser 315

Thr

Phe

Arg

Val

Val 320

Ser

Val

Leu

Thr

Val 325

Val

His

Gin

Asp

Trp 330

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu 335

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val 340

Ser

Asn

Lys

Gly

Leu 345

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu 350

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys 355

Thr

Lys

Gly

Gin

Pro 360

Arg

Glu

Pro

Gin

Val 365

Tyr

Thr

Leu

Pro

Pro 370

Ser

Arg

Glu

Glu

Met 375

Thr

Lys

Asn

Gin

Val 380

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu 385

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr 390

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala 395

Val

Glu

Trp

Glu

Ser 400

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu 405

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr 410

Thr

Pro

Pro

Met

Leu 415

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser 420

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser 425

Lys

Leu

Thr

Val

Asp 430

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin 435

Gin

Gly

Asn

Val

Phe 440

Ser

Cys

Ser

Val

Met 445

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

450 455 450 <210> 3 <211> 163 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3

Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 15 10 15

Ser Ser His Gly Ile His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu

Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr 35 40

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 50 55

Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser 65 70

Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Ala Pro 85

30

Asp Gly Arg Asn Lys Asp Tyr Ala 45

Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys 60

Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 75 80

Leu Gly Pro Leu Asp Tyr Trp Gly 90 95

PL 210 435 B1

Gin

Gly

Thr

Leu 100

val

Thr

Val

Ser

Ser 105

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly 110

Pro

Ser

Val

Phe

Pro 115

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser 120

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu 125

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu 130

Gly

Cys

Leu

Val

Lys 135

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu 140

Pro

Val

Thr

Val

Ser 145

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala 150

Leu

Thr

Ser

Gly

Val 155

His

Thr

Phe

Pro

Ala 160

Val

Leu

Gin

<210> 4 <211> 463 <212> PRT <213> Homo sapiens <400 4

Met 1

Glu

Phe

Gly

Leu 5

Ser

Trp

Val

Phe

Leu 10

Val

Ala

Leu

Leu

Arg 15

Gly

Val

Gin

Cys

Gin

Val

Gin

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Val

Val

Glu

20

25

30

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Thr

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

35

40

45

Ser

Ser

Tyr

Gly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

50

55

60

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Ser

Asn

Lys

His

Tyr

Ala

65

70

75

80

Asp

Ser

Ala

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

85

90

95

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

100

105

110

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Ala

Gly

Leu

Leu

Gly

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

115

120

125

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

130

135

140

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

145

150

155

160

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

165

170

175

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

180

185

190

Val

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

PL 210 435 B1

195

200

205

Pro

Ser 210

Ser

Asn

Phe

Gly

Thr 215

Gin

Thr

Tyr

Thr

Cys 220

Asn

Val

Asp

His

Lys 225

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys 230

Val

Asp

Lys

Thr

Val 235

Glu

Arg

Lys

Cys

Cys 240

Val

Glu

Cys

Pro

Pro 245

Cys

Pro

Ala

Pro

Pro 250

Val

Ala

Gly

Pro

Ser 255

Val

Phe

Leu

Phe

Pro 260

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp 265

Thr

Leu

Met

Ile

Ser 270

Arg

Thr

Pro

Glu

Val 275

Thr

Cys

Val

Val

Val 280

Asp

Val

Ser

His

Glu 285

Asp

Pro

Glu

Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 290 295 300

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser

305 310 315 320

Val Leu Thr Val Val His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

325 330 335

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 340 345 350

Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro 355 360 365

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu 370 375 380

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

385 390 395 400

Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser

405 410 415

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 420 425 430

Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 435 440 445

His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 5 <211> 169 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5

Gly Val Val Gin Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

PL 210 435 B1

10 15

Gly

Phe

Thr

Phe 20

Ser

Ser

Tyr

Gly

Met 25

His

Trp

Val

Arg

Gin 30

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Ser

Asn

35

40

45

Lys

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

50

55

60

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

65

70

75

80

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Ala

Arg

Ile

Ile

Thr

Pro

85

90

95

Cys

Met

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

100

105

110

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

115

120

125

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

130

135

140

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

145

150

155

160

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

165 <210> 6 <211> 167 <212> PRT

<213> Homo ε

;apiens

<400> 6

Gly

Val

Val

Gin

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Val

Ala

Ser

1

5

10

15

Gly

Phe

Ile

Phe

Ser

Ser

His

Gly

Ile

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

20

25

30

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Arg

Asn

35

40

45

Lys

Asp

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

50

55

60

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

65

70

75

80

Asp

Thr

Ala

val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Val

Ala

Pro

Leu

Gly

Pro

Leu

85

90

95

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

PL 210 435 B1

100

105

110

Lys

Gly

Pro 115

Ser

Val

Phe

Pro

Leu 120

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg 125

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser 130

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly 135

Cys

Leu

Val

Lys

Asp 140

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro 145

Val

Thr

Val

Ser

Trp 150

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu 155

Thr

Ser

Gly

Val

His 160

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

165 <210> 7 <211> 172 <212> PRT <213> Homo sapiens <40 0 7

Ser 1

Gly

Pro

Gly

Leu 5

Val

Lys

Pro

Ser

Gin 10

Ile

Leu

Ser

Leu

Thr 15

Cys

Thr

Val

Ser

Gly 20

Gly

Ser

Ile

Ser

Ser 25

Gly

Gly

His

Tyr

Trp 30

Ser

Trp

Ile

Arg

Gin 35

His

Pro

Gly

Lys

Gly 40

Leu

Glu

Trp

Ile

Gly 45

Tyr

Ile

Tyr

Tyr

Ile 50

Gly

Asn

Thr

Tyr

Tyr 55

Asn

Pro

Ser

Leu

Lys 60

Ser

Arg

Val

Thr

Ile 65

Ser

Val

Asp

Thr

Ser 70

Lys

Asn

Gin

Phe

Ser 75

Leu

Lys

Leu

Ser

Ser 80

Val

Thr

Ala

Ala

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Asp

Ser

Gly

90 95

Asp Tyr Tyr Gly Ile Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val 100 105 HO

Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys 115 120 125

Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys 130 135 140

Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu 145 150 155 160

Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin 165 170 <210> 8 <211> 153 <212> PRT

PL 210 435 B1 <213> Homo sapiens

<400> 8

Arg

Ser

Leu 5

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala 10

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr 15

Phe

Pro 1

Gly

Ser

Ser

His

Gly

Ile

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

20

25

30

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Arg

Asn

Lys

Asp

Tyr

Ala

35

40

45

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

50

55

60

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

65

70

75

80

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Val

Ala

Pro

Leu

Gly

Pro

Leu

Asp

Tyr

Trp

Gly

85

90

95

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

100

105

110

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

115

120

125

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

130

135

140

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

145

150

<210> 9 <211> 167 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221> MOD_RES <222> (103) <223> Dowolny aminokwas

<400> 9

Ala 15

Ser

Gly 1

Val

Val

Gin

Pro 5

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg 10

Leu

Ser

Cys

Ala

Gly

Phe

Thr

Phe 20

Ser

Ser

Tyr

Gly

Met 25

His

Trp

Val

Arg

Gin 30

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly 35

Leu

Glu

Trp

Val

Ala 40

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp 45

Gly

Ser

Asn

Lys

Tyr 50

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val 55

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr 60

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

PL 210 435 B1

65

70

75

80

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr 85

Tyr

Cys

Ala

Arg

Asp 90

Pro

Arg

Gly

Ala

Thr 95

Leu

Tyr

Tyr

Tyr

Tyr 100

Tyr

Arg

Xaa

Asp

Val 105

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr 110

Thr

Val

Thr

Val

Ser 115

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys 120

Gly

Pro

Ser

Val

Phe 125

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys 130

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser 135

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala 140

Leu

Gly

Cys

Leu

Val 145

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro 150

Glu

Pro

Val

Thr

Val 155

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly 160

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

165 <210> 10 <211> 151 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10

Gly 1

Val

Val

Gin

Pro 5

Gly

Arg

Ser

Leu Arg 10

Leu

Ser

Cys

Ala

Al a 15

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser

Tyr

Gly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

20

25

30

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Ser

His

35

40

45

Lys

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

50

55

60

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

65

70

75

80

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Ala

Val

Val

Val

Pro

Ala

85

90

95

Ala

Met

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

100

105

110

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

115

120

125

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

130

135

140

Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150

PL 210 435 B1 <210> 11 <211> 146 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221> MOD_RES <222> (22) <223> Dowolny aminokwas <400> 11

Val 1

Val

Gin

Pro

Gly 5

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu 10

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser 15

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser 20

Ser

Xaa

Gly

Met

His 25

Trp

Val

Arg

Gin

Ala 30

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu 35

Glu

Trp

Val

Ala

Val 40

Ile

Trp

Ser

Asp

Gly 45

Ser

His

Lys

Tyr

Tyr 50

Ala

Asp

Ser

Val

Lys 55

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile 60

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser 65

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr 70

Leu

Gin

Met

Asn

Ser 75

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp 80

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr 85

Cys

Ala

Arg

Gly

Thr 90

Met

Ile

Val

Val

Gly 95

Thr

Leu

Asp

Tyr

Trp 100

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu 105

Val

Thr

val

Ser

Ser 110

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly 115

Pro

Ser

Val

Phe

Pro 120

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser 125

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

130 135 140

Glu Pro 145 <210> 12 <211> 174 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12 Ser Gly 1

Gly Gly

Val 5

Val

Gin

Pro

Gly

Arg 10

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser 15

Cys

Ala

Ala

Ser Gly 20

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser 25

Tyr

Gly

Val

His

Trp 30

val

Arg

Gin

Ala

Pro Gly 35

Lys

Gly

Leu

Glu 40

Trp

Val

Ala

Val

Ile 45

Trp

Tyr

Asp

Gly

Ser

Asn Lys

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

PL 210 435 B1

50

55

60

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Ser

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

65

70

75

80

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Asp

Ser

Tyr

Tyr

85

90

95

Asp

Phe

Trp

Ser

Gly

Arg

Gly

Gly

Met

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

100

105

110

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

115

120

125

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

130

135

140

Cys

Leu

val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

145

150

155

160

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

165 170 <210> 13 <211> 163 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13

Val 1

Gin

Pro

Gly

Arg 5

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser 10

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly 15

Phe

Thr

Phe

Ser

Asn 20

Tyr

Ala

Met

His

Trp 25

Val

Arg

Gin

Ala

Pro 30

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu 35

Trp

Val

Val

Val

Ile 40

Trp

His

Asp

Gly

Asn 45

Asn

Lys

Tyr

Tyr

Ala 50

Glu

Ser

Val

Lys

Gly 55

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser 60

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys 65

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu 70

Gin

Met

Asn

Ser

Leu 75

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr 80

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys 85

Ala

Arg

Asp

Gin

Gly 90

Thr

Gly

Trp

Tyr

Gly 95

Gly

Phe

Asp

Phe

Trp 100

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu 105

Val

Thr

Val

Ser

Ser 110

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly 115

Pro

Ser

Val

Phe

Pro 120

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser 125

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu 130

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu 135

Gly

Cys

Leu

Val

Lys 140

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

PL 210 435 B1

145 150 155 160

His Thr Phe <210> 14 <211> 235 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14

Met 1

Glu

Thr

Pro

Ala 5

Gin

Leu

Leu

Phe

Leu 10

Leu

Leu

Leu

Trp

Leu 15

Pro

Asp

Thr

Thr

Gly

Glu

Ile

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Gly

Thr

Leu

Ser

20

25

30

Leu

Ser

Pro

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

35

40

45

Ile

Ser

Ser

Ser

Phe

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin

Ala

50

55

60

Pro

Arg

Leu

Leu

Ile

Tyr

Gly

Ala

Ser

Ser

Arg

Ala

Thr

Gly

Ile

Pro

65

70

75

80

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

85

90

95

Ser

Arg

Leu

Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Tyr

100

105

110

Gly

Thr

Ser

Pro

Trp

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

115

120

125

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

130

135

140

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

145

150

155

160

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

165

170

175

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

180

185

190

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

195

200

205

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

210

215

220

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

225 230 235 <210> 15

PL 210 435 B1 <211> 233 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15

Met Glu Thr Pro Ala Gin Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 15 10 I⁵

Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser 20 25 30

Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Thr Ser Val Ser 35 40 45

Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg 50 55 60

Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg

70 75 80

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg

90 95

Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Ile 100 105 HO

Ser Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 115 120 125

Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu 130 135 140

Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro

145 150 155 160

Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly

165 170 175

Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 180 185 190

Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 195 200 205

Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val 210 215 220

Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 16 <211> 139 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16

Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg

PL 210 435 B1

5

Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Tyr 20

Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40

Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55

Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro 65 70

Gin Gin Tyr Gly Arg Ser Pro Phe 85

Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100

Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120

Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135

15

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro 25 30

Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 45

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 60

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 75 80

Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val 90 95

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 105 HO

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 125

Lys Val Gin <210> 17 <211> 234 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17

