RS55447B1 - Metode za inhibiranje vezivanja endosijalina za ligande - Google Patents

Metode za inhibiranje vezivanja endosijalina za ligande

Info

Publication number
RS55447B1
RS55447B1 RS20161097A RSP20161097A RS55447B1 RS 55447 B1 RS55447 B1 RS 55447B1 RS 20161097 A RS20161097 A RS 20161097A RS P20161097 A RSP20161097 A RS P20161097A RS 55447 B1 RS55447 B1 RS 55447B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
endosialin
cells
antibody
cell
binding
Prior art date
Application number
RS20161097A
Other languages
English (en)
Inventor
Yuhong Zhou
Brian E Tomkowicz
Luigi Grasso
Philip M Sass
Nicolas C Nicolaides
Original Assignee
Morphotek Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Morphotek Inc filed Critical Morphotek Inc
Publication of RS55447B1 publication Critical patent/RS55447B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2851—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Flanged Joints, Insulating Joints, And Other Joints (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

OBLAST TEHNIKE
Ovaj pronalazak je uopšteno povezan sa oblašću imunoterapeutike. Ovaj pronalazak je posebno povezan sa smešama i metodama za prekid interakcije endosijalina sa njegovim supstratima kako bi se inhibirale ćelijske funkcije, uključujući angiogenezu i pokretljivost ćelija.
STANJE TEHNIKE
Angiogeneza je regulisan proces koji obuhvata formiranje novih krvnih sudova. Igra ključnu ulogu u normalnom rastu, embrionskom razvoju, zalečivanju rana i drugim fiziološkim procesima (Yancopouloset al.(2000), 407:242-8). U okviru razvojnog kapilara, proteini vanćelijske matrice (ECM) služe kao strukturalna potpora za proliferirajuća endotelna i tumorska tkiva i pružaju podršku za rast ćelija tumora.De novoangiogeneza učestvuje u nekoliko stanja bolesti, uključujući karcinom, gde se pojavljuje formiranje novih krvnih sudova „nalik na embrione" (u daljem tekstu: „neovaskularizacija") koji se razlikuju od normalnog vaskularnog sistema po pitanju strukture i funkcije (Hanahanet al.(2000)Cell,100:57- 70). Izvestan brojin vivoiin vitrostudija pokazao je biološke razlike između normalnog i obolelog vaskularnog sistema pomoću raznih modela sistema angiogeneze, na taj način povećavajući mogućnost stvaranja novih antiangiogenetskih jedinjenja koja mogu da selektivno inhibiraju formiranje krvnih sudova embrionskog tipa, endotelnih ćelija povezanih sa tumorom za terapiju neovaskularnih bolesti. Imajući u vidu ove prilike za terapiju, u toku je intenzivna potraga za potencijalnim ciljevima koji mogu posebno da inhibiraju rast i funkciju ćelija tumora i drugih neovaskularnih endotelnih ili stromalnih ćelija povezanih za bolestima (fibroblasti, periciti,itd.).
U pokušaju da se identifikuju takvi ciljevi, osmišljene su strategije za identifikovanje antigena na površini ćelija strome tumora, kao i za izolovanje određenih proteina ili RNK koji su izraženi u stromalnim ćelijama tumora (Rettigeta/.(1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA,89:10832-6; St. Croixet al.
(2000)Science,289:1197-1202). Ove strategije su identifikovale protein na površini ćelije koji izgleda da je specifično eksprimiran u stromalnim ćelijama tumora, koji se naziva endosijalin (ili endotelni tumorski marker 1 (TEMI) ili CD248).
Ispitivanje šema ekspresije gena u normalnom i neoplastičnom tkivu ukazuje na povećanje eksprimiranja iRNK endosijalina u novim krvnim sudovima tumora. (St Croixet al.(2000)Science,289:1197-1202). Slični nivoi eksprimiranja endosijalina zapaženi su kod kolorektalnog karcinoma kod ljudi (Rmaliet al.(2005) World J. Gastroenterol.,11:1283-1286), tkiva karcinoma dojke (Davieset at.
(2004)Clin. Exp. Metastasis,21:31-37), i histiocitoma (Dolzniget al.(2005)Cancer Immun.,5:10). Eksprimiranje endosijalina kod ljudi praćeno je kod visoko invazivnih glioblastoma, angioplastičnih astrocitoma, i metastatičkih karcinoma, uključujući melanome (Bradyet al.(2004)J. Neuropathol. Exp.
Neurol,63:1274-1283; Huber (2006) J.Cuthan. Pa/Ao/.,33:145-155).
Upotreba antitela u imunohistohemijskim studijama pronašla je grubo eksprimiranjeendosijalina u određenom broju neovaskularnih endotelnih ćelija, fibroblasta i/ili pericita (Virgintinoet al,(2007)Angiogenesis,10:35-45) u malignim tkivima, dok jc cksprimiranjc u linijama ćelija dobijenih iz endotelnih kultura nalik embrionalnim poput, bez ograničenja, HUVEC (endotelne ćelije porekla iz umbilikalne vene) ili HMVEC-(neonatalne dermalne mikrovaskularne endotelne ćelije) ograničeno. Analize antitela, polipeptida ili neproteinskih liganda koji mogu da se vezuju za endosijalin utvrdile su podset takvih molekula koji mogu da potisnu sposobnost endosijalina da se vezuje za svoj supstrat i/ili da potisnu međućelijske aktivnosti koje dovode do ćelijske staze ili smrti.
Rettiget al.opisao je monoklonska antitela koja prepoznaju antigene na krvnim sudovima u okviru raznih tipova karcinoma (Rettiget al.(1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA,89:10832-6). Jedno od njih je označeno kao FB5 i generisano putem imunizacije miševa pomoću humanih embrionskih fibroblasta. FB5 prepoznaje -100 kDa protein na površini linije ćelije neuroblastoma, LAl-5s (SAD patent br. 5,342,757). FB5 je mišje antitelo (IgGl) koje se vezuje sa endosijalinom i za koje se pokazalo da prepoznaje endotelne ćelije povezane sa mnogim različitim tipovima karcinoma. Strukturna procena je klasifikovala endosijalin kao protein C tipa integralne membrane nalik na lektin, koji se sastoji od pet globularnih vanćelijskih domena (uključujući i lektinski domen C tipa, jedan domen sličan šemi Sushi/ccp/scr, i tri EGF (epidermalni faktor rasta) ponavljanja). Ovaj protein takođe sadrži regiju nalik na mucin, transmembranski segment i kratki citoplazmični rep. Čini se da je ovaj protein glikoprotein. Analiza ugljenih hidrata pokazuje da protein jezgra endosijalina obiluje O-vezanim glikozilacijama (Christian et. al (2001)J. Biol. Chem.,276:48588-48595). Naknadni rad je kombinovao regije koje određuju komplementarnost (CDR) mišjeg FB5 u kičmu humanog IgGl, kako bi stvorio humanizovano antitelo koje se vezuje za krvne sudove sa malignim tkivima, kao i podset ćelija u HMVEC kulturama. US 6 090 930 A opisuje proizvodnju nekoliko humanizovanih mišjih antitelaspecifičnih za antigen FB5, koji prepoznaje mišje antitelo FB5.
Teminokaut miševi se normalno razvijaju i ispoljavaju normalno zalečenje rana, što nagoveštava da endosijalin nije potreban za neovaskularizaciju tokom fetalnog razvoja ili zalečenja rana.
(Nandaet al.(2006)Proc. Natl. Acad Sci. USA,103:3351-3356). Kada su ćelije kolorektalnog karcinoma implantiranc u određena mesta na abdomenuTeminokaut miševa, gubitak eksprimiranja endosijalina bio je povezan sa smanjenjem rasta tumora, invazije i metastaza u poređenju sa životinjama koje su roditelji. Pokazalo se da odsustvo eksprimiranja endosijalina umanjuje rast, invaziju i metastazu ksenografta ljudskog tumora kod nokaut miša sa endosijalinom. (Nandaet al.(2006)Proc. Natl. Acad. Sci. USA,103:3351-3356). Pored toga, nedostatak endosijalina doveo je do povećanja broja malih nezrelih krvnih sudova i umanjio brojeve srednjih i velikih tumorskih krvnih sudova.
Neovaskularizacija je povezana sa raznim stanjima bolesti. Kod karcinoma se smatra daje neovaskularizacija značajna za snabdevanje tumora krvlju. Kod neonkološkog karcinoma ili malignih bolesti poput retinopatije i makularne degeneracije, nekontrolisana neovaskularizacija izaziva gubitak vida (Wilkinson-Berka (2004)Curi: Pharm. Des.,10:3331-48; Das and McGuire (2003)Prog. Retin. EyeRes.,22:721-48). Staviše, nekoliko izveštajaje utvrdilo ulogu neovaskularizacije kod inflamatornih bolesti (Paleolog and Miotla (1998)Angiogenesis,2(4):295-307). Metode za bolje razumevanje molekularnih puteva u embrionskim endotelnim ćelijama i ćelijama prethodnicama, kao i ćelijama povezanim za endotelom (periciti, fibroblasti,itd.)koje su povezane sa ovim stanjima bolesti, dovešće do razvoja novih lekova za lečenje tih bolesti. Obratno, neovaskularizacija se povezuje sa zalečenjem rana (Galianoet al.(2004)Am. J. Pathol,164:1935-47). Identifikacija molekularnih puteva, koja podstiče vaskularizaciju za zalečenje rana, može da ponudi mogućnost identifikacije lekova i faktora koji mogu da podstiču te procese za poboljšanje tretmana rana povezanih sa povredama, opekotinama i infekcijama.
Težak problem kod efektivne antiangiogenetske i proangiogenetske terapije je nedefinisana priroda bioloških procesa molekula i povezanih puteva koji su važni za aktiviranje ćelijskih procesa koji su povezani sa neovaskularizacijom (Baglevet al.(2003)Cancer Res.,63:5866-73). Sposobnost identifikovanja i objašnjavanja molekula i njihove funkcije kod regulisanja datog puta može da dovede do izolovanja efektivnih jedinjenja koja imaju stimulatornc ili inhibitornc aktivnosti kod neovaskularnih bolesti poput karcinoma, inflamacije, okularnih oboljenja, kardiovaskularnih bolesti i zalečenja rana. Sposobnost izolovanja i proučavanja ovih jedinjenja putem testiranja na bazi molekula obezbedila bi dodatnu korisnost za procenu njihovih efekata kako bi se posebno potisnula ili stimulisala normalna biologija ćelija koja učestvuje u neovaskularizaciji, u suprotnosti sa endotelnim ćelijama nalik odraslim povezanim sa krvnim sudovima u normalnom odraslom tkivu (Asahara and Kavvamoto (2004)Am. J. Physiol. Cell Phvsiol,287:C572-9).
IZLAGANJE SUŠTINE PRONALASKA
U jednom aspektu ovaj pronalazak obezbeđuje antitelo koje naročito vezuje endosijalin, pri čemu je navedeno antitelo proizvedeno od strane ćelija koja imaju ATCC pristupni broj PTA-9017 ili njegov antigen-vezujući fragment.
U drugom aspektu ovaj pronalazak obezbeđuje rekombinantnu ćeliju koja eksprimira antitelo ili antigen-vezujući fragment pronalaska.
Takođc jc obezbeđen izolovani polinukleotid koji kodira teški lanac i laki lanac antitela ili antigen-vezujući fragment pronalaska.
Takođe je obezbeđena smeša za davanje ispitaniku, pri čemu se smeša sadrži u antitelu ili antigen-vezujućem fragmentu pronalaska.
Takođe je obezbeđeno antitelo ili antigen-vezujući fragment pronalaska za upotrebu u medicini, uključujući tretman i dijagnozu, po mogućstvu za upotrebu kod tretmanaa karcinoma.
U daljem aspektu ovaj pronalazak obezbeđuje upotrebu antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta pronalaska, u kome navedeno antitelo ili antigen-vezujući fragment inhibira interakciju endosijalina eksprimiranog na površini ćelije pomoću kolagena ili fibronektina za proizvodnju leka za upotrebu u lečenju karcinoma kod ispitanika.
Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment pronalaska inhibira eksprimiranje endosijalina u ćeliji koja eksprimira endosijalin na genetskom nivou. Ligandi za endosijalin mogu biti proteini vanćelijske matrice, kao što su kolagen ili fibronektin. U nekim oblicima ligand može da bude kolagen I ili kolagen IV. U poželjnim oblicima, ćelija može da bude ćelija sisara. Regulisanje eksprimiranja endosijalina na genetskom nivou može se ostvariti na bilo koji način pogodan u ovoj oblasti, poput „antisense" molekula nukleinske kiseline, RNK sa dvostrukim lancem, ribozima, „hammerhead" ribozima, mamaca oligonukleotida, i slično. Regulisanje eksprimiranja endosijalina može se takođe ostvariti nokautiranjem gena koji kodira endosijalin.
Opstrukcija endosijalina na površini ćelije može se ostvariti na bilo koji način pogodan u ovoj oblasti, kao što su antitela koja se posebno vezuju za endosijalin, antitela koja se posebno vezuju za ligand endosijalina i slično. Pogodna antitela mogu biti himerična antitela, humanizovana antitela, potpuno humana antitela, antigen-vezujući fragmenti koji specifično vezuju antigene, i slično. U nekim oblicima, afinitet antitela prema antigenu je po mogućstvu manji od oko 1 x IO"<7>M, a još poželjnije manji od oko 1 x 10"<s>M, zatim još poželjnije manji od oko 1 x IO"<9>M, i najpoželjnije manji od oko 1 x IO"<10>M. U nekim poželjnim oblicima, antitelo je antiendosijalinsko antitelo ili antigen-vezujući fragment, koji posebno prepoznaje endosijalin. Antitela M4 (koja proizvode ćelije koje imaju ATCC pristupni broj PTA-9017 pronalaska) i M4.1 su humanizovana antitela za humani endosijalin. Dok antitela M4 i M4.1 dele sekvencu lakog lanca, razlikuju se u teškom lancu za jednu sekvencu aminokiseline prikazanu, na primer, pri ostatku 429 od SEQ ID NO:20 u vezi sa ostatkom 429 od SEQ ID NO:24. Promena aminokiseline je rezultat promene jednog nukleotida prikazanog, na primer, pri nukleotidu 1286 od SEQ ID NO: 19 u vezi sa nukleotidom 1286 od SEQ ID NO:23.
Inhibiranje interakcije endosijalina pomoću liganda za endosijalin može da utiče na puteve, kaskade i nizvodne efekte izazvane normalnom interakcijom. Na primer, opstrukcija ili inhibicija interakcije ćelije koja eksprimira endosijalin pomoću liganda endosijalina može da inhibira aktiviranje integrina, aktiviranje matričnih metaloproteaza, i/ili eksprimiranje matričnih metaloproteaza. Može doći do inhibicije pokretljivosti ćelija. Može doći do inhibicije angiogeneze ili neovaskularizacije.
U nekim oblicima, inhibicija interakcije ćelije koja eksprimira endosijalin pomoću njegovog liganda inhibira aktiviranje integrina pi, P2, ili P3. U nekim oblicima, inhibicija interakcije ćelije koja eksprimira endosijalin pomoću njegovog liganda inhibira migraciju ćelije. U nekim oblicima, inhibicija interakcije ćelije koja eksprimira endosijalin pomoću njegovog liganda inhibira aktiviranje ili eksprimiranje matrične metaloproteaze. U poželjnim oblicima, matrična metaloproteaza je MMP-9.
Takođe je otkriveno antitelo ili antigen-vezujući fragment pronalaska za upotrebu kod tretiranja karcinoma. Tretman se može vršiti putem inhibiranja angiogeneze ili neovaskularizacije. Upotreba može da obuhvatain vitroiin vivoinhibiciju angiogeneze ili neovaskularizacije. Ispitaniku se može dati terapeutski delotvoran iznos antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta koji specifično vezuje endosijalin ili smeša koja vrši opstrukciju endosijalina eksprimiranog na površini ćelije tako da interakcija ćelije sa Ugandom endosijalina bude inhibirana. Ova inhibicija suzbija angiogenezu i/ili neovaskularizaciju tkiva, organa ili neoplazme u ispitaniku kome se daje ta smeša. Ligandi za endosijalin mogu biti vanćelijski matrični proteini poput kolagena (npr.kolagen I ili kolagen IV) ili fibronektin. Smeša se može sastojati od antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta opisanog i navedenog kao primer u ovom dokumentu, koji mogu fizički da blokiraju interakciju endosijalina na površini ćelije pomoću najmanje jednog liganda endosijalina. Pogodna antitela mogu da budu himerična antitela, humanizovana antitela, potpuno humana antitela, fragmenti antitela, i slično.
KRATAK OPIS SLTKA NACRTA
Slike 1A i 1Bprikazuju imunohistohemijsku analizu endosijalin pozitivnih ćelija tumorskog tkiva. Tumori su izolovani od pacijenata sa kolorektalnim karcinomom i zamrznuti u tečnom azotu. Uzorci su podeljeni na tanke isečke i prebojeni anti-endosijalinom ili izotopskim kontrolnim antitelom. Kao što se vidi iz slika, krvni sudovi u tumoru (Slika 1A) su prebojeni pozitivno za endosijalin dok je serijski isečak prebojen izotopskim kontrolnim antitelom bio negativan (Slika 1B).
Slike 2A i 2Bprikazuju imunohistohemijsku analizu endosijalin pozitivnih ćelija normalnog tkiva. Normalna tkiva su izolovana od pacijenata putem biopsije i zamrznuta u tečnom azotu. Uzorci su podeljeni na tanke isečke i prebojeni anti-endosijalinom ili izotopskim kontrolnim antitelom. Kao što se vidi iz slika, normalno tkivo je sadržalo malo EPC ćelija (strelica, Slika 2A) dok je serijski isečak prebojen izotopskim kontrolnim antitelom bio negativan (Slika 2B). Mnoga testirana normalna tkiva su imala malo EPC ćelija što je utvrđeno putemin situili bojenjem antitelima.
Slika3 prikazuje izolovanje endosijalin-pozitivnih ćelija iz primarnih endotelnih kultura. HMVEC kulture su obogaćene za EPC ćelije izdvajanjem. Kulture izdvojene pomoću endosijalina su zatim upoređene sa HMVEC roditeljskim kulturama za procenat ćelija koje eksprimiraju endosijalin. Kao što je prikazano, izdvojena kultura je imala znatno veći broj endosijalin-pozitivnih ćelija u poređenju sa neizdvojenom roditeljskom kulturom, kao što je određeno imunobojenjem preko antiendosijalnog antitela, praćenog fluorescentnim sjedinjenim sekundarnim antitelom. Broj ćelija svakog polja određenje svetlosnom mikroskopijom.
Slika 4prikazuje da se rekombinantni endosijalin (Fc-TEMl) vezuje za vanćelijske matrične proteine (EMP). ELISA ploče, premazane EMP fibronektinom (FN), kolagenom (COL; uključujući kolagen I tipa (COLI) i kolagen IV tipa (COL IV)), vitronektin (VN), laminin (LN), ili želatin (Gel), blokirane su ELISA puferom za testiranje pre dodavanja prečišćenog Fc- TEMI proteina u sve većim koncentracijama. Nakon dvočasovne inkubacije, ploče su oprane i testirane za vezivanje pomoću HRP-povezanog kozjeg anti-miš sekundarnog monoklonskog antitela (mAb) koje je specifično za Fc rep pomoću standardnih ELISA uslova. Ploče su oprane i razvijene, a zatim testirane pomoću čitača za ploče pri OD 450 nm. Kao što je prikazano na Slici 4A, Fc-TEMl je grubo vezan za FN i COL, dok je slabo vezivanje uočeno kod LM, VN, ili Gel. Za sliku 4B, ELISA ploča je prethodno premazana preko noći sledećim antigenima: Staphvlococcus enterotoxin B (STEB), ovalbumin (OVA), gama globulin kod goveda (BGG), 90-kD glikoproteinski antigen povezan sa tumorom, eksprimiran na većini ćelija melanoma (TA90), lizozim jajeta kokoške (HEL), tetanus toksoid (TT), 1% BSA, humani mezotelin, humani GM-CSF, kozji IgG, i mišji IgG. Fc-TEMl je dodavan u sve većim količinama (5, 10, 50 ug/ml) i dozvoljeno je da se vezuje 2 sata. Ploče su zatim oprane i HRP-sjedinjeno kozje anti-miš antitelo je dodato kako bi se detektovao vezani Fc-TEMl.
Slika 5prikazuje mapiranje fibronektina (FN) koji vezuje domene za endosijalin. Proteolitički i rekombinantni fragmenti dobijeni od fibronektina (FN) su ispitam za sposobnost podržavanja TEM-1 vezivanja. Procenjeni FN fragmenti obuhvataju: N-terminalni 70kDa fragment (Sigma kat. br. F0287)
(dobijen cepanjem fibronektina pomoću katepsina D); 30kDa fragment koji vezuje heparin (Sigma kat. br. F9911); 45 kDa fragment koji vezuje želatin (Sigma kat. br. F0162) (oba dobijena tripsinskim cepanjem 70kDa fragmenta); 120 kDa fragment koji sadrži domen spajanja ćelije ("120 kDa fragment"); i dva rekombinantna fragmenta: Fn2, koji sadrži prve 7 FN domena III tipa, i Fn4, koji sadrži lokaciju međulančanih disulfidnih veza i a4pi domen koji vezuje integrin. Dijagram FN strukture je prilagođen iz Wierzbicka-Patynowskiet al(2003)J. Cell Sci.,116:3269-76.
Slika 6prikazuje rekombinantni Fc-TEMl koji se vezuje za EMP i fibronektin u prisustvu inhibitora. M4 je humanizovano antitelo za humani endosijalin, dokje rbtTEMl zečje antitelo za humani endosijalin. Test je sproveden kao što je opisano na Slici 4, osim što su antitela dodavana da bi se merila sposobnost narušavanja ili blokiranja Fc-TEMl da se veže za FN. Kao što je prikazano na ovoj slici, M4 je bio u stanju da inhibira Fc-TEMl vezivanje za FN, dok nespecifični kontrolni (HulgG) nije.
Slika7 prikazuje vezivanje endosijalina za EMP fragmente i inhibiciju istog pomoću inhibitorskih jedinjenja endosijalin-EMP. Fragmenti fibronektina ilustrovani su na Slici 5. Slika 7A prikazuje vezivanje za fragmente proteina dobijene iz nativnog FN. Slika 7B prikazuje vezivanje za fragmente proteina dobijene iz denaturisanog FN. Za Slike 7 A i 7B, FN fragment je obložen na ELISA ploči pri naznačenim koncentracijama. Anti-FN poliklonsko antitelo praćeno dodavanjem HRP-sjedinjenog kozjeg anti-miš sekundarnog antitela korišćeno je za utvrđivanje netaknutih vezanih proteina. Fc-TEMl(1,25Lig/ml) jc dodat i dozvoljeno je da sc vezuje 2 sata. Ploče su zatim oprane i HRP-sjedinjeno kozje anti-miš antitelo je dodato kako bi se utvrdio vezani Fc-TEMl. Stub sa linijama (Fc-TEMl-nativni) na Slici 7B predstavlja Fc-TEMl vezivanje za nenaturisani FN. Kao što je prikazano, endosijalin se vezuje za N-terminalnu regiju fibronektina, pri čemu je uočeno malo ili nikakvo vezivanje za fragmente FN-2, FN-4, ili 120 kDa. Poliklonska antitela za fibronektin vezana za sve fragmente. Slike 7C i 7D prikazuju vezivanje Fc-TEMl za 70 kDa fragment FN i inhibiciju te interakcije pomoću inhibitorskih jedinjenja endosijalin-EMP. Čitav FN i 70 kDa FN protein su premazani na ELISA ploči pri fiksnoj koncentraciji od -15 nmol/well za oba proteina. Izvršena je preinkubacija Fc-TEMl (1,25 iig/ml) na 4°C u trajanju od 1 sata sa sve većim količinama antiendosijalinskog antitela M4 ili izotipskog kontrolnog IgG. Fc-TEM1/M4 (Slika 7C) ili Fc-TEMl/IgG (Slika 7D) kompleksi su dodati mikrotitarskim pločama obloženim pomoću FN i 70 kDa i inkubirani u trajanju od 2 sata na sobnoj temperaturi. Vezani Fc-TEMl protein je detektovan dodavanjem HRP-sjedinjenog kozjeg anti-miš sekundarnog antitela.
Slika8 ilustrujc promenu u morfologiji ćelija na mešavini želatinastih proteina koja sc prodaje pod trgovinskim nazivom MATRIGEL (BD Biosciences) nakon eksprimiranja endosijalina. 8E4 ćelije od CHO-K1 ili CHO-TEM1 su zasejane na mikrotitarsku ploču sa 96 čašica, obloženu MATRIGEL-om i inkubiranom na 37°C. Nakon prekonoćne inkubacije, ćelije su fotografisane radi makroskopskog ispitivanja formiranja tubula.
Slika9 prikazuje ćelijsko vezivanje za EMP fragmente posredstvom endosijalina. Izvršena je transfekcija CHO ćelija pomoću vektora koji eksprimira endosijalin ili probnu kDNK. Potvrđeno je da ćelije eksprimiraju endosijalin na površini ćelije (CHOTEM1), dok one kod kojih je izvršena transfekcija pomoću probnog (CHOK1) ne eksprimiraju. Za Sliku 9A, jajne ćelije kineskog hrčka (CHO) su dodate prethodno obloženoj mikrotitarskoj ploči sa 96 čašica, koja sadrži razne ECM proteine. Dopušteno je da se ćelije stežu 1 sat na 37°C i čašice su temeljno oprane kako bi se uklonile sve slabo vezane ćelije. Broj vezanih ćelija je određen pomoću CELLTITER-GLO testa održivosti luminescentnih ćelija. Skraćenice: Col, kolagen; FN, fibronektin; LN, laminin; TN, tenascin; VN, vitronektin; Neg, goveđi serumski albumin. Za Sliku 9B, izvršena jc transfekcija jajnih ćelija kineskog hrčka (CHO) pomoću vektora koji eksprimira endosijalin ili probnu kDNK. Ćelije su potvrđene FACS analizom da bi se ekprimirao endosijalin na površini ćelije (CHOTEM1) dok one kod kojih je izvršena transfekcija pomoću probnog (CHOK1) nisu. Zatim je testirana sposobnost ćelija za vezivanje samog EMP fibronektina ili u kombinaciji sa antiendosijalinskim antitelom M4 ili kontrolnim IgG. Slika 9B demonstrira da antiendosijalinsko antitelo M4 umanjuje vezivanje ćelija za FN posredstvom endosijalina. Izvršena je preinkubacija ćelija (1.5E5) u trajanju od 1 sata na 4°C sa antitelom M4 (100 ug/ml) ili IgG izotopskim kontrolnim antitelom (100 ug/ml). Za Sliku 9C, testirana je sposobnost ćelija da vezuju FN pune dužine ili fragmente fibronektina. Kao što je prikazano na Slici 9A, broj vezanih CHO-TEM1 ćelija bio je šestostruko veći od broja roditeljskih CHO-K1 ćelija u čašicama obloženim FN. Nisu uočene nikakve značajne razlike u vezivanju između CHO-K1 i CHO-TEM1 ćelija za površine obložene lamininom ili vibronektinom, dok je vezivanje za kolagene i tenascin bilo preslabo da bi se procenile ikakve značajne razlike (Slika 9A). Prethodni tretman CHO-TEM1 ćelija pomoću M4 antitela uticao je na smanjenje vezivanja ćelija koje zavisi od TEM 1 -FN id 50%, dok IgG kontrolno antitelo nije imalo nikakvog dej stva (Slika 9B). Tretman M4 antitelom nije uticao na vezivanje ćelija koje zavisi od FN, a nezavisno je od endosijalina (osnovno vezivanje) roditeljskih CHO-K1 ćelija. CHO-TEM1 ćelije pokazale su trostruko do petostruko uvećano vezivanje za FN, 70 kDa, i 30 kDa fragmente u poređenju sa roditeljskim CHO-Kl ćelijama, a nije uočeno nikakvo značajno vezivanje za 45 kDa ili Fn2 fragmente. CHO-TEM1 ćelije su vezivale MATRIGEL pet puta bolje od CHO-K1 (Slika 9C).
Slika 10prikazuje identifikaciju inhibitorskih jedinjenja endosijalin-EMP kolagena. Izvršenaje transfekcija CHO ćelija pomoću vektora koji eksprimira endosijalin ili probnu kDNK. Potvrđeno je da ćelije eksprimiraju endosijalin na površini ćelije (CHOTEM1), dok one kod kojih je izvršena transfekcija pomoću probnog (CHOK1) ne eksprimiraju. Zatim je testirana sposobnost ćelija da vezuju sam EMP kolagen I tipa (COL I) ili u kombinaciji sa antiendosijalinskim antitelom M4 ili kontrolnim IgG. Kao što je prikazano, preterano eksprimiranje endosijalina izaziva povećano vezivanje ćelija za COL I koje se može blokirati inhibitorima endosijalina poput M4, nasuprot kontrolnog molekula (IgG). RbtTEMl je takođe potisnuo vezivanje Fc-TEMl za COL I (podaci nisu prikazani).
Slika11 prikazuje ćelijsko vezivanje za EMP kolagen posredstvom endosijalina. Izvršenaje transfekcija CHO ćelija pomoću vektora koji eksprimira endosijalin ili probnu kDNK. Potvrđeno je da ćelije eksprimiraju endosijalin na površini ćelije (CHOTEM1), dok one kod kojih je izvršena transfekcija pomoću probnog (CHOK1) ne eksprimiraju. Zatim je testirana sposobnost ćelija da vezuju EMP kolagen I tipa. Kao što je prikazano, preterano eksprimiranje endosijalina izaziva povećano vezivanje ćelija za
COL I.
Slika 12prikazuje posredovanje migracije ćelija pomoću endosijalina ili inhibiciju iste pomoću antiendosijalinskog antitela M4. Određena je sposobnost M4 da inhibira migraciju CHO-TEM1 i CHO-Kl ćelija preko membrana obloženih MATRIGEL-om (Slika 12A) ili FN-om (Slika 12B). Ćelije su dodate u komoru na vrhu i dozvoljeno je da migriraju 48 sati na 37°C. Membrana je uklonjena, a broj migriranih ćelija je određen pomoću CELLTITER-GLO testa održivosti luminescentnih ćelija. Onde gde je naznačeno, ćelije su tretirane pomoću M4 ili izotipskog kontrolnog IgG za vreme trajanja eksperimenta. Kao što je prikazano na Slici 12A, CHO-K1 ćelije su ispoljile skromnu ćelijsku migraciju, dok su CHO-TEM1 ćelije ispoljile više nego desetostruko pojačanu migraciju. Tretman M4 antitelom, ali ne kontrolnim IgG, poništio je migraciju CHO-TEM1 ćelija. Slični rezultati su uočeni u eksperimentima migracije pomoću transwell komora obloženim FN-om (Slika 12B).
Slika13 prikazuje poboljšanje ćelijskih puteva endosijalinom. Izvršena je transfekcija CHO ćelija pomoću vektora koji eksprimira endosijalin ili probnu kDNK. Potvrđeno je da ćelije eksprimiraju endosijalin na površini ćelije (CHOTEM1), dok one kod kojih je izvršena transfekcija pomoću probnog (CHOK1) ne eksprimiraju. Zatim je testirana sposobnost ćelija da povećaju ćelijske puteve. Jedan takav put je put MMP9, koji igra ulogu u ćelijskoj migraciji. Kao što je prikazano, preterano eksprimiranje endosijalina izaziva povećanu aktivnost MMP-9 nasuprot kontrolnim ćelijama.
Slika 14prikazuje dejstvo blokiranja endosijalina na aktiviranje P integrina. Izvršena je transfekcija ćelija humanog embrionskog bubrega 293 (HEK293) pomoću vektora koji eksprimira endosijalin ili probnu kDNK. Potvrđeno je da ćelije eksprimiraju endosijalin na površini ćelija (293TEM1), dok one kod kojih je izvršena transfekcija pomoću probnog (293T) ne eksprimiraju. Zatim je testirana sposobnost ćelija da povećaju ćelijske puteve. Jedan takav put je put integrina koji igra ulogu u ćelijskoj migraciji. Kao što je prikazano, preterano eksprimiranje endosijalina izaziva povećanu aktivnost integrina pi (Slika 14B) nasuprot kontrolnim ćelijama, dok direktno dejstvo na eksprimiranje pi na površini ćelije nije promenjeno (Slika 14A). Tretman ćelija pomoću inhibitora endosijalina M4 izazvao je potisnutu aktivnost integrina, a nije uočeno nikakvo dejstvo na nivoe površina ćelija (Slika 14B). Ovi podaci prikazuju sposobnost korišćenja inhibitora endosijalina za potiskivanje funkcije integrina u ćelijama koje eksprimiraju endosijalin.
Slika 15ilustruje da antitelo M4.1 prepoznaje neredukovani humani TEM-1 u CHO-TEM-1 ćelijama i humane primarne pericite ali ne mišje TEM-1 u 2H11 ćelijama miševa. Zečji poliklonski nasuprot humanog TEM-1 (rabPAb TEM-1) prepoznaje humani TEM-1 u CHO-TEM-1 ćelijama i humanim pericitima, ali takođe i mišji TEM-1 u 2H11 ćelijama miševa. Ni M4.1 niti rabPAb TEM-1 nisu reagovali protiv lizata roditeljskih CHO-K1 ćelija ili NSO i MSI ćelija miševa usled nedostatka TEM-1 eksprimiranja u ovim ćelijama. Samo rabPAb TEM-1 je reagovao sa regukovanim humanim TEM-1, premda u manjoj meri u poređenju sa neredukovanim TEM-1.
DETALJAN OPIS
Razni pojmovi povezani sa aspektima ovog pronalaska koriste se u specifikaciji i patentnim zahtevima. Takvim pojmovima treba davati njihovo uobičajeno značenje iz ove oblasti, osim ukoliko je drugačije naznačeno. Ostale posebno definisane pojmove treba tumačiti na način dosledan definiciji navedenoj u ovom dokumentu.
Podrazumeva se da ovaj pronalazak nije ograničen na određene metode, reagense, jedinjenja, smeše ili biološke sisteme, koji, naravno, mogu da variraju. Takođe se podrazumeva daje terminologija koja je korišćena u ovom dokumentu namenjena za samo za opisivanje određenih oblika, i nije namenjena da bude ograničavajuća.
U skladu sa upotrebom u ovoj specifikaciji i priloženim patentnim zahtevima, oblici u jednini obuhvataju i oblike u nožini, osim ukoliko sadržina jasno ukazuje drugačije. Stoga, na primer, pozivanje na „ćeliju" obuhvata kombinaciju dve ili više ćelija, i slično.
Svaki opseg naveden u ovom dokumentu obuhvata sve kombinacije i podkombinacije opsega, kao i specifične cifre u ovom dokumentu.
Pojam „oko", koji se ovde koristi prilikom pozivanja na mernu vrednost, kao što je iznos, vremensko trajanje, i slično, treba da obuhvata varijacije od ±20% ili ±10%, poželjnije ±5%, još poželjnije ±1%, a najpoželjnije ±0,1% od naznačene vrednosti, jer su takve varijacije odgovarajuće za sprovođenje otkrivenih metoda.
„Specifični test endosijalina" (ESA) odnosi se na testove koji se mogu koristiti za identifikovanje jedinjenja koja mogu direktno ili indirektno da naruše eksprimiranje endosijalina ili biološku aktivnost koja izaziva modifikovano direktno ili indirektno vezivanje ćelija koje eksprimiraju endosijalin ili endosijalina za EMP preko endosijalina ili mehanizama uz posredovanje integrina, kao i da modifikuju ćelijske endogene puteve, kao što su, ali bez ograničenja, matrična metaloproteaza (MMP) i/ili ćelijska proliferacija ili preživljavanje.
„Polinukleotid", koji se sinonimno naziva „nukleinska kiselina" ili „molekul nukleinske kiseline", odnosi se na bilo koji poliribonukleotid ili polideoksiribonukleotid, koji može da bude nemodifikovana RNK ili DNK ili modifikovana RNK ili DNK. „Polinukleotidi" obuhvataju, bez ograničenja, jednolančanu DNK i dvolančanu DNK, DNK koja je mešavina jednolančanih i dvolančanih regija, jednolančanu i dvolančanu RNK, RNK koja je mešavina jednolančanih i dvolančanih regija, hibridne molekule koji čine DNK i RNK koje mogu biti jednolančane ili, tipično dvolančane ili mešavina jednolančanih i dvolančanih regija. Pored toga, „polinukleotid" se odnosi na trolančane regije koje čine RNK ili DNK ili i RNK i DNK. Pojam „polinukleotid" takođe obuhvata DNK i RNK koje sadrže jednu ili više modifikovanih baza i DNK i RNK čije su kičme modifikovane radi stabilnosti i drugih razloga. „Modifikovane" baze obuhvataju, na primer, tritilisane baze i neobične baze, kao što je inozin. Razne modifikacije se mogu izvršiti na DNK i RNK; stoga, „polinukleotid" obuhvata hernijski, enzimski ili metabolički modifikovane oblike polinukleotida koji se obično nalaze u prirodi, kao i hemijske oblike DNK i RNK karakteristične za viruse i ćelije. „Polinukleotid" takođe obuhvata relativno kratke lance nukleinske kiseline, koji se često nazivaju oligonukleotidima.
„Vektor" je replikon, poput plazmida, faga, kozmida ili virusa u koji se neki drugi segment nukleinske kiseline može ubaciti operacijom, kako bi se izazvala replikacija eskprimiranja tog segmenta.
„Polipeptid", „peptid" i „protein" koriste se naizmenično u ovom dokumentu za polimer ostataka aminokiselina. Ovi pojmovi se odnose na polimere aminokiselina u kojima je ostatak jedne ili više aminokiselina veštački hemijski mimetik odgovarajuće prirodne aminokiseline, kao i na prirodne polimere aminokiselina i neprirodne polimere aminokiselina. Polipeptidi obuhvataju konzervativno modifikovane varijante. Vešta osoba će prepoznati da su zamene, brisanja ili dodavanja sekvenci nukleinske kiseline, peptida, polipeptida ili proteina, koje menjaju, dodaju ili brišu jednu aminokiselinu ili mali procenat aminokiselina u kodiranoj sekvenci „konzervativno modifikovana varijanta" gde promena izaziva zamenu aminokiseline hemijski sličnom aminokiselinom. Tabele konzervativne zamene, koje daju funkcionalno slične aminokiseline, dobro su poznate u ovoj oblasti. Takve konzervativno modifikovane varijante su dodatak i ne isključuju polimorfne varijante, interspecijske homologe i alele pronalaska.
Pojam „eksprimirati", „eksprimirani" ili „eksprimiranje" molekula nukleinske kiseline odnosi se na biosintezu genetskog proizvoda. Ovaj pojam obuhvata transkripciju gena u RNK.
Na primer, ali bez ograničenja, regulatorni gen poput „antisense" nukleinske kiseline ili interferentne nukleinske kiseline može se eksprimirati transkripcijom „antisense" RNK ili RNKi ili shRNK (RNK sa strukturom ukosnice). Ovaj pojam takođe obuhvata translaciju RNK u jedan ili više polipeptida, i obuhvata sve prirodne post-transkripcijske i post-translacijske modifikacije.
Ćelija je „transformisana" ili „transfektovana" egzogenim ili heterološkim nukleinskim kiselinama poput DNK, kada je ta DNK uvedena unutar ćelije. DNK koja se transformiše može i ne mora biti integrisana (kovalentno povezana) u genom ćelije. Kod prokariota, kvasca i ćelija sisara, na primer, DNK koja se transformiše može se održati na epizomalnom elementu kao što je plazmid. Po pitanju eukariotskih ćelija, stabilno transformisana ćelija, ili „stabilna ćelija" je ona u kojoj se transformisana DNK integrisala u hromozom tako da su je nasledile ćerke ćelije putem replikacije hromozoma. Ova stabilnost se demonstrira sposobnošću eukariotske ćelije da uspostavlja linije ćelija ili klonove koji se sastoje od populacije ćerki ćelija koje sadrže DNK koja se transformiše. „Klon" je populacija ćelija dobijenih iz jedne ćelije ili zajedničkog pretka putem mitoze. „Linija ćelija" je klon primarne ćelije koja je sposobna za stabilni rastin vitroza mnoge generacije.
Kao što se koristi u ovom dokumentu, „test jedinjenje" se odnosi na bilo koji purifikovani molekul, značajno purifikovani molekul, molekule koji su jedna ili više komponenti mešavine jedinjenja, ili mešavina jedinjenja sa bilo kojim materijalom koji se može iskoristiti. Test jedinjenja mogu biti organska ili neorganske hemikalije, ili biomolekuli, kao i svi fragmenti, analozi, homolozi, konjugati i derivati istih. „Biomolekuli" obuhvataju proteine, polipeptide, nukleinske kiseline, lipide, monosaharide, polisaharide, kao i sve fragmente, analoge, homologe, konjugate i derivate istih. Test jedinjenja mogu biti prirodnog ili sintetičkog porekla, i mogu biti izolovani ili prečišćeni iz njihovih prirodnih izvora, ili se mogu sintetizovatide novo.Test jedinjenja se mogu definisati u smislu strukture ili sastava, ili mogu biti nedefinisani. Jedinjenje može da bude izolovani proizvod nepoznate strukture, mešavina nekoliko poznatih proizvoda, ili nedefinisana smeša koja čini jedno ili više jedinjenja. Primeri nedefinisanih smeša obuhvataju ekstrakte ćelija i tkiva, medijum rasta u kom su prokariotske, eukariotske i arhebakterijske ćelije kultivisane, fermentacione bujone, biblioteke za eksprimiranje proteina, i slično.
„Nokdaun" se odnosi na ćeliju ili organizam sa umanjenom ekspresijom jednog ili više gena. Kao što će to ceniti osobe stručne u ovoj oblasti, nokdaun će ispoljiti najmanje oko 50% smanjenja eksprimiranja, poželjno će ispoljiti najmanje oko 67% smanjenja eksprimiranja, a još poželjnije će ispoljiti najmanje oko 75% smanjenja eksprimiranja, iako su veća smanjenja moguća, uključujući najmanje oko 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili više smanjenja eksprimiranja.
„Inhibirati" ili „inhibicija" ili „ometati" znači redukovati, umanjiti, blokirati, sprečiti, odložiti, potisnuti, deaktivirati, desenzitivisati, zaustaviti, ili smanjiti biološku aktivnost ili ekspresiju gena, genetski proizvod{ npr.polipeptid), ili put od interesa. U nekim preferiranim oblicima pronalaska, inhibicija eksprimiranja biološke aktivnosti proteina ili puta od interesa, na primer endosijalina ili puta ćelijske migracije, odnosi se na umanjenje (inhibiciju ili smanjenje) veće od između 50% i 99%, a preciznije oko 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69% 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili više. Inhibicija može biti direktna, da radi na molekulu ili samom putu od interesa, iliindirektna, tj.,radi na molekulu ili putu koji utiče na molekul ili put od interesa.
Pojam „rekombinantan" kada se koristi uz pozivanje na,npr.ćeliju, ili nukleinsku kiselinu, protein ili vektor, ukazuje na to da su ćelija, nukleinska kiselina, protein ili vektor modifikovani uvođenjem hetelološke nukleinske kiseline ili proteina ili izmenom nativne nukleinske kiseline ili proteina, ili da je ćelija dobijena iz ćelije koja je modifikovana na taj način. Stoga, na primer, rekombinantne ćelije eksprimiraju gene koji se ne nalaze u nativnom (nerekombinantnom) obliku ćelije ili eksprimiraju nativne gene koji su drugačije nepravilno eksprimirani, nedovoljno eksprimirani ili uopšte nisu eksprimirani.
„Delotvorna količina" i „terapeutski delotvorna količina" koriste se naizmenično u ovom
dokumentu, a odnose se na količinu antitela, antigen-vezujućeg fragmenta, ili smeše, kao što je opisano u ovom dokumentu, koja je delotvorna za ostvarivanje nekog određenog biološkog rezultata, kao što su, ali bez ograničenja, biološki rezultati otkriveni, opisani ili navedeni kao primer u ovom dokumentu. Takvi rezultati mogu da obuhvataju, ali bez ograničenja, tretman bolesti povezanih sa angiogenezom ili neovaskularizacijom, kao što je određeno na bilo koji način koji je pogodan u ovoj oblasti.
U skladu sa upotrebom u ovom dokumentu, „mera" ili „odrediti" odnosi se na bilo kakva kvalitativna ili kvantitativna određenja.
„Ligand endosijalina" odnosi se na bilo koju hemikaliju, biomolekul, kompleks, analog, homolog ili derivat istih koji se mogu vezati, reagovati, stimulisati i/ili izmeniti eksprimiranje endosijalina.
Osim ukoliko je tako naznačeno, pojmovi „subjekat" ili „pacijent" koriste se naizmenično i odnose se na sisare, poput ljudskih sisara i neljudskih primata, kao i eksperimentalnih životinja poput zečeva, pasa, mačaka, pacova, miševa i drugih životinja. U skladu sa upotrebom u ovom dokumentu, pojmovi „subjekat" ili „pacijent" odnose se na bilo kog pacijenta sisara ili ispitanika na kome se smeše pronalaska mogu primeniti.
„Angiogeneza" se odnosi na formiranje novih krvnih sudova.
„Neovaskularizacija" sc odnosi na patološku proliferaciju novih krvnih sudova u tkivima ili organima koji obično ne sadrže krvne sudove, ili patološku proliferaciju krvnih sudova različitog tipa ili količine o odnosu na normalno stanje kod određenog tkiva ili organa.
„Epitop" se odnosi na imunološku determinantu antigena koja služi kao mesto za vezivanje antitela. U skladu sa upotrebom u ovom dokumentu, pojam „konformacioni epitop" odnosi se na nepovezani epitop formiran prostornim odnosom između aminokiselina antigena, koje ne predstavljaju neprekinutu seriju aminokiselina.
„Izolovan" znači izmenjen „ljudskom rukom" u odnosu na prirodno stanje. Ukoliko se neki molekul ili smeša pojavljuju u prirodi, „izolovani su" ukoliko su promenjeni ili uklonjeni iz prvobitnog okruženja, ili oboje. Na primer, polinukleotid ili polipeptid koji je prirodno prisutan u živoj biljci ili životinji nije „izolovan", ali isti taj polinukleotid ili polipeptid koji je odvojen od materijala koji koegzistiraju sa njim u prirodnom stanju je „izolovan", u skladu sa upotrebom tog pojma u ovom dokumentu.
„Suštinski iste" u odnosu na sckvcncc nuklcinskih kiselina ili aminokiselina, označava najmanje 65% identičnosti između dve ili više sekvenci. Po mogućstvu, ovaj pojam se odnosi na najmanje oko 70% identičnosti između dve ili više sekvenci, povoljnije najmanje oko 75% identičnosti, još povoljnije najmanje oko 80% identičnosti, još povoljnije najmanje oko 85% identičnosti, još povoljnije najmanje oko 90% identičnosti, još povoljnije najmanje oko 91% identičnosti, još povoljnije najmanje oko 92%
identičnosti, još povoljnije najmanje oko 93% identičnosti, još povoljnije najmanje oko 94% identičnosti, još povoljnije najmanje oko 95% identičnosti, još povoljnije najmanje oko 96% identičnosti, još povoljnije najmanje oko 97% identičnosti, još povoljnije najmanje oko 98% identičnosti, još povoljnije najmanje oko 99% ili više identičnosti.
Otkriveno je u skladu sa ovim pronalaskom da endosijalin posebno reaguje sa vanćelijskim matričnim proteinima, uključujući fibronektin ili kolagen. Takođe je utvrđeno da ova interakcija promoviše migraciju ćelija i dodatno promoviše i podstiče angiogenezu. Kao dopuna ovim zapažanjima, otkriveno je da ometanje interakcije između endosijalina i vanćelijskih matričnih proteina može da potisne migraciju ćelija i angiogenezu.
Inhibiranje eksprimiranja endosijalina može se dogoditi na nivou gena ili na nivou proteina. Na primer, inhibiranje eksprimiranja endosijalina može da obuhvata ciljanje DNK koja kodira endosijalin, ili ciljanje mRNK transkripta gena endosijalina.
Metode regulacije gena su poznate i spremno se primenjuju u ovoj oblasti, i pogodne su za upotrebu u ovom izlaganju. Na primer, u ćelijama koje su posebno napravljene kako bi eksprimirale transgen koji kodira endosijalin( npr.SEQ ID NO:l, 3, ili 5), transgen se može staviti pod kontrolu inducibilnog promotera. Inducibilni promoteri pogodni za upotrebu u ovom izlaganju biće poznati osobama koje su stručne u ovoj oblasti.
Geni koji kodiraju endosijalin mogu se inhibirati upotrebom raznih drugih tehnika za post-transkripcijsko prigušivanje gena (prigušivanje RNK). Prigušivanje RNK obuhvata obradu dvolančane RNK (dsRNA) u male 21-28 fragmente nukleotida putem RNase enzima na bazi H („Dicer" ili „nalik na Dicer"). Proizvodi za rascepljivanje, koje su siRNK (mala interferentna RNK) ili miRNA (mikroRNK) su inkorporirani u komplekse protenskih efektora koji regulišu ekspresiju gena na način koji se specifično odnosi na sekvencu.
RNK interferencija (RNKi) je mehanizam post-transkripcijskog prigušivanja gena uz posredstvo dvolančane RNK (dsRNA), koji se razlikuje od antisense i pristupa na bazi ribozima (videti Jain,Pharmacogenomics(2004) 5:239-42, radi pregleda RNKi and siRNK). RNK interferencija je korisna u metodi za inhibiranje ekprimiranja endosijalina u ćeliji ili u životinji poput čoveka transformisanjem ćelije, ili ubrizgavanja nukleinske kiseline u životinju( npr.dsRNA) koja se hibridizuje pod strogim uslovima do gena koji kodira endosijalin i ublažava ekspresiju ciljnog gena. RNK interferencija obezbeđuje shRNK ili siRNK koje čine više sekvenci koje ciljaju jednu ili više regija gena endosinjalina. Smatra se da molekuli dvolančane RNK (dsRNK) (shRNK ili siRNK) usmeravaju degradaciju mRNK u ćelijama raznih tipova, koja se odnosi na posebnu sekvencu, nakon prvobitne obrade od strane enzima nalik na RNase III, koji se naziva DICER (Bernstein E.eta/.(2001) Nature 409:363-366) na manje dsRNK molekule koji se sastoje od 21 nt lanca, od kojih svaki ima 5' fosfat grupu i 3' hidroksil, i obuhvara 19 nt regiju koja se precizno dopunjuje sa drugim lancem, tako da postoji 19 nt dupleks regija sa čije se strane nalaze 2 nt-3' viška. Stoga se vrši posredovanje RNKi putem kratkih interferentnih RNK (siRNK), koje obično čine dvolančanu regiju otprilike 19 nukleotida u dužini sa 1-2 nukleotid 3' viška na svakom lancu, rezultirajući ukupnom dužinom između otprilike 21 i 23 nukleotida. U ćelijama sisara, dsRNK koja je duža od oko 30 nukleotida obično inducira nespecifičnu degradaciju mRNK putem reakcije interferona. Međutim, prisustvo siRNK u ćelijama sisara, pre nego da induciraju reakciju interferona, rezultiraju prigušivanjem gena specifičnim za sekvencu.
Viralni vektori ili DNK vektori kodiraju shRNK (RNK sa strukturom ukosnice), koje se obrađuju u ćelijskoj citoplazmi do kratke interferentne RNK (siRNK). Uopšteno, kratka interferentna RNK (siRNK) čini RNK dupleks koji je po mogućstvu dužine otprilike 19 baznih parova i dodatno čini jedan ili dva jednolančana viška ili petlje. siRNK može da obuhvata dva RNK lanca hibridizirana zajedno, ili može da obuhvata jedan RNK lanac koji obuhvata deo koji se samostalno hibridizira. siRNK mogu da obuhvataju jedan ili više krajeva lanaca, koji mogu da obuhvataju fosfatne i/ili hidroksilne grupe. siRNK obično obuhvataju deo koji se hibridizira u strogim uslovima sa ciljnim transkriptom. Jedan lanac siRNK (ili dela siRNK koji se samostalno hibridizira) se obično precizno dopunjuje sa regijom ciljnog transkripta, što znači da se siRNK hibridizira do ciljnog transkripta bez ijednog neslaganja. Može se desiti da se ne dostigne savršena podudarnost, a neslaganja se mogu nalaziti u siRNK terminalima ili u blizini istih.
Pokazalo se da siRNK smanjuje ekspresiju gena kada se prenese u ćelije sisara metodama poput transfekcije, elektroporacije, transfekcije posredstvom katjonskih lipozoma, mikroinjekcije, ili kada se eksprimira u ćelijama putem bilo kog od raznih pristupa na bazi plazmida. Pregled RNK interferencije pomoću siRNK prikazanje u,npr.Tuschl (2002)Nat. Biotechnol.20:446-8; Yu J-Yet al.(2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA,99:6047-52; Sui Get al.(2002)Proc. Natl. Acad. Sci. USA,99:5515-20; Paddisonet al.(2002)Genes and Dev.,16:948-58; Brummelkampet a/.(2002) Science,296:550-3, 2002; Mivagashiet al.(2002)Nat. Biotechnol.,20:497-500; i, Paulet al.(2002)Nat. Biotechnol,20:505-8. Kao što je opisano u ovim i drugim referencama, siRNK može da se sastoji od dva pojedinačna lanca nukleinske kiseline ili jednog lanca sa regijom koja se samostalno dopunjuje, sposobnom da formira strukturu ukosnice (matična petlja). Izvestan broj varijacija u strukturi, dužini, broju neslaganja, veličini petlje, identičnosti nukleotida u viškovima, itd. dosledni su sa efektivnim prigušivanjem gena izazvanim pomoću siRNK. Iako ne postoji želja za vezivanjem za bilo koju teoriju, smatra se da intercelularna obrada (pomoću DICER-a) različitih prethodnika rezultira proizvodnjom siRNK koja se sposobna da efikasno posreduje u prigušivanju gena. Mogu se ciljati egzoni umesto introna, i mogu se izabrati sekvence koje se dopunjuju sa regionima u okviru 3' dela ciljnog transkripta. Sekvence koje sadrže otprilike ekvimolarni odnos različitih nukleotida i da bi se izbegavali nizovi u kojima se jedan ostatak ponavlja više puta.
siRNK stoga mogu da sačinjavaju RNK molekule sa dvolančanom regijom dužine oko 19 nukleotida sa 1-2 nukleotida 3' viška na svakom lancu, rezultirajući ukupnom dužinom između otprilike 21 i 23 nukleotida. U skladu sa upotrebom u ovom dokumentu, siRNK takođe obuhvataju razne RNK strukture koje se mogu obrađivatiin vivokako bi se stvarali takvi molekuli. Takve strukture obuhvataju RNK lance koji sadrže dva dopunska elementa koji se hibridiziraju jedan za drugi kako bi formirali stablo, petlju, a opciono i višak, po mogućstvu višak od 3'. Po mogućstvu, stablo ima dužinu 19 baznih parova, petlja 1-20, još povoljnije 4-10, a najpovoljnije oko 6-8 nt dužine, i/ili višak ima dužinu oko 1-20, a još pogodnije oko 2-15 nt. U određenim oblicima pronalaska, stablo ima najmanje 19 nukleotida dužine, a može da ima do oko 29 nukleotida dužine. Postoji manja verovatnoća da petlje od 4 ili više nukleotida budu podložne sternim ograničenjima od kraćih petlji, pa su stoga poželjnije. Višak može da obuhvata 5' fosfat i 3' hidroksil. Višak može, ali ne mora da sačinjava većinu U ostataka,npr.između 1 i 5 U ostataka. Klasične siRNK, kao što je gore opisano, izazivaju degradaciju mRNK za koje su ciljani, na taj način takođe umanjujući stopu sinteze proteina. Pored siRNK koje funkcionišu preko klasičnog puta, određene siRNK koje sc vezuju za 3' UTR šablonskog transkripta mogu da inhibiraju ckprimiranjc proteina kodiranog šablonskim transkriptom pomoću mehanizma povezanog sa klasičnom RNK interferencijom, ali različitog od iste,npr.smanjenjem translacije transkripta umesto smanjenja njegove stabilnosti. Takve RNK se nazivaju mikroRNK (miRNK) i njihova tipična dužina je između otprilike 20 i 26 nukleotida,npr.dužine 22 nt. Veruje se da se izvode iz većih prethodnika poznatih kao mali temporalni RNK (stRNK) ili od prethodnika mRNK, čija je dužina obično oko 70 nt sa petljom približne dužine 4-15 nt (Grishoketa/.(2001)Cell,106:23^1; Hutvagneretal.(2001)Science,293:834-8; Kettinget al.(2001)Genes Dev.,15:2654-9). Endogene RNK ovog tipa su identifikovane kod izvesnog broja organizama, uključujući sisare, nagoveštavajući da ovaj mehanizam post-transkripcijskog prigušivanja gena može da bude široko rasprostranjen (Lagos-Quintanaet al.(2001)Science,294:853-8, 2001; Pasquinelli (2002)Trends Gen.,18:171-3). Pokazalo se da mikroRNK blokiraju translaciju ciljnih transkripta koji sadrže ciljne lokacije u ćelijama sisara (Zenget ali ( 2002) Mol. Cell,9:1327-33).
siRNK poput prirodnih ili veštačkih( tj.napravljenih ljudskom rukom) mRNK koje se vezuju u okviru 3' UTR (ili na nekom drugom mestu u ciljnom transkriptu) i inhibiraju translaciju, mogu da tolerišu veći broj neslaganja u siRNK/šablonskom dupleksu, a naročito mogu da tolerišu neslaganja u okviru centralne regije dupleksa. Zapravo, postoje dokazi da neka neslaganja mogu da budu poželjna ili potrebna, jer prirodne stRNK često ispoljavaju takva neslaganja, kao i mRNK za koje se pokazalo da ispoljavaju translacijuin vitro.Na primer, prilikom hibridizacije sa ciljnim transkriptom, takve siRNK
često obuhvataju dva niza savršene komplementarnosti, odvojena regijom neslaganja. Moguće su razne strukture. Na primer, mRNK mogu da obuhvataju više područja neidentičnosti (neslaganja). Područja neidentičnosti (neslaganja) ne moraju da budu simetrična u smislu da i cilj i mRNK obuhvataju nesparene nukleotide. Obično nizovi savršene komplementarnosti imaju dužinu od najmanje 5 nukleotida,npr.6, 7, ili više nukleotida dužine, dok regije neslaganja mogu da imaju dužinu od, na primer, 1, 2, 3, ili 4 nukleotida dužine.
Strukture ukosnice namenjene za imitiranje prethodnika siRNK i mRNK obrađuju se intracelularno u molekule sposobne za redukovanje ili inhibiranje eksprimiranja ciljnih transkripta (McManuset al.(2002)RNA8:842-50). Ove strukture ukosnice, zasnovane na klasičnim siRNK koje se sastoje od dva RNK lanca koja formiraju dupleks strukturu od 19 bp, klasifikovane su kao ukosnice klase I ili klase II. Ukosnice klase I inkorporiraju petlju na 5' ili 3' kraju „antisense" siRNK lanca( tj.lanca koji dopunjuje ciljni transkript, čija ihhibicija je poželjna) ali su inače identične klasičnim siRNK. Ukosnice klase II podsećaju na prethodnike mRNK u smislu da obuhvataju dupleks regiju od 19 nt i petlju na nekom od 3' ili 5' krajeva antisense lanca dupleksa, uz jedno ili više neslaganja nukleotida u stablu. Ovi molekuli se obrađuju intracelularno u male RNK dupleks strukture sposobne za posredovanje u prigušivanju. Čini se da ispoljavaju dejstva kroz degradaciju ciljne mRNK umesto kroz translacijsku represiju, kao što se smatra daje slučaj za prirodne mRNK i siRNK.
Stoga, očigledno je daje raznoliki niz RNK molekula koji sadrži dupleks strukture u staju da posreduje u prigušivanju putem raznih mehanizama. Svaka takva RNK, čiji se jedan deo vezuje za ciljni transkript i smanjuje njegovo eksprimiranje, bilo izazivanjem degradacije, inhibiranjem translacije, ili na neki drugi način, smatra se daje siRNK, i bilo koja struktura koja generiše takvu siRNK( tj.služi kao prethodnik RNK) jc korisna u praktičnoj primeni ovog pronalaska.
Dopunska metoda RNK interferencije je upotreba shRNK (RNK sa strukturom ukosnice). Plazmid koji sadrži kodiranje DNK sekvence za određenu željenu siRNK sekvencu dovodi se u ciljnu ćeliju transfekcijom ili infekcijom posredstvom virusa. Kada se nađe u ćeliji, DNK sekvenca se stalno transkribuje u RNK molekule koji se povratno transkribuju i formiraju strukture ukosnice putem intramolekularnog baznog sparivanja. Ove strukture ukosnice, nakon ćelijske obrade, ekvivalentne su transfektovanim siRNK molekulima i ćelija ih koristi za posredovanje RNKi željenog proteina. Upotreba shRNK ima prednost u odnosu na transfekciju siRNK, jer ova prethodna može da dovede do stabilne, dugoročne inhibicije eksprimiranja proteina. Inhibicija eksprimiranja proteina pomoću transfektovanih siRNK je prolazni fenomen koji se ne događa u periodima dužim od nekoliko dana. U nekim slučajevima, to može biti bolje i poželjno. U slučajevima gde su potrebni duži periodi inhibiranja proteina, inhibicija posredstvom shRNK je poželjna. Upotreba shRNK je naročito poželjna. Vektori koji kodiraju siRNK su obično sastavi koji čine promoter, sekvencu ciljnog gena koji je potrebno prigušiti u „čulnoj" orijentaciji, umetak, antisense sekvence ciljnog gena i terminator.
Inhibicija ekprimiranja endosijalina takođe se može ostvariti na druge načine koji su poznati i spremno sc primenjuju u ovoj oblasti. Na primer, mogu sc koristiti antisense nukleinske kiseline. „Antisense" RNK transkripti imaju osnovnu sekvencu koja dopunjuje deo ili celokupni RNK transkript u istoj ćeliji. Pokazalo se da takvi transkripti moduliraju ekspresiju gena putem raznih mehanizama, uključujući modulaciju RNK splajsovanja, modulaciju RNK transporta i modulaciju translacije mRNK(Denhardt (1992) Ann. NYAcad. Sci., 660:70-6,1992;Nellene/a/.(1993) TrendsBiochem. Sci,18:419-23; i, Bakeret al.(1999)Biochim. Biophys. Acta.,1489: 3-18). Prema tome, inhibiranje endosijalina u ćeliji može se ostvariti eksprimiranjem antisense molekula nukleinske kiseline u ćeliji.
Antisense nukleinske kiseline su obično jednolančane nukleinske kiseline (DNK, RNK, modifikovana DNK, ili modifikovana RNK) koje dopunjuju deo ciljne nukleinske kiseline (npr. mRNK transkript) te su stoga u stanju da se vezuju za cilj kako bi formirali dupleks. To su obično oligonukleotidi čija se dužina kreće od 15 do 35 nukleotida, ali može da se kreće od 10 do otprilike 50 nukleotida. Vezivanje obično redukuje ili inhibira funkciju ciljne nukleinske kiseline, poput gena koji kodira endosijalin. Na primer, „antisense" oligonukleotidi mogu da blokiraju transkripciju kada se vežu za genomsku DNK, inhibiraju translaciju kada sc vežu za mRNK, i/ili dovedu do degradacije nukleinske kiseline. Inhibicija eksprimiranja endosijalina može se postići primenom antisense nukleinskih kiselina ili peptidnih nukleinskih kiselina, koje čine sekvence komplementarne sekvencama mRNK koje kodiraju protein endosijalin. Antisense tehnologija i njene primene su dobro poznate u ovoj oblasti i opisane su u Phillips (ed.)Antisense Technology, Methods Enzvmol,2000, tomovi 313 i 314, Academic Press, San Dijego, i referencama navedenim u njima. Takođe pogledati Crooke (ed.) "Antisense Dru<g>Technology: Principles, Strategies, andApplications" (1 izdanje) Marcel Dekker i referencama navedenim u njemu.
„Antisense" oligonukleotidi mogu se sintetizovati pomoću osnovne sekvence koja je komplementarna delu bilo kog RNK transkripta u ćeliji. „Antisense" oligonukleotidi mogu da moduliraju ekspresiju gena putem raznih mehanizama, uključujući modulaciju RNK splajsovanja, modulaciju RNK transporta i modulaciju translacije mRNK. Razna svojstva „antisense" oligonukleitida, uključujući stabilnost, toksičnost, raspored tkiva, ćelijski unos i afinitet prema vezivanju, mogu se promeniti putem hemijskih modifikacija, uključujući (i) zamenu fosfodicstarskc kičme( npr.peptidna nukleinska kiselina, peptide nucleic acid, fosforotioat oligonukleotidi i forsforamidat oligonukleotidi), (ii) modifikaciju šećerne baze( npr.2'-0-propilriboza i 2'-metoksietoksiriboza), i (iii) modifikaciju nukleozida( npr.C-5 propinil U, C-5 tiazol U, i fenoksazin C) (Wagner (1995)Nat. Medicine,1:1116-8; Vargaet al.(1999)Immun. Lett,69:217-24; Neilsen (1999)Curr. Opin. Biotech.,10:71 -5; i Woolf
(1990)Nucleic Acids Res., 18:1763-9).
Inhibiranje eksprimiranja gena endosijalina takođe se može ostvariti upotrebom ribozima. Pokazalo se da molekuli određenih nukleinskih kiselina, koji se nazivaju ribozimima ili deoksiribozimima, katalizuju rascepljenje RNK molekula specifično za sekvencu. Mesto rascepljenja se određuje komplementarnim uparivanjem nukleotida u RNK ili DNK enzimu sa nukleotidima u ciljnoj RNK. Stoga, RNK i DNK enzimi mogu se napraviti da rascepljuju bilo koji RNK molekul, na taj način uvećavajući stopu degradacije (Cottenet al.(1989)EMBOJ.,8:861-6; and, Usmanet al.(1996)Curr. Opin. Struct. Biol.,1:527-33). Hammerhead ribozimi se takođe rutinski koriste u regulaciji gena (Lvngstadaas (2001)Crit. Rev. Oral Biol. Med.,12:469-78).
U preferiranim aspektima pronalaska, ciljane ćelije mogu se specifično transformisati pomoću nukleinske kiseline koja prigušuje transkripciju, poput shRNK ili siRNK, ili se mogu transformisati pomoću vektora koji kodiraju takve nukleinske kiseline tako da ćelija eksprimira inhibitorske molekule nukleinske kiseline. Transformacija ćelija se može sprovesti na bilo koji način koji je pogodan u ovoj oblasti, uključujući one opisane i navedene kao primer u ovom dokumentu.
Mamac oligonukleotidi su takođe pogodni za eksprimiranje gena koji kodiraju endosijalin. Nedavna klinička ispitivanja testirala su sposobnost mamac oligonukleotida da odvajaju patogene proteine. Mamac oligonukleotidi generalno sadrže element za pojačavanje koji može da prodire u ćelije, a kada se nađu unutar njih, mamac oligonukleotidi vezuju se za proteine koji vezuju DNK specifične za sekvencu i ometaju transkripciju (Fichouet al.( 2006) Trends Biotechnol,24:563-70; Nakamuraet al.
(2002)In Vivo,16:45-8; Tomitaet al.(1997)Exp. Nephrol,5:429-34).
Genetska regulacija eksprimiranja endosijalina može se takođe ostvariti nokdaunom gena koji kodira endosijalin. Kao što će potvrditi osobe stručne u ovoj oblasti, sekvenca gena endosijalina (iz bilo kog organizma od interesa), na primer, SEQ ID NO: 1,3, ili 5, može se koristiti za generisanje molekula nukleinske kiseline i vektore za eksprimiranje nokdauna gena endosijalina. Razmatrajući ih u smislu njihovih sekvenci, molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju regulatorne, a naročito inhibitorne sekvence izvedene iz SEQ ID NO: 1, 3, i 5, obuhvataju alelske varijante, homologe i prirodne mutante SEQ ID NO: 1, 3, i 5. Pošto se očekuje da takve varijante i homolozi poseduju određene razlike u sekvenci nukleotida, ovaj pronalazak pruža izolovane polinukleotide koji imaju najmanje oko 60%, po mogućstvu najmanje oko 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69% ili 70%, još poželjnije najmanje oko 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%. 78%, 79%, ili 80%, još poželjnije 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, i još poželjnije 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, i najpoželjnije 96%, 97%), 98%) i 99% ili više identičnosti sa bilo kojom nokdaun nukleinskom kiselinom izvedenom iz SEQ ID NO: 1, 3, ili 5. Zbog prirodne varijacije sekvenci koja verovatno postoji među genima koji kodiraju te regulatorne sekvence u različitim organizmima, osoba stručna u ovoj oblasti bi očekivala da otkrije ovaj nivo varijacije, pritom i dalje održavajući jedinstvena svojstva nokdaun polinukleotida. Prema tome, takve varijante i homolozi se smatraju suštinski istim jedne drugima i obuhvaćene su obimom ovog pronalaska.
Molekuli nokdaun nukleinske kiseline mogu se pripremiti dvema opštim metodama: (1) mogu biti sintetizovani iz odgovarajućih nukleotidnih trifosfata, ili (2) mogu biti izolovani iz bioloških izvora. Obe metode koriste protokole koji su dobro poznati u ovoj oblasti.
Dostupnost informacija sekvence nukleotida, poput cele sekvence nukleinske kiseline endosijalina, na primer, SEQ ID NOs: 1, 3, i 5, omogućava pripremu molekula izolovane nukleinske kiseline pronalaska putem sinteze oligonukleotida. Sintetički oligonukleotidi mogu se pripremiti metodom fosforamadita koja se koristi u Applied Biosvstems 38A DNA Svnthesizer ili sličnim uređajima. Rezultirajuća konstrukcija može se purifikovati u skladu sa metodama poznatim u ovoj oblasti, kao što je tečna hromatografija visokih performansi (HPLC). Sintetički DNK molekul izgrađen na takav način može se klonirati i pojačati u odgovarajućem vektoru.
Nokdaun nukleinske kiseline mogu se održavati kao DNK u bilo kom pogodnom vektoru za kloniranje. U nekim preferiranim aspektima, klonovi se održavaju u vektoru koji klonira/eksprimira plazmid, a bilo koji se može umnožavati u odgovarajućoj prokariotskoj ili eukariotskoj ćeliji domaćinu.
Molekuli nokdaun nukleinske kiseline obuhvataju kDNK, genomsku DNK, RNK i fragmente istih, koji mogu biti jednolančani, dvolančani, ili čak i trolančani. Stoga, ovaj pronalazak obezbeđuje oligonukleotide („sense" ili „antisense" lanci DNK ili RNK) sa sekvencama koje su u stanju da se hibridiziraju sa najmanje jednom sekvencom molekula nukleinske kiseline ovog pronalaska, naročito SEQ ID NO: 1, 3, ili 5. Takvi oligonukleotidi su korisni kao sonde za detektovanje gena koji kodiraju endosijalin, ili za pozitivno ili negativno regulisanje ekspresije gena koji kodiraju endosijalin tokom ili pre translacije mRNK u protein. Metode u kojima oligonukleotidi ili polinukleotidi mogu da se koriste kao sonde za takve testove obuhvataju, ali bez ograničenja: (1)in situhibridizaciju; (2) Southern hibridizaciju (3) severnu hibridizaciju; i (4) reakcije razvrstane amplifikacije kao što su lančane reakcije polimeraze (PCR) i lančane reakcije ligaze (LCR).
Takođe istaknuti u skladu sa ovim pronalaskom su vektori i kompleti za proizvodnju transgenih ćelija domaćina koje čine polinukleotid koji kodira regulatornu sekvencu za inhibiranje eksprimiranja endosijalina, ili homologa, analoga ili varijante istih u „sense" ili „antisense" orijentaciji, ili konstrukcije pod kontrolom ćelije ili promotera koji su specifični za tkiva i/ili drugih regulatornih sekvenci. Takvi vektori su pogodni za modulaciju, i po mogućstvu inhibiranje eksprimiranja endosijalina.
Odgovarajuće ćelije domaćina obuhvataju, ali bez ograničenja, biljne ćelije, bakterijske ćelije, ćelije kvasca i drugih gljiva, ćelije insekata i ćelije sisara koje eksprimiraju endosijalin. Ove ćelije se
mogu neoplastično transformisati. Poželjnije su ljudske ćelije.
Vektori za transformisanje širokog spektra ovih ćelija domaćina dobro su poznati osobama stručnim u ovoj oblasti. Tu spadaju, bez ograničenja, plazmidi, fagmidi, kozmidi, bakulovirusi, bakmidi, bakterijski veštački hromozomi (BAC), veštački hromozomi kvasca (YAC), kao i drugi vektori bakterija, kvasca i virusa.
Regija za kodiranje regulatorne sekvence može se smestiti pod snažni konstitutivni promoter, kao što su promoteri za sledeće gene: hipoksantin fosforibozil transferaza (HPRT), adenozin deaminaza, piruvat kinaza, beta-aktin, humani miozin, humani hemoglobin, humani mišićni kreatin, i drugi. Pored toga, mnogi virusni promoteri funkcionišu konstitutivno u eukariotskim ćelijama i pogodne su za upotrebu u ovom pronalasku. Takvi virusni promoteri obuhvataju, bez ograničenja, citomegalovirus (CMV) trenutni rani promoter, rane i kasne promotere SV40, promoter tumora mlečne žlezde kod miševa (MMTV), duga terminalna ponavljanja (LTR) Melonijevog virusa leukemije, virus humane imunodeficijencije (HTV), Epštajn-Barov virus (EBV), Rous sarkoma virus (RSV), i ostale retroviruse, i promoter timidin kinaze virusa herpes simplex. Drugi promoteri su poznati osobama koje su stručne u ovoj oblasti. U jednom obliku, regija za kodiranje regulatorne sekvence je stavljena pod promoter koji se može indukovati, kao što je metalotioneinski promoter, promoter koji se može indukovati pomoću tetraciklina, promoter koji se može indukovati pomoću doksiciklina, promoteri koji sadrže jedan ili više elemenata reakcije stimulisanih interferonom (ISRE), kao što su protein kinaza R 2',5'-oligoadenilat sintetaze, Mx geni, ADAR1, i slično. Ostali pogodni promoteri koji se mogu indukovati biće poznati osobama koje su stručne u ovoj oblasti.
Nokdaun vektori se mogu koristiti za transformisanje raznih ćelija koje eksprimiraju endosijalin sa regulatornim sekvencama nukleinske kiseline. Poznate su razne tehnike u ovoj oblasti za uvođenje stranih gena u ćelije i mogu se koristiti za izgradnju rekombinantnih ćelija, u skladu sa raznim oblicima pronalaska. Iskorišćena tehnika trebalo bi da obezbedi stabilan prenos sekvence heterološkog gena do ćelije domaćina, tako da potomstvo ćelije može da nasledi i eksprimira sekvencu heterološkog gena, i tako da neophodne razvojne i fiziološke funkcije ćelija primalaca ne budu poremećene. Tehnike koje se mogu iskoristiti obuhvataju, bez ograničenja, transfer hromozoma (ćelijska fuzija, prenos gena posredstvom hromozoma, prenos gena posredstvom inikro ćelije), fizičke metode( npr.transfekciju, fuziju sferoplasta, mikroinjektiranje, elektroporaciju, nosioca lipozoma), prenos virusnog vektora( npr.rekombinantnih DNK virusa, rekombinantnih RNK virusa) i slično (opisano u Cline (1985)Pharmac. Ther.,29:69-92).
Nokdaun ćelije sa inhibiranim eksprimiranjem endosijalina mogu se napraviti inhibiranjem translacije mRNK koja kodira transportni protein pomoću „post-transkripcijskog prigušivanja gena". Gen iz vrste koja je ciljana za smanjenje, ili fragment istog, može se koristiti za kontrolu proizvodnje kodiranog proteina. „Antisense" molekuli pune dužine mogu se koristiti u tu svrhu. Takođe se mogu koristiti antisense oligonukleotidi ciljani za posebne regije mRNK koje su kritične za translaciju. „Antisense" molekuli se mogu obezbeditiin situtransformisanjem ćelija pomoću DNK konstrukcije koja, nakon transkripcije, proizvodi „antisense" RNK sekvence. Takve konstrukcije se mogu napraviti da proizvode „antisense" sekvence pune ili delimične dužine. Ovaj efekat prigušivanja gena može se pojačati transgenom prekomernom proizvodnjom kako „sense", tako i „antisense" RNK sekvence koja kodira gen, tako da se proizvodi velika količina dsRNK (na primer, videti Waterhouseeta/.(1998)Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.,95:13959- 64). Po tom pitanju, utvrđeno je da su sekvence koje sadrže dsRNK koje odgovaraju delu ili ćelom najmanje jednom intronu, naročito delotvorne. U jednom obliku, deo ili ceo „antisense" lanac sekvence za kodiranje je eksprimovan transgenom. U drugom obliku, hibridizirajući „sense" i „antisense" lanci dela ili cele sekvence za kodiranje za jedan endosijalin su transgeno eksprimirani.
Ćelije koje mogu da budu ciljane, ili na neki drugi način iskorišćene u pronalasku, obuhvataju ćelije koje prirodno eksprimiraju endosijalin ili ćelije kod kojih je izvršena transfekcija pomoću rekombinantnog plazmida koji eksprimira endosijalin. Primarne ćelije pronalaska koje eksprimiraju endosijalin mogu se izolovati iz tkiva ili kupiti od prodavača koji prodaju endotelne ćelije, kao što su, bez ograničenja, HUVEC ili HMVEC, kao i primarni i kultivisani fibroblasti. Transfektirane ćelije pronalaska obuhvataju bilo koju poznatu liniju eksprimiranja ćelija insekata, na primer, ćelijeSpodoptera frugiperda.Linije eksprimiranja ćelija takođe mogu da budu linije ćelija kvasca, poput, na primer, ćelijeSaccharomyces cerevisiaeiSchizosaccharomyces pombe.Ćelije za eksprimiranje takođe mogu biti ćelije sisara, na primer jajne ćelije kineskog hrčka, ćelije bubrega bebe hrčka, humana embrionska linija bubrega 293, normalne linije psećih ćelija bubrega, normalne linije mačjih ćelija bubrega, ćelije bubrega kod majmuna, ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna, COS ćelije, i ne-tumorigenetičke ćelije mišjeg mioblasta G8, linije ćelija fibroblasta, linije ćelija mijeloma, mišje NIH/3T3 ćelije, LMTK ćelije, mišje Sertolijeve ćelije, ćelije karcinoma grlića materice kod ljudi, ćelije jetre „bufalo" pacova, ćelije ljudskih pluća, ćelije ljudske jetre, ćelije tumora mlečne žlezde kod miševa, TRI ćelije, MRC 5 ćelije, i FS4 ćelije.
Inhibiranje eksprimiranja endosijalina inhibira interakciju endosijalina sa bilo kojim ligandom endosijalina. Ligandi endosijalina obuhvataju vanćelijske matrične proteine, poput fibronektina i kolagena.
Takođe su navedene metode za inhibiranje interakcije endosijalina eksprimiranog ćelijom koja eksprimira endosijalin pomoću liganda endosijalina koji čini blokiranje ili sprečavanje eksprimiranja od strane ćelije. Stoga, na primer, fizička barijera služi za inhibiranje, sprečavanje ili drugačije onemogućavanje interakcije eksprimiranog endosijalina pomoću liganda endosijalina. Bilo koja hemikalija ili biomolekul može da posluži za ometanje ove interakcije. Na primer, mali molekuli, polipeptidi, antitela i antigen-vezujući fragmenti istih koji se specifično vezuju za endosijalin, ili alternativno, specifično vezuju za ligand endosijalina, mogu se iskoristiti u ovim metodama.
U nekim preferiranim oblicima, inhibiranje interakcije ćelije koja eksprimira endosijalin pomoću liganda za endosijalin predstavlja inhibiranje vezivanja liganda endosijalina za eksprimirani endosijalin. Na primer, interakcija između endosijalina i njegovog liganda je onemogućena, blokirana, ometana ili na neki drugi način sprečena molekularnom barijerom. Na taj način, pristup liganda ćeliji je onemogućen, inhibiran, blokiran, ometan ili sprečen. Ometanje endosijalina može se dogoditi na bilo koji način pogodan u ovoj oblasti, na primer pomoću hemikalije ili biomolekula.
Na primer, pogodne hemikalije obuhvataju, bez ograničenja, strukture aminokiselina, steroide, cikline, antracene, teške metale, hinolone, terpene, fenole, glikozide, alkiloide, lipide, itd. ili mešavine istih koje mogu da ispolje biološko dejstvo na ćelije koje eksprimiraju endosijalin. Hemikalije se mogu generisati hernijskom sintezom ili izvesti iz biokataliza ili bioloških fluida. Hemikalije se mogu dobiti iz izvora poput ljudi, neljudskih sisara, biljaka, kvasaca, gljiva i/ili prokariotskih izvora.
Konkurentni inhibitori inhibiraju interkciju endosijalina ili ćelije koja eksprimira endosijalin pomoću liganda za endosijalin. „Konkurentni inhibitor" se nadmeće sa Ugandom za mesto vezivanja za endosijalin. Konkurentni inhibitori su ligandi endosijalina, na primer, kolagen (npr.kolagen I ili IV) ili fibronektin, ili fragmenti istog koji vezuju endosijalin. Konkurentni inhibitori takođe obuhvataju 70 kDa N-terminalni fragment fibronektina, 45 kDa fragment fibronektina za izgradnju želatina, i 30 kDa fragment za vezivanje fibronektina.
U visoko preferiranim oblicima, antitela ili antigen-vezujući fragmenti ovog pronalaska koriste se za ometanje interakcije eksprimovanog endosijalina pomoću liganda endosijalina. Antitela ili antigen-vezujući fragmenti mogu biti specifični za epitop na endosijalinu ili za epitop na Ugandu endosijalina. Poželjnija su antitela i antigen-vezujući fragmenti istih, koja su specifična za endosijalin. Antitela liganda, poput fibronektina, kolagena i slično, su komercijalno dostupna.
Odgovarajuća antitela mogu biti poliklonska ili monoklonska, ili mogu biti derivati ili fragmenti antitela koja zadržavaju specifičnost za endosijalin ili ligand endosijalina. Antitela mogu da budu od bilo kojih pet klasa antitela,tj.IgA, IgD, IgE, IgG i IgM izotipi. Odgovarajuća antitela takođe obuhvataju IgY izotop koji se generalno nalazi u serumu kokoške ili ćurke i žumancu jajeta kokoške ili ćurke.
Derivati antitela i antigen-vezujući fragmenti su pogodni za upotrebu u ovom pronalasku i takvi derivati čine delove netaknutih antitela koja zadržavaju specifičnost vezivanja antigena molekula roditeljskog antitela. Na primer, derivati mogu da sačinjavaju najmanje jednu varijabilnu regiju
(varijabilnu regiju teškog ili lakog lanca). Primeri odgovarajućih derivata i fragmenata antitela obuhvataju, bez ograničenja, antitela sa poliepitopskom specifičnošću, bispecifičnim antitelima, diatela (diabodies), i jednolančane molekule, kao i Fab, F(ab')2, Fd, Fabc, i Fv molekule, jednolančana (Sc) antitela, lake lance pojedinačnih antitela, himerične fuzije između lanaca antitela i ostalih molekula, monomere i dimere teških lanaca, monomere i dimere lakih lanaca, dimere koji se sastoje od jednog teškog i jednog lakog lanca, i slično. Izotopi svih antitela mogu se koristiti za proizvodnju derivata i fragmenata antitela. Derivati i fragmenti antitela mogu se rekombinantno proizvoditi.
Antitela pogodna za upotrebu u ovom pronalasku mogu se izvesti iz bilo koje vrste. Na primer, antitela mogu biti mišja, pasovska, kozja, konjska, svinjska, goveđa, pileća, zečija, magareća, ljudska, i slično. Za upotrebu u metodama tretmana, ili za primenu kod ljudi, nehumana izvedena antitela mogu se strukturalno izmeniti da budu manje antigenetska nakon primene na ljudskog pacijenta.
Stoga, u nekim oblicima pronalaska, antitela koja se koriste su himerična antitela. Himerična antitela i metode za njihovu proizvodnju su dobro poznata i uspostavljena u ovoj oblasti. Na primer, himerično antitelo može da čini domen vezivanja mišjeg antigena za humani Fc ili neki drugi slični strukturalni domen.
U nekim oblicima, antitela su humanizovana antitela. Humanizovana antitela mogu da budu himerični imunoglobulini, lanci imunoglobulina ili fragmenti istih (poput Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ili druge potsekvence antitela koje vezuju antigene) koje sadrže minimalnu sekvencu izvedenu iz neljudskog imunoglobulina. Humanizovana antitela su većinom humani imunoglobulini (prijemno antitelo) u kom se ostaci iz regije koja određuje komplementarnost (CDR) primaoca zamenjuju ostacima iz CDR neljudskih vrsta (antitelo donor), poput miša, pacova ili zeca, koji imaju željenu specifičnost, afinitet i kapacitet. U nekim slučajevima, ostaci regije Fv okvira (FWR) humanog imunoglobulina zamenjuju se odgovarajućim neljudskim ostacima. Stavišc, humanizovana antitela mogu da čine ostatke koji sc nc nalaze ni u prijemnom antitelu, niti u uvedenom CDR ili sekvencama okvira. Ove modifikacije se vrše kako bi se učinak antitela dodatno oplemenio i optimizovao. Uopšteno, humanizovano antitelo će suštinski činiti ceo najmanje jedan, a tipično dva, promenljiva domena, u kojima sve ili suštinski sve CDR regije odgovaraju istim kod neljudskog imunoglobulina i sve ili suštinski sve FWR regije predstavljaju iste u sekvenci humanog imunoglobulina. Humanizovano antitelo će optimalno takođe činiti najmanje jedan deo regije imunoglobulinske konstante (Fc), tipično od humanog imunoglobulina. Za više detalja, videti Joneset al.(1986)Nature,321:522-5; Reichmannel al.(1988)Nature,332:323-9; i Presta (1992)Curr. Op. Struct. Biol,2:593-6.
Kod preferiranih aspekata ovog pronalaska, antitela su potpuno humana. To znači daje antitelo u potpunosti ljudskog porekla, ili se u suprotnom sastoji od sekvence aminokiseline koja je identična
humanom obliku antitela.
Antitela ovog pronalaska mogu se označiti ili na neki drugi način konjugirati do raznih delova hemikalija ili biomolekula, na primer za terapeutske ili dijagnostičke primene. Delovi molekula mogu biti citotoksični, na primer, bakterijski toksini, virusni toksini, radioizotopi, i slično. Delovi molekula mogu biti uočljive oznake, na primer, fluorescentne oznake, radio-oznake, biotin, i slično. Dodatni delovi molekula obuhvataju, ali bez ograničenja, glikozijaciju, acetilaciju, pegilaciju, fosforilaciju i amidaciju. Antitela koja su korisna u ovom pronalasku mogu i sama biti izvedena pomoću poznatih grupa za zaštitu/blokiranje, proteolitičkog rascepljivanja, povezivanja sa ćelijskim Ugandom ili drugim proteinima, i slično.
Osobe koje su stručne u ovoj oblasti će prepoznati da se specifičnost antitela prevashodno određuje pomoću šest CDR regija, naročito H lanac CDR3 (Kalaet al.(2002)J. Biochem.,132:535-41; Moreaet al.(1998)J. Mol. Biol,275:269-94; i, Chothiaet al.(1987)J. Mol. Biol,196:901- 17). Regije okvira antitela, međutim, mogu da igraju ulogu u interakcijama između antigena i antitela (Pankaet al.(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA,85:3080-4), naročito po pitanju njihove uloge u konformaciji CDR petlji (Footeet al.(1992)J. Mol. Biol,224:487-99). Stoga, antitela pogodna za upotrebu u inventivnim metodama mogu da sačinjavaju bilo koju kombinaciju H (teškog) ili L (lakog) lanca CDR ili FWR regija koje dodeljuju specifičnost antitela za endosijalin ili Ugande endosijalina.
Ćelije koje proizvode antitela koja se mogu koristiti u skladu sa pronalaskom smeštene su u Amer. Type Cult. Coll. (10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209) 11. marta 2008. godine i dodeljen im je Pristupni br. PTA-9017.
Podrazumeva se da, zbog varijacije prirodne sekvence koja verovatno postoji između teškog i lakog lanca i gena koji ih kodiraju, osoba koja je stručna u ovoj oblasti bi očekivala da otkrije neki nivo varijacije u okviru sekvenci aminokiselina ili gena koji ih kodiraju, pritom održavajući jedinstvena vezivna svojstva (npr.specifičnosti afinitet) antitela ovog pronalaska. Takvo očekivanje je delimično pripisivo usled degenerisanosti genetičkog koda, kao i usled poznatog evolucionarnog uspeha varijacija sekvenci konzervativnih aminokiselina, koje ne menjaju prirodu kodiranog proteina na primetan način. Prema tome, takve varijante i homolozi se smatraju suštinski istim jedne drugima i obuhvaćene su obimom ovog pronalaska.
Varijante koje imaju jednu ili više izmena, brisanja, dodavanja ili zamena aminokiselina koje zadržavaju biološka svojstva( npr.afinitet ka vezivanju ili aktivnost imunog efektora) antitela opisanih u ovom dokumentu, razmatraju se za upotrebu u ovom pronalasku. Stručna osoba može da proizvede varijante koje imaju jednu ili više izmena, brisanja, dodavanja ili zamena aminokiselina. Te varijante mogu da obuhvataju, na primer: (a) varijante u kojim su jedan ili više ostataka aminokiselina zamenjeni konzervativnim ili nekonzervativnim aminokiselinama, (b) varijante u kojima je jedna ili više aminokiselina dodata ili izbrisana iz polipeptida, (c) varijante u kojim jedna ili više aminokiselina obuhvata grupu supstituenata, i (d) varijante u kojima je polipeptid spojen sa nekim drugim peptidom ili polipcptidom, poput fuzijskog partnera, proteinske oznake ili nekog drugog hemijskog dela, koji može da sadrži korisna svojstva za polipeptid, poput, na primer, epitopa za antitelo, polihistidinske sekvence, biotinskog dela molekula i slično. Antitela ovog pronalaska mogu da obuhvataju varijante u kojima se ostaci aminokiselina iz jedne vrste zamenjuju odgovarajućim ostatkom u drugoj vrsti, bilo u očuvanom ili neočuvanom položaju. U drugim oblicima, ostaci aminokiselina u neočuvanim položajima zamenjuju se konzervativnim i nekonzervativnim ostacima. Tehnike za dobijanje ovih varijanti, uključujući genetičke (potiskivanja, brisanja, mutacije,Ud.),hemijske i enzimske tehnike, poznate su osobama prosečne stručnosti u ovoj oblasti.
Ovaj pronalazak razmatra antitela ili antigen-vezujuće fragmente istih sa sekvencama aminokiselina koje su suštinski iste kao prethodno opisane sekvence aminokiselina. Antitela M4 (koje proizvode ćelije sa ATCC pristupom br. PTA - 9017 pronalaska) i M4.1 su humanizovana antitela za humani endosijalin. Dok antitela M4 i M4.1 dele sekvencu lakog lanca, razlikuju se u teškom lancu za jednu sekvencu aminokiseline prikazanu, na primer, pri ostatku 429 od SEQ ID NO:20 u vezi sa ostatkom 429 od SEQ ID NO:24. Ovaj pronalazak dalje razmatra antitela, ili antigen-vezujuće fragmente istih, koji su u igri za vezivanje za endosijalin pomoću antitela M4 ili M4.1. Ovaj pronalazak dalje razmatra antitela, ili antigen-vezujuće fragmente istih, koji vezuju isti epitop endosijalina kao antitelo M4iliM4.1.
Antitela pogodna za upotrebu u ovom pronalasku mogu da imaju afinitete prema vezivanju za ciljni antigen, poput endosijalina ili liganda endosijalina, koji obuhvataju konstantu disocijacije (Kd) od manje od 1 x 10"<2>M. U nekim oblicima, Kuje manja od 1 x 10"<3>M. U drugim oblicima, Kd je manja od 1 x IO"<4>M. U nekim oblicima, Koje manja od 1 x 10"<5>M. U drugim oblicima, Koje manja od 1 x IO"<6>M. U drugim oblicima, Koje manja od 1 x IO"<7>M. U drugim oblicima, Koje manja od 1 x 10"<8>M. U drugim oblicima, Koje manja od 1 x IO"<9>M. U drugim oblicima, Koje manja od 1 x 10"<10>M. U drugim oblicima, Koje manja od 1 x 10"<11>M. U nekim oblicima, Kuje manja od 1 x 10"<12>M. U drugim oblicima, KD je manja od 1 x 10"<13>M. U drugim oblicima, KD je manja od 1 x IO"<14>M. U drugim oblicima, KD je manja od 1 x 10"15M.
Specifičnost i/ili afinitet antitela koja se vezuju za endosijalin može se opciono optimizovati usmerenom evolucijom ćelija koje proizvode to antitelo, upotrebom dominantnog negativnog alela neuparenog gena za popravku, poput PMS1, PMS2, PMS2-134, PMSR2, PMSR3, MLH1, MLH2, MLH3, MLH4, MLH5, MLH6, PMSL9, MSH1, i MSH2, uvedenog u ćelije koje proizvode antitelo. Ćelije koje sadrže dominantni negativni mutant će postati hiperpromenljive i akumulirane mutacije pri većoj stopi od kontrolnih ćelija nad kojima nije izvršena transfekcija. Skup mutirajućih ćelija može se proveriti za prisustvo klonova koji proizvode veći afinitet/specifičnost antitela ili vezivnih proteina, ili koji jednostavno rastu brže i bolje pod određenim uslovima. Tehnika za generisanje hiperpromenljivih ćelija pomoću dominantnih negativnih alela neuparenih gena za popravku opisana je u patentu SAD br. 6,146,894. Popravka neslaganja se takođe može inhibirati pomoću hemijskih inhibitora popravke neslaganja, koji su opisani u WO 02/054856. Tehnika za poboljšanje antitela pomoću dominantnih negativnih alela neuparenih gena za popravku ili hemijskih inhibitora popravke neslaganja mogu se primeniti na ćelije za eksprimiranje kod sisara, kvasca, biljaka ili na prokariotske ćelije koje takođe eksprimiraju klonirane gene imunoglobulina ili proteina. Ćelije koje eksprimiraju dominantne negativne alele ili male molekule mogu se „izlečiti" tako što se dominantni negativni alel može isključiti, ukoliko je inducibilan, eliminisan iz ćelije, dok se mala hemikalija može ukloniti iz kulture rasta, rezultat čega su ćelije koje su još jednom genetički stabilne i više ne akumuliraju mutacije po abnormalno visokoj stopi.
Inhibiranje eksprimiranja endosijalina inhibira interakciju endosijalina sa bilo kojim ligandom endosijalina. Ligandi endosijalina obuhvataju vanćelijske matrične proteine, poput fibronektina i kolagena. Bilo koji podtip kolagena može da posluži kao ligand za endosijalin. Kolagen I i Kolagen IV su poželjniji.
Inhibiranje interakcije endosijalina sa ligandima endosijalina inhibira puteve i kaskade koje su povećane ili na neki drugi način aktivirane kao rezultat ove interakcije. Na primer, interakcija endosijalina sa ligandima endosijalina može da promoviše eksprimiranje i/ili aktiviranje molekula za povezivanje, kao što su integrini, koji posreduju u vezivanju ćelija za vanćelijsku matricu ili druge ćelije, i koji posreduju kod signalnih puteva ćelija, između ostalog.
Integrini pretežno postoje kao heterodimeri koji sadrže dva izrazita lanca, a (alfa) i P (beta) podjedinicu. Ima otprilike 18ai 8 P podjedinica koje su karakterisane. Pored toga, izvestan broj podjedinica integrina postoji u vidu varijanti putem diferencijalnog splajsovanja. Razne kombinacije alfa i beta integrina rezultira u više od 24 jedinstvena aktivna kompleksa integrina (Hynes (2002)Cell,110:673). Podjedinice integrina prodiru u membranu plazme, i uopšteno sadrže kratke citoplazmične domene od oko 40 do 70 aminokiselina. Van membrane ćelijske plazme, alfa i beta lanci se nalaze blizu jedni drugima u dužini od oko 23 nm. Amino-termini svakog lanca integrina nalaze se jedan uz drugi sa udaljenošću od 5 nm između njih, kako bi formirali regiju za vezivanje liganda za interakciju EMP. Integrini se kategorišu pomoću nekoliko kriterijuma. Alfa lanci su klasifikovani kao takvi jer podskup a lanaca ima strukturne elemente umetnute blizu amino-terminusa pod nazivom alfa-A domen, jer ima sličan strukturni motiv kao A-domeni u okviru von Willebrand faktora. Integrini koji nose ovaj domen mogu ili da se vežu za kolagene (kompleksi integrina alpl i a2pl), ili da deluju kao molekuli za vezivanje ćelije sa velijom sa onim kompleksima koji sadrže integrine P2 porodice. Dve glavne funkcije integrina su vezivanje ćelije za vanćelijske matrične proteine i signalna transdukcija posredovanjem vezivanja integrina EMP za ćeliju. Pored toga, integrini takođe učestvuju u mnogim drugim biološkim aktivnostima, uključujući vezivanje virusa, poput adenovirusa, eho (ECHO) virusa, Hantavirusa, virusa oboljenja stopala i usta, kao i vezivanje za ćelije koje učestvuju u kontroli imunog sistema i kontaktu ćelija-ćelija za ćelijsku migraciju. Integrini uparuju EMP (što zavisi od kompleksa integrina) sa citoskeletom u okviru ćelije. Utvrđeno je nekoliko liganda integrina. Učestaliji ligandi su fibronektin, vitronektin, kolagen i laminin. Interakcije između integrina, EMP i mikrofilamenata unutar ćelije povezane su preko konstrukcijskih proteina, u koje spadaju talin, paksilin i alfa-aktinin. Ove interakcije utiču na regulisanje kinaza poput FAK (kinaza fokalne adhezije) i Src članova porodice kinaze do fosforilat supstrata poput pl30CAS, na taj način regrutujući signalne adaptere poput Crk u svrhe posredovanja kod ćelijskih reakcija, uključujući aktiviranje puteva, proliferaciju i/ili opstanak ćelija. Svaka od ovih funkcija povezanih sa integrinima može se sklopiti kao test posmatranja za praćenje aktivnosti integrina, kao funkcije aktivnosti endosijalina za testove radi utvrđivanja farmakoloških agenasa ili efikasnih molekula koji ciljaju endosijalin. Staviše, ciljanje integrina sa farmakološkim agensima za endosijalin u ćelijama koje eksprimiraju endosijalin, ima širok spektar prilika za potiskivanje virusne infekcije dobijene posredstvom integrina, i druge patološke bolesti.
Stoga, inhibiranje interakcije endosijalina sa Ugandom endosijalina inhibira eksprimiranje i/ili aktiviranje molekula integrina na ćeliji koja eksprimira endosijalin. U nekim poželjnim oblicima, eksprimiranje ili aktiviranje integrina pi, P2, ili P3 se potiskuje inhibiranjem.
Ostali molekuli i putevi, čije je eksprimiranje i/ili aktiviranje pod uticajem inhibiranja interakcije endosijalina sa ligandima endosijalina, obuhvataju matrične metaloproteinaze (MMP). MMP su proteaze koje zavise od cinka, koje igraju ulogu u, između ostalog, degradaciji vanćelijskih matričnih proteina, receptora na površini ćelije i slično. MMP igraju ulogu u ćelijskoj migraciji, proliferaciji i angiogenezi, između ostalog. MMP porodica enzima ima zajednički motiv vezivanja cinka (HExxHxxGxxH) u okviru svoje aktivne lokacije, i očuvani metionin koji prati aktivnu lokaciju. MMP se klasifikuju prema međusobnoj homologiji, specifičnosti supstrata i delimično prema njihovoj ćelijskoj lokalizaciji. Uopšteno se dele na 4 klase: kolagenaze, stromelizine, želatinaze i MMP membranskog tipa (MT- MMP). MMP tipa kolagenaze su sposobni za degradaciju trostruko spiralnih vlaknastih kolagena u izrazite fragmente. Ovi kolageni su značajne komponente kostiju i hrskavice, a ova klasa MMP predstavlja jedine poznate enzime kod sisara koji su sposobni za njihovo degradiranje. Obuhvataju MMP-1 (međuprostornu kolagenazu); MMP-8 (neutrofilna kolagenaza); MMP-13 (kolagenaza 3); i MMP-18. Enzimi MMP tipa stromelizina ispoljavaju široku sposobnost za rasecanje EMP-a ali nisu u stanju da raseku trostruko spiralne vlaknaste kolagene. Ova klasa obuhvata MMP-3 (Stromelizin 1); MMP-10 (Stromelizin 2); MMP-11 (Stromelizin 3); MMP-12 (Makrofag metaloelastaza); MMP-19 (PvASI-1, koji se takođe naziva stromelizin-4); i MMP- 20 (enamelizin); MMP-22 (C-MMP) i MMP-27. MMP tipa želatinaze degradiraju uglavnom kolagen IV tipa i želatin, i odlikuju se prisustvom dodatnog domena umetnutog u katalitički domen. Ova regija koja vezuje želatin nalazi se odmah ispred motiva za vezivanje cinka, i formira posebnu jedinicu za savijanje koja ne remeti strukturu katalitičkog domena. Ova klasa obuhvata MMP-2 (72 kDa želatinaza, želatinaza-A); MMP-9 (92 kDa želatinaza, želatinaza-B). Na kraju, MMP vezani membranom su oni koji su vezani za spoljašnju ćelijsku membranu. Tu spadaju: Red transmembranskog cisteina II tipa MMP-23; MMP 17 i 25 povezani sa glikozil fosfatidilinositolom (MT4-MMP i MT6-MMP, tim redosledom); i transmembranski MMP 14, 15, 16, 24 I tipa (MT1-MMP, MT2-MMP, MT3-MMP, i MT5-MMP, tim redosledom). Svi ovi MMP imaju lokaciju rasecanja furina u pro-peptidu, što je karakteristika koju takođe deli MMP-11.
Stoga, inhibiranje interakcije endosijalina sa ligandom endosijalina inhibira eksprimiranje i/ili aktiviranje MMP-a na ćeliji koja eksprimira endosijalin. Eksprimiranje ili aktiviranje MMP-1, MMP-2, MMP-8, MMP-9, MMP-12, MMP-13, ili MMP-18 može biti potisnuto inhibiranjem.
Bez želje za vezivanjem za bilo koju određenu teoriju ili mehanizam rada, smatra se da endosijalin funksioniše direktno ili indirektno u angiogenezi, naročito po pitanju neovaskularizacije i bolesti poput raka. Stoga, smatra se da ometanje vezivanja endosijalina ili ćelija koje eksprimiraju endosijalin za ligande endosijalina, ili ometanje aktiviranja integrina posredstvom endosijalina, eksprimiranja MMP-a i/ili ćelijsku proliferaciju/preživljavanje može da potisne vaskularizaciju povezanu sa neovaskularnom bolešću.
U skladu sa tim, takođe su navedene metode za inhibiranje angiogeneze. Ova metoda se može sprovestiin vitroiliin vivo.Metode za inhibiranje angiogeneze mogu da se sastoje od primene terapeutski delotvorne količine neke smeše na ispitaniku, koja ometa endosijalin eksprimiran na površini neke ćelije, pri čemu navedena opstrukcija inhibira interakciju navedene ćelije sa nekim ligandom endosijalina, i pri čemu inhibiranje navedene interakcije navedene ćelije sa navedenim ligandom inhibira angiogenezu tkiva, organa ili neoplazme u ispitaniku.
Metode za inhibiranje angiogeneze takođe mogu da obuhvataju ostvarivanje kontakta ćelije, ćelijske kulture, tkiva ili organa sa nekom smešom koja ometa endosijalin eksprimiran na površini neke ćelije, pri čemu navedena opstrukcija inhibira interakciju navedene ćelije sa nekim ligandom endosijalina, i pri čemu inhibiranje navedene interakcije navedene ćelije sa navedenim ligandom inhibira
angiogenezu od strane navedene ćelije, ćelijske kulture, tkiva ili organa.
Smeša može da se sastoji od najmanje jednog konkurentnog inhibitora opisanog u ovom dokumentu. U nekim oblicima, konkurentni inhibitori su ligandi endosijalina, na primer, kolagena, fibronektina, ili fragmenata istih koji vezuju endosijalin. Poželjni konkurentni inhibitori su fragmenti kolagena I, kolagena IV, ili fibronektina. Najpoželjniji konkurentni inhibitori su 70 kDa N-terminalni fragment fibronektina, 45 kDa fragment fibronektina koji vezuje želatin, i 30 kDa fragment fibronektina koji vezuje heparin.
Smeša se sastoji od najmanje jednog antitela koje se posebno vezuje za endosijalin. Takva antitela po mogućstvu imaju afinitet prema endosijalinu koji je manji od oko 1 x 10"7 M, još poželjnije manje od oko 1 x IO"8 M, još poželjnije manje od oko 1 x IO"9 M, i još poželjnije manje od oko 1 x 10"<In>M. Antitela koja se posebno vezuju za endosijalin mogu da obuhvataju ona antitela čije su karakteristike opisane i navedene kao primer u ovom dokumentu. Ćelije koje proizvode antitela koje se mogu koristiti u skladu sa ovim pronalaskom su smeštene kod Amer. Type Cult. Coll. (10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209) 11. marta 2008. godine i dodeljen im je Pristupni br. PTA-9017. Antitela mogu biti poliklonska, monoklonska, antigen-vezujući fragmenti, himerična, humanizovana, potpuno humana, i slično, kao što je opisano u ovom dokumentu.
Inhibiranje eksprimiranja endosijalina inhibira interakciju endosijalina sa bilo kojim ligandom endosijalina. Ligandi endosijalina obuhvataju vanćelijske matrične proteine, poput fibronektina i kolagena.
Takođe su navedene metode za inhibiranje neovaskularizacije. Ova metoda se može sprovestiin vitroiliin vivo.Metode za inhibiranje neovaskularizacije obuhvataju primene terapeutski delotvorne količine neke smeše na ispitaniku, koja ometa endosijalin eksprimiran na površini neke ćelije, pri čemu navedena opstrukcija inhibira interakciju navedene ćelije sa nekim ligandom endosijalina, i pri čemu inhibiranje navedene interakcije navedene ćelije sa navedenim ligandom inhibira neovaskularizaciju tkiva, organa ili neoplazme u ispitaniku.
Metode za inhibiranje neovaskularizacije mogu da obuhvataju ostvarivanje kontakta ćelije, ćelijske kulture, tkiva ili organa sa smešom koja ometa endosijalin eksprimiran na površini neke ćelije, pri čemu navedena opstrukcija inhibira interakciju navedene ćelije sa ligandom endosijalina,
i pri čemu inhibiranje navedene interakcije navedene ćelije sa navedenim ligandom inhibira neovaskularizaciju navedene ćelije, ćelijske kulture, tkiva ili organa.
Smeša se sastoji od najmanje jednog konkurentnog inhibitora koji je opisan u ovom dokumentu. Konkurentni inhibitori mogu biti ligandi endosijalina, na primer, kolagen, fibronektin ili fragmenti istih koji vezuju endosijalin. Poželjni konkurentni inhibitori su fragmenti kolagena I, kolagena IV, ili fibronektina. Najpoželjniji konkurentni inliibitori su 70 kDa N-tcrminalni fragment fibronektina, 45 kDa fragment fibronektina koji vezuje želatin, i 30 kDa fragment fibronektina koji vezuje heparin.
U poželjnim oblicima, smeša se sastoji od najmanje jednog antitela koje se posebno vezuje za endosijalin. Takva antitela po mogućstvu imaju afinitet prema endosijalinu koji je manji od oko 1 x 10"<7>M, još poželjnije manje od oko 1 x IO"<8>M, još poželjnije manje od oko 1 x IO"<9>M, i još poželjnije manje od oko 1 x 10"<10>M. Antitela koja se posebno vezuju za endosijalin mogu da obuhvataju ona antitela čije su karakteristike opisane i navedene kao primer u ovom dokumentu. Ćelije koje proizvode antitela koja se mogu koristiti u skladu sa pronalaskom smeštene su u Amer. Type Cult. Coll. (10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209) 11. marta 2008. godine i dodeljen im je Pristupni br. PTA-9017. Antitela mogu biti poliklonska, monoklonska, antigen-vezujući fragmenti, himerična, humanizovana, potpuno humana, i slično, kao što je opisano u ovom dokumentu.
Inhibiranje eksprimiranja endosijalina inhibira interakciju endosijalina sa bilo kojim ligandom endosijalina. Ligandi endosijalina obuhvataju vanćelijske matrične proteine poput fibronektina, na primer, humani fibronektin (SEQ ID NO:35) i kolagen.
Da bi pronalazak bio spremnije shvaćen i istom dato praktično dejstvo, sada će biti navedeni jedan ili više primera, u kojima je barem deo navoda opisan iz eksperimentalnog rada u razvoju ovog pronalaska.
Bilo koji primer opisan ispod koji ne spada u obim patentnih zahteva je dat samo kao pozadinska informacija.
Primer 1:Imunohistohemijska analiza eksprimiranja endosijalina na tumorskom tkivu
Upotreba antitela za detektovanje ćelija koje eksprimiraju endosijalin je prikazana putem imunohistohemije tumorskih tkiva. Antiendosijalin ili normalno IgG antitelo je primenjeno na sveže zamrznuta ljudska tkiva sa kolorektalnim karcinomom u dve koncentracije (0,5 p.g/ml i 2,5 ug/ml). Fosfatom puferisan fiziološki rastvor [PBS (0,15M NaCl, pH 7,2)] + 1% goveđi serumski albumin su služili kao rastvarač za primarna antitela. Tkiva su umetnuta u Tissue-Tek® O.C.T. medijum, zamrznuta na suvom ledu i čuvana u plastičnim kesama na temperaturi ispod -70°C. Tkiva su segmentirana na približno 5 um i fiksirana tokom 10 minuta u acetonu sobne temperature. Preparati su čuvani na temperaturi ispod -70°C do dobijanja boje. Neposredno pre dobijanja boje, preparati su fiksirani tokom 10 sekundi u 10% neutralnom puferisanom formalinu.
Kriostatom zamrznuti isečci su dva puta isprani fosfatom puferisanim fiziološkim rastvorom (PBS [0,15M NaCl, pH 7,2]). Endogene peroksidaze su blokirane inkubacijom preparata u rastvoru peroksidaze iz Dako En Vision™ kompleta tokom 5 minuta i ispiranjem dva puta u PBS (0,15M NaCl, pH 7,2). Zatim, preparati su tretirani blokadom proteina projektovanom da smanji nespecifično vezivanje tokom 20 minuta. Blokada proteina je pripremljena na sledeći način: PBS (0,15M NaCl, pH 7,2); 0,5% kazein; 1 % goveđi serumski albumin (BSA); i 1,5% normalnog kozjeg seruma. Nakon blokade proteina, primarno antitelo (test artikal M4, negativno kontrolno antitelo, ili nijedno [sam pufer kao kontrola testa]) jc primcnjcno na sobnoj temperaturi tokom jednog sata. Zatim, preparati su dva puta isprani sa PBS-om (0,15M NaCl, pH 7,2), tretiran peroksidaze-obeleženim kozjim anti-IgG polimerom iz Dako EnVision™ kompleta tokom 30 minuta (EnVision™ polimer je korišćen u koncentraciji dostavljenoj od proizvođača), ispran dva puta sa PBS-om (0,15M NaCl, pH 7,2), i tretiran rastvorom supstrata i hromogena (DAB) iz Dako EnVision™ kompletom tokom 8 minuta. Svi preparati su isprani vodom, kontraobojeni hematoksilinom, dehidriram i pokriveni staklom radi tumačenja rezultata. Kao što se vidi iz slika, krvni sudovi u tumoru (Slika 1A) su prebojeni pozitivno za endosijalin dok je serijski isečak prebojen izotopskim kontrolnim antitelom bio negativan (Slika 1B).
Primer 2: Imunohistohemijska analiza eksprimiranja endosijalina na zdravom tkivu
Upotreba antitela za detektovanje ćelija koje eksprimiraju endosijalin je prikazana putem imunohistohemije normalnih tkiva. Ukratko, uzorci normalnog tkiva su segmentirani kriostatom i analizirani za eksprimiranje endosijalina kao što je opisano gore. Normalna tkiva su sadržala vrlo malo ćelija nalik na fibroblaste i dendrite koje su eksprimirale endosijalin iako ne jednako snažno ili homogeno kao što se videlo kod tumorom zahvaćenih krvnih sudova (Slika 2A i B). Ove ćelije su korisne za izučavanje efekata neovaskularizacije i mogu se izolovati za ekspresiju gena u cilju izučavanja profila rasta ćelija, njihovog diferenciranja, migracije ili identifikacije „genetskih potpisa". Mogu se izučavatiin vivo, ex vivoiliin vitrokorišćenjem metoda koje su poznate stručnjacima kao i onih koje su navedene u daljem tekstu.
Primer 3: Izolovanje i obogaćivanje ćelija koje eksprimiraju endosijalin
Kako bi pokazali da proteini koji mogu da vežu endosijalin služe kao efikasan način obogaćivanja ćelija nalik na endotelne i fibroblaste koje eksprimiraju endosijalin, humane mikrovaskularne endotelne ćelije (HMVEC) su izdvojene koristeći antitelo koje može da veže endosijalin u cilju izolovanja obogaćene populacije ćelija koje eksprimiraju endosijalin iz početne količine sa 5-10% ćelija koje eksprimiraju endosijalin. Sa željom da ne bude ograničen metodom ili specifičnim reagensima navedenim ispod, ovaj primer demonstrira upotrebu endosijalinskih antitela koja mogu da izoluju ćelije koje eksprimiraju endosijalin.
Ukratko, mikrotitarske ploče sa 96 čašica su obložene u sterilnim uslovima sa kozjim anti-humanim IgG Fcy. Zatim, 20Lig/ml humanog anti-endosijalinskog antitela M4 je dodato na ploče dok su tri čašice (A, B, C) kao kontrole bez antitela, i inkubirane tokom 1 sata na 4°C. HMVEC ćelije su prikupljene sa kultura od 10 cm iz Petrijeve posude sa DPBS/EDTA umesto tripsina kako bi se izbeglo oštećenje ćelijskih membrana, čime endosijalin proteini na površini ćelije ostaju netaknuti. Grupisane ćelije su stavljene u čašice u dve različite koncentracije, bilo kao 100.000 ćelija/čašici ili 50.000 ćelija/čašici u mikrotitarskim pločama sa 96 čašica nakon aspiracije i ispiranja svih nevezanih anti-endosijalnskih antitela. Ćelije su inkubirane u čašicama tokom jednog sata na 4°C. Čašice su zatim oprane sa DPBS/FBS četiri puta (sve dok kontrolne čašice A, B i C nisu više imale ćelije unutar čašice). Čašice sa 50.000 ćelija/čašici su pokazale jako mali broj ćelija dok su čašice sa 100.000 ćelija/čašici sadržale značajan broj ćelija pričvršćen za ploču. Ćelije su zatim inkubirane tokom tri dana u odgovarajućem medijumu za rast. Kontrolne B i C čašice su izabrane iz ploča sa 100.000 ćelija/čašici za imunobojenje. Boja Kalcein, AM je korišćena da oboji ćelije zbog vizualizacije pomoću Nikon® Eclipse TS 100 fluorescentnog mikroskopa. Pozitivne izdvojene kulture su proširene za rast i dalju analizu homogenog eksprimiranja endosijalina kao što je opisano u daljem tekstu.
Radi daljeg određivanja sposobnosti izolovanja ćelija koje eksprimiraju endosijalin, HMVEC ćelije sa izdvojenim anti-endosijalinskim antitelom i neizdvojene HMVEC kulture su pripremljene za imunobojenje pomoću fluorescentnog anti-endosijalinskog antitela ili fluorescentnog a-pi-integrin antitela kao kontrole. Kao što je očekivano, više od 90% ćelija je bilo pozitivno obojeno za a-pl-integrin kod izdvojenih i neizdvojenih kultura (nije prikazano), dok je više od 90% ćelija bilo pozitivno obojeno za endosijalin kod izdvojenih kultura dok je samo 5-7% ćelija bilo pozitivno obojeno za endosijalin kod neizdvojenih HMVEC kultura. Ovi podaci pokazuju mogućnost da se izoluju i obogate vitalne ćelije koje eksprimiraju endosijalin pomoću proteina koji vezuju endosijalin kao što su antitela.
Kao što je prikazano na Slici 3, izdvojena kultura je imala mnogo veći broj endosijalin-pozitivnih ćelija u poređenju sa neizdvojenom roditeljskom kulturom putem imunobojenja sa anti-endosijalinskim antitelom, a zatim sa fluorescentnim konjugovanim sekundarnim antitelom. Broj ćelija svakog polja određenje svetlosnom mikroskopijom.
Primer 4:Interakcija endosijalina sa vanćelijskim matričnim proteinima
Izgradnja TEMI i Fc- TEM- 1 ekspresije plazmida.PCR je korišćen da pojača DNK fragment koji predstavlja aminokiseline 1-685 TEMI otvorenog okvira čitanja (GenBank # AF279142) od LA1-5S genomske DNK. Rezultujući amplikoni su pocepani pomoćuEcoRIi Xbal i ligiran u pEF6-V5-HisA (Invitrogen). Za generisanje Fc-TEM-1, vanćelijski region TEMI je spojen sa monomerskim mišjim IgG2b FcYdomenom i ligiran u derivativni pEF6-EK-Mm-IgG2b-Fcy-ND vektor koji sadrži regiju prepoznavanja enterokinaze (DDDD) praćen modifikovanim mišjim IgG2b FcT(karika putem CH3) domenom. Kako bi sc sprečila dimerizacija, četiri zaostala traga cisterina odgovorna za vezivanje disulfida unutar teškog lanca su promenjeni u serin. Rezultujući monomerski, izlučeni fuzioni protein se sastoji od TEM 1 vanćelijskog domena pune dužine i mišjeg IgG2b Fcy. Integritet svih plazmidnih sekvenci je potvrđen pomoću Beckman® DTCS hemijskog kompleta (Beckman Coulter, Fullerton, CA). Sirovi podaci su dobij eni pomoću CEQ 8000 DNK sekvencerom i analizirani VectorNTI® softverom (Invitrogen).
Purifikacija Fc- TEM- 1.CHO-TEMl-Fcy ćelije su kultivisane na 25 L skali u IS-CHO-CD medijumu (Irvine Scientific, Santa Ana, CA), dopunjene 2 mM L-glutaminom, IX Penicilinom/Streptomicinom, 6 g/L hidrolizatom soje i 2,2 g/L natrijum bikarbonata (Irvine Scientific), na Wave20/50EH platformi sa Cellbag50® (GE Healthcare, Piscataway, NJ), sve dok vitalnost kulture nije dostigla 50-70%. Kondicionirani vanćelijski medijum je pročišćen pomoću Flexstand® stacionarnog pilot sistema šupljeg vlakna (GE Healthcare) sa 0,2 um koturom šupljeg vlakna (GE Healthcare) sve dok nije ostalo 0,5 L kulture u prijemnoj posudi. U ovom trenutku, koncentrovana ćelijska masa je oprana sa 4 L fosfatom puferisanim fiziološkim rastvorom (PBS, 20mM K fosfat, 150 mM NaCl pH 7,2), kako bi se povratila preostala vanćelijska tečnost. Rezultat pranja sa 4 L je spojen sa pročišćenim sirovim materijalom. Medijum za pročišćenu kulturu je zatim koncentrovan dvanaestostruko (29 L do 2,5 L); pomoću Prep/Scale® spiralnog namotaja, kompleta kotura za ultrafiltraciju od 2,5 ft<2>lOOk, u Prep/Scale® držaču (Millipore, Billerica, MA), i pomoću peristaltičke pumpe dovođen u stanje ulaznog pritiska od 20 PSI, i stopom recirkulacije od približno 400 ml/min. Rezultujući koncentrovani sirov materijal je filterski sterilizovan pomoću filtera sa bocom na vrhu koji ima membranu od 0,2 um (Nalgene). TEM 1 -Fcy je uhvaćen pomoću hromatografij e sa afinitetom prema proteinu A, u koloni od 10x100 mm ProSep-vA® (Millipore), i eluiran dodavanjem zapremine elucionog pufera za 5 kolona (100 mM citrat/10 mM acetat pH 3,0). Eluirani materijal je dijalizovan u odnosu na pufer QA (20 mM Tris-Cl pH 8,0), i dodatno prečišćen hromatografij om sa razmenom jona preko 5 ml HiTrap® Q-FF kolona (GE Healthcare). Vezani proteini su oprani pomoću 15% pufera QB (20 mM Tris-Cl, 1 M NaCl pH 8,0), praćenog eluiranjem vezanog Fc-TEM-1 pomoću 35% pufera QB. Eluirani proteini su koncentrovani pomoću ultra-filtracije u Modelu 8400 modula za ultra-filtraciju sa pozitivnim pritiskom (Millipore) opremljenog 100 kDa MWCO membranom (Millipore), do konačne zapremine od oko 5 ml. Koncentrovani Fc-TEM-1 je purifikovan hromatografij om ekskluzije pripremne veličine na Sephacrvl® S- 300HR 26 x 60 kolona (GE Healthcare), uravnotežen pomoću PBS. Frakcije koje sadrže purifikovani Fc-TEM-1 su grupisane, koncentrovane do nominalnog obima između 0,1-1 mg/ml pomoću ultra-filtracija pomoću 100 kDa MWCO membrane i smeštene u alikvotovima za jednokratnu upotrebu na-80°C.
Purifikovani Fc-TEM-1 (2,9 ug) je napunjen na 4-12% Bis-Tris gel (Invitrogen, Inc.), i izvršena je elektroforena u MOPS Running puferu (50 mM MOPS, 50 mM Tris, 3,5 mM SDS, 1 mM EDTA pH 7,7), u trajanju od 40 minuta. Za bojenje, gel je fiksiran u trajanju od 15 minuta u rastvoru za fiksiranje
(50% metanol, 10% sirćetna kiselina), opran dva puta u trajanju od 10 minuta u dejonizovanoj vodi, i bojen najmanje u trajanju od sat vremena pomoću GelCode Blue koloidalne Coomassie Blue (kumasi plave) boje (Pierce). Boja se skinuta sa gela ponovljenim pranjem dejonizovanom vodom.
Prethodno obložene fibronektinom (FN), Kolagenom I (Col I), Kolagenom IV (Col IV), Lamininom (LN) (BD Biosciences, San Diego CA), Vitronektinom (VN), ili želatinom (Gel) (Chemicon Inti.) mikrotitarske ploče sa 96 čašica korišćene su za ispitivanje vezivanja Fc-TEM-1. Vezivanje TEMI sa Col I, Col IV, i FN nije usledilo zbog zagađivača u tragovima u purufikovanom proteinu iz ljudske plazme, jer ni Col I niti Col IV nisu otkriveni u FN pomoću anti-Col antitela ELISA, niti je otkriven FN u Col (podaci nisu prikazani). Sve ploče su blokirane puferom za testiranje (0,5% BSA, 0,5% Tween-20 u PBS) u trajanju od 2h pre dodavanja Fc-TEM-1 fuzijskog proteina, rastvorivog endosijalina generisanog fuzijom N-tenTiinalne glavne sekvence i celog vanćelijskog domena endosijalina do mišjeg gama teškog lanca. Nakon inkubacije na sobnoj temperaturi, ploče su oprane, a HRP kozje anti-humano IgG (H+L) antitelo (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA) dodavano je u trajanju od 1 h. Razvijanje boja je ispitano pomoću SureBlue™ TMB supstrata peroksidaze (KPL, Gaithersburg, MD). I BSA i humano izotopsko kontrolno antitelo korišćeni su kao negativne kontrole. Fc-TEM-1 nije vezao BSA, niti je humani izotop vezao bilo koji ECM protein (podaci nisu prikazani).
Kao što je prikazano na Slici 4A, Fc-TEMl vezan za fibronektin i kolagen I i IV na način koji zavisi od doze, dok nikakvo vezivanje nije zapaženo u okviru čitavog opsega doziranja do LN ili VN. Interesantno je da, dok je Fc-TEMl vezivao kolagen, nikakvo vezivanje za želatin (kolagen denaturisan toplotom) nije uočeno. Nijedan od četiri testirana mišja izotopa IgG antitela nije mogao da se veže za bilo koji ECM protein, isključujući mogućnost da su interakcije vršene posredstvom mišje Fc kičme Fc-TEMl fuzijskog proteina (podaci nisu prikazani). Fuzijski protein koji sadrži mišji gama teški lanac i samo lektinski domen endosijalina takođe vezuje FN (podaci nisu prikazani).
Da bi se potvrdila selektivnost interakcije Fc-TEMl i ECM proteina, Fc-TEMl je nanesen na ELISA ploče obložene različitim purifikovanim proteinima. ELISA testovi specifični za antigene su sprovedeni oblaganjem TP Immunomini ELISA ploča pomoću 1 iig/ml STEB (Staphvlococcus enterotoxin B vakcina), 2 ug/ml goveđi gamma globulin, 2 ug/ml 90 kD glikoproteinskog antigena povezanog sa tumorom, eksprimiranog na većini ćelija melanoma (TA90), 2 iig/ml lizozim jajeta kokoške, 1:500 rastvor tetanus toksoida, 1% BSA, 0,2 iig/ml humani mezotelin, 2 ug/ml ovalbumin (OVA), 1 iig/ml humani GM-CSF, 2 ug/ml kozji IgG, 2 ug/ml mišji IgG rastvoren u bikarbonatnom puferu za oblaganje (pH 9,6) (Sigma) preko noći na 4°C. Ploče su oprane tri puta puferom za pranje (koji sadrži 0,5% TWEEN-20) blokiranim pomoću lx pufera za testiranje u trajanju od 2 sata na sobnoj temperaturi i ELISA test je sprvoveden na način koji je prethodno opisan. Kao što je prikazano na Slici 4B, Fc-TEMl nije se vezao ni za jedan testirani protein osim za anti-miš Fc koje je korišćeno kao pozivitno kontrolno antitelo.
Primer 5: Inhibiranje TEMI vezivanja za fibronektin ljudske plazme
Mikrotitatske ploče sa 96 čašica su prethodno obložene Fibronektinom (FN), i ispitana je sposobnost anti-TEM-1 antitela da blokiraju adheziju posredstvom Fc-TEM-1 putem ELISA testa. Ukratko, ploča obložena FN-om je blokirana puferom za testiranje (0,5% BSA, 0,5% Tween-20 u PBS) u trajanju od 2 h pre dodavanja fuzijskih proteina. Fc-TEM-1 je preinkubiran u trajanju od 1 h na 4°C sa antitelima M4 (humanizovano antiendosijalinsko entitelo opisano kao ESI u SAD Pat. publikaciji br. 20060239911), humanim izotopom (HulgG), ili anti-TEM-1 antitelom uzgajanim u zečevima (RbtTEMl). M4 se ne vezuje za homologe endosijalina različitih vrsta, uz izuzetak neljudskih primata. Vezivni epitop za M4 je mapiran na vanćelijski lektinski domen endosijalina. Kompleks proteina/antitela je dodat ploči obloženoj pomoću FN i dopušteno je da se vrši prianjanje u trajanju od 1 h na sobnoj temperaturi, u koje vreme su ploče oprane, a HRP kozje anti-humano IgG (H+L) antitelo (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA) dodavano u trajanju od 1 h. Razvijanje boja je ispitano pomoću SureBlue™ TMB supstrata peroksidaze (KPL, Gaithersburg, MD). Kao što je prikazano na Slici 6, M4 je potisnuo vezivanje Fc-TEMl za fibronektin, pri čemu nespecifična kontrola (HulgG) nije potisnula vezivanje. RbtTEMl takođe je potisnuo vezivanje Fc-TEMl za fibronektin (podaci nisