PL214003B1 - Przeciwcialo monoklonalne wiazace sie z antygenem 4 cytotoksycznych limfocytów T(CTLA-4), lub jego wiazacy antygen fragment oraz sposób wytwarzania tego przeciwciala - Google Patents

Description

Niniejszy wynalazek dotyczy przeciwciała monoklonalnego wiążącego się z antygenem 4 cytotoksycznych limfocytów T (CTLA-4) lub jego wiążącego antygen fragmentu oraz sposobu wytwarzania tego przeciwciała. Przeciwciała te mogą znaleźć zastosowanie w szczególności w chorobach przewlekłych, w których wymagane jest powtarzane podawanie przeciwciał.

Niniejsze zgłoszenie zastrzega pierwszeństwo z tymczasowego zgłoszenia patentowego, nr seryjny US 60/113,647 złożonego 23 grudnia, 1998, którego treść włącza się niniejszym jako odnośnik literaturowy.

Regulacja odpowiedzi immunologicznej u pacjentów umożliwiłaby leczenie wielu chorób u ludzi, które to leczenie charakteryzowałoby się specyficznym działaniem, tak rzadko spotykanym w przypadku stosowania leków konwencjonalnych. Możliwe byłoby zarówno podnoszenie, jak i obniżanie odpowiedzi układu immunologicznego. Rola komórek T i komórek B w regulacji odpowiedzi immunologicznej była niejednokrotnie dogłębnie badana i opisywana. Z badań tych wynika, że w wielu przypadkach w zapobieganiu i leczeniu chorób szczególnie istotna wydaje się być rola komórek T.

Komórki T posiadają bardzo złożone systemy kontrolowania własnych oddziaływań. W procesach oddziaływania między komórkami T wykorzystywane są liczne receptory i czynniki rozpuszczalne. A zatem to, co wpływa na jeden konkretny sygnał, może zmieniać ogólną odpowiedź immunologiczną i zależeć od wielu konkretnych czynników, receptorów i kontrareceptorów, które biorą udział wdanym szlaku. Szlaki obniżania odpowiedzi są równie istotne, jak te wymagane do aktywacji. Jednym z mechanizmów zapobiegania odpowiedzi immunologicznej wobec konkretnego antygenu jest proces „edukacji” w grasicy, prowadzący do tolerancji komórek T. Znane są również i inne mechanizmy, takie jak wydzielanie cytokin supresyjnych.

Aktywacja komórek T wymaga nie tylko stymulacji poprzez receptor antygenu (receptor komórek T, ang. T celi receptor (TOR)), lecz również dodatkowych sygnałów poprzez kostymulujące cząsteczki powierzchniowe, takie jak CD28. Ligandami dla CD28 są biała B7-1 (CD80) i B7-2 (CD86), które są wyrażane na komórkach prezentujących antygen, takich jak komórki dendrytyczne, aktywowane komórki B albo monocyty, które oddziałują z CD28 lub CTLA-4 komórek T w celu dostarczenia sygnału kostymulującego. Rola kostymulującego przekazywania sygnałów była badana w doświadczalnym alergicznym zapaleniu mózgu i rdzenia (ang. experimental allergic encephaloyelitis, EAE) przez Perrin iwsp., Immunol Res 14:189-99 (1995). EAE jest chorobą autoimmunologiczną indukowaną przez komórki Th1 skierowane przeciwko antygenom mielinowym, która dostarcza modelu in vivo do badania roli kostymulacji z udziełem B7 w indukcji patologicznej odpowiedzi immunologicznej. Stosując rozpuszczalne białko fuzyjne jako ligand dla receptora B7, jak również monoklonalne przeciwciała swoiste wobec CD80 albo CD86, Perrin i wsp. wykazali, że kostymulacja B7 odgrywa ważną rolę w EAE, warunkując kliniczny efekt choroby.

Oddziaływanie między B7 i CD28 jest jednym z kilku kostymulacyjnych szlaków przekazywania sygnałów, które wydaje się wystarczające do włączenia procesu dojrzewania i namnażania komórek T swoistych wobec antygenu. Brak kostymulacji i związane z tym niewystarczające wytwarzanie IL-2, zapobiega następującej kolejno proliferacji komórek T i indukuje stan braku reaktywności nazwany „anergią. Wiele wirusów i nowotworów może blokować aktywację i proliferację komórek T prowadząc do niewystarczającej aktywności albo braku aktywności układu immunologicznego gospodarza wobec zainfekowanych albo transformowanych komórek. Wśród możliwych zaburzeń funkcjonowania komórek T, anergia może być co najmniej częściowo odpowiedzialna za niezdolność gospodarza do usuwania komórek patogennych albo nowotworowych.

Zastosowanie białka B7 w pośredniczeniu w odporności przeciwnowotworowej zostało opisane w Chen i wsp., Celi 71:1093-1102 (1992) oraz Townsend and Allison, Science 259:368 (1993). Publikacja przeglądowa Schwartz, Celi 71:1065 (1992) opisuje rolę CD28, CTLA-4 i B7 w wytwarzaniu IL-2 oraz immunoterapii. Harding i wsp., Naturę 356:607-609 (1994) wykazali, że przekazywanie sygnałów, w których pośredniczy CD28, stymuluje mysie komórki T i zapobiega indukcji anergii w klonach komórek T. Patrz również patenty USA nr 5,434,131,5,770,197 i 5,773,253 oraz międzynarodowe zgłoszenia patentowe nr WO 93/00431, WO 95/01994, WO 95/03408, WO 95/24217 i WO 95/33770.

Z powyższych rozważań jasno wynika, że komórki T wymagają dwóch rodzajów sygnałów z komórek prezentujących antygen (ang. antigen presenting celi, APC), aby mogły być aktywowane i następnie ulegać różnicowaniu, aby wykazywać funkcje efektorowe. Po pierwsze, istnieje sygnał swoisty wobec antygenu wytwarzany przez oddziaływania pomiędzy TCR na komórkach T i czą

PL 214 003 Β1 steczkami MHC prezentującymi peptydy na APC. Po drugie, istnieje sygnał niezależny od antygenu, w którym pośredniczy oddziaływanie CD28 z przedstawicielami rodziny B7 (B7-1 (CD80) lub B7-2 (CD86)). Dokładne usytuowanie CTLA-4 w procesach związanych z odpowiedzią odpornościową było początkowo nieoczywiste. Mysi CTLA-4 został po raz pierwszy zidentyfikowany i sklonowany przez Brunet i wsp., Naturę 328:267- 270 (1987), w ramach poszukiwań cząsteczek, które są preferencyjnie wyrażane na cytotoksycznych limfocytach T. Ludzki CTLA-4 został zidentyfikowany i sklonowany niedługo później przez Dariavach i wsp. Eur. J. Immunol. 18:1901 -1905 (1988). Mysie i ludzkie cząsteczki CTLA-4 wykazują około 76% homologię całej sekwencji i identyczność sekwencji w domenach cytoplazmatycznych (Dariavach i wsp. Eur. J. Immunol. 18:1901-1905 (1988)). CTLA-4 jest przedstawicielem białek nadrodziny immunoglobulin (Ig). Nadrodzina Ig stanowi grupę białek, które mają wspólne właściwości strukturalne zmiennych (V) albo stałych (C) domen cząsteczek Ig. Przedstawiciele tej nadrodziny Ig obejmują między innymi same immunoglobuliny, cząsteczki głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) (tj., MHC klasy I i II) oraz cząsteczki TCR.

W 1991, Linsley i wsp., J. Exp. Med. 174:561-569 (1991), zaproponowali, że CTLA-4 jest drugim receptorem dla B7. Podobnie, Harper i wsp., J Immunol 147:1037-44 (1991) wykazali, że cząsteczki CTLA-4 i CD28 są blisko spokrewnione u myszy i człowieka pod względem sekwencji, ekspresji mRNA, struktury genu i położenia na chromosomie. Patrz również Balzano i wsp., Int J Cancer Suppl 7:28-32 (1992). Dalsze dowody na taką rolę przyniosły badania funkcjonalne. Przykładowo, Lenschow i wsp., Science 257:789-79 (1992) wykazali, że CTLA-4-lg indukowała długotrwałe przeżycie przeszczepów wysepek trzustkowych. Freeman i wsp., Science 262:907-909 (1993) badali rolę CTLA-4 u myszy z niedoborem B7. Badanie ligandów dla CTLA-4 jest opisane w Lenschow i wsp., PNAS 90:11054-11058 (1993). Linsley i wsp., Science 257:792-795 (1992) opisują immunosupresję in vivo wywołaną przez rozpuszczalną postać CTLA-4. Linsley i wsp., J Exp Med 176:1595-604 (1992) przygotowali przeciwciała, które wiązały CTLA-4 i które nie wykazywały reakcji krzyżowej z CD28 oraz doszli do wniosku, że CTLA-4 jest wyrażany wspólnie z CD28 na aktywowanych limfocytach T i kooperatywnie reguluje adhezję komórek T i ich aktywację przez B7. Kuchroo i wsp., Celi 80:707-18 (1995) wykazali, że cząsteczki kostymulujące B7-1 i B7-2 aktywowały szlaki rozwojowe Th1/Th2 w zróżnicowany sposób. Yiqun i wsp., Int Immunol 8:37-44 (1996) wykazali, że istnieją zróżnicowane wymagania odnośnie sygnałów kostymulujących od przedstawicieli rodziny B7 dla spoczynkowych komórek pamięci T względem ostatnio aktywowanych komórek pamięci T wobec rozpuszczalnych antygenów przypominających. Patrz również de Boer i wsp. Eur J Immunol 23:3120-5 (1993).

Kilka grup zaproponowało alternatywne albo odrębne oddziaływania receptor/ligand dla CTLA-4 w porównaniu z CD28, a nawet zaproponowano trzeci kompleks B-7, który jest rozpoznawany przez przeciwciała BB1. Patrz, na przykład, Hathcock i wsp. Science 262:905-7 (1993), Freeman i wsp. Science 262:907-9 (1993), Freeman i wsp. J Exp Med 178:2185-92 (1993), Lenschow i wsp. Proc Natl Acad Sci USA 90:11054-8 (1993), Razi-Wolfi wsp. Proc Natl Acad Sci USA 90:11182-6 (1993) oraz Boussiotis i wsp. Proc Natl Acad Sci USA 90:11059-63 (1993). Ale w publikacji Freeman i wsp. J Immunol 161:2708-15 (1998) omówiono odkrycie, że przeciwciało BB1 wiąże się z cząsteczką, która jest identyczna z powierzchniową formą CD74, postulując że BB1 mAb wiąże się z białkiem innym niż B7-1, a epitop ten jest również obecny na białku B7-1. Przez co stało się konieczne ponowne rozważenie prowadzenia badań przy zastosowaniu BB1 mAb w analizie ekspresji i funkcji CD80.

Prowadząc badania wiatach 1993 - 1995, naukowcy podjęli dalsze próby ustalania roli, jaką odgrywa CTLA-4 w stymulacji komórek T. Najpierw, przez zastosowanie przeciwciał monoklonalnych przeciwko CTLA-4, Walunas i wsp., Immunity 1:405-13 (1994) dostarczyli dowodów, że CTLA-4 może działać jako negatywny regulator aktywacji komórek T. Następnie, Waterhouse i wsp., Science 270:985-988 (1995) pokazali, że myszy z niedoborem CTLA-4 akumulowały w węzłach limfatycznych i śledzionach komórki prekursorowe T (blastocyty, blasty T) z podwyższonym poziomem markerów aktywacyjnych. Komórki prekursorowe naciekały tkankę wątroby, serca, płuc i trzustki, ilości immunoglobuliny w surowicy były podwyższone, a komórki T namnażały się spontanicznie i silnie po stymulacji przez receptor komórki T, jednakże były one podatne na śmierć komórkową indukowaną przez sieciowanie receptora Fas i przez promieniowanie gamma. Waterhouse i wsp. doszli do wniosku, że CTLA-4 działa jako negatywny regulator aktywacji komórek T i jest istotny w kontroli homeostazy limfocytów. Jako komentarz dotyczący tego zagadnienia Allison i Krummel, Science 270:932-933 (1995) omawiali pracę Waterhouse i wsp. jako wykazującą, że CTLA-4 działa obniżając odpowiedź komórek T albo odgrywa rolę w hamowaniu przekazywania sygnałów przy aktywacji i rozwoju komórek T. Tivol i wsp., Immunity 3:541 -7 (1995) również otrzymali myszy z niedoborem CTLA-4 i wykazali, że u takich

PL 214 003 Β1 myszy szybko rozwija się choroba związana z proliferacją białych krwinek z wielonarządowym limfocytarnym naciekiem i niszczeniem tkanek ze szczególnie ostrym zapaleniem mięśnia sercowego i zapaleniem trzustki. Wywnioskowali oni, że CTLA-4 odrywa kluczową rolę w obniżaniu aktywacji komórek T i utrzymywaniu homeostazy immunologicznej. Ponadto, Krummel i Allison, J Exp Med 182:459-65 (1995) dalej wyjaśnili, że CD28 i CTLA-4 wywierają przeciwny efekt na odpowiedź komórek T na stymulację. Wytworzyli oni przeciwciało przeciwko CTLA-4 i badali wpływ jego wiązania z CTLA-4 w układzie z zastosowaniem wysoko oczyszczonych komórek T. W swoim sprawozdaniu, pokazali oni, że obecność niskich poziomów B7-2 na świeżo eksplantowanych komórkach T może częściowo hamować proliferację komórek T, a w hamowaniu tym pośredniczyły oddziaływania z CTLA-4. Sieciowanie CTLA-4 jednocześnie z TCR i CD28 mocno hamuje proliferację i wydzielenie IL-2 przez komórki T. Wreszcie, wyniki te wykazały, że CD28 i CTLA-4 dostarczają przeciwstawnych sygnałów, które wydają się być integrowane przez komórki T przy określaniu odpowiedzi na antygen. Zatem, uznali oni, że wynik stymulacji receptora komórek T jest regulowany przez sygnały kostymulacyjne CD28, jak również sygnały hamujące dostarczane przez CTLA-4. Patrz również Krummel i wsp. Int Immunol 8:519-23 (1996) i patent USA nr 5,811,097 oraz międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO 97/20574.

Przeprowadzono rozmaite dodatkowe doświadczenia wyjaśniające dokładniej powyższą funkcję CTLA-4. Przykładowo, Walunas i wsp., J Exp Med 183:2541-50 (1996), przez zastosowanie przeciwciała anty-CTLA-4, zasugerowali, że przekazywanie sygnałów przez CTLA-4 nie reguluje przeżywalności komórek albo odpowiedzi na IL-2, ale hamuje zależne od CD28 wytwarzanie IL-2. Ponadto, Perrin i wsp. J Immunol 157:1333-6 (1996) wykazali, że przeciwciała anty-CTLA-4 w doświadczalnym zapaleniu mózgu i rdzenia (EAE), nasilały chorobę i zwiększały śmiertelność. Nasileniu choroby towarzyszyło zwiększone wytwarzanie cytokin TNF-alpha, IFN-gamma i IL-2 powodujących zapalenie mózgu i rdzenia. Zatem stwierdzili oni, że CTLA-4 reguluje intensywność odpowiedzi immunologicznej w EAE, hamując wytwarzanie zapalnych cytokin i objawy kliniczne choroby. Patrz również Hurwitz i wsp. J Neuroimmunol 73:57-62 (1997) i Cepero i wsp. J Exp Med 188:199-204 (1998) (rybozym anty-CTLA-4 typu „spinki do włosów, który specyficznie znosi ekspresję CTLA-4 po przeniesieniu do mysiego modelu komórek T).

Ponadto Blair i wsp., J Immunol 160:12-5 (1998) badali efekty funkcjonalne zestawu monoklonalnych przeciwciał (mAb) przeciwko CTLA-4 na spoczynkowe ludzkie komórki T CD4+. Ich wyniki pokazały, że niektóre mAb wobec CTLA-4 mogły hamować odpowiedzi proliferacyjne spoczynkowych komórek CD4+ i przejście od GO do G1 w cyklu komórkowym. Efekty hamujące CTLA-4 były widoczne w ciągu 4 godz., w czasie kiedy ekspresja CTLA-4 na powierzchni komórki pozostawała niewykrywalna. Jednakże inne mAb wobec CTLA-4, nie dawały żadnych wykrywalnych efektów hamujących, wskazując, że samo wiązanie mAb do CTLA-4 nie wystarcza, aby pośredniczyć w obniżaniu poziomu odpowiedzi komórek T. Co interesujące, po zatrzymaniu wytwarzania IL-2, hamujące mAb anty-CTLA-4 pozwalały na indukcję i ekspresję genu przeżywałności komórki, bcl-X(L). Zgodnie z tą obserwacją, komórki pozostawały żywe i nie obserwowano apoptozy po połączeniu z CTLA-4.

W związku z anergią, Perez i wsp., Immunity 6:411-7 (1997) wykazali, że indukcji anergii komórek T przeciwdziałało blokowanie CTLA-4 i wywnioskowali, że wynik rozpoznania antygenu przez komórki T jest uwarunkowany przez oddziaływanie CD28 lub CTLA-4 na komórkach T z cząsteczkami B7. Również, Van Parijs i wsp., J Exp Med 186: 1119-28 (1997) badali rolę interleukiny 12 i kostymulatorów w anergii komórek T in vivo i stwierdzili, że przez hamowanie udziału CTLA-4 w czasie indukcji anergii, zablokowana została proliferacja komórek T i nie następowało pełne różnicowanie Th1. Jednakże, komórki T eksponowane na dające tolerancję antygeny w obecności zarówno IL-12, jak i przeciwciał antyCTLA-4 nie wykazywały anergii i zachowywały się identycznie, jak komórki T, które zetknęły się z antygenem immunogennym. Wyniki te sugerują, że w indukcji anergii in vivo uczestniczą dwa procesy: udział CTLA-4, który prowadzi do blokowania zdolności komórek T do proliferacji i nieobecność prototypowej zapalnej cytokiny, IL-12, co zapobiega różnicowaniu komórek T w komórki efektorowe Th1. Kombinacja IL-12 i przeciwciał anty-CTLA-4 wystarczała do przekształcenia bodźca, który jest normalnie tolerowany w bodziec immunogenny.

W związku z infekcjami, McCoy i wsp., J Exp Med 186: 183-7 (1997) pokazali, że przeciwciała anty-CTLA-4 bardzo zwiększały i przyspieszały odpowiedź immunologiczną komórek T na Nippostrongylus brasiliensis, czego wynikiem było znaczne zmniejszenie liczby dorosłych robaków i wczesne zakończenie wytwarzania jaj przez pasożyta. Patrz również Murphy i wsp. J. Immunol. 161:4153-4160 (1998) (Leishmania donovani).

PL 214 003 Β1

W związku z nowotworem, Kwon i wsp., PNAS USA 94:8099-103 (1997) opracowali model syngenicznego mysiego raka prostaty i badali dwa odrębne zabiegi mające na celu wzbudzenie odpowiedzi przeciwko rakowi prostaty poprzez wzmocnioną kostymulację komórek T: (i) dostarczenie bezpośredniej kostymulacji przez komórki raka prostaty transdukowane do uzyskania ekspresji ligandu B7.1 i (ii) blokadę in vivo CTLA-4 komórek T za pośrednictwem przeciwciał, co zapobiega obniżeniu odpowiedzi komórek T. Wykazano, że blokada CTLA-4 in vivo za pośrednictwem przeciwciał wzmocniła odpowiedzi immunologiczne przeciwko rakowi prostaty. Również, Yang i wsp. Cancer Res 57:4036-41 (1997) badali czy blokada funkcji CTLA-4 prowadzi do wzmocnienia antynowotworowych odpowiedzi komórek T w różnych stadiach wzrostu nowotworu. W oparciu o wyniki in vitro i in vivo stwierdzili oni, że blokada CTLA-4 u osób z nowotworem wzmacniała ich zdolność do wytwarzania odpowiedzi przeciwnowotworowych komórek T, ale wystąpienie takiego wzmocnionego efektu w ich modelu ograniczało się do wczesnych stadiów rozwoju nowotworu. Ponadto, Hurwitz i wsp. Proc Natl Acad Sci USA 95: 10067-71 (1998) badali generowanie odpowiedzi przeciwnowotworowej za pośrednictwem komórek T i stwierdzili, że zależy ona od zaangażowania receptora komórek T przez główny kompleks zgodności tkankowej/antygen, jak również od związania CD28 przez B7.

Pewne nowotwory, takie jak rak sutka SM1 były oporne na immunoterapię anty-CTLA-4. Zatem przy zastosowaniu kombinacji blokady CTLA-4 i szczepionki złożonej z komórek SM1 wyrażających czynnik stymulujący kolonie granulocytów-makrofagów, obserwowano regresje rodzicielskich komórek nowotworowych SM1 pomimo nieskuteczności każdego z tych sposobów leczenia osobno. Terapia kombinowana prowadziła do utrzymującej się długo odporności wobec SM1 i zależała zarówno od komórek T CD4(+), jak i CD8(+). Odkrycia te sugerowały, że blokada CTLA-4 działa na poziomie pochodzących od gospodarza komórek prezentujących antygen.

W odniesieniu do cukrzycy, Luhder i wsp., J Exp Med 187:427-32 (1998) wstrzykiwali mAb antyCTLA-4 myszy transgenicznej pod względem TCR, stanowiącej model cukrzycy w różnych stadiach choroby. Stwierdzili oni, że udział CTLA-4 w czasie, kiedy potencjalnie cukrzycogenne komórki T są po raz pierwszy aktywowane, jest zdarzeniem decydującym; jeżeli ich udział jest możliwy, następuje inwazja wysepek, jednakże pozostaje ona całkiem nieszkodliwa miesiącami. Jeżeli nie, zapalenie wysepek trzustkowych z naciekaniem limfocytarnym jest bardziej agresywne i cukrzyca szybko się rozwija.

W odniesieniu do immunizacji szczepionką, Horspool i wsp., J Immunol 160:2706-14 (1998) stwierdzili, że nienaruszone mAb anty-CTLA-4, ale nie fragmenty Fab, hamują pierwotną odpowiedź humoralną wobec pCIA/beta gal bez wpływu na odpowiedzi przypominające, co wskazuje, że aktywacja CTLA-4 hamuje wytwarzanie Ab, ale nie wzbudzanie komórek T. Blokada ligandów dla CD28 i CTLA-4, CD80 (B7-1) i CD86 (B7-2), wykazała odrębne, niezachodzące na siebie funkcje. Blokada CD80 przy początkowej immunizacji całkowicie znosiła pierwszorzędowe i drugorzędowe odpowiedzi immunologiczne przeciwciał, podczas gdy blokada CD86 znosiła odpowiedzi pierwszorzędowe, ale nie drugorzędowe. Jednoczesna blokada CD80 + CD86 była mniej skuteczna w znoszeniu odpowiedzi Ab niż każda z nich osobno. Wzmocnienie kostymulacji przez jednoczesne wstrzyknięcie plazmidów wyrażających B7 zwiększało odpowiedzi CTL, ale nie odpowiedzi Ab i nie wskazywało na przejście od Th1 do Th2. Odkrycia te wskazują na złożoną i odrębną rolę dla CD28, CTLA-4, CD80 i CD86 w kostymulacji komórek T po zaszczepieniu kwasem nukleinowym.

W odniesieniu do odrzucania alloprzeszczepu, Markees i wsp., J Clin lnvest 101:2446-55 (1998) stwierdzili w mysim modelu odrzucania alloprzeszczepu skóry, że przyjęcie się przeszczepu wyjściowo zależy od obecności INF-gamma, CTLA-4 oraz komórek T CD4(+). Dodaniu do protokołu mAb anty-CTLA-4 lub anty-IFN-gamma towarzyszyło szybkie odrzucenie przeszczepu, podczas gdy mAb anty-IL-4 nie miało żadnego wpływu.

W związku z rolą CTLA-4 w odniesieniu do CD28, Fallarino i wsp., J Exp Med 188:205-10 (1998) wytworzyli myszy transgeniczne pod względem TCR/z niedoborem genu aktywującego rekombinazę 2/typu dzikiego pod względem CD 28 albo z niedoborem CD28, które immunizowano nowotworem wyrażającym antygen. Wzbudzone komórki T z obydwu typów myszy wytwarzały cytokiny i namnażały się w odpowiedzi na komórki stymulujące z brakiem ekspresji B7. Jednakże, podczas gdy odpowiedź komórek T CD28+/+ była zwiększona poprzez kostymulację B7-1, odpowiedź komórek T CD28-/- była silnie zahamowana. Hamowanie to było odwracane przez monoklonalne przeciwciała przeciwko B7-1 albo CTLA-4. Zatem CTLA-4 może silnie hamować aktywację komórek T w nieobecności CD28, wskazując, że antagonizm sygnału, w którym pośredniczy TCR jest wystarczający, aby wyjaśnić efekt hamujący CTLA-4. Również, Lin i wsp., J Exp Med 188: 199-204 (1998) badali

PL 214 003 Β1 odrzucanie alloprzeszczepu serca u myszy z niedoborem CD28. Serca H-2(q) przeszczepiano allogenicznej myszy typu dzikiego albo myszy z niedoborem CD28 (H-2(b)). Odrzucanie przeszczepu było opóźnione u myszy z niedoborem CD28 w porównaniu z myszami typu dzikiego. Traktowanie biorców typu dzikiego immunoglobuliną-CTLA-4 (CTLA-4-lg), albo mAb anty-B7-1 plus anty-B7-2 znacząco przedłużało przeżycie alloprzeszczepu. Przeciwnie, traktowanie myszy z niedoborem CD28 CTLA-4-lg, mAb anty-B7-1 plus anty-B7-2 lub blokującymi mAb anty-CTLA-4 indukowało przyspieszenie odrzucenia przeszczepu. U nietraktowanych niczym myszy typu dzikiego i u myszy z niedoborem CD28 traktowanych CTLA-4-lg lub mAb anty-CTLA-4, zwiększonej szybkości odrzucania przeszczepu towarzyszył silny naciek jednojądrzastych komórek i zwiększony poziom transkryptów IFN-gamma i IL-6 w przeszczepionych sercach. Zatem, negatywna rola regulatorowa CTLA-4 rozciąga się poza jego potencjalną zdolność przeciwdziałania aktywacji CD28 przez współzawodnictwo ligandów. Nawet w nieobecności CD28, CTLA-4 odgrywa hamującą rolę w regulowaniu odrzucenia alloprzeszczepu.

Podjęto również prace nad dalszym opisem ekspresji CTLA-4. Przykładowo, Alegre i wsp., J Immunol 157:4762-70 (1996) zaproponowali, że powierzchniowy CTLA-4 ulega szybkiej internalizacji, co może wyjaśniać niskie poziomy ekspresji zasadniczo wykrywane na powierzchni komórek. Wywnioskowali oni, że zarówno CD28, jak i IL-2 odgrywają ważną rolę w podwyższaniu ekspresji CTLA-4. Ponadto akumulacja CTLA-4 na powierzchni komórek wydaje się być regulowana przede wszystkim przez jego szybką endocytozę. Również Castan i wsp. Immunology 90:265-71 (1997) w oparciu o analizę immunohistologiczną ekspresji CTLA-4 in situ, wysunęli sugestię, że komórki T w ośrodku namnażania, które były dodatnie względem CTLA-4, powinny być ważne dla regulacji immunologicznej.

Zgodnie z powyższym, w świetle szerokiego zastosowania i kluczowej roli, którą CTLA-4 wydaje się pełnić w mechanizmie odpowiedzi immunologicznej, byłoby pożądane wytworzenie przeciwciał wobec CTLA-4, które mogą być skutecznie stosowane w immunoterapii. Ponadto, byłoby pożądane otrzymanie przeciwciał wobec CTLA-4, które można byłoby wykorzystać w chorobach przewlekłych, w których wymagane jest powtarzane podawanie przeciwciał.

Krótki opis figur

Fig. 1 przedstawia serię sekwencji nukleotydowych i aminokwasowych łańcucha ciężkiego i lekkiego łańcucha kappa cząsteczek immunoglobuliny: 4.1.1 (Fig. 1A), 4.8.1 (Fig. 1B), 4.14.3 (Fig. 1C), 6.1.1 (Fig. 1D), 3.1.1 (Fig. 1E), 4.10.2 (Fig. 1F), 2.1.3 (Fig. 1G), 4.13.1 (Fig. 1H), 11.2.1 (Fig. 11), 11.6.1 (Fig. 1J), 11.7.1 (Fig. 1K), 12.3.1.1 (Fig. 1L) i 12.9.1.1 (Fig. 1M).

Fig. 2 przedstawia dopasowanie przewidywanych sekwencji aminokwasowych łańcucha ciężkiego z klonów 4.1.1, 4.8.1, 4.14.3, 6.1.1, 3.1.1, 4.10.2, 4.13.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 i 12.9.1.1 oraz sekwencji aminokwasowej linii zarodkowej DP-50 (3-33). Różnice między sekwencją linii zarodkowej DP-50 i sekwencją klonów są wytłuszczone. Figura pokazuje również pozycje sekwencji CDR1, CDR2 i CDR3 jako zacieniowanie.

Fig. 3 przedstawia dopasowanie przewidywanej sekwencji aminokwasowej łańcucha ciężkiego klonu 2.1.3 oraz sekwencji aminokwasowej linii zarodkowej DP-65 (4-31). Różnice między sekwencją linii zarodkowej DP-65 i sekwencją klonu są wytłuszczone. Na figurze pozycje sekwencji CDR1, CDR2 i CDR3 przeciwciała zostały podkreślone.

Fig. 4 przedstawia dopasowanie przewidywanej sekwencji aminokwasowej łańcucha lekkiego kappa klonów 4.1.1,4.8.1. 4.14.3, 6.1.1,4.10.2 i 4.13.1 oraz sekwencji aminokwasowej linii zarodkowej A27. Różnice między sekwencją linii zarodkowej A27 i sekwencją klonu są wytłuszczone. Na figurze pozycje sekwencji CDR1, CDR2 i CDR3 przeciwciała zostały podkreślone. Delecje obserwowane wCDR1 klonów 4.8.1,4.14.3 i 6.1.1 są oznaczone jako „0”.

Fig. 5 przedstawia dopasowanie przewidywanej sekwencji aminokwasowej łańcucha lekkiego kappa klonów 3.1.1, 11.2.1, 11.6.1 i 11.7.1 oraz sekwencji aminokwasowej linii zarodkowej 012. Różnice między sekwencją linii zarodkowej 012 i sekwencją klonu są wytłuszczone. Na figurze pozycje sekwencji CDR1, CDR2 i CDR3 przeciwciała zostały podkreślone.

Fig. 6 przedstawia dopasowanie przewidywanej sekwencji aminokwasowej łańcucha lekkiego kappa klonu 2.1.3 oraz sekwencji aminokwasowej linii zarodkowej A10/A26. Różnice między sekwencją linii zarodkowej 012 i sekwencją klonu są wytłuszczone. Na figurze pozycje sekwencji CDR1, CDR2 i CDR3 przeciwciała zostały podkreślone.

Fig. 7 przedstawia dopasowanie przewidywanej sekwencji aminokwasowej łańcucha lekkiego kappa klonu 12.3.1 oraz sekwencji aminokwasowej linii zarodkowej A17. Różnice między sekwencją linii zarodkowej A17 i sekwencją klonu są wytłuszczone. Na figurze pozycje sekwencji CDR1, CDR2 i CDR3 przeciwciała zostały podkreślone.

PL 214 003 Β1

Fig. 8 przedstawia dopasowanie przewidywanej sekwencji aminokwasowej łańcucha lekkiego kappa klonu 12.9.1 oraz sekwencji aminokwasowej linii zarodkowej A3/A19. Różnice między sekwencją linii zarodkowej A3/A19 i sekwencją klonu są wytłuszczone. Na figurze pozycje sekwencji CDR1, CDR2 i CDR3 przeciwciała zostały podkreślone.

Fig. 9 przedstawia podsumowanie N-końcowych sekwencji aminokwasowych wytworzonych poprzez bezpośrednie sekwencjonowanie białka ciężkiego i lekkiego łańcucha przeciwciał.

Fig. 10 przedstawia pewne dodatkowe informacje dotyczące charakterystyki niektórych ujawnionych niniejszym przeciwciał. Na Fig. 10A zebrane są dane dotyczące klonów 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.14.3 i 6.1.1. Przedstawione są dane dotyczące stężenia, ogniskowania izoelektrycznego (IEF), SDS-PAGE, chromatografii wykluczania ze względu na wielkość (SEC), chromatografii cieczowej/spektroskopii mas (LCMS), spektroskopii mas (MALDI) N-końcowych sekwencji łańcucha lekkiego. Dodatkowe szczegółowe informacje dotyczące IEF są przedstawione na Fig. 10B; dotyczące SDS-PAGE są przedstawione na 10C; a SEC przeciwciała 4.1.1 na 10D.

Fig. 11 przedstawia ekspresję B7-1 i B7-2 na komórkach Raji z zastosowaniem mAb antyCD80-PE i anty-CD86-PE.

Fig. 12 przedstawia zależne od stężenia wzmocnienie wytwarzania IL-2 w teście blastocyty T/Raji indukowane przez blokujące przeciwciała anty-CTLA-4 (BNI3, 4.1.1,4.8.1 i 6.1.1).

Fig. 13 przedstawia zależne od stężenia wzmocnienie wytwarzania IFN-γ w teście blastocyty T/Raji indukowane przez blokujące przeciwciała anty-CTLA-4 (BNI3, 4.1.1, 4.8.1 i 6.1.1) (te same komórki T dawcy).

Fig. 14 przedstawia średnie wzmocnienie wytwarzania IL-2 w komórkach T od 6 dawców indukowane przez blokujące przeciwciała anty-CTLA-4 w teście blastocysty T/Raji.

Fig. 15 przedstawia średnie wzmocnienie wytwarzania IFN-γ w komórkach T od 6 dawców indukowane przez blokujące przeciwciała anty-CTLA-4 w teście blastocyty T/Raji.

Fig. 16 przedstawia wzmocnienie wytwarzania IL-2 w hPBMC od 5 dawców indukowane przez blokujące mAb anty-CTLA-4 mierzone 72 godziny po stymulacji SEA.

Fig. 17 przedstawia wzmocnienie wytwarzania IL-2 w pełnej krwi od 3 dawców indukowane przez blokujące mAb anty-CTLA-4 mierzone 72 i 96 godzin po stymulacji SEA.

Fig. 18 przedstawia hamowanie wzrostu nowotworu przez przeciwciało anty-mysi-CTLA-4 w mysim modelu włókniakomięsaka.

Fig. 19 przedstawia wzmocnienie wytwarzania IL-2 indukowane przez przeciwciała anty-CTLA-4 (4.1.1 i 11.2.1) w 72 godzinnych testach blastocyty T/Raji i Superantygen (pełna krew i jednojądrzaste komórki krwi obwodowej od 6 pacjentów).

Fig. 20 przedstawia zależne od dawki wzmocnienie wytwarzania IL-2 indukowane przez przeciwciała anty-CTLA-4 (4.1.1 i 11.2.1) w 72 godzinnym w teście blastocyty T/Raji.

Fig. 21 przedstawia zależne od dawki wzmocnienie wytwarzania IL-2 indukowane przez przeciwciała anty-CTLA-4 (4.1.1 i 11.2.1) w 72 godzinnym teście Superantygenu dla pełnej krwi stymulowanej 100 ng/ml superantygenu.

Fig. 22 przedstawia serię dodatkowych sekwencji nukleotydowych i aminokwasowych następujących łańcuchów przeciwciała anty-CTLA-4: łańcuch ciężki pełnej długości 4.1.1 (sekwencja cDNA 22(a), sekwencja genomowa 22(b) oraz sekwencja aminokwasowa 22(c)), pełnej długości nieglikozylowany łańcuch ciężki 4.1.1 (sekwencja cDNA 22(d) i sekwencja aminokwasowa 22(e)), łańcuch lekki 4.1.1 (sekwencja cDNA 22(f) i sekwencja aminokwasowa 22(g)), pełnej długości łańcuch ciężki 4.8.1 (sekwencja cDNA 22(h) i sekwencja aminokwasowa 22(i)), łańcuch lekki 4.8.1 (sekwencja cDNA 22(j) i sekwencja aminokwasowa 22(k)), pełnej długości łańcuch ciężki 6.1.1 (sekwencja cDNA 22(1) i sekwencja aminokwasowa 22(m)), łańcuch lekki 6.1.1 (sekwencja cDNA 22(n) i sekwencja aminokwasowa 22(o)), pełnej długości łańcuch ciężki 11.2.1 (sekwencja cDNA 22(p) i sekwencja aminokwasowa 22(q)) oraz łańcuch lekki 11.2.1 (sekwencja cDNA 22(r) i sekwencja aminokwasowa 22(s)).

Przedmiotem wynalazku jest przeciwciało monoklonalne wiążące się z CTLA-4, lub jego wiążący antygen fragment, obejmuje region zmienny łańcucha ciężkiego przynajmniej w 85% identyczny z regionem zmiennym łańcucha ciężkiego z SEK. NR ID.: 63, oraz region zmienny łańcucha lekkiego przynajmniej w 90% identyczny z regionem zmiennym łańcucha lekkiego z SEK. NR ID.: 65. Korzystnie region zmienny łańcucha ciężkiego jest przynajmniej w 90% identyczny z regionem zmiennym łańcucha ciężkiego z SEK. NR ID.: 63.

Korzystnie przeciwciało lub fragment według wynalazku wiąże się z CTLA-4 z K_D wynoszącą 10'⁹ M lub większym powinowactwem.

PL 214 003 Β1

Korzystniej przeciwciało lub fragment według wynalazku hamuje wiązanie pomiędzy CTLA-4 i B7-2 z IC₅₀ wynoszącym 100 nM lub niższym.

Najkorzystniej przeciwciało lub fragment według wynalazku wiąże się z CTLA-4 z K_D wynoszącą 10'⁹ M lub większym powinowactwem oraz hamuje wiązanie pomiędzy CTLA-4 i B7-2 z IC₅₀ wynoszącym 100 nM lub niższym.

W innym aspekcie wynalazek dostarcza sposobu wytwarzania przeciwciała według wynalazku obejmującego etapy:

a) immunizowania niebędącego człowiekiem ssaka immunogenem obejmującym CTLA-4, przy czym ssak jest zdolny do ekspresji ludzkich przeciwciał w swoich komórkach B;

b) izolowania komórek B z ssaka;

c) przesiewania komórek B, lub uzyskanych z nich linii komórkowych, pod kątem przeciwciał wiążących CTLA-4;

d) hodowania linii komórkowej wyrażającej przeciwciała, które wiążą się z CTLA-4; oraz

e) izolowania przeciwciał, które wiążą się z CTLA-4.

Szczegółowy opis wynalazku

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, dostarczone są pełne ludzkie monoklonalne przeciwciała przeciwko ludzkiemu CTLA-4. Niniejszym przedstawione zostały także sekwencje nukleotydowe kodujące sekwencje aminokwasowe obejmujące lekki i ciężki łańcuch cząsteczek immunoglobulinowych, a w szczególności sekwencje odpowiadające ciągłym sekwencjom ciężkiego i lekkiego łańcucha od FR1 i CDR1 do CDR3 i FR4. Ponadto ujawniono niniejszym przeciwciała o podobnych właściwościach wiązania i przeciwciała (lub inne czynniki antagonistyczne) o podobnych właściwościach funkcjonalnych do opisanych tu przeciwciał. W niniejszym opisie ujawnione zostały ponadto hybrydomy wyrażające takie cząsteczki immunoglobulin i przeciwciała monoklonalne.

Definicje

O ile nie określono inaczej, terminy naukowe i techniczne użyte w odniesieniu do rozwiązań według wynalazku mają znaczenia powszechnie zrozumiałe dla specjalisty w dziedzinie. Dalej, o ile nie wymaga tego kontekst, terminy użyte w liczbie pojedynczej obejmują liczbę mnogą, a użyte w liczbie mnogiej obejmują liczbę pojedynczą. Ogólnie, użyte w niniejszym zgłoszeniu nazewnictwo i techniki dotyczące hodowli komórek i tkanek, biologii molekularnej, chemii białek, oligo- i polinukleotydów oraz hybrydyzacji są powszechnie znane i stosowane w dziedzinie. Do tworzenia rekombinowanych cząsteczek DNA, syntezy oligonukleotydów, hodowli i transformacji (np. przez elektroporację, lipofekcję) tkanek zastosowano standardowe techniki. Reakcje enzymatyczne i procesy oczyszczania przeprowadzano zgodnie z zaleceniami producentów, sposobami powszechnie znanymi w dziedzinie lub jak opisano w niniejszym zgłoszeniu. Opisane niżej techniki i procedury są ogólnie wykonywane zgodnie ze zwykłymi metodami dobrze znanymi w dziedzinie, jak opisano w wielu ogólnych i bardziej szczegółowych publikacjach, cytowanych i omawianych w niniejszym opisie. Patrz np. Sambrook i wsp. Molecular cloning: A Laboratory Manuał (wyd. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Nazewnictwo, techniki i procedury laboratoryjne używane niniejszym w odniesieniu do chemii analitycznej, syntezy organicznej, chemii medycznej i farmacji są dobrze znane w dziedzinie i powszechnie używane w dziedzinie. Standardowe techniki stosowano do syntez chemicznych, analiz chemicznych, przygotowywania i dostarczania farmaceutyków oraz leczenia pacjentów.

O ile nie wskazano inaczej, wymienione poniżej terminy stosowane w niniejszym zgłoszeniu, powinny być rozumiane jako posiadające następujące znaczenia:

Stosowany w niniejszym zgłoszeniu termin „wyizolowany polinukleotyd” oznacza polinukleotyd z genomu, cDNA, bądź pochodzenia syntetycznego, lub też połączenie powyższych, który ze względu na swoje pochodzenie (1) nie jest złączony z całym lub fragmentem polinukleotydu w którym „wyizolowany polinukleotyd” znajduje się w naturze, (2) jest funkcjonalnie połączony z polinukleotydem z którym nie jest połączony w naturze, lub (3) nie występuje naturalnie jako część większej sekwencji.

Stosowany w niniejszym zgłoszeniu termin „wyizolowane białko” odnosi się do białka, którego podstawę stanowi cDNA, rekombinowany RNA lub do białka pochodzenia syntetycznego lub ich połączenia, które ze względu na swoje pochodzenie lub źródło z którego zostało otrzymane (1) nie jest związane z białkami występującymi w naturze, (2) jest wolne od innych białek z tego samego źródła, np. jest wolne od mysich białek, (3) jest wyrażane przez komórki innego gatunku, lub (4) nie występuje naturalnie.