Met Glu Thr Pro Ala Gin Leu Leu 1 5

Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu 20

Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr 35 40

Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr 50 55

Arg Pro Leu Ile Tyr Gly Val Ser 65 70

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 85

Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala 100

Ile Ser Pro Phe Thr Phe Gly Pro 115 120

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe

Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 10 15

Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser 25 30

Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser 45

Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro 60

Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp 75 80

Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 90 95

Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly 105 110

Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg 125

Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin

PL 210 435 B1

130 ‘135 140

Leu 145

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala 150

Ser

Val

Val

Cys

Leu 155

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr 160

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys 165

Val

Gin

Trp

Lys

Val 170

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin 175

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin 180

Glu

Ser

Val

Thr

Glu 185

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp 190

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu 195

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr 200

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp 205

Tyr

Glu

Lys

His

Lys 210

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu 215

Val

Thr

His

Gin

Gly 220

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

225 230 <210> 18 <211> 152 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18

Gin 1

Ser

Pro

Ser

Ser 5

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 10

Gly

Asp

Arg

Val

Thr 15

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala 20

Ser

Gin

Ser

Ile

Asn 25

Thr

Tyr

Leu

Ile

Trp 30

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro 35

Gly

Lys

Ala

Pro

Asn 40

Phe

Leu

Ile

Ser

Ala 45

Thr

Ser

Ile

Leu

Gin 50

Ser

Gly

Val

Pro

Ser 55

Arg

Phe

Arg

Gly

Ser 60

Gly

Ser

Gly

Thr

Asn 65

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile 70

Asn

Ser

Leu

His

Pro 75

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr 80

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin 85

Ser

Tyr

Ser

Thr

Pro 90

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro 95

Gly

Thr

Lys

Val

Asp 100

Ile

Lys

Arg

Thr

Val 105

Ala

Ala

Pro

Ser

Val 110

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro 115

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu 120

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala 125

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

130 135 140

Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly 145 150

PL 210 435 B1 <210> 19 <211> 142 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19

Ser 1

Pro

Gly

Thr

Leu 5

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly 10

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu 15

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Ile

Ser

Ser

Asn

Phe

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

20

25

30

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

Leu

Leu

Ile

Tyr

Arg

Pro

Ser

Ser

35

40

45

Arg

Ala

Thr

Gly

Ile

Pro

Asp

Ser

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

50

55

60

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Arg

Leu

Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Leu

65

70

75

80

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Tyr

Gly

Thr

Ser

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

Gly

85

90

95

Thr

Lys

Val

Asp

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

100

105

110

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

115

120

125

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

130 135 140 <210> 20 <211> 155 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 20

Ser

Pro

Asp

Phe

Gin

Ser

Val

Thr

Pro

Lys

Glu

Lys

Val

Thr

Ile

Thr

1

5

10

15

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Ile

Gly

Ser

Ser

Leu

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

20

25

30

Lys

Pro

Asp

Gin

Ser

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

Lys

Tyr

Ala

Ser

Gin

Ser

35

40

45

Phe

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

50

55

60

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Asn

Ser

Leu

Glu

Ala

Glu

Asp

Ala

Ala

Thr

Tyr

65

70

75

80

Tyr

Cys

His

Gin

Ser

Ser

Ser

Leu

Pro

Leu

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

90 95

PL 210 435 B1

Lys Val Glu

Ile 100

Lys

Arg

Thr

Val

Ala 105

Ala

Pro

Ser

Val

Phe 110

Ile

Phe

Pro Pro Ser 115

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys 120

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser 125

Val

Val

Cys

Leu Leu Asn 130

Asn

Phe

Tyr

Pro 135

Arg

Glu

Ala

Lys

Val 140

Gin

Trp

Lys

Val

Asp Asn Ala 145

Leu

Gin

Ser 150

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu 155

<210> 21 <211> 146 <212> PRT

<213> Homo

sapiens

<400> 21 Gin Ser Pro 1 '

Gly

Thr 5

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro 10

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr 15

Leu

Ser Cys Arg

Ala 20

Ser

Gin

Ser

Val

Ser 25

Ser

Tyr

Leu

Ala

Trp 30

Tyr

Gin

Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser 35 40 45

Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 50 55 60

Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val 65 70 75 80

Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Arg Ser Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly 85 90 95

Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile 100 105 HO

Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val 115 120 125

Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys 130 135 140

Gly Gly

145 <210> 22 <211> 139 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22

Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 15 10 15

PL 210 435 B1

Arg

Ala

Ser

Gin 20

Ser

Ile

Asn

Ser

Tyr 25

Leu

Asp

Trp

Tyr

Gin 30

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Ser

Leu

Gin

35

40

45

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

50

55

60

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

65

70

75

80

Cys

Gin

Gin

Tyr

Tyr

Ser

Thr

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

Gly

Thr

Lys

85

90

95

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

100

105

110

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

115

120

125

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

130 135 <210> 23 <211> 134 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23

Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr 15 10 15

Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asn Ile Ser Arg Tyr Leu Asn Trp Tyr 20 25 30

Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu Ile Tyr Val Ala Ser 35 40 45

Ile Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Gly Phe Ser Ala Ser Gly Ser Gly 50 55 60

Pro Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala 65 70 75 80

Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Ser Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro 85 90 95

Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe 100 105 HO

Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val 115 120 125

Val Cys Leu Leu Asn Asn 130

PL 210 435 B1 <210> 24 <211> 150 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24

Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr 15 10 15

Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile Cys Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr 20 25 30

Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Val Leu Ile Tyr Ala Ala Ser 35 40 45

Ser Leu Gin Gly Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 50 55 60

Ile Asp Cys Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala 65 70 75 80

Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Ile Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro 85 90 95

Gly Thr Arg Val Asp Ile Glu Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe 100 105 110

Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val 115 120 125

Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp 130 135 140

Lys Val Asp Asn Ala Tyr

145 150 <210> 25 <211> 139 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25

Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly Gin Pro Ala Ser Ile Ser Cys 1 5 10 15

Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val Tyr Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn 20 25 30

Trp Phe Gin Gin Arg Pro Gly Gin Ser Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys ' 35 40 45

Val Ser Asn Trp Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp

PL 210 435 B1

65

70

75

80

Val

Gly

Val

Tyr

Tyr 85

Cys

Met

Gin

Gly

Ser 90

His

Trp

Pro

Pro

Thr 95

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr 100

Lys

Val

Glu

Ile

Lys 105

Arg

Thr

Val

Ala

Ala 110

Pro

Ser

Val

Phe

Ile 115

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp 120

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser 125

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

130 135 <210> 26 <211> 133 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26

Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Leu 15 10 15

His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly 20 25 30

Gin Ser Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly 35 40 45

Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 50 55 60

Lys Leu Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met

70 75 80

Gin Ala Leu Gin Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu

90 95

Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser 100 105 HO

Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn 115 120 125

Asn Phe Tyr Pro Arg 130 <210> 27 <211> 1392 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120 tgtgtagcgt ctggattcac cttcagtagc catggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180

PL 210 435 B1 ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttata tggtatgatg gaagaaataa atactatgca 240 gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtttctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag aggaggtcac 360 ttcggtcctt ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc agcctccacc 420 aagggcccat cggtcttccc cctggcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcg 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgctctga ccagcggcgt gcacaccttc ccagctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcaacttcg gcacccagac ctacacctgc 660 aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga cagttgagcg caaatgttgt 720 gtcgagtgcc caccgtgccc agcaccacct gtggcaggac cgtcagtctt cctcttcccc 780 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacgtg cgtggtggtg 840 gacgtgagcc acgaagaccc cgaggtccag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 900 cataatgcca agacaaagcc acgggaggag cagttcaaca gcacgttccg tgtggtcagc 960 gtcctcaccg ttgtgcacca ggactggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1020 aacaaaggcc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aaaccaaagg gcagccccga 1080 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1140 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctacccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1200 gggcagccgg agaacaacta caagaccaca cctcccatgc tggactccga cggctccttc 1260 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1320 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1380 ccgggtaaat ga 1392 <210> 28 <211> 1395 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 28 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120 tgtacagcgt ctggattcac cttcagtaac tatggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180 ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttata tggtatgatg gaagtaataa acactatgga 240 gactccgtga agggccgatt caccatctcc agtgacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag aggagagaga 360 ctggggtcct actttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcagcctcc 420 accaagggcc catcggtctt ccccctggcg ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca 480 gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 540 tcaggcgctc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccagctg tcctacagtc ctcaggactc 600 tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcaact tcggcaccca gacctacacc 660 tgcaacgtag atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agacagttga gcgcaaatgt 720 tgtgtcgagt gcccaccgtg cccagcacca cctgtggcag gaccgtcagt cttcctcttc 780 cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg 840 gtggacgtga gccacgaaga ccccgaggtc cagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 900 gtgcataatg ccaagacaaa gccacgggag gagcagttca acagcacgtt ccgtgtggtc 960 agcgtcctca ccgttgtgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1020 tccaacaaag gcctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaaaccaa agggcagccc 1080 cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc 1140 agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1200 aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acacctccca tgctggactc cgacggctcc 1260 ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1320 tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 1380 tctccgggta aatga 1395 <210> 29 <211> 489 <212> DNA

PL 210 435 B1 <213> Homo sapiens <400 29 cctgggaggt ccctgagact ctcctgtgca gcgtctggat tcaccttcag tagtcatggc 60 atccactggg tccgccaggc tccaggcaag gggctggagt gggtggcagt tatatggtat 120 gatggaagaa ataaagacta tgcagactcc gtgaagggcc gattcaccat ctccagagac 180 aattccaaga agacgctgta tttgcaaatg aacagcctga gagccgagga cacggctgtg 240 tattactgtg cgagagtggc cccactgggg ccacttgact actggggcca gggaaccctg 300 gtcaccgtct cctcagcctc caccaagggc ccatcggtct tccccctggc gccctgctcc 360 aggagcacct ccgagagcac agcggccctg ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa 420 ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgct ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccagct 480 gtcctacag <210 30 <211> 1392 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtcgagcctg ggaggtccct gagactctcc 120 tgtacagcgt ctggattcac cttcagtagt tatggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180 ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttata tggtatgatg gaagcaataa acactatgca 240 gactccgcga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag agccggactg 360 ctgggttact ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc agcctccacc 420 aagggcccat cggtcttccc cctggcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcg 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgctctga ccagcggcgt gcacaccttc ccagctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcaacttcg gcacccagac ctacacctgc 660 aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga cagttgagcg caaatgttgt 720 gtcgagtgcc caccgtgccc agcaccacct gtggcaggac cgtcagtctt cctcttcccc 780 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacgtg cgtggtggtg 840 gacgtgagcc acgaagaccc cgaggtccag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 900 cataatgcca agacaaagcc acgggaggag cagttcaaca gcacgttccg tgtggtcagc 960 gtcctcaccg ttgtgcacca ggactggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1020 aacaaaggcc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aaaccaaagg gcagccccga 1080 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1140 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctacccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1200 gggcagccgg agaacaacta caagaccaca cctcccatgc tggactccga cggctccttc 1260 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1320 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1380 ccgggtaaat ga 1392 <210 31 <211> 507 <212> DNA <213> Homo sapiens <400 31 ggcgtggtcc agcctgggag gtccctgaga ctctcctgtg cagcgtctgg attcaccttc 60 agtagctatg gcatgcactg ggtccgccag gctccaggca aggggctgga gtgggtggca 120 gttatatggt atgatggaag taataaatac tatgcagact ccgtgaaggg ccgattcacc 180 atctccagag acaattccaa gaacacgctg tatctgcaaa tgaacagcct gagagccgag 240 gacacggctg tgtattactg tgcgagaggg gcccgtataa taaccccttg tatggacgtc 300 tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc 360

PL 210 435 B1 cccctggcgc cctgctccag gagcacctcc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg gtgcacacct tcccagctgt cctacag gagagcacag cggccctggg ctgcctggtc 420 tcgtggaact caggcgctct gaccagcggc 480

507 <210> 32 <211> 501 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 32 ggcgtggtcc agcctgggag gtccctgaga agtagtcatg gcatccactg ggtccgccag gttatatggt atgatggaag aaataaagac atctccagag acaattccaa gaacacgctg gacacggctg tgtattactg tgcgagagtg cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcagcc gcgccctgct ccaggagcac ctccgagagc tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg accttcccag ctgtcctaca g ctctcctgtg tagcgtctgg attcatcttc 60 gctccaggca aggggctgga gtgggtggca 120 tatgcagact ccgtgaaggg ccgattcacc 180 tatttgcaaa tgaacagcct gagagccgag 240 gccccactgg ggccacttga ctactggggc 300 tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg 360 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac 420 aactcaggcg ctctgaccag cggcgtgcac 480

501 <210> 33 <211> 516 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 33 tcgggcccag gactggtgaa gccttcacag ggctccatca gcagtggtgg tcactactgg ctggagtgga ttgggtacat ctattacatt agtcgagtta ccatatcagt agacacgtct gtgactgccg cggacacggc cgtgtattat atagacgtct ggggccaagg gaccacggtc tccgtcttcc ccctggcgcc ctgctccagg tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc atcctgtccc tcacctgcac tgtctctggt 60 agctggatcc gccagcaccc agggaagggc 120 gggaacacct actacaaccc gtccctcaag 180 aagaaccagt tctccctgaa gctgagctct 240 tgtgcgagag atagtgggga ctactacggt 300 accgtctcct cagcttccac caagggccca 360 agcacctccg agagcacagc cgccctgggc 420 gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg 480 ctacaa 516 <210> 34 <211> 459 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 34 cctgggaggt ccctgagact ctcctgtgca gcgtctggat tcaccttcag tagtcatggc 60 atccactggg tccgccaggc tccaggcaag gggctggagt gggtggcagt tatatggtat 120 gatggaagaa ataaagacta tgcagactcc gtgaagggcc gattcaccat ctccagagac 180 aattccaaga acacgctgta tttgcaaatg aacagcctga gagccgagga cacggctgtg 240 tattactgtg cgagagtggc cccactgggg ccacttgact actggggcca gggaaccctg 300 gtcaccgtct cctcagcctc caccaagggc ccatcggtct tccccctggc gccctgctcc 360 aggagcacct ccgagagcac agcggccctg ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa 420 ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgct ctgaccagc 459 <210> 35 <211> 503 <212> DNA

