BR112020019418A2

BR112020019418A2 - tratamento e prevenção de infecções microbianas

Info

Publication number: BR112020019418A2
Application number: BR112020019418-2A
Authority: BR
Inventors: Morten Sommer; Virginia MARTINEZ; Eric Van Der Helm; Jakob Krause HAABER; Ana De Santiago Torio; Christian Grøndahl; Jasper Clube
Original assignee: Snipr Biome Aps.
Priority date: 2018-03-25
Filing date: 2019-03-25
Publication date: 2021-02-17
Also published as: GB2587521A8; DE112019001543T5; JP2021519293A; CN112292145A; GB2609346B; EP4066851A1; GB2587521A; EP4085923A1; GB202016887D0; AU2019246043A1; SG11202009504YA; EP3773685A1; IL277473A; GB2609346A; GB202215998D0; CA3094458A1; JP2024023210A; GB2587521B; KR20210006344A; WO2019185551A1

Abstract

A presente invenção refere-se a métodos para tratamento ou prevenção de infecções microbianas (por exemplo, bacterianas) e meios para executar estes métodos. Em particular, torna-se possível o tratamento de infecções que necessitem de terapia rápida e duradoura, como no tratamento de condições agudas como septicemia, sepse, SRIS ou choque séptico. A invenção é particularmente útil, por exemplo, para o tratamento de micróbios bem como para uso ambiental, alimentar e de bebidas. A invenção refere-se, entre outros, a métodos de controle da corrosão microbiologicamente influenciada (CMI) ou da bioincrustação de um substrato ou fluido em um sistema industrial ou doméstico. A invenção também é útil para o tratamento de infecções bacterianas patogênicas em indivíduos que recebem um tratamento para uma doença ou condição, como um transplante ou um tratamento para o câncer, uma infecção viral ou uma doença autoimune.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "TRATAMENTO E PREVENÇÃO DE INFECÇÕES MICROBIANAS".

CAMPO TÉCNICO

[0826] A invenção fornece métodos para tratamento ou prevenção de infecções microbianas (por exemplo, bacterianas) e meios para executar estes métodos. Em particular, torna-se possível o tratamento de infecções que necessitem de terapia rápida ou duradoura, como no tratamento de condições agudas como septicemia, sepse, SRIS ou choque séptico. A invenção também é particularmente útil, por exemplo, para o tratamento de micróbios para uso ambiental, alimentar e de bebidas. A invenção refere-se, entre outros, a métodos de controle da corrosão microbiologicamente influenciada (CMI) ou da bioincrustação de um substrato ou fluido em um sistema industrial ou doméstico.

[0827] A invenção também é útil para o tratamento de infecções bacterianas patogênicas em indivíduos que recebem um tratamento para uma doença ou condição, como um transplante ou um tratamento para o câncer, uma infecção viral ou uma doença autoimune.

ANTECEDENTES

[0828] A septicemia é uma infecção aguda e grave da corrente sanguínea. É também conhecido como bacteremia, ou envenenamento do sangue. A septicemia ocorre quando uma infecção bacteriana em algum lugar no corpo, como nos pulmões ou na pele, entra na corrente sanguínea. Isto é perigoso porque as bactérias e as suas toxinas podem ser transportadas através da corrente sanguínea para todo o corpo do indivíduo. A septicemia pode tornar-se rapidamente fatal. Deve ser tratada rapidamente, como em um hospital. Se for deixada sem tratamento, a septicemia pode avançar para a sepse.

[0829] A septicemia e a sepse não são as mesmas. A sepse é uma complicação grave da septicemia. Sepse é quando ocorre inflamação em todo o corpo. Esta inflamação pode causar coágulos sanguíneos e bloquear o oxigênio de alcançar órgãos vitais, resultando em falência dos órgãos. O Institutos Nacionais de Saúde (NIH) dos EUA estima que mais de 1 milhão de americanos têm sepse grave todos os anos. Entre 28 e 50% desses pacientes podem morrer da condição. Quando a inflamação ocorre com pressão arterial extremamente baixa, chama-se choque séptico. Choque séptico é fatal em muitos casos.

[0830] O aumento da idade média da população, o aumento do número de pessoas com doenças crônicas, com fármacos imunossupressores e o aumento do número de procedimentos invasivos realizados têm levado a um aumento da taxa de sepse. Pessoas com mais de 65 anos, particularmente aquelas que têm problemas de saúde, são ainda mais suscetíveis à sepse do que qualquer outro grupo. De acordo com um estudo publicado em 2006, enquanto as pessoas com idade igual ou superior a 65 anos constituem cerca de 12% da população americana, elas constituem 65% dos casos de sepse nos hospitais.

[0831] A septicemia é causada por uma infecção em uma parte do corpo. Esta infecção é tipicamente aguda. Muitos tipos de bactérias podem levar à septicemia. Muitas vezes, a fonte exata da infecção não pode ser determinada. As infecções mais comuns que levam à septicemia são: • infecções do trato urinário • infecções pulmonares, como pneumonia • infecções renais • infecções na área abdominal

[0832] As bactérias dessas infecções entram na corrente sanguínea e se multiplicam rapidamente, causando infecção aguda e sintomas imediatos.

[0833] As pessoas que já se encontram no hospital para outra coisa, como uma cirurgia, correm maior risco de desenvolver septicemia.

Infecções secundárias podem ocorrer durante a internação. Estas infecções são frequentemente mais perigosas porque as bactérias podem já ser resistentes aos antibióticos. Existe um maior risco de desenvolver a septicemia se o indivíduo: • apresenta feridas ou queimaduras graves • é muito jovem ou muito velho • possui um sistema imunológico comprometido, que pode ocorrer a partir de doenças como HIV ou leucemia • tem um cateter urinário ou intravenoso • está em ventilação mecânica • está recebendo tratamentos médicos que debilitam o sistema imune, como quimioterapia ou injeções de esteroides

[0834] Os sintomas da septicemia geralmente começam muito rapidamente. Mesmo nos primeiros estágios da doença, uma pessoa pode parecer muito doente. Eles podem ocorrer depois de uma lesão, cirurgia ou outra infecção localizada (por exemplo, confinada a um local), como pneumonia. Os sintomas iniciais mais comuns são: • calafrios • temperatura corporal elevada (febre) • respiração muito rápida • ritmo cardíaco rápido

[0835] Sintomas mais graves começarão a surgir à medida que a septicemia progride sem tratamento adequado. Estes incluem o seguinte: • confusão ou incapacidade de pensar claramente • náuseas e vômitos • pontos vermelhos que aparecem na pele • volume de urina reduzido • fluxo sanguíneo inadequado (choque)

[0836] A septicemia que começou a afetar os órgãos ou a função tecidual é uma emergência médica aguda. Deve ser tratada rapidamente em um hospital. Muitas pessoas com septicemia são internadas na UTI de um hospital para tratamento e recuperação. Recomenda-se que nunca tenha uma abordagem de "esperar e ver" ou tente tratar o problema em casa. É fundamental chegar imediatamente ao hospital se o paciente apresentar sinais de septicemia.

[0837] A septicemia tem uma série de complicações graves. Estas complicações podem ser fatais se não forem tratadas ou se o tratamento for atrasado por muito tempo. Choque séptico

[0838] Uma complicação da septicemia é uma queda séria da pressão arterial. Isto é chamado choque séptico. As toxinas liberadas pelas bactérias na corrente sanguínea podem causar um fluxo sanguíneo extremamente baixo, o que pode resultar em danos nos órgãos ou tecidos. Choque séptico é uma emergência médica aguda. As pessoas com choque séptico são geralmente cuidadas na unidade de terapia intensiva (UTI) de um hospital. O paciente pode precisar ser colocado em um ventilador, ou aparelho respiratório, se estiver em choque séptico. Síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA).

[0839] Outra complicação da septicemia é a síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA). Esta é uma condição de risco à vida que impede que oxigênio suficiente chegue aos seus pulmões e sangue. Segundo o Instituto Nacional do Coração, Pulmão e Sangue (NHLBI), a SDRA é fatal em cerca de um terço dos casos. Muitas vezes resulta em algum nível de dano pulmonar permanente. Também pode danificar o cérebro, o que pode levar a problemas de memória. Sepse

[0840] A sepse ocorre quando o organismo tem uma forte resposta imune à infecção. Isto leva à inflamação difundida em todo o organismo.

Chama-se sepse grave se levar à falência dos órgãos. As pessoas com doenças crônicas, como o VIH ou o câncer, correm um risco maior de sepse. Isto ocorre porque elas têm um sistema imune enfraquecido e não podem lutar contra a infecção por conta própria. A sepse causa milhões de mortes globalmente a cada ano e é a causa mais comum de morte em pessoas que foram hospitalizadas. Estima-se que a incidência mundial de sepse seja de 18 milhões de casos por ano. Nos Estados Unidos, a sepse afeta aproximadamente 3 em 1.000 pessoas, e a sepse grave contribui para mais de 200.000 mortes por ano. A sepse ocorre em 1 a 2% de todas as hospitalizações e representa até 25% da utilização do leito da UTI.

[0841] O diagnóstico precoce é necessário para administrar adequadamente a sepse, já que o início da terapia rápida é fundamental para reduzir os óbitos por sepse grave. Nas primeiras três horas de suspeita de sepse, estudos diagnósticos devem incluir contagem de leucócitos, dosagem de lactato sérico e obtenção de culturas apropriadas antes de iniciar antibióticos, desde que isso não atrase seu uso por mais de 45 minutos

[0842] As fontes primárias mais comuns de infecção que resultam em sepse são os pulmões, o abdômen e o trato urinário. Tipicamente, 50% de todos os casos de sepse começam como uma infecção nos pulmões.

[0843] A velocidade do tratamento é essencial. Dois conjuntos de hemoculturas (aeróbias e anaeróbias) devem ser tomados sem retardar o início dos antibióticos. Culturas de outros locais, como secreções respiratórias, urina, feridas, líquido cefalorraquidiano e locais de inserção de cateter (in-situ mais de 48 horas) podem ser coletadas se houver suspeita de infecções desses locais. Em sepse grave e choque séptico, antibióticos de amplo espectro (geralmente dois, um antibiótico β-lactâmico com ampla cobertura, ou carbapenem de amplo espectro combinado com fluoroquinolonas, macrolídeos ou aminoglicosídeos) são convencionais. Entretanto, a combinação de antibióticos não é recomendada para o tratamento da sepse sem choque e em pessoas imunocomprometidas, a menos que a combinação seja usada para ampliar a atividade antibacteriana. A administração de antibióticos é importante na determinação da sobrevivência da pessoa. Alguns recomendam que sejam administrados dentro de uma hora após a realização do diagnóstico, afirmando que, por cada hora de atraso na administração de antibióticos, há um aumento associado de 6% na mortalidade.

[0844] A terapia precoce direcionada a um alvo (EGDT) é uma abordagem para o manejo da sepse grave nas primeiras 6 horas após o diagnóstico. É uma abordagem gradual, com o objetivo fisiológico de otimizar a pré-carga cardíaca, a pós-carga e a contratilidade. Inclui a administração precoce de antibióticos.

[0845] A sepse neonatal pode ser difícil de diagnosticar, pois os recém-nascidos podem estar assintomáticos. Se um recém-nascido apresentar sinais e sintomas sugestivos de sepse, os antibióticos são imediatamente iniciados e são alterados para visar um organismo específico identificado por testes diagnósticos ou descontinuados depois que uma causa infecciosa dos sintomas ter sido excluída.

[0846] Cerca de 20 a 35% das pessoas com sepse grave e 30 a 70% das pessoas com choque séptico morrem. A Campanha Sobrevivendo à Sepse (SSC) é uma iniciativa global para reunir organizações profissionais na redução da mortalidade por sepse. Os antibióticos são administrados dentro de duas horas após a admissão/diagnóstico. A cada hora que a antibioticoterapia é negada ao paciente após o início do choque séptico, a chance de sobrevivência do paciente é reduzida em 7,9% (Survivesepsis.org 2005)

[0847] Há, portanto, uma necessidade de tratamento rápido de infecções microbianas agudas, como infecções bacterianas associadas à septicemia, sepse ou choque séptico. Também seria vantajoso se o tratamento fosse duradouro durante muitas horas. O tratamento rápido e duradouro dos micróbios também é desejável para o controle da corrosão microbiologicamente influenciada (CMI) ou da bioincrustação de um substrato em um sistema industrial ou doméstico.

[0848] As infecções bacterianas agudas podem, em determinadas circunstâncias, ser ameaçadoras para a saúde ou mesmo ameaçadoras para a vida. Este pode ser o caso, por exemplo, em pacientes oncológicos, pacientes transplantados ou outros indivíduos. A necessidade do tratamento da infecção bacteriana pode tornar-se urgente e, na verdade, um foco imediato de atenção no atendimento médico. Seria útil fornecer métodos de tratamento de infecções bacterianas patogênicas de uma forma que não prejudique a eficácia do câncer ou de outra terapia separada à qual o paciente também precise responder.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0849] A invenção fornece uma solução usando a ação de corte de nuclease programável de genomas de micróbios, que é diferente do inibidor metabólico e de outros mecanismos de ação usados por beta- lactâmicos e outros antibióticos convencionais para o tratamento de infecções. O corte direcionado fornece morte ou redução ou proliferação seletiva de micróbios para tratar ou prevenir infecções. Além disso, os inventores descobriram surpreendentemente que uma morte substancial (por vários logs) pode ser alcançada muito rapidamente (por exemplo, dentro de 15 minutos) e efeitos sustentáveis podem ser alcançados (por exemplo, por mais de 1 hora, e mesmo cerca de 3 horas após o tratamento ter começado) em algumas modalidades. Assim, a invenção fornece as seguintes configurações. Em uma primeira configuração

[0850] Uma nuclease programável para uso em um método de tratamento de uma infecção microbiana de um indivíduo, em que a infecção microbiana é causada por micróbios de uma primeira espécie ou cepa e a nuclease é programável para cortar um sítio-alvo composto pelos genomas dos micróbios que infectaram o indivíduo, em que os micróbios da primeira espécie ou cepa são mortos, ou o crescimento ou proliferação dos micróbios é reduzido, o método de tratamento compreendendo a exposição do indivíduo à nuclease em que a nuclease é programada para cortar o local-alvo, em que os genomas dos micróbios compreendidos pelo indivíduo são cortados e a infecção microbiana do indivíduo é tratada. Em uma segunda configuração

[0851] Uma pluralidade de vírus (por exemplo, fagos ou fagemídeos para produzir fago) para uso com uma nuclease programável em um método de tratamento de uma infecção microbiana de um indivíduo, em que a infecção microbiana é causada por micróbios de uma primeira espécie ou cepa e a nuclease é programável para cortar um sítio-alvo composto pelos genomas dos micróbios que infectaram o indivíduo, em que os micróbios da primeira espécie ou cepa são mortos, ou o crescimento ou proliferação dos micróbios é reduzido, o método de tratamento que compreende a exposição do indivíduo à nuclease e aos vírus em que a nuclease é programada para cortar o local-alvo, em que os genomas dos micróbios compreendidos pelo indivíduo são cortados e a infecção microbiana do indivíduo é tratada;

[0852] em que cada vírus compreende uma cópia de um ácido nucleico que codifica um RNA para a expressão do RNA no indivíduo, em que o RNA se complexa com a nuclease para programar a nuclease para cortar o local-alvo em micróbios incluídos no indivíduo;

[0853] em que os vírus são capazes de infectar micróbios compostos pelo indivíduo para entregar-lhe o ácido nucleico.

Em uma terceira configuração

[0854] Uma composição compreendendo uma pluralidade de ácidos nucleicos para programar uma nuclease programável em um método de tratamento de uma infecção microbiana de um indivíduo, em que a infecção microbiana é causada por micróbios de uma primeira espécie ou cepa e a nuclease é programável para cortar um sítio-alvo composto pelos genomas dos micróbios que infectaram o indivíduo, em que os micróbios da primeira espécie ou cepa são mortos, ou o crescimento ou proliferação dos micróbios é reduzido, o método de tratamento que compreende a exposição do indivíduo à nuclease e aos ácidos nucleicos em que a nuclease é programada para cortar o local-alvo, em que os genomas dos micróbios compreendidos pelo indivíduo são cortados e a infecção microbiana do indivíduo é tratada;

[0855] em que cada ácido nucleico codifica um RNA para a expressão do RNA no indivíduo, em que o RNA se complexa com a nuclease para programar a nuclease para cortar o local-alvo em micróbios incluídos no indivíduo; Em uma quarta configuração

[0856] Um sistema CRISPR/Cas compreendendo uma nuclease de acordo com a invenção para uso no método de tratamento, em que a nuclease é uma nuclease Cas (por exemplo, uma Cas 3 ou 9) e o sistema compreende um ou mais RNAs guia ou DNA que codifica um ou mais RNAs guia, em que cada RNA guia é capaz de programar a nuclease Cas para cortar um local-alvo composto pelos genomas dos micróbios. Em uma quinta configuração

[0857] Um método para o tratamento de uma infecção microbiana de um indivíduo, em que a infecção microbiana é causada por micróbios de uma primeira espécie ou cepa e a nuclease é programável para cortar um sítio-alvo composto pelos genomas dos micróbios que infectaram o indivíduo, em que os micróbios da primeira espécie ou cepa são mortos, ou o crescimento ou proliferação dos micróbios é reduzido, o método de tratamento compreendendo a exposição do indivíduo à nuclease em que a nuclease é programada para cortar o local-alvo, em que os genomas dos micróbios compreendidos pelo indivíduo são cortados e a infecção microbiana do indivíduo é tratada. Em uma sexta configuração

[0858] Um método para o tratamento de uma infecção microbiana de um indivíduo, em que a infecção microbiana é causada por micróbios de uma primeira espécie ou cepa e a nuclease é programável para cortar um sítio-alvo composto pelos genomas dos micróbios que infectaram o indivíduo, em que os micróbios da primeira espécie ou cepa são mortos, ou o crescimento ou proliferação dos micróbios é reduzido, o método de tratamento compreendendo a exposição do indivíduo à nuclease e uma pluralidade de vírus em que a nuclease é programada para cortar o local-alvo, em que os genomas dos micróbios compreendidos pelo indivíduo são cortados e a infecção microbiana do indivíduo é tratada; em que cada vírus compreende uma cópia de um ácido nucleico que codifica um RNA para a expressão do RNA no indivíduo, em que o RNA se complexa com a nuclease para programar a nuclease para cortar o local-alvo em micróbios incluídos no indivíduo; em que os vírus são capazes de infectar micróbios compostos pelo indivíduo para entregar-lhe o ácido nucleico. Em uma sétima configuração

[0859] Um método para o tratamento de uma infecção microbiana de um indivíduo, em que a infecção microbiana é causada por micróbios de uma primeira espécie ou cepa e a nuclease é programável para cortar um sítio-alvo composto pelos genomas dos micróbios que infectaram o indivíduo, em que os micróbios da primeira espécie ou cepa são mortos, ou o crescimento ou proliferação dos micróbios é reduzido, o método de tratamento compreendendo a exposição do indivíduo à nuclease e uma pluralidade de ácidos nucleicos em que a nuclease é programada para cortar o local-alvo, em que os genomas dos micróbios compreendidos pelo indivíduo são cortados e a infecção microbiana do indivíduo é tratada; em que cada vírus compreende uma cópia de um ácido nucleico que codifica um RNA para a expressão do RNA no indivíduo, em que o RNA se complexa com a nuclease para programar a nuclease para cortar o local-alvo em micróbios incluídos no indivíduo; em que cada ácido nucleico codifica um RNA para a expressão do RNA no indivíduo, em que o RNA se complexa com a nuclease para programar a nuclease para cortar o local-alvo em micróbios incluídos no indivíduo; Em uma oitava configuração

[0860] Uso de uma nuclease, pluralidade de vírus, sistema, RNA guia, DNA ou vetor da invenção, na fabricação de uma composição para a realização de um método de tratamento conforme definido aqui, em que o indivíduo é um organismo diferente de um ser humano ou animal. Em uma nona configuração

[0861] Uso de uma pluralidade, pluralidade de vírus, sistema, RNA guia, DNA ou vetor da invenção para a fabricação de uma composição para realização de um método ex vivo ou in vitro do tratamento de uma infecção microbiana de um substrato, em que a infecção microbiana é causada por micróbios de uma primeira espécie ou cepa e a nuclease é programável para cortar um sítio-alvo composto pelos genomas dos micróbios que infectaram o substrato, em que os micróbios da primeira espécie ou cepa são mortos, ou o crescimento ou proliferação dos micróbios é reduzido, o método de tratamento que compreende a exposição do indivíduo à nuclease em que a nuclease é programada para cortar o local-alvo, em que os genomas dos micróbios compreendidos pelo indivíduo são cortados e a infecção microbiana aguda do substrato é tratada. Em uma décima configuração

[0862] Uso de uma nuclease programável na fabricação de uma composição para realização de um método ex vivo ou in vitro do tratamento de uma infecção microbiana de um substrato, em que a infecção microbiana é causada por micróbios de uma primeira espécie ou cepa e a nuclease é programável para cortar um sítio-alvo composto pelos genomas dos micróbios que infectaram o substrato, em que os micróbios da primeira espécie ou cepa são mortos, ou o crescimento ou proliferação dos micróbios é reduzido, o método de tratamento compreendendo a exposição do indivíduo à nuclease em que a nuclease é programada para cortar o local-alvo, em que os genomas dos micróbios compreendidos pelo indivíduo são cortados e a infecção microbiana do indivíduo é tratada. Em qualquer configuração:

[0863] Por exemplo, a infecção é uma infecção aguda. Por exemplo, a infecção é uma infecção aguda que é tratada rapidamente. Por exemplo, a infecção é tratada rapidamente - por exemplo, o método compreende reduzir a infecção em pelo menos 100 vezes nos primeiros 30 minutos (por exemplo, nos primeiros 15 minutos) do tratamento. Por exemplo, o tratamento é duradouro, por exemplo, a redução da infecção persiste durante, pelo menos, 30 minutos imediatamente após os primeiros 30 minutos do tratamento. Além disso, opcionalmente, uma redução da infecção em pelo menos 100 vezes ou 1000 vezes é mantida durante pelo menos 60 minutos (por exemplo, pelo menos 120 minutos) após o início do tratamento. A exemplificação é fornecida abaixo, o que demonstra de forma surpreendente estes, como uma morte rápida que foi duradoura em cerca de 3 horas após o início do tratamento. Por exemplo, o método melhora a sobrevivência do indivíduo ou melhora as taxas de sobrevivência em humanos ou pacientes humanos que sofrem de infecção pelos micróbios da primeira espécie ou cepa.

[0864] A invenção também fornece uma solução para a necessidade de um tratamento eficaz de infecções bacterianas patogênicas em indivíduos submetidos a um câncer ou outra terapia separada que também deve ser eficaz. Assim, a invenção fornece ainda: Em uma décima primeira configuração

[0865] Um método para tratar uma infecção bacteriana patogênica em um indivíduo humano ou animal causado por bactérias (primeiras bactérias) de uma primeira espécie ou cepa, o método compreendendo matar seletivamente as primeiras bactérias compreendidas pelo indivíduo cortando um local-alvo composto pelos genomas das primeiras bactérias, em que o corte é realizado usando uma nuclease programável que é programada para cortar o local-alvo, em que o indivíduo sofre de uma doença ou condição posterior que não a infecção bacteriana patogênica e o método inclui a administração de uma terapia ao indivíduo para tratar ou prevenir a doença ou condição posterior, em que a nuclease trata a infecção e a terapia é eficaz na presença da nuclease programada para tratar ou prevenir a doença ou condição. Em uma décima segunda configuração

[0866] Um método para tratar uma infecção bacteriana patogênica em um paciente com câncer causado por bactérias (primeiras bactérias) de uma primeira espécie ou cepa, o método compreendendo matar seletivamente as primeiras bactérias compreendidas pelo indivíduo, cortando um local-alvo composto pelos genomas das primeiras bactérias, em que o corte é realizado usando uma nuclease Cas programada pelo RNA guia para cortar o local-alvo, no qual o método inclui a administração de uma imunoterapia ao indivíduo para tratar o câncer no paciente, em que a nuclease trata a infecção e a imunoterapia é eficaz na presença da nuclease programada para tratar o câncer. Em uma décima terceira configuração

[0867] Uma nuclease programável para uso no método da invenção. Em uma décima quarta configuração

[0868] Um sistema CRISPR/Cas compreendendo uma nuclease de acordo com a 13a configuração para uso no método da 11 a ou 12 a configuração, em que a nuclease é uma nuclease Cas (por exemplo, uma Cas 3 ou 9) e o sistema compreende um ou mais RNAs guia (gRNAs) ou DNA que codifica um ou mais RNAs guia, em que cada RNA guia é capaz de programar a nuclease Cas para cortar um local-alvo composto pelos genomas das primeiras bactérias. Em uma décima quinta configuração

[0869] Um RNA guia ou um DNA que codifica um RNA guia para uso no sistema ou método de tratamento de uma infecção bacteriana patogênica. Em uma décima sexta configuração

[0870] Um vetor do ácido nucleico compreendendo o RNA guia ou DNA. Em uma décima sétima configuração

[0871] Uma composição farmacêutica compreendendo um primeiro vetor do ácido nucleico (ou uma pluralidade dos mesmos) que codifica a nuclease e um segundo vector do ácido nucleico (ou uma pluralidade dos mesmos) que codifica o RNA guia.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0872] Figura 1. Curvas de tempo-morte para a cepa de Escherichia coli (EHEC) ATCC43888, abrigando o sistema CGV. (a) indução do CRISPR matou 99,98% da população em 30 minutos (linha preta). Crescimento na ausência de indução é apresentado em linhas tracejadas. O CRISPR foi induzido no ponto do tempo 0 e monitorado até 60 minutos. (b) séries de diluição (101–106) de pontos de gota (5 μl) em placas de ágar LB de E. coli ATCC43888 que abrigam o sistema CGV após 30 minutos de indução.

[0873] Figura 2. Morte por CRISPR da cepa alvo da Escherichia coli (EHEC) ATCC43888 em larvas de Galleria mellonella. Larvas de G. mellonella foram administradas com injeções de bactérias atrás da pata falsa esquerda final. Cerca de 1h após a injeção, os indutores de CRISPR foram administrados atrás da pata falsa direita final. As larvas foram incubadas a 37 °C por 2h e sacrificadas. As bactérias de controle que transportam um plasmídeo de RNA guia único fora do alvo também foram injetadas no grupo controle.

[0874] Figura 3. Curvas de morte por CRISPR da Escherichia coli (EHEC) ATCC43888 em Galleria mellonella. Larvas de G. mellonella foram administradas com injeções de bactérias atrás da pata falsa esquerda final. Cerca de 1h após a injeção, os indutores de CRISPR foram administrados atrás da pata falsa direita final. As larvas foram incubadas a 37 °C e sacrificadas 0, 1 e 2h após a indução.

[0875] Figura 4. Curvas de sobrevida de Kaplan-Meier de larvas de Galleria mellonella infectadas com Escherichia coli (EHE) ATCC43888. A indução de CRISPR melhora significativamente a sobrevivência das larvas (linha preta) em comparação com o controle fora do alvo que transporta um plasmídeo de RNA guia único fora do alvo (linha tracejada).

[0876] Figura 5. Curvas de tempo-morte para Escherichia coli Nissle 1917, abrigando o sistema CGV direcionando pks. (a) indução do CRISPR matou 99,98% da população em 15 minutos (linha preta). Crescimento na ausência de indução é apresentado em linhas tracejadas. O CRISPR foi induzido no ponto do tempo 0 e monitorado por mais de 3 h. (b) séries de diluição (101–106) de pontos de gota (5 μl) em placas de ágar LB de E. coli Nissle 1917 abrigando o sistema CGV após 15 minutos de indução.

[0877] Figura 6. Curvas de tempo-morte para Escherichia coli Nissle 1917, abrigando o sistema CGV direcionando yapH. (a) indução do CRISPR matou 99,98% da população em 15 minutos (linha preta). Crescimento na ausência de indução é apresentado em linhas tracejadas. O CRISPR foi induzido no ponto do tempo 0 e monitorado por mais de 3 h. (b) séries de diluição (101–106) de pontos de gota (5 μl) em placas de ágar LB de E. coli Nissle 1917 abrigando o sistema CGV após 15 minutos de indução.

[0878] Figura 7: Morte completa de C. difficile transconjugal. A morte de precisão completa de Clostridium difficile usando uma matriz CRISPR de codificação de gRNA que foi fornecida a partir de uma espécie bacteriana carreadora probiótica por plasmídeos conjugados como vetores é mostrada. Uma bactéria carreadora (cepa doadora de E. coli contendo os vetores foi unida com Clostridium difficile que foi morta após a entrega da matriz projetada. Isto aproveitou a maquinaria Cas3 endógena da Clostridium difficile. Foi alcançada uma morte de 100% das células de Clostridium difficile, que é mostrada nesta figura.

[0879] Figura 8: O tratamento com antibióticos durante a terapia ICI tem resultados fatais: Curva de Kaplan Meier para sobrevida geral de uma coorte de validação do Centro de Câncer Memorial Sloan Ketterin, incluindo n=239 pacientes com NSCLC avançado tratados com mAb anti-PD-L1/anti-PD-1 que receberam antibióticos (ATB) (ATB,n=68) ou não (sem ATB, n=171) dois meses antes da injeção do bloqueio do ponto de controle imune. Houve sobrevida média geral de 21,9 meses na ausência de tratamento com antibióticos, em comparação com sobrevida geral de 9,8 meses com tratamento com antibióticos. Assim, a sobrevida global mediana em pacientes tratados com antibióticos clássicos é < 50% (ou > 12 meses mais curta) da dos pacientes que não recebem tratamento com antibióticos.

[0880] Figuras 9A e 9B: o micrótomo intestinal modula a eficácia da inibição anti-PD-1 em pacientes com melanoma (de Gopalakrishnan et al, Science 2018, 359, 97-103)

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0881] A abordagem da presente invenção é diferente das abordagens antibióticas convencionais. A presente invenção utiliza o corte direcionado de genomas microbianos usando nucleases programadas, enquanto os antibióticos convencionais dependem de processos metabólicos e ciclos de replicação de células – e a inibição desses – para sua atividade. Ao concentrar-se em vez de cortar nuclease, a invenção consegue surpreendentemente uma morte microbiana muito rápida e eficiente que também é notavelmente durável. Isto é demonstrado em experimentos abaixo com diferentes micróbios, diferentes nucleases e diferentes abordagens de administração. Tipicamente, a morte de 99-100% foi observada surpreendentemente muitas vezes e a morte de 3-4 logs foi conseguida muito rapidamente e com duração durável.

[0882] A invenção fornece métodos para tratamento ou prevenção de infecções microbianas (por exemplo, bacterianas) e meios para executar estes métodos. Em particular, torna-se possível o tratamento de infecções que necessitem de terapia rápida, como no tratamento de condições agudas como septicemia, sepse, SRIS ou choque séptico. Como explicado aqui, uma resposta rápida é vital para lidar com a infecção microbiana em muitos ambientes. A velocidade é essencial para muitos cenários de infecção, como infecções agudas que requerem admissão hospitalar. Os benefícios da invenção podem ser uma ou mais das seguintes: redução da propagação, gravidade ou progressão da infecção no indivíduo; redução do desenvolvimento, gravidade ou progressão dos sintomas da infecção (por exemplo, sepse ou choque séptico); e um aumento na probabilidade de sobrevivência em pacientes humanos ou animais.

[0883] A invenção usa o corte de nuclease programável de genomas de micróbios. O corte direcionado proporciona a morte ou redução seletiva de micróbios para o crescimento ou a proliferação no tratamento ou prevenção de infecções, em oposição à morte microbiana de mais amplo espectro de várias espécies diferentes, conforme visto com antibióticos convencionais. A morte seletiva é vantajosa para deixar micróbios benéficos não direcionados pelo tratamento, o que pode ser benéfico para o paciente. Além disso, os inventores descobriram surpreendentemente que uma morte substancial (por vários logs) pode ser alcançada muito rapidamente (por exemplo, dentro de 15 minutos) e efeitos sustentáveis podem ser alcançados (por exemplo, por mais de 1 hora) em algumas modalidades. Tal como exemplificado abaixo, os inventores poderiam surpreendentemente conseguir uma morte rápida e duradoura durante cerca de 2-3 horas.

[0884] Assim, a invenção fornece os seguintes aspectos:

[0885] Uma nuclease programável para uso em um método de tratamento de uma infecção microbiana (por exemplo, uma infecção bacteriana aguda) de um indivíduo, em que a infecção microbiana é causada por micróbios de uma primeira espécie ou cepa e a nuclease é programável para cortar um sítio-alvo composto pelos genomas dos micróbios que infectaram o indivíduo, em que os micróbios da primeira espécie ou cepa são mortos, ou o crescimento ou proliferação dos micróbios é reduzido, o método de tratamento compreendendo a exposição do indivíduo à nuclease em que a nuclease é programada para cortar o local-alvo, em que os genomas dos micróbios compreendidos pelo indivíduo são cortados e a infecção microbiana do indivíduo é tratada.

[0886] Outro aspecto fornece: Uma nuclease programável para uso em um método de tratamento rápido de uma infecção microbiana aguda (por exemplo, bacteriana) de um indivíduo, em que a infecção microbiana é causada por micróbios de uma primeira espécie ou cepa e a nuclease é programável para cortar um sítio-alvo composto pelos genomas dos micróbios que infectaram o indivíduo, em que os micróbios da primeira espécie ou cepa são mortos, ou o crescimento ou proliferação dos micróbios é reduzido, o método de tratamento compreendendo a exposição do indivíduo à nuclease em que a nuclease é programada para cortar o local-alvo, em que os genomas dos micróbios compreendidos pelo indivíduo são cortados e a infecção microbiana aguda do indivíduo é tratada rapidamente.

[0887] Outro aspecto fornece: Uma nuclease programável para uso em um método de tratamento de uma infecção microbiana (p.ex. bacteriana) de um indivíduo, em que a infecção microbiana é causada por micróbios de uma primeira espécie ou cepa e a nuclease é programável para cortar um sítio-alvo composto pelos genomas dos micróbios que infectaram o indivíduo, em que os micróbios da primeira espécie ou cepa são mortos, ou o crescimento ou proliferação dos micróbios é reduzido, o método de tratamento compreendendo a exposição do indivíduo à nuclease e a um ácido nucleico que programa a nuclease para reconhecer ou cortar o local-alvo, em que os genomas dos micróbios compreendidos pelo indivíduo são cortados e a infecção microbiana do indivíduo é tratada.

[0888] Outro aspecto fornece: Uma nuclease programável para uso em um método de tratamento rápido de uma infecção microbiana aguda (por exemplo, bacteriana) de um indivíduo, em que a infecção microbiana é causada por micróbios de uma primeira espécie ou cepa e a nuclease é programável para cortar um sítio-alvo composto pelos genomas dos micróbios que infectaram o indivíduo, em que os micróbios da primeira espécie ou cepa são mortos, ou o crescimento ou proliferação dos micróbios é reduzido, o método de tratamento compreendendo a exposição do indivíduo à nuclease e ao ácido nucleico que programa a nuclease para reconhecer e cortar o local-alvo, em que os genomas dos micróbios compreendidos pelo indivíduo são cortados e a infecção microbiana aguda do indivíduo é tratada rapidamente.

[0889] Outro aspecto fornece: Uma nuclease programável para uso em um método de tratamento durável de uma infecção microbiana (p.ex. Bacteriana) de um indivíduo, em que a infecção microbiana é causada por micróbios de uma primeira espécie ou cepa e a nuclease é programável para cortar um sítio-alvo composto pelos genomas dos micróbios que infectaram o indivíduo, em que os micróbios da primeira espécie ou cepa são duravelmente mortos, ou o crescimento ou proliferação dos micróbios é reduzido, o método de tratamento compreendendo a exposição do indivíduo à nuclease em que a nuclease é programada para cortar o local-alvo, em que os genomas dos micróbios compreendidos pelo indivíduo são cortados e a infecção microbiana do indivíduo é tratada.

[0890] Outro aspecto fornece: Uma nuclease programável para uso em um método de tratamento durável de uma infecção microbiana (p.ex. bacteriana) de um indivíduo, em que a infecção microbiana é causada por micróbios de uma primeira espécie ou cepa e a nuclease é programável para cortar um sítio-alvo composto pelos genomas dos micróbios que infectaram o indivíduo, em que os micróbios da primeira espécie ou cepa são duravelmente mortos, ou o crescimento ou proliferação dos micróbios é reduzido, o método de tratamento compreendendo a exposição do indivíduo à nuclease e a um ácido nucleico que programa a nuclease para reconhecer ou cortar o local- alvo, em que os genomas dos micróbios compreendidos pelo indivíduo são cortados e a infecção microbiana do indivíduo é tratada.

[0891] Outro aspecto fornece: Uma nuclease programável para uso em um método de tratamento durável de uma infecção microbiana aguda (por exemplo, bacteriana) de um indivíduo, em que a infecção microbiana é causada por micróbios de uma primeira espécie ou cepa e a nuclease é programável para cortar um sítio-alvo composto pelos genomas dos micróbios que infectaram o indivíduo, em que os micróbios da primeira espécie ou cepa são duravelmente mortos, ou o crescimento ou proliferação dos micróbios é reduzido, o método de tratamento compreendendo a exposição do indivíduo à nuclease e ao ácido nucleico que programa a nuclease para reconhecer e cortar o local-alvo, em que os genomas dos micróbios compreendidos pelo indivíduo são cortados e a infecção microbiana aguda do indivíduo é tratada.

[0892] Surpreendentemente, como exemplificado abaixo, foi observado um efeito duradouro de vários logs (por exemplo, 3 ou 4 logs) usando uma nuclease (em oposição às médias convencionais para a morte por antibióticos convencionais) cerca de 3 horas após a primeira exposição de bactérias com uma nuclease programada. Este aspecto da invenção, portanto, possibilita regimes de dosagem para exposição menos frequente a uma nuclease programada (ou seja, administração menos frequente de uma nuclease programada, nuclease programável e/ou ácido nucleico para programação da nuclease). Por exemplo, um Cas e um gRNA (ou DNA que codifica um gRNA) para a programação da nuclease são administrados com uma nuclease programável (por exemplo, uma Cas 9 ou Cas 3) ao indivíduo pela primeira vez (T1) e pela segunda vez (T2); ou um gRNA (ou DNA que codifica um gRNA) é administrado em T1 e T2 para programar uma nuclease Cas endógena (por exemplo, uma Cas 9 ou Cas 3) de bactérias da referida primeira espécie ou cepa, em que a Cas endógena programada corta os genomas das bactérias para matar as bactérias ou reduzir o crescimento ou proliferação, tratando assim a infecção. Esta dosagem menos frequente é conveniente para o médico de saúde e para o paciente, bem como proporciona uma terapia econômica. Assim, opcionalmente, a nuclease e/ou o ácido nucleico são administrados ao indivíduo em T1 e T2, em que T2 é pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 24 horas após T1. Por exemplo, T2 é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 24 horas após T1. Por exemplo, T2 é 2-7 horas após T1. Por exemplo, T2 é 1 hora após T1. Por exemplo, T2 é 2 horas após T1. Por exemplo, T2 é 3 horas após T1. Por exemplo, T2 é 4 horas após T1. Por exemplo, T2 é 5 horas após T1.

[0893] Opcionalmente, a nuclease (por exemplo, nuclease programada) e/ou um ácido nucleico que programa a nuclease para reconhecer e cortar o local-alvo é administrado ao indivíduo em T1 e T2, onde T2 é pelo menos 1 hora (por exemplo, 1, 1,5, 2, 2,5 ou 3 horas) após T1.

[0894] Outro aspecto fornece: Uma nuclease Cas para uso em um método de tratamento de uma infecção microbiana (por exemplo, bacteriana) de um indivíduo, em que a infecção microbiana é causada por micróbios de uma primeira espécie ou cepa e a nuclease é programável com um RNA guia (gRNA) para cortar um local-alvo composto pelos genomas dos micróbios que infectaram o indivíduo, onde os micróbios da primeira espécie ou cepa são mortos, ou o crescimento ou proliferação dos micróbios é reduzido, o método de tratamento compreendendo administrar ao indivíduo o dito ácido nucleico, no qual o ácido nucleico é o gRNA ou um DNA que codifica o gRNA, programando assim a nuclease para reconhecer e cortar o local- alvo dos micróbios compreendendo o indivíduo, através do qual os genomas dos micróbios são cortados e a infecção microbiana do indivíduo é tratada, em que o método compreende administrar o ácido nucleico ao indivíduo pela primeira vez (T1) e pela segunda vez (T2), em que o indivíduo é exposto a nuclease programada em T1 e T2, e em que T2 não é inferior a 1 hora após T1.

[0895] Opcionalmente, T2 não é menor que 2 horas após T1; opcionalmente, T2 não é menor que 3 horas após T1; opcionalmente,

T2 não é menor que 4 horas após T1; opcionalmente, T2 não é menor que 5 horas após T1; opcionalmente, T2 não é menor que 6 horas após T1; opcionalmente, T2 não é menor que 7 horas após T1; opcionalmente, T2 não é menor que 8 horas após T1; opcionalmente, T2 não é menor que 9 horas após T1; opcionalmente, T2 não é menor que 10 horas após T1; opcionalmente, T2 não é menor que 11 horas após T1; opcionalmente, T2 não é menor que 12 horas após T1; opcionalmente, T2 não é menor que 13 horas após T1; opcionalmente, T2 não é menor que 14 horas após T1; ou opcionalmente, T2 não é menor que 24 horas após T1. Adicionalmente ou alternativamente: Opcionalmente, T2 não é maior que 7 horas após T1; opcionalmente, T2 não é maior que 12 horas após T1; opcionalmente, T2 não é maior que 24 horas após T1; opcionalmente, T2 é 2-7 horas após T1; opcionalmente, T2 é 24 horas após T1; opcionalmente, T2 é 7 horas após T1; opcionalmente, T2 é 6 horas após T1; opcionalmente, T2 é 5 horas após T1; opcionalmente, T2 é 4 horas após T1; opcionalmente, T2 é 3 horas após T1; opcionalmente, T2 é 2 horas após T1; opcionalmente, T2 é 1 hora após T1. Por exemplo, T2 é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 24 horas após T1. Por exemplo, T2 é 1-7 horas após T1; ou T2 é 2-7 horas após T1; ou T2 é 3-7 horas após T1; ou T2 é 4-7 horas após T1; ou T2 é 5-7 horas após T1; ou T2 é 6-7 horas após T1.

[0896] Opcionalmente, o método compreende reduzir a infecção em pelo menos 100 vezes nos primeiros 30 minutos (por exemplo, nos primeiros 15 minutos) do tratamento. Opcionalmente, o método compreende reduzir a infecção em pelo menos 1000 vezes nos primeiros 30 minutos (por exemplo, nos primeiros 15 minutos) do tratamento. Opcionalmente, o método compreende reduzir a infecção em pelo menos 10000 vezes nos primeiros 30 minutos (por exemplo, nos primeiros 15 minutos) do tratamento.

[0897] Opcionalmente, o método compreende reduzir a infecção de modo que a redução na infecção persiste por 30 minutos imediatamente após os primeiros 30 minutos do tratamento. Opcionalmente, o método compreende reduzir a infecção de modo que uma redução na infecção em pelo menos 100 vezes persiste por 30 minutos imediatamente após os primeiros 30 minutos do tratamento. Opcionalmente, o método compreende reduzir a infecção de modo que uma redução na infecção em pelo menos 1000 vezes persiste por 30 minutos imediatamente após os primeiros 30 minutos do tratamento. Opcionalmente, o método compreende reduzir a infecção de modo que uma redução na infecção em pelo menos 10000 vezes persiste por 30 minutos imediatamente após os primeiros 30 minutos do tratamento.

[0898] Opcionalmente, o método compreende reduzir a infecção em pelo menos 100 vezes pelos primeiros 30 minutos (p.ex., pelos primeiros 15 minutos) do tratamento; e em que uma redução na infecção em pelo menos 100 vezes persiste por 30 minutos imediatamente após os primeiros 30 minutos do tratamento. Opcionalmente, o método compreende reduzir a infecção em pelo menos 1000 vezes pelos primeiros 30 minutos (p.ex., pelos primeiros 15 minutos) do tratamento; e em que uma redução na infecção em pelo menos 1000 vezes persiste por 30 minutos imediatamente após os primeiros 30 minutos do tratamento. Opcionalmente, o método compreende reduzir a infecção em pelo menos 10000 vezes pelos primeiros 30 minutos (p.ex., pelos primeiros 15 minutos) do tratamento; e em que uma redução na infecção em pelo menos 10000 vezes persiste por 30 minutos imediatamente após os primeiros 30 minutos do tratamento.

[0899] Opcionalmente, o método compreende manter a redução da infecção em pelo menos 100 vezes por pelo menos 60 minutos (por exemplo, pelo menos 120, 145 ou 180 minutos) após expor o indivíduo à nuclease programada. Opcionalmente, uma redução da infecção em pelo menos 100 vezes é mantida durante pelo menos 60 minutos (por exemplo, pelo menos 120, 145 ou 180 minutos) após a exposição do indivíduo à nuclease programada. Opcionalmente, o método compreende manter a redução da infecção em pelo menos 1000 vezes por pelo menos 60 minutos (por exemplo, pelo menos 120, 145 ou 180 minutos) após expor o indivíduo à nuclease programada. Opcionalmente, uma redução da infecção em pelo menos 1000 vezes é mantida durante pelo menos 60 minutos (por exemplo, pelo menos 120, 145 ou 180 minutos) após a exposição do indivíduo à nuclease programada. Opcionalmente, o método compreende manter a redução da infecção em pelo menos 10000 vezes por pelo menos 60 minutos (por exemplo, pelo menos 120, 145 ou 180 minutos) após expor o indivíduo à nuclease programada. Opcionalmente, uma redução da infecção em pelo menos 10000 vezes é mantida durante pelo menos 60 minutos (por exemplo, pelo menos 120, 145 ou 180 minutos) após a exposição do indivíduo à nuclease programada.

[0900] Opcionalmente, o método compreende reduzir a infecção em pelo menos 100 vezes pelos primeiros 30 minutos (p.ex., pelos primeiros 15 minutos) do tratamento; e em que a redução da infecção em pelo menos 100 vezes é mantida por pelo menos 60 minutos (p.ex., pelo menos 120, 145 ou 180 minutos) após a exposição do indivíduo à nuclease programada. Opcionalmente, o método compreende reduzir a infecção em pelo menos 1000 vezes pelos primeiros 30 minutos (p.ex., pelos primeiros 15 minutos) do tratamento; e em que a redução da infecção em pelo menos 1000 vezes é mantida por pelo menos 60 minutos (p.ex., pelo menos 120, 145 ou 180 minutos) após a exposição do indivíduo à nuclease programada. Opcionalmente, o método compreende reduzir a infecção em pelo menos 10000 vezes pelos primeiros 30 minutos (p.ex., pelos primeiros 15 minutos) do tratamento; e em que a redução da infecção em pelo menos 10000 vezes é mantida por pelo menos 60 minutos (p.ex., pelo menos 120, 145 ou 180 minutos) após a exposição do indivíduo à nuclease programada.

[0901] Opcionalmente, o método compreende reduzir a infecção em pelo menos 10000 vezes pelos primeiros 15 minutos do tratamento; e em que a redução da infecção em pelo menos 10000 vezes é mantida por pelo menos 45 minutos após a exposição do indivíduo à nuclease programada. Isto é exemplificado abaixo.

[0902] Em um exemplo, a infecção é duravelmente tratada, onde uma redução da infecção em pelo menos 100 vezes é mantida durante pelo menos 60 minutos (por exemplo, pelo menos 120, 145 ou 180 minutos) após o começo do tratamento. Em um exemplo, a infecção é duravelmente tratada, onde uma redução da infecção em pelo menos 1000 vezes é mantida durante pelo menos 60 minutos (por exemplo, pelo menos 120, 145 ou 180 minutos) após o começo do tratamento. Em um exemplo, a infecção é duravelmente tratada, onde uma redução da infecção em pelo menos 10000 vezes é mantida durante pelo menos 60 minutos (por exemplo, pelo menos 120, 145 ou 180 minutos) após o começo do tratamento.

[0903] Opcionalmente, a infecção é reduzida pelo menos 100.000 vezes nos primeiros 30 ou 45 minutos do tratamento. Opcionalmente, a infecção é reduzida pelo menos 100.000 vezes nos primeiros 30 ou 45 minutos do tratamento e a redução é mantida até o 60º minuto do tratamento.

[0904] Opcionalmente, a infecção é reduzida pelo menos 1000,000 vezes nos primeiros 30 ou 45 minutos do tratamento. Opcionalmente, a infecção é reduzida pelo menos 1000,000 vezes nos primeiros 30 ou 45 minutos do tratamento e a redução é mantida até o 60º minuto do tratamento.

[0905] Opcionalmente, a infecção é reduzida pelo menos 100 vezes nos primeiros 15 minutos do tratamento. Opcionalmente, a infecção é reduzida pelo menos 1000 vezes nos primeiros 15 minutos do tratamento. Opcionalmente, a infecção é reduzida pelo menos 100 vezes nos primeiros 15 minutos do tratamento e pelo menos 1.000 vezes nos primeiros 30 minutos do tratamento.

[0906] Por exemplo, a redução é mantida durante, pelo menos, mais 15 minutos, por exemplo, a infecção é reduzida pelo menos 100 vezes ou pelo menos 1000 vezes nos primeiros 15 minutos do tratamento e a redução é mantida de 15 a 30 minutos ou 15 a 45 minutos do tratamento ou 15 a 60 minutos do tratamento.

[0907] Por exemplo, a infecção é reduzida pelo menos 100 vezes ou pelo menos 1000 vezes ou pelo menos 10.000 vezes nos primeiros 15 minutos do tratamento nos primeiros 15 minutos e a redução é mantida durante o período de 15 a 30 minutos ou 15 a 45 minutos do tratamento.

[0908] Opcionalmente, o método compreende reduzir a infecção em pelo menos 100 vezes nos primeiros 30 minutos (por exemplo, nos primeiros 15 minutos) do tratamento.

[0909] Opcionalmente, o método compreende reduzir a infecção em pelo menos 1000 vezes nos primeiros 30 minutos (por exemplo, nos primeiros 15 minutos) do tratamento.

[0910] Opcionalmente, o método compreende reduzir a infecção em pelo menos 10000 vezes nos primeiros 30 minutos (por exemplo, nos primeiros 15 minutos) do tratamento.

[0911] Opcionalmente, o método compreende na redução da infecção de forma que a redução da infecção persista por 30 minutos imediatamente após os primeiros 30 minutos do tratamento, por exemplo, a redução pode persistir por pelo menos 60 minutos após os primeiros 30 minutos do tratamento. Se o tratamento for administrado no tempo zero (T0), então a redução da infecção pode estar presente aos 60 minutos contados após T0, e de fato pode persistir após esses

60 minutos. Na figura 1 (a), 5 (a) e 6 (a), por exemplo, a redução é observada aos 60-180 minutos após T0. Opcionalmente, a redução na infecção persiste por pelo menos 30 minutos após os primeiros 30 minutos do tratamento.

[0912] Em um exemplo, a infecção é reduzida em pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99%, por exemplo, nos primeiros 15 minutos do tratamento. Em um exemplo, a infecção é reduzida em pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99%, por exemplo, nos primeiros 30 minutos do tratamento.

[0913] Para determinar a morte ou a redução do crescimento ou da proliferação dos micróbios-alvo, pode-se, por exemplo, determinar a diferença no número de micróbios da primeira espécie ou cepa em (i) uma amostra retirada do indivíduo (por exemplo, uma amostra de sangue, intestino ou de folha) imediatamente antes do início do tratamento e (ii) uma amostra (do mesmo tipo que a amostra de (i), por exemplo, sangue, intestino ou folha, respectivamente) retirada do indivíduo aos 30 minutos do tratamento. Por exemplo, se os micróbios forem bactérias, as amostras podem ser avaliadas quanto à diferença entre as unidades formadoras de colônias (UFC)/ml de amostra, por exemplo, quando as amostras tiverem sido plaqueadas em ágar nas respectivas placas de Petri e incubadas em condições idênticas. Outro exemplo pode usar a contagem microscópica de micróbios em amostras ou outros métodos de rotina que sejam conhecidos do destinatário qualificado.

[0914] Em um exemplo, pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de morte dos micróbios é alcançada nos primeiros 30, 60, 90 ou 120 minutos (por exemplo, nos primeiros 30 minutos; ou nos primeiros 120 minutos) do tratamento. Por exemplo, em que o indivíduo é um ser humano ou animal, a morte é determinada comparando a prevalência (por exemplo, por contagem de colônias padrão em uma placa de ágar) dos micróbios (por exemplo, bactérias) em uma amostra de sangue colhida imediatamente antes do início do tratamento versus uma amostra colhida após os primeiros 15 ou 30 minutos do tratamento. Em um exemplo, pelo menos 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de morte dos micróbios é alcançada nas primeiras 0,5, 1 ou 2 horas de tratamento. Em um exemplo, pelo menos 99% de morte dos micróbios é alcançada nos primeiros 30 minutos do tratamento. Em um exemplo, pelo menos 99% de morte dos micróbios é alcançada nas primeiras 2 horas do tratamento. Em um exemplo, 100% de morte é alcançada. Estes são exemplificados abaixo. Em uma modalidade, menos de 100% dos micróbios são mortos.

[0915] Exemplos trabalhados de morte em bactérias são mostrados abaixo. Surpreendentemente, usando uma nuclease programada para direcionar as bactérias de escolha, o corte específico resultou na rápida morte das bactérias alvo – pelo menos 3 ou 4 logs de mortes (ou seja, 1000 ou 10.000 vezes de morte) poderia ser observado em espaços muito curtos de tempo e surpreendentemente estes foram sustentados por pelo menos uma hora. Opcionalmente, a infecção é reduzida pelo menos 1000 vezes nos primeiros 15, 30 ou 45 minutos do tratamento. Opcionalmente, a infecção é reduzida pelo menos 1000 vezes nos primeiros 15, 30 ou 45 minutos do tratamento e a redução é mantida até o 60, 120 ou 180 minuto do tratamento. Opcionalmente, a infecção é reduzida pelo menos 10000 vezes nos primeiros 15, 30 ou 45 minutos do tratamento. Opcionalmente, a infecção é reduzida pelo menos 10000 vezes nos primeiros 15, 30 ou 45 minutos do tratamento e a redução é mantida até o 60, 120 ou 180 minuto do tratamento. Ver, por exemplo, a exemplificação na Fig 5a.

[0916] Em um exemplo, 100% de morte é alcançada em 24 horas após o início do tratamento.

[0917] Em um exemplo, a infecção é reduzida em pelo menos 1000 vezes durante 2 horas ou mais (por exemplo, durante 2-3 horas). Opcionalmente, a infecção também é reduzida em pelo menos 1000 vezes nos primeiros 15 ou 13 minutos do tratamento.

[0918] Em um exemplo, a infecção é reduzida em pelo menos 10000 vezes durante 2 horas ou mais (por exemplo, durante 2-3 horas). Opcionalmente, a infecção também é reduzida em pelo menos 10000 vezes nos primeiros 15 ou 13 minutos do tratamento.

[0919] Em um exemplo, a infecção é reduzida em pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% durante 1 hora, ou durante 1 hora ou mais, ou durante 2 horas ou mais (por exemplo, durante 2-3 horas). Opcionalmente, a infecção é reduzida em pelo menos 90% durante 1 hora; ou durante 1 hora ou mais; ou durante 2 horas ou mais (por exemplo, durante 2-3 horas) e, opcionalmente, nos primeiros 30 minutos (por exemplo, nos primeiros 15 minutos) do tratamento. Opcionalmente, a infecção é reduzida em pelo menos 90% por 1h ou mais e nos primeiros 30 minutos (por exemplo, nos primeiros 15 minutos) do tratamento. Opcionalmente, a infecção é reduzida em pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% nos primeiros 15 ou 13 minutos do tratamento. Opcionalmente, a infecção é reduzida em pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% nos primeiros 15 ou 13 minutos do tratamento; e em que a redução é mantida por 1 hora ou mais (por exemplo, durante 2 horas ou mais; ou durante 3 horas ou mais; ou durante cerca de 2 horas; ou durante 2 horas; ou durante cerca de 3 horas; ou durante 3 horas). Exemplificação abaixo é fornecida, onde as bactérias são E. coli.