PL 214 003 Β1

Stosowane w niniejszym opisie określenie „polipeptyd” oznacza ogólny termin odnoszący się do natywnego białka, jego fragmentów lub analogów sekwencji polipeptydowej. Zatem natywne białko, części i analogi sekwencji polipeptydowej są podrodzajami (ang. species) ogólnie określonej grupy polipeptydów (ang. genuś). Korzystnie peptydy mogą obejmować cząsteczki ciężkiego łańcucha ludzkich immunoglobulin oraz cząsteczki lekkiego łańcucha kappa ludzkich immunoglobulin, przedstawione na Fig. 1. jak również cząsteczki przeciwciał powstałe przez połączenia ciężkich łańcuchów immunoglobulin z lekkimi łańcuchami immunoglobulin, jak np. cząsteczkami lekkiego łańcucha kappa immunoglobulin, i odwrotnie, jak również ich fragmenty i analogi.

Stosowany niniejszym w odniesieniu do przedmiotu termin „naturalnie występujący” lub „występujący w naturze” dotyczy przedmiotu, który można znaleźć w przyrodzie. Przykładowo, naturalnie występująca jest sekwencja polipeptydowa lub polinukleotydowa, która jest obecna w jakimś organizmie (włączając wirusy), może być wyodrębniona ze źródła w naturze i nie została celowo zmieniona przez człowieka w laboratorium lub w inny sposób.

Stosowany w niniejszym zgłoszeniu termin „funkcjonalnie połączony” odnosi się do takiego połączenia opisywanych tym terminem składników, że mogą one działać w zamierzony sposób. Sekwencja kontrolna „połączona funkcjonalnie z sekwencją kodującą jest z nią zligowana w taki sposób, że osiąga się ekspresję sekwencji kodującej w warunkach właściwych dla sekwencji kontrolnej.

Używany w niniejszym zgłoszeniu termin „sekwencja kontrolna odnosi się do sekwencji polinukleotydowych, niezbędnych, aby doprowadzić do ekspresji i obróbki sekwencji kodujących, z którymi są one połączone. Takie sekwencje kontrolne są różne w zależności od organizmu gospodarza; u prokariotów, sekwencje kontrolne zwykle obejmują promotor, miejsce wiązania rybosomu i sekwencję zakończenia (terminacji) transkrypcji; u eukariontów, zazwyczaj, takie sekwencje kontrolne obejmują promotory i sekwencje zakończenia transkrypcji. Termin „sekwencje kontrolne” obejmuje w założeniu przynajmniej wszystkie składniki, których obecność jest niezbędna do ekspresji i obróbki, a może również obejmować dodatkowe składniki, których obecność jest korzystna, jak przykładowo, sekwencje liderowe i sekwencje partnerów fuzji.

Używany w niniejszym zgłoszeniu termin „polinukleotyd” odnosi się do polimerycznej postaci nukleotydów, o długości przynajmniej 10 zasad, zarówno rybonukleotydów, jak i deoksyrybonukleotydów lub modyfikowanych postaci któregokolwiek rodzaju nukleotydów. Termin obejmuje jednoi dwuniciową postać DNA.

Stosowany w niniejszym zgłoszeniu termin „oligonukleotyd” odnosi się do występujących naturalnie oraz modyfikowanych nukleotydów połączonych występującymi naturalnie oraz niewystępującymi naturalnie wiązaniami oligonukleotydowymi. Oligonukleotydy są podzbiorem polinukleotydów, które zazwyczaj zawierają 200 zasad lub mniej. Korzystnie oligonukleotydy mają długość 10 do 60 zasad, a najkorzystniej długość 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 lub 20 do 40 zasad. Oligonukleotydy zwykle są jednoniciowe, np. jako sondy, choć oligonukleotydy mogą również występować w postaci dwuniciowej, np. stosowane do mutagenezy genu. Oligonukleotydy według wynalazku mogą być zarówno sensowne (tj. niekodujące), jak i antysensowne (tj. kodujące).

Stosowany w niniejszym zgłoszeniu termin „naturalnie występujące nukleotydy” obejmuje deoksyrybonukleotydy i rybonukleotydy. Używany w niniejszym zgłoszeniu termin „modyfikowane nukleotydy” obejmuje nukleotydy z modyfikowaną lub podstawioną grupą cukrową i tym podobne. Stosowany w niniejszym zgłoszeniu termin „wiązania oligonukleotydowe obejmuje takie wiązania oligonukleotydowe jak wiązanie tiofosforanowe, ditiofosforanowe, selenofosforanowe, diselenofosforanowe, tioanilofosforanowe, anilofosforanowe, amidofosforanowe i tym podobne. Patrz np. LaPlanche i wsp. Nuci. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec i wsp. J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984); Stein i wsp., Nuci. Acids Res. 16:3209 (1988); Zon i wsp., Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon i wsp. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, str. 87-108 (F. Eckstein, wyd. Oxford Uniwersity Press, Oxford England (1991)); Stec i wsp. Patent USA nr 5,151,510; Uhlmann i Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990). Oligonukleotyd może zawierać znacznik pozwalający na jego wykrycie, jeśli jest to pożądane.

Stosowany niniejszym termin „wybiórczo hybrydyzuje odnosi się do wykrywalnego i specyficznego wiązania. Polinukleotydy, oligonukleotydy i ich fragmenty w rozumieniu niniejszego zgłoszenia wybiórczo hybrydyzują z łańcuchami kwasów nukleinowych w warunkach hybrydyzacji i przemywania minimalizujących wykrywalne wiązanie do niespecyficznych kwasów nukleinowych. W celu osiągnięcia wybiórczej hybrydyzacji można zastosować znane w dziedzinie i omówione w niniejszym zgłoszeniu ostre warunki hybrydyzacji. Ogólnie, homologia sekwencji pomiędzy polinu

PL 214 003 Β1 kleotydami, oligonukleotydami i ich fragmentami a wybraną sekwencją kwasu nukleinowego musi wynosić przynajmniej 80%, a zazwyczaj, korzystnie wraz z wzrastającą homologią, przynajmniej 85%, 90%, 95%, 99% i 100%. Dwie sekwencje aminokwasowe są homologiczne gdy ich sekwencje są częściowo bądź całkowicie identyczne. Przykładowo, 85% homologią oznacza, że 85% aminokwasów jest identyczne przy najlepszym dopasowaniu dwóch sekwencji. Przerwy (w jednej lub obu porównywanych sekwencjach) są dozwolone, aby zmaksymalizować dopasowanie; korzystne są przerwy o długości 5 lub mniej, bardziej korzystne są przerwy długości 2 lub mniej. Alternatywnie i korzystniej, dwie sekwencje białkowe (lub otrzymane z nich sekwencje polipeptydów o długości przynajmniej 30 aminokwasów) są homologiczne, w znaczeniu tu stosowanym, gdy wynik ich przyrównania, otrzymany w programie ALIGN z macierzą danych mutacyjnych i karą za przerwę wynoszącą 6 lub więcej, wynosi przynajmniej 5 (w jednostkach odchylenia standardowego). Patrz, Dayhoff M.O., w Atlas of Protein Sequence and Structure, str. 101-110 (tom 5, National Biomedical Research Foundation (1972)) i dodatek drugi do tego tomu, str. 1-10. Jeszcze korzystniej, dwie sekwencje lub ich części są homologiczne, gdy ich aminokwasy są w 50% lub więcej identyczne przy optymalnym dopasowaniu za pomocą programu ALIGN.

Stosowany niniejszym termin „odpowiada” oznacza, że sekwencja polinukleotydu jest homologiczna (tj. identyczna, a niekoniecznie pokrewna ewolucyjnie) do części bądź całej sekwencji polinukleotydowej odniesienia (tj. sekwencji referencyjnej), bądź odnosi się do sekwencji polipeptydowej identycznej z sekwencją polipeptydową odniesienia. Dla odróżnienia, stosowany niniejszym termin „komplementarny” dotyczy sekwencji, której sekwencja komplementarna jest homologiczna do całej bądź części sekwencji polinukleotydowej odniesienia. Na przykład, sekwencja nukleotydowa „TATAC” odpowiada sekwencji odniesienia „TATAC” i jest komplementarna do sekwencji odniesienia „GTATA”.

Następujące określenia są stosowane do opisania relacji pomiędzy dwoma lub większą liczbą sekwencji polinukleotydowych bądź aminokwasowych: „sekwencja odniesienia, „okienko porównania, „identyczność sekwencji, „procent identyczności sekwencji” i „zasadnicza identyczność. „Sekwencja odniesienia” jest określona jako sekwencja będąca podstawą porównania sekwencji; sekwencja odniesienia może być podzbiorem większej sekwencji, przykładowo częścią pełnej długości cDNA lub sekwencji genu podanej w liście sekwencji lub też może zawierać pełny cDNA bądź sekwencję genu. Ogólnie, sekwencja odniesienia ma długość przynajmniej 18 nukleotydów lub 6 aminokwasów, zwykle przynajmniej 24 nukleotydów lub 6 aminokwasów i często przynajmniej 48 nukleotydów lub 16 aminokwasów. Ponieważ dla dwóch polinukleotydów lub sekwencji aminokwasowych każde z nich może (1) zawierać sekwencję (tj. część pełnego polinukleotydu lub sekwencji aminokwasowej) podobną u tych dwóch cząsteczek i (2) może również zawierać sekwencję różną u tych dwóch polinukleotydów lub sekwencji aminokwasowych, porównanie sekwencji dwu lub więcej cząsteczek zwykle wykonuje się w „okienku porównania, aby znaleźć i porównać lokalne obszary podobieństwa sekwencji.

Stosowany niniejszym termin „okienko porównania” dotyczy pojęciowego segmentu przynajmniej 18 nukleotydowych lub 6 aminokwasowych następujących po sobie pozycji przy porównywaniu sekwencji polinukleotydowych lub aminokwasowch do sekwencji odniesienia o co najmniej 18 nukleotydach lub 6 aminokwasach następujących po sobie, przy czym część sekwencji polinukleotydowej w okienku porównania może zawierać delecje, insercje, podstawienia i tym podobne (np. przerwy) w 20% lub mniej w porównaniu z sekwencją odniesienia (niezwierającą insercji lub delecji) w celu optymalnego dopasowania dwóch sekwencji. Optymalne dopasowanie sekwencji w okienku porównania można przeprowadzić zgodnie z algorytmem lokalnej homologii Smitha i Watermana, Adv. Appl. Math 2:482 (1981), zgodnie z algorytmem dopasowania homologii Needlemana iWunscha J. Mol. Biol. 48:443 (1970), metodą szukania podobieństwa Pearsona i Lipmana Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 85:2444 (1988), przez komputerowe implementacje tych algorytmów (pakiet oprogramowania zawierający GAP, BESTFIT, FASTA i TFASTA z Wisconsin Genetics Software wersja 7.0 (Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wisconsin), pakiet programów Geneworks lub MacVector), lub przez sprawdzenie i najlepsze dopasowanie (tj. dające najwyższy stopień homologii w okienku porównania) otrzymane różnymi metodami jest wybierane.

Stosowany niniejszym termin „identyczność sekwencji oznacza dwa polinukleotydy lub sekwencje aminokwasowe identyczne (np., nukleotyd za nukleotydem lub aminokwas za aminokwasem) w okienku porównania. Stosowany niniejszym termin „procent identyczności sekwencji” obliczany jest dla porównania dwóch optymalnie dopasowanych (przyrównanych) sekwencji w okienku porównania, przez określenie liczby pozycji, w których występują identyczne w obu sekwencjach zasady kwasów

PL 214 003 Β1 nukleinowych (np. A, T, C, G, U lub I) lub reszty aminokwasowe, z otrzymaniem liczby pasujących do siebie pozycji, podzielenie liczby pasujących do siebie pozycji przez liczbę wszystkich pozycji w okienku porównania (tj., przez rozmiar okienka), a następnie pomnożenie przez 100 w celu otrzymania procentu identyczności sekwencji. Stosowany niniejszym termin „zasadnicza identyczność” oznacza sekwencje polinukleotydowe lub aminokwasowe zawierające sekwencje o przynajmniej 85% identyczności sekwencji, korzystnie przynajmniej 90 do 95% identyczności sekwencji, zwykle przynajmniej 99% identyczności w porównaniu do sekwencji odniesienia w okienku porównania zawierającym przynajmniej 18 pozycji nukleotydowych (6 aminokwasowych), często w okienku o przynajmniej 24-48 pozycjach nukleotydowych (8-16 aminokwasowych), przy czym procent identyczności sekwencji oblicza się przez porównanie sekwencji odniesienia z tą sekwencją, która może zawierać delecje lub insercje, których liczba wynosi 20% lub mniej w sekwencji odniesienia w okienku porównania. Sekwencja odniesienia może być podzbiorem większej sekwencji.

Stosowane w niniejszym opisie nazwy dwudziestu typowych aminokwasów i ich skróty są zgodne z konwencjonalnym użyciem. Patrz Immunology - A synthesis (drugie wydanie, E.S. Golub D.R. Green, red., Sinauer Associates, Sunderland, Mass (1991)). Odpowiednimi składnikami polipeptydów według wynalazku mogą również być stereoizomery (np. aminokwasy D) dwudziestu typowych aminokwasów, niewystępujące w naturze aminokwasy, takie jak α,α-dipodstawione aminokwasy, N-alkiloaminokwasy, kwas mlekowy i inne niekonwencjonalne aminokwasy. Przykłady niekonwencjonalnych aminokwasów obejmują: 4-hydroksyprolinę, y-karboksyglutaminian, ε-Ν,Ν,Ν-trimetylolizynę, ε-Ν-acetylolizynę, O-fosfoserynę, N-acetyloserynę, N-formylometioninę, 3-metylohistydynę, 5-hydroksylizynę, σ-Ν-metyloragininę oraz inne podobne aminokwasy i iminokwasy (np. 4-hydroksyprolinę). W stosowanym tu zapisie aminokwasów lewa strona odpowiada końcowi aminowemu, a prawa strona końcowi karboksylowemu, zgodnie ze standardowym zapisem i zwyczajem.

Podobnie, o ile nie zaznaczono inaczej, lewy koniec sekwencji pojedynczej nici polinukleotydowej odpowiada końcowi 5'; lewy koniec dwuniciowej sekwencji polinukleotydowej odpowiada końcowi 5’. Kierunek 5’-3' powstającego transkryptu RNA określa się jako kierunek transkrypcji; regiony sekwencji nici DNA o sekwencji takiej samej jak nić RNA i położone w kierunku 5’ od końca 5’ transkryptu określa się jako „sekwencje powyżej (ang. upstream); regiony sekwencji nici DNA o sekwencji takiej samej jak nić RNA i położone w kierunku 3' od końca 3’ transkryptu określa się jako „sekwencje poniżej (ang. downstream).

Stosowany niniejszym termin „zasadnicza identyczność” w odniesieniu do polipeptydów oznacza, że dwie sekwencje polipeptydowe, po ich optymalnym dopasowaniu, na przykład uzyskanym za pomocą programu GAP czy BESTFIT z domyślnymi wagami dla przerw, mają przynajmniej 80% identyczność sekwencji, korzystniej przynajmniej 90% identyczność sekwencji, bardziej korzystnie przynajmniej 95% identyczność sekwencji, a najkorzystniej przynajmniej 99% identyczność sekwencji. Korzystnie, pozycje reszt aminokwasowych, które nie są identyczne, różnią się konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi. Konserwatywne podstawienia aminokwasowe odnoszą się do wymiany reszt o podobnych łańcuchach bocznych. Przykładowo, grupę aminokwasów o alifatycznych łańcuchach bocznych stanowią glicyna, alanina, walina, lecucyna i izoleucyna; grupę aminokwasów o alifatyczno-hydroksylowych łańcuchach bocznych stanowią seryna i treonina; grupę aminokwasów zawierających grupę amidową w łańcuchach bocznych stanowią asparaginian i glutaminian; grupę aminokwasów o aromatycznych łańcuchach bocznych stanowią fenyloalanina, tyrozyna itryptofan; grupę aminokwasów o zasadowych łańcuchach bocznych stanowią lizyna, arginina i histydyna; a grupę aminokwasów o łańcuchach bocznych zawierających siarkę stanowią metionina i cysteina. Grupy walina-leucyna-izoleucyna, fenyloalanina-tyrozyna, lizyna-arginina, alanina-walina, asparaginian-glutaminian i glutamina-asparagina stanowią korzystne konserwatywne grupy podstawień aminokwasowych.

Jak omówiono niniejszym, uważa się, że mniejsze zmiany w sekwencji aminokwasowej przeciwciał lub cząsteczek immunoglobulin są w zasięgu niniejszego wynalazku, sprawiając, że różnice sekwencji aminokwasowej utrzymują się na poziomie przynajmniej 90%, 95% i najkorzystniej 99%. W szczególności rozważane są konserwatywne podstawienia aminokwasowe. Konserwatywne podstawienia aminokwasowe to takie, które mają miejsce w obrębie rodziny aminokwasów spokrewnionych łańcuchem bocznym. Kodowane genetycznie aminokwasy są ogólnie podzielone na rodziny (1) kwasowe= asparaginian, glutaminian; (2) zasadowe= lizyna, arginina, histydyna; (3) niepolarne= alanina, walina, leucyna, izoleucyna, prolina, fenyloalanina, metionina, tryptofan oraz (4) nienaładowane polarne= glicyna, asparagina, glutamina, cysteina, seryna, treonina i tyrozyna. Najkorzystniejszymi

PL 214 003 Β1 rodzinami są: seryna i treonina, które stanowią rodzinę aminokwasów alifatyczno-hydroksylowych; asparagina i glutamina, które stanowią rodzinę aminokwasów zawierających grupę amidową; alanina, walina, leucyna i izoleucyna, które stanowią rodzinę alifatyczną; i fenyloalanina, tryptofan i tyrozyna, które stanowią rodzinę aminokwasów aromatycznych. Przykładowo, można oczekiwać że pojedyncze zastąpienie leucyny izoleucyną lub waliną, asparaginianu glutaminianem, treoniny serynąlub podobne zastąpienie aminokwasu pokrewnym strukturalnie aminokwasem nie wywrze dużego wpływu na właściwości wiązania powstałej cząsteczki, w szczególności, jeśli podstawienie nie dotyczy aminokwasu w miejscu wiązania. Na podstawie oznaczenia specyficznej aktywności pochodnej polipeptydu można bez trudu określić, czy w wyniku zmiany aminokwasu powstaje funkcjonalny polipeptyd. Odpowiednie testy opisano szczegółowo w niniejszym zgłoszeniu. Specjalista w dziedzinie może łatwo przygotować fragmenty bądź analogi przeciwciał lub cząsteczek immunoglobulin. Korzystnie końce aminowe i karboksylowe fragmentów lub analogów przypadają blisko granic domen funkcjonalnych. Domeny strukturalne i funkcjonalne można określić porównując dane sekwencji nukleotydowej i/lub aminokwasowej z publicznymi lub prywatnymi bazami danych. Korzystnie, do określenia motywów sekwencji lub przewidywanych domen konformacji białka występujących w innych białkach o znanej strukturze i/lub funkcji, wykorzystuje się komputerowe metody porównawcze. Znane są metody identyfikacji sekwencji białkowych, które ulegają fałdowaniu w znane struktury trójwymiarowe, Bowie i wsp., Science 253:164 (1991). Zatem, zamieszczone dalej przykłady pokazują, że specjalista w dziedzinie może rozpoznawać motywy sekwencji i konformacji strukturalnej, które można wykorzystać do określania domen strukturalnych i funkcjonalnych.

Korzystnymi podstawieniami aminokwasowymi są takie, które: (1) zmniejszają podatność na proteolizę, (2) zmniejszają podatność na utlenienie, (3) zmieniają powinowactwo wiązania do tworzenia kompleksów białkowych i (4) nadają lub zmieniają inne fizycznochemiczne lub funkcjonalne właściwości takich analogów. Analogi mogą obejmować różne muteiny sekwencji, inne niż naturalnie występujące sekwencje peptydowe. Przykładowo, pojedyncze lub wielokrotne podstawienia aminokwasowe (korzystnie podstawienia aminokwasowe konserwatywne) mogą być zrobione w naturalnie występującej sekwencji (korzystnie w części polipeptydu poza domeną (domenami) uczestniczącą w oddziaływaniach między cząsteczkami). Konserwatywne podstawienie aminokwasowe nie powinno istotnie zmieniać strukturalnych właściwości macierzystej cząsteczki (np. zmiana aminokwasu nie powinna przerywać helisy występującej w macierzystej cząsteczce lub zaburzać innego rodzaju struktury drugorzędowe występujące w macierzystej cząsteczce). Przykłady znanych w dziedzinie drugorzędowych i trzeciorzędowych struktur białek opisane są w Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, W. H. Freeeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)) oraz Thornton i wsp., Naturę 354:105 (1991).

Stosowany niniejszym termin „fragment polipeptydu” odnosi się do polipeptydu o delecji na końcu aminokwasowym i/lub karboksylowym, ale w którym sekwencja pozostałych aminokwasów jest identyczna jak w odpowiednich pozycjach naturalnie występującej sekwencji określanej, przykładowo, na podstawie pełnej długości sekwencji cDNA. Fragmenty zwykle mają długość przynajmniej 5, 6, 8 lub 10 aminokwasów, korzystnie długość przynajmniej 14 aminokwasów, bardziej korzystnie długość przynajmniej 20 aminokwasów, zazwyczaj długość przynajmniej 50 aminokwasów i jeszcze korzystniej długość przynajmniej 70 aminokwasów. Stosowany niniejszym termin „analog” dotyczy polipeptydów składających się z odcinka przynajmniej 25 aminokwasów o zasadniczej identyczności do części wydedukowanej sekwencji aminokwasowej i o przynajmniej jednej z następujących właściwości: (1) specyficzne wiązanie do CTLA-4, w odpowiednich warunkach wiązania, (2) zdolność blokowania wiązania CTLA-4 do jego receptorów, lub (3) zdolność hamowania wzrostu komórek wyrażających CTLA-4 in vitro lub in vivo. Zazwyczaj analogi polipeptydów zawierają konserwatywne pod względem naturalnie występującej sekwencji podstawienie aminokwasowe (lub addycję lub delecję). Analogi zazwyczaj mają długość 20 aminokwasów, korzystnie przynajmniej 50 aminokwasów lub więcej i często mogą być równie długie jak naturalnie występujący polipeptyd.

Analogi peptydów są często używane w przemyśle farmaceutycznym jako niepeptydowe leki o właściwościach analogicznych do peptydu będącego ich matrycą. Ten rodzaj związków niepeptydowych nazywa się „mim etyka mi peptydów” lub „peptydomimetykami”, Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Vebere i Freidinger TINS str. 392 (1985); Evans i wsp. J. Med. Chem. 30:1229 (1987). Takie związki zwykle są opracowywane przy użyciu komputerowego modelowania cząsteczek. Mimetyki peptydów, które są strukturalnie podobne do użytecznych leczniczo peptydów, mogą być stoso

PL 214 003 Β1 wane do wytwarzania ekwiwalentnego skutku profilaktycznego lub terapeutycznego. Ogólnie, peptydomimetyki są strukturalnie podobne do modelowego peptydu (np. polipeptydu o właściwościach biochemicznych lub aktywności farmakologicznej), takiego jak ludzkie przeciwciało, ale jedno lub więcej z ich wiązań peptydowych jest ewentualnie zastąpiona wiązaniem wybranym spośród -CH₂NH-, -CH₂S-, -CH₂-CH₂-, -CH=CH- (cis i trans), -COCH₂-, -CH(OH)CH₂- oraz -CH₂SO-, metodami dobrze znanymi w dziedzinie. Do wytworzenia bardziej stabilnego peptydu można wykorzystać uporządkowane podstawienie jednego lub więcej aminokwasów sekwencji konsensusowej (sekwencji najwyższej zgodności) D-aminokwasem tego samego rodzaju (np. podstawiając D-lizynę w miejsce L-lizyny). Ponadto, metodami znanymi w dziedzinie można tworzyć wewnętrznie związane peptydy zawierające sekwencję konsensusową (Rizo i Gierasch Ann Rev. Biochem. 61:387 (1997)); przykładowo, dodając wewnętrzne reszty cysternowe, pozwalające na tworzenie mostków disiarczkowych, które prowadzą do cyklizacji białka.

„Przeciwciało lub „peptyd(y) przeciwciała odnoszą się do nienaruszonego przeciwciała lub jego wiążącego fragmentu (tj. fragmentu odpowiadającego za wiązanie), który współzawodniczy z nienaruszonym przeciwciałem w swoistym wiązaniu. Fragmenty wiążące wytwarza się technikami rekombinowanego DNA lub przez chemiczne czy też enzymatyczne cięcie nienaruszonych przeciwciał. Fragmenty wiążące obejmują Fab, Fab', F(ab')₂, Fv i przeciwciała jednołańcuchowe. Jako przeciwciało inne niż „bispecyficzne lub „bifunkcyjne rozumie się przeciwciało, którego każde miejsce wiążące jest identyczne. Przeciwciało zasadniczo hamuje wiązanie receptora z ligandem, gdy nadmiar przeciwciała zmniejsza ilość receptora związanego z ligandem o co najmniej 20%, 40%, 60%, 80%, a zazwyczaj więcej niż 85% lub więcej (mierzone in wtro w teście wiązania kompetycyjnego).

Termin „epitop” obejmuje dowolną determinantę białkową zdolną do specyficznego wiązania z immunoglobuliną lub receptorem komórki T. Determinanty epitopów zwykle składają się z chemicznie aktywnych ugrupowań powierzchniowych cząsteczek, takich jak aminokwasy lub boczne łańcuchy cukrowe i zazwyczaj posiadają specyficzne trójwymiarowe właściwości, jak również specyficzny rozkład ładunku. Uważa się, że przeciwciało specyficznie wiąże antygen, jeśli stała dysocjacji jest <1 μΜ, korzystnie <100 nM, a najkorzystniej <10 nM.

Stosowany niniejszym termin „środek” dotyczy związku chemicznego, mieszaniny związków chemicznych, makrocząsteczki biologicznej lub wyciągu sporządzonego z materiału biologicznego.

Stosowany niniejszym termin „znacznik” lub „wyznakowany” dotyczy włączania wykrywalnego markera, np. przez włączenie wyznakowanego radioaktywnie aminokwasu lub dołączenie do polipeptydu ugrupowań biotynylowych, które można wykryć znakowaną awidyną (np. streptawidyną zawierająca marker fluorescencyjny lub marker o aktywności enzymatycznej, który można wykryć metodami optycznymi bądź kolorymetrycznymi). W pewnych sytuacjach znacznik lub marker mogą również być lecznicze. Zastosować można rozmaite metody znakowania polipeptydów i glikoprotein znane w dziedzinie. Przykłady znaczników dla polipeptydów obejmują nieograniczająco następujące: radioizotopy lub radionuklidy (np. ³H, ¹⁴C, ¹⁵N, ³⁵S, ⁹⁰Y, Tc, 'in, ¹²⁵l, ¹³¹1), znaczniki fluorescencyjne (np. FITC, rodamina, luminofory z domieszką lantanowców), znaczniki enzymatyczne (np. peroksydaza chrzanowa, β-galaktozydaza, lucyferaza, fosfataza alkaliczna), chemiluminescencyjne, grupy biotynylowe, wcześniej określone epitopy polipeptydowe rozpoznawane przez drugorzędową grupę reporterową(np. sekwencje suwaka leucynowego, miejsca wiązania dla przeciwciał drugorzędowych, domeny wiązania metali, znaczniki epitopowe). Znaczniki mogą być przyłączone przez ramiona łącznikowe (ang. spacer) różnej długości, aby zmniejszyć potencjalną zawadę sferyczną.

Stosowany niniejszym termin „środek farmaceutyczny lub lek dotyczy związku chemicznego lub kompozycji zdolnej do wywołania pożądanego skutku leczniczego przy podaniu w odpowiedni sposób pacjentowi. Inne terminy chemiczne tu używane są zgodnie z konwencjonalnym użyciem i znaczeniem w dziedzinie, jak wskazano przykładowo wThe MaeGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker S., McGraw-Hill, San Francisco (1985)).

Stosowany niniejszym termin „środek przeciwnowotworowy” odnosi się do środków, których funkcjonalną cechą jest hamowanie rozwoju lub progresji nowotworu u człowieka, w szczególności złośliwych zmian nowotworowych (rakowych), takich jak rak, mięsak, chłoniak lub białaczka. Hamowanie przerzutów jest częstą właściwością środków przeciwnowotworowych.

Stosowany niniejszym termin „zasadniczo czysty” oznacza, że rodzaj substancji jest obecny w przeważającej mierze (np. jego masa molowa jest większa niż któregokolwiek z pozostałych indywidualnych składników kompozycji) i korzystnie zasadniczo czysta frakcja jest kompozycją, w której dany rodzaj substancji stanowi przynajmniej 50% (na podstawie molowej) wszystkich obecnych rodzą

PL 214 003 Β1 jów makrocząsteczek. Zwykle zasadniczo czysta kompozycja zawiera więcej niż około 80% wszystkich rodzajów makrocząsteczek obecnych w kompozycji, bardziej korzystnie więcej niż około 80%, 90%, 95% i 99%. Najkorzystniej, przedmiotowa substancja jest oczyszczona do zasadniczej homogenności (zanieczyszczenia nie mogą być w mieszaninie wykryte konwencjonalnymi sposobami detekcji), przy czym kompozycja składa się zasadniczo z jednego rodzaju makrocząsteczek.

Termin pacjenci obejmuje ludzi i podmioty weterynaryjne.

Struktura przeciwciał

Jak wiadomo, podstawową jednostkę strukturalną przeciwciała stanowi tetramer. Każdy tetramer składa się z dwóch identycznych par łańcuchów polipeptydowych, a każda para z łańcucha „lekkiego (około 25 kDa) i łańcucha „ciężkiego (około 50-70 kDa). Część amino-końcowa każdego łańcucha zawiera region zmienny obejmujący 100 do 110 lub więcej aminokwasów głównie odpowiedzialny za rozpoznanie antygenu. Część karboksy-końcowa każdego łańcucha stanowi region stały głównie odpowiedzialny za funkcje efektorowe. Ludzkie łańcuchy lekkie są zaklasyfikowane jako łańcuchy kappa i lambda. Łańcuchy ciężkie są zaklasyfikowane jako mu, delta, gamma, alfa lub epsilon i definiują izotyp przeciwciała jako IgM, IgD, IgG, IgA i IgE, odpowiednio. W obrębie łańcuchów lekkich i ciężkich, regiony zmienne są połączone regionem „J obejmującym około 12 lub więcej aminokwasów, a łańcuch ciężki zawiera również region „D” złożony z około 10 aminokwasów. Patrz, Fundamental Immunology rozdz. 7 (Paul, W., wyd. 2-gie. Raven Press, N. Y. (1989)). Regiony zmienne z każdej pary łańcuchów lekki/ciężki tworzą miejsce wiązania przeciwciała.

A zatem, nienaruszone przeciwciało IgG ma dwa miejsca wiązania. Z wyjątkiem przeciwciał bifunkcjonalnych albo bispecyficznych, dwa miejsca wiązania są takie same.

Wszystkie łańcuchy wykazują taką samą ogólną strukturę stosunkowo konserwatywnych regionów zrębowych (FR, ang. framework region) połączonych trzema regionami superzmiennymi, nazywanymi również regionami określającymi komplementarność lub CDR {ang. complementarity determining regions). Regiony CDR z dwóch łańcuchów z każdej pary są dopasowane do siebie poprzez regiony zrębowe, umożliwiając wiązanie specyficznego epitopu. W kierunku od końca N do końca C, zarówno łańcuchy lekkie, jak i ciężkie zawierają domeny FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. Aminokwasy przypisuje się do odpowiedniej domeny zgodnie z definicją Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 i 1991)) lub Chothia i Lesk J., Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia i wsp. Naturę 342:878-883 (1989).

Przeciwciała bispecyficzne albo bifunkcjonalne są sztucznymi hybrydowymi przeciwciałami mającymi dwie różne pary ciężkich/lekkich łańcuchów i dwa różne miejsca wiązania. Przeciwciała bispecyficzne można wytworzyć różnymi sposobami, łącznie z fuzją hybrydom albo łączeniem fragmentów Fab’. Patrz np. Songsivilai i Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990), Kostelny i wsp., J. Immunol. 148:1547-1553 (1992). Ponadto bispecyficzne przeciwciała można wytwarzać jako „diciała” {ang. diabody) (Holliger i wsp. „Diabodies: smali bivalent and bispecific antibody fragments” PNAS USA 90:6444-6448 (1993)) albo przeciwciało typu „Janusin” (Traunecker i wsp. „Bispecific single chain molecules (Janusins) target cytotoxic lymphocytes on HIV infected cells” EMBO J 10:3655-3659 (1991) oraz Traunecker i wsp. „Janusin: new molecular design for bispecific reagents” Int J CancerSuppl 7:51-52 (1992)).

Wytwarzanie bispecyficznych przeciwciał możne być stosunkowo pracochłonnym procesem w porównaniu z wytwarzaniem konwencjonalnych przeciwciał, a wydajność i stopień czystości jest zasadniczo niższy dla przeciwciał bispecyficznych. Przeciwciała bispecyficzne nie istnieją w formie fragmentów mających pojedyncze miejsce wiązania (np. Fab, Fab’ i Fv).

Ludzkie przeciwciała i humanizowanie przeciwciał

Ludzkie przeciwciała pozwalają uniknąć pewnych problemów związanych z przeciwciałami posiadającymi mysie i szczurze regiony zmienne i/lub stale. Obecność takich białek pochodzących od myszy i szczurów może prowadzić do szybkiego usuwania przeciwciał z organizmu albo może prowadzić do wywołania u pacjenta odpowiedzi immunologicznej przeciwko przeciwciału. Aby unikać zastosowania przeciwciała pochodzących od myszy lub szczura, postuluje się możliwość uzyskania przeciwciał humanizowanych albo wytworzenia przeciwciał w pełni ludzkich poprzez wprowadzenie funkcji ludzkich przeciwciał do gryzoni, tak aby gryzoń mógł wytwarzać przeciwciała mające całkowicie ludzkie sekwencje.

PL 214 003 Β1

Ludzkie przeciwciała

Możliwość klonowania i rekonstrukcji ludzkiego loci o rozmiarach milionów par zasad w YAC i wprowadzania ich do linii zarodkowych myszy stanowi potężne narzędzie do identyfikowania funkcjonalnych składników bardzo dużych albo jedynie wstępnie zmapowanych loci, jak również do wytwarzania przydatnych modeli chorób ludzkich. Ponadto, wykorzystywanie takiej technologii do zastąpienia mysich loci ich ludzkimi ekwiwalentami mogłoby stanowić unikalną możliwość badania ekspresji i regulacji produktów genowych w czasie rozwoju, ich komunikowania się z innymi układami oraz ich udziału w indukcji i rozwoju chorób.

Ważnym praktycznym zastosowaniem takiej strategii jest „humanizowanie” mysiego humoralnego układu immunologicznego. Wprowadzenie ludzkich loci immunoglobulinowych (Ig) do myszy, w której endogenne geny Ig zostały zinaktywowane, oferuje możliwość badania mechanizmów leżących u podstaw programowanej ekspresji i procesu składania przeciwciał, jak również ich roli w rozwoju komórek B. Ponadto, taka strategia stanowiłaby idealne źródło wytwarzania w pełni ludzkich przeciwciał monoklonalnych (Mab) - milowy krok w stronę spełnienia obietnicy terapii ludzkich chorób przeciwciałami. Oczekuje się, że w pełni ludzkie przeciwciała zminimalizują immunogenne i alergiczne reakcje związane z mysimi i pochodzącymi z myszy Mab, a zatem zwiększą skuteczność i bezpieczeństwo podawanych przeciwciał. Można oczekiwać, że zastosowanie w pełni ludzkich przeciwciał dostarczy istotnych korzyści w leczeniu przewlekłych i nawracających ludzkich chorób, takich jak zapalenie, choroby autoimmunologiczne i nowotwory, które wymagają powtarzającego się podawania przeciwciał.

Jednym z podejść zmierzających do tego celu było otrzymanie myszy niewytwarzających mysich przeciwciał (tj. z niedoborem wytwarzania własnych przeciwciał), z dużymi fragmentami ludzkich loci Ig, spodziewając się, że takie myszy będą wytwarzać szeroki repertuar ludzkich przeciwciał pod nieobecność przeciwciał mysich. Duże fragmenty ludzkich Ig zachowują dużą zmienność genową, jak również odpowiednią regulację wytwarzania i ekspresji przeciwciał. Poprzez wykorzystanie mysiej maszynerii do otrzymywania różnorodności i selekcji przeciwciał oraz brak tolerancji immunologicznej wobec ludzkich białek, odtworzony repertuar ludzkich przeciwciał w tych myszach może dawać przeciwciała o wysokim powinowactwie wobec dowolnego antygenu będącego przedmiotem zainteresowania, włączając w to antygeny ludzkie. Stosując technologię hybrydomy można wytworzyć i wyselekcjonować od ręki ludzkie Mab o pożądanej specyficzności wobec antygenu.

Tą ogólną strategię zaprezentowano w związku z opracowaniem przez nas pierwszego rodzaju XenoMouse™ jak opublikowano w 1994. Patrz Green i wsp. Naturę Genetics 7:13-21 (1994). XenoMouse™ otrzymane przy użyciu sztucznych chromosomów drożdżowych (ang. yeast artificial chromosomes, YAC) zawierających fragmenty o wielkości 245 kb i 190 kb do konfiguracji linii zarodkowej ludzkiego łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego kappa, odpowiednio, które zawierają sekwencje rdzeniowe regionu zmiennego i stałego. Udowodniono, że YAC zawierający ludzką Ig odpowiada mysiemu systemowi zarówno w kwestii re-aranżacji, jak i wyrażania przeciwciał i wykazuje zdolność do zastępowania inaktywowanych genów mysich. Zostało to pokazane przez ich zdolność do indukowania rozwoju komórek B, do tworzenia repertuaru całkowicie ludzkich przeciwciał typu dorosłego i do wytwarzania specyficznych wobec antygenu ludzkich Mab. Wyniki te sugerują również, że wprowadzenie większej porcji loci ludzkiego Ig zawierających większą liczbę genów V, dodatkowe elementy regulatorowe i regiony stałe ludzkich Ig może odtworzyć zasadniczo pełen repertuar, który jest charakterystyczny dla ludzkiej odpowiedzi humoralnej na infekcję i immunizację. Praca Green i wsp. została ostatnio rozszerzona o wprowadzenie ponad 80% repertuaru ludzkich przeciwciał poprzez wprowadzenie fragmentów YAC o wielkości tysięcy par zasad i konfiguracji zarodkowej loci ludzkiego łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego kappa, odpowiednio, z wytworzeniem myszy XenoMouse™. Patrz Mendez i wsp. Naturę Genetics 15:146-156 (1997), Green i Jakobovits J: Exp. Med. 188:483-495 (1998) oraz zgłoszenie patentowe USA, nr seryjny 08/759,620, złożone 3 grudnia, 1996.

Takie podejście jest dalej omawiane i przedstawione w zgłoszeniach patentowych USA o nr seryjnych: 07/466,008, z 12 stycznia 1990, 07/610,515, z 8 listopada 1990, 07/919,297, z 24 lipca 1992, 07/922,649, z 30 lipca 1992, 08/031,801 z 15 marca 1993, 08/112,848 z 27 sierpnia 1993, 08/234,145 z 28 kwietnia 1994, 08/376,279, z 20 stycznia 1995, 08/430, 938 z 27 kwietnia 1995, 08/464,584 z 5 czerwca 1995, 08/464,582 z 5 czerwca 1995, 08/463,191 z 5 czerwca 1995, 08/462,837 z 5 czerwca 1995, 08/486,853 z 5 czerwca 1995, 08/486,857 z 5 czerwca 1995, 08/486,859 z 5 czerwca 1995, 08/462,513 z 5 czerwca 1995, 08/724,752 z 2 października 1996 i 08/759,620 z 3 grudnia 1996. Patrz także Mendez i wsp. Naturę Genetics 15:146-156 (1997) oraz Green i Jakobovits J. Exp. Med. 188:483495

PL 214 003 Β1 (1998). Patrz także europejskie zgłoszenie patentowe nr EP 0463 151 B1, o udzieleniu którego opublikowano 12 czerwca 1996, międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO 94/02602, opublikowane 3 lutego 1994, międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO 96/34096, opublikowane 31 października 1996 i WO 98/24893 opublikowane 11 czerwca 1998.

W alternatywnym podejściu inni, włączając w to GenPharm International, Inc. wykorzystali strategię „minilocus”. W strategii minilocus, egzogenny locus Ig jest naśladowany poprzez włączenie kawałków (poszczególnych genów) pochodzących z locus Ig. A zatem jeden lub więcej genów V_H, jeden lub więcej genów D_H jeden lub więcej genów J_H, region stały mu i drugi region stały (korzystnie region stały gamma) tworzy się w konstrukcie do wstawienia do zwierzęcia. Podejście to jest opisane w patencie USA nr 5,545,807 na rzecz Surani i wsp. oraz w patentach USA Nr 5,545,806, 5,625,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016, 5,770,429, 5,789,650 i 5,814,318, każdy na rzecz Lonberg i Kay, w patencie USA nr 5,591,669 na rzecz Krimpenfort i Bems, w patentach USA nr 5,612,205, 5,721,367, 5,789,215 na rzecz Bems i wsp., w patencie USA nr 5,643,763 na rzecz Choi i Dunn oraz w zgłoszeniach patentowych USA GenPharm International o nr seryjnych: 07/574,748 z 29 sierpnia 1990, 07/575,962 z 31 sierpnia 1990, 07/810,279 z 17 grudnia 1991, 07/853,408 z 18 marca 1992, 07/904,068, złożone 23 czerwca, 1992, 07/990,860, złożone 16 grudnia, 1992, 08/053,131 z 26 kwietnia 1993, 08/096,762 z 22 lipca 1993, 08/155,301 z 18 listopada 1993, 08/161,739 z 3 grudnia 1993, 08/165,699 z 10 grudnia 1993, 08/209,741 z 9 marca 1994. Patrz także europejskie zgłoszenie patentowe nr 0 546 073 B1, międzynarodowe zgłoszenia patentowe nr WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852 i WO 98/24884. Patrz ponadto Taylor i wsp., (1992), Chen i wsp., (1993), Tuaillon i wsp., 1993, Choi et al., (1993), Lonberg i wsp., (1994), Taylor i wsp., (1994) oraz Tuaillon i wsp., (1995), Fishwild i wsp., (1996).

Surani i wsp., którzy przenieśli prawa z wynalazku na Medical Research Counsel („MRC”), wytworzyli transgeniczną mysz posiadającą locus Ig przez zastosowanie podejścia minilocus. Lonberg i Kay zGenPhann International, idąc śladem twórców niniejszego wynalazku, zaproponowali inaktywację endogennego mysiego locus Ig połączoną z powtórzeniem zasadniczo prac Surani i wsp.

