JP2022535816A - コラーゲン結合薬物担体を用いてがんを処置するための方法および組成物 - Google Patents

コラーゲン結合薬物担体を用いてがんを処置するための方法および組成物 Download PDF

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Abstract

本開示は、腫瘍微小環境への細胞毒性剤の効率的な送達によって改善された抗腫瘍効力をもたらす、腫瘍を標的とした薬物担体に関する。本開示の局面は、コラーゲン結合ドメインに機能的に連結されたアルブミンまたはIgG Fcドメインポリペプチドを含む、ポリペプチドに関する。さらなる局面は、本開示のポリペプチド、核酸、または細胞を含む組成物に関する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2019年6月3日付で出願された米国特許仮出願第62/856,468号の優先権の恩典を主張するものであり、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
II. 発明の分野
本発明は広くは、医学の分野に関する。より具体的には、本発明は、がんを処置するためのヌクレオチド構築体、タンパク質、および薬物担体を伴う組成物および方法に関する。
III. 背景
血清アルブミン(SA)は、血中で最も豊富なタンパク質である。低分子、ペプチド、およびサイトカインを含むいくつかの化合物は、疾患病変への改善された薬物送達のために、SAに融合され、コンジュゲートされ、またはSAと共製剤化されている。並外れて長いSAの血漿中半減期および/または親水性は、薬物の薬物動態、安全性、および効力の改善に寄与する。
ドキソルビシン(Dox)は、米国食品医薬品局(US Food and Drug Administration; FDA)によって広範囲のがんを処置するために承認されている低分子抗がん薬である。Doxは、受動膜貫通拡散を介して細胞内に内部移行し、DNA機能を妨害して、増殖中の細胞の死を引き起こす。Dox処置は一部の患者集団の生存を引き延ばすが、一つには薬剤耐性獲得のために、抗腫瘍効力は劇的ではない。不十分なDox治療指数も、その治療的使用を限定している。実際に、骨髄抑制、過度の炎症、および心臓毒性を含む、Doxのかなりの毒性が外来診察所において報告されている。Doxは、他の化学療法剤と組み合わせて用いられることが多い。Doxの効力および最大耐量を改善するための他のアプローチは、リポソーム製剤(Doxil)であり、循環血中SAのシステイン-34 (ヒト配列中)とのコンジュゲーションをインサイチューで達成するために開発された、pH感受性の切断可能なリンカーを有するDoxのマレイミド誘導体(アルドキソルビシン)の使用である。
腫瘍への細胞毒性剤の受動的なターゲティングのための戦略が開発されているが、非特異的な毒性を低減し、治療効果を達成するために必要な最小有効量を減少させながら細胞毒性剤の効力を増大しうる、よりターゲティングされた療法が当技術分野において必要とされている。
本明細書で、本発明者らは、腫瘍微小環境への細胞毒性剤の効率的な送達によって改善された抗腫瘍効力をもたらす、腫瘍を標的とした薬物担体について記述する。本開示の局面は、コラーゲン結合ドメインに機能的に連結されたアルブミンポリペプチドまたはIgG Fcドメインポリペプチドを含む、ポリペプチドに関する。さらなる局面は、本開示のポリペプチド、核酸、または細胞を含む組成物に関する。さらなる局面は、本開示のポリペプチドをコードする核酸に関する。さらなる局面は、本開示の核酸またはポリペプチドを含む細胞に関する。
本開示のさらなる局面は、細胞内で本開示の核酸を発現させる段階、および、発現されたポリペプチドを単離する段階を含む、ポリペプチドを作製するための方法に関する。
さらなる局面は、本開示のポリペプチド、核酸、または組成物を投与する段階を含む、がんを処置するための方法に関する。さらなる局面は、対象における細胞毒性剤を含む処置の非特異的毒性を低減するための方法であって、本開示のポリペプチドまたは組成物を対象に投与する段階を含む方法に関する。「非特異的毒性」という用語は、非がん性細胞の毒性または細胞死をいう。
さらなる局面は、対象の腫瘍における細胞毒性剤の蓄積を増加させるための方法であって、本開示のポリペプチド、核酸、または組成物を対象に投与する段階を含む方法に関する。
さらなる局面は、腫瘍血管系への細胞毒性剤のターゲティングされた送達のための方法であって、本開示のポリペプチドまたは組成物を対象に投与する段階を含む方法に関する。さらなる局面は、対象における腫瘍を処置する方法であって、本開示のポリペプチドまたは組成物を腫瘍または対象に投与する段階を含む方法に関する。いくつかの局面において、本方法は、腫瘍成長または腫瘍進行を阻害するためのものである。阻害は少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、99、もしくは100% (またはその中で導出可能な任意の範囲)、多くとも10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、99、もしくは100% (またはその中で導出可能な任意の範囲)、または約10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、99、もしくは100% (またはその中で導出可能な任意の範囲)でありうる。
いくつかの態様において、ポリペプチドは細胞毒性剤に機能的に連結されている。「機能的に連結された」という用語は、共有結合的または非共有結合的な付着をいう。いくつかの態様において、付着は共有結合性である。いくつかの態様において、付着は非共有結合性である。いくつかの態様において、ポリペプチドは細胞毒性剤に共有結合的に連結されている。いくつかの態様において、ペプチドは細胞毒性剤に非共有結合的に連結されている。いくつかの態様において、ポリペプチドは、切断可能なリンカーを通じて細胞毒性剤に連結されている。いくつかの態様において、切断可能なリンカーはpH切断可能なリンカーを含む。いくつかの態様において、リンカーはヒドラゾンリンカーを含む。いくつかの態様において、リンカーは7.4未満のpHで切断される。いくつかの態様において、リンカーは酸性pHで切断される。いくつかの態様において、リンカーの最適な切断は、4.5、5、5.5、6、もしくは6.5 (またはその中の任意の範囲)のpHである。最適な切断は、切断の少なくとも75、80、85、90、95、または99%が6、5、4、3、2、1、0.5、もしくは0.25時間未満(またはその中で導出可能な任意の範囲)の期間に溶液中でまたはインビトロで行われるpHをいう。いくつかの態様において、ポリペプチドは、二機能性リンカーを通じて細胞毒性剤および/またはコラーゲン結合ポリペプチドに連結されている。
いくつかの態様において、細胞毒性剤はドキソルビシンを含む。いくつかの態様において、細胞毒性剤はドキソルビシンの誘導体を含む。いくつかの態様において、細胞毒性剤はアルドキソルビシンを含む。いくつかの態様において、細胞毒性剤は、本明細書において記述される細胞毒性剤である。いくつかの態様において、細胞毒性剤は、ポリペプチドの投与の前にポリペプチドにコンジュゲートされる。いくつかの態様において、細胞毒性剤のインサイチューでのコンジュゲーションは除外される。
いくつかの態様において、ポリペプチドは、ペプチド結合を通じてコラーゲン結合ドメインに共有結合的に連結されている。いくつかの態様において、ポリペプチドは、デコリンまたはフォンヴィルブランド因子(vWF)由来のコラーゲン結合ドメインを含む。いくつかの態様において、コラーゲン結合ドメインは、SEQ ID NO:1またはその断片と少なくとも80%の同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの態様において、コラーゲン結合ドメインは、SEQ ID NO:1～4もしくは11～14、またはその断片と少なくとも70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%の同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの態様において、コラーゲン結合ドメインは、SEQ ID NO:1、またはその断片と少なくとも70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%の同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの態様において、コラーゲン結合ドメインは、SEQ ID NO:2、またはその断片と少なくとも70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%の同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの態様において、コラーゲン結合ドメインは、SEQ ID NO:3、またはその断片と少なくとも70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%の同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの態様において、コラーゲン結合ドメインは、SEQ ID NO:4、またはその断片と少なくとも70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%の同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの態様において、コラーゲン結合ドメインは、SEQ ID NO:11、またはその断片と少なくとも70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%の同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの態様において、コラーゲン結合ドメインは、SEQ ID NO:12、またはその断片と少なくとも70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%の同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの態様において、コラーゲン結合ドメインは、SEQ ID NO:13、またはその断片と少なくとも70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100%の同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの態様において、コラーゲン結合ドメインは、SEQ ID NO:14、またはその断片と少なくとも70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100%の同一性を有するポリペプチドを含む。
いくつかの態様において、ポリペプチドは、アルブミンポリペプチドに共有結合的に連結されている。いくつかの態様において、アルブミンポリペプチドは、SEQ ID NO:7～10の1つと少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100% (またはその中で導出可能な任意の範囲)の同一性を有するポリペプチドを含む。
いくつかの態様において、ポリペプチドは、IgG Fcドメインポリペプチドに共有結合的に連結されている。いくつかの態様において、IgG Fcドメインポリペプチドは、SEQ ID NO:15～18の1つと少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100% (またはその中で導出可能な任意の範囲)の同一性を有するポリペプチドを含む。
いくつかの態様において、コラーゲン結合ドメインは、アルブミンポリペプチドのアミノ末端にある。いくつかの態様において、コラーゲン結合ドメインは、アルブミンポリペプチドのカルボキシ末端にある。「アミノ末端に」または「カルボキシ末端に」という語句は、あるポリペプチドの別のポリペプチドに対する相対的な位置をいう。例えば、一方のポリペプチドが「アミノ末端に」ある場合、それは他方のポリペプチドのN末端アミン基に連結されている。しかしながら、2つのポリペプチドまたはドメインの間には介在配列がありうる。同様に、「カルボキシ末端にある」ポリペプチドは、別のポリペプチドまたはドメインのカルボキシ末端に連結されたポリペプチドをいう。いくつかの態様において、細胞毒性剤は、コラーゲン結合ドメインのアミノ末端に連結されている。いくつかの態様において、細胞毒性剤は、コラーゲン結合ドメインのカルボキシ末端に連結されている。いくつかの態様において、細胞毒性剤は、アルブミンポリペプチドのアミノ末端に連結されている。いくつかの態様において、細胞毒性剤は、アルブミンポリペプチドのカルボキシ末端に連結されている。いくつかの態様において、コラーゲン結合ドメインは、IgG Fcドメインポリペプチドのアミノ末端にある。
いくつかの態様において、コラーゲン結合ドメインは、IgG Fcドメインポリペプチドのカルボキシ末端にある。いくつかの態様において、細胞毒性剤は、コラーゲン結合ドメインのアミノ末端に連結されている。いくつかの態様において、細胞毒性剤は、コラーゲン結合ドメインのカルボキシ末端に連結されている。いくつかの態様において、細胞毒性剤は、IgG Fcドメインポリペプチドのアミノ末端に連結されている。いくつかの態様において、細胞毒性剤は、IgG Fcドメインポリペプチドのカルボキシ末端に連結されている。
いくつかの態様において、ポリペプチドは、IgG Fcドメインポリペプチドとコラーゲン結合ドメインとの間にリンカーを含む。いくつかの態様において、リンカーは、グリシンおよびセリンアミノ酸残基を含む。いくつかの態様において、リンカーは、GGGS、(GGGS)n、または(GGGS)2を含む。
いくつかの態様において、ポリペプチドは、アルブミンポリペプチドとコラーゲン結合ドメインとの間にリンカーを含む。いくつかの態様において、リンカーは、グリシンおよびセリンアミノ酸残基を含む。いくつかの態様において、リンカーは、GGGS、(GGGS)n、または(GGGS)2を含む。いくつかの態様において、nは2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12もしくはそれ以上(またはその中で導出可能な任意の範囲)である。
いくつかの態様において、ポリペプチドは、粒子、ナノベシクル、またはリポソームに機能的に連結されていない。いくつかの態様において、ポリペプチドは、ナノ粒子またはマイクロプレートもしくはビーズなどの固体支持体に機能的に連結されていない。いくつかの態様において、組成物は、リポソーム、粒子、またはナノベシクルを含まない。いくつかの態様において、組成物は、ナノ粒子またはマイクロプレートもしくはビーズなどの固体支持体を含まない。
いくつかの態様において、ポリペプチドは、少なくとも2つのコラーゲン結合ドメインを含む。いくつかの態様において、ポリペプチドは、少なくとも2、3、4、5、6、7、または8つのコラーゲン結合ドメインを含む。コラーゲン結合ドメインは、タンデムでありうるか、またはアルブミンポリペプチドもしくはIgG Fcドメインポリペプチドのアミノ末端およびカルボキシ末端の両方にありうる。
いくつかの態様において、細胞毒性剤とアルブミンとの比は3:1である。いくつかの態様において、細胞毒性剤とアルブミンとの比は、少なくとも0.5:1、1:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1、5:1、5.5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、もしくは10:1 (またはその中で導出可能な任意の範囲)、多くとも0.5:1、1:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1、5:1、5.5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、もしくは10:1 (またはその中で導出可能な任意の範囲)、または正確に0.5:1、1:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1、5:1、5.5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、もしくは10:1 (またはその中で導出可能な任意の範囲)である。いくつかの態様において、アルブミンポリペプチドとコラーゲン結合ドメインとの比は、1:1、1:2、1:3、1:4、4:1、3:1、もしくは2:1 (またはその中で導出可能な任意の範囲)である。
いくつかの態様において、細胞毒性剤とIgG Fcドメインとの比は3:1である。いくつかの態様において、細胞毒性剤とIgG Fcドメインとの比は、少なくとも0.5:1、1:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1、5:1、5.5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、もしくは10:1 (またはその中で導出可能な任意の範囲)、多くとも0.5:1、1:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1、5:1、5.5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、もしくは10:1 (またはその中で導出可能な任意の範囲)、または正確に0.5:1、1:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1、5:1、5.5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、もしくは10:1 (またはその中で導出可能な任意の範囲)である。いくつかの態様において、IgG Fcドメインポリペプチドとコラーゲン結合ドメインとの比は、1:1、1:2、1:3、1:4、4:1、3:1、もしくは2:1 (またはその中で導出可能な任意の範囲)である。
いくつかの態様において、対象はがんを有する。いくつかの態様において、対象は乳がんもしくは結腸がんを有するか、または腫瘍は乳房腫瘍もしくは結腸腫瘍である。いくつかの態様において、対象は、本明細書において記載されるがん、または本明細書において記載されるがん由来の腫瘍を有する。いくつかの態様において、がんまたは腫瘍は固形腫瘍を含む。いくつかの態様において、血液学的腫瘍またはがんは除外される。
いくつかの態様において、非特異的毒性は、アルブミンに連結されておりかつコラーゲン結合ドメインに連結されていない同じ細胞毒性剤の毒性と比較して低減される。例えば、非特異的毒性は、コラーゲン結合ドメインを含むポリペプチドにおいて、コラーゲン結合ドメインを有しない同じポリペプチドと比較して少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90、または95%だけ低減されうる。いくつかの態様において、腫瘍における細胞毒性剤の蓄積は、アルブミンに連結されておりかつコラーゲン結合ドメインに連結されていない同じ細胞毒性剤の用量と比較して増加する。いくつかの態様において、増加は少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90、または95%である。
いくつかの態様において、非特異的毒性は、IgG Fcドメインに連結されておりかつコラーゲン結合ドメインに連結されていない同じ細胞毒性剤の毒性と比較して低減される。例えば、非特異的毒性は、コラーゲン結合ドメインを含むポリペプチドにおいて、コラーゲン結合ドメインを有しない同じポリペプチドと比較して少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90、または95%だけ低減されうる。いくつかの態様において、腫瘍における細胞毒性剤の蓄積は、IgG Fcドメインに連結されておりかつコラーゲン結合ドメインに連結されていない同じ細胞毒性剤の用量と比較して増加する。いくつかの態様において、増加は少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90、または95%である。
いくつかの態様において、本方法は、さらなるがん療法の投与をさらに含む。いくつかの態様において、対象は免疫療法を受けているか、または受けるつもりである。いくつかの態様において、対象は、免疫療法に非応答性であると判定されている。いくつかの態様において、対象は難治性がんを有する。いくつかの態様において、対象は、以前の療法または以前の免疫療法に関連する毒性を経験した対象である。いくつかの態様において、本方法は、免疫療法の投与をさらに含む。いくつかの態様において、免疫療法はポリペプチドの前に、ポリペプチドの後に、またはポリペプチドと同時に投与される。いくつかの態様において、免疫療法は、チェックポイント阻害剤療法を含む。いくつかの態様において、チェックポイント阻害剤療法には単一のチェックポイント阻害剤療法が含まれ、これは1つのチェックポイント阻害剤のみが投与されることを示す。いくつかの態様において、チェックポイント阻害剤療法には組み合わせチェックポイント阻害剤療法が含まれ、これはPD-1に対する阻害剤およびCTLA-4に対する阻害剤などの、少なくとも2つのチェックポイント阻害剤が投与されることを示す。いくつかの態様において、チェックポイント阻害剤療法はPD-1抗体を含む。いくつかの態様において、チェックポイント阻害剤療法は、本明細書において記述される1つまたは複数のチェックポイント阻害剤を含む。
いくつかの態様において、ポリペプチドおよびさらなる療法は、同じ組成物中で投与される。いくつかの態様において、ポリペプチドおよびさらなる療法は、別個の組成物中で投与される。いくつかの態様において、本開示の組成物は、1つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤をさらに含む。いくつかの態様において、本開示の組成物は、PD-1抗体を含む。いくつかの態様において、本開示の組成物は、CTLA-4抗体を含む。 いくつかの態様において、本開示の組成物は、PD-1およびCTLA-4抗体を含む。
いくつかの態様において、ポリペプチドまたは組成物は、全身的に投与される。いくつかの態様において、ポリペプチドまたは組成物は、静脈内注射によって投与される。いくつかの態様において、ポリペプチドまたは組成物は、腫瘍内または腫瘍周囲に投与される。いくつかの態様において、ポリペプチドまたは組成物は、本明細書において記述される投与経路を通じて投与される。
いくつかの態様において、細胞毒性剤の投与用量は、コラーゲン結合ドメインにコンジュゲートされていない細胞毒性剤の最小有効量よりも少ない。いくつかの態様において、細胞毒性剤の投与用量は、コラーゲン結合ドメインにコンジュゲートされていない細胞毒性剤の最小有効量よりも少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、もしくは90% (またはその中で導出可能な任意の範囲)少ない。いくつかの態様において、細胞毒性剤の投与用量は、アルブミンポリペプチドにコンジュゲートされておりかつコラーゲン結合ドメインにコンジュゲートされていない細胞毒性剤の最小有効量よりも少ない。いくつかの態様において、細胞毒性剤の投与用量は、アルブミンポリペプチドにコンジュゲートされておりかつコラーゲン結合ドメインにコンジュゲートされていない細胞毒性剤の最小有効量よりも少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、もしくは90% (またはその中で導出可能な任意の範囲)少ない。いくつかの態様において、細胞毒性剤の投与用量は、IgG Fcドメインポリペプチドにコンジュゲートされておりかつコラーゲン結合ドメインにコンジュゲートされていない細胞毒性剤の最小有効量よりも少ない。いくつかの態様において、細胞毒性剤の投与用量は、IgG Fcドメインポリペプチドにコンジュゲートされておりかつコラーゲン結合ドメインにコンジュゲートされていない細胞毒性剤の最小有効量よりも少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、もしくは90% (またはその中で導出可能な任意の範囲)少ない。いくつかの態様において、対象は、細胞毒性剤で以前に処置されている。いくつかの態様において、対象は、以前の処置に非応答性であると判定されているか、または対象は以前の処置に対する非特異的毒性を経験している。いくつかの態様において、対象は、以前の療法に応答して2つ、3つ、4つ、または5つを超える免疫関連の有害事象を経験する。
いくつかの態様において、本開示の組成物およびポリペプチドは、細胞毒性剤のターゲティングされた送達を提供する。そのようなターゲティングされた送達は、コラーゲン結合ドメインを有しない同じポリペプチドを含む組成物と比較して心臓障害の低減、生存の延長、有効用量濃度の低減、腫瘍浸潤リンパ球の増加、CD8+細胞傷害性T細胞の増加、ナチュラルキラー細胞の増加、IFN-g、TNF-a、IL-5およびIL-6などの炎症性サイトカインの低減、または赤血球、白血球、ヘマトクリットおよび/もしくはヘモグロビン濃度の無害な低減を提供しうる。
「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語は、遺伝子産物をいう場合、本明細書において互換的に用いられる。