[0920] Opcionalmente, o indivíduo é um ser humano ou animal e os micróbios são bactérias (por exemplo, E coli ou C dificile), em que a infecção sanguínea do indivíduo pelas bactérias é reduzida pelo menos 100 vezes nos primeiros 30 minutos (por exemplo, nos primeiros 15 minutos) do tratamento. Opcionalmente, o indivíduo é um ser humano ou animal e os micróbios são bactérias (por exemplo, E coli ou C dificile), em que a infecção sanguínea do indivíduo pelas bactérias é reduzida pelo menos 1000 vezes nos primeiros 30 minutos (por exemplo, nos primeiros 15 minutos) do tratamento. Opcionalmente, o indivíduo é um ser humano ou animal e os micróbios são bactérias (por exemplo, E coli ou C dificile), em que a infecção sanguínea do indivíduo pelas bactérias é reduzida pelo menos 10,00 vezes nos primeiros 30 minutos (por exemplo, nos primeiros 15 minutos) do tratamento. Opcionalmente, as E coli são E coli EHEC.

[0921] Opcionalmente, a nuclease programada (por exemplo, uma Cas9 ou Cas3) é capaz de cortar um local-alvo composto por E. coli (EHEC) ATCC43888. Opcionalmente, a nuclease programada (por exemplo, uma Cas9 ou Cas3) é capaz de cortar um local-alvo composto por E. coli Nissle. Opcionalmente, a invenção mata a E coli e/ou Klebsiella (por exemplo, K pneumoniae) que produzem uma beta- lactamase de espectro estendido (ESBL). Assim, a invenção pode ser para tratar ou prevenir uma infecção bacteriana ESBL em um indivíduo, por exemplo, um ser humano. Por exemplo, a infecção é uma infecção do trato urinário (ITU) ou septicemia. Em um exemplo, as bactérias são resistentes a uma mais ou a todas as cefalosporinas, penicilinas, fluoroquinolonas, trimetoprim e tetraciclina. Em um exemplo, as bactérias são E. coli ou Klebsiella resistente a carbapenem.

[0922] Opcionalmente, o sangue do indivíduo está infectado com 107 a 1012 UFC/ml (por exemplo, de 107 a 1011, de 107 a 1010, de 107 a 109 ou de 107 a 108 UFC/ml) das bactérias imediatamente antes do tratamento.

[0923] O exemplo trabalhado abaixo mostra a sobrevivência melhorada usando o método da invenção em um modelo in vivo. Assim, em um exemplo, o método da invenção é melhorar a sobrevivência do indivíduo tratando a infecção microbiana aguda de um indivíduo. Em um exemplo, a nuclease programada aqui é capaz de realizar a morte de bactérias da primeira espécie ou cepa no modelo in vivo da infecção de larvas de Galleria mellonella.

[0924] A nuclease pode ser, por exemplo, uma DNase (por exemplo, uma Cpf1, Cas9 ou Cas3) ou uma RNase (por exemplo, Cas13b). Em um exemplo, a nuclease é uma nuclease de Classe 1. Em um exemplo, a nuclease é uma nuclease de Classe 2. Em um exemplo, a nuclease é uma nuclease do tipo I, por exemplo, uma nuclease do Tipo IA, IB, IC, ID, IE, IF ou IU. Em um exemplo, a nuclease é uma nuclease do Tipo II, por exemplo, uma nuclease do Tipo IIA, IB ou IC, por exemplo, uma Cas9, spCas9 ou saCas9. Em um exemplo, a nuclease é uma nuclease Tipo III, por exemplo, uma nuclease Tipo IIIA, IIIB, IIIC ou IIID. Em um exemplo, a nuclease é uma nuclease do Tipo IV, por exemplo, uma nuclease do Tipo IVA ou IVB. Em um exemplo, a nuclease é uma nuclease do Tipo V, por exemplo, uma cpf1. Em um exemplo, a nuclease é uma nuclease Tipo VI, por exemplo, uma Cas13, p.ex., uma Cas13a, b, c ou d.

[0925] Por exemplo, a nuclease é uma Cas3 Tipo IA.

[0926] Por exemplo, a nuclease é uma Cas3 Tipo IB, por exemplo, uma Cas3 de Clostridium (por exemplo, C dificile).

[0927] Por exemplo, a nuclease é uma Cas3 Tipo IC.

[0928] Por exemplo, a nuclease é uma Cas3 Tipo ID.

[0929] Por exemplo, a nuclease é uma Cas3 Tipo IE, por exemplo, uma Cas3 de E coli ou Pseudomonas (por exemplo, P aeruginosa).

[0930] Por exemplo, a nuclease é uma Cas3 Tipo IF, por exemplo, uma Cas3 de Pseudomonas (por exemplo, P aeruginosa).

[0931] Por exemplo, a nuclease é uma Cas3 Tipo IU.

[0932] Em um exemplo, a nuclease é uma Cas6, por exemplo Cas6f.

[0933] Em um exemplo, a nuclease é uma nuclease isolada ou recombinante. Por exemplo, a nuclease é uma nuclease sintética ou de ocorrência não natural. Em um exemplo, a nuclease é uma nicase.

[0934] Em um exemplo, a nuclease é ex vivo, por in vitro. Em um exemplo, o ácido nucleico é ex vivo. Em um exemplo, o RNA guia ou DNA que codifica o(s) RNA(s) guia aqui é ex vivo, por exemplo, in vitro.

[0935] Opcionalmente, a nuclease é uma nuclease Cas (por exemplo, uma Cpf1, CasX, CasY, Cas13b, Cas 3 ou 9), uma meganuclease, uma TALEN (nuclease efetora do tipo ativador de transcrição) ou nuclease do dedo de zinco. Em um exemplo, a Cas é uma Cas9 de Streptococcus (p.ex., pyogenes ou aureus), Cas3 de Clostridium (ex., dificile), de Salmonella (ex., typhimurium) ou de E coli. Por exemplo, a Cas é uma spCas. Em um exemplo, a Cas9 é combinada com um tracrRNA ou um DNA que codifica um tracrRNA que é operável com a Cas. Por exemplo, o tracrRNA é da mesma espécie que a Cas, por exemplo, um tracrRNA ou DNA de S pyogenes codificando isto.

[0936] Em um exemplo, a nuclease é uma Cas 3 codificada por um ácido nucleico compreendendo a SEQ ID NO: 9 ou uma sequência que seja pelo menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica a ela. Opcionalmente, as bactérias também são bactérias Clostridium (ex, C dificile); ou qualquer Clostridium mostrada na Tabela 1. Isto é exemplificado abaixo.

[0937] Em um exemplo, a nuclease é uma Cas 9 codificada por um ácido nucleico compreendendo a SEQ ID NO: 10 ou uma sequência que seja pelo menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica a ela. Em um exemplo, a nuclease é uma Cas 9 compreendendo a SEQ ID NO: 11 ou uma sequência que seja pelo menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica a ela. Opcionalmente, as bactérias também são bactérias Clostridium (ex, C dificile); ou qualquer Clostridium mostrada na Tabela

1. Opcionalmente, as bactérias também são E coli (por exemplo, EHEC). Isto é exemplificado abaixo.

[0938] Opcionalmente, o método compreende a administração ao indivíduo de um RNA ou um ácido nucleico (p.ex., DNA) que codifica um RNA para a expressão do RNA no indivíduo, em que o RNA se complexa com a nuclease para programar a nuclease para cortar o local-alvo em micróbios incluídos no indivíduo.

[0939] Opcionalmente, a nuclease é administrada simultaneamente ou sequencialmente com o RNA ou o ácido nucleico ao indivíduo.

[0940] Opcionalmente, o indivíduo compreende a nuclease antes da administração do RNA ou do ácido nucleico ao indivíduo. Por exemplo, a nuclease é uma nuclease Cas que é uma nuclease Cas endógena de células bacterianas das primeiras espécies ou cepas que são compreendidas pelo indivíduo. Assim, neste exemplo, o RNA ou o ácido nucleico podem ser administrados ao indivíduo e introduzidos nas bactérias para programação endógena da Cas composta pelas bactérias, formando assim a nuclease Cas programada que corta o local-alvo nos genomas das bactérias, por meio do qual as bactérias são mortas ou o crescimento ou proliferação de bactérias é reduzido, tratando ou impedindo assim a infecção.

[0941] Opcionalmente, uma pluralidade de vírus (por exemplo, fagos ou fagemídeos) é administrada ao indivíduo, em que cada vírus compreende uma cópia (por exemplo, uma ou mais, por exemplo, uma pluralidade de cópias) do ácido nucleico, em que os vírus infectam os micróbios compreendidos pelo indivíduo para entregar a ele o ácido nucleico. Por exemplo, os vírus aqui são fagos ou fagemídeos que infectam (ou são capazes de infectar) as bactérias da primeira espécie ou cepa.

[0942] Opcionalmente, a razão de vírus administrados: micróbios compreendidos pelo indivíduo é de 10 para 150. Por exemplo, os micróbios são bactérias e a razão é de 10 para 100, ou seja, uma multiplicidade de infecções (MOI) de 1 para 100 (por exemplo, em que os vírus são capazes de replicação, por exemplo, são fagos e não fagemídeos), por exemplo, de 10 para 100. A razão pode ser determinada, por exemplo, usando uma amostra (por exemplo, uma amostra de sangue ou de intestino) de um indivíduo humano ou animal imediatamente antes do tratamento e determinando o número de micróbios (por exemplo, bactérias por ml de amostra de sangue ou de intestino). A quantidade de vírus a ser administrada pode então ser trabalhada de acordo com a determinação usando a amostra.

[0943] Opcionalmente, os micróbios são bactérias. Alternativamente, os micróbios são arqueas. Alternativamente, os micróbios são vírus. Alternativamente, os micróbios são fungos. Alternativamente, os micróbios são algas. Alternativamente, os micróbios são protozoários.

[0944] Em um exemplo, o indivíduo é um ser humano e a infecção é uma infecção nosocomial. Em um exemplo, o indivíduo é uma planta, uma levedura, um protista ou uma ameba.

[0945] Opcionalmente, o indivíduo é um ser humano (por exemplo, um adulto, uma criança, um recém-nascido, um adolescente, masculino ou feminino) ou animal (por exemplo, cão, gato, cavalo, vaca, ovelha, cabra, salmão, galinha, peru, porco, animal de estimação ou gado).

[0946] Em um exemplo, o indivíduo é um ser humano ou animal e: Opcionalmente, a infecção é uma infecção dos pulmões, abdômen ou trato urinário. Em um exemplo, o indivíduo sofre de uma infecção do trato urinário, infecções pulmonares, como pneumonia, infecção renal ou infecção abdominal. Em um exemplo, o indivíduo é um paciente de cirurgia. Em um exemplo, o indivíduo é um paciente com queimaduras. Em um exemplo, o indivíduo tem uma ferida infectada (por exemplo, uma ferida bacterianamente infetada). Em um exemplo, o indivíduo está sofrendo de AIDS ou está infectado pelo HIV. Em um exemplo, o indivíduo está sofrendo de um câncer, como um câncer no sangue, por exemplo, leucemia, por exemplo, AML ou CML ou CLL ou um linfoma. Em um exemplo, o indivíduo é um paciente transplantado de tecidos ou órgãos, por exemplo, um paciente transplantado de células estaminais hematopoiéticas ou de medula óssea. Em um exemplo, o indivíduo tem um cateter urinário ou intravenoso. Em um exemplo, o indivíduo está em ventilação mecânica. Em um exemplo, o indivíduo tem recebido um imunossupressor. Em um exemplo, o indivíduo sofre de pneumonia. Em um exemplo, o paciente está em uma unidade de terapia intensiva (UTI). Em um exemplo, o indivíduo é um paciente com síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA). Em um exemplo, o indivíduo está sofrendo de meningite, de uma infecção na gravidez, de uma ruptura da vesícula biliar (uma ruptura da vesícula biliar é uma condição médica onde a vesícula biliar vaza ou estoura. As rupturas são geralmente causadas por inflamação da vesícula biliar), aborto com choque séptico (aborto com choque séptico pode ser uma doença aguda de risco à vida), endometrite (endometrite é uma condição inflamatória do revestimento do útero, geralmente devido a uma infecção), síndrome do desconforto respiratório agudo (A síndrome do desconforto respiratório agudo é uma condição pulmonar; ocorre quando o fluido enche os sacos aéreos nos pulmões) ou celulite.

[0947] O aumento da idade média da população, o aumento do número de pessoas com doenças crônicas, com fármacos imunossupressores e o aumento do número de procedimentos invasivos realizados têm levado a um aumento da taxa de sepse. Opcionalmente, o indivíduo foi submetido a cirurgia, está em medicação imunossupressora e/ou sofre de doença crônica.

[0948] Opcionalmente, o indivíduo é um ser humano com mais de 60, 65, 70, 75 ou 80 anos de idade ou é um paciente pediátrico. Em alternativa, o indivíduo é um indivíduo pediátrico (por exemplo, um bebê ou uma criança humana) ou adolescente. Em um exemplo, o método trata ou previne a sepse neonatal no indivíduo. Em um exemplo, o indivíduo é um ser humano ou animal imunocomprometido, por exemplo, que sofre de uma infecção viral aguda, como a infecção pelo HIV; ou o indivíduo sofre de câncer, por exemplo, de um câncer no sangue, como uma leucemia; ou o paciente é um paciente transplantado, por exemplo, que recebeu um transplante de órgão, tecido ou medula óssea. Em um exemplo, o indivíduo é um ser humano ou animal que é positivo para o lipopolissacarídeo bacteriano gram- negativo ou o lipídeo A. Em um exemplo, o indivíduo é um ser humano ou animal que é positivo para o ácido lipoteicóico da parede celular bacteriana gram positiva.

[0949] Opcionalmente, o método trata ou previne a septicemia e/ou sepse (por exemplo, choque séptico) no indivíduo.

[0950] Os critérios da SRIS (Síndrome de resposta inflamatória sistêmica) têm sido utilizados para definir sepse.

[0951] A SRIS é a presença de dois ou mais dos seguintes: temperatura corporal, frequência cardíaca, frequência respiratória ou gás sanguíneo anormais e contagem de leucócitos. A sepse é, por exemplo, a SRIS em resposta a um processo infeccioso. Sepse grave é, por exemplo, sepse com disfunção orgânica induzida por sepse ou hipoperfusão tecidual (manifestando-se como hipotensão, lactato elevado ou débito urinário reduzido). O choque séptico é, por exemplo, sepse grave mais pressão arterial persistentemente baixa, apesar da administração de fluidos intravenosos.

[0952] Em uma modalidade, o método previne ou atrasa a progressão da disfunção de órgãos finais no indivíduo (quando o indivíduo é um ser humano ou animal).

[0953] Exemplos de disfunção de órgãos finais incluem os seguintes: • Pulmões: síndrome do desconforto respiratório agudo

(SDRA) (PaO2/FiO2 < 300) • Cérebro: sintomas de encefalopatia incluindo agitação, confusão, coma; as causas podem incluir isquemia, sangramento, formação de coágulos sanguíneos em pequenos vasos sanguíneos, microabscessos, leucoencefalopatia necrotizante multifocal • Fígado: a interrupção da função sintética protéica manifesta-se agudamente como interrupção progressiva da coagulação sanguínea devido à incapacidade de sintetizar fatores de coagulação e a interrupção das funções metabólicas leva ao metabolismo da bilirrubina comprometido, resultando em níveis elevados de bilirrubina sérica não conjugada • Rim: baixo débito urinário ou sem débito urinário, anomalias eletrolíticas ou sobrecarga de volume • Coração: insuficiência cardíaca sistólica e diastólica, provavelmente devido a sinais químicos que deprimem a função miócita, dano celular, manifesta como vazamento de troponina (embora não necessariamente isquêmico na natureza)

[0954] Existem definições mais específicas de disfunção de órgãos finais para SRIS em pediatria. • disfunção cardiovascular (após a reanimação com fluidos com, pelo menos, 40 ml/kg de cristaloide) • hipotensão com pressão arterial < 5 o percentil para idade ou pressão arterial sistólica < 2 desvios padrão abaixo do normal para idade, ou • exigência de vasopressor, ou • dois dos seguintes critérios: • acidose metabólica inexplicada com déficit básico > 5 MEq/l • acidose láctica: lactato sérico 2 vezes o limite superior do normal • oligúria (débito de urina < 0,5 ml/kg/h)

• enchimento capilar prolongado > 5 segundos • diferença de temperatura entre o núcleo e o periférico > 3 °C • disfunção respiratória (na ausência de cardiopatia cianótica ou doença pulmonar crônica conhecida) • a razão entre a pressão parcial arterial de oxigênio e a fração de oxigênio nos gases inspirados (PaO2/FiO2) < 300 (definição de lesão pulmonar aguda), ou • pressão parcial arterial de dióxido de carbono (PaCO2) > 65 torr (20 mmHg) sobre a PaCO2 basal (evidência de insuficiência respiratória hipercápnica), ou • necessidade suplementar de oxigênio superior a FiO2 0,5 para manter a saturação de oxigênio ≥ 92% • disfunção neurológica • pontuação de coma de Glasgow (GCS) ≤ 11, ou • alteração do estado mental com queda no GCS de 3 ou mais pontos em uma pessoa com atraso de desenvolvimento/ deficiência intelectual • disfunção hematológica • contagem de plaquetas < 80.000/mm 3 ou queda de 50% do máximo em cronicamente trombocitopênico, ou • razão normalizada internacional (INR) > 2 • coagulação intravascular disseminada • disfunção renal • creatinina sérica ≥ 2 vezes o limite superior de normal para idade ou aumento de 2 vezes na creatinina basal em pessoas com doença renal crônica • disfunção hepática (aplicável apenas a bebês > 1 mês) • bilirrubina sérica total ≥ 4 mg/dl, ou • alanina aminotransferase (ALT) ≥ 2 vezes o limite superior do normal

[0955] A Tabela 2 define os critérios para um diagnóstico positivo de sepse.

[0956] Opcionalmente, o método reduz um ou mais sintomas no paciente selecionado a partir de febre, temperatura corporal baixa, respiração rápida, frequência cardíaca elevada, confusão, acidose metabólica, alcalose respiratória, pressão arterial baixa, disfunção da coagulação sanguínea (como coagulação sanguínea em um ou mais órgãos, ou hematomas) e edema. Opcionalmente, o método reduz o choque séptico. Opcionalmente, a sepse é sepse grave.

[0957] Opcionalmente, no início do tratamento, o indivíduo (por exemplo, um ser humano) tem uma temperatura de < 36 °C ou > 38 °C; uma frequência cardíaca > 90/min, uma frequência respiratória > 20 respirações/min ou PaCO2 < 4,3 kPa; e uma contagem de leucócitos de < 4000/mm³ ou > 12.000/mm³.

[0958] Opcionalmente, no início do tratamento, o indivíduo (por exemplo, um ser humano) tem presença de dois ou mais dos seguintes: temperatura corporal anormal, frequência cardíaca anormal, frequência respiratória anormal, gás sanguíneo anormal e contagem anormal de leucócitos.

[0959] Opcionalmente, o indivíduo é uma planta. Em um exemplo, o indivíduo é um protista, p.ex., ameba. Opcionalmente, neste exemplo, os micróbios são vírus (por exemplo, vírus grandes ou gian, por exemplo, Mimivirus). A nuclease, por exemplo, é um Cas e é programável usando um RNA guia fornecido por uma virofago que infecta os micróbios do vírus.

[0960] Em um exemplo, os micróbios são leveduras, por exemplo, Candida.

[0961] De preferência, os micróbios são bactérias. Opcionalmente, as bactérias são bactérias gram-positivas. Opcionalmente, as bactérias são Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Legionella, Heamophilus, Ghonnorhea, Acinetobacter, Escherichia, Klebsiella, Pseudomonas ou bactérias Stenotrophomonas (por exemplo, E. coli (p.ex., E coli EHEC), C dificile, V cólera, Staphylococcus (por exemplo, S aureus ou MRSA), Strepytococcus pyogenes, Acinetobacter baumannii, Legionella, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae bacteria).

[0962] Opcionalmente, a primeira espécie é selecionada a partir das espécies da Tabela 1.

[0963] Opcionalmente, a primeira espécie é a E. coli enterohemorrágica (EHEC), o sorotipo da E.coli O157:H7 ou a E. coli produtora da toxina Shiga (STEC)). Em um exemplo, as bactérias são selecionadas de • E. coli produtora da toxina Shiga (STEC) (STEC pode também ser referida como E. coli produtora de Verocitotoxina (VTEC); • E. coli enterohemorrágica (EHEC) (esse patótipo é o mais comumente ouvido nas notícias em associação com surtos de origem alimentar); • E. coli enterotoxigênica (ETEC); • E. coli enteropatogênica (EPEC); • E. coli enteroagregativa (EAEC); • E. coli enteroinvasiva (EIEC); e. • E. coli difusamente aderente (DAEC).

[0964] O sorotipo da Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC) O157:H7 é um patógeno humano responsável por surtos de diarreia com sangue e síndrome hemolítico-urêmica (HUS) em todo o mundo. Os antimicrobianos convencionais desencadeiam uma resposta SOS em EHDC que promove a liberação da potente toxina Shiga, responsável por grande parte da morbidade e mortalidade associada à infecção pela EHDC. Os bovinos são um reservatório natural de EHEC e cerca de 75% dos surtos de EHEC estão ligados ao consumo de produtos contaminados derivados de bovinos. A EHEC causa doença em seres humanos, mas é assintomática em ruminantes adultos. As características da infecção pelo sorotipo da E.coli O157:H7 (EHEC) incluem cãibras abdominais e diarreia com sangue, bem como a síndrome hemolítico-urêmica (HUS) com complicação potencialmente fatal. Atualmente, há necessidade de tratamento para infecções por EHDC (Goldwater e Bettelheim, 2012). O uso de antibióticos convencionais agrava a citotoxicidade mediada pela toxina Shiga. Em um estudo de epidemiologia realizado pelos Centros de Controle e Prevenção de Doenças, os pacientes tratados com antibióticos para enterite EHEC tiveram maior risco de desenvolver HUS (Slutsker et al., 1998). Estudos adicionais apoiam a contraindicação de antibióticos na infecção pela EHEC; crianças com antibioticoterapia para colite hemorrágica associada a EHEC tiveram maior chance de desenvolver HUS (Wong et al., 2000; Zimmerhackl, 2000; Safdar et al., 2002; Tarr et al., 2005). Os antibióticos convencionais promovem a produção de toxinas Shiga, melhorando a replicação e a expressão de genes stx que são codificados em um genoma de profago lambdoide cromossomicamente integrado. A abordagem da presente invenção depende do corte de nuclease. A indução do stx também promove lise mediada por fago do envelope de células EHEC, permitindo a liberação e disseminação da toxina Shiga no ambiente (Karch et al., 1999; Matsushiro et al., 1999; Wagner et al., 2002). Assim, vantajosamente, a invenção oferece meios alternativos para o tratamento da EHEC em indivíduos humanos e animais. Isto é exemplificado abaixo com resultados surpreendentes na velocidade e na duração da ação anti- EHEC produzida pela ação da nuclease (ao contrário da ação convencional antibiótica).

[0965] Em um exemplo, o indivíduo (por exemplo, um ser humano)

está sofrendo ou em risco de síndrome hemolítico-urêmica (HUS), por exemplo, o indivíduo está sofrendo de uma infecção por E coli, como uma infecção por E coli EHEC.

[0966] Um aspecto da invenção fornece: Uma pluralidade de vírus (por exemplo, fagos ou fagemídeos para produzir fago) para uso com a nuclease da invenção no método de tratamento, em que cada vírus compreende uma cópia de um ácido nucleico descrito aqui, em que os vírus são capazes de infectar micróbios compreendidos pelo indivíduo para entregar-lhe o ácido nucleico.

[0967] Um aspecto da invenção fornece: Uma pluralidade de vírus (por exemplo, fagos ou fagemídeos para produzir fago) para uso com uma nuclease programável em um método de tratamento de uma infecção microbiana de um indivíduo, em que a infecção microbiana é causada por micróbios de uma primeira espécie ou cepa e a nuclease é programável para cortar um sítio-alvo composto pelos genomas dos micróbios que infectaram o indivíduo, em que os micróbios da primeira espécie ou cepa são mortos, ou o crescimento ou proliferação dos micróbios é reduzido, o método de tratamento que compreende a exposição do indivíduo à nuclease em que a nuclease é programada para cortar o local-alvo, em que os genomas dos micróbios compreendidos pelo indivíduo são cortados e a infecção microbiana do indivíduo é tratada;

[0968] em que cada vírus compreende uma cópia de um ácido nucleico que codifica um RNA para a expressão do RNA no indivíduo, em que o RNA se complexa com a nuclease para programar a nuclease para cortar o local-alvo em micróbios incluídos no indivíduo;

[0969] em que os vírus são capazes de infectar micróbios compostos pelo indivíduo para entregar-lhe o ácido nucleico.

[0970] Opcionalmente, o método é para tratamento durável, por exemplo, como descrito aqui; e/ou opcionalmente, a infecção é infecção aguda.

[0971] Opcionalmente, o método é para tratamento rápido, por exemplo, conforme descrito aqui; e/ou opcionalmente, a infecção é infecção aguda.

[0972] Opcionalmente, a nuclease está de acordo com qualquer nuclease da invenção aqui. Opcionalmente, o ácido nucleico está de acordo com qualquer ácido nucleico da invenção aqui.

[0973] Opcionalmente, a nuclease está de acordo com qualquer nuclease da invenção aqui. Opcionalmente, o ácido nucleico está de acordo com qualquer ácido nucleico da invenção aqui.

[0974] Em uma alternativa, quando os micróbios são vírus, a pluralidade de vírus são fagos que são capazes de infectar as células hospedeiras que abrigam os micróbios, em que os ácidos nucleicos são introduzidos nas células hospedeiras para expressão do RNA. Os complexos de RNA com a nuclease nas células hospedeiras para guiar a nuclease para cortar um local-alvo dos micróbios (ou seja, para cortar RNA ou DNA viral), inativando assim os micróbios virais. Por exemplo, os micróbios são vírus (por exemplo, em ameba; ou em células humanas ou animais ou vegetais) e os vírus da referida pluralidade de vírus são capazes de direcionar os micróbios, através dos quais a nuclease é programada para cortar os micróbios (por exemplo, na ameba ou nas referidas células).

[0975] Um aspecto da invenção fornece: uma composição compreendendo uma pluralidade de ácidos nucleicos para a programação da nuclease da invenção no método de tratamento, em que cada ácido nucleico é um ácido nucleico como definido aqui.

[0976] Um aspecto da invenção fornece: uma composição compreendendo uma pluralidade de ácidos nucleicos para programar uma nuclease programável em um método de tratamento de uma infecção microbiana de um indivíduo, em que a infecção microbiana é causada por micróbios de uma primeira espécie ou cepa e a nuclease é programável para cortar um sítio-alvo composto pelos genomas dos micróbios que infectaram o indivíduo, em que os micróbios da primeira espécie ou cepa são mortos, ou o crescimento ou proliferação dos micróbios é reduzido, o método de tratamento que compreende a exposição do indivíduo à nuclease e aos ácidos nucleicos em que a nuclease é programada para cortar o local-alvo, em que os genomas dos micróbios compreendidos pelo indivíduo são cortados e a infecção microbiana do indivíduo é tratada; em que cada ácido nucleico codifica um RNA para a expressão do RNA no indivíduo, em que o RNA se complexa com a nuclease para programar a nuclease para cortar o local-alvo em micróbios incluídos no indivíduo;

[0977] Opcionalmente, o método é para tratamento durável, por exemplo, como descrito aqui; e/ou opcionalmente, a infecção é infecção aguda.

[0978] Opcionalmente, o método é para tratamento rápido, por exemplo, conforme descrito aqui; e/ou opcionalmente, a infecção é infecção aguda.

[0979] Opcionalmente, a nuclease está de acordo com qualquer nuclease da invenção aqui. Opcionalmente, cada ácido nucleico está de acordo com qualquer ácido nucleico da invenção aqui.

[0980] Opcionalmente, a composição é uma composição farmacêutica compreendendo os ácidos nucleicos e um diluente, carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Opcionalmente, a composição é para administração oral, intravenosa, pulmonar, retal, tópica, bucal, ocular, intranasal ou subcutânea a um indivíduo humano ou animal. Opcionalmente, a composição é um herbicida ou um pesticida ou um inseticida ou um nematodicida ou um aracnicida. Opcionalmente, a composição é tóxica para a levedura. Opcionalmente, a composição é tóxica para vírus gigantes.

[0981] Um aspecto da invenção fornece: Um sistema CRISPR/Cas compreendendo uma nuclease de acordo com a invenção para uso no método de tratamento, em que a nuclease é uma nuclease Cas (por exemplo, uma Cas 3 ou 9 ou qualquer outra Cas mencionada aqui) e o sistema compreende um ou mais RNAs guia ou DNA que codifica um ou mais RNAs guia, em que cada RNA guia é capaz de programar a nuclease Cas para cortar um local-alvo composto pelos genomas dos micróbios.

[0982] Em um exemplo, cada RNA guia mencionado aqui é um RNA guia único (ou seja, um RNA guia quimérico). Em um outro exemplo, cada RNA guia compreende um crRNA que é hibridizado para um tracrRNA.

[0983] Em um exemplo, um local-alvo mencionado aqui é compreendido por um gene essencial, por um gene de virulência ou por um gene de resistência ao antibiótico das bactérias. Em um exemplo, um local-alvo mencionado aqui é compreendido por uma sequência multi-cópia (ou seja, uma sequência que está presente em mais de uma (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9, ou mais) cópias em cada genoma bacteriano). Por exemplo, o local-alvo é compreendido por um gene do RNA ribossômico. Em um exemplo, um local-alvo mencionado aqui é compreendido por um gene do RNA ribossômico (por exemplo, um gene do RNA ribossômico 23S), um gene yapH ou um gene pks; ou por um homólogo ou ortólogo do mesmo.

[0984] Opcionalmente, cada RNA guia aqui é capaz de hibridizar para uma sequência de protoespaçadores que compreende o local-alvo, onde a sequência de protoespaçadores tem 15-45 nucleotídeos de comprimento, por exemplo, 15-25; 18-21; 20; ou cerca de 20 nucleotídeos de comprimento. Opcionalmente, cada RNA guia aqui inclui uma sequência de espaçadores com 15-45 nucleotídeos de comprimento, por exemplo, 15-25; 18-21; 20; ou cerca de 20 nucleotídeos de comprimento.

[0985] Opcionalmente, cada RNA guia aqui é cognato para um motivo adjacente ao protoespaçador (PAM) 5 ′-NGG, por exemplo, onde as bactérias são E coli. Opcionalmente, cada RNA guia aqui é cognato a um motivo adjacente ao protoespaçador (PAM) 5′-CCA ou 5′-CCT, por exemplo, onde as bactérias são C dificile.

[0986] Um aspecto da invenção fornece: Um RNA guia ou um DNA que codifica um RNA guia para uso no sistema da invenção para uso no método de tratamento de uma infecção microbiana aguda no indivíduo, por exemplo, septicemia ou sepse.

[0987] Um aspecto da invenção fornece: Um vetor do ácido nucleico compreendendo o RNA guia ou DNA.

[0988] Opcionalmente, o vetor é um fago, fagemídeo, viriofago, vírus, plasmídeo (por exemplo, plasmídeo conjugado) ou transpóson. O exemplo abaixo mostra que a morte quase completa pode ser alcançada usando um plasmídeo conjugado como vetor. Assim, em uma modalidade, cada vetor é um plasmídeo conjugado que é administrado de bactérias carreadoras, por exemplo, bactérias carreadoras probióticas para administração ao indivíduo humano ou animal. Em um exemplo, as bactérias carreadoras são Lactobacillus (por exemplo, L reuteri) ou E coli. Isto é exemplificado abaixo e conseguiu morte completa (100%).

[0989] Um aspecto da invenção fornece: Uma composição anti- sepse ou anti-septicemia para a administração a um ser humano ou animal para o tratamento da sepse ou septicemia, a composição compreendendo uma pluralidade de vetores, em que cada vetor é um vetor da invenção.

[0990] Um aspecto da invenção fornece: Um método de tratamento (por exemplo, tratamento rápido e/ou duradouro) de uma infecção microbiana aguda de um indivíduo, no qual o método é definido aqui.

[0991] Um aspecto da invenção fornece: Um método para o tratamento (por exemplo, tratamento rápido e/ou duradouro) de uma infecção microbiana aguda de um indivíduo, em que a infecção microbiana é causada por micróbios de uma primeira espécie ou cepa e a nuclease é programável para cortar um sítio-alvo composto pelos genomas dos micróbios que infectaram o indivíduo, em que os micróbios da primeira espécie ou cepa são mortos, ou o crescimento ou proliferação dos micróbios é reduzido, o método de tratamento compreendendo a exposição do indivíduo à nuclease em que a nuclease é programada para cortar o local-alvo, em que os genomas dos micróbios compreendidos pelo indivíduo são cortados e a infecção microbiana aguda do indivíduo é tratada (por exemplo, tratamento rápido e/ou duradouro).

[0992] Um aspecto da invenção fornece: Um método para o tratamento (por exemplo, tratamento rápido e/ou duradouro) de uma infecção microbiana aguda de um indivíduo, em que a infecção microbiana é causada por micróbios de uma primeira espécie ou cepa e a nuclease é programável para cortar um local-alvo composto pelos genomas dos micróbios que infectaram o indivíduo, em que os micróbios da primeira espécie ou cepa são mortos, ou o crescimento ou proliferação dos micróbios é reduzido, o método de tratamento compreendendo a exposição do indivíduo à nuclease e uma pluralidade de vírus em que a nuclease é programada para cortar o local-alvo, por meio dos quais os genomas dos micróbios compreendidos pelo indivíduo são cortados e a infecção microbiana aguda do indivíduo é tratada (por exemplo, tratada de forma rápida e/ou duradoura); em que cada vírus compreende uma cópia de um ácido nucleico que codifica um RNA para a expressão do RNA no indivíduo, em que o RNA se complexa com a nuclease para programar a nuclease para cortar o local-alvo em micróbios compreendidos no indivíduo; em que os vírus são capazes de infectar micróbios compreendidos pelo indivíduo para entregar-lhe o ácido nucleico.

[0993] Opcionalmente, a nuclease está de acordo com qualquer nuclease da invenção aqui. Opcionalmente, o ácido nucleico está de acordo com qualquer ácido nucleico da invenção aqui.

[0994] Um aspecto da invenção fornece: Um método para o tratamento (por exemplo, tratamento rápido e/ou duradouro) de uma infecção microbiana aguda de um indivíduo, em que a infecção microbiana é causada por micróbios de uma primeira espécie ou cepa e a nuclease é programável para cortar um sítio-alvo composto pelos genomas dos micróbios que infectaram o indivíduo, em que os micróbios da primeira espécie ou cepa são mortos, ou o crescimento ou proliferação dos micróbios é reduzido, o método de tratamento compreendendo a exposição do indivíduo à nuclease e uma pluralidade de ácidos nucleicos em que a nuclease é programada para cortar o local-alvo, em que os genomas dos micróbios compreendidos pelo indivíduo são cortados e a infecção microbiana aguda do indivíduo é tratada (por exemplo, tratamento rápido e/ou duradouro); em que cada vírus compreende uma cópia de um ácido nucleico que codifica um RNA para a expressão do RNA no indivíduo, em que o RNA se complexa com a nuclease para programar a nuclease para cortar o local-alvo nos micróbios compreendido pelo indivíduo; em que cada ácido nucleico codifica um RNA para a expressão do RNA no indivíduo, em que o RNA se complexa com a nuclease para programar a nuclease para cortar o local-alvo em micróbios incluídos no indivíduo.

[0995] Opcionalmente, a nuclease está de acordo com qualquer nuclease da invenção aqui. Opcionalmente, cada ácido nucleico está de acordo com qualquer ácido nucleico da invenção aqui.

[0996] Em um exemplo, a invenção é para uso médico ou odontológico ou oftálmico (por exemplo, para tratar ou prevenir uma infecção em um organismo ou limitar a propagação da infecção em um organismo).

[0997] Em um exemplo, a invenção é para uso cosmético (por exemplo, uso em um produto cosmético, por exemplo, maquiagem), ou para uso higiênico (por exemplo, uso em um produto de higiene, por exemplo, sabão).

[0998] Em um exemplo, os vetores e/ou nuclease antes da administração do indivíduo são compostos por uma composição que é como qualquer um dos seguintes (aqui o hospedeiro se refere aos micróbios da primeira espécie ou cepa): Em um exemplo, a composição é uma composição médica, oftálmica, dentária ou farmacêutica (por exemplo, composta por uma vacina anti-hospedeiro). Em um exemplo, a composição é uma composição antimicrobiana, por exemplo, um antibiótico ou antiviral, por exemplo, um medicamento, um desinfectante ou um enxaguante bucal. Em um exemplo, a composição é uma composição cosmética (por exemplo, composição para face ou para o corpo). Em um exemplo, a composição é um herbicida. Em um exemplo, a composição é um pesticida (por exemplo, quando o hospedeiro é um hospedeiro de Bacillus (por exemplo, thuringiensis)). Em um exemplo, a composição é um aditivo para bebidas (por exemplo, cerveja, vinho ou bebidas alcoólicas). Em um exemplo, a composição é um aditivo alimentar (por exemplo, onde o hospedeiro é um hospedeiro de E. coli, Salmonella, Listeria ou Clostridium (por exemplo, botulinum). Em um exemplo, a composição é um aditivo de água. Em um exemplo, a composição é um aditivo para ambientes de animais aquáticos (por exemplo, num tanque de peixes). Em um exemplo, a composição é uma composição da indústria petrolífera ou petroquímica ou é composta em tal composição (por exemplo, quando o hospedeiro é uma bactéria de redução de sulfato, por exemplo, um hospedeiro Desulfovibrio). Em um exemplo, a composição é um óleo ou um aditivo petroquímico. Em um exemplo, a composição é um aditivo químico.

Em um exemplo, a composição é um desinfetante (por exemplo, para esterilizar equipamento para uso humano ou animal, por exemplo, para uso cirúrgico ou médico, ou para alimentação de bebês). Em um exemplo, a composição é uma composição de higiene pessoal para uso humano ou animal.

Em um exemplo, a composição é uma composição para uso ambiental, por exemplo, para tratamento de solo ou descontaminação ambiental (por exemplo, de esgoto, ou de petróleo, uma petroquímica ou um químico, por exemplo, quando o hospedeiro é uma bactéria de redução de sulfato, por exemplo, um hospedeiro Desulfovibrio). Em um exemplo, a composição é um estimulador de crescimento vegetal.

Em um exemplo, a composição é uma composição para uso em petróleo, petroquímica, metal ou extração mineral.

Em um exemplo, a composição é um tratamento de tecido ou aditivo.

Em um exemplo, a composição é um tratamento ou aditivo de pele, couro ou camurça animal.

Em um exemplo, a composição é um aditivo corante.

Em um exemplo, a composição é um aditivo de preparação ou fermentação de bebidas (por exemplo, cerveja ou vinho) (por exemplo, quando o hospedeiro é um hospedeiro de Lactobacillus). Em um exemplo, a composição é um aditivo de papel.

Em um exemplo, a composição é um aditivo de tinta.

Em um exemplo, a composição é um aditivo de cola.

Por exemplo, a composição é uma composição anti-humana ou animal ou parasitária vegetal.

Em um exemplo, a composição é um aditivo de ar (por exemplo, para ar para dentro ou produzido por equipamento de condicionamento de ar, por exemplo, onde o hospedeiro é um hospedeiro de Legionella). Em um exemplo, a composição é um aditivo anticongelante (por exemplo, onde o hospedeiro é um hospedeiro de Legionella). Em um exemplo, a composição é um colírio ou uma composição oftálmica (por exemplo, um líquido para lentes de contato). Em um exemplo, a composição é composta por um laticínio (por exemplo, a composição está dentro ou é um leite ou um produto de leite; por exemplo, onde o hospedeiro é um hospedeiro de Lactobacillus, de Streptococcus, de Lactococcus ou de Listeria). Em um exemplo, a composição é ou é composta de um produto de limpeza industrial ou doméstico (por exemplo, onde o hospedeiro é um hospedeiro de E. coli, Salmonella, Listeria ou Clostridium (por exemplo, botulinum). Em um exemplo, a composição é composta por um combustível.

Em um exemplo, a composição é composta por um solvente (por exemplo, que não a água). Em um exemplo, a composição é um aditivo de assamento (por exemplo, um aditivo de assamento de alimentos). Em um exemplo, a composição é um reagente de laboratório (por exemplo, para uso em biotecnologia ou tecnologia de DNA ou RNA recombinante). Em um exemplo, a composição é composta por um agente de amaciamento de fibras.

Em um exemplo, a composição é para o uso em um processo da síntese da vitamina.

Em um exemplo, a composição é uma composição anti-colheita ou de deterioração de planta (por exemplo, quando o hospedeiro é uma bactéria saprotrófica). Por exemplo, a composição é um composto anticorrosão, por exemplo, para prevenir ou reduzir a corrosão do metal (por exemplo, quando o hospedeiro é uma bactéria que reduz o sulfato, por exemplo, um hospedeiro Desulfovibrio, por exemplo, para reduzir ou prevenir a corrosão do equipamento de extração, tratamento ou contenção de óleo; equipamentos de extração, tratamento ou contenção de metais; ou equipamento de extração, tratamento ou contenção de minerais.

Em um exemplo, a composição é uma composição de agricultura ou agrícola ou é composta por tal composição.

Em um exemplo, a composição é um aditivo de silagem.

A invenção fornece uma matriz CRISPR, sequência de nucleotídeos de codificação de gRNA, vetor ou pluralidade de vetores descritos aqui para uso em qualquer uma das composições descritas neste parágrafo ou para uso em qualquer aplicação descrita neste parágrafo, por exemplo, em que a célula hospedeira é uma célula bacteriana ou arqueal. A invenção fornece um método para qualquer aplicação descrita neste parágrafo, em que o método compreende a combinação de uma matriz CRISPR, sequência de nucleotídeos de codificação de gRNA, vetor ou pluralidade da invenção com uma célula hospedeira (por exemplo, célula bacteriana ou arqueal). Em uma modalidade, a célula hospedeira não está presente em um no ser humano (ou embrião humano) ou animal.

[0999] Qualquer aspecto da presente invenção é, por exemplo, para um uso industrial ou doméstico, ou é usado em um método para esse uso. Por exemplo, é para ou usado na agricultura, indústria de petróleo ou petrolífera, indústria alimentar ou de bebidas, indústria de vestuário, indústria de embalagens, indústria eletrônica, indústria de informática, indústria ambiental, indústria química, indústria espacial, indústria de automóvel, indústria biotecnológica, indústria médica, indústria de cuidados de saúde, indústria odontológica, indústria de energia, indústria de produtos de consumo, indústria farmacêutica, indústria mineira, indústria de limpeza, indústria florestal, indústria pesqueira, indústria de lazer, indústria de reciclagem, indústria cosmética, indústria de plásticos, indústria de celulose ou papel, indústria têxtil, indústria de vestuário, indústria de couro ou camurça ou de peles de animais, indústria tabaqueira ou indústria siderúrgica.

[1000] Células hospedeiras aqui se referem aos micróbios da primeira espécie ou cepa. Opcionalmente, qualquer célula(s) hospedeira(s) aqui é(são) células bacterianas ou arqueais. Em um exemplo, a(s) célula(s) está(ão) em fase estacionária. Em um exemplo, a(s) célula(s) está(ão) em fase exponencial. Em um exemplo, a(s) célula(s) está(ão) em fase de atraso. Em um exemplo, a(s) célula(s) é(são) do tipo selvagem ou células de ocorrência natural, por exemplo, compostas por um micrombioma de ocorrência natural, por exemplo, de um ser humano, animal, vegetal, solo, água, mar, água ou ambiente. Em um exemplo, a(s) célula(s) é(são) geneticamente modificada(s) artificialmente.

[1001] Em um exemplo, uma pluralidade de vetores da invenção é introduzida em uma pluralidade das ditas células hospedeiras, onde as células hospedeiras são compostas por uma população bacteriana, por exemplo, ex vivo, in vivo ou in vitro. Por exemplo, as células hospedeiras são compostas por uma população de microbiota composta por um organismo ou ambiente (por exemplo, uma microbiota hidroviária, microbiota aquática, microbiota intestinal humana ou de animal, microbiota de cavidade oral humana ou animal, microbiota vaginal humana ou animal, pele humana ou animal ou microbiota de cabelo ou de axilas humana ou animal), a população compreendendo as primeiras bactérias simbióticas ou comensais com o organismo ou ambiente e as segunda bactérias contendo as referidas células hospedeiras, em que as células hospedeiras são prejudiciais (por exemplo, patogênicas) ao organismo ou ambiente. Em uma modalidade, a população é ex vivo. Em um exemplo, a razão da primeira subpopulação de bactérias com a segunda subpopulação de bactérias é aumentada. Em um exemplo, as primeiras bactérias são Bacteroides (por exemplo, B fragalis e/ou B thaiotamicron). Opcionalmente, os Bactereroides compreendem uma, duas, três ou mais espécies de Bacteroides selecionadas de caccae, capillosus, cellulosilyticus, coprocola, coprophilus, coprosuis, distasonis, dorei, eggerthii, faecis, finegoldii, fluxus, fragalis, intestinalis, melaninogenicus, nordii, oleiciplenus, oralis, ovatus, pectinophilus, plebeius, stercoris, thetaiotaomicron, uniformis, vulgatus e xylanisolvens. Por exemplo, os Bacteroides são ou compreendem o B thaiotaomicron. Por exemplo, os Bacteroides são ou compreendem o B fragalis.

[1002] Em um exemplo, o hospedeiro, a primeira ou segunda células são quaisquer espécies bacterianas reveladas em US201603333348, GB1609811.3, PCT/EP2017/063593 e todas as aplicações equivalentes dos EUA. As revelações destas espécies (incluindo especificamente a Tabela 1 do PCT/EP2017/063593) são aqui incorporadas na sua totalidade e para a inclusão potencial de uma ou mais revelações nelas contidas em uma ou mais reivindicações contidas aqui.

[1003] Em um exemplo, a(s) célula(s) hospedeira(s) ou a população bacteriana está(ão) abrigada(s) por uma bebida ou água (por exemplo, um curso de água ou água potável) para consumo humano. Em um exemplo, a(s) célula(s) hospedeira(s) ou a referida população é composta por uma composição (por exemplo, um medicamento (por exemplo, transplante intestinal bacteriano), bebida, enxague bucal ou gênero alimentício) para administração a um animal humano ou não humano para povoar e reequilibrar o intestino ou microbiota oral do mesmo (por exemplo, em que o dito uso do medicamento é para tratar ou prevenir uma doença ou condição no ser humano ou animal). Em um exemplo, a(s) célula(s) hospedeira(s) ou a dita população está numa superfície sólida ou é composta por um biofilme (por exemplo, um biofilme intestinal ou um biofilme em um aparelho industrial). Em um exemplo da invenção para o tratamento in vitro de um fluido industrial ou médico, superfície sólida, aparelho ou recipiente (por exemplo, para comida, bens de consumo, cosméticos, produtos de cuidados de saúde pessoais, petróleo ou produção de petróleo); ou para o tratamento de um curso de água, água, uma bebida, um gênero alimentício ou um cosmético, em que a(s) célula(s) hospedeira(s) é(são) composta(s) por ou sobre o fluido, a superfície, o aparelho, o recipiente, o curso de água, a água, a bebida, o gênero alimentício ou o cosmético.

[1004] Em um exemplo, a invenção fornece um recipiente para uso médico ou nutricional, em que o recipiente compreende os vetores para uso no método. Por exemplo, o recipiente é um recipiente esterilizado, por exemplo, um inalador ou ligado a uma seringa ou agulha IV.

[1005] Em um exemplo, os vetores ou a composição são para administração (ou são administrados) ao indivíduo animal humano ou não humano por administração em mucosas, no intestino, oral, intranasal, intra-retal, intravaginal, ocular ou bucal.

[1006] Opcionalmente, cada célula hospedeira é de uma cepa ou espécie encontrada em microbiota humana, opcionalmente em que as células hospedeiras são misturadas com células de uma cepa ou espécie diferente, em que as diferentes células são Enterobacteriaceae ou bactérias que são probióticas, comensais ou simbióticas com humanos (por exemplo, no intestino humano). Em um exemplo, a célula hospedeira é uma célula de E coli ou de Salmonella.

[1007] A invenção destina-se, opcionalmente, a alterar a razão relativa de subpopulações de primeira e segunda bactérias numa população mista de bactérias, por exemplo, para alterar microbiomas humanos ou animais, como a alteração da proporção de Bacteroidetes (por exemplo, Bacteroides, por exemplo, fragalis e/ou thetaiotaomicron), Firmicutes e/ou bactérias gram positivas ou negativas em microbiota de um ser humano.

[1008] Em um exemplo, os vetores ou a composição da invenção compreende uma sequência de nucleotídeos para expressar na célula hospedeira uma endolisina para lise de células hospedeiras, opcionalmente em que a endolisina é uma endolisina de fago phi11, fago Twort, fago P68, fago phiWMY ou fago K (por exemplo, endolisina MV-L ou endolisina P-27/HP).

[1009] Em um exemplo, o local-alvo é compreendido por um cromossoma de cada célula hospedeira do micróbio, por exemplo, em que a sequência é composta por um gene de resistência aos antibióticos, um gene de virulência ou um gene essencial da célula hospedeira. Um exemplo fornece os vetores da invenção em combinação com um agente antibiótico (por exemplo, um antibiótico beta-lactâmico), por exemplo, em que os vetores visam uma sequência de protoespaçador composto por um gene de resistência a antibióticos composto por genoma de células hospedeiras ou epissoma (por exemplo, um plasmídeo composto pelas células hospedeiras). Em um exemplo, o epissome é um plasmídeo, transpóson, elemento genético móvel ou sequência viral (por exemplo, sequência de fago ou profago).

[1010] Em um exemplo, o alvo é uma sequência cromossômica, uma sequência endógena de células hospedeiras, uma sequência de células hospedeiras do tipo selvagem, uma sequência de células hospedeiras cromossômicas não virais, não uma sequência exógena e/ou uma sequência de não fagos (isto é, mais uma ou todas estas), por exemplo, a sequência é uma sequência de células cromossômicas do tipo selvagem, como o gene de resistência a antibióticos ou a sequência de genes essenciais, composta por um cromossoma de células hospedeiras. Em um exemplo, a sequência é uma sequência de plasmídeos de células hospedeiras, por exemplo, uma sequência de genes de resistência a antibióticos.

[1011] Opcionalmente, a nuclease é uma Cas e o local-alvo é composto por uma sequência de protoespaçadores que é adjacente a um motivo adjacente ao protoespaçador (PAM) NGG, NAG, NGA, NGC, NGNG, NGRRT ou NNAAW, por exemplo, um PAM AAAGAAA ou TAAGAAA (essas sequências são escritas de 5' a 3'). Em uma modalidade, o PAM é imediatamente adjacente à extremidade 3’ da sequência do protoespaçador. Em um exemplo, a Cas é uma Cas de S aureus, S theromophilus ou S pyogenes. Em um exemplo, a Cas é Cpf1 e/ou o PAM é TTN ou CTA. Opcionalmente, a Cas é uma Cas do sistema CRISPR Tipo I (por exemplo, Tipo I-A, I-B, I-C, I-D, I-E ou I-F). Opcionalmente, a Cas é uma Cas do sistema CRISPR Tipo II.

Opcionalmente, a Cas é uma Cas do sistema CRISPR Tipo IIII. Opcionalmente, a Cas é uma Cas do sistema CRISPR Tipo IV. Opcionalmente, a Cas é uma Cas do sistema CRISPR Tipo V. Opcionalmente, a Cas é uma Cas do sistema CRISPR Tipo VI.

[1012] Opcionalmente, a nuclease é uma Cas e cada vetor compreende uma matriz de CRISPR cognato que compreende várias cópias do mesmo espaçador para o local-alvo. Opcionalmente, é fornecido um vetor ou uma pluralidade de vetores da invenção, em que o(s) vetor(es) compreende uma pluralidade de matriz CRISPR das ditas sequências de codificação de gRNA para o direcionamento da sequência de protoespaçadores de células hospedeiras, em que os protoespaçadores compreendem o local-alvo. Opcionalmente, o vetor ou cada vetor inclui duas, três ou mais cópias de sequências de ácidos nucleicos que codificam crRNAs (por exemplo, gRNAs), em que as cópias compreendem a mesma sequência de espaçadores para direcionar um local-alvo de células hospedeiras (por exemplo, um local composto por uma sequência de virulência, resistência ou de genes essenciais).

[1013] Em um exemplo, pelo menos duas sequências alvo são modificadas pela Cas, por exemplo, um gene de resistência aos antibióticos e um gene essencial. A segmentação múltipla desta forma pode ser útil para reduzir a evolução da fuga das células hospedeiras mutantes.

[1014] Em um exemplo, a Cas é um nuclease Cas de células hospedeiras endógenas do tipo selvagem. Em um exemplo, o corte do local-alvo é realizado por uma nuclease Cas de dsDNA (por exemplo, uma Cas9, por exemplo, uma spCas9 ou saCas9), em que o reparo do corte é por junção de extremidade não homóloga (NHEJ); alternativamente a Cas é uma exonuclease ou Cas3.

[1015] Em um exemplo, a matriz, a sequência de codificação de gRNA ou o vetor não é combinado com uma sequência de codificação de endonuclease Cas que é naturalmente encontrada em uma célula junto com sequências repetidas da matriz ou sequência de codificação de gRNA.

[1016] Uma sequência de tracrRNA pode ser omitida de uma matriz ou vetor da invenção, por exemplo, para sistemas Cas de um tipo que não use tracrRNA, ou um tracrRNA endógeno pode ser usado com o cRNA codificado pelo vetor.

[1017] Em um exemplo, o local-alvo hospedeiro é compreendido por pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30 ou 40 nucleotídeos contíguos.

[1018] Em um exemplo, o ou cada vetor compreende um promotor exógeno funcional para a transcrição do crRNA ou do gRNA nos micróbios.

[1019] Opcionalmente, cada vetor é um plasmídeo, cosmídeo, vírus, virião, fago, fagemídeo ou profago. Por exemplo, a invenção fornece uma pluralidade de bacteriófago compreendendo uma pluralidade de vetores da invenção, por exemplo, em que os vetores são idênticos. Em um exemplo, o vetor é um vetor viral. Os vetores virais têm uma capacidade particularmente limitada para a inserção de DNA exógeno, assim é necessário considerar a capacidade de empacotamento do vírus. É necessário deixar espaço para sequências que codificam funções virais vitais, como para expressar proteínas de revestimento e polimerase. Em um exemplo, o vetor é um vetor de fago ou um AAV ou vetor lentiviral. Os vetores de fago são úteis onde o hospedeiro é uma célula bacteriana. Em um exemplo, o vetor é um vírus capaz de infectar uma célula hospedeira de arquea.

[1020] Opcionalmente, os componentes do vetor são compostos por um transpóson capaz de transferir para e/ou entre as células hospedeiras. O transpóson pode ser um transpóson como descrito em US201603333333348, GB1609811.3 e todos os pedidos equivalentes dos EUA; as revelações destes, incluindo estas revelações específicas de transpóson, são aqui incorporadas na sua totalidade e para a inclusão potencial de uma ou mais revelações em uma ou mais reivindicações contidas aqui.

[1021] Em um exemplo, o ou cada vetor é fornecido por uma nanopartícula ou em lipossomas.

[1022] Em um exemplo, a ou cada célula hospedeira (ou primeira e/ou segunda bactéria) é uma célula gram-positiva. Em um exemplo, a ou cada célula hospedeira é uma Enterobacteriaceae, por exemplo, células de Salmonella, Yersinia pestis, Klebsiella, Shigella, Proteus, Enterobacter, Serratia ou Citrobacter. Opcionalmente, a ou cada célula é uma célula de E coli (por exemplo, E coli K12) ou Salmonella (por exemplo, S enteric serovar typhimurium). Opcionalmente, a ou cada célula hospedeira (ou primeira e/ou segunda bactéria) é uma célula gram-negativa.

