BRPI9916853B1 - Anticorpo monoclonal ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente ao antígeno do linfócito t citotóxico 4 (ctla-4) e ácido nucleico - Google Patents

Abstract

patente de invenção: "anticorpos monoclonais humanos ao ctla-4". de acordo com a presente invenção, são providos anticorpos monocionais totalmente humanos contra o antígeno 4 de t-linfócito citotóxico humano (ctla-4). as sequências de nucleotídio codificadoras e as sequências de aminoácido que compreendem moléculas de imunoglobulina de cadeia pesada e leve, particularmente sequências de cadeia pesada e leve contíguas que abrangem as regiões de determinação complementares (cdrs), especificamente de dentro de fr1 e/ou cdr1 a cdr3 e/ou dentro de fr4, são providas. adicionalmente são providos anticorpos dotados de propriedades de aglomeração similares e anticorpos (ou outros antagonistas) dotados de funcionalidade similar como anticorpos descritos no presente relatório.

Description

(54) Título: ANTICORPO MONOCLONAL OU UM FRAGMENTO DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO DO MESMO QUE SE LIGA ESPECIFICAMENTE AO ANTÍGENO DO LINFÓCITO Τ CITOTÓXICO 4 (CTLA-4) E ÁCIDO NUCLEICO (73) Titular: PFIZER INC., Sociedade Norte-Americana. Endereço: 235 East42nd Street, 20th Floor, New York, NY 10017, ESTADOS UNIDOS DA AMÉRICA(US); AMGEN FREMONT INC., Sociedade Norte-Americana. Endereço: 6701 Kaiser Drive, Fremont CA 94555, ESTADOS UNIDOS DA AMÉRICA(US) (72) Inventor: DOUGLAS CHARLES HANSON; EILEEN ELLIOT MUELLER; JEFFREY HERBERT HANKE; STEVEN CHRISTOPHER GILMAR; C. GEOFFREY DAVIS; JOSE RAMON CORVALAN; MARK JOSEPH NEVEU

Código de Controle: BC233D889DD355AE 05D4DEA2762601C8

Prazo de Validade: 10 (dez) anos contados a partir de 24/04/2018, observadas as condições legais

Expedida em: 24/04/2018

Assinado digitalmente por:

Júlio César Castelo Branco Reis Moreira

Diretor de Patente

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para

ANTICORPO MONOCLONAL OU UM FRAGMENTO DE LIGAÇÃO A

ANTÍGENO DO MESMO QUE SE LIGA ESPECIFICAMENTE AO

ANTÍGENO DO LINFÓCITO T CITOTÓXICO 4 (CTLA-4) E ÁCIDO

NUCLEICO.

Fundamentos da Invenção

1. Referência Cruzada aos Pedidos de Depósito Correlatos

O presente pedido de depósito reivindica prioridade ao Pedido de Depósito de Patente Provisório U.S. N°. de Série 60/113.647, depositado em 23 de dezembro de 1998, cuja descrição está incorporada no presente relatório em sua totalidade.

2. Sumário da Invenção

De acordo com a presente invenção, são providos anticorpos monoclonais totalmente humanos contra o antígeno 4 de Tlinfócito citotóxico humano (CTLA-4). As seqüências de nucleotídio que codificam e as seqüências de aminoácido que compreendem moléculas de imunoglobulina de cadeia pesada e leve, particularmente seqüências de cadeia contígua pesada e leve que abrangem as regiões de determinação de complementaridade (CDRs), especificamente de dentro da FR1 e/ou CDR1 a CDR3 e/ou dentro da FR4, são providas. Adicionalmente são providos anticorpos dotados de propriedades de aglomeração similares e anticorpos (ou outros antagonistas) que têm funcionalidade similar como os anticorpos descritos no presente relatório.

3. Fundamentos da Tecnologia

A regulação da resposta imune em pacientes proveria um tratamento desejável de muitas doenças humanas que poderiam levar a uma especificidade de ação que é raramente encontrada através do uso de drogas convencionais. Tanto a regulação ascendente quanto a regulação descendente de respostas do sistema imune seriam possíveis. Os papéis das células T e células B foram extensivamente estudados e caracterizados em conexão com a regulação da resposta imune. Desses estudos, o papel das células T parece, em muitos casos, ser particularmente importante na prevenção e no tratamento da doença.

As células T têm sistemas muito complexos para o controle de suas interações. As interações entre as células T utilizam vários receptores e fatores solúveis para o processo. Deste modo, o que efetua qualquer sinal particular que pode ter na resposta imune geralmente varia e depende dos fatores particulares, receptores e contra-receptores que estão envolvidos na passagem. As passagens para as respostas de regulação descendente são tão importantes quanto as necessárias para a ativação. A educação tímica que leva à tolerância da célula T é um mecanismo para a prevenção de uma resposta imune a um antígeno particular. Outros mecanismos, tais como a secreção de citocinas supressivas, também são conhecidos.

A ativação das células T requerem não só o estímulo através do receptor de antígeno (receptor da célula T (TCR)), mas a sinalização adicional através das moléculas de superfície co-estimulantes tais como CD28. Os ligantes para CD28 são as proteínas B7-1 (CD80) e B7-2 (CD86), que são expressas em células que pressentem o antígeno tais como as células dentríticas, células B ativadas ou monócitos que interagem com a célula T CD28 ou CTLA-4 para fornecer um sinal coestimulante. O papel da sinalização coestimulante foi estudado em encefalomielite alérgica experimental (EAE) por Perrin et al. Immunol Res 14:189-99 (1995). EAE é um distúrbio auto-imune, induzido pelas células Th1 dirigidas contra antígenos da mielina que provê um modelo in vivo para o estudo do papel da coestimulação mediada por B7 na indução de uma resposta imune patológica. O uso de um ligante de proteína de fusão solúvel para os receptores B7, bem como anticorpos monoclonais específicos para CD80 ou CD86, Perrin et al. demonstrou que a coestimulação de B7 desempenha um papel proeminente na determinação da doença clínica resultante na EAE.

A interação entre B7 e CD28 é um de vários caminhos de sinalização coestimulante que parecem ser suficientes para disparar a maturação e a proliferação de células T específicas para antígeno. A falta de coestimulação, e a inadequação concomitante da produção de IL-2, impedem a pro3 liferação subsequente da célula T e induzem um estado de não-reatividade que recebe o termo anergia. Uma variedade de vírus e tumores pode bloquear a ativação e a proliferação da célula T, levando à atividade insuficiente ou não-reatividade do sistema imune do hospedeiro às células infectadas ou transformadas. Entre vários distúrbios possíveis da célula T, a anergia pode ser pelo menos parcialmente responsável pela falha do hospedeiro para eliminar as células patogênicas ou tumorgênicas.

O uso da proteína B7 para mediar a imunidade antitumor foi descrito em Chen et al. Cellll: 1093-1102 (1992) e Townsend e Allison Science 259: 368 (1993). Schwartz Cell 71: 1065 (1992) revê o papel das CD28, CTLA-4 e B7 na produção de IL-2 e imunoterapia. Harding et al. Nature 356: 607-609 (1994) demonstra que a sinalização mediada por CD28 coestimula as células T de murinos e impede a indução de anergia em clones da célula T. Vide também as Patentes U.S. N°s. 5.434.131, 5.770.197 e 5.773.253 e Pedidos de Depósito de Patente de Invenção Internacional N°s. WO 93/00431, WO 95/01994, WO 93/00431, WO 95/01994, WO 95/03408, WO 95/24217 eWO 95/33770.

A partir do precedente, ficou claro que as células T requiseram dois tipos de sinais da célula que apresente o antígeno (APC) para a ativação e subseqüente diferenciação para a função do agente de efeito. Primeiro, há um sinai específico de antígeno gerado pelas interações entre a TOR na célula T e as moléculas MHC que apresentem os peptídios na APC. Segundo, há um sinal específico de antígeno mediado pela interação de CD28 com os membros da família B7 (B7-1 (CD80) ou B7-2 (CD86)). Exatamente onde o CTLA-4 se ajusta no lugar de resposta imune foi inicialmente evasiva. O CTLA-4 de murino foi primeiro identificado e clonado por Brunet et al. Nature 328:267-270 (1987), como parte de uma pesquisa de moléculas que são, de preferência, expressas em linfócitos T citotóxicos. O CTLA-4 humano foi identificado e clonado imediatamente depois por Dariavach et al. Eur. J. Immunol 81: 1901-1905 (1988). As moléculas de CTLA-4 de murinos e humanos têm cerca de 76% de homologia de seqüência geral e abordam a identidade de seqüência completa em seus domínios citoplásmicos (Daria4 vach et al. Eur. J. Immunol. 18:1901-1905 (1988)). O CTLA-4 é um membro das proteínas da superfamília imunoglobulina (Ig). A superfamília Ig é um grupo de proteínas que partilham configurações estruturais chave de um domínio ou variável (V) ou constante (C) de moléculas de Ig. Os membros da superfamília Ig incluem, sem limitação, as próprias imunoglobulinas, as moléculas da classe do complexo de histocompatibilidade principal (MHC) (isto é, classe de MHC I e II), e as moléculas de TCR.

Em 1991, Linsley et al. J. Exp. Med. 174:561-569 (1991), propôs que o CTLA-4 foi um segundo receptor para B7. De modo similar, Harper et al. J. Immunol 147:1037-44 (1991) demonstrou que as moléculas de CTLA4 e CD28 são intrinsecamente relacionadas tanto em ratos quanto em humanos quanto à seqüência, expressão de mensagem, estrutura de gene e localização cromossômica. Vide também Balzano et al., Int J Câncer Suppl 7: 28-32 (1992). Mais evidência deste papel apareceu através de estudos funcionais. Por exemplo, Lenschow et al. Science 257: 789-792 (1992) demonstrou que o CTLA-4-lg induzia a sobrevivência a longo prazo de enxertos de ilhota pancreáticos. Freeman et al. Science 262: 907-909 (1993) examinou o papel de CTLA-4 em camundongos deficientes em B7. O exame dos ligantes para CTLA-4 é descrito em Lenschow et al. P.N.A.S 90: 1105411058 (1993). Linsley et al. Science 257: 792-795 (1992) descreve a imunossupressão in vivo por uma forma solúvel de CTLA-4. Linsley et al. J. Exp Med 176: 1595-604 (1992) preparou anticorpos que se aglomeraram a CTLA-4 e que não foram reativos cruzados com CD28 e concluiu que o CTLA-4 é coexpresso com CD28 em linfócitos T e cooperativamente regula a adesão da célula T e a ativação por B7. Kuchroo et al. Cell 80: 707-18 (1995) demonstrou que as moléculas coestimulantes B7-1 e B7-2 diferentemente ativaram os caminhos de desenvolvimento de Th1/Th2. Yiqun et al. Int Immun. 8: 37-44 (1996) demonstrou que há exigências diferenciais para os sinais co-estimulantes de membros da família B7 por descanso versus células T de memória recentemente ativada em direção a antígenos de regresso solúveis. Vide também Boer et al. Eur J Immunol 23: 3120-5 (1993).

Vários grupos propuseram interações de receptor/ligante alter5 nativas ou distintas para CTLA-4 quando comparado com CD28 e até propuseram um terceiro complexo de B-7 que foi reconhecido por um anticorpo BB1. Vide, por exemplo, Hathcock et al. Science 262: 11054-8 (1993), Freeman et al. Science 262: 907-9 (1993), Freeman et al. J Exp Med 178:218592 (1993), Lenschow et al. Proc Natl Acad Sei U S 4 90: 11054-8 (1993), Razi-Wolf et al. Proc Natl Acad Sei U S A 90:11182-6 (1993) E Boussiotis et al. Proc Natl Acad Sei U S A 90:11059-63 (1993). Mas vide Freeman et al. J Immunol 161: 2708-15 (1998) que discute achar que o anticorpo BB1 se aglomera a uma molécula idêntica à forma da superfície da célula de CD74 e, por conseguinte, o mAb BB1 se aglomera a uma proteína distinta de B7-1 e este epítopo está também presente na proteína B7-1. Deste modo, esta observação exigiu que o campo reconsiderasse os estudos com o uso de mAb BB1 na análise da expressão e da função de CD80.

Começando em 1993 e culminando em 1995, os investigadores começaram a delinear mais o papel de CTLA-4 no estímulo da célula T. Primeiro, através do uso de anticorpos monoclonais contra CTLA-4, Walunas et al. Immunity 1: 405-13 (1994) proveu a evidência de que o CTLA-4 pode funcionar como um regulador negativo da ativação da célula T. Em seguida, Waterhouse et al. Science 270: 985-988 (1995) demonstrou que os camundongos deficientes para CTLA-4 acumularam inflamações da célula T com formadores de ativação regulada de modo ascendente em seus nós de linfa e baços. As células inflamadas também infiltraram no fígado, coração, pulmão e tecido do pâncreas, e quantidades de imunoglobulina de soro foram elevadas e suas células T se proliferaram espontaneamente e fortemente quando estimuladas através do receptor da célula T, no entanto, elas foram sensíveis à morte da célula induzida por reticulação do receptor Fas e por irradiação gama. Waterhouse et al. concluiu que o CTLA-4 age como um regulador negativo da ativação da célula T e é vital para o controle de homeostase de linfócito. Em um comentário na mesma edição, Allison e Krummel Science 270: 932-933 (1995) discutiram a obra de Waterhouse et al. como demonstrativa de que o CTLA-4 age para regular de modo descendente a resposta da célula T ou tem um papel de sinalização inibidora na ativação e no desenvolvimento da célula T. Tivol et al. Immunity 3: 541-7 (1995) também gerou camundongos deficientes em CTLA-4 e demonstrou que esses camundongos rapidamente desenvolvem doença linfoproliferativa com infiltração linfocítica múltipla dos órgãos e destruição do tecido, com miocardite e pancreatite particufarmente graves. Eles concluíram que o CTLA-4 desempenha um papel-chave na regulação descendente da ativação da célula T e manutenção da homeostase imunológica. Da mesma forma, Krummel e Allison J Exp Med 182: 459-65 (1995) adicionalmente esclareceu que CD28 e CTLA-4 têm efeitos opostos na resposta das células T ao estímulo. Eles geraram um anticorpo para o CTLA-4 e investigaram os efeitos de sua aglomeração ao CTLA-4 em um sistema com o uso de células T altamente purificadas. Em seu relatório, eles mostraram que a presença de níveis baixos de B7-2 em células T recém-explantadas pode inibir parcialmente a proliferação da célula T e esta inibição foi mediada por interações com CTLA-4. A reticulação de CTLA-4 com a TCR e CD28 inibe fortemente a proliferação e a secreção de IL-2 por células T. Finalmente, os resultados mostraram que CD28 e CTLA-4 fornecem sinais opostos que parecem ser integrados pela célula T na determinação da resposta ao antígeno. Deste modo, eles concluíram que o resultado do estímulo do receptor de antígeno da célula T é regulado por sinais coestimulantes da CD28, bem como sinais inibidores derivados do CTLA-4. Vide também Krummel et al. Int Immunol 8: 519-23 (1996) e Patente U.S. N°. 5.811.097 e Pedido de Depósito de Patente de Invenção Internacional N°. WO 97/20574.

Uma variedade de experimentos adicionais foi conduzida adicionalmente elucidando a função acima do CTLA-4. Por exemplo, Walunas et al. JExp Med 183:2541-50 (1996) através do uso de anticorpos antiCTLA-4, sugeriu que a sinalização do CTLA-4 não regula a sobrevivência da célula ou resposta a IL-2, mas inibe a produção de IL-2 dependente de CD28. Da mesma forma, Perrin et al. J Immunol 157; 1333-6 (1996) demonstrou que os anticorpos antiCTLA-4 em encefalomielite alérgica experimental (EAE), exacerbou a doença e aumentou a mortalidade. A exacerbação da doença foi associada com a produção intensificada das citocinas encefalitogênicas

TNF-alfa, IFN-gama e IL-2. Deste modo, eles concluíram que o CTLA-4 regula a intensidade da resposta auto-imune em EAE, atenuando a produção de citocina inflamatória e manifestações da doença clínica. Vide também Hurwitz et al. J Neuroimmunol 73: 57-62 (1997) e Cepero et al. J Exp Med 188: 199-204 (1998) (uma ribozima de hairpina antiCTLA-4 que especificamente abroga a expressão de CTLA-4 após a transferência de gene a um modelo de célula T de ratos).

Além disso, Blair et al. J Immunol 160: 12-5 (1998) avaliou os efeitos funcionais de um painel de anticorpos monoclonais de CTLA-4 (mAbs) em células T CD4+ em repouso. Seus resultados demonstraram que alguns mAbs de CTLA-4 poderiam inibir respostas proliferativas de células CD4+ em repouso e a transição do ciclo da célula de G0 para G1. Os efeitos inibidores de CTLA-4 foram evidentes em 4 horas, em um momento quando a expressão de CTLA-4 da superfície da célula permaneceu indetectável. Outros mAbs de CTLA-4, no entanto, não tiveram efeitos inibidores detectáveis, indicando que a aglomeração de mAbs para CTLA-4 isoladamente não foi suficiente para mediar a regulação descendente de respostas da célula T. De modo interessante, embora a produção de IL-2 foi suspensa, os mAbs antiCTLA-4 inibidores permitiram a indução e a expressão do gene bcl-X(L) de sobrevivência da célula. Coerente com esta observação, as células permaneceram viáveis e a apoptose não foi detectada após a ligação de CTLA4.

Em conexão com a anergia, Perez et al. Immunity 6: 411-7 (1997) demonstrou que a indução de anergia da célula T foi prevenida pelo bloqueio da CTLA-4 e concluiu que o resultado do reconhecimento do antígeno por células T é determinado pela interação de CD28 ou CTLA-4 nas células T com moléculas B7. Da mesma forma, Van Parijs et al. J Exp Med 186: 1119-28 (1997) examinou o papel da interleucina 12 e coestimulantes na anergia da célula T in vivo e verificou que através da inibição do engate de CTLA-4 inibidor durante a indução da anergia, a proliferação da célula T foi bloqueada, e a diferenciação de Th1 completa não foi promovida. No entanto, as células T expostas ao antígeno tolerogênico na presença tanto de

IL-2 quanto de anticorpo antiCTLA-4 não foram anergizadas, e se comportaram de modo idêntico às células T que encontraram antígeno imunogênico. Esses resultados sugeriram que dois processos contribuem para a indução de anergia in vivo: engate do CTLA-4, que leva a um bloqueio na capacidade de as células T proliferarem, e a ausência de uma citocina inflamatória prototípica, IL-12, que impede a diferenciação das células T nas células do agente de efeito Th1. A combinação de IL-2 e anticorpo CTLA-4 foi suficiente para converter um estímulo normalmente tolerogênico a um imunogênico.

Em conexão com as infecções, McCoy et al. J Exp Med 186: 183-7 (1997) demonstrou que os anticorpos antiCTLA-4 aumentaram e aceleraram muito a resposta imune da célula T ao Nippostrongylus brasiliensis, resultando em uma redução profunda nos números de caracóis adultos e a prévia terminação da produção de ovos de parasita. Vide também Murphy et al. Jlmmunol. 161:4153-4160 (1998) (Leishmania donovani).

Em conexão com o câncer, Kwon et al, PNAS USA 94:8099-103 (1997) estabeleceu um modelo de câncer de próstata de murinos singenéicos e examinou duas manipulações distintas destinadas a obter uma resposta contra o câncer de próstata através do co-estímulo da célula T intensificado: (I) provisão de co-estímulo direto por células de câncer de próstata transduzidas para expressar o ligante B7.1 e (ii) bloqueio mediado por anticorpo in vivo do CTLA-4 da célula T, que impede a regulação descendente da célula T. Demonstrou-se que o bloqueio mediado por anticorpo in vivo de CTLA-4 aumentou as respostas imunes contra o câncer de próstata. Da mesma forma, Yang et al. Cancer Res 57: 4036-41 (1997) investigou se o bloqueio da função do CTLA-4 leva a intensificação das respostas da célula T antitumor em vários estágios do desenvolvimento do tumor. Com base nos resultados in vitro e in vivo, eles verificaram que o bloqueio de CTLA-4 em indivíduos que portam o tumor intensificou a capacidade de gerar respostas da célula T antitumor, mas a expressão desse efeito de intensificação foi restrita a estágios anteriores do desenvolvimento do tumor em seu modelo. Além disso, Hurzwitz et al. Proc Nati Acad Sei U S A 95: 10067-71 (1998) investigou que a geração de uma resposta antitumor mediada por célula T depende do engate do receptor da célula T por maior complexo de histocompatibilidade/antígeno bem como a ligação de CD28 por B7. Certos tumores, tais como o carcinoma mamário SM1, foram refratários à imunoterapia antiCTLA-4. Deste modo, através do uso de uma combinação de bloqueio de CTLA-4 e uma vacina que consiste em células SM1 que expressam o fator estimulante de colônia de granulócito-macrofagia, regressão de tumores de SM1 pais foi observado, apesar da ineficácia de cada tratamento isoladamente. Esta terapia em combinação resultou em imunidade duradoura a SM1 e dependeu de ambas as células T CD4(+) e CD8(+). As descobertas sugeriram que o bloqueio de CTLA-4 age ao nível de uma célula que apresenta antígeno derivado do hospedeiro.

Em conexão com diabetes, Ludher et al J Exp Med 187: 427-32 (1998) injetou um mAb antiCTLA-4 em um modelo de camundongo transgênico de TCR de diabetes em diferentes estágios da doença. Eles descobriram que o engate de CTLA-4 no momento em que as células T potencialmente diabetogênicas são primeiro ativadas é um evento pivotal; se o engate for permitido, a invasão das ilhotas ocorre, mas permanece bem inócua por meses. Caso não, a insulite é muito mais agressiva, e o diabetes rapidamente sucede.

Em conexão com a imunização da vacina, Horspool et al. J Immunol 160:2706-14 (1998) verificou que o mAb antiCTLA-4 intacto, mas não os fragmentos Fab suprimiu a resposta humoral primária a pClA/beta gal sem afetar as respostas de retorno, indicando que a ativação do CTLA-4 inibiu a produção de Ab, mas não a formação de primer da célula T. O bloqueio dos ligantes para CD28 e CTLA-4, CD80 (B7-1) e CD86 (B7-2), revelou função distinta e não sobrejacente. O bloqueio de CD80 na imunização inicial ab-rogou completamente as respostas do Ab primárias e secundárias, ao passo que o bloqueio do CD86 suprimiu as respostas primárias, mas não as secundárias. O bloqueio simultâneo de CD80 + CD86 foi menos eficiente na supressão de respostas Ab do que cada uma isoladamente. A intensificação do co-estímulo via co-injeção de plasmídios que expressam B7 aumentou as respostas de CTL, mas não as respostas de Ab, e sem a evidência de rotação de Th1 para Th2. Essas descobertas sugerem papéis complexos e distintos para CD28, CTLA-4, CD80 e CD86 no co-estímulo da célula T após a vacinação de ácido nucléico.

Em conexão com a rejeição de aloenxerto, Markees et al. J Clin Invest 101: 2446-55 (1998) verificou em um modelo de camundongo de rejeição de aloenxerto de pele que a aceitação inicialmente dependeu da presença de células T IFN-gamma, CTLA-4 e CD4(+). A adição de mAb antiCTLA-4 ou anti-IFN-gama ao protocolo foi associada com a pronta rejeição do enxerto, ao passo que o mAb anti-IL-4 não teve efeito algum.

Em conexão com o papel do CTLA-4 em relação ao CD28, Fallarino et al. J Exp Med 188: 205-10 (1998) gerou camundongos transgênicos/deficientes de gene de ativação de recombinase/deficientes de CD28 ou de tipo selvagem de CD28 que foram imunizados com um tumor de expressão de antígeno. As células T iniciadas de ambos os tipos de camundongos produziram citocinas e se proliferaram em resposta às células estimulantes falhas de expressão de B7. No entanto, considerando-se que a resposta das células T CD28+/+ foi aumentada por co-estímulo com B7-1, a resposta das células T CD28-/- foi fortemente inibida. Esta inibição foi revertida por anticorpo monoclonal contra B7-1 ou CTLA-4. Deste modo, o CTLA-4 pode potencialmente inibir a ativação da célula T na ausência de CD28, indicando que o antagonismo de um sinal mediado por TCR é suficiente para explicar o efeito inibidor de CTLA-4. Da mesma forma, Lin et al. J Exp Med 188: 199204 (1998) estudou a rejeição de aloenxertos do coração em camundongos deficientes em CD28. Os corações H-2(q) foram transplantados em camundongos (H-2(b)) alogênicos do tipo selvagem ou deficientes em CD28. A rejeição do enxerto foi atrasada nos camundongos deficientes em CD28 comparados com os do tipo selvagem. O tratamento de recipientes do tipo selvagem com imunoglobulina (Ig) de CTLA-4 ou com anti-B7-1 mais mAbs anti-B7-2 prolongou significativamente a sobrevivência ao aloenxerto. Pelo contrário, o tratamento de camundongos deficientes em CD28 com mAbs CTLA-4-lg, anti-B7-1 mais anti-B7-2, ou um mAb antiCTLA-4 de bloqueio induziu a aceleração da rejeição do aloenxerto. Esta taxa aumentada de re11 jeição ao enxerto foi associada com mais infiltração mononuclear grave e níveis aumentados de IFN-gama e transcrições de IL-6 em corações doadores de camundongos deficientes em CD28 não-tratados do tipo selvagem e tratados com CTLA-4-lg ou antiCTLA-4. Deste modo, o papel regulador negativo de CTLA-4 se estende além de sua capacidade potencial de impedir a ativação de CD28 através da competição de ligante. Mesmo na ausência de CD28, o CTLA-4 desempenha um papel inibidor na regulação da rejeição ao aloenxerto.

Da mesma forma, a caracterização adicional da expressão de CTLA-4 foi investigada. Por exemplo, Alegre et al. J Immunol 157: 4762-70 (1996) propôs que o CTLA-4 da superfície é rapidamente internalizado, o que pode explicar os baixos níveis de expressão geralmente detectados na superfície da célula. Eles concluíram que tanto a CD28 quanto o IL-2 desempenham papéis importantes para a regulação ascendente da expressão de CTLA-4. Além disso, o acúmulo na superfície da célula de CTLA-4 pareceu ser primariamente regulado por sua endocitose rápida. Da mesma forma, Castan et al., Immunology 90: 265-71 (1997) com base em análises imunohistológicas in situ da expressão de CTLA-4, sugeriu que as células T do centro germinal, que foram positivas ao CTLA-4, poderíam ser importantes para a regulação imune.

Conseqüentemente, à vista do papel amplo e pivotal que o CTLA-4 parece ter em resposta imune, seria desejável gerar anticorpos ao CTLA-4 que podem ser utilizados eficientemente em imunoterapia. Além disso, seria desejável gerar anticorpos contra o CTLA-4 que possa ser utilizado em doenças crônicas em que as administrações repetidas dos anticorpos são necessárias.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 provê uma série de seqüências de nucleotídio e aminoácido de moléculas de imunoglobulina de cadeia pesada e kappa leve de acordo com a invenção: 4.1.1 (Figura 1 A), 4.8.1 (Figura 1B), 4.14.3 (Figura 1C), 6.1.1 (Figura 1D), 3.1.1 (Figura 1E), 4.10.2 (Figura 1F), 2.1.3 (Figura 1G), 4.13.1 (Figura 1H), 11.2.1 (Figura 11), 11.6.1 (Figura 1J), 11.7.1 (Figura

1Κ), 12.3.1.1 (Figura 1L) e 12.9.1.1 (Figura 1M).

A Figura 2 provê um alinhamento de seqüência entre as seqüências preditas de aminoácido de cadeia pesada dos clones 4.1.1 (SEQ ID NO; 74), 4.8.1 (SEQ ID NO: 75), 4.14.3 (SEQ ID NO: 78), 6.1.1 (SEQ ID NO: 79), 3.1.1 (SEQ ID NO: 73), 4.10.2 (SEQ ID NO: 76),4.13.1 (SEQ ID NO: 77), 11.2.1 (SEQ ID NO: 80), 11.6.1 (SEQ ID NO: 81), 11.7.1 (SEQ ID NO: 82), 12.3.1.1 (SEQ ID NO: 83)e 12.9.1.1 (SEQ ID NO: 84) e a seqüência de aminoácido (SEQ ID NO: 72) da linha de germe DP-50 (3-33). As diferenças entre a seqüência de linha de germe DP-50 e a da seqüência nos clones são indicadas em negrito. A Figura também mostra as posições das seqüências CDR1, CDR2 e CDR3 dos anticorpos conforme sombreado.

A Figura 3 provê um alinhamento de seqüência entre a seqüência de aminoácido de cadeia pesada do clone 2.1.3 (SEQ ID NO: 86) e a seqüência de aminoácido (SEQ ID NO: 85) de linha de germe DP-65 (4-31). As diferenças entre a seqüência de linha de germe DP-65 e a da seqüência no clone são indicadas em negrito. A Figura também mostra as posições das seqüências CDR1, CDR2 e CDR3 do anticorpo conforme sublinhado.

A Figura 4 provê um alinhamento de seqüência entre a seqüência de aminoáddo de cadeia leve kappa predita dos clones 4.1.1 (SEQID NO: 88), 4.8.1 (SEQ ID NO: 89), 4.14.3 (SEQ ID NO: 90), 6.1.1 (SEQ ID NO: 91), 4.10.2 (SEQ ID NO: 92) e

4.13.1 (SEQ ID NO: 93) e a seqüência de aminoácido (SEQ ID NO: 87) de linha de germe A27. As diferenças entre a seqüência de linha de germe A27 e a da seqüência no done são indicadas em negrito. A Figura também mostra as posições das seqüências CDR1, CDR2 e CDR3 do anticorpo conforme sublinhado. Apagamentos aparentes nos CDR1s dos clones 4.8.1,4.14.3 e 6.1.1 são indicados com Os.

A Figura 5 provê um alinhamento de seqüência entre a seqüência de aminoácido de cadeia leve kappa dos clones 3.1.1 (SEQ ID NO: 95), 11.2.1(SEQ ID NO: 96), 11.6.1 (SEQ ID NO: 97)e 11.7.1 (SEQ ID NO: 98) e a seqüência de aminoácido (SEQ ID NO: 94) da linha de germe 012. As diferenças entre a seqüência da linha de germe 012 e a da seqüência no clone são indicadas em negrito. A Figura também mostra as posições das seqüências CDR1, CDR2 e CDR3 do anticorpo conforme sublinhado.

A Figura 6 provê um alinhamento de seqüência entre a seqüência de aminoácido de cadeia leve kappa predita do clone 2.1.3 (SEQ ID NO: 112) e a seqüência de aminoácido (SEQ ID NO: 99) de linha de germe A10/A26. As diferenças entre a seqüência da linha de germe A10/A26 e a da seqüência no clone são indicadas em negrito. A Figura também mostra as posições das seqüências CDR1, CDR2 e CDR3 do anticorpo conforme sublinhado.

A Figura 7 provê um alinhamento de seqüência da seqüência de aminoácido de cadeia leve kappa predita do clone 12.3.1 (SEQ ID NO: 114) e a seqüência de aminoácido (SEQ ID NO: 113) da linha de germe A17. As diferenças entre a seqüência de linha de germe A17 e a da seqüência no clone são indicadas em negrito. A Figura também mostra as posições das seqüências CDR1, CDR2 e CDR3 do anticorpo conforme sublinhado.

A Figura 8 provê um alinhamento de seqüência da seqüência de aminoácido de cadeia leve kappa predita do clone 12.9.1 (SEQ ID NO: 116) e a seqüência de aminoácido (SEQ ID NO: 115) da linha de germe A3/A19. As diferenças entre a seqüência de linha de germe A3/A19 e a da seqüência no clone são indicadas em negrito. A Figura também mostra as posições das seqüências CDR1, CDR2 e CDR3 do anticorpo conforme sublinhado.

A Figura 9 provê um sumário de seqüências de aminoácido Nterminal geradas através de seqüenciamento de proteína direta das cadeias leve e pesada dos anticorpos.

A Figura 10 provê certas informações de caracterização adicionais sobre certos anticorpos de acordo com a invenção. Na Figura 10A, os dados relacionados aos clones 3.1.1,4.1.1,4.8.1,4.10.2,4.14.3 e 6.1.1 são resumidos. Os dados relacionados à concentração, focagem isoelétrica (IEF), SDS-PAGE, cromatografia de exclusão de tamanho, CTomatografia líquida/espectroscopia de massa (LCMS), espectroscopia de massa (MALDI), seqüências N-terminais são providos. Informações adicionais detalhadas relacionadas à IEF são providas na Figura 10B; relacionadas à SDS-PAGE são providas na 10C, e SEC do anticorpo 4.1.1 na 10D.

A Figura 11 mostra a expressão de B7-1 e B7-2 em células Raji com o uso de mAbs anti-CD80-PE e anti-CD86-PE.

A Figura 12 mostra a intensificação dependente de concentração da produção de IL-2 no ensaio de inflamação da célula T/Raji induzida por anticorpos de bloqueio antiCTLA-4 (BNI3,4.1.1,4.8.1 e 6.1.1).

A Figura 13 mostra a intensificação dependente de concentração da produção de IFN-γ no ensaio de inflamação da célula T/Raji induzida por anticorpos de bloqueio antiCTLA-4 (BNI3,4.1.1,4.8.1 e 6.1.1) (mesmo doador de células T).

A Figura 13 mostra a intensificação dependente da concentração da produção de IFN-γ no ensaio de inflamação de célula T/Raji induzido por anticorpos de bloqueio de CTLA-4 (BNI3 4.1.1, 4.8.1 e 6.1.1 da invenção) (mesmo doador de células T).

A Figura 14 mostra a intensificação média da produção de IL-2 em células T de 6 doadores induzida pelos anticorpos de bloqueio de CTLA4 no ensaio de inflamação de célula T/Raji.

A Figura 15 mostra a intensificação média da produção de INF-γ em células T de 6 doadores induzidos por anticorpos de bloqueio de CTLA-4 no ensaio de inflamação de célula T/Raji.

A Figura 16 mostra a intensificação da produção de IL-2 em hPBMC de 5 doadores induzidos por mAbs de bloqueio antiCTLA-4 conforme medido a 72 horas após o estímulo com SEA.

A Figura 17 mostra a intensificação da produção de IL-2 em todo o sangue de 3 doadores induzidos por mAbs de bloqueio antiCTLA-4 conforme medido a 72 e 96 horas após o estímulo com SEA.

A Figura 18 mostra a inibição do desenvolvimento de tumor com um anticorpo CTLA-4 anti-murinos em um modelo de tumor de fibrossarcoma de murinos.

A Figura 19 mostra a intensificação da produção IL-2 induzida por anticorpos antiCTLA-4 (4.11 e 11.2.1) da invenção em ensaios de 72 horas de inflamação de célula T/Raji e Superantígeno (células mononucleares de todo o sangue e de sangue periférico de 6 doadores).

A Figura 20 mostra a intensificação dependente de dose da produção de IL-2 induzida pelos anticorpos CTLA4 (4.1.1 e 11.2.1) da invenção em um ensaio de 72 horas de inflamação/Raji.

A Figura 21 mostra a intensificação dependente de dose da produção de IL-2 induzida por anticorpos antiCTLA (4.1.1 e 11.2.1) da invenção em um ensaio de todo o sangue de Superantígeno de 72 horas estimulado com 100 ng/ml de Superantígeno.

A Figura 22 provê uma série de seqüências adicionais de nucieotídio e aminoácido das seguintes cadeias de anticorpo antiCTLA-4: cadeia pesada 4.1.1 de comprimento total (cDNA 22(a), genômico 22(b) e aminoácido 22(c)); cadeia pesada 4.1.1 aglicosada de comprimento total (cDNA 22(d) e aminoácido 22(e)); cadeia leve 4.1.1 (cDNA 22(f) e aminoácido 22(g)); cadeia pesada 4.8.1 de comprimento total (cDNA 22(h) e aminoácido 22(i)); cadeia pesada 4.8.1 (cDNA 22(j) e aminoácido 22(k)); cadeia pesada

6.1.1 de comprimento total (cDNA 22(l) e aminoácido 22(m)); cadeia leve

6.1.1 (cDNA 22(n) e aminoácido 22(o)); cadeia pesada 11.2.1 de comprimento total (cDNA 22(p) e aminoácido 22(q)); e cadeia leve 11.2.1 (cDNA 22 (r) e aminoácido 22(s));

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

De acordo com um primeiro aspecto da invenção, é provido um anticorpo capaz de aglomeração com CTLA-4, que compreende uma seqüência de aminoácido de região variável de cadeia pesada que compreende uma seqüência de aminoácido contígua da qual uma seqüência FR1 a uma seqüência FR3 codificada por um gene da família V_H3-33 humano e que compreende pelo menos uma das substituições de aminoácido nas seqüências CDR1, seqüências CDR2, ou seqüências de estrutura mostradas na Figura 2. Em uma modalidade preferida, a seqüência de aminoácido compreende uma seqüência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NOJO, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:68 e SEQ ID NO:70. Em outra modalidade preferida, o anticorpo adicionalmente compreende uma seqüência de aminoácido de região variável de cadeia leve que compreende uma seqüência selecionada do grupo que consiste em uma seqüência que compreende SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, SEQ ID

NO:69eSEQ ID NO:71.

De acordo com um segundo aspecto da presente invenção, é provido um anticorpo que compreende uma seqüência de aminoácido de cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO:1 e uma seqüência de aminoácido de cadeia leve que compreende a SEQ ID NO: 14.

De acordo com um terceiro aspecto da presente invenção, é provido um anticorpo que compreende uma seqüência de aminoácido de cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO:2 e uma seqüência de aminoácido variável de cadeia leve que compreende a SEQ ID NO:15.

De acordo com um quarto aspecto da presente invenção, é provido um anticorpo que compreende uma seqüência de aminoácido de cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO:4 e uma seqüência de aminoácido variável de cadeia leve que compreende a SEQ ID NO:17.

De acordo com um quinto aspecto da presente invenção, é provido um anticorpo monoclonal humano isolado capaz de ligação a CTLA-4. Em uma modalidade preferida, o anticorpo é capaz de competir para aglomeração com CTLA-4 com um anticorpo selecionado do grupo que consiste em 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.13.1, 4.14.3, 6.1.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1,

12.3.1.1 e 12.9.1.1. Em outra modalidade preferida, o anticorpo possui especificidade de aglomeração substanciaímente similar a CTLA-4 como um anticorpo selecionado do grupo que consiste em 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2,

4.13.1, 4.14.3, 6.1.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 e 12.9.1.1. Em outra modalidade preferida, o anticorpo é selecionado do grupo que consiste em

3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.13.1, 4.14.3, 6.1.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1

12.3.1.1 e 12.9.1.1. Em outra modalidade preferida, o anticorpo tem reação cruzada com CTLA-4 de espécies de mamíferos inferiores, de preferência, as espécies de mamíferos inferiores que compreendem camundongo, rato e coelho e, com maior preferência, camundongo e rato. Em outra modalidade preferida, o anticorpo não tem reação cruzada com CTLA-4 de primatas, de preferência, os primatas compreendem macacos cinomolgos e rhesus. Em outra modalidade preferida, o anticorpo tem uma seletividade para CTLA-4 sobre CD28, B7-2, CD44 e hlgG1 maior que cerca de 100:1 e, de preferên17 cia, cerca de 500:1 ou mais. Em outra modalidade preferida, a afinidade de aglomeração do anticorpo é cerca de 10'⁹ M ou mais e, de preferência, cerca de 10'¹° M ou mais. Em outra modalidade preferida, o anticorpo inibe a aglomeração entre CTLA-4 e B7-2 com um IC₅₀ inferior a cerca de 100 nM e, de preferência, inferior a cerca de 0,38 nM. Em outra modalidade preferida, o anticorpo inibe a aglomeração entre CTLA-4 e B7-1 com um IC₅o inferior a cerca de 100 nM ou mais e, de preferência, inferior a cerca de 0,50 nM. Em outra modalidade preferida, o anticorpo intensifica a produção de IL-2 em ensaio de inflamação de célula T/Raji em cerca de 500 pg/ml ou mais e, de preferência, em cerca de 3846 pg/ml ou mais. Em outra modalidade preferida, o anticorpo intensifica a produção de IFN-yem um ensaio de inflamação de célula T/Raji em cerca de 500 pg/ml ou mais e, de preferência, em cerca de 1233 pg/ml ou mais. Em outra modalidade preferida, o anticorpo intensifica a produção de IL-2 em um ensaio de superantígeno de hPBMC ou sangue total em cerca de 500 pg/ml ou mais. Em outra modalidade preferida, o anticorpo aumenta a produção de IL-2 em um ensaio de superantígeno de hPBMC ou sangue total em cerca de 500 pg/ml ou, de preferência, 1500 pg/ml ou mais ou superior a cerca de 30% ou, de preferência, 50% em relação ao controle.

De acordo com um sexto aspecto da presente invenção, é provido um anticorpo humanizado dotado de uma especificidade substancialmente similar a CTLA-4 como um anticorpo selecionado do grupo que consiste em 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2. 4.13.1, 4.14.3, 6.1.1, 11.2.1, 11.6.1,

11.7.1, 12.3.1.1 e 12.9.1.1. Em uma modalidade preferida, o anticorpo tem reação cruzada com CTLA-4 de espécies de mamíferos inferiores, de preferência, as espécies de mamíferos inferiores compreendem camundongo, rato e coelho e, com maior preferência, camundongo e rato. Em outra modalidade preferida, o anticorpo não tem reação cruzada com CTLA-4 de primatas, de preferência, os primatas compreendem macacos cinomolgos e rhesus. Em outra modalidade preferida, o anticorpo tem uma seletividade para CTLA-4 sobre CD28, B7-2, CD44 e hlgG 1 maior que cerca de 100:1 e, de preferência, cerca de 500:1 ou mais. Em outra modalidade preferida, a afinidade de aglomeração do anticorpo é cerca de 10'⁹ M ou mais e, de preferência, cerca de 10'¹° M ou mais. Em outra modalidade preferida, o anticorpo inibe a aglomeração entre CTLA-4 e B7-2 com um IC50 inferior a cerca de 100 nM e, de preferência, inferior a cerca de 0,38 nM. Em outra modalidade preferida, 0 anticorpo inibe a aglomeração entre CTLA-4 e B7-1 com um IC50 inferior a cerca de 100 nM ou mais e, de preferência, inferior a cerca de 0,50 nM. Em outra modalidade preferida, 0 anticorpo intensifica a produção de IL-2 em ensaio de inflamação de célula T/Raji em cerca de 500 pg/ml ou mais e, de preferência, em cerca de 3846 pg/ml ou mais. Em outra modalidade preferida, 0 anticorpo intensifica a produção de IFN-γ em um ensaio de inflamação de célula T/Raji em cerca de 500 pg/ml ou mais e, de preferência, em cerca de 1233 pg/ml ou mais. Em outra modalidade preferida, 0 anticorpo intensifica a produção de IL-2 em um ensaio de superantígeno de hPBMC ou sangue total em cerca de 500 pg/ml ou mais. Em outra modalidade preferida, 0 anticorpo aumenta a produção de IL-2 em um ensaio de superantígeno de hPBMC ou sangue total em cerca de 500 pg/ml ou, de preferência, 1500 pg/ml ou mais ou superior a cerca de 30% ou, de preferência, 50% em relação ao controle.

De acordo com um sétimo aspecto da presente invenção, é provido um anticorpo que se aglomera ao CTLA-4, que compreende uma seqüência de aminoácido de cadeia pesada que compreende as seqüências humanas FR1, FR2, e FR3 codificadas por uma família de gene V_H 3-33 humano operativamente ligado em quadro com uma seqüência CDR1, CDR2 e CDR3 sendo que as seqüências CDR1, CDR2 e CDR3 são independentemente selecionadas das seqüências CDR1, CDR2 e CDR3 ilustradas na Figura 2. Em uma modalidade preferida, 0 anticorpo da Reivindicação 32, que adicionalmente compreende qualquer uma das mutações somáticas às seqüências FR1, FR2 e FR3, conforme ilustrado na Figura 2.

De acordo com um oitavo aspecto da presente invenção, é provido um anticorpo que se aglomera ao CTLA-4, que compreende uma seqüência de aminoácido de cadeia pesada que compreende as seqüências humanas FR1, FR2, e FR3 codificadas por uma família de gene Vh 3-33 humano operativamente ligado em quadro com uma seqüência CDR1, CDR2 e CDR3, anticorpo que tem as seguintes propriedades: uma afinidade de aglomeração para CTLA-4 de cerca de 10'⁹ ou mais; inibe a aglomeração entre CTLA-4 e B7-1 com um IC50 de cerca de 100 nM ou menos; inibe a aglomeração entre CTLA-4 e B7-2 com um IC50 de cerca de 100 nM ou menos; e aumenta a produção de citocina em um ensaio de células humanas T por 500 pg/ml ou mais.

De acordo com um nono aspecto da presente invenção, é provido um anticorpo que se aglomera ao CTLA-4, que compreende uma seqüência de aminoácido de cadeia pesada que compreende as seqüências FR1, FR2, e FR3 operativamente ligadas em quadro com uma seqüência CDR1, CDR2 e CDR3 independentemente selecionada das seqüências CDR1, CDR2 e CDR3 ilustradas nas Figuras 2 e 3, anticorpo que tem as seguintes propriedades: uma afinidade de aglomeração para CTLA-4 de cerca de 10'⁹ ou mais; inibe a aglomeração entre CTLA-4 e B7-1 com um IC50 de cerca de 100 nM ou menos; inibe a aglomeração entre CTLA-4 e B7-2 com um IC50 de cerca de 100 nM ou menos; e aumenta a produção de citocina em um ensaio de células humanas T por 500 pg/ml ou mais.

De acordo com um décimo aspecto da presente invenção, é provido um sistema de cultura de célula para ensaiar a estimulação de célula T, que compreende uma cultura de inflamações de célula T humana cocultivada com uma linha de célula de Raji. Em uma modalidade preferida, as inflamações de célula T são lavadas antes da cultura com a linha de célula de Raji.

De acordo com um décimo-primeiro aspecto da presente invenção, é provido um ensaio para a medição de estimulação de célula T, que compreende: aplicação de uma cultura de inflamações de célula T humana e uma linha de célula de Raji; contato da cultura com um agente; e medição da produção de citocina pela cultura.

De acordo com um décimo-segundo aspecto da presente invenção, é provido um ensaio funcional para a triagem de uma porção para a função estimulante da célula T, que compreende: aplicação de uma cultura de inflamações de célula T humana e uma linha de célula de Raji; contato da cultura com a porção; e avaliação da produção de citocina pela cultura.

De acordo com um décimo-terceiro aspecto da presente invenção, é provido um ensaio estimulante da célula T para a função inibidora de CTLA-4, que compreende o contato de uma cultura que compreende inflamações de célula T humana e uma linha de célula de Raji com um agente e avaliação da produção de citocina pela cultura.

De acordo com um décimo-quarto aspecto da presente invenção, é provido um método para a triagem de um agente para a atividade estimulante da célula T, que compreende: contato do agente com uma cultura de célula que compreende inflamações da célula T humana e uma linha de célula Raji; e avaliação da produção de citocina pela cultura.

Em cada um dos aspectos décimo a décimo-quarto da presente invenção, em uma modalidade preferida, as inflamações da célula T são lavadas antes da cultura com a linha de célula Raji. Em outra modalidade preferida, a citocina é IL-2 ou IFN-γ. Em uma modalidade preferida, a produção de citocina é medida em sobrenadante isolado da cultura. Em uma modalidade preferida, o agente é um anticorpo e, de preferência, se aglomera ao CTLA-4.

De acordo com um décimo-quinto aspecto da presente invenção, é provido um ensaio para a medição do estímulo da célula T, que compreende: aplicação de uma população de células mononucleares do sangue periférico humano ou todo o sangue humano estimulado com enterotoxina A de estafilococus; contato da cultura com um agente e medição da produção de citocina pela população da célula.

De acordo com um décimo-sexto aspecto da presente invenção, é provido um ensaio funcional para a triagem de uma porção para a função estimulante da célula T, que compreende: aplicação de uma população de células mononucleares do sangue periférico humano ou todo o sangue humano estimulado com enterotoxina A de estafilococus: contato da cultura com a porção e avaliação da produção de citocina pela população da célula.

De acordo com um décimo-sétimo aspecto da presente inven21 ção, é provido um ensaio estimulante da célula T para a função inibidora de CTLA-4, que compreende: contato de uma população de células mononucleares do sangue periférico humano ou todo o sangue humano estimulado com enterotoxina A de estafilococus com um agente e avaliação da produ5 ção de citocina pela população da célula.

De acordo com um décimo-oitavo aspecto da presente invenção, é provido um método para a triagem de um agente para a atividade estimulante da célula T, que compreende: contato do agente com uma população de células mononucleares do sangue periférico humano ou de todo o sangue humano estimulado com enterotoxina A de estafilococus; e avaliação da t produção de citocina pela população da célula.

Em cada um dos aspectos décimo-quinto a décimo-oitavo da presente invenção, em uma modalidade preferida, a citocina é IL-2. Em outra modalidade preferida, a produção da citocina é medida em sobrenadante isolado da cultura. Em uma modalidade preferida, o agente é um anticorpo e, de preferência, se aglomera ao CTLA-4.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES PREFERIDAS

De acordo com a presente invenção, são providos anticorpos monoclonais totalmente humanos contra o CTLA-4 humano. As seqüências de nucleotídio de codificação e seqüências de aminoácido que compreendem moléculas de imunoglobulina de cadeia pesada e leve, particularmente as seqüências que correspondem a seqüências contíguas de cadeia pesada e leve de FR1 e CDR1 a CDR3 e FR4, são providas. Adicionaimente são providos anticorpos dotados de propriedades de aglomeração similares e anticorpos (ou outros antagonistas) dotados de funcionalidade similar como os anticorpos descritos no presente relatório. Os hibrídomas que expressam essas moléculas de imunoglobulina e os anticorpos monoclonais são também providos.

Definições

A menos que definido de outro modo no presente relatório, os termos científicos e técnicos usados em conexão com a presente invenção devem ter os significados comumente entendidos por aqueles versados na técnica. Além disso, a menos que exigido de outro modo pelo contexto, termos singulares devem incluir pluralidades e os termos plurais devem incluir o singular. Geralmente, as nomenclaturas utilizadas em conexão com, e as técnicas de cultura de célula e tecido, biologia molecular, e química de proteína e oligo- ou polinucleotídio e hibridização descrita no presente relatório são aquelas bem-conhecidas e comumente usadas na técnica. Técnicas padrão são usadas para DNA recombinante, síntese de oligonucleotídio e cultura e transformação de tecido (por exemplo, eletroporação, lipofecção). Reações enzimáticas e técnicas de purificação são executadas de acordo com as especificações do fabricante ou como comumente realizadas na técnica ou conforme descrito no presente relatório. As técnicas precedentes e procedimentos são geralmente executados de acordo com os métodos convencionais bem-conhecidos na técnica e conforme descrito em várias referências gerais e mais específicas citadas e discutidas por todo o presente relatório descritivo. Vide, por exemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2* ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)), que está incorporada no presente relatório a título de referência. As nomenclaturas utilizadas em conexão com e os procedimentos e técnicas de laboratório de química analítica, química orgânica sintética e química medicinal e farmacêutica descrita no presente relatório são aquelas bem-conhecidas e comumente usadas na técnica. As técnicas padrão são usadas para sínteses químicas, análises químicas, preparação farmacêutica, formulação e aplicação; e tratamento de pacientes.