PL 210 435 B1 <213> Homo sapiens <400> 35 ggcgtggtcc agtagctatg gttatatggt atctccagag gacacggctg taccggtkgg ggcccatcgg ctgggctgcc gctctgacca agcctgggag gcatgcactg atgatggaag acaattccaa tgtattactg acgtctgggg tcttccccct tggtcaagga gcggcgtgca gtccctgaga ggtccgccag taataaatac gaacacgctg tgcgagagat ccaagggacc ggcgccctgc ctacttcccc ctctcctgtg gctccaggca tatgcagact tatctgcaaa ccgaggggag acggtcaccg tccaggagca gaaccggtga cagcgtctgg aggggctgga ccgtgaaggg tgaacagcct ctacccttta tctcctcagc cctccgagag cggtgtcgtg attcaccttc 60 gtgggtggca 120 ccgattcacc 180 gagagccgag 240 ctactactac 300 ctccaccaag 360 cacagcggcc 420 gaactcaggc 480

503 <210> 36 <211> 451 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 36 ggcgtggtcc agtagctatg gttatatggt atctccagag gacacggctg tggggccaag cccctggcgc aaggactact agcctgggag gcatgcactg atgatggaag acaattccaa tgtattactg ggaccacggt cctgctccag tccccgaacc gtccctgaga ggtccgccag tcataaatac gaacacgctg tgcgagaggc caccgtctcc gagcacctcc ggtgacggtg ctctcctgtg gctccaggca tatgcagact tatctgcaaa gctgtagtag tcagcctcca gagagcacag t

cagcgtctgg aggggctgga ccgtgaaggg tgaacagcct taccagctgc ccaagggccc cggccctggg attcaccttc 60 gtgggtggca 120 ccgattcacc 180 gagagccgag 240 tatggacgtc 300 atcggtcttc 360 ctgcctggtc 420

451 <210> 37 <211> 438 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> modified_base <222> (64) <223> a, c, t, g, inna lub nieznana <400> 37 gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt 60 agcngtggca tgcactgggt. ccgccaggct ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt 120 atatggtctg atggaagtca taaatactat gcagactccg tgaagggccg attcaccatc 180 tccagagaca attccaagaa cacgctgtat ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac 240 acggctgtgt attactgtgc gagaggaact atgatagtag tgggtaccct tgactactgg 300 ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc 360 ctggcgccct gctccaggag cacctccgag agcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag 420 gactacttcc ccgaaccg 438 <210> 38 <211> 562 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 38 tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt tactatggcg tctgggggag gcgtggtcca 60

PL 210 435 B1 gcctgggagg tccctgagac tctcctgtgc agcgtctgga ttcaccttca gtagctatgg 120 cgtgcactgg gtccgccagg ctccaggcaa ggggctggag tgggtggcag ttatatggta 180 tgatggaagt aataaatact atgcagactc cgtgaagggc cgattcacca tctccagaga 240 caattccaag agcacgctgt atctgcaaat gaacagcctg agagccgagg acacggctgt 300 gtattattgt gcgagagact cgtattacga tttttggagt ggtcggggcg gtatggacgt 360 ctggggccaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcagcctcc accaagggcc catcggtctt 420 ccccctggcg ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca gcggccctgg gctgcctggt 480 caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgctc tgaccagcgg 540 cgtgcacacc ttcccagctg tc 562 <210> 39 <211> 490 <212> DNA <213> Homo sapiens <400 39 gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc tgtgcagcgt ctggattcac cttcagtaac 60 tatgccatgc actgggtccg ccaggctcca ggcaaggggc tggagtgggt ggtagttatt 120 tggcatgatg gaaataataa atactatgca gagtccgtga agggccgatt caccatctcc 180 agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg 240 gctgtatatt actgtgcgag agatcagggc actggctggt acggaggctt tgacttctgg 300 ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc 360 ctggcgccct gctccaggag cacctccgag agcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag 420 gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg tggaactcag gcgctctgac cagcggcgtg 480 cacaccttcc 490 <210 40 <211> 708 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 40 atggaaaccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120 ctctcctgca gggccagtca gagtattagc agcagcttct tagcctggta ccagcagaga 180 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 240 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 300 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta cctcaccctg gacgttcggc 360 caagggacca aggtggaaat caaacgaact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 420 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 480 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 540 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 600 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 660 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgttag 708 <210 41 <211> 702 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 41 atggaaaccc gaaattgtgt ctctcctgca caggctccca cagcgcagct tgacgcagtc ggaccagtgt ggctcctcat tctcttcctc tccaggcacc tagcagcagt ctatggtgca ctgctactct ctgtctttgt tacttagcct tccagcaggg ggctcccaga ctccagggga ggtaccagca ccactggcat taccaccgga aagagccacc gaaacctggc cccagacagg

120

180

240

PL 210 435 B1 ttcagtggca gattttgcag accaaggtgg gatgagcagt agagaggcca agtgtcacag agcaaagcag agctcgcccg gtgggtctgg tctattactg agatcaagcg tgaaatctgg aagtacagtg agcaggacag actacgagaa tcacaaagag gacagacttc tcagcagtat aactgtggct aactgcctct gaaggtggat caaggacagc acacaaagtc cttcaacagg actctcacca ggcatctcac gcaccatctg gttgtgtgcc aacgccctcc acctacagcc tacgcctgcg ggagagtgtt tcagcagact ccttcacttt tcttcatctt tgctgaataa aatcgggtaa tcagcagcac aagtcaccca ag ggagcctgaa 300 cggcggaggg 360 cccgccatct 420 cttctatccc 480 ctcccaggag 540 cctgacgctg 600 tcagggcctg 660

702 <210> 42 <211> 417 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 42 ggcaccctgt gtcagcagct tatggtgcat acagacttca cagcagtatg actgtggctg actgcctctg ctttgtctcc acttagcctg ccagcagggc ctctcaccat gtaggtcacc caccatctgt ttgtgtgcct aggggaaaga gtaccagcag cactggcatc cagcagactg attcactttc cttcatcttc gctgaataac gccaccctct aaacctggcc ccagacaggt gagcctgagg ggccctggga ccgccatctg ttctatccca cctgcagggc aggctcccag tcagtggcag attttgcagt ccaaagtgga atgagcagtt gagaggccaa cagtcagagt 60 actcctcatc 120 tgggtctggg 180 gtattactgt 240 tatcaagcga 300 gaaatctgga 360 agtacag 417 <210> 43 <211> 705 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 43 atggaaaccc gaaattgtgt ctctcctgta ggccaggctc aggttcagtg gaagattttg gggaccaaag tctgatgagc cccagagagg gagagtgtca ctgagcaaag ctgagctcgc cagcgcagct tgacgcagtc gggccagtca ccaggcccct gcagtgggtc cagtgtatta tggatatcaa agttgaaatc ccaaagtaca cagagcagga cagactacga ccgtcacaaa tctcttcctc tccaggcacc aagtgttagc catctatggt tgggacagac ctgtcagcag acgaactgtg tggaactgcc gtggaaggtg cagcaaggac gaaacacaaa gagcttcaac ctgctactct ctgtctttgt agctacttag gtatccagca ttcactctca tatggtatct gctgcaccat tctgttgtgt gataacgccc agcacctaca gtctacgcct aggggagagt ggctcccaga ctccagggga cctggtacca gggccactgg ccatcagcag caccattcac ctgtcttcat gcctgctgaa tccaatcggg gcctcagcag gcgaagtcac gttag taccaccgga aagagccacc acagaaacct catcccagac actggagcct tttcggccct cttcccgcca taacttctat taactcccag caccctgacg ccatcagggc

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

705 <210> 44 <211> 458 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 44 cagtctccat agtcagagca ttcctgatct ggctctggga tactactgtc atcaaacgaa aaatctggaa cctccctgtc ttaacaccta ctgctacatc caaatttcac aacagagtta ctgtggctgc ctgcctctgt tgcatctgta tttaatttgg cattttgcaa tctcaccatc cagtacccca accatctgtc tgtgtgcctg ggagacagag tatcagcaga agtggggtcc aacagtcttc ttcactttcg ttcatcttcc ctgaataact tcaccatcac aaccagggaa catcaaggtt atcctgaaga gccctgggac cgccatctga tctatcccag ttgccgggca 60 agcccctaac 120 ccgtggcagt 180 ttttgcaact 240 caaagtggat 300 tgagcagttg 360 agaggccaaa 420

PL 210 435 B1 gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa tcgggtaa 458 <210> 45 <211> 426 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 45 tctccaggca ccctgtcttt gtctccaggg gaaagagcca ccctctcctg cagggccagt 60 cagagtatta gcagcaattt cttagcctgg taccagcaga aacctggcca ggctcccagg 120 ctcctcatct atcgtccatc cagcagggcc actggcatcc cagacagttt cagtggcagt 180 gggtctggga cagacttcac tctcaccatc agcagactgg agcctgagga ttttgcatta 240 tattactgtc agcagtatgg tacgtcacca ttcactttcg gccctgggac caaagtggat 300 atcaagcgaa ctgtggctgc accatctgtc ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg 360 aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg ctgaataact tctatcccag agaggccaaa 420 gtacag 426 <210> 46 <211> 465 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 46 tctccagact ttcagtctgt gactccaaag gagaaagtca ccatcacctg ccgggccagt 60 cagagcattg gtagtagctt acattggtat cagcagaaac cagatcagtc tccaaagctc 120 ctcatcaagt atgcttccca gtccttctct ggggtcccct cgaggttcag tggcagtgga 180 tctgggacag atttcaccct caccatcaat agcctggaag ctgaagatgc tgcaacgtat 240 tactgtcatc agagtagtag tttaccgctc actttcggcg gagggaccaa ggtggagatc 300 aaacgaactg tggctgcacc atctgtcttc atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa 360 tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg aataacttct atcccagaga ggccaaagta 420 cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg ggtaactccc aggag 465 <210> 47 <211> 440 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 47 cagtctccag gcaccctgtc tttgtctcca ggggaaagag ccaccctctc ctgcagggcc 60 agtcagagtg tcagcagcta cttagcctgg taccagcaga aacctggcca ggctcccagg 120 ctcctcatct atggtgcatc cagcagggcc actggcatcc cagacaggtt cagtggcagt 180 gggtctggga cagacttcac tctcaccatc agcagactgg agcctgagga ttttgcagtg 240 tattactgtc aacagtatgg taggtcacca ttcactttcg gccctgggac caaagtagat 300 atcaagcgaa ctgtggctgc accatctgtc ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg 360 aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg ctgaataact tctatcccag agaggccaaa 420 gtacagtgga aaggtggata 440 <210> 48 <211> 417 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 48 ccatcctccc tgtctgcatc tgtaggagac agagtcacca tcacttgccg ggcaagtcag 60

PL 210 435 B1 agcattaaca gctatttaga ttggtatcag cagaaaccag ggaaagcccc taaactcctg 120 atctatgctg catccagttt gcaaagtggg gtcccatcaa ggttcagtgg cagtggatct 180 gggacagatt tcactctcac catcagcagt ctgcaacctg aagattttgc aacttactac 240 tgtcaacagt attacagtac tccattcact ttcggccctg ggaccaaagt ggaaatcaaa 300 cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 360 ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagta 417 <210> 49 <211> 402 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> modyfikowana zasada <222> (207) <223> a, c, t, g, inna lub nieznana <400> 49 acccagtctc catcctccct gtctgcatct gtaggagaca gagtcaccat cacttgccgg 60 gcaagtcaga acattagcag gtatttaaat tggtatcaac agaaaccagg gaaagcccct 120 aagttcctga tctatgttgc atctattttg caaagtgggg tcccatcagg gttcagtgcc 180 agtggatctg ggccagattt cactctnacc atcagcagtc tgcaacctga agattttgca 240 acttactact gtcaacagag ttacagtacc ccattcactt tcggccctgg gaccaaagtg 300 gatatcaaac gaactgtggc tgcaccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag 360 ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata ac 402 <210> 50 <211> 451 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 50 acccagtctc catcctccct gtctgcatct gtaggagaca gagtcaccat cacttgccgg 60 gcaagtcaga gcatttgcaa ctatttaaat tggtatcagc agaaaccagg aaaagcccct 120 agggtcctga tctatgctgc atccagtttg caaggtgggg tcccgtcaag gttcagtggc 180 agtggatctg ggacagattg cactctcacc atcagcagtc tgcaacctga agattttgca 240 acttactact gtcaacagag ttacactacc ccattcactt tcggccctgg gaccagagtg 300 gatatcgaac gaactgtggc tgcaccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag 360 ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc 420 aaagtacagt ggaaggtgga taacgcctat t 451 <210> 51 <211> 419 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 51 ccactctccc tgcccgtcac ccttggacag ccggcctcca tctcctgcag gtctagtcaa 60 agcctcgtat acagtgatgg aaacacctac ttgaattggt ttcagcagag gccaggccaa 120 tctccaaggc gcctaattta taaggtttct aactgggact ctggggtccc agacagattc 180 agcggcagtg ggtcaggcac tgatttcaca ctgaaaatca gcagggtgga ggctgaggat 240 gttggggttt attactgcat gcaaggttca cactggcctc cgacgttcgg ccaagggacc 300 aaggtggaaa tcaaacgaac tgtggctgca ccatctgtct tcatcttccc gccatctgat 360 gagcagttga aatctggaac tgcctctgtt gtgtgcctgc tgaataactt ctatcccac 419

