CZ20012349A3 - Lidské monoklonální protilátky proti CTLA-4 - Google Patents

Description

(57) Anotace:

Plně lidské monoklonální protilátky proti antigenu 4 lidských cytotoxických T lymfocytů (CTLA-4). Nukleotidové sekvence kódující aminokyselinové sekvence lehkých a těžkých řetězců imunoglobulinových molekul, zejména souvislé sekvence lehkého a těžkého řetězce zahrnující úseky určující komplementaritu (CDR), specificky zahrnující úseky od FR1 a/nebo CDR1 až do CDR3 a/nebo úsek FR4. Protilátky mající podobné vazebné vlastnosti a protilátky (nebo jiné antagonisty) mající podobné funkce jako popsané protilátky.

Zvýšení tvorby IL-2 po indukci monoklonálnim protilátkami (MAb) anti-CTLA-4 (30pg/ml)v 72hodinovém testu T lymfoblastu/buněk Ráji a v superantigenovém testu (6 dárců)

12000

10000

CT4.1.1 □ CT11.2.1.4

CM

N O

8000

6000

TBIast/Rajl SEA/PBMC

SEA/ Krev • · .4*

179356/HK • · ,······ ··»····· ·· ·· ·· ···

Pl/ i

Lidské monoklonální protilátky proti CTLA-4

Odkaz na souvisej ící přihlášky

Předkládaná přihláška si nárokuje prioritu z prozatímní přihlášky U.S. č. 60/113 647, podané 23 prosince 1998, jejíž význaky jsou plně zahrnuty formou odkazu.

Oblast techniky

Předmětem monoklonální cytotoxických předkládaného protilátky T lymfocytů vynálezu jsou proti lidskému (CTLA-4). Dále plně lidské antigenu 4 nukleotidové sekvence kódující a aminokyselinové sekvence obsahující těžké a lehké řetězce imunoglobulinových molekul, obzvláště souvislé sekvence těžkého a lehkého řetězce zahrnující oblasti určující komplementaritu (CDR), specificky od FR1 a/nebo CDR1 až do CDR3 a/nebo v FR4. Předmětem vynálezu jsou také protilátky mající podobné vazebné vlastnosti a protilátky (nebo jiní antagonisté) mající podobnou funkci jako protilátky popsané v tomto vynálezu.

Dosavadní stav techniky

Regulace imunitní reakce pacientů by poskytla žádoucí léčbu mnoha lidských nemocí, která by mohla vést ke specifickému účinku, jehož lze zřídka dosáhnout použitím běžných léků. Bylo by možné dosáhnout aktivace i utlumení reakcí imunitního systému. Úlohy T a B lymfocytů byly obsáhle studovány a charakterizovány ve spojitosti s regulací imunitní reakce. Z těchto studií vyplývá, že úloha • ·

T lymfocytů je v mnoha případech obzvláště důležitá při prevenci nemocí a léčbě.

T lymfocyty mají velmi složitý systém kontroly svých interakcí. Pro interakce mezi T lymfocyty jsou používány početné receptory a rozpustné faktory. Tudíž účinek každého konkrétního signálu na imunitní reakci se většinou mění a závisí na konkrétních faktorech, receptorech a protireceptorech, které jsou zapojeny do metabolické dráhy. Metabolické dráhy pro utlumení reakcí jsou stejně důležité jako dráhy vyžadované pro aktivaci. Jeden mechanismus prevence imunitní reakce na v thymu vedoucí k toleranci další mechanismy, jako je cytokinů.

Aktivace T lymfocytů prostřednictvím antigenového (TCR)), ale další signály konkrétní antigen je vyzrávání T lymfocytů. Jsou také známy například sekrece supresivních nevyžaduje pouze stimulaci receptoru (T buněčný receptor prostřednictvím kostimulačních (společně stimulujících) povrchových molekul, jako je například CD2 8. Ligandy pro CD28 jsou proteiny B71 (CD80) a B7-2 (CD86), které jsou exprimovány na buňkách prezentujících antigen jako jsou například dendritické buňky, aktivované B lymfocyty nebo monocyty, které interagují s CD28 nebo CTLA-4 T lymfocytů pro zajištění kostimulačního signálu. Úloha kostimulačních signálů byla studována u experimentální alergické encefalomyelitidy (EAE) autory Perrinem et al. (Immunol. Res. , 14, 189-99, 1995). EAE je autoimunitní porucha indukovaná buňkami Thl namířenými proti myelinovým antigenům, která poskytuje in vivo model pro studium úlohy B7 zprostředkované kostimulace v indukci patologické imunitní reakce. Použitím rozpustného fúzního proteinového ligandu pro receptory B7, jakož i monoklonálních protilátek specifických bud' pro CD8 0 nebo CD86, Perrin et al. prokázali, že B7 kostimulace má významnou úlohu pro určení klinického výsledku nemoci u EAE.

Interakce mezi B7 a CD28 je jedna z několika kostimulačních signálních drah, která se jeví postačující pro spuštění maturace a proliferace antigen-specifických T lymfocytů. Nedostatečná kostimulace a doprovodná nedostatečnost produkce IL-2 zabraňují následné proliferaci T lymfocytů a indukují stav nereaktivity nazývaný „anergie. Aktivaci a proliferaci T lymfocytů může blokovat celá řada virů a nádorů, což vede k nepostačující aktivitě nebo nereaktivitě hostitelského imunitního systému k infikovaným nebo transformovaným buňkám. Z celé řady možných poruch T lymfocytů může být anergie alespoň částečně zodpovědná za selhání hostitele zbavit se patogenů nebo nádorových buněk.

Použití proteinu B7 ke zprostředkování protinádorové imunity bylo popsáno v práci Chen et al. (Cell, 71, 10931102, 1992) a Townsend a Allison (Science, 259, 368, 1993). Schwartz (Cell, 71, 1065, 1992) podává přehled úlohy CD28, CTLA-4, a B7 v produkci IL-2 a imunoterapii. Harding et al. (Nátuře, 356, 607-609, 1994) dokazuje, že signály zprostředkované CD28 kostimulují myší T lymfocyty a zabraňují indukci anergie u klonů T lymfocytů. (viz také patenty Spojených Států č. 5 434 131, 5 770 197, a 5 773 253, a mezinárodní patentové přihlášky č. WO 93/00431, WO 95/01994, WO 95/03408, WO 95/24217, a WO 95/33770) .

Z výše uvedeného je jasné, že T lymfocyty vyžadují dva typy signálů od buněk prezentujících antigen (APC) pro aktivaci a následnou diferenciaci efektorové funkce. Zaprvé je zde antigen-specifický signál vznikající pro interakcích mezi TCR na T lymfocytech a molekulách MHC prezentujících peptidy na APC. Zadruhé zde je signál na antigenu nezávislý, který je zprostředkováván interakcí CD28 se členy rodiny B7 (B7-1 (CD80) nebo B7-2 (CDB6) ) . Zpočátku bylo nejasné, kam přesně do prostředí imunitní reaktivity CTLA-4 patří. Myší CTLA-4 byl poprvé identifikován a klonován autory Brunet et al. (Nátuře, 328, 267-270, 1987) jako součást hledání molekul, které jsou přednostně exprimovány na cytotoxických T lymfocytech. Lidský CTLA-4 byl identifikován a klonován krátce nato autory Dariavach et al. (Eur. J. Immunol. , 18,

1901-1905, 1988) . Molekuly CTLA-4 myšího a lidského původu mají přibližně celkem ze 76 % homologní sekvence a blíží se k úplné identitě sekvencí svých cyto plazmatických domén (Dariavach et al., Eur. J. Immunol., 18, 1901-1905, 1988).

CTLA-4 je člen imunoglobulinové (Ig) velké rodiny (superfamily) proteinů.

Rodina Ig je skupina proteinů, které sdílejí klíčové strukturní charakteristické vlastnosti buď variabilních (V) nebo konstantních (C) domén Ig molekul. Členové Ig rodiny, bez omezení, zahrnují samotné imunoglobuliny, molekuly hlavního histokompatibilního komplexu (MHC) (tj. MHC třídy I a II) a molekuly TCR.

V roce 1991, Linsley et al. (J. Exp. Med., 174, 561-569, 1991) navrhovali, že CTLA-4 je druhý receptor pro B7. Podobně Harper et al. (J. Immunol., 147, 1037-44, 1991) prokázali, že molekuly CTLA-4 a CD28 jsou blízce příbuzné u myši a člověka, co se týče sekvence, exprese RNA, genové struktury a lokalizace chromozomů. (Viz také Balzano et al. , Int. J. Cancer Suppl. , 7, 28-32, 1992) . Další důkaz pro tuto úlohu byl získán funkčními studiemi. Například Lenschow et al. (Science, 257, 789-792, 1992) prokázal, že CTLA-4-Ig indukoval dlouhodobé přežívání štěpů pankreatických ostrůvků.

Freeman et al. (Science, 262, 907-909, 1993) zkoumal úlohu CTLA-4 u myší s deficitem B7. Zkoumání ligandů pro CTLA-4 je popsáno v práci Lenschow et al. (P.N.A.S., 90, 11054-11058, 1993). Linsley et al. (Science, 257, 792-795, 1992) popisuje imunosupresi in vivo prostřednictvím rozpustné formy CTLA-4.

Linsley et al. (J. Exp. Med. 176, 1595-604, 1992) připravili protilátky, které váží CTLA-4 a které nereagují zkříženě s CD28 a uzavřeli, že CTLA-4 je exprimován společně (koexprimován) s CD28 na aktivovaných T lymfocytech a kooperativně reguluje adhezi T lymfocytů a aktivaci prostřednictvím B7. Kuchroo et al. (Cell, 80, 707-18, 1995) prokázali, že kostimulační molekuly B7-1 a B7-2 odlišně aktivovaly vývojové metabolické dráhy Thl/Th2. Yiqun et al. (Int. Immunol. 8, 37-44, 1996) prokázali, že existují odlišné požadavky na kostimulační signály od členů rodiny B7 pomocí klidových versus nově aktivovaných pamětových T lymfocytů vůči rozpustným upomínacím antigenům. (Viz také de Boer et al., Eur. J. Immunol., 23, 3120-5, 1993).

Několik skupin vědců navrhovalo alternativní nebo rozdílné interakce receptor/ligand pro CTLA-4 ve srovnání s CD28 a dokonce přemýšleli o třetím B-7 komplexu, který byl rozpoznáván prostřednictvím protilátky BB1. (Viz například Hathcock et al. , Science, 262, 905-7, 1993, Freeman et al. , Science, 262, 907-9, 1993, Freeman et al., J. Exp. Med., 178, 2185-92, 1993, Lenschow et al. , Proč. Nati. Acad. Sci.

U.S.A., 90, 11054-8, 1993, Razi-Wolf et al. , Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 90, 11182-6, 1993 a Boussiotis et al. , Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 90, 11059-63, 1993). Ale Freeman et al. (J. Immunol., 161, 2708-15, 1998) diskutovali zjištění, že protilátka BB1 váže molekulu, která je totožná s buněčnou povrchovou formou CD74, a tudíž BB1 mAB váže protein odlišný než je B7-1, a tento epitop se také vyskytuje na proteinu B7-1. Toto zjištění tedy vyžadovalo prostor pro opětné uvážení studií s použitím BB1 mAB v analýze exprese a funkce CD80.

Počínaje rokem 1993 s kulminací v roce 1995 začali vědci dále zpřesňovat úlohu CTLA-4 ve stimulaci T lymfocytů. Nejdříve s použitím monoklonálních protilátek proti CTLA-4 Walunas et al. (Immunity, 1, 405-13, 1994) poskytli důkaz, že CTLA-4 může působit jako negativní regulátor aktivace T lymfocytů. Potom Waterhouse et al. (Science, 270, 985-988,

1995) prokázali, že myši s deficitem CTLA-4 akumulovaly T lymfoblasty s aktivovanými aktivačními markéry ve svých lymfatických uzlinách a slezině. Blasty také infiltrovaly játra, srdce, plíce a pankreatickou tkáň, imunoglobulinů bylo zvýšeno byly ale a spontánně, když buněčného receptoru, indukované obsazením

Fas a zářením gama.

byly (zesítěním, Waterhouse a T lymfocyty stimulovány senzitivní a množství sérových proliterovaly silně prostřednictvím T k buněčné smrti cross-linking) receptoru et al. uzavřeli, že CTLA-4 působí jako negativní regulátor aktivace T lymfocytů a je životně důležitý pro kontrolu homeostázy lymfocytů.

V komentáři ve stejném vydání Allison a Krummel Science, 270, 932-933, 1995) diskutovali práci Waterhouse et al. jako průkaznou, že CTLA-4 působí tak, že tlumí reaktivitu T lymfocytů nebo má inhibiční signální úlohu v aktivaci a vývoji T lymfocytů. Tivol et al. (Immunity, 3, 541-7, 1995) také vytvořili myši s deficitem CTLA-4 a prokázali, že se u těchto myší rychle vyvíjejí lymfoproliferativní choroby s multiorgánovou lymfocytární infiltrací a tkáňovou destrukcí, s obzvláště závažnou myokarditidou a pankreatitidou. Uzavřeli, že CTLA-4 má klíčovou úlohu v tlumení aktivace T lymfocytů a udržování imunologické homeostázy. Krummel a Allison (J. Exp. Med., 182, 459-65, 1995) dále objasnili, že CD28 a CTLA-4 mají opačné účinky na reakci T lymfocytů na stimulaci. Vytvořili protilátku proti CTLA-4 a zkoumali účinky její vazby na CTLA-4 v systému používajícímu vysoce purifikované T lymfocyty. Ve svém článku ukázali, že přítomnost nízkých hladin B7-2 na čerstvě explantované T lymfocyty může částečně inhibovat proliferaci T lymfocytů a tato inhibice byla zprostředkována interakcemi s CTLA-4. Zkřížená vazba CTLA-4 spolu s TCR a CD28 silně inhibuje proliferaci a sekreci IL-2 T lymfocyty. Konečně výsledky ukázaly, že CD28 a CTLA-4 předávají opačné signály, které se zdají být sjednoceny T lymfocyty při určování reakce na antigen. Autoři tudíž receptoru T lymfocytů kostimulačními signály, uzavřeli, antigenem jakož i že výsledek stimulace je regulován CD28 inhibičními signály ·

« · · · · · · • * ····· · · pocházejícími od CTLA-4. (Viz také Krummel et al. , Int. Immunol., 8, 519-23, 1996, a patent Spojených Států č.

811 097 a mezinárodní patentová přihláška WO 97/20574.)

Byla prováděna celá řada dalších pokusů pro další objasnění výše uvedené funkce CTLA-4. Například Walunas et al. (J. Exp. Med., 183, 2541-50, 1996) prostřednictvím použití protilátek anti-CTLA-4 navrhovali, že signální dráha CTLA-4 nereguluje přežívání buněk nebo reaktivitu na IL-2, ale inhibuje produkci IL-2 závislou na CD28. Také Perrin et al. (J. Immunol., 157, 1333-6, 1996) prokázali, že protilátky anti-CTLA-4 použité u experimentální alergické encefalomyelitidy (EAE) exacerbovaly nemoc a zvýšily úmrtnost. Exacerbace nemoci byla spojena se zvýšenou produkcí encefalitogenních cytokinů TNF-alfa, IFN-gama a IL-2. Tito autoři tedy uzavřeli, že CTLA-4 reguluje intenzitu autoimunitní reakce u EAE, oslabuje produkci zánětlivých cytokinů a klinickou manifestaci nemoci. (Viz také Hurwitz et al . , J. Neuroimmunol. , 73, 57-62, 1997 a Cepero et al. , J.

Exp. Med., 188, 199-204, 1998) (anti-CTLA-4 vlásenkový ribozym, který specificky ruší expresi CTLA-4 po přenosu genu do myšího modelu T lymfocytů).

Kromě toho Blair et al. (J. Immunol., 160, 12-5, 1998) vyhodnotili působení panelu CTLA-4 monoklonálních protilátek (mAb) na klidové lidské CD4+ T lymfocyty. Jejich výsledky prokázaly, že některé CTLA-4 mAb inhibovaly proliferaci klidových buněk CD4+ a přechodné stádium buněčného cyklu od G0 do G1. Inhibiční vliv CTLA-4 byl zjevný během 4 hodin, v době, kdy exprese buněčného povrchového CTLA-4 nebyla detekovatelná. Ale další CTLA-4 mAb neměly zjistitelný inhibiční účinek, což indikovalo, že vazba mAb na samotný CTLA-4 nebyla postačující pro zprostředkování útlumu reakcí T lymfocytů. Je zajímavé, že zatímco produkce IL-2 byla zastavena, inhibiční anti-CTLA-4 mAb umožnily indukci a expresi genu přežívání buněk bcl-X(L). Ve shodě s tímto pozorováním zůstávaly buňky životaschopné a po ligaci CTLA-4 nebyla zjišťována apoptóza.

Ve spojitosti s anergií Perez et al. (Immunity, 6, 4117, 1997) prokázali, že indukci anergie T lymfocytů bylo zabráněno blokádou CTLA-4 a uzavřeli, že výsledek rozpoznávání antigenu T lymfocyty je určován interakcí CD28 nebo CTLA-4 na T lymfocytech s molekulami B7. Také Van Parijs et al. (J. Exp. Med., 186, 1119-28, 1997) zkoumali úlohu interleukinu 12 a kostimulátorů u anergie T lymfocytů in vivo a nalezli, že prostřednictvím inhibice zapojení CTLA-4 v průběhu indukce anergie byla blokována proliferace T lymfocytů a nebyla podněcována plná diferenciace Thl. Ale T lymfocyty vystavené antigenu vyvolávajícímu toleranci v přítomnosti jak IL-12, tak protilátky anti-CTLA-4 nebyly anergizoávny a chovaly se identicky jako T lymfocyty, které potkaly imunogenní antigen. Tyto výsledky svědčí pro to, že k indukci anergie in vivo přispívají dva procesy: zapojení CTLA-4, které vede k blokádě schopnosti T lymfocytů proliferovat, a absence prototypového zánětlivého cytokinu, IL-12, který zabraňuje diferenciaci T lymfocytů na Thl efektorové buňky. Kombinace IL-12 a anti-CTLA-4 protilátky byla postačující ke konverzi normálně tolerovaného stimulu na imunogenní podnět.

Ve spojitosti s infekcemi prokázali McCoy et al. (J. Exp. Med., 186, 183-7, 1997), že anti-CTLA-4 protilátky značně zesílily a urychlily imunitní reakci T lymfocytů na Nippostrongylus brasiliensis, což mělo za následek vydatnou redukci počtu dospělých červů a časné ukončení produkce vajíček parazitem. (Viz také Murphy et al., J. Immunol., 161, 4153-4160, 1998)(Leishmania donovani).

Ve spojitosti s rakovinou zavedli Kwon et al. (PNAS USA, 94, 8099-103, 1997) syngenní myší model karcinomu prostaty a zkoumali dvě odlišné manipulace, o kterých se předpokládalo, že vyvolají reakci proti karcinomu prostaty prostřednictvím * <1 zvýšené kostimulaace T lymfocytů: i) zabezpečení přímé kostimulace prostatickými rakovinnými buňkami transdukovanými tak, že exprimovaly ligand B7-1 a ii) in vivo blokáda CTLA-4 T lymfocytů zprostředkovaná protilátkou, což zabraňovalo útlumu T lymfocytů. Bylo prokázáno, že in vivo blokáda CTLA-4 zprostředkovaná protilátkou zvýšila imunitní reakci proti karcinomu prostaty. Také Yang et al. (Cancer Res., 57, 403641, 1997) studovali, zda blokáda funkce CTLA-4 vede k zesílení protinádorové odpovědi T lymfocytů v různých stádiích nádorového růstu. Na základě in vitro a in vivo výsledků zjistili, že blokáda CTLA-4 u jedinců s nádorem zvýšila kapacitu vytvářet protinádorovou odpověď T lymfocytů, ale exprese tohoto zesilujícího účinku v jejich modelu byla omezena na časná stádia růstu nádoru. Dále Hurwitz et al. (Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 95, 10067-71, 1998) zjistili, že vyvolání protinádorové reakce zprostředkované T lymfocyty závisí na zapojení receptoru T lymfocytů hlavním histokompatibilním komplexem/antigenem, jakož i ligace CD28 prostřednictvím B7. Určité nádory, jako například karcinom prsu SMI, byly refrakterní na imunoterapii anti-CTLA-4. A tak díky použití kombinace blokády CTLA-4 a vakcíny obsahující faktor stimulující granulocytové a makrofágové kolonie exprimovaný buňkami SMI byla pozorována regrese parentálních SMI nádorů, navzdory neúčinnosti každé jednotlivé léčby použité samotné. Tato kombinační léčba měla za následek dlouhotrvající imunitu na SMI a závisela jak na CD4(+), tak na CD8(+) T lymfocytech. Zjištění svědčí pro to, že blokáda CTLA-4 působí na úrovni buňky prezentující antigen pocházející z hostitele.

Ve spojitosti s diabetem Luhder et al. (J. Exp. Med., 187, 427-32, 1998) injikovali anti-CTLA-4 mAb do TCR transgenního myšího modelu diabetů v různých stádiích nemoci. Nalezli, že zapojení CTLA-4 v době, kdy jsou poprvé aktivovány potenciálně diabetogenní T lymfocyty, je klíčový ···· · · · jev, je-li zapojení tolerováno, nastává invaze ostrůvků, ale zůstává po celé měsíce zcela neškodná. Jestliže zapoení tolerováno není, inzulitida je mnohem agresivnější a rychle vzniká diabetes.

Ve spojitosti s imunizací prostřednictvím vakcíny zjistili Horspool et al. (J. Immunol., 160, 2706-14, 1998), že intaktní anti-CTLA-4 mAb, ale ne fragmenty Fab, tlumili primární humorální odpověď na pCIA/beta gal bez ovlivnění upomínací reakce, což naznačuje, že aktivace CTLA-4 inhibovala produkci 2\b, ale ne instruování (priming) T lymfocytů. Blokáda ligandů pro CD2B a CTLA-4, CD80 (B7-1) a CD86 (B7-2), odhalila rozdílnou a nepřekrývající se funkci. Blokáda CD80 při iniciální imunizaci kompletně zrušila primární a sekundární Ab reakci, zatímco blokáda CD86 tlumila odpověď primární, ale ne sekundární. Současná blokáda CD80 + CD86 byla méně účinná v tlumení Ab reakcí, než blokáda každého z nich samotného. Zesílení kostimulace prostřednictvím společné injekce plazmidů exprimujících B7 zvýšilo CTL reakce, ale ne Ab odpovědi, a bez průkazu asymetrie Thl k Th2. Tato zjištění svědčí pro složité a rozdílné úlohy CD28, CTLA-4, CD80 a CD86 při kostimulaci T lymfocytů po vakcinaci nukleovou kyselinou.

Ve spojitosti s rejekcí štěpu zjistili Markees et al. (J. Clin. Invest., 101, 2446-55, 1998) v myším modelu rejekce kožního aloštěpu, že přijetí zpočátku záviselo na přítomnosti IFN-gama, CTLA-4, a CD4(+) T lymfocytů. Přidání anti-CTLA-4 neb anti-IFN-gama mAb do laboratorního protokolu bylo spojeno s okamžitou rejekcí štěpu, zatímco anti-IL-4 mAb neměla žádný účinek.

Ve spojitosti s úlohou CTLA-4 ve vztahu k CD28, Fallarino et al. (J. Exp. Med., 188, 205-10, 1998) vytvořili transgenní myši TCR/s deficitem genu 2 aktivujícího rekombinázu/ s CD28 divokým typem nebo s deficitem CD28, které byly imunizovány nádorem exprimujícím antigen.

• <

Instruované T lymfocyty od obou typů myší produkovaly cytokiny a proliferovaly při reakci na stimulující buňky bez exprese B7. Avšak zatímco odpověď CD28 + /+ T lymfocytů zesílena kostimulací s B7-1, odpověď CD28-/- T lymfocytů byla silně inhibována. Tato inhibice byla zrušena monoklonální protilátkou proti B7-1 nebo CTLA-4. Tedy CTLA-4 mohou účinně inhibovat aktivaci T lymfocytů v nepřítomnosti CD28, což indikuje, že antagonismus signálu zprostředkovaného TCR je postačujcíí pro vysvětlení inhibičního účinku CTLA-4. Také Lin et al. (J. Exp. Med., 188, 199-204, 1998) studovali rejekci srdečních aloštěpů u myší s deficitem CD28. H-2(q) srdce byla transplantována do myší s alogenním divokým typem nebo s deficitem CD28 (H-2(b)). Rejekce štěpu byla oddálena u myší s deficitem CD28 ve srovnání s myšmi s divokým typem. Ošetření příjemců s divokým typem s CTLA-4 imunoglobulínem (Ig) nebo s anti-B7-l plus anti-B7-2 mAb významně prodloužilo přežívání aloštěpů. Na rozdíl od toho, ošetření myší s deficitem CD28 s CTLA-4-Ig, anti-B7-l plus anti-B7-2 mAb, nebo blokující anti-CTLA-4 mAb indukovalo akceleraci rejekce aloštěpů. Tato zvýšená rychlost rejekce štěpu byla spojena se závažnější infiltrací mononukleárními buňkami a zvýšenými hladinami transkriptů IFN-gama a IL-6 v dárcovských srdcích neošetřeného divokého typu a myší s deficitem CD28 ošetřených CTLA-4-Ig- nebo anti-CTLA-4 mAb. Tudíž negativní regulační úloha CTLA-4 se šíří za jeho potenciální schopnost zabránit aktivaci CD28 prostřednictvím kompetice o ligand. Dokonce i v nepřítomnosti CD28 má CTLA-4 inhibiční účinek v regulaci rejekce aloštěpů.

Byla také studována další charakterizace exprese CTLA-4. Například Alegre et al. (J. Immunol., 157, 4762-70, 1996) navrhli, že povrchový CTLA-4 je rychle internalizován, což může vysvětlit nízké hladiny exprese obecně zjišťované na povrchu buněk. Uzavřeli, že jak CD28 tak IL-2 mají důležité úlohy v aktivaci exprese CTLA-4. Kromě toho se zdá, že

akumulace CTLA-4 na buněčném povrchu je primárně regulována jeho rychlou endocytózou. Také Castan et al. (Immunology, 90, 265-71, 1997) na základě in šitu imunohistologických analýz exprese CTLA-4 naznačili, že germinální centra T lymfocytů, která byla CTLA-4 pozitivní, mohou být důležitá pro imunitní regulaci.

Podle toho ve světle široké a ústřední úlohy, kterou jak se ukazuje, CTLA-4 má v imunní reaktivitě, by bylo žádoucí vytvořit protilátky k CTLA-4, které mohou být účinně používány v imunoterapii. Navíc by bylo žádoucí vytvořit protilátky proti CTLA-4, které mohou být používány u chronických nemocí, u kterých je vyžadováno opakované podávání protilátek.

Popis obrázků

Obrázek 1 popisuje řadu nukleotidových a aminokyselinových sekvencí těžkého řetěze a lehkého řetězce kapa (k) imunoglobulinovych molekul podle vynálezu: 4.1.1 (obrázek 1A), 4.8.1 (obrázek 1B), 4.14.3 (obrázek 1C), 6.1.1 (obrázek ID), 3.1.1 (obrázek 1E), 4.10.2 (obrázek 1F), 2.1.3 (obrázek 1G) , 4.13.1 (obrázek 1H) , 11.2.1 (obrázek II),

11.6.1 (obrázek 1J) , 11.7.1 (obrázek 1K) , 12.3.1.1 (obrázek

1L) a 12.9.1.1 (obrázek 1M).

Obrázek 2 poskytuje srovnání sekvencí mezi predikovanými aminokyselinovými sekvencemi těžkého řetězce z klonů 4.1.1,

4.8.1, 4.14.3, 6.1.1, 3.1.1, 4.10.2, 4.13.1, 11.2.1, 11.6.1,

11.7.1, 12.3.1.1, and 12.9.1.1 a aminokyselinová sekvence zárodečné linie DP-50 (3-33). Rozdíly v aminokyselinové sekvenci zárodečné linie DP-50 a sekvencí v klonu jsou znázorněny tučně. Obrázek také ukazuje pozici sekvencí CDR1, CDR2 a CDR3, které jsou vystínovány.

Obrázek 3 ukazuje přiřazení sekvencí predikované aminokyselinové sekvence těžkého řetězce klonu 2.1.3 a zárodečné linie DP-65 (4-31). Rozdíly v aminokyselinové sekvenci zárodečné linie DP-65 a sekvencí v klonu jsou znázorněny tučně. Obrázek také ukazuje pozici sekvencí CDR1, CDR2 a CDR3, které jsou podtrženy.

Obrázek 4 ukazuje přiřazení predikované aminokyselinové sekvence lehkého řetězce kapa klonů 4.1.1, 4.8.1, 4.14.3,

6.1.1, 4.10.2 a 4.13.1 a zárodečné linie A27 aminokyselinové sekvence. Rozdíly v aminokyselinové sekvenci zárodečné linie A27 a sekvencí v klonu jsou znázorněny tučně. Obrázek také ukazuje pozici sekvencí CDR1, CDR2 a CDR3 protilátky, které jsou podtrženy. Zjevné delece v úseku CDR1 klonů 4.8.1, 4.14.3 a 6.1.1 jsou označeny symboly 0.

Obrázek 5 ukazuje přiřazení predikované aminokyselinové sekvence lehkého řetězce kapa klonů 3.1.1, 11.2.1, 11.6.1, a 11.7.1 a zárodečné linie 012. Rozdíly v aminokyselinové sekvenci zárodečné linie 012 a sekvencí v klonu jsou znázorněny tučně. Obrázek také ukazuje pozici sekvencí CDR1, CDR2 a CDR3 protilátky, které jsou podtrženy.

Obrázek 6 ukazuje přiřazení predikované aminokyselinové sekvence lehkého řetězce kapa klonu 2.1.3 a sekvencí zárodečné linie A10/A26. Rozdíly v aminokyselinové sekvenci zárodečné linie A10/A26 a sekvencí klonu jsou znázorněny tučně. Obrázek také ukazuje pozici sekvencí CDR1, CDR2 a CDR3 protilátky, které jsou podtrženy.

Obrázek 7 ukazuje přiřazení predikované aminokyselinové sekvence lehkého řetězce kapa klonu 12.3.1 a sekvencí zárodečné linie A17. Rozdíly v aminokyselinové sekvenci zárodečné linie A17 a sekvencí klonu jsou znázorněny tučně.

Obrázek také ukazuje pozici sekvencí CDR1, CDR2 a CDR3 protilátky, které jsou podtrženy.

Obrázek 8 ukazuje přiřazení predikované aminokyselinové sekvence lehkého řetězce kapa klonu 12.9.1 a zárodečné linie A3/A19. Rozdíly v aminokyselinové sekvenci zárodečné linie A3/A19 a sekvencí klonu jsou znázorněny tučně. Obrázek také ukazuje pozici sekvencí CDR1, CDR2 a CDR3 protilátky, které jsou podtrženy.

Obrázek 9 ukazuje souhrn N-koncové aminokyselinové sekvence získaný přímým proteinovým sekvencováním těžkého a lehkého řetězce protilátek.

Obrázek 10 uvádí některé další charakteristiky některých protilátek podle vynálezu. Na obr. 10A jsou shrnuta data týkající se klonů 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.14.3 a 6.1.1 Data týkající se koncentrace, isoelektrického fokusingu (IEF), SDS-PAGE, vylučovací chromatografie, kapalinové chromatografie/hmotové spektroskopie (LCMS), hmotové spektroskopie (MALDI), N-koncové sekvence lehkého řetězce jso uvedena. Další detailní údaje týkající se IEF jsou na obr. 10B, data týkající se SDS-PAGE na obr. 10C a SEC protilátky klonu 4.1.1. na obr. 10D.

Obrázek 11 ukazuje expresi B7-1 a B7-2 na buňkách Ráji užitím monoklonálních protilátek (mAb) anti-CD8O-PE and anti-CD86PE.

Obrázek 12 ukazuje na koncentraci závislé zvýšení produkce IL-2 v testu T lymfoblastů/Raji indukované blokujícími protilátkami anti-CTLA-4 (BNI3, 4.1.1, 4.8.1 a 6.1.1).

• · · · · · · · · ······· · · · · ·· ·a ·

Obrázek 13 ukazuje na koncentraci závislé zvýšení produkce IFN-γ v testu T lymfoblastú/Raji indukované blokujícími protilátkami anti-CTLA-4 (BNI3, 4.1.1., 4.8.1 a 6.1.1)(shodné donorové T-buňky).

Obrázek 14 ukazuje průměrné zvýšení produkce IL-2 T-buňkami ze 6 donorů indukovaných blokujícími monoklonálními protilátkami anti-CTLA-4 testu T-buňky blast/Raji.

Obr. 15 ukazuje průměrné zvýšení produkce IFN-γ T-buňkami ze 6 donorů indukovaných blokujícími monoklonálními protilátkami anti-CTLA-4 testu T-buňky blast/Raji.

Obr. 16 ukazuje průměrné zvýšení produkce IL-2 v hPBMC z 5 donorů indukovaných blokujícími monoklonálními protilátkami anti-CTLA-4 testu T-buňky blast/Raji, měřeno 72 hodin po stimulaci SEA.

Obrázek 17 ukazuje průměrné zvýšení produkce IL-2 v celé krvi ze 3 donorů indukovaných blokujícími monoklonálními protilátkami anti-CTLA-4 testu T-buňky blast/Raji, měřeno 72 a 96 hodin po stimulaci SEA.

Obrázek 18 ukazuje inhibici růstu tumorů s protilátkou antimyší CTLA-4 na modelu myšího fibrosarkomu.

Obrázek 19 ukazuje zvýšení podukce IL-2 indukované protilátkami anti-CTLA4 (4.1.1 a 11.2.1) podle vynálezu v testu T blast/Raji a Superantigen po 72 hodinách (mononukleární buňky z celé krve a periferní krve ze 6 dárců).

Obrázek 20 ukazuje na dávce závislé zvýšení podukce IL-2 indukované protilátkami anti-CTLA4 (4.1.1 a 11.2.1) podle vynálezu v testu T blast/Raji a Superantigen po 72 hodinách.

Obrázek 21 ukazuje na dávce závislé zvýšení podukce IL-2 indukované protilátkami anti-CTLA4 (4.1.1 a 11.2.1) podle vynálezu v testu a Superantigenu po 72 hodinách, kde celá krev byla stimulovaná 100 ng/ml superantigenu.

Obr. 22 ukazuje sérii dalších nukleotidových a aminokyselinových sekvencí následujících řetězců protilátek anti-CTLA-4: těžký řetězec 4.1.1 plné délky (cDNA 22 (a) , genomická sekvence 22(b), a aminokyselinová sekvence 22 (c)), aglykosylovaný těžký řetězec plné 4.1.1 (cDNA 22(d) a aminokyselinová sekvence 22 (e)), lehký řetězec 4.1.1 (cDNA 22(f) a aminokyselinová sekvence 22(g) ) , těžký řetězec 4.8.1 plné délky (cDNA 22(h) a aminokyselinová sekvence 22 (i)) , lehký řetězec 4.8.1 (cDNA 22 (j) a aminokyselinová sekvence 22(k)), těžký řetězec 6.1.1 plné délky (cDNA 22(1) a aminokyselinová sekvence 22(m)), lehký řetězec 6.1.1 (cDNA (n) a aminokyselinová sekvence22(o)) , těžký řetězec 11.2.1 plné délky (cDNA 22(p) a aminokyselinová sekvence 22(q)), a lehký řetězec 11.2.1 (cDNA 22 (r) a aminokyselinová sekvence (s)) .

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález v prvním aspektu poskytuje protilátku schopnou vázat CTLA-4, která obsahuje aminokyselinovou sekvenci variabilního úseku těžkého řetězce obsahující souvislou sekvenci aminokyselin od sekvence FR1 do sekvence FR3, který je kódován genem lidské rodiny V_H3-33, a obsahuje alespoň jednu z aminokyselinových substitucí v sekvenci CDR1, CDR2 nebo sekvenci kostry, jak je ukázáno na obr. 2. Ve výhodném provedení vynálezu aminokyselinová

sekvence	obsahuje sekvenci	vybranou	ze	skupiny	obsahuj ící
SEKVENCI	ID.	Č.	1, SEKVENCI	ID.	Č.	2,	SEKVENCI	ID	. Č.	3;
SEKVENCI	ID.	Č.	4, SEKVENCI	ID.	Č.	5,	SEKVENCI	ID	. Č.	6,
SEKVENCI	ID.	č.	8, SEKVENCI	ID.	XZ c.	9,	SEKVENCI	ID.	Č.	10,
SEKVENCI	ID.	č.	11, SEKVENCI	ID.	č.	12,	SEKVENCI	ID	. Č.	13,
SEKVENCI	ID.	XZ c.	63, SEKVENCI	ID.	č.	64,	SEKVENCI	ID	. Č.	6 6,
SEKVENCI	ID.	xz c.	68 a SEKVENCI ID	. č	. 70. V jiném	výhodném

provedení protilátka dále obsahuje sekvenci variabilního úseku lehkého řetězce, která obsahuje sekvenci vybranou ze

skupiny	obsahující SEKVENCI	ID.	xz c.	14,	SEKVENCI	ID.	Č.	15,
SEKVENCI	ID.	Č.	16, SEKVENCI	ID.	. č.	. 17,	SEKVENCI	ID.	Č.	18,
SEKVENCI	ID.	Č.	19, SEKVENCI	ID.	. č.	. 20,	SEKVENCI	ID.	xz c.	21,
SEKVENCI	ID.	Č.	22, SEKVENCI	ID.	. č,	. 23,	SEKVENCI	ID.	xz c.	24,
SEKVENCI	ID.	Č.	25, SEKVENCI	ID.	xz . c	. 26,	SEKVENCI	ID.	č.	65,
SEKVENCI	ID.	Č.	67, SEKVENCI	ID.	č.	69, a	SEKVENCI	ID.	č.	71.
Předkládaný	vynález ve	druhém	aspektu	poskytuje

protilátku, která obsahuje aminokyselinovou sekvenci těžkého řetězce obsahující SEKVENCI ID. Č. 1 a aminokyselinovou sekvenci variabilního úseku lehkého řetězce obsahující SEKVENCI ID. Č. 14.

Třetí aspekt předkládaného vynálezu poskytuje protilátku, která obsahuje aminokyselinovou sekvenci těžkého řetězce obsahující SEKVENCI ID. Č. 2 a variabilní aminokyselinovou sekvenci lehkého řetězce obsahující SEKVENCI ID. Č. 15.

Čtvrtý aspekt předkládaného vynálezu poskytuje protilátku, která obsahuje aminokyselinovou sekvenci těžkého řetězce obsahující SEKVENCI ID. Č. 4 a variabilní aminokyselinovou sekvenci lehkého řetězce obsahující SEKVENCI ID. Č. 17.

Pátý aspekt předkládaného vynálezu poskytuje izolovanou lidskou monoklonální protilátku, která je schopná vázat s na ···· · · · ·*· • 9 ····· · · • · · · · · ··· ········ ·· «· «· ···

CTLA-4. Ve výhodném provedení vynálezu je protilátka schopná kompetovat o vazbu s CTLA-4 s protilátkou vybranou ze skupiny obsahující protilátky 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.13.1, 4.14.3, 6.1.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 a 12.9.1.1.

V jiném výhodném provedení mají protilátky v podstatě podobnou vazebnou specificitu k CTLA-4 jako protilátky vybrané ze skupiny obsahující protilátky 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.13.1, 4.14.3, 6.1.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 a 12.9.1.

V ještě dalším výhodném provedení vynálezu jsou protilátky vybrány ze skupiny obsahující protilátky 3.1.1,

4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.13.1, 4.14.3, 6.1.1, 11.2.1, 11.6.1,

11.7.1, 12.3.1.1 a 12.9.1.1. V ještě dalším provedení předkládaného vynálezu není protilátka křížově reaktivní s CTLA-4 nižších savců, kdy výhodně k nižším savcům patří druhy jako je myš, potkan/krysa a králík, nejvýhodněji myš a potkan/krysa. V jiném výhodném provedení je protilátka křížově reaktivní s CTLA-4 primátů, zejména výhodně primáty rodu makak (Macaca), jako M. fascicularis (cynomologní m.) a M. mullata (m. rhesus). V dalším výhodném provedení protilátka vykazuje selektivitu pro CTLA-4 ve srovnání s CD28, B7-2, CD44 a hlgGl vyšší než 100:1 a výhodně 500:1 nebo vyšší. V dalším výhodném provedení je vazebná afinita protilátky 10~⁹ M nebo vyšší a výhodně ΙΟ'¹⁰ M nebo vyšší.

V jiném výhodném provedení protilátka inhibuje vazbu mezi CTLA-4 B7-2 s IC₅₀ menší než 100 nM a výhodně menší než 0,3 8 nM. V dalším výhodném provedení protilátka inhibuje vazbu mezi CTLA-4 B7-1 s IC₅₀ menší než 100 nM a výhodně menší než 0,50 nM. V jiném výhodném provedení protilátka zvyšuje produkci IL-2 v testu T buněk blast/Raji o 500 pg/ml nebo více a výhodně o 3846 pg/ml nebo více. V jiném výhodném provedení protilátka zvyšuje produkci IFN-γ v testu T buněk blast/Raji o 500 pg/ml nebo více a výhodně o 1233 pg/ml nebo více. V ještě dalším výhodném provedení protilátka zvyšuje

produkci IL-2 v superantigenovém testu hPBMT nebo celé krve o 500 pg/ml nebo více. V jiném výhodném provedení protilátka zvyšuje produkci IFN-γ v testu T buněk blast/Raji o 500 pg/ml nebo více a výhodně o 1233 pg/ml nebo více. V ještě dalším výhodném provedení protilátka zvyšuje produkci IL-2 v superantigenovém testu hPBMT nebo celé krve o 500 pg/ml nebo více a výhodně o 1500 pg/ml a více nebo o 30 % více, výhodně o 50 % více ve srovnání s kontrolou.