「対象」、「哺乳類」および「患者」という用語は互換的に用いられる。いくつかの態様において、対象は哺乳類である。いくつかの態様において、対象はヒトである。いくつかの態様において、対象はマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ロバまたは実験用被験動物、例えばショウジョウバエ、ゼブラフィッシュなどである。
いくつかの態様において、患者はがんの処置を以前に受けている。いくつかの態様において、対象は以前のがん処置に耐性であった。いくつかの態様において、対象は、以前のがん処置に対する不良応答者であると判定された。
方法および組成物は、本明細書において記述される態様のいずれかの除外を含むことが企図される。
本明細書において用いられる場合、「または」および「および/または」という用語は、複数の構成要素を組み合わせて、または互いに排他的に記述するために利用される。例えば、「x、y、および/またはz」は、「x」のみ、「y」のみ、「z」のみ、「x、y、およびz」、「(xおよびy)またはz」、「xまたは(yおよびz)」または「xまたはyまたはz」をいうことができる。x、y、またはzが態様から特に除外されうることが特に企図される。
本出願の全体を通じて、「約」という用語は、値にはその値を決定するために利用される装置または方法に対しての誤差の標準偏差が含まれることを示すために、細胞生物学の分野におけるその平易で通常の意味にしたがって用いられる。
「含む(including)」、「含有する(containing)」または「によって特徴付けられる」と同義である「含む(comprising)」という用語は、包括的または自由形式であり、さらなる、引用されていない要素または方法の段階を除外するものではない。「からなる」という語句は、指定されていない任意の要素、段階、または成分を除外する。「から本質的になる」という語句は、記述された主題の範囲を、特定の材料または段階およびその基本かつ新規の特徴に実質的に影響を与えないものに限定する。「含む(comprising)」という用語の文脈のなかで記述された態様はまた、「からなる(consisting of)」または「から本質的になる(consisting essentially of)」という用語の文脈のなかで実施されうることが企図される。
本発明の1つの態様に関して論じられた任意の制限が、本発明の他の任意の態様に適用されうることが特に企図される。さらに、本発明の任意の組成物が本発明の任意の方法において用いられてもよく、本発明の任意の組成物を作出または利用するために本発明の任意の方法が用いられてもよい。実施例に記載された態様の局面はまた、異なる実施例中の他所にまたは本出願中の他所に、例えば発明の概要、態様の詳細な説明、特許請求の範囲、および図の凡例の説明に論じられている態様の文脈において実施されうる態様である。
以下の図面は、本明細書の一部を構成し、本発明のある種の局面をさらに実証するために含められている。本発明は、これらの図面の1つまたは複数を本明細書に提示した具体的な態様の詳細な説明と併せて参照することによってよりよく理解されうる。
図1A～H Dox-CBD-SAの合成および特性評価。(A) CBD-SAを介した薬物送達の概略図。(B) Dox-CBD-SAの合成スキーム。(C) コラーゲンI型およびコラーゲンIII型に対するCBD-SAおよびSAの親和性(Kd値が示されている)をELISAによって測定した。N.D. = 低シグナルのため決定されなかった。[濃度] vs [シグナル]のグラフを図7に示す。2つの実験的複製。(D) タンパク質あたりのDoxコンジュゲーション比率が提示されている。値は、BCAタンパク質定量アッセイ(タンパク質)の結果および495 nmでの吸光度(Dox) (3回の実験的複製の平均 ± SD)に基づいて計算された。(E) 3つの異なるpH条件下でのDox-CBD-SAからのDox放出動態を、蛍光(495 nmでの励起、590 nmでの発光)によって評価した(n = 3、平均 ± SD。2つの実験的複製)。(F) MMTV-PyMT細胞を播種し、終夜インキュベートした。Dox、Dox-SAまたはDox-CBD-SAを加えた(赤色)。また、細胞をlysotracker (緑色)で染色した。スケールバー = 20 μm。代表的な写真が提示されている。2つの実験的複製。(G、H) インビトロでのMMTV-PyMT細胞またはMC38細胞に対するDox変種の細胞毒性(n = 6、平均 ± SEM)。2つの実験的複製。 図1-1の説明を参照されたい。 図2A～D Dox-CBD-SAは、Dox-SAと同等の血漿薬物動態を示し、アルドキソルビシンおよびDox-SAよりも高い腫瘍蓄積を示す。(A) アルドキソルビシン、Dox-SAまたはDox-CBD-SA (Doxベースで5 mg/kg)を尾静脈注射(i.v.)により、腫瘍のないFVBマウスに投与した。血漿を表示の時点で収集した。Doxの血漿中濃度を蛍光によって測定した(平均 ± SEM、アルドキソルビシンの場合n = 4、Dox-SAおよびDox-CBD-SAの場合n = 5)。(B) 指数関数的な二相崩壊: MFI (t) = Ae-αt + Be-βtを用いて、Doxの血漿中半減期を計算した。t1/2, α, 速いクリアランス半減期; t1/2, β, 遅いクリアランス半減期。(平均 ± SEM。アルドキソルビシンの場合n = 4、Dox-SAおよびDox-CBD-SAの場合n = 5)。(C) MMTV-PyMT腫瘍担持マウスをアルドキソルビシン、Dox-SA、またはDox-CBD-SA (Doxベースで4.16 mg/kg)で処置した。表示の時点で、腫瘍を採取し、腫瘍内のDoxの量を定量化した(平均 ± SEM。群あたり2時間の場合n = 5、24時間の場合n = 7)。(D) 100 μgのDyLight 488標識SAまたは等モル量のDyLight 488標識CBD-SAをMMTV-PyMT腫瘍担持マウスにi.v.注射した。注射1時間後に、腫瘍を採取し、共焦点顕微鏡法により蛍光を分析した。また、組織をDAPIおよび抗CD31抗体で染色した。スケールバー = 100 μm。各3つの腫瘍の代表的な画像。2つの実験的複製。統計分析は、ANOVAを用いテューキーの検定で行った。＊p < 0.05; ＊＊p < 0.01; N.S. = 有意ではない。 図3A～L Dox-CBD-SAはMMTV-PyMT乳がんモデルにおいて増強された、抗腫瘍効力および腫瘍へのリンパ球の浸潤を示す。(A) 5×105個のMMTV-PyMT細胞を0日目にFVBマウスに接種した。アルドキソルビシン、Dox-SA、またはDox-CBD-SA (Doxベースで5 mg/kg)を7日目にi.v.注射した。グラフは、最初のマウスが死亡するまでの腫瘍体積を描く(平均 ± SEM)。(B) 生存率。(C～F) 個々の腫瘍増殖曲線。CRは完全な応答頻度を示す。3つの実験的複製。(G～L) 5×105個のMMTV-PyMT細胞を0日目に接種した。アルドキソルビシン、Dox-SA、またはDox-CBD-SA (Doxベースで5 mg/kg)を7日目にi.v.注射した。14日目に腫瘍内のリンパ球を抽出し、続いてフローサイトメトリー分析を行った。(G～I) グラフは、腫瘍重量(mg)あたりの(G) CD45+CD8+CD3+ T細胞、(H) CD45+CD4+CD3+ T細胞、および(I) CD45+NK1.1+CD3- NK細胞の数を描く。バーは平均 ± SEMを表す。(J～L) グラフは[腫瘍重量(mg)あたりのCD45+CD8+CD3+ T細胞] (J)、[腫瘍重量(mg)あたりのCD45+CD4+CD3+ T細胞] (K)または[腫瘍重量(mg)あたりのCD45+NK1.1+CD3- NK細胞] (L) vs [腫瘍重量]を示す。2つの実験的複製。統計分析は、(A、H、I) ANOVAを用いテューキーの検定または(G) クラスカル・ウォリス検定とそれに続くダンの検定、または(B) ログランク(マンテル・コックス)検定で行った。＊p < 0.05; ＊＊p < 0.01; N.S. = 有意ではない。 図3-1の説明を参照されたい。 図4A～G Dox-CBD-SA処置は毒性の低減を示す。20 mg/kgのアルドキソルビシンまたはDox-CBD-SA (Doxベース)を0日目に尾静脈注射により、腫瘍のないFVBマウスに投与した。(A～D) 3日目の血漿サイトカイン濃度。(E) 6日目の赤血球カウント。(F) 3日目の白血球カウント。(G) 16日目の脾臓重量。データは平均 ± SEMを表す。2つの実験的複製。統計分析は、ANOVAを用いテューキーの検定で行った。＊p < 0.05; ＊＊p < 0.01; N.S. = 有意ではない。 図5A～H Dox-CBD-SA処置は、確立されたMC38腫瘍を抗PD-1チェックポイント阻害剤との組み合わせで完全に根絶する。0日目に5×105個のMC38細胞を接種した。6、9、および12日目にマウスに5 mg/kg (Doxベース)のアルドキソルビシンまたはDox-CBD-SAをi.v.注射した。また、10日目および13日目にαPD-1をi.p.注射した。(A) 実験スケジュール。(B) グラフは、最初のマウスが死亡するまでの腫瘍体積を描く(平均 ± SEM)、CR = 完全寛解。(C) 生存率。(D～G) 個々の腫瘍増殖曲線。CRは完全な応答頻度を示す。(H) 60日目に、Dox-CBD-SA + αPD-1で処置されたサバイバーを、5×105個のMC38細胞の皮下注射によって再度抗原投与した。また、ナイーブマウスを対照群と同じ量の細胞で抗原投与した。触知可能な腫瘍を発症したマウスの数を示す。2つの実験的複製。統計分析は、生存曲線のログランク(マンテル・コックス)検定を用いて行った。＊p < 0.05; ＊＊p < 0.01; N.S. = 有意ではない。 MALDI-TOF MS分析によるSAへのCBD融合の確認。CBD-SAをMALDI-TOF MSによって分析した。横座標は質量電荷比(m/z)であり、縦座標は荷電イオンの強度である。2つの実験的複製。 図7A～B コラーゲンI型およびIII型に対するCBD-SAの結合親和性。(A) コラーゲンI型および(B) コラーゲンIII型に対するCBD-SAの親和性をELISAによって決定した(n = 4、平均 ± SD)。[濃度] vs [シグナル]のグラフを示す。2つの実験的複製。 DoxとコンジュゲートされたマウスSAおよびCBD-SAのSDS-PAGE分析。Dox-SAおよびDox-CBD-SAを、クマシーブルー染色を用いたSDS-PAGEにより分析した。R 還元型(reduced); NR 非還元型(non-reduced)。代表的な画像を提示する。2つの実験的複製。 図9A～B 流体力学的サイズ。(A) 非コンジュゲートCBD-SA、Dox-CBD-SAおよび凍結乾燥後に再構成されたDox-CBD-SAのサイズをDLSによって測定した。(B) 非コンジュゲートSAおよびDox-SAのサイズも測定した。2つの実験的複製。 コラーゲンIII型とフォンヴィルブランド因子のA3ドメインとの間の結合界面。III型コラーゲンと複合体を形成したフォンヴィルブランド因子のA3ドメイン(CBD)の結晶構造(PDB 4DMU)。UCSFキメラを用いて画像を処理した。リジンは青色として表示されている。 Dox-SAからのDoxのインビトロ放出動態。3つの異なるpH条件下でのDox-SAからのDox放出動態を蛍光によって評価した(495 nmでの励起、590 nmでの発光、n = 3、平均 ± SD)。2つの実験的複製。 図12A～B DyLight 800で標識されたSAおよびCBD-SAの血漿薬物動態。DyLight 800標識SAまたはCBD-SA 200 μgを尾静脈注(i.v.)により、腫瘍のないFVBマウスに投与した。血漿を表示の時点で収集した。(A) 各サンプルのシグナル強度を、注射後1分で収集されたサンプルの平均シグナル強度で正規化した(平均 ± SEM、n = 4)。(B) 指数関数的な二相崩壊: MFI (t) = Ae-t + Be-βtを用いて、標識SAおよびCBD-SAの血漿中半減期を計算した。t1/2, β, 遅いクリアランス半減期。(平均 ± SEM。n = 4)。1つの実験的複製。 図13A～B 20 mg/kgのアルドキソルビシンまたはDox-CBD-SAを投与されたマウスの血液学的値の変化。注射後6日目の(A) ヘマトクリットおよび(B) ヘモグロビン濃度。2つの実験的複製。統計分析は、ANOVAを用いテューキーの検定で行った。＊＊p < 0.01; N.S. = 有意ではない。 Dox-CBD-SA処置後の主要臓器の組織学的分析。腫瘍のないFVBマウスに0日目にDox-CBD-SA (20 mg/kg)を投与した。16日目に、心臓、肝臓、腎臓、および肺を採取し、処理して、組織切片を得た(未処置の場合n = 7、Dox-CBD-SAの場合n = 5)。スケールバー = 200 μm。H&E染色された組織像を盲目的に評価し、Dox-CBD-SA処置後に有意な異常は観察されなかった。代表的な画像を示す。2つの実験的複製。 図15A～B 処置中のMC38腫瘍担持マウスのMC38腫瘍再度抗原投与および体重変化。(A) グラフは、MC38細胞で再度抗原投与されたDox-CBD-SA + αPD-1処置サバイバーの腫瘍サイズを描く(平均 ± SEM)。また、ナイーブマウスを対照群と同じ量の細胞で抗原投与した。触知可能な腫瘍を発症したマウスの数を示す。(B) 図5における処置中のマウスの体重変化(平均 ± SEM)。直線は初期体重の85%を表す。2つの実験的複製。
詳細な説明
低分子抗がん剤は組織に広く分布し、全身性の副作用を誘発するため、その薬物動態および生体内分布を改善するための薬物の改変が試みられている。薬物送達のための腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原の能動的ターゲティングが、治療戦略である。しかしながら、これは適用可能ながんの範囲を本質的に制限し、また、抗原選択的な細胞ターゲティングおよび死滅化のために薬剤耐性獲得につながる可能性があり、その抗原は突然変異によって失われる可能性がある。本明細書で、本発明者らは、これらの問題を克服するためにCBD-SA (コラーゲン結合ドメイン-血清アルブミン)を操作した。他の能動的な活性化戦略とは異なり、CBD-SAは腫瘍関連抗原の発現の事前調査を必要としない。というのは、コラーゲンは腫瘍においてほぼ遍在的に発現されており、CBDは腫瘍微小環境内の異常な血管構造を介して腫瘍間質に接近するからである。続いて、CBD-SAは露出したコラーゲンに結合し、腫瘍間質を化学療法剤の貯留槽に変換する。
心臓毒性はDoxの主な欠点であり、これによってDoxの生涯蓄積量が制限される。驚いたことに、20 mg/kgのDox-CBD-SA投与でさえ心臓障害の兆候を示さないことが分かった。これは、CBD-SAと事前にコンジュゲートされたDoxが、マウスモデルにおいて15 mg/kgの蓄積量で心臓組織に不可逆的に損傷を与える遊離Doxよりも低い心臓毒性であることを示唆している。重要なことに、15 mg/kgの蓄積量は、ヒトでの最大蓄積量とほぼ同等である。コンジュゲートの効力および非特異的毒性は、いささか驚きかつ予想外である。というのは、CBD-SAが、肝臓、腎臓、および創傷などの体内の望ましくない部位に蓄積する可能性があり、そこで有窓内皮または漏出性内皮を介してコラーゲンが露出されうるという仮説を立てることができるからである。しかし、本発明者らは、20 mg/kgのDox-CBD-SA投与後に肝臓および腎臓での病理学的損傷を観察しなかった。したがって、本開示は、細胞毒性剤を腫瘍環境に対してターゲティングするための新規の戦略について記述する。
I. ターゲティングポリペプチド
A. コラーゲン結合ドメイン
フォンヴィルブランド因子(vWF)は血液凝固因子であり、I型およびIII型の両方のコラーゲン、ならびに血小板上の接着受容体GPIbに結合する。損傷時に、内皮細胞下のコラーゲンが血漿に曝され、vWF-コラーゲン結合が血栓症カスケードを惹起する。vWF Aドメインは、報告されている非細菌由来のタンパク質/ペプチドの中でコラーゲンに対して最も高い親和性を有する。
いくつかの態様において、ポリペプチドは、デコリン由来のコラーゲン結合ドメインを含む。いくつかの態様において、コラーゲン結合ドメインは、ウシに由来するLRELHLNNNC (SEQ ID NO:11)またはヒトに由来するLRELHLDNNC (SEQ ID NO:12)などのデコリンペプチドを含む。
いくつかの態様において、コラーゲン結合ドメインは、以下のアミノ酸配列:
Figure 2022535816000001
によって表される、ヒトデコリン由来のペプチド断片を含む。
いくつかの態様において、コラーゲン結合ペプチドは、フォンヴィルブランド因子(vWF)由来のペプチドである。ヒトvWFの配列は以下:
Figure 2022535816000002
Figure 2022535816000003
を含む。
いくつかの態様において、ペプチドは、vWF A3ドメイン由来である。vWF A3ドメインはヒト配列、残基番号1670～1874 (成熟vWFの残基番号907～1111)に由来し、以下の配列:
Figure 2022535816000004
を有する。
いくつかの態様において、ECMペプチドは、以下のアミノ酸配列:
Figure 2022535816000005
によって表されるvWF A3の全部または断片を含む。
いくつかの態様において、コラーゲン結合ドメインは、以下の配列:
Figure 2022535816000006
を有するポリペプチドを含む。
いくつかの態様において、ポリペプチドは、以下の配列:
Figure 2022535816000007
を有するコラーゲン結合ドメインアルブミンポリペプチドを含む。
例示的なペプチドとしては、SEQ ID NO:1～4または11～14のいずれか1つの全部または一部が挙げられる。コラーゲン結合ドメインは、SEQ ID NO: 1～4または11～14などの、本開示のポリペプチドと75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100% (またはその中で導出可能な任意の範囲)の同一性を有するポリペプチドでありうる。
B. リンカー
リンカー配列がポリペプチドに含まれうる。例えば、少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100個もしくはそれ以上(またはその中で導出可能な任意の範囲)、多くとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100個もしくはそれ以上(またはその中で導出可能な任意の範囲)、または正確に3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100個もしくはそれ以上(またはその中で導出可能な任意の範囲)のアミノ酸を有するリンカーがその抗体およびペプチドを分離しうる。
いくつかの態様において、アルブミンポリペプチド、IgG Fcドメインポリペプチド、コラーゲン結合ドメインおよび/または細胞毒性剤は、共有結合している。例えば、細胞毒性剤は、コラーゲン結合ドメインに共有結合されうる。いくつかの態様において、細胞毒性剤は、アルブミンポリペプチドに共有結合している。いくつかの態様において、細胞毒性剤は、IgG Fcドメインポリペプチドに共有結合している。いくつかの態様において、リンカーは、細胞毒性剤とコラーゲン結合ドメインまたはアルブミンポリペプチドとの間にある。いくつかの態様において、リンカーは、細胞毒性剤とコラーゲン結合ドメインまたはIgG Fcドメインポリペプチドとの間にある。いくつかの態様において、アルブミンポリペプチドは、コラーゲンドメインに共有結合している。いくつかの態様において、IgG Fcドメインポリペプチドは、コラーゲンドメインに共有結合している。いくつかの態様において、リンカーは、アルブミンポリペプチドとコラーゲン結合ドメインとの間にある。いくつかの態様において、リンカーは、IgG Fcドメインポリペプチドとコラーゲン結合ドメインとの間にある。いくつかの態様において、リンカーは二官能性リンカーを含む。アミノ酸またはペプチド模倣配列などのリンカーが、ペプチドおよび/または抗体配列の間に挿入されうる。リンカーは、可動性の立体構造、規則正しい二次構造を形成できないこと、またはいずれかのドメインを促進し、もしくはいずれかのドメインと相互作用しうる疎水性もしくは荷電性を含む1つまたは複数の特性を有しうる。可動性のタンパク質領域において通常見られるアミノ酸の例としては、Gly、AsnおよびSerが挙げられうる。例えば、適当なペプチドリンカーはGGGSGGGS (SEQ ID NO:5)または(GGGS)n (SEQ ID NO:6)でありえ、式中でn = 1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10 (またはその中で導出可能な任意の範囲)。ThrおよびAlaなどの、他のほぼ中性のアミノ酸もリンカー配列において用いられうる。リンカー配列の長さは、融合タンパク質の機能または活性に有意な影響を与えることなく変化しうる(例えば、米国特許第6,087,329号を参照のこと)。特定の局面において、リンカーは少なくとも4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、もしくは100個(またはその中で導出可能な任意の範囲)、多くとも4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、もしくは100個(またはその中で導出可能な任意の範囲)、または正確に4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、もしくは100個(またはその中で導出可能な任意の範囲)のアミノ酸残基でありうる。ペプチドおよび抗体の重鎖または軽鎖は、約1～25アミノ酸残基を有するペプチド配列によってつながれている。リンカーの例としては、スルホ-スクシンイミジル誘導体(スルホ-SMCC、スルホ-SMPB)、スベリン酸ジスクシンイミジル(DSS)、グルタル酸ジスクシンイミジル(DSG)および酒石酸ジスクシンイミジル(DST)などの、化学部分およびコンジュゲーション剤(conjugating agent)も挙げられうる。リンカーの例としては、CN (ここでN=1～100の炭素原子)などの、線状炭素鎖がさらに挙げられうる。いくつかの態様において、リンカーは、バリン-シトルリン(val-cit)、フェニルアラニン-リジン(phe-lys)リンカー、またはマレイミドカプロン-バリン-シトルリン-p-アミノベンジルオキシカルボニル(vc)リンカーなどの、ジペプチドリンカーであることができる。いくつかの態様において、リンカーは、スルホスクシンイミジル-4-[N-マレイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシレート(smcc)である。スルホ-smccコンジュゲーションは、スルフヒドリル(チオール, --SH)と反応するマレイミド基を介して行われるが、そのスルホ-NHSエステルは一級アミン(リジンおよびタンパク質またはペプチドのN末端に見られる)に対して反応性である。さらに、リンカーはマレイミドカプロイル(mc)でありうる。いくつかの態様において、共有結合はトラウトの試薬の使用によって達成されうる。
C. アルブミン
いくつかの態様において、アルブミンポリペプチドはマウス由来である。いくつかの態様において、アルブミンポリペプチドはヒト由来である。
いくつかの態様において、アルブミンポリペプチドは、以下の配列:
Figure 2022535816000008
を有するポリペプチドと少なくとも70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100% (またはその中で導出可能な任意の範囲)の同一性を有するポリペプチドまたは断片を含みうる。
いくつかの態様において、アルブミンポリペプチドは、以下の配列:
Figure 2022535816000009
を有するポリペプチドと少なくとも70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100% (またはその中で導出可能な任意の範囲)の同一性を有するポリペプチドまたは断片を含みうる。
いくつかの態様において、アルブミンポリペプチドは、以下の配列:
Figure 2022535816000010
を有するポリペプチドと少なくとも70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100% (またはその中で導出可能な任意の範囲)の同一性を有するポリペプチドまたは断片を含みうる。
いくつかの態様において、アルブミンポリペプチドは、以下の配列:
Figure 2022535816000011
を有するポリペプチドと少なくとも70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100% (またはその中で導出可能な任意の範囲)の同一性を有するポリペプチドまたは断片を含みうる。
D. ヒトIgG由来のFcドメイン
アルブミンと同様に、ヒトIgG由来のFcドメインは、Fcドメインにもアルブミンと同様に細胞リサイクリングシステムを有するため、薬物半減期を増強するために用いられる。いくつかの態様において、アルブミンポリペプチドはヒト由来である。
いくつかの態様において、hIgG1 Fcポリペプチドは、以下の配列(IGHG1、99～330):
Figure 2022535816000012
を有するポリペプチドと少なくとも70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100% (またはその中で導出可能な任意の範囲)の同一性を有するポリペプチドまたは断片を含みうる。
いくつかの態様において、hIgG2 Fcポリペプチドは、以下の配列(IGHG2、99～326):
Figure 2022535816000013