PL 210 435 B1 <210> 52 <211> 419 <212> DNA <213> Homo sapiens <400 52 cctggagagc tacaactatt ttgggttcta gattttacac caagctctac gtggctgcac gcctctgttg cggcttccat tggattggta atcgggcctc tgaaactcag aaactcctct catctgtctt tgtgcctgct ctcttgcagg tctagtcaga gcctcctgca tagtaatgga 60 cctgcagaag ccaggacagt ctccacagct cctgatctat 120 cggggtccct gacaggttca gtggcagtgg atcaggcaca 180 cagagtggag gctgaggatg ttggggttta ttactgcatg 240 cactttcggc ggagggacca aggtggagat caaacgaact 300 catcttcccg ccatctgatg agcagttgaa atctggaact 360 gaataacttc tatcccagar aggccaaagt acattccat 419 <210> 53 <211> 1392 <212> DNA <213> Homo <400> 53 atggagtttg gtgcagctgg tgtgtagcgt ggcaaggggc gactccgtga caaatgaaca ttcggtcctt aagggcccat gccctgggct ggcgctctga tccctcagca aacgtagatc gtcgagtgcc ccaaaaccca gacgtgagcc cataatgcca gtcctcaccg aacaaaggcc gaaccacagg ctgacctgcc gggcagccgg ttcctctaca tgctccgtga ccgggtaaat sapiens ggctgagctg tggagtctgg ctggattcac tggagtgggt agggccgatt gcctgagagc ttgactactg cggtcttccc gcctggtcaa ccagcggcgt gcgtggtgac acaagcccag caccgtgccc aggacaccct acgaagaccc agacaaagcc ttgtgcacca tcccagcccc tgtacaccct tggtcaaagg agaacaacta gcaagctcac tgcatgaggc ga ggttttcctc gggaggcgtg cttcagtagc ggcagttata caccatctcc cgaggacacg gggccaggga cctggcgccc ggactacttc gcacaccttc cgtgccctcc caacaccaag agcaccacct catgatctcc cgaggtccag acgggaggag ggactggctg catcgagaaa gcccccatcc cttctacccc caagaccaca cgtggacaag tctgcacaac gttgctcttt gtccagcctg catggcatgc tggtatgatg agagacaatt gctgtgtatt accctggtca tgctccagga cccgaaccgg ccagctgtcc agcaacttcg gtggacaaga gtggcaggac cggacccctg ttcaactggt cagttcaaca aacggcaagg accatctcca cgggaggaga agcgacatcg cctcccatgc agcaggtggc cactacacgc taagaggtgt ggaggtccct actgggtccg gaagaaataa ccaagaacac actgtgcgag ccgtctcctc gcacctccga tgacggtgtc tacagtcctc gcacccagac cagttgagcg cgtcagtctt aggtcacgtg acgtggacgg gcacgttccg agtacaagtg aaaccaaagg tgaccaagaa ccgtggagtg tggactccga agcaggggaa agaagagcct ccagtgtcag gagactctcc ccaggctcca atactatgca gctgtttctg aggaggtcac agcctccacc gagcacagcg gtggaactca aggactctac ctacacctgc caaatgttgt cctcttcccc cgtggtggtg cgtggaggtg tgtggtcagc caaggtctcc gcagccccga ccaggtcagc ggagagcaat cggctccttc cgtcttctca ctccctgtct

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1392 <210> 54 <211> 1999 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 54 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120 tgtgtagcgt ctggattcac cttcagtagc catggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180 ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttata tggtatgatg gaagaaataa atactatgca 240

PL 210 435 B1 gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtttctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag aggaggtcac 360 ttcggtcctt ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc agctagcacc 420 aagggcccat cggtcttccc cctggcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcg 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgctctga ccagcggcgt gcacaccttc ccagctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcaacttcg gcacccagac ctacacctgc 660 aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga cagttggtga gaggccagct 720 cagggaggga gggtgtctgc tggaagccag gctcagccct cctgcctgga cgcaccccgg 780 ctgtgcagcc ccagcccagg gcagcaaggc aggccccatc tgtctcctca cccggaggcc 840 tctgcccgcc ccactcatgc tcagggagag ggtcttctgg ctttttccac caggctccag 900 gcaggcacag gctgggtgcc cctaccccag gcccttcaca cacaggggca ggtgcttggc 960 tcagacctgc caaaagccat atccgggagg accctgcccc tgacctaagc cgaccccaaa 1020 ggccaaactg tccactccct cagctcggac accttctctc ctcccagatc cgagtaactc 1080 ccaatcttct ctctgcagag cgcaaatgtt gtgtcgagtg cccaccgtgc ccaggtaagc 1140 cagcccaggc ctcgccctcc agctcaaggc gggacaggtg ccctagagta gcctgcatcc 1200 agggacaggc cccagctggg tgctgacacg tccacctcca tctcttcctc agcaccacct 1260 gtggcaggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 1320 cggacccctg aggtcacgtg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc cgaggtccag 1380 ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc acgggaggag 1440 cagttcaaca gcacgttccg tgtggtcagc gtcctcaccg ttgtgcacca ggactggctg 1500 aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaaggcc tcccagcccc catcgagaaa 1560 accatctcca aaaccaaagg tgggacccgc ggggtatgag ggccacatgg acagaggccg 1620 gctcggccca ccctctgccc tgggagtgac cgctgtgcca acctctgtcc ctacagggca 1680 gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gaggagatga ccaagaacca 1740 ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctaccccagc gacatcgccg tggagtggga 1800 gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacacct cccatgctgg actccgacgg 1860 ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt 1920 cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc 1980 cctgtctccg ggtaaatga 1999 <210> 55 <211> 1392 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 55 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120 tgtgtagcgt ctggattcac cttcagtagc catggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180 ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttata tggtatgatg gaagaaataa atactatgca 240 gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtttctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag aggaggtcac 360 ttcggtcctt ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc agcctccacc 420 aagggcccat cggtcttccc cctggcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcg 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgctctga ccagcggcgt gcacaccttc ccagctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcaacttcg gcacccagac ctacacctgc 660 aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga cagttgagcg caaatgttgt 720 gtcgagtgcc caccgtgccc agcaccacct gtggcaggac cgtcagtctt cctcttcccc 780 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacgtg cgtggtggtg 840 gacgtgagcc acgaagaccc cgaggtccag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 900 cataatgcca agacaaagcc acgggaggag cagttccaaa gcacgttccg tgtggtcagc 960 gtcctcaccg ttgtgcacca ggactggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1020 aacaaaggcc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aaaccaaagg gcagccccga 1080 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1140 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctacccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1200

PL 210 435 B1 gggcagccgg agaacaacta caagaccaca cctcccatgc tggactccga cggctccttc 1260 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1320 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1380 ccgggtaaat ga <210> 56 <211> 708 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 56 atggaaaccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120 ctctcctgca gggccagtca gagtattagc agcagcttct tagcctggta ccagcagaga 180 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 240 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 300 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta cctcaccctg gacgttcggc 360 caagggacca aggtggaaat caaacgaact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 420 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 480 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 540 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 600 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 660 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgttag 708 <210> 57 <211> 1395 <212> DNA <213> Homo <400> 57 atggagtttg gtgcagctgg tgtacagcgt ggcaaggggc gactccgtga caaatgaaca ctggggtcct accaagggcc gcggccctgg tcaggcgctc tactccctca tgcaacgtag tgtgtcgagt cccccaaaac gtggacgtga gtgcataatg agcgtcctca tccaacaaag cgagaaccac agcctgacct aatgggcagc ttcttcctct tcatgctccg tctccgggta sapiens ggctgagctg tggagtctgg ctggattcac tggagtgggt agggccgatt gcctgagagc actttgacta catcggtctt gctgcctggt tgaccagcgg gcagcgtggt atcacaagcc gcccaccgtg ccaaggacac gccacgaaga ccaagacaaa ccgttgtgca gcctcccagc aggtgtacac gcctggtcaa cggagaacaa acagcaagct tgatgcatga aatga ggttttcctc gggaggcgtg cttcagtaac ggcagttata caccatctcc cgaggacacg ctggggccag ccccctggcg caaggactac cgtgcacacc gaccgtgccc cagcaacacc cccagcacca cctcatgatc ccccgaggtc gccacgggag ccaggactgg ccccatcgag cctgccccca aggcttctac ctacaagacc caccgtggac ggctctgcac gttgctcttt gtccagcctg tatggcatgc tggtatgatg agtgacaatt gctgtgtatt ggaaccctgg ccctgctcca ttccccgaac ttcccagctg tccagcaact aaggtggaca cctgtggcag tcccggaccc cagttcaact gagcagttca ctgaacggca aaaaccatct tcccgggagg cccagcgaca acacctccca aagagcaggt aaccactaca taagaggtgt ggaggtccct actgggtccg gaagtaataa ccaagaacac actgtgcgag tcaccgtctc ggagcacctc cggtgacggt tcctacagtc tcggcaccca agacagttga gaccgtcagt ctgaggtcac ggtacgtgga acagcacgtt aggagtacaa ccaaaaccaa agatgaccaa tcgccgtgga tgctggactc ggcagcaggg cgcagaagag ccagtgtcag gagactctcc ccaggctcca acactatgga gctgtatctg aggagagaga ctcagcctcc cgagagcaca gtcgtggaac ctcaggactc gacctacacc gcgcaaatgt cttcctcttc gtgcgtggtg cggcgtggag ccgtgtggtc gtgcaaggtc agggcagccc gaaccaggtc gtgggagagc cgacggctcc gaacgtcttc cctctccctg

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1395

PL 210 435 B1 <210> 58 <211> 702 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 58 atggaaaccc gaaattgtgt ctctcctgca caggctccca ttcagtggca gattttgcag accaaggtgg gatgagcagt agagaggcca agtgtcacag agcaaagcag agctcgcccg cagcgcagct tgacgcagtc ggaccagtgt ggctcctcat gtgggtctgg tctattactg agatcaagcg tgaaatctgg aagtacagtg agcaggacag actacgagaa tcacaaagag tctcttcctc tccaggcacc tagcagcagt ctatggtgca gacagacttc tcagcagtat aactgtggct aactgcctct gaaggtggat caaggacagc acacaaagtc cttcaacagg ctgctactct ctgtctttgt tacttagcct tccagcaggg actctcacca ggcatctcac gcaccatctg gttgtgtgcc aacgccctcc acctacagcc tacgcctgcg ggagagtgtt ggctcccaga ctccagggga ggtaccagca ccactggcat tcagcagact ccttcacttt tcttcatctt tgctgaataa aatcgggtaa tcagcagcac aagtcaccca ag taccaccgga 60 aagagccacc 120 gaaacctggc 180 cccagacagg 240 ggagcctgaa 300 cggcggaggg 360 cccgccatct 420 cttctatccc 480 ctcccaggag 540 cctgacgctg 600 tcagggcctg 660

702 <210> 59 <211> 1392 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 59 atggagtttg gtgcagctgg tgtacagcgt ggcaaggggc gactccgcga caaatgaaca ctgggttact aagggcccat gccctgggct ggcgctctga tccctcagca aacgtagatc gtcgagtgcc ccaaaaccca gacgtgagcc cataatgcca gtcctcaccg aacaaaggcc gaaccacagg ctgacctgcc gggcagccgg ttcctctaca tgctccgtga ccgggtaaat ggctgagctg tggagtctgg ctggattcac tggagtgggt agggccgatt gcctgagagc ttgactactg cggtcttccc gcctggtcaa ccagcggcgt gcgtggtgac acaagcccag caccgtgccc aggacaccct acgaagaccc agacaaagcc ttgtgcacca tcccagcccc tgtacaccct tggtcaaagg agaacaacta gcaagctcac tgcatgaggc ga ggttttcctc gggaggcgtg cttcagtagt ggcagttata caccatctcc cgaggacacg gggccaggga cctggcgccc ggactacttc gcacaccttc cgtgccctcc caacaccaag agcaccacct catgatctcc cgaggtccag acgggaggag ggactggctg catcgagaaa gcccccatcc cttctacccc caagaccaca cgtggacaag tctgcacaac gttgctcttt gtcgagcctg tatggcatgc tggtatgatg agagacaatt gctgtgtatt accctggtca tgctccagga cccgaaccgg ccagctgtcc agcaacttcg gtggacaaga gtggcaggac cggacccctg ttcaactggt cagttcaaca aacggcaagg accatctcca cgggaggaga agcgacatcg cctcccatgc agcaggtggc cactacacgc taagaggtgt ggaggtccct actgggtccg gaagcaataa ccaagaacac actgtgcgag ccgtctcctc gcacctccga tgacggtgtc tacagtcctc gcacccagac cagttgagcg cgtcagtctt aggtcacgtg acgtggacgg gcacgttccg agtacaagtg aaaccaaagg tgaccaagaa ccgtggagtg tggactccga agcaggggaa agaagagcct ccagtgtcag gagactctcc ccaggctcca acactatgca gctgtatctg agccggactg agcctccacc gagcacagcg gtggaactca aggactctac ctacacctgc caaatgttgt cctcttcccc cgtggtggtg cgtggaggtg tgtggtcagc caaggtctcc gcagccccga ccaggtcagc ggagagcaat cggctccttc cgtcttctca ctccctgtct