Předkládaný vynález v šestém aspektu poskytuje humanizovanou protilátku, která má v podstatě podobnou vazebnou specificitu k CTLA-4 jako protilátky vybrané ze skupiny obsahující protilátky 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2,

4.13.1, 4.14.3, 6.1.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 a

12.9.1.1. Ve výhodném provedení není protilátka křížově reaktivní s CTLA-4 nižších savců, kdy výhodně k nižším savcům patří druhy jako je myš, potkan/krysa a králík, nej výhodněji myš a potkan/krysa. V jiném výhodném provedení je protilátka křížově reaktivní s CTLA-4 primátů, jako je zejména výhodně cynomolgní makak (Macaca fascicularis) a makak rhesus (Macaca mullata). V dalším výhodném provedení protilátka vykazuje selektivitu pro CTLA-4 ve srovnání s CD28, B7-2, CD44 a hlgGl vyšší než 100:1 a výhodně 500:1 nebo vyšší. V dalším výhodném provedení je vazebná afinita protilátky 10‘⁹ M nebo vyšší a výhodně 10'¹⁰ M nebo vyšší. V jiném výhodném provedení protilátka inhibuje vazbu mezi CTLA-4 B7-2 s IC₅₀ menší než 100 nM a výhodně menší než 0,38 nM. V dalším výhodném provedení protilátka inhibuje vazbu mezi CTLA-4 B7-1 s IC₅₀ menší než 100 nM a výhodně menší než 0,50 nM. V jiném výhodném provedení protilátka zvyšuje produkci IL-2 v testu s T blasty/buňkami Ráji o 500 pg/ml nebo více a výhodně o 3846 pg/ml nebo více. V jiném výhodném provedení protilátka zvyšuje produkci IFN-γ v testu T blast/Raji o 500 pg/ml nebo více a výhodně o 1233 pg/ml nebo více. V ještě dalším výhodném provedení protilátka zvyšuje produkci IL-2 • · ···· ··· ········ ·· · · ·· ··· v superantigenovém testu hPBMT nebo celé krve o 500 pg/ml nebo více. V jiném výhodném provedení protilátka zvyšuje produkci IFN-γ v testu T buněk blast/Raji o 500 pg/ml nebo více a výhodně o 1233 pg/ml nebo více. V ještě dalším výhodném provedení protilátka zvyšuje produkci IL-2 v superantigenovém testu hPBMT nebo celé krve o 50 0 pg/ml nebo více a výhodně o 1500 pg/ml a více, nebo o 30 % více, výhodně o 50 % více ve srovnání s kontrolou.

Předkládaný vynález v sedmém aspektu poskytuje protilátku, která se váže CTLA-4, a která obsahuje aminokyselinovou sekvenci těžkého řetězce obsahující lidské sekvence FR1, FR2, a FR3 kódované genem lidské rodiny V_H3-33, který je operativně spojen ve čtecím rámci se sekvencí CDR1, CDR2 a CDR3, přičemž sekvence CDR1, CDR2 a CDR3 j sou nezávisle vybrány ze sekvencí CDR1, CDR2 a CDR3 uvedených na obr. 2. Ve výhodném provedení protilátka podle vynálezu dále obsahuje jakékoliv somatické mutace v sekvencích FR1, FR2 a FR3, jak je ilustrováno na obr. 2.

Předkládaný vynález v osmém aspektu poskytuje protilátku vázající se k CTLA-4, která obsahuje aminokyselinovou sekvenci těžkého řetězce obsahující lidské sekvence FR1, FR2, a FR3 kódované genem lidské rodiny V_H3-33, který je operativně spojen ve čtecím rámci se sekvencí CDR1, CDR2 a CDR3, přičemž protilátka má následující výhodné vlastnosti: vazebnou afinitu pro CTLA-4 10'⁹ M nebo vyšší, inhibuje vazbu mezi CTLA-4 a B7-1 s IC₅₀ 100 nM nebo nižší, inhibuje vazbu mezi CTLA-4 a B7-2 s IC₅₀ 100 nM nebo nižší a zvyšuje produkci cytokinu v testu lidských T lymfocytů o 500 pg/ml nebo více. Předkládaný vynález v devátém aspektu poskytuje protilátku vázající se k CTLA-4, která obsahuje aminokyselinovou sekvenci těžkého řetězce obsahující lidské sekvence FR1, FR2, a FR3 operativně spojené ve čtecím rámci se sekvencí CDR1, CDR2 a CDR3, nezávisle vybranou ze sekvencí CDR1, CDR2 a CDR3 uvedených na obr. 2 a 3, přičemž protilátka má následující • · · · ··· ···· • « «*··· · · · • ··*> ·« ··· · · • · ···· · · · ·*>····· ·· · · ·· ··· výhodné vlastnosti: vazebnou afinitu pro CTLA-4 10'⁹ M nebo vyšší, inhibuje vazbu mezi CTLA-4 a B7-1 s IC₅₀ 100 nM nebo nižší, inhibuje vazbu mezi CTLA-4 a B7-2 s IC₅₀ 100 nM nebo nižší a zvyšuje produkci cytokinu v testu lidských T lymfocytů o 500 pg/ml nebo více.

Předkládaný vynález v desátém aspektu poskytuje systém buněčné kultury pro testování stimulace T lymfocytů, obsahující kulturu lidských T lymfoblastů kokultivovaných (společně kultivovaných) s buňkami linie Ráji. Ve výhodném provedení T lymfoblasty jsou před kokultivací opláchnuty s buněčnou linií Ráji.

Předkládaný vynález v jedenáctém aspektu poskytuje způsob testování pro měření stimulace T lymfocytů, který spočívá v tom, že se poskytne kultura lidských T lymfoblastů a buněk Ráji, tato kultura se přivede do kontaktu s testovaným činidlem, a měří se produkce cytokinů v této kultuře.

Předkládaný vynález ve dvanáctém aspektu poskytuje funkční test pro screening stimulačních funkčních skupin T lymfocytů, který spočívá v tom, že se poskytne kultura lidských T lymfoblastů a buněk Ráji, tato kultura se přivede do kontaktu s testovanou funkční skupinou, a vyhodnotí se produkce cytokinů v této kultuře.

Předkládaný vynález ve třináctém aspektu poskytuje test stimulace T lymfocytů pro CTLA-4 inhibiční funkce, který spočívá v tom, že se kultura kultura lidských T lymfoblastů a buněk Ráji přivede do kontaktu s testovaným činidlem a vyhodnotí se produkce cytokinů v této kultuře.

Předkládaný vynález ve čtrnáctém aspektu poskytuje způsob testování (screening) na stimulační aktivitu T lymfocytů, který spočívá v tom, že se činidlo přivede do kontaktu s kulturou lidských T lymfoblastů a buněk Ráji a vyhodnotí se produkce cytokinů v této kultuře.

»< ·· ·· ·· ♦ • · * ♦ · · I* · · · • · · · · · · ·· · • · ···· · · * ««···««· ·· t · 9 9 9 9 9

V desátém až čtrnáctém aspektu vynálezu se výhodně T lymfoblasty před kultivací s buňkami Ráji opláchnou. V jiném výhodném provedení vynálezu cytokiny jsou IL-2 nebo IFN-γ. Ve výhodném provedení vynálezu se produkce cytokinů měří v supernatantu izolovaném z kultury. Ve výhodném provedení je činidlo protilátka a výhodně se váže k CTLA-4.

Předkládaný vynález v patnáctém aspektu poskytuje test k měření stimulace T lymfocytů, který spočívá v tom, že se poskytne populace lidských mononukleárních buněk periferní krve nebo celé krve stimulovaných stafylokokovým enterotoxinem A, kultura se přivede do kontaktu s činidlem, a měří se produkce cytokinů buněčnou populací.

Předkládaný vynález v šestnáctém aspektu poskytuje funkční test pro screening skupin se stimulační funkcí pro T lymfocyty, který spočívá v tom, že se poskytne populace lidských mononukleárních buněk periferní krve nebo celé krve stimulovaných stafylokokovým enterotoxinem A, kultura se přivede do kontaktu s funkční skupinou, a měří se produkce cytokinů buněčnou populací.

Předkládaný vynález v sedmnáctém aspektu poskytuje stimulační test T lymfocytů na inhibiční funkce CTLA-4, který spočívá v tom, že se populace lidských mononukleárních buněk periferní krve nebo celé krve stimulovaných stafylokokovým enterotoxinem A přivede do kontaktu s činidlem a vyhodnotí se produkce cytokinů buněčnou populací.

Předkládaný vynález v osmnáctém aspektu poskytuje způsob screeningu činidel na stimulační aktivitu pro T lymfocyty, který spočívá v tom, že se populace lidských mononukleárních buněk periferní krve nebo celé krve stimulovaných stafylokokovým enterotoxinem A přivede do kontaktu s činidlem a vyhodnotí se produkce cytokinů buněčnou populací.

Ve výhodném provedení šestnáctého až osmnáctého aspektu předkládaného vynálezu je cytokin IL-2. V jiném výhodném provedení je produkce cytokinů měřena v supernatantu

• · · · · « · · · ·· izolovaném z kultury. Ve výhodném provedení je činidlo protilátka a výhodně protilátka vázající se na CTLA-4.

Podrobný popis vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje plně lidskou monoklonální protilátku proti lidskému CTLA-4. Vynález zejména poskytuje také nukleotidová sekvence kódující aminokyselinové sekvence obsahující těžký a lehký řetězec imunoglobulinových molekul, zejména sekvence odpovídající souvislým sekvencím těžkého a lehkého řetězce z FR1 a CDR1 a CDR3 a FR4. Dále vynález poskytuje protilátky mající podobné vazebné vlastnosti jako protilátky a protilátky (nebo jiné antagonisty) mající podobné funkce jako protilátky popsané ve vynálezu. Také poskytuje hybridomy exprimující tyto imunoglobulinové molekuly a také monoklonální protilátky.

Definice

Pokud není definováno jinak, vědecké a technické termíny jsou v předkládané přihlášce užívány v tom smyslu, jak jsou odborníkovi obecně srozumitelné. Pokud ze souvislosti nevyplývá opak, termíny použité v jednotném čísle zahrnují i množné číslo a termíny použité v množném čísle zahrnují i jednotné číslo. Obecně jsou názvosloví a metody použité v této přihlášce v souvislosti s buněčnými a tkáňovými kulturami, molekulární biologií, biochemií proteinů, oligonukleotidů a polynukleotidů a hybridizačním technikami obecně známé a odborníkovi srozumitelné. pro rekombinantní DNA, syntézu oligonukleotidů, tkáňové kultury a transformace byly užity standardní postupy odborníkovi známé (jako je např. elektroforéza, lipofekce atd.). Enzymatické reakce a purifikační metody se prováděly podle návodů výrobce, nebo obecně známými postupy a nebo jak je popsáno zde. Všechny zmíněné metody se prováděly odborníkovi známým způsobem, jak byly popsány v obecných příručkách, jako je např. Sambrook et • «

al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989, nebo ve specifických publikacích, které jsou dále v textu citovány, a tyto citace jsou formou odkazu do přihlášky zahrnuty. Názvosloví použité v přihlášce v souvislosti s laboratorními postupy z oboru analytické chemie, organické syntetické chemie a lékařské a farmaceutické chemie jsou obecně užívané a odborníkovi známé. Pro chemické syntézy, chemické analýzy, přípravu a formulaci farmaceutických přípravků a podávání přípravků pacientům a léčení byly užity standardní postupy odborníkům známé.

Následující termíny užívané v přihlášce mají, pokud není specificky uvedeno jinak, následující význam:

Termín izolovaný polynukleotid znamená podle vynálezu polynukleotid genomové DNA, cDNA nebo syntetického původu nebo jakoukoliv jejich kombinaci, který je izolovaný tím, že 1) není spojen ani s celým ani s částí polynukleotidu, ve kterém se izolovaný polynukleotid nalézá v přírodě, 2) je operativně spojený s polynukleotidem, se kterým není v přírodě spojen, nebo 3) v přírodě se nevyskytuje jako součást delší sekvence.

Termín izolovaný protein znamená podle vynálezu protein vzniklý na základě cDNA, rekombinantní RNA nebo syntetickým způsobem nebo jakoukoliv jejich kombinací, který je izolovaný vzhledem k původu nebo vzniku tím, že 1) není spojen s proteiny tak, jak se nachází v přírodě, 2) neobsahuje další proteiny ze stejného zdroje, např. neobsahuje žádné další proteiny z myši, a 3) je exprimován buňkami jiného biologického druhu, nebo 4) nevyskytuje se v přírodě.

Termín polypeptid se užívá v popisu vynálezu jako generický termín a označuje nativní protein, fragmenty nebo analogy polypeptidové sekvence. Tudíž nativní protein, • · fragmenty nebo analogy jsou druhy polypeptidovéh rodu. Výhodné polypeptidy podle předkládaného vynálezu jsou např. molekuly těžkého řetězce lidského imunoglobulinu a molekuly lehkého řetězce kapa lidského imunoglobulinu uvedené na obr. 1, a také molekuly protilátek vytvořené jejich kombinací, obsahující molekuly těžkého řetězce s molekulami lehkého řetězce, např. lehkého řetězce kapa lidského imunoglobulinu, a také naopak, a také jejich fragmenty a analogy.

Termín přirozeně se vyskytující nebo vyskytující se v přírodě se v popisu vynálezu týká skutečnosti, že příslušný předmět lze nalézt v přírodě. Tak např. polypeptid nebo polynukleotidová sekvence, které jsou přítomny v organismu (včetně virů) a které z takové přírodního zdroje mohou být izolovány a nebyly přitom záměrně člověkem modifikovány, aú už v laboratoři nebo jinak, jsou přirozeně se vyskytující.

Termín operativně spojený v popisu vynálezu označuje to, že složky jsou v takové pozici, která jim umožňuje zamýšlenou funkci. Kontrolní sekvence operativně spojená s kódující sekvencí je ligována s kódující sekvencí takovým způsobem, aby bylo dosaženo exprese kódující sekvence za podmínek vhodných pro funkci kontrolní sekvence.

Termín kontrolní sekvence označuje v popisu vynález polynukleotidovou sekvenci, která je nutná k expresi a obecně k činnosti kódující sekvence, ke které je ligována (připojena). Kontrolní sekvence jsou různé povahy v závislosti na hostitelském organismu: u prokaryotických organismů obsahuje kontrolní sekvence obecně promotor, ribozomální vazebné místo a terminační sekvenci transkripce, u eukaryotických organismů obsahuje kontrolní sekvence obecně promotor a terminační sekvenci transkripce. Termín kontrolní sekvence zahrnuje jakožto minimum všechny složky, jejichž přítomnost je nezbytná pro expresi a zpracování DNA, přitom • · • ·

může obsahovat ještě další složky, jejichž přítomnost je výhodná, např. vedoucí sekvenci (leader) nebo partnerskou fúzní sekvenci.

Termín polynukleotid podle předkládaného vynálezu znamená polymerní formu nukleotidů délky nejméně 10 baží, a to Buďto ribonukleotidů nebo deoxyribonukleotidů nebo modifikované formy obou těchto typů nukleotidů, termín přitom zahrnuje jak jednořetězcové tak dvouřetězcové formy DNA.

Termín oligonukleotid podle vynálezu označuje přirozeně se vyskytující i modifikované nukleotidy navázané oligonukleotidovymi vazbami přirozeně se vyskytujícími nebo jinými než přirozeně se vyskytujícími. Oligonukleotidy jsou obecně podmnožinou polynukleotidu a obsahují přibližně 200 baží nebo méně. Výhodné oligonukleotidy obsahují 10 až 60 baží a nejvýhodněji 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,' 19 nebo 20 až 40 baží. Oligonukleotidy jsou obvykle jednořetězcové, např. oligonukleotidové sondy, ačkoliv mohou být i dvouřetězcové, např. pro konstrukci mutovaných genů. Oligonukleotidy podle vynálezu jsou buďto sense nebo antisense oligonukleotidy.

Termín přirozeně se vyskytující oligonukleotidy označuje jak ribonukleotidy tak i deoxyribonukleotidy.

Termín modifikované oligonukleotidy označuje v popisu vynálezu nukleotidy s modifikovanými nebo substituovanými cukernými skupinami a podobně. Termín oligonukleotidové vazby označuj e oligonukleotidové vazby jako je vazba fosforothioátová, fosforodithioátová, fosforoselenoátová, fosfordiselenoátová, fosforoanilothoátová, fosforoaniladátová, fosforoamidátová a další. Viz např. publikace LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al. J. Am.

Chem. Soc. 106:6077 (1984); Stein et al. Nucl. Acids Res.

16:3209 (1988); Zon et al. Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed. , Oxford

University Press, Oxford England (1991)); Stec et al. U.S.

• 4

Patent č. 5,151,510; 90:543 (1990), které oligonukleotidy mohou třeba.

Uhlmann and Peyman Chemical Reviews jsou zahrnuty formou odkazu. Všechny být pro detekci označeny, pokud je to

Termín selektivně detekovatelně oligonukleotidy hybridizují s hybridizace a detekovatelně znamená v popisu vynálezu vázat. Polynukleotidy, podle vynálezu selektivně kyselin za minimali zováno hybridi zovat a specificky se a jejich fragmenty řetězci nukleových kdy je nespecifických nukleových stringencí se užívají což je odborníkům známo Obecně podmínek množství promývání, vazby

Podmínky s vysokou selektivní hybridizace, ještě diskutováno. Obecně homologie sekvencí kyselin mezi polynukleotidy, oligonukleotidy a fragmenty sekvencí nukleových kyselin podle vynálezu nukleovými kyselinami je nejméně 80 % s rostoucí homologií alespoň 85%, aminokyselinové sekvence jsou částečná nebo úplná identita mezi např. 85% homologie znamená, že identických, když jsou dvě s dosažením maximální shody dvou přiřazených sekvencí) maximální shody, výhodné jsou nejvýhodněj ší Alternativně

90%, 95%, homologní, jej ich 85 % kyselin. dosažení bude zde nukleových a požadovanými a více, výhodně 99% a 100%.

Dvě pokud j e sekvencemi.

aminokyselin zde

Tak je přiřazeny (alignment) (matching). Mezery (v jedné ze jsou povoleny, aby mezery velikosti velikosti sekvence j sou mezery a výhodně, dvě sekvence proteinové z nich odvozené polypeptidové aminokyselin) termínu, pokud mají skóre shody jednotkách standardní odchylky) s mutační datovou maticí j sou homologní, a sankcí dvě bylo dosaženo nebo kratší, nebo kratší.

sekvence (nebo dvě dlouhé alespoň 30 ve smyslu přiřazení při užití zde užívaného vyšší než 5 (v za mezeru programu ALIGN nebo více. Viz and of Protein: Sequence

5, National Biomedical

Dayhoff, M.O., in Atlas str. 101-110 (Volume Foundation (1972)), a Supplement 2 k tomuto dílu,

Structure,

Research str. 1-10.

• ·

Dvě sekvence nebo jejich části jsou výhodně homologní, když jejich aminokyseliny jsou z 50 %a více identické při dosažení optimální shody přiřazení v programu ALIGN. Termín odpovídá se v popisu vynálezu užívá ve významu, že polynukleotidová sekvence je homologní (tj . identická, nikoliv evolučně příbuzná) s celou nebo částí referenční polynukleotidová sekvence, nebo že polypeptidová sekvence je identická s referenční polypeptidovou sekvencí. Naproti tomu termín komplementární znamená, že komplementární sekvence je homologní k části nebo celé polynukleotidová sekvence, ke které se srovnává. Tak pro ilustraci nukleotidová sekvence TATAC odpovídá referenční sekvenci TATAC a je komplementární k referenční sekvenci GTATA.

Následující termíny se užívají k popisu vztahů mezi dvěma nebo více polynukleotidovymi nebo aminokyselinovými sekvencemi: referenční sekvence, srovnávací okno, sekvenční identita, procento sekvenční identity a podstatná identita. Referenční sekvence je definována jako sekvence použitá jako základ pro srovnávání sekvencí, referenční sekvence může být podmnožina větší sekvence, např. segment cDNA plné délky nebo genové sekvence uvedené v seznamu sekvencí, nebo může obsahovat celou cDNA nebo genovou sekvenci. Obecně je referenční sekvence dlouhá alespoň 18 nukleotidů nebo 6 aminokyselin, často 24 nukleotidů nebo 8 aminokyselin, a častěji alespoň 48 nukleotidů nebo 16 aminokyselin. Jelikož v případě dvou polynukleotidů nebo aminokyselinových sekvencí každý/á z nich 1) může obsahovat sekvenci (tj. část úplné polynukleotidové nebo aminokyselinové sekvence), která je pro obě molekuly podobná a 2) dále může obsahovat sekvenci, která je pro obě molekuly odlišná, srovnávání dvou nebo více sekvencí se provádí obvykle pomocí tzv. srovnávacího okna pro identifikaci a srovnání lokálních úseků sekvenční identity/podobnosti.

Termín srovnávací okno označuje myšlený segment alespoň 18 souvisle po sobě následujících nukleotidových pozic nebo 6 aminokyselin, kde polynukleotidová sekvence nebo aminokyselinová sekvence může být srovnána s referenční sekvencí alespoň 18 souvisle po sobě jdoucích nukleotidů nebo sekvencí 6 aminokyselin, přičemž úsek polynukleotidové sekvence ve srovnávacím okně může obsahovat adice, delece, substituce apod. (tj . mezery) z 20 % nebo méně ve srovnání s referenční sekvencí (která neobsahuje adice nebo delece) pro dosažení optimální shody přiřazení dvou sekvencí. Optimální přiřazení sekvencí při porovnávání srovnávacích oken může být prováděno algoritmem lokální homologie podle Smith a Waterman Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), algoritmem homologního přiřazení podle

Needleman and Wunsch J. Mol. Biol. 48:443 (1970), metodou vyhledávání podobnosti podle Pearson and Lipman Proč. Nati. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:2444 (1988), počítačovou implementací těchto algoritmů (GAP, BESTFIT, FASTA, a TFASTA v programovém balíku Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0 od Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), nebo v programovém balíku Geneworks nebo MacVector), nebo prohlížením, a nej lepší přiřazení (které vede k nejvyššímu procentu homologie ve srovnávacím okně) získané různými metodami se vybere.

Termín sekvenční identita znamená identitu dvou polynukleotidových nebo aminokyselinových sekvencí (tj . jsou identické na bázi nukleotid za nukleotidem nebo zbytek za zbytkem) ve srovnávacím okně. Termín procento sekvenční identity označuje hodnotu, která se vypočte porovnáním dvou optimálně přiřazených sekvencí ve srovnávacím okně a určením počtu pozic, kde jsou identické báze (např. A, T, C, G, U nebo I) nebo aminokyselinové zbytky v obou sekvencích, čímž se získá počet shodných pozic, a tento počet shodných pozic se dělí celkovým počtem pozic ve srovnávacím okně (tj . velikostí okna) a výsledek se vynásobí 100, čímž se dostane • · · · • · · · · · · · ········ ·· · · ·· · hodnota procenta sekvenční identity. Termín podstatná identita v přihlášce označuje vlastnosti polynukleotidové nebo aminokyselinové sekvence, kdy polynukleotidová nebo aminokyselinová sekvence obsahuje sekvenci, která má alespoň 85% sekvenční identitu, výhodně alespoň 90 až 95% sekvenční identitu, a nejvýhodněji a nej obvykleji alespoň 99% sekvenční identitu při srovnání s referenční sekvencí ve srovnávacím okně velikosti alespoň 18 nukleotidů (6 aminokyselin), často velikosti alespoň 24 až 48 nukleotidů (8 až 16 aminokyselin), kdy procento sekvenční identity se vypočítává ze srovnání referenční sekvence se sekvencí, která může obsahovat delece nebo adice představující nejvýše 20 % celkové referenční sekvence ve srovnávacím okně.

V popisu vynálezu se pro označení 20 esenciálních aminokyselin užívají konvenční zkratky, viz publikace Immunology - A Synthesis (2nd Edition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. 20 (1991)), která je vložena formou odkazu. Stereoisomery dvaceti konvenčních aminokyselin (např. D-aminokyseliny) , přírodně se nevyskytující aminokyseliny, jako např. a-, a-disubstituované aminokyseliny, N-alkylaminokyseliny, kyselina mléčná a další neobvyklé aminokyseliny mohou být také vhodné složky polypeptidů podle předkládaného vynálezu. K příkladům neobvyklých aminokyselin patří: 4-hydroxyprolin, γ-karboxyglutamát, ε-Ν,N,N-trimethyllysin, ε-N-acetyllysine, O-fosfoserin, N-acetylserin, N-formylmethionin, 3-methylhistidin, 5-hydroxylysin, σ-N-methylarginin, a další podobné aminokyseliny (např. 4-hydroxyprolin) . Při označování polypeptidů v popisu vynálezu je vlevo amino-koncová část a vpravo karboxy-koncová část polypeptidů v souladu s konvencí odborníkovi známou.

Obdobně, pokud není specifikováno jinak, levý konec jednořetězcové polynukleotidové sekvence je 5'-konec a tudíž směr vlevo u dvouřetězcové polynukleotidové sekvence je • · označován jako 5'-směr. Směr od 5'-konce do 3'-konce, kterým vzniká RNA transkript je označován jako směr transkripce, úseky DNA řetězce mající stejnou sekvenci jako RNA, ležící 5'-směrem od 5'-konce RNA transkriptu jsou označovány jako upstream (tj . proti směru transkripce) sekvence, úseky DNA řetězce mající stejnou sekvenci jako RNA, ležící 3'-směrem od

3'-konce RNA transkriptu jsou označovány jako downstream (tj. po směru transkripce) sekvence.

Při aplikaci na polypeptidy termín znamená, že dvě peptidové sekvence, přiřazeny, jako např.

předem nastavených hodnot váhy mezery, sekvenční výhodněj i sekvenční pozicích, substitucí substituce podstatná identita pokud jsou optimálně v programu GAP nebo BESTFIt při požití sdílejí alespoň 80% identitu, výhodně alespoň 90% sekvenční identitu, 95% sekvenční identitu a nejvýhodněji alespoň 99% identitu. Výhodně aminokyselinové zbytky v které nejsou identické, se liší konzervativní aminokyseliny. Konzervativní j sou ma j í podobné aminokyselin s glycin, alanin, valin, aminokyselin majících řetězec obsahuje serin s postranním řetězcem obsahujícím amidovou skupinu obsahuje asparagin aromatické aminokyselinové vzájemné záměny takových aminokyselin, které postranní alifatickým alanin, tryptofan, řetězec obsahuje řetězce. tak např. postranním řetězcem leucin a isoleucin, alifatický-hydroxy1ový a threonin, skupina skupiny obsahuj e skupina postranní aminokyselin a glutamin, skupina aminokyselin postranní řetězce obsahuje fenylalanin, skupina aminokyselinmajících bazický lysin, arginin a histidin, aminokyselin majících postranní řetězec obsahující maj ících tyrosin a postranní a skupina síru obsahuje cystein a methionin. Výhodné skupiny aminokyselin pro konzervativní substituce jsou: valin-leucin-isoleucin, fenylalanin-tyrosin, lysin-arginin, alanin-valin, glutamátaspartát a asparagin-glutamin.

• ·

Jak již bylo diskutováno, menší variace v aminokyselinové sekvenci protilátek nebo i munoglobulinových molekul jsou že variace protilátek zahrnuty v předkládaném vynálezu, za předpokladu, udržují alespoň 75%, výhodněji alespoň 80%, 90% nejvýhodněji 99% sekvenční identitu, konzervativní nebo 95% a sem patří

Zejména

Konzervat ivní aminokyselin.

takové substituce, které aminokyselin, které jsou Geneticky kódované aspartát, (3) nepolární fenylalanin, glycin, tyrosin. rodinu substituce substituce jsou v rámci rodiny postranními skupinami.

obecně dělí do rodin: (1) kyselé = bazické = lysin, arginin, histidin, valin, leucin, isoleucin, prolin, tryptofan, a (4) nenabité polární glutamin, cystein, serin, threonin, rodiny jsou: serin a threonin tvoří hydroxylovou, asparagin a glutamin tvoří rodinu obsahující amidovou skupinu, alanin, valin, leucin a isoleucin tvoří alifatickou rodinu, a aromatickou rodinu.

se odehráváj í příbuzné svými aminokyselin se glutamát, (2) alanin, methionin, asparagin,

Výhodněj ší alifatickouizolované nahrazení fenylalanin, Tak např. leucinu aspartátu glutamátem, threoninu tryptofan a tyrosin tvoří je rozumné očekávat, že isoleucinem nebo valinem, serinem nebo podobné náhrady aminokyselin strukturně příbuznými aminokyselinami, nebudou mát závažný vliv na vazebné nebo jiné vlastnosti výsledné molekuly, zejména pokud se náhrady nebudou týkat oblasti kostry. Zda záměna aminokyseliny vedla k funkčnímu peptidu lze okamžitě ověřit testováním specifické aktivity polypeptidového derivátu. Příslušné testy jsou v této přihlášce podrobně popsány. Fragmenty nebo analogy protilátek nebo imunoglobulinových molekul mohou být odborníkem snadno připraveny. Výhodné amino-konce nebo karboxy-konce fragmentů nebo analogů se vyskytují v blízkosti hranic funkčních domén. Strukturní a funkční domény mohou být identifikovány srovnáním nukleotidové a/nebo aminokyselinové sekvence s daty ve veřejných nebo soukromých databázích sekvencí. Výhodně se • · • · užívají počítačové metody k identifikaci sekvenčních motivů nebo predikci proteinových konformačních domén, které se vyskytují u jiných proteinů, jejichž struktura a/nebo funkce je známá. Metody k identifikaci proteinových sekvencí, které se skládají do známých trojrozměrných struktur, jsou odborníkům známy (viz např. Bowie et al. Science 2 53:164 (1991)). Čili předcházející příklady ukazují, že odborník je schopen rozeznat motivy a strukturní konformace, které lze užít pro definování strukturních a funkčních domén podle předkládaného vynálezu.

Výhodné aminokyselinové substituce jsou takové, které:

(1) redukují citlivost k proteolýze, (2) redukují citlivost k oxidaci, (3) mění vazebnou afinitu pro vytvářející se proteinové komplexy, (4) mění vazebné afinity a (5) poskytují nebo modifikují jiné fyzikálně-chemické nebo funkční vlastnosti takových analogů. Analogy mohou obsahovat různé muteiny sekvence odlišné od přirozeně se vyskytující peptidové sekvence. Tak např. jednoduchá nebo vícenásobná aminokyselinová substituce (výhodně konzervativní substituce aminokyselin) se může provést sekvenci (výhodně v části tvořící intermolekulární (např.

strukturu parentální struktur v přirozeně se vyskytující polypeptidů mimo doménu/domény spojení). Konzervativní neměla podstatně změnit (parentální) sekvence narušit šroubovícovou by původní by neměla nebo sekundárních

Příklady struktur narušit jiné typy pro parentální sekundárních a polypeptidů publikacích (Creighton,

Introduction to Protein Structure

Proteins,

Ed. , W. H.

Structures

Freeman and aminokyselinové substituce strukturní charakteristiky náhrada aminokyseliny molekuly charakteristických v oboru známých byly popsány např. v and Molecular Principles Company, New York (1984)), (C. Branden and J. Tooze, eds. , Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)), a Thornton • · · · et at. Nátuře 354:105 (1991), které jsou vloženy formou odkazu.

Termín polypeptidový fragment označuje v předkládané přihlášce polypeptid s delecí amino-konce a/nebo karboxykonce, přičemž zbývající aminokyselinová sekvence je identická s odpovídajícími pozicemi přirozeně se vyskytující sekvence, dedukované např. na základě cDNA plné délky. Fragmenty jsou typicky dlouhé alespoň 6, 6, 8 nebo 10 aminokyselin, výhodně alespoň 14 aminokyselin a nejvýhodněji alespoň 20 aminokyselin, obvykle však alespoň 50 aminokyselin a ještě výhodněji alespoň 70 aminokyselin.

Termín analog v popisu vynálezu znamená polypeptid, který obsahuje segment alespoň 25 aminokyselin, který má podstatnou identitu s úsekem dedukované aminokyselinové sekvence a která má alespoň jednu z následujících vlastností: (1) specificky se váže k CTLA-4 za vhodných vazebných podmínek, (2) má schopnost blokovat vazbu CTLA-4 s jeho receptorem, nebo (3) má schopnost inhibovat růst buněk exprimujících CTLA-4 in vitro nebo in vivo. Typicky polypeptidové analogy obsahují konzervativní aminokyselinové substituce (nebo adice nebo delece) vzhledem k přirozeně se vyskytující sekvenci. Analogy jsou typicky dlouhé alespoň 20 aminokyselin, výhodně alespoň 50 aminokyselin nebo delší, a často jsou dlouhé stejně jako přirozeně se vyskytující polypeptid plné délky.

Peptidové analogy jsou obecně ve farmaceutickém průmyslu užívány jako nepeptidové léčiva s vlastnostmi analogickými s původním (templátovým) peptidem. Tyto typy nepeptidových sloučenin se nazývají peptidová mimetika nebo také peptidomimetika (viz Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber and Freidinger TINS p.392 (1985); and Evans et al. J. Med. Chem. 30:1229 (1987)). Takové sloučeniny jsou obvykle vyvíjeny pomocí počítačového modelování molekul. Peptidomimetika strukturně podobná terapeuticky užitečným • ·

peptidům se mohou užít pro dosažení ekvivalentního terapeutického nebo profylaktického účinku. Obecně jsou peptidomimetika strukturně podobná paradigmatickému peptidu (tj . polypeptidu, který má požadované biochemické vlastnosti nebo farmakologickou aktivitu), jako jsou např. protilátky, ale má jednu nebo více peptidových vazeb nahrazených vazbou vybranou ze skupiny obsahující: --CH₂NH--, --CH₂S--, --CH₂-CH₂--, --CH=CH--{cis a trans), --COCH₂--, --CH (OH) CH₂--, a --CH₂SO--, a sice metodami, které jsou odborníkům známy. Systematická substituce jedné nebo více aminokyselin kanonickou sekvencí D-aminokyselin stejného typu (tj. např. D-lysin místo L-lysinu) se může využít k přípravě stabilnějších peptidů. Kromě toho nepřirozené peptidy obsahující kanonickou sekvenci nebo v podstatě identickou variaci mohou být připraveny metodami, které jsou odborníkům známy (viz např. Rizo a Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992)), např. přidáním vnitřních cysteinových zbytků schopných tvořit intramolekulární disulfidické můstky, které cyklizují peptid.

Termíny protilátka nebo protilátkový peptid se týkají intaktní protilátky nebo jejího vazebného fragmentu, který kompetuje s intaktní protilátkou o specifickou vazbu. Vazebné fragmenty se připravují technikami rekombinantní DNA nebo enzymatickým nebo chemickým štěpením intaktních K vazebným fragmentům a jednořetězcové bispecifické nebo všechna svá vazebná patří fragmenty Fab, Fab¹ protilátky. Protilátky bifunkční jsou takové, místa identická. Protilátka podstatně

2, Fv než maj í inhibuje adhezi receptoru na protireceptor, když přístup protilátky snižuje množství receptoru vázaného na protireceptor alespoň o 20 %, 40 %, 60 % nebo 80 %, obvykle alespoň o více než 85 % (měřeno kompetitivním vazebným testem in vítro).

• ·

Termín epitop označuje jakoukoliv proteinovou determinantu schopnou specificky se vázat na imunoglobulin nebo receptor T-buňky. Epitopové determinanty jsou obvykle tvořeny chemicky aktivním povrchovým seskupením molekul jako jsou aminokyseliny nebo cukerné postranní řetězce a obvykle mají specifické trojrozměrné strukturní vlastnosti a také specifické specificky menší nebo jde o náboj. Protilátka se když disociační konstanta je rovna 1 μΜ, výhodně menší nejvýhodněji je menší nebo rovna 10 nM.

Termín činidlo vlastnosti pokud váže na antigen, nebo rovna 100 nM a nebo agens označuje v přihlášce chemickou sloučeninu, směs chemických sloučenin, biologickou makromolekulu nebo extrakt připravený biologických materiálů.

Termín značka znamená inkorporaci vložením radioaktivně a/nebo značený v popisu vynálezu detekovatelného markéru, tj . např.

značené aminokyseliny nebo navázání biotinylových skupin k polypeptidu, které pak mohou být detekovány značeným avidinem (tj. straptavidin obsahující fluorescenční markér nebo enzymatickou aktivitu, které mohou být detekovány optickými nebo kolorimetrickými metodami. Mohou být použity různé metody značení polypeptidů a glykoproteinů, které jsou odborníkům známé. K příkladům značek pro polypeptidy patří, aniž by výčet byl omezující, následující: radioisotopy nebo radionuklidy (např. ³H, ¹⁴C, ¹⁵N, ³⁵S, ⁹⁰Y, ⁹⁹Tc, ^1ιτΙη, ¹²⁵I, ¹³¹I), fluorescenční značky (např. FITC, rhodamin, lanthanidfosfory), enzymatické značky (např. křenová peroxidáza, β-galaktosidáza, luciferáza, alkalická fosfatáza), chemiluminiscenční značky, biotinylové skupiny, predeterminované polypeptidové epitopy rozpoznávané sekundární reportérovou molekulou (např. párové sekvence leucinového zipu, vazebná místa pro sekundární protilátku, domény vázající kov, epitopové značky). V některých provedeních vynálezu jsou značky navázány prostřednictvím • · oddělovacího ramínka (spaceru) různé délky, aby se redukovaly potenciální sterické zábrany.

Termíny farmaceutické činidlo nebo farmaceutický přípravek nebo léčivo se v popisu vynálezu užívají k označení chemických sloučenin, které jsou schopné vyvolat požadovaný terapeutický účinek, pokud jsou správně podávány pacientovi. Další chemické termíny jsou v předkládané přihlášce užívány ve smyslu, který je obvyklý a odborníkům známý, např. jak je uvedeno ve slovníku The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed. , McGraw-Hill, San Francisco (1985)).

Termín antineoplázické činidlo označuje činidlo, které má takové funkční vlastnosti, že inhibuje vývoj nebo progresi neoplázií u člověka, zejména maligních (rakovinných) lézí, jako je např. karcinom, sarkom, lymfom nebo leukémie. Častou vlastností antineoplázického činidla je inhibice metastáz.

V podstatě čistý znamená v předkládané přihlášce znamená, že předmětný druh je převládající přítomný druh (tj. na molární úrovni je hojnější než jakýkoliv jiný druh přítomný ve sloučenině), výhodně v podstatě čistá frakce je přípravek, kde předmětný druh je zastoupen alespoň z 50 % (na molárním základě) mezi všemi přítomnými makromolekulami. Obecně v podstatě čistý přípravek obsahuje více než 80 % všech druhů makromolekul přítomných v přípravku, výhodněji více než 85 %, 90 %, 95 % a 99 %. Nej výhodně ji je předmětný druh purifikován do nezbytné homogenity (konvenčními metodami nelze detekovat kontaminující druhy molekul), přičemž přípravek je v podstatě tvořen jediným druhem makromolekuly.

Struktura protilátky

Základní strukturní jednotka protilátky je, jak je známo, tvořena tetramerem. Každý tetramer je složen ze dvou identických dvojic polypeptidových řetězců, přičemž každý pár obsahuje jeden lehký (přibližně 25 kDa) a jeden těžký • ·

(přibližně 50 až 70 kDa) řetězec. Amino-koncová část každého řetězce obsahuje variabilní úsek složený přibližně ze 100 až 110 nebo i více aminokyselin, primárně zodpovědný za rozpoznání antigenu. Karboxy-koncová část každého řetězce definuje konstantní úsek primárně zodpovědný za efektorové funkce. Lidské lehké řetězce jsou klasifikovány jako kapa a lambda lehké řetězce. Lidské těžké řetězce jsou klasifikovány jako mí (μ), delta, gama, alfa a epsilon a definují isotyp protilátky označovaný jako IgM, IgD, IgG, IgA, a IgE, v uvedeném pořadí. Uvnitř těžkého a lehkého řetězce jsou variabilní a konstantní úsek spojeny úsekem J velikosti 12 nebo více aminokyselin, přičemž těžký řetězec obsahuje navíc úsek D velikosti 10 a více aminokyselin (pro obecný přehled viz publikace Fundamenta.1 Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed. , 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)), která je celá zahrnuta formou odkazu. Variabilní úseky každé dvojice těžký/lehký řetězec vytvářejí vazebné místo protilátky.

Takže intaktní IgG má dvě vazebná místa. Až na bifunkční nebo bispecifické protilátky, tato vazebná místa jsou shodná.

Všechny řetězce mají stejnou obecnou strukturu relativně konzervativního úseku kostry (FR) spojeného třemi hypervarlabilními úseky, které se nazývají úseky determinující komplementaritu, zkráceně CDR. úseky CDR ze dvou řetězců z každého páru jsou spojeny úsekem kostry, což umožňuje vazbu na specifický epitop. Ve směru od N-konce k C-konci, těžký a lehký řetězec obsahují domény FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 and FR4. Přiřazení aminokyselin ke každé doméně je v souladu s definicí podle Kabata: Seguences of Proteins of Inmunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991)), nebo publikacemi Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), Chothia et al. Nátuře 342:878-883 (1989).

Bispecifická nebo bifunkční protilátka je umělá hybridní protilátka obsahující dva různé páry těžký/lehký • · řetězec a dvě odlišná vazebná místa. Bispecifické protilátky mohou být připraveny řadou metod, např. fúzí hybridomů nebo spojením fragmentů Fab(viz Songsivilai & Lachmann Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990), Kostelny et al. J. Immunol.

148:1547 1553 (1992)). Kromě toho bispecifické protilátky mohou být tvořeny jako tzv. diabodies (Holliger et al.

'Diabodies': smáli fragments (Traunecker (Janusins)

PNAS USA bivalent and bispecific nebo

90:6444-6448 (1993)) antibody Janusiny molecules chain

Bispecific cytotoxic

J 10:3655-3659 et al.

target cells EMBO on HIV infected et al.

Janusin: new molecular design : 51-52 (1992) ) .

proces relativně náročný na single lymphocytes (1991), Traunecker for bispecific reagents Int J Produkce bispecifických práci ve srovnání i stupeň čistoty, pro bispecifické

Cancer Suppl protilátek je s produkcí konvenčních protilátek a výtěžky kterých se dosahuje, jsou obvykle nižší protilátky. Bispecifické protilátky neexistují ve formě fragmentů majícíh jedno vazebné místo (jako jsou např. fragmenty Fab, Fab' a Fv).

Lidské protilátky a humanizace protilátek

Při použití lidských protilátek nedochází k některým problémům, které jsou spojeny s protilátkami, které obsahují variabilní a/nebo konstantní úseky z protilátek myši nebo potkana. Přítomnost proteinů pocházejících z myši nebo potkana vede k tomu, že se zvyšuje clearance a protilátka může vyvolat imunitní reakci u pacienta. Aby se zabránilo užívání protilátek pocházejících z myši nebo potkana, bylo navrženo vyvinout humanizované protilátky nebo připravit plně lidské protilátky tím, že se vnesou funkce lidských protilátek do hlodavce, který pak bude produkovat protilátky mající plně lidské sekvence.

• e • ·

Lidské protilátky

Schopnost klonování a rekonstrukce lidských lokusů velikosti megabází v YAC (umělých kvasinkových chromozómech a jejich vnesení do myších zárodečných buněk poskytují velmi účinné metody ke zjištění funkčních komponent velmi velkých nebo jen hrubě zmapovaných lokusů a k vytvoření užitečných modelů lidských nemocí. Kromě toho užití takové technologie k nahrazení myších lokusů jejich lidskými ekvivalenty poskytuje jedinečné informace o expresi a regulaci produktů lidských genů v průběhu vývoje, jejich komunikaci s jinými systémy a jejich účast v indukci a rozvoj nemoci.

Důležitou praktickou aplikací takové strategie je humanizace myšího humorálnho imunitního systému. Vnesení lidských imunoglobulinových (Ig) lokusů do myši, jejíž endogenní Ig geny byly inaktivovány, nabízí možnost zkoumat mechanismus programované exprese a sestavování protilátek a také jejich roli ve vývoji B lymfocytů.

