BR112020019251A2

BR112020019251A2 - Compostos com atividade anti-tumor contra células de câncer com mutações de her2 exon 19

Info

Publication number: BR112020019251A2
Application number: BR112020019251-1A
Authority: BR
Inventors: Jacqulyne ROBICHAUX; John V. HEYMACH
Original assignee: Board Of Regents, The University Of Texas System
Priority date: 2018-03-27
Filing date: 2019-03-27
Publication date: 2021-01-12
Also published as: EP3773551A4; IL277373A; WO2019191279A2; RU2020134932A; CN112088000A; US20210361655A1; AU2019243738B2; SG11202009498RA; AU2019243738A1; EP3773551A2; JP2021519306A; KR20200136417A; PH12020551495A1; JP7386174B2; CA3094108A1; MX2020010121A; WO2019191279A3

Abstract

a presente invenção refere-se a métodos de tratamento de câncer em um paciente determinado a ter uma mutação do exon 19 de her2, como uma mutação pontual, pela administração de um inibidor de tirosina quinase de terceira geração, como o poziotinib.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOS- TOS COM ATIVIDADE ANTI-TUMOR CONTRA CÉLULAS DE CÂN- CER COM MUTAÇÕES DE HER2 EXON 19".

[0001] Este Pedido de Patente reivindica o benefício dos Pedidos de Patente Provisórios dos Estados Unidos nº 62/ 648.629, depositado em 27 de março de 2018 e 62/688.049 depositados em 21 de junho de 2018, ambos incorporados aqui, neste pedido de patente por referên- cia em sua totalidade.

INCORPORAÇÃO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0002] A listagem de sequência que está contida no arquivo de- nominado "UTFC.P1354WOWO ST25" que tem 1,3 KB (conforme medido no Microsoft WindowsO) e foi criada em 27 de março de 2019, está arquivada neste pedido de patente por envio eletrônico e é incor- porada por referência aqui neste pedido de patente

ANTECEDENTES

[0003] Esta invenção foi feita com o apoio do governo sob o núme- ro de concessão CA190628 concedido pelo National Institutes of Health. O governo tem determinados direitos sobre a invenção.

1. Campo

[0004] A presente invenção refere-se, de um modo geral, ao cam- po da medicina e da biologia molecular. Mais especificamente ela diz respeito a métodos para o tratamento de pacientes com mutações exon 19 de HER2, tais como mutações de ponta.

2. Descrição da Técnica Relacionada

[0005] O HER?2 é mutado em 2 - 3% dos casos de câncer de pul- mão de células não pequenas (NSCLC), e os inibidores de tirosina quinase (TKlIs) com atividade contra HER2 incluindo afatinib e dacomi- tinibe produziram taxas de resposta objetivas inferiores a 30%. Embo- ra a maioria das mutações HER2 no NSCLC ocorra no exon 20, as mutações pontuais no exon 19 ocorrem no NSCLC e em outros tipos de câncer, como o câncer de mama. Estudos anteriores mostraram que as mutações pontuais no exon 19 de HER2 são frequentemente resistentes aos inibidores da tirosina quinase atualmente aprovados, como o lapatinibe, devido a um complexo HER2/ fármaco menos energeticamente favorável. Portanto, há uma necessidade clínica sig- nificativa de identificar novas terapias para superar a resistência inata aos medicamentos de tumores NSCLC que abrigam mutações no exon 19 de HER.

SUMÁRIO

[0006] Em determinadas modalidades, a presente divulgação for- nece métodos e composições para o tratamento de câncer em pacien- tes com mutações no exon 19 de HER2, como mutações pontuais no exon 19. Em uma modalidade, é fornecido um método de tratamento de câncer em um indivíduo, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de poziotinib ao indivíduo, em que o indivíduo foi determinado como tendo uma ou mais mutações do exon 19 de HER?2, como um ou mais mutações pontuais do exon 19 de HER2. Em as- pectos específicos, o indivíduo é um ser humano.

[0007] Em determinados aspectos, uma ou mais mutações do exon 19 de HER compreendem uma ou mais mutações pontuais, in- serções e/ou deleções de 1-18 nucleotídeos entre os aminoácidos 668-769 de HER2 (por exemplo, SEQ ID NO: 1) . Em alguns aspectos, o indivíduo foi determinado como tendo 2, 3 ou 4 mutações no exon 19 de HER2. Em alguns aspectos, uma ou mais mutações do exon 19 de HER2 estão em um ou mais resíduos selecionados a partir do grupo que consiste em R668, R678, V754, L755, 1767 e D769. Em alguns aspectos, uma ou mais mutações do exon 19 de HER2 são seleciona- das a partir do grupo que consiste em R668Q, R678Q, V754M, L755P, L755S, L755W, D769H, D769N, I1767M e D769Y. Em alguns aspectos, uma ou mais mutações do exon 19 de HER2 estão em um ou mais resíduos selecionados a partir do grupo que consiste em R668, R678, V754, L755 e D769. Em alguns aspectos, uma ou mais mutações do exon 19 de HER2 são selecionadas a partir do grupo que consiste em R668Q, R678Q, V754M, L755P, L755S, L755W, D769H, D769N e D769Y.

[0008] Em alguns aspectos, o poziotinib é ainda definido como sal de cloridrato de poziotinib. Em determinados aspectos, o sal de clori- drato de poziotinib é formulado como um comprimido.

[0009] Em alguns aspectos, o indivíduo é resistente ou mostrou resistência ao inibidor de tirosina quinase administrado anteriormente. Em determinados aspectos, o inibidor da tirosina quinase é lapatinib, afatinib, dacomitinib, osimertinib, ibrutinib, nazartinib ou beratinib.

[0010] Em determinados aspectos, o poziotinib é administrado através da via oral. Em alguns aspectos, o poziotinib é administrado em uma dose de 5-25 mg, como 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 2, 23, 24 ou 25 mg. Em determinados aspectos, o poziotinib é administrado em uma dose de 8 mg, 12 mg ou 16 mg. Em alguns aspectos, o poziotinib é administrado diariamente. Em determi- nados aspectos, o poziotinib é administrado de forma contínua. Em alguns aspectos, o poziotinib é administrado em ciclos de 28 dias.

[0011] Em determinados aspectos, o indivíduo foi determinado como tendo uma mutação do exon 19 de HER2, como uma mutação pontual, por meio da análise de uma amostra genômica do indivíduo. Em alguns aspectos, a amostra genômica é isolada de saliva, sangue, urina, tecido normal ou tecido tumoral. Em aspectos particulares, a presença de uma mutação do exon 19 de HER é determinada por se- quenciamento de ácido nucleico (por exemplo, sequenciamento de DNA de tecido tumoral ou DNA livre circulante do plasma) ou análises de PCR.

[0012] Em determinados aspectos, o método compreende ainda a administração de uma terapia anticâncer adicional. Em alguns aspec- tos, a terapia anticâncer é quimioterapia, radioterapia, terapia genética, cirurgia, terapia hormonal, terapia anti-angiogênica ou imunoterapia. Em determinados aspectos, o poziotinib e/ou a terapia anticâncer são administrados por via intravenosa, subcutânea, intraóssea, oral, trans- dérmica, em liberação sustentada, em liberação controlada, em libera- ção retardada, como um supositório ou sublingual. Em alguns aspec- tos, a administração de poziotinib e/ou terapia anticâncer compreende administração local, regional ou sistêmica. Em aspectos particulares, o poziotinib e/ou terapia anticâncer são administrados duas ou mais ve- zes, como diariamente, em dias alternados ou semanalmente.

[0013] Em alguns aspectos, o câncer é o câncer oral, câncer oro- faríngeo, câncer nasofaríngeo, câncer respiratório, câncer urogenital, câncer gastrointestinal, câncer de tecido do sistema nervoso central ou periférico, câncer endócrino ou neuroendócrino ou câncer hematopoié- tico, glioma, sarcoma, carcinoma, linfoma, melanoma, fibroma, menin- gioma, câncer cerebral, câncer orofaríngeo, câncer nasofaríngeo, cân- cer renal, câncer biliar, feocromocitoma, câncer de células das ilhotas pancreáticas, tumores de Li-Fraumeni, câncer de tireoide, câncer de paratireoide, tumores pituitários, glândulas adrenais, tumores de sar- coma, múltiplos tumores neuroendócrinos tipo | e tipo Il, câncer de ma- ma, câncer de pulmão, câncer de cabeça e pescoço, câncer de próstata, câncer de esôfago, câncer de traqueia, câncer de fígado, câncer de bexiga, câncer de estômago, câncer de pâncreas, câncer de ovário, câncer de útero, câncer cervical, câncer testicular, câncer de cólon, câncer retal ou câncer de pele. Em alguns aspectos, o câncer é câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de bexiga, câncer anal, câncer endometrial, câncer de ovário ou câncer de pulmão de células não pe- quenas (NSCLC). Em aspectos específicos, o câncer é NSCLC.

[0014] Em outra modalidade, é fornecida uma composição farma-

cêutica que compreende poziotinib para um paciente determinado a ter uma ou mais mutações do exon 19 de HER2, tais como uma ou mais mutações pontuais do exon 19 de HER2. Em certos aspectos, uma ou mais mutações do exon 19 de HER compreendem uma mutação pon- tual, inserção e /ou cancelamento de 1-18 nucleotídeos entre os ami- noácidos 668-769. Em determinados aspectos, o indivíduo foi determi- nado como tendo 2, 3 ou 4 mutações no exon 19 de HER?2.

[0015] Em alguns aspectos, uma ou mais mutações do exon 19 de HER2 estão em um ou mais resíduos selecionados a partir do grupo que consiste em R668, R678, V754, L755, 1767 e D769. Em aspectos específicos, uma ou mais mutações do exon 19 são selecionadas a partir do grupo que consiste em R668Q, R678Q, V754M, L755P, L755S, L755W, D769H, D769N, I1767M e D769Y. Em alguns aspectos, o paciente está sendo tratado com uma terapia anticâncer. Em alguns aspectos, uma ou mais mutações do exon 19 de HER2 estão em um ou mais resíduos selecionados a partir do grupo que consiste em R668, R678, V754, L755 e D769. Em alguns aspectos, uma ou mais mutações do exon 19 de HER2 são selecionadas a partir do grupo que consiste em R668Q, R678Q, V754M, L755P, L7558S, L755W, D769H, D769N e D769Y.

[0016] Em ainda outra modalidade, é fornecido um método para prever uma resposta ao poziotinib de forma isolada ou em combinação com uma terapia anticâncer em um indivíduo com um câncer que compreende a detecção de uma mutação do exon 19 de HER2 (por exemplo, mutação pontual do exon 19 de HER2 ) em uma amostra genômica obtida do referido paciente, em que se a amostra for positiva para a presença da mutação do exon 19 de HER?2, então o paciente deverá ter uma resposta favorável ao poziotinib isolado ou em combi- nação com uma terapia anticâncer. Em alguns aspectos, a amostra genômica é isolada de saliva, sangue, urina, tecido normal ou tecido tumoral. Em determinados aspectos, a presença de uma mutação do exon 19 de HER2 é determinada por sequenciamento de ácido nuclei- co ou análises de PCR. Em certos aspectos, a mutação do exon 19 de HER2 compreende uma ou mais mutações pontuais, inserções e/ou deleções de 1 a18 nucleotídeos entre os aminoácidos 668-769. Em alguns aspectos, a mutação do exon 19 de HER2 está no resíduo R668, R678, V754, L755, 1767 e D769. Em alguns aspectos, a muta- ção do exon 19 de EGFR é selecionada a partir do grupo que consiste em R668Q, R678Q, V754M, L755P, L755S, L755W, D769H, D769N, I767M e D769Y. Em alguns aspectos, uma ou mais mutações do exon 19 de HER2 estão em um ou mais resíduos selecionados a partir do grupo que consiste em R668, R678, V754, L755 e D769. Em alguns aspectos, uma ou mais mutações do exon 19 de HER2 são seleciona- das partir do grupo que consiste em R668Q, R678Q, V754M, L755P, L755S, L755W, D769H, D769N e D769Y. Em determinados aspectos, uma resposta favorável ao inibidor de poziotinib isolado ou em combi- nação com uma terapia anticâncer compreende a redução no tamanho ou carga do tumor, bloqueio do crescimento do tumor, redução da dor associada ao tumor, redução da patologia associada ao câncer, redu- ção de sintomas do câncer associado, não progressão do câncer, au- mento do intervalo livre de doença, aumento do tempo para progres- são, indução da remissão, redução da metástase ou aumento da so- brevida do paciente. Em outros aspectos, o paciente que se prevê ter uma resposta favorável é administrado com poziotinib isolado ou em combinação com uma segunda terapia anticâncer.