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1392

<210>	60
<211>	705
<212>	DNA
<213>	Homo
<400>	60

PL 210 435 B1 atggaaaccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120 ctctcctgta gggccagtca aagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 180 ggccaggctc ccaggcccct catctatggt gtatccagca gggccactgg catcccagac 240 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag actggagcct 300 gaagattttg cagtgtatta ctgtcagcag tatggtatct caccattcac tttcggccct 360 gggaccaaag tggatatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 420 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 480 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 540 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 600 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 660 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 705 <210> 61 <211> 1413 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 61 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120 tgtgcagcgt ctggattcac cttcagtagc tatggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180 ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttata tggtatgatg gaagtaataa atactatgca 240 gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag agatccgagg 360 ggagctaccc tttactacta ctactacggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 420 accgtctcct cagcctccac caagggccca tcggtcttcc ccctggcgcc ctgctccagg 480 agcacctccg agagcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg 540 gtgacggtgt cgtggaactc aggcgctctg accagcggcg tgcacacctt cccagctgtc 600 ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcaacttc 660 ggcacccaga cctacacctg caacgtagat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 720 acagttgagc gcaaatgttg tgtcgagtgc ccaccgtgcc cagcaccacc tgtggcagga 780 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 840 gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ccgaggtcca gttcaactgg 900 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cacgggagga gcagttcaac 960 agcacgttcc gtgtggtcag cgtcctcacc gttgtgcacc aggactggct gaacggcaag 1020 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaaggc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1080 aaaaccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 1140 atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc 1200 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac acctcccatg 1260 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1320 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1380 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 1413 <210> 62 <211> 714 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 62 atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgaggtgcc 60 agatgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga 120 gtcaccatca cttgccgggc aagtcagagc attaacagct atttagattg gtatcagcag 180 aaaccaggga aagcccctaa actcctgatc tatgctgcat ccagtttgca aagtggggtc 240 ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg 300 caacctgaag attttgcaac ttactactgt caacagtatt acagtactcc attcactttc 360

PL 210 435 B1 ggccctggga ccaaagtgga aatcaaacga actgtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgtta gtga

420

480

540

600

660

714 <210> 63 <211> 463 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val 1 5

Val Gin Cys Gin Val Gin Leu Val 20

Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser 35 40

Ser Ser His Gly Met His Trp Val 50 55

Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr 65 70

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 85

Thr Leu Phe Leu Gin Met Asn Ser 100

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly His 115 120

Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 130 135

Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser 145 150

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp 165

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr 180

Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr 195 200

Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin 210 215

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 225 230

Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly 10 15

Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin 25 30

Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe 45

Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 60

Asp Gly Arg Asn Lys Tyr Tyr Ala 75 80

Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 90 95

Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 105 110

Phe Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 125

Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 140

Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 155 160

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 170 175

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 185 190

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 205

Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His 220

Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys 235 240

PL 210 435 B1

Val

Glu

Cys

Pro

Pro 245

Cys

Pro

Ala

Pro

Pro 250

Val

Ala

Gly

Pro

Ser 255

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

260

265

270

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

275

280

285

Val

Gin

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

290

295

300

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Phe

Asn

Ser

Thr

Phe

Arg

Val

Val

Ser

305

310

315

320

Val

Leu

Thr

Val

Val

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

325

330

335

Cys

Lys

val

Ser

Asn

Lys

Gly

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

340

345

350

Ser

Lys

Thr

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

355

360

365

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

370

375

380

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

385

390

395

400

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Met

Leu

Asp

Ser

405

410

415

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

420

425

430

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

435

440

445

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

450 455 460 <210> 64 <211> 463 <212> PRT

<213> Homo

sapiens

<400> 64 Met Glu 1

Phe

Gly

Leu 5

Ser

Trp

Val

Phe

Leu 10

Val

Ala

Leu

Leu

Arg 15

Gly

Val

Gin

Cys

Gin 20

Val

Gin

Leu

Val

Glu 25

Ser

Gly

Gly

Gly

Val 30

Val

Gin

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Val

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

40 45

PL 210 435 B1

Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 60

Asp Gly Arg Asn Lys Tyr Tyr Ala 75 80

Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 90 95

Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 105 110

Phe Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 125

Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 140

Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 155 160

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 170 175

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 185 190

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 205

Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His 220

Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys 235 240

Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 250 255

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 265 270

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 285

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 300

Gin Ser Thr Phe Arg Val Val Ser 315 320

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 330 335

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 345 350

Ser Ser His Gly Met His Trp Val 50 55

Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr 65 70

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 85

Thr Leu Phe Leu Gin Met Asn Ser 100

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly His 115 120

Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 130 135

Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser 145 150

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp 165

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr 180

Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr 195 200

Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin 210 215

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 225 230

Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala 245

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 260

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 275 280

Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp 290 295

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe 305 310

Val Leu Thr Val Val His Gin Asp 325

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 340

PL 210 435 B1

Ser

Lys

Thr 355

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg 360

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr 365

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser 370

Arg

Glu

Glu

Met

Thr 375

Lys

Asn

Gin

Val

Ser 380

Leu

Thr

Cys

Leu

Val 385

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro 390

Ser

Asp

Ile

Ala

Val 395

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn 400

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn 405

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr 410

Pro

Pro

Met

Leu

Asp 415

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe 420

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys 425

Leu

Thr

Val

Asp

Lys 430

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin 435

Gly

Asn

Val

Phe

Ser 440

Cys

Ser

Val

Met

His 445

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

450 455 460 <210> 65 <211> 235 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65

Met 1

Glu

Thr

Pro

Ala 5

Gin

Leu

Leu

Phe

Leu 10

Leu

Leu

Leu

Trp

Leu 15

Pro

Asp

Thr

Thr

Gly 20

Glu

Ile

Val

Leu

Thr 25

Gin

Ser

Pro

Gly

Thr 30

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro 35

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr 40

Leu

Ser

Cys

Arg

Ala 45

Ser

Gin

Ser

Ile

Ser 50

Ser

Ser

Phe

Leu

Ala 55

Trp

Tyr

Gin

Gin

Arg 60

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro 65

Arg

Leu

Leu

Ile

Tyr 70

Gly

Ala

Ser

Ser

Arg 75

Ala

Thr

Gly

Ile

Pro 80

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly 85

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr 90

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr 95

Ile

Ser

Arg

Leu

Glu 100

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala 105

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gin 110

Gin

Tyr

Gly

Thr

Ser 115

Pro

Trp

Thr

Phe

Gly 120

Gin

Gly

Thr

Lys

Val 125

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr 130

Val

Ala

Ala

Pro

Ser 135

Val

Phe

Ile

Phe

Pro 140

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

145 150 155 160

PL 210 435 B1

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala 165

Lys

Val

Gin

Trp

Lys 170

Val

Asp

Asn

Ala

Leu 175

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser 180

Gin

Glu

Ser

Val

Thr 185

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys 190

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser 195

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu 200

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala 205

Asp

Tyr

Glu

Lys

His 210

Lys

Val

Tyr

Ala

Cys 215

Glu

Val

Thr

His

Gin 220

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

225 230 235 <210> 66 <211> 464 <212> PRT <213> Homo sapiens <400 66

Met 1

Glu

Phe

Gly

Leu 5

Ser

Trp

Val

Phe

Leu 10

Val

Ala

Leu

Leu

Arg 15

Gly

Val

Gin

Cys

Gin

Val

Gin

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Val

Val

Gin

20

25

30

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Thr

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

35

40

45

Ser

Asn

Tyr

Gly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

50

55

60

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Ser

Asn

Lys

His

Tyr

Gly

65

70

75

80

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

85

90

95

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

100

105

110

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Glu

Arg

Leu

Gly

Ser

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

115

120

125

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

130

135

140

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

145

150

155

160

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

165

170

175

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

180

185

190

PL 210 435 B1

Ala Val Leu Gin Ser 195

Val Pro Ser Ser Asn 210

His Lys Pro Ser Asn 225

Cys Val Glu Cys Pro 245

Val Phe Leu Phe Pro 260

Thr Pro Glu Val Thr 275

Glu Val Gin Phe Asn 290

Lys Thr Lys Pro Arg 305

Ser Val Leu Thr Val 325

Lys Cys Lys Val Ser 340

Ile Ser Lys Thr Lys 355

Pro Pro Ser Arg Glu 370

Leu Val Lys Gly Phe 385

Asn Gly Gin Pro Glu 405

Ser Asp Gly Ser Phe 420

Arg Trp Gin Gin Gly 435

Leu His Asn His Tyr 450

Ser Gly Leu Tyr Ser 200

Phe Gly Thr Gin Thr 215

Thr Lys Val Asp Lys 230

Pro Cys Pro Ala Pro 250

Pro Lys Pro Lys Asp 265

Cys Val Val Val Asp 280

Trp Tyr Val Asp Gly 295

Glu Glu Gin Phe Asn 310

Val His Gin Asp Trp 330

Asn Lys Gly Leu Pro 345

Gly Gin Pro Arg Glu 360

Glu Met Thr Lys Asn 375

Tyr Pro Ser Asp Ile 390

Asn Asn Tyr Lys Thr 410

Phe Leu Tyr Ser Lys 425

Asn Val Phe Ser Cys 440

Thr Gin Lys Ser Leu 455

Leu Ser Ser Val Val 205

Tyr Thr Cys Asn Val 220

Thr Val Glu Arg Lys 235

Pro Val Ala Gly Pro 255

Thr Leu Met Ile Ser 270

Val Ser His Glu Asp 285

Val Glu Val His Asn 300

Ser Thr Phe Arg Val 315

Leu Asn Gly Lys Glu 335

Ala Pro Ile Glu Lys 350

Pro Gin Val Tyr Thr 365

Gin Val Ser Leu Thr 380

Ala Val Glu Trp Glu 395

Thr Pro Pro Met Leu 415

Leu Thr Val Asp Lys 430

Ser Val Met His Glu 445

Ser Leu Ser Pro Gly 460

Thr

Asp

Cys

240

Ser

Arg

Pro

Ala

Val

320

Tyr

Thr

Leu

Cys

Ser

400

Asp

Ser

Ala

Lys

<210>	67
<211>	233
<212>	PRT
<213>	Homo sapiens
<400>	67

PL 210 435 B1

Met 1

Glu

Thr

Pro

Ala 5

Gin

Leu

Leu

Phe

Leu 10

Leu

Leu

Leu

Trp

Leu 15

Pro

Asp

Thr

Thr

Gly

Glu

Ile

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Gly

Thr

Leu

Ser

20

25

30

Leu

Ser

Pro

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Arg

Thr

Ser

Val

Ser

35

40

45

Ser

Ser

Tyr

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

50

55

60

Leu

Leu

Ile

Tyr

Gly

Ala

Ser

Ser

Arg

Ala

Thr

Gly

Ile

Pro

Asp

Arg

65

70

75

80

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Arg

85

90

95

Leu

Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Tyr

Gly

Ile

100

105

110

Ser

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

115

120

125

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

130

135

140

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

145

150

155

160

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

165

170

175

Asn

Ser

Gin

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

180

185

190

Ser

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

195

200

205

Lys

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

210

215

220

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

225 230 <210> 68 <211> 463 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly 15 10 15

Val Gin Cys Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Glu 20 25 30

PL 210 435 B1

Pro

Gly

Arg 35

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser 40

Cys

Thr

Ala

Ser

Gly 45

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser

Tyr

Gly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

50

55

60

Glu

Trp

Val

Ala

val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Ser

Asn

Lys

His

Tyr

Ala

65

70

75

80

Asp

Ser

Ala

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

85

90

95

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

100

105

110

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Ala

Gly

Leu

Leu

Gly

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

115

120

125

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

130

135

140

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

145

150

155

160

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

165

170

175

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

180

185

190

Val

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

195

200

205

Pro

Ser

Ser

Asn

Phe

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

Thr

Cys

Asn

Val

Asp

His

210

215

220

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Thr

Val

Glu

Arg

Lys

Cys

Cys

225

230

235

240

Val

Glu

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Pro

Val

Ala

Gly

Pro

Ser

Val

245

250

255

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

260

265

270

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

275

280

285

Val

Gin

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

290

295

300

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Phe

Asn

Ser

Thr

Phe

Arg

Val

Val

Ser

305

310

315

320

Val

Leu

Thr

Val

Val

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

325

330

335

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Gly

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

PL 210 435 B1

340 345 350

Ser

Lys

Thr 355

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg 360

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr 365

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser 370

Arg

Glu

Glu

Met

Thr 375

Lys

Asn

Gin

Val

Ser 380

Leu

Thr

Cys

Leu

Val 385

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro 390

Ser

Asp

Ile

Ala

Val 395

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn 400

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn 405

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr 410

Pro

Pro

Met

Leu

Asp 415

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe 420

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys 425

Leu

Thr

Val

Asp

Lys 430

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin 435

Gly

Asn

val

Phe

Ser 440

Cys

Ser

Val

Met

His 445

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

450 455 460 <210> 69 <211> 234 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 69