Conforme utilizado de acordo com a presente descrição, os seguintes termos, a menos que indicado de outro modo, devem ser entendidos como tendo os seguintes significados:

O termo polinucleotídio isolado, conforme empregado no presente relatório, deve significar um polinucleotídio de origem genômica, cDNA ou sintética ou alguma de suas combinações, que, em virtude de sua origem, o polinucleotídio isolado (1) não é associado com o todo ou uma parte de um polinucleotídio em que o polinucleotídio isolado é encontrado na natureza, (2) é operativamente ligado a um polinucleotídio não-ligado na natureza, ou (3) não ocorre na natureza como parte de uma seqüência maior.

O termo proteína isolada referido no presente relatório quer dizer uma proteína de cDNA, RNA recombinante, ou origem sintética ou alguma de suas combinações, que, em virtude de sua origem, ou fonte de derivação, a proteína isolada (1) não é associada com as proteínas encontradas na natureza, (2) é livre de outras proteínas da mesma fonte, por exemplo, livre de proteínas de murino, (3) é expressa por uma célula de uma espécie diferente, ou (4) não ocorre na natureza.

O termo polipeptídio, conforme empregado no presente relatório como um termo genérico para se referir a uma proteína nativa, fragmentos ou análogos de uma seqüência de polipeptídio. Daí, a proteína nativa, fragmentos e análogos são espécies do gênero polipeptídio. Os polipeptídios preferidos, de acordo com a invenção, compreendem as moléculas de imunoglobulina de cadeia pesada humana e as moléculas de imunoglobulina de cadeia leve kappa humana representadas na Figura 1, bem como moléculas de anticorpo formadas pelas combinações que compreendem as moléculas de imunoglobulina de cadeia pesada com as moléculas de imunoglobulina de cadeia leve, tais como as moléculas de imunoglobulina de cadeia leve kappa, e vice-versa, bem como fragmentos e análogos das mesmas.

O termo que ocorre naturalmente, conforme aplicado aqui a um objeto, refere-se ao fato de que um objeto pode ser encontrado na natureza. Por exemplo, uma seqüência de polipeptídio ou polinucleotídio que é presente em um organismo (inclusive vírus) que pode ser isolado de uma fonte na natureza e que não foi intencionalmente modificado pelo homem no laboratório ou de outro modo é o que ocorre naturalmente.

O termo operativamente ligado, conforme empregado no presente relatório, refere-se às posições dos componentes assim descritos que estão em uma relação que lhes permite funcionar em sua maneira pretendida. Uma seqüência de controle operativamente ligada a uma seqüência de codificação está ligada de tal maneira que a expressão da seqüência de codificação é obtida sob condições compatíveis com as seqüências de contro24 le.

O termo seqüência de controle, conforme empregado no presente relatório, refere-se a seqüências de polinucleotídio necessárias para efetuar a expressão e o processamento de seqüências de codificação a que elas estão ligadas. A natureza dessas seqüências de controle difere dependendo do organismo do hospedeiro, em procariotes, tais seqüências de controle geralmente incluem promotor, ponto de aglomeração ribossomática, e seqüência de terminação de transcrição; em eucariotes, geralmente, essas seqüências de controle incluem promotores e seqüência de terminação de transcrição. O termo seqüências de controle deve incluir, no mínimo, todos os componentes cuja presença é essencial para a expressão e o processamento, e também podem incluir componentes adicionais cuja presença é vantajosa, por exemplo, seqüências líderes e seqüências de parceiro de fusão.

O termo polinucleotídio, conforme referido no presente relatório, quer dizer uma forma polimérica de nucleotídios de pelo menos 10 bases de comprimento, sejam ribonucleotídios ou desoxinucleotídios ou uma forma modificada de cada tipo de nucleotídio. O termo inclui formas de cordão simples e duplo de DNA.

O termo oligonucleotídio referido no presente relatório inclui nucleotídios que ocorrem naturalmente e modificados ligados entre si por ligações de oligonucleotídio que não ocorrem naturalmente. Os oligonucleotídios são um subconjunto de polinucleotídio que geralmente compreende um comprimento de 200 bases ou menos. De preferência, os oligonucleotídios têm 10 a 60 bases de comprimento e, com maior preferência, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 a 40 bases de comprimento. Os oligonucleotídios são geralmente de cordão simples, por exemplo, para sondas; embora os oligonucleotídios possam ser de cordão duplo, por exemplo, para uso na construção de um gene mutante. Os oligonucleotídios da invenção podem ser oligonucleotídios sentido ou anti-sentido.

O termo nucleotídios que ocorrem naturalmente referido no presente relatório inclui desoxirribonucleotídios e ribonucleotídios. O termo nucleotídios modificados referidos no presente relatório incluem nucleotídios com grupo de açúcar modificado ou substituído e outros do gênero. O termo ligações de oiigonucleotídios referido no presente relatório inclui ligações de oiigonucleotídios tais como fosforotioato, fosforoditioato, fosforosselenoato, fosforodisselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniíadato, fosforoamidato e outros do gênero. Vide, por exemplo, LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14: 9081 (1986); Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106: 6077 (1984); Stein et al. Nucl. Acids Res. 16: 3209 (1988); Zon et al. Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein Ed, Oxford University Press, Oxford England (1991)), Stec et al. Patente U.S. N°. 5.151.510; Uhlmann e Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990), cujas descrições estão incorporadas no presente relatório a título de referência. Um oligonucleotídio pode incluir uma etiqueta para detecção, se desejado.

O termo hibridizar seletivamente referido no presente relatório quer dizer aglomerar-se de modo detectável e específico. Os polinucleotídios, oiigonucleotídios e seus fragmentos, de acordo com a invenção, hibridizam seletivamente aos cordões de ácido nucléico sob hibridização e condições de lavagem que minimizam proporções apreciáveis de aglomeração detectável a ácidos nucléicos não-específicos. As condições de alta estringência podem ser usadas para obter condições de hibridização seletiva conforme conhecido na técnica e no presente relatório discutido. Geralmente, a homologia da seqüência de ácido nucléico entre os polinucleotídios, oiigonucleotídios e fragmentos da invenção e uma seqüência de ácido nucléico de interesse serão pelo menos 80% e, mais tipicamente, com, de preferência, homologias crescentes de pelo menos 85%, 90%, 95%, 99% e 100%. Duas sequências de aminoácido são homólogas se houver uma identidade parcial ou completa entre suas seqüências. Por exemplo, 85% de homologia quer dizer que 85% dos aminoácidos são idênticos quando duas seqüências são alinhadas para a correspondência máxima. Lacunas (em cada uma das duas seqüências sendo correspondida) são permitidas na maximização da correspondência; comprimentos de lacuna de 5 ou menos são preferidos, sendo que 2 ou menos é de maior preferência. Alternativamente e de preferência, duas seqüências de proteína (ou seqüências de polipeptídio derivadas delas de pelo menos 30 aminoácidos de comprimento) são homólogas, como este termo é empregado no presente relatório, se elas tiverem uma pontuação de alinhamento de mais que 5 (em unidades de desvio padrão) com o uso do programa ALIGN com a matriz de dados de mutação e uma penalidade de lacuna de 6 ou mais. Vide Dayhoff, M. O., em Atlas ofProtein Sequence and Structure, pp. 101-110 (Volume 5, National Biomedical Research Foundation (1972)) e Suplemento 2 a este volume, pp. 1-10. As duas seqüências ou suas partes são, com maior preferência, homólogas se seus aminoácidos forem maiores ou iguais a 50% idênticos quando otimamente alinhados com o uso do programa ALIGN. O termo corresponde a é usado no presente relatório para significar que uma seqüência de polinucleotídio é homóloga (isto é, é idêntica, não estritamente relacionada de modo evolucionário) ao todo ou uma parte de uma seqüência de polinucleotídio de referência ou que uma seqüência de polipeptídeo é idêntica à seqüência de polipeptídeo de referência. Em contradição, o termo complementar a é usado no presente relatório para querer dizer que a seqüência complementar é homóloga ao todo ou uma parte de uma seqüência de polinucleotídio de referência. Para fins de ilustração, a seqüência de nucleotídio TATAC corresponde a uma seqüência de referência TATAC e é complementar a uma seqüência de referência GTATA.

Os seguintes termos são usados para descrever as relações de seqüência entre duas ou mais seqüências de polinucleotídio ou aminoácido: seqüência de referência, janela de comparação, identidade de seqüência, porcentagem da identidade de seqüência e identidade substancial. Uma seqüência de referência é uma seqüência definida usada como uma base para uma comparação de seqüência; uma seqüência de referência pode ser um subconjunto de uma seqüência maior, por exemplo, como um segmento de um cDNA de comprimento total ou seqüência de gene fornecida em uma listagem de seqüência ou pode compreender um cDNA completo ou seqüência de gene. Geralmente, uma seqüência de referência tem pelo menos 18 nucleotídios ou 6 aminoácidos de comprimento, frequentemente pelo menos 24 nucleotídios ou 8 aminoácidos de comprimento e, freqüentemente, pelo menos 48 nucleotídios ou 16 aminoácidos de comprimento. Uma vez que dois polinucleotídios ou seqüências de aminoácido podem, cada um, (1) compreender uma seqüência (isto é, uma parte da seqüência completa de polinucleotídio ou aminoácido) similar entre as duas moléculas, e (2) pode adicionalmente compreender uma seqüência divergente entre as duas seqüências de polinucleotídios ou aminoácido, as comparações de seqüência entre duas (ou mais) moléculas são tipicamente executadas ao se compararem as seqüências das duas moléculas em uma janela de comparação para identificar e comparar regiões locais de similaridade de seqüêncía. Uma “janela de comparação conforme usado no presente relatório, refere-se a um segmento conceituai de pelo menos 18 posições contíguas de nucleotídio ou 6 aminoácidos em que uma seqüência de polinucleotídio ou seqüência de aminoácido pode ser comparada a uma seqüência de referência de pelo menos 18 nucleotídios contíguos ou 6 seqüências de aminoácido e em que a parte da seqüência de polinucleotídio na janela de comparação pode compreender adições, apagamentos, substituições e outros do gênero (isto é, lacunas) de 20 porcento ou menos se comparada à seqüência de referência (que não compreende adições ou apagamentos) para o alinhamento ótimo das seqüências. O alinhamento ótimo das duas seqüências para alinhar uma janela de comparação pode ser conduzido pelo algoritmo de homologia local de Smith e Waterman Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), pelo algoritmo alinhado de homologia de Needleman e Wunsch J. Mol. Biol.

48: 443 (1970), pela busca do método de similaridade de Pearson e Lipman

Proc. Nati. Acad Sei. (U.S.A.) 85:2444 (1988), pelas implementações computadorizadas desses algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Versão 7.0 (Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), pacotes de software Geneworks, ou

MacVector), ou por inspeção, e o melhor alinhamento (isto é, que resulta na porcentagem mais alta de homologia na janela de comparação) gerado pelos vários métodos é selecionado.

O termo identidade de seqüência quer dizer que duas seqüências de polinucleotídio ou aminoácido são idênticas (isto é, em uma base nucleotídio por nucleotídio ou resíduo por resíduo) na janela de comparação. O termo porcentagem de identidade de seqüência é calculado ao se compararem duas seqüências otimamente alinhadas na janela de comparação, determinar o número de posições a que a base ácido nucléica idêntica (por exemplo, A, T, C, G, U ou I) ou resíduo ocorre em ambas as seqüências para se obter o número de posições correspondentes, dividir o número das posições correspondentes pelo número total de posições na janela de comparação (isto é, tamanho da janela) e multiplicar o resultado por 100 para se obter a porcentagem da identidade de seqüência. Os termos identidade substancial, conforme usado no presente relatório denota uma característica de uma seqüência de polinucleotídio ou aminoácido, em que o polinucleotídio ou aminoácido compreende uma seqüência que tenha pelo menos 85 porcento de identidade de seqüência, de preferência, pelo menos 90 a 95 porcento de identidade de seqüência, mais usualmente, peio menos 99 porcento de identidade de seqüência comparada a uma seqüência de referência em uma janela de comparação de pelo menos 18 posições de nucleotídio (6 de aminoácido), freqüentemente em uma janela de pelo menos 24-48 posições de nucleotídio (8-16 de aminoácido), em que a porcentagem da identidade da seqüência é calculada ao se comparar a seqüência de referência à seqüência que pode incluir pagamentos ou adições que totalizam 20 porcento ou menos da seqüência de referência na janela de comparação. A seqüência de referência pode ser um subconjunto de uma seqüência maior.

Conforme usado no presente relatório, os vinte aminoácidos convencionais e suas abreviações seguem o uso convencional. Vide Immunology-A Synthesis (2^S Edição, E. S. Golub e D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), que está incorporado no presente relatório a título de referência. Os estereoisômeros (por exemplo, Daminoácidos) dos vinte aminoácidos convencionais, aminoácidos não-natura is, tais como a-, aminoácidos α-dissubstituídos, aminoácidos de N-alquila, ácido fático, e outros aminoácidos não-convencionais podem ser também componentes adequados para os polipeptídios da presente invenção. Exemplos de aminoácidos não-convencionais incluem 4-hidroxiprolina, γcarboxiglutamato, ε-Ν,Ν,Ν-trimetilisina, ε-Ν-acetilisina, O-fosfosserina, Nacetilserina, N-formilmetionina, 3-metiiistidina, 5-hidroxilisina, σ-Νmetilarginina, e outros aminoácidos similares e iminoácidos (por exemplo, 4hidroxiprolina). Na notação de polipeptídio usada no presente relatório, a direção esquerda é a direção amino terminal e a direção direita é a direção carbóxi-terminal, de acordo com o uso padrão e convenção.

De modo similar, a menos que especificado de outro modo, a extremidade esquerda de seqüências de polinucleotídio de cordão simples é a extremidade 5’; a direção direita de seqüências de polinucleotídio é referida como a direção 5’. A direção de adição de 5’ para 3’ de transcrições de RNA nascentes é referida como a direção de transcrição; as regiões de seqüência do cordão de DNA que têm a mesma seqüência que o RNA e que são a extremidade 5’ para 5’ da transcrição de RNA são referidas como as seqüências a montante, as regiões de seqüência no cordão de DNA que têm a mesma seqüência que o RNA e que são a extremidade 3’ para 3’ da transcrição de RNA são referidas como seqüências a jusante.

Conforme aplicado aos polipeptídios, o termo identidade substancial quer dizer que duas seqüências de peptídio, quando otimamente alinhadas, tal como pelos programas GAP ou BESTFIT com o uso de pesos de lacuna padrão, partilham pelo menos 80 porcento de identidade de seqüência, de preferência, pelo menos 90 porcento de identidade de seqüência, com maior preferência, pelo menos 95 porcento de identidade de seqüência e, com a máxima preferência, pelo menos 99 porcento de identidade de seqüência. De preferência, as posições de resíduo que não são idênticas diferem por substituições conservadoras de aminoácido. As substituições conservadoras de aminoácido se referem à intercambialidade de resíduos que têm cadeias laterais similares. Por exemplo, um grupo de aminoácidos com cadeias laterais alifáticas é glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; um grupo de aminoácidos com cadeias laterais alifáticas-hidroxila é serina e treonina; um grupo de aminoácidos que têm cadeias laterais que contêm amida é aspargina e glutamina; um grupo de aminoácidos que tem cadeias laterais aromáticas é fenilalanina, tirosina e triptofan; um grupo de aminoácidos que tem cadeias laterais básicas é lisina, arginina e histidina; e um grupo de aminoácidos que tem cadeias laterais que contêm enxofre é cisteína e metionina. Os grupos preferidos de substituição conservadora de aminoácidos são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutâmico-aspártico e asparagina-glutamina.

Conforme discutido no presente relatório, variações menores nas seqüências de aminoácido de anticorpos ou moléculas de imunoglobulina são contempladas como sendo abrangidas pela presente invenção, contanto que as variações na seqüência de aminoácido mantenha pelo menos 75%, com maior preferência, pelo menos 80%, 90%, 95% e, com a máxima preferência, 99%. Em particular, substituições conservadoras de aminoácido são contempladas. As substituições conservadoras são as que ocorrem em uma família de aminoácidos relatados em suas cadeias laterais. Os aminoácidos geneticamente codificados são geralmente divididos em famílias: (1) ácidos = aspartato, glutamato; (2) básicos = lisina, arginina, histidina; (3) não-polares = alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofan e (4) polares não carregados = glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. As famílias de máxima preferência são: serina e treonina são a família alifática-hidróxi; asparagina e glutamina são uma família que contém amida; alanina, valina, leucina e isoleucina são uma família alifática; e fenilalanina, triptofan e tirosina são uma família aromática. Por exemplo, é razoável esperar que uma substituição isolada de uma leucina com uma isoleucina ou valina, um aspartato com um glutamato, uma treonina com uma serina, ou uma substituição similar de um aminoácido com um aminoácido estruturalmente relatado não terá um efeito maior na aglomeração ou propriedades da molécula resultante, especialmente se a substituição não envolver um aminoácido em um ponto de estrutura. Se uma alteração de aminoácido resultar em um peptídio funcional pode prontamente ser determinado por ensaio da atividade específica do derivado de polipeptídio. Os ensaios são descritos detalhadamente no presente relatório.

Os fragmentos ou análogos de anticorpos ou moléculas de imunoglobulina podem ser prontamente preparados por aqueles versados na técnica. Os términos amino- e carbóxi- preferidos de fragmentos ou análogos ocorrem próximo aos limites de domínios funcionais. Os domínios estruturais e funcionais podem ser identificados por comparação dos dados da seqüência de nucleotídio e/ou aminoácido a bancos de dados públicos ou particulares. De preferência, métodos de comparação computadorizados são usados para identificar motivos de seqüência ou domínios de conformação de proteína predita que ocorrem nas proteínas de estrutura e/ou função conhecida. Os métodos para identificar as seqüências de proteína que se dobram em uma estrutura tridimensional conhecida são conhecidos. Bowie et al. Science 253: 164 (1991). Deste modo, os exemplos precedentes demonstram que aqueles versados na técnica podem reconhecer motivos de seqüência e conformações estruturais que podem ser usados para definir domínios estruturais e funcionais de acordo com a presente invenção.

As substituições de aminoácido preferidas são as que: (1) reduzem a suscetibilidade à proteólise, (2) reduzem a não suscetibilidade à oxidação, (3) alteram a afinidade de aglomeração para formar complexos de proteína, (4) alteram as afinidades de aglomeração, e (5) conferem ou modificam outras propriedades físico-químicas ou funcionais desses análogos. Os análogos podem incluir várias muteínas de uma seqüência diferente da seqüência de peptídio que ocorre naturalmente. Por exemplo, as substituições simples ou múltiplas de aminoácido (de preferência, substituições conservadoras de aminoácido) podem ser feitas na seqüência que ocorre naturalmente (de preferência, na parte do polipeptídio fora do(s) domínio(s) que forma(m) contatos intermoleculares. Uma substituição de aminoácido conservadora não deve substancialmente alterar as características estruturais da seqüência-pai (por exemplo, um aminoácido de substituição não deve tender a romper uma hélice que ocorre na seqüência-pai, ou interromper outros tipos de estrutura secundária que caracteriza a seqüência-pai). Exemplos de estruturas secundárias e terciárias de polipeptídio reconhecidas pela técnica são descritas em Proteins, Structures and Molecular Princi32 pies (Creíghton, Ed. W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden e J. Tooze, eds, Garland Publíshing, New York, N.Y. (1991)); e Thornton et al. Nature 354:105 (1991); que estão incorporadas no presente relatório a título de referência.

O termo fragmento de polipeptídio, conforme usado no presente relatório, refere-se a um polipeptídio que tem um apagamento aminoterminal e/ou carbóxi-terminal, mas onde a seqüência de aminoácido remanescente é idêntica às posições correspondentes na seqüência que ocorre naturalmente deduzidas, por exemplo, de uma seqüência de cDNA de com10 primento total. Os fragmentos tipicamente têm pelo menos 5, 6, 8 ou 10 aminoácidos de comprimento, de preferência, pelo menos 14 aminoácidos de comprimento, com maior preferência, pelo menos 20 aminoácidos de comprimento, geralmente pelo menos 50 aminoácidos de comprimento e ainda com maior preferência, pelo menos 70 aminoácidos de comprimento. O ter15 mo análogo conforme usado no presente relatório refere-se a polipeptídios que compreendem um segmento de pelo menos 25 aminoácidos que tem identidade substancial a uma parte de uma seqüência de aminoácido deduzida e que tem pelo menos uma das seguintes propriedades: (1) aglomeração específica ao CTLA-4, sob condições de aglomeração adequadas, (2) capacidade de bloquear a aglomeração ao CTLA-4 com seus receptores, ou (3) capacidade de inibir o desenvolvimento da célula de expressão de CTLA4 in vitro ou in vivo. Tipicamente, os análogos de polipeptídio compreendem uma substituição conservadora de aminoácido (ou adição ou apagamento) com relação à seqüência que ocorre naturalmente. Os análogos têm tipica25 mente pelo menos 20 aminoácidos de comprimento, de preferência, pelo menos 50 aminoácidos de comprimento ou mais, e podem frequentemente ser tão longos quanto um polipeptídio de comprimento total que ocorre naturalmente.

Os análogos de peptídio são comumente usados na indústria farmacêutica como drogas que não de peptídio com propriedades análogas às do peptídio de modelo. Esses tipos de composto que não de peptídio recebem o termo mímicas de peptídio ou peptidomímicas. Fauchere, J.

Adv. Drug Res. 15: 29 (1986); Veber e Freidinger TINS p. 392 (1985); e Evans et al. J. Med. Chem. 30: 1229 (1987), que estão Incorporados no presente relatório a título de referência. Esses compostos são freqüentemente desenvolvidos com o auxílio de modelagem molecular computadorizada. As mímicas de peptídio que são estruturalmente similares aos peptídios terapeuticamente úteis podem ser usadas para produzir um efeito terapêutico ou profilático equivalente. Geralmente, as peptidomímicas são estruturalmente similares a um polipeptídio paradigma (isto é, um polipeptídio que tem uma propriedade bioquímica ou atividade farmacológica), tal como um anticorpo humano, mas têm uma ou mais ligações de peptídio opcionalmente substituídas por uma ligação selecionada do grupo que consiste em -CH₂NH-, -CH₂S-, -CH₂- CH₂-, -CH=CH-(cis e trans), -COCH₂-, -CH(OH)CH₂- e -CH₂SO-, por métodos bem-conhecidos na técnica. A substituição sistemática de um ou mais aminoácidos de uma seqüência de consenso com um Daminoácido do mesmo tipo (por exemplo, D-lisina no lugar de L-lisina) pode ser usada para gerar peptídios mais estáveis. Além disso, os peptídios limitados que compreendem uma variação de seqüência de consenso ou seqüência de consenso substanciaímente idêntica podem ser gerados por métodos conhecidos na técnica (Rizo e Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61: 387 (1992), incorporada no presente relatório a título de referência); por exemplo, ao adicionar resíduos de cisteína internos capazes de formar pontes de dissulfeto intramoleculares que ciclizam o peptídio.

Anticorpo ou peptídio(s) de anticorpo referem-se a um anticorpo intacto, ou um de seus fragmentos de aglomeração que compete com o anticorpo intacto para aglomeração específica. Os fragmentos de aglomeração são produzidos por técnicas de DNA recombinante, ou por clivagem enzimática ou química de anticorpos intactos. Os fragmentos de aglomeração incluem anticorpos Fab, Fab’, F(abj₂, Fv e de cadeia simples. Entendese que um anticorpo que não seja um anticorpo biespecífico ou “bifuncional tenha cada um de seus pontos de aglomeração idêntico. Um anticorpo substanciaímente inibe a adesão de um receptor a um contra-receptor quando um excesso de anticorpo reduz a quantidade de receptor ligada ao con34 tra-receptor em pelo menos cerca de 20%, 40%, 60% ou 80% e, mais geralmente, mais que cerca de 85% (conforme medido em um ensaio de aglomeração competitiva in vitro).

O termo epítopo inclui qualquer determinante de proteína capaz de aglomeração específica a um receptor de imunoglobulina ou célula T. Os determinantes epitópicos geralmente consistem em agrupamentos de superfície quimicamente ativos de moléculas tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e usualmente têm características estruturais tridimensionais, bem como características de carga específica. Diz-se que um anticorpo especificamente se aglomera a um antígeno quando a constante de dissociação é < 1 μΜ, de preferência, < 100 nM e, com a máxima preferência, < 10 nM.

O termo agente é usado no presente relatório para denotar um composto químico, uma mistura de compostos químicos, uma macromolécula biológica ou um extrato feito de materiais biológicos.

Conforme usado no presente relatório, os termos etiqueta ou etiquetado refere-se à incorporação de um marcador detectável, por exemplo, pela incorporação de um aminoácido radioetiquetado ou fixação a um polipeptídio de porções de biotinila que podem ser detectadas por avidina marcada (por exemplo, estreptavidina que contém um marcador fluorescente ou atividade enzimática que possa ser detectada por métodos óticos ou colorimétricos). Em certas situações, a etiqueta ou marcador pode também ser terapêutico. Vários métodos de etiquetar polipeptídios e glicoproteínas são conhecidos na técnica e podem ser usados. Exemplos de etiquetas para polipeptídios incluem, mas sem limitação, os seguintes: radioisótopos ou radioinuclídios (por exemplo, ³H, ¹⁴C, ¹⁵N, ³⁵S, ⁹⁰Y, Tc, ¹¹¹ln, ¹²⁵l, ¹³¹l), etiquetas fluorescentes (por exemplo, FITC, rodamina, fósforos de lantanida), etiquetas enzimáticas (por exemplo, peroxidase de rábano-silvestre, βgalactosidase, luciferase, fosfatase alcalina), grupos biotinila quimiluminescentes, epítopos de polipeptídio predeterminados reconhecidos por um repórter secundário (por exemplo, seqüências de par de zíper de leucina, pontos de aglomeração para anticorpos secundários, domínios de aglomera35 ção de metal, etiquetas de epítopo). Em algumas modalidades, as etiquetas são fixadas por braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir o impedimento estérico potencial.

O termo agente ou droga farmacêutica, conforme usado no presente relatório, refere-se a um composto químico ou composição capaz de induzir um efeito terapêutico desejado quando devidamente administrado a um paciente. Outros termos químicos no presente relatório são usados de acordo com o uso convencional na técnica, conforme exemplificado pelo The McGraw-Hiil Dictionary of Chemical Terms (Parker, S. Ed., McGraw-Hiil, San Francisco (1985)), incorporado no presente relatório a título de referência.

O termo agente antineoplástico está usado no presente relatório para se referir a agentes que têm propriedade funcional de inibir um desenvolvimento ou progressão de um neopiasma em um ser humano, particularmente uma lesão maligna (cancerosa), tal como carcinoma, sarcoma, linfoma ou leucemia. A inibição de metástase é freqüentemente uma propriedade de agentes antineoplásticos.

Conforme usado no presente relatório, substancialmente puro quer dizer que uma espécie de objeto é a espécie predominante presente (isto é, em uma base molar ele é mais abundante que qualquer outra espécie individual na composição) e, de preferência, uma fração substancialmente purificada é uma composição em que a espécie do objeto compreende pelo menos cerca de 50 porcento (em uma base molar) de todas as espécies macromoieculares presentes. Geralmente, uma composição substancialmente pura compreenderá mais que cerca de 80 porcento de todas as espécies macromoieculares presentes na composição, com maior preferência, mais que cerca de 85%, 90%, 95% e 99%. Com a máxima preferência, a espécie do objeto é purificada à homogeneidade essencial (a espécie contaminante não pode ser detectada na composição por métodos de detecção convencionais) em que a composição consiste essencialmente em uma única espécie macromolecular.

O termo paciente inclui sujeitos humanos e veterinários.

Estrutura do Anticorpo

Sabe-se que a unidade estrutural básica do anticorpo compreende um tetrâmero. Cada tetrâmero é composto de dois pares de cadeias de polipeptídio, sendo que cada par tem uma cadeia leve (cerca de 25 kDa) e uma cadeia pesada (cerca de 50-70 kDa). A parte amino-terminal de cada cadeia inclui uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos primariamente responsáveis pelo reconhecimento do antígeno. A parte carbóxi-terminal de cada cadeia define uma região constante primariamente responsável pela função do agente de efeito. As cadeias leves humanas são classificadas como cadeias leves kappa e lambda. As cadeias pesadas são classificadas como mu, delta, gama, alfa ou épsilon, e definem o isótipo do anticorpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. Em cadeias leves e pesadas, as regiões variáveis e constantes são unidas por uma região “J de cerca de .12 ou mais aminoácidos, sendo que a cadeia pesada também inclui uma região D de cerca de mais 10 aminoácidos. Vide genericamente Fundamental Immunology Cap. 7 (Paul, W., ed., 2’ ed. Raven Press, N.Y. (1989)) (incorporado a título de referência em sua totalidade para todos os fins). As regiões variáveis de cada par de cadeia leve/pesada formam o ponto de aglomeração de anticorpo.

Deste modo, um anticorpo IgG intacto tem dois pontos de aglomeração. Exceto em anticorpos bifuncionais ou biespecíficos, os dois pontos de aglomeração são os mesmos.

Todas as cadeias exibem a mesma estrutura geral de regiões de estrutura (FR) relativamente conservada unida por três regiões hipervariáveis, também chamadas regiões de determinação de complementaridade ou CDRs. As CDRs das duas cadeias de cada par são alinhadas pelas regiões de estrutura, que possibilita a aglomeração a um epítopo específico. De Nterminal para C-terminal, tanto as cadeias leves quanto as pesadas compreendem os domínios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. A designação de aminoácidos a cada domínio está de acordo com as definições de Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 e 1991)), ou Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:

901-917 (1987); Chothia et al. Nature 342: 878-883 (1989).

Um anticorpo biespecífico ou bifuncional é um anticorpo híbrido artificial com dois pares de cadeia leve/pesada diferentes e dois pontos diferentes de aglomeração. Os anticorpos biespecíficos podem ser produzidos por uma variedade de métodos que incluem a fusão de hibridomas ou ligação de fragmentos Fab’. Vide, por exemplo, Songsivilai & Lachmann Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990), Kostelny et al. J. Immunol. 148: 15471553 (1992). Além disso, os anticorpos biespecíficos podem ser formados como diacorpos (Holfiger et al. 'Díabodies¹: small bivalent and bispecific antibody fragments PNAS USA 90: 6444-6448 (1993)) ou Janusins (Traunecker et al. Bispecific single Chain molecules (Janusins) target cytotoxic lymphocytes on HIV infected cells EMBO J10:3655-3659 (1991) e Traunecker et al. Janusin: new molecular design for bispecific reagents Int J Câncer Suppl 7:51-52 (1992)). A produção de anticorpos biespecíficos pode ser um processo de trabalho relativamente intensivo comparado com a produção de anticorpos convencionais e rendimentos e grau de pureza são geralmente mais baixos para os anticorpos biespecíficos. Os anticorpos biespecíficos não existem na forma de fragmentos com um único ponto de aglomeração (por exemplo, Fab, Fab’ e Fv).

Anticorpos Humanos e Humanização de Anticorpos

Os anticorpos humanos evitam certos problemas associados com anticorpos que têm regiões variáveis ou constantes murinas e/ou de rato. A presença dessas proteínas murinas ou derivadas de ratos pode levar ao distanciamento rápido dos anticorpos ou pode levar à geração de uma resposta imune contra o anticorpo por um paciente. A fim de evitar a utilização de anticorpos murinos ou derivados de ratos, foi postulado que pode-se desenvolver anticorpos humanizados ou gerar anticorpos totalmente humanos através da introdução da função de anticorpo humano em um roedor de modo que o roedor produziría anticorpos com seqüências totalmente humanas.

Anticorpos Humanos

A capacidade de clonar e reconstruir locais humanos dimensio38 nados por megabase em YACs e introduzi-los na linha de germe do camundongo provê uma poderosa abordagem para elucidar os componentes funcionais de locais muito grandes ou cruelmente mapeados bem como gerar modelos úteis de doença humana. Além disso, a utilização dessa tecnologia para a substituição de locais do camundongo com seus equivalentes humanos poderia prover insights únicos para a expressão e a regulação de produtos do gene humano durante o desenvolvimento, sua comunicação com outros sistemas, e seu envolvimento em indução e progressão de doença.

Uma aplicação prática importante dessa estratégia é a humanização'¹ do sistema imune humoral do camundongo. A introdução de locais de imunoglobulina humana (Ig) em camundongos em que os genes das Ig endógenas foram desativados oferece a oportunidade de estudar a expressão subjacente programada dos mecanismos e a montagem de anticorpos bem como seu papel no desenvolvimento da célula B. Além disso, essa estratégia poderia prover uma fonte ideal para a produção de anticorpos monoclonais totalmente humanos (Mabs) um marco importante em direção ao cumprimento da promessa de terapia de anticorpo em doença humana. Espera-se que os anticorpos totalmente humanos minimizem as respostas imunogênicas e alérgicas intrínsecas a camundongo ou Mabs derivados de camundongo e, deste modo, aumentem a eficácia e segurança dos anticorpos ministrados. O uso de anticorpos totalmente humanos pode ser esperado para prover uma vantagem substancial no tratamento de doenças humanas crônicas e recorrentes, tais como inflamações, auto-imunidade e câncer, que requer administrações de anticorpo repetidas.

Uma abordagem para esta meta foi submeter à engenharia linhagens de camundongo deficientes na produção de anticorpo de camundongo com fragmentos grandes dos locais das Ig humanas em antecipação que esses camundongos produziríam um repertório grande de anticorpos humanos na ausência de anticorpos de camundongo. Os fragmentos das Ig humanos grandes preservariam a grande diversidade de gene variável bem como a devida regulação de produção e expressão de anticorpo. Ao explorar a maquinaria do camundongo para diversificação e seleção de anticorpo e a falta de tolerância imunológica às proteínas humanas, o repertório de anticorpo humano reproduzido nessas linhagens de camundongo deve render anticorpos de alta afinidade contra qualquer antígeno de interesse, inclusive antígenos humanos. O uso da tecnologia de hibridoma, Mabs humanos específicos de antígeno com a especificidade desejada poderia ser prontamente produzido e selecionado.

Esta estratégia geral foi demonstrada em conexão com nossa geração das primeiras linhagens de XenoMouse™ conforme publicado em 1994. Vide Green et al. Nature Genetics 7: 13-21 (1994). As linhagens de XenoMouse™ foram submetidas à engenharia com cromossomos artificiais de levedura (YACs) que continham 245 kb e 190 kb de fragmentos de configuração de linha de germe do local da cadeia pesada humana e local de cadeia leve kappa, respectivamente, que continha seqüências de região constante e variável de núcleo. Id. A Ig humana que contém YACs provou ser compatível com o sistema do camundongo tanto para a redisposição quanto para a expressão de anticorpos e foi capaz de substituição para os genes de Ig da camundongo inativados. Isto foi demonstrado por sua capacidade de induzir o desenvolvimento de célula B, produzir um repertório humano semelhante ao de adulto de anticorpos totalmente humanos, e gerar Mabs humanos específicos de antígeno. Esses resultados também sugeriram que a introdução de partes maiores dos locais da Ig humana que contêm números maiores de genes V, elementos reguladores adicionais, e as regiões constantes da Ig humana poderíam recapitular substancialmente o repertório completo que é característico da resposta humoral humana à infecção e imunização. O trabalho de Green et al. foi recentemente estendido para a introdução de mais que cerca de 80% do repertório de anticorpo humano através da introdução de fragmentos de YAC de configuração de linha de germe dimensionados com megabase dos locais de cadeia pesada humana e locais de cadeia leve kappa, respectivamente, para produzir camundongos XenoMouse™. Vide Mendez et al. Nature Genetics 15: 146-156 (1997), Green e Jakobovits J. Exp. Med. 188: 483-495 (1988) e Pedido de Depósito de Patente U.S. N⁹ de Série 08/759.620 depositada em 3 de de40 zembro de 1996, cujas descrições estão incorporadas aqui por referência.

Essa abordagem é adicionalmente discutida e delineada nos

Pedidos de Depósito de Patente U.S. N^es de Série 07/466.008, depositado em 12 de janeiro de 1990, 07/610.515, depositado em 8 de novembro de

1990, 07/919.297, depositado em 24 de julho de 1992, 07/922.649, depositado em 30 de julho de 1992, 08/031.801 depositado em 15 de março de 1993, 08/112.848, depositado em 27 de agosto de 1993, 08/234.145, depositado em 28 de abril de 1994, 08/376.279, depositado em 20 de janeiro de 1995, 08/430.938, depositado em 27 de abril de 1995, 08/464.584, deposita10 do em 5 de junho de 1995,08/464.582, depositado em 5 de junho de 1995, 08/463.191, depositado em 5 de junho de 1995, 08/462.837, depositado em 5 de junho de 1995, 08/486.853, depositado em 5 de junho de 1995, 08/486.857, depositado em 5 de junho de 1995, 08/486.859 depositado em 5 de junho de 1995, 08/462.513, depositado em 5 de junho de 1995,

08/724.752, depositado em 2 de outubro de 1996 e 08/759.620, depositado em 3 de dezembro de 1996. Vide também Mendez et al., Nature Genetics 15: 146-156 (1997) e Green e Jakobovits J. Exp. Med. 188: 483-495 (1998). Vide também Patente Européia N°. EP 0 463 151 B1, concessão publicada em 12 de junho de 1996, Pedido de Depósito de Patente Internacional N°.

WO 94/02602, publicado em 3 de fevereiro de 1994, Pedido de Depósito de Patente Internacional N° WO 96/34096, publicado em 31 de outubro de 1996 e WO 98/24893, publicado em 11 de junho de 1998. As descrições de cada uma das patentes acima citadas, pedidos de depósito e referências estão aqui incorporados por referência em sua totalidade.

Em uma abordagem alternativa, outras, inclusive a GenPharm

International, Inc., utilizaram uma abordagem minilocal. Na abordagem minilocal, um local da Ig exógena é imitado através da inclusão de peças (genes individuais) dos locais da Ig. Deste modo, um ou mais genes V_H, ou um ou mais genes Dh, um ou mais genes J_H, uma região constante um, e uma segunda região constante (de preferência, uma região constante gama) são formados em uma construção para a inserção em um animal. Esta abordagem é descrita na Patente U.S. N° 5.545.807 concedido a Surani et al. e

Patentes U.S. N°s. 5.545.806, 5.625.825, 5.625.126, 5.633.425, 5.661.016, 5.770.429, 5.789.650 e 5.814.318 cada uma concedida a Lonberg e Kay, Patente U.S. N°. 5.591.669 concedida a Krimpenfort e Berns, Patentes U.S. N°s. 5.612.205, 5.721.367, 5.789.215 concedida a Berns et al. e Patente U.S. N°. 5.643.763 concedida a Choi e Dunn, e Pedido de Depósito de Patente Internacional US da GenPharm N°s. de Série 07/574.748 depositada em 29 de agosto de 1990, 07/575.962 depositada em 31 de agosto de 1990, 07/810.279, depositada em 17 de dezembro de 1991,07/853.408 depositada em 18 de março de 1992, 07/904.068, depositada em 23 de junho de 1992, 07/990.860, depositada em 16 de dezembro de 1992, 08/053.131, depositada em 26 de abril de 1993, 08/096.762 depositada em 22 de julho de 1993, 08/155.301, depositada em 18 de novembro de 1993,08/161.739 depositada em 3 de dezembro de 1993, 08/165.699, depositada em 10 de dezembro de 1993, 08/209.741 depositada em 9 de março de 1994, cujas descrições estão incorporadas aqui por referência. Vide também Patente Européia N°. 0 546 073 B1, Pedidos de Depósito de Patente de Invenção internacional N°. WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852 e WO 98/24884 cujas descrições estão incorporadas aqui por referência em sua totalidade. Vide ainda Taylor et al., 1992, Chen et al., 1993, Tuaíllon et al., 1993, Choi et al., 1993, Lonberg et al., (1994), Taylor et al., (1994) e Tuaillon et al., (1995), Fishwild et al., (1996), cujas descrições estão incorporadas aqui por referência em sua totalidade.

Os inventores de Surani et al., citados acima e concedidos ao Medicai Research Counsel (o MRC), produziram um camundongo transgênico que tinha um locai de Ig através do uso da abordagem de minilocal. Os inventores no trabalho da GenPharm International, citados acima, Lonberg e Kay, seguindo a orientação dos presentes inventores, propuseram a desativação do local de Ig de camundongo endógena acoplada com duplicação substancial do trabalho de Surani et al.

Uma vantagem da abordagem de minilocal é a rapidez com que as construções que incluem partes do local de Ig podem ser geradas e intro42 duzidas em animais. Comensuradamente, no entanto, uma desvantagem significativa da abordagem de minilocal é que, na teoria, a diversidade insuficiente é introduzida através da inclusão de números pequenos de genes V, D e J. Na verdade, a obra publicada parece suportar esta preocupação. O desenvolvimento de célula B e a produção de anticorpo de animais produzidos através do uso da abordagem de minilocal parecem ameaçados. Por conseguinte, a pesquisa que cerca a presente invenção foi conseqüentemente dirigida para a introdução de partes grandes do local de Ig a fim de obter maior diversidade e em um esforço para reconstituir o repertório imune dos animais.

As respostas do anticorpo anticamundongo humano (HAMA) levaram a indústria a preparar anticorpos quiméricos ou humanizados de outro modo. Embora os anticorpos quiméricos tenham uma região constante humana e uma região variável de murinos, espera-se que certas respostas de anticorpo, antiquimérico humano (HACA) serão observadas, particularmente em utilizações crônicas ou multidose do anticorpo. Deste modo, seria desejável prover anticorpos totalmente humanos contra o CTLA-4 a fim de anular preocupações e/ou efeitos da resposta de HAMA ou HACA. Tecnologias de Humanização e Tela

Conforme foi discutido acima em conexão com a geração de anticorpo humano, há vantagens para a produção de anticorpos com imunogenicidade reduzida. Até um certo ponto, isto pode ser realizado em conexão com as técnicas de humanização e técnicas de tela com o uso de bibliotecas apropriadas. Será apreciado que anticorpos de murinos ou anticorpos de outras espécies podem ser humanizados ou primatizados com o uso de técnicas bem-conhecidas na técnica. Vide, por exemplo, Winter e Harrís Immunol Today 14; 43-46 (1993) e Wright et al, Crit. Reviews in Immunol. 12: 125-168 (1992). O anticorpo de interesse pode ser submetido à engenharia por técnicas de DNA recombinante para substituir os domínios de articulação CH1, CH2, CH3 e/ou o domínio da estrutura com a seqüência humana correspondente (vide WO 92/02190 e Patente U.S. N°s. 5.530.101, 5.585.089, 5.693.761, 5.693.792, 5.714.350 e 5.777.085). Da mesma forma, o uso de cDNA de Ig para a construção de genes de imunoglobulina quimérica é conhecido na técnica (Liu et al., P.N.A.S. 84:3439 (1987) e J. Immunol. 139: 3521 (1987)). O mRNA é isolado de um hibridoma ou outra célula que produza o anticorpo e usado para produzir cDNA. O cDNA de interesse pode ser amplificado pela reação em cadeia de polimerase com o uso de primers específicos (Patentes U.S. N°s. 4.683.195 e 4.683.202). Alternativamente, uma biblioteca é feita e passa por triagem para isolar a seqüência de interesse. A seqüência de DNA que codifica a região variável do anticorpo é então fundida às seqüências de região constante humana. As seqüências de genes de regiões constantes humanas podem ser encontradas em Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, N.I.H. publicação no. 91-3242. Os genes da região humana C estão prontamente disponíveis de clones conhecidos. A escolha de isótipo será guiada pelas funções do agente de efeito desejadas, tais como fixação de complemento, ou atividade em citotoxidade celular dependente de anticorpo. Os isótipos preferidos são lgG1, lgG2, lgG3 e lgG4. Os isótipos particülarmente preferidos para anticorpos da invenção são lgG2 e lgG4. Cada uma das regiões constantes de cadeia leve humana, kappa ou lambda, pode ser usada. O anticorpo humanizado quimérico é então expresso por métodos convencionais.

Os fragmentos de anticorpo, tais como Fv, F(ab’)₂ θ Fab podem ser preparados por divagem da proteína intacta, por exemplo, por protease ou divagem química. Alternativamente, um gene truncado é designado. Por exemplo, um gene quimérico que codifica uma parte do fragmento F(ab’)₂ incluiría seqüências de DNA que codificam o domínio CH1 e região de articulação da cadeia H, seguido por um códon de parada translacional para render a molécula truncada.

Em uma abordagem, as seqüências de consenso que codificam as regiões J de cadeia leve e pesada podem ser usadas para designar oligonucleotídios para uso como primers para introduzir pontos de restrição úteis na região J para subseqüente ligação de segmentos da região V aos segmentos da região C humana. O cDNA da região C pode ser modificado por mutagênese dirigido ao ponto para colocar um ponto de restrição na po44 sição análoga na seqüência humana.

Vetores de expressão incluem plasmídios, retrovírus, cosmídios, YACs, epissomos derivados de EBV, e outros do gênero. Um vetor conveniente é um que codifica uma seqüência de imunoglobulina CH ou CL humana funcionaimente completa, com pontos de restrição apropriados submetidos à engenharia de modo que qualquer seqüência de VH ou VL pode ser facilmente inserida e expressa. Nesses vetores, a emenda geralmente ocorre entre o ponto doador de emenda na região J inserida e o ponto aceitador de emenda que precede a região C humana, e também nas regiões de emenda que ocorrem nos éxons CH humanos. A poiiadenilação e a terminação da transcrição ocorrem em pontos cromossômicos nativos a jusante das regiões de codificação. O anticorpo quimérico resultante pode ser unido a qualquer promotor forte, inclusive LTRs retrovirais, por exemplo, o anteriormente promotor SV-40, (Okayama et al. Mol. Cell. Bio. 3:280 (1983)), LTR de vírus de sarcoma Rous (Gorman et al., P.N.A.S. 79: 6777 (1982)), e LTR de vírus da leucemia em murino (Grosschedi et al., Cell 41: 885 (1985)); promotores de Ig nativos, etc.

Além disso, os anticorpos humanos ou anticorpos de outras espécies podem ser gerados através de tecnologias do tipo tela, inclusive, sem limitação, tela de fagia, tela retrovirai, tela ribossomal, e outras técnicas, com o uso de técnicas bem-conhecidas na técnica e as moléculas resultantes podem ser sujeitas à maturação adicional, tal como maturação por afinidade, como as técnicas bem-conhecidas na técnica. Wright e Harris, supra., Hanes e Plucthau PNAS USA 94: 4937-4942 (1997) (tela ribossomal), Parmley e Smith Gene 73: 305-318 (1988) (tela de fagia), Scott TIBS 17; 241-245 (1992), Cwirla et al., PNAS USA 87: 6378-6382 (1990), Russel et al., Nucl. Acids Research 21:1081-1085 (1993), Hoganboom et al., Immunol. Reviews 130: 43-68 (1992), Chiswell e McCafferty TIBTECH 10: 80-84 (1992), e Patente U.S. N⁵ 5.733.743. Se as tecnologias de tela forem utilizadas para produzir anticorpos que não são humanos, esses anticorpos podem ser humanizados conforme descrito acima.

Com o uso dessas técnicas, os anticorpos podem ser gerados para células de expressão de CTLA-4, CTLA-4 mesmo, formas de CTLA-4, epítopos ou peptídios das mesmas, e bibliotecas de expressão a estas (vide, por exemplo, a Patente U.S. N°. 5.703.057) que pode posteriormente ser tríadas conforme descrito acima para as atividades descritas acima.

Critérios Adicionais para a Terapêutica de Anticorpo

Conforme será apreciado, geralmente não é desejável matar as células de expressão de CTLA-4. Em vez disso, geralmente se deseja simplesmente inibir a aglomeração de CTLA-4 com seus ligantes para mitigar a regulação descendente da célula T. Um dos mecanismos principais através dos quais os anticorpos matam as células é através da fixação de complemento e participação no CDC. A região constante de um anticorpo desempenha um papel importante em conexão com uma capacidade de o anticorpo fixar o complemento e participar no CDC. Deste modo, geratmente se seleciona o isótipo de um anticorpo para prover a capacidade de fixação do complemento ou não. No caso da presente invenção, geralmente, conforme mencionado acima, geralmente não se prefere utilizar um anticorpo que mata as células. Há vários isotipos de anticorpos capazes de fixação de complemento e CDC, inclusive, sem limitação, o seguinte: IgM de murinos, lgG2a de murinos, lgG2b de murinos, lgG3 de murinos, IgM humano, lgG1 humano e lgG3 humano. Esses são os isotipos que não incluem, sem limitação, lgG2 humano e lgG4 humano.

Será apreciado que os anticorpos gerados não possuem inicialmente um isótipo desejado particular, mas em vez disso, o anticorpo conforme gerado pode possuir qualquer isótipo e o anticorpo pode ser isótipo intercalado após o uso de técnicas convencionais que são bem-conhecidas na técnica. Essas técnicas incluem o uso de técnicas de recombinante direto (vide, por exemplo, Patente U.S. N°. 4.816.397), técnica de fusão célulacéluia (vide, por exemplo, Pedido de Depósito de Patente U.S. N°. 08/730.639 depositado em 11 de outubro de 1996), entre outros.

Na técnica de fusão célula-céluia, um mieloma ou outra linha de célula é preparada que tem uma cadeia pesada com qualquer isótipo desejado e outro mieloma ou outra linha de célula é preparada que tem a cadeia leve. Essas células podem, em seguida, ser fundidas e uma linha de célula que expressa um anticorpo intacto pode ser isolada.

A título de exemplo, a maior parte dos anticorpos CTLA-4 discutidos no presente relatório são anticorpo lgG2 antiCTLA-4. Uma vez que esses anticorpos têm aglomeração desejada à molécula de CTLA-4, qualquer um desses anticorpos pode ser prontamente isótipo intercalado para gerar um isótipo lgG4 humano, por exemplo, enquanto ainda têm a mesma região variável (que define a especificidade do anticorpo e um pouco de sua afinidade).

Conseqüentemente, quando os candidatos a anticorpo são gerados que atendem aos atributos estruturais desejados, conforme discutido acima, eles podem ser geralmente providos com pelo menos certos atributos funcionais adicionais desejados através da intercalação de isótipo.

Projeto e Geração de Outras Terapêuticas

De acordo com a presente invenção e com base na atividade dos anticorpos produzidos e caracterizados no presente relatório com relação ao CTLA-4, o projeto de outras modalidades terapêuticas inclusive outros anticorpos, outros antagonistas, ou porções químicas que não anticorpos é facilitado. Essas modalidades incluem, sem limitação, anticorpos com atividade ou funcionalidade de aglomeração similar, terapêutica de anticorpo avançada, tal como anticorpos biespecíficos, imunotoxinas, e terapêutica radioetiquetada, geração de terapêutica de peptídio, terapias de gene, particularmente intracorpos, terapêutica anti-sentido, e moléculas pequenas. Além disso, conforme discutido acima, a função do agente de efetuação dos anticorpos da invenção pode ser alterada por intercalação de isótipo a um lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgD, IgA, IgE ou IgM para vários usos terapêuticos.

Em conexão com a geração de terapêutica de anticorpo avançada, onde a fixação de complemento for um atributo desejável, pode ser possível evitar a dependência de complemento para matar a célula através do uso de biespecíficos, imunotoxinas ou radioetiquetas, por exemplo.

Em conexão com anticorpos biespecíficos, os anticorpos biespecíficos podem ser gerados que compreendem: (i) dois anticorpos, um com uma especificidade a CTLA-4 e outro a uma segunda molécula que são conjugados entre si, (ii) um único anticorpo que tem uma cadeia específica para CTLA-4 e uma segunda cadeia específica para uma segunda molécula, ou (iii) um único anticorpo de cadeia que tenha especificidade a CTLA-4 e a outra molécula. Esses anticorpos biespecíficos podem ser gerados com o uso de técnicas bem-conhecidas, por exemplo, em conexão com (i) e (ii), vide, por exemplo, Fanger et al., Immunol Methods 4: 72-81 (1994) e Wright e Harris, supra e em conexão com (iii), vide, por exemplo, Traunecker et al. Int. J. Câncer (Suppl.) 7:51-52 (1992).

Além disso, Kappabodies (III et al. Design and construction of a hybrid immunoglobulin domain with properties of both heavy and light chain variabie regions Protein Eng 10: 949-57 (1997)), Minibodies (Martin et al., The affinity-selection of a minibody polypeptide inhibitor of human interleukin-6 EMBO J 13:5303-9 (1994)), Diabodies (Holliger et al. Oiabodies’: small bivalent and bispecific antibody fragments PNAS USA 90: 6444-6448 (1993)), ou Janusins (Traunecker et al. “Bispecific single chain molecules (Janusins) target cytotoxic lymphocytes on HIV infected cells EMBO J 10: 3655-3659 (1991) e Traunecker et al. Janusin: new molecular design for bispecific reagents Int J Câncer Suppl 7: 51-52 (1992)) pode também ser prepardo.

Em conexão com as imunotoxinas, os anticorpos podem ser modificados para agir como imunotoxinas que utilizam técnicas bemconhecidas na área. Vide, por exemplo, Vitetta Immunol Today 14: 252 (1993). Vide também Patente U.S. N°. 5.194.594. Em conexão com a preparação de anticorpos radioetiquetados, esses anticorpos modificados pode também ser prontamente preparados com a utilização de técnicas bemconhecidas na área. Vide, por exemplo, Junghans et al. em Câncer Chemoíherapy and Biotherapy 655-686 (2⁹ edição, Chafnerand Longo, eds., Lippincott Raven (1996)). Vide também Patentes U.S. N°s. 4.681.581, 4.735.210, 5.101.827, 5.102.990 (RE 35.500), 5.648.471 e 5.697.902. Cada uma das imunotoxinas e moléculas radioetiquetadas provavelmente mataria as células que expressam CTLA-4 e particularmente aquelas células em que os anticorpos da invenção são eficientes.

Em conexão com a geração de peptídios terapêuticos, através da utilização de informação estrutural relacionada a CTLA-4 e anticorpos a este, tais como os anticorpos da invenção (conforme discutido abaixo em conexão com moléculas pequenas) ou triagem de bibliotecas de peptídio, os peptídios terapêuticos podem ser gerados sendo dirigidos contra CTLA-4. O projeto e a triagem terapêutica de peptídio são discutidos em conexão com Houghten et al. Biotechniques 13:412-421 (1992), Houghten PNAS USA 82: 5131-5135 (1985), Pinalla et al. Biotechniques 13: 901-905 (1992), Blake e Litzi-Davis BioConjugate Chem. 3: 510-513 (1992). As imunotoxinas e moléculas radioetiquetadas podem também ser preparadas e, de uma maneira similar, em conexão com porções peptídicas, conforme discutido acima em conexão com os anticorpos.

A informação importante relacionada à aglomeração de um anticorpo a um antígeno pode ser compilada através de experimentação de tela de fagia. Esses experimentos são geralmente realizados através de tomada panorâmica de uma biblioteca de fagia que expressa peptídios aleatórios para aglomeração com os anticorpos da invenção para determinar se os peptídios podem ser isolados de tal aglomeração. Se for bem sucedido, certa informação de epítopo pode ser compilada dos peptídios que se aglomeram.

Em geral, as bibliotecas de fagia que expressam peptídios aleatórios podem ser compradas da New England Biolabs (bibliotecas 7-mer e 12-mer, Kit de Biblioteca Ph.D.-7 Peptide 7-mer e Kit de Biblioteca Ph.D.-12 Peptide 12-mer, respectivamente) com base em um sistema de bacteriofagia M13. A biblioteca 7-mer representa uma diversidade de cerca de 2,0 χ 10⁹ clones independentes, que representa a maior parte, se não for tudo, das 20⁷ = 1,28 x 10⁹ seqüências 7-mer possíveis. A biblioteca 12-mer contém cerca de 1,9 x 10⁹ clones independentes e representa somente uma amostragem muito pequena do espaço da seqüência potencial de 20¹² = 4,1 x 10¹⁵ seqüências 12-mer. Cada uma das bibliotecas 7-mer e 12-mer são tomadas panoramicamente ou triadas de acordo com as recomendações do fabricante em que as chapas foram revestidas com um anticorpo para capturar o anticorpo apropriado (um IgG Fc anti-humano de cabra para um anticorpo IgG, por exemplo) seguido por lavagem. A fagia aglomerada é eluída com 0,2 M de glicina-HCI, pH 2,2. Após três rodadas de seleção/amplificação à estringência constante (0,5% Tween), através do uso de seqüenciamento de DNA, pode-se caracterizar clones das bibliotecas que são reativos com um ou mais dos anticorpos. A reatividade dos peptídios pode ser determinada por ELISA. Para uma discussão adicional de análise de epítopo de peptídios vide também Scott, J. K. e Smith, G. P Science 249; 386-390 (1990); Cwírla et al. PNAS USA 87: 6378-6382 (1990); Felici et al. J. Mol. Biol. 222: 301-310 (1991) e Kuwabara et al. Nature Biotechnology 15: 74-78 (1997).

O projeto de gene e/ou terapêutico anti-sentido através de técnicas convencionais também é facilitado através da presente invenção. Essas modalidades podem ser utilizadas para a modulação da função de CTLA-4. Em conexão com esta, os anticorpos da presente invenção facilitam o projeto e uso de ensaios funcionais relacionados a esta. Um projeto e estratégia para a terapêutica anti-sentido é discutido detalhadamente no Pedido de Depósito de Patente Internacional N°. WO 94/29444. O projeto e as estratégias para a terapia de gene são bem-conhecidos. No entanto, em particular, o uso de técnicas terapêuticas de gene que envolvem intracorpos poderia provar ser particularmente vantajoso. Vide, por exemplo, Chen et al. Human Gene Therapy 5: 595-601 (1994) e Marasco Gene Therapy 4: 11-15 (1997). O projeto geral de terapêutica de gene e considerações relacionadas à mesma também são discutidos no Pedido de Depósito de Patente Internacional N°. WO 97/38137. Os materiais genéticos que codificam um anticorpo da invenção (tal como o 4.1.1, 4.8.1 ou 6.1.1, ou outros) podem ser inclusos em um sistema de expressão adequado (seja viral, viral atenuado, não viral, nu ou de outro modo) e ministrados a um hospedeiro para a geração in vivo do anticorpo no hospedeiro.

A terapêutica de molécula pequena pode também ser prevista de acordo com a presente invenção. As drogas podem ser designadas para modular a atividade de CTLA-4 com base na presente invenção. O conhecimento compilado da estrutura da molécula de CTLA-4 e suas interações com outras moléculas de acordo com a presente invenção, tais como anticorpos da invenção, CD28, B7, B7-1, B7-2 e outros podem ser utilizados para racionalmente designar modalidades terapêuticas adicionais. A este respeito, técnicas de projeto de droga racional tais como cristalografia por raio X, modelo molecular auxiliado (ou assistido) por computador (CAMM), relação quantitativa ou qualitativa de estrutura-atividade (QSAR) e tecnologias similares podem ser utilizadas para focar esforços de descoberta de drogas. O projeto racional permite a predição de estrutura de proteína ou sintética que pode interagir com a molécula ou formas específicas desta que pode ser usada para modificar ou modular a atividade do CTLA-4. Essas estruturas podem ser sintetizadas quimicamente ou expressas em sistemas biológicos. Esta abordagem foi revista em Capsey et al. Genetically Engineered Human Therapeutic Drugs (Stockton Press, NY (1988)). Na verdade, o projeto racional de moléculas (sejam peptídios, peptidomimética, moléculas pequenas ou algo do gênero) com base em relações estrutura-atividade conhecidas ou delineadas com outras moléculas (tais como anticorpos de acordo com a invenção) tornou-se geralmente rotina. Vide, por exemplo, Fry et al. Specific, irreversible inactivation of the epidermal growth factor receptor and erbB2, by a new class of tyrosine kinase inhibitor Proc Natl Acad Sei U S A 95:12022-7 (1998); Hoffman et al. A model of Cdc25 phosfatase catalytic domain and Cdk-interaction surface based on the presence of a rhodanese homology domain'¹ J Mol Biol 282: 195-208 (1998); Ginalski et al. Modelling of active forms of protein kinases: p38 - a case study Acta Biochim PolAA: 557-64 (1997); Jouko et al. Identification of csk tyrosine phosphorilation sites and a tyrosine residue important for kinase domain structure. Biochem J 322: 927-35 (1997); Singh et al. Structure-based design of a potent, selective, and irreversible inhibitor of the catalytic domain of the erbB receptor subfamily of protein tyrosine kinases J Med Chem 40: 1130-5 (1997); Mandei et al. ABGEN: a knowledge based automated approach for antibody structure modeling Nat Biotechno 14: 323-8 (1996); Monfardini et al. Rationa! design, analysis, and potential utility of GM-CSF antagonists Proc Assoe Am Physicians 108: 420-31 (1996); Furet et al. Modelling study of protein kinase inhibitors: binding mode of staurosporine and origin of the seiectivity of CGP 52411 J Comput Aided Mol Des 9:465-72 (1995).

Além disso, as bibliotecas combinatórias podem ser designadas e sintetizadas e usadas em programas de triagem, tais como tentativas de triagem de alta produtividade operacional.

Administração Terapêutica e Formulações

Será apreciado que a administração de entidades terapêuticas, de acordo com a invenção, serão ministradas com carreadores adequados, excipientes e outros agentes incorporados às formulações para prover transferência, entrega, tolerância, e outros do gênero. Uma diversidade de formulações apropriadas pode ser encontrada no formulário conhecido de todos os químicos farmacêuticos: Remington’s Pharmaceutical Sciences (15⁵ ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975)), particularmente Capítulo 87, por Blaug, Seymour, no mesmo. Essas formulações incluem, por exemplo, pós, pastas, ungüentos, geléias, ceras, óleos, lipídios, lipídio (catiônico ou aniônico) que contém vesículas (tais como Lipofectin™), conjugados de DNA, pastas de absorção anidra, emulsões de óleo-em-água e água-emóleo, emulsões carbocera (glicóis de polietileno de vários pesos moleculares), géis semi-sóiidos e misturas semi-sólidas que contêm carbocera. Qualquer uma das misturas precedentes pode ser apropriada em tratamentos e terapias de acordo com a presente invenção, contanto que o ingrediente ativo na formulação não seja desativado pela formulação e a formulação seja fisiologicamente compatível e tolerável com a rota de administração. Vide também Powell et al. Compendium of excipients for parenteral formulations PDA J Pharm Sei Technol. 52:238-311 (1998) e as citações no mesmo para obter informação adicional relacionada a excipientes e carreadores bemconhecidos dos químicos farmacêuticos.

Preparação de Anticorpos

Os anticorpos, de acordo com a invenção, são, de preferência, preparados através da utilização de camundongo transgênico que tenha uma parte substancial do anticorpo humano que produz genoma inserido, mas que seja rendido deficiente na produção de anticorpos de murino endógenos. Esses camundongos então são capazes de produzir moléculas de imunoglobulina humana e anticorpos e são deficientes na produção de moléculas de imunoglobulina de murino e anticorpos. As tecnologias utilizadas para obter as mesmas são descritas nas patentes, pedidos de depósito e referências descritas nos Fundamentos, no presente relatório. Em particular, no entanto, uma modalidade preferida da produção transgênica de camundongos e anticorpos dos mesmos é descrita no Pedido de Depósito de Patente U.S. N° de Série 08/759.620, depositado em 3 de dezembro de 1996, cuja descrição está incorporada no presente relatório a título de referência. Vide também Mendez et al. Nature Genetics 15: 146-156 (1997), cuja descrição está incorporada no presente relatório a título de referência.

Através do uso dessa tecnologia, produziu-se anticorpos monoclonais totalmente humanos a uma variedade de antígenos. Essencialmente, imunizou-se linhas XenoMouse™ de camundongos com um antígeno de interesse, recuperou-se células linfáticas (tais como B-células) dos camundongos que expressam anticorpos, fundiu-se essas células com uma linha de célula do tipo mieióide para preparar linhas de célula de hibridoma imortal, e essas linhas de célula de hibridoma passam por triagem e são selecionadas para identificar as linhas de célula de hibridoma que produzem anticorpos específicos para o antígeno de interesse. Utilizou-se essas técnicas de acordo com a presente invenção para a preparação de anticorpos específicos para CTLA-4. No presente relatório, descreve-se a produção de linhas de célula múltiplas de hibridoma que produzem anticorpos específicos para CTLA-4. Além disso, é provido uma caracterização dos anticorpos produzidos por essas linhas de células, inclusive nucleotídios e análises de seqüência de aminoácido das cadeias pesada e leve desses anticorpos.

Os anticorpos derivados de linhas de célula de hibridoma discutidos no presente relatório são designados 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.13.1, 4.14.3, 6.1.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 e 12.9.1.1. Cada um dos anticorpos produzidos pelas linhas de célula anteriormente mencionadas são cadeias pesadas lgG2 ou lgG4 totalmente humanas com cadeias leves kappa humanas. Em geral, os anticorpos de acordo com a invenção têm afinidades muito altas, tipicamente tendo Kd’s de cerca de 10'⁹ a cerca de 10¹¹ M, quando medidos ou por fase sólida ou fase de solução.

Conforme será apreciado, os anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser expressos em linhas de célula diferentes das linhas de célula de hibridoma. As seqüências que codificam os cDNAs ou clones genômicos para os anticorpos particulares podem ser usadas para a transformação de células hospedeiras de mamíferos ou não mamíferos. A transformação pode ser por qualquer método conhecido para a introdução de polinucleotídios em uma célula hospedeira, inclusive, por exemplo, o embalamento do polinucleotídio em um vírus (ou em um vetor viral) e transdução de uma célula hospedeira com o vírus (ou vetor) ou por procedimentos de transfecção conhecidos na técnica, conforme exemplificado pelas Patentes U.S. N°s. 4.399.216, 4.912.040, 4.740.461 e 4.959.455 (patentes que estão incorporadas no presente relatório a título de referência). O procedimento de transformação usado depende do hospedeiro a ser transformado. Métodos para a introdução de polinucleotídios heterólogos em células de mamíferos são bem-conhecidos na técnica e incluem, sem limitação, transfecção mediada por dextrano, precipitação de fosfato de cálcio, transfecção mediada por polibreno, fusão de protoplasto, eletroporação, bombardeamento de partícula, encapsulação do(s) polinucleotídio(s) em lipossomos, conjugados de peptídio, dendrímeros e microinjeção direta do DNA nos núcleos.

As linhas de célula de mamíferos disponíveis como hospedeiras para expressão são bem-conhecidas na técnica e incluem muitas linhas de célula imortalizadas disponíveis junto à American Type Culture Collection (ATCC), inclusive, sem limitação, células de ovário de cobaia chinesa (CHO), células NSO₀, HeLa, células de rim de filhote de hamster (BHK), células de rim de macaco (COS), células de carcinoma hepatocelular humanas (por exemplo, Hep G2) e várias outras linhas de células. As células que não de mamíferos, inclusive, sem limitação, bactérias, levedura, inseto e plantas podem também ser usadas para expressar anticorpos recombinantes. A mutagênese dirigida ao ponto do domínio de CH2 do anticorpo para eliminar a glicosilação pode ser preferida a fim de impedir alterações ou na imunogenicidade, farmacocinética e/ou funções de efeitos que resultem de glicosilação não humana. Os métodos de expressão são selecionados ao se determinar qual sistema gera os níveis mais altos de expressão e produzem anticorpos com propriedades de aglomeração de CTLA-4 constitutivo.

Além disso, a expressão de anticorpos da invenção (ou outras de suas porções) de linhas de célula de produção pode ser intensificada com o uso de várias técnicas conhecidas. Por exemplo, a sitetase de glutamina e os sistemas de expressão do gene DHFR são abordagens comuns para intensificar a expressão sob certas condições. Os clones de célula de alta expressão podem ser identificados com o uso de técnicas convencionais, tais como clonagem de diluição limitada e tecnologia de Microdrop. O sistema GS é discutido no todo ou em parte em conexão com as Patentes Européias N°s. 0 216 846, 0 256 055 e 0 323 997 e Pedido de Depósito de Patente Europeu N°. 89303964.4.

Os anticorpos da invenção podem também ser produzidos transgenicamente através da geração de um mamífero ou planta que seja transgênico para as seqüências de cadeia pesada e leve de imunoglobulina de interesse e produção do anticorpo em uma forma recuperável das mesmas. Em conexão com a produção transgênica em mamíferos, anticorpos podem ser produzidos em e recuperados do leite de cabra, vaca, e outros mamíferos. Vide, por exemplo, Patentes U.S. N°s. 5.827.690, 5.756.687, 5.750.172 e 5.741.957.

Os anticorpos, de acordo com a presente invenção, foram analisados estrutural e funcionalmente. Em conexão com as estruturas dos anticorpos, as seqüências de aminoácido das cadeias pesada e kappa leve foram preditas com base nas seqüências de cDNA obtidas através de TA-PCR dos hibridomas. Vide Exemplos 3 e 4 e Figuras 1-8. O seqüencíamento nterminal dos anticorpos também foi conduzido em confirmação dos resultados discutidos nos Exemplos 3 e 4. Vide Exemplo 5 e Figura 9. As análises cinéticas dos anticorpos foram conduzidas para determinar afinidades. Vide Exemplo 2. Os anticorpos, de acordo com a invenção (e particularmente os anticorpos 4.1.1,4.8.1 e 6.1.1 da invenção) têm altas afinidades (4.1.1:1.63 X 10¹° 1/M; 4.8.1:3.54 X 10¹° 1/M; e 6.1.1:7.2 X 10⁹1/M). Aiém disso, os anticorpos foram analisados por focagem isoelétrica (IEF), redução de eletroforese de gel (SDS-PAGE), cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia líquida/espectroscopia de massa e espectroscopia de massa e produção de anticorpo pelos hibridomas foram avaliados. Vide Exemplo 6 e Figura 10.

Em conexão com a análise funcional de anticorpos de acordo com a presente invenção, esses anticorpos provaram ser inibidores potentes de CTLA-4 e sua aglomeração a seus ligantes da família B7 de moléculas. Por exemplo, os anticorpos de acordo com a presente invenção demonstraram bloquear a aglomeração de CTLA-4 a B7-1 ou B7-2. Vide Exemplo 7. Na verdade, muitos dos anticorpos de acordo com a presente invenção têm ICsoS nanomolares e subnanomolares com relação à inibição da aglomeração de CTLA-4 a B7-1 e B7-2. Além disso, os anticorpos da invenção têm excelente seletividade para CTLA-4 se comparados a CD28, CD44, B7-2 ou hlgG1. Vide Exemplo 8. A seletividade é uma razão que reflete o grau de aglomeração preferencial de uma molécula com um primeiro agente se comparada à aglomeração da molécula com uma segunda e opcionalmente outras moléculas. No presente relatório, a seletividade se refere ao grau de aglomeração preferencial de um anticorpo da invenção a CTLA-4 se comparada à aglomeração do anticorpo a outras moléculas tais como CD28, CD44, B7-2 ou hlgG1. Os valores da seletividade de anticorpos da invenção superiores a 500:1 são comuns. Os anticorpos da invenção também demonstraram induzir ou intensificar a expressão de certas citocinas (tais como IL-2 e IFN-γ) por células T cultivadas em um modelo de inflamação de célula T. Vide Exemplos 9 e 10 e Figuras 12-17. Além disso, espera-se que os anticorpos da invenção inibirão o crescimento de tumores em modelos de tumor in vivo apropriados. O projeto desses modelos é discutido nos Exemplos 11 e12.

Os resultados demonstraram, de acordo com a presente invenção, indicar que os anticorpos da presente invenção têm certas qualidades que podem tornar os presentes anticorpos mais eficazes do que os anticorpos terapêuticos atuais contra o CTLA-4.

Em particular, os anticorpos 4.1.1, 4.8.1 e 6.1.1 da invenção têm propriedades altamente desejáveis. Suas características estruturais, funções ou atividades provêem critérios que facilitam o projeto ou seleção de anticorpos adicionais ou outras moléculas conforme discutido acima. Esses critérios incluem um ou mais do seguinte:

Capacidade de competir para a aglomeração a CTLA-4 com um ou mais dos anticorpos da invenção;

Especificidade de aglomeração similar a CTLA-4 como um ou mais anticorpos da invenção;

Uma afinidade de aglomeração para CTLA-4 de cerca de 10'⁹ M ou mais e, de preferência, cerca de 1O'^W M ou mais;

Não tem reação cruzada com CTLA-4 de mamíferos inferiores, inclusive, de preferência, camundongo, rato, ou coelho e, de preferência, CTLA-4 de camundongo ou rato;

Tem reação cruzada com CTLA-4 de primatas, inclusive, de preferência, CTLA-4 de cinomolgos e rhesus.

Uma seletividade para CTLA-4 sobre CD28, B7-2, CD44 ou hlgG1 de pelo menos 100:1 ou mais e, de preferência, de cerca de 300, 400 ou 500:1 ou mais;

Um IC50 em CTLA-4 de bloqueio que se aglomera a B7-2 de cerca de 100 nM ou menos e, de preferência, 5, 4, 3, 2, 1, 0,5 ou 0,38 nM ou menos;

Um IC₅₀ em CTLA-4 de bloqueio que se aglomera a B7-1 de cerca de 100 nM ou menos e, de preferência, 5, 4, 3, 2, 1, 0,5 ou 0,50 nM ou menos;

Uma intensificação da produção de citocina em um ou mais ensaios in vitro, por exemplo:

Uma intensificação na produção de IL-2 em um ensaio de infla57 mação de célula T/Raji de cerca de 500 pg/ml ou mais e, de preferência, 750,1000,1500,2000, 3000 ou 3846 pg/ml ou mais;

Uma intensificação na produção de IFN-γ em um ensaio de inflamação de célula T/Raji de cerca de 500 pg/ml ou mais e, de preferência, 750, 1000 ou 1233 pg/ml ou mais;

Uma intensificação na produção de IL-2 em hPBMC ou ensaio de superantígeno de todo o sangue de cerca de 500 pg/ml ou mais e, de preferência, 750, 1000, 1200 ou 1511 pg/ml ou mais. Expresso de outro modo, é desejável que a produção de IL-2 seja intensificada em cerca de 30, 35,40,45,50 porcento ou mais em relação ao controle no ensaio.

Espera-se que os anticorpos (ou moléculas designadas ou sintetizadas destes) que têm uma ou mais dessas propriedades terão eficácia similar aos anticorpos descritos na presente invenção.

As propriedades funcionais desejáveis discutidas acima podem freqüentemente resultar de aglomeração a e inibição de CTLA-4 por uma molécula (isto é, anticorpo, fragmento de anticorpo, peptídio ou molécula pequena) de uma maneira similar como um anticorpo da invenção (isto é, aglomeração ao mesmo epítopo ou similar da molécula de CTLA-4). A molécula ou pode ser ministrada diretamente (isto é, administração direta a um paciente dessas moléculas). Ou, alternativamente, a molécula pode ser ministrada indiretamente (isto é, um peptídio ou algo do gênero que produz uma resposta imune em um paciente (similar a uma vacina) em que a resposta imune inclui a geração de anticorpos que se aglomeram ao mesmo epítopo ou similar ou um anticorpo ou fragmento que seja produzido in situ após a administração de materiais genéticos que codificam esses anticorpos ou seus fragmentos que se aglomeram ao mesmo epítopo ou similar). Deste modo, será apreciado que o epítopo no CTLA-4 a que os anticorpos da presente invenção se aglomeram podem ser úteis em conexão com a preparação e/ou projeto de terapêutica de acordo com a invenção. No projeto de droga, a informação negativa é freqüentemente útil também (isto é, o fato de que um anticorpo que se aglomera ao CTLA-4 não parece se aglomerar a um epítopo que age como um inibidor de CTLA-4 é útil). Deste modo, o epí58 topo a que os anticorpos da invenção se aglomeram que não levam à funcionalidade desejada pode também ser muito útil. Conseqüentemente, também contempladas com a presente invenção são moléculas (e, particularmente, anticorpos) que se aglomeram aos mesmos epítopos ou similares como anticorpos da invenção.

Além do fato de que os anticorpos da invenção e os epítopos a que eles se aglomeram são contemplados de acordo com a presente invenção, conduziu-se alguns estudos de mapeamento de epítopo preliminares de certos anticorpos de acordo com a presente invenção e, particularmente, os anticorpos 4.1.1 e 11.2.1 da invenção.

Como uma primeira etapa, conduziu-se estudos de competição de BIAcore para gerar um mapa tosco de aglomeração como entre certos anticorpos da invenção em conexão com sua capacidade de competir para aglomeração a CTLA-4. Para esta finalidade, o CTLA-4 foi aglomerado a uma pastilha BIAcore e um primeiro anticorpo, sob condições de saturação, foi aglomerado ao mesmo e a competição dos anticorpos secundários subseqüentes que se aglomeram ao CTLA-4 foi medida. Esta técnica possibilitou a geração de um mapa tosco no qual as famílias de anticorpos podem ser classificadas.

Através deste processo, determinou-se que certos anticorpos de acordo com a invenção poderíam ser categorizados como incidentes nas seguintes categorias epitópicas:

Categoria	Anticorpos	Competição para Aglomeração a CTLA-4
A	BO1M*	Competição cruzada livre um com o outro; competição cruzada com a categoria B; alguma competição cruzada com a categoria D
BO2M**
B	4.1.1	Competição cruzada livre um com o outro; competição cruzada com as categorias A, C e D.
4.13.1
C	6.1.1	Competição cruzada livre um com o outro; competição cruzada com a categoria B e categoria D
3.1.1
4.8.1
11.2.1
11.6.1
11.7.1

Continuação

Categoria	Anticorpos	Competição para Aglomeração a CTLA-4
D	4.14.3	Competição cruzada com as categorias C e B; alguma competição cruzada com a categoria A
E	4.9.1	BNI3 bloqueia a aglomeração de 4.9.1 ao CTLA-4, mas não o reverso.
BNI3***

(*) (**) Disponível junto à Biostride.

(***) Disponível junto à Pharmingen.

Como uma próxima etapa, tentou-se determinar se os anticorpos da invenção reconheciam um epitopo linear no CTLA-4 sob condições de redução e que não de redução nas manchas do Oeste. Observou-se que nenhum dos anticorpos 3.1.1,11.7.1,11.6.1 ou 11.2.1 da invenção pareciam reconhecer uma forma reduzida de CTLA-4 na mancha do Oeste. Conseqüentemente, pareceu provável que o epitopo a que cada um desses anticorpos se aglomerou não era um epitopo linear, mas mais provavelmente era um epitopo conformacional cuja estrutura pode ter sido ab-rogada sob condições de redução.

Por conseguinte, procurou-se determinar se podia aprender sobre os resíduos na molécula de CTLA-4 que são importantes para a aglomeração dos anticorpos da invenção. Uma maneira que utiiizou-se foi conduzir avaliações cinéticas de afastamento de taxas como entre o CTLA-4 humano e duas moléculas de CTLA-4 de primatas altamente conservadas (CTLA-4 de cinomólogo e sagüi). Estudos de BIAcore demonstraram que o anticorpo 4.1.1 da invenção se aglomerou ao CTLA-4 humano, de cinomólogo e sagüi à mesma taxa. No entanto, com relação aos descontos de taxa (afinidade), o anticorpo 4.1.1 teve a mais alta afinidade (afastamento de taxa mais lenta) para humano, um afastamento de taxa mais rápida com cinomólogo e muito mais rápida para afastamento de taxa de sagüi. O anticorpo 11.2.1 da invenção, por outro lado, se aglomera ao CTLA-4 humano, de cinomólogo e sagüi aproximadamente à mesma taxa e tem aproximadamente o mesmo afastamento de taxa relativo para cada um dos três. Esta informação adicionalmente indica que os anticorpos 4.1.1 e 11.2.1 da invenção se aglomeram a epítopos diferentes no CTLA-4.

Para estudar mais o epítopo a que os anticorpos das categorias B e C da invenção se aglomeram, conduziu-se certos estudos de mutagênese dirigida ao ponto. O CTLA-4 de sagüi tem duas alterações importantes nos resíduos 105 e 106 em relação ao CTLA-4 humano. Essas diferenças são uma alteração de leucina para metionina no resíduo 105 e uma alteração de glicina para serina no resíduo 106. Conseqüentemente, mudou-se o CTLA-4 humano que codifica o cDNA mudado para codificar um CTLA-4 mudado que tem as alterações L105M e G106S. O CTLA-4 mutante de substituição homóloga não efetuou a aglomeração de uma proteína de fusão B7.2-lgG1. Além disso, a aglomeração com o anticorpo 11.2.1 da invenção não foi efetuada. No entanto, essa molécula foi significativamente inibida em sua capacidade de se aglomerar com o anticorpo 4.1.1 da invenção (similar ao sagüi). Em seguida, mudou-se um CTLA-4 de sagüi que codifica o cDNA para criar um CTLA-4 de sagüi mutante que tem uma alteração S106G. Essa alteração resultou na restauração de aglomeração estável entre o anticorpo 4.1.1 e o mutante CTLA-4 de sagüi. Além disso, mudamos um CTLA-4 de sagüi que codifica o cDNA para criar um CTLA-4 de sagüi mutante com uma alteração M105L. Essa alteração restaurou parcialmente a aglomeração ente o anticorpo 4.1.1 e o CTLA-4 mutante.

Cada um dos anticorpos de categoria B a D da invenção parece ter propriedades funcionais similares e parece ter o potencial para agir como agentes terapêuticos antiCTLA-4. Além disso, cada uma das moléculas faz certa competição cruzada em sua aglomeração para o CTLA-4. No entanto, conforme será observado a partir da discussão acima, cada uma das moléculas nas diferentes categorias parece se aglomerar a epítopos conformacionais separados no CTLA-4.

A partir do precedente, será apreciado que a informação de epítopo discutida acima indica que os anticorpos (ou outras moléculas, conforme discutido acima) que tem competição cruzada com os anticorpos da invenção provavelmente terão certo potencial terapêutico de acordo com a presente invenção. Além disso, espera-se que os anticorpos (ou outras moléculas, conforme discutido acima) que tem competição cruzada com anti61 corpos da invenção (isto é, competição cruzada com anticorpos de categoria B, C e/ou D) provavelmente terão certo potencial terapêutico de acordo com a presente invenção. Adicionalmente, espera-se que os anticorpos (ou outras moléculas, conforme discutido acima) que tem competição cruzada com os anticorpos da invenção (isto é, competição cruzada com os anticorpos de categorias B, C e/ou D) e que (i) não são reduzidos em sua aglomeração ao CTLA4 de sagüi (similar ao anticorpo 11.2.1) ou (ii) são reduzidos em sua aglomeração ao CTLA-4 de sagüi (similar ao anticorpo 4.1.1) provavelmente terão certo potencial terapêutico adicional de acordo com a presente invenção. Os anticorpos (ou outras moléculas, conforme discutido acima) que competem com as categorias A e E podem também ter certo potencial terapêutico.

EXEMPLOS

Os seguintes exemplos, que incluem os experimentos conduzidos e resultados obtidos são providos para fins ilustrativos apenas e não devem ser construídos como limitadores da presente invenção.

EXEMPLO 1

Geração de Anticorpo AntiCTLA-4 oue Produz Hibridomas

Os anticorpos da invenção foram preparados, selecionados e ensaiados de acordo com o presente Exemplo.

Preparação do Antígeno: Três imunogenes distintos foram preparados para a imunização dos camundongos XenoMouse™: (i) uma proteína de fusão CTLA-4-lgG (ii) um peptídeo CTLA-4, e (iii) 300.19 células de linfoma de murinos transfectadas com um mutante de CTLA-4 (Y201 V) que é constitutivamente expressa sobre a superfície da célula.

(i) Proteína de Fusão CTLA-4-IqG1

Expressão da Construção do Vetor

O cDNA que codifica o domínio extracelular maduro de CTLA-4 foi amplificado por PCR da biblioteca de cDNA de timo humano (Clontech) com o uso de primers designados para a seqüência publicada (Eur. J. Immunol. 18:1901-1905 (1988)). O fragmento foi direcionalmente subclonado em pSR5, um plasmídio de expressão de vírus Sindbis (In Vitrogen), entre o peptídio de sinal M de oncostatina humana e os domínios CH1 /CH2/CH3 de gama 1 (lgG1) humano. A proteína de fusão não contém um domínio de articulação, mas contém cisteína 120 no domínio extracelular de CTLA-4 para formar um dimer covalente. O vetor resultante foi chamado de CTLA4lgG1/pSR5. O cDNA de CTLA-4lgG1 completo no vetor teve seqüência confirmada em ambas as linhagens. A seqüência de aminoácido, a proteína de CTLA4-lg é mostrada abaixo. O domínio extracelular maduro para CD44 foi amplificado por PCR de biblioteca de linfócito humano (Clontech) e subclonado em pSinRepõ para gerar uma proteína de controle com a cauda lgG1 idêntica.

Proteína de Fusão OM-CTLA4-lqG1 (SEQ ID NO: 100):

MGVLLTORTLLSLVLALLFPSMASMAIVIHVAQPAWLASSRGIA

SFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICT

GTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGL6CKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIPEPCPDSDLEGAPSVEFLFPPKPKD

TLMISRTPEWCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST

YRWSVLIVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPTPIEKTISKAKGQPREPQVYT

LPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSIDIAVEWESNGQPENNYKKPPVLDS

DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMEALHNHYTQKSLSLSPGK

Sublinhado: peptídio de sinal

Negrito: domínio extracelular CTLA4

Os cDNAs para o domínio extracelulares maduros de CD28 foram amplificados por PCR de biblioteca de linfócito humano (Clontech) e então subclonados em pCDM8 (J. Immunol. 151:5261-71 (1993)) para produzir uma proteína de fusão lgG1 humana que contém tanto divagem de trombina quanto regiões de articulação. O CTLA4 de sagüi, Cinomólogo e Rhesus foram clonados de mRNA isolado de PBMCs estimulados com PHA com o uso de técnicas padrão de PCR degenerada. O seqüenciamento demonstrou que a seqüência de aminoácido de rhesus e cinomólogo foi idêntica com três diferenças de domínio extracelular CTLA4 humana madura (S13N, I17T e L105M). O sagüi demonstrou dez diferenças de aminoácido do domínio extracelular CTLA4 humano maduro (V21A, V33I, A41T, A51G,

S71F, Q75K, Τ88Μ, L105M e G106S). A mutagênese com ponto dirigido foi usada para fazer mutações de ponto simples de todos os aminoácidos diferentes em CTLA4 de sagüi para mapear aminoácidos importantes para a interação dos anticorpos com CTLA4-lgG humano. As mutações de CTLA4IgG humano e de sagüi para mapeamento de epítopo foram geradas por mutagênese dirigida ao ponto de agente de correspondência (Promega). As proteínas de fusão JgG foram produzidas por transfecção transiente de células Cos7 e purificadas com o uso de técnicas de Proteína A padrão. As proteínas de CTLA4-lgG mutantes foram avaliadas para quanto à aglomeração a anticorpos por imunomanchamento e uso de análises BIAcore. Expressão/Purificacão de Proteína Recombinante

O vírus sindbis recombinante foi gerado por eletroporação (Gibco) de células de Rim de Cobaia Bebê com SP6 in vitro transcrita CTLA4-lgG1/pSR5 mRNA e adjuvante DH-26S conforme descrito por In Vitrogen. Quarenta e oito horas após, o vírus recombinante foi colhido e titulado para a expressão de proteína ótima em células de ovário de cobaia chinesa (CHOK1). As células CHO-K1 foram cultivadas em suspensão em DMEM/F12 (Gibco) que continha 10% de soro bovino de feto desativado por calor (Gibco), aminoácidos não essenciais (Gibco), 4mM glutamina (Gibco), penicilina/estreptomicina (Gibco), 10mM Hepes pH 7,5 (Gibco). Para produzir CTLA-4lgG, as células CHO-K1 foram ressuspensas em 1 χ 10⁷ células/ml em DMEM/F12 e incubadas com vírus sindbis por uma hora em temperatura ambiente. As células foram então diluídas a 1 χ 10⁶ /ml em DMEM/F12 que continha 1% de soro bovino de feto esvaziado de IgG bovino com o uso de sefarose de proteína A (Pharmacia) aminoácidos não essenciais, glutamina 4mM, 12,5mM Hepes pH 7,5 e penicilina/estreptomicina. Quarenta e oito horas após a infecção, as células foram dispostas em péletes e o meio condicionado foi colhido e suplementado com comprimidos inibidores de protease completa (Boehringer Mannheim), o pH foi ajustado para 7,5, e filtrado 0,2μ (Nalgene). FPLC (Pharmacia) foi usado para purificar com afinidade a proteína de fusão com o uso de 5 ml de coluna HiTrap de proteína A (Pharmacia) a uma vazão de 10 ml/min. A coluna foi lavada com 30 volumes de leito de PBS e eluída com 0,1 M de glicina/HCI pH 2,8 a 1 ml/min. As frações (1 ml) foram imediatamente neutralizadas para o pH 7,5 com Tris pH 9. As frações que continham CTLA-4-lgG1 foram identificadas por SDS-PAGE e então concentradas com o uso de centriplus 50 (Amicon) antes da aplicação a sefarose 200 colunas (Pharmacia) a 1 ml/min com o uso de PBS como solvente. As frações que continham CTLA-4-lgG1 foram eleitas, filtradas estéreis 0,2μ (Millipore), determinadas as alíquotas e congeladas a -80°C. CD44lgG1 foi expresso e purificado com o uso dos mesmos métodos. CD28-lgG foi purificado de meio condicionado de células Cos7 transientemente transfectadas.

Caracterização de CTLA-4-lgG1:

O CTLA-4-lgG1 purificado migrou como uma faixa simples em SDS-PAGE com o uso de agente de mancha de Coomassie coloidal (Novex). Sob condições que não de redução, CTLA-4-lgG1 foi um dimer (100kDa), que reduziu para um monômero de 50kDa quando tratado com 50mM DTT. O sequenciamento de aminoácido do CTLA-4-lgG1 purificado em solução confirmou o N-término de CTLA-4 (MHVAQPAWLAS) (SEQ ID NO: 101), e que o peptídio de sinal oncostatina-M foi clivado da proteína de fusão madura. O CTLA-4-lgG1 aglomerado a B7.1-lgG em de uma maneira dependente de concentração e a aglomeração foi bloqueada por um anticorpo de cobaia-anti-humano antiCTLA-4 (BNI3: PharMingen). O CTLA-4-lgG estéril ficou livre de endotoxina e quantificado por OD280 com o uso de 1,4 como o coeficiente de extinção. O rendimento de CTLA-4-lgG purificado variou entre 0,5-3mgs/litro de células CHO-K1.

(ii) Peptídio CTLA-4

O seguinte peptídio CTLA-4 (SEQ ID NO: 102) foi preparado conforme descrito abaixo:

NH₂:MHVAQPAWLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQA

DSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYI

CKVEMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPC-CONH₂

Abreviações/Materiais

NMP, N-Metilpirrolidinona, TFE, 2,2,2-Trifluoroetanol; DCM, Di65 clorometano; FMOC, Fluorenil Metoxicarboníla. Todos os reagentes foram fornecidos por Perkin Elmer, com as seguintes exceções: TFE, Aldrich Chemical, resina FMOC-PAL-PEG, Perseptive Biosystems. Fmoc-Arg(PMC)-OH, FMOC-Asn(Trt)-OH, FMOC-Asp(tBu)-OH, FMOC-Cys(Trt)-OH, FMOC5 Glu(tBu)-OH, FMOC-Gln(Trt)-OH, FMOC-Hys(Boc)-OH, FMOC-Lys(BOC)OH, FMOC-Ser(tBu)-OH, FMOC-Thr(tBu)-OH e FMOC-Tyr(tBu)-OH foram usados para aqueles aminoácidos que requerem grupos de proteção de cadeia lateral.

Síntese de Peptidio:

A síntese de peptídio foi executada em um Perkin-Elmer 431 A, retroajustado com monitoração de retorno via absorção de UV a 301 nm (detector Perkin-Elmer Modelo 759A). A seqüência de peptídio foi montada em uma resina FMOC-PAL-PEG com o uso de ciclos de acoplamento duplo condicional. Os acoplamentos duplos forçados foram executados em ciclos

10, 11, 18, 19, 20 e 28 a 33. A resina foi lavada com mistura de 50% de

DCM e TFE ao se completar cada ciclo de acilação, seguida pelo encapamento de grupos amino não reagidos com anidreto acético em NMP. A resina foi removida do reator após se completar o ciclo 49 e o restante continuou a se completar. A divagem do peptídio da resina foi executada com o uso do

Reagente K (King et al., International Journal of Protein and Peptide Research 36: 255-266 (1990) por 6 horas em 415 mg de resina que obteve 186 mg de peptídio de CTLA-4 bruto.

Caracterização de Peptídio:

Alíquotas de 25 mg do peptídio de CTLA-4 bruto foram díssolvi25 das em 5 ml 6M de Guanidina HCI/100 mM K2PO3 a pH6,4 e eluídas em um Pharmacia Hi Load Superdex 75 16/60 coluna (16 mm x 600 mm, 120 ml de volume de leito) com 2M de Guanidina HCI/ 100 mM K2PO3 a pH 6,4 a 2 ml/min por 180 minutos coletando frações de 5 ml. As frações foram analisadas ao se carregar 1,7 μΙ de frações a um gel Laemeli NuPAGE corrente com tampão corrente MES e visualização através de protocolo de mancha de prata Daichii. Essas frações que exibem um peso molecular de 12 KDa, conforme julgado versus padrões de peso molecular, foram eleitos entre si e armazenados a 4°C. As frações combinadas foram analisadas por UV e eletroforese de gel. O seqüenciamento de aminoácido foi executado ao se absorver uma amostra de 100 microlitros em um cartucho ProSorb (absorvido em uma membrana PVDF) e lavagem para remover os sais do tampão. O seqüenciamento foi executado em um Biosystems Applied 420. A seqüência N-terminal esperada (Μ Η V A Q P A V V L A) foi observada. O imunomanchamento demonstrou que o peptídio foi reconhecido pelo CTLA-4 antihumano BNI3 (PharMingen). Para remover o sal, uma alíquota que continha 648 pg de material foi colocada em tubo de diálise 3500 Da MWCO e dialisado contra 0,1% TFA / H2O a 4°C por 9 dias com agitação. Todos os conteúdos do saco de diálise foram liofilizados a um pó.

(iii) células 300.19 transfectadas com CTLA-4 (V201V)

O comprimento total de cDNA de CTLA-4 foi amplificado por

PCR de biblioteca de cDNA de timo humano (Stratagene) e subclonado em pIRESneo (Clontech). Uma mutação de CTLA-4 que resulta em expressão de superfície de célula constitutiva foi introduzida com o uso do Sistema de Mutagênese MatchMaker (Promega). A mutação da tirosina Y201 para valina inibe a aglomeração da proteína de adaptina AP50 responsável pela internalização rápida de CTLA-4 (Chuang et al. J. Immunol. 159: 144-151 (1997)). As células de linfoma de murinos 300.19 livres de micoplasma foram cultivadas em RPMI-1640 que continha 10% de soro de feto de ovelha, aminoácidos não essenciais, penicilina/estreptomicina, 2mM de glutamina, 12,5 mM de Hepes pH 7,5, e 25 uM de beta-mercaptoetanol. As células foram eletroporadas (3 x 10⁶/0,4 ml de RPMI livre de soro) em uma câmara de 1 ml com 20 ug CTLA-4 Y201V/plRESneo com o uso de 200V/1180uF (Gibco CelIPorator). As células ficaram descansando por 10 minutos e então 8 mis de meio de RPMI completo preaquecido. A 48 horas, as células foram diluídas a 0,5 x 10⁶/ml em meio de RPMI completo que continham 1 mg/ml G418 (Gibco). As células resistentes foram expandidas e mostraram expressar CTLA-4 sobre a superfície da célula com o uso de anticorpo BNI3 conjugado com ficoeritrina (PharMingen). As células de expressão de alto nível foram isoladas por classificação estéril.

Imunização e geração de hibridoma: Camundongos XenoMouse (8 a 10 semanas de idade) foram imunizados (i) subcutaneamente à base de caudas com 1 x 10⁷ células 300.19 que foram transfectadas para expressar CTLA-4 conforme descrito acima, ressuspensas em salina com tampão de fosfato (PBS) com adjuvante de Freund, ou (ii) subcutaneamente à base da cauda com (a) 10 pg da proteína de fusão de CTLA-4 ou (b) 10 pg de peptídio CTLA-4, emulsificado com adjuvante de Freund completo. Em cada caso, a dose toi repetida três ou quatro vezes em adjuvante de Freund incompleto. Quatro dias antes da fusão, os camundongos receberam uma injeção final do imunogeno ou células em PBS. Linfócitos de nó de baço e/ou linfa de camundongos imunizados foram fundidos com a [linha de célula P3 de mieloma não secretória de murinos] e foram sujeitos à seleção HAT conforme previamente descrito (Galfre G e Mistein C., Preparation of monoclonal antibodies: strategies and procedures Methods Enzymol. 73: 3-46 (1981)). Um painel grande de hibridomas todos secretando anticorpos humano específico para CTLA-4 lgG₃k ou lgG4k (conforme detectado abaixo) foram recuperados.

Ensaio ELISA: ELISA para determinação de anticorpos específicos de antígeno em soro de camundongo e em sobrenadantes do hibridoma foi executado conforme descrito (Coligan et al., Unidade 2.1 Enzyme-linked immunosorbent assays'¹ in Current protocols in immunology (1994)) com o uso de proteína de fusão CTLA-4-lg para capturar os anticorpos. Para animais que são imunizados com a proteína de fusão CTLA-4-lg, adicionalmente faz-se triagem para a reatividade não-específica contra a parte de Ig humano da proteína de fusão. Isto é realizado com o uso de chapas de

ELISA revestidas com lgG1 humano como um controle negativo para especificidade.

Em um ensaio ELISA preferido, as seguintes técnicas são usadas:

As chapas de ELISA são revestidas com 100 μΙ/cavidade do antígeno no tampão de revestimento da chapa (0,1 M Tampão de Carbonato, pH 9,6 e NaHCO₃ (MW 84) 8,4 g/l). As chapas são então incubadas a 4°C da noite para o dia. Após a incubação, o tampão de revestimento é removido e a chapa é bloqueada com tampão de bloqueio de 200 μΙ/cavidade (0,5% BSA, 0,1% Tween 20, 0,01 % Thimerosal em 1 X PBS) e incubada à temperatura ambiente por 1 hora. Altemativamente, as chapas são armazenadas em refrigerador com tampão de bloqueio e vedadores de chapa. O tampão de bloqueio é removido e δθμΐ/cavidade de sobrenadante de hibridoma, soro ou outro sobrenadante de hibridoma (controle positivo) e meio HAT ou tampão de bloqueio (controle negativo) é adicionado. As chapas são incubadas à temperatura ambiente por 2 horas. Após a incubação, a chapa é lavada com tampão de lavagem (1 x PBS). O anticorpo de detecção (isto é, lgG2HRP anti-humano de rato (SB # 9070-05) para anticorpos lgG2 ou lgG4HRP anti-humano de rato (SB #9070-05) para anticorpos lgG4) é acrescentado a 100 μΙ/cavidade (lgG2-HRP anti-humano de camundongo @ 1:2000 ou lgG4-HRP anti-humano de rato @ 1:1000 (cada um diluído em tampão de bloqueio)). As chapas são incubadas à temperatura ambiente por 1 hora e então lavadas com tampão de lavagem. Por conseguinte, 100 μΙ/cavidade de solução de desenvolvimento recém-preparada (10 ml de tampão de substrato, 5 mg OPD (o-fenilenodiamina, Sigma Cat. N°. P-7288) e 10 μΙ 30% H₂O₂ (Sigma)) é adicionada as cavidades. As chapas se desenvolvem por 10-20 minutos, até que as cavidades de controle negativo parcamente começam a mostrar cor. Em seguida, 100 μΙ/cavidade de solução de parada (2 M H₂SO4) é adicionado e as chapas são lidas em uma leitora de chapa ELISA a um comprimento de onda de 490 nm.

Determinação de constantes de afinidade de Mabs totalmente humanos por

BIAcore:

A medição da afinidade de anticorpos monoclonais humanos purificados, fragmentos de Fab, ou sobrenadantes de hibridoma por ressonância de plasmon foi executada com o uso de instrumento BIAcore 2000, com o uso de procedimentos gerais descritos pelos fabricantes.

A análise cinética dos anticorpos foi executada com o uso de antígenos imobilizados sobre a superfície do sensor a uma baixa densidade. Três superfícies do chip de sensor do BIAcore foram imobilizados com a proteína de fusão CTLA-4-lg a uma densidade variante de cerca de 390-900 com o uso da proteína de fusão CTLA-4lg a 20 ou 50 μΙ/ml em 10 mM de acetato de sódio a pH 5,0 com o uso do kit de acoplamento de amina fornecido pelo fabricante (BIAcore, Inc.). A quarta superfície do chip de sensor

BIAcore foi imobilizada com lgG1 (900 RU) e foi usada como uma superfície de controle negativo para aglomeração não-específica. A análise cinética foi executada a uma vazão de 25 ou 50 microlitros por minuto e taxas de dissociação (kd ou Κοκ) e associação (ka ou Kon) foram determinadas com o uso do software provido pelo fabricante (BIA evaluation 3.0) que permite cálculos de ajuste global.

EXEMPLO 2

Medição de Afinidade de Anticorpos AntiCTLA-4

Na seguinte tabela, as medições de afinidade para certos dos anticorpos selecionados desta maneira são providas:

TABELA 1

	Fase sólida (por BIAcore)
Hibridoma	Dentro	Afasta-	Constante	Constante	Densida-
	das Taxas	mento das	de Associa-	de Dissocia-	de da
	Ka (M'1S'1	Taxas Kg	ção KA (1/M)	ção KD (M) =	Superfí-
	x10’6)	(S’1x10'4)	= ka/kdXlO10	kd/kaxW10	cie [RU]
Moab01	0,68	1,01	0,67	1,48	878,7
	0,70	4,66	0,15	6,68	504,5
	0,77	6,49	0,19	8,41	457,2
	0,60	3,08	0,20	5,11	397,8
4.1.1	1,85	0,72	2,58	0,39	878,7
	1,88	1,21	1,55	0,64	504,5
	1,73	1,54	1,13	0,88	457,2
	1,86	1,47	1,26	0,79	397,8
4.8.1	0,32	0,07	4,46	0,22	878,7
	0,31	0,23	1,33	0,75	504,5
	0,28	0,06	4,82	0,21	397,8

Continuação

4.14.3	2,81	3,04	0,92	1,08	878,7
	2,88	3,97	0,73	1,38	504,5
	2,84	6,66	0,43	2,35	457,2
	3,17	5,03	0,63	1,58	397,8
6.1.1	0,43	0,35	1,21	0,83	878,7
	0,46	0,90	0,51	1,98	504,5
	0,31	0,51	0,61	1,63	457,2
	0,45	0,79	0,57	1,76	397,8
3.1.1	1,04	0,96	1,07	0,93	878,7
	0,95	1,72	0,55	1,82	504,5
	0,73	1,65	0,44	2,27	457,2
	0,91	2,07	0,44	2,28	397,8
4.9.1	1,55	13,80	0,11	8,94	878,7
	1,43	19,00	0,08	13,20	504,5
	1,35	20,50	0,07	15,20	397,8
4.10.2	1,00	2,53	0,39	2,54	878,7
	0,94	4,30	0,22	4,55	504,5
	0,70	5,05	0,14	7,21	457,2
	1,00	5,24	0,19	5,25	397,8
2.1.3	1,24	9,59	0,13	7,72	878,7
	1,17	13,10	0,09	11,20	504,5
	1,11	13,00	0,09	11,70	397,8
4.13.1	1,22	5,83	0,21	4,78	878,7
	1,29	6,65	0,19	5,17	504,5
	1,23	7,25	0,17	5,88	397,8

Conforme será observado, os anticorpos preparados de acordo com a invenção têm altas afinidades e constantes de aglomeração. EXEMPLO 3

Estruturas de Anticorpos AntíCTLA-4 Preparados de acordo com a Invenção

Na seguinte discussão, a informação estrutural relacionada a anticorpos preparados de acordo com a presente invenção é provida.

A fim de analisar estruturas de anticorpos produzidos de acordo com a invenção, clona-se genes que codificam os fragmentos de cadeia pe10 sada e leve do hibridoma particular. A clonagem e o seqüenciamento do ge71 ne foram realizados conforme se segue:

Poli(A)⁺ mRNA foi isolado de cerca de 2 x 10⁵ células de hibridoma derivadas de camundongos XenoMouse imunizados com o uso de um kit Fast-Track (Invitrogen). A geração de cDNA primado aleatório foi seguida por PCR. Os primers da região variável específicos da família de V_H humano ou V_k humano (Marks et al., Oligonucleotide primers for polymerase chain reaction amplification of human immunoglobulin variable genes and design of family-specific oligonucleotides probes Eur. J. Immunol. 21:985-991 (1991) ou um primer de Vh humano universal, MG-30 (CAGGTGCAGCTGGAGCAGTCIGG) foi usado em conjunção com primers específicos para a região de constante Oy2 humano (MG-40d; 5'-GCTGAGGGAGTAGAGTCCTGAGGA3j ou região de constante Ck (hkP2; conforme previamente descrito em Green et al., 1994). As seqüências de transcrições de cadeia pesada e kappa derivadas de Mabs de hibridomas foram obtidas por seqüenciamento direto de produtos de PCR gerados de poli(A)⁺ RNA com o uso dos primers descritos acima. Os produtos de PCR foram também clonados em pCRIl com o uso de um kit de clonagem TA (Invitrogen) e ambas as linhagens foram seqüenciadas com o uso de kits de seqüenciamento Prism dyeterminator e uma máquina de seqüenciamento ABJ 377. Todas as seqüências foram analisadas por alinhamentos ao diretório de seqüência V BASE (Tomlinson et al., MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK) com o uso de programas de software MacVector e Geneworks.

Além disso, cada um dos anticorpos 4.1.1, 4.8.1, 11.2.1 e 6.1.1 foram sujeitos a seqüências de DNA de comprimento total. Para esse seqüenciamento, Poli(A)⁺ mRNA foi isolado de cerca de 4 X 10⁶ células de hibridoma com o uso do kit mRNA Direct (Dynal). O mRNA foi transcrito de modo reverso com o uso de kit oligo-dT(18) e Advantage ΤΑ/PCR (Clonetech). O banco de dados da região variável (V Base) foi usado para designar os primers de amplificação que começam no ponto inicial ATG do gene DP50 de cadeia pesada (5TATCTAAGCTTCTAGACTCGACCGCCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTG-3j e para o códon de parada da região de constante lgG2 (5’72

TTCTCTGATCAGAATTCCTATCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGCT-3’). Uma seqüência de Kozak ótima (ACCGCCACC) foi adicionada em 5’ ao ponto inicial ATG. O mesmo método foi usado para designar um primer ao ponto inicial ATG do gene A27 de cadeia kappa (5’TCTTGAAGCTTGCCCGGGCCCGCCACCATGGAAACCCCAGCGCAG-3').

O cDNA 012 foi clonado pelo uso de um primer ao ponto inicial ATG (5’TCTTCAAGCTTGCCCGGGCCCGCCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCT-3) e o primer do códon de parada da região de constante kappa acima. Os cDNAs de cadeia pesada também foram clonados como construções genômicas por mutagênese direta ao ponto para adicionar um ponto Nhel na extremidade do domínio da variável J e subclonagem de um fragmento Nhel que contém as regiões CH1/Articulação/CH2/CH3 do lgG2 genômico. A mutação do ponto para gerar o ponto Nhel não altera a seqüência de aminoácido de linha de germe. Os pares de primer foram usados para amplificar os cDNAs com o uso do Kit Advantage High Fidelity PCR (Clontech). A seqüência da PCR foi obtida pelo seqüenciamento direto com o uso de kits de seqüenciamento dye-terminator e uma máquina de seqüenciamento ABI. O produto da PCR foi clonado em vetores de expressão de mamíferos de sintetase de glutamina pEE (Lonza) e três clones foram seqüenciados para confirmar as mutações somáticas. Para cada clone, a seqüência foi verificada em ambas as linhagens em pelo menos três reações. Um anticorpo 4.1.1 aglicosilado foi gerado por mutagênese dirigida ao ponto de N294Q no domínio CH2. Os anticorpos recombinantes foram produzidos por transfecção transiente de células Cos7 em FCS esvaziado de IgG e purificado com o uso de técnicas de sefarose de Proteína A padrão. Os transfectantes estáveis foram gerados por eletroporação de células de NSO de murinos e seleção em meio livre de glutamina. O recombinante 4.1.1 com ou sem glicosilação exibiu especificidade idêntica e afinidade para o CTLA4 nos ensaios ELISA e BIAcore in vitro.

Análise de Utilização de Gene

A seguinte Tabela apresenta a utilização do gene evidenciada por clones de hibridoma selecionados de anticorpos de acordo com a invenção:

TABELA II

Utilização de Gene de Cadeia Pesada e Leve

Clone	Cadeia pesada		Cadeia leve Kappa
VH	D	JH		VK	JK
4.1.1	DP-50	DIR4 ou DIR3	JH4		A27	JK1
4.8.1	DP-50	7-27	JH4		A27	JK4
4.14.3	DP-50	7-27	JH4		A27	JK3
6.1.1	DP-50	DIR5 ou DIR5rc	JH4		A27	JK3
3.1.1	DP-50	3-3	JH6		012	JK3
4.10.2	DP-50	7-27	JH4		A27	JK3
2.1.3	DP-65	1-26	JH6		A10/A26	JK4
4.13.1	DP-50	7-27	JH4		A27	JK3
11.2.1	DP-50	D1-26	JH6		012	JK3
11.6.1	DP-50	D2-2 ou D4	JH6		012	JK3
11.7.1	DP-50	D3-22 ou D21-9	JH4		012	JK3
12.3.1.1	DP-50	D3-3 ou DXP4	JH6		A17	JK1
12.9.1.1	DP-50	D6-19	JH4		A3/A19	JK4
4.9.1	DP-47	5-24 e/ou 6-19	JH4		L5	JK1

Conforme será observado, os anticorpos de acordo com a presente invenção foram gerados com uma forte tendência pela utilização da região variável de cadeia pesada DP-50. O gene DP-50 também é referido como gene da família Vh 3-33. Somente um anticorpo que foi selecionado na base de aglomeração de CTLA-4 e ensaios preliminares funcionais in vitro mostrou uma utilização de gene de cadeia pesada diferente de DP-50. Tal clone, 2.1.3, utiliza uma região variável de cadeia pesada DP-65 e é um isótipo de lgG4. O gene DP-65 também é referido como gene da família V_H 431. Por outro lado, o clone, 4.9.1, que tem uma região variável de cadeia pesada DP-47 se aglomera ao CTLA-4, mas não inibe a aglomeração a B7-1 ou B7-2. Em camundongos XenoMouse, há mais que 30 genes variáveis de cadeia pesada funcionais distintos com que gerar anticorpos. A tendência, por conseguinte, é indicativa de um motivo de aglomeração preferido da interação anticorpo-antígeno com relação às propriedades combinadas de aglomeração ao antígeno e atividade funcional.

Análise da Mutação

Conforme será apreciado, a análise de utilização de gene provê somente uma vista geral limitada da estrutura de anticorpo. Como as células B em animais XenoMouse estocasticamente geram transcrições de cadeia V-D-J pesada ou V-J leve kappa, há vários processos secundários que ocorrem, inclusive, sem limitação, hipermutação somática, n-adições e extensões CDR3. Vide, por exemplo, Mendez et al., Nature Genetics 15: 146-156 (1997) e Patente U.S. N°. de Série 08/759.620, depositada em 3 de dezembro de 1996. Conseqüentemente, para examinar mais a estrutura de anticorpo, as seqüências de aminoácido preditas dos anticorpos foram geradas de cDNAs obtidos dos clones. Além disso, as seqüências de aminoácido Nterminal foram obtidas através de seqüenciamento de proteína.

A Figura 1 provê nucleotídio e seqüências de aminoácido das cadeias pesada e kappa leve dos clones 4.1.1 (Figura 1 A), 4.8.1 (Figura 1B),

4.14.3 (Figura 1C), 6.1.1 (Figura 1D), 3.1.1 (Figura 1E), 4.10.2 (Figura 1F),

2.1.3 (Figura 1G), 4.13.1 (Figura 1H), 11.2.1 (Figura 11), 11.6.1 (Figura 1J),

11.7.1 (Figura 1K), 12.3.1.1 (Figura 1L) e 12.9.1.1 (Figura 1M). Nas Figuras 1 A, 1B e 1D, as seqüências estendidas dos anticorpos 4.1.1, 4.8.1 e 6.1.1 foram obtidas por clonagem de comprimento total dos cDNAs conforme descrito acima. Nessas Figuras, a seqüência de peptídio de sinal (ou as bases que codificam as mesmas) são indicadas em negrito e as seqüências utilizadas para a reação PCR 5’ são sublinhadas.

A Figura 2 provê um alinhamento de seqüência entre as se75 qüências de aminoácido de cadeia pesada dos clones 4.1.1, 4.8.1, 4.14.3, 6.1.1, 3.1.1, 4.10.2, 4.13.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 e 12.9.1.1 e a seqüência de aminoácido da linha de germe DP-50 (3-33). As diferenças entre a seqüência de linha de germe DP-50 e a da seqüência nos clones são indicadas em negrito. A Figura também mostra que as posições das seqüências CDR1, CDR2 e CDR3 dos anticorpos são sombreadas.

A Figura 3 provê um alinhamento de seqüência entre a seqüência de aminoácido de cadeia pesada do clone 2.1.3 e a seqüência de aminoácido de linha de germe DP-65 (4-31). As diferenças entre a seqüência de linha de germe DP-65 e a da seqüência no clone são indicadas em negrito. A Figura também mostra as posições das seqüências CDR1, CDR2 e CDR3 do anticorpo conforme sublinhado.

A Figura 4 provê um alinhamento de seqüência entre a seqüência de aminoácido de cadeia leve kappa predita dos clones 4.1.1, 4.8.1, 4.14.3, 6.1.1, 4.10.2 e 4.13.1 e a seqüência de aminoácido de linha de germe A27. As diferenças entre a seqüência de linha de germe A27 e a da seqüência no clone são indicadas em negrito. A Figura também mostra as posições das seqüências CDR1, CDR2 e CDR3 do anticorpo conforme sublinhado. Apagamentos aparentes nos CDR1s dos clones 4.8.1,4.14.3 e 6.1.1 são indicados com Os.

A Figura 5 provê um alinhamento de seqüência entre a seqüência de aminoácido de cadeia leve kappa dos clones 3.1.1, 11.2.1, 11.6.1 e

11.7.1 e a seqüência de aminoácido da linha de germe 012. As diferenças entre a seqüência da linha de germe 012 e a da seqüência no clone são indicadas em negrito. A Figura também mostra as posições das seqüências CDR1, CDR2 e CDR3 do anticorpo conforme sublinhado.

A Figura 6 provê um alinhamento de seqüência entre a seqüência de aminoácido de cadeia leve kappa predita do clone 2.1.3 e a seqüência de aminoácido de linha de germe A10/A26. As diferenças entre a seqüência da linha de germe A10/A26 e a da seqüência no clone são indicadas em negrito. A Figura também mostra as posições das seqüências CDR1, CDR2 e CDR3 do anticorpo conforme sublinhado.

A Figura 7 provê um alinhamento de seqüência da seqüência de aminoácido de cadeia leve kappa predita do clone 12.3.1 e a seqüência de aminoácido da linha de germe A17. As diferenças entre a seqüência de linha de germe A17 e a da seqüência no clone são indicadas em negrito. A Figura também mostra as posições das seqüências CDR1, CDR2 e CDR3 do anticorpo conforme sublinhado.

A Figura 8 provê um alinhamento de seqüência da seqüência de aminoácido de cadeia leve kappa predita do clone 12.9.1 e a seqüência de aminoácido da linha de germe A3/A19. As diferenças entre a seqüência de linha de germe A3/A19 e a da seqüência no clone são indicadas em negrito. A Figura também mostra as posições das seqüências CDR1, CDR2 e CDR3 do anticorpo conforme sublinhado.

A Figura 22 provê uma série de seqüências de nucleotídio adicional e aminoácido das seguintes cadeias de anticorpo antiCTLA-4:

4.1.1:

cadeia pesada 4.1.1 de comprimento total (cDNA 22(a), genômico 22(b) e aminoácido 22(c));

cadeia pesada 4.1.1 aglicosilada de comprimento total (cDNA 22(d) e aminoácido 22(e));

cadeia leve 4.1.1 (cDNA 22(f) e aminoácido 22(g));

4.8.1:

cadeia pesada 4.8.1 de comprimento total (cDNA 22(h) e aminoácído 22(i));

cadeia leve 4.8.1 (cDNA 22(j) e aminoácido 22(k));

6.1.1:

cadeia pesada 6.1.1 de comprimento total (cDNA 22(l) e aminoácido 22(m));

cadeia leve 6.1.1 (cDNA 22(n) e aminoácido 22(o));

11.2.1:

cadeia pesada 11.2.1 de comprimento total (cDNA 22(p) e aminoácido 22(q)); e cadeia leve 11.2.1 (cDNA 22 (r) e aminoácido 22(s));

As seqüências de peptídio de sinal são mostradas em negrito e texto grande. Os quadros de leitura aberta na seqüência de DNA genômica

4.1.1 de comprimento total (Fig. 22(b)) são sublinhados. E as mutações introduzidas para fazer a cadeia pesada 4.1.1 aglicosilada e a alteração resultante (N294Q) são mostradas em sublinhado duplo e texto em negrito (cDNA (Fig. 22(b) e aminoácido (Fig. 22(c));

EXEMPLO 4

Análise de Substituições de Aminoácido de Cadeia Pesada e Leve

Na Figura 2, que provê um alinhamento de seqüência entre as seqüências de aminoácido de cadeia pesada preditas dos clones 4.1.1, 4.8.1, 4.14.3, 6.1.1 3.1.1, 4.10.2, 4.13.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 e

12.9.1.1 e a seqüência de aminoácido de linha de germe DP-50 (3-33), um modelo interessante emerge. Além do fato de que a tendência para a cadeia pesada DP-50 na maioria dos clones, é relativamente limitada a hipermutação nos anticorpos em relação ao gene DP-50 de linha de germe. Por exemplo, os clones 3.1.1 e 11.2.1 não têm mutações. Além disso, as mutações nos outros clones são geralmente alterações conservantes, que envolvem substituições de aminoácidos com propriedades similares aos aminoácidos na linha de germe. As mutações em muitas das seqüências CDR1 e CDR2 são particularmente conservantes por natureza. Três das cadeias pesadas representadas na Figura 2, 4.10.2, 4.13.1 e 4.14.3 são claramente derivadas de um único evento de recombinação (isto é, derivam de um centro germinal idêntico) e são proximamente idênticas na seqüência. Se essas três forem consideradas como uma única seqüência, entre os 10 anticorpos diferentes que contêm a cadeia pesada DP50, no CDR1 e CDR2 há 3 posições em que um resíduo não-polar é substituído por outro resíduo não-poiar, 12 em que um resíduo não-carregado polar é substituído por outro resíduo não-carregado polar e 1 em que um resíduo caregado polar é substituído por outro resíduo carregado polar. Além disso, há duas posições em que dois resíduos são muito similares estruturalmente, glicina e alanina, são substituídas uma pela outra. As únicas mutações não-estritamente conservantes envolvem 3 substituições de um resíduo carregado polar para um resíduo não-carregado polar e uma substituição de um resíduo não-polar por um resíduo polar.

As cadeias leves desses anticorpos são derivadas de 5 genes Vk diferentes. O gene A27 é o mais pesadamente representado e é a fonte de 6 cadeias leves diferentes. A comparação dessas 6 seqüências revela duas configurações notáveis. Primeiro, em três delas, 4.8.1, 4.14.3 e 6.1.1, contêm apagamentos de um ou dois resíduos em CDR1, um evento raro. Segundo, há um prejuízo forte contra a serina de linha de germe na posição seis no CDR3 em que a serina foi substituída em toda seqüência. Isto sugere que uma serina nesta posição é incompatível com a aglomeração ao CTLA4.

Será apreciado que muitas das substituições de aminoácido acima identificadas existem em proximidade íntima ou dentro de um CDR. Essas substituições pareceríam sofrer algum efeito na aglomeração do anticorpo à molécula de CTLA-4. Além disso, essas substituições poderiam ter efeito significativo na afinidade dos anticorpos.

EXEMPLO 5

Análise da Seqüência de Aminoácido N-terminal de Anticorpos de acordo com a Invenção

A fim de verificar mais a composição e estrutura dos anticorpos de acordo com a invenção identificados acima, foram seqüenciados alguns anticorpos com o uso de um dispositivo de seqüência Perkin-Elmer. As cadeias tanto pesadas quanto kappa leve dos anticorpos foram isoladas e purificadas através do uso de eletroforese de gel preparativa e técnicas de eletromanchamento e, em seguida, seqüenciados diretamente conforme descrito no Exemplo 6. Uma maioria das seqüências de cadeia pesada foi bloqueada no seu terminal amino. Por conseguinte, esses anticorpos foram primeiro tratados com aminopeptidase de piroglutamato e posteriormente seqüenciados.

Os resultados deste experimento são mostrados na Figura 9. A Figura 9 também provê o peso molecular das cadeias pesada e leve conforme determinado por espectroscopia de massa (MALDI).

EXEMPLO 6

Caracterização Adicional de Anticorpos de acordo com a Invenção

A Figura 10 provê certas informações de caracterização adicional sobre certos dos anticorpos de acordo com a invenção. Na Figura, os dados relacionados aos clones 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.14.3 e 6.1.1 são resumidos. Os seguintes dados são providos: Concentração, focagem isoelétrica (IEF), SDS-PAGE, cromatografia de exclusão de tamanho, FACS, espectroscopia de massa (MALDI), e seqüências N-terminais de cadeia leve.

Geralmente, os dados foram gerados como se segue:

Materiais e Métodos

A Concentração de Proteína foi determinada a 280 nm de uma varredura de UV (200-350 nm), onde 1,58 unidades de absorção a 280 nm se igualaram a 1 mg/ml.

O SDS-PAGE foi executado com o uso do sistema de eletroforese NuPAGE da Novex com um gel NuPAGE a 10% e tampão corrente MES. As amostras foram preparadas ao se diluir 3:1 com 4 x tampão de amostra NuPAGE (+/-) beta-mercaptoetanol, aquecido e ~ 5 ug de proteína foi carregado sobre o gel. O gel foi então manchado com solução de manchamento Brilliant Blue R (Sigma cat. # B-6529) e as estimativas de tamanho molecular foram feitas ao se compararem as faixas manchadas a Perfect Protein Markers (Novagen cat# 69149-3).

Para o seqüenciamento N-terminal, as amostras foram executadas conforme acima em géis NuPAGE, transferidas para a membrana de imobilização Pro Blot (Applied Biosystems) então manchadas com Azul de Coomassie R-250. As faixas de proteína manchadas foram excisadas e sujeitas à análise de seqüência por degradação de Edman automatizada em um Dispositivo de Seqüência 494 Procise HT da Applied Biosystems.

A focagem isoelétrica (IEF) foi executada com o uso de géis IEF 3-9 pHast da Pharmacia (cat# 17-0543-01). As amostras foram diluídas em glicerol a 10% para ~0,8 mg/ml e 1 ui foi carregado sobre o gel e então manchado com prata. As estimativas de pl foram feitas ao se comparar faixas manchadas a padrões de faixa ampla (pH3-10) IEF (Pharmacia cat # 1780

0471-01).

A cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) foi executada em salina com tampão de fosfato (PBS) no sistema SMART da Pharmacia com o uso da coluna Seperdex 75 PC de 3,2/30. As estimativas de tamanho molecular foram feitas por comparação do tempo de retenção de pico aos tempos de retenção de pico do gel.

Para os estudos de FACS, as células T periféricas humanas foram preparadas e estimuladas por 48 horas. As células T foram lavadas uma vez, ressuspensa em tampões FACS a 1x10⁶ células/100 ui e manchadas para a expressão da superfície de CD3 com 10 ui de anti-CD3-FITC (Immunotech, Marseille, França) por 30 minutos à temperatura ambiente. As células foram lavadas duas vezes, então fixadas, permeabilizadas (Fix and Perm, Caltag) e manchadas para a expressão intracelular de CTLA-4 com 10 ui de anti-CD152-PE (Pharmingen). A citometria de fluxo foi executada com o uso de um Becton Dickinson FACSort. Os quadrantes foram ajustados por análise de anticorpos de controle de isótipo em questão (Caltag).

Conforme foi discutido acima, os anticorpos antiCTLA-4 demonstraram ter certas atividades de modulação imune poderosas. Os seguintes experimentos foram executados a fim de determinar se os anticorpos de acordo com a presente invenção tinham essas atividades. Em geral, os experimentos foram designados para avaliar a capacidade de os anticorpos para inibir a interação entre moléculas CTLA-4 e B7, ser seletivos como entre as moléculas CTLA-4 e B7 e CD28, e promover a produção de citocina da célula T, inclusive, sem limitação, à expressão de IL-2 e/ou IFN-γ. Além disso, o exame da reatividade cruzada de anticorpos da invenção com certos tecidos humanos e moléculas de CTLA-4 em outras espécies (por exemplo, camundongo e primata) foi realizado.

EXEMPLO 7

Competição ELISA: Inibição de CTLA-4/B7-1 ou B7-2 Interação por Anticorpos de Acordo com a Presente Invenção

Um ensaio in vitro foi conduzido para determinar se os anticorpos de acordo com a presente invenção foram capazes de aglomeração de

CTLA-4 com B7-1 ou B7-2. Conforme será apreciado, espera-se que os anticorpos da invenção capazes de inibir a aglomeração do CTLA-4 com moléculas de B7 sejam candidatos à regulação imune através da passagem de CTLA-4. No ensaio, os seguintes materiais e métodos foram utilizados. Materiais e Métodos nM B7.1 -lg(G1) óu B7.2lg(G1) (Repligen, Inc. Needham, MA) em PBS da Dulbecco foi revestido em chapas de 96 cavidades MaxiSorp (Nunc, Dinamarca, # 439454) e incubado a 4°C da noite para o dia. No dia 2, B7-lg foi removido e as chapas foram bloqueadas com 1% de BSA mais 0,05% Tween-20 em D-PBS por duas horas. As chapas foram lavadas 3X com tampão de lavagem (0,05% Tween-20 em D-PBS). O anticorpo em concentrações de teste apropriadas e CTLA-4-lg(G4) (0,3 nM conc. final) (Repligen, Inc. Needham, MA) foram pré-misturados por 15 minutos e então adicionados à chapa revestida com B7-lg (60 ul de volume total) e incubados a TA por 1,5 hora. As chapas foram lavadas 3X e 50 μΙ de uma diluição de 1 a 1000 de anticorpo lgG4 anti-humano de camundongo etiquetado com HRP (Zymed, São Francisco, CA, # 05-3820) foi adicionado e incubado à TA por 1 hora. As chapas foram lavadas 3X e 50 μΙ de substrato de peroxidase TMB Microwell (Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, MD, #50-76-04) foi adicionado e incubado à TA por 20 minutos e então 50 μΙ de 1N H2SO4 foi adicionado à chapa. As chapas foram lidas a 450 nm com 0 uso de uma leitora de chapa Molecular Devices (Sunnyvale, CA). Todas as amostras foram testadas em duplicata. O sinal máximo foi definido como aglomeração de CTLA-4 Ig na ausência de anticorpo de teste. A aglomeração não-específica foi definida como absorção na ausência de CTLA-4-lg e anticorpo de teste.

Os resultados do ensaio são fornecidos na Tabela IIIA e IIIB. Na Tabela IIIA, os resultados são mostrados para uma variedade de anticorpos de acordo com a invenção. Na Tabela IIIB, os resultados são mostrados comparando 0 anticorpo 4.1.1 da invenção com 0 anticorpo 11.2.1 da invenção de um experimento separado.

TABELA IIIA

Clone CTLA-4-lg	Isótipo	CTLA4/B7.2 Comp. ELISA IC50 (nM)	CTLA4/B7.1 Comp. ELISA IC50 (nM)
CT3.1.1	igG2	0,45+0,07 (n=3)	0,63+0,10 (n=2)
CT4.1.1	igG2	0,38+0,06 (n=5)	0,50±0,05 (n=2)
CT4.8.1	igG2	0,57±0,03 (n=3)	0,17+0,28 (n=2)
CT4.9.1	igG2	não-competitívo (n=3)	não-competitivo (n=2)
CT4.10.2	igG2	1,50+0,37 (n=3)	3,39±0,31 (n=2)
CT4.13.1	igG2	0,49±0,05 (n=3)	0,98±0,11 (n=2)
CT4.14.3	igG2	0,69+0,11 (n=3)	1,04+0,15 (n=2)
CT6.1.1	igG2	0,39±0,06 (n=3)	0,67±0,07 (n=2)

TABELA IIIB

Clone CTLA-4-lg	Isótipo	CTLA4/B7.2 Comp. ELISA IC50 (nM)	CTLA4/B7.1 Comp. ELISA IC50 (nM)
CT4.1.1	igG2	0,55+0,08 (n=4)	0,87±0,14(n=2)
CT11.2.1	igG2	0,56±0,05 (n=4)	0,81 ±0,24 (n=2)

EXEMPLO 8

Razões de Seletividade de Anticorpos da Invenção com Relação a CTLA-4 versus CD28 ou B7-2

Outro ensaio in vitro foi conduzido para determinar a seletividade de anticorpos da invenção com relação a CTLA-4 versus CD28 ou B7-2. Os seguintes materiais e métodos foram utilizados em conexão com os experimentos:

ELISA Seletividade do CTLA-4: Materiais e Métodos

Uma chapa FluroNUNC de 96 cavidades (Nunc Cat N°. 475515) foi revestida com quatro antígenos: CTLA-4/lg, CD44/lg, CD28/lg e B7.2/lg (antígenos gerados em casa). Os antígenos foram revestidos da noite para o dia a ⁺4°C a 1 ug/ml 100 ul/cavidade em 0,1 M de tampão de bicarbonato de sodio, pH 9,6. A chapa foi então lavada com PBST (PBS + 0,1 % Tween 20) três vezes com o uso de um lavador de chapa NUNC. A chapa foi bloqueada com PBST+0,5% BSA a 150 ul/cavidade. A chapa foi incubada à TA por 1 hora então lavada com PBST três vezes. Em seguida, aos anticorpos antiC83

TLA-4 da invenção foram diluídos em bloco a 1 pg/ml e foram adicionados à chapa. A chapa foi incubada à TA por 1 hora então lavada com PBST três vezes. As cavidades que continham os anticorpos da invenção foram então tratadas com 100 μΙ/cavidade de lgG2-HRP anti-humano (Southern Biotech Cat N°. 9070-05) a uma diluição de 1:4000 em bloco. Da mesma forma, uma fileira foi tratada com IgG anti-humano (Jackson Cat N°. 209-035-088) para normalizar para o revestimento de chapa. Este anticorpo foi diluído para 1:5000 em bloco e adicionado a 100 ul/cavidade. Da mesma forma, uma fileira foi tratada com CTLA-4-HRP (Pharmingen Cat N°. 345815/HRP sob medida conjugado) como um controle positivo. Este anticorpo foi usado a 0,05 ug/ml diluído em bloco. A chapa foi incubada à TA por 1 hora então lavada com PBST três vezes. O substrato quemiluminescente LBA (Pierce) foi adicionado a 100 μΙ/cavidade e a chapa foi incubada em um agitador de chapa por 5 min. A chapa foi então lida com o uso de um lumi-imager por uma exposição de 2 min.

Ensaio de Aglomeração de Seletividade do INGEN CTLA-4-lq: Materiais e

Métodos

Dynabeads M-450 (Dynal A.S., Oslo, Noruega # 140.02) foram lavados 3X com tampão de fosfato de Na, pH 7,4 e ressuspensos em tampão de fosfato de Na. 1,0 μg CTLA-4-lg(G1), 1,0 pg CD28-lg(G1) ou 1,0 a 3,0 pg B7,2-lg(G1) (Repligen, Inc. Needham, MA) foram adicionados a 100 μΙ de pérolas e incubados da noite para o dia em um rotor a 4°C. No dia 2, as pérolas foram lavadas 3X em 1% de BSA mais 0,05% de Tween-20 em PBS da Dulbecco e bloqueadas por 30 minutos. As pérolas foram diluídas 1 a 10 com tampão de bloqueio e 25 μΙ das pérolas revestidas foram adicionados a tubos de polipropileno de 12x75 mm. Todas as amostras foram testadas em duplicata. 50 μΙ de anticorpo de teste (1 pg/ml de concentração final) ou tampão de bloqueio foi adicionado aos tubos e incubados por 30 minutos no carrossel Analyzer Origen 1.5 (IGEN International, Inc., Gaithersburg, MD) à TA, vortexação a 100 rpm. 25 μΙ de lgG1, igG2 ou lgG4 anti-humano de murinos (Zymed, Inc. San Francisco, CA # 05-3300, 05-3500 e 05-3800) (concentração final de 3 pg/ml em 100 μΙ de volume total) foram adicionados aos tubos. Os tubos foram incubados por 30 minutos à TA no carrossel girando a 100 rpm. 200 μΙ de tampão de ensaio Origen (IGEN International, Inc., Gaítherburg, MD #402-050-03) por tubo foram adicionados e girados brevemente e então os tubos foram contados no Analyzer Origen e as uni5 dades ECL (eletroquimiluminescência) foram determinadas para cada tubo. Os fatores de normalização foram determinados para corrigir as diferenças em aglomeração de proteínas de fusão a Dynabeads, e as unidades ECL foram corrigidas para a aglomeração não-específica antes do cálculo de razões de seletividade.

Os resultados dos ensaios são fornecidos nas Tabelas IVA e

IVB.

TABELA IVA

Clone	Isótipo	CTLA4/ CD28 ELISA	CTLA4/ B7.2 ELISA	CTLA4/ CD44 ELISA	CTLA4/ CD28 IGEN	CTLA4/ B7.2 IGEN
3.1.1	lgG2	>500:1(n=3)	>500:1(n=3)	>500:1(n=3)	>500:1 (n=2)	>500:1(n=1) 195:1 (n=1)
4.1.1	lgG2	>500:1(n=3)	>500:1(n=3) 485:1 (n=1)	>500:1(n=3)	>500:1(n=1) 261:1 (n=1)	>500:1(n=1) 107:1 (n=1)
4.8.1	igG2	>500:1 (n=3)	>500:1(n=2) 190:1 (n=1)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=2)	>500:1 (n=2)
4.9.1	igG2	>500:1(n=2) 244:1 (n=1)	>500:1 (n=2) 33:1 (n=1)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=1)	>500:1 (n=1)
4.102	igG2	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=1)	>500:1 (n=1)
4.13.1	igG2	>500:1(n=2) 46:1 (n=1)	>500:1(n=3)	>500:1(n=3)	>500:1(n=1) 329:1 (n=1)	>500:1(n=2)
4.14.3	igG2	>500:1 (n=2) 80:1 (n=1)	>500:1 (n=2) 10:1 (n=1)	>500:1 (n=2) 126:1 (n=1)	>413:1(n=1)	>234:1 (n=1)
6.1.1	igG2	>500:1 (n=2) 52:1 (n=1)	>500:1 (n=3)	>500:1 M)	>500:1 (n=2)	>500:1 (n=2)

TABELA IVB

Clone	Isótipo	CTLA4/CD28 ELISA	CTLA4/B7.2 ELISA	CTLA4/hlgG ELISA
4.1.1	lgG2	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=2)	>500:1 (n=3)
11.2.1	!gG2	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=3)

EXEMPLO 9

Modelo do Sinal da Célula T Humana

A fim de definir adicionalmente a atividade dos anticorpos de acordo com a invenção para agir como reguladores imunes, desenvolveu-se certos ensaios de célula T a fim de quantificar o aumento da produção de célula T IL-2 no bloqueio do sinal do CTLA-4 com os anticorpos. Os seguintes materiais e métodos foram utilizados em conexão com os experimentos. Materiais e Métodos

As células T humanas recém-isoladas foram preparadas pelo uso de Histopaque (Sigma, St. Louis, MO #A-70543) e T-kwik (Lympho-Kwik, One Lambda, Canoga Park, CA, #LK-50-T) e estimuladas com PHA (1 pg/ml) (Fitoemaglutina Purificada, Murex Diagnostics Ltd. Dartford, England, #HA 16) em meio (RPMI 1640 que contém L-glutamina, aminoácidos não essenciais MEM, penicilina, estreptomicina, 25 mM de Hepes e 10% FBS) a uma concentração de 1 x 10⁶ células/ml e incubadas a 37°C por dois dias. As células foram lavadas e diluídas em meio para 2x10⁶ células/ml. As células de Raji (Burkitt lymphoma, Human ATCC N^Q CCL 86 Classe II, American Type Culture Collection Rockville, MD) foram tratadas com mitomicina C (Sigma St Louis, MO, # M-4287) 25 pg/ml) por uma hora a 37°C. As células de Raji foram lavadas 4X em PBS e ressuspensas a 2x10⁶ células/ml. As inflamações de células T humana (5 x 10⁵/ml), células de Raji (5 x 10⁵/ml) e anticorpos antiCTLA-4 ou um anticorpo de controle com isótipo correspondido a várias concentrações foram adicionadas a chapas de microtítulo de 96 cavidades e as chapas foram incubadas a 37°C por 72 horas. O volume total por cavidade foi 200 pl. Setenta e duas horas após a estimulação, as chapas foram giradas e o sobrenadante foi removido e congelado para posterior determinação de IL-2 (kit de IL-2 ELISA Ouantikine, R&D Systems, Minnea86 polis, MN, #D2050) e IFN-γ (kit ELISA IFN-g Quantikine, R&D Systems). O aumento de citocina foi definido como a diferença entre os níveis de citocina em culturas que contêm um mAb de bloqueio antiCTLA-4 versus um anticorpo de controle com isótipo correspondente. Para experimentos de citometria de fluxo, as células de Raji foram lavadas 1 x com tampão FACS (PBS que contém 2% de FCS desativado por calor, 0,025% de azeto de sódio). Os péletes de célula foram ressuspensas em tampão de FACS a 1x10⁶ células/100 μΙ e incubadas com 10 μΐ de anti-CD80-PE (Becton, Dickinson, San Jose, CA) ou anti-CD86-PE (Pharmingen, San Diego, CA) por 30 minutos à temperatura ambiente. As células foram lavadas duas vezes e ressuspensas em 1 ml de tampão FACS. A citometria de fluxo foi executada com o uso de um FACSort da Becton Dickinson. Os marcadores de histograma foram ajustados por análise de anticorpos de controle do isótipo em questão (Caltag, Burlingame, CA).

Em geral, desenvolvemos um ensaio que pode ser usado para a determinação rápida da regulação ascendente da célula T IL-2. Conforme será apreciado, a estimulação das células T é dependente de B7 e CD28. Além disso, as inflamações T lavadas não tornam detectável o IL-2 e as células Raji não tornam detectável o IL-2 mesmo quando estimuladas com LPS ou PWM. No entanto, em combinação, as inflamações T co-cultivadas com células de Raji podem modelar B7, CTLA-4 e CD28 e os eventos de sinalização e os efeitos de anticorpos nestes podem ser avaliados.

A Figura 11 mostra a expressão de B7-1 e B7-2 em células Raji com o uso de mAbs anti-CD80-PE e anti-CD86-PE com o uso de citometria de fluxo (FACs) conforme descrito no Exemplo 6.

A Figura 12 mostra a intensificação dependente de concentração da produção de IL-2 no ensaio de inflamação de célula T/Raji induzido por anticorpos de bloqueio de CTLA-4 (BNI3 (PharMingen) e os anticorpos 4.1.1,

4.8.1 e 6.1.1 da invenção).

A Figura 13 mostra a intensificação dependente da concentração da produção de IFN-γ no ensaio de inflamação de célula T/Raji induzido por anticorpos de bloqueio de CTLA-4 (BNI3 (PharMingen) e os anticorpos 4.1.1,

4.8.1 e 6.1.1 da invenção) (mesmas células T de doador).

A Figura 14 mostra a intensificação média da produção de IL-2 em células T de 6 doadores induzida pelos anticorpos de bloqueio de CTLA4 no ensaio de inflamação de célula T/Raji. É interessante considerar que o mAb, CT4.9.1, se aglomera ao CTLA4, mas não bloqueia a aglomeração de B7. Deste modo, simplesmente a aglomeração a CTLA-4 é insuficiente por si só para prover um anticorpo funcional da invenção.

A Figura 15 mostra a intensificação média da produção de IFN-γ em células T de 6 doadores induzidos por anticorpos de bloqueio de CTLA-4 no ensaio de inflamação de célula T/Raji.

A Figura 19 mostra uma comparação entre os anticorpos 4.1.1 e

11.2.1 da invenção a uma concentração de 30 pg/ml no ensaio de inflamação de célula T/Raji de 72 horas, conforme descrito neste Exemplo 9 e no ensaio de superantígeno descrito no Exemplo 10.

A Figura 20 mostra a intensificação dependente de concentração da produção de IL-2 no ensaio de inflamação de célula T/Raji induzido pelos anticorpos CTLA4 4.1.1 e 11.2.1 da invenção.

A seguinte Tabela IVc fornece informação relacionada à intensificação média e faixa de intensificação da resposta de citocina nos ensaios

Raji e SEA da invenção. Cada um dos experimentos incluso nos resultados é baseado em anticorpo a uma dose de 30 pg/ml e medido a 72 horas. Os números de doadores usados nos experimentos são bem como as respostas são mostradas.

TABELA IVC

Ensaio	mAb	Cito- cina	Intensificação da faixa pg/ml	SEM	Intensificação da faixa pg/ml	n	Resposta do doador
T ceil blast/Raji	4.1.1	IL-2	3329	408	0 a 8861	42	19 de 21
T cell blast/Raji	4.1.1	IFN-γ	3630	980	600 a 13939	17	13 de 13
T cell blast/Raji	11.2.1	IL-2	3509	488	369 a 6424	18	14 de 14

continuação

SEA (PBMC)	4.1.1	IL-2	2800	312	330 a 6699	42	17 de 17
SEA (PBMC)	11.2.1	IL-2	2438	366	147 a 8360	25	15 de 15
SEA (Whole Blood)	4.1.1	IL-2	6089	665	-168 a 18417	46	15 de 17
SEA (Whole Blood)	11.2.1	IL-2	6935	700	-111a 11803	25	12 de 14

EXEMPLO 10

Modelo de Sinal de Célula T Humana

Desenvolvemos um segundo ensaio celular a fim de quantificar a 5 intensificação de regulação ascendente de célula T IL-2 no bloqueio de sinal CTLA-4 com os anticorpos. Os seguintes materiais e métodos foram utilizados em conexão com os experimentos:

Materiais e Métodos

PBMC humanos foram preparados com o uso de Accuspina. As 10 chapas de microtítulo foram previamente revestidas com um anticorpo antiCD3 (Ieu4, Becton Dickinson) (60 ng/ml) e incubadas por 2 horas a 37°C. hPBMC foram adicionados aos cavidades a 200.000 células por cavidade. Enterotoxina A de estafilococus (SEA) (Sigma) foi adicionada às cavidades a 100 ng/ml. Os anticorpos foram adicionados às cavidades, geralmente a 30 pg/ml. As células foram então estimuladas por 48, 72 ou 96 horas. As chapas foram centrifugadas ao tempo-ponto desejado e os sobrenadantes foram removidos das cavidades. Posteriormente, os sobrenadantes foram verificados quanto à produção de IL-2 com o uso de ELISA (R&D Systems).

Os resultados desses experimentos são mostrados nas Figuras

16, 17 e 21. Na Figura 16, a indução da produção de IL-2 em hPBMC de 5 doadores foi medida 72 horas após a estimulação. Na Figura 17, os resultados são mostrados da medição de todo o sangue, analisando a diferença na indução da produção de IL-2 no sangue de 3 doadores, conforme medido a e 96 horas após a estimulação.

Na Figura 21, a intensificação da produção de IL-2 em todo o sangue de 2 doadores conforme medido a 72 horas após a estimulação. EXEMPLOU

Modelo de Tumor Animal

Estabeleceu-se um modelo de tumor animal para a análise in vivo de anticorpos CTLA-4 anti-murinos em inibir o desenvolvimento do tumor. No modelo, um tumor de fibrosarcoma de murinos é desenvolvido, e os animais são tratados com anticorpos CTLA-4 anti-murinos. Os materiais e métodos para o estabelecimento do modelo são providos abaixo:

Materiais e Métodos

Camundongos A/J fêmeas (6-8 semanas de idade) foram injetados subcutaneamente do lado dorsal do pescoço com 0,2 ml de células de tumor Sa1N (1 χ 10⁶) (Baskar 1995). O CTLA-4 anti-murinos ou um anticorpo de controle correspondido ao isótipo (PharMingen, San Diego, CA, 200 ug/animal) foram injetados intraperitionealmente nos dias 0,4, 7 e 14 após a injeção de células com tumor. As medições de tumor foram tomadas durante o curso dos experimentos de 3-4 semanas com o uso de um calibrador eletrônico Starret SPC Plus (Athol, MA) e o tamanho do tumor foi expresso como a área de superfície coberta pelo desenvolvimento do tumor (mm²).

A Figura 18 mostra a inibição de desenvolvimento de tumor com um anticorpo CTLA-4 anti-murinos em um modelo de tumor de fibrosdarcoma de ratos. Conforme mostrado na Figura 18, os animais tratados com antiCTLA-4 teve uma redução no desenvolvimento do tumor se comparado com os animais tratados com um anticorpo de controle de isótipo. Conseqüentemente, os mAbs de CTLA-4 anti-murinos são capazes de inibir o desenvolvimento de um fibrosarcoma em um modelo de tumor de camundongo.

Espera-se que os anticorpos com reação cruzada com o CTLA-4 de ratos desempenhem similaridade no modelo. No entanto, dos anticorpos da invenção que foram verificados quanto a reatividade cruzada, nenhum tem reação cruzada com o CTLA-4 de murinos.

EXEMPLO 12

Modelos Animais de Tumor

A fim de adicionalmente investigar a atividade de anticorpos de acordo com a invenção, um modelo de camundongo xenoenxerto SCID foi designado para testar a erradicação dos tumores estabelecidos e suas metástases derivadas. No modelo, os camundongos SCID são providos com células T enxertadas e são implantadas com célula de pulmão não pequeno derivado do paciente (NSCL) ou células de carcinoma coloretal (CC). A implantação é feita aos chumaços gordos gonadais de camundongos SCID. Os tumores se desenvolvem e são posteriormente removidos. Os camundongos desenvolvem tumor semelhante ao humano e metástase de fígado. Esse modelo é descrito em Bumpers et al., J. SurgicalRes. 61:282-288 (1996).

Espera-se que os anticorpos da invenção inibirão o desenvolvimento de tumores formados nesses camundongos.

INCORPORAÇÃO A TÍTULO DE REFERÊNCIA

Todas as referências no presente relatório citadas, inclusive patentes, pedidos de depósito de patente, documentos, livros de texto, e outros do gênero, e as referências no presente relatório citadas, ao ponto em que eles já não estão prontos, estão no presente relatório incorporados a título de referência em sua totalidade. Além disso, as seguintes referências também estão incorporadas a título de referência no presente relatório em sua totalidade, inclusive as referências citadas em tais referências:

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Pedido de Depósito de Patente U.S. N°. de série 08/096.762 depositado em 22 de julho de 1993

Pedido de Depósito de Patente U.S. N°. de série 08/112.848 depositado em 27 de agosto de 1993

Pedido de Depósito de Patente U.S. N°. de série 08/155.301 depositado em 18 de novembro de 1993

Pedido de Depósito de Patente U.S. N°. de série 08/161.739 depositado em 3 de dezembro de 1993

Pedido de Depósito de Patente U.S. N°. de série 08/165.699 depositado em 10 de dezembro de 1993

Pedido de Depósito de Patente U.S. N°. de série 08/209.741 depositado em 9 de março de 1994

Pedido de Depósito de Patente U.S. N°. de série 08/234.145 de98 positado em 28 de abril de 1994

Pedido de Depósito de Patente U.S. N°. de série 08/724.752 depositado em 2 de outubro de 1996

Pedido de Depósito de Patente U.S. N°. de série 08/730.639 depositado em 11 de outubro de 1996

Pedido de Depósito de Patente U.S. N°. de série 08/759.620 depositado em 3 de dezembro de 1996

Pedido de Depósito de Patente U.S. N°. de série 08/759.620 depositado em 3 de dezembro de 1996 Patente U.S. N°. 4.399.216 Patente U.S. N°. 4.681.581 Patente U.S. N°. 4.683.195 Patente U.S. N°. 4.683.202 Patente U.S. N°. 4.735.210 Patente U.S. N°. 4.740.461 Patente U.S. N°. 4.816.397 Patente U.S. N°. 4.912.040 Patente U.S. N°. 4.959.455 Patente U.S. N°. 5.101.827 Patente U.S. N°. 5.102.990 (RE 35.500) Patente U.S. N°. 5.151.510 Patente U.S. N°. 5.194.594 Patente U.S. N°. 5.434.131 Patente U.S. N°. 5.530.101 Patente U.S. N°. 5.545.806 Patente U.S. N°. 5.545.807 Patente U.S. N°. 5.585.089 Patente U.S. N°. 5.591.669 Patente U.S. N°. 5.612.205 Patente U.S. N°. 5.625.126 Patente U.S. N°. 5.625.825 Patente U.S. N°. 5.633.425

Patente U.S. N°. 5.643.763

Patente U.S. N°. 5.648.471

Patente U.S. N°. 5.661.016

Patente U.S. N°. 5.693.761

Patente U.S. N°. 5.693.792

Patente U.S. N°. 5.697.902

Patente U.S. N°. 5.703.057

Patente U.S. N°. 5.714.350

Patente U.S. N°. 5.721.367

Patente U.S. N°. 5.733.743

Patente U.S. N°. 5.770.197

Patente U.S. N°. 5.770.429

Patente U.S. N°. 5.773.253

Patente U.S. N°. 5.777.085

Patente U.S. N°. 5.789.215

Patente U.S. N°. 5.789.650

Patente U.S. N°. 5.811.097

Patente Européia N°. EP 0 546 073 B1

Patente Européia N°. EP 0 463 151 B1, concessão publicada em de junho de 1996

Pedido de Depósito de Patente Internacional N°. WO 92/02190 Pedido de Depósito de Patente Internacional N°. WO 92/03918 Pedido de Depósito de Patente Internacional N°. WO 92/22645 Pedido de Depósito de Patente Internacional N°. WO 92/22647 Pedido de Depósito de Patente Internacional N°. WO 92/22670 Pedido de Depósito de Patente Internacional N°. WO 93/00431 Pedido de Depósito de Patente Internacional N°. WO 93/12227 Pedido de Depósito de Patente Internacional N°. WO 94/00569 Pedido de Depósito de Patente Internacional N°. WO 94/02602, publicada em 3 de fevereiro de 1994

Pedido de Depósito de Patente Internacional N°. WO 94/25585 Pedido de Depósito de Patente Internacional N°. WO 94/29444

100

Pedido de Depósito de Patente Internacional N°. WO 95/01994 Pedido de Depósito de Patente internacional N°. WO 95/03408 Pedido de Depósito de Patente Internacional N°. WO 95/24217 Pedido de Depósito de Patente Internacional N°. WO 95/33770

Pedido de Depósito de Patente Internacional N°. WO 96/14436

Pedido de Depósito de Patente Internacional N°. WO 96/34096, publicada em 31 de outubro de 1996

Pedido de Depósito de Patente Internacional N°. WO 97/13852 Pedido de Depósito de Patente Internacional N°. WO 97/20574

Pedido de Depósito de Patente Internacional N°. WO 97/38137

Pedido de Depósito de Patente Iníernacionai N°. WO 98/24884 Pedido de Depósito de Patente Internacional N°. WO 98/24893, publicado em 11 de Junho de 1998.

EQUIVALENTES

A descrição precedente e os Exemplos detalham certas modalidades preferidas da invenção e descrevem o melhor modo contemplado pelos inventores. Será apreciado, no entanto, que não importa quão detalhado o precedente possa parecer no texto, a invenção pode ser praticada de muitas maneiras e a invenção deve ser construída de acordo com as reivin20 dicações anexas e qualquer um de seus equivalentes.

Claims (4)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Anticorpo monoclonal ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente ao antígeno do linfócito T citotóxico 4 (CTLA-4), caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo ou fragmento

   5 de ligação a antígeno compreende a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada definida em SEQ ID NO: 70 e a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve definida em SEQ ID NO: 71; e em que o fragmento de ligação a antígeno é selecionado a partir do grupo consistindo em Fab, Fab’, F(ab’)₂, e Fv.

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2. 2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo compreende a sequência de aminoácidos de cadeia pesada da SEQ ID NO: 70 e a sequência de aminoácidos de cadeia leve da SEQ ID NO: 71.
3. 3. Ácido nucléico isolado, caracterizado pelo fato de que com15 preende a sequência de nucleotídeo de cadeia pesada de SEQ ID NO: 61, a sequência de nucleotídeo de cadeia leve de SEQ ID NO: 62, ou ambos.
4. 4. Ácido nucléico isolado de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que é operacionalmente ligado a uma sequência de controle de expressão.

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