[0017] Em outra modalidade, é fornecido um ácido nucleico isolado que codifica uma proteína HER2 mutante, em que a referida proteína mu- tante difere de HER2 humano de tipo selvagem por uma ou mais muta- ções do exon 19 de HER2 compreendendo uma mutação pontual, inser- ção e/ou deleção de 1-18 nucleotídeos entre os aminoácidos 668-769 de HER2 ou SEQ ID NO: 1 (GW FGILIKRROQ KIRKYTMRRL LQETELVEPL TPSGAMPNQA QMRILKETEL RKVKVLGA FGTVYKGI- WI PDGENVDKIPV AIKVILRENTS PKANKEILD). Em alguns aspectos, uma ou mais mutações do exon 19 de HER2 estão em um ou mais resíduos selecionados do grupo que consiste em R668, R678, V754, L755, 1767 e D769. Em certos aspectos, uma ou mais mutações do exon 19 são selecionadas do grupo que consiste em R668Q, R678Q, V754M, L755P, L7558S, L755W, D769H, D769N, I1767M e D769Y. Em alguns aspectos, uma ou mais mutações do exon 19 de HER?2 estão em um ou mais resíduos selecionados do grupo que consiste em R668, R678, V754, L755 e D769. Em alguns aspectos, uma ou mais mutações do exon 19 de HER2 são selecionadas do grupo que consis- te em R668Q, R678Q, V754M, L755P, L7558S, L755W, D769H, D769N e D769Y. Em alguns aspectos, o método compreende ainda a admi- nistração de poziotinib isolado ou em combinação com uma segunda terapia anticâncer ao referido paciente que se prevê ter uma resposta favorável.

[0018] É ainda fornecida aqui uma composição que compreende ácidos nucleicos isolados de células cancerosas humanas; e um par de iniciadores que pode amplificar pelo menos uma primeira porção do exon 19 mutado de uma sequência de codificação de HER2 humano.

[0019] Em alguns aspectos, a composição compreende ainda uma molécula de sonda marcada que pode se hibridizar especificamente com a primeira porção do exon 19 da sequência de codificação de HER humano quando há uma mutação na sequência. Em certos as- pectos, a composição compreende ainda uma polimerase de DNA termoestável. Em certos aspectos, a composição compreende ainda dNTPS. Em aspectos particulares, a sonda marcada hibridiza com a primeira porção do exon 19 da sequência de codificação de HER2 humano quando há uma mutação selecionada do grupo que consiste em R668Q, R678Q, V754M, L755P, L7558S, L755W, D769H, D769N e D769Y.

[0020] Uma outra modalidade fornece um ácido nucleico isolado que codifica uma proteína HER2 mutante, em que a referida proteína mutante difere de HER2 humano de tipo selvagem por uma ou mais mutações do exon 19 de HER2 compreendendo uma ou mais muta- ções pontuais, inserções e/ou deleções de 1-18 nucleotídeos entre os aminoácidos 668-769. Em alguns aspectos, uma ou mais mutações do exon 19 de HER2 estão no resíduo R668, R678, V754, L755, 1767 e/ou D769. Em certos aspectos, uma ou mais mutações do exon 19 de HER?2 são selecionadas do grupo que consiste em R668Q, R6789Q, V754M, L755P, L7558S, L755W, D769H, D769N, I1767M e D769Y. Em alguns aspectos, uma ou mais mutações do exon 19 de HER?2 estão em um ou mais resíduos selecionados a partir do grupo que consiste em R668, R678, V754, L755 e D769. Em alguns aspectos, uma ou mais mutações do exon 19 de HER2 são selecionadas a partir do gru- po que consiste em R668Q, R678Q, V754M, L755P, L7558S, L755W, D769H, D769N e D769Y.

[0021] Outros objetos, características e vantagens da presente in- venção tornar-se-ão evidentes a partir da seguinte descrição detalha- da. Deve ser entendido, no entanto, que a descrição detalhada e os exemplos específicos, embora indiquem modalidades de preferência da invenção, são dados apenas a título de ilustração, uma vez que vá- rias mudanças e modificações dentro do espírito e escopo da invenção se tornarão aparentes para aqueles versados na técnica a partir desta descrição detalhada.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0022] Os desenhos que se seguem fazem parte do presente rela- tório descritivo e são incluídos para demonstrar ainda certos aspectos da presente invenção. A invenção pode ser mais bem compreendida por referência a um ou mais desses desenhos em combinação com a descrição detalhada de modalidades específicas aqui apresentadas.

[0023] FIGS. 1A-1B: o crescimento independente de IL-3 de |i- nhas de células Ba/F3 estáveis que expressam o vetor vazio ou HER2 L755P demonstra que L755P é uma mutação HER2 de ativação. À viabilidade de células foi determinada pelo ensaio Cell Titer Glo. À média + SEM é traçada para cada linha de células (n = 3). As curvas de resposta de dose de células HER2 L755P Ba/F3 tratadas com os inibidores indicados demonstram inibição da viabilidade de células por poziotinib. A viabilidade de células foi determinada pelo ensaio Cell Titer Glow ao longo do tempo (FIG. 1A), e as estimativas de ICs5so foram calculadas por GraphPad Prism (FIG. 1B). A média + SEM é traçada para cada dose n = 2.

[0024] FIG. 2: Esquema representando mutações em HER?2.

[0025] FIG. 3: Curvas de dose-resposta de viabilidade de células de linhas de células HER2 mutantes Ba/F3 tratadas com poziotinib ou TKls indicados por 72 horas.

[0026] FIG. 4: Viabilidade de células de linhas de células Ba/F3 estáveis que expressam mutações do exon 19 de HER?2 cultivadas em condições livres de IL-3 durante 14 dias. A viabilidade de células foi determinada a cada 3 dias através do ensaio Cell Titer Glo. A média + SEM é traçada para cada linha de células (n = 3 experimentos biologi- camente independentes).

[0027] FIGS. 5A-5D: (A) Mapa de calor dos valores log ICs5so de cé- lulas Ba/F3 que expressam de forma estável as mutações indicadas após 72 horas de tratamento com a fármaco. A viabilidade de células foi determinada através do ensaio Cell Titer Glo (N>3). (B), ICso HER2 médio de linhas de células mutantes do exon 19 após tratamento com fármaco durante 72 horas. As barras são representativas da média + SEM (N23). (C) Valores médios de IC5o de células Ba/F3 que expres-

sam L755S ou L755P com os inibidores indicados. Os pontos são re- presentativos da média + SEM (N >23). A significância estatística foi determinada por um teste t pareado. (D) Tabela de valores de ICs5o pa- ra cada fármaco e mutação representada no painel A.

[0028] FIGS. 6A-6C: (A) Curvas de resposta à dose de células CW -2 tratadas com os inibidores indicados por 72 horas. (B) Curva de crescimento tumoral de xenoenxertos de células CW-2 (HER2 L755S) tratados com os inibidores indicados. ANOVA de duas vias foi usada para determinar a significância estatística. O asterisco indica signifi- cância entre o veículo e o poziotinib ou neratinib. (C) Gráfico de barras do volume do tumor CW-2 no dia 21. Os pontos são representativos de tumores individuais e as barras são representativas da média + SEM. A linha pontilhada indica randomização em 350mm?. A significância estatística foi determinada por ANOVA de uma via.

DESCRIÇÃO DE MODALIDADES ILUSTRATIVAS

[0029] Embora a maioria das mutações ativadoras de cânceres de pulmão de células não pequenas mutantes HER2 (NSCLCs) sejam sensíveis ao inibidor de tirosina quinase (TKIs) EGFR disponível, um subconjunto com alterações no exon 19 de HER? é resistente. Os pre- sentes estudos utilizaram testes in silico, in vitro e in vivo para modelar alterações estruturais induzidas por essas mutações no exon 19 e identificar inibidores eficazes. Foi verificado que o poziotinib, devido ao seu pequeno tamanho e flexibilidade, foi capaz de contornar essas al- terações estéricas e é um inibidor potente e relativamente seletivo das proteínas mutantes do exon 19 de HER2. Assim, esses dados identifi- cam o poziotinib como um potente inibidor clinicamente ativo das mu- tações do exon 19 de HER?2 e iluminam as características moleculares dos inibidores da quinase que podem contornar as alterações estéri- cas induzidas por essas mutações.

[0030] Por conseguinte, determinadas modalidades da presente divulgação fornecem métodos para o tratamento de pacientes com câncer com mutações do exon 19 de HER2, tais como mutações pon- tuais do exon 19 de HER2. Em particular, os presentes métodos com- preendem a administração de poziotinib (também conhecido como HM781-36B) a pacientes identificados como tendo mutações pontuais no exon 19 de HER. O tamanho e a flexibilidade do poziotinib superam os obstáculos estéricos, inibindo os mutantes do exon 19 do HER2 em baixas concentrações nano molares. Assim, o poziotinib, bem como inibidores estruturalmente semelhantes, são inibidores potentes de HER2 que podem ser usados para direcionar mutações do exon 19 de HER?2 que são resistentes a TKls irreversíveis de 2º e 3º gerações. |. Definições

[0031] Conforme usado neste pedido de patente e neste relatório descritivo, "um" ou "uma" pode significar um ou mais. Conforme usado neste relatório descritivo, na(s) reivindicação (ões), quando usado em conjunto com a palavra "compreendendo", as palavras "um" ou "uma" podem significar um ou mais de um.

[0032] O uso do termo "ou" nas reivindicações é usado para signi- ficar "e/ou", a menos que explicitamente indicado para se referir a al- ternativas apenas ou as alternativas são mutuamente exclusivas, em- bora a divulgação suporte uma definição que se refere apenas a alter- nativas e "e/ou". Conforme usado neste pedido de patente, "outro" po- de significar pelo menos um segundo ou mais. Os termos "cerca de", "substancialmente" e "aproximadamente" significam, em geral, o valor declarado mais ou menos 5%.

[0033] "Tratamento" ou "tratar" inclui (1) inibir uma doença em um indivíduo ou paciente experimentando ou exibindo a patologia ou sin- tomatologia da doença (por exemplo, interromper o desenvolvimento da patologia e/ou a sintomatologia), (2) melhorar uma doença em um indivíduo ou paciente que está experimentando ou exibindo a patologia ou sintomatologia da doença (por exemplo, revertendo a patologia e/ou a sintomatologia) e/ou (3) efetuando qualquer diminuição mensu- rável em uma doença em um indivíduo ou paciente que está experi- mentando ou exibindo a patologia ou sintomatologia da doença. Por exemplo, um tratamento pode incluir a administração de uma quanti- dade eficaz de poziotinib.

[0034] "Prevenção" ou "prevenindo" inclui: (1) inibir o início de uma doença em um indivíduo ou paciente que pode estar em risco e/ou predisposto à doença, mas ainda não experimentou ou apresentou al- guma ou toda a patologia ou sintomatologia da doença, e/ou (2) retar- dar o início da patologia ou sintomatologia de uma doença em um indi- víduo ou paciente que pode estar em risco e/ou predisposto à doença, mas ainda não experimentou ou apresentou qualquer ou toda a pato- logia ou sintomatologia da doença.

[0035] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, o termo "paciente" ou "indivíduo" se refere a um organismo vivo de mamífero, como um ser humano, macaco, vaca, ovelha, cabra, cão, gato, ca- mundongo, rato, porquinho-da-índia ou espécie transgênica os mes- mos. Em determinadas modalidades, o paciente ou indivíduo é um primata. Exemplos não limitativos de pacientes humanos são adultos, jovens, bebês e fetos.

[0036] O termo "efetivo", na forma em que esse termo é usado no relatório descritivo e/ou reivindicações, significa adequado para atingir um resultado desejado, esperado ou pretendido. "Quantidade eficaz", "quantidade terapeuticamente eficaz" ou "quantidade farmaceutica- mente eficaz" quando usada no contexto de tratamento de um pacien- te ou indivíduo com um composto significa aquela quantidade do com- posto que, quando administrada a um indivíduo ou paciente para tratar ou prevenir uma doença, é uma quantidade suficiente para efetuar tal tratamento ou prevenção da doença.

[0037] Na forma usada aqui, neste pedido de patente, "ICso" refe- re-se a uma dose inibidora que é 50% da resposta máxima obtida. Es- ta medida quantitativa indica quanto de um determinado fármaco ou outra substância (inibidor) é necessário para inibir um determinado processo biológico, bioquímico ou químico (ou componente de um processo, ou seja, uma enzima, célula, receptor de células ou micror- ganismo) pela metade.

[0038] Um agente "anticâncer" é capaz de afetar negativamente uma célula cancerosa/tumor em um indivíduo, por exemplo, promo- vendo a morte de células cancerosas, induzindo apoptose em células cancerosas, reduzindo a taxa de crescimento de células cancerosas, reduzindo o incidência ou número de metástases, redução do tamanho do tumor, inibição do crescimento do tumor, redução do suprimento de sangue para um tumor ou células cancerosas, promoção de uma res- posta imune contra células cancerosas ou um tumor, prevenção ou inibição da progressão do câncer ou aumento da vida útil de um indiví- duo com câncer.

[0039] O termo "inserção (ões)" ou "mutação (ões) de inserção" refere-se à adição de um ou mais pares de bases de nucleotídeos em uma sequência de DNA. Por exemplo, uma mutação de inserção do exon 19 de HER2 pode ocorrer entre os aminoácidos 668-769, de cer- ca de 2-21 pares de bases.

[0040] "Hibridizar" ou "hibridização" refere-se à ligação entre os ácidos nucleicos. As condições para hibridação podem ser variadas de acordo com a homologia de sequência dos ácidos nucleicos a serem ligados. Assim, se a homologia de sequência entre os ácidos nucleicos em questão for alta, são utilizadas condições estringentes. Se a homo- logia da sequência for baixa, condições suaves são usadas. Quando as condições de hibridização são rigorosas, a especificidade de hibri- dização aumenta, e este aumento da especificidade de hibridização leva a uma diminuição no rendimento de produtos de hibridização não específicos. No entanto, em condições de hibridização moderadas, a especificidade de hibridização diminui, e essa diminuição na especifi- cidade de hibridização leva a um aumento no rendimento de produtos de hibridização não específicos.