Kromě toho tato strategie poskytuj e ideální zdroj pro produkci monokolonálních plně lidských protilátek jakožto významný milník na cestě ke splnění příslibu protilátkových terapií lidských nemocí. Očekává se, že plně lidské protilátky minimalizují imunitní a alergické reakce, které jsou vlastní myším protilátkám nebo protilátkám z nich derivátizovaných, a tudíž zvýší bezpečnost a účinnost podávání protilátek. Podávání plně lidských protilátek bude zásadně výhodné pro léčení chronických a rekurentních nemocí, jako jsou zánětlivá a autoimunitní onemocnění a rakovina,kdy je třeba opakované podávání protilátek.

Jeden z přístupů k dosažení tohoto cíle je metodami genového inženýrství upravit myší kmeny deficientní v tvorbě protilátek pomocí velkých fragmentů lidských Ig lokusů s očekáváním, že takto modifikované myši budou tvořit velký repertoár lidských protilátek aniž by tvořily myší protilátky. Velké fragmenty lidské Ig zachovají velkou • · · • · · · · · * 9 9 » 9 9 99

9 9 9 99

9 9 99« genovou diverzitu a také správnou regulaci protilátek. Vzhledem k pro diverzifikaci a imunologické tolerance repertoár lidských protilátek v těchto myších mělo vést k využití mechanismů selekci protilátek k lidským proteinům, a exprese organismu tvorby myšího nepřítomnosti reprodukovaný kmenech by vysokoafinitním protilátkám proti jakémukoliv antigenu, včetně lidských antigenů. Užitím hybridomů mohou být snadno připravovány a požadovanému technologie selektovány antigenně specifické monoklonální protilátky, poprvé demonstrována ve myší XenoMouse™, jak bylo al. Nátuře Genetics 7:13Tato obecná strategie byla spojení s vytvořením prvních kmenů publikováno v r. 1994 (viz Green et (1994)). Kmeny XenoMouse™ byly geneticky manipulovány pomocí umělých kvasinkových chromozómů (YAC) obsahujících fragmenty velikosti 245 a 190 kb se zárodečnou konfigurací lokusů pro lidský těžký řetězce lidský obsahující jádro sekvencí konstantního a YAC obsahující lidské Ig se ukázaly jako systémem jak pro nové uspořádání tak expresi protilátek a byly vhodné pro substituci inaktivovaných myších Ig genů. To bylo prokázáno jejich schopností indukovat vývoj B-lymfocytů, vytvářet vytvářet výsledky lidských regulační v podstatě opakovat pro lidskou imunitní humorální reakci na Práce Greena et al. byla 80 % repertoáru lidských YAC velikosti megabází lokusů pro lidský těžký do myší XenoMouse™ (viz

15:146-156 (1997), Green a Jakobovits J. Exp. Med. 188:483lehký řetězec kapa, variabilního úseku.

kompatibilní s myším dospělý antigenně také vedly Ig lokusů elementy repertoár plně lidských protilátek a specifické lidské mní protilátky, k předpokladu, že vnesení velkých obsahujících velký počet V genů, a lidské konstantní úseky, by plný repertoár, který je charakteristický infekci a imunizaci.

Tyto částí další mohlo nedávno rozšířena o vnesení více než protilátek prostřednictvím fragmentů obsahujících zárodečnou konfiguraci řetězec a lidský lehký řetězec kapa např. Mendez et al. Nátuře Genetics • · · ·« ·· ·· ** ·· «··· * · - « » · · » * · · « ««I • · -» · · · · · ·

9 · · 9 9*9 ·*·· ·»·· 99 99 99999

495 (1998), patentová přihláška U.S. Seriál No. 08/759,620, podaná 3.12.1996, vložená formou odkazu).

Tento experimentální přístup byl dále diskutován a popsán

v patentové	přihlášce U.S.	07/466,008,	podané	12.1.1990,
07/610,515,	podané 8.11.1990,	07/919,297,	podané	24.7.1992,
07/922,649,	podané 30.7.1992,	08/031,801,	podané	15.3.1993,
08/112,848,	podané 27.8.1993,	08/234,145,	podané	28.4.1994,
08/376,279,	podané 20.1.1995,	08/430, 938,	podané	27.4.1995,
081464,584,	podané 5.6.1995,	08/464,582,	podané	5.6.1995,
08/463,191,	podané 5.6.1995,	08/462,837,	podané	5.6.1995,
08/486,853,	podané 5.6.1995,	08/486,857,	podané	5.6.1995,
08/486,859,	podané 5.6.1995,	08/462,513,	podané	5.6.1995,
08/1724,752	, podané 2.10.	1996, a 08/759,62	0, podané
3.12.1996.	Viz také publikace	Mendez et al. Nátuře Genetics

15:146-156 (1997) a Green a Jakobovits J. Exp. Med. 188:483495 (1998) . Viz dále také Evropský patent EP 0 463 151 B 1, udělení zveřejněno 12.6. 1996, mezinárodní patentová přihláška č. W094/02602, publikovaná 3.2.1994, mezinárodní patentová přihláška č. WO 96/34096, publikovaná 31.10.1996, a mezinárodní patentová přihláška č. WO 98/24893, publikovaná 11.6.1998. Vynálezy popsané ve výše citovaných patentech, přihláškách a publikacích jsou v úplnosti formou odkazu zahrnuty v předkládané přihlášce.

Alternativní přístup použitý dalšími, např. firmou GenPharm International, lne., využil tzv. minilokusů. Při této metodě je exogenní Ig lokus napodoben vložením kousků (jednotlivých genů) z Ig lokusů. Takže se vytvoří konstrukt, obsahující jeden nebo více V_H genů, jeden nebo více D_H genů, jeden nebo více J_H genů, konstantní úsek μ a druhý konstantní úsek (výhodně konstantní úsek gama), vhodný pro inzerci do zvířete.

Takové metody byly popsány v patentu U.S.

Surani et al. , a U.S. č. 5,545,806, 5,625,825,

5,545,807,

5,625,126,

5,633,425, 5,661,016, 5,770,429, 5,789,650, a

5,814,318, všechny Lonberg a Kay, a U.S.

5,591,669, • · ·

• · • ·

Krimpenfort a Berns, U.S. č. 5,612,205, 5,721,367 a

5,789,215, Berns et al. , a U.S. č. 5,643,763 Choi a Dunn, a

U.S. patentové přihlášky GenPharm International č.

07/574,748,

31.8.1990,

18.3.1992, podaná 16.12.1992, podaná 29.8.1990,

07/810,279,

07/904,068, podaná podaná

08/053,131,

č. 07/575,962, podaná

07/853,408,

07/990,860,

26.4.1993,

17.12. 1991,

23.6.1992, č. podaná

č. 08/096,762, podaná 22.6.1993, č. 08/155,301, podaná 18.11.1993, č. 08/161,739, podaná 3.12.1993, č. 08/165,699, podaná 10.12.1993, č. 08/209,741, podaná 9.3.1994, jejichž úplné popisy jsou zahrnuty formou odkazu. Viz také Evropský patent č. 0

WO

546

WO

WO

WO

WO a WO

073 B 1,

92/22645,

94/00569,

98/24884,

Viz mezinárodní patentové

WO 92/22647, WO

WO 94/25585, WO jejichž úplné popisy také publikace Taylor et Tuaillon et al., (1994), (1995) a přihlášky

92/22670, 96/14436, j sou také

92/03918,

93/12227,

97/13852, zahrnuty formou odkazu.

1992, Chen et al., 1993,

1993, Lonberg et al. , Tuaillon et al., také plně zahrnuty formou

Původci Surani et

Taylor et

Fishwild et al., odkazu.

1993, Choi et al., (1994), (1996), které al. , al. , and j sou al. , ve výše přihlašovatele Medical Research Counsel transgenní myši mající Ig lokus metodou vynálezů firmy GenPharm International Lonberg a Kay navrhli citovaném vynálezu (MRC), připravily minilokusů. Původci inaktivaci endogenního myšího Ig lokusu spojenou s podstatnou duplikací práce Surani et al.

Výhodou metody minilokusů je především rychlost, s jakou mohou být konstrukty obsahující úseky Ig lokusů vytvářeny a vkládány do zvířat. Avšak současně nevýhodou metody minilokusů je to, že vnesením malého počtu V, D, a J genů se vnese nedostatečná diverzita. A skutečně publikované práce potvrzují tyto obavy. Vývoj B-lymfocytů a tvorba protilátek u zvířat připravených metodou minilokusů jsou nedostatečné. Tudíž výzkum, který byl základem pro předkládaný vynález, byl « · zaměřen na vnesení velkých úseků Ig lokusů, aby bylo dosaženo velké diverzity a aby byl rekonstituován celý imunitní repertoár.

Lidská anti-myší protilátková reakce (HAMA) vedla průmysl k přípravě chimérických nebo jiným způsobem humanizovaných protilátek. Jelikož chimérické protilátky mají lidský konstantní úsek a myší variabilní úsek, očekává se, že bude pozorována určitá lidská antichimérická protilátková reakce (HACA), zejména při chronickém nebo mnohodávkovém použití protilátky.

Je tudíž potřebné poskytnout plně lidské protilátky proti CTLA-4, aby bylo možné odstranit obavy a také ovlivnit HAMA nebo HACA reakce.

Humanizace protilátek a metody displeje

Jak bylo již diskutováno výše ve spojitosti s tvorbou lidských protilátek, je výhodné připravovat protilátky se sníženou imunogenicitou. Toho lze do jisté míry dosáhnout metodami humanizace a displeje užitím vhodných knihoven. Je známo, že myší protilátky nebo protilátky z jiných druhů mohou být humanizovány nebo primatizovány metodami, které jsou v oboru dobře známy, viz např. Winter a Harris Immunol Today 14:43-46 (1993) a Wright et al. Crit. Reviews in Immunol. 12125-168 (1992). Požadované protilátky lze připravit metodami rekombinantní DNA substitucí domén CH1, CH2, CH3, kloubové domény a/nebo domény kostry odpovídajícími lidskými doménami (viz WO 92/02190 a U.S. patenty č. 5,530,101, 5,585,089, 5,693,761, 5,693,792, 5,714,350, a 5,777,085). Také použití Ig cDNA pro konstrukci chimérických Ig genů je odborníkům známo (viz např. Liu et al. P.N.A.S. 84:3439 (1987) a J. Immunol. 139:3521 (1987)). mRNA se izoluje z hybridomů nebo jiných buněk produkujících protilátku a užije se pro přípravu cDNA. Požadovaná cDNA se pak amplifikuje např. polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) užitím specifických primerů (viz U.S. patenty č. 4,683,195 a 4,683,202). Alternativně se připraví knihovna a provede se její screening, čímž se izoluje požadovaná sekvence. DNA sekvence kódující variabilní úsek protilátky se pak fúzuje se sekvencí lidskou konstantní sekvencí. Sekvence lidských konstantních úseku lze najít v publikaci Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, N.I.H. publication no. 91-3242. Lidské geny C úseků jsou okamžitě k dispozici ze známých klonů. Výběr isotypů se řídí požadovanými efektorovými funkcemi, jako je např. fixace komplementu, nebo aktivita v buněčné cytotoxicitě závislé na protilátkách. Výhodné isotypy jsou IgGl, IgG2, IgG3 a IgG4. Zvláště výhodné isotypy protilátek podle předkládaného vynálezu jsou IgG2 a IgG4. Mohou být užity oba typy konstantních úseků lidského lehkého řetězce kapa i lambda. Chimérické humanizované protilátky se pak exprimují obvyklým způsobem.

Protilátkové fragmenty jako např. Fv, F(ab')2 a Fab se připraví štěpením intaktních proteinů, např. proteázami nebo chemicky. Alternativně se připraví zkrácené geny. Tak např. chimérický gen kódující část fragmentu F(ab')₂ by zahrnoval sekvence DNA kódující doménu CH1 a kloubový úsek H řetězce, pak by následoval translační stop-kodon, aby vznikla zkrácená molekula.

V jedné metodě se užijí kanonické sekvence kódující J úseky těžkého a lehkého řetězce pro návrh sekvencí oligonukleotidových primerů, které se užijí pro vnesení vhodných restrikčních míst do J úseků pro následné spojení segmentů V úseku se segmenty lidského C úseku. cDNA C úseku může být modifikována místně cílenou mutagenezí, aby se umístila restrikční místa do analogických pozic v lidské sekvenci.

K expresním vektorům patří plazmidy, retroviry, kosmidy,

YAC, episomy odvozené z EBV, atd. Vhodným vektorem je takový, který kóduje funkčně kompletní CH nebo CL sekvenci lidského imunoglobulinu, s vhodně vloženými restrikčními místy, takže jakákoliv sekvence VH nebo VL může být snadno vložena a exprimována. V takových vektorech dochází k sestřihu zpravidla mezi donorovým sestřihovým místem ve vloženém J úseku a akceptorovým sestřihovým místem, které předchází lidský C úsek, a také v sestřihových úsecích, které se vyskytují v lidských CH exonech. Polyadenylace a terminace transkripce se uskutečňuje v přirozených chromozómových místech směrem downstream od kódujícího úseku. Výsledná chimérická protilátka se může spojit s jakýmkoliv silným promotorem, včetně promotorů jako je retrovirový LTR, např. časný promotor SV-40 (Okayama et al. Mol. Cell. Bio. 3:280 (1983)), LTR viru Rousova sarkomu (Gorman et al. P.N.A.S. Ί9-.6ΊΊΊ (1982)), a LTR Moloneyho myšího leukemickévo viru (Grosschedl et al. Cell 41:885 (1985)), nativní promotory Ig apod.

Kromě toho lidské protilátky nebo protilátky z jiných biologických druhů mohou být připraveny metodami typu displeje, např. displeje na fágu, retroviru, ribozomu apod., což jsou metody odborníkovi známé, a výsledné molekuly se podrobí dodatečné maturaci (zrání), jako je např. afinitní maturace, které jsou v oboru známy (viz např. Wright a Harris, viz výše, Hanes a Plucthau PNAS USA 94:4937-4942 (1997) (ribosomální display), Parmley a Smith Gene 73:305-318 (1988) (fágovy displej), Scott TIBS 17:241-245 (1992), Cwirla et al. PNAS USA 87:6378-6382 (1990), Russel et al. Nucl.

Acids Research 21:1081-1085 (1993), Hoganboom et al. Immunol. Reviews 130:43-68 (1992), Chiswell a McCafferty TIBTECH

10:80-84 (1992), aU.S. Patent č. 5,733,743.

Pokud se uvedené metody displeje užijí k produkci protilátek, které nejsou lidské, takové protilátky se pak mohou humanizovat, jak bylo již výše popsáno.

• 9 « ·

Užitím těchto postupů lze připravit protilátky k buňkám produkujícím CTLA-4, samotnému CTLA-4, formám CTLA-4 epitopů nebo peptidů a jejich expresním knihovnám (viz např. U.S. Patent č. 5,703,057), které se pak mohou podrobit screeningu na aktivity výše popsané.

Další kritéria pro protilátková léčiva

Obecně řečeno není žádoucí usmrtit buňky exprimující CTLA-4. Spíše je potřebné jednoduše inhibovat vazbu CTLA-4 s ligandy, aby se zmírnila inaktivace T-lymfocytů. Jeden z hlavních mechanismů, kterým protilátky usmrcují buňky, je fixace komplemetu a účast na CDC. Konstantní úsek protilátky hraje důležitou roli ve schopnosti protilátky fixovat komplemet a podílet se na CDC. Takže obecně se vybere isotyp protilátky, který buďto umožňuje fixaci komplementu nebo ne. V předkládaném vynálezu není výhodné, jak již bylo zmíněno výše, užít takové protilátky, které vedou k usmrcení buněk. Existují četné isotypy protilátek, které jsou schopné fixovat komplement a CDC, patří k nim např. následující protilátky: myší IgM, myší IgG2a, myší IgG2b, myší IgG3, lidská IgM, lidská IgGl a lidská IgG3. nepatří sem však např. isotypy lidské IgG2 a IgG4.

Protilátky, které se připraví, nemusejí mít na počátku zvláštní požadovaný isotyp, ale mohou to být protilátky v podstatě jakéhokoliv isotypu a pak je isotyp přepnut užitím metod, které jsou odborníkovi známy. K takovým metodám patří např. metody přímé rekombinace (viz např. U.S. Patent č. 4,816,397), metody buěnčné fúze (viz např. U.S. patentová přihláška 08/730,639, podaní 11.10.1996).

Při metodě buněčných fúzí se připraví myelomová buněčná linie nebo jiná linie, která obsahuje těžký řetězec požadovaného isotypu a další myelomová buněčná linie nebo jiná linie, která obsahuje lehký řetězec. Tyto buňky jsou pak • · • · • · · ♦ · · · ♦ ······· · · · · · · · fúzovány a výsledná buněčná linie exprimující intaktní protilátku je izolována.

Jako příklad uvádíme, že většina CTLA-4 protilátek diskutoivaných v předložené přihlášce jsou lidské anti-CTLA-4 IgG2 protilátky. Jelikož tyto protilátky mají požadovanou vazbu k molekule CTLA-4, kterákoliv z nich může být snadno isotypově přepnuta a vytvořit např. lidský isotyp IgG4, přičemž si uchová stejný variabilní úsek (který definuje protilátkovou specificitu a také z části afinitu).

Tudíž se připraví kandidátní protilátky, které splňují strukturní požadavky jak byly diskutovány výše, a které jsou vybaveny alespoň některými dalšími funkčními vlastnostmi nutnými pro přepnutí isotypu.

Návrhy a tvorba dalších léčiv

Na základě aktivity protilátek k CTLA-4 popsaných a charakterizovaných zde lze v souladu s vynálezem snadno navrhovat další léčiva, včetně dalších protilátek, antagonistů nebo chemických sloučenin jiných než jsou protilátky. K takovým formám léčiv patří např. protilátky mající podobnou vazebnou aktivitu nebo funkci, pokročilá protilátkaová léčiva, jako jsou např. bispecifické protilátky, imunotoxiny a radioaktivně značená léčiva, tvorba peptidových léčiv, genové terapie, intrabodies, antisense léčiva a malé molekuly. Kromě toho, jak již bylo diskutováno výše, efektorové funkce protilátek podle vynálezu mohou být změněny přepnutím isotypu na IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgA nebo IgM pro různá teraputická využití.

Ve spojení s přípravou pokročilých protilátkových léčiv, kde je požadovanou vlastností fixace komplementu, je možné závisost usmrcení buněk na komplementu obejít, tím že se užijí bisopecifické protilátky, imunotoxiny nebo radioaktivní značky.

• · · ··· ♦ · · • · ····· · · • · ······· ······· ·· ·· ·* ···

Mohou být připraveny takové bispecifické protilátky, které obsahují (I) dvě protilátky, kdy jedna má specificitu k CTLA-4 a druhá protilátka má specificitu k druhé molekule, které jsou společně konjugovány, (II) jednu protilátku, která má jeden řetězec specifický pro CTLA-4 a druhý řetězec specifický pro druhou molekulu, nebo (III) jednořetězcovou protilátku, která má specificitu k CTLA-4 a k druhé molekule. Takové bispecifické protilátky mohou být připraveny metodami, které jsou odborníkům známy, pro (I) a (II) viz např. Fanger et al. Immunol Methods 4:72-81 (1994) a Wright a Harris, cit. výše, pro (III) viz např. Traunecker et al. Int. J. Cancer (Suppl.) 7:51-52 ( 1992).

Kromě toho mohou být připraveny i tzv. kappabodies (111 et al. Design arid construction of a hybrid immunoglobulin domain with properties of both heavy and light chain variable regions Protein Eng 10:949-57 (1997)), minibodies (Martin et al. The affinity-selection of a minibody polypeptide inhibitor of human interleukin-6 EMBO J 13:5303-9 (1994)), diabodies (Holliger et al. 'Diabodies¹: smáli bivalent and bispecific antibody fragments PNAS USA 90:6444-6448 (1993)), nebo Janusiny (Traunecker et al. Bispecific single chain molecules (Janusins) target cytotoxic lymphocytes on HIV infected cells EMBO J 10:36553659 (1991) a Traunecker et al. Janusin: new molecular design for bispecific reagents Int J Cancer Suppl 7:51-52 (1992)) .

Pokud jde o imunotoxiny, protilátky mohou být modifikovány tak, aby působily jako imunotoxiny, a sice metodami, které jsou odborníkům známy. Viz např. Vitetta Immunol Today 14:252 (1993) a také U.S. Patent č. 5,194,594.

Pokud jde o přípravu radioaktivně značených protilátek, takto modifikované protilátky lze sndano připravit metodami, které jsou odborníkům známy. Viz např. Junghans et al. , Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2d edition, • ·

Chafner and Longo, eds., Lippincott Raven (1996)), U.S. Patenty č. 4,681,581, 4,735,210, 5,101,827, 5,102,990 (RE

35,500), 5,648,471 a 5,697,902. Každý z imunotoxinů nebo radiaktivně značených molekul pravděpodobně povede k usmrcení buněk exprimujících CTLA-4, zejména těch buněk, kde protilátky podle vynálezu jsou účinné.

Pokud jde o přípravu peptidových léčiv, užitím strukturních informací týkajících se CTLA-4 a protilátek k CTLA-4, např. protilátek podle vynálezu (jak bude ještě popsáno dále ve spojení s malými molekulami), nebo screeningem peptidových knihoven, je možné připravit terapeutické peptidy namířené proti CTLA-4. Návrh a screening peptidových léčib byly např. popsány v publikacích Houghten et al. Biotechniques 13:412-421 (1992), Houghten PNAS USA

82:5131-5135 (1985), Pinalla et al. Biotechniques 13:901-905 (1992), Blake a Litzi-Davis BioConjugate Chem. 3:510-513 (1992) . Imunotoxiny a radioaktivně značené protilátky mohou být připraveny podobným způsobem, jako peptidové části, jak bylo diskutováno výše pro protilátky.

Důležité informace týkající se vazby protilátky a antigenu mohou být získány experimenty s fágovou expozicí (fágový displej). Takové experimenty se obecně provádějí rýžováním fágové knihovny exprimující náhodné peptidy na vazbu s protilátkou podle vynálezu, a pak určením, zda peptid, který se váže, může být izolován. Pokud je pokus úspěšný, z peptidu, který se váže, je možné získat určité informace o epitopu.

Obecně fágové knihovny exprimující náhodné peptidy mohou být koupeny od firmy New England Biolabs (knihovny 7-merů a 12-merů, souprava Ph.D.-7 Peptide 7-mer Library Kit a Ph.D.-12 Peptid představují valnou většinu, pokud ne všechny, z 20⁷ = 1,28 x 10⁹ sekvencí 7-merů. Knihovna 12-merů představuje diverzitu přibližně 1,9 x 10⁹ nezávislých klonů, které představují jen velmi malou část možných 2O¹² = 4.1 x 10¹⁵ sekvencí 12-merů.

« ·

Každá z knihoven 7-merů a 12-merů byla rýžována nebo screenována podle návodu výrobce, kde destičky byly potaženy protilátkou k zachycení vhodné protilátky (např. kozí anti-lidský IgG Fc pro IgG protilátku) a pak opláchnuty. Navázaný fág byl eluován 0,2 M glycin-HCl, pH 2,2. Po třech opakováních cyklů selekce/amplifikace při konstantní stringenci (0,5% Tween) bylo možné pomocí sekvencování DNA charakterizovat klony z knihovny, které reagovaly s jednou nebo více protilátkami, reaktivita peptidů se může určit pomocí ELISA. Pro další diskusi o epitopové analýze peptidů viz např. také Scott, J.K. a Smith, G.P. Science 249:386-390 (1990); Cwirla et al. PNAS USA 87:63786382 (1990); Felici et al. J. Mol. Biol. 222:301-310 (1991), and Kuwabara et al. Nátuře Biotechnology 15:74-78 (1997).

Návrh a příprava genových léčiv a antisense léčiv konvenčními metodami jsou také usnadněny prostřednictvím předkládaného vynálezu. Tyto formy léčiv se mohou užít pro modulaci funkce CTLA-4. V této souvislosti protilátky podle vynálezu usandňují návrh a použití funkčních testů. Návrh a příprava antisense léčiv byly podrobně diskutovány např. v mezinárodní patentové přihlášce WO 94/29444. Návrhy a strategie pro genovou terapii jsou odborníkům známy. Avšak ve specifickém případě použití metod užívajících intrabodies může být zvláště výhodné. Viz např. Chen et al . Human Gene Therapy 5:595-601 (1994) a Marasco Gene Therapy 4:11-15 (1997). Obecné návrhy a úvahy týkající se léčiv vhodných pro genové terapie lze najít např. Také mezinárodní patentové přihlášce WO 97/38137. Genetické materiály kódující protilátky podle vynálezu (jako např. 4.1.1, 4.8.1 nebo 6.1.1, a další) se vloží do vhodného expresního systému (ve formě viru, atenuovaného viru, nevirové formě, nahé formě nebo jiné) a podají se příjemci, a pak se protilátky tvoří in vivo v příjemci/hostiteli.

·> · • * · ·

Léčiva zvaná malé molekuly lze také připravovat užitím předkládaného vynálezu. Lze navrhnout taková léčiva, která budou modulovat aktivitu CTLA-4. Znalosti získané ze struktury CTLA-4 a interakce s jinými molekulami podle vynálezu, např. CD28, B7, B7-1, B7-2, a dalšími, se mohou využít k racionálnímu návrhu dalších forem léčiv. V tomto ohledu mohou být využity metody racionálních návrhů léčiv jako je rentgenová krystalografie, počítačové molekulové modelování (CAMM), kvantitativní nebo kvalitativní analýza vztahu struktura-aktivita (QSAR) a podobné metody, k dalšímu upřesnění cílů při objevování nových léčiv. Metody racionálního navrhování dovolují predikovat proteinové nebo syntetické struktury, které reagují s molekulou nebo její specifickou formou, a které mohou být užity k modifikaci nebo modulaci aktivity CTLA-4. Takové struktury se mohou syntetizovat chemicky nebo exprimovat v biologických systémech. Tyto metody byly v přehledu uvedeny např. v Capsey et al. Genetically Engineered Human Therapeutic Drugs (Stockton Press, NY (1988)). A skutečně racionální návrh molekul (peptidů, peptidomimetic, malých molekul apod.) založený na známém, nebo alespoň nastíněném, vztahu mezi strukturou a aktivitou s jinými molekulami (jako jsou např. protilátky podle vynálezu), se nyní obecně stává rutinním postupem. Viz např. Fry et al. Specific, irreversible inactivation of the epidermal growth factor receptor and erbB2, by a new class of tyrosine kinase inhibitor Proč Nati Acad Sci USA 95:12022-7 (1998); Hoffman et al. A model of Cdc25 phosphatase catalytic domain and Cdk-interaction surface based on the presence of a rhodanese homology domain J Mol Biol 282:195-208 (1998); Ginalski et al. Modelling of active forms of protein kinases: p38--a čase study Acta Biochim Pol 44:557-64 (1997); Jouko et al. Identification of csk tyrosine phosphorylation sites and a tyrosine residue important for kinase domain structure Biochem J 322:927-35 • · (1997); Singh et al. Structure-based design of a potent, selective, and irreversible inhibitor of the catalytic domain of the erbB receptor subfamily of protein tyrosine kinases J Med Chem 40:1130-5 (1997); Mandel et al. ABGEN: a knowledgebased automated approach for antibody structure modeling Nat Biotechnol 14:323-8 (1996); Monfardini et al. Rational desig analysis, and potential utility of GM-CSF antagonists Proč Assoc Am Physicians 108:420-31 (1996); Furet et al. Modelling study of protein kinase inhibitors: binding mode of staurosporine and origin of the selectivity of CGP 52411 J Comput Aided Mol Des 9:465-72 ( 1995).

Jako další možnost se mohou připravit a syntetizovat kombinační knihovny a použít ve screeningových programech, jako jsou např. vysokovýkonné screenigové programy.

Formulace léčiv a jejich podávání

Léčiva obsahující sloučeniny podle vynálezu se podávají formulována s vhodnými nosiči, excipienty a dalšími činidly, která jsou součástí farmaceutického přípravku, aby se zlepšil přenos, příjem, tolerance apod. Existují mnohé vhodné lékové formy, jak je známo odborníků v oboru farmaceutické chemie, a jak bylo popsáno např. v publikaci Remington's Pharmaceutical Sciences (15th ed. , Mack Publishing Company, Easton, PA (1975)), zejména kapitola 87: Blaug a Seymour. Takové přípravky obsahují např. prášky, pasty, masti, želé, vosky, oleje, tuky, vesikuly (kationtové nebo anionotvé) obsahující tuky (jako je např. Lipofectin™), DNA konjugáty, bezvodé absorpční pasty, emulze typu olej ve vodě nebo typu vody v oleji, emulzní karbovosky (polyethylenglykoly různých molekulových hmotností), polotuhé gely a polotuhé směsi obsahující karbovosky. Kterákoliv výše uvedená směs může být vhodná pro použití vynálezu za předpokladu, že účinná složka přípravku není inaktivována těmito pomocnými látkami pro formulaci přípravku a že přípravek je fyziologicky kompatibilní a tolerovatelný při daném způsobu podávání. Pro další informace týkající se excipientů a nosičů, které jsou odborníkům ve farmaceutické chemii známy, viz také Powell et al. Compendium of excipients for parenteral formulations PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998).

Příprava protilátek

Protilátky podle předkládaného vynálezu se výhodně připravují prostřednictvím transgenních myší, které obsahují vloženou podstatnou část lidského genomu produkujícího protilátky a naopak jsou deficientní v produkci endogenních myších protilátek. Takové myši jsou pak schopné produkovat molekuly lidského imunoglobulinu a protilátek a jsou deficientní v produkci myších imunoglobulinových molekul a protilátek. Postupy vhodné k dosažení tohoto cíle byly popsány v patentech, patentových přihláškách a dalších publikacích, které jsou uvedeny ve stavu techniky. Výhodné provedení transgenních myší a produkce protilátek je popsáno v U.S. patentové přihlášce č. 08/759,620, podané 3.12.1996, a dále také viz Mendez et al. Nátuře Genetice 15:146-156 (1997) , což je

Použitím plně zahrnuto těchto metod formou odkazu.

monoklonální byly celé protilátky k Podstata postupu spočívala v tom, byly imunizovány požadovaným připraveny plnjě lidské řadě různých antigenů. že myši linií XenoMouse“ antigenem, z myši, která exprimovala požadované protilátky byly odebrány lymfatické buňky (jako např. B-lymfocyty), fúzovány s buňkami myeloidní linie, čímž se získaly imortalizované hybridomové linie a tyto hybridomové linie se pak podrobily screeningu a selekci, kdy byly identifikovány hybridomové buněnčné linie produkující protilátku specifickou k požadovanému antigenů.

V předkládaném vynálezu byly tyto metody použity pro přípravu protilátek specifických k CTLA-4. Popisuje se zde proto příprava mnoha hybridomových linií, které produkují

protilátky specifické proti CTLA-4. Dále vynález poskytuje charakteristiky těchto protilátek, včetně analýz nukleotidých a aminokyselinových sekvencí těžkého a lehkého řetězce těchto protilátek.

Protilátky pocházející z výše uvedených hybridomových linií byly označeny 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.13.1,

4.14.3, 6.1.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 a 12.9.1.1. Každá z těchto protilátek představuje plně lidský buďto IgG2 nebo IgG4 řetězec s lidským lehkým řetězcem kapa. Obecně řečeno protilátky podle vynálezu mají velmi vysokou afinitu, typicky mají hodnoty Kd od 10'⁹ do 10~^1:lM, když jsou měřeny v pevné nebo kapalné fázi.

Protilátky podle vynálezu mohou být exprimovány i v jiných buňkách či buněčných liniích než jen hybridomových.

Sekvence kódující cDNA nebo genomické klony určitých protilátek mohou být užit pro transformaci buněk vhodného hostitele, kterým je savec nebo organismus jiný než savec. K transformaci lze užít jakoukoliv známou metodu pro vnesení polynukleotidů do hostitelské buňky, včetně metod jako je např. sbalení (pakážování) polynukleotidu do viru (nebo do virového vektoru a transdukce hostitelské buňky virem (vektorem), nebo transfekcí, jak byly např. popsány v U.S. Patentech č. 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 a 4,959,455 (které jsou zahrnuty formou odkazu). Použitá metody transformace závisí na hostiteli, který má být transformován. Metody pro vnášení hetrologních polynukleotidů do savčích buněk jsou odborníkům známy a patří k nim, aniž by však tento výčet byl vyčerpávající, dextranem zprostředkovaná transfekce, precipitace s kalciumfosfátem, transfekce zprostředkovaná polybrenem, fúze protoplastů, elektroporace, bombardování mikročásticemi, enkapsulace polynukleotidu do lipososmů, peptidové konjugáty, dendrimery a přímé mikroinjkece DNA do jádra.

• · · ·

Linie savčích buněk vhodných jako hostitelské buňky pro expresi jsou odborníkům dobře známy a patří k nim mnoho imortalizovaných buněčných linií dostupných v Americké sbírce kultur a mikroroganismů (ATCC), jako jsou např. buňky vaječníků čínksého křečka (CHO), buňky NSO₀, buňky HeLa, buňky BHK (křeččí fetální ledviny), COS buňky (opičích ledvin), buňky lidského hepatocelulárního karcinomu (např. Hep G2) a celá řada dalších buněčných linií. K vhodným buňkám, které nejsou ze savců, a které mohou být užity pro expresi rekombinantních protilátek patří, avšak výčet tím není omezen, např. bakteriální buňky, kvasinky, houby, hmyz a rostliny. Místně cílená mutageneze protilátkové domény CH2, která eliminuje glykosylaci, je výhodná k tomu, aby se zabránilo změnám v imunogenicitě, farmakokinetice a/nebo efektorových funkcích, které jsou výsledek glykosylace lišící se od lidského glykosylačního profilu. Metody exprese se vybírají na základě toho, že se stanoví, který systém produkuje nejvyšší expresní hladiny a tvoří protilátky s konstitutivními vazebnými vlastnostmi pro CTLA-4.

Dále exprese protilátek podle vynálezu (nebo jiných sloučenin) v produkčních liniích může být zesílena řadou známých metod. Tak např. expresní systém glutaminsyntetázy a DHFR jsou známé systémy pro zvýšení exprese za jistých podmínek. Buněčné klony s vysokou expresí mohou být identifikovány konvenčními metodami, jako je např. klonování limitního ředění a nebo technika mikrokapky. Systém GS byl podrobně popsán a diskutován ve spojení s Evropskými patenty č. 0 216 846, 0 256 055 a 0 323 997 a evropskou patentovou přihláškou č. 5 89303964.4.

Protilátky podle vynálezu mohou být připraveny také transgenním způsobem, a sice vytvořením transgenního zvířete nebo transgenní rostliny, které je transgenní na požadované sekvence těžkého a lehkého řetězce imunoglobulinu, a produkcí protilátek v izolovatelné formě. Pokud jde o transgenní • · savce, protilátky mohou být produkovány do mléka, ze kterého jsou pak izolovány, a sice u kozy, krávy a jiných savců (viz patenty U.S. č. 5,827,690, 5,756,687, 5,750,172, a 5,741,957.

Protilátky podle předkládaného vynálezu byly analyzovány strukturně i funkčně. Ve spojení se strukturami protilátek byly aminokyselinové sekvence těžkého a kapa lehkého řetězce predikovány na základě cDNA sekvencí získaných pomocí RT-PCR hybridomů. Viz příklady 3 a 4 a obrázky 1 až 8. Sekvencování A-konců protilátek bylo také provedeno pro potvrzení výsledků diskutovaných v příkladech 3 a 4. Viz také příklad 5 a obr. 9. Kinetické analýzy protilátek byly provedeny ke stanovení jejich afinit, viz příklad 2. Protilátky podle vynálezu (zejména 4.1.1, 4.8.1 a 6.1.1) mají vysoké afinity (4.1.1: 1,63 X ΙΟ¹⁰ 1/M, 4.8.1: 3,54 X ΙΟ¹⁰ 1/M; a 6.1.1: 7,2 x 10⁹

1/M). Dále byly zaostřováním (IEF), protilátky redukuj ící

PAGE), velikostní vylučovací analyzovány izoelektrickým gelovou elektroforézou (SDSchromatografií, kapalinovou chromatografií a hmotovou spektroskopií a vhodnocením tvorby protilátek hybridomy. Viz příklad 6 a obr. 10.

Pokud jde o funkční analýzu protilátek podle vynálezu, tyto protilátky se ukázaly být silnými inhibitory CTLA-4 a jeho vazby na ligandy z rodiny molekul B7. Tak např. bylo ukázáno, že protilátky podle vynálezu blokovaly vazbu CTLA-4 jak na B7-1 tak i B7-2. Viz příklad 7. Skutečně, mnoho protilátek podle vynálezu má hodnotu IC₅₀ pro inhibici vazby CTLA-4 na B7-1 nebo B7-2 řádu nanomolů a nižší, kromě toho protilátky podle vynálezu mají vynikající selektivitu pro CTLA-4 ve srovnání např. s CD2 8, CD44, B7-2 nebo hlgGl. Viz příklad 8. Selektivita je poměr, který odráží stupeň preference vazby molekuly s prvním činidlem ve srovnání s druhým, a případně dalším, činidlem. V předkládaném popisu se termín selektivita týká stupně preference vazby protilátky podle vynálezu k CTLA-4 ve srovnání s vazbou protilátky s jinými molekulami, jako např. CD28, CD44, B7-2 nebo hlgGl.

• ·

Hodnoty selektivity protilátek podle vynálezu vyšší než 500:1 jsou běžné. Bylo také ukázáno, že protilátky podle vynálezu indukují nebo zvyšují expresi některých cytokinů (jako např. IL-2 a IFN-γ) v kultuře T lymfocytů a v modelu T lymfoblastů. Viz příklady 9 a 10 a také obrázky 12 až 17. Lze také očekávat, že protilátky podle vynálezu budou inhibovat růst nádorů ve vhodných in vivo modelech nádorů. Návrh takových modelů je popsán a diskutován v příkladech 11 a 12.

Výsledky popsané v předkládané přihlášce ukázaly, že protilátky podle vynálezu mají určité výhodné vlastnosti, pro které jsou vhodnější a účinnější než v současnosti užívané protilátky proti CTLA-4.

Zejména protilátky 4.1.1, 4.8.1 a 6.1.1 podle vynálezu mají výhodné vlastnosti. Jejich strukturní charakteristiky, funkce nebo aktivity poskytují měřítka, která usnadňují návrh a selekci dalších protilátek nebo jiných typů molekul, jak již bylo diskutováno výše. K těmto kritériím patří jedno nebo více z následujících:

schopnost kompetovat o vazbu k CTLA-4 s jednou nebo více protilátkami podle vynálezu, podobná vazebná specificita k CTLA-4 jako má jedna nebo více protilátek podle vynálezu, vazebná afinita k CTLA-4 10'⁹ nebo vyšší, výhodně 1O¹⁰ nebo vyšší, nereeaguje křížově s CTLA-4 nižších savců, j ako j e např.

myš, potkan, králík, výhodně nereeaguje s

CTLA-4 myši a potkana, reaguje křížově s CTLA-4 primátů, výhodně cynomolgního makaka (Macaca fascicularis) mullata), selektivita pro CTLA-4 proti je alespoň 100:1 nebo vyšší, a makaka rhesus (Macaca

CD2B, B7-2, CD44 nebo hlgGl výhodně 3 0 0, 400 nebo 500:1 nebo vyšší, ···· · *♦· • ·

IC50 blokování	CTLA-4 vazby na B7-2	je	100	nM nebo	nižší,
výhodně 5, 4,	3, 2, 1, 0,5 nebo 0,38	nM	nebo	nižší,
IC50 blokování	CTLA-4 vazby na B7-1	je	100	nM nebo	nižší,
výhodně 5, 4,	3, 2, 1, 0,5 nebo 0,50	nM	nebo	nižší,
zvyšuje produkci cytokinů v jednom	nebo	více in	ví tro

testech, např.

zvyšuje produkci IL-2 v testu T lymfoblasty/Raji buňky o 500 pg/ml nebo více, výhodně 750, 1000, 1500, 2000, 3000 nebo 3846 pg/ml, zvyšuje produkci IFN-γ v testu T lymfoblasty/Raji buňky o 500 pg/ml nebo více, výhodně 750, 1000 nebo 1233 pg/ml nebo více, zvyšuje produkci IL-2 v testu hPBMC nebo testu superantigenu celé krve o 500 pg/ml nebo více a výhodně 750, 1000, 1200 nebo 1511 pg/ml nebo více, vyjádřeno jinak produkce IL-2 je zvýšena o 30, 35, 40, 45, 50 procent a více při srovnání s kontrolním testem.

Očekává se, že protilátky podle vynálezu (nebo molekuly na jejich základě navržené nebo syntetizované), mající jednu nebo více z uvedených vlastností, budou mít také podobnou účinnost jako protilátky podle předkládaného vynálezu.

Požadované funkční vlastnosti popsané výše vedou k vazbě na CTLA-4 a inhibici vazby CTLA-4 molekulou (např. protilátkou, protilátkovým fragmentem, peptidem, malou molekulou) podobným způsobem jako se chová protilátka podle vynálezu (tj . vazbou na stejný nebo podobný epitop molekuly CTLA-4) .

Molekula podle vynálezu se podává buďto přímo (tj. přímé podávání molekul pacientovi) nebo se může podávat nepřímo (tj . např. podáváním peptidu nebo podobné molekuly, která vyvolá imunitní reakci u pacienta, podobně jako vakcína, a tato reakce zahrnuje tvorbu protilátek, které se váží na stejný nebo podobný epitop nebo protilátku nebo její • ·

fragment, které jsou produkovány po podání genetického materiálu, který kóduje takové protilátky nebo jejich fragmenty vázající se stejný nebo podobný epitop). Takže je jasné, že epitop na CTLA-4, ke kterému se váží protilátky podle vynálezu, je užitečný ve spojení s přípravou léčiv podle vynálezu. Při návrhu léčiv bývá stejně tak důležitá i negativní informace (tj . skutečnost, že protilátka, která se váže na CTLA-4, se neváže na epitop, který působí jako inhibitor CTLA-4, je užitečná). Takže epitop, na který se váží protilátky podle vynálezu, které nevedou k požadovaným funkcím, může být také velmi důležitý. Tudíž do rozsahu předkládaného vynálezu spadají také molekuly (a zejména protilátky), které se váží na stejný nebo podobný epitop jako protilátky podle předkládaného vynálezu.

Kromě toho, že předmětem předkládaného vynálezu jsou protilátky a lze tudíž uvažovat i epitopy, na které se váží, byly provedeny i předběžné studie mapování epitopů pro určité protilátky podle vynálezu, zejména protilátky 4.1.1 a 11.2.1

Jako první krok byly provedeny kompetiční studie BIAcore pro vytvoření hrubé mapy vazeb mezi protilátkami podle vynálezu také ve spojení s jejich schopností kompetovat o vazbu s CTLA-4. Pro tento účel byl CTLA-4 navázán na čip BIAcore a první protilátka, za saturujících podmínek, byla navázána na čip a pak byla měřena kompetiční vazba následné sekundární protilátky na CTLA-4. Tato metoda umožňuje vytvoření hrubé mapy, podle které lze klasifikovat rodiny protilátek.

