CN113993592A - 针对携带酪氨酸激酶抑制剂耐药性egfr突变的癌症的化合物 - Google Patents

针对携带酪氨酸激酶抑制剂耐药性egfr突变的癌症的化合物 Download PDF

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Abstract

本公开提供了通过施用第三代酪氨酸激酶抑制剂例如波齐替尼来治疗被确定具有奥希替尼耐药性EGFR突变的患者的癌症的方法。

Description

针对携带酪氨酸激酶抑制剂耐药性EGFR突变的癌症的化合物
本申请要求2019年4月17日提交的美国临时专利申请第62/835,343号的权益，该申请的全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明大体上涉及分子生物学和医药领域。更具体地，本发明涉及治疗具有酪氨酸激酶抑制剂耐药性EGFR突变的患者的方法。
背景技术
大约10％的非小细胞肺癌(NSCLC)具有表皮生长因子受体(EGFR)突变，导致对例如吉非替尼、厄洛替尼和奥希替尼的酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的敏感性增加。最近，奥希替尼被批准用于EGFR突变型NSCLC4的一线治疗，但新发(de novo)耐药和获得性耐药仍然是许多患者的治疗障碍。一系列非典型和获得性EGFR突变可能会赋予奥希替尼耐药性。研究表明，这些非典型的和获得性的耐药突变改变了奥希替尼前面靠近溶剂的药物结合口袋的确认，导致药物与受体的结合亲和力发生变化。因此，对于治疗耐药性EGFR突变癌症的新疗法存在未满足的需求。
发明内容
本公开的实施方案提供用于治疗具有耐药性EGFR突变的患者的癌症的方法和组合物。在第一实施方案中，提供了一种治疗受试者的癌症的方法，包括向受试者施用有效量的波齐替尼，其中已确定该受试者具有一个或多个表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(TKI)耐药性突变。在某些方面，患者是人。
在一些方面，波齐替尼被进一步确定义波齐替尼盐酸盐。在某些方面，波齐替尼盐酸盐被配制成片剂。
在某些方面，一个或多个EGFR TKI耐药性突变包括外显子18、19、20或21处的点突变、插入和/或缺失1-18个核苷酸。在一些方面，一个或多个EGFR TKI耐药性突变包括外显子18的氨基酸688-728之间的一个或多个点突变、插入和/或缺失3-18个核苷酸。在特定方面，一个或多个EGFR外显子18突变位于一个或多个选自由E709、L718、G719、S720、G724和T725组成的组的残基处。在特定方面，一个或多个EGFR外显子18突变包括E709A、E709K、L718Q、L718V、G719A、G719S、S720P、G724S和/或T725M。在一些方面，一个或多个EGFR TKI耐药性突变包括外显子19的氨基酸729-761之间的一个或多个点突变、插入和/或缺失3-18个核苷酸。在某些方面，一个或多个EGFR外显子19突变位于一个或多个选自由I744、L747、L747、K754、A755、K757和/或D761组成的组的残基处。在特定方面，一个或多个EGFR外显子19突变包括I744V、I744T、L747S、L747FS、A755T、K757R和/或D761N。在一些方面，一个或多个EGFR TKI耐药性突变包括外显子20的氨基酸763-823之间的一个或多个点突变、插入和/或缺失3-18个核苷酸。在某些方面，一个或多个EGFR外显子20突变位于一个或多个选自由A763、A767、S768、V769、N771、H773、D770、V774、C775、S784、L792、G796、C797、S811和R776组成的组的残基处。在一些方面，一个或多个EGFR外显子20突变包括A767ASV、D770insNPG、S784F、R776C、S768I、V774M、S768I、H773insAH、H773insNPH、V774A、V769L、V769M、S768dupSVD、A763insLQEA、N771dupN、R776H、L792H、G796D、S784F、C775Y和/或S811F。在某些方面，一个或多个EGFR TKI耐药性突变包括外显子21的氨基酸824-875之间的一个或多个点突变、插入和/或缺失3-18个核苷酸。在特定方面，一个或多个EGFR外显子21突变位于一个或多个选自由L833、V834、G836、V843、T854、L861、L861、L862、L844和L858组成的组的残基处。在一些方面，一个或多个EGFR外显子21突变可包括L833F、L833V、V834L、L858R、L861Q、V843I、L861R、L862V、L844V、L861Q、G836S和/或T854I。在一些方面，已确定受试者具有2、3或4种EGFR TKI耐药性突变。在某些方面，一个或多个EGFR TKI耐药性突变位于残基E709、L718、G719、G724、C797、V843、T854、L861和/或L792处。在某些方面，已确定受试者在残基C797和/或T790处不具有EGFR突变。在特定方面，确定受试者在残基T790处不具有EGFR突变。在其他方面，确定受试者具有单独的T790突变或与T790突变另一种突变例如G719突变，例如G719A或G719S的组合。在某些方面，确定受试者在C797残基处具有突变。在一些方面，一个或多个EGFR TKI耐药性突变选自由G719X、E709X、G724S、L718X、L861Q、T8541、V8431、C797S和/或L792X组成的组，其中X是任何氨基酸。在特定方面，一个或多个EGFR TKI耐药性突变选自由L861Q、G719S、L858R/L792H、L858R/C797S和Exl9del/C797S组成的组。
在一些方面，受试者先前已被施用TKI。在某些方面，受试者对先前施用的TKI耐药。在一些方面，TKI是拉帕替尼(lapatinib)、阿法替尼(afatinib)、达克替尼(dacomitinib)、奥希替尼(osimertinib)、依鲁替尼(ibrutinib)、纳扎替尼(nazartinib)、奥莫替尼(olmutinib)、罗西替尼(rociletinib)、纳古替尼(naquotinib)或来那替尼(neratinib)。在特定方面，TKI是奥希替尼、依鲁替尼、纳扎替尼、奥莫替尼、罗西替尼或纳古替尼。在特定方面，TKI是奥希替尼。
在某些方面，通过分析来自患者的基因组样本确定受试者具有EGFR TKI耐药性突变。在一些方面，基因组样本是从唾液、血液、尿液、正常组织或肿瘤组织中分离出来的。在某些方面，通过核酸测序或PCR分析确定EGFR TKI耐药性突变的存在。
在特定方面，波齐替尼被口服施用。在一些方面，波齐替尼以5-25mg的剂量施用。在特定方面，波齐替尼以8mg、12mg或16mg的剂量施用。在一些方面，波齐替尼每天施用。在某些方面，波齐替尼被连续施用。在一些方面，波齐替尼以28天的周期施用。
在额外方面，所述方法还包括施用额外的抗癌疗法。在一些方面，额外的抗癌疗法是化疗、放疗、基因疗法、手术、激素疗法、抗血管生成疗法或免疫疗法。在特定方面，波齐替尼和/或抗癌疗法被静脉内、皮下、骨内、口服、经皮、以持续释放剂、控制释放剂、延迟释放剂、作为栓剂或舌下施用。在一些方面，施用波齐替尼和/或抗癌疗法包括局部、区域性或全身施用。在特定方面，波齐替尼和/或抗癌疗法被施用两次或更多次。
在一些方面，癌症是口腔癌、口咽癌、鼻咽癌、呼吸道癌、泌尿生殖器癌、胃肠癌、中枢或外周神经系统组织癌、内分泌或神经内分泌癌或造血系统癌、胶质瘤、肉瘤、恶性上皮肿瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、纤维瘤、脑膜瘤、脑癌、口咽癌、鼻咽癌、肾癌、胆囊癌、嗜铬细胞瘤、胰岛细胞癌、李-法美尼肿瘤、甲状腺癌、甲状旁腺癌、垂体瘤、肾上腺肿瘤、成骨肉瘤、多发性神经内分泌I型和II型肿瘤、乳腺癌、肺癌、头颈癌、前列腺癌、食道癌、气管癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、睾丸癌、结肠癌、直肠癌或皮肤癌。在特定方面，癌症是非小细胞肺癌。
在另一个实施方案中，提供了一种包含波齐替尼的药物组合物，用于被确定具有一个或多个EGFR TKI耐药性突变的受试者。在一些方面，组合物被进一步明确为口服组合物。在某些方面，组合物包含5-25mg的波齐替尼。在特定方面，组合物包含8mg、12mg或16mg的波齐替尼。在一些方面，波齐替尼被进一步定义为波齐替尼盐酸盐。在一些方面，组合物被配制成片剂。在一些方面，受试者正在接受抗癌疗法治疗。
在某些方面，一个或多个EGFR TKI耐药性突变包括外显子18、19、20或21处的点突变、插入和/或缺失1-18个核苷酸。在一些方面，一个或多个EGFR TKI耐药性突变包括外显子18的氨基酸688-728之间的一个或多个点突变、插入和/或缺失3-18个核苷酸。在特定方面，一个或多个EGFR外显子18突变位于一个或多个选自由E709、L718、G719、S720和G724组成的组的残基处。在特定方面，一个或多个EGFR外显子18突变包括E709A、L718Q、L718V、G719A、G719S、S720P和/或G724S。在一些方面，一个或多个EGFR TKI耐药性突变包括外显子19的氨基酸729-761之间的一个或多个点突变、插入和/或缺失3-18个核苷酸。在某些方面，一个或多个EGFR外显子19突变位于一个或多个选自由I744、L747、L747、A755、K757和/或D761组成的组的残基处。在特定方面，一个或多个EGFR外显子19突变包括I744V、I744T、L747S、L747FS、A755T、K757R和/或D761N。在一些方面，一个或多个EGFR TKI耐药性突变包括外显子20的氨基酸763-823之间的一个或多个点突变、插入和/或缺失3-18个核苷酸。在某些方面，一个或多个EGFR外显子20突变位于一个或多个选自由A763、S768、V769、H773、D770、V774、C775、S784、L792、G796、C797、S811和R776组成的组的残基处。在一些方面，一个或多个EGFR外显子20突变包括D770insNPG、S784F、R776C、S768I、V774M、S768I、H773insAH、H773insNPH、V774A、V769L、V769M、S768dupSVD、A763insLQEA、L792H、G796D、S784F、C775Y和/或S811F。在某些方面，一个或多个EGFR TKI耐药性突变包括外显子21的氨基酸824-875之间的一个或多个点突变、插入和/或缺失3-18个核苷酸。在特定方面，一个或多个EGFR外显子21突变位于一个或多个选自由L833、V834、G836、V843、T854、L861、L861、L862、L844和L858组成的组的残基处。在一些方面，一个或多个EGFR外显子21突变可包括L833F、V834L、L858R、L861Q、V843I、L861R、L862V、L844V、L861Q、G836S和/或T854I。在一些方面，已确定受试者具有2、3或4个EGFR TKI耐药性突变。在某些方面，一个或多个EGFR TKI耐药性突变位于残基E709、L718、G719、G724、C797、V843、T854、L861和/或L792处。在某些方面，已确定受试者在残基C797和/或T790处不具有EGFR突变。在特定方面，确定受试者在残基T790处不具有EGFR突变。在其他方面，确定受试者具有单独的T790突变或与T790突变另一种突变的组合。在某些方面，确定受试者在C797残基处具有突变。在一些方面，一个或多个EGFR TKI耐药性突变选自由G719X、E709X、G724S、L718X、L861Q、T8541、V8431、C797S和/或L792X组成的组，其中X是任何氨基酸。在特定方面，一个或多个EGFR TKI耐药性突变选自由L861Q、G719S、L858R/L792H、L858R/C797S和Ex19del/C797S组成的组。
在另一个实施方案中，提供了一种预测患有癌症的受试者对单独的波齐替尼或与第二种抗癌疗法联合使用的波齐替尼的反应的方法，包括在从所述患者获得的基因组样本中检测EGFR TKI耐药性突变，其中如果所述样本对EGFR TKI耐药性突变的存在呈阳性，则预测所述患者对单独的波齐替尼或与抗癌疗法联合使用的波齐替尼具有良好反应。
在某些方面，一个或多个EGFR TKI耐药性突变包括外显子18、19、20或21处的点突变、插入和/或缺失1-18个核苷酸。在一些方面，一个或多个EGFR TKI耐药性突变包括外显子18的氨基酸688-728之间的一个或多个点突变、插入和/或缺失3-18个核苷酸。在特定方面，一个或多个EGFR外显子18突变位于一个或多个选自由E709、L718、G719、S720和G724组成的组的残基处。在特定方面，一个或多个EGFR外显子18突变包括E709A、L718Q、L718V、G719A、G719S、S720P和/或G724S。在一些方面，一个或多个EGFR TKI耐药性突变包括外显子19的氨基酸729-761之间的一个或多个点突变、插入和/或缺失3-18个核苷酸。在某些方面，一个或多个EGFR外显子19突变位于一个或多个选自由I744、L747、L747、A755、K757和/或D761组成的组的残基处。在特定方面，一个或多个EGFR外显子19突变包括I744V、I744T、L747S、L747FS、A755T、K757R和/或D761N。在一些方面，一个或多个EGFR TKI耐药性突变包括外显子20的氨基酸763-823之间的一个或多个点突变、插入和/或缺失3-18个核苷酸。在某些方面，一个或多个EGFR外显子20突变位于一个或多个选自由A763、S768、V769、H773、D770、V774、C775、S784、L792、G796、C797、S811和R776组成的组的残基处。在一些方面，一个或多个EGFR外显子20突变包括D770insNPG、S784F、R776C、S768I、V774M、S768I、H773insAH、H773insNPH、V774A、V769L、V769M、S768dupSVD、A763insLQEA、L792H、G796D、S784F、C775Y和/或S811F。在某些方面，一个或多个EGFR TKI耐药性突变包括外显子21的氨基酸824-875之间的一个或多个点突变、插入和/或缺失3-18个核苷酸。在特定方面，一个或多个EGFR外显子21突变位于一个或多个选自由L833、V834、G836、V843、T854、L861、L861、L862、L844和L858组成的组的残基处。在一些方面，一个或多个EGFR外显子21突变可包括L833F、V834L、L858R、L861Q、V843I、L861R、L862V、L844V、L861Q、G836S和/或T854I。在一些方面，已确定受试者具有2、3或4个EGFR TKI耐药性突变。在某些方面，一个或多个EGFR TKI耐药性突变位于残基E709、L718、G719、G724、C797、V843、T854、L861和/或L792处。在某些方面，已确定受试者在残基C797和/或T790处不具有EGFR突变。在特定方面，确定受试者在残基T790处不具有EGFR突变。在其他方面，确定受试者具有单独的T790突变或T790突变与另一种突变的组合。在某些方面，确定受试者在C797残基处具有突变。在一些方面，一个或多个EGFR TKI耐药性突变选自由G719X、E709X、G724S、L718X、L861Q、T8541、V8431、C797S和/或L792X组成的组，其中X是任何氨基酸。在特定方面，一个或多个EGFR TKI耐药性突变选自由L861Q、G719S、L858R/L792H、L858R/C797S和Ex19del/C797S组成的组。
在一些方面，对单独的波齐替尼或与抗癌疗法联合使用的波齐替尼的良好反应包括减小肿瘤大小或负荷、阻断肿瘤生长、减少肿瘤相关疼痛、减少癌症相关病理、减少癌症相关症状、癌症无进展、增加无病间隔、增加距进展的时间、诱导缓解、减少转移或增加患者存活率。
在另外的方面，所述方法还包括向被预测具有良好反应的所述患者施用单独的波齐替尼或与第二种抗癌疗法组合的波齐替尼。在一些方面，波齐替尼被口服施用。在某些方面，波齐替尼以5-25mg的剂量施用。在某些方面，波齐替尼以8mg、12mg或16mg的剂量施用。在一些方面，波齐替尼被进一步定义为波齐替尼盐酸盐。在特定方面，波齐替尼盐酸盐被配制成片剂。
本发明的其他目标、特征和优点将从以下详述中变得明显。然而，应理解该详述和具体实施例虽然指示了本发明的优选实施方案，但是仅以说明的方式被提供，因为在本发明的精神和范围内的各种变化和修改将从该详述中变得对本领域技术人员明显。
附图说明
以下附图形成本说明书的一部分并且被包括在内以进一步展示本发明的特定方面。可以参考这些附图中的一个或多个以及本文呈现的具体实施方案的详细描述来更好地理解本发明。
图1A-1D：突变型EGFR的计算机建模表明外显子18的P环对奥希替尼是重要的，但对波齐替尼结合不重要。(图1A)与EGFR外显子19del(E746_A7450del)结合的奥希替尼的计算机建模在奥希替尼的吲哚环和EGFR外显子18的P环(包括氨基酸V726和F723(虚线))之间具有明显的π堆积相互作用。波齐替尼进一步延伸进入与包括T790在内的疏水裂缝相互作用的药物结合口袋。(图1B)EGFR G719S与奥希替尼在反应性构象的分子建模，且G719S的预测构象表明TKI-蛋白质在吲哚环处的相互作用不稳定。(图1C)EGFR G719S与波齐替尼的计算机建模显示波齐替尼结合或TKI-蛋白质相互作用没有预测的变化。(图1D)L719Q突变的分子建模表明Q719阻碍了奥希替尼与M793的相互作用，并使迈克尔受体(反应基团)脱出与C797不对齐。相比之下，即使在L719Q突变的情况下，波齐替尼受Q719的影响较小，并且仍然取与C797反应的位置。
图2A-2D：波齐替尼在体外比奥希替尼对非典型EGFR突变更有效且更具选择性。(图2A)用波齐替尼或奥希替尼治疗72小时的表达跨越外显子18-21的原发性非典型突变的Ba/F3细胞的Log IC50值的热图。突变从最耐药到最敏感从上到下排序。经典的EGFR突变列在底部以供比较。(图2B)用波齐替尼或奥希替尼治疗72小时的表达跨越外显子18-21的原发性非典型突变的Ba/F3细胞的IC50值除以用波齐替尼或奥希替尼治疗72小时的表达野生型EGFR的Ba/F3细胞(+10ng/ml EGF)的IC50值的比率的热图。经典的EGFR突变列在底部以供比较。(图2C)用波齐替尼或奥希替尼治疗72小时的表达跨越外显子18-21的原发性非典型突变的Ba/F3细胞的IC50值的条形图。统计学差异通过学生t检验确定。(图2D)用波齐替尼或奥希替尼治疗72小时的表达跨越外显子18-21的原发性非典型突变的Ba/F3细胞的突变型/WT比率的条形图。统计学差异通过学生t检验确定。
图3A-3D：非典型的P环外显子18突变在体内导致对奥希替尼而不是波齐替尼的原发耐药性。(图3A)用所示的抑制剂治疗28天的携带EGFR外显子18P环突变(G719A)的NSCLC的PDX模型的肿瘤生长曲线。(图3B)在用所示抑制剂治疗后的28天实验结束时，G719A肿瘤体积百分比变化的平均值±SEM的条形图。符号代表小鼠个体。通过ANOVA和Tukey检验确定显著差异以进行多重比较。(图3C)用所示抑制剂治疗28天的具有非P环外显子18EGFR突变(E709K L858R)的NSCLC PDX模型的肿瘤生长曲线。(图3D)在用指定抑制剂治疗后，28天实验结束时，E709K/L858R肿瘤体积百分比变化的平均值±SEM的条形图。符号代表小鼠个体。通过ANOVA和Tukey检验确定显著差异以进行多重比较。
图4A-4D：获得性非典型突变驱动对奥希替尼的耐药性，但对喹唑啉TKI敏感，并且同时发生的突变的药物敏感性/耐药性图谱可能是由原发突变驱动的。(图4A)用波齐替尼或奥希替尼治疗72小时的表达跨越外显子18-21的获得性非典型突变的Ba/F3细胞的LogIC50值的热图。突变从最耐药到最敏感从上到下排序。(图4B)用波齐替尼或奥希替尼治疗72小时的表达跨越外显子18-21的获得性非典型突变的Ba/F3细胞的IC50值除以用波齐替尼或奥希替尼治疗72小时的表达野生型EGFR的Ba/F3细胞(+10ng/ml EGF)的IC50值的比率的热图。(图4C)用波齐替尼或奥希替尼治疗72小时的表达跨越外显子18-21的获得性非典型突变的Ba/F3细胞的IC50值的条形图。统计学差异由学生t检验确定。(图4D)用波齐替尼或奥希替尼治疗72小时的表达跨越外显子18-21的获得性非典型突变的Ba/F3细胞的突变型/WT比率的条形图。统计学差异由对分图A的学生t检验确定，但药物从左到右从选择性最高到选择性最低重新排序。
具体实施方式
目前的研究在各种恶性肿瘤如NSCLC中鉴定了奥希替尼耐药性EGFR突变。系统地评估了耐药突变对多种TKI的药物敏感性。发现耐药性EGFR突变对波齐替尼敏感。
因此，本公开的某些实施方案提供了用于治疗具有奥希替尼耐药性EGFR突变的癌症患者的方法。特别地，本公开的方法包括向经鉴定具有一个或多个奥希替尼耐药性EGFR突变例如外显子18、19、20或21突变的患者施用波齐替尼(也称为HM781-36B)。波齐替尼的大小和柔韧性克服了空间位阻，从而在低纳摩尔浓度下抑制EGFR突变体。因此，波齐替尼以及结构相似的抑制剂是有效的EGFR抑制剂，可用于靶向奥希替尼耐药性EGFR突变。
I.定义
如本说明书所用，“一个/种(a)”或“一个/种(an)”可表示一个/种或更多个/种。如权利要求中所用，当与词“包括”一起使用时，词“一个/种(a)”或“一个/种(an)”可表示一个/种或一个/种以上。
权利要求中使用术语“或”来意指“和/或”，除非明确指出仅指替代方案或替代方案是相互排斥的，但是本公开支持仅指替代方案和“和/或”的定义。如本文所用，“另一个/另一种(another)”可以意指至少第二个/第二种或更多个/更多种。
术语“基本上”应理解为方法或组合物仅包括指定的步骤或材料，以及不会实质上影响那些方法和组合物的基本和新颖特征的步骤或材料。
术语“基本上不含”是针对98％的所列组分使用的并且少于2％的是组合物或颗粒基本上不含的组分。
本文中使用的术语“基本上”或“大约”可用于修饰任何定量比较、值、测量或其他表示，所示定量比较、值、测量或其他表示可以允许变化而不导致与其相关的基本功能的变化。
术语“约”通常是指在使用测量所述值的标准分析技术确定的所述值的标准偏差内。这些术语也可以用来指所述值的加减5％。
“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”包括(1)抑制经历或表现出疾病的病理学或症状学的受试者或患者中的该疾病(例如，阻止病理学和/或症状学的进一步发展)，(2)改善经历或表现出疾病的病理学或症状学的受试者或患者的该疾病(例如，逆转病理学和/或症状学)，和/或(3)实现经历或表现出疾病的病理学或症状学的受试者或患者的该疾病的任何可测量减少。例如，治疗可包括施用有效量的波齐替尼。
“预防性治疗”包括：(1)降低或减轻可能处于疾病的风险和/或易患疾病但尚未经历或表现出该疾病的任何或所有病理学或症状学的受试者或患者中发生该疾病的风险，和/或(2)减缓可能处于疾病的风险和/或易患疾病但尚未出现或表现出该疾病的任何或所有病理学或症状学的受试者或患者中该疾病的病理学或症状学的发作。
如本文所用，术语“患者”或“受试者”是指活的哺乳动物生物体，例如人类、猴、牛、绵羊、山羊、犬、猫、小鼠、大鼠、豚鼠或其转基因物种。在某些实施方案中，患者或受试者为灵长类动物。人类患者的非限制性实例为成人、青少年、婴儿和胎儿。
如在本说明书和/或权利要求中使用的术语，术语“有效”是指足以实现期望的、预期的或想要的结果。当在用化合物治疗患者或受试者的情况下使用时，“有效量”、“治疗有效量”或“药物有效量”是指当对受试者或患者施用化合物以治疗或预防疾病时，足以实现对疾病的此类治疗或预防的化合物的量。
如本文所用，术语“IC50”指的是所获得的最大反应的抑制剂量的50％。这种定量测量指示，需要多少特定药物或其他物质(抑制剂)才能将给定的生物、生化或化学过程(或过程的成分，即酶、细胞、细胞受体或微生物)抑制一半。
例如，通过促进杀伤癌细胞、诱导癌细胞凋亡、降低癌细胞生长速率、降低转移的发生率或数量、减小肿瘤尺寸、抑制肿瘤生长、减少对肿瘤或癌细胞的血液供应，促进对癌细胞或肿瘤的免疫反应、预防或抑制癌症进展或增加具有癌症的受试者的寿命，“抗癌”药能够对受试者的癌细胞/肿瘤产生不利影响。
术语“插入”或“插入突变”是指向DNA序列中加入一个或更多个核苷酸碱基对。
“杂交(Hybridize)”或“杂交(hybridization)”是指核酸之间的结合。杂交条件可根据待结合核酸的序列同源性而变化。因此，如果受试核酸之间的序列同源性高，则使用严格条件。如果序列同源性较低，则使用温和条件。当杂交条件严格时，杂交特异性增加，并且这种杂交特异性的增加导致非特异性杂交产物的产量降低。然而，在温和的杂交条件下，杂交特异性降低，并且这种杂交特异性的降低导致非特异性杂交产物的产量增加。
“探针(probe)”或“探针(probes)”是指长度为至少八(8)个核苷酸并且由于探针中至少一条序列与靶区域中序列的互补性而与靶序列形成杂交体结构的多核苷酸。多核苷酸可包括DNA和/或RNA。在某些实施方案中，探针被可检测地标记。探针的尺寸可以有很大差异。通常，探针的长度为例如至少8-15个核苷酸。其他探针的长度为例如至少20、30或40个核苷酸。还有一些探针稍微更长一些，例如长度为至少50、60、70、80或90个核苷酸。探针也可以具有落入前述范围内的任何具体长度。优选地，探针不含有与用于在聚合酶链式反应期间引发靶序列的序列互补的序列。
“寡核苷酸”或“多核苷酸”是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的单链或双链聚合物，其可以是未修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA。
“修饰的核糖核苷酸”或脱氧核糖核苷酸是指，可用于代替核酸中天然存在的碱基的分子，包括但不限于修饰的嘌呤和嘧啶，稀有碱基，可转换(convertible)核苷，嘌呤和嘧啶的结构类似物，标记的、衍生的和修饰的核苷和核苷酸，共轭核苷和核苷酸，序列修饰物，末端修饰物，间隔子修饰物，以及具有主链修饰的核苷酸，所述主链修饰包括但不限于核糖修饰的核苷酸、氨基磷酸酯(phosphoramidate)、硫代磷酸酯、亚磷酰胺(phosphonamidite)、甲基膦酸酯、甲基亚磷酰胺(methyl phosphoramidite)、甲基亚膦酰胺(methyl phosphonamidite)、5'-β-氰乙基亚磷酰胺(5’-β-cyanoethylphosphoramidite)、亚甲基膦酸酯、二硫代磷酸酯、肽核酸、非手性和中性核苷酸间键(internucleotidic linkage)。
“变体”是指分别相对于野生型或受试者群体中最普遍的形式，因一个或多个核苷酸或氨基酸的交换、缺失或插入而不同的多核苷酸或多肽。交换、缺失或插入的核苷酸或氨基酸的数量可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多，例如25、30、35、40、45或50个。
“引物”或“引物序列”是指与靶核酸序列(例如，要扩增的DNA模板)杂交以引发核酸合成反应的寡核苷酸。引物可以是DNA寡核苷酸、RNA寡核苷酸或嵌合序列。引物可以含有天然、合成或修饰的核苷酸。引物长度的上限和下限都是凭经验确定的。引物长度的下限是在核酸扩增反应条件下与靶核酸杂交后形成稳定双链体所需的最小长度。在这种杂交条件下，非常短的引物(长度通常少于3-4个核苷酸)不会与靶核酸形成热力学稳定的双链体。上限通常由在靶核酸中预定核酸序列以外的区域中形成双链体的可能性来确定。通常，合适的引物长度在约10至约40个核苷酸长的范围内。在某些实施方案中，例如，引物的长度可以为10-40、15-30或10-20个核苷酸长。当置于适当条件下时，引物能够在多核苷酸序列上作为合成起始点。
“检测(detection)”、“可检测的(detectable)”及其语法等效物是指确定靶核酸序列的存在和/或数量和/或身份的方式。在一些实施方案中，检测发生在扩增靶核酸序列时。在其他实施方案中，靶核酸的测序可以表征为“检测”该靶核酸。连接于探针的标记可以包括可通过例如化学或物理方式检测的本领域已知的多种不同标记中的任一种。可以连接于探针的标记可以包括例如荧光材料和发光材料。
“扩增(amplifying)”、“扩增(amplification)”及其语法等同体是指以依赖模板的方式复制靶核酸序列的至少一部分的任何方法，包括但不限于，用于以线性或指数方式扩增核酸序列的大量技术。用于进行扩增步骤的示例性手段包括，连接酶链式反应(LCR)、连接酶检测反应(LDR)、连接后Q-复制酶扩增、PCR、引物延伸、链置换扩增(SDA)、超支化(hyperbranched)链置换扩增、多重置换扩增(MDA)、核酸链基扩增(NASBA)、两步多重扩增(two-step multiplexed amplification)、滚环扩增(RCA)、重组酶-聚合酶扩增(RPA)(TwistDx,Cambridg,UK)和自持序列复制(3SR)，包括其多重化形式或组合，例如但不限于OLA/PCR、PCR/OLA、LDR/PCR、PCR/PCR/LDR、PCR/LDR、LCR/PCR、PCR/LCR(也称为组合链式反应-CCR)等。此类技术的描述尤其可见于Sambrook et al.Molecular Cloning,3rd Edition(分子克隆，第三版)。
本文通常使用的“药学上可接受的”是指，在合理医学判断范围内、适合用于与人类和动物的组织、器官和/或体液接触，但没有过度毒性、刺激、过敏反应或与合理的益处/风险比相称的其他问题或并发症的化合物、材料、组合物和/或剂型。
“药学上可接受的盐”是指，如上所定义的药学上可接受的并且具有所需的药理学活性的本发明化合物的盐。此类盐的非限制性实例包括与无机酸或与有机酸形成的酸加成盐，无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸和磷酸；有机酸例如1,2-乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、2-萘磺酸、3-苯基丙酸、4,4'-亚甲基双(3-羟基-2-烯-1-羧酸)、4-甲基双环[2.2.2]辛-2-烯-1-羧酸、乙酸、脂肪族一元和二元羧酸、脂肪族硫酸、芳香族硫酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环戊烷丙酸、乙磺酸、富马酸、葡庚糖酸、葡糖酸、谷氨酸、乙醇酸、庚酸、己酸、羟萘甲酸、乳酸、十二烷基硫酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、甲磺酸、粘康酸、邻-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、草酸、对氯苯磺酸、苯基取代的链烷酸、丙酸、对甲苯磺酸、丙酮酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、四丁基乙酸和三甲基乙酸。药学上可接受的盐还包括，当存在的酸性质子能够与无机碱或有机碱反应时可以形成的碱加成盐。可接受的无机碱包括氢氧化钠、碳酸钠、氢氧化钾、氢氧化铝和氢氧化钙。可接受的有机碱的非限制性实例包括乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇和N-甲基葡糖胺。应当认识到，构成本发明任何盐的一部分的具体阴离子或阳离子不是关键的，只要盐作为一个整体是药理学上可接受的即可。药学上可接受的盐的其他实例及其制备和使用方法提供于Handbook ofPharmaceutical Salts:Properties,and Use(药用盐手册：性质和使用)(P.H.Stahl&C.G.Wermuth eds.,Verlag Helvetica Chimica Acta,2002)。
II.耐药性EGFR突变
本公开的某些实施方案涉及确定受试者是否具有一个或多个奥希替尼耐药性EGFR突变，例如外显子18、19、20或21突变。受试者可能具有2、3、4或更多个EGFR外显子20突变。一个或多个EGFR突变可以位于外显子18或20中的一个或多个选自由E709、L718、G719、G724、C797、V843、T854、L861和L792组成的组的残基处。一个或多个EGFR突变可以是G719X、E709X、G724S、L718X、L861Q、T8541、V8431、C797S和/或L792X，其中X是任何氨基酸。突变检测方法在本领域是已知的，包括PCR分析和核酸测序，以及FISH和CGH。在特定方面，EGFR突变通过DNA测序检测，例如对来自肿瘤的DNA或来自血浆的循环游离DNA进行测序。
EGFR外显子18突变可包括氨基酸688-728之间的外显子18的一个或多个点突变、插入和/或缺失3-18个核苷酸，所述缺失是氨基酸之间符合读框的缺失。一个或多个EGFR外显子18突变可以位于一个或多个选自由E709、L718、G719、S720和G724组成的组的残基处。一个或多个EGFR外显子18突变可包括E709A、L718Q、L718V、G719A、G719S、S720P和/或G724S。
EGFR外显子19突变可包括氨基酸729-761之间的外显子19的一个或多个点突变、插入和/或缺失3-18个核苷酸，所述缺失为氨基酸之间符合读框的缺失。一个或多个EGFR外显子19突变可以位于一个或多个选自由I744、L747、L747、A755、K757和/或D761组成的组的残基处。一个或多个EGFR外显子19突变可包括I744V、I744T、L747S、L747FS、A755T、K757R和/或D761N。
EGFR外显子20突变可包括氨基酸763-823之间的一个或多个点突变、插入和/或缺失3-18个核苷酸。在某些方面，一个或多个EGFR外显子20突变位于一个或多个选自由A763、S768、V769、H773、D770、V774、C775、S784、L792、G796、C797、S811和R776组成的组的残基处。在一些方面，一个或多个EGFR外显子20突变包括D770insNPG、S784F、R776C、S768I、V774M、S768I、H773insAH、H773insNPH、V774A、V769L、V769M、S768dupSVD、A763insLQEA、L792H、G796D、S784F、C775Y和/或S811F。
EGFR外显子21突变可包括氨基酸824-875之间的外显子21的一个或多个点突变、插入和/或缺失3-18个核苷酸，所述缺失为氨基酸之间符合读框的缺失。一个或多个EGFR外显子21突变可以位于一个或多个选自由L833、V834、G836、V843、T854、L861、L862、L844和L858组成的组的残基处。一个或多个EGFR外显子21突变可包括L833F、V834L、L858R、L861Q、V843I、L861R、L862V、L844V、L861Q、G836S和/或T854I。
在一些方面，受试者可能在EGFR残基C797和T790处具有或发生突变，该突变可能导致对TKI如波齐替尼的耐药性。因此，在某些方面，确定受试者在EGFR C797和/或T790处不具有突变，如C797S和/或T790M。在一些方面，具有T790突变如T790M的受试者可施用奥希替尼，而具有C797突变如C797S的受试者可施用化疗和/或放疗。例如，如果C797S是在经典EGFR突变(例如，L858R或外显子19缺失)的背景下获得的，而T790M不存在，则这些突变可能对波齐替尼敏感。然而，如果获得C797S突变并伴有T790M突变或外显子20插入突变，则这些突变可能对波齐替尼耐药。此外，如果获得T790M突变并伴有经典突变(例如，L858R或外显子19缺失)，则这些突变可能对波齐替尼耐药，但对奥希替尼敏感。此外，在体外，当获得T790M突变并伴有外显子18点突变(G719X/T790M)时，这些突变似乎仍然对波齐替尼敏感。在一些方面，L858R/C797S、Ex19del/C797S或G719X/T790M突变体对波齐替尼和其他喹唑啉胺TKI均敏感。然而，在某些方面，L858R/T790M/C797S、外显子19缺失/T790M/C797s和外显子20插入+C797S或T790M突变体对EGFR TKI耐药。
患者样品可以是包括来自受试者肺癌的核酸的任何身体组织或体液。在某些实施方案中，样品将是包含循环肿瘤细胞或细胞游离DNA的血液样品。在其他实施方案中，样品可以是组织，例如肺组织。肺组织可以来自肿瘤组织，并且可以是新鲜冷冻的或福尔马林固定石蜡包埋的(FFPE)。在某些实施方案中，获得肺肿瘤FFPE样品。
适用于本文所述方法的样品含有遗传材料，例如基因组DNA(gDNA)。基因组DNA通常从生物样品中提取，例如血液或口腔内壁的黏膜刮屑(scraping)，但也可以从其他生物样品中提取，包括尿液、肿瘤或咳吐物(expectorant)。样品本身通常包括有核细胞(例如血液细胞或口腔细胞)或从受试者取出的组织，包括正常组织或肿瘤组织。用于获得、处理和分析样品的方法和试剂是本领域已知的。在一些实施方案中，在例如抽血的医疗保健提供者的帮助下获得样品。在一些实施方案中，在没有医疗保健提供者的帮助下获得样品，例如，在非侵入性获得样品的情况下，例如使用口腔拭子或刷子获得的、包含口腔细胞的样品，或漱口水样品。
在某些情况下，可以处理生物样品以进行DNA分离。例如，可以将细胞样品或组织样品中的DNA与样品的其他组分分离。可以使用本领域已知的标准技术从生物样品中收获细胞。例如，可以通过离心细胞样品并重悬浮沉淀的细胞来收获细胞。可以将细胞重悬浮于缓冲溶液，例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。在离心细胞悬浮液以获得细胞团块后,可以裂解细胞以提取DNA，例如gDNA。参见，例如Ausubel et al.(2003)。可以浓缩和/或纯化样品以分离DNA。从受试者获得的所有样品，包括那些经过任何类型的进一步处理的样品，都视为是从受试者获得的。可使用常规方法从生物样品中提取基因组DNA，包括例如苯酚提取。或者可以使用诸如
Figure BDA0003415053570000162
组织试剂盒(Qiagen,Chatsworth,Calif.)和
Figure BDA0003415053570000161
基因组DNA纯化试剂盒(Promega)等试剂盒提取基因组DNA。样品来源的非限制性例子包括尿液、血液和组织。
可以使用本领域已知的方法确定本文所述的耐药性EGFR突变的存在或不存在。例如，凝胶电泳、毛细管电泳、尺寸排阻层析、测序和/或阵列可用于检测插入突变的存在或不存在。在需要时，可以使用本领域已知的方法，例如PCR，来完成核酸的扩增。在一个实例中，从受试者获得样品(例如，包含基因组DNA的样品)。然后检查样品中的DNA，以确定本文所述插入突变的身份。可以通过本文所述的任何方法，例如通过测序，或通过将基因组DNA、RNA或cDNA中的基因与核酸探针例如DNA探针(其包括cDNA和寡核苷酸探针)或RNA探针杂交，检测插入突变。可以将核酸探针设计为与具体变体特异性杂交或优先杂交。
一组探针通常是指一组用于检测本公开的可操作治疗建议中使用的靶遗传变异(例如，EGFR突变)的引物，通常是引物对，和/或可检测地标记的探针。在扩增反应中使用引物对来界定跨越每个上述基因的靶遗传变异的扩增子。由一组匹配的探针检测该组扩增子。在示例性实施方案中，本发明的方法可以使用用于检测一组靶遗传变异诸如EGFR 20突变的TaqManTM(Roche Molecular Systems,Pleasanton,Calif.)测定。在一个实施方案中，该组探针是用于生成扩增子的一组引物，该扩增子通过诸如下一代测序反应等核酸测序反应检测。在这些实施方案中，例如，可以采用AmpliSEQTM(Life Technologies/Ion Torrent,Carlsbad,Calif.)或TruSEQTM(Illumina,San Diego,Calif.)技术。
对核酸标志物的分析可以使用本领域已知的技术来进行，包括但不限于序列分析和电泳分析。序列分析的非限制性实例包括Maxam-Gilbert测序、Sanger测序、毛细管阵列DNA测序、热循环测序(Sears et al.,1992)、固相测序(Zimmerman et al.,1992)、质谱测序例如基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/MS；Fu et al.,1998)和杂交测序(Chee et al.,1996；Drmanac et al.,1993；Drmanac et al.,1998)。电泳分析的非限制性实例包括平板凝胶电泳，例如琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳和变性梯度凝胶电泳。此外，可以使用来自公司例如Life Technologies/Ion Torrent PGM或Proton、Illumina HiSEQ或MiSEQ以及Roche/454下一代测序系统的市售试剂盒和仪器进行下一代测序方法。
其他核酸分析方法可以包括直接手动测序(Church and Gilbert,1988；Sangeret al.,1977；美国专利第5,288,644号)；自动荧光测序；单链构象多态性分析(SSCP)(Schafer et al.,1995)；钳夹变性凝胶电泳(CDGE)；二维凝胶电泳(2DGE或TDGE)；构象敏感凝胶电泳(CSGE)；变性梯度凝胶电泳(DGGE)(Sheffield et al.,1989)；变性高效液相色谱(DHPLC,Underhill et al.，1997)；红外基质辅助激光解吸/电离(IR-MALDI)质谱(WO99/57318)；迁移率变化分析(Orita et al.,1989)；限制酶分析(Flavell et al.,1978；Geever et al.,1981)；实时定量PCR(Raca et al.,2004)；异源双链分析；化学错配切割(CMC)(Cotton et al.,1985)；RNA酶保护测定(Myers et al.,1985)；使用识别核苷酸错配的多肽，例如大肠杆菌(E.coli)的mutS蛋白；等位基因特异性PCR，以及这些方法的组合。参见，例如，美国专利公开第2004/0014095号，其全部内容通过引用并入本文。
在一个实例中，鉴定样品中EGFR突变的方法包括，使来自所述样品的核酸与能够与编码突变EGFR蛋白或其包含突变的片段的核酸特异性杂交的核酸探针接触，和检测所述杂交。在具体实施方案中，所述探针用例如放射性同位素(3H、32P或33P)、荧光剂(若丹明或荧光素)或显色剂可检测地标记。在具体实施方案中，探针是反义寡聚体，例如PNA、吗啉代-氨基磷酸酯、LNA或2'-烷氧基烷氧基。探针可以为约8个核苷酸至约100个核苷酸，或约10至约75个、或约15至约50个、或约20至约30个核苷酸。在另一方面，将本公开的所述探针提供在试剂盒中，用于鉴定样品中的EGFR突变，所述试剂盒包括与EGFR基因中的突变位点特异性杂交或邻近该位点杂交的寡核苷酸。该试剂盒还可以包括基于使用该试剂盒的杂交测试结果，使用波齐替尼治疗患有含有EGFR突变的肿瘤的患者的说明书。
另一方面，检测样品中EGFR突变的方法包括，从所述样品扩增对应于所述EGFR基因或其疑似含有突变的片段的核酸，并将扩增的核酸的电泳迁移率与相应野生型EGFR基因或其片段的电泳迁移率进行比较。迁移率的差异指示扩增的核酸序列中存在突变。可以在聚丙烯酰胺凝胶上测定电泳迁移率。
或者，可以使用酶促突变检测(EMD)(Del Tito et al.,1998)分析核酸以检测突变。EMD使用噬菌体解离酶T4内切核酸酶VII，该酶沿着双链DNA进行扫描，直到它检测并切割由点突变、插入和缺失导致的碱基对错配引起的结构扭曲。例如通过凝胶电泳检测通过解离酶切割形成的两个短片段，指示存在突变。EMD方法的优点是，使用单一方案来鉴别直接从PCR反应测定的点突变、缺失和插入，消除了对样品纯化的需要，从而缩短杂交时间并提高信噪比。可以分析含有高达20倍过量的正常DNA和尺寸高达4kb的片段的混合样品。然而，EMD扫描不能鉴定突变阳性样品中发生的具体碱基变化，如有必要，需要另外的测序程序来鉴定该突变。如美国专利第5,869,245号所证明的，可以使用类似于解离酶T4内切核酸酶VII的CEL I酶。
III.治疗方法
本文进一步提供了用于治疗个体癌症或延缓其进展的方法，包括向个体、向被确定具有耐药性EGFR突变的受试者施用有效量的波齐替尼或结构相似的抑制剂。受试者可能有一个以上的EGFR突变。
考虑待被治疗的癌症的实例包括肺癌、头颈癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、骨癌、睾丸癌、宫颈癌、胃肠癌、淋巴瘤、肺肿瘤前病变、结肠癌、黑色素瘤和膀胱癌。在特定方面，癌症是非小细胞肺癌。
在一些实施方案中，受试者是哺乳动物，例如灵长类动物，优选高等灵长类动物，例如人类(例如，患本文所述病症或处于患本文所述病症的风险的患者)。在一个实施方案中，受试者需要增强免疫反应。在某些实施方案中，受试者是免疫功能受损的，或处于免疫功能受损的风险。例如，受试者正在接受或已经接受化疗治疗和/或放疗。或者，或组合地，受试者由于感染而导致免疫功能受损或处于免疫功能受损的风险。
某些实施方案涉及确定对具有奥希替尼耐药性EGFR突变的受试者施用波齐替尼，也称为HM781-36B、HM781-36和1-[4-[4-[(3,4-二氯-2-氟苯氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基]-氧基哌啶-1-基]丙-2-烯-1-酮。波齐替尼是一种基于喹唑啉的泛HER抑制剂，其不可逆地阻断通过HER家族的酪氨酸激酶受体(包括HER1、HER2和HER4)的信号传递。波齐替尼或结构类似的化合物(例如，美国专利号8,188,102和美国专利公开号20130071452；通过引用并入本文)可以用于本方法中。
波齐替尼，如波齐替尼盐酸盐，可以例如以片剂形式口服施用。波齐替尼可以以4mg-25mg的剂量，例如以5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg、16mg、17mg、18mg、19mg、20mg、21mg、22mg、23mg或24mg的剂量施用。可以每天、每隔一天、每3天或每周一次施用。可以按连续时间表，如28天为一个周期给药。
在一些方面，可对具有T790突变(例如T790M)的受试者施用奥希替尼，并且可对具有C797突变(例如C797S)的受试者施用如本文所述化疗和/或放疗。可以单独或联合波齐替尼施用奥希替尼、化疗和/或放疗。可以以25mg至100mg，例如约40mg或80mg的剂量施用奥希替尼。可以每天、每隔一天、每2天、每3天或每周一次给药。奥希替尼可以例如以片剂形式口服施用。
A.药物组合物
本文还提供了包括波齐替尼和药学上可接受的载体的药物组合物和制剂，用于被确定具有耐药性EGFR突变的受试者。
可以通过将具有所需纯度的活性成分(例如抗体或多肽)与一种或多种任选的药学上可接受的载体(Remington's Pharmaceutical Sciences 22nd edition(雷明顿药物学，第22版),2012)混合来制备冻干制剂或水溶液形式的本文所述药物组合物和制剂。药学上可接受的载体在所采用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，包括但不限于：缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反离子，例如钠；金属配合物(例如锌-蛋白质配合物)；和/或非离子表面活性剂，例如聚乙二醇(PEG)。本文的示例性药学上可接受的载体还包括间质药物分散剂，例如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如可溶性人PH-20透明质酸酶糖蛋白，例如rHuPH20(
Figure BDA0003415053570000201
Baxter International,Inc.)。某些示例性sHASEGP(包括rHuPH20)和使用方法描述于美国专利公开号2005/0260186和2006/0104968中。一方面，sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶如软骨素酶组合。
B.组合疗法
在某些实施方案中，本发明实施方案的组合物和方法涉及与至少一种另外的疗法组合的波齐替尼。另外的疗法可以是放疗、手术(例如，乳房肿瘤切除术和乳房切除术)、化疗、基因疗法、DNA疗法、病毒疗法、RNA疗法、免疫疗法、骨髓移植、纳米疗法、单克隆抗体疗法或前述疗法的组合。另外的疗法可以为辅助疗法或新辅助疗法的形式。
在一些实施方案中，另外的疗法是施用小分子酶抑制剂或抗转移剂。在一些实施方案中，另外的疗法是施用副作用限制剂(例如，旨在减少治疗副作用的发生和/或严重程度的药剂，例如止吐剂等)。在一些实施例中，另外的疗法是放疗。在一些实施方案中，另外的疗法是手术。在一些实施方案中，另外的疗法是放疗与手术的组合。在一些实施方案中，另外的疗法是γ辐射。在一些实施方案中，另外的疗法是靶向PBK/AKT/mTOR途径、HSP90抑制剂、微管蛋白抑制剂、凋亡抑制剂和/或化学预防剂的疗法。另外的疗法可以是本领域已知的一种或多种化学治疗剂。
相对于另外的癌症疗法，例如免疫检查点疗法，可以在各种组合之前、期间、之后或以各种组合施用波齐替尼。施用间隔可以从同时到几分钟到几天到几周。在将波齐替尼与另外的治疗剂分开提供给患者的实施方案中，通常会确保在每次递送之间没有很长的时间段，使得这两种化合物仍能够对患者产生有利的联合效果。在这种情况下，预期可以在彼此相隔约12-24或72小时内，更具体而言，彼此相隔约6-12小时内向患者提供抗体疗法和抗癌疗法。在一些情况下，如果各自施用之间间隔几天(2、3、4、5、6或7)到几周(1、2、3、4、5、6、7、或8)，可能需要显著延长治疗时间。
可以采用各种组合。对于下文的实例而言，波齐替尼为“A”，抗癌疗法为“B”：
Figure BDA0003415053570000211
考虑到药剂的毒性(如果有的话)，将本实施方案的任何化合物或疗法施用至患者应当遵循用于施用此类化合物的一般方案。因此，在一些实施方案中，存在监测可归因于联合疗法的毒性的步骤。
1.化疗
根据本发明的实施方案，可以使用各种各样的化学治疗剂。术语“化疗”是指使用药物治疗癌症。“化学治疗剂”用于表示在癌症治疗中施用的化合物或组合物。这些药剂或药物根据其在细胞内的活性模式来分类，例如，它们是否以及在哪个阶段影响细胞周期。或者，药剂可基于其直接交联DNA、嵌入DNA或通过影响核酸合成诱导染色体和有丝分裂畸变的能力来表征。
化疗剂的实例包括烷化剂，例如噻替哌和环磷酰胺；烷基磺酸盐，如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶类，如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌、美托替呢(meturedopa)和瑞多巴(uredopa)；乙烯亚胺和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三亚乙基硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；多聚乙酰(acetogenin)(尤其是布拉他辛和布拉他辛酮)；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康)；苔藓抑素；卡利司他丁(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；念珠藻素(cryptophycin)(特别是念珠藻素1和念珠藻素8)；尾海兔素(dolastatin)；倍癌霉素(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；五加素(eleutherobin)；水鬼蕉碱；肉球菌素(sarcodictyin)；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、盐酸甲氧氮芥、美法仑、新恩比兴、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺和乌拉莫司汀；亚硝基脲类，例如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷尼司汀(ranimnustine)；抗生素类，例如烯二炔抗生素类(例如，卡奇霉素(calicheamicin)，尤其是卡奇霉素γlI和卡奇霉素ωI1)；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素A；双膦酸盐，例如氯膦酸盐；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新制癌素生色团和相关的色蛋白烯二炔抗生素生色团、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素、安曲霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C(cactinomycin)、卡拉比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素、放线菌素D(dactinomycin)、道诺霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素(包括吗啉代-阿霉素、氰基吗啉代-阿霉素、2-吡咯并-阿霉素和脱氧阿霉素)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素例如丝裂霉素C、霉酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星、链霉黑素、链脲霉素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁和佐柔比星；抗代谢物，例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸、蝶罗呤和三甲曲沙；嘌呤类似物，例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤和硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨和氟尿苷；雄激素，例如卡普睾酮、屈他雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷和睾内酯；抗肾上腺素，例如米托坦和曲洛司坦；叶酸补充剂，例如弗林酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶、阿莫斯汀(bestrabucil)；比生群；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺；亚丝醌；艾氟米辛(elformithine)；依利醋铵；埃博霉素；乙环氧啶；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明(lonidainine)；美登素类，例如美登木素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫达醇(mopidanmol)；二胺硝呢(nitraerine)；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基酰肼；甲基苄肼；PSK多糖复合物；雷佐生；根霉素；西佐喃；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯毒素(尤其是T-2毒素、犹孢菌素A(verracurin A)、漆斑菌素A和蛇形菌素(anguidine))；氨基甲酸乙酯；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；伽胞嘧啶；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；紫杉烷类，例如紫杉醇和多西他赛、吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；铂配位化合物，例如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春花碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺凡特龙(novantrone)；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；伊立替康(例如，CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇类，例如视黄酸；卡培他滨；卡铂、甲基苄肼、普卡霉素、吉西他滨、诺维苯(navelbine)、法呢基-蛋白转移酶抑制剂、反铂(transplatinum)和任何上述物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
2.放疗
导致DNA损伤并已被广泛使用的其他因素包括通常已知的γ射线、X射线和/或放射性同位素向肿瘤细胞的定向递送。还考虑了其他形式的DNA损伤因素，例如微波、质子束照射(美国专利第5,760,395号和第4,870,287号)和紫外线照射。很可能所有这些因素都会对DNA、对DNA前体、对DNA复制和修复以及对染色体的组装和维持产生广泛的损伤。X射线的剂量范围从每天50-200伦琴的长时间(3-4周)剂量到2000-6000伦琴的单次剂量。放射性同位素的剂量范围变化很大，并取决于同位素的半衰期、发射辐射的强度和类型以及肿瘤细胞的吸收。
3.免疫疗法
本领域技术人员应当理解，另外的免疫疗法可以与实施方案的方法组合或结合使用。在癌症治疗的背景下，免疫疗法通常依赖于免疫效应细胞以及靶向和破坏癌细胞的分子的使用。利妥昔单抗
Figure BDA0003415053570000231
就是这样实例。免疫效应物可以是，例如，对肿瘤细胞表面上的一些标志物具有特异性的抗体。单独的抗体可以作为治疗的效应物，或者它可以招募其他细胞来实际影响细胞杀伤。抗体还可以与药物或毒素(化学治疗剂、放射性核素、蓖麻毒蛋白A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)缀合并用作靶向剂。或者，效应物可以是携带直接或间接与肿瘤细胞靶标相互作用的表面分子的淋巴细胞。各种效应细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。
抗体-药物缀合物已成为开发癌症治疗剂的突破性方法。癌症是世界上导致死亡的主要原因之一。抗体药物缀合物(ADC)包含与细胞杀伤药物共价连接的单克隆抗体(MAb)。这种方法将MAb对其抗原靶标的高特异性与高效细胞毒性药物相结合，从而产生将有效载荷(药物)递送至具有富集水平的抗原的肿瘤细胞的“武装的”MAb。药物的靶向递送也最大限度地减少了其在正常组织中的暴露，从而降低了毒性并提高了治疗指数。FDA批准的两种ADC药物，即2011年批准的
Figure BDA0003415053570000241
(维布妥昔单抗(brentuximab vedotin))和2013年批准的
Figure BDA0003415053570000242
(曲妥珠单抗美坦新偶联物(trastuzumab emtansine)或T-DM1)验证了该方法。目前有30多种ADC候选药物处于癌症治疗临床试验的各个阶段(Lealet al.,2014)。随着抗体工程和接头-有效载荷(linker-payload)优化越来越成熟，新ADC的发现和开发越来越依赖于适合这种方法的新靶标的鉴定和验证以及靶向MAb的生成。ADC靶标的两个标准是在肿瘤细胞中的表达上调/高水平和稳健的内化。
在免疫疗法的一个方面，肿瘤细胞必须携带适合靶向，即不存在于大多数其他细胞上的某标志物。存在许多肿瘤标志物，并且在本实施方案的背景中，这些标志物中的任何一种都可能适合被靶向。常见的肿瘤标志物包括CD20、癌胚抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸化路易斯抗原(Sialyl Lewis Antigen)、MucA、MucB、PLAP、层黏连蛋白受体、erb B和p155。免疫疗法的另一方面是将抗癌作用与免疫刺激作用相结合。还存在免疫刺激分子，包括：细胞因子，例如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFN、趋化因子,例如MIP-1、MCP-1、IL-8，以及生长因子,例如FLT3配体。
免疫疗法的实例包括免疫佐剂，例如牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、二硝基氯苯和芳香族化合物(美国专利第5,801,005号和第5,739,169号；Hui and Hashimoto,1998；Christodoulides et al.,1998)、细胞因子疗法，例如干扰素α、β和γ，IL-1、GM-CSF和TNF(Bukowski et al.,1998；Davidson et al.,1998；Hellstrand et al.,1998)；基因疗法，例如TNF、IL-1、IL-2和p53(Qin et al.,1998；Austin-Ward和Villaseca,1998；美国专利第5,830,880号和第5,846,945号)；以及单克隆抗体，例如抗CD20、抗神经节苷脂GM2和抗p185(Hollander,2012；Hanibuchi et al.,1998；美国专利第5,824,311号)。预期一种或多种抗癌疗法可与本文所述的抗体疗法一起使用。
在一些实施方案中，免疫疗法可以是免疫检查点抑制剂。免疫检查点要么调高信号(例如，共刺激分子)要么降低信号。免疫检查点阻断可以靶向的抑制性免疫检查点包括腺苷A2A受体(A2AR)、B7-H3(也称为CD276)、B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4，也称为CD152)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、杀伤细胞免疫球蛋白(KIR)、淋巴细胞活化基因3(LAG3)、程序性死亡因子1(PD-1)、T细胞免疫球蛋白结构域和黏蛋白结构域3(TIM-3)和T细胞激活抑制物Ig V结构域(VISTA)。特别地，免疫检查点抑制剂靶向PD-1轴和/或CTLA-4。
免疫检查点抑制剂可以是药物例如小分子、配体或受体的重组形式，或者特别地是抗体，例如人抗体(例如，国际专利公开WO2015016718；Pardoll,Nat Rev Cancer,12(4):252-64,2012；两者均通过引用并入本文)。可以使用免疫检查点蛋白或其类似物的已知抑制剂，特别是可以使用嵌合、人源化或人源形式的抗体。如技术人员应当知道的，本公开中提及的某些抗体可使用替代名称和/或等效名称。在本发明的上下文中，这类替代和/或等效名称是可互换的。例如，众所周知，帕博利珠单抗(lambrolizumab)也以替代和等效名称MK-3475和派姆单抗(pembrolizumab)为人所知。
在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抑制PD-1与其配体结合配偶体结合的分子。在具体方面，PD-1配体结合配偶体是PDL1和/或PDL2。在另一个实施方案中，PDL1结合拮抗剂是抑制PDL1与其结合配偶体结合的分子。在具体方面，PDL1结合配偶体是PD-1和/或B7-1。在另一个实施方案中，PDL2结合拮抗剂是抑制PDL2与其结合配偶体结合的分子。在具体方面，PDL2结合配偶体是PD-1。拮抗剂可以是抗体、其抗原结合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。示例性抗体描述于美国专利号8,735,553、8,354,509和8,008,449中，上述专利均通过引用并入本文。用于本文提供的方法中的其他PD-1轴拮抗剂是本领域已知的，例如美国专利公开号US20140294898、US2014022021和US20110008369中描述的，上述专利公开均通过引用并入本文。
在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抗PD-1抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)。在一些实施方案中，抗PD-1抗体选自纳武单抗、派姆单抗和CT-011。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是免疫黏附素(例如，包含PDL1或PDL2的融合到恒定区(例如，免疫球蛋白序列的Fc区)的细胞外部分或PD-1结合部分的免疫黏附素)。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是AMP-224。纳武单抗，也称为MDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558和
Figure BDA0003415053570000262
是描述于WO2006/121168中的抗PD-1抗体。派姆单抗，也称为MK-3475、Merck3475、帕博利珠单抗、
Figure BDA0003415053570000261
和SCH-900475，是描述于WO2009/114335中的抗PD-1抗体。CT-011，也称为hBAT或hBAT-1，是描述于WO2009/101611中的抗PD-1抗体。AMP-224，也称为B7-DCIg，是描述于WO2010/027827和WO2011/066342中的PDL2-Fc融合可溶性受体。
可以在本文提供的方法中靶向的另一免疫检查点是细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)，也称为CD152。人CTLA-4的完整cDNA序列的Genbank登录号为L15006。CTLA-4存在于T细胞表面，且当与抗原呈递细胞表面的CD80或CD86结合时充当“关闭”开关。CTLA4是在辅助性T细胞表面表达并向T细胞传递抑制信号的免疫球蛋白超家族成员。CTLA4类似于T细胞共刺激蛋白CD28，且这两种分子都与抗原呈递细胞上的CD80和CD86(也分别称为B7-1和B7-2)结合。CTLA4向T细胞传递抑制信号，而CD28则传递刺激信号。细胞内CTLA4也存在于调节性T细胞中，且可能对其功能很重要。通过T细胞受体和CD28激活T细胞会导致CTLA-4即B7分子的抑制性受体的表达增加。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗CTLA-4抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。
可以使用本领域公知的方法生成适用于本发明方法的抗人CTLA-4抗体(或从其衍生的VH和/或VL结构域)。或者，可以使用本领域公认的抗CTLA-4抗体。例如，本文公开的方法可以使用以下公开的抗CTLA-4抗体：美国专利第8,119,129号；国际专利公开号WO 01/14424、WO 98/42752和WO 00/37504(CP675,206，也称为曲美木单抗(tremelimumab)；以前称为替西木单抗(ticilimumab))；美国专利第6,207,156号；Hurwitz et al.,1998；Camacho et al.,2004；以及Mokyr et al.,1998。每一前述出版物的教导均在此通过引用并入。也可以使用与任何这些本领域公认的抗体竞争结合CTLA-4的抗体。例如，人源化CTLA-4抗体描述于国际专利申请号WO2001014424和WO2000037504以及美国专利第8,017,114号中；其全部通过引用并入本文。
示例性抗CTLA-4抗体是伊匹单抗(也称为10D1、MDX-010、MDX-101和
Figure BDA0003415053570000271
)或其抗原结合片段和变体(参见，例如，WO 01/14424)。在其他实施方案中，该抗体包含伊匹单抗的重链和轻链CDR或VR。因此，在一个实施方案中，该抗体包含伊匹单抗VH区的CDR1、CDR2和CDR3结构域以及伊匹单抗VL区的CDR1、CDR2和CDR3结构域。在另一个实施方案中，该抗体与上述抗体竞争结合CTLA-4上的相同表位。在另一个实施方案中，该抗体与上述抗体具有至少约90％的可变区氨基酸序列同一性(例如，与伊匹单抗具有至少约90％、95％或99％的可变区同一性)。
用于调节CTLA-4的其他分子包括：CTLA-4配体和受体(例如美国专利号5,844,905、5,885,796和国际专利申请号WO1995001994和WO1998042752中描述的，其全部通过引用并入本文)和免疫黏附素(例如美国专利号8,329,867中描述的，其通过引用并入本文)。
4.手术
大约60％的癌症患者会接受某些类型的手术，这包括预防性、诊断性或分期、治愈性和姑息性手术。治愈性手术包括切除术，其中全部或部分癌性组织被物理去除、切除和/或破坏并且可以与其他疗法结合使用，例如本发明实施方式的疗法、化疗、放疗、激素疗法、基因疗法、免疫疗法和/或替代疗法。肿瘤切除是指物理切除至少一部分肿瘤。除肿瘤切除术外，手术治疗还包括激光手术、冷冻手术、电外科和通过显微镜控制的手术(莫氏手术(Mohs’surgery))。
在切除部分或全部癌性细胞、组织或肿瘤后，可在体内形成空腔。治疗可以通过灌注、直接注射或其他抗癌疗法的局部区域应用来完成。此类治疗可重复，例如每1、2、3、4、5、6或7天，或每1、2、3、4和5周或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。这些治疗也可以具有不同的剂量。
5.其他剂
预期其他剂可与本发明实施方案的某些方面组合使用，以提高治疗的疗效。这些另外的剂包括影响细胞表面受体和细胞间隙连接(GAP junction)的上调的剂、细胞生长抑制剂和分化剂、细胞黏附抑制剂、增加过度增殖细胞对凋亡诱导剂的敏感性的剂或其他生物剂。通过提高细胞间隙连接的数量来增加细胞间信号传导会增加对邻近过度增殖细胞群的抗过度增殖作用。在其他实施方案中，细胞生长抑制剂或分化剂可与本发明实施方案的某些方面组合使用，以提高治疗的抗过度增殖功效。考虑了细胞黏附抑制剂来提高本发明实施方案的功效。细胞黏附抑制剂的实例是黏着斑激酶(FAK)抑制剂和洛伐他汀。还预期，增加过度增殖细胞对凋亡的敏感性的其他剂，例如抗体c225，可以与本发明实施方案的某些方面组合使用，以提高治疗功效。
IV.试剂盒
用于检测奥希替尼耐药性EGFR突变(例如本文公开的那些突变)的试剂盒也在本公开的范围内。这种试剂盒的实例可以包括一组奥希替尼耐药性EGFR突变特异性引物。该试剂盒还可以包括使用引物检测本文所述具体奥希替尼耐药性EGFR突变的存在或不存在的说明书。该试剂盒还可以包括用于诊断目的的说明书，其指出在来自癌症患者的样品中对本文所述奥希替尼耐药性EGFR突变的阳性鉴定表明对酪氨酸激酶抑制剂波齐替尼或结构相似的抑制剂的敏感性。该试剂盒还可以包括这样的说明书，该说明书指出在来自癌症患者的样品中对本文所述奥希替尼耐药性EGFR突变的阳性鉴定表明患者应该用波齐替尼或结构相似的抑制剂治疗。
V.实施例
包括以下实施例以说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当理解，以下实施例中公开的技术遵循发明人发现的在本发明的实践中发挥良好作用的技术，因此可以视为构成其实施的优选模式。然而，本领域技术人员根据本公开应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对公开的具体实施方案进行许多改变，且这些改变仍然获得类似或相似的结果。
实施例1-鉴定具有奥希替尼耐药性EGFR突变的癌细胞的药物
产生表达奥希替尼或厄洛替尼耐药突变的一组Ba/F3细胞系，所述耐药突变包括跨越外显子18-21的非典型EGFR突变和经典EGFR突变。然后通过剥夺IL-3后的持续细胞活力来评估突变的转化能力。然后针对波齐替尼筛选激活性EGFR突变型Ba/F3细胞。通过CellTiter Glo测定确定细胞活力。
波齐替尼抑制表达非典型突变如L861Q、G719S、L858R/L792H、L858R/C797S和Ex19del/C797S的Ba/F3细胞系的增殖，IC50值<3nM。对额外的新发耐药突变如I740duplPVAIK的计算机建模显示，受体激酶铰链的变化可能会阻止奥希替尼结合，但药物结合口袋中更深的残基与波齐替尼结合，不受影响。对突变型EGFR的计算机建模表明外显子18的P环对奥希替尼很重要，但对波齐替尼结合不重要(图1)。对与EGFR外显子19del(E746_A7450del)结合的奥希替尼的计算机建模在奥希替尼的吲哚环和EGFR外显子18的P环(包括氨基酸V726和F723)之间具有明显的π堆积相互作用。波齐替尼进一步延伸进入与包括T790在内的疏水裂缝相互作用的药物结合口袋中。EGFR G719S与波齐替尼的计算机建模显示，波齐替尼结合或TKI-蛋白质相互作用没有预测的变化(图1C)。L719Q突变的分子建模表明Q719阻碍了奥希替尼与M793的相互作用，并使迈克尔受体(反应基团)移出与C797不对齐。相比之下，即使在L719Q突变的情况下，波齐替尼受Q719的影响也较小，并且仍然取与C797反应的位置(图1D)。
图2A表明，波齐替尼在体外比奥希替尼对非典型EGFR突变更有效且更具选择性。此外，已经表明非典型的P环外显子18突变在体内导致对奥希替尼而不是波齐替尼的原发性耐药(图3A)。
进一步的研究表明，获得性非典型突变驱动对奥希替尼的耐药性，但对喹唑啉TKI敏感，并且同时发生的突变的药物敏感性/耐药性图谱可能是由原发突变驱动的(图4)。
因此，波齐替尼是新发和获得性非典型奥希替尼耐药性EGFR突变型NSCLC(包括L861Q、G719S、L858R/L792H、L858R/C797S和Exl9del/C797S)的有效抑制剂。目前的研究表明，第二代TKI，尤其是波齐替尼，克服了非典型EGFR突变型NSCLC中的奥希替尼耐药性。
表1：用波齐替尼或奥希替尼治疗72小时后，表达所示原发非典型突变的Ba/F3细胞的IC50值
Figure BDA0003415053570000301
Figure BDA0003415053570000311
Figure BDA0003415053570000321
表2：在用波齐替尼或奥希替尼治疗72小时后，表达所示获得性非典型突变的Ba/F3细胞的IC50值。
Figure BDA0003415053570000322
表3：用于产生Ba/F3细胞系的突变和序列的列表。
Figure BDA0003415053570000331
Figure BDA0003415053570000341
Figure BDA0003415053570000351
Figure BDA0003415053570000361
实施例2-材料和方法
Ba/F3细胞系产生和IL-3剥夺：如前所述(Robichauxetal等人，2018)创建Ba/F3细胞系。简而言之，通过逆转录病毒转导Ba/F3细胞系12小时来产生稳定的Ba/F3细胞系。逆转录病毒是通过使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)将表1中总结的基于pBabe-Puro的载体(Addgene和Bioinnovatise)转染到Phoenix 293T-ampho细胞(Orbigen)中来产生的。转导三天后，将2μg/ml嘌呤霉素(Invitrogen)添加到RPMI培养基中。然后细胞系在不存在IL-3的情况下生长两周，并且每三天使用Cell Titer Glo测定(Progema)评估细胞活力。将得到的稳定细胞系维持在含有10％FBS且不含IL-3的RPMI-1640培养基中。
细胞活力测定和IC50估算：如前所述，使用Cell Titer Glo测定(Promega)确定细胞成活力(Robichaux等人，2018年)。简而言之，将每孔2000-3000个细胞铺于384孔板(Greiner Bio-One)中，一式三份。用7种不同浓度的酪氨酸激酶抑制剂或单独的溶媒处理细胞，终体积40μL/孔。3天后，向每个孔中加入11μL Cell Titer Glo。摇晃平板15分钟，使用FLUOstar OPTIMA多模式酶标仪(BMG LABTECH)确定生物发光。将生物发光值针对DMSO处理的细胞归一化，并使用非线性回归拟合具有可变斜率的归一化数据，在GraphPad Prism中对归一化值作图。通过GraphPad Prism计算50％抑制时的IC50值。
根据本公开，本文公开和要求保护的所有方法可以在没有过度实验的情况下进行和执行。虽然已经根据优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但对本领域技术人员来说明显的是，可以在不脱离本发明的概念、精神和范围的情况下，对本文所述方法和所述方法的步骤或步骤顺序进行改变。更具体地，显然，某些化学和生理学相关的剂可以替代本文所述的剂，同时会获得相同或相似的结果。所有这些对本领域技术人员明显的类似替代和修改都视为落入所附权利要求书所定义的本发明的精神、范围和概念内。
参考文献
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Claims (82)

1.一种治疗受试者的癌症的方法，包括向所述受试者施用有效量的波齐替尼，其中已确定所述受试者具有一个或多个表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(TKI)耐药性突变。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述波齐替尼被进一步确定为波齐替尼盐酸盐。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述波齐替尼盐酸盐被配制成片剂。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述一个或多个EGFR TKI耐药性突变包括外显子18、19、20或21处的点突变、插入和/或缺失1-18个核苷酸。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述一个或多个EGFR TKI耐药性突变包括外显子18的氨基酸688-728之间的一个或多个点突变、插入和/或缺失3-18个核苷酸。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述一个或多个EGFR外显子18突变位于一个或多个选自由E709、L718、G719、S720和G724组成的组的残基处。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述一个或多个EGFR外显子18突变位于一个或多个选自由E709、L718、G719、S720、G724和T725组成的组的残基处。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的方法，其中所述一个或多个EGFR外显子18突变包括E709A、L718Q、L718V、G719A、G719S、S720P和/或G724S。
9.根据权利要求5至8中任一项所述的方法，其中所述一个或多个EGFR外显子18突变包括E709A、E709K、L718Q、L718V、G719A、G719S、S720P、G724S和/或T725M。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述一个或多个EGFR TKI耐药性突变包括外显子19的氨基酸729-761之间的一个或多个点突变、插入和/或缺失3-18个核苷酸。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述一个或多个EGFR外显子19突变位于一个或多个选自由I744、L747、L747、A755、K757和/或D761组成的组的残基处。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中所述一个或多个EGFR外显子19突变位于一个或多个选自由I744、L747、L747、K754、A755、K757和/或D761组成的组的残基处。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的方法，其中所述一个或多个EGFR外显子19突变包括I744V、I744T、L747S、L747FS、A755T、K757R和/或D761N。
14.根据权利要求10至13中任一项所述的方法，其中所述一个或多个EGFR外显子19突变包括I744V、I744T、L747S、L747P、L747FS、K754E、A755T、K757R和/或D761N。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述一个或多个EGFR TKI耐药性突变包括外显子20的氨基酸763-823之间的一个或多个点突变、插入和/或缺失3-18个核苷酸。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述一个或多个EGFR外显子20突变位于一个或多个选自由A763、S768、V769、H773、D770、V774、C775、S784、L792、G796、C797、S811和R776组成的组的残基处。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述一个或多个EGFR外显子20突变位于一个或多个选自由A763、A767、S768、V769、N771、H773、D770、V774、C775、S784、L792、G796、C797、S811和R776组成的组的残基处。
18.根据权利要求15至18中任一项所述的方法，其中所述一个或多个EGFR外显子20突变包括D770insNPG、S784F、R776C、S768I、V774M、S768I、H773insAH、H773insNPH、V774A、V769L、V769M、S768dupSVD、A763insLQEA、L792H、G796D、S784F、C775Y和/或S811F。
19.根据权利要求15至18中任一项所述的方法，其中所述一个或多个EGFR外显子20突变包括A767ASV、D770insNPG、S784F、R776C、S768I、V774M、S768I、H773insAH、H773insNPH、V774A、V769L、V769M、S768dupSVD、A763insLQEA、N771dupN、R776H、L792H、G796D、S784F、C775Y和/或S811F。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述一个或多个EGFR TKI耐药性突变包括外显子21的氨基酸824-875之间的一个或多个点突变、插入和/或缺失3-18个核苷酸。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述一个或多个EGFR外显子21突变位于一个或多个选自由L833、V834、G836、V843、T854、L861、L861、L862、L844和L858组成的组的残基处。
22.根据权利要求20或21所述的方法，其中所述一个或多个EGFR外显子21突变可包括L833F、V834L、L858R、L861Q、V843I、L861R、L862V、L844V、L861Q、G836S和/或T854I。
23.根据权利要求20至22中任一项所述的方法，其中所述一个或多个EGFR外显子21突变可包括L833F、L833V、V834L、L858R、L861Q、V843I、L861R、L862V、L844V、L861Q、G836S和/或T854I。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中已确定所述受试者具有2、3或4个EGFR TKI耐药性突变。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述受试者先前已被施用TKI。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述受试者对先前施用的TKI耐药。
27.根据权利要求25或26所述的方法，其中所述TKI是拉帕替尼、阿法替尼、达克替尼、奥希替尼、依鲁替尼、纳扎替尼、奥莫替尼、诺司替尼、纳古替尼(naquotinib)或来那替尼(neratinib)。
28.根据权利要求25至27中任一项所述的方法，其中所述TKI是奥希替尼、依鲁替尼、纳扎替尼、奥莫替尼、诺司替尼或纳古替尼。
29.根据权利要求25至28中任一项所述的方法，其中所述TKI是奥希替尼。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的方法，其中所述一个或多个EGFR TKI耐药性突变位于残基E709、L718、G719、G724、C797、V843、T854、L861和/或L792处。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的方法，其中已确定所述受试者在残基C797或T790处不具有EGFR突变。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的方法，其中确定所述受试者在残基T790处不具有EGFR突变。
33.根据权利要求1至30中任一项所述的方法，其中所述受试者具有T790突变。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述受试者具有与至少一个额外突变组合的T790突变。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述受试者具有T790M和G719A突变。
36.根据权利要求34所述的方法，其中所述受试者具有T790M和G719S突变。
37.根据权利要求32至36中任一项所述的方法，其中确定所述受试者在残基C797处具有突变。
38.根据权利要求1至37中任一项所述的方法，其中所述一个或多个EGFR TKI耐药性突变选自由G719X、E709X、G724S、L718X、L861Q、T8541、V8431、C797S和/或L792X组成的组，其中X是任何氨基酸。
39.根据权利要求1至38中任一项所述的方法，其中所述一个或多个EGFR TKI耐药性突变选自由L861Q、G719S、L858R/L792H、L858R/C797S和Ex19del/C797S组成的组。
40.根据权利要求1至39中任一项所述的方法，其中通过分析来自患者的基因组样本确定所述受试者具有EGFR TKI耐药性突变。
41.根据权利要求41所述的方法，其中所述基因组样本是从唾液、血液、尿液、正常组织或肿瘤组织中分离的。
42.根据权利要求1至41中任一项所述的方法，其中通过核酸测序或PCR分析确定EGFRTKI耐药性突变的存在。
43.根据权利要求1至42中任一项所述的方法，其中所述波齐替尼被口服施用。
44.根据权利要求1至43中任一项所述的方法，其中所述波齐替尼以5-25mg的剂量施用。
45.根据权利要求1至44中任一项所述的方法，其中所述波齐替尼以8mg、12mg或16mg的剂量施用。
46.根据权利要求1至45中任一项所述的方法，其中所述波齐替尼每天施用。
47.根据权利要求1至46中任一项所述的方法，其中所述波齐替尼被连续施用。
48.根据权利要求1至47中任一项所述的方法，其中所述波齐替尼以28天的周期施用。
49.根据权利要求1至48中任一项所述的方法，还包括施用额外的抗癌疗法。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述额外的抗癌疗法是化疗、放疗、基因疗法、手术、激素疗法、抗血管生成疗法或免疫疗法。
51.根据权利要求49或50所述的方法，其中所述波齐替尼和/或抗癌疗法被静脉内、皮下、骨内、口服、经皮、以持续释放剂、控制释放剂、延迟释放剂、作为栓剂或舌下施用。
52.根据权利要求49至51中任一项所述的方法，其中施用所述波齐替尼和/或抗癌疗法包括局部、区域性或全身施用。
53.根据权利要求49至52中任一项所述的方法，其中所述波齐替尼和/或抗癌疗法施用两次或更多次。
54.根据权利要求1至53中任一项所述的方法，其中所述癌症是口腔癌、口咽癌、鼻咽癌、呼吸道癌、泌尿生殖器癌、胃肠癌、中枢或外周神经系统组织癌、内分泌或神经内分泌癌或造血系统癌、胶质瘤、肉瘤、恶性上皮肿瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、纤维瘤、脑膜瘤、脑癌、口咽癌、鼻咽癌、肾癌、胆囊癌、嗜铬细胞瘤、胰岛细胞癌、李-法美尼肿瘤、甲状腺癌、甲状旁腺癌、垂体瘤、肾上腺肿瘤、成骨肉瘤、多发性神经内分泌I型和II型肿瘤、乳腺癌、肺癌、头颈癌、前列腺癌、食道癌、气管癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、睾丸癌、结肠癌、直肠癌或皮肤癌。
55.根据权利要求1至54中任一项所述的方法，其中所述癌症是非小细胞肺癌。
56.根据权利要求1至55中任一项所述的方法，其中所述患者是人。
57.一种包含波齐替尼的药物组合物，用于被确定具有一个或多个EGFR TKI耐药性突变的受试者。
58.根据权利要求57所述的组合物，其中所述组合物进一步定义为口服组合物。
59.根据权利要求57或58所述的组合物，其中所述组合物包含5-25mg波齐替尼。
60.根据权利要求57或58所述的组合物，其中所述组合物包含8mg、12mg或16mg波齐替尼。
61.根据权利要求57所述的组合物，其中所述波齐替尼被进一步确定为波齐替尼盐酸盐。
62.根据权利要求57或58所述的组合物，其中所述组合物被配制成片剂。
63.根据权利要求57至62中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个EGFR TKI耐药性突变包括外显子18、19、20或21处的点突变、插入和/或缺失1-18个核苷酸。
64.根据权利要求57至63中任一项所述的组合物，其中已确定所述受试者具有2、3或4种EGFR TKI耐药性突变。
65.根据权利要求57至64中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个EGFR TKI耐药性突变位于残基E709、L718、G719、G724、C797、V843、T854、L861和/或L792处。
66.根据权利要求57至65中任一项所述的组合物，其中已确定所述受试者在残基C797或T790处不具有EGFR突变。
67.根据权利要求57至66中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个EGFR TKI耐药性突变选自由G719X、E709X、G724S、L718X、L861Q、T8541、V8431、C797S和/或L792X组成的组，其中X是任何氨基酸。
68.根据权利要求57至67中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个EGFR TKI耐药性突变选自由L861Q、G719S、L858R/L792H、L858R/C797S和Ex19del/C797S组成的组。
69.根据权利要求57至68中任一项所述的组合物，其中所述受试者正在接受抗癌疗法治疗。
70.一种预测患有癌症的受试者对单独的波齐替尼或与第二种抗癌疗法联合使用的波齐替尼的反应的方法，包括在从所述患者获得的基因组样本中检测EGFR TKI耐药性突变，其中如果所述样本对所述EGFR TKI耐药性突变的存在呈阳性，则预测所述患者对单独的波齐替尼或与抗癌疗法联合使用的波齐替尼具有良好反应。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述EGFR TKI耐药性突变位于残基E709、L718、G719、G724、C797、V843、T854、L861和/或L792处。
72.根据权利要求70或71所述的方法，其中所述基因组样本是从唾液、血液、尿液、正常组织或肿瘤组织中分离的。
73.根据权利要求70至72中任一项所述的方法，其中通过核酸测序或PCR分析确定HER外显子21突变的存在。
74.根据权利要求70至73中任一项所述的方法，其中所述EGFR TKI耐药性突变选自由G719X、E709X、G724S、L718X、L861Q、T8541、V8431、C797S和/或L792X组成的组，其中X是任何氨基酸。
75.根据权利要求70至74中任一项所述的方法，其中所述EGFR TKI耐药性突变选自由L861Q、G719S、L858R/L792H、L858R/C797S和Ex19del/C797S组成的组。
76.根据权利要求70至75中任一项所述的方法，其中对单独的波齐替尼或与抗癌疗法联合使用的波齐替尼的良好反应包括减小肿瘤大小或负荷、阻断肿瘤生长、减少肿瘤相关疼痛、减少癌症相关病理学、减少癌症相关症状、癌症无进展、增加无病间隔、增加距进展的时间、诱导缓解、减少转移或增加患者存活率。
77.根据权利要求70至76中任一项所述的方法，还包括向被预测具有良好反应的所述患者施用单独的波齐替尼或与第二种抗癌疗法联合的波齐替尼。
78.根据权利要求70至77中任一项所述的方法，其中所述波齐替尼被口服施用。
79.根据权利要求70至78中任一项所述的方法，其中所述波齐替尼以5-25mg的剂量施用。
80.根据权利要求70至79中任一项所述的方法，其中所述波齐替尼以8mg、12mg或16mg的剂量施用。
81.根据权利要求70至80中任一项所述的方法，其中所述波齐替尼进一步确定为波齐替尼盐酸盐。
82.根据权利要求81所述的方法，其中所述波齐替尼盐酸盐被配制成片剂。
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