を有するポリペプチドと少なくとも70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100% (またはその中で導出可能な任意の範囲)の同一性を有するポリペプチドまたは断片を含みうる。
いくつかの態様において、hIgG3 Fcポリペプチドは、以下の配列(IGHG3、99～376):
Figure 2022535816000014
を有するポリペプチドと少なくとも70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100% (またはその中で導出可能な任意の範囲)の同一性を有するポリペプチドまたは断片を含みうる。
いくつかの態様において、hIgG4 Fcポリペプチドは、以下の配列(IGHG4、99～327):
Figure 2022535816000015
を有するポリペプチドと少なくとも70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100% (またはその中で導出可能な任意の範囲)の同一性を有するポリペプチドまたは断片を含みうる。
II. 細胞毒性剤
本開示の態様は、細胞毒性剤に連結されたアルブミン-コラーゲン結合ドメインコンジュゲートに関する。本開示の態様は、細胞毒性剤に連結されたIgG Fcドメイン-コラーゲン結合ドメインコンジュゲートに関する。細胞毒性剤は酵素阻害剤、例えばジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤、チミジル酸シンターゼ阻害剤、DNAインターカレーター、DNA切断剤、トポイソメラーゼ阻害剤、アントラサイクリンファミリーの薬物、ビンカ薬物、マイトマイシン、ブレオマイシン、細胞毒性ヌクレオシド、プテリジンファミリーの薬物、ジインエン(diynene)、ポドフィロトキシン、ドラスタチン、メイタンシノイド、分化誘導剤、およびタキソールを含む。
これらのクラスのメンバーは、例えば、タキソール、メトトレキサート、メトプテリン、ジクロロメトトレキサート、5-フルオロウラシル、6-メルカプトプリン、シトシンアラビノシド、メルファラン、ロイロシン、ロイロシデイン、アクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、マイトマイシンC、マイトマイシンA、カミノマイシン、アミノプテリン、タリソマイシン、ポドフィロトキシンおよびポドフィロトキシン誘導体、例えばエトポシドまたはリン酸エトポシド、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソールを含むタキサン、タキソテール レチノイン酸、酪酸、N8-アセチルスペルミジン、カンプトテシン、カリケアマイシン、エスペラマイシン、エンジイン、デュオカルマイシンA、デュオカルマイシンSA、カリケアマイシン、カンプトテシン、ヘミアステリン、メイタンシノイド(DM1を含む)、モノメチルアウリスタチンE (MMAE)、モノメチルアウリスタチンF (MMAF)およびメイタンシノイド(DM4)ならびにそれらの類似体を含む。
細胞毒性剤は、細菌毒素、例えばジフテリア毒素、植物毒素、例えばリシン、低分子毒素、例えばゲルダナマイシン、メイタンシノイド、およびカリケアマイシン、ヘミアステリンも含む。毒素は、チューブリン結合、DNA結合、またはトポイソメラーゼ阻害を含む機構によって、その細胞毒性効果および細胞増殖抑制効果を発揮しうる。
メイタンシノイド、ドラスタチン、オーリスタチン、トリコテセン、カリケアマイシン、およびCC1065などの細胞毒性剤、ならびに毒素活性を有するこれらの毒素の誘導体も使用されうる。他の細胞毒性剤は、BCNU、ストレプトゾシン(streptozoicin)、ビンクリスチンおよび5-フルオロウラシル、米国特許第5,053,394号、同第5,770,710号に記述されているLL-E33288複合体として集合的に知られている薬剤のファミリー、ならびにエスペラミシン(米国特許第5,877,296号)を含む。使用できる酵素的に活性な毒素およびその断片は、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、エキソトキシンA鎖(緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)由来)、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、α-サルシン、シナアブラギリ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ(Phytolaca americana)タンパク質(PAPI、PAPII、およびPAP-S)、ニガウリ(momordica charantia)阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ(sapaonaria officinalis)阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセンを含む。例えば、1993年10月28日付で公開されたWO 93/21232を参照されたい。いくつかの態様において、細胞毒性剤は、本明細書において記述される化学療法剤を含む。
III. さらなる治療法
A. 免疫療法
いくつかの態様において、本方法は、がん免疫療法の投与を含む。がん免疫療法(免疫腫瘍学と呼ばれることもあり、IOと略される)は、がんを処置するための免疫系の使用である。免疫療法は能動的、受動的またはハイブリッド(能動的および受動的)に分類することができる。これらのアプローチは、がん細胞がその表面に、腫瘍関連抗原(TAA)として知られる、免疫系により検出されうる分子を有することが多いという事実を利用しており; それらはタンパク質または他の高分子(例えば炭水化物)であることが多い。能動免疫療法は、TAAをターゲティングすることによって腫瘍細胞を攻撃するように免疫系に指令する。受動免疫療法は、既存の抗腫瘍応答を増強し、モノクローナル抗体、リンパ球およびサイトカインの使用を含む。本開示の方法において有用な免疫療法を以下に記述する。
1. チェックポイント阻害剤および併用処置
本開示の態様は、免疫チェックポイント阻害剤(チェックポイント阻害剤療法ともいわれる)の投与を含むことができ、これを以下にさらに記述する。
a. PD-1、PD-L1、およびPD-L2阻害剤
PD-1は、T細胞が感染または腫瘍に遭遇する腫瘍微小環境において作用することができる。活性化されたT細胞はPD-1を上方制御し、末梢組織においてPD-1を発現し続ける。IFN-ガンマなどのサイトカインは、上皮細胞および腫瘍細胞でのPD-L1の発現を誘導する。PD-L2はマクロファージおよび樹状細胞に発現する。PD-1の主な役割は、末梢でのエフェクタT細胞の活性を制限し、免疫応答中の組織への過度の損傷を防ぐことである。本開示の阻害剤は、PD-1および/またはPD-L1活性の1つまたは複数の機能を遮断しうる。
「PD-1」の代替名には、CD279およびSLEB2が含まれる。「PD-L1」の代替名には、B7-H1、B7-4、CD274、およびB7-Hが含まれる。「PD-L2」の代替名には、B7-DC、Btdc、およびCD273が含まれる。いくつかの態様において、PD-1、PD-L1、およびPD-L2は、ヒトPD-1、PD-L1、およびPD-L2である。
いくつかの態様において、PD-1阻害剤は、PD-1とそのリガンド結合パートナーの結合を阻害する分子である。特定の局面において、PD-1リガンド結合パートナーはPD-L1および/またはPD-L2である。別の態様において、PD-L1阻害剤は、PD-L1とそのリガンド結合パートナーの結合を阻害する分子である。特定の局面において、PD-L1結合パートナーはPD-1および/またはB7-1である。別の態様において、PD-L2阻害剤は、PD-L2とそのリガンド結合パートナーの結合を阻害する分子である。特定の局面において、PD-L2結合パートナーはPD-1である。阻害剤は抗体、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、またはオリゴペプチドでもよい。例示的な抗体は米国特許第8,735,553号、同第8,354,509号、および同第8,008,449号に記述されており、全てが参照により本明細書に組み入れられる。本明細書において提供される方法および組成物で用いるための他のPD-1阻害剤は、米国特許出願公開第US2014/0294898号、同第US2014/022021号、および同第US2011/0008369号に記述のように当技術分野において公知であり、これらは全て参照により本明細書に組み入れられる。
いくつかの態様において、PD-1阻害剤は抗PD-1抗体(例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体)である。いくつかの態様において、抗PD-1抗体は、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、およびピディリズマブからなる群より選択される。いくつかの態様において、PD-1阻害剤は、イムノアドヘシン(例えば、定常領域(例えば、免疫グロブリン配列のFc領域)と融合したPD-L1またはPD-L2の細胞外部分またはPD-1結合部分を含むイムノアドヘシン)である。いくつかの態様において、PD-L1阻害剤はAMP-224を含む。ニボルマブはMDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558、およびOPDIVO(登録商標)としても知られ、WO2006/121168に記述の抗PD-1抗体である。ペンブロリズマブはMK-3475、Merck3475、ランブロリズマブ、KEYTRUDA(登録商標)、およびSCH-900475としても知られ、WO2009/114335に記述の抗PD-1抗体である。ピディリズマブはCT-011、hBAT、またはhBAT-1としても知られ、WO2009/101611に記述の抗PD-1抗体である。AMP-224はB7-DCIgとしても知られ、WO2010/027827およびWO2011/066342に記述のPD-L2-Fc融合可溶性受容体である。さらなるPD-1阻害剤は、AMP-514としても知られるMEDI0680、およびREGN2810を含む。
いくつかの態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、MEDI4736としても知られるデュルバルマブ、MPDL3280Aとしても知られるアテゾリズマブ、MSB00010118Cとしても知られるアベルマブ、MDX-1105、BMS-936559、またはそれらの組み合わせなどのPD-L1阻害剤である。ある種の局面において、免疫チェックポイント阻害剤は、rHIgM12B7などのPD-L2阻害剤である。
いくつかの態様において、阻害剤はニボルマブ、ペンブロリズマブ、またはピディリズマブの重鎖および軽鎖CDRまたはVRを含む。したがって、1つの態様において、阻害剤は、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、またはピディリズマブのVH領域のCDR1、CDR2、およびCDR3ドメイン、ならびにニボルマブ、ペンブロリズマブ、またはピディリズマブのVL領域のCDR1、CDR2およびCDR3ドメインを含む。別の態様において、前記抗体は、前述した抗体と同じ、PD-1、PD-L1、もしくはPD-L2上のエピトープとの結合において競合する、および/または前述した抗体と同じ、PD-1、PD-L1、もしくはPD-L2上のエピトープに結合する。別の態様において、前記抗体は、上述した抗体と少なくとも約70、75、80、85、90、95、97、もしくは99% (またはその中で導出可能な範囲)の可変領域アミノ酸配列同一性を有する。
b. CTLA-4、B7-1、およびB7-2
本明細書において提供される方法において標的にされることができる別の免疫チェックポイントは、CD152としても知られる細胞傷害性Tリンパ球タンパク質4 (CTLA-4)である。ヒトCTLA-4の完全cDNA配列はGenbankアクセッション番号L15006を有する。CTLA-4はT細胞表面に見出され、抗原提示細胞の表面上のB7-1 (CD80)またはB7-2 (CD86)に結合すると「オフ」スイッチとして働く。CTLA4は、ヘルパーT細胞表面に発現し、阻害シグナルをT細胞に伝達する免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。CTLA4はT細胞補助刺激タンパク質であるCD28に類似し、両分子とも、抗原提示細胞上のB7-1およびB7-2に結合する。CTLA-4は阻害シグナルをT細胞に伝達するのに対して、CD28は刺激シグナルを伝達する。細胞内CTLA-4は調節性T細胞の中にも見出され、その機能にとって重要である可能性がある。T細胞受容体およびCD28を介してT細胞が活性化されると、B7分子に対する抑制性受容体であるCTLA-4の発現が増加する。本開示の阻害剤は、CTLA-4、B7-1、および/またはB7-2活性の1つまたは複数の機能を遮断しうる。いくつかの態様において、阻害剤はCTLA-4およびB7-1相互作用を遮断する。いくつかの態様において、阻害剤はCTLA-4およびB7-2相互作用を遮断する。
いくつかの態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、抗CTLA-4抗体(例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、もしくはキメラ抗体)、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、またはオリゴペプチドである。
本発明の方法で用いるのに適した抗ヒト-CTLA-4抗体(またはそれに由来するVHドメインおよび/もしくはVLドメイン)は、当技術分野において周知の方法を用いて作出することができる。あるいは、当技術分野において認められている抗CTLA-4抗体を用いることができる。例えば、米国特許第8,119,129号、WO01/14424、WO98/42752;WO00/37504 (CP675,206、トレメリムマブ; 以前はチシリムマブ(ticilimumab)としても知られる)、米国特許第6,207,156号; Hurwitz et al., 1998に開示される抗CTLA-4抗体は、本明細書において開示される方法において用いることができる。前述した刊行物のそれぞれの開示は参照により本明細書に組み入れられる。CTLA-4との結合では、これらの当技術分野において認められている任意の抗体と競合する抗体も用いることができる。例えば、ヒト化CTLA-4抗体は、国際特許出願番号WO2001/014424、WO2000/037504、および米国特許第8,017,114号に記述されており、全てが参照により本明細書に組み入れられる。
本開示の方法および組成物においてチェックポイント阻害剤として有用なさらなる抗CTLA-4抗体は、イピリムマブ(10D1、MDX-010、MDX-101、およびYervoy(登録商標)としても知られる)またはその抗原結合断片および変種である(例えば、WO01/14424を参照されたい)。
いくつかの態様において、阻害剤はトレメリムマブまたはイピリムマブの重鎖および軽鎖CDRまたはVRを含む。したがって、1つの態様において、阻害剤は、トレメリムマブまたはイピリムマブのVH領域のCDR1、CDR2、およびCDR3ドメイン、ならびにトレメリムマブまたはイピリムマブのVL領域のCDR1、CDR2およびCDR3ドメインを含む。別の態様において、前記抗体は、前述した抗体と同じ、PD-1、B7-1、もしくはB7-2上のエピトープとの結合において競合する、および/または前述した抗体と同じ、PD-1、B7-1、もしくはB7-2上のエピトープに結合する。別の態様において、前記抗体は、上述した抗体と少なくとも約70、75、80、85、90、95、97、もしくは99% (またはその中で導出可能な範囲)の可変領域アミノ酸配列同一性を有する。
2. 共刺激分子の阻害
いくつかの態様において、免疫療法は共刺激分子の阻害剤を含む。いくつかの態様において、阻害剤は、B7-1 (CD80)、B7-2 (CD86)、CD28、ICOS、OX40 (TNFRSF4)、4-1BB (CD137; TNFRSF9)、CD40L (CD40LG)、GITR (TNFRSF18)の阻害剤、およびその組み合わせを含む。阻害剤は、阻害性の抗体、ポリペプチド、化合物、および核酸を含む。
3. 樹状細胞療法
樹状細胞療法は、樹状細胞に腫瘍抗原をリンパ球へ提示させ、それによってリンパ球を活性化し、抗原を提示している他の細胞を死滅化するようにリンパ球を刺激することによって抗腫瘍応答を惹起する。樹状細胞は、哺乳類免疫系における抗原提示細胞(APC)である。がん処置において、樹状細胞はがん抗原のターゲティングを助ける。樹状細胞に基づく細胞がん療法の一例は、シプリューセル-Tである。
樹状細胞に腫瘍抗原を提示するように誘導する1つの方法は、自家腫瘍溶解物または短いペプチド(がん細胞上のタンパク質抗原に対応するタンパク質の小さな部分)をワクチン接種することによるものである。これらのペプチドは、免疫および抗腫瘍応答を高めるためにアジュバント(免疫原性の高い物質)と組み合わせて与えられることが多い。他のアジュバントは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)などの、樹状細胞を誘引および/または活性化するタンパク質または他の化学物質を含む。
樹状細胞は腫瘍細胞にGM-CSFを発現させることによりインビボで活性化することもできる。これは、腫瘍細胞を遺伝子操作してGM-CSFを産生させることにより、またはGM-CSFを発現する腫瘍溶解性ウイルスを腫瘍細胞に感染させることにより達成することができる。
別の戦略は、樹状細胞を患者の血液から除去し、それらを体外で活性化することである。樹状細胞は、単一の腫瘍特異的ペプチド/タンパク質または腫瘍細胞溶解物(破壊された腫瘍細胞の溶液)でありうる、腫瘍抗原の存在下で活性化される。これらの細胞(選択的なアジュバントを有する)が注入され、免疫応答を惹起する。
樹状細胞療法は、樹状細胞の表面の受容体に結合する抗体の使用を含む。抗原を抗体に加えることができ、樹状細胞を成熟へ誘導し、腫瘍に対する免疫を提供することができる。
4. CAR-T細胞療法
キメラ抗原受容体(キメラ免疫受容体、キメラT細胞受容体または人工T細胞受容体としても知られている、CAR)は、がん細胞を標的とする免疫細胞と新しい特異性を組み合わせた操作された受容体である。通常、これらの受容体はモノクローナル抗体の特異性をT細胞へ移植する。受容体は、異なる供給源からの部分が融合しているため、キメラと呼ばれる。CAR-T細胞療法は、がん療法のためにそのような形質転換細胞を用いる処置をいう。
CAR-T細胞デザインの基本原理には、抗原結合機能とT細胞活性化機能を組み合わせた組換え受容体が含まれる。CAR-T細胞の一般的な前提は、がん細胞に見られるマーカーに対してターゲティングされたT細胞を人工的に作出することである。科学者らは人からT細胞を取り除き、それらを遺伝的に改変し、がん細胞を攻撃するためにそれらを患者に戻すことができる。T細胞がCAR-T細胞になるように操作されると、それは「生きている薬物」として作用する。CAR-T細胞は、細胞外リガンド認識ドメインと細胞内シグナル伝達分子との間にリンクを作出し、これがT細胞を活性化する。細胞外リガンド認識ドメインは通常、一本鎖可変断片(scFv)である。CAR-T細胞療法の安全性の重要な局面は、正常細胞ではなく、がん性腫瘍細胞だけが標的とされることを確実にする方法である。CAR-T細胞の特異性は、標的とされる分子の選択によって決定される。
例示的なCAR-T療法としてはチサゲンレクルユーセル(Tisagenlecleucel) (キムリア(Kymriah))およびアキシカブタゲンシロルユーセル(Axicabtagene ciloleucel) (イエスカルタ(Yescarta))が挙げられる。いくつかの態様において、CAR-T療法はCD19を標的とする。
5. サイトカイン療法
サイトカインは、腫瘍内に存在する多くのタイプの細胞によって産生されるタンパク質である。それらは免疫応答を調節することができる。腫瘍は、多くの場合、サイトカインを利用して腫瘍を成長させ、免疫応答を低減させる。これらの免疫調節効果により、免疫応答を惹起させる薬物としてそれらを用いることが可能になる。一般的に用いられる2つのサイトカインは、インターフェロンおよびインターロイキンである。
インターフェロンは免疫系によって産生される。それらは通常、抗ウイルス応答に関与しているが、がんにも使われている。それらは3つの群に分類される: タイプI (IFNαおよびIFNβ)、タイプII (IFNγ)ならびにタイプIII (IFNλ)。
インターロイキンは、数々の免疫系効果を有する。IL-2は例示的なインターロイキンサイトカイン療法である。
6. 養子T細胞療法
養子T細胞療法は、T細胞の輸血(養子細胞移入)による受動免疫の一形態である。T細胞は血液および組織中に見られ、通常、外来病原体を見つけると活性化する。具体的には、T細胞の表面受容体が、表面抗原上に外来タンパク質の一部を提示する細胞に遭遇すると、T細胞は活性化する。これらは感染細胞または抗原提示細胞(APC)のいずれかであることができる。それらは正常組織中および腫瘍組織中に見られ、その場合、それらは腫瘍浸潤リンパ球(TIL)として知られている。それらは、腫瘍抗原を提示する樹状細胞などのAPCの存在により活性化される。これらの細胞は腫瘍を攻撃しうるが、腫瘍内の環境は免疫抑制性が高く、免疫介在性の腫瘍死を防ぐ。
腫瘍を標的としたT細胞を産生および取得する複数の方法が開発されている。腫瘍抗原に特異的なT細胞は、腫瘍サンプルから除去する(TIL)か、血液からろ過することができる。その後の活性化および培養はエクスビボで実施され、その結果、再注入される。活性化は、遺伝子治療を通じて、またはT細胞を腫瘍抗原に曝露することによって行うことができる。
がん処置は、本明細書において記述されるがん処置のいずれかを除外しうることが企図される。さらに、本開示の態様は、本明細書において記述される療法の処置を以前に受けた患者、本明細書において記述される療法の処置を現在受けている患者、または本明細書において記述される療法の処置を受けていない患者を含む。いくつかの態様において、患者は、本明細書において記述される療法に抵抗性であると判定された患者である。いくつかの態様において、患者は、本明細書において記述される療法に感受性であると判定された患者である。
B. 腫瘍溶解性ウイルス
いくつかの態様において、さらなる治療法は、腫瘍溶解性ウイルスを含む。腫瘍溶解性ウイルスは、選択的にがん細胞に感染し、がん細胞を死滅化するウイルスである。感染したがん細胞が腫瘍溶解によって破壊されると、それらは新しい感染性ウイルス粒子またはビリオンを放出して、残存している腫瘍を破壊するのを助ける。腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞の直接破壊を引き起こすだけでなく、長期免疫療法のために宿主の抗腫瘍免疫応答を刺激すると考えられている。
C. 多糖類
いくつかの態様において、さらなる治療法は多糖類を含む。キノコに見出されるある種の化合物、主に多糖類は、免疫系を上方制御することができ、抗がん特性を持ちうる。例えば、レンチナンなどのベータ-グルカンは、マクロファージ、NK細胞、T細胞および免疫系サイトカインを刺激することが実験室での研究において示されており、免疫学的アジュバントとして臨床試験で調べられている。
D. 新生抗原
いくつかの態様において、さらなる治療法は新生抗原の投与を含む。多くの腫瘍は変異を発現している。これらの変異は、T細胞免疫療法で用いるための新しいターゲティング可能な抗原(新生抗原)を潜在的に作出する。RNA配列決定データを用いて特定された、がん病変におけるCD8+ T細胞の存在は、変異負荷の高い腫瘍において高くなる。ナチュラルキラー細胞およびT細胞の細胞溶解活性に関連する転写物のレベルは、多くのヒト腫瘍における変異負荷と正の相関がある。
E. 化学療法
いくつかの態様において、さらなる治療法は化学療法を含む。化学療法剤の適当なクラスは、(a) アルキル化剤、例えばナイトロジェンマスタード(例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド(cylophosphamide)、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル)、エチレンイミンおよびメチルメラミン(例えば、ヘキサメチルメラミン、チオテパ)、アルキルスルホネート(例えば、ブスルファン)、ニトロソ尿素(例えば、カルムスチン、ロムスチン、クロロゾトシン(chlorozoticin)、ストレプトゾシン)およびトリアジン(例えば、ジカルバジン)、(b) 代謝拮抗薬、例えば葉酸類似体(例えば、メトトレキサート)、ピリミジン類似体(例えば、5-フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、アザウリジン)およびプリン類似体ならびに関連物質(例えば、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、ペントスタチン)、(c) 天然産物、例えばビンカアルカロイド(例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン)、エピポドフィロトキシン(例えば、エトポシド、テニポシド)、抗生物質(例えば、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシンおよびミトキサントロン)、酵素(例えば、L-アスパラギナーゼ)、ならびに生物学的応答修飾物質(例えば、インターフェロン-α)、ならびに(d) 種々の作用物質(Miscellaneous Agents)、例えば白金配位錯体(例えば、シスプラチン、カルボプラチン)、置換尿素(例えば、ヒドロキシ尿素)、メチルヒドラジン(methylhydiazine)誘導体(例えば、プロカルバジン)、および副腎皮質抑制剤(adreocortical suppressant) (例えば、タキソールおよびミトタン)を含む。いくつかの態様において、シスプラチンは特に適当な化学療法剤である。
シスプラチンは、例えば、転移性精巣がんもしくは卵巣がん、進行性膀胱がん、頭頸部がん、子宮頸がん、肺がんまたは他の腫瘍などのがんを処置するために広く用いられてきた。シスプラチンは経口的に吸収されず、それゆえ、例えば、静脈内、皮下、腫瘍内または腹腔内注射などの他の経路を介して送達しなければならない。シスプラチンは単独でまたは他の薬剤との組み合わせで用いることができ、ある種の態様では計3過程について3週間ごとに5日間、約15 mg/m2から約20 mg/m2を含め臨床用途において用いられる有効用量が企図される。いくつかの態様において、治療用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたEgr-1プロモーターを含む構築体と併せて細胞および/または対象に送達されるシスプラチンの量は、シスプラチンを単独で用いる場合に送達されるであろう量よりも少ない。
他の適当な化学療法剤は、抗微小管剤、例えば、パクリタキセル(「タキソール」)および塩酸ドキソルビシン(「ドキソルビシン」)を含む。アデノウイルスベクターおよびドキソルビシンを介して送達されるEgr-1プロモーター/TNFα構築体の組み合わせは、化学療法および/またはTNF-αに対する耐性を克服するのに効果的であることが確認されており、このことから、構築体およびドキソルビシンによる併用処置がドキソルビシンおよびTNF-αの両方に対する耐性を克服することが示唆される。
ドキソルビシンは吸収が不十分であり、好ましくは静脈内投与される。ある種の態様において、成体に適切な静脈内用量は、約21日間隔で約60 mg/m2から約75 mg/m2または約3週間から約4週間間隔で繰り返される2日もしくは3日連続のそれぞれで約25 mg/m2から約30 mg/m2または週に1回、約20 mg/m2を含む。最低用量は、前の化学療法によって引き起こされた前の骨髄抑制もしくは腫瘍性骨髄浸潤がある場合、または薬物が他の骨髄造血抑制薬と組み合わされている場合、高齢患者において用いられるべきである。
ナイトロジェンマスタードは、本開示の方法において有用な別の適当な化学療法剤である。ナイトロジェンマスタードは、メクロレタミン(HN2)、シクロホスファミドおよび/またはイホスファミド、メルファラン(L-サルコリシン)、ならびにクロラムブシルを含みうるが、これらに限定されることはない。シクロホスファミド(シトキサン(CYTOXAN)(登録商標))はMead Johnsonから入手可能であり、NEOSTAR(登録商標)はAdriaから入手可能であり)、別の適当な化学療法剤である。成体に適した経口用量は、例えば、約1 mg/kg/日から約5 mg/kg/日を含み、静脈内用量は、例えば、最初に約2日から約5日にわたり分割用量で約40 mg/kgから約50 mg/kg、または約7日から約10日ごとに約10 mg/kgから約15 mg/kgまたは週2回、約3 mg/kgから約5 mg/kg、または約1.5 mg/kg/日から約3 mg/kg/日を含む。胃腸への悪影響のため、静脈内経路が好ましい。薬物はまた、筋肉内に、浸潤によりまたは体腔内に投与されることもある。
さらなる適当な化学療法剤は、シタラビン(シトシンアラビノシド)、5-フルオロウラシル(フルオロウラシル; 5-FU)およびフロクスウリジン(フルオロデ-オキシウリジン; FudR)などの、ピリミジン類似体を含む。5-FUは、約7.5から約1000 mg/m2のどこかの投与量で対象に投与されうる。さらに、5-FU投薬スケジュールは種々の期間、例えば、最大6週間、または本開示が関連する当業者によって決定されるものでありうる。
別の適当な化学療法剤であるゲムシタビン二リン酸(GEMZAR(登録商標)、Eli Lilly & Co.、「ゲムシタビン」)は、進行性および転移性膵臓がんの処置に推奨され、それゆえ、同様にこれらのがんに対し本開示において有用であろう。
患者に送達される化学療法剤の量は可変でありうる。1つの適当な態様において、化学療法剤は、化学療法が構築体とともに投与される場合、宿主におけるがんの停止または退行を引き起こすのに有効な量で投与されうる。他の態様において、化学療法剤は、化学療法剤の化学療法有効量よりも2から10,000倍少ないどこかの量で投与されうる。例えば、化学療法剤は、化学療法剤の化学療法有効量よりも約20倍少ない、約500倍少ない、またはさらには約5000倍少ない量で投与されうる。本開示の化学療法薬は、構築体との組み合わせでの所望の治療活性について、および有効な投与量の決定について、インビボで試験することができる。例えば、そのような化合物はヒトでの試験の前に、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギなどを含むが、これらに限定されない、適当な動物モデル系で試験することができる。実施例に記述されているように、インビトロ試験を用いて、適当な組み合わせおよび投与量を決定することもできる。
F. 放射線療法
いくつかの態様において、さらなる療法または前の療法は、電離放射線などの、放射線を含む。本明細書において用いられる場合、「電離放射線」は、十分なエネルギーを有するか、または電離(電子の獲得もしくは喪失)を生み出すための核相互作用を介して十分なエネルギーを生み出すことができる粒子または光子を含む放射線を意味する。例示的なかつ好ましい電離放射線は、x線である。標的組織または細胞にx線を送達するための手段は、当技術分野において周知である。
いくつかの態様において、電離放射線の量は20 Gyより大きく、1回の線量で投与される。いくつかの態様において、電離放射線の量は18 Gyであり、3回の線量で投与される。いくつかの態様において、電離放射線の量は少なくとも2、4、6、8、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、18、19、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、もしくは40 Gy (またはその中で導出可能な任意の範囲)、多くとも2、4、6、8、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、18、19、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、もしくは40 Gy (またはその中で導出可能な任意の範囲)、または正確に2、4、6、8、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、18、19、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、もしくは40 Gy (またはその中で導出可能な任意の範囲)である。いくつかの態様において、電離放射線は少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10回(またはその中で導出可能な任意の範囲)、多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10回(またはその中で導出可能な任意の範囲)、または正確に1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10回(またはその中で導出可能な任意の範囲)の線量で投与される。2回以上の線量が投与される場合、線量は約1、4、8、12、もしくは24時間または1、2、3、4、5、6、7、もしくは8日または1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、もしくは16週間、あるいはその中で導出可能な任意の範囲の間隔を空けてもよい。
いくつかの態様において、IRの量はIRの総線量として提示されてもよく、それが分割線量で投与される。例えば、いくつかの態様において、総線量は、各5 Gyの10回の分割線量で投与される50 Gyである。いくつかの態様において、総線量は、各2～3 Gyの20～60回の分割線量で投与される50～90 Gyである。いくつかの態様において、IRの総線量は少なくとも20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、125、130、135、140、もしくは150 (またはその中で導出可能な任意の範囲)、多くとも20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、125、130、135、140、もしくは150 (またはその中で導出可能な任意の範囲)、または約20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、125、130、135、140、もしくは150 (またはその中で導出可能な任意の範囲)である。いくつかの態様において、総線量は少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、15、20、25、30、35、40、45、もしくは50 Gy (またはその中で導出可能な任意の範囲）、多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、15、20、25、30、35、40、45、もしくは50 Gy (またはその中で導出可能な任意の範囲）、または正確に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、15、20、25、30、35、40、45、もしくは50 Gy (またはその中で導出可能な任意の範囲）の分割線量で投与される。いくつかの態様において、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100回、多くとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100回、または正確に2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100回の分割線量が投与される(またはその中で導出可能な任意の範囲)。いくつかの態様において、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、もしくは12回(またはその中で導出可能な任意の範囲)、多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、もしくは12回(またはその中で導出可能な任意の範囲)、または正確に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、もしくは12回(またはその中で導出可能な任意の範囲)の分割線量が1日当たり投与される。いくつかの態様において、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、もしくは30回(またはその中で導出可能な任意の範囲)、多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、もしくは30回(またはその中で導出可能な任意の範囲)、または正確に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、もしくは30回(またはその中で導出可能な任意の範囲)の分割線量が1週間当たり投与される。
G. 外科手術
がんを有する人のおよそ60%は、予防手術、診断、または進行度診断のための手術、根治的手術、および姑息的手術を含む何らかの種類の外科手術を受ける。根治的手術は、がん組織の全てまたは一部が物理的に除去、切除、および/または破壊される切除を含み、本発明の態様の処置、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法、および/または代替療法などの他の療法とともに用いられる場合がある。腫瘍切除とは、腫瘍の少なくとも一部の物理的除去をいう。腫瘍切除に加えて、外科手術による処置は、レーザー手術、凍結手術、電気手術、および顕微鏡的に管理される手術(microscopically-controlled surgery) (モース術)を含む。
がんの細胞、組織、または腫瘍の一部または全てを切除すると体内に空洞が形成されることがある。処置は、その領域にさらなる抗がん療法を灌流、直接注射、または局所塗布することによって行われてもよい。そのような処置は、例えば、1日、2日、3日、4日、5日、6日、もしくは7日ごとに、または1週間、2週間、3週間、4週間、および5週間ごとに、または1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、7ヶ月、8ヶ月、9ヶ月、10ヶ月、11ヶ月、もしくは12ヶ月ごとに繰り返されてもよい。これらの処置もさまざまな投与量の処置であってもよい。
H. 他の作用物質
処置の治療有効性を改善するために、本発明の態様のある種の局面と組み合わせて他の作用物質が用いられうることが企図される。これらのさらなる作用物質には、細胞表面受容体およびギャップ結合の上方制御に影響を及ぼす作用物質、細胞分裂停止物質および分化物質、細胞接着阻害剤、アポトーシス誘導物質に対する過剰増殖性細胞の感受性を高める作用物質、または他の生物学的作用物質が含まれる。ギャップ結合数を増やすことで細胞間シグナル伝達を増大させると、付近の過剰増殖性細胞集団に対する抗過剰増殖作用が増大する。他の態様において、処置の抗過剰増殖有効性を改善するために、細胞分裂停止物質または分化物質は本発明の態様のある種の局面と組み合わせて用いることができる。細胞接着阻害剤は本発明の態様の有効性を改善することが企図される。細胞接着阻害剤の例は局所接着キナーゼ(FAK)阻害剤およびロバスタチンである。処置有効性を改善するために、アポトーシスに対する過剰増殖性細胞の感受性を高める他の作用物質、例えば、抗体c225を本発明の態様のある種の局面と併用できることがさらに企図される。
IV. 核酸
ある種の態様において、本明細書において記述されるポリペプチドをコードする組換え核酸がある。
本出願において用いられる場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、組換えであるか、または、全ゲノム核酸がない状態で単離されているかのいずれかの核酸分子をいう。「ポリヌクレオチド」という用語の範囲内に含まれるのは、オリゴヌクレオチド(長さが100残基またはそれ未満の核酸)、例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスなどを含む、組換えベクターである。ポリヌクレオチドは、ある局面において、天然の遺伝子またはタンパク質コード配列から実質的に単離されている、調節配列を含む。ポリヌクレオチドは、一本鎖(コーディングもしくはアンチセンス)または二本鎖であってよく、RNA、DNA(ゲノム、cDNAもしくは合成)、その類似体、またはその組み合わせであってよい。ポリヌクレオチドのなかにさらなるコーディングまたは非コーディング配列が存在してもよいが、存在しなくてもよい。
この点において、「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、または「核酸」という用語は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードする核酸(適切な転写、翻訳後修飾または局在化に必要とされる任意の配列を含む)をいうように用いられる。当業者に理解される通り、この用語はゲノム配列、発現カセット、cDNA配列、ならびにタンパク質、ポリペプチド、ドメイン、ペプチド、融合タンパク質、および変異体を発現するかまたは発現するように適合されうる、遺伝子操作されたもっと小さな核酸セグメントを包含する。ポリペプチドの全部または一部をコードする核酸は、そのようなポリペプチドの全部または一部をコードする連続核酸配列を含むことができる。また、特定のポリペプチドは、わずかに異なる核酸配列を有するがそれでも同じまたは実質的に類似のタンパク質をコードする、変種を含む核酸によってコードされうることも考えられる(上記を参照のこと)。
特定の態様には、相互作用成分が相互作用する場合のポリメラーゼドメインからのポリメラーゼ活性に依存して遺伝子転写を駆動するポリペプチド(例えば、ポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、1つまたは複数の短縮型ポリメラーゼドメインまたはポリペプチドである相互作用成分)をコードする核酸配列を組み入れた、単離された核酸セグメントおよび組換えベクターがある。「組換え」という用語は、ポリペプチドまたは特異的ポリペプチドの名称と関連して用いることができ、これは一般に、インビトロにおいて操作されている核酸分子またはこのような分子の複製産物である核酸分子から産生されたポリペプチドをいう。
核酸セグメントは、コード配列それ自体の長さにかかわらず、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、付加的な制限酵素部位、マルチクローニング部位、他のコードセグメントなどのような、他の核酸配列と組み合わせてもよく、したがってその全長はかなり変化することがある。それゆえ、ほぼすべての長さの核酸断片を使用することができ、その全長は精製の容易さによっておよび意図された組換え核酸プロトコルにおける用途によって制限されることが好ましいものと考えられる。場合によっては、核酸配列は、例えば、ポリペプチドの精製、輸送、分泌、翻訳後修飾を可能にするための、またはターゲティングもしくは有効性などの治療的有用性を可能にするための、さらなる異種コード配列を有するポリペプチド配列をコードすることができる。先に論じられる通り、タグまたは他の異種ポリペプチドを、修飾されたポリペプチドをコードする配列に付加することができ、「異種」とは、修飾されたポリペプチドと同じものではないポリペプチドをいう。
ある態様には、本明細書において開示される配列と実質的同一性を有するポリヌクレオチド変種があり; 該変種は、本明細書において記述される方法(例えば、標準パラメータによるBLAST解析)を用い本明細書において提供されるポリヌクレオチド配列と比べて、以下の間の全ての値および範囲を含む少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%、またはそれ以上の配列同一性を含む。ある局面において、単離されたポリヌクレオチドは、配列の全長にわたり、本明細書において記述されるアミノ酸配列と少なくとも90%、好ましくは95%、およびそれ以上の同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列; または該単離されたポリヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列を含む。
A. ベクター
ポリペプチドは、核酸分子によってコードされてもよい。核酸分子は核酸ベクターの形態であってよい。「ベクター」という用語は、異種核酸配列を、複製され発現されうる細胞へ導入するために、挿入できる担体核酸分子をいうように用いられる。核酸配列は「異種」であってよく、これは文脈中で、ベクターが導入されている細胞にとって、または核酸配列が組み入れられる核酸にとって核酸配列が異質であることを意味し、これには、細胞中または核酸中の配列と同種であるが、しかし、通常は見出されない、宿主細胞内または核酸内のある位置における配列が含まれる。ベクターにはDNA、RNA、プラスミド、コスミド、ウイルス(バクテリオファージ、動物ウイルスおよび植物ウイルス)、ならびに人工染色体(例えば、YAC)が含まれる。当業者は、標準的な組換え技術(例えば、ともに参照により本明細書に組み入れられるSambrook et al., 2001; Ausubel et al., 1996)を通じてベクターを構築するのに必要なものを十分に持っていると考えられる。ベクターは、ポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、1つもしくは複数の短縮型ポリメラーゼドメイン、または1つもしくは複数の短縮型RNAポリメラーゼドメインに融合、付着または連結されている相互作用成分を産生するために宿主細胞において用いられてもよい。
「発現ベクター」という用語は、転写されうる遺伝子産物の少なくとも一部をコードする核酸配列を含むベクターをいう。場合によっては、次にRNA分子をタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに翻訳する。発現ベクターは、特定の宿主生物において機能的に連結されたコード配列の転写およびおそらく翻訳にとって必要な核酸配列をいう種々の「制御配列」を含みうる。転写および翻訳を支配する制御配列に加えて、ベクターおよび発現ベクターは、その上他の機能も果たしかつ本明細書において記述される、核酸配列を含んでもよい。
B. 細胞
本開示は、特に原核生物の細胞、真核生物の細胞、組織、器官、または生物、より具体的には哺乳類の細胞、組織、器官、または生物において、関心対象の標的RNAを改変するための方法を提供する。標的RNAは、細胞内の核酸分子に含まれうる。いくつかの態様において、標的RNAは、哺乳類細胞または植物細胞などの、真核細胞にある。哺乳類細胞は、ヒト、ヒト以外の霊長類、ウシ、ブタ、げっ歯類、またはマウスの細胞でありうる。細胞は、家禽、魚またはエビなどの哺乳類以外の真核細胞でありうる。植物細胞は、キャッサバ、トウモロコシ、モロコシ、コムギ、またはイネなどの作物植物のものでありうる。植物細胞はまた、藻類、樹木または野菜のものでありうる。本開示の方法、システム、および組成物により細胞において誘導されるRNAの調節は、抗体、デンプン、アルコールまたは他の所望の細胞アウトプットなどの生物学的産物の産生の改善のために細胞および細胞の後代が改変されるようなものでありうる。細胞において誘導されるRNAの調節は、細胞および細胞の後代が、産生される生物学的産物を変化させる改変を含むようなものでありうる。
哺乳類細胞は、ヒトまたはヒト以外の哺乳類、例えば、霊長類、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、げっ歯類、ウサギ科(Leporidae)、例えばサル、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ウサギ、ラットまたはマウスの細胞でありうる。細胞は、家禽の鳥(例えば、ニワトリ)、脊椎動物の魚(例えば、サーモン)または甲殻類(例えば、カキ、ハマグリ、ロブスター、エビ)の細胞などの哺乳類以外の真核細胞でありうる。細胞はまた、植物細胞でありうる。植物細胞は、単子葉植物または双子葉植物のものであってよく、あるいはキャッサバ、炭素有機物(com)、モロコシ、ダイズ、コムギ、カラスムギまたはイネなどの作物植物または穀物植物のものであってよい。植物細胞はまた、藻類、樹木または生産植物、果物または野菜(例えば、柑橘類の樹木などの樹木、例えば、オレンジ、グレープフルーツまたはレモンの樹木; モモまたはネクタリンの樹木; リンゴまたはナシの樹木; アーモンドまたはクルミまたはピスタチオの樹木などの堅果樹; ナス科植物; アブラナ(Brassica)属の植物; アキノノゲシ(Lactuca)属の植物; ホウレンソウ(Spinacia)属の植物; トウガラシ(Capsicum)属の植物; 綿、タバコ、アスパラガス、ニンジン、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー、トマト、ナス、コショウ、レタス、ホウレンソウ、イチゴ、ブルーベリー、ラズベリー、ブラックベリー、ブドウ、コーヒー、ココアなど)のものであってよい。
本明細書において用いられる場合、「細胞」、「細胞株」、および「細胞培養物」という用語は互換的に用いることができる。これらの用語の全てが、任意のおよび全ての次世代のその後代も含む。故意または偶然の変異により全ての後代が同一ではないことがあると理解されると考えられる。異種核酸配列を発現するという文脈において、「宿主細胞」とは、原核細胞または真核細胞をいい、これには、ベクターを複製できるかまたはベクターによってコードされる異種遺伝子を発現できる、任意の形質転換可能な生物が含まれる。宿主細胞はベクターまたはウイルスのレシピエントとして、使用されることができかつ使用されている。宿主細胞は「形質移入」または「形質転換」されてもよく、それらは組換えタンパク質をコードする配列などの、外因性の核酸が宿主細胞に移入または導入される過程をいう。形質転換細胞には、初代対象細胞およびその後代が含まれる。
いくつかのベクターは、原核細胞と真核細胞の両方において複製および/または発現させる制御配列を使用してもよい。当業者はさらに、それらを維持してベクターの複製を許容するために上記の宿主細胞の全てをインキュベートする条件を理解すると考えられる。同様に、ベクターの大規模産生とともに、ベクターによってコードされる核酸、およびその同族のポリペプチド、タンパク質、またはペプチドの産生を可能にすると考えられる技術および条件が理解され、公知である。
C. 発現システム
先に論じた組成物の少なくとも一部または全部を含む多数の発現システムが存在する。原核生物および/または真核生物に基づくシステムを態様で用いるために使用して、核酸配列、またはその同源のポリペプチド、タンパク質およびペプチドを産生することができる。例えば、本開示のベクター、融合タンパク質、RNAヘアピン結合タンパク質、RNAターゲティング分子、RNA調節ドメイン、およびアクセサリータンパク質は、誘導性または構成性発現システムなどの、発現システムを利用しうる。そのような多くのシステムが市販されており、広く使用可能である。
昆虫細胞/バキュロウイルスシステムは、ともに参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,871,986号、同第4,879,236号に記述されているように、異種核酸セグメントの高レベルのタンパク質発現をもたらすことができ、例えば、INVITROGEN(登録商標)からMAXBAC(登録商標) 2.0の名称で、およびCLONTECH(登録商標)からBACPACK(商標) BACULOVIRUS EXPRESSION SYSTEMの名称で購入することができる。
開示の発現システムに加え、発現システムの他の例としては、合成エクダイソン誘導性受容体またはそのpET発現システム、つまり大腸菌発現システムを含む、STRATAGENE(登録商標)のCOMPLETE CONTROL Inducible Mammalian Expression Systemが挙げられる。誘導性発現システムの別例はINVITROGEN(登録商標)から入手可能で、T-REX(商標) (テトラサイクリン調節発現)システム、つまり全長CMVプロモーターを用いた誘導性の哺乳類発現システムを有するものである。INVITROGEN(登録商標)は、メチロトローフ酵母ピチアメタノリカ(Pichia methanolica)における組換えタンパク質の高レベル産生のために設計された、Pichia methanolica Expression Systemと呼ばれる酵母発現システムも提供している。当業者なら、発現構築体などのベクターを発現させる方法、核酸配列、またはその同源のポリペプチド、タンパク質、もしくはペプチドを産生する方法を承知していると考えられる。
V. タンパク性組成物
コラーゲン結合ドメインに連結されたアルブミンポリペプチドを含むまたはコードするものなどの本開示のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、もしくは50個またはそれ以上の変種アミノ酸または核酸置換を含み、あるいはSEQ ID NO:1～18のいずれかの、少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、300、400、500、550、1000、1500、2000個もしくはそれ以上またはその中で導出可能な任意の範囲、または多くとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、300、400、500、550、1000、1500、2000個もしくはそれ以上またはその中で導出可能な任意の範囲の連続するアミノ酸または核酸と少なくとも60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%類似、同一、または相同でありうる。
コラーゲン結合ドメインに連結されたアルブミンポリペプチドを含むまたはコードするものなどの本開示のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:1～18のいずれかの、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、300、400、500、550、1000、1500、2000個もしくはそれ以上またはその中で導出可能な任意の範囲の連続するアミノ酸を含みうる。
いくつかの態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO:1～18のアミノ酸1～2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、650、700、750、800、850、900、1000、1500、もしくは2000 (またはその中で導出可能な任意の範囲)を含む。
いくつかの態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO:1～18のいずれかの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、650、700、750、800、850、900、1000、1500、もしくは2000個(またはその中で導出可能な任意の範囲)の連続するアミノ酸を含む。
いくつかの態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO:1～18のいずれかの、
少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、650、700、750、800、850、900、1000、1500、もしくは2000個(またはその中で導出可能な任意の範囲)、
多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、650、700、750、800、850、900、1000、1500、もしくは2000個(またはその中で導出可能な任意の範囲)、または
正確に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、650、700、750、800、850、900、1000、1500、もしくは2000個(またはその中で導出可能な任意の範囲)の連続するアミノ酸を含み、
SEQ ID NO:1～18のいずれかの位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、650、700、750、800、850、900、1000、1500、または2000から始まる。
いくつかの態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO:1～18のいずれかの1つと少なくとも60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%類似、同一、もしくは相同である、多くとも60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%類似、同一、もしくは相同である、または正確に60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%類似、同一、もしくは相同である、
SEQ ID NO:1～18の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、650、700、750、800、850、900、1000、1500、もしくは2000個(またはその中で導出可能な任意の範囲)の連続するアミノ酸を含む。
本開示のポリペプチドは、
少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、もしくは615個(またはその中で導出可能な任意の範囲)の、
多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、もしくは615個(またはその中で導出可能な任意の範囲)の、または
正確に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、もしくは615個(またはその中で導出可能な任意の範囲)の、
置換を含みうる。
置換は、SEQ ID NO:1～18のいずれかのアミノ酸位置または核酸位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、650、700、750、800、850、900、1000、1500、もしくは2000 (またはその中で導出可能な任意の範囲)にありうる。
本明細書において記述されるポリペプチドは、
少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、300、400、500、550、1000個もしくはそれ以上(またはその中で導出可能な任意の範囲)、
多くとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、300、400、500、550、1000個もしくはそれ以上(またはその中で導出可能な任意の範囲)、または
正確に5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、300、400、500、550、1000個もしくはそれ以上(またはその中で導出可能な任意の範囲)
のアミノ酸の固定長のものでありうる。
置換変種は、典型的には、タンパク質内の1つまたは複数の部位での1つのアミノ酸と別のアミノ酸との交換を含み、他の機能または特性を失ってかまたは失うことなく、ポリペプチドについての1つまたは複数の特性を修飾するように設計されてもよい。置換は保存的であってもよく、すなわち、1つのアミノ酸が、類似の形状および電荷のアミノ酸に置換されてもよい。保存的置換は当技術分野において周知であり、これには、例えば、アラニンのセリンへの、アルギニンのリジンへの、アスパラギンのグルタミンまたはヒスチジンへの、アスパラギン酸のグルタミン酸への、システインのセリンへの、グルタミンのアスパラギンへの、グルタミン酸のアスパラギン酸への、グリシンのプロリンへの、ヒスチジンのアスパラギンまたはグルタミンへの、イソロイシンのロイシンまたはバリンへの、ロイシンのバリンまたはイソロイシンへの、リジンのアルギニンへの、メチオニンのロイシンまたはイソロイシンへの、フェニルアラニンのチロシン、ロイシンまたはメチオニンへの、セリンのトレオニンへの、トレオニンのセリンへの、トリプトファンのチロシンへの、チロシンのトリプトファンまたはフェニルアラニンへの、および、バリンのイソロイシンまたはロイシンへの変化が含まれる。あるいは、置換はポリペプチドの機能または活性が影響を受けるように非保存的であってもよい。非保存的変化は、典型的には、非極性アミノ酸または非荷電アミノ酸の代わりに極性アミノ酸または荷電アミノ酸を用いておよびその逆など、1つの残基を化学的に異なる残基に置換することを含む。
タンパク質は、組換えであってもまたはインビトロで合成されてもよい。あるいは、非組換えまたは組換えタンパク質を細菌から単離してもよい。そのような変種を含有する細菌を、組成物および方法のなかで実践できることも考えられる。結果的に、タンパク質は単離されなくてもよい。
「機能的に等価なコドン」という用語は、アルギニンまたはセリンに対する6種類のコドンなどの、同じアミノ酸をコードするコドンをいうように、本明細書において用いられ、同様に、生物学的に等価のアミノ酸をコードするコドンもいう。
アミノ酸および核酸の配列は、タンパク質の発現が関与している生物学的タンパク質活性の維持を含む上記の基準を満たす限り、それぞれ、さらなるN末端もしくはC末端アミノ酸、または5'もしくは3'配列などのさらなる残基を含むこともあり、それでも本質的には、本明細書において開示されている配列の1つに記載の通りでありうることも理解されると考えられる。末端配列の付加は核酸配列に特に当てはまり、例えば、コード領域の5'部分または3'部分のいずれか一方に隣接する種々の非コード配列を含むことができる。
以下は、等価なまたは場合によっては改善された、第二世代の分子を作製するためにタンパク質のアミノ酸を変化させることに基づく考察である。例えば、ある特定のアミノ酸を、相互作用結合能をさほど失わないようにタンパク質構造中の他のアミノ酸の代わりに用いることができる。例えば、酵素触媒ドメインまたは相互作用成分などの構造は、そのような機能を維持するために置換されたアミノ酸を有しうる。タンパク質の機能活性を規定するのはタンパク質の相互作用能および性質であることから、タンパク質配列の中に、およびその基礎となるDNAコード配列の中にある特定のアミノ酸置換を施し、それでも、類似の特性を有するタンパク質を産生させることができる。このように、遺伝子のDNA配列において、その生物学的有用性または活性をさほど失わないように種々の変化を施すことができるものと本発明者らは企図している。
他の態様において、1つまたは複数の置換を導入することによってポリペプチドの機能の改変が意図される。例えば、ある特定のアミノ酸を、相互作用成分の相互作用結合能を改変することを意図してタンパク質構造中の他のアミノ酸の代わりに用いることができる。例えば、タンパク質相互作用ドメイン、核酸相互作用ドメイン、および触媒部位などの構造は、そのような機能を改変するために置換されたアミノ酸を有しうる。タンパク質の機能活性を規定するのはタンパク質の相互作用能および性質であることから、タンパク質配列の中に、およびその基礎となるDNAコード配列の中にある特定のアミノ酸置換を施し、それでも、異なる特性を有するタンパク質を産生させることができる。このように、遺伝子のDNA配列において、その生物学的有用性または活性をかなり変化させるように種々の変化を施すことができるものと本発明者らは企図している。
そのような変化を加える場合、アミノ酸の疎水性親水性指標を考慮してもよい。タンパク質に相互作用生物機能を付与する際の疎水性親水性アミノ酸指数の重要性は、一般的に当技術分野において理解されている(Kyte and Doolittle, 1982)。アミノ酸の相対的な疎水性親水性指標の特徴が、得られるタンパク質の二次構造に寄与し、さらには、タンパク質と他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、DNA、抗体、抗原などとの相互作用を規定することが容認されている。
同様に、親水性に基づいて有効に同類のアミノ酸の置換がなされることも当技術分野において理解される。参照により本明細書に組み入れられる米国特許第4,554,101号は、その隣接するアミノ酸の親水性によって支配されるタンパク質の最大局所平均親水性が、タンパク質の生物特性と相関すると述べている。1つのアミノ酸を、類似の親水性値を有する別のアミノ酸に置換することができ、それでもなお、生物学的に等価かつ免疫学的に等価なタンパク質を作製することができると理解される。
上記で概説した通り、アミノ酸の置換は一般的に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば疎水性、親水性、電荷、大きさなどに基づく。前述のさまざまな特徴を考慮に入れた例示的置換は周知であり、アルギニンおよびリジン; グルタミン酸およびアスパラギン酸; セリンおよびトレオニン; グルタミンおよびアスパラギン; ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシンを含む。
特定の態様において、本明細書において記述されるタンパク質の全部または一部を、従来の技術にしたがって溶液中でまたは固体支持体上で合成することもできる。各種の自動合成機が市販されており、それらを公知のプロトコルにしたがって用いることができる。例えば、Stewart and Young, (1984); Tarn et al., (1983); Merrifield, (1986); およびBarany and Merrifield (1979)を参照されたく、これらの各々が参照により本明細書に組み入れられる。あるいは、ペプチドまたはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入し、これを適切な宿主細胞に形質転換または形質移入し、これを発現に適した条件の下で培養する組換えDNA技術を使用することもできる。
1つの態様では、タンパク質の産生および/または提示のための、微生物を含めた細胞への遺伝子移入の使用を含む。関心対象のタンパク質に対する遺伝子を適切な宿主細胞に移入し、引き続いて適切な条件下での細胞の培養を行うことができる。実質的にすべてのポリペプチドをコードする核酸を、使用することができる。組換え発現ベクターの作製、およびそのベクターに含まれる要素は、本明細書において論じられている。あるいは、産生されるタンパク質は、タンパク質の産生に用いられる細胞によって通常合成される内因性タンパク質であってもよい。
VI. 併用療法
本開示の組成物および関連する方法、特にコラーゲン結合ドメインに連結されたアルブミンポリペプチドまたはIgG Fcドメインポリペプチドを含むポリペプチドの投与も、本明細書において記述されるさらなる治療法などの、さらなる治療法の投与と組み合わせてまたは当技術分野において公知の他の従来の治療法と組み合わせて用いられうる。
本明細書において開示される治療用組成物および処置は、数分間から数週間に及ぶ間隔だけ、別の処置または薬剤に先行し、同時進行し、および/または後続しうる。薬剤が細胞、組織または生物に別々に適用される態様において、一般的に、治療剤がなお細胞、組織または生物に対して好都合な併用効果を奏することができうるように各送達時点同士の間の重要な期間を過ぎないことが確実にされるであろう。例えば、そのような場合、細胞、組織または生物が2、3、4種類またはそれ以上の薬剤または処置と実質的に同時に(すなわち、約1分未満以内に)接触されうることが企図される。他の局面において、1種類または複数種の治療剤または処置が、別の治療剤の投与または処置の実施の前および/または後の1分間、5分間、10分間、20分間、30分間、45分間、60分間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、11時間、12時間、13時間、14時間、15時間、16時間、17時間、18時間、19時間、20時間、21時間、22時間、22時間、23時間、24時間、25時間、26時間、27時間、28時間、29時間、30時間、31時間、32時間、33時間、34時間、35時間、36時間、37時間、38時間、39時間、40時間、41時間、42時間、43時間、44時間、45時間、46時間、47時間、48時間、1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、14日間、15日間、16日間、17日間、18日間、19日間、20日間、21日間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間もしくは8週間以内にまたはそれ以上の範囲内で、およびその中で導出可能な任意の範囲内で投与または提供されうる。
治療剤および処置のさまざまな併用レジメンが利用されうる。そのような併用の非限定的な例を以下に示すが、ここで、治療剤、例えば本明細書において開示される組成物は「A」であり、本明細書において記述または当技術分野において公知の第2の薬剤、例えばさらなる薬剤、化学療法薬、またはチェックポイント阻害剤は「B」である。
Figure 2022535816000016
いくつかの態様において、2つ以上の治療過程が利用されうる。複数過程が実施されうることが企図される。
VII. 治療方法
本方法および組成物は、がんを処置するための方法に関する。いくつかの態様において、がんは固形腫瘍を含む。いくつかの態様において、がんは非リンパ系である。いくつかの態様において、がんは乳がんまたは結腸がんである。
本開示の組成物は、インビボ、インビトロまたはエクスビボでの投与に用いられうる。組成物の投与経路は、例えば腫瘍内、皮内、皮下、静脈内、リンパ管内および腹腔内投与でありうる。いくつかの態様において、投与は腫瘍内またはリンパ管内または腫瘍周囲である。いくつかの態様において、該組成物は、がん組織またはリンパ節内に直接投与される。
「腫瘍」は、本明細書において用いられる場合、悪性であれ良性であれ、あらゆる新生細胞の成長および増殖、ならびにあらゆる前がん性およびがん性の細胞および組織をいう。用語「がん」、「がん性」、「細胞増殖性障害」、「増殖性障害」および「腫瘍」は、本明細書において言及される場合、相互に排他的でない。
処置に適したがんは、全てのタイプ、位置、サイズおよび特徴の腫瘍を含むが、これらに限定されることはない。本開示の方法および組成物は、例えば、膵がん、結腸がん、急性骨髄性白血病、副腎皮質がん、AIDS関連がん、AIDS関連リンパ腫、肛門がん、虫垂がん、星状細胞腫、小児の小脳または大脳の基底細胞がん、胆管がん、肝外膀胱がん、骨のがん、骨肉腫/悪性線維性組織球腫、脳幹膠腫、脳腫瘍、小脳の星状細胞腫脳腫瘍、大脳の星状細胞腫/悪性膠腫脳腫瘍、上衣細胞腫脳腫瘍、髄芽細胞腫脳腫瘍、テント上原始神経外胚葉腫瘍脳腫瘍、視覚伝導路および視床下部の膠腫、乳がん、特定の乳がん、例えば非浸潤性乳管がん、浸潤性乳管がん、乳房の管状腺がん、乳房の髄様がん、乳房の粘液性がん腫、乳房の乳頭状がん、乳房の篩状がん、浸潤性小葉がん、炎症性乳がん、非浸潤性小葉がん、男性の乳がん、乳頭のページェット病、乳房の葉状腫瘍、再発性および/または転移性乳がん、ルミナルAまたはB型乳がん、三重陰性/基底細胞様乳がん、およびHER2過剰型乳がん、リンパ系のがん、気管支腺腫/カルチノイド、気管がん、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、小児のカルチノイド腫瘍、原発不明の胃腸のがん、中枢神経系のリンパ腫、原発性の小脳の星状細胞腫、小児の大脳の星状細胞腫/悪性膠腫、小児の子宮頸がん、小児のがん、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性障害、皮膚T細胞性リンパ腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、子宮内膜がん、上衣細胞腫、食道がん、ユーイング、小児の性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管がん、目のがん、網膜芽細胞腫、胆嚢がん、胃(gastric/stomach)がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍(GIST)、胚細胞腫瘍:頭蓋外、性腺外または卵巣、妊娠性絨毛性腫瘍、脳幹の膠腫、膠腫、小児の大脳の星状細胞腫、小児の視覚伝導路および視床下部の膠腫、胃カルチノイド、ヘアリー細胞白血病、頭頸部がん、心臓のがん、肝細胞(肝)がん、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、視床下部および視覚伝導路の膠腫、小児の眼内黒色腫、膵島細胞がん(内分泌膵)、カポジ肉腫、腎がん(腎細胞がん)、喉頭がん、白血病、急性リンパ芽球性(急性リンパ性白血病とも称される)白血病、急性骨髄性(myeloid)(急性骨髄性(myelogenous)白血病とも称される)白血病、慢性リンパ性(慢性リンパ性白血病とも称される)白血病、慢性骨髄性(myelogenous)(慢性骨髄性(myeloid)白血病とも称される)白血病、ヘアリー細胞口唇および口腔のがん、脂肪肉腫、肝がん(原発性)、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、リンパ腫、AIDS関連リンパ腫、バーキットリンパ腫、皮膚T細胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキン(ホジキン以外のすべてのリンパ腫の古い分類)リンパ腫、中枢神経原発リンパ腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、骨の悪性線維性組織球腫/骨肉腫、小児の髄芽細胞腫、眼内(目の)黒色腫、メルケル細胞がん、成人の悪性中皮腫、小児の中皮腫、転移性頸部扁平上皮(squamous neck)がん、口腔(mouth)がん、多発性内分泌腫瘍症、多発性骨髄腫/形質細胞腫瘍、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成/骨髄増殖性疾患、慢性骨髄性白血病、成人の急性骨髄性白血病、小児の急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、慢性骨髄増殖性障害、鼻腔および副鼻腔のがん、鼻咽腔がん、神経芽細胞腫、口腔(oral)がん、口腔咽頭がん、骨肉腫/骨の悪性線維性組織球腫、卵巣がん、卵巣上皮がん(表層上皮性・間質性腫瘍)、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵がん、膵島細胞副鼻腔および鼻腔のがん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、松果体の星状細胞腫、松果体胚腫、松果体芽腫およびテント上原始神経外胚葉腫瘍、小児の下垂体腺腫、形質細胞腫瘍/多発性骨髄腫、胸膜肺芽細胞腫、中枢神経原発リンパ腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞がん(腎がん)、腎盂および尿管の移行上皮がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、小児の唾液腺がん肉腫、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍、カポジ肉腫、軟部組織肉腫、子宮のセザリー症候群肉腫、皮膚がん(非黒色腫)、皮膚がん(黒色腫)、皮膚がん、メルケル細胞小細胞肺がん、小腸のがん、軟部組織肉腫、扁平上皮がん、原発不明の頸部扁平上皮がん、転移性胃がん、テント上原始神経外胚葉腫瘍、小児のT細胞リンパ腫、精巣がん、喉のがん、胸腺腫、小児の胸腺腫、胸腺がん、甲状腺がん、尿道がん、子宮がん、子宮内膜の子宮肉腫、膣がん、視覚伝導路および視床下部の膠腫、小児の外陰がん、ならびにウィルムス腫瘍(腎がん)を処置するのに適している。
VIII. 薬学的組成物および方法
いくつかの態様において、薬学的組成物は、対象に投与される。異なる局面は、対象に組成物の有効量を投与することを伴う。いくつかの態様において、阻害剤を含む組成物は、がんを処置するために、または腫瘍のサイズを低減するために対象または患者に投与されうる。さらに、そのような化合物は、さらなるがん療法と組み合わせて投与することができる。
組成物は、非経口投与用に製剤化することができ、例えば、静脈内、経カテーテル注射、動脈内注射、筋肉内、皮下、または腹腔内経路を介した注射用に製剤化することができる。典型的には、そのような組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして、注射剤として調製することができる; 注射前に液体を添加して溶液または懸濁液を調製するために用いるのに適した固体形態も調製することができる; および、調製物を乳化することもできる。そのような製剤の調製は、本開示に照らして当業者に公知であろう。他の投与経路は、腫瘍内、腫瘍周囲、リンパ内、がん組織への注射、およびリンパ節への注射を含む。いくつかの態様において、投与は全身性である。
他の投与経路も企図される。例えば、構築体および薬剤は、担体と関連して投与されうる。いくつかの態様において、担体はナノ粒子またはマイクロ粒子である。いくつかの態様において、ナノ粒子またはマイクロ粒子は腫瘍指向性ナノ粒子またはマイクロ粒子である。例えば、担体は、該担体を腫瘍に指向させるターゲティング部分をさらに含みうる。ターゲティング部分は、腫瘍細胞を特異的に認識する結合剤(例えば抗体、例えばscFvなど、または他の抗原結合剤)でありうる。いくつかの態様において、構築体は担体内に封入される。いくつかの態様において、構築体は担体表面に共有結合または非共有結合される。いくつかの態様において、担体はリポソームである。さらなる態様において、本明細書において記述される担体分子は、除外される。
粒子は、可変寸法の構造を有することができ、ミクロスフェア、マイクロ粒子、ナノ粒子、ナノスフェア、またはリポソームとしてさまざまに知られている。そのような粒子状製剤は、構築体の粒子への共有結合または非共有結合によって形成することができる。いくつかの態様において、本明細書において記述される粒子は、除外される。
注射用の使用に適した薬学的形態としては、滅菌された水性の溶液または分散液; ゴマ油、ピーナッツ油または水性プロピレングリコールを含む配合物; および滅菌注射用液剤または分散剤の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。全ての場合において、該形態は、滅菌していなければならず、容易に注射されうる程度に流動性でなければならない。また、製造および保存の条件下で安定であるのがよく、微生物、例えば細菌および真菌の夾雑作用から保護されていなければならない。
また、担体は、例えば水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液状ポリエチレングリコールなど)、その適当な混合物ならびに植物油を含む溶媒または分散媒でありうる。適正な流動性は、例えば、コーティング、例えばレシチンの使用によって、分散剤の場合は必要とされる粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持されうる。微生物の作用の抑制は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされうる。多くの場合、等張性剤、例えば糖類、塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、該組成物中における吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらされうる。
滅菌注射用液剤は、必要とされる量の活性化合物を、上記に列挙した種々のその他の成分を必要に応じて有する適切な溶媒中に組み込んだ後、ろ過滅菌することにより調製される。一般的に、分散剤は、種々の滅菌活性成分を、ベースの分散媒および上記に列挙したもののうちの必要とされるその他の成分を含む滅菌媒体に組み込むことにより調製される。滅菌注射用液剤の調製用の滅菌粉末剤の場合、好ましい調製方法は真空乾燥および凍結乾燥手法であり、これにより、活性成分に加えてさらなる所望の成分の粉末が、先に滅菌ろ過したその溶液から得られる。
本明細書において用いられる場合、「薬学的に許容される」という用語は、化合物、物質、組成物および/または投薬形態が、正しい医学的判断の範囲内において、人間および動物の組織との接触に適しており、過度な毒性、刺激、アレルギー応答または問題となる他の合併症がなく、妥当な便益/リスク比と釣り合っていることをいう。「薬学的に許容される担体」という用語は、化学剤の担持または輸送に関与する薬学的に許容される物質、組成物または媒体、例えば液状または固形の増量剤、希釈剤、賦形剤、溶媒または封入材を意味する。
本明細書において用いられる場合、「薬学的に許容される塩」は、親化合物を、存在している酸部分または塩基部分をその塩形態に変換させることにより修飾した本開示の化合物の誘導体をいう。薬学的に許容される塩の例としては、非限定的に、アミンなどの塩基性残基の鉱酸または有機酸の塩; カルボン酸などの酸性残基のアルカリ塩または有機塩などが挙げられる。薬学的に許容される塩としては、例えば非毒性の無機酸または有機酸で形成される親化合物の慣用的な非毒性の塩または第4級アンモニウム塩が挙げられる。薬学的に許容される塩を、塩基性部分または酸性部分を含む親化合物から、慣用的な化学的方法によって合成してもよい。
対象の状態に応じて投薬量におけるいくらかの変動が必然的に生じる。投与を担う人は、任意の事象において個々の対象に適切な用量を決定する。治療用または予防用組成物の有効量は、意図された目的に基づいて決定される。「単位用量」または「投薬量」という用語は、対象における使用に適した物理的に独立した単位をいい、各単位は、その投与、すなわち適切な経路およびレジメンを伴って上記に論考した所望の応答がもたらされるように計算された所定量の該組成物を含む。投与される量は、処置回数および単位用量の両方に従って所望される効果に依存する。また、該組成物の厳密な量は実務者の判断にも依存し、各個体に固有である。用量に影響を及ぼす要素としては、対象の身体の状態および臨床状態、投与経路、意図される処置目的(症状の緩和か治癒か)、ならびに具体的な組成物の効力、安定性および毒性が挙げられる。
液剤は、製剤化されたら、投薬製剤に適合する様式で、治療的または予防的に有効であるような量で投与される。製剤は、種々の剤形で、例えば上記の型の注射用液剤で容易に投与される。
典型的には、ヒト成人(およそ70キログラムの体重)に対して、約0.1 mg～約3000 mg (その間のあらゆる値および範囲を含む)、または約5 mg～約1000 mg (その間のあらゆる値および範囲を含む)、または約10 mg～約100 mg (その間のあらゆる値および範囲を含む)の化合物が投与される。このような投薬量範囲は一例にすぎないこと、および投与は、当業者に公知の要素に応じて調整されうることが理解されよう。
ある種の態様において、対象は、
約0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20.0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、410、420、425、430、440、441、450、460、470、475、480、490、500、510、520、525、530、540、550、560、570、575、580、590、600、610、620、625、630、640、650、660、670、675、680、690、700、710、720、725、730、740、750、760、770、775、780、790、800、810、820、825、830、840、850、860、870、875、880、890、900、910、920、925、930、940、950、960、970、975、980、990、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、6000、7000、8000、9000、10000ミリグラム(mg)もしくはマイクログラム(mcg)もしくはμg/kgもしくはマイクログラム/kg/分もしくはmg/kg/分もしくはマイクログラム/kg/時もしくはmg/kg/時で、またはその中で導出可能な任意の範囲で、
少なくとも約0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20.0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、410、420、425、430、440、441、450、460、470、475、480、490、500、510、520、525、530、540、550、560、570、575、580、590、600、610、620、625、630、640、650、660、670、675、680、690、700、710、720、725、730、740、750、760、770、775、780、790、800、810、820、825、830、840、850、860、870、875、880、890、900、910、920、925、930、940、950、960、970、975、980、990、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、6000、7000、8000、9000、10000ミリグラム(mg)もしくはマイクログラム(mcg)もしくはμg/kgもしくはマイクログラム/kg/分もしくはmg/kg/分もしくはマイクログラム/kg/時もしくはmg/kg/時で、またはその中で導出可能な任意の範囲で、あるいは
多くとも約0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20.0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、410、420、425、430、440、441、450、460、470、475、480、490、500、510、520、525、530、540、550、560、570、575、580、590、600、610、620、625、630、640、650、660、670、675、680、690、700、710、720、725、730、740、750、760、770、775、780、790、800、810、820、825、830、840、850、860、870、875、880、890、900、910、920、925、930、940、950、960、970、975、980、990、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、6000、7000、8000、9000、10000ミリグラム(mg)もしくはマイクログラム(mcg)もしくはμg/kgもしくはマイクログラム/kg/分もしくはmg/kg/分もしくはマイクログラム/kg/時もしくはmg/kg/時で、またはその中で導出可能な任意の範囲で、
投与される。
投薬は頓用で行なわれうるか、または1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18もしくは24時間毎に(あるいはその中で導出可能な任意の範囲)または1日に1、2、3、4、5、6、7、8、9回もしくはそれ以上(あるいはその中で導出可能な任意の範囲)行なわれうる。投薬は、病状の徴候の前または後に最初に行なわれてもよい。いくつかの態様において、患者は、レジメンの初回投薬を、該患者が病状の徴候または症状を起こすかまたは示してから1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12時間後(あるいはその中で導出可能な任意の範囲)または1、2、3、4または5日後(あるいはその中で導出可能な任意の範囲)に行なわれる。患者は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10日間もしくはそれ以上(あるいはその中で導出可能な任意の範囲)、または病状の症状が消失もしくは低減されるまで、または感染の症状が消失もしくは低減してから6、12、18もしくは24時間後または1、2、3、4もしくは5日後まで、処置されうる。
IX. 実施例
以下の実施例は、本開示の好ましい態様を実証するために含めている。当業者には、以下の実施例に開示した手法が、本発明者が、本開示の実施において充分に機能を果たすと見出した手法であり、したがって、その実施のための好ましい形態を構成しているとみなされうることが認識されよう。しかしながら、当業者は、本開示に鑑みると、開示している具体的な態様において、本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく多くの変更が行なわれうるが、それでもなお同様または類似の結果が得られることが認識されるはずである。
実施例1－がん療法のための薬物-コンジュゲート担体としての操作されたコラーゲン結合血清アルブミン
血清アルブミン(SA)は、受動的ターゲティングを介して細胞毒性剤を腫瘍に送達するための担体として用いられる。SAの腫瘍ターゲティング能力をさらに改善するために、本発明者らは、受動的および能動的ターゲティングの組み合わせを通じて、腫瘍内にSA-薬物コンジュゲートを保持するためのアプローチを開発しようとした。SAはフォンヴィルブランド因子のコラーゲン結合ドメイン(CBD)と組換え融合され、腫瘍血管透過性による血管外遊出後に腫瘍間質内に結合した。ドキソルビシン(Dox)は、pH感受性リンカーを介してCBD-SAにコンジュゲートされた。Dox-CBD-SA処置は、乳がんのマウスモデルにおけるDox-SAおよびアルドキソルビシン処置の両方と比較して、腫瘍増殖を有意に抑制した。Dox-CBD-SAは、宿主の抗腫瘍免疫を効率的に刺激し、抗PD-1チェックポイント阻害剤と組み合わせて用いられた場合にMC38結腸がん腫の完全な根絶を引き起こした。Dox-CBD-SAはアルドキソルビシンと比較して有害事象を減少させた。したがって、操作されたCBD-SAは、固形腫瘍の処置のための用途が広く、臨床的に関連のある薬物コンジュゲート担体タンパク質でありうる。
A. 導入
ドキソルビシン(Dox)は、米国食品医薬品局(US Food and Drug Administration; FDA)によって広範囲のがんを処置するために承認されている低分子抗がん薬である。Doxは、受動膜貫通拡散を介して細胞内に内部移行し、DNA機能を妨害して、増殖中の細胞の死を引き起こす。Dox処置は一部の患者集団の生存を引き延ばすが、一つには薬剤耐性獲得のために、抗腫瘍効力は劇的ではない。不十分なDox治療指数も、その治療的使用を限定している。実際に、骨髄抑制、過度の炎症、および心臓毒性を含む、Doxの無視できない毒性が外来診察所において報告されている(13、14)。効力を改善するために、Doxは、他の化学療法剤と組み合わせて用いられることが多い。本明細書で、本発明者らは、N末端がVWF A3ドメインのC末端と融合された組換えマウスSA (CBD-SA) をデザインし、注射前にpH依存性の切断可能なヒドラゾン結合を介してアルドキソルビシンがCBD-SAにコンジュゲートされた (すなわち、Dox-CBD-SA)(21)。本発明者らは、操作されたCBD-SAを腫瘍標的薬物担体として評価し、それにより、腫瘍微小環境への効率的なDox送達によって改善された抗腫瘍効力を得た。
B. 結果
1. CBD-SAはコラーゲンに結合し、Doxにコンジュゲートされうる
本発明者らは、腫瘍微小環境を標的とするためにDox-CBD-SAコンジュゲートを合成した(図1A、B)。本発明者らは、インビトロでの組換えコラーゲンタンパク質へのCBD-SAの結合能力を最初に調べた。(GGGS)2リンカー(SEQ ID NO:3)を用いてマウスSAのN末端にCBDを付し、SAを組換え発現させた。CBD-SAの分子量をMALDI-TOF MSによって分析した(図6)。コラーゲンI型およびIII型へのCBD-SAの強い結合親和性(nM範囲の解離定数(Kd)値)が観察された(図1C、図7)。Doxコンジュゲーションのため、本発明者らは最初に、2-イミノチオラン(トラウトの試薬としても知られる)を用いてCBD-SAのリジン残基をチオール化した。次いで、アルドキソルビシンをCBD-SAに共有結合的にコンジュゲートさせた。未改変SAも同じ方法でアルドキソルビシンとコンジュゲートさせた(Dox-SA)。非還元条件下でのSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)は、精製されたDox-SAおよびDox-CBD-SAが単量体であることを示した(図8)。Doxコンジュゲーションの前後に、CBD-SAの流体力学的サイズを測定した(図9)。この結果から、CBD-SAが単量体の形態で存在し、Doxコンジュゲーションが凍結乾燥/再構成サイクルの後でさえこの特性を変えなかったことも示された。SA分子およびCBD-SA分子ごとに、およそ3つのDox分子がコンジュゲートされた(図1D)。注目すべきことに、本発明者らのコンジュゲーション方法は、VWF A3ドメインとヒトコラーゲンIIIとの間の結合界面にシステインまたはリジン残基がないため、コラーゲンへのCBD-SAの結合能力に影響を与えないであろう(図10、PDB: 4DMU (22))。この界面は、SAドメインに対するC末端融合部位からも遠く離れている。
2. Doxは酸性pH条件下で放出される
DoxはpH感受性の切断可能なリンカーでSAに連結されているので、異なるpH条件下でのコンジュゲートからのDoxの放出動態を調べた(図1E)。48時間のインキュベーション後、Dox-CBD-SAからのDox放出はpH 5.0およびpH 6.5 (報告された腫瘍微小環境条件)で最大に達した。対照的に、48時間後pH 7.4で約20%のDoxしか放出されなかった。Dox-SAは同様の放出プロファイルを示した(図11)。これらのデータは、ヒドラゾン結合を介して連結された低分子化学物質の既報の放出動態と一致して、コンジュゲートからのDoxのpH依存性放出を示している(21)。
3. Doxコンジュゲートはがん細胞により取り込まれ、細胞毒性を保持する
本発明者らは、Doxの蛍光を検出することにより共焦点レーザー走査顕微鏡法を用いて、Doxコンジュゲートの細胞内局在を遊離薬物と比較した。Doxは乳がんの主要な薬物であるため(23)、ここで本発明者らは実験モデルとしてマウス乳がんウイルス-ポリオーマウイルスミドルT抗原(MMTV-PyMT)マウス乳がんを選択した。MMTV-PyMT細胞をDoxまたはDoxコンジュゲートの存在下で培養し、次いで、それらの細胞内取り込みを評価した(図1F)。1時間のインキュベーション後、遊離Doxが細胞質、細胞内酸性オルガネラ、および選択的に核において検出され、これは、その送達が受動的な膜貫通拡散によって媒介されることを示している。対照的に、Dox-SAまたはDox-CBD-SAのいずれかの添加から1時間後に、細胞質は、コンジュゲートされていないDoxと比較して強い蛍光を示さなかった。むしろ、ところどころに位置する蛍光が観察され、一部の点はリソソームと共局在しており、これは、Dox-SAとDox-CBD-SAがエンドサイトーシスを介してともに内部移行されたことを示唆するものであった。Doxコンジュゲートの添加から24時間後、Dox由来の蛍光が核でも観察され、これは、細胞内オルガネラの酸性pHがコンジュゲートからの薬物遊離を誘導したことを示唆するものであった。次に、本発明者らは、インビトロで異なるDox形態の細胞毒性を調べた。MMTV-PyMT細胞またはMC38結腸がん腫細胞を播種し、Dox形態の存在下で3日間インキュベートした。生死判別試験から、全3つのDox形態がインビトロで同等の細胞毒性を有することが示された(図1G、H)。
4. Dox-CBD-SAは、アルドキソルビシンと同等の血漿薬物動態を実証し、腫瘍に蓄積する
アルドキソルビシンは静脈内(i.v.)投与後に素早く、内因性SAと反応するため、Doxと比較してかなり長い血漿中半減期を有する(18)。本発明者らは、腫瘍のないFVBマウスを用いてSAおよびCBD-SAの事前コンジュゲーション有りまたは無しのアルドキソルビシンの血漿薬物動態を試験した。i.v.注射後、アルドキソルビシン、Dox-SA、およびDox-CBD-SAの同様の血漿中半減期が観察された(図2A、B)。本発明者らはまた、pH非感受性リンカーを用いて蛍光標識されたSAおよびCBD-SAの血漿薬物動態を調べた(図12)。この結果は、Doxまたは色素のいずれかとコンジュゲートされた各タンパク質の半減期が類似していることを示し、コンジュゲートからのDoxの遊離が血液循環では起こらないことを示唆するものであった。
次に、本発明者らは、SAへのCBD融合が、腫瘍微小環境内のコラーゲンに対する能動的ターゲティングを介して腫瘍内のDoxの量を増加させるものと仮定した。この仮説を試験するために、本発明者らは、単回i.v.投与後の腫瘍組織内のDoxの量を測定した。Dox-CBD-SAは、投与後2時間でアルドキソルビシンおよびDox-SAと比較してDoxの有意に高い腫瘍蓄積を示した(図2C)。CBD-SAとのコンジュゲーションは同様に、注射24時間後に最高のDoxの腫瘍蓄積を達成し、アルドキソルビシンと比較して有意な増加を示した。組織学的分析は、蛍光標識されたCBD-SAが腫瘍組織内のCD31染色と共局在することを明らかにし、CBD-SAが腫瘍血管系を標的とすることを実証していた(図2D)。これらのデータは、DoxがコンジュゲートされているSAへのCBD融合によりDoxは腫瘍をターゲティングできるようになり、その結果Doxの腫瘍蓄積の増強がもたらされることを実証している。
5. Dox-CBD-SAはMMTV-PyMTマウス乳がんモデルにおいて優れた効力を実証する
血漿薬物動態および腫瘍蓄積研究に動機付けされて、本発明者らは、インビボでのDox-CBD-SAの抗腫瘍効果を評価した。MMTV-PyMT同所性腫瘍担持マウスに、尾静脈を介してDox形態の単回i.v.注射(Doxベースで5 mg/kg)を行った。Dox-SAおよびDox-CBD-SAは腫瘍増殖を有意に抑制したが、アルドキソルビシンは抑制しなかった(図3A、C～F)。これは、SAとのDoxの事前のコンジュゲーションが、内因性SAとのアルドキソルビシンのインサイチューでのコンジュゲーションよりも高い治療効果を提供することを示唆している。注目すべきことに、Dox-CBD-SAはDox-SAと比較してより大きな治療効果を示した。Dox-CBD-SA処置は、他の全群と比較して生存率を有意に引き延ばし(図3B)、12匹中2匹のマウスで完全な腫瘍寛解を誘導した。これらのデータは、CBD融合SAが抗腫瘍効力という点で未改変SAと比較して優れたDox担体として機能することを実証している。
6. Dox-CBD-SAはリンパ球の腫瘍浸潤を増強する
Doxは、壊死細胞からの抗原に対する免疫応答を刺激するICDを誘発すると報告されている(15)。実際、ICDは、結腸直腸がんおよび乳がんなどの複数の種類のがんの有益な予後マーカーである腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の数を増加させる(24、25)。本発明者らは、Dox-CBD-SA処理後のTIL、特にT細胞およびナチュラルキラー(NK)細胞を分析した。リンパ球を腫瘍から抽出し、さまざまなDox形態で処理してから7日後にフローサイトメトリーによって分析した。アルドキソルビシンまたはDox-SAではなく、Dox-CBD-SAは、単位腫瘍量あたりの腫瘍内のCD8+ T細胞、CD4+ T細胞、およびNK細胞の数を有意に増加させた(図3G～I)。特に、Dox-CBD-SA処理は、CD8+ T細胞の数を他の処理群よりも2倍超高く増加させた(図3G)。個々の腫瘍サイズおよびTIL細胞数のプロットは、Dox-CBD-SAが実際に小さな腫瘍サイズと腫瘍浸潤CD8+ T細胞、CD4+ T細胞およびNK細胞の数との間の相関関係を誘導したことを明らかにした(図3J～L)。これらのデータは、リンパ球、特にCD8+細胞傷害性T細胞の浸潤の増強が、Dox-CBD-SAの優れた抗腫瘍効果に寄与する可能性があることを示唆している。
7. Dox-CBD-SAは毒性の低減を示す
コンジュゲートされたアルドキソルビシンは生理学的pH下でSAから非常にゆっくりと放出されるだけであるため(図1E)、本発明者らは、Dox-CBD-SAがアルドキソルビシンと比較して毒性の低減を示すと仮定した。本発明者らは、腫瘍のないFVBマウスを用いて、アルドキソルビシンまたはDox-CBD-SA (Doxベースで20 mg/kg)の単回注射後の有害事象を評価した。アルドキソルビシンの投与は、IFN-γ、TNF-α、IL-5、およびIL-6などの炎症性サイトカインの血漿中濃度を増加させたが、Dox-CBD-SAは増加させなかった(図4A～D)。アルドキソルビシン処置はまた、赤血球(RBC)カウント、白血球(WBC)カウント、ヘマトクリット、およびヘモグロビン濃度の有意な減少を誘発した(図4E、F、図13)。対照的に、血液学的数値に対するDox-CBD-SAの悪影響は軽度であった。未処置群と比較して、WBCカウントの有意な減少のみが観察された。アルドキソルビシン投与は脾腫を誘発したが、Dox-CBD-SA処置は誘発しなかった(図4G)。組織学的分析により、Dox-CBD-SA処置は心臓、肝臓、腎臓、または肺において観察可能な損傷をもたらさないことが明らかにされた(図14)。これらのデータは、CBD-SAとのDoxの事前のコンジュゲーションがさまざまな面で毒性を低減したことを示唆している。
8. 抗PD-1抗体(αPD-1)と組み合わせたDox-CBD-SAはMC38腫瘍を根絶する