Tímto způsobem bylo stanoveno, že protilátky podle vynálezu lze rozdělit do následujících epitopových kategorií.

• ·

Kategorie	Protilátka	Kompetice o vazbu CTLA-4
A	B01M*	Plně křížově kompetují navzájem, křížově kompetují s kategorií B, do jisté míry kompetují s kategorií D
B02M*
B	4.1.1	Plně křížově kompetují navzájem, křížově kompetují s kategorií A, C a D
4.13.1
C	6.1.1	Plně křížově kompetují navzájem, křížově kompetují s kategorií B a D
3.1.1
4.8.1
11.2.1
11.6.1
11.7.1
D	4.14.1	křížově kompetují s kategorií C a B, do jisté míry s kategorií A
E	4.9.1	BNI3 blokuje vazbu 4.9.1 na CTLA-4, ale ne naopak
BNI3***

(*) a (**) jsou dostupné od Biostride (***) jsou dostupné od Pharmingen

V dalším kroku se původci pokusili stanovit, zda protilátky podle vynálezu rozpoznávají lineární epitop na CTLA-4 z aredukujících a neredukujících podmínek metodou westernového přenosu (western blot). Bylopozorováno, že žádná z protilátek 4.1.1, 3.1.1, 11.7.1, 1 1.6.1 nebo 11.2.1 nerozpoznávala redukovanou formu CTLA-4 na westernovém přenosu. Tudíž se zdá, že všechny epitopy rozpoznávané příslušnými protilátkami nejsou lineární epitopy, ale spíše konformační epitop, jehož struktura je zrušena v redukujících podmínkách.

Tudíž bylo dále zkoumáno, zda je možné něco zjistit o aminokyselinových zbytcích, které jsou důležité pro vazbu protilátek podle vynálezu. Jednou metodou bylo užití kinetické metody stanovení rychlostních konstant pro lidský • · • « ··»·· ·· • ····»*··· • · ···««·

CTLA-4 a dva vysoce konzervativní CTLA-4 primátů (makak, Macaca fascicularis a marmoset, Callithrix jacchuss). Studie pomocí techniky BIAcore ukázaly, že protilátka podle vynálezu 4.1.1 se váže na CTLA-4 člověka i obou primátů stejnou rychlostí. Avšak vzhledem ke kinetice se ukázalo, že protilátka 4.1.1 má nejvyšší afinitu (nejmenší rychlost rozpadu) pro lidský CTLA-4, rychlejší rozpad pro CTLA-4 makaka a ještě mnohem rychlejší pro marmoseta. Naproti tomu protilátka 11.2.1 se váže na CTLA-4 člověka i obou primátů se stejnou rychlostí, přitom má i stejné afinity (rychlosti rozpadu) pro všechny tři CTLA-4. Tato informace dále ukazuje, že protilátky 4.1.1 a 11.2.1 se váží na různé epitopy CTLA-4.

Pro další zkoumání epitopů, na které se váží protilátky kategorie B a C podle vynálezu byly provedeny studie s místně cílenou mutagenezí. CTLA-4 marmoseta má proti lidskému dva významné rozdíly, a sice ve zbytcích 105 a 106. Tyto rozdíly jsou změna lučinu na methionio v pozici 105 a glycinu na serin v pozici 106. Tudíž byla mutována cDNA kódující lidský CTLA-4 tak, aby kódovala mutovaný CTLA-4 mající záměny L105M a G106S. Homologní náhrada mutovaného CTLA-4 neovlivnila vazbu B7.2-IgGI fúzního proteinu. Avšak tato molekula byla významně inhibována ve schopnosti vázat se na protilátku 4.1.1 podle vynálezu (podobně marmoset). Dále byla mutován cDNA marmoseta kódujcí CTLA-4, čímž byla vytvořena mutanta CTLA-4 marmoseta obsahující záměnu S106G. Tato záměna vedla k obnovení původní stabilní vazby. Kromě toho byla připravena mutanta CTLA-4 marmoseta majííc záměnu M105L. Tato záměna částečně obnovila vazbu mezi protilátkou 4.1.1 a mutovaným CTLA-4 .

Každá z kategorií protilátek A až D podle vynálezu se zdá mít podobné funkční vlastnosti a má zřejmě potenciál působit jako silné teraputické činidlo anti-CTLA-4. Dále každá z molekul vykazuje jistou křížovou kompetici ve vazbě k CTLA-4. Avšak jak již bylo výše diskutováno, každá z molekul ·· » ·4· · ···· · · * ·· C « · C * β 4 · ·· • » a · · · ··«· * * ···· ♦ · ·····«·· ·· ·» ·· · různých kategorií se zjevně váže na samostatný konformační epitop CTLA-4.

Z předchozích údajů a diskusí vyplývá, že informace o epitopech diskutoavné výše ukazují, že protilátky (nebo jiné molekuly) podle vynálezu, které křížově kompetují s protilátkami, budou mít zřejmě značný terapeutický potenciál. Dále lze čekat, že že protilátky (nebo jiné molekuly) podle vynálezu, které křížově kompetují s protilátkami podle vynálezu (tj. křížově kompetují s protilátkami skupin B, C a/nebo D, budou mít podle předkládaného vynálezu další terapeutický potenciál. A dále lze čekat, že že protilátky (nebo jiné molekuly) podle vynálezu, které křížově kompetují s protilátkami podle vynálezu (tj . křížově kompetují s protilátkami skupin B, C a/nebo D) a I) nemají sníženou vazbu s CTLA-4 marmoseta (podobné protilátkce 111.2.1) nebo II) mají sníženou vazbu s

CTLA-4 marmoseta, budou mít podle předkládaného vynálezu další terapeutický potenciál, molekuly) podle vynálezu, s protilátkami skupin A a E

Také protilátky (nebo jiné které křížově kompetují podle vynálezu mají určitý terapeutický potenciál.

··

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady a dosažených výsledků jsou účely a předkládaný vynález včetně provedených pokusů uvedeny pouze pro ilustrativní ijak neomezují.

Příklad 1

Příprava hybridomů produkujících protilátku anti-CTLA-4

Protilátky podle vynálezu byly připraveny, selektovány a testovány podle popsaného příkladu.

Příprava antigenu:

Pro imunizaci myší XenoMouse™ byly připraveny tři rozdílné imunogeny: i) fúzní protein CTLA-4-IgG, ii) peptid CTLA-4 a iii) buňky myšího lymfomu 300,19 transfekované mutantou CTLA-4 (Y201V), která je konstitutivně exprimovaná na buněčném povrchu.

i) fúzní protein CTLA-4-IgG

Konstrukce expresního vektoru:

cDNA kódující zralou extracelulární doménu CTLA-4 byla amplifikována pomocí PCR z cDNA knihovny lidského thymu (Clontech) s použitím primerů navržených podle publikované sekvence (Eur. J. Immunol., 18, 1901-1905, 1988). Fragment byl směrově subklonován do pSR5, expresního plazmidu viru Sindbis (InVitrogen), mezi domény CH1/CH2/CH3 signálního peptidu lidského onkostatinu M a lidského IgG gama 1 (IgGl). Fúzní protein neobsahuje kloubovou doménu, ale obsahuje cystein 120 v extracelulární doméně CTLA-4 za vzniku kovalentního dimeru. Výsledný vektor byl nazván CTLA-4• ·

IgG/pSR5. Sekvence kompletní cDNA CTLA-4-IgGl ve vektoru byla potvrzena v obou vláknech. Aminokyselinová sekvence proteinu CTLA-4-Ig je ukázána níže. Zralá extracelulární doména pro CD44 byla amplifikována pomocí PCR z lidské lymfocytové knihovny (Clontech) a subklonována do pSinRep5 za vzniku kontrolního proteinu s identickým koncem IgGl.

Fúzní protein OM-CTLA4-IgGl:

MGVLLTORTLLSLVLALLFPSMASMAMHVAOPAWLASSRGIAS FVC

EYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICT GTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIY VIDPEPCPDSDLEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPE

VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRIZVSVLTVLHQDWLNGKE YKCKVSNKALPTPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Podtrženo: signální peptid

Tučně: extracelulární doména CTLA-4 cDNA pro zralou extracelulární doménu CD28 byly amplifikovány pomocí PCR z lidské lymfocytové knihovny (Clontech), a pak subklonovány do pCDM8 (J. Immunol., 151, 5261-71, 1993) za vzniku fúzního proteinu lidského IgGl obsahujícího oblast štěpení trombinem a kloubovou oblast.

CTLA-4 z opic

Macaca mullata

Callithrix jacchuss, Macaca fascicularis a byl klonován z mRNA izolované z PBMC stimulovaných

PHA s použitím standardních technik degenerované PCR. Sekvencování prokázalo, že aminokyselinové sekvence opis rhesus a cynomologous byly totožné, se třemi odlišnostmi oproti zralé lidské extracelulární doméně CTLA-4 (S13N, I17T a L105M). U opic C. jacchuss bylo prokázáno deset aminokyselinových odchylek od zralé lidské extracelulární • e • · · • · • * ···· ···· cdomény CTLA-4 (V21A, V33I, A41T, L105M a G106S). Místně cílená vytváření jednobodových mutací v marmoset CTLA-4 pro mapování

T88M,

A51G, 541, S71F, Q75K, mutageneze byla použita pro všech aminokyselin odlišných aminokyselin důležitých pro interakci protilátek s lidským CTLA-4-IgG. Mutace marmoset CTLA-4-IgG pro epitopové mapování byly místně cílené lidského a pomocí značkovací soupravy (Promega). Fúzní proteiny přechodné transfekce buněk standardních technik Protein pro

IgG

Cos7

A. U vytvářeny mutageneze byly produkovány pomocí a purifikovány s použitím mutovaných proteinů CTLA-4k protilátkám prostřednictvím

IgG byla hodnocena vazba imunopřenosu (imunoblotting) a s použitím analýz BIAcore.

Exprese/purifikace rekombinantního proteinu

Rekombinantní virus Sindbis vznikal elektroporací (Gibco) buněk z embryonálních ledvin křečka s SP6 in vitro transkribovanou mRNA CTLA-4-IgGl/pSR5 a pomocnou mRNA DH-26S, jak popsáno firmou InVitrogen. Rekombinantní virus byl sklízen čtyřicet osm hodin později a titrován na optimální expresi proteinu v buňkách ovarií čínského křečka (CHO-K1). Buňky CHO-K1 byly pěstovány v suspenzi DMEM/F12 obsahuj ící (Gibco), (Gibco), penicilin/streptomycin (Gibco) . Tiby resuspendovány inkubovány místnosti.

byly pěstovány v suspenzi

10% teplem inaktivované fetální 1 neesenciální aminokyseliny (Gibco), (Gibco) , lOmM produkovaly CTLA-4-IgG, byly v množství lxlO⁷ buněk/ml v virem Sindbis jednu hodinu byly buňky naředěny na lxl0⁶/ml v DMEM/F12 fetální bovinní sérum zbavené (Gibco) bovinní sérum

Pak

1%

4mM glutamin

Hepes pH 7,5 buňky CH0-K1

DMEM/F12 a při teplotě obsahuj ícím s použitím aminokyseliny, 4mM glutamin, 12,5mM Hepes penicilin/streptomycin. Čtyřicet osm hodin po buňky peletovány a kondicionovaná média byla doplněna tabletami úplného inhibitoru proteáz (Boehringer

Protein A Sepharose (Pharmacia), 4mM glutamin, 12,5mM Čtyřicet osm kondi c i onovaná bovinního IgG neesenciální pH 7,5, a infekci byly sklizena a ·

• · · • · · · • · · ·

Mannheim), pH bylo upraveno na 7,5, a média byla filtrována přes 0,2 filtr (Nalgene) . FPLC (Pharmacia) byla použita pro afinitní purifikaci fúzního proteinu s použitím 5ml kolony A

HiTrap (Pharmacia) při rychlosti průtoku 10 ml/minutu. Kolona byla promyta PBS 30 objemy kolony a eluována O,1M glycinem/HCl, pH 2,8, rychlostí 1 ml/minutu. Frakce (1 ml) byly okamžitě neutralizovány na pH 7,5 pomocí Tris pH 9. Frakce obsahující CTLA-4-IgGl byly identifikovány prostřednictvím SDS-PAGE, a pak koncentrovány s použitím Centriplus 50 (Amicon) před aplikací na kolonu Sepharose 200 (Pharmacia) rychlostí 1 ml/minutu s použitím PBS jako rozpouštědla. Frakce obsahující CTLA-4-IgGl byly sloučeny, sterilizovány filtrací 0,2 (Millipore), rozděleny na poměrné části a zmraženy v -80°C. CD44-IgGl byl exprimován a purifikován s použitím stejných metod. CD28-IgG byl purifikován z kondicionovaných médií od přechodně transfekovaných buněk Cos7.

Charakterizace CTLA-4-IgGl

Purifikovaný CTLA-4-IgGl migroval jako jeden pás na SDS-PAGE při použití barvení koloidní modří Coomassie (Novex). Za neredukujících podmínek byl CTLA-4-IgGl dimer (lOOkD), který se redukoval na monomer o velikosti 50 kD, když byl ošetřen 50mM DTT. Sekvencování aminokyselin purifikovaného CTLA-4-IgGl v roztoku potvrdilo N-koncovou část CTLA-4 (MHVAQPAWLAS) a to, že signální peptid onkostatinu M byl odštěpen ze zralého fúzního proteinu.

CTLA-4-IgGl se vázal na imobilizovaný B7.1-IgG způsobem závislým na koncentraci a vazba byla blokována křeččí protilidskou anti-CTLA-4 protilátkou (BNI3, PharMingen). Sterilní CTLA-4-IgG byl bez endotoxinu a byl kvantifikován při OD280 s použitím 1,4 jako extinčního koeficientu. Výtěžek purifikovaného CTLA-4-IgG se pohyboval v rozmezí 0,5 až 3 mg/1 buněk CHO-K1.

• · • · (ii) CTLA-4 peptid

Následující peptid CTLA-4 byl připraven tak, jak je popsáno dále:

NH_2: MHVAQPAWLAS SRGI AS FVCEYAS PGKATEVRVTVLRQADSQVT EVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTS SGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICK VELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPC-CONHz

Zkratky/materiál:

NMP, N-methylpyrolidinon; TFE, 2,2,2-trifluoroethanol; DCM, dichloromethan; FMOC, fluorenylmethoxykarbonyl. Všechny reagencie byly dodávány firmou Perkin Elmer s následujícími výjimkami: TFE od firmy Aldrich Chemical, FMOC-PAL-PEG pryskyřice od firmy Perseptive Biosystems. Pro ty aminokyseliny, které vyžadují ochranné skupiny postranních řetězců, byly použity: Fmoc-Arg(PMC)-OH, FMOC-Asn(Trt)-OH, FMOC-Asp(tBu)-OH, FMOC-Cys(Trt)-OH, FMOC-Glu(tBu)-OH, FMOC-Gln(Trt)-OH, FMOC-His(Boc)-OH, FMOC-Lys(BOC)OH, FMOC-Ser(tBu)-OH, FMOC-Thr(tBu)-OH a FMOC-Tyr(tBu)-OH.

Syntéza peptidu

Syntéza peptidu byla prováděna na přístroji Perkin-Elmer 431A dodatečně vybaveném monitorováním vazby prostřednictvím UV absorbance v 301 nm (Perkin-Elmer Model 759A detector). Sekvence peptidu byla syntzetizována na pryskyřici FMOC-PALPEG s použitím kondicionovaných dvojitých kondenzačních cyklů. Zesílené dvojité kondenzační reakce byly prováděny v cyklech 10, 11, 18, 19, 20 a 28 až 33. Pryskyřice byla promyta 50% směsí DCM a TFE při ukončení každého acylačního cyklu, a potom následovalo zakrytí nezreagovaných aminoskupin acetanhydridem v NMP. Pryskyřice byla odstraněna z reaktoru po ukončení cyklu 49 a zbytek pokračoval až do ukončení. Odštěpení peptidu z pryskyřice bylo prováděno

• · ···· ·»·· . 69 s použitím Reagent K (King et al. , International Journal of Protein and Peptide Research, 36, 255-266, 1990) po dobu 6 hodin na 415 mg pryskyřice, která poskytla 186 mg hrubého peptidu CTLA-4.

Charakterizace peptidu

25mg alikvoty hrubého peptidu CTLA-4 byly rozpuštěny v 5 ml 6M guanidin HCl/lOOmM K₂PO₃ při pH 6,4 a eluovány přes kolonu Pharmacia Hi Load Superdex 75 16/60 (16 mm x 600 mm, 12 0 ml objem kolony) s 2M guanidin HCl/lOOmM K₂PO₃ při pH 6,4 rychlostí 2 ml/min po dobu 180 minut a při sběru 5ml frakcí. Frakce byly analyzovány nanesením 1,7 μΐ frakce na gel NuPAGE Laemeli s MES pufrem a vizualizací prostřednictvím Daichiiova protokolu barvení stříbrem. Frakce mající molekulovou hmotnost 12 kD, jak usuzováno ze srovnání se standardy molekulové hmotnosti, byly sloučeny a uloženy ve 4 °C.

Spojené frakce byly analyzovány pomocí UV a elektroforézy v gelu. Sekvencování aminokyselin bylo prováděno absorpcí vzorku o objemu 100 μΐ na zásobník ProSorb (absorpce na membránu PVDF)a promytím pro odstranění solí pufru. Sekvencování bylo prováděno na přístroji Applied Biosystems 420. Byla pozorována očekávaná N-koncová sekvence (Μ Η V A Q P A V V L A). Imunopřenos prokázal, že peptid byl rozpoznáván CTLA-4 proti-lidskou BNI3 (PharMingen). Pro odsolení byl alikvot obsahující 648 μg materiálu přenesen do dialyzačních trubiček 3 50 0 D MWCO a byl dialyzován proti 0,1% TFA/H₂O ve 4 °C po dobu 9 dnů s mícháním. Veškerý obsah dialyzačního váčku byl lyofilizován na prášek.

(iii) Buňky 300.19 transfekované CTLA-4 (Y201V)

Kompletní cDNA CTLA-4 byla amplifikována pomocí PCR z cDNA knihovny lidského thymu (Stratagene) a subklonována do pIRESneo (Clontech). Byla zavedena mutace CTLA-4, která má za následek konstitutivní expresi na buněčném povrchu s použitím • · systému MatchMaker Mutagenesis (Promega). Mutace tyrosinu Y201 na valin inhibuje vazbu proteinu adaptinu AP50, který je zodpovědný za rychlou internalizaci CTLA-4 (Chuang et al., J. Immunol., 159, 144-151, 1997). Buňky 300.19 myšího lymfomu bez mykoplazmat byly pěstovány v RPMI-1640 obsahujícím 10% fetální telecí sérum, neesenciální aminokyseliny, penicilin/streptomycin, 2mM glutamin, 12,5mM Hepes pH 7,5, a 25 M beta-merkaptoethanol. Buňky byly transfekovány elektroporací (3xl0⁶/0,4 ml RPMI bez séra) v lml komůrce s 2 0 g CTLA-4--Y201V/pIRESneo s použitím 200V/1180uF (Gibco CellPorator). Buňky byly ponechány v klidu 10 minut, a pak bylo přidáno 8 ml předem ohřátého kompletního média RPMI. Za 48 hodin byly buňky naředěny na 0,5xl0⁶/ml kompletním médiem RPMI obsahujícím 1 mg/ml G418 (Gibco). Rezistentní buňky se rozšířily a vykazovaly expresi CTLA-4 na buněčném povrchu při použití protilátky BNI3 konjugované s fykoerythrinem (PharMingen). Buňky s vysokou hladinou exprese byly izolovány sterilním tříděním.

Imunizace a příprava hybridomu

Myši XenoMouse (staré 8 až 10 týdnů) byly imunizovány i) subkutánně do kořene ocasu s lxlO⁷ buněk 300.19, které byly transfekovány tak, aby exprimovaly CTLA-4, jak popsáno výše, a resuspendovány ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfáty (PBS) s kompletním Freundovým adjuvans, nebo ii) subkutánně do kořene ocasu s a) 10 g CTLA-4 fúzního proteinu nebo b) 10 g peptidu CTLA-4 emulgovaného v kompletním Freundově adjuvans. V každém případě byla dávka opakována třikrát nebo čtyřikrát v nekompletním Freundově adjuvans. Čtyři dny před fúzí dostaly myši poslední injekci imunogenu nebo buněk v PBS. Lymfocyty ze sleziny a/nebo lymfatických uzlin z imunizovaných myší byly fúzovány s buněčnou linií myšího nesekrečního myelomu P3 a byly podrobeny selekci HAT tak, jak bylo popsáno dříve (Galfre, G. a Milstein, C., Preparation • ·

of monoclonal ^ntibodies, strategies and procedures. , Methods Enzymol., 73, 3-46, 1981). Byl získán velký panel hybridomů, které všechny sekretovaly CTLA-4 specifické lidské IgG₂K nebo IgG₄K protilátky (jak odhaleno níže).

Test ELISA

ELISA pro zjišťování antigen-specifických protilátek v myším séru a v supernatantech hybridomů byla prováděna tak, jak bylo popsáno (Coligan et al. , oddíl 2.1, Enzyme-linked immunosorbent assays,, Current protocols in immunology, 1994) s použitím CTLA-4-Ig fúzního proteinu k záchytu protilátek. Zvířata, která byla imunizována fúzním proteinem CTLA-4-Ig, původci navíc testovali na nespecifickou reaktivitu proti lidské Ig části fúzního proteinu. To bylo prováděno s použitím ELISA destiček potažených lidským Ig jako negativní kontrolou specifity.

Ve výhodném testu ELISA byly použity následující techniky:

ELISA destičky byly potahovány 100 μΐ/jamku potahovacím pufrem pro destičky s antigenem (O,1M uhličitanový pufr, pH 9,6 a NaHCO₃ (MW 84) 8,4 g/1). Potom byly destičky inkubovány přes noc ve 4 °C. Po inkubaci byl potahovací pufr odstraněn a destička byla blokována 200 μΐ/jamku blokovacího pufru (0,5% BSA, 0,1% Tween 20, 0,01% Thimerosal v 1 x PBS) a inkubována při teplotě místnosti 1 hodinu. Nebo byly destičky s blokovacím pufrem uloženy v lednici a utěsněny. Blokovací pufr byl odstraněn a bylo přidáno 50 μΐ/jamku supernatantu z hybridomů, séra nebo supernatantu z jiného hybridomů (pozitivní kontrola) a média HAT nebo blokovacího pufru (negativní kontrola). Destičky byly inkubovány 2 hodiny při teplotě místnosti. Po inkubaci byly destičky promyty promývacím pufrem (lx PBS). Detekující protilátka (tj . myší proti-lidská IgG2-HRP (SB, #9070-05) pro protilátky IgG2 nebo myší proti-lidská IgG4-HRP (SB #9200-05) pro protilátky IgG4) • 9 » 9

9 9 9 9999 byla přidána v množství 100 μΐ/jamku (myší proti-lidská IgG2HRP v ředění 1:2000 nebo myší proti-lidská IgG4-HRP v ředění 1:1000 (každá naředěná blokujícím pufrem). Destičky byly inkubovány při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny, a pak promyty promývacím pufrem. Potom bylo do jamek přidáno 100 μΐ/jamku čerstvě připraveného vyvíjecího roztoku (10 ml substrátového pufru, 5 mg OPD (o-fenylendiamin, Sigma kat. č. P-7288) a 10 μΐ 30% H₂O₂ (Sigma) . Destičky se ponechaly vyvíjet 10 až 20 minut, dokud se neobjevilo slabé zabarvení v jamkách s negativními kontrolami. Potom bylo přidáno 100 μΐ/jamku stopovacího roztoku (2M H₂SO₄) a destičky byly odečítány na odečítacím zařízení pro destičky ELISA při vlnové délce 490 nm.

Zjišťování afinitních konstant plně lidských Mab pomocí zařízení BIAcore

Měření afinity purifikovaných lidských monoklonálních protilátek, Fab fragmentů nebo supernatantů z hybridomu prostřednictvím plazmonové rezonance bylo prováděno s použitím přístroje BIAcore 2000, s použitím obecných postupů uvedených výrobcem.

Kinetická analýza protilátek byla prováděna s použitím antigenů imobilizovaných s nízkou denzitou na povrchu senzoru. Na třech površích senzorického čipu BIAcore byl imobilizován fúzní protein CTLA-4-Ig v hustotě pohybující se od přibližně 390 do 900 při použití fúzního proteinu CTLA-4Ig v koncentraci 2 0 nebo 50 g/ml v lOmM acetátu sodném, pH 5,0, s použitím soupravy pro kondenzaci aminů dodávané výrobcem (BIAcore, lne.). Na čtvrtém povrchu senzorického čipu BIAcore byl imobilizován IgGl (900 RU) a byl použit jako negativní kontrolní povrch pro nespecifickou vazbu. Kinetická analýza byla prováděna při rychlosti průtoku 25 nebo 50 μΐ/minutu a byly určovány disociační (kd nebo k_Off) a asociační (ka nebo k_on) rychlosti s použitím software

poskytnutého výrobcem (BIA evaluation 3.0), který umožnil celkové výpočty.

Příklad 2

Měření afinity anti-CTLA-4 protilátek

V následující tabulce jsou poskytnuty výsledky měření afinity některých z protilátek takto vybraných.

Tabulka I

	Pevná fáze	(pomocí BIAcore)
Hybridom	Rychlost asociace Ka (M ^S’1 xlO6)	Rychlost disociace (S_1 xl0~4)	Asociační konstanta KA (1/M)=ka/kd xlO10	Disociační konstanta KD (M) =kd/kaxlO~10	Povrchová denzita [RU]
MoabOl	0,68	1,01	0,67	1,48	878,7
	0,70	4,66	0,15	6,68	504,5
	0,77	6,49	0,19	8,41	457,2
	0,60	3,08	0,20	5,11	397,8
4.1.1	1,85	0,72	2,58	0,39	878,7
	1,88	1,21	1,55	0,64	504,5
	1,73	1,54	1,13	0,88	457,2
	1,86	1,47	1,26	0,79	397,8
4.8.1	0,32	0,07	4,46	0,22	878,7
	0,31	0,23	1,33	0,75	504,5
	0,28	0,06	4,82	0,21	397,8
4.14.3	2,81	3,04	0,92	1,08	878,7
	2,88	3,97	0,73	1,38	504,5
	2,84	6,66	0,43	2,35	457,2
	3,17	5,03	0,63	1,58	397,8

• ·

6.1.1	0,43	0,35	1,21	0,83	878,7
	0,46	0,90	0,51	1,98	504,5
	0,31	0,51	0,61	1,63	457,2
	0,45	0,79	0,57	1,76	397,8
3.1.1	1,04	0,96	1,07	0,93	878,7
	0,95	1,72	0,55	1,82	504,5
	0,73	1,65	0,44	2,27	457,2
	0,91	2,07	0,44	2,28	397,8
4.9.1	1,55	13,80	0,11	8,94	878,7
	1,43	19,00	0,08	13,20	504,5
	1,35	20,50	0,07	15,20	397,8
4.10.2	1,00	2,53	0,39	2,54	878,7
	0,94	4,30	0,22	4,55	504,5
	0,70	5,05	0,14	7,21	457,2
	1,00	5,24	0,19	5,25	397,8
2.1.3	1,24	9,59	0,13	7,72	878,7
	1,17	13,10	0,09	11,20	504,5
	1,11	13,00	0,09	11,70	397,8
4.13.1	1,22	5,83	0,21	4,78	878,7
	1,29	6,65	0,19	5,17	504,5
	1,23	7,25	0,17	5,88	397,8

Jak je z údajů vidět, protilátky připravené podle vynálezu mají vysoké afinity a vazebné konstanty.

Příklad 3

Struktury anti-CTLA-4 protilátek připravených podle vynálezu

V následující diskusi jsou poskytnuty strukturální informace týkající se protilátek připravených podle vynálezu.

Tiby se analyzovaly struktury protilátek vytvořených podle vynálezu, vyklonovali původci geny kódující fragmenty • · • · · · • · · • · · · • · byla pocházej ících soupravy Fast-Track s náhodnými specifické lidských V_K

2xl0⁵ myší

Po izolována z přibližně z imunizovaných (Invitrogen) primery následovala PCR. Byly pro variabilní oblasti rodin (Marks et al. , „Oligonucleotide reaction amplification of human těžkého a lehkého řetězce z konkrétního hybridomů. Klonování genů a sekvencování bylo prováděno následovně:

Póly (A) ⁺ mRNA hybridomových buněk XenoMouse s použitím vytvoření cDNA použity primery lidských V_H nebo primers for polymerase chain immunoglobulin variable genes and design of family-specific oligonucleotide probes., Eur. J. Immunol., 21, 985-991,

1991) ve spojení s primery specifickými pro konstantní oblast lidského C 2 (MG-40d, 5 -GCTGAGGGAGTAGAGTCCTGAGGA-3 ) nebo

Ck (hxP2, jak popsáno dříve v transkriptů lidských mAb a řetězce kappa přímým sekvencováním produktů PCR s použitím primerů popsaných výše, klonovány (Invitrogen) konstantní oblast

1994) . Sekvence z těžkého řetězce do pCRII s použitím a obě vlákna byla

Green et al., pocházej ících byly získány póly (A) ⁺ z hybridomů vzniklých z

Produkty PCR byly

TA klonovacího

RNA také kitu sekvencována s použitím sekvencování s terminační barevnou značkou Prism souprav pro a přístrojem pro sekvencování ABI 377. Všechny sekvence byly analyzovány pomocí (Tomlinson

Cambridge,

Geneworks.

et

UK) srovnání s „V BASE sequence directory al., MRC Centre for Protein Engineering, s použitím programového software MacVector a byla

6.1.1 podrobena

Dále

4.8.1, 11.2.1 a

DNA. Pro z přibližně mRNA

Direct toto

4xl0⁶ kit každá z protilátek 4.1.1, sekvencování kompletní sekvencování byla izolována póly(A)⁺ mRNA hybridomových buněk s použitím soupravy (Dynal). mRNA byla reverzně přepsána s použitím a soupravy Advantage RT/PCR kit (Clonetech). databáze variabilních oblastí (V Base) oligo-dT(18)

Byla použita pro navržení

amplifikačních primerů začínajících v počátečním místě ATG těžkého řetězce genu DP50:

-TATCTAAGCTTCTAGACTCGACCGCCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTG-3 a ke stop kodonu konstantní oblasti IgG2:

-TTCTCTGATCAGAATTCCTATCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGCT-3 .

K počátečnímu místu ATG byla přidána 5 optimální Kozáková sekvence (ACCGCCACC). Stejná metoda byla použita pro návrh primerů k počátečnímu místu ATG řetězce kappa genu Ά27:

-TCTTCAAGCTTGCCCGGGCCCGCCACCATGGAAACCCCAGCGCAG-3 a ke stop kodonu kappa konstantní oblasti:

-TTCTTTGATCAGAATTCTCACTAACACTCTCCCCTGTTGAAGC-3 . 012 cDNA byla klonována s použitím primerů k počátečnímu místu ATG: 5 -TCTTCAAGCTTGCCCGGGCCCGCCACCATGGCATGAGGGTCCCCGCT-3 a primerů pro stop kodon kappa konstantní oblasti uvedeného výše. cDNA těžkého řetězce byly také klonovány jako genomové konstrukty místně cílenou mutagenezí přidáním místa Nhel na konec variabilní J domény a subklonováním fragmentu Nhel obsahujícím genomové oblasti IgG2 CHl/kloubová oblast/CH2/CH3. Bodová mutace pro vznik místa Nhel nemění aminokyselinovou sekvenci proti sekvenci zárodečné linie. Páry primerů byly použity pro amplifikaci cDNA s použitím soupravy Advantage High Fidelity PCR Kit (Clonetech). Sekvence z PCR byla získána přímým sekvencováním s použitím sekvenačních souprav s terminační barevnou značkou a přístrojem pro sekvencování ABI. Produkt PCR byl klonován do savčích expresních vektorů pEE-glutaminsyntetáza (Lonza) a tři klony byly sekvencovány pro potvrzení somatických mutací. U každého klonu byla sekvence verifikována na obou vláknech v přinejmenším třech reakcích. Neglykosylovaná protilátka

4.1.1 byla vytvořena místně cílenou mutagenezí N294Q v doméně CH2. Rekombinantní protilátky byly produkovány přechodnou transfekcí buněk Cos7 v FCS bez IgG a purifikovány s použitím standardních technik Protein A Sepharose. Stabilní transfektanty byly vytvářeny elektroporací myších buněk NSO a • ·

selekcí v médiu bez glutaminu. Rekombinantní 4.1.1 s glykosylací nebo bez ní projevovaly identickou speciíitu a afinitu pro CTLA-4 v in vitro testech ELISA a BIAcore.

Analýza utilizace genu

Následující tabulka uvádí utilizaci genu prokázanou vybranými hybridomovými klony protilátek podle vynálezu:

Tabulka II

Utilizace genů těžkého a lehkého řetězce

Klon	Těžký řetězec		Lehký řetězec kapa
VH	D	JH		VK	JK
4.1.1	DP-50	DIR4 nebo DIR3	JH4		A2 7	JK1
4.8.1	DP-50	7-27	JH4		A2 7	JK4
4.14.3	DP-50	7-27	JH4		A2 7	JK3
6.1.1	DP-50	DIR5 nebo DIR5rc	JH4		A2 7	JK3
3.1.1	DP-50	3-3	JH6		012	JK3
4.10.2	DP-50	7-27	JH4		A27	JK3
2.1.3	DP-65	1-26	JH6		A10/A26	JK4
4.13.1	DP-50	7-27	JH4		A2 7	JK3
11.2.1	DP-50	Dl-26	JH6		012	JK3
11.6.1	DP-50	D2-2 nebo D4	JH6		012	JK3
11.7.1	DP-50	D3-22 nebo D21-9	JH4		012	JK3
12.3.1.1	DP-50	D3-3 nebo DXP4	JH6		AI 7	JK1
12.9.1.1	DP-50	D6-19	JH4		A3/A19	JK4
4.9.1	DP-47	5-24 a/nebo 6-19	JH4		L5	JK1

Jak bylo pozorováno, protilátky podle předkládaného vynálezu byly vytvářeny se silnou tendencí k utilizaci variabilní oblasti těžkého řetězce DP-50. Gen DP-50 je také odkazován do rodiny genu V_H 3-33. Pouze jedna protilátka, která byla selektována na základě vazby CTLA-4 a předběžných in vitro funkčních testů vykázala utilizaci genu těžkého • ·

řetězce jiného než je DP-50. Tento klon, 2.1.3., používal variabilní oblast těžkého řetězce DP-65 a je izotypu IgG4. Gen DP-65 je také odkazován do rodiny genu V_H 4-31. Na druhé straně klon 4.9.1, který má variabilní oblast těžkého řetězce DP-47, váže CTLA-4, ale neinhibuje vazbu k B7-1 nebo B7-2. U myší XenoMouse je více než 30 odlišných funkčních variabilních genů těžkého řetězce, ke kterým se tvoří protilátky. Tato tendence je tudíž ukazatel preferovaného vazebného motivu v interakci protilátka-antigen s ohledem na kombinované vlastnosti vazby k antigenu a funkční aktivitu.

Mutační analýza

Jak bylo vyhodnoceno, pouze omezený přehled B lymfocyty myší XenoMouse Janalýza utilizace genů poskytuje protilátkové struktury. Protože náhodně vytvářejí transkripty V-Dtěžkého řetězce nebo V-J kappa lehkého řetězce, celá řada sekundárních procesů, které se objevují, omezení, somatické hypermutace, n-adicí (Viz například Mendez et al., 1997, patentová přihláška podaná zkoumání ale bez extenzí.

146-156,

08/759 620, pro další získané z klonů j e zde včetně, a CDR3

Nátuře Genetics, 15, Spojených Států č.

3. prosince, 1996. V souladu s tím byly protilátkové struktury vytvářeny z cDNA predikované aminokyselinové sekvence protilátek. Navíc byly získány prostřednictvím sekvencování proteinů N-koncové aminokyselinové sekvence.

Obrázek 1 ami nokys e1i nové z klonů

4.1.1 poskytuje nukleotidové a predikované sekvence těžkých a kappa lehkých (obrázek 1A) řetězců (obrázek

1C) ,

6.1.1 (obrázek / “

ID) ,

4.14.3

4.10.2 (obrázek

2.1.3 (obrázek (obrázek

IG) ,

11.6.1 (obrázek

12.3.1.1

1F) ,

II) , (obrázek 1L) a

4.13.1 (obrázek 1H)

11.2.1

12.9.1.1 /

1J) , 11.7.1 (obrázek 1K) , (obrázek 1M) . Na obrázcích

ΙΑ, 1B a

4.8.1 a

ID jsou uvedené

6.1.1 získané rozšířené sekvence protilátek 4.1.1, klonováním kompletních cDNA, jak • · popsáno výše.

Na těchto obrázcích jsou sekvence signálního báze kódující totéž) označeny tučně a sekvence 5 PCR reakce jsou podtrženy.

peptidu (nebo používané pro

Obrázek 2 poskytuje srovnání sekvencí mezi predikovanými aminokyselinovými sekvencemi těžkého řetězce z klonů 4.1.1,

4.8.1, 4.14.3, 6.1.1,

3.1.1, 4.10.2, 4.13.1, 11.2.1, 11.6.1,

11.7.1, 12.3.1.1 a

12.9.1.1 a aminokyselinovou sekvencí (3-33). Rozdíly mezi sekvencí zárodečné linie DP-50 a sekvencemi z klonů jsou označeny tučným písmem. Obrázek také ukazuje pozice sekvencí CDR1, CDR2 a CDR3 protilátek jako stínované.

zárodečné linie DP-50

Obrázek 3 poskytuje srovnání sekvencí mezi predikovanou aminokyselinovou sekvencí těžkého řetězce klonu aminokyselinovou sekvencí zárodečné linie DP-65 Rozdíly mezi sekvencí zárodečné linie DP-65 a z klonu jsou označeny tučným písmem. Obrázek také pozice sekvencí CDR1, CDR2 a CDR3 protilátky jako podtržené.

Obrázek 4 poskytuje srovnání ami nokys e1inovou

2.1.3 a (4-31).

sekvencí ukazuj e sekvencí kappa sekvencí mezi predikovanou lehkého řetězce z klonů

4.1.1,

4.8.1,

4.14.3,

6.1.1,

4.10.2 a

4.13.1 a aminokyselinovou sekvencí zárodečné linie sekvencí zárodečné linie A27.

Rozdíly mezi z klonů jsou označeny tučným písmem. Obrázek také ukazuje pozice sekvencí CDR1, CDR2 a CDR3 protilátek jako podtržené. Zřejmé delece jsou označeny „0.

sekvencí mezi predikovanou lehkého řetězce z klonů

A2 7 a sekvencemi v CDR klonů 4.8.1, 4.14.3 a 6.1.1

Obrázek 5 poskytuje srovnání ami nokys e1i novou sekvencí kappa

3.1.1, 11.2.1., zárodečné linie

012 a sekvencí

11,6,1 a 11.7.1 a aminokyselinovou sekvencí 012. Rozdíly mezi sekvencí z klonů jsou označeny tučným také ukazuje pozice sekvencí CDR1, CDR2 a jako podtržené.

zárodečné linie písmem. Obrázek

CDR3 protilátek

Obrázek 6 poskytuje srovnání sekvencí mezi predikovanou aminokyselinovou sekvencí kappa lehkého řetězce klonu 2.1.3 a • · ·· ·· ·· • · · · · · * • · · · · · · aminokyselinovou sekvencí zárodečné linie A10/A26. Rozdíly mezi sekvencí zárodečné linie A10/A26 a sekvencí z klonu jsou označeny tučným písmem. Obrázek také ukazuje pozice sekvencí CDR1, CDR2 a CDR3 protilátek jako podtržené.

Obrázek 7 poskytuje srovnání sekvencí mezi predikovanou aminokyselinovou sekvencí kappa lehkého řetězce klonu 12.3.1 a aminokyselinovou sekvencí zárodečné linie A17. Rozdíly mezi sekvencí zárodečné linie A17 a sekvencí z klonu jsou označeny tučným písmem. Obrázek také ukazuje pozice sekvencí CDR1, CDR2 a CDR3 protilátek jako podtržené.

Obrázek 8 poskytuje srovnání sekvencí mezi predikovanou aminokyselinovou sekvencí kappa lehkého řetězce klonu 12.9.1 a aminokyselinovou sekvencí zárodečné linie A3/A19. Rozdíly mezi sekvencí zárodečné linie A3/A19 a sekvencí z klonu jsou označeny tučným písmem. Obrázek také ukazuje pozice sekvencí CDR1, CDR2 a CDR3 protilátek jako podtržené.

Obrázek 22 poskytuje série dalších nukleotidových a aminokyselinových sekvencí následujících anti-CTLA-4 protilátkových řetězců:

4.1.1:

kompletní 4.1.1 těžký řetězec (cDNA 22(a), genomová 22(b) a aminokyselinová 22(c)) kompletní neglykosylováný 4.1.1 těžký řetězec (cDNA 22(d) a aminokyselinová 22 (e))

4.1.1 lehký řetězec (cDNA 22(f) a aminokyselinová 22(g))

4.8.1:

kompletní 4.8.1 těžký řetězec (cDNA 22(h) a aminokyselinová 22 (i))

4.8.1 lehký řetězec (cDNA 22 (j) a aminokyselinová 22(k)) • · • · • · · · ♦ · · »······· ·· ·· ··

6.1.1:

kompletní 6.1.1 těžký řetězec (cDNA 22(1) a aminokyselinová 22(m))

6.1.1 lehký řetězec (cDNA 22(n) a aminokyselinová 22(o))

11.2.1:

kompletní 11.2.1 těžký řetězec (cDNA 22(p) a aminokyselinová 22(q))

11.2.1 lehký řetězec (cDNA 22(r) a aminokyselinová 22 (s))

Sekvence signálního peptidu jsou označeny tučným písmem a velkým textem. Otevřené čtecí rámce kompletní sekvence

4.1.1 genomové DNA (obr. 22(b)) jsou podtržené. A mutace zavedené pro vytvoření neglykosylovaného 4.1.1 těžkého řetězce a výsledná změna (N294Q) jsou označeny podtržením a tučným textem (sekvence cDNA (obr. 22(b)) a aminokyselinová sekvence (obr. 22 (c)) .