Met 1

Glu

Thr

Pro

Ala 5

Gin

Leu

Leu

Phe

Leu 10

Leu

Leu

Leu

Trp

Leu 15

Pro

Asp

Thr

Thr

Gly 20

Glu

Ile

Val

Leu

Thr 25

Gin

Ser

Pro

Gly

Thr 30

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro 35

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr 40

Leu

Ser

Cys

Arg

Ala 45

Ser

Gin

Ser

Val

Ser 50

Ser

Tyr

Leu

Ala

Trp 55

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro 60

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg 65

Pro

Leu

Ile

Tyr

Gly 70

Val

Ser

Ser

Arg

Ala 75

Thr

Gly

Ile

Pro

Asp 80

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser 85

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp 90

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile 95

Ser

Arg

Leu

Glu

Pro 100

Glu

Asp

Phe

Ala

Val 105

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin 110

Tyr

Gly

Ile

Ser

Pro 115

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro 120

Gly

Thr

Lys

Val

Asp 125

Ile

Lys

Arg

Thr

Val 130

Ala

Ala

Pro

Ser

Val 135

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro 140

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

PL 210 435 B1

145

Pro Arg Glu Ala

Gly Asn Ser Gin 180

Tyr Ser Leu Ser 195

His Lys Val Tyr 210

Val Thr Lys Ser 225

150

Lys Val Gin Trp 165

Glu Ser Val Thr

Ser Thr Leu Thr 200

Ala Cys Glu Val 215

Phe Asn Arg Gly 230

155

Lys Val Asp Asn 170

Glu Gin Asp Ser 185

Leu Ser Lys Ala

Thr His Gin Gly 220

Glu Cys

160

Ala Leu Gin Ser 175

Lys Asp Ser Thr 190

Asp Tyr Glu Lys 205

Leu Ser Ser Pro <210> 70 <211> 451 <212> PRT <213> Homo sapie <400> 70

Gin Val Gin Leu

Ser Leu Arg Leu 20

Gly Met His Trp 35

Ala Val Ile Trp 50

Lys Gly Arg Phe 65

Leu Gin Met Asn

Ala Arg Asp Pro 100

Asp Val Trp Gly 115

Lys Gly Pro Ser 130

Glu Ser Thr Ala 145

Pro Val Thr Val

Thr Phe Pro Ala ns

Val Glu Ser Gly 5

Ser Cys Ala Ala

Val Arg Gin Ala 40

Tyr Asp Gly Ser 55

Thr Ile Ser Arg 70

Ser Leu Arg Ala 85

Arg Gly Ala Thr

Gin Gly Thr Thr 120

Val Phe Pro Leu 135

Ala Leu Gly Cys 150

Ser Trp Asn Ser 165

Val Leu Gin Ser

Gly Gly Val Val 10

Ser Gly Phe Thr 25

Pro Gly Lys Gly

Asn Lys Tyr Tyr 60

Asp Asn Ser Lys 75

Glu Asp Thr Ala 90

Leu Tyr Tyr Tyr 105

Val Thr Val Ser

Ala Pro Cys Ser 140

Leu Val Lys Asp 155

Gly Ala Leu Thr 170

Ser Gly Leu Tyr

Gin Pro Gly Arg 15

Phe Ser Ser Tyr 30

Leu Glu Trp Val 45

Ala Asp Ser Val

Asn Thr Leu Tyr 80

Val Tyr Tyr Cys 95

Tyr Tyr Gly Met 110

Ser Ala Ser Thr 125

Arg Ser Thr Ser

Tyr Phe Pro Glu 160

Ser Gly Val His 175

Ser Leu Ser Ser

PL 210 435 B1

180

Val Val Thr Val Pro 195

Asn Val Asp His Lys 210

Arg Lys Cys Cys Val 225

Gly Pro Ser Val Phe 245

Ile Ser Arg Thr Pro 260

Glu Asp Pro Glu Val 275

His Asn Ala Lys Thr 290

Arg Val Val Ser Val 305

Lys Glu Tyr Lys Cys 325

Glu Lys Thr Ile Ser 340

Tyr Thr Leu Pro Pro 355

Leu Thr Cys Leu Val 370

Trp Glu Ser Asn Gly 385

Met Leu Asp Ser Asp 405

Asp Lys Ser Arg Trp 420

His Glu Ala Leu His 435

Pro Gly Lys 450

185 190

Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr Tyr Thr Cys 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu 215 220

Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 265 270

Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe 295 300

Leu Thr Val Val His Gin Asp Trp Leu Asn Gly 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile 330 335

Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val 345 350

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 375 380

Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 410 415

Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 425 430

Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser 440 445 <210> 71 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens

PL 210 435 B1 <400 71

Asp 1

Ile

Gin

Met

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Ile

Asn

Ser

Tyr

20

25

30

Leu

Asp

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Ala

Ala

Ser

Ser

Leu

Gin

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Tyr

Tyr

Ser

Thr

Pro

Phe

85

90

95

Thr

Phe

Gly

Pro

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

100

105

110

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

115

120

125

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

130

135

140

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

145

150

155

160

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

165

170

175

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

180

185

190

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

195

200

205

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

210 <210> 72 <211> 89 <212> PRT

<213> Homo

sapiens

<400> 72 Gly Val 1

Val

Gin

Pro 5

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg 10

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala 15

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe 20

Ser

Ser

Tyr

Gly

Met 25

His

Trp

Val

Arg

Gin 30

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Ser

Asn

PL 210 435 B1

40 45

Lys

Tyr 50

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val 55

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr 60

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn 65

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu 70

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn 75

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu 80

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

<210> 73 <211> 169 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 73

Gly 1

Val

Val

Gin

Pro 5

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg 10

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala 15

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser

Tyr

Gly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

20

25

30

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Ser

Asn

35

40

45

Lys

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

50

55

60

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

65

70

75

80

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Ala

Arg

Ile

Ile

Thr

Pro

85

90

95

Cys

Met

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

100

105

110

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

115

120

125

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

130

135

140

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

145

150

155

160

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

165

<210>	74
<211>	167
<212>	PRT
<213>	Homo sapiens
<400>	74

PL 210 435 B1

Gly 1

Val

Val

Gin

Pro 5

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg 10

Leu

Ser

Cys

Val

Ala 15

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe 20

Ser

Ser

His

Gly

Met 25

His

Trp

Val

Arg

Gin 30

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly 35

Leu

Glu

Trp

val

Ala 40

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp 45

Gly

Arg

Asn

Lys

Tyr 50

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val 55

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr 60

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn 65

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu 70

Phe

Leu

Gin

Met

Asn 75

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu 80

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr 85

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly 90

Gly

His

Phe

Gly

Pro 95

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly 100

Gin

Gly

Thr

Leu

Val 105

Thr

Val

Ser

Ser

Ala 110

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro 115

Ser

Val

Phe

Pro

Leu 120

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg 125

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser 130

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly 135

Cys

Leu

Val

Lys

Asp 140

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

145 150 155 160

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin 165 <210> 75 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 75

Gly Val Val Gin Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser 15 10 15

Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro 20 25 30

Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn 35 40 45

Lys His Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp 50 55 60

Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu

70 75 80

Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Glu Arg Leu Gly Ser Tyr

90 95

PL 210 435 B1

Phe

Asp

Tyr

Trp 100

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu 105

Val

Thr

Val

Ser

Ser 110

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly 115

Pro

Ser

Val

Phe

Pro 120

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser 125

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu 130

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu 135

Gly

Cys

Leu

Val

Lys 140

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu 145

Pro

Val

Thr

Val

Ser 150

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala 155

Leu

Thr

Ser

Gly

Val 160

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

165 <210> 76 <211> 167 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 76

Gly 1

Val

Val

Gin

Pro 5

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg 10

Leu

Ser

Cys

Val

Ala 15

Ser

Gly

Phe

Ile

Phe 20

Ser

Ser

His

Gly

Ile 25

His

Trp

Val

Arg

Gin 30

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly 35

Leu

Glu

Trp

Val

Ala 40

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp 45

Gly

Arg

Asn

Lys

Asp 50

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val 55

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr 60

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn 65

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu 70

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn 75

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu 80

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr 85

Tyr

Cys

Ala

Arg

Val 90

Ala

Pro

Leu

Gly

Pro 95

Leu

Asp

Tyr

Trp

Gly 100

Gin

Gly

Thr

Leu

Val 105

Thr

Val

Ser

Ser

Ala 110

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro 115

Ser

Val

Phe

Pro

Leu 120

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg 125

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser 130

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly 135

Cys

Leu

Val

Lys

Asp 140

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

145 150 155 160

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin 165 <210> 77 <211> 153

PL 210 435 B1

<212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 77 Pro Gly 1	Arg	Ser	Leu 5	Arg	Leu	Ser
Ser	Ser	His	Gly 20	Ile	His	Trp	Val
Glu	Trp	Val 35	Ala	Val	Ile	Trp	Tyr 40
Asp	Ser 50	Val	Lys	Gly	Arg	Phe 55	Thr
Thr 65	Leu	Tyr	Leu	Gin	Met 70	Asn	Ser
Tyr	Tyr	Cys	Ala	Arg 85	Val	Ala	Pro
Gin	Gly	Thr	Leu 100	Val	Thr	Val	Ser
Val	Phe	Pro 115	Leu	Ala	Pro	Cys	Ser 120
Ala	Leu 130	Gly	Cys	Leu	Val	Lys 135	Asp
Ser	Trp	Asn	Ser	Gly	Ala	Leu	Thr

145 150

Cys	Ala 10	Ala	Ser	Gly	Phe	Thr 15	Phe
Arg 25	Gin	Ala	Pro	Gly	Lys 30	Gly	Leu
Asp	Gly	Arg	Asn	Lys 45	Asp	Tyr	Ala
Ile	Ser	Arg	Asp	Asn	Ser	Lys	Asn

Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 75 80

Leu Gly Pro Leu Asp Tyr Trp Gly 90 95

Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 105 HO

Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 125

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 140

Ser <210> 78 <211> 163 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78

Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser 1 5

Ser Ser His Gly Ile His Trp Val 20

Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr 35 40

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 50 55

Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser 65 10

Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Ala Pro 85

Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 10 15

Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 25 30

Asp Gly Arg Asn Lys Asp Tyr Ala 45

Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys 60

Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 75 80

Leu Gly Pro Leu Asp Tyr Trp Gly 90 95

PL 210 435 B1

Gin

Gly

Thr

Leu 100

Val

Thr

Val

Ser

Ser 105

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly 110

Pro

Ser

Val

Phe

Pro 115

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser 120

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu 125

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu 130

Gly

Cys

Leu

Val

Lys 135

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu 140

Pro

Val

Thr

Val

Ser 145

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala 150

Leu

Thr

Ser

Gly

Val 155

His

Thr

Phe

Pro

Ala 160

Val Leu Gin <210> 79 <211> 138 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 79

Arg

Leu

Ser

Cys

Thr 15

Ala

Gly 1

Gly

Val

Val

Glu 5

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu 10

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser

Tyr

Gly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

20

25

30

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Ser

35

40

45

Asn

Lys

His

Tyr

Ala

Asp

Ser

Ala

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

50

55

60

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

65

70

75

80

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Ala

Gly

Leu

Leu

Gly

Tyr

85

90

95

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

100

105

110

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

115

120

125

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

130 135 <210> 80 <211> 167 <212> PRT

<213> Homo sapiens
<400> 80
Gly Val Val Gin Pro Gly Arg Ser	Leu Arg Leu	Ser Cys Ala Ala Ser
1 5	10	15

PL 210 435 B1

Gly

Phe

Thr

Phe 20

Ser

Ser

Tyr

Gly

Met 25

His

Trp

Val

Arg

Gin 30

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly 35

Leu

Glu

Trp

Val

Ala 40

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp 45

Gly

Ser

Asn

Lys

Tyr 50

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val 55

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr 60

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn 65

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu 70

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn 75

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu 80

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr 85

Tyr

Cys

Ala

Arg

Asp 90

Pro

Arg

Gly

Ala

Thr 95

Leu

Tyr

Tyr

Tyr

Tyr 100

Tyr

Gly

Met

Asp

val 105

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr 110

Thr

Val

Thr

Val

Ser 115

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys 120

Gly

Pro

Ser

Val

Phe 125

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys 130

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser 135

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala 140

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His 165 <210 81 <211> 150 <212> PRT <213> Homo sapiens <400 81

Gly Val Val Gin Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 15 10 15

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro 20 25 30

Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser His 35 40 45

Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp 50 55 60

Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu 65 70 75 80

Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ala Val Val Val Pro Ala 85 90 95

Ala Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala 100 105 110

PL 210 435 B1

Ser

Thr

Lys 115

Gly

Pro

Ser

Val

Phe 120

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys 125

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

130

135

140

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

145 150 <210> 82 <211> 146 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 82