Zaletą podejścia minilocus jest szybkość z jaką można wytworzyć i wprowadzić do zwierząt konstrukty zawierające części locus Ig. Jednakże, z drugiej strony, znaczącą niedogodnością podejścia wykorzystującego minilocus jest to, że w teorii uzyskuje się niedostateczne zróżnicowanie niewielkiej liczby genów V, D i J. Rzeczywiście, opublikowane prace wydają się potwierdzać taką obawę. Uzyskiwanie komórek B i wytwarzanie przeciwciał przez zwierzęta otrzymywane w podejściu minilocus wydaje się być wstrzymane. Dlatego badania skoncentrowane wokół niniejszego wynalazku kierowano stale w stronę wprowadzenia większych części locus Ig w celu uzyskania większego zróżnicowania i w celu zrekonstruowania repertuaru immunologicznego zwierząt.

Odpowiedzi ludzkich przeciwciał anty-mysich (ang. human anti-mouse antibody, HAMA) doprowadziły do przemysłowego otrzymywania chimerowych i w inny sposób humanizowanych przeciwciał. Jakkolwiek chimerowe przeciwciała mają ludzkie regiony stałe i mysie regiony zmienne, można się spodziewać, że będą obserwowane pewne odpowiedzi ludzkich przeciwciał anty-chimerowych (ang. human anti-chimeric antibody, HACA), szczególnie przy długotrwałym lub wielodawkowym stosowaniu przeciwciała. A zatem, będzie pożądane dostarczenie w pełni ludzkich przeciwciał wobec CTLA-4 w celu oddalenia obaw i/lub działań związanych z odpowiedzią HAMA lub HACA.

Technologie humanizowania i prezentacji

Jak omówiono powyżej w odniesieniu do wytwarzania ludzkiego przeciwciała, istnieją zalety wytwarzania przeciwciał o obniżonej immunogenności. Do pewnego stopnia można je uzyskać w powiązaniu z technikami humanizacji i prezentacji stosując odpowiednie biblioteki. Będzie można dostrzec, że mysie przeciwciała albo przeciwciała z innych gatunków można humanizować albo upodobnić do przeciwciał naczelnych (ang. primatize) stosując techniki znane w tej dziedzinie. Patrz na przykład, Winter i Harris Immunol Today 14:43-46 (1993) oraz Wright i wsp. Crit. Reviews in Immunol 12125-168 (1992). Przeciwciało będące przedmiotem zainteresowania można skonstruować techniką rekombinowania DNA w celu zastąpienia domen zawiasowych CH1, CH2 i CH3 i/lub domen zrębowych odpowiednimi sekwencjami ludzkimi (patrz WO 92/02190 i patenty USA nr 5,530,101, 5,585,089, 5,693,761, 5,693,792, 5,714,350 i 5,777,085). Ponadto znane jest w tej dziedzinie stosowanie cDNA Ig w celu rekonstrukcji genów immunoglobulinowych (Liu i wsp. P.N.A.S. 84:3439 (1987) oraz J. Immunol.139:3521 (1987)). mRNA izoluje się z hybrydomy albo innych komórek wytwarzających przeciwciała i używa się do wytworzenia cDNA. cDNA będący przedmiotem zain

PL 214 003 Β1 teresowania można powielać w reakcji łańcuchowej polimerazy stosując specyficzne startery (patenty USA nr 4,683,195 i 4,683,202). Alternatywnie, tworzy się i przeszukuje biblioteki w celu wyizolowania sekwencji będącej przedmiotem zainteresowania. Sekwencja DNA kodująca region zmienny przeciwciała poddawana jest fuzji z sekwencjami ludzkiego regionu stałego. Sekwencje genów ludzkich regionów stałych można znaleźć w Kabat i wsp. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, N.I.H. publikacja nr 91-3242. Geny ludzkich regionów C są łatwo dostępne ze znanych klonów. Przy wyborze izotypu będzie można kierować się pożądanymi funkcjami efektorowymi, takimi jak wiązanie dopełniacza albo aktywność przy zależnej od przeciwciała cytotoksyczności komórkowej. Korzystnymi izotypami są lgG1, lgG2, lgG3 i lgG4. Szczególnie użytecznymi izotypami dla przeciwciał opisanych niniejszym są lgG2 i lgG4. Można zastosować każdy z regionów stałych ludzkiego łańcucha lekkiego, kappa lub lambda. Chimerowe, humanizowane przeciwciała można następnie wyrażać poprzez zastosowanie konwencjonalnych metod.

Fragmenty przeciwciał, takie jak Fv, F(ab')₂ i Fab można przygotować poprzez cięcie białka będącego przedmiotem zainteresowania, np. poprzez cięcie proteazą albo cięcie chemiczne. Alternatywnie, projektuje się gen skrócony. Przykładowo, chimerowy gen kodujący część fragmentu F(ab')₂ będzie zawierał sekwencje DNA kodujące domenę CHI i region zawiasowy łańcucha H, po którym następuje kodon stop dla translacji, tak aby otrzymać cząsteczkę skróconą.

W jednym z podejść można zastosować sekwencje najwyższej zgodności kodujące ciężkie i lekkie łańcuchy regionów J w celu zaprojektowania oligonukleotydów do zastosowania jako startery do wprowadzenia przydatnych miejsc restrykcyjnych do regionu J w celu następującego dalej połączenia fragmentów regionu V z odcinkami ludzkiego regionu C. DNA regionu C można zmodyfikować poprzez ukierunkowaną mutagenezę w celu umieszczenia miejsca restrykcyjnego w analogicznej pozycji ludzkiej sekwencji.

Wektory ekspresyjne obejmują plazmidy, retrowirusy, kosmidy, YAC, episomy pochodzące od EBV i tym podobne. Dogodny wektor jest takim wektorem, który koduje funkcjonalnie kompletną sekwencję ludzkiej immunoglobuliny CH lub CL, z odpowiednimi miejscami restrykcyjnymi utworzonymi w taki sposób, aby można było wstawiać i wyrażać dowolną sekwencję VH lub VL. W takich wektorach, składanie zwykle następuje pomiędzy donorowym miejscem składania we wstawionym regionie J i akceptorowym miejscem składania, które poprzedza ludzki region C, a także w regionie składania, który występuje w obrębie ludzkich eksonów CH. Poliadenylacja i terminacja transkrypcji następują w natywnych miejscach chromosomowych poniżej regionów kodujących. Otrzymane w rezultacie chimerowe przeciwciało można dołączyć do dowolnego silnego promotora, łącznie z retrowirusowym LTR, takiego jak np. wczesny promotor SV-40 (Okayama i wsp. Mol. Celi. Bio. 3:280 (1983)), LTR wirusa mięsaka Rousa (Gorman i wsp. P.N.A.S. 79:6777 (1982) i LTR mysiego wirusa białaczki Moloneya (Grosschedl i wsp. Celi 41 :885 (1985)); natywne promotory Ig, itd.

Ponadto, ludzkie przeciwciała lub przeciwciała z innych gatunków można wytworzyć poprzez technologię prezentacji, włączając w to między innymi prezentację na fagach, prezentację na retrowirusach, prezentację na rybosomach i inne techniki, stosowane w tej dziedzinie, a otrzymane w rezultacie cząsteczki można poddawać dalszemu dojrzewaniu, takiemu jak dojrzewanie poprzez powinowactwo, jako że techniki te są dobrze znane w tej dziedzinie. Wright i Harris, jak wyżej., Hanes i Plucthau PNAS USA 94:4937-4942 (1997) (prezentacja na rybosomach), Parmley i Smith, Gene 73:305-318 (1988) (prezentacja na fagach), Scott, TIBS 17:241-245 (1992), Cwirla i wsp., PNAS USA 87:6378-6382 (1990), Russel i wsp. Nuci. Acids Research 21:1081-1085 (1993), Hoganboom i wsp. Immunol. Reviews 130:43-68 (1992), Chiswell i McCafferty TIBTECH 10:80-84 (1992) oraz patent USA nr 5,733,743. Jeżeli technologię prezentacji stosuje się do wytworzenia przeciwciał, które nie są ludzkie, takie przeciwciała mogą być humanizowane jak opisano powyżej.

Stosując te techniki, można wytworzyć przeciwciała wobec komórek wyrażających CTLA-4, samego CTLA-4, form CTLA-4, jego peptydów i epitopów oraz bibliotek ekspresyjnych (patrz np. patent USA nr 5,703,057) które można przeszukiwać następnie jak opisano powyżej pod kątem opisanych powyżej aktywności.

Dodatkowe kryteria dla leków na bazie przeciwciał

Jak będzie to docenione, zasadniczo nie jest pożądane zabijanie komórek wyrażających CTLA-4. Raczej, ogólnie pożądane jest po prostu hamowanie wiązania CTLA-4 z jego ligandami w celu złagodzenia obniżania aktywności komórek T. Jednym z głównych mechanizmów, przez który przeciwciała zabijają komórki jest wiązanie dopełniacza i udział w CDC. Region stały przeciwciała odgrywa ważną rolę z punktu widzenia zdolności przeciwciała do wiązania dopełniacza i udziału w CDC. Zatem, gene

PL 214 003 Β1 ralnie można tak wybrać izotyp przeciwciała, aby dostarczyć zdolności wiązania dopełniacza albo nie. W przypadku niniejszego wynalazku, ogólnie, jak wspomniano powyżej, nie jest korzystne stosowanie przeciwciała, które zabija komórki. Istnieje wiele izotypów przeciwciał, które mają zdolność wiązania dopełniacza i CDC, obejmujące między innymi: mysią IgM, mysią lgG2a, mysią lgG2b, mysią lgG3, ludzką IgM, ludzką lgG1 i ludzką lgG3. Izotypy takie nie obejmują, między innymi, ludzkiej lgG2 i ludzkiej lgG4.

Będzie docenione, że przeciwciała, które są wytwarzane nie muszą wyjściowo posiadać pożądanego izotypu, ale raczej wytworzone przeciwciało może posiadać dowolny izotyp, który można później przełączyć stosując znane w dziedzinie konwencjonalne techniki. Takie techniki obejmują, między innymi, zastosowanie bezpośrednich technik rekombinowania (patrz np. patent USA nr 4.816.397). techniki fuzji komórka-komórka (patrz np. zgłoszenie patentowe nr 08/730,639 z 11 października 1996).

W technice fuzji komórka-komórka, przygotowywana jest linia komórkowa szpiczaka albo inna, która posiada łańcuch ciężki z pożądanym izotopem oraz inna linia komórkowa szpiczaka albo inna, która posiada łańcuch lekki. Takie komórki można następnie poddać fuzji i wyizolować linię komórkową wyrażającą nienaruszone przeciwciało.

Jako przykład, większość omawianych tu przeciwciał przeciwko CTLA-4 to ludzkie przeciwciało anty-CTLA-4 lgG2. Ponieważ takie przeciwciała posiadają pożądaną zdolność wiązania cząsteczki CTLA-4, dowolnemu z takich przeciwciał można łatwo zmienić izotyp w celu wytworzenia, na przykład, ludzkiego izotypu lgG4, jednocześnie posiadającego nadal ten sam region zmienny (który definiuje specyficzność przeciwciała i część jego powinowactwa).

A zatem, po wytworzeniu przeciwciał, które posiadają pożądane atrybuty „strukturalne” jak omówiono powyżej, można je zaopatrzyć w najmniej pewne dodatkowe pożądane atrybuty „funkcjonalne poprzez zmianę izotypu.

Projektowanie i wytwarzanie innych leków

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem i na podstawie aktywności przeciwciał, które są wytwarzane i charakteryzowane w odniesieniu do CTLA-4, ułatwione jest projektowanie innych środków terapeutycznych, obejmujących inne przeciwciała, innych antagonistów albo cząsteczki chemiczne inne niż przeciwciała. Takie środki obejmują, między innymi, przeciwciała o podobnej aktywności wiązania albo funkcjonalności, zaawansowane leki w oparciu o przeciwciała, takie jak przeciwciała bispecyficzne, immunotoksyny i leki wyznakowane radioaktywnie, wytwarzanie leków peptydowych, terapie genowe, a w szczególności wytwarzanie przeciwciał typu „intrabody wewnątrz komórki, terapie w oparciu o cząsteczki antysensowne i małe cząsteczki. Ponadto, jak omówiono powyżej, funkcje efektorowe przeciwciał według wynalazku można zmieniać przez zmianę izotypu na lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgD, IgA, IgE lub IgM dla różnych zastosowań leczniczych.

W związku z opracowywaniem zaawansowanych terapeutyków w oparciu o przeciwciała, dla których wiązanie dopełniacza jest pożądanym atrybutem, możliwe jest odsunięcie na bok zależności od dopełniacza, na rzecz uśmiercania komórek poprzez zastosowanie, na przykład, przeciwciał bispecyficznych, immunotoksyn i leków wyznakowanych radioaktywnie.

W odniesieniu do przeciwciał bispecyficznych, można wytworzyć przeciwciała bispecyficzne, które zawierają (i) dwa połączone ze sobą przeciwciała: jedno swoiste wobec CTLA-4, a drugie wobec innej cząsteczki, (ii) pojedyncze przeciwciało, które ma jeden łańcuch swoisty wobec CTLA-4, a drugi łańcuch swoisty wobec innej cząsteczki lub (iii) przeciwciało jednołańcuchowe, które wykazuje swoistość względem CTLA-4 i innej cząsteczki. Takie bispecyficzne przeciwciała można wytworzyć przy zastosowaniu dobrze znanych technik, na przykład odnośnie (i) i (ii), patrz Fanger i wsp. Immunol Methods 4:72-81 (1994) oraz Wright i Harris, jak wyżej, a odnośnie (iii) patrz Traunecker i wsp. Int. J. Cancer (Suppl.) 7:51-52 (1992).

Ponadto, można również wytworzyć „kappa-ciała (ang. kappabodies) (III i wsp. „Design and construction of a hybrid immunoglobulin domain with properties of both heavy and light chain variable regions” Protein Eng 10:949-57 (1997)), „mini-ciała” (ang. minibodieś) (Martin i wsp. „The affinity-selection of a minibody polypeptide inhibitor of human interleukin-6” EMBO J 13:5303-9 (1994)), „di-ciała” (Holliger i wsp. ,,'Diabodies': „smali bivalent and bispecific antibody fragments” PNAS USA 90:6444-6448 (1993)), albo przeciwciała typu „Janusin” (Traunecker i wsp. „Bispecific single chain molecules (Janusins) target cytotoxic lymphocytes on HIV infected cells” EMBO J 10:3655-3659 (1991) oraz Traunecker i wsp. „Janusin: new molecular design for bispecific reagents” Int J Cancer Suppl 7:51-52 (1992)).

PL 214 003 Β1

W odniesieniu do immunotoksyn, przeciwciała można modyfikować tak, aby działały jako immunotoksyny stosując techniki dobrze znane w dziedzinie. Patrz na przykład, Vitetta Immunol Today 14:252 (1993). Patrz również patent USA nr 5,194,594. Jeśli chodzi o wytwarzanie wyznakowanych radioaktywnie przeciwciał, takie zmodyfikowane przeciwciała można łatwo otrzymać stosując techniki dobrze znane w dziedzinie. Patrz np., Junghans i wsp. w Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (wydanie 2, Chafner i Longo, red., Lippincott Raven (1996)). Patrz również patenty USA nr 4,681,581, 4,735,210, 5,101,827, 5,102,990 (RE 35,500), 5,648,471 i 5,697,902. Każda z immunotoksyn i cząsteczek wyznakowanych radioaktywnie będzie prawdopodobnie zabijała komórki wyrażające CTLA-4, a w szczególności te komórki, wobec których przeciwciała tu opisane są skuteczne.

W odniesieniu do wytwarzania leków peptydowych poprzez zastosowanie informacji strukturalnej związanej z CTLA-4 i przeciwciałami skierowanymi wobec niego, takich jak przeciwciała według wynalazku (jak omówiono poniżej w odniesieniu do małych cząsteczek) albo poprzez przeszukiwanie bibliotek peptydowych, można wytworzyć lecznicze peptydy skierowane przeciwko CTLA-4. Projektowanie i przeszukiwanie bibliotek peptydowych jest omówione w Houghten i wsp. Biotechniques 13:412-421 (1992), Houghten PNAS USA 82:5131-5135 (1985), Pinalla i wsp. Biotechniques 13:901-905 (1992), Blake i Litzi-Davis BioConjugate Chem. 3:510-513 (1992). Immunotoksyny i leki wyznakowane radioaktywnie można również wytworzyć, w podobny sposób, w połączeniu z ugrupowaniami peptydów, jak zostało to omówione powyżej w odniesieniu do przeciwciał.

Ważne informacje dotyczące wiązania przeciwciała z antygenem można uzyskać poprzez doświadczenia z prezentacją na fagach. Takie doświadczenia prowadzi się na ogół poprzez przesiewanie biblioteki fagowej z ekspresją losowych peptydów pod kątem wiązania przeciwciał według wynalazku w celu określenia, czy można wyizolować wiążące peptydy. Jeżeli to się uda, na podstawie wiążących peptydów można zdobyć pewne informacje o epitopach.

Zasadniczo, biblioteki fagowe z ekspresją losowych peptydów oparte o system bakteriofaga M13 można nabyć w New England Biolabs (biblioteki 7-merowe i 12-merowe, Ph.D.-7 Peptide 7-mer Library Kit i Ph.D.-12 Peptide 12-mer Library Kit, odpowiednio). Biblioteka 7-merowa zawiera 2,0 χ 10⁹ niezależnych klonów, które reprezentują większość, jeżeli nie wszystkie z 20⁷ = 1,28 x 10⁹ możliwych sekwencji 7 merowych. Biblioteka 12-merowa zawiera około 1,9 χ 10⁹ niezależnych klonów, reprezentujących jedynie niewielką próbkę możliwych 20¹² = 4,1 χ 10¹⁵ sekwencji 12-merowych. Każdą z 7-merowych i 12-merowych bibliotek przesiewa się lub przeszukuje zgodnie z zaleceniami producenta, przy czym płytki są opłaszczane przeciwciałami w celu wyłapania odpowiedniego przeciwciała (na przykład kozie Fc przeciwko ludzkiej IgG dla przeciwciała IgG), a następnie przemywane. Związane fagi wymywa się przy zastosowaniu 0,2 M glicyny-HCI, pH 2,2. Po 3 rundach selekcji/namnażania przy stałej ostrości (0,5% Tween), klony z bibliotek, które wykazują reakcję z jednym albo większą liczbą przeciwciał można scharakteryzować poprzez sekwencjonowanie DNA. Reaktywność peptydów można potwierdzić w teście ELISA. Dodatkowe omówienie dotyczące analizy epitopów w peptydach można znaleźć w Scott, J. K. i Smith, G. P. Science 249:386-390 (1990); Cwirla i wsp. PNAS USA 87:63786382 (1990); Felici i wsp. J. Mol. Biol. 222:301-310 (1991) oraz Kuwabara i wsp. Naturę Biotechnology 15:74-78 (1997).

Dzięki niniejszemu wynalazkowi ułatwione jest również projektowanie leków genowych i/lub antysensownych poprzez zastosowanie konwencjonalnych technik. Takie środki można zastosować do modulowania funkcji CTLA-4. W związku z tym przeciwciała według niniejszego wynalazku ułatwiają opracowywanie i zastosowanie testów funkcjonalnych. Projektowanie i strategia terapii w oparciu o cząsteczki antysensowne jest szczegółowo omówiona w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym nr WO 94/29444. Projektowanie i strategie terapii genowej są dobrze znane. Jednakże zastosowanie technik terapii genowej w których biorą udział przeciwciała typu „intrabody” mogłoby okazać się szczególnie korzystne. Patrz np., Chen i wsp. Humań Gene Therapy 5:595-601 (1994) oraz Marasco Gene Therapy 4:11 - 15(1997). Ogólny obraz i zagadnienia dotyczące leków genowych zostały omówione w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym nr WO 97/38137. Materiał genetyczny kodujący przeciwciało (takie jak 4.1.1,4.8.1 lub 6.1.1 i inne) może znajdować się w odpowiednim układzie ekspresyjnym (czy to wirusowym, opartym na osłabionych wirusach, nie-wirusowym, nagim DNA albo innych) i podawane gospodarzowi w celu wytworzenia przeciwciał in vivow gospodarzu.

Możliwe jest także opracowanie małych cząsteczek leczniczych. W oparciu o niniejszy wynalazek można zaprojektować leki, tak, aby modulowały aktywność CTLA-4. Wiedza zdobyta na podstawie struktury cząsteczki CTLA-4 i jej oddziaływań z innymi cząsteczkami, takimi jak przeciwciała według wynalazku i inne ujawnione niniejszym przeciwciała, CD28, B7, B7-1, B7-2, może być zastosowana do teoretycznego zaprojektowania dodatkowych środków terapeutycznych. W tym aspekcie, w celu skupie20

PL 214 003 Β1 nia wysiłków na projektowaniu leków można zastosować teoretyczne techniki projektowania leków, takie jak krystalografia rentgenowska, modelowanie komputerowe (lub z pomocą komputera) (ang. computer assisted molecular modeling, CAMM), ilościowy lub jakościowy związek struktura-funkcja (ang. quantitative or qualitative structure-activity relationship, QSAR) i podobne technologie. Projektowanie teoretyczne umożliwia przewidywanie struktur białkowych albo syntetycznych, które mogą oddziaływać z cząsteczką albo jej specyficznymi formami, które można zastosować do modyfikowania albo modulowania aktywności CTLA-4. Takie struktury można syntetyzować chemicznie albo wyrażać w układach biologicznych. Podejście takie zostało omówione w Capsey i wsp. Genetically Engineered Humań Therapeutic Drugs (Stockton Press, NY (1988)). W rzeczywistości, teoretyczne projektowanie cząsteczek (czy to peptydów, peptydomimetyków, małych cząsteczek czy temu podobnych) w oparciu o znany albo ustalony związek struktura-aktywność z innymi cząsteczkami (takimi jak przeciwciała według wynalazku) staje się rutynowe. Patrz np. Fry i wsp. „Specific, irreversible inactivation of the epidermal growth factor receptor and erbB2, by a new class of tyrosine kinase inhibitor” Proc Natl Acad Sci LFSA 95:12022-7 (1998); Hoffman i wsp. „A model of Cdc25 phosphatase catalytic domain and Cdk-interaction surface based on the presence of a rhodanese homology domain” J Mol Biol 282:195-208 (1998); Ginalski i wsp. „Modelling of active forms of protein kinases: p38-a case study” Acta Biochim Pol 44:557-64 (1997); Jouko i wsp. „Identification of csk tyrosine phosphorylation sites and a tyrosine residue important for kinase domain structure” Biochem J 322:927-35 (1997); Singh i wsp. „Structure-based design of a potent, selective, and irreversible inhibitor of the catalytic domain of the erbB receptor subfamily of protein tyrosine kinases” J Med Chem 40:1130-5 (1997); Mandel i wsp. „ABGEN: a knowledge-based automated approach for antibody structure modeling” Nat Biotechnol 14:323-8 (1996); Monfardini i wsp. „Rational design, analysis, and potential utility of GM-CSF antagonists” Proc Assoc Am Physicians 108:420-31 (1996); Furet i wsp. „Modelling study of protein kinase inhibitors: binding modę of staurosporine and origin of the selectivity of CGP 52411” J Comput Aided Mol Des 9:465-72 (1995).

Ponadto, można zaprojektować i zsyntetyzować biblioteki kombinatoryczne i zastosować je w programach przeszukiwania, takich jak próby przeszukiwania na dużą skalę.

Podawanie leków i kompozycie farmaceutyczne

Będzie to docenione, że podawanie środków terapeutycznych może być dokonywane poprzez podawanie ich wraz z odpowiednimi nośnikami, zarobkami i innymi środkami, które wchodzą w skład kompozycji w celu zapewnienia ulepszonego przenoszenia, dostarczenia, tolerancji i tym podobnych. Liczne odpowiednie kompozycje można znaleźć w zbiorze znanym specjalistom z dziedziny chemii farmaceutycznej: Remingtońs Pharmaceutical Sciences (wyd. 15, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975)), szczególnie w rozdziale 87 autorstwa Blaug, Seymour. Kompozycje te obejmują, na przykład proszki, pasty, maści, żele, woski, oleje, lipidy, pęcherzyki zawierające lipidy (kationowe albo anionowe) (takie jak Lipofectin TM), koniugaty DNA, bezwodne pasty absorpcyjne, emulsje oleju w wodzie albo wody woleju, emulsje wosków węglowych (glikole polietylenowe o różnych ciężarach cząsteczkowych), żele półpłynne, mieszaniny półpłynne zawierające woski węglowe. Dowolna z powyższych mieszanin może być odpowiednia do leczenia i terapii, zakładając, ze składnik aktywny nie jest inaktywowany przez kompozycję i jest ona fizjologicznie dopuszczalna i tolerowana przy danej drodze podawania. Patrz również Powell i wsp. „Compendium of excipients for parenteral formulations” PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998) i zacytowane tam odnośniki w celu uzyskania dodatkowych informacji dotyczących zarobek i nośników dobrze znanych w dziedzinie chemii leków. Wytwarzanie przeciwciał

Przeciwciała według wynalazku są korzystnie otrzymywane przez zastosowanie transgenicznej myszy, do której wprowadzono istotną część ludzkiego genomu niezbędną dla wytworzenia przeciwciała, a jednocześnie którą uczyniono niezdolną do wytwarzania endogennych, mysich przeciwciał. Takie myszy są wówczas zdolne do wytwarzania cząsteczek ludzkich immunoglobulin i przeciwciał, a są niezdolne do wytwarzania cząsteczek mysich immunoglobulin i przeciwciał. Technologie zastosowane do osiągnięcia tego celu są ujawnione w patentach, zgłoszeniach patentowych i odnośnikach zamieszczonych w części dotyczącej stanu techniki. Jednakże szczególnie korzystne postacie wykonania dla procesu wytwarzania transgenicznych myszy, a z nich przeciwciał, są ujawnione w zgłoszeniu patentowym USA nr seryjny 08/759,620 z 3 grudnia 1996. Patrz także Mendez i wsp. Naturę Genetics 15:146-156 (1997).

Dzięki zastosowaniu takiej technologii, wytworzyliśmy w pełni ludzkie monoklonalne przeciwciała wobec rozmaitych antygenów. Zasadniczo, immunizujemy linie myszy XenoMouse™ antygenem będącym przedmiotem zainteresowania, pobieramy komórki limfatyczne (takie jak komórki B) z myszy, które wyrażają przeciwciała, łączymy takie pobrane komórki z liniami komórkowymi typu szpicza

PL 214 003 Β1 ka w celu otrzymania unieśmiertelnionych linii komórkowych hybrydom i takie linie komórkowe hybrydom są przeszukiwane i selekcjonowane w celu zidentyfikowania linii komórkowych hybrydomy, które wytwarzają przeciwciała swoiste wobec antygenu będącego przedmiotem zainteresowania. Zastosowaliśmy te techniki do wytworzenia przeciwciał swoistych wobec CTLA-4. Niniejszym opisujemy wytwarzanie wielu linii komórkowych hybrydom, które wytwarzają przeciwciała swoiste wobec CTLA-4. Ponadto, dostarczyliśmy charakterystykę przeciwciał wytwarzanych przez takie linie komórkowe, włączając w to analizę sekwencji aminokwasowej ciężkich i lekkich łańcuchów takich przeciwciał.

Przeciwciała pochodzące z omawianych niniejszym hybrydom są oznaczone jako 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1,4.10.2, 4.13.1,4.14.3, 6.1.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 i 12.9.1.1. Każde z przeciwciał wytwarzanych przez wymienione uprzednio linie komórkowe obejmuje w pełni ludzkie łańcuchy ciężkie lgG2 bądź lgG4 z ludzkimi łańcuchami lekkimi kappa. Ogólnie, przeciwciała według wynalazku posiadają bardzo wysokie powinowactwo, zazwyczaj wykazują K_d od około 10'⁹ do około 10'¹¹ M, przy pomiarze w fazie stałej bądź w roztworze.

Będzie doceniony fakt, że przeciwciała według wynalazku mogą być wyrażane w liniach komórkowych innych niż linie komórek hybrydomy.

Sekwencje kodujące DNA albo klony genomowe dla poszczególnych przeciwciał można zastosować do transformowania odpowiednich ssaczych albo innych niż ssacze komórek gospodarza. Transformację można przeprowadzić dowolną ze znanych metod do wprowadzania polinukleotydów do komórek gospodarza, włączając w to między innymi pakowanie polinukleotydów do wirusów (albo do wektorów wirusowych) i transdukowanie komórek gospodarza wirusem (albo wektorem) albo procedurę transfekcji znaną w dziedzinie, której przykłady przedstawiono w patentach USA 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461, i 4,959,455. Zastosowane procedury transformacji będą zależały od gospodarza, który ma być transformowany. Sposoby wprowadzania heterologicznych polinukleotydów do komórek ssaków są dobrze znane w dziedzinie i obejmują między innymi transfekcję zachodzącą za pośrednictwem dekstranu, precypitację fosforanem wapnia, transfekcję zachodzącą za pośrednictwem polibrenu, fuzję protoplastów, elektroporację, bombardowanie cząstkami, enkapsulacja polinukleotydów w liposomach, koniugaty peptydowe, dendrymery i bezpośrednie wstrzykiwanie DNA do jąder.

Ssacze linie komórkowe dostępne jako gospodarz do ekspresji są dobrze znane w dziedzinie i obejmują wiele unieśmiertelnionych linii komórkowych dostępnych z American Type Culture Collection (ATCC), włączając w to między innymi komórki jajnika chomika chińskiego (ang. Chinese hamster ovary, CHO), NSO₀, komórki HeLa, komórki nerki młodego chomika (ang. baby hamster kidney, BHK), komórki małpiej nerki (COS), ludzkie komórki raka wątroby (np., Hep G2) i wiele innych linii komórkowych. Komórki nie-ssacze obejmujące między innymi komórki bakteryjne, drożdżowe, owadzie i roślinne mogą być zastosowane do wyrażania zrekombinowanych przeciwciał. Ukierunkowana metageneza domeny CH2 przeciwciała w celu wyeliminowanie glikozylacji może być korzystna w celu zapobiegania zmianom w immunogenności, farmakokinetyce i/lub funkcjach efektorowych będących wynikiem nie występującej u ludzi glikozylacji. Metody ekspresji są wybrane przez określenie, który system daje najwyższe poziomy ekspresji i wytwarza przeciwciała z konstytutywnymi właściwościami wiązania CTLA-4.

Ponadto, ekspresję przeciwciał według wynalazku (lub innych pochodzących z nich ugrupowań) w wytwarzających je liniach komórkowych można wzmocnić przez zastosowanie wielu znanych technik. Przykładowo, układy ekspresji genu syntetazy glutaminowej i DHFR są powszechnie stosowanymi podejściami mającymi na celu wzmocnienie ekspresji w pewnych warunkach. Klony komórkowe do wysokiej ekspresji można zidentyfikować poprzez zastosowanie konwencjonalnych technik, takich jak klonowanie poprzez ograniczone rozcieńczenia i technologia Microdrop. Układ GS jest omówiony w całości albo częściowo w powiązaniu z patentami europejskimi nr 0 216 846, 0 256 055 i 0 323 997 oraz europejskim zgłoszeniem patentowym nr 89303964.4.

Przeciwciała według wynalazku mogą być również wytwarzane transgenicznie poprzez otrzymanie ssaka albo rośliny, która jest transgeniczna pod względem sekwencji łańcucha ciężkiego i lekkiego immunoglobuliny będących przedmiotem zainteresowania i wytwarzanie z nich przeciwciała, w postaci odzyskiwalnej. W powiązaniu z transgenicznym otrzymywaniem w ssakach, przeciwciała mogą być wytwarzane i odzyskiwane z mleka kóz, krów i innych ssaków. Patrz patenty USA nr 5,827,690, 5,756,687, 5,750,172 i 5,741,957.

Przeciwciała według niniejszego wynalazku można analizować strukturalnie i funkcjonalnie. W powiązaniu ze strukturami przeciwciał, sekwencje aminokwasowe łańcucha ciężkiego i lekkiego kappa przewidziano na podstawie sekwencji cDNA otrzymanych z hybrydom poprzez RT-PCR. Patrz Przykłady 3 i 4 oraz Figury 1-8. N-końcowe sekwencjonowanie przeciwciał przeprowadzono również

PL 214 003 Β1 w celu potwierdzenia wyników omówionych w Przykładach 3 i 4. Patrz Przykład 5 i Fig. 9. Analizę kinetyczną przeciwciał przeprowadzono w celu określenia powinowactwa. Patrz Przykład 2. Przeciwciała według wynalazku oparte na przeciwciele 11.2.1 oraz inne opisane tu przeciwciała (a w szczególności przeciwciała 4.1.1, 4.8.1 i 6.1.1) mają wysokie powinowactwo (4.1.1:1,63 χ 1O¹⁰ l/M; 4.8.1: 3,54 χ 1O¹⁰ l/M; a 6.1.1:7,2 χ 10⁹ l/M). Ponadto przeciwciała analizowano poprzez ogniskowanie izoelektryczne (ang. isoelectric focusing, IEF), elektroforezę w żelu redukującym (SDS-PAGE), chromatografię wykluczania ze względu na wielkość, chromatografię cieczową/spektroskopię mas oraz spektroskopię mas i testowano wytwarzanie przeciwciał przez hybrydomy. Patrz Przykład 6 i Fig. 10.

W powiązaniu z analizą funkcjonalną przeciwciał według wynalazku, udowodniono, że takie przeciwciała są silnymi inhibitorami CTLA-4 i jego wiązania z ligandami z rodziny cząsteczek B7. Przykładowo, wykazano, że przeciwciała według wynalazku blokują wiązanie CTLA-4 bądź z B7-1 bądź B7-2. Patrz Przykład 7. Rzeczywiście przeciwciała według wynalazku i inne ujawnione tu przeciwciała posiadają nanomolowe i subnanomolowe IC₅₀ w odniesieniu do hamowania wiązania CTLA-4 z B7-1 i B7-2. Ponadto, przeciwciała te posiadają znakomitą wybiórczość wobec CTLA-4 w porównaniu z CD28, CD44, B7-2 albo hlgG1. Patrz Przykład 8. Wybiórczość jest stosunkiem, który odzwierciedla stopień preferencyjnego wiązania się cząsteczki z pierwszym czynnikiem w porównaniu związaniem się cząsteczki z drugim i ewentualnie z innymi cząsteczkami. Niniejszym, wybiórczość dotyczy stopnia preferencyjnego wiązania się przeciwciała w porównaniu z wiązaniem się przeciwciała z innymi cząsteczkami, takimi jak CD28, CD44, B7-2 lub hlgG1. Wartości wybiórczości przeciwciał według wynalazku są większe niż 500:1. Wykazano również, że przeciwciała według wynalazku indukują lub zwiększają ekspresję pewnych cytokin (takich jak IL-2 i IFN-γ) poprzez jednoczesne hodowanie komórek T w modelu blastocytów T. Patrz Przykład 9 i 10 oraz Fig. 12-17. Ponadto, można się spodziewać, że przeciwciała według wynalazku będą hamowały wzrost nowotworów w odpowiednich modelach in vivo. Projektowanie takich modeli jest omówione w Przykładzie 11 i 12.

Przedstawione niniejszym wyniki wskazują, że przeciwciała według wynalazku i pozostałe ujawnione tu przeciwciała posiadają pewne cechy, które czynią te przeciwciała bardziej skutecznymi niż obecnie znane przeciwciała terapeutyczne wobec CTLA-4.

W szczególności przeciwciała 4.1.1,4.8.1 i 6.1.1 posiadają wysoce pożądane właściwości. Ich właściwości strukturalne, funkcje i aktywności dostarczają kryteriów, które ułatwiają projektowanie albo wybór dodatkowych przeciwciał albo innych omawianych tu cząsteczek. Takie kryteria obejmują między innymi jedno lub więcej z następujących:

Zdolność do współzawodniczenia o wiązanie z jednym lub większą liczbą przeciwciał według wynalazku;

Podobna specyficzność wiązania z CTLA-4 co jedna lub większa liczba przeciwciał według wynalazku;

Powinowactwo wiązania z CTLA-4 wynoszące około 10'⁹ M albo więcej, a korzystnie około 10'¹° M albo więcej;

Brak reakcji krzyżowej z CTLA-4 z gatunków niższych ssaków, włączając w to korzystnie mysz, szczura i królika, a korzystniej mysią i szczurzą CTLA-4;

Reakcja krzyżowa z CTLA-4 z naczelnych, korzystnie CTLA-4 makaków rezusa (Macaca mulatta) i jawajskiego (Macaca fuscata);

Wybiórczość wobec CTLA-4 w stosunku do CD28, B7-2, CD44 i hlgG1 więcej niż około 100:1, a korzystnie około 300, 400 albo 500:1 lub więcej;

IC₅₀ przy blokowaniu wiązania CTLA-4 z B7-2 wynoszące około 100 nM lub mniej, a korzystnie 5, 4, 3, 2, 1,0,5, lub 0,38 nM lub mniej;

IC₅₀ przy blokowaniu wiązania CTLA-4 z B7-1 wynoszące około 100 nM lub mniej, a korzystnie 5, 4, 3, 2, 1,0,5, lub 0,50 nM lub mniej;

Zwiększenie wytwarzania cytokin w jednym lub większej liczbie testów in vitro:

Zwiększenie wytwarzania IL-2 w teście blastocytów T/Raji o około 500 pg/ml lub więcej, a korzystnie 750, 1000, 1500, 2000, 3000, lub 3846 pg/ml albo więcej;

Zwiększenie wytwarzania IFN-γ w teście blastocytów T/Raji o około 500 pg/ml lub więcej lub więcej, a korzystnie 750, 1000 albo 1233 pg/ml lub więcej: albo

Zwiększenie wytwarzania IL-2 w hPBMC lub teście z superantygenem dla pełnej krwi o około 500 pg/ml lub więcej, a korzystnie 750, 1000, 1200 lub 1511 pg/ml lub więcej; Innymi słowy, pożądane jest aby wytwarzanie IL-2 było zwiększone w teście o około 30, 35, 40, 45, 50 procent lub więcej w stosunku do kontroli.

PL 214 003 Β1

Można się spodziewać, że przeciwciała (albo cząsteczki zaprojektowane albo zsyntetyzowane na ich podstawie) mające jedną lub więcej z tych właściwości będą posiadały podobną skuteczność, jak przeciwciała opisane w niniejszym opisie.

Pożądane właściwości funkcjonalne omówione powyżej często są wynikiem wiązania się i hamowania CTLA-4 przez cząsteczkę (to jest przeciwciało, fragment przeciwciała, peptyd albo małą cząsteczkę) w podobny sposób jak przeciwciało według wynalazku (tj. wiązanie się z tym samym lub podobnym epitopem cząsteczki CTLA-4). Cząsteczka może być podawana bezpośrednio (tj., przez bezpośrednie podawanie pacjentowi takich cząsteczek). Albo alternatywnie cząsteczka może być „podawana” pośrednio (tj. peptyd albo jemu podobny czynnik, który wytwarza odpowiedź immunologiczną u pacjenta (podobną do szczepionki), przy czym odpowiedź immunologiczna obejmuje wytwarzanie przeciwciał, które wiążąsię z tym samym albo podobnym epitopem, albo przeciwciało lub jego fragment, który jest wytwarzany in situ po podaniu materiału genetycznego, który koduje takie przeciwciała lub ich fragmenty wiążące się z tym samym lub podobnym epitopem). Zatem będzie docenione, ze epitop na CTLA-4, do którego wiążą się przeciwciała według wynalazku może być przydatny w kontekście wytwarzania i/lub projektowania leków. Przy projektowaniu leków przydatna jest również informacja negatywna (tj. przydatny jest fakt, że przeciwciało, które wiąże się z CTLA-4 wydaje się nie wiązać do epitopu, który działa jako inhibitor CTLA-4). Tak więc epitop, do którego wiążą się przeciwciała według wynalazku, nie prowadząc do pożądanej funkcjonalności może być bardzo przydatny. Niniejszym przedstawiono również cząsteczki (a w szczególności przeciwciała), które wiążąsię z tymi samymi albo podobnymi epitopami jak przeciwciała według wynalazku.

Ponadto przeprowadziliśmy pewne wstępne badania nad mapowaniem epitopów dla pewnych przeciwciał, a w szczególności przeciwciał 4.1.1 i 11.2.1.

Jako pierwszy etap przeprowadziliśmy badania współzawodnictwa BIAcore w celu utworzenia wstępnej mapy wiązania pomiędzy niektórymi przeciwciałami na podstawie ich zdolności do współzawodnictwa o wiązanie się z CTLA-4. W tym celu CTLA-4 był wiązany z chipem BIAcore, przyłączano do niego pierwsze przeciwciało w warunkach wysycenia i mierzono następujące po tym wiązanie drugiego przeciwciała z CTLA-4.

Technika ta umożliwia wytworzenie wstępnej mapy, na podstawie której można zaliczyć przeciwciała od odpowiedniej rodziny.

Dzięki temu procesowi określiliśmy, że niektóre przeciwciała, w tym przeciwciała według wynalazku, można podzielić na następujące kategorie epitopowe:

Kategoria	Przeciwciała	Współzawodnictwo o wiązanie CTLA-4
A	BO1M*	W pełni dowolne wzajemne współzawodnictwo; współzawodniczy krzyżowo z kategorią B; pewne współzawodnictwo z kategorią D
BO2M“
B	4.1.1	W pełni dowolne wzajemne współzawodnictwo; współzawodniczy krzyżowo z kategorią A, C i D;
4.13.1
C	6.1.1	W pełni dowolne wzajemne współzawodnictwo; współzawodniczy krzyżowo z kategorią B i kategorią D;
3.1.1
4.8.1
11.2.1
11.6.1
11.7.1
D	4.14.3	Współzawodniczy krzyżowo z kategorią B i C; pewne współzawodnictwo z kategorią A
E	4.9.1	BIN3 blokuje wiązanie się 4.9.1 z CTLA4, ale nie odwrotnie
BNI3*“

(*)(**) dostępne z Biostride (***) dostępne z Pharmingen

PL 214 003 Β1

W następnym etapie usiłowaliśmy ustalić czy przeciwciała według wynalazku i inne ujawnione w niniejszym opisie przeciwciała rozpoznają liniowy epitop na CTLA-4 w warunkach redukujących i nieredukujących w analizie Western biot. Zaobserwowaliśmy, że żadne z przeciwciał 4.1.1, 11.7.1, 11.6.1 ani 11.2.1 nie wydaje się rozpoznawać zredukowanej postaci CTLA-4 w analizie Western biot. Zatem, wydaje się prawdopodobne, że epitop, do którego wiąże się każde z tych przeciwciał nie jest epitopem liniowym, a bardziej prawdopodobnie było epitopem konformacyjnym, którego struktura mogła ulec zniszczeniu w warunkach redukujących.