[1023] Opcionalmente, o hospedeiro (ou primeira e/ou segunda bactéria) é micoplasma, clamídia, espiroqueta ou micobactérias. Opcionalmente, o hospedeiro (ou a primeira e/ou segunda bactéria) é um hospedeiro Streptococcus (ex., piogenes ou termófilo). Opcionalmente, o hospedeiro (ou primeira e/ou segunda bactéria) é um hospedeiro Staphylococcus (ex., aureus, por exemplo, MRSA). Opcionalmente, o hospedeiro (ou a primeira e/ou segunda bactéria) é um hospedeiro da E. coli (ex., O157: H7). Opcionalmente, o hospedeiro (ou a primeira e/ou segunda bactéria) é um hospedeiro de Pseudomonas (ex., aeruginosa). Opcionalmente, o hospedeiro (ou primeira e/ou segunda bactéria) é um hospedeiro de Vibro (ex., cholerae (ex., O139) ou vulnificus). Opcionalmente, o hospedeiro (ou primeira e/ou segunda bactéria) é um hospedeiro de Neisseria (ex., gonnorrhoeae ou meningitidis). Opcionalmente, o hospedeiro (ou primeira e/ou segunda bactéria) é um hospedeiro de Bordetella (ex.,

pertussis). Opcionalmente, o hospedeiro (ou primeira e/ou segunda bactéria) é um hospedeiro de Haemophilus (ex., influenzae). Opcionalmente, o hospedeiro (ou primeira e/ou segunda bactéria) é um hospedeiro de Shigella (ex., disenteriae). Opcionalmente, o hospedeiro (ou primeira e/ou segunda bactéria) é um hospedeiro de Brucella (ex., abortus). Opcionalmente, o hospedeiro (ou primeira e/ou segunda bactéria) é um hospedeiro de Francisella.

Opcionalmente, o hospedeiro (ou primeira e/ou segunda bactéria) é um hospedeiro de Xanthomonas.

Opcionalmente, o hospedeiro (ou primeira e/ou segunda bactéria) é um hospedeiro de Agrobacterium.

Opcionalmente, o hospedeiro (ou primeira e/ou segunda bactéria) é um hospedeiro de Erwinia.

Opcionalmente, o hospedeiro (ou primeira e/ou segunda bactéria) é um hospedeiro de Legionella (ex., pneumophila). Opcionalmente, o hospedeiro (ou primeira e/ou segunda bactéria) é um hospedeiro de Listeria (por exemplo, monocytogenes). Opcionalmente, o hospedeiro (ou a primeira e/ou segunda bactéria) é um hospedeiro de Campylobacter (ex., jejuni). Opcionalmente, o hospedeiro (ou primeira e/ou segunda bactéria) é um hospedeiro de Yersinia (ex., pestis). Opcionalmente, o hospedeiro (ou primeira e/ou segunda bactéria) é um hospedeiro de Borelia (ex., burgdorferi). Opcionalmente, o hospedeiro (ou a primeira e/ou segunda bactéria) é um hospedeiro de Helicobacter (ex., pylori). Opcionalmente, o hospedeiro (ou a primeira e/ou segunda bactéria) é um hospedeiro de Clostridium (ex., dificile ou botulinum). Opcionalmente, o hospedeiro (ou primeira e/ou segunda bactéria) é um hospedeiro de Erlichia (ex., chaffeensis). Opcionalmente, o hospedeiro (ou a primeira e/ou segunda bactéria) é um hospedeiro de Salmonella (ex., typhi ou enterica, ex, sorotipo typhimurium, ex, DT 104). Opcionalmente, o hospedeiro (ou primeira e/ou segunda bactéria) é um hospedeiro de Chlamydia (ex., pneumoniae). Opcionalmente, o hospedeiro (ou primeira e/ou segunda bactéria) é um hospedeiro de

Parachlamydia. Opcionalmente, o hospedeiro (ou primeira e/ou segunda bactéria) é um hospedeiro de Corynebacterium (ex., amycolatum). Opcionalmente, o hospedeiro (ou primeira e/ou segunda bactéria) é um hospedeiro de Klebsiella (ex., pneumoniae). Opcionalmente, o hospedeiro (ou primeira e/ou segunda bactéria) é um hospedeiro de Enterococcus (ex., faecalis ou faecim, ex., resistente à linezolida). Opcionalmente, o hospedeiro (ou a primeira e/ou segunda bactéria) é um hospedeiro de Acinetobacter (ex., baumannii, p.ex., multirresistente ao fármaco).

[1024] Opcionalmente, a invenção é para a redução do crescimento ou da proliferação de células hospedeiras em um ambiente (por exemplo, solo, uma composição compreendendo as referidas células hospedeiras e células de levedura), microbioma humano, animal ou vegetal. Isto é útil, por exemplo, quando o microbioma é de ocorrência natural.

[1025] Opcionalmente, a nuclease é uma Cas e o alvo é composto por uma sequência de protoespaçadores que compreende pelo menos 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 nucleotídeos contíguos imediatamente 3' de um PAM cognato no genoma da célula hospedeira, onde o PAM é selecionado de AWG, AAG, AGG, GAG e ATG. Uso não-médico, ex vivo & in vitro, etc

[1026] Em determinadas configurações, a observação inventiva da morte microbiana rápida e duradoura e da inibição do crescimento ou da proliferação através do corte de nuclease encontra aplicação em outros indivíduos que não os humanos e os animais (por exemplo, para tratar plantas ou culturas de leveduras), ou para o tratamento ex vivo ou in vitro de substratos, como superfícies industriais, fluidos e aparelhos. Assim, a invenção fornece ainda os seguintes conceitos. Qualquer outra característica aqui da invenção, suas configurações, aspectos, modalidades, opções e exemplos acima e em outros lugares aqui são combináveis mutatis mutandis com esses conceitos (incluindo para fornecer combinações de recursos nas reivindicações aqui).

[1027] Um conceito fornece: uso de uma nuclease, pluralidade de vírus, sistema, RNA guia, DNA ou vetor da invenção, na fabricação de uma composição para a realização de um método de tratamento conforme definido aqui, em que o indivíduo é um organismo diferente de um ser humano ou animal.

[1028] Um conceito fornece: uso de uma pluralidade, pluralidade de vírus, sistema, RNA guia, DNA ou vetor da invenção para a fabricação de uma composição para realização de um método ex vivo ou in vitro do tratamento de uma infecção microbiana de um substrato, em que a infecção microbiana é causada por micróbios de uma primeira espécie ou cepa e a nuclease é programável para cortar um sítio-alvo composto pelos genomas dos micróbios que infectaram o substrato, em que os micróbios da primeira espécie ou cepa são mortos, ou o crescimento ou proliferação dos micróbios é reduzido, o método de tratamento que compreende a exposição do indivíduo à nuclease em que a nuclease é programada para cortar o local-alvo, em que os genomas dos micróbios compreendidos pelo indivíduo são cortados e a infecção microbiana aguda do substrato é tratada.

[1029] Neste caso, o tratamento de uma infecção de um substrato pode significar o tratamento de uma população bacteriana (por exemplo, uma ou mais colônias) em uma superfície do substrato e/ou incorporada no material do substrato. Por exemplo, o tratamento pode ser o tratamento para matar bactérias na superfície de um aparelho ou equipamento industrial (por exemplo, equipamento médico, como um bisturi, dispositivo médico ou tubagem). Em outro exemplo, o substrato é um fluido (por exemplo, um líquido ou um gás), como um fluido médico ou produto de petróleo em forma líquida (por exemplo, um óleo ou fluido ou líquido de hidrocarboneto).

[1030] Um conceito fornece: uso de uma nuclease programável na fabricação de uma composição para realização de um método ex vivo ou in vitro do tratamento de uma infecção microbiana de um substrato, em que a infecção microbiana é causada por micróbios de uma primeira espécie ou cepa e a nuclease é programável para cortar um sítio-alvo composto pelos genomas dos micróbios que infectaram o substrato, em que os micróbios da primeira espécie ou cepa são mortos, ou o crescimento ou proliferação dos micróbios é reduzido, o método de tratamento compreendendo a exposição do indivíduo à nuclease em que a nuclease é programada para cortar o local-alvo, em que os genomas dos micróbios compreendidos pelo indivíduo são cortados e a infecção microbiana do indivíduo é tratada.

[1031] Opcionalmente, a nuclease (por exemplo, nuclease programada) e/ou um ácido nucleico que programa a nuclease para reconhecer e cortar o local-alvo é administrado ao indivíduo ou substrato em um primeiro tempo (T1) e um segundo tempo (T2), onde T2 é pelo menos 1 hora após T1. T1 e T2 podem ser conforme definidos aqui.

[1032] Opcionalmente, a infecção é reduzida em pelo menos 100 vezes nos primeiros 30 minutos (por exemplo, nos primeiros 15 minutos) do tratamento. Opcionalmente, a infecção é mantida em pelo menos 100 vezes por pelo menos 60 minutos (por exemplo, pelo menos 120 minutos) após expor o indivíduo à nuclease programada.

[1033] Opcionalmente, a redução na infecção persiste por pelo menos 30 minutos imediatamente após os primeiros 30 minutos do tratamento.

[1034] Opcionalmente, o método compreende a administração ao indivíduo ou substrato de um RNA ou um ácido nucleico que codifica um RNA para a expressão do RNA no indivíduo ou substrato, em que o RNA se complexa com a nuclease para programar a nuclease para cortar o local-alvo em micróbios compreendidos no indivíduo ou substrato.

[1035] Opcionalmente, a nuclease é administrada simultaneamente ou sequencialmente com o RNA ou o ácido nucleico ao indivíduo ou substrato.

[1036] Opcionalmente, o indivíduo ou substrato compreende a nuclease antes da administração do RNA ou do ácido nucleico.

[1037] Opcionalmente, uma pluralidade de vírus (por exemplo, fago) é administrada ao indivíduo ou substrato, no qual cada vírus compreende uma cópia do ácido nucleico, no qual os vírus infectam os micróbios compreendidos pelo indivíduo ou substrato para entregar a ele o ácido nucleico.

[1038] Opcionalmente, a razão de vírus administrados: micróbios é de 10 para 150.

[1039] Opcionalmente, a infecção é reduzida em pelo menos 90% por 1h ou mais, opcionalmente nos primeiros 30 minutos (por exemplo, nos primeiros 15 minutos) do tratamento.

[1040] Opcionalmente, a infecção é reduzida em pelo menos 100 vezes pelos primeiros 30 minutos (p.ex., pelos primeiros 15 minutos) do tratamento; e em que a redução da infecção em pelo menos 100 vezes é mantida por pelo menos 60 minutos (p.ex., pelo menos 120, 145 ou 180 minutos) após a exposição do indivíduo ou substrato à nuclease programada.

[1041] Opcionalmente, o indivíduo é uma planta; ou em que o substrato é um substrato metálico, plástico, de concreto, de pedra, de madeira, de vidro ou de cerâmica. Opcionalmente, o indivíduo é um fluido (por exemplo, um líquido ou um gás).

[1042] Opcionalmente, os micróbios são bactérias ou arquea. Opcionalmente, as bactérias são bactérias gram-positivas. Opcionalmente, as bactérias são Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Legionella, Heamophilus, Ghonnorhea, Acinetobacter,

Escherichia, Klebsiella, Pseudomonas ou bactérias Stenotrophomonas (por exemplo, E. coli (p.ex., E coli EHEC), C dificile, V cólera, Staphylococcus (por exemplo, S aureus ou MRSA), Strepytococcus pyogenes, Acinetobacter baumannii, Legionella, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae bacteria).

[1043] Opcionalmente, a nuclease é uma nuclease Cas (por exemplo, uma Cas 3 ou 9), uma meganuclease, uma TALEN (nuclease efetora do tipo ativador de transcrição) ou nuclease do dedo de zinco.

[1044] Faz-se referência a WO2016177682, que discute aspectos da corrosão microbiologicamente influenciada (CMI) ou da bioincrustração de substratos e revela métodos para controle da CIM ou bioincrustração de um substrato. Os métodos, nucleases, matrizes, RNAs, vetores e vírus revelados nesse documento podem ser usados na presente invenção, por exemplo, para a realização do método ou uso da presente invenção e as revelações dessas partes e os substratos e bactérias revelados em WO2016177682 são aqui incorporados por referência para potencialmente fornecer a revelação de recursos possíveis para serem usados em uma ou mais reivindicações contidas aqui.

[1045] Opcionalmente, o uso da presente invenção é para controlar a corrosão microbiologicamente influenciada (MIC) ou a bioincrustração de um substrato em um sistema industrial ou doméstico (por exemplo, um sistema revelado em WO2016177682, cuja revelação é incorporada aqui por referência). Em um exemplo, o sistema inclui equipamento (por exemplo, para uso em um processo industrial) e a superfície é uma superfície do referido equipamento. Em um exemplo, a bioincrustração compreende a formação, a proliferação ou a manutenção do biofilme microbiano e/ou do lodo. Em um exemplo, os micróbios são sésseis. Em um exemplo, "controlar" compreende a prevenção, redução ou eliminação de CMI ou bioincrustração, ou a redução da propagação do

CMI ou bioincrustração no sistema. O crescimento ou a proliferação ou a manutenção de células são, por exemplo, uma característica da viabilidade celular. Assim, em um exemplo, o método reduz a proliferação e/ou manutenção de micróbios.

[1046] Opcionalmente, os micróbios são compostos por um biofilme microbiano que está em contato com o referido substrato. Opcionalmente, as referidas células de superfície e hospedeiras estão em contato com um fluido, como um líquido aquoso (por exemplo, água do mar, água doce, água armazenada ou água potável).

[1047] A água fresca é água de ocorrência natural na superfície da terra em folhas de gelo, em tampas de gelo, em geleiras, em icebergs, em pântanos, em lagoas, em lagos, em rios e córregos, e no subsolo como águas subterrâneas em aquíferos e em córregos subterrâneos. A água doce é geralmente caracterizada por ter baixas concentrações de sais dissolvidos e outros sólidos dissolvidos totais. O termo exclui especificamente a água do mar e a água salobra, embora inclua águas ricas em minerais, como águas de chalybeate. Em um exemplo a dita água fresca é qualquer destes tipos de água fresca. A água potável é a água destinada ao consumo humano ou animal (por exemplo, gado). Em um exemplo, o fluido é selecionado a partir de água de refrigeração industrial em que o sistema é um sistema de refrigeração; água de esgoto em que o sistema é um sistema de tratamento ou armazenamento de águas residuais; água potável em que o sistema é um sistema de processamento, armazenamento, transporte ou fornecimento de água potável; água de fabricação de papel em que o sistema é um sistema de fabricação ou processamento de papel; água de piscina em que o sistema é uma piscina ou tanque de água ou sistema de armazenagem; água de extintor de incêndio em que o sistema é um sistema de extinção de incêndio; ou água de processo industrial em qualquer tubo, tanque, cova, lagoa ou canal.

[1048] Opcionalmente, o uso é para controlar a acidificação bacteriana de um líquido em um reservatório ou recipiente), em que o fluido compreende uma população de primeiras células hospedeiras de uma primeira espécie microbiana que media a dita bioincrustração, o método compreendendo (i) colocar a população em contato com uma pluralidade de vetores capazes de transformar ou transduzir as células, cada vetor compreendendo uma matriz CRISPR em que as matrizes CRISPR são introduzidas nas células hospedeiras, em que (a) cada matriz CRISPR compreende uma ou mais sequências para a expressão de um crRNA e um promotor para a transcrição da(s) sequência(s) em uma célula hospedeira; e (b) cada crRNA é capaz de hibridizar para uma sequência- alvo de uma célula hospedeira para guiar a Cas (por exemplo, uma nuclease Cas) na célula hospedeira para modificar a sequência-alvo (por exemplo, para cortar a sequência-alvo); a sequência-alvo sendo uma sequência genética para mediar a viabilidade das células hospedeiras; e

[1049] em que o método compreende permitir a expressão de tais cRNAs na presença de Cas nas células hospedeiras, modificando assim as sequências alvo nas células hospedeiras, resultando na redução da viabilidade da célula hospedeira e no controle da dita bioincrustração.

[1050] Em um exemplo, o fluido é um líquido. Em um exemplo, o fluido é um fluido gasoso. Sistemas:

[1051] Um sistema exemplificador é selecionado do grupo que consiste em um:

[1052] Sistema petroquímico de recuperação, processamento, armazenagem ou transporte; sistema de recuperação, processamento, armazenamento ou transporte de hidrocarbonetos; sistema de recuperação, processamento, armazenamento ou transporte de petróleo bruto; sistema de recuperação, processamento, armazenamento ou transporte de gás natural (por exemplo, poço de petróleo, plataforma de petróleo, equipamento de perfuração de petróleo, sistema de bombeamento de petróleo, oleoduto, plataforma de gás, equipamento de extração de gás, equipamento de bobeamento de gás, gasoduto, petroleiro, navio-cisterna, equipamento de armazenamento de petróleo ou de armazenamento de gás); equipamento de processamento ou armazenamento de água; reservatório de água (por exemplo, reservatório de água potável); equipamento de ar ou de ar condicionado (por exemplo, refrigeração ou aquecimento), por exemplo, tubo de refrigeração, condensador ou trocador de calor; equipamento médico ou cirúrgico; equipamento de tratamento ambiental (por exemplo, solo, via navegável ou ar); equipamento de fabricação ou reciclagem de papel; usina elétrica, por exemplo, uma usina térmica ou nuclear; equipamento de armazenamento de combustível (por exemplo, combustível de hidrocarboneto, por exemplo, petróleo, diesel ou LPG); sistema de recuperação de mineral ou combustível, de minas ou metalúrgica, por exemplo, um equipamento de exploração de minas e mineração; sistema de engenharia; equipamento de transporte; equipamento de armazenamento de carga ou de mercadorias (por exemplo, um contêiner de carga); equipamento de fabricação, processamento ou embalagem de alimentos ou bebidas; equipamento de limpeza (por exemplo, equipamento de lavandaria, por exemplo, máquina de lavar roupa ou máquina de lavar louça); equipamento de catering (por exemplo, catering doméstico ou comercial); equipamento de agricultura; equipamento de construção (por exemplo, construção, infraestruturas de serviços públicos ou construção de estradas); equipamento de aviação; equipamento aeroespacial; equipamento de transporte (por exemplo, um veículo a motor (por exemplo, um automóvel, caminhão ou van); um vagão; uma aeronave (por exemplo, um avião) ou um veículo marítimo ou fluvial (por exemplo, um barco ou navio, submarino ou aerobarco); equipamento de embalagem, por exemplo, equipamento de embalagem de bens de consumo; equipamento de embalagem de alimentos ou bebidas; equipamentos eletrônicos (por exemplo, um computador ou celular ou um componente eletrônico dos mesmos); ou equipamento de fabricação ou embalagem de componentes eletrônicos; equipamento odontológico; tubagens industriais ou domésticas (por exemplo, um tubo subaquático) ou um reservatório de armazenamento (por exemplo, um depósito de água ou um depósito de combustível (por exemplo, um depósito de gasolina, por exemplo, um depósito de gasolina de um veículo); equipamento subterrâneo; edifício (por exemplo, uma habitação ou escritórios ou instalações comerciais ou uma fábrica ou central elétrica); estrada; ponte; equipamento agrícola; sistema de fábrica; petróleo bruto ou equipamento de exploração de gás natural; sistema de escritório; e um sistema doméstico.

[1053] Por exemplo, o sistema é usado em uma indústria ou negócios selecionados do grupo que consiste em agricultura, indústria de petróleo ou petrolífera, indústria alimentar ou de bebidas, indústria de vestuário, indústria de embalagens, indústria eletrônica, indústria de informática, indústria ambiental, indústria química, indústria aeroespacial, indústria de automóvel, indústria biotecnológica, indústria médica, indústria de cuidados de saúde, indústria odontológica, indústria de energia, indústria de produtos de consumo, indústria farmacêutica, indústria mineira, indústria de limpeza, indústria florestal, indústria pesqueira, indústria de lazer, indústria de reciclagem, indústria cosmética, indústria de plásticos, indústria de celulose ou papel, indústria têxtil, indústria de vestuário, indústria de couro ou camurça ou de peles de animais, indústria tabaqueira e indústria siderúrgica. Em um exemplo, a superfície ou o fluido a ser tratado é uma superfície ou um fluido do equipamento usado na dita indústria selecionada. Em um exemplo, o sistema é usado na indústria de petróleo bruto. Em um exemplo, o sistema é usado na indústria de gás natural. Em um exemplo, o sistema é usado na indústria de petróleo. Por exemplo, o sistema é um contêiner marítimo, plataforma ou equipamento (por exemplo, plataforma de petróleo ou gás ou equipamento para uso no mar), navio ou barco. Em uma modalidade, tal sistema está ancorado no mar; por exemplo, ancorado não temporariamente no mar, por exemplo, foi ancorado no mar por 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9,10, 11, 12, 13,14,15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou mais meses (por exemplo, meses contíguos). Em uma modalidade, tal sistema encontra-se nas águas de um país ou de um Estado; por exemplo, não temporariamente no mar em tais águas, por exemplo, tem estado em águas do referido país por 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9,10, 11, 12, 13,14,15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou mais meses (por exemplo, meses contíguos).

[1054] Em um exemplo, a superfície do substrato a ser tratada compreende aço inoxidável, aço de carbono, cobre, níquel, latão, alumínio, concreto, plástico ou madeira. Em um exemplo, o substrato é uma solda ou junção de metal. Em um exemplo, a superfície é uma superfície metálica (por exemplo, aço ou ferro) ou não metálica (por exemplo, plástico, concreto, asfalto, madeira, borracha ou pedra). Em um exemplo, o metal é uma liga (por exemplo, aço inoxidável, latão ou uma liga de níquel, zinco, cobre ou alumínio). Em um exemplo, a superfície é uma superfície de polímero artificial. Em um exemplo, a superfície é um revestimento de substrato. Em um exemplo, o substrato está em contato com o solo, água doce ou água do mar.

[1055] Em um exemplo, o fluido é água potável; um curso de água; água salobra; ou um combustível líquido, por exemplo, gasolina ou diesel (por exemplo, para um automóvel ou veículo motorizado), LPG,

querosene, um álcool (por exemplo, etanol, metanol ou butanol), hidrogênio líquido ou amoníaco líquido), em um exemplo, o combustível é combustível líquido armazenado. Em um exemplo, o fluido é um óleo ou líquido não aquoso. Em um exemplo, o líquido é um líquido composto por um curso de água ou uma massa de água, por exemplo, água do mar, água fresca, água potável, um rio, um córrego, uma lagoa, um lago, um reservatório, água armazenada (por exemplo, em um tanque de armazenamento de água ou equipamento refrigerando), água subterrânea, água de poço, água em uma formação de rocha, água do solo ou água de chuva. Em um exemplo, o líquido é água do mar. Em um exemplo, o substrato está em contato com um líquido mencionado neste parágrafo. Por exemplo, o fluido ou líquido é selecionado a partir do grupo consistindo em um óleo, uma solução aquosa, um fluido de fraturamento hidráulico, um combustível, dióxido de carbono, um gás natural, uma mistura óleo/água, uma mistura de combustível/água, água contendo sais, água do oceano ou do mar, água salobra, fontes de água doce, lagos, rios, córregos, brejos, lagoas, pântanos, escoamento de água da descongelação de neve ou gelo, nascentes, águas subterrâneas, aquíferos, precipitação, qualquer substância que seja líquida à temperatura ambiente (por exemplo, na rtp) e hidrofóbica, mas solúvel em solventes orgânicos, hexanos, benzeno, tolueno, clorofórmio, éter dietílico, óleos vegetais, óleos petroquímicos, petróleo bruto, produtos petroquímicos refinados, óleos essenciais voláteis, combustíveis fósseis, gasolina, misturas de hidrocarbonetos, combustível de jato, combustível de foguete, biocombustíveis. Em um exemplo, o fluido é uma mistura de óleo/água.

[1056] Os termos "corrosão microbiologicamente influenciada" ou "CMI", conforme usado aqui, salvo especificação em contrário, referem- se a processos nos quais qualquer elemento (substrato) de um sistema é estruturalmente comprometido devido à ação de pelo menos um membro de uma população microbiana, por exemplo, de uma população bacteriana ou arqueal. O termo "bioincrustração", como usado aqui, salvo especificação em contrário, refere-se a processos nos quais microrganismos se acumulam (como bactérias e/ou arquea) em uma superfície de substrato em contato com um fluido (por exemplo, água ou um líquido aquoso, ou um hidrocarboneto ou um petroquímico). Inclui-se também a acumulação e proliferação indesejáveis de microorganismos (como bactérias e/ou arquea) em um fluido (por exemplo, água ou líquido aquoso, ou um hidrocarboneto, ou um petroquímico), ou seja, "acidificação" do fluido. Em um exemplo, as bactérias são compostas por água de lastro do navio ou do barco e as bactérias são ambientalmente indesejáveis. O termo "substrato", como usado aqui, refere-se a qualquer tipo de superfície em que as células possam ser ligadas e em que um biofilme possa formar-se e crescer ou em que possa ocorrer bioincrustração (por exemplo, formação de lodo ou lama). O substrato pode ser um substrato "industrial", como a superfície do equipamento em um sistema de tubulação petroquímico, de combustível, de petróleo bruto ou de gás, ou um substrato "não industrial" (por exemplo, doméstico, por exemplo, doméstico ou de escritório), como um balcão de cozinha ou um substrato de chuveiro ou um substrato de jardim.

[1057] Em uma alternativa, em vez de uma população de células bacterianas hospedeiras, a população é uma população de células arqueais de uma primeira espécie.

[1058] Opcionalmente, esse fluido é um líquido aquoso (por exemplo, água do mar, água doce, água armazenada ou água potável).

[1059] Em uma alternativa, os micróbios são células de algas.

[1060] Opcionalmente, os micróbios são células de bactérias redutoras de sulfato (SRB) (por exemplo, células Desulfovibrio ou Desulfotomaculum). Em um exemplo, as células são selecionadas do grupo consistindo em células de Desulfotomaculum nigrificans, Desulfacinum infernum, Thermodesulfobacterium mobile, Thermodesulforhabdus norvegicus, Archaeoglobus fulgidus, Desulfomicrobium apsheronum, Desulfovibrio gabonensis, Desulfovibrio longus, Desulfovibrio vietnamensis, Desulfobacterium cetonicum, Desulphomaculum halophilum, Desulfobacter vibrioformis e Desulfotomaculum thermocisternum. Em um exemplo, a população compreende uma mistura de duas ou mais destas espécies de células.

[1061] Opcionalmente, a superfície ou o fluido é composto por um equipamento de recuperação, processamento, armazenamento ou transporte de petróleo bruto, gás ou petroquímicos. O petróleo bruto é um dos recursos energéticos mais importantes do mundo. É usado como matéria-prima em várias indústrias, incluindo a indústria petroquímica de refinarias, onde o petróleo bruto é refinado através de vários processos tecnológicos em produtos de consumo, como gasolina, óleos, óleos de parafina, lubrificantes, asfalto, óleo combustível doméstico, vaselina e polímeros. Os produtos derivados do petróleo também são normalmente usados em muitos outros processos químicos. Em uma alternativa, o fluido é um dito produto de consumo ou a superfície está em contato com tal produto de consumo.

[1062] Opcionalmente, a superfície está em contato com a água do mar, um líquido de fraturamento ou líquido em um poço; ou em que o fluido é água do mar, um líquido de fraturamento ou líquido em um poço.

[1063] Opcionalmente, a etapa (i) do método consiste em fornecer uma população de células microbianas de uma segunda espécie (segunda célula hospedeira), as segundas células compreendendo os referidos vetores, em que os vetores são capazes de transferir da segunda célula hospedeira para a primeira célula hospedeira; e combinando as segundas células hospedeiras com as primeiras células hospedeiras, por meio das quais os vetores são introduzidos nas primeiras células hospedeiras. Em um exemplo, a(s) segunda(s) célula(s) é(são) ambientalmente, industrialmente ou domesticamente aceitável(is), em um ambiente (por exemplo, em um ambiente de água ou solo) e a(s) primeira(s) célula(s) hospedeira(s) não é(são) aceitável(is) no ambiente.

[1064] Opcionalmente, as primeiras células hospedeiras são compostas por uma mistura de células microbianas (por exemplo, compostas por um biofilme microbiano) antes do contato com os referidos vetores, em que a mistura compreende células da segunda espécie.

[1065] Opcionalmente, a segunda espécie é uma espécie de Bacillus ou bactérias redutoras de nitrato ou bactérias oxidantes sulfuretos redutores de nitrato (NRB).

[1066] Opcionalmente, o NRB é selecionado do grupo consistindo em Campylobacter sp., Nitrobacter sp., Nitrosomonas sp., Thiomicrospira sp., Sulfurospirillum sp., Thauera sp., Paracoccus sp., Pseudomonas sp., Rhodobacter sp. e Desulfovibrio sp; ou compreende pelo menos 2 dessas espécies.

[1067] Opcionalmente, o NRB é selecionado a partir do grupo consistindo em Nitrobacter vulgaris, Nitrosomonas europea, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas aeruginosa, Paracoccus denitrificans, Sulfurospirillum deleyianum e Rhodobacter sphaeroides.

[1068] Opcionalmente, o método consiste em contatar as células hospedeiras da referida primeira espécie com um biocida simultaneamente ou sequencialmente com esses vetores. Em um exemplo, os vetores e biocidas são fornecidos pré-misturados em uma composição que é contactada com as células hospedeiras.

[1069] Opcionalmente, o biocida é selecionado a partir do grupo consistindo em sulfato de tetraquis hidroximetilfosfonio (THPS), glutaraldeído, monóxido de cloro, dióxido de cloro, hipoclorito de cálcio,

hipoclorito de potássio, hipoclorito de sódio, dibromoproprionamida (DBNPA), metileno bis (tiocianato) (MBT), 2-(tiocianometiltio) benzotiazol (TCMTB), bronopol, 2-bromo-2-nitro-1,3-propanodiol (BNPD), cloreto de tributil tetradecil fosfônio (TTPC), taurinamida e seus derivados, fenóis, sais de amônio quaternário, agentes contendo cloro, sais de quinaldínio, lactonas, corantes orgânicos, tiosemicarbazonas, quinonas, carbamatos, ureia, salicilamida, carbanilida, guanida, amidinas, imidazolinas, ácido acético, ácido benzóico, ácido sórbico, ácido propiônico, ácido bórico, ácido desidroacético, ácido sulfuroso, ácido vanílico, ésteres de p-hidroxibenzoato, isopropanol, propilenoglicol, álcool benzílico, clorobutanol, álcool feniletílico, formaldeído, iodo e suas soluções, povidona-iodo, hexametilenotetramina, noxitiolina, cloreto de 1-(3-cloroalil)-3,5,7-triazo- 1-azoniaadamantano, taurolidina, taurultam, N-(5-nitro-2-furfurilideno)- 1-amino-hidantoína, 5-nitro-2-furaldeído semicarbazona, 3,4,4'- triclorocarbanilida, 3,4',5-tribromossalicilanilida, 3-trifluorometil-4,4'- diclorocarbanilida, 8-hidroxiquinolina, ácido 1-ciclopropil-6-fluoro-1,4-di- hidro-4-oxo-7-(1-piperazinil)-3-quinolinocarboxílico, ácido 1,4-di-hidro- 1-etil-6-fluoro-4-oxo-7-(1-piperazinil)-3-quinolinocarboxílico, peróxido de hidrogênio, ácido peracético, oxicloroseno de sódio, paraclorometaxilenol, 2,4,4'-tricloro-2'-hidroxidifenol, timol, clorexidina, cloreto de benzalcônio, cloreto de cetilpiridínio, sulfadiazina de prata, nitrato de prata, bromo, ozônio, isotiazolonas, polioxietileno (dimetilimino) etileno (dimetilimino) dicloreto de etileno, 2-(terc- butilamino) -4-cloro-6-etilamino-5'-triazina (terbutilazina), e suas combinações. Em um exemplo, o biocida é o sulfato de tetraquis hidroximetil fosfônio (THPS). Em um exemplo, o biocida é um composto de amônio quaternário.

[1070] Opcionalmente, o sistema é usado em uma operação industrial selecionada do grupo que consiste em exploração de minas;

transporte; recuperação ou processamento de petróleo bruto, gás ou petroquímica; fraturamento hidráulico; aquecimento ou arrefecimento de ar ou água; produção, armazenamento ou fornecimento de água potável; transporte de hidrocarbonetos; e tratamento de águas residuais.

[1071] Opcionalmente, a superfície é uma superfície de equipamento usado na indústria selecionada; ou onde o fluido é um fluido composto por equipamento usado na indústria selecionada.

[1072] Opcionalmente, a superfície é uma superfície de cozinha, banho ou equipamento de jardinagem; ou em que o fluido é composto por cozinha, equipamento de banho ou jardinagem. Por exemplo, o equipamento é utilizado numa configuração doméstica.

[1073] Opcionalmente, o fluido é um líquido potável contido num recipiente (por exemplo, um depósito de água ou uma garrafa) e a superfície é uma superfície do contêiner em contato com o líquido.

[1074] Opcionalmente, cada vetor compreende um elemento genético móvel (MGE), no qual o MGE compreende uma origem de transferência (Orit) e uma dita matriz CRISPR; na qual o MGE é capaz de transferir entre uma célula hospedeira da referida primeira espécie e uma outra célula hospedeira microbiana no referido sistema industrial ou doméstico. Por exemplo, a(s) célula(s) adicional(ais) é(são) ambientalmente, industrialmente ou domesticamente aceitável(is), em um ambiente (por exemplo, em um ambiente de água ou solo) e a(s) primeira(s) célula(s) hospedeira(s) não é(são) aceitável(is) no ambiente. Opcionalmente, o oriT é funcional na primeira e outras células hospedeiras.

[1075] Opcionalmente, a primeira e outras células hospedeiras são compostas por um biofilme de fluido em contato com essa superfície; ou em que essas células são compostas por esse fluido.

[1076] Opcionalmente, cada MGE é ou compreende um elemento integrativo e conjugado (ICE); ou em que cada vetor é um fago capaz de infectar células hospedeiras da primeira espécie e cada MGE é um ácido nucleico de fago capaz de tal transferência entre as células. Opcionalmente, cada ICE é um transpóson, por exemplo, um transpóson conjugado. Opcionalmente, cada vetor é um plasmídeo, opcionalmente composto por um MGE como descrito aqui. Opcionalmente, as sequências são compostas por um transpóson conjugado da primeira célula e/ou célula adicional.

[1077] Por exemplo, o método é um método de controle da corrosão microbiologicamente influenciada (MIC) ou da bioincrustração de um substrato composto por um óleo bruto, gás ou petroquímicos, equipamento de processamento, armazenamento ou transporte (por exemplo, um petroleiro de petróleo bruto, uma plataforma de petróleo ou equipamento de perfuração de petróleo), em que uma superfície do substrato está em contato com uma população de primeiras células hospedeiras, em que as primeiras células hospedeiras são bactérias redutoras de enxofre ou sulfato (SRB), bactérias produtoras de substâncias poliméricas extracelulares (EPSB), bactérias produtoras de ácido (APB), bactérias oxidantes de enxofre ou sulfureto (SOBB), bactérias oxidantes de ferro (IOB), bactérias comburentes de manganês (MOB), bactérias oxidantes de manganês (MOB), bactérias produtoras de amoníaco (AmPB) ou bactérias produtoras de acetato (AcPB) de uma primeira espécie que media a CMI ou a bioincrustração do substrato, em que a superfície e a população de células estão em contato com um líquido selecionado a partir de água do mar, água fresca, um líquido de fraturamento ou líquido em um poço (por exemplo, poço de petróleo ou gás natural), o método compreendendo (i) colocar a população celular em contato com vetores ao misturar o líquido com uma pluralidade de vetores capazes de transformar ou transduzir as primeiras células hospedeiras, cada vetor compreendendo uma matriz CRISPR em que as matrizes CRISPR são introduzidas nas células hospedeiras, em que (a) cada matriz CRISPR compreende uma ou mais sequências para a expressão de um crRNA e um promotor para a transcrição da(s) sequência(s) em uma célula hospedeira; (b) cada crRNA é capaz de hibridizar para uma sequência- alvo de uma célula hospedeira para guiar a Cas (por exemplo, uma nuclease Cas, p.ex., uma Cas9 ou Cfp1) na célula hospedeira para modificar a sequência-alvo (por exemplo, para cortar a sequência-alvo); a sequência-alvo sendo uma sequência genética para mediar a viabilidade das células hospedeiras; (c) em que cada sequência de (a) compreende uma sequência R1-S1-R1' para expressão e produção do respectivo crRNA em uma primeira célula hospedeira, em que R1 é uma primeira repetição CRISPR, R1' é uma segunda repetição CRISPR e R1 ou R1' é opcional; e S1 é um primeiro espaçador de CRISPR que compreende ou consiste em uma sequência de nucleotídeos que é 70, 75, 80, 85, 90 ou 95% ou mais idêntica a uma sequência-alvo de uma referida primeira célula hospedeira e (ii) permitir a expressão de tais cRNAs na presença de Cas nas células hospedeiras, modificando assim as sequências alvo nas células hospedeiras, resultando na redução da viabilidade da célula hospedeira e no controle de CMI ou bioincrustração do referido substrato. Em uma modalidade, tanto R1 como R1' estão presentes.

[1078] Em um exemplo, o método é um método para controlar a bioincrustração bacteriana em água de lastre de um navio ou barco, em que a água compreende uma população de primeiras células hospedeiras de uma primeira espécie microbiana que media a dita bioincrustração, o método compreendendo

[1079] (i) colocar a população em contato com uma pluralidade de vetores capazes de transformar ou transduzir as células, cada vetor compreendendo uma matriz CRISPR em que as matrizes CRISPR são introduzidas nas células hospedeiras, em que (a) cada matriz CRISPR compreende uma ou mais sequências para a expressão de um crRNA e um promotor para a transcrição da(s) sequência(s) em uma célula hospedeira; e (b) cada crRNA é capaz de hibridizar para uma sequência- alvo de uma célula hospedeira para guiar a Cas (por exemplo, uma nuclease Cas) na célula hospedeira para modificar a sequência-alvo (por exemplo, para cortar a sequência-alvo); a sequência-alvo sendo uma sequência genética para mediar a viabilidade das células hospedeiras; e (ii) permitir a expressão de tais cRNAs na presença de Cas nas células hospedeiras, modificando assim as sequências alvo nas células hospedeiras, resultando na redução da viabilidade da célula hospedeira e no controle da referida bioincrustração.

[1080] Opcionalmente, as primeiras células hospedeiras são células de Vibrio cholerae, E. coli ou Enterococci sp.

[1081] Opcionalmente, a etapa (i) compreende a mistura da água de lastro com os vetores, por exemplo, no casco de um navio ou barco. Opcionalmente, o navio ou barco é um veículo marítimo e a água é água do mar. Opcionalmente, em vez de um navio ou barco, a água de lastro é composta por um contêiner ou uma plataforma de perfuração no mar, por exemplo, uma plataforma de óleo ou uma plataforma de óleo. Em um exemplo, o navio, barco, contêiner, plataforma ou equipamento está ancorado no mar (ou seja, não temporariamente na sua localização).

[1082] Em um exemplo, o método é um método de descarga de água de lastro de um navio ou barco, no qual a água descarregada de lastro é composta por água tratada pelo método. Opcionalmente, a água é descarregada para uma massa de água, por exemplo, um mar,

oceano ou via navegável (por exemplo, um rio, canal, lago ou reservatório) ou para um contêiner. PARÁGRAFOS:

[1083] A invenção fornece os seguintes parágrafos, que são suportados pelos Exemplos abaixo:

1. Uma nuclease Cas programável (por exemplo, Cas3 ou Cas9) para uso em um método de tratamento da infecção por E coli ou C difficile de um indivíduo, em que a nuclease Cas é programável com um RNA guia para cortar um local alvo composto pelos genomas de bactérias E coli ou C dificile que infectaram o indivíduo, em que as células de E coli ou C dificile são mortas, ou o crescimento ou a proliferação das células é reduzido, o método de tratamento as, no qual a nuclease é programada com RNA guia para cortar o local-alvo, em que os genomas das bactérias E coli ou C dificile compreendidos pelo indivíduo são cortados e a infecção do indivíduo é reduzida em pelo menos 100 vezes nos primeiros 30 minutos (por exemplo, nos primeiros 15 minutos) do tratamento.

2. Uma nuclease Cas programável (por exemplo, Cas3 ou Cas9) (opcionalmente de acordo com o parágrafo 1) para uso em um método de tratamento da infecção por E coli ou C difficile de um indivíduo, em que a nuclease Cas é programável com um RNA guia para cortar um local-alvo composto pelos genomas de bactérias E coli ou C dificile que infectaram o indivíduo, em que as células de E coli ou C dificile são mortas, ou o crescimento ou proliferação das células é reduzido, o método de tratamento compreendendo expor o indivíduo à nuclease Cas em que a nuclease é programada com RNA guia para cortar o local-alvo, através do qual os genomas das bactérias E coli ou C dificile compreendidos pelo indivíduo são cortados e a infecção do indivíduo é reduzida, em que uma redução da infecção em pelo menos 100 vezes é mantida durante pelo menos 60 minutos (por exemplo, pelo menos 120, 145 ou 180 minutos) após a exposição do indivíduo à nuclease programada.

3. A nuclease de qualquer parágrafo anterior, em que pelo menos 60% da infecção é reduzida em 60 minutos após expor o indivíduo à nuclease programada.

4. A nuclease de qualquer parágrafo anterior, em que a nuclease (por exemplo, nuclease programada) e/ou um ácido nucleico que codifica o RNA guia é administrado ao indivíduo pela primeira vez (T1) e pela segunda vez (T2), em que T2 é pelo menos 1 hora após T1.

5. A nuclease de qualquer parágrafo anterior, em que o método compreende reduzir a infecção de modo que a redução na infecção persiste por 30 minutos imediatamente após os primeiros 30 minutos do tratamento.

6. A nuclease de qualquer parágrafo anterior, em que o método compreende a administração ao indivíduo do RNA ou um ácido nucleico que codifica o RNA para a expressão do RNA no indivíduo, em que o RNA se complexa com a nuclease para programar a nuclease para cortar o local-alvo em micróbios compreendidos pelo indivíduo.

7. A nuclease de qualquer parágrafo anterior, em que a nuclease é administrada simultaneamente ou sequencialmente com o RNA ou ácido nucleico que codifica o RNA para o indivíduo.

8. A nuclease do parágrafo 7, em que o indivíduo compreende a nuclease antes da administração do RNA ou do ácido nucleico ao indivíduo.

9. A nuclease de qualquer parágrafo anterior, em que uma pluralidade de vírus (por exemplo, fago) é administrada ao indivíduo, no qual cada vírus compreende uma cópia de um ácido nucleico codificando o RNA, no qual os vírus infectam os micróbios compreendidos pelo indivíduo para entregar a ele o ácido nucleico.

10. A nuclease do parágrafo 9, em que a razão de vírus administrados: micróbios compreendidos pelo indivíduo é de 10 para

150.

11. A nuclease de acordo com qualquer parágrafo anterior, em que o indivíduo é um ser humano ou animal, opcionalmente em que o indivíduo é um ser humano com mais de 65 anos de idade ou é um paciente pediátrico.

12. A nuclease de acordo com o parágrafo 11, em que a infecção é uma infecção dos pulmões, abdômen ou trato urinário; ou em que o indivíduo foi submetido à cirurgia, está em um medicamento imunossupressor e/ou está sofrendo de uma doença crônica.

13. A nuclease de acordo com qualquer parágrafo anterior, em que a infecção é reduzida em pelo menos 90% por 1h ou mais, opcionalmente nos primeiros 30 minutos (por exemplo, nos primeiros 15 minutos) do tratamento.

14. A nuclease de acordo com qualquer parágrafo anterior, em que o método compreende reduzir a infecção em pelo menos 100 vezes pelos primeiros 30 minutos (p.ex., pelos primeiros 15 minutos) do tratamento; e em que a redução da infecção em pelo menos 100 vezes é mantida por pelo menos 60 minutos (p.ex., pelo menos 120, 145 ou 180 minutos) após a exposição do indivíduo à nuclease programada.

15. A nuclease de acordo com qualquer um dos parágrafos 11 a 14, em que o método trata ou previne a septicemia e/ou sepse (por exemplo, choque séptico) no indivíduo.

16. A nuclease do parágrafo 16, em que no início do tratamento, o indivíduo (por exemplo, um ser humano) tem uma temperatura de < 36 °C ou > 38 °C; uma frequência cardíaca > 90/min, uma frequência respiratória > 20 respirações/min ou PaCO2 < 4,3 kPa; e uma contagem de leucócitos de < 4000/mm³ ou > 12.000/mm³.

17. A nuclease do parágrafo 15 ou 16, em que no início do tratamento, o indivíduo (por exemplo, um ser humano) tem presença de dois ou mais dos seguintes: temperatura corporal anormal, frequência cardíaca anormal, frequência respiratória anormal, gás sanguíneo anormal e contagem anormal de leucócitos.

18. A nuclease de acordo com qualquer um dos parágrafos, em que o indivíduo é um ser humano ou animal e os micróbios são bactérias (por exemplo, E coli ou C dificile), em que a infecção sanguínea do indivíduo pelas bactérias é reduzida pelo menos 100 ou 1000 vezes nos primeiros 30 minutos (por exemplo, nos primeiros 15 minutos) do tratamento.

19. A nuclease de qualquer um dos parágrafos 11 a 18, em que o sangue do indivíduo é infectado com 107 a 1012 UFC/ml da bactéria imediatamente antes do tratamento.

20. A nuclease de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 10, em que o indivíduo é uma planta.

21. A nuclease de acordo com qualquer parágrafo anterior, onde as bactérias são compostas por um microbioma.

22. A nuclease, de acordo com o parágrafo 21, em que o microbioma compreende bactérias de Lactobacillus e/ou Streptococcus.

23. A nuclease de acordo com qualquer parágrafo anterior, em que a E coli é E coli EHEC.

24. A nuclease de acordo com qualquer parágrafo anterior, em que a nuclease é uma nuclease Cas (por exemplo, uma Cas 3 ou 9), uma meganuclease, uma TALEN (nuclease efetora do tipo ativador de transcrição) ou nuclease do dedo de zinco.

25. Uma pluralidade de vírus (por exemplo, fagos ou fagemídeos para produzir fago) para uso com a nuclease, de qualquer um dos parágrafos anteriores, no método de tratamento, em que cada vírus compreende uma cópia de um ácido nucleico que codifica o RNA, em que os vírus são capazes de infectar micróbios compreendidos pelo indivíduo para entregar-lhe o ácido nucleico.

26. Uma composição compreendendo uma pluralidade de ácidos nucleicos para a programação da nuclease, de qualquer um dos parágrafos 1 a 24, no método de tratamento, em que cada ácido nucleico é um ácido nucleico como definido em qualquer um dos parágrafos 6 a 9.

27. Um sistema CRISPR/Cas compreendendo uma nuclease, de acordo com qualquer parágrafo anterior, para uso no método de tratamento, em que a nuclease é uma nuclease Cas (por exemplo, uma Cas 3 ou 9) e o sistema compreende um ou mais RNAs guia ou DNA que codifica um ou mais RNAs guia, em que cada RNA guia é capaz de programar a nuclease Cas para cortar um local-alvo composto pelos genomas dos micróbios.

28. Um RNA guia ou um DNA que codifica um RNA guia para uso no sistema do parágrafo 27 para uso no método de tratamento de uma infecção microbiana aguda no indivíduo, por exemplo, septicemia ou sepse.

29. Um vetor do ácido nucleico compreendendo o RNA guia ou DNA, mencionado no parágrafo 27 ou 28.

30. O vetor do parágrafo 29, em que o vetor é um fago, fagemídeo, viriofago, vírus, plasmídeo (por exemplo, plasmídeo conjugado) ou transpóson.

31. Uma composição anti-sepse ou anti-septicemia para a administração a um ser humano ou animal para o tratamento da sepse ou septicemia, a composição compreendendo uma pluralidade de vetores, em que cada vetor está de acordo com o parágrafo 29 ou 30.

32. Um método de tratamento de uma infecção microbiana aguda de um indivíduo, no qual o método é definido por qualquer parágrafo anterior.

33. Uso de uma nuclease, pluralidade de vírus, sistema, RNA guia, DNA ou vetor, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 25 e 27 a 30, na fabricação de uma composição para a realização de um método de tratamento conforme definido em qualquer um dos parágrafos anteriores, em que o indivíduo é um organismo diferente de um ser humano ou animal.

34. Uso de uma pluralidade, pluralidade de vírus, sistema, RNA guia, DNA ou vetor, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 25 e 27 a 30, para a fabricação de uma composição para realização de um método ex vivo do tratamento de uma infecção microbiana de um substrato, em que a infecção microbiana é causada por micróbios de uma primeira espécie ou cepa e a nuclease é programável para cortar um sítio-alvo composto pelos genomas dos micróbios que infectaram o substrato, em que os micróbios da primeira espécie ou cepa são mortos, ou o crescimento ou proliferação dos micróbios é reduzido, o método de tratamento que compreende a exposição do indivíduo à nuclease em que a nuclease é programada para cortar o local-alvo, em que os genomas dos micróbios compreendidos pelo indivíduo são cortados e a infecção microbiana aguda do substrato é tratada.

35. Uso de uma nuclease programável na fabricação de uma composição para realização de um método ex vivo ou in vitro do tratamento de uma infecção microbiana de um substrato, em que a infecção microbiana é causada por micróbios de uma primeira espécie ou cepa e a nuclease é programável para cortar um sítio-alvo composto pelos genomas dos micróbios que infectaram o substrato, em que os micróbios da primeira espécie ou cepa são mortos, ou o crescimento ou proliferação dos micróbios é reduzido, o método de tratamento compreendendo a exposição do indivíduo à nuclease em que a nuclease é programada para cortar o local-alvo, em que os genomas dos micróbios compreendidos pelo indivíduo são cortados e a infecção microbiana do indivíduo é tratada.

36. O uso do parágrafo 33, 34, 35, em que a nuclease (por exemplo, nuclease programada) e/ou um ácido nucleico que programa a nuclease para reconhecer e cortar o local-alvo é administrado ao indivíduo ou substrato em um primeiro tempo (T1) e um segundo tempo (T2), onde T2 é pelo menos 1 hora após T1.

37. O uso de qualquer um dos parágrafos 33 a 36, em que a infecção é reduzida em pelo menos 100 vezes nos primeiros 30 minutos (por exemplo, nos primeiros 15 minutos) do tratamento.

38. O uso de qualquer um dos parágrafos 33 a 37, em que a redução da infecção é mantida em pelo menos 100 vezes por pelo menos 60 minutos (por exemplo, pelo menos 120 minutos) após expor o indivíduo à nuclease programada.

39. O uso de qualquer um dos parágrafos 33 a 38, em que a redução da infecção persiste por 30 minutos imediatamente após os primeiros 30 minutos do tratamento.

40. O uso de qualquer um dos parágrafos 33 a 39, em que o método compreende a administração ao indivíduo ou substrato de um RNA ou um ácido nucleico que codifica um RNA para a expressão do RNA no indivíduo ou substrato, em que o RNA se complexa com a nuclease para programar a nuclease para cortar o local-alvo em micróbios compreendidos no indivíduo ou substrato.

41. Uso do parágrafo 40, em que a nuclease é administrada simultaneamente ou sequencialmente com o RNA ou o ácido nucleico ao indivíduo ou substrato.

42. Uso do parágrafo 40, em que o indivíduo ou o substrato compreende a nuclease antes da administração do RNA ou do ácido nucleico.

43. Uso de qualquer um dos parágrafos 40 a 42, em que uma pluralidade de vírus (por exemplo, fago) é administrada ao indivíduo ou substrato, no qual cada vírus compreende uma cópia do ácido nucleico, no qual os vírus infectam os micróbios compreendidos pelo indivíduo ou substrato para entregar a ele o ácido nucleico.

44. Uso do parágrafo 43, em que a razão de vírus administrados: micróbios é de 10 para 150.

45. Uso de qualquer um dos parágrafos 33 a 44, em que a infecção é reduzida em pelo menos 90% durante 1 hora pu mais, opcionalmente nos primeiros 30 minutos (por exemplo, nos primeiros 15 minutos) do tratamento.

46. Uso de qualquer um dos parágrafos 44 a 45, em que a infecção é reduzida em pelo menos 100 vezes nos primeiros 30 minutos (por exemplo, nos primeiros 15 minutos) do tratamento; e em que a redução da infecção em pelo menos 100 vezes é mantida por pelo menos 60 minutos (p.ex., pelo menos 120, 145 ou 180 minutos) após a exposição do indivíduo ou substrato à nuclease programada.

47. Uso de qualquer um dos parágrafos 33 a 46, em que o indivíduo é uma planta; ou em que o substrato é um substrato metálico, plástico, de concreto, de pedra, de madeira, de vidro ou de cerâmica.

48. O uso de qualquer um dos parágrafos 33 a 47, em que os micróbios são bactérias.

49. O uso de acordo com o parágrafo 48, em que as bactérias são bactérias gram-positivas.

50. Uso de acordo com o parágrafo 48 ou 49, em que as bactérias são Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Legionella, Heamophilus, Ghonnorhea, Acinetobacter, Escherichia, Klebsiella, Pseudomonas ou bactérias Stenotrophomonas (por exemplo, E. coli (p.ex., E coli EHEC), C dificile, V cólera, Staphylococcus (por exemplo, S aureus ou MRSA), Strepytococcus pyogenes, Acinetobacter baumannii, Legionella, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae bacteria).

51. so de acordo com qualquer um dos parágrafos 33 a 50, em que a nuclease é uma nuclease Cas (por exemplo, uma Cas 3 ou

9), uma meganuclease, uma TALEN (nuclease efetora do tipo ativador de transcrição) ou nuclease do dedo de zinco.

TRATAMENTO DE INFECÇÕES BACTERIANAS PATOGÊNICAS

[1084] As complicações infecciosas são uma causa grave de morbilidade e mortalidade em pacientes oncológicos, especialmente naqueles com malignidades hematológicas subjacentes, onde estudos de autópsia demonstram que cerca de 60% dos óbitos estão relacionados com a infecção. Embora existam menos dados sobre a mortalidade infecciosa em pacientes com tumores de órgãos sólidos, estima-se que cerca de 50% destes pacientes tenham uma infecção como causa primária ou associada de morte (“Epidemiology of Infections in Cancer Patients”, em “Infectious Complications in Cancer Patients”, Springer International Publishing Switzerland (2014)). As infecções bacterianas dominam. Estas complicações infecciosas continuam a ser uma limitação significativa das modalidades de tratamento do câncer.

[1085] Os efeitos prejudiciais do tratamento clássico com antibióticos de largo espectro foram demonstrados em pacientes oncológicos tratados pelo inibidor do ponto de verificação imune (ICI). Routy et al investigaram como o microbioma intestinal influencia a eficácia da imunoterapia com base na PD-1 contra tumores epiteliais (Routy et al Science 2018, 359, 91-97). Neste trabalho, os autores também analisaram conjuntos de dados para infecções/uso de antibióticos em pacientes com NSCLC avançada (n =140), carcinoma de células renais (n= 67) ou carcinoma urotelial (n =42) que receberam ICI do anticorpo contra a interação PD-1/PD-L1 após uma ou várias terapias anteriores. Entre esses pacientes, foram prescritos antibióticos de amplo espectro (inibidores beta-lactâmicos +/−, fluoroquinolonas ou macrolídeos) em até 2 meses antes ou 1 mês após a primeira administração de mAb PD-1/PD-L1. Os pacientes geralmente tomaram antibiótico por via oral para indicações comuns (infecções dentárias, urinárias e pulmonares). Observou-se o efeito prejudicial do tratamento de infecções em pacientes oncológicos submetidos à terapia ICI com antibióticos clássicos de largo espectro. Ver figura 8, que mostra que o tratamento com antibióticos durante a terapia ICI tem resultados fatais: houve uma sobrevivência global mádia de 21,9 meses na ausência de tratamento com antibióticos, em comparação com uma sobrevivência global de 9,8 meses com tratamento com antibióticos. Assim, a sobrevida global mediana em pacientes tratados com antibióticos clássicos é < 50% (ou > 12 meses mais curta) da dos pacientes que não recebem tratamento com antibióticos.