Příklad 4

Analýza aminokyselinových substitucí těžkého a lehkého řetězce

Na obrázku 2, který poskytuje srovnání sekvencí mezi predikovanými aminokyselinovými sekvencemi těžkého řetězce z klonů 4.1.1, 4.8.1, 4.14.3, 6.1.1, 3.1.1, 4.10.2, 4.13.1,

11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 a 12.9.1.1 a aminokyselinovou sekvencí zárodečné linie DP-50 (3-33) , vyšel najevo zajímavý vzor. Navíc k faktu dispozice pro těžký řetězec DP-50 ve většině klonů, existuje relativně omezená hypermutace v protilátkách příbuzných s genem zárodečné linie DP-50. Například klony 3.1.1 a 11.2.1 neměly žádné mutace. Navíc mutace v dalších klonech jsou všeobecně konzervativní • · změny týkající se substitucí aminokyselin s podobnými vlastnostmi s aminokyselinami v zárodečné linii. Mutace v mnoha sekvencích CDR1 a CDR2 jsou obzvláště konzervativní povahy. Tři těžké řetězce zobrazené na obrázku 2, 4.10.2,

4.13.1 a 4.14.3, jasně pocházejí od jednoho rekombinantního jevu (tj . pocházejí z totožného germinálního centra) a mají téměř totožnou sekvenci. Jestliže jsou tyto tři považovány za jednu sekvenci, pak z 10 rozdílných protilátek obsahujících DP50 těžký řetězec, jsou v CDR1 a CDR2 3 pozice, ve kterých je nepolární zbytek nahrazen jiným nepolárním zbytkem, 12, kdy je polární nenabitý zbytek nahrazen jiným polárním nenabitým zbytkem a 1, ve které je polární nabitý zbytek nahrazen jiným polárním nabitým zbytkem. Navíc jsou dvě pozice, ve kterých jsou dva zbytky, které jsou velice podobné strukturálně, glycin a alanin, substituovány navzájem. Jediné mutace, které nejsou striktně konzervativní, se týkají 3 substitucí polárního nabitého zbytku polárním nenabitým zbytkem a jedné substituce nepolárního zbytku polárním zbytkem.

Lehké řetězce těchto protilátek pocházejí z 5 rozdílných genů Vk. Gen A27 je zastoupen nejvíce a je zdrojem 6 odlišných lehkých řetězců. Srovnání těchto 6 sekvencí odhalilo dvě pozoruhodné charakteristické stránky. Zaprvé tři z nich, 4.8.1, 4.14.3 a 6.1.1, obsahují delece jednoho nebo dvou zbytků v CDR1, což je vzácný jev. Zadruhé, existuje silný důvod proti šeřinu v pozici šest v CDR3 zárodečné linie, a serin je v každé sekvenci nahrazen. To svědčí pro to, že serin v této pozici je nekompatibilní s vazbou CTLA-4.

Uznává se, že mnoho z výše identifikovaných aminokyselinových substitucí existuje v těsné blízkosti s CDR nebo v CDR. Zdá se, že tyto substituce mají určitý vliv na vazbu protilátky k molekule CTLA-4. Dále tyto substituce by mohly mít významný účinek na afinitu protilátek.

β • *

Příklad 5

Analýza N-koncové aminokyselinové sekvence protilátek podle vynálezu

Aby se dále verifikovalo složení a struktura protilátek podle vynálezu identifikovaných výše, sekvencovali původci několik těchto protilátek s použitím sekvenačního přístroje Perkin-Elmer. Byly izolovány oba, těžký a kappa lehký řetězec protilátek, a purifikovány prostřednictvím preparativní gelové elektroforézy a elektropřenosu, a pak přímo sekvencovány, jak je popsáno v příkladu 6. Většina sekvencí těžkého řetězce byla blokována na svém amino-konci. Tyto protilátky byly tedy nejdříve ošetřeny pyroglutamátaminopeptidázou, a pak sekvencovány.

Výsledky tohoto pokusu jsou ukázány na obrázku 9. Obrázek 9 také poskytuje molekulovou hmotnost těžkého a lehkého řetězce, jak byly určeny hmotnostní spektroskopií (MALDI).

Příklad 6

Další charakterizace protilátek podle vynálezu

Obrázek 10 poskytuje některé další charakteristické informace o určitých protilátkách podle vynálezu. Na obrázku jsou sumarizována data týkající se klonů

3.1.1, 4.1.1, 4.8.1,

4.14.3 a 6.1.1. Jsou poskytnuta koncentrace, izoelektrické zaostřování

SDS-PAGE, vylučovací chromatografie, následující data: (focusing) (IEF), FACS, hmotnostní lehkého řetězce.

spektroskopie (MALDI) a N-koncové sekvence

Data všeobecně byla získávána následovně:

• · • · * r Μ « · ·· • » « · ·*· · • · « * β · ·· • ·4· ···· »· · >··

Materiál a metody:

Proteinová koncentrace byla zjišťována při 280 nm z UV skenu (2 00 až 3 50 nm) , kdy 1,58 jednotky absorbance při 2 80 nm odpovídalo 1 mg/ml.

SDS-PAGE byla prováděna s použitím elektroforetického systému s 10% gelem NuPAGE a pracovním pufrem MES. Vzorky byly připraveny ředěním 3:1 s 4x pufrem NuPAGE pro vzorky (+/-), beta-merkaptoethanolem, zahřátím a na gel bylo naneseno ~5 g proteinu. Gel byl pak obarven barvicím roztokem Brilliant Blue R (Sigma kat. č. B-6529) a molekulové hmotnosti byly vyhodnoceny srovnáním obarvených pásů se standardy „Perfect Protein Markers (Novagen kat. č. 691493) .

Pro N-koncové sekvencování byly vzorky děleny tak, jak je uvedeno výše, na gelech NuPAGE, přeneseny na imobilizační membránu Pro Blot (Applied Biosystems), a pak obarveny modří Coomassie Blue R-250. Obarvené proteinové pásy byly vyříznuty a podrobeny sekvenační analýze pomocí automatizované Edmanovy degradace na sekvenačním přístroji Applied Biosystems 494 Procise HT Sequencer.

Izoelektrické zaostřování (IEF) bylo prováděno s použitím gelů Pharmacia IEF 3-9 pHast (kat. č. 17-0543-01). Vzorky byly naředěny 10% glycerolem na koncentraci -0,8 mg/ml a 1 μΐ byl nanesen na gel, a poté obarven. Hodnoty pí pak byly vyhodnoceny srovnáním obarvených pásů se standardy IEF pro široké rozmezí (pH 3 až 10) (Pharmacia, kat. č. 17-047101) .

Vylučovací chromatografie (SEC) byla prováděna ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfáty (PBS) na systému SMART Pharmacia s použitím kolony Superdex 75 PC 3.2/30. Molekulové hmotnosti byly vyhodnoceny srovnáním retenčního času vrcholu s retenčním časem gelu.

Pro studie FACS byly připraveny lidské periferní T lymfocyty a 48 hodin stimulovány. T lymfocyty byly jednou

promyty, resuspendovány ve FACS pufru v množství lxlO⁶ buněk/100 μΐ a barveny na povrchovou expresi CD3 s 10 μΐ anti-CD3-FITC (Immunotech, Marseille, Francie) po dobu 30 minut při teplotě místnosti. Buňky byly promyty dvakrát, pak fixovány, permeabilizovány (Fix and Perm, Caltag) a obarveny na intracelulární expresi CTLA-4 s 10 μΐ anti-CD152-PE (Pharmingen). Průtoková cytometrie byla prováděna s použitím přístroje FACsort Becton Dickinson. Kvadranty byly ustanoveny analýzou relevantních izotypových kontrolních protilátek (Caltag).

Jak bylo diskutováno výše, bylo prokázáno, že antiCTLA-4 protilátky mají spolehlivou silnou imunomodulační aktivitu. Následující pokusy byly prováděny proto, aby se určilo, jestli protilátky podle předkládaného vynálezu mají tuto aktivitu. Pokusy byly obecně navrženy pro stanovení schopnosti protilátek inhibovat interakci mezi molekulami CTLA-4 a B7, být selektivní pro molekuly CTLA-4, B7 a CD2 8 a podporovat produkci cytokinů T lymfocyty, včetně, ale bez omezení, exprese IL-2 a/nebo IFN- . Dále se vyšetřovala zkřížená reaktivita protilátek podle vynálezu s některými lidskými tkáněmi a molekulami CTLA-4 jiných živočišných druhů (např. myší a primátů).

Příklad 7

Kompetitivní ELISA: inhibice interakce CTLA-4/B7-1 nebo B7-2 protilátkami podle vynálezu

Byl prováděn in vitro test, aby se určilo, jestli byly protilátky podle předkládaného vynálezu schopné inhibice vazby CTLA-4 s B7-1 nebo B7-2. Jak bylo uznáno, očekává se, že protilátky podle vynálezu, které jsou schopné inhibovat vazbu CTLA-4 s molekulami B7, jsou kandidáty pro regulaci imunity prostřednictvím metabolické dráhy CTLA-4. V testu byly použity následující materiály a metody:

Materiály a metody

96-jamkové destičky MaxiSorp byly potaženy 3 nM B7.1-Ig(Gl) nebo B7.2-Ig(Gl) (Repligen, lne. Needham, MA) v Dulbeccově PBS a inkubovány ve 4 °C přes noc. Druhý den byl B7-Ig odstraněn a destičky byly blokovány 1% BSA s 0,05% Tween-20 v D-PBS po dobu dvou hodin. Destičky byly promyty 3x promývacím pufrem (0,05% Tween-20 v D-PBS). Protilátky v příslušných testovaných koncentracích a CTLA-4-Ig(G4) (0,3 nM konečná koncentrace) (Repligen, lne. Needham, MA) byly předem míchány po dobu 15 minut a pak přidány na destičku potaženou B7-Ig (60 μΐ celkový objem) a inkubovány při teplotě místnosti 1,5 hodiny. Destičky byly promyty 3x a bylo přidáno 50 μΐ ředění 1 až 1000 myší protilidské protilátky IgG4 konjugované s HRP (Zymed, San Francisco, CA, č. 05-3820) a destičky byly inkubovány 20 minut při teplotě místnosti, a pak bylo na destičku přidáno 50 μΐ IN H₂SO₄. Destičky byly odečítány ve 450 nm s použitím odečítacího zařízení pro destičky od Molecular Devices (Sunnyvale, CA) . Všechny vzorky byly testovány v duplikáátech. Maximální signál byl definován jako vazba CTLA-4 v nepřítomnosti testované protilátky. Nespecifická vazba byla definována jako absorbance v nepřítomnosti CTLA-4Ig a testované protilátky.

Výsledky testu jsou uvedeny v tabulkách IIIA a IIIB. V tabulce IIIA jsou výsledky uvedeny pro celou řadu protilátek podle vynálezu. V tabulce IIIB jsou uvedeny výsledky srovnávající protilátku 4.1.1 podle vynálezu s protilátkou 11.2.1 podle vynálezu ze samostatného pokusu.

Tabulka IIΙΑ

Klon CTLA-4-Ig	Izotyp	CTLA-4/B7.2 komp. ELISA IC50 (nM)	CTLA-4/B7.1 komp. ELISA IC50 (nM)
CT3.1.1	IgG2	0,45±0,07 (n=3)	0,63±0,10 (n=2)
CT4.1.1	IgG2	0,38±0,06 (n=5)	0,50±0,05 (n=2)
CT4.8.1	IgG2	0,57+0,03 (n=3)	0,17±0,28 (n=2)
CT4.9.1	IgG2	Nekompetitivní (n=3)	Nekompetitivní (n=2)
CT4.10.2	IgG2	l,50±0,37 (n=3)	3,39+0,31 (n=2)
CT4.13.1	IgG2	0,49±0,05 (n=3)	0,98±0,ll (n=2)
CT4.14.3	IgG2	0,69±0,ll (n=3)	l,04±0,15 (n=2)
CT6.1.1	IgG2	0,39±0,06 (n=3)	0,67±0,07 (n=2)

Tabulka IIIB

Klon CTLA-4-Ig	Izotyp	CTLA-4/B7.2 komp. ELISA IC50 (nM)	CTLA-4/B7.1 komp. ELISA IC50 (nM)
CT4.1.1	IgG2	0,55±0,08 (n=4)	0,87+0,14 (n=2)
CT11.2.1	IgG2	0,56±0,05 (n=4)	0,81+0,24 (n=2)

Příklad 8

Poměr selektivity protilátek podle vynálezu k CTLA-4 ve srovnání s CD28 nebo B7-2

Byl prováděn další in vitro test, aby se určila selektivita protilátek podle vynálezu vzhledem k CTLA-4 buď proti CD28 nebo B7-2. V pokusech byly použity následující materiály a metody.

	88	• · · * • · • ·	• · · » 9 9 9 · 9 9 9 9 • 9 · 9 9 9 9 9 9 9 9 9
ELISA na selektivitu CTLA-4: Materiály a 96-jamková destička FluroNUNC (Nunc	metody kat. č.	475515) byla
potažena čtyřmi antigeny:	CTLA-4/lg,	CD44/Ig,	CD28/Ig a

B7.2/lg (antigeny vytvořené ve vlastní laboratoři). Destička byla potahována přes noc ve 4 °C antigeny v koncentraci 1 g/ml v množství 100 μΐ/jamku v O,1M pufru hydrogenuhličitanu sodném, pH 96. Destička pak byla promyta s PBST (PBS + 0,1% Tween-20) třikrát s použitím myčky destiček NUNC. Destička byla blokována s PPBST +0,5% BSA v množství 150 μΐ/jamku. Destička byla inkubována při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny, a pak promyta třikrát s PBST. Pak byly naředěny anti-CTLA-4 protilátky podle vynálezu en bloc v 1 g/ml a byly přidány na destičku. Destička byla inkubována při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny, a pak promyta třikrát s PBST. Jamky, které obsahovaly protilátky podle vynálezu, pak byly ošetřeny 100 μΐ/jamku proti-lidským IgG2-HRP (Souther Biotech kat. č. 9070-05) v ředění 1:4000 en bloc. Jedna řada byla také ošetřena proti-lidským IgG (Jackson kat. č. 209-035-088) pro normalizaci potažení destiček. Tato protilátka byla naředěna 1:5000 en bloc a přidána v množství 100 μΐ/jamku. Jedna řada byla také ošetřena proti-lidským CTLA-4-HRP (Pharmingen, kat. č. 345815/konjugováno s HRP na přání zákazníka) jako pozitivní kontrola. Tato protilátka byla použita v množství 0,05 g/ml ředěná en bloc. Destička byla inkubována při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny, a pak promyta třikrát s PBST. LBA chemiluminescenční substrát (Pierce) byl přidán v množství 100 μΐ/jamku a destička byla inkubována na třepačce destiček 5 minut. Destička pak byla odečtena s použitím zobrazovacího zařízení luminescence po 2 minutové expozici.

Test selektivity vazby IGEN pro CTLA-4: materiály a metody

Perličky M-450 Dynabeads (Dynal A.S., Oslo, Norsko, č. 140.02) byly promyty 3x pufrem fosfátem sodným, pH 7,4, a resuspendovány v pufru fosfátu sodném. Ke 100 μΐ perliček byl přidán 1,0 g CTLA-4-Ig (Gl) , 1,0 g CD28-Ig(Gl) nebo 1,0 až

3,0 g B7.2-Ig(Gl) (Repligen, lne. Needham, MA) a byly inkubovány přes noc na rotátoru ve 4 °C. Druhý den byly perličky promyty 3x v 1% BSA plus 0,05% Tween-20 v Dulbeccově PBS a blokovány 30 minut. Perličky byly naředěny 1 až 10 blokujícím pufrem a 25 μΐ potažených perliček bylo dáno do polypropylenových zkumavek 12x75 mm. Všechny vzorky byly testovány v duplikátu. Do zkumavek bylo přidáno 50 μΐ testované protilátky (konečná koncentrace 1 g/ml) nebo blokujícího pufru a inkubováno 30 minut na karuselovém pásu analyzátoru Origen 1,5 (IGEN Internátional, lne. , Gaithersburg, MD) při teplotě místnosti, vortexováno 100 rpm. Do zkumavek bylo přidáno 25 μΐ myší proti-lidské IgGl, IgG2 nebo IgG4 s rutheniem (Zymed, lne., San Francisco, CA, č. 053300, 05-3500 a 05-3800) (konečná koncentrace 3 g/ml ve 100 μΐ celkového objemu). Zkumavky byly inkubovány 30 minut při teplotě místnosti na karuselovém pásu, vortexováno 100 rpm. Bylo přidáno 200 μΐ pufru testu Origen (IGEN International, lne., Gaithersburg, MD, č. 402-050-03) do každé zkumavky, krátce vortexováno, a pak byly zkumavky odečítány na analyzátoru Origen a pro každou zkumavku byly určeny jednotky ECL (elektrochemiluminiscence). Byly zjištěny noramlizační faktory pro opravu odchylek vazby fúzních proteinů na perličky Dynabeads a jednotky ECL byly korigovány na nespecifickou vazbu před výpočtem stupně selektivity.

Výsledky testů jsou uvedeny v tabulkách IVA a IVB.

• ·

Tabulka IVA

Klon	Izotyp	CTLA4/CD28 ELISA	CTLA4/B7.2 ELISA	CTLA4/CD44 ELISA	CTLA4/CD28 IGEN	CTLA4/B7.2 IGEN
3.1.1	IgG2	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=2)	>500:1 (n=l) 195:1 (n=l)
4.1.1	IgG2	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=2) 485:1 (n=l)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=l) 261:1 (n=l)	>500:1 (n=l) 107:1 (n=l)
4.8.1	IgG2	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=2) 190:1 (n=l)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=2)	>500:1 (n=2)
4.9.1	IgG2	>500:1 (n=2) 244:1 (n=l)	>500:1 (n=2) 33:1 (n=l)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=l)	>500:1 (n=l)
4.10.2	IgG2	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=l)	>500:1 (n=l)
4.13.1	IgG2	>500:1 (n=2) 46:1 (n=l)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=l) 329:1 (n=l)	>500:1 (n=2)
4.14.3	IgG2	>500:1 (n=2) 80:1 (n=l)	>500:1 (n=2) 10:1 (n=l)	>500:1 (n=2) 126:1 (n=l)	>413:1 (n=l)	>234:1 (n=l)
6.1.1	IgG2	>500:1 (n=2) 52:1 (n=l)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=2)	>500:1 (n=2)

Tabulka IVB

Klon	Izotyp	CTLA4/CD28 ELISA	CTLA4/B7.2 ELISA	CTLA4/hIgG ELISA
4.1.1	IgG2	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=2)	>500:1 (n=3)
11.2.1	IgG2	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=3)

• ·

Příklad 9

Model buněčného signálu lidských T lymfocytů

Pro další vymezení aktivity protilátek podle vynálezu při působení jako regulátorů imunity, vyvinuli původci některé testy T lymfocytů, aby se kvantifikovalo zvýšení produkce IL-2 T lymfocyty při blokádě CTLA-4 signálu protilátkami. Při těchto pokusech byly použity následující materiály a metody:

Materiály a metody

Čerstvě izolované lidské T lymfocyty byly připraveny a použitím Histopaque (Sigma, St. Louis, MO, č. A-70543) a T-kwik (Lympho-Kwik, One Lambda, Canoga Park, CA, č. LK-50-T) a stimulovány s PHA (1 g/ml) (purifikovaný fytohemaglutinin, Murex Diagnostics Ltd., Dartford, England, č. HA 16) v médiu (RPMI 1640 obsahující L-glutamin, MEM neesenciální aminokyseliny, penicilín, streptomycin, 25 mM Hepes a 10% FBS) v koncentrace lxlO⁶ buněk/ml a inkubovány ve 37 °C po 2 dny. Buňky byly promyty a naředěny médiem na 2xl0⁶ buněk/ml. Buňky Ráji (Burkittův lymfom, lidský, ATCC č.: CCL 86 Class II Američan Type Culture Collection, Rockville, MD) byly ošetřeny mitomycinem C (Sigma, St. Louis, MO, č. M-4287) (25 g/ml) jednu hodinu ve 3 7 °C. Buňky Ráji byly promyty 4x v PBS a resuspendovány v množství 2xl0⁶ buněk/ml. Lidské T lymfoblasty (5xl0^s/ml) , buňky Ráji (5xlO^s/ml) a anti-CTLA-4 protilátky nebo kontrolní protilátka souhlasného izotypu v různých koncentracích byly přidány na 96-jamkové mikrotitrační destičky a destičky byly inkubovány ve 37 °C po 72 hodin. Celkový objem jamky byl 200 μΐ. 72 hodin po stimulaci byly destičky stočeny a supernatant byl odstraněn a zamražen pro pozdější zjišťování IL-2 (Quantikine IL-2 ELISA kit, R&D Systems, MN, č. D 2050) a IFN- (Quantikine IL-2 • ·

ELISA kit, R&D Systems). Zvýšení cytokinů bylo definováno jako rozdíl mezi hladinami cytokinů v tkáňových kulturách obsahujících anti-CTLA-4 blokující mAb proti kontrolní protilátce souhlasného izotypu. Pro experimenty s průtokovou cytometrií byly buňky Ráji promyty lx pufrem FACS (PBS obsahující 2% teplem inaktivované FCS, 0,025% azid sodný). Buněčné pelety byly resuspendovány v pufru FACS v množství lxlO⁶ buněk/100 μΐ a inkubovány s 10 μΐ anti-CD80-PE (Becton Dickinson, San Josse, CA) nebo anti-CD86-PE (Pharmingen, San Diego) po dobu 30 minut při teplotě místnosti. Buňky byly promyty dvakrát a resuspendovány v 1 ml pufru FACS. Průtoková cytometrie byla prováděna s použitím přístroje Becton Dickinson FACSort. Histogramové markéry byly nastavené analýzou relevantních izotypových kontrolních protilátek (Caltag, Burlingame, CA) .

Původci obecně vyvinuly test, který může být použit pro rychlé určení aktivace IL-2 T lymfocyty. Jak bylo uznáno, stimulace T lymfocytů je závislá na B7 a CD28. Navíc promyté T blasty netvořily zjistitelný IL-2 a buňky Ráji netvořily zjistitelný IL-2, dokonce ani když byly stimulovány LPS neb PWM. Ale, v kombinaci, T blasty společně pěstované s buňkami Ráji mohou modelovat signální jevy B7, CTLA-4 a CD2 8 a může na nich tedy být hodnocen účinek protilátek.

Obrázek 11 ukazuje expresi B7-1 a B7-2 na buňkách Ráji při použití anti-CD80-PE a anti-CD86-Pe mAb a s použitím průtokové cytometrie (FACS), jak je popsáno v příkladu 6.

Obrázek 12 ukazuje na koncentraci závislé zvýšení produkce IL-2 v testu s T lymfoblasty/Raji indukované protilátkami blokujícími CTLA-4 (BNI3 (Pharmingen) a 4.1.1, 4.8.6 a 6.1.1 protilátkami podle vynálezu).

Obrázek 13 ukazuje na koncentraci závislé zvýšení produkce IFN- v testu s T lymfoblasty/Raji indukované protilátkami blokujícími CTLA-4 (BNI3 (Pharmingen) a 4.1.1, • ·

4.8.6 a 6.1.1 protilátkami podle vynálezu) (stejné dárcovské T lymfocyty).

Obrázek 14 ukazuje průměrné zvýšení produkce IL-2 v T lymfocytech od 6 dárců indukované protilátkami blokujícími CTLA-4 v testu s T lymfoblasty/Raji. Je zajímavé zvážit, že mAb CT4.9.1 se váže na CTLA-4, ale neblokuje vazbu B7. Tedy pouhá vazba na CTLA-4 nepostačuje sama zajistit funkční protilátku podle vynálezu.

Obrázek 15 ukazuje průměrné zvýšení produkce IFN- v T lymfocytech od 6 dárců indukované protilátkami blokujícími CTLA-4 v testu s T lymfoblasty/Raji.

Obrázek 19 ukazuje srovnání mezi 4.1.1 a 11.2.1 protilátkami podle vynálezu v koncentraci 30 g/ml v 72 hodinovém testu s T lymfoblasty/Raji, jak bylo popsáno v tomto příkladu 9 a v testu se superantigenem popsaném v příkladu 10.

Obrázek 20 ukazuje na koncentraci závislé zvýšení produkce IL-2 v testu s T lymfoblasty/Raji indukované 4.1.1 a 11.2.1 CTLA-4 protilátkami podle vynálezu.

Následující tabulka IVC poskytuje informaci týkající se průměrného zvýšení a rozsahu zvýšení cytokinové odpovědi v testech Ráji a SEA podle vynálezu. Každý z pokusů zahrnutých ve výsledcích je založen na protilátce v dávce 30 g/ml a měřen v 72 hodinách. Jsou uvedeny počty dárců zúčastněných v pokusech, jakož i odpovědi.

• ·

Tabulka IVC

Test	mAb	Cytokin	Průměrné zvýšení pg/ml	SEM	Rozsah zvýšení pg/ml	n	Reakce dárců
T lymfoblasty/ Raj i	4.1.1	IL-2	3329	408	0 až 8861	42	19 z 21
T lymfoblasty/ Raj i	4.1.1	IFN-	3630	980	600 až 13939	17	13 ze 13
T lymfoblasty/ Raj i	11.2.1	IL-2	3509	488	369 až 6424	18	14 ze 14
SEA (PBMC)	4.1.1	IL-2	2800	312	330 až 6699	42	17 ze 17
SEA (PBMC)	11.2.1	IL-2	2438	366	147 až 8360	25	15 Z 15
SEA (plná krev)	4.1.1	IL-2	6089	665	-168 až 18417	46	15 ze 17
SEA (plná krev)	11.2.1	IL-2	6935	700	-111 až 11803	25	12 z 14

Příklad 10

Model signálu T lymfocytů u člověka

Původci vyvinuli druhý buněčný test, aby se kvantifikovalo zvýšení aktivace IL-2 T lymfocyty při blokádě signálu CTLA-4 protilátkami. Při těchto pokusech byly použity následující materiály a metody:

Materiály a metody

Lidské PBMC byly připraveny s použitím Accuspin. Mikrotitrační destičky byly předem potaženy s anti-CD3 protilátkou (leu4, Becton Dickinson) (60 ng/ml) a inkubovány 2 hodiny ve 37 °C. Do jamek byly přidány hPBMC v množství

200 000 buněk na jamku. Do jamek byl přidán stafylokokový enterotoxin A (SEA) (Sigma) v koncentraci 100 ng/ml. Do jamek byly přidány protilátky, obvykle v koncentraci 30 g/ml. Pak byly buňky stimulovány 48, 72 nebo 96 hodin. Destičky byly stočeny v žádoucím časovém bodu a z jamek byl odstraněn supernatant. Potom byla v supernatantu vyšetřována produkce IL-2 s použitím ELISA (R&D Systems).

Výsledky z těchto pokusů jsou ukázány na obrázcích 16, 17 a 21. Na obrázku 16 byla měřena indukce produkce IL-2 v hPBMC od 5 dárců 72 hodin po stimulaci. Na obrázku 17 jsou ukázány výsledky z měření plné krve rozebírající rozdíl v indukci produkce IL-2 v krvi 3 dárců, jak byla měřena 72 a 96 hodin po stimulaci.

Na obrázku 21 je zvýšení produkce IL-2 v plné krvi 2 dárců, jak měřeno 72 hodin po stimulaci.

Příklad 11

Model nádoru u zvířat

Původci nastolili modle nádoru u zvířat pro in vivo analýzu proti-myších CTLA-4 protilátek při inhibici nádorového růstu. V tomto modelu nádoru je pěstován myší fibrosarkom a zvířata jsou ošetřována proti-myšími CTLA-4

protilátkami. Materiály poskytnuty níže:	a metody	pro	zavedení	modelu j sou
Materiály a metody
Samicím myší A/J	(ve věku 6	až	8 týdnů)	byly podány
subkutánní injekce do	dorzální	strany krku	s 0,2 ml

nádorových buněk SalN (lxlO⁶) (Baskar 1995).

Intraperitoneální injekcí byla podána proti-myší CTLA-4 nebo kontrolní protilátka souhlasného izotypu (Phramingen, San Diego, CA, 200 g/zvíře) ve dnech 0, 4, 7 a 14 po injekci nádorových buněk. Nádor byl měřen v průběhu 3 až 4 týdnů pokusů s použitím elektronického kaliperu Starrett SPC Plus a · ·

• · ···· ····

(Athol, MA) a velikost nádoru byla vyjádřena jako povrchová oblast postižená růstem nádoru (mm²) .

Obrázek 18 ukazuje inhibici nádorového růstu při protimyší CTLA-4 protilátce v modelu nádoru myšího fibrosarkomu. Jak je ukázáno na obrázku 18, u zvířat ošetřených s antiCTLA-4 nastala redukce nádorového růstu ve srovnání se zvířaty ošetřenými izotypovou kontrolní protilátkou. Podle toho jsou proti-myší CTLA-4 mAb schopné inhibovat růst fibrosarkomu v modelu myšího nádoru.

Lze očekávat, že protilátky, které reagují zkříženě s myším CTLA-4, se budou v tomto modelu chovat podobně. Ale žádná z protilátek podle vynálezu, u kterých byla zkoumána zkřížená reaktivita, nereaguje zkříženě s myším CTLA-4.

Příklad 12

Model nádoru u zvířat

Aby se dále zkoumala aktivita protilátek podle -vynálezu, byl navržen model xenoimplantátu myší SCID pro testování eradikace zjištěných nádorů a jejich metastáz. V tomto modelu jsou myším SCID podány jako štěp lidské T lymfocyty a myším jsou implantovány buňky pocházející z velkobuněčného plicního karcinomu (NSCL) nebo kolorektálního (CC) karcinomu pacientů. Implantace se provádí do tukových polštářků v gonádách myší SCID. Tumory se ponechají narůst, a pak se odstraní. U myší se rozvinuly nádorové metastázy jater podobné lidskému nádoru. Tento model je popsán v práci Bumpers et al., J. Surgical Res., 61, 282-288, 1996).

Očekává se, že protilátky podle vynálezu budou inhibovat růst nádorů tvořených u těchto myší.

• ·

SEZNAM SEKVENCÍ

Nukleotidové a aminokyselinové sekvence jsou uvedeny ve formě seznamu podle WIPO standardu 25.

Všechny uvedené v popisném poli <213> sekvence Homo sapiens.

sekvence jsou lidského původů, angl.

termín human označuje zdroj <210> 1 <211> 463 <212> PRT <213> Human <400> 1

Met Glu Phe 1

Gly

Leu Ser 5

Trp

Val

Phe Leu Val 10

Ala Leu Leu

Arg 15

Gly

Val

Gin

Cys

Gin

Val

Gin

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Val

Val

Gin

20

25

30

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Val

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

35

40

45

Ser

Ser

His

Gly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

50

55

60

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Arg

Asn

Lys

Tyr

Tyr

Ala

65

70

75

80

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

85

90

95

Thr

Leu

Phe

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

100

105

110

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Gly

His

Phe

Gly

Pro

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

115

120

125

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

130

135

140

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

145

150

155

160

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

165

170

175

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

180

185

190

Val

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

195

200

205

Pro

Ser

Ser

Asn

Phe

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

Thr

Cys

Asn

Val

Asp

His

210

215

220

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Thr

Val

Glu

Arg

Lys

Cys

Cys

225

230

235

240

Val

Glu

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Pro

Val

Ala

Gly

Pro

Ser

Val

245

250

255

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

260

265

270

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

275

280

285

Val

Gin

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

290

295

300

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Phe

Asn

Ser

Thr

Phe

Arg

Val

Val

Ser

305

310

315

320

Val

Leu

Thr

Val

Val

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

325

330

335

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Gly

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

340

345

350

Ser

Lys

Thr

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

355

360

365

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

370

375

380

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

385

390

395

400

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Met

Leu

Asp

Ser

405

410

415

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

420

425

430

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

435

440

445

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

450

455

460

<210> 2 <211> 464 <212> PRT <213 > Hutnan <400> 2

Met

Glu

Phe

Gly

Leu

Ser

Trp

Val

Phe

Leu

Val

Ala

Leu

Leu

Arg

Gly

1

5

10

15

Val

Gin

Cys

Gin

Val

Gin

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Val

Val

Gin

20

25

30

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Thr

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

35

40

45

Ser

Asn

Tyr

Gly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

50

55

60

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Ser

Asn

Lys

His

Tyr

Gly

65

70

75

80

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

85

90

95

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

100

105

110

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Glu

Arg

Leu

Gly

Ser

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

115

120

125

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

130

135

140

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

145

150

155

160

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

165

170

175

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

180

185

190

Ala

Val

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

r ·

195

200

205

Val

Pro

Ser

Ser

Asn

Phe

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

Thr

Cys

Asn

Val

Asp

210

215

220

His

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Thr

Val

Glu

Arg

Lys

Cys

225

230

235

240

Cys

Val

Glu

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Pro

Val

Ala

Gly

Pro

Ser

245

250

255

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

260

265

270

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

275

280

285

Glu

Val

Gin

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

290

295

300

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Phe

Asn

Ser

Thr

Phe

Arg

Val

Val

305

310

315

320

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Val

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

325

330

335

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Gly

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

340

345

350

Ile

Ser

Lys

Thr

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

355

360

365

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

370

375

380

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

385

390

395

400

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Met

Leu

Asp

405

410

415

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

420

425

430

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

435

440

445

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

450

455

460

<210>

3

<211>

163

<212>

PRT

<213>

Human

<400>

3

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

1

5

10

15

Ser

Ser

His

Gly

Ile

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

20

25

30

Glu

Trp

val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Arg

Asn

Lys

Asp

Tyr

Ala

35

40

45

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Lys

50

55

60

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

65

70

75

80

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Val

Ala

Pro

Leu

Gly

Pro

Leu

Asp

Tyr

Trp

Gly

85

90

95

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

100

105

110

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

115

120

125

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

130

135

140

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

145

150

155

160

Val Leu Gin

100 • 4 44 ·· * 44« < · · * » 4 e·

4 4 «44444 * 4 4 4 4 v. «444 « · 4'444»