Zatem, chcieliśmy stwierdzić, czy możemy określić, które reszty w obrębie cząsteczki CTLA-4 są istotne dla wiązania przeciwciał według wynalazku. Jednym ze sposobów, które zastosowaliśmy było przeprowadzenie pomiarów kinetycznych szybkości dysocjacji pomiędzy ludzkim CTLA-4 i dwiema wysoce konserwowanymi cząsteczkami CTLA-4 naczelnych (CTLA-4 makaka jawajskiego i marmozety). Badania BIAcore pokazały, że przeciwciało 4.1.1 wiąże się z CTLA-4 ludzkim, makaka jawajskiego i marmozety z tą samą szybkością. Jednakże w odniesieniu do szybkości dysocjacji (powinowactwo), przeciwciało 4.1.1 miało najwyższe powinowactwo (najmniejszą szybkość dysocjacji) dla ludzkiego CTLA-4, większą szybkość dysocjacji dla CTLA-4 makaka jawajskiego, a największą szybkość dysocjacji dla CTLA-4 marmozety. Z drugiej strony, przeciwciało 11.2.1 według wynalazku wiąże się z CTLA-4 ludzkim, makaka jawajskiego i marmozety z tą samą szybkością i ma prawie taką samą szybkość dysocjacji dla każdego z nich. Dane te wskazują dodatkowo, że przeciwciała 4.1.1 i 11.2.1 wiążąsię z różnymi epitopami na CTLA-4.

W celu dalszego zbadania epitopów, do których wiążą się przeciwciała kategorii B i C, przeprowadziliśmy pewne badania z ukierunkowaną mutagenezą. CTLA-4 marmozety posiada dwie ważne zmiany w resztach 105 i 106 w stosunku do ludzkiego CTLA-4. Takie różnice to zmiana leucyny na metioninę w pozycji 105 i zmiana glicyny na serynę w pozycji 106. A zatem mutowaliśmy DNA kodujący ludzki CTLA-4 tak, aby kodował zmutowany CTLA-4 z substytucjami L105M i G106S. Homologiczna wymiana w CTLA-4 nie miała wpływu na wiązanie białka fuzyjnego B7.2-lgG1. Ponadto, wiązanie przeciwciała 11.2.1 nie zostało zmienione. Jednakże cząsteczki miały mocno zahamowaną zdolność do wiązania się z przeciwciałem 4.1.1 (podobnie jak w przypadku CTLA-4 marmozety). Następnie zmutowaliśmy DNA kodujący CTLA-4 marmozety w celu utworzenia mutanta CTLA-4 marmozety zawierającego substytucję S106SG. Taka zmiana prowadzi do odtworzenia stabilnego wiązania między przeciwciałem 4.1.1 i zmutowanym CTLA-4 marmozety. Ponadto, zmutowaliśmy cDNA kodujący CTLA-4 marmozety w celu utworzenia mutanta CTLA-4 marmozety z substytucją M105L. Taka zmiana częściowo przywracała wiązanie pomiędzy przeciwciałem 4.1.1 i zmutowanym CTLA-4 marmozety.

Każde z przeciwciał należących do kategorii od B do D wydaje się posiadać podobne właściwości funkcjonalne i wydaje się posiadać zdolność działania jako silny czynnik leczniczy przeciwko CTLA-4. Ponadto, każda z cząsteczek zapewnia współzawodnictwo krzyżowe w wiązaniu z CTLA-4. Jednakże, jak to będzie widoczne z powyższego omówienia, każda z cząsteczek z różnych kategorii wydaje się wiązać z odrębnymi konformacyjnymi epitopami na CTLA-4.

Na podstawie powyższego będzie można wywnioskować, że omawiane powyżej dane o epitopach wskazują, iż przeciwciała (lub inne cząsteczki, jak omówiono powyżej), które współzawodniczą z przeciwciałami według wynalazku, będą prawdopodobnie miały pewien terapeutyczny potencjał. Ponadto, można się spodziewać, że przeciwciała (lub inne cząsteczki, jak omówiono powyżej), które współzawodniczą krzyżowo z przeciwciałami z kategorii B, C i/lub D będą prawdopodobnie miały pewien potencjał terapeutyczny. Dodatkowo, można się spodziewać, że przeciwciała (lub inne cząsteczki, jak omówiono powyżej), które współzawodniczą krzyżowo z przeciwciałami kategorii B, C i/lub D i które (i) nie wykazują zmniejszonego wiązania z CTLA-4 marmozety (podobne do przeciwciała 11.2.1) albo (ii) wykazują zmniejszone wiązanie z CTLA-4 marmozety (podobne do przeciwciała 4.1.1) będą prawdopodobnie miały pewien potencjał terapeutyczny. Przeciwciała (lub inne cząsteczki, jak omówiono powyżej), które współzawodniczą krzyżowo z kategoriami A i E mogą mieć również pewien potencjał terapeutyczny. Przykłady

Następujące przykłady, włączając w to przeprowadzone doświadczenia i uzyskane wyniki są przedstawione jedynie dla celów ilustracji, a nie jako ograniczenie niniejszego wynalazku. Przykład 1

Otrzymywanie hybrydom wytwarzających przeciwciało anty-CTLA-4

Przeciwciała według wynalazku były przygotowane, wybrane i testowane zgodnie z niniejszym Przykładem.

Otrzymywanie przeciwciał: Wytworzono trzy odrębne immunogeny do immunizacji myszy XenoMouse™: (i) białko fuzyjne CTLA-4-lg, (ii) peptyd CTLA-4 oraz (iii) mysie komórki chłoniaka 300.19

PL 214 003 Β1 transfekowane zmutowanym CTLA-4 (Y201V) który jest konstytutywnie wyrażany na powierzchni komórki.

(i) Białko fuzyjne CTLA-4-lgG1: Konstrukcja wektora ekspresyjnego:

cDNA kodujący dojrzałą zewnątrzkomórkową domenę CTLA-4 powielono w reakcji PCR z biblioteki cDNA ludzkiej grasicy (Clontech) stosując startery zaprojektowane na podstawie opublikowanej sekwencji (Eur. J Immunol 18:1901-1905 (1988)). Fragment sklonowano w odpowiedniej orientacji w pSR5, plazmidzie ekspresyjnym z wirusa Sindbis (Invitrogen), pomiędzy peptydem sygnałowym ludzkiej onkostatyny M i domenami ludzkiej IgG gamma 1 (lgG1) CH1/CH2/CH3. Białko fuzyjne nie zawiera domeny zawiasowej, ale zawiera cysteinę 120 w domenie zewnątrzkomórkowej CTLA-4 w celu utworzenia kowalencyjnego dimeru. Otrzymany w rezultacie wektor nazwano CTLA-4-lgG1/pSR5. Sekwencję pełnego cDNA CTLA-4-lgG1 w wektorze potwierdzono dla obu nici. Sekwencja aminokwasowa białka CTLA4-lg jest przedstawiona poniżej. Dojrzałą domenę zewnątrzkomórkową dla CD44 powielono w reakcji PCR z biblioteki ludzkich limfocytów (Clontech) i klonowano w PsinRep5 w celu wytworzenia białka kontrolnego z identycznym ogonem lgG1.

Białko fuzyjne OM-CTLA4-lgG1:

MGVLLTORTLLSLVLALLFPSMASMAMHVAOPAVVLASSRGIASFVC

EYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICT GTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIY VIDPEPCPDSDLEGAPSVFLFPPKPKDTLM1SRTPEVTCWVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKE YKCKVSNKALPTPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Podkreślenie: peptyd sygnałowy

Wytłuszczenie: domena zewnątrzkomórkową CTLA-4 cDNA kodujący dojrzałą zewnątrzkomórkową domenę CD28 powielono w reakcji PCR z Biblioteki ludzkich limfocytów (Clontech), a następnie sklonowano w pCDM8 (J. Immunol. 151: 5261-71 (1993)) w celu wytworzenia białka fuzyjnego ludzkiej lgG1 zawierającej zarówno miejsce cięcia dla trombiny jak i regiony zawiasowe. CTLA-4 marmozety, makaka jawajskiego i rezusa sklonowano z mRNA wyizolowanego z PBMC stymulowanych PHA przy zastosowaniu standardowych technik zdegenerowanej reakcji PCR. Sekwencjonowanie wykazało, że sekwencja aminokwasowa dla rezusa i makaka jawajskiego była identyczna poza trzema różnicami w stosunku do zewnątrzkomórkowej domeny dojrzałej ludzkiego CTLA-4 (S13N, I17T i L105M). Sekwencja dla marmozety wykazywała dziesięć różnic aminokwasowych w stosunku do zewnątrzkomórkowej domeny dojrzałej ludzkiego CTLA4 (V21A, V331, A41T, A51G, 54I, S71 F, Q75K, T88M, L105M i G106S). Ukierunkowaną mutagenezę zastosowano, aby otrzymać pojedyncze mutacje wszystkich aminokwasów odmiennych w CTLA-4 marmozety, w celu zmapowania aminokwasów ważnych ze względu na oddziaływania przeciwciał z ludzkim CTLA-4-lgG. Mutacje w celu mapowania epitopu CTLA-lgG ludzkiego i marmozety wytworzono przy zastosowaniu ukierunkowanej mutagenezy za pomocą zestawu „matchmaker site-directed mutagenesis” (Promega). Białka fuzyjne z IgG wytworzono poprzez przejściową transfekcję komórek Cos7 i oczyszczono przy zastosowaniu standardowych technik z białkiem A. Zmutowane białka CTLA4-lgG oceniano pod kątem wiązania do przeciwciał w testach immunologicznych na filtrach (ang. immunobloting) i przy zastosowaniu analiz BIAcore.

Ekspresja/oczyszczanie zrekombinowanego białka

Zrekombinowany wirus sindbis otrzymano poprzez elektroporację (Gibco) komórek nerki chomika BHK mRNA CTLA-4-IgG 1/pSRS uzyskanym w transkrypcji in vitro w układzie SP6 oraz mRNA pomocniczym DH-26S, jak opisano przez lnvitrogen. Czterdzieści osiem godzin później zrekombinowanego wirusa zbierano i miareczkowano w celu uzyskania optymalnej ekspresji w komórkach jajnika

PL 214 003 Β1 chomika chińskiego (CHO-K1). Komórki CHO-K1 hodowano w zawiesinie w DMEM/F12 (Gibco) zawierającej 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (Gibco), nie-niezbędne aminokwasy (Gibco), 4 mM glutaminy (Gibco), penicylinę/streptomycynę (Gibco), 10 mM Hepes pH 7,5 (Gibco). W celu wytworzenia CTLA-4-lgG, komórki CHO-K1 zawieszano w stężeniu 1x10⁷ komórek/ml wDMEM/F12 i inkubowano z wirusem sindbis przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Komórki rozcieńczano następnie do 1 x 10⁶/ml w DMEM/F12 zawierającym 1% płodowej surowicy bydlęcej pozbawionej bydlęcych IgG przy użyciu złoża Białko A - sepharose (Pharmacia), nie-niezbędne aminokwasów (Gibco), 4 mM glutaminy (Gibco), 10 mM Hepes pH 7,5 (Gibco), penicylinę/streptomycynę. Czterdzieści osiem godzin po infekcji komórki zwirowywano, a kondycjonowaną pożywkę zbierano i dodawano do niej tabletki z inhibitorem proteaz (Boehringer Mannheim), doprowadzano pH do 7,5, i filtrowano przez filtr 0,2 μ (Nalgene). FPLC (Pharmacia) zastosowano do oczyszczenia poprzez powinowactwo białka fuzyjnego przy użyciu 5 ml kolumny z białkiem A HiTrap (Pharmacia) przy szybkości przepływu 10 ml/min. Kolumnę przemywano PBS 30 objętościami złoża i wymywano 0,1 M glicyna/HCI pH 2,8 przy przepływie 1 ml/min. Frakcje (1 ml) natychmiast neutralizowano do pH 7,5 przy użyciu Tris pH 9. Frakcje zawierające CTLA-4-lgG1 identyfikowano przez SDS-PAGE, a następnie zatężano przy zastosowaniu Centriplus 50 (Amicon) przed nałożeniem na kolumnę sepharose 200 (Pharmacia) przy przepływie 1 ml/min przy użyciu PBS jako rozpuszczalnika. Frakcje zawierające CTLA-4-lgG1 łączono, filtrowano sterylnie przez filtr 0,2 μ (Millipore), porcjowano i zamrażano w -80°C. CD44-lgG1 wyrażano i oczyszczano przy zastosowaniu tych samych metod. CD28-lgG oczyszczano z kondycjonowanej pożywki z przejściowo transfekowanych komórek Cos7.

Charakterystyka CTLA-4-lgG1:

Oczyszczone CTLA-4-lgG1 migruje jako pojedynczy prążek na SDS-PAGE przy użyciu koloidalnego barwienia Coommassie (Novex). W warunkach nieredukujących CTLA-4-lgG1 jest dimerem (100 kDa), który ulega redukcji do monomeru o wielkości 50 kDa monomer po potraktowaniu 50 mM DTT. Ustalenie sekwencji aminokwasowej oczyszczonego CTLA-4-lgG1 w roztworze potwierdziło prawidłowy N-koniec CTLA-4 (MHVAQPAWLAS) i że peptyd sygnałowy onkostatyny został odcięty od dojrzałego białka fuzyjnego.

CTLA-4-lgG1 wiąże się z unieruchomioną B7.1-lgG w sposób zależny od stężenia, a wiązanie było blokowane przez chomicze-anty-ludzkie przeciwciało anty-CTLA-4 (BNI3: PharMingen). Sterylne CTLA-4-lgG było wolne od endotoksyny i oznaczone ilościowo poprzez OD280 stosując 1,4 jako współczynnik ekstynkcji. Wydajność oczyszczania CTLA-4-lgG wynosiła między 0,5-3 mg/litr komórek CHO-K1.

(ii) Peptyd CTLA-4

Następujący peptyd CTLA-4 przygotowano jak opisano poniżej:

NH₂:MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVT

EVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICK VELMYPPPYYLGIGNGTQIYV1DPEPC-CONH₂

Oznaczenia/Materiały:

NMP, N-metylopirolidinon; TFE, 2,2,2-trifluoroetanol; DCM, dichlorometan; FMOC, Fluorenylometoksykarbonyl. Wszystkie odczynniki były dostarczone przez Perkin Elmer, z następującymi wyjątkami: TFE, Aldrich Chemical, żywica FMOC-PAL-PEG, Perseptive Biosystems. Fmoc-Arg(pMC)OH, FMOC-Asn(Trt)-OH, FMOC-Asp(tBu)-OH, FMOC-Cys(Trt)-OH, FMOCGIu(tBu)-OH, FMOC-Gln(Trt)OH, FMOC-His(Boc)-OH, FMOC-Lys(BOC)OH, FMOC-Ser(tBu)-OH, FMOC-Tr(tBu)-OH i FMOC-Tyr(tBu)-OH zastosowano do aminokwasów wymagających bocznych grup ochronnych.

Synteza peptydów:

Syntezę peptydów przeprowadzano na Perkin-Elmer 431 A, z zamontowaną przystawką do śledzenia sprzężenia zwrotnego poprzez absorbancję UV przy 301 mn (detektor Perkin-Elmer Model 759A). Sekwencje peptydu składano na żywicy FMOC-PAL-PEG z zastosowaniem warunkowych podwójnych cykli łączenia. Wymuszone podwójne połączenia przeprowadzano w cyklach 10, 11, 18, 19, 20 i od 28 do 33. Żywicę przemywano 50% mieszaniną DCM i TFE na zakończenie każdego cyklu acylacji, a następnie przeprowadzano blokowanie nieprzereagowanych grup aminowych bezwodnikiem octowym w NMP. Żywice usuwano z reaktora po zakończeniu 49 cyklu, a dla pozostałości kontynuowano reakcję do zakończenia. Odcięcie peptydu od żywicy przeprowadzano przy zastosowaniu

PL 214 003 Β1 odczynnika K (King i wsp. International Journal of Protein and Peptide Research 36:255-266 (1990)) przez 6 godzin na 415 mg żywicy uzyskując 186 mg surowego peptydu CTLA-4.

Charakterystyka peptydu:

Próbki 25 mg surowego peptydu CTLA-4 rozpuszczano w 5 ml 6M chlorowodorku guanidyny/100 mM K₂PO₃ przy pH 6,4 i wymywano na kolumnie Pharmacia Hi Load Superdex 75 16/60 (16 mm x 600 mm, objętość złoża 120 ml) 2 M HCI guanidyny/100 mM K₂PO₃ przy pH 6,4 i szybkości 2 ml/min, przez 180 minut zbierając 5 ml frakcje. Frakcje analizowano poprzez nakładanie 1,7 μΙ frakcji na żel Laemeli NuPAGE, żel w buforze MES i uwidaczniano przy zastosowaniu protokołu barwienia srebrem Daichii. Frakcje wykazujące ciężar cząsteczkowy 12 kDa, jak oszacowano poprzez porównanie z standardem masy molekularnej, łączono razem i przechowywano w 4°C. Połączone frakcje analizowano przez UV i elektroforezę żelową, Sekwencjonowanie aminokwasów przeprowadzono poprzez absorbowanie 100 mikrolitrowej próbki na wkładzie ProSorb (absorbowanym na membranie PVDF). Całość przemywano w celu usunięcia soli buforu. Sekwencjonowanie przeprowadzano na urządzeniu Applied Biosystems 420. Obserwowano spodziewaną sekwencję końca N(MHVAQPA V V L A). Immunoblotting pokazał, że peptyd był rozpoznawany przez BNI3 anty-ludzki CTLA-4 (PharMingen). W celu odsolenia próbkę zawierającą 648 pg materiału umieszczono w probówce dializacyjnej 3500 Da MWCO i dializowano z mieszaniem wobec 0,1% TFA/H₂O w4°C przez 9 dni. Całą zawartość woreczka dializacyjnego liofilizowno do uzyskania proszku.

(iii) komórki 300.19 transfekowane CTLA-4 (Y201V) cDNA CTLA-4 pełnej długości oczyszczano w PCR z biblioteki cDNA ludzkiej grasicy (Stratagene) i subklonowano w pIRESneo (Clontech). Mutację CTLA-4, której wynikiem jest konstytutywna ekspresja na powierzchni komórki wprowadzono przy zastosowaniu MatchMaker Mutagenesis System (Promega). Mutacja tyrozyny, Y201 do waliny hamuje wiązanie białka adaptyny AP50, które jest odpowiedzialne za gwałtowną intenalizację CTLA-4 (Chuang i wsp. J. Immunol. 159:144-151 (1997)). Wolne od mikoplazmy mysie komórki chłoniaka 300.19 hodowano w RPMI-1640 zawierającym 10% płodową surowicę cielęcą, nie-niezbędne aminokwasy, penicylinę/streptomycynę, 2 mM glutaminę, 12,5 mM Hepes pH 7,5 i 25 μΜ beta-merkaptoetanol. Komórki poddawano elektroporacji (3x10⁶/0,4 ml wolnego od surowicy RPMI) w1 ml komorze z 20 pg CTLA-4-Y201V/plRESneo stosując 200 V/1180 pF (Gibco CeliPorator). Komórki pozostawiano na 10 minut, a następnie dodawano 8 ml ogrzanej uprzednio pożywki RPMI. Po 48 godzinach komórki rozcieńczano do 0,5 x 10⁶/ml w kompletnej pożywce RPMI zawierającej 1 mg/ml G418 (Gibco). Komórki oporne namnażano i wykazano, że wyrażają CTLA-4 na powierzchni komórki przy zastosowaniu przeciwciała BNI3 skoniugowanego z fikoerytryną (PharMingen). Komórki o wysokiej ekspresji izolowano poprzez sterylne sortowanie.

Immunizacja i wytwarzanie hybrydomy: myszy XenoMouse (w wieku od 8 do 10 tygodni) immunizowano (i) podskórnie przy podstawie ogona 1x10⁷ komórek 300.19, które transfekowano w celu wyrażania CTLA-4, jak opisano powyżej, zawieszano w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem z kompletnym adiuwantem Freunda albo (ii) podskórnie przy podstawie ogona (a) 10 pg białka fuzyjnego CTLA-4 albo (b) 10 pg peptydu CTLA-4 zemulgowanego z kompletnym adiuwantem Freunda. W każdym przypadku dawkę powtarzano trzy lub czterokrotnie w niekompletnym adiuwancie Freunda. Cztery dni przed fuzją myszy otrzymywały ostatni zastrzyk immunogenu albo komórek w PBS. Limfocyty ze śledziony i/lub węzłów limfatycznych z immunizowanych myszy poddawano fuzji z mysią nie wydzielającą linią komórkową szpiczaka P3 i poddano selekcji HAT jak opisano uprzednio (Galfre. G. i Milstein, C., „Preparation of monoclonal antibodies: strategies and Procedures.” Methods Enzymol. 73:3-46 (1981)). Otrzymano obszerny panel hybrydom, z których wszystkie wydzielały ludzkie przeciwciała lgG₂K lub lgG₄K, jak wykrywano poniżej) specyficzne wobec CTLA-4, które odzyskiwano.

Test ELISA: Test ELISA przeprowadzano do wykrywania przeciwciał swoistych wobec antygenu w surowicy mysiej i supernatantach hybrydomy, jak opisano (Coligan i wsp., Rozdział 2.1, „Enzyme-linked immunosorbent assays” w Current protocols in immunology (1994)) stosując białko fuzyjne CTLA-4-lg do wyłapywania przeciwciał. Dla zwierząt, które są immunizowane białkiem fuzyjnym CTLA-4-lg, przeprowadziliśmy dodatkowo test na niespecyficzną reaktywność względem części ludzkiej Ig białka fuzyjnego. Dokonano tego przy zastosowaniu płytek ELISA opłaszczonych ludzką lgG1 służących jako kontrola negatywna dla specyficzności.

W korzystnym teście ELISA zastosowano następujące techniki:

Płytki ELISA opłaszczano antygenem w ilości 100 ąg/studzienkę w buforze do opłaszczania płytek (0,1 M bufor węglanowy, pH 9,6 i NaHCO₃ (MW 84) 8,4 g/l). Płytki inkubowano następnie w 4°C

PL 214 003 Β1 przez noc. Po inkubacji bufor do opłaszczania płytek usuwa się, a płytki blokuje się buforem blokującym (0,5% BSA, 0,1% Tween 20, 0,01% tiomersal w 1 x PBS) w ilości 200 μΙ/studzienkę i inkubuje w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Alternatywnie, płytki przechowuje się w lodówce z buforem blokującym i uszczelniaczem płytek. Bufor blokujący usuwa się i dodaje 50 μΙ/studzienkę supernatantu znad hybrydomy, surowicy lub supernatantu znad innej hybrydomy (kontrola pozytywna) lub pożywkę HAT lub bufor blokujący (kontrola negatywna). Płytki inkubuje się przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Po inkubacji, płytki przemywa się buforem do przemywania (1 x PBS). Przeciwciało wykrywające (tj. mysie anty-ludzkie lgG2-HRP (SB, #9070-05) dla przeciwciał lgG2 lub mysie anty ludzkie lgG4-HRP (SB #9200-05) dla przeciwciał lgG4) dodaje się w ilości 100 μΙ/studzienkę (mysie anty-ludzkie lgG2-HRP przy rozcieńczeniu 1:2000 lub mysie anty-ludzkie lgG4HRP przy rozcieńczeniu 1:1000 (każde z nich rozcieńczone w buforze blokującym)). Płytki inkubuje się przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po inkubacji, płytki przemywa się buforem do przemywania. Następnie do studzienek dodaje się 100 pg/studzienkę świeżo przygotowanego roztworu do wywoływania (10 ml buforu podstawowego, 5 mg OPD (o-fenylenodiamina, Sigma Nr kat. P-7288) i 10 pg 30% H₂O₂ (Sigma)). Płytki pozostawia się do wywołania na 10-20 minut, aż studzienki kontroli negatywnej zaczynają nabierać barwy. Następnie, dodaje się 100 pg/studzienkę roztworu hamującego (2M H₂SO₄) i płytki sczytuje się w czytniku płytek ELISA przy długości fali 490 nm.

Pomiar stałych powinowactwa w pełni ludzkich monoklonalnych przeciwciał przy użyciu BIAcore:

Pomiar powinowactwa oczyszczonych ludzkich monoklonalnych przeciwciał, fragmentów Fab albo supernatantów hybrydom poprzez rezonans plazmonów przeprowadzono przy zastosowaniu urządzenia BIAcore 2000, stosując ogólne, opisane przez producenta procedury.

Analizę kinetyczną przeciwciał przeprowadzono przy zastosowaniu antygenów unieruchomionych na powierzchni czujnika przy małej gęstości. Do trzech powierzchni mikropłytki czujnika było przytwierdzane białko fuzyjne przy gęstości w zakresie od około 390 do 900 stosując białko fuzyjne CTLA-4-lg w stężeniu 20 lub 50 pg/ml w 10 mM octanie sodu pH 5,0 z użyciem zestawu wiążącego aminy dostarczonego przez producenta (BIAcore, Inc.). Do czwartej powierzchni mikropłytki czujnika było unieruchomione lgG1 (900 RU) i używano ją jako kontrolę negatywną dla niespecyficznego wiązania. Analizę kinetyczną przeprowadzano przy szybkości przepływu 25 lub 50 mikrolitrów na minutę, a szybkości dysocjacji (kd lub k_Off) i asocjacji (ka lub k_on) określano przy zastosowaniu oprogramowania dostarczonego przez producenta (ocena BIA 3,0) co umożliwia globalne kalkulacje dopasowania. Przykład 2

Pomiar powinowactwa przeciwciał anty-CTLA-4

W następującej tabeli dostarczony jest wynik pomiaru powinowactwa dla pewnych przeciwciał:

Tabela I

	Faza stała (BiAcore)
Hybrydoma	Szybkość wiązania Ka(M'1S'1x106)	Szybkość dysocjacji Kd(S'1x10'4)	Stała asocjacji Ka(1/M)=Ka/kdx1010	Stała dysocjacji Kd(M)=Kd/kaXl O'10	Gęstość powierzchniowa [RU]
1	2	3	4	5	6
Moab01	0.68	1.01	0.67	1.48	878.7
	0.70	4.66	0.15	6.68	504.5
	0.77	6.49	0.19	8.41	457.2
	0.60	3.08	0.20	5.11	397.8
4.1.1	1.85	0.72	2.58	0.39	878.7
	1.88	1.21	1.55	0.64	504.5
	1.73	1.54	1.13	0.88	457.2
	1.86	1.47	1.26	0.79	397.8

PL 214 003 Β1 cd. tabeli I

1	2	3	4	5	6
4.8.1	0.32	0.07	4.46	0.22	878.7
	0.31	0.23	1.33	0.75	504.5
	0.28	0.06	4.82	0.21	397.8
4.14.3	2.81	3.04	0.92	1.08	878.7
	2.88	3.97	0.73	1.38	504.5
	2.84	6.66	0.43	2.35	457.2
	3.17	5.03	0.63	1.58	397.8
6.1.1	0.43	0.35	1.21	0.83	878.7
	0.46	0.90	0.51	1.98	504.5
	0.31	0.51	0.61	1.63	457.2
	0.45	0.79	0.57	1.76	397.8
3.1.1	1.04	0.96	1.07	0.93	878.7
	0.95	1.72	0.55	1.82	504.5
	0.73	1.65	0.44	2.27	457.2
	0.91	2.07	0.44	2.28	397.8
4.9.1	1.55	13.80	0.11	8.94	878.7
	1.43	19.00	0.08	13.20	504.5
	1.35	20.50	0.07	15.20	397.8
4.10.2	1.00	2.53	0.39	2.54	878.7
	0.94	4.30	0.22	4.55	504.5
	0.70	5.05	0.14	7.21	457.2
	1.00	5.24	0.19	5.25	397.8
2.1.3	1.24	9.59	0.13	7.72	878.7
	1.17	13.10	0.09	11.20	504.5
	1.11	13.00	0.09	11.70	397.8
4.13.1	1.22	5.83	0.21	4.78	878.7
	1.29	6.65	0.19	5.17	504.5
	1.23	7.25	0.17	5.88	397.8

Co będzie można zaobserwować, przeciwciała wykazują wysokie powinowactwo i stałe wiązania. P r zy k ł a d 3

Struktura przeciwciał anty-CTLA-4

W następującym dalej omówieniu dostarczone są informacje strukturalne dotyczące przeciwciał według wynalazku.

W celu dokonania analizy struktur przeciwciał sklonowaliśmy geny kodujące fragmenty ciężkich i lekkich łańcuchów z niektórych hybrydom. Klonowanie i sekwencjonowanie przeprowadzono jak następuje:

PL 214 003 Β1 mRNA poli(A)⁺ izolowano przy użyciu zestawu Fast-Track kit (lnvitrogen) z około 2 χ 10⁵ komórek hybrydomy pochodzących z immunizowanej myszy XenoMouse. Otrzymywanie cDNA z zastosowaniem losowych starterów monitorowano przez PCR. Startery specyficzne dla regionów zmiennych rodziny ludzkich V_H lub Vk (Marks i wsp., „Oligonucleotide primers for polymerase chain reaction amplification of human immunoglobulin variable genes and design of family-specific oligonucleotide probes.” Eur. J. Immunol. 21:985-991(1991)) albo uniwersalny starter dla ludzkiego V_H, MG-30 (CAGGTGCAGCTGGAGCAGTCIGG) zastosowano w połączeniu ze starterami specyficznymi wobec ludzkiego regionu stałego Cyl (MG-40d; 5'-GCTGAGGGAGTAGAGTCCTGAGGA-3') albo regionu stałego Ck (ΙίκΡ2; jak opisano uprzednio w Green i wsp., 1994). Sekwencje transkryptów pochodzących z łańcuchów ciężkich i kappa z hybrydom otrzymano poprzez bezpośrednie sekwencjonowanie produktów PCR wytworzonych z RNA poli(A⁺) przy użyciu opisanych powyżej starterów. Produkty PCR sklonowano również w pCRII przy użyciu zestawu do klonowania TA (lnvitrogen) i obydwie nici sekwencjonowano przy użyciu zestawu do sekwencjonowania Prism z barwnymi terminatorami oraz urządzenia do sekwencjonowania ABI 377. Wszystkie sekwencje analizowano poprzez dopasowanie „V BASE sequence directory” (Tomlinson i wsp., MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK) stosując oprogramowanie MacVector i Geneworks.

Ponadto, każde z przeciwciał 4.1.1,4.8.1, 11.2.1 i 6.1.1 poddawano sekwencjonowaniu na całej długości. Do takiego sekwencjonowania izolowano mRNA poly(A)⁺ z około 4 χ 10⁶ komórek hybrydoma przy użyciu zestawu mRNA Direct (Dynal). mRNA poddawano odwrotnej transkrypcji przy użyciu oligo-dT(18) i zestawu Advantage do RT/PCR (Clonetech). Bazę danych dla regionu zmiennego (V Base) zastosowano w celu zaprojektowania starterów do amplifikacji rozpoczynających się w miejscu startu ATG łańcucha ciężkiego genu DP50 (5'-TATCTAAGCTTCTAGACTCGACCGCCACCATGGAGTTTGGGCTGATG-3’) i do kodonu stop regionu stałego lgG2 _i5t.TTCTCTGATCAGAATTCCTATCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGCT-3').

Po stronie 5' miejsca startu ATG dodano optymalną sekwencję Kozaka (ACCGCCACC).

Tą samą metodę zastosowano do zaprojektowania startera dla miejsca startu ATG łańcucha kappa genu A27 (5'-TCTTCAAGCTTGCCCGGGCCCGCCACCATGGAAACCCCAGCGCA-3') i do kodonu stop regionu stałego kappa (5'-TTCTTTGATCAGAATTCTCACTAACACTCTCCCCTGTTGAAGC-3’).

cDNA 012 sklonowano przy użyciu startera dla miejsca startu ATG (5’-TCTTCAAGCTTGCCCGGGCCCGCCACCATGGACATGAGGGTCCCCG T-3) i kodonu stop regionu stałego kappa jak opisano powyżej. Łańcuch ciężki DNA sklonowano również jako genomowe konstrukty poprzez ukierunkowana mutagenezę w celu dodania miejsca Nhel na końcu domeny zmiennej J i subklonowanie fragmentu Nhel zawierającego genomowe regiony lgG2 CH1/Zawias/CH2/CH3. Mutacje punktowe do wytworzenia miejsca Nhel nie zmieniają sekwencji aminokwasowej w stosunku do linii zarodkowej. Pary starterów zastosowano do powielenia DNA przy zastosowaniu zestawu Advantage High Fidelity PCR (Clonetech). Sekwencję produktów PCR otrzymano przez bezpośrednie sekwencjonowanie przy użyciu zestawu do sekwencjonowania z barwnymi terminatorami oraz urządzenia do sekwencjonowania ABI. Produkt PCR sklonowano w ssaczych wektorach ekspresyjnych pEE syntetazy glutaminianowej (Lonza) i trzy klony sekwencjonowano w celu potwierdzenia mutacji somatycznych. Dla każdego klonu sekwencja była sprawdzana z dwóch nici w co najmniej trzech reakcjach. Nieglikozylowane przeciwciało 4.1.1 wytworzono poprzez ukierunkowana mutagenezę N294Q w domenie CH2. Zrekombinowane przeciwciała wytworzono poprzez przejściową transfekcję komórek Cos7 w FCS pozbawionej IgG i oczyszczano przy zastosowaniu standardowych technik z białkiem A - sepharose. Stabilne transfektanty wytwarzano poprzez elektroporację mysich komórek NSO i selekcję na pożywce wolnej od glutaminy. Zrekombinowane przeciwciała 4.1.1

PL 214 003 Β1 z albo bez glikozylacji wykazywały identyczną specyficzność i powinowactwo wobec CTLA-4 w teście ELISA in vitro i teście BIAcore.

Analiza wykorzystania genu

Następująca Tabela przedstawia wykorzystanie genu wykazane poprzez wyselekcjonowane klony przeciwciał hybrydom:

Tabela II

Wykorzystanie łańcucha lekkiego i ciężkiego

Klon	Łańcuch ciężki	Łańcuch lekki kappa
VH	D	JH	VK	JK
4.1.1	DP-50	DIR4 lub DIR3	JH4	A27	JK1
4.8.1	DP-50	7-27	JH4	Λ27	JK4
4.14.3	DP-50	7-27	JH4	A27	JK3
6.1.1	DP-50	DIR5 lub DIR5rc	JH4	A27	JK3
3.1.1	DP-50	3-3	JH6	012	JK3
4.10.2	DP-50	7-27	JH4	A27	JK3
2.1.3	DP-65	1-26	JH6	Α10/A26	JK4
4.13.1	DP-50	7-27	JH4	A27	JK3
11.2.1	DP-50	D1-26	JH6	012	JK3
11.6.1	DP-50	D2-2 lub D4	JH6	012	JK3
11.7.1	DP-50	D3-22 lub D21-9	JH4	012	JK3
12.3.1.1	DP-50	D3-3 lub DXP4	A17	A17	JK1
12.9.1.1	DP-50	D6-19	A3/A19	A3/A19	JK4
4.9.1	DP-47	5-24 i lub 6-19	L5	L5	JK1

Jak będzie można to zobaczyć, przeciwciała zostały wytworzone z silną tendencją do wykorzystania regionów zmiennych łańcucha ciężkiego DP-50. Gen DP-50 jest również określany jako rodzina genu V_H 3-33. Tylko jedno przeciwciało, które zostało wyselekcjonowane na podstawie wiązania z CTLA-4 i wstępnych analiz funkcjonalnych in vitro wykazało wykorzystanie łańcucha ciężkiego inne niż DP-50. Klon ten, 2.1.3 wykorzystuje region łańcucha ciężkiego i izotyp lgG4. Gen DP-65 jest również określany jako rodzina genowa V_H 4-31. Z drugiej strony, klon 4.9.1, który posiada region zmienny łańcucha ciężkiego DP-47 wiąże się z CTLA-4, ale nie hamuje wiązania z B7-1, ani B7-2. U myszy XenoMouse istnieje ponad 30 odrębnych funkcjonalnych zmiennych genów łańcuchów ciężkich, z którymi wytwarza przeciwciała. Tendencja wskazuje zatem na preferowane wiązanie motywu oddziaływania antygen-antygen w odniesieniu do połączonych właściwości wiązania antygenu i aktywności funkcjonalnej.

Analiza przez mutacje

Jak będzie to docenione, analiza wykorzystania genu dostarcza jedynie ogólnej wiedzy na temat struktury przeciwciała. Ponieważ komórki B zwierząt XenoMouse losowo wytwarzają transkrypty łańcucha ciężkiego V-D-J albo łańcucha lekkiego V-J kappa, następuje wiele procesów drugorzędowych, włączając w to między innymi hipermutacje somatyczne, addycje końca N i wydłużanie CDR3. Patrz na przykład Mendez i wsp. Naturę Genetics 15:146-156 (1997) i zgłoszenie patentowe USA o nr seryjnym 08/759,620 z 3 grudnia 1996. Zatem, aby dalej zbadać strukturę przeciwciała uzyskano przewidywane sekwencje aminokwasowe przeciwciał z cDNA otrzymanego z tych klonów. Ponadto, ustalono N-końcowe sekwencje aminokwasowe poprzez zsekwencjonowanie białka.

PL 214 003 Β1

Fig. 1 przedstawia sekwencje nukleotydowe i przewidywane sekwencje aminokwasowe łańcucha ciężkiego i lekkiego łańcucha kappa klonów 4.1.1 (Fig. 1 A), 4.8.1 (Fig. 1B), 4.14.3 (Fig. 1C), 6.1.1 (Fig. 1D), 3.1.1 (Fig. 1E), 4.10.2 (Fig. 1F), 2.1.3 (Fig. 1G), 4.13.1 (Fig. 1H), 11.2.1 (Fig. 11), 11.6.1 (Fig. 1J), 11.7.1 (Fig. 1 K), 12.3.1.1 (Fig. 1L) i 12.9.1.1 (Fig. 1M). Na figurach 1 A, 1B i 1D wydłużone sekwencje dla przeciwciał 4.1.1,4.8.1 i 6.1.1 uzyskano poprzez klonowanie pełnej długości cDNA, jak opisano powyżej. Na tych figurach sekwencje peptydu sygnałowego (albo kodujących je zasad) są wytłuszczone, a sekwencje wykorzystane w reakcji 5'PCR są podkreślone.

Fig. 2 przedstawia dopasowanie przewidywanych sekwencji aminokwasowych łańcucha ciężkiego z klonów 4.1.1, 4.8.1, 4.14.3, 6.1.1, 3.1.1, 4.10.2, 4.13.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 i 12.9.1.1 oraz sekwencji aminokwasowej linii zarodkowej DP-50 (3-33). Różnice pomiędzy sekwencją linii zarodkowej DP-50 i sekwencją klonów są wytłuszczone. Figura pokazuje również pozycje sekwencji CDR1, CDR2 i CDR3 jako zacieniowanie.

Fig. 3 przedstawia dopasowanie przewidywanych sekwencji aminokwasowych łańcucha ciężkiego klonu 2.1.3 oraz sekwencji aminokwasowej linii zarodkowej DP-65 (4-31). Różnice pomiędzy sekwencją linii zarodkowej DP-65 i sekwencją klonu są wytłuszczone. Figura pokazuje również pozycje sekwencji CDR1, CDR2 i CDR3 przeciwciała poprzez podkreślenie.

Fig. 4 przedstawia dopasowanie przewidywanych sekwencji aminokwasowych łańcucha lekkiego kappa klonów 4.1.1,4.8.1,4.14.3, 6.1.1,4.10.2 i 4.13.1 oraz sekwencji aminokwasowej linii zarodkowej A27. Różnice pomiędzy sekwencją linii zarodkowej A27 i sekwencją klonu są wytłuszczone. Figura pokazuje również pozycje sekwencji CDR1, CDR2 i CDR3 przeciwciała poprzez podkreślenie. Obserwowane delecje w CDR1 klonów 4.8.1,4.14.3 i 6.1.1 są oznaczone jako „0”.

Fig. 5 przedstawia dopasowanie przewidywanych sekwencji aminokwasowych łańcucha lekkiego kappa klonów 3.1.1, 11.2.1, 11.6.1 i 11.7.1 oraz sekwencji aminokwasowej linii zarodkowej 012. Różnice pomiędzy sekwencją linii zarodkowej 012 i sekwencją klonu są wytłuszczone. Figura pokazuje również pozycje sekwencji CDR1, CDR2 i CDR3 przeciwciała poprzez podkreślenie.

Fig. 6 przedstawia dopasowanie przewidywanych sekwencji aminokwasowych łańcucha lekkiego kappa klonu 2.1.3 oraz sekwencji aminokwasowej linii zarodkowej A10/A26. Różnice pomiędzy sekwencją linii zarodkowej A10/A26 i sekwencją klonu są wytłuszczone. Figura pokazuje również pozycje sekwencji CDR1, CDR2 i CDR3 przeciwciała poprzez podkreślenie.

Fig. 7 przedstawia dopasowanie przewidywanych sekwencji aminokwasowych łańcucha lekkiego kappa klonu 12.3.1 oraz sekwencji aminokwasowej linii zarodkowej A17. Różnice pomiędzy sekwencją linii zarodkowej A17 i sekwencją klonu są wytłuszczone. Figura pokazuje również pozycje sekwencji CDR1, CDR2 i CDR3 przeciwciała poprzez podkreślenie.

Fig. 8 przedstawia dopasowanie przewidywanych sekwencji aminokwasowych łańcucha lekkiego kappa klonu 12.9.1 oraz sekwencji aminokwasowej linii zarodkowej A3/A19. Różnice pomiędzy sekwencją linii zarodkowej A3/A19 i sekwencją klonu są wytłuszczone. Figura pokazuje również pozycje sekwencji CDR1, CDR2 i CDR3 przeciwciała poprzez podkreślenie.

Fig. 22 przedstawia serię dodatkowych sekwencji nukleotydowych i aminokwasowych następujących łańcuchów przeciwciał anty-CTLA-4:

4.1.1:

łańcuch ciężki pełnej długości 4.1.1 (sekwencja cDNA 22(a), genomowa 22(b) i aminokwasowa 22(c));

łańcuch ciężki pełnej długości 4.1.1 nieglikozylowany (sekwencja cDNA 22(d) i aminokwasowa 22(e));

łańcuch lekki 4.1.1 (sekwencja cDNA 22(f) i aminokwasowa 22(g));

4.8.1:

łańcuch ciężki pełnej długości 4.8.1 (sekwencja cDNA 22(h) i aminokwasowa 22(i));

łańcuch lekki 4.8.1 (sekwencja cDNA 22(j) i sekwencja aminokwasowa 22(k));

6.1.1:

łańcuch ciężki pełnej długości 6.1.1 (sekwencja cDNA 22(1) i sekwencja aminokwasowa 22(m)); łańcuch lekki 6.1.1 (sekwencja cDNA 22(n) i aminokwasowa 22(o));

11.2.1:

łańcuch ciężki pełnej długości 11.2.1 (sekwencja cDNA 22(p) i aminokwasowa 22(q)); i łańcuch lekki 11.2.1 (sekwencja cDNA22(r) i aminokwasowa 22(s)).