[1086] O trabalho de Gopalakrishnan et al é outro exemplo recente que apoia a importância de um microbioma "saudável" nos resultados da terapia imunoncológica (Gopalakrishnan et al, Science 2018, 359, 97-103). Ver Figuras 9A e 9B. Observou-se que o microbioma intestinal modula a eficácia da inibição anti-PD-1 em pacientes com melanoma.

[1087] Vários outros estudos somam-se à base de evidências em expansão da ligação crítica entre os resultados da microbioma e da imunoncologia: • “Microbiota: a key orchestrator of cancer therapy”, Nat. Rev. Cancer 2017, 17, 271-285 • Matson et al, Science 2018, 359, 104–108 • L. Derosa et al Annals of Oncology 2018 (epub 30 de março 2018) • M. Vétizou et al Science. 2015, 350, 1079-84 • Sivan et al Science 2015, 350, 1084-1089

[1088] Outro relatório – que afirma ser a primeira revisão sistemática da infecção entre pacientes que recebem bloqueio do ponto de verificação imune para terapia de câncer– investigou infecções graves em indivíduos com melanoma tratados com inibidores do ponto de verificação imune (contra CTLA-4, PD-1 e/ou PD-L1) (M. Del Castillo et al Clin. Infect. Dis. 2016, 63, 1490-1493). As infecções graves foram definidas como infecções que requerem hospitalização ou antimicrobianos parenterais. Dos 740 pacientes (898 ciclos de bloqueio do ponto de verificação imune), a infecção grave foi desenvolvida em 54 pacientes (7,3%). Nove pacientes (17%) foram considerados como tendo morrido de uma infecção. O número total de infecções foi de 58, já que alguns pacientes desenvolveram infecção > 1. A maioria das infecções foi bacteriana na origem (~ 80%; ou seja, infecções bacterianas: 80% de 7,3%: 5,8% dos pacientes). As infecções por pneumonia e corrente sanguínea foram os dois tipos dominantes de infecção bacteriana.

[1089] Os fármacos bloqueadores do ponto de verificação imune são associados aos efeitos adversos imune-relacionados (irEAs) relacionados ao sistema imune regulado positivamente. As complicações são administradas com fármacos imunossupressores, como esteroides (a imunossupressão é um fator de risco para infecções oportunistas subsequentes). Dos 740 pacientes, 46% receberam esteroides durante o tratamento. O risco de infecções graves foi de 13,5% na coorte recebendo corticosteroides ou infliximabe (vs 7,3% na população total).

[1090] Em um outro relatório, foi investigada a preocupação emergente das doenças infecciosas em pacientes com câncer de pulmão que receberam a terapia ICI. Dos 84 pacientes com NSCLC que receberam nivolumabe (inibidor da PD-1), 20 pacientes (23,8%) desenvolveram doença infecciosa. As infecções bacterianas representaram 75% das infecções, ou seja, infecções bacterianas em 18% dos pacientes. O tipo mais comum de infecção bacteriana foi pneumonia. Ver K. Fujita et al Eur. Resp. J. 2017, 50, OA1478.

[1091] O bacilo gram-negativo da E. coli é uma das causas as mais comuns do bacteraemia em pacientes com câncer.

A taxa de mortalidade por todas as causas de 30 dias para este patógeno é alta (~ 15%) (Y.

E.

Ha et al Int J.

Antimicr.

Agen. 2013, 42, 403-409). As estimativas publicadas de mortalidade por 30 dias por todas as causas entre os pacientes com bacteremia de E. coli (câncer/não câncer) variam entre cerca de 10% e 35% (J.

K.

Abernethy et al Clin.

Microbiol.

Infect. 2015, 21, 251.e1–251.e8), destacando claramente a alta carga associada a apenas este patógeno.

Globalmente, os agentes patogênicos causadores da bacteremia são principalmente bactérias gram-negativas (65%), sendo a E. coli (18,3%), a P. aeruginosa (18,3%) e a K. pneumoniae (17,3%) os organismos mais comuns encontrados; os três agentes patogênicos em conjunto representam 54% dos casos de bacteremia, ou 85% dos casos gram-negativos, de acordo com um estudo que investigou > 100 casos de bacteremia em pacientes com câncer (G.

Samonis et al Support Care Cancer 2013, 21, 2521 – 2526). A mortalidade hospitalar foi de 26,2% neste estudo.

Números comparáveis podem ser encontrados em outro lugar.

Por exemplo, um estudo de pacientes oncológicos adultos neutropênicos e não- neutropênicos com infecções da corrente sanguínea investigou 399 casos de infecções da corrente sanguínea em 344 pacientes oncológicos: o maior grupo de patógenos causadores foi bacilos gram- negativos (45%). Dos isolados clínicos, E. coli (35%) foi o que mais contribuiu para os gram-negativos, seguido por K. pneumoniae (20%) e P. aeruginosa (19%) (E.

Velasco et al, Eur.

J.

Clin.

Microbiol.

Infect.

Dis. 2006, 25, 1-7). Os três agentes patogênicos representam coletivamente 33% dos casos de bacteremia (ou 74% dos casos gram negativos). A mortalidade global de 30 dias foi de 32% neste estudo.

Dois outros relatos examinaram os agentes causadores da infecção da corrente sanguínea em pacientes com tumores sólidos e também encontraram bactérias gram-negativas como o tipo dominando do patógeno (47-55%

das infecções, em várias centenas de pacientes) (M. Marín et al., Medicine 2014, 93, 143-149; M. Anatoliotaki et al., Infection 2004, 32, 65-71; ver também C. Gudiol et al., Virulence 2016, 7, 298-308). No maior dos dois estudos (com números mais robustos para patógenos individuais), os três principais patógenos do grupo gram-negativo foram novamente E. coli (55%), P. aeruginosa (18%) e Klebsiella spp. (11%) – correspondendo a 92% dos casos gram-negativos, ou 51% dos 528 casos totais de infecções da corrente sanguínea estudados.

[1092] Os dados apresentados acima sobre os agentes patogênicos infecciosos causadores específicos em indivíduos com câncer estão resumidos na Tabela 5 abaixo.

[1093] Assim, os dados disponíveis sobre as infecções da corrente sanguínea no câncer indicam que os agentes patogênicos gram- negativos estão envolvidos em 45-65% dos casos de infecção, sendo que três agentes patogênicos-chave – E. coli, K. pneumoniae, e P. aeruginosa – são os culpados na grande maioria dos casos gram- negativos (73-92%).

[1094] Assim, os inventores formularam o dilema de um oncologista: • A redução na eficácia da terapia do câncer é provavelmente devido à reduzida diversidade de microbiomas resultante de terapia com antibióticos • Pelo menos 1/3 dos pacientes em inibidores do ponto de verificação tiveram infecções sérias e de risco à vida • Não tratar essas infecções pode resultar em morte decorrente da infecção (1-2 semanas) • O tratamento com antibióticos clássicos leva à redução da sobrevida livre de progressão após 4 anos, de > 40% para cerca de 10%. • A escolha consiste em tratar a necessidade imediata de uma infecção potencialmente fatal (que deve ser tratada), com o risco de minar seriamente a terapia do câncer.

[1095] Os inventores perceberam, portanto, que há necessidade de métodos que possam tratar uma infecção patogênica bacteriana de uma forma diferente que minimize o comprometimento com a terapia oncológica. Os inventores perceberam que essa necessidade também seria útil em outros ambientes de terapia, onde a composição do microbioma pode modular os resultados da terapia, por exemplo, em ambientes de transplante.

[1096] Embora não desejando estar ligado por qualquer teoria particular, os inventores acreditam que aliviar o efeito prejudicial da antibioticoterapia tradicional sobre a sobrevivência global em pacientes ICI usando a invenção pode, em algumas modalidades, traduzir até uma duplicação da sobrevivência global (ou > 12 meses). Capturar um efeito de tratamento de vários meses em termos de sobrevivência global mediana é uma realização muito substancial neste espaço. De fato, uma dimensão de efeito desta ordem de grandeza é comparável aos resultados relatados para os ensaios da ICI (ou seja, quando os benefícios são geralmente medidos em meses, e não em anos). Além disso, prevê-se que os fármacos PD-1/PD-L1 dominem o mercado do ICI. Em 2023, prevê-se que a PD-1/PD-L1 seja responsável por 94% das vendas globais de ICIs no valor de 46B de dólares (os bloqueadores de CTLA-4 representam apenas 6%), fonte: “Landscape & Forecast: Immune Checkpoint Inhibitors”, Decision Resources, Dezembro 2017. Assim, a necessidade de melhorar o tratamento usando os inibidores do ponto de verificação imune da PD-1 ou da PD-L1 é particularmente urgente na medicina, e acreditamos que a invenção atual encontra benefícios particulares nesse sentido.

[1097] Em um exemplo, o método elimina a necessidade de administrar um antibiótico clássico, como um antibiótico de largo espectro (ou qualquer outro revelado aqui). Em outro exemplo, a invenção reduz a quantidade ou frequência de dosagem de um antibiótico clássico, como um antibiótico de amplo espectro (ou qualquer outro aqui revelado aqui) que é administrado ao indivíduo para tratar a infecção. Por exemplo, o indivíduo pode ser administrado a um antibiótico de largo espectro de baixa dose (por exemplo, 50, 40, 30, 20, 10% ou menos de uma dose convencional), enquanto o corte de nuclease guiado é usado e, assim, o tratamento da infecção neste cenário. A invenção pode ser particularmente benéfica para pacientes com imunossupressores, por exemplo, para pacientes oncológicos, transplantados ou pacientes que sofrem de infecção viral (por exemplo, infecção pelo VIH (vírus da imunodeficiência humana), CMV (citomegalovírus) ou RSV (vírus respiratório sincicial).

[1098] O termo "antibiótico de largo espectro" pode referir-se a um antibiótico que atua sobre os dois principais grupos bacterianos, gram- positivos e gram-negativos, ou qualquer antibiótico que atue contra uma vasta gama de bactérias causadoras de doenças. Estes medicamentos são usados quando se suspeita de infecção bacteriana, mas o grupo de bactérias é desconhecido (também chamado de terapia empírica) ou quando se suspeita de infecção com múltiplos grupos de bactérias. Embora os antibióticos potentes e de largo espectro representem riscos específicos, especialmente a interrupção de bactérias nativas e normais e o desenvolvimento de resistência antimicrobiana. Exemplos de antibióticos de largo espectro comumente usados são: Aminoglicosídeos (exceto estreptomicina), ampicilina, amoxicilina, ácido clavulânico (augmentina), carbapenemos (por exemplo, imipenem), piperacilina, tazobactam, quinolonas (por exemplo, ciprofloxacina), tetraciclinas, cloranfenicol, ticarcilina, trimetoprima e sulfametoxazol (bactrim). Na medicina veterinária, exemplos são co-amoxiclav, (por exemplo, em animais pequenos), penicilina, estreptomicina, oxitetraciclina e sulfonamidas potencializadas.

CLÁUSULAS:

[1099] A invenção, portanto, em um aspecto fornece as seguintes cláusulas que são direcionadas ao tratamento de uma infecção bacteriana patogênica usando uma nuclease programada.

1. Um método para tratar uma infecção bacteriana patogênica em um indivíduo humano ou animal causado por bactérias (primeiras bactérias) de uma primeira espécie ou cepa, o método compreendendo matar seletivamente as primeiras bactérias compreendidas pelo indivíduo cortando um local-alvo composto pelos genomas das primeiras bactérias, em que o corte é realizado usando uma nuclease programável que é programada para cortar o local-alvo, em que o indivíduo sofre de uma doença ou condição posterior que não a infecção bacteriana patogênica e o método inclui a administração de uma terapia ao indivíduo para tratar ou prevenir a doença ou condição posterior, em que a nuclease trata a infecção e a terapia é eficaz na presença da nuclease programada para tratar ou prevenir a doença ou condição. Em um exemplo, a cláusula 1 fornece:

[1100] Um método para tratar uma infecção bacteriana patogênica em um paciente com câncer causado por bactérias (primeiras bactérias) de uma primeira espécie ou cepa, o método compreendendo matar seletivamente as primeiras bactérias compreendidas pelo indivíduo, cortando um local-alvo composto pelos genomas das primeiras bactérias, em que o corte é realizado usando uma nuclease Cas programada pelo RNA guia para cortar o local-alvo, no qual o método inclui a administração de uma imunoterapia ao indivíduo para tratar o câncer no paciente, em que a nuclease trata a infecção e a imunoterapia é eficaz na presença da nuclease programada para tratar o câncer.

[1101] Um método para tratar uma infecção bacteriana patogênica em um paciente com câncer causado por bactérias (primeiras bactérias)

de uma primeira espécie ou cepa, o método compreendendo matar seletivamente as primeiras bactérias compreendidas pelo indivíduo, cortando um local-alvo composto pelos genomas das primeiras bactérias, em que o corte é realizado usando uma nuclease Cas programada pelo RNA guia para cortar o local-alvo, no qual o método inclui a administração de uma imunoterapia ao indivíduo para tratar o câncer no paciente, em que a nuclease trata a infecção e a imunoterapia é eficaz na presença da nuclease programada para tratar o câncer;

[1102] sendo que (a) a imunoterapia compreende a administração ao paciente de um anticorpo anti-PD-1 opcionalmente selecionado de pembrozumabe (ou KEYTRUDA™) e nivolumabe (ou OPDIVO™); e (b) o câncer é selecionado a partir de melanoma metastático; carcinoma das células renais; câncer de bexiga; tumor sólido; câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC); carcinoma das células escamosas da testa e do pescoço (HNSCC); linfoma de Hodgkin; câncer que superexpressa a PD-L1e sem mutações no EGFR ou no ALK; câncer colorretal e carcinoma hepatocelular; e (c) as primeiras bactérias são selecionadas de bactérias Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, E coli, Salmonella (por exemplo, S typhimurium), Clostridium dificile, Staphylococcus (por exemplo, S aureus ou S epidermis), Streptococcus (por exemplo, S viridans ou S thermophilus), Pneumococcus e Enterococcus.

[1103] Um método para tratar uma infecção bacteriana patogênica em um paciente com câncer causado por bactérias (primeiras bactérias) de uma primeira espécie ou cepa, o método compreendendo matar seletivamente as primeiras bactérias compreendidas pelo indivíduo, cortando um local-alvo composto pelos genomas das primeiras bactérias, em que o corte é realizado usando uma nuclease Cas programada pelo RNA guia para cortar o local-alvo, no qual o método inclui a administração de uma imunoterapia ao indivíduo para tratar o câncer no paciente, em que a nuclease trata a infecção e a imunoterapia é eficaz na presença da nuclease programada para tratar o câncer;

[1104] sendo que (a) a imunoterapia compreende a administração ao paciente de um anticorpo anti-PD-L1 opcionalmente selecionado de atezolimumabe (ou TECENTRIQ™), avelumabe (ou BAVENCIO™) e durvalumabe (ou IMFINZI™); e (b) o câncer é selecionado a partir de melanoma metastático; carcinoma das células renais; um tumor sólido; câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC); carcinoma das células escamosas da testa e do pescoço (HNSCC); carcinoma de célula de Merkel; linfoma de Hodgkin; câncer que superexpressa a PD-L1e sem mutações no EGFR ou no ALK; câncer colorretal e carcinoma hepatocelular; e (c) as primeiras bactérias são selecionadas de bactérias Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, E coli, Salmonella (por exemplo, S typhimurium), Clostridium dificile, Staphylococcus (por exemplo, S aureus ou S epidermis), Streptococcus (por exemplo, S viridans ou S thermophilus), Pneumococcus e Enterococcus.

[1105] Um método para tratar uma infecção bacteriana patogênica em um paciente com câncer causado por bactérias (primeiras bactérias) de uma primeira espécie ou cepa, o método compreendendo matar seletivamente as primeiras bactérias compreendidas pelo indivíduo, cortando um local-alvo composto pelos genomas das primeiras bactérias, em que o corte é realizado usando uma nuclease Cas programada pelo RNA guia para cortar o local-alvo, no qual o método inclui a administração de uma imunoterapia ao indivíduo para tratar o câncer no paciente, em que a nuclease trata a infecção e a imunoterapia é eficaz na presença da nuclease programada para tratar o câncer;

[1106] sendo que

(a) a imunoterapia compreende a administração ao paciente de um anticorpo anti-CD52 opcionalmente alemtuzumabe (ou CAMPATH™); e (b) o câncer é uma leucemia linfocítica crônica de células B (CLL); e (c) as primeiras bactérias são selecionadas de bactérias Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, E coli, Salmonella (por exemplo, S typhimurium), Clostridium dificile, Staphylococcus (por exemplo, S aureus ou S epidermis), Streptococcus (por exemplo, S viridans ou S thermophilus), Pneumococcus e Enterococcus.

[1107] Um método para tratar uma infecção bacteriana patogênica em um paciente com câncer causado por bactérias (primeiras bactérias) de uma primeira espécie ou cepa, o método compreendendo matar seletivamente as primeiras bactérias compreendidas pelo indivíduo, cortando um local-alvo composto pelos genomas das primeiras bactérias, em que o corte é realizado usando uma nuclease Cas programada pelo RNA guia para cortar o local-alvo, no qual o método inclui a administração de uma imunoterapia ao indivíduo para tratar o câncer no paciente, em que a nuclease trata a infecção e a imunoterapia é eficaz na presença da nuclease programada para tratar o câncer;

[1108] sendo que (a) a imunoterapia compreende a administração ao paciente de um anticorpo anti-CD20 opcionalmente ofatumumabe (ou ARZERRA™) ou rituximabe (ou RITUXAN™); e (b) o câncer é uma leucemia linfocítica crônica de células B (CLL) (p.ex., CLL refratária) ou linfoma não Hodgkin; e (c) as primeiras bactérias são selecionadas de bactérias Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, E coli, Salmonella (por exemplo, S typhimurium), Clostridium dificile, Staphylococcus (por exemplo, S aureus ou S epidermis), Streptococcus (por exemplo, S viridans ou S thermophilus), Pneumococcus e Enterococcus.

[1109] Um método para tratar uma infecção bacteriana patogênica em um paciente com câncer causado por bactérias (primeiras bactérias) de uma primeira espécie ou cepa, o método compreendendo matar seletivamente as primeiras bactérias compreendidas pelo indivíduo, cortando um local-alvo composto pelos genomas das primeiras bactérias, em que o corte é realizado usando uma nuclease Cas programada pelo RNA guia para cortar o local-alvo, no qual o método inclui a administração de uma imunoterapia ao indivíduo para tratar o câncer no paciente, em que a nuclease trata a infecção e a imunoterapia é eficaz na presença da nuclease programada para tratar o câncer;

[1110] sendo que (a) a imunoterapia compreende a administração ao paciente de um anticorpo anti-KIR, opcionalmente lirilumabe; e (b) o câncer é, opcionalmente, leucemia mieloide aguda ou carcinoma de células escamosas da cabeça e do pescoço (SCCHN); e (c) as primeiras bactérias são selecionadas de bactérias Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, E coli, Salmonella (por exemplo, S typhimurium), Clostridium dificile, Staphylococcus (por exemplo, S aureus ou S epidermis), Streptococcus (por exemplo, S viridans ou S thermophilus), Pneumococcus e Enterococcus.

[1111] Um método para tratar uma infecção bacteriana patogênica em um paciente com câncer causado por bactérias (primeiras bactérias) de uma primeira espécie ou cepa, o método compreendendo matar seletivamente as primeiras bactérias compreendidas pelo indivíduo, cortando um local-alvo composto pelos genomas das primeiras bactérias, em que o corte é realizado usando uma nuclease Cas programada pelo RNA guia para cortar o local-alvo, no qual o método inclui a administração de uma imunoterapia ao indivíduo para tratar o câncer no paciente, em que a nuclease trata a infecção e a imunoterapia é eficaz na presença da nuclease programada para tratar o câncer;

[1112] sendo que (a) a imunoterapia compreende a administração ao paciente de um anticorpo anti-CD19 opcionalmente selecionado de axicabtagene ciloleucel (ou YESCARTA™) e tisagenlecleucel (ou KYMRIAH™); e (b) o câncer é selecionado a partir de um linfoma de células B (por exemplo, linfoma não Hodgkin (NHL); linfoma difuso de células B grandes (DLBCL); linfoma primário de células B grandes mediastinais; ou linfoma de células B de alto grau); leucemia linfoblástica aguda de células B (ALL); ou linfoma do sistema nervoso central; e (c) as primeiras bactérias são selecionadas de bactérias Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, E coli, Salmonella (por exemplo, S typhimurium), Clostridium dificile, Staphylococcus (por exemplo, S aureus ou S epidermis), Streptococcus (por exemplo, S viridans ou S thermophilus), Pneumococcus e Enterococcus.

[1113] Em alternativa, o CAR-T é um CAR-T anti-CD30, CD38 ou CD22. Em um exemplo, o câncer é um linfoma de grandes células B após, pelo menos, dois outros tipos de tratamento falharem. Em um exemplo, o câncer é um linfoma de células B de grau elevado e DLBCL decorrente de linfoma folicular. Em um exemplo, o câncer é a leucemia linfoblástica aguda de células B recorrentes/remitentes. Em um exemplo, o câncer é o principal linfoma do sistema nervoso central.

[1114] Em um exemplo, a nuclease trata a infecção sem causar redução na eficácia da terapia. Em uma modalidade, "sem causar redução na eficácia da terapia" significa a eficácia da terapia em comparação com uma redução causada em pacientes pela administração de um antibiótico de amplo espectro (ou um antibiótico revelado aqui) que mata uma pluralidade de espécies diferentes, em que a pluralidade compreende a primeira espécie. Em uma modalidade, "sem causar redução na eficácia da terapia" significa que a eficácia da terapia é reduzida em não mais de 70, 80, 90 ou 95% em comparação com a administração da terapia na ausência de tratamento da infecção bacteriana patogênica (ou comparado com a terapia normalmente obtida em pacientes que sofrem da doença ou condição e recebendo a referida terapia). Isto pode ser avaliado, por exemplo, determinando a duração da sobrevivência sem progressão do indivíduo ou tratamento da doença ou condição, ou a sobrevivência global do indivíduo; e/ou determinando uma redução de um ou mais sintomas da doença ou condição.

[1115] Em um exemplo, a infecção é tratada completamente ou substancialmente completamente. Em outro exemplo, a infecção é reduzida (por exemplo, em pelo menos 80, 90 ou 95%, conforme determinado por um marcador da infecção ou por um sintoma do mesmo). Um marcador pode, por exemplo, ser CFUs de bactérias da primeira espécie ou cepa por ml de uma amostra de sangue colhida do paciente após a realização do método, por exemplo, dentro de 24 horas após a realização desse método, por exemplo, de 1-12 horas ou 1-24 horas após a realização do método ou de 1-12 horas ou 1-24 horas após a administração de um RNA ou DNA que codifica o RNA para programar a nuclease no indivíduo. Por exemplo, o RNA é um RNA guia e a nuclease é Cas (por exemplo, uma Cas3 ou uma Cas9). A redução pode ser comparada com uma amostra retirada do indivíduo imediatamente antes do início do método. Alternativamente, a amostra pode ser uma amostra de fezes, saliva ou urina.

[1116] Em um exemplo, a invenção aumenta a taxa de sobrevivência global em um indivíduo humano (em comparação com a taxa de sobrevivência global mediana em seres humanos que sofrem do mesmo câncer e que recebem o mesmo tratamento de terapia do câncer (por exemplo, administração do mesmo inibidor do ponto de verificação imune, como o nivolumabe, o pembrozumabe ou outro anticorpo revelado aqui). Em um exemplo, qualquer composição, ou outro produto da invenção aqui é fornecido para uso em tal método de tratamento.

[1117] Em um exemplo, o método é praticado em uma população de indivíduos humanos e a taxa de sobrevivência global média para a população é de 120-250% (por exemplo, 150-200%) da taxa de sobrevivência global média em seres humanos que sofrem do mesmo câncer e que recebem o mesmo tratamento de terapia do câncer (por exemplo, administração do mesmo inibidor do ponto de verificação imune, como nivolumabe, pembrozumabe ou outro anticorpo revelado aqui). Em um exemplo, qualquer composição, ou outro produto da invenção aqui é fornecido para uso em tal método de tratamento.

[1118] Uma "infecção bacteriana patogênica" é uma infecção que ameaça a saúde do indivíduo, por exemplo, uma infecção com risco de morte. Em uma modalidade, uma infecção bacteriana patogênica é uma infecção que requer hospitalização ou antimicrobianos parenterais. A infecção pode ser uma infecção bacteriana aguda, como uma infecção sistêmica ou uma infecção localizada. Os patógenos bacterianos causam frequentemente a infecção em áreas específicas do corpo. Outros são generalistas. Uma infecção bacteriana patogênica é contrastada com uma infecção de bactérias comensais, como bactérias intestinais comensais; neste caso, as bactérias não causam uma situação imediata de saúde ou risco de vida.

[1119] A infecção (ou sintoma dela) pode ser qualquer um dos seguintes: • Vaginose bacteriana: isso é causado por bactérias que alteram a microbiota vaginal causada por um crescimento excessivo de bactérias que se destacam das espécies de lactobacilos que mantêm populações microbianas vaginais saudáveis. • Meningite bacteriana: é uma inflamação bacteriana das meninges, ou seja, das membranas protetoras que cobrem o cérebro e a medula espinhal. • Pneumonia bacteriana: é uma infecção bacteriana dos pulmões. • Infecção do trato urinário: é causada predominantemente por bactérias.

Os sintomas incluem a sensação forte e frequente ou o desejo de urinar, dor durante a micção, e a urina que é turva.

O principal agente causal é a Escherichia coli.

As bactérias podem ascender na bexiga ou no rim e causar cistite e nefrite. • Gastroenterite bacteriana: é causada por bactérias entéricas e patogênicas.

Estas espécies patogênicas são normalmente distintas das bactérias normalmente inofensivas da flora intestinal normal.

Mas uma cepa diferente da mesma espécie pode ser patogênica. • Infecções bacterianas da pele: estas incluem: • Impetigo, que é uma infecção bacteriana altamente contagiosa da pele comumente observada em crianças.

É causada por Staphylococcus aureus e Streptococcus pyogenes. • Erisipelas, que é uma infecção aguda por estreptococo bacteriano das camadas mais profundas da pele que se propagam através do sistema linfático. • Celulite, que é uma inflamação difusa do tecido conjuntivo com inflamação severa de camadas dérmicas e subcutâneas da pele.

A celulite pode ser causada pela flora normal da pele ou pelo contato contagioso, e ocorre geralmente através da pele aberta, cortes, bolhas, rachaduras na pele, picadas de insetos, picadas de animais, queimaduras, feridas cirúrgicas, injeção de fármacos intravenosa, ou locais de inserção de cateter intravenoso.

Na maioria dos casos é a pele na face ou pernas inferiores que é afetada, embora a celulite possa ocorrer em outros tecidos.

[1120] Em um exemplo, as primeiras bactérias são Streptococcus e o paciente está sofrendo da infecção torácica, celulite ou tonsilite. Em um exemplo, as primeiras bactérias são Enterococcus e o paciente está sofrendo da infecção da bexiga ou septicemia. Em um exemplo, as primeiras bactérias são Pseudomonas aeruginosa e o paciente está sofrendo de diarreia. Em um exemplo, as primeiras bactérias são E. coli e o paciente está sofrendo de diarreia.

2. O método da cláusula 1, em que o indivíduo é um paciente oncológico e a terapia é uma terapia oncológica.

3. O método da cláusula 2, em que a terapia inclui a administração de um transplante de células estaminais hematopoiéticas, agente quimioterápico, inibidor do ponto de verificação imune, agonista do ponto de verificação imune ou um potenciador de uma célula imune (p.ex., células T e/ou NK); terapia celular adotiva (por exemplo, terapia com CAR-T); radiação ou cirurgia.

[1121] Em um exemplo, a terapia é imunoterapia. Exemplos de imunoterapia adequada são a administração de terapia celular adotiva (por exemplo, terapia de CAR-T), um inibidor do ponto de verificação imune, um agonista do ponto de verificação imune ou um potenciador de células imunes (por exemplo, células T e/ou células NK). Por exemplo, administração de um anticorpo anti-CTLA4, PD-1, PD-L1, PD- L2, LAG3, 0X40, CD28, BTLA, CD137, CD27, HVEM, KIR, TIM-3, VISTA, ICOS, GITR, TIGIT ou SIRPa, como a administração de um anticorpo selecionado de ipilimumabe (ou YERVOY™), tremelimumabe, nivolumabe (ou OPDIVO™), pembrolizumabe (ou KEYTRUDA™), pidilizumabe, BMS-936559, durvalumabe e atezolizumabe, ou uma terapia de CAR-T, como axicabtagene ciloleucel (Yescarta™) ou tisagenlecleucel (Kymriah™).

[1122] Em um exemplo, o potenciador imune compreende uma interleucina-2 (IL-2) ou um fragmento ou um mutante de deleção do mesmo.

[1123] Em um exemplo, a cirurgia compreende a remoção de tecido necrótico ou canceroso.

[1124] Em um exemplo, a quimioterapia compreende a administração de um medicamento de quimioterapia contendo platina. Em um exemplo, a quimioterapia compreende a administração de gefitinibe.

[1125] Em um exemplo, a terapia compreende a administração de ciclofosfamida, metotrexato e 5-fluorouracila (CMF); ou doxorrubicina e ciclofosfamida (AC); docetaxel, doxorrubicina e ciclofosfamida (TAC); ou doxorrubicina, bleomicina, vinblastina e dacarbazina (ABVD); ou mustina, vincristina, procarbazina e prednisolona (MOPP); ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina e prednisolona (CHOP); bleomicina, etoposido e cisplatina (BEP); epirrubicina, cisplatina e 5- fluorouracila (ECF); ou epirrubicina, cisplatina e capecitabina (ECX); metotrexato, vincristina, doxorrubicina e cisplatina (MVAC); ciclofosfamida, doxorrubicina e vincristina (CAV); ou 5-fluorouracila, ácido folínico e oxaliplatina (FOLFOX).

[1126] Em um exemplo, o câncer é câncer de mama e a terapia compreende administrar CMF ou AC. Em um exemplo, o câncer é o linfoma de Hodgkin e a terapia compreende a administração de TAC, ABVD ou MOPP. Em um exemplo, o câncer é o linfoma não-Hodgkin e a terapia compreende a administração de CHOP. Em um exemplo, o câncer é câncer de célula germinativa e a terapia compreende administrar BEP. Em um exemplo, o câncer é câncer de estômago e a terapia compreende administrar ECF ou ECX. Em um exemplo, o câncer é câncer de bexiga e a terapia compreende administrar MVAC. Em um exemplo, o câncer é câncer de pulmão e a terapia compreende administrar CAV. Em um exemplo, o câncer é câncer colorretal e a terapia compreende administrar FOLFOX.

4. Método, de acordo com a cláusula 3, em que a terapia é um anticorpo inibidor do ponto de verificação imune.

[1127] Opcionalmente, o anticorpo é um anticorpo anti-CTLA4, PD- 1, PD-L1, PD-L2, LAG3, 0X40, CD28, BTLA, CD137, CD27, HVEM, KIR, TIM-3, VISTA, ICOS, GITR, TIGIT ou SIRPa. Em um exemplo, o anticorpo é um anticorpo anti-PD-1. Em um exemplo, o anticorpo é um anticorpo anti-PD-L1. Em um exemplo, o anticorpo é um anticorpo anti- CTLA4.

5. O método da cláusula 3, em que a terapia é a administração de um anticorpo selecionado de ipilimumabe (ou YERVOY™), tremelimumabe, nivolumabe (ou OPDIVO™), pembrolizumabe (ou KEYTRUDA™), pidilizumabe, BMS-936559, durvalumabe e atezolizumabe.

[1128] Opcionalmente, o anticorpo (por exemplo, anticorpo anti-PD- L1) é administrado com um anticorpo anti-CTLA4 (por exemplo, ipilimumabe ou tremelimumabe).

[1129] Em um exemplo, o anticorpo anti-PD-1 apresentado aqui é selecionado a partir de nivolumabe, pembrozumabe, pidilizumabe, OPDIVO®, KEYTRUDA®, AMP-514, REGN2810, CT-011, BMS 936559, MPDL3280A e AMP-224.

[1130] Em um exemplo, o anticorpo anti-CTLA4 aqui é selecionado de tremelimumabe, YERVOY® e ipilimumabe.

[1131] Em um exemplo, a terapia é a administração de um anticorpo anti-KIR, por exemplo, o lirilumabe.

[1132] Em um exemplo, o inibidor do ponto de verificação é selecionado a partir de um inibidor de CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG- 3, BTLA, B7H3, B7H4, TIM3, KIR ou A2aR. Em certos aspectos, o inibidor do ponto de verificação imune é um antagonista de ligação do eixo da morte programada de células humanas 1 (PD-1). Em alguns aspectos, o antagonista da ligação do eixo da PD-1 é selecionado a partir do grupo consistindo em um antagonista da ligação da PD-1, um antagonista da ligação da PD-L1 e um antagonista da ligação da PD-L2. Em certos aspectos, o antagonista da ligação do eixo PD-1 é um antagonista de ligação da PD-1. Em alguns aspectos, o antagonista de ligação da PD-1 inibe a ligação da PD-1 à PD-L1 e/ou à PD-L2.

[1133] Em algumas modalidades, o inibidor do ponto de verificação imune é um antagonista da PD-L1, como o durvalumabe, também conhecido como MEDI4736, atzolizumabe, também conhecido como MPDL3280A, ou avelumabe, também conhecido como MSB00010118C. Em certos aspectos, o inibidor do ponto de verificação imune é um antagonista da PD-L2, como o rHIgM12B7. Em alguns aspectos, o inibidor do ponto de verificação imune é um antagonista de LAG-3, como IMP321 ou BMS-986016. O inibidor do ponto de verificação imune pode ser um antagonista do receptor A2a da adenosina (A2aR), como PBF-509.

[1134] Em algumas modalidades, o anticorpo descrito aqui (como um anticorpo anti-PD-1, um anticorpo anti-PD-L1 ou um anticorpo anti- PD-L2) compreende ainda uma região constante humana ou murina. Em um aspecto adicional, a região constante humana é selecionada do grupo que consiste em IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Em um aspecto ainda mais específico, a região constante humana é IgG1. Em um aspecto ainda mais específico, a região constante murina é selecionada do grupo que consiste em IgG1, IgG2A, IgG2B e IgG3. Em um aspecto ainda mais específico, o anticorpo reduziu a função efetora mínima. Em um aspecto ainda mais específico, a função efetora mínima resulta da produção em células procarióticas, CHO, Cos ou HEK. Em um aspecto ainda mais específico, a função efetora mínima resulta de uma "mutação Fc com menos efetor" ou de uma aglicosilação.

[1135] Por exemplo, a terapia compreende um transplante de células estaminais hematopoiéticas, por exemplo, um transplante de medula óssea (como quando o paciente é um paciente oncológico, por exemplo, um paciente com câncer de sangue ou leucemia).

[1136] Por exemplo, a terapia compreende um transplante de células estaminais, um enxerto de pele ou um transplante de órgãos, por exemplo, um transplante de coração, fígado, rim ou pulmão.

6. O método da cláusula 1 ou 2, em que a terapia é um transplante de tecido, órgão ou célula.

7. O método de qualquer cláusula anterior, em que o tratamento da infecção bacteriana é realizado simultaneamente com a administração da terapia ao indivíduo.

8. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 6, no qual o tratamento da infecção bacteriana é realizado imediatamente antes da administração da terapia ao indivíduo.

[1137] Por exemplo, o tratamento da infecção bacteriana não é realizado em mais de 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 dia, ou 24, 12, 6, 5, 4, 3, 2, 1 ou 0,5 horas antes da terapia da doença ou condição posterior. Por exemplo, o tratamento da infecção bacteriana não é realizado em mais de 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 dia, ou 24, 12, 6, 5, 4, 3, 2, 1 ou 0,5 horas após a terapia da doença ou condição posterior.

[1138] O tratamento da infecção e a administração da terapia podem ser realizados simultaneamente ou sequencialmente.

9. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 6, em que o tratamento da infecção bacteriana é realizado imediatamente depois da administração da terapia ao indivíduo.

10. O método de qualquer cláusula anterior, em que o método compreende a administração ao indivíduo de um RNA ou um ácido nucleico que codifica um RNA para a expressão do RNA no indivíduo, em que o RNA se complexa com a nuclease para programar a nuclease para cortar o local-alvo na primeira bactéria compreendida pelo indivíduo, matando assim a primeira bactéria.

[1139] O RNA ou o ácido nucleico são, por exemplo, administrados ao individuo ou paciente por via oral, por injeção intravenosa, por injeção subcutânea ou por inalação.

11. O método de qualquer cláusula anterior, compreendendo a administração de um vetor (por exemplo, fago ou plasmídeos) ao indivíduo, em que o vetor codifica a nuclease programável.

[1140] A nuclease é, por exemplo, administrada ao individuo ou paciente por via oral, por injeção intravenosa, por injeção subcutânea ou por inalação.

12. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 10, em que a nuclease programável é uma nuclease endógena (p.ex., nuclease Cas) das primeiras células.

13. O método de qualquer cláusula anterior, em que a eficácia da terapia na presença da nuclease programada é maior do que a eficácia da terapia na presença de um antibiótico de largo espectro.

[1141] Em um exemplo, a eficácia sendo maior é avaliada ao determinar a duração da sobrevivência sem progressão ou tratamento da doença ou condição; e/ou determinando uma redução de um ou mais sintomas da doença ou condição. Por exemplo, esta determinação é comparada a uma determinação análoga em um paciente que sofre da doença ou da condição assim como a infecção bacteriana e que está sendo tratada com a terapia e o antibiótico (do que a morte de nuclease das primeiras bactérias como pela a invenção).

14. O método de qualquer cláusula anterior, em que a eficácia da terapia na presença da nuclease programada é maior do que a eficácia da terapia na presença de um antibiótico selecionado de meticilina, vancomicina, linezolida, daptomicina, quinupristina, dalfopristina; teicoplanina; cefalosporina; carbapenem; fluoroquinolona; aminoglicosídeo; colistina; eritromicina; clindamicina; beta-lactama; macrolídeo; amoxicilina; azitromicina; penicilina; ceftriaxona;

azitromicina; ciprofloxacina; isoniazida (INH); rifampicina (RMP); amicacina; canamicina; capreomicina; trimetoprim; itrofurantoína; cefalexina; amoxicilina; metronidazol (MTZ); cefixima; tetraciclina; e meropenem.

15. O método de qualquer cláusula anterior, em que a primeira bactéria é selecionada de (i) Staphylococcus aureus resistente a um antibiótico selecionado de meticilina, vancomicina, linezolida, daptomicina, quinupristina, dalfopristina e teicoplaina; (ii) Pseudomonas aeuroginosa resistente a um antibiótico selecionado de cefalosporinas, carbapenemos, fluoroquinolonas, aminoglicosídeos e colistina; (iii) espécies de Klebsiella resistentes a carbapenem; (iv) espécies de Streptoccocus resistentes a antibióticos selecionados de eritromicina, clindamicina, beta-lactâmicos, macrolídeos, amoxicilina, azitromicina e penicilina; (v) espécies de Salmonella resistentes a um antibiótico selecionado de ceftriaxona, azitromicina e ciprofloxacina; (vi) espécies de Shigella resistentes à ciprofloxacina ou à azitromicina; (vii) Mycobacterium tuberculosis resistentes a um antibiótico selecionado da resistência à isoniazida (INH), rifampicina (RMP), fluoroquinolona, amicacina, canamicina, capreomicina e azitromicina; (viii) espécies de Enterococcus resistentes à vancomicina; (ix) espécies de Enterobacteriaceae resistentes a antibióticos selecionados de cefalosporina e carbapenem; (x) E. coli resistente a um antibiótico selecionado de trimetoprim, itrofurantoína, cefalexina e amoxicilina; (xi) espécies de Clostridium resistentes a metronidazol (MTZ), fluoroquinolona ou carbapenem; (xii) Neisseria gonnorrhoea resistente a um antibiótico selecionado de cefixima, ceftriaxona, azitromicina e tetraciclina; (xiii) Acinetobacter baumannii resistente a um antibiótico selecionado de beta-lactâmico, meropenem e carbapenem; e (xiv) espécies de Campylobacter resistentes à ciprofanicina ou à azitromicina.

16. O método de qualquer cláusula anterior, em que o tratamento da infecção trata ou previne no indivíduo uma condição selecionada a partir da vaginose, meningite, pneumonia, infecção do trato urinário, cistite, nefrite, gastroenterite, infecção da pele, impetigo, erisipela, infecção dentária e celulite.

17. O método de qualquer cláusula anterior, no qual o tratamento da infecção trata ou previne a septicemia ou a sepse no indivíduo.

[1142] Em um exemplo, a infecção é uma infecção da corrente sanguínea.

18. O método de qualquer cláusula precedente, em que a doença ou a condição adicional são um câncer; doença autoimune ou condição; infecção viral ou doença ou condição do trato gastrointestinal.

[1143] Em um exemplo, o câncer é metastático. Em um exemplo, o câncer é melanoma. Em um exemplo, o câncer é um tumor sólido com uma deficiência de reparação de incompatibilidade ou instabilidade microssatélite. Em um exemplo, o câncer é o NSCLC. Em um exemplo, o câncer é o HNSCC. Em um exemplo, o câncer é o linfoma de Hodgkin. Em um exemplo, o câncer é o câncer urotelial. Em um exemplo, o câncer é o câncer de pulmão. Em um exemplo, o câncer é o câncer de cabeça e de pescoço. Em um exemplo, o câncer é o câncer de cabeça. Em um exemplo, o câncer é o câncer de pescoço.

[1144] Em um exemplo, a infecção viral é uma infecção pelo HIV, CMV ou RSV.

19. O método de qualquer cláusula anterior, em que o indivíduo compreende bactérias (segunda bactéria) de uma ou mais cepas ou espécies diferentes da primeira cepa ou espécie, em que os genomas da segunda bactéria não compreendem o local-alvo, em que os genomas da segunda bactéria não são cortados pela nuclease programada no indivíduo, em que a segunda bactéria sobrevive na presença da nuclease programada no paciente; e em que a terapia é eficaz na presença da segunda bactéria.

20. O método da cláusula 19, em que a redução da segunda bactéria em pacientes (por exemplo, no microbioma intestinal) está associada à redução da eficácia da terapia.

[1145] Opcionalmente, a terapia é eficaz na presença da segunda bactéria no intestino do indivíduo.

[1146] Opcionalmente, a primeira e/ou segunda bactérias estão presentes no intestino do indivíduo imediatamente antes da realização do método.

[1147] Opcionalmente, a primeira e/ou segunda bactérias estão presentes no sangue do indivíduo imediatamente antes da realização do método.

[1148] Opcionalmente, as primeiras bactérias estão presentes no sangue do indivíduo e as segundas bactérias estão presentes no intestino do indivíduo imediatamente antes de executar o método.

[1149] Opcionalmente, as primeiras bactérias estão presentes no intestino do indivíduo e as segundas bactérias estão presentes no sangue do indivíduo imediatamente antes da realização do método.

[1150] Opcionalmente, as primeiras bactérias no sangue do indivíduo são mortas.

[1151] Opcionalmente, as bactérias são bactérias gram-positivas. Opcionalmente, as bactérias são bactérias gram-negativas.

[1152] Opcionalmente, a primeira e a segunda bactérias são capazes de ser mortas pelo mesmo antibiótico. Opcionalmente, o método não compreende a administração do antibiótico ao indivíduo. Em um exemplo, o antibiótico é selecionado de meticilina, vancomicina, linezolida, daptomicina, quinupristina, dalfopristina; teicoplanina; cefalosporina; carbapenem; fluoroquinolona; aminoglicosídeo; colistina; eritromicina; clindamicina; beta-lactama; macrolídeo; amoxicilina;

azitromicina; penicilina; ceftriaxona; azitromicina; ciprofloxacina; isoniazida (INH); rifampicina (RMP); amicacina; canamicina; capreomicina; trimetoprim; itrofurantoína; cefalexina; amoxicilina; metronidazol (MTZ); cefixima; tetraciclina; e meropenem. Por exemplo, o antibiótico é selecionado dentre aminoglicosídeos, ampicilina, amoxicilina, amoxicilina ou ácido clavulânico, carbapenemos (p.ex., imipenem), piperacilina ou tazobactam, quinolonas (p.ex., ciprofloxacina), tetraciclinas, cloranfenicol, ticarcilina, trimetoprima ou sulfametoxazol, penicilina, estreptomicina, oxitetraciclina e sulfonamidas potencializadas. Em um exemplo, as primeiras bactérias são resistentes a um antibiótico selecionado dos aminoglicosídeos, ampicilina, amoxicilina, amoxicilina ou ácido clavulânico, carbapenemos (p.ex., imipenem), piperacilina ou tazobactam, quinolonas (p.ex., ciproprofloxacina), tetraciclinas, cloranfenicol, ticarcilina, trimetoprim ou sulfametoxazol, penicilina, estreptomicina, oxitetraciclina e sulfonamidas potencializadas. Em uma alternativa, o antibiótico é selecionado a partir de beta-lactâmico, fluoroquinolona e macrolídeo.

[1153] Opcionalmente, a primeira e a segunda bactérias são bactérias das mesmas espécies, mas são cepas diferentes das espécies.

[1154] Opcionalmente, a primeira e a segunda bactérias são bactérias do mesmo gênero, mas são bactérias de diferentes espécies do gênero.

[1155] Opcionalmente, a primeira e a segunda bactérias são bactérias da mesma família, mas são bactérias de diferentes gêneros da família.

[1156] Opcionalmente, a primeira e a segunda bactérias são bactérias gram-positivas.

[1157] Opcionalmente, a primeira e a segunda bactérias são bactérias gram-negativas.

[1158] Opcionalmente, a terapia é eficaz na presença da segunda bactéria.

[1159] Opcionalmente, a redução da segunda bactéria nos pacientes está associada à redução da eficácia da terapia. Opcionalmente, a redução da segunda bactéria nos pacientes reduz a eficácia da terapia.

[1160] Opcionalmente, a presença da segunda bactéria nos pacientes está associada à eficácia aumentada da terapia. Opcionalmente, a presença da segunda bactéria nos pacientes aumenta a eficácia da terapia. Por exemplo, o aumento da eficiência é a eficiência em comparação com a terapia na ausência ou a redução da presença da segunda bactéria, como na presença de um antibiótico que mata a segunda bactéria.

[1161] Em um exemplo, a terapia é eficaz na presença da segunda bactéria, na qual a doença ou a condição (ou um sintoma dela) é reduzida no indivíduo em pelo menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 95%. Em um exemplo, a terapia é eficaz na presença da segunda bactéria, na qual a progressão da doença ou condição (ou um sintoma dela) é reduzida no indivíduo em pelo menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 95%. Em um exemplo, a terapia é eficaz na presença da segunda bactéria, na qual a progressão doença-livre da doença ou da condição (ou um sintoma dela) é reduzida no indivíduo em pelo menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 95%. Em um exemplo, a terapia é eficaz na presença da segunda bactéria, na qual a duração da doença ou condição (ou um sintoma dela) é reduzida no indivíduo em pelo menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 95%. Em um exemplo, a terapia é eficaz na presença da segunda bactéria, na qual a gravidade da doença ou condição (ou um sintoma dela) é reduzida no indivíduo em pelo menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 95%. Em um exemplo, a terapia é eficaz na presença da segunda bactéria, na qual a doença ou a condição (ou um sintoma dela) é reduzida por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 21 ou 28 dias ou por pelo menos 1, 2, 3,4 5, 6 ou 12 meses em pacientes em pelo menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 95%. Em um exemplo, a terapia é eficaz na presença da segunda bactéria, na qual a doença ou a condição (ou um sintoma dela) é tratada por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 21 ou 28 dias ou por pelo menos 1, 2, 3,4 5, 6 ou 12 meses no paciente em pelo menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 95%. Em um exemplo, a terapia é eficaz na presença da segunda bactéria, na qual a doença ou a condição (ou um sintoma dela) é indetectável por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 21 ou 28 dias ou por pelo menos 1, 2, 3,4 5, 6 ou 12 meses em pacientes em pelo menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 95%.

21. O método da cláusula 19 ou 20, em que a segunda bactéria é selecionada do grupo consistindo em Akkermansia, Alistipes, Bacteroides, Barnesiella, Bifidobacterium, Clostridium, Collinsella, Enterococcus, Fusobacterium, Lactobacillus, Propionibacterium, Ruminococcus, bactéria filamentosa segmentada (SFB); bactérias Veillonella, Prevotella, Escherichia e Streptococcus.

[1162] Em um exemplo as segundas bactérias que produzem ácidos graxos de corrente curta (por exemplo, bactérias produtoras de butirato). Em aspectos específicos, as espécies de bactérias produzem butirato. Por exemplo, a segunda bactéria é Clostridiales. As bactérias de Clostridiales podem ser substancialmente ou incluir bactérias na forma de esporos. Em aspectos particulares, as segundas bactérias são da família Ruminococcaceae, Christensenellaceae, Clostridiaceae ou Coriobacteriacease. Em algumas modalidades, as bactérias Clostridiales (p.ex., Clostridium) compreendem uma primeira família e uma segunda família. Em algumas modalidades, a primeira família é selecionada do grupo consistindo em Ruminococcaceae,

Christensenellaceae, Clostridiaceae e Coriobacteriacease, e a segunda família não é idêntica à primeira família. Em um exemplo, as segundas bactérias são Faecalibacterium prausnitzii, Ruminococcus albus, Ruminococcus bromii, Ruminococcus callidus, Ruminococcus flavefaciens, Ruminococcus champanellensis, Ruminococcus faecis, Ruminococcus gauvreauii, Ruminococcus gnavus, Ruminococcus hansenii, Ruminococcus hydrogenotrophicus, Ruminococcus lactaris, Ruminococcus luti , Ruminococcus obeum, Ruminococcus palustris , Ruminococcus pasteurii, Ruminococcus productus, Ruminococcus schinkii, Ruminococcus torques, Subdoligranulum variabile, Butyrivibrio fibrisolvens, Roseburia intestinalis, Anaerostipes caccae, Blautia obeum, Eubacterium nodatum ou Eubacterium oxidoreducens. Em aspectos específicos, as segundas bactérias são Fecalibacterium prausnitzii. Em um exemplo as segundas bactérias são Firmiciutes.

[1163] Em certas modalidades, as primeiras bactérias são Bacteroidia ou Prevotellaceae, por exemplo, Bacteroidetes ou Bacteroides.

[1164] Em uma modalidade, o tratamento resulta em ou mantém um microbioma (por exemplo, microbioma do intestino e/ou do sangue) do indivíduo, que é benéfico para a inibição do ponto de verificação imune ou outra terapia. Por exemplo, o microbioma compreende uma elevada abundância relativa de uma ou mais espécies bacterianas do filo Firmiciutes, classe Clostridia, ordem Clostridiales, família Ruminococcaceae, gênero Ruminococcus, gênero Hydrogenoanaerobacterium, gênero Fecalibacterium, filo Actinobacteria, classe Coribacteriobylum, ordem Coriaobacteriales, família Coriobacteriaceae, domínio Archaea, filo Euryarchaeota ou família Christensenellaceae. Adicionalmente ou alternativamente, o microbioma compreende uma baixa abundância relativa de bactérias do género Dialister, família Veillonellaceae, filo Bacteroidetes, classe

Bactereroida, ordem Bacteroidales ou família Prevotellaceae. Por conseguinte, um perfil microbiano favorável teria uma abundância relativa mais elevada de uma ou mais espécies bacterianas do filo Firmiciutes, classe Clostridia, ordem Clostridiales, família Ruminococcaceae, gênero Ruminococcus, gênero Hydrogenoanaerobacterium, filo Actinobacteria, classe Coriobacteria, ordem Coriaobacteriales, família Coriobacteriaceae, domínio Archaea, filo Cyanobacteria, filo Euryarchaeota ou família Christensenellaceae, e/ou tem uma abundância reduzida de uma ou mais espécies bacterianas do gênero Dialister, família Veillonellaceae, filo Bacteroidetes, classe Bacteroida, ordem Bacteroidales e/ou família Prevotellaceae.

[1165] Por exemplo, o microbioma compreende uma maior abundância relativa de Firmicutes em comparação com Bacteroidetes, Bacteroida, Bacteroidales ou Prevotellaceae. Por exemplo, o microbioma compreende uma maior abundância relativa de Firmicutes em comparação com Bacteroidetes, Bacteroida, Bacteroidales e Prevotellaceae.

[1166] Opcionalmente, as segundas bactérias são selecionadas do grupo consistindo em Akkermansia muciniphila; Alistipes shahii; Bacteroides fragilis; Bacteroides uniformis; Barnesiella intestinihominis; Bacteroides dorei; Bifidobacterium adolescentis; Bifidobacterium breve; Bifidobacterium longum; Clostridium orbiscindens; Clostridium novyi; Clostridium perfringens; Collinsella aerofaciens; Enterococcus hirae; Fusobacterium nucleatum; Lactobacillus casei Shirota; L. casei AO47; Lactobacillus rhamnosus; Propionibacterium granulosum; Ruminococcus gnavus; Segmented filamentous bacteria (SFB); Veillonella; Lactobacilli; Bacteroides; Clostridia; Prevotella; E. coli Nissle; Lactobacillus plantarum; Lactobacillus delbrueckii (p.ex., subsp. Bulgaricus); Lactobacillus paracasei; Lactobacillus acidophilus;

Bifidobacterium infantis; e Streptococcus salivarius (p.ex., subsp. Thermophilus). Ver “The microbiome in cancer immunotherapy: Diagnostic tools and therapeutic strategies”; Laurence Zitvogel et al; Science 23 Mar 2018: Vol.359, número 6382, pp. 1366-1370; DOI:

10.1126/science.aar6918.

[1167] Em um exemplo as segundas bactérias são bactérias comensais em seres humanos.

[1168] Em um exemplo, as primeiras bactérias são compostas por microbiota intestinal, microbiota da pele, microbiota da cavidade oral, microbiota da garganta, microbiota do cabelo, microbiota da axilas, microbiota vaginal, microbiota retal, microbiota anal, microbiota ocular, microbiota nasal, microbiota da língua, microbiota do pulmão, microbiota do fígado, microbiota do rim, microbiota genital, microbiota peniana, microbiota escrotal, microbiota da glândula mamária, microbiota auricular, microbiota da uretra, microbiota labial, microbiota do órgão ou microbiota dentária.

[1169] Em um exemplo, as segundas bactérias são compostas por microbiota intestinal, microbiota da pele, microbiota da cavidade oral, microbiota da garganta, microbiota do cabelo, microbiota da axilas, microbiota vaginal, microbiota retal, microbiota anal, microbiota ocular, microbiota nasal, microbiota da língua, microbiota do pulmão, microbiota do fígado, microbiota do rim, microbiota genital, microbiota peniana, microbiota escrotal, microbiota da glândula mamária, microbiota auricular, microbiota da uretra, microbiota labial, microbiota do órgão ou microbiota dentária.

[1170] Em um exemplo, a primeira e/ou segunda bactérias são bactérias transmitidas pelo sangue.

[1171] 22. O método de qualquer cláusula anterior, em que as primeiras bactérias são selecionadas do grupo consistindo em bacterias Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Helicobacter,

Legionella, Heamophilus, Ghonnorhea, Acinetobacter, Escherichia, Klebsiella, Pseudomonas ou Stenotrophomonas.

[1172] A H pilori tem sido implicada no câncer gástrico e úlceras gástricas. Assim, em um exemplo, as primeiras bactérias são H pilori e opcionalmente a doença é um câncer, como o câncer gástrico. Em uma modalidade, a terapia é quimioterapia ou terapia com um inibidor do ponto de verificação imune (por exemplo, um anticorpo). Em um exemplo, as primeiras bactérias são H pylori e a doença é úlcera(s) gástrica(s). Em uma modalidade, a terapia tripla para úlceras gástricas é administrada ao indivíduo.

[1173] Em um exemplo, as primeiras bactérias são bactérias gram- negativas e opcionalmente a infecção é uma infecção de sangue. Em um exemplo, as primeiras bactérias são selecionadas de E. coli, P. aeruginosa e K. pneumoniae, e opcionalmente a infecção é uma infecção sanguínea.

23. O método da cláusula 22, em que as primeiras bactérias são selecionadas do grupo consistindo em bactérias E. coli (p.ex., E coli EPEC), C dificile, V cólera, Staphylococcus (p.ex., S aureus ou MRSA), Streptococcus pyogenes, Helicobacter pylori, Acinetobacter baumannii, Legionella, Pseudomonas aeruginosa e Klebsiella pneumoniae.

[1174] Em um exemplo, o indivíduo foi administrado com um fármaco imunossupressor, ou está em curso de um fármaco imunossupressor, por exemplo, esteróide, como corticosteroide.

24. Um nuclease programável para uso no método de qualquer cláusula anterior.

25. O método ou nuclease de acordo com qualquer cláusula anterior, em que a nuclease é uma nuclease Cas (por exemplo, uma Cas 3 ou 9), uma meganuclease, uma TALEN (nuclease efetora do tipo ativador de transcrição) ou nuclease do dedo de zinco.

26. Um sistema CRISPR/Cas compreendendo uma nuclease de acordo com a cláusula 24 ou 25 para uso no método de qualquer uma das cláusulas 1 a 23, em que a nuclease é uma nuclease Cas (por exemplo, uma Cas 3 ou 9) e o sistema compreende um ou mais RNAs guia (gRNAs) ou DNA que codifica um ou mais RNAs guia, em que cada RNA guia é capaz de programar a nuclease Cas para cortar um local- alvo composto pelos genomas das primeiras bactérias.

27. Um RNA guia ou um DNA que codifica um RNA guia para uso no sistema da cláusula 26.

28. Um RNA guia ou um DNA que codifica um RNA guia para uso no método de tratamento de uma infecção bacteriana patogênica de acordo com qualquer uma das cláusulas 1 a 23, em que o RNA guia é capaz de programar a nuclease, em que a nuclease é uma nuclease Cas (por exemplo, uma nuclease Cas9, Cas3, Cas13, CasX, Casy ou Cpf1).

29. Um vetor do ácido nucleico compreendendo o RNA guia ou DNA, mencionado em qualquer uma das cláusulas 26 a 28.

30. Um vector de ácido nucleico que codifica a nuclease da cláusula 24 ou 25 e, opcionalmente, o RNA guia da cláusula 29.

31. O vetor da cláusula 29 ou 30 em que o vetor é um fago, plasmídeo fagemídeo p.ex., plasmídeo conjugado) ou transpóson.

[1175] O fago é capaz de infectar as primeiras bactérias e os fagemídeos são capazes de produzir tal fago na presença de um fago auxiliar.

32. Uma composição farmacêutica compreendendo um primeiro vetor do ácido nucleico (ou uma pluralidade dos mesmos) que codifica a nuclease da cláusula 24 ou 25 e um segundo vetor do ácido nucleico (ou uma pluralidade dos mesmos) que codifica o RNA guia da cláusula 29, a composição compreendendo ainda um diluente, excipiente ou carreador farmaceuticamente aceitável.

33. Uma composição farmacêutica compreendendo o sistema CRISPR/Cas da cláusula 26 e um diluente, excipiente ou carreador farmaceuticamente aceitável.

34. Uma composição farmacêutica compreendendo o vetor da cláusula 31 e um diluente, excipiente ou carreador farmaceuticamente aceitável.

[1176] A prevenção de uma doença ou condição descrita aqui pode, por exemplo, reduzir o risco da doença ou condição no indivíduo ou paciente.

[1177] Em alternativa, em vez das primeiras bactérias, a infecção é causada pela primeira archaea e, nesta modalidade, todas as características do método e outras configurações da invenção relacionadas a matar as primeiras bactérias se referem, em vez disso, mutatis mutandis à morte da primeira arcaea.

[1178] Em uma modalidade, o método compreende a realização do método de tratamento de uma infecção microbiana aguda, como descrito aqui, e, assim, as características desse método descritas aqui são combináveis com o presente método de tratamento de uma infecção bacteriana patogênica (ou seja, onde a infecção bacteriana patogênica é a infecção microbiana aguda no primeiro método). Em uma modalidade, o método compreende a realização do método de tratamento duradouro de uma infecção microbiana, como descrito aqui, e, assim, as características desse método descritas aqui são combináveis com o presente método de tratamento de uma infecção bacteriana patogênica (ou seja, onde a infecção bacteriana patogênica é a infecção microbiana no primeiro método). Qualquer uma das características facultativas do primeiro método pode aplicar-se mutatis mutandis ao presente método de tratamento de uma infecção bacteriana patogênica. ASPECTOS:

[1179] Assim, a invenção fornece os seguintes aspectos, que são características opcionais das cláusulas acima:

1. O método de qualquer uma das cláusulas 1-23, em que a infecção é reduzida pelo menos 100 vezes nos primeiros 30 minutos de execução da etapa (b). Opcionalmente, a infecção é reduzida pelo menos 1000 vezes nos primeiros 30 minutos de execução da etapa (b). Opcionalmente, a redução na infecção persiste por pelo menos 30 minutos imediatamente após os primeiros 30 de execução da etapa (b). Por exemplo, a redução pode ser avaliada ao determinar a diferença no número de bactérias da primeira espécie ou cepa em (i) uma amostra retirada do indivíduo (por exemplo, uma amostra de sangue) imediatamente antes do início do método e (ii) uma amostra (do mesmo tipo que a amostra de (i), por exemplo, uma amostra de sangue) retirada do indivíduo aos 30 minutos do tratamento. Por exemplo, as amostras podem ser avaliadas quanto à diferença entre as unidades formadoras de colônias (UFC)/ml de amostra, por exemplo, quando as amostras tiverem sido plaqueadas em ágar nas respectivas placas de Petri e incubadas em condições idênticas. Outro exemplo pode usar a contagem microscópica de bactérias em amostras ou outros métodos de rotina que sejam conhecidos do destinatário qualificado.

2. O método de qualquer uma das cláusulas 1-23, em que a infecção do sangue do indivíduo pela primeira bactéria é reduzida pelo menos 100 ou 1000 vezes nos primeiros 30 minutos de execução da etapa (b).

3. O método do aspecto 2, no qual o sangue é infectado de 105 a 1012 (por exemplo, 107 a 1012) UFC/ml da primeira bactéria imediatamente antes do tratamento.

4. O método de acordo com qualquer uma das cláusulas 1- 23 ou qualquer aspecto anterior, no qual o método compreende a administração ao indivíduo de um ácido nucleico (p.ex., um RNA) e uma nuclease, em que o ácido nucleico se complexa com a nuclease para programar a nuclease para cortar o local-alvo nas primeiras bactérias compreendidas pelo indivíduo.

5. O método do aspecto 4, em que a nuclease é administrada simultaneamente ou sequencialmente com o ácido nucleico ao indivíduo.

6. O método do aspecto 4, em que o indivíduo compreende a nuclease antes da administração do ácido nucleico ao indivíduo.

7. O método de qualquer um dos aspectos 4 a 6, em que uma pluralidade de fagos é administrada ao indivíduo, no qual cada fago compreende uma cópia do ácido nucleico, no qual o fago infecta as primeiras bactérias compreendidas pelo indivíduo para entregá-las ao ácido nucleico.

8. O método do aspecto 7, em que a razão de fago administrado: primeiras bactérias compreendidas pelo indivíduo é de 10 para 150. Por exemplo, a razão é de 10 para 100, ou seja, uma multiplicidade de infecções (MOI) de 10 para 100.

[1180] A razão pode ser determinada, por exemplo, usando uma amostra (por exemplo, uma amostra de sangue ou de intestino) de um indivíduo humano ou animal imediatamente antes do tratamento e determinando o número de bactérias por ml de amostra de sangue ou de intestino). A quantidade de fago a ser administrada pode então ser trabalhada de acordo com a determinação usando a amostra.

9. O método de qualquer uma das cláusulas 1-23 ou qualquer aspecto anterior, em que a infecção é uma infecção dos pulmões, cérebro, pele, abdômen ou trato urinário.

10. O método de qualquer uma das cláusulas 1-23 ou qualquer aspecto anterior, em que o indivíduo tenha sido submetido à cirurgia, está em uma medicação imunossupressora, sofrendo de queimaduras, de diabetes, de câncer ou de doença crônica.

11. O método de qualquer uma das cláusulas 1-23 ou qualquer aspecto anterior, em que o indivíduo seja um ser humano com mais de 65 anos de idade ou um paciente pediátrico.

12. O método de qualquer uma das cláusulas 1-23 ou qualquer aspecto anterior, em que o método trata ou previne a sepse no indivíduo.

13. O método da cláusula 12, em que no início do tratamento, o indivíduo (por exemplo, um ser humano) tem uma temperatura de < 36 °C ou > 38 °C; uma frequência cardíaca > 90/min, uma frequência respiratória > 20 respirações/min ou PaCO2 < 4,3 kPa; e uma contagem de leucócitos de < 4000/mm³ ou > 12.000/mm³.

14. O método da cláusula 12 ou 13, em que no início do tratamento, o indivíduo (por exemplo, um ser humano) tem presença de dois ou mais dos seguintes: temperatura corporal anormal, frequência cardíaca anormal, frequência respiratória anormal, gás sanguíneo anormal e contagem anormal de leucócitos. Modulação do ponto de verificação imune

[1181] Os pontos de verificações imunes da invenção aumentam um sinal (p.ex., moléculas coestimulatórias) ou diminuem um sinal. As moléculas inibitórias do ponto de verificação imune que podem ser direcionadas pela modulação do ponto de verificação imune na invenção incluem o receptor de adenosina A2A (A2AR), B7-H3 (também conhecido como CD276), o atenuador de linfócitos B e T (BTLA), proteína 4 associada a linfócitos T citotóxicos (CTLA-4, também conhecida como CD 152), indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO), imunoglobulina da célula killer (KIR), gene de ativação de linfócitos 3 (LAG3), morte programada 1 (PD-1), domínio de imunoglobulina de células T e domínio de mucina 3 (TIM-3) e supressor de Ig de domínio V da ativação de células T (VISTA). Em particular, os inibidores do ponto de verificação imune têm como alvo o eixo PD-1 e/ou CTLA-4.

[1182] Os inibidores do ponto de verificação imune podem ser fármacos como moléculas pequenas, formas recombinantes de receptores ou ligantes, ou anticorpos, como anticorpos humanos (p.ex., WO2015016718; Pardoll, Nat Rev Cancer, 12(4): 252:64–2012; estando todos aqui incorporados por referência. Podem ser usados inibidores conhecidos das proteínas do ponto de verificação imune ou seus análogos, em particular formas de anticorpos quimerizados, humanizados ou humanos. Como o versado na técnica sabe, nomes alternativos e/ou equivalentes podem ser usados para certos anticorpos mencionados na presente revelação. Esses nomes alternativas e/ou equivalentes são intercambiáveis no contexto da presente invenção. Por exemplo, sabe-se que o lambrovizumabe também é conhecido sob os nomes alternativos e equivalentes MK-3475 e pembrozumabe.

[1183] É contemplado que qualquer um dos inibidores do ponto de verificação imune que são conhecidos na técnica para estimular respostas imunes pode ser usado. Isto inclui inibidores que direta ou indiretamente estimulam ou melhoram os linfócitos T antígeno- específicos. Estes inibidores do ponto de verificação imune incluem, sem limitação, agentes que direcionam proteínas do ponto de verificação imune e vias que envolvem PD-L2, LAG3, BTLA, B7H4 e TIM3. Por exemplo, os inibidores do LAG3 conhecidos na técnica incluem o LG3 solúvel (IMP321 ou LAG3-Ig revelado em WO2009044273), assim como anticorpos de camundongo, humanos ou humanizados que bloqueiam o LAG3 humano (por exemplo, IMP701 revelado em WO2008132601) ou anticorpos totalmente humanos que bloqueiam o LAG3 humano (como revelado em EP 2320940). Outro exemplo é fornecido pelo uso de agentes de bloqueio em direção ao BTLA, incluindo, sem limitação, anticorpos que bloqueiam a interação do BTLA humano com seu ligante (como o 4C7 revelado em WO2011014438). Outro exemplo é fornecido pelo uso de agentes neutralizantes B7H4 incluindo, sem limitação, anticorpos para B7H4 humano (revelado em WO 2013025779 e em WO2013067492) ou formas recombinantes solúveis de B7H4 (como revelado em US20120177645). Outro exemplo é fornecido por agentes neutralizantes B7-H3, incluindo, sem limitação, anticorpos neutralizando B7-H3 humano (por exemplo MGA271 revelado como BRCA84D e derivados em US 20120294796). Outro exemplo é fornecido por agentes que têm como alvo TIM3, incluindo, sem limitação, anticorpos dirigidos ao TIM3 humano (por exemplo, conforme revelado em WO 2013006490 A2 ou o TIM3 anti-humano, anticorpo de bloqueio F38-2E2 revelado por Jones et al, J Exp Med. 2008; 205(12):2763-79). A. Antagonistas do eixo PD-1

[1184] A disfunção ou anergia das células T ocorre concomitantemente com uma expressão induzida e sustentada do receptor inibitório, polipeptídeo de morte programada 1 (PD-1). Assim, é fornecido aqui o direcionamento terapêutico da PD-1 e de outras moléculas que sinalizam através de interações com a PD-1, como o ligante de morte programada 1 (PD-L1) e o ligante de morte programada 2 (PD-L2). O PD-L1 é supexpressado em muitos cânceres e está frequentemente associado a um mau prognóstico (Okazaki T et al., Intern. Immun. 2007, 19(7):813). Assim, os métodos melhorados de tratamento do câncer, inibindo a interação da PD-L1/PD-1 em combinação com a modulação do microbioma, são fornecidos aqui.

[1185] Por exemplo, os antagonistas de ligação do eixo PD-1 incluem um antagonista de ligação de PD-1, um antagonista de ligação de PD-L1 e um antagonista de ligação de PD-L2. Os nomes alternativos para "PD-1" incluem CD279 e SLEB2. Os nomes alternativos para "PD- L1" incluem B7-H1, B7-4, CD274 e B7-H. Os nomes alternativos para "PD-L2" incluem B7-DC, Btdc e CD273. Em algumas modalidades, PD- 1, PD-L1 e PD-L2 são PD-1, PD-L1 e PD-L2 humanos.

[1186] Em algumas modalidades, o antagonista de ligação da PD-1 é uma molécula que inibe a ligação da PD-1 aos seus parceiros de ligação do ligante. Em um aspecto específico, os parceiros de ligação do ligante da PD-1 são PD-L1 e/ou PD-L2. Em outra modalidade, um antagonista de ligação PD-L1 é uma molécula que inibe a ligação do PD-L1 aos seus parceiros de ligação. Em um aspecto específico, os parceiros de ligação do PD-L1 são PD-1 e/ou B7-1. Em outra modalidade, o antagonista de ligação do PD-L2 é uma molécula que inibe a ligação do PD-L2 aos seus parceiros de ligação. Em um aspecto específico, um parceiro de ligação do PD-L2 é PD-1. O antagonista pode ser um anticorpo, um fragmento de ligação do antígeno do mesmo, uma imunoadesina, uma proteína de fusão ou oligopeptídeo. Os anticorpos exemplares estão descritos nas patentes US Nos. US8735553, US8354509 e US8008499, todos aqui incorporados por referência. Outros antagonistas do eixo PD-1 para uso nos métodos fornecidos aqui são conhecidos na técnica, como descrito no pedido de patente US No. US20140294898, US2014022021 e US20110008369, todos aqui incorporados por referência.

[1187] Em algumas modalidades, o antagonista de ligação da PD-1 é um anticorpo anti-PD-1, por exemplo, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-1 é selecionado do grupo consistindo em nivolumabe, pembrolizumabe e CT-011. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação da PD-1 é uma imunoadesina (por exemplo, uma imunoadesina que compreende uma porção de ligação extracelular ou PD-1 do PDL1 ou PD-L2 fundida a uma região constante (por exemplo, uma região Fc de uma sequência de imunoglobulina). Em algumas modalidades, o antagonista de ligação de PD-1 é AMP-224. Nivolumabe, também conhecido como MDX-1106-04, MDX-1106, ONO- 4538, BMS-936558 e OPDIVO®, é um anticorpo anti-PD-1 descrito em WO2006/121168. Pembrozumabe, também conhecido como MK-3475,

Merck 3475, lambrozumabe, KEYTRUDA® e SCH-900475, é um anticorpo anti-PD-1 descrito em WO2009/114335. CT-011, também conhecido como hBAT ou hBAT-1, é um anticorpo anti-PD-1 descrito em WO2009/101611. AMP-224, também conhecido como B7-DCIg, é um receptor solúvel de fusão PD-L2-Fc descrito em WO2010/027827 e WO2011/066342. Outros antagonistas adicionais da ligação de PD-1 incluem pidilizumabe, também conhecido como CT-011, MEDI0680, também conhecido como AMP-514 e REGN2810.

[1188] Em algumas modalidades, o inibidor do ponto de verificação imune é um antagonista da PD-L1, como o durvalumabe, também conhecido como MEDI4736, atzolizumabe, também conhecido como MPDL3280A, ou avelumabe, também conhecido como MSB00010118C. Em certos aspectos, o inibidor do ponto de verificação imune é um antagonista da PD-L2, como o rHIgM12B7. Em alguns aspectos, o inibidor do ponto de verificação imune é um antagonista de LAG-3, como, mas não se limitando a, IMP321 e BMS-986016. O inibidor do ponto de verificação imune pode ser um antagonista do receptor A2a da adenosina (A2aR), como PBF-509.

[1189] Em algumas modalidades, qualquer anticorpo descrito aqui (como um anticorpo anti-PD-1, um anticorpo anti-PD-L1 ou um anticorpo anti-PD-L2) compreende ainda uma região constante humana ou murina. Em um aspecto adicional, a região constante humana é selecionada do grupo que consiste em IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Em um aspecto ainda mais específico, a região constante humana é IgG1. Em um aspecto ainda mais específico, a região constante murina é selecionada do grupo que consiste em IgG1, IgG2A, IgG2B e IgG3. Em um aspecto ainda mais específico, o anticorpo reduziu a função efetora mínima. Em um aspecto ainda mais específico, a função efetora mínima resulta da produção em células procarióticas. Em um aspecto ainda mais específico, a função efetora mínima resulta de uma "mutação Fc com menos efetor" ou de uma aglicosilação. A glicosilação de anticorpos é tipicamente N-ligada ou O-ligada. N-ligada refere-se à fixação da porção de carboidratos à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As sequências de tripeptídeo asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido, exceto prolina, são as sequências de reconhecimento para fixação enzimática da porção de carboidratos para a cadeia lateral da asparagina. Assim, a presença de qualquer uma destas sequências de tripeptídeo em um polipeptídeo cria um sítio de glicosilação potencial. A glicosilação O- ligada refere-se à fixação de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose ou xilose a um ácido hidroxiamino, mais comumente a serina ou treonina, embora a 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina também possa ser usada. A remoção dos locais de glicosilação que forma um anticorpo é realizada de forma conveniente alterando a sequência de aminoácidos de forma que uma das sequências de tripeptídeos descritas acima (para os locais de glicosilação ligados ao N) seja removida. A alteração pode ser realizada através da substituição de um resíduo de asparagina, serina ou treonina no interior do sítio de glicosilação de outro resíduo de aminoácidos (por exemplo, glicina, alanina ou uma substituição conservadora).

[1190] O anticorpo ou o fragmento de ligação do antígeno pode ser feito usando métodos conhecidos na técnica, por exemplo, por um processo compreendendo a cultura de uma célula hospedeira contendo ácido nucleico que codifica qualquer um dos anticorpos anti-PD-L1, anti- PD-1 ou anti-PD-L2 descritos anteriormente, ou fragmento de ligação do antígeno em uma forma adequada para expressão, em condições adequadas para produção desse anticorpo ou fragmento, e recuperação do anticorpo ou fragmento. B. CTLA-4

[1191] Outro ponto de verificação imune que pode ser direcionado nos métodos fornecidos aqui é a proteína 4 associada aos linfócitos T citotóxicos (CTLA-4), também conhecida como CD152. A sequência completa de cDNA do CTLA-4 humano tem o número de acesso Genbank L15006. O CTLA-4 encontra-se na superfície das células T e age como um "interruptor de desligado" quando ligado ao CD80 ou CD86 na superfície das células que apresentam o antígeno. O CTLA4 é um membro da superfamília de imunoglobulinas que é expressada na superfície das células T auxiliares e transmite um sinal inibitório para as células T. O CTLA4 é semelhante à proteína co-estimulatória de células T, CD28, e ambas as moléculas se ligam ao CD80 e CD86, também chamados B7-1 e B7-2, respectivamente, nas células apresentadoras de antígenos. O CTLA4 transmite um sinal inibitório para as células T, enquanto o CD28 transmite um sinal estimulante. O CTLA4 intracelular também é encontrado em células T reguladoras e pode ser importante para sua função. A ativação de células T através do receptor de células T e CD28 leva a uma expressão aumentada de CTLA-4, um receptor inibitório para moléculas B7.

[1192] Em algumas modalidades, o inibidor do ponto de verificação imune é um anticorpo anti-CTLA-4 (por exemplo, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico), um fragmento de ligação do antígeno do mesmo, uma imunoadesina, uma proteína de fusão ou oligopeptídeo.

[1193] Os anticorpos anti-humanos-CTLA-4 (ou domínios VH e/ou VL derivados deles) adequados para uso nos presentes métodos podem ser gerados usando métodos bem conhecidos na técnica. Alternativamente, podem ser usados anticorpos anti-CTLA-4 reconhecidos pela técnica. Por exemplo, os anticorpos anti-CTLA-4 revelados em: US8,119,129, WO 01/14424, WO 98/42752; WO 00/37504 (CP675,206, também conhecido como tremelimumabe; anteriormente ticilimumabe), patente US No. 6.207.156; Hurwitz et al,

1998; podem ser usados nos métodos revelados aqui. Os ensinamentos de cada uma das publicações mencionadas anteriormente estão incorporados aqui por referência. Também podem ser usados anticorpos que concorrem com qualquer um destes anticorpos reconhecidos pela técnica para ligação ao CTLA-4. Por exemplo, um anticorpo CTLA-4 humanizado é descrito no pedido de patente Internacional No. WO2001014424, WO2000037504 e patente US No. US8017114; todos aqui incorporados por referência.

[1194] Um anticorpo anti-CTLA-4 exemplificador é o ipilimumabe (também conhecido como 10D1, MDX-010, MDX-101 e Yervoy®) ou fragmentos de ligação do antígeno e suas variantes (ver, por exemplo, WO01/14424). Em outras modalidades, o anticorpo compreende as CDRs de cadeia pesada e leve ou VRS de ipilimumabe. Assim, em uma modalidade, o anticorpo compreende os domínios CDR1, CDR2 e CDR3 da região VH de ipilimumabe e os domínios CDR1, CDR2 e CDR3 da região VL de ipilimumabe. Nem outra modalidade, o anticorpo concorre para a ligação com e/ou liga-se ao mesmo epítopo da CTLA-4 que os anticorpos acima mencionados. Em outra modalidade, o anticorpo tem pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência de aminoácidos de região variável com os anticorpos mencionados acima (por exemplo, pelo menos cerca de 90%, 95% ou 99% de identidade de região variável com ipilimumabe).

[1195] Outras moléculas para modulação da CTLA-4 incluem ligantes e receptores CTLA-4 solúveis, como descritos nas patentes US Nos. US5844905, US5885796 e nos pedidos de patente Internacional WO1995001994 e WO1998042752; todos incorporados aqui por referência, e imunoadesinas, como descrito na patente US8329867, incorporada aqui por referência. C. Receptor tipo imunoglobulina Killer (KIR)

[1196] Outro inibidor do ponto de verificação imune para uso na presente invenção é um anticorpo anti-KIR. Os anticorpos anti- humanos-KIR (ou domínios VH/VL derivados deles) adequados para uso nos presentes métodos podem ser gerados usando métodos bem conhecidos na técnica.

[1197] Em alternativa, podem ser utilizados anticorpos anti-KIR reconhecidos pela técnica. O anticorpo anti-KIR pode ser reativo cruzado com receptores KIR inibitórios múltiplos e potencializa a citotoxicidade das células NK que possuem um ou mais destes receptores. Por exemplo, o anticorpo anti-KIR pode se ligar a cada uma das células KIR2D2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 e potencializar a atividade das células NK reduzindo, neutralizando e/ou invertendo a inibição da citotoxicidade das células NK mediadas por qualquer uma ou todas estas KIRs. Em alguns aspectos, o anticorpo anti-KIR não liga o KIR2DS4 e/ou o KIR2DS3. Por exemplo, podem ser usados anticorpos monoclonais 1-7F9 (também conhecido como IPH2101), 14F1, 1-6F1 e 1-6F5, descritos em WO 2006/003179, cujos ensinamentos são incorporados aqui por referência. Também podem ser usados anticorpos que concorrem com qualquer um destes anticorpos reconhecidos pela técnica para ligação ao KIR. Outros anticorpos anti- KIR reconhecidos pela técnica que podem ser usados incluem, por exemplo, os revelados em WO 2005/003168, WO 2005/009465, WO 2006/072625, WO 2006/072626, WO 2007/042573, WO 2008/084106, WO 2010/065939, WO 2012/071411 e WO 2012/160448.

[1198] Um anticorpo anti-KIR exemplificador é o lirilumabe (também referido como BMS-986015 ou IPH2102). Em outras modalidades, o anticorpo anti-KIR compreende as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) ou regiões variáveis (VRs) de lirilumabe de cadeia pesada e leve. Assim, em uma modalidade, o anticorpo compreende os domínios CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável de cadeia pesada (VH) de lirilumabe e os domínios CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável de cadeia leve VL de lirilumabe. Em outra modalidade, o anticorpo tem, pelo menos, cerca de 90% de identidade de sequência de aminoácidos de região variável com o lirilumabe.

[1199] Exemplos de cânceres contemplados para tratamento incluem câncer do pulmão, câncer da cabeça e pescoço, câncer de mama, câncer pancreático, câncer da próstata, câncer renal, câncer de osso, câncer testicular, câncer cervical, câncer gastrointestinal, linfomas, lesões pré-neoplásicas no pulmão, câncer do cólon, melanoma metastático, câncer da pele das células basais, câncer da pele das células escamosas, dermatofibrossarcoma protuberans, carcinoma de células de Merkel, sarcoma de Kaposi, ceratoacantoma, tumores de células fusiformes, carcinomas sebáceos, carcinoma anexial microcístico, doença de Paget da mama, fibroxantoma atípico, leiomiossarcoma e angiossarcoma, Lentigo Maligna, melanoma lentigo maligna, melanoma superficial de propagação, melanoma nodular, melanoma lentiginoso acral, melanoma desmoplásico e câncer de bexiga.

[1200] Em algumas modalidades, o indivíduo tem câncer que é resistente (tem sido demonstrado ser resistente) a uma ou mais terapias anticâncer. Em algumas modalidades, a resistência à terapia anticâncer inclui câncer recidivo ou câncer refratário. A recidiva pode referir-se ao reaparecimento do câncer, no local original ou em um novo local, após o tratamento. Em algumas modalidades, a resistência à terapia anticâncer inclui a progressão do câncer durante o tratamento com a terapia do anticâncer. Em algumas modalidades, o câncer está no estágio adiantado ou no estágio atrasado. O indivíduo pode ter um câncer que expressa (demonstrou expressar, por exemplo, em um teste de diagnóstico) o biomarcador PD-Ll. Em algumas modalidades, o câncer do paciente expressa um baixo biomarcador PD-Ll. Em algumas modalidades, o câncer do paciente expressa um elevado biomarcador

PD-Ll. O biomarcador PD-Ll pode ser detectado na amostra usando um método selecionado do grupo consistindo em FACS, Western blot, ELISA, imunoprecipitação, imuno-histoquímica, imunofluorescência, radioimunoensaio, dot blotting, métodos de imunodetecção, HPLC, ressonância de plásmon de superfície, espectroscopia óptica, espectrometria de massa, HPLC, qPCR, RT-qPCR, qPCR multiplex ou RT-qPCR, análise de microarranjo, SAGE, técnica de MassARRAY, e FISH, e combinações destes.

[1201] Em algumas modalidades, o câncer tem níveis baixos de infiltração com células T. Em algumas modalidades, o câncer não tem nenhum infiltrado detectável de células T. Em algumas modalidades, o câncer é um câncer não imunogênico (por exemplo, câncer colorretal não imunogênico e/ou câncer ovariano).

[1202] Por exemplo, uma quantidade terapeuticamente efetiva ou suficiente do inibidor do ponto de verificação imune, como um anticorpo, é administrada a um ser humano, estará na faixa de cerca de 0,01 a cerca de 50 mg/kg de peso corporal do paciente, seja por uma ou mais administrações. Em algumas modalidades, o anticorpo usado é de cerca de 0,01 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 0,01 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 0,01 a cerca de 35 mg/kg, cerca de 0,01 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 0,01 a cerca de 25 mg/kg, cerca de 0,01 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 0,01 a cerca de 15 mg/kg, cerca de 0,01 a cerca de 10 mg/kg, cerca de 0,01 a cerca de 5 mg/kg, ou cerca de 0,01 a cerca de 1 mg/kg administrados diariamente, por exemplo. Em algumas modalidades, o anticorpo é administrado a 15 mg/kg. No entanto, outros regimes de dose podem ser úteis. Em uma modalidade, o anticorpo anti-PD-Ll descrito aqui é administrado a um ser humano em uma dose de cerca de 100 mg, cerca de 200 mg, cerca de 300 mg, cerca de 400 mg, cerca de 500 mg, cerca de 600 mg, cerca de 700 mg, cerca de 800 mg, cerca de 900 mg, cerca de 1000 mg, cerca de 1100 mg, cerca de 1200 mg,

cerca de 1300 mg ou cerca de 1400 mg, no dia 1 do ciclo de 21 dias. A dose pode ser administrada como dose única ou como doses múltiplas (por exemplo, 2 ou 3 doses), como infusões. O progresso dessa terapia é facilmente monitorado por técnicas convencionais. Terapias anti-câncer e outras terapias

[1203] Em algumas modalidades, o inibidor do ponto de verificação imune pode ser administrado em combinação com pelo menos um terapêutico adicional. A terapia adicional pode ser uma terapia oncológica como a radioterapia, cirurgia, quimioterapia, terapia gênica, terapia do DNA, terapia viral, terapia do RNA, imunoterapia, transplante da medula óssea, nanoterapia, terapia com anticorpos monoclonais, ou uma combinação dos anteriores. A terapia adicional pode estar na forma de terapia adjuvante ou neoadjuvante.

[1204] Em um exemplo, a terapia oncológica (quer com ou sem administração de um inibidor do ponto de verificação imune) ou qualquer outra doença (por exemplo, infecção viral ou doença autoimune) pode ser radioterapia, cirurgia, quimioterapia, terapia gênica, terapia de DNA, terapia viral, terapia de RNA, imunoterapia, transplante de medula óssea, nanoterapia ou terapia com anticorpos monoclonais. A terapia pode ser uma combinação dos anteriores. Uma terapia adicional pode ser administrada.

[1205] Em algumas modalidades, a terapia (ou a terapia oncológica adicional) é a administração de um inibidor enzimático de pequena molécula ou de um agente antimetastático. Em algumas modalidades, a terapia adicional é a administração de agentes limitantes de efeito colateral (por exemplo, agentes destinados a diminuir a ocorrência e/ou gravidade dos efeitos colaterais do tratamento, como agentes anti- náusea, etc).

[1206] Em algumas modalidades, a terapia (ou a terapia oncológica adicional) é a radioterapia. Em algumas modalidades, a terapia (ou a terapia oncológica adicional é a cirurgia. Em algumas modalidades, a terapia (ou a terapia oncológica adicional) é uma combinação da radioterapia e da cirurgia. Em algumas modalidades, a terapia (ou a terapia oncológica adicional) é a irradiação gama. Em algumas modalidades, a terapia (ou a terapia oncológica adicional) é a terapia que foca a via de PBK/AKT/mTOR, o inibidor de HSP90, o inibidor da tubulina, o inibidor da apoptose, e/ou o agente quimiopreventivo. A terapia (ou a terapia oncológica adicional) pode ser um ou mais dos agentes quimioterapêuticos conhecidos na técnica.

[1207] A administração de qualquer composto ou terapia das presentes modalidades a um paciente seguirá protocolos gerais para a administração desses compostos, levando em conta a toxicidade, se houver, dos agentes. Portanto, em algumas modalidades há uma etapa de monitoramento da toxicidade que é atribuível à terapia combinada.

[1208] A terapia pode incluir ou consistir em administração ao indivíduo de qualquer um dos seguintes:

1. Quimioterapia

[1209] Uma grande variedade de agentes quimioterápicos pode ser usada de acordo com as presentes modalidades. O termo "quimioterapia" refere-se ao uso de fármacos para tratar o câncer. Um "agente quimioterápico" é usado para conotar um composto ou composição que é administrado no tratamento do câncer. Esses agentes ou fármacos são categorizados por seu modo de atividade dentro de uma célula, por exemplo, se e em que estágio eles afetam o ciclo da célula. Alternativamente, um agente pode ser caracterizado com base na sua capacidade de reticular o DNA, de intercalar no DNA ou de induzir aberrações cromossômicas e mitóticas, afetando a síntese de ácidos nucleicos.

[1210] Exemplos de agentes quimioterápicos incluem agentes alquilantes, como tiotepa e ciclosfosfamida; sulfonatos de alquila, como busulfano, improsulfano e piposulfano; aziridinas, como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etileniminas e metilamelaminas, incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina e bulatacinona); uma camptotecina (incluindo o análogo sintético topotecano); briostatina; calistatina; CC-1065 (por exemplo, seus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina e bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (por exemplo, os análogos sintéticos, KW- 2189 e CB 1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; uma sarcodictina; espongistatina; mostardas de nitrogênio, como clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, melfalano, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida e mostarda de uracila; nitrosureias, como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina e ranimnustina; antibióticos, como os antibióticos enedina (por exemplo, calicheamicina, especialmente calicheamicina gammall e calicheamicina omegall); dinemicina, incluindo dinemicina A; bisfosfonatos, como clodronato; uma esperamicina; bem como cromóforo neocarzinostatina e cromóforos antiobióticos enedina relacionados a cromoproteína, aclacinomisinas, actinomicina, autrarnicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina (por exemplo, morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino- doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina e deoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalarnicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina e zorrubicina; anti-metabólitos, como metotrexato e 5-fluorouracila (5-FU); análogos de ácido fólico, como denopterina, pteropterina e trimetrexato; análogos de purina, como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina e tioguanina; análogos de pirimidina, como ancitabina, azacitidina, 6- azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina e floxuridina; andrógenos, como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano e testolactona; anti- adrenais, como mitotano e trilostano; reforçador de ácido fólico, como ácido frolínico; aceglatona; glicosídeo aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracila; amsacrina; bestrabucila; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elformitina; acetato de eliptínio; uma epotilona; etoglucida; nitrato de gálio; hidroxiureia; lentinano; lonidainina; maitansinóides, como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenameto; pirarrubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2-etil-hidrazida; procarbazina; complexo PSK -polissacarídeo; razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (por exemplo, toxina T-2, verracurina A, roridina A e anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; taxóides, por exemplo, paclitaxel e docetaxel gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; complexos de coordenação de platina, como cisplatina, oxaliplatina e carboplatina; vinblastina; platina; etoposídeo (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; novantrona; teniposídeo; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; irinotecano (por exemplo, CPT-11); inibidor de topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinóides, como ácido retinóico; capecitabina; carboplatina, procarbazina, plicomicina, gemcitabina, navelbina, inibidores de farnesil-proteína tansferase, transplatina e sais,

ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos acima.

2. Radioterapia

[1211] Outros fatores que causam danos ao DNA e têm sido usados extensivamente incluem o que é comumente conhecido como raios γ, raios X e/ou a entrega direcionada de radioisótopos às células tumorais. Outras formas de fatores prejudiciais ao DNA também são contempladas, como micro-ondas, irradiação do feixe de próton (Patentes US 5.760.395 e 4.870.287) e irradiação UV. É muito provável que todos estes fatores afetem uma vasta gama de danos no DNA, nos precursores do DNA, na replicação e reparação do DNA, bem como na montagem e manutenção dos cromossomas. As faixas de dosagem para raios X variam de doses diárias de 50 a 200 roentgens por períodos prolongados de tempo (3 a 4 semanas), até doses únicas de 2000 a 6000 roentgens. As faixas de dosagem para radioisótopos variam muito e dependem da meia-vida do isótopo, da intensidade e do tipo de radiação emitida e da absorção pelas células neoplásicas.

3. Imunoterapia

[1212] O versado na técnica compreenderá que as imunoterapias podem ser usadas em combinação ou em conjunto com os métodos descritos aqui. No contexto do tratamento oncológico, os imunoterapêuticos geralmente dependem do uso de células e moléculas imunitárias efetoras para alvejar e destruir células cancerosas. O rituximabe (RITUXAN®) é um exemplo de imunoterapia. O efetor imune pode ser, por exemplo, um anticorpo específico para um marcador na superfície de uma célula tumoral. O anticorpo, por si só, pode servir como efetor da terapia ou pode recrutar outras células para efetivamente efetuar a morte das células. O anticorpo também pode ser conjugado a um fármaco ou uma toxina (quimioterápicos, radionuclídeos, cadeia A de ricina, toxina da cólera, toxina da coqueluche, etc.) e servir como agente de direcionamento. Alternativamente, o efetor pode ser um linfócito que transporta uma molécula de superfície que interage, direta ou indiretamente, com um alvo de células tumorais. Várias células efetoras incluem células T citotóxicas e células NK.

[1213] Em um exemplo, a imunoterapia compreende terapia celular adotiva, como administração de CAR-T, por exemplo, administração de CAR-T anti-CD19 ou CD20.

[1214] Em um exemplo, a imunoterapia compreende ou consiste na administração de uma IL-2 (por exemplo, uma IL-2 truncada ou IL-2 pegilada ou IL-2 fundida a Fc).

[1215] Os conjugados de anticorpos-fármacos surgiram como uma abordagem inovadora para o desenvolvimento da terapêutica do câncer. Os conjugados de anticorpos-fármacos (ADCs) incluem anticorpos monoclonais (MAbs) que estão covalentemente ligados a fármacos que matam células. Esta abordagem combina a elevada especificidade dos MAbs em relação aos seus antígenos alvo com substâncias citotóxicas altamente potentes, resultando em MAbs "armados" que fornecem a carga útil (fármaco) às células tumorais com níveis enriquecidos do antígeno. A administração direcionada do fármaco também minimiza sua exposição em tecidos normais, resultando na diminuição da toxicidade e melhora do índice terapêutico. A aprovação de dois fármacos ADC, ADCETRIS® (brentuximabe vedotina) em 2011 e KADCYLA® (trastuzumabe entansina ou T-DM1) em 2013 pela FDA validou a abordagem. Existem atualmente mais de 30 candidatos a fármacos ADC em várias fases de ensaios clínicos para tratamento oncológico. À medida que a engenharia de anticorpos e a otimização da carga útil do ligante estão se tornando cada vez mais amadurecidas, a descoberta e o desenvolvimento de novos ADCs são cada vez mais dependentes da identificação e validação de novos alvos que são adequados a essa abordagem e à geração de MAbs alvo. Dois critérios para alvos ADC são níveis de expressão elevados/reguladas positivas em células tumorais e uma internalização robusta.

[1216] Em um aspecto da imunoterapia, a célula tumoral deve ter algum marcador que seja passível de direcionamento, ou seja, não está presente na maioria das outras células. Existem muitos marcadores tumorais e qualquer um destes pode ser adequado para direcionamento no contexto das presentes modalidades. Os marcadores tumorais comuns incluem CD20, antígeno carcinoembrionário, tirosinase (p97), gp68, TAG-72, HMFG, antígeno de Sialyl Lewis, MucA, MucB, PLAP, receptor de laminina, erb B e pi 55. Um aspecto alternativo da imunoterapia é combinar os efeitos anticâncer com efeitos estimulatórios imunológicos. Moléculas de estímulo imune também existem incluindo: citocinas, como IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, gama-IFN, quimiocinas, como MIP-1, MCP-1, IL-8 e fatores de crescimento, como o ligante FLT3.

4. Cirurgia

[1217] O câncer ou outra doença ou condição podem ser tratados por cirurgia na invenção.

[1218] Aproximadamente 60% das pessoas com câncer serão submetidas a cirurgia de algum tipo, que inclui cirurgia preventiva, diagnóstica ou estadiamento, curativa e paliativa. A cirurgia curativa inclui a ressecção na qual todo ou parte do tecido canceroso é fisicamente removido, excisado e/ou destruído e pode ser usado em conjunto com outras terapias, como o tratamento das presentes modalidades, quimioterapia, radioterapia, terapia hormonal, terapia gênica, imunoterapia e/ou terapias alternativas. A ressecção tumoral refere-se à remoção física de pelo menos parte de um tumor. Além da ressecção tumoral, o tratamento cirúrgico inclui cirurgia a laser, criocirurgia, eletrocirurgia e cirurgia microcontrolada (cirurgia de Mohs).

[1219] Após a excisão de parte ou de todas as células cancerosas, tecidos ou tumores, pode formar-se uma cavidade no corpo. O tratamento pode ser realizado através da perfusão, injeção direta ou aplicação local da área com uma terapia anticâncer adicional. Esse tratamento pode ser repetido, por exemplo, a cada 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dias, ou a cada 1, 2, 3, 4 e 5 semanas ou a cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 meses. Estes tratamentos podem ser de doses variadas também.

5. Transplantes bacterianos

[1220] Em uma modalidade, a terapia compreende administrar ao indivíduo um transplante bacteriano, por exemplo, um transplante microbiano fecal, compreendendo bactérias definidas. Por exemplo, o transplante é qualquer composição revelada em WO201806445, cuja revelação (especialmente as composições nele contidas) é incorporada aqui incorporado na íntegra, para possível aplicação na presente invenção. Por exemplo, o transplante está de acordo com qualquer um dos parágrafos seguintes (tabelas e números de sequência referentes às tabelas e sequências em WO201806445, que são explicitamente incorporadas aqui para possível uso nas reivindicações):

[1221] 1. Uma composição compreendendo pelo menos uma população isolada ou purificada de bactérias pertencentes a uma ou mais famílias Ruminococcaceae, Clostridiaceae, Lachnospiraceae, Micrococcaceae e/ou Veilonellaceae.

[1222] 2. Uma composição compreendendo pelo menos duas populações isoladas ou purificadas de bactérias pertencentes a uma ou mais famílias Ruminococcaceae, Clostridiaceae, Lachnospiraceae, Micrococcaceae e/ou Veilonellaceae.

[1223] 3. A composição do parágrafo 1 ou do parágrafo 2, em que cada uma das populações de bactérias está presente na composição a uma concentração de pelo menos 10^3 UFC.

[1224] 4. A composição do parágrafo 1 ou do parágrafo 2, em que a composição é um produto bacteriano vivo ou um produto bioterapêutico vivo.

[1225] 5. A composição do parágrafo 1 ou do parágrafo 2, em que pelo menos uma bactéria isolada ou purificada da população ou pelo menos duas populações isoladas ou purificadas de bactérias são fornecidas como esporos bacterianos.

[1226] 6. A composição do parágrafo 1 ou do parágrafo 2, em que pelo menos uma população de bactérias ou pelo menos duas populações de bactérias isoladas ou purificadas pertencem à família Clostridiales XII e/ou à família Clostridiales XIII.

[1227] 7. A composição do parágrafo 1 ou do parágrafo 2, em que pelo menos uma bactéria isolada ou purificada da população ou pelo menos duas populações isoladas ou purificadas de bactérias pertencem à família Ruminococcaceae e/ou à família Clostridiaceae.

[1228] 8. A composição do parágrafo 1 ou do parágrafo 2, em que a população de bactérias pertencentes à família Ruminococcaceae é definida como uma população de bactérias pertencentes ao gênero Ruminococcus.

[1229] 9. A composição do parágrafo 8, em que a população de bactérias pertencentes ao gênero Ruminococcus é definida ainda como uma população de bactérias pertencentes à espécie Ruminococcus bromii.

[1230] 10. A composição do parágrafo 1 ou do parágrafo 2, em que a população de bactérias pertencentes à família Ruminococcaceae é definida ainda como uma população de bactérias pertencentes ao gênero Fecalibacterium.

[1231] 11. A composição do parágrafo 10, em que a população de bactérias pertencentes ao gênero Faecalibacterium é definida ainda como uma população de bactérias pertencentes à espécie

Faecalibacterium prausnitzii.

[1232] 12. A composição do parágrafo 1 ou do parágrafo 2, em que a população de bactérias pertencentes à família Micrococcaceae é definida ainda como uma população de bactérias pertencentes ao gênero Rothia.

[1233] 13. A composição do parágrafo 1 ou do parágrafo 2, em que a composição compreende ainda uma população de bactérias pertencentes à espécie Porphyromonas pastori, a espécie Clostridium hungatei, a espécie Phascotochacterium faecium, ao gênero Peptonifílico e/ou à classe Mollicutes.

[1234] 14. A composição do parágrafo 1 ou do parágrafo 2, em que a composição é essencialmente livre de populações de bactérias pertencentes à ordem Bacteroidales.

[1235] 15. A composição do parágrafo 1 ou do parágrafo 2, em que pelo menos uma bactéria isolada ou purificada da população ou pelo menos duas populações isoladas ou purificadas de bactérias pertencem a uma ou mais espécies, subespécies ou cepas bacterianas selecionadas do grupo consistindo em espécies na Tabela 1 com um índice de enriquecimento (ei) maior que 0,5.

[1236] 16. A composição do parágrafo 1 ou do parágrafo 2, em que pelo menos uma bactéria isolada ou purificada da população ou pelo menos duas populações isoladas ou purificadas de bactérias são selecionadas a partir do grupo consistindo em espécies na Tabela 1 com um “ei” igual a 1.

[1237] 17. A composição do parágrafo 1 ou do parágrafo 2, em que pelo menos uma bactéria isolada ou purificada da população ou pelo menos duas populações de bactérias isoladas ou purificadas compreendem uma sequência de nucleotídeos de RNA 16S ribossomal (rRNA) que é pelo menos 90 % idêntica (por exemplo, pelo menos 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica) à sequência de nucleotídeos

16S rRNA de bactérias identificadas por IDs de taxonomia NCBI selecionados do grupo consistindo em ID de taxonomia NCBI: 717959, 587, 758823, 649756, 44749, 671218, 1264, 1122135, 853, 484018, 46503, 54565, 290052, 216931, 575978, 433321, 1796646, 213810, 228924, 290054, 1509, 1462919, 29375, 337097, 1298596, 487174, 642492, 1735, 1297424, 742766, 46680, 132925, 411467, 1318465, 1852367, 1841857, 169679, 1175296, 259063, 172901, 39488, 57172, 28118, 166486, 28133, 1529, 694434, 1007096, 84030, 56774, 102148, 626947, 216933, 1348613, 1472417, 100176, 824, 1471761, 1297617, 288966, 1317125, 28197, 358743, 264639, 1265, 1335, 66219, 69473, 115117, 341220, 1732, 873513, 396504, 1796619, 45851, 2741, 105841, 86332, 1349822, 84037, 180311, 54291, 1217282, 762984, 1185412, 154046, 663278, 1543, 398512, 69825, 1841867, 1535, 1510, 84026, 1502, 1619234, 39497, 1544, 29343, 649762, 332095, 536633, 1033731, 574930, 742818, 177412, 1121308, 419208, 1673717, 55779, 28117, 626937, 180332, 1776382, 40519, 34062, 40518, 74426, 1216062, 293826, 850, 645466, 474960, 36835, 115544, 1515, 88431, 216932, 1417852, 39492, 1583, 420247, 118967, 169435, 37658, 138595, 31971, 100886, 1197717, 234908, 537007, 319644, 168384, 915173, 95159, 1816678, 626940, 501571, 1796620, 888727, 1147123, 376806, 1274356, 1267, 39495, 404403, 1348, 253314, 258515, 33033, 1118061, 357276, 214851, 320502, 217731, 246787, 29371, 649764, 901, 29374, 33043, 39778, 682400, 871665, 160404, 745368, 408, 1584, 333367, 47246, 1096246, 53342, 438033, 351091, 1796622, 1776384, 817, 48256, 720554, 500632, 36849, 301302, 879970, 655811, 264463, 1532, 285, 995, 242750, 29539, 1432052, 622312, 1796636, 1337051, 328814, 28446, 1492, 820, 39496, 52786, 1549, 1796618, 582, 46507, 109327, 1531, 1382, 33039, 311460, 230143, 216935, 539, 35519, 1681, 328813, 214853, 89014, 1121115, 1585974, 29466, 1363, 292800, 270498, 214856, 142877, 133926, 209880,

179628, 1121102, 105612, 1796615, 39777, 29353, 1579, 163665, 53443, 261299, 1302, 1150298, 938289, 358742, 471875, 938278, 1796613, 1118057, 1077144, 1737, 218205, 1121298, 684066, 433659, 52699, 204516, 706562, 253257, 328812, 1280, 147802, 58134, 1335613, 891, 585394, 1582, 235931, 308994, 1589, 1682, 1736, 28129, 178001, 551788, 2051, 856, 118562, 101070, 515619, 40215, 187979, 82979, 29363, 1776391, 1285191, 84112, 157688, 38304, 36850, 341694, 287, 75612, 818, 371674, 338188, 88164, 588581, 676965, 546271, 1236512, 178338, 862517, 157687, 158, 51048, 1583331, 529, 888745, 394340, 40545, 855, 553973, 938293, 93063, 708634, 179995, 1351, 476652, 1464038, 555088, 237576, 879566, 1852371, 742727, 1377, 35830, 997353, 218538, 83771, 1605, 28111, 131109, 46609, 690567, 46206, 155615, 51616, 40542, 203, 294, 1034346, 156456, 80866, 554406, 796942, 1002367, 29347, 796944, 61592, 487175, 1050201, 762948, 137732, 1211819, 1019, 272548, 1717, 384636, 216940, 2087, 45634, 466107, 1689, 47678, 575, 979627, 840, 1660, 1236517, 617123, 546, 28135, 82171, 483, 501496, 99656, 1379, 84032, 39483, 1107316, 584, 28124, 1033744, 657309, 536441, 76123, 1118060, 89152, 76122, 303, 1541, 507751, 515620, 38302, 53419, 726, 40324, 1796610, 988946, 1852370, 1017, 1168289, 76936, 94869, 1161098, 215580, 1125779, 327575, 549, 1450648 e

478.

[1238] 18. A composição do parágrafo 1 ou parágrafo 2, em que pelo menos uma população isolada ou purificada de bactérias ou pelo menos duas populações isoladas ou purificadas de bactérias são espécies, subespécies ou cepas bacterianas compreendendo uma sequência de genes de rRNA 16S pelo menos 80 % idêntica (p.ex., pelo menos 85, 90, 95 ou 98% idêntica) à sequência da SEQ ID NO: 1-876.

[1239] 19. A composição do parágrafo 1 ou parágrafo 2, em que pelo menos uma bactéria da população isolada ou purificada ou pelo menos duas populações isoladas ou purificadas de bactérias pertencem a espécies, subespécies ou cepas bacterianas selecionadas do grupo consistindo em Bacteroides coagulans, Clostridium aldenense, Clostridium aldrichii, Clostridium alkalicellulosi, Clostridium amygdalinum, Clostridium asparagiforme, Clostridium cellulosi, Clostridium citroniae, Clostridium clariflavum DSM 19732, Clostridium clostridioforme, Clostridium colinum, Clostridium fimetarium, Clostridium hiranonis, Clostridium hungatei, Clostridium hylemonae DSM 15053, Clostridium indolis, Clostridium lactatifermentans, Clostridium leptum, Clostridium methylpentosum, Clostridium oroticum, Clostridium papyrosolvens DSM 2782, Clostridium populeti, Clostridium propionicum, Clostridium saccharolyticum, Clostridium scindens, Clostridium sporosphaeroides, Clostridium stercorarium, Clostridium straminisolvens, Clostridium sufflavum, Clostridium termitidis, Clostridium thermosuccino genes, Clostridium viride, Clostridium xylanolyticum, Desulfotomaculum guttoideum, Eubacterium rectale ATCC 33656, Eubacterium dolichum, Eubacterium eligens ATCC 27750, Eubacterium hallii, Eubacterium infirmum, Eubacterium siraeum, Eubacterium tenue, Ruminococcus torques, Acetanaerobacterium elongatum, Acetatifactor muris, Acetivibrio cellulolyticus, Acetivibrio ethanolgignens, Acholeplasma brassicae 0502, Acholeplasma parvum, Acholeplasma vituli, Acinetobacter junii, Actinobacillus porcinus, Actinomyces bowdenii, Actinomyces dentalis, Actinomyces odontolyticus, Acutalibacter muris, Aerococcus viridans, Aeromicrobium fastidiosum, Alistipes finegoldii, Alistipes obesi, Alistipes onderdonkii, Alistipes putredinis, Alistipes shahii, Alistipes shahii WAL 8301, Alistipes timonensis JC136, Alkalibacter saccharofermentans, Alkaliphilus metalliredigens QYMF, Allisonella histaminiformans, Allobaculum stercoricanis DSM 13633, Alloprevotella rava, Alloprevotella tannerae, Anaerobacterium chartisolvens, Anaerobiospirillum thomasii,

Anaerobium acetethylicum, Anaerococcus octavius NCTC 9810, Anaerococcus provenciensis, Anaerococcus vaginalis ATCC 51170, Anaerocolumna jejuensis, Anaerofilum agile, Anaerofustis stercorihominis, Anaeroglobus geminatus, Anaeromassilibacillus senegalensis, Anaeroplasma abactoclasticum, Anaerorhabdus furcosa, Anaerosporobacter mobilis, Anaerostipes butyraticus, Anaerostipes caccae, Anaerostipes hadrus, Anaerotruncus colihominis, Anaerovorax odorimutans, Anoxybacillus rupiensis, Aquabacterium limnoticum, Arcobacter butzleri, Arthrospira platensis, Asaccharobacter celatus, Atopobium parvulum, Bacteroides caccae, Bacteroides caecimuris, Bacteroides cellulosilyticus, Bacteroides clarus YIT 12056, Bacteroides dorei, Bacteroides eggerthii, Bacteroides finegoldii, Bacteroides fragilis, Bacteroides gallinarum, Bacteroides massiliensis, Bacteroides oleiciplenus YIT 12058, Bacteroides plebeius DSM 17135, Bacteroides rodentium JCM 16496, Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides uniformis, Bacteroides xylanisolvens XB1A, Bacteroides xylanolyticus, Barnesiella intestinihominis, Beduini massiliensis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium longum subsp. infantis, Blautia caecimuris, Blautia coccoides, Blautia faecis, Blautia glucerasea, Blautia hansenii DSM 20583, Blautia hydrogenotrophica, Blautia luti, Blautia luti DSM 14534, Blautia wexlerae DSM 19850, Budvicia aquatica, Butyricicoccus pullicaecorum, Butyricimonas paravirosa, Butyrivibrio crossotus, Caldicoprobacter oshimai, Caloramator coolhaasii, Caloramator proteoclasticus, Caloramator quimbayensis, Campylobacter gracilis, Campylobacter rectus, Campylobacter ureolyticus DSM 20703, Capnocytophaga gingivalis, Capnocytophaga leadbetteri, Capnocytophaga sputigena, Casaltella massiliensis, Catabacter hongkongensis, Catenibacterium mitsuokai, Christensenella minuta, Christensenella timonensis, Chryseobacterium taklimakanense, Citrobacter freundii, Cloacibacillus porcorum,

Clostridioides difficile ATCC 9689 = DSM 1296, Clostridium amylolyticum, Clostridium bowmanii, Clostridium butyricum, Clostridium cadaveris, Clostridium colicanis, Clostridium gasigenes, Clostridium lentocellum DSM 5427, Clostridium oceanicum, Clostridium oryzae, Clostridium paraputrificum, Clostridium pascui, Clostridium perfringens, Clostridium quinii, Clostridium saccharobutylicum, Clostridium sporogenes, Clostridium ventriculi, Collinsella aerofaciens, Comamonas testosteroni, Coprobacter fastidiosus NSB1, Coprococcus eutactus, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium durum, Corynebacterium mycetoides, Corynebacterium pyruviciproducens ATCC BAA-1742, Corynebacterium tuberculostearicum, Culturomica massiliensis, Cuneatibacter caecimuris, Defluviitalea saccharophila, Delftia acidovorans, Desulfitobacterium chlororespirans, Desulfitobacterium metallireducens, Desulfosporosinus acididurans, Desulfotomaculum halophilum, Desulfotomaculum intricatum, Desulfotomaculum tongense, Desulfovibrio desulfuricans subsp. desulfuricans, Desulfovibrio idahonensis, Desulfovibrio litoralis, Desulfovibrio piger, Desulfovibrio simplex, Desulfovibrio zosterae, Desulfuromonas acetoxidans, Dethiobacter alkaliphilus AHT 1, Dethiosulfatibacter aminovorans, Dialister invisus, Dialister propionicifaciens, Dielma fastidiosa, Dietzia alimentaria 72, Dorea longicatena, Dysgonomonas gadei ATCC BAA-286, Dysgonomonas mossii, Eggerthella lenta, Eikenella corrodens, Eisenbergiella tayi, Emergencia timonensis, Enorma massiliensis phi, Enterococcus faecalis, Enterorhabdus muris, Ethanoligenens harbinense YUAN-3, Eubacterium coprostanoligenes, Eubacterium limosum, Eubacterium oxidoreducens, Eubacterium sulci ATCC 35585, Eubacterium uniforme, Eubacterium ventriosum, Eubacterium xylanophilum, Extibacter muris, Ezakiella peruensis, Faecalibacterium prausnitzii, Faecalicoccus acidiformans, Faecalitalea cylindroides, Filifactor villosus, Flavonifr actor plautii, Flintibacter butyricus, Frisingicoccus caecimuris, Fucophilus fucoidanolyticus, Fusicatenibacter saccharivorans, Fusobacterium mortiferum, Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii, Fusobacterium simiae, Fusobacterium varium, Garciella nitratireducens, Gemella haemolysans, Gemmiger formicilis, Gordonibacter urolithinfaciens, Gracilibacter thermotolerans JW/YJL-S1, Granulicatella elegans, Guggenheimella bovis, Haemophilus haemolyticus, Helicobacter typhlonius, Hespellia stercorisuis, Holdemanella biformis, Holdemania massiliensis AP2, Howardella ureilytica, Hungatella effluvii, Hungatella hathewayi, Hydrogenoanaerobacterium saccharovorans, Ihubacter massiliensis, Intestinibacter bartlettii, Intestinimonas butyriciproducens, Irregularibacter muris, Kiloniella laminariae DSM 19542, Kroppenstedtia guangzhouensis , Lachnoanaerobaculum orale, Lachnoanaerobaculum umeaense, Lachnoclostridium phytofermentans, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus algidus, Lactobacillus animalis, Lactobacillus casei, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus fornicalis, Lactobacillus iners, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus rogosae, Lactococcus garvieae, Lactonifactor longoviformis, Leptotrichia buccalis, Leptotrichia hofstadii, Leptotrichia hongkongensis, Leptotrichia wadei, Leuconostoc inhae, Levyella massiliensis, Loriellopsis cavernicola, Lutispora thermophila, Marinilabilia salmonicolor JCM 21150, Marvinbryantia formatexigens, Mesoplasma photuris, Methanobrevibacter smithii ATCC 35061, Methanomassiliicoccus luminyensis BIO, Methylobacterium extorquens, Mitsuokella jalaludinii, Mobilitalea sibirica, Mobiluncus curtisii, Mogibacterium pumilum, Mogibacterium timidum, Moorella glycerini, Moorella humiferrea, Moraxella nonliquefaciens, Moraxella osloensis, Morganella morganii, Moryella indoligenes, Muribaculum intestinale, Murimonas intestini, Natranaerovirga pectinivora, Neglecta timonensis, Neisseria cinerea, Neisseria oralis, Nocardioides mesophilus, Novibacillus thermophilus, Ochrobactrum anthropi,

Odoribacter splanchnicus, Olsenella profusa, Olsenella uli, Oribacterium asaccharolyticum ACB7, Oribacterium sinus, Oscillibacter ruminantium GH1, Oscillibacter valericigenes, Oxobacter pfennigii, Pantoea agglomerans, Papillibacter cinnamivorans, Parabacteroides faecis, Parabacteroides goldsteinii, Parabacteroides gordonii, Parabacteroides merdae, Parasporobacterium paucivorans, Parasutterella excrementihominis, Parasutterella secunda, Parvimonas micra, Peptococcus niger, Peptoniphilus duerdenii ATCC BAA- 1640, Peptoniphilus grossensis ph5, Peptoniphilus koenoeneniae, Peptoniphilus senegalensis JC140, Peptostreptococcus stomatis, Phascolarctobacterium succinatutens, Phocea massiliensis, Pontibacter indicus, Porphyromonas bennonis, Porphyromonas endodontalis, Porphyromonas pasteri, Prevotella bergensis, Prevotella buccae ATCC 33574, Prevotella denticola, Prevotella enoeca, Prevotella fusca JCM 17724, Prevotella loescheii, Prevotella nigrescens, Prevotella oris, Prevotella pollens ATCC 700821, Prevotella stercorea DSM 18206, P rev ote llamas silia timonensis, Propionispira arcuata, Proteus mirabilis, Providencia rettgeri, Pseudobacteroides cellulosolvens ATCC 35603 = DSM 2933, Pseudobutyrivibrio ruminis, Pseudoflavonifr actor capillosus ATCC 29799, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas mandelii, Pseudomonas nitroreducens, Pseudomonas putida, Raoultella ornithinolytica, Raoultella planticola, Raoultibacter massiliensis , Robinsoniella peoriensis, Romboutsia timonensis, Roseburia faecis, Roseburia hominis A2-183, Roseburia intestinalis, Roseburia inulinivorans DSM 16841, Rothia dentocariosa ATCC 17931, Ruminiclostridium thermocellum, Ruminococcus albus, Ruminococcus bromii, Ruminococcus callidus, Ruminococcus champanellensis 18P13 = JCM 17042, Ruminococcus faecis JCM 15917, Ruminococcus flavefaciens, Ruminococcus gauvreauii, Ruminococcus lactaris ATCC 29176, Rummeliibacillus pycnus, Saccharofermentans acetigenes,

Scardovia wiggsiae, Schlegelella thermodepolymerans , Sedimentibacter hongkongensis, Selenomonas sputigena ATCC 35185, Slackia exigua ATCC 700122, Slackia piriformis YIT 12062, Solitalea canadensis, Solobacterium moorei, Sphingomonas aquatilis, Spiroplasma alleghenense, Spiroplasma chinense, Spiroplasma chrysopicola, Spiroplasma culicicola, Spiroplasma lampyridicola, Sporobacter termitidis, Staphylococcus aureus, Stenotrophomonas maltophilia, Stomatobaculum longum, Streptococcus agalactiae ATCC 13813, Streptococcus cristatus, Streptococcus equinus, Streptococcus gordonii, Streptococcus lactarius, Streptococcus parauberis, Subdoligranulum variabile, Succinivibrio dextrinosolvens, Sutterella stercoricanis, Sutterella wadsworthensis, Syntrophococcus sucromutans, Syntrophomonas zehnderi OL-4, Terrisporobacter mayombei, Thermoleophilum album, Treponema denticola, Treponema socranskii, Tyzzerella nexilis DSM 1787, Vallitalea guaymasensis, Vallitalea pronyensis, Vampirovibrio chlorellavorus, Veillonella atypica, Veillonella denticariosi, Veillonella dispar, Veillonella parvula, Victivallis vadensis, Vulcanibacillus modesticaldus e Weissella confusa.

[1240] Em um exemplo, o transplante compreende ou consiste em SER-109 ou SER-262 (e opcionalmente a condição é uma infecção por C dificile); VE202 ou SER-287 (e opcionalmente a doença é colite ulcerativa); SER-301 (e opcionalmente a doença é IBD); SER-401 (e opcionalmente a condição é um câncer; por exemplo, em que a terapia inclui ainda a administração de um anticorpo do eixo anti-PD-1, por exemplo, um anticorpo anti-PD-1); VE800 ou SER-155 (e, opcionalmente, a terapia inclui ainda a administração de um transplante, por exemplo, uma célula-tronco hematopoiética ou um transplante de órgãos sólidos); EDP1066 ou EDP1815 (e opcionalmente a doença é uma condição inflamatória, por exemplo, colite, doença de Crohn, asma, artrite reumatoide (RA), psoríase, dermatite (por exemplo, dermatite atópica) ou IBD); ou EDP1503 (e a doença é um câncer, por exemplo, câncer colorretal, carcinoma de células renais, melanoma ou câncer recidivado da PD-1). Em um exemplo, a terapia compreende a administração de SGM-1019, SG-2-0776 ou EB8018 (e opcionalmente a doença ou condição é NASH ou IBD ou uma condição inflamatória, por exemplo, colite, doença de Crohn, asma, artrite reumatoide (RA), psoríase e dermatite (por exemplo, dermatite atópica). Os que começam com "VE" são desenvolvidos pela Vadanta Biosciences, SER são desenvolvidos pela Seres Therapeutics, EDP são desenvolvidos pela Evelo Biosciences, SG são desenvolvidos pela Second Genome e EB são desenvolvidos pela Enterome.

[1241] Em um exemplo, a doença ou condição descrita aqui é uma condição inflamatória, por exemplo, colite, doença de Crohn, asma, artrite reumatoide (RA), psoríase, dermatite (por exemplo, dermatite atópica) ou IBD.

6. Outros agentes

[1242] É contemplado que outros agentes podem ser usados em combinação com certos aspectos das presentes modalidades para melhorar a eficácia terapêutica do tratamento. Esses agentes adicionais incluem agentes que afetam a regulação positiva de receptores de superfície celular e junções GAP, agentes citostáticos e de diferenciação, inibidores da adesão celular, agentes que aumentam a sensibilidade das células hiperproliferativas aos indutores apoptóticos ou outros agentes biológicos. O aumento da sinalização intercelular pela elevação do número de junções GAP aumentaria os efeitos anti- hiperproliferativos na população de células hiperproliferativas vizinhas. Em outras modalidades, os agentes citostáticos ou de diferenciação podem ser usados em combinação com certos aspectos das presentes modalidades para melhorar a eficácia anti-hiperproliferativa dos tratamentos. Os inibidores da adesão celular são contemplados para melhorar a eficácia das presentes modalidades. Exemplos de inibidores de adesão celular são inibidores da quinase de adesão focal (FAKs) e Lovastatina. Além disso, é contemplado que outros agentes que aumentam a sensibilidade de uma célula hiperproliferativa à apoptose, como o anticorpo c225, poderiam ser usados em combinação com certos aspectos das presentes modalidades para melhorar a eficácia do tratamento. Doenças e condições

[1243] Opcionalmente, a doença ou condição é selecionada a partir de

[1244] (a) uma doença ou condição neurodegenerativa;

[1245] (b) uma doença ou condição cerebral;

[1246] (c) uma doença ou condição do sistema nervoso central (SNC);

[1247] (d) perda ou prejuízo de memória;

[1248] (e) uma doença ou condição cardíaca ou cardiovascular, por exemplo, ataque cardíaco, acidente vascular cerebral ou fibrilação atrial;

[1249] (f) uma doença ou condição hepática;

[1250] (g) uma doença ou condição renal, por exemplo, doença renal crônica (DRC);

[1251] (h) uma doença ou condição pancreática;

[1252] (i) uma doença ou condição pulmonar, por exemplo, fibrose cística ou DPOC;

[1253] (j) uma doença ou condição gastrointestinal;

[1254] (k) uma doença ou condição da garganta ou da cavidade oral;

[1255] (l) uma doença ou condição ocular;

[1256] (m) uma doença ou condição genital, por exemplo, uma doença ou condição vaginal, labial, peniana ou escrotal;

[1257] (n) doença ou condição sexualmente transmissível, por exemplo, gonorreia, infecção pelo HIV, sífilis ou infecção por clamídia;

[1258] (o) uma doença ou condição auricular;

[1259] (p) uma doença ou condição cutânea;

[1260] (q) uma doença ou condição cardíaca;

[1261] (r) uma doença ou condição nasal;

[1262] (s) uma doença ou condição hematológica, por exemplo, anemia, por exemplo, anemia de doença crônica ou câncer;

[1263] (t) uma infecção viral;

[1264] (u) uma infecção bacteriana patogênica;

[1265] (v) um câncer;

[1266] (w) uma doença ou condição autoimune, por exemplo, LES;

[1267] (x) uma doença ou condição inflamatória, por exemplo, artrite reumatoide, psoríase, eczema, asma, colite ulcerativa, colite, doença de Crohn ou IBD;

[1268] (y) autismo;

[1269] (z) TDAH;

[1270] (aa) transtorno bipolar;

[1271] (bb) esclerose lateral amiotrófica (ELA);

[1272] (cc) osteoartrite;

[1273] (dd) um defeito ou condição congénita ou de desenvolvimento;

[1274] (ee) aborto;

[1275] (ff) uma condição de coagulação sanguínea;

[1276] (gg) bronquite;

[1277] (hh) AMD seco ou úmido;

[1278] (ii) neovascularização (por exemplo, de um tumor ou olho);

[1279] (jj) gripe comum;

[1280] (kk) epilepsia;

[1281] (II) fibrose, por exemplo, fibrose hepática ou pulmonar;

[1282] (mm) uma doença ou condição fúngica, por exemplo, afta;

[1283] (nn) doença ou condição metabólica, por exemplo, obesidade, anorexia, diabetes, diabetes tipo I ou tipo II.

[1284] (oo) úlcera(s), por exemplo, ulceração gástrica ou ulceração cutânea;

[1285] (pp) pele seca;

[1286] (qq) síndrome de Sjogren;

[1287] (rr) tempestade de citocinas;

[1288] (ss) surdez, perda ou comprometimento auditivo;

[1289] (tt) metabolismo lento ou rápido (ou seja, mais lento ou mais rápido do que a média para peso, sexo e idade do indivíduo);

[1290] (uu) distúrbio de concepção, por exemplo, infertilidade ou baixa fertilidade;

[1291] (vv) icterícia;

[1292] (ww) erupção cutânea;

[1293] (xx) doença de Kawasaki;

[1294] (yy) doença de Lyme;

[1295] (zz) uma alergia, por exemplo, uma alergia a noz, grama, pólen, ácaro da poeira, peles de gato ou de cão ou caspa;

[1296] (aaa) malária, febre tifoide, tuberculose ou cólera;

[1297] (bbb) depressão;

[1298] (ccc) atraso mental;

[1299] (ddd) microcefalia;

[1300] (eee) desnutrição;

[1301] (fff) conjuntivite;

[1302] (ggg) pneumonia;

[1303] (hhh) embolia pulmonar;

[1304] (iii) hipertensão pulmonar;

[1305] (jjj) uma desordem óssea;

[1306] (kkk) sepse ou choque séptico;

[1307] (lll) sinusite;

[1308] (mm) estresse (por exemplo, estresse ocupacional);

[1309] (nnn) talassemia, anemia, doença de von Willebrand ou hemofilia;

[1310] (ooo) Herpes ou herpes labial;

[1311] (ppp) menstruação;

[1312] (qqq) contagem baixa de esperma. Doenças ou condições neurodegenerativas ou do SNC para tratamento ou prevenção pelo método

[1313] Em um exemplo, a doença ou a condição neurodegenerativa ou do SNC é selecionada do grupo que consiste em doença de Alzheimer, geriopsicose, síndrome de Down, doença de Parkinson, doença de Creutzfeldt-Jakob, neuropatia diabética, síndrome de Parkinson, doença de Huntington, doença de Machado-Joseph, esclerose lateral amiotrófica, neuropatia diabética doença de Creutzfeldt-Jakob. Por exemplo, a doença é a doença de Alzheimer. Por exemplo, a doença é a síndrome de Parkinson.

[1314] Em um exemplo em que o método da invenção é praticado em um indivíduo humano ou animal para tratar uma doença ou condição do SNC ou neurodegenerativa, o método provoca a regulação negativa das células Tregs no indivíduo, dessa forma, promovendo a entrada de macrófagos sistêmicos derivados de monócitos e/ou células Treg através do plexo coroide no cérebro do indivíduo, através do qual a doença ou condição (por exemplo, doença de Alzheimer) é tratada, prevenida ou a progressão da mesma é reduzida. Em uma modalidade, o método causa um aumento do IFN-gama no sistema de SNC (por exemplo, no cérebro e/ou LCR) do indivíduo. Em um exemplo, o método restaura a fibra nervosa e/ou reduz a progressão do dano à fibra nervosa. Em um exemplo, o método restaura a mielina do nervo e/ou reduz a progressão do dano da mielina do nervo. Em um exemplo, o método da invenção trata ou previne uma doença ou condição revelada em WO2015136541 e/ou o método pode ser usado com qualquer método revelado em WO2015136541 (a revelação deste documento é incorporada por referência aqui na sua totalidade, por exemplo, para revelação de tais métodos, doenças, condições e potenciais agentes terapêuticos que podem ser administrados ao indivíduo para realização de tratamento e/ou prevenção de doenças e condições neurodegenerativas e do SNC, por exemplo, agentes como inibidores do ponto de verificação imune, por exemplo, anti-PD-1, anti-PD-L1, anti- TI43 ou outros anticorpos revelados aqui). Cânceres para o tratamento ou a prevenção pelo método

[1315] Os cânceres que podem ser tratados incluem tumores que não são vascularizados, não ainda substancialmente vascularizados ou tumores vascularizados. Os cânceres podem compreender tumores não sólidos (como tumores hematológicos, por exemplo, leucemias e linfomas) ou podem compreender tumores sólidos. Os tipos de cânceres a serem tratados com a invenção incluem, entre outros, carcinoma, blastoma e sarcoma, e certas malignidades linfoides ou leucemias, tumores benignos e malignos, e malignidades como, por exemplo, sarcomas, carcinomas e melanomas. Também estão incluídos tumores/cânceres adultos e tumores/cânceres pediátricos.

[1316] Os cânceres hematológicos são cânceres do sangue ou da medula óssea. Exemplos de cânceres hematológicos (ou hematógenos) incluem leucemias, incluindo leucemias agudas (como leucemias linfocíticas agudas, leucemia mielocítica aguda, leucemia mielógena aguda e mieloblastos, promielocítica, mielomonocítica, monocítica e eritroleucemia), leucemias crônicas (como leucemia mielocítica crônica (granulocítica), leucemia mielógena crônica, e leucemia linfocítica crônica), policitemia vera, linfoma, doença de Hodgkin, linfoma não- Hodgkin (formas indolentes e de alto grau), mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom, doença de cadeia pesada,

síndrome mieiodisplásica, leucemia de células pilosas e mielodisplasia.

[1317] Tumores sólidos são massas anormais de tecido que normalmente não contêm cistos ou áreas líquidas. Os tumores sólidos podem ser benignos ou malignos. Diferentes tipos de tumores sólidos são nomeados para o tipo de células que os formam (como sarcomas, carcinomas e linfomas). Exemplos de tumores sólidos, como sarcomas e carcinomas, incluem fibrossarcoma, mixossarcoma, lipossarcoma, condrossarcoma, osteossarcoma, e outros sarcomas, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma, carcinoma do cólon, malignidade linfoide, câncer do pâncreas, câncer da mama, câncer do pulmão, câncer do ovário, câncer da próstata, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células escamosas, carcinoma basocelular, adenocarcinoma, carcinoma da glândula sudorípara, carcinoma medular da tireoide, carcinoma papilífero da tireoide, feocromocitomas carcinoma da glândula sebácea, carcinoma papilar, adenocarcinoma papilar, carcinoma medular da tireoide, carcinoma papilar da tireóide, feocromocitoma, carcinoma da glândula sebácea, carcinoma papilar, adenocarcinoma papilar, carcinoma medular, carcinoma broncogênico, carcinoma de células renais, hepatoma, carcinoma do ducto biliar, coriocarcinoma, tumor de Wilms, câncer cervical, tumor testicular, seminoma, carcinoma da bexiga, melanoma e tumores do SNC (como um glioma (como glioma de tronco cerebral e gliomas mistos), glioblastoma (também conhecido como glioblastoma multiforme), astrocitoma, linfoma do SNC, germinoma, meduloblastoma, craniofariogioma de Schwannoma, ependimoma, pineaioma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, neuroblastoma, retinoblastoma e metástases cerebrais).

[1318] Em um exemplo, o câncer é um câncer hematológico. Em um exemplo, o câncer é o NSCLC. Em um exemplo, o câncer é o carcinoma de células renais. Em um exemplo, o câncer é um carcinoma urotelial.

Em um exemplo, o câncer é o melanoma. Doenças autoimunes para o tratamento ou a prevenção pelo método

[1319] • Encefalomielite aguda disseminada (ADEM)

[1320] • Leucoencefalite hemorrágica necrotizante aguda

[1321] • Doença de Addison

[1322] • Agamaglobulinemia

[1323] • Alopecia areata

[1324] • Amiloidose

[1325] • Espondilite anquilosante

[1326] • Nefrite anti-GBM/anti-TBM

[1327] • Síndrome antifosfolipídeo (SAF)

[1328] • Angioedema autoimune

[1329] • Anemia aplásica autoimune

[1330] • Disautonomia autoimune

[1331] • Hepatite autoimune

[1332] • Hiperlipidemia autoimune

[1333] • Imunodeficiência autoimune

[1334] • Doença da orelha interna autoimune (AIED)

[1335] • Miocardite autoimune

[1336] • Oóforite autoimune

[1337] • Pancreatite autoimune

[1338] • Retinopatia autoimune

[1339] • Púrpura trombocitopênica autoimune (ATP)

[1340] • Doença autoimune da tiroide

[1341] • Urticária autoimune

[1342] • Neuropatias axonais e neuronais

[1343] • Doença de Balo

[1344] • Doença de Behcet

[1345] • Penfigóide bolhoso

[1346] • Cardiomiopatia

[1347] • Doença de Castleman

[1348] • Doença celíaca

[1349] • Doença de Chagas

[1350] • Síndrome de fadiga crônica

[1351] • Polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica (CIDP)

[1352] • Ostomielite multifocal recorrente crônica (CRMO)

[1353] • Síndrome de Churg-Strauss

[1354] • Penfigóide cicatricial/penfigóide mucoso benigno

[1355] • Doença de Crohn

[1356] • Síndrome de Cogans

[1357] • Doença por aglutininas a frio

[1358] • Bloqueio cardíaco congênito

[1359] • Miocardite de Coxsackie

[1360] • Doença de CREST

[1361] • Criogenulinemia mista essencial

[1362] • Neuropatias desmielinizantes

[1363] • Dermatite herpetiforme

[1364] • Dermatomiosite

[1365] • Doença de Devic (neuromielite óptica)

[1366] • Lúpus discóide

[1367] • Síndrome de Dressler

[1368] • Endometriose

[1369] • Esofagite eosinofílica

[1370] • Fasciíte eosinofílica

[1371] • Eritema nodoso

[1372] • Encefalomielite alérgica experimental

[1373] • Síndrome de Evans

[1374] • Fibromialgia

[1375] • Alveolite fibrosante

[1376] • Arterite de células gigantes (arterite temporal)

[1377] • Miocardite de células gigantes

[1378] • Glomerulonefrite

[1379] • Síndrome de Goodpasture

[1380] • Granulomatose com poliangeíte (GPA) (anteriormente denominada granulomatose de Wegener)

[1381] • Doença de graves

[1382] • Síndrome de Guillain-Barre

[1383] • Encefalite de Hashimoto

[1384] • Tireoidite de Hashimoto

[1385] • Anemia hemolítica

[1386] • Púrpura de Henoch-Schonlein

[1387] • Herpes gestationis

[1388] • Hipogamaglobulinemia

[1389] • Púrpura trombocitopênica idiopática (ITP)

[1390] • Nefropatia por IgA

[1391] • Doença esclerosante relacionada a IgG4

[1392] • Lipoproteínas imunorreguladoras

[1393] • Miosite corporal de inclusão

[1394] • Cistite intersticial

[1395] • Artrite juvenil

[1396] • Diabetes juvenil (diabetes tipo 1)

[1397] • Miosite juvenil

[1398] • Síndrome de Kawasaki

[1399] • Síndrome de Lambert-Eaton

[1400] • Vasculite leucocitoclástica

[1401] • Líquen plano

[1402] • Líquen escleroso

[1403] • Conjuntivite ligneosa

[1404] • Doença linear de IgA (LAD)

[1405] • Lúpus (SLE)

[1406] • Doença de Lyme, crônica

[1407] • Doença de Meniere

[1408] • Poliangeíte microscópica

[1409] • Doença mista do tecido conjuntivo (MCTD)

[1410] • Úlcera de Mooren

[1411] • Doença de Mucha-Habermann

[1412] • Esclerose múltipla

[1413] • Miastenia grave

[1414] • Miosite

[1415] • Narcolepsia

[1416] • Neuromielite óptica (Devic)

[1417] • Neutropenia

[1418] • Penfigóide cicatricial ocular

[1419] • Neurite óptica

[1420] • Reumatismo palindrômico

[1421] • PANDAS (distúrbios neuropsiquiátricos pediátricos autoimunes associados ao Streptococcus)

[1422] • Degeneração cerebelar paraneoplásica

[1423] • Hemoglobinúria paroxística noturna (PNH)

[1424] • Síndrome de Parry Romberg

[1425] • Síndrome de Parsonnage-Turner

[1426] • Pars planitis (uveíte periférica)

[1427] • Pênfigo

[1428] • Neuropatia periférica

[1429] • Encefalomielite perivenosa

[1430] • Anemia perniciosa

[1431] • Síndrome de POEMS

[1432] • Poliarterite nodosa

[1433] • Síndromes poliglandulares autoimunes tipo I, II e III

[1434] • Polimialgia reumática

[1435] • Pomiosite

[1436] • Síndrome do infarto pós-miocárdio

[1437] • Síndrome pós-pericardiotomia

[1438] • Dermatite progesterona

[1439] • Cirrose biliar primária

[1440] • Colangite esclerosante primária

[1441] • Psoríase

[1442] • Artrite psoriática

[1443] • Fibrose pulmonar idiopática

[1444] • Pioderma gangrenoso

[1445] • Aplasia de células vermelhas puras

[1446] • Fenômeno de Raynauds

[1447] • Artrite reativa

[1448] • Distrofia simpático reflexa

[1449] • Síndrome de Reiter

[1450] • Policondrite recidivante

[1451] • Síndrome das pernas inquietas

[1452] • Fibrose retroperitoneal

[1453] • Febre reumática

[1454] • Artrite reumatoide

[1455] • Sarcoidose

[1456] • Síndrome de Schmidt

[1457] • Esclerite

[1458] • Esclerodermia

[1459] • Síndrome de Sjogren

[1460] • Autoimunidade espermática e testicular

[1461] • Síndrome de pessoa rígida

[1462] • Endocardite bacteriana subaguda (SBE)

[1463] • Síndrome de Susac

[1464] • Oftalmia simpática

[1465] • Arterite de Takayasu

[1466] • Arterite temporal/arterite de células gigantes

[1467] • Púrpura trombocitopênica (TTP)

[1468] • Síndrome de Tolosa-Hunt

[1469] • Mielite transversal

[1470] • Diabetes tipo 1

[1471] • Colite ulcerativa

[1472] • Doença do tecido conjuntivo não diferenciada (UCED)

[1473] • Uveíte

[1474] • Vasculite

[1475] • Dermatose vesiculobulosa

[1476] • Vitiligo

[1477] • Granulomatose de Wegener (agora denominada granulomatose com poliangeíte (ACP).

[1478]

[1479] Doenças inflamatórias para tratamento ou prevenção pelo método

[1480] • Alzheimer

[1481] • Espondilite anquilosante

[1482] • Artrite (osteoartrite, artrite reumatoide (RA), artrite psoriásica)

[1483] • Asma

[1484] • Aterosclerose

[1485] • Doença de Crohn

[1486] • Colite

[1487] • Dermatite

[1488] • Diverticulite

[1489] • Fibromialgia

[1490] • Hepatite

[1491] • Síndrome do intestino irritável (IBS)

[1492] • Lúpus eritematoso sistêmico (LES)

[1493] • Nefrite

[1494] • Doença de Parkinson

[1495] • Colite ulcerativa. CONCEITOS:

[1496] A invenção fornece os seguintes conceitos.

[1497] 1. Uma nuclease programável para uso em um método de tratamento de uma infecção microbiana aguda de um indivíduo, em que a infecção microbiana é causada por micróbios de uma primeira espécie ou cepa e a nuclease é programável para cortar um sítio-alvo composto pelos genomas dos micróbios que infectaram o indivíduo, em que os micróbios da primeira espécie ou cepa são mortos, ou o crescimento ou proliferação dos micróbios é reduzido, o método de tratamento compreendendo a exposição do indivíduo à nuclease em que a nuclease é programada para cortar o local-alvo, em que os genomas dos micróbios compreendidos pelo indivíduo são cortados e a infecção microbiana aguda do indivíduo é tratada.

[1498] 2. Uma nuclease programável para uso em um método de tratamento durável de uma infecção microbiana (p.ex. Bacteriana) de um indivíduo, em que a infecção microbiana é causada por micróbios de uma primeira espécie ou cepa e a nuclease é programável para cortar um sítio-alvo composto pelos genomas dos micróbios que infectaram o indivíduo, em que os micróbios da primeira espécie ou cepa são duravelmente mortos, ou o crescimento ou proliferação dos micróbios é reduzido, o método de tratamento compreendendo a exposição do indivíduo à nuclease em que a nuclease é programada para cortar o local-alvo, em que os genomas dos micróbios compreendidos pelo indivíduo são cortados e a infecção microbiana do indivíduo é tratada de forma durável.

[1499] 3. A nuclease do conceito 2, em que a nuclease (por exemplo, nuclease programada) e/ou um ácido nucleico que programa a nuclease para reconhecer e cortar o local-alvo é administrado ao indivíduo em um primeiro tempo (T1) e um segundo tempo (T2), onde T2 é pelo menos 1 hora após T1.

[1500] 4. A nuclease de qualquer conceito anterior, em que o método compreende reduzir a infecção em pelo menos 100 vezes nos primeiros 30 minutos (por exemplo, nos primeiros 15 minutos) do tratamento.

[1501] 5. A nuclease de qualquer conceito anterior, em que o método compreende manter a redução da infecção em pelo menos 100 vezes por pelo menos 60 minutos (por exemplo, pelo menos 120 minutos) após expor o indivíduo à nuclease programada.

[1502] 6. A nuclease de qualquer conceito anterior, em que o método compreende reduzir a infecção de modo que a redução na infecção persiste por 30 minutos imediatamente após os primeiros 30 minutos do tratamento.

[1503] 7. A nuclease de qualquer conceito anterior, em que o método compreende a administração ao indivíduo do RNA ou um ácido nucleico que codifica o RNA para a expressão do RNA no indivíduo, em que o RNA se complexa com a nuclease para programar a nuclease para cortar o local-alvo em micróbios compreendidos pelo indivíduo.

[1504] 8. A nuclease do conceito 7, em que a nuclease é administrada simultaneamente ou sequencialmente com o RNA ou o ácido nucleico ao indivíduo.

[1505] 9. A nuclease do conceito 7, em que o indivíduo compreende a nuclease antes da administração do RNA ou do ácido nucleico ao indivíduo.

[1506] 10. A nuclease de qualquer um dos conceitos 7 a 9, em que uma pluralidade de vírus (por exemplo, fago) é administrada ao indivíduo, no qual cada vírus compreende uma cópia do ácido nucleico, no qual os vírus infectam os micróbios compreendidos pelo indivíduo para entregar a ele o ácido nucleico.

[1507] 11. A nuclease do conceito 10, em que a razão de vírus administrados: micróbios compreendidos pelo indivíduo é de 10 para

150.

[1508] 12. A nuclease de acordo com qualquer conceito anterior, em que o indivíduo é um ser humano ou animal, opcionalmente em que o indivíduo é um ser humano com mais de 65 anos de idade ou é um paciente pediátrico.

[1509] 13. A nuclease de acordo com o conceito 12, em que a infecção é uma infecção dos pulmões, abdômen ou trato urinário; ou em que o indivíduo foi submetido à cirurgia, está em um medicamento imunossupressor e/ou está sofrendo de uma doença crônica.

[1510] 14. A nuclease de acordo com qualquer conceito anterior, em que a infecção é reduzida em pelo menos 90% por 1h ou mais, opcionalmente nos primeiros 30 minutos (por exemplo, nos primeiros 15 minutos) do tratamento.

[1511] 15. A nuclease de acordo com qualquer conceito anterior, em que o método compreende reduzir a infecção em pelo menos 100 vezes pelos primeiros 30 minutos (p.ex., pelos primeiros 15 minutos) do tratamento; e em que a redução da infecção em pelo menos 100 vezes é mantida por pelo menos 60 minutos (p.ex., pelo menos 120, 145 ou 180 minutos) após a exposição do indivíduo à nuclease programada.

[1512] 16. A nuclease de acordo com qualquer um dos conceitos 12 a 15, em que o método trata ou previne a septicemia e/ou sepse (por exemplo, choque séptico) no indivíduo.

[1513] 17. A nuclease do conceito 16, em que no início do tratamento, o indivíduo (por exemplo, um ser humano) tem uma temperatura de < 36 °C ou > 38 °C; uma frequência cardíaca > 90/min,

uma frequência respiratória > 20 respirações/min ou PaCO2 < 4,3 kPa; e uma contagem de leucócitos de < 4000/mm³ ou > 12.000/mm³.

[1514] 18. A nuclease do conceito 16 ou 17, em que no início do tratamento, o indivíduo (por exemplo, um ser humano) tem presença de dois ou mais dos seguintes: temperatura corporal anormal, frequência cardíaca anormal, frequência respiratória anormal, gás sanguíneo anormal e contagem anormal de leucócitos.

[1515] 19. A nuclease de qualquer um dos conceitos anteriores, em que o indivíduo é um ser humano ou animal e os micróbios são bactérias (por exemplo, E coli ou C dificile), em que a infecção sanguínea do indivíduo pelas bactérias é reduzida pelo menos 100 ou 1000 vezes nos primeiros 30 minutos (por exemplo, nos primeiros 15 minutos) do tratamento.

[1516] 20. A nuclease de qualquer um dos conceitos 12 a 19, em que o sangue do indivíduo é infectado com 107 a 1012 UFC/ml da bactéria imediatamente antes do tratamento.

[1517] 21. A nuclease de acordo com qualquer um dos conceitos 1 a 11, em que o indivíduo é uma planta.

[1518] 22. A nuclease de acordo com qualquer conceito anterior, em que os micróbios são bactérias.

[1519] 23. A nuclease de acordo com o conceito 22, em que as bactérias são bactérias gram-positivas.

[1520] 24. A nuclease de acordo com o conceito 22 ou 23, em que as bactérias são Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Legionella, Heamophilus, Ghonnorhea, Acinetobacter, Escherichia, Klebsiella, Pseudomonas ou bactérias Stenotrophomonas (por exemplo, E. coli (p.ex., E coli EHEC), C dificile, V cólera, Staphylococcus (por exemplo, S aureus ou MRSA), Strepytococcus pyogenes, Acinetobacter baumannii, Legionella, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae bacteria).

[1521] 25. A nuclease de acordo com qualquer conceito anterior, em que a nuclease é uma nuclease Cas (por exemplo, uma Cas 3 ou 9), uma meganuclease, uma TALEN (nuclease efetora do tipo ativador de transcrição) ou nuclease do dedo de zinco.

[1522] 26. Uma pluralidade de vírus (por exemplo, fagos ou fagemídeos para produzir fago) para uso com a nuclease, de qualquer um dos conceitos anteriores, no método de tratamento, em que cada vírus compreende uma cópia de um ácido nucleico como definido em qualquer um dos conceitos 7 a 9, em que os vírus são capazes de infectar micróbios compreendidos pelo indivíduo para entregar-lhe o ácido nucleico.

[1523] 27. Uma composição compreendendo uma pluralidade de ácidos nucleicos para a programação da nuclease, de qualquer um dos conceitos 1 a 25, no método de tratamento, em que cada ácido nucleico é um ácido nucleico como definido em qualquer um dos conceitos 7 a

9.

[1524] 28. Um sistema CRISPR/Cas compreendendo uma nuclease, de acordo com qualquer conceito anterior, para uso no método de tratamento, em que a nuclease é uma nuclease Cas (por exemplo, uma Cas 3 ou 9) e o sistema compreende um ou mais RNAs guia ou DNA que codifica um ou mais RNAs guia, em que cada RNA guia é capaz de programar a nuclease Cas para cortar um local-alvo composto pelos genomas dos micróbios.

[1525] 29. Um RNA guia ou um DNA que codifica um RNA guia para uso no sistema do conceito 28 para uso no método de tratamento de uma infecção microbiana aguda no indivíduo, por exemplo, septicemia ou sepse.

[1526] 30. Um vetor do ácido nucleico compreendendo o RNA guia ou DNA, mencionado no conceito 27 ou 29.

[1527] 31. O vetor do conceito 30, em que o vetor é um fago,

fagemídeo, viriofago, vírus, plasmídeo (por exemplo, plasmídeo conjugado) ou transpóson.

[1528] 32. Uma composição anti-sepse ou anti-septicemia para a administração a um ser humano ou animal para o tratamento da sepse ou septicemia, a composição compreendendo uma pluralidade de vetores, em que cada vetor está de acordo com o conceito 30 ou 31.

[1529] 33. Um método de tratamento de uma infecção microbiana aguda de um indivíduo, no qual o método é definido por qualquer conceito anterior.

[1530] 34. Uso de uma nuclease, pluralidade de vírus, sistema, RNA guia, DNA ou vetor, de acordo com qualquer um dos conceitos 1 a 26 e 28 a 30, na fabricação de uma composição para a realização de um método de tratamento conforme definido em qualquer um dos conceitos anteriores, em que o indivíduo é um organismo diferente de um ser humano ou animal.

[1531] 35. Uso de uma pluralidade, pluralidade de vírus, sistema, RNA guia, DNA ou vetor, de acordo com qualquer um dos conceitos 1 a 26 e 28 a 30, para a fabricação de uma composição para realização de um método ex vivo do tratamento de uma infecção microbiana de um substrato, em que a infecção microbiana é causada por micróbios de uma primeira espécie ou cepa e a nuclease é programável para cortar um sítio-alvo composto pelos genomas dos micróbios que infectaram o substrato, em que os micróbios da primeira espécie ou cepa são mortos, ou o crescimento ou proliferação dos micróbios é reduzido, o método de tratamento que compreende a exposição do indivíduo à nuclease em que a nuclease é programada para cortar o local-alvo, em que os genomas dos micróbios compreendidos pelo indivíduo são cortados e a infecção microbiana aguda do substrato é tratada.

[1532] 36. Uso de uma nuclease programável na fabricação de uma composição para realização de um método ex vivo ou in vitro do tratamento de uma infecção microbiana de um substrato, em que a infecção microbiana é causada por micróbios de uma primeira espécie ou cepa e a nuclease é programável para cortar um sítio-alvo composto pelos genomas dos micróbios que infectaram o substrato, em que os micróbios da primeira espécie ou cepa são mortos, ou o crescimento ou proliferação dos micróbios é reduzido, o método de tratamento compreendendo a exposição do indivíduo à nuclease em que a nuclease é programada para cortar o local-alvo, em que os genomas dos micróbios compreendidos pelo indivíduo são cortados e a infecção microbiana do indivíduo é tratada.

[1533] 37. O uso do conceito 34, 35 ou 36, em que a nuclease (por exemplo, nuclease programada) e/ou um ácido nucleico que programa a nuclease para reconhecer e cortar o local-alvo é administrado ao indivíduo ou substrato em um primeiro tempo (T1) e um segundo tempo (T2), onde T2 é pelo menos 1 hora após T1.

[1534] 38. O uso de qualquer um dos conceitos 34 a 37, em que a infecção é reduzida em pelo menos 100 vezes nos primeiros 30 minutos (por exemplo, nos primeiros 15 minutos) do tratamento.

[1535] 39. O uso de qualquer um dos conceitos 34 a 38, em que a redução da infecção é mantida em pelo menos 100 vezes por pelo menos 60 minutos (por exemplo, pelo menos 120 minutos) após expor o indivíduo à nuclease programada.

[1536] 40. O uso de qualquer um dos conceitos 34 a 39, em que a redução da infecção persiste por 30 minutos imediatamente após os primeiros 30 minutos do tratamento.

[1537] 41. O uso de qualquer um dos conceitos 34 a 40, em que o método compreende a administração ao indivíduo ou substrato de um RNA ou um ácido nucleico que codifica um RNA para a expressão do RNA no indivíduo ou substrato, em que o RNA se complexa com a nuclease para programar a nuclease para cortar o local-alvo em micróbios compreendidos no indivíduo ou substrato.

[1538] 42. Uso do conceito 41, em que a nuclease é administrada simultaneamente ou sequencialmente com o RNA ou o ácido nucleico ao indivíduo ou substrato.

[1539] 43. Uso do conceito 41, em que o indivíduo ou o substrato compreende a nuclease antes da administração do RNA ou do ácido nucleico.

[1540] 44. Uso de qualquer um dos conceitos 41 a 43, em que uma pluralidade de vírus (por exemplo, fago) é administrada ao indivíduo ou substrato, no qual cada vírus compreende uma cópia do ácido nucleico, no qual os vírus infectam os micróbios compreendidos pelo indivíduo ou substrato para entregar a ele o ácido nucleico.

[1541] 45. Uso do conceito 44, em que a razão de vírus administrados: micróbios é de 10 para 150.

[1542] 46. Uso de qualquer um dos conceitos 34 a 45, em que a infecção é reduzida em pelo menos 90% durante 1 hora ou mais, opcionalmente nos primeiros 30 minutos (por exemplo, nos primeiros 15 minutos) do tratamento.

[1543] 47. Uso de qualquer um dos conceitos 34 a 46, em que a infecção é reduzida em pelo menos 100 vezes nos primeiros 30 minutos (por exemplo, nos primeiros 15 minutos) do tratamento; e em que a redução da infecção em pelo menos 100 vezes é mantida por pelo menos 60 minutos (p.ex., pelo menos 120, 145 ou 180 minutos) após a exposição do indivíduo ou substrato à nuclease programada.

[1544] 48. Uso de qualquer um dos conceitos 34 a 47, em que o indivíduo é uma planta; ou em que o substrato é um substrato metálico, plástico, de concreto, de pedra, de madeira, de vidro ou de cerâmica.

[1545] 49. O uso de qualquer um dos conceitos 34 a 48, em que os micróbios são bactérias.

[1546] 50. O uso de acordo com o conceito 49, em que as bactérias são bactérias gram-positivas.

[1547] 51. O uso de acordo com o conceito 49 ou 50, em que as bactérias são Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Legionella, Heamophilus, Ghonnorhea, Acinetobacter, Escherichia, Klebsiella, Pseudomonas ou bactérias Stenotrophomonas (por exemplo, E. coli (p.ex., E coli EHEC), C dificile, V cólera, Staphylococcus (por exemplo, S aureus ou MRSA), Strepytococcus pyogenes, Acinetobacter baumannii, Legionella, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae bacteria).

[1548] 52. O uso de acordo com qualquer um dos conceitos 34 a 51, em que a nuclease é uma nuclease Cas (por exemplo, uma Cas 3 ou 9), uma meganuclease, uma TALEN (nuclease efetora do tipo ativador de transcrição) ou nuclease do dedo de zinco.

[1549] A revelação das seguintes e de todas as patentes e pedidos da contraparte US (incluindo continuações ou divisões) é aqui incorporada por referência para uso na presente invenção: US9701964, WO2016177682, US20180140698, WO2017211753, PCT/EP2018/066954, PCT/EP2018/066980, PCT/EP2018/071454, USSN 15/985,658, US20160345578 e US20180155729.

ASPECTOS

[1550] A invenção fornece os seguintes aspectos. Em particular, um aspecto baseia-se na surpreendente descoberta de que atrelar o Cas3 endógeno a uma população bacteriana mista é capaz de matar essencialmente todas as bactérias-alvo. Isto é exemplificado aqui por uma população bacteriana mista compreendendo a E coli misturada com células hospedeiras de C dificile, uma combinação que pode ser encontrada em um microbioma humano (por exemplo, o microbioma do intestino) por exemplo. Além disso, a morte duradoura foi surpreendentemente vista ao usar Cas3 endógena. Os inventores acreditam que a publicação de tal surpreendente atrelamento da Cas3 endógena em uma população bacteriana mista não tem sido relatada na técnica. Para esse efeito, são fornecidos os seguintes aspectos:

[1551] 1. Um método de modificação de uma população mista de bactérias microbiota, a população mista compreendendo uma primeira e segunda subpopulação de bactérias, em que a primeira subpopulação compreende uma primeira espécie de microbiota e a segunda subpopulação compreende uma população de células hospedeiras de uma segunda espécie de microbiota, em que a segunda espécie é uma espécie diferente da primeira espécie de microbiota e as bactérias dessa segunda espécie compreende o ácido nucleico endógeno que codifica uma nuclease Cas endógena funcional, o método compreendendo

[1552] (a) combinar a população mista de bactérias da microbiota com várias cópias de sequências de ácidos nucleicos modificados que codificam as crRNAs de modificação de hospedeiros (HM), e

[1553] (b) exprimir Hm-crRNAs em células hospedeiras, em que cada Hm-crRNA é codificado por uma respectiva sequência de ácido nucleico modificado e é operável com a nuclease Cas endógena expressada em função da segunda espécie de bactérias e expressada em uma respectiva célula hospedeira; a dita nuclease Cas endógena expressada sendo ativa na respectiva célula hospedeira, na qual a respectiva sequência de ácidos nucleicos modificada e Cas formam um sistema HM-CRISPR/Cas e a sequência de ácidos nucleicos modificada compreende

[1554] (i) uma sequência de ácidos nucleicos compreendendo um espaçador e sequências de repetição que codificam o dito HM-crRNA;

[1555] (ii) uma sequência de ácidos nucleicos codificando uma sequência da dita HM-crRNA, em que a dita sequência HM-crRNA é capaz de se hibridizar a uma sequência-alvo de células hospedeiras para guiar a nuclease Cas endógena para a sequência-alvo na célula hospedeira; e em que a sequência de ácidos nucleicos modificada não codifica a dita nuclease Cas que é endógena para a segunda espécie de bactérias; em que HM-crRNAs guia a atividade da CAS endógena para modificar as sequências-alvo hospedeiras em células hospedeiras, em que as células hospedeiras são mortas ou o crescimento da população de células hospedeiras é reduzido, reduzindo assim a proporção da população de células hospedeiras e alterando a razão relativa das referidas subpopulações de bactérias na população bacteriana mista.

[1556] Opcionalmente, o sistema HM compreende uma sequência de tracrRNA ou uma sequência de DNA que expressa uma sequência de tracrRNA.

[1557] 2. O método do aspecto 1, compreendendo reduzir o crescimento da população de células hospedeiras em pelo menos 100 vezes em relação ao crescimento de uma população controle de células hospedeiras que não receberam essa modificação Cas, por exemplo, nos primeiros 15 ou 30 minutos de execução do método.

[1558] Opcionalmente, o método compreende a redução do crescimento da população de células hospedeiras em pelo menos 3 ou 4 logs, em comparação com o crescimento de uma população de controle de células hospedeiras que não receberam essa modificação Cas, por exemplo, nos primeiros 15 ou 30 minutos de execução do método.

[1559] Em um exemplo, pelo menos 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de morte das células hospedeiras é alcançada nas primeiras 0,5, 1 ou 2 horas de tratamento (ou seja, ao realizar o método). Em um exemplo, pelo menos 99% de morte das células hospedeiras é alcançada nos primeiros 30 minutos do tratamento. Em um exemplo, pelo menos 99% de morte das células hospedeiras é alcançada nas primeiras 2 horas do tratamento. Em um exemplo, 100% de morte é alcançada. Estes são exemplificados abaixo. Em uma modalidade, menos de 100% das células hospedeiras são mortas.

[1560] Em um exemplo, a população de células hospedeiras é reduzida em pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99%, por exemplo, nos primeiros 15 minutos do tratamento. Em um exemplo, a população de células hospedeiras é reduzida em pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99%, por exemplo, nos primeiros 30 minutos do tratamento.

[1561] Opcionalmente, o método compreende reduzir a população de células hospedeiras em pelo menos 100 vezes nos primeiros 30 minutos (por exemplo, nos primeiros 15 minutos) do tratamento. Opcionalmente, o método compreende reduzir a população de células hospedeiras em pelo menos 1000 vezes nos primeiros 30 minutos (por exemplo, nos primeiros 15 minutos) do tratamento. Opcionalmente, o método compreende reduzir a população de células hospedeiras em pelo menos 10000 vezes nos primeiros 30 minutos (por exemplo, nos primeiros 15 minutos) do tratamento.

[1562] 3. O método de qualquer aspecto anterior, em que a população de células hospedeiras está em uma superfície, pelo qual o crescimento da população de células hospedeiras é inibido nessa superfície.

[1563] 4. O método de qualquer aspecto anterior, em que a primeira espécie de microbiota compreende uma sequência de DNA que codifica o RNA ribossomal 16s e que é pelo menos 80 % idêntica a uma sequência de DNA que codifica o RNA ribossomal 16s da espécie de célula hospedeira, em que o crescimento das primeiras bactérias na população mista não é inibido pelo dito sistema HM.

[1564] 5. O método de qualquer aspecto anterior, em que a primeira espécie é uma espécie de comensal intestinal humana e/ou uma espécie probiótica intestinal humana.

[1565] 6. O método de qualquer aspecto anterior, em que a espécie hospedeira é uma espécie de Clostridium.

[1566] Opcionalmente, as células hospedeiras são células bacterianas gram-positivas e/ou as primeiras células são células bacterianas gram-positivas.

[1567] Opcionalmente, as células hospedeiras são células bacterianas gram-positivas e/ou as primeiras células são células bacterianas gram-negativas.

[1568] Opcionalmente, as células hospedeiras são células bacterianas gram-negativas e/ou as primeiras células são células bacterianas gram-positivas.

[1569] Opcionalmente, as células hospedeiras são células bacterianas gram-negativas e/ou as primeiras células são células bacterianas gram-negativas.

[1570] Opcionalmente, a(s) célula(s) hospedeira(s) compreendem uma Cas3 tipo I endógena funcional. Opcionalmente, a(s) célula(s) hospedeira(s) compreendem uma Cas3 tipo IA endógena funcional. Opcionalmente, a(s) célula(s) hospedeira(s) compreendem uma Cas3 tipo IB endógena funcional. Opcionalmente, a(s) célula(s) hospedeira(s) compreendem uma Cas3 tipo IC endógena funcional. Opcionalmente, a(s) célula(s) hospedeira(s) compreendem uma Cas3 tipo ID endógena funcional. Opcionalmente, a(s) célula(s) hospedeira(s) compreendem uma Cas3 tipo IE endógena funcional. Opcionalmente, a(s) célula(s) hospedeira(s) compreendem uma Cas3 tipo IF endógena funcional. Opcionalmente, a(s) célula(s) hospedeira(s) compreendem uma Cas3 tipo IU endógena funcional.

[1571] Por exemplo, a espécie de célula hospedeira é uma espécie de Clostridium (por exemplo, C difficile) e a Cas é uma Cas3 tipo IB endógena. Por exemplo, a espécie de célula hospedeira é uma espécie de Pseudomonas (por exemplo, P aeruginosa) e a Cas é uma Cas3 tipo IE ou F endógena. Por exemplo, a espécie de célula hospedeira é uma espécie de Escherichia (por exemplo, E coli) e a Cas é uma Cas3 tipo IE endógena (por exemplo, uma Cas3 ativada ou com desreprimida). Por exemplo, a Cas3 é usada com um complexo cascata de células hospedeiras funcionais endógenas. Nesse exemplo, nenhuma Cas e/ou Cas3 cascata (ou sequência nucleotídica de codificação de Cas3 e/ou Cas cascata) é introduzida na(s) célula(s) hospedeira(s).

[1572] Em um exemplo, as primeiras células são E coli. Opcionalmente, uma, duas, três ou mais espécies de bactérias estão presentes na população mista. Em um exemplo, a microbiota é uma população de microbiota humana, animal, mamífera, roedora, de camundongo ou de inseto (por exemplo, microbiota intestinal ou sanguínea). Por exemplo, a microbiota é uma população de microbiota intestinal de mamíferos.

[1573] Opcionalmente, a população de células hospedeiras consiste em células Firmicutes.

[1574] Opcionalmente, a modificação corta uma sequência-alvo cromossômica hospedeira, na qual as células hospedeiras são mortas. Assim, o método pode ser um método para matar células bacterianas hospedeiras, por exemplo, compostas por um indivíduo humano, mamífero, inseto ou animal.

[1575] 7. O método de qualquer aspecto anterior, no qual, para cada célula hospedeira, o sistema compreende componentes de acordo com (i) a (iv): (i) pelo menos uma sequência endógena de ácidos nucleicos que codifica uma nuclease Cas com atividade endógena de nuclease Cas codificada por uma sequência endógena de ácidos nucleicos composta pelo genoma bacteriano das células hospedeiras; (ii) uma matriz HM-CRISPR modificada compreendendo uma sequência de espaçadores e repetições codificando um HM-crRNA, o HM-crRNA compreendendo uma sequência que se hibridizada a uma sequência- alvo de células hospedeiras para direcionar a Cas para o alvo na célula hospedeira para modificar a sequência-alvo; (iii) uma sequência de tracrRNA ou uma sequência de DNA opcional que expressa uma sequência de tracrRNA; (iv) em que o componente (ii) está codificado em um vetor ácido que transforma a célula hospedeira, através do qual o HM-crRNA direciona a atividade de Cas endógena para o alvo, de modo a modificar a sequência-alvo do hospedeiro na célula hospedeira; e em que a sequência-alvo é modificada pela atividade da Cas endógena, através da qual a célula hospedeira é morta ou o crescimento da célula hospedeira é reduzido; o método compreendendo a introdução do vetor de (iv) nas células hospedeiras e expressando o dito HM-crRNA nas células hospedeiras, permitindo que o HM-Crna se hibridize às sequências-alvo de células hospedeiras para direcionar a Cas endógena para os alvos nas células hospedeiras para modificar sequências-alvo, pela qual as células hospedeiras são mortas ou o crescimento das células hospedeiras é reduzido, alterando assim a razão relativa das referidas subpopulações na população mista de bactérias.

[1576] 8. O método de qualquer aspecto anterior, em que cada vetor é um vírus ou fago, fagemídeo ou partícula não-replicativa que é capaz de infectar uma célula hospedeira.

[1577] 9. O método de qualquer aspecto anterior, em que, alternativamente, o HM-crRNA e o tracrRNA são compostos por um único RNA guia (gRNA), o método compreendendo a introdução do referido gRNA nas células hospedeiras ou a expressando o gRNA nas células hospedeiras.

[1578] 10. O método de qualquer aspecto anterior, em que cada uma das primeiras e segundas espécies é uma espécie de Firmiciutes respectiva e o crescimento da primeira bactéria não é inibido pelo sistema HM.

[1579] 11. O método de qualquer aspecto anterior, em que cada uma das primeiras e segundas espécies é uma espécie respectiva gram-positiva e o crescimento da primeira bactéria não é inibido pelo sistema HM.

[1580] 12. O método de qualquer aspecto anterior, no qual cada uma das primeiras e segundas espécies é uma espécie gram-negativa respectiva e o crescimento da primeira bactéria não é inibido pelo sistema HM.

[1581] 11. O método de qualquer aspecto anterior, em que cada uma das primeiras espécies é gram-negativa, a espécie da célula hospedeira é uma espécie gram-positiva e o crescimento da primeira bactéria não é inibido pelo sistema HM.

[1582] Como exemplificado abaixo, o inventor surpreendentemente poderia transferir o vetor de uma célula gram-negativa para uma célula gram-positiva para matar o último no método da invenção.

[1583] Em um exemplo, as primeiras células são células carreadoras que compreendem o ácido nucleico modificado. Por exemplo, o ácido nucleico pode ser transferido das bactérias carreadoras através da conjugação das primeiras bactérias com as células hospedeiras e da transferência conjugativa do ácido nucleico para as células hospedeiras. Alternativamente, as primeiras células podem compreender o ácido nucleico que codifica uma partícula viral, fago ou não-replicativa, na qual esta última é produzida nas primeiras células e, posteriormente, infecta as células hospedeiras na população mista, introduzindo assim o ácido nucleico nas células hospedeiras para a sua modificação de acordo com o método da invenção.

[1584] 12. O método de qualquer aspecto anterior para tratar uma infecção de células hospedeiras de um indivíduo humano ou animal, o método compreendendo a exposição das células hospedeiras a um primeiro antibiótico simultânea ou sequencialmente com as referidas sequências de ácidos nucleicos modificados que codificam HM-crRNAs, em que as sequências alvo são cada uma compostas por um gene de resistência a antibióticos para resistência ao referido primeiro antibiótico, em que a infecção da célula hospedeira é tratada no indivíduo.

[1585] 13. O método de qualquer aspecto anterior para tratar ou reduzir o risco de uma doença ou condição em um indivíduo humano ou animal, em que a doença ou condição é mediada por essa segunda espécie bacteriana, em que a primeira espécie bacteriana é probiótica, comensal ou simbiótica com seres humanos e em que as primeiras células de espécies bacterianas não compreendem a referida sequência-alvo, em que a modificação da sequência-alvo pela referida Cas é realizada e o crescimento das células hospedeiras é inibido no referido indivíduo, mas o crescimento das primeiras células de espécies bacterianas não é inibido, em que a doença ou condição é tratada ou o risco da doença ou condição no indivíduo em questão é reduzido.

[1586] Assim, as primeiras células podem ser células carreadoras, como, por exemplo, células de E coli ou Lactobacillus (por exemplo, L reuteri) (ver discussão sobre outras células carreadoras acima).

[1587] 14. O método de qualquer aspecto anterior para o tratamento de fluidos, superfícies, aparelhos ou recipientes industriais ou médicos; ou para tratar um curso de água, água, uma bebida, um gênero alimentício ou um cosmético, em que as referidas células hospedeiras são compostas por ou sobre o fluido, a superfície, o aparelho, o recipiente, a água, a bebida, o gênero alimentício ou o cosmético, em que o crescimento das células hospedeiras é inibido, realizando assim o referido tratamento.

[1588] 15. O método de qualquer aspecto anterior, em que cada célula hospedeira é uma célula de Staphylococcus, Streptococcus,

Pseudomonas (p.ex., P aerugonisa ou siringae), Acinetobacter (p.ex., A baumannii), Salmonella (p.ex., S typhiumurium), Klebsiella (p.ex., K pneumoniae), Helicobacter (p.ex., H pylori) Listeria, E coli, Desulfovibrio, Vibrio (p.ex., V cholerae), ou Clostridium (p.ex., C dificile).

[1589] 16. O método de qualquer aspecto anterior, em que cada sequência-alvo é composta por um gene de resistência a antibióticos ou um gene essencial da célula hospedeira.

[1590] 17. O método de qualquer aspecto anterior, em que cada sequência-alvo é exclusiva da(s) célula(s) hospedeira(s), por exemplo, não encontrada(s) em células da mesma espécie, mas sim uma cepa diferente da(s) célula(s) hospedeira(s).

[1591] 18. O método de qualquer aspecto anterior para aumentar a proporção de Bacteroides na população mista, no qual esse aumento é realizado.

[1592] 19. O método do aspecto 18, em que a proporção de B thetaiotomicron e/ou B. fragilis é aumentada.

[1593] 20. O método do aspecto 18 ou 19, em que a razão relativa de Bacteroidetes versus Firmiciutes ou células hospedeiras gram- positivas compostas pela população mista é aumentada.

[1594] 21. O método de qualquer aspecto precedente para favorecer os Bacteroidetes comensais ou simbióticos em um humano ou animal.

[1595] 22. O método de qualquer aspecto anterior, compreendendo ainda depois de realizar a modificação das células hospedeiras, obter uma quantidade de bactérias da referida população mista, compreendendo uma razão alterada da primeira e da segunda células, produzindo uma cultura bacteriana compreendendo as referidas bactérias obtidas, e administrando a cultura (opcionalmente junto com outro agente terapêutico) a um ser humano ou animal, tratando ou prevenindo assim uma doença ou condição no ser humano ou animal.

[1596] 23. O método de qualquer aspecto precedente para produzir a estimulação da célula de Paneth por bactérias intestinais em um humano ou animal, no qual as bactérias intestinais são compostas pela população mista, e em que o método compreende a produção da população mista, compreendendo uma razão alterada da primeira e segunda células no dito ser humano ou animal, ou a administração da referida população mista, compreendendo essa razão alterada para o ser humano ou animal, em que as células de Paneth são estimuladas.

[1597] 24. O método de qualquer aspecto precedente para o desenvolvimento de uma resposta imune em um ser humano ou animal, em que as bactérias intestinais são compostas pela população mista, e em que o método compreende a produção da população mista, compreendendo uma razão alterada da primeira e da segunda células no dito ser humano ou animal, ou administrando a referida população mista compreendendo essa razão alterada para o ser humano ou animal, através da qual se desenvolve a referida resposta imune.

[1598] 25. O método de qualquer aspecto anterior, em que a população mista da etapa (a) compreende uma terceira espécie bacteriana.

[1599] 26. O método do aspecto 25, em que a terceira espécie é E. coli.

[1600] 27. O método do aspecto 25 ou 26, em que a primeira espécie é uma Firmicutes, e a segunda espécie é uma Firmicutes e a terceira espécie é um comensal humano do intestino ou uma espécie probiótica do intestino humano.

[1601] 28. O método de aspecto 25, em que a primeira espécie é uma espécie gram-positiva, e a segunda espécie é uma espécie gram- negativa e a terceira espécie é um comensal humano do intestino ou uma espécie probiótica do intestino humano (por exemplo, uma espécie gram-negativa).

[1602] Por exemplo, as primeiras células são células de E coli e as células hospedeiras são selecionadas a partir de C dificile, H pylori, Klebsiella, Pseudomonas ou E coli, e a Cas é uma nuclease Cas3 tipo I que corta uma sequência-alvo cromossômica das células hospedeiras, matando assim as células hospedeiras. Em um exemplo, a Cas3 é uma Cas3 tipo IB, por exemplo, em que as células hospedeiras são células C dificile. Em um exemplo, a Cas3 é uma Cas3 tipo IE ou F, por exemplo, em que as células hospedeiras são células de P aeruginosa ou siringae. Em um exemplo, a Cas3 é uma Cas3 tipo IE, por exemplo, em que as células hospedeiras são células de E coli. Em um exemplo, a Cas3 é uma Cas3 tipo IE, por exemplo, em que as células hospedeiras são células de Salmonella.

[1603] A invenção fornece também os seguintes conceitos: CONCEITOS:

[1604] 1. Um método para tratar uma infecção bacteriana patogênica em um indivíduo humano ou animal causado por bactérias (primeiras bactérias) de uma primeira espécie ou cepa, o método compreendendo matar seletivamente as primeiras bactérias compreendidas pelo indivíduo cortando um local-alvo composto pelos genomas das primeiras bactérias, em que o corte é realizado usando uma nuclease programável que é programada para cortar o local-alvo, em que o indivíduo sofre de uma doença ou condição posterior que não a infecção bacteriana patogênica e o método inclui a administração de uma terapia ao indivíduo para tratar ou prevenir a doença ou condição posterior, em que a nuclease trata a infecção e a terapia é eficaz na presença da nuclease programada para tratar ou prevenir a doença ou condição.

[1605] 2. O método do conceito 1, em que o indivíduo é um paciente oncológico e a terapia compreende a administração de um transplante de células estaminais hematopoiéticas, agente quimioterápico, inibidor do ponto de verificação imune, agonista do ponto de verificação imune ou um potenciador de células imunes; terapia celular adotiva; radiação ou cirurgia.

[1606] 3. O método do conceito 2, em que a terapia é um anticorpo inibidor do ponto de verificação imune, ou um anticorpo selecionado de ipilimumabe (ou YERVOY®), tremelimumabe, nivolumabe (ou OPDIVO®), pembrozumabe (ou KEYTRUDA®), pidilizumabe, BMS- 936559, durvalumabe (ou IMFINZI®) e atezolizumabe (ou TECENTRIQ®).

[1607] 4. O método do conceito 1, em que a terapia é um transplante de tecido, órgão ou célula.

[1608] 5. O método do conceito 1, em que o tratamento da infecção bacteriana é realizado simultaneamente com a administração da terapia ao indivíduo.

[1609] 6. O método do conceito 1, em que o tratamento da infecção bacteriana é realizado imediatamente depois ou antes da administração da terapia ao indivíduo.

[1610] 7. O método do conceito 1, em que o método compreende a administração ao indivíduo de um RNA ou um ácido nucleico que codifica um RNA para a expressão do RNA no indivíduo, em que o RNA se complexa com a nuclease para programar a nuclease para cortar o local-alvo na primeira bactéria compreendida pelo indivíduo, matando assim a primeira bactéria.

[1611] 8. O método do conceito 1, compreendendo a administração de um vetor de ácido nucleico ao indivíduo, em que o vetor codifica a nuclease programável.

[1612] 9. O método do conceito 1, em que a nuclease programável é uma nuclease endógena das primeiras células.

[1613] 10. O método do conceito 1, em que a eficácia da terapia na presença da nuclease programada é maior do que a eficácia da terapia na presença de um antibiótico de largo espectro.

[1614] 11. O método do conceito 1, em que a eficácia da terapia na presença da nuclease programada é maior do que a eficácia da terapia na presença de um antibiótico selecionado de meticilina, vancomicina, linezolida, daptomicina, quinupristina, dalfopristina; teicoplanina; cefalosporina; carbapenem; fluoroquinolona; aminoglicosídeo; colistina; eritromicina; clindamicina; beta-lactama; macrolídeo; amoxicilina; azitromicina; penicilina; ceftriaxona; azitromicina; ciprofloxacina; isoniazida (INH); rifampicina (RMP); amicacina; canamicina; capreomicina; trimetoprim; itrofurantoína; cefalexina; amoxicilina; metronidazol (MTZ); cefixima; tetraciclina; e meropenem.

[1615] 12. O método do conceito 1, em que a primeira bactéria é selecionada de (i) Staphylococcus aureus resistente a um antibiótico selecionado de meticilina, vancomicina, linezolida, daptomicina, quinupristina, dalfopristina e teicoplaina; (ii) Pseudomonas aeuroginosa resistente a um antibiótico selecionado de cefalosporinas, carbapenemos, fluoroquinolonas, aminoglicosídeos e colistina; (iii) espécies de Klebsiella resistentes a carbapenem; (iv) espécies de Streptoccocus resistentes a antibióticos selecionados de eritromicina, clindamicina, beta-lactâmicos, macrolídeos, amoxicilina, azitromicina e penicilina; (v) espécies de Salmonella resistentes a um antibiótico selecionado de ceftriaxona, azitromicina e ciprofloxacina; (vi) espécies de Shigella resistentes à ciprofloxacina ou à azitromicina; (vii) Mycobacterium tuberculosis resistentes a um antibiótico selecionado da resistência à isoniazida (INH), rifampicina (RMP), fluoroquinolona, amicacina, canamicina, capreomicina e azitromicina; (viii) espécies de Enterococcus resistentes à vancomicina; (ix) espécies de Enterobacteriaceae resistentes a antibióticos selecionados de cefalosporina e carbapenem; (x) E. coli resistente a um antibiótico selecionado de trimetoprim, itrofurantoína, cefalexina e amoxicilina; (xi)

espécies de Clostridium resistentes a metronidazol (MTZ), fluoroquinolona ou carbapenem; (xii) Neisseria gonnorrhoea resistente a um antibiótico selecionado de cefixima, ceftriaxona, azitromicina e tetraciclina; (xiii) Acinetobacter baumannii resistente a um antibiótico selecionado de beta-lactâmico, meropenem e carbapenem; e (xiv) espécies de Campylobacter resistentes à ciprofanicina ou à azitromicina.

[1616] 13. O método do conceito 1, em que o tratamento da infecção trata ou previne no indivíduo uma condição selecionada a partir da vaginose, meningite, pneumonia, infecção do trato urinário, cistite, nefrite, gastroenterite, infecção de pele, impetigo, erisipela, celulite, septicemia ou sepse no indivíduo.

[1617] 14. O método do conceito 1, em que a doença ou a condição adicional são um câncer; doença autoimune ou condição; ou doença ou condição do trato gastrointestinal.

[1618] 15. O método do conceito 1, em que o indivíduo compreende bactérias (segunda bactéria) de uma ou mais cepas ou espécies diferentes da primeira cepa ou espécie, em que os genomas da segunda bactéria não compreendem o local-alvo, em que os genomas da segunda bactéria não são cortados pela nuclease programada no indivíduo, em que a segunda bactéria sobrevive na presença da nuclease programada no paciente; e em que a terapia é eficaz na presença da segunda bactéria.

[1619] 16. O método do conceito 15, em que a redução da segunda bactéria em pacientes está associada à redução da eficácia da terapia.

[1620] 17. O método do conceito 15, em que a segunda bactéria é selecionada do grupo consistindo em Akkermansia, Alistipes, Bacteroides, Barnesiella, Bifidobacterium, Clostridium, Collinsella, Enterococcus, Fusobacterium, Lactobacillus, Propionibacterium, Ruminococcus, bactéria filamentosa segmentada (SFB); bactérias

Veillonella, Prevotella, Escherichia e Streptococcus.

[1621] 18. O método do conceito 1, em que as primeiras bactérias são selecionadas do grupo consistindo em bactérias E. coli, C dificile, V cólera, Staphylococcus, Streptococcus pyogenes, Acinetobacter baumannii, Legionella, Pseudomonas aeruginosa e Klebsiella pneumoniae.

[1622] 19. O método do conceito 1, em que a nuclease é uma nuclease Cas, uma meganuclease, uma nuclease efetora do tipo ativador de transcrição (TALEN) ou nuclease do dedo de zinco.

[1623] 20. Um método para tratar uma infecção bacteriana patogênica em um paciente com câncer causado por bactérias (primeiras bactérias) de uma primeira espécie ou cepa, o método compreendendo matar seletivamente as primeiras bactérias compreendidas pelo indivíduo, cortando um local-alvo composto pelos genomas das primeiras bactérias, em que o corte é realizado usando uma nuclease Cas programada pelo RNA guia para cortar o local-alvo, no qual o método inclui a administração de uma imunoterapia ao indivíduo para tratar o câncer no paciente, em que a nuclease trata a infecção e a imunoterapia é eficaz na presença da nuclease programada para tratar o câncer.

[1624] Será entendido que as modalidades em particular descritas aqui são mostradas por meio de ilustração e não como limitações da invenção. As principais características desta invenção podem ser empregadas em várias modalidades sem se afastar do escopo da invenção. Os versados na técnica reconhecerão ou serão capazes de usar com determinação não mais do que a rotina de estudo, muitos equivalentes para procedimentos específicos descritos aqui. Tais equivalentes são considerados como estando dentro do escopo desta invenção e são cobertos pelas reivindicações. Todas as publicações e pedidos de patentes mencionados na especificação são indicativos do nível de competência dos qualificados na técnica a que se refere esta invenção. Todas as publicações e pedidos de patente e todas as patentes e pedidos de patente US equivalentes descritos aqui são incorporados por referência na mesma medida em que se cada publicação, patente ou pedido de patente individual foi especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por referência. O uso da palavra "a" ou "uma" quando usada em conjunto com o termo "compreendendo" nas reivindicações e/ou a especificação pode significar "uma", mas também é coerente com o significado de "um ou mais", "pelo menos uma" e "uma ou mais de uma". O uso do termo "ou" nas reivindicações é usado para significar "e/ou", a menos que seja explicitamente indicado para referir-se a alternativas apenas ou as alternativas são mutuamente exclusivas, embora a revelação suporte uma definição que se refere apenas a alternativas e "e/ou". Ao longo desse pedido, o termo "cerca de" é usado para indicar que um valor inclui a variação inerente do erro para o dispositivo, o método sendo empregado para determinar o valor ou a variação existente entre os indivíduos do estudo.

[1625] Tal como usado nesse relatório descritivo e reivindicação(ões), as palavras "compreendendo" (e qualquer forma de compreendendo, por exemplo, "compreende" e "compreender"), "ter" (e qualquer forma de ter, por exemplo, "tendo" e "tem"), "incluindo" (e qualquer forma de incluir, como "inclui" e "incluindo") ou "contendo" (e qualquer forma de conter, como "contém" e "contendo") são inclusivas ou abertas e não excluem elementos adicionais e não recitados ou etapas de método.

[1626] O termo "ou suas combinações" ou semelhante ao usado aqui se refere a todas as permutações e combinações dos itens listados que precedem o termo. Por exemplo, "A, B, C, ou suas combinações se destinam a incluir pelo menos um de: A, B, C, AB, AC, BC ou ABC, e se a ordem for importante em um contexto particular, também BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC ou CAB. Continuando com este exemplo, estão expressamente incluídas combinações que contêm repetições de um ou mais itens ou termos, como BB, AAA, MB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB, etc. O versado na técnica compreenderá que normalmente não há limite para o número de itens ou termos em qualquer combinação, a menos que de outra forma aparente do contexto.

[1627] Qualquer parte desta revelação pode ser lida em combinação com qualquer outra parte da revelação, salvo indicação em contrário aparente do contexto.

[1628] Todos as composições e/ou métodos revelados e reivindicados aqui podem ser feitos e executados sem experimentação indevida conforme a presente revelação. Embora as composições e os métodos dessa invenção tenham sido descritos em termos de modalidades preferidas, ficará evidente para os versados na técnica que as variações podem ser aplicadas às composições e/ou métodos e nas etapas ou na sequência de etapas do método descrito aqui sem que se afaste do conceito, espírito e escopo da invenção. Todas essas modificações e substituições semelhantes evidentes aos versados na técnica são consideradas dentro do espírito, escopo e conceito da invenção como definido pelas reivindicações anexas.

[1629] A presente invenção é descrita mais detalhadamente nos seguintes Exemplos não-limitantes.

EXEMPLOS Morte rápida com precisão de bactérias com nucleases programáveis

[1630] Os exemplos fornecem um método para a morte rápida e precisa de cepas de Escherichia coli e Clostridium difficile. Como modelo de sistema de nuclease programável, usamos um sistema de vetor guiado por CRISPR (CGV™) para direcionar especificamente a E.

coli enterohemorrágico (EHEC) e E. coli Nissle probiótica. EXEMPLO 1. Morte precisa da cepa alvo de E.coli Enterohemorrágica (EPEC).

1.1. Design, construção e entrega do sistema de vetor guiado CRISPR (CGV) direcionando a E. coli (EHEC) ATCC43888.

[1631] A invenção fornece um sistema CGV para especificamente direcionar a E. coli enterohemorrágica (EHEC) ATCC43888 (um isolado fecal humano obtido da American Type Culture Collection). O sistema CGV é composto por dois vetores: (a) um vetor contendo um tracrRNA e a proteína Cas9 de Streptococcus pyogenes (SpCas); (b) um vetor contendo um RNA guia (gRNA) que compreende uma sequência de nucleotídeos capaz de hibridizar para uma sequência-alvo nas células hospedeiras para guiar o SpCas9 para a sequência-alvo. Para permitir a morte específica de E. coli (EHEC) ATCC43888, foi escolhida uma sequência específica do genoma desta cepa para o alvo. Especificamente, a sequência contém 20 nucleotídeos do gene de RNA ribossomal 23S de E. coli (EHEC) ATCC43888. Além disso, o motivo adjacente ao protoespaçador (PAM) de 5 ′-NGG foi localizado adjacente à sequência-alvo selecionada. A sequência-alvo selecionada no gene rRNA 23S pode ser encontrada na Tabela 3.

1.2 Caracterização do sistema CGV direcionando a E. coli (EHEC) ATCC43888.

[1632] Para estabelecer a funcionalidade do sistema CGV na mediação da morte específica de sequência em E. coli (EHEC) ATCC43888, o sistema foi transformado em células E.coli (EHEC) ATCC43888. As culturas durante a noite foram diluídas em 1:100 em caldo de lisogenia fresco (LB) e cultivadas em fase medioexponencial OD600 ~ 0,6. O sistema CRISPR foi induzido pela adição de teofilina e arabinose (2mM teofilina e arabinose a 1%), e a sobrevivência da cepa foi seguida ao longo do tempo, através do revestimento das culturas em diluições seriadas a cada 15 minutos, por 1 h (Figura 1). A indução de CRISPR em E. coli (EHEC) desencadeou surpreendentemente uma rápida morte das células, atingindo 99,98% de morte em 30 minutos de indução (Figura 1). EXEMPLO 2. Morte in vivo CRISPR da cepa alvo E. coli enterohemorrágica (EHEC) no modelo de infecção in vivo de larvas da Galleria mellonella.

2.1. Eficácia do CRISPR contra infecções por E. coli (EHEC) ATCC43888 em Galleria mellonella

[1633] A morte CRISPR da cepa alvo de E. coli (EHEC) ATCC43888 foi testada no modelo de infecção in vivo de G. mellonella. Para tanto, larvas de G. mellonella receberam injeções de bactérias 108 UFC E. coli (EHDC) ATCC43888, atrás da pata falsa esquerda final. Cerca de 1h após a injeção, os indutores de CRISPR (2mM teofilina e arabinose a 1%) foram administrados atrás da pata falsa direita final. As larvas foram incubadas a 37 °C e sacrificadas após 1 e 2h após a indução. Conforme mostrado nas Figuras 2 e 3, a indução de CRISPR matou 99% da população após 2 h, em comparação com o controle fora do alvo.

2.2. Curvas de sobrevida de larvas de G. mellonella infectadas com E. coli enterochemorrágica (EHEC).

[1634] Larvas de G. mellonella foram administradas com injeções de bactérias (8 × 104 CFU E. coli ATCC43888) atrás da pata falsa esquerda final. Cerca de 1h após a injeção, os indutores de CRISPR (2mM teofilina e arabinose a 1%) foram administrados atrás da pata falsa direita final. As larvas foram incubadas a 37 °C e a sobrevida foi monitorada por 115 h, com óbito indicado por falta de movimento e falta de resposta ao toque. A morte CRISPR da cepa alvo de E. coli (EHEC) ATCC43888 em larvas de G. mellonella melhorou significativamente a sobrevida das larvas em comparação com o controle fora do alvo (Figura 4) (teste log-rank, P < 0,03).

EXEMPLO 3. Morte de precisão da cepa alvo probiótica de E. coli Nissle 1917

3.1. Design, construção e entrega do sistema de vetor guiado CRISPR (CGV) direcionando a E. coli Nissle 1917.

[1635] A invenção fornece um sistema de CGV para especificamente direcionar a E. coli Nissle 1917. O sistema CGV é composto por dois vetores: (a) um vetor contendo um tracrRNA e a Cas9 de Streptococcus pyogenes (SpCas); (b) um vetor contendo um RNA guia (gRNA) que compreende uma sequência de nucleotídeos capaz de hibridizar para uma sequência-alvo nas células hospedeiras para guiar o SpCas9 para a sequência-alvo. Para permitir a morte específica de E. coli Nissle 1917, foi escolhida uma sequência específica do genoma desta cepa para o alvo. Especificamente, a sequência contém 20 nucleotídeos do gene pks de E. coli Nissle 1917. Além disso, o motivo adjacente ao protoespaçador (PAM) de 5 ′-NGG foi localizado adjacente à sequência-alvo selecionada. A sequência-alvo selecionada no gene pks pode ser encontrada na Tabela 3.

[1636] Além disso, foi selecionado um alvo do genoma diferente para matar especificamente a E. coli Nissle 1917. A sequência contém 20 nucleotídeos do gene yapH. Além disso, o motivo adjacente ao protoespaçador (PAM) de 5 ′-NGG foi localizado adjacente à sequência- alvo selecionada. A sequência-alvo selecionada no gene yapH pode ser encontrada na Tabela 3.

3.2. Construção e entrega dos vetores guiado por CRISPR (CGV) direcionando a E. coli Nissle 1917.

[1637] Para estabelecer a funcionalidade dos CGVs na mediação da morte específica de sequência em E. coli Nissle 1917, o sistema foi transformado em células E.coli Nissle 1917. As culturas durante a noite foram diluídas em 1:100 em caldo de lisogenia fresco (LB) e cultivadas em fase medioexponencial OD600 ~ 0,6. O sistema CRISPR foi induzido pela adição de teofilina e arabinose (2mM teofilina e arabinose a 1%), e a sobrevivência da cepa foi seguida ao longo do tempo, através do revestimento das culturas em diluições seriadas a cada 15 minutos, por 3 h (Figura 5). As Figuras 5 e 6 mostram o ensaio de morte CRISPR em E. coli Nissle 1917, direcionando o gene pks e o gene yapH, respectivamente. Em ambos os casos, a indução de CRISPR desencadeia uma rápida morte de células de E. coli Nissle 1917, atingindo 99,98% de mortes em apenas 15 minutos de indução. EXEMPLO 4. Morte CRISPR in vitro de Clostridium difficile pelos vetores do plasmídeo conjugado e Cas3

[1638] Este experimento envolve a morte de precisão de Clostridium difficile usando uma matriz CRISPR de codificação de gRNA que foi fornecida a partir de uma espécie bacteriana carreadora probiótica por plasmídeos conjugados como vetores (que chamamos de vetores guiados de CRISPR (CGV™)). Uma bactéria carreadora (cepa doadora de E. coli contendo os vetores guiados CRISPR (CGV™)) foi unida com Clostridium difficile que foi morta após a entrega de CGV™ contendo a matriz projetada. Este CGV™ aproveitou a maquinaria Cas3 endógena da Clostridium difficile 630Δerm. Foi alcançada uma morte de 100% das células de Clostridium difficile. Introdução

[1639] Clostridium difficile (C. difficile) é um patógeno oportunista humano formador de esporos que pode colonizar assintomaticamente o intestino de indivíduos saudáveis. Os dois principais fatores de risco para a contração de doenças associadas à C. difficile, como a diarreia nosocomial, são a idade e o tratamento com antibióticos e podem ter consequências fatais. C. difficile 630Δerm, o sujeito de nosso estudo, é uma cepa bem caracterizada e é amplamente usada para a geração de amostras mutantes. Objetivos do estudo

Objetivo 1: Entrega de CGVs por conjugação.

[1640] Um vetor guiado CRISPR (CGV) contendo uma matriz para especificamente direcionar e matar C. difficile foi desenhado e montado. O mesmo CGV faltando a matriz foi montado para uso como um controle para eficiência de conjugação. Ambos os VGC foram transformados na cepa carreadora Escherichia coli CA434, que foi usada como uma cepa doadora para conjugar o plasmídeo em nossa cepa de interesse C. difficile 630Δerm. Objetivo 2: Atrelamento da máquina Clostridium difficile endógena Cas3.

[1641] Após a transcrição da matriz CRISPR administrada na cepa alvo do receptor C. difficile, a Cas3 endógena foi guiada para cortar seu próprio DNA, levando à morte bacteriana. Objetivo 3: Erradicação da Clostridium difficile 630Δerm.

[1642] Realização da morte eficiente de células C. difficile transconjugantes usando CGVs desenhados Materiais e métodos Cepas bacterianas e condições de crescimento

[1643] A cepa CA434 da E. coli foi adquirida da Chain Biotech. Ela foi cultivada em meios ricos em nutrientes (2xYT) e cultivada durante a noite a 37 °C e 250 rpm. O meio foi suplementado com 12,5 μg/mL de tianfenicol quando necessário para a manutenção dos CGVs.

[1644] Clostridium difficile 630Δerm foi cultivada em ágar BHI suplementado com 5 g/L de extrato de levedura, 0,03% L-cisteina, 250μg/ml D-cicloserina e 8 ug/ml de cefoxitina (BHIS + CC). C. difficile foi cultivada durante a noite em um armário anaeróbico de vinil Coy em atmosfera de 92% N2, 6% CO2 e 2% H2 a 37 °C. O acoplamento do doador CA434 e C. difficile foi cultivado em ágar BHI simples para permitir o crescimento da cepa doadora. O tianfenicol foi adicionado às placas BHIS + CC com uma concentração final de 12,5 μg/mL para seleção de transconjugados após o acoplamento. Todas as placas foram secas por 1,5 horas e transferidas, junto com a versão de caldo deste meio, para a câmara anaeróbica pelo menos 3 horas antes do uso. Procedimentos de transferência CGV

[1645] As células carreadoras de E. coli CA434 foram obtidas por eletroporação de qualquer um dos nossos CGVs (vetor controle pMTL84151-FJ797649 e vetor CRISPR pMTL84151-cdCRISPR1). Para isso, as culturas durante a noite de E. coli CA434 foram diluídas 1:100 em meio 100 fresco 2x YT, sem seleção, e cultivadas em OD600 ~ 0,5. Em seguida, elas foram feitas eletrocompetentes por procedimentos padronizados (Sharan et al., 2009). As células eletrocompetentes foram transformadas com plasmídeo pMTL84151-FJ797649 ou pMTL84151- cdCRISPR1 e recuperadas em 2xYT por 1 h a 37 °C com agitação (250 rpm). Finalmente, elas foram revestidas em ágar LB suplementado com 12,5 μg/mL tianfenicol para seleção de transformantes. Os transformantes foram cultivados em 2xYT líquido suplementado com 12,5 μg/mL tianfenicol a 37 °C e 250rpm para acoplamento com C. difficile. 1 ml de células doadoras foi centrifugado a 4000xg por 2 minutos, sobrenadante removido e cuidadosamente lavado com 400μl de PBS. Após um segundo ciclo de centrifugação, o pélete foi transferido para a câmara anaeróbica para acoplamento com C. difficile em placas não seletivas BHI. C. difficile foi preparada para acoplamento após protocolo modificado (Des Purdy et al., 2002). C. difficile 630Δerm foi incubado de um dia para o outro em placas seletivas BHIS+CC, a partir das quais foi inoculado um esfregaço de um dia para o outro em 1 ml de BHI não seletivo e incubado durante a noite para o acoplamento. 200μl dessa cultura foi usada para ressuspender as células doadoras peletizadas e a cultura mista foi revestida em manchas de 20μl sobre placas BHI não seletivas. O acoplamento foi incubado 24h para permitir a conjugação. Após a incubação, toda a placa foi cuidadosamente raspada com um laço de inoculação estéril, ressuspensa em BHI e diluições seriadas foram revestidas em placas BHI+CC para evitar o crescimento de E. coli doadora e em BHI+CC suplementadas com tianfenicol para seleção adicional de transconjugados. As colônias únicas foram contadas após 48 horas. Resultados

[1646] Repetições de placas de BHI+CC+ tianfenicol, selecionadas para transconjugados C. difficile portadores do controle CGV, mostraram um número consistente de colônias resultando em cerca de ~ 600-750 UFCs por experimento de acoplamento. Para o acoplamento de C. difficile com E. coli CA434 que transportava o CGV com a matriz CRISPR, as placas foram esvaziadas, não se observaram colônias. Isso se traduz em 100% de morte de células C. difficile 630Δerm transconjugantes que recebem a matriz CRISPR (ver a Figura 7: Morte de C. difficile 630Δerm transconjugantes). Discussão e conclusões

[1647] Os resultados deste experimento mostram que poderíamos conjugar com sucesso CGVs contendo as matrizes de CRISPR desejadas em C. difficile 630Δerm de uma bactéria portadora de E. coli. Também poderíamos aproveitar com sucesso a maquinaria C. difficile endógena Cas3 para uma morte CRISPR muito eficiente. Referências

[1648] Purdy D, O'Keeffe TA, Elmore M, Herbert M, McLeod A, Bokori-Brown M, Ostrowski A, Minton NP. (2002) Conjugative transfer of clostridial shuttle vectors from Escherichia coli to Clostridium difficile through circumvention of the restriction barrier. Molec. Microbiology 46(2), 439-452

[1649] Sharan, S. K., Thomason, L. C., Kuznetsov, S. G., e Court, D. L. (2009) Recombineering: a homologous recombination-based method of genetic engineering. Nat. Protoc. 4, 206−223

TABELA 1: Exemplo de bactérias Opcionalmente, as bactérias são selecionadas desta Tabela.

Abiotrophia Acidocella Actinomyces Alkalilimnicola Aquaspirillum Abiotrophia defectiva Acidocella aminolytica Actinomyces bovis Alkalilimnicola ehrlichii Aquaspirillum polymorphum Acaricomes Acidocella facilis Actinomyces denticolens Alkaliphilus Aquaspirillum putridiconchylium Acaricomes phytoseiuli Acidomonas Actinomyces europaeus Alkaliphilus oremlandii Aquaspirillum serpens Acetitomaculum Acidomonas methanolica Actinomyces georgiae Alkaliphilus transvaalensis Aquimarina Acetitomaculum ruminis Acidothermus Actinomyces gerencseriae Allochromatium Aquimarina latercula Acetivibrio Acidothermus cellulolyticus Actinomyces hordeovulneris Allochromatium vinosum Arcanobacterium Acetivibrio cellulolyticus Acidovorax Actinomyces howellii Alloiococcus Arcanobacterium haemolyticum Acetivibrio ethanolgignens Acidovorax anthurii Actinomyces hyovaginalis Alloiococcus otitis Arcanobacterium pyogenes Acetivibrio multivorans Acidovorax caeni Actinomyces israelii Allokutzneria Archangium

200/234 Acetoanaerobium Acidovorax cattleyae Actinomyces johnsonii Allokutzneria albata Archangium gephyra Acetoanaerobium noterae Acidovorax citrulli Actinomyces meyeri Altererythrobacter Arcobacter Acetobacter Acidovorax defluvii Actinomyces naeslundii Altererythrobacter ishigakiensis Arcobacter butzleri Acetobacter aceti Acidovorax delafieldii Actinomyces neuii Altermonas Arcobacter cryaerophilus Acetobacter cerevisiae Acidovorax facilis Actinomyces odontolyticus Altermonas haloplanktis Arcobacter halophilus Acetobacter cibinongensis Acidovorax konjaci Actinomyces oris Altermonas macleodii Arcobacter nitrofigilis Acetobacter estunensis Acidovorax temperans Actinomyces radingae Alysiella Arcobacter skirrowii Acetobacter fabarum Acidovorax valerianellae Actinomyces slackii Alysiella crassa Arhodomonas Acetobacter ghanensis Acinetobacter Actinomyces turicensis Alysiella filiformis Arhodomonas aquaeolei Acetobacter indonesiensis Acinetobacter baumannii Actinomyces viscosus Aminobacter Arsenophonus Acetobacter lovaniensis Acinetobacter baylyi Actinoplanes Aminobacter aganoensis Arsenophonus nasoniae Acetobacter malorum Acinetobacter bouvetii Actinoplanes auranticolor Aminobacter aminovorans Arthrobacter Acetobacter nitrogenifigens Acinetobacter calcoaceticus Actinoplanes brasiliensis Aminobacter niigataensis Arthrobacter agilis

Acetobacter oeni Acinetobacter gerneri Actinoplanes consettensis Aminobacterium Arthrobacter albus Acetobacter orientalis Acinetobacter haemolyticus Actinoplanes deccanensis Aminobacterium mobile Arthrobacter aurescens Acetobacter orleanensis Acinetobacter johnsonii Actinoplanes derwentensis Aminomonas Arthrobacter chlorophenolicus Acetobacter pasteurianus Acinetobacter junii Actinoplanes digitatis Aminomonas paucivorans Arthrobacter citreus Acetobacter pornorurn Acinetobacter lwoffi Actinoplanes durhamensis Ammoniphilus Arthrobacter crystallopoietes Acetobacter senegalensis Acinetobacter parvus Actinoplanes ferrugineus Ammoniphilus oxalaticus Arthrobacter cumminsii Acetobacter xylinus Acinetobacter radioresistens Actinoplanes globisporus Ammoniphilus oxalivorans Arthrobacter globiformis Acetobacterium Acinetobacter schindleri Actinoplanes humidus Amphibacillus Arthrobacter histidinolovorans Acetobacterium bakii Acinetobacter soli Actinoplanes italicus Amphibacillus xylanus Arthrobacter ilicis Acetobacterium carbinolicum Acinetobacter tandoii Actinoplanes liguriensis Amphritea Arthrobacter luteus Acetobacterium dehalogenans Acinetobacter tjernbergiae Actinoplanes lobatus Amphritea balenae Arthrobacter methylotrophus Acetobacterium fimetarium Acinetobacter towneri Actinoplanes missouriensis Amphritea japonica Arthrobacter mysorens

201/234 Acetobacterium malicum Acinetobacter ursingii Actinoplanes palleronii Amycolatopsis Arthrobacter nicotianae Acetobacterium paludosum Acinetobacter venetianus Actinoplanes philippinensis Amycolatopsis alba Arthrobacter nicotinovorans Acetobacterium tundrae Acrocarpospora Actinoplanes rectilineatus Amycolatopsis albidoflavus Arthrobacter oxydans Acetobacterium wieringae Acrocarpospora corrugata Actinoplanes regularis Amycolatopsis azurea Arthrobacter pascens Acetobacterium woodii Acrocarpospora macrocephala Actinoplanes teichomyceticus Amycolatopsis coloradensis Arthrobacter phenanthrenivorans Acetofilamentum Acrocarpospora pleiomorpha Actinoplanes utahensis Amycolatopsis lurida Arthrobacter polychromogenes Acetofilamentum rigidum Actibacter Actinopolyspora Amycolatopsis mediterranei Atrhrobacter protophormiae Acetohalobium Actibacter sediminis Actinopolyspora halophila Amycolatopsis rifamycinica Arthrobacter psychrolactophilus Acetohalobium arabaticum Actinoalloteichus Actinopolyspora mortivallis Amycolatopsis rubida Arthrobacter ramosus Acetomicrobium Actinoalloteichus cyanogriseus Actinosynnema Amycolatopsis sulphurea Arthrobacter sulfonivorans Acetomicrobium faecale Actinoalloteichus Actinosynnema mirum Amycolatopsis tolypomycina Arthrobacter sulfureus Acetomicrobium flavidum hymeniacidonis Actinotalea Anabaena Arthrobacter uratoxydans Actinoalloteichus spitiensis Actinotalea fermentans Anabaena cylindrica Arthrobacter ureafaciens

Acetonema Actinobaccillus Aerococcus Anabaena flos-aquae Arthrobacter viscosus Acetonema longum Actinobacillus capsulatus Aerococcus sanguinicola Anabaena variabilis Arthrobacter woluwensis Acetothermus Actinobacillus delphinicola Aerococcus urinae Anaeroarcus Asaia Acetothermus paucivorans Actinobacillus hominis Aerococcus urinaeequi Anaeroarcus burkinensis Asaia bogorensis Acholeplasma Actinobacillus indolicus Aerococcus urinaehominis Anaerobaculum Asanoa Acholeplasma axanthum Actinobacillus lignieresii Aerococcus viridans Anaerobaculum mobile Asanoa ferruginea Acholeplasma brassicae Actinobacillus minor Aeromicrobium Anaerobiospirillum Asticcacaulis Acholeplasma cavigenitalium Actinobacillus muris Aeromicrobium erythreum Anaerobiospirillum Asticcacaulis biprosthecium Acholeplasma equifetale Actinobacillus Aeromonas succiniciproducens Asticcacaulis excentricus Acholeplasma granularum pleuropneumoniae Aeromonas allosaccharophila Anaerobiospirillum thomasii Atopobacter Acholeplasma hippikon Actinobacillus porcinus Aeromonas bestiarum Anaerococcus Atopobacter phocae Acholeplasma laidlawii Actinobacillus rossii Aeromonas caviae Anaerococcus hydrogenalis Atopobium

202/234 Acholeplasma modicum Actinobacillus scotiae Aeromonas encheleia Anaerococcus lactolyticus Atopobium fossor Acholeplasma morum Actinobacillus seminis enteropelogenes Anaerococcus prevotii Atopobium minutum Acholeplasma multilocale Actinobacillus succinogenes Aeromonas eucrenophila Anaerococcus tetradius Atopobium parvulum Acholeplasma oculi Actinobaccillus suis Aeromonas ichthiosmia Anaerococcus vaginalis Atopobium rimae Acholeplasma palmae Actinobacillus ureae Aeromonas jandaei Anaerofustis Atopobium vaginae Acholeplasma parvum Actinobaculum Aeromonas media Anaerofustis stercorihominis Aureobacterium Acholeplasma pleciae Actinobaculum massiliense Aeromonas popoffii Anaeromusa Aureobacterium barkeri Acholeplasma vituli Actinobaculum schaalii Aeromonas sobria Anaeromusa acidaminophila Aurobacterium Achromobacter Actinobaculum suis Aeromonas veronii Anaeromyxobacter Aurobacterium liquefaciens Achromobacter denitrificans Actinomyces urinale Agrobacterium Anaeromyxobacter dehalogenans Avibacterium Achromobacter insolitus Actinocatenispora Agrobacterium gelatinovorum Anaerorhabdus Avibacterium avium Achromobacter piechaudii Actinocatenispora rupis Anaerorhabdus furcosa Avibacterium gallinarum

Achromobacter ruhlandii Actinocatenispora thailandica Agrococcus Anaerosinus Avibacterium paragallinarum Achromobacter spanius Actinocatenispora sera Agrococcus citreus Anaerosinus glycerini Avibacterium volantium Acidaminobacter Actinocorallia Agrococcus jenensis Anaerovirgula Azoarcus Acidaminobacter Actinocorallia aurantiaca Agromonas Anaerovirgula multivorans Azoarcus indigens hydrogenoformans Actinocorallia aurea Agromonas oligotrophica Ancalomicrobium Azoarcus tolulyticus Acidaminococcus Actinocorallia cavernae Agromyces Ancalomicrobium adetum Azoarcus toluvorans Acidaminococcus fermentans Actinocorallia glomerata Agromyces fucosus Ancylobacter Azohydromonas Acidaminococcus intestini Actinocorallia herbida Agromyces hippuratus Ancylobacter aquaticus Azohydromonas australica Acidicaldus Actinocorallia libanotica Agromyces luteolus Aneurinibacillus Azohydromonas lata Acidicaldus organivorans Actinocorallia longicatena Agromyces mediolanus Aneurinibacillus aneurinilyticus Azomonas Acidimicrobium Actinomadura Agromyces ramosus Aneurinibacillus migulanus Azomonas agilis Acidimicrobium ferrooxidans Actinomadura alba Agromyces rhizospherae Aneurinibacillus thermoaerophilus Azomonas insignis

203/234 Acidiphilium Actinomadura atramentaria Akkermansia Angiococcus Azomonas macrocytogenes Acidiphilium acidophilum Actinomadura bangladeshensis Akkermansia muciniphila Angiococcus disciformis Azorhizobium Acidiphilium angustum Actinomadura catellatispora Albidiferax Angulomicrobium Azorhizobium caulinodans Acidiphilium cryptum Actinomadura chibensis Albidiferax ferrireducens Angulomicrobium tetraedrale Azorhizophilus Acidiphilium multivorum Actinomadura chokoriensis Albidovulum Anoxybacillus Azorhizophilus paspali Acidiphilium organovorum Actinomadura citrea Albidovulum inexpectatum Anoxybacillus pushchinoensis Azospirillum Acidiphilium rubrum Actinomadura coerulea Alcaligenes Aquabacterium Azospirillum brasilense Acidisoma Actinomadura echinospora Alcaligenes denitrificans Aquabacterium commune Azospirillum halopraeferens Acidisoma sibiricum Actinomadura fibrosa Alcaligenes faecalis Aquabacterium parvum Azospirillum irakense Acidisoma tundrae Actinomadura formosensis Alcanivorax Azotobacter Acidisphaera Actinomadura hibisca Alcanivorax borkumensis Azotobacter beijerinckii Acidisphaera rubrifaciens Actinomadura kijaniata Alcanivorax jadensis Azotobacter chroococcum Actinomadura latina Azotobacter nigricans

Acidithiobacillus Actinomadura livida Algicola Azotobacter salinestris Acidithiobacillus albertensis Actinomadura luteofluorescens Algicola bacteriolytica Azotobacter vinelandii Acidithiobacillus caldus Actinomadura macra Alicyclobacillus Acidithiobacillus ferrooxidans Actinomadura madurae Alicyclobacillus Acidithiobacillus thiooxidans Actinomadura oligospora disulfidooxidans Acidobacterium Actinomadura pelletieri Alicyclobacillus sendaiensis Acidobacterium capsulatum Actinomadura rubrobrunea Alicyclobacillus vulcanalis Actinomadura rugatobispora Alishewanella Actinomadura umbrina Alishewanella fetalis Actinomadura verrucosospora Alkalibacillus Actinomadura vinacea Alkalibacillus haloalkaliphilus Actinomadura viridilutea

204/234 Actinomadura viridis Actinomadura yumaensis

Bacillus Bacteroides Bibersteinia Borrelia Brevinema [ver abaixo] Bacteroides caccae Bibersteinia trehalosi Borrelia afzelii Brevinema andersonii Bacteroides coagulans Bifidobacterium Borrelia americana Brevundimonas Bacteriovorax Bacteroides eggerthii Bifidobacterium adolescentis Borrelia burgdorferi Brevundimonas alba Bacteriovorax stolpii Bacteroides fragilis Bifidobacterium angulatum Borrelia carolinensis Brevundimonas aurantiaca Bacteroides galacturonicus Bifidobacterium animalis Borrelia coriaceae Brevundimonas diminuta Bacteroides helcogenes Bifidobacterium asteroides Borrelia garinii Brevundimonas intermedia Bacteroides ovatus Bifidobacterium bifidum Borrelia japonica Brevundimonas subvibrioides Bacteroides pectinophilus Bifidobacterium boum Brevundimonas vancanneytii Bacteroides pyogenes Bifidobacterium breve

Bacteroides salyersiae Bifidobacterium catenulatum Bosea Brevundimonas variabilis Bacteroides stercoris Bifidobacterium choerinum Bosea minatitlanensis Brevundimonas vesicularis Bacteroides suis Bifidobacterium coryneforme Bosea thiooxidans Brochothrix Bacteroides tectus Bifidobacterium cuniculi Brachybacterium Brochothrix campestris Bacteroides thetaiotaomicron Bifidobacterium dentium Brachybacterium alimentarium Brochothrix thermosphacta Bacteroides uniformis Bifidobacterium gallicum Brachybacterium faecium Brucella Bacteroides ureolyticus Bifidobacterium gallinarum Brachybacterium Brucella canis Bacteroides vulgatus Bifidobacterium indicum paraconglomeratum Brucella neotomae Balnearium Bifidobacterium longum Brachybacterium rhamnosum Bryobacter Balnearium lithotrophicum Bifidobacterium Brachybacterium tyrofermentans Bryobacter aggregatus Balneatrix magnumBifidobacterium Brachyspira Burkholderia Balneatrix alpica merycicum Brachyspira alvinipulli Burkholderia ambifaria

205/234 Balneola Bifidobacterium minimum Brachyspira hyodysenteriae Burkholderia andropogonis Balneola vulgaris Bifidobacterium Brachyspira innocens Burkholderia anthina Barnesiella pseudocatenulatum Brachyspira murdochii Burkholderia caledonica Barnesiella viscericola Bifidobacterium Brachyspira pilosicoli Burkholderia caryophylli Bartonella pseudolongum Bradyrhizobium Burkholderia cenocepacia Bartonella alsatica Bifidobacterium pullorum Bradyrhizobium canariense Burkholderia cepacia Bartonella bacilliformis Bifidobacterium ruminantium Bradyrhizobium elkanii Burkholderia cocovenenans Bartonella clarridgeiae Bifidobacterium saeculare Bradyrhizobium japonicum Burkholderia dolosa Bartonella doshiae Bifidobacterium subtile Bradyrhizobium liaoningense Burkholderia fungorum Bartonella elizabethae Bifidobacterium thermophilum Brenneria Burkholderia glathei Bartonella grahamii Bilophila Brenneria alni Burkholderia glumae Bartonella henselae Bilophila wadsworthia Brenneria nigrifluens Burkholderia graminis Brenneria quercina Burkholderia kururiensis

Bartonella rochalimae Biostraticola Brenneria quercina Burkholderia multivorans Bartonella vinsonii Biostraticola tofi Brenneria salicis Burkholderia phenazinium Bavariicoccus Bizionia Brevibacillus Burkholderia plantarii Bavariicoccus seileri Bizionia argentinensis Brevibacillus agri Burkholderia pyrrocinia Bdellovibrio Blastobacter Brevibacillus borstelensis Burkholderia silvatlantica Bdellovibrio bacteriovorus Blastobacter capsulatus Brevibacillus brevis Burkholderia stabilis Bdellovibrio exovorus Blastobacter denitrificans Brevibacillus centrosporus Burkholderia thailandensis Beggiatoa Blastococcus Brevibacillus choshinensis Burkholderia tropica Beggiatoa alba Blastococcus aggregatus Brevibacillus invocatus Burkholderia unamae Beijerinckia Blastococcus saxobsidens Brevibacillus laterosporus Burkholderia vietnamiensis Beijerinckia derxii Blastochloris Brevibacillus parabrevis Buttiauxella Beijerinckia fluminensis Blastochloris viridis Brevibacillus reuszeri Buttiauxella agrestis

206/234 Beijerinckia indica Blastomonas Brevibacterium Buttiauxella brennerae Beijerinckia mobilis Blastomonas natatoria Brevibacterium abidum Buttiauxella ferragutiae Belliella Blastopirellula Brevibacterium album Buttiauxella gaviniae Belliella baltica Blastopirellula marina Brevibacterium aurantiacum Buttiauxella izardii Bellilinea Blautia Brevibacterium celere Buttiauxella noackiae Bellilinea caldifistulae Blautia coccoides Brevibacterium epidermidis Buttiauxella warmboldiae Belnapia Blautia hansenii Brevibacterium frigoritolerans Butyrivibrio Belnapia moabensis Blautia producta Brevibacterium halotolerans Butyrivibrio fibrisolvens Bergeriella Blautia wexlerae Brevibacterium iodinum Butyrivibrio hungatei Bergeriella denitrificans Bogoriella Brevibacterium linens Butyrivibrio Beutenbergia Bogoriella caseilytica Brevibacterium lyticum proteoclasticus Beutenbergia cavernae Bordetella Brevibacterium mcbrellneri Bordetella avium

Bordetella bronchiseptica Brevibacterium otitidis Bordetella hinzii Brevibacterium oxydans Bordetella holmesii Brevibacterium paucivorans Bordetella parapertussis Brevibacterium stationis Bordetella pertussis Bordetella petrii Bordetella trematum

Bacillus B. aminovorans B. glucanolyticus B. taeanensis B. lautus B. acidiceler B. amylolyticus B. gordonae B. tequilensis B. lehensis B. acidicola B. andreesenii B. gottheilii B. thermantarcticus B. lentimorbus B. acidiproducens B. aneurinilyticus B. graminis B. thermoaerophilus B. lentus

207/234 B. acidocaldarius B. anthracis B. halmapalus B. thermoamylovorans B. licheniformis B. acidoterrestris B. aquimaris B. haloalkaliphilus B. thermocatenulatus B. ligniniphilus B. aeolius B. arenosi B. halochares B. thermocloacae B. litoralis B. aerius B. arseniciselenatis B. halodenitrificans B. thermocopriae B. locisalis B. aerophilus B. arsenicus B. halodurans B. thermodenitrificans B. luciferensis B. agaradhaerens B. aurantiacus B. halophilus B. thermoglucosidasius B. luteolus B. agri B. arvi B. halosaccharovorans B. thermolactis B. luteus B. aidingensis B. aryabhattai B. hemicellulosilyticus B. thermoleovorans B. macauensis B. akibai B. asahii B. hemicentroti B. thermophilus B. macerans B. alcalophilus B. atrophaeus B. herbersteinensis B. thermoruber B. macquariensis B. algicola B. axarquiensis B. horikoshii B. thermosphaericus B. macyae B. alginolyticus B. azotofixans B. horneckiae B. thiaminolyticus B. malacitensis B. alkalidiazotrophicus B. azotoformans B. horti B. thioparans B. mannanilyticus

B. alkalinitrilicus B. badius B. huizhouensis B. thuringiensis B. marisflavi B. alkalisediminis B. barbaricus B. humi B. tianshenii B. marismortui B. alkalitelluris B. bataviensis B. hwajinpoensis B. trypoxylicola B. marmarensis B. altitudinis B. beijingensis B. idriensis B. tusciae B. massiliensis B. alveayuensis B. benzoevorans B. indicus B. validus B. megaterium B. alvei B. beringensis B. infantis B. vallismortis B. mesonae B. amyloliquefaciens B. berkeleyi B. infernus B. vedderi B. methanolicus  B.

B. beveridgei B. insolitus B. velezensis B. methylotrophicus a. subsp. amyloliquefaciens B. bogoriensis B. invictae B. vietnamensis B. migulanus

 B. a. subsp. plantarum B. boroniphilus B. iranensis B. vireti B. mojavensis B. borstelensis B. isabeliae B. vulcani B. mucilaginosus

B. dipsosauri B. brevis Migula B. isronensis B. wakoensis B. muralis

208/234 B. drentensis B. butanolivorans B. jeotgali B. weihenstephanensis B. murimartini

B. edaphicus B. canaveralius B. kaustophilus B. xiamenensis B. mycoides

B. ehimensis B. carboniphilus B. kobensis B. xiaoxiensis B. naganoensis

B. eiseniae B. cecembensis B. kochii B. zhanjiangensis B. nanhaiensis

B. enclensis B. cellulosilyticus B. kokeshiiformis B. peoriae B. nanhaiisediminis

B. endophyticus B. centrosporus B. koreensis B. persepolensis B. nealsonii

B. endoradicis B. cereus B. korlensis B. persicus B. neidei

B. farraginis B. chagannorensis B. kribbensis B. pervagus B. neizhouensis

B. fastidiosus B. chitinolyticus B. krulwichiae B. plakortidis B. niabensis

B. fengqiuensis B. chondroitinus B. laevolacticus B. pocheonensis B. niacini

B. firmus B. choshinensis B. larvae B. polygoni B. novalis

B. flexus B. chungangensis B. laterosporus B. polymyxa B. oceanisediminis

B. foraminis B. cibi B. salexigens B. popilliae B. odysseyi

B. fordii B. circulans B. saliphilus B. pseudalcalophilus B. okhensis B. formosus B. clarkii B. schlegelii B. pseudofirmus B. okuhidensis B. fortis B. clausii B. sediminis B. pseudomycoides B. oleronius B. fumarioli B. coagulans B. selenatarsenatis B. psychrodurans B. oryzaecorticis B. funiculus B. coahuilensis B. selenitireducens B. psychrophilus B. oshimensis B. fusiformis B. cohnii B. seohaeanensis B. psychrosaccharolyticus B. pabuli B. galactophilus B. composti B. shacheensis B. psychrotolerans B. pakistanensis B. galactosidilyticus B. curdlanolyticus B. shackletonii B. pulvifaciens B. pallidus B. galliciensis B. cycloheptanicus B. siamensis B. pumilus B. pallidus B. gelatini B. cytotoxicus B. silvestris B. purgationiresistens B. panacisoli B. gibsonii B. daliensis B. simplex B. pycnus B. panaciterrae B. ginsengi B. decisifrondis B. siralis B. qingdaonensis B. pantothenticus

209/234 B. ginsengihumi B. decolorationis B. smithii B. qingshengii B. parabrevis B. ginsengisoli B. deserti B. soli B. reuszeri B. paraflexus B. globisporus (p.ex., B.

B. solimangrovi B. rhizosphaerae B. pasteurii g. subsp.

Globisporus; ou B.

B. solisalsi B. rigui B. patagoniensis g. subsp.

Marinus) B. songklensis B. ruris B. sonorensis B. safensis B. sphaericus B. salarius B. sporothermodurans B. stearothermophilus B. stratosphericus B. subterraneus B. subtilis (p.ex., B. s. subsp.

Inaquosorum; ou B.

s. subsp.

Spizizeni; ou B. s. subsp.

Subtilis)

Caenimonas Campylobacter Cardiobacterium Catenuloplanes Curtobacterium Caenimonas koreensis Campylobacter coli Cardiobacterium hominis Catenuloplanes atrovinosus Curtobacterium albidum Caldalkalibacillus Campylobacter concisus Carnimonas Catenuloplanes castaneus Curtobacterium citreus Caldalkalibacillus uzonensis Campylobacter curvus Carnimonas nigrificans Catenuloplanes crispus Caldanaerobacter Campylobacter fetus Carnobacterium Catenuloplanes indicus Caldanaerobacter subterraneus Campylobacter gracilis Carnobacterium alterfunditum Catenuloplanes japonicus Caldanaerobius Campylobacter helveticus Carnobacterium divergens Catenuloplanes nepalensis Caldanaerobius fijiensis Campylobacter hominis Carnobacterium funditum Catenuloplanes niger Caldanaerobius Campylobacter hyointestinalis Carnobacterium gallinarum Chryseobacterium polysaccharolyticus Campylobacter jejuni Carnobacterium Chryseobacterium balustinum

210/234 Caldanaerobius zeae Campylobacter lari maltaromaticum Citrobacter Caldanaerovirga Campylobacter mucosalis Carnobacterium mobile C. amalonaticus Caldanaerovirga acetigignens Campylobacter rectus Carnobacterium viridans C. braakii Caldicellulosiruptor Campylobacter showae Caryophanon C. diversus Caldicellulosiruptor bescii Campylobacter sputorum Caryophanon latum C. farmeri Caldicellulosiruptor kristjanssonii Campylobacter upsaliensis Caryophanon tenue C. freundii Caldicellulosiruptor owensensis Capnocytophaga Catellatospora C. gillenii Capnocytophaga canimorsus Catellatospora citrea C. koseri Capnocytophaga cynodegmi Catellatospora C. murliniae Capnocytophaga gingivalis methionotrophica C. pasteurii[1] Capnocytophaga granulosa Catenococcus C. rodentium Capnocytophaga haemolytica Catenococcus thiocycli C. sedlakii

Capnocytophaga ochracea C. werkmanii Capnocytophaga sputigena C. youngae Clostridium (ver abaixo) Coccochloris Coccochloris elabens Corynebacterium Corynebacterium flavescens Corynebacterium variabile

Clostridium Clostridium absonum, Clostridium aceticum, Clostridium acetireducens, Clostridium acetobutylicum, Clostridium acidisoli, Clostridium aciditolerans, Clostridium acidurici, Clostridium aerotolerans, Clostridium aestuarii, Clostridium akagii, Clostridium aldenense, Clostridium aldrichii, Clostridium algidicarni, Clostridium algidixylanolyticum,

211/234 Clostridium algifaecis, Clostridium algoriphilum, Clostridium alkalicellulosi, Clostridium aminophilum, Clostridium aminovalericum, Clostridium amygdalinum, Clostridium amylolyticum, Clostridium arbusti, Clostridium arcticum, Clostridium argentinense, Clostridium asparagiforme, Clostridium aurantibutyricum, Clostridium autoethanogenum, Clostridium baratii, Clostridium barkeri, Clostridium bartlettii, Clostridium beijerinckii, Clostridium bifermentans, Clostridium bolteae, Clostridium bornimense, Clostridium botulinum, Clostridium bowmanii, Clostridium bryantii, Clostridium butyricum, Clostridium cadaveris, Clostridium caenicola, Clostridium caminithermale, Clostridium carboxidivorans, Clostridium carnis, Clostridium cavendishii, Clostridium celatum, Clostridium celerecrescens, Clostridium cellobioparum, Clostridium cellulofermentans, Clostridium cellulolyticum, Clostridium cellulosi, Clostridium cellulovorans, Clostridium chartatabidum, Clostridium chauvoei, Clostridium chromiireducens, Clostridium citroniae, Clostridium clariflavum, Clostridium clostridioforme, Clostridium coccoides, Clostridium cochlearium, Clostridium colletant, Clostridium colicanis, Clostridium colinum, Clostridium collagenovorans, Clostridium cylindrosporum, Clostridium difficile, Clostridium diolis, Clostridium disporicum, Clostridium drakei, Clostridium durum, Clostridium estertheticum, Clostridium estertheticum estertheticum, Clostridium estertheticum laramiense, Clostridium fallax, Clostridium felsineum, Clostridium fervidum, Clostridium fimetarium, Clostridium formicaceticum, Clostridium frigidicarnis, Clostridium frigoris, Clostridium ganghwense, Clostridium gasigenes, Clostridium ghonii, Clostridium glycolicum, Clostridium glycyrrhizinilyticum, Clostridium grantii, Clostridium haemolyticum, Clostridium halophilum, Clostridium hastiforme, Clostridium hathewayi, Clostridium herbivorans, Clostridium hiranonis, Clostridium histolyticum, Clostridium homopropionicum, Clostridium huakuii, Clostridium hungatei, Clostridium hydrogeniformans, Clostridium hydroxybenzoicum, Clostridium hylemonae, Clostridium jejuense, Clostridium indolis, Clostridium innocuum, Clostridium intestinale,

Clostridium irregulare, Clostridium isatidis, Clostridium josui, Clostridium kluyveri, Clostridium lactatifermentans, Clostridium lacusfryxellense, Clostridium laramiense, Clostridium lavalense, Clostridium lentocellum, Clostridium lentoputrescens, Clostridium leptum, Clostridium limosum, Clostridium litorale, Clostridium lituseburense, Clostridium ljungdahlii, Clostridium lortetii, Clostridium lundense, Clostridium magnum, Clostridium malenominatum, Clostridium mangenotii, Clostridium mayombei, Clostridium methoxybenzovorans, Clostridium methylpentosum, Clostridium neopropionicum, Clostridium nexile, Clostridium nitrophenolicum, Clostridium novyi, Clostridium oceanicum, Clostridium orbiscindens, Clostridium oroticum, Clostridium oxalicum, Clostridium papyrosolvens, Clostridium paradoxum, Clostridium paraperfringens (Alias: C. welchii), Clostridium paraputrificum, Clostridium pascui, Clostridium pasteurianum, Clostridium peptidivorans, Clostridium perenne, Clostridium perfringens, Clostridium pfennigii, Clostridium phytofermentans, Clostridium piliforme, Clostridium polysaccharolyticum, Clostridium populeti, Clostridium propionicum, Clostridium proteoclasticum, Clostridium proteolyticum, Clostridium psychrophilum, Clostridium puniceum, Clostridium purinilyticum, Clostridium putrefaciens, Clostridium putrificum, Clostridium quercicolum, Clostridium quinii, Clostridium ramosum, Clostridium rectum, Clostridium roseum, Clostridium saccharobutylicum, Clostridium saccharogumia, Clostridium saccharolyticum, Clostridium saccharoperbutylacetonicum, Clostridium sardiniense, Clostridium sartagoforme, Clostridium scatologenes, Clostridium schirmacherense, Clostridium scindens, Clostridium septicum, Clostridium sordellii, Clostridium sphenoides, Clostridium spiroforme, Clostridium sporogenes, Clostridium sporosphaeroides, Clostridium stercorarium, Clostridium stercorarium leptospartum, Clostridium stercorarium stercorarium,

212/234 Clostridium stercorarium thermolacticum, Clostridium sticklandii, Clostridium straminisolvens, Clostridium subterminale, Clostridium sufflavum, Clostridium sulfidigenes, Clostridium symbiosum, Clostridium tagluense, Clostridium tepidiprofundi, Clostridium termitidis, Clostridium tertium, Clostridium tetani, Clostridium tetanomorphum, Clostridium thermaceticum, Clostridium thermautotrophicum, Clostridium thermoalcaliphilum, Clostridium thermobutyricum, Clostridium thermocellum, Clostridium thermocopriae, Clostridium thermohydrosulfuricum, Clostridium thermolacticum, Clostridium thermopalmarium, Clostridium thermopapyrolyticum, Clostridium thermosaccharolyticum, Clostridium thermosuccinogenes, Clostridium thermosulfurigenes, Clostridium thiosulfatireducens, Clostridium tyrobutyricum, Clostridium uliginosum, Clostridium ultunense, Clostridium villosum, Clostridium vincentii, Clostridium viride, Clostridium xylanolyticum, Clostridium xylanovorans

Dactylosporangium Deinococcus Delftia Echinicola Dactylosporangium Deinococcus aerius Delftia acidovorans Echinicola pacifica aurantiacum Deinococcus apachensis Echinicola vietnamensis Dactylosporangium fulvum Deinococcus aquaticus Dactylosporangium Deinococcus aquatilis matsuzakiense Deinococcus caeni Desulfovibrio

Dactylosporangium roseum Deinococcus radiodurans Desulfovibrio

Dactylosporangium Deinococcus radiophilus desulfuricans thailandense Diplococcus Dactylosporangium vinaceum Diplococcus pneumoniae

Enterobacter Enterobacter kobei Faecalibacterium Flavobacterium E. aerogenes E. ludwigii Faecalibacterium Flavobacterium antarcticum E. amnigenus E. mori prausnitzii Flavobacterium aquatile E. agglomerans E. nimipressuralis Flavobacterium aquidurense

213/234 E. arachidis E. oryzae Fangia Flavobacterium balustinum E. asburiae E. pulveris Fangia hongkongensis Flavobacterium croceum E. cancerogenous E. pyrinus E. cloacae E. radicincitans Flavobacterium cucumis Fastidiosipila E. cowanii E. taylorae Flavobacterium daejeonense Fastidiosipila sanguinis E. dissolvens E. turicensis Flavobacterium defluvii E. gergoviae E. sakazakii Enterobacter soli Fusobacterium Flavobacterium degerlachei E. helveticus Fusobacterium nucleatum Flavobacterium E. hormaechei Enterococcus denitrificans E. intermedius Enterococcus durans Flavobacterium filum Enterococcus faecalis Flavobacterium flevense Enterococcus faecium Flavobacterium frigidarium

Erwinia Flavobacterium mizutaii Erwinia hapontici Flavobacterium okeanokoites

Escherichia Escherichia coli

Gaetbulibacter Haemophilus Ideonella Janibacter Gaetbulibacter Haemophilus aegyptius Ideonella azotifigens Janibacter anophelis saemankumensis Haemophilus aphrophilus Janibacter corallicola Idiomarina Haemophilus felis Janibacter limosus Gallibacterium Idiomarina abyssalis Haemophilus gallinarum Janibacter melonis Gallibacterium anatis Idiomarina baltica Haemophilus haemolyticus Janibacter terrae

214/234 Idiomarina Haemophilus influenzae Gallicola fontislapidosi Jannaschia Haemophilus paracuniculus Gallicola barnesae Idiomarina loihiensis Jannaschia cystaugens Haemophilus Idiomarina ramblicola Jannaschia helgolandensis Garciella parahaemolyticus Idiomarina seosinensis Jannaschia pohangensis Garciella nitratireducens Haemophilus parainfluenzae Idiomarina zobellii Jannaschia rubra Haemophilus Geobacillus paraphrohaemolyticus Ignatzschineria Geobacillus Haemophilus parasuis Ignatzschineria larvae thermoglucosidasius Haemophilus pittmaniae Janthinobacterium Geobacillus Janthinobacterium stearothermophilus

Geobacter Hafnia Ignavigranum agaricidamnosum Geobacter bemidjiensis Hafnia alvei Ignavigranum ruoffiae Janthinobacterium lividum Geobacter bremensis Hahella Ilumatobacter Jejuia Geobacter chapellei Hahella ganghwensis Ilumatobacter fluminis Jejuia pallidilutea Geobacter grbiciae Geobacter hydrogenophilus Halalkalibacillus Ilyobacter Jeotgalibacillus Geobacter lovleyi Halalkalibacillus Ilyobacter delafieldii Jeotgalibacillus Geobacter metallireducens halophilus Ilyobacter insuetus alimentarius Geobacter pelophilus Ilyobacter polytropus Geobacter pickeringii Helicobacter Jeotgalicoccus Ilyobacter tartaricus Geobacter sulfurreducens Helicobacter pylori Jeotgalicoccus halotolerans

215/234 Geodermatophilus Geodermatophilus obscurus

Gluconacetobacter Gluconacetobacter xylinus

Gordonia Gordonia rubripertincta

Kaistia Labedella Listeria ivanovii Micrococcus Nesterenkonia Kaistia adipata Labedella gwakjiensis L. marthii Micrococcus luteus Nesterenkonia holobia Kaistia soli L. monocytogenes Micrococcus lylae Labrenzia Nocardia L. newyorkensis Kangiella Labrenzia aggregata Moraxella Nocardia argentinensis L. riparia Kangiella aquimarina Labrenzia alba Moraxella bovis Nocardia corallina L. rocourtiae Kangiella koreensis Labrenzia alexandrii Moraxella nonliquefaciens Nocardia otitidiscaviarum L. seeligeri Labrenzia marina Moraxella osloensis L. weihenstephanensis Kerstersia Kerstersia gyiorum L. welshimeri Labrys Nakamurella Labrys methylaminiphilus Nakamurella multipartita Listonella Kiloniella Labrys miyagiensis

216/234 Kiloniella laminariae Listonella anguillarum Nannocystis Labrys monachus Nannocystis pusilla Labrys okinawensis Macrococcus Klebsiella Labrys portucalensis Macrococcus bovicus K. granulomatis Natranaerobius K. oxytoca Natranaerobius thermophilus [ver abaixo] Marinobacter K. pneumoniae Natranaerobius trueperi Marinobacter algicola Laceyella K. terrigena Laceyella putida Naxibacter Marinobacter bryozoorum K. variicola Naxibacter alkalitolerans Marinobacter flavimaris

Kluyvera Neisseria

Kluyvera ascorbata Neisseria cinerea Neisseria denitrificans

Kocuria Lechevalieria Meiothermus Neisseria gonorrhoeae Kocuria roasea Lechevalieria Meiothermus ruber Neisseria lactamica Kocuria varians aerocolonigenes Neisseria mucosa Methylophilus Neisseria sicca Kurthia Legionella Methylophilus Neisseria subflava Kurthia zopfii methylotrophus [ver abaixo] Neptunomonas Microbacterium Neptunomonas japonica Listeria Microbacterium L. aquatica ammoniaphilum L. booriae Microbacterium L. cornellensis arborescens

217/234 L. fleischmannii Microbacterium L. floridensis liquefaciens L. grandensis Microbacterium oxydans L. grayi L. innocua

Lactobacillus L. catenaformis L. mali L. parakefiri L. sakei

L. acetotolerans L. ceti L. manihotivorans L. paralimentarius L. salivarius

L. acidifarinae L. coleohominis L. mindensis L. paraplantarum L. sanfranciscensis

L. acidipiscis L. collinoides L. mucosae L. pentosus L. satsumensis

L. acidophilus L. composti L. murinus L. perolens L. secaliphilus

Lactobacillus agilis L. concavus L. nagelii L. plantarum L. sharpeae

L. algidus L. coryniformis L. namurensis L. pontis L. siliginis

L. alimentarius L. crispatus L. nantensis L. protectus L. spicheri

L. amylolyticus L. crustorum L. oligofermentans L. psittaci L. suebicus

218/234 L. amylophilus L. curvatus L. oris L. rennini L. thailandensis

L. amylotrophicus L. delbrueckii subsp.

L. panis L. reuteri L. ultunensis bulgaricus L. amylovorus L. pantheris L. rhamnosus L. vaccinostercus L. delbrueckii subsp.

L. animalis delbrueckii L. parabrevis L. rimae L. vaginalis

L. antri L. delbrueckii subsp.

L. parabuchneri L. rogosae L. versmoldensis lactis L. apodemi L. paracasei L. rossiae L. vini

L. dextrinicus

L. aviarius L. diolivorans L. paracollinoides L. ruminis L. vitulinus

L. bifermentans L. equi L. parafarraginis L. saerimneri L. zeae

L. brevis L. equigenerosi L. homohiochii L. jensenii L. zymae

L. buchneri L. farraginis L. iners L. johnsonii L. gastricus

L. camelliae L. farciminis L. ingluviei L. kalixensis L. ghanensis

L. casei L. fermentum L. intestinalis L. kefiranofaciens L. graminis

219/234 L. kitasatonis L. fornicalis L. fuchuensis L. kefiri L. hammesii

L. kunkeei L. fructivorans L. gallinarum L. kimchii L. hamsteri

L. leichmannii L. frumenti L. gasseri L. helveticus L. harbinensis

L. lindneri L. hilgardii L. hayakitensis

L. malefermentans

Legionella Legionella drancourtii Candidatus Legionella Legionella quinlivanii Legionella dresdenensis jeonii Legionella rowbothamii Legionella drozanskii Legionella jordanis Legionella rubrilucens

Legionella adelaidensis Legionella dumoffii Legionella lansingensis Legionella sainthelensi Legionella anisa Legionella erythra Legionella londiniensis Legionella santicrucis Legionella beliardensis Legionella fairfieldensis Legionella longbeachae Legionella shakespearei Legionella birminghamensis Legionella fallonii Legionella lytica Legionella spiritensis Legionella bozemanae Legionella feeleii Legionella maceachernii Legionella steelei Legionella brunensis Legionella geestiana Legionella massiliensis Legionella steigerwaltii Legionella busanensis Legionella genomospecies Legionella micdadei Legionella taurinensis Legionella cardiaca Legionella gormanii Legionella monrovica Legionella tucsonensis Legionella cherrii Legionella gratiana Legionella moravica Legionella tunisiensis Legionella cincinnatiensis Legionella gresilensis Legionella nagasakiensis Legionella wadsworthii Legionella clemsonensis Legionella hackeliae Legionella nautarum Legionella waltersii

220/234 Legionella donaldsonii Legionella impletisoli Legionella norrlandica Legionella worsleiensis Legionella israelensis Legionella oakridgensis Legionella yabuuchiae Legionella jamestowniensis Legionella parisiensis Legionella pittsburghensis Legionella pneumophila Legionella quateirensis

Oceanibulbus Paenibacillus Prevotella Quadrisphaera Oceanibulbus indolifex Paenibacillus Quadrisphaera granulorum thiaminolyticus Prevotella albensis Prevotella amnii Prevotella bergensis

Oceanicaulis Pantoea Prevotella bivia Quatrionicoccus Oceanicaulis alexandrii Pantoea agglomerans Prevotella brevis Quatrionicoccus Prevotella bryantii australiensis Oceanicola Prevotella buccae Oceanicola batsensis Prevotella buccalis Paracoccus Prevotella copri Oceanicola granulosus Paracoccus alcaliphilus Prevotella dentalis Oceanicola nanhaiensis Quinella Prevotella denticola Quinella ovalis Paucimonas Prevotella disiens Oceanimonas Paucimonas lemoignei Prevotella histicola Oceanimonas baumannii Prevotella intermedia Pectobacterium Prevotella maculosa Oceaniserpentilla Ralstonia

221/234 Pectobacterium aroidearum Prevotella marshii Oceaniserpentilla haliotis Ralstonia eutropha Prevotella melaninogenica Pectobacterium Prevotella micans Oceanisphaera atrosepticum Ralstonia insidiosa Prevotella multiformis Oceanisphaera donghaensis Pectobacterium Ralstonia mannitolilytica Prevotella nigrescens Oceanisphaera litoralis betavasculorum Ralstonia pickettii Prevotella oralis Pectobacterium cacticida Prevotella oris Oceanithermus Pectobacterium carnegieana Ralstonia Oceanithermus desulfurans Pectobacterium carotovorum pseudosolanacearum Oceanithermus profundus Pectobacterium chrysanthemi Ralstonia syzygii Oceanobacillus Oceanobacillus caeni Pectobacterium cypripedii

Oceanospirillum Pectobacterium rhapontici Prevotella oulorum Ralstonia solanacearum Oceanospirillum linum Pectobacterium wasabiae Prevotella pallens Prevotella salivae Ramlibacter Planococcus Prevotella stercorea Ramlibacter henchirensis Planococcus citreus Prevotella tannerae Ramlibacter tataouinensis Prevotella timonensis

Planomicrobium Prevotella veroralis Raoultella Planomicrobium Raoultella ornithinolytica Providencia okeanokoites Raoultella planticola Providencia stuartii Raoultella terrigena Plesiomonas Pseudomonas Plesiomonas shigelloides Rathayibacter

222/234 Pseudomonas aeruginosa Rathayibacter caricis Proteus Pseudomonas alcaligenes Rathayibacter festucae Proteus vulgaris Pseudomonas Rathayibacter iranicus anguillispetica Rathayibacter rathayi Pseudomonas fluorescens Rathayibacter toxicus Pseudoalteromonas Rathayibacter tritici haloplanktis Pseudomonas mendocina Rhodobacter Pseudomonas Rhodobacter sphaeroides pseudoalcaligenes Pseudomonas putida Ruegeria Ruegeria gelatinovorans

Pseudomonas tutzeri Pseudomonas syringae

Psychrobacter Psychrobacter faecalis Psychrobacter phenylpyruvicus

Saccharococcus Sagittula Sanguibacter Stenotrophomonas Tatlockia Saccharococcus thermophilus Sagittula stellata Sanguibacter keddieii Stenotrophomonas maltophilia Tatlockia maceachernii Saccharomonospora Salegentibacter Sanguibacter suarezii Streptococcus Tatlockia micdadei

223/234 Saccharomonospora azurea Salegentibacter salegens Saprospira Saccharomonospora cyanea Salimicrobium Saprospira grandis [também ver abaixo] Tenacibaculum Saccharomonospora viridis Salimicrobium album Sarcina Streptomyces Tenacibaculum amylolyticum Saccharophagus Salinibacter Sarcina maxima Streptomyces achromogenes Tenacibaculum discolor Saccharophagus degradans Salinibacter ruber Sarcina ventriculi Streptomyces cesalbus Tenacibaculum gallaicum Saccharopolyspora Salinicoccus Sebaldella Streptomyces cescaepitosus Tenacibaculum lutimaris Saccharopolyspora erythraea Salinicoccus alkaliphilus Sebaldella termitidis Streptomyces cesdiastaticus Saccharopolyspora gregorii Salinicoccus hispanicus Streptomyces cesexfoliatus Tenacibaculum mesophilum

Saccharopolyspora hirsuta Salinicoccus roseus Serratia Streptomyces fimbriatus Tenacibaculum skagerrakense Saccharopolyspora hordei Salinispora Serratia fonticola Streptomyces fradiae Saccharopolyspora rectivirgula Salinispora arenicola Serratia marcescens Streptomyces fulvissimus Tepidanaerobacter

Saccharopolyspora spinosa Salinispora tropica Sphaerotilus Streptomyces griseoruber Tepidanaerobacter Saccharopolyspora taberi Salinivibrio Sphaerotilus natans Streptomyces griseus syntrophicus Salinivibrio costicola Streptomyces lavendulae

Saccharothrix Salmonella Sphingobacterium Streptomyces phaeochromogenes Tepidibacter Saccharothrix australiensis Salmonella bongori Sphingobacterium multivorum Streptomyces thermodiastaticus Tepidibacter formicigenes Saccharothrix coeruleofusca Salmonella enterica Staphylococcus Streptomyces tubercidicus Tepidibacter thalassicus Saccharothrix espanaensis Salmonella subterranea [ver abaixo] Saccharothrix longispora Salmonella typhi Thermus Saccharothrix mutabilis Thermus aquaticus Saccharothrix syringae Thermus filiformis Saccharothrix tangerinus Thermus thermophilus Saccharothrix texasensis

Staphylococcus

224/234 S. equorum S. microti S. schleiferi S. arlettae S. felis S. muscae S. sciuri

S. agnetis S. fleurettii S. nepalensis S. simiae S. gallinarum S. pasteuri S. simulans S. aureus S. haemolyticus S. petrasii S. stepanovicii S. auricularis S. hominis S. pettenkoferi S. succinus S. capitis S. hyicus S. piscifermentans S. vitulinus S. caprae S. intermedius S. pseudintermedius S. warneri S. carnosus S. kloosii S. pseudolugdunensis S. xylosus S. caseolyticus S. leei S. pulvereri S. chromogenes S. lentus S. rostri S. lugdunensis S. saccharolyticus S. lutrae

S. cohnii S. lyticans S. saprophyticus

S. condimenti S. massiliensis

S. delphini S. devriesei S. epidermidis

Streptococcus Streptococcus agalactiae Streptococcus infantarius Streptococcus orisratti Streptococcus thermophilus Streptococcus anginosus Streptococcus iniae Streptococcus parasanguinis Streptococcus sanguinis Streptococcus bovis Streptococcus intermedius Streptococcus peroris Streptococcus sobrinus Streptococcus canis Streptococcus lactarius Streptococcus pneumoniae Streptococcus suis Streptococcus constellatus Streptococcus milleri Streptococcus Streptococcus uberis

225/234 Streptococcus downei Streptococcus mitis pseudopneumoniae Streptococcus vestibularis Streptococcus dysgalactiae Streptococcus mutans Streptococcus pyogenes Streptococcus viridans Streptococcus equines Streptococcus oralis Streptococcus ratti Streptococcus zooepidemicus Streptococcus faecalis Streptococcus tigurinus Streptococcus salivariu Streptococcus ferus

Uliginosibacterium Vagococcus Vibrio Virgibacillus Xanthobacter Uliginosibacterium Vagococcus carniphilus Vibrio aerogenes Virgibacillus halodenitrificans Xanthobacter agilis gangwonense Vagococcus elongatus Vibrio aestuarianus Virgibacillus pantothenticus Xanthobacter Vagococcus fessus Vibrio albensis Weissella aminoxidans Ulvibacter Vagococcus fluvialis Vibrio alginolyticus Weissella cibaria Xanthobacter autotrophicus

Ulvibacter litoralis Vagococcus lutrae Vibrio campbellii Weissella confusa Xanthobacter flavus Vagococcus salmoninarum Vibrio cholerae Weissella halotolerans Xanthobacter tagetidis Vibrio cincinnatiensis Weissella hellenica Xanthobacter viscosus

Umezawaea Variovorax Vibrio coralliilyticus Weissella kandleri Umezawaea tangerina Variovorax boronicumulans Vibrio cyclitrophicus Weissella koreensis Xanthomonas Variovorax dokdonensis Vibrio diazotrophicus Weissella minor Xanthomonas albilineans Undibacterium Variovorax paradoxus Vibrio fluvialis Weissella paramesenteroides Xanthomonas alfalfae Undibacterium pigrum Variovorax soli Vibrio furnissii Weissella soli Xanthomonas arboricola Veillonella Vibrio gazogenes Weissella thailandensis Xanthomonas axonopodis Ureaplasma Veillonella atypica Vibrio halioticoli Weissella viridescens Xanthomonas campestris Ureaplasma urealyticum Veillonella caviae Vibrio harveyi Williamsia Veillonella criceti Vibrio ichthyoenteri Williamsia marianensis Xanthomonas citri

Veillonella dispar Vibrio mediterranei Williamsia maris Xanthomonas codiaei Veillonella montpellierensis Vibrio metschnikovii Williamsia serinedens Xanthomonas cucurbitae Ureibacillus Veillonella parvula Vibrio mytili Winogradskyella Xanthomonas euvesicatoria

226/234 Ureibacillus composti Veillonella ratti Vibrio natriegens Winogradskyella thalassocola Xanthomonas fragariae Ureibacillus suwonensis Veillonella rodentium Vibrio navarrensis Wolbachia Venenivibrio Vibrio nereis Wolbachia persica Xanthomonas fuscans Ureibacillus terrenus Venenivibrio stagnispumantis Vibrio nigripulchritudo Ureibacillus thermophilus Xanthomonas gardneri Vibrio ordalii Wolinella Ureibacillus Xanthomonas hortorum Verminephrobacter Vibrio orientalis Wolinella succinogenes thermosphaericus Xanthomonas hyacinthi Verminephrobacter eiseniae Vibrio parahaemolyticus Verrucomicrobium Vibrio pectenicida Zobellia Xanthomonas perforans Verrucomicrobium spinosum Vibrio penaeicida Zobellia galactanivorans Xanthomonas phaseoli Vibrio proteolyticus Zobellia uliginosa Xanthomonas pisi Vibrio shilonii Zoogloea Xanthomonas populi Vibrio splendidus Zoogloea ramigera Xanthomonas theicola Zoogloea resiniphila

Vibrio tubiashii Xanthomonas translucens Vibrio vulnificus

Xanthomonas vesicatoria

Xylella Xylella fastidiosa

Xylophilus Xylophilus ampelinus

227/234 Xenophilus Yangia Yersinia mollaretii Zooshikella Zobellella

Xenophilus azovorans Yangia pacifica Yersinia philomiragia Zooshikella ganghwensis Zobellella denitrificans Yaniella Yersinia pestis Zunongwangia Zobellella taiwanensis

Xenorhabdus Yaniella flava Yersinia pseudotuberculosis Zunongwangia profunda Zeaxanthinibacter Yaniella halotolerans Yersinia rohdei Zymobacter Zeaxanthinibacter enoshimensis Xenorhabdus beddingii Yeosuana Yersinia ruckeri Zymobacter palmae Zhihengliuella Xenorhabdus bovienii Yeosuana aromativorans Yokenella Zymomonas Zhihengliuella halotolerans Xenorhabdus cabanillasii Yersinia Yokenella regensburgei Zymomonas mobilis Xenorhabdus doucetiae Yersinia aldovae Yonghaparkia Zymophilus Xylanibacterium Xenorhabdus griffiniae Yersinia bercovieri Yonghaparkia alkaliphila Zymophilus paucivorans Xylanibacterium ulmi Xenorhabdus hominickii Yersinia enterocolitica Zavarzinia Zymophilus raffinosivorans Xenorhabdus koppenhoeferi Yersinia entomophaga Zavarzinia compransoris Yersinia frederiksenii

Xenorhabdus nematophila Yersinia intermedia

Xenorhabdus poinarii Yersinia kristensenii

Xylanibacter Xylanibacter oryzae

228/234

TABELA 2: Síndrome da resposta inflamatória sistêmica Achados Valor Temperatura <36 °C (96,8 °F) ou >38 °C (100,4 °F) Frequência cardíaca >90/min Frequência >20/min ou PaCO2<32 mmHg (4,3 kPa) respiratória <4x109/L (<4000/mm³), >12x109/L (>12.000/mm³), ou

WBC 10% bandas TABELA 3. Sequências de alvos genômicos para seletivamente matar com CRISPR cepas de E. coli .

[1650] O PAM de 3 bp é mostrado em negrito (ou seja, tgg, agg e cgg). Os locais de clivagem de SpCas9-gRNA esperados são indicados por setas verticais (3 bp a montante do PAM). Cepa alvo Gene alvo Sequência genômica alvo E. coli (EHEC) 23S ribosomal ATCC43888 RNA (SEQ ID NO: 1) E. coli Nissle 1917 yapH (SEQ ID NO: 2) E. coli Nissle 1917 pks (SEQ ID NO: 3) TABELA 4. Sequências de alvos genômicos e Cas para seletivamente matar com CRISPR C dificile

(a) Visão geral dos espaçadores de design no pMTL84151-cdCRISPR1 visando C. difficile Gene Nome PAM alvo

CC ACACCTTAACCCAGCCATAGAGTCTGATAATAACTT tcdA TA2 A C (SEQ ID NO: 4)

CC GACTTATTTGAGTCTATAGAGAAACCTAGTTCAGTA tcdB TB2 A A (SEQ ID NO: 5) rRNA TCGACGACTTCTTCCAAAAGGTTAGATAATCGGCTTC TRR1 CCT -1 (SEQ ID NO: 6) rRNA CC GTACAGGATGGACCCGCGTCTGATTAGCTAGTTGGT TRR2 -2 A A (SEQ ID NO: 7)

TAR CC TCCTCATGGAGATACTGCTGTTTATTATGCTATGGTA gyrA 1 A (SEQ ID NO: 8) (b) uma sequência Cas3 (SEQ ID NO: 9) Sequência

TCAAATAAATTGGTCTATTTCATTACTTATAAGCACACCTTTACCAAATATCT GTTTTGTATGCTTATTTTCGTATATATCATATTTATATAAAAGTATTTTTAAAT CTTCAAGACCTTTCACCTGTATGTCAATTACATTTTGTTTAGCTTTATATATTG GTAAATTTACAGTTTTTTTAATTATCTCTCTTCTTGCTTTTTTTCTCTTAGACTT TATTTTATTTATCAATTGTCTATCATCATTACTATATGCATTTATAAGCTCTTG TCCCAACTCTTCATAATCTTTGATTAAAGTTTCTTCAATTTTATTATATATATC CTCTGGAATTACTGTATATCCTTCAATATTTCTAAGTATATTTTGTGCATCTTT AGAACCTAAACTATATGGCGTTATAGTATCTAAAATATTTAAAGCACTGGTA AATCTCTTTTCAAAAGCTGTACCTTCTAGACTTTCTTTAGAGTATAGTATCTTA ACCATTTCTACCTTATATTTTTCTTTCATCTTCACACATTCTTTTCCATTTATAA AAGTTTTCAGTAGCTCAAGTCCTTTTTCTACAATATCCTTATCATAAATACTAC CTATTCCTGTAGCTTTTTCTGTATATATAAATATATTTGGGCTATTTTCTTCAT ACTCACGACTTCTATAACATCTACCAAATCGTTGAAATAGACTGTCAAGTGTT GAATTTTCTGTATGAAGCTCATCAAAATCAATATCAAGGGATGCTTCCACTAA TTGTGTAGTAATCCAAATACCATTACTATCACTATCTGCAAATTCTTTTATATA TTTTTCTAATTTTGCTCTATCTTCTTGTATATACATAGAATGTAAAAGATTTAA GTTGACATCTATTCCTTTTGGCTTAACTATTTCTTCTATTAACTCATATTTTTCT ACAGCACTTTTAACTGTATTTACTATTACAAGAACTTTTTTATTCATTCCACTT TGTATTATTTTACCTAAGTTTTCATCTATTGAATTTTCTACAATAGACACACAA TGTCTTATTTTTTCTGTATTACATGTCAATTCAGCTAAGTTACTATTCATTACA CCTCTTTTTTTTAATTCATCTATATATATGGTTGGCATAGTAGCTGTCATTATC ATAAATCTGCCACCTATCTTATGTATCATTTCTATACCTTTTACCAATACAGCT GCTATTTCTGGTGAATATGCTTGTATCTCATCTATTACTACTTTTGAATATGCT AATGTTGAGTACACTTTTTCATACCCTCTATACAAAAAAGGAAATTTAAATAT TTGGTCTATTGTAGAAAATGTCAGTTTGCAAGATAATAACTTTGCTAAATCTA CAATCTCACTTGAATTTTCTTGATTACTTTCTTCTAGATAATCTATTGCTGTTG AATGTAACAAACCTAAGAATGTATCATTTGATTCTCCAACTCCAACTATATTT TTTGCTCTATCAAATAATGCATTTATACTTACTCTTAATGGAAGTGTAAAAAA TGCCTTGTCTTTATCTATCCAAATTAAGGCAGTTTCTGTTTTTCCCATTCCTGT AGGTGCAATCAGTATTATATTCTTATTTCTATTAGATTTAGCAAATGATTGAG CCTCTCTCAAACTACCAAACTCTTTCATTAAATAATTTTCTGTCTGTTCTCCTA TATTTATAACATTATTGCATTCCACAACTTCATGAGCAGAAGCACTGTGGTCT AATCTATGTAGTATTCCTTTTAACATAATATATAAATTATAGTACTTGTGATTT TTATCTATTCTTTTTTCTACACTTTGTAGATATACTTTACTCAATTTTTCTGTTT TTATTGGATATCTAACTTTAAATTCATGCTGTAGTTCATAAACTTTATTTATTA AATCTTCATCTAATATTTTTTGTATTAAATTTTTAAAATCTTTATCTATAAAGA TATCTCTTTCATGATGATATACAATAACTTGATTTAATACTGCTCTAAGTTCTT TATTTTTTTTCCTGTCTATATAACTATAATCAATAAATGCAGGAGAAAGATAA TTATGGCCTACATTATTTTCTAAATGAGTTACTATTTTAGGTTCATTTATTTTA GTATCCATTCTGCTTTTTATTAACTCTTGAAACGGTGAAAATGCTTTTCCAATA TCATGAAATTCTATAACAAAGTCAAGTAATTGCCAAAATATCTCCTCTTCTAG AAAATCTAAGCTATTTATATTTTTTCCATAACTTTCTCTTAATACATTCATTTG TTTTAAAAGTTCATCAGTATGTTCTCTAAGTGTTTCCACTGGATTAGATTTAGC

ATATAACAT TABELA 4. Sequências de Cas9 usadas para matar seletivamente E coli. SEQ ID NO: 10 (sequência de nucleotídeos da Cas9)

ATGGATAAGAAATACTCAATAGGCTTAGATATCGGCACAAATAGCGTCGGATGG GCGGTGATCACTGATGAATATAAGGTTCCGTCTAAAAAGTTCAAGGTTCTGGGA AATACAGACCGCCACAGTATCAAAAAAAATCTTATAGGGGCTCTTTTATTTGAC AGTGGAGAGACAGCGGAAGCGACTCGTCTCAAACGGACAGCTCGTAGAAGGTA TACACGTCGGAAGAATCGTATTTGTTATCTACAGGAGATTTTTTCAAATGAGATG GCGAAAGTAGATGATAGTTTCTTTCATCGACTTGAAGAGTCTTTTTTGGTGGAAG AAGACAAGAAGCATGAACGTCATCCTATTTTTGGAAATATAGTAGATGAAGTTG CTTATCATGAGAAATATCCAACTATCTATCATCTGCGAAAAAAATTGGTAGATTC TACTGATAAAGCGGATTTGCGCTTAATCTATTTGGCCTTAGCGCATATGATTAAG TTTCGTGGTCATTTTTTGATTGAGGGAGATTTAAATCCTGATAATAGTGATGTGG ACAAACTATTTATCCAGTTGGTACAAACCTACAATCAATTATTTGAAGAAAACC CTATTAACGCAAGTGGAGTAGATGCTAAAGCGATTCTTTCTGCACGATTGAGTA AATCAAGACGATTAGAAAATCTCATTGCTCAGCTCCCCGGTGAGAAGAAAAATG GCTTATTTGGGAATCTCATTGCTTTGTCATTGGGTTTGACCCCTAATTTTAAATCA AATTTTGATTTGGCAGAAGATGCTAAATTACAGCTTTCAAAAGATACTTACGATG ATGATTTAGATAATTTATTGGCGCAAATTGGAGATCAATATGCTGATTTGTTTTT GGCAGCTAAGAATTTATCAGATGCTATTTTACTTTCAGATATCCTAAGAGTAAAT ACTGAAATAACTAAGGCTCCCCTATCAGCTTCAATGATTAAACGCTACGATGAA CATCATCAAGACTTGACTCTTTTAAAAGCTTTAGTTCGACAACAACTTCCAGAAA AGTATAAAGAAATCTTTTTTGATCAATCAAAAAACGGATATGCAGGTTATATTG ATGGGGGAGCTAGCCAAGAAGAATTTTATAAATTTATCAAACCAATTTTAGAAA AAATGGATGGTACTGAGGAATTATTGGTGAAACTAAATCGTGAAGATTTGCTGC GCAAGCAACGGACCTTTGACAACGGCTCTATTCCCCATCAAATTCACTTGGGTG AGCTGCATGCTATTTTGAGAAGACAAGAAGACTTTTATCCATTTTTAAAAGACA ATCGTGAGAAGATTGAAAAAATCTTGACTTTTCGAATTCCTTATTATGTTGGTCC ATTGGCGCGTGGCAATAGTCGTTTTGCATGGATGACTCGGAAGTCTGAAGAAAC AATTACCCCATGGAATTTTGAAGAAGTTGTCGATAAAGGTGCTTCAGCTCAATC ATTTATTGAACGCATGACAAACTTTGATAAAAATCTTCCAAATGAAAAAGTACT ACCAAAACATAGTTTGCTTTATGAGTATTTTACGGTTTATAACGAATTGACAAAG GTCAAATATGTTACTGAAGGAATGCGAAAACCAGCATTTCTTTCAGGTGAACAG AAGAAAGCCATTGTTGATTTACTCTTCAAAACAAATCGAAAAGTAACCGTTAAG CAATTAAAAGAAGATTATTTCAAAAAAATAGAATGTTTTGATAGTGTTGAAATT TCAGGAGTTGAAGATAGATTTAATGCTTCATTAGGTACCTACCATGATTTGCTAA AAATTATTAAAGATAAAGATTTTTTGGATAATGAAGAAAATGAAGATATCTTAG AGGATATTGTTTTAACATTGACCTTATTTGAAGATAGGGAGATGATTGAGGAAA GACTTAAAACATATGCTCACCTCTTTGATGATAAGGTGATGAAACAGCTTAAAC GTCGCCGTTATACTGGTTGGGGACGTTTGTCTCGAAAATTGATTAATGGTATTAG GGATAAGCAATCTGGCAAAACAATATTAGATTTTTTGAAATCAGATGGTTTTGCC AATCGCAATTTTATGCAGCTGATCCATGATGATAGTTTGACATTTAAAGAAGAC ATTCAAAAAGCACAAGTGTCTGGACAAGGCGATAGTTTACATGAACATATTGCA AATTTAGCTGGTAGCCCTGCTATTAAAAAAGGTATTTTACAGACTGTAAAAGTTG TTGATGAATTGGTCAAAGTAATGGGGCGGCATAAGCCAGAAAATATCGTTATTG AAATGGCACGTGAAAATCAGACAACTCAAAAGGGCCAGAAAAATTCGCGAGAG CGTATGAAACGAATCGAAGAAGGTATCAAAGAATTAGGAAGTCAGATTCTTAAA GAGCATCCTGTTGAAAATACTCAATTGCAAAATGAAAAGCTCTATCTCTATTATC TCCAAAATGGAAGAGACATGTATGTGGACCAAGAATTAGATATTAATCGTTTAA GTGATTATGATGTCGATCACATTGTTCCACAAAGTTTCCTTAAAGACGATTCAAT AGACAATAAGGTCTTAACGCGTTCTGATAAAAATCGTGGTAAATCGGATAACGT TCCAAGTGAAGAAGTAGTCAAAAAGATGAAAAACTATTGGAGACAACTTCTAA ACGCCAAGTTAATCACTCAACGTAAGTTTGATAATTTAACGAAAGCTGAACGTG GAGGTTTGAGTGAACTTGATAAAGCTGGTTTTATCAAACGCCAATTGGTTGAAA CTCGCCAAATCACTAAGCATGTGGCACAAATTTTGGATAGTCGCATGAATACTA AATACGATGAAAATGATAAACTTATTCGAGAGGTTAAAGTGATTACCTTAAAAT CTAAATTAGTTTCTGACTTCCGAAAAGATTTCCAATTCTATAAAGTACGTGAGAT TAACAATTACCATCATGCCCATGATGCGTATCTAAATGCCGTCGTTGGAACTGCT TTGATTAAGAAATATCCAAAACTTGAATCGGAGTTTGTCTATGGTGATTATAAAG TTTATGATGTTCGTAAAATGATTGCTAAGTCTGAGCAAGAAATAGGCAAAGCAA CCGCAAAATATTTCTTTTACTCTAATATCATGAACTTCTTCAAAACAGAAATTAC ACTTGCAAATGGAGAGATTCGCAAACGCCCTCTAATCGAAACTAATGGGGAAAC TGGAGAAATTGTCTGGGATAAAGGGCGAGATTTTGCCACAGTGCGCAAAGTATT GTCCATGCCCCAAGTCAATATTGTCAAGAAAACAGAAGTACAGACAGGCGGATT CTCCAAGGAGTCAATTTTACCAAAAAGAAATTCGGACAAGCTTATTGCTCGTAA AAAAGACTGGGATCCAAAAAAATATGGTGGTTTTGATAGTCCAACGGTAGCTTA TTCAGTCCTAGTGGTTGCTAAGGTGGAAAAAGGGAAATCGAAGAAGTTAAAATC CGTTAAAGAGTTACTAGGGATCACAATTATGGAAAGAAGTTCCTTTGAAAAAAA TCCGATTGACTTTTTAGAAGCTAAAGGATATAAGGAAGTTAAAAAAGACTTAAT CATTAAACTACCTAAATATAGTCTTTTTGAGTTAGAAAACGGTCGTAAACGGAT GCTGGCTAGTGCCGGAGAATTACAAAAAGGAAATGAGCTGGCTCTGCCAAGCA AATATGTGAATTTTTTATATTTAGCTAGTCATTATGAAAAGTTGAAGGGTAGTCC AGAAGATAACGAACAAAAACAATTGTTTGTGGAGCAGCATAAGCATTATTTAGA TGAGATTATTGAGCAAATCAGTGAATTTTCTAAGCGTGTTATTTTAGCAGATGCC AATTTAGATAAAGTTCTTAGTGCATATAACAAACATAGAGACAAACCAATACGT GAACAAGCAGAAAATATTATTCATTTATTTACGTTGACGAATCTTGGAGCTCCCG CTGCTTTTAAATATTTTGATACAACAATTGATCGTAAACGATATACGTCTACAAA AGAAGTTTTAGATGCCACTCTTATCCATCAATCCATCACTGGTCTTTATGAAACA

CGCATTGATTTGAGTCAGCTAGGAGGTGACTGA SEQ ID NO: 11 (sequência de aminoácidos da Cas9)

MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGE TAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHE RHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEG DLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLP GEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQY ADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLP EKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRK QRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNS RFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYE YFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKI ECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREM IEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGF ANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVD ELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVE NTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLT RSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDK AGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDF QFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKS EQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATV RKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTV AYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIK LPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNE QKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIH

LFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD Tabela 5: E. coli/K. pneumoniae/P. Bactérias gram-neg. como aeruginosa como patógenos patógenos infecciosos Publicação causadores de bacteremia em causadores em pacientes pacientes oncológicos oncológicos [fração de casos gram-neg.] Samonis et al 65 % 54% [85%] Velasco et al 45 % 33% [74%] Marín et al 55 % 51% [92%] Anatoliotaki et al 47 % 34% [73%]

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Nuclease programável para uso em um método de tratamento de uma infecção microbiana aguda de um indivíduo, caracterizada pelo fato de que a infecção microbiana é causada por micróbios de uma primeira espécie ou cepa e a nuclease é programável para cortar um sítio-alvo composto pelos genomas dos micróbios que infectaram o indivíduo, em que os micróbios da primeira espécie ou cepa são mortos, ou o crescimento ou proliferação dos micróbios é reduzido, o método de tratamento compreendendo a exposição do indivíduo à nuclease em que a nuclease é programada para cortar o local-alvo, em que os genomas dos micróbios compostos pelo indivíduo são cortados e a infecção microbiana aguda do indivíduo é tratada, em que o método compreende reduzir a infecção pelo menos 100 vezes nos primeiros 30 minutos do tratamento.

2. Nuclease programável para uso em um método de tratamento durável de uma infecção microbiana de um indivíduo, caracterizada pelo fato de que a infecção microbiana é causada por micróbios de uma primeira espécie ou cepa e a nuclease é programável para cortar um sítio-alvo composto pelos genomas dos micróbios que infectaram o indivíduo, em que os micróbios da primeira espécie ou cepa são duravelmente mortos, ou o crescimento ou proliferação dos micróbios é reduzido, o método de tratamento compreendendo a exposição do indivíduo à nuclease em que a nuclease é programada para cortar o local-alvo, em que os genomas dos micróbios compreendidos pelo indivíduo são cortados e a infecção microbiana do indivíduo é tratada de forma durável.

3. Nuclease de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a nuclease e/ou um ácido nucleico que programa a nuclease para reconhecer e cortar o local-alvo é administrado ao indivíduo em um primeiro tempo (T1) e um segundo tempo (T2), onde

T2 é pelo menos 1 hora após T1.

4. Nuclease de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizada pelo fato de que o método compreende reduzir a infecção em pelo menos 100 vezes nos primeiros 30 minutos do tratamento.

5. Nuclease, de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que o método compreende manter a redução da infecção em pelo menos 100 vezes por pelo menos 60 minutos após expor o indivíduo à nuclease programada.

6. Nuclease, de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que o método compreende reduzir a infecção de modo que a redução na infecção persiste por 30 minutos imediatamente após os primeiros 30 minutos do tratamento.

7. Nuclease, de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que o método compreende a administração ao indivíduo do RNA ou um ácido nucleico que codifica o RNA para a expressão do RNA no indivíduo, em que o RNA se complexa com a nuclease para programar a nuclease para cortar o local-alvo em micróbios compreendidos pelo indivíduo.

8. Nuclease, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a. a nuclease é administrada simultaneamente ou sequencialmente com o RNA ou o ácido nucleico ao indivíduo; ou b. o indivíduo compreende a nuclease antes da administração do RNA ou do ácido nucleico ao indivíduo.

9. Nuclease, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizada pelo fato de que uma pluralidade de vírus é administrada ao indivíduo, no qual cada vírus compreende uma cópia do ácido nucleico, no qual os vírus infectam os micróbios compreendidos pelo indivíduo para entregar a ele o ácido nucleico.

10. Nuclease, de acordo com a reivindicação 9,

caracterizada pelo fato de que a razão de vírus administrados: micróbios compreendidos pelo indivíduo é de 10 para 150.

11. Nuclease, de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizada pelo fato de que a infecção é uma infecção dos pulmões, abdômen ou trato urinário; ou em que o indivíduo foi submetido à cirurgia, está em um medicamento imunossupressor e está sofrendo de uma doença crônica.

12. Nuclease, de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizada pelo fato de que a nuclease é para uso em um método para tratar uma infecção bacteriana patogênica em um indivíduo causada por bactérias (primeiras bactérias) de uma primeira espécie ou cepa, o método compreendendo matar seletivamente as primeiras bactérias compreendidas pelo indivíduo cortando um local-alvo composto pelos genomas das primeiras bactérias, em que o corte é realizado usando a nuclease programável que é programada para cortar o local-alvo, em que o indivíduo sofre de uma doença ou condição posterior que não a infecção bacteriana patogênica e o método inclui a administração de uma terapia ao indivíduo para tratar ou prevenir a doença ou condição posterior, em que a nuclease trata a infecção e a terapia é eficaz na presença da nuclease programada para tratar ou prevenir a doença ou condição.

13. Nuclease de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que i) o indivíduo é um paciente oncológico e a terapia compreende a administração de um transplante de células estaminais hematopoiéticas, agente quimioterápico, inibidor do ponto de verificação imune, agonista do ponto de verificação imune ou um potenciador de células imunológicas; terapia celular adotiva; radiação ou cirurgia; ou (ii) a terapia é um transplante de tecido, órgão ou de células.

14. Nuclease, de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que o tratamento da infecção trata ou previne no indivíduo uma condição selecionada a partir da vaginose, meningite, pneumonia, infecção do trato urinário, cistite, nefrite, gastroenterite, infecção da pele, impetigo, erisipela, celulite, septicemia ou sepse no indivíduo.

15. Nuclease, de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizada pelo fato de que a infecção é reduzida em pelo menos 90% por 1h ou mais, opcionalmente nos primeiros 30 minutos (opcionalmente nos primeiros 15 minutos) do tratamento.

16. Nuclease, de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizada pelo fato de que o método compreende reduzir a infecção em pelo menos 100 vezes pelos primeiros 30 minutos (opcionalmente pelos primeiros 15 minutos) do tratamento; e em que a redução da infecção em pelo menos 100 vezes é mantida por pelo menos 60 minutos após a exposição do indivíduo à nuclease programada.

17. Nuclease, de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizada pelo fato de que o método trata ou previne a septicemia e/ou sepse no indivíduo, em que o indivíduo tem uma temperatura de < 36 °C ou > 38 °C; uma frequência cardíaca > 90/min, uma frequência respiratória > 20 respirações/min ou PaCO2 < 4,3 kPa; e uma contagem de leucócitos de < 4000/mm³ ou > 12.000/mm³.

18. Nuclease, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que no início do tratamento, o indivíduo tem presença de dois ou mais dos seguintes: temperatura corporal anormal, frequência cardíaca anormal, frequência respiratória anormal, gás sanguíneo anormal e contagem anormal de leucócitos.

19. Nuclease, de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizada pelo fato de que o indivíduo é um ser humano ou animal e os micróbios são bactérias, em que a infecção sanguínea do indivíduo pelas bactérias é reduzida pelo menos 100 ou 1000 vezes nos primeiros 30 minutos do tratamento.

20. Nuclease, de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizada pelo fato de que os micróbios são bactérias.

21. Nuclease, de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizada pelo fato de que a nuclease é uma nuclease Cas, uma meganuclease, uma TALEN (nuclease efetora do tipo ativador de transcrição) ou nuclease do dedo de zinco.

22. Pluralidade de vírus (por exemplo, fagos ou fagemídeos para produzir fago) para uso com a nuclease, como definida em qualquer reivindicação anterior no método de tratamento, caracterizada pelo fato de que cada vírus ou fagos compreende uma cópia de um ácido nucleico como definido em qualquer uma das reivindicações 7 a 9, em que os vírus ou fagos são capazes de infectar micróbios compreendidos pelo indivíduo para entregar-lhe o ácido nucleico.

23. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma pluralidade de ácidos nucleicos para a programação da nuclease, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 21, no método de tratamento, em que cada ácido nucleico é um ácido nucleico como definido em qualquer uma das reivindicações 7 a 9.

24. Sistema CRISPR/Cas caracterizado pelo fato de que compreende uma nuclease, como definida em qualquer reivindicação 1 a 21, para uso no método de tratamento, em que a nuclease é uma nuclease Cas e o sistema compreende um ou mais RNAs guia ou DNA que codifica um ou mais RNAs guia, em que cada RNA guia é capaz de programar a nuclease Cas para cortar um local-alvo composto pelos genomas dos micróbios.

25. RNA guia ou um DNA que codifica um RNA guia caracterizado pelo fato de que é para uso no sistema como definido na reivindicação 24, para uso no método de tratamento de uma infecção microbiana aguda no indivíduo, opcionalmente, septicemia ou sepse, em que o indivíduo é um ser humano ou animal.

26. Vetor do ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que compreende o RNA guia ou DNA, mencionado na reivindicação 24 ou

25.

27. Vetor de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o vetor é um fago, fagemídeo, viriofago, vírus, plasmídeo ou transpóson.

28. Composição antissepse ou antissepticemia para a administração a um ser humano ou animal para o tratamento da sepse ou septicemia, a composição caracterizada pelo fato de que compreende uma pluralidade de vetores, em cada vetor é como definido na reivindicação 26 ou 27.

29. Método de tratamento de uma infecção microbiana aguda de um indivíduo, caracterizado pelo fato de que o método é definido por qualquer reivindicação anterior.

30. Uso de uma nuclease, pluralidade de vírus, fago, fagemídeos, sistema, RNA guia, DNA ou vetor, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de uma composição para a realização de um método de tratamento conforme definido em qualquer uma das reivindicações anteriores.

31. Método de acordo com a reivindicação 29 ou uso de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a nuclease e/ou um ácido nucleico que programa a nuclease para reconhecer e cortar o local-alvo é administrado ao indivíduo ou substrato em um primeiro tempo (T1) e um segundo tempo (T2), onde T2 é pelo menos 1 hora após T1.

32. Método ou uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 31, caracterizado pelo fato de que a infecção é reduzida em pelo menos 100 vezes nos primeiros 30 minutos (opcionalmente, nos primeiros 15 minutos) do tratamento.

33. Método ou uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 32, caracterizado pelo fato de que a redução da infecção é mantida em pelo menos 100 vezes por pelo menos 60 minutos após expor o indivíduo à nuclease programada.

34. Método ou uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 33, caracterizado pelo fato de que a redução da infecção persiste por 30 minutos imediatamente após os primeiros 30 minutos do tratamento.

35. Nuclease, vírus, fago, fagemídeos, sistema, RNA guia, DNA, vetor, composição, método ou uso de qualquer reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que os micróbios são bactérias E coli (opcionalmente E coli EHEC) ou C difficile.

36. Nuclease, vírus, fago, fagemídeos, sistema, RNA guia, DNA, vetor, composição, método ou uso de qualquer reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que os micróbios são bactérias E coli (opcionalmente E coli EHEC) Klebsiella ou Pseudomonas, o indivíduo é um ser humano e a infecção é uma infecção pulmonar.