4444 4444 »4 4444 <210> 4 <211> 463 <212> PRT <213> Human <400> 4

Met 1

Glu

Phe

Gly Leu 5

Ser Trp Val

Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg

Gly

10

15

Val

Gin

Cys

Gin

Val

Gin

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Val

Val

Glu

20

25

30

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Thr

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

35

40

45

Ser

Ser

Tyr

Gly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

50

55

60

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Ser

Asn

Lys

His

Tyr

Ala

65

70

75

80

Asp

Ser

Ala

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

85

90

95

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

100

105

110

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Ala

Gly

Leu

Leu

Gly

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

115

120

125

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

130

135

14 0

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

145

150

155

160

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

165

170

175

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

180

185

190

Val

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

195

200

205

Pro

Ser

Ser

Asn

Phe

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

Thr

Cys

Asn

Val

Asp

His

210

215

220

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Thr

Val

Glu

Arg

Lys

Cys

Cys

225

230

235

240

Val

Glu

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Pro

Val

Ala

Gly

Pro

Ser

Val

245

250

255

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

260

265

270

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

275

280

285

Val

Gin

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

290

295

300

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Phe

Asn

Ser

Thr

Phe

Arg

Val

Val

Ser

305

310

315

320

Val

Leu

Thr

Val

Val

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

325

330

335

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Gly

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

340

345

350

Ser

Lys

Thr

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

355

360

365

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

370

375

380

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

385

390

395

400

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Met

Leu

Asp

Ser

405

410

415

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

• ·

420 425 430

Trp Gin Gin 435 His Asn His 450

Gly Asn Val

Phe Lys 455

Ser Cys

Ser Val Met

His 445 Pro

Glu Ala

Leu

440 Ser

Leu

Gly

Lys

Tyr

Thr

Gin

Ser

Leu

Ser 460

<210>

5

<211>

169

<212>

PRT

<213>

Human

<400>

5

Gly

Val Val

Gin

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

1

5

10

15

Gly

Phe Thr

Phe

Ser

Ser

Tyr

Gly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

20

25

30

Gly

Lys Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Ser

Asn

35

40

45

Lys

Tyr Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

50

55

60

Asn

Ser Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

65

70

75

80

Asp

Thr Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Ala

Arg

Ile

Ile

Thr

Pro

85

90

95

Cys

Met Asp

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

100

105

110

Ser

Thr Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

115

120

125

Thr

Ser Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

130

135

140

Pro

Glu Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

145

150

155

160

Val

His Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

165

<210>

6

<211>

167

<212>

PRT

<213>

Human

<400>

6

Gly

Val Val

Gin

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Val

Ala

Ser

1

5

10

15

Gly

Phe Ile

Phe

Ser

Ser

His

Gly

Ile

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

20

25

30

Gly

Lys Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Arg

Asn

35

40

45

Lys

Asp Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

50

55

60

Asn

Ser Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

65

70

75

80

Asp

Thr Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Val

Ala

Pro

Leu

Gly

Pro

Leu

85

90

95

Asp

Tyr Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

100

105

110

Lys

Gly Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

115

120

125

Glu

Ser Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

130

135

140

Pro

Val Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

145

150

155

160

• ·

102

Thr

Phe

Pro

Ala

Val 165

Leu

Gin

<210>

7

<211>

172

<212>

PRT

<213>

Human

<400>

7

Ser

Gly

Pro

Gly Leu

Val

Lys

Pro

Ser

Gin

Ile

Leu

Ser

Leu

Thr

Cys

1

5

10

15

Thr

Val

Ser

Gly Gly

Ser

Ile

Ser

Ser

Gly

Gly

His

Tyr

Trp

Ser

Trp

20

25

30

Ile

Arg

Gin

His

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Ile

Gly

Tyr

Ile

Tyr

35

40

45

Tyr

Ile

Gly

Asn

Thr

Tyr

Tyr

Asn

Pro

Ser

Leu

Lys

Ser

Arg

Val

Thr

50

55

60

Ile

Ser

Val

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

Phe

Ser

Leu

Lys

Leu

Ser

Ser

65

70

75

80

Val

Thr

Ala

Ala

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Asp

Ser

Gly

85

90

95

Asp

Tyr

Tyr

Gly

Ile

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

100

105

110

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

115

120

125

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

130

135

140

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

145

150

155

160

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

165

170

<210>

8

<211>

153

<212>

PRT

<213>

Human

<400>

8

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

1

5

10

15

Ser

Ser

His

Gly

Ile

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

20

25

30

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Arg

Asn

Lys

Asp

Tyr

Ala

35

40

45

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

50

55

60

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

65

70

75

80

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Val

Ala

Pro

Leu

Gly

Pro

Leu

Asp

Tyr

Trp

Gly

85

90

95

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

100

105

110

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

115

120

125

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

130

135

140

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

145 150 <210> 9 <211> 167 • · · ·

103 ···· ···· <212> PRT <213> Human <220>

<400> 9

Gly

Val Val

Gin

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

1

5

10

15

Gly

Phe Thr

Phe

Ser

Ser

Tyr

Gly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

20

25

30

Gly

Lys Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Ser

Asn

35

40

45

Lys

Tyr Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

50

55

60

Asn

Ser Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

65

70

75

80

Asp

Thr Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Asp

Pro

Arg

Gly

Ala

Thr

Leu

85

90

95

Tyr

Tyr Tyr

Tyr

Tyr

Arg

Xaa

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Thr

Val

100

105

110

Thr

Val Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

115

120

125

Pro

Cys Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

130

135

140

Val

Lys Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

145

150

155

160

Ala

Leu Thr

Ser

Gly

Val

His

165

<210>

10

<211>

151

<212>

PRT

<213>

Human

<400>

10

Gly

Val Val

Gin

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

1

5

10

15

Gly

Phe Thr

Phe

Ser

Ser

Tyr

Gly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

20

25

30

Gly

Lys Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Ser

His

35

40

45

Lys

Tyr Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

50

55

60

Asn

Ser Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

65

70

75

80

Asp

Thr Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Ala

Val

Val

Val

Pro

Ala

85

90

95

Ala

Met Asp

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

100

105

110

Ser

Thr Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

115

120

125

Thr

Ser Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

130

135

140

Pro

Glu Pro

Val

Thr

Val

Ser

145

150

<210> 11 <211> 146 <212> PRT <213> Human • ·

104 <220>

<400> 11

Val

Val Gin

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

1

5

10

15

Phe

Thr Phe

Ser

Ser

Xaa

Gly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

20

25

30

Lys

Gly Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Ser

Asp

Gly

Ser

His

Lys

35

40

45

Tyr

Tyr Ala

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

50

55

60

Ser

Lys Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

65

70

75

80

Thr

Ala Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Thr

Met

Ile

Val

Val

Gly

Thr

85

90

95

Leu

Asp Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

100

105

110

Thr

Lys Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

115

120

125

Ser

Glu Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

130

135

140

Glu

Pro

145

<210>

12

<211>

174

<212>

PRT

<213>

Human

<400>

12

Ser

Gly Gly

Gly

Val

Val

Gin

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

1

5

10

15

Ala

Ala Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser

Tyr

Gly

Val

His

Trp

Val

Arg

20

25

30

Gin

Ala Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

35

40

45

Gly

Ser Asn

Lys

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

50

55

60

Ser

Arg Asp

Asn

Ser

Lys

Ser

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

65

70

75

80

Arg

Ala Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Asp

Ser

Tyr

Tyr

85

90

95

Asp

Phe Trp

Ser

Gly

Arg

Gly

Gly

Met

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

100

105

110

Thr

Val Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

115

120

125

Leu

Ala Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

130

135

140

Cys

Leu Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

145

150

155

160

Ser

Gly Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

165

170

<210>

13

<211>

163

<212>

PRT

<213>

Human

<400>

13

Val

Gin Pro

Gly Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

5 10 15

105 ·· ·· ·· ·· · · ···· ··· ··· • « ····· · · • · ···· ··

Thr

Phe Ser

Asn Tyr 20

Ala Met His

Trp Val Arg Gin Ala Pro

Gly

Lys

25

30

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Val

Val

Ile

Trp

His

Asp

Gly

Asn

Asn

Lys

Tyr

35

40

45

Tyr

Ala

Glu

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

50

55

60

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

65

70

75

80

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Asp

Gin

Gly

Thr

Gly

Trp

Tyr

Gly

Gly

85

90

95

Phe

Asp

Phe

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

100

105

110

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

115

120

125

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

130

135

140

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

145

150

155

160

His

Thr

Phe

<210>

14

<211>

235

<212>

PRT

<213>

Human

<400>

14

Met

Glu

Thr

Pro

Ala

Gin

Leu

Leu

Phe

Leu

Leu

Leu

Leu

Trp

Leu

Pro

1

5

10

15

Asp

Thr

Thr

Gly

Glu

Ile

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Gly

Thr

Leu

Ser

20

25

30

Leu

Ser

Pro

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

35

40

45

Ile

Ser

Ser

Ser

Phe

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin

Ala

50

55

60

Pro

Arg

Leu

Leu

Ile

Tyr

Gly

Ala

Ser

Ser

Arg

Ala

Thr

Gly

Ile

Pro

65

70

75

80

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

85

90

95

Ser

Arg

Leu

Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Tyr

100

105

110

Gly

Thr

Ser

Pro

Trp

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

115

120

125

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

130

135

140

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

145

150

155

160

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

165

170

175

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

180

185

190

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

195

200

205

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

210

215

220

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

225

230

235

<210> 15 <211> 233 <212> PRT • · • · • ·

106 <213> Human <400> 15

Met

Glu

Thr

Pro

Ala

Gin

Leu

Leu

Phe

Leu

Leu

Leu

Leu

Trp

Leu

Pro

1

5

10

15

Asp

Thr

Thr

Gly

Glu

Ile

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Gly

Thr

Leu

Ser

20

25

30

Leu

Ser

Pro

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Arg

Thr

Ser

Val

Ser

35

40

45

Ser

Ser

Tyr

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

50

55

60

Leu

Leu

Ile

Tyr

Gly

Ala

Ser

Ser

Arg

Ala

Thr

Gly

Ile

Pro

Asp

Arg

65

70

75

80

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Arg

85

90

95

Leu

Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Tyr

Gly

Ile

100

105

110

Ser

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

115

120

125

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

130

135

140

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

145

150

155

160

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

165

170

175

Asn

Ser

Gin

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

180

185

190

Ser

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

195

200

205

Lys

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

210

215

220

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

225

230

<210>

16

<211>

139

<212>

PRT

<213>

Human

<400>

16

Gly

Thr

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Arg

1

5

10

15

Ala

Ser

Gin

Ser

Val

Ser

Ser

Tyr

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

20

25

30

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

Leu

Leu

Ile

Tyr

Gly

Ala

Ser

Ser

Arg

Ala

Thr

35

40

45

Gly

Ile

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

50

55

60

Leu

Thr

Ile

Ser

Arg

Leu

Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

65

70

75

80

Gin

Gin

Tyr

Gly

Arg

Ser

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

Gly

Thr

Lys

Val

85

90

95

Asp

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

100

105

110

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

115

120

125

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

130

135

<210> 17 <211> 234

107 <212> PRT <213> Human <400> 17

Met

Glu

Thr

Pro

Ala

Gin

Leu

Leu

Phe

Leu

Leu

Leu

Leu

Trp

Leu

Pro

1

5

10

15

Asp

Thr

Thr

Gly

Glu

Ile

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Gly

Thr

Leu

Ser

20

25

30

Leu

Ser

Pro

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

35

40

45

Val

Ser

Ser

Tyr

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

50

55

60

Arg

Pro

Leu

Ile

Tyr

Gly

Val

Ser

Ser

Arg

Ala

Thr

Gly

Ile

Pro

Asp

65

70

75

80

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

85

90

95

Arg

Leu

Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Tyr

Gly

100

105

110

Ile

Ser

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

Gly

Thr

Lys

Val

Asp

Ile

Lys

Arg

115

120

125

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

130

135

14 0

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

145

150

155

160

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

165

170

175

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

180

185

190

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

195

200

205

His

Lys

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

210

215

220

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

225 230 <210> 18 <211> 152 <212> PRT <213> Human <400> 18

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

1

5

10

15

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Ile

Asn

Thr

Tyr

Leu

Ile

Trp

Tyr

Gin

20

25

30

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Asn

Phe

Leu

Ile

Ser

Ala

Thr

Ser

Ile

35

40

45

Leu

Gin

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Arg

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

50

55

60

Asn

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Asn

Ser

Leu

His

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

65

70

75

80

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

Tyr

Ser

Thr

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

Gly

85

90

95

Thr

Lys

Val

Asp

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

100

105

110

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly Thr

Ala

Ser

Val

Val

115

120

125

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

130

135

140

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

145

150

• ·

108

<210> 19 <211> 142 <212> PRT <213> Human <400> 19

Ser

Pro Gly

Thr

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

1

5

10

15

Cys

Arg Ala

Ser

Gin

Ser

Ile

Ser

Ser

Asn

Phe

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

20

25

30

Gin

Lys Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

Leu

Leu

Ile

Tyr

Arg

Pro

Ser

Ser

35

40

45

Arg

Ala Thr

Gly

Ile

Pro

Asp

Ser

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

50

55

60

Asp

Phe Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Arg

Leu

Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Leu

65

70

75

80

Tyr

Tyr Cys

Gin

Gin

Tyr

Gly

Thr

Ser

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

Gly

85

90

95

Thr

Lys Val

Asp

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

100

105

110

Phe

Pro Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

115

120

125

Cys

Leu Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

130

135

140

<210>

20

<211>

155

<212>

PRT

<213>

Human

<400>

20

Ser

Pro Asp

Phe

Gin

Ser

Val

Thr

Pro

Lys

Glu

Lys

Val

Thr

Ile

Thr

1

5

10

15

Cys

Arg Ala

Ser

Gin

Ser

Ile

Gly

Ser

Ser

Leu

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

20

25

30

Lys

Pro Asp

Gin

Ser

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

Lys

Tyr

Ala

Ser

Gin

Ser

35

40

45

Phe

Ser Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

50

55

60

Phe

Thr Leu

Thr

Ile

Asn

Ser

Leu

Glu

Ala

Glu

Asp

Ala

Ala

Thr

Tyr

65

70

75

80

Tyr

Cys His

Gin

Ser

Ser

Ser

Leu

Pro

Leu

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

85

90

95

Lys

Val Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

100

105

110

Pro

Pro Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

115

120

125

Leu

Leu Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

130

135

140

Asp

Asn Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

145

150

155

<210>

21

<211>

146

<212>

PRT

<213>

Human

<400>

21

Gin

Ser Pro

Gly Thr

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

10 15

109

Ser Cys Arg Ala

Ser

Gin

Ser Val

Ser Ser Tyr Leu Ala Trp

Tyr

Gin

20

25

30

Gin

Lys Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

Leu

Leu

Ile

Tyr

Gly

Ala

Ser

Ser

35

40

45

Arg

Ala Thr

Gly

Ile

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

50

55

60

Asp

Phe Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Arg

Leu

Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

65

70

75

80

Tyr

Tyr Cys

Gin

Gin

Tyr

Gly

Arg

Ser

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

Gly

85

90

95

Thr

Lys Val

Asp

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

100

105

110

Phe

Pro Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

115

120

125

Cys

Leu Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

130

135

14 0

Gly

Gly

145

<210>

22

<211>

139

<212>

PRT

<213>

Human

<400>

22

Pro

Ser Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

1

5

10

15

Arg

Ala Ser

Gin

Ser

Ile

Asn

Ser

Tyr

Leu

Asp

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

20

25

30

Pro

Gly Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Ser

Leu

Gin

35

40

45

Ser

Gly Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

50

55

60

Thr

Leu Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

65

70

75

80

Cys

Gin Gin

Tyr

Tyr

Ser

Thr

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

Gly

Thr

Lys

85

90

95

Val

Glu Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

100

105

110

Pro

Ser Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

115

120

125

Leu

Asn Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

130

135

<210>

23

<211>

134

<212>

PRT

<213>

Hutnan

<400>

23

Thr

Gin Ser

Pro

Ser

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

1

5

10

15

Ile

Thr Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Asn

Ile

Ser

Arg

Tyr

Leu

Asn

Trp

Tyr

20

25

30

Gin

Gin Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Phe

Leu

Ile

Tyr

Val

Ala

Ser

35

40

45

Ile

Leu Gin

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Gly

Phe

Ser

Ala

Ser

Gly

Ser

Gly

50

55

60

Pro

Asp Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

65

70

75

80

Thr

Tyr Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

Tyr

Ser

Thr

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

110

90 95

Gly

Thr Lys

Val

Asp

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

100

105

110

Ile

Phe Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

115

120

125

Val

Cys Leu

Leu

Asn

Asn

130

<210>

24

<211>

150

<212>

PRT

<213>

Human

<400>

24

Thr

Gin Ser

Pro

Ser

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

1

5

10

15

Ile

Thr Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Ile

Cys

Asn

Tyr

Leu

Asn

Trp

Tyr

20

25

30

Gin

Gin Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Arg

Val

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

35

40

45

Ser

Leu Gin

Gly

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

50

55

60

Ile

Asp Cys

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

65

70

75

80

Thr

Tyr Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

Tyr

Ile

Thr

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

85

90

95

Gly

Thr Arg

Val

Asp

Ile

Glu

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

100

105

110

Ile

Phe Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

115

120

125

Val

Cys Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

130

135

140

Lys

Val Asp

Asn

Ala

Tyr

145

150

<210>

25

<211>

139

<212>

PRT

<213>

Human

<400>

25

Pro

Leu Ser

Leu

Pro

Val

Thr

Leu

Gly

Gin

Pro

Ala

Ser

Ile

Ser

Cys

1

5

10

15

Arg

Ser Ser

Gin

Ser

Leu

Val

Tyr

Ser

Asp

Gly

Asn

Thr

Tyr

Leu

Asn

20

25

30

Trp

Phe Gin

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin

Ser

Pro

Arg

Arg

Leu

Ile

Tyr

Lys

35

40

45

Val

Ser Asn

Trp

Asp

Ser

Gly

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Lys

Ile

Ser

Arg

Val

Glu

Ala

Glu

Asp

65

70

75

80

Val

Gly Val

Tyr

Tyr

Cys

Met

Gin

Gly

Ser

His

Trp

Pro

Pro

Thr

Phe

85

90

95

Gly

Gin Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

100

105

110

Val

Phe Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

115

120

125

Ser

Val Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

130

135

<210> 26 • ·

111 <211> 133 <212> PRT <213> Human <400> 26

Pro

Gly

Glu

Pro

Ala

Ser

Ile

Ser

Cys

Arg

Ser

Ser

Gin

Ser

Leu

Leu

1

5

10

15

His

Ser

Asn

Gly

Tyr

Asn

Tyr

Leu

Asp

Trp

Tyr

Leu

Gin

Lys

Pro

Gly

20

25

30

Gin

Ser

Pro

Gin

Leu

Leu

Ile

Tyr

Leu

Gly

Ser

Asn

Arg

Ala

Ser

Gly

35

40

45

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

50

55

60

Lys

Leu

Ser

Arg

Val

Glu

Ala

Glu

Asp

Val

Gly

Val

Tyr

Tyr

Cys

Met

65

70

75

80

Gin

Ala

Leu

Gin

Thr

Pro

Leu

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

85

90

95

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

100

105

110

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

115

120

125

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

130 <210> 27 <211> 364 <212> PRT <213> Human <400> 27

Met

Gly

Val

Leu

Leu

Thr

Gin

Arg

Thr

Leu

Leu

Ser

Leu

Val

Leu

Ala

1

5

10

15

Leu

Leu

Phe

Pro

Ser

Met

Ala

Ser

Met

Ala

Met

His

Val

Ala

Gin

Pro

20

25

30

Ala

Val

Val

Leu

Ala

Ser

Ser

Arg

Gly

Ile

Ala

Ser

Phe

Val

Cys

Glu

35

40

45

Tyr

Ala

Ser

Pro

Gly

Lys

Ala

Thr

Glu

Val

Arg

Val

Thr

Val

Leu

Arg

50

55

60

Gin

Ala

Asp

Ser

Gin

Val

Thr

Glu

Val

Cys

Ala

Ala

Thr

Tyr

Met

Met

65

70

75

80

Gly

Asn

Glu

Leu

Thr

Phe

Leu

Asp

Asp

Ser

Ile

Cys

Thr

Gly

Thr

Ser

85

90

95

Ser

Gly Asn

Gin

Val

Asn

Leu

Thr

Ile

Gin

Gly

Leu

Arg

Ala

Met

Asp

100

105

110

Thr

Gly

Leu

Tyr

Ile

Cys

Lys

Val

Glu

Leu

Met

Tyr

Pro

Pro

Pro

Tyr

115

120

125

Tyr

Leu

Gly

Ile

Gly

Asn

Gly

Thr

Gin

Ile

Tyr

Val

Ile

Asp

Pro

Glu

130

135

14 0

Pro

Cys

Pro

Asp

Ser

Asp

Leu

Glu

Gly

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

145

150

155

160

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

165

170

175

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

180

185

190

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

195

200

205

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

210

215

220

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

225

230

235

240

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Thr

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

···· ····

11'2

245

250

255

Lys

Gly Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

260

265

270

Asp

Glu Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

275

280

285

Phe

Tyr Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

290

295

300

Glu

Asn Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

305

310

315

320

Phe

Phe Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

325

330

335

Gly

Asn Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

340

345

350

Tyr

Thr Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

355

360

<210>

28

<211>

12

<212>

PRT

<213>

Human

<400>

28

Met

His Val

Ala

Gin

Pro

Ala

Val

Val

Leu

Ala

Ser

1

5

10

<210>

29

<211>

120

<212>

PRT

<213>

Human

<400>

29

Met

His Val

Ala

Gin

Pro

Ala

Val

Val

Leu

Ala

Ser

Ser

Arg

Gly

Ile

1

5

10

15

Ala

Ser Phe

Val

Cys

Glu

Tyr

Ala

Ser

Pro

Gly

Lys

Ala

Thr

Glu

Val

20

25

30

Arg

Val Thr

Val

Leu

Arg

Gin

Ala

Asp

Ser

Gin

Val

Thr

Glu

Val

Cys

35

40

45

Ala

Ala Thr

Tyr

Met

Met

Gly

Asn

Glu

Leu

Thr

Phe

Leu

Asp

Asp

Ser

50

55

60

Ile

Cys Thr

Gly

Thr

Ser

Ser

Gly

Asn

Gin

Val

Asn

Leu

Thr

Ile

Gin

65

70

75

80

Gly

Leu Arg

Ala

Met

Asp

Thr

Gly

Leu

Tyr

Ile

Cys

Lys

Val

Glu

Leu

85

90

95

Met

Tyr Pro

Pro

Pro

Tyr

Tyr

Leu

Gly

Ile

Gly

Asn

Gly

Thr

Gin

Ile

100

105

110

Tyr

Val Ile

Asp

Pro

Glu

Pro

Cys

115

120

<210>

30

<211>

11

<212>

PRT

<213>

Human

<400>

30

Met

His Val

Ala

Gin

Pro

Ala

Val

Val

Leu

Ala

1

5

10

<210>

31

<211>

89

<212>

PRT

<213>

Human

• ·

113 • · · · ♦ · · • · · · · · · • · · · · ········ ·· ··

<400>

31

Gly

Val

Val

Gin

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

1

5

10

15

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser

Tyr

Gly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

20

25

30

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Ser

Asn

35

40

45

Lys

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

50

55

60

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

65

70

75

80

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

85

<210> 32 <211> 169 <212> PRT <213> Human <400> 32

Gly

Val

Val

Gin

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

1

5

10

15

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser

Tyr

Gly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

20

25

30

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Ser

Asn

35

40

45

Lys

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

50

55

60

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

65

70

75

80

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Ala

Arg

Ile

Ile

Thr

Pro

85

90

95

Cys

Met

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

100

105

110

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

115

120

125

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

130

135

140

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

145

150

155

160

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

165 <210> 33 <211> 167 <212> PRT <213> Human <400> 33

Gly

Val

Val

Gin

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Val

Ala

Ser

1

5

10

15

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser

His

Gly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

20

25

30

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Arg

Asn

35

40

45

Lys

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

50

55

60

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Phe

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

65

70

75

80

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Gly

His

Phe

Gly

Pro

Phe

• · β · • ·

114 ···· ····

90 95

Asp

Tyr Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

100

105

110

Lys

Gly Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

115

120

125

Glu

Ser Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

130

135

14 0

Pro

Val Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

145

150

155

160

Thr

Phe Pro

Ala

Val

Leu

Gin

165

<210>

34

<211>

166

<212>

PRT

<213>

Human

<400>

34

Gly

Val Val

Gin

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Thr

Ala

Ser

1

5

10

15

Gly

Phe Thr

Phe

Ser

Asn

Tyr

Gly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

20

25

30

Gly

Lys Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Ser

Asn

35

40

45

Lys

His Tyr

Gly

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

50

55

60

Asn

Ser Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

65

70

75

80

Asp

Thr Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Glu

Arg

Leu

Gly

Ser

Tyr

85

90

95

Phe

Asp Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

100

105

110

Thr

Lys Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

115

120

125

Ser

Glu Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

130

135

140

Glu

Pro Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

145

150

155

160

His

Thr Phe

Pro

Ala

Val

165

<210>

35

<211>

167

<212>

PRT

<213>

Human

<400>

35

Gly

Val Val

Gin

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Val

Ala

Ser

1

5

10

15

Gly

Phe Ile

Phe

Ser

Ser

His

Gly

Ile

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

20

25

30

Gly

Lys Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Arg

Asn

35

40

45

Lys

Asp Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

50

55

60

Asn

Ser Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

65

70

75

80

Asp

Thr Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Val

Ala

Pro

Leu

Gly

Pro

Leu

85

90

95

Asp

Tyr Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

100

105

110

• · • · • · • ·

115

Lys

Gly

Pro Ser 115

Val

Phe

Pro

Leu Ala Pro 120

Cys

Ser

Arg 125

Ser Thr Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

130

135

140

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

145

150

155

160

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

165 <210> 36 <211> 153 <212> PRT <213> Human <400> 36

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

1

5

10

15

Ser

Ser

His

Gly

Ile

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

20

25

30

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Arg

Asn

Lys

Asp

Tyr

Ala

35

40

45

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

50

55

60

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

65

70

75

80

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Val

Ala

Pro

Leu

Gly

Pro

Leu

Asp

Tyr

Trp

Gly

85

90

95

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

100

105

110

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

115

120

125

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

130

135

140

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

145 150

<210>

37

<211>

163

<212>

PRT

<213>

Human

<400>

37

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

1

5

10

15

Ser

Ser

His

Gly

Ile

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

20

25

30

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Arg

Asn

Lys

Asp

Tyr

Ala

35

40

45

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Lys

50

55

60

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

65

70

75

80

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Val

Ala

Pro

Leu

Gly

Pro

Leu

Asp

Tyr

Trp

Gly

85

90

95

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

100

105

110

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

115

120

125

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

130

135

140

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

116 • · · · * · · · »· • · · · » · ·· • · ·»·« ·· • · ·««· « * <· ··<· »·»· ·· ·> ·· ··»

145

150

155

160

Val Leu Gin <210? 38 <211? 138 <212? PRT <213> Human <400> 38

Gly

Gly

Val

Val

Glu

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Thr

Ala

1

5

10

15

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser

Tyr

Gly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

20

25

30

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Ser

35

40

45

Asn

Lys

His

Tyr

Ala

Asp

Ser

Ala

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

50

55

60

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

65

70

75

80

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Ala

Gly

Leu

Leu

Gly

Tyr

85

90

95

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

100

105

110

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

115

120

125

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

130

135

<210> 39 <211? 167 <212? PRT <213? Human <220?

<400>

39

Gly

Val

Val

Gin

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

1

5

10

15

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser

Tyr

Gly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

20

25

30

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Ser

Asn

35

40

45

Lys

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

50

55

60

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

65

70

75

80

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Asp

Pro

Arg

Gly

Ala

Thr

Leu

85

90

95

Tyr

Tyr

Tyr

Tyr

Tyr

Arg

Xaa

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Thr

Val

100

105

110

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

115

120

125

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

130

135

140

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

145

150

155

160

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

165 <210> 40 ··

117 <211> 150 <212> PRT <213> Human <400> 40

Gly

Val Val

Gin

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

1

5

10

15

Gly

Phe Thr

Phe

Ser

Ser

Tyr

Gly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

20

25

30

Gly

Lys Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Ser

His

35

40

45

Lys

Tyr Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

50

55

60

Asn

Ser Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

65

70

75

80

Asp

Thr Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Ala

Val

Val

Val

Pro

Ala

85

90

95

Ala

Met Asp

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

100

105

110

Ser

Thr Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

115

120

125

Thr

Ser Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

130

13 5

140

Pro

Glu Pro

Val

Thr

Val

145

150

<210>

41

<211>

146

<212>

PRT

<213>

Human

<400>

41

Val

Val Gin

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

1

5

10

15

Phe

Thr Phe

Ser

Ser

Cys

Gly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

20

25

30

Lys

Gly Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Ser

Asp

Gly

Ser

His

Lys

35

40

45

Tyr

Tyr Ala

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

50

55

60

Ser

Lys Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

65

70

75

80

Thr

Ala Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Thr

Met

Ile

Val

Val

Gly

Thr

85

90

95

Leu

Asp Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

100

105

110

Thr

Lys Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

115

120

125

Ser

Glu Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

130

135

14 0

Glu

Pro

145

<210>

42

<211>

171

<212>

PRT

<213>

Human

<400>

42

Gly

Val Val

Gin

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

10 15 • · • ·

118

Gly

Phe Thr

Phe Ser 20

Ser Tyr Gly

Val His 25

Trp Val

Arg Gin Ala 30

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Ser

Asn

35

40

45

Lys

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

50

55

60

Asn

Ser

Lys

Ser

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

65

70

75

80

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Asp

Ser

Tyr

Tyr

Asp

Phe

Trp

85

90

95

Ser

Gly

Arg

Gly

Gly

Met

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

100

105

110

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

115

120

125

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

130

135

140

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

145

150

155

160

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

165 170 <210> 43 <211> 163 <212> PRT <213> Human <400> 43

Val

Gin

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

1

5

10

15

Thr

Phe

Ser

Asn

Tyr

Ala

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

20

25

30

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Val

Val

Ile

Trp

His

Asp

Gly

Asn

Asn

Lys

Tyr

35

40

45

Tyr

Ala

Glu

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

50

55

60

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

65

70

75

80

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Asp

Gin

Gly

Thr

Gly

Trp

Tyr

Gly

Gly

85

90

95

Phe

Asp

Phe

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

100

105

110

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

115

120

125

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

130

135

140

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

145

150

155

160

His

Thr

Phe

<210> 44 <211> 76 <212> PRT <213> Human <400> 44

Val

Ser

Gly

Gly

Ser

Ile

Ser

Ser

Gly

Gly

Tyr

Tyr

Trp

Ser

Trp

Ile

1

5

10

15

Arg

Gin

His

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Ile

Gly

Tyr

Ile

Tyr

Tyr

20

25

30

Ser

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Asn

Pro

Ser

Leu

Lys

Ser

Arg

Val

Thr

Ile

• ·

35

40 Asn Gin Phe

Ser Leu Lys

45 Leu Ser Ser Val

Ser Val Asp 50 Thr Ala Ala 65

Thr Ser

Lys Ala 70

55 Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala 75

60 Arg

Asp

Thr

<210>

45

<211>

172

<212>

PRT

<213>

Human

<400>

45

Ser

Gly Pro

Gly

Leu

Val

Lys

Pro

Ser

Gin

Ile

Leu

Ser

Leu

Thr

Cys

1

5

10

15

Thr

Val Ser

Gly

Gly

Ser

Ile

Ser

Ser

Gly

Gly

His

Tyr

Trp

Ser

Trp

20

25

30

Ile

Arg Gin

His

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Ile

Gly

Tyr

Ile

Tyr

35

40

45

Tyr

Ile Gly

Asn

Thr

Tyr

Tyr

Asn

Pro

Ser

Leu

Lys

Ser

Arg

Val

Thr

50

55

60

Ile

Ser Val

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

Phe

Ser

Leu

Lys

Leu

Ser

Ser

65

70

75

80

Val

Thr Ala

Ala

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Asp

Ser

Gly

85

90

95

Asp

Tyr Tyr

Gly

Ile

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

100

105

110

Ser

Ser Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

115

120

125

Ser

Arg Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

130

135

140

Asp

Tyr Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

14 5

150

155

160

Thr

Ser Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

165

170

<210>

46

<211>

96

<212>

PRT

<213>

Human

<400>

46

Glu

Ile Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Gly

Thr

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

1

5

10

15

Glu

Arg Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Val

Ser

Ser

Ser

20

25

30

Tyr

Leu Ala

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

Leu

Leu

35

40

45

Ile

Tyr Gly

Ala

Ser

Ser

Arg

Ala

Thr

Gly

Ile

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

50

55

60

Gly

Ser Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Arg

Leu

Glu

65

70

75

80

Pro

Glu Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Tyr

Gly

Ser

Ser

Pro

85

90

95

<210>

47

<211>

141

<212>

PRT

<213>

Human

<400>

47

Gin

Ser Pro

Gly

Thr

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

• ·

120

10 15

Ser

Cys Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Ile

Ser

Ser

Ser

Phe

Leu

Ala

Trp

Tyr

20

25

30

Gin

Gin Arg

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

Leu

Leu

Ile

Tyr

Gly

Ala

Ser

35

40

45

Ser

Arg Ala

Thr

Gly

Ile

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

50

55

60

Thr

Asp Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Arg

Leu

Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

65

70

75

80

Val

Tyr Tyr

Cys

Gin

Gin

Tyr

Gly

Thr

Ser

Pro

Trp

Thr

Phe

Gly

Gin

85

90

95

Gly

Thr Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

100

105

110

Ile

Phe Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

115

120

125

Val

Cys Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

130

135

140

<210>

48

<211>

141

<212>

PRT

<213>

Human

<400>

48

Gin

Ser Pro

Gly

Thr

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

1

5

10

15

Ser

Cys Arg

Thr

Ser

Val

Ser

Ser

Ser

Tyr

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Gin

20

25

30

Lys

Pro Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

Leu

Leu

Ile

Tyr

Gly

Ala

Ser

Ser

Arg

35

40

45

Ala

Thr Gly

Ile

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

50

55

60

Phe

Thr Leu

Thr

Ile

Ser

Arg

Leu

Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

65

70

75

80

Tyr

Cys Gin

Gin

Tyr

Gly

Ile

Ser

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

85

90

95

Lys

Val Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

100

105

110

Pro

Pro Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

115

120

125

Leu

Leu Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

130

135

140

<210>

49

<211>

139

<212>

PRT

<213>

Human

<400>

49

Gly

Thr Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Arg

1

5

10

15

Ala

Ser Gin

Ser

Val

Ser

Ser

Tyr

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

20

25

30

Gly

Gin Ala

Pro

Arg

Leu

Leu

Ile

Tyr

Gly

Ala

Ser

Ser

Arg

Ala

Thr

35

40

45

Gly

Ile Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

50

55

60

Leu

Thr Ile

Ser

Arg

Leu

Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

65

70

75

80

Gin

Gin Tyr

Gly

Arg

Ser

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

Gly

Thr

Lys

Val

85

90

95

• ♦

121

Asp

Ile Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

100

105

110

Ser

Asp Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

115

120

125

Asn

Asn Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

130

135

<210>

50

<211>

142

<212>

PRT

<213>

Human

<400>

50

Gin

Ser Pro

Gly

Thr

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

1

5

10

15

Ser

Cys Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Val

Ser

Ser

Tyr

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

20

25

30

Gin

Lys Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

Pro

Leu

Ile

Tyr

Gly

Val

Ser

Ser

35

40

45

Arg

Ala Thr

Gly

Ile

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

50

55

60

Asp

Phe Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Arg

Leu

Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

65

70

75

80

Tyr

Tyr Cys

Gin

Gin

Tyr

Gly

Ile

Ser

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

Gly

85

90

95

Thr

Lys Val

Asp

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

100

105

110

Phe

Pro Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

115

120

125

Cys

Leu Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

130

135

140

<210>

51

<211>

142

<212>

PRT

<213>

Human

<400>

51

Ser

Pro Gly

Thr

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

1

5

10

15

Cys

Arg Ala

Ser

Gin

Ser

Ile

Ser

Ser

Asn

Phe

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

20

25

30

Gin

Lys Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

Leu

Leu

Ile

Tyr

Arg

Pro

Ser

Ser

35

40

45

Arg

Ala Thr

Gly

Ile

Pro

Asp

Ser

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

50

55

60

Asp

Phe Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Arg

Leu

Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Leu

65

70

75

80

Tyr

Tyr Cys

Gin

Gin

Tyr

Gly

Thr

Ser

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

Gly

85

90

95

Thr

Lys Val

Asp

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

100

105

110

Phe

Pro Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

LyS

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

115

120

125

Cys

Leu Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

130

135

140

<210>

52

<211>

146

<212>

PRT

<213>

Human

• · <400> 52

Gin

Ser Pro

Gly

Thr

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

1

5

10

15

Ser

Cys Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Val

Ser

Ser

Tyr

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

20

25

30

Gin

Lys Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

Leu

Leu

Ile

Tyr

Gly

Ala

Ser

Ser

35

40

45

Arg

Ala Thr

Gly

Ile

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

50

55

60

Asp

Phe Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Arg

Leu

Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

65

70

75

80

Tyr

Tyr Cys

Gin

Gin

Tyr

Gly

Arg

Ser

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

Gly

85

90

95

Thr

Lys Val

Asp

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

100

105

110

Phe

Pro Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

115

120

125

Cys

Leu Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

130

135

14 0

Gly

Gly

14 5

<210>

53

<211>

95

<212>

PRT

<213>

Human

<400>

53

Asp

Ile Gin

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

1

5

10

15

Asp

Arg Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Ile

Ser

Ser

Tyr

20

25

30

Leu

Asn Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Ala Ala

Ser

Ser

Leu

Gin

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

Tyr

Ser

Thr

Pro

85

90

95

<210>

54

<211>

152

<212>

PRT

<213>

Human

<400>

54

Gin

Ser Pro

Ser

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

1

5

10

15

Thr

Cys Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Ile

Asn

Thr

Tyr

Leu

Ile

Trp

Tyr

Gin

20

25

30

Gin

Lys Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Asn

Phe

Leu

Ile

Ser

Ala

Thr

Ser

Ile

35

40

45

Leu

Gin Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Arg

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

50

55

60

Asn

Phe Thr

Leu

Thr

Ile

Asn

Ser

Leu

His

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

65

70

75

80

Tyr

Tyr Cys

Gin

Gin

Ser

Tyr

Ser

Thr

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

Gly

85

90

95

Thr

Lys Val

Asp

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

123

100

105

110

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

115

120

125

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

130

135

140

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

145

150

<210> 55 <211> 139 <212> PRT <213> Human <400> 55

Pro

Ser

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

1

5

10

15

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Ile

Asn

Ser

Tyr

Leu

Asp

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

20

25

30

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Ser

Leu

Gin

35

40

45

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

50

55

60

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

65

70

75

80

Cys

Gin

Gin

Tyr

Tyr

Ser

Thr

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

Gly

Thr

Lys

85

90

95

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

100

105

110

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

115

120

125

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

130

135

<210> 56 <211> 134 <212> PRT <213> Human <400> 56

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

1

5

10

15

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Asn

Ile

Ser

Arg

Tyr

Leu

Asn

Trp

Tyr

20

25

30

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Phe

Leu

Ile

Tyr

Val

Ala

Ser

35

40

45

Ile

Leu

Gin

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Gly

Phe

Ser

Ala

Ser

Gly

Ser

Gly

50

55

60

Pro

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

65

70

75

80

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

Tyr

Ser

Thr

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

85

90

95

Gly

Thr

Lys

Val

Asp

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

100

105

110

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

115

120

125

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

130

<210> 57 <211> 150 <212> PRT • ·

124 <213> Human <400> 57

Thr

Gin Ser

Pro

Ser

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

1

5

10

15

Ile

Thr Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Ile

Cys

Asn

Tyr

Leu

Asn

Trp

Tyr

20

25

30

Gin

Gin Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Arg

Val

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

35

40

45

Ser

Leu Gin

Gly

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

50

55

60

Ile

Asp Cys

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

65

70

75

80

Thr

Tyr Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

Tyr

Ile

Thr

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

85

90

95

Gly

Thr Arg

Val

Asp

Ile

Glu

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

100

105

110

Ile

Phe Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

115

120

125

Val.

Cys Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

130

135

140

Lys

Val Asp

Asn

Ala

Tyr

145

150

<210>

58

<211>

96

<212>

PRT

<213>

Human

<400>

58

Glu

Ile Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Asp

Phe

Gin

Ser

Val

Thr

Pro

Lys

1

5

10

15

Glu

Lys Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Ile

Gly

Ser

Ser

20

25

30

Leu

His Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Asp

Gin

Ser

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

35

40

45

Lys

Tyr Ala

Ser

Gin

Ser

Phe

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Asn

Ser

Leu

Glu

Ala

65

70

75

80

Glu

Asp Ala

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

His

Gin

Ser

Ser

Ser

Leu

Pro

Gin

85

90

95

<210>

59

<211>

155

<212>

PRT

<213>

Human

<400>

59

Ser

Pro Asp

Phe

Gin

Ser

Val

Thr

Pro

Lys

Glu

Lys

Val

Thr

Ile

Thr

1

5

10

15

Cys

Arg Ala

Ser

Gin

Ser

Ile

Gly

Ser

Ser

Leu

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

20

25

30

Lys

Pro Asp

Gin

Ser

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

Lys

Tyr

Ala

Ser

Gin

Ser

35

40

45

Phe

Ser Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

50

55

60

Phe

Thr Leu

Thr

Ile

Asn

Ser

Leu

Glu

Ala

Glu

Asp

Ala

Ala

Thr

Tyr

65

70

75

80

Tyr

Cys His

Gin

Ser

Ser

Ser

Leu

Pro

Leu

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

90 95

125

Lys Val Glu

Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

Pro Ser Val

Phe 110

Ile

Phe

100

105

Pro

Pro Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

115

120

125

Leu

Leu Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

130

135

140

Asp

Asn Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

145

150

155

<210>

60

<211>

100

<212>

PRT

<213>

Human

<400>

60

Asp

Val Val

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Leu

Ser

Leu

Pro

Val

Thr

Leu

Gly

1

5

10

15

Gin

Pro Ala

Ser

Ile

Ser

Cys

Arg

Ser

Ser

Gin

Ser

Leu

Val

Tyr

Ser

20

25

30

Asp

Gly Asn

Thr

Tyr

Leu

Asn

Trp

Phe

Gin

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin

Ser

35

40

45

Pro

Arg Arg

Leu

Ile

Tyr

Lys

Val

Ser

Asn

Arg

Asp

Ser

Gly

Val

Pro

50

55

60

Asp

Arg Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Lys

Ile

65

70

75

80

Ser

Arg Val

Glu

Ala

Glu

Asp

Val

Gly

Val

Tyr

Tyr

Cys

Met

Gin

Gly

85

90

95

Thr

His Trp

Pro

100

<210>

61

<211>

139

<212>

PRT

<213>

Human

<400>

61

Pro

Leu Ser

Leu

Pro

Val

Thr

Leu

Gly

Gin

Pro

Ala

Ser

Ile

Ser

Cys

1

5

10

15

Arg

Ser Ser

Gin

Ser

Leu

Val

Tyr

Ser

Asp

Gly

Asn

Thr

Tyr

Leu

Asn

20

25

30

Trp

Phe Gin

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin

Ser

Pro

Arg

Arg

Leu

Ile

Tyr

Lys

35

40

45

Val

Ser Asn

Trp

Asp

Ser

Gly

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Lys

Ile

Ser

Arg

Val

Glu

Ala

Glu

Asp

65

70

75

80

Val

Gly Val

Tyr

Tyr

Cys

Met

Gin

Gly

Ser

His

Trp

Pro

Pro

Thr

Phe

85

90

95

Gly

Gin Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

100

105

110

Val

Phe Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

115

120

125

Ser

Val Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

130

135

<210>

62

<211>

100

<212>

PRT

<213>

Human

<400> 62 • ·

126

Asp 1

Ile Val

Met

Thr Gin Ser 5

Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

10

15

Glu

Pro

Ala

Ser

Ile

Ser

Cys

Arg

Ser

Ser

Gin

Ser

Leu

Leu

His

Ser

20

25

30

Asn

Gly

Tyr

Asn

Tyr

Leu

Asp

Trp

Tyr

Leu

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ser

35

40

45

Pro

Gin

Leu

Leu

Ile

Tyr

Leu

Gly

Ser

Asn

Arg

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

50

55

60

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Lys

Ile

65

70

75

80

Ser

Arg

Val

Glu

Ala

Glu

Asp

Val

Gly

Val

Tyr

Tyr

Cys

Met

Gin

Ala

85

90

95

Leu

Gin

Thr

Pro

100

<210>

63

<211>

133

<212>

PRT

<213>

Human

<400>

63

Pro

Gly

Glu

Pro

Ala

Ser

Ile

Ser

Cys

Arg

Ser

Ser

Gin

Ser

Leu

Leu

1

5

10

15

His

Ser

Asn

Gly

Tyr

Asn

Tyr

Leu

Asp

Trp

Tyr

Leu

Gin

Lys

Pro

Gly

20

25

30

Gin

Ser

Pro

Gin

Leu

Leu

Ile

Tyr

Leu

Gly

Ser

Asn

Arg

Ala

Ser

Gly

35

40

45

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

50

55

60

Lys

Leu

Ser

Arg

Val

Glu

Ala

Glu

Asp

Val

Gly

Val

Tyr

Tyr

Cys

Met

65

70

75

80

Gin

Ala

Leu

Gin

Thr

Pro

Leu

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

85

90

95

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

100

105

110

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

115

120

125

Asn Phe Tyr Pro Arg

130

	<210>	64
	<211>	20
	<212>	PRT
	<213>	Human
	<400>	64
Asp	Ile Gin	Met Thr Gin Ser	Pro Ser Ser Leu	Ser Ala Ser Val Gly
1		5	10	15
Asp	Arg Val	Thr
		20

<210> 65 <211> 20 <212> PRT <213> Human <400> 65

Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr

127 <210> 66 <211> 20 <212> PRT <213> Human <400> 66

Glu	Ile Val	Leu Thr	Gin	Ser	Pro	Gly
1		5
Glu	Arg Ala	Thr
		20
	<210>	67
	<211>	20
	<212>	PRT
	<213>	Human
	<400>	67
Asp	Ile Gin	Met Thr	Gin	Ser	Pro	Ser
1		5
Asp	Arg Val	Thr
		20
	<210>	68
	<211>	20
	<212>	PRT
	<213>	Human
	<400>	68
Thr	Gly Glu	Phe Val	Leu	Thr	Gin	Ser
1		5
Pro	Gly Glu	Arg
		20
	<210>	69
	<211>	20
	<212>	PRT
	<213>	Human
	<400>	69
Glu	Phe Val	Leu Thr	Gin	Ser	Pro	Gly
1		5
Glu	Arg Ala	Thr
		20
	<210>	70
	<211>	20
	<212>	PRT
	<213>	Human
	<400>	70
Glu	Ile Val	Leu Thr	Gin	Ser	Pro	Gly
1		5
Glu	Arg Ala	Thr

Leu Ser Leu Ser Pro Gly

Val Ser Ala Ser Val Gly

Gly Thr Leu Ser Leu Ser

Leu Ser Leu Ser Pro Gly

Leu Ser Leu Ser Pro Gly <210> 71 <211> 20 <212> PRT <213> Human • ·

128

	<400>	71
Glu	Ile Val	Leu Thr	Gin	Ser	Pro
1		5
Glu	Arg Ala	Thr
		20
	<210>	72
	<211>	20
	<212>	PRT
	<213>	Human
	<400>	72
Glu	Ile Val	Leu Thr	Gin	Ser	Pro
1		5
Glu	Arg Ala	Thr
		20
	<210>	73 '
	<211>	20
	<212>	PRT
	<213>	Human
	<400>	73
Val	Gin Leu	Val Glu	Ser	Gly Gly
1		5
Leu	Arg Leu	Ser
		20
	<210>	74
	<211>	5
	<212>	PRT
	<213>	Human
	<400>	74
Pro	Glu Val	Gin Phe
1		5
	<210>	75
	<211>	20
	<212>	PRT
	<213>	Human
	<400>	75
Val	Gin Leu	Val Glu	Ser	Gly Gly
1		5
Leu	Arg Leu	Ser
		20
	<210>	76
	<211>	10
	<212>	PRT
	<213>	Human
	<400>	76
Pro	Glu Val	Gin Phe	Asn	Trp Tyr
1		5
	<210>	77
	<211>	17
	<212>	PRT
	<213>	Human

Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

15

Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 10 15

Gly Val Val Gin Pro Gly Arg Ser 10 15

Gly Val Val Gin Pro Gly Arg Ser 10 15

Val Asp • ·

129 ···· ··· · · · • · · · · · · · ·..

	<400>	77
Val	Gin Leu	Val	Glu	Ser Gly Gly Gly Val	Val Gin Pro Gly Arg Ser
1			5	10	15
Leu

<210> 78 <211> 8 <212> PRT <213> Human

	<400>	78
Pro	Glu Val	Gin	Phe	Asn	Trp
1	<210>	79	5
	<211>	20
	<212>	PRT
	<213>	Human
	<400>	79
Glu	Val Gin	Leu	Leu	Glu	Ser
1			5
Ser	Leu Arg	Leu
		20
	<210>	80
	<211>	20
	<212>	PRT
	<213>	Human
	<400>	80
Val	Gin Leu	Val	Glu	Ser	Gly
1			5
Leu	Arg Leu	Ser
		20
	<210>	81
	<211>	10
	<212>	PRT
	<213>	Human
	<400>	81
Pro	Glu Val	Gin	Phe	Asn	Trp
1	<210>	82	5
	<211>	20
	<212>	PRT
	<213>	Human
	<400>	82
Val	Gin Leu	Val	Glu	Ser	Gly
1			5
Leu	Arg Leu	Ser
		20

Tyr

Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly

15

Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg Ser

15

Tyr Val Asp

Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg Ser

15 <210> 83 <211> 9 <212> PRT • ·

<213> Human
	<400>	83
Pro	Glu Val	Gin Phe	Asn	Trp	Tyr	Val
1		5
	<210>	84
	<211>	20
	<212>	PRT
	<213>	Human
	<400>	84
Val	Gin Leu	Val Glu	Ser	Gly	Gly	Gly
1		5
Leu	Arg Leu	Ser
		20
	<210>	85
	<211>	6
	<212>	PRT
	<213>	Human
	<400>	85
Pro	Glu Val	Gin Phe	Asn
1		5
	<210>	86
	<211>	20
	<212>	PRT
	<213>	Human
	<400>	86
Val	Gin Leu	Val Glu	Ser	Gly	Gly	Gly
1		5
Leu	Arg Leu	Ser
		20
	<210>	87
	<211>	10
	<212>	PRT
	<213>	Human
	<400>	87
Pro	Glu Val	Gin Phe	Asn	Trp	Tyr	Val
1		5
	<210>	88
	<211>	8
	<212>	PRT
	<213>	Human
	<400>	88
Asp	Ile Gin	Met Thr	Gin	Ser	Pro
1		5
	<210>	89
	<211>	8
	<212>	PRT
	<213>	Human

<400> 89

Val Gin Pro Gly Arg Ser

Val Glu Pro Gly Arg Ser • 4

131

Gin Ser Pro

Glu Ile Val Leu Thr

1	5
Glu	<210> 90 <211> 8 <212> PRT <213> Human <400> 90 Ile Val Leu Thr
1	5
Thr	<210> 91 <211> 10 <212> PRT <213 > Human <400> 91 Gly Glu Phe Val
1	5
Glu	<210> 92 <211> 8 <212> PRT <213> Human <400> 92 Phe Val Leu Thr
1	5
Glu	<210> 93 <211> 8 <212> PRT <213> Human <400> 93 Ile Val Leu Thr
1	5
Glu	<210> 94 <211> 8 <212 > PRT <213> Human <400> 94 Ile Val Leu Thr
1	5
	<210> 95 <211> 463 <212> PRT <213> Human

Gin Ser Pro

Leu Thr Gin Ser Pro

Gin Ser Pro

Gin Ser Pro

Gin Ser Pro <400> 95

Met

Glu

Phe

Gly

Leu

Ser

Trp

Val

Phe

Leu

Val

Ala

Leu

Leu

Arg

Gly

1

5

10

15

Val

Gin

Cys

Gin

Val

Gin

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Val

Val

Gin

20

25

30

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Val

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

35

40

45

Ser

Ser

His

Gly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

• ·

132

50

55

60

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Arg

Asn

Lys

Tyr

Tyr

Ala

65

70

75

80

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

85

90

95

Thr

Leu

Phe

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

100

105

110

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Gly

His

Phe

Gly

Pro

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

115

120

125

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

130

135

140

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

145

150

155

160

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

165

170

175

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

180

185

190

Val

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

195

200

205

Pro

Ser

Ser

Asn

Phe

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

Thr

Cys

Asn

Val

Asp

His

210

215

220

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Thr

Val

Glu

Arg

Lys

Cys

Cys

225

230

235

240

Val

Glu

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Pro

Val

Ala

Gly

Pro

Ser

Val

245

250

255

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

260

265

270

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

275

280

285

Val

Gin

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

290

295

300

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Phe

Asn

Ser

Thr

Phe

Arg

Val

Val

Ser

305

310

315

320

Val

Leu

Thr

Val

Val

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

325

330

335

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Gly

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

340

345

350

Ser

Lys

Thr

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

355

360

365

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

370

375

380

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

385

390

395

400

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Met

Leu

Asp

Ser

405

410

415

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

420

425

430

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

435

440

445

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

450

455

460

<210>

96

<211>

463

<212>

PRT

<213>

Human

<400>

96

Met

Glu

Phe

Gly

Leu

Ser

Trp

Val

Phe

Leu

Val

Ala

Leu

Leu

Arg

Gly

1

5

10

15

Val

Gin

Cys

Gin

Val

Gin

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Val

Val

Gin

• ♦

133

25 30

Pro Gly Arg 35

Ser Leu

Arg

Leu

Ser Cys Val 40

Ala

Ser

Gly 45

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser

His

Gly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

50

55

60

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Arg

Asn

Lys

Tyr

Tyr

Ala

65

70

75

80

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

85

90

95

Thr

Leu

Phe

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

100

105

110

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Gly

His

Phe

Gly

Pro

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

115

120

125

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

130

135

140

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

145

150

155

160

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

165

170

175

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

180

185

190

Val

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

195

200

205

Pro

Ser

Ser

Asn

Phe

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

Thr

Cys

Asn

Val

Asp

His

210

215

220

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Thr

Val

Glu

Arg

Lys

Cys

Cys

225

230

235

240

Val

Glu

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Pro

Val

Ala

Gly

Pro

Ser

Val

245

250

255

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

260

265

270

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

275

280

285

Val

Gin

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

290

295

300

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Phe

Gin

Ser

Thr

Phe

Arg

Val

Val

Ser

305

310

315

320

Val

Leu

Thr

Val

Val

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

325

330

335

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Gly

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

340

345

350

Ser

Lys

Thr

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

355

360

365

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

370

375

380

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

3Θ5

390

395

400

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Met

Leu

Asp

Ser

405

410

415

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

420

425

430

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

435

440

445

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

450

455

460

<210> 97 <211> 235 <212> PRT <213> Human • · ·

134 •4 ·· ·· ···· • » 9 9 · ► *« • · · »···· · 9 .<·.