[0041] Uma "sonda" ou "sondas" refere-se a um polinucleotídeo que tem pelo menos oito (8) nucleotídeos de comprimento e que forma uma estrutura híbrida com uma sequência alvo, devido à complemen- taridade de pelo menos uma sequência na sonda com um sequência na região alvo. O polinucleotídeo pode ser composto de DNA e/ou RNA. As sondas em determinadas modalidades são marcadas de for- ma detectável. As sondas podem variar significativamente em tama- nho. Geralmente, as sondas têm, por exemplo, pelo menos 8 a 15 nu- cleotídeos de comprimento. Outras sondas têm, por exemplo, pelo menos 20, 30 ou 40 nucleotídeos de comprimento. Ainda outras son- das são um pouco mais longas, tendo pelo menos, por exemplo, 50, 60, 70, 80 ou 90 nucleotídeos de comprimento. As sondas também podem ser de qualquer comprimento específico que se enquadre nas faixas anteriores. De preferência, a sonda não contém uma sequência complementar à (s) sequência (s) usada (s) para iniciar uma sequência alvo durante a reação em cadeia da polimerase.

[0042] "Oligonucleotídeo" ou "polinucleotídeo" refere-se a um po- límero de um desoxirribonucleotídeo ou ribonucleotídeo de fita simples ou dupla, que pode ser RNA ou DNA não modificado ou RNA ou DNA modificado.

[0043] Um "ribonucleotídeo modificado" ou desoxirribonucleotídeo se refere a moléculas que podem ser usadas no lugar de bases de ocorrência natural no ácido nucleico e incluem, mas não está limitado a, purinas e pirimidinas modificadas, bases menores, nucleosídeos conversíveis, análogos estruturais de purinas e pirimidinas, nucleosí-

deos e nucleotídeos marcados, derivatizados e modificados, nucleosí- deos e nucleotídeos conjugados, modificadores de sequência, modifi- cadores de término, modificadores de espaçador e nucleotídeos com modificações de estrutura principal, incluindo, mas não se limitando a, nucleotídeos modificados por ribose, fosforamidatos, fosforotioatos, fosfonamiditos, fosfonatos de metila, fosforamiditos de metila, fosfo- namiditos de metila, 5'-B- fosforamiditos de cianoetila, metilenofosfona- tos, fosforoditioatos, ácidos nucleicos peptídicos, ligações internucleo- tídicas aquirais e neutras.

[0044] Uma "variante" refere-se a um polinucleotídeo ou polipeptí- deo que difere em relação a um tipo selvagem ou a forma mais preva- lente em uma população de indivíduos pela troca, deleção ou inserção de um ou mais nucleotídeos ou aminoácidos, respectivamente. O nú- mero de nucleotídeos ou aminoácidos trocados, deletados ou inseridos pode ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,19, ou mais, como 25, 30, 35, 40, 45 ou 50.

[0045] Um "iniciador" ou "sequência de iniciador" refere-se a um oligonucleotídeo que se hibridiza com uma sequência de ácido nuclei- co alvo (por exemplo, um molde de DNA a ser amplificado) para iniciar uma reação de síntese de ácido nucleico. O iniciador pode ser um oli- gonucleotídeo de DNA, um oligonucleotídeo de RNA ou uma sequên- cia quimérica. O iniciador pode conter nucleotídeos naturais, sintéticos ou modificados. Os limites superior e inferior do comprimento do inici- ador são determinados empiricamente. O limite inferior do comprimen- to do iniciador é o comprimento mínimo que é necessário para formar um duplex estável após a hibridização com o ácido nucleico alvo em condições de reação de amplificação de ácido nucleico. Iniciadores muito curtos (geralmente com menos de 3-4 nucleotídeos de compri- mento) não formam duplexes termodinamicamente estáveis com ácido nucleico alvo sob tais condições de hibridização. O limite superior é frequentemente determinado pela possibilidade de ter uma formação de duplex em uma região diferente da sequência de ácido nucleico pré-determinada no ácido nucleico alvo. Geralmente, os comprimentos de iniciador adequados estão na faixa de cerca de 10 a cerca de 40 nucleotídeos de comprimento. Em determinadas modalidades, por exemplo, um iniciador pode ter 10-40, 15-30 ou 10-20 nucleotídeos de comprimento. Um iniciador é capaz de atuar como um ponto de inicia- ção da síntese em uma sequência de polinucleotídeos quando coloca- do em condições apropriadas.

[0046] "Detecção", "detectável" e seus equivalentes gramaticais referem-se a formas de determinar a presença e/ou quantidade e/ou identidade de uma sequência de ácido nucleico alvo. Em algumas mo- dalidades, a detecção ocorre amplificando a sequência de ácido nu- cleico alvo. Em outras modalidades, o sequenciamento do ácido nu- cleico alvo pode ser caracterizado como "detecção" do ácido nucleico alvo. Um rótulo ligado à sonda pode incluir qualquer um de uma varie- dade de rótulos diferentes conhecidos na técnica que podem ser de- tectados por, por exemplo, meios químicos ou físicos. Os rótulos que podem ser fixados às sondas podem incluir, por exemplo, materiais fluorescentes e luminescentes.

[0047] "Amplificando", "amplificação" e seus equivalentes gramati- cais referem-se a qualquer método pelo qual pelo menos uma parte de uma sequência de ácido nucleico alvo é reproduzida de uma ma- neira dependente de modelo, incluindo, sem limitação, uma ampla gama de técnicas para amplificar sequências de ácido nucleico, tanto linearmente quanto exponencialmente. Os meios exemplares para rea- lizar uma etapa de amplificação incluem reação em cadeia de ligase (LCR), reação de detecção de ligase (LDR), ligação seguida de ampli- ficação de Q-replicase, PCR, extensão de iniciador, amplificação de deslocamento de faixa (SDA), amplificação de deslocamento de faixa hiper-ramificada, amplificação de deslocamento múltiplo (MDA), ampli- ficação baseada em faixa de ácido nucleico (NASBA), amplificações multiplexadas em duas etapas, amplificação por círculo rolante (RCA), amplificação de polimerase de recombinase (RPA) (TwistDx, Cam- bridg, UK) e replicação de sequência autossustentada (3SR ), incluin- do versões multiplex ou combinações dos mesmos, por exemplo, mas não limitado a, OLA/PCR, PCR/OLA, LDR/PCR, PCR/PCR/LDR, PCR/LDR, LCR/PCR, PCR/LCR (também conhecido como combinado reação em cadeia-CCR) e semelhantes. As descrições de tais técnicas podem ser encontradas, entre outros lugares, em Sambrook et al. Mo- lecular Cloning, 3rd Edition).X

[0048] Como geralmente usado neste pedido de patente, "farma- ceuticamente aceitável" se refere aos compostos, materiais, composi- ções e/ou formas de dosagem que são, dentro do escopo do bom jul- gamento médico, adequados para uso em contato com os tecidos, ór- gãos e/ou fluidos corporais de seres humanos e animais sem toxicida- de excessiva, irritação, resposta alérgica ou outros problemas ou com- plicações proporcionais a uma relação risco/benefício razoável.

[0049] "Sais farmaceuticamente aceitáveis" significa sais de com- postos da presente invenção que são farmaceuticamente aceitáveis, conforme definido acima, e que possuem a atividade farmacológica desejada. Exemplos não limitativos de tais sais incluem sais de adição de ácido formados com ácidos inorgânicos, tais como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico e ácido fosfórico; ou com ácidos orgânicos, tais como ácido 1,2 etanodissulfônico, ácido 2 hidroxietanossulfônico, ácido 2 naftalenossulfônico, ácido 3 fenilpro- piônico, 4,4 ' metilenebis (ácido 3 hidróxi 2 eno-1 carboxílico), ácido 4- metilbiciclo-[2.2.2]-oct-2-eno-1carboxílico, ácido acético, ácidos mono- e dicarboxílicos alifáticos, ácidos sulfúricos alifáticos, ácidos sulfúricos aromáticos, ácido benzenossulfônico, ácido benzoico, ácido canforsul-

fônico, ácido carbônico, ácido cinâmico, ácido cítrico, ácido ciclopenta- nopropiônico, ácido etanossulfônico, ácido fumárico, ácido glucohep- tônico, ácido glucônico, ácido glutâmico, ácido glicólico, ácido hepta- noico, ácido hexanoico, ácido hidroxinaftoico, ácido lático, ácido lau- rilsulfárico, ácido maleico, ácido málico, ácido malônico, ácido mandé- lico, ácido metanossulfônico, ácido mucônico, ácido (4-hidroxibenzoil)- benzoico, ácido oxálico, ácido p clorobenzenossulfônico, ácidos alca- noicos substituídos por fenila, ácido propiônico, ácido p-toluenossul- fônico, ácido pirúvico, ácido salicílico, ácido esteárico, ácido succínico, ácido tartárico, ácido butilaceto terciário e ácido trimetilacético. Os sais farmaceuticamente aceitáveis também incluem sais de adição de base que podem ser formados quando os prótons ácidos presentes são capazes de reagir com bases inorgânicas ou orgânicas. As bases inorgânicas aceitáveis incluem hidróxido de sódio, carbonato de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de alumínio e hidróxido de cálcio. Exemplos não limitativos de bases orgânicas aceitáveis incluem etano- lamina, dietanolamina, trietanolamina, trometamina e N metilglucami- na. Deve ser reconhecido que o ânion ou cátion particular que forma uma parte de qualquer sal desta invenção não é crítico, desde que o sal, como um todo, seja farmacologicamente aceitável. Exemplos adi- cionais de sais farmaceuticamente aceitáveis e seus métodos de pre- paração e uso são apresentados em Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, and Use (P. H. Stahl & C. G. Wermuth eds., Verlag Helvetica Chimica Acta, 2002).

Il. Mutações do HER2 Exon 19.

[0050] Detrminadas modalidades da presente divulgação dizem respeito a determinar se um indivíduo tem uma ou mais mutações do exon 19 de HER2, tais como mutações pontuais, particularmente uma ou mais mutações conforme representado na FIG. 2. O indivíduo pode ter 2, 3, 4 ou mais mutações do exon 19 de HER2. Os métodos de de-

tecção de mutações são conhecidos na técnica, incluindo análises de PCR e sequenciamento de ácido nucleico, bem como FISH e CGH. Em aspectos particulares, as mutações do exon 19 são detectadas por sequenciamento de DNA, como de um tumor ou DNA livre circulante de plasma.

[0051] A(s) mutação(ões) do exon 19 de HER2 podem compreen- der uma ou mais mutações pontuais, inserções e/ou deleções de 1 até 18 nucleotídeos entre os aminoácidos 668 e 769. As uma ou mais mu- tações do exon 19 de HER2 podem estar localizadas em um ou mais resíduos selecionados a partir do grupo que consiste em R668, R678, V754, L755, 1767 e D769. Mutações do exon 19 de HER2 podem inclu- ir R6868Q, R678Q, V754M, L755P, L7558S, L755W, D769H, D769N, I767M e/ou D769Y.

[0052] A amostra do paciente pode ser qualquer tecido corporal ou fluido que inclua ácidos nucleicos do câncer de pulmão no indivíduo. Em determinadas modalidades, a amostra será uma amostra de san- gue compreendendo células tumorais circulantes ou DNA livre de célu- las. Em outras modalidades, a amostra pode ser um tecido, como um tecido pulmonar. O tecido pulmonar pode ser de um tecido tumoral e pode ser congelado fresco ou fixado em formalina e embebido em pa- rafina (FFPE). Em determinadas modalidades, é obtida uma amostra de tumor de pulmão FFPE.

[0053] As amostras que são adequadas para serem usadas nos métodos descritos aqui neste pedido de patente contêm material gené- tico, por exemplo, DNA genômico (gDNA). O DNA genômico é tipica- mente extraído de amostras biológicas, como sangue ou raspagem da mucosa do revestimento da boca, mas pode ser extraído de outras amostras biológicas, incluindo urina, tumor ou expectorante. A própria amostra incluirá tipicamente células nucleadas (por exemplo, sangue ou células bucais) ou tecido removido do indivíduo, incluindo tecido normal ou tumoral. Métodos e reagentes são conhecidos na técnica para obter, processar e analisar amostras. Em algumas modalidades, a amostra é obtida com a ajuda de um provedor de cuidados de saú- de, por exemplo, para coletar sangue. Em algumas modalidades, a amostra é obtida sem a ajuda de um provedor de cuidados de saúde, por exemplo, onde a amostra é obtida de forma não invasiva, como uma amostra compreendendo células bucais que é obtida usando um esfregaço ou escova bucal, ou uma amostra de enxaguatório bucal.