Val Val Gin Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 15 10 15

Phe Thr Phe Ser Ser Cys Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly 20 25 30

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Ser Asp Gly Ser His Lys 35 40 45

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 50 55 60

Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

70 75 80

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Met Ile Val Val Gly Thr

90 95

Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 100 105 HO

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr 115 120 125

Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 130 135 140

Glu Pro 145 <210> 83 <211> 171 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 83

Gly Val Val Gin Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 15 10 15

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gin Ala Pro

PL 210 435 B1

Gly Lys Gly Leu Glu 35

Lys Tyr Tyr Ala Asp 50

Asn Ser Lys Ser Thr 65

Asp Thr Ala Val Tyr 85

Ser Gly Arg Gly Gly 100

Val Ser Ser Ala Ser 115

Cys Ser Arg Ser Thr 130

Lys Asp Tyr Phe Pro 145

Leu Thr Ser Gly Val 165

Trp Val Ala Val Ile 40

Ser Val Lys Gly Arg 55

Leu Tyr Leu Gin Met 70

Tyr Cys Ala Arg Asp 90

Met Asp Val Trp Gly 105

Thr Lys Gly Pro Ser 120

Ser Glu Ser Thr Ala 135

Glu Pro Val Thr Val 150

His Thr Phe Pro Ala 170

Trp Tyr Asp Gly Ser 45

Phe Thr Ile Ser Arg 60

Asn Ser Leu Arg Ala 75

Ser Tyr Tyr Asp Phe 95

Gin Gly Thr Thr Val ^J 110

Val Phe Pro Leu Ala 125

Ala Leu Gly Cys Leu 140

Ser Trp Asn Ser Gly 155

Val

Asn

Asp

Glu

Trp

Thr

Pro

Val

Ala

160 <210> 84 <211> 163 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 84

Val Gin Pro Gly Arg 1 5

Thr Phe Ser Asn Tyr 20

Gly Leu Glu Trp Val 35

Tyr Ala Glu Ser Val 50

Lys Asn Thr Leu Tyr 65

Ala Val Tyr Tyr Cys 85

Phe Asp Phe Trp Gly 100

Thr Lys Gly Pro Ser

Ser Leu Arg Leu Ser 10

Ala Met His Trp Val 25

Val Val Ile Trp His 40

Lys Gly Arg Phe Thr 55

Leu Gin Met Asn Ser 70

Ala Arg Asp Gin Gly 90

Gin Gly Thr Leu Val 105

Val Phe Pro Leu Ala

Cys Ala Ala Ser Gly 15

Arg Gin Ala Pro Gly 30

Asp Gly Asn Asn Lys 45

Ile Ser Arg Asp Asn 60

Leu Arg Ala Glu Asp 75

Thr Gly Trp Tyr Gly 95

Thr Val Ser Ser Ala 110

Pro Cys Ser Arg Ser

Phe

Lys

Tyr

Ser

Thr

Gly

Ser

Thr

PL 210 435 B1

115

120

125

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

130

135

140

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

145

150

155

160

His Thr Phe <210> 85 <211> 76 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 85

Tyr

Tyr

Trp

Ser

Trp 15

Ile

Val 1

Ser

Gly

Gly

Ser 5

Ile

Ser

Ser

Gly

Gly 10

Arg

Gin

His

Pro 20

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu 25

Trp

Ile

Gly

Tyr

Ile 30

Tyr

Tyr

Ser

Gly

Ser 35

Thr

Tyr

Tyr

Asn

Pro 40

Ser

Leu

Lys

Ser

Arg 45

Val

Thr

Ile

Ser

Val 50

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn 55

Gin

Phe

Ser

Leu

Lys 60

Leu

Ser

Ser

Val

Thr

Ala

Ala

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

70 75 <210> 86 <211> 172 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 86

Gly

Leu 5

Val

Lys

Pro

Ser

Gin 10

Ile

Leu

Ser

Leu

Thr 15

Cys

Ser 1

Gly

Pro

Thr

Val

Ser

Gly 20

Gly

Ser

Ile

Ser

Ser 25

Gly

Gly

His

Tyr

Trp 30

Ser

Trp

Ile

Arg

Gin 35

His

Pro

Gly

Lys

Gly 40

Leu

Glu

Trp

Ile

Gly 45

Tyr

Ile

Tyr

Tyr

Ile 50

Gly

Asn

Thr

Tyr

Tyr 55

Asn

Pro

Ser

Leu

Lys 60

Ser

Arg

Val

Thr

Ile 65

Ser

Val

Asp

Thr

Ser 70

Lys

Asn

Gin

Phe

Ser 75

Leu

Lys

Leu

Ser

Ser 80

Val

Thr

Ala

Ala

Asp 85

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr 90

Cys

Ala

Arg

Asp

Ser 95

Gly

Asp

Tyr

Tyr

Gly

Ile

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

PL 210 435 B1

100

105

110

Ser Ser Ala 115

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro 120

Ser

Val

Phe

Pro

Leu 125

Ala

Pro

Cys

Ser Arg Ser 130

Thr

Ser

Glu

Ser 135

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly 140

Cys

Leu

Val

Lys

Asp Tyr Phe 145

Pro

Glu

Pro 150

Val

Thr

Val

Ser

Trp 155

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu 160

Thr Ser Gly

Val

His 165

Thr

Phe

Pro

Ala

Val 170

Leu

Gin

<210 87 <211> 96 <212> PRT

<213> Homo

sapiens

<400> 87 Glu Ile Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Gly

Thr

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45

Ile Tyr Gly 50

Ala

Ser

Ser

Arg 55

Ala

Thr

Gly

Ile

Pro 60

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly Ser Gly 65

Ser

Gly

Thr 70

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr 75

Ile

Ser

Arg

Leu

Glu 80

Pro Glu Asp

Phe

Ala 85

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gin 90

Gin

Tyr

Gly

Ser

Ser 95

Pro

<210> 88 <211> 141 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 88 Gin Ser Pro 1

Gly

Thr 5

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro 10

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr 15

Leu

Ser Cys Arg

Ala 20

Ser

Gin

Ser

Ile

Ser 25

Ser

Ser

Phe

Leu

Ala 30

Trp

Tyr

Gin Gin Arg 35

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro 40

Arg

Leu

Leu

Ile

Tyr 45

Gly

Ala

Ser

Ser Arg Ala 50

Thr

Gly

Ile

Pro 55

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly 60

Ser

Gly

Ser

Gly

100

PL 210 435 B1

Thr 65

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr 70

Ile

Ser

Arg

Leu

Glu 75

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala 80

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gin 85

Gin

Tyr

Gly

Thr

Ser 90

Pro

Trp

Thr

Phe

Gly 95

Gin

Gly

Thr

Lys

Val 100

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr 105

Val

Ala

Ala

Pro

Ser 110

Val

Phe

Ile

Phe

Pro 115

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin 120

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr 125

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

130 135 140 <210> 89 <211> 141 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 89

Gin 1

Ser

Pro

Gly

Thr 5

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro 10

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr 15

Leu

Ser

Cys

Arg

Thr

Ser

Val

Ser

Ser

Ser

Tyr

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Gin

20

25

30

Lys

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

Leu

Leu

Ile

Tyr

Gly

Ala

Ser

Ser

Arg

35

40

45

Ala

Thr

Gly

Ile

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

50

55

60

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Arg

Leu

Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

65

70

75

80

Tyr

Cys

Gin

Gin

Tyr

Gly

Ile

Ser

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

85

90

95

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

100

105

110

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

115

120

125

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

130 135 140 <210> 90 <211> 139 <212> PRT

<213> Homo sapiens
<400> 90
Gly Thr Leu Ser Leu Ser	Pro Gly Glu Arg Ala Thr	Leu Ser Cys Arg
1 5	10	15

PL 210 435 B1

101

Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro 20 25 30

Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 35 40 45

Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 50 55 60

Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 65 70 75 80

Gin Gin Tyr Gly Arg Ser Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val 85 90 95

Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 100 105 110

Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 115 120 125

Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin 130 135 <210> 91 <211> 142 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 91

Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu 15 10 15

Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin 20 25 30

Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Pro Leu Ile Tyr Gly Val Ser Ser 35 40 45

Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 50 55 60

Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val 65 70 75 80

Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Ile Ser Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly 85 90 95

Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile 100 105 110

Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val 115 120 125

Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin 130 135 140

102

PL 210 435 B1 <210> 92 <211> 142 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 92

Gly 10

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu 15

Ser

Ser 1

Pro

Gly

Thr

Leu 5

Ser

Leu

Ser

Pro

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Ile

Ser

Ser

Asn

Phe

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

20

25

30

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

Leu

Leu

Ile

Tyr

Arg

Pro

Ser

Ser

35

40

45

Arg

Ala

Thr

Gly

Ile

Pro

Asp

Ser

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

50

55

60

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Arg

Leu

Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Leu

65

70

75

80

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Tyr

Gly

Thr

Ser

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

Gly

85

90

95

Thr

Lys

Val

Asp

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

100

105

110

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

115

120

125

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

130

135

140

<210> 93 <211> 146 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 93

Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu 15 10 15

Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin 20 25 30

Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser 35 40 45

Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 50 55 60

Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val 65 70 75 80

Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Arg Ser Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly

PL 210 435 B1

103

85

90

95

Thr

Lys

Val

Asp 100

Ile

Lys

Arg

Thr

Val 105

Ala

Ala

Pro

Ser

Val 110

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro 115

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu 120

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala 125

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

130 135 140

Gly Gly 145 <210> 94 <211> 95 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 94 Asp Ile Gin 1

Met

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp Arg Val

Thr 20

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala 25

Ser

Gin

Ser

Ile

Ser 30

Ser

Tyr

Leu Asn Trp 35

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro 40

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys 45

Leu

Leu

Ile

Tyr Ala Ala 50

Ser

Ser

Leu

Gin 55

Ser

Gly

Val

Pro

Ser 60

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser Gly Ser 65

Gly

Thr

Asp 70

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile 75

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro 80

Glu Asp Phe

Ala

Thr 85

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin 90

Ser

Tyr

Ser

Thr

Pro 95

<210> 95 <211> 152 <212> PRT <213> Homo

sapiens

<400> 95 Gin Ser Pro 1

Ser

Ser 5

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 10

Gly

Asp

Arg

Val

Thr 15

Ile

Thr Cys Arg

Ala 20

Ser

Gin

Ser

Ile

Asn 25

Thr

Tyr

Leu

Ile

Trp 30

Tyr

Gin

Gin Lys Pro 35

Gly

Lys

Ala

Pro

Asn 40

Phe

Leu

Ile

Ser

Ala 45

Thr

Ser

Ile

Leu Gin Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Arg

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

55 60

104

PL 210 435 B1

Asn 65

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile 70

Asn

Ser

Leu

His

Pro 75

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr 80

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin 85

Ser

Tyr

Ser

Thr

Pro 90

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro 95

Gly

Thr

Lys

Val

Asp 100

Ile

Lys

Arg

Thr

Val 105

Ala

Ala

Pro

Ser

Val 110

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro 115

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu 120

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala 125

Ser

Val

Val

Cys

Leu 130

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr 135

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys 140

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

145 150 <210> 96 <211> 139 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 96

Pro 1

Ser

Ser

Leu

Ser 5

Ala

Ser

Val

Gly

Asp 10

Arg

Val

Thr

Ile

Thr 15

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Ile

Asn

Ser

Tyr

Leu

Asp

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

20

25

30

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Ser

Leu

Gin

35

40

45

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

50

55

60

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

65

70

75

80

Cys

Gin

Gin

Tyr

Tyr

Ser

Thr

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

Gly

Thr

Lys

85

90

95

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

100

105

110

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

115

120

125

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

130

135

<210> 97 <211> 134 <212> PRT <213> Homo sapiens

PL 210 435 B1

105

<400 97

Thr 1

Gin

Ser

Pro

Ser 5

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser 10

Val

Gly

Asp

Arg

Val 15

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Asn

Ile

Ser

Arg

Tyr

Leu

Asn

Trp

Tyr

20

25

30

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Phe

Leu

Ile

Tyr

Val

Ala

Ser

35

40

45

Ile

Leu

Gin

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Gly

Phe

Ser

Ala

Ser

Gly

Ser

Gly

50

55

60

Pro

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

65

70

75

80

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

Tyr

Ser

Thr

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

85

90

95

Gly

Thr

Lys

Val

Asp

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

val

Phe

100

105

110

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

115

120

125

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

130 <210> 98 <211> 150 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 98

Thr 1

Gin

Ser

Pro

Ser 5

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser 10

val

Gly

Asp

Arg

Val 15

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg 20

Ala

Ser

Gin

Ser

Ile 25

Cys

Asn

Tyr

Leu

Asn 30

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys 35

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro 40

Arg

Val

Leu

Ile

Tyr 45

Ala

Al a

Ser

Ser

Leu 50

Gin

Gly

Gly

Val

Pro 55

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly 60

Ser

Gly

Ser

Gly

Ile 65

Asp

Cys

Thr

Leu

Thr 70

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin 75

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala 80

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin 85

Gin

Ser

Tyr

Ile

Thr 90

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly 95

Pro

Gly

Thr

Arg

Val 100

Asp

Ile

Glu

Arg

Thr 105

Val

Ala

Ala

Pro

Ser 110

val

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

115 120 125

106

PL 210 435 B1

Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp 130 135 140

Lys Val Asp Asn Ala Tyr

145 150 <210> 99 <211> 96 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 99

Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Asp Phe Gin Ser Val Thr Pro Lys 15 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile Gly Ser Ser 20 25 30

Leu His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Asp Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Gin Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala

70 75 80

Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gin Ser Ser Ser Leu Pro Gin

90 95 <210> 100 <211> 364 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 100

Met Gly Val Leu Leu 1 5

Leu Leu Phe Pro Ser 20

Ala Val Val Leu Ala 35

Tyr Ala Ser Pro Gly 50

Gin Ala Asp Ser Gin 65

Gly Asn Glu Leu Thr 85

Thr Gin Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala 10 15

Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gin Pro 25 30

Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu 40 45

Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg 55 60

Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met 70 75 80

Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser 90 95

Ser Gly Asn Gin Val Asn Leu Thr Ile Gin Gly Leu Arg Ala Met Asp

PL 210 435 B1

107

Tyr

Glu

Phe

160

Val

Phe

Pro

Thr

Val

240

Ala

Arg

Gly

Pro

Ser

320

Gin

His

108

PL 210 435 B1

10 <210> 102 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 102

Met His Val Ala Gin Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile 15 10 15

Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val 20 25 30

Arg Val Thr Val Leu Arg Gin Ala Asp Ser Gin Val Thr Glu Val Cys 35 40 45

Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser 50 55 60

Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gin Val Asn Leu Thr Ile Gin

70 75 80

Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu

90 95

Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gin Ile 100 105 110

Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys 115 120 <210> 103 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 103

Met His Val Ala Gin Pro Ala Val Val Leu Ala 15 10 <210> 104 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Seąuence <220>

<223> Description of Artificial Seąuence: Primer <220>

<221> modyfikowana zasada <222> (21) <223> i <400> 104

PL 210 435 B1

109 caggtgcagc tggagcagtc ngg <210> 105 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Seąuence <220>

<223> Description of Artificial Seąuence: Primer <400> 105 gctgagggag tagagtcctg agga <210> 106 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Seąuence <220>

<223> Description of Artificial Seąuence: Primer <400> 106 tatctaagct tctagactcg accgccacca tggagtttgg gctgagctg <210> 107 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Seąuence <220>

<223> Description of Artificial Seąuence: Primer <400> 107 ttctctgatc agaattccta tcatttaccc ggagacaggg agagct <210> 108 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Seąuence <220>

<223> Description of Artificial Seąuence: Optimal Kozak seąuence <400> 108 accgccacc <210> 109 <211> 45 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 109 tcttcaagct tgcccgggcc cgccaccatg gaaaccccag cgcag

110

PL 210 435 B1 <210> 110 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Seąuence <220>

<223> Description of Artificial Seąuence: Primer <400> 110 ttctttgatc agaattctca ctaacactct cccctgttga age <210> 111 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Seąuence <220>

<223> Description of Artificial Seąuence: Primer <400> 111 tcttcaagct tgcccgggcc cgccaccatg gacatgaggg tccccgct <210> 112 <211> 155 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 112

Ser 1

Pro

Asp

Phe

Gin 5

Ser

Val

Thr

Pro

Lys 10

Glu

Lys

Val

Thr

Ile 15

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser 20

Gin

Ser

Ile

Gly

Ser 25

Ser

Leu

His

Trp

Tyr 30

Gin

Gin

Lys

Pro

Asp

Gin

Ser

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

Lys

Tyr

Ala

Ser

Gin

Ser

40 45

Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 50 55 60

Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr 65 70 75 80

Tyr Cys His Gin Ser Ser Ser Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr 85 90 95

Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe 100 105 HO

Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys 115 120 125

Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val 130 135 140

PL 210 435 B1

111

Asp Asn Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

145

150

155

<210> 113

<211> 100

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 113

Asp Val Val

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Leu

Ser

Leu

Pro

Val

Thr

Leu

Gly

1

5

10

15

Gin Pro Ala

Ser

Ile

Ser

Cys

Arg

Ser

Ser

Gin

Ser

Leu

Val

Tyr

Ser

20

25

30

Asp Gly Asn

Thr

Tyr

Leu

Asn

Trp

Phe

Gin

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin

Ser

35

40

45

Pro Arg Arg

Leu

Ile

Tyr

Lys

Val

Ser

Asn

Arg

Asp

Ser

Gly

Val

Pro

50

55

60

Asp Arg Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Lys

Ile

65

70

75

80

Ser Arg Val

Glu

Ala

Glu

Asp

Val

Gly

Val

Tyr

Tyr

Cys

Met

Gin

Gly

85

90

95

Thr His Trp

Pro

100 <210> 114 <211> 139 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 114

Pro 1

Leu

Ser

Leu

Pro 5

Val

Thr

Leu

Gly

Gin 10

Pro

Ala

Ser

Ile

Ser 15

Cys

Arg

Ser

Ser

Gin 20

Ser

Leu

Val

Tyr

Ser 25

Asp

Gly

Asn

Thr

Tyr 30

Leu

Asn

Trp

Phe

Gin 35

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin 40

Ser

Pro

Arg

Arg

Leu 45

Ile

Tyr

Lys

Val

Ser 50

Asn

Trp

Asp

Ser

Gly 55

Val

Pro

Asp

Arg

Phe 60

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser 65

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr 70

Leu

Lys

Ile

Ser

Arg 75

Val

Glu

Ala

Glu

Asp 80

Val

Gly

Val

Tyr

Tyr 85

Cys

Met

Gin

Gly

Ser 90

His

Trp

Pro

Pro

Thr 95

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

112

PL 210 435 B1

100

105

110

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu Lys

Ser

Gly Thr Ala

115

120

125

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

130 135 <210> 115 <211> 100 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400 115

Leu

Ser 10

Leu

Pro

Val

Thr

Pro 15

Gly

Asp 1

Ile

Val

Met

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Glu

Pro

Ala

Ser 20

Ile

Ser

Cys

Arg

Ser 25

Ser

Gin

Ser

Leu

Leu 30

His

Ser

Asn

Gly

Tyr 35

Asn

Tyr

Leu

Asp

Trp 40

Tyr

Leu

Gin

Lys

Pro 45

Gly

Gin

Ser

Pro

Gin 50

Leu

Leu

Ile

Tyr

Leu 55

Gly

Ser

Asn

Arg

Ala 60

Ser

Gly

Val

Pro

Asp 65

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser 70

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp 75

Phe

Thr

Leu

Lys

Ile 80

Ser

Arg

Val

Glu

Ala

Glu

Asp

Val

Gly

Val

Tyr

Tyr

Cys

Met

Gin

Ala

90 95

Leu Gin Thr Pro 100 <210> 116 <211> 133 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 116

Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Leu 15 10 15

His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly 20 25 30

Gin Ser Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly 35 40 45

Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 50 55 60

Lys Leu Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met 65 70 75 80

PL 210 435 B1

113

Gin

Ala

Leu

Gin

Thr

Pro

Leu

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

85

90

95

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

100

105

110

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

115

120

125

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

130 <210 117 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <40 0 117

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr 20 <210 118 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 118

Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr 20 <210 119 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400 119

Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr 20

<210	120
<211>	20
<212>	PRT
<213>	Homo sapiens
<400>	120

114

PL 210 435 B1

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr 20 <210> 121 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 121

Thr Gly Glu Phe Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser 15 10 15

Pro Gly Glu Arg 20 <210> 122 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 122

Glu Phe Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr 20 <210> 123 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 123

Glu Tle Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr 20 <210> 124 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 124

Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr 20

PL 210 435 B1

115 <210> 125 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400 125

Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr 20 <210> 126 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 126

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser 20 <210 127 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 127

Pro Glu Val Gin Phe 1 5 <210> 128 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 128

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser 20 <210> 129 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400 129

Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp 15 10

116

PL 210 435 B1 <210 130 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 130

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu <210> 131 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 131

Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr 1 5 <210> 132 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 132

Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu 20 <210> 133 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 133

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser 20 <210> 134 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 134

Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp 15 10

PL 210 435 B1

117 <210> 135 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 135

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser 20 <210 136 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 136

Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val 1 5 <210> 137 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 137

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser 20 <210 138 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400 138

Pro Glu Val Gin Phe Asn 1 5 <210 139 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 139

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Glu Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser

118

PL 210 435 B1

<210	140
<211>	10
<212>	PRT
<213>	Homo	sapiens
<400>	140
Pro Glu Val	Gin Phe

<210> 141 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 141

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro 1 5 <210 142 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 142

Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro 1 5 <210 143 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400 143

Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro 1 5 <210> 144 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400 144

Thr Gly Glu Phe Val Leu Thr Gin Ser Pro 15 10 <210> 145 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens

PL 210 435 B1

119 <400> 145

Glu Phe Val Leu Thr Gin Ser Pro 1 5 <210> 146 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 146

Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro 1 5 <210> 147 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 147

Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro

Claims (16)

1. Ludzkie przeciwciało monoklonalne wiążące się z antygenem 4 cytotoksycznych limfocytów T (CTLA-4), lub jego wiążący antygen fragment, przy czym przeciwciało to obejmuje:

a) łańcuch ciężki obejmujący sekwencję aminokwasową z SEK. NR ID.: 9 lub sekwencję aminokwasową co najmniej w 90% z nią identyczną; oraz

b) łańcuch lekki obejmujący sekwencję aminokwasową z SEK. NR ID.: 22 lub sekwencję aminokwasową co najmniej w 90% z nią identyczną;

przy czym przeciwciało lub fragment ma powinowactwo wiązania wobec CTLA-4 wynoszące 10 ^-9 M lub większe, oraz przeciwciało lub fragment hamują wiązanie pomiędzy CTLA-4 i B7-1 z IC50 wynoszącym 100 nM lub niższym oraz obniżają lub hamują wiązanie pomiędzy CTLA-4 i B7-2 z IC50100 nM lub niższym.

2. Przeciwciało lub fragment według zastrz. 1, znamienne tym, że:

a) łańcuch lekki obejmuje sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha lekkiego przeciwciała 11.2.1 jak przedstawiono na Fig. 5; lub b) łańcuch ciężki obejmuje sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 lub CDR3 przeciwciała

11.2.1 jak przedstawiono na Fig. 2.

3. Przeciwciało lub fragment według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało zawiera sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha ciężkiego przeciwciała 11.2.1 jak przedstawiono na Fig. 2 i sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha lekkiego przeciwciała 11.2.1 jak przedstawiono na Fig. 5.

4. Przeciwciało lub fragment według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało zawiera sekwencję aminokwasową domeny zmiennej łańcucha ciężkiego przeciwciała 11.2.1 (nr dostępu ATCC PTA-5169).

5. Przeciwciało lub fragment według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało zawiera sekwencję aminokwasową domeny zmiennej łańcucha lekkiego przeciwciała 11.2.1 (nr dostępu ATCC PTA-5169).

6. Przeciwciało lub fragment według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało zawiera sekwencje aminokwasowe domeny zmiennej łańcucha ciężkiego i domeny zmiennej łańcucha lekkiego przeciwciała 11.2.1 (nr dostępu ATCC PTA-5169).

120

PL 210 435 B1

7. Przeciwciało lub fragment według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało jest przeciwciałem 11.2.1 (nr dostępu ATCC PTA-5169) lub ma taką samą sekwencję aminokwasową jak przeciwciało 11.2.1.

8. Przeciwciało lub fragment według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało zawiera sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha ciężkiego jak przedstawione w SEK. NR ID.: 70 lub sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha lekkiego jak przedstawione w SEK. NR ID.: 71.

9. Przeciwciało lub fragment według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało zawiera sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha ciężkiego jak przedstawione w SEK. NR ID.: 70 i sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha lekkiego jak przedstawione w SEK. NR ID.: 71.

10. Przeciwciało lub fragment według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało zawiera sekwencję aminokwasową regionu zmiennego łańcucha ciężkiego jak przedstawiono w SEK. NR ID.: 70.

11. Przeciwciało lub fragment według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało zawiera sekwencję aminokwasową regionu zmiennego łańcucha lekkiego jak przedstawiono w SEK. NR ID.: 71.

12. Przeciwciało lub fragment według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało zawiera sekwencję aminokwasową domeny zmiennej łańcucha ciężkiego z SEK. NR ID.: 70 oraz sekwencję aminokwasową domeny zmiennej łańcucha lekkiego z SEK. NR ID.: 71.

13. Przeciwciało lub fragment według zastrz. 1, znamienne tym, że łańcuch lekki obejmuje sekwencję aminokwasową SEK. NR ID.: 22 lub 71.

14. Przeciwciało lub fragment według zastrz. 1, znamienne tym, że łańcuch ciężki obejmuje sekwencję aminokwasową SEK. NR ID.: 70.

15. Przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że zawiera sekwencję aminokwasową łańcucha ciężkiego z SEK. NR ID.: 70 oraz sekwencję aminokwasową łańcucha lekkiego z SEK. NR ID.: 71.

16. Ludzkie przeciwciało monoklonalne wiążące się z CTLA-4, które składa się z sekwencji aminokwasowej łańcucha ciężkiego z SEK. NR ID.: 70 oraz sekwencji aminokwasowej łańcucha lekkiego z SEK. NR ID.: 71.