CN115916233A - 靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及靶向IL‑12异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述融合蛋白与人PD‑1或人PD‑L1结合。

Description

靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年10月3日提交的美国临时申请第62/910,328号和2020年4月3日提交的美国临时申请第63/005,100号的权益，其内容通过引用整体并入本文。
背景技术
为了使T细胞发挥有效的抗肿瘤应答，必须发生三件事。第一，T细胞必须在肿瘤环境中与由MHC呈递的抗原性肿瘤肽结合。第二，共刺激分子必须与T细胞结合。并且第三，T细胞必须由如IL-12和IL-2等细胞因子诱导以产生共刺激性细胞因子，如允许分化和扩增的IFNγ。在不存在细胞因子诱导的情况下，仅识别肿瘤肽会导致T细胞变得无反应性，由此导致具有耐受性。因此，在癌症免疫治疗中非常有前景的方法是基于细胞因子的治疗。实际上，IL-2已被批准用于患有转移性肾细胞癌和恶性黑色素瘤的患者。然而，目前尚无批准的重组IL-12在人类体内的使用。
重组IL-12是有前景的基于细胞因子的治疗，因为其在活化免疫系统方面具有广泛的作用。如上所述，IL-12诱导T细胞产生如IFNγ的共刺激性细胞因子。IL-12还导致树突细胞的抗原呈递增加(Grohmann U.等人，1999)，其有助于T细胞与肿瘤肽的进一步结合。事实上，小鼠IL-12已被证明在移植有肿瘤的小鼠中具有抗肿瘤活性(Brunda,MJ.等人，1993)。然而，由于全身毒性，因此IL-12迄今为止在人类临床试验中面临障碍。与其它细胞因子一样，IL-12的半衰期短，这需要进行频繁的团注。
T细胞活化后，免疫检查点蛋白诸如PD-1被上调，以通过在与免疫检查点配体诸如PD-L1结合后耗尽活化的T细胞来排除自身免疫。然而，诸如PD-1的免疫检查点蛋白在肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)中也上调，并且诸如PD-L1的免疫检查点配体在肿瘤细胞上过表达，从而有助于肿瘤细胞的免疫逃逸。已经证明，通过诸如
Figure BDA0003679091520000011
(纳武单抗)和
Figure BDA0003679091520000012
(派姆单抗)等药物阻断免疫检查点相互作用来消除对TIL的抑制作用对癌症治疗高度有效。尽管诸如纳武单抗和派姆单抗的检查点阻断疗法有前景，但许多患者仍然无法实现对单独的检查点阻断的足够的反应。
因此，在肿瘤治疗中仍存在对利用不需要高剂量并且靶向肿瘤以避免全身毒性的细胞因子的治疗策略的未满足的需求。此外，需要确定另外的治疗方式以与检查点阻断相叠加，其能够提高患者的反应率。这可能特别复杂，因为另外的治疗方式不应与检查点阻断竞争。本发明通过提供具有提高的半衰期并更选择性地靶向TILs以改善安全特性，并且不与它们可能结合的检查点阻断抗体竞争的靶向PD-1和PD-L1的IL-12融合蛋白，解决了这些需求和警告。
发明内容
如图79A所描绘的，本文提供了具有靶向scFv x scIL-12-Fc形式的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白。
在一个方面，本发明提供了靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其包含：(a)第一单体，其从N末端到C末端包含：(i)第一IL-12蛋白质结构域；(ii)第一结构域接头；(iii)第二IL-12蛋白质结构域；iv)第二结构域接头；和(v)包含CH2-CH3的第一变体Fc结构域；和(b)第二单体，从N末端到C末端包含：(i)scFv结构域；(ii)第三结构域接头；(iii)包含CH2-CH3的第二变体Fc结构域；其中第一IL-12蛋白质结构域包含IL-12p35亚基并且第二IL-12蛋白质结构域包含IL-12p40亚基，或者第一IL-12蛋白质结构域包含IL-12p40亚基并且第二IL-12蛋白质结构域包含IL-12p35亚基，其中scFv结构域包含可变重结构域、scFv接头、可变轻结构域，并且scFv结构域结合靶抗原，并且其中第一和第二变体Fc结构域包含促进第一和第二Fc结构域异源二聚化的修饰。
在一些实施方式中，scFv结构域结合选自由人PD-1和人PD-L1组成的组的靶抗原。在一些实施方式中，scFv结构域结合人PD-1。在一些实施方式中，scFv结构域结合人PD-1并且不与纳武单抗和/或派姆单抗竞争人PD-1。在一些实施方式中，scFv结构域结合人PD-L1。
在一些实施方式中，结合人PD-1的scFv结构域包含选自由以下组成的组的可变重链和可变轻链：(a)1C11[PD-1]_H0L0(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(b)1C11[PD-1]_H3L3(SEQID NOS:XXX和XXX)、(c)1C11[PD-1]_H3.240_L3.148(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(d)1C11[PD-1]_H3.241_L3.148(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(e)1C11[PD-1]_H3.234_L3.144(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(f)1C11[PD-1]_H3.241_L3.92(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(g)1C11[PD-1]_H3.303_L3.152(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(h)1C11[PD-1]_H3.329_L3.220(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(i)1C11[PD-1]_H3.329_L3.220(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(j)1C11[PD-1]_H3.328_L3.152(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(k)派姆单抗[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(l)尼沃利珠单抗(nivolizumab)[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(m)皮地利珠单抗[PD-1](SEQ IDNOS:XXX和XXX)、(n)MK-3475[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(o)BAP049克隆E[PD-1](SEQID NOS:XXX和XXX)、(p)BAP049克隆B[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(q)H7709N[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(r)H7798N[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(s)h1H3 Var 6[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(t)APE2058[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(u)H005-1[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(v)317-4B6[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(w)326-4A3[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(x)hPD-1mAb 7[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(y)克隆38[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(z)克隆39[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(aa)克隆41[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ab)克隆48[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ac)PD1-17[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ad)PD1-28[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ae)PD1-33[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(af)PD1-35[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ag)LOPD180[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ah)Ab948[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ai)人源化EH-12.2H7[PD-1](SEQ ID NOS:XXX)、(aj)RG1H10[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ak)RG1H10-H2A-22-1S[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(al))RG1H10-H2A-27-2S[PD-1](SEQID NOS:XXX和XXX)、(am)RG1H10-3C[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(an)RG1H10-16C[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ao)RG1H10-17C[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ap)RG1H10-19C[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(aq)RG1H10-21C[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ar)RG1H10-23C2[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)和(as)mAB7[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)。
在一些实施方式中，结合人PD-1并且不与纳武单抗和/或派姆单抗竞争人PD-1的scFv结构域包含选自由以下组成的组的可变重链和可变轻链：(i)mAb A[PD-1]_H1L1(SEQID NOS:XXX和XXX)、(ii)mAb B[PD-1]_H1L1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(iii)mAb C[PD-1]_H1L1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)和(iv)mAb C[PD-1]_H1.19L1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)。在一些实施方式中，结合人PD-1并且不与纳武单抗和/或派姆单抗竞争人PD-1的scFv结构域包含：选自由以下组成的组的可变重链：(a)mAb C[PD-1]_H1(SEQ ID NO:XXX)、(b)mAb C[PD-1]_H1.19(SEQ ID NO:XXX)、(c)mAb C[PD-1]_H1.48(SEQ ID NO:XXX)、(d)mAb C[PD-1]_H1.125(SEQ ID NO:XXX)、(e)mAb C[PD-1]_H1.130(SEQ ID NO:XXX)、(f)mAb C[PD-1]_H1.132(SEQ ID NO:XXX)、(g)mAb C[PD-1]_H1.169(SEQ ID NO:XXX)、(h)mAb C[PD-1]_H1.175(SEQ ID NO:XXX)和(i)mAb C[PD-1]_H2(SEQ ID NO:XXX)；和选自由以下组成的组的可变轻链：(a)mAb C[PD-1]_L1(SEQ ID NO:XXX)、(b)mAb C[PD-1]_L1.1(SEQ ID NO:XXX)、(c)mAb C[PD-1]_L1.3(SEQ ID NO:XXX)、(d)mAb C[PD-1]_L1.45(SEQ ID NO:XXX)、(e)mAb C[PD-1]_L1.117(SEQ ID NO:XXX)、(f)mAb C[PD-1]_L1.129(SEQ ID NO:XXX)、(g)mAb C[PD-1]_L1.135(SEQ ID NO:XXX)、(h)mAb C[PD-1]_L1.136(SEQ ID NO:XXX)、(i)mAbC[PD-1]_L1.140(SEQ ID NO:XXX)和(j)mAb C[PD-1]_L2(SEQ ID NO:XXX)。
在一些实施方式中，结合人PD-L1的scFv结构域包含选自由以下组成的组的可变重链和可变轻链：(a)杜瓦鲁单抗(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(b)阿特珠单抗(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(c)A09-246-2(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(d)12A4(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(e)3G10(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(f)10A5(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(f)h3D10 Var 1(SEQ IDNOS:XXX和XXX)、(g)h3D10 Var 2(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(h)h3D10 Var 3(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(i)h3D10 Var 4(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(j)h3D10 Var 5(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(k)h3D10 Var 6(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(l)h3D10 Var 7(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(m)h3D10 Var 8(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(n)h3D10 Var 9(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(o)h3D10 Var 10(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(p)h3D10 Var 11(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(q)h3D10 Var 12(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(r)h3D10 Var 13(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(s)h3D10 Var 14(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(t)Antibody A(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(u)C5H9v2(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(v)人源化29E.2A3(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(w)1B9(SEQID NOS:XXX和XXX)、(x)4H1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(y)mAb-42(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(z)BAP058-03(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(aa)BAP058-04(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ab)BAP058-06(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ac)BAP058-07(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ad)BAP058-11(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ae)BAP058-13(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(af)H6(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ag)RC5(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ah)SH1A1Q(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ai)SH1B3(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(aj)SH1D1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ak)SH1D2(SEQ IDNOS:XXX和XXX)、(al)SH1D12(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(am)SH1E1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(an)SH1G9(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ao)SH1E6(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ap)SH1A2(SEQID NOS:XXX和XXX)、(aq)SH1B1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ar)H6B1L(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(as)H6A1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(at)H6B1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(au)H6B2(SEQID NOS:XXX和XXX)、(av)G12(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(aw)RSA1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ax)RA3(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ay)SH1E2(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(az)SH1E4(SEQ IDNOS:XXX和XXX)、(ba)SH1B1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(bb)SH1C8(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(bc)H1H9364P2(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(bd)H1H9373P2(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(be)H1H8314N(SEQ ID NOS:XXX和XXX)和(bf)PDL1.3(SEQ ID NOS:XXX和XXX)。
在一些实施方式中，促进第一和第二Fc结构域的异源二聚化的修饰是选自由以下组成的组的一组氨基酸取代：根据EU编号，L368D/K370S和S364K；L368D/K370S和S364K/E357L；L368D/K370S和S364K/E357Q；T411E/K360E/Q362E和D401K；L368E/K370S和S364K；K370S和S364K/E357Q；T366S/L368A/Y407V和T366W；以及T366S/L368A/Y407V/Y349C和T366W/S354C。
在一些实施方式中，根据EU编号，第一和/或第二变体Fc结构域具有另外一组包含Q295E/N384D/Q418E/N421D的氨基酸取代。在一些实施方式中，根据EU编号，第一变体Fc结构域或第二变体Fc结构域具有另外一组包含Q295E/N384D/Q418E/N421D的氨基酸取代。在一些实施方式中，根据EU编号，第一和第二变体Fc结构域各自具有另外一组包含Q295E/N384D/Q418E/N421D的氨基酸取代。
在一些实施方式中，第一和/或第二变体Fc结构域具有另外一组由以下组成的氨基酸取代：根据EU编号，G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del和E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方式中，第一变体Fc结构域或第二变体Fc结构域具有另外一组由以下组成的氨基酸取代：根据EU编号，G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del、和E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方式中，第一和第二变体Fc结构域具有另外一组由以下组成的氨基酸取代：根据EU编号，G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del和E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。
在一些实施方式中，根据EU编号，第一和第二变体Fc结构域各自包含氨基酸取代M428L/N434S。
在一些实施方式中，IL-12p40亚基具有由选自由以下组成的组的多肽序列：SEQID NO:3(人IL-12亚基β(IL-12p40)前体序列)和SEQ ID NO:4(人IL-12亚基β(IL-12p40)成熟形式序列)，并且IL-12p35亚基具有由选自由以下组成的组的多肽序列：SEQ ID NO:1(人IL-12亚基α(IL-12p35)前体序列)和SEQ ID NO:2(人IL-12亚基α(IL-12p35)成熟形式序列)。在一些实施方式中，IL-12p40亚基是变体IL-12p40亚基和/或IL-12p35亚基是变体IL-12p35亚基。
在一些实施方式中，IL-12p40亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p40亚基；和/或IL-12p35亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p35亚基。
在一些实施方式中，IL-12p40亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p40亚基。在一些实施方式中，IL-12p35亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p35亚基。
在一些实施方式中，IL-12p40亚基在选自由以下组成的组的氨基酸残基上具有一个或多个氨基酸取代：E59、K99、D18、K264、C252、N200、E3、D7、E12、D14、W15、P17、A19、P20、G21、E22、M23、D29、E32、E33、D34、L40、D41、Q42、S43、E45、L47、T54、I55、Q56、K58、F60、G61、D62、Q65、Y66、E73、K84、E86、D87、G88、I89、W90、D93、D97、E100、K102、N103、K104、F106、E110、N113、Y114、D129、D142、Q144、E156、R159、D161、N162、K163、D166、D170、Q172、D174、A176、C177、P178、A179、A180、E181、S183、P185、E187、S204、F206、R208、D209、D214、N218、Q220、N226、Q229、E231、E235、T242、P243、S245、Y246、F247、S248、Q256、K258、K260、E262、D265、D270、N281、Q289、D290、R291、Y292、Y293和E299。
在某些实施方式中，IL-12p40亚基具有一个或多个选自由以下组成的组的氨基酸取代：E59K、K99E、K99Y、D18K、K264E、C252S、N200Q、D18N、E32Q、E33Q、D34K、D34N、Q42E、S43E、S43K、E45Q、Q56E、E59Q、D62N、E73Q、D87N、E100Q、N103D、N103Q、N113D、N113Q、Q144E、R159E、D161N、K163E、E187Q、N200D、N218Q、Q229E、E235Q、Q256N、K258E、K260E、E262Q、N281D、N281Q和E299Q。
在一些实施方式中，IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的氨基酸取代：E59K/K99E、E59K/K99Y、D18K/E59K/K99E、E59K/K99E/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、E59K/K99E/C252S、E59K/K99Y/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S、E59K/K99E/C252S/K264E、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q、E59K/K99Y/N200Q、D18K/E59K/K99E/N200Q、E59K/K99E/N200Q/K264E、D18K/E59K/K99E/N200Q/K264E、E59K/K99E/N200Q/C252S、E59K/K99Y/N200Q/C252S、D18K/E59K/K99E/N200Q/C252S、E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、D18K/E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、D18K/E59K/K99E/C252S、E32K/D34N/E59K/K99E、E32Q/D34N/E59K/K99E、D34K/E59K/K99E、D34N/E59K、D34N/E59K/K99E、Q42E/E45Q、Q42E/E59Q、Q42E/Q56E/E59Q、E32Q/E59Q、D34N/E59Q、S43E/E59Q、S43K/E49Q、E45K/E59K/K99E、E45Q/Q56E、E45Q/Q56E/E59Q、E59Q/E187Q、E59Q/K163E、E59Q/K99E、E59Q/K258E、E59Q/K260E、E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E、E59K/K99E/Q144E、E59K/K99E/Q144K、E59K/K99E/R159E、E59K/K99Y、E59Y/K99E、E59Y/K99Y、E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、N103D/N113D、N103D/N113D/N200D、N103D/N113D/N281D、N103D/N200D、N103D/N200D/N281D、N103D/N281D、N103D/N113D/N200D/N281D、N103Q/N113Q、N103Q/N113Q/N200Q、N103Q/N113Q/N281Q、N103Q/N200Q、N103Q/N200Q/N281Q、N103Q/N281Q、N113D/N200D、N113D/N200D/N281D、N113D/N281D、N113Q/N200Q、N113Q/N281Q、N113Q/N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q/N281Q、N200D/N281D和N200Q/N281Q。
在一些实施方式中，IL-12p40亚基或变体IL-12p40亚基包含选自由以下组成的组的氨基酸取代：E59K/K99E、E59K/K99Y、D18K/E59K/K99E、E59K/K99E/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、E59K/K99E/C252S、E59K/K99Y/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S、E59K/K99E/C252S/K264E、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q、E59K/K99Y/N200Q、D18K/E59K/K99E/N200Q、E59K/K99E/N200Q/K264E、D18K/E59K/K99E/N200Q/K264E、E59K/K99E/N200Q/C252S、E59K/K99Y/N200Q/C252S、D18K/E59K/K99E/N200Q/C252S、E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E和D18K/E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E。
在某些实施方式中，IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的多肽序列：图89A-89C中描绘的任何一个，i)SEQ ID NO:57(IL-12p40(N103D))、ii)SEQ ID NO:58(IL-12p40(N113D))、iii)SEQ ID NO:59(IL-12p40(N200D))、iv)SEQ ID NO:60(IL-12p40(N281D))、v)SEQ ID NO:61(IL-12p40(N103D/N113D/N200D/N281D))、vi)SEQ ID NO:62(IL-12p40(Q42E))、vii)SEQ ID NO:63(IL-12p40(E45Q))、viii)SEQ ID NO:64(IL-12p40(Q56E))、ix)SEQ ID NO:65(IL-12p40(E59Q))、x)SEQ ID NO:66(IL-12p40(D62N))、xi)SEQ ID NO:67(IL-12p40(Q42E/E45Q))、xii)SEQ ID NO:68(IL-12p40(E45Q/Q56E))、xiii)SEQ ID NO:69(IL-12p40(Q42E/E59Q))、xiv)SEQ ID NO:70(IL-12p40(Q56E/E59Q))、xv)SEQ ID NO:71(IL-12p40(Q42E/E45Q/Q56E))、xvi)SEQ ID NO:72(IL-12p40(E45Q/Q56E/E59Q))、xvii)SEQ ID NO:73(IL-12p40(D161N))、xviii)SEQ ID NO:74(IL-12p40(E73Q))、xix)SEQ IDNO:75(IL-12p40(Q144E))、xx)SEQ ID NO:76(IL-12p40(E262Q))、xxi)SEQ ID NO:77(IL-12p40(E100Q))、xxii)SEQ ID NO:78(IL-12p40(D18N))、xxiii)SEQ ID NO:79(IL-12p40(E33Q))、xxiv)SEQ ID NO:80(IL-12p40(Q229E))、xxv)SEQ ID NO:81(IL-12p40(E235Q))、xxvi)SEQ ID NO:82(IL-12p40(Q256N))、xxvii)SEQ ID NO:83(IL-12p40(E299Q))、xxviii)SEQ ID NO:84(IL-12p40(D87N))、xxix)IL-12p40(E32Q)、xxx)IL-12p40(D34N)、xxxi)IL-12p40(S43E)、xxxii)IL-12p40(S43K)、xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))、xxxiv)SEQ ID NO:205(IL-12p40(E59K))、xxxv)IL-12p40(K99E)、xxxvi)IL-12p40(K163E)、xxxvii)IL-12p40(E187Q)、xxxviii)IL-12p40(K258E)、xxxix)IL-12p40(K260E)、xl)SEQ ID NO:206(IL-12p40(E32Q/E59Q))、xli)SEQ ID NO:207(IL-12p40(D34N/E59Q))、xlii)SEQ ID NO:208(IL-12p40(E59Q/E187Q))、xliii)SEQ ID NO:209(IL-12p40(S43E/E59Q))、xliv)SEQ ID NO:210(IL-12p40(S43K/E49Q))、xlv)SEQ ID NO:211(IL-12p40(E59Q/K163E))、xlvi)SEQ ID NO:212(IL-12p40(E59Q/K99E))、xlvii)SEQ ID NO:213(IL-12p40(E59Q/K258E))、xlviii)SEQ IDNO:214(IL-12p40(E59Q/K260E))、xlix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K))l)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E))、li)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E))、lii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))、liii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y))、liv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99E))、lv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E45K/E59K/K99E))、lvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144E))、lvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144K))、lviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/R159E))、lix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))、lx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/K264E))、lxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(C252S))、lxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(DI8K/E59K/K99E/C252S))、lxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/C252S/K264E))、lxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y/C252S))、lxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S/K264E))、lxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S))、lxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D))、lxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D))、lxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N281D))、lxx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D))、lxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N281D))、lxxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200D/N281D))、lxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p50(N103D/N113D/N200D))、lxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D/N281D))、lxxv)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D/N281D))、lxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D/N281D))、lxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q))、lxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q))、lxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q))、lxxx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N281Q))、lxxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q))、lxxxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q))、lxxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N281Q))、lxxxiv)SEQID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q))、lxxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N281Q))、lxxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q/N281Q))、lxxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q))、lxxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N281Q))、lxxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q/N281Q))、xc)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q/N281Q))、xci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q/N281Q))、xcii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K/K99E))、xciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34K/E59K/K99E))、xciv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32Q/D34N/E59K/K99E))、xcv)SEQID NO:XXX(IL-12p40(E32K/D34N/E59K/K99E))、xcvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99Y))、xcvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E))、xcviii)SEQID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E))、xcix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E))、c)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E))、ci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E))、cii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E))、ciii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E))、civ)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E))、cv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E))、cvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E))、cvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E))、cviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))和cix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))。
在一些实施方式中，IL-12p35亚基具有一个或多个氨基酸取代，作为选自由以下组成的组的氨基酸残基：Q20、N21、Q35、E38、S44、E45、E46、H49、K54、D55、T59、V60、E61、C63、L64、P65、E67、L68、N71、S73、C74、L75、N76、E79、N85、L89、F96、M97、L124、M125、Q130、Q135、N136、E143、Q146、N151、E153、K158、E162、E163、D165、I171、R181、I182、R183、V185、T186、D188、R189、V190、S192、Y193、N195和A196。在某些实施方式中，IL-12p35亚基具有一个或多个选自由以下组成的组的氨基酸取代：N21D、Q35D、E38Q、D55Q、D55K、N71D、N71Q、L75A、N76D、E79Q、N85D、N85Q、L89A、F96A、M97A、L124A、M125A、Q130E、Q135E、N136D、E143Q、Q146E、N151D、N151K、E153K、E153Q、K158E、E162Q、E163Q、D165N、I171A、N195D和N195Q。在一些实施方式中，IL-12p35亚基具有一个或多个选自由以下组成的组的氨基酸取代：N21D/N151D、D55Q/N151D、N71D/N85D、N71D/N85D/N195D、N71D/N195D、N71Q/N85Q、N71Q/N85Q/N195Q、N71Q/N195Q、E79Q/N151D、N85D/N195D、N85Q/N195Q、Q130E/N151D、N136D/N151D、E143Q/N151D、N151D/E153Q、N151D/D165N和N151D/K158E。
在一些实施方式中，IL-12p35亚基具有一个或多个选自由以下组成的组的氨基酸取代：i)SEQ ID NO:113(IL-12p35(N71D))、ii)SEQ ID NO:114(IL-12p35(N85D))、iii)SEQID NO:115(IL-12p35(N195D))、iv)SEQ ID NO:116(IL-12p35(N71D/N85D/N195D))、v)SEQID NO:117(IL-12p35(E153Q))、vi)SEQ ID NO:118(IL-12p35(E38Q))、vii)SEQ ID NO:119(IL-12p35(N151D))、viii)SEQ ID NO:120(IL-12p35(Q135E))、ix)SEQ ID NO:121(IL-12p35(Q35D))、x)SEQ ID NO:122(IL-12p35(Q146E))、xi)SEQ ID NO:123(IL-12p35(N76D))、xii)SEQ ID NO:124(IL-12p35(E162Q))、xiii)SEQ ID NO:125(IL-12p35(E163Q))、xiv)IL-12p35(N21D)、xv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))、xvi)IL-12p35(E79Q)、xvii)IL-12p35(Q130E)、xviii)IL-12p35(N136D)、xix)IL-12p35(E143Q)、xx)SEQID NO:227(IL-12p35(N151K))、xxi)SEQ ID NO:226(IL-12p35(E153K))、xxii)IL-12p35(K158E)、xxiii)IL-12p35(D165N)、xxiv)SEQ ID NO:225(IL-12p35(N151D/E153Q))、xxv)SEQ ID NO:228(IL-12p35(N151D/D165N))、xxvi)SEQ ID NO:229(IL-12p35(Q130E/N151D))、xxvii)SEQ ID NO:230(IL-12p35(N151D/K158E))、xxviii)SEQ ID NO:231(IL-12p35(E79Q/N151D))、xxix)SEQ ID NO:232(IL-12p35(D55Q/N151D))、xxx)SEQ ID NO:233(IL-12p35(N136D/N151D))、xxxi)SEQ ID NO:234(IL-12p35(N21D/N151D))、xxxii)SEQ IDNO:235(IL-12p35(E143Q/N151D))、xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(F96A))、xxxiv)SEQID NO:XXX(IL-12p35(M97A))、xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L89A))、xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L124A))、xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M125A))、xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L75A))、xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(I171A))、xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q))、xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q))、xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N195Q))、xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q))、xxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N195Q))、xl)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q/N195Q)、xli)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q/N195Q))、xlii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71D/N85D))、xliii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71D/N195D)、xliv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85D/N195D))、xlv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))和xlvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55K))。
如图79B所描绘，本文提供了具有靶向Fab x scIL-12-Fc形式的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白。
在一个方面，本发明提供了靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其包含：(a)第一单体，其从N末端到C末端包含：(i)第一IL-12蛋白质结构域；(ii)第一结构域接头；(iii)第二IL-12蛋白质结构域；(iv)第一变体Fc结构域；(b)包含重链的第二单体，所述重链包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；和(c)包含轻链的第三单体，所述轻链包含VL-CL；其中VH和VL结构域形成结合靶抗原的抗原结合结构域；其中第一IL-12蛋白质结构域包含IL-12p35亚基并且第二IL-12蛋白质结构域包含IL-12p40亚基，或者第一IL-12蛋白质结构域包含IL-12p40亚基并且第二IL-12蛋白质结构域包含IL-12p35亚基，其中第一和第二变体Fc结构域包含促进第一和第二变体Fc结构域异源二聚化的修饰。
在一些实施方式中，抗原结合结构域结合选自由人PD-1和人PD-L1组成的组的靶抗原。在一些实施方式中，抗原结合结构域结合人PD-1。在一些实施方式中，抗原结合结构域结合人PD-1并且不与纳武单抗和/或派姆单抗竞争人PD-1。在一些实施方式中，抗原结合结构域结合人PD-L1。
在一些实施方式中，结合人PD-1的抗原结合结构域包含选自由以下组成的组的VH结构域和VL结构域：(a)1C11[PD-1]_H0L0(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(b)1C11[PD-1]_H3L3(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(c)1C11[PD-1]_H3.240_L3.148(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(d)1C11[PD-1]_H3.241_L3.148(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(e)1C11[PD-1]_H3.234_L3.144(SEQID NOS:XXX和XXX)、(f)1C11[PD-1]_H3.241_L3.92(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(g)1C11[PD-1]_H3.303_L3.152(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(h)1C11[PD-1]_H3.329_L3.220(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(i)1C11[PD-1]_H3.329_L3.220(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(j)1C11[PD-1]_H3.328_L3.152(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(k)派姆单抗[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(l)尼沃利珠单抗(nivolizumab)[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(m)皮地利珠单抗[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(n)MK-3475[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(o)BAP049克隆E[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(p)BAP049克隆B[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(q)H7709N[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(r)H7798N[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(s)h1H3 Var 6[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(t)APE2058[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(u)H005-1[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(v)317-4B6[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(w)326-4A3[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(x)hPD-1mAb 7[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(y)克隆38[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(z)克隆39[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(aa)克隆41[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ab)克隆48[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ac)PD1-17[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ad)PD1-28[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ae)PD1-33[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(af)PD1-35[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ag)LOPD180[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ah)Ab948[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ai)人源化EH-12.2H7[PD-1](SEQ ID NOS:XXX)、(aj)RG1H10[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ak)RG1H10-H2A-22-1S[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(al))RG1H10-H2A-27-2S[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(am)RG1H10-3C[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(an)RG1H10-16C[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ao)RG1H10-17C[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ap)RG1H10-19C[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(aq)RG1H10-21C[PD-1](SEQ IDNOS:XXX和XXX)、(ar)RG1H10-23C2[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)和(as)mAB7[PD-1](SEQID NOS:XXX和XXX)。
在一些实施方式中，结合人PD-1并且不与纳武单抗和/或派姆单抗竞争人PD-1的抗原结合结构域包含选自由以下组成的组的VH结构域和VL结构域：(i)mAb A[PD-1]_H1L1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ii)mAb B[PD-1]_H1L1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(iii)mAb C[PD-1]_H1L1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)和(iv)mAb C[PD-1]_H1.19L1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)。在一些实施方式中，结合人PD-1并且不与纳武单抗和/或派姆单抗竞争人PD-1的scFv结构域包含：选自由以下组成的组的可变重链：(a)mAb C[PD-1]_H1(SEQ ID NO:XXX)、(b)mAb C[PD-1]_H1.19(SEQ ID NO:XXX)、(c)mAb C[PD-1]_H1.48(SEQ ID NO:XXX)、(d)mAb C[PD-1]_H1.125(SEQ ID NO:XXX)、(e)mAb C[PD-1]_H1.130(SEQ ID NO:XXX)、(f)mAb C[PD-1]_H1.132(SEQ ID NO:XXX)、(g)mAb C[PD-1]_H1.169(SEQ ID NO:XXX)、(h)mAb C[PD-1]_H1.175(SEQ ID NO:XXX)和(i)mAb C[PD-1]_H2(SEQ ID NO:XXX)；和选自由以下组成的组的可变轻链：(a)mAb C[PD-1]_L1(SEQ ID NO:XXX)、(b)mAb C[PD-1]_L1.1(SEQ IDNO:XXX)、(c)mAb C[PD-1]_L1.3(SEQ ID NO:XXX)、(d)mAb C[PD-1]_L1.45(SEQ ID NO:XXX)、(e)mAb C[PD-1]_L1.117(SEQ ID NO:XXX)、(f)mAb C[PD-1]_L1.129(SEQ ID NO:XXX)、(g)mAb C[PD-1]_L1.135(SEQ ID NO:XXX)、(h)mAb C[PD-1]_L1.136(SEQ ID NO:XXX)、(i)mAb C[PD-1]_L1.140(SEQ ID NO:XXX)和(j)mAb C[PD-1]_L2(SEQ ID NO:XXX)。
在某些实施方式中，结合人PD-1并且不与纳武单抗和/或派姆单抗竞争人PD-1的抗原结合结构域包含：选自由以下组成的组的VH结构域：(a)mAb C[PD-1]_H1(SEQ ID NO:XXX)、(b)mAb C[PD-1]_H1.19(SEQ ID NO:XXX)、(c)mAb C[PD-1]_H1.48(SEQ ID NO:XXX)、(d)mAb C[PD-1]_H1.125(SEQ ID NO:XXX)、(e)mAb C[PD-1]_H1.130(SEQ ID NO:XXX)、(f)mAb C[PD-1]_H1.132(SEQ ID NO:XXX)、(g)mAb C[PD-1]_H1.169(SEQ ID NO:XXX)、(h)mAbC[PD-1]_H1.175(SEQ ID NO:XXX)和(i)mAb C[PD-1]_H2(SEQ ID NO:XXX)；和选自由以下组成的组的VL结构域：(a)mAb C[PD-1]_L1(SEQ ID NO:XXX)、(b)mAb C[PD-1]_L1.1(SEQID NO:XXX)、(c)mAb C[PD-1]_L1.3(SEQ ID NO:XXX)、(d)mAb C[PD-1]_L1.45(SEQ ID NO:XXX)、(e)mAb C[PD-1]_L1.117(SEQ ID NO:XXX)、(f)mAb C[PD-1]_L1.129(SEQ ID NO:XXX)、(g)mAb C[PD-1]_L1.135(SEQ ID NO:XXX)、(h)mAb C[PD-1]_L1.136(SEQ ID NO:XXX)、(i)mAb C[PD-1]_L1.140(SEQ ID NO:XXX)和(j)mAb C[PD-1]_L2(SEQ ID NO:XXX)。
在一些实施方式中，结合人PD-L1的抗原结合结构域包含选自由以下组成的组的VH结构域和VL结构域：(a)杜瓦鲁单抗(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(b)阿特珠单抗(SEQ IDNOS:XXX和XXX)、(c)A09-246-2(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(d)12A4(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(e)3G10(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(f)10A5(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(f)h3D10 Var 1(SEQID NOS:XXX和XXX)、(g)h3D10 Var 2(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(h)h3D10 Var 3(SEQ IDNOS:XXX和XXX)、(i)h3D10 Var 4(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(j)h3D10 Var 5(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(k)h3D10 Var 6(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(l)h3D10 Var 7(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(m)h3D10 Var 8(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(n)h3D10 Var 9(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(o)h3D10 Var 10(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(p)h3D10 Var 11(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(q)h3D10 Var 12(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(r)h3D10 Var 13(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(s)h3D10 Var14(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(t)Antibody A(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(u)C5H9v2(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(v)人源化29E.2A3(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(w)1B9(SEQ IDNOS:XXX和XXX)、(x)4H1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(y)mAb-42(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(z)BAP058-03(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(aa)BAP058-04(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ab)BAP058-06(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ac)BAP058-07(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ad)BAP058-11(SEQID NOS:XXX和XXX)、(ae)BAP058-13(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(af)H6(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ag)RC5(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ah)SH1A1Q(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ai)SH1B3(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(aj)SH1D1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ak)SH1D2(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(al)SH1D12(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(am)SH1E1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(an)SH1G9(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ao)SH1E6(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ap)SH1A2(SEQ IDNOS:XXX和XXX)、(aq)SH1B1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ar)H6B1L(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(as)H6A1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(at)H6B1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(au)H6B2(SEQ IDNOS:XXX和XXX)、(av)G12(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(aw)RSA1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ax)RA3(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ay)SH1E2(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(az)SH1E4(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ba)SH1B1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(bb)SH1C8(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(bc)H1H9364P2(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(bd)H1H9373P2(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(be)H1H8314N(SEQ ID NOS:XXX和XXX)和(bf)PDL1.3(SEQ ID NOS:XXX和XXX)。
在一些实施方式中，促进第一和第二Fc结构域的异源二聚化的修饰是选自由以下组成的组的一组氨基酸取代：根据EU编号，L368D/K370S和S364K；L368D/K370S和S364K/E357L；L368D/K370S和S364K/E357Q；T411E/K360E/Q362E和D401K；L368E/K370S和S364K；K370S和S364K/E357Q；T366S/L368A/Y407V和T366W；以及T366S/L368A/Y407V/Y349C和T366W/S354C。
在一些实施方式中，根据EU编号，第一和/或第二变体Fc结构域具有另外一组包含Q295E/N384D/Q418E/N421D的氨基酸取代。在一些实施方式中，根据EU编号，第一变体Fc结构域或第二变体Fc结构域具有另外一组包含Q295E/N384D/Q418E/N421D的氨基酸取代。在一些实施方式中，根据EU编号，第一和第二变体Fc结构域各自具有另外一组包含Q295E/N384D/Q418E/N421D的氨基酸取代。
在一些实施方式中，第一和/或第二变体Fc结构域具有另外一组由以下组成的氨基酸取代：根据EU编号，G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del和E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方式中，第一变体Fc结构域或第二变体Fc结构域具有另外一组由以下组成的氨基酸取代：根据EU编号，G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del、和E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方式中，第一和第二变体Fc结构域具有另外一组由以下组成的氨基酸取代：根据EU编号，G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del和E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。
在一些实施方式中，根据EU编号，第一和第二变体Fc结构域各自包含氨基酸取代M428L/N434S。
在一些实施方式中，IL-12p40亚基具有由选自由以下组成的组的多肽序列：SEQID NO:3(人IL-12亚基β(IL-12p40)前体序列)和SEQ ID NO:4(人IL-12亚基β(IL-12p40)成熟形式序列)，并且IL-12p35亚基具有由选自由以下组成的组的多肽序列：SEQ ID NO:1(人IL-12亚基α(IL-12p35)前体序列)和SEQ ID NO:2(人IL-12亚基α(IL-12p35)成熟形式序列)。在一些实施方式中，IL-12p40亚基是变体IL-12p40亚基和/或IL-12p35亚基是变体IL-12p35亚基。
在一些实施方式中，IL-12p40亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p40亚基；和/或IL-12p35亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p35亚基。
在一些实施方式中，IL-12p40亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p40亚基。在一些实施方式中，IL-12p35亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p35亚基。
在一些实施方式中，IL-12p40亚基在选自由以下组成的组的氨基酸残基上具有一个或多个氨基酸取代：E59、K99、D18、K264、C252、N200、E3、D7、E12、D14、W15、P17、A19、P20、G21、E22、M23、D29、E32、E33、D34、L40、D41、Q42、S43、E45、L47、T54、I55、Q56、K58、F60、G61、D62、Q65、Y66、E73、K84、E86、D87、G88、I89、W90、D93、D97、E100、K102、N103、K104、F106、E110、N113、Y114、D129、D142、Q144、E156、R159、D161、N162、K163、D166、D170、Q172、D174、A176、C177、P178、A179、A180、E181、S183、P185、E187、S204、F206、R208、D209、D214、N218、Q220、N226、Q229、E231、E235、T242、P243、S245、Y246、F247、S248、Q256、K258、K260、E262、D265、D270、N281、Q289、D290、R291、Y292、Y293和E299。
在某些实施方式中，IL-12p40亚基具有一个或多个选自由以下组成的组的氨基酸取代：E59K、K99E、K99Y、D18K、K264E、C252S、N200Q、D18N、E32Q、E33Q、D34K、D34N、Q42E、S43E、S43K、E45Q、Q56E、E59Q、D62N、E73Q、D87N、E100Q、N103D、N103Q、N113D、N113Q、Q144E、R159E、D161N、K163E、E187Q、N200D、N218Q、Q229E、E235Q、Q256N、K258E、K260E、E262Q、N281D、N281Q和E299Q。
在一些实施方式中，IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的氨基酸取代：E59K/K99E、E59K/K99Y、D18K/E59K/K99E、E59K/K99E/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、E59K/K99E/C252S、E59K/K99Y/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S、E59K/K99E/C252S/K264E、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q、E59K/K99Y/N200Q、D18K/E59K/K99E/N200Q、E59K/K99E/N200Q/K264E、D18K/E59K/K99E/N200Q/K264E、E59K/K99E/N200Q/C252S、E59K/K99Y/N200Q/C252S、D18K/E59K/K99E/N200Q/C252S、E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、D18K/E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、D18K/E59K/K99E/C252S、E32K/D34N/E59K/K99E、E32Q/D34N/E59K/K99E、D34K/E59K/K99E、D34N/E59K、D34N/E59K/K99E、Q42E/E45Q、Q42E/E59Q、Q42E/Q56E/E59Q、E32Q/E59Q、D34N/E59Q、S43E/E59Q、S43K/E49Q、E45K/E59K/K99E、E45Q/Q56E、E45Q/Q56E/E59Q、E59Q/E187Q、E59Q/K163E、E59Q/K99E、E59Q/K258E、E59Q/K260E、E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E、E59K/K99E/Q144E、E59K/K99E/Q144K、E59K/K99E/R159E、E59K/K99Y、E59Y/K99E、E59Y/K99Y、E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、N103D/N113D、N103D/N113D/N200D、N103D/N113D/N281D、N103D/N200D、N103D/N200D/N281D、N103D/N281D、N103D/N113D/N200D/N281D、N103Q/N113Q、N103Q/N113Q/N200Q、N103Q/N113Q/N281Q、N103Q/N200Q、N103Q/N200Q/N281Q、N103Q/N281Q、N113D/N200D、N113D/N200D/N281D、N113D/N281D、N113Q/N200Q、N113Q/N281Q、N113Q/N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q/N281Q、N200D/N281D和N200Q/N281Q。
在一些实施方式中，IL-12p40亚基或变体IL-12p40亚基包含选自由以下组成的组的氨基酸取代：E59K/K99E、E59K/K99Y、D18K/E59K/K99E、E59K/K99E/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、E59K/K99E/C252S、E59K/K99Y/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S、E59K/K99E/C252S/K264E、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q、E59K/K99Y/N200Q、D18K/E59K/K99E/N200Q、E59K/K99E/N200Q/K264E、D18K/E59K/K99E/N200Q/K264E、E59K/K99E/N200Q/C252S、E59K/K99Y/N200Q/C252S、D18K/E59K/K99E/N200Q/C252S、E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E和D18K/E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E。
在某些实施方式中，IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的多肽序列：i)SEQID NO:57(IL-12p40(N103D))、ii)SEQ ID NO:58(IL-12p40(N113D))、iii)SEQ ID NO:59(IL-12p40(N200D))、iv)SEQ ID NO:60(IL-12p40(N281D))、v)SEQ ID NO:61(IL-12p40(N103D/N113D/N200D/N281D))、vi)SEQ ID NO:62(IL-12p40(Q42E))、vii)SEQ ID NO:63(IL-12p40(E45Q))、viii)SEQ ID NO:64(IL-12p40(Q56E))、ix)SEQ ID NO:65(IL-12p40(E59Q))、x)SEQ ID NO:66(IL-12p40(D62N))、xi)SEQ ID NO:67(IL-12p40(Q42E/E45Q))、xii)SEQ ID NO:68(IL-12p40(E45Q/Q56E))、xiii)SEQ ID NO:69(IL-12p40(Q42E/E59Q))、xiv)SEQ ID NO:70(IL-12p40(Q56E/E59Q))、xv)SEQ ID NO:71(IL-12p40(Q42E/E45Q/Q56E))、xvi)SEQ ID NO:72(IL-12p40(E45Q/Q56E/E59Q))、xvii)SEQ ID NO:73(IL-12p40(D161N))、xviii)SEQ ID NO:74(IL-12p40(E73Q))、xix)SEQ ID NO:75(IL-12p40(Q144E))、xx)SEQ ID NO:76(IL-12p40(E262Q))、xxi)SEQ ID NO:77(IL-12p40(E100Q))、xxii)SEQ ID NO:78(IL-12p40(D18N))、xxiii)SEQ ID NO:79(IL-12p40(E33Q))、xxiv)SEQID NO:80(IL-12p40(Q229E))、xxv)SEQ ID NO:81(IL-12p40(E235Q))、xxvi)SEQ ID NO:82(IL-12p40(Q256N))、xxvii)SEQ ID NO:83(IL-12p40(E299Q))、xxviii)SEQ ID NO:84(IL-12p40(D87N))、xxix)IL-12p40(E32Q)、xxx)IL-12p40(D34N)、xxxi)IL-12p40(S43E)、xxxii)IL-12p40(S43K)、xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))、xxxiv)SEQ ID NO:205(IL-12p40(E59K))、xxxv)IL-12p40(K99E)、xxxvi)IL-12p40(K163E)、xxxvii)IL-12p40(E187Q)、xxxviii)IL-12p40(K258E)、xxxix)IL-12p40(K260E)、xl)SEQ ID NO:206(IL-12p40(E32Q/E59Q))、xli)SEQ ID NO:207(IL-12p40(D34N/E59Q))、xlii)SEQ ID NO:208(IL-12p40(E59Q/E187Q))、xliii)SEQ IDNO:209(IL-12p40(S43E/E59Q))、xliv)SEQ ID NO:210(IL-12p40(S43K/E49Q))、xlv)SEQID NO:211(IL-12p40(E59Q/K163E))、xlvi)SEQ ID NO:212(IL-12p40(E59Q/K99E))、xlvii)SEQ ID NO:213(IL-12p40(E59Q/K258E))、xlviii)SEQ ID NO:214(IL-12p40(E59Q/K260E))、xlix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K))l)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E))、li)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E))、lii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))、liii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y))、liv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99E))、lv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E45K/E59K/K99E))、lvi)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144E))、lvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144K))、lviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/R159E))、lix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))、lx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/K264E))、lxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(C252S))、lxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(DI8K/E59K/K99E/C252S))、lxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/C252S/K264E))、lxiv)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y/C252S))、lxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S/K264E))、lxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S))、lxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D))、lxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D))、lxix)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N103D/N281D))、lxx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D))、lxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N281D))、lxxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200D/N281D))、lxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p50(N103D/N113D/N200D))、lxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D/N281D))、lxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D/N281D))、lxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D/N281D))、lxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q))、lxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q))、lxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q))、lxxx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N281Q))、lxxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q))、lxxxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q))、lxxxiii)SEQID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N281Q))、lxxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q))、lxxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N281Q))、lxxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q/N281Q))、lxxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q))、lxxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N281Q))、lxxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q/N281Q))、xc)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q/N281Q))、xci)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q/N281Q))、xcii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K/K99E))、xciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34K/E59K/K99E))、xciv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32Q/D34N/E59K/K99E))、xcv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32K/D34N/E59K/K99E))、xcvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99Y))、xcvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E))、xcviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E))、xcix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E))、c)SEQID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E))、ci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E))、cii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E))、ciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E))、civ)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E))、cv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E))、cvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E))、cvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E))、cviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))、和cix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))。
在一些实施方式中，IL-12p35亚基具有一个或多个氨基酸取代，作为选自由以下组成的组的氨基酸残基：Q20、N21、Q35、E38、S44、E45、E46、H49、K54、D55、T59、V60、E61、C63、L64、P65、E67、L68、N71、S73、C74、L75、N76、E79、N85、L89、F96、M97、L124、M125、Q130、Q135、N136、E143、Q146、N151、E153、K158、E162、E163、D165、I171、R181、I182、R183、V185、T186、D188、R189、V190、S192、Y193、N195和A196。在某些实施方式中，IL-12p35亚基具有一个或多个选自由以下组成的组的氨基酸取代：N21D、Q35D、E38Q、D55Q、D55K、N71D、N71Q、L75A、N76D、E79Q、N85D、N85Q、L89A、F96A、M97A、L124A、M125A、Q130E、Q135E、N136D、E143Q、Q146E、N151D、N151K、E153K、E153Q、K158E、E162Q、E163Q、D165N、I171A、N195D和N195Q。在一些实施方式中，IL-12p35亚基具有一个或多个选自由以下组成的组的氨基酸取代：N21D/N151D、D55Q/N151D、N71D/N85D、N71D/N85D/N195D、N71D/N195D、N71Q/N85Q、N71Q/N85Q/N195Q、N71Q/N195Q、E79Q/N151D、N85D/N195D、N85Q/N195Q、Q130E/N151D、N136D/N151D、E143Q/N151D、N151D/E153Q、N151D/D165N和N151D/K158E。
在一些实施方式中，IL-12p35亚基具有一个或多个选自由以下组成的组的氨基酸取代：i)SEQ ID NO:113(IL-12p35(N71D))、ii)SEQ ID NO:114(IL-12p35(N85D))、iii)SEQID NO:115(IL-12p35(N195D))、iv)SEQ ID NO:116(IL-12p35(N71D/N85D/N195D))、v)SEQID NO:117(IL-12p35(E153Q))、vi)SEQ ID NO:118(IL-12p35(E38Q))、vii)SEQ ID NO:119(IL-12p35(N151D))、viii)SEQ ID NO:120(IL-12p35(Q135E))、ix)SEQ ID NO:121(IL-12p35(Q35D))、x)SEQ ID NO:122(IL-12p35(Q146E))、xi)SEQ ID NO:123(IL-12p35(N76D))、xii)SEQ ID NO:124(IL-12p35(E162Q))、xiii)SEQ ID NO:125(IL-12p35(E163Q))、xiv)IL-12p35(N21D)、xv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))、xvi)IL-12p35(E79Q)、xvii)IL-12p35(Q130E)、xviii)IL-12p35(N136D)、xix)IL-12p35(E143Q)、xx)SEQID NO:227(IL-12p35(N151K))、xxi)SEQ ID NO:226(IL-12p35(E153K))、xxii)IL-12p35(K158E)、xxiii)IL-12p35(D165N)、xxiv)SEQ ID NO:225(IL-12p35(N151D/E153Q))、xxv)SEQ ID NO:228(IL-12p35(N151D/D165N))、xxvi)SEQ ID NO:229(IL-12p35(Q130E/N151D))、xxvii)SEQ ID NO:230(IL-12p35(N151D/K158E))、xxviii)SEQ ID NO:231(IL-12p35(E79Q/N151D))、xxix)SEQ ID NO:232(IL-12p35(D55Q/N151D))、xxx)SEQ ID NO:233(IL-12p35(N136D/N151D))、xxxi)SEQ ID NO:234(IL-12p35(N21D/N151D))、xxxii)SEQ IDNO:235(IL-12p35(E143Q/N151D))、xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(F96A))、xxxiv)SEQID NO:XXX(IL-12p35(M97A))、xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L89A))、xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L124A))、xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M125A))、xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L75A))、xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(I171A))、xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q))、xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q))、xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N195Q))、xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q))、xxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N195Q))、xl)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q/N195Q)、xli)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q/N195Q))、xlii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71D/N85D))、xliii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71D/N195D)、xliv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85D/N195D))、xlv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))和xlvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55K))。
在一些实施方式中，本文所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白选自由以下组成的组：XENP28792、XENP28793、XENP28794、XENP28796、XENP31073、XENP31074、XENP31106、XENP31136、XENP31137、XENP31140、XENP31460、XENP31461、XENP31462、XENP31585、XENP31586、XENP32192、XENP32193、XENP32194、XENP32195、XENP31108、XENP31463、XENP31464、XENP31465、XENP33686、XENP33687、XENP33693、XENP33694、XENP33695、XENP33696、XENP33697、XENP33685、XENP33688、XENP33689、XENP33690、XENP33691、XENP33692和任何在图80A-80H、81A-81B、82A-82H、98A-B、99A-B、100A-100D、101A-101D、102A-102D、103A-103D、104A-104D、105A-105D、106、107A-107B、108A-108D、109A-109D、110A-110D、111A-111D、112A-112D、113A-113D、114A-114B、115A-115D、116A-116D、117A-117D、118A-118D、119A-119D、120A-120D和121A-121D中所述描绘的。
如图79C所描绘，本文提供了具有靶向mAb x Fc-scIL-12形式的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白。
在一个方面，本发明提供了靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其包含：(a)第一单体，其从N末端到C末端包含：包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3的重链，其中CH2-CH3是第一变体Fc结构域；(b)第二单体，从N末端到C末端包含：VH-CH1-铰链-CH2-CH3-结构域接头-第一IL-12蛋白质结构域-结构域接头-第二IL-12蛋白质结构域，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；(c)第三单体，从N末端到C末端包含：轻链包含VL-CL；其中VH和VL结构域形成结合靶抗原的抗原结合结构域；其中第一IL-12蛋白质结构域包含IL-12p35亚基并且第二IL-12蛋白质结构域包含IL-12p40亚基，或者第一IL-12蛋白质结构域包含IL-12p40亚基并且第二IL-12蛋白质结构域包含IL-12p35亚基，其中第一和第二变体Fc结构域包含促进第一和第二变体Fc结构域异源二聚化的修饰。
如图79D所描绘，本文提供了具有靶向中心x IL-12-Fc形式的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白。
在另一个方面，本发明提供靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其包含：(a)第一单体，从N末端到C末端包含：VH-CH1-第一结构域接头-IL-12p35亚基-任选结构域接头-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变体Fc结构域；(b)第二单体，其从N末端到C末端包含：VH-CH1-第一结构域接头-IL-12p40亚基-任选结构域接头-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；和(c)第三单体，其从N末端到C末端包含：包含VL-CL的轻链，其中VH和VL结构域形成结合靶抗原的抗原结合结构域，并且其中第一和第二变体Fc结构域包括促进第一和第二变体Fc结构域异二聚化的修饰。
如图79E所描绘的，本文提供了具有靶向中心x scIL-12-Fc形式的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白。
在另一方面，本发明提供靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其包含：(a)第一单体，其从N末端到C末端包含：VH-CH1-结构域接头-第一IL-12蛋白质结构域-结构域接头-第二个IL-12蛋白质结构域-结构域接头-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，其从N末端到C末端包含：包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3的重链，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；(c)第三单体，其从N末端到C末端包含：轻链包含VL-CL；其中VH和VL结构域形成结合靶抗原的抗原结合结构域；其中第一IL-12蛋白质结构域包含IL-12p35亚基并且第二IL-12蛋白质结构域包含IL-12p40亚基，或者第一IL-12蛋白质结构域包含IL-12p40亚基并且第二IL-12蛋白质结构域包含IL-12p35亚基，并且其中第一和第二变体Fc结构域包含促进第一和第二变体Fc结构域异源二聚化的修饰。
在任何一种靶向IL-12-Fc融合形式的一些实施方式中，抗原结合结构域结合选自由人PD-1和人PD-L1组成的组的靶抗原。在一些实施方式中，抗原结合结构域结合人PD-1。在一些实施方式中，抗原结合结构域结合人PD-1并且不与纳武单抗和/或派姆单抗竞争人PD-1。在一些实施方式中，抗原结合结构域结合人PD-L1。
在任何一种靶向IL-12-Fc融合形式的一些实施方式中，结合人PD-1的抗原结合结构域包含选自由以下组成的组的VH结构域和VL结构域：(a)1C11[PD-1]_H0L0(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(b)1C11[PD-1]_H3L3(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(c)1C11[PD-1]_H3.240_L3.148(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(d)1C11[PD-1]_H3.241_L3.148(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(e)1C11[PD-1]_H3.234_L3.144(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(f)1C11[PD-1]_H3.241_L3.92(SEQID NOS:XXX和XXX)、(g)1C11[PD-1]_H3.303_L3.152(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(h)1C11[PD-1]_H3.329_L3.220(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(i)1C11[PD-1]_H3.329_L3.220(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(j)1C11[PD-1]_H3.328_L3.152(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(k)派姆单抗[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(l)尼沃利珠单抗(nivolizumab)[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(m)皮地利珠单抗[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(n)MK-3475[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(o)BAP049克隆E[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(p)BAP049克隆B[PD-1](SEQID NOS:XXX和XXX)、(q)H7709N[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(r)H7798N[PD-1](SEQ IDNOS:XXX和XXX)、(s)h1H3 Var 6[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(t)APE2058[PD-1](SEQID NOS:XXX和XXX)、(u)H005-1[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(v)317-4B6[PD-1](SEQ IDNOS:XXX和XXX)、(w)326-4A3[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(x)hPD-1mAb 7[PD-1](SEQID NOS:XXX和XXX)、(y)克隆38[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(z)克隆39[PD-1](SEQ IDNOS:XXX和XXX)、(aa)克隆41[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ab)克隆48[PD-1](SEQ IDNOS:XXX和XXX)、(ac)PD1-17[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ad)PD1-28[PD-1](SEQ IDNOS:XXX和XXX)、(ae)PD1-33[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(af)PD1-35[PD-1](SEQ IDNOS:XXX和XXX)、(ag)LOPD180[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ah)Ab948[PD-1](SEQ IDNOS:XXX和XXX)、(ai)人源化EH-12.2H7[PD-1](SEQ ID NOS:XXX)、(aj)RG1H10[PD-1](SEQID NOS:XXX和XXX)、(ak)RG1H10-H2A-22-1S[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(al))RG1H10-H2A-27-2S[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(am)RG1H10-3C[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(an)RG1H10-16C[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ao)RG1H10-17C[PD-1](SEQ IDNOS:XXX和XXX)、(ap)RG1H10-19C[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(aq)RG1H10-21C[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ar)RG1H10-23C2[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)和(as)mAB7[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)。
在任何一种靶向IL-12-Fc融合形式的一些实施方式中，结合人PD-1并且不与纳武单抗和/或派姆单抗竞争人PD-1的抗原结合结构域包含选自由以下组成的组的VH结构域和VL结构域：(i)mAb A[PD-1]_H1L1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ii)mAb B[PD-1]_H1L1(SEQ IDNOS:XXX和XXX)、(iii)mAb C[PD-1]_H1L1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)和(iv)mAb C[PD-1]_H1.19L1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)。在一些实施方式中，结合人PD-1并且不与纳武单抗和/或派姆单抗竞争人PD-1的scFv结构域包含：选自由以下组成的组的可变重链：(a)mAb C[PD-1]_H1(SEQ ID NO:XXX)、(b)mAb C[PD-1]_H1.19(SEQ ID NO:XXX)、(c)mAb C[PD-1]_H1.48(SEQ ID NO:XXX)、(d)mAb C[PD-1]_H1.125(SEQ ID NO:XXX)、(e)mAb C[PD-1]_H1.130(SEQ ID NO:XXX)、(f)mAb C[PD-1]_H1.132(SEQ ID NO:XXX)、(g)mAb C[PD-1]_H1.169(SEQ ID NO:XXX)、(h)mAb C[PD-1]_H1.175(SEQ ID NO:XXX)和(i)mAb C[PD-1]_H2(SEQID NO:XXX)；和选自由以下组成的组的可变轻链：(a)mAb C[PD-1]_L1(SEQ ID NO:XXX)、(b)mAb C[PD-1]_L1.1(SEQ ID NO:XXX)、(c)mAb C[PD-1]_L1.3(SEQ ID NO:XXX)、(d)mAbC[PD-1]_L1.45(SEQ ID NO:XXX)、(e)mAb C[PD-1]_L1.117(SEQ ID NO:XXX)、(f)mAb C[PD-1]_L1.129(SEQ ID NO:XXX)、(g)mAb C[PD-1]_L1.135(SEQ ID NO:XXX)、(h)mAb C[PD-1]_L1.136(SEQ ID NO:XXX)、(i)mAb C[PD-1]_L1.140(SEQ ID NO:XXX)和(j)mAb C[PD-1]_L2(SEQ ID NO:XXX)。
在任何一种靶向IL-12-Fc融合形式的某些实施方式中，结合人PD-1并且不与纳武单抗和/或派姆单抗竞争人PD-1的抗原结合结构域包含：选自由以下组成的组的VH结构域：(a)mAb C[PD-1]_H1(SEQ ID NO:XXX)、(b)mAb C[PD-1]_H1.19(SEQ ID NO:XXX)、(c)mAb C[PD-1]_H1.48(SEQ ID NO:XXX)、(d)mAb C[PD-1]_H1.125(SEQ ID NO:XXX)、(e)mAb C[PD-1]_H1.130(SEQ ID NO:XXX)、(f)mAb C[PD-1]_H1.132(SEQ ID NO:XXX)、(g)mAb C[PD-1]_H1.169(SEQ ID NO:XXX)、(h)mAb C[PD-1]_H1.175(SEQ ID NO:XXX)和(i)mAb C[PD-1]_H2(SEQ ID NO:XXX)；和选自由以下组成的组的VL结构域：(a)mAb C[PD-1]_L1(SEQ ID NO:XXX)、(b)mAb C[PD-1]_L1.1(SEQ ID NO:XXX)、(c)mAb C[PD-1]_L1.3(SEQ ID NO:XXX)、(d)mAb C[PD-1]_L1.45(SEQ ID NO:XXX)、(e)mAb C[PD-1]_L1.117(SEQ ID NO:XXX)、(f)mAb C[PD-1]_L1.129(SEQ ID NO:XXX)、(g)mAb C[PD-1]_L1.135(SEQ ID NO:XXX)、(h)mAbC[PD-1]_L1.136(SEQ ID NO:XXX)、(i)mAb C[PD-1]_L1.140(SEQ ID NO:XXX)和(j)mAb C[PD-1]_L2(SEQ ID NO:XXX)。
在任何一种靶向IL-12-Fc融合形式的一些实施方式中，结合人PD-L1的抗原结合结构域包含选自由以下组成的组的VH结构域和VL结构域：(a)杜瓦鲁单抗(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(b)阿特珠单抗(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(c)A09-246-2(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(d)12A4(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(e)3G10(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(f)10A5(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(f)h3D10 Var 1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(g)h3D10 Var 2(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(h)h3D10 Var 3(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(i)h3D10 Var 4(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(j)h3D10 Var 5(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(k)h3D10 Var 6(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(l)h3D10 Var 7(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(m)h3D10 Var 8(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(n)h3D10Var 9(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(o)h3D10 Var 10(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(p)h3D10 Var11(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(q)h3D10 Var 12(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(r)h3D10 Var 13(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(s)h3D10 Var 14(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(t)Antibody A(SEQID NOS:XXX和XXX)、(u)C5H9v2(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(v)人源化29E.2A3(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(w)1B9(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(x)4H1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(y)mAb-42(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(z)BAP058-03(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(aa)BAP058-04(SEQ IDNOS:XXX和XXX)、(ab)BAP058-06(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ac)BAP058-07(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ad)BAP058-11(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ae)BAP058-13(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(af)H6(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ag)RC5(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ah)SH1A1Q(SEQ IDNOS:XXX和XXX)、(ai)SH1B3(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(aj)SH1D1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ak)SH1D2(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(al)SH1D12(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(am)SH1E1(SEQID NOS:XXX和XXX)、(an)SH1G9(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ao)SH1E6(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ap)SH1A2(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(aq)SH1B1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ar)H6B1L(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(as)H6A1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(at)H6B1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(au)H6B2(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(av)G12(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(aw)RSA1(SEQID NOS:XXX和XXX)、(ax)RA3(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ay)SH1E2(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(az)SH1E4(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ba)SH1B1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(bb)SH1C8(SEQID NOS:XXX和XXX)、(bc)H1H9364P2(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(bd)H1H9373P2(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(be)H1H8314N(SEQ ID NOS:XXX和XXX)和(bf)PDL1.3(SEQ ID NOS:XXX和XXX)。
在任何一种靶向IL-12-Fc融合形式的一些实施方式中，促进第一和第二Fc结构域的异源二聚化的修饰是选自由以下组成的组的一组氨基酸取代：根据EU编号，L368D/K370S和S364K；L368D/K370S和S364K/E357L；L368D/K370S和S364K/E357Q；T411E/K360E/Q362E和D401K；L368E/K370S和S364K；K370S和S364K/E357Q；T366S/L368A/Y407V和T366W；以及T366S/L368A/Y407V/Y349C和T366W/S354C。
在一些实施方式中，根据EU编号，第一和/或第二变体Fc结构域具有另外一组包含Q295E/N384D/Q418E/N421D的氨基酸取代。在一些实施方式中，根据EU编号，第一变体Fc结构域或第二变体Fc结构域具有另外一组包含Q295E/N384D/Q418E/N421D的氨基酸取代。在一些实施方式中，根据EU编号，第一和第二变体Fc结构域各自具有另外一组包含Q295E/N384D/Q418E/N421D的氨基酸取代。
在任何一种靶向IL-12-Fc融合形式的一些实施方式中，第一和/或第二变体Fc结构域具有另外一组由以下组成的氨基酸取代：根据EU编号，G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del和E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方式中，第一变体Fc结构域或第二变体Fc结构域具有另外一组由以下组成的氨基酸取代：根据EU编号，G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del、和E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方式中，第一和第二变体Fc结构域具有另外一组由以下组成的氨基酸取代：根据EU编号，G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del和E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。
在任何一种靶向IL-12-Fc融合形式的一些实施方式中，根据EU编号，第一和第二变体Fc结构域各自包含氨基酸取代M428L/N434S。
在任何一种靶向IL-12-Fc融合形式的一些实施方式中，IL-12p40亚基具有由选自由以下组成的组：SEQ ID NO:3(人IL-12亚基β(IL-12p40)前体序列)和SEQ ID NO:4(人IL-12亚基β(IL-12p40)成熟形式序列)，并且IL-12p35亚基具有由选自由以下组成的组的多肽序列：SEQ ID NO:1(人IL-12亚基α(IL-12p35)前体序列)和SEQ ID NO:2(人IL-12亚基α(IL-12p35)成熟形式序列)。在一些实施方式中，IL-12p40亚基是变体IL-12p40亚基和/或IL-12p35亚基是变体IL-12p35亚基。
在任何一种靶向IL-12-Fc融合形式的一些实施方式中，IL-12p40亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p40亚基；和/或IL-12p35亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p35亚基。
在任何一种靶向IL-12-Fc融合形式的一些实施方式中，IL-12p40亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p40亚基。在一些实施方式中，IL-12p35亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p35亚基。
在任何一种靶向IL-12-Fc融合形式的一些实施方式中，IL-12p40亚基在选自由以下组成的组的氨基酸残基上具有一个或多个氨基酸取代：E59、K99、D18、K264、C252、N200、E3、D7、E12、D14、W15、P17、A19、P20、G21、E22、M23、D29、E32、E33、D34、L40、D41、Q42、S43、E45、L47、T54、I55、Q56、K58、F60、G61、D62、Q65、Y66、E73、K84、E86、D87、G88、I89、W90、D93、D97、E100、K102、N103、K104、F106、E110、N113、Y114、D129、D142、Q144、E156、R159、D161、N162、K163、D166、D170、Q172、D174、A176、C177、P178、A179、A180、E181、S183、P185、E187、S204、F206、R208、D209、D214、N218、Q220、N226、Q229、E231、E235、T242、P243、S245、Y246、F247、S248、Q256、K258、K260、E262、D265、D270、N281、Q289、D290、R291、Y292、Y293和E299。
在任何一种靶向IL-12-Fc融合形式的某些实施方式中，IL-12p40亚基具有一个或多个选自由以下组成的组的氨基酸取代：E59K、K99E、K99Y、D18K、K264E、C252S、N200Q、D18N、E32Q、E33Q、D34K、D34N、Q42E、S43E、S43K、E45Q、Q56E、E59Q、D62N、E73Q、D87N、E100Q、N103D、N103Q、N113D、N113Q、Q144E、R159E、D161N、K163E、E187Q、N200D、N218Q、Q229E、E235Q、Q256N、K258E、K260E、E262Q、N281D、N281Q和E299Q。
在一些实施方式中，IL-12p40亚基或变体IL-12p40亚基包含选自由以下组成的组的氨基酸取代：E59K/K99E、E59K/K99Y、D18K/E59K/K99E、E59K/K99E/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、E59K/K99E/C252S、E59K/K99Y/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S、E59K/K99E/C252S/K264E、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q、E59K/K99Y/N200Q、D18K/E59K/K99E/N200Q、E59K/K99E/N200Q/K264E、D18K/E59K/K99E/N200Q/K264E、E59K/K99E/N200Q/C252S、E59K/K99Y/N200Q/C252S、D18K/E59K/K99E/N200Q/C252S、E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E和D18K/E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E。
在一些实施方式中，IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的氨基酸取代：E59K/K99E、E59K/K99Y、D18K/E59K/K99E、E59K/K99E/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、E59K/K99E/C252S、E59K/K99Y/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S、E59K/K99E/C252S/K264E、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q、E59K/K99Y/N200Q、D18K/E59K/K99E/N200Q、E59K/K99E/N200Q/K264E、D18K/E59K/K99E/N200Q/K264E、E59K/K99E/N200Q/C252S、E59K/K99Y/N200Q/C252S、D18K/E59K/K99E/N200Q/C252S、E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、D18K/E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、D18K/E59K/K99E/C252S、E32K/D34N/E59K/K99E、E32Q/D34N/E59K/K99E、D34K/E59K/K99E、D34N/E59K、D34N/E59K/K99E、Q42E/E45Q、Q42E/E59Q、Q42E/Q56E/E59Q、E32Q/E59Q、D34N/E59Q、S43E/E59Q、S43K/E49Q、E45K/E59K/K99E、E45Q/Q56E、E45Q/Q56E/E59Q、E59Q/E187Q、E59Q/K163E、E59Q/K99E、E59Q/K258E、E59Q/K260E、E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E、E59K/K99E/Q144E、E59K/K99E/Q144K、E59K/K99E/R159E、E59K/K99Y、E59Y/K99E、E59Y/K99Y、E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、N103D/N113D、N103D/N113D/N200D、N103D/N113D/N281D、N103D/N200D、N103D/N200D/N281D、N103D/N281D、N103D/N113D/N200D/N281D、N103Q/N113Q、N103Q/N113Q/N200Q、N103Q/N113Q/N281Q、N103Q/N200Q、N103Q/N200Q/N281Q、N103Q/N281Q、N113D/N200D、N113D/N200D/N281D、N113D/N281D、N113Q/N200Q、N113Q/N281Q、N113Q/N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q/N281Q、N200D/N281D和N200Q/N281Q。
在任何一种靶向IL-12-Fc融合形式的某些实施方式中，IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的多肽序列：i)SEQ ID NO:57(IL-12p40(N103D))、ii)SEQ ID NO:58(IL-12p40(N113D))、iii)SEQ ID NO:59(IL-12p40(N200D))、iv)SEQ ID NO:60(IL-12p40(N281D))、v)SEQ ID NO:61(IL-12p40(N103D/N113D/N200D/N281D))、vi)SEQ ID NO:62(IL-12p40(Q42E))、vii)SEQ ID NO:63(IL-12p40(E45Q))、viii)SEQ ID NO:64(IL-12p40(Q56E))、ix)SEQ ID NO:65(IL-12p40(E59Q))、x)SEQ ID NO:66(IL-12p40(D62N))、xi)SEQID NO:67(IL-12p40(Q42E/E45Q))、xii)SEQ ID NO:68(IL-12p40(E45Q/Q56E))、xiii)SEQID NO:69(IL-12p40(Q42E/E59Q))、xiv)SEQ ID NO:70(IL-12p40(Q56E/E59Q))、xv)SEQ IDNO:71(IL-12p40(Q42E/E45Q/Q56E))、xvi)SEQ ID NO:72(IL-12p40(E45Q/Q56E/E59Q))、xvii)SEQ ID NO:73(IL-12p40(D161N))、xviii)SEQ ID NO:74(IL-12p40(E73Q))、xix)SEQID NO:75(IL-12p40(Q144E))、xx)SEQ ID NO:76(IL-12p40(E262Q))、xxi)SEQ ID NO:77(IL-12p40(E100Q))、xxii)SEQ ID NO:78(IL-12p40(D18N))、xxiii)SEQ ID NO:79(IL-12p40(E33Q))、xxiv)SEQ ID NO:80(IL-12p40(Q229E))、xxv)SEQ ID NO:81(IL-12p40(E235Q))、xxvi)SEQ ID NO:82(IL-12p40(Q256N))、xxvii)SEQ ID NO:83(IL-12p40(E299Q))、xxviii)SEQ ID NO:84(IL-12p40(D87N))、xxix)IL-12p40(E32Q)、xxx)IL-12p40(D34N)、xxxi)IL-12p40(S43E)、xxxii)IL-12p40(S43K)、xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))、xxxiv)SEQ ID NO:205(IL-12p40(E59K))、xxxv)IL-12p40(K99E)、xxxvi)IL-12p40(K163E)、xxxvii)IL-12p40(E187Q)、xxxviii)IL-12p40(K258E)、xxxix)IL-12p40(K260E)、xl)SEQ ID NO:206(IL-12p40(E32Q/E59Q))、xli)SEQ ID NO:207(IL-12p40(D34N/E59Q))、xlii)SEQ ID NO:208(IL-12p40(E59Q/E187Q))、xliii)SEQ ID NO:209(IL-12p40(S43E/E59Q))、xliv)SEQ ID NO:210(IL-12p40(S43K/E49Q))、xlv)SEQ ID NO:211(IL-12p40(E59Q/K163E))、xlvi)SEQ ID NO:212(IL-12p40(E59Q/K99E))、xlvii)SEQ ID NO:213(IL-12p40(E59Q/K258E))、xlviii)SEQ IDNO:214(IL-12p40(E59Q/K260E))、xlix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K))l)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E))、li)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E))、lii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))、liii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y))、liv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99E))、lv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E45K/E59K/K99E))、lvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144E))、lvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144K))、lviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/R159E))、lix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))、lx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/K264E))、lxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(C252S))、lxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(DI8K/E59K/K99E/C252S))、lxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/C252S/K264E))、lxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y/C252S))、lxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S/K264E))、lxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S))、lxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D))、lxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D))、lxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N281D))、lxx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D))、lxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N281D))、lxxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200D/N281D))、lxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p50(N103D/N113D/N200D))、lxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D/N281D))、lxxv)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D/N281D))、lxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D/N281D))、lxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q))、lxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q))、lxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q))、lxxx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N281Q))、lxxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q))、lxxxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q))、lxxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N281Q))、lxxxiv)SEQID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q))、lxxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N281Q))、lxxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q/N281Q))、lxxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q))、lxxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N281Q))、lxxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q/N281Q))、xc)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q/N281Q))、xci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q/N281Q))、xcii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K/K99E))、xciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34K/E59K/K99E))、xciv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32Q/D34N/E59K/K99E))、xcv)SEQID NO:XXX(IL-12p40(E32K/D34N/E59K/K99E))、xcvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99Y))、xcvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E))、xcviii)SEQID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E))、xcix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E))、c)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E))、ci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E))、cii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E))、ciii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E))、civ)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E))、cv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E))、cvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E))、cvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E))、cviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))、和cix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))。
在任何一种靶向IL-12-Fc融合形式的一些实施方式中，IL-12p35亚基具有一个或多个氨基酸取代，作为选自由以下组成的组的氨基酸残基：Q20、N21、Q35、E38、S44、E45、E46、H49、K54、D55、T59、V60、E61、C63、L64、P65、E67、L68、N71、S73、C74、L75、N76、E79、N85、L89、F96、M97、L124、M125、Q130、Q135、N136、E143、Q146、N151、E153、K158、E162、E163、D165、I171、R181、I182、R183、V185、T186、D188、R189、V190、S192、Y193、N195和A196。在某些实施方式中，IL-12p35亚基具有一个或多个选自由以下组成的组的氨基酸取代：N21D、Q35D、E38Q、D55Q、D55K、N71D、N71Q、L75A、N76D、E79Q、N85D、N85Q、L89A、F96A、M97A、L124A、M125A、Q130E、Q135E、N136D、E143Q、Q146E、N151D、N151K、E153K、E153Q、K158E、E162Q、E163Q、D165N、I171A、N195D和N195Q。在一些实施方式中，IL-12p35亚基具有一个或多个选自由以下组成的组的氨基酸取代：N21D/N151D、D55Q/N151D、N71D/N85D、N71D/N85D/N195D、N71D/N195D、N71Q/N85Q、N71Q/N85Q/N195Q、N71Q/N195Q、E79Q/N151D、N85D/N195D、N85Q/N195Q、Q130E/N151D、N136D/N151D、E143Q/N151D、N151D/E153Q、N151D/D165N和N151D/K158E。
在任何一种靶向IL-12-Fc融合形式的一些实施方式中，IL-12p35亚基具有一个或多个选自由以下组成的组的氨基酸取代：i)SEQ ID NO:113(IL-12p35(N71D))、ii)SEQ IDNO:114(IL-12p35(N85D))、iii)SEQ ID NO:115(IL-12p35(N195D))、iv)SEQ ID NO:116(IL-12p35(N71D/N85D/N195D))、v)SEQ ID NO:117(IL-12p35(E153Q))、vi)SEQ ID NO:118(IL-12p35(E38Q))、vii)SEQ ID NO:119(IL-12p35(N151D))、viii)SEQ ID NO:120(IL-12p35(Q135E))、ix)SEQ ID NO:121(IL-12p35(Q35D))、x)SEQ ID NO:122(IL-12p35(Q146E))、xi)SEQ ID NO:123(IL-12p35(N76D))、xii)SEQ ID NO:124(IL-12p35(E162Q))、xiii)SEQ ID NO:125(IL-12p35(E163Q))、xiv)IL-12p35(N21D)、xv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))、xvi)IL-12p35(E79Q)、xvii)IL-12p35(Q130E)、xviii)IL-12p35(N136D)、xix)IL-12p35(E143Q)、xx)SEQ ID NO:227(IL-12p35(N151K))、xxi)SEQ ID NO:226(IL-12p35(E153K))、xxii)IL-12p35(K158E)、xxiii)IL-12p35(D165N)、xxiv)SEQ ID NO:225(IL-12p35(N151D/E153Q))、xxv)SEQ ID NO:228(IL-12p35(N151D/D165N))、xxvi)SEQ IDNO:229(IL-12p35(Q130E/N151D))、xxvii)SEQ ID NO:230(IL-12p35(N151D/K158E))、xxviii)SEQ ID NO:231(IL-12p35(E79Q/N151D))、xxix)SEQ ID NO:232(IL-12p35(D55Q/N151D))、xxx)SEQ ID NO:233(IL-12p35(N136D/N151D))、xxxi)SEQ ID NO:234(IL-12p35(N21D/N151D))、xxxii)SEQ ID NO:235(IL-12p35(E143Q/N151D))、xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(F96A))、xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M97A))、xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L89A))、xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L124A))、xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M125A))、xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L75A))、xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(I171A))、xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q))、xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q))、xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N195Q))、xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q))、xxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N195Q))、xl)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q/N195Q)、xli)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q/N195Q))、xlii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p35(N71D/N85D))、xliii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71D/N195D)、xliv)SEQID NO:XXX(IL-12p35(N85D/N195D))、xlv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))和xlvi)SEQID NO:XXX(IL-12p35(D55K))。
在一个方面，提供包含本文所述的任何靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白的组合物，用于治疗受试者的癌症。
在另一个方面，提供了一种或多种编码本文靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白中的任一种的核酸。在一些方面，本文提供了包含任何一种或多种核酸的宿主细胞。
在另一个方面，本文公开了一种制备靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白的方法，使得该方法包括在产生靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白的条件下培养本文提供的任何一种宿主细胞。
在某些方面，本文公开了一种纯化本文所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白的方法。所述方法包括：(a)提供包含本文所述的任何一种靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白的的组合物；(b)将组合物上样到离子交换柱上；以及(c)收集含有靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白的级分。
在另一个方面，本发明提供了一种在有需要的患者中治疗癌症的方法。该方法包括向患者施用治疗有效量的根据本文提供的任何说明性实施方式的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白。在一些实施方式中，该方法进一步包括施用治疗有效量的检查点阻断抗体。在一些实施方式中，检查点阻断抗体选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗TIM3抗体、抗TIGIT抗体、抗LAG3抗体和抗CTLA-4抗体。在一些实施方式中，抗PD-1抗体是纳武单抗、派姆单抗或皮地利珠单抗。在一些实施方式中，抗PD-L1抗体是阿特珠单抗、阿维鲁单抗或杜巴单抗。在一些实施方式中，患者在施用后表现出淋巴细胞的增加。在一些实施方式中，患者在施用后表现出外周CD8+T细胞的增加。
在另一方面中，本发明提供了一种在有需要的患者中诱导T细胞扩增的方法，所述方法包括向患者施用根据本文提供的任何说明性实施方式的治疗有效量的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白。在一些实施方式中，该方法进一步包括施用治疗有效量的检查点阻断抗体。在一些实施方式中，检查点阻断抗体选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗TIM3抗体、抗TIGIT抗体、抗LAG3抗体和抗CTLA-4抗体。在一些实施方式中，抗PD-1抗体是纳武单抗、派姆单抗或皮地利珠单抗。在一些实施方式中，抗PD-L1抗体是阿特珠单抗、阿维鲁单抗或杜巴单抗。在一些实施方式中，T细胞扩增为T细胞增加至少2倍。在一些实施方式中，在施用检查点抑制剂之前施用靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白。在一些实施方式中，在施用检查点抑制剂之后施用靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白。
附图说明
图1A和图1B描绘了IL-12及其受体的序列。
图2A-图2E描绘Fc异源二聚变体组的有用对(包括偏斜和pI变体)。没有对应的“单体2”的变体是可以在任一单体上单独使用的pI变体。
图3描绘了同配变体抗体恒定区和其相应取代的列表。pI_(-)指示较低pI变体，而pI_(+)指示较高pI变体。这些可以任选地且独立地与本发明的其它异源二聚化变体(以及其它变体类型，如本文所概述的)组合。
图4描绘了消融FcγR结合的有用消融变体(有时被称为“敲除”或“KO”变体)。通常，消融变体发现于这两个单体上，但是在一些情况下，所述消融变体可以仅在一个单体上。
图5示出了本发明的“非细胞因子”组分的特别有用的实施方式。
图6描绘了许多示例性结构域接头。在一些实施例中，这些接头可用于将IL-12p35亚基、IL-12p40亚基或单链IL-12复合物与Fc区的N-末端连接。在一些实施例中，这些接头可用于在单链IL-12复合物中将IL-12p35亚基与IL-12p40亚基融合。需要注意的是scIL-12复合物可以包含N末端连接至IL-12p40的IL-12p35或N末端连接至IL-12p35的IL-12p40。同样，在本文所描述的一些情况下，Fc结构域的铰链部分充当结构域接头，所述结构域接头也可以与这些接头中的任何接头组合。
图7描绘许多带电荷的scFv接头，所述带电荷的scFv接头可用于增加或减少利用一个或多个scFv作为组分的异源二聚体抗体的pI。(+H)阳性接头在本文中特别有用。根据Whitlow等人，Protein Engineering 6(8):989-995(1993)，具有单一电荷的单个现有技术scFv接头被称为“Whitlow”。应注意的是，这种接头用于减少scFv中的聚集和增强scFv中的蛋白水解稳定性。
图8A-8D示出了几个有用的基于人IgG1的IL-12-Fc融合物主链的序列，没有细胞因子序列(例如IL-12p35亚基、IL-12p40亚基或scIL-12复合物)。主链1基于人类IgG1(356E/358M同种异型)，并且包括两条链上的C220S、S364K/E357Q:L368D/K370S偏斜变体、具有L368D/K370S偏斜变体的链上的Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体以及两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。主链2基于人IgG1(356E/358M同种异型)，并且包括两条链上的C220S、S364K:L368D/K370S偏斜变体、具有L368D/K370S偏斜变体的链上的Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体以及两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。主链3基于人IgG1(356E/358M同种异型)，并且包括两条链上的C220S、S364K:L368E/K370S偏斜变体、具有L368E/K370S偏斜变体的链上的Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体以及两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。主链4基于人IgG1(356E/358M同种异型)，并且包括两条链上的C220S、D401K:K360E/Q362E/T411E偏斜变体、具有K360E/Q362E/T411E偏斜变体的链上的Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体以及两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。主链5基于人IgG1(356D/358L同种异型)，并且包括两条链上的C220S、S364K/E357Q:L368D/K370S偏斜变体、具有L368D/K370S偏斜变体的链上的Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体以及两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。主链6基于人IgG1(356E/358M同种异型)，并且包括两条链上的C220S、S364K/E357Q:L368D/K370S偏斜变体、具有L368D/K370S偏斜变体的链上的Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体和两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体以及两条链上的N297A变体。除了突变是N297S之外，主链7与主链6相同。主链6和主链7的替代形式可以不含两条链中的消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。主链8基于人IgG4，并且包括S364K/E357Q:L368D/K370S偏斜变体、具有L368D/K370S偏斜变体的链上的Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体以及两条链上的S228P(EU编号，这是Kabat中的S241P)变体，其消融如本领域已知的Fab臂交换。主链9基于人IgG2，并且包括S364K/E357Q:L368D/K370S偏斜变体、具有L368D/K370S偏斜变体的链上的Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体。主链10基于人IgG2，并且包括S364K/E357Q:L368D/K370S偏斜变体、具有L368D/K370S偏斜变体的链上的Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体以及两条链上的S267K变体。除了其包括M428L/N434S Xtend突变之外，主链11与主链1相同。主链12基于人类IgG1(356E/358M同种异型)，并且包括两条相同链上的C220S、两条相同链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。主链13基于人类IgG1(356E/358M同种异型)，并且包括两条链上的C220S、S364K/E357Q:L368D/K370S偏斜变体、具有S364K/E357Q偏斜变体的链上的P217R/P229R/N276K pI变体和两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。
如本领域技术人员将了解并且在下文概述的，这些序列可以与本文概述的任何IL-12-Fc融合形式一起使用，包含但不限于IL-12-异源Fc、异源Fc-IL-12和scIL-12-Fc形式，如图9所示意性地描绘的。应当注意，对于异源Fc-IL-12融合物，主链可以进一步包括K447的缺失。另外，可以将任何IL-12p35和/或IL-12p40变体以任何组合并入图7的这些主链中。
在这些主链的每一条主链内包括与所列举的序列90％、95％、98％和99％相同(如本文所定义)和/或含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个额外的氨基酸取代的序列(与附图的“亲本”相比，如本领域技术人员将理解，与亲本人IgG1(或IgG2或IgG4，这取决于主链)相比，已经含有多个氨基酸修饰)。即，除了此图的主链中所含的偏斜变体、pI变体和消融变体之外，所列举主链可以含有另外的氨基酸修饰(通常是氨基酸取代)。
图9A-9F描绘了本发明的IL-12-Fc融合蛋白的说明性形式。N末端IL-12异源二聚体Fc融合或“IL-12-异源Fc”(图9A)形式包括与异源二聚体Fc的一侧的N末端重组融合的IL-12p40亚基和与异源二聚体Fc的另一侧的N末端重组融合的IL-12p35亚基。IL-12p35和IL-12p40亚基可以通过结构域接头与其相应Fc链连接。C末端IL-12异源二聚体Fc融合或“异源Fc-IL-12”(图9B)形式包括与异源二聚体Fc的一侧的C末端重组融合的IL-12p40亚基和与异源二聚体Fc的另一侧的C末端重组融合的IL-12p35亚基。IL-12p35和IL-12p40亚基可以通过结构域接头与其相应Fc链连接。N末端单链IL-12-Fc融合或“scIL-12-Fc”(图9C-9D)形式包括与异源二聚体Fc的一侧的N末端(任选地通过结构域接头)重组融合的单链IL-12复合物(或“scIL-12复合物”)，其中分子的另一侧是“仅Fc”或“空-Fc”异源二聚体Fc。C末端单链IL-12-Fc融合或“Fc-scIL-12”(图9E-9F)形式包括与异源二聚体Fc的一侧的C末端(任选地通过结构域接头)重组融合的scIL-12复合物，其中分子的另一侧是“仅Fc”或“空-Fc”异源二聚体Fc。scIL-12复合物可包含N末端连接至IL-12p40的IL-12p35或N末端连接至IL-12p35的IL-12p40，任选但通常具有结构域接头。scIL-12复合物中两个亚基的顺序可以指定如下：“scIL-12(p40/p35)”，其中IL-12p40亚基在N末端连接至IL-12p35亚基，或“scIL-12(p35/p40)”，其中IL-12p35在N末端连接至IL-12p40亚基。
图10描绘了XENP27201的序列，即“IL-12-异源Fc”形式的说明性IL-12-Fc融合蛋白，其包含野生型IL-12p40和野生型IL-12p35序列。接头加双下划线(但是如本领域技术人员将了解的，接头可以被其它接头替代，其中的一些在图6中进行了描绘)，并且斜线(/)指示IL-12p35、IL-12p40、接头和Fc区之间的一个或多个边界。
图11描绘了XENP27202的序列，即“异源Fc-IL-12”形式的说明性IL-12-Fc融合蛋白，其包含野生型IL-12p40和野生型IL-12p35序列。接头加双下划线(但是如本领域技术人员将了解的，接头可以被其它接头替代，其中的一些在图6中进行了描绘)，并且斜线(/)指示IL-12p35、IL-12p40、接头和Fc区之间的一个或多个边界。
图12描绘了XENP27203和XENP27204的序列，即“scIL-12-Fc”形式的说明性IL-12-Fc融合蛋白，其包含野生型IL-12p40和野生型IL-12p35序列。接头加双下划线(但是如本领域技术人员将了解的，接头可以被其它接头替代，其中的一些在图6中进行了描绘)，并且斜线(/)指示IL-12p35、IL-12p40、接头和Fc区之间的一个或多个边界。
图13A-13C描绘了A)色谱图，所述色谱图说明了XENP27201的纯化部分2(在蛋白A色谱法之后的阴离子交换色谱法)以及如图13A中所描绘的从阴离子交换分离中分离出的峰B相对于峰A的纯度和同质性，如通过B)利用多角度光散射的分析型尺寸排阻色谱法(aSEC-MALS)和C)分析型阴离子交换色谱法(分析型AIEX)测定的。图13B还描绘了如通过多角度光散射测定的峰中的蛋白质物种的分子量。
图14A-14C描绘了A)色谱图，所述色谱图展示了XENP27203的纯化部分2(在蛋白A色谱法之后的阴离子交换色谱法)以及如图14A中所描绘的从阴离子交换分离中分离出的峰B相对于峰A的纯度和同质性，如通过B)利用多角度光散射的分析型尺寸排阻色谱法(SEC-MALS)和C)分析型阴离子交换色谱法测定的。图14B还描绘了如通过多角度光散射测定的峰中的蛋白质物种的分子量。
图15A和图15B描绘了A)二价IL-12p40-Fc融合物和B)二价IL-12p35-Fc融合物的卡通示意图。每个融合物包括与同源二聚体Fc的N末端重组融合的IL-12p40或IL-12p35亚基。亚基可以在其相应Fc区C末端与N末端之间具有结构域接头。
图16描绘了XENP27560(一种二价IL-12p40-Fc融合物)和XENP27561(一种二价IL-12p35-Fc融合物)的序列(图15A和15B中描绘的卡通示意图)，其包含野生型IL-12p40和野生型IL-12p35序列。接头加双下划线(但是如本领域技术人员将了解的，接头可以被其它接头替代，其中的一些在图6中进行了描绘)，并且斜线(/)指示IL-12p35、IL-12p40、接头和Fc区之间的一个或多个边界。
图17A-图17D描绘了在将活化的PBMC与指示的测试制品一起温育之后，A)CD4+CD45RA-CD25hi T细胞、B)CD8+CD45RA-CD25hi T细胞、C)γδT细胞和D)NK细胞上的STAT4磷酸化。
图18描绘了IL-12p40(基于IL-12p40成熟形式序列)上的预测有助于IL-12p40与IL-12受体的结合的残基。
图19描绘了在MOE中使用QuaSAR数据包鉴定为具有至少19的ASA评分(使用
Figure BDA0003679091520000371
Figure BDA0003679091520000372
的水分子半径和每个原子的多面体表示计算的水可及表面积)的IL-12p40(基于IL-12p40成熟形式序列)上的天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺残基。
图20描绘了IL-12p40(基于IL-12p40成熟形式序列)上的预期与IL-23受体接触的残基(基于保藏在登录号为5MZV的PDB中的晶体结构)以及预测的一种或多种接触类型。“D”指示基于接近度预测的接触。“H”指示基于潜在氢键预测的接触。“I”指示基于潜在盐桥预测的接触。“A”指示基于潜在芳烃结合预测的接触。
图21A-图21G描绘了为降低IL-12异源二聚体复合物对IL-12受体的亲和力和/或去除推定的糖基化位点而设计的说明性IL-12p40变体的序列。经修饰的氨基酸加下划线并以粗体表示。
图22A-图22G描绘了具有Fc融合配偶体的说明性IL-12p40变体的氨基酸序列。结构域接头加双下划线，并且IL-12p40变体用斜体表示。
图23描绘了在MOE中使用QuaSAR数据包鉴定为具有至少103的ASA评分(使用
Figure BDA0003679091520000381
Figure BDA0003679091520000382
的水分子半径和每个原子的多面体表示计算的水可及表面积)的IL-12p35(基于IL-12p35成熟形式序列)上的天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺残基。
图24A-图24C描绘了为降低IL-12异源二聚体复合物对IL-12受体的亲和力和/或去除推定的糖基化位点而设计的说明性IL-12p35变体的序列。经修饰的氨基酸加下划线并以粗体表示。
图25A-图25C描绘了具有Fc融合配偶体的说明性IL-12p35变体的氨基酸序列。结构域接头加双下划线，并且IL-12p35变体用斜体表示。
图26A-图26Q描绘了为降低IL-12-Fc融合物对IL-12受体的亲和力或去除推定的糖基化位点而设计的说明性变体IL-12-Fc融合物的序列。接头加双下划线(但是如本领域技术人员将了解的，接头可以被其它接头替代)，并且斜线(/)指示IL-12p35、IL-12p40、接头和Fc区之间的一个或多个边界。
图27A-图27B描绘了在将活化的PBMC与包含被工程化以降低亲和力和效力的IL-12p40变体的IL-12-Fc融合物一起温育后，A)CD4+CD45RA+CD25+T细胞和B)CD8+CD45RA+CD25+T细胞上的STAT4磷酸化。
图28A-图28B描绘了在将活化的PBMC与包含被工程化以降低亲和力和效力的IL-12p35变体的IL-12-Fc融合物一起温育后，A)CD4+CD45RA+CD25+T细胞和B)CD8+CD45RA+CD25+T细胞上的STAT4磷酸化。
图29描绘了作为包含IL-12p40或IL-12p35变体的IL-12-Fc融合物的EC50(用于STAT4磷酸化)，以及EC50相对于WT IL-12-Fc XENP27201的减小倍数。27201-1和27201-2表示XENP27201的两个单独生产的批次。
图30A-图30B描绘了设计用于降低IL-12异源二聚体复合物对IL-12受体的亲和力的说明性IL-12p40变体的序列。经修饰的氨基酸加下划线并以粗体表示。
图31A-图31C描绘了具有Fc融合配偶体的说明性IL-12p40变体的氨基酸序列。结构域接头加双下划线，并且IL-12p40变体用斜体表示。
图32描绘了为降低IL-12异源二聚体复合物对IL-12受体的亲和力而设计的说明性IL-12p35变体的序列。经修饰的氨基酸加下划线并以粗体表示。
图33A-图33B描绘了具有Fc融合配偶体的说明性IL-12p35变体的氨基酸序列。结构域接头加双下划线，并且IL-12p35变体用斜体表示。
图34A-34L描绘了为降低IL-12-Fc融合物对IL-12受体的亲和力而设计的说明性变体IL-12-Fc融合物的序列。接头加双下划线(但是如本领域技术人员将了解的，接头可以被其它接头替代，其中的一些在图6中进行了描绘)，并且斜线(/)指示IL-12p35、IL-12p40、接头和Fc区之间的一个或多个边界。
图35A-图35B描绘了在将活化的PBMC与包含被工程化以降低亲和力和效力的IL-12p40变体的IL-12-Fc融合物一起温育后，A)CD4+CD45RA+CD25+T细胞和B)CD8+CD45RA+CD25+T细胞上的STAT4磷酸化。
图36A-图36B描绘了在将活化的PBMC与包含被工程化以降低亲和力和效力的IL-12p40和/或IL-12p35变体的IL-12-Fc融合物一起温育后，A)CD4+CD45RA+CD25+T细胞和B)CD8+CD45RA+CD25+T细胞上的STAT4磷酸化。
图37描绘了包含IL-12p40和/或IL-12p35变体的IL-12-Fc融合物的EC50(用于STAT4磷酸化)，以及EC50相对于WT IL-12-Fc XENP27201的减小倍数。数据表明，通过包括IL-12p40亚基中的仅E59K取代的IL-12-Fc融合物，效力降低了多达12倍。
图38描绘了为降低IL-12异源二聚体复合物对IL-12受体的亲和力而设计的说明性IL-12p40变体的序列。经修饰的氨基酸加下划线并以粗体表示。
图39描绘了为降低IL-12异源二聚体复合物对IL-12受体的亲和力而设计的说明性IL-12p35变体的序列。经修饰的氨基酸加下划线并以粗体表示。
图40A-40G描绘了为降低IL-12-Fc融合物对IL-12受体的亲和力而设计的说明性变体IL-12-Fc融合物的序列。接头加双下划线(但是如本领域技术人员将了解的，接头可以被其它接头替代，其中的一些在图6中进行了描绘)，并且斜线(/)指示IL-12p35、IL-12p40、接头和Fc区之间的一个或多个边界。
图41A-图41B描绘了在将活化的PBMC与包含被工程化以降低亲和力和效力的Il-12p40和/或IL-12p35变体的IL-12-Fc融合物一起温育后，A)CD4+CD45RA+CD25+T细胞和B)CD8+CD45RA+CD25+T细胞上的STAT4磷酸化。
图42描绘了包含IL-12p40和/或IL-12p35变体的IL-12-Fc融合物的EC50(用于STAT4磷酸化)，以及EC50相对于WT IL-12-Fc XENP27201的减小倍数。数据表明，效力降低了多达100倍。
图43A-图43B描绘了为降低IL-12异源二聚体复合物对IL-12受体的亲和力而设计的说明性IL-12p40变体的序列。经修饰的氨基酸加下划线并以粗体表示。
图44描绘了为降低IL-12异源二聚体复合物对IL-12受体的亲和力而设计的说明性IL-12p35变体的序列。经修饰的氨基酸加下划线并以粗体表示。
图45A-45I描绘了为降低IL-12-Fc融合物对IL-12受体的亲和力而设计的说明性变体IL-12-Fc融合物的序列。接头加双下划线(但是如本领域技术人员将了解的，接头可以被其它接头替代，其中的一些在图6中进行了描绘)，并且斜线(/)指示IL-12p35、IL-12p40、接头和Fc区之间的一个或多个边界。
图46A-图46C描绘了为降低IL-12-Fc融合物对IL-12受体的亲和力而设计的说明性变体IL-12-Fc融合物的序列，进一步用Xtend Fc(M428L/N434S)工程化以延长半衰期。接头加双下划线(但是如本领域技术人员将了解的，接头可以被其它接头替代，其中的一些在图6中进行了描绘)，并且斜线(/)指示IL-12p35、IL-12p40、接头和Fc区之间的一个或多个边界。应当注意，提供这些序列是出于说明性目的提供的，并且在其它附图中描绘的序列中的任何序列也可以包括用于延长半衰期的Xtend Fc(M428L/N434S)。
图47A-图47D描绘了在将活化的PBMC与包含被工程化以降低亲和力和效力的IL-12p40和/或IL-12p35变体的IL-12-Fc融合物一起温育后，A)CD4+CD45RA+CD25+T细胞、B)CD4+CD45RA-CD25+T细胞、C)CD8+CD45RA+CD25+T细胞和D)CD8+CD45RA-CD25+T细胞上的STAT4磷酸化。
图48描绘了包含IL-12p40和/或IL-12p35变体的IL-12-Fc融合物的EC50(用于STAT4磷酸化)，以及EC50相对于WT IL-12-Fc XENP27201的减小倍数。
图49A-图49D描绘了用于本发明的二价IL-12-Fc融合蛋白的说明性形式。二价N末端单链(图49A-图49B)形式包括两个相同的单体，每个单体包括与同源二聚体Fc链的N末端(任选地通过结构域接头)重组融合的scIL-12复合物。二价C末端单链(图49C-图49D)形式包括两个相同的单体，每个单体包括与同源二聚体Fc链的C末端(任选地通过结构域接头)重组融合的scIL-12复合物。scIL-12复合物可包含N末端连接至IL-12p40的IL-12p35或N末端连接至IL-12p35的IL-12p40，任选地具有结构域接头。scIL-12复合物中两个亚基的顺序可以指定如下：“scIL-12(p40/p35)”，其中IL-12p40亚基在N末端连接至IL-12p35亚基，或“scIL-12(p35/p40)”，其中IL-12p35在N末端连接至IL-12p40亚基。
图50描绘了XENP31289和XENP31291，(scIL-12(p40/p35))2-Fc形式的说明性IL-12-Fc融合蛋白的序列。XENP31289包含野生型IL-12p40和野生型IL-12p35亚基。XENP31291包含IL-12p40(E59K/K99E)变体和野生型IL-12p35亚基。接头加双下划线(但是如本领域技术人员将了解的，接头可以被其它接头替代，其中的一些在图6中进行了描绘)，并且斜线(/)指示IL-12p35、IL-12p40、接头和Fc区之间的一个或多个边界。
图51描绘了XENP31290，scIL-12(p40/p35)-Fc形式的说明性IL-12-Fc融合蛋白的序列，其含有IL-12p40(E59K/K99E)变体和野生型IL-12p35亚基。接头加双下划线(但是如本领域技术人员将了解的，接头可以被其它接头替代，其中的一些在图6中进行了描绘)，并且斜线(/)指示IL-12p35、IL-12p40、接头和Fc区之间的一个或多个边界。
图52A-图52D描绘了在将活化的PBMC与具有WT IL-12p40亚基或变体IL-12p40(E59K/K99E)亚基的呈scIL-12(p40/p35)-Fc和(scIL-12(p40/p35))2-Fc形式的IL-12-Fc融合物一起温育后，A)CD4+CD45RA+CD25+T细胞、B)CD4+CD45RA-CD25+T细胞、C)CD8+CD45RA+CD25+T细胞和D)CD8+CD45RA-CD25+T细胞上的STAT4磷酸化。数据显示，包含变体IL-12p40(E59K/K99E)亚基的呈scIL-12(p40/p35)-Fc和(scIL-12(p40/p35))2-Fc融合物的IL-12-Fc融合物相对于包含WT IL-12p40亚基的IL-12-Fc融合物表现出降低的效力。
图53描绘了具有WT IL-12p40亚基或变体IL-12p40(E59K/K99E)亚基的呈scIL-12(p40/p35)-Fc和(scIL-12(p40/p35))2-Fc形式的IL-12-Fc融合物的EC50(用于STAT4磷酸化)。
图54描绘了XENP16432的序列，XENP16432为基于纳武单抗和具有E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体的IgG1主链的抗PD-1mAb。
图55A-图55D描绘了在给药了XENP16432(二价抗PD-1mAb)或XENP29952(包含变体IL-12p40(E59K)的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)的pp65-MCF7和huPBMC-移植的NSG小鼠体内于A)第11天、B)第13天和C)第15天以及D)随着时间推移的肿瘤体积的变化(通过卡尺测量确定)。值得注意的是，如肿瘤体积变化所指示的，到第11天，XENP29952显著增强了抗肿瘤活性(使用未配对t检验对经过基线校正的数据进行的统计)。
图56A-图56F描绘了在PBMC移植和第一剂量的PBS、XENP16432(二价抗PD-1mAb)或XENP29952(包含变体IL-12p40(E59K)的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)之后，在经过pp65-MCF7和huPBMC移植的NSG小鼠中在第14天的A)CD45细胞，B)CD3+T细胞，C)CD4+T细胞，D)CD8+T细胞，E)NK细胞计数以及F)CD4+T细胞与CD8+T细胞比。在第14天，与PBS对照和通过XENP16432进行检查点阻断两者相比，XENP29952的CD45+、CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK细胞的扩增显著增加(使用未配对t检验对经过对数变换的数据进行统计分析)。
图57A-图57D描绘了在PBMC移植和第一剂量的PBS、XENP16432(二价抗PD-1mAb)或XENP29952(包括变体IL-12p40(E59K)的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)之后，在经过pp65-和huPBMC移植的NSG小鼠中在A)第7天和B)第14天的血清IFNγ浓度以及在C)第7天和D)第14天的血清CD25浓度。此外，与通过XENP16432进行的检查点阻断相比，到第7天，XENP29952显著增强了IFNγ和的CD25分泌(使用未配对t检验对经过对数变换的日期进行的统计)。
图58A-图58I描绘了在经过huPBMC移植的NSG小鼠中，到A)第3天、B)第6天、C)第10天、D)第13天、E)第17天、F)第20天、G)第24天和H)第27天以及I)随时间推移的体重变化(作为GVHD指标)，所述小鼠以0.3或0.03mg/kg用PBS或XENP29952(包括变体IL-12p40(E59K)的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)、XENP30597(包括变体IL-12p40(D18K/E59K/K99E)的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)、XENP31254(包括变体IL-12p40(D18K/E59K/K99E)的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)、XENP31251(包括变体IL-12p40(E59K/K99Y)的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)或XENP31258(包括变体IL-12p40(E59K/K99E/K264E)的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)给药。值得注意的是，IL-12-Fc融合测试制品诱导了与其体外效力相关的不同程度的GVHD。另外，数据示出了测试制品的剂量应答(即，与0.03mg/kg相比，0.3mg/kg增强了GVHD)。
图59A-图59C描绘了在PBMC移植和以0.3或0.03mg/kg的第一剂量的PBS或XENP29952(包括变体IL-12p40(E59K)的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)、XENP30597(包括变体IL-12p40(E59K/K99E)的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)、XENP31254(包括变体IL-12p40(D18K/E59K/K99E)的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)、XENP31251(包括变体IL-12p40(E59K/K99Y)的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)或XENP31258(包括变体IL-12p40(E59K/K99E/K264E)的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)之后，在A)第7天、B)第10天和C)第14天在经过huPBMC移植的NSG小鼠中的CD8+T细胞上的PD-1表达(作为活化指标)。值得注意的是，IL-12-Fc融合测试制品诱导了与其体外效力相关的不同程度的CD8+T细胞活化。另外，数据示出了测试制品的剂量应答(即，与0.03mg/kg相比，0.3mg/kg增强了CD8+T细胞活化)。
图60A-图60C描绘了在PBMC移植和以0.3或0.03mg/kg的第一剂量的PBS或XENP29952(包括变体IL-12p40(E59K)的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)、XENP30597(包括变体IL-12p40(E59K/K99E)的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)、XENP31254(包括变体IL-12p40(D18K/E59K/K99E)的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)、XENP31251(包括变体IL-12p40(E59K/K99Y)的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)或XENP31258(包括变体IL-12p40(E59K/K99E/K264E)的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)之后，在A)第7天、B)第10天和C)第14天在经过huPBMC移植的NSG小鼠中的CD4+T细胞上的PD-1表达(作为活化指标)。值得注意的是，IL-12-Fc融合测试制品诱导了与其体外效力相关的不同程度的CD4+T细胞活化。另外，数据示出了测试制品的剂量应答(即，与0.03mg/kg相比，0.3mg/kg增强了CD4+T细胞活化)。
图61A-图61D描绘了在PBMC移植和以0.3或0.03mg/kg的第一剂量的PBS或XENP29952(包括变体IL-12p40(E59K)的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)、XENP30597(包括变体IL-12p40(E59K/K99E)的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)、XENP31254(包括变体IL-12p40(D18K/E59K/K99E)的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)、XENP31251(包括变体IL-12p40(E59K/K99Y)的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)或XENP31258(包括变体IL-12p40(E59K/K99E/K264E)的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)之后，在第A)7天、B)10天、C)14和D)31天在经过huPBMC移植的NSG小鼠中的IFNγ血清浓度。值得注意的是，IL-12-Fc融合测试制品诱导了与其体外效力相关的不同水平的IFNγ分泌。另外，数据示出了测试制品的剂量应答(即，与0.03mg/kg相比，0.3mg/kg诱导的IFNγ分泌增强)。
图62A-图62K描绘了在将活化的PBMC(来自第二供体；供体2)与重组人IL-12、XENP29952(包括变体IL-12p40(E59K)的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)、XENP30597(包括变体IL-12p40(E59K/K99E)的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)、XENP31254(包括变体IL-12p40(D18K/E59K/K99E)的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)、XENP31251(包括变体IL-12p40(E59K/K99Y)的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)或XENP31258(包括变体IL-12p40(E59K/K99E/K264E)的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)一起温育之后，在A)CD4+CD45RA-CD25+T细胞、B)CD4+CD45RA+CD25+T细胞、C)CD4+CD45RA+CD25-T细胞、D)CD4+CD45RA-CD25-T细胞、E)CD8+CD45RA-CD25+T细胞、F)CD8+CD45RA+CD25+T细胞、G)CD8+CD45RA+CD25-T细胞、H)CD8+CD45RA-CD25-T细胞、I)Tregs、J)γδT细胞和K)CD56+NK细胞上的STAT4磷酸化。数据示出了效力阶梯，其中XENP29952为最强效变体，XENP31254和XENP31258为最不强效变体，并且XENP30597和XENP31251介于两者之间。值得注意的是，如由效力降低的IL-12-Fc融合变体在体内诱导的GVHD和T细胞活化程度与体外效力相关。
图63A-图63D描绘了在给药了PBS、XENP16432(二价抗PD-1mAb)或XENP31258、XENP31251或XENP31251和XENP16432的组合的经过pp65-MCF7和huPBMC-移植的NSG小鼠体内于A)第14天、B)第16天和C)第21天以及D)随着时间推移的肿瘤体积的变化(通过卡尺测量确定)。与PBS治疗相比，XENP31258到第14天显着增强了抗肿瘤活性，XENP31251(单独或与XENP16432组合)到第16天显着增强了抗肿瘤活性；与单独使用XENP16432治疗相比，XENP31251与XENP16432组合到第21天显着增强了抗肿瘤活性(使用曼-惠特尼检验(Mann-Whitney test)对基线校正数据进行统计)。
图64A-图64F描绘了在PBMC移植和第一剂量的PBS、XENP16432(二价抗PD-1mAb)、XENP31258、XENP31251或XENP31251和XENP16432的组合之后，在经过pp65-MCF7和huPBMC移植的NSG小鼠中在第14天的A)CD45细胞，B)CD3+T细胞，C)CD4+T细胞，D)CD8+T细胞，E)NK细胞计数以及F)CD8+T细胞与CD4+T细胞比。值得注意的是，数据表明，与单独的XENP31251或XENP16432相比，用XENP31251与XENP16432组合的治疗显著增强了淋巴细胞扩增，从而表明IL-12-Fc融合物有效地与检查点阻断组合。
图65A-图65B描绘了为降低IL-12-Fc融合物对IL-12受体的亲和力而设计的说明性变体IL-12-Fc融合物的序列，进一步用Xtend Fc(M428L/N434S)工程化以延长半衰期。接头加双下划线(但是如本领域技术人员将了解的，接头可以被其它接头替代，其中的一些在图6中进行了描绘)，并且斜线(/)指示Il-12p35、IL-12p40、接头和Fc区之间的一个或多个边界。应当注意，提供这些序列是出于说明性目的提供的，并且在其它附图中描绘的序列中的任何序列也可以包括用于延长半衰期的Xtend Fc(M428L/N434S)。
图66-图66C描绘了为去除游离半胱氨酸而用C252S工程化的说明性IL-12p40变体的序列(除了表达和亲和力/效力变体之外)。
图67A-图67N描绘了为去除游离半胱氨酸而用在IL-12p40亚基中的C252S工程化的说明性IL-12-Fc融合物的序列(除了表达和亲和力/效力变体之外)。接头加双下划线(但是如本领域技术人员将了解的，接头可以被其它接头替代，其中的一些在图6中进行了描绘)，并且斜线(/)指示IL-12p35、IL-12p40、接头和Fc区之间的一个或多个边界。
图68A-图68E描绘了在将活化的PBMC与包括为去除游离半胱氨酸而具有或不具有另外的工程化的IL-12p40变体的IL-12-Fc一起温育之后，A)CD8+CD45RA-CD25+T细胞、B)CD8+CD45RA+CD25+T、C)CD4+CD45RA-CD25+T、D)CD4+CD45RA+CD25+T和E)NK细胞上的STAT4磷酸化。数据表明，与没有C252S修饰的变体相比，包括IL-12p40亚基中的C252S的大多数变体表现出类似的效力，但是略有改善。
图69描绘了本发明中使用的多种抗原的抗原序列(包括人和食蟹猴两者)，以促进开发易于临床开发的结合到两者的抗原结合结构域。
图70A-图70I描绘了可用于本发明的靶向IL-12-Fc融合物的说明性抗PD-1ABD的可变重链和可变轻链的序列。CDR加有下划线。如本文所示并且对于本文含有CDR的每个序列都是如此，取决于所使用的如表1中所示的编号，CDR位置的精确标识可能略微不同，并因此本文中不仅包括带下划线的CDR，而且还包括使用其它编号系统的VH和VL结构域内所包括的CDR。
图71描绘了XENP21575的序列，其是基于杂交瘤克隆1C11和在重链中具有E233P/L234V/L235A/G236del/S267K取代的人IgG1的可变区的嵌合和人源化的抗PD-1抗体。CDR带有下划线，并且斜线表示可变结构域的边界。如本文所示并且对于本文包含CDR的每个序列都是如此，CDR位置的精确鉴定可以根据使用的如表1中所示编号而略微不同，并因此本文包括的不仅是有下划线的CDR，而且是使用其他编号系统在VH和VL结构域内包括的CDR。如本领域技术人员将理解的，VH和VL结构域可以被格式化为Fab或scFv，以用于本发明的靶向PD-1的IL-12-Fc融合蛋白。
图72描绘了在重链中具有E233P/L234V/L235A/G236del/S267K取代的二价人IgG1形式的抗PD-1mAb A、mAb B和mAb C的说明性人源化变体的序列。CDR带有下划线，并且斜线表示可变结构域的边界。如本文所示并且对于本文包含CDR的每个序列都是如此，CDR位置的精确鉴定可以根据使用的如表1中所示编号而略微不同，并因此本文包括的不仅是有下划线的CDR，而且是使用其他编号系统在VH和VL结构域内包括的CDR。如本领域技术人员将理解的，VH和VL结构域可以被格式化为Fab或scFv，以用于本发明的靶向PD-1的IL-12-Fc融合蛋白。
图73描绘了如通过归一化BLI响应(normalized BLI-response)Octet所示的XENP16432(基于纳武单抗的二价抗PD-1mAb)、XENP21461(派姆单抗)、嵌合mAb A(chmAbA)、嵌合mAb B(chmAb B)、嵌合mAb C和基于1C11的mAb的表位分箱(binning)。大于0.5的归一化BLI响应表示抗体对不会分箱到同一表位。
图74A和图74B描绘了通过Octet(以及相关的传感图)确定的XENP28536对A)人PD-1和B)食蟹猴PD-1的亲和力。
图75A-图75I描绘了如通过Octet确定的亲和力工程化的mAb C[PD-1]_H1L1变体(具有E233P/L234V/L235A/G236_/S267K消融变体的二价IgG1形式的)的表观解离常数(KDapp)、结合速率(ka)和解离速率，以及相比mAb C[PD-1]_H1L1的倍数提高。列出的可变重链或可变轻链区中的取代基于Xencor编号(在下一栏中列出了相应的Kabat位置)。在可变重链区或可变轻链区中具有单个点突变的304个变体中，我们仅标识出11个变体(包括mAbC[PD-1]_H1_L1.1和mab_C[PD-1]_H1_L1.3)，其与WT相比，具有的亲和力提高了超过2倍。
图76A-图76J描绘了可用于本发明的靶向IL-12-Fc融合物的说明性抗PD-L1 ABD的可变重链和可变轻链的序列。CDR加有下划线。如本文所示并且对于本文含有CDR的每个序列都是如此，取决于所使用的如表1中所示的编号，CDR位置的精确标识可能略微不同，并因此本文中不仅包括带下划线的CDR，而且还包括使用其它编号系统的VH和VL结构域内所包括的CDR。
图77展示基于人IgG1的几个有用的靶向IL-12-Fc融合形式主链的序列，而无细胞因子序列(例如，IL12p40和/或IL12p35亚基)或VH，并且进一步排除图78中所描绘的轻链主链。主链1基于人IgG1(356E/358M同种异型)，并且包括S364K/E357Q:L368D/K370S偏斜变体、具有L368D/K370S偏斜变体的链上的C220S和Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体和两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。主链2基于人IgG1(356E/358M同种异型)，并且包括S364K/E357Q:L368D/K370S偏斜变体、具有L368D/K370S偏斜变体的链上的N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体、具有S364K/E357Q变体的链中的C220S和两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。主链3基于人IgG1(356E/358M同种异型)，并且包括S364K/E357Q:L368D/K370S偏斜变体、具有L368D/K370S偏斜变体的链上的N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体、具有S364K/E357Q变体的链上的Q196K/I199T/P217R/P228R/N276K pI变体和两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。
在某些实施方式中，这些序列可以是356D/358L同种异型的。在其它实施方式中，这些序列可包括N297A或N297S取代。在一些其它实施方式中，这些序列可包括M428L/N434SXtend突变。在其它实施方式中，这些序列可替代地基于人IgG4，并且包括两条链上的S228P(EU编号，这是Kabat中的S241P)变体，其消除如本领域已知的Fab臂交换。在又其它实施方式中，这些序列可以替代地基于人IgG2。此外，这些序列可以替代地利用图2-4中描绘的其他偏斜变体，pI变体和消融变体。
如本领域技术人员将理解并且如下文所概述，任何IL12p40和/或IL12p35变体都可以并入这些主链中。此外，如所属领域技术人员将理解并且如下所概述，这些序列可与本文概述的任何VH和VL对一起使用，包括scFv或Fab。
在这些主链的每一条主链内包括与所列举的序列90％、95％、98％和99％相同(如本文所定义)和/或含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个额外的氨基酸取代的序列(与附图的“亲本”相比，如本领域技术人员将理解，与亲本人IgG1(或IgG2或IgG4，这取决于主链)相比，已经含有多个氨基酸修饰)。即，除了此图的主链中所含的偏斜变体、pI变体和消融变体之外，所列举主链可以含有另外的氨基酸修饰(通常是氨基酸取代)。
图78描绘可用于本发明的靶向IL-12-Fc融合蛋白的轻链的“非Fv”主链(即恒定轻链)。
图79A-图79E描绘用于本发明的靶向IL-12-Fc融合蛋白的几种形式。“scIL-12xscFv”形式(图79A)包含融合(可选地通过可变长度接头)到IL12p35的IL12p40(称为scIL-12)，然后将其融合(可选地通过可变长度接头)到异源二聚体Fc区的N末端，其中scFv融合到异源二聚体Fc的另一侧。“scIL-12x Fab”形式(图79B)包含融合(可选地通过可变长度接头)到IL12p35的IL12p40(称为scIL-12)，然后将其融合(可选地通过可变长度接头)到异源二聚体Fc区的N末端，可变重链(VH)与异源二聚体Fc的另一侧融合，同时单独转染相应的轻链以形成具有VH的Fab。“mAb-scIL-12”形式(图79C)包含融合到第一和第二异源二聚体Fc的N末端的VH，以及融合到异源二聚体Fc的一个的C末端的scIL-12，同时单独转染相应的轻链以形成具有VH的Fab。“中心IL-12(central-IL-12)”形式(图79D)包含重组融合至IL12p40亚基的N末端的VH，然后将其进一步融合至异源二聚体Fc的一侧，以及重组融合至IL12p35亚基的N末端的VH，然后将其进一步融合至异源二聚体Fc的另一侧，同时分别转染相应的轻链以形成具有VH的Fab。“中心scIL-12”形式(图79E)包含重组融合至scIL-12的N末端的VH，然后将其进一步融合至异源二聚体Fc的一侧，以及重组融合至异源二聚体Fc的另一侧的VH，同时分别转染相应的轻链以形成具有VH的Fab。需要注意的是，在每种形式中，IL-12p40亚基和IL-12p35亚基的位置可以互换。
图80A-图80J描绘了“scIL-12x Fab”形式的说明性靶向PD-1的IL-12-Fc融合蛋白的序列。CDR加有下划线。如本文所示并且对于本文含有CDR的每个序列都是如此，取决于所使用的如表1中所示的编号，CDR位置的精确标识可能略微不同，并因此本文中不仅包括带下划线的CDR，而且还包括使用其它编号系统的VH和VL结构域内所包括的CDR。IL-12亚基为斜体，接头加有双下划线(尽管如本领域技术人员将理解的，接头可以被其它接头代替，其中一些描绘于图6和图7中)，并且斜线(/)表示IL-12亚基、接头、可变区与恒定/Fc区之间的边界。如本领域技术人员将清楚的，所描述的每种靶向PD-1的IL-12-Fc融合蛋白也能够包括Xtend Fc(M428L/N434S)。
图81A和图81B描绘了“scIL-12x Fab”形式的说明性靶向PD-L1的IL-12-Fc融合蛋白的序列。CDR加有下划线。如本文所示并且对于本文含有CDR的每个序列都是如此，取决于所使用的如表1中所示的编号，CDR位置的精确标识可能略微不同，并因此本文中不仅包括带下划线的CDR，而且还包括使用其它编号系统的VH和VL结构域内所包括的CDR。IL-12亚基为斜体，接头加有双下划线(尽管如本领域技术人员将理解的，接头可以被其它接头代替，其中一些描绘于图6和图7中)，并且斜线(/)表示IL-12亚基、接头、可变区与恒定/Fc区之间的边界。如本领域技术人员将清楚的，所描述的每种靶向PD-L1的IL-12-Fc融合蛋白也能够包括Xtend Fc(M428L/N434S)。
图82A-图82H描绘了“scIL-12x Fab”形式的说明性靶向RSVI的L-12-Fc融合蛋白的序列。CDR加有下划线。如本文所示并且对于本文含有CDR的每个序列都是如此，取决于所使用的如表1中所示的编号，CDR位置的精确标识可能略微不同，并因此本文中不仅包括带下划线的CDR，而且还包括使用其它编号系统的VH和VL结构域内所包括的CDR。IL-12亚基为斜体，接头加有双下划线(尽管如本领域技术人员将理解的，接头可以被其它接头代替，其中一些描绘于图6和图7中)，并且斜线(/)表示IL-12亚基、接头、可变区与恒定/Fc区之间的边界。如本领域技术人员将清楚的，所描述的每种靶向的RSV的IL-12-Fc融合蛋白也能够包括Xtend Fc(M428L/N434S)。
图83A和图83B描绘了在将活化的PBMC与包含WT或降低的效力IL-12[p40(E59K/K99E)]变体的非靶向和靶向IL-12-Fc融合物一起温育后，A)CD4+CD25+PD1+T细胞和B)CD8+CD25+PD1+T细胞上的STAT4磷酸化。靶向RSV的IL-12-Fc融合物表现出与非靶向IL-12-Fc融合物相当的活性。XENP31106和XENP31108，分别是靶向PD-1和PD-L1的IL-12-Fc融合物，其包括效力降低的IL-12[p40(E59K/K99E)]变体，它们都比它们的非靶向和对照靶向RSV的对应物更有效。XENP31073，靶向PD-1的WT IL-12-Fc，表现出与其非靶向和对照靶向RSV的对应物相当的活性。
图84描绘了在将活化的PBMC与包含多种效力降低的IL-12变体的靶向IL-12-Fc融合物一起温育后，CD8+CD45RA-CD25+T细胞上的STAT4磷酸化。靶向PD-1的IL-12-Fc融合物比对应的靶向RSV的IL-12-Fc融合物更有效；并且靶向的PD-L1的IL-12-Fc融合物比对应的靶向RSV的IL-12-Fc融合物和对应的靶向PD-1的IL-12-Fc融合物更有效。
图85描绘了用非靶向和靶向PD-1的IL-12-Fc融合物给药后，huPBMC移植的NSG小鼠的体重随时间的变化(作为初始体重的百分比)。尽管XENP31462已经以较低剂量给药，但到第17天，与XENP31258相比，XENP31462显着增强了GVHD。
图86A-图86E描绘了用非靶向和靶向PD-1的IL-12-Fc融合物以第一剂量给药后，在第14天的A)CD45+、B)CD3+、C)CD4+、D)CD8+和E)NK细胞计数。尽管XENP31462以低于XENP31258的剂量给药，但到第14天，XENP31462显着增强了所有淋巴细胞群的扩增(使用非配对t检验对对数转换数据进行统计)。
图87A和图87B描绘了用非靶向和靶向PD-1的IL-12-Fc融合物的第一剂量给药后，在第14天的huPBMC移植的NSG小鼠血液中人A)CD4+T细胞和B)CD8+T细胞(如PD-1MFI所示)的活化。尽管XENP31462以低于XENP31258的剂量给药，但到第14天，XENP31462显着增强了T细胞的活化(使用非配对t检验对对数转换数据进行统计)。
图88描绘了在pp65-MCF7和huPBMC移植的NSG小鼠中随时间变化的肿瘤体积(如通过卡尺测量确定)，该小鼠用XENP31258(非靶向IL-12[p40(E59K/K99E/K264E)]-Fc融合物)或XENP31462(靶向PD-1的IL-12[p40(E59K/K99E/K264E)]-Fc融合物)给药。XENP31462表现出与XENP31258相当的抗肿瘤活性，尽管XENP31462已以低10倍的剂量给药。
图89A-89C描绘了说明性亲和力/效力IL-12p40亚基变体的序列。图89A显示了包含亲和力变体取代和C252S取代的氨基酸序列。图89B显示了包含亲和力变体取代和N200Q取代的氨基酸序列。图89C显示了包含亲和力变体取代以及C252S和N200Q取代的氨基酸序列。
图90描绘了用IL-12p40亚基中的氨基酸取代包括C252取代(除了表达和亲和力/效力变体之外)工程化的说明性变体IL-12-Fc非-Xtend融合物的序列。
图91A-91C描绘了用IL-12p40亚基中的氨基酸取代包括N200Q取代(除了表达和亲和力/效力变体之外)工程化的说明性变体IL-12-Fc非-Xtend融合物的序列，例如，XENP33669、XENP33671和XENP33672。
图92A-92C描绘了用IL-12p40亚基中的氨基酸取代包括C252S和N200Q取代(除了表达和亲和力/效力变体之外)工程化的说明性变体IL-12-Fc非-Xtend融合物的序列，例如，XENP33670和XENP33673。
图93描绘了说明性变体IL-12-Fc非Xtend融合蛋白XENP33468的序列。
图94描绘了说明性变体IL-12-Fc Xtend蛋白的序列，包括XENP33680。
图95A-95C描绘了用IL-12p40亚基中的氨基酸取代包括C252取代(除了表达和亲和力/效力变体之外)工程化的说明性变体IL-12-Fc Xtend融合物的序列，例如，XENP33674、XENP33677和XENP33681。
图96A-96C描绘了用IL-12p40亚基中的氨基酸取代包括N200Q取代(除了表达和亲和力/效力变体之外)工程化的说明性变体IL-12-Fc Xtend融合物的序列，例如，XENP33675、XENP33678和XENP33682。
图97A-97C描绘了用IL-12p40亚基中的氨基酸取代包括C252S和N200Q取代(除了表达和亲和力/效力变体之外)工程化的说明性变体IL-12-Fc Xtend融合物的序列，例如，XENP33676、XENP33679和XENP33683。
图98A-98B描绘了用IL-12p40亚基中的氨基酸取代(例如，亲和力/效力变体)工程化的说明性靶向PD-1的变体IL-12-Fc非Xtend融合物的序列。
图99A-99B描绘了用IL-12p40亚基中的包括C252取代的氨基酸取代工程化的说明性靶向PD-1的变体IL-12-Fc非Xtend融合物的序列。
图100A-100D描绘了用IL-12p40亚基中的包括N200Q取代的氨基酸取代工程化的说明性靶向PD-1的变体IL-12-Fc非Xtend融合物的序列，例如，XENP33686。
图101A-101D描绘了用IL-12p40亚基中的包括C252S和N200Q取代的氨基酸取代工程化的说明性靶向PD-1的变体IL-12-Fc非Xtend融合物的序列，例如，XENP33687。
图102A-102D描绘了用IL-12p40亚基中的氨基酸取代工程化的说明性靶向PD-1的变体IL-12-Fc Xtend融合物的序列，例如，XENP33693。
图103A-103D描绘了用IL-12p40亚基中的包括C252S取代的氨基酸取代工程化的说明性靶向PD-1的变体IL-12-Fc Xtend融合物的序列，例如，XENP33695。
图104A-104D描绘了用IL-12p40亚基中的包括N200Q取代的氨基酸取代工程化的说明性靶向PD-1的变体IL-12-Fc Xtend融合物的序列，例如，XENP33696。
图105A-105D描绘了用IL-12p40亚基中的包括C252S和N200Q取代的氨基酸取代工程化的说明性靶向PD-1的变体IL-12-Fc Xtend融合物的序列，例如，XENP33697。
图106描绘了用IL-12p40亚基中的氨基酸取代(例如，亲和力/效力变体)工程化的说明性靶向RSV的变体IL-12-Fc非Xtend融合物的序列。
图107A-107B描绘了用IL-12p40亚基中的包括C252取代的氨基酸取代工程化的说明性靶向RSV的变体IL-12-Fc非Xtend融合物的序列。
图108A-108D描绘了用IL-12p40亚基中的包括N200Q取代的氨基酸取代工程化的说明性靶向RSV的变体IL-12-Fc非Xtend融合物的序列，例如，XENP33684。
图109A-109D描绘了用IL-12p40亚基中的包括C252S和N200Q取代的氨基酸取代工程化的说明性靶向RSV的变体IL-12-Fc非Xtend融合物的序列，例如，XENP33685。
图110A-110D描绘了用IL-12p40亚基中的用氨基酸取代(例如，亲和力/效力变体)工程化的说明性靶向RSV的变体IL-12-Fc Xtend融合物的序列，例如，XENP33689。
图111A-111D描绘了用IL-12p40亚基中的包括C252取代的氨基酸取代工程化的说明性靶向RSV的变体IL-12-Fc Xtend融合物的序列，例如，XENP33690。
图112A-112D描绘了用IL-12p40亚基中的包括N200Q取代的氨基酸取代工程化的说明性靶向RSV的变体IL-12-Fc Xtend融合物的序列，例如，XENP33691。
图113A-113D描绘了用IL-12p40亚基中的包括C252S和N200Q取代的氨基酸取代工程化的说明性靶向RSV的变体IL-12-Fc Xtend融合物的序列，例如，XENP33692。
图114A-114B描绘了用IL-12p40亚基中用氨基酸取代(例如，亲和力/效力变体)工程化的说明性靶向PD-L1的变体IL-12-Fc非Xtend融合物的序列。
图115A-115D描绘了用IL-12p40亚基中的包括C252取代的氨基酸取代工程化的说明性靶向PD-L1的变体IL-12-Fc非Xtend融合物的序列。
图116A-116D描绘了用IL-12p40亚基中的包括N200Q取代的氨基酸取代工程化的说明性靶向PD-L1的变体IL-12-Fc非Xtend融合物的序列。
图117A-117D描绘了用IL-12p40亚基中的包括C252S和N200Q取代的氨基酸取代工程化的说明性靶向PD-L1的变体IL-12-Fc非Xtend融合物的序列。
图118A-118B描绘了用IL-12p40亚基中的氨基酸取代(例如，亲和力/效力变体)工程化的说明性靶向PD-L1的变体IL-12-Fc Xtend融合物的序列。
图119A-119D描绘了用IL-12p40亚基中的包括C252取代的氨基酸取代工程化的说明性靶向PD-L1的变体IL-12-Fc Xtend融合物的序列。
图120A-120D描绘了用IL-12p40亚基中的包括N200Q取代的氨基酸取代工程化的说明性靶向PD-L1的变体IL-12-Fc Xtend融合物的序列。
图121A-121D描绘了用IL-12p40亚基中的包括C252S和N200Q取代的氨基酸取代工程化的说明性靶向PD-L1的变体IL-12-Fc Xtend融合物的序列。
图121A-121D描绘了与(图121A)进一步包含至少p40[N103Q]去糖基化变体的IL-12-Fc融合物、(图121B)进一步包含至少p40[N113Q]去糖基化变体的IL-12-Fc融合物、(图121C)进一步包含至少p40[N200Q]去糖基化变体的IL-12-Fc融合物和(图121D)进一步包含至少p40[N281Q]去糖基化变体的IL-12-Fc融合物相比，在将活化的PBMC与XENP32190(包含IL-12p40变体E59K/K99E/C252S/K264E的IL-12-Fc融合物一起温育后，CD8+CD45RA-CD25+T细胞上的STAT4磷酸化。数据通常显示N103Q变体增强IL-12-Fc融合物的效力，N200Q变体降低IL-12-Fc融合物的效力，并且N113Q和N281Q变体不影响IL-12-Fc融合物的效力。
图123描绘了与进一步包含至少p35去糖基化变体的IL-12-Fc融合物相比，在将活化的PBMC与XENP32190(包含IL-12p40变体E59K/K99E/C252S/K264E的IL-12-Fc融合物一起温育后，CD8+CD45RA-CD25+T细胞上的STAT4磷酸化。数据显示，没有一个p35去糖基化变体影响IL-12-Fc融合物的效力。
在一些情况下，对于附图提供的序列来说，接头加双下划线(但是如本领域技术人员将了解的，接头可以被其它接头替代，其中的一些在图6中进行了描绘)，并且斜线(/)指示IL-12p35、IL-12p40、接头和Fc区之间的一个或多个边界。
具体实施方式
I.概述
本发明涉及含有抗原结合结构域、IL-12亚基和Fc结构域的新颖的异源二聚体融合蛋白构建体。
如上所述，IL-12是由α链(p35亚基；IL-12p35)和β链(p40亚基；IL-12p40)以共价连接组成的，以形成具有生物活性的IL-12异源二聚体。IL-12通过与T细胞上由IL-12受体β1(IL-12Rβ1)和IL-12受体β2(IL-12Rβ2)组成的二聚体IL-12受体复合物结合并诱导IFNγ分泌来发挥其细胞信号传导功能。然而，IL-12p40亚基也可以以同源二聚体形式存在，据报道，所述同源二聚体通过竞争与IL-12受体的结合来拮抗IL-12活性。从而，本发明通过提供新颖的IL-12-Fc融合蛋白以及效力降低的新颖的IL-12变体来解决IL-12半衰期短的问题。如图79A-79E中通常所示，本发明的靶向IL-12异源二聚体融合蛋白可以具有多种构象。
本发明的靶向PD-1的IL-12异源二聚体Fc蛋白可以促进或诱导T细胞活化。在一些实施例中，向患者施用靶向PD-1的IL-12异源二聚体Fc蛋白中的任一种诱导了患者中的T细胞活化。在一些情况下，施用诱导患者中的IFN-γ分泌。在某些情况下，向患者施用靶向PD-1的IL-12异源二聚体Fc蛋白会诱导患者淋巴细胞的扩增。
这种靶向PD-1的IL-12异源二聚体Fc蛋白可用于治疗癌症，例如实体瘤癌或液体瘤癌。在一些实施方式中，向患者施用任何一种靶向PD-1的IL-12异源二聚体Fc蛋白可减小肿瘤大小。在一些实施方式中，本发明的靶向PD-1的IL-12异源二聚体Fc蛋白，与相当的非靶向IL-12异源二聚体Fc蛋白相比，具有增加的治疗活性。
示例性的非限制性变体IL-12p35蛋白、变体IL-12p40蛋白、非靶向IL-12Fc融合蛋白及在2018年10月03日提交的美国临时申请号62/740,813、2019年5月15日提交的美国临时申请号62/848,512、2019年10月3日提交的PCT申请号PCT/US19/54570和2019年10月3日提交的美国申请号16/592,656、2020年4月03号提交的美国临时申请号63/005,083中公开的形式，其公开内容通过引用整体并入本文，包括附图、附图说明、权利要求书和序列表。
可用于本发明的示例性非限制性PD-1抗体公开于2019年4月18日提交的PCT申请号PCT/US19/28206、2019年4月18日提交的美国申请号16/388,811、2018年12月21日提交美国临时申请号62/784,334、2018年11月08日提交的US2019/0270816、2018年11月08日提交WO2019/094637、2018年11月08日提交的US2019/0263909以及2018年10月12日提交美国临时申请号62/744,946，其公开内容通过引用整体并入本文，包括附图、附图说明和序列表。
II.定义
为了可以更全面地理解本申请，下面阐述几个定义。此类定义意在涵盖语法等同物。
本文中的“消融”意指结合和/或活性的降低或去除。因此，例如，“消融FcγR结合”意指Fc区氨基酸变体与不含有特异性变体的Fc区相比具有少于50％的起始结合，优选的是少于70％-80％-90％-95％-98％的结合损失，并且通常所述结合低于Biacore测定中可检测结合的水平。FcγR结合的消融中的特定用途如图4所示的那些特定用途。然而，除非另有说明，否则本发明的Fc单体保持与FcRn的结合。
如本文所使用的，“ADCC”或“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”指其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体并且随后引起靶细胞溶解的细胞介导反应。ADCC与结合FcγRIIIa相关；与FcγRIIIa结合的增加引起ADCC活性的增加。如本文所讨论的，本发明的许多实施方式完全消融ADCC活性。
本文中的“修饰”意指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失或对与蛋白质化学连接的部分的更改。例如，修饰可以是与蛋白质连接的改变的碳水化合物或PEG结构。本文中通过“氨基酸修饰”指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。为清楚起见，除非另外说明，否则氨基酸修饰总是针对由DNA编码的氨基酸，例如具有DNA和RNA形式的密码子的20种氨基酸。
本文中通过“氨基酸取代”或“取代”指用不同的氨基酸替换亲本多肽序列中特定位置的氨基酸。特别地，在一些实施方式中，取代是针对并非天然存在于特定位置、并非天然存在于生物体内或任何生物体内的氨基酸。举例来说，取代E272Y或272Y指在位置272处的谷氨酸被酪氨酸替换的变体多肽，在这种情况下是Fc变体。为清楚起见，已经被工程化以改变核酸编码序列但不改变起始氨基酸(例如，将CGG(编码精氨酸)换成CGA(仍然编码精氨酸)以增加宿主生物体表达水平)的蛋白质不是“氨基酸取代”；即，尽管产生了编码相同蛋白质的新基因，但是如果蛋白质在其开始的特定位置处具有相同氨基酸，则所述蛋白质不是氨基酸取代。
如本文所使用的，“氨基酸插入”或“插入”指在亲本多肽序列中的特定位置处添加氨基酸残基或序列。举例来说，-233E表示在位置233之后和位置234之前插入谷氨酸。另外，-233ADE或A233ADE表示在位置233之后和位置234之前插入AlaAspGlu。
如本文所使用，“氨基酸缺失”或“缺失”意指在亲本多肽序列的特定位置处去除氨基酸残基或序列。例如，E233-、E233#、E233()或E233del指代位置233处的谷氨酸的缺失。另外，EDA233-或EDA233#指代开始于位置233的序列GluAspAla的缺失。
如本文所使用的，“变体蛋白质”、“蛋白质变体”或“变体”指由于至少一个修饰而与亲本蛋白质不同的蛋白质。蛋白质变体可以指代蛋白质本身、包含所述蛋白质的组合物、对所述蛋白质进行编码的氨基酸序列或对所述蛋白质进行编码的DNA序列。优选地，蛋白质变体与亲本蛋白相比具有至少一种氨基酸修饰，例如，与亲本相比，约一种到约七十种氨基酸修饰，并且优选地约一种到约五种氨基酸修饰。修饰可以是添加、缺失或取代。如下文所描述的，在一些实施方式中，亲本多肽，例如，Fc亲本多肽，是人野生型序列，如来自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc区。本文的蛋白质变体序列将优选与亲本蛋白序列具有至少约80％的同一性，并且最优选至少约90％的同一性，更优选至少约95-98-99％的同一性。
如本文所使用的，“蛋白质”指至少两个共价连接的氨基酸，包括蛋白质、多肽、寡肽和肽。当生物功能分子或复合物包含两种或更多种蛋白质时，每种蛋白质可称为“单体”或称为“亚基”或称为“结构域”；并且生物功能分子可称为“复合物”。在一些实施方式中，功能复合物的两种或更多种蛋白质是非共价连接的。在一些实施例中，术语“单体”是指包括一种或多种蛋白质的一个或多个组分、片段或亚基的多肽或蛋白质，并且所述组分、片段或亚基是共价连接的。
如本文所用的“残基”指蛋白质中的位置及其相关的氨基酸实体。例如，天冬酰胺297(也称为Asn297或N297)是人抗体IgG1中位置297处的残基。
如本文所使用的，“IgG亚类修饰”或“同种型修饰”指将一个IgG同种型的一个氨基酸转换为不同的比对IgG同种型中的对应氨基酸的氨基酸修饰。例如，因为在EU位置296处IgG1包含酪氨酸并且IgG2包含苯丙氨酸，所以IgG2中的F296Y取代被认为是IgG亚类修饰。
每个IgG链的羧基端部分限定了主要负责效应子功能的恒定区。Kabat等人收集了重链和轻链的可变区的多个一级序列。基于序列的保守度，其将单个一级序列分类为CDR和框架并且列出其列表(参见SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST,第5th版,NIH出版,No.91-3242,E.A.Kabat等人，所述文献通过引用整体并入)。在整个本发明说明书中，当提及可变结构域中的残基(大致是轻链可变区的残基1-107和重链可变区的残基1-113)时通常使用Kabat编号系统并且Fc区使用EU编号系统(例如Kabat等人,同上(1991))。
在免疫球蛋白的IgG亚类中，重链中存在几种免疫球蛋白质结构域。本文中通过“免疫球蛋白(Ig)结构域”意指具有不同三级结构的免疫球蛋白的区域。本发明感兴趣的是重链结构域，包括恒定重链(CH)结构域和铰链结构域。在IgG抗体的上下文中，IgG同种型各自具有三个CH区。因此，在IgG的上下文中，“CH”结构域如下：“CH1”指根据如Kabat中的EU索引的位置118-215。“铰链”指根据如Kabat中的EU索引的位置216-230。“CH2”是指根据如Kabat中的EU索引的位置231-340，并且“CH3”是指根据如Kabat中的EU索引的位置341-447。如表1所示，在不同的编号系统之间，重链结构域的精确编号和布置可以有所不同。如本文所示和下文所描述的，pI变体可以处于CH区的一个或多个CH区以及铰链区中，如下文所讨论的。
重链的另一种类型的Ig结构域是铰链区。“铰链”或“铰链区”或“抗体铰链区”或“免疫球蛋白铰链区”在本文中意指包含抗体的第一与第二重链恒定结构域之间的氨基酸的柔性多肽。在结构上，IgG CH1结构域在EU位置215处终止，并且IgG CH2结构域在残基EU位置231处开始。因此，对于IgG，抗体铰链在本文中定义为包括位置216(IgG1中的E216)到230(IgG1中的P230)，其中编号是根据如Kabat中的EU索引。在一些实施方式中，例如在Fc区的上下文中，包括铰链，通常是指位置216-230。如本文所指出的，pI变体也可以处于铰链区中。
如本文所使用的，“非天然发生修饰”意指不是同种型的氨基酸修饰。例如，因为IgG均不包含位置434处的丝氨酸，所以IgG1、IgG2、IgG3或IgG4(或其杂交体)中的取代434S被视为非天然存在的修饰。
如本文所用的“氨基酸”和“氨基酸实体”指由DNA和RNA编码的20种天然存在的氨基酸之一。
如本文所用的“效应子功能”指由抗体Fc区与Fc受体或配体的相互作用产生的生物化学事件。效应子功能包括但不限于ADCC、ADCP和CDC。
如本文所使用的，“IgG Fc配体”或“Fc配体”指来自与IgG抗体的Fc区结合以形成Fc/Fc配体复合物的任何生物体的分子，优选地多肽。Fc配体包括但不限于FcγRI、FcγRII、FcγRIII、FcRn、C1q、C3、甘露聚糖结合凝集素、甘露糖受体、葡萄球菌蛋白A、链球菌蛋白G和病毒性FcγR。Fc配体还包括Fc受体同源物(FcRH)，其为与FcγR同源的Fc受体家族(Davis等人,2002,Immunological Reviews 190:123-136，其通过引用整体并入)。Fc配体可包括结合Fc的未发现的分子。特别的IgG Fc配体是FcRn和Fcγ受体。
如本文所用的“Fcγ受体”、“FcγR”或“FcγR(FcgammaR)”指结合IgG抗体Fc区并且由FcγR基因编码的蛋白质家族的任何成员。在人中，这个家族包括但不限于FcγRI(CD64)，包括同种型FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc；FcγRII(CD32)，包括同种型FcγRIIa(包括同种异型H131和R131)、FcγRIIb(包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)和FcγRIIc；和FcγRIII(CD16)，包括同种型FcγRIIIa(包括同种异型V158和F158)和FcγRIIIb(包括同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)(Jefferis等人,2002,免疫学快报(Immunol Lett)82:57-65，其通过引用整体并入)，以及任何未发现的人FcγR或FcγR同种型或同种异型。FcγR可来自任何生物体，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔和猴。小鼠FcγR包括但不限于FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)和FcγRIII-2(CD16-2)以及任何未发现的小鼠FcγR或FcγR同种型或同种异型。
如本文所用的“FcRn”或“新生Fc受体”指结合IgG抗体Fc区，并且至少部分地由FcRn基因编码的蛋白质。FcγR可来自任何生物体，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔和猴。如本领域中所已知，功能性FcRn蛋白包括两种多肽，常常被称为重链和轻链。轻链是β-2-微球蛋白(β-2-微球蛋白)，并且重链由FcRn基因编码。除非本文另外指出，否则FcRn或FcRn蛋白指FcRn重链与β2-微球蛋白的复合物。各种Fc变体可以用于增加与FcRn的结合并且在一些情况下用于增加血清半衰期。通常，除非另有说明，否则本发明的Fc单体保持与FcRn的结合(并且，如下所述，可以包括氨基酸变体以增加与FcRn的结合)。
如本文所用，“亲本多肽”意指随后修饰以生成变体的起始多肽。亲本多肽可以是天然存在的多肽或者天然存在的多肽的变体或工程化型式。亲本多肽可指代多肽本身、包含所述亲本多肽的组合物，或编码所述亲本多肽的氨基酸序列。
如本文所用，“Fc”或“Fc区”或“Fc结构域”指包含抗体的恒定区，在一些情况下不包含所有第一恒定区免疫球蛋白质结构域(例如，CH1)或其一部分，并且在一些情况下，任选地包括铰链的全部或一部分的多肽。对于IgG，Fc结构域包括免疫球蛋白质结构域CH2和CH3(Cγ2和Cγ3)，以及任选地CH1(Cγ1)与CH2(Cγ2)之间的铰链区的全部或一部分。因此，在一些情况下，Fc结构域从N末端到C末端包括CH2-CH3和铰链-CH2-CH3。在一些实施方式中，Fc结构域是来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc结构域，其中IgG1铰链-CH2-CH3和IgG4铰链-CH2-CH3特别用于许多实施方式中。另外，在人IgG1 Fc结构域的情况下，铰链时常包括C220S氨基酸取代。另外，在人IgG4 Fc结构域的情况下，铰链时常包括S228P氨基酸取代。尽管Fc区的边界可变化，但是人类IgG重链Fc区通常被定义为包括其羧基端的残基E216、C226或A231，其中编号是根据如Kabat中的EU索引。在一些实施方式中，如下文更全面地描述，对Fc区进行氨基酸修饰，例如以改变与一种或多种FcγR或FcRn的结合。
如本领域的技术人员将理解的，在不同的编号系统之间，重恒定区结构域的精确编号和布置可以有所不同。根据EU和Kabat的重恒定区编号的有用比较如下，参见Edelman等人,1969,Proc Natl Acad Sci USA)63:78-85，以及Kabat等人,1991,Sequences ofProteins of Immunological Interest,第5版,美国公共卫生署(United States PublicHealth Service),国立卫生研究院(National Institute of Health),贝塞斯达(Bethesda)，所述文献通过引用整体并入。
表1
Figure BDA0003679091520000571
Figure BDA0003679091520000581
如本文所用，“Fc变体”或“变体Fc”指包括Fc结构域中的氨基酸修饰的蛋白质。修饰可以是添加、缺失或取代。本发明的Fc变体根据构成它们的氨基酸修饰来定义。因此，例如，N434S或434S是相对于亲本Fc多肽在位置434处具有丝氨酸的取代的Fc变体，其中编号根据EU索引。同样地，M428L/N434S定义了相对于亲本Fc多肽具有取代M428L和N434S的Fc变体。WT氨基酸的身份标识可以是非特定的，在此情况下前述变体称为428L/434S。应注意，提供取代的顺序是任意的，也就是说，例如，428L/434S是与434S/428L相同的Fc变体等。对于本发明所讨论的涉及抗体或其衍生物和片段的所有位置，除非另外指出，否则根据EU索引进行氨基酸位置编号。EU索引或如Kabat或EU编号方案中的EU索引是指EU抗体的编号(Edelman等人,1969,Proc Natl Acad Sci USA 63:78-85，所述文献特此通过引用整体并入)。修饰可以是添加、缺失或取代。
如本文所用，“融合蛋白”指至少两个蛋白质或蛋白质结构域的共价连接。融合蛋白可以包括人工序列，例如，结构域接头、变体Fc结构域、变体IL-12p40亚基结构域、变体IL-12p35亚基结构域等，如本文所描述的。本文中的“Fc融合蛋白”或“免疫粘附素”指包括Fc区的蛋白质，所述Fc区通常(任选地通过结构域接头，如本文所述)与一个或多个不同的蛋白质结构域连接。因此，“IL-12Fc融合物”包括与IL-12p40亚基、IL12p35亚基和/或单链IL-12复合物(scIL-12)连接(任选地但通常通过结构域接头)的Fc区，如本文所描述的。在一些情况下，两个Fc融合蛋白可以形成同源二聚体Fc融合蛋白或异源二聚体Fc融合蛋白，在一些情况下后者是优选的。在一些情况下，异源二聚体Fc融合蛋白的一个单体包括单独的Fc结构域(例如，“空Fc结构域”)，并且另一个单体是Fc融合物，包括变体Fc结构域和一个或两个IL-12亚基结构域，如本文所概述的。
如本文所用的“位置”指蛋白质序列中的位置。位置可顺序地或根据已建立格式例如抗体编号的EU索引进行编号。
在本文中，在本发明的异源二聚体蛋白的单体的上下文中，“链型(strandedness)”意指，类似于DNA的“相匹配”的两个链，异源二聚化变体并入到每个单体中以便保持、产生和/或增强“相匹配”以形成异源二聚体的能力。例如，如果一些pI变体被工程工程化为单体A(例如，使pI更高)，则作为也可以利用的“电荷对”的空间变体不干扰pI变体，例如使pI更高的电荷变体被放在同一个“链”或“单体”上以保存两种功能性。类似地，对于如下文更充分地概述的以成对的组出现的“偏斜”变体，技术人员将认为pI决定将进入并入所述对中的一组的链或单体，从而使得还使用偏斜变体的pI使pI分离最大化。
在本文中，“野生型或WT”意指在自然界发现的氨基酸序列或核苷酸序列，包含等位变异。WT蛋白质具有尚未经有意修饰的氨基酸序列或核苷酸序列。
本发明的异源二聚体蛋白通常是分离的或重组的。在用于描述本文所公开的各种多肽时，“分离的”意指已经从表达多肽的细胞或细胞培养物中鉴定并且分离和/或回收的多肽。通常，将通过至少一个纯化步骤来制备分离的多肽。“分离的蛋白质”指基本上不含来自细胞培养物的诸如宿主细胞蛋白等其他蛋白质的蛋白质。“重组”指在外源性宿主细胞中使用重组核酸技术生成的蛋白质。
关于蛋白质序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为，在比对序列并引入缺口(如果必要的话)以实现最大序列同一性百分比之后并且在不将任何保守取代视为序列同一性的一部分的情况下，候选序列中的与特定(亲本)序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。出于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以以本领域的能力范围内的各种方式实现，例如使用可公开获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件实现。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括在进行比较的序列的全长内实现最大比对所需的任何算法。一种特定程序是美国公布号20160244525的[0279]到[0280]段落中所概述的ALIGN-2程序，所述美国专利特此通过引用并入。
本发明的氨基酸序列(“发明序列”)与亲本氨基酸序列之间的同一性的程度被计算为两个序列比对中的精确匹配数除以“发明序列”的长度或亲本序列的长度，以最短者为准。结果以同一性百分比表示。
在一些实施方式中，两个或更多个氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％或90％同一性。在一些实施方式中，两个或更多个氨基酸序列具有至少95％、97％、98％、99％或甚至100％同一性。
本文中的“IL-12p40亚基结构域”意指β链(p40亚基；IL-12p40)。如本文所讨论的，IL-12p40亚基结构域可以是野生型人序列(例如，来自图1的SEQ ID NO:3)、野生型人成熟形式序列(例如，来自图1的SEQ ID NO:4)或其变体，如下文更全面地讨论(例如，参见例如图20、23和29)。
本文中的“IL-12p35亚基结构域”意指α-链(p35亚基；IL-12p35)。如本文所讨论的，IL-12p35亚基结构域可以是野生型人全长序列(例如来自图1的SEQ ID NO:1)、野生型人成熟形式序列(例如来自图1的SEQ ID NO:2)或其变体，如下面更充分讨论的(例如，参见图20、23和29)。
当本发明的IL-12亚基结构域缔合在一起时，其与包括IL-12受体β1和IL-12受体β2的二聚体IL-12受体复合物特异性结合。可以在相互作用的解离常数(KD)方面表达特异性结合的强度或亲和力，其中更小的KD表示更大的亲和力并且更大的KD表示更小的亲和力。结合特性可以通过本领域众所周知的方法来确定，如生物层干涉法和基于表面等离振子共振的方法，包含Biacore和Octet方法。一种这样的方法需要测量抗原结合位点/抗原或受体/配体复合物缔合和解离的速率，其中速率取决于复合物配偶体的浓度、相互作用的亲和力以及在两个方向上同等地影响速率的几何参数。因此，可以确定缔合速率(ka)和解离速率(kd)两者，并且kd/ka的比率等于解离常数KD(参见Nature 361:186-187(1993)和Davies等人(1990)Annual Rev Biochem 59:439-473)，所述两个文献通过引用以其针对其中的方法全文并入本文。
特定分子的特异性结合可以例如通过针对配体(在这种情况下通常为受体)的KD为以下的分子来表现：至少约10-4M、至少约10-5M、至少约10-6M、至少约10-7M、至少约10-8M、至少约10-9M、可替代地至少约10-10M、至少约10-11M、至少约10-12M或更大。典型地，与其受体特异性地结合的分子的KD将是对照分子相对于受体的KD的20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5,000倍、10,000倍或更多倍。
而且，特定分子的特异性结合可以例如通过针对配体或受体的ka或缔合速率为以下的分子来表现：针对相对于对照物的受体大至少20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5,000倍、10,000倍或更多倍。
本文中“融合”或“共价连接”指如本文所概述，组分(例如，IL-12亚基和Fc结构域)通过肽键直接或经由结构域接头间接连接。
如本文所用，术语“单链”是指包括通过肽键线性连接的氨基酸结构域的分子。在某些实施方式中，生物功能IL-12是单链IL-12复合物或“scIL-12”，即IL-12p35亚基和IL-12p40亚基单体结构域融合以形成单个肽链。在特定的此类实施方式中，IL-12p35亚基的C末端与IL-12p40亚基的N末端连接，指定为“scIL-12(p35/p40)”。在一些情况下，IL-12p35亚基的C末端直接连接到IL-12p40亚基的N末端。在其他情况下，IL-12p35亚基的C末端通过接头连接到IL-12p40亚基的N末端。
在另一个特定的此类实施方式中，IL-12p40亚基的C末端与IL-12p35亚基的N末端连接，指定为“scIL-12(p40/p35)”。在某些情况下，IL-12p40亚基的C末端直接连接到IL-12p35亚基的N末端。在其他情况下，IL-12p40亚基的C末端通过接头连接到IL-12p35亚基的N末端。另外，当这些复合物进一步融合到Fc结构域时，其仍然是“单链”。应注意的是，其中p35和p40亚基位于同一氨基酸链上的这些单链构建体仍然是含有两个氨基酸链的异源二聚体复合物的一部分(例如，scIL-12(p35/p40)组分和“空臂(empty arm)”Fc组分)。换句话说，存在组成异源二聚体复合物的两条单链。
本发明的融合蛋白可以采取多种形式，包含异源二聚体形式，如图79A-79E所描绘的那些。如上所述，这些图中描绘的IL-12p35和IL-12p40亚基可以互换。
III.异源二聚体Fc融合蛋白
在一些方面中，本发明涉及包含抗原结合结构域、Fc区的靶向异源二聚体Fc融合蛋白，所述Fc区通常(任选地通过结构域接头)与一个或多个不同的IL-12蛋白质结构域连接。在一方面中，异源二聚体Fc融合蛋白是IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，包含处于不同取向的IL-12p40和IL-12p35亚基，使得其一起存在以与IL-12Rβ1/β2的IL-12受体复合物结合。Fc结构域可以来源于IgG Fc结构域，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc结构域，其中IgG1和IgG4 Fc结构域在本发明中特别有用。如本文所述，IgG1 Fc结构域可通常但不总是与消融变体结合使用以消融效应子功能。类似地，当期望低效应子功能时，可使用IgG4 Fc结构域。
如本文所述和本领域已知的，本发明的靶向IL-12异源二聚体蛋白包含不同结构域，其也可以重叠。这些结构域包含但不限于Fc结构域、CH2结构域、CH3结构域和铰链结构域、IL-12p40亚基结构域和IL-12p35亚基结构域。如本文所描述的，这些结构域以不同的形式连接在一起，如图79A-79E所概述的。
在本文中的一些实施方式中，当蛋白质片段，例如，IL-12p40或IL-12p35与Fc结构域连接时，蛋白质片段的C末端与Fc结构域的铰链的全部或部分连接；例如，其通常与作为IgG1铰链的开始的序列EPKS连接。在本文中的其它实施方式中，当蛋白质片段，例如，IL-12p40或IL-12p35与Fc结构域连接时，蛋白质片段的N末端与CH3结构域的C末端连接。
在Fc结构域蛋白的本文概述的一些构建体和序列中，IL-12p40或IL-12p35蛋白片段的C末端连接至结构域接头的N末端，结构域接头的C末端连接至恒定Fc结构域的N末端(N-IL-12p40或IL-12p35蛋白片段-接头-Fc结构域-C)，尽管其可以转换(N-Fc结构域-接头-IL-12p40或IL-12p35蛋白片段-C)。在本文概述的其它构建体和序列中，第一蛋白质片段的C末端与第二蛋白质片段的N末端连接，任选地通过结构域接头，第二蛋白质片段的C末端与恒定Fc结构域的N末端连接，任选地通过结构域接头。在又另一个构建体中，第一蛋白质片段的N末端与第二蛋白质片段的C末端连接，任选地通过结构域接头，第二蛋白质片段的N末端与恒定Fc结构域的C末端连接，任选地通过结构域接头。在本文概述的又其它构建体和序列中，提供了未与第一蛋白质片段或第二蛋白质片段连接的恒定Fc结构域。异源二聚体Fc融合蛋白可含有两种或更多种本文所述的例示性单体Fc结构域蛋白。
在一些实施方式中，接头是“结构域接头”，其用于将如本文概述的任何两个结构域连接在一起，其中一些描绘于图6中。虽然可以使用任何合适的接头，但许多实施方式利用甘氨酸-丝氨酸聚合物，包括例如(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)n和(GGGS)n，其中n是至少一的整数(并且通常为0到1到2到3到4到5)以及允许具有足够的长度和柔性的两个结构域重组连接的任何肽序列以允许各结构域保留其生物学功能。在一些情况下，并且注意“链型”，如下文所概述，接头是带电荷的结构域接头。在一些实施方式中，结构域接头利用甘氨酸-丝氨酸聚合物，包括例如(GA)n、(GAGGA)n、(GGGGA)n和(GGGA)n，其中n是至少一的整数(并且通常为0到1到2到3到4到5到6到7到8到9到10)以及允许具有足够的长度和柔性的两个结构域重组连接的任何肽序列以允许各结构域保留其生物学功能。图6中描绘了结构域接头的说明性实施方式。先前已经报道Fc融合蛋白中Gly-Ser接头中的丝氨酸残基可能会发生O-糖基化。在一些情况下，包含Gly-Ala的结构域接头在制造或产生Fc融合物的背景下的降低了异质性。
因此，在一些实施方式中，本发明提供异源二聚体Fc融合蛋白，其依赖于使用两种不同的重链变体Fc序列，其将自组装以形成异源二聚体Fc结构域融合多肽。在一个实施方式中，异二聚Fc融合蛋白含有至少两个恒定结构域，所述至少两个恒定结构域可以被工程化以产生异源二聚体，如pI工程化。可以使用的其它Fc结构域包括含有已经过pI工程化的本发明的CH1、CH2、CH3和铰链结构域中的一个或多个的片段。具体地，图8A-8F中所描绘的形式是异源二聚体Fc融合蛋白，意味着蛋白具有两个缔合的Fc序列，所述序列自组装成异源二聚体Fc结构域和至少一个蛋白片段(例如，1、2或更多个蛋白片段)。在一些情况下，第一蛋白质片段连接至第一Fc序列，并且第二蛋白质片段连接至第二Fc序列。在一些情况下，异源二聚体Fc融合蛋白含有第一蛋白片段，所述第一蛋白片段连接至第二蛋白片段，所述第二蛋白片段接至第一Fc序列；以及第二Fc序列，所述第二Fc序列不连接至第一蛋白片段或第二蛋白片段。
本发明涉及用于提供允许与一个或多个结合配偶体、配体或受体结合的异源二聚体Fc融合蛋白的新颖构建体。异源二聚体Fc融合构建体基于抗体的重链的两个Fc结构域(例如，组装成“二聚体”的两个“单体”)的自组装性质。通过改变如下面更充分讨论的每种单体的氨基酸序列来制备异源二聚体Fc融合物。因此，本发明总体上涉及产生异二聚Fc融合蛋白，所述异二聚Fc融合蛋白可以以若干方式共同接合一个或多个结合配偶体或一个或多个配体或一个或多个受体，这依赖于恒定区中的在每个链上有所不同的促进异源二聚体形成和/或允许相比于同源二聚体易于纯化异源二聚体的氨基酸变体。存在多种机制可以用于生成本发明的异源二聚体。另外，如本领域技术人员将了解的，这些机制可以组合以确保高异源二聚化。因此，导致异源二聚体产生的氨基酸变体被称为“异源二聚化变体”。如下文所讨论的，异源二聚化变体可以包括空间变体(例如，下文所描述的“旋钮与孔(knobsand holes)”或“偏斜”变体和下文所描述的“电荷对”)以及“pI变体”，这允许纯化同源二聚体远离异源二聚体。如在特此通过引用以其全文并入的WO2014/145806中通常描述的，并且具体如下文所讨论的“异源二聚化变体”，异源二聚化的有用机制包括“旋钮与孔”(“KIH”；有时在本文描述为“偏斜”变体(参见WO2014/145806中的讨论))、如WO2014/145806中所描述的“静电转向”或“电荷对”、如WO2014/145806中所描述的pI变体以及如WO2014/145806以及下文中所概述的一般另外的Fc变体。
在本发明中，存在可以使纯化异源二聚体蛋白和抗体变得容易的若干种基本机制；一种机制依赖于使用pI变体，使得每个单体以及随后每个二聚体物类具有不同pI，从而允许等电纯化A-A、A-B和B-B二聚体蛋白。可替代地，一些形式也允许基于大小的分离。如下文中进一步概述的，还可能相比于同源二聚体“偏斜”异源二聚体的形成。因此，空间异源二聚化变体和pI或电荷对变体的组合特别用于本发明。
通常，特别用于本发明的实施方式依赖于包括偏斜变体的变体组，所述偏斜变体相比于同源二聚化形成鼓励异源二聚化形成、与pI变体偶联，所述pI变体增加两个单体与每个二聚体物类之间的pI差。
另外，如下文更全面地概述的，取决于异源二聚体Fc融合蛋白的形式，pI变体可以包含在单体的恒定结构域和/或Fc结构域内，或可以使用结构域接头。也就是说，本发明提供了在单体中的一个或两个单体和/或带电结构域接头上的pI变体。另外，用于替代性功能的另外的氨基酸工程化还可赋予pI变化，如Fc、FcRn和KO变体。
在将pI用作分离机制以允许纯化异源二聚体蛋白的本发明中，可以将氨基酸变体引入到单体多肽中的一个或两个中；也就是说，可以使单体之一(为了简单起见，在本文称为“单体A”)的pI工程化远离单体B，或者单体A和单体B两者均可以随着单体A的pI增加和单体B的pI降低而改变。如所讨论的，任一个单体或两个单体的pI变化可以通过以下进行：去除或添加带电荷残基(例如，由带正电荷的氨基酸残基或带负电荷的氨基酸残基替代中性氨基酸，例如，谷氨酰胺到谷氨酸)、将带电荷残基从带正电或带负电改变为相反电荷(例如，天冬氨酸到赖氨酸)或将带电荷残基改变为中性残基(例如，电荷损失；赖氨酸到丝氨酸)。多种这些变体在附图中示出。
因此，本发明的这个实施方式提供了产生单体中的至少一个单体的充分pI变化，从而使得异源二聚体可以与同源二聚体分离。如本领域技术人员将了解的并且如下文中进一步讨论的，这可以通过以下来完成：使用“野生型”重链恒定区和已经工程化以增大或减小其pI的变体区(wt A:B+或wt A:B-)或增大一个区并减小另一个区(A+:B-或A-:B+)。
因此，通常，本发明的一些实施方式的组分是恒定区中的氨基酸变体，所述氨基酸变体涉及通过将氨基酸取代(“pI变体”或“pI取代”)并入到单体中的一个或两个单体中来更改二聚体蛋白的单体中的至少一个单体(如果不是两个单体的话)的等电点(pI)。异源二聚体与两个同源二聚体的分离可以在两个单体的pI相差少至0.1个pH单位时完成，其中0.2、0.3、0.4和0.5或更多个pH单位均可用于本发明。
如本领域技术人员将了解的，每一个或两个单体上要包括的用于得到良好分离的pI变体数量将部分地取决于组分的起始pI。也就是说，为了确定对哪个单体进行工程化或处于哪个“方向”(例如，更具阳性或更具阴性)，计算Fc结构域的序列，并且在一些情况下，计算与Fc结构域连接的一个或多个蛋白质结构域，并据此做出决定。如本领域已知的，不同的Fc结构域和/或蛋白质结构域将具有用于本发明中的不同起始pI。通常，如本文所概述的，pI被工程化以使各个单体的总pI差为至少约0.1log，如本文所概述的优选的是0.2到0.5。
此外，如本领域技术人员将了解的并且如本文所概述的，在一些实施方式中，可以基于大小来使异源二聚体与同源二聚体分离。如图所示，例如，若干种形式允许基于大小来分离异源二聚体和同源二聚体。
在pI变体用于实现异源二聚化的情况下，通过使用一个或多个Fc结构域的一个或多个恒定区，提供了用于设计和纯化异源二聚体Fc融合蛋白的更模块化的方法。因此，在一些实施方式中，异源二聚化变体(包括偏斜和纯化异源二聚化变体)必须被工程化。另外，在一些实施方式中，通过从不同的IgG同种型输入pI变体，由pI变体造成免疫原性的可能性显著降低，使得在未引入显著免疫原性的情况下改变pI。因此，要解决的另一个问题是阐明具有高人序列含量的低pI恒定结构域，例如最小化或避免任何特定位置处的非人残基。
可与此pI工程化一起发生的附加益处同样是血清半衰期的延长和FcRn结合的增加。也就是说，如USSN 13/194,904(以引用方式以其全文并入)中所描述的，降低抗体恒定结构域(包括在抗体和Fc融合物中找到的那些)的pI可能导致血清保留在体内的时间更长。具有增加的血清半衰期的这些pI变体也促进pI变化以进行纯化。
另外，应注意，异源二聚化变体的pI变体给予了Fc融合蛋白的分析和质量控制过程另外的益处，因为在同源二聚体存在时消除、最小化和进行区分的能力是显著的。类似地，能够可靠地测试异源二聚体Fc融合蛋白产生的可重现性很重要。
A.异源二聚化变体
本发明提供了包括呈各种形式的异源二聚体Fc融合蛋白的异源二聚体蛋白，所述异源二聚体蛋白利用异源二聚体变体以允许异源二聚体形成和/或远离同源二聚体而纯化。异源二聚体融合构建体基于两个Fc结构域的自组装性质，例如，组装成“二聚体”的两个“单体”。
存在适合的多对异源二聚化偏斜变体组。这些变体以成“对”的“组”出现。也就是说，所述对中的一组并入第一单体中并且所述对中的另一组并入第二单体中。应注意，这些组不一定表现为“孔中旋钮”变体，一个单体上的残基与另一个单体上的残基一一对应；也就是说，这些对组形成了两个单体之间的界面，所述界面鼓励异源二聚体形成并且不鼓励同源二聚体形成，从而允许在生物学条件下自发形成的异源二聚体的百分比超过90％，而非预期的50％(25％同源二聚体A/A:50％异源二聚体A/B:25％同源二聚体B/B)。
B.空间变体
在一些实施方式中，可以通过添加空间变体来促进异源二聚体形成。换句话说，通过改变每个重链中的氨基酸，相比于与相同的Fc氨基酸序列形成同源二聚体，不同的重链更有可能缔合形成异源二聚体结构。合适的空间变体包含在USSN 15/141,350的图29中以及图2中，所有所述文献特此通过引用以其全文并入。
一种机制在本领域通常称为“旋钮和孔”，是指形成空间影响以利于异源二聚体形成和不利于同源二聚体形成的氨基酸工程化，如在USSN 61/596,846,Ridgway等人,Protein Engineering 9(7):617(1996)；Atwell等人,J.Mol.Biol.1997 270:26；美国专利第8,216,805号中所述，所有这些都以引用方式全文并入本文中。附图标识了许多依赖于“旋钮和孔”的“单体A-单体B”对。另外，如Merchant等人,Nature Biotech.16:677(1998)中所述，这些“旋钮和孔”突变可以与二硫键组合以偏斜形成异源二聚化。
用于产生异源二聚体的另一种机制有时称为“静电转向”，如Gunasekaran等人,J.Biol.Chem.285(25):19637(2010)中所述，所述文献以引用方式全文并入本文中。这在本文有时被称为“电荷对”。在此实施方式中，静电用于使形成朝着异源二聚化偏斜。如本领域的技术人员将理解的，这些电荷对还可能影响pI并因此影响纯化，并且因此在一些情况下还可以被视为pI变体。然而，由于这些是为了强制发生异源二聚化而生成并且不是作为纯化工具使用，因此其被分类为“空间变体”。这些包括但不限于D221E/P228E/L368E与D221R/P228R/K409R配对(例如，这些是“单体”对应组)和C220E/P228E/368E与C220R/E224R/P228R/K409R配对。
其它单体A和单体B变体可以任选且独立地以任何量与其它变体(如本文中概述的pI变体或US 2012/0149876的图37中所示的其它空间变体，其全部以引用方式明确并入本文中)组合。
在一些实施例中，本文所概述的空间变体可以任选且独立地与任何pI变体(或其它变体，如Fc变体、FcRn变体等)并入到一个或两个单体中，并且可以独立且任选地包含在本发明的蛋白质中或并不包含在内。
合适的偏斜变体的列表在图2中找到。在多个实施方式中，特别适用的组中的对，其包含但不限于S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K；L368E/K370S:S364K；T411E/K360E/Q362E:D401K；L368D/K370S:S364K/E357L、K370S:S364K/E357Q和T366S/L368A/Y407V:T366W(任选地包括二硫桥键，T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C)。就命名法而言，对“S364K/E357Q:L368D/K370S”意指单体中的一者具有双变体组S364K/E357Q并且另一者具有双变体组L368D/K370S；如上文所述，这些对的“链型”取决于起始pI。
C.异源二聚体的pI(等电点)变体
通常，如本领域技术人员将了解的，存在两种一般类别的pI变体：增大蛋白质的pI(碱性变化)的变体和减小蛋白质的pI(酸性变化)的变体。如本文所描述的，可以使用这些变体的所有组合：一个单体可以属于野生型或是不显示出与野生型显著不同的pI的变体，并且另一个可以更具碱性或更具酸性。可替代地，可改变各单体，一个更具碱性且一个更具酸性。
pI变体的优选组合在USSN 15/141,350的图30中示出，所有这些文献都以引用的方式全文并入本文中。如本文所概述和附图中所示，这些变化相对于IgG1示出，但所有同种型可以这种方式改变，以及同种型杂合体。在重链恒定结构域来自IgG2-4的情况下，也可以使用R133E和R133Q。
在一个实施方式中，如果Fc单体中的一个包括CH1结构域，那么pI变体的优选组合具有包含208D/295E/384D/418E/421D变体(当相对于人IgG1时为N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D)的一个单体。在一些例子中，第二单体包含带正电荷的结构域接头，包括(GKPGS)4。在一些情况下，第一单体包括CH1结构域，包括位置208。因此，在不包括CH1结构域的构建体中(例如对于在其中一个结构域上不利用CH1结构域的异源二聚体Fc融合蛋白)，优选的负pI变体Fc组包括295E/384D/418E/421D变异(当相对于人IgG1时为Q295E/N384D/Q418E/N421D)。
在一些实施方式中，在Fc结构域的铰链中进行突变，包括位置216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229和230。因此，pI突变以及特别地取代可以在位置216-230中的一个或多个位置中进行，其中1、2、3、4或5个突变可用于本发明中。同样，设想了单独或与其它结构域中的其它pI变体一起的所有可能的组合。
可用于降低铰链结构域的pI的具体取代包括但不限于221位处的缺失、222位处的非天然缬氨酸或苏氨酸、223位处的缺失、224位处的非天然谷氨酸、225位处的缺失、235位处的缺失，以及236位处的缺失或非天然丙氨酸。在一些情况下，仅在铰链结构域中进行pI取代，并且在其它情况下，这些取代以任何组合添加至其它结构域中的其它pI变体。
在一些实施方式中，可以在CH2区域中进行突变，包括位置233、234、235、236、274、296、300、309、320、322、326、327、334和339。应该注意，可以进行233-236的改变以增加IgG2主链中的效应子功能(以及327A)。同样，可以对这14个位置进行所有可能的组合；例如，pI抗体可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个CH2 pI取代。
可用于降低CH2结构域的pI的具体取代包括但不限于：位置274处的非天然谷氨酰胺或谷氨酸、位置296处的非天然苯丙氨酸、位置300处的非天然苯丙氨酸、位置309处的非天然缬氨酸、位置320处的非天然谷氨酸、位置322处的非天然谷氨酸、位置326处的非天然谷氨酸、位置327处的非天然甘氨酸、位置334处的非天然谷氨酸、位置339处的非天然苏氨酸，以及CH2内的和与其它结构域的所有可能组合。
在这个实施方式中，突变可以独立且任选地选自位置355、359、362、384、389、392、397、418、419、444和447。可用于降低CH3结构域的pI的具体取代包括但不限于：位置355处的非天然谷氨酰胺或谷氨酸、位置384处的非天然丝氨酸、位置392处的非天然天冬酰胺或谷氨酸、位置397处的非天然甲硫氨酸、位置419处的非天然谷氨酸、位置359处的非天然谷氨酸、位置362处的非天然谷氨酸、位置389处的非天然谷氨酸、位置418处的非天然谷氨酸、位置444处的非天然谷氨酸，以及位置447处的缺失或非天然天冬氨酸。
D.同种型变体
另外，本发明的许多实施方式依赖于特定位置处的pI氨基酸从一个IgG同种型到另一个的“输入”，由此降低或消除将不想要的免疫原性引入变体中的可能性。许多这些在美国公开申请号2014/0370013的图21中示出，该美国公开申请以引用方式并入本文中。即，IgG1是治疗性抗体的常见同种型，其原因有多种，包括高效应子功能。然而，IgG1的重链恒定区具有比IgG2的重链恒定区更高的pI(8.10相对于7.31)。通过将特定位置的IgG2残基引入IgG1主链中，使得所得单体的pI降低(或提高)且另外展现出较长的血清半衰期。例如，IgG1在位置137处具有甘氨酸(pI5.97)，并且IgG2具有谷氨酸(pI3.22)；输入谷氨酸将影响所得蛋白质的pI。如下文所述，通常需要许多氨基酸取代来显著影响变体Fc融合蛋白的pI。然而，应该注意，如下文所论述，即使IgG2分子的变化也允许增加血清半衰期。
在其它实施方式中，进行非同种型氨基酸变化，以减少所得蛋白质的总电荷状态(例如通过将更高的pI氨基酸变为更低的pI氨基酸)，或允许在结构中调节稳定性等等，如下文更进一步描述。
另外，通过pI工程化重恒定结构域和轻恒定结构域两者，可以看到异源二聚体的每个单体的显著变化。如本文所讨论的，使两个单体的pI相差至少0.5可以通过离子交换色谱法或等电聚焦或对等电点敏感的其它方法进行分离。
E.计算pI
每个单体的pI可以取决于变体重链恒定结构域的pI和总单体的pI，所述总单体包括变体重链恒定结构域和融合配偶体。因此，在一些实施方式中，使用美国公开申请号2014/0370013中的图19的图表，基于变体重链恒定结构域来计算pI变化。如本文所讨论的，要工程化哪个单体通常由每个单体的固有pI来决定。
F.还赋予了更好的FcRn体内结合的pI变体
在pI变体减小单体的pI的情况下，其可以具有提高体内血清固位的附加益处。
虽然仍在审查中，但是据信，Fc区在体内具有较长的半衰期，因为在核内体中以pH6与FcRn的结合螯合了Fc(Ghetie和Ward,1997Immunol Today.18(12):592-598，所述文献特此通过引用整体并入)。随后核内体隔室使Fc再循环到细胞表面。一旦隔室向胞外空间打开，则约7.4的较高pH诱导将Fc释放回到血液中。在小鼠中，Dall'Acqua等人显示了，在pH为6和pH为7.4时具有增加的FcRn结合的Fc突变体实际上具有降低的血清浓度和与野生型Fc相同的半衰期(Dall'Acqua等人,2002,J.Immunol.169:5171-5180，所述文献通过引用整体并入)。据认为，在pH为7.4时FcRn的Fc的增加的亲和力阻止将Fc释放回到血液中。因此，将增加Fc体内半衰期的Fc突变理想地将增强较低pH下的FcRn结合，同时仍允许Fc在较高pH下释放。在6.0至7.4的pH范围内，氨基酸组胺酸改变了其电荷状态。因此，在Fc/FcRn复合物中的重要位置找到His残基并不出乎意料。
许多Fc取代，其发现可用于增加与FcRn的结合和增加血清半衰期，如具体公开于USSN 12/341,769中，其以引用的方式全文并入本文中，包括但不限于434S、434A、428L、308F、259I、428L/434S、259I/308F、436I/428L、436I、252Y/428L、252Y/434S、428L/434S、436V/428L和259I/308F/428L。
G.用于额外功能的额外Fc变体
除了pI氨基酸变体之外，存在出于各种原因可以进行的许多有用的Fc氨基酸修饰，包括但不限于更改与一个或多个FcγR的结合、与FcRn的更改结合等。
因此，本发明的蛋白质可以包括氨基酸修饰，包括本文所概述的异源二聚化变体，所述异源二聚化变体包括pI变体和空间变体。每组变体可以独立且任选地包括在任何特定异源二聚体蛋白中或不包括在内。
H.FcγR变体
因此，存在可以更改与Fcγ受体中的一个或多个的结合而进行的多个有用Fc取代。导致增加的结合以及减少的结合的取代可以是有用的。例如，已知与FcγRIIIa的结合增加引起ADCC增加(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性；细胞介导的反应，其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上所结合的抗体且随后造成靶细胞溶解)。类似地，在一些情况下，与FcγRIIb(一种抑制性受体)的结合减少也可能是有利的。可以用于本发明中的氨基酸取代包括USSN 11/124,620(特别是图41)、USSN 11/174,287、USSN 11/396,495、USSN11/538,406中列出的那些，其均明确地以引用方式整体并入本文中并且特别是针对其中公开的变体。可以使用的特定变体包括但不限于236A、239D、239E、332E、332D、239D/332E、267D、267E、328F、267E/328F、236A/332E、239D/332E/330Y、239D、332E/330L、243A、243L、264A、264V和299T。
另外，增加对FcγRIIc的亲和力的氨基酸取代也可包括在本文概述的Fc结构域变体中。在例如USSN 11/124,620和14/578,305中描述的取代是有用的。
I.消融变体
类似地，另一类功能变体是“FcγR消融变体”或“Fc敲除(FcKO或KO)”变体。在这些实施方式中，对于一些治疗应用，期望减少或去除Fc结构域与一种或多种或所有Fcγ受体(例如FcγR1、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa等)的正常结合，以避免其它作用机制。即，例如，在许多实施方式中，特别是在使用免疫调节蛋白时，期望消融FcγRIIIa结合以消除或显著降低ADCC活性，使得一个Fc结构域包含一个或多个Fcγ受体消融变体。这些消融变体在USSN 15/141,350的图31中描绘，所有文献以全文引用的方式并入本文中，并且每一个都可以独立地和任选地被包括或排除，其中优选的方面利用选自由以下组成的组的消融变体：G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G和E233P/L234V/L235A/G236del。应该注意，本文提及的消融变体消融FcγR结合，但通常不消融FcRn结合。
J.异源二聚体变体和Fc变体的组合
如本领域技术人员将了解的，所有所列举的异源二聚化变体(包括偏斜变体和/或pI变体)可以以任何方式任选且独立地组合，只要其保持其“链型”或“单体分隔”即可。另外，所有这些变体可以组合成异源二聚化形式中的任一种异源二聚化形式。
在pI变体的情况下，虽然附图中示出了特别有用的实施方式，但是可以遵循改变两个单体之间的pI差以促进纯化的基本规则，以生成其它组合。
另外，任何异源二聚化变体、偏斜和pI也可独立且任选地与如本文一般概述的Fc消融变体、Fc变体、FcRn变体组合。
另外，单体Fc结构域可包含一组氨基酸取代，该一组氨基酸取代包括C220S/S267K/L368D/K370S或C220S/S267K/S364K/E357Q。
另外，异源二聚体Fc融合蛋白可包含偏斜变体(例如，如USSN 15/141,350的图1A-1C中所示的一组氨基酸取代，所有文献以全文引用的方式并入本文中)，其中特别有用的偏斜变体选自由以下组成的组：S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K；L368E/K370S:S364K；T411E/K360E/Q362E:D401K；L368D/K370S:S364K/E357L；K370S:S364K/E357Q；T366S/L368A/Y407V:T366W；和T366S/L368A/Y407V:T366W(任选地包括二硫桥键，T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C)、任选的消融变体、任选的带电荷的结构域接头；和任选的pI变体。
在一些实施方式中，Fc结构域包含选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：根据EU索引的236R、S239D、S239E、F243L、M252Y、V259I、S267D、S267E、S67K、S298A、V308F、L328F、L328R、330L、I332D、I332E、M428L、N434A、N434S、236R/L328R、S239D/I332E、236R/L328F、V259I/V308F、S267E/L328F、M428L/N43S、Y436I/M428L、N436V/M428L、V436I/N434S、Y436V/N434S、S239D/I332E/330L、M252Y/S54T/T256E、V259I/V308F/M428L、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_/S267K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_以及E233P/L234V/L235A/G236_/S267K。
在一个实施方式中，可用于本发明的偏斜和pI变体的特定组合是T366S/L368A/Y407V:T366W(任选地包括二硫桥键，T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C)，其中一种单体包含Q295E/N384D/Q418E/N481D并且另一单体包含带正电荷的结构域接头。如本领域将理解的，“孔包旋钮(knobs in holes)”变体不改变pI，并且因此可用于任一单体上。
IV.白介素12
本发明涉及白介素12的生物学功能形式。如上所述，白介素12或“IL-12”的生物功能形式是异源二聚体，由IL-12p35亚基(IL-12亚基α)和IL-12p40亚基(IL-12亚基β)构成，在此被指定为“IL-12异源二聚体复合物”。此复合物可以以两种不同的形式使用。如图8A-B所示，IL-12p40亚基和IL-12p35亚基彼此不是共价连接，而是与组装作为异源二聚体的第一Fc结构域和第二Fc结构域分别共价连接。可替代地，可以任选地使用(如本文所描述的)结构域接头共价连接IL-12p35和IL-12p40亚基，如图8C-F通常所示，在此被指定为单链IL-12复合物或“scIL-12”。scIL-12中两个亚基的顺序可以指定如下：“scIL-12(p40/p35)”，其中IL-12p40亚基(使用或者不使用结构域接头)在N末端与IL-12p35亚基连接，或“scIL-12(p35/p40)”，其中IL-12p35(使用或者不使用结构域接头)在N末端与IL-12p40亚基连接。
在一些实施方式中，人IL-12p35蛋白具有在NCBI参考序列编号NP_000873.2、NP_001341511.1或NP_001341512.1，或SEQ ID NO:1(如图1所描绘的人IL-12亚基α(IL-12p35)前体序列)中列出的氨基酸序列。在一些情况下，人IL-12p35的编码序列在NCBI参考序列中列出。编号NM_000882.3.、NM_001354582.2或NM_001354583.2。本文概述的Fc融合异源二聚体蛋白的示例性IL-12p35蛋白可以具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列(如图1所描绘的人IL-12亚基α(IL-12p35)成熟形式序列)或SEQ ID NO:1的氨基酸23-219。在一些实施例中，IL-12p35蛋白与SEQ ID NO:2具有至少90％，例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性。Fc融合蛋白的IL-12p35亚基可以具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸突变。
在一些实施方式中，人IL-12p40蛋白具有在NCBI参考序列编号NP_002178.2或SEQID NO:3(如图1所描绘的人IL-12亚基β(IL-12p40)前体序列)中列出的氨基酸序列。在一些情况下，人IL-12p40的编码序列在NCBI参考序列编号NM_002187.3中列出。本文概述的Fc融合蛋白的示例性IL-12p40蛋白可以具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列(如图1所描绘的人IL-12亚基β(IL-12p40)成熟形式序列)或SEQ ID NO:3的氨基酸23-328。在一些实施例中，IL-12p40蛋白与SEQ ID NO:4具有至少90％，例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性。Fc融合蛋白的IL-12p40亚基可以具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸突变。
本发明还提供了变体IL-12p40亚基和变体IL-12p35亚基。这些变体可用作本文所述的生物功能IL-12复合物以及IL-12-Fc融合物中的任何融合物的一部分。图21A-图21G、图66A-图66C和图89A-89C中提供了示例性变体IL-12p40亚基及其氨基酸序列。图24A-图24C中提供了示例性变体IL-12p35亚基及其氨基酸序列。
A.表达变体
作为引文，本发明的IL-12p40和IL-12p35亚基还包括用于去除旨在减少异质性的潜在的N-糖基化位点的变体。本文所述的IL-12p40和/或IL-12p35变体可包括一种或多种去糖基化(也称为去糖基化(aglycosylation))取代或修饰。
IL-12p40上可引入氨基酸修饰的此类潜在N-糖基化位点包括一个或多个选自N103、N113、N200和N281组成的组的取代(根据如图1所描绘的人IL-12亚基β(IL-12p40)成熟形式序列)。在这些位点的说明性修饰包括一个或多个选自由N103D、N103Q、N113D、N113Q、N200D、N200Q、N281D和N218Q组成的组的取代。IL-12p40表达变体可在这些位点包括一个或多个修饰。在一个实施方式中，IL-12p40变体包含N103D。在一个实施方式中，IL-12p40变体包含N103Q。在一个实施方式中，IL-12p40变体包含N113D。在一个实施方式中，IL-12p40变体包含N113Q。在一个实施方式中，IL-12p40变体包含N200D。在一个实施方式中，IL-12p40变体包含N200Q。在一个实施方式中，IL-12p40变体包含N281D。在一个实施方式中，IL-12p40变体包含N281Q。在一个实施方式中，IL-12p40变体包含N103D/N113D。在一个实施方式中，IL-12p40变体包含N103D/N113D/N200D。在一个实施方式中，IL-12p40变体包含N103D/N113D/N281D。在一个实施方式中，IL-12p40变体包含N103D/N200D。在一个实施方式中，IL-12p40变体包含N103D/N200D/N281D。在一个实施方式中，IL-12p40变体包含N103D/N281D。在一个实施方式中，IL-12p40变体包含N103D/N113D/N200D/N281D。在一个实施方式中，IL-12p40变体包含N103Q/N113Q。在一个实施方式中，IL-12p40变体包含N103Q/N113Q/N200Q。在一个实施方式中，IL-12p40变体包含N103Q/N113Q/N281Q。在一个实施方式中，IL-12p40变体包含N103Q/N200Q。在一个实施方式中，IL-12p40变体包含N103Q/N200Q/N281Q。在一个实施方式中，IL-12p40变体包含N103Q/N281Q。在一个实施方式中，IL-12p40变体包含N113D/N200D。在一个实施方式中，IL-12p40变体包含N113D/N200D/N281D。在一个实施方式中，IL-12p40变体包含N113D/N281D。在一个实施方式中，IL-12p40变体包含N113Q/N200Q。在一个实施方式中，IL-12p40变体包含N113Q/N281Q。在一个实施方式中，IL-12p40变体包含N113Q/N200Q/N281Q。在一个实施方式中，IL-12p40变体包含N103Q/N113Q/N200Q/N281Q。在一个实施方式中，IL-12p40变体包含N200D/N281D。在一个实施方式中，IL-12p40变体包含N200Q/N281Q。这些修饰可以单独使用或者与其它任何IL-12p40变体(如亲和力变体)组合使用。
IL-12p35上可引入氨基酸修饰的此类潜在N-糖基化位点包括一个或多个选自N71、N85和N195组成的组的取代(根据如图1所描绘的人IL-12亚基α(IL-12p35)成熟形式序列)。在这些位点的说明性修饰包括一个或多个选自由N71D、N71Q、N85D、N85Q、N195D和N195Q组成的组的取代。IL-12p35变体可以在这些位点包括一个或多个修饰。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含N71D。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含N71Q。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含N85D。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含N85Q。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含N195D。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含N195Q。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含N71D/N85D。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含N71Q/N85Q。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含N85D/N195D。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含N85Q/N195Q。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含N71D/N195D。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含N71Q/N195Q。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含N71D/N85D/N195D。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含N71Q/N85Q/N195Q。这些修饰可以单独使用或者与其它任何IL-12p35变体(如亲和力变体)组合使用。
在一些实施方式中，任何靶向IL-12蛋白包括变体IL-12p35亚基，其包含一个或多个(例如，1、2或3)个选自由N71、N85、N195、N71D、N85D、N195D、N71Q、N85Q、N195Q及其任意组合组成的组的去糖基化变体。在一些实施方式中，任何靶向IL-12蛋白包括变体IL-12p40亚基，其包含一个或多个(例如，1、2、3或4)个选自由N103、N113、N200、N281、N103D、N113D、N200D、N281D、N103Q、N113Q、N200Q、N281Q及其任意组合组成的组的去糖基化变体。在一些实施方式中，本文所描述的靶向IL-12蛋白包括野生型IL-2p40亚基和变体IL-12p35亚基，其包含一个或多个(例如，1、2或3)个选自由N71、N85、N195、N71D、N85D、N195D、N71Q、N85Q、N195Q及其任意组合组成的组的去糖基化变体。在一些实施方式中，本文所描述的靶向IL-12蛋白包括野生型IL-12p35亚基并且本文所描述的靶向IL-12蛋白包括变体IL-12p40亚基，其包含一个或多个(例如，1、2、3或4)个选自由N103、N113、N200、N281、N103D、N113D、N200D、N281D、N103Q、N113Q、N200Q、N281Q及其任意组合组成的组的去糖基化变体。在一些实施方式中，本文所描述的靶向IL-12蛋白包括野生型IL-12p35亚基(其包含一个或多个(例如，1、2或3)个选自由N71、N85、N195、N71D、N85D、N195D、N71Q、N85Q、N195Q及其任意组合组成的组的去糖基化变体)和变体IL-12p40亚基(其包含一个或多个(例如，1、2、3或4)个选自由N103、N113、N200、N281、N103D、N113D、N200D、N281D、N103Q、N113Q、N200Q、N281Q及其任意组合组成的组的去糖基化变体)。
IL-12p40亚基在位置252处具有游离半胱氨酸(根据如图1A所描绘的人IL-12亚基β(IL-12p40)成熟形式序列进行编号)，所述半胱氨酸可以与其它游离半胱氨酸结合，至少导致异质性并且导致免疫原性差。因此，例如通过引入C252S修饰(尽管也可以使用其它取代)来工程化IL-12p40变体以去除游离半胱氨酸。C252的修饰(例如，C252S)可以单独使用或者与其它任何IL-12p40变体(如亲和力或表达变体)组合使用。在图65A-65B中描绘了说明性IL-12p40变体，其包括C252处的修饰以去除游离半胱氨酸。用其它变体IL-12p40亚基生成了说明性IL-12-Fc融合蛋白，其序列在图66A-66C中描绘，并如实施例1B中一般描述的那样产生。这些修饰可以单独使用或者与其它任何IL-12p40变体(如亲和力变体)组合使用。
B.亲和力和效力变体
本发明提供了IL-12p40变体和IL-12p35变体，所述变体形成对IL-12受体的结合亲和力发生改变(降低或增加)的生物功能性IL-12。在一些情况下，变体IL-12p40亚基对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变(降低或增加)的结合亲和力。在一些情况下，变体IL-12p35对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变(降低或增加)的结合亲和力。本发明提供了IL-12p40变体和IL-12p35变体，所述变体形成相较于野生型IL-12p40和IL-12p35的发生改变的效力(降低或增加)的生物功能性IL-12。
IL-12p40上可以引入氨基酸修饰的合适位点包括：E3、D7、E12、D14、W15、P17、D18、A19、P20、G21、E22、M23、D29、E32、E33、D34、L40、D41、Q42、S43、E45、L47、T54、I55、Q56、K58、E59、F60、G61、D62、Q65、Y66、E73、K84、E86、D87、G88、I89、W90、D93、D97、K99、E100、K102、N103、K104、F106、E110、N113、Y114、D129、D142、Q144、E156、R159、D161、N162、K163、D166、D170、Q172、D174、A176、C177、P178、A179、A180、E181、S183、P185、E187、N200、S204、F206、R208、D209、D214、N218、Q220、N226、Q229、E231、E235、T242、P243、S245、Y246、F247、S248、Q256、K158、C252、K260、E262、K264、D265、D270、N281、Q289、D290、R291、Y292、Y293和E299(如图1所描绘的根据人IL-12亚基β(IL-12p40)成熟形式序列编码)的任何组合。在这些位点的说明性修饰包括：D18K、D18N、E32Q、E33Q、D34K、D34N、Q42E、S43E、S43K、E45Q、Q56E、E59K、E59Q、D62N、E73Q、D87N、K99E、K99Y、E100Q、N103D、N103Q、N113D、N113Q、Q144E、R159E、D161N、K163E、E187Q、N200D、N200Q、N218Q、Q229E、E235Q、C252S、Q256N、K258E、K260E、E262Q、K264E、N281D、N281Q和E299Q。IL-12p40亲和力变体可以在这些位点中的一个或多个处包括修饰。
IL-12p40亚基在位置252处具有游离半胱氨酸(根据如图1A所描绘的人IL-12亚基β(IL-12p40)成熟形式序列进行编号)，所述半胱氨酸可以与其它游离半胱氨酸结合，至少导致异质性并且导致免疫原性差。因此，例如通过引入C252S修饰(尽管也可以使用其它取代)来工程化IL-12p40变体以去除游离半胱氨酸。C252的修饰(例如，C252S)可以单独使用或者与其它任何IL-12p40变体(如亲和力或表达变体)组合使用。在图65A-65B中描绘了说明性IL-12p40变体，其包括C252处的修饰以去除游离半胱氨酸。用其它变体IL-12p40亚基生成了说明性IL-12-Fc融合蛋白，其序列在图66A-66C中描绘，并如实施例1B中一般描述的那样产生。这些修饰可以单独使用或者与其它任何IL-12p40变体(如亲和力变体)组合使用。
在一些实施方式中，本文所述的靶向IL-12Fc融合物的IL-12p40亚基包含氨基酸取代i)E59K/C252S。在一些实施方式中，IL-12p40亚基包含氨基酸取代E59K/N200Q。在一些实施方式中，IL-12p40亚基包含氨基酸取代E59K/K99E/N200Q。在一些实施方式中，IL-12p40亚基包含氨基酸取代E59K/K99Y/N200Q。在一些实施方式中，IL-12p40亚基包含氨基酸取代E59K/K99E/N200Q/C252S。在一些实施方式中，IL-12p40亚基包含氨基酸取代E59K/K99Y/N200Q/C252S。在一些实施方式中，IL-12p40亚基包含氨基酸取代E59K/K99E/N200Q/K264E。在一些实施方式中，IL-12p40亚基包含氨基酸取代D18K/E59K/K99E/N200Q。在一些实施方式中，IL-12p40亚基包含氨基酸取代D18K/E59K/K99E/C252S。在一些实施方式中，IL-12p40亚基包含氨基酸取代。在一些实施方式中，IL-12p40亚基包含氨基酸取代D18K/E59K/K99E/N200Q/C252S。D18K/E59K/K99E/N200Q/K264E。在一些实施方式中，IL-12p40亚基包含氨基酸取代D18K/E59K/K99E/C252S/K264E。在一些实施方式中，IL-12p40亚基包含氨基酸取代D18K/E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E。
在一个实施方式中，IL-12p40变体包含氨基酸取代D18K/E59K/K99E。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含D18K/E59K/K99E/K264E。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含D18K/E59Y/K99E。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含D18K/E59K/K99E/C252S。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含D18K/E59K/K99E/C252S/K264E。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含E32K/D34N/E59K/K99E。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含E32Q/E59Q。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含E32Q/D34N/E59K/K99E。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含D34N/E59K。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含D34N/E59Q。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含D34N/E59K/K99E。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含D34K/E59K/K99E。在一个实施方式中，IL-12p40变体包含Q42E/E45Q。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含E45Q/Q56E。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含Q42E/E59Q。在又一个实施方式中，IL-12p40变体包含Q56E/E59Q。在又一个实施方式中，IL-12p40变体包含Q42E/Q56E/E59Q。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含E45Q/Q56E/E59Q。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含S43E/E59Q。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含S43K/E49Q。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含E45K/E59K/K99E。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含E59K/K99Y。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含E59K/K99E。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含E59K/K99E/Q144E。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含E59K/K99E/Q144K。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含E59K/K99E/R159E。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含E59K/K99E/K264E。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E。E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含E59Q/K163E。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含E59Q/K99E。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含E59Q/E187Q。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含E59Q/K258E。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含E59Q/K260E。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含E59Y/K99E。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含E59Y/K99Y。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含C252S。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含E59K/K99Y/C252S。E59K/K99E/C252S/K264E。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含E59K/K99E/C252S。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含N103D/N113D。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含N103D/N200D。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含N103D/N281D。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含N113D/N200D。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含N113D/N281D。N200D/N281D。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含N113D/N200D/N281D。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含N103Q。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含N113Q。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含N200Q。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含N281Q。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含N103D/N113D/N200D。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含N103D/N113D/N281D。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含N103D/N200D/N281D。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含N103Q/N113Q。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含N103Q/N200Q。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含N103Q/N281Q。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含N113Q/N200Q。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含N113Q/N281Q。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含N200Q/N281Q。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含N103Q/N113Q/N200Q。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含N103Q/N113Q/N281Q。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含N103Q/N200Q/N281Q。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含N113Q/N200Q/N281Q。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含N103Q/N113Q/N200Q/N281Q。在另一个实施方式中，IL-12p40变体包含N103D/N113D/N200D/N281D。另外，这些修饰可以单独使用或者与其它任何IL-12p40变体(如表达变体)组合使用。IL-12p40变体的示例性氨基酸序列在包括图66A-66C和67A-67N的图中以及序列表中提供。
IL-12p35上可以引入氨基酸修饰的合适位点选自由以下组成的组：任何一个或多个选自以下组成的组：Q20、N21、Q35、E38、S44、E45、E46、H49、K54、D55、T59、V60、E61、C63、L64、P65、E67、L68、N71、S73、C74、L75、N76、E79、N85、F96、M97、L89、L124、M125、Q130、Q135、N136、E143、Q146、N151、E153、K158、E162、E163、D165、I171、R181、I182、R183、V185、T186、D188、R189、V190、S192、Y193和A196(根据图1所描绘的人IL-12亚基α(IL-12p35)成熟形式序列进行编号)。说明性的修饰选自由以下组成的组N21D、Q35D、E38Q、D55Q、D55K、N71D、N71Q、L75A、N76D、E79Q、N85D、N85Q、L89A、F96A、M97A、L124A、M125A、Q130E、Q135E、N136D、E143Q、Q146E、N151D、N151K、E153K、E153Q、K158E、E162Q、E163Q、D165N、I171A、N195D和N195Q。IL-12p35亲和力变体可以在这些位点中的一个或多个处包括修饰。
在一个实施方式中，IL-12p35变体包含氨基酸取代N71D。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含N85D。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含N195D。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含N71D/N85D/N195D。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含E153Q。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含E38Q。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含N151D。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含Q135E。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含Q35D。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含Q146E。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含N76D。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含E162Q。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含E163Q。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含N21D。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含D55Q。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含E79Q。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含Q130E。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含N136D。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含E143Q。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含N151K。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含E153K。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含K158E。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含D165N。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含N151D/E153Q。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含氨基酸取代N151D/D165N。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含Q130E/N151D。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含N151D/K158E。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含E79Q/N151D。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含D55Q/N151D。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含N136D/N151D。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含N21D/N151D。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含E143Q/N151D。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含F96A。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含M97A。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含L89A。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含L124A。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含M125A。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含L75A。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含I171A。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含N71Q。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含N85Q。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含N195Q。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含N71Q/N85Q。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含N71W/N195Q。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含N85Q/N195Q。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含N71Q/N85Q/N195Q。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含N71D/N85D。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含N71D/N195D。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含N85D/N195D。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含D55Q。在一个实施方式中，IL-12p35变体包含D55K。另外，这些修饰可以单独使用或者与其它任何IL-12p35变体(如表达变体)组合使用。
生物功能IL-12异源二聚体复合物可以包含野生型IL-12p40亚基和野生型IL-12p35亚基、变体IL-12p40亚基和野生型IL-12p35亚基、野生型IL-12p40亚基和变体IL-12p35亚基，或变体IL-12p40亚基和变体IL-12p35亚基。
在一些实施方式中，IL-12p40变体包含去除潜在N-糖基化位点的氨基酸修饰(例如，取代、添加和缺失)。在一些实施方式中，IL-12p35变体包含去除潜在N-糖基化位点的氨基酸修饰(例如，取代、添加和缺失)。在一些实施方式中，与野生型IL-12相比，本发明的IL-12异源二聚体Fc蛋白具有下降或降低的糖基化。在一些实施方式中，本发明的IL-12异源二聚体Fc蛋白的糖基化状态不同于野生型IL-12蛋白。
与野生型IL-12(包括p40/p35异源二聚体和p40同源二聚体)相比，包含IL-12p40变体和/或IL-12p35变体的靶向IL-12异源二聚体Fc蛋白对IL-12受体的结合亲和力下降或降低。与野生型IL-12相比，本发明的靶向IL-12异源二聚体Fc蛋白具有下降或降低的效力。
如下文进一步详细描述的，靶向IL-12异源二聚体Fc蛋白具有延长或增加的血清半衰期。IL-12异源二聚体Fc蛋白具有下降或降低的毒性潜力。本发明的IL-12异源二聚体Fc蛋白在免疫细胞(例如但不限于T细胞和NK细胞)中诱导STAT4磷酸化的效力下降或降低。
在一些实施方式中，与野生型IL-12相比，本发明的IL-12异源二聚体Fc蛋白提供改进的药代动力学。此外，与野生型IL-12相比，此类IL-12异源二聚体Fc蛋白在治疗上是有效的并且具有改善的治疗指数。本发明的IL-12异源二聚体Fc蛋白可以促进或诱导T细胞活化。在一些实施例中，向患者施用IL-12异源二聚体Fc蛋白中的任一种诱导了患者中的T细胞活化。在一些情况下，施用诱导患者中的IFN-γ分泌。在某些情况下，IL-12异源二异源二聚体Fc蛋白的施用会诱导患者中淋巴细胞的扩增。在一些实施方式中，IL-12异源二聚体Fc蛋白可用于治疗癌症，例如实体瘤癌或液体瘤癌。在一些实施方式中，向患者施用任何一种IL-12异源二聚体Fc蛋白，并且在一些情况下，与检查点阻断剂组合可减小肿瘤大小。
V.结构域接头
在一些实施例中，IL-12p35和IL-12p40亚基通过接头连接在一起。任选地，亚基不通过接头连接。在其他实施方式中，IL-12p35和IL-12p40亚基是非共价连接的。在一些实施方式中，IL-12p35和IL-12P40亚基之间的接头是图6中列出的接头，例如但不限于各种甘氨酸-丝氨酸接头和甘氨酸-丙氨酸接头。
在一些实施例中，IL-12p35亚基通过接头与Fc结构域连接。在某些实施方式中，IL-12p35亚基直接连接至Fc结构域，例如没有接头。在其它实施方式中，IL-12p40亚基通过接头与Fc结构域连接。在其它实施方式中，IL-12p40亚基直接与Fc结构域连接。在一些情况下，不使用接头将IL-12p35亚基或IL-12p40亚基与Fc结构域连接。
VI.PD-1和PD-L1抗体单体
在一些方面，本发明涉及与人PD-1结合的IL-12Fc融合蛋白。在一些实施方式中，此类IL-12Fc融合蛋白不与治疗性抗体竞争结合PD-1，例如但不限于纳武单抗、派姆单抗、西米普利单抗(cemiplimab)、司利珠单抗(spartalizumab)、卡瑞利珠单抗(camrelizumab)、信迪力单抗(sinilimab)、替雷利珠单抗(tislelizumab)、特瑞普利单抗(toripalimab)、AMP-224、AMP-514等。
在其他方面，本发明涉及与人PD-L1结合的IL-12Fc融合蛋白。在一些实施方式中，此类IL-12Fc融合蛋白不与治疗性抗体竞争结合PD-L1，例如但不限于阿特珠单抗、阿维鲁单抗、杜瓦鲁单抗、KN035等。
在其他方面，本发明涉及与人RSV结合的IL-12Fc融合蛋白。
异源二聚体Fc融合蛋白可以包括不干扰治疗性检查点阻断抗体活性的任何有用抗体形式的抗体单体。
在一些实施方式中，抗体单体包括与Fc结构域连接的Fab或scFv。在一些情况下，PD-1抗体单体含有抗PD-1(VH)-CH1-Fc和抗PD-1VL-Ckappa。在一些情况下，PD-1抗体单体含有抗PD-1scFv-Fc。.在某些情况下，PD-L1抗体单体包含抗PD-L1(VH)-CH1-Fc和抗PD-L1VL-Ckappa。在一些情况下，PD-1抗体单体含有抗PD-L1 scFv-Fc。
图70A-70G中提供了与治疗性抗PD-1抗体(例如，纳武单抗和/或派姆单抗)竞争结合PD-1的说明性抗体单体的可变重链和可变轻链的氨基酸序列。在一些情况下，PD-1抗体单体包含抗PD-1抗体的可变重链和可变轻链，例如但不限于1C11[PD-1]、派姆单抗、尼沃利珠单抗(nivolizumab)、皮地利珠单抗、MK-3475[PD-1]、BAP049克隆E[PD-1]、BAP049克隆B[PD-1]、H7709N[PD-1]、H7798N[PD-1]、h1H3 Var 6[PD-1]、APE2058[PD-1]、H005-1[PD-1]、317-4B6[PD-1]、326-4A3[PD-1]、hPD-1mAb 7[PD-1]、克隆38[PD-1]、克隆39[PD-1]、克隆41[PD-1]、克隆48[PD-1]、PD1-17[PD-1]、PD1-28[PD-1]、PD1-33[PD-1]、PD1-35[PD-1]、LOPD180[PD-1]、Ab948[PD-1]、人源化EH-12.2H7[PD-1]、RG1H10[PD-1]、RG1H10-H2A-22-1S[PD-1]、RG1H10-H2A-27-2S[PD-1]、RG1H10-3C[PD-1]、RG1H10-16C[PD-1]、RG1H10-17C[PD-1]、RG1H10-19C[PD-1]、RG1H10-21C[PD-1]、RG1H10-23C2[PD-1]和mAB7[PD-1]。
图70G-70I中提供了与治疗性抗PD-1抗体(例如，纳武单抗和/或派姆单抗)竞争结合PD-1的说明性抗体单体的可变重链和可变轻链的氨基酸序列。
在一些实施方式中，PD-1抗体单体包含抗PD-1抗体的可变重链和可变轻链，例如但不限于mAb A[PD-1]_H1L1、mAb B[PD-1]_H1L1、mAb C[PD-1]_H1L1和mAb C[PD-1]_H1.19_L10。在一些实施方式中，PD-1抗体单体利用选自由以下组成的组的VH结构域(或其CDR1、CDR2和CDR3)：mAb C[PD-1]_H1、mAb C[PD-1]_H1.19、mAb C[PD-1]_H1.48、mAb C[PD-1]_H1.125、mAb C[PD-1]_H1.130、mAb C[PD-1]_H1.132、mAb C[PD-1]_H1.169、mAb C[PD-1]_H1.175和mAb C[PD-1]_H2；和选自由以下组成的组的VL结构域(或其CDR1、CDR2和CDR3)：mAb C[PD-1]_L1、mAb C[PD-1]_L1.1、mAb C[PD-1]_L1.3、mAb C[PD-1]_L1.45、mAbC[PD-1]_L1.117、mAb C[PD-1]_L1.129、mAb C[PD-1]_L1.135、mAb C[PD-1]_L1.136、mAb C[PD-1]_L1.140和mAb C[PD-1]_L2。
在一些实施方式中，本文所述的靶向IL-12-Fc融合物的PD-1抗原结合结构域包含mAb C_H1的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.1的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。mAb C_H1的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.3的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.45的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.117的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.129的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.135的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAbC_L1.136的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1 ABD包含mAb C_H1的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.140的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L2的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。
在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.19的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.19的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.1的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。mAb C_H1.19的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.3的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.19的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.45的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.19的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.117的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.19的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.129的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.19的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.135的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.19的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.136的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.19的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.140的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.19的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L2的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。
在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.48的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.48的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.1的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。mAb C_H1.48的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.3的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.48的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.45的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.48的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.117的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.48的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.129的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.48的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.135的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.48的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.136的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.48的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.140的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.48的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L2的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。
在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.125的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.125的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.1的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。mAb C_H1.125的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.3的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.125的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.45的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.125的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.117的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.125的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.129的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.125的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.135的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.125的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.136的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.125的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.140的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.125的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L2的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。
在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.130的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.130的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.1的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。mAb C_H1.130的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.3的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.130的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.45的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.130的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.117的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.130的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.129的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.130的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.135的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.130的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.136的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.130的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.140的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.130的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L2的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。
在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.132的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.132的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.1的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。mAb C_H1.132的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.3的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.132的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.45的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.132的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.117的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.132的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.129的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.132的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.135的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.132的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.136的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.132的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.140的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.132的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L2的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。
在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.169的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.169的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.1的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。mAb C_H1.169的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.3的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.169的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.45的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.169的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.117的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.169的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.129的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.169的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.135的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.169的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.136的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.169的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.140的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.169的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L2的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。
在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.175的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.175的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.1的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。mAb C_H1.175的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.3的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.175的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.45的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.175的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.117的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.175的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.129的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.175的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.135的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.175的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.136的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.175的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.140的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H1.175的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L2的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。
在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H2的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H2的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.1的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。mAb C_H2的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.3的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H2的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.45的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H2的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.117的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H2的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.129的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H2的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAbC_L1.135的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H2的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.136的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H2的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L1.140的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中，PD-1ABD包含mAb C_H2的可变重链或CDR1、CDR2和CDR3以及mAb C_L2的可变轻链或CDR1、CDR2和CDR3。
图76A-76J中提供了说明性抗体单体人PD-L1的可变重链和可变轻链的氨基酸序列。在一些实施方式中，说明性抗PD-L1抗体单体包含抗PD-L1抗体的可变重链和可变轻链，例如但不限于YW243.55.S70(也称为作为MPDL3280A，克隆YW243.55.S70)、杜瓦鲁单抗、阿特珠单抗、12A4、3G10、10A5、h3D10 Var 1、h3D10 Var 2、h3D10 Var 3、h3D10 Var 4、h3D10Var 5、h3D10 Var 6、h3D10 Var 7、h3D10 Var 8、h3D10 Var 9、h3D10 Var 10、h3D10Var11、h3D10 Var 12、h3D10 Var 13、h3D10 Var 14、Antibody A、C5H9v2、人源化29E.2A3、1B9、4H1、mAb-42、BAP058-03、BAP058-04、BAP058-06、BAP058-07、BAP058-11、BAP058-13、H6、RC5、SH1A1Q、SH1B3、SH1D1、SH1D2、SH1D12、SH1E1、SH1G9、SH1E6、SH1A2、SH1B1、H6B1L、H6A1、H6B1、H6B2、G12、RSA1、RA3、SH1E2、SH1E4、SH1B1、SH1C8、H1H9364P2、H1H9373P2、H1H8314N和PDL1。
另外，本发明的抗体包括与本文概述的抗原结合结构域结合于相同表位的抗体，或与本文概述的抗原结合结构域竞争结合。通常使用如本文概述的Biacore测定来确定结合竞争。
A.抗体
如下所讨论，通常使用术语“抗体”。可以用于本发明的抗体可以采用如本文所述的多种形式，包括本文所述和图中所描绘的传统抗体以及抗体衍生物、片段和模拟物。
本发明提供含有检查点抗原结合结构域和Fc结构域的抗体融合蛋白。在一些实施例中，抗体融合蛋白与本文所述的IL-12Fc融合蛋白形成异源二聚体蛋白。在其他实施方式中，抗体融合蛋白与另一种抗体融合蛋白形成异源二聚体蛋白，所述另一种抗体融合蛋白包含检查点抗原结合结构域和Fc结构域。示例性实施方式包括但不限于不与靶向PD-1的IL-12-Fc融合蛋白、靶向PD-L1的IL-12-Fc融合蛋白和不与PD-1阻断抗体竞争的靶向PD-1的IL-12-Fc融合蛋白。
传统抗体结构单位通常包括四聚体。每个四聚体通常由两对相同的多肽链构成，每对具有一个“轻链”(通常具有约25kDa的分子量)和一个“重链”(通常具有约50-70kDa的分子量)。人轻链被分类为κ轻链和λ轻链。本发明涉及通常基于IgG类的抗体或抗体片段(抗体单体)，其具有几个亚类，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。通常，IgG1、IgG2和IgG4比IgG3更频繁地使用。应注意，IgG1具有在356(D或E)和358(L或M)处具有多型性的不同同种异型。本文描绘的序列使用356D/358M同种异型，然而本文包括其它同种异型。也就是说，本文包括的包含IgG1 Fc结构域的任何序列可以具有替代356D/358M同种异型的356E/358L。
另外，本文中的许多序列在220位处的至少一个半胱氨酸被丝氨酸取代；通常，这是在本文中所描绘的大多数序列的“scFv单体”侧，尽管它也可以在“Fab单体”侧或两者上，以减少二硫化物的形成。本文序列中特别包括这些半胱氨酸中的一个或两个被取代(C220S)。
因此，如本文所用的“同种型”意指根据其恒定区的化学和抗原特征界定的免疫球蛋白的任一子类。应当理解，治疗性抗体还可以包含同种型和/或亚类的杂合体。举例来说，如以引用的方式并入的美国公开申请例如，如通过引用并入的美国公开申请号2009/0163699中所示，本发明涵盖IgG1/G2杂合体的pI工程化。
每条链的氨基端部分包括主要负责抗原识别的约100至110个或更多个氨基酸的可变区，在本领域和本文中通常称为“Fv结构域”或“Fv区”。在可变区中，重链和轻链的每个V结构域聚集三个环以形成抗原结合位点。每个环被称为互补决定区(下文中称为“CDR”)，其中氨基酸序列中的变化是最显著的。“可变的”是指可变区的某些区段在抗体之间序列差异很大这一事实。可变区内的可变性不是均匀分布的。相反，V区由通过称为“高变区”的极端可变的较短区分隔开的称为框架区(FR)的15-30个氨基酸的相对不变的区段组成，所述高变区各自9-15个氨基酸长或更长。
每个VH和VL由三个高变区(“互补决定区”，“CDR”)和四个FR构成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
高变区通常涵盖来自轻链可变区中约氨基酸残基24-34(LCDR1；“L”表示轻链)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)以及重链可变区中约31-35B(HCDR1；“H”表示重链)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)的氨基酸残基；Kabat等人,SEQUENCES OF PROTEINS OFIMMUNOLOGICAL INTEREST,第5版,美国公共卫生署(United States Public HealthService),国立卫生研究院(National Institute of Health),贝塞斯达(Bethesda).Md.(1991)和/或那些形成高变环的残基(例如轻链可变区中的残基26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)以及重链可变区中的26-32(HCDR1)、53-55(HCDR2)和96-101(HCDR3)；Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917。下面描述本发明的特定CDR。
如本领域技术人员将理解的，CDR的确切编号和放置在不同编号系统中可以是不同的。然而，应理解，可变重链和/或可变轻链序列的公开包括相关(固有)CDR的公开。因此，每个重链可变区的公开内容是vhCDR(例如vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3)的公开内容，并且每个轻链可变区的公开内容是vlCDR(例如vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3)的公开内容。CDR编号的有用比较如下，参见Lafranc等人,Dev.Comp.Immunol.27(1):55-77(2003):
表1
Figure BDA0003679091520000881
在整个本说明书中，当提及可变结构域中的残基(大致是轻链可变区中的残基1-107和重链可变区中的残基1-113)时，通常使用Kabat编号系统，且Fc区使用EU编号系统(例如Kabat等，同上(1991))。
本发明提供了大量不同的CDR集合。在这种情况下，“完整CDR集合”包含三个可变轻链和三个可变重链CDRs，例如vlCDR1、vlCDR2、vlCDR3、vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3。这些可以尊敬地是较大可变轻链结构域或可变重链结构域的一部分。另外，如本文中更全面地概述的，当使用重链和轻链时(例如当使用Fab时)，可变重链结构域和可变轻链结构域可以在单独的多肽链上，或在scFv序列的情况下在单个多肽链上。
CDR有助于形成抗体的抗原结合位点，或更具体来说，表位结合位点。“表位”是指与称为互补位的抗体分子可变区中的特定抗原结合位点相互作用的决定簇。表位是诸如氨基酸或糖侧链的分子的组，并且通常具有特定的结构特征以及特定的电荷特征。单个抗原可具有多于一个表位。
表位可以包含直接参与结合的氨基酸残基(也称为表位的免疫显性组分)和不直接参与结合的其它氨基酸残基，如被特异性抗原结合肽有效阻断的氨基酸残基；换句话说，氨基酸残基在特异性抗原结合肽的覆盖面积内。
表位可以是构象的或线性的。通过来自线性多肽链的不同区段的空间并置的氨基酸产生构象表位。线性表位是由多肽链中的相邻氨基酸残基产生的表位。构象和非构象表位的区别可以在于在变性溶剂存在下，与前者而非后者的结合丧失。
表位通常包括独特空间构象中的至少3个，并且更通常至少5个或8-10个氨基酸。识别相同表位的抗体可以在简单的免疫分析中验证，展示一种抗体阻断另一种抗体与目标抗原结合的能力，例如“框并”。如下文所概述，本发明不仅包括本文所列举的抗原结合结构域和抗体，还包括竞争与所列举的抗原结合结构域结合的表位结合的抗原结合结构域和抗体。
每条链的羧基端部分限定了主要负责效应子功能的恒定区。Kabat等人收集了重链和轻链的可变区的多个一级序列。基于序列的保守程度，他们将单个一级序列分类为CDR和框架，并制作了其列表(参见SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST,第5版,第91-3242号NIH公开,E.A.Kabat等，通过引用整体并入本文中)。
在免疫球蛋白的IgG亚类中，重链中存在几种免疫球蛋白质结构域。本文中通过“免疫球蛋白(Ig)结构域”意指具有不同三级结构的免疫球蛋白的区域。本发明感兴趣的是重链结构域，包括恒定重链(CH)结构域和铰链结构域。在IgG抗体的上下文中，IgG同种型各自具有三个CH区。因此，在IgG的上下文中，“CH”结构域如下：“CH1”是指根据如Kabat中的EU编号的位置118-220。“CH2”根据如Kabat中的EU编号是指位置237-340，并且“CH3”根据如Kabat中的EU编号是指位置341-447。如本文所示和下文所描述的，pI变体可以处于CH区的一个或多个CH区以及铰链区中，如下文所讨论的。
重链的另一种类型的Ig结构域是铰链区。“铰链”或“铰链区”或“抗体铰链区”或“免疫球蛋白铰链区”在本文中意味着包含抗体的第一与第二恒定结构域之间的氨基酸的柔性多肽。在结构上，IgG CH1结构域在EU位置220处终止，并且IgG CH2结构域在残基EU位置237处开始。因此，对于IgG，抗体铰链在本文中定义为包括位置221(IgG1中的D221)到236(IgG1中的G236)，其中所述编号根据如Kabat中的EU编号。在一些实施方式中，例如在Fc区的背景下，包括下铰链，“下铰链”通常指的是位置226或230。如本文所指出的，pI变体也可以处于铰链区中。
轻链通常包含两个结构域，即可变轻链结构域(含有轻链CDR并且与可变重链结构域一起形成Fv区)和恒定轻链区(通常称为CL或Cκ)。
下文概述的用于其它取代的另一所关注区是Fc区。
因此，本发明提供了不同的抗体结构域。如本文所述以及所属领域中已知，本发明的异源二聚体抗体包括重链和轻链内的不同结构域，其也可以是重叠的。这些结构域包括但不限于Fc结构域、CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域、铰链结构域、重恒定结构域(CH1-铰链-Fc结构域或CH1-铰链-CH2-CH3)、可变重结构域、可变轻结构域、轻恒定结构域、Fab结构域和scFv结构域。
因此，“Fc结构域”包括-CH2-CH3结构域和任选的铰链结构域。在本文的实施方式中，当scFv附接于Fc结构域时，其为附接于Fc结构域的全部或部分铰链的scFv构建体的C末端；例如，其通常附接于作为铰链的开始的序列EPKS(SEQ ID NO:XX)。重链包含可变重链结构域和恒定结构域，其包括包含CH2-CH3的CH1-任选的铰链-Fc结构域。轻链包括可变轻链结构域和轻链恒定结构域。scFv包括可变重链、scFv接头以及可变轻链结构域。在本文概述的大多数构建体和序列中，可变轻链的C末端连接至scFv接头的N末端，其C末端连接至可变重链的N末端(N-vh-接头-vl-C)，尽管其可以被转换(N-vl-接头-vh-C)。
本发明的一些实施方式包含至少一个scFv结构域，其虽然不是天然存在的，但是通常包括由scFv接头连接在一起的可变重链结构域和可变轻链结构域。如本文所概述的，虽然scFv结构域通常从N-末端到C-末端定向为vh-scFv接头-vl，但对于任何scFv结构域(或使用来自Fab的vh和vl序列构建的那些)，这可以是相反为vl-scFv接头-vh，其中在一端或两端具有可选的接头，这取决于形式(一般地参见US 62/353,511的图4A-4B)。
如本文所示，可以使用许多合适的scFv接头，包括通过重组技术生成的传统肽键。接头肽可以主要包含以下氨基酸残基：Gly、Ser、Ala或Thr。接头肽应当具有足够以确保相对于彼此的正确构象以使得其保留期望活性的方式连接两个分子的长度。在一个实施方式中，接头具有约1至50个氨基酸的长度，优选约1至30个氨基酸的长度。在一个实施方式中，可使用长度为1至20个氨基酸的接头，在一些实施方式中使用约5至约10个氨基酸。可用的接头包括甘氨酸-丝氨酸聚合物，包括例如(GS)n(SEQ ID NO:XXX)、(GSGGS)n(SEQ ID NO:XXX)、(GGGGS)n(SEQ ID NO:XXX)和(GGGS)n(SEQ ID NO:XXX)(其中n是至少1(并且通常是3-4)的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和其它柔性接头。可选地，各种非蛋白质聚合物可以用作接头，包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物，其可以用作接头。
其它接头序列可以包括CL/CH1结构域的任何长度的任何序列，但不包括CL/CH1结构域的所有残基；例如CL/CH1结构域的前5-12个氨基酸残基。接头可以来源于免疫球蛋白轻链，例如Cκ或Cλ。接头可以来源于任何同种型的免疫球蛋白重链，包括例如Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cα1、Cα2、Cδ、Cε和Cμ。接头序列还可以来源于其它蛋白质，如Ig样蛋白(例如，TCR、FcR、KIR)、铰链区来源的序列以及来自其它蛋白质的其它天然序列。
在一些实施方式中，scFv接头是带电荷scFv接头，其中的一些在US 62/353,511的图4A中示出。因此，本发明还提供了带电荷的scFv接头，以促进第一和第二单体(例如，IL-12(p35/p40或p40/p35)单体和PD-1ABD单体)之间的pI分离。也就是说，通过并入带正或负(或两者，在不同单体上使用scFv的主链的情况下)电的scFv接头，由此允许包含带电接头的单体改变pI而不会在Fc结构域中产生进一步的变化。这些带电荷的接头可以被取代到含有标准接头的任何scFv中。再次，如本领域技术人员将理解的，根据所期望的pI变化，在正确的“链”或单体上使用带电的scFv接头。例如，如本文所讨论的，为了产生三F形式的异源二聚体抗体，计算了每个所期望的抗原结合结构域的Fv区的初始pI，并选择其一来产生scFv，并根据pI选择正性或负性接头。
带电结构域接头还可以用于增加本发明的单体的pI分离，并且因此图10中所包含的那些在本文中可以用于利用接头的任何实施方式中。
在一个实施方式中，抗体是抗体片段，只要其含有至少一个恒定结构域，其可以被工程化以产生异源二聚体，例如pI工程化。可以使用的其他抗体片段包括含有一个或多个已经过pI工程化的本发明的CH1、CH2、CH3、铰链和CL结构域的片段。特别地，图34A-34H中描绘的形式是Fc融合蛋白，被称为“异源二聚体Fc融合蛋白”或“双功能异源二聚体Fc融合蛋白”或“异源二聚体融合蛋白”，意味着该蛋白质具有至少两个自组装成异源二聚体Fc结构域的相关Fc序列和至少一个Fv区，无论是作为Fab还是作为ScFv。
B.嵌合和人源化抗体
在一些实施方式中，本文的抗体可衍生自来自不同物种的混合物，例如嵌合抗体和/或人源化抗体。通常，“嵌合抗体”和“人源化抗体”都是指组合来自超过一种物种的区域的抗体。例如，“嵌合抗体”传统上包括来自小鼠(或在一些情况下为大鼠)的可变区和来自人的恒定区。“人源化抗体”通常是指非人抗体，其具有与人抗体中发现的序列交换的可变结构域框架区。通常，在人源化抗体中，除CDR之外的整个抗体由人来源的多核苷酸编码或除了在其CDR内之外，与这种抗体相同。CDR(部分或全部由源自非人类生物体的核酸编码)被移植到人类抗体可变区的β-折叠框架中以形成抗体，其特异性由移植的CDR决定。这类抗体的形成描述于例如WO 92/11018，Jones,1986,Nature 321:522-525，Verhoeyen等人,1988,Science239:1534-1536中，其以引用的方式整体并入本文中。所选择的受体框架残基“回复突变”到相应的供体残基通常需要重新获得在初始移植构筑体中丧失的亲和力(US5530101；US 5585089；US 5693761；US 5693762；US 6180370；US 5859205；US 5821337；US6054297；US 6407213，其以引用的方式整体并入本文中)。人源化抗体最佳地还将包含免疫球蛋白恒定区(通常是人类免疫球蛋白的恒定区)的至少一部分，并且因此通常包含人类Fc区。人源化抗体也可使用具有基因工程化的免疫系统的小鼠产生。Roque等人,2004,Biotechnol.Prog.20:639-654，其以引用的方式整体并入本文中。用于人源化和重塑非人类抗体的多种技术和方法是所属领域熟知的(参见Tsurushita和Vasquez,2004,Humanization of Monoclonal Antibodies,Molecular Biology of B Cells,533-545,爱思唯尔科学公司(Elsevier Science)(美国)和其中引用的参考文献，其以引用的方式整体并入本文中)。人源化方法包括但不限于以下文献中所述的方法：Jones等人,1986,Nature321:522-525；Riechmann等人,1988,Nature 332:323-329；Verhoeyen等人,1988,Science239:1534-1536；Queen等人,1989,Proc Natl Acad Sci,USA 86:10029-33；He等人,1998,J.Immunol。160:1029-1035；Carter等人,1992,Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-9；Presta等人,1997,Cancer Res.57(20):4593-9；Gorman等人,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:4181-4185；O'Connor等人,1998,Protein Eng 11:321-8，所有这些文献以引用的方式整体并入本文中。降低非人类抗体可变区免疫原性的人源化或其它方法可以包括表面再塑方法，如例如Roguska等人,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:969-973中所述，其以引用的方式整体并入本文中。在某些实施方式中，本发明的抗体包含来自特定种系重链免疫球蛋白基因的重链可变区和/或来自特定种系轻链免疫球蛋白基因的轻链可变区。举例来说，这类抗体可包含人类抗体或由人类抗体组成，所述人类抗体包含作为特定种系序列“的产物”或“衍生自”特定种系序列的重链或轻链可变区。通过比较人类抗体的氨基酸序列与人类种系免疫球蛋白的氨基酸序列并选择序列与人类抗体序列最接近(即，最大％同一性)的人类种系免疫球蛋白，可以鉴定人类抗体是人类种系免疫球蛋白序列“的产物”或“衍生自”人类种系免疫球蛋白序列。由于例如天然存在的体细胞突变或有意引入定点突变，作为特定人类种系免疫球蛋白序列“的产物”或“衍生自”特定人类种系免疫球蛋白序列的人类抗体与种系序列相比可含有氨基酸差异。然而，人源化抗体通常与由人类种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列在氨基酸序列上具有至少90％相同，并且在与其它物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如，鼠种系序列)进行比较时，含有将抗体鉴定为源自人类序列的氨基酸残基。在某些情况下，人源化抗体可以与由种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列在氨基酸序列上至少95％、96％、97％、98％或99％，或甚至至少96％、97％、98％或99％相同。通常，源自特定人类种系序列的人源化抗体将显示出与由人类种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列不多于10-20个氨基酸差异(在引入本文中的任何偏斜变体、pI变体和消融变体之前；也就是说，在引入本发明的变体之前，变体的数量通常较低)。在某些情况下，相比于由生殖系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列，人源化抗体可显示不超过5或甚至不超过4、3、2或1个氨基酸差异(同样，在引入本文的任何偏斜、pI和消融变体之前；也就是说，在引入本发明的变体之前，变体数目通常较低)。在一个实施方式中，亲本抗体已经发生亲和力成熟，如所属领域中已知。可以利用基于结构的方法进行人源化和亲和力成熟，例如如USSN11/004,590中所述。基于选择的方法可以用于人源化和/或亲和力成熟抗体可变区，包括但不限于以下文献中所述的方法：Wu等人,1999,J.Mol.Biol.294:151-162；Baca等人,1997,J.Biol.Chem.272(16):10678-10684；Rosok等人,1996,J.Biol.Chem.271(37):22611-22618；Rader等人,1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:8910-8915；Krauss等人,2003,Protein Engineering 16(10):753-759，其以引用的方式整体并入本文中。其它人源化方法可涉及仅移植部分CDR，包括但不限于以下文献中所述的方法：USSN 09/810,510；Tan等人,2002,J.Immunol.169:1119-1125；De Pascalis等人,2002,J.Immunol.169:3076-3084，所有所述文献都以引用的方式整体并入本文中。
VII.本发明的有用形式
如图79A-79E所示，本发明的异源二聚体融合蛋白存在许多有用的形式。通常，本发明的异源二聚体融合蛋白具有三个功能组分：抗原结合结构域、IL-12异源二聚体组分和Fc组分，两者都可以采取与本文概述的形式不同的形式，并且两者都可以以任何配置与其它组分组合。
在一些实施例中，IL-12p35和IL-12p40亚基任选地用结构域接头共价连接，并且在本文中被称为单链IL-12复合物或“scIL-12”。scIL-12可包含N末端连接至IL-12p40的IL-12p35或N末端连接至IL-12p35的IL-12p40，任选具有结构域接头。scIL-12中两个亚基的顺序可以指定如下：“scIL-12(p40/p35)”，其中IL-12p40亚基(使用或者不使用结构域接头)在N末端连接至IL-12p35亚基，或“scIL-12(p35/p40)”，其中IL-12p35亚基(使用或者不使用结构域接头)在N末端连接至IL-12p40亚基。
在一些实施例中，IL-12p35亚基和IL-12p40亚基不共价连接，而是与组装作为异源二聚体的第一Fc结构域和第二Fc结构域分别共价连接。
第一和第二Fc结构域可以具有选自由以下组成的组的一组氨基酸取代：根据EU编号，a)L368D/K370S和S364K；b)L368D/K370S和S364K/E357L；c)L368D/K370S和S364K/E357Q；d)S267K/L368D/K370S和S267K/S364K/E357Q；e)T411E/K360E/Q362E和D401K；f)L368E/K370S和S364K；以及g)K370S和S364K/E357Q和h)T366S/L368A/Y407V和T366W(任选地包括二硫桥键，T366S/L368A/Y407V/Y349C和T366W/S354C)。
在一些实施方式中，第一和/或第二Fc结构域具有另外一组包括根据EU编号的Q295E/N384D/Q418E/N421D的氨基酸取代。
任选地，第一和/或第二Fc结构域具有选自由以下组成的组的另外一组氨基酸取代：根据EU编号，G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del和E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方式中，第一Fc结构域具有选自由以下组成的组的另外一组氨基酸取代：根据EU编号，G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del和E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方式中，第二Fc结构域具有选自由以下组成的组的另外一组氨基酸取代：根据EU编号，G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del和E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在某些实施方式中，第一Fc结构域和第二Fc结构域各自具有选自由以下组成的组的另外一组氨基酸取代：根据EU编号，G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del和E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。
任选地，第一Fc结构域和/或第二Fc结构域具有用于半衰期延长的M428L/N434S变体。在一些实施方式中，第一和第二Fc结构域各自具有M428L/N434S取代。在一些实施方式中，第一Fc结构域具有M428L/N434S取代。在一些实施方式中，第二Fc结构域具有M428L/N434S取代。
A.靶向scFv x scIL-12-Fc形式
在一些实施方式中，本发明提供了靶向N末端单链(sc)IL-12-Fc融合物或“靶向scFv x scIL-12-Fc”或“scIL-12-Fc x靶向scFv”形式。在此实施方式中，如图79A所示，异源二聚体融合蛋白包括两个单体。第一单体(从N末端到C末端)包含scIL-12任选的结构域接头-Fc。第二单体包含结合靶抗原(也称为靶向臂)的scFv结构域。靶向scIL-12可以是“靶向scIL-12(p40/p35)”，其中IL-12p40亚基在N末端连接(使用或不使用结构域接头)至IL-12p35亚基，或“靶向scFv x scIL-12(p35/p40)”，其中IL-12p35在N末端连接(使用或不使用结构域接头)至IL-12p40亚基。
换言之，“scIL-12x scFv”形式(参见，例如，图79A)包含融合(任选通过可变长度接头)到人IL-12p35的人IL-12p40(称为scIL-12)，将其融合(任选通过可变长度接头)到异源二聚体Fc区的N末端，其中scFv融合到异源二聚体Fc区的另一侧。需要注意的是，在这种形式中，IL-12p40亚基和IL-12p35亚基的位置可以互换。
在一些实施方式中，靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白包含：(a)包含第一蛋白质结构域、第二蛋白质结构域和第一变体Fc结构域的融合蛋白，其中第一蛋白质结构域与第二蛋白质结构域共价连接，其中第二蛋白质结构域与第一Fc结构域的N末端共价连接；和(b)第二融合蛋白第二单体包含结合诸如人PD-1或人PD-L1的靶抗原(也称为靶向臂)的scFv结构域。scFv结构域包含第二变体Fc结构域。第一和第二变体Fc结构域包含促进第一和第二Fc结构域异源二聚化的修饰。在一些情况下，第一蛋白质结构域包含IL-12p40亚基(或变体IL-12p40亚基)并且第二蛋白质结构域包含IL-12p35亚基(或变体IL-12p35亚基)。在其他情况下，第一蛋白质结构域包含IL-12p35亚基(或变体IL-12p35亚基)并且第二蛋白质结构域包含IL-12p40亚基(或变体IL-12p40亚基)。
在这种形式中，例如，本文所述，有用的Fc变体包括但不限于偏斜变体、pI变体、同配变体、FcγR变体、消融变体及其任何组合。在靶向scFv x scIL-12-Fc形式中，一个优选的实施方式利用了偏斜变体对S364K/E357Q和L368D/K370S。在一些实施方式中，第一变体Fc结构域包括偏斜变体S364K/E357Q，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S。在一些实施方式中，第一变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体S364K/E357Q。
在一些实施方式中，scFv结构域结合人PD-1。在图70A-70G和相应的序列表提供了说明性抗PD-1scFv的氨基酸序列，其包括其与纳武单抗和/或派姆单抗竞争结合PD-1的可变重链(VH)结构域和可变轻链(VL)结构域。如图70A-70G中提供的，诸如竞争性PD-1scFv的示例性抗PD-1scFv包括但不限于1C11[PD-1]、派姆单抗、尼沃利珠单抗、皮地利珠单抗(nivolizumab)、MK-3475[PD-1]、BAP049克隆E[PD-1]、BAP049克隆B[PD-1]、H7709N[PD-1]、H7798N[PD-1]、h1H3 Var 6[PD-1]、APE2058[PD-1]、H005-1[PD-1]、317-4B6[PD-1]、326-4A3[PD-1]、hPD-1mAb 7[PD-1]、克隆38[PD-1]、克隆39[PD-1]、克隆41[PD-1]、克隆48[PD-1]、PD1-17[PD-1]、PD1-28[PD-1]、PD1-33[PD-1]、PD1-35[PD-1]、LOPD180[PD-1]、Ab948[PD-1]、人源化EH-12.2H7[PD-1]、RG1H10[PD-1]、RG1H10-H2A-22-1S[PD-1]、RG1H10-H2A-27-2S[PD-1]、RG1H10-3C[PD-1]、RG1H10-16C[PD-1]、RG1H10-17C[PD-1]、RG1H10-19C[PD-1]、RG1H10-21C[PD-1]、RG1H10-23C2[PD-1]、mAB7[PD-1]和PD1AB-6[PD-1]。
在某些实施方式中，scFv结构域结合人PD-1并且不与纳武单抗和/或派姆单抗竞争人PD-1。在一些情况下，scFv与纳武单抗结合的表位不同。在某些情况下，scFv与派姆单抗结合的表位不同。在图70G-70I和相应的序列表提供了说明性抗PD-1scFv的氨基酸序列，其包含不与纳武单抗和/或派姆单抗竞争结合PD-1的可变重链(VH)结构域和可变轻链(VL)结构域。
示例性抗PD-1scFv，例如非竞争性抗PD-1scFv使用的序列包括但不限于mAb A[PD-1]_H1L1、mAb B[PD-1]_H1L1的序列、mAb C[PD-1]_H1L1和mAb C[PD-1]_H1.19L10的那些。在一些实施方式中，如图70G-70I和相应的序列表所提供的，说明性抗PD-1Fab利用了选自由以下组成的组的VH结构域：mAb C[PD-1]_H1、mAb C[PD-1]_H1.19、mAb C[PD-1]_H1.48、mAb C[PD-1]_H1.125、mAb C[PD-1]_H1.130、mAb C[PD-1]_H1.132、mAb C[PD-1]_H1.169、mAb C[PD-1]_H1.175和mAb C[PD-1]_H2；和选自由以下组成的组的VL结构域：mAbC[PD-1]_L1、mAb C[PD-1]_L1.1、mAb C[PD-1]_L1.3、mAb C[PD-1]_L1.45、mAb C[PD-1]_L1.117、mAb C[PD-1]_L1.129、mAb C[PD-1]_L1.135、mAb C[PD-1]_L1.136、mAb C[PD-1]_L1.140和mAb C[PD-1]_L2。另外的抗PD-1scFv包括但不限于，例如，如图75A-75E所提到的mAb C[PD-1]_H1.1_L1至mAb C[PD-1]H1.168_L1的序列，以及如图75E-75I所提到的mAb_C[PD-1]_H1_L1.1至mAb_C[PD-1]_H1_L1.134。
在一些实施方式中，scFv结构域结合人PD-L1。图76A-76J和相应的序列表中提供了包含可变重链(VH)结构域和可变轻链(VL)结构域的说明性抗PD-L1 scFv的氨基酸序列。在一些实施方式中，如图76A-76J和相应的序列表中提供的，说明性抗PD-L1 scFv利用VH结构域和VL结构域，代表为杜瓦鲁单抗、阿特珠单抗、12A4、3G10、10A5、h3D10 Var 1、h3D10Var 2、h3D10 Var 3、h3D10 Var 4、h3D10 Var 5、h3D10 Var 6、h3D10 Var 7、h3D10 Var8、h3D10 Var 9、h3D10 Var 10、h3D10 Var 11、h3D10 Var 12、h3D10 Var 13、h3D10 Var14、抗体A、C5H9v2、人源化29E.2A3、1B9、4H1、mAb-42、BAP058-03、BAP058-04、BAP058-06、BAP058-07、BAP058-11、BAP058-13、H6、RC5、SH1A1Q、SH1B3、SH1D1、SH1D2、SH1D12、SH1E1、SH1G9、SH1E6、SH1A2、SH1B1、H6B1L、H6A1、H6B1、H6B2、G12、RSA1、RA3、SH1E2、SH1E4、SH1B1、SH1C8、H1H9364P2、H1H9373P2、H1H8314N和PDL1。
在这种形式中，有用的变体IL-12p40亚基包括但不限于D18K/E59K/K99E、D18K/E59K/K99E/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、E32Q/D34N/E59K/K99E、E59K/K99E、E59K/K99E/C252S/K264E和E59K/K99E/K264E和E59K/K99Y。在一些实施方式中，这种形式的变体IL-12p40还包括一个或多个选自由以下组成的组的糖基化修饰：N103D、N103Q、N113D、N113Q、N200D、N200Q、N281D和N281Q。
在这种形式中，有用的变体IL-12p35亚基包括但不限于一个或多个选自由以下组成的组的取代：N71D、N71Q、N85D、N85Q、N195D和N195Q。
在一些实施方式中，靶向PD-1的scFv x scIL-12异源二聚体Fc融合蛋白包含如本文所述结合PD-1的任何一种scFv，变体IL-12p40亚基，其包含一组或多组选自由以下组成的组的氨基酸取代D18K/E59K/K99E、D18K/E59K/K99E/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、E32Q/D34N/E59K/K99E、E59K/K99E、E59K/K99E/C252S/K264E和E59K/K99E/K264E、E59K/K99Y、N103D、N103Q、N113D、N113Q、N200D、N200Q、N281D和N281Q；和野生型(未修饰的)IL-12p35亚基。
在一些实施方式中，靶向PD-L1的scFv x scIL-12异源二聚体Fc融合蛋白包含如本文所述结合PD-L1的任何一种scFv，变体IL-12p40亚基，其包含一组或多组选自由以下组成的组的氨基酸取代D18K/E59K/K99E、D18K/E59K/K99E/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、E32Q/D34N/E59K/K99E、E59K/K99E、E59K/K99E/C252S/K264E和E59K/K99E/K264E、E59K/K99Y、N103D、N103Q、N113D、N113Q、N200D、N200Q、N281D和N281Q；和野生型(未修饰的)IL-12p35亚基。
在一些实施方式中，靶向PD-1的scFv x scIL-12异源二聚体Fc融合蛋白包含如本文所述结合PD-1的任何一种scFv，变体IL-12p40亚基，其包含一组或多组选自由以下组成的组的氨基酸取代D18K/E59K/K99E、D18K/E59K/K99E/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、E32Q/D34N/E59K/K99E、E59K/K99E、E59K/K99E/C252S/K264E和E59K/K99E/K264E、E59K/K99Y、N103D、N103Q、N113D、N113Q、N200D、N200Q、N281D和N281Q；和变体IL-12p35亚基，其包含一个或多个选自由以下组成的组的取代：N71D、N71Q、N85D、N85Q、N195D和N195Q。
在一些实施方式中，靶向PD-L1的scFv x scIL-12异源二聚体Fc融合蛋白包含如本文所述结合PD-L1的任何一种scFv，变体IL-12p40亚基，其包含一组或多组选自由以下组成的组的氨基酸取代D18K/E59K/K99E、D18K/E59K/K99E/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、E32Q/D34N/E59K/K99E、E59K/K99E、E59K/K99E/C252S/K264E和E59K/K99E/K264E、E59K/K99Y、N103D、N103Q、N113D、N113Q、N200D、N200Q、N281D和N281Q；和变体IL-12p35亚基，其包含一个或多个选自由以下组成的组的取代：N71D、N71Q、N85D、N85Q、N195D和N195Q。
B.靶向Fab x scIL-12-Fc形式
在一些实施方式中，本发明提供靶向N末端单链IL-12-Fc融合物或“靶向Fab xscIL-12-Fc”或“scIL-12-Fc x靶向Fab”形式。在该实施方式中，如图79B所示，异源二聚体融合蛋白包含三个单体。第一单体(从N末端到C末端)包含scIL-12任选的结构域接头-Fc。第二单体是包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3的抗原结合结构域(也称为靶向臂)的重链。第三结构域是包含VL-CL的抗原结合结构域的轻链。轻链(第三种单体)单独转染，以便与第二种单体的VH形成Fab，并且Fab结合靶抗原。
第一单体的scIL-12可以是“scIL-12(p40/p35)”，其中IL-12p40亚基在N末端连接(使用或不使用结构域接头)至IL-12p35亚基，或“scIL-12(p35/p40)”，其中IL-12p35在N末端连接(使用或不使用结构域接头)至IL-12p40亚基。
换言之，“scIL-12 x Fab”形式(参见，图79B)包含融合(可选地通过可变长度接头)到人IL-12p35的人IL-12p40(称为scIL-12)，然后将其融合(可选地通过可变长度接头)到异源二聚体Fc区的N末端，可变重链(VH)与异源二聚体Fc的另一侧融合，同时单独转染相应的轻链以形成具有VH的Fab。需要注意的是，在这种形式中，IL-12p40亚基和IL-12p35亚基的位置可以互换。
在一些实施方式中，靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白包含：(a)融合蛋白，其包含第一蛋白质结构域、第二蛋白质结构域和第一变体Fc结构域，其中第一蛋白质结构域与第二蛋白质结构域共价连接，其中第二蛋白质结构域与第一Fc结构域的N末端共价连接；和(b)第二融合蛋白第二单体包含结合诸如人PD-1或人PD-L1的靶抗原(也称为靶向臂)的Fab结构域。Fab结构域包含第二变体Fc结构域。第一和第二变体Fc结构域包含促进第一和第二Fc结构域异源二聚化的修饰。在一些情况下，第一蛋白质结构域包含IL-12p40亚基(或变体IL-12p40亚基)并且第二蛋白质结构域包含IL-12p35亚基(或变体IL-12p35亚基)。在其他情况下，第一蛋白质结构域包含IL-12p35亚基(或变体IL-12p35亚基)并且第二蛋白质结构域包含IL-12p40亚基(或变体IL-12p40亚基)。
在这种形式中，例如，本文所述，有用的Fc变体包括但不限于偏斜变体、pI变体、同配变体、FcγR变体、消融变体及其任何组合。在靶向Fab x scIL-12-Fc形式中，一个优选的实施方式利用了偏斜变体对S364K/E357Q和L368D/K370S。在一些实施方式中，第一变体Fc结构域包括偏斜变体S364K/E357Q，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S。在一些实施方式中，第一变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体S364K/E357Q。
在一些实施方式中，Fab结合人PD-1。在图70A-70G和相应的序列表提供了说明性抗PD-1Fab的氨基酸序列，其与纳武单抗和/或派姆单抗竞争结合PD-1。诸如竞争性PD-1Fab的示例性抗PD-1Fab包括但不限于1C11[PD-1]、派姆单抗、尼沃利珠单抗(nivolizumab)、皮地利珠单抗、MK-3475[PD-1]、BAP049克隆E[PD-1]、BAP049克隆B[PD-1]、H7709N[PD-1]、H7798N[PD-1]、h1H3 Var 6[PD-1]、APE2058[PD-1]、H005-1[PD-1]、317-4B6[PD-1]、326-4A3[PD-1]、hPD-1mAb 7[PD-1]、克隆38[PD-1]、克隆39[PD-1]、克隆41[PD-1]、克隆48[PD-1]、PD1-17[PD-1]、PD1-28[PD-1]、PD1-33[PD-1]、PD1-35[PD-1]、LOPD180[PD-1]、Ab948[PD-1]、人源化EH-12.2H7[PD-1]、RG1H10[PD-1]、RG1H10-H2A-22-1S[PD-1]、RG1H10-H2A-27-2S[PD-1]、RG1H10-3C[PD-1]、RG1H10-16C[PD-1]、RG1H10-17C[PD-1]、RG1H10-19C[PD-1]、RG1H10-21C[PD-1]、RG1H10-23C2[PD-1]、mAB7[PD-1]。
在某些实施方式中，Fab结合人PD-1不与纳武单抗和/或派姆单抗竞争人PD-1。在某些情况下，Fab结合与纳武单抗不同的表位。在一些情况下，Fab结合与派姆单抗不同的表位。在图70G-70I和相应的序列表提供了说明性抗PD-1Fab的氨基酸序列，其包含不与纳武单抗和/或派姆单抗竞争结合PD-1的可变重链(VH)结构域和可变轻链(VL)结构域。
示例性抗PD-1Fab，例如非竞争性抗PD-1Fab利用的序列包括但不限于mAb A[PD-1]_H1L1、mAb B[PD-1]_H1L1的序列、mAb C[PD-1]_H1L1和mAb C[PD-1]_H1.19L10。在一些实施方式中，如图70G-70I和相应的序列表所提供的，说明性抗PD-1Fab利用了选自由以下组成的组的VH结构域：mAb C[PD-1]_H1、mAb C[PD-1]_H1.19、mAb C[PD-1]_H1.48、mAb C[PD-1]_H1.125、mAb C[PD-1]_H1.130、mAb C[PD-1]_H1.132、mAb C[PD-1]_H1.169、mAb C[PD-1]_H1.175和mAb C[PD-1]_H2；和选自由以下组成的组的VL结构域：mAb C[PD-1]_L1、mAb C[PD-1]_L1.1、mAb C[PD-1]_L1.3、mAb C[PD-1]_L1.45、mAb C[PD-1]_L1.117、mAb C[PD-1]_L1.129、mAb C[PD-1]_L1.135、mAb C[PD-1]_L1.136、mAb C[PD-1]_L1.140和mAb C[PD-1]_L2。另外的抗PD-1scFv包括但不限于，例如，如图75A-75E所提到的mAb C[PD-1]_H1.1_L1至mAb C[PD-1]H1.168_L1的序列，以及如图75E-75I所提到的mAb_C[PD-1]_H1_L1.1至mAb_C[PD-1]_H1_L1.134。
在一些实施方式中，Fab结合人PD-L1。图76A-76J提供了包含可变重链(VH)结构域和可变轻链(VL)结构域的说明性抗PD-L1 Fab的氨基酸序列。在一些实施方式中，如图76A-76J和相应的序列表中提供的，说明性抗PD-L1 Fab利用VH结构域和VL结构域，代表为YW243.55.S70、MPDL3280A、杜瓦鲁单抗、阿特珠单抗、12A4、3G10、10A5、h3D10 Var 1、h3D10Var 2、h3D10 Var 3、h3D10 Var 4、h3D10 Var 5、h3D10 Var 6、h3D10 Var 7、h3D10 Var8、h3D10 Var 9、h3D10 Var 10、h3D10 Var 11、h3D10 Var 12、h3D10 Var 13、h3D10 Var14、抗体A、C5H9v2、人源化29E.2A3、1B9、4H1、mAb-42、BAP058-03、BAP058-04、BAP058-06、BAP058-07、BAP058-11、BAP058-13、H6、RC5、SH1A1Q、SH1B3、SH1D1、SH1D2、SH1D12、SH1E1、SH1G9、SH1E6、SH1A2、SH1B1、H6B1L、H6A1、H6B1、H6B2、G12、RSA1、RA3、SH1E2、SH1E4、SH1B1、SH1C8、H1H9364P2、H1H9373P2、H1H8314N和PDL1。
靶向PD-1的sc-IL12形式形式的示例性实施方式包括但不限于在图80A-80J、81A-81B、98A、98B、99A、99B、100A-100D、101A-101D、102A-102D、103A-103D、104A-104D和105A-105D中描绘的构建体和氨基酸序列。在一些情况下，靶向PD-1的Fab x sc-IL12 Fc融合蛋白的示例性实施方式包括序列表中提供的XENP33686、XENP33687、XENP33693、XENP33694、XENP33695、XENP33696和XENP33697。
在其他情况下，靶向PD-1的Fab x sc-IL12 Fc形式的示例性实施方式包括，如在图80A-80J和81A-81B和序列表提供的序列中描绘的XENP28792、XENP28793、XENP28794、XENP28796、XENP31073、XENP31074、XENP31106、XENP31136、XENP31137、XENP31140、XENP31460、XENP31461、XENP31462、XENP31585、XENP31586、XENP32192、XENP32193、XENP32194和XENP32195。例如，靶向PD-1的Fab x scIL12 x scIL-12-Fc(例如，XENP32195)的第一单体利用链1-人_IL12p40_E59K/K99E/C252S/K264E_(GGGGS)5-人_IL12p35_(GGGGS)2_(单链)_Fc(216)_IgG1_pI(-)_同配_A_C220S/PVA_/S267K/L368D/K370S的序列，第二单体利用链2-mAb C[PD-1]_H1IgG1_PVA_/S267K/S364K/E357Q的序列，以及第三单体利用链3-mAb C[PD-1]_L1.1的序列。
靶向PD-L1的单链IL-12形式的示例性实施方式包括但不限于图114A-114B、115A-115D、116-116D、117A-117D、118A-118D、119A-119D、120A-120D和121A-121D以及序列表中中描绘的构建体和氨基酸序列。
靶向RSV的单链IL12形式的示例性实施方式包括但不限于图106、107A-107B、108A-108D、109A-109D、110A-110D、111A-111D、112A-112D和113A-113D以及序列表中所描绘的构建体和氨基酸序列。在一些情况下，靶向RSV的Fab x scIL12融合蛋白的示例性实施方式包括XENP33684、XENP33685、XENP33688、XENP33689、XENP33690、XENP33691和XENP33692。
在这种形式中，有用的变体IL-12p40亚基包括但不限于E59K/C252S、E59K/N200Q、E59K/K99E/N200Q、E59K/K99Y/N200Q、E59K/K99E/N200Q/C252S、E59K/K99Y/N200Q/C252S、E59K/K99E/N200Q/K264E、D18K/E59K/K99E/N200Q、D18K/E59K/K99E/C252S、D18K/E59K/K99E/N200Q/C252S、D18K/E59K/K99E/N200Q/K264E、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、D18K/E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、D18K/E59K/K99E、D18K/E59K/K99E/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、E32Q/D34N/E59K/K99E、E59K/K99E、E59K/K99E/C252S/K264E和E59K/K99E/K264E和E59K/K99Y。在一些实施方式中，这种形式的变体IL-12p40还包括一个或多个选自由以下组成的组的糖基化修饰：N103D、N103Q、N113D、N113Q、N200D、N200Q、N281D和N281Q。
在这种形式中，有用的变体IL-12p35亚基包括但不限于一个或多个选自由以下组成的组的取代：N71D、N71Q、N85D、N85Q、N195D和N195Q。
在一些实施方式中，靶向PD-1的Fab x scIL-12异源二聚体Fc融合蛋白包含如本文所述结合PD-1的任何一种Fab，变体IL-12p40亚基，其包含一组或多组选自由以下组成的组的氨基酸取代E59K/C252S、E59K/N200Q、E59K/K99E/N200Q、E59K/K99Y/N200Q、E59K/K99E/N200Q/C252S、E59K/K99Y/N200Q/C252S、E59K/K99E/N200Q/K264E、D18K/E59K/K99E/N200Q、D18K/E59K/K99E/C252S、D18K/E59K/K99E/N200Q/C252S、D18K/E59K/K99E/N200Q/K264E、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、D18K/E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、D18K/E59K/K99E、D18K/E59K/K99E/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、E32Q/D34N/E59K/K99E、E59K/K99E、E59K/K99E/C252S/K264E和E59K/K99E/K264E、E59K/K99Y、N103D、N103Q、N113D、N113Q、N200D、N200Q、N281D和N281Q；和野生型(未修饰的)IL-12p35亚基。
在一些实施方式中，靶向PD-L1的Fab x scIL-12异源二聚体Fc融合蛋白包含如本文所述结合PD-L1的任何一种Fab，变体IL-12p40亚基，其包含一组或多组选自由以下组成的组的氨基酸取代E59K/C252S、E59K/N200Q、E59K/K99E/N200Q、E59K/K99Y/N200Q、E59K/K99E/N200Q/C252S、E59K/K99Y/N200Q/C252S、E59K/K99E/N200Q/K264E、D18K/E59K/K99E/N200Q、D18K/E59K/K99E/C252S、D18K/E59K/K99E/N200Q/C252S、D18K/E59K/K99E/N200Q/K264E、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、D18K/E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、D18K/E59K/K99E、D18K/E59K/K99E/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、E32Q/D34N/E59K/K99E、E59K/K99E、E59K/K99E/C252S/K264E和E59K/K99E/K264E、E59K/K99Y、N103D、N103Q、N113D、N113Q、N200D、N200Q、N281D和N281Q；和野生型(未修饰的)IL-12p35亚基。
在一些实施方式中，靶向PD-1的Fab x scIL-12异源二聚体Fc融合蛋白包含如本文所述结合PD-1的任何一种Fab，变体IL-12p40亚基，其包含一组或多组选自由以下组成的组的氨基酸取代E59K/C252S、E59K/N200Q、E59K/K99E/N200Q、E59K/K99Y/N200Q、E59K/K99E/N200Q/C252S、E59K/K99Y/N200Q/C252S、E59K/K99E/N200Q/K264E、D18K/E59K/K99E/N200Q、D18K/E59K/K99E/C252S、D18K/E59K/K99E/N200Q/C252S、D18K/E59K/K99E/N200Q/K264E、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、D18K/E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、D18K/E59K/K99E、D18K/E59K/K99E/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、E32Q/D34N/E59K/K99E、E59K/K99E、E59K/K99E/C252S/K264E和E59K/K99E/K264E、E59K/K99Y、N103D、N103Q、N113D、N113Q、N200D、N200Q、N281D和N281Q；和变体IL-12p35亚基，其包含一个或多个选自由以下组成的组的取代：N71D、N71Q、N85D、N85Q、N195D和N195Q。
在一些实施方式中，靶向PD-L1的Fab x scIL-12异源二聚体Fc融合蛋白包含如本文所述结合PD-L1的任何一种Fab，变体IL-12p40亚基，其包含一组或多组选自由以下组成的组的氨基酸取代E59K/C252S、E59K/N200Q、E59K/K99E/N200Q、E59K/K99Y/N200Q、E59K/K99E/N200Q/C252S、E59K/K99Y/N200Q/C252S、E59K/K99E/N200Q/K264E、D18K/E59K/K99E/N200Q、D18K/E59K/K99E/C252S、D18K/E59K/K99E/N200Q/C252S、D18K/E59K/K99E/N200Q/K264E、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、D18K/E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、D18K/E59K/K99E、D18K/E59K/K99E/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、E32Q/D34N/E59K/K99E、E59K/K99E、E59K/K99E/C252S/K264E和E59K/K99E/K264E、E59K/K99Y、N103D、N103Q、N113D、N113Q、N200D、N200Q、N281D和N281Q；和变体IL-12p35亚基，其包含一个或多个选自由以下组成的组的取代：N71D、N71Q、N85D、N85Q、N195D和N195Q。
C.靶向mAb x Fc-scIL-12形式
在另一个实施方式中，本发明提供mAb-C末端单链IL-12-Fc融合物或“mAb-scIL-12”形式，如图79C所示。在这个实施方式中，IL-12异源二聚体Fc融合蛋白包含三个单体(尽管融合蛋白是四聚体)。mAb(可称为靶向臂)代表抗原结合结构域。mAb-scIL-12形式包含(a)第一单体，其包含与第一Fc结构域的N端融合(连接)的第一VH结构域，(b)融合(连接)到第二Fc结构域的N末端的第二VH结构域，所述第二Fc结构域在其C末端融合到scIL-12的N末端，和(c)包含轻链的第三单体。如上，scIL-12可以是“scIL-12(p40/p35)”，其中IL-12p40亚基或变体IL-12p40亚基在N末端连接(使用或者不使用结构域接头)至IL-12p35亚基或变体IL-12p35亚基，或是“scIL-12(p35/p40)”，其中IL-12p35亚基或变体IL-12p35亚基在N末端连接(使用或者不使用结构域接头)至IL-12p40亚基或变体IL-12p40亚基。在一些实施方式中，第一单体包含抗原结合结构域的重链。换言之，第一单体包括从N末端到C末端：VH-CH1-铰链-CH2-CH3。在一些实施方式中，第二单体包含连接至scIL-12(例如，IL-12p35/p40或IL-12p40/p35)的抗原结合结构域的重链。在一些实施方式中，第二单体包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3-结构域接头-IL-12p35亚基-结构域接头-IL-12p40亚基。在一些实施方式中，第二单体包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3-结构域接头-IL-12p40亚基-结构域接头-IL-12p35亚基。在一些情况下，IL-12p35亚基和IL-12p40亚基之间的结构域接头是可选的。
“mAb-scIL-12”形式(参见，例如，图79C)包含融合到第一和第二异源二聚体Fc的N末端的VH，以及融合到异源二聚体Fc的一个的C末端的scIL-12，同时单独转染相应的轻链以形成具有VH的Fab。需要注意的是，在这种形式中，IL-12p40亚基和IL-12p35亚基的位置可以互换。
在这种形式中，例如，本文所述，有用的Fc变体包括但不限于偏斜变体、pI变体、同配变体、FcγR变体、消融变体及其任何组合。在mAb-scIL-12形式中，一个优选的实施方式利用了偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。在一些实施方式中，第一变体Fc结构域包括偏斜变体S364K/E357Q，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S。在一些实施方式中，第一变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体S364K/E357Q。
在一些实施方式中，mAb-scIL12形式的抗原结合结构域结合人PD-1。在某些实施方式中，抗原结合结构域结合人PD-1不与纳武单抗和/或派姆单抗竞争人PD-1。在一些情况下，抗原结合结构域结合与纳武单抗不同的表位。在一些情况下，抗原结合结构域结合与派姆单抗不同的表位。在一些实施方式中，抗原结合结构域结合人PD-L1。上文描述了靶向人PD-1和人PD-L1的说明性抗原结合结构域。
D.靶向中心IL-12-Fc形式
在另一个实施方式中，本发明提供了中心IL-12-Fc融合物或“中心IL-12-Fc”形式，如图79D所示。在这个实施方式中，IL-12异源二聚体Fc融合蛋白包含三个单体(尽管融合蛋白是四聚体)。中心IL-12-Fc的靶向臂代表抗原结合结构域。这种形式包括(a)包含抗原结合结构域的VH结构域的第一单体被融合至IL-12p35亚基或变体IL-12p35亚基的N末端，所述IL-12p35亚基或变体IL-12p35亚基在其C端融合至第一Fc结构域的N末端，(b)包含抗原结合结构域的VH结构域的第二单体被融合至IL-12p40亚基或变体IL-12p40亚基的N末端，所述IL-12p40亚基或变体IL-12p40亚基在其C末端融合至第二Fc结构域的N末端，和(c)包含抗原结合结构域的轻链的第三单体，其被单独转染并与VH结构域形成抗原结合结构域。
“中心IL-12”形式(参见，例如，图79D)包含重组融合至人IL12p40亚基的N末端的VH，然后将其进一步融合至异源二聚体Fc的一侧，以及重组融合至人IL12p35亚基的N末端的VH，然后将其进一步融合至异源二聚体Fc的另一侧，同时分别转染相应的轻链以形成具有VH的Fab。需要注意的是，在这种形式中，IL-12p40亚基和IL-12p35亚基的位置可以互换。
在这种形式中，例如，本文所述，有用的Fc变体包括但不限于偏斜变体、pI变体、同配变体、FcγR变体、消融变体及其任何组合。在中心IL-12-Fc形式中，一个优选的实施方式利用了偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。在一些实施方式中，第一变体Fc结构域包括偏斜变体S364K/E357Q，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S。在一些实施方式中，第一变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体S364K/E357Q。
在一些实施方式中，抗原结合结构域如中心IL-12-Fc的Fab结合人PD-1。在某些实施方式中，抗原结合结构域结合人PD-1不与纳武单抗和/或派姆单抗竞争人PD-1。在一些情况下，抗原结合结构域结合与纳武单抗不同的表位。在一些情况下，抗原结合结构域结合与派姆单抗不同的表位。在一些实施方式中，抗原结合结构域结合人PD-L1。上文描述了靶向人PD-1和人PD-L1的说明性抗原结合结构域。
E.靶向中心scIL-12-Fc形式
在另一个实施方式中，本发明提供中心单链IL-12-Fc融合物或“中心scIL-12-Fc”形式，如图79E所示。在这个实施方式中，IL-12异源二聚体Fc融合蛋白包含三个单体(尽管融合蛋白是四聚体)。中心-scIL-12形式包含(a)融合(连接)至scIL-12的N末端的第一重链结构域(VH-CH1)，scIL-12在其C末端融合至第一Fc结构域的N末端，(b)包含重链的第二单体，该重链包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3，使得CH2-CH3是第二Fc结构域，和(c)第三单体包含轻链(VL-CL)。如上，scIL-12可以是“scIL-12(p40/p35)”，其中IL-12p40亚基或变体IL-12p40亚基在N末端连接(使用或者不使用结构域接头)至IL-12p35亚基或变体IL-12p35亚基，或是“scIL-12(p35/p40)”，其中IL-12p35亚基或变体IL-12p35亚基在N末端连接(使用或者不使用结构域接头)至IL-12p40亚基或变体IL-12p40亚基。
在一些实施方式中，第二单体包含抗原结合结构域的重链。换言之，第二单体包括从N末端到C末端：VH-CH1-铰链-CH2-CH3。在一些实施方式中，第一单体包含连接至scIL-12(例如，IL-12p35/p40或IL-12p40/p35)的抗原结合结构域的重链。在一些实施方式中，第一单体包含VH-CH1-结构域接头-IL-12p35亚基-结构域接头-IL-12p40亚基-CH2-CH3。在一些实施方式中，第一单体包含VH-CH1-结构域接头-IL-12p40亚基-结构域接头-IL-12p35亚基-CH2-CH3。在一些情况下，IL-12p35亚基和IL-12p40亚基之间的结构域接头是可选的。
“中心scIL-12”形式(参见，例如，图79E)包含重组融合至scIL-12的N末端的VH，然后将其进一步融合至异源二聚体Fc的一侧，以及重组融合至异源二聚体Fc的另一侧的VH，同时分别转染相应的轻链以形成具有VH的Fab。需要注意的是，在这种形式中，IL-12p40亚基和IL-12p35亚基的位置可以互换。
在这种形式中，例如，本文所述，有用的Fc变体包括但不限于偏斜变体、pI变体、同配变体、FcγR变体、消融变体及其任何组合。在mAb-scIL-12形式中，一个优选的实施方式利用了偏斜变体对S364K/E357Q和L368D/K370S。在一些实施方式中，第一变体Fc结构域包括偏斜变体S364K/E357Q，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S。在一些实施方式中，第一变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体S364K/E357Q。
在一些实施方式中，中心IL-12-Fc的抗原结合结构域结合人PD-1。在某些实施方式中，抗原结合结构域结合人PD-1不与纳武单抗和/或派姆单抗竞争人PD-1。在一些情况下，抗原结合结构域结合与纳武单抗不同的表位。在一些情况下，抗原结合结构域结合与派姆单抗不同的表位。在一些实施方式中，Fab结合人PD-L1。上文描述了靶向人PD-1和人PD-L1的说明性抗原结合结构域。
VIII.本发明的有用实施方式
如本领域的技术人员将理解的并且如下文更全面地讨论的，本发明的异源二聚体融合蛋白可以采取各种配置，如图79A-79E中总体上描绘的。在一些实施方式中，IL-12异源二聚体Fc融合蛋白靶向人PD-1。在一些实施方式中，IL-12异源二聚体Fc融合蛋白靶向人PD-L1。
在一些方面，本文提供靶向scFv x scIL-12-Fc形式的IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，例如抗PD-1scFv x scIL-12-Fc融合蛋白和抗PD-L1 scFv x scIL-12-Fc融合蛋白。此外，本文提供靶向Fab x scIL-12-Fc形式的IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，例如抗PD-1Fabx scIL-12-Fc融合蛋白和抗PD-L1 Fab x scIL-12-Fc融合蛋白。
图80A-80J和81A-81B中提供了抗PD-1Fab x scIL-12-Fc融合物的示例性融合蛋白的氨基酸序列。在一些实施方式中，本文提供了靶向PD-1的Fab x scIL12-Fc融合蛋白，包括但不限于XENP28792、XENP28793、XENP28794、XENP28796、XENP31073、XENP31074、XENP31106、XENP31136、XENP31137、XENP31140、XENP31460、XENP31461、XENP31462、XENP31585、XENP31586、XENP32192、XENP32193、XENP32194和XENP32195，如图80A-80J和81A-81B中提供的氨基酸序列以及还有序列表中所描绘。还提供了靶向PD-L1的scIL-12融合蛋白，包括但不限于XENP31108、XENP31463、XENP31464和XENP31465，如图81A-81B和83B所示。
靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白的有用实施方式包含第一单体(第一融合蛋白)，其包含共价连接(任选地通过结构域接头)至第一Fc结构域的N末端的单链IL-12复合物(“scIL-12”)，和包含scFv或Fab和第二Fc结构域的第二单体(第二融合蛋白；也称为靶向臂)。scIL-12可以是“scIL-12(p40/p35)”，其中IL-12p40亚基在N末端连接(有或没有结构域接头)至IL-12p35亚基，或“scIL-12(p35/p40)”，其中IL-12p35在N末端连接(有或没有结构域接头)至IL-12p40亚基。在一些实施方式中，靶向IL-12Fc融合蛋白的IL-12p40亚基是变体IL-12p40亚基。在一些特定此类实施方式中，IL-12p40亚基是异质性降低的变体IL-12p40亚基。在其他特定此类实施方式中，IL-12p40亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的(即，下降或降低)亲和力的变体IL-12p40亚基。
在一些实施方式中，变体IL-12p40亚基在选自由以下组成的组的氨基酸残基上具有一个或多个氨基酸修饰：E3、D7、E12、D14、W15、P17、D18、A19、P20、G21、E22、M23、D29、E32、E33、D34、L40、D41、Q42、S43、E45、L47、T54、I55、Q56、K58、E59、F60、G61、D62、Q65、Y66、E73、K84、E86、D87、G88、I89、W90、D93、D97、K99、E100、K102、N103、K104、F106、E110、N113、Y114、D129、D142、Q144、E156、R159、D161、N162、K163、D166、D170、Q172、D174、A176、C177、P178、A179、A180、E181、S183、P185、E187、N200、S204、F206、R208、D209、D214、N218、Q220、N226、Q229、E231、E235、T242、P243、S245、Y246、F247、S248、C252、Q256、K258、K260、E262、K264、D265、D270、N281、Q289、D290、R291、Y292、Y293和E299(根据人IL-12β亚基(IL-12p40)成熟形式序列编号)。在一些实施方式中，变体IL-12p40亚基具有一个或多个选自由以下组成的组的氨基酸取代：D18K、D18N、E32Q、E33Q、D34K、D34N、Q42E、S43E、S43K、E45Q、Q56E、E59K、E59Q、D62N、E73Q、D87N、K99E、K99Y、E100Q、N103D、N103Q、N113D、N113Q、Q144E、R159E、D161N、K163E、E187Q、N200D、N200Q、N218Q、Q229E、E235Q、C252S、Q256N、K258E、K260E、E262Q、K264E、N281D、N281Q和E299Q。在一些实施方式中，变体IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的氨基酸取代：E59K/C252S、E59K/N200Q、E59K/K99E/N200Q、E59K/K99Y/N200Q、E59K/K99E/N200Q/C252S、E59K/K99Y/N200Q/C252S、E59K/K99E/N200Q/K264E、D18K/E59K/K99E/N200Q、D18K/E59K/K99E/C252S、D18K/E59K/K99E/N200Q/C252S、D18K/E59K/K99E/N200Q/K264E、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、D18K/E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、D18K/E59K/K99E、DI8K/E59K/K99E/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、E32K/D34N/E59K/K99E、E32Q/D34N/E59K/K99E、D34K/E59K/K99E、D34N/E59K、D34N/E59K/K99E、Q42E/E45Q、Q42E/E59Q、Q42E/Q56E/E59Q、E32Q/E59Q、D34N/E59Q、S43E/E59Q、S43K/E49Q、E45K/E59K/K99E、E45Q/Q56E、E45Q/Q56E/E59Q、E59Q/E187Q、E59Q/K163E、E59Q/K99E、E59Q/K258E、E59Q/K260E、E59K/K99E、E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E E59K/K99E/Q144E、E59K/K99E/Q144K、E59K/K99E/R159E、E59K/K99E/K264E、E59K/K99E/C252S、E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99Y、E59K/K99Y/C252S、E59Y/K99E、E59Y/K99Y、E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、N103D/N113D、N103D/N113D/N200D、N103D/N113D/N281D、N103D/N200D、N103D/N200D/N281D、N103D/N281D、N103D/N113D/N200D/N281D、N103Q/N113Q、N103Q/N113Q/N200Q、N103Q/N113Q/N281Q、N103Q/N200Q、N103Q/N200Q/N281Q、N103Q/N281Q、N113D/N200D、N113D/N200D/N281D、N113D/N281D、N113Q/N200Q、N113Q/N281Q、N113Q/N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q/N281Q、N200D/N281D和N200Q/N281Q。在一些实施方式中，IL-12p40变体具有选自由以下组成的组的多肽序列：i i)SEQ ID NO:57(IL-12p40(N103D))、ii)SEQID NO:58(IL-12p40(N113D))、iii)SEQ ID NO:59(IL-12p40(N200D))、iv)SEQ ID NO:60(IL-12p40(N281D))、v)SEQ ID NO:61(IL-12p40(N103D/N113D/N200D/N281D))、vi)SEQ IDNO:62(IL-12p40(Q42E))、vii)SEQ ID NO:63(IL-12p40(E45Q))、viii)SEQ ID NO:64(IL-12p40(Q56E))、ix)SEQ ID NO:65(IL-12p40(E59Q))、x)SEQ ID NO:66(IL-12p40(D62N))、xi)SEQ ID NO:67(IL-12p40(Q42E/E45Q))、xii)SEQ ID NO:68(IL-12p40(E45Q/Q56E))、xiii)SEQ ID NO:69(IL-12p40(Q42E/E59Q))、xiv)SEQ ID NO:70(IL-12p40(Q56E/E59Q))、xv)SEQ ID NO:71(IL-12p40(Q42E/E45Q/Q56E))、xvi)SEQ ID NO:72(IL-12p40(E45Q/Q56E/E59Q))、xvii)SEQ ID NO:73(IL-12p40(D161N))、xviii)SEQ ID NO:74(IL-12p40(E73Q))、xix)SEQ ID NO:75(IL-12p40(Q144E))、xx)SEQ ID NO:76(IL-12p40(E262Q))、xxi)SEQ ID NO:77(IL-12p40(E100Q))、xxii)SEQ ID NO:78(IL-12p40(D18N))、xxiii)SEQID NO:79(IL-12p40(E33Q))、xxiv)SEQ ID NO:80(IL-12p40(Q229E))、xxv)SEQ ID NO:81(IL-12p40(E235Q))、xxvi)SEQ ID NO:82(IL-12p40(Q256N))、xxvii)SEQ ID NO:83(IL-12p40(E299Q))、xxviii)SEQ ID NO:84(IL-12p40(D87N))、xxix)IL-12p40(E32Q)、xxx)IL-12p40(D34N)、xxxi)IL-12p40(S43E)、xxxii)IL-12p40(S43K)、xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))、xxxiv)SEQ ID NO:205(IL-12p40(E59K))、xxxv)IL-12p40(K99E)、xxxvi)IL-12p40(K163E)、xxxvii)IL-12p40(E187Q)、xxxviii)IL-12p40(K258E)、xxxix)IL-12p40(K260E)、xl)SEQ ID NO:206(IL-12p40(E32Q/E59Q))、xli)SEQ ID NO:207(IL-12p40(D34N/E59Q))、xlii)SEQ ID NO:208(IL-12p40(E59Q/E187Q))、xliii)SEQ ID NO:209(IL-12p40(S43E/E59Q))、xliv)SEQ IDNO:210(IL-12p40(S43K/E49Q))、xlv)SEQ ID NO:211(IL-12p40(E59Q/K163E))、xlvi)SEQID NO:212(IL-12p40(E59Q/K99E))、xlvii)SEQ ID NO:213(IL-12p40(E59Q/K258E))、xlviii)SEQ ID NO:214(IL-12p40(E59Q/K260E))、xlix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K))l)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E))、li)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E))、lii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))、liii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y))、liv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99E))、lv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E45K/E59K/K99E))、lvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144E))、lvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144K))、lviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/R159E))、lix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))、lx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/K264E))、lxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(C252S))、lxii)SEQID NO:XXX(IL-12p40(DI8K/E59K/K99E/C252S))、lxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/C252S/K264E))、lxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y/C252S))、lxv)SEQID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S/K264E))、lxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S))、lxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D))、lxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D))、lxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N281D))、lxx)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D))、lxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N281D))、lxxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200D/N281D))、lxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p50(N103D/N113D/N200D))、lxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D/N281D))、lxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D/N281D))、lxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D/N281D))、lxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q))、lxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q))、lxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q))、lxxx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N281Q))、lxxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q))、lxxxii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q))、lxxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N281Q))、lxxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q))、lxxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N281Q))、lxxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q/N281Q))、lxxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q))、lxxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N281Q))、lxxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q/N281Q))、xc)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q/N281Q))、xci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q/N281Q))、xcii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K/K99E))、xciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34K/E59K/K99E))、xciv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32Q/D34N/E59K/K99E))、xcv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32K/D34N/E59K/K99E))、xcvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99Y))、xcvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E))、xcviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E))、xcix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E))、c)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E))、ci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E))、cii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E))、ciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E))、civ)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E))、cv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E))、cvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E))、cvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E))、cviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))和cix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))。
在一些实施方式中，靶向IL-12Fc融合蛋白的IL-12p35亚基是变体IL-12p35亚基。在一些特定此类实施方式中，IL-12p35亚基是异质性降低的变体IL-12p35亚基。在其他特定此类实施方式中，IL-12p35亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的(即，下降或降低)亲和力的变体IL-12p35亚基。在一些实施例中，变体IL-12p35亚基在选自由以下组成的组的氨基酸残基上具有一个或多个氨基酸修饰：Q20、N21、Q35、E38、S44、E45、E46、H49、K54、D55、T59、V60、E61、C63、L64、P65、E67、L68、N71、S73、C74、L75、N76、E79、N85、L89、F96、M97、L124、M125、Q130、Q135、N136、E143、Q146、N151、E153、K158、E162、E163、D165、I171、R181、I182、R183、V185、T186、D188、R189、V190、S192、Y193、N195和A196(根据人IL-12亚基α(IL-12p35)成熟形式序列编号)。在一些实施方式中，变体IL-12p35亚基具有一个或多个选自由以下组成的组的氨基酸取代：N21D、Q35D、E38Q、D55Q、D55K、N71D、N71Q、L75A、N76D、E79Q、N85D、N85Q、L89A、F96A、M97A、L124A、M125A、Q130E、Q135E、N136D、E143Q、Q146E、N151D、N151K、E153K、E153Q、K158E、E162Q、E163Q、D165N、I171A、N195D和N195Q。在一些实施方式中，变体IL-12p35亚基具有氨基酸取代N21D/N151D、D55Q/N151D、N71D/N85D、N71D/N85D/N195D、N71D/N195D、N71Q/N85Q、N71Q/N85Q/N195Q、N71Q/N195Q、E79Q/N151D、N85D/N195D、N85Q/N195Q、Q130E/N151D、N136D/N151D、E143Q/N151D、N151D/E153Q、N151D/D165N和N151D/K158E。在一些实施方式中，变体IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的多肽序列：i)SEQ ID NO:XX(IL-12p35(N71D))、ii)SEQ ID NO:XX(IL-12p35(N85D))、iii)SEQ ID NO:XX(IL-12p35(N195D))、iv)SEQ ID NO:XX(IL-12p35(N71D/N85D/N195D))、v)SEQ ID NO:XX(IL-12p35(E153Q))、vi)SEQ ID NO:XX(IL-12p35(E38Q))、vii)SEQ ID NO:XX(IL-12p35(N151D))、viii)SEQ IDNO:XX(IL-12p35(Q135E))、ix)SEQ ID NO:XX(IL-12p35(Q35D))、x)SEQ ID NO:XX(IL-12p35(Q146E))、xi)SEQ ID NO:XX(IL-12p35(N76D))、xii)SEQ ID NO:XX(IL-12p35(E162Q))、xiii)SEQ ID NO:XX(IL-12p35(E163Q))、xiv)SEQ ID NO:XX(IL-12p35(N21D))、xv)SEQ ID NO:XX(IL-12p35(D55Q))、xvi)SEQ ID NO:XX(IL-12p35(E79Q))、xvii)SEQ IDNO:XX(IL-12p35(Q130E))、xviii)SEQ ID NO:XX(IL-12p35(N136D))、xix)SEQ ID NO:XX(IL-12p35(E143Q))、xx)SEQ ID NO:XX(IL-12p35(N151K))、xxi)SEQ ID NO:XX(IL-12p35(E153K))、xxii)SEQ ID NO:XX(IL-12p35(K158E))、xxiii)SEQ ID NO:XX(IL-12p35(D165N))、xxiv)SEQ ID NO:XX(IL-12p35(N151D/E153Q))、xxv)SEQ ID NO:XX(IL-12p35(N151D/D165N))、xxvi)SEQ ID NO:XX(IL-12p35(Q130E/N151D))、xxvii)SEQ ID NO:XX(IL-12p35(N151D/K158E))、xxviii)SEQ ID NO:XX(IL-12p35(E79Q/N151D))、xxix)SEQ IDNO:XX(IL-12p35(D55Q/N151D))、xxx)SEQ ID NO:XX(IL-12p35(N136D/N151D))、xxxi)SEQID NO:XX(IL-12p35(N21D/N151D))、xxxii)SEQ ID NO:XX(IL-12p35(E143Q/N151D))、xxxiii)SEQ ID NO:XX(IL-12p35(F96A))、xxxiv)SEQ ID NO:XX(IL-12p35(M97A))、xxxv)SEQ ID NO:XX(IL-12p35(L89A))、xxxvi)SEQ ID NO:XX(IL-12p35(L124A))、xxxvii)SEQID NO:XX(IL-12p35(M125A))、xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L75A))、xxxiv)SEQ IDNO:XXX(IL-12p35(I171A))、xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q))、xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q))、xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N195Q))、xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q))、xxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N195Q))、xl)SEQ IDNO:XXX(IL-12p35(N85Q/N195Q)、xli)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q/N195Q))、xlii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71D/N85D))、xliii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71D/N195D)、xliv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85D/N195D))、xlv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))和xlvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55K))))。
在一些实施方式中，说明性靶向IL-12-Fc形式的变体IL-12p40亚基结构域包含选自由SEQ ID NO:57-84和图21A-21G和图43A-43B中描绘的氨基酸序列组成的组的氨基酸序列。在某些实施方式中，示例性变体IL-12p40亚基的氨基酸序列在图21A-21G、26A-26L、30A-30B、34A-34G、38、43A-43B、45A-45I、50、51、65A-65B、66A-66C、67A-67N、89A-89C、90、91A-91C、92A-92C、94、91A-95C、96A-96C、97！-97C、98A-98B、99A-99B、100A-100C、102A、102C、103A-103C、104A-104C、105A-105C、106、107A-107B、108A-108C、109A-109C、110A、110C、111A-111C、112A-112C、113A-113C、114A、115A-115C-116A-116C、117A-117C、118A-118D、119A-119D、120A-120D和121A-121D以及序列表中提供。
在一些实施方式中，说明性靶向IL-12-Fc形式的变体IL-12p35亚基结构域包含选自由SEQ ID NO:113-125和图24A-24C和图44所描绘的氨基酸序列组成的组的氨基酸序列。在某些实施方式中，示例性变体IL-12p35亚基的氨基酸序列在图24A-24C、25A、25C、26M-26Q、32、34H-34L、39、44、45A-45I和67K-67N以及序列表中提供。
在一些实施方式中，说明性靶向IL-12-Fc形式的变体IL-12p40亚基结构域包含选自由SEQ ID NO:57-84和图21A-21G和图43A-43B中描绘的氨基酸序列组成的组的氨基酸序列。在一些实施方式中，说明性靶向IL-12-Fc形式的变体IL-12p35亚基结构域包含选自由SEQ ID NO:113-125和图24A-24C和图44所描绘的氨基酸序列组成的组的氨基酸序列。
在另外的实施方式中，含有变体IL-12p40亚基的单体包含选自由以下组成的组的多肽序列：i)SEQ ID NO:XX(XENP27201链1)、ii)SEQ ID NO:85(XenD24752)、iii)SEQ IDNO:86(XenD24753)、iv)SEQ ID NO:87(XenD24754)、v)SEQ ID NO:88(XenD24755)、vi)SEQID NO:89(XenD24756)、vii)SEQ ID NO:90(XenD24757)、viii)SEQ ID NO:91(XenD24758)、ix)SEQ ID NO:92(XenD24759)、x)SEQ ID NO:93(XenD24760)、xi)SEQ ID NO:94(XenD24761)、xii)SEQ ID NO:95(XenD24762)、xiii)SEQ ID NO:96(XenD24763)、xiv)SEQID NO:97(XenD24764)、xv)SEQ ID NO:98(XenD24765)、xvi)SEQ ID NO:99(XenD24766)、xvii)SEQ ID NO:100(XenD24767)、xviii)SEQ ID NO:101(XenD24768)、xix)SEQ ID NO:102(XenD24769)、xx)SEQ ID NO:103(XenD24770)、xxi)SEQ ID NO:104(XenD24771)、xxii)SEQ ID NO:105(XenD24772)、xxiii)SEQ ID NO:106(XenD24773)、xxiv)SEQ ID NO:107(XenD24774)、xxv)SEQ ID NO:108(XenD24775)、xxvi)SEQ ID NO:109(XenD24776)、xxvii)SEQ ID NO:110(XenD24777)、xxviii)SEQ ID NO:111(XenD24778)、xxix)SEQ ID NO:112(XenD24792)、xxx)SEQ ID NO:215(XenD25922)、xxxi)SEQ ID NO:216(XenD25923)、xxxii)SEQ ID NO:217(XenD25924)、xxxiii)SEQ ID NO:218(XenD25925)、xxxiv)SEQ ID NO:219(XenD25926)、xxxv)SEQ ID NO:220(XenD25927)、xxxvi)SEQ ID NO:221(XenD25928)、xxxvii)SEQ ID NO:222(XenD25929)、xxxviii)SEQ ID NO:223(XenD25930)以及xxxix)SEQID NO:224(XenD25931)；和包含变体IL-12p35亚基的单体包含选自由以下组成的组的多肽序列：i)SEQ ID NO:113(IL-12p35(N71D))、ii)SEQ ID NO:114(IL-12p35(N85D))、iii)SEQID NO:115(IL-12p35(N195D))、iv)SEQ ID NO:116(IL-12p35(N71D/N85D/N195D))、v)SEQID NO:117(IL-12p35(E153Q))、vi)SEQ ID NO:118(IL-12p35(E38Q))、vii)SEQ ID NO:119(IL-12p35(N151D))、viii)SEQ ID NO:120(IL-12p35(Q135E))、ix)SEQ ID NO:121(IL-12p35(Q35D))、x)SEQ ID NO:122(IL-12p35(Q146E))、xi)SEQ ID NO:123(IL-12p35(N76D))、xii)SEQ ID NO:124(IL-12p35(E162Q))、xiii)SEQ ID NO:125(IL-12p35(E163Q))、xiv)SEQ ID NO:XX(IL-12p35(N21D))、xv)SEQ ID NO:XX(IL-12p35(D55Q))、xvi)SEQ ID NO:XX(IL-12p35(E79Q))、xvii)SEQ ID NO:XX(IL-12p35(Q130E))、xviii)SEQID NO:XX(IL-12p35(N136D))、xix)SEQ ID NO:XX(IL-12p35(E143Q))、xx)SEQ ID NO:227(IL-12p35(N151K))、xxi)SEQ ID NO:226(IL-12p35(E153K))、xxii)SEQ ID NO:XX(IL-12p35(K158E))、xxiii)SEQ ID NO:XX(IL-12p35(D165N))、xxiv)SEQ ID NO:225(IL-12p35(N151D/E153Q))、xxv)SEQ ID NO:228(IL-12p35(N151D/D165N))、xxvi)SEQ ID NO:XX(IL-12p35(Q130E/N151D))、xxvii)SEQ ID NO:230(IL-12p35(N151D/K158E))、xxviii)SEQ IDNO:231(IL-12p35(E79Q/N151D))、xxix)SEQ ID NO:232(IL-12p35(D55Q/N151D))、xxx)SEQID NO:233(IL-12p35(N136D/N151D))、xxxi)SEQ ID NO:234(IL-12p35(N21D/N151D))、xxxii)SEQ ID NO:235(IL-12p35(E143Q/N151D))、xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(F96A))、xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M97A))、xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L89A))、xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L124A))、xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M125A))、xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L75A))、xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(I171A))、xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q))、xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q))、xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N195Q))、xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q))、xxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71W/N195Q))、lx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q/N195Q)、lxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q/N195Q))、lxii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p35(N71D/N85D))、lxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71D/N195D)、lxiv)SEQID NO:XXX(IL-12p35(N85D/N195D))、lxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))和lxvi)SEQID NO:XXX(IL-12p35(D55K))。
如上所述，靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白的抗原结合结构域结合人PD-1。在某些实施方式中，抗原结合结构域结合人PD-1并且不与纳武单抗和/或派姆单抗竞争人PD-1。在一些情况下，抗原结合结构域结合与纳武单抗不同的表位。在一些情况下，抗原结合结构域结合与派姆单抗不同的表位。在一些实施方式中，抗原结合结构域结合人PD-L1。上文描述了靶向人PD-1和人PD-L1的说明性抗原结合结构域。此类抗原结合结构域的氨基酸序列在图70A-70I、71、72、75A-75I和76A-76J以及序列表中描绘。
对于本文概述的任何的异源二聚体Fc融合蛋白中，在第一单体、第二单体上和/或scIL-12中使用的任选的结构域接头可以相同或不同。另外，异源二聚体蛋白的第一Fc结构域和第二Fc结构域的氨基酸序列可以不同。
本发明的Fc结构域包括IgG Fc结构域，例如，IgG1 Fc结构域。在一些实施方式中，第一和第二Fc结构域包含选自由以下组成的组的一组氨基酸取代：根据EU编号，L368D/K370S和S364K；L368D/K370S和S364K/E357L；L368D/K370S和S364K/E357Q；T411E/K360E/Q362E和D401K；L368E/K370S和S364K；K370S和S364K/E357Q；T366S/L368A/Y407V和T366W；以及T366S/L368A/Y407V/Y349C和T366W/S354C。在一些情况下，根据EU编号，本文概述的任何异源二聚体Fc融合形式的第一和/或第二Fc结构域可具有包含Q295E/N384D/Q418E/N421D的另一组氨基酸取代。在一些实施方式中，第一Fc和/或第二Fc结构域具有另外一组由以下组成的氨基酸取代：根据EU编号，G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G和E233P/L234V/L235A/G236del。
在一些实施方式中，靶向IL-12Fc融合蛋白通过在Fc结构域中包含M428L和N434S的取代进一步工程化以延长半衰期。在一些实施方式中，IL-12Fc融合蛋白通过在第一和第二变体Fc结构域中包含M428L/N434S的取代进一步工程化以延长半衰期。本文列出的任何靶向IL-12Fc融合物都可以被工程化用于延长半衰期。
另外的异源二聚体变体可以独立地并且任选地包括并选自附图中概述的变体。这些组合物可以进一步包括消融变体、pI变体、带电荷变体、同种型变体等。
本文概述的许多实施方式通常依赖于图79D的中心IL-12-Fc形式，其包含：包含靶向臂的VH结构域的第一单体(第一融合蛋白)融合至变体IL-12p35亚基结构域的N末端，所述变体IL-12p 35亚基结构域共价连接(任选通过结构域接头)至第一Fc结构域的N末端；包含靶向臂的VH结构域的第二单体(第二融合蛋白)融合至变体IL-12p40亚基结构域的N末端，所述变体IL-12p 40亚基结构域共价连接(任选通过结构域接头)至第二Fc结构域的N末端，和包含靶向臂的轻链的第三单体。
靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白的有用实施方式包含第一单体(第一融合蛋白；也称为第一靶向臂)，其包含共价连接(任选地通过结构域接头)至IL-12p35亚基结构域的VH-CH1，其共价连接(任选地通过结构域接头)至第一Fc结构域的C末端，和第二单体(第二融合蛋白；也称为第二靶向臂)，其包含共价连接(任选通过结构域接头)至IL-12p40亚基结构域的VH-CH1，其共价连接(任选通过结构域接头)至第二Fc结构域的C末端。
IX.本发明的核酸
本发明进一步提供了核酸组合物，所述核酸组合物对本发明的异源二聚体Fc融合蛋白、IL-12亚基和IL-12异源二聚体复合物进行编码(或者，在单体Fc结构域蛋白的情况下，也对所述蛋白进行编码的核酸)。
如本领域的技术人员将理解的，核酸组合物将取决于异源二聚体蛋白的形式。因此，例如，当形式需要三个氨基酸序列时，三个核酸序列可以并入到一个或多个表达载体中以进行表达。类似地，仅两种核酸需要一些形式；再次，所述两种核酸可以被放入到一个或两个表达载体中。
如本领域已知的，对本发明的组分进行编码的核酸可以并入到如本领域已知并且取决于用于产生本发明的异源二聚体Fc融合蛋白的宿主细胞的表达载体中。通常，核酸可操作地连接到任何数量的调控元件(启动子、复制起点、可选择标记、核糖体结合位点、诱导剂等)。表达载体可以是染色体外的或整合的载体。
本发明的核酸和/或表达载体然后转化成如本领域众所周知的任何数量的不同类型的宿主细胞，包括哺乳动物细胞、细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞和/或真菌细胞，其中哺乳动物细胞(例如，CHO细胞)可用于许多实施方式中。
在一些实施方式中，如果根据形式适用的话，编码每个单体的核酸通常在不同或相同的启动子控制下各自包含在单个表达载体内。在本发明的特别有用的实施方式中，这两种或三种核酸中的每种包含在不同表达载体上。
通过培养包含如本领域众所周知的表达载体的宿主细胞来制备本发明的异源二聚体Fc融合蛋白。一旦产生，就进行传统的融合蛋白或抗体纯化步骤，包括离子交换色谱法步骤。如本文所讨论的，使两个单体的pI相差至少0.5可以通过离子交换色谱法或等电聚焦或对等电点敏感的其它方法进行分离。也就是说，包含改变每个单体的等电点(pI)的pI取代使得每个单体具有不同的pI并且异源二聚体也具有不同的pI，从而促进异源二聚体的等电纯化(例如，阴离子交换色谱法、阳离子交换色谱法)。这些取代还有助于确定和监测纯化(例如，IEF凝胶、cIEF和分析型IEX柱)后的任何污染性同源二聚体。
X.IL-12异源二聚体免疫调节Fc融合蛋白的生物学和生化功能
通常，本发明的Fc融合蛋白施用于患有癌症的患者，并且以如本文所描述的多种方式对功效进行评估。因此，在可以进行标准功效测定时，如癌症负载、肿瘤大小、对存在或转移程度的评估等，可以也可以基于免疫状态评估来估计免疫肿瘤学治疗。这可以多种方式进行，包括体外和体内测定。例如，可以与“旧式”测量如肿瘤负荷、大小、浸润性、LN参与、转移等一起进行免疫状态变化(例如，在ipi处理后ICOS+CD4+T细胞的存在)的评估。因此，可以评估以下中的任一个或全部：PVRIG对CD4+T细胞活化或增殖、CD8+T(CTL)细胞活化或增殖、CD8+T细胞介导的细胞毒性活性和/或CTL介导的细胞耗竭、NK细胞活性和NK介导的细胞耗竭的抑制作用；PVRIG对Treg细胞分化和增殖和Treg或骨髓来源的抑制细胞(MDSC)介导的免疫抑制或免疫耐受的增强作用；和/或PVRIG对通过免疫细胞产生促炎性细胞因子的影响，例如通过T细胞或其它免疫细胞产生IL-2、
Figure BDA0003679091520001161
或TNF-α。
在一些实施方式中，通过使用例如CFSE稀释方法、免疫效应细胞的Ki67细胞内染色和3H-胸腺掺入法评估免疫细胞增殖来进行治疗估计，
在一些实施方式中，通过评估基因表达的增加或活化相关标志物的蛋白质含量的增加来评定处理，所述标志物包括以下中的一个或多个：CD25、CD69、CD137、ICOS、PD1、GITR、OX40以及通过CD107A的表面表达测量的细胞脱粒。
通常，按本领域已知的那样进行基因表达测定。
通常，按本领域已知的那样进行蛋白质表达测量。
在一些实施方式中，通过评估各种细胞参数如酶活性(包含蛋白酶活性)、细胞膜渗透性、细胞粘附、ATP产生、辅酶产生和核苷酸摄取活性来估计通过靶细胞活力检测测量的细胞毒活性进行治疗估计。这些测定的具体实施例包括但不限于台盼蓝(Trypan Blue)或PI染色、51Cr或35S释放法、LDH活性、MTT和/或WST分析、钙黄绿素-AM分析、基于发光的分析以及其它分析。
在一些实施方式中，通过使用众所周知的技术评估通过细胞因子产生测量的T细胞活性、使用包括但不限于IFNγ、TNFα、GM-CSF、IL2、IL6、IL4、IL5、IL10、IL13的细胞因子的培养物上清液中的细胞内度量，来进行处理的评估。
因此，可以使用评估以下中的一个或多个的测定来评定治疗：(i)免疫应答的增加；(ii)αβ和/或γδT细胞活化的增加；(iii)细胞毒性T细胞活性的增加；(iv)NK和/或NKT细胞活性的增加；(v)αβ和/或γδT细胞抑制的缓解；(vi)促炎性细胞因子分泌的增加；(vii)IL-2分泌的增加；(viii)干扰素
Figure BDA0003679091520001171
产生的增加；(ix)Th1反应的增加；(x)Th2反应的减少；(xi)调节性T细胞(Treg)中的至少一种的细胞数量和/或活性的减少或消除。
A.测量功效和效力的测定
在一些实施方式中，使用如本领域已知的混合淋巴细胞反应(MLR)测定来评定T细胞活化。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施方式中，信号传导通路测定测量免疫应答的增加或减少，如例如通过不同因子的磷酸化或去磷酸化或通过测量其它翻译后修饰所测量的。IL-12通过STAT4的磷酸化介导IFNγ表达和分泌(Morinobu等人,2002)。因此，在一个优选实施方式中，信号传导途径测定测量免疫应答的增加或减少，如STAT4的磷酸化所指示的。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施方式中，信号传导途径测定测量αβ和/或γδT细胞活化的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如CD137、CD107a、PD1等活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺活化性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施方式中，信号传导通路测定测量细胞毒性T细胞活性的增加或减少，如例如通过直接杀伤靶细胞(例如癌细胞)或通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如CD137、CD107a、PD1等活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施方式中，信号传导途径测定测量NK和/或NKT细胞活性的增加或减少，如例如通过直接杀伤靶细胞如例如癌细胞或通过细胞因子分泌或通过如例如CD107a等活化标志物的表达变化所测量的。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施方式中，信号传导途径测定测量αβ和/或γδT细胞抑制的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如CD137、CD107a、PD1等活化标志物的表达变化所测量的。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施方式中，信号传导途径测定测量如例如通过ELISA或通过Luminex或通过基于多珠方法或通过胞内染色和FACS分析或通过Alispot等测量的促炎性细胞因子分泌的增加或减少。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施方式中，信号传导途径测定测量IL-2分泌的增加或减少，如例如通过ELISA或通过Luminex或通过基于微珠的多重方法或通过细胞内染色和FACS分析或通过Alispot等所测量的。活性的增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施方式中，信号传导途径测定测量如例如通过ELISA或通过Luminex或通过基于多珠方法或通过细胞内染色和FACS分析或通过Alispot等测量的干扰素-
Figure BDA0003679091520001181
产生的增加或减少。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施方式中，信号传导途径测定测量Th1反应的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过活化标志物的表达变化所测量的。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施方式中，信号传导途径测定测量Th2反应的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过活化标志物的表达变化所测量的。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施方式中，信号传导途径测定测量至少一种调控T细胞(Treg)的细胞数量和/或活性的增加或减少，如例如通过流式细胞术或通过IHC所测量的。反应减少指示免疫刺激活性。如下所概述，适当的减少与增加相同。