[0054] Em alguns casos, uma amostra biológica pode ser proces- sada para isolamento de DNA. Por exemplo, o DNA em uma amostra de célula ou tecido pode ser separado de outros componentes da amostra. As células podem ser colhidas de uma amostra biológica usando técnicas padrão conhecidas na técnica. Por exemplo, as célu- las podem ser colhidas centrifugando uma amostra de células e res- suspendendo as células peletizadas. As células podem ser ressuspen- sas em uma solução tamponada, como solução salina tamponada com fosfato (PBS). Depois de centrifugar a suspensão de células para obter um sedimento de células, as células podem ser lisadas para extrair o DNA, por exemplo, gDNA. Ver, por exemplo, Ausubel et al. (2003). A amostra pode ser concentrada e/ou purificada para isolar DNA. Todas as amostras obtidas de um indivíduo, incluindo aquelas submetidas a qualquer tipo de processamento posterior, são consideradas como ob- tidas do indivíduo. Métodos de rotina podem ser usados para extrair DNA genômico de uma amostra biológica, incluindo, por exemplo, ex- tração de fenol. Alternativamente, o DNA genômico pode ser extraído com kits como o QIAampã& Tissue Kit (Qiagen, Chatsworth, Califórnia) e o kit de purificação Wizard& Genomic DNA (Promega). Exemplos não limitativos de fontes de amostras incluem urina, sangue e tecido.

[0055] A presença ou a ausência de mutações do exon 19 de HER2, tal como uma mutação pontual do exon 19, conforme descrito aqui neste pedido de patente, pode ser determinada com utilização métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, eletroforese em gel, ele- troforese capilar, cromatografia de exclusão de tamanho, sequencia- mento e/ou matrizes podem ser usados para detectar a presença ou a ausência de mutações. A amplificação de ácidos nucleicos, quando desejável, pode ser realizada com a utilização de métodos conhecidos na técnica, por exemplo, PCR. Em um exemplo, uma amostra (por exemplo, uma amostra que compreenda DNA genômico), é obtida de um indivíduo. O DNA na amostra é então examinado para determinar a identidade de uma mutação como descrita aqui, neste pedido de pa- tente. Uma mutação pode ser detectada através de qualquer método descrito aqui, neste pedido de patente, por exemplo, por sequencia- mento ou por hibridização do gene no DNA genômico, RNA ou cDNA para uma sonda de ácido nucleico, por exemplo, uma sonda de DNA (que inclui sondas de cDNA e oligonucleotídeos) ou uma sonda de RNA. A sonda de ácido nucleico pode ser projetada para hibridizar es- pecífica ou de preferência com uma variante particular.

[0056] Um conjunto de sondas normalmente refere-se a um con- junto de iniciadores, geralmente pares de iniciadores e/ou sondas marcadas de forma detectável que são usadas para detectar as varia- ções genéticas alvo (por exemplo, mutações do exon 19 de HER2) usadas nas recomendações de tratamento acionáveis da presente di- vulgação. Os pares de iniciadores são usados em uma reação de am- plificação para definir um amplicon que abrange uma região para uma variação genética alvo para cada um dos genes acima mencionados. O conjunto de amplicons é detectado por um conjunto de sondas cor- respondentes. Em uma modalidade exemplar, os presentes métodos podem usar ensaios TaqMan "“ (Roche Molecular Systems, Pleasan- ton, Calif.) que são usados para detectar um conjunto de variações genéticas alvo, como mutações do exon 19 de HER2. Em uma moda-

lidade, o conjunto de sondas é um conjunto de iniciadores usados para gerar amplicons que são detectados através de uma reação de se- quenciamento de ácido nucleico, como uma reação de sequenciamen- to de próxima geração. Nestas modalidades, por exemplo, a tecnologia AmpliSEQ *“ (Life Technologies/ lon Torrent, Carlsbad, Calif.) Ou Tru- SEQ 7" (Illumina, San Diego, Calif.) pode ser empregada.

[0057] A análise de marcadores de ácido nucleico pode ser reali- zada usando técnicas conhecidas na técnica incluindo, sem limitação, análise de sequência e análise eletroforética. Exemplos não limitativos de análise de sequência incluem sequenciamento de Maxam-Gilbert, sequenciamento de Sanger, sequenciamento de DNA de matriz capi- lar, sequenciamento de ciclo térmico (Sears et al., 1992), sequencia- mento de fase sólida (Zimmerman et al., 1992), sequenciamento com espectrometria de massa tais como espectrometria de massa de tem- po de voo de dessorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI- TOF/MS; Fu et al., 1998) e sequenciamento por hibridização (Chee et al., 1996; Drmanac et al., 1993; Drmanac et al., 1998). Exemplos não limitativos de análise eletroforética incluem eletroforese em gel de pla- ca, como agarose ou eletroforese em gel de poliacrilamida, eletrofore- se capilar e eletroforese em gel de gradiente desnaturante. Além dis- so, os métodos de sequenciamento de próxima geração podem ser executados usando kits e instrumentos comercialmente disponíveis de empresas como a Life Technologies/ lon Torrent PGM ou Proton, a Illumina HISEQ ou MISEQ e o sistema de sequenciamento de próxima geração Roche/454.

[0058] Outros métodos de análise de ácido nucleico podem incluir sequenciação manual direta (Church e Gilbert, 1988; Sanger et al. 1977; Patente U.S. No. 5.288.644); sequenciamento fluorescente au- tomatizado; ensaios de polimorfismo de conformação de fita simples (SSCP) (Schafer et al., 1995); eletroforese em gel desnaturante clam-

peado (CDGE); eletroforese em gel bidimensional (2DGE ou TDGE); eletroforese em gel sensível à conformação (CSGE); eletroforese em gel de gradiente desnaturante (DGGE) (Sheffield et al., 1989); croma- tografia líquida desnaturante de alto desempenho (DHPLC, Underhill et al., 1997); espectrometria de massa de dessorção/ionização de laser as- sistida por matriz de infravermelho (IR-MALDI) (WO 99/57318); análise de deslocamento de mobilidade (Orita et al., 1989); análise de enzimas de restrição (Flavell et al., 1978; Geever et al., 1981); PCR quantitativo em tempo real (Raca et al., 2004); análise heteroduplex; clivagem de incompatibilidade química (CMC) (Cotton et al., 1985); Ensaios de pro- teção de RNase (Myers et al., 1985); uso de polipeptídeos que reco- nhecem incompatibilidades de nucleotídeos, por exemplo, proteína mutS de E. coli; POR alelo-específico e combinações de tais métodos. Ver, por exemplo, Publicação de Patente U.S. No. 2004/0014095, que é aqui incorporada neste pedido de patente por referência na sua tota- lidade.

[0059] Em um exemplo, um método de identificação de uma muta- ção HER2 em uma amostra compreende o contato de um ácido nu- cleico da referida amostra com uma sonda de ácido nucleico que é ca- paz de hibridizar especificamente para o ácido nucleico que codifica uma proteína HER2 mutada, ou fragmento desta incorporando muta- ção e detecção da referida hibridação. Em uma modalidade específica, a referida sonda é marcada de forma detectável, como com um radioi- sótopo (?H, 32P ou 3%P), um agente fluorescente (rodamina ou fluores- ceína) ou um agente cromogênico. Em uma modalidade específica, a sonda é um oligômero anti-sentido, por exemplo PNA, morfolino- fosforamidatos, LNA ou 2'-alcoxialcóxi. A sonda pode ser de cerca de 8 nucleotídeos a cerca de 100 nucleotídeos, ou cerca de 10 a cerca de 75, ou cerca de 15 a cerca de 50, ou cerca de 20 a cerca de 30. Em outro aspecto, as referidas sondas da presente divulgação são forne-

cidas em um kit para identificar mutações de HER2 em uma amostra, o referido kit compreendendo um oligonucleotídeo que hibridiza espe- cificamente ou adjacente a um local de mutação no gene HER?2. O kit pode ainda compreender instruções para o tratamento de pacientes com tumores que contêm mutações do exon 19 de HER2 com pozioti- nib com base no resultado de um teste de hibridização usando o kit.

[0060] Em outro aspecto, um método para detectar uma mutação do exon 19 de HER2 em uma amostra compreende a amplificação dos ácidos nucleicos da amostra correspondentes ao exon 19 do referido gene ou HER2, ou um fragmento do mesmo suspeito de conter uma mutação, e comparar a mobilidade do ácido nucleico amplificado com relação à mobilidade eletroforética do gene HER2 de tipo selvagem correspondente ou fragmento do mesmo. Uma diferença na mobilida- de indica a presença de uma mutação na sequência de ácido nucleico amplificada. A mobilidade eletroforética pode ser determinada em gel de poliacrilamida.

[0061] Alternativamente, os ácidos nucleicos podem ser analisa- dos para a detecção de mutações usando Enzymatic Mutation Detec- tion (EMD) (Del Tito et al., 1998). A EMD usa a endonuclease VII do bacteriófago resolvase Tº, que faz a varredura ao longo do DNA de fita dupla até detectar e clivar distorções estruturais causadas por incom- patibilidades de pares de bases resultantes de mutações pontuais, in- serções e deleções. A detecção de dois fragmentos curtos formados por clivagem por resolvase, por exemplo por eletroforese em gel, indi- ca a presença de uma mutação. Os benefícios do método EMD são um único protocolo para identificar mutações pontuais, deleções e in- serções testadas diretamente de reações de PCR, eliminando a ne- cessidade de purificação da amostra, encurtando o tempo de hibridi- zação e aumentando a razão sinal-ruído. Amostras mistas contendo até um excesso de 20 vezes de DNA normal e fragmentos de até 4 kb de tamanho podem ser testadas. No entanto, a varredura de EMD não identifica mudanças de base específicas que ocorrem em amostras de mutação positiva que requerem procedimentos de sequenciamento adicionais para a identidade da mutação, se necessário. A enzima CEL | pode ser usada de forma semelhante à endonuclease VII de re- solvase T4, conforme demonstrado na Patente U.S. No. 5.869.245. Ill. Métodos de Tratamento

[0062] São providos ainda métodos para tratar ou retardar a pro- gressão do câncer em um indivíduo, que compreendem a administra- ção ao indivíduo de uma quantidade eficaz de poziotinib ou um inibidor estruturalmente semelhante, a um indivíduo determinado por ter uma mutação do exon 19 de HER2, tal como uma mutação de exon de 19 pontos. O indivíduo pode ter mais de uma mutação do exon 19 HER.

[0063] Os exemplos de cânceres contemplados para tratamento incluem câncer de pulmão, câncer de cabeça e pescoço, câncer de mama, câncer de pâncreas, câncer de próstata, câncer renal, câncer ósseo, câncer testicular, câncer cervical, câncer gastrointestinal, linfo- mas, lesões pré-neoplásicas no pulmão, câncer de cólon, melanoma e câncer de bexiga. Em aspectos específicos, o câncer é câncer de pul- mão de células não pequenas.

[0064] Em algumas modalidades, o indivíduo é um mamífero, por exemplo, um primata, de preferência um primata superior, por exem- plo, um ser humano (por exemplo, um paciente com, ou em risco de ter, um distúrbio aqui descrito). Em uma modalidade, o indivíduo preci- sa aumentar uma resposta imune. Em determinadas modalidades, o indivíduo é, ou corre risco de ser, imuno comprometido. Por exemplo, o indivíduo está sendo ou foi submetido a um tratamento quimioterápi- co e/ou radioterapia. Alternativamente, ou em combinação, o indivíduo é, ou está em risco de ser, imuno comprometido como resultado de uma infecção.

[0065] Determinadas modalidades dizem respeito à administração de poziotinib (também conhecido como HM781-36B, HM781-36, e 1- [4-[4-(3,4-dicloro-2-fluoroanilino)-7-metoxiquinazolin-6-il] oxipiperidin-1- il] prop-2-en-1-ona) a um indivíduo determinado a ter mutações do exon 19 de HER2, como uma mutação pontual do exon 19. Poziotinib é um inibidor de pan-HER à base de quinazolina que bloqueia irrever- sivelmente a sinalização por meio da família HER de receptores de tirosina-quinase, incluindo HER1, HER2 e HERA4. Poziotinib ou com- postos estruturalmente semelhantes (por exemplo, Patente U.S. No.

8.188.102 e Publicação de Patente U.S. No. 20130071452; incorpora- do aqui, neste pedido de patente por referência) podem ser usados nos presentes métodos. A . Composições Farmacêuticas.

[0066] Também são fornecidas aqui, neste pedido de patente, composições e formulações farmacêuticas que compreendem pozioti- nib e um veículo farmaceuticamente aceitável para indivíduos determi- nados a ter uma mutação do exon 19 de HER2, como uma mutação pontual do exon 19.

[0067] As composições e formulações farmacêuticas como descri- tas aqui, neste pedido de patente podem ser preparadas misturando os ingredientes ativos (como um anticorpo ou um polipeptídeo) com o grau de pureza desejado com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis opcionais (Remington's Pharmaceutical Sciences 22º edi- ção, 2012) , na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis são geralmente não tóxicos para os destinatários nas dosagens e concentrações empregadas e incluem, mas não estão limitados a: tampões, tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzila- mônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio; cloreto de benzetônio; fenol, butil ou álcool benzílico; alquilparabenos, tais como metil ou propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipéptidos de baixo peso molecular (menos de cerca de resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imuno- globulinas; polímeros hidrofílicos como polivinil pirrolidona; aminoáci- dos, tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou li- sina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes de quelação como EDTA; açú- cares como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-íons forma- dores de sal, tais como sódio; complexos de metal (por exemplo, com- plexos de Zn-proteína); e/ou surfatantes não iônicos, tais como polieti- lenoglicol (PEG). Os veículos farmaceuticamente aceitáveis exempla- res aqui neste pedido de patente incluem ainda agentes de dispersão de fármacos instersticiais, tais como glicoproteínas de hialuronidase neutra-ativa solúvel (SHASEGP), por exemplo, glicoproteínas de hialu- ronidase PH-20 solúveis humanas, como rHuPH20 (HYLENEXGO, Bax- ter International, Inc.). Certos exemplos de sSHASEGPs e métodos de uso, incluindo rHuPH20, são descritos nas Publicações de Patentes dos Estados Unidos Nos. 2005/0260186 e 2006/0104968. Em um as- pecto, um sSHASEGP é combinado com uma ou mais glicosaminogli- canases adicionais, como condroitinases. B. Terapias de Combinação

[0068] Em determinadas modalidades, as composições e méto- dos das presentes modalidades envolvem poziotinib em combinação com pelo menos uma terapia adicional. A terapia adicional pode ser radioterapia, cirurgia (por exemplo, lumpectomia e mastectomia), qui- mioterapia, terapia genética, terapia de DNA, terapia viral, terapia de RNA, imunoterapia, transplante de medula óssea, nanoterapia, terapia de anticorpo monoclonal ou uma combinação das anteriores. A terapia adicional pode ser na forma de terapia adjuvante ou neoadjuvante.

[0069] Em algumas modalidades, a terapia adicional é a adminis- tração de um inibidor enzimático de molécula pequena ou agente an- timetastático. Em algumas modalidades, a terapia adicional é a admi- nistração de agentes limitantes de efeitos colaterais (por exemplo, agentes destinados a diminuir a ocorrência e/ou a gravidade dos efei- tos colaterais do tratamento, tais como agentes anti-náusea, etc.). Em algumas modalidades, a terapia adicional é a radioterapia. Em algu- mas modalidades, a terapia adicional é a cirurgia. Em algumas moda- lidades, a terapia adicional é uma combinação de radioterapia e cirur- gia. Em algumas modalidades, a terapia adicional é a irradiação gama. Em algumas modalidades, a terapia adicional é terapia direcionada à via PBK/AKT/mMTOR, inibidor de HSP90, inibidor de tubulina, inibidor de apoptose e/ou agente químico preventivo. A terapia adicional pode ser um ou mais dos agentes quimioterapêuticos conhecidos na técni- ca.

[0070] O poziotinib pode ser administrado antes, durante, após ou em várias combinações com relação a uma terapia de câncer adicio- nal, como a terapia de ponto de controle imunológico. As administra- ções podem ser em intervalos que variam de simultaneamente a minu- tos a dias a semanas. Em modalidades em que o poziotinib é forneci- do a um paciente separadamente de um agente terapêutico adicional, geralmente é garantido que um período de tempo significativo não ex- pire entre o tempo de cada entrega, de modo que os dois compostos ainda sejam capazes de exercer um efeito vantajoso efeito combinado no paciente. Em tais casos, é contemplado que se pode fornecer a um paciente a terapia de anticorpos e a terapia anticâncer dentro de cerca de 12 a 24 ou 72 h uma da outra e, mais particularmente, dentro de cerca de 6 a 12 h uma da outra. Em algumas situações, pode ser de- sejável estender o período de tempo para o tratamento significativa- mente, onde vários dias (2, 3, 4, 5, 6 ou 7) a várias semanas (1, 2,3,

4, 5, 6, 7, ou 8) lapso entre as respectivas administrações.

[0071] Várias combinações podem ser empregadas. Para o exem- plo abaixo, o poziotinib é "A" e uma terapia anticâncer é "B": A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A/B/A/A A/A/B/A

[0072] A administração de qualquer composto ou terapia das pre- sentes modalidades a um paciente seguirá os protocolos gerais para a administração de tais compostos, levando em consideração a toxicida- de, se houver, dos agentes. Portanto, em algumas modalidades, há uma etapa de monitoramento da toxicidade que é atribuível à terapia de combinação.

1. Quimioterapia

[0073] Uma ampla variedade de agentes quimioterápicos pode ser usada de acordo com as presentes modalidades. O termo "quimiotera- pia" refere-se ao uso de fármacos para tratar o câncer. Um "agente quimioterápico" é usado para conotar um composto ou composição que é administrado no tratamento do câncer. Esses agentes ou fárma- cos são categorizados por seu modo de atividade dentro de uma célu- la, por exemplo, se e em que estágio eles afetam o ciclo de células.

Alternativamente, um agente pode ser caracterizado com base na sua capacidade de reticular DNA diretamente, intercalar em DNA ou indu- zir aberrações cromossômicas e mitóticas afetando a síntese de ácido nucleico.

[0074] Os exemplos de agentes quimioterápicos incluem agentes alquilantes, tais como tiotepa e ciclosfosfamida; sulfonatos de alquila, tais como busulfan, improsulfan e piposulfan; aziridinas, tais como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etileniminas e meti- lamelaminas, incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosfo- ramida, trietilenotiofosforamida e trimetilolomelamina; acetogeninas

(especialmente bullatacin e bullatacinone); uma camptotecina (incluin- do o análogo sintético topotecano); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluindo seus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina e bizele- sina); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8); do- lastatina; duocarmicina (incluindo os análogos sintéticos, KW-2189 e CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; uma sarcodictina; espongista- tina; mostardas de nitrogênio, como clorambucila, clornafazina, colo- fosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, melfalano, novembiquina, fenesterina, prednimusti- na, trofosfamida e mostarda de uracila; nitrosureias, tais como carmus- tina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina e ranimnustina; antibióticos, tais como os antibióticos enedina (por exemplo, calichea- micina, especialmente calicheamicina gammall e calicheamicina ome- gal1); dinemicin, incluindo dinemicin A; bisfosfonatos, como clodrona- to; uma esperamicina; bem como cromóforo de neocarzinostatina e cromóforos antiobióticos de cromoproteína enedina relacionados, aclacinomisinas, actinomicina, autrarniciana, azasserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofinila, ccomomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-0x0-L-norleu- cina, doxorrubicina (incluindo morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino- doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina e deoxidoxorrubicina), epirrubi- cina, esorubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicina, Tais como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalarnicina, olivomicinas, peplo- micina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estrepto- nigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina e zorrubici- na; anti-metabólitos, como metotrexato e 5-fluorouracil (5-FU); análo- gos de ácido fólico, tais como denopterina, pteropterina e trimetrexato; análogos de purina, tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamipri- na e tioguanina; análogos de pirimidina, tais como ancitabina, azaciti- dina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina,

enocitabina e floxuridina; andrógenos, tais como calusterona, propio- nato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano e testolactona; an- ticadrenais, como mitotano e trilostano; reforçador de ácido fólico, co- mo ácido frolínico; aceglatona; glicosídeo aldofosfamida; ácido ami- nolevulínico; eniluracil; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcine; diaziquone; elformitina; acetato de eliptínio; uma epotilona; etoglucida; nitrato de gálio; hidroxiureia; lentinan; loni- dainina; maitansinoides, tais como maitansina e ansamitocinas; mito- guazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fename- to; pirarrubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2-etil-hidrazida; pro- carbazina; Complexo PSK polissacarídeo; razoxano; rizoxina; sizofi- ran; spirogermanium; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2', 2"-tricloro- trietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, ro- ridina A e anguidina); uretano; vindesine; dacarbazina; mannomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; taxoides, por exemplo, paclitaxel e docetaxel gemcita- bina; 6-tioguanina; mercaptopurina; complexos de coordenação de pla- tina, como cisplatina, oxaliplatina e carboplatina; vinblastina; platina; etoposido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; novantrona; teniposida; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xelo- da; ibandronato; irinotecano (por exemplo, CPT-11); inibidor de to- poisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides, como ácido retinoico; capecitabina; carboplatina, procarbazina, plicomicina, gemcitabien, navelbina, inibidores da proteína farnesil-tansferase, transplatina e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos anteriores.

2. Radioterapia

[0075] Outros fatores que causam danos ao DNA e têm sido usa- dos extensivamente incluem o que é comumente conhecido como rai- OS y, raios X e/ou o suprimento direcionado de radioisótopos para célu-

las tumorais. Outras formas de fatores de dano ao DNA também são contempladas, tais como micro-ondas, irradiação por feixe de prótons (Patentes U.S. 5.760.395 e 4.870.287) e irradiação UV. É mais prová- vel que todos esses fatores afetem uma ampla gama de danos ao DNA, aos precursores do DNA, à replicação e reparo do DNA e à mon- tagem e manutenção dos cromossomos. As faixas de dosagem para raios X variam de doses diárias de 50 a 200 roentgens por períodos prolongados de tempo (3 a 4 semanas), a doses únicas de 2.000 a

6.000 roentgens. As faixas de dosagem dos radioisótopos variam am- plamente e dependem da meia-vida do isótopo, da força e do tipo de radiação emitida e da captação pelas células neoplásicas.

3. Imunoterapia

[0076] O versado na técnica entenderá que imunoterapias adicio- nais podem ser usadas em combinação ou em conjunto com métodos das modalidades. No contexto do tratamento do câncer, os imunotera- pêuticos, geralmente, dependem do uso de células e moléculas efeto- ras do sistema imunológico para direcionar e destruir células cancero- sas. Rituximab (RITUXANO) é um exemplo. O efetor imune pode ser, por exemplo, um anticorpo específico para algum marcador na super- fície de uma célula tumoral. O anticorpo isolado pode servir como um efetor da terapia ou pode recrutar outras células para realmente afetar a morte de células. O anticorpo também pode ser conjugado a um fármaco ou toxina (quimioterapêutico, radionuclídeo, cadeia A de rici- na, toxina da cólera, toxina da tosse convulsa, etc.) e servir como um agente de direcionamento. Alternativamente, o efetor pode ser um lin- fócito carregando uma molécula de superfície que interage, direta ou indiretamente, com uma célula tumoral alvo. Várias células efetoras incluem células T citotóxicas e células NK.

[0077] Os conjugados anticorpo-fármaco surgiram como uma abordagem inovadora para o desenvolvimento de terapêuticas do cân-

cer. O câncer é uma das principais causas de morte no mundo. Conju- gados anticorpo-fármaco (ADCs) compreendem anticorpos monoclio- nais (MAbs) que estão covalentemente ligados a fármacos que matam células. Esta abordagem combina a alta especificidade dos MAbs con- tra seus alvos de antígeno com fármacos citotóxicos altamente poten- tes, resultando em MAbs "armados" que entregam a carga útil (fárma- co) às células tumorais com níveis enriquecidos do antígeno. A distri- buição direcionada do fármaco também minimiza sua exposição em tecidos normais, resultando em diminuição da toxicidade e melhora do Índice terapêutico. A aprovação de dois medicamentos ADC, ADCE- TRISO (brentuximabe vedotin) em 2011 e KADCYLAG (trastuzumabe emtansina ou T-DM1) em 2013 pelo FDA validou a abordagem. Atual- mente, existem mais de 30 candidatos a medicamentos ADC em vá- rios estágios de ensaios clínicos para tratamento de câncer (Leal et al., 2014). Conforme a engenharia de anticorpos e a otimização da carga útil do ligante estão se tornando mais e mais maduras, a descoberta e o desenvolvimento de novos ADCs estão cada vez mais dependentes da identificação e validação de novos alvos que sejam adequados pa- ra esta abordagem e a geração de MAbs de direcionamento. Dois cri- térios para alvos de ADC são níveis elevados/regulados de expressão em células tumorais e internalização robusta.

[0078] Em um aspecto da imunoterapia, a célula do tumor deve conter algum marcador que seja passível de direcionamento, ou seja, não esteja presente na maioria das outras células. Existem muitos marcadores tumorais e qualquer um deles pode ser adequado para direcionamento no contexto das presentes modalidades. Os marcado- res tumorais comuns incluem CD20, antígeno carcinoembrionário, tiro- sinase (p97), gp68, TAG-72, HMFG, Antígeno Sialyl Lewis, MucA, MucB, PLAP, receptor de laminina, erb B e p155. Um aspecto alterna- tivo da imunoterapia é combinar os efeitos anticâncer com os efeitos estimuladores imunológicos. Moléculas de estimulação imunológica também existem, incluindo: citocinas, como IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, gama-lIFN, quimiocinas, como MIP-1, MCP-1, IL-8 e fatores de cresci- mento, como o ligante FLT3.

[0079] Os exemplos de imunoterapias incluem adjuvantes imuno- lógicos, por exemplo, Mycobacterium bovis, Plasmodium falciparum, dinitroclorobenzeno e compostos aromáticos (Patentes U.S. 5.801.005 e 5.739.169; Hui e Hashimoto, 1998; Christodoulides et al., 1998); te- rapia com citocinas, por exemplo, interferons a, B e y, IL-1, GM-CSF e TNF (Bukowski et al., 1998; Davidson et al., 1998; Hellstrand et al., 1998); terapia génica, por exemplo, TNF, IL-1, IL-2 e p53 (Qin et al. 1998; Austin-Ward e Villaseca, 1998; Patentes U.S. 5.830.880 e

5.846.945); e anticorpos monoclonais, por exemplo, anti-CD20, anti- gangliósido GM2 e anti-p185 (Hollander, 2012; Hanibuchi et al., 1998; Patente U.S. 5.824.311). É contemplado que uma ou mais terapias anticâncer podem ser empregadas com as terapias de anticorpos des- critas aqui, neste pedido de patente.

[0080] Em algumas modalidades, a imunoterapia pode ser um ini- bidor do ponto de controle imunológico. Os pontos de verificação imu- nológicos aumentam um sinal (por exemplo, moléculas coestimulató- rias) ou diminuem um sinal. Os pontos de controle imunológicos inibi- tórios que podem ser direcionados pelo bloqueio do ponto de controle imunológico incluem o receptor A2A de adenosina (A2AR), B7-H3 (também conhecido como CD276), atenuador de linfócitos B e T (BTLA), proteína 4 associada a linfócitos T citotóxicos (CTLA-4, tam- bém conhecido como CD152), indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO), imunoglobulina de células assassinas (KIR), gene de ativação de linfó- citos-3 (LAG3), morte programada 1 (PD-1), domínio de imunoglobuli- na de células T e mucina domínio 3 (TIM-3) e supressor de lg de do- mínio V de ativação de células T (VISTA). Em particular, os inibidores do ponto de verificação imunológico têm como alvo o eixo PD-1 e/ou CTLA-4.

[0081] Os inibidores do ponto de verificação imunológico podem ser fármacos, como pequenas moléculas, formas recombinantes de ligantes ou receptores, ou, de modo específico, são anticorpos, como anticorpos humanos (por exemplo, Publicação de Patente Internacio- nal WO2015016718; Pardoll, Nat Rev Cancer, 12 ( 4): 252-64, 2012; ambos incorporados aqui, neste pedido de patente por referência). Podem ser usados inibidores conhecidos das proteínas de ponto de verificação imunológico ou seus análogos, em particular podem ser usadas formas quimerizadas, humanizadas ou humanas de anticor- pos. Como o versado na técnica saberá, nomes alternativos e/ou equi- valentes podem estar em uso para certos anticorpos mencionados na presente divulgação. Esses nomes alternativos e/ou equivalentes são intercambiáveis no contexto da presente invenção. Por exemplo, sabe- se que o lambrolizumab também é conhecido pelos nomes alternativos e equivalentes MK-3475 e pembrolizumab.

[0082] Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao PD- 1 é uma molécula que inibe a ligação do PD-1 aos seus parceiros de ligação com o ligante. Em um aspecto específico, os parceiros de liga- ção com o ligante PD-1 são PDL1 e/ou PDL2. Em outra modalidade, um antagonista de ligação ao PDL1 é uma molécula que inibe a liga- ção do PDL1 aos seus parceiros de ligação. Em um aspecto especiífi- Co, os parceiros de ligação a PDL1 são PD-1 e/ou B7-1. Em outra mo- dalidade, o antagonista de ligação ao PDL2 é uma molécula que inibe a ligação do PDL2 aos seus parceiros de ligação. Em um aspecto es- pecífico, um parceiro de ligação a PDL2 é PD-1. O antagonista pode ser um anticorpo, um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, uma imunoadesina, uma proteína de fusão ou um oligopeptídeo. Anti- corpos exemplares são descritos nas Patentes U.S. Nos. 8.735.553,

8.354.509 e 8.008.449, todas incorporadas aqui, neste pedido de paten- te, por referência. Outros antagonistas do eixo PD-1 para uso nos méto- dos fornecidos neste pedido de patente são conhecidos na técnica, tal como descrito nas Publicações de Patentes US Nos. US20140294898, US2014022021 e US20110008369, todas incorporadas aqui, neste pedido de patente por referência.

[0083] Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao PD- 1 é um anticorpo anti-PD-1 (por exemplo, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico). Em algumas moda- lidades, o anticorpo anti-PD-1 é selecionado do grupo que consiste em nivolumab, pembrolizumab e CT-011. Em algumas modalidades, o an- tagonista de ligação a PD-1 é uma imunoadesina (por exemplo, uma imunoadesina que compreende uma porção de ligação extra de célu- las ou PD-1 de PDL1 ou PDL?2 fundida a uma região constante (por exemplo, uma região Fc de uma sequência de imunoglobulina). Em algumas modalidades, o antagonista de ligação a PD-1 é AMP- 224. Nivolumab, também conhecido como MDX-1106-04, MDX-1106, ONO- 4538, BMS-936558 e OPDIVOGO, é um anticorpo anti-PD-1 descrito em WO 2006/121168. Pembrolizumab, também conhecido como MK- 3475, Merck 3475, lambrolizumab, KEYTRUDAG e SCH-900475, é um anticorpo anti-PD-1 descrito em WOZ2009/114335. CT-011, também conhecido como hBAT ou hBAT -1, é um anticorpo anti-PD-1 descrito em WO 2009/101611. AMP-224, também conhecido como B7-DCIg, é um receptor solúvel de fusão PDL2-Fc descrito em WO 2010/027827 e WO 2011/066342.

[0084] Outro ponto de verificação imune que pode ser direcionado nos métodos fornecidos aqui neste pedido de patente é a proteína 4 associada a linfócitos T citotóxicos (CTLA-4), também conhecida como CD152. A sequência de cDNA completa de CTLA-4 humana tem o número de acesso no Genbank L15006. CTLA-4 é encontrado na su-

perfície das células T e atua como um interruptor "off" quando ligado ao CD80 ou CD86 na superfície das células apresentadoras de antí- geno. CTLA4 é um membro da superfamília das imunoglobulinas que se expressa na superfície das células T Helper e transmite um sinal inibitório às células T. CTLA4 é semelhante à proteína coestimuladora de células T, CD28, e ambas as moléculas se ligam a CD80 e CD86, também chamadas de B7-1 e B7-2 respectivamente, nas células apre- sentadoras de antígeno. CTLAA4 transmite um sinal inibitório para as células T, enquanto CD28 transmite um sinal estimulador. O CTLA4 intra de células também é encontrado nas células T reguladoras e po- de ser importante para sua função. A ativação de células T através do receptor de células T e CD28 leva ao aumento da expressão de CTLA- 4, um receptor inibitório para moléculas B7.

[0085] Em algumas modalidades, o inibidor do ponto de verifica- ção imunológico é um anticorpo anti-CTLA-4 (por exemplo, um anti- corpo humano, um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico), um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, uma imunoadesina, uma proteína de fusão ou oligopeptídeo.

[0086] Anticorpos anti-CTLA-4 humano (ou domínios VH e/ou VL derivados dos mesmos) adequados para uso nos presentes métodos podem ser gerados usando métodos bem conhecidos na técnica. Al- ternativamente, podem ser usados anticorpos anti-CTLA-4 reconheci- dos na arte. Por exemplo, os anticorpos anti-CTLA-4 divulgados em: Patente U.S. No. 8.119.129; Publicação de Patente Internacional Nos. WO 01/14424, WO 98/42752 e WO 00/37504 (CP675,206, também conhecido como tremelimumab; anteriormente ticilimumab); Patente U.S. No. 6.207.156; Hurwitz et al., 1998; Camacho et al., 2004; e Mokyr et al., 1998 podem ser usados nos métodos aqui divulgados. Os ensinamentos de cada uma das publicações acima mencionadas são aqui incorporados por referência. Os anticorpos que competem com qualquer um destes anticorpos reconhecidos na técnica para a ligação a CTLA-4 também podem ser usados. Por exemplo, um anticorpo CTLA-4 humanizado é descrito nos Pedidos de Patente Internacional Nos. WO 2001014424 e WO 2000037504, e na Patente U.S. No.

8.017.114; todos incorporados aqui, neste pedido de patente por refe- rência.

[0087] Um anticorpo anti-CTLA-4 exemplar é o ipilimumab (tam- bém conhecido como 10D1, MDX-010, MDX-101 e YervoyO) ou frag- mentos de ligação ao antígeno e variantes dos mesmos (ver, por exemplo, WO 01/14424). Em outras modalidades, o anticorpo compre- ende os CDRs ou VRs da cadeia pesada e leve do ipilimumab. Por conseguinte, em uma modalidade, o anticorpo compreende os domí- nios CDR1, CDR2 e CDR3 da região VH do ipilimumabe e os domínios CDR1, CDR2 e CDR3 da região VL do ipilimumabe. Em outra modali- dade, o anticorpo compete pela ligação com e/ou se liga ao mesmo epítopo em CTLA-4 que os anticorpos mencionados acima. Em outra modalidade, o anticorpo tem pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência de aminoácidos de região variável com os anticorpos mencionados acima (por exemplo, pelo menos cerca de 90%, 95% ou 99% de identidade de região variável com ipilimumabe).

[0088] Outras moléculas para modular CTLA-4 incluem ligandos e receptores de CTLA-4, tais como descritos nas Patentes U.S. Nos.

5.844.905, 5.885.796 e nos Pedidos de Patente Internacional Nos. WO 1995001994 e WO 1998042752; todas aqui neste pedido de patente por referência, e imunoadesinas, tais como descritas na Patente U.S. No. 8.329.867, incorporada aqui, neste pedido de patente por referên- cia.

4. Cirurgia

[0089] Aproximadamente 60% das pessoas com câncer serão submetidas a cirurgia de algum tipo, que inclui cirurgia preventiva, di-

agnóstica ou de estadiamento, curativa e paliativa. A cirurgia curativa inclui a ressecção na qual todo ou parte do tecido canceroso é fisica- mente removido, excisado e/ou destruído e pode ser usado em conjun- to com outras terapias, como o tratamento das presentes modalidades, quimioterapia, radioterapia, terapia hormonal, terapia genética, imuno- terapia e/ou terapias alternativas. A ressecção do tumor refere-se à remoção física de pelo menos parte de um tumor. Além da ressecção do tumor, o tratamento por cirurgia inclui cirurgia a laser, criocirurgia, eletrocirurgia e cirurgia microscopicamente controlada (cirurgia de Mohs).

[0090] Depois da excisão de parte ou de todas as células cancero- sas, tecido ou tumor, uma cavidade pode ser formada no corpo. O tra- tamento pode ser realizado por perfusão, injeção direta ou aplicação local da área com uma terapia anticâncer adicional. Tal tratamento po- de ser repetido, por exemplo, a cada 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dias, ou a ca- da 1,2,3,4 e 5 semanas ou a cada 1, 2, 3,4, 5,6,7,8,9,10,11 ou 12 meses. Esses tratamentos também podem ser de várias dosagens.

5. Outros Agentes

[0091] É contemplado que outros agentes podem ser usados em combinação com determinados aspectos das presentes modalidades para melhorar a eficácia terapêutica do tratamento. Estes agentes adi- cionais incluem agentes que afetam a regulação positiva de receptores de superfície de células e junções GAP, agentes citostáticos e de dife- renciação, inibidores de adesão de células, agentes que aumentam a sensibilidade das células hiperproliferativas a indutores apoptóticos ou outros agentes biológicos. Aumentos na sinalização inter de células pela elevação do número de junções GAP aumentariam os efeitos an- ti-hiperproliferativos na população de células hiperproliferativas vizi- nhas. Em outras modalidades, os agentes citostáticos ou de diferenci- ação podem ser usados em combinação com certos aspectos das pre-

sentes modalidades para melhorar a eficácia anti-hiperproliferativa dos tratamentos. Os inibidores da adesão de células são contemplados para melhorar a eficácia das presentes modalidades. Exemplos de ini- bidores da adesão de células são os inibidores da cinase de adesão focal (FAKs) e a Lovastatina. É ainda contemplado que outros agentes que aumentam a sensibilidade de uma célula hiperproliferativa à apop- tose, como o anticorpo c225, podem ser usados em combinação com certos aspectos das presentes modalidades para melhorar a eficácia do tratamento. IV. Kit

[0092] Também dentro do âmbito da presente divulgação estão kits para detectar mutações do exon 19 de HER2, tais como aquelas divulgadas neste documento. Um exemplo de tal kit pode incluir um conjunto de iniciadores específicos de mutação do exon 19. O kit pode ainda compreender instruções para o uso dos iniciadores para detectar a presença ou ausência das mutações específicas do exon 19 de HER?2 aqui descritas. O kit pode ainda compreender instruções para fins de diagnóstico, indicando que uma identificação positiva de muta- ções do exon 19 de HER?2 aqui descritas em uma amostra de um pa- ciente com câncer indica sensibilidade ao inibidor da tirosina quinase poziotinib ou um inibidor estruturalmente semelhante. O kit pode ainda compreender instruções que indicam que uma identificação positiva de mutações do exon 19 de HER2 aqui descritas em uma amostra de um paciente com câncer indica que um paciente deve ser tratado com po- ziotinib ou um inibidor estruturalmente semelhante. Exemplos

[0093] Os exemplos que se seguem são incluídos para demonstrar modalidades preferidas da invenção. Deve ser apreciado por aqueles versados na técnica que as técnicas divulgadas nos exemplos que se seguem representam técnicas descobertas pelo inventor para funcio-

nar bem na prática da invenção e, portanto, podem ser consideradas como constituindo modos preferidos para sua prática. No entanto, aqueles versados na técnica devem, à luz da presente divulgação, apreciar que muitas mudanças podem ser feitas nas modalidades es- pecíficas que são divulgadas e ainda obter um resultado semelhante ou semelhante sem se afastar do espírito e do âmbito da invenção. Exemplo 1 - Identificação de drogas para células cancerosas com mutações HER Exon 19.

[0094] Células Ba/F3 que expressam a mutação de ponto L755P do exon 19 foram geradas. As células foram testadas quanto à inde- pendência de IL-3 e testadas contra HER2 TKls incluindo lapatinibe, afatinib, EGF-816, ibrutinib e poziotinib, bem como o anticorpo HER2 trastuzumabe usando o ensaio Cell Titer Glo. Células Ba/ F3 que ex- pressam HER2 L755P cresceram independentemente de IL-3, indi- cando que HER2 L755P é uma mutação de ativação. Além disso, tras- tuzumabe, lapatinibe, EGF-816 e ibrutinib não inibiram a viabilidade de células das células Ba F3 que expressam a proteína HER2 L755P.

[0095] Embora o afatinib TKI de 2º geração tenha mostrado algu- ma atividade (valor de ICso = 13 nM), foi descoberto que o poziotinib inibiu significativamente o crescimento de células mutantes Ba/F3 HER2 L755P com um valor de IC5o de 3,0 nM. Além disso, várias ou- tras mutações do exon 19 de HER2, incluindo D769Y, D769N, D769H, L755S e R678Q, foram testadas quanto à sua sensibilidade a diferen- tes TKls, incluindo poziotinib. Foi verificado que o poziotinib inibiu o crescimento dessas células mutantes (FIG. 3).

[0096] A viabilidade de células de linhas de células Ba/F3 estáveis que expressam mutações do exon 19 de HER?2 cultivadas em condi- ções livres de IL-3 foi medida durante 14 dias. A viabilidade de células foi determinada a cada 3 dias pelo ensaio Cell Titer Glo (FIG. 4). FIG. 5A mostra um mapa de calor de valores log IC5o de células Ba/F3 ex-

pressando de forma estável as mutações indicadas após 72 horas de tratamento com fármacos. Os valores médios de ICs5o de células Ba/F3 que expressam L755S ou L755P com os inibidores indicados foram medidos (FIG. 5C). Foi observado que o tratamento com poziotinib apresentou os menores valores de ICso em comparação com os outros inibidores testados.

[0097] Em outras experiências, as células colorretais CW-2 foram tratadas com os diferentes inibidores em várias concentrações e pozio- tinib mostrou resultar na maior diminuição da viabilidade de células (FIG. 6A). Um estudo em camundongos foi realizado com camundon- gos inoculados com células CW-2 tratadas com poziotinib, afatinib ou neratinib. O crescimento do tumor diminuiu significativamente nos ca- mundongos tratados com poziotinib a 5 mg/kg (FIG. 6C). Assim, o po- ziotinib, bem como inibidores estruturalmente semelhantes, são inibi- dores potentes das mutações do exon 19 de HER2 e podem ser usa- dos como terapêutica para superar a resistência de novo aos medica- mentos. Exemplo 2 — Materiais e Métodos

[0098] Geração de linha de células e privação de IL-3: a linha de células Ba/F3 foi cultivada em meio RPMI-1640 completo (R8758; Sigma Life Science) suplementado com L-glutamina, 10% de FBS ina- tivado por calor (Gibco), 1% penicilina/estreptomicina (Sigma Life Sci- ence) e IL-3 de camundongo 10 ng/ml (sistemas R&D) em condições estéreis. Linhas de células estáveis foram geradas por transdução re- troviral da linha de células Ba/F3 durante 12 horas. Os retrovírus fo- ram gerados por transfecção de vetores baseados em pBabe-Puro na linha de células de empacotamento de ampho Phoenix 293T (Orbigen) usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). 72 horas depois da transdu- ção, 2 ug/ml de puromicina (Invitrogen) foi adicionado ao meio. Após 5 dias de seleção, as células foram coradas com FITC-HER2 (Biole-

gend) e classificadas via FACS. As linhas de células foram em seguida cultivadas na ausência de IL-3 durante 15 dias e a viabilidade de célu- las foi determinada a cada 3 dias usando o ensaio Cell Titer Glo (Pro- gema). As linhas de células estáveis resultantes foram mantidas em meio RPMI-1640 completo descrito acima sem IL-3. A identidade da linha de células foi confirmada por impressão digital de DNA por meio de repetições curtas em tandem usando o kit PowerPlex 1.2 (Prome- ga). Os resultados das impressões digitais foram comparados com as impressões digitais de referência mantidas pela fonte primária da linha de células. Todas as linhas de células estavam isentas de microplas- ma. Para gerar linhas de células HER2 L775P, as células foram trans- duzidas com c.2264T> C (criado a partir de Bioinnovatise de pBabe- puro HER WT de Addgene (tt 40978)). Tabela 1. Estatística com relação à ANOVA de dois sentidos Fase Tier da comparação múliva — — | Sumário TVelorp. Austado Bate õ5nssveuvs us o RE OC ,»»SÀS Veículo vs. Neraínb (30mgko) ns Poziotinb (Smg/kg) vs. Neratinib (30mg/kg) 0.0333 Poziotinib (mg/kg) vs. Neratinib (30mg/ko) ” <0.0001

ELLA LI Dia 15 Bi 3 O Veícuro vs. Poziotnb Eng] [3 Veículo vs. Afatinib (20mg/kg ns (Veículo. vs. Afatib (20mg/ka) Veículo vs Neratirib (G0mg/kg ns Fono Engate MABDUITIIE is gato Alctinio (20mg/g) vs. Neratinio (20mg/xg 0904 fifatni (20mglkg) vs. Neratinb (J0mg'kg, E 00002 Lo L0IbDoÔà3 SO [LA

BERE O OOSDDTDODOOOXXA Veículo vs. Poziounio (Sala) : Weículo. vs. Neratinib (30mg/kg) ns 07201 'Veículo vs Neratinb (30mg/kg sã 0.0029

[0099] Ensaio de viabilidade de células e estimativa de IC5so: À viabilidade de células foi determinada usando o ensaio Cell Titer Glo (Promega) como descrito anteriormente (Robichaux et al., 2018). Re- sumidamente, 2.000-3.000 células por cavidade foram semeadas em placas de 384 cavidades (Greiner Bio-One) em triplicado técnico. As células foram tratadas com sete concentrações diferentes de inibidores de tirosina quinase ou veículo isolado em um volume final de 40 ul por poço. Após 3 dias, 11 ul de Cell Titer Glo foram adicionados a cada cavidade. As placas foram agitadas durante 15 minutos e a biolumi- nescência foi determinada usando um leitor de microplacas multi-modo FLUOstar OPTIMA (BMG LABTECH). Os valores de bioluminescência foram normalizados com relação à células tratadas com DMSO e os valores normalizados foram plotados no GraphPad Prism usando ajus- te de regressão não linear para dados normalizados com uma inclina- ção variável. Os valores de ICs5so foram calculados por GraphPad Prism com 50% de inibição.

[00100] Inibidores de tirosina quinase e T-DM1: Todos os inibido- res foram adquiridos de Selleck Chemical com exceção de EGF816 e pirotinibe que foram adquiridos de MedChem Express. Todos os inibi- dores foram dissolvidos em DMSO a uma concentração de 10 mM e armazenados a -80ºC. Os inibidores foram limitados a dois congela- mento/descongelamento/ciclo antes de serem descartados. O T-DM1 foi adquirido reconstituído na farmácia institucional M.D. Anderson Cancer Center.

[00101] Linhas de células humanas: células MCF10A foram ad- quiridas da ATCC e foram cultivadas em meio DMEM/F12 suplemen- tado com 1% de penicilina/estreptomicina, 5% de soro de cavalo (sig- ma), 20ng/ml de EGF, 0,5 mg/ml de hidrocortisona e 10 ug /ml de insu- lina. Linhas de células estáveis foram criadas por transdução retroviral e retrovírus foram gerados por transfecção de vetores baseados em pBabe-Puro resumidos na Tabela 1 (Addgene e Bioinnovatise) em cé- lulas Phoenix 293T-ampho (Orbigen) usando Lipofectamine 2000 (Invi- trogen). Dois dias após a transdução, 0,5 ug/ml de puromicina (Invitro- gen) foi adicionado ao meio RPMI. Após 14 dias de seleção, as células foram testadas em ensaios de viabilidade celular conforme descrito acima. As células CW-2 foram fornecidas pelo banco de dados de li- nha de células Riken sob MTA e foram mantidas em RPMI contendo 10% de FBS e 1% de penicilina/estreptomicina.

[00102] Estudos de xenoenxerto in vivo: xenoenxertos de linha de células CW-2 foram criados pela injeção de 1x106 células em 50% de matrigel em camundongos nu fêmeas nu/nu de 6 semanas de ida- de. Quando os tumores atingiram 350 mm3, os camundongos foram randomizados em 4 grupos: 20 mg/kg de afatinib, 5 mg/kg de pozioti- nib, 30 mg/kg de neratinib ou controle de veículo (0,5% de metilcelulo- se, 2% de Tween-80 em dH20O). Os volumes do tumor foram medidos três vezes por semana. Os camundongos receberam a droga de se- gunda a sexta-feira (5 dias por semana), mas começaram a dosagem na quarta-feira, permitindo um feriado de 2 dias após os primeiros 3 dias de dosagem.

[00103] “Camundongos Y772dupYVMA PDX foram adquiridos de Jax Labs (Modelo % TMO1446). Fragmentos de tumores que expres- sam HER2 Y772dupYVMA foram inoculados em camundongos NSG fêmeas de 5 a 6 semanas de idade (Jax Labs ft 005557). Os camun- dongos foram medidos três vezes por semana, e quando os tumores atingiram um volume de 200 a 300 mm3, os camundongos foram ran- domizados em quatro grupos de tratamento: controle de veículo (0,5% metilcelulose, 0,05% Tween-80 em dH20O), 2,mg/kg de poziotinib, 10 mg/kg T-DM1, ou combinação de 2,mg/kg de poziotinib e 10 mg/kg de T-DM1. Os volumes tumorais e o peso corporal foram medidos três vezes por semana. Os camundongos tratados com 2,mg/kg de pozioti- nib receberam a droga por via oral de segunda a sexta-feira (5 dias por semana). Os camundongos tratados com 10 mg/kg de T-DM1 recebe- ram uma dose intravenosa (IV) de T-DM1 no dia da randomização. Os camundongos tratados com a combinação de poziotinib e T-DM1 re- ceberam uma dose |V de T-DM1 e iniciaram 2,mg/kg de poziotinib cin- co dias por semana, 3 dias após a dose de T-DM1. Os camundongos receberam um feriado de dosagem se o camundongo cair no peso corporal em mais de 10% ou se o peso corporal cair abaixo de 20 gramas. A sobrevida livre de progressão foi definida como a duplica- ção do tumor da melhor resposta para duas medições consecutivas. À regressão completa foi definida como uma redução superior a 95% na carga do tumor e, para camundongos com regressão completa, a du- plicação do tumor foi definida como superior a 75 mm3 por mais de duas medições consecutivas. Os experimentos foram concluídos de acordo com as Boas Práticas para Animais e com a aprovação do Comitê Institucional de Uso e Cuidado de Animais do MD Anderson Cancer Center (Houston, TX).

[00104] Todos os métodos divulgados e reivindicados neste docu- mento podem ser feitos e executados sem experimentação indevida à luz da presente divulgação. Embora as composições e métodos desta invenção tenham sido descritos em termos de modalidades de prefe- rência, se tornará evidente para aqueles versados na técnica que vari- ações podem ser aplicadas aos métodos e nas etapas ou na sequên- cia de etapas do método descrito aqui, sem se afastar do conceito, es- pírito e âmbito da invenção. Mais especificamente, será evidente que certos agentes que são química e fisiologicamente relacionados po- dem ser substituídos pelos agentes descritos neste documento, en- quanto os mesmos resultados ou resultados semelhantes seriam al- cançados. Todos esses substitutos e modificações semelhantes evi- dentes para os versados na técnica são considerados como estando dentro do espírito, âmbito e conceito da invenção conforme definido pelas reivindicações anexas.

REFERENCIAS As referências que se seguem, na medida em que forne- cem procedimentos exemplares ou outros detalhes complementares aos aqui estabelecidos, são especificamente incorporadas aqui, neste pedido de patente por referência. Arcila et al., Clin Cancer Res 18:4910-8, 2012.

Arcila et al., Mol Cancer Ther 12(2):220-229, 2013. Austin-Ward and Villaseca, Revista Medica de Chile, 126(7):838-845,

1998. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, 2003. Bukowski et al., Clinical Cancer Res., 4(10):2337-2347, 1998. Camacho et al. J Clin Oncology 22(145): Abstract No. 2505 (antibody CP-675206), 2004. Cha et al. Int J Cancer 130:2445-54, 2012. Chee et al., Science, 274:610-614, 1996. Cho et al., Cancer Res 73:6770-9, 2013. Christodoulides et al., Microbiology, 144(Pt 11):3027-3037, 1998. Church and Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1991-1995 (1988). Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4397-4401 (1985). Davidson et al., J. Inmunother., 21(5):389-398, 1998. Davies et al., Plos One 8, 2013. Del Tito et al., Clinical Chemistry 44:731-739, 1998. Drmanac et al., Nat. Biotechnol., 16:54-58, 1998. Drmanac et al., Science, 260:1649-1652, 1993. Flavell et al., Cell 15:25 (1978). Fu et al., Nat. Biotechnol., 16:381-384, 1998/ Geever et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5081 (1981). Hanibuchi et al., Int. J. Cancer, 78(4):480-485, 1998. Hellstrand et al., Acta Oncologica, 37(4):347-353, 1998. Hollander, Front. Immun., 3:3, 2012. Hong et al., J Biol Chem 282:19781-7, 2007. Hui and Hashimoto, /nfection Immun., 66(11):5329-5336, 1998. Hurwitz et al. Proc Natl Acad Sci USA 95(17): 10067-10071, 1998. International Patent Publication No. WO 99/57318 International Patent Publication No. WO1995001994

International Patent Publication No.

WO1998042752 International Patent Publication No.

WO2000037504 International Patent Publication No.

WO2001014424 International Patent Publication No.

WO2009/101611 International Patent Publication No.

WO2009/114335 International Patent Publication No.

WO2010/027827 International Patent Publication No.

WO2011/066342 International Patent Publication No.

WO2015016718 International Patent Publication No.WO 00/37504 International Patent Publication No.WO01/14424 International Patent Publication No.WO98/42752 Kosaka et al., Cancer Res 2017. Leal, M., Ann N Y Acad Sci 1321, 41-54, 2014. Lynch et al., N Engl J Med. 350(21):2129-2139, 2004. Maemondo et al/., N Engl J Med 362:2380-8, 2010. Mitsudomi and Yatabe, Cancer Sci. 98(12):1817-1824, 2007. Mokyr et al.

Cancer Res 58:5301-5304, 1998. Oxnard et al., J Thorac Oncol. 8(2):179-184, 2013. Paez et al., Science 304(5676):1497-1500, 2004. Pao et al., Proc Natl Acad Sci USA 101(36):13306-13311, 2004. Pardoll, Nat Rev Cancer, 12(4): 252-64, 2012. Perera et al., Proc Natl Acad Sci U S A 106:474-9, 2009. Qin et al., Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA, 95(24):14411-14416, 1998. Raca et al., Genet Test 8(4):387-94 (2004). Robichaux et al., Nature Medicine, 2018. Sanger et al., Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 74:5463-5467 (1977). Sears et al., Biotechniques, 13:626-633, 1992. Sheffield et al., Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 86:232-236 (1989). Shen et al., J Recept Signal Transduct Res 36:89-97, 2016. Thress et al., Nat Med 21:560-2, 2015.

U.S. Patent No. 4,870,287 U.S. Patent No. 5,288,644 U.S. Patent No. 5,739,169 U.S. Patent No. 5,760,395 U.S. Patent No. 5,801,005 U.S. Patent No. 5,824,311 U.S. Patent No. 5,830,880 U.S. Patent No. 5,844,905 U.S. Patent No. 5,846,945 U.S. Patent No. 5,869,245 U.S. Patent No. 5,885,796 U.S. Patent No. 6,207,156 U.S. Patent No. 8,008,449 U.S. Patent No. 8,017,114 U.S. Patent No. 8,119,129 U.S. Patent No. 8,188,102 U.S. Patent No. 8,329,867 U.S. Patent No. 8,354,509 U.S. Patent No. 8,735,553 U.S. Patent Publication No. 2004/0014095 U.S. Patent Publication No. 2005/0260186 U.S. Patent Publication No. 2006/0104968 U.S. Patent Publication No. 20110008369 U.S. Patent Publication No. 2013007 1452 U.S. Patent Publication No. 2014022021 U.S. Patent Publication No. 20140294898 Underhill et al., Genome Res. 7:996-1005 (1997).

Yang et al., Int J Cancer 2016.

Yasuda et al., Sci Transl Med 5(216):216ra177, 2013.

Zimmerman et al., Methods Mol. Cell. Biol., 3:39-42, 199

Claims

UT REIVINDICAÇÕES

1. Método de tratamento de câncer em um indivíduo, carac- terizado pelo fato de que compreende a administração de uma quanti- dade eficaz de poziotinib ao indivíduo, em que o indivíduo foi determi- nado como tendo uma ou mais mutações do exon 19 de HER2.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que uma ou mais mutações do exon 19 de HER2 compre- endem uma mutação pontual, inserção e/ou deleção de 1-18 nucleotí- deos entre os aminoácidos 668-769 de HER?2.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as uma ou mais mutações do exon 19 de HER2 são ainda definidas como mutações pontuais de HER2.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que que o indivíduo tenha sido determinado como tendo 2,3 ou 4 mutações HER2 do exon 19.

5. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que uma ou mais mutações do exon 19 de HER2 estão em um ou mais resíduos selecionados do grupo que consiste em R668, R678, V754, L755, 1767 e D769.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 caracterizado pelo fato de que as uma ou mais mutações do exon 19 de HER2 são selecionadas a partir do grupo que consiste em R668Q, R678Q, V754M, L755P, L755S, L755W, D769H, D769N, I767M e D769Y.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a mutação do exon 19 é L755P.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o indivíduo foi determinado como tendo uma mutação do exon 19 de HER2 por meio da análise de uma amostra genômica do paciente.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a amostra genômica é isolada de saliva, sangue, uri- na, tecido normal ou tecido tumoral.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a presença de uma mutação do exon 19 de HER2 é determinada por sequenciamento de ácido nu- cleico ou análises de PCR.

11.Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado que ainda compreende a administração de uma terapia anticâncer adi- cional.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracteriza- do pelo fato de que a terapia anticâncer adicional é quimioterapia, ra- dioterapia, terapia genética, cirurgia, terapia hormonal, terapia anti- angiogênica ou imunoterapia.

13. Método de acordo com a reivindicação 11, caracteriza- do pelo fato de que a terapia com poziotinib e/ou anticâncer é adminis- trada por via intravenosa, subcutânea, intraóssea, oral, transdérmica, em liberação sustentada, em liberação controlada, em liberação retar- dada, como um supositório ou sublingual.

14. Método de acordo com a reivindicação 11, caracteriza- do pelo fato de que a administração de poziotinib e/ou terapia anticân- cer compreende administração local, regional ou sistêmica.

15. Método de acordo com a reivindicação 11, caracteriza- do pelo fato de que a administração de poziotinib e/ou terapia anticân- cer são administrados duas ou mais vezes.

16. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o poziotinib é administrado por via oral.

17. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o poziotinib é administrado em uma dose de 5 a 25 mg.

18. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o poziotinib é administrado em uma dose de 8 mg, 12mg, ou 16 mg.

19. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o poziotinib é administrado diariamente.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracteriza- do pelo fato de que o poziotinib é administrado em uma base contínua.

21. Método de acordo com a reivindicação 19, caracteriza- do pelo fato de que o poziotinib é administrado em ciclos e 28 dias.

22. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o câncer é câncer oral, câncer orofaríngeo, câncer nasofaríngeo, câncer respiratório, câncer urogenital, câncer gastrointestinal, câncer de tecido do sistema nervo- so central ou periférico, um câncer endócrino ou neuroendócrino ou câncer hematopoiético, glioma, sarcoma, carcinoma, linfoma, melano- ma, fibroma, meningioma, cérebro câncer, câncer orofaríngeo, câncer nasofaríngeo, câncer renal, câncer biliar, feocromocitoma, câncer de células das ilhotas pancreáticas, tumores de Li-Fraumeni, câncer de tireoide, câncer de paratireoide, tumores hipofisários, tumores da glân- dula adrenal, tumores de sarcoma osteogênico, múltiplos neuroendó- crinos tipo | e tipo Il tumores, câncer de mama, câncer de pulmão, câncer de cabeça e pescoço, câncer de próstata, câncer de esôfago, câncer de traqueia, câncer de fígado, câncer de bexiga, câncer de es- tômago, câncer de pâncreas, câncer de ovário, câncer uterino, câncer cervical, câncer testicular, câncer de cólon, reto câncer ou câncer de pele.

23. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o câncer é o câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC).

24. Método de acordo com qualquer uma das reivindica-

ções 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o câncer é câncer colorre- tal.

25. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um ser hu- mano.

26. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende poziotinib para uso em um indivíduo determinado como tendo uma ou mais mutações do exon 19 de HER2.

27. Composição de acordo com a reivindicação 26, caracte- rizada pelo fato de que uma ou mais mutações do exon 19 de HER2 compreendem uma mutação pontual, inserção e/ou deleção de 1-18 nucleotídeos entre os aminoácidos 668-769.

28. Composição de acordo com a reivindicação 26, caracte- rizada pelo fato de que uma ou mais mutações do exon 19 de HER2 são ainda definidas como mutações pontuais de HER2.

29. Composição de acordo com a reivindicação 26, caracte- rizada pelo fato de que o indivíduo foi determinado como tendo 2, 3 ou 4 mutações no exon 19 de HER2.

30. Composição de acordo com a reivindicação 28, caracte- rizada pelo fato de que uma ou mais mutações do exon 19 de HER2 estão em um ou mais resíduos selecionados do grupo que consiste em R668, R678, V754, L755, 1767 e D769.

31. Composição de acordo com a reivindicação 26, caracte- rizada pelo fato de que uma ou mais mutações do exon 19 de HER2 são selecionadas do grupo que consiste em R668Q, R678Q, V754M, L755P, L7558S, L755W, D769H, D769N, I767M e D769Y.

32. Composição de acordo com a reivindicação 26, caracte- rizada pelo fato de que o indivíduo está sendo tratado com uma terapia anticâncer.

33. Método para prever uma resposta ao poziotinib isolado ou em combinação com uma segunda terapia anticâncer em um indi- víduo com câncer, caracterizado pelo fato de que compreende a de- tecção de uma mutação do exon 19 de HER2 em uma amostra genô- mica obtida do referido paciente, em que se a amostra for positiva para a presença da mutação do exon 19 de HER2, então o paciente deverá ter uma resposta favorável ao poziotinib isolado ou em combinação com uma terapia anticâncer.

34. Método de acordo com a reivindicação 33, caracteriza- do pelo fato de que a mutação do exon 19 de HER2 é ainda definida como uma mutação pontual do exon 19 de HER2.

35. Método de acordo com a reivindicação 33, caracteriza- do pelo fato de que a amostra genômica é isolada de saliva, sangue, urina, tecido normal ou tecido tumoral.

36. Método de acordo com a reivindicação 33, caracteriza- do pelo fato de que a presença de uma mutação do exon 19 de HER2 é determinada por sequenciamento de ácido nucleico ou análises de PCR.

37. Método de acordo com a reivindicação 36, caracteriza- do pelo fato de que a mutação do exon 19 de HER2 compreende uma mutação pontual, inserção e/ou deleção de 1-18 nucleotídeos entre os aminoácidos 668-769.

38. Método de acordo com a reivindicação 37, caracteriza- do pelo fato de que uma ou mais mutações do exon 19 de HER?2 estão em um ou mais resíduos selecionados do grupo que consiste em R668, R678, V754, L755, 1767 e D769.

39. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 33 a 38, caracterizado pelo fato de que uma ou mais mutações do exon 19 de HER2 são selecionadas do grupo que consiste em R668Q, R678Q, V754M, L755P, L755S, L755W, D769H, D769N, I767M e D769Y.

40. Método de acordo com a reivindicação 33, caracteriza- do pelo fato de que uma resposta favorável ao poziotinib isolado ou em combinação com uma terapia anticâncer compreende redução no tamanho ou carga do tumor, bloqueio do crescimento do tumor, redu- ção da dor associada ao tumor, redução da patologia associada ao câncer, redução dos sintomas associados ao câncer, não progressão do câncer, aumento do intervalo livre da doença, aumento do tempo para progressão, indução da remissão, redução da metástase ou au- mento da sobrevida do paciente.

41. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 33 a 41, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a ad- ministração de poziotinib isolado ou em combinação com uma segun- da terapia anticâncer ao referido paciente com previsão de resposta favorável.

42. Composição caracterizada pelo fato de que compreen- de (a) ácidos nucleicos isolados de células cancerosas huma- nas; e (b) um par de iniciadores que pode amplificar pelo menos uma primeira porção do exon 19 mutado de uma sequência de codifi- cação de HER2 humano.

43. Composição de acordo com a reivindicação 42, caracte- rizada pelo fato de que compreende ainda uma molécula de sonda marcada que poderá hibridizar especificamente com a primeira porção do exon 19 da sequência de codificação de HER humano quando hou- ver uma mutação na sequência.

44. Composição de acordo com a reivindicação 42, caracte- rizada pelo fato de que compreende ainda uma DNA polimerase ter- moestável.

45. Composição de acordo com a reivindicação 42, caracte-

rizada pelo fato de que compreende ainda dNTPS.

46. Composição de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 43 a 45, caracterizada pelo fato de que a sonda marcada hibri- diza com a primeira porção do exon 19 da sequência de codificação de HER2 humano quando há uma mutação selecionada do grupo que consiste em R668Q, R678Q, V754M, L755P, L7558S , L755W, D769H, D769N, 1767M e D769Y.

47. Ácido nucleico isolado caracterizado pelo fato de que codifica uma proteína HER2 mutante, em que a referida proteína mu- tante difere de HER2 humano de tipo selvagem por uma ou mais mu- tações do exon 19 de HER2 compreendendo uma ou mais mutações pontuais, inserções e/ou deleções de 1-18 nucleotídeos entre aminoá- cidos 668-769.

48. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que uma ou mais mutações do exon 19 de HER?2 estão no resíduo R668, R678, V754, L755, 1767 e/ou D769.

49. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 47 ou 48, caracterizado pelo fato de que uma ou mais mutações do exon 19 de HER2 são selecionadas do grupo que consiste em R6680Q, R678Q, V754M, L755P, L755S, L755W, D769H, D769N, I767M e D769Y.