« * · · * « 9 « · ·· • · »······ ····«·· ·· ·· ··999

<400>

97

Met

Glu

Thr

Pro

Ala

Gin

Leu

Leu

Phe

Leu

Leu

Leu

Leu

Trp

Leu

Pro

1

5

10

15

Asp

Thr

Thr

Gly

Glu

Ile

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Gly

Thr

Leu

Ser

20

25

30

Leu

Ser

Pro

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

35

40

45

Ile

Ser

Ser

Ser

Phe

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin

Ala

50

55

60

Pro

Arg

Leu

Leu

Ile

Tyr

Gly

Ala

Ser

Ser

Arg

Ala

Thr

Gly

Ile

Pro

65

70

75

80

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

85

90

95

Ser

Arg

Leu

Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Tyr

100

105

110

Gly

Thr

Ser

Pro

Trp

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

115

120

125

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

130

135

140

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

145

150

155

160

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

165

170

175

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

180

185

190

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

195

200

205

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

210

215

220

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

225

230

235

<210>

98

<211>

464

<212>

PRT

<213>

Human

<400>

98

Met

Glu

Phe

Gly

Leu

Ser

Trp

Val

Phe

Leu

Val

Ala

Leu

Leu

Arg

Gly

1

5

10

15

Val

Gin

Cys

Gin

Val

Gin

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Val

Val

Gin

20

25

30

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Thr

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

35

40

45

Ser

Asn

Tyr

Gly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

50

55

60

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Ser

Asn

Lys

His

Tyr

Gly

65

70

75

80

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

85

90

95

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

100

105

110

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Glu

Arg

Leu

Gly

Ser

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

115

120

125

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

130

135

140

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

145

150

155

160

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

165

170

175

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

« · • ♦ • · • · ·

135 ···· ····

180 185 190

Ala Val

Leu 195

Gin Ser

Ser

Gly

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

Val

Val

Thr

200

205

Val

Pro

Ser

Ser

Asn

Phe

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

Thr

Cys

Asn

Val

Asp

210

215

220

His

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Thr

Val

Glu

Arg

Lys

Cys

225

230

235

240

Cys

Val

Glu

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Pro

Val

Ala

Gly

Pro

Ser

245

250

255

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

260

265

270

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

275

280

285

Glu

Val

Gin

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

290

295

300

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Phe

Asn

Ser

Thr

Phe

Arg

Val

Val

305

310

315

320

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Val

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

325

330

335

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Gly

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

340

345

350

Ile

Ser

Lys

Thr

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

355

360

365

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

370

375

380

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

385

390

395

400

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Met

Leu

Asp

405

410

415

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

420

425

430

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

435

440

445

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

450

455

460

<210>

99

<211>

233

<212>

PRT

<213>

Human

<400>

99

Met

Glu

Thr

Pro

Ala

Gin

Leu

Leu

Phe

Leu

Leu

Leu

Leu

Trp

Leu

Pro

1

5

10

15

Asp

Thr

Thr

Gly

Glu

Ile

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Gly

Thr

Leu

Ser

20

25

30

Leu

Ser

Pro

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Arg

Thr

Ser

Val

Ser

35

40

45

Ser

Ser

Tyr

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

50

55

60

Leu

Leu

Ile

Tyr

Gly

Ala

Ser

Ser

Arg

Ala

Thr

Gly

Ile

Pro

Asp

Arg

65

70

75

80

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Arg

85

90

95

Leu

Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Tyr

Gly

Ile

100

105

110

Ser

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

115

120

125

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

130

135

140

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

• ·

136

145					150
Arg	Glu	Ala	Lys	Val	Gin	Trp	Lys
				165
Asn	Ser	Gin	Glu	Ser	Val	Thr	Glu
			180
Ser	Leu	Ser	Ser	Thr	Leu	Thr	Leu
		195					200
Lys	Val	Tyr	Ala	Cys	Glu	Val	Thr
	210					215
Thr	Lys	Ser	Phe	Asn	Arg	Gly	Glu
225					230

		155					160
Val	Asp	Asn	Ala	Leu	Gin	Ser	Gly
	170					175
Gin	Asp	Ser	Lys	Asp	Ser	Thr	Tyr
185					190
Ser	Lys	Ala	Asp	Tyr	Glu	Lys	His
				205
His	Gin	Gly	Leu	Ser	Ser	Pro	Val
			220
Cys

<210> 100 <211> 463 <212> PRT <213> Human <400> 100

Met

Glu

Phe

Gly

Leu

Ser

Trp

Val

Phe

Leu

Val

Ala

Leu

Leu

Arg

Gly

1

5

10

15

Val

Gin

Cys

Gin

Val

Gin

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Val

Val

Glu

20

25

30

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Thr

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

35

40

45

Ser

Ser

Tyr

Gly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

50

55

60

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Ser

Asn

Lys

His

Tyr

Ala

65

70

75

80

Asp

Ser

Ala

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

85

90

95

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

100

105

110

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Ala

Gly

Leu

Leu

Gly

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

115

120

125

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

130

135

140

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

145

150

155

160

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

165

170

175

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

180

185

190

Val

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

195

200

205

Pro

Ser

Ser

Asn

Phe

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

Thr

Cys

Asn

Val

Asp

His

210

215

220

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Thr

Val

Glu

Arg

Lys

Cys

Cys

225

230

235

240

Val

Glu

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Pro

Val

Ala

Gly

Pro

Ser

Val

245

250

255

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

260

265

270

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

275

280

285

Val

Gin

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

290

295

300

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Phe

Asn

Ser

Thr

Phe

Arg

Val

Val

Ser

305

310

315

320

Val

Leu

Thr

Val

Val

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

325

330

335

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Gly

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

• ·

137

340 345 350

Ser

Lys Thr

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

355

360

365

Pro

Ser Arg

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

370

375

380

Val

Lys Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

385

390

395

400

Gly

Gin Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Met

Leu

Asp

Ser

405

410

415

Asp

Gly Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

420

425

430

Trp

Gin Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

435

440

445

His

Asn His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

450

455

460

<210>

101

<211>

234

<212>

PRT

<213>

Human

<400>

101

Met

Glu Thr

Pro

Ala

Gin

Leu

Leu

Phe

Leu

Leu

Leu

Leu

Trp

Leu

Pro

1

5

10

15

Asp

Thr Thr

Gly

Glu

Ile

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Gly

Thr

Leu

Ser

20

25

30

Leu

Ser Pro

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

35

40

45

Val

Ser Ser

Tyr

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

50

55

60

Arg

Pro Leu

Ile

Tyr

Gly

Val

Ser

Ser

Arg

Ala

Thr

Gly

Ile

Pro

Asp

65

70

75

80

Arg

Phe Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

85

90

95

Arg

Leu Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Tyr

Gly

100

105

110

Ile

Ser Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

Gly

Thr

Lys

Val

Asp

Ile

Lys

Arg

115

120

125

Thr

Val Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

130

135

140

Leu

Lys Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

145

150

155

160

Pro

Arg Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

165

170

175

Gly

Asn Ser

Gin

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

180

185

190

Tyr

Ser Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

195

200

205

His

Lys Val

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

210

215

220

Val

Thr Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

225

230

<210>

102

<211>

451

<212>

PRT

<213>

Human

<400>

102

Gin

Val Gin

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Val

Val

Gin

Pro

Gly

Arg

10 15

138

Ser

Leu Arg

Leu Ser 20

Cys Ala Ala

Ser Gly 25

Phe

Thr

Phe

Ser 30

Ser

Tyr

Gly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Ser

Asn

Lys

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Asp

Pro

Arg

Gly

Ala

Thr

Leu

Tyr

Tyr

Tyr

Tyr

Tyr

•Gly

Met

100

105

110

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

115

120

125

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

130

135

140

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leú

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

145

150

155

160

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

165

170

175

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

180

185

190

Val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

Asn

Phe

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

Thr

Cys

195

200

205

Asn

Val

Asp

His

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Thr

Val

Glu

210

215

220

Arg

Lys

Cys

Cys

Val

Glu

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Pro

Val

Ala

225

230

235

240

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

245

250

255

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

260

265

270

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Gin

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

275

280

285

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Phe

Asn

Ser

Thr

Phe

290

295

300

Arg

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Val

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

305

310

315

320

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Gly

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

325

330

335

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

Thr

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

340

345

350

Tyr

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

355

360

365

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

370

375

380

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

385

390

395

400

Met

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

405

410

415

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

420

425

430

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

435

440

445

Pro

Gly

Lys

450

<210> 103 <211> 214 <212> PRT <213> Human • · • · • ·

139

<400>

103

Asp

Ile

Gin

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

1

5

10

15

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Ile

Asn

Ser

Tyr

20

25

30

Leu

Asp

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Ala

Ala

Ser

Ser

Leu

Gin

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Tyr

Tyr

Ser

Thr

Pro

Phe

85

90

95

Thr

Phe

Gly

Pro

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

100

105

110

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

115

120

125

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

130

135

140

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

145

150

155

160

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

165

170

175

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

180

185

190

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

195

200

205

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

210 <210> 104 <211> 22 <212> DNA <213> Human <400> 104 caggtgcagc tggagcagtc gg

<210>	105
<211>	24
<212>	DNA
<213>	Human
<400>	105

gctgagggag tagagtcctg agga

<210>	106
<211>	49
<212>	DNA
<213>	Human
<400>	106

tatctaagct tctagactcg accgccacca tggagtttgg gctgagctg <210> 107 <211> 46 <212> DNA <213> Human <400> 107 • · • ·

140 ttctctgatc agaattccta tcatttaccc ggagacaggg agagct <210>

<211>

<212>

<213>

108

DNA Human <400>

accgccacc

108 <210>

<211>

<212>

<213>

109

DNA Human

109 <400>

tcttcaagct tgcccgggcc cgccaccatg gaaaccccag cgcag

<210>	110
<211>	43
<212>	DNA
<213>	Human
<400>	110

ttctttgatc agaattctca ctaacactct cccctgttga agc

<210>	111
<211>	48
<212>	DNA
<213>	Human
<400>	111

tcttcaagct tgcccgggcc cgccaccatg gacatgaggg tccccgct <210>

<211>

<212>

<213>

112 1392 DNA Human <400> atggagtttg < gtgcagctgg tgtgtagcgt ggcaaggggc gactccgtga caaatgaaca ttcggtcctt aagggcccat gccctgggct ggcgctctga tccctcagca aacgtagatc gtcgagtgcc ccaaaaccca gacgtgagcc cataatgcca gtcctcaccg aacaaaggcc gaaccacagg ctgacctgcc gggcagccgg

- 112 ggctgagctg tggagtctgg ctggattcac tggagtgggt agggccgatt gcctgagagc ttgactactg cggtcttccc gcctggtcaa ccagcggcgt gcgtggtgac acaagcccag caccgtgccc aggacaccct acgaagaccc agacaaagcc ttgtgcacca tcccagcccc tgtacaccct tggtcaaagg agaacaacta ggttttcctc gggaggcgtg cttcagtagc ggcagttata caccatctcc cgaggacacg gggccaggga cctggcgccc ggactacttc gcacaccttc cgtgccctcc caacaccaag agcaccacct catgatctcc cgaggtccag acgggaggag ggactggctg catcgagaaa gcccccatcc cttctacccc caagaccaca gttgctcttt gtccagcctg catggcatgc tggtatgatg agagacaatt gctgtgtatt accctggtca tgctccagga cccgaaccgg ccagctgtcc agcaacttcg gtggacaaga gtggcaggac cggacccctg aggtcacgtg ttcaactggt cagttcaaca aacggcaagg accatctcca cgggaggaga agcgacatcg cctcccatgc taagaggtgt ggaggtccct actgggtccg gaagaaataa ccaagaacac actgtgcgag ccgtctcctc gcacctccga tgacggtgtc tacagtcctc gcacccagac cagttgagcg cgtcagtctt acgtggacgg gcacgttccg agtacaagtg aaaccaaagg tgaccaagaa ccgtggagtg tggactccga ccagtgtcag gagactctcc ccaggctcca atactatgca gctgtttctg aggaggtcac agcctccacc gagcacagcg gtggaactca aggactctac ctacacctgc caaatgttgt cctcttcccc cgtggtggtg cgtggaggtg tgtggtcagc caaggtctcc gcagccccga ccaggtcagc ggagagcaat cggctccttc

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960 1020 1080 1140 1200 1260 « · • ·

141 ttcctctaca gcaagctcac tgctccgtga tgcatgaggc ccgggtaaat ga cgtggacaag tctgcacaac agcaggtggc cactacacgc agcaggggaa agaagagcct cgtcttctca ctccctgtct

1320

1380

1392

<210>	113
<211>	708
<212>	DNA
<213>	Human
<400>	113

atggaaaccc gaaattgtgt ctctcctgca cctggccagg gacaggttca cctgaagatt caagggacca ccatctgatg tatcccagag caggagagtg acgctgagca ggcctgagct cagcgcagct tgacgcagtc gggccagtca ctcccaggct gtggcagtgg ttgcagtgta aggtggaaat agcagttgaa aggccaaagt tcacagagca aagcagacta cgcccgtcac tctcttcctc tccaggcacc gagtattagc cctcatctat gtctgggaca ttactgtcag caaacgaact atctggaact acagtggaag ggacagcaag cgagaaacac aaagagcttc ctgctactct ctgtctttgt agcagcttct ggtgcatcca gacttcactc cagtatggta gtggctgcac gcctctgttg gtggataacg gacagcacct aaagtctacg aacaggggag ggctcccaga ctccagggga tagcctggta gcagggccac tcaccatcag cctcaccctg catctgtctt tgtgcctgct ccctccaatc acagcctcag cctgcgaagt agtgttag taccaccgga aagagccacc ccagcagaga tggcatccca cagactggag gacgttcggc catcttcccg gaataacttc gggtaactcc cagcaccctg cacccatcag

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

708

<210>	114
<211>	1395
<212>	DNA
<213>	Human
<400>	114

atggagtttg gtgcagctgg tgtacagcgt ggcaaggggc gactccgtga caaatgaaca ctggggtcct accaagggcc gcggccctgg tcaggcgctc tactccctca tgcaacgtag tgtgtcgagt cccccaaaac gtggacgtga gtgcataatg agcgtcctca tccaacaaag cgagaaccac agcctgacct aatgggcagc ttcttcctct tcatgctccg tctccgggta ggctgagctg tggagtctgg ctggattcac tggagtgggt agggccgatt gcctgagagc actttgacta catcggtctt gctgcctggt tgaccagcgg gcagcgtggt atcacaagcc gcccaccgtg ccaaggacac gccacgaaga ccaagacaaa ccgttgtgca gcctcccagc aggtgtacac gcctggtcaa cggagaacaa acagcaagct tgatgcatga aatga ggttttcctc gggaggcgtg cttcagtaac ggcagttata caccatctcc cgaggacacg ctggggccag ccccctggcg caaggactac cgtgcacacc gacCgtgccc cagcaacacc cccagcacca cctcatgatc ccccgaggtc gccacgggag ccaggactgg ccccatcgag cctgccccca aggcttctac ctacaagacc caccgtggac ggctctgcac gttgctcttt gtccagcctg tatggcatgc tggtatgatg agtgacaatt gctgtgtatt ggaaccctgg ccctgctcca ttccccgaac ttcccagctg tccagcaact aaggtggaca cctgtggcag tcccggaccc cagttcaact gagcagttca ctgaacggca aaaaccatct tcccgggagg cccagcgaca acacctccca aagagcaggt aaccactaca taagaggtgt ggaggtccct actgggtccg gaagtaataa ccaagaacac actgtgcgag tcaccgtctc ggagcacctc cggtgacggt tcctacagtc tcggcaccca agacagttga gaccgtcagt ctgaggtcac ggtacgtgga acagcacgtt aggagtacaa ccaaaaccaa agatgaccaa tcgccgtgga tgctggactc ggcagcaggg cgcagaagag ccagtgtcag gagactctcc ccaggctcca acactatgga gctgtatctg aggagagaga ctcagcctcc cgagagcaca gtcgtggaac ctcaggactc gacctacacc gcgcaaatgt cttcctcttc gtgcgtggtg cggcgtggag ccgtgtggtc gtgcaaggtc agggcagccc gaaccaggtc gtgggagagc cgacggctcc gaacgtcttc cctctccctg

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1395

<210>	115
<211>	702
<212>	DNA
<213>	Human
<400>	115

atggaaaccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga e ·

142 • « gaaattgtgt ctctcctgca caggctccca ttcagtggca gattttgcag accaaggtgg gatgagcagt agagaggcca agtgtcacag agcaaagcag agctcgcccg tgacgcagtc ggaccagtgt ggctcctcat gtgggtctgg tctattactg agatcaagcg tgaaatctgg aagtacagtg agcaggacag actacgagaa tcacaaagag tccaggcacc tagcagcagt ctatggtgca gacagacttc tcagcagtat aactgtggct aactgcctet gaaggtggat caaggacagc acacaaagtc cttcaacagg ctgtctttgt tacttagcct tccagcaggg actctcacca ggcatctcac gcaccatctg gttgtgtgcc aacgccctcc acctacagcc tacgcctgcg ggagagtgtt ctccagggga ggtaccagca ccactggcat tcagcagact ccttcacttt tcttcatctt tgctgaataa aatcgggtaa tcagcagcac aagtcaccca ag aagagccacc gaaacctggc cccagacagg ggagcctgaa cggcggaggg cccgccatct cttctatccc ctcccaggag cctgacgctg tcagggcctg

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

702

<210>	116
<211>	489
<212>	DNA
<213>	Human
<400>	116

cctgggaggt atccactggg gatggaagaa aattccaaga tattactgtg gtcaccgtct aggagcacct ccggtgacgg gtcctacag ccctgagact tccgccaggc ataaagacta agacgctgta cgagagtggc cctcagcctc ccgagagcac tgtcgtggaa ctcctgtgca tccaggcaag tgcagactcc tttgcaaatg cccactgggg caccaagggc agcggccctg ctcaggcgct gcgtctggat gggctggagt gtgaagggcc aacagcctga ccacttgact ccatcggtct ggctgcctgg ctgaccagcg tcaccttcag gggtggcagt gattcaccat gagccgagga actggggcca tccccctggc tcaaggacta gcgtgcacac tagtcatggc tatatggtat ctccagagac cacggctgtg gggaaccctg gccctgctcc cttccccgaa cttcccagct

120

180

240

300

360

420

480

489

<210>	117
<211>	417
<212>	DNA
<213>	Human
<400>	117

ggcaccctgt gtcagcagct tatggtgcat acagacttca cagcagtatg actgtggctg actgcctctg ctttgtctcc acttagcctg ccagcagggc ctctcaccat gtaggtcacc caccatctgt ttgtgtgcct aggggaaaga gtaccagcag cactggcatc cagcagactg attcactttc cttcatcttc gctgaataac gccaccctct aaacctggcc ccagacaggt gagcctgagg ggccctggga ccgccatctg ttctatccca cctgcagggc aggctcccag tcagtggcag attttgcagt ccaaagtgga atgagcagtt gagaggccaa cagtcagagt actcctcatc tgggtctggg gtattactgt tatcaagcga gaaatctgga agtacag

120

180

240

300

360

417

<210>	118
<211>	1392
<212>	DNA
<213>	Human
<400>	118

atggagtttg gtgcagctgg tgtacagcgt ggcaaggggc gactccgcga caaatgaaca ctgggttact aagggcccat gccctgggct ggcgctctga tccctcagca aacgtagatc gtcgagtgcc ggctgagctg tggagtctgg ctggattcac tggagtgggt agggccgatt gcctgagagc ttgactactg cggtcttccc gcctggtcaa ccagcggcgt gcgtggtgac acaagcccag caccgtgccc ggttttcctc gggaggcgtg cttcagtagt ggcagttata caccatctcc cgaggacacg gggccaggga cctggcgccc ggactacttc gcacaccttc cgtgccctcc caacaccaag agcaccacct gttgctcttt gtcgagcctg tatggcatgc tggtatgatg agagacaatt gctgtgtatt accctggtca tgctccagga cccgaaccgg ccagctgtCc agcaacttcg gtggacaaga gtggcaggac taagaggtgt ggaggtccct actgggtccg gaagcaataa ccaagaacac actgtgcgag ccgtctcctc gcacctccga tgacggtgtc tacagtcctc gcacccagac cagttgagcg cgtcagtctt ccagtgtcag gagactctcc ccaggctcca acactatgca gctgtatctg agccggactg agcctccacc gagcacagčg gtggaactca aggactctac ctacacctgc caaatgttgt cctcttcccc

120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 • «

143 ccaaaaccca gacgtgagcc cataatgcca gtcctcaccg aacaaaggcc gaaccacagg ctgacctgcc gggcagccgg ttcctctaca tgctccgtga ccgggtaaat <210:

<211:

<212: <213:

<400: atggaaaccc gaaattgtgt ctctcctgta ggccaggctc aggttcagtg gaagattttg gggaccaaag tctgatgagc cccagagagg gagagtgtca ctgagcaaag ctgagctcgc <210:

<211 <212 <213 <400 ggcgtggtcc agtagctatg gttatatggt atctccagag gacacggctg tggggccaag cccctggcgc aaggactact gtgcacacct aggacaccct acgaagaccc agacaaagcc ttgtgcacca tcccagcccc tgtacaccct tggtcaaagg agaacaacta gcaagctcac tgcatgaggc ga • 119 • 705 • DNA • Human • 119 cagcgcagct tgacgcagtc gggccagtca ccaggcccct gcagtgggtc cagtgtatta tggatatcaa agttgaaatc ccaaagtaca cagagcagga cagactacga ccgtcacaaa > 120 . 507 > DNA > Human > 120 agcctgggag gcatgcactg atgatggaag acaattccaa tgtattactg ggaccacggt cctgctccag tccccgaacc tcccagctgt catgatctcc cgaggtccag acgggaggag ggactggctg catcgagaaa gcccccatcc cttctacccc caagaccaca cgtggacaag tctgcacaac tctcttcctc tccaggcacc aagtgttagc catctatggt tgggacagac ctgtcagcag acgaactgtg tggaactgcc gtggaaggtg cagcaaggac gaaacacaaa gagcttcaac gtccctgaga ggtccgccag taataaatac gaacacgctg tgcgagaggg caccgtctcc gagcacctcc ggtgacggtg cctacag cggacccctg ttcaactggt cagttcaaca aacggcaagg accatctcca cgggaggaga agcgacatcg cctcccatgc agcaggtggc cactacacgc aggtcacgtg acgtggacgg gcacgttccg agtacaagtg aaaccaaagg tgaccaagaa ccgtggagtg tggactccga agcaggggaa agaagagcct cgtggtggtg cgtggaggtg tgtggtcagc caaggtctcc gcagccccga ccaggtcagc ggagagcaat cggctccttc cgtcttctca ctccctgtct

840

900

960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 13 92 ctgctactct ctgtctttgt agctacttag gtatccagca ttcactctca tatggtatct gctgcaccat tctgttgtgt gataacgccc agcacctaca gtctacgcct aggggagagt ctctcctgtg gctccaggca tatgcagact tatctgcaaa gcccgtataa tcagcctcca gagagcacag tcgtggaact ggctcccaga ctccagggga cctggtacca gggccactgg ccatcagcag caccattcac ctgtcttcat gcctgctgaa tccaatcggg gcctcagcag gcgaagtcac gttag taccaccgga aagagccacc acagaaacct catcccagac actggagcct tttcggccct cttcccgcca taacttctat taactcccag caccctgacg ccatcagggc

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

705 cagcgtctgg aggggctgga ccgtgaaggg tgaacagcct taaccccttg ccaagggccc cggccctggg caggcgctct attcaccttc gtgggtggca ccgattcacc gagagccgag tatggacgtc atcggtcttc ctgcctggtc gaccagcggc

120

180

240

300

360

420

480

507 <210> 121 <211> 458 <212> DNA <213> Human <400: cagtctccat agtcagagca ttcctgatct ggctctggga tactactgtc atcaaacgaa aaatctggaa gtacagtgga

121 cctccctgtc ttaacaccta ctgctacatc caaatttcac aacagagtta ctgtggctgc ctgcctctgt aggtggataa tgcatctgta tttaatttgg cattttgcaa tctcaccatc cagtacccca accatctgtc tgtgtgcctg cgccctccaa ggagacagag tatcagcaga agtggggtcc aacagtcttc ttcactttcg ttcatcttcc ctgaataact tcgggtaa tcaccatcac aaccagggaa catcaaggtt atcctgaaga gccctgggac cgccatctga tctatcccag ttgccgggca agcccctaac ccgtggcagt ttttgcaact caaagtggat tgagcagttg agaggccaaa

120

180

240

300

360

420

458 • ·

<210>	122
<211>	501
<212>	DNA
<213>	Human
<400>	122

ggcgtggtcc agtagtcatg gttatatggt atctccagag gacacggctg cagggaaccc gcgccctgct tacttccccg accttcccag agcctgggag gcatccactg atgatggaag acaattccaa tgtattactg tggtcaccgt ccaggagcac aaccggtgac ctgtcctaca gtccctgaga ggtccgccag aaataaagac gaacacgctg tgcgagagtg ctcctcagcc ctccgagagc ggtgtcgtgg 9 ctctcctgtg gctccaggca tatgcagact tatttgcaaa gccccactgg tccaccaagg acagcggccc aactcaggcg tagcgtctgg aggggctgga ccgtgaaggg tgaacagcct ggccacttga gcccatcggt tgggctgcct ctctgaccag attcatcttc gtgggtggca ccgattcacc gagagccgag ctactggggc cttccccctg ggtcaaggac cggcgtgcac

120 180 240 300 360 420 480 501 <210> 123 <211> 426 <212> DNA <213> Human <400> 123 tctccaggca ccctgtcttt gtctccaggg gaaagagcca ccctctcctg cagggccagt 60 cagagtatta gcagcaattt cttagcctgg taccagcaga aacctggcca ggctcccagg 120 ctcctcatct atcgtccatc cagcagggcc actggcatcc cagacagttt cagtggcagt 180 gggtctggga cagacttcac tctcaccatc agcagactgg agcctgagga ttttgcatta 240 tattactgtc agcagtatgg tacgtcacca ttcactttcg gccctgggac caaagtggat 300 atcaagcgaa ctgtggctgc accatctgtc ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg 360 aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg ctgaataact tctatcccag agaggccaaa 420 gtacag 426 <210> 124 <211> 516 <212> DNA <213 > Human <400> 124 tcgggCccag gactggtgaa gccttcacag atcctgtccc tcacctgcac tgtctctggt 60 ggctccatca gcagtggtgg tcactactgg agctggatcc gccagcaccc agggaagggc 120 ctggagtgga ttgggtacat ctattacatt gggaacacct actacaaccc gtccctcaag 180 agtcgagtta ccatatcagt agacacgtct aagaaccagt tctccctgaa gctgagctct 240 gtgactgccg cggacacggc cgtgtattat tgtgcgagag atagtgggga ctactacggt 300 atagacgtct ggggccaagg gaccacggtc accgtctcct cagcttccac caagggccca 360 tccgtcttcc ccctggcgcc ctgctccagg agcacctccg agagcacagc cgccctgggc 420 tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg 480 accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc ctacaa 516 <210> 125 <211> 465 <212> DNA <213> Human <400> 125 tctccagact ttcagtctgt gactccaaag gagaaagtca ccatcacctg ccgggccagt 60 cagagcattg gtagtagctt acattggtat cagcagaaac cagatcagtc tccaaagctc 120 ctcatcaagt atgcttccca gtccttctct ggggtcccct cgaggttcag tggcagtgga 180 tctgggacag atttcaccct caccatcaat agcctggaag ctgaagatgc tgcaacgtat 240 tactgtcatc agagtagtag tttaccgctc actttcggcg gagggaccaa ggtggagatc 300 aaacgaactg tggctgcacc atctgtcttc atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa 360 tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg aataacttct atcccagaga ggccaaagta 420 • · • ·

145 cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg ggtaactccc aggag

465 <210> 126 <211> 459 <212> DNA <213> Human <400> 126 cctgggaggt ccctgagact ctcctgtgca gcgtctggat tcaccttcag tagtcatggc 60 atccactggg tccgccaggc tccaggcaag gggctggagt gggtggcagt tatatggtat 120 gatggaagaa ataaagacta tgcagactcc gtgaagggcc gattcaccat ctccagagac 180 aattccaaga acacgctgta tttgcaaatg aacagcctga gagccgagga cacggctgtg 240 tattactgtg cgagagtggc cccactgggg ccacttgact actggggcca gggaaccctg 300 gtcaccgtct cctcagcctc caccaagggc ccatcggtct tccccctggc gccctgctcc 360 aggagcacct ccgagagcac agcggccctg ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa 420 ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgct ctgaccagc 459 <210> 127 <211> 440 <212> DNA <213> Human <400> 127 cagtctccag gcaccctgtc tttgtctcca ggggaaagag ccaccctctc ctgcagggcc 60 agtcagagtg tcagcagcta cttagcctgg taccagcaga aacctggcca ggctcccagg 120 ctcctcatct atggtgcatc cagcagggcc actggcatcc cagacaggtt cagtggcagt 180 gggtctggga cagacttcac tctcaccatc agcagactgg agcctgagga ttttgcagtg 240 tattactgtc aacagtatgg taggtcacca ttcactttcg gccctgggac caaagtagat 300 atcaagcgaa ctgtggctgc accatctgtc ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg 360 aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg ctgaataact tctatcccag agaggccaaa 420 gtacagtgga aaggtggata 440 <210> 128 <211> 503 <212> DNA <213> Human <400: ggcgtggtcc agtagctatg gttatatggt atctccagag gacacggctg taccggtkgg ggcccatcgg ctgggctgcc gctctgacca • 128 agcctgggag gcatgcactg atgatggaag acaattccaa tgtattactg acgtctgggg tcttccccct tggtcaagga gcggcgtgca gtccctgaga ggtccgccag taataaatac gaacacgctg tgcgagagat ccaagggacc ggcgccctgc ctacttcccc cac ctctcctgtg gctccaggca tatgcagact tatctgcaaa ccgaggggag acggtcaccg tccaggagca gaaccggtga cagcgtctgg aggggctgga ccgtgaaggg tgaacagcct ctacccttta tctcctcagc cctccgagag cggtgtcgtg attcaccttc gtgggtggca ccgattcacc gagagccgag ctactactac ctccaccaag cacagcggcc gaactcaggc

12 0 180 240 300 360 420 480 503 <210> 129 <211> 417 <212> DNA <213> Human <400: ccatcctccc agcattaaca atctatgctg gggacagatt tgtcaacagt cgaactgtgg ggaactgcct

129 tgtctgcatc gctatttaga catccagttt tcactctcac attacagtac ctgcaccatc ctgttgtgtg tgtaggagac ttggtatcag gcaaagtggg catcagcagt tccattcact tgtcttcatc cctgctgaat agagtcacca cagaaaccag gtcccatcaa ctgcaacctg ttcggccctg ttcccgccat aacttctatc tcacttgccg ggaaagcccc ggttcagtgg aagattttgc ggaccaaagt ctgatgagca ccagagaggc ggcaagtcag taaactcctg cagtggatct aacttactac ggaaateaaa gttgaaatct caaagta

120

180

240

300

360

417 • · <210> 130 <211> 451 <212> DNA <213> Human <400> 130 ggcgtggtcc agcctgggag gtccctgaga ctctcctgtg cagcgtctgg attcaccttc 60 agtagctatg gcatgcactg ggtccgccag gctccaggca aggggctgga gtgggtggca 120 gttatatggt atgatggaag tcataaatac tatgcagact ccgtgaaggg ccgattcacc 180 atctccagag acaattccaa gaacacgctg tatctgcaaa tgaacagcct gagagccgag 240 gacacggctg tgtattactg tgcgagaggc gctgtagtag taccagctgc tatggacgtc 300 tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc 360 cccctggcgc cctgctccag gagcacctcc gagagcacag cggccctggg ctgcctggtc 420 aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg t 451 <210> 131 <211> 402 <212> DNA <213> Human <220>

<400> 131 acccagtctc catcctccct gtctgcatct gtaggagaca gagtcaccat cacttgccgg 60 gcaagtcaga acattagcag gtatttaaat tggtatcaac agaaaccagg gaaagcccct 120 aagttcctga tctatgttgc atctattttg caaagtgggg tcccatcagg gttcagtgcc 180 agtggatctg ggccagattt cactctnacc atcagcagtc tgcaacctga agattttgca 240 acttactact gtcaacagag ttacagtacc ccattcactt tcggccctgg gaccaaagtg 300 gatatcaaac gaactgtggc tgcaccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag 360 ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata ac 402 <210> 132 <211> 438 <212> DNA <213> Human <220>

<400> 132 gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt 60 agcngtggca tgcactgggt ccgccaggct ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt 120 atatggtctg atggaagtca taaatactat gcagactccg tgaagggccg attcaccatc 180 tccagagaca attccaagaa cacgctgtat ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac 240 acggctgtgt attactgtgc gagaggaact atgatagtag tgggtaccct tgactactgg 300 ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc 360 ctggcgccct gctccaggag cacctccgag agcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag 420 gactacttcc ccgaaccg 438 <210> 133 <211> 451 <212> DNA <213> Human <400> 133 acccagtctc catcctccct gtctgcatct gtaggagaca gagtcaccat cacttgccgg 60 gcaagtcaga gcatttgcaa ctatttaaat tggtaťcagc agaaaccagg aaaagcccct 120 agggtcctga tctatgctgc atccagtttg caaggtgggg tcccgtcaag gttcagtggc 180 agtggatctg ggacagattg cactctcacc atcagcagtc tgcaacctga agattttgca 240 acttactact gtcaacagag ttacactacc ccattcactt tcggccctgg gaccagagtg 300 gatatcgaac gaactgtggc tgcaccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag 360 • · • · • ·

147 ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc 420 aaagtacagt ggaaggtgga taacgcctat t 451 <210> 134 <211> 562 <212> DNA <213> Human <400> 134 tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt tactatggcg tctgggggag gcgtggtcca 60 gcctgggagg tccctgagac tctcctgtgc agcgtctgga ttcaccttca gtagctatgg 120 cgtgcactgg gtccgccagg ctccaggcaa ggggctggag tgggtggcag ttatatggta 180 tgatggaagt aataaatact atgcagačtc cgtgaagggc cgattcacca tctccagaga 240 caattccaag agcacgctgt atctgcaaat gaacagcctg agagccgagg acacggctgt 300 gtattattgt gcgagagact cgtattacga tttttggagt ggtcggggcg gtatggacgt 360 ctggggccaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcagcctcc accaagggcc catcggtctt 420 ccccctggcg ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca gcggccctgg gctgcctggt 480 caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgctc tgaccagcgg 540 cgtgcacacc ttcccagctg tc 562 <210> 135 <211> 419 <212> DNA <213> Human <400> 135 ccactctccc tgcccgtcac ccttggacag ccggcctcca tctcctgcag gtctagtcaa 60 agcctcgtat acagtgatgg aaacacctac ttgaattggt ttcagcagag gccaggccaa 120 tctccaaggc gcctaattta taaggtttct aactgggact ctggggtccc agacagattc 180 agcggcagtg ggtcaggcac tgatttcaca ctgaaaatca gcagggtgga ggctgaggat 240 gttggggttt attactgcat gcaaggttca cactggcctc cgacgttcgg ccaagggacc 300 aaggtggaaa tcaaacgaac tgtggctgca ccatctgtct tcatcttccc gccatctgat 360 gagcagttga aatctggaac tgcctctgtt gtgtgcctgc tgaataactt ctatcccac 419 <210> 136 <211> 490 <212> DNA <213> Human <400> 136 gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc tgtgcagcgt ctggattcac cttcagtaac 60 tatgccatgc actgggtccg ccaggctcca ggcaaggggc tggagtgggt ggtagttatt 120 tggcatgatg gaaataataa atactatgca gagtccgtga agggccgatt cacaatctcc 180 agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg 240 gctgtatatt actgtgcgag agatcagggc actggctggt acggaggctt tgacttctgg 300 ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc 360 ctggcgccct gctccaggag cacctccgag agcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag 420 gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg tggaactcag gcgctctgac cagcggcgtg 480 cacaccttcc 490 <210> 137 <211> 419 <212> DNA <213> Human <400> 137 cctggagagc tacaactatt ttgggttcta gattttacac caagctctac cggcttccat tggattggta atcgggcctc tgaaactcag aaactcctct ctcttgcagg cctgcagaag cggggtccct cagagtggag cactttcggc tctagtcaga ccaggacagt gacaggttca gctgaggatg ggagggacca gcctcctgca ctccacagct gtggcagtgg ttggggttta aggtggagat tagtaatgga cctgatctat atcaggcaca ttactgcatg caaacgaact

120

180

240

300

148 gtggctgcac catctgtctt catcttcccg gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc

ccatctgatg agcagttgaa atctggaact tatcccagar aggccaaagt acattccat

360

419

<210> <211> <212> <213>	138 1392 DNA Human
<400>	138

atggagtttg gtgcagctgg tgtgtagcgt ggcaaggggc gactccgtga caaatgaaca ttcggtcctt aagggcccat gccctgggct ggcgctctga tccctcagca aacgtagatc gtcgagtgcc ccaaaaccca gacgtgagcc cataatgcca gtcctcaccg aacaaaggcc gaaccacagg ctgacctgcc gggcagccgg ttcctctaca tgctccgtga ccgggtaaat ggctgagctg tggagtctgg ctggattcac tggagtgggt agggccgatt gcctgagagc ttgactactg cggtcttccc gcctggtcaa ccagcggcgt gcgtggtgac acaagcccag caccgtgccc aggacaccct acgaagaccc agacaaagcc ttgtgcacca tcccagcccc tgtacaccct tggtcaaagg agaacaacta gcaagctcac tgcatgaggc ga ggttttcctc gggaggcgtg cttcagtagc ggcagttata caccatctcc cgaggacacg gggccaggga cctggcgccc ggactacttc gcacaccttc cgtgccctcc caacaccaag agcaccacct catgatctcc cgaggtccag acgggaggag ggactggctg catcgagaaa gcccccatcc cttctacccc caagaccaca cgtggacaag tctgcacaac gttgctcttt gtccagcctg catggcatgc tggtatgatg agagacaatt gctgtgtatt accctggtca tgctccagga cccgaaccgg ccagctgtcc agcaacttcg gtggacaaga gtggcaggac cggacccctg ttcaactggt cagttcaaca aacggcaagg accatctcca cgggaggaga agcgacatcg cctcccatgc agcaggtggc cactacacgc taagaggtgt ggaggtccct actgggtccg gaagaaataa ccaagaacac actgtgcgag ccgtctcctc gcacctccga tgacggtgtc tacagtcctc gcacccagac cagttgagcg cgtcagtctt aggtcacgtg acgtggacgg gcacgttccg agtacaagtg aaaccaaagg tgaccaagaa ccgtggagtg tggactccga agcaggggaa agaagagcct ccagtgtcag gagactctcc ccaggctcca atactatgca gctgtttctg aggaggtcac agcctccacc gagcacagcg gtggaactca aggactctac ctacacctgc caaatgttgt cctcttcccc cgtggtggtg cgtggaggtg tgtggtcagc caaggtctcc gcagccccga ccaggtcagc ggagagcaat cggctccttc cgtcttctca ctccctgtct

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1392

<210> <211> <212> <213>	139 1999 DNA Human
<400>	139

atggagtttg gtgcagctgg tgtgtagcgt ggcaaggggc gactccgtga caaatgaaca ttcggtcctt aagggcccat gccctgggct ggcgctctga tccctcagca aacgtagatc cagggaggga ctgtgcagcc tctgcccgcc gcaggcacag tcagacctgc ggccaaactg ccaatcttct cagcccaggc agggacaggc ggctgagctg tggagtctgg ctggattcac tggagtgggt agggccgatt gcctgagagc ttgactactg cggtcttccc gcctggtcaa ccagcggcgt gcgtggtgac acaagcccag gggtgtctgc ccagcccagg ccactcatgc gctgggtgcc caaaagccat tccactccct ctctgcagag ctcgccctcc cccagctggg ggttttcctc gggaggcgtg cttcagtagc ggcagttata caccatctcc cgaggacacg gggccaggga cctggcgccc ggactacttc gcacaccttc cgtgccctcc caacaccaag tggaagccag gcagcaaggc tcagggagag cctaccccag atccgggagg cagctcggac cgcaaatgtt agctcaaggč tgctgacacg gttgctcttt gtccagcctg catggcatgc tggtatgatg agagacaatt gctgtgtatt accctggtca tgctccagga cccgaaccgg ccagctgtcc agcaacttcg gtggacaaga gctcagccct aggccccatc ggtcttctgg gcccttcaca accctgcccc accttctctc gtgtcgagtg gggacaggtg tccacctcca taagaggtgt ggaggtccct actgggtccg gaagaaataa ccaagaacac actgtgcgag ccgtctcctc gcacctccga tgacggtgtc tacagtcctc gcacccagac cagttggtga cctgcctgga tgtctcctca ctttttccac cacaggggca tgacctaagc ctcccagatc cccaccgtgc ccctagagta tctcttcctc ccagtgtcag gagactctcc ccaggctcca atactatgca gctgtttctg aggaggtcac agctagcacc gagcacagcg gtggaactca aggactctac ctacacctgc gaggccagct cgcaccccgg cccggaggcc caggctccag ggtgcttggc cgaccccaaa cgagtaactc ccaggtaagc gcctgcatcc agcaccacct