在一个实施方式中，信号传导途径测定测量M2巨噬细胞细胞数量的增加或减少，如例如通过流式细胞术或通过IHC所测量的。反应减少指示免疫刺激活性。如下所概述，适当的减少与增加相同。
在一个实施方式中，信号传导途径测定测量M2巨噬细胞促肿瘤发生活性的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过活化标志物的表达变化所测量的。反应减少指示免疫刺激活性。如下所概述，适当的减少与增加相同。
在一个实施方式中，信号传导途径测定测量N2嗜中性粒细胞增量的增加或减少，如例如通过流式细胞术或通过IHC所测量的。反应减少指示免疫刺激活性。如下所概述，适当的减少与增加相同。
在一个实施方式中，信号传导途径测定测量N2嗜中性粒细胞促肿瘤发生活性的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过活化标志物的表达变化所测量的。反应减少指示免疫刺激活性。如下所概述，适当的减少与增加相同。
在一个实施方式中，信号传导途径测定测量T细胞活化抑制的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如CD137、CD107a、PD1等活化标志物的表达变化所测量的。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施方式中，信号传导途径测定测量CTL活化抑制的增加或减少，如例如通过直接杀伤靶细胞如例如癌细胞或通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如CD137、CD107a、PD1等活化标志物的表达变化所测量的。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施方式中，信号传导途径测定测量αβ和/或γδT细胞耗尽的增加或减少，如例如通过活化标志物的表达变化所测量的。反应减少指示免疫刺激活性。如下所概述，适当的减少与增加相同。
在一个实施方式中，信号传导途径测定测量αβ和/或γδT细胞反应的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如CD137、CD107a、PD1等活化标志物的表达变化所测量的。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施方式中，信号传导途径测定测量抗原特异性记忆反应的刺激的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如CD45RA、CCR7等活化标志物的表达变化所测量的。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施方式中，信号传导途径测定测量癌细胞的细胞凋亡或裂解的增加或减少，如例如通过细胞毒性测定(如例如MTT、Cr释放、Calcine AM)或通过基于流式细胞术的测定(如例如CFSE稀释或碘化丙啶染色等)所测量。活性增加指示免疫刺活化性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施方式中，信号传导途径测定测量如例如通过细胞毒性测定如例如MTT、Cr释放、钙黄绿素AM或通过基于流式细胞术测定如例如CFSE稀释或碘化丙啶染色等测量的刺激对癌细胞的细胞毒性或细胞抑制作用的增加或减少。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施方式中，信号传导途径测定测量如例如通过细胞毒性测定如例如MTT、Cr释放、钙黄绿素AM或通过基于流式细胞术测定如例如CFSE稀释或碘化丙啶染色等测量的直接杀伤的癌细胞的增加或减少。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施方式中，信号传导途径测定测量Th17活性的增加或减小，如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过活化标志物的表达变化所测量的。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施方式中，信号传导途径测定测量补体依赖性细胞毒性和/或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性的诱导的增加或减少，如例如通过细胞毒性测定如例如MTT、Cr释放、Calcine AM或通过基于流式细胞术的测定如例如CFSE稀释或碘化丙啶染色等所测量的。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施方式中，例如通过直接杀伤靶细胞(例如癌细胞)或通过细胞因子分泌或通过增殖或通过活化标志物(例如CD137、CD107a、PD1等)的表达变化来测量T细胞活化。对于T细胞，增殖、细胞表面活化标志物(例如，CD25、CD69、CD137、PD1)、细胞毒性(杀伤靶细胞的能力)和细胞因子产生(例如，IL-2、IL-4、IL-6、IFNγ、TNF-a、IL-10、IL-17A)的增加将指示免疫调节，这将符合癌细胞的杀伤增强。
在一个实施方式中，例如通过直接杀伤靶细胞如例如癌细胞或通过细胞因子分泌或通过增殖或通过改变活化标志物如例如CD107a等的表达测量NK细胞活化。对于NK细胞，增殖增加、细胞毒性(杀伤靶细胞并增加CD107a、颗粒酶和穿孔素表达的能力)、细胞因子产生(例如，IFNγ和TNF)和细胞表面受体表达(例如CD25)将指示免疫调节，其与增强的癌细胞杀伤作用相一致。
在一个实施方式中，例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过改变活化标志物的表达来测量γδT细胞活化。
在一个实施方式中，例如通过细胞因子分泌或通过活化标志物的表达变化来测量Th1细胞活化。
活性或应答的适当增加(或减少，如上文所概述的视情况而定)比参考样品或对照样品例如不含有本发明的IL-12异源二聚体融合蛋白的测试样品中的信号增加10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％至99％。类似地，与参考或对照样品相比，增加至少一倍、两倍、三倍、四倍或五倍显示功效。
XI.检查点阻断抗体
在一些实施方式中，将本文所述的IL-12-Fc融合蛋白与其它治疗剂组合，所述其它治疗剂包括检查点阻断抗体，例如但不限于PD-1抑制剂、TIM3抑制剂、CTLA4抑制剂、PD-L1抑制剂、TIGIT抑制剂、LAG3抑制剂或其组合。在一些实施方式中，在施用检查点阻断抗体之前将本文所述的IL-12-Fc融合蛋白施用于受试者。在一些实施方式中，在施用检查点阻断抗体之后将本文所述的IL-12-Fc融合蛋白施用于受试者。在某些情况下，任何IL-12-Fc融合蛋白和检查点阻断抗体同时或依次施用。
A.抗PD-1抗体
在一些实施方式中，本文所述的IL-12-Fc融合蛋白可以与检查点阻断抗体例如抗PD-1抗体联合施用给患有癌症的受试者。在一些情况下，抗PD-1抗体包括XENP16432(二价抗PD-1mAb、检查点抑制剂，通过抑制所植入的人T细胞来增强抗肿瘤活性；图53中所描绘的序列)。
示例性非限制性抗PD-1抗体分子公开于2015年7月30日公开的标题为“PD-1的抗体分子及其用途(Antibody Molecules to PD-1and Uses Thereof)”的US 2015/0210769中，所述文献以引用方式以其全文并入。
在一个实施方式中，抗PD-1抗体分子包括至少一个或两个重链可变结构域(任选地包括恒定区)、至少一个或两个轻链可变结构域(任选地包括恒定区)或两者，包含BAP049-克隆-A、BAP049-克隆-B、BAP049-克隆-C、BAP049-克隆-D或BAP049-克隆-E的氨基酸序列；或如US 2015/0210769的表1中所述，或由表1中的核苷酸序列编码；或与任何上述序列基本相同的序列(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高的同一性)。抗PD-1抗体分子任选地包含来自重链、轻链或两者的前导序列，如US2015/0210769的表4中所示；或与其基本相同的序列。
在另一个实施方式中，抗PD-1抗体分子包括来自本文所述抗体的重链可变区和/或轻链可变区的至少一个、两个或三个互补决定区(CDR)，例如，抗体选自BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum05、BAP049-hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-hum14、BAP049-hum15、BAP049-hum16、BAP049-克隆-A、BAP049-克隆-B、BAP049-克隆-C、BAP049-克隆-D或BAP049-克隆-E的任一种；或如表1中所述，或由表1中的核苷酸序列编码；或与任何上述序列基本相同的序列(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高的同一性)。
在又一个实施方式中，抗PD-1抗体分子包含来自重链可变区的至少一个、两个或三个CDR(或总体地所有CDR)，所述重链可变区包含US 2015/0210769的表1中所示的氨基酸序列，或由表1中所示的核苷酸序列编码。在一个实施方式中，相对于表1所示或由表1所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，CDR(或总体地所有CDR)中的一个或多个具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个改变，例如，氨基酸取代或缺失。
在又另一个实施方式中，抗PD-1抗体分子包含来自轻链可变区的至少一个、两个或三个CDR(或总体地所有CDR)，所述轻链可变区包括US 2015/0210769的表1中所示或由表1中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一个实施方式中，相对于表1所示或由表1所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，CDR(或总体地所有CDR)中的一个或多个具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个改变，例如，氨基酸取代或缺失。在某些实施方式中，抗PD-1抗体分子在轻链CDR中包括取代，例如在轻链的CDR1、CDR2和/或CDR3中的一个或多个取代。在一个实施方式中，抗PD-1抗体分子在轻链可变区的102位的轻链CDR3中包括取代，例如在根据表1的轻可变区的102位的半胱氨酸取代为酪氨酸或半胱氨酸取代为丝氨酸残基(例如，对于鼠或嵌合的、未修饰的，为SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:24；或对于修饰的序列，为SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:74、或SEQ ID NO:78的任一者)。
在又一个实施方式中，抗PD-1抗体分子包含来自重和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR(或总体地所有CDR)，所述重和轻链可变区包含US2015/0210769的表1中所示的氨基酸序列，或由表1中所示的核苷酸序列编码。在一个实施方式中，相对于表1所示或由表1所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，CDR(或总体地所有CDR)中的一个或多个具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个改变，例如，氨基酸取代或缺失。
在一个实施方式中，抗PD-1抗体分子包括：
(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:4的VHCDR1氨基酸序列，
SEQ ID NO:5的VHCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:3的VHCDR3氨基酸序列；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:13的VLCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO:14的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:33的VLCDR3氨基酸序列，各自公开于US 2015/0210769的表1中；
(b)VH，其包含选自SEQ ID NO:1的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:2的VHCDR2氨基酸序列；SEQ ID NO:3的VHCDR3氨基酸序列；以及VL，其包含SEQ ID NO:10的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:11的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:32的VLCDR3氨基酸序列，其各自公开于US 2015/0210769的表1中；
(c)VH，其包含SEQ ID NO:224的VHCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO:5的VHCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:3的VHCDR3氨基酸序列；以及VL，其包含SEQ ID NO:13的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:14的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:33的VLCDR3氨基酸序列，其各自公开于US 2015/0210769的表1中；或者
(d)VH，其包含SEQ ID NO:224的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:2的VHCDR2氨基酸序列；和SEQ ID NO:3的VHCDR3氨基酸序列；以及VL，其包含SEQ ID NO:10的VLCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO:11的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:32的VLCDR3氨基酸序列，各自公开于US 2015/0210769的表1中。
在另一个实施方式中，抗PD-1抗体分子包含(i)重链可变区(VH)，其包含选自SEQID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:224的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5的VHCDR2氨基酸序列；和SEQ ID NO:3的VHCDR3氨基酸序列；和(ii)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:13的VLCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:14的VLCDR2氨基酸序列，和SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33的VLCDR3氨基酸序列，各自公开在US2015/0210769的表1中。
在其它实施方式中，PD-1抑制剂是选自纳武单抗、派姆单抗或皮地利珠单抗的抗PD-1抗体。
在一些实施方式中，抗PD-1抗体是纳武单抗。纳武单抗的替代名称包含MDX-1106、MDX-1106-04、ONO-4538或BMS-936558。在一些实施方式中，抗PD-1抗体是纳武单抗(CAS注册号：946414-94-4)。纳武单抗是一种完全人IgG4单克隆抗体，其可特异性阻断PD1。在US8,008,449和WO2006/121168中公开了纳武单抗(克隆5C4)和特异性结合PD1的其它人单克隆抗体。在一个实施方式中，PD-1的抑制剂是纳武单抗，并具有本文公开的序列(或与其基本相同或相似的序列，例如，与指定序列具有至少85％、90％、95％或更高的同一性的序列)。在一些实施方式中，抗PD-1抗体是派姆单抗。派姆单抗(也被称为兰洛利珠单抗(lambrolizumab)、MK-3475、MK03475、SCH-900475或
Figure BDA0003679091520001241
Merck)是结合PD-1的人源化的IgG4单克隆抗体。派姆单抗和其它人源化抗PD-1抗体公开于Hamid,O.等人(2013)New England Journal of Medicine 369(2):134–44、US 8,354,509和WO2009/114335中。
在一个实施方式中，PD-1的抑制剂是在例如US 8,354,509和WO 2009/114335中公开的派姆单抗，并具有本文公开的序列(或与其基本上相同或类似的序列，例如，与指定序列至少85％、90％、95％相同或更高相同的序列)。
在一些实施方式中，抗PD-1抗体是皮地利珠单抗。皮地利珠单抗(CT-011；CureTech)是与PD1结合的人源化IgG1k单克隆抗体。皮地利珠单抗和其它人源化抗PD-1单克隆抗体在US 8,747,847和WO2009/101611中公开。
其它抗PD1抗体包括AMP 514(Amplimmune)等等，例如US 8,609,089、US2010028330和/或US 20120114649中公开的抗PD1抗体。
在一些实施方式中，PD-1抑制剂是免疫粘附素(例如，包含与恒定区(例如，免疫球蛋白序列的Fc区)融合的PD-Ll或PD-L2的细胞外或PD-1结合部分的免疫粘附素)。在一些实施方式中，PD-1抑制剂是AMP-224(B7-DCIg；Amplimmune；例如，公开于WO2010/027827和WO2011/066342中)，其是阻断PD-1和B7-H1之间相互作用的PD-L2Fc融合可溶性受体。
在一些实施例中，抗PD-1抗体可以与本发明的IL-12Fc融合蛋白组合使用。存在若干种抗PD-1抗体，包含但不限于目前经FDA批准的两种抗体，派姆单抗和尼沃利珠单抗，以及目前正在临床测试中的抗体，包含但不限于替雷利珠单抗(tislelizumab)、Sym021、REGN2810(由Rengeneron开发)、JNJ-63723283(由J和J开发)、SHR-1210、皮地利珠单抗、AMP-224、MEDIo680、PDR001和CT-001以及Liu等人，J.Hemat.&Oncol.(2017)10:136中概述的其它抗体，其中的抗体通过引用明确并入。
在一些实施方式中，本文所描述的IL-12-Fc融合蛋白可以与抗PD-1抑制剂(例如，抗PD-1抗体)组合使用。在某些实施方式中，本文所描述的IL-12-Fc融合蛋白(例如，本文所描述的任何XENP序列)与抗PD-1抗体组合施用。
B.抗TIM3抗体
示例性的非限制性抗TIM-3抗体分子公开于2015年8月6日公开的标题为“Antibody Molecules to TIM-3and Uses Thereof”的美国2015/0218274中，该专利以引用方式整体并入本文。
在一个实施方式中，抗TIM-3抗体分子包括至少一个或两个重链可变结构域(任选地包括恒定区)、至少一个或两个轻链可变结构域(任选地包括恒定区)或两者，其包含ABTIM3、ABTIM3-hum01、ABTIM3-hum02、ABTIM3-hum03、ABTIM3-hum04、ABTIM3-hum05、ABTIM3-hum06、ABTIM3-hum07、ABTIM3-hum08、ABTIM3-hum09、ABTIM3-hum10、ABTIM3-hum11、ABTIM3-hum12、ABTIM3-hum13、ABTIM3-hum14、ABTIM3-hum15、ABTIM3-hum16、ABTIM3-hum17、ABTIM3-hum18、ABTIM3-hum19、ABTIM3-hum20、ABTIM3-hum21、ABTIM3-hum22、ABTIM3-hum23的氨基酸序列；或如US2015/0218274的表1至表4中所述；或由表1至表4中的核苷酸序列编码；或与任何上述序列基本相同的序列(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高的同一性)。抗TIM-3抗体分子任选地包含来自重链、轻链或两者的前导序列，如US2015/0218274中所示的；或与其基本相同的序列。
在又一个实施方式中，抗TIM-3抗体分子包括来自本文所述抗体的重链可变区和/或轻链可变区的至少一个、两个或三个互补决定区(CDR)，例如选自ABTIM3、ABTIM3-hum01、ABTIM3-hum02、ABTIM3-hum03、ABTIM3-hum04、ABTIM3-hum05、ABTIM3-hum06、ABTIM3-hum07、ABTIM3-hum08、ABTIM3-hum09、ABTIM3-hum10、ABTIM3-hum11、ABTIM3-hum12、ABTIM3-hum13、ABTIM3-hum14、ABTIM3-hum15、ABTIM3-hum16、ABTIM3-hum17、ABTIM3-hum18、ABTIM3-hum19、ABTIM3-hum20、ABTIM3-hum21、ABTIM3-hum22、ABTIM3-hum23中任一种；或如US 2015/0218274的表1至表4中所述；或由表1至表4中的核苷酸序列编码；或与任何上述序列基本相同的序列(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高的同一性)的抗体。
在又一个实施方式中，抗TIM-3抗体分子包括来自重链可变区的至少一个、两个或三个CDR(或总体地所有CDR)，所述重链可变区包含US 2015/0218274的表1至表4中所示的，或由表1至表4中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一个实施方式中，相对于表1-4中所示的或由表1-4所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，一个或多个CDR(或总体地所有CDR)具有一个、二个、三个、四个、五个、六个或更多个改变，例如氨基酸取代或缺失。
在又一个实施方式中，抗TIM-3抗体分子包括来自轻链可变区的至少一个、两个或三个CDR(或总体地所有CDR)，所述轻链可变区包含US 2015/0218274的表1-4中所示的，或由表1-4中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一个实施方式中，相对于表1-4中所示的或由表1-4中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，一个或多个CDR(或总体地所有CDR)具有一个、二个、三个、四个、五个、六个或更多个改变，例如氨基酸取代或缺失。在某些实施方式中，抗TIM-3抗体分子在轻链CDR中包括取代，例如在轻链的CDR1、CDR2和/或CDR3中的一个或多个取代。
在又一个实施方式中，抗TIM-3抗体分子包括来自重链和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR(或总体地所有CDR)，所述重链和轻链可变区包含US2015/0218274的表1至表4中所示的，或由表1至表4中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一个实施方式中，相对于表1-4中所示的或由表1-4中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，一个或多个CDR(或总体地所有CDR)具有一个、二个、三个、四个、五个、六个或更多个改变，例如氨基酸取代或缺失。
在一个实施方式中，抗TIM-3抗体分子包含：
(a)重链可变区(VH)，其包含选自SEQ ID NO:9的VHCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO:10的VHCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:5的VHCDR3氨基酸序列；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:12的VLCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO:13的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:14的VLCDR3氨基酸序列，各自公开于US 2015/0218274的表1至表4中；
(b)VH，其包含选自SEQ ID NO:3的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:4的VHCDR2氨基酸序列；SEQ ID NO:5的VHCDR3氨基酸序列；以及VL，其包含SEQ ID NO:6的VLCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO:7的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8的VLCDR3氨基酸序列，其各自公开于US 2015/0218274的表1至表4中；
(c)VH，其包含选自SEQ ID NO:9的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:25的VHCDR2氨基酸序列；SEQ ID NO:5的VHCDR3氨基酸序列；以及VL，其包含SEQ ID NO:12的VLCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO:13的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:14的VLCDR3氨基酸序列，其各自公开于US 2015/0218274的表1至表4中；
(d)VH，其包含选自SEQ ID NO:3的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:24的VHCDR2氨基酸序列；SEQ ID NO:5的VHCDR3氨基酸序列；以及VL，其包含SEQ ID NO:6的VLCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO:7的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8的VLCDR3氨基酸序列，其各自公开于US 2015/0218274的表1至表4中；
(e)VH，其包含选自SEQ ID NO:9的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:31的VHCDR2氨基酸序列；SEQ ID NO:5的VHCDR3氨基酸序列；以及VL，其包含SEQ ID NO:12的VLCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO:13的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:14的VLCDR3氨基酸序列，其各自公开于US 2015/0218274的表1至表4中；或
(f)VH，其包含选自SEQ ID NO：3的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO：30的VHCDR2氨基酸序列；SEQ ID NO：5的VHCDR3氨基酸序列；以及VL，其包含SEQ ID NO：6的VLCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO：7的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO：8的VLCDR3氨基酸序列，其各自公开于US 2015/0218274的表1-4中。
示例性抗TIM-3抗体公开于美国专利第8,552,156号、WO 2011/155607、EP2581113和美国公开第2014/044728号中。
在一些实施例中，抗TIM-3抗体可以与本发明的IL-12Fc融合蛋白组合使用。在临床开发中有几种TIM-3抗体，包括但不限于MBG453和TSR-022。
在一些实施方式中，本文所描述的IL-12-Fc融合蛋白可以与TIM3抑制剂(例如，抗TIM3抗体)组合使用。在某些实施方式中，本文所描述的IL-12Fc融合蛋白(例如，本文所描述的任何XENP序列)与抗TIM3抗体组合施用。
C.抗CTLA4抗体
示例性抗CTLA4抗体包括替西木单抗(tremelimumab)(可从Pfizer获得的IgG2单克隆抗体，前称ticilimumab，CP-675,206)；和伊匹单抗(ipilimumab)(CTLA-4抗体，也称为MDX-010，CAS编号477202-00-9)。其它示例性的抗CTLA-4抗体公开于例如美国专利第5,811,097号中。
在一个实施方式中，抗CTLA4抗体是伊匹单抗，其公开于例如US 5,811,097、US 7,605,238、WO00/32231和WO97/20574中，并具有本文公开的序列(或与其基本相同或相似的序列，例如，与指定序列至少85％、90％、95％或更高同一性的序列)。
在一个实施方式中，抗CTLA4抗体是替西木单抗，例如在US 6,682,736和WO00/37504中公开，并具有本文公开的序列(或与其基本相同或相似的序列，例如，与指定序列至少85％、90％、95％相同或更高的序列)。
在一些实施例中，抗CTLA-4抗体可以与本发明的IL-12-Fc融合蛋白组合使用。因此，用于本文概述的联合疗法的合适的抗CTLA-4抗体包括但不限于一种当前FDA批准的抗体伊匹单抗，以及另外几种正在开发中的抗体，包括CP-675,206和AGEN-1884。
在一些实施方式中，本文所描述的IL-12-Fc融合蛋白可以与抗CTLA-4抑制剂(例如，抗CTLA-4抗体)组合使用。在某些实施方式中，本文所描述的IL-12-Fc融合蛋白(例如，本文所描述的任何XENP序列)与抗CTLA-4抗体组合施用。
D.抗PD-L1抗体
示例性的非限制性抗PD-L1抗体分子公开于2016年4月21日公开的标题为“Antibody Molecules to PD-L1 and Uses Thereof(PD-L1的抗体分子及其用途)”的US2016/0108123中，该专利以引用方式整体并入本文。
在一个实施方式中，抗PD-L1抗体分子包括至少一个或两个重链可变结构域(任选地包括恒定区)、至少一个或两个轻链可变结构域(任选地包括恒定区)或两者，其包含BAP058-hum01、BAP058-hum02、BAP058-hum03、BAP058-hum04、BAP058-hum05、BAP058-hum06、BAP058-hum07、BAP058-hum08、BAP058-hum09、BAP058-hum10、BAP058-hum11、BAP058-hum12、BAP058-hum13、BAP058-hum14、BAP058-hum15、BAP058-hum16、BAP058-hum17、BAP058-克隆-K、BAP058-克隆-L、BAP058-克隆-M、BAP058-克隆-N或BAP058-克隆-O中任一种；或如US 2016/0108123的表1中所述，或由表1中的核苷酸序列编码的氨基酸序列；或与任何上述序列基本相同的序列(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高的同一性)。
在又一个实施方式中，抗PD-L1抗体分子包括来自本文所述抗体的重链可变区和/或轻链可变区的至少一个、两个或三个互补决定区(CDR)，例如，抗体选自BAP058-hum01、BAP058-hum02、BAP058-hum03、BAP058-hum04、BAP058-hum05、BAP058-hum06、BAP058-hum07、BAP058-hum08、BAP058-hum09、BAP058-hum10、BAP058-hum11、BAP058-hum12、BAP058-hum13、BAP058-hum14、BAP058-hum15、BAP058-hum16、BAP058-hum17、BAP058-Clone-K、BAP058-克隆-L、BAP058-克隆-M、BAP058-克隆-N或BAP058-克隆-O的任一个；或如US 2016/0108123的表1中所述，或由表1中的核苷酸序列编码；或与任何上述序列基本相同的序列(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高的同一性)。
在又一个实施方式中，抗PD-L1抗体分子包含来自重链可变区的至少一个、两个或三个CDR(或总体地所有CDR)，所述重链可变区包含US 2016/0108123的表1中所示的氨基酸序列，或由表1中所示的核苷酸序列编码。在一个实施方式中，相对于表1所示或由表1所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，CDR(或总体地所有CDR)中的一个或多个具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个改变，例如，氨基酸取代或缺失。
在又一个实施方式中，抗PD-L1抗体分子包含来自轻链可变区的至少一个、两个或三个CDR(或总体地所有CDR)，所述轻链可变区包含US 2016/0108123的表1中所示的氨基酸序列，或由表1中所示的核苷酸序列编码。在一个实施方式中，相对于表1所示或由表1所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，CDR(或总体地所有CDR)中的一个或多个具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个改变，例如，氨基酸取代或缺失。在某些实施方式中，抗PD-L1抗体分子在轻链CDR中包括取代，例如在轻链的CDR1、CDR2和/或CDR3中的一个或多个取代。
在又一个实施方式中，抗PD-L1抗体分子包含来自重和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR(或总体地所有CDR)，所述重和轻链可变区包含US2016/0108123的表1中所示的氨基酸序列，或由表1中所示的核苷酸序列编码。在一个实施方式中，相对于表1所示或由表1所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，CDR(或总体地所有CDR)中的一个或多个具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个改变，例如，氨基酸取代或缺失。
在一个实施方式中，抗PD-L1抗体分子包含：
(i)重链可变区(VH)，其包括选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:195的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:2的VHCDR2氨基酸序列；SEQ ID NO:3的VHCDR3氨基酸序列，其各自在US 2016/0108123的表1中公开；和
(ii)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:9的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:10的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:11的VLCDR3氨基酸序列，其各自在US 2016/0108123的表1中公开。
在另一个实施方式中，抗PD-L1抗体分子包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:195的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:5的VHCDR2氨基酸序列；SEQ ID NO:3的VHCDR3氨基酸序列，其各自在US 2016/0108123的表1中公开；和
(ii)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:12的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:13的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:14的VLCDR3氨基酸序列，其各自在US 2016/0108123的表1中公开。
在一个实施方式中，抗PD-L1抗体分子包含SEQ ID NO:1的VHCDR1氨基酸序列。在另一个实施方式中，抗PD-L1抗体分子包含SEQ ID NO:4的VHCDR1氨基酸序列。在又一个实施方式中，抗PD-L1抗体分子包含SEQ ID NO:195的VHCDR1氨基酸序列，每个在US 2016/0108123的表1中公开。
在一些实施方式中，PD-L1抑制剂是抗体分子。在一些实施方式中，抗PD-Ll抑制剂选自YW243.55.S70、MPDL3280A、MEDI-4736、MSB-0010718C、MDX-1105、阿特珠单抗、杜巴单抗、阿维鲁单抗或BMS936559。
在一些实施方式中，抗PD-L1抗体是阿特珠单抗。阿特珠单抗(也称为MPDL3280A和
Figure BDA0003679091520001301
Roche)是与PD-L1结合的单克隆抗体。阿特珠单抗和其它人源化抗PD-L1抗体在US8,217,149中公开，并具有本文公开的序列(或与其基本相同或相似的序列，例如，与指定序列具有至少85％、90％、95％或更高同一性的序列)。
在一些实施方式中，抗PD-L1抗体是阿维鲁单抗。阿维鲁单抗(也称为A09-246-2；Merck Serono)是与PD-L1结合的单克隆抗体。阿维鲁单抗和其它人源化抗PD-L1抗体在US9,324,298和WO2013/079174中公开，并具有本文公开的序列(或与其基本相同或相似的序列，例如，与指定序列具有至少85％、90％、95％或更高同一性的序列)。
在一些实施方式中，抗PD-L1抗体是杜瓦鲁单抗(durvalumab)。杜瓦鲁单抗(也称为MEDI4736；AstraZeneca)是与PD-L1结合的单克隆抗体。杜瓦鲁单抗和其它人源化抗PD-L1抗体在US 8,779,108中公开，并具有本文公开的序列(或与其基本相同或相似的序列，例如，与指定序列具有至少85％、90％、95％或更高同一性的序列)。
在一些实施方式中，抗PD-L1抗体是BMS-936559。BMS-936559(也称为MDX-1105；BMS)是与PD-L1结合的单克隆抗体。BMS-936559和其它人源化抗PD-L1抗体在US 7,943,743和WO 2007005874中公开，并具有本文公开的序列(或与其基本相同或相似的序列，例如，与指定序列至少85％、90％、95％相同或更高的序列)。
在一些实施例中，抗PD-L1抗体可以与本发明的IL-12-Fc融合蛋白组合使用。存在若干种抗PD-L1抗体，包含目前经FDA批准的三种抗体，阿特珠单抗、阿维鲁单抗和杜瓦鲁单抗，以及目前正在临床测试中的抗体，包含但不限于LY33000054和CS1001，以及Liu等人，J.Hemat.&Oncol.(2017)10:136中概述的其它抗体，其中的抗体通过引用明确并入。
在一些实施方式中，本文所述的IL-12-Fc融合蛋白可以与PD-L1或PD-L2抑制剂(例如，抗PD-L1抗体)组合使用。
E.抗TIGIT抗体
在一些实施方式中，抗TIGIT抗体是OMP-313M32。OMP-313M32(OncoMedPharmaceuticals)是与TIGIT结合的单克隆抗体。OMP-313M32和其它人源化抗TIGIT抗体公开于US20160376365和WO 2016191643中，并具有本文公开的序列(或与其基本相同或相似的序列，例如，与指定序列具有至少85％、90％、95％或更高同一性的序列)。
在一些实施方式中，抗TIGIT抗体是BMS-986207。BMS-986207(也称为ONO-4686；Bristol-Myers Squibb)是与TIGIT结合的单克隆抗体。BMS-986207和其它人源化抗TIGIT抗体公开于US20160176963和WO 2016106302中，并具有本文公开的序列(或与其基本相同或相似的序列，例如，与指定序列具有至少85％、90％、95％或更高同一性的序列)。
在一些实施方式中，抗TIGIT抗体是MTIG7192。MTIG7192(Genentech)是与TIGIT结合的单克隆抗体。MTIG7192和其它人源化抗TIGIT抗体在US2017088613、WO 2017053748和WO 2016011264中公开，并具有本文公开的序列(或与其基本相同或相似的序列，例如，与指定序列至少85％、90％、95％相同或更高的序列)。
在一些实施方式中，抗TIGIT抗体可以与本发明的IL-12-Fc融合蛋白组合使用。有几种TIGIT抗体正在临床开发中，BMS-986207、OMP-313M32和MTIG7192A。
在一些实施方式中，本文所描述的IL-12-Fc融合蛋白可以与抗TIGIT抑制剂(例如，抗TIGIT抗体)组合使用。在某些实施方式中，本文所描述的IL-12-Fc融合蛋白(例如，本文所描述的任何XENP序列)与抗TIGIT抗体组合施用。
F.抗LAG3抗体
示例性的非限制性抗LAG-3抗体分子公开于2015年9月17日公开的标题为“Antibody Molecules to LAG-3and Uses Thereof(LAG-3的抗体分子及其用途)”的US2015/0259420中，该专利以引用方式整体并入本文。
在一个实施方式中，抗LAG-3抗体分子包括至少一个或两个重链可变结构域(任选地包括恒定区)、至少一个或两个轻链可变结构域(任选地包括恒定区)或两者，其包含BAP050-hum01、BAP050-hum02、BAP050-hum03、BAP050-hum04、BAP050-hum05、BAP050-hum06、BAP050-hum07、BAP050-hum08、BAP050-hum09、BAP050-hum10、BAP050-hum11、BAP050-hum12、BAP050-hum13、BAP050-hum14、BAP050-hum15、BAP050-hum16、BAP050-hum17、BAP050-hum18、BAP050-hum19、BAP050-hum20、huBAP050(Ser)(例如，BAP050-hum01-Ser、BAP050-hum02-Ser、BAP050-hum03-Ser、BAP050-hum04-Ser、BAP050-hum05-Ser、BAP050-hum06-Ser、BAP050-hum07-Ser、BAP050-hum08-Ser、BAP050-hum09-Ser、BAP050-hum10-Ser、BAP050-hum11-Ser、BAP050-hum12-Ser、BAP050-hum13-Ser、BAP050-hum14-Ser、BAP050-hum15-Ser、BAP050-hum18-Ser、BAP050-hum19-Ser或BAP050-hum20-Ser)、BAP050-克隆-F、BAP050-克隆-G、BAP050-克隆-H、BAP050-克隆-I或BAP050-克隆-J中任一种的；或如US2015/0259420的表1中所述，或由表1中的核苷酸序列编码的氨基酸序列；或与任何上述序列基本相同的序列(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高的同一性)。
在又一个实施方式中，抗LAG-3抗体分子包括来自本文所述抗体的重链可变区和/或轻链可变区的至少一个、两个或三个互补决定区(CDR)，例如，抗体选自BAP050-hum01、BAP050-hum02、BAP050-hum03、BAP050-hum04、BAP050-hum05、BAP050-hum06、BAP050-hum07、BAP050-hum08、BAP050-hum09、BAP050-hum10、BAP050-hum11、BAP050-hum12、BAP050-hum13、BAP050-hum14、BAP050-hum15、BAP050-hum16、BAP050-hum17、BAP050-hum18、BAP050-hum19、BAP050-hum20、huBAP050(Ser)(例如，BAP050-hum01-Ser、BAP050-hum02-Ser、BAP050-hum03-Ser、BAP050-hum04-Ser、BAP050-hum05-Ser、BAP050-hum06-Ser、BAP050-hum07-Ser、BAP050-hum08-Ser、BAP050-hum09-Ser、BAP050-hum10-Ser、BAP050-hum11-Ser、BAP050-hum12-Ser、BAP050-hum13-Ser、BAP050-hum14-Ser、BAP050-hum15-Ser、BAP050-hum18-Ser、BAP050-hum19-Ser或BAP050-hum20-Ser)、BAP050-克隆-F、BAP050-克隆-G、BAP050-克隆-H、BAP050-克隆-I或BAP050-克隆-J的任一种；或如US 2015/0259420的表1中所述，或由表1中的核苷酸序列编码；或与任何上述序列基本相同的序列(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高的同一性)。
在又一个实施方式中，抗LAG-3抗体分子包含来自重链可变区的至少一个、两个或三个CDR(或总体地所有CDR)，所述重链可变区包含US 2015/0259420的表1中所示的氨基酸序列，或由表1中所示的核苷酸序列编码。在一个实施方式中，相对于表1所示或由表1所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，CDR(或总体地所有CDR)中的一个或多个具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个改变，例如，氨基酸取代或缺失。
在又另一个实施方式中，抗LAG-3抗体分子包含来自轻链可变区的至少一个、两个或三个CDR(或总体地所有CDR)，所述轻链可变区包括US 2015/0259420的表1中所示或由表1中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一个实施方式中，相对于表1所示或由表1所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，CDR(或总体地所有CDR)中的一个或多个具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个改变，例如，氨基酸取代或缺失。在某些实施方式中，抗PD-L1抗体分子在轻链CDR中包括取代，例如在轻链的CDR1、CDR2和/或CDR3中的一个或多个取代。
在又一个实施方式中，抗LAG-3抗体分子包含来自重和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR(或总体地所有CDR)，所述重和轻链可变区包含US 2015/0259420的表1中所示的氨基酸序列，或由表1中所示的核苷酸序列编码。在一个实施方式中，相对于表1所示或由表1所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，CDR(或总体地所有CDR)中的一个或多个具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个改变，例如，氨基酸取代或缺失。
在一个实施方式中，抗LAG-3抗体分子包含：
(i)重链可变区(VH)，其包括选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:286的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:2的VHCDR2氨基酸序列；SEQ ID NO:3的VHCDR3氨基酸序列，其各自在US 2015/0259420的表1中公开；和
(ii)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:10的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:11的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:12的VLCDR3氨基酸序列，其各自在US 2015/0259420的表1中公开。
在另一个实施方式中，抗LAG-3抗体分子包含：
(i)重链可变区(VH)，其包括选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:286的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:5的VHCDR2氨基酸序列；SEQ ID NO:3的VHCDR3氨基酸序列，其各自在US 2015/0259420的表1中公开；和
(ii)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:13的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:14的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:15的VLCDR3氨基酸序列，其各自在US 2015/0259420的表1中公开。
在一个实施方式中，抗LAG-3抗体分子包含SEQ ID NO:1的VHCDR1氨基酸序列。在另一个实施方式中，抗LAG-3抗体分子包含SEQ ID NO:4的VHCDR1氨基酸序列。在又一个实施方式中，抗LAG-3抗体分子包含SEQ ID NO:286的VHCDR1氨基酸序列，其各自公开于US2015/0259420的表1中。
在一些实施方式中，抗LAG-3抗体是BMS-986016。BMS-986016(也称为BMS986016；Bristol-Myers Squibb)是与LAG-3结合的单克隆抗体。BMS-986016和其它人源化的抗LAG-3抗体公开于US 2011/0150892、WO2010/019570和WO2014/008218中。
在一些实施方式中，抗LAG3抗体是LAG525。LAG525(也称为IMP701；Novartis)是与LAG3结合的单克隆抗体。LAG525和其它人源化抗LAG3抗体在US 9,244,059和WO2008132601中公开，并具有本文公开的序列(或与其基本相同或相似的序列，例如，与指定序列至少85％、90％、95％相同或更高的序列)。
其它示例性抗LAG3抗体公开于例如US2011150892和US2018066054中。
在一些实施例中，抗LAG-3抗体可以与本发明的IL-12-Fc融合蛋白组合使用。有几种抗LAG-3抗体在临床开发中，包括再生元(Regeneron)的REGN3767和TSR-033(Tesaro)。
在一些实施方式中，本文所描述的IL-12-Fc融合蛋白可以与抗LAG3抑制剂(例如，抗LAG3抗体)组合使用。在某些实施方式中，本文所描述的IL-12-Fc融合蛋白(例如，本文所描述的任何XENP序列)与抗LAG3抗体组合施用。
XII.联合疗法
在一些方面，本文所描述的IL-12-Fc融合蛋白与另一种治疗剂组合施用。如本文所用，“组合”施用意味着在受试者患有病症的过程期间向受试者递送两种(或更多种)不同的治疗，例如，在受试者已经被诊断为患有所述病症之后并且在所述病症已经治愈或消除或治疗由于其它原因已经停止之前递送所述两种或更多种治疗。在一些实施方式中，对一种治疗的递送在对第二治疗的递送开始时仍然发生，使得在施用方面存在重叠。在本文中有时将其称为“同时”或“并发递送”。在其它实施方式中，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始之前结束。在任一种情况的一些实施方式中，由于组合施用，治疗更有效。例如，第二种治疗更有效，例如，与在不存在第一种治疗的情况下给予第二种治疗相比，利用更少的第二种治疗可以看到等效的效果，或者第二种治疗在更大程度上减轻了症状，或利用第一种治疗看到类似的情况。在一些实施方式中，递送使得病症有关的症状或与其它参数的减少大于在不存在另一种治疗的情况下递送一种治疗所观察到的减少。两种治疗的效果可以是部分累加、完全累加或大于累加。递送可以使得当递送第二种时仍然可以检测到递送的第一种治疗的效果。
本文所描述的IL-12-Fc融合蛋白(例如，本文所描述的任何XENP序列)和至少一种另外的治疗剂可以在相同或单独的组合物中同时施用或顺序施用。对于顺序施用，可以首先施用本文所描述的IL-12-Fc融合蛋白(例如，本文所描述的任何XENP序列)，并且可以其次施用另外的药剂，或者可以颠倒施用顺序。
本文所描述的IL-12-Fc融合蛋白(例如，本文所描述的任何XENP序列)和/或其它治疗剂、手术或方式可以在活动性病症期间，或在疾病缓解期间或活动性疾病较轻期间施用。IL-12-Fc融合蛋白(例如，本文所描述的任何XENP序列)可以在其它治疗之前、与治疗同时、在治疗之后或在病症缓解期间施用。
当组合施用时，IL-12-Fc融合蛋白(例如，本文所述的任何XENP序列)和其它药剂(例如，第二或第三药剂)或全部可以以低于或等于单独使用(例如，作为单一治疗)的每种药剂的量或剂量的量或剂量施用。在一些实施方式中，IL-12-Fc融合蛋白(例如，本文所述的任何XENP序列)、其他药剂(例如，第二或第三药剂)或全部的施用量或剂量比单独使用(例如，作为单一治疗)的每种药剂的量或剂量低(例如至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。在其他实施方式中，IL-12-Fc融合蛋白(例如，本文所述的任何XENP序列)、其他药剂(例如，第二或第三药剂)或全部的导致期望效果(例如癌症治疗)的量或剂量比单独使用(例如，作为单一治疗)的每种药剂的实现相同治疗效果所需的量或剂量低(例如低至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。
在进一步方面中，本文所述的IL-12-Fc融合蛋白(例如，本文所述的任何XENP序列)可用于与以下联合的治疗方案中：化学疗法、放射、免疫抑制剂(例如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和FK506)、针对检查点抑制剂的抗体，或其它免疫消融剂例如CAMPATH、其它抗体疗法、癌得星(cytoxan)、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR90165、细胞因子、和照射、肽疫苗，如Izumoto等人，2008 J Neurosurg 108:963-971中所述。
在某些情况下，本发明的化合物与其它治疗剂例如其它抗癌剂、抗过敏剂、抗恶心剂(或止吐药)、止痛药、细胞保护剂及其组合结合。
在一个实施方式中，本文所述的IL-12-Fc融合蛋白(例如，本文所述的任何XENP序列)可以与化疗剂组合使用。示例性化学治疗剂包括蒽环类(例如，阿达比星、柔红霉素、阿霉素(例如，脂质体阿霉素))、蒽二酮衍生物(例如，米托蒽醌)、长春花生物碱(例如，长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨)、烷基化剂(例如，环磷酰胺、达卡巴嗪、美法仑、异环磷酰胺、替莫唑胺)、免疫细胞抗体(例如，阿仑单抗、吉妥珠单抗、利妥昔单抗、奥法木单抗、托西莫单抗、brentuximab)、抗代谢药(包括，例如叶酸拮抗剂、阿糖胞苷、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂(例如氟达拉滨))、mTOR抑制剂、TNFR糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)激动剂、蛋白酶体抑制剂(例如阿克拉霉素A、胶体毒素或硼替佐米)、免疫调节剂例如沙利度胺或沙利度胺衍生物(如来那度胺)、激酶抑制剂例如依鲁替尼(如Imbruvica)、皮质类固醇(如地塞米松、泼尼松)和CVP(环磷酰胺、长春新碱和泼尼松的组合)、含或不含依托泊苷(例如VP-16)的CHOP(环磷酰胺、羟基柔红霉素、
Figure BDA0003679091520001351
(长春新碱)和泼尼松的组合)、环磷酰胺和喷妥他汀的组合、苯丁酸氮芥和泼尼松的组合、氟达拉滨和环磷酰胺的组合、或另一种药剂，如盐酸氮芥(例如Mustargen)、阿霉素
Figure BDA0003679091520001361
甲氨蝶呤、奥沙利铂或阿糖胞苷(ara-C)。
考虑用于联合疗法的一般化学治疗剂包括阿那曲唑
Figure BDA0003679091520001362
比卡鲁胺
Figure BDA0003679091520001363
硫酸博来霉素
Figure BDA0003679091520001364
白消安
Figure BDA0003679091520001365
白消安注射液
Figure BDA0003679091520001366
卡培他滨
Figure BDA0003679091520001367
N4-戊氧羰基5-脱氧5-氟胞苷、卡铂
Figure BDA0003679091520001368
卡莫司汀
Figure BDA0003679091520001369
苯丁酸氮芥
Figure BDA00036790915200013610
顺铂
Figure BDA00036790915200013611
克拉屈滨
Figure BDA00036790915200013612
环磷酰胺(
Figure BDA00036790915200013613
或
Figure BDA00036790915200013614
)、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷
Figure BDA00036790915200013615
阿糖胞苷脂质体注射液
Figure BDA00036790915200013616
达卡巴嗪
Figure BDA00036790915200013617
放线菌素(Actinomycin D、Cosmegan)、盐酸柔红霉素
Figure BDA00036790915200013618
柠檬酸柔红霉素脂质体注射液
Figure BDA00036790915200013619
地塞米松、多西他赛
Figure BDA00036790915200013620
盐酸阿霉素
Figure BDA00036790915200013621
依托泊苷
Figure BDA00036790915200013624
磷酸氟达拉滨
Figure BDA00036790915200013622
5-氟尿嘧啶
Figure BDA00036790915200013623
氟他胺
Figure BDA00036790915200013625
替扎西他滨、吉西他滨(二氟脱氧胞苷)、羟基脲
Figure BDA00036790915200013626
依达比星
Figure BDA00036790915200013627
异环磷酰胺
Figure BDA00036790915200013628
伊立替康
Figure BDA00036790915200013629
L-天冬酰胺酶
Figure BDA00036790915200013630
亚叶酸钙、美法仑
Figure BDA00036790915200013631
6-巯基嘌呤
Figure BDA00036790915200013632
甲氨蝶呤
Figure BDA00036790915200013633
米托蒽醌
Figure BDA00036790915200013634
mylotarg、紫杉醇
Figure BDA00036790915200013635
phoenix(Yttrium90/MX-DTPA)、喷妥他汀、带有卡莫司汀植入物的聚苯丙生
Figure BDA00036790915200013636
柠檬酸他莫昔芬
Figure BDA00036790915200013637
替尼泊苷
Figure BDA00036790915200013638
6-硫鸟嘌呤、硫替太帕、替拉帕明
Figure BDA00036790915200013639
注射用盐酸托泊替康
Figure BDA00036790915200013640
长春碱
Figure BDA00036790915200013641
长春新碱
Figure BDA00036790915200013642
和长春瑞滨
Figure BDA00036790915200013643
XIII.治疗
一旦制成，在与本发明的异源二聚体Fc融合蛋白结合的情况下，通过治疗癌症、通常促进T细胞活化(例如，不再抑制T细胞)，本发明的组合物可以用于许多肿瘤学应用。
因此，本发明的异源二聚体组合物可以用于治疗这些癌症。
A.体内施用的融合蛋白组合物
通过以冻干制剂或水溶液的形式，将具有期望纯度的融合蛋白与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(如雷明顿药物科学(Remington's PharmaceuticalSciences)第16版，Osol,A.Ed.[1980]中概述的)混合来制备根据本发明使用的融合蛋白的制剂以用于储存。可接受的载体、缓冲剂、赋形剂或稳定剂在所用剂量和浓度下对接受者无毒，并且包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苯甲基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属配合物(例如锌-蛋白质配合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
B.施用方式
本发明的融合蛋白和化疗剂根据已知的方法，如静脉内施用(作为团注物(bolus)或通过在一段时间内连续输注)向受试者施用。
C.治疗方式
在本发明的方法中，用疗法来提供对疾病或病症的阳性治疗应答。“阳性治疗应答”旨在改善疾病或病症和/或改善与疾病或病症相关联的症状。例如，阳性治疗反应将指对疾病的以下改善中的一种或多种：(1)减少赘生性细胞的数量；(2)增加赘生性细胞死亡；(3)抑制赘生性细胞存活；(5)抑制(即减慢到某种程度并且优选地停止)肿瘤生长；(6)增加患者存活率；以及(7)与疾病或病症相关联的一个或多个症状的一些缓解。
可以通过对那个疾病或病症具有特异性的标准化反应标准来确定任何给定疾病或病症的阳性治疗反应。可以使用筛选技术诸如磁共振成像(MRI)扫描、x-射线成像、计算机断层(CT)扫描、骨扫描成像、内窥镜检查和肿瘤活检取样，包含骨髓吸出(BMA)和对循环中的肿瘤细胞计数来估计针对肿瘤形态(即总体肿瘤负荷、肿瘤大小等)改变的肿瘤反应。
除了这些阳性治疗反应之外，正经受疗法的受试者可能经历与疾病相关联的症状的改善的有益效果。
根据本发明的治疗包括所使用的“治疗有效量的”药物。“治疗有效量”指以剂量计并且持续所需的时间段以实现所希望的治疗结果的有效的量。
治疗有效量可以根据因素而变化，诸如个体的疾病状态、年龄、性别、以及体重、以及药物在个体中引发希望的反应的能力。治疗有效量也是蛋白或蛋白部分的治疗有益效果超过其任何毒性或有害效果的量。
肿瘤疗法的“治疗有效量”还可以通过其稳定疾病的进展的能力测量。可以在预示人肿瘤的功效的动物模型系统中评定化合物抑制癌症的能力。
可替代地，通过熟练的从业者已知的体外测定，组合物的这种特性可以通过检验化合物抑制肿瘤生长或诱导凋亡的能力来评定。治疗有效量的治疗化合物可以减小肿瘤大小或以其他方式减轻受试者的症状。本领域的普通技术人员将能够基于如受试者的大小、受试者症状的严重程度和特定的组合物或所选择的施用途径这种因素确定这种量。
调整剂量方案以提供最佳的期望反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单个团注物，或者可以随时间施用若干分次剂量，或者可以按治疗状况的紧急情况所表明的成比例地减少或增加剂量。为了方便施用和剂量的均匀性，肠胃外组合物可以按剂量单位调配。如本文使用的剂量单位指作为针对要治疗受试者的单一剂量适合的物理上离散的单位；各单位含有与所需药物载体缔合的、经计算产生所期望的治疗效果的预定量的活性化合物。
针对本发明的剂量单位形式的规格受制于并直接取决于：(a)活性化合物的独特特性和要实现的特定治疗效果，和(b)个体敏感性对复合用于治疗的此类活性化合物造成的本领域固有限制。
用于本发明的异源二聚体蛋白的有效剂量和剂量方案取决于待治疗的疾病或病状并且可以由本领域的技术人员确定。
用于本发明的治疗有效量的异源二聚体蛋白的示例性非限制性范围是约0.1-100mg/kg。
所有引用的参考文献通过引用以其全部内容明确地并入本文。
尽管出于说明的目的已经在上文描述了本发明的具体实施方式，但是本领域技术人员将了解的是，在不脱离如所附权利要求所描述的本发明的情况下可以做出许多细节变化。
实施例
下文提供的实施例旨在说明本发明。这些实施例不旨在将本发明限制于任何特定的应用或操作理论。对于本发明中论述的所有恒定区位置，编号均根据EU索引，如Kabat(Kabat等人,1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,美国公共卫生署(United States Public Health Service),国立卫生研究院(NationalInstitute of Health),贝塞斯达(Bethesda)，所述文献通过引用整体并入)中所述。抗体领域中的技术人员将理解，这个规约由免疫球蛋白序列的特定区结构域中的非顺序编号组成，所述非顺序编号使得能够对免疫球蛋白家族中的保守位置进行归一化的引用。因此，如通过EU索引定义的任何给定免疫球蛋白的位置不一定对应于其顺序序列。
在美国专利公开号2015/0307629、2014/0288275和WO2014/145806中概述了一般和具体的科学技术，所有这些都通过引用明确地并入本文，特别是其中概述的技术。
实施例1：IL-12-Fc融合蛋白
与其它细胞因子一样，IL-12具有短的半衰期，并且进行高剂量治疗以克服短半衰期会导致全身毒性。另外，据报道，抗肿瘤作用需要通过IL-12持续诱导IFNγ的产生(Gollob,JA等人,2000)。进一步地，据报道，IL-12p40亚基，无论是单体还是同源二聚体，都通过竞争与IL-12受体的结合来拮抗IL-12活性(Gillessen,S等人,1995)；因此，这对IL-12p40和IL-12p35亚基预复合是有利的。为了解决这两个警告，我们将IL-12异源二聚体工程化为Fc融合蛋白(在此统称为IL-12-Fc融合物)，所述Fc融合蛋白既可以通过FcRn介导的再循环增强循环，也可以使IL-12p40和IL-12p35亚基预复合。
1A：以各种形式工程化IL-12-Fc融合物
我们生成了N末端IL-12异源二聚体Fc融合物或“IL-12-异源Fc”形式，其包括与异源二聚体Fc的一侧的N末端重组融合的IL-12p40亚基和与异源二聚体Fc的另一侧的N末端重组融合的IL-12p35亚基(图9A)。IL-12p40和IL-12p35亚基可以通过结构域接头与其相应Fc链连接。这种形式的一种说明性蛋白质是XENP27201，其序列如图10描绘。
我们生成了C末端IL-12异源二聚体Fc融合物或“异源Fc-IL-12”形式，其包括与异源二聚体Fc的一侧的C末端重组融合的IL-12p40亚基和与异源二聚体Fc的另一侧的C末端重组融合的IL-12p35亚基(图9B)。IL-12p30和IL-12p35亚基可以通过结构域接头与其相应Fc链连接。这种形式的说明性蛋白质是XENP27202，其序列如图11描绘。
我们进一步生成了N末端单链IL-12-Fc融合物或“scIL-12-Fc”形式，其包括与异源二聚体Fc的一侧的N末端(任选地通过结构域接头)重组融合的单链IL-12复合物(或“scIL-12复合物”)，其中分子的另一侧是“仅Fc”或“空Fc”异源二聚体Fc(图9C-9D)。scIL-12复合物可包含N末端连接至IL-12p40的IL-12p35或N末端连接至IL-12p35的IL-12p40，任选地具有结构域接头。文中scIL-12复合物中两个亚基的顺序被指定如下：“scIL-12(p40/p35)”，其中IL-12p40亚基在N末端连接至IL-12p35亚基，或“scIL-12(p35/p40)”，其中IL-12p35在N末端连接至IL-12p35亚基。scIL-12-Fc形式的说明性蛋白质包括XENP27203和XENP27204，其序列在图12中描绘。
图9A-9F描绘了设想使用的另外的IL-12-Fc形式的动画示意图。
1B：说明性IL-12-Fc融合物的产生和物理表征
1B(a):IL-12-异源Fc
通过标准基因合成构筑编码IL-12p35和IL-12p40亚基的质粒，然后亚克隆到含有Fc融合配偶体(例如，如图8A-8D中描绘的恒定区)的pTT5表达载体中。通过在HEK293E细胞中进行瞬时转染产生了蛋白质，并且通过包括蛋白A色谱法(纯化部分1)然后是阴离子交换色谱法(纯化部分2)的两步纯化工艺对所述蛋白质进行了纯化。图13A中描绘了描绘说明性IL-12-异源Fc XENP27201的纯化部分2的色谱图。色谱图示出了两个峰的分离(峰A和峰B)，通过利用多角度光散射的分析型尺寸排阻色谱法(aSEC-MALS)和分析型阴离子交换色谱法(分析型AIEX)来进一步表征所述峰的纯度和同质性，如下文所描述的。
使用aSEC-MALS分析从XENP27201的纯化部分2中分离出的峰A和B，以推断出其组分蛋白物类。在Agilent 1200高效液相色谱(HPLC)系统上进行分析。将样品以1.0mL/min注射到Superdex TM 200 10/300GL柱(GE Healthcare Life Sciences)上，使用1x PBS，pH7.4作为流动相，在4℃下25分钟，UV检测波长为280nM。在带有
Figure BDA0003679091520001401
T-rEX折射率检测器的
Figure BDA0003679091520001402
(加利福尼亚州圣塔芭芭拉的怀雅特技术公司(WyattTechnology,Santa Barbara,Cali.))上进行MALS。使用Agilent OpenLab色谱数据系统(CDS)ChemStation版AIC C.01.07版本和ASTRA 6.1.7.15版本进行分析。图13B中描绘了描绘峰A和B的aSEC分离曲线的色谱图以及通过MALS确定的组分物类的MW。曲线示出峰A包括分子量为约299kD和约140kD的物种，而峰B主要包括分子量为约118kD的物种，考虑到聚糖贡献的另外质量，这与XENP27201(基于氨基酸序列)的经计算的分子量110.4kDa相一致。
还使用分析型AIEX对来自纯化部分2的峰进行了分析，以进一步评估峰B的纯度和同质性。在Agilent 1200高效液相色谱(HPLC)系统上进行分析。利用280nM的UV检测波长，在20mM Tris、pH 8.5缓冲液中使用0-40％NaCl梯度以1.0毫升/分钟将样品注入到Proteomix SAX-NP5 5μM无孔柱(特拉华州纽瓦克的赛分科技有限公司(SepaxTechnologies,Inc.,Newark,Del.))上。使用Agilent OpenLAB CDS ChemStation版AICC.01.07版本进行分析。图13C中描绘了描绘峰A和B的分析型AIEX分离的色谱图。与峰B的aSEC分离曲线一致，峰B的分析型AIEX分离曲线展示了峰B中物种的纯度和同质性。从此处开始，XENP27201表示从纯化部分2中分离出的峰B，如图13A所描绘的。
1B(b)：scIL-12(p40/p35)-Fc
通过标准基因合成来构建对通过接头重组融合至IL-12p35的IL-12p40进行编码的质粒，然后亚克隆到含有Fc融合配偶体的pTT5表达载体中(例如，如图8A-8D所描绘的恒定区)。通过在HEK293E细胞中进行瞬时转染产生了蛋白质，并且通过包括蛋白A色谱法(纯化部分1)以及阴离子交换色谱法(纯化部分2)的两步纯化工艺对所述蛋白质进行了纯化。
图14A中描绘了描绘说明性scIL-12(p40/p35)-Fc融合物XENP27203的纯化部分2的色谱图。如上所述，色谱图示出了两个峰的分离，通过aSEC-MALS和分析型AIEX来进一步表征所述峰的纯度和同质性，如实施例1B(a)所描述，其色谱图在图14B-图14C中描绘。
从XENP27203的纯化部分2分离出的峰A和峰B的aSEC分离曲线示出峰A包括分子量为约396kD、约188kD和约118kD的物种，而峰B主要包括分子量为约118kD的物种，考虑到聚糖贡献的另外质量，这与XENP27203(基于氨基酸序列)的经计算的分子量111.3kDa相一致。如实施例1B(a)所描述的，还使用分析型AIEX对峰进行了分析，以进一步研究峰B的纯度和同质性。与峰B的aSEC分离曲线一致，峰B的分析型AIEX分离曲线(图14C)展示了峰B中物种的纯度和同质性。从此处开始，XENP27203表示从阴离子交换中分离出的峰B，如图14A所描绘的。
1C：IL-12-Fc融合物在诱导STAT4磷酸化中的体外活性
在细胞因子与其受体结合后，与细胞因子受体缔合的Janus激酶(JAK)使STAT蛋白磷酸化，然后所述STAT蛋白转运到细胞核中以调节进一步的下游过程。具体地说，IL-12通过STAT4的磷酸化介导IFNγ表达和分泌(Morinobu等人,2002)。因此，研究了上述IL-12-异源Fc(XENP27201)和scIL-12(p40/p35)-Fc(XENP27203)在各种淋巴细胞群中诱导STAT4磷酸化的能力。二价IL-12p35-Fc融合物和IL-12p40-Fc融合物(卡通示意图和序列在图15A-15B和图16中描绘)以及重组IL-12用作对照。
通过与板结合的抗CD3(100ng/ml)温育3天来活化新鲜的PBMC。在活化之后，然后在37℃下在所指示的浓度下将新鲜的PBMC与所指示的测试制品一起温育，持续15分钟。温育之后，首先用抗CD3-BUV395(UCHT1)、抗CD4-BV605(RPA-T4)、抗CD8-AF700(SK1)、抗CD14-APC/Fire750(M5E2)、抗CD20-PerCP/5.5(2H7)、抗CD25-BV421(M-A251)和抗CD56-PE抗体对PBMC染色。在第一次染色之后，使用PerFix EXPOSE(Beckman Coulter,Indianapolis,Ind.)使细胞透化。透化后，用抗-抗CD45RA-BV510(HI100)、抗-FoxP3-AF488(259D)和抗pSTAT4-AF647(38/p-Stat4)抗体对细胞进行染色。在第二次染色之后，通过流式细胞术对细胞进行分析以研究各种淋巴细胞群上的STAT4磷酸化。在图17A-17D中描绘了描绘各种淋巴细胞群上的pSTAT4 MFI的数据，所述数据指示由IL-12-Fc融合物进行的经由IL-12受体的信号传导。
数据显示，XENP27201和XENP27203在各种淋巴细胞群中均能有效诱导STAT4磷酸化，达到与重组IL-12诱导的水平相似的水平，而二价IL-12p40-Fc(XENP27560)和二价IL-12p35-Fc(XENP27561)融合物是不活跃的。值得注意的是，两种IL-12-Fc融合形式表现出类似的效力。另外，与XENP27560和XENP27561相比，经纯化的IL-12-Fc融合蛋白诱导STAT4磷酸化的能力证实了从XENP27201和XENP27203两者的纯化部分2分离出的峰B(如实施例1B中所描述的)由包括完整的IL-12异源二聚体的活性物种组成。
实施例2：被工程化以得到降低的效力的IL-12变体
为了进一步延长半衰期并降低毒性潜力，用对IL-12受体减少的结合亲和力将IL-12变体工程化，因为推断这会减少抗原沉默(antigen sink)并降低效力。
XIV.2A：工程化IL-12p40和IL-12p35变体(第1轮)
2A(a)：工程化IL-12p40变体
我们首先将W15、P17、D18、A19、P20、G21、M23、L40、D41、Q42、S43、E45、L47、T54、I55、Q56、K58、E59、F60、G61、D62、Y66和K84标识为IL-12p40上用于引入亲和力调节取代的潜在位点(图18中描绘的残基)。
作为第二策略，通过在MOE软件中使用QuaSAR数据包来标识IL-12p40晶体结构(PDB码3HMX)中的高度暴露的天冬氨酸残基、谷氨酸残基、天冬酰胺残基和谷氨酰胺残基(根据使用
Figure BDA0003679091520001421
的水分子半径和每个原子的多面体表示计算的水可及表面积)，从而推断这些残基可以有助于IL-12p40与IL-12受体之间的结合。具体地说，我们将搜索重点放在可以合并同配取代(即Asn和Asp；以及Gln和Glu)的残基上，目的是使免疫原性潜力最小化。因此，我们标识了E3、D7、E12、D14、D18、E22、D29、E32、E33、D41、Q42、E45、Q56、E59、D62、Q65、E73、E86、D93、D97、E100、N103、E110、D129、D142、Q144、E156、D161、N162、E166、E170、Q172、D174、E187、N200、D209、D214、N218、Q220、N226、Q229、E231、E235、Q256、E262、D265、D270、N281、Q289和E299，其ASA得分至少为19(图19中所描绘的残基和ASA评分)。
如上文所描述的，p40亚基由IL-12和IL-23共享。Bloch，等人(2018)报道了IL-23与IL-23R和Nb22E11复合的晶体结构。作为第三策略，推断IL-12p40亚基上的与IL-23R接触的残基也可以涉及结合IL-12受体复合物中类似受体IL-12Rβ2。因此，使用Bloch等人报道的晶体结构。(PDB码5MZV)并在MOE软件中进行建模，将D87、G88、I89、W90、K104和F106标识为IL-12p40上的可能与IL-12Rβ2接触的残基(图20中所描绘的残基和预测的接触类型)。
最后，为了确保我们不会干扰IL-12p40和IL-12p35亚基之间的自然相互作用，我们根据Luo等人，(2010)报道的晶体结构标识了IL-12p40上可能与IL-12p35接触的以下残基：K102、Y114、A176、C177、P178、A179、A180、E181、S183、P185、S204、F206、R208、T242、P243、S245、Y246、F247、S248、D290、R291、Y292和Y293。
考虑到上述情况，设计了许多IL-12p40变体，特别地如上所描述的位于可以引入同配取代的残基处的变体，目的是降低IL-12异源二聚体与IL-12受体的亲和力。还设计了用于去除p40中潜在的N-糖基化位点的取代，以检查糖基化对蛋白质异质性的影响。图21A-21F中描绘了说明性变体的序列。通过标准基因合成来构建对IL-12p40变体进行编码的质粒、然后亚克隆到含有Fc融合配偶体(例如，如图8A-8D所描绘的恒定区)的pTT5表达载体中，其对应的氨基酸序列在图22A-22G中描绘。
2A(b)：工程化IL-12p35变体
与上文描述的第二策略一样，在MOE软件中使用QuaSAR数据包来标识IL-12p35晶体结构(PDB码3HMX)中的高度暴露的天冬氨酸残基、谷氨酸残基、天冬酰胺残基和谷氨酰胺残基，从而推断这些残基可以有助于IL-12异源二聚体复合物与IL-12受体之间的结合。再次，此处具体地将重点放在可以并入同配取代以使免疫原性潜力最小化的残基上。我们标识了ASA得分至少为103的Q35、E38、E46、D55、E67、N71、N76、N85、Q135、Q146、N151、E153、E162和E163(如图23所描绘的残基和ASA得分)。
如上所述，为了确保我们不会干扰IL-12p40和IL-12p35亚基之间的自然相互作用，我们根据Luo等人.(2010)报道的晶体结构标识了IL-12p35上可能与IL-12p40接触的以下残基：Q20、S44、E45、E46、H49、K54、T59、V60、E61、C63、L64、P65、E67、L68、S73、C74、R181、I182、R183、V185、T186、D188、R189、V190、S192、Y193和A196。
考虑到上述情况，设计了具有同配取代的许多IL-12p35变体，目的是降低IL-12异源二聚体与IL-12受体的亲和力。还设计了用于去除p35中潜在的N-糖基化位点的取代，以检查糖基化对蛋白质异质性的影响。图24A-24B中描绘了说明性变体的序列。通过标准基因合成来构建对IL-12p35变体进行编码的质粒、然后亚克隆到含有Fc融合配偶体(例如，如图8A-8D所描绘的恒定区)的pTT5表达载体中，其对应的氨基酸序列在图25A-25C中描绘。
2A(c)：工程化IL-12p35变体
设计具有上述变体IL-12亚基的说明性变体IL-12-Fc融合蛋白，这是为了生成对IL-12受体具有亲和力降低以降低效力的IL-12-Fc融合物，其序列在图26A-26Q中描绘。如实施例1B中总体上描述的，我们产生并纯化IL-12-Fc融合物，并在pSTAT4测定中研究其活性。
用100ng/ml抗CD3(OKT3)活化人PBMC持续2天。然后将活化的PBMC与指示的测试制品在37℃下温育15分钟。然后用使用PerFix EXPOSE试剂盒(印第安纳州印第安纳波利斯的贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter,Indianapolis,Ind.))将细胞用抗CD3-BUV395(UCHT1)、抗CD4-BV605(RPAT4)、抗CD8-AF700(SK1)、抗CD25-BV510(M-A251)、抗CD45RA-BV421(HI100)、抗CD56-PE(N901)、抗FoxP3-AF488(259D)和抗pSTAT4-AF647(38/p-Stat4)染色，并通过流式细胞术进行分析。
显示通过具有IL-12p35或IL-12p40变体的IL-12-Fc融合物对CD4+CD45RA+CD25+和CD8+CD45RA+CD25+T细胞诱导STAT4磷酸化的数据分别描绘于图27A-27B和图28A-28B中。图29描绘了各种变体IL-12-Fc融合物的EC50和EC50相对于WT IL-12-Fc XENP27201的减小倍数。数据显示，大多数包含变体IL-12p40亚基或IL-12p30亚基的IL-12-Fc融合物在诱导STAT4磷酸化方面表现出降低的效力。值得注意的是，IL-12p40亚基中的E59Q和E235Q取代，以及IL-12p35取代中的E153Q和N151D取代能够分别使变体IL-12-Fc融合物的效力降低2倍以上。另外，包括E59Q的IL-12p40双突变体和三突变体使效力降低多达6.5倍。
令人惊讶的是，包含IL-12p40(D87N)或IL-12p40(E262Q)的两种变体IL-12-Fc融合物表现出效力增加。虽然所关注的是减少效力，其目的是降低抗原沉默并且由此增加IL-12-Fc融合物的半衰期，但效力增加的IL-12-Fc融合物可以在其它背景下使用。
2B：工程化IL-12p40和IL-12p35变体(第2轮)
为了工程化另外的IL-12p40和IL-12p35变体，其目的是降低所述变体对IL-12受体的亲和力并降低生物活性IL-12复合物的效力，用扩展标准来重新应用实施例2A中所描述的策略。例如，使用比实施例2A中定义的阈值更低的ASA评分阈值以用于标识在其上引入取代的IL-12p40和IL-12p35残基。还将标准扩展成包含另外的氨基酸残基，具体地将重点放在较大的残基如赖氨酸上，在所述残基处，引入取代更可能破坏IL-12p35、IL-12p40和/或IL-12复合物与IL-12受体的相互作用。类似地，引入具体地将重点放在较大的残基如赖氨酸上的非同配取代，以破坏IL-12p35、IL-12p40和/或IL-12复合物与IL-12受体的相互作用。使用这些方法，我们进一步标识了IL-12p40亚基中的D34、K99、K163、K258和K260；和IL-12p35亚基中的N21、E79、Q130、N136、E143、K158和D165作为适合工程化取代的残基。另外，生成另外的组合变体，所述组合变体并入了实施例2中标识的对最大效力降低有贡献的取代。
鉴于上述情况，设计了另外的IL-12p40和IL-12p35变体，其说明性序列分别在图30A-30B和32中进行了描绘。如上，通过标准基因合成来构建对IL-12p40和IL-12p35变体进行编码的质粒、然后亚克隆到含有Fc融合配偶体的pTT5表达载体中，其对应的氨基酸序列分别在图31A-31C和图33A和33B中描绘。实施例1B中总体上描述的那样生成具有另外的变体IL-12亚基的IL-12-Fc融合蛋白，其序列在图34A-图34L中进行了描绘。
如上文总体上描述的，在pSTAT4测定中研究了另外的变体IL-12-Fc融合物的活性。具体地说，用100ng/ml抗-CD3(OKT3)活化人PBMC持续2天。然后将活化的PBMC与指示的测试制品在37℃下温育15分钟。然后将细胞用抗CD3-BUV395(UCHT1)、抗CD4-BV605(RPAT4)、抗CD8-AF700(SK1)、抗CD25-BV510(M-A251)、抗CD45RA-BV421(HI100)和抗CD56-PE(N901)染色。接下来，使用PerFix EXPOSE(印第安纳州印第安纳波利斯的贝克曼库尔特公司)将细胞透化。在透化之后，将细胞用抗FoxP3-AF488(259D)和抗pSTAT4-AF647(38/p-Stat4)染色，并通过流式细胞术进行分析。在图35A-35B和图36A-35B中描绘了描绘在CD4+CD45RA-CD25+和CD8+CD45RA+CD25+T细胞上的pSTAT4 MFI的数据，并且在图37中示出了描绘EC50(以及相对于WT IL-12-Fc XENP27201的减小倍数)的数据。数据显示，大多数包含变体IL-12p40亚基和/或IL-12p30亚基的IL-12-Fc融合物在诱导STAT4磷酸化方面表现出降低的效力。
2C：工程化IL-12p40和IL-12p35变体(第3轮)
在实施例2B中，相较于包含IL-12p40(E59Q)的IL-12-Fc融合物XENP28825在效力上仅具有约2倍的降低，我们发现包含IL-12p40(E59K)的IL-12-Fc融合物XENP29952能够达到约12倍的降低。另外，注意到，在IL-12p40亚基中包含E59Q的若干个双突变体表现出>3.5倍的效力降低(例如，XENP29953、XENP29954和XENP29959)。进一步地，注意到，虽然包括IL-12p35(N151D)的XENP28846实现增加的效力，但实际上IL-12p35(D55Q/N151D)实现在效力上约2倍的降低，这向我们表明对IL-12p35亚基中D55的修饰大大有助于效力降低。因此，为了进一步降低IL-12-Fc融合物的效力，我们生成了另外的组合变体，所述组合变体并入了实施例2B中的对最大效力降低有贡献的取代。另外，如实施例2B中，我们进一步包含非同配取代，具体地将重点放在较大的残基如赖氨酸上。
鉴于上述情况，我们设计了另外的IL-12p40和IL-12p35变体，其说明性序列分别在图38和39中进行了描绘。如实施例1B中总体上描述的那样生产，我们生成了具有另外的变体IL-12亚基的IL-12-Fc融合蛋白，其序列在图40A-图40G中进行了描绘。如上文总体上描述的，在pSTAT4测定中研究了另外的变体IL-12-Fc融合物的活性。在图41A和图41B中描绘了描绘在CD4+CD45RA-CD25+和CD8+CD45RA+CD25+T细胞上的pSTAT4 MFI的数据，并且在图42中示出了描绘EC50(以及相对于WT IL-12-Fc XENP27201的减小倍数)的数据。数据显示，所有包含变体IL-12p40和/或IL-12p30亚基的新的IL-12-Fc融合物在诱导STAT4磷酸化方面表现出大幅降低的效力。值得注意的是，与XENP27201相比，XENP30607和XENP30608在效力上降低了约100倍。
2D：工程化IL-12p40和IL-12p35变体(第4轮)
我们通过并入实施例2中发现的另外的变体对效力变化有贡献以及通过进一步使用非同配取代破坏IL-12p35、IL-12p40和/或IL-12复合物与IL-12受体的相互作用来进一步工程化IL-12p40和IL-12p35亚基，所述非同配取代具体地将重点放在较大的残基如赖氨酸和酪氨酸上。
另外，我们在MOE软件中基于表面暴露进行另外的结构分析，以标识IL-12p40和IL-12p35亚基中的引入修饰的另外的残基。我们进一步标识了IL-12p40亚基中的残基R159和K264；IL-12p35亚基中的残基L75、L89、F96、M97、L124、M125和I171。我们使用了较早描述的方法以及丙氨酸取代(与丙氨酸扫描诱变技术相一致)来初步研究这些另外标识的残基处的修饰的作用。
鉴于上述情况，我们设计了另外的IL-12p40和IL-12p35变体，其说明性序列分别在图43A、图43B和44中进行了描绘。如实施例1B中总体上描述的那样产生，生成具有另外的变体IL-12亚基的IL-12-Fc融合蛋白，其序列在图45A-图45I和图46A-图46C中进行了描绘。
如上文总体上描述的，在pSTAT4测定中研究了另外的变体IL-12-Fc融合物的活性。在图47A-图47D中描绘了描绘在CD4+CD45RA+CD25+、CD4+CD45RA-CD25+、CD8+CD45RA+CD25+和CD8+CD45RA-CD25+T细胞上的pSTAT4 MFI的数据，并且在图48中示出了描绘EC50(以及相对于WT IL-12-Fc XENP27201的减小倍数)的数据。数据显示，所有包含变体IL-12p40和/或IL-12p30亚基的新的IL-12-Fc融合物在诱导STAT4磷酸化方面表现出大幅降低的效力。
实施例3：二价IL-12-Fc融合物
我们还设想了二价IL-12-Fc融合物。一种此类形式是二价N末端IL-12-Fc融合形式(图49A-图49B)，其包括两个相同的单体，每个单体包括与同源二聚体Fc链的N末端(任选地通过结构域接头)重组融合的scIL-12复合物。另一种此类形式是二价C末端IL-12-Fc融合形式(图49C-图49D)，其包括两个相同的单体，每个单体包括与同源二聚体Fc链的C末端(任选地通过结构域接头)重组融合的scIL-12复合物。
实施例4：替代IL-12-Fc融合形式的效力降低的IL-12变体
我们还在另外的IL-12-Fc融合形式的上下文中研究了IL-12变体。scIL-12(p40/p35)-Fc和(scIL-12(p40/p35))2-Fc形式的融合物是用WT IL-12p40亚基或变体IL-12p40(E59K/K99E)亚基生成的并且如实施例1B中通常描述的产生(并且其序列在图50-图51中描绘)。
如上文总体上描述的，在pSTAT4测定中研究IL-12-Fc融合物的活性。具体地说，在37℃下用100ng/ml抗-CD3(OKT3)活化人PBMC持续2天。然后在37℃下将经活化的PBMC与所指示的测试制品一起温育，持续15分钟。然后将细胞用抗CD3-BUV395(UCHT1)、抗CD4-BV605(RPAT4)、抗CD8-AF700(SK1)、抗CD25-BV711(M-A251)、抗CD45RA-BV421(HI100)和抗CD56-PE(N901)染色。接下来，使用PerFix EXPOSE(印第安纳州印第安纳波利斯的贝克曼库尔特公司)将细胞透化。在透化之后，将细胞用抗FoxP3-V450(259D)和抗pSTAT4-AF647(38/p-Stat4)染色，并通过流式细胞术进行分析。在图52A-图52D中描绘了描绘在CD4+CD45RA+CD25+、CD4+CD45RA-CD25+、CD8+CD45RA+CD25+和CD8+CD45RA-CD25+T细胞上的pSTAT4 MFI的数据，并且在图53中示出了描绘EC50(以及相对于WT IL-12-Fc XENP27201的减小倍数)的数据。数据显示，各种形式的IL-12-Fc融合物表现出非常类似的效力，并且包括变体IL-12p40(E59K/K99E)亚基的scIL-12(p40/p35)-Fc和(scIL-12(p40/p35))2-Fc融合物中的IL-12-Fc融合物显示出与包括变体IL-12p40(E59K/K99E)亚基的呈IL-12-异源Fc形式的IL-12-Fc融合物非常类似的效力。
实施例5：IL-12-Fc融合物增强体内T细胞的同种异体抗肿瘤作用
接下来，我们研究了本发明的IL-12-Fc融合物的体内抗肿瘤作用。在第-15天，将NOD SCIDγ(NSG)小鼠右腹皮下植入3×106个pp-65表达MCF-7细胞。在第0天，将小鼠腹膜内植入1.5×106个人PBMC。然后在第0天、第7天、第14天和第21天用0.03mg/kg XENP29952对小鼠(n＝15)进行治疗，即，包括变体IL-12p40(E59K)的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物。使用的对照物(n＝10)是PBS和XENP16432(二价抗PD-1mAb，通过抑制所植入的人T细胞来增强抗肿瘤活性的检查点抑制剂；图53中所描绘的序列)。通过卡尺测量监测肿瘤体积，图54中示出了其数据(第1剂量后的天数)。在第7天、第14天和第21天抽取血液和血清，并通过流式细胞术进行分析，以研究人淋巴细胞的扩增，其数据如图55A-图55D所示，并通过U-PLEX Biomarker第1组人类测定(马里兰州罗克维尔市的Meso Scale公司(Meso Scale,Rockville,Md.))对血清细胞因子浓度进行分析，数据如图图56A-图56F所描绘。
此外，数据显示，在第14天，与PBS对照和通过XENP16432进行检查点阻断两者相比，IL-12异源Fc融合物XENP29952的CD45+、CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK细胞的扩增显著增加(使用未配对t检验对经过对数变换的数据进行统计分析)。值得注意的是，如肿瘤体积变化所指示的，到第11天，XENP29952显著增强了抗肿瘤活性(使用未配对t检验对经过基线校正的数据进行的统计)。此外，与通过XENP16432进行的检查点阻断相比，到第7天，XENP29952显著增强了IFNγ和的CD25分泌(使用未配对t检验对经过对数变换的日期进行的统计)。
除了抗肿瘤活性之外，移植的人PBMC还发展出针对小鼠细胞的自身免疫应答，并且随后引发了移植物抗宿主病(GVHD)。因此，应当注意，尽管用XENP29952治疗的所有动物到第19天均死亡，但这可能是由于人淋巴细胞的显著增强的扩增加剧了所述动物患有GVHD。这突显了效力降低的IL-12变体不仅对于改善药代动力学而且对于改善治疗指数的重要性。
实施例6：IL-12-Fc融合物表现出与体外效力相关的体内调节活性
由于实施例5中用XENP29952治疗的所有动物均因GVHD而死亡，因此在GVHD研究中研究了用效力降低的IL-12变体工程化的IL-12-Fc融合物的体内活性。
NSG小鼠在第-1天通过IV-OSP植入10x106人PBMC，并在第0、7、14和21天以0.3或0.03mg/kg腹膜内给药以下测试制品：XENP29952(包括变体IL-12p40(E59K)的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)、XENP30597(包括变体IL-12p40(E59K/K99E)的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)、XENP31254(包括变体IL-12p40(D18K/E59K/K99E)的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)、XENP31251(包括变体IL-12p40(E59K/K99Y)的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)或XENP31258(包括变体IL-12p40(E59K/K99E/K264E)的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)。每周评估两次体重作为GVHD的指标，其数据在图58A-58I中描绘为体重变化(相对于初始体重)。另外，在第7天、第10天、第14天和第31天抽血以研究PD-1表达水平所指示的各种T细胞群体的活化(其数据在图59A-图69C和图60A-图60C中描绘)，并抽取血清以研究细胞因子分泌(其数据在图61A-图61D中描绘)。值得注意的是，数据示出了测试制品的剂量应答(即，与0.03mg/kg剂量相比，0.3mg/kg剂量增强了GVHD、T细胞活化和IFNγ分泌)。
令人惊讶的是，XENP31251似乎是体外诱导CD4+T细胞上STAT4磷酸化的最弱变体之一(参见图47A-47B)，是GVHD的更强诱导剂之一。因此，使用两个单独的PBMC供体，在如上文通常所描述的STAT4磷酸化测定中重新研究了相同的说明性效力降低的IL-12-Fc的体外活性。在37℃下用1μg/ml抗CD3(OKT3)活化人PBMC持续2天。然后将活化的PBMC与指示的测试制品在37℃下温育15分钟。
然后将细胞用抗CD3-BUV395(UCHT1)、抗CD4-BV605(RPAT4)、抗CD8-AF700(SK1)、抗CD25-BV510(M-A251)、抗CD45-BV785、抗CD45RA-BV421(HI100)、抗CD16-PE(B73)和抗CD56-PE(N901)染色。接下来，使用PerFix EXPOSE(印第安纳州印第安纳波利斯的贝克曼库尔特公司)将细胞透化。在透化之后，将细胞用抗FoxP3-AF488(259D)和抗pSTAT4-AF647(38/p-Stat4)染色，并通过流式细胞术进行分析。在图62A-62K中描绘了来自第一供体的PBMC中各种淋巴细胞群体上的STAT4磷酸化的诱导(数据未示出第二供体)。来自两个供体并且跨不同的淋巴细胞群体的数据示出了效力阶梯，其中XENP29952为最强效变体，XENP31254和XENP31258为最不强效变体，并且XENP30597和XENP31251介于两者之间。值得注意的是，如由效力降低的IL-12-Fc融合变体在体内诱导的GVHD、T细胞活化程度和IFNγ分泌与体外效力相关。例如，在0.03mg/kg剂量下，相较于所有效力降低的IL-12-Fc融合物，XENP29952诱导的GVHD、T细胞活化和IFNγ分泌更高，而XENP31254和XENP31258诱导的GVHD、T细胞活化和IFNγ分泌最低。
实施例7：IL-12-Fc融合物具有抗肿瘤活性，并与检查点阻断有效组合
接下来，研究了与另外的IL-12-Fc融合物结合的体内抗肿瘤作用以及IL-12-Fc融合物与检查点阻断结合的作用。在第-15天，将NSG小鼠右腹皮下植入3×106个pp-65表达MCF-7细胞。在第0天，将小鼠腹膜内移植5×106个人PBMC。然后在第0天、第7天、第14天和第21天用单独的0.1mg/kg XENP31251或与3.0mg/kg抗PD-1mAb XENP16432组合治疗小鼠。使用的对照物是PBS、单独的3.0mg/kg XENP16432和XENP31258。通过卡尺测量监测肿瘤体积，图63A-图63D中示出了其数据(第1剂量后的天数)。在第7天、第14天和第21天抽血，并通过流式细胞术进行分析，以研究人淋巴细胞的扩增，第14天的数据如图64A-图64F所描绘。
数据表明，与用PBS治疗相比，到第14天XENP31258显著增强了抗肿瘤活性，并且XENP31251(单独或与XENP16432组合)到第16天显著增强了抗肿瘤活性(如肿瘤体积的变化所指示的)(使用曼-惠特尼检验对经过基线校正的数据进行的统计)。值得注意的是，数据表明，与XENP16432单独使用治疗相比，XENP31251与XENP16432的组合在第21天显著增强了抗肿瘤活性；并且与单独的XENP31251或XENP16432相比，用XENP31251与XENP16432组合的治疗显著增强了淋巴细胞扩增，从而表明IL-12-Fc融合物有效地与检查点阻断组合。
实施例8：去除IL-12p40亚基中的游离半胱氨酸
IL-12p40亚基在位置252处具有游离半胱氨酸(根据如图1所描绘的人IL-12亚基β(IL-12p40)成熟形式序列进行编号)，所述半胱氨酸可以与其它游离半胱氨酸结合，至少导致异质性并且导致免疫原性差。因此，例如通过引入C252S修饰(尽管也可以使用其它取代)来工程化IL-12p40变体以去除游离半胱氨酸。C252的修饰(例如，C252S)可以单独使用或者与其它任何IL-12p40变体(如亲和力或表达变体)组合使用。在图66A-66C中描绘了说明性IL-12p40变体，其包括C252处的修饰以去除游离半胱氨酸。实施例1B中总体上描述的那样生成具有另外的变体IL-12p40亚基的说明性IL-12-Fc融合蛋白，其序列在图67A-图67N中进行了描绘。
如上文通常所描述的，在pSTAT4测定中研究了为去除游离半胱氨酸而工程化的变体IL-12p40的活性，以确定去除游离半胱氨酸不会引起活性的任何变化。将经活化的PBMC与指示的测试制品一起温育，并评估各种群体上的pSTAT4 MFI，其数据如图68A-68E所描绘。数据表明，包括C252S修饰的变体表现出与不包含C252S修饰的对应变体的活性类似的活性。值得注意的是，对于测试的4个变体中的3个，将具有和不具有C252S突变的版本(即，D18K/E59K/K99E；D18K/E59K/K99E/K264E和E59K/K99E)工程化，C252S突变似乎会稍微提高IL-12-Fc融合物的效力。
实施例9：PD-1靶向臂
如上所述，PD-1表达在活化的肿瘤浸润淋巴细胞上被上调。因此，将本发明的IL-12-Fc融合蛋白靶向表达PD-1淋巴细胞可能是将IL-12-Fc融合物导向肿瘤环境并避免全身毒性的有用方法。在图70A-图70I、图71和图72中描绘了预期在本文中使用其可变区的抗PD-1mAbs的序列。
9A：mAb A、mAb B和mAb C不会交叉竞争与纳武单抗的结合
另外，因为将本发明的靶向的IL-12-Fc融合蛋白与PD-1阻断抗体组合，或在用PD-1阻断抗体处理后给予本发明的靶向的IL-12-Fc融合蛋白将是有用的，因此重要的是，靶向的IL-12-Fc融合蛋白的PD-1靶向臂不会结合与PD-1阻断抗体相同或相似的表位。本文考虑的PD-1阻断抗体包括但不限于纳武单抗和派姆单抗。为了研究上述抗PD-1结合结构域是否与纳武单抗和派姆单抗竞争，我们对嵌合mAbs进行了串联表位分箱。使用Octet HTX仪器进行串联表位分箱。首先使用HIS1K生物传感器捕获PD-1-His，然后将其浸入100nM的第一抗体中，然后浸入100nM的第二抗体中。测试的抗体是XENP16432(基于纳武单抗的二价抗PD-1mAb；序列在图54中描绘)、XENP21461(派姆单抗；序列在图54中描绘、嵌合mAb A、嵌合mAbB和基于1C11的mAb。也包括PD-L1-Fc，以研究抗体对PD-1:PD-L1相互作用的阻断。针对将生物传感器浸入HBS-EP缓冲液中，然后浸入抗PD-1抗体中的BLI反应对BLI反应进行归一化。如果抗体对提供的归一化BLI反应小于0.5，则认为该对竞争或部分竞争且位于同一表位箱中，即识别非常相似或高度重叠的表位。如果抗体对提供的归一化BLI响应大于0.5，则认为该对是非竞争性的，并被分箱至不同的表位。图73中概括了每个抗体对的归一化BLI响应。
分箱显示，抗PD-1mAb A、mAb B和mAb C不与纳武单抗或派姆单抗竞争，而基于1C11的mAb与纳武单抗和派姆单抗竞争。另外，mAb A似乎没有阻断PD-1:PD-L1相互作用，而mAb B和mAb C阻断了PD-1:PD-L1相互作用。
为了简单起见，与纳武单抗和/或派姆单抗竞争的PD-1结合结构域在本文中被称为抗PD-1[C]，并且不与纳武单抗和/或派姆单抗竞争的PD-1结合结构域被称为抗PD-1[NC]。
9B:mAb C对人和食蟹猴PD-1有交叉反应
此外，为了便于临床开发，研究靶向PD-1的IL-12-Fc融合物的各种参数是有用的，如食蟹猴中的药代动力学、药效学和毒性。如上文总体所述的，我们使用Octet研究了XENP28536与人和食蟹猴PD-1的结合。具体地说，使用抗人Fc(AHC)生物传感器来捕获抗体并浸入多种浓度的人和食蟹猴PD-1-His中，以确定KD，其数据如图74A-图74B所描绘。
9C：基于mAb C的ABD的亲和力优化
我们工程化了亲和力优化的mAb C变体。通过标准诱变构建了变体文库，以将点突变引入XENP28536的可变重链或可变轻链区。图70A-图70I中描绘了说明性序列(可变结构域序列)。如上文总体所述的，对Octet进行了亲和力工程化的mAb C[PD-1]_H1L1变体(以具有E233P/L234V/L235A/G236_/S267K消融变体的二价IgG1形式)的亲和力筛选，其数据如图75A-图75I所描绘。在可变重链区或可变轻链区中具有单个点突变的304个变体中，无论是，我们仅标识出11个变体(包括mAb C[PD-1]_H1_L1.1和mab_C[PD-1]_H1_L1.3)，其与WT相比，具有的亲和力提高了超过2倍。有利的VH取代是在位置32、52A和97(根据Kabat编号)处；并且有利的VL取代是在位置27D、30、93和94(根据Kabat编号)处。
组合有利的单取代VH变体和/或单取代VL变体以产生另外的变体，其序列在图70A-图70I中描绘。
实施例10：PD-L1靶向臂
如上所述，PD-L1被肿瘤细胞过度表达。因此，将本发明的IL-12-Fc融合蛋白靶向表达PD-L1肿瘤细胞可能是将IL-12-Fc融合物导向肿瘤环境并避免全身毒性的有用方法。在图76A-图76J中描绘了预期在本文中使用其可变区的几种抗PD-L1 mAb的序列。
实施例11：靶向IL-12-Fc融合物
11A：工程化和生产靶向IL-12-Fc融合物
通过标准基因合成构筑编码IL-12p40亚基、IL-12p35亚基或抗原结合结构域的各种区的质粒，然后亚克隆到含有Fc融合配偶体(例如，如图77-图78中描绘的恒定区)的pTT5表达载体中。图79A-图79E中描绘了说明性靶向IL-12-Fc融合物的卡通示意图。
特定的说明性形式，即“scIL-12x Fab”形式(图79B)包含重组融合至异源二聚体Fc区的N末端的单链IL-12复合物(或“scIL-12复合物”)，其中可变重链(VH)与异源二聚体Fc的另一侧融合，同时单独转染相应轻链以形成具有VH的Fab。
我们以这种形式使用抗PD-1靶向臂、抗PD-L1靶向臂和对照抗RSV靶向臂生成靶向IL-12-Fc融合物，其在本文中分别被称为靶向PD-1的IL-12-Fc融合物、靶向PD-L1的IL-12-Fc融合物和靶向RSV的IL-12-Fc融合物，其说明性序列在图80A-图80J、图81A、图81B和图82A-图82H中所描绘。没有靶向臂的IL-12-Fc融合物在本文中可与非靶向IL-12-Fc融合物互换。
通过在HEK293E细胞中进行瞬时转染产生了蛋白质，并且通过包括蛋白A色谱法和离子交换色谱法的两步纯化过程进行纯化。
11B：靶向IL-12-Fc融合物在体外表现出增强的活性
在第一个实验中，在pSTAT4测定中研究了包含WT和效力降低的IL-12[p40(E59K/K99E)]变体的靶向IL-12-Fc融合物的活性(如上文大体所述；图83A和图83B中描绘的数据)。在第二个实验中，在pSTAT4测定中研究了包含另外的效力降低的IL-12变体的靶向IL-12-Fc融合物的活性(图84描绘的数据)。
总的来说，数据显示，靶向RSV的IL-12-Fc融合物表现出与非靶向IL-12-Fc融合物相当的活性；靶向PD-1的IL-12-Fc融合比非靶向(或靶向RSV的)IL-12-Fc融合物更有效；并且靶向PD-L1的IL-12-Fc融合物比非靶向(或靶向RSV的)IL-12-Fc融合物和靶向PD-L1的IL-12-Fc融合物更有效。值得注意的是，第一个实验显示靶向PD-1不会增强WT IL-12的效力，这表明靶向可能仅在IL-12效力降低的情况下是必要的。因此，预计在肿瘤环境之外，靶向PD-1和靶向PD-L1的效力降低的IL-12-Fc融合物将表现出与非靶向(或靶向RSV的)效力降低的IL-12-Fc融合物相当的活性。而在肿瘤环境中，靶向PD-1和靶向PD-L1的IL-12-Fc融合物将表现出恢复的有效活性。
11C：靶向IL-12-Fc融合物表现出增强的体内活性
在GVHD研究中研究了靶向PD-1的IL-12-Fc融合物。在第1天，通过IV-OSP将10x106人PBMC移植到NSG小鼠(每组10只)中，并在第0、7、14和21天给予指示浓度的指示测试制品。每周两次评估体重作为GVHD的指标(体重变化占初始体重的百分比，如图85所示)；在研究过程中定期抽血(例如，第0天、第5天、第7天、第9天、第11天、第13天、第14天、第15天、第17天、第19天、第21天等)以评估各种淋巴细胞的扩增(图86A-图86E中描绘的第14天的数据)；并且评估了PD-1在CD4+和CD8+T细胞上的表达(图87A-图87B中描绘的第14天的数据)。值得注意的是，数据显示，尽管XENP31462已经以低于XENP31258的剂量给药，但到第17天，与XENP31258相比，XENP31462显着增强了GVHD。同样，到第14天，与XENP31258相比，XENP31462显着增强了淋巴细胞的扩增和活化。
还在小鼠抗肿瘤模型中研究了靶向PD-1的IL-12-Fc融合物。对于该研究，使用的是MHC I/II-DKO(NSG-DKO)并因此耐受GVHD的NSG小鼠。在第-15天，给NSG-DKO小鼠(每组10只)经腹膜内接种3x106 pp65转导的MCF-7细胞。然后，在第0天，给小鼠经腹膜内注射5x106人PBMCs并用指定的测试制品处理，并在第7、14和21天用指示的测试制品进一步处理。每周通过卡尺测量肿瘤体积三次，其数据在图88中示出。尽管以10倍低的剂量给药，靶向PD-1的效力降低的IL-12-Fc融合物XENP31462表现出与非靶向性效力降低的IL-12-Fc相当的抗肿瘤活性。
实施例12：选择变体以去除IL12亚基上的潜在N-糖基化位点调节IL-12-Fc融合物的活
性
在如上所述，在pSTAT4测定中研究了用p40和p35亚基中的变体工程化以去除推定的N-糖基化位点的糖基化的IL-12-Fc融合物的生物学活性(如实施例2A中的一般描述)。在图122A中描绘了将XENP32190(包含IL-12p40变体E59K/K99E/C252S/K264E的IL-12-Fc融合物)与进一步包含至少一个p40[N103Q]去糖基化变体的相应分子进行比较的数据；在图122B中描绘了将XENP32190与进一步包含至少一个p40[N113Q]去糖基化变体的相应分子进行比较的数据；在图122C中描绘了将XENP32190与进一步包含至少一个p40[N200Q]去糖基化变体的相应分子进行比较的数据；图122D描绘了将XENP32190与进一步包含至少一个p40[N281Q]去糖基化变体的相应分子进行比较的数据；在图123中描绘了将XENP32190与在IL12p35亚基中进一步包含去糖基化变体的相应分子进行比较的数据。
在图122A中观察到N103Q去糖基化变体增强了IL-12-Fc融合物的效力。与XENP32190相比，每个具有N103Q变体的IL-12-Fc融合物(XENP32996和XENP33002除外)都表现出增强的效力。值得注意的是，XENP32996和XENP33002还包括N200Q去糖基化变体。在图122中观察到N200Q变体降低了IL-12-Fc融合物的效力。与XENP32190相比，每个具有N200Q变体的IL-12-Fc融合物(XENP32996和XENP33002除外)都表现出显着降低的效力。值得注意的是，XENP32996和XENP33002还包括N103Q变体。总的来说，数据表明N103Q和N200Q变体传递了一种附加效应。例如，在XENP32996和XENP33002中，N200Q变体效力降低，而N103Q效力恢复。此外，这表明N200Q变体传达出显着降低的效力，而不是完全消除IL-12活性。有趣的是，N200Q变体传递的在效力上的降低与在MOE中使用QuaSAR包的早期计算工作(如实施例2A中所述)是一致的，其中N200被标识为可能有助于IL12p40亚基和IL-12受体之间结合的高度暴露残基。
在图122B和122D中观察到，N113Q和N281Q去糖基化变体本身不影响IL12活性(尽管XENP32994的数据暗示效力略有增加)。与上述观察结果一致，包含N200Q变体会进一步降低效力，并且包含N113Q变体会进一步增加IL-12-Fc融合物的效力。最后，在图123中观察到IL12p35亚基中的去糖基化变体不调节IL-12活性。
提供上述实施例以向本领域中的技术人员给出如何实施和使用本发明的组合物、系统和方法的实施方式的完整公开和说明，并非意图限制发明人对于他们的发明的主张范围。用于实施本发明的上述模式的修改为熟练的技术人员所显见，并且意图属于以下权利要求范围之内。本说明书中所提及的所有专利和出版物指示本发明所属领域的技术人员的水平。本公开中引用的所有参考文献通过引用并入，其程度如同每个参考文献已经以全文引用的方式单独地并入。
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Claims (104)

1.一种靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其包含：
a)第一单体，其从N末端至C末端包含：
i)第一IL-12蛋白质结构域；
ii)第一结构域接头；
iii)第二IL-12蛋白质结构域；
iv)第二结构域接头；以及
v)第一变体Fc结构域，其包含CH2-CH3；和
b)第二单体，其从N末端至C末端包含：
i)scFv结构域；
ii)第三结构域接头；以及
iii)第二变体Fc结构域，其包含CH2-CH3；
其中，所述第一IL-12蛋白质结构域包含IL-12p35亚基并且所述第二IL-12蛋白质结构域包含IL-12p40亚基，或者所述第一IL-12蛋白质结构域包含IL-12p40亚基并且所述第二IL-12蛋白质结构域包含IL-12p35亚基，
其中，所述scFv结构域包含可变重结构域、scFv接头、可变轻结构域，并且所述scFv结构域结合靶抗原，并且
其中，所述第一和所述第二变体Fc结构域包含促进所述第一和所述第二Fc结构域异源二聚化的修饰。
2.根据权利要求1所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，所述scFv结构域结合选自由人PD-1和人PD-L1组成的组的靶抗原。
3.根据权利要求2所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，所述scFv结构域结合人PD-1。
4.根据权利要求3所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，所述scFv结构域包含选自由以下组成的组的可变重链和可变轻链：(a)1C11[PD-1]_H0L0(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(b)1C11[PD-1]_H3L3(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(c)1C11[PD-1]_H3.240_L3.148(SEQID NOS:XXX和XXX)、(d)1C11[PD-1]_H3.241_L3.148(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(e)1C11[PD-1]_H3.234_L3.144(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(f)1C11[PD-1]_H3.241_L3.92(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(g)1C11[PD-1]_H3.303_L3.152(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(h)1C11[PD-1]_H3.329_L3.220(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(i)1C11[PD-1]_H3.329_L3.220(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(j)1C11[PD-1]_H3.328_L3.152(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(k)派姆单抗[PD-1](SEQID NOS:XXX和XXX)、(l)尼沃利珠单抗[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(m)皮地利珠单抗[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(n)MK-3475[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(o)BAP049克隆E[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(p)BAP049克隆B[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(q)H7709N[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(r)H7798N[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(s)h1H3 Var 6[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(t)APE2058[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(u)H005-1[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(v)317-4B6[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(w)326-4A3[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(x)hPD-1 mAb 7[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(y)克隆38[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(z)克隆39[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(aa)克隆41[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ab)克隆48[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ac)PD1-17[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ad)PD1-28[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ae)PD1-33[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(af)PD1-35[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ag)LOPD180[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ah)Ab948[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ai)人源化EH-12.2H7[PD-1](SEQ ID NOS:XXX)、(aj)RG1H10[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ak)RG1H10-H2A-22-1S[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(al))RG1H10-H2A-27-2S[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(am)RG1H10-3C[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(an)RG1H10-16C[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ao)RG1H10-17C[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ap)RG1H10-19C[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(aq)RG1H10-21C[PD-1](SEQ IDNOS:XXX和XXX)、(ar)RG1H10-23C2[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)和(as)mAB7[PD-1](SEQID NOS:XXX和XXX)。
5.根据权利要求2所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，所述scFv结构域结合人PD-1并且不与纳武单抗和/或派姆单抗竞争所述人PD-1。
6.根据权利要求5所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中
(1)结合人PD-1的所述scFv结构域包含选自由以下组成的组的可变重链和可变轻链：(i)mAb A[PD-1]_H1L1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ii)mAb B[PD-1]_H1L1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(iii)mAb C[PD-1]_H1L1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)和(iv)mAb C[PD-1]_H1.19L1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)，或
(2)所述scFv结构域包含选自由以下组成的组的可变重链：(a)mAb C[PD-1]_H1(SEQID NO:XXX)、(b)mAb C[PD-1]_H1.19(SEQ ID NO:XXX)、(c)mAb C[PD-1]_H1.48(SEQ IDNO:XXX)、(d)mAb C[PD-1]_H1.125(SEQ ID NO:XXX)、(e)mAb C[PD-1]_H1.130(SEQ ID NO:XXX)、(f)mAb C[PD-1]_H1.132(SEQ ID NO:XXX)、(g)mAb C[PD-1]_H1.169(SEQ ID NO:XXX)、(h)mAb C[PD-1]_H1.175(SEQ ID NO:XXX)和(i)mAb C[PD-1]_H2(SEQ ID NO:XXX)；和选自由以下组成的组的可变轻链：(a)mAb C[PD-1]_L1(SEQ ID NO:XXX)、(b)mAb C[PD-1]_L1.1(SEQ ID NO:XXX)、(c)mAb C[PD-1]_L1.3(SEQ ID NO:XXX)、(d)mAb C[PD-1]_L1.45(SEQ ID NO:XXX)、(e)mAb C[PD-1]_L1.117(SEQ ID NO:XXX)、(f)mAb C[PD-1]_L1.129(SEQ ID NO:XXX)、(g)mAb C[PD-1]_L1.135(SEQ ID NO:XXX)、(h)mAb C[PD-1]_L1.136(SEQ ID NO:XXX)、(i)mAb C[PD-1]_L1.140(SEQ ID NO:XXX)和(j)mAb C[PD-1]_L2(SEQ ID NO:XXX)。
7.根据权利要求2所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，所述scFv结构域结合人PD-L1。
8.根据权利要求7所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，结合人PD-L1的所述scFv结构域包含选自由以下组成的组的可变重链和可变轻链：(a)杜瓦鲁单抗(SEQ IDNOS:XXX和XXX)、(b)阿特珠单抗(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(c)A09-246-2(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(d)12A4(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(e)3G10(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(f)10A5(SEQID NOS:XXX和XXX)、(f)h3D10 Var 1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(g)h3D10 Var 2(SEQ IDNOS:XXX和XXX)、(h)h3D10 Var 3(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(i)h3D10 Var 4(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(j)h3D10 Var 5(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(k)h3D10 Var 6(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(l)h3D10 Var 7(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(m)h3D10 Var 8(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(n)h3D10 Var 9(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(o)h3D10 Var 10(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(p)h3D10 Var 11(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(q)h3D10 Var 12(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(r)h3D10 Var 13(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(s)h3D10 Var 14(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(t)Antibody A(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(u)C5H9v2(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(v)人源化29E.2A3(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(w)1B9(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(x)4H1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(y)mAb-42(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(z)BAP058-03(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(aa)BAP058-04(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ab)BAP058-06(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ac)BAP058-07(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ad)BAP058-11(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ae)BAP058-13(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(af)H6(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ag)RC5(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ah)SH1A1Q(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ai)SH1B3(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(aj)SH1D1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ak)SH1D2(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(al)SH1D12(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(am)SH1E1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(an)SH1G9(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ao)SH1E6(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ap)SH1A2(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(aq)SH1B1(SEQ IDNOS:XXX和XXX)、(ar)H6B1L(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(as)H6A1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(at)H6B1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(au)H6B2(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(av)G12(SEQ IDNOS:XXX和XXX)、(aw)RSA1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ax)RA3(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ay)SH1E2(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(az)SH1E4(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ba)SH1B1(SEQ IDNOS:XXX和XXX)、(bb)SH1C8(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(bc)H1H9364P2(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(bd)H1H9373P2(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(be)H1H8314N(SEQ ID NOS:XXX和XXX)和(bf)PDL1.3(SEQ ID NOS:XXX和XXX)。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，所述变体IL-12p40亚基具有与选自由以下组成的组的多肽序列至少90％的序列同一性：SEQ IDNO:3(人IL-12亚基β(IL-12p40)前体序列)和SEQ ID NO:4(人IL-12亚基β(IL-12p40)成熟形式序列)，以及所述IL-12p35亚基具有与选自由以下组成的组的多肽序列至少90％的序列同一性：SEQ ID NO:1(人IL-12亚基α(IL-12p35)前体序列)和SEQ ID NO:2(人IL-12亚基α(IL-12p35)成熟形式序列)。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，所述IL-12p40亚基是变体IL-12p40亚基和/或所述IL-12p35亚基是变体IL-12p35亚基。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，所述IL-12p40亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p40亚基；和/或所述IL-12p35亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p35亚基。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，所述变体IL-12p40亚基包含在选自由以下组成的组的氨基酸残基上的一个或多个氨基酸取代：E59、K99、D18、K264、C252、N200、E3、D7、E12、D14、W15、P17、A19、P20、G21、E22、M23、D29、E32、E33、D34、L40、D41、Q42、S43、E45、L47、T54、I55、Q56、K58、F60、G61、D62、Q65、Y66、E73、K84、E86、D87、G88、I89、W90、D93、D97、E100、K102、N103、K104、F106、E110、N113、Y114、D129、D142、Q144、E156、R159、D161、N162、K163、D166、D170、Q172、D174、A176、C177、P178、A179、A180、E181、S183、P185、E187、S204、F206、R208、D209、D214、N218、Q220、N226、Q229、E231、E235、T242、P243、S245、Y246、F247、S248、Q256、K258、K260、E262、D265、D270、N281、Q289、D290、R291、Y292、Y293和E299。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，所述变体IL-12p40亚基包含一个或多个选自由以下组成的组的氨基酸取代：E59K、K99E、K99Y、D18K、K264E、C252S、N200Q、D18N、E32Q、E33Q、D34K、D34N、Q42E、S43E、S43K、E45Q、Q56E、E59Q、D62N、E73Q、D87N、E100Q、N103D、N103Q、N113D、N113Q、Q144E、R159E、D161N、K163E、E187Q、N200D、N218Q、Q229E、E235Q、Q256N、K258E、K260E、E262Q、N281D、N281Q和E299Q。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，所述变体IL-12p40亚基包含选自由以下组成的组的氨基酸取代：E59K/K99E、E59K/K99Y、D18K/E59K/K99E、E59K/K99E/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、E59K/K99E/C252S、E59K/K99Y/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S、E59K/K99E/C252S/K264E、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q、E59K/K99Y/N200Q、D18K/E59K/K99E/N200Q、E59K/K99E/N200Q/K264E、D18K/E59K/K99E/N200Q/K264E、E59K/K99E/N200Q/C252S、E59K/K99Y/N200Q/C252S、D18K/E59K/K99E/N200Q/C252S、E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、D18K/E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、D18K/E59K/K99E/C252S、E32K/D34N/E59K/K99E、E32Q/D34N/E59K/K99E、D34K/E59K/K99E、D34N/E59K、D34N/E59K/K99E、Q42E/E45Q、Q42E/E59Q、Q42E/Q56E/E59Q、E32Q/E59Q、D34N/E59Q、S43E/E59Q、S43K/E49Q、E45K/E59K/K99E、E45Q/Q56E、E45Q/Q56E/E59Q、E59Q/E187Q、E59Q/K163E、E59Q/K99E、E59Q/K258E、E59Q/K260E、E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E、E59K/K99E/Q144E、E59K/K99E/Q144K、E59K/K99E/R159E、E59K/K99Y、E59Y/K99E、E59Y/K99Y、E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、N103D/N113D、N103D/N113D/N200D、N103D/N113D/N281D、N103D/N200D、N103D/N200D/N281D、N103D/N281D、N103D/N113D/N200D/N281D、N103Q/N113Q、N103Q/N113Q/N200Q、N103Q/N113Q/N281Q、N103Q/N200Q、N103Q/N200Q/N281Q、N103Q/N281Q、N113D/N200D、N113D/N200D/N281D、N113D/N281D、N113Q/N200Q、N113Q/N281Q、N113Q/N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q/N281Q、N200D/N281D和N200Q/N281Q。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，所述变体IL-12p40亚基包含选自由以下组成的组的氨基酸取代：E59K/K99E、E59K/K99Y、D18K/E59K/K99E、E59K/K99E/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、E59K/K99E/C252S、E59K/K99Y/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S、E59K/K99E/C252S/K264E、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q、E59K/K99Y/N200Q、D18K/E59K/K99E/N200Q、E59K/K99E/N200Q/K264E、D18K/E59K/K99E/N200Q/K264E、E59K/K99E/N200Q/C252S、E59K/K99Y/N200Q/C252S、D18K/E59K/K99E/N200Q/C252S、E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E和D18K/E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，所述变体IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的多肽序列：图89A-89C中描绘的任何一个，i)SEQ ID NO:57(IL-12p40(N103D))、ii)SEQ ID NO:58(IL-12p40(N113D))、iii)SEQ ID NO:59(IL-12p40(N200D))、iv)SEQ ID NO:60(IL-12p40(N281D))、v)SEQ ID NO:61(IL-12p40(N103D/N113D/N200D/N281D))、vi)SEQ ID NO:62(IL-12p40(Q42E))、vii)SEQ ID NO:63(IL-12p40(E45Q))、viii)SEQ ID NO:64(IL-12p40(Q56E))、ix)SEQ ID NO:65(IL-12p40(E59Q))、x)SEQ ID NO:66(IL-12p40(D62N))、xi)SEQ ID NO:67(IL-12p40(Q42E/E45Q))、xii)SEQ ID NO:68(IL-12p40(E45Q/Q56E))、xiii)SEQ ID NO:69(IL-12p40(Q42E/E59Q))、xiv)SEQ ID NO:70(IL-12p40(Q56E/E59Q))、xv)SEQ ID NO:71(IL-12p40(Q42E/E45Q/Q56E))、xvi)SEQ ID NO:72(IL-12p40(E45Q/Q56E/E59Q))、xvii)SEQ ID NO:73(IL-12p40(D161N))、xviii)SEQ ID NO:74(IL-12p40(E73Q))、xix)SEQ ID NO:75(IL-12p40(Q144E))、xx)SEQ ID NO:76(IL-12p40(E262Q))、xxi)SEQ ID NO:77(IL-12p40(E100Q))、xxii)SEQ ID NO:78(IL-12p40(D18N))、xxiii)SEQ ID NO:79(IL-12p40(E33Q))、xxiv)SEQID NO:80(IL-12p40(Q229E))、xxv)SEQ ID NO:81(IL-12p40(E235Q))、xxvi)SEQ ID NO:82(IL-12p40(Q256N))、xxvii)SEQ ID NO:83(IL-12p40(E299Q))、xxviii)SEQ ID NO:84(IL-12p40(D87N))、xxix)IL-12p40(E32Q)、xxx)IL-12p40(D34N)、xxxi)IL-12p40(S43E)、xxxii)IL-12p40(S43K)、xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))、xxxiv)SEQ ID NO:205(IL-12p40(E59K))、xxxv)IL-12p40(K99E)、xxxvi)IL-12p40(K163E)、xxxvii)IL-12p40(E187Q)、xxxviii)IL-12p40(K258E)、xxxix)IL-12p40(K260E)、xl)SEQ ID NO:206(IL-12p40(E32Q/E59Q))、xli)SEQ ID NO:207(IL-12p40(D34N/E59Q))、xlii)SEQ ID NO:208(IL-12p40(E59Q/E187Q))、xliii)SEQ IDNO:209(IL-12p40(S43E/E59Q))、xliv)SEQ ID NO:210(IL-12p40(S43K/E49Q))、xlv)SEQID NO:211(IL-12p40(E59Q/K163E))、xlvi)SEQ ID NO:212(IL-12p40(E59Q/K99E))、xlvii)SEQ ID NO:213(IL-12p40(E59Q/K258E))、xlviii)SEQ ID NO:214(IL-12p40(E59Q/K260E))、xlix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K))l)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E))、li)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E))、lii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))、liii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y))、liv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99E))、lv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E45K/E59K/K99E))、lvi)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144E))、lvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144K))、lviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/R159E))、lix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))、lx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/K264E))、lxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(C252S))、lxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(DI8K/E59K/K99E/C252S))、lxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/C252S/K264E))、lxiv)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y/C252S))、lxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S/K264E))、lxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S))、lxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D))、lxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D))、lxix)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N103D/N281D))、lxx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D))、lxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N281D))、lxxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200D/N281D))、lxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p50(N103D/N113D/N200D))、lxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D/N281D))、lxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D/N281D))、lxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D/N281D))、lxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q))、lxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q))、lxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q))、lxxx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N281Q))、lxxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q))、lxxxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q))、lxxxiii)SEQID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N281Q))、lxxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q))、lxxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N281Q))、lxxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q/N281Q))、lxxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q))、lxxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N281Q))、lxxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q/N281Q))、xc)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q/N281Q))、xci)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q/N281Q))、xcii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K/K99E))、xciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34K/E59K/K99E))、xciv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32Q/D34N/E59K/K99E))、xcv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32K/D34N/E59K/K99E))、xcvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99Y))、xcvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E))、xcviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E))、xcix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E))、c)SEQID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E))、ci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E))、cii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E))、ciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E))、civ)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E))、cv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E))、cvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E))、cvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E))、cviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))、和cix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，所述IL-12p35亚基具有一个或多个氨基酸取代作为选自由以下组成的组的氨基酸残基：Q20、N21、Q35、E38、S44、E45、E46、H49、K54、D55、T59、V60、E61、C63、L64、P65、E67、L68、N71、S73、C74、L75、N76、E79、N85、L89、F96、M97、L124、M125、Q130、Q135、N136、E143、Q146、N151、E153、K158、E162、E163、D165、I171、R181、I182、R183、V185、T186、D188、R189、V190、S192、Y193、N195和A196。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，所述IL-12p35亚基具有一个或多个选自由以下组成的组的氨基酸取代：N21D、Q35D、E38Q、D55Q、D55K、N71D、N71Q、L75A、N76D、E79Q、N85D、N85Q、L89A、F96A、M97A、L124A、M125A、Q130E、Q135E、N136D、E143Q、Q146E、N151D、N151K、E153K、E153Q、K158E、E162Q、E163Q、D165N、I171A、N195D和N195Q。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，所述IL-12p35亚基具有一个或多个选自由以下组成的组的氨基酸取代：N21D/N151D、D55Q/N151D、N71D/N85D、N71D/N85D/N195D、N71D/N195D、N71Q/N85Q、N71Q/N85Q/N195Q、N71Q/N195Q、E79Q/N151D、N85D/N195D、N85Q/N195Q、Q130E/N151D、N136D/N151D、E143Q/N151D、N151D/E153Q、N151D/D165N和N151D/K158E。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，所述IL-12p35亚基具有一个或多个选自由以下组成的组的多肽序列：i)SEQ ID NO:113(IL-12p35(N71D))、ii)SEQ ID NO:114(IL-12p35(N85D))、iii)SEQ ID NO:115(IL-12p35(N195D))、iv)SEQ ID NO:116(IL-12p35(N71D/N85D/N195D))、v)SEQ ID NO:117(IL-12p35(E153Q))、vi)SEQ ID NO:118(IL-12p35(E38Q))、vii)SEQ ID NO:119(IL-12p35(N151D))、viii)SEQ ID NO:120(IL-12p35(Q135E))、ix)SEQ ID NO:121(IL-12p35(Q35D))、x)SEQ IDNO:122(IL-12p35(Q146E))、xi)SEQ ID NO:123(IL-12p35(N76D))、xii)SEQ ID NO:124(IL-12p35(E162Q))、xiii)SEQ ID NO:125(IL-12p35(E163Q))、xiv)IL-12p35(N21D)、xv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))、xvi)IL-12p35(E79Q)、xvii)IL-12p35(Q130E)、xviii)IL-12p35(N136D)、xix)IL-12p35(E143Q)、xx)SEQ ID NO:227(IL-12p35(N151K))、xxi)SEQID NO:226(IL-12p35(E153K))、xxii)IL-12p35(K158E)、xxiii)IL-12p35(D165N)、xxiv)SEQ ID NO:225(IL-12p35(N151D/E153Q))、xxv)SEQ ID NO:228(IL-12p35(N151D/D165N))、xxvi)SEQ ID NO:229(IL-12p35(Q130E/N151D))、xxvii)SEQ ID NO:230(IL-12p35(N151D/K158E))、xxviii)SEQ ID NO:231(IL-12p35(E79Q/N151D))、xxix)SEQ IDNO:232(IL-12p35(D55Q/N151D))、xxx)SEQ ID NO:233(IL-12p35(N136D/N151D))、xxxi)SEQ ID NO:234(IL-12p35(N21D/N151D))、xxxii)SEQ ID NO:235(IL-12p35(E143Q/N151D))、xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(F96A))、xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M97A))、xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L89A))、xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L124A))、xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M125A))、xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L75A))、xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(I171A))、xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q))、xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q))、xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N195Q))、xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q))、xxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N195Q))、xl)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q/N195Q)、xli)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q/N195Q))、xlii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71D/N85D))、xliii)SEQID NO:XXX(IL-12p35(N71D/N195D)、xliv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85D/N195D))、xlv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))和xlvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55K))。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，促进所述第一和所述第二Fc结构域的异源二聚化的所述修饰是选自由以下组成的组的一组氨基酸取代：根据EU编号，L368D/K370S和S364K；L368D/K370S和S364K/E357L；L368D/K370S和S364K/E357Q；T411E/K360E/Q362E和D401K；L368E/K370S和S364K；K370S和S364K/E357Q；T366S/L368A/Y407V和T366W和T366S/L368A/Y407V/Y349C和T366W/S354C。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，所述第一和/或所述第二变体Fc结构域具有包括根据EU编号的Q295E/N384D/Q418E/N421D的另外一组氨基酸取代。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，所述第一和/或所述第二变体Fc结构域具有由以下组成的另一组氨基酸取代：根据EU编号，G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del和E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，根据EU编号，所述第一和所述第二变体Fc结构域各自包含氨基酸取代M428L/N434S。
25.一种包含根据权利要求1至24中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白的组合物，其用于治疗受试者的癌症。
26.一种或多种核酸，其编码根据权利要求1至24中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白。
27.一种宿主细胞，其包含根据权利要求26所述的一种或多种核酸。
28.一种制备靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白的方法，所述方法包括在产生所述靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白的条件下培养根据权利要求27所述的宿主细胞。
29.一种纯化根据权利要求1至24中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白的方法，所述方法包括：
a)提供包含所述靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白的组合物；
b)将所述组合物上样到离子交换柱上；以及
c)收集含有所述靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白的级分。
30.一种靶向IL-12Fc异源二聚体融合蛋白，其包含：
a)第一单体，其从N末端至C末端包含：
i)第一IL-12蛋白质结构域；
ii)第一结构域接头；
iii)第二IL-12蛋白质结构域；和
iv)第一变体Fc结构域；
b)第二单体，其包含含有VH-CH1-铰链-CH2-CH3的重链，其中所述CH2-CH3是第二变体Fc结构域；和
c)第三单体，其包含含有VL-CL的轻链；
其中，所述VH和VL结构域形成结合靶抗原的抗原结合结构域；
其中，所述第一IL-12蛋白质结构域包含IL-12p35亚基并且所述第二IL-12蛋白质结构域包含IL-12p40亚基，或者所述第一IL-12蛋白质结构域包含IL-12p40亚基并且所述第二IL-12蛋白质结构域包含IL-12p35亚基，以及
其中，所述第一和所述第二Fc结构域包含促进所述第一和第二变体Fc结构域异源二聚化的修饰。
31.根据权利要求30所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，所述抗原结合结构域结合选自由人PD-1和人PD-L1组成的组的靶抗原。
32.根据权利要求30或31所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，所述抗原结合结构域结合人PD-1。
33.根据权利要求32所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，所述抗原结合结构域包含选自由以下组成的组的VH结构域和VL结构域：(a)1C11[PD-1]_H0L0(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(b)1C11[PD-1]_H3L3(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(c)1C11[PD-1]_H3.240_L3.148(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(d)1C11[PD-1]_H3.241_L3.148(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(e)1C11[PD-1]_H3.234_L3.144(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(f)1C11[PD-1]_H3.241_L3.92(SEQID NOS:XXX和XXX)、(g)1C11[PD-1]_H3.303_L3.152(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(h)1C11[PD-1]_H3.329_L3.220(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(i)1C11[PD-1]_H3.329_L3.220(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(j)1C11[PD-1]_H3.328_L3.152(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(k)派姆单抗[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(l)尼沃利珠单抗(nivolizumab)[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(m)皮地利珠单抗[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(n)MK-3475[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(o)BAP049克隆E[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(p)BAP049克隆B[PD-1](SEQID NOS:XXX和XXX)、(q)H7709N[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(r)H7798N[PD-1](SEQ IDNOS:XXX和XXX)、(s)h1H3 Var 6[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(t)APE2058[PD-1](SEQID NOS:XXX和XXX)、(u)H005-1[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(v)317-4B6[PD-1](SEQ IDNOS:XXX和XXX)、(w)326-4A3[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(x)hPD-1mAb 7[PD-1](SEQID NOS:XXX和XXX)、(y)克隆38[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(z)克隆39[PD-1](SEQ IDNOS:XXX和XXX)、(aa)克隆41[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ab)克隆48[PD-1](SEQ IDNOS:XXX和XXX)、(ac)PD1-17[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ad)PD1-28[PD-1](SEQ IDNOS:XXX和XXX)、(ae)PD1-33[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(af)PD1-35[PD-1](SEQ IDNOS:XXX和XXX)、(ag)LOPD180[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ah)Ab948[PD-1](SEQ IDNOS:XXX和XXX)、(ai)人源化EH-12.2H7[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(aj)RG1H10[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ak)RG1H10-H2A-22-1S[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(al))RG1H10-H2A-27-2S[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(am)RG1H10-3C[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(an)RG1H10-16C[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ao)RG1H10-17C[PD-1](SEQID NOS:XXX和XXX)、(ap)RG1H10-19C[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(aq)RG1H10-21C[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ar)RG1H10-23C2[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)和(as)mAB7[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)。
34.根据权利要求30或31所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，所述抗原结合结构域结合人PD-1并且不与纳武单抗和/或派姆单抗竞争所述人PD-1。
35.根据权利要求34所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中
(1)所述抗原结合结构域包含选自由以下组成的组的VH结构域和VL结构域：(i)mAb A[PD-1]_H1L1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ii)mAb B[PD-1]_H1L1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(iii)mAb C[PD-1]_H1L1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)和(iv)mAb C[PD-1]_H1.19L1(SEQ IDNOS:XXX和XXX)，或
(2)所述抗原结合结构域包含：选自由以下组成的组的VH结构域：(a)mAb C[PD-1]_H1(SEQ ID NO:XXX)、(b)mAb C[PD-1]_H1.19(SEQ ID NO:XXX)、(c)mAb C[PD-1]_H1.48(SEQID NO:XXX)、(d)mAb C[PD-1]_H1.125(SEQ ID NO:XXX)、(e)mAb C[PD-1]_H1.130(SEQ IDNO:XXX)、(f)mAb C[PD-1]_H1.132(SEQ ID NO:XXX)、(g)mAb C[PD-1]_H1.169(SEQ ID NO:XXX)、(h)mAb C[PD-1]_H1.175(SEQ ID NO:XXX)和(i)mAb C[PD-1]_H2(SEQ ID NO:XXX)；和选自由以下组成的组的VL结构域：(a)mAb C[PD-1]_L1(SEQ ID NO:XXX)、(b)mAb C[PD-1]_L1.1(SEQ ID NO:XXX)、(c)mAb C[PD-1]_L1.3(SEQ ID NO:XXX)、(d)mAb C[PD-1]_L1.45(SEQ ID NO:XXX)、(e)mAb C[PD-1]_L1.117(SEQ ID NO:XXX)、(f)mAb C[PD-1]_L1.129(SEQ ID NO:XXX)、(g)mAb C[PD-1]_L1.135(SEQ ID NO:XXX)、(h)mAb C[PD-1]_L1.136(SEQ ID NO:XXX)、(i)mAb C[PD-1]_L1.140(SEQ ID NO:XXX)和(j)mAb C[PD-1]_L2(SEQ ID NO:XXX)。
36.根据权利要求30或31所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，所述抗原结合结构域结合人PD-L1。
37.根据权利要求36所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，所述抗原结合结构域包含选自由以下组成的组的VH结构域和VL结构域：YW243.55.S70(SEQ ID NOS:XXX和XXX)，(a)杜瓦鲁单抗(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(b)阿特珠单抗(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(c)A09-246-2(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(d)12A4(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(e)3G10(SEQ IDNOS:XXX和XXX)、(f)10A5(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(f)h3D10 Var 1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(g)h3D10 Var 2(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(h)h3D10 Var 3(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(i)h3D10 Var 4(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(j)h3D10 Var 5(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(k)h3D10 Var 6(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(l)h3D10 Var 7(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(m)h3D10Var 8(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(n)h3D10 Var 9(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(o)h3D10 Var10(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(p)h3D10 Var 11(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(q)h3D10 Var 12(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(r)h3D10 Var 13(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(s)h3D10 Var 14(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(t)Antibody A(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(u)C5H9v2(SEQ IDNOS:XXX和XXX)、(v)人源化29E.2A3(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(w)1B9(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(x)4H1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(y)mAb-42(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(z)BAP058-03(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(aa)BAP058-04(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ab)BAP058-06(SEQ IDNOS:XXX和XXX)、(ac)BAP058-07(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ad)BAP058-11(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ae)BAP058-13(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(af)H6(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ag)RC5(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ah)SH1A1Q(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ai)SH1B3(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(aj)SH1D1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ak)SH1D2(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(al)SH1D12(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(am)SH1E1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(an)SH1G9(SEQ IDNOS:XXX和XXX)、(ao)SH1E6(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ap)SH1A2(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(aq)SH1B1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ar)H6B1L(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(as)H6A1(SEQ IDNOS:XXX和XXX)、(at)H6B1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(au)H6B2(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(av)G12(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(aw)RSA1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ax)RA3(SEQ IDNOS:XXX和XXX)、(ay)SH1E2(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(az)SH1E4(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ba)SH1B1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(bb)SH1C8(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(bc)H1H9364P2(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(bd)H1H9373P2(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(be)H1H8314N(SEQ IDNOS:XXX和XXX)和(bf)PDL1.3(SEQ ID NOS:XXX和XXX)。
38.根据权利要求30至37中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，所述IL-12p40亚基具有与选自由以下组成的组的多肽序列至少90％的同一性：SEQ ID NO:3(人IL-12亚基β(IL-12p40)前体序列)和SEQ ID NO:4(人IL-12亚基β(IL-12p40)成熟形式序列)，以及所述IL-12p35亚基具有与选自由以下组成的组的多肽序列至少90％的同一性：SEQ ID NO:1(人IL-12亚基α(IL-12p35)前体序列)和SEQ ID NO:2(人IL-12亚基α(IL-12p35)成熟形式序列)。
39.根据权利要求30至38中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，所述IL-12p40亚基是变体IL-12p40亚基和/或所述IL-12p35亚基是变体IL-12p35亚基。
40.根据权利要求30至39中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，所述IL-12p40亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p40亚基；和/或所述IL-12p35亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p35亚基。
41.根据权利要求30至40中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，所述IL-12p40亚基具有在选自由以下组成的组的氨基酸残基上的一个或多个氨基酸取代：E59、K99、D18、K264、C252、N200、E3、D7、E12、D14、W15、P17、A19、P20、G21、E22、M23、D29、E32、E33、D34、L40、D41、Q42、S43、E45、L47、T54、I55、Q56、K58、F60、G61、D62、Q65、Y66、E73、K84、E86、D87、G88、I89、W90、D93、D97、E100、K102、N103、K104、F106、E110、N113、Y114、D129、D142、Q144、E156、R159、D161、N162、K163、D166、D170、Q172、D174、A176、C177、P178、A179、A180、E181、S183、P185、E187、S204、F206、R208、D209、D214、N218、Q220、N226、Q229、E231、E235、T242、P243、S245、Y246、F247、S248、Q256、K258、K260、E262、D265、D270、N281、Q289、D290、R291、Y292、Y293和E299。
42.根据权利要求30至41中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，所述IL-12p40亚基具有一个或多个选自由以下组成的组的氨基酸取代：E59K、K99E、K99Y、D18K、K264E、C252S、N200Q、D18N、E32Q、E33Q、D34K、D34N、Q42E、S43E、S43K、E45Q、Q56E、E59Q、D62N、E73Q、D87N、E100Q、N103D、N103Q、N113D、N113Q、Q144E、R159E、D161N、K163E、E187Q、N200D、N218Q、Q229E、E235Q、Q256N、K258E、K260E、E262Q、N281D、N281Q和E299Q。
43.根据权利要求30至42中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的氨基酸取代：E59K/K99E、E59K/K99Y、D18K/E59K/K99E、E59K/K99E/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、E59K/K99E/C252S、E59K/K99Y/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S、E59K/K99E/C252S/K264E、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q、E59K/K99Y/N200Q、D18K/E59K/K99E/N200Q、E59K/K99E/N200Q/K264E、D18K/E59K/K99E/N200Q/K264E、E59K/K99E/N200Q/C252S、E59K/K99Y/N200Q/C252S、D18K/E59K/K99E/N200Q/C252S、E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、D18K/E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、D18K/E59K/K99E/C252S、E32K/D34N/E59K/K99E、E32Q/D34N/E59K/K99E、D34K/E59K/K99E、D34N/E59K、D34N/E59K/K99E、Q42E/E45Q、Q42E/E59Q、Q42E/Q56E/E59Q、E32Q/E59Q、D34N/E59Q、S43E/E59Q、S43K/E49Q、E45K/E59K/K99E、E45Q/Q56E、E45Q/Q56E/E59Q、E59Q/E187Q、E59Q/K163E、E59Q/K99E、E59Q/K258E、E59Q/K260E、E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E、E59K/K99E/Q144E、E59K/K99E/Q144K、E59K/K99E/R159E、E59K/K99Y、E59Y/K99E、E59Y/K99Y、E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、N103D/N113D、N103D/N113D/N200D、N103D/N113D/N281D、N103D/N200D、N103D/N200D/N281D、N103D/N281D、N103D/N113D/N200D/N281D、N103Q/N113Q、N103Q/N113Q/N200Q、N103Q/N113Q/N281Q、N103Q/N200Q、N103Q/N200Q/N281Q、N103Q/N281Q、N113D/N200D、N113D/N200D/N281D、N113D/N281D、N113Q/N200Q、N113Q/N281Q、N113Q/N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q/N281Q、N200D/N281D和N200Q/N281Q。
44.根据权利要求30至43中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，所述变体IL-12p40亚基包含选自由以下组成的组的氨基酸取代：E59K/K99E、E59K/K99Y、D18K/E59K/K99E、E59K/K99E/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、E59K/K99E/C252S、E59K/K99Y/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S、E59K/K99E/C252S/K264E、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q、E59K/K99Y/N200Q、D18K/E59K/K99E/N200Q、E59K/K99E/N200Q/K264E、D18K/E59K/K99E/N200Q/K264E、E59K/K99E/N200Q/C252S、E59K/K99Y/N200Q/C252S、D18K/E59K/K99E/N200Q/C252S、E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E和D18K/E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E。
45.根据权利要求30-44中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的多肽序列：i)SEQ ID NO:57(IL-12p40(N103D))、ii)SEQ ID NO:58(IL-12p40(N113D))、iii)SEQ ID NO:59(IL-12p40(N200D))、iv)SEQ IDNO:60(IL-12p40(N281D))、v)SEQ ID NO:61(IL-12p40(N103D/N113D/N200D/N281D))、vi)SEQ ID NO:62(IL-12p40(Q42E))、vii)SEQ ID NO:63(IL-12p40(E45Q))、viii)SEQ ID NO:64(IL-12p40(Q56E))、ix)SEQ ID NO:65(IL-12p40(E59Q))、x)SEQ ID NO:66(IL-12p40(D62N))、xi)SEQ ID NO:67(IL-12p40(Q42E/E45Q))、xii)SEQ ID NO:68(IL-12p40(E45Q/Q56E))、xiii)SEQ ID NO:69(IL-12p40(Q42E/E59Q))、xiv)SEQ ID NO:70(IL-12p40(Q56E/E59Q))、xv)SEQ ID NO:71(IL-12p40(Q42E/E45Q/Q56E))、xvi)SEQ ID NO:72(IL-12p40(E45Q/Q56E/E59Q))、xvii)SEQ ID NO:73(IL-12p40(D161N))、xviii)SEQ ID NO:74(IL-12p40(E73Q))、xix)SEQ ID NO:75(IL-12p40(Q144E))、xx)SEQ ID NO:76(IL-12p40(E262Q))、xxi)SEQ ID NO:77(IL-12p40(E100Q))、xxii)SEQ ID NO:78(IL-12p40(D18N))、xxiii)SEQ ID NO:79(IL-12p40(E33Q))、xxiv)SEQ ID NO:80(IL-12p40(Q229E))、xxv)SEQID NO:81(IL-12p40(E235Q))、xxvi)SEQ ID NO:82(IL-12p40(Q256N))、xxvii)SEQ ID NO:83(IL-12p40(E299Q))、xxviii)SEQ ID NO:84(IL-12p40(D87N))、xxix)IL-12p40(E32Q)、xxx)IL-12p40(D34N)、xxxi)IL-12p40(S43E)、xxxii)(L-12p40(S43K)、xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))、xxxiv)SEQ ID NO:205(IL-12p40(E59K))、xxxv)IL-12p40(K99E)、xxxvi)IL-12p40(K163E)、xxxvii)IL-12p40(E187Q)、xxxviii)IL-12p40(K258E)、xxxix)IL-12p40(K260E)、xl)SEQ ID NO:206(IL-12p40(E32Q/E59Q))、xli)SEQ ID NO:207(IL-12p40(D34N/E59Q))、xlii)SEQ ID NO:208(IL-12p40(E59Q/E187Q))、xliii)SEQ ID NO:209(IL-12p40(S43E/E59Q))、xliv)SEQ IDNO:210(IL-12p40(S43K/E49Q))、xlv)SEQ ID NO:211(IL-12p40(E59Q/K163E))、xlvi)SEQID NO:212(IL-12p40(E59Q/K99E))、xlvii)SEQ ID NO:213(IL-12p40(E59Q/K258E))、xlviii)SEQ ID NO:214(IL-12p40(E59Q/K260E))、xlix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K))l)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E))、li)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E))、lii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))、liii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y))、liv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99E))、lv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E45K/E59K/K99E))、lvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144E))、lvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144K))、lviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/R159E))、lix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))、lx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/K264E))、lxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(C252S))、lxii)SEQID NO:XXX(IL-12p40(DI8K/E59K/K99E/C252S))、lxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/C252S/K264E))、lxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y/C252S))、lxv)SEQID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S/K264E))、lxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S))、lxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D))、lxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D))、lxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N281D))、lxx)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D))、lxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N281D))、lxxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200D/N281D))、lxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p50(N103D/N113D/N200D))、lxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D/N281D))、lxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D/N281D))、lxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D/N281D))、lxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q))、lxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q))、lxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q))、lxxx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N281Q))、lxxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q))、lxxxii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q))、lxxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N281Q))、lxxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q))、lxxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N281Q))、lxxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q/N281Q))、lxxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q))、lxxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N281Q))、lxxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q/N281Q))、xc)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q/N281Q))、xci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q/N281Q))、xcii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K/K99E))、xciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34K/E59K/K99E))、xciv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32Q/D34N/E59K/K99E))、xcv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32K/D34N/E59K/K99E))、xcvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99Y))、xcvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E))、xcviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E))、xcix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E))、c)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E))、ci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E))、cii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E))、ciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E))、civ)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E))、cv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E))、cvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E))、cvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E))、cviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))、和cix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))。
46.根据权利要求30至45中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，所述IL-12p35亚基具有一个或多个氨基酸取代作为选自由以下组成的组的氨基酸残基：Q20、N21、Q35、E38、S44、E45、E46、H49、K54、D55、T59、V60、E61、C63、L64、P65、E67、L68、N71、S73、C74、L75、N76、E79、N85、L89、F96、M97、L124、M125、Q130、Q135、N136、E143、Q146、N151、E153、K158、E162、E163、D165、I171、R181、I182、R183、V185、T186、D188、R189、V190、S192、Y193、N195和A196。
47.根据权利要求30至46中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，所述IL-12p35亚基具有一个或多个选自由以下组成的组的氨基酸取代：N21D、Q35D、E38Q、D55Q、D55K、N71D、N71Q、L75A、N76D、E79Q、N85D、N85Q、L89A、F96A、M97A、L124A、M125A、Q130E、Q135E、N136D、E143Q、Q146E、N151D、N151K、E153K、E153Q、K158E、E162Q、E163Q、D165N、I171A、N195D和N195Q。
48.根据权利要求30至47中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，所述IL-12p35亚基具有一个或多个选自由以下组成的组的氨基酸取代：N21D/N151D、D55Q/N151D、N71D/N85D、N71D/N85D/N195D、N71D/N195D、N71Q/N85Q、N71Q/N85Q/N195Q、N71Q/N195Q、E79Q/N151D、N85D/N195D、N85Q/N195Q、Q130E/N151D、N136D/N151D、E143Q/N151D、N151D/E153Q、N151D/D165N和N151D/K158E。
49.根据权利要求30至48中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有一个或多个选自由以下组成的组的多肽序列：i)SEQ ID NO:113(IL-12p35(N71D))、ii)SEQ ID NO:114(IL-12p35(N85D))、iii)SEQ ID NO:115(IL-12p35(N195D))、iv)SEQ ID NO:116(IL-12p35(N71D/N85D/N195D))、v)SEQ ID NO:117(IL-12p35(E153Q))、vi)SEQ ID NO:118(IL-12p35(E38Q))、vii)SEQ ID NO:119(IL-12p35(N151D))、viii)SEQ ID NO:120(IL-12p35(Q135E))、ix)SEQ ID NO:121(IL-12p35(Q35D))、x)SEQ IDNO:122(IL-12p35(Q146E))、xi)SEQ ID NO:123(IL-12p35(N76D))、xii)SEQ ID NO:124(IL-12p35(E162Q))、xiii)SEQ ID NO:125(IL-12p35(E163Q))、xiv)IL-12p35(N21D)、xv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))、xvi)IL-12p35(E79Q)、xvii)IL-12p35(Q130E)、xviii)IL-12p35(N136D)、xix)IL-12p35(E143Q)、xx)SEQ ID NO:227(IL-12p35(N151K))、xxi)SEQID NO:226(IL-12p35(E153K))、xxii)IL-12p35(K158E)、xxiii)IL-12p35(D165N)、xxiv)SEQ ID NO:225(IL-12p35(N151D/E153Q))、xxv)SEQ ID NO:228(IL-12p35(N151D/D165N))、xxvi)SEQ ID NO:229(IL-12p35(Q130E/N151D))、xxvii)SEQ ID NO:230(IL-12p35(N151D/K158E))、xxviii)SEQ ID NO:231(IL-12p35(E79Q/N151D))、xxix)SEQ IDNO:232(IL-12p35(D55Q/N151D))、xxx)SEQ ID NO:233(IL-12p35(N136D/N151D))、xxxi)SEQ ID NO:234(IL-12p35(N21D/N151D))、xxxii)SEQ ID NO:235(IL-12p35(E143Q/N151D))、xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(F96A))、xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M97A))、xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L89A))、xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L124A))、xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M125A))、xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L75A))、xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(I171A))、xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q))、xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q))、xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N195Q))、xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q))、xxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N195Q))、xl)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q/N195Q)、xli)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q/N195Q))、xlii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71D/N85D))、xliii)SEQID NO:XXX(IL-12p35(N71D/N195D)、xliv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85D/N195D))、xlv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))和xlvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55K))。
50.根据权利要求30至49中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，促进所述第一和所述第二变体Fc结构域的异源二聚化的所述修饰是选自由以下组成的组的一组氨基酸取代：根据EU编号，L368D/K370S和S364K；L368D/K370S和S364K/E357L；L368D/K370S和S364K/E357Q；T411E/K360E/Q362E和D401K；L368E/K370S和S364K；K370S和S364K/E357Q；和T366S/L368A/Y407V和T366W(任选包括二硫桥键，T366S/L368A/Y407V/Y349C和T366W/S354C)。
51.根据权利要求30至50中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，所述第一和/或所述第二变体Fc结构域包含包括根据EU编号的Q295E/N384D/Q418E/N421D的另外一组氨基酸取代。
52.根据权利要求30至51中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，所述第一和/或所述第二变体Fc结构域包含选自由以下组成的组的另一组氨基酸取代：根据EU编号，G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del和E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。
53.根据权利要求30至52中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，根据EU编号，所述第一和所述第二变体Fc结构域各自包含氨基酸取代M428L/N434S。
54.根据权利要求30至53中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，所述融合蛋白选自由以下组成的组：XENP28792、XENP28793、XENP28794、XENP28796、XENP31073、XENP31074、XENP31106、XENP31136、XENP31137、XENP31140、XENP31460、XENP31461、XENP31462、XENP31585、XENP31586、XENP32192、XENP32193、XENP32194、XENP32195、XENP31108、XENP31463、XENP31464、XENP31465、XENP33686、XENP33687、XENP33693、XENP33694、XENP33695、XENP33696、XENP33697、XENP33685、XENP33688、XENP33689、XENP33690、XENP33691、XENP33692和任何在图80A-80H、81A-81B、82A-82H、98A-B、99A-B、100A-100D、101A-101D、102A-102D、103A-103D、104A-104D、105A-105D、106、107A-107B、108A-108D、109A-109D、110A-110D、111A-111D、112A-112D、113A-113D、114A-114B、115A-115D、116A-116D、117A-117D、118A-118D、119A-119D、120A-120D和121A-121D中所述描绘的。
55.一种包含根据权利要求30至54中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白的组合物，其用于治疗受试者的癌症。
56.一种或多种核酸，其编码根据权利要求30至54中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白。
57.一种宿主细胞，其包含根据权利要求56所述的一种或多种核酸。
58.一种制备靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白的方法，所述方法包括在产生所述靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白的条件下培养根据权利要求57所述的宿主细胞。
59.一种纯化根据权利要求30至54中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白的方法，所述方法包括：
a)提供包含所述靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白的组合物；
b)将所述组合物上样到离子交换柱上；以及
c)收集含有所述靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白的级分。
60.一种靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其包含：
a)第一单体，其从N末端至C末端包含：含有VH-CH1-铰链-CH2-CH3的重链，其中所述CH2-CH3是第一变体Fc结构域；
b)第二单体，其从N末端到C末端包含：VH-CH1-铰链-CH2-CH3-结构域接头-第一IL-12蛋白质结构域-结构域接头-第二IL-12蛋白质结构域，其中所述CH2-CH3是第二个变体Fc结构域；和
c)第三单体，其从N末端到C末端包含：含有VL-CL的轻链；
其中，所述VH和VL结构域形成结合靶抗原的抗原结合结构域，
其中，所述第一IL-12蛋白质结构域包含IL-12p35亚基并且所述第二IL-12蛋白质结构域包含IL-12p40亚基，或者所述第一IL-12蛋白质结构域包含IL-12p40亚基并且所述第二IL-12蛋白质结构域包含IL-12p35亚基，以及
其中，所述第一和所述第二Fc结构域包含促进所述第一和第二变体Fc结构域异源二聚化的修饰。
61.一种靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其包含：
a)第一单体，其从N末端至C末端包含：VH-CH1-结构域接头-IL-12p35亚基-任选结构域接头-CH2-CH3，其中所述CH2-CH3是第一变体Fc结构域；
b)第二单体，其从N末端到C末端包含：含VH-CH1-第一结构域接头-IL-12p40亚基-任选结构域接头-CH2-CH3，其中所述CH2-CH3是第二变体Fc结构域；和
c)第三单体，其从N末端到C末端包含：含有VL-CL的轻链；
其中，所述VH和VL结构域形成结合靶抗原的抗原结合结构域，并且其中所述第一和所述第二变体Fc结构域包含促进所述第一和第二变体Fc结构域异源二聚化的修饰。
62.一种靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其包含：
a)第一单体，其从N末端至C末端包含：VH-CH1-结构域接头-第一IL-12蛋白质结构域-结构域接头-第二IL-12蛋白质结构域-结构域接头-CH2-CH3，其中所述CH2-CH3是第一变体Fc结构域；
b)第二单体，其从N末端到C末端包含：含VH-CH1-铰链-CH2-CH3的重链，其中所述CH2-CH3是第二变体Fc结构域；和
c)第三单体，其从N末端到C末端包含：含有VL-CL的轻链；
其中，所述VH和VL结构域形成结合靶抗原的抗原结合结构域，
其中，所述第一IL-12蛋白质结构域包含IL-12p35亚基并且所述第二IL-12蛋白质结构域包含IL-12p40亚基，或者所述第一IL-12蛋白质结构域包含IL-12p40亚基并且所述第二IL-12蛋白质结构域包含IL-12p35亚基，以及
其中，所述第一和所述第二Fc结构域包含促进所述第一和第二变体Fc结构域异源二聚化的修饰。
63.根据权利要求60至62中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，所述抗原结合结构域结合选自由人PD-1和人PD-L1组成的组的靶抗原。
64.根据权利要求63所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，所述抗原结合结构域结合人PD-1。
65.根据权利要求64所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，所述抗原结合结构域包含选自由以下组成的组的VH结构域和VL结构域：(a)1C11[PD-1]_H0L0(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(b)1C11[PD-1]_H3L3(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(c)1C11[PD-1]_H3.240_L3.148(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(d)1C11[PD-1]_H3.241_L3.148(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(e)1C11[PD-1]_H3.234_L3.144(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(f)1C11[PD-1]_H3.241_L3.92(SEQID NOS:XXX和XXX)、(g)1C11[PD-1]_H3.303_L3.152(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(h)1C11[PD-1]_H3.329_L3.220(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(i)1C11[PD-1]_H3.329_L3.220(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(j)1C11[PD-1]_H3.328_L3.152(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(k)派姆单抗[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(l)尼沃利珠单抗[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(m)皮地利珠单抗[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(n)MK-3475[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(o)BAP049克隆E[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(p)BAP049克隆B[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(q)H7709N[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(r)H7798N[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(s)h1H3 Var 6[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(t)APE2058[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(u)H005-1[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(v)317-4B6[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(w)326-4A3[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(x)hPD-1mAb 7[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(y)克隆38[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(z)克隆39[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(aa)克隆41[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ab)克隆48[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ac)PD1-17[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ad)PD1-28[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ae)PD1-33[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(af)PD1-35[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ag)LOPD180[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ah)Ab948[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ai)人源化EH-12.2H7[PD-1](图70E和图70F的SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(aj)RG1H10[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ak)RG1H10-H2A-22-1S[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(al))RG1H10-H2A-27-2S[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(am)RG1H10-3C[PD-1](SEQ IDNOS:XXX和XXX)、(an)RG1H10-16C[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ao)RG1H10-17C[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ap)RG1H10-19C[PD-1](图70G的SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(aq)RG1H10-21C[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ar)RG1H10-23C2[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)和(as)mAB7[PD-1](SEQ ID NOS:XXX和XXX)。
66.根据权利要求63所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，所述抗原结合结构域结合人PD-1并且不与纳武单抗和/或派姆单抗竞争所述人PD-1。
67.根据权利要求66所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中
(1)所述抗原结合结构域包含选自由以下组成的组的VH结构域和VL结构域：(i)mAb A[PD-1]_H1L1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ii)mAb B[PD-1]_H1L1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(iii)mAb C[PD-1]_H1L1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)和(iv)mAb C[PD-1]_H1.19L1(SEQ IDNOS:XXX和XXX)，或
(2)所述抗原结合结构域包括：
选自由以下组成的组的VH结构域：(a)mAb C[PD-1]_H1(SEQ ID NO:XXX)、(b)mAb C[PD-1]_H1.19(SEQ ID NO:XXX)、(c)mAb C[PD-1]_H1.48(SEQ ID NO:XXX)、(d)mAb C[PD-1]_H1.125(SEQ ID NO:XXX)、(e)mAb C[PD-1]_H1.130(SEQ ID NO:XXX)、(f)mAb C[PD-1]_H1.132(SEQ ID NO:XXX)、(g)mAb C[PD-1]_H1.169(SEQ ID NO:XXX)、(h)mAb C[PD-1]_H1.175(SEQ ID NO:XXX)、(i)mAb C[PD-1]_H2(SEQ ID NO:XXX)；和
选自由以下组成的组的VL结构域：(a)mAb C[PD-1]_L1(SEQ ID NO:XXX)、(b)mAb C[PD-1]_L1.1(SEQ ID NO:XXX)、(c)mAb C[PD-1]_L1.3(SEQ ID NO:XXX)、(d)mAb C[PD-1]_L1.45(SEQ ID NO:XXX)、(e)mAb C[PD-1]_L1.117(SEQ ID NO:XXX)、(f)mAb C[PD-1]_L1.129(SEQ ID NO:XXX)、(g)mAb C[PD-1]_L1.135(SEQ ID NO:XXX)、(h)mAb C[PD-1]_L1.136(SEQ ID NO:XXX)、(i)mAb C[PD-1]_L1.140(SEQ ID NO:XXX)和(j)mAb C[PD-1]_L2(SEQ ID NO:XXX)。
68.根据权利要求63所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，所述抗原结合结构域结合人PD-L1。
69.根据权利要求68所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，所述抗原结合结构域包含选自由以下组成的组的VH结构域和VL结构域：(a)杜瓦鲁单抗(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(b)阿特珠单抗(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(c)A09-246-2(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(d)12A4(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(e)3G10(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(f)10A5(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(f)h3D10 Var 1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(g)h3D10 Var 2(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(h)h3D10 Var 3(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(i)h3D10 Var 4(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(j)h3D10 Var 5(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(k)h3D10 Var 6(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(l)h3D10 Var 7(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(m)h3D10 Var 8(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(n)h3D10Var 9(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(o)h3D10 Var 10(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(p)h3D10 Var11(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(q)h3D10 Var 12(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(r)h3D10 Var 13(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(s)h3D10 Var 14(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(t)Antibody A(SEQID NOS:XXX和XXX)、(u)C5H9v2(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(v)人源化29E.2A3(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(w)1B9(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(x)4H1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(y)mAb-42(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(z)BAP058-03(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(aa)BAP058-04(SEQ IDNOS:XXX和XXX)、(ab)BAP058-06(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ac)BAP058-07(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ad)BAP058-11(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ae)BAP058-13(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(af)H6(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ag)RC5(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ah)SH1A1Q(SEQ IDNOS:XXX和XXX)、(ai)SH1B3(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(aj)SH1D1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ak)SH1D2(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(al)SH1D12(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(am)SH1E1(SEQID NOS:XXX和XXX)、(an)SH1G9(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ao)SH1E6(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ap)SH1A2(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(aq)SH1B1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ar)H6B1L(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(as)H6A1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(at)H6B1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(au)H6B2(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(av)G12(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(aw)RSA1(SEQID NOS:XXX和XXX)、(ax)RA3(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ay)SH1E2(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(az)SH1E4(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(ba)SH1B1(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(bb)SH1C8(SEQID NOS:XXX和XXX)、(bc)H1H9364P2(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(bd)H1H9373P2(SEQ ID NOS:XXX和XXX)、(be)H1H8314N(SEQ ID NOS:XXX和XXX)和(bf)PDL1.3(SEQ ID NOS:XXX和XXX)。
70.根据权利要求60至69中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，所述IL-12p40亚基具有与选自由以下组成的组的多肽序列至少90％的序列同一性：SEQ IDNO:3(人IL-12亚基β(IL-12p40)前体序列)和SEQ ID NO:4(人IL-12亚基β(IL-12p40)成熟形式序列)，以及所述IL-12p35亚基具有与选自由以下组成的组的多肽序列至少90％的序列同一性：SEQ ID NO:1(人IL-12亚基α(IL-12p35)前体序列)和SEQ ID NO:2(人IL-12亚基α(IL-12p35)成熟形式序列)。
71.根据权利要求60至70中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，所述IL-12p40亚基是变体IL-12p40亚基和/或所述IL-12p35亚基是变体IL-12p35亚基。
72.根据权利要求60至71中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，所述IL-12p40亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p40亚基；和/或所述IL-12p35亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p35亚基。
73.根据权利要求60至72中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，所述IL-12p40亚基包含在选自由以下组成的组的氨基酸残基上的一个或多个氨基酸取代：E59、K99、D18、K264、C252、N200、E3、D7、E12、D14、W15、P17、A19、P20、G21、E22、M23、D29、E32、E33、D34、L40、D41、Q42、S43、E45、L47、T54、I55、Q56、K58、F60、G61、D62、Q65、Y66、E73、K84、E86、D87、G88、I89、W90、D93、D97、E100、K102、N103、K104、F106、E110、N113、Y114、D129、D142、Q144、E156、R159、D161、N162、K163、D166、D170、Q172、D174、A176、C177、P178、A179、A180、E181、S183、P185、E187、S204、F206、R208、D209、D214、N218、Q220、N226、Q229、E231、E235、T242、P243、S245、Y246、F247、S248、Q256、K258、K260、E262、D265、D270、N281、Q289、D290、R291、Y292、Y293和E299。
74.根据权利要求60至73中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，所述IL-12p40亚基包含一个或多个选自由以下组成的组的氨基酸取代：E59K、K99E、K99Y、D18K、K264E、C252S、N200Q、D18N、E32Q、E33Q、D34K、D34N、Q42E、S43E、S43K、E45Q、Q56E、E59Q、D62N、E73Q、D87N、E100Q、N103D、N103Q、N113D、N113Q、Q144E、R159E、D161N、K163E、E187Q、N200D、N218Q、Q229E、E235Q、Q256N、K258E、K260E、E262Q、N281D、N281Q和E299Q。
75.根据权利要求60至74中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，所述IL-12p40亚基包含选自由以下组成的组的氨基酸取代：E59K/K99E、E59K/K99Y、D18K/E59K/K99E、E59K/K99E/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、E59K/K99E/C252S、E59K/K99Y/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S、E59K/K99E/C252S/K264E、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q、E59K/K99Y/N200Q、D18K/E59K/K99E/N200Q、E59K/K99E/N200Q/K264E、D18K/E59K/K99E/N200Q/K264E、E59K/K99E/N200Q/C252S、E59K/K99Y/N200Q/C252S、D18K/E59K/K99E/N200Q/C252S、E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、D18K/E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、D18K/E59K/K99E/C252S、E32K/D34N/E59K/K99E、E32Q/D34N/E59K/K99E、D34K/E59K/K99E、D34N/E59K、D34N/E59K/K99E、Q42E/E45Q、Q42E/E59Q、Q42E/Q56E/E59Q、E32Q/E59Q、D34N/E59Q、S43E/E59Q、S43K/E49Q、E45K/E59K/K99E、E45Q/Q56E、E45Q/Q56E/E59Q、E59Q/E187Q、E59Q/K163E、E59Q/K99E、E59Q/K258E、E59Q/K260E、E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E、E59K/K99E/Q144E、E59K/K99E/Q144K、E59K/K99E/R159E、E59K/K99Y、E59Y/K99E、E59Y/K99Y、E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、N103D/N113D、N103D/N113D/N200D、N103D/N113D/N281D、N103D/N200D、N103D/N200D/N281D、N103D/N281D、N103D/N113D/N200D/N281D、N103Q/N113Q、N103Q/N113Q/N200Q、N103Q/N113Q/N281Q、N103Q/N200Q、N103Q/N200Q/N281Q、N103Q/N281Q、N113D/N200D、N113D/N200D/N281D、N113D/N281D、N113Q/N200Q、N113Q/N281Q、N113Q/N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q/N281Q、N200D/N281D和N200Q/N281Q。
76.根据权利要求60至75中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，所述IL-12p40亚基包含选自由以下组成的组的多肽序列：i)SEQ ID NO:57(IL-12p40(N103D))、ii)SEQ ID NO:58(IL-12p40(N113D))、iii)SEQ ID NO:59(IL-12p40(N200D))、iv)SEQ ID NO:60(IL-12p40(N281D))、v)SEQ ID NO:61(IL-12p40(N103D/N113D/N200D/N281D))、vi)SEQ ID NO:62(IL-12p40(Q42E))、vii)SEQ ID NO:63(IL-12p40(E45Q))、viii)SEQ ID NO:64(IL-12p40(Q56E))、ix)SEQ ID NO:65(IL-12p40(E59Q))、x)SEQ IDNO:66(IL-12p40(D62N))、xi)SEQ ID NO:67(IL-12p40(Q42E/E45Q))、xii)SEQ ID NO:68(IL-12p40(E45Q/Q56E))、xiii)SEQ ID NO:69(IL-12p40(Q42E/E59Q))、xiv)SEQ ID NO:70(IL-12p40(Q56E/E59Q))、xv)SEQ ID NO:71(IL-12p40(Q42E/E45Q/Q56E))、xvi)SEQ IDNO:72(IL-12p40(E45Q/Q56E/E59Q))、xvii)SEQ ID NO:73(IL-12p40(D161N))、xviii)SEQID NO:74(IL-12p40(E73Q))、xix)SEQ ID NO:75(IL-12p40(Q144E))、xx)SEQ ID NO:76(IL-12p40(E262Q))、xxi)SEQ ID NO:77(IL-12p40(E100Q))、xxii)SEQ ID NO:78(IL-12p40(D18N))、xxiii)SEQ ID NO:79(IL-12p40(E33Q))、xxiv)SEQ ID NO:80(IL-12p40(Q229E))、xxv)SEQ ID NO:81(IL-12p40(E235Q))、xxvi)SEQ ID NO:82(IL-12p40(Q256N))、xxvii)SEQ ID NO:83(IL-12p40(E299Q))、xxviii)SEQ ID NO:84(IL-12p40(D87N))、xxix)IL-12p40(E32Q)、xxx)IL-12p40(D34N)、xxxi)IL-12p40(S43E)、xxxii)(L-12p40(S43K)、xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))、xxxiv)SEQ ID NO:205(IL-12p40(E59K))、xxxv)IL-12p40(K99E)、xxxvi)IL-12p40(K163E)、xxxvii)IL-12p40(E187Q)、xxxviii)IL-12p40(K258E)、xxxix)IL-12p40(K260E)、xl)SEQ ID NO:206(IL-12p40(E32Q/E59Q))、xli)SEQ ID NO:207(IL-12p40(D34N/E59Q))、xlii)SEQ ID NO:208(IL-12p40(E59Q/E187Q))、xliii)SEQ ID NO:209(IL-12p40(S43E/E59Q))、xliv)SEQ ID NO:210(IL-12p40(S43K/E49Q))、xlv)SEQ ID NO:211(IL-12p40(E59Q/K163E))、xlvi)SEQ ID NO:212(IL-12p40(E59Q/K99E))、xlvii)SEQ IDNO:213(IL-12p40(E59Q/K258E))、xlviii)SEQ ID NO:214(IL-12p40(E59Q/K260E))、xlix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K))l)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E))、li)SEQID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E))、lii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))、liii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y))、liv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99E))、lv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E45K/E59K/K99E))、lvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144E))、lvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144K))、lviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/R159E))、lix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))、lx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/K264E))、lxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(C252S))、lxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(DI8K/E59K/K99E/C252S))、lxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/C252S/K264E))、lxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y/C252S))、lxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S/K264E))、lxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S))、lxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D))、lxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D))、lxix)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N103D/N281D))、lxx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D))、lxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N281D))、lxxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200D/N281D))、lxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p50(N103D/N113D/N200D))、lxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D/N281D))、lxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D/N281D))、lxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D/N281D))、lxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q))、lxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q))、lxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q))、lxxx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N281Q))、lxxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q))、lxxxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q))、lxxxiii)SEQID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N281Q))、lxxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q))、lxxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N281Q))、lxxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q/N281Q))、lxxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q))、lxxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N281Q))、lxxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q/N281Q))、xc)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q/N281Q))、xci)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q/N281Q))、xcii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K/K99E))、xciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34K/E59K/K99E))、xciv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32Q/D34N/E59K/K99E))、xcv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32K/D34N/E59K/K99E))、xcvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99Y))、xcvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E))、xcviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E))、xcix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E))、c)SEQID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E))、ci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E))、cii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E))、ciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E))、civ)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E))、cv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E))、cvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E))、cvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E))、cviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))、和cix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))。
77.根据权利要求60至76中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，所述IL-12p35亚基包含一个或多个氨基酸取代作为选自由以下组成的组的氨基酸残基：Q20、N21、Q35、E38、S44、E45、E46、H49、K54、D55、T59、V60、E61、C63、L64、P65、E67、L68、N71、S73、C74、L75、N76、E79、N85、L89、F96、M97、L124、M125、Q130、Q135、N136、E143、Q146、N151、E153、K158、E162、E163、D165、I171、R181、I182、R183、V185、T186、D188、R189、V190、S192、Y193、N195和A196。
78.根据权利要求60至77中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，所述IL-12p35亚基包含一个或多个选自由以下组成的组的氨基酸取代：N21D、Q35D、E38Q、D55Q、D55K、N71D、N71Q、L75A、N76D、E79Q、N85D、N85Q、L89A、F96A、M97A、L124A、M125A、Q130E、Q135E、N136D、E143Q、Q146E、N151D、N151K、E153K、E153Q、K158E、E162Q、E163Q、D165N、I171A、N195D和N195Q。
79.根据权利要求60至78中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，所述IL-12p35亚基包含一个或多个选自由以下组成的组的氨基酸取代：N21D/N151D、D55Q/N151D、N71D/N85D、N71D/N85D/N195D、N71D/N195D、N71Q/N85Q、N71Q/N85Q/N195Q、N71Q/N195Q、E79Q/N151D、N85D/N195D、N85Q/N195Q、Q130E/N151D、N136D/N151D、E143Q/N151D、N151D/E153Q、N151D/D165N和N151D/K158E。
80.根据权利要求60至79中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基包含一个或多个选自由以下组成的组的多肽序列：i)SEQ ID NO:113(IL-12p35(N71D))、ii)SEQ ID NO:114(IL-12p35(N85D))、iii)SEQ ID NO:115(IL-12p35(N195D))、iv)SEQ ID NO:116(IL-12p35(N71D/N85D/N195D))、v)SEQ ID NO:117(IL-12p35(E153Q))、vi)SEQ ID NO:118(IL-12p35(E38Q))、vii)SEQ ID NO:119(IL-12p35(N151D))、viii)SEQ ID NO:120(IL-12p35(Q135E))、ix)SEQ ID NO:121(IL-12p35(Q35D))、x)SEQ IDNO:122(IL-12p35(Q146E))、xi)SEQ ID NO:123(IL-12p35(N76D))、xii)SEQ ID NO:124(IL-12p35(E162Q))、xiii)SEQ ID NO:125(IL-12p35(E163Q))、xiv)IL-12p35(N21D)、xv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))、xvi)IL-12p35(E79Q)、xvii)IL-12p35(Q130E)、xviii)IL-12p35(N136D)、xix)IL-12p35(E143Q)、xx)SEQ ID NO:227(IL-12p35(N151K))、xxi)SEQID NO:226(IL-12p35(E153K))、xxii)IL-12p35(K158E)、xxiii)IL-12p35(D165N)、xxiv)SEQ ID NO:225(IL-12p35(N151D/E153Q))、xxv)SEQ ID NO:228(IL-12p35(N151D/D165N))、xxvi)SEQ ID NO:229(IL-12p35(Q130E/N151D))、xxvii)SEQ ID NO:230(IL-12p35(N151D/K158E))、xxviii)SEQ ID NO:231(IL-12p35(E79Q/N151D))、xxix)SEQ IDNO:232(IL-12p35(D55Q/N151D))、xxx)SEQ ID NO:233(IL-12p35(N136D/N151D))、xxxi)SEQ ID NO:234(IL-12p35(N21D/N151D))、xxxii)SEQ ID NO:235(IL-12p35(E143Q/N151D))、xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(F96A))、xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M97A))、xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L89A))、xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L124A))、xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M125A))、xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L75A))、xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(I171A))、xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q))、xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q))、xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N195Q))、xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q))、xxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N195Q))、xl)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q/N195Q)、xli)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q/N195Q))、xlii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71D/N85D))、xliii)SEQID NO:XXX(IL-12p35(N71D/N195D)、xliv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85D/N195D))、xlv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))和xlvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55K))。
81.根据权利要求60至80中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，促进所述第一和所述第二变体Fc结构域的异源二聚化的所述修饰是选自由以下组成的组的一组氨基酸取代：根据EU编号，L368D/K370S和S364K；L368D/K370S和S364K/E357L；L368D/K370S和S364K/E357Q；T411E/K360E/Q362E和D401K；L368E/K370S和S364K；K370S；和S364K/E357Q；和T366S/L368A/Y407V和T366W(任选包括二硫桥键，T366S/L368A/Y407V/Y349C和T366W/S354C)。
82.根据权利要求60至81中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，所述第一和/或所述第二变体Fc结构域包含包括根据EU编号的Q295E/N384D/Q418E/N421D的另外一组氨基酸取代。
83.根据权利要求60至82中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，所述第一和/或所述第二变体Fc结构域包含选自由以下组成的组的另一组氨基酸取代：根据EU编号，G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del和E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。
84.根据权利要求60至83中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，其中，根据EU编号，所述第一和所述第二变体Fc结构域各自包含氨基酸取代M428L/N434S。
85.一种包含根据权利要求60至84中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白的组合物，其用于治疗受试者的癌症。
86.一种或多种核酸，其编码根据权利要求60至84中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白。
87.一种宿主细胞，其包含根据权利要求86所述的一种或多种核酸。
88.一种制备靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白的方法，所述方法包括在产生所述靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白的条件下培养根据权利要求87所述的宿主细胞。
89.一种纯化根据权利要求60至84中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白的方法，所述方法包括：
a)提供包含所述靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白的组合物；
b)将所述组合物上样到离子交换柱上；以及
c)收集含有所述靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白的级分。
90.一种在有需要的患者中治疗癌症的方法，所述方法包括将治疗有效量的根据权利要求1-24、30-54和60-84中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白施用给所述患者。
91.根据权利要求90所述的方法，其进一步包括施用治疗有效量的检查点阻断抗体。
92.根据权利要求91所述的方法，其中，所述检查点阻断抗体选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗TIM3抗体、抗TIGIT抗体、抗LAG3抗体和抗CTLA-4抗体。
93.根据权利要求92所述的方法，其中，所述抗PD-1抗体是纳武单抗、派姆单抗或皮地利珠单抗。
94.根据权利要求93所述的方法，其中，所述抗PD-L1抗体是阿特珠单抗、阿维鲁单抗或杜巴单抗。
95.根据权利要求90到94中任一项所述的方法，其中所述患者在施用之后表现出淋巴细胞增加。
96.根据权利要求90到95中任一项所述的方法，其中所述患者在施用之后表现出外周CD8+T细胞增加。
97.一种在有需要的患者中诱导T细胞扩增的方法，所述方法包括将治疗有效量的根据权利要求1-24、30-54和60-84中任一项所述的靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白施用给所述患者。
98.根据权利要求97所述的方法，其进一步包括施用治疗有效量的检查点阻断抗体。
99.根据权利要求98所述的方法，其中，所述检查点阻断抗体选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗TIM3抗体、抗TIGIT抗体、抗LAG3抗体和抗CTLA-4抗体。
100.根据权利要求99所述的方法，其中，所述抗PD-1抗体是纳武单抗、派姆单抗或皮地利珠单抗。
101.根据权利要求99所述的方法，其中，所述抗PD-L1抗体是阿特珠单抗、阿维鲁单抗或杜巴单抗。
102.根据权利要求97到101中任一项所述的方法，其中，所述T细胞扩增是T细胞增加至少2倍。
103.根据权利要求91至96和98至102中任一项所述的方法，其中，靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白在检查点抑制剂之前施用。
104.根据权利要求91至96和98至102中任一项所述的方法，其中，靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白在检查点抑制剂之后施用。
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