Dox-CBD-SA処置によって誘発されるTILの増加の観察に基づいて(図3G～L)、本発明者らは、CPIとのDox-CBD-SA併用療法は、CPIとのアルドキソルビシン併用療法と比較してより大きな治療効果を示すものと仮定した。この仮定を検証するために、本発明者らは外来診察所において最も広く用いられているCPIとしてαPD-1を選択した(26)。重要なことに、αPD-1は臨床試験においてDoxと組み合わせて用いられる(例えばNCT02648477)。本発明者らは、免疫原性である(27)がDox単剤療法では治癒できない(28)MC38結腸がん腫モデルを用いて、αPD-1と組み合わせたアルドキソルビシンおよびDox-CBD-SAの抗腫瘍効果を調べた。C57BL/6マウスに5×105個のMC38細胞を皮下接種した。処置スケジュールを図5Aに示す。アルドキソルビシンまたはDox-CBD-SAを腫瘍接種6、9、および12日後にマウスに投与した。Dox-CBD-SAはTILの数を増やすため、本発明者らは、Dox処置1日後に2回(10日目および13日目)αPD-1 100 μgを注射した。Dox-CBD-SA + αPD-1療法は確立されたMC38腫瘍を完全に根絶し(平均腫瘍体積は6日目に約100 mm3であった、図5B、G)、他の全群と比較してマウスの生存を有意に引き延ばした(図5C)。他の処置群では、一部のマウスは完全な応答を示すことができず、平均腫瘍サイズは徐々に増加した(図5B、D～F)。Dox-CBD-SA + αPD-1で処置されたサバイバーでは、追加の治療法なしにMC38細胞で再度抗原投与されたマウスは触知可能な腫瘍を発症せず、これは、それらが強力な免疫学的抗腫瘍記憶を獲得していたことを実証するものであった(図5H、図15A)。処置中、15%を超える体重減少を示したマウスはなかった(図15B)。これらのデータは、Dox-CBD-SAがICDの誘導を通じてαPD-1と相乗作用し、同等の用量のアルドキソルビシン + αPD-1では達成できなかったさらなる抗腫瘍効果を示すことを示している。
C. 考察
低分子抗がん剤は組織に広く分布し、全身性の副作用を誘発するため、その薬物動態および生体内分布を改善するための薬物の改変が試みられている。ナノ粒子製剤(17)ドキソルビシンまたはSA反応性(18、19)ドキソルビシンは、病理学的に異常な血管系に部分的に基づいて、腫瘍内での薬物動態および蓄積の改善を示す(5)。しかしながら、この効果はその不均一性のために、ヒトのがんで常に有効でありうるわけではない(29)。したがって、受動的ターゲティングのみに依存している薬物には、改善の余地がありうる。薬物送達のための腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原の能動的ターゲティングは、別の治療戦略である。しかしながら、これは適用可能ながんの範囲を本質的に制限し、また、抗原選択的な細胞ターゲティングおよび死滅化のために薬剤耐性獲得につながる可能性があり、その抗原は突然変異によって失われる可能性がある(30)。本明細書で、本発明者らは、これらの問題を克服するためにCBD-SAを操作した。他の能動的な活性化戦略とは異なり、CBD-SAは腫瘍関連抗原の発現の事前調査を必要としない。というのは、コラーゲンは腫瘍においてほぼ遍在的に発現されており、CBDは腫瘍微小環境内の異常な血管構造を介して腫瘍間質に接近するからである(6)。続いて、CBD-SAは露出したコラーゲンに結合し(図1C、図7)、腫瘍間質を化学療法剤の貯留槽に変換する。CBD-SAへのDox結合は、アルドキソルビシンおよびDox-SAと比較して、腫瘍組織内でのDoxの有意に高い蓄積を示した(図2C)。腫瘍組織内でのDox-CBD-SAの蓄積後、腫瘍微小環境での弱酸性条件の下で切断されうるヒドラゾン結合(図1E) (21)により、CBD-SAからのDoxの持続放出が可能になる。同時に、腫瘍細胞がSAを取り込むことが知られている(1)。注目すべきことに、CBD融合はSAの細胞取り込みを変化させることはなく(図1F)、これは、Dox-CBD-SAもDox-SAと同じくらい効率的に細胞内に送達されうることを示すものであった。したがって、Dox放出の一部は、Dox-CBD-SAがまだマトリックスに結合している間に腫瘍間質で発生する可能性があり、一部は、エンドサイトーシス後のエンドリソソーム区画で発生する可能性がある。比較的低分子量のCBD-SA (88 kDa、図6)は、腫瘍組織への拡散という点で有益でありうる(32)。
抗腫瘍効力という点で、Dox-CBD-SAは、アルドキソルビシンおよびDox-SAと比較して、MMTV-PyMT乳がんの増殖を有意に抑制し、マウスの生存を引き延ばした(図3A～F)。Dox-CBD-SAはインビボで腫瘍組織への最も高い蓄積を示したため、Dox-CBD-SAは腫瘍細胞増殖の阻害を介して腫瘍細胞死をより効率的に誘導するはずである。この効果に加えて、Dox-CBD-SAの単回注射は、そのより速い血漿クリアランス半減期にもかかわらず、長期的な治療効果をもたらした(図2A、B)。これは、Dox-CBD-SA処置がDox-SAおよびアルドキソルビシン処置と比較して高い数および密度のTILを誘導するという本発明者らの観察によって説明することができた(図3G～L)。それゆえ、Dox-CBD-SAの抗腫瘍作用機序は、直接的な細胞死滅化であるだけでなく、宿主の抗腫瘍免疫の刺激でもありうる。Dox-CBD-SAは腫瘍内に効率的に蓄積するため、アルドキソルビシンおよびDox-SAよりも効率的にICDおよび免疫系への腫瘍抗原曝露を誘発しうる。結果として、Dox-CBD-SAは、αPD-1と組み合わせて投与された場合、MC38結腸がん腫を相乗的に根絶した(図5B、G)。アルドキソルビシンと比較したDox-SAおよびDox-CBD-SAの改善された治療効力(図3A～F)はまた、注射前のDoxの事前コンジュゲーションがより高い抗腫瘍効力を提供することを示している。血液循環からの迅速なクリアランスに加えて、血漿中のシステイン、グルタチオン、フィブロネクチン、またはα1-アンチトリプシンなどの他のスルフヒドリル化合物とのアルドキソルビシンのインサイチューでのコンジュゲーション(18)もアルドキソルビシンの非効率的な治療効力の考えられる原因である。
心臓毒性はDoxの主な欠点であり、これによってDoxの生涯蓄積量が制限される(13)。組織学的分析により、20 mg/kgのDox-CBD-SA投与でさえ心臓障害の兆候を示さないことが明らかにされた(図14)。これは、CBD-SAと事前にコンジュゲートされたDoxが、マウスモデルにおいて15 mg/kgの蓄積量で心臓組織に不可逆的に損傷を与える遊離Doxよりも、低い心臓毒性であることを示唆している(34)。重要なことに、15 mg/kgの蓄積量は、ヒトでの最大蓄積量とほぼ同等である(35)。
製造プロセスに関して、本発明者らは、薬物コンジュゲーション比率の正確な制御を可能にするトラウトの試薬を用いてDoxをコンジュゲートした(36)。この方法は、VWF A3ドメインとコラーゲンとの間の結合界面にリジン残基がないため、CBDとコラーゲンとの間の結合を無効化するリスクがほとんどない(図10) (22)。さらに、SAはCBD配列のおよそ7倍の数のリジン残基を含み、これは、コンジュゲーションによるCBDの好ましくないコンフォメーション変化のリスクが低いことも示唆している。トラウトの試薬は、CD70をターゲティングするADC (MDX-1203、Bristol-Myers Squibb)にも使用されており(37)、その技術移転の適応性を示している。CBD-SAは高収量(およそ70～100 mg/L HEK293細胞培養物)で産生されるため、本発明者らは、CBD-SAへのDoxの事前のコンジュゲーションが単純かつ技術移転可能な産生方法で高い抗腫瘍効力を生み出すことを提案するものである。
CBD-SAは肝臓、腎臓、および創傷などの体内の望ましくない部位に蓄積し、そこで有窓内皮または漏出性内皮を介してコラーゲンが露出されうるものと予想されうるため、非特異的毒性の低減は予想外である。しかし、本発明者らは、20 mg/kgのDox-CBD-SA投与後に肝臓および腎臓での病理学的損傷を観察しなかった(図14)。さらに、この分野での前の研究から、化学的コンジュゲーションが一般にSAの半減期を減少させる可能性があることが示されているので、本ポリペプチドの効力の増加はいくぶん予想外である。メトトレキサート・コンジュゲーションは、薬物:タンパク質比に依存する形で、循環血中からのメトトレキサート-SAコンジュゲートのクリアランスを加速したことが報告されている(38)。したがって、Dox-SAおよびDox-CBD-SAの半減期がナイーブマウスSAの報告された半減期(t1/2, β = 35 (h))よりも短かったにもかかわらず、治療効率の向上が達成されたことは驚きである(39)。
結論として、Dox-CBD-SAは腫瘍中に蓄積し、宿主の抗腫瘍免疫を活性化した。結果として、Dox-CBD-SAの単剤療法は同所性MMTV-PyMT乳房腫瘍の増殖を抑制し、生存を引き延ばした。より重要なことに、αPD-1を介した免疫チェックポイント阻害とDox-CBD-SAの併用療法は、免疫原性MC38モデルでの腫瘍を完全に根絶した。CBD融合は、受動的にターゲティングさせられる薬物担体として古典的に用いられているSAに能動的なターゲティング能力をもたらし、これは、体循環から腫瘍への効果的な薬物送達を可能にした。CBD-SAは、血液中に自然に存在する2つのタンパク質(VWF A3ドメインおよびSA)で構成されているため、非免疫原性であり、かつ生物学的に許容されるものと予想される。さらに、CBD-SAは腫瘍タイプ特異的抗原に独立して作用するため、薬物担体としてさまざまなタイプの固形腫瘍に対する幅広い適応性を提供する。それゆえ、CBD-SAは抗腫瘍薬担体としてのがん療法への臨床技術移転の可能性を有しうる。
D. 材料および方法
1. 研究デザイン
本研究は、薬物コンジュゲーション担体としての操作されたコラーゲン結合SAによる腫瘍への抗がん薬送達の戦略を検証するためにデザインされた。具体的には、本発明者らは、乳がんおよび結腸がん腫のマウスモデルに対するDox-CBD-SAの抗腫瘍効力が、その非改変形態と比較して改善されるかどうかを試験した。Dox-CBD-SAの副作用も、腫瘍のないマウスを用いて試験した。本発明者らは、腫瘍増殖、抗がん免疫応答、および処置後の毒性の複合的見地を測定した。必要なサンプルサイズを事前に決定するために統計的手法は用いなかったが、適切な統計的検定で有意な結果が得られるように、パイロット実験および既刊の結果からの推定に基づいてサンプルサイズを決定した。CBD-SAは、再現性を確保するために複数の個人によって産生された。図12 (1回)を除いて、全ての実験を少なくとも2回繰り返した。動物実験では、最初のDox-CBD-SA注射の直前に、マウスをケージ内の処置群に無作為に分け、同じように処置した。動物愛護のガイドラインにしがたい、動物が処置に関係のない理由で健康上の問題を発症した場合にのみ、サンプルを分析から除外した。腫瘍サイズがMMTV-PyMTモデルで500 mm3を超え、MC38モデルで600 mm3を超えると、生存エンドポイントに到達した。統計量を計算するために使用されるn値は、図中または図の凡例中に示されている。薬物投与および病理学的分析は、盲検法で実施された。統計的手法は「統計分析」のセクションに記述されている。
2. 細胞培養
マウス乳がんウイルス-ポリオーマウイルスミドルT抗原(MMTV-PyMT)細胞は、既述のようにFVB-Tg (MMTV-PyMT)トランスジェニックマウスにおいて自然発生した乳がんから得られた(9)。MC38結腸がん腫細胞株は、R. Weichselbaum研究所(シカゴ大学)により親切にも提供していただいた。110 mg/Lのピルビン酸ナトリウム、10%熱不活化FBS、および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補充したDMEM (Gibco)を、両方の細胞株に用いた。IMPACT I病原体試験(IDEXX BioResearch)により、マイコプラズマ混入について細胞株をチェックした。
3. マウス
8～12週齢の雌性FVBマウスをCharles RiverおよびJackson Laboratoryから入手した。8～12週齢の雌性C57BL/6マウスをJackson Laboratoryから入手した。この研究において実施された全ての動物実験は、シカゴ大学の施設内動物管理使用委員会から承認された。
4. CBD-SAの産生および精製
CBD-SAタンパク質を既報のCBDタンパク質と同様にデザインし、産生し、精製した(9)。ヒトVWF A3ドメイン残基Cys1670～Gly1874 (成熟VWFの907～1111)とプロペプチドを有しないマウスSA (SA全体の25～608アミノ酸) との融合体をコードする配列を合成し、Genscriptによる哺乳類発現ベクターpcDNA3.1(+)にサブクローニングした。組換えタンパク質のさらなる精製のため、Hisタグ(6 His)をコードする配列をC末端に挿入した。懸濁液に適応したHEK-293F細胞を、無血清FreeStyle 293発現培地(Gibco)中で日常的に維持した。トランスフェクションの日に、細胞を1×106個の細胞/mLの密度で新鮮な培地中に希釈した。2 μg/mLのプラスミドDNA、2 μg/mLの直線状25 kDaポリエチレンイミン(Polysciences)、およびOptiPRO SFM media (終濃度4%、Thermo fisher scientific)を添加した。培養フラスコを5% CO2の存在下、37℃で135 rpmにて軌道振とうにより攪拌した。トランスフェクションの7日後、細胞培地を遠心分離によって収集し、0.22 μmフィルタでろ過した。AKTA pure 25 (GE Healthcare)を用いて、培地をHisTrap HP 5 mLカラム(GE Healthcare)にロードした。洗浄緩衝液(20 mMイミダゾール、20 mM NaH2PO4、0.5 M NaCl、pH 7.4)でのカラムの洗浄後、500 mMイミダゾール(20 mM NaH2PO4、0.5 M NaCl、pH 7.4中)の勾配でタンパク質を溶出させた。HiLoad Superdex 200PGカラム(GE Healthcare)を用いサイズ排除クロマトグラフィーで溶出液をさらに精製した。全ての精製段階を4℃で行った。タンパク質は、SDS-PAGEによって純度90%超と検証された。
5. MALDI-TOF MS
精製されたCBD-SAを、既述のようにMALDI-TOF MS (Bruker Ultraflextreme MALDI TOF/TOF)によって分析した(9)。データ取得にはBruker flexControl(商標)を用い、データ処理にはBruker flexAnalysis(商標)を用いた。最初に、α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸(Sigma-Aldrich)の飽和溶液を、溶媒として50:50のアセトニトリル:水中1%のTFAの中で調製した。PBS中のCBD-SA (5 μL、0.1 mg/mL)およびマトリックス溶液(25 μL)を混合し、その混合物1 μLをMTP 384粉砕鋼ターゲットプレート上に滴下した。液滴を窒素ガス流中で乾燥させた。全てのサンプルを、75%のレーザー強度で2500回のレーザーショットにより高質量線形ポジティブモード法を用いて分析した。測定値を、炭酸脱水酵素、ホスホリラーゼB、およびウシSAの混合物を用いて3点で外部校正した。
6. 結合親和性アッセイ
コラーゲンに対するCBD-SAの結合親和性を既述のように試験した(9)。96ウェルELISAプレート(Greiner Bio-One)をコラーゲンIまたはコラーゲンIII (PBS中に各10 μg/mL)により37℃で終夜コーティングした後に、0.05% Tween 20を含むPBS (PBS-T)中2%のBSAにより室温で1時間ブロッキングした。その後、ウェルをPBS-Tで洗浄し、漸増濃度のCBD-SAとともに室温で2時間さらにインキュベートした。PBS-Tで3回洗浄した後、ウェルをマウスSAに対するビオチン結合Abとともに室温で1時間インキュベートした。洗浄後、結合したCBD-SAを、テトラメチルベンジジン基質を用いて450 nmの吸光度を測定し570 nmの吸光度を差し引くことにより検出した。見かけのKd値を、1部位特異的な結合と想定してPrismソフトウェア(バージョン7、GraphPad)の非線形回帰分析によって取得した。
7. Doxコンジュゲートの合成
マウスSAまたはCBD-SAを、2 mM EDTAを含有するPBSに溶解した。2 mM EDTAを含有するPBSに溶解された4モル当量のトラウトの試薬を添加し、暗所中、室温で1時間インキュベートした。過剰なトラウトの試薬を、Zebaスピン脱塩カラム(Thermo fisher scientific)によって除去した。10 mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH 5.9)に溶解された15モル当量のアルドキソルビシン(MedChemExpress)を添加し、室温で1時間および暗所中4℃で終夜インキュベートした。反応をクエンチするために、アルドキソルビシンに対して20モル当量のL-システイン(2 mM EDTAを含有するPBSに溶解されたSigma-Aldrich(製薬グレード))を添加した。未反応のDox沈殿物を遠心分離(10000×g、5分)によって除去した。上清をZebaスピン脱塩カラムによってさらに精製した後に、Amicon-Ultra (Merck、10K MWCO)を用いて限外ろ過した。最終生成物中のDoxの濃度を、モル吸光係数10650 (L・mol-1・cm-1)を用いて、495 nmでの吸光度により定量化した。タンパク質含有物の濃度を、Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo fisher scientific)により、製造元の指示にしたがって測定した。
8. 動的光散乱(DLS)
Zetasizer Nano ZS (Malvern)を用いて、PBS中のDoxコンジュゲートの流体力学的サイズを測定した。コンジュゲートを合成直後に分析するか、または凍結乾燥し、使用するまで-20℃で貯蔵した。
9. ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)
本発明者らの以前の研究に記述されているようにSDS-PAGEを実施した(9)。4～20%の勾配ゲル(Bio-Rad)を用い、各Doxコンジュゲート0.5 μgを10 mM DTTによる還元有りまたは無しでロードした。電気泳動後、SimplyBlue SafeStain (Thermo fisher scientific)を製造元の指示にしたがってゲル染色に用いた。画像取得にはChemiDoc XRS+システム(Bio-Rad)を用いた。
10. コンジュゲートからのDoxのpH依存性放出
Slide-A-Lyzer MINI透析装置(Thermo fisher scientific、10K MWCO)を用いて、コンジュゲートからのDoxの放出プロファイルを決定した。DoxコンジュゲートをPBS (pH 6.5もしくは7.4)または0.1 M酢酸緩衝液(pH 5.0)中に希釈して、終濃度100 μM (Doxベース)とした。各サンプル150 μLを装置にロードし、緩衝液50 mLで透析した。磁気撹拌機を用いて透析を実施した。ステージの温度を37℃に設定し、透析中はサンプルを光から保護した。透析液をさまざまな時点で収集し、サンプル収集が終了するまで4℃で貯蔵した。透析液を96ウェル黒色プレートに二つ組でロードした(90 μL/ウェル)。495 nmでの励起および590 nmでの発光を用いて、蛍光を決定した。ドキソルビシン塩酸塩の連続希釈液を同じ緩衝液中で調製して、標準曲線を作成した。
11. Doxコンジュゲートの細胞取り込み
Doxコンジュゲートの細胞取り込みを評価するために、MMTV-PyMT細胞を96ウェルハイコンテントイメージングプレート(Corning)に5000個の細胞/ウェルで播種し、終夜インキュベートした。細胞をPBSで洗浄し、Doxの50 μM当量の濃度でDMEM (110 mg/Lのピルビン酸ナトリウム、10%熱不活化FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、フェノールレッド(-))に溶解された遊離Dox、Dox-SA、またはDox-CBD-SAにより処理した。インキュベーション後、細胞を2回洗浄し、75 nMのLysotracker Deep Redで処理し、37℃で30分間さらにインキュベートした。細胞を2回洗浄し、IX83顕微鏡(Olympus)により倍率60倍で観察した。ImageJソフトウェア(NIH)を用いて画像を処理した。スケールバー; 20 μm。
12. インビトロ細胞毒性
MMTV-PyMT細胞またはMC38細胞を96ウェル組織培養プレート(BD Falcon)に3000個の細胞/ウェルで播種し、終夜インキュベートした。細胞をDMEM (110 mg/Lのピルビン酸ナトリウム、10%熱不活化FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、フェノールレッド(-))で洗浄し、80 μL/ウェルのDMEMを添加した。その後、PBS中のアルドキソルビシン、Dox-SA、またはDox-CBD-SAの連続希釈液を添加した(20 μL/ウェル)。細胞を37℃で3日間インキュベートし、製造元の指示にしたがいCellTiter 96(登録商標) AQueous One Solution Cell Proliferation Assay Kit (Promega)を用いて生存性を決定した。80 μL/ウェルのDMEM + 20 μL/ウェルのPBSで処理した細胞を100%の生存性と定義し、同じ混合物を含む無細胞ウェルを0%の生存性と定義した。最大半量阻害濃度(IC50)値をPrismソフトウェアの非線形回帰分析によって得た([阻害剤] vs 正規化された応答)。
13. Doxコンジュゲートの血漿薬物動態
ポリペプチド-Doxナノ粒子に関する以前の報告を参照した(40)。Doxの薬物動態を測定するために、5 mg/kg Dox当量のアルドキソルビシン、Dox-SA、またはDox-CBD-SAを雌性FVBマウスに静脈内注射した。血液サンプルを注射後5分、30分、1時間、4時間、12時間、25時間、50時間、および75時間の時点で、EDTAコーティングされたチューブに収集した。血液サンプルは、サンプル収集が終了するまで4℃で貯蔵した。サンプルを遠心分離し(2000×g、5分)、血漿を収集した。酸性化イソプロパノール(75 mM HCl、10%水、90%イソプロパノール)中に希釈した血漿サンプルを96ウェル黒色プレート(100 μL/ウェル)にロードした。上記のように蛍光を測定した。血漿サンプルを、注射を受けていないマウスからも収集し、酸性化イソプロパノール中に希釈し、バックグラウンド蛍光の標準曲線を作成するために測定した。指数関数的な二相崩壊(Y = Ae-αt + Be- αt)適合を用いて、血漿中半減期を計算した。速いクリアランス半減期: t1/2,□、遅いクリアランス半減期: t1/2, α。Prismソフトウェア(v7、GraphPad)を用いてデータを分析した。
14. SAおよびCBD-SAの血漿薬物動態
SAおよびCBD-SAを、製造元の指示にしたがいDyLight 800 NHSエステル(Thermo fisher scientific)で標識した。未反応の色素を、上記のようにZebaスピン脱塩カラムによって除去した。標識化の後、各タンパク質200 μgを雌性FVBマウスに静脈内注射した。血液サンプルを注射後1分、1時間、4時間、24時間、74時間、および120時間の時点で、EDTAコーティングされたチューブに収集した。血液サンプルは、サンプル収集が終了するまで4℃で貯蔵した。サンプルを遠心分離し(2000×g、5分)、血漿を収集した。血液サンプルをPBS中に希釈し、96ウェル黒色プレート(100 μL/ウェル)にロードした。血漿中の各タンパク質の濃度を、LI-COR Infrared Odyssey Imager (Li-COR Biosciences)で測定した。曲線適合の方法および血漿中半減期の計算は、上述した。
15. MMTV-PyMT腫瘍の接種および処置
MMTV-PyMTマウス乳がんモデルを既述のように調製した(9)。PBS 50 μLに懸濁した計5×105個のMMTV-PyMT細胞を、各マウスの右側の乳腺に皮下注射した。マウスを、尾静脈注射により、7日目にアルドキソルビシン、Dox-SAまたはDox-CBD-SA (5 mg/kg)で処置した。表示された時点でデジタルノギスを用いて腫瘍を測定し、体積を楕円体として計算した。ここで、V = 4/3 × 3.14 × 深さ/2 × 幅/2 × 高さ/2。腫瘍体積が500 mm3を超えた場合に、または活発な潰瘍形成が観察された場合にマウスを殺処理した。治療実験には、Charles River起源のFVBマウスを用いた。腫瘍浸潤リンパ球(TIL)分析には、Jackson LaboratoryおよびCharles Riverの両社起源のFVBマウスを用いた。異なる供給業者からのマウスの割合は、全群間で均等化された。
16. MC38腫瘍の接種および処置
MC38マウス結腸がん腫モデルを既述のようにB16F10黒色腫モデルと同様に調製した(9)。PBS 50 μLに懸濁した計5×105個のMC38細胞を、各C57BL/6マウスの背中の左側に皮内注射した。マウスにアルドキソルビシン、Dox-SAまたはDox-CBD-SA (5 mg/kg)を6、9、12日目にi.v.注射した。また、マウスを10および13日目に抗PD-1 (クローン29F.1A12、Bio X Cell) 100 μgでi.p.処置した。腫瘍増殖を上記のようにモニターした。腫瘍体積が600 mm3を超えた場合に、または活発な潰瘍形成が観察された場合にマウスを殺処理した。60日目に、ナイーブC57BL/6マウスまたは腫瘍のないサバイバーを、5×105個のMC38細胞の皮内注射によって再度抗原投与した。
17. 腫瘍蓄積研究
ポリペプチド-Doxナノ粒子に関する以前の報告を参照した(40)。アルドキソルビシン、Dox-SA、またはDox-CBD-SAを尾静脈により4.16 mg/kgで、確立した腫瘍を有するFVBマウスに注射した。注射から2時間または24時間後に腫瘍を収集し、秤量し、氷上に置いた。腫瘍組織を酸性化イソプロパノール1 mLに懸濁し、Lysing Matrix D and FastPrep-24 5G (MP Biomedical)を用いて5000ビート/分で40秒間ホモジナイズした。ホモジナイゼーション後、サンプルを光から保護し、4℃で終夜インキュベートした。サンプルを遠心分離し(5000×g、5分)、上清を96ウェル黒色プレートにロードした(100 μL/ウェル、三つ組)。上記のように組織抽出物中のDoxの量を定量化するために蛍光を測定した。未処置マウスの腫瘍も処理し、組織抽出物の連続希釈液を測定して、組織由来の自家蛍光の標準曲線を得た。
18. 腫瘍内に注入されたCBD-SAの組織学的分析
マウスSA (Sigma-Aldrich)およびCBD-SAを、製造元の指示にしたがってNHS-DyLight 488とコンジュゲートさせた。未反応の色素をZebaスピン脱塩カラムによって除去し、次に蛍光タンパク質溶液を使用するまで4℃で貯蔵した。等モルの色素で標識された蛍光標識SAまたはCBD-SA 100 μgをMMTV-PyMT腫瘍担持マウスに静脈内注射した。注射1時間後に、腫瘍を採取し、OCT化合物とともにドライアイス中で凍結させた。10 μmの組織スライスを凍結切片によって得た。組織をPBS中2%のパラホルムアルデヒドにより室温で15分間固定した。PBS-Tで洗浄した後に、組織をPBS-T中の2%のBSAにより室温で1時間ブロッキングした。組織をビオチン標識抗マウスCD31抗体(1:100、Biolegend)およびAlexa Fluor 647ストレプトアビジン(1:1000、Biolegend)で染色した。組織を3回洗浄した後、DAPI (Thermo fisher scientific)を含むProLongゴールド退色防止封入剤で覆った。画像化のために倍率60倍でIX83顕微鏡(Olympus)を用いた。ImageJソフトウェア(NIH)を用いて、画像を処理した。
19. フローサイトメトリーおよび抗体
MMTV-PyMTモデルを上記のように調製した。マウスを7日目にアルドキソルビシン、Dox-SAまたはDox-CBD-SA (5 mg/kg)で処置した。14日目にマウスを殺処理した。細胞懸濁液を既述のように各腫瘍から得た(9)。腫瘍を採取し、2% FBS、2 mg/mLコラゲナーゼDおよび40 μg/mL DNase I (Roche)を補充したダルベッコ改変イーグル培地(Dulbecco's Modified Eagle Medium; DMEM)中37℃で30分間消化した。単一細胞懸濁液を、70 μmの細胞ストレーナで臓器を穏やかに破壊することによって得た。赤血球をACK溶解緩衝液(Quality Biological)で溶解した。固定可能な生/死細胞の識別は、Fixable Viability Dye eFluor 455 (eBioscience)を製造元の指示にしたがって用い実施した。洗浄段階の後、固定前に細胞を氷上で20分間、特異抗体により染色した。以下の抗体を用いて細胞を染色した: CD3 (145-2C11、BD Biosciences)、CD4 (RM4-5、BD Biosciences)、CD8α (53-6.7、BD Biosciences)、CD45 (30-F11、BD Biosciences)、およびNK1.1 (PK136、BD Biosciences)。全てのフローサイトメトリー分析は、Fortessaフローサイトメーター(BD Biosciences)を用いて行い、FlowJo ソフトウェア (Tree Star)を用いて分析した。
20. 毒性プロファイル
腫瘍のないFVBマウスに、静脈内注射により20 mg/kgのアルドキソルビシンまたはDox-CBD-SAを投与した。血漿サイトカイン分析および血液学的分析のために、注射後3日目および6日目に顎下出血によってEDTAコーティングチューブ中に各マウスから血液サンプルを収集した。各マウスの体重を表示の時点で測定した。16日目に、マウスを殺処理し、臓器を採取した。脾臓の重さを量り、他の臓器を組織学的分析に用いた。初期体重の15%超の減少が観察された場合に、マウスを殺処理した。
21. 血液学的分析
COULTER Ac・T 5diff CP血液分析器(Beckman coulter)を製造元の指示にしたがい用いて、血液サンプルを分析した。
22. 血漿サイトカインの測定
上記のように全血サンプルから血漿を集め、使用するまで-20℃で貯蔵した。血漿中のサイトカイン濃度は、Ready-SET-Go! ELISAキット(eBioscience)およびCan Get Signal solution (TOYOBO)を製造元の指示にしたがい用いて測定した。
23. 心臓、肝臓、腎臓、および肺の組織学的分析
臓器をPBS中2%のパラホルムアルデヒドで終夜固定した。パラフィンに包埋した後、ブロックを5 μmの切片に切断し、続けてH&E染色を行った。
24. 統計分析
実験群間の統計的に有意な差を、既述のようにPrismソフトウェア(v7、GraphPad)を用いて決定した(9)。一元配置分散分析とそれに続くテューキーのHSD事後検定を用いた場合、群間の分散はブラウン・フォーサイス検定によって類似していることが分かった。ノンパラメトリックデータ(図3G)には、クラスカル・ウォリス検定とそれに続くダンの多重比較検定を用いた。ログランク(マンテル・コックス)検定を用いることにより、生存曲線を分析した。記号＊および＊＊は、それぞれ0.05および0.01未満のP値を示す; N.S.、有意ではない。
ある種の態様を、ある程度具体的に、または1つもしくは複数の個々の態様を参照しながら上記に説明したが、当業者であれば、本開示の態様に対して、本発明の範囲を逸脱することなく数多くの変形を行なうことができよう。さらに、同等または異なる特性を有し、同じまたは異なる問題に対処するさらなる実施例を形成するために、適切な場合は上記の任意の実施例の諸局面を記載の任意のその他の実施例の諸局面と組み合わせてもよい。同様に、上記の有益性および利点は一態様に関連していてもよく、いくつかの態様に関連していてもよいことは理解されよう。特許出願公開公報または他の刊行物に対する言及はいずれも、該公開公報/刊行物の開示内容の参照により本明細書に具体的に組み入れられる。特許請求の範囲は、ミーンズ-プラス-ファンクション限定またはステップ-プラス-ファンクション限定を、所与の請求項にそれぞれ、語句(1つまたは複数)「～のための手段(means for)」または「～のための段階(step for)」を用いて明示していない限り、かかる限定を含むと解釈されるべきでない。
参考文献
以下の参考文献および本明細書全体で参照される刊行物は、例示的な手順の詳細または本明細書に記載されるものを補足する他の詳細を提供する程度まで、参照により本明細書に具体的に組み入れられる。
Figure 2022535816000017
Figure 2022535816000018
Figure 2022535816000019
Figure 2022535816000020
Figure 2022535816000021
いくつかの態様において、ポリペプチドは、IgG Fcドメインポリペプチドとコラーゲン結合ドメインとの間にリンカーを含む。いくつかの態様において、リンカーは、グリシンおよびセリンアミノ酸残基を含む。いくつかの態様において、リンカーは、GGGS(配列番号：19)、(GGGS)n (配列番号：20)、または(GGGS)2 (配列番号：5)を含む。
いくつかの態様において、ポリペプチドは、アルブミンポリペプチドとコラーゲン結合ドメインとの間にリンカーを含む。いくつかの態様において、リンカーは、グリシンおよびセリンアミノ酸残基を含む。いくつかの態様において、リンカーは、GGGS(配列番号：19)、(GGGS)n (配列番号：20)、または(GGGS)2 (配列番号：5)を含む。いくつかの態様において、nは2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12もしくはそれ以上(またはその中で導出可能な任意の範囲)である。
本発明の1つの態様に関して論じられた任意の制限が、本発明の他の任意の態様に適用されうることが特に企図される。さらに、本発明の任意の組成物が本発明の任意の方法において用いられてもよく、本発明の任意の組成物を作出または利用するために本発明の任意の方法が用いられてもよい。実施例に記載された態様の局面はまた、異なる実施例中の他所にまたは本出願中の他所に、例えば発明の概要、態様の詳細な説明、特許請求の範囲、および図の凡例の説明に論じられている態様の文脈において実施されうる態様である。
[本発明1001]
コラーゲン結合ドメインに機能的に連結されたアルブミンポリペプチドまたはIgG Fcドメインポリペプチドを含む、ポリペプチド。
[本発明1002]
細胞毒性剤に機能的に連結されている、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1003]
細胞毒性剤に共有結合的に連結されている、本発明1002のポリペプチド。
[本発明1004]
切断可能なリンカーを通じて細胞毒性剤に連結されている、本発明1002または1003のポリペプチド。
[本発明1005]
切断可能なリンカーがpH切断可能なリンカーを含む、本発明1004のポリペプチド。
[本発明1006]
リンカーがヒドラゾンリンカーを含む、本発明1005のポリペプチド。
[本発明1007]
リンカーが7.4未満のpHで切断される、本発明1005または1006のポリペプチド。
[本発明1008]
二機能性リンカーを通じて細胞毒性剤および/またはコラーゲン結合ポリペプチドに連結されている、本発明1001～1007のいずれかのポリペプチド。
[本発明1009]
細胞毒性剤がドキソルビシンを含む、本発明1002～1008のいずれかのポリペプチド。
[本発明1010]
ペプチド結合を通じてコラーゲン結合ドメインに共有結合的に連結されている、本発明1001～1009のいずれかのポリペプチド。
[本発明1011]
デコリンまたはフォンヴィルブランド因子(VWF)由来のコラーゲン結合ドメインを含む、本発明1001～1010のいずれかのポリペプチド。
[本発明1012]
コラーゲン結合ドメインが、アルブミンポリペプチドまたはIgG Fcドメインポリペプチドのアミノ末端にある、本発明1001～1011のいずれかのポリペプチド。
[本発明1013]
アルブミンポリペプチドまたはIgG Fcドメインポリペプチドとコラーゲン結合ドメインとの間にリンカーを含む、本発明1001～1012のいずれかのポリペプチド。
[本発明1014]
リンカーが、グリシンおよびセリンアミノ酸残基を含む、本発明1013のポリペプチド。
[本発明1015]
リンカーが、GGGS、(GGGS) n 、または(GGGS) 2 を含む、本発明1014のポリペプチド。
[本発明1016]
粒子、ナノベシクル、またはリポソームに機能的に連結されていない、本発明1001～1015のいずれかのポリペプチド。
[本発明1017]
少なくとも2つのコラーゲン結合ドメインを含む、本発明1001～1016のいずれかのポリペプチド。
[本発明1018]
細胞毒性剤とアルブミンとの比が3:1である、本発明1002～1017のいずれかのポリペプチド。
[本発明1019]
本発明1001～1018のいずれかのポリペプチドを含む組成物。
[本発明1020]
リポソーム、粒子、またはナノベシクルを含まない、本発明1019の組成物。
[本発明1021]
本発明1001～1018のいずれかのポリペプチドをコードする核酸。
[本発明1022]
本発明1021の核酸を含む細胞。
[本発明1023]
細胞内で本発明1021の核酸を発現させる段階、および、発現されたポリペプチドを単離する段階を含む、ポリペプチドを作製するための方法。
[本発明1024]
本発明1001～1018のいずれかのポリペプチドまたは本発明1019もしくは1020の組成物を投与する段階を含む、がんを処置するための方法。
[本発明1025]
対象における細胞毒性剤を含む処置の非特異的毒性を低減するための方法であって、本発明1002～1018のいずれかのポリペプチドまたは本発明1019もしくは1020の組成物を対象に投与する段階を含む、前記方法。
[本発明1026]
対象が、がんを有する、本発明1025の方法。
[本発明1027]
非特異的毒性が、アルブミンまたはIgG Fcドメインポリペプチドに連結されておりかつコラーゲン結合ドメインに連結されていない同じ細胞毒性剤の毒性と比較して低減される、本発明1025または1026の方法。
[本発明1028]
対象の腫瘍における細胞毒性剤の蓄積を増加させるための方法であって、本発明1002～1018のいずれかのポリペプチドまたは本発明1019もしくは1020の組成物を対象に投与する段階を含む、前記方法。
[本発明1029]
腫瘍における細胞毒性剤の蓄積が、アルブミンまたはIgG Fcドメインポリペプチドに連結されておりかつコラーゲン結合ドメインに連結されていない同じ細胞毒性剤の用量と比較して増加する、本発明1028の方法。
[本発明1030]
腫瘍血管系への細胞毒性剤のターゲティングされた送達のための方法であって、本発明1002～1018のいずれかのポリペプチドまたは本発明1019もしくは1020の組成物を対象に投与する段階を含む、前記方法。
[本発明1031]
がんまたは腫瘍が固形腫瘍を含む、本発明1024、または1026～1030のいずれかの方法。
[本発明1032]
がんが乳房もしくは結腸がんを含む、または腫瘍が乳房もしくは結腸における腫瘍を含む、本発明1024、または1026～1030のいずれかの方法。
[本発明1033]
1つまたは複数のさらなるがん療法の投与をさらに含む、本発明1024～1032のいずれかの方法。
[本発明1034]
対象が免疫療法を受けているか、または受けるつもりである、本発明1024～1033のいずれかの方法。
[本発明1035]
免疫療法の投与をさらに含む、本発明1024～1034のいずれかの方法。
[本発明1036]
免疫療法がポリペプチドの前に、ポリペプチドの後に、またはポリペプチドと同時に投与される、本発明1035の方法。
[本発明1037]
免疫療法が、チェックポイント阻害剤療法を含む、本発明1034～1036のいずれかの方法。
[本発明1038]
チェックポイント阻害剤療法がPD-1抗体を含む、本発明1037の方法。
[本発明1039]
ポリペプチドまたは組成物が、全身的に投与される、本発明1024～1038のいずれかの方法。
[本発明1040]
ポリペプチドまたは組成物が、静脈内注射によって投与される、本発明1039の方法。
[本発明1041]
細胞毒性剤の投与用量が、コラーゲン結合ドメインに連結されていない細胞毒性剤の最小有効量よりも少ない、本発明1024～1040のいずれかの方法。
[本発明1042]
細胞毒性剤の投与用量が、アルブミンポリペプチドまたはIgG Fcドメインポリペプチドにコンジュゲートされておりかつコラーゲン結合ドメインに連結されていない細胞毒性剤の最小有効量よりも少ない、本発明1024～1041のいずれかの方法。
[本発明1043]
対象が、細胞毒性剤で以前に処置されている、本発明1024～1042のいずれかの方法。
[本発明1044]
対象が、以前の処置に非応答性であると判定されているか、または対象が、以前の処置に対する非特異的毒性を経験している、本発明1043の方法。
B. 結果
1. CBD-SAはコラーゲンに結合し、Doxにコンジュゲートされうる
本発明者らは、腫瘍微小環境を標的とするためにDox-CBD-SAコンジュゲートを合成した(図1A、B)。本発明者らは、インビトロでの組換えコラーゲンタンパク質へのCBD-SAの結合能力を最初に調べた。(GGGS)2リンカー(SEQ ID NO:5)を用いてマウスSAのN末端にCBDを付し、SAを組換え発現させた。CBD-SAの分子量をMALDI-TOF MSによって分析した(図6)。コラーゲンI型およびIII型へのCBD-SAの強い結合親和性(nM範囲の解離定数(Kd)値)が観察された(図1C、図7)。Doxコンジュゲーションのため、本発明者らは最初に、2-イミノチオラン(トラウトの試薬としても知られる)を用いてCBD-SAのリジン残基をチオール化した。次いで、アルドキソルビシンをCBD-SAに共有結合的にコンジュゲートさせた。未改変SAも同じ方法でアルドキソルビシンとコンジュゲートさせた(Dox-SA)。非還元条件下でのSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)は、精製されたDox-SAおよびDox-CBD-SAが単量体であることを示した(図8)。Doxコンジュゲーションの前後に、CBD-SAの流体力学的サイズを測定した(図9)。この結果から、CBD-SAが単量体の形態で存在し、Doxコンジュゲーションが凍結乾燥/再構成サイクルの後でさえこの特性を変えなかったことも示された。SA分子およびCBD-SA分子ごとに、およそ3つのDox分子がコンジュゲートされた(図1D)。注目すべきことに、本発明者らのコンジュゲーション方法は、VWF A3ドメインとヒトコラーゲンIIIとの間の結合界面にシステインまたはリジン残基がないため、コラーゲンへのCBD-SAの結合能力に影響を与えないであろう(図10、PDB: 4DMU (22))。この界面は、SAドメインに対するC末端融合部位からも遠く離れている。
4. CBD-SAの産生および精製
CBD-SAタンパク質を既報のCBDタンパク質と同様にデザインし、産生し、精製した(9)。ヒトVWF A3ドメイン残基Cys1670～Gly1874 (成熟VWFの907～1111)とプロペプチドを有しないマウスSA (SA全体の25～608アミノ酸) との融合体をコードする配列を合成し、Genscriptによる哺乳類発現ベクターpcDNA3.1(+)にサブクローニングした。組換えタンパク質のさらなる精製のため、Hisタグ(6 His(配列番号：21))をコードする配列をC末端に挿入した。懸濁液に適応したHEK-293F細胞を、無血清FreeStyle 293発現培地(Gibco)中で日常的に維持した。トランスフェクションの日に、細胞を1×106個の細胞/mLの密度で新鮮な培地中に希釈した。2 μg/mLのプラスミドDNA、2 μg/mLの直線状25 kDaポリエチレンイミン(Polysciences)、およびOptiPRO SFM media (終濃度4%、Thermo fisher scientific)を添加した。培養フラスコを5% CO2の存在下、37℃で135 rpmにて軌道振とうにより攪拌した。トランスフェクションの7日後、細胞培地を遠心分離によって収集し、0.22 μmフィルタでろ過した。AKTA pure 25 (GE Healthcare)を用いて、培地をHisTrap HP 5 mLカラム(GE Healthcare)にロードした。洗浄緩衝液(20 mMイミダゾール、20 mM NaH2PO4、0.5 M NaCl、pH 7.4)でのカラムの洗浄後、500 mMイミダゾール(20 mM NaH2PO4、0.5 M NaCl、pH 7.4中)の勾配でタンパク質を溶出させた。HiLoad Superdex 200PGカラム(GE Healthcare)を用いサイズ排除クロマトグラフィーで溶出液をさらに精製した。全ての精製段階を4℃で行った。タンパク質は、SDS-PAGEによって純度90%超と検証された。

Claims (44)

  1. コラーゲン結合ドメインに機能的に連結されたアルブミンポリペプチドまたはIgG Fcドメインポリペプチドを含む、ポリペプチド。
  2. 細胞毒性剤に機能的に連結されている、請求項1記載のポリペプチド。
  3. 細胞毒性剤に共有結合的に連結されている、請求項2記載のポリペプチド。
  4. 切断可能なリンカーを通じて細胞毒性剤に連結されている、請求項2または3記載のポリペプチド。
  5. 切断可能なリンカーがpH切断可能なリンカーを含む、請求項4記載のポリペプチド。
  6. リンカーがヒドラゾンリンカーを含む、請求項5記載のポリペプチド。
  7. リンカーが7.4未満のpHで切断される、請求項5または6記載のポリペプチド。
  8. 二機能性リンカーを通じて細胞毒性剤および/またはコラーゲン結合ポリペプチドに連結されている、請求項1～7のいずれか一項記載のポリペプチド。
  9. 細胞毒性剤がドキソルビシンを含む、請求項2～8のいずれか一項記載のポリペプチド。
  10. ペプチド結合を通じてコラーゲン結合ドメインに共有結合的に連結されている、請求項1～9のいずれか一項記載のポリペプチド。
  11. デコリンまたはフォンヴィルブランド因子(VWF)由来のコラーゲン結合ドメインを含む、請求項1～10のいずれか一項記載のポリペプチド。
  12. コラーゲン結合ドメインが、アルブミンポリペプチドまたはIgG Fcドメインポリペプチドのアミノ末端にある、請求項1～11のいずれか一項記載のポリペプチド。
  13. アルブミンポリペプチドまたはIgG Fcドメインポリペプチドとコラーゲン結合ドメインとの間にリンカーを含む、請求項1～12のいずれか一項記載のポリペプチド。
  14. リンカーが、グリシンおよびセリンアミノ酸残基を含む、請求項13記載のポリペプチド。
  15. リンカーが、GGGS、(GGGS)n、または(GGGS)2を含む、請求項14記載のポリペプチド。
  16. 粒子、ナノベシクル、またはリポソームに機能的に連結されていない、請求項1～15のいずれか一項記載のポリペプチド。
  17. 少なくとも2つのコラーゲン結合ドメインを含む、請求項1～16のいずれか一項記載のポリペプチド。
  18. 細胞毒性剤とアルブミンとの比が3:1である、請求項2～17のいずれか一項記載のポリペプチド。
  19. 請求項1～18のいずれか一項記載のポリペプチドを含む組成物。
  20. リポソーム、粒子、またはナノベシクルを含まない、請求項19記載の組成物。
  21. 請求項1～18のいずれか一項記載のポリペプチドをコードする核酸。
  22. 請求項21記載の核酸を含む細胞。
  23. 細胞内で請求項21記載の核酸を発現させる段階、および、発現されたポリペプチドを単離する段階を含む、ポリペプチドを作製するための方法。
  24. 請求項1～18のいずれか一項記載のポリペプチドまたは請求項19もしくは20記載の組成物を投与する段階を含む、がんを処置するための方法。
  25. 対象における細胞毒性剤を含む処置の非特異的毒性を低減するための方法であって、請求項2～18のいずれか一項記載のポリペプチドまたは請求項19もしくは20記載の組成物を対象に投与する段階を含む、前記方法。
  26. 対象が、がんを有する、請求項25記載の方法。
  27. 非特異的毒性が、アルブミンまたはIgG Fcドメインポリペプチドに連結されておりかつコラーゲン結合ドメインに連結されていない同じ細胞毒性剤の毒性と比較して低減される、請求項25または26記載の方法。
  28. 対象の腫瘍における細胞毒性剤の蓄積を増加させるための方法であって、請求項2～18のいずれか一項記載のポリペプチドまたは請求項19もしくは20記載の組成物を対象に投与する段階を含む、前記方法。
  29. 腫瘍における細胞毒性剤の蓄積が、アルブミンまたはIgG Fcドメインポリペプチドに連結されておりかつコラーゲン結合ドメインに連結されていない同じ細胞毒性剤の用量と比較して増加する、請求項28記載の方法。
  30. 腫瘍血管系への細胞毒性剤のターゲティングされた送達のための方法であって、請求項2～18のいずれか一項記載のポリペプチドまたは請求項19もしくは20記載の組成物を対象に投与する段階を含む、前記方法。
  31. がんまたは腫瘍が固形腫瘍を含む、請求項24、または26～30のいずれか一項記載の方法。
  32. がんが乳房もしくは結腸がんを含む、または腫瘍が乳房もしくは結腸における腫瘍を含む、請求項24、または26～30のいずれか一項記載の方法。
  33. 1つまたは複数のさらなるがん療法の投与をさらに含む、請求項24～32のいずれか一項記載の方法。
  34. 対象が免疫療法を受けているか、または受けるつもりである、請求項24～33のいずれか一項記載の方法。
  35. 免疫療法の投与をさらに含む、請求項24～34のいずれか一項記載の方法。
  36. 免疫療法がポリペプチドの前に、ポリペプチドの後に、またはポリペプチドと同時に投与される、請求項35記載の方法。
  37. 免疫療法が、チェックポイント阻害剤療法を含む、請求項34～36のいずれか一項記載の方法。
  38. チェックポイント阻害剤療法がPD-1抗体を含む、請求項37記載の方法。
  39. ポリペプチドまたは組成物が、全身的に投与される、請求項24～38のいずれか一項記載の方法。
  40. ポリペプチドまたは組成物が、静脈内注射によって投与される、請求項39記載の方法。
  41. 細胞毒性剤の投与用量が、コラーゲン結合ドメインに連結されていない細胞毒性剤の最小有効量よりも少ない、請求項24～40のいずれか一項記載の方法。
  42. 細胞毒性剤の投与用量が、アルブミンポリペプチドまたはIgG Fcドメインポリペプチドにコンジュゲートされておりかつコラーゲン結合ドメインに連結されていない細胞毒性剤の最小有効量よりも少ない、請求項24～41のいずれか一項記載の方法。
  43. 対象が、細胞毒性剤で以前に処置されている、請求項24～42のいずれか一項記載の方法。
  44. 対象が、以前の処置に非応答性であると判定されているか、または対象が、以前の処置に対する非特異的毒性を経験している、請求項43記載の方法。
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