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960 1020 1080 1140 1200 1260 • · • · • · • ·

149 gtggcaggac cggacccctg ttcaactggt cagttcaaca aacggcaagg accatctcca gctcggccca gccccgagaa ggtcagcctg gagcaatggg ctccttcttc cttctcatgc cctgtctccg cgtcagtctt aggtcacgtg acgtggacgg gcacgttccg agtacaagtg aaaccaaagg ccctctgccc ccacaggtgt acctgcctgg cagccggaga ctctacagca tccgtgatgc ggtaaatga cctcttcccc cgtggtggtg cgtggaggtg tgtggtcagc caaggtctcc tgggacccgc tgggagtgac acaccctgcc tcaaaggctt acaactacaa agctcaccgt atgaggctct ccaaaaccca gacgtgagcc cataatgcca gtcctcaccg aacaaaggcc ggggtatgag cgctgtgcca cccatcccgg ctaccccagc gaccacacct ggacaagagc gcacaaccac aggacaccct acgaagaccc agacaaagcc ttgtgcacca tcccagcccc ggccacatgg acctctgtcc gaggagatga gacatcgccg cccatgctgg aggtggcagc tacacgcaga catgatctcc cgaggtccag acgggaggag ggactggctg catcgagaaa acagaggccg ctacagggca ccaagaacca tggagtggga actccgacgg aggggaacgt agagcctctc

1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 1999 <210> 140 <211> 1392 <212> DNA <213> Human <400: atggagtttg gtgcagctgg tgtgtagcgt ggcaaggggc gactccgtga caaatgaaca ttcggtcctt aagggcccat gccctgggct ggcgctctga tccctcagca aacgtagatc gtcgagtgcc ccaaaaccca gacgtgagcc cataatgcca gtcctcaccg aacaaaggcc gaaccacagg ctgacctgcc gggcagccgg ttcctctaca tgctccgtga ccgggtaaat <210 <211 <212 <213

140 ggctgagctg tggagtctgg ctggattcac tggagtgggt agggccgatt gcctgagagc ttgactactg cggtcttccc gcctggtcaa ccagcggcgt gcgtggtgac acaagcccag caccgtgccc aggacaccct acgaagaccc agacaaagcc ttgtgcacca tcccagcccc tgtacaccct tggtcaaagg agaacaacta gcaagctcac tgcatgaggc ga

141 • 708 • DNA

Human ggttttcctc gggaggcgtg cttcagtagc ggcagttata caccatctcc cgaggacacg gggccaggga cctggcgccc ggactacttc gcacaccttc cgtgccctcc caacaccaag agcaccacct catgatctcc cgaggtccag acgggaggag ggactggctg catcgagaaa gcccccatcc cttctacccc caagaccaca cgtggacaag tctgcacaac gttgctcttt gtccagcctg catggcatgc tggtatgatg agagacaatt gctgtgtatt accctggtca tgctccagga cccgaaccgg ccagctgtcc agcaacttcg gtggacaaga gtggcaggac cggacccctg ttcaactggt cagttccaaa aacggcaagg accatctcca cgggaggaga agcgacatcg cctcccatgc agcaggtggc cactacacgc taagaggtgt ggaggtccct actgggtccg gaagaaataa ccaagaacac actgtgcgag ccgtctcctc gcacctccga tgacggtgtc tacagtcctc gcacccagac cagttgagcg cgtcagtctt aggtcacgtg acgtggacgg gcacgttccg agtacaagtg aaaccaaagg tgaccaagaa ccgtggagtg tggactccga agcaggggaa agaagagcct ccagtgtcag gagactctcc ccaggctcca atactatgca gctgtttctg aggaggtcac agcctccacc gagcacagcg gtggaactca aggactctac ctacacctgc caaatgttgt cctcttcccc cgtggtggtg cgtggaggtg tgtggtcagc caaggtctcc gcagccccga ccaggtcagc ggagagcaat cggctccttc cgtcttctca ctccctgtct

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1392 <400: atggaaaccc gaaattgtgt ctctcctgca cctggccagg gacaggttca cctgaagatt caagggacca ccatctgatg tatcccagag caggagagtg

141 cagcgcagct tgacgcagtc gggccagtca ctcccaggct gtggcagtgg ttgcagtgta aggtggaaat agcagttgaa aggccaaagt tcacagagca tctcttcctc tccaggcacc gagtattagc cctcatctat gtctgggaca ttactgtcag caaacgaact atctggaact acagtggaag ggacagcaag ctgctactct ctgtctttgt agcagcttct ggtgcatcca gacttcactc cagtatggta gtggctgcac gcctctgttg gtggataacg gacagcacct ggctcccaga ctccagggga tagcctggta gcagggccac tcaccatcag cctcaccctg catctgtctt tgtgcctgct ccctccaatc acagcctcag taccaccgga aagagccacc ccagcagaga tggcatccca cagactggag gacgttcggc catcttcccg gaataacttc gggtaactcc cagcaccctg

120

180

240

300

360

420

480

540

600 • · • · ·

150 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 660 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgttag 708 <210> 142 <211> 1395 <212> DNA <213> Human <400> 142 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120 tgtacagcgt ctggattcac cttcagtaac tatggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180 ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttata tggtatgatg gaagtaataa acactatgga 240 gactccgtga agggccgatt caccatctcc agtgacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag aggagagaga 360 ctggggtcct actttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcagcctcc 420 accaagggcc catcggtctt ccccctggcg ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca 480 gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 540 tcaggcgctc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccagctg tcctacagtc ctcaggactc 600 tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcaact tcggcaccca gacctacacc 660 tgcaacgtag atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agacagttga gcgcaaatgt 720 tgtgtcgagt gcccaccgtg cccagcacca cctgtggcag gaccgtcagt cttcctcttc 780 cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg 840 gtggacgtga gccacgaaga ccccgaggtc cagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 900 gtgcataatg ccaagacaaa gccacgggag gagcagttca acagcacgtt ccgtgtggtc 960 agcgtcctca ccgttgtgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1020 tccaacaaag gcctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaaaccaa agggcagccc 1080 cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc 1140 agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1200 aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acacctccca tgctggactc cgacggctcc 1260 ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1320 tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 1380 tctccgggta aatga 1395 <210> 143 <211> 702 <212> DNA <213> Human <400: atggaaaccc gaaattgtgt ctctcctgca caggctccca ttcagtggca gattttgcag accaaggtgg gatgagcagt agagaggcca agtgtcacag agcaaagcag agctcgcccg • 143 cagcgcagct tgacgcagtc ggaccagtgt ggctcctcat gtgggtctgg tctattactg agatcaagcg tgaaatctgg aagtacagtg agcaggacag actacgagaa tcacaaagag tctcttcctc tccaggcacc tagcagcagt ctatggtgca gacagacttc tcagcagtat aactgtggct aactgcctct gaaggtggat caaggacagc acacaaagtc cttcaacagg ctgctactct ctgtctttgt tacttagcct tccagcaggg actctcacca ggcatctcac gcaccatctg gttgtgtgcc aacgccctcc acctacagcc tacgcctgcg ggagagtgtt ggctcccaga ctccagggga ggtaccagca ccactggcat tcagcagact ccttcacttt tcttcatctt tgctgaataa aatcgggtaa tcagcagcac aagtcaccca ag taccaccgga aagagccacc gaaacctggc cccagacagg ggagcctgaa cggcggaggg cccgccatct cttctatccc ctcccaggag cctgacgctg tcagggcctg

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

702

<210> <211> <212> <213>	144 1392 DNA Human
<400>	144

atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtcgagcctg ggaggtccct gagactctcc

120 • · ·· · · · · ···· ··· · • · · · · ♦ · · • · · · · · · • · ·· ·· · · ·

151 tgtacagcgt ctggattcac cttcagtagt tatggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180 ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttata tggtatgatg gaagcaataa acactatgca 240 gactccgcga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag agccggactg 360 ctgggttact ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc agcctccacc 420 aagggcccat cggtcttccc cctggcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcg 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgctctga ccagcggcgt gcacaccttc ccagctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcaacttcg gcacccagac ctacacctgc 660 aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga cagttgagcg caaatgttgt 720 gtcgagtgcc caccgtgccc agcaccacct gtggcaggac cgtcagtctt cctcttcccc 780 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacgtg cgtggtggtg 840 gacgtgagcc acgaagaccc cgaggtccag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 900 cataatgcca agacaaagcc acgggaggag cagttcaaca gcacgttccg tgtggtcagc 960 gtcctcaccg ttgtgcacca ggactggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1020 aacaaaggcc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aaaccaaagg gcagccccga 1080 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1140 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctacccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1200 gggcagccgg agaacaacta caagaccaca cctcccatgc tggactccga cggctccttc 1260 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1320 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1380 ccgggtaaat ga 1392 <210> 145 <211> 705 <212> DNA <213> Human <400> 145 atggaaaccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120 ctctcctgta gggccagtca aagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 180 ggccaggctc ccaggcccct catctatggt gtatccagca gggccactgg catcccagac 240 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag actggagcct 300 gaagattttg cagtgtatta ctgtcagcag tatggtatct caccattcac tttcggccct 360 gggaccaaag tggatatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 420 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 480 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 540 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 600 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 660 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 705 <210> 146 <211> 1413 <212> DNA <213> Human <400> 146 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120 tgtgcagcgt ctggattcac cttcagtagc tatggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180 ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttata tggtatgatg gaagtaataa atactatgca 240 gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag agatccgagg 360 ggagctaccc tttactacta ctactacggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 420 accgtctcct cagcctccac caagggccca tcggtcttcc ccctggcgcc ctgctccagg 480 agcacctccg agagcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg 540 gtgacggtgt cgtggaactc aggcgctctg accagcggcg tgcacacctt cccagctgtc 600 ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcaacttc 660 ggcacccaga cctacacctg caacgtagat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 720 acagttgagc gcaaatgttg tgtcgagtgc ccaccgtgcc cagcaccacc tgtggcagga 780 • · ccgtcagtct gaggtcacgt tacgtggacg agcacgttcc gagtacaagt aaaaccaaag atgaccaaga gccgtggagt ctggactccg cagcagggga cagaagagcc tcctcttccc gcgtggtggt gcgtggaggt gtgtggtcag gcaaggtctc ggcagccccg accaggtcag gggagagcaa acggctcctt acgtcttctc tctccctgtc cccaaaaccc ggacgtgagc gcataatgcc cgtcctcacc caacaaaggc agaaccacag cctgacctgc tgggcagccg cttcctctac atgctccgtg tccgggtaaa

152 aaggacaccc cacgaagacc aagacaaagc gttgtgcacc ctcccagccc gtgtacaccc ctggtcaaag gagaacaact agcaagctca atgcatgagg tga tcatgatctc ccgaggtcca cacgggagga aggactggct ccatcgagaa tgcccccatc gcttctaccc acaagaccac ccgtggacaa ctctgcacaa ccggacccct gttcaactgg gcagttcaac gaacggcaag aaccatctcc ccgggaggag cagcgacatc acctcccatg gagcaggtgg ccactacacg

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1413 <210> 147 <211> 714 <212> DNA <213> Human

147 gggtccccgc tccagatgac cttgccgggc aagcccctaa tcagtggcag attttgcaac ccaaagtgga atgagcagtt gagaggccaa gtgtcacaga gcaaagcaga gctcgcccgt <400> atggacatga agatgtgaca gtcaccatca aaaccaggga ccatcaaggt caacctgaag ggccctggga ccgccatctg ttctatccca tcccaggaga ctgacgctga cagggcctga tcagctcctg ccagtctcca aagtcagagc actcctgatc tggatctggg ttactactgt aatcaaacga gaaatctgga agtacagtgg gcaggacagc ctacgagaaa cacaaagagc gggctcctgc tcctccctgt attaacagct tatgctgcat acagatttca caacagtatt actgtggctg actgcctctg aaggtggata aaggacagca cacaaagtct ttcaacaggg tactctggct ctgcatctgt atttagattg ccagtttgca ctctcaccat acagtactcc caccatctgt ttgtgtgcct acgccctcca cctacagcct acgcctgcga gagagtgtta ccgaggtgcc aggagacaga gtatcagcag aagtggggtc cagcagtctg attcactttc cttcatcttc gctgaataac atcgggtaac cagcagcacc agtcacccat gtga

120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 714

Seznam citovaně literatury

Všechny publikace citované v přihlášce včetně patentů, patentových přihlášek, vědeckých článků, příruček apod., a také publikace v nich citované, jsou zahrnuty v plném rozsahu formou odkazu. Kromě toho jsou plně zahrnuty i následující publikace, včetně publikací v nich citovaných.

Alegre et al. J Immunol 157:4762-70 (1996)

Allison and Krummel Science 270:932-933 (1995)

Balzano et al. Int J Cancer Suppl 7:28-32 (1992)

Blair et al. JImmunol 160:12-5 (1998)

Blake and Litzi-Davis BioConjugate Chem. 3:510-513 (1992)

Boussiotis et al. Proč Nati Acad Stí USA 90:11059-63 (1993)

Bowie et al. Science 253:164 (1991)

Bruggeman et al. PNAS USA 86:6709-6713 (1989)

Bruggeman, M. and Neuberger, M.S. in Methods: A companion to Methods in Enzymology 2:159-165 (Lemer et al. eds. Academie Press (1991))

Bruggemann et al., “Human antibody production in transgenic mice: expression from 100 kb of the human IgH locus.” Eur. J. Immunol. 21:1323-1326 (1991)

Bruggemann, M. and Neuberger, M.S. “Strategies for expressing human antibody repertoires in transgenic mice.” Immunology Today 17:391-397 (1996)

Brunet et al. Nátuře 328:267-270 (1987)

Bumpers et al J. Surgical Res. 61:282-288 (1996)

Capsey et al. Genetically Engineered Human Therapeutic Drugs (Stockton Press, NY (1988))

Castan et al. Immunology 90:265-71 (1997) • ·

54

Cepero et al. JExp Med 188:199-204 (1998)

Chen et al. “Immunoglobulin gene rearrangement in B-cell deficient mice generated by targeted deletion of the Jh locus” International Immunology 5:647656(1993)

Chen et al. Cell 71:1093-1102 (1992)

Chen et al. Human Gene Therapy 5:595-601 (1994)

Chiswell and McCafferty TIBTECH 10:80-84 (1992)

Choi et al. “Transgenic mice containing a human heavy chain immunoglobulin gene fragment cloned in a yeast artificial chromosome” Nátuře Genetics 4:117123 (1993)

Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)

Chothia et al. Nátuře 342:878-883 (1989)

Chuang et al. J. Immunol. 159:144-151(1997)

Coligan et al., Unit 2.1, “Enzyme-linked immunosorbent assays,” in Current protocols in immunology (1994)

Cwirla et al. PNAS USA 87:6378-6382 (1990)

Dariavach et al. Eur. J. Immunol. 18:1901-1905 (1988)

Dayhoff, M.O., in Atlas of Protein Sequence and Structure, pp. 101-110 (Volume 5, National Biomedical Research Foundation (1972)) and Supplement 2 to this volume, pp. 1-10 de Boer et al. Eur JImmunol 23:3120-5 (1993)

Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)).

Evans et al. J. Med. Chem. 30:1229 (1987)

Fallarino et al. JExp Med 188:205-10 (1998)

Fanger et al. Immunol Methods 4:72-81 (1994)

Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986)

Fishwild et al., “High-avidity human IgGy monoclonal antibodies from a novel strain of minilocus transgenic mice.” Nátuře Biotech. 14:845-851 (1996).

55

Freeman et al. JExp Med 178:2185-92 (1993)

Freeman et al. J Immunol 161:2708-15 (1998)

Freeman et al. Science 262:907-9 (1993)

Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989))

Galfre, G. and Milstein, C., “Preparation of monoclonal antibodies: strategies and procedures.” Methods Enzymol. 73:3-46 (1981)

Gorman et al. P.N.A.S. 79:6777 (1982)

Green and Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998)

Green et al. Nátuře Genetics 7:13-21 (1994)

Grosschedl et al. Cell 41:885 (1985)

Hanes and Plucthau PNAS USA 94:4937-4942 (1997)

Harding et al. Nátuře 356:607-609 (1994)

Harper et al. J Immunol 147:1037-44 (1991)

Hathcock et al. Science 262:905-7 (1993)

Hoganboom et al. Immunol. Reviews 130:43-68 (1992)

Horspool et al. J Immunol 160:2706-14 (1998)

Houghten et al. Biotechniques 13:412-421 (1992)

Houghten PNAS USA 82:5131-5135 (1985)

Hurwitz et al. JNeuroimmunol 73:57-62 (1997)

Hurwitz et al. Proč Nati Acad Sci U S A 95:10067-71 (1998)

Immunology - A Synthesis (2^nd Edition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991))

Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)) • ♦ • η

56

Jakobovits et al., “Germ-line transmission and expression of a human-derived yeast artificial-chromosome.” Nátuře 362:255-258 (1993)

Jakobovits, A. et al., “Analysis of homozygous mutant chimeric mice: Deletion of the immunoglobulin heavy-chain joining region blocks B-cell development and antibody production.” Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90:2551-2555 (1993)

Jakobovits, A., “Humanizing the mouše genome.” Current Biology 4:761-763 (1994)

Jakobovits, A., “Production of fully human antibodies by transgenic mice.” Current Opinion in Biotechnology 6:561-566 (1995)

Junghans et al. in Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2d edition, Chafher and Longo, eds., Lippincott Raven (1996))

Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, N.I.H. publication no. 91-3242

Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991))

Kostelny et al. J. Immunol. 148:1547-1553 (1992)

Krummel and Allison JExp Med 182:459-65 (1995)

Krummel et al. Int Immunol 8:519-23 (1996)

Kuchroo et al. Cell 80:707-18 (1995)

Kwon et al. PNAS USA 94:8099-103 (1997)

LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986)

Lenschow et al. Proč Nati Acad Sci USA 90:11054-8 (1993)

Lenschow et al. Science 257:789-792 (1992)

Lin et al. J Exp Med 188:199-204 (1998)

- Linsley et al. JExp Med 176:1595-604 (1992)

Linsley et al. J. Exp. Med. 174:561-569 (1991)

Linsley et al. Science 257:792-795 (1992)

Liu et al. J.Immunol.l39:352\ (1987) • · • * ······ ········ · · ·· ·· ·

57

Liu et al. P.N.A.S. 84:3439 (1987)

Lonberg et al., “Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications.” Nátuře 368:856-859 (1994).

Luhder et al. JExp Med 187:427-32 (1998)

Marasco Gene Therapy 4:11 -15 (1997)

Markees et aLJClin Invest 101:2446-55 (1998)

Marks et al., “Oligonucleotide primers for polymerase chain reaction amplification of human immunoglobulin variable genes and design of family-specifíc oligonucleotide probes.” Eur. J. Immunol. 21:985-991 (1991)

McCoy et al. JExp Med 186:183-7 (1997)

Mendez et al. Nátuře Genetics 15:146-156 (1997)

Needleman and Wunsch J. Mol. Biol. 48:443 (1970)

Okayama et al. Mol. Cell. Bio. 3:280 (1983)

Parmley and Smith Gene 73:305-318 (1988)

Pearson and Lipman Proč. Nati. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:2444 (1988)

Perez et al. Immunity 6:411-7 (1997)

Perrin et al. Immunol Res 14:189-99 (1995)

Perrin et al. J Immunol 157:1333-6 (1996)

Pinalla et al. Biotechniques 13:901-905 (1992)

Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984))

Razi-Wolf et al. Proč Nati Acad Sci USA 90:11182-6 (1993)

Remington’s Pharmaceutical Sciences (15^,h ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975)), particularly Chapter 87 by Blaug, Seymour

Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992)

Russel et al. Nucl. Acids Research 21:1081-1085 (1993)

Schwartz Cell 71:1065 (1992) • 9

58

Scott TIBS 17:241-245 (1992)

Smith and Waterman Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)

Songsivilai & Lachmann Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990)

Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984)

Stein et al. Nucl. Adds Res. 16:3209 (1988)

Taylor et al., “A transgenic mouše that expresses a diversity of human sequence heavy and light chain immunoglobulins.” Nudeic Adds Research 20:6287-6295 (1992)

Taylor et al., “Human immunoglobulin transgenes undergo rearrangement, somatic mutation and class switching in mice that lack endogenous IgM.” Intemational Irnmunology 6:579-591 (1994)

The McGra-w-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985))

Thomton et at. Nátuře 354:105 (1991)

Tivol et al. Immunity 3:541-7 (1995)

Townsend and Allison Science 259:368 (1993)

Traunecker et al. Int. J. Cancer (Suppl.) 7:51-52 (1992)

Tuaillon et al. “Analysis of direct and inverted DJh rearrangements in a human Ig heavy chain transgenic minilocus” J. Immunol. 154:6453-6465 (1995)

Tuaillon et al., “Human immunoglobulin heavy-chain minilocus recombination in transgenic mice: gene-segment use in μ and γ transcripts.” Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90:3720-3724 (1993)

Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990)

Van Parijs et al. JExp Med 186:1119-28 (1997)

Veber and Freidinger TINS p.392 (1985)

Vitetta Immunol Today 14:252 (1993)

Walunas et al. Immunity 1:405-13 (1994)

Walunas et al. JExp Med 183:2541-50 (1996) • *

59

Waterhouse et al. Science 270:985-988 (1995)

Winter and Harris Immunol Today 14:43-46 (1993)

Wright et al. Crit. Reviews in Immunol. 12125-168 (1992)

Yang et al. CancerRes 57:4036-41 (1997)

Yi-qun et al. Jnt Immunol 8:37-44 (1996)

Zon et al. Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991)

Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Pracíical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991))

Fry et al. “Specific, irreversible inactivation of the epidermal growth factor receptor and erbB2, by a new class of tyrosine kinase inhibitor” Proč Nati Acad Sci USA 95:12022-7 (1998)

Hofftnan et al. “A model of Cdc25 phosphatase catalytic domain and Cdkinteraction surface based on the presence of a rhodanese homology domain” J Mol Biol 282:195-208 (1998)

Ginalski et al. “Modelling of active forms of protein kinases: p38~a čase study” Acta Biochim Pol 44:557-64 (1997)

Jouko et al. “Identification of csk tyrosine phosphorylation sites and a tyrosine residue important for kinase domain structure” Biochem J322:927-35 (1997)

Singh et al. “Structure-based design of a potent, selective, and irreversible inhibitor of the catalytic domain of the erbB receptor subfamily of protein tyrosine kinases” JMed Chem 40:1130-5 (1997)

Mandel et al. “ABGEN: a knowledge-based automated approach for antibody structure modeling” AtatBiotechnol 14:323-8 (1996)

Monfardini ét al. “Rational design, analysis, and potential utility of GM-CSF antagonists” Proč Assoc Am Physicians 108:420-31 (1996)

Furet et al. “Modelling study of protein kinase inhibitors: binding mode of staurosporine and origin of the selectivity of CGP 52411” J Comput Aided Mol Par 9:465-72 (1995)

111 et al. “Design and construction of a hybrid immunoglobulin domain with properties of both heavy and light chain variable regions” Protein Eng 10:94957 (1997) • ·

160

Martin et al. “The affínity-selection of a minibody polypeptide inhibitor of human interleukin-6” EMBO /13:5303-9 (1994)

Přihlášky vynálezu USA:

U.S. Patent Application Seriál No. 07/466,008, fíled January 12,1990

U.S. Patent Application Seriál No. 07/574,748, fíled August 29,1990

U.S. Patent Application Seriál No. 07/575,962, fíled August 31,1990

U.S. Patent Application Seriál No. 07/610,515, fíled November 8,1990

U.S. Patent Application Seriál No. 07/810,279, fíled December 17,1991

U.S. Patent Application Seriál No. 07/853,408, fíled March 18,1992

U.S. Patent Application Seriál No. 07/904,068, fíled June 23,1992

U.S. Patent Application Seriál No. 07/919,297, fíled July 24,1992

U.S. Patent Application Seriál No. 07/922,649, fíled July 30,1992

U.S. Patent Application Seriál No. 07/990,860, fíled December 16,1992

U.S. Patent Application Seriál No. 08/031,801, fíled March 15,1993

U.S. Patent Application Seriál No. 08/053,131, fíled Apríl 26, 1993

U.S. Patent Application Seriál No. 08/096,762, fíled July 22,1993

U.S. Patent Application Seriál No. 08/112,848, fíled August 27,1993

U.S. Patent Application Seriál No. 08/155,301, fíled November 18,1993

U.S. Patent Application Seriál No. 08/161,739, fíled December 3,1993

U.S. Patent Application Seriál No. 08/165,699, fíled December 10,1993

U.S. Patent Application Seriál No. 08/209,741, fíled March 9,1994

U.S. Patent Application Seriál No. 08/234,145, fíled Apríl 28,1994

U.S. Patent Application Seriál No. 08/724,752, fíled October 2,1996

U.S. Patent Application Seriál No. 08/730,639, fíled October 11,1996

U.S. Patent Application Seriál No. 08/759,620, fíled December 3,1996

U.S. Patent Application Seriál No. 08/759,620, fíled December 3,1996

Patenty USA:

U.S. Patent No. 4,399,216

U.S. Patent No. 4,681,581

U.S. Patent No. 4,683,195

U.S. Patent No. 4,683,202

U.S. Patent No. 4,735,210

U.S. Patent No. 4,740,461

U.S. Patent No. 4,816,397

U.S. Patent No. 4,912,040

U.S. Patent No. 4,959,455

U.S. Patent No. 5,101,827

U.S. Patent No. 5,102,990 (RE 35,500)

U.S. Patent No. 5,151,510

U.S. Patent No. 5,194,594

U.S. Patent No. 5,434,131

U.S. Patent No. 5,530,101

U.S. Patent No. 5,545,806

U.S. Patent No. 5,545,807

U.S. Patent No. 5,585,089

U.S. Patent No. 5,591,669 • ··· ····

161

U.S. Patent No. 5,612,205

U.S. Patent No. 5,625,126

U.S. Patent No. 5,625,825

U.S. Patent No. 5,633,425

U.S. Patent No. 5,643,763

U.S. Patent No. 5,648,471

U.S. Patent No. 5,661,016

U.S. Patent No. 5,693,761

U.S. Patent No. 5,693,792

U.S. Patent No. 5,697,902

U.S. Patent No. 5,703,057

U.S. Patent No. 5,714,350

U.S. Patent No. 5,721,367

U.S. Patent No. 5,733,743

U.S. Patent No. 5,770,197

U.S. Patent No. 5,770,429

U.S. Patent No. 5,773,253

U.S. Patent No. 5,777,085

U.S. Patent No. 5,789,215

U.S. Patent No. 5,789,650

U.S. Patent No. 5,811,097

Evropské patenty:

European Patent No. EP 0 546 073 Β1

European Patent No. EP 0 463 151 B1, grant published June 12, 1996

Mezinárodní přihlášky PCT:

Intemational Patent Application No. WO 92/02190

Intemational Patent Application No. WO 92/03918

International Patent Application No. WO 92/22645

Intemational Patent Application No. WO 92/22647

Intemational Patent Application No. WO 92/22670

Intemational Patent Application No. WO 93/00431

Intemational Patent Application No. WO 93/12227

Intemational Patent Application No. WO 94/00569

Intemational Patent Application No. WO 94/02602, published February 3,1994

Intemational Patent Application No. WO 94/25585

Intemational Patent Application No. WO 94/29444

Intemational Patent Application No. WO 95/01994

Intemational Patent Application No. WO 95/03408

Intemational Patent Application No. WO 95/24217

Intemational Patent Application No. WO 95/33770

Intemational Patent Application No. WO 96/14436

Intemational Patent Application No. WO 96/34096, published October 31,1996

Intemational Patent Application No. WO 97/13852

Intemational Patent Application No. WO 97/20574

Intemational Patent Application No. WO 97/38137

Intemational Patent Application No. WO 98/24884 « ·

Intemational Patent Application No. WO 98/24893, published June 11,1998

Ekvivalenty

Popis vynálezu a příklady výhodných provedení uváděj í dle původců nejvýhodnější provedení vynálezu. Je však zřejmé, že vynález lze realizovat různými ekvivalentními způsoby. Předmět vynálezu je definován následujícími patentovým nároky a jejich ekvivalenty.

Claims (32)

1. Lidská monoklonální protilátka, která se váže na antigen 4 cytotoxických T lymfocytů (CTLA-4) nebo její fragment vázající se na antigen.

2. Protilátka nebo její fragment podle nároku 1, která inhibuje vazbu lidského CTLA-4 na B7-1 s IC₅₀ 100 nM nebo nižší, a inhibuje vazbu lidského CTLA-4 na B7-2 s IC₅₀ 100 nM nebo nižší, přičemž protilátka má alespoň jednu vlastnost vybranou z následujících:

a) váže se na CTLA-4 s vazebnou afinitou 10'^{3 * * * * * 9} nebo vyšší,

b) zvyšuje produkci cytokinů v testu lidských T lymfocytů o 500 pg/ml nebo více,

c) zvyšuje produkci IL-2 v testu lidských T lymfocytů o 500 pg/ml nebo více,

d) zvyšuje produkci interferonu-γ v testu lidských

T lymfocytů o 500 pg/ml nebo více,

e) neváže se na CTLA-4 myši, potkana nebo králíka, a

f) váže se na CTLA-4 cynomolgního makaka (Macaca fascicularis) a rhesus makaka {Macaca mullata) .

3. Způsob přípravy protilátek vázajících se na CTLA-4 vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy:

a) imunizuje se savec jiný než člověk imunogenem obsahujícím CTLA-4, přičemž tento savec je schopen exprimovat lidské protilátky ve svých B lymfocytech,

b) ze savce se izolují B lymfocyty,

c) provede se screening B lymfocytů nebo buněčných linií pocházejících z těchto lymfocytů na protilátky vázající se na CTLA-4, • 9 • · • · • · ···· · · · ·

164

d) kultivují se buněčné linie exprimující protilátky vázající se na CTLA-4, a

e) izolují se protilátky vázající se na CTLA-4.

4. Protilátka vázající se na CTLA-4, která je připravena způsobem podle nároku 3.

5. Protilátka nebo její fragment podle kteréhokoliv z nároků

1, 2 a 4, která inhibuje vazbu lidského CTLA-4 na B7-1 s IC₅₀ nižší než 0,50 nM a inhibuje vazbu lidského CTLA-4 na B7-2 s IC₅₀ nižší než 0,38 nM.

6. Protilátka nebo její fragment podle nároku 1, která obsahuje aminokyselinovou sekvenci lehkého řetězce vybranou ze skupiny obsahující:

a) zárodečnou aminokyselinovou sekvenci lidského genu A2 7 V_L nebo tuto zárodečnou sekvenci s alespoň j ednou mutací, b) zárodečnou aminokyselinovou sekvenci lidského genu 012 V_L nebo tuto zárodečnou sekvenci s alespoň j ednou mutací, c) zárodečnou ami nokys e1inovou sekvenci lidského genu

A10/A26 V_L nebo tuto zárodečnou sekvenci s alespoň jednou mutací,

d) zárodečnou ami nokys e1inovou sekvenci lidského genu A17 V_L nebo tuto zárodečnou sekvenci s alespoň jednou mutací, e) zárodečnou ami nokys e1inovou sekvenci lidského genu

A3/A19 V_L nebo tuto zárodečnou sekvenci s alespoň jednou mutací.

• · · • · • · • · · ·

165

7. Protilátka nebo její fragment podle nároku 6, kde zárodečná aminokyselinová sekvence lidského genu A2 7 V_L obsahuje alespoň jednu mutaci vybranou ze skupiny obsahující mutace:

a) alespoň jedna aminokyselina v CDR1 je deletována ve srovnání s lidskou zárodečnou aminokyselinovou sekvencí A2 7 V_L,

b) serinový zbytek v pozici 6 zárodečné CDR3, uvedené na obr. 4, lidského genu A2 7 V_L byl nahrazen, a

c) CDR1 obsahuje alespoň jednu konzervativní nebo nekonzervativní aminokyselinovou substituci ve srovnání s lidskou zárodečnou aminokyselinovou sekvencí A27 V_L.

8. Protilátka nebo její fragment podle kteréhokoliv z nároků

1, 2 a 4 až 7, která obsahuje sekvence lehkého řetězce

CDR1, CDR2 nebo CDR3 uvedené na kterémkoliv z obrázků 4 až

9. Protilátka nebo její fragment podle nároku 8, kde aminokyselinová sekvence CDR1, CDR2 nebo CDR3 je vybrána ze skupiny obsahující:

a) aminokyselinové sekvence CDR1, CDR2 a CDR3 protilátky

4.1.1, protilátky 4.14.3., protilátky 6.1.1, protilátky

4.10.2 nebo protilátky 4.13.1, uvedených na obr. 4,

b) aminokyselinové sekvence CDR1, CDR2 a CDR3 protilátky 3.1.1, protilátky 11.2 .1, protilátky 11 .6.1 nebo protilátky 11.7. 1, uvedených na obr. 5, c) ami nokys e1inové sekvence CDR1, CDR2 a CDR3 protilátky 2.1.3 uvedené na obr. 6, d) aminokyselinové sekvence CDR1, CDR2 a CDR3 protilátky 12.3.1 uvedené na obr. 7, e) aminokyselinové sekvence CDR1, CDR2 a CDR3 protilátky

166

12.9.1 uvedené na obr. 8.

10.Protilátka nebo její fragment podle kteréhokoliv z nároků 1, 2 a 4 až 9, která obsahuje aminokyselinovou sekvenci lehkého řetězce vybranou ze skupiny obsahující aminokyselinové sekvence uvedené zde jako SEKVENCE ID. Č. 14 až 26, 65, 67, 69 a 71.

11. Protilátka nebo její fragment podle kteréhokoliv z nároků

1, 2 a 4 až 10, která má těžký řetězec obsahující zárodečnou aminokyselinovou sekvenci lidského genu V_H 3-33 (DP-50) nebo tuto zárodečnou sekvenci s alespoň jednou mutací.

12. Protilátka nebo její fragment podle nároku 1, která obsahuje aminokyselinovou sekvenci těžkého řetězce vybranou ze skupiny obsahující:

a) zárodečnou aminokyselinovou sekvenci lidského genu

V_H 3-33 (DP-50) nebo tuto zárodečnou sekvenci s alespoň jednou mutací,

b) zárodečnou aminokyselinovou sekvenci lidského genu

V_H 4-31 (DP-65) nebo tuto zárodečnou sekvenci s alespoň jednou mutací, a

c) zárodečnou aminokyselinovou sekvenci lidského genu V_H DP-47 nebo tuto zárodečnou sekvenci s alespoň jednou mutací.

13.Protilátka nebo její fragment podle nároku 1 nebo 11, která obsahuje sekvenci CDR1, CDR2 a CDR3 těžkého řetězce uvedenou na obr. 2.

• · · · • · · · • * • · • · ···· · · ··

167

14. Protilátka nebo její fragment podle nároku 1, která obsahuje těžký řetězec obsahující aminokyselinové sekvence CDR1, CDR2 a CDR3 protilátky uvedené na obr. 2.

15. Protilátka nebo její fragment podle kteréhokoliv z nároků

1, 2 a 4 až 14, která obsahuje aminokyselinovou sekvenci těžkého řetězce vybranou ze skupiny obsahující aminokyselinové sekvence uvedené zde jako SEKVENCE ID. Č. 1 až 8, 10 až 13, 63, 66, 68 nebo 70.

16. Protilátka nebo její fragment podle nároku 1, která je vybraná ze skupiny obsahující:

a) protilátku nebo její fragment obsahující aminokyselinovou sekvenci variabilního úseku těžkého řetězce uvedenou jako SEKVENCE ID. Č. 63 a dále obsahující aminokyselinovou sekvenci variabilního úseku lehkého řetězce uvedenou jako SEKVENCE ID. Č. 65,

b) protilátku nebo její fragment obsahující aminokyselinovou sekvenci variabilního úseku těžkého řetězce uvedenou jako SEKVENCE ID. Č. 66 a dále obsahující aminokyselinovou sekvenci variabilního úseku lehkého řetězce uvedenou jako SEKVENCE ID. Č. 67,

c) protilátku nebo její fragment obsahující aminokyselinovou sekvenci variabilního úseku těžkého řetězce uvedenou jako SEKVENCE ID. Č. 68 a dále obsahující aminokyselinovou sekvenci variabilního úseku lehkého řetězce uvedenou jako SEKVENCE ID. Č. 69,

d) protilátku nebo její fragment obsahující aminokyselinovou sekvenci variabilního úseku těžkého řetězce uvedenou jako SEKVENCE ID. Č. 70 a dále obsahující aminokyselinovou sekvenci variabilního úseku lehkého řetězce uvedenou jako SEKVENCE ID. Č. 71.

• · • ·

168

17. Protilátka nebo její fragment podle nároku 16, která obsahuj e:

a) aminokyselinovou sekvenci těžkého řetězce podle SEKVENCE ID. Č. 63 a aminokyselinovou sekvenci lehkého řetězce podle SEKVENCE ID. Č. 65, přičemž protilátka postrádá signální peptidy uvedené v těchto sekvencích,

b) aminokyselinovou sekvenci těžkého řetězce podle SEKVENCE ID. Č. 66 a aminokyselinovou sekvenci lehkého řetězce podle SEKVENCE ID. Č. 67, přičemž protilátka postrádá signální peptidy uvedené v těchto sekvencích,

c) aminokyselinovou sekvenci těžkého řetězce podle SEKVENCE ID. Č. 68 a aminokyselinovou sekvenci lehkého řetězce podle SEKVENCE ID. Č. 69, přičemž protilátka postrádá signální peptidy uvedené v těchto sekvencích,

d) aminokyselinovou sekvenci těžkého řetězce podle SEKVENCE ID. Č. 70 a aminokyselinovou sekvenci lehkého řetězce podle SEKVENCE ID. Č. 71, přičemž protilátka postrádá signální peptidy uvedené v těchto sekvencích.

18. Protilátka podle nároku 1, která má jednu nebo více vlastností vybraných ze skupiny obsahující vlastnosti:

a) kompetitivně inhibuje vazbu CTLA-4 s protilátkou podle nároku 16 nebo 17,

b) váže se na stejný epitop jako protilátka podle nároku 16 nebo 17, a

c) má vazebnou specificitu, která je v podstatě shodná s protilátkou podle nároku 16 nebo 17.

19. Protilátka, která kompetitivně inhibuje vazbu CTLA-4 s protilátkou 4.1.1, 4.8.1, 6.1.1 nebo 11.2.1, mající aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. 22.

• · • · • ·

169

20. Protilátka podle nároku 19, která obsahuje sekvenci CDR identickou s CDR sekvencí protilátky uvedené na obr. 22.

21. Protilátka nebo její fragment podle kteréhokoliv z nároků

1, 2 a 4 až 5, která obsahuje alespoň jednu sekvenci ze skupiny obsahuj ící:

a) lidské sekvence FR1, FR2 a FR3 kódované lidskou rodinou genů V_H 3-33 nebo touto rodinou genů s konzervativní substitucí, jednoduchou nekonzervativní substitucí nebo oběma,

b) lidské sekvence FR1, FR2 a FR3 kódované lidskou rodinou genů Vk A2 7 nebo touto rodinou genů s konzervativní substitucí, jednoduchou nekonzervativní substitucí nebo oběma.

22. Protilátka vázající CTLA-4, která obsahuje aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny obsahující:

a) aminokyselinovou sekvenci obsahující úsek aminokyselinových zbytků 1 až 89 podle SEKVENCE ID. Č. 5 operativně spojený s aminokyselinovou sekvencí CDR3, který je kódován genem D7-27 a genem JH4,

b) aminokyselinovou sekvenci uvedenou v předchozím bodu dále obsahující mutace v pozicích 24, 40 a 47 v úseku aminokyselinových zbytků 1 až 89 podle SEKVENCE ID. Č. 5, a

c) aminokyselinovou sekvenci uvedenou v předchozích bodech dále obsahující mutace v pozicích 1, 3 a 7 v aminokyselinové sekvenci CDR.

23.Systém buněčné kultury pro testování stimulace T lymfocytů obsahující lidské T lymfoblasty kokultivované s buněčnou • · • 9 ♦ · · · · · · ’ • · · · · · * * • · ·· ·· ··· - . · · · · ·

170 linií Ráji.

24. Způsob měření stimulace T lymfocytů vyznačuj ící se t í m, že obsahuje kroky, kdy:

a) poskytne se kultura lidských T lymfoblastů a buněčné linie Ráji,

b) tato kultura se přivede do kontaktu s činidlem,

c) měří se produkce cytokinů v kultuře.

25. Farmaceutický přípravek pro léčení rakoviny, zánětlivých nebo autoimunitních onemocnění vyznačující se tím, že obsahuje protilátku nebo její fragment podle kteréhokoliv z nároků 1, 2 a 4 až 22 a farmaceuticky přijatelný nosič.

26. Buněčná linie produkující protilátky nebo její fragmenty podle kteréhokoliv z nároků 1, 2 a 4 až 22.

27.Izolovaná nukleová kyselina, která kóduje těžký nebo lehký řetězec protilátky nebo jejího fragmentu podle kteréhokoliv z nároků 1, 2 a 4 až 22, nebo fragment takové nukleové kyseliny.

28.Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 27 operativně spojená s expresní kontrolní sekvencí.

29. Hostitelská buňka obsahující izolovanou nukleovou kyselinu podle nároku 27 nebo 28.

30. Transgenní savec nebo rostlina obsahující nukleovou kyselinu podle nároku 27 nebo 28, kterýžto savec nebo rostlina exprimuje tuto nukleovou kyselinu.

• <

• ·

171

31.Způsob zvýšení tvorby cytokinů v T lymfocytech pacienta, vyznačuj ící se t í m, v ze obsahuj e krok, kdy se pacientovi podá protilátka nebo její fragment podle kteréhokoliv z nároků 1, 2 a 4 až 22 nebo farmaceutický přípravek podle nároku 25 . 32.Způsob zvýšení reakce cytotoxických T lymfocytů pacienta, vyznačuj ící se t í m, že obsahuj e krok, kdy

se pacientovi podá protilátka nebo její fragment podle kteréhokoliv z nároků 1, 2 a 4 až 22 nebo farmaceutický přípravek podle nároku 25.

33. Způsob léčení nádorů u pacienta, vyznačuj ící se tím, že obsahuje krok, kdy se pacientovi podá kombinace obsahující protilátku nebo její fragment podle kteréhokoliv z nároků 1, 2 a 4 až 22 nebo farmaceutický přípravek podle nároku 25 a buňky exprimující faktor stimulující kolonie granulocytů-makrofágů.

34. Způsob podle nároku 32 vyznačující se tím, že protilátka nebo její fragment se nepodílejí na cytotoxicitě závislé na komplementu.