PT749323E

PT749323E - Metodos para modular a anergia das celulas t

Info

Publication number: PT749323E
Application number: PT95914695T
Authority: PT
Inventors: Vassiliki A Boussiotis; Gordon J Freeman; Lee M Nadler
Original assignee: Dana Farber Cancer Inst Inc
Priority date: 1994-03-08
Filing date: 1995-03-08
Publication date: 2001-05-31
Also published as: GR3035158T3; ATE197766T1; ES2153895T3; DE69519513T2; EP0749323A1; HK1016019A1; US20020051784A1; DE69519513D1; EP0749323B1; EP1025856A2; US6451305B1; DK0749323T3; AU709711B2; JP2007126481A; JPH09510211A; EP1025856A3; AU2157995A; CA2185027A1; WO1995024217A1

Description

Descrição “Métodos para modular a .mergia das células T”

Antecedentes da invenção

As respostas das células T específicas dos antigénios exigem múltiplas interacções entre os receptores existentes na superfície celular das células T e os ligandos existentes em células que apresentem antigénios. A interacção principal tem lugar entre o complexo CD3 receptor das células T e uma molécula do complexo principal da histocompatibilidade que apresente um péptido antigénico para o receptor das células T, desencadeando consequentemente nas células T um sinal específico do antigénio. Para além deste sinal específico do antigénio, as respostas das células T exigem um segundo sinal co-estimulador. E possível gerar um sinal co-estimulador nas células T estimulando-as através de um receptor CD28 da superfície celular (Harding, F.A. (1992) Nature 356:607-609). Foram já identificados os ligandos para os CD28 em células possuidoras de antigénios (CPA). Os ligandos dos CD28 compreendem os elementos da família B7 de proteínas, tais como B7-1 e B7-2 (Freedman, A.S. et al. (1987) J. Immunol. 137:3260-3267; Freeman, G.J. et al. (1989) J. lmmunol. 143:2714-2722; Freeman, G.J. et al. (1991) J. Exp. Med. 174:625-631; Freeman, G.J. et al. (1993) Science 262:909--911; Azuma, M. et al. (1993) Nature 366:76-79; Freeman, G.J. et al. (1993) J. Exp. Med 178:2185-292). Também se demonstrou que as proteínas B7 se ligam a outro receptor da superfície das células T, relacionado com o CD28, designado por CTLA4, embora a função do CTLA4 na co-estimulação ainda não esteja devidamente explicada (Linsley, P.S. (1991) J.

Exp. Med. 174:561-569).

Demonstrou-se que o envio de um sinal específico de um antigénio para uma células T na ausência de um sinal co-estimulador não induz uma resposta das células T, induzindo antes um estado de falta de responsividade, também designado por anergia das células T (ver Schwartz, R.H. (1990) Science 248:1349; Jenkins, M.K. et al. (1988) J. Immunol. 140:3324). Com base neste fenómeno foram propostas soluções terapêuticas para induzir a falta dc rcspon-sividade das células T a um antigénio, implicando o bloqueio de um sinal co-estimulador nas células T. Por exemplo, foi utilizada uma proteína de fusão CTLA41g, que se liga simultaneamente às B7-1 e B7-2 e que bloqueia a sua interacção com os CD28, para inibir a rejeição de enxertos aiogénicos e xenogénicos (ver, v.g. Turka, LA et al. (1992) Proc. Natl. Acad Sei. USA 89:11102-11105; Lenschow, DJ. et al. (1992) Science 257:789-792). Em alternativa, foram propostas soluções terapêuticas para estimular uma resposta das células T a um antigénio numa célula (v.g. uma célula tumoral). Por exemplo, descobriu-se que células tumorais, modificadas para exprimirem o ligando B7-1 das CD28 sobre a sua superfície, desencadeavam um sinal co-estimulador nas células T (ver, v.g., Chen, L. et al. (1992) Cell 71:1093-1102; Townsend, S.E. e Allison, J.P. (1993) Science 259:368-370; e Baskar, S. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:5687-5690).

Para além das interaeções co-estimuladoras e específicas dos antigénios, admite-se que haja muitos outros receptores da superfície celular das células T que desempenhem uma função acessória na activação das células T (explicado por Clark, EA e Ledbetter, J.A. (1994) em Nature 367:425-428). Como exemplos de tais receptores da superfície das células refere-se: os CD4 que interactuam com os antigénios de classe Π do CPH (o mesmo que MHC); os CD8, que interactuam com os antigénios de classe I do CPH; os CD40 que interactuam com os CD40L (gp39); a M-1AIC (o mesmo que ICAM-1) que interactua com a A-1FL: e o CD2 que interactua com a A-3FL (também conhecida por CD58) (Selvaraj, P. et al. (1987) Nature 326:400-403). Demonstrou-se que o CD2 também interactua com as CD48 e CD59. embora com uma afinidade menor do que a A-3FL em seres humanos (Arulanandam, A.R. et al. (1993) J. Exp. Med. 177:1439-1450; Sandrin, M.S. etal. (1993) J. Immunol. 151:4606-4613). O CD2 é uma glicoproteína com uma massa molecular relativa compreendida entre 50000 e 58000 que é expressa nos timócitos e nas células T perfeitamente desenvolvidas. O CD2 liga-se aos eritrócitos dos ovídeos, o que é uma propriedade responsável pelo fenómeno de distribuição das células T em rosetas E. A interaeção entre os CD2 numa célula T e as A-3FL numa CAA (o mesmo que APC) pode facilitar o reconhecimento de antigénios pelas células T, estimulando assim as respostas das células T específicas de antigénios (ver, v.g., Bierer, B. et al. (1988) J. Exp. Med. 168:1145; Moingeon, P. et al. (1989) Nature 339:312; Koyasu, S. Et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:2603; Selvaraj, P. et al. (1987) Nature 326:400 e Bierer, B. et al. (1988) J. Immunol. 140:3358). Este efeito é atribuído, pelo menos parcialmente, à maior adesão entre as células T e as CAA, mediada pela interaeção de tipo CD2/A-3FL. Além disso, demonstrou-se que as células T, in vitro, podem ser estimuladas de modo a proliferarem e a segregarem a IL-2 na ausência das CAA, utilizando-se para tal uma combinação adequada de anticorpos anti-CD2 (ver, v.g. Meuer, S. et al. (1984) Cell 36:897; Feetrson, A. et al. (1987) Nature 329-842; Yang, Y.S. et al. (1986) J. Immunol. 137:1097; e S.C. Meuer em Leucocyte Typing IV, White cell differentiation antigens, W. Knapp et al., Eds. (Oxford, 1989), pág. 270). Por exemplo, as células T podem ser activadas com um anticorpo TI 1.3 anti-CD2 em combinação com qualquer um dos outros dois anticorpos TI 1.2 ou TI 1.1 anti-CD2. Demonstrou--se que um epítopo TI 1.3 é um “neoepítopo” que não é exposto nos CD2 em células T em repouso mas que é exposto nos CD2 após a activação das células T (Meuer, S. et al. (1984)

Cell 36:897). Embora experiências efectuadas com culturas in vitro envolvendo os CD2 tenham permitido associar este receptor superficial ao fenómeno de adesão entre as células T e as CAA e na activação das células T, tais estudos não permitiram concluir qual é a função fisiológica que os CD2 podem desempenhar nas respostas das células T aos antigénios. O documento EP-A-0 503 646 descreve anticorpos monoclonais que reconhecem as A-3FL e a sua utilização potencial em aplicações em que seja desejável inibir a ligação entre as A-3FL e o seu receptor (CD2), v.g. em imunomodulação. O documento W093/06866 descreve a utilização de inibidores da interaeção de tipo CD2/A-3FL para evitar e tratar doenças de pele caracterizadas por uma maior activação das células T e por uma existência anormal de antigénios na derme e na epiderme. O documento WO93/06852 descreve um método para fazer aumentar a tolerância de tecidos transplantados com aloenxertos ou xenoenxertos num mamífero, mediante a administração de uma proteína A-3FL ou de ligação aos CD2. O documento W093/00431 descreve o receptor CTLA-4 como sendo um ligando para o antigénio B7 e descreve também métodos para tratar doenças do sistema imunitário em que intervêm indirectamente interaeções com as células T. 0 documento W091/11194 descreve uma composição que contém a A-3FL, um imunogénio e como coadjuvante um ligando ou um anticorpo que reconheça no CD2 um epítopo diferente daquele que é ligado pelas A-3FL, para estimular e para aumentar a resposta imunitária de um animal hospedeiro perante esse imunogénio.

Descrição abreviada da invenção A presente invenção descreve métodos para modular a falta de responsividade das células T, específica de antigénios. A invenção compreende os métodos para conservar ou inverter a falta de responsividade das células T, mediante a inibição ou a estimulação das células T não responsivas, por meio de um receptor da superfície celular. Descobriu-se que as células T específicas de antigénios que passaram a ser não responsivas a um antigénio, podem readquirir a capacidade para responderem ao antigénio ao serem estimuladas por meio de um receptor da superfície celular, tal como o CD2. Assim sendo, a invenção divulga um papel funcional para os CD2 na reversão da falta de responsividade das células T específicas dos antigénios (também designada por anergia das células T).

Uma variante da presente invenção implica a manutenção da anergia das células T fazendo contactar células T anergizadas com um agente que iniba a estimulação das células T através dos CD2. Os agentes mrbidores dos CD2 são aqueles que inibem uma interacção entre os CD2 e um ligando dos CD2 (v.g. A-3FL, CD48 ou CD59). Tais agentes compreendem os anticoipos de bloqueio, as fornias solúveis de CD2 e dos ligandos de CD2, péptidos e moléculas pequenas. Em alternativa, um agente inibidor dos CD2 pode actuar intracelularmente para inibir um sinal intracelular desencadeado nas células T através dos CD2. Uma outra variante da invenção tem a ver com a reversão da anergia das células T fazendo contactar células T anergizadas com um agente que estimule as células T através dos CD2. Como agentes estimuladores dos CD2 refere-se uma célula que exprima um ligando CD2 sobre a sua superfície (v.g. A-3FL, CD48 ou CD59), formas multivalentes de um ligando CD2 ou anticorpos estimuladores anti-CD2. Em alternativa, um agente estimulador CD2 pode actuar intracelularmente para desencadear um sinal através dos CD2.

Os métodos da invenção são úteis terapeuticamente em situações em que seja desejável modular respostas imunitárias especificas de antigénios, v.g. manter a falta de responsividade das cclulas T específicas de antigénios ou restabelecer a responsividade das células T específicas de antigénios. Por exemplo, eventualmente pode ser necessário manter a feita de responsividade das células T num paciente que tenha recebido um transplante de um órgão ou de medula óssea, para evitar a rejeição do enxerto, mediante a inibição da estimulação através dos CD2. Além disso, é possível manter a falta de responsividade das células T bloqueando a estimulação dos CD2 num paciente que padeça de uma doença de natureza autoimunitária para mitigar sintomas dessa doença autoimunitária. Nestes casos, administra-se ao paciente um agente inibidor dos CD2 numa quantidade e durante um período suficientes para que seja mantida a falta de responsividade das células T. Em alternativa, é possível reverter a falta de responsividade das células T num paciente portador de um tumor para estimular uma resposta das células T específica do tumor, ou então num paciente que receba uma vacina para aumentar a eficácia dessa vacina. Por exemplo, é possível modificar uma célula (v.g. uma célula tumoral) para exprimir um ligando CD2 ou é possível administrar um agente estimulador CD2 a um paciente portador de um tumor ou no qual tenha sido removido um tumor cirurgicamente, para assim se evitar a recorrência do tumor. Além disso, a responsividade especifica dos antigénios pode ser restabelecida em células T anergizadas in vitro mediante a estimulação das células T por meio das CD2. As células T responsívas geradas in vitro podem ser depois administradas a um paciente.

Descrição abreviada dos desenhos A figura 1 ilustra um conjunto de gráficos de barras que mostram a proliferação das células T e a produção de IL-2 em resposta a um novo estímulo produzido por células que apresentam antigénios artificiais ou por uma linhagem celular linfoblastóide depois de ter recebido um estímulo primário. A figura 2 é um gráfico que mostra a proliferação das células T anergizadas a seguir a uma cultura em IIΛ e com estimulação feita com células que apresentam antigénios artificiais ou com uma linhagem celular linfoblastóide. A figura 3 é um gráfico de barras que mostra a proliferação de células T anergizadas a seguir a uma cultura em IL-2 e com estímulo por meio de uma linhagem celular linfoblastóide na presença de anticorpos dirigidos contra as moléculas da superfície celular na linhagem de células linfoblastóídes. A figura 4 é um gráfico de barras que mostra a proliferação de IL-2 e a sua produção por células T anergizadas a seguir à cultura em IL-2 e com estímulo por meio de células que apresentam antigénios artificiais. A figura 5 ilustra um conjunto de gráficos de banas que mostram a proliferação de células T e a produção de IL-2 a seguir a um estímulo primário, cultura em IL-2, um segundo estímulo e um novo estímulo com células que apresentam antigénios artificiais ou com uma linhagem de células linfoblastóídes. A figura 6 ilustra um conjunto de gráficos que mostram a expressão dos epítopos Tll.l, TI 1.2 e T11.3 dos CD2 em células CT-1, em células CT-1 anergizadas e em células CT-1 anergizadas a seguir à cultura em IL-2. A figura 7 é uma fotografia de um filtro de imunotransferência de proteínas de células T imunoprecipitadas com um anticorpo anti-CD2 (Tll.l, TI 1.2 ou TI 1.3) e imunotransferidas com um anti-soro específico da JAK-cinase (R80) (painel da esquerda) ou com um anti-soro específico da JAK-3-cinase (painel da direita), mostrando a associação da forma dos CD2 que exprime as TI 1.3 com a JAK-3-cmase.

Descrição minuciosa da invenção A presente invenção diz respeito a métodos para modular a falta de responsividade das células T específicas dos antigénios. A expressão “falta de responsividade das células T” aqui utilizada serve para designar uma redução ou a falta de proliferação das células T, a secreção de lmfòquma ou a mdução de funções efectoras por uma célula T ao scr exposta ao antigénio (ou à parte antígénica) a que a célula T deixou de dar resposta. As expressões “falta de responsividade das células Τ’ e “anergia das células T” são aqui utilizadas indiferentemente. Os métodos da presente invenção proporcionam um mecanismo para manter ou para reverter a falta de responsividade de uma célula T a um antigénio in vitro ou in vivo. As células T não responsivas são células em que foi induzida anergia ou falta de responsividade das células T, por exemplo, por exposição a um antigénio na ausência de um sinal co-estimulador. A mdução da falta de responsividade das células T designa a criação inicial de um estado de anergia das células T. A anergia das células T pode ser induzida, por exemplo, desencadeando numa célula T um sinal específico do antigénio (v.g. com um péptido antigénico associado ao CPH (o mesmo que MHC) numa célula que apresente um antigénio) na ausência de um sinal co-estimulador. Assim sendo, os métodos da presente invenção são parficulannente úteis para modular a falta de responsividade de células T específicas de antigénios em células T anérgicas (isto é, células T em que foi previamente induzida ou criada falta de responsividade ou anergia). O termo “modulação” abrange quer a manutenção de um estado de falta de resposta (isto é, anergia permanente das células T) quer a reversão de um estado de falta de resposta (isto é, o restabelecimento da responsividade das células T).

Os métodos da presente invenção implicam a utilização de agentes que inibam ou estimulem uma célula T anergizada para se manter ou reverter a anergia das células T. A invenção baseia-se, pelo menos parcialmente, na descoberta do facto de uma célula T que tenha deixado de reagir a nm antigénin (por exemplo, ao receber um sinal específico do antigénio na ausência de um sinal co-estimulador) poder ser estimulada para readquirir a capacidade de responder ao antigénio. A responsividade das células T anergizadas, específica dos antigémos, pode ser restabelecida mediante a estimulação das células T por meio dc um receptor superficial, tal como o CD2, na presença do antigénio. Deste modo, de acordo com uma variante da invenção, mantém-se a falta de responsividade das células T fazendo contactar uma célula T anergjzada com um agente que iniba a estimulação das células T através do CD2. Pelo contrário, os métodos para reverter a falta de responsividade das células T implicam o estabelecimento de contacto de uma célula T anergizada com um agente que estimule a célula T através do CD2. Cada um destes métodos é minuciosamente descrito nas subsecções seguintes.

I. Métodos para manter a falta de responsividade das células T

Um dos aspectos da presente invenção diz respeito a métodos para manter a falta de responsividade das células T, particularmente úteis em situações terapêuticas em que tenha sido induzida a anergia das células T e em que seja desejável conservar o estado de falta de resposta ao antigénio. Como exemplos de tais situações terapêuticas refere-se os casos dos pacientes transplantados com células ou tecidos alogénicos ou xenogénicos, por exemplo, um transplante de um órgão ou de medula óssea, e os casos dos pacientes que padeçam de uma doença de natureza autoimunitária. Nestas situações é possível que um regime terapêutico tenha induzido um estado de falta de responsividade das células T específicas dos antigémos no paciente que se pretende tratar. Por exemplo, a falta de responsividade das células T específicas dos antigéníos pode ser induzida no paciente graças à inibição de um sinal co--estimulador nas células T, v.g. com um agente CTLA4Ig (ver, v.g. Turka, L.A. etal. (1992) Proc. Natl.Acad Sei. USA 89:11102-11105; Lenschow, DJ. etal. (1992) Science 257:789-792).

Nesta variante da invenção mantém-se a falta de responsividade das células T a um antigénio fazendo contactar a célula T com um agente que iniba a estimulação dessa célula T através de um receptor superficial CD2. Os agentes que inibem a estimulação das células T através de um receptor superficial CD2 podem levar ao bloqueio completo da estimulação das células T através do CD2 ou podem levar à inibição parcial da estimulação das células T através do CD2, desde que se mantenha a falta de responsividade das células T, tal como aqui definida. De acordo com uma variante, o agente que inibe a estimulação das células T através de um receptor superficial CD2 (doravante aqui designado por agente inibidor CD2) actua segundo um mecanismo de bloqueio da interaeção do receptor superficial CD2 com um ligando CD2. De preferência, o agente bloqueia a interaeção do CD2 com o seu ligando, o A-3FL (CD58). Em alternativa, o agente inibe a interaeção do CD2 com outro ligando, tal como o CD48 ou o CD59. Como agentes utilizáveis para bloquear ou inibir a interaeção entre o CD2 e um ligando CD2 refere-se: os anticorpos que se ligam quer ao CD2 quer ao ligando CD2 (v.g., os anticorpos de bloqueio); uma forma solúvel de CD2 (v.g., uma fonna truncada da molécula a que falte um domínio transmembranar ou citoplásmico ou uma proteína de fiisão solúvel, v.g. uma proteína de fiisão de ímunoglobulina) que conserve a capacidade para se ligar a um ligando CD2; uma forma solúvel de um ligando CD2 (v.g., uma fonna truncada da molécula a que falte um domínio transmembranar ou citoplásmico ou uma proteína de fusão solúvel, v.g. uma proteína de fusão de ímunoglobulina) que conserve a capacidade de se ligar ao CD2; péptidos que inibam a interaeção do CD2 e de um ligando CD2; e moléculas pequenas que inibam a ínteracção do CD2 e de um ligando CD2. Em alternativa, um agente inibídor CD2 pode actuar intracelulaimente para inibir um sinal intracelular desencadeado por meio do CD2. Cada um destes agentes inibidores CD2 é descrito minuciosamente a seguir. A. Anticorpos de bloqueio

De acordo com uma variante, um agente inibidor CD2 é um anticorpo que se liga quer ao CD2 (isto é, um anticorpo anti-CD2) quer a um ligando CD2 (isto é, um anticorpo anti--ligando CD2) para praticamente bloquear ou inibir uma interacção entre o CD2 e um ligando CD2 (isto é, anticorpos de bloqueio). Os anticorpos de bloqueio anti-CD2 encontram-se descritos na especialidade (v.g. TS2/18; ver, por exemplo, Sanchez-Madrid, F. (1982) Proc. Natl. Acad Sei. USA 79:7489) e é possível adquiri-los nos circuitos comerciais (v.g. o anti-Leu 5 fornecido por Becton Dickinson, Mountain View, CA). Os anticorpos anti-ligando CD2 compreendem os anticorpos anti-A-3FL, os anticorpos anti-CD48 e os anticorpos anti-CD59. Os anticorpos anti-A-3FL que é possível utilizar para praticamente bloquear ou inibir uma interacção do CD2 com o A-3FL são conhecidos na especialidade (v.g. TS2/9; ver, por exemplo, Sanchez--Madrid, F. (1982) Proc. Natl. Acad Sei. USA 79:7489). Os anticorpos de bloqueio anti-CD48 (ver, v.g. Sandrin, M.S. (1993) J. Immunol. 151:4606 e Kato, K. et al. (1993) Eur. J. lmmunol. 23:1412) e os anticorpos de bloqueio anti-CD59 (ver, v.g. Deckert, M. et al. (1992) Eur. J. lmmunol. 22:2943-2947) também são conhecidos na especialidade.

Além do mais, os anticorpos para o CD2 ou para um ligando CD2 (v.g., A-3FL) podem ser produzidos por meio de técnicas convencionais. Os anticorpos podem ser policlonais ou então, mais preferencialmente, são monoclonais. Os anticorpos policlonais e monoclonais podem ser preparados por meio de técnicas convencionais conhecidas na especialidade. Por exemplo, é possível imunizar um mamífero (v.g. um murganho, um criceto ou um coelho) com um antigénio (isto é, CD2 ou um ligando CD2), por exemplo, com proteínas purificadas, proteínas recombinantes ou os seus fragmentos peptídicos, ou com uma célula que exprima o antigénio (v.g., que exprima o CD2 ou um ligando CD2 sobre a superfície celular) para fazer surgir uma resposta de anticorpos contra o antigénio no mamífero. Em alternativa, é possível utilizar tecidos ou um órgão intacto, que exprimam o antigénio, para fazer surgir os anticorpos. A evolução da imunização pode ser verificada por detecção das concentrações de anticorpos no plasma ou no soro. E possível utilizar o protocolo convencional de EISLE (o mesmo que ELISA) ou qualquer outro imunoensaio com o antigénio para se avaliar as concentrações dos anticorpos. A seguir à imunização é possível obter os anti-soros e é possível, se desejado, isolar anticorpos policlonais a partir desses soros. Para se produzir anticorpos monoclonais é possível fazer uma colheita de células produtoras de anticorpos (linfócitos) a partir de um animal imunizado e fundi-las com células de mieloma por meio de procedimentos convencionais de fusão de células somáticas, tomando pois imortais essas células e gerando células de hibridomas. Tais técnicas são bem conhecidas na especialidade. Por exemplo, é possível utilizar a técnica dos hibridomas originalmente desenvolvida por Kohler e Milstein ((1975) Nature 256:495-497) e também quaisquer outras técnicas, tais como a técnica do hibridoma das células B humanas (Kozbar et cã. (1983) Immunol. Today 4:72) e a técnica do hibridoma de EBV para produzir anticorpos monoclonais humanos (Cole et al. (1985) Monoclonal Antibodies in Câncer Tkerapy, Allen R. Bliss, Inc., páginas 77-96). As células de hibridomas podem ser pesquisadas por via imunoquímica para a produção de anticorpos especificamente reactivos com o antigénio e é possível isolar os anticorpos monoclonais.

Outro método para gerar anticorpos específicos, ou fragmentos de anticorpos, reactivos contra o CD2 ou contra um ligando CD2, consiste em pesquisar bancos de dados de expressão que codifiquem genes de imunoglobulina, ou partes suas, expressos em bactérias com o antigénio (ou com uma parte sua) Por exemplo, é possível exprimir fragmentos Fac (o mesmo que Fab) completos, regiões Vh, regiões Fv e anticorpos de cadeia singular em bactérias, utilizando bancos de expressão de bacteriófagos. Ver, por exemplo, Ward et al. (1989) Nature 341:544--546; Huse et al (1989) Science 246:1275-1281, c McCaffcrty et al. (1990) Nature 348:552--554. Em alternativa, é possível utilizar o murganho SCID-hu para a produção de anticorpos ou dos seus fragmentos.

Tal como aqui utilizado, o termo “anticorpo” pretende abranger os seus fragmentos que conservem uma propriedade funcional desejada, v.g., a capacidade para inibir a interacção entre o CD2 e um ligando CD2. Os anticorpos podem ser fragmentados mediante a utilização de técnicas convencionais e os seus fragmentos podem ser sujeitos a pesquisas para investigar a sua utilidade, de uma forma idêntica à anteriormente descrita a propósito dos anticorpos intactos. Por exemplo, é possível gerar fragmentos F(ac’)2 (o mesmo que F(ab’)2) tratando o anticorpo com pepsina. O fragmento F(ac’)2 resultante pode ser tratado de modo a serem reduzidas as pontes dissulfureto para serem produzidos fragmentos Fac’. O termo “anticorpo” também pretende designar os seus derivados que conservem uma propriedades funcional desejada, v.g., a capacidade para inibir uma interacção entre o CD2 e um ligando CD2. Como exemplos de derivados de anticorpos refere-se as moléculas quiméricas, as moléculas humanizadas, as moléculas com funções efectoras reduzidas e as moléculas biespecíficas. Um anticorpo, ou um seu fragmento, produzido num paciente não humano pode ser reconhecido, em graus variáveis, como alienígena quando esse anticorpo for administrado a um paciente humano e possa ser gerada no paciente uma resposta imunitária contra o anticorpo. Uma solução para minimizar ou para eliminar este problema consiste em 14- 14- * t produzir derivados de anticorpos quiméricos ou humanizados, isto é, moléculas de anticorpos que contenham partes que sejam derivadas de anticorpos não humanos e partes que sejam derivadas de anticorpos humanos. As moléculas de anticorpos quiméricos podem compreender, por exemplo, a região variável de um anticorpo de um murganho, de um rato ou de qualquer outra espécie, com regiões constantes humanas. Foram já descritos diversos procedimentos para a preparação de anticorpos quiméricos. Ver, por exemplo, Monison et al., Proc. Nctíl. AcacL Sei. U.S.A. 81, 6851 (1985); Takeda et al. Nature 314, 452 (1985), Cabilly et al. patente de invenção noite-americana n° 4 816 567; Boss et al. patente de invenção norte-americana n° 4 816 397; Tanaguchi et al. publicação da patente de invenção europeia com o n° EP 171496; publicação da patente de invenção europeia com o n° 0173494, patente de invenção do Reino Unido com o n° GB 1277096B. De acordo com uma outra modificação, os anticorpos humanizados possuem apenas os domínios hipervariáveis da região variável de origem não humana e possuem outras partes da região variável do anticorpo, em especial as regiões estruturais conservadas do domínio de ligação do antigénio, de origem humana. Tais anticorpos humanizados podem ser produzidos em conformidade com quaisquer das diversas técnicas conhecidas na especialidade (v.g., Teng et al., Proc. Nctíl. AcacL Sei. U.S.A., 80, 7308--7312 (1983); Kozbor et al., Immunology Today, 4, 7279 (1983); OIsson et al., Meth. Enzymol., 92,3-16 (1982)), e são obtidos preferencialmente em conformidade com os preceitos explicitados na publicação do PCT com o n° WO92/06193 ou no documento EP 0239400. Os anticorpos humanizados podem ser obtidos nos circuitos comerciais, por exemplo, na empresa ‘Scotgen Limited’, 2 Holly Road, Twickenham, Middlesex, Grã-Bretanha.

Para fins terapêuticos também é preferível que uma preparação de anticorpos não seja capaz de fixar o complemento ou de induzir outras funções efectoras. A fixação do complemento 15 pode ser evitada por supressão da parcela Fc do anticorpo, mediante a utilização de um isotipo do anticorpo que não seja capaz de fixar o complemento, ou então, de forma menos preferencial, mediante a utilização de um anticorpo fixador do complemento em conjunto com um fármaco que iniba a fixação do complemento. Em alternativa, é possível mutacionar os resíduos aminoácidus dentro da região Fc, que são importantes para activar o complemento (ver, vg Tan et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA., 87:162-166; Duncan e Winter (1988) Nature 332:738-740), para reduzir ou para eliminar a capacidade do anticorpo intacto para activar o complemento. De igual modo, também é possível mutacionar os resíduos aminoácidos dentro da região Fc, que são importantes para a ligação da região Fc aos receptores Fc (ver, v.g. Canfield, S.M. e S.L. Monison (1991) J. Exp. Med. 173:1483-1491; e Lund, J. et al. (1991) J. lmmunol. 147:2657-2662), para reduzir ou para eliminar a ligação do receptor Fc no caso de vir a ser utilizado um anticorpo intacto. » É possível avaliar um anticorpo que se ligue ao CD2 ou a um ligando CD2 em termos da sua actividade bloqueadora ou inibitória, recorrendo a técnicas convencionais. Por exemplo, é possível determinar a capacidade do anticoipo para inibir a proliferação e/ou a secreção de linfoquinas pelas células T activadas num sistema de cultura de células T in vitro (ver, v.g. Sanchez-Madrid, F. (1982) Proc. Natl. Acad Sei. USA 79:7489). Em alternativa, é possível utilizar um ensaio de distribuição das células T em rosetas E para avaliar a inibição da ligação do CD2 aos eritrócitos dos ovídeos (há um protocolo de ensaio adequado que foi descrito por Pepinslsy, R.B. et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:18244-18249). B. Formas solúveis de receptores e ligandos

Noutros métodos da invenção utiliza-se um agente inibidor CD2 que é uma forma solúvel de CD2 ou de um ligando CD2 que conserva a sua especificidade de ligação. É possível 16 utilizar uma forma solúvel de CD2 ou de um ligando CD2 para inibir de maneira competitiva uma interacção entre o CD2 e um ligando CD2 sobre a superfície das células. É possível utilizar uma forma solúvel de um ligando CD2, tal como CD48, CD59 ou preferencialmente A-3FL (CD58) para inibir a estimulação das células T através do CD2.

De acordo com uma variante, uma fornia solúvel de CD2 ou dc um ligando CD2 é uma forma truncada da molécula que compreende um domínio extracelular da molécula ou uma sua parte funcional. É possível utilizar uma parte do domínio extracelular de CD2 que conserve a capacidade de se ligar a um ligando CD2. De igual modo, é possível utilizar uma parte do domínio extracelular de um ligando CD2 que conserve a capacidade de se ligar ao CD2. É possível obter uma forma solúvel truncada de CD2 ou de um ligando CD2 recorrendo a técnicas convencionais do ADN recombinante, por exemplo, introduzindo nas células hospedeiras um vector de expressão recombinante que contenha uma sequência nucleotidica que codifique o domínio extracelular da molécula, ou uma sua parte funcional, sob uma forma adequada para expressão e secreção do domínio extracelular pelas células hospedeiras, isolando-se então o domínio extracelular (ou uma sua parcela) a partir do meio de cultura. E possível engendrar uma forma recombinante truncada de CD2 ou de um ligando CD2 com base na sequência nucleotidica que codifica a proteína, recoirendo-se para isso a técnicas convencionais. A sequência nucleotidica que codifica o CD2 humano foi descrita por Seed, B. e Aruffo, A. (1987) Proc. Natl. Acad Sei. USA 84:3365-3369. Foram já descritas duas formas da molécula A-3FL, incluindo uma proteína transmemhranar típica. Há uma sequência nucleotidica que codifica a forma transmembranar de A-3FL que foi descrita por Wallner, B.P. etal. (1987) J. Exp. Med. 166:923-932. A segunda forma é uma proteína ligada ao glicosil-fosfatidil-inositol (GPI). Há uma sequência nucleotidica que codifica esta forma de A-3FL que foi descrita por Seed. B. (1987) Nature 329:840-842. A forma de A-3FL ligada ao GPI está estavelmente fixada às membranas celulares por um apêndice fosfolipídico. Assim, é possível obter uma forma solúvel de A-3FL, por exemplo, quer por expressão recombinante do domínio extracelular da proteína quer por clivagem do apêndice fosfolipídico da forma ligada ao GPI (v g, utilizando a fosfolipase C específica do fosfatidil-inositol), a partir da superfície das células que exprimam esta forma de A-3FL para libertar uma forma solúvel de AFL. Outro ligando CD2, o CD48, é uma proteína transmembranar típica. Há uma sequência nucleotídica que codifica a CD48, descrita por Korinek, V. et al. (1991) em Immunogenetics 33:108-112. Há outra proteína membranar fixada pelo fosfatídil-inositol, semelhante à fornia de A-3FL ligada ao GPI, que é a CD59 que é um outro ligando CD2. Assim, a CD59 pode ser clivada para ser separada da superfície das células que exprimam o ligando, por tratamento com fosfolipase para se obter uma forma solúvel de CD59. F,m alternativa, é possível exprimir por via recombinante o domínio extracelular da CD59. Há uma sequência nucleotídica que codifica a CD59 humana que foi descrita por Sawada, R. et al. (1990) em DNA Cell. Biol. 9:213-220.

Uma outra forma solúvel de CD2 ou de um ligando CD2 utilizável nos métodos da presente invenção é uma proteína de fusão. A expressão “proteína de fusão” aqui utilizada designa uma proteína constituída por um primeiro polipeptido de uma primeira proteína em sequência contígua de aminoácidos com um segundo polipeptido de uma segunda proteína. É possível obter as proteínas de fusão por meio de técnicas convencionais do ADN recombinante, em que uma sequência nucleotídica que codifica o primeiro polipeptido é ligada concatenadamente a uma sequência nucleotídica que codifica o segundo polipeptido, e estas sequências nucleotídicas são expressas (v.g., utilizando um vector de expressão recombinante introduzido numa célula hospedeira) para produzirem a proteína de fusão. Uma proteína de fusão preferida é uma proteína de fusão de imunoglobulina que contenha um domínio extracelular, ou uma parte funcional do CD2 ou de um ligando CD2, ligado a uma região constante de cadeia pesada da imunoglobulina (v.g. as regiões de charneira, CH2 e CH3 de uma imunoglobulina humana, tal como a IgCrl). É possível preparar proteínas de fusão de imunoglobulinas, por exemplo, em conformidade com os preceitos descritos por Capon, DJ. et al (1989) em Nature 317-525-531 e na patente de invenção norte-americana n° 5 116 964 de Capon e Lasky.

Outro exemplo de formas solúveis de ligandos CD2 utilizáveis nos métodos aqui descritos é um ligando CD2 ligado ao GPI, incorporado numa miçela. Os ligandos CD2 que possuam um apêndice lipídico de fosfatidil-inositol fixado estavelmente dentro de uma membrana (v.g. A-3FL ou CD59) podem ser isolados como uma forma ligada ao GPI e incorporados numa micela. As mi celas que possuam A-3FL ou CD59 podem ser utilizadas então para inibir uma interacção entre o CD2 e um ligando CD2. As micelas que contenham A-3FL ou CD59 podem ser preparadas conforme descrito no documento WO 89/10938.

De acordo com outra variante da presente invenção, uma forma solúvel de um ligando CD2 é uma forma multivalente do ligando, por exemplo, um dímero, um trímero ou um tetrâmero. Comprovou-se que os multímeros de A-3FL possuem uma maior actividade bloqueadora das interacções inibidoras de tipo A-3FL/CD2, num ensaio de distribuição de células T em rosetas E (ver Pepinsky, R.B. etal. (1991) J. Biol. Chem. 266:18244-18249). Os monómeros de um ligando CD2 também podem ser quimicamente interligados para formarem multímeros, conforme descrito por Pepinsky et al. (citado supra). C. Péptidos e moléculas pequenas

Os agentes inibidores CD2 utilizáveis para se manter a falta de responsividade das células T também compreendem os péptidos ou as moléculas pequenas que inibam ou 19 praticamente bloqueiem a interacção do CD2 e de um ligando CD2. Por exemplo, no método da presente invenção é possível utilizar um fragmento peptídico de CD2 ou de um ligando CD2 que conserve a capacidade de se ligar ao receptor ou ao ligando e que iniba a interacção entre ligando e receptor ligado à membrana. Há um fragmento peptídico de CD2, contendo um domínio de ligação de A-3FL, que vem descrito no documento WO 90/08187. Em alternativa, é possível utilizar um fragmento peptídico de A-3FL que contenha um domínio de ligação do CD2, conforme descrito no documento WO 92/16622. É possível preparar outros péptidos adequados e pesquisar a sua capacidade para inibirem uma interacção de tipo CD2/ /ligando CD2, por exemplo, a capacidade do péptido para inibir a proliferação e/ou a secreção de linfoquinas pelas células T activadas, num sistema de cultura de células T in vitro, ou pela capacidade do péptido para inibir a distribuição das células T em rosetas E. A presente invenção compreende também a utilização de moléculas pequenas que inibam uma interacção entre o CD2 e um ligando CD2 para que seja mantida a falta de responsividade das células T. Por exemplo, é possível utilizar uma molécula pequena que simule a estrutura do péptido que contém uma região de CD2 de ligação do A-3FL ou uma região de A-3FL de ligação do CD2 (conforme descrito supra). Os métodos para a concepção de tais “peptidomiméticos” com base numa sequência de aminoácidos de um péptido são conhecidos na especialidade. Em alternativa, é possível recorrer a um sistema de cultura de células T in vitro ou a um ensaio de distribuição de células T em rosetas E para pesquisar moléculas pequenas que inibam uma interacção de tipo CD2/ligando CD2. D. Agentes inibidores CD2 intracelulares

Em alternativa a um agente que actue extracelularmente para inibir uma interacção entre o CD2 e o ligando CD2, também pode haver um agente inibidor C!D2 que actue intracelularmente para inibir um sinal intracelular desencadeado numa célula T através do receptor superficial CD2 O desencadeamento de um sinal intracelular através de um receptor superficial CD2 numa célula T é mediado pelo complexo CD3 e em particular pela cadeia zeta das CD3 (ver Howard, F.D. et al. (1992) J. Exp. Med 176:139-145). Os sinais intracelulares que sâo induzidos por este circuito de transdução do sinal compreendem a actividade da tirosina-cmase proteínica, a actividade de cinase C proteínica e um aumento do cálcio livre intracelular citossólico. Assim sendo, é possível utilizar como agente inibidor CD2, para se manter a falta de responsividade das células T, um agente que iniba um ou vários destes sinais intracelulares induzidos pela estimulação das células T através do CD2.

Além disso, a reversão da anergia das células T por estimulação através do CD2 é acompanhada pela associação da tirosina-cinase JAK-3 com o CD2 e pela fosforilação da cinase de JAK-3 (ver o exemplo 6). Assim, para se manter a anergia das células T, é possível inibir a actividade das JAK-3. Posto isto, um agente inibidor CD2 pode ser um agente que iniba a actividade intracelular de uma cinase de JAK-3, por exemplo, um agente que iniba a associação da cinase de JAK-3 com o CD2 e/ou iniba a fosforilação da cinase de JAK-3. E. Inibição da exposição a um neoepítopo TI 1.3

De acordo com um método para se manter a falta de responsividade das células T, conforme aqui descrito, também pode eventualmente ser necessário inibir a exposição de um neoepítopo TI 1.3 sobre o receptor superficial CD2. Um “neoepítopo TI 1.3” é um epítopo numa molécula CD2 que é reconhecido (isto é, é ligado) por um anticorpo TI 1.3. Descohriu-se que a indução da anergia das células T está associada ao declínio da modulação (isto é, expressão reduzida ou falta dela) de um neoepítopo TI 1.3 no CD2 nas células T anergizadas. De igual modo, descobriu-se que a reversão da anergia das células T está associada à reexposição do neoepítopo TI 1.3 no CD2 (ver o exemplo 5). Para se manter a falta de responsividade das células T pode ser necessário eventualmente inibir a exposição do neoepítopo TI 1.3 no CD2 nas células T. Descobriu-se que há um agente para estimular a exposição do neoepítopo TI 1.3 em células T anergizadas e que é um factor de crescimento das células T, tal como a IL-2. Em consequência, para se manter a falta de responsividade das células T é possível utilizar um agente que iniba a produção ou a actividade de um factor de crescimento das células T. Um agente preferido utilizável na manutenção da anergia das células T inibe a produção ou a actividade da IL-2. Assim, em conjunto com um primeiro agente que iniba a estimulação das células T através do CD2, pode ser necessário eventualmente fazer contactar as células T com um segundo agente que iniba a actividade da IL-2, tal como um anticorpo anli-IL-2 ou um anticorpo anti-receptor de EL-2. F. Utilizações previstas para os agentes inibidores CD2

Os agentes inibidores CD2 podem ser administrados a um paciente para fins terapêuticos, por exemplo, para inibirem a rejeição do transplante de um órgão ou de medula óssea, para inibirem a doença provocada pelo enxerto no hospedeiro nos casos de transplantação de medula óssea ou para o tratamento de uma doença de natureza autoimunitária num paciente. Assim sendo, a invenção proporciona um método para que seja mantida a falta de responsividade das células T a um antigénio num paciente ao qual seja administrado um agente que iniba a estimulação das células T através de um receptor superficial CD2. O teimo ‘'paciente” designa qualquer organismo vivo em que possa ser desencadeada uma resposta de natureza imunitária, v.g. um mamífero. Como exemplos de pacientes refere-se os seres humanos, os macacos, os cães, os gatos, os murganhos, os ratos e suas espécies transgénicas.

Administra-se um agente inibidor CD2 aos pacientes numa formulação biologicamente compatível, adequada para administração farmacêutica irt vivo, numa quantidade e durante um período suficientes para que seja mantida nesse paciente a falta de responsividade das células T. A expressão “formulação biologicamente compatível adequada para administração in vivo” significa uma formulação do agente inibidor CD2 que iiá ser administrado, cm que os efeitos tóxicos são superados pelos efeitos terapêuticos do agente. A administração de um agente inibidor CD2, conforme aqui se descreve, é feita numa formulação farmacológica que contém uma quantidade terapeuticamente activa de agente por si só ou num veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. A administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do agente inibidor CD2 significa a administração de uma quantidade eficaz segundo doses e durante os períodos necessários para se alcançar o resultado pretendido (v.g., para se manter a falta de responsividade das células T). Por exemplo, uma quantidade terapeuticamente activa de um agente inibidor CD2 pode variar de acordo com factores tais como o estado da doença, a idade, o sexo e o peso do indivíduo em causa e pode variar também com a capacidade que o agente possa ter para desencadear uma resposta pretendida nesse indivíduo. É possível ajustar os regimes de dosagem para se conseguir a resposta terapêutica óptima. Por exemplo, é possível administrar diariamente várias doses divididas ou então a dose pode ser proporcionalmente reduzida, conforme indicado pelas exigências da situação terapêutica. O agente inibidor CD2 pode ser administrado de uma forma conveniente, por exemplo, por injecção (subcutânea, intravenosa, etc.), por administração oral, por inalação, por aplicação transdérmica ou por administração rectal. Consoante a via de administração utilizada, assim o composto activo pode ser revestido com um material para o proteger contra a acção de enzimas, ácidos c ouras condições naturais que eventualmente possam inactivar esse composto.

Para se administrar um agente inibidor CD2 por outra via diferente da parentérica, pode ser necessário eventualmente revestir o agente ou administrá-lo conjuntamente com um material que impeça a sua inactivação. Por exemplo, um agente inibidor CD2 pode ser administrado a um indivíduo num veículo ou num diluente adequado, pode ser administrado conjuntamente com mibidores enzimátícos ou então num veículo adequado, por exemplo, os lipossomas. Os diluentes farmaceuticamente aceitáveis são seleccionados entre soluções salinas e tampões aquosos. Os inibidores enzimáticos são seleccionados entre inibidores da tripsina pancreática, fluorofosfato de diisopropilo (DEP) e trasilol. Os bpossomas compreendem as emulsões de tipo água-em-óleo e também os lipossomas convencionais (Strejan et cd. (1984) J. Neuroimmunol. 7:27). O composto activo também pode ser administrado por via parentérica ou mtraperitoneal. É possível preparar também dispersões em glicerol, polietileno-glicóis líquidos e suas misturas e em óleos. Em condições vulgares de armazenagem e de utilização, estas preparações podem conter um agente conservante para impedir o crescimento de microrganismos.

As composições farmacêuticas adequadas para injecção compreendem as dispersões ou as soluções aquosas estéreis (se solúveis em água) e os pós estéreis para preparação extemporânea de dispersões ou de soluções injectáveis estéreis. Em todos os casos, a composição tem de ser estéril e tem de ser suficientemente fluída para poder ser manipulada com uma seringa. Tem de ser estável nas condições de fabrico e de armazenagem e tem de ser protegida contra a acção contaminante de microrganismos, tais como bactérias e fungos. O veículo pode ser um solvente ou um meio de dispersão que contenha, por exemplo, água, etanol, um poliol (por exemplo, o glicerol, o propileno-gbcol e o polietileno-glicol líquido e quejandos) c as suas misturas adequadas. É possível manter uma fluidez conveniente, por exemplo, mediante a utilização de um agente de revestimento, tal como a lecitina, mediante a manutenção de um tamanho adequado das partículas, no caso de uma dispersão, e com o auxílio de agentes tensioactivos. A prevenção da acção de microrganismos pode ser conseguida por meio de diversos agentes antibacterianos e antifungicos, por exemplo, parabenos, cloro-butanoi, fenol, ácido ascórbico, timerosal e outros que lais. Em muitos casos será preferível incorporar na composição agentes isotónicos, por exemplo, açúcares, polialcóois, tais como o manitol e o sorbitol, e cloreto de sódio. A absorção prolongada das composições injectáveis pode ser conseguida incorporando na composição um agente que retarde a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina. É possível preparar soluções injectáveis estéreis incorporando o composto activo (v.g., um agente inibidor CD2), na quantidade necessária, num solvente adequado juntamente com um ingrediente ou uma combinação dos ingredientes anteriormente enumerados, de acordo com a conveniência, seguindo-se uma operação de esterilização por filtração. De um modo geral, as dispersões são preparadas incorporando o composto activo num veículo estéril que contenha um meio básico de dispersão e todos os outros ingredientes necessários seleccionados entre os referidos supra. No caso dos pós estéreis para a preparação de soluções injectáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são a secagem hipobárica e a bofílização que permitem obter um pó do ingrediente activo (v.g. um agente inibidor CD2) mais qualquer ingrediente aditivo desejado proveniente de uma sua solução previamente esterilizada por filtração.

No caso de o composto activo estar convenientemente protegido, conforme anteriormente descrito, é possível administrar um agente por via oral, por exemplo, com um diluente inerte ou com um veículo edível assimilável. Tal como aqui utilizada, a expressão “veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico” designa todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos. agentes antibacterianos e antifungicos, agentes isotónicos e retardadores da absorção e outros que tais. A utilização de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente activas é bem conhecida na especialidade. Com a excepção de eventuais incompatibilidades entre quaisquer meios ou agentes convencionais e o composto activo, também está aqui prevista a sua utilização em composições terapêuticas. Tambcm é possível incorporar outros compostos activos nas composições. É especialmente vantajoso formular composições parentéticas em formas unitárias de dosagem, por razões de facilidade de administração e de uniformidade de dosagem. A expressão ‘forma unitária de dosagem’, tal como aqui utilizada, refere-se a unidades fisicamente discretas que são adequadas como doses unitárias para os mamíferos que se pretenda tratar; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de composto activo, calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o necessário veículo farmacêutico. As especificações para as formas unitárias de dosagem da presente invenção são determinadas e directamente dependentes das a) características exclusivas do composto activo e do efeito terapêutico particular que se pretenda conseguir e b) das limitações inerentes à especialidade de preparação de compostos, tais como o composto activo, para o tratamento de sensibilidade em indivíduos. O programa de administração de um agente inibidor CD2 a um paciente pode ser coordenado com a administração de outros agentes terapêuticos. Por exemplo, num paciente em que tenha sido induzida a falta de responsividade das células T por se ter administrado ao paciente um agente que iniba nesse paciente um sinal co-estimulador das células T (v.g., CTLA4Ig), é possível administrar-lhe simultaneamente um agente inibidor CD2 em conjunto com o agente que inibe o sinal co-estimulador das células T ou efectuar a administração subsequente do agente que inibe o sinal co-estimulador das células T. Além disso, no caso de se manter um agente inibidor CD2 a um nível eficaz in vivo, então o agente inibidor CD2 pode ser administrado antes da administração do agente que iniba um sinal co-estimulador das células T. Em alternativa, é possível administrar um agente inibidor CD2 concomitantemente com outros tratamentos terapêuticos vulgares utilizados para inibir uma resposta dc natureza imunitária contra um antigénio. Por exemplo, é possível administrar um agente inibidor CD2 como parte de um regime terapêutico que compreenda a administração de um fármaco imunossupressor, tal como a ciclosporina A ou FK506.

De acordo com uma variante da invenção, mantém-se a falta de responsívidade das células T a um antigénio numa célula alogénica ou xenogénica. Assim sendo, o método da presente invenção pode ser utilizado para tratar um paciente que tenha recebido uma célula alogénica ou xenogénica, por exemplo, um paciente que tenha recebido um transplante de um órgão ou um paciente que tenha recebido um transplante de medula óssea. Posto isto, o método da presente invenção é útil para inibir num paciente a rejeição de tecidos transplantados ou para inibir a doença originada pelo enxerto no hospedeiro.

De acordo com outra variante da presente invenção, prevê-se a falta de responsívidade das células T a um autoantigénio. Em consequência, é possível utilizar o método da invenção para tratar um paciente que padeça de uma doença de natureza autoimunitária ou para o tratar de uma doença associada a uma resposta imunitária inadequada ou anormal. Como exemplos de doenças ou afecções de natureza autoimunitária associadas a uma resposta imunitária inadequada ou anormal refere-se as seleccionadas entre artrite reumatóide, artrite reumatóide juvenil, artrite psoriática, psoríase, reacções reversas dos leprosos, eritrema nodosum leprosum, uveíte de tipo autoimunitário, esclerose múltipla, encefalomielite alérgica, lúpus eritematoso 27 sistémico, encefalopatia hemorrágica necrotizante aguda, perda de audição sensorineural progressiva bilateral idiopática, anemia aplásica, anemia eritrocitária pura, trombocitopenia idiopática, policondrite, escleroderma, granulomatose de Wegener, hepatite activa crónica, miastema grave, síndroma de Stevens-Johnson, psilose idiopática, líquen plano, doença de Crohn, oftalmopatia de Graves, arcoidose, cirrose biliar primária, diabetes juvenis primários, secura ocular associada à síndroma de Sjõgren, uveíte posterior e fibrose pulmonar intersticial. Assim, o método da presente invenção é útil para mitigar os sintomas de doenças e afecções de natureza autoimunitária associadas a uma resposta inadequada ou anormal de tipo imunitano.

Π. Métodos para induzir e manter a falta de responsividade das células T

De acordo com outra variante, a invenção proporciona um método para induzir e manter a falta de responsividade das células T. Segundo esta variante, faz-se contactar as células T com um primeiro agente que iniba a estimulação das células T através do CD28 ou CTLA4 e com um segundo agente que iniba a estimulação de células T através do CD2. O primeiro agente tem por objecto inibir um sinal co-estimulador nas células T, induzindo consequentemente a anergia das células T. O segundo agente tem por objecto manter a anergia das células T não responsivas. Como exemplos de agentes que é possível utilizar para inibir a estimulação através do CD2 (isto é, um segundo agente) refere-se os agentes inibidores CD2 descritos nas secções anteriores. Como exemplos de agentes que é possível utilizar para induzir a falta de responsividade das células T (isto é, um primeiro agente, aqui designado por agente iníbidor CD28/CTLA4) refere-se os agentes que bloqueiem ou inibam de forma relevante uma interaeção entre o CD28 ou o CTLA4 e um ligando CD28 ou CTLA4. Como exemplos de agentes inibidores CD28/CTLA4 adequados refere-se os anticorpos de bloqueio que se ligam ao CD28, ao CTLA4 ou a um ligando CD28 ou CTLA4 (v.g. B7-1 ou B7-2); as formas solúveis de CD28, de CTLA4 e de ligandos CD28 ou CTLA4; e os péptidos e as moléculas pequenas que inibam uma interacção entre CD28/CTLA4 e um ligando CD28 ou CTLA4. Em alternativa, um agente inibidor CD8/CTLA4 pode actuar intracelularmente para inibir um sinal intracelular desencadeado nas células T através do CD28 ou do CTLA4.

Os agentes inibitórios CD28/CTLA4 utilizáveis para induzir a falta de responsividade das células T podem ser preparados conforme descrito antes a propósito dos agentes inibitórios CD2. Os anticorpos de bloqueio que se ligam a CD28, B7-1 ou B7-2 foram já anteriormente descritos na especialidade (ver, v.g Damle, N.K. et al. (1981) Proc. Natl. AcacL Sei. USA 78:5096-5100; Freedman, A.S. (1987) J. Immunol. 137:3260-3267; e Hatchcock, K.S. (1993) Science 262:905-907) e podem ser preparados por meio de técnicas convencionais, conforme descrito antes. As formas solúveis de CD28, CTLA4 e B7-1 também foram já descritas na especialidade (ver, v.g. Linsley et al. (1991) J. Exp. Med 173:721-730; e Linsley, P.S. et al. (1991) J. Exp. Med 174:561-569) e podem ser preparadas por meio de técnicas convencionais, conforme descrito antes. As sequências nucleotídicas das moléculas humanas CD28, CTLA4, B7-1 e B7-2 são já conhecidas na especialidade (CD28: Aruffo, A. e Seed, B. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:8573-8577; CTLA4: Dariavach, P. et al. (1988) Eur. J. Immunol. 18:1901-1905; B7-1: Freeman, G.J. etcd. (1989)J. Immunol. 143:2714-2722; B7-2: Freeman, G.J. et al. (1993) Science 262:909-911 e Azuma, M. et al. (1993) Nature 366:76-79). Um agente inibitório CD28/CTLA4 preferido é uma proteína de fusão CTLA4Ig, tal como foi descrita por Linsley, P.S. etal (1991) J. Exp. Med 174:561-569.

Para se induzir e manter a falta de responsividade das células T é possível fazer contactar uma destas células T com um agente inibitório CD28/CTLA4 e com um agente inibitório CD2, simultânea ou sequencialmente. No caso de o contacto ser feito sequencialmente, é preferível que contacte primeiro com o agente inibitório CD28/CTLA4 e depois com o agente inibitório CD2.

Este método também é útil para fins terapêuticos, em situações em que seja desejável inibir uma resposta imunitária especifica do antigénio, por exemplo, no transplante de órgãos, no transplante de medula óssea e em doenças de natureza autoimunitária. Para fins terapêuticos, administra-se um agente inibitório CD28/CTLA4 e um agente inibitório CD2 a um paciente para nele induzir e manter a falta de responsividade das células T. Estes agentes podem ser administrados a um paciente simultânea ou sequencialmente. As vias de administração, as composições farmacêuticas para administração, o programa de administração e as doses administráveis e outras considerações para efeitos de administração obedecem à descrição anterior feita a propósito dos agentes inibitórios CD2.

ΙΠ. Métodos para restabelecer a responsividade das células T A invenção proporciona também métodos para restabelecer a responsividade de uma célula T anergizada a um antigénio (isto é, reversão da anergia). Estes métodos restabelecem a capacidade de uma célula T anergizada para responder (v.g. proliferar e segregar DL-2) após a subsequente estimulação da célula T por um antigénio e por uma molécula co-estimuladora. Este método é útil em situações terapêuticas em que seja desejável estimular uma resposta imunitária contra um antigénio por parte das células T anergizadas. Um exemplo desta situação é o de um paciente portador dc um tumor em que a presença desse tumor fez com que as células T deixassem de responder aos antigénios tumoraís.

De acordo com uma variante, a responsividade das células T a um antigénio é restabelecida fazendo contactar uma célula T ançi gizaria, na presença do antigénio, com um agente que estimule essa célula T por meio de um receptor superficial CD2. O método proporciona um mecanismo segundo o qual a responsividade das células T é total ou parcialmente restabelecida (comparativamente com a responsividade das células T antes de terem ficado anergizadas), de tal modo que as células T respondam (isto é, proliferem, segreguem IL-2) ao estímulo subsequente pelo antigénio e por uma molécula co-estimul adora. Um agente que estimule uma célula T através de um receptor superficial CD2 recebe aqui a designação de agente estimulador CD2. Para restabelecer a responsividade das células T, um agente estimulador CD2 pode ser uma célula que exprima um ligando CD2 na sua superfície. Em alternativa, um agente estimulador CD2 pode ser uma forma solúvel estimuladora de um ligando CD2 (v.g., uma forma multivalente ou uma forma micelar). Além disso, o agente estimulador CD2 pode ser pelo menos um anticorpo anti-CD2 ou uma sua combinação. Um agente estimulador CD2 útil nos métodos da presente invenção também pode ser um agente que actue intracelularmente para estimular um sinal intracelular desencadeado pelo CD2. A. Células que exprimem um ligando CD2

De acordo com uma variante praticada num método para restabelecer a responsividade das células T a um antigénio, um agente estimulador CD2 é uma célula que exprime um ligando CD2 na sua superfície. De preferência, o ligando CD2 é a A-3FL (CD58). Em alternativa, um ligando CD2 pode ser CD48 ou CD59. Assim, para se restabelecer a responsividade das células T a um antigénio, é possível fazer contactar uma célula T sem responsividade, com uma célula que exprima um ligando CD2 (v.g. A-3FL) e com o antigénio na sua superfície. Uma célula que naturalmente não exprima um ligando CD2 pode ser modificada para exprimir um ligando CD2. Por exemplo, uma célula tumoral que constitutivamente exprima antigénios tumorais, mas que não consiga exprimir a A-3FL, pode ser modificada para exprimir a A-3FL. Uma célula tumoral também pode ser modificada para exprimir CD48 ou CD59. Em alternativa, uma célula pode exprimir ligandos CD2 na sua superfície, mas em quantidade insuficiente para reverter a anergia das células T. Em tal caso, é possível fazer aumentar o nível de expressão de um ligando CD2 numa superfície celular . Diz-se que uma cclula é “modificada para exprimir um ligando CD2” quando daí resultar a expressão de um ligando CD2 sobre a superfície da célula. Antes da modificação, a célula pode ser incapaz de exprimir um ligando CD2, pode ser capaz de exprimir um ligando CD2 mas falhar ao fazê-lo, ou pode exprimir quantidades insuficientes de um ligando CD2. Assim sendo, é possível modificar uma célula para exprimir um ligando CD2 recorrendo a qualquer das inúmeras técnicas existentes, v.g., introduzindo na célula ácido nucleico que codifique o ligando CD2, acoplando um ligando CD2 à superfície da célula ou estimulando a expressão de um ligando CD2 sobre a superfície da célula.

Um método preferido para se modificar uma célula para exprimir um ligando CD2 consiste em introduzir na célula um ácido nucleico que codifique um ligando CD2, tal como a A-3FL, numa forma conveniente para a expressão do ligando CD2 sobre a superfície da célula. É possível introduzir numa célula hospedeira um ácido nucleico que codifique um ligando CD2 (v.g., um vector de expressão recombinante), recorrendo-se para isso a diversas técnicas úteis para a introdução de ácidos nucleicos em células de mamíferos (geralmente designadas por técnicas de transfecção), inchando a electroporação, a precipitação com fosfato de cálcio, o tratamento com DEAE-dextrano, a lipofecção, a microinjecção e a infecção com vectores virais. Os métodos adequados para transfectar células de mamíferos podem ser estudados na obra de Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratorv Manual· 2a Edição. publicação de Cold Spring Harbor Laboratoiy (1989)) e noulros manuais de laboratório. O ácido nucleico que irá ser introduzido pode ser, por exemplo, ADN que contenha o gene que codifica o ligando CD2, o ARN de cadeia singular e sentido natural que codifica o ligando CD2 ou um vector de expressão recombinante que contenha um ADNc que codifica o ligando CD2. Os ADNc preferidos que devem ser utilizados são os que se destinam à forma trans-membranar da A-3FL humana (conforme descrito por Wallner, B.P. et al. (1987) em J. Exp. Med 166:923-932) e a forma de A-3FL humana ligada ao GPI (descrito por Seed, B. (1987) Nature 329:840-842). Em alternativa, é possível utilizar os ADNc para a CD48 humana (descrito por Korinek, V. et al. (1991) Immunogenetics 33:108-112) e a CD59 humana (conforme descrito por Sawada, R. et al. (1990) DNA Cell. Biol. 9:123-220). Além disso, é possível modificar uma célula para exprimir ligandos CD2 múltiplos. Há várias combinações de A-3FL (ambas as formas), CD48 e CD59 que podem ser expressas em células e que são evidentes para os especialistas na matéria. O ácido nucleico que codifica um ligando CD2 que é introduzido numa célula está numa forma adequada para expressão do ligando CD2 sobre a superfície da célula. O ácido nucleico contém as necessárias sequências codificadoras e reguladoras fundamentais para a transcrição e para a tradução de um gene, podendo conter promotores, intensificadores e sinais de poliadenilação, e as sequências necessárias para transportar a molécula para a superfície da célula tumoral, incluindo as sequências de sinal do terminal N. No caso de o ácido nucleico ser um ADNc num vector de expressão recombinante, as funções reguladoras responsáveis pela transcrição e/ou tradução do ADNc são fornecidas frequentemente por sequências virais. Como exemplos de promotores virais vulgarmente utilizados refere-se os que são obtidos a partir de poliomas, adenovírus 2, citomegalovínis e vinis 40 dos símios e ainda os RTL (o 33 mesmo que LTR) retrovirais. É possível seleccionar sequências reguladoras ligadas ao ADNc para se conseguir uma transcrição constitutiva ou tnduzível, por exemplo, mediante a utilização de um promotor induzível, tal como o promotor da metalotioneína ou um promotor responsivo glucocorticóide. »

Uma forma preferível de resolver o problema da introdução do ácido nueleico que codifica um ligando CD2 nas células (v.g., células tumorais) consiste em utilizar um vector virai que contenha ácido nueleico, v.g. um ADNc, que codifique o ligando CD2. Como exemplos de vedores virais que podem ser utilizados refere-se os vedores retrovirais (Eglitis, M.A. et al. (1985) Science 23:1395-1398; Danos, O. e Mulligan, R. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:6460-6464; Markowitz, D. et al. (1988) J. Virol. 62:1120-1124), os vedores adenovirais (Rosenfeld, M.A. et al. (1992) Cell 68:143-155) e os vedores adenovirais associados (Tratschin, J.D. et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260). A infecção de células tumorais com um vedor virai tem a vantagem de fazer com que uma grande proporção de células receba o ácido nueleico, sendo assim contornada a necessidade de uma selecção de células que tenham recebido ácido nueleico, e as moléculas codificadas com um vector virai, v.g. com um ADNc contido no vedor virai, são expressas de forma eficiente em células que tenham incorporado ácido nueleico do vector virai.

Em alternativa, um ligando CD2 pode ser expresso numa célula utilizando um vector de expressão plasnMco que contenha ácido nueleico, v.g. um ADNc, que codifique o ligando CD2. Os vedores de expressão plasnúdicos adequados são o CDM8 (Seed, B., Nature 329, 840 (1987)) e o pMT2PC /Kaufinan et al., EMBO J. 6, 187-195 (1987)). Uma vez que apenas uma fraeção pequena de células (cerca de uma em 10ã) integra tipicamente nos seus genomas o ADN plasmídico, é vantajoso transfectar um ácido nueleico que codifique um marcador seleccionável para dentro de uma célula, conjuntamente com os ácidos nucleicos relevantes, para permitir a selecção de células transfectadas. Os marcadores seleccionáveis preferidos são aqueles que conferem resistência aos fármacos, tais como o G418, a higromicma e o metotrexato. Os marcadores seleccionáveis podem ser introduzidos no mesmo plasmídeo em que foram introduzidos os genes relevantes ou podem se introduzidos num plasmídeo separado. A seguir à selecção das células transfectadas, utilizando os marcadores seleccionáveis adequados, é possível confirmar a expressão da molécula co-estimuladora sobre a superfície da célula por contrastação das células por imunofluorescência. Por exemplo, as células podem ser contrastadas com um anticorpo monoclonado, marcado de forma fluorescente, reactivo contra o ligando CD2, ou então com um receptor solúvel, marcado de forma fluorescente, que se liga ao ligando CD2 (v.g. o CD2 solúvel). Os anticorpos que podem ser utilizados para a detecção de A-3FL foram descritos por Sanchez-Madrid, F. (1982) em Proc. Natl. Acad Sei. USA 79:7489 (v.g, TS2/9); os anticorpos que é possível utilizar para a detecção dos anticorpos CD48 foram descritos por Sandrin, M.S. (1993) em J. Immunol. 151:4606 e Kato, K. et al (1993) em Eur. J. Immunol. 23:1412; os anticorpos que é possível utilizar para detectar o CD59 foram descritos por Deckert, M. et al. (1992) em Eur. J. Immunol. 22:2943-2947.

Nos casos em que a transfecção de células (v.g. células tumorais) conduz à modificação de uma grande proporção de células e à expressão eficiente de um ligando CD2 sobre a superfície das células, v.g., quando se utiliza um vector de expressão virai, é possível utilizar eventualmente células sem mais nenhum isolamento nem subclonagem. Em alternativa, é possível preparar uma população homogénea de células transfectadas, isolando uma única célula transfectada, mediante clonagem por diluição limitante a que se segue a expansão dessa célula úmea numa população clonal de células, por meio de técnicas convencionais

Em alternativa à introdução de um ácido nucleico que codifique um ligando CD2 dentro de uma célula, é possível modificar uma célula para exprimir um ligando CD2, induzindo ou aumentando o nível de expressão do ligando CD2 sobre a superfície da célula. É possível utilizar um agente que estimule a expressão de um ligando CD2 para induzir ou fazer aumentar a expressão de um ligando CD2 sobre a superfície de uma célula. Por exemplo, é possível íàzer contactar as células com um agente in vitro num meio de cultura. O agente que estimula a expressão de um ligando CD2 pode actuar, por exemplo, fazendo aumentar a transcrição de um gene do ligando CD2, fazendo aumentar a tradução de um ARNm de um ligando CD2 ou fazendo aumentar a estabilidade ou o transporte de um ligando CD2 para a superfície da célula. Outro agente que é possível utilizar para induzir ou fazer aumentar a expressão de um ligando CD2 na superfície de uma célula tumoral é um ácido nucleico que codifique um factor de transcrição que regule perfeitamente a transcrição do gene que codifica o ligando CD2. Este ácido nucleico pode ser transfectado para dentro da célula, conforme anteriormente descrito, para fazer aumentar a transcrição do gene do ligando CD2, dai resultando maiores níveis de ligando CD2 à superfície da célula.

Em alternativa, é possível modificar uma célula (v.g. uma célula tumoral) para exprimir um ligando CD2, mediante o acoplamento de um ligando CD2 à superfície da célula. Por exemplo, é possível obter um ligando CD2 utilizando a tecnologia convencional do ADN recombinante e sistemas de expressão que permitam a produção e o isolamento da proteína do ligando CD2. Em alternativa, é possível isolar um ligando CD2 a partir de células que exprimam o ligando CD2, utilizando para tal técnicas convencionais de purificação de proteínas. O ligando CD2 isolado é depois acoplado à superfície da célula. Os termos “acoplado” ou “acoplamento” referem-se a mecanismos químicos, enzimáticos e de outro tipo que permitem que um ligando CD2 seja ligado a uma célula, de tal modo que o ligando CD2 fique presente sobre a superfície da célula e seja capaz de desencadear um sinal nas células T através do CD2. Por exemplo, o ligando CD2 pode ser quimicamente interligado com a superfície da célula, utilizando-se para tal reagentes de interligação comercialmente disponíveis (v.g. os fornecidos por Píerce, Rockford IL). Outra maneira de resolver esta questão consiste em acoplar uma forma dc um ligando CD2 ligado pelo GPi, tal como o A-3FL ou o CD59, à superfície de uma célula, mediante a inserção do apêndice lipídico da molécula dentro da membrana da célula Há ainda um outro modo de resolver esta questão que consiste em acoplar um ligando CD2 a uma célula por meio de um anticorpo biespecífico que se liga simultaneamente ao ligando CD2 e à molécula da superfície celular sobre a célula. Também é possível utilizar fragmentos, mutantes ou variantes de ligandos CD2 que conservem a capacidade de desencadear um sinal nas células T através do CD2 quando acoplados à superfície de uma célula. B. Formas solúveis e estimuladoras de ligandos CD2

Em outras variantes da invenção, o agente estimulador CD2 utilizado para restabelecer a responsividade das células T é uma forma solúvel e estimuladora de um ligando CD2. Demonstrou-se que as fornias solúveis de ligandos CD2 desencadeiam um sinal através do CD2 em combinação com um anticorpo anti-CD2 adequado. De acordo com uma variante, a forma de ligando CD2, estimuladora e solúvel, é uma forma multivalenle de um ligando CD2, por exemplo, um dímero, um trímero ou um tetrâmero. Também se demonstrou que os muitímeros de A-3FL desencadeiam a activação de células T in vitro em combinação com um anticorpo anti-CD2 adequado (um anticorpo TI 1.3) (ver Pepinsky, R.B. et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:18244-18249). Assim sendo, é possível utilizar os muitímeros de um ligando CD2 que estimulem a activação das células T através do CD2, enquanto agentes estimuladores CD2. De preferência, utiliza-se uma forma tmiltivalente de um ligando CD2 em combinação com um anticorpo antí-CD2 que se ligue ao epitopo TI 1.3 (v.g. o anticorpo TI 1.3). Os monómeros de um ligando CD2 podem ser quimicamente interligados para formarem multímeros, conforme descrito por Pepinsky et ai. (otjra citada supra).

Ainda de acordo com outra variante, a forma de um ligando CD2, solúvel e estimuladora, é um ligando CD2 ligado ao GPÍ incorporado numa micela. Os ligandos CD2 que possuam um apêndice lipídico fosfatidil-inositol, para fixação dentro de uma membrana (v.g. A-3FL ou CD59), podem ser isolados sob uma forma ligada ao GPÍ e incorporados numa micela. As micelas que possuam A-3FL ou CD59 podem ser preparadas conforme descrito no documento WO 89/10938. Também é possível utilizar uma forma micelar de um ligando CD2 em combinação com um anticorpo anti-CD2 adequado, v.g., um anticorpo TI 1.3, para estimular uma célula T através do CD2 (ver o documento WO 89/10938). C. Anticorpos anti-CD2 estimuladores

De acordo com outro aspecto da presente invenção, o agente que estimula a célula T através de um receptor superficial CD2 é pelo menos um anticorpo anti-CD2. As formas estimuladoras de anticorpos anti-CD2 encontram-se descritas nas obras da especialidade. De preferência, a estimulação através do CD2, com anticorpos anti-CD2, realiza-se utilizando uma combinação constituída pelo menos por dois anticorpos anti-CD2 diferentes. As combinações estimuladoras de anticorpos anti-CD2 que foram já descritas são as seguintes: o anticorpo TI 1.3 em combinação com o anticorpo TI 1.1 ou com o anticorpo TI 1.2 (Meuer, S.C. et al. (1984) Cell 36:897-906) e o anticorpo 9.6 (que reconhece o mesmo epitopo que é reconhecido pelo TI 1.1) em combinação com o anticorpo 9.1 (Yang. S. Y. et al. (1986) J. Immunol. 137:1097- -1100). Também é possível utilizar outros anticorpos que se liguem aos mesmos epítopos a que se ligam estes anticorpos. É possível preparar outros anticorpos anti-CD2 estimuladores, ou combinações de anticorpos, e fazer a sua identificação por meio de técnicas convencionais. Por exemplo, é possível identificar anticorpos estimuladores ou uma combinação de anticorpos estimuladores com base na capacidade desses anticorpos para estimularem a proliferação das células T na ausência de células que apresentem o antigénio num sistema de cultura de células T in viíro. D. Agentes estimuladores CD2 intracelulares

Em alternativa a um agente que actue extracelularmente para estimular uma célula T através do CD2, um agente estimulador CD2 pode actuar intracelularmente para estimular um sinal intracelular desencadeado numa célula T através do receptor superficial CD2. Conforme se disse antes, o desencadeamento de um sinal intracelular através de um receptor superficial CD2 numa célula T é mediado pelo complexo CD3 e induz a actividade da tirosina-cinase proteínica, a actividade da cinase C proteínica e o aumento do cálcio livre cttossólico intracelular. Assim sendo, é possível utilizar como agente estimulador CD2, para restabelecer a responsívidade das células T, um agente que estimule um ou vários destes sinais intracelulares induzidos pela estimulação das células T através do CD2.

Além disso, conforme se disse antes, a reversão da anergia das células T é acompanhada pela associação da tirosina-cinase JAK-3 com o CD2 e pela fosforilação da cinase JAK-3 (ver o exemplo 6). Posto isto, um agente estimulador CD2 pode ser um agente que estimule a actividade intracelular da cinase JAK-3, por exemplo, um agente que estimule a associação da cinase JAK-3 com o CD2 e/ou estimule a fosforilação da cinase JAK-3. E. Tratamento preparatório de uma célula T não responsiva

Para além de se fazer contactar uma célula T anergizada com um agente estimulador CD2, eventualmente pode ser necessário efectuar um ‘tratamento preparatório” de uma célula T para estimulação através do CD2 para restabelecer na célula T a responsividade específica do antigenio. A expressão tratamento preparatório” de uma célula T utiliza-se aqui para descrever um tratamento de uma célula T segundo o qual se prepara essa célula T para a subsequente estimulação, v.g. através do CD2. Assim sendo, é possível fazer uma célula T anergizada contactar em primeiro lugar com um agente que eíectua o tratamento preparatório da célula T para estimulação através de um receptor superficial CD2. De acordo com uma variante, um agente que eíectua o tratamento preparatório da célula T para estimulação através do CD2 é um factor do crescimento das células T, de preferência a IL-2. Como exemplos de outros factores de crescimento das células T que é possível utilizar para efectuar o tratamento preparatório das células T anergizadas refere-se a 1L~4 e a IL-7. Os receptores para cada uma destas três linfoquinas (IL-2, 1L-4 e IL-7) utilizam uma subunidade sinalizadora comum, a cadeia gama da IL-2, e por isso desencadeiam sinais intracelulares semelhantes. Para etêctuar o tratamento preparatório das células T é possível utilizar outras citoquinas que se ligam a um receptor, utilizando a cadeia gama de um receptor IL-2 para a sinalização intracelular, ou agentes que actuem intracelulannente para activarem o circuito sinalizador da cadeia gama do receptor de IL-2.

Em alternativa, um agente que efectue o tratamento preparatório de uma célula T não responsiva estimula a exposição de um neoepítopo TI 1.3 sobre o receptor superficial CD2 na célula T. Em consequência, é possível utilizar a exposição de um epítopo TI 1.3 no CD2 como forma de avaliação do tratamento preparatório de uma célula T A exposição do epítopo ΤΙ 1.3 no CD2 nas células T pode ser avaliada determinando a capacidade do anticorpo TI 1.3 para se ligar às células T (v.g. por citometria de fluxo) íJm agente preferido que pode ser utilizado para expor um neoepítopo TI 1.3 no CD2 é a 1L-2.

De acordo com este aspecto da presente invenção, é possível fazer contactar uma célula T nao responsiva com um agente que efectue o tratamento preparatório da célula T antes do contacto com um agente estimulador CD2. Por exemplo, é possível criar uma célula T em cultura em 1L-2 para se efectuar o tratamento preparatório da célula T para estimulação através do CD2, antes de ser estimulada com uma célula que exprima um ligando CD2 ou com anticorpos estimuladores anti-CD2. F. Utilizações dos agentes estimuladores CD2

Os métodos da invenção para restabelecer a responsividade de células T a um antigénio podem ser utilizados para fins terapêuticos. Por exemplo, o antigénio pode ser daqueles que são expressos sobre células tumorais e o método pode ser utilizado para aumentar a responsividade antitumoral. Em alternativa, o método pode ser utilizado para aumentar a responsividade a agentes patogénicos, tais como vírus, bactérias, parasitas e fungos, ou para aumentar a eficiência de vacinas contra tais agentes patogénicos. Por exemplo, é possível administrar um agente estimulador a um paciente infectado com um agente patogénico ou é possível co-admínistrar esse agente com uma vacina para aumentar a responsividade das células T aos antigénios da vacina. O método também pode ser utilizado concomitantemente com tratamentos terapêuticos que compreendam a cultura de células T in vitro, uma vez que as células T têm tendência para deixarem de ser responsivas aos antigénios ao serem criadas em cultura in vitro. Posto isto, o método da invenção pode ser utilizado para aumentar a responsividadc antigénica de células T criadas in vitro que se destinem a ser utilizadas para fins terapêuticos A responsividade específica antigénica de uma célula T anergizada pode ser restabelecida fazendo contactar a célula T anergizada com um agente estimulador CD2 quer in vivo quer ex vivo. Faz-se contactar uma célula T específica do autigcnio com um agente estimulador CD2, de preferência na presença do antigénio. Por exemplo, faz-se contactar a célula T com o agente estimulador CD2 em cultura in vitro na presença de células que exprimam o antigénio ou in vivo em que o antigénio se encontra presente endogenamente ou o antigénio é co-administrado com o agente estimulador CD2. Ainda é possível fazer contactar uma célula T com um agente que realize o tratamento preparatório da célula T para estimulação através do CD2 quer in vitro quer in vivo. Por exemplo, é possível fazer a incubação das células T in vitro com IL-2 ou então é possível administrar ÍL-2 sistemicamente a um paciente.

As vias de administração, as composições farmacêuticas para administração, a programação temporal, as doses administráveis e outras considerações para administração dos agentes estimuladores CD2 são as que foram anteriormente descritas a propósito dos agentes inibitórios CD2, ou podem ser facilmente adaptadas a partir daquelas especificações. Para além das composições anteriormente descritas para os agentes inibidores CD2, os agentes estimuladores CD2 também podem ser administrados com um adjuvante. Utiliza-se o adjuvante no seu sentido mais amplo, podendo ser qualquer composto estimulador imunitário, tal como um interferão. Os adjuvantes aqui previstos compreendem os seleccionados entre resorcinóis, agentes tensioactivos não iónicos, tais como éter oleílico de polioxietileno e o éter n-hexadecílico de polietileno. No caso de se efectuar a co-administração de um agente estimulador CD2 com outro agente terapêutico, por exemplo, com uma vacina, o protocolo de programação temporal e o regime de dosagem do agente estimulador CD2 podem ser coordenados com o protocolo de programação temporal e com o regime de dosagem praticados para a administração do outro agente para que haja uma eficácia máxima dos dois agentes terapêuticos. IV. Métodos para restabelecer uma resposta das células T a um antigénio

Uma célula T anergizada, específica do antigénio, que seja estimulada por meio do CD2, de acordo com um método da presente invenção, readquire a capacidade para responder ao antigénio ao ser exposta a esse antigénio conjuntamente com um estímulo que desencadeie um sinal co-estimulador. Assim sendo, a invenção proporciona também um método para restabelecer uma resposta a um antigénio por parte de uma célula T que não seja responsiva a esse antigénio, segundo o qual se faz contactar a referida célula T, na presença do antigénio, com um primeiro agente que estimule a célula T através de um receptor superficial CD2. Além disso, faz-se contactar a célula T com um segundo agente que estimule essa célula T através de um receptor superficial CTLA4 ou CD28. O método pode ser usado para fins terapêuticos para aumentar uma resposta antitumoral num paciente portador de um tumor. Em alternativa, o método para restabelecer uma resposta a um antigénio pode ser utilizado para diversos fins terapêuticos, tais como a estimulação de uma resposta imunitária contra um agente patogénico (v.g., bactérias, vírus, parasitas ou fungos) e estimular a eficácia da vacinação contra um agente patogénico.

Como exemplos de primeiros agentes utilizáveis neste método refere-se os agentes estimuladores CD2 já antes descritos minuciosamente. Como exemplos de segundos agentes utilizáveis neste método refere-se uma célula que exprima um ligando CTLA4 ou CD28 (v.g. uma célula que tenha sido modificada para exprimir um ligando CTLA4 ou CD28 conforme descrito antes a propósito dos ligandos CD2), uma forma estimuladora de um ligando CTLA4 ou CD28 (v.g. uma forma muitivalente) ou anticorpos estimuladores que se liguem a CD28 ou CTLA4 (v.g: um anticorpos estimulador anti-CD28, conforme descrito por Harding, F.A. 81992) Nature 356:607-609). Os ligandos CTLA4 e CD28 preferidos são ο B7-1 c ο B7-2.

De acordo com uma variante preferida, o primeiro agente é um ligando CD2 sobre a superfície de uma célula e o segundo agente é um ligando CTLA4 ou CD28 sobre a superfície da mesma célula ou de outra célula. Um ligando CD2 preferido é o A-3FL. Em alternativa, o ligando CD2 pode ser o CD48 ou o CD59. Os ligandos CD28 e CTLA4 são ο B7-1 e ο B7-2. É possível modificar uma célula para exprimir um ligando CD2 e/ou o ligando CD28/CTLA4 segundo um método anteriormente descrito. Por exemplo, é possível introduzir um ácido nucleico que codifique um ligando CD2 e/ou o ligando CD28/CTLA4 dentro da célula, numa forma adequada para expressão do(s) ligando(s) sobre a superfície da célula. Em alternativa, os ligandos CD2 e/ou CD28/CTLA4 podem ser introduzidos em células ou acoplados à superfície de células.

Para restabelecer a responsividade das células T a um antigénio pode ser necessário fazer contactar as células T com um terceiro agente que faça o tratamento preparatório das células T para estimulação através do CD2. Os agentes para fazer o tratamento preparatório de uma célula T foram já descritos antes. Um agente preferido para fazer o tratamento preparatório das células T e para estimular a exposição de um neoepítopo TI 1.3 no CD2 nas células T é a IL-2. E possível fazer contactar as células com o agente que realiza o tratamento preparatório das células T para estimulação através do CD2, antes de as fazer contactar com um agente que estimule a célula T através do CD2. E possível fazer contactar uma célula T com um agente que realize o tratamento preparatório da célula T para estimulação através do CD2 quer in vitro quer in vivo. Por exemplo, é possível obter células T a partir de um paciente e criá-las em cultura in vitro em IL-2 antes de serem readministradas ao paciente ou é possível administrar a esse paciente IL-2 de fonna sistémica.

De acordo com uma variante preferida, a invenção proporciona um método para restabelecer uma resposta das células T específica de tumores num paciente portador de um tumor, o qual consiste em modificar as células tumorais para exprimirem um ligando CD2 e um ligando CD28 ou CTLA4. De preferência, as células tumorais são modificadas para exprimirem um ligando CD2 e um ligando CD28 ou CTLA4 introduzindo nas células tumorais pelo menos um ácido nucleico que codifique o ligando CD2 e o ligando CD28 ou CTLA4 numa forma adequada para expressão do ligando CD2 e do ligando CD28 ou CTLA4 sobre a superfície das células tumorais. As células tumorais podem ser modificadas in vivo ou ex vivo. Por exemplo, é possível modificar uma célula tumoral para exprimir um ligando CD2 in vivo por infecção dessas células tumorais com um vírus recombinante que codifique o ligando CD2 numa forma adequada para expressão do ligando CD2 sobre a superfície da célula tumoral. Em alternativa, é possível retirar células tumorais de um paciente, modificá-las ex vivo para exprimirem um ligando CD2 e readministrá-las ao paciente. Quando a modificação tiver lugar ex vivo, é possível modificar uma amostra de células tumorais para exprimirem os dois ligandos (isto é, um ligando CD2 e um ligando CD28 ou CTLA4) ou então, em alternativa, é possível modificar uma amostra de células tumorais para exprimirem um ligando CD2 e é possível modificar uma segunda amostra de células tumorais para exprimirem um ligando CD28 ou CTLA4. As duas amostras de células tumorais podem ser então administradas a um paciente simultânea ou sequencialmente. Pode ser benéfico administrar em primeiro lugar uma amostra de células tumorais que exprimam o ligando CD2 para restabelecer a responsividade específica do tumor, seguindo-se a administração de uma amostra de células tumorais que exprimam um ligando CD28 ou CTLA4 para estimular uma resposta das células T específicas do tumor.

As células T específicas do tumor também podem ser estimuladas quer in vivo quer ex vivo. Por exemplo, é possível estimular células T in vivo modificando células tumorais in vivo ou administrando células tumorais modificadas (ou outros agentes estimuladores CD2) ao paciente. Em alternativa, é possível obter células T a partir de um paciente, estimulá-las ex vivo (v.g. com uma célula tumoral portadora de A-3FL ou com uma célula tumoral e anticorpos anti-CD2) e readministrá-las depois ao paciente. As células T estimuladas in vitro podem ser, em primeiro lugar, criadas em cultura in vitro com IL-2 para se fazer o tratamento preparatório dessas células T ou então é possível administrar ÍL-2 sistemicamente ao paciente para fazer o tratamento preparatório de células T para estimulação através do CD2.

Assim sendo, a presente invenção proporciona células tumorais modificadas para exprimirem um ligando CD2, em que essas células tumorais não exprimem um ligando CD2 antes da modificação. De preferência, as células tumorais são modificadas para exprimirem A-3FL. A invenção proporciona também uma célula tumoral que é modificada para exprimir um ligando CD2 e um ligando CD28 ou CTLA4, em que a célula tumoral não exprime o ligando CD2 nem o ligando CD28 ou CTLA4 antes da modificação. São preferíveis as células tumorais modificadas para exprimirem o A-3FL e ο B7-1 ou B7-2. As células tumorais podem ser modificadas para exprimirem um ligando CD2 e facultativamente um ligando CD28 ou CTLA4, conforme descrito antes. As células tumorais modificadas podem ser incorporadas numa composição adequada para administração farmacêutica Por exemplo, é possível administrar células tumorais num veículo ou num diluente farmaceuticamente aceitável (v.g., uma solução salina estéril) As células tumorais podem ser administradas por uma via adequada que conduza as células tumorais a um lugar desejado, v.g., por injecção intravenosa, subcutânea, intramuscular ou intraperitoneal.

Ilustra-se a presente invenção mais coiiveuieutemciitc por meio dos exemplos a seguir apresentados que devem ser considerados não limitativos. EXEMPLO 1: indução da falta de responsividade das células T por inibição

de um sinal co-estimulador nas células T

Nos exemplos foram utilizados dois clanes de células T auxiliares (CT-1, CT-2, o mesmo que TC-1, TC-2) específicos para o aloantigénio HLA-DR7. Estes clanes são CD4 CD8 CD28 e foram gerados com recurso a uma metodologia convencional (conforme descrito por J. Goronzy et al. (1987) em Methods Enzymol. 150:333). Em algumas experiências os clones de células T foram estimulados com células NIH-3T3 ou COS transfectadas para exprimirem o ALA-DR7 e/ou outras moléculas da superfície celular. Estas células transfectadas são aqui consideradas como células possuidoras de aloantigénios artificiais (CPalo-A, o mesmo que alo-APC). Antes da transfecção estas células são incapazes de estimular a proliferação das células T ou a produção de 1L-2. Os transfectantes são designados pelo nome das moléculas que exprimem sobre as suas superfícies, de acordo com a nomenclatura seguinte: as células que exprimem apenas o HLA-DR7 são designadas por t-DR7, as células que exprimem simultaneamente o HLA-DR7 e ο B7-1 são designadas por t-DR7/B7-l, as células que exprimem o HLA-DR7 e o M-1A1C são designadas por t-DR7/M-lAIC, etc.. Noutras experiências os clones de células T foram estimulados com uma linhagem celular linfoblastóide homozigórica de HLA-DR7 que co-exprime HLA-DR7, B7-1 (CD80), B7-2, M-1AIC (o mesmo que ICAM-1) (CD54) e A-.3FL (CD58). Esta linhagem celular recebe a designação de LBL-DR7. As respostas das células T foram avaliadas medindo a proliferação de células T ou a produção de 1L-2 por meio de técnicas convencionais. Os resultados obtidos com os dois clones eram comparáveis de forma consistente. Apenas são apresentados os resultados obtidos com o CT-1.

Num primeiro conjunto de experiências produziu-se uma co-cultura de CT-1 durante 72 horas altemativamente com t-DR7, t-DR7/B7-l ou LBL-DR7. O CT-1 e as CPalo-A ou LBL-DR7 foram criados em cultura (2,5 x 104 células/cavidade) à razão óptima de 1:1. Ao fim de 72 horas de preparação da cultura primária efectuou-se o isolamento das células CT-1 a partir de CPalo-A artificiais por meio de centrifugação em gradiente de ‘PercolT e a partir

TM de LBL-DR7 por separação em ‘Ficoll ’, tendo sido efectuada uma lavagem exaustiva e uma criação em cultura em meio sem 1L-2 durante 24 horas. Cada população foi depois novamente estimulada com um segundo estímulo, quer as CPalo-A artificiais (t-DR7, t-DR7/B7, t-DR7/ /M-1A1C), quer células LBL-DR7 quer IL-2. As CPalo-A artificiais e as células LBL-DR7 foram tratadas com mitomicina C à razão de 20 pg/mL (Sigma Chemical Co., St Louis, MO) a 37°C durante 2 horas e foram lavadas de forma exaustiva. As células LBL-DR7 foram irradiadas a 9600 rads em algumas experiências. Juntou-se a determinadas culturas (indicadas na figura 1), à razão de 10 pg/mL, o Acm anti-B7-l (133) e a proteína de fusão CTLA4-Ig. Utilizou-se a IL-2 humana recombinante (Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA), à razão de 100 UI/mL. Mediu-se a proliferação pela técnica de incorporação de [^Hj-timidina (1 pCi) (DuPont, Boston, MA) durante as últimas 16 horas de um período de incubação de 72 horas. Mediu-se a acumulação de IL-2 pelo método de ensaio de imunossorção ligada com enzimas (Biosource, Camarillo, CA) em sobrenadantes colhidos 24 horas após o início da cultura. Os resultados obtidos são representativos de 7 experiências. Os resultados estão indicados na figura 1 em que as barras a cheio representam a resposta das células CT-1 às CPalo-A artificiais, as barras tracejadas representam a resposta a LBL-DR7 e as barras em branco representam a resposta â JLL-2 humana recombinaute exógena. A cultura primária de CT-1 com t-DR7 induziu a falta de responsividade das células T (isto é, a anergia). conforme evidenciado pela falta de uma resposta ao novo estímulo das CT-1 com as CPalo-A ou com LBL-DR7 (ver a figura 1, painel A). Esta experiência confirma que a estimulação de um sinal específico do antigénio nas CT-1, na ausência de um sinal co-estimulador (ν>.#, na ausência de ligação a B7-1) induz a falta de responsividade das células T. Pelo contrário, a cultura primária quer com t-DR7/B7-l quer com LBL-DR7 originou uma significativa resposta proliferativa secundária e uma acumulação de IL-2 (ver a figura 1, painéis B e C). A adição de um Acm anti-B7-l (descrito por AS. Freedman et al. (1987) em J. Immunol. 137:3260) às células LBL-DR7 na cultura primária originou uma proliferação e uma acumulação reduzidas de ÍL-2, mas não induziu a falta de responsividade ao novo estímulo (ver a figura 1, painel D). Isto fica a dever-se à incapacidade do anticorpos anti-B7-l para inibirem uma interaeção entre outros elementos da família B7 (v.g., B7-2) e os seus receptores nas células T (v.g., CD28 e/ou CTLA4). No entanto, a cultura primária de LBL-DR7 na presença de CTLA4-Ig (conforme descrito por C.D. Gimmi et al. (1993) em Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:6586) teve como resultado a anergia (ver a figura 1, painel E). Isto fica a dever-se à incapacidade do CTLA4-Ig para inibir a interaeção de todos os elementos da família B7 com os seus receptores nas células T. Em todos os casos, tanto as células anergizadas como as células não anergizadas responderam ignalmente bem à TL-2 exógena. Estes resultados demonstram que o bloqueio da família B7 de moléculas co-estimuladoras é necessário e suficiente para induzir a anergia específica dos aloantigénios, uma vez que todas as outras moléculas superficiais expressas sobre as células LBL-DR7 que não estejam bloqueadas pelo CTLA4-lg não conseguiram impedir a indução de anergia na presença de CTLA4-Ig. Além disso, a seguir à indução da anergia, parece que nem os elementos da família B7 nem outras moléculas co-estimuladoras de tipo não B7 expressas nas células LBL-DR7 foram capazes de inverter este estado. EXEMPLO 2: a estimulação de células T com B7-1 ou M-1AIC não inverte a

falta de responsividade das células T

Num segundo conjunto de experiências criou-se em cultura em IL-2 células CT-1 anergizadas, durante 3 a 21 dias, para se determinar se a IL-2 seria capaz de restabelecer a responsividade ao aloantigénio específico. As células CT-1 foram anergizadas em primeiro lugar por meio de uma co-cultura primária com t-DR7 (conforme descrito no exemplo 1) e foram depois incubadas em IL-2 durante 3 a 21 dias. Estas células CT-1 foram novamente estimuladas com as CPalo-A ou com as LBL-DR7 (segundo os intervalos de tempo indicados na figura 2) a seguir à incubação em IL-2. Os resultados indicados na figura 2 são representativos de 5 experiências. Em nenhum momento até ao 2 F dia após a incubação em IL-2 o novo estímulo com t-DR7, t-DR7/B7-l ou DR7/M-1AIC não foi capaz de restabelecer a responsividade (ver a figura 2) num intervalo amplo de variação das proporções entre estimulador:respondedor. Pelo contrário, decorridos pelo menos 7 dias de cultura em IL-2, o novo estímulo com LBL-DR7 induziu uma resposta proliferativa (ver a figura 2) que estava associada a uma acumulação significativa de IL-2. Estes resultados indicam que a seguir a uma cultura prolongada em IL-2, a responsividade das células CT-1, específica do aloantigénio, pode ser restabelecida por cultura com LBL-DR7, mas parece que nem a B7-1 nem a M-1AIC (em CPalo-A) são suficientes para realizarem uma co-estimulação. Em experiências de contraprova demonstrou-se que a resposta das CT-1 era específica do aloantigénio, uma vez que íoi inibida por um Acm anti-DR (conforme desciito por R.I. Todd et al. (1984) cm Hum. lmmunoi. 10:23) e uma vez que a proliferação das células T ou a acumulação de 1L-2 não foi induzida por outros dois LBL em que cada um deles é homozigótico para um haplotipo de DR diferente (LBL-DR1 e LBL-DRS). EXEMPLO 3: manutenção da falta de responsividade das células T por

bloqueio de uma interacção CD2/A-3FL

Num terceiro conjunto de experiências investigou-se a capacidade das células LBL-DR7 para restabelecerem a responsividade das CT-1, específica do aloantigénio. O efeito da LBL-DR7 não foi mediado por um factor solúvel segregado, uma vez que o novo estímulo com t-DR7/ /B7-1 ou t-DR7/M-lAIC, na presença do sobrenadante da cultura de LBL-DR7 não restabeleceu a responsividade. Pelo contrário, as células LBL-DR7 fixadas com paraformaldeído, tratadas com mitomicina C ou irradiadas, induziram respostas proliferativas idênticas, sugerindo tal facto que houve uma molécula da superfície celular implicada na inversão observada da anergia por parte das células LBL-DR7. Foram utilizados Acm de bloqueio ou proteínas de fusão, dirigidos contra um conjunto de moléculas da superfície celular expressas nas CP A, para se determinar se haveria uma ou várias moléculas conhecidas da superfície celular, responsáveis pelo restabelecimento da responsividade por parte das células LBL-DR7. Após a indução da anergia com CPalo-A de t-DR7, seguindo-se uma preparação em cultura em IL-2, durante 7 dias pelo menos, as células CT-1 foram novamente estimuladas com LBL-DR7, quer por si só quer na presença de cada um dos seguintes Acm ou proteínas de fusão: anti-DR (9-49) (descrito por R.I. Todd et al. (1984) em Hum. Immunol. 10:23), anti-A-lFL (TS1/22) (descrito por F. Sanchez-Madrid et al. (1982) em Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79:7489), anti--A-3FL (TS2/9) (descrito por F. Saucliez-Madrid et al. (1982) cm Proc. Natl. Acad Sei. USA 79:7489), anti-B7-l (133) (descrito por A.S. Freedman et al. (1987) em Immunol. 137:3260), BB-1 (descrito por E. Clark et al. em Leucocyte Typing, A. Bemard et al., eds. (Springer-Verlang, Berlin Heidelberg, 1984, pág. 339), CTLA4-Ig (descrito por C.D. Gimmi et al. (1993) em Proc. Natl. Acad Sei. USA 90:6586), anti-CD24 (BA-1, de ascites a 1:100) (descrito por C.S. Abramson et d. (1981) em 7. Immunol. 126:83), anti-CD40 (JRG 12), anti-CD72 (J3-109, BU-40, de ascites a 1:100) (descrito por B. Dorken et al. em Leucocyte Typing IV White cell dfferentiation antigens, W. Knapp et al., Eds. (Oxford, 1989) pág. 99). Todos os Acm (purificados) e todas as proteínas de fusão foram utilizados à razão de 10 pgfrnL. Mediu-se a proliferação conforme indicado no exemplo 1. Os resultados estão agrupados na figura 3 e são representativos de 4 experiências.

Apenas três Acm inibiram a capacidade do LBL-DR7 para inverter a falta de responsividade das células T (isto é, mantiveram a falta de responsividade das células T): anti-DR, anti-A-lFL e anti-A-3FL (ver a figura 3). Parece que nem os elementos da família B7 nem outras moléculas da superfície das células, incluindo as CD24, CD40 e CD72, são importantes para a reversão da anergia, conforme evidenciado pela incapacidade dos Acm ou das proteínas de fusão que se ligam a estas moléculas para inibirem a resposta proliferativa. A inibição observada respeitante à proliferação mediada pelo LBL-DR7, por acção do anti-DR, fica a dever-se à inibição do reconhecimento do antigénio pela célula T. A inibição observada respeitante à proliferação mediada pelo LBL-DR7, por acção do anti-A-3FL, é consistente com o facto de o A-3FL estar implicado na reversão da anergia. uma vez que se mantém a falta de responsividade das células T quando é inibida uma interacção entre o A-3FL sobre uma célula que apresente um antigénio e um CD2 numa célula T anergizada (v.g., mediante o bloqueio com um anticorpo antÍ-A-3FL). A inibição observada da proliferação mediada pelo LBL-DR7 por acção do Acm anti-A-lFL sugere que os ligandos A-1FL também podem estar eventualmente implicados na reversão da anergia. É improvável que o M-l AIC seja um bgando A-3FL que esteja implicado na reversão da anergia, uma vez que as células Í-DR7/M-1AIC não restabelecem a proliferação de células anergizadas após uma cultura prolongada em 1L-2. No entanto, pode haver outros ligandos A-1FL, incluindo a M-2AIC e a M-3AIC, que também podem estar eventualmente envolvidos na reversão da anergia, para além da interacção de CD2/A-3FL. EXEMPLO 4: reversão da falta de responsividade das células T por

estimulação com A-3FL

Para se examinar directamente se o A-3FL e o aloantigénio podem realizar a reversão de um estado definido de anergia clonal específico do aloantigénio, efectuou-se a transfecção de células COS para exprimir apenas o DR7 (COS-DR7), apenas ο B7-1 e ο B7-2 (COS-B7-1/ /B7-2) ou apenas o A-3FL (COS-A-3FL) ou o DR7 em combinação com uma ou várias destas moléculas (COS-DR7/B7-1/B7-2, COS-DR7/A-3FL, COS-DR7/A-3FL/B7-1/B7-2). As células COS foram transfectadas com os ADN que codificam quer as cadeias (COS-DR7) de ALH-DRa (o mesmo que HLA-DRa) e DR7p (DRC1*0701), B7-1 e B7-2 (COS-B7-1/B7-2), ALH-DRa e DR73, B7-1 e B7-2 (COS-DR7/B7-1/B7-2), A-3FL (COS-A-3FL), ALH-DRa e DR7p e A-3FL (COS-DR7/A-3FL), ALH-DRa e DR7f3, A-3FL, B7-1 e B7-2 (COS-DR7/A-2FL/B7-1/B7-2) quer apenas o vector pCDNAl (pseudo-COS). Avaliou-se a expressão de DR7 e de A-3FL utilizando respectivamente os Acm 9-49 e TS2/9, seguindo-se a utilização de anti-lg de murganho conjugada na cabra com ITCF (o mesmo que FITC); avaliou-se a expressão de B7-1 e B7-2 utilizando CTLA4-lg biotinilado, seguindo-se o tratamento com estreptavidina conjugada com ficoeritrina. Avaliou-se a co-expressão de A-3FL c DR7 utilizando TS2/9, scguindo-se a utilização de anti-lg de murganho conjugado na cabra e marcado com ITCF e o 9-49 conjugado com ficoeritrina, tendo sido verificado que era detectável em 50% a 72% das células transfectadas. Avaliou-se a co-expressão de DR7 e B7-1/B7-2 utilizando o 9-49 conjugado e marcado com ITCF e o CTLA4-lg biotinilado, seguindo-se o tratamento com estreptavidina conjugada com ficoeritrina, tendo sido certificado que era detectável em 40% a 50% das células transfectadas. Antes de serem utilizadas, as células COS transfectadas foram tratadas com mitomicina C, conforme descrito no exemplo 1. Após a indução da anergia com t-DR7, a que se seguiu uma cultura em IL-2 humana recombinante, as células CT-1 (2,5 x 104 células/cavidade) foram novamente estimuladas com cada um dos tipos de transfectantes COS, à razão de 2 x 104 células/ /cavidade. Mediu-se a proliferação e a acumulação de IL-2, conforme indicado no exemplo 1. Os resultados obtidos estão ilustrados na figura 4 e são representativos de três experiências com COS-DR7/A-3FL, COS-DR7/B7-1/B7-2 e pseudo-COS e de mais duas experiências com transfectantes COS-DR7, COS-A-3FL, COS-B7-1/B7-2 e COS-DR7/A-3FL/B7-1/B7-2. O estímulo com COS-DR7, COS-B7-1/B7-2, COS-A-3FL e COS-DR7/B7-1/B7-2 não induziu a proliferação ou a acumulação de IL-2. Pelo contrário, os transfectantes que co-exprimem DR7 e A-3FL (COS-DR7/A-3FL e COS-DR7/A-3FL/B7-1/B7-2) induziram níveis equivalentes de proliferação e de acumulação de IL-2, indicando isso uma responsividade restabelecida ao aloantigénio na presença de co-estimulação com A-3FL. 54

I

Para se determinar se a estimulação pelo A-3FL efectuou a reversão anérgica e restabeleceu completamente a responsividade especifica do aloantigémo, as células CT-1 foram anergizadas, criadas em cultura em IL-2 e criadas em co-cultura quer com LBL-DR7, COS-DR7/A-3FL quer com COS-D7/B7-1/B7-2 durante 72 horas. A seguir foram isoladas das LDL-DR7, por separação cm ‘Ficoll™’, e dos transfectantes COS, por centrifugação em gradiente de ‘PercolT, e novamente estimuladas com os estímulos indicados. Os resultados ilustrados na figura 5 são representativos de cinco experiências em que o novo estímulo foi realizado com estimuladores LBL-DR7 e também são representativos de três experiências em que o novo estímulo foi realizado com estimuladores que eram os transfectantes COS. A seguir à criação em cultura sequencial com IL-2 e LBL-DR7 ou COS-DR7/A-3FL, as células CT-1 previamente anergizadas responderam aos t-DR7/B7-l, t-DR7/M-lAIC e LBL-DR7 (ver a figura 5, painéis superior e intermédio). Pelo contrário, quando os COS-DR7/B7-1/B7-2 foram utilizados a seguir à cultura em IL-2, não foi observada nenhuma resposta ao novo estímulo (figura 5, painel inferior). Em todos os casos as células CT-1 proliferaram igualmente para a IL-2 exógena (figura 5). Isto demonstra que a cultura de células CT-1 anergizadas em IL-2 pelo menos durante 7 dias, seguindo-se-lhe a apresentação do aloantigémo e a estimulação pelo A-3FL, é suficiente para realizar a reversão da aneigia específica do aloantigémo e para restabelecer a responsividade ao aloantigémo na presença de sinais co-estimuladores previamente insuficientes.

EXEMPLO 5: reexpressão do neoepítopo TI 13 de CD2 numa célula T anergizada, por cultura em IL-2 A expressão dos epítopos Tll.leTll.2de CD2 e do epítopo TI 1.3 de CD2R pelas células CT-1 foi estudada por citometria de fluxo, para várias condições de cultura. As células CT-1, antes e após a indução da anergia e a seguir à cultua com EL-2 durante 7 dias, foram 55 * marcadas com anticorpos para os epítopos Tll.l, T11.2 ou T11.3 da molécula CD2 ou com as contraprovas adaptadas do isotipo adequado e foram analisadas por citometria de fluxo (citómetro ‘EPICS Elite Flow’; Coulter). Os resultados estão indicados na figura 6. Os picos a sombreado representam a marcação com o Acm adaptado ao isotipo e os picos não sombreados representam a marcação com os Acm para qualquer dos epítopos Tll.l, TI 1.2 ou TI 1.3, conforme indicado. Os dados são representativos de três experiências. Num estado responsivo, as células CT-1 exprimem os epítopos Tll.l, TI 1.2 e T11.3. a seguir à indução de anergia nas células CT-1 por cultura com t-DR7 (conforme descrito no exemplo 1), as células CT-1 continuam a exprimir os epítopos Tll.l e T11.2, mas a expressão do epítopo T11.3 (CD2R) deixa de ser detectável. O epítopo TI 1.3 é reexpresso ao fim de 7 dias de cultura com IL-2, exactamente no momento em que estas células readquirem a responsividade ao aloantigénio, e com co-estimulação com A-3FL (ver a figura 6). Além disso, embora as células CT-1 não anérgicas proliferem, na combinação mitogénica de TI 1.3 com qualquer dos Acm Tll.l ou TI 1.2, o mesmo não sucede com as células CT-1 anergizadas. Depois de 7 dias de cultura em IL-2 e concomitante reaparecimento do epítopo TI 1.3, as células CT-1 anérgicas readquirem a responsividade às combinações mitogénicas dos Acm anti-CD2 (v.g., ο T11.3 com qualquer dos Acm TI 1.2 ou TI 1.2). A ausência do epítopo TI 1.3 detectável nas células CT-1, a seguir à indução de anergia, não ficou a dever-se simplesmente à falta de proliferação das células T, estando sim directamente relacionada com a indução da anergia. EXEMPLO 6: associação de CD2 com a cinasc JAK-3 na reversão da anergia

das células T A estimulação de células CT-1, não anergizadas, com quaisquer das células t-DR7/B7-l ou LBL-DR7, teve como consequência a fosforilação da tirosina das cinases tirosínicas JAK-1 e 56 » 56 » * » JAK-3. Para se estudar o papel das cinases JAK na reversão da anergia das células T, foram utilizadas células ΓΤ-1 previamente anergizadas que foram estimuladas com diversos agentes estimuladores e depois examinou-se a fosforilação da cinase JAK e a associação com o CD2. Ao contrário das células T não anergizadas, as células T previamente anergizadas não revelaram a fosforilação da tirosina de qualquer das cinases JAK-1 ou JAK-3 quando estimuladas com qualquer das substâncias t-DR7/B7-l ou LBL-DR7. No entanto, ao fim de 7 dias de cultura das células T em IL-2, o novo estímulo das células com LBL-DR7 teve como resultado a fosforilação significativa das cinases JAK-1 e JAK-3. Este período a seguir à cultura em IL-2 coincide com a altura em que as células T readquirem a responsividade ao aloantigénio e estimulação de A-3FL. Para se determinar se o CD2 estava associado com qualquer elemento da família das cinases JAK nessa altura, os lisados de células CT-1 foram imunoprecipitados com um anticorpo monoclonal contra o CD2, sendo qualquer dos TI 1.1, TI 1.2 ou T11.3, e os imunoprecipitados foram sujeitos a uma operação de electroforese num gel convencional para a prática do protocolo de EGPA-DSS. As proteínas que ficaram sobre o gel foram transferidas para um filtro que foi depois submetido a um procedimento de imunotransferência com um anti-soro vulgar (R80) anti-cinase JAK ou com um anti-soro específico da JAK-3. Os resultados destas experiências de imunotransferência estão ilustrados na figura 7. Estas experiências demonstraram que a forma de CD2 que exprime o TI 1.3, aquando da reversão da anergia das células T, estava associada com uma cinase JAK de 116 kD (ver a figura 7, painel da esquerda). Além disso, identificou-se esta cinase JAK de 116 kD e concluiu-se que era a JAK-3 por imunotransferência com um anti-soro específico para a cinase JAK-3 (ver a figura 7, painel da direita).

Lisboa, 14 de Fevereiro de 2001

Claims

Reivindicações Utilização de um primeiro agente que iniba a estimulação das células T por meio de um receptor superficial CD28 ou CTLA4 e de um segundo agente que iniba a estimulação das células T por meio de um receptor superficial CD2 para a preparação de uma ou várias composições farmacêuticas para induzir ou manter a responsividade das células T a um antigénio num paciente, em que os referidos primeiro e segundo agentes estão correspondentemente incorporados numa só composição farmacêutica ou então numa primeira e numa segunda composições farmacêuticas, sendo as referidas primeira e segunda composições farmacêuticas aplicáveis simultânea ou sequencialmeníe. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o referido primeiro agente bloqueia uma interacção do receptor superficial CD28 ou CTLA4 com um ligando CD28 ou CTLA4 e/ou o referido segundo agente bloqueia uma interacção do receptor superficial CD2 com um ligando CD2. Utilização de acordo com a reivindicação 2, em que o referido ligando CD28 ou CTLA4 é seleccionado entre o conjunto constituído por B7-1 e B7-2 e/ou o referido ligando CD2 é o A-3FL. Utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 2 ou 3, em que o referido primeiro agente é seleccionado entre o conjunto constituído por: (a) um anticorpo anti-CD28, um anticorpo anti-CTLA4, um anticorpo anti-B7-l e um anticorpo anti-B7-2 ou um anti-anticorpo B7-1 e nm anti-anticoipo B7-2; ou (b) uma fornia solúvel de uma proteína CD28, uma forma solúvel de uma proteína CTLA-4, uma forma solúvel de uma proteína B7-1 e uma forma solúvel de uma proteína B7-2; ou então é uma proteína de fusão CTLA4-Ig, e/ou o referido segundo agente é seleccionado entre o conjunto constituído pior: (a) um anticorpo anti-CD2 e um anticorpo anti-ligando CD2; ou (b) uma forma solúvel de uma proteína CD2 e uma forma solúvel de um ligando CD2. Utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4, em que a referida e eventualmente única composição farmacêutica ou pelo menos uma das referidas primeira e segunda composições farmacêuticas compreende também um terceiro agente que iniba a exposição do neoepítopo TI 1.3 no receptor superficial CD2 nas células T, ou em que o referido terceiro agente é utilizado para a preparação de uma composição farmacêutica para inibir a exposição do neoepítopo TI 1.3 no receptor superficial CD2 nas células T, sendo esta terceira composição farmacêutica aplicável simultânea ou sequencialmente em relação à referida composição farmacêutica eventualmente única ou em relação às referidas primeira e/ou segunda composições farmacêuticas. Utilização de acordo com a reivindicação 5, em que o referido terceiro agente inibe a produção ou a actividade de um factor de crescimento das células T. Utilização de acordo com a reivindicação 6, em que o referido factor de crescimento das cclulas T c a IL-2.
8. Utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 7, em que o referido antigénio está sobre a superfície de uma célula alogénica ou xenogénica e o referido paciente é alguém que recebe essa célula alogénica ou xenogénica.
9. Utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 7, em que o referido antigénio é um autoantigénio.
10. Método para restabelecer a responsividade de uma célula T específica de um antigénio, a qual não é responsiva a esse antigénio, consistindo tal método em fazer contactar a célula T in vitro na presença do referido antigénio com um agente que estimule a célula T através de um receptor superficial CD2.
11. Método de acordo com a reivindicação 10, em que o referido agente é um ligando CD2 ou é pelo menos um anticorpo anti-CD2.
12. Método de acordo com a reivindicação 11, em que o referido ligando CD2 está sobre a superfície de uma célula que exprime o referido antigénio.
13. Método de acordo com a reivindicação 12, em que o referido ligando CD2 é o A-3FL.
14. Método de acordo com uma qualquer das reivindicações 12 ou 3, cm que o referido ligando CD2 é expresso sobre a superfície celular introduzindo na célula uma molécula de ácido nucleico que codifique o referido ligando CD2 numa forma adequada para a expressão do retendo ligando CD2 sobre essa superfície da célula. 15. Método de acordo com a reivindicação 14, em que a referida célula é uma célula tumoral.
16. Método de acordo com a reivindicação 11, em que o referido anticoipo anti-CD2 eventualmente único se liga ao neoepítopo TI 1.3 no referido reccptor superficial CD2.
17. Método de acordo com uma qualquer das reivindicações 10 a 16, o qual consiste também em fazer contactar a referida célula T com um segundo agente que estimule a exposição do neoepítopo TI 1.3 sobre o referido receptor superficial CD2 na referida célula T.
18. Método de acordo com a reivindicação 17, em que o referido segundo agente é a ÍL-2 ou a IL-4.
19. Método de acordo com a reivindicação 18, segundo o qual se faz contactar a referida célula T com a LL-2 ou a IL-4 antes de se fazer contactar com o referido segundo agente.
20. Método de acordo com uma qualquer das reivindicações 10 a 19, o qual consiste também em fazer contactar a referida célula T na presença do referido antigénio com um agente que estimule a referida célula T através de um receptor superficial CD28 ou CTLA4.
21. Método de acordo com a reivindicação 20, em que o referido agente é um ligando CD28 ou CTLA4.
22. Método de acordo com a reivindicação 21, em que o referido ligando CD28 ou CTLA4 está sobre a superfície de uma célula que exprime o referido antigénio.
23. Método de acordo com uma qualquer das reivindicações 21 ou 22, em que o referido ligando CD28 ou CTLA4 é ο B7-1 ou ο B7-2.
24. Método de acordo com uma qualquer das reivindicações 22 ou 23, em que o referido ligando CD28 ou CTLA4 é expresso sobre a superfície da célula introduzindo nessa célula uma molécula de ácido nucleico que codifique o referido ligando numa forma adequada para a expressão do referido ligando CD28 ou CTLA4 sobre a superfície da célula.
25. Utilização de um agente que modifique uma célula tumoral para exprimir um ligando CD2 e um ligando CD28 ou CTLA4 para a preparação de uma composição farmacêutica para estimular uma resposta das células T à referida célula tumoral num paciente com um tumor.
26. Utilização de acordo com a reivindicação 25, em que o referido agente é pelo menos um ácido nucleico que codifique o referido ligando CD2 e o referido ligando CD28 ou CTLA4 numa forma adequada para a expressão do referido ligando CD2 e do referido ligando CD28 ou CTLA4 sobre a superfície da célula tumoral.
27. Utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 25 ou 26, em que a referida célula tumoral é obtida a partir de um paciente e modificada ex vivo para formar uma 6 célula tumoral modificada e em que a referida célula tumoral modificada é utilizada para a preparação de uma composição farmacêutica.
28. Utilização de acordo com a reivindicação 27, em que se modifica uma primeira amostra de células mmorais para exprimii um ligando CD2 para formar uma primeira amostra de células tumorais modificadas e em que se modifica uma segunda amostra de células tumorais para exprimir um ligando CD28 ou CTLA4 para formar uma segunda amostra de células tumorais modificadas.
29. Utilização de acordo com a reivindicação 28, em que as composições farmacêuticas que contêm as referidas primeira e segunda amostras de células tumorais modificadas são concebidas para serem administradas simultaneamente.
30. Utilização de acordo com a reivindicação 28, em que as composições farmacêuticas que contêm as referidas primeira e segunda amostras de células tumorais modificadas são concebidas para serem administradas sequencialmente.
31. Utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 25 a 30, em que a referida composição farmacêutica contém também um agente que estimula a exposição do neoepítopo TI 1.3 sobre o receptor superficial CD2 nas células T.
32. Utilização de acordo com a reivindicação 31, em que o referido agente é a IL-2 ou a IL-4. 7
33. Utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 25 a 30, em que as células T são obtidas a partir de um paciente e vão contactar com a 1L-2 ou a IL-4 ex vivo e em que as referidas células T são utilizadas para a preparação de uma composição farmacêutica. Lisboa, 14 de Fevereiro de 2001 v/o AGsr;í\y ΟΑλΑ cx Pro-l-sc- *c-::Cí3· ir.avÍi/ÍCí

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