PL 214 003 Β1

Sekwencje peptydów sygnałowych są pokazane poprzez wytłuszczenie i powiększone litery. Otwarte ramki odczytu wgenomowej sekwencji pełnej długości (Fig. 22(b)) są podkreślone. Mutacje wprowadzone w celu wytworzenia nieglikozylowanego łańcucha ciężkiego 4.1.1 i uzyskana w rezultacie zmiana (N294O) jest pokazana jako podwójne podkreślenie i wytłuszczenie (sekwencja cDNA (Fig. 22(b)) i aminokwasowa (Fig. 22(c))).

Przykład 4

Analiza podstawień aminokwasowych w łańcuchu ciężkim i lekkim

Z Fig. 2, która przedstawia dopasowanie przewidywanych sekwencji aminokwasowych łańcucha ciężkiego z klonów 4.1.1,4.8.1,4.14.3, 6.1.1,3.1.1,4.10.2, 4.13.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 i 12.9.1.1 oraz sekwencji aminokwasowej linii zarodkowej DP-50 (3-33), wyłania się interesująca zależność. Poza tendencją do wykorzystania łańcucha ciężkiego DP-50 w większości klonów, istnieje stosunkowo ograniczona hipermutacja w przeciwciałach w stosunku do linii zarodkowej DP-50. Przykładowo, klony 3.1.1 i 11.2.1 nie mają mutacji. Ponadto, mutacje winnych klonach są zazwyczaj zmianami konserwatywnymi, obejmującymi podstawienia aminokwasami o podobnych właściwościach co aminokwasy w linii zarodkowej. Mutacje w obrębie wielu sekwencji CDR1 i CDR2 są szczególnie konserwowane w naturze. Trzy spośród łańcuchów ciężkich przedstawionych na Fig. 2, 4.10.2, 4.13.1, 4.14.3 wyraźnie pochodzą z jednego zdarzenia rekombinacyjnego (tj. pochodzą z identycznego ośrodka zarodkowego) i mają prawie identyczną sekwencję. Jeżeli traktować je jako pojedynczą sekwencję, wówczas wśród 10 różnych przeciwciał zawierających łańcuch ciężki DP-50, w CDR1 i CDR2 są 3 pozycje, w których niepolarna reszta jest zamieniona na inną niepolarną resztę, 12, w których polarna nienaładowana reszta jest zamieniona na inną polarną nienaładowaną resztę i 1, w której polarna reszta jest zamieniona na inną polarną resztę. Ponadto, istnieją dwie pozycje, w których dwie reszty, które są bardzo podobne strukturalnie, glicyna i alanina są zamienione jedna na drugą. Jedyne mutacje niecałkowicie konserwatywne obejmują 3 podstawienia polarnych naładowanych reszt polarnymi nieładowanymi resztami, i 1 podstawienie niepolamej reszty resztą polarną.

Łańcuchy lekkie tych przeciwciał pochodzą z 5 różnych genów Vk. Gen A27 jest najsilniej reprezentowany i jest źródłem 6 różnych łańcuchów lekkich. Porównanie tych 6 sekwencji wykazuje dwie warte wspomnienia właściwości. Po pierwsze, trzy z nich, 4.8.1,4.14.3 i 6.1.1, zawierają delecje jednej albo dwóch reszt wCDR1, co jest rzadkim zdarzeniem. Po drugie, istnieje silne uprzedzenie wobec zarodkowej seryny w pozycji szóstej w CDR3, co przejawiająca się tym, że seryna ta została zastąpiona w każdej sekwencji. Sugeruje to, że seryna w tej pozycji jest niekompatybilna z wiązaniem CTLA-4.

Będzie można dostrzec, że wiele ze zidentyfikowanych powyżej podstawień znajduje się w bliskości albo w obrębie CDR. Takie podstawienia będą mogły mieć pewien wpływ na wiązanie się przeciwciała cząsteczką CTLA-4. Ponadto, takie podstawienia będą miały znaczący wpływ na powinowactwo przeciwciał.

Przykład 5

Analiza N-końcowej sekwencji aminokwasowej przeciwciał

W celu dalszego zweryfikowania składu i struktury zidentyfikowanych powyżej przeciwciał według wynalazku zsekwencjonowaliśmy niektóre z przeciwciał przy zastosowaniu sekwenatora Perkin-Elmer. Zarówno łańcuch ciężki jak i lekki przeciwciał wyizolowano i oczyszczono poprzez zastosowanie preparatywnej elektroforezy żelowej i technik elektrotransferu na filtr, a następnie bezpośrednio sekwencjonowano jak opisano w Przykładzie 6. Większość sekwencji łańcucha ciężkiego była blokowana na końcu aminowym. Zatem takie przeciwciała traktowano najpierw aminopeptydazą piroglutaminianową, a następnie sekwencjonowano.

Wynik takiego doświadczenia jest pokazany na Fig. 9. Fig. 9 przedstawia również masy cząsteczkowe ciężkich i lekkich łańcuchów jak oznaczono poprzez spektroskopię mas (MALDI). Przykład 6

Dodatkowa charakterystyka przeciwciał

Fig. 10 przedstawia pewne dodatkowe informacje dotyczące charakterystyki niektórych przeciwciał. Na Figurze 10A, zebrane są dane dotyczące klonów 3.1.1,4.1.1,4.8.1,4.10.2, 4.14.3 i 6.1.1. Przedstawione są dane dotyczące: stężenia, ogniskowania izoelektrycznego (IEF), SDS-PAGE, chromatografii wykluczania zależnej od wielkości, spektroskopii mas (MALDI) i N-końcowych sekwencji łańcucha lekkiego.

PL 214 003 Β1

Zasadniczo dane uzyskano jak opisano poniżej:

Materiały i Metody

Stężenie białka oznaczono przy 280 nm poprzez skan UV (200-350 nm), przy czym absorbancja wynosząca 1.58 jednostki przy 280 nm odpowiada 1 mg/ml.

SDS-PAGE przeprowadzono przy zastosowaniu systemu elektroforezy Novex NuPAGE z użyciem 10% żelu NuPAGE i buforu do elektroforezy MES. Próbki przygotowano poprzez rozcieńczenie 3:1 w buforze do próbek 4 x NuPAGE (+/-) beta-merkaptoetanol, podgrzewano i ~5 Lig białka nakładano na żel. Żel barwiono następnie roztworem do barwienia Brilliant Blue R (Sigma cat.# B6529) i masę cząsteczkową oszacowano poprzez porównanie wybarwionych prążków z markerem „Perfect Protein Markers” (Novagen cat#69149-3).

W celu N-końcowego sekwencjonowania, próbki przepuszczono jak wyżej na żelu NuPAGE, przenoszono na filtr Pro Biot (Applied Biosystems), a następnie barwiono roztworem do barwienia Coomassie Blue R-250. Wybarwione prążki białkowe wycinano i poddawano analizie sekwencyjnej poprzez automatyczną degradację Edmana w sekwenatorze Applied Biosystems 494 Procise HT Sequencer.

Ogniskowanie izoelektryczne (JEF) przeprowadzono przy zastosowaniu żeli Pharmacia IEF 3-9 pHast gels (kat. # 17-0543-01). Próbki rozcieńczano w 10% glicerolu do -0,8 mg/ml i 1 μΙ nakładano na żel a następnie barwiono srebrem. Oszacowania pi dokonywano poprzez porównywanie wybarwionych prążków ze standardami IEF o szerokim zakresie (pH 3-10) (Pharmacia kat. # 17-0471-01).

Chromatografię wykluczania zależną od wielkości (SEC) przeprowadzano w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) w systemie Pharmacia SMART przy użyciu kolumny Superdex 75 PC 3,2/30. Oszacowania masy cząsteczkowej dokonywano poprzez porównanie piku czasu zatrzymania z czasem zatrzymania żelu.

Do badań FACS, otrzymano ludzkie obwodowe komórki T i stymulowano je przez 48 godzin. Komórki T przemywano jeden raz, zawieszano w buforze FACS w stężeniu 1x10⁶ komórek/100 μΙ i barwiono pod kątem ekspresji powierzchniowego CD3 10 μΙ przeciwciał anty-CD3-FITC (Immunotech, Marseille, France) przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Komórki dwukrotnie przemywano, a następnie utrwalano, permeabilizowano (zwiększano przepuszczalność błony komórkowej) (Fix and Penn, Caltag) i barwiono pod kątem ekspresji powierzchniowego CTLA-4 przy użyciu 10 μΙ anty-CD1S2-PE (Pharmingen). Cytometrię przepływową przeprowadzono przy zastosowaniu Becton Dickinson FACSort. Kwadranty ustalano poprzez analizę przeciwciał kontrolnych o odpowiednich izotypach (Caltag).

Jak omówiono powyżej, wykazano że przeciwciała anty-CTLA-4 posiadają pewne silne właściwości modulowania układu immunologicznego. Przeprowadzono następujące doświadczenia w celu stwierdzenia, czy przeciwciała według wynalazku posiadają takie aktywności. Generalnie, doświadczenia zaprojektowano tak, aby zbadać zdolność przeciwciał do hamowania oddziaływań pomiędzy cząsteczkami CTLA-4 i B7, do bycia wybiórczymi dla CTLA-4 względem cząsteczek B7 i CD28 oraz promowania wytwarzania cytokin dla komórek T, włączając w to między innymi ekspresję IL-2 i/lub IFN-γ. Ponadto podjęto badania nad reakcją krzyżową przeciwciał z niektórymi tkankami ludzkimi i cząsteczkami CTLA-4 z innych gatunków (np. myszy i naczelnych).

Przykład 7

Kom petycyjny test ELISA: hamowanie oddziaływań CTLA-4/B7-1 lub B7-2 przez przeciwciała

Przeprowadzono test in vitro w celu określenia czy przeciwciała według wynalazku mają zdolność do hamowania wiązania CTLA-4 bądź z B7-1 bądź z B7-2. Jak będzie można to ocenić, przeciwciała które mają zdolność do hamowania wiązania CTLA-4 z cząsteczkami B7 będą mogły być kandydatami do regulowania odpowiedzi immunologicznej poprzez szlak CTLA-4. W teście, zastosowano następujące materiały i metody:

Materiały i metody nM B7.1 -lg(G1) lub B7.2-lg(G1) (Repligen, Inc. Needham, MA) w PBS Dulbecco zastosowano do opłaszczenia 96-studzienkowych płytek MaxiSorp (Nunc, Denmark, #439454) i inkubowano przez noc w4°C. Dnia 2, B7-lg usunięto i płytki blokowano 1% BSA plus 0,05% Tween-20 w D-PBS przez dwie godziny. Płytki przemywano 3X buforem do przemywania (0,05% Tween-20 w D-PBS). Przeciwciała w odpowiednich stężeniach i CTLA-4-lg(G4) (stężenie końcowe 0,3 nM) (Repligen, Inc. Needham, MA) mieszano wstępnie przez 15 minut, a następnie dodawano do płytek opłaszczonych B7-lg (60 μΙ całkowitej objętości) i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1,5 godziny. Płytki przemywano 3X i dodawano 50 μΙ rozcieńczenia 1 do 1000 wyznakowanego HRP mysiego anty-ludzkiego

PL 214 003 Β1 przeciwciała lgG4 (Zymed, San Francisco, CA, #05-3820) i inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT). Płytki przemywano 3X i dodawano 50 μΙ substratu peroksydazy TMB Microwell (Kirkegaard & Peuy, Gaithersburg, MD, #50-76-04) inkubowano w RT przez 20 minut, a następnie do płytki dodawano 50 μΙ 1N H₂SO₄. Płytki sczytywano przy 450 nm przy użyciu czytnika płytek Molecular Device (Sunnyvale, CA). Wszystkie płytki testowano w dwóch powtórzeniach. Maksymalny sygnał był zdefiniowany jako wiązanie CTLA-4-lg w nieobecności przeciwciała. Wiązanie niespecyficzne było zdefiniowane w nieobecności CTLA-4-lg i testowego przeciwciała.

Wyniki z tego testu są przedstawione w tabeli 111A i IIIB. W Tabeli IHA, wyniki są pokazane dla różnych przeciwciał. W Tabeli IIIB, pokazano wyniki porównujące przeciwciało 4.1.1 z przeciwciałem 11.2.1 według wynalazku z odrębnego doświadczenia.

Tabela IIIA

Klon CTLA-4-lg	Izotyp	CTLA4/B7.2 Komp. ELISA IC$o (nM)	CTLA4/B7.1 Komp. ELISA IC$o (nM)
CT3.1.1	lgG2	0.45 ± 0.07 (n=3)	0.63 ± 0.10 (n=2)
CT4.1.1	lgG2	0.38 ± 0.06 (n=5)	0.50 ± 0.05 (n=2)
CT4.8.1	igG2	0.57 ± 0.03 (n=3)	0.17 ± 0.28 (n=2)
CT4.9.1	igG2	Niekompetycyjny (n=3)	Niekompetycyjny (n=2)
CT4.10.2	igG2	1.50 ± 0.37 (n=3)	3.39 + 0.31 (n=2)
CT4.13.1	igG2	0.49 ± 0.05 (n=3)	0.98 ± 0.11 (n=2)
CT4.14.3	igG2	0.69 ± 0.11 (n=3)	1.04 ± 0.15 (n=2)
CT6.1.1	igG2	0.39 ± 0.06 (n=3)	0.67 ± 0.07 (n=2)

Tabela IIIB

Klon CTLA-4-lg	Izotyp	CTLA4/B7.2 Komp. ELISA IC50 (nM)	CTLA4/B7.1 Komp. ELISA IC50 (nM)
CT4.1.1	lgG2	0.55 ± 0.08 (n=4)	0.87 ± 0.14 (n=2)
CT11.2.1	lgG2	0.56 ± 0.05 (n=4)	0.81 ± 0.24 (n=2)

Przykład 8

Stosunek wybiórczości przeciwciał dla CTLA-4 względem CD28 bądź B7-2

Inny test in vitro został przeprowadzony w celu określenia wybiórczości przeciwciał dla CTLA-4 względem CD28 bądź B7-2. W związku z doświadczeniami zastosowano następujące materiały i metody:

Test ELISA stwierdzający wybiórczość dla CTLA-4: Materiały i metody

96-studzienkową płytkę FluroNUNC (Nunc nr kat. 475515) opłaszczono wstępnie czterema antygenami: CTLA-4/lg, CD44/lg, CD28/lg i B7.2/lg (antygeny wytworzone na miejscu). Płytki powlekano antygenami przez noc w temperaturze +4°C w stężeniu 1 ąg/ml i w ilości 100 μΙ/studzienkę w 0,1 M fosforanie sodowym, pH 9,6. Płytkę przemywano następnie trzykrotnie PBST (PBS + 0,1% Tween-20) stosując zmywarkę płytek NUNC. Płytki blokowano PBST+ 0,5% BSA w stężeniu 150 μΙ/studzienkę. Płytki inkubowano w RT przez 1 godzinę, a następnie przemywano trzykrotnie PBST. Następnie przeciwciała anty-CTLA-4 rozcieńczano do stężenia 1 pg/ml i dodawano na płytkę. Płytki inkubowano w RT przez 1 godzinę, a następnie przemywano trzykrotnie PBST. Płytki, które zawierały przeciwciała traktowano następnie w 100 μΙ/studzienkę anty-ludzkimi lgG2-HRP (Southern Biotech nr kat. 9070-05) w rozcieńczeniu 1:4000. Ponadto, jeden rząd traktowano anty-ludzkimi IgG (Jackson Cat Nr 209-035-088) w celu znormalizowania wstępnego opłaszczenia. Przeciwciało rozcieńczono 1:5000 i dodawano w ilości 100 μΙ/studzienkę. Jeden rząd traktowano również anty-ludzkimi CTLA-4-HRP (Pharmingen Cat No. 345815/skoniugowanymi z HRP) jako kontrolę pozytywną. Przeciwciało to zastoso

PL 214 003 Β1 wano jako rozcieńczone w bloku do 0,05 pg/ml. Płytki inkubowano w RT przez 1 godzinę, a następnie przemywano trzykrotnie PBST. Dodawano chemiluminescencyjny substrat LBA (Pierce) w stężeniu 100 pl/studzienkę i płytki inkubowano na wytrząsarce płytek przez 5 min. Płytki sczytywano następnie przy użyciu urządzenia do wykrywania fluorescencji przez 2 min ekspozycji.

Test wybiórczości wiązania IGEN CTLA-4-lg: Materiały i Metody

Kulki Dynabeads M-450 (Dynal A.S, Oslo, Norway #140.02) przemywano 3X buforem fosforanowym Na, pH 7,4 i zawieszano w buforze fosforanowym. 1,0 pg CTLA-4-lg(G1), 1,0 pg CD28-lg(G1) lub 1,0 do 3,0 pg B7.2-lg(G1) (Repligen, Inc. Needham, MA) dodawano do 100 pi kulek i inkubowano przez noc na wytrząsarce rotacyjnej w4°C. Drugiego dnia kulki przemywano 3X 1% BSA plus 0,05% Tween-20 w PBS Dulbecco i blokowano przez 30 minut. Kulki rozcieńczano 1 to 10 buforem blokującym i 25 pi powleczonych kulek dodawano do probówek polipropylenowych 12x75 mm. Wszystkie próbki testowano w dwóch powtórzeniach. 50 pi przeciwciała testowego (końcowe stężenie 1 pg/ml) lub buforu blokującego dodawano do probówek i inkubowano przez 30 minut na karuzeli Origen 1.5 Analyzer (IGEN International, Inc., Gaithersburg, MD) w RT, mieszając z prędkością 100 rpm. Do probówek dodawano 25 pi rutenylowanych mysich anty-ludzkich lgG1, lgG2 lub lgG4 (Zymed, Inc. San Francisco, CA #05-3300, 05-3500 i 05-3800) (końcowe stężenie 3 pg/ml w całkowitej objętości 100 pi). Probówki inkubowano przez 30 minut w RT na karuzeli mieszając je z prędkością 100 rpm. Do każdej probówki dodawano 200 pi buforu Origen (IGEN International, Inc., Gaithersburg, MD #402-050-03) krótko mieszano, a następnie probówki zliczano w analizatorze Origen Analyzer i dla każdej probówki oznaczano jednostki ECL (elektrochemiluminescencji). Określano współczynnik normalizacji w celu skorygowania różnic wiązania białek fuzyjnych do Dynabeads i jednostki ECL korygowano pod kątem niespecyficznego wiązania przed obliczeniem stosunków wybiórczości.

Wyniki tych testów są przedstawione w Tabelach IV A i IVB.

Tabela IVA

Klon	Izo typ	CTLA4.CD28 ELISA	CTLA4/B7.2 ELISA	CTLA4/CD44 ELISA	CTLA4/CD28 IGEN	CTLA4/B7.2 IGEN
3.1.1	lgG2	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=2)	>500:1 (n=1) 195:1 (n=1)
4.1.1	lgG2	>500:1 (n=3)	>5001 (n=2) 485:1 (n=1)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=1) 261:1 (n=1)	>500:1 (n=1) 107:1 (n=1)
4.8.1	igG2	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=2) 190:1 (n=1)	>500:1 (n=3	>500:1 (n=2)	>500:1 (n=2)
4.9.1	igG2	>500:1 (n=2) 244:1 (n=1)	>500:1 (n=2) 33:1 (n=1)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=1)	>500:1 (n=1)
4.10.2	igG2	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=1)	>500:1 (n=1)
4.13.1	igG2	>500:1 (n=2) 46:1 (n=1)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=1) 329:1 (n=1)	>500:1 (n=2)
4.14.3	igG2	>500:1 (n=2) 80:1 (n=1)	>500:1 (n=2) 10:1 (n=1)	>500:1 (n=2) 126:1 (n=1)	>413:1 (n=1)	>234:1 (n=1)
6.1,1	igG2	>500:1 (n=2) 52:1 (n=1)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=2)	>500:1 (n=2)

Tabela IVB

Klon	Izotop	CTLA4/CD28 ELISA	CTLA4/B7.2 ELISA	CTLA4/hlgG ELISA
4.1.1	lgG2	->500:1 (n=3;	>500:1 (n=2)	>500:1 (n=3)
11.2.1	lgG2	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=3)

Przykład 9

Ludzki model przekazywania sygnału przez komórki T

W celu dalszego zdefiniowania aktywności przeciwciał w działaniu jako regulatorów aktywności immunologicznej, opracowaliśmy pewne testy dla komórek T w celu oceny ilościowej wzmocnienia

PL 214 003 Β1 wytwarzania IL-2 przez komórki T przy blokadzie sygnału CTLA-4 przez przeciwciała. Następujące materiały i metody zastosowano w związku z doświadczeniami:

Materiały i metody

Świeżo izolowane komórki T otrzymano przez zastosowanie Histopaque (Sigma, St. Louis, M O #A-70543) iT-kwik (Lympho-Kwik, One Lambda, Canoga Park, CA, #LK-50-T) i stymulowano PHA (1 ąg/ml) (oczyszczona fitohemaglutynina, Murex Diagnostics Ltd. Dartford, England, #HA 16) w pożywce (RPMI 1640 zawierającej L-glutaminę, nieniezbędne aminokwasy MEM, penicylinę, streptomycynę, 25 mM Hepes i 10% FBS) w stężeniu 1 χ 10⁶ komórek/ml i inkubowano w 37°C przez dwa dni. Komórki przemywano następnie i rozcieńczano w pożywce do 2x10⁶ komórek/ml. Komórki Raji (chłoniak Burkitta, Ludzkie nr ATCC: CCL 86 Class l,l American Type Culture Collection Rockville, MD) traktowano następnie mitomycyną C (Sigma St. Louis, MO, # M-4287) (25 μΙ/ml) przez 1 godzinę w 37°C. Komórki Raji przemywano potem 4X w PBS i zawieszano w stężeniu 2x10⁶ komórek/ml. Ludzkie komórki blastyczne T (5x10⁵/ml), komórki Raji (5x10⁵/ml) i przeciwciała anty-CTLA-4 albo izotypowe pasujące kontrolne przeciwciało w różnych stężeniach dodawano do 96-studzienkowych płytek mikrotitracyjnych i płytki inkubowano w 37°C przez 72 godziny. Całkowita objętość na studzienkę wynosiła 200 μΙ. Siedemdziesiąt dwie godziny po stymulacji, płytki zwirowywano, a supernatant pobierano i zamrażano w celu dalszego oznaczania IL-2 (Ouantikine IL-2 ELISA kit, R&D Systems, Minneapolis, MN, #D2050) i IFN-γ (Ouantikine IFN-g ELISA kit, R&D Systems). Wzmocnienie cytokin zdefiniowano jako różnice pomiędzy poziomem cytokin w hodowlach zawierających blokujące mAb anty-CTLA-4 versus przeciwciało kontrolne o pasującym izotypie. Dla doświadczeń z cytometrią przepływową, komórki Raji przemywano 1x buforem FACS (bufor PBS zawierający 2% inaktywowaną termicznie FOS, 0,025% azydek sodu). Osady komórkowe zawieszano w buforze FACS w stężeniu 1x10⁶ komórek/100 μΙ i inkubowano z 10 μΙ anty-CD80-PE (Becton Dickinson, San Jose, CA) lub anty-CD86-PE (Pharmingen, San Diego, CA) przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Komórki przemywano następnie dwukrotnie i zawieszano w 1 ml bufona FACS. Cytometrię przepływową przeprowadzono stosując Becton Dickinson FACSort. Markery histogramowe ustalono poprzez analizę odpowiednich izotypowych przeciwciał kontrolnych (Caltag, Burlingame, CA).

Ogólnie, opracowaliśmy test, który można zastosować do szybkiego określania podwyższenia poziomu wydzielania IL-2 przez komórki T. Jak będzie to można ocenić, stymulacja komórek T jest zależna od B7 i CD28. Ponadto, przemywane komórki blastyczne T nie wytwarzają IL-2 i komórki Raji nie wytwarzają wykrywalnych ilości IL-2 nawet po stymulacji LPS lub PWM. Jednakże, w kombinacji, komórki blastyczne T hodowane jednocześnie z komórkami Raji mogą modelować przekazywanie sygnałów przez B7, CTLA-4 i CD28 i dzięki temu można oceniać wpływ przeciwciał taką sygnalizację.

Fig. 11 pokazuje ekspresję B7-1 i B7-2 na komórkach Raji przy zastosowaniu mAb anty-CD80PE i anty-CD86-PE przy zastosowaniu cytometrii przepływowej (FASC) jak opisano w Przykładzie 6.

Fig. 12 pokazuje zależne od stężenia wzmocnienie wytwarzania IL-2 w teście blastocytów T/komórki Raji indukowane poprzez blokujące przeciwciała anty-CTLA-4 (BNI3 (PharMingen) oraz przeciwciała 4.1.1,4.8.1 i 6.1.1).

Fig. 13 pokazuje zależne od stężenia wzmocnienie wytwarzania IFN-γ w teście blastocyty T/komórki Raji indukowane poprzez blokujące przeciwciała anty-CTLA-4 (BNI3, 4.1.1,4.8.1 i 6.1.1) (te same donorowe komórki T).

Fig. 14 pokazuje średnie wzmocnienie wytwarzania IL-2 w komórkach T od 6 dawców indukowane poprzez blokujące przeciwciała anty-CTLA-4 w teście blastocyty T/komórki Raji. Interesujący jest fakt, że mAb, CT4.9.1, wiążąsię z CTLA-4, ale nie blokują wiązania z B7. A zatem, proste wiązanie z CTLA-4 jest samo niewystarczające, aby dostarczyć funkcjonalne przeciwciało według wynalazku.

Fig. 15 pokazuje średnie wzmocnienie wytwarzania IFN-γ w komórkach T od 6 dawców indukowane poprzez blokujące przeciwciała anty-CTLA-4 w teście blastocyty T/komórki Raji.

Fig. 19 pokazuje porównanie między przeciwciałami 4.1.1 i 11.2.1 według wynalazku w stężeniu 30 ąg/ml w 72 godzinnym teście blastocyty T /komórki Raji jak opisano w Przykładzie 9 i teście z superantygenem opisanym w Przekładzie 10.

Fig. 20 pokazuje zależne od stężenia wzmocnienie wytwarzania IL-2 w teście blastocyty T/komórki Raji indukowane przez przeciwciała anty-CTLA-4 4.1.1 i 11.2.1.

Przedstawiona poniżej Tabela IVc dostarcza informacji dotyczących średniego wzmocnienia i zakresu wytwarzania odpowiedzi cytokinowej w testach Raji i SEA. Każde z doświadczeń włączonych do wyników opiera się na przeciwciałach w dawce 30 ąg/ml i pomiarach w 72 godzinie. Pokazane są liczby dawców zastosowanych w tych doświadczeniach jak również odpowiedzi.

PL 214 003 Β1

Tabela IVc

Test	mAb	Cytokina	Średnie wzmocnienie pg/ml	SEM	Zakres wzmacniania pg/ml	n	Odpowiedź donora
T blastocyty/Raji	4.1.1	IL-2	3329	408	0 do 8861	42	19z21
T blastocyty/Raji	4.1.1	IFN-y	3630	980	600 do 13939	17	13 z 13
T blastocyty/Raji	11.2.1	IL-2	3509	488	369 do 6424	18	14 z 14
SEA (PBMC)	4.1.1	IL-2	2800	312	330 do 6699	42	17 z 17
SEA (PMBC)	11.2.1	IL-2	2438	366	147 do 8360	25	15 z 15
SEA (krew pełna)	4.1.1	IL-2	6089	665	-168 do 18417	46	15 z 17
SEA (krew pełna)	11.2.1	IL-2	6935	700	-111 do 11803	25	12 z 14

Przykład 10

Model przekazywania sygnału przez ludzkie komórki T

Opracowaliśmy drugi test komórkowy w celu oceny ilościowej wzmocnienia wytwarzania IL-2 przez komórki T przy blokadzie sygnału CTL-4 przez przeciwciała.

Następujące materiały i metody zastosowano w związku z doświadczeniami: Materiały i metody

Ludzkie PBMC przygotowano przy użyciu Accuspin. Płytki do mikromiareczkowania opłaszczono przeciwciałem anty-CD3 (Ieu4, Becton Dickinson) (60 ng/ml) i inkubowano przez 2 godziny w 37°C. hPBMC dodawano do studzienek w stężeniu 200000 komórek na studzienkę. Enterotoksynę A Staphylcoccus (SEA) (Sigma) dodawano do studzienek w stężeniu 100 ng/ml. Przeciwciała dodawano do studzienek zwykle w stężeniu 30 ąg/ml. Komórki stymulowano następnie przez 48, 72 lub 96 godzin. Płytki zwirowywano w odpowiednich punktach czasowych i supernatanty pobierano ze studzienek. Następnie, supernatanty sprawdzano pod kątem wytwarzania IL-2 stosując test ELISA (R&D Systems).

Wyniki tych doświadczeń są pokazane na Fig. 16, 17 i 21.

Na Fig. 16 indukcję wytwarzania IL-2 w hPBMC od 5 dawców mierzono 72 godziny po stymulacji. Na Fig. 17 pokazane są wyniki pomiarów dla pełnej krwi, analizujące różnice w indukcji wytwarzania IL-2 we krwi od 3 dawców mierzone po 72 i 96 godzinach po stymulacji SEA.

Na Fig. 21 wzmocnienie wytwarzania IL-2 dla pełnej krwi od 2 dawców mierzono 72 godziny po stymulacji.

Przykład 11

Zwierzęcy model nowotworu

Opracowaliśmy zwierzęcy model nowotworu do analizy przeciwciał anty-mysie-CTLA-4 in vivo pod kątem ich aktywności hamującej wzrost nowotworu. W tym modelu, hodowano u myszy włókniakomięsak, a zwierzęta traktowano przeciwciałami anty-mysie-CTLA-4. Materiały i metody do opracowania modelu są przedstawione poniżej:

Materiały i metody

Samicom myszy A/J (6-8 tygodniowym) wstrzykiwano podskórnie po stronie grzbietowej szyi 0,2 ml komórek nowotworowych SaIN (1x10⁶) (Baskar 1995). Przeciwciało anty-mysi CTLA-4 albo kontrolne o pasującym izotypie (PharMingen, San Diego, CA, 200 ąg/zwierzę) wstrzyknięto dootrzewnowo dnia 0, 4, 7 i 14 po wstrzyknięciu komórek nowotworowych. Pomiarów nowotworu dokonywano w okresie 3-4 tygodniowych doświadczeń przy użyciu elektronicznego przyrządu do kalibracji Starrett SPC Plus (Athol, MA), a rozmiar nowotworu wyrażano jako powierzchnię pokrytą przez nowotwór (mm²).

Fig. 18 pokazuje hamowanie wzrostu nowotworu przez przeciwciało anty-mysi CTLA-4 w mysim modelu włókniakomięsaka. Jak pokazano na Fig. 18 zwierzęta traktowane anty-CTLA-4 wykazują zmniejszenie wzrostu nowotworu w porównaniu ze zwierzętami traktowanymi izotypowym przeciwciałem kontrolnym. A zatem, mAb anty-mysi CTLA-4 są zdolne do hamowania wzrostu włókniakomięsaka w mysim modelu nowotworu.

PL 214 003 Β1

Można się spodziewać, że przeciwciała, które wykazują reakcje krzyżową z mysim CTLA-4 będą zachowywały się podobnie w tym modelu. Jednakże, przeciwciała według wynalazku, które sprawdzano pod kątem reakcji krzyżowej, nie wykazująjej z mysim CTLA-4.

Przykład 12

Zwierzęcy model nowotworu

Zaprojektowano mysi model heteroprzeszczepu u myszy SCID w celu dalszego zbadania aktywności przeciwciał wobec ustalonych nowotworów i pochodzących od nich przerzutów. W tym modelu, dostarczone są myszy SCID z przeszczepionymi ludzkimi komórkami T, którym wszczepiono pochodzące od pacjenta komórki nie-małokomórkowego raka płuc (ang. non-small celi lung, NSCL) albo raka jelita grubego i okrężnicy (ang. colorectal carcinoma, CC). Wszczepienia dokonuje się do gonadalnych poduszek tłuszczowych myszy SCTD. Umożliwia się wzrost nowotworu, a następnie usuwa się go. U myszy rozwija się nowotwór typu ludzkiego i przerzuty do wątroby. Taki model jest opisany w (Bumpers i wsp. J. Surgical Res. 61:282-288 (1996).

Oczekuje się, że opisane tu przeciwciała będą hamować wzrost nowotworów powstałych u takich myszy.

Literatura

Alegre i wsp. J Immunol 157: 4762-70 (1996)

Allison i Krummel Science 270: 932-933 (1995)

Balzano i wsp. Int J Cancer Suppl 7: 28-32 (1992)

Blair i wsp. J Immunol 160:12-5 (1998)

Blake i Litzi-Davis BioConjugate Chem. 3: 510-513 (1992)

Boussiotis i wsp. Proc Natl Acad Sci USA 90:11059-63 (1993)

Bowie i wsp. Science 253:164 (1991)

Bruggeman i wsp. PN AS USA 86: 6709-6713 (1989)

Bruggeman, M. i Neuberger, M. S. w Methods: A companion to Methods in Enzymology 2:159-165 (Lerner i wsp. red. Academic Press (1991))

Bruggemann i wsp., „Humań antibody production in transgenic mice: expression from 100 kb of the human IgH locus.” Eur. J. Immunol. 21: 1323-1326 (1991)

Bruggemann, M. i Neuberger, M. S. „Strategies for expressing human antibody repertoires in transgenic mice.” Immunology Today 17: 391-397 (1996)

Brunet i wsp. Naturę 328: 267-270 (1987)

Bumpersetal J. Surgical Res. 61: 282-288 (1996)

Capsey i wsp. Genetically Engineered Human Therapeutic Drugs (Stockton Press, NY (1988))

Castan i wsp. Immunology 90: 265-71 (1997)

Cepero i wsp. J Exp Med 188:199-204 (1998)

Chen i wsp. „Immunoglobulin gene rearrangement in B-cell deficient mice generated by targeted deletion of the JH locus” International Immunology 5: 647656 (1993)

Cheni wsp. Celi 71:1093-1102 (1992)

Chen i wsp. Human Gene Therapy 5 : 595-601 (1994)

Chiswell i McCafferty TIBTECH 10: 80-84 (1992)

Choi i wsp. „Transgenic mice containing a human heavy chain immunoglobulin gene fragment cloned in a yeast artificial chromosome” Naturę Genetics 4: 117123 (1993)

Chothia i Lesk J. Mol. Biol. 196: 901 -917 (1987)

Chothia i wsp. Naturę 342: 878-883 (1989)

Chuang i wsp. J. Immunol. 159:144-151 (1997)

Coligan i wsp., Unit 2.1, „Enzyme-linked immunosorbent assays, in Current protocols in immunology (1994)

Cwirla i wsp. PNAS USA 87: 6378-6382 (1990)

Dariavach i wsp. Eur. J. Immunol. 18: 1901 -1905 (1988)

Dayhoff, M. O., w Atlas of Protein Sequence and Structure, str. 101-110 (Vol. 5, National Biomedical Research Foundation (1972)) oraz dodatek nr 2 do tego tomu, str. 1-10 de Boer i wsp. Eur J Immunol 23: 3120-5 (1993)

Eckstein, Red., Oxford University Press, Oxford England (1991)

Evans i wsp. J. Med. Chem. 30: 1229 (1987)

Fallarino i wsp. J Exp Med 188: 205-10 (1998)

Fanger i wsp. Immunol Methods 4: 72-81 (1994)

PL 214 003 Β1

Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15: 29 (1986)

Fishwild i wsp., „High-avidity human IgGy monoclonal antibodies from a novel strain of minilocus transgenic mice.” Naturę Biotech. 14: 845-851 (1996)

Freeman i wsp. J Exp Med 178: 2185-92 (1993)

Freeman i wsp. J Immunol 161: 2708-15 (1998)

Freeman i wsp. Science 262: 907-9 (1993)

Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., red., wyd. 2, Raven Press, N. Y. (1989))

Galfre, G. i Milstein, C., „Preparation of monoclonal antibodies: strategies and procedures.” Methods Enzymol. 73: 3-46 (1981)

Gorman i wsp. P. N. A. S. 79: 6777 (1982)

Green and Jakobovits J. Exp. Med. 188: 483-495 (1998)

Green i wsp. Naturę Genetics 7:13-21 (1994)

Grosschedl i wsp. Celi 41:885 (1985)

Hanes and Plucthau PNAS USA 94: 4937-4942 (1997)

Harding i wsp. Naturę 356: 607-609 (1994)

Harper i wsp. J Immunol 147:1037-44 (1991)

Hathcock i wsp. Science 262: 905-7 (1993)

Hoganboom i wsp. Immunol. Reviews 130: 43-68 (1992)

Horspool i wsp. J Immunol 160: 2706-14 (1998)

Houghten i wsp. Bioteehniques 13: 412-421 (1992)

Houghten PNAS USA 82: 5131 -5135 (1985)

Hurwitz i wsp. J Neuroimmunol 73: 57-62 (1997)

Hurwitz i wsp. Proc Natl Acad Sci U S A 95: 10067-71 (1998)

Immunology-A Synthesis (wyd. 2, E. S. Golub i D. R. Greń, red., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991))

Introduction to Protein Structure (C. Branden i J. Tooze, red., Garland Publishing, New York, N. Y. (1991))

Jakobovits i wsp., „Germ-line transmission and expression of a human-derived yeast artificialchromosome.” Naturę 362: 255-258 (1993)

Jakobovits, A. i wsp., „Analysis of homozygous mutant chimeric mice: Deletion of the immunoglobulin heavy-chain joining region blocks B-cell development and antibody production.” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551-2555 (1993)

Jakobovits, A., „Humanizing the mouse genome.” Current Biology 4: 761-763 (1994)

Jakobovits, A., „Production of fully human antibodies by transgenic mice.” Current Opinion in Biotechnology 6: 561 -566 (1995)

Junghans i wsp. in Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2 wyd., Chafner i Longo, red., Lippincott Raven (1996))

Kabat i wsp. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, N. I. H. publication no. 91-3242

Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991))

Kostelny i wsp. J. Immunol. 148:1547-1553 (1992)

Krummel and Allison J Exp Med 182: 459-65 (1995)

Krummel i wsp. Intlmmunol 8: 519-23 (1996)

Kuchroo i wsp. Celi 80: 707-18 (1995)

Kwon i wsp. PNAS USA 94: 8099-103 (1997)

LaPlanche i wsp. Nuci. Acids Res. 14: 9081 (1986)

Lenschow i wsp. Proc Natl Acad Sci USA 90:11054-8 (1993)

Lenschow i wsp. Science 257: 789-792 (1992)

Lin i wsp. J Exp Med 188: 199-204 (1998)

Linsley i wsp. J Exp Med 176: 1595-604 (1992)

Linsley i wsp. J. Exp. Med. 174: 561 -569 (1991)

Linsley i wsp. Science 257: 792-795 (1992)

Liu i wsp. J. Immunol. 139: 3521 (1987)

Liu i wsp. P. N. A. S. 84: 3439 (1987)

PL 214 003 Β1

Lonberg i wsp., „Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications.” Naturę 368: 856-859 (1994).

Luhder i wsp. J Exp Med 187: 427-32 (1998)

Marasco Gene Therapy 4:11-15(1997)

Markees i wsp. J Clin lnvest 101: 2446-55 (1998)

Marks i wsp., „Oligonucleotide primers for polymerase chain reaction amplification of human immunoglobulin variable genes and design of family-specific oligonucleotide probes.” Eur. J. Immunol. 21: 985-991 (1991)

McCoy i wsp. J Exp Med 186: 183-7 (1997)

Mendez i wsp. Naturę Genetics 15: 146-156 (1997) Needleman i Wunsch J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)

Okayama i wsp. Mol. Celi. Bio. 3: 280 (1983)

Parmley and Smith Gene 73: 305-318 (1988)

Pearson and Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.) 85: 2444 (1988)

Perez i wsp. Immunity 6: 411 -7 (1997)

Perrin i wsp. Immunol Res 14:189-99 (1995)

Perrin i wsp. J Immunol 157 : 1333-6 (1996)

Pinalia i wsp. Biotechniques 13: 901-905 (1992)

Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, red., W. H. Freeman and Company, New York (1984))

Razi-Wolf i wsp. Proc Natl Acad Sci U S A 90: 11182-6 (1993)

Remington's Pharmaceutical Sciences (15th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975)), szczególnie rozdział 87 napisany przez Blaug, Seymour

Rizo i Gierasch, Ann. Rev. Biochem. 61: 387 (1992)

Russel i wsp. Nuci. Acids Research 21: 1081 -1085 (1993)

Schwartz Celi 71:1065 (1992)

Scott TIBS 17: 241 -245 (1992)

Smith i Waterman Adv Appl. Math. 2: 482 (1981)

Songsivilai i Lachmann Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990)

Stec i wsp. J. Am. Chem. Soc. 106: 6077 (1984)

Stein i wsp. Nuci. Acids Res. 16: 3209 (1988)

Taylor i wsp., „A transgenic mouse that expresses adiversity of human sequence heavy and light chain immunoglobulins.” Nucleic Acids Research 20: 6287-6295 (1992)

Taylor i wsp., „Human immunoglobulin transgenes undergo rearrangement, somatic mutation and class switching in mice that lack endogenous IgM.” International Immunology 6: 579-591 (1994)

The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., red., McGraw-Hill, San Francisco (1985)) Thornton et at. Naturę 354:105 (1991)

Tivol i wsp. Immunity 3: 541 -7 (1995)

Townsend i Allison Science 259: 368 (1993)

Trauneckeri wsp. Int. J. Cancer (SuppL) 7: 51-52 (1992)

Tuaillon i wsp. „Analysis of direct and inverted DJH rearrangements in a human Ig heavy chain transgenic minilocus” J. Immunol. 154: 6453-6465 (1995)

Tuaillon i wsp., „Human immunoglobulin heavy-chain minilocus recombination in transgenic mice: gene-segment use in p and y transcripts. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 3720-3724(1993)

Uhlmann i Peyman, Chemical Reviews 90: 543 (1990)

Van Parijs i wsp. J Exp Med 186:1119-28 (1997)

Veberi Freidinger TINS str. 392 (1985)

Vitetta Immunol Today 14: 252 (1993)

Walunas i wsp. Immunity I: 405-13 (1994)

Walunas i wsp. J Exp Med 183: 2541 -50 (1996)

Waterhouse i wsp. Science 270: 985-988 (1995)

Winter and Harris Immunol Today 14: 43-46 (1993)

Wright i wsp. Crit. Reviews in Im77lunol. 12125-168 (1992)

Yang i wsp. CancerRes 57: 4036-41 (1997)

Yi-qun i wsp. Int Immunol 8: 37-44 (1996)

Zon i wsp. Anti-Cancer Drug Design 6: 539 (1991)

PL 214 003 Β1

Zon i wsp. Oligonucleotides and Analogues. A Practical Approach, str. 87-108 (F. Eckstein, red., Oxford University Press, Oxford England (1991))

Fry i wsp. “Specific, irreversible inactivation of the epidermal growth factor receptor and erbB2, by a new class of tyrosine kinase inhibitor” Proc Natl Acad Sci USA 95: 12022-7 (1998)

Hoffman i wsp. „A model of Cdc25 phosphatase catalytic domain and Cdkinteraction surface based on the presence of a rhodanese homology domain” J Mol Biol 282: 195-208 (1998)

Ginalski i wsp. „Modelling of active forms of protein kinases: p38-a case study” Acta Biochim Pol 44:557-64(1997)

Jouko i wsp. „Identification of csk tyrosine phosphorylation sites and a tyrosine residue important for kinase domain structure” Biochem J 322: 927-35 (1997)

Singh i wsp. „Structure-based design of a potent, selective, and irreversible inhibitor of the catalytic domain of the erbB receptor subfamily of protein tyrosine kinases” J Med Chem 40: 1130-5 (1997)

Mandel i wsp. „ABGEN: a knowledge-based automated approach for antibody structure modeling” Nat Biotechnol 14: 323-8 (1996)

Monfardini i wsp. „Rational design, analysis, and potential utility of GM-CSF antagonists” Proc Assoc Am Physicians 108: 420-31 (1996)

Furet i wsp. „Modelling study of protein kinase inhibitors: binding modę of staurosporine and origin of the selectivity of CGP 52411” J Comput Aided Mol Des 9: 465-72 (1995)

III i wsp. „Design and construction of a hybrid immunoglobulin domain with properties of both heavy and light chain variable regions” Protein Eng 10: 94957 (1997)

Martin i wsp. „The affinity-selection of aminibody polypeptide inhibitor of human interleukin-6” EMBO J 13: 5303-9 (1994)

Zgłoszenie patentowe nr seryjny 07/466,008, złożone 12 stycznia, 1990

Zgłoszenie patentowe nr seryjny 07/574,748, złożone 29 sierpnia, 1990

Zgłoszenie patentowe nr seryjny 07/575,962, złożone 31 sierpnia, 1990

Zgłoszenie patentowe USA nr seryjny 07/610,515, złożone 8 listopada, 1990

Zgłoszenie patentowe USA nr seryjny 07/810,279, złożone 17 grudnia, 1991

Zgłoszenie patentowe USA nr seryjny 07/853,408, złożone 18 marca, 1992

Zgłoszenie patentowe USA nr seryjny 07/904,068, złożone 23 czerwca, 1992,

Zgłoszenie patentowe USA nr seryjny 07/919,297, złożone 24 lipca 1992

Zgłoszenie patentowe USA nr seryjny 07/990,860, złożone 16 grudnia 1992

Zgłoszenie patentowe USA nr seryjny 08/031,801, złożone 15 marca 1993

Zgłoszenie patentowe USA nr seryjny 08/053,131, złożone 26 kwietnia, 1993

Zgłoszenie patentowe USA nr seryjny 08/096,762, złożone 22 lipca, 1993

Zgłoszenie patentowe USA nr seryjny 08/112,848, złożone 27 sierpnia, 1993

Zgłoszenie patentowe USA nr seryjny 08/155,301, złożone 18 listopada, 1993

Zgłoszenie patentowe USA nr seryjny 08/161,739, złożone 3 grudnia, 1993

Zgłoszenie patentowe USA nr seryjny 08/165,699, złożone 10 grudnia, 1993

Zgłoszenie patentowe USA nr seryjny 08/209,741, złożone 9 marca, 1994

Zgłoszenie patentowe USA nr seryjny 08/234,145, złożone 28 kwietnia, 1994

Zgłoszenie patentowe USA nr seryjny 08/724,752, złożone 2 października, 1996

Zgłoszenie patentowe USA nr seryjny 08/730,639, złożone 11 października, 1996

Zgłoszenie patentowe USA nr seryjny 08/759,620, złożone 3 grudnia, 1996

Patent USA nr 4,399,216

Patent USA nr 4,681,581

Patent USA nr 4,683,195

Patent USA nr 4,683,202

Patent USA nr 4,753,210

Patent USA nr 4,740,461

Patent USA nr 4,816,397

Patent USA nr 4,912,040

Patent USA nr 4,959,455

Patent USA nr 5,101,827

Patent USA nr 5,102,990 (RE 35,500)

Patent USA nr 5,151,510

Patent USA nr 5,194,594

PL 214 003 Β1

Patent USA nr 5,434,131 Patent USA nr 5,530,101 Patent USA nr 5,545,806 Patent USA nr 5,545,807 Patent USA nr 5,585,089 Patent USA nr 5,591,669 Patent USA nr 5,612,205 Patent USA nr 5,625,126 Patent USA nr 5,625,825 Patent USA nr 5,633,425 Patent USA nr 5,643,763 PatentUSA nr 5,648,471 Patent USA nr 5,661,016 Patent USA nr 5,693,761 Patent USA nr 5,693,792 Patent USA nr 5,697,902 Patent USA nr 5,703,057 PatentUSA nr 5,714,350 PatentUSA nr 5,721,367 Patent USA nr 5,733,743 PatentUSA nr 5,770,197 Patent USA nr 5,770,429 Patent USA nr 5,773,253 Patent USA nr 5,777,085 Patent USA nr 5,789,215 Patent USA nr 5,789,650 Patent USA nr 5,811,097

Europejskie zgłoszenie patentowe nr EP 0 546 Europejskie zgłoszenie patentowe nr EP 0 463 Międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO Międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO Międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO Międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO Międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO Międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO Międzynarodowa zgłoszenie patentowe nr WO Międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO Międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO Międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO Międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO Międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO Międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO Międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO Międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO Międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO Międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO Międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO Międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO Międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO Międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO Międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO Międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO Międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO Międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO Międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO

073 B1

151 B1, opublikowane 12 czerwca 1996

92/02190

92/03918

92/22645

92/22647

92/22670

93/00431

93/12227

94/00569

94/02602 opublikowane 3 lutego 1994

94/25585

96/14436

97/13852

98/24884

94/25585

94/29444

95/01994

95/03408

95/24217

95/33770

96/14436

96/34096, opublikowane 31 października 1996

97/13852

97/20574

97/38137

98/24884

98/24893, opublikowane 11 czerwca 1998.

PL 214 003 Β1

Lista sekwencji <110> ABGENIK, INC.

PFIZ-ER INC.

<120> Monoklonalne przeciwciało przeciwko CTLA-4 <130> ΑΒΧ-PFl PCT <140> PCT/US99/30895 <141> 1999-12-23 <150> 60/113,647 <151> 1999-12-23 <160> 147 <170> Patentln wer. 2.1 <210> 1 <211> 463 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 1

Ser

Trp Val

Phe Leu 10

Val

Ala

Leu

Leu

Arg 15

Gly

Met

Glu

Phe Gly

Leu 5

Val

Gin

Cys

Gin

Val

Gin

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Val

Val

Gin

20

25

30

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Val

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

35

40

45

Ser

Ser

His

Gly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

50

55

60

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Arg

Asn

Lys

Tyr

Tyr

Ala

65

70

75

80

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

85

90

95

Thr

Leu

Phe

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

100

105

110

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Gly

His

Phe

Gly

Pro

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

115

120

125

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

130

135

140

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

145

150

155

160

Ala

Leu

Gly

cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

165

170

175

PL 214 003 Β1

Ser

Trp

Asn

Ser 180

Gly

ΑΣ3

Leu

Thr

Ser 185

Gly

Val

His

Thr

Phe 190

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

195

200

205

Pro

Ser

Ser

Asn

Phe

dy

Thr

Gin

Thr

Tyr

Thr

Cys

Asn

Val

Asp

His

210

215

220

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Thr

Val

Glu

Arg

Lys

Cys

Cys

225

230

235

240

Val

Glu

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Pro

Val

Ala

Gly

Pro

Ser

Val

245

250

255

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

260

265

270

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

275

280

285

Val

Gin

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

dy

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

290

295

300

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Phe

Asn

Ser

Thr

Phe

Arg

Val

Val

Ser

305

310

315

320

Val

Leu

Thr

Val

Val

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

325

330

335

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Gly

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

340

345

350

Ser

Lys

Thr

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

355

360

365

Pro

Ser

Arg

G1 u

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

U ^5 U

370

375

380

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Vał

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

385

390

395

400

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Met

Leu

Asp

Ser

405

410

415

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

420

425

430

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

43 5

440

445

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

450

455

4 60

<210> 2 <211> 464

PL 214 003 Β1 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 2

Met 1

Glu

Phe

Gly

Leu 5

Ser

Trp

Val

Phe

Leu 10

Val

Ala

Leu

Leu

Arg 15

Gly

Val

Gin

Cys

Gin

Val

Gin

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Val

Val

Gin

20

25

30

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Thr

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

35

40

4 5

Ser

Asn

Tyr

Gly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

50

55

60

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Tl ώ

Trp

Tyr

Asp

Gly

Ser

Asn

Lys

His

Tyr

Giy

65

70

75

80

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

85

90

95

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Al a

Glu.

Asp

Thr

Ala

Val

100

105

110

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Glu

Arg

Leu

Gly

Ser

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

115

120

125

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

130

135

140

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

145

150

155

160

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

165

170

17 5

Val

Ser

Trp

As n

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

180

185

190

Al a

Va 1

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

195

200

205

a 1

Pro

Ser

Ser

Asn

Phe

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

Thr

Cys

Asn

Val

Asp

210

215

220

His

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Thr

Val

Glu

Arg

Lys

Cys

225

230

235

240

Cys

Val

Glu

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Al a

Pro

Pro

Val

Ala

Gly

Pro

Ser

245

250

255

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

260

2 65

270

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Va 1

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

275

280

285

PL 214 003 Β1

Glu

Val 290

Gin

Phe

Asn

Trp

Tyr 2 9b

Val

Asp

Gly

Val

Glu 300

Val

His

Asn

Ala

Lys

Tir n

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Phe

Asn

Ser

Thr

Phe

Arg

Val

Val

305

310

315

320

Ser

val

Leu

Thr

Val

Val

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

325

330

335

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Gly

Leu

Pro

Ala

Pro

Tle

Glu

Lys

Thr

340

345

350

Ile

Ser

Lys

Tłir

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

355

360

365

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

370

375

380

Leu

val

Lys

Gly

Phe

f£y£.

Pro

C! a, y

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

38 5

390

395

400

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Met

Leu

Asp

405

410

415

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

420

425

430

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

435

440

445

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Łys

450 455 460 <210> 3 <211> 163 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3

Pro Gly 1

Arg

Ser

Leu Arg 5

Leu

Ser

Cys

Ala Ala 10

Ser

Gly

Phe

Thr 15

Phe

Ser

Ser

His

Gly

Ile

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

20

25

30

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Arg

Asn

Lys

Asp

Tyr

Ala

35

40

45

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Lys

50

55

60

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

65

70

75

80

Tyr Tyr Cys Ala Arg V-.il Ala Pro Leu. Gly Pro Leu Asp Tyr Trp Gly

90 95

PL 214 003 Β1

Gin

dy

Thr

Leu 100

Val

Thr

Val

Ser

Ser 105

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly 110

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

115

120

125

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

130

135

140

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

145

150

155

160

Val

Leu

Gin

<210> 4 <211> 463 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 4

Phe

Leu 10

Val

Ala

Leu

Leu

Arg 15

Gly

Met 1

Glu

Phe Gly

Leu 5

Ser

Trp

Val

Val

Gin

Cys

Gin

Val

Gin

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Val

Val

Glu

20

25

30

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Thr

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

35

40

45

Ser

Ser

Tyr

Gly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

dy

Leu

50

55

60

Glu

Trp

Val

Ala

val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Ser

Asn

Lys

His

Tyr

Ala

65

70

75

80

Asp

Ser

Ala

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

85

90

95

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Al a

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

100

105

110

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Ala

θίγ

Leu

leu

Gly

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

115

120

125

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

dy

Pro

Ser

130

135

140

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

145

150

155

160

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Vai

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

165

170

175

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

L ,e u

Thr

Ser

dy

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

180

185

190

Val

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

val

val

Thr

Val

PL 214 003 Β1

195

200

205

Pro

Ser

Ser

Asn

Phe

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

Thr

Cys

Asn

Yal

Asp

His

2x0

215

220

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Thr

Val

Glu

Arg

Lys

Cys

cys

225

230

235

240

Val

Glu

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Pro

Val

Ala

Gly

Pro

Ser

Val

245

250

255

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

260

265

270

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

275

280

285

Val

Gin

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

290

295

300

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Phe

Asn

Ser

Thr

Phe

Arg

Val

Val

Ser

305

310

315

320

Val

Leu

Thr

Val

Val

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

325

330

335

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

dy

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

340

345

350

Ser

Lys

Thr

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

355

360

365

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

370

375

380

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

385

390

395

4 00

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Met

Leu

Asp

Ser

405

410

415

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

420

425

430

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

Hi s

Glu

Al a

Leu

435

440

445

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

450

455

4 60

<210> 5 <211> 169 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5

Gly Val Val Gin Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

PL 214 003 Β1

1

5

10

15

Giy

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser

Tyr

Gly

Met

His

Trp

Va 1

Arg

Gin

Ala

Pro

20

25

3 0

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Tle

Trp

Tyr

Asp

Gly

Ser

Asn

35

40

45

Lys

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

50

55

60

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

65

70

75

80

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Ala

Arg

Ile

Ile

Thr

Pro

85

90

95

Cys

Met

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

100

105

110

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

cys

Ser

Arg

Ser

115

120

125

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

val

Lys

Asp

Tyr

Phe

130

135

140

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ar a

Leu

Thr

Ser

Gly

145

150

155

160

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

165 <210> 6 <211> 167 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6

Gly 1

Val

Val Gin

Pro 5

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg 10

Leu

Ser Cys

Val

Ala 15

Ser

Gly

Phe

Ile

Phe

Ser

Ser

His

Gly

Ile

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

20

25

30

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

dy

Arg

Asn

35

40

45

Lys

Asp

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

50

55

60

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arą

Ala

Glu

65

70

75

80

Asp

Thr

Ala

val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Val

Ala

Pro

Leu

Gly

Pro

Leu

85

90

95

Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

PL 214 003 Β1

100

105

110

Lys

Gly

Pro

Se.r

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

115

120

125

Glu

Ser

Thr

Al a

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

130

135

140

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

145

150

155

160

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

165 <210> Ί <211> 172 <212> PRT

<213> Homo

sapiens

<400> 7

Ser

Gly

Pro

Gly

Leu

Val

Lys

Pro

Ser

Gin

Tle

Leu

Ser

Leu

Thr

cys

1

5

10

15

Thr

Val

Ser

Gly

Gly

Ser

Ile

Ser

Ser

Gly

Gly

His

Tyr

Trp

Ser

Trp

20

25

30

ile

Arg

Gin

His

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Ile

Gly

Tyr

Tle

Tyr

35

40

45

Tyr

ile

Gly

Asn

Thr

Tyr

Tyr

Asn

Pro

Ser

Leu

Lys

Ser

Arg

Val

Thr

50

55

60

Ile

Ser

val

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

Phe

Ser

Leu

Lys

Leu

Ser

Ser

65

70

75

80

Val

Thr

Ala

Ala

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Asp

Ser

Gly

85

90

95

Asp

Tyr

Tyr

Gly

Ile

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Thr

vai

Thr

Val

100

105

110

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Al a

Pro

Cys

115

120

125

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

130

135

140

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

145

150

155

160

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

vai

Leu

Gin

165 170 <210> 8 <211> 153 <212> PRT

PL 214 003 Β1 <213> Homo sapiens <400> 8

Pro 1

Gly Arg

Ser

Leu 5

Arg

Leu

Ser

Cys Ala 10

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr 15

Phe

Ser

Ser

His

Gly

Ile

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

20

25

30

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Arg

Asn

Lys

Asp

Tyr

Ala

35

40

45

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

50

55

60

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

65

7G

75

80

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Val

Ala

Pro

Leu

Gly

Pro

Leu

Asp

Φ y y

Trp

Gly

85

90

95

Gin

Gly

Thr

Leu

val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

100

105

110

val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

115

120

125

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

130

135

140

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

145 150 <210> 9 <211> 167 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221> MODJłES <222> (103) <223> Dowolny aminokwas <400> 9

Gly 1

Val

Val

Gin

Pro 5

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg 10

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala 15

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe 20

Ser

Ser

Tyr

Gly

Met 25

His

Trp

Val

Arg

Gin 30

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly 35

Leu

Glu

Trp

Val

Ala 40

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp 45

Gly

Ser

Asn

Lys

Tyr 50

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val 55

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr 60

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu

PL 214 003 Β1

65

7 0

75

90

Asp

Thr

Ala

val

Tyr

Tyr

Cys

^11 a.

Arg

Asp

Pro

Arg

Gly

Ala

Thr

Leu

85

90

95

Tyr

Tyr

Tyr

Tyr

Tyr

Arg

Xaa

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Thr

Val

100

105

110

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

115

120

125

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

130

135

140

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

V a 1

Ser

Trp

Asn

Ser

dy

145

150

155

160

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

165 <210> 10 <211> 151 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10

Gly 1

Val

Val

Gin

Pro 5

Gly Arg

Ser

Leu

Arg 10

Leu

Ser Cys

Ala

Ala 15

Ser

siy

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser

Tyr

Gly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

20

25

30

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Ser

His

35

40

45

Lys

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

50

55

60

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Al a

Glu

65

70

75

80

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Ala

Val

Val

Val

Pro

Ala

85

90

95

Al a

Met

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

Giy

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

100

105

110

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

115

120

125

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

130 135 140

Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150

PL 214 003 Β1

<210> 11 <211> 146 <212> PRT <213> Homo

sapiens

<220>

<221> MOD RES

<222> (22)

<223> Dowol,

ny aminokwas

<400> 11

Val

Val Gin

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

1

5

10

15

Phe

Thr Phe

Ser

Ser

Xaa

Gly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

20

25

30

Lys

Gly Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Ser

Asp

Gly

Ser

His

Łys

35

40

45

Tyr

Tyr Ala

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

ile

Ser

Arg

Asp

Asn

50

55

60

Ser

Lys Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

65

70

7 5

80

Thr

Ala Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Thr

Met

I le

Val

Val

Gr y

Thr

85

90

95

Leu

Asp Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

100

105

110

Thr

Lys Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

115

120

125

Ser

Glu Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

130

135

140

Glu

Pro

145

<210> 12

<211> 174

z 12 PRT

<213> Homo ;

sapiens

<400> 12

Ser

Gly Gly

Gly

Val

vai

Gin

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

1

5

10

15

Ala

Ala Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser

Tyr

Gly

Val

His

Trp

Val

Arg

20

25

30

Gin

Ala Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

35

40

45

Gly

Ser Asn

Lys

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

He

PL 214 003 Β1

50

55

60

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Ser

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

65

70

75

00

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Asp

Ser

Tyr

Tyr

85

90

95

Asp

Phe

Trp

Ser

Gly

Arg

Gly

Gly

Met

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

100

105

110

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

val

Phe

Pro

115

120

12 5

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

c-iy

130

135

140

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

145

1 o 0

155

160

Ser

G1 y

Ala

JLe u

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

170 <210> 13 <211> 163 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 13

Val 1

Gin

Pro

Gly Arg 5

Ser Leu

Arg

Leu

Ser 10

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly 15

Phe

Thr

Phe

Ser

Asn

Tyr

Ala

Met

His

Trp

Val

Arg

G1 n

Ala

Pro

Gly

Lys

2 0

25

30

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Val

Val

Tle

Trp

His

Asp

Gly

Asn

Asn

Lys

Tyr

35

40

45

Tyr

A.. a

Glu

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

50

55

60

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

65

70

75

80

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Asp

Gin

Gly

Thr

Gly

Trp

Tyr

Gly

Gly

85

90

95

Phe

Asp

Phe

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

100

105

110

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

115

120

125

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

130

135

140

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

PL 214 003 Β1

145 150

His Thr Phe

155

160 <210> 14 <211> 235 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14

Met 1

Glu

Thr

Pro

Ala 5

Gin

Leu

Leu

Phe

Leu 10

Leu

Leu

Leu

Trp

Leu 15

Pro

Asp

Thr

Thr

Gly

Glu

Ile

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Gly

Thr

Leu

Ser

20

25

30

Leu

Ser

Pro

Gly

Glu

Arg

. 1. cx

Thr

Leu

Ser

cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

35

40

45

Ile

Ser

Ser

Ser

Phe

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin

Ala

50

55

60

Pro

Arg

Leu

Leu

Ile

Tyr

Gly

Ala

Ser

Ser

Arg

Ala

Thr

Gly

Ile

Pro

65

70

7 5

80

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

85

90

95

Ser

Arg

Leu

Glu

.Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Tyr

100

105

110

Gly

Thr

Ser

Pro

Trp

Thr

Phe

Gly

Gin

Giy

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

115

120

125

Arg

Thr

Val.

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

G1 u

130

135

14 0

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

, j. ci

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

145

150

155

160

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

165

170

2 *y

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

Ser

val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

180

185

190

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

195

200

205

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

210

215

220

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

225

230

235

<210 15

PL 214 003 Β1 <211> 233 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 15

Leu

Leu

Phe

Leu 10

Leu Leu Leu

Trp

Leu 15

Pro

Met 1

Glu

Thr

Pro Ala 5

Gin

Asp

Thr

Thr

Gly

Glu

ile

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Gly

Thr

Leu

Ser

20

25

30

Leu

Ser

Pro

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Arg

Thr

Ser

Vai

Ser

35

40

45

Ser

Ser

Tyr

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Al a

Pro

Arg

50

55

60

Leu

Leu

Ile

Tyr

Gly

Ala

Ser

Ser

Arg

Ala

Thr

Gly

ile

Pro

Asp

Arg

65

70

η

30

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Arg

85

90

95

Leu

Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Tyr

Gly

Ile

100

105

110

Ser

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

115

120

125

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

I le

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

130

135

140

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

145

150

155

160

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

165

170

175

Asn

Ser

Gin

GXu

Ser

vai

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

180

185

190

Ser

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

195

200

205

Lys

Val

Tyr

7X1 S

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

210

215

220

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

225

230

<210> 16 <211> 139 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16

Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg

PL 214 003 Β1

1

5

10

15

AJ. ci

Ser

Gin

Ser

vai

Ser

Ser

Tyr

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

20

25

30

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

Leu

Leu

Ile

Tyr

Gly

Ala

Ser

Ser

Arg

Ala

Thr

35

40

45

dy

Ile

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

50

55

60

Leu

Thr

Ile

Ser

Arg

Leu

Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

val

Tyr

Tyr

Cys

65

70

75

80

Gin

Gin

Tyr

Gly

Arg

Ser

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

Gly

Thr

Lys

vai

85

90

95

Asp

He

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

vai

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

100

105

110

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

115

120

125

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

130 135 <210> 17 <211> 234 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17

Met 1

Glu

Thr

Pro

Ala 5

Gin

Leu Leu

Phe

Leu 10

Leu

Leu

Leu

Trp

Leu 15

Pro

Asp

Thr

Thr

Gly

Glu

Ile

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Gly

Thr

Leu

Ser

20

25

30

Leu

Ser

Pro

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

35

40

45

Val

Ser

Ser

Tyr

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

50

55

60

Arg

Pro

Leu

Ile

Tyr

dy

Val

Ser

Ser

Arg

Ala

Thr

Gly

Ile

Pro

Asp

65

70

75

80

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

85

90

95

Arg

Leu

Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Tyr

Gly

100

105

110

Ile

Ser

Pro

Phe

Thr

Phe

dy

Pro

Gly

Thr

Lys

Val

Asp

I Le

Lys

Arg

115

120

125

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

PL 214 003 Β1

130

135

140

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

145

150

155

160

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Vai

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

165

170

175

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

180

185

190

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

195

200

205

His

Lys

Val

Tyr

Ala

cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

210

215

220

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

cys

225 230 <210> 18 <211> 152 <212> PRT <213> Homo sapiens <400 18

Gin 1

Ser

Pro

Ser

Ser 5

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 10

Gly

Asp

Arg

Val

Thr 15

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Ile

Asn

Thr

Tyr

Leu

Ile

Trp

Tyr

Gin

20

25

30

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Asn

Phe

Leu

ile

Ser

Ala

Thr

Ser

Ile

35

40

45

Leu

Gin

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Arg

Gly

Ser

dy

Ser

Gly

Thr

50

55

60

Asn

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Asn

Ser

Leu

His

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

65

70

75

80

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

Tyr

Ser

Thr

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

Gly

85

90

95

Thr

Lys

Val

Asp

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

100

105

110

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

115

120

125

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Al a

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

130 135 140

Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly

145 150

PL 214 003 Β1 <210> 19 <211> 142 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19

Ser 1

Pro

Gly

Thr

Leu 5

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly 10

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu 15

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Ile

Ser

Ser

Asn

Phe

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

20

25

30

Gin

Łys

Pro

dy

Gin

Ala

Pro

Arg

Leu

Leu

Ile

Tyr

Arg

Pro

Ser

Ser

35

40

45

Arg

Ala

Thr

Gly

Ile

Pro

Asp

Ser

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

50

55

60

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Arg

Leu

Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Leu

65

70

75

ao

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Tyr

Gly

Thr

Ser

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

Gly

85

90

95

Thr

Lys

vai

Asp

Ile

Łys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

100

105

110

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

val

val

115

120

125

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

130 135 140 <210> 20 <211> 155 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 20	Ser	Val	Thr
Ser 1	Pro	Asp	Phe	Gin 5
Cys	Arg	Ala	Ser 20	G1 n	Ser	Ile	Gly
Lys	Pro	Asp 35	Gin	Ser	Pro	Lys	Leu 40
Phe	Ser 50	Gx y	Val	Pro	Ser	Arg 55	Phe
Phe 65	Thr	Leu	Thr	Ile	Asn 70	Ser	Leu
Tyr	Cys	His	Gin	Ser 85	Ser	Ser	Leu

Pro	Lys 10	Glu	Lys	Val	Thr	ile 15	Thr
Ser 25	Ser	Leu	His	Trp	Tyr 30	Gin.	Gin
Leu	Ile	Lys	Tyr	Ala 45	Ser	Gin	Ser
Ser	Gly	Ser	Gly 60	Ser	Gly	Thr	Asp
Glu	Ala	Glu 75	Asp	Ala	Ala	Thr	Tyr 80
Pro	Leu 90	Thr	Phe	Gly	Gly	Gly 95	Thr

PL 214 003 Β1

Lys

Val

1 u

I ..i. Θ 100

Lys

Arg

Thr

Val

Ala 105

Ala

Pro

Ser

Val

Phe 110

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

115

120

125

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

130

135

140

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

145 150 155 <210> 21 <211> 146 <212> PRT

<213> Homo

sapiens

<400> 21

Gin

Ser

Pro

Gly

Thr

i_iSU

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Glu

Ar g

Al a

^|**·

L^s u

1.

5

10

15

Ser

cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

val

Ser

Ser

Tyr

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

20

25

30

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

Leu

Leu

Ile

Tyr

Gly

Ala

Ser

Ser

35

40

45

Arg

Ala

Thr

Gly

Ile

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

50

55

60

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Arg

Leu

Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

65

70

75

80

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Tyr

Gly

Arg

Ser

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

Gly

B5

90

95

Thr

Lys

val

Asp

Ile

Lys

Arg

T łm

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

100

105

110

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

G Lu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

115

120

125

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

130 135 140

Gly Gly

145 <210> 22 <211> 139 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22

Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys

10 15

PL 214 003 Β1

Arg

Ala

Ser

Gin 20

Ser

Ile

Asn

Ser

Tyr 25

Leu

Asp

Trp

Tyr

Gin 30

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Ser

Leu

Gin

35

40

45

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

50

55

60

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

65

70

75

80

Cys

Gin

Gin

Tyr

Tyr

Ser

Thr

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

Gly

Thr

Lys

85

90

95

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Al a

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

100

105

110

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

115

120

125

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

130 135 <210> 23 <211> 134 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23

Thr 1

Gin

Ser

Pro

Ser 5

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser 10

Val

Gly

Asp

Arg

Val· 15

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Asn

Ile

Ser

Arg

Tyr

Leu

Asn

Trp

Tyr

20

25

30

G1 n

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Phe

Leu

Ile

Tyr

Val

Ala

Ser

35

40

45

Ile

Leu

Gin

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Gly

Phe

Ser

Ala

Ser

Gly

Ser

Gly

50

55

60

Pro

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

65

70

75

80

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

Tyr

Ser

Thr

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

85

90

95

Gly

Thr

Lys

Val

Asp

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

100

105

110

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

115

120

125

Val Cys Leu Leu Asn Asn

130

PL 214 003 Β1 <210> 24 <211> 150 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24

Thr 1

Gin

Ser

Pro Ser 5

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser 10

Val

dy

Asp

Arg

Val 15

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Ile

Cys

Asn

Tyr

Leu

Asn

Trp

Tyr

20

2

30

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Arg

Val

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

35

40

45

Ser

Leu

Gin

Gly

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Giy

Ser

Gly

50

55

60

Ile

Asp

Cys

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

phe

Ala

65

70

75

80

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

Tyr

Ile

Thr

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

85

90

95

Gly

Thr

Arg

Val

Asp

Ile

Ir U

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

100

105

110

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

115

120

125

Va 1

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Ar g

Glu

Ala

Lys

val

Gin

Trp

130

135

140

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Tyr

145 150 <210> 25 <211> 139 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25

Pro 1

leu

Ser

Leu

Pro Val 5

Thr

Leu Gly

Gin 10

Pro

Ala

Ser

Ile

Ser 15

Cys

Arg

Ser

Ser

Gin

Ser

Leu

Val

Tyr

Ser

Asp

Gly

Asn

Thr

Tyr

Leu

Asn

20

25

30

Trp

Phe

Gin

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin

Ser

Pro

Arg

Arg

Leu

Ile

Tyr

Lys

35

40

45

Val

Ser

Asn

Trp

Asp

Ser

Giy

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

50

55

60

Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp

PL 214 003 Β1

65

70

75

80

Val

Gly

Val

Tyr

Tyr

Cys

Met

Gin

Gly

Ser

His

Trp

Pro

Pro

Thr

Phe

85

90

95

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

100

105

110

Val

Phe

ile

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

115

120

125

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

130 135 <210> 26 <211> 133 <212> PRT

<213> Homo

sapiens

<400> 26

Pro

Gly

Glu

Pro

Al a

Ser

Ile

Ser

Cys

Arg

Ser

Ser

Gin

Ser

Leu

Leu

1

5

10

15

His

Ser

Asn

Gly

Tyr

Asn

Tyr

Leu

Asp

Trp

Tyr

Leu

Gin

Lys

Pro

Gly

20

25

30

Gin

Ser

Pro

Gin

Leu

Leu

Ile

Tyr

Leu

Gly

Ser

Asn

Arg

Ala

Ser

Gly

35

40

45

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

50

55

60

Lys

Leu

Ser

Arg

Val

Glu

Ala

Glu

Asp

Val

Gly

Val

Tyr

Tyr

Cys

Met

65

70

75

80

Gin

Ala

Leu

Gin

Thr

Pro

Leu

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

val

Glu

85

90

95

Ile

Ly s

Arg

Thr

Vai

Al a

Al a

Pro

Ser

ci .'.1.

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

100

105

110

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

115 1.20 125

Asn Phe Tyr Pro Arg

130 <210> 27 <211> 1392 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc120 cgtgtagcgt ctggattcac cttcagtagc catggcatgc actgggtccg ccaggctcca180

PL 214 003 Β1 ggcaaggggc gactccgtga caaatgaaca ttcggtcctt aagggcccat gccctgggct ggcgctctga tccctcagca aacgtagatc gtcgagtgcc ccaaaaccca gacgtgagcc cataatgcca gtcctcaccg aacaaaggcc gaaccacagg ctgacctgcc gggcagccgg ttcctctaca tgctccgtga ccgggtaaat tggagtgggt agggccgatt gcctgagagc ttgactactg cggtcttccc gcctggtcaa ccagcggcgt gcgtggtgac acaagcccag caccgtgccc aggacaccct acgaagaccc agacaaagcc ttgtgcacca tcccagcccc tgtacaccct tggtcaaagg agaacaacta gcaagctcac tgcatgaggc ga ggcagttata caccatctcc cgaggacacg gggccaggga cctggcgccc ggactacttc gcacaccttc cgtgccctcc caacaccaag agcaccacct catgatctcc cgaggtccag acgggaggag ggactggctg catcgagaaa gcccccatcc cttctacccc caagaccaca cgtggacaag tctgcacaac tggtatgatg agagacaatt gctgtgtatt accctggtca tgctccagga cccgaaccgg ccagctgtcc agcaacttcg gtggacaaga gtggcaggac cggacccctg ttcaactggt cagttcaaca aacggcaagg accatctcca cgggaggaga agcgacatcg cctcccatgc agcaggtggc cactacacgc gaagaaataa ccaagaacac actgtgcgag ccgtctcctc gcacctccga tgacggtgtc tacagtcctc gcacccagac cagttgagcg cgtcagtctt aggtcacgtg acgtggacgg gcacgttccg agtacaagtg aaaccaaagg tgaccaagaa ccgtggagtg tggactccga agcaggggaa agaagagcct atactatgca gctgtttctg aggaggtcac agcctccacc gagcacagcg gtggaactca aggactctac ctacacctgc caaatgttgt cctcttcccc cgtggtggtg cgtggaggtg tgtggtcagc caaggtctcc gcagccccga ccaggtcagc ggagagcaat cggctccttc cgtcttctca ctccctgtct

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1392 <210> 28 <211> 1395 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 28 atggagtttg gtgcagctgg tgtacagcgt ggcaaggggc gactccgtga caaatgaaca ctggggtcct accaagggcc gcggccctgg tcaggcgctc tactccctca tgcaacgtag tgtgtcgagt cccccaaaac gtggacgtga gtgcataatg agcgtcctca tccaacaaag cgagaaccac agcctgacct aatgggcagc ttcttcctct tcatgctccg tctccgggta ggctgagctg tggagtctgg ctggattcac tggagtgggt agggccgatt gcctgagagc actttgacta catcggtctt gctgcctggt tgaccagcgg gcagcgtggt atcacaagcc gcccaccgtg ccaaggacac gccacgaaga ccaagacaaa ccgttgtgca gcctcccagc aggtgtacac gcctggtcaa cggagaacaa acagcaagct tgatgcatga aatga ggttttcctc gggaggcgtg cttcagtaac ggcagttata caccatctcc cgaggacacg ctggggccag ccccctggcg caaggactac cgtgcacacc gaccgtgccc cagcaacacc cccagcacca cctęatgatc ccccgaggtc gccacgggag ccaggactgg ccccatcgag cctgccccca aggcttctac ctacaagacc caccgtggac ggctctgcac gttgctcttt gtccagcctg tatggcatgc tggtatgatg agtgacaatt gctgtgtatt ggaaccctgg ccctgctcca ttccccgaac ttcccagctg tccagcaact aaggtggaca cctgtggcag tcccggaccc cagttcaact gagcagttca ctgaacggca aaaaccatct tcccgggagg cccagcgaca acacctccca aagagcaggt aaccactaca taagaggtgt ggaggtccct actgggtccg gaagtaataa ccaagaacac actgtgcgag tcaccgtctc ggagcacctc cggtgacggt tcctacagtc tcggcaccca agacagttga gaccgtcagt ctgaggtcac ggtacgtgga acagcacgtt aggagtacaa ccaaaaccaa agatgaccaa tcgccgtgga tgctggactc ggcagcaggg cgcagaagag ccagtgtcag gagact.ctcc ccaggctcca acactatgga gctgtatctg aggagagaga ctcagcctcc cgagagcaca gtcgtggaac ctcaggactc gacctacacc gcgcaaatgt cttcctcttc gtgcgtggtg cggcgtggag ccgtgtggtc gtgcaaggtc agggcagccc gaaccaggtc gtgggagagc cgacggctcc gaacgtcttc cctctccctg

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1395 <210> 29 <211> 439 <212> DNA

PL 214 003 Β1 <213> Homo sapiens <400> 29 cctgggaggt atccactggg gatggaagaa aattccaaga tattactgtg gtcaccgtct aggagcacct ccggtgacgg gtcctacag ccctgagact tccgccaggc ataaagacta agacgctgta cgagagtggc cctcagcctc ccgagagcac tgtcgtggaa ctcctgtgca tccaggcaag tgcagactcc tttgcaaatg cccactgggg caccaagggc agcggccctg ctcaggcgct gcgtctggat gggctggagt gtgaagggcc aacagcctga ccacttgact ccatcggtct ggctgcctgg ctgaccagcg tcaccttcag gggtggcagt gattcaccat gagccgagga actggggcca tccccctggc tcaaggacta gcgtgcacac tagtcatggc tatatggtat ctccagagac cacggctgtg gggaaccctg gccctgctcc cttccccgaa cttcccagct

120

180

240

300

360

420

480

489 <210> 30 <211> 1392 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 atggagtttg gtgcagctgg tgtacagcgt ggcaaggggc gactccgcga caaatgaaca ctgggttact aagggcccat gccctgggct ggcgctctga tccctcagca aacgtagatc gtcgagtgcc ccaaaaccca gacgtgagcc cataat.gcca gtcctcaccg aacaaaggcc gaaccacagg ctgacctgcc gggcagccgg ttcctctaca tgctccgtga ccgggtaaat ggctgagctg tggagtctgg ctggattcac tggagtgggt agggccgatt gcctgagagc ttgactactg cggtcttccc gcctggtcaa ccagcggcgt gcgtggtgac acaagcccag caccgtgccc aggacaccct acgaagaccc óięćlCclclHCJCC ttgtgcacca tcccagcccc tgtacaccct tggtcaaagg agaacaacta gcaagctcac tgcatgaggc ga ggttttcctc gggaggcgtg cttcagtagt ggcagttata caccatctcc cgaggacacg gggccaggga cctggcgccc ggactacttc gcacaccttc cgtgccctcc caacaccaag agcaccacct catgatctcc cgaggtccag acgggaggag ggactggctg catcgagaaa gcccccatcc cttctacccc caagaccaca cgtggacaag tctgcacaac gttgctcttt gtcgagcctg tatggcatgc tggtatgatg agagacaatt gctgtgtatt accctggtca tgctccagga cccgaaccgg ccagctgtcc agcaacttcg gtggacaaga gtggcaggac cggacccctg ttcaactggt cagttcaaca aacggcaagg accatctcca cgggaggaga agcgacatcg cctcccatgc agcaggtggc cactacacgc taagaggtgt ggaggtccct actgggtccg gaagcaataa ccaagaacac actgtgcgag ccatctcctc gcacctccga tgacggtgtc tacagtcct.c gcacccagac cagttgagcg cgtcagtctt aggtcacgtg acgtggacgg gcacgttccg agtacaagtg aaaccaaagg tgaccaagaa ccgtggagtg tggactccga agcaggggaa agaagagcct ccagtgtcag gagactctcc ccaggctcca acactatgca gctgtatctg agccggactg agcctccacc gagcacagcg gtggaactca aggactctac ctacacctgc caaatgttgt cctcttcccc cgtggtggtg cgtggaggtg tgtggtcagc caaggtctcc gcagccccga ccaggtcagc ggagagcaat cggctccttc cgtcttctca ctccctgtct

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1.200

1260

1320

1380

1392 <210> 31 <211> 507 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 31 ggcgtggtcc agtagctatg gttatatggt atctccagag gacacggctg tggggccaag agcctgggag gcatgcactg atgatggaag acaattccaa tgtattactg ggaccacggt gtccctgaga ggtccgccag taataaatac gaacacgctg tgcgagaggg caccgtctcc ctctcctgtg gctccaggca tatgcagact tatctgcaaa gcccgtataa tcagcctcca cagcgtctgg aggggctgga ccgtgaaggg tgaacagcct taaccccttg ccaaggaccc attcaccttc gtgggtggca ccgattcacc gagagccgag tatggacgtc atcggtcttc

120

180

240

300

360

PL 214 003 Β1 cccctggcgc aaggactact gtgcacacct cctgctccag tccccgaacc tcccagctgt gagcacctcc ggtgacggtg cctacag gagagcacag tcgtggaact cggccctggg ctgcctggtc caggcgctct gaccagcggc

420

480

507 <210 32 <211> 501 <2I2> DNA <213> Homo sapiens <400 32 ggcgtggtcc agtagtcatg gttatatggt atctccagag gacacggctg cagggaaccc gcgccctgct tacttccccg accttcccag agcctgggag gcatccactg atgatggaag acaattccaa tgtattactg tggtcaccgt ccaggagcac aaccggtgac ctgtcctaca gtccctgaga ggtccgccag aaataaagac gaacacgctg tgcgagagtg ctcctcagcc ctccgagagc ggtgtcgtgg g ctctcctgtg gctccaggca tatgcagact tarttgcaaa gccccactgg tccaccaagg acagcggccc aactcaggcg tagcgtctgg aggggctgga ccgtgaaggg tgaacagcct ggccacttga gcccatcggt tgggctgcct ctctgaccag attcatcttc 60 gtgggtggca 120 ccgattcacc 180 gagagccgag 240 ctactggggc 300 cttccccctg 360 ggtcaaggac 420 cggcgtgcac 480

501 <210> 33 <211> 516 <212> DNA <213> Homo sapiens <400 33 tcgggcccag ggctccatca ctggagtgga agtcgagtta gtgactgccg atagacgtct tccgtcttcc tgcctggtca accagcggcg gactggtgaa gcagtggtgg ttgggtacat ccatatcagt cggacacggc ggggccaagg ccctggcgcc aggactactt cgcacacctt gccttcacag tcactactgg ctattacatt agacacgtct cgtgtattat gaccacggtc ctgctccagg ccccgaaccg cccggctgtc atcctgtccc agctggatcc gggaacacct aagaaccagt tgtgcgagag accgtctcct agcacctccg gtgacggtgt ctacaa tcacctgcac gccagcaccc actacaaccc tctccctgaa atagtgggga cagcttccac agagcacagc cgtggaactc tgtctctggt agggaagggc gtccctcaag gctgagctct ctactacggt caagggccca cgccctgggc aggcgccctg

120

180

240

300

360

420

480

516 <210 34 <211> 459 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 34 cctgggaggt atccactggg gatggaagaa aattccaaga tattactgtg gtcaccgtct aggagcacct ccggtgacgg ccctgagact tccgccaggc ataaagacta acacgctgta cgagagtggc cctcagcctc ccgagagcac tgtcgtggaa ctcctgtgca tccaggcaag tgcagactcc tttgcaaatg cccactgggg caccaagggc agcggccctg ctcaggcgct gcgtctggat gggctggagt gtgaagggcc aacagcctga ccacttgact ccatcggtct ggctgcctgg ctgaccagc tcaccttcag gggtggcagt gattcaccat gagccgagga actggggcca tccccctggc tcaaggacta tagtcatggc tatatggtat ctccagagac cacggctgtg gggaaccctg gccctgctcc cttccccgaa

120

180

240

300

360

420

59 <210 35 <211> 503 <212> DNA

PL 214 003 Β1 <213> Homo sapiens agcctgggag gcatgcactg atgatggaag acaattccaa tgtattactg acgtctgggg tcttccccct tggtcaagga gcggcgtgca gtccctgaga ggtccgccag taataaatac gaacacgctg tgcgagagat ccaagggacc ggcgccctgc ctacttcccc cac ctctcctgtg gctccaggca tatgcagact tatctgcaaa ccgaggggag acggtcaccg tccaggagca gaaccggtga cagcgtctgg aggggctgga ccgtgaaggg tgaacagcct ctacccttta tctcctcagc cctccgagag cggtgtcgtg attcaccttc gtgggtggca ccgattcacc gagagccgag ctactactac ctccaccaag cacagcggcc gaactcaggc

120

180

240

300

360

420

480

503 <210 36 <211> 451 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 36 ggcgtggtcc agcctgggag gtccctgaga ctctcctgtg cagcgtctgg attcaccttc agr.agctatg gcatgcactg ggtccgccag gctccaggca aggggctgga gtgggtggca gttatatggt atgatggaag tcataaatac tatgcagact ccgtgaaggg ccgattcacc atctccagag acaattccaa gaacacgctg tatctgcaaa tgaacagcct gagagccgag gacacggctg tgtattactg tgcgagaggc gctgtagtag taccagctgc tatggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcgc cctgctccag gagcacctcc gagagcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg t

120

180

240

300

360

420

451 <210 37 <211> 438 <212> DNA <213> Homo sapiens <22Q>

<221> modifiedjoase <222> (64) <223> a, c, t, g, inna lub nieznana <400 37 gtggtccagc agcngtggca atatggtctg tccagagaca acggctgtgt ggccagggaa ctggcgccct gactacttcc ctgggaggtc tgcactgggt atggaagtca attccaagaa attactgtgc ccctggtcac gctccaggag ccgaaccg cctgagactc ccgccaggct taaatactat cacgctgtat gagaggaact cgtctcctca cacctccgag tcctgtgcag ccaggcaagg gcagactccg ct.gcaaatga atgatagtag gcctccacca agcacagcgg cgtctggatt ggctggagtg tgaagggccg acagcctgag tgggtaccct agggcccatc ccctgggctg caccttcagt ggtggcagtt attcaccatc agccgaggac tgactactgg ggtcttcccc cctggtcaag

120

180

240

300

360

420

439 <210> 38 <211> 562 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 38 tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt tactatggcg tctgggggag gcgtggtcca 60

PL 214 003 Β1 gcctgggagg cgtgcactgg tgatggaagt caattccaag gtattattgt ctggggccaa ccccctggcg caaggactac cgtgcacacc tccctgagac gtccgccagg aataaatact agcacgctgt gcgagagact gggaccacgg cocagctcca (Ł t i* C- 0. C) ći ći C. ttcccagctg tctcctgtgc ctccaggcaa atgcagactc atctgcaaat cgtattacga tcaccgtctc ggagcacctc cggtgacggt tc agcgtctgga ggggctggag cgtgaagggc gaacagcctg tttttggagt ctcagcctcc cgagagcaca gtcgtggaac ttcaccttca tgggtggcag cgattcacca agagccgagg ggtcggggcg accaagggcc gcggccctgg tcaggcgctc gcagctatgg ttatatggta tctccagaga acacggctgt gtatggacgt catcggtctt gctgcctggt tgaccagcgg

120

ISO

240

300

360

420

480

540

562 <210 39 <211> 490 <212> DNA <213> Homo sapiens <400 39 gtccagcctg tatgccatgc tggcatgatg agagacaatt gctgtatatt ggccagggaa ctggcgccct gactacttcc cacaccttcc ggaggtccct actgggtccg gaaataataa ccaagaacac actgtgcgag ccctggtcac gctccaggag ccgaaccggt gagactctcc ccaggctcca atactatgca gctgtatctg agatcagggc cgtctcctca cacctccgag gacggtgtcg tgtgcagcgt ggcaaggggc gagtccgtga caaatgaaca actggctggt gcctccacca agcacagcgg tggaactcag ctggattcac tggagtgggt agggccgatt gcctgagagc acggaggctt agggcccatc ccctgggctg gcgctctgac cttcagt.aac ggtagttatt caccatctcc cgaggacacg tgacttctgg ggtcttcccc cctggtcaag cagcggcgtg

120

180

240

300

360

420

480

490 <210>

<211>

<212>

<213>

708

DNA

Homo sapiens tctcttcctc tccaggcacc gagtattagc cctcatctat gtctgggaca ttactgtcag caaacgaact atctggaact acagtggaag ggacagcaag cgagaaacac aaagagcttc ctgctactct ctgtctttgt agcagcttct ggtgcatcca gacttcactc cagtatggta gtggctgcac gcctctgttg gtggataacg gacagcacct aaagtctacg aacaggggag ggctcccaga ctccagggga tagcctggta gcagggccac tcaccatcag cctcaccctg catctgtctt tgtgcctgct ccctccaatc acagcctcag cctgcgaagt agtgttag

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

708

702 DNA Homo sapiens <400> 41 atggaaaccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga60 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc120 ctctcctgca ggaccagtgt tagcagcagt tacttagcct ggtaccagca gaaacctggcISO caggctccca ggctcctcat ctatggtgca tccagcaggg ccactggcat cccagacagg240

PL 214 003 Β1 ttcagtggca gattttgcag accaaggtgg gatgagcagt agagaggcca agtgtcacag agcaaagcag agctcgcccg gtgggtctgg tctattactg agatcaagcg tgaaatctgg aagtacagtg agcaggacag actacgagaa tcacaaagag gacagacttc tcagcagtat aactgtggct aactgcctct gaaggtggat caaggacagc acacaaagtc cttcaacagg actctcacca ggcatctcac gcaccatctg gttgtgtgcc aacgccctcc acctacagcc tacgcctgcg ggagagtgtt tcagcagact tcttcatctt tgctgaataa aatcgggtaa tcagcagcac aagtcaccca ag ggagcctgaa cggcggaggg cccgccatct cttctatccc ctcccaggag cctgacgctg tcagggcctg

300

360

420

480

540

600

660

702 <210> 42 <211> 417 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 42

ggcaccctgt	ctttgtctcc	aggggaaaga	gccaccctct	cctgcagggc	cagtcagagt	60
gtcagcagct	acttagcctg	gtaccagcag	aaacctggcc	aggctcccag	actcctcatc	120
tatggtgcat	ccagcagggc	cactggcatc	ccagacaggt	tcagtggcag	tgggtctggg	180
acagacttca	ctctcaccat	cagcagactg	gagcctgagg	attttgcagt	gtattactgt	240
cagcagtatg	gtaggtcacc	attcactttc	ggccctggga	ccaaagtgga	tatcaagcga	300
actgtggctg	caccatctgt	cttcatcttc	ccgccatctg	atgagcagtt	gaaatctgga	3 60
actgcctctg	ttgtgtgcct	gctgaataac	ttctatccca	gagaggccaa	agtacag	417
<210> 43
<211> 705
<212> DNA
<213> Homo	sapiens
<400> 43
atggaaaccc	cagcgcagct	tctcttcctc	ctgctactct	ggctcccaga	taccaccgga	60
gaaattgtgt	tgacgcagtc	tccaggcacc	ctgtctttgt	ctccagggga	aagagccacc	120
ctctcctgta	gggccagtca	aagtgttagc	agctacttag	cctggtacca	acagaaacct	180
ggccaggctc	ccaggcccct	catctatggt	gtatccagca	gggccactgg	catcccagac	2 4 0
aggttcagtg	gcagtgggtc	tgggacagac	ttcactctca	ccatcagcag	actggagcct	300
gaagattttg	cagtgtatta	ctgtcagcag	tatggtatct	caccattcac	tttcggccct	3 60
gggaccaaag	tggatatcaa	acgaactgtg	gctgcaccat	ctgtcttcat	cttcccgcca	420
tctgatgagc	agttgaaatc	tggaactgcc	tctgttgtgt	gcctgctgaa	taacttctat	480
cccagagagg	ccaaagtaca	gtggaaggtg	gataacgccc	tccaatcagg	taactcccag	540
gagagtgtca	cagagcagga	cagcaaggac	agcacctaca	gcctcagcag	caccctgacg	600
ctgagcaaag	cagactacga	gaaacacaaa	gtctacgcct	gcgaagtcac	ccatcagggc	660
ctgagctcgc	ccgtcacaaa	gagcttcaac	aggggagagt	gttag		705

<210> 44 <211> 458 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 44 cagtctccat agtcagagca ttcctgatct ggctctggga tactactgtc atcaaacgaa aaatctggaa cctccctgtc ttaacaccta ctgctacatc caaatttcac aacagagtta ctgtggctgc ctgcctctgt tgcatctgta tttaatttgg cattttgcaa tctcaccatc cagtacccca accatctgtc tgtgtgcctg ggagacagag tatcagcaga agtggggtcc aacagtcttc ttcactttcg ttcatcttcc ctgaataact tcaccatcac aaccagggaa catcaaggtt atcctgaaga gccctgggac cgccatctga tctatcccag ttgccgggca agcccctaac ccgtggcagt ttttgcaact caaagtggat tgagcagttg agaggccaaa

120

180

240

300

360

420

PL 214 003 Β1 gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa tcgggtaa

458 <210> 45 <211> 426 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 45 tctccaggca cagagtatta ctcctcatct gggtctggga tattactgtc atcaagcgaa aaatctggaa gtacag ccctgtcttt gcagcaattt atcgtccatc cagacttcac agcagtatgg ctgtggctgc ctgcctctgt gtctccaggg cttagcctgg cagcagggcc tctcaccatc tacgtcacca accatctgtc tgtgtgcctg gaaagagcca taccagcaga actggcatcc agcagactgg ttcactttcg ttcatcttcc

Ca d L* O· d k·-* ccctctcctg aacctggcca cagacagttt agcctgagga gccctgggac cgccatctga tctatcccag cagggccagt ggctcccagg cagtggcagt ttttgcatta caaagtggat tgagcagttg agaggccaaa

120

180

240

300

360

420

426 <210> 46 <211> 465 <212> DNA <213> Homo sapiens tctccagact cagagcattg ctcatcaagt tctgggacag tactgtcatc aaacgaactg tctggaactg cagtggaagg ttcagtctgt gtagtagctt atgcttccca atttcaccct agagtagtag tggctgcacc cctctgttgt tggataacgc gactccaaag acattggtat gtccttctct caccatcaat tttaccgctc atctgtcttc gtgcctgctg cctccaatcg gagaaagtca cagcagaaac ggggtcccct agcctggaag actttcggcg atcttcccgc aataacttct ggtaactccc ccatcacctg cagatcagtc cgaggttcag ctgaagatgc gagggaccaa catctgatga atcccaaaga aggag ccgggccagt tccaaagctc tggcagtgga tgcaacgtat ggtggagatc gcagttgaaa ggccaaagta

120

180

240

300

360

420

465 <210> 47 <211> 440 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 47 cagtctccag agtcagagtg ctcctcatct gggtctggga tattactgtc atcaagcgaa aaatctggaa gtacagtgga gcaccctgtc tcagcagcta atggtgcatc cagacttcac aacagtatgg ctgtggctgc ctgcctctgt aaggtggata tttgtctcca cttagcctgg cagcagggcc tctcaccatc taggtcacca accatctgtc tgtgtgcctg ggggaaaga.g taccagcaga actggcatcc agcagactgg ttcactttcg ttcatcttcc ctgaataact ccaccctctG aacctggcca cagacaggtt agcctgagga gccctgggac cgccatctga tctatcccag ctgcagggcc ggctcccagg cagtggcagt ttttgcagtg caaagtagat tgagcagttg agaggccaaa

120

180

240

300

360

420

440 <210> 48 <211> 417 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 48 ccatcctccc tgtctgcatc tgtaggagac agagtcacca tcacttgccg ggcaagtcag 60

PL 214 003 Β1 agcattaaca atctatgctg gggacagatt tgtcaac.agt cgaactgtgg ggaactgcct gctatttaga catccagttt tcactctcac attacagtac ctgcaccatc ctgttgtgtg ttggtatcag gcaaagtggg catcagcagt tccattcact tgtcttcatc cctgctgaat cagaaaccag gtcccatcaa ct.gcaacctg ttcggccctg ttcccgccat aacttctatc ggaaagcccc ggttcagtgg aagattttgc ggaccaaagt ctgatgagca caaactcctg cagtggatct aacttactac ggaaatcaaa gttgaaatct

120

180

240

300

360 ccagagaggc caaagta

417 <210> 49 <211> 402 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> modyfikowana zasada <222> (207) <223> a, c, t, g, inna lub nieznana <400> 49 acccagtctc gcaagtcaga aagttcctga agtggatctg acttactact gatatcaaac ttgaaatctg catcctccct acattagcag tctatgttgc ggccagattt gtcaacagag gaactgtggc gaactgcctc gtctgcatct gtatttaaat atctattttg cactctnacc ttacagtacc tgcaccatct tgttgtgtgc gtaggagaca tggtatcaac caaagtgggg atcagcagtc ccattcactt gtcttcatct ctgctgaata gagtcaccat agaaaccagg tcccatcagg tgcaacctga tcggccctgg tcccgccatc ac cacttgccgg gaaagcccct gttcagtgcc agattttgca gaccaaagtg tgatgagcag

120

180

240

300

360

402

<210> <211> <212> <213>	50 451 DNA Homo sapiens
<400>	50

acccagtctc gcaagtcaga agggtcctga agtggatctg acttactact gatatcgaac ttgaaatctg aaagtacagt catcctccct gcatttgcaa tctatgctgc ggacagattg gtcaacagag gaactgtggc gaactgcctc ggaaggtgga gtctgcatct ctatttaaat atccagtttg cactctcacc ttacactacc tgcaccatct tgttgtgtgc taacgcctat gtaggagaca tggtatcagc caaggtgggg atcagcagtc ccattcactt gtcttcatct ctgctgaata gagtcaccat agaaaccagg tcccgtcaag tgcaacctga tcggccctgg tcccgccatc acttctatcc cacttgccgg aaaagcccct gttcagtggc agattttgca gaccagagtg tgatgagcag cagagaggcc

120

180

240

300

360

420

451 <210> 51 <211> 419 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 51 ccactctccc tgcccgtcac ccttggacag ccggcctcca tctcctgcag gtctagtcaa60 agcctcgtat acagtgatgg aaacacctac ttgaattggt ttcagcagag gccaggccaa120 tctccaaggc gcctaattta taaggtttct aactgggact ctggggtccc agacagattc180 agcggcagtg ggtcaggcac tgatttcaca ctgaaaatca gcagggtgga ggctgaggat240 gttggggttt attactgcat gcaaggttca. cactggcctc cgacgttcgg ccaagggacc300 aaggtggaaa tcaaacgaac tgtggctgca ccatctgtct tcatcttccc gccatctgat360 gagcagttga aatctggaac tgcctctgtt gtgtgcc.tgc tgaataactt ctatcccac419

PL 214 003 Β1 <210> 52 <211> 419 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 52 cctggagagc cggcttccat ctcttgcagg tctagtcaga gcctcctgca tagtaatgga60 tacaactatt tggattggta cctgcagaag ccaggacagt ctccacagct cctgatctat120 ttgggttcta atcgggcctc cggggtccct gacaggttca gtggcagtgg atcaggcaca180 gattttacao tgaaactcag cagagtggag gctgaggatg ttggggttta ttactgcatg240 caagctctac aaactcctct cactttcggc ggagggacca aggtggagat caaacgaact300 gtggctgcac catctgtctt catcttcccg ccatctgatg agcagttgaa atctggaact360 gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc tatcccagar aggccaaagt acattccat419 <210> 53 <2łl> 1392 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 53 atggagtttg gtgcagctgg tgtgtagcgt ggcaaggggc gactccgtga caaatgaaca ttcggtcctt aagggcccat gccctgggct ggcgctctga tccctcagca aacgtagatc gtcgagLgcc ccaaaaccca gacgtgagcc cataatgcca gtcctcaccg aacaaaggcc gaaccacagg ctgacctgcc gggcagccgg ttcctctaca tgctccgtga ccgggtaaat ggctgagctg tggagtctgg ctggattcac tggagtgggt agggccgatt gcctgagagc ttgactactg cggtcttccc gcctggtcaa ccagcggcgt gcgtggtgac acaagcccag caccgtgccc aggacaccct acgaagaccc agacaaagcc ttgtgcacca tcccagcccc tgtacaccct tggtcaaagg agaacaacta gcaagctcac tgcatgaggc ga ggttttcctc gggaggcgtg cttcagtagc ggcagttata caccatctcc cgaggacacg gggccaggga cctggcgccc ggactacttc gcacaccttc cgtgccctcc caacaccaag agcaccacct catgatctcc cgaggtccag acgggaggag ggactggctg catcgagaaa gcccccatcc cttctacccc caagaccaca cgtggacaag tctgcacaac gttgctcttt gtccagcctg catggcatgc tggtatgatg agagacaatt gctgtgtatt accctggtca tgctccagga cccgaaccgg ccagctgtcc agcaacttcg gtggacaaga gtggcaggac cggacccctg ttcaactggt cagttcaaca aacggcaagg accatctcca cgggaggaga agcgacatcg cctcccatgc agcaggtggc cactacacgc taagaggtgt ggaggtccct actgggtccg gaagaaataa ccaagaacac actgtgcgag ccgtctcctc gcacctccga tgacggtgtc tacagtcctc gcacccagac cagttgagcg cgtcagtctt aggtcacgtg acgtggacgg gcacgttccg agtacaagtg aaaccaaagg tgaccaagaa ccgtggagtg tggactccga agcaggggaa agaagagcct ccagtgtcag gagactctcc cęaggctcca atactatgca gctgtttctg aggaggtcac agcctccacc gagcacagcg gtggaactca aggactctac ctacacctgc caaatgttgt cctcttcccc cgtggtggtg cgtggaggtg tgtggtcagc caaggtctcc gcagccccga ccaggtcagc ggagagcaat cggctccttc cgtcttctca ctccctgtct

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1.260

1320

1380

1392 <210> 54 <211> 1999 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 54 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc120 tgtgtagcgt ctggattcac cttcagtagc catggcatgc actgggtccg ccaggctcca180 ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttata tggtatgatg gaagaaataa atactatgca240

PL 214 003 Β1 gactccgtga caaatgaaca ttcggtcctt aagggcccat gccctgggct ggcgctctga tcccLcagca aacgtagatc cagggaggga ctgtgcagcc tctgcccgcc gcaggcacag tcagacctgc ggccaaactg ccaatcttct cagcccaggc agggacaggc gtggcaggac cggacccctg ttcaactggt cagttcaaca aacggcaagg accatctcca gctcggccca gccccgagaa ggtcagcctg gagcaatggg ctccttcttc cttctcatgc cctgtctccg agggccgatt gcctgagagc ttgactactg cggtcttccc gcctggtcaa ccagcggcgt gcgtggtgac acaagcccag gggtgtctgc ccagcccagg ccactcatgc gctgggtgcc caaaagccat tccactccct ctctgcagag ctcgccctcc cccagctggg cgtcagtctt aggtcacgtg acgtggacgg gcacgttccg agtacaagtg aaaccaaagg ccctctgccc ccacaggtgt acctgcctgg cagccggaga ctctacagca tccgtgatgc ggtaaatga caccatctcc cgaggacacg gggccaggga cctggcgccc ggactacttc gcacaccttc cgtgccctcc caacaccaag tggaagccag gcagcaaggc tcagggagag cctaccccag atccgggagg cagctcggac cgcaaatgtt agctcaaggc tgctgacacg cctcttcccc cgtggtggtg cgtggaggtg tgtggtcagc caaggtctcc tgggacccgc tgggagtgac acaccctgcc tcaaaggctt acaactacaa agctcaccgt atgaggctct agagacaatt gctgtgtatt accctggtca tgctccagga cccgaaccgg ccagctgtcc agcaacttcg gtggacaaga gctcagccct aggccccatc ggtcttctgg gcccttcaca accctgcccc accttctctc gtgtcgagtg gggacaggtg tccacctcca ccaaaaccca gacgtgagcc C3.tZ3ćLtlCJCC3 gtcctcaccg aacaaaggcc ggggtatgag cgctgtgcca cccatcccgg ctaccccagc gaccacacct ggacaagagc gcacaaccac ccaagaacac actgtgcgag ccgtctcctc gcacctccga tgacggtgtc tacagtcctc gcacccagac cagttggtga cctgcctgga tgtctcctca ctttttccac cacaggggca tgacctaagc ctcccagatc cccaccgtgc ccctagagta tctcttcctc aggacaccct acgaagaccc agacaaagcc ttgtgcacca tcccagcccc ggccacatgg acctctgtcc gaggagatga gacatcgccg cccatgctgg aggtggcagc tacacgcaga gctgtttctg aggaggtcac agctagcacc gagcacagcg gtggaactca aggactctac ctacacctgc gaggccagct cgcaccccgg cccggaggcc caggctccag ggtgcttggc cgaccccaaa cąagtaactc ccaggtaagc gcctgcatcc agcaccacct catgatctcc cgaggtccag acgggaggag ggactggctg catcgagaaa acagaggccg ctacagggca ccaagaacca tggagtggga actccgacgg aggggaacgt agagcctctc

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1440

1500

1560

1620

1680

1740

1800

1860

1920

1980

1999

<210>	55
<211>	1392
<212>	DNA
<213>	Homo
<400>	55

sapiens atggagtttg gtgcagctgg tgtgtagcgt ggcaaggggc gactccgtga caaatgaaca ttcggtcctt aagggcccat gccctgggct ggcgctctga tccctcagca aacgtagatc gtcgagtgcc ccaaaaccca gacgtgagcc cataatgcca gtcctcaccg aacaaaggcc gaaccacagg ctgacctgcc ggctgagctg tggagtctgg ctggattcac tggagtgggt agggccgatt gcctgagagc ttgactactg cggtcttccc gcctggtcaa ccagcggcgt gcgtggtgac acaagcccag caccgtgccc aggacaccct acgaagaccc agacaaagcc ttgtgcacca tcccagcccc tgtacaccct tggtcaaagg ggttttcctc gggaggcgtg cttcagtagc ggcagttata caccatctcc cgaggacacg gggccaggga cctggcgccc ggactacttc gcacaccttc cgtgccctcc csscsccssę agcaccacct catgatctcc cgaggtccag acgggaggag ggactggctg catcgagaaa gcccccatcc cttctacccc gttgctcttt gtccagcctg catggcatgc tggtatgatg agagacaatt gctgtgtatt accctggtca tgctccagga cccgaaccgg ccagctgtcc agcaacttcg gtggacaaga gtggcaggac cggacccctg ttcaactggt cagttccaaa aacggcaagg accatctcca cgggaggaga agcgacatcg taagaggtgt ggaggtccct actgggtccg gaagaaataa ccaagaacac actgtgcgag ccgtctcctc gcacctccga tgacggtgtc tacagtcctc gcacccagac cagttgagcg cgtcagtctt aggtcacgtg acgtggacgg gcacgttccg agtacaagtg aaaccaaagg tgaccaagaa ccgtggagtg ccagtgtcag gagactctcc ccaggctcca atactatgca gctgtttctg aggaggtcac agcctccacc gagcacagcg gtggaactca aggactctac ctacacctgc caaatgttgt cctcttcccc cgtggtggtg cgtggaggtg tgtggtcagc caaggtctcc gcagccccga ccaggtaagc ggagagcaat

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

PL 214 003 Β1 gggcagccgg ttcctctaca tgctccgtga ccgggtaaat.

<210> 56 <211> 708 <212> DNA <213> Homo <400> 56 atggaaaccc gaaattgtgt ctctcctgca cctggccagg gacaggttca cctgaagatt caagggacca ccatctgatg tatcccagag caggagagtg acgctgagca ggcctgagct aęaacaacta gcaagctcac tgcatgaggc ga sapiens cagcgcagct tgacgcagtc gggccagtca ctcccaggct gtggcagtgg ttgcagtgta aggtggaaat agcagttgaa aggccaaagt tcacagagca aagcagacta cgcccgtcac caagaccaca cgtggacaag tctgcacaac tctcttcctc tccaggcacc gagtattagc cctcatctat gtctgggaca ttactgtcag caaacgaact atctggaact acagtggaag ggacagcaag cgagaaacac aaagagcttc cctcccatgc agcaggtggc cactacacgc tggactccga agaagagcct cggctccttc cgtcttctca ctccctgtct

1260

1320

1380

1392 ctgctactct ctgtctttgt agcagcttct ggtgcatcca gacttcactc cagtatggta gtggctgcac gcctctgttg gtggataacg gacagcacct aaagtctacg aacaggggag ggctcccaga ctccagggga tagcctggta gcagggccac tcaccatcag cctcaccctg catctgtctt tgtgcctgct ccctccaatc acagcctcag cctgcgaagt agtgttag taccaccgga SćlCJełęCCclCC ccagcagaga tggcatccca cagactggag gacgttcggc catcttcccg gaataacttc gggtaactcc cagcaccctg cacccatcag

120

180

240

300

360

20

480

540

600

660

708 <210> 57 <211> 1395 <212> DNA <213> Homo <400> 57 atggagtttg gtgcagctgg tgtacagcgt ggcaaggggc gactccgtga caaatgaaca ctggggtcct accaagggcc gcggccctgg tcaggcgctc tactccctca tgcaacgtag tgtgtcgagt cccccaaaac gtggacgtga gtgcataatg agcgtcctca tccaacaaag cgagaaccac agcctgacct aatgggcagc ttcttcctct tcatgctccg tctccgggta sapiens ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60 tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120 ctggattcac cttcagtaac tatggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180 tggagtgggt ggcagttata tggtatgatg gaagtaataa acactatgga 240 agggccgatt caccatctcc agtgacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300 gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag aggagagaga 360 actttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcagcctcc 420 catcggtctt ccccctggcg ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca 480 gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 540 tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccagctg tcctacagtc ctcaggactc 6C0 gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcaact tcggcaccca gacctacacc 660 atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agacagttga gcgcaaatgt 720 gcccaccgtg cccagcacca cctgtggcag gaccgtcagt cttcctcttc 780 ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg 840 gccacgaaga ccccgaggtc cagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 900 ccaagacaaa gccacgggag gagcagttca acagcacgtt ccgtgtggtc 960 ccgttgtgca ccaggactgg ct.gaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1020 gcctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaaaccaa agggcagccc 1080 aggtgtacac cctgccccca tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc 1140 gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1200 cggagaacaa ctacaagacc acacctccca tgctggactc cgacggctcc 1260 acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1320 tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 1380 aatga 1395

PL 214 003 Β1 <210> 58 <211> 702 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 58 atggaaaccc gaaartgtgt ctctcctgca caggctccca ttcagtggca gattttgcag accaaggtgg gatgagcagt agagaggcca agtgtcacag agcaaagcag agctcgcccg cagcgcagct tgacgcagtc ggaccagtgt ggctcctcat gtgggtctgg tctattactg agatcaagcg tgaaatctgg aagtacagtg agcaggacag actacgagaa tcacaaagag tctcttcctc tccaggcacc tagcagcagt ctatggtgca gacagacttc tcagcagtat aactgtggct aactgcctct gaaggtggat caaggacagc acacaaagtc cttcaacagg ctgctactct ctgtctttgt tacttagcct tccagcaggg actctcacca ggcatctcac gcaccatctg gttgtgtgcc aacgccctcc acctacagcc tacgcctgcg ggagagtgtt ggctcccaga ctccagggga ggtaccagca ccactggcat tcagcagact ccttcacttt tcttcatctt tgctgaataa aatcgggtaa tcagcagcac aagt caccca ag taccaccgga aagagccacc gaaacctggc cccagacagg ggagcctgaa cggcggaggg cccgccatct cttctatccc ctcccaggag cctgacgctg tcagggcctg

120

190

240

300

360

420

480

540

600

660

702 <210> 59 <211> 1392 <212 > DNA <213> Homo sapiens <400> 59 atggagtttg gtgcagctgg tgtacagcgt ggcaaggggc gactccgcga caaatgaaca ctgggttact aagggcccat gccctgggct ggcgctctga tccctcagca aacgtagatc gtcgagtgcc

C ·™. Ci d d C5 6—· C <· gacgtgagcc cataatgcca gtcctcaccg aacaaaggcc gaaccacagg ctgacctgcc gggcagccgg ttcctctaca tgctccgtga ccgggtaaat ggctgagctg tggagtctgg ctggattcac tggagtgggt agggccgatt gcctgagagc ttgactactg cggtcttccc gcctggtcaa ccagcggcgt gcgtggtgac acaagcccag caccgtgccc aggacaccct acgaagaccc agacaaagcc ttgtgcacca tcccagcccc tgtacaccct tggtcaaagg agaacaacta gcaagctcac tgcatgaggc ga ggttttcctc gggaggcgtg cttcagtagt ggcagttata caccatctcc cgaggacacg gggccaggga cctggcgccc ggactacttc gcacaccttc cgtgccctcc caacaccaag agcaccacct catgatctcc cgaggtccag acgggaggag ggactggctg catcgagaaa gcccccatcc cttctacccc caagaccaca cgtggacaag tctgcacaac gttgctcttt gtcgagcctg tatggcatgc tggtatgatg agagacaatt gctgtgtatt accctggtca tgctccagga cccgaaccgg ccagctgtcc agcaacttcg gtggacaaga gtggcaggac cggacccctg ttcaactggt cagttcaaca aacggcaagg accatctcca cgggaggaga agcgacatcg cctcccatgc agcaggtggc cactacacgc taagaggtgt ggaggtccct actgggtccg gaagcaataa ccaagaacac actgtgcgag ccgtctcctc gcacctccga tgacggtgtc tacagtcctc gcacccagac cagttgagcg cgtcagtctt aggtcacgtg acgtggacgg gcacgttccg agtacaagtg aaaccaaagg tgaccaagaa ccgtggagtg tggactccga agcaggggaa agaagagcct ccagtgtcag gagactctcc ccaggctcca acactatgca gctgtatotg agccggactg agcctccacc gagcacagcg gtggaactca aggactctac ctacacctgc caaatgttgt cctcttcccc cgtggtggtg cgtggaggtg tgtggtcagc caaggtctcc gcagccccga ccaggtcagc ggagagcaat cggctccttc cgtcttctca ctccctgtct

120

180

240

300

60

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1392

<210>	60
<211>	705
<212>	DNA
<213>	Homo

sapiens <400> 60

PL 214 003 Β1 atggaaaccc gaaattgtgt ctctcctgta ggccaggctc aggttcagtg gaagattttg gggaccaaag tctgatgagc cccagagagg gagagtgtca ctgagcaaag ctgagctcgc cagcgcagct tgacgcagtc gggccagtca ccaggcccct gcagtgggtc cagtgtatta tggatatcaa agttgaaatc ccaaagtaca cagagcagga cagactacga ccgtcacaaa tctcttcctc tccaggcacc aagtgttagc catctatggt tgggacagac ctgtcagcag acgaactgtg tggaactgcc gtggaaggtg cagcaaggac gaaacacaaa gagcttcaac ctgctactct c t g t nr, 1t. g t agctacttag gtatccagca ttcactctca tatggtatct gctgcaccat tctgttgtgt gataacgccc agcacctaca gtctacgcct aggggagagt ggctcccaga ctccagggga cctggtacca gggccactgg ccatcagcag caccattcac ctgtcttcat gcctgctgaa tccaatcggg gcctcagcag gcgaagtcac gttag taccaccgga aagagccacc acagaaacct catcccagac actggagcct tttcggccct cttcccgcca taacttctat taactcccag caccctgacg Gcatcagggc

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

705 <210> 61 <211> 1413 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 61 atggagtttg gtgcagctgg tgtgcagcgt ggcaaggggc gac.tccgtga caaatgaaca ggagctaccc accgtctcct agcacctccg gtgacggtgt ctacagtcct ggcacccaga acagttgagc ccgtcagtct gagqtcacgt tacgtggacg agcacgctcc gagtacaagt aaaaccaaag atgaccaaga gccgtggagt ctggactccg cageagggga cagaagagcc ggctgagctg tggagtctgg ctggattcac tggagtgggt agggccgatt gcctgagagc tttactacta cagcctccac agagcacagc cgtggaactc caggactcta cctacacctg gc.aaatgttg tcctcttccc gcgtggtggt gcgtggaggt gtgtggtcag gcaaggtctc ggcagccccg accaggtcag gggagagcaa acggctcctt acgtcttctc tctccctgtc ggttttcctc gggaggcgtg cttcagtagc ggcagttata caccatctcc cgaggacacg ctactacggt caagggccca ggccctgggc aggcgctctg ctccctcagc caacgtagat tgtcgagtgc cccaaaaccc ggacgtgagc gcataatgcc cgtcctcacc oaacaaaggc agaaccacag cctgacctgc tgggcagccg cttcctctac atgctccgtg tccgggtaaa gttgctcttt gtccagcctg tatggcatgc tggtatgatg agagacaatt gctgtgtatt atggacgtct tcggtcttcc tgcctggtca accagcggcg agcgtggtga cacaagccca ccaccgtgcc aaggacaccc cacgaagaGC aagacaaagc gttgtgcacc ctcccagccc gtgtacaccc crggtcaaag gagaacaact agcaagctca atgcatgagg tga taagaggtgt ggaggtccct actgggtccg gaagtaataa ccaagaacac actgtgcgag ggggccaagg ccctggcgcc aggactactt tgcacacctt ccgtgccctc gcaacaccaa cagcaccacc tcatgatctc CGgaggtcca cacgggagga aggactggct ccatcgagaa tgcccccatc gcttctaccc acaagaccac ccgtggacaa ctctgcacaa ccagtgtcag gagactctcc ccaggctcca atactatgca gctgtatcLg agatccgagg gaccacggtc ctgctccagg ccccgaaccg cccagctgtc cagcaacttc ggtggacaag tgtggcagga ccggacccct gttcaactgg gcagttcaac gaacggcaag aaccatctcc ccgggaggag cagcgacatc acctcccatg gagcaggtgg ccactacacg

120

180

240

300

360

420

480 540

600 660

720

780 840

900 960 1020 1080

114 0 1200 1260 1320 1380 1413 <210> 62 <211> 714 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 62 atggacatga agatgtgaca gtcaccatca ccatcaaggt caacctgaag gggtccccgc tccagatgac cttgccgggc aagcccctaa tcagtggcag atiUgcaac tcagctcctg ccagtctcca aagtcagagc actcctgatc tggatctggg t tactactgt gggctcctgc tcctccctgt attaacagct tatgctgcat acagatttca caacagtatt tactctggct ctgcatctgt atttagattg ccagtttgca ctctcaccat acagtactcc ccgaggtgcc aggagacaga gtatcagcag aagtggggtc cagcagtctg attcactttc

120

180

240

300

360

PL 214 003 Β1 ggccctggga ccgccatctg ttctatccca tcccaggaga ctgacgctga cagggcctga ccaaagtgga atgagcagtt gagaggccaa gtgtcacaga gcaaagcaga gctcgcccgt aatcaaacga gaaatctgga agtacagtgg gcaggacagc ctacgagaaa cacaaagagc actgtggctg actgcctctg aaggtggata aaggacagca cacaaagtct ttcaacaggg caccatctgt ttgtgtgcct acgccctcca cctacagcct acgcctgcga gagagtgtta cttcatcttc 420 gctgaataac 480 atcgggtaac 540 cagcagcacc 600 agtcacccat 660 gtga 714 <210> 63 <211> 463 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63

Met 1

Glu

Phe

Gly Leu 5

Ser

Trp val

Phe

Leu 10

Val Ala

Leu

Leu

Arg 15

Gly

Val

Gin

Cys

Gin

Val

Gin

Leu

Val

Glu

Ser

dy

Gly

dy

Val

Val

Gin

20

25

30

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Val

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

35

40

45

Ser

Ser

His

Gly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

50

55

60

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Arg

Asn

Lys

Tyr

Tyr

Ala

65

70

7 5

80

ASp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

85

90

95

Thr

Leu

Phe

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

100

105

110

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Gly

His

Phe

Gly

Pro

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

115

120

12 5

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

130

135

140

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

145

150

155

160

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

val

1 65

170

175

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

180

185

190

Val

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

val

Thr

Val

195

200

205

Pro

Ser

Ser

Asn

Phe

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

Thr

Cys

Asn

val

Asp

His

210

215

220

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Thr

Val

Glu

Arg

Lys

Cys

Cys

225

230

235

240

PL 214 003 Β1

Va.l

Glu

Cys

Pro

Pro 245

Cys

Pro

Ala

Pro

Pro 250

Val

Ala

Gly

Pro

Ser 255

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

260

265

270

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

275

280

285

Val

Gin

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

290

295

300

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Phe

Asn

Ser

Thr

Phe

Arg

Val

Val

Ser

305

310

315

320

val

Leu

Thr

Val

Val

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

lys

325

330

335

Cys

Lys

Val

3©x

Asn

Lys

Gly

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

340

345

350

Ser

Lys

Thr

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Leu

Pro

355

360

365

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

370

375

380

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

ile

Ala

Va.l

Glu

Trp

G1 u

Ser

Asn

385

390

395

400

Gly

C-ln

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Met

Leu

Asp

Ser

405

410

415

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Ly s

Ser

Arg

420

425

430

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ara

Leu

435

440

445

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

S© K

Pro

Gly

Lys

450 455 460

<210>	64
<211>	463
<212>	PRT
<213>	Homo sapiens
<400>	64

Met 1

Glu

Phe

Gly

Leu 5

Ser

Trp Val

Phe

Leu Val 10

Ala

Leu

Leu

Arg 15

Gly

Val

Gin

cys

Gin

Val

Gin

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Giy

Gly

Val

val

Gin

20

25

30

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Val

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

35

40

45

PL 214 003 Β1

Ser

Ser 50

His

Gly Met

His

Trp 55

Val Arg

Gin

Ala

Pro 60

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Arg

Asn

Lys

Tyr

Tyr

Ala

65

70

75

80

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Łys

Asn

85

90

95

Thr

Leu

Phe

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

100

105

110

Tyr

Tyr

cys

Ala

Arg

Gly

Gly

His

Phe

Gly

Pro

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

115

120

125

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

G1 y

Pro

Ser

130

135

140

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

145

150

155

160

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

165

170

175

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

180

185

190

Va 1

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

195

200

205

Pro

Ser

Ser

Asn

Phe

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

Thr

cys

Asn

Val

Asp

His

210

215

220

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Va 1

Asp

Lys

Thr

Val

Glu

Arg

Lys

Cys

Cys

225

230

235

240

Val

Glu

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Pro

Val

Ala

Gly

Pro

Ser

Val

245

250

255

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

260

265

270

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

275

280

285

Val

Gin

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

290

295

300

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Phe

Gin

Ser

Thr

Phe

Arg

Val

val

Ser

305

310

315

320

Val

Leu

Thr

Val

Val

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

dy

Lys

Glu

ψγ y-

Lys

325

330

335

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Gly

Ii e u

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

340

345

350

PL 214 003 Β1

Ser

Lys

Thr 355

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg 360

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr 365

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

370

375

380

vai

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

385

390

395

400

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Met

Leu

Asp

Ser

405

410

415

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

420

425

430

Trp

G1 n

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

cys

Ser

y ci 1.

Met

His

G1 u

Ala

Leu

435

440

445

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

ciy

Lys

450 455 460 <210> 65 <211> 235 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65

Met

Glu

Thr

Pro

Ala 5

Gin

Leu

Leu

Phe

Leu 10

Leu

Leu

Leu

Trp

Leu 15

Pro

Asp

Thr

Thr

Gly

Glu

Ile

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Gly

Thr

Leu

Ser

20

25

30

Leu

Ser

Pro

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

35

40

45

Ile

Ser

Ser

Ser

Phe

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin

Ala

50

55

60

Pro

Arg

Leu

Leu

Ile

Tyr

Gly

Ala

Ser

Ser

Arg

Ala

Thr

Gly

ile

Pro

65

70

75

80

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

85

90

95

Ser

Arg

Leu

Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gin.

Gin

Tyr

100

105

110

Gly

Thr

Ser

Pro

Trp

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

115

120

125

Arg

Thr

vai

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

130

135

140

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

145 150 155 160

PL 214 003 Β1

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala 165

Lys

Val

Gin

Trp

Lys 170

Val

Asp

Asn

Al a

Leu 175

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

180

185

190

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

195

200

205

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

210

215

220

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

225 230 235 <210 66 <211> 464 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400 66

Gly Leu 5

Ser Trp Val

Phe

Leu Val 10

Ala

Leu

Leu

Arg 15

Gly

Met 1

Glu

Phe

Val

Gin

Cys

Gin

Val

Gin

Leu

val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Val

Val

Gin

20

25

30

Ero

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Thr

Ala

Ser

Giy

Phe

Thr

Phe

35

40

45

Ser

Asn

Tyr

Gly

Met

His

Trp

val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

50

55

60

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Ser

Asn

Lys

His

Tyr

Gly

65

70

75

80

Asp

5 O X‘

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

85

90

95

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

^3* H

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

100

105

110

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Glu

Arg

Leu

Gly

Ser

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

115

120

125

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

130

135

140

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

ser

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

145

150

155

160

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

165

170

175

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

dy

Val

His

Thr

Phe

Pro

180

185

190

PL 214 003 Β1

Ala

Val

Leu 195

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu 200

Tyr

Se r

Leu

Ser

Ser 205

Val.

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

Asn

Phe

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

Thr

Cys

Asn

Val

Asp

210

215

220

His

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Thr

Val

Glu

Arg

Lys

cys

225

230

235

240

Cys

Val

Glu

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Pro

Val

Ala

Gly

Pro

Ser

245

250

255

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

260

2 65

270

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

275

280

285

Glu

Val

Gin

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

290

295

300

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Phe

Asn

Ser

Thr

Phe

Arg

Val

Val

305

310

315

320

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Val

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

325

330

335

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Gly

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

340

345

350

Tle

Ser

Lys

Thr

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

355

360

365

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

370

375

380

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

385

390

395

400

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Met

L ίί

Asp

405

410

415

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

420

425

430

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

435

440

445

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

450

455

460

<210> 67 <211> 233 <2121 PRT <213> Homo sapiens <400 67

PL 214 003 Β1

Met 1

Glu

Thr

Pro

L, ci 5

Gin

Leu

Leu

Phe

Leu

Leu

Leu

Leu

Trp

Leu 15

Pro

Asp

Thr

Thr

dy

G1 u

Ile

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Gly

Thr

Leu

Ser

20

'“i c Z. □

30

Leu

Ser

Pro

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Arg

Thr

Ser

Val

Ser

35

40

45

Ser

Ser

Tyr

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

50

55

60

Leu

Leu

Ile

Tyr

Gly

Ala

Ser

Ser

Arg

Ala

Thr

Gly

Ile

Pro

Asp

Arg

65

70

75

80

Phe

Ser

siy

Ser

G1 y

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Arg

8 5

90

95

Leu

Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Tyr

Gly

Ile

100

105

110

Ser

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

115

120

125

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

val

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

130

135

140

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

145

150

155

160

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

165

170

175

Asn

Ser

G1 n

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

18 0

185

190

Ser

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

195

200

205

Lys

Val

Tyr

Al 3

cys

Glu

val

Thr

His

Gin

Gly

Lbu

Ser

Ser

Pro

Val

210

215

220

Thr

Łys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

225 230 <210> 68 <2il> 463 <212> PRT <213> Homo sapiens <4068

Met 1

Gili

Phe

Gly

Leu 5

Ser

Trp

Val

Phe

Leu 10

Ala

Leu

Leu

Arg 15

Gly

vai

Gin

Cys

01.. π 20

Val

Gin

Leu

Val

Glu 25

Ser

Gly

Gly

Gly

Val 30

Val

Glu

PL 214 003 Β1

Pro

Gly

Arg 35

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser 40

Cys

Thr

Ala

Ser

Gly 4 5

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser

Tyr

Gly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

50

55

60

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Ser

Asn

Lys

His

Tyr

Ala

65

70

75

80

Asp

Ser

Ala

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

85

90

95

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

100

105

110

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Ala

Gly

Leu

Leu

Gly

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

115

120

125

Gin

dy

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Łys

Gly

Pro

Ser

130

135

140

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Al. a

145

150

155

160

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

val

Thr

Val

165

170

175

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

180

185

190

Val

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

195

200

205

Pro

Ser

Ser

Asn

Phe

dy

Thr

Gin

Thr

Tyr

Thr

Cys

Asn

Val

Asp

His

210

215

220

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Thr

Val

Glu

Arg

Lys

Cys

Cys

225

230

235

240

Val

Glu

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Pro

val

Ala

Gly’

Pro

Ser

Val

245

250

255

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

260

265

270

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

275

280

285

val

Gin

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

290

295

300

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Phe

Asn

Ser

Thr

Phe

Arg

Val

Val

Ser

305

310

315

320

Val

Leu

Thr

Val

Val

His

Gl.n

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

325

330

335

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

PL 214 003 Β1

340

345

350

Ser

Lys

Thr

Lys

Gly

G1 n

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

355

360

365

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

370

375

380

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

385

390

395

400

dy

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Met

Leu

Asp

Ser

405

410

415

Asp

G1 y

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

1.

Asp

Lys

Ser

Arg

420

425

430

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Al a

Leu

435

440

445

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

450 455 460 <210> 69 <211> 234 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 69

Met 1

Glu

Thr

Pro

Ala 5

Gin

Leu

Leu

Phe

Leu 10

Leu

Leu

Leu

Trp

Leu 15

Pro

Asp

Thr

Thr

Gly

Glu

Ile

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Gly

Thr

Leu

Ser

20

25

30

Leu

Ser

Pro

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

35

40

45

Val

Ser

Ser

Tyr

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

50

55

60

Arg

Pro

Leu

Ile

Tyr

Gly

Val

Ser

Ser

Arg

Ala

Thr

Gly

Ile

Pro

Asp

65

70

75

80

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

85

90

95

Arg

Leu

Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Tyr

Gly

100

105

110

Ile

Ser

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

Gly

Thr

Lys

Val

Asp

Ile

Lys

Arg

115

120

125

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

130

135

140

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

PL 214 003 Β1

145

150

155

160

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ar a

Leu

Gin

Ser

165

170

175

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

180

185

190

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

195

200

205

His

Lys

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ss r

Pro

210

215

220

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

cys

225 230 <210> 70 <211> 451 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70

Gin 1

Val

Gin

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly

Gly Gly Val 10

Val

Gin

Pro

Gly 15

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser

Tyr

20

25

30

Gly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

4 5

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Ser

Asn

Lys

Tyr

Tyr

Al a

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

cys

85

90

95

Ala

Arg

Asp

Pro

Arg

Gly

Ala

Thr

Leu

Tyr

Tyr

Tyr

Tyr

Tyr

Gly

Met

100

105

110

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

115

120

125

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

130

135

140

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

145

150

15 5

160

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

dy

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Vai

His

165

170

175

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

PL 214 003 Β1

180

185

190

Val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

Asn

Phe

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

Thr

Cys

195

200

205

Asn

Val

Asp

His

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Thr

val

Glu

210

215

220

Arg

Lys

Cys

Cys

Val

Glu

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Pro

Val

Ala

225

230

235

240

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

245

250

255

He

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

260

265

270

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Gin

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

275

280

285

His

Asn

Al a

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Phe

Asn

Ser

Thr

Phe

290

295

300

Arg

Val

Val

Ser

Vai

Leu

Thr

Val

Val

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

305

310

315

3 20

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Gly

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

325

330

335

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

Thr

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

340

345

350

Tyr

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

355

360

365

Leu

Thr

cys

Leu

Va 1

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

370

375

380

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

385

390

395

400

Met

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

vai

405

410

415

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

Giy

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

420

425

430

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

435

440

445

Pro Gly Lys

450

<210>	71
<211>	214
<212>	PRT
<213>	Homo

sapiens

PL 214 003 Β1 <400 71

Asp 1

Ile

Gin

Met

Thr 5

Gin.

Ser

Pro

Ser

Ser 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Ile

Asn

Ser

Tyr

20

25

30

Leu

Asp

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

1 le

35

40

45

Tyr

7^.1.

Ala

Ser

Ser

Leu

Gin

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Giy

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

cys

Gin

Gin

Tyr

Tyr

Ser

Thr

Pro

Phe

85

90

95

Thr

Phe

Gly

Pro

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Al a

Ala

100

105

110

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

115

120

125

Thr

Al a

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

130

135

'14 0

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

145

150

155

160

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

165

170

175

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

180

185

190

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

195

200

205

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

210 <210> 72 <211> 89 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 72

Gly 1

Val Val

Gin

Pro 5

Gly

Arg

Ser

Leu Arg Leu 10

Ser

Cys

Ala

A.1 3 15

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser

Tyr

Gly

Mm 4” iti U

His

Trp

vai

Arg

Gin

Pro

20

25

30

Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn

PL 214 003 Β1

35

40

45

Lys

Tyr 50

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val 55

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr 60

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn 65

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu 70

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn 75

Ser

Leu

Arg

Alei

Glu 80

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

<210> 73 <211> 169 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 73

Gly Val

Val

Gin

Pro 5

Gly Arg

Ser Leu

Arg 10

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala 15

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser

Tyr

Gly

Met

His

Trp

val

Arg

Gin

Ala

Pro

20

25

30

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Ser

Asn

35

40

45

Lys

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

50

55

60

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

65

70

75

80

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Ala

Arg

Ile

Tle

Thr

Pro

85

90

95

Cys

Met

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Thr

val

Thr

val

Ser

Ser

Ala

100

105

110

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

115

120

125

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

130

135

140

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

145

150

155

160

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

165 <210 74 <211> 167 <212> PRT <213> Homo sapiens <400 74

PL 214 003 Β1

Gly 1

Val

Val

Gin

Pro 5

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg 10

Leu

Ser

Cys

Val

Ala 15

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser

His

Gly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

20

25

30

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Arg

Asn

35

40

45

Lys

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

50

55

60

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Phe

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

65

70

75

80

ASp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Gly

His

Phe

Gly

Pro

Phe

85

90

95

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Łeu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

100

105

110

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

115

120

125

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

130

135

140

Pro

Val

Thr

val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

val

His

145

150

155

160

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

165 <210> 75 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 75

Gly 1

Val

val

G.. n

Pro Gly Arg 5

Ser

Leu Arg 10

Leu

Ser

Cys

Thr

Ala 15

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Asn

Tyr

dy

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

20

25

30

Gly

Lys

Gly

Le u

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Ser

Asn

35

40

45

Lys

His

Tyr

Gly

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

50

55

60

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

65

70

75

80

Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Glu Arg Leu Gly Ser Tyr

90 95

PL 214 003 Β1

Phe

Asp

Tyr

Trp Gly 100

Gin

Gly

Thr

Leu 105

Val

Thr

Val

Ser

Ser 110

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

115

120

12 5

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

130

135

140

Glu

Pro

val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

145

150

155

160

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

165 <210> 76 <211> 167 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 76

Arg

Ser

Leu Arg 10

Leu

Ser

Cys

Val

Ala 15

Ser

Gly 1

Val

Val

Gin

Pro 5

Gly

Gly

Phe

Ile

Phe

Ser

Ser

His

Gly

Ile

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

20

25

30

Gly

Lys

Gly

Leu

C-lu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Arg

Asn

35

40

45

Lys

Asp

Tyr

Ala

ASp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

50

55

60

Asn

Ser

lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

65

70

75

80

Asp

Thr

Ala

val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Val

Ala

Pro

Leu

dy

Pro

Leu

85

90

95

Asp

Tyr

Trp

G1 y

Gin

Giy

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Al a

Ser

Thr

100

105

110

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

115

120

125

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

130

135

140

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

145

150

155

160

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin <210> 77 <211> 153

PL 214 003 Β1 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 77

Pro 1

Gly

Arg

Ser

Leu 5

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala 10

Ale

Ser

Gly

Phe

Thr 15

Phe

Ser

Ser

His

G1 y

Ile

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

20

25

30

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Arg

Asn

Lys

Asp

Tyr

Ala

35

40

45

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

50

55

60

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

65

70

75

80

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Val

Ala

Pro

Leu

Gly

Pro

Leu

Asp

Tyr

Trp

Gly

85

90

95

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

100

105

110

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

115

120

125

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

130

135

140

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

145 150 <210> 78 <211> 163 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78

Pro 1.

Gly

Arg

Ser

Leu Arg 5

Leu

Ser

Cys

Ala 10

Ara

Ser

Gly

Phe

Thr 15

Phe

Ser

Ser

His

Gly

Ile

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

20

25

30

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Arg

Asn

Lys

Asp

Tyr

Ala

35

40

45

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Lys

50

55

60

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Le u

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

1 a

Val

65

70

75

80

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Val

Ala

Pro

Leu

Gly

Pro

Leu

Asp

Tyr

Trp

Gly

85

90

95

PL 214 003 Β1

Gin

Gly

Thr

Leu 100

Val

Thr

Val

Ser

Ser 105

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly 110

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ara

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

115

120

125

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

vai

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

130

135

140

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

145

150

155

160

Val

Leu

Gin

<210> 79 <211> 138 <212> PRT

<213> Homo

sapiens

<400 79

Gly

Gly

Val

Val

Glu

Pro

Giy

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Thr

Ala

1

5

10

15

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser

Tyr

Gly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

20

25

30

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Ser

35

40

45

Asn

Lys

His

Tyr

Al a

ASp

Ser

Ala

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

50

55

60

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

65

70

75

8 0

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Al a

Arg

Ala

Gly

Leu

Leu

dy

Tyr

85

90

95

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

100

105

110

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

115

120

125

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

130 135 <210> 80 <211> 167 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 80

Gly Val Val Gin Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

5 10 15

PL 214 003 Β1

dy

Phe

Thr

Phe 20

Ser

Ser

Tyr

Gly Met 25

His

Trp

Val

Arg

Gin 30

Ala

Pro

Gly

Lys

dy

Leu

Glu

Trp

val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Ser

Asn

35

40

45

Lys

Tyr

Tyr

Ara

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

50

55

60

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

65

70

75

80

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Asp

Pro

Arg

Gly

Ala

Thr

Leu

85

90

95

Tyr

Tyr

Tyr

Tyr

Tyr

dy

Met

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Thr

Val

100

105

110

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Al a

115

120

125

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

130

135

140

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

1.45

150

155

160

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

165 <210> 81 <2111 150 <212> PRT <213> Homo sapiens <400 81

Gly 1

V al

Val

Gin

Pro 5

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg r

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala 15

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser

Tyr

Gly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

20

25

30

dy

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Val

ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Ser

His

35

40

45

Lys

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

50

55

60

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

65

70

75

80

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Ala

Val

Val

Val

Pro

Ala

85

90

95

Ala

Met

Asp

Val

Ί’γ’ρ

Gly

Gin

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

val

Ser

Ser

Ala

100

105

110

PL 214 003 Β1

Ser

Thr

Lys 115

Gly

Pro

Ser

Val

Phe 120

Pro

Leu

Pro

Cys 125

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

cys

Leu

Val

cys

Asp

Tyr

Phe

130

135

140

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

145 150 <210> 82 <211> 146 <212> PRT

<213> Homo

sapiens

<400> 82

Val

Val

Gin

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

dy

1

S

10

15

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser

Cys

dy

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

20

25

30

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Ser

Asp

Gly

Ser

His

Lys

35

40

45

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

50

55

60

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

65

70

75

80

Thr

Al a

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Thr

Met

Ile

Val

vai

Gly

Thr

85

90

95

Leu

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

100

105

110

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

cys

Ser

Arg

Ser

Thr

115

120

125

Ser

Gili

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

130 135 140

Glu Pro

145
<210>	83
<211>	171
<212>	PRT
<213>	Homo sapiens
<400>	83

Gly 1

val

Val

Gin

Pro 5

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg 10

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala Ί C,

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser

Tyr

Gly

Val

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

PL 214 003 Β1

20

25

30

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Val

1 le

Trp

Tyr

Asp

Gly

Ser

Asn

35

40

45

Lys

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

Lys

C-ly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

50

55

60

Asn

Ser

Lys

Ser

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

65

70

75

80

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Asp

Ser

Tyr

Tyr

Asp

Phe

Trp

85

90

95

Ser

dy

Arg

Gly

Gly

Met

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

100

105

110

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

115

120

125

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

cys

Leu

Val

130

135

140

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

145

150

155

160

Leu

Thr

Ser

Gly

val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

165 170 <210> 84 <211> 163 <212> PRT <213> Homo sapiens <4001 84

Val 1

Gin

Pro

Gly

Arg 5

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser 10

cys

Ala

Ala

Ser

Gly 15

Phe

Thr

Phe

Ser

Asn

Tyr

Ala

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

20

25

30

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Val

Val

Ile

Trp

His

Asp

dy

Asn

Asn

Lys

Tyr

35

40

45

Tyr

Ala

Glu

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

50

55

60

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

65

70

75

80

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Asp

Gin

Gly

Thr

Gly

Trp

Tyr

Gly

Gly

85

90

95

Phe

Asp

Phe

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Va.l

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

100

105

110

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr

PL 214 003 Β1

115

120

125

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Ehe

Pro

130

135

140

-Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

145

150

155

160

His Thr Phe <210> 85 <211> 76 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 85

Ser

Ser Gly

Gly 10

Tyr

Tyr

•rrp

Ser

Trp 15

Ile

Val 1

Ser

Gly

Gly Ser 5

Ile

Arg

Gin

His

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Ile

Gly

Tyr

Ile

Tyr

Tyr

20

25

30

Ser

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Asn

Pro

Ser

Leu

Lys

Ser

Arg

Val

Th z?

Ile

35

40

45

Ser

Val

Asp

Thr

Ser

Iiys

Asn

Gin

Phe

Ser

Leu

Lys

Leu

Ser

Ser

Val

50

55

60

Thr

Ala

Ala

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

70 75 <210> 86 <211> 172.

<212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 86	Gly	Leu 5	Val	Lys	Pro
Ser 1	Gly	Pro
Thr	Val	Ser	Gly 20	Gly	Ser	Ile	Ser
Ile	Arg	Gin 35	His	Pro	Gly	Lys	Gly 40
Tyr	Ile 50	Gly	Asn	Thr	Tyr	Tyr 55	Asn
Ile 65	Ser	Val	Asp	Thr	Ser 70	Lys	Asn
Val	Thr	AT a	Ala	Asp 85	Thr	Ala	Val

	Gin 10	Ile	Leu	Ser	Leu	Thr 15	cys
Ser 25	Gly	Gly	His	Tyr	Trp 30	Ser	Trp
Leu	Glu	Trp	Tle	Gly 45	Tyr	Ile	Tyr
Pro	Ser	Leu	Lys 60	Ser	Arg	Val	Thr
Gin	Phe	Ser 75	Leu	Lys	Leu	Ser	Ser 80
Tyr	Tyr 90	Cys	Ala	Arg	Asp	Ser 95	Gly

Asp Tyr Tyr Gly Ile Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val

PL 214 003 Β1

100

105

110

Ser

Ser

Ala

Ser

ΈΙίχ

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

115

120

125

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

130

135

140

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

145

150

155

160

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

165 170 <210> 87 <211> 96 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 87

Glu 1

Ile Val

Leu

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Gly

Thr 10

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro 15

dy

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Val

Ser

Ser

Ser

2 0

25

30

Tyr

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

Leu

Leu

35

40

45

Ile

Tyr

Gly

Ala

Ser

Ser

Arg

Ala

Thr

Gly

ile

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Arg

Leu

Glu

65

70

75

Θ0

Pro

Glu

Asp

Phe

Ais

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Tyr

Gly

Ser

Ser

Pro

85

90

95

<210> 88 <211> 141 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 88

Leu

Ser

Pro 10

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr 15

Leu

Gin 1

Ser

Pro Gly

Thr 5

Leu

Ser

Ser

Cys

Arg

Ala 20

Ser

Gin

Ser

Ile

Ser 25

Ser

Ser

Phe

Leu

Al 3 30

Trp

Tyr

Gin

Gin

Arg 35

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro 40

Arg

Leu

Leu

11^

Tyr 45

Gly

Ala

Ser

Ser

Arg

Ala

Thr

Gly

Ile

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

55 60

100

PL 214 003 Β1

Thr 65

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr 0

Ile

Ser

Arg

Leu

Glu 75

Pro

Glu

Asp

Phe

Al 3 SC

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gin 35

Gin

Tyr

Gly

Thr

Ser 90

Pro

Trp

Thr

Phe

Gly 95

Gin

Gly

Thr

Lys

Val 100

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr 105

Val

Ala

Ala

Pro

Ser 110

Val

Phe

Ile

Phe

Pro 115

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin 120

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr 125

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

3

Lys

130 135 140 <210> 89 <211> 141 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 89

Gin 1

Ser

Pro

Gly

Thr Leu 5

Ser

Leu

Ser

Pro 10

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr 15

Leu

Ser

Cys

Arg

Thr

Ser

Val

Ser

Ser

Ser

Tyr

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Gin

20

25

30

Lys

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

Leu

Leu

Ile

Tyr

Gly

Ala

Ser

Ser

Arg

35

40

45

Ala

Thr

Gly

Ile

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

50

55

60

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Arg

Leu

Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

Al a

Val

Tyr

65

70

75

80

Tyr

Cys

Gin

Gin

Tyr

Gly

Ile

Ser

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

85

90

95

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Va,l

Phe

Ile

Phe

100

105

110

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

115

120

125

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

130

135

140

<210> 90 <211> 139 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 90

Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg 1 5 10 15

PL 214 003 Β1

101

Al 3

Ser

Gin

Ser 20

Val

Ser

Ser

Tyr

Leu 25

Ala

Trp

iyr

Gin

Gin 30

Lys

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

Leu

Leu

Ile

Tyr

Gly

Ala

Ser

Ser

Arg

Al a

Thr

35

40

45

G1 y

Tle

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

50

55

60

Leu

Thr

Ile

Ser

Arg

Len

Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

val

Tyr

Tyr

Cys

65

70

75

80

Gin

Gin

Tyr

Gly

Arg

Ser

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

Gly

Thr

Lys

Val

8 5

90

95

Asp

Ile

Lys

Arg

Thr

vai

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

I ie

Phe

Pro

Pro

100

105

110

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

115

120

125

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

130 135 <210> 91 <211> 142 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 91

Gin 1

Ser

Pro

Gly Thr 5

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro 10

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr 15

Leu

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Val

Ser

Ser

Tyr

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

20

25

30

Gin

Lys

Pro

Giy

Gin

Ala

Pro

Arg

Pro

Leu

Ile

Tyr

Gly

Val

Ser

Ser

35

40

45

Arg

Ala

Thr

el y

Ile

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

dy

Ser

Gly

Thr

50

55

60

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Arg

Leu

Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

65

70

75

80

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Tyr

Gly

Ile

Ser

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

Giy

85

90

95

Thr

Lys

Val

Asp

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

val

Phe

Ile

100

105

110

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

,.ys

Ser

dy

Thr

Ala

Ser

Val

Val

115

120

125

C ys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ais

Lys

Val

Gin

130

135

140

102

PL 214 003 Β1 <210h 92 <211> 142 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 92

Ser 1

Pro

Gly

Thr

Leu 5

Ser

Leu Ser

Pro Gly 10

Glu Arg

Ala

Thr

Leu 15

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Ile

Ser

Ser

Asn

Phe

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

20

25

30

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

Leu

Leu

Ile

Tyr

Arg

Pro

Ser

Ser

35

40

45

Arg

Ala

Thr

Gly

Ile

Pro

Asp

Ser

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

50

55

60

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Arg

Leu

Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

Al a

Leu

65

70

75

80

Tyr

Tyr

Cys

Gin

G1 n

Tyr

Gly

Thr

Ser

Pro

Phe

Thr

Phe

Giy

Pro

Gly

85

90

95

Thr

Lys

val

Asp

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

100

105

110

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

115

120

125

Cys

Leu

Łeu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

130 135 140 <210 93 <211> 146 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 93

Gin 1

Ser

Pro

Gly

Thr 5

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro 10

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr 15

Leu

Ser

cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Val

Ser

Ser

Tyr

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

20

25

30

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

Leu

Leu

Ile

Tyr

Gly

Ala

Ser

Ser

35

40

45

Arg

Ala

Thr

Gly

Ile

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

50

55

60

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Arg

Leu

Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

65

70

75

80

Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Arg Ser Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly

PL 214 003 Β1

103

85

90

95

Thr

Lys

Val

ASP

ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

100

105

110

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

1'15

120

125

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

130 135 140

Gly Gly

145 <210> 94 <211> 95 <212> PRT

<213> Homo

sapiens

<400> 94

Asp

Ile

Gin

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

1

5

10

15

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

T θ

Ser

Ser

Tyr

20

25

30

Leu

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Ala

Ara

Ser

Ser

Leu

Gin

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

Tyr

Ser

Thr

Pro

90 95 <210> 95 <211> 152 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 95

Ser Val 10

Gly

Asp Arg Val

Thr 15

Ile

Gin 1

Ser

Pro

Ser

Ser 5

Leu

Ser

Ala

Thr

Cys

Arg

Ala 20

Ser

Gin

Ser

Ile

Asn 25

Thr

Tyr

Leu

Ile

Trp 30

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro 35

Gly

Lys

Ala

Pro

Asn 40

Phe

Leu

Ile

Ser

Aia 45

Thr

Ser

Ile

Leu

Gin

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Arg

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

55 60

104

PL 214 003 Β1

Asn 65

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile 70

Asn

Ser

Leu

His

Pro 75

G1 u

Asp

Phe

Ala

Thr 80

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

Tyr

Ser

Thr

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

Gly

85

90

95

Thr

Lys

Val

Asp

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

100

105

110

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

val

115

120

125

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

130

135

140

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Giy

145 150 <210> 96 <211> 139 <212> PRT

<213> Homo

sapiens

<400> 96

Pro

Ser

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

1

5

10

15

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Ile

Asn

Ser

Tyr

Leu

Asp

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

20

25

30

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Ser

Leu

Gin

35

40

45

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

50

55

60

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Phe

Al a.

Thr

Tyr

Tyr

65

70

75

80

Cys

Gin

Gin

Tyr

Tyr

Ser

Thr

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

Gly

Thr

Lys

85

90

95

Val

Glu

I le

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

100

105

110

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

115

120

125

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

val

130 135 <210> 97 <211 > 134 <212> PRT <213> Homo sapiens

PL 214 003 Β1

105

<400 97

Arg

Val 15

Thr

Thr Gin 1

Ser

Pro

Ser 5

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser 10

Val

Gly

Asp

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Asn

Ile

Ser

Arg

Tyr

Leu

Asn

Trp

Tyr

20

25

30

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Phe

Leu

Ile

Tyr

Val

Ala

Ser

35

40

45

Ile

Leu

Gin

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Gly

Phe

Ser

Ala

Ser

Gly

Ser

Gly

50

55

60

Pro

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

65

70

75

80

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

Tyr

Ser

Thr

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

85

90

95

Gly

Thr

Lys

Val

Asp

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

100

105

110

Tle

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

iys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

115

120

125

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

130 <210 98 <211> 150 <212> PM <213> Homo sapiens

<400 98

Ser 5

Ser

Leu

Ser

Ser 10

Val

Gly

Asp

Arg

Val 15

Thr

Thr Gin 1

Ser

Pro

ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

11Θ

Cys

Asn

Tyr

Leu

Asn

Trp

Tyr

20

25

30

Gin

Gin

lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Arg

Val

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

35

40

45

Ser

Leu

Gin

Gly

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

50

55

60

Ile

Asp

Cys

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

65

70

75

80

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

Tyr

ile

Thr

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

85

90

95

Gly

Thr

Arg

Val

Asp

Ile

Glu

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

100

105

110

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

115

120

125

106

PL 214 003 Β1

Val Cys Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

130

135

140

Lys Val Asp

Asn

Ala

Tyr

145

150

<210> 99

<211> 96

<212> PRT

<213> Homo

sapiens

<400> 99

Glu Tle Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Asp

Phe

Gin

Ser

Val

Thr

Pro

Lys

1

5

10

15

Glu Lys Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Ile

Gly

Ser

Ser

20

25

30

Leu His Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Asp

Gin

Ser

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

35

40

45

Lys Tyr Ala

Ser

Gin

Ser

Phe

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser Gly Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Asn

Ser

Leu

Glu

Ala

65

70

75

80

Glu Asp Ala

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

His

Gin

Ser

Ser

Ser

Leu

Pro

Gin

85

90

95

<210> 100

<211> 364

<212> PRT

<213> Homo

SHpi-SIlS

<400> 100

Met Gly Val

Leu

Leu

Thr

Gin

Arg

Thr

L eu

Leu

Ser

Leu

Val

Leu

Ala

1

5

10

15

Leu Leu Phe

Pro

Ser

Met

Ala

Ser

Met

Ala

Met

His

Val

Ala

Gin

Pro

20

25

30

Ala Val Val

Leu

Ala

Ser

Ser

Arg

Gly

Ile

Ala

Ser

Phe

Val

Cys

Glu

35

40

45

Tyr Ala Ser

Pro

Gly

Lys

Ala

Thr

Glu

Val

Arg

Val

Thr

Val

Leu

Arg

50

55

60

Gin Ala Asp

Ser

Gin

Val

Thr

Glu

Val

Cys

Ala

Ala

Thr

Tyr·

Met

Met

65

70

75

Θ0

Gly Asn Glu

Le u

Thr

Phe

Leu

Asp

Asp

Ser

Ile

Cys

Thr

Gly

Thr

Ser

85

90

95

Ser Gly Asn Gin Val Asn ieu Thr Ile Gin Gly Leu Arg Ala Met Asp

PL 214 003 Β1

107

100

105

110

Thr

Gly

Leu

Tyr

Ile

cys

Lys

Val

Glu

Leu

Met

Tyr

Pro

Pro

Pro

Tyr

115

120

125

Tyr

Leu

Gly

Ile

Gly

Asn

Gly

Thr

Gin

Ile

Tyr

Val

Ile

Asp

Pro

Glu

130

135

140

Pro

Cys

Pro

Asp

Ser

Asp

Leu

Glu

Gly

Ala

Pro

Ser

Vai

Phe

Leu

Phe

145

150

155

160

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

165

170

175

Thr

Cys

Val

Val

val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

180

185

190

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn.

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

195

200

205

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

210

215

220

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

225

230

235

240

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Thr

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

I.ys

Ala

245

250

255

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

260

2 65

270

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

275

280

285

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Al a

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

290

295

300

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Giy

Ser

305

310

315

32 0

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

325

330

335

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

340

345

350

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

355

360

<210> 101 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 101

Met His Val Ala Gin Pro Ala Val Val Leu Ala Ser

108

PL 214 003 Β1

<210>	102
<211>	120
<212>	PRT
<213>	Homo	sapiens
<400>	102
Met His Val	Al a	Gin	Pro	Ala	Val
1			5
Ala Ser Phe	Val	Cys	Glu	Tyr	Ala
		20
Arg val Thr	Val	Leu	Arg	Gin	Ala
	35					40
Ala Ala Thr	Tyr	Met	Met	Gly	Asn
50				55
Ile Cys Thr	Gly	Thr	Ser	Ser	Gly
65				70
Gly Leu Arg	Ala	Met	Asp	Thr	Gly
			85
Met Tyr Pro	Pro	Pro	Tyr	Tyr	Leu
		100
Tyr Val Ile	Asp	Pro	Glu	Pro	Cys
	115					120
<210>	103
<211>	11
<212>	PRT
<213>	Homo :	sapiens
<400>	103
Met H:	i...s Val	Ala	Gin	Pro	Ala	Val
1			5
<210>	104
<211>	23
<212>	DNA
<213>	Artificial	. Seguenc	:e
<220>
<223>	Description of	Artificial

Val Leu Ala

Seguence; Primer

Val	Leu 10	Ala	Ser	Ser	Arg	Gly 15	Ile
Ser 25	Pro	Gly	Lys	Ala	Thr 30	Glu	Val
Asp	Ser	Gin	Val	Thr 45	Glu	Val	Cys
Glu	Leu	Thr	Phe 60	Leu	Asp	Asp	Ser
Asn	Gin	V 1 75	Asn	Leu	Thr	Ile	Gin 80
Leu	Tyr 90	Ile	Cys	Lys	Val	Glu 95	Leu
Gly 105	Ile	Gly	Asn	Gly	Thr 110	Gin	Ile

<220>

<221> modyfikowana zasada <222> (21) <223> i <400> 104

PL 214 003 Β1

109 caggtgcagc tggagcagtc ngg <210> 105 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Description of Artificial Seguence: Primer <400 105 gctgagggag tagagtcctg agga 24 <210> 106 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Seąuence <220 <223> Description of Artificial Seguence: Primer <400> 106 tatctaagct tctagactcg accgccacca tggagtttgg gctgagctg 49 <210 107 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Seąuence <220 <223> Description of Artificial Seguence: Primer <400> 107 ttctctgatc agaattccta tcatttaccc ggagacaggg agagct 46 <210 108 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Seąuence <220 <223> Description of Artificial Sequence: Optimal Kozak seąuence <400 108 accgccacc 9 <210> 109 <211> 45 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 109 tcttcaagct tgcccgggcc cgccaccatg gaaaccccag cgcag

110

PL 214 003 Β1 <210> 110 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequen.ce <220>

<223> Description of Artificial Seąuence: Primer <400> 110 ttctttgatc agaattctca ctaacactct cccctgttga ago 43 <210> 111 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Seąuence <220>

<223> Description of Artificial Seguence: Primer <400> 111 tcttcaagct tgcccgggcc cgccaccatg gacatgaggg tccccgct 48 <210> 112 <211> 155 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 112

Gin 5

Ser

Val

Thr

Pro

Lys 10

Glu

Lys

Val

Thr

Ile 15

Thr

Ser 1

Pro

Asp

Phe

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Ile

Gly

Ser

Ser

Leu

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

20

25

30

Lys

Pro

Asp

Gin

Ser

Pro

Lys

Leu

Leu

ile

Lys

Tyr

Ala

Ser

Gin

Ser

35

40

45

Phe

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

50

55

60

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Asn

Ser

Leu

Glu

Ala

Glu

Asp

Ala

Ala

Thr

Tyr

65

70

75

80

Tyr

Cys

His

Gin

Ser

Ser

Ser

Leu

Pro

Leu

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

85

90

95

Lys

Val

Glu

ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

100

105

110

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

val

Cys

115

120

125

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

130

135

140

PL 214 003 Β1

111

Asp Asn Ala Leu Gin. Ser Gly Asn Ser Gin Glu

145 150 155 <210> 113 <211> 100 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 113

Asp Val i

Val

Met

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Leu

Ser 10

Leu Pro

Val

Thr

Leu 15

Gly

GL n

Pro

Ala

Ser

Ile

Ser

Cys

Arg

Ser

Ser

Gin

Ser

Leu

Val

Tyr

Ser

20

25

30

Asp

Gly

Asn

Thr

Tyr

Leu

Asn

Trp

Phe

Gin

Gin

Arg

Pro

dy

Gin

Ser

35

40

45

Pro

Arg

Arg

Leu

Ile

Tyr

Lys

Val

Ser

Asn

Arg

Asp

Ser

Gly

Val

Pro

50

55

60

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Lys

Ile

65

70

7

80

Ser

Arg

Val

Glu

Ala

Glu

Asp

Val

Gly

Val

Tyr

Tyr

Cys

Met

Gin

Gly

90 95

Thr His Trp Pro

100 <210> 114 <211> 139 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 114

Pro 1

LSU

Ser

Leu

Pro 5

Val

Thr

Leu

Gly

Gin 10

Prc

Ala

Ser

Ile

Ser 15

Cys

Arg

Ser

Ser

Gin

Ser

Leu

Val

Tyr

Ser

Asp

Gly

Asn

Thr

Tyr

Leu

Asn

20

25

30

Trp

Phe

Gin

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin

Ser

Pro

Arg

Arg

Leu

Ile

Tyr

Lys

35

4 0

45

Val

Ser

Asn

Trp

Asp

Ser

Gly

Val·

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

50

55

60

Ser

dy

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Lys

Ile

Ser

Arg

Val

Glu

Ala

Glu

Asp

65

70

75

80

Val

Gly

Val

Tyr

Tyr

Cys

Met

Gin

Gly

Ser

His

Trp

Pro

Pro

Thr

Phe

85

90

95

Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser

112

PL 214 003 Β1

100

105

110

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu Lys

Ser

Gly Thr Ala

115

120

125

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

130 135 <210> 115 <211> 100 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 1.15

Pro

Leu

Ser 10

Leu

Pro

Val

Thr

Pro 15

Gly

Asp

Ile

Val

Met

Thr 5

Gin

Ser

Glu

Pro

Ala

Ser 20

Ile

Ser

cys

Arg

Ser 25

Ser

Gin

Ser

Leu

Leu 30

His

Ser

Asn

Gly

Tyr 35

Asn

Tyr

Leu

Asp

Trp 40

Tyr

Leu

Gin

Lys

Pro 45

Gly

Gin

Ser

Pro

Gin 50

Leu

Leu

11

Tyr

Leu 5 5

Gly

Ser

Asn

Arg

Ala 60

Ser

Gly

Val

Pro

Asp 65

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser 70

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp 75

Phe

Thr

Leu

Lys

Ile 80

Ser

Arg

val

Glu

Ala 85

Glu

Asp

Val

Gly

Val 90

Tyr

Tyr

Cys

Met

Gin 95

Ala

Leu

G1 n

Thr

Pro 100

<210> 116 <211> 133 <2121 PRT <213> Homo sapiens

<400> 116

Ser

1.1, e

Ser

Cys

Arg 10

Ser

Ser

Gin

Ser

Leu 15

Leu

Pro 1

Gly

Glu

Pro

Ala 5

His

Ser

Asn

Gly

Tyr

Asn

Tyr

Leu

Asp

Trp

Tyr

Leu

Gin

Lys

Pro

Gly

20

2*5

30

Gin

Ser

Pro

Gin

Leu

Leu

Ile

Tyr

Leu

ciy

Ser

Asn

Arg

Ala

Ser

Gly

35

40

45

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

50

55

60

Lys

Leu

Ser

Arg

Val

Glu

Ala

Glu

Asp

Val

ciy

val

TyE

Tyr

Cys

Met

65

70

75

90

PL 214 003 Β1

113

Gin

Ala

Leu

Gin

Thr 85

Pro

LSlI

Thr

Phe

Gly 90

Gly

dy

Thr

Lys

Val 95

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

100

105

110

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

115

120

125

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

130 <210> 117 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 117 Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser	Pro Ser Ser Leu Ser Ala 10	Ser Val Gly 15
1	5
Asp Arg Val Thr
20

<210> 118 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 118 Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser	Pro Gly 15
1	5	10
Glu Arg	Ala	Thr 20

<210> 119 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 119 Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser	Pro Gly 15
1	5	10
Glu Arg	Ala	Thr
		20

<210> 120 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 120

114

PL 214 003 Β1

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser

5

Pro Ser Ser

Val Ser Ala Ser Val Gly

Asp Arg Val Thr <210> 121 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 121

Thr Gly Glu Phe Val Leu Thr Gin Ser

5

Pro Gly Thr Leu Ser

Leu

Ser

Pro Gly Glu Arg <210> 122 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 122 Glu Phe Val Leu Thr Gin Ser	Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser 10	Pro Gly 15
1	5
Glu Arg	Ala	Thr
		20

<210> 123 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 123
Glu Ile 1	Val	Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser	Pro Gly 15
5	10
Glu Arg	Ala	Thr 20

<210> 124 <2U> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 124

Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser

10

Pro Gly

Glu Arg Ala Thr

PL 214 003 Β1

115 <210 125 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400 125

Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr <210 126 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 126	Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin	Pro Gly Arg 15
Gin Val 1	Gin
5	10
Ser Leu	Arg	Leu 20	Ser

<210> 127 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 127

Pro Glu Val Gin Phe

5 <210> 128 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 128

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg

5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser

<210>	12 9
<211>	10
<212>	PRT
<213>	Homo sapiens
<400>	129
Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp	Tyr Val Asp
1	5	10

116

PL 214 003 Β1 <210> 130 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 130

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg

5 10 15

Ser Leu <210> 131 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 131

Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr

5 <210> 132 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 132

Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly

10 15

Ser Leu Arg Leu <210> 133 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 133

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin

10

Pro Gly Arg

Ser Leu Arg Leu Ser

<210>	134
<211>	10
<212>	PRT
<213>	Homo	sapiens
<400>	134
Pro Glu Val	Gin Phe Asn Trp	Tyr Val Asp
1		5	10

PL 214 003 Β1

117 <210> 135 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 135

Gin Val 1	Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val	Val Gin Pro Gly Arg 15
5	10
Ser Leu	Arg Leu Ser 20

<210> 136 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400 136

Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val

5 <210 137 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400 137
Gin Val	Gin	Leu	Val Glu	Ser Gly Gly Gly Val Val Gin	Pro Gly Arg
1			5	10	15
Ser Leu	Arg	Leu	Ser
		20

<210> <211> <212> <213>	138 6 PRT Homo sapiens
<400> 138 Pro Glu Val Gin Phe Asn 1 5

<210>	139
<211>	21
<212>	PRT
<213>	Homo sapiens
<400>	139

Glu

Ser

Gly

Gly val

Val

Glu

Pro

Gly

Arg

Ser Leu Arg Leu Ser

118

PL 214 003 Β1

<210>	140
<211>	10
<212>	PRT
<213>	Homo sapiens
<400>	140

Pro Glu Val Gin Phe	Asn Trp Tyr	Val	Asp 10
1	5
<210>	141
<211>	8
<212>	PRT
<213>	Homo sapiens
<400>	141
Asp Ile Gin Met Thr	Gin	Ser	Pro
1	5
<210>	142
<211>	8
<212>	PRT
<213>	Homo sapiens
<400>	142
Glu Ile Val Leu Thr	Gin	Ser	Pro
1	5
<210>	143
<211>	8
<212>	PRT
<213>	Homo sapiens
<400>	143
Glu Ile Val Leu Thr	Gin	Ser	Pro
1	5
<210>	144
<211>	10
<212>	PRT
<213>	Homo sapiens
<400>	144
Thr Gly Glu Phe Val	Leu	Thr	Gin	Ser	Pro
1	5					10

<210> 145 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens

PL 214 003 Β1

119 <400> 145

Glu Phe Val Leu Thr	Gin	Ser	Pro
1	5
<210>	146
<211>	8
<212>	PRT
<213>	Homo sapiens
<400>	146
Glu Ile Val Leu Thr	Gin	Ser	Pro
1	5

<210>	147
<211>	8
<212>	PRT
<213>	Homo sapiens
<400>	147
Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro
1	5

120

Claims (10)

1. Przeciwciało monoklonalne wiążące się z antygenem 4 cytotoksycznych limfocytów T (CTLA-4), lub jego wiążący antygen fragment, znamienne tym, że obejmuje region zmienny łańcucha ciężkiego przynajmniej w 85% identyczny z regionem zmiennym łańcucha ciężkiego z SEKW NR ID: 63, oraz region zmienny łańcucha lekkiego przynajmniej w 90% identyczny z regionem zmiennym łańcucha lekkiego z SEKW NR ID: 65.

2. Przeciwciało lub fragment według zastrz. 1, znamienne tym, że obejmuje region zmienny łańcucha ciężkiego przynajmniej w 90% identyczny z regionem zmiennym łańcucha ciężkiego z SEKW NR ID: 63.

3. Przeciwciało lub fragment według zastrz. 1, znamienne tym, że wiąże się z CTLA-4 z K_D wynoszącą 10'⁹ M lub większym powinowactwem.

4. Przeciwciało lub fragment według zastrz. 2, znamienne tym, że wiąże się z CTLA-4 z K_D wynoszącą 10'⁹ M lub większym powinowactwem.

5. Przeciwciało lub fragment według zastrz. 1, znamienne tym, że hamuje wiązanie pomiędzy CTLA-4 i B7-2 z IC₅₀ wynoszącym 100 nM lub niższym.

6. Przeciwciało lub fragment według zastrz. 2, znamienne tym, że hamuje wiązanie pomiędzy CTLA-4 i B7-2 z IC₅₀ wynoszącym 100 nM lub niższym.

7. Przeciwciało lub fragment według zastrz. 1, znamienne tym, że wiąże się z CTLA-4 z K_D wynoszącą 10'⁹ M lub większym powinowactwem oraz hamuje wiązanie pomiędzy CTLA-4 i B7-2 z IC₅₀ wynoszącym 100 nM lub niższym.

8. Przeciwciało lub fragment według zastrz. 2, znamienne tym, że wiąże się z CTLA-4 z K_D wynoszącą 10'⁹ M lub większym powinowactwem oraz hamuje wiązanie pomiędzy CTLA-4 i B7-2 z IC₅₀ wynoszącym 100 nM lub niższym.

9. Sposób wytwarzania przeciwciała określonego w zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje etapy:

a) immunizowania niebędącego człowiekiem ssaka immunogenem obejmującym CTLA-4, przy czym ssak jest zdolny do ekspresji ludzkich przeciwciał w swoich komórkach B;

b) izolowania komórek B z ssaka;

c) przesiewania komórek B, lub uzyskanych z nich linii komórkowych, pod kątem przeciwciał wiążących CTLA-4;

d) hodowania linii komórkowej wyrażającej przeciwciała, które wiążąsię z CTLA-4;

oraz

e) izolowania przeciwciał, które wiążąsię z CTLA-4.

10. Sposób wytwarzania przeciwciała określonego w zastrz. 2, znamienny tym, że obejmuje etapy:

a) immunizowania niebędącego człowiekiem ssaka immunogenem obejmującym CTLA-4, przy czym ssak jest zdolny do ekspresji ludzkich przeciwciał w swoich komórkach B;

b) izolowania komórek B z ssaka;

c) przesiewania komórek B, lub uzyskanych z nich linii komórkowych, pod kątem przeciwciał wiążących CTLA-4;

d) hodowania linii komórkowej wyrażającej przeciwciała, które wiążąsię z CTLA-4;

oraz

e) izolowania przeciwciał, które wiążąsię z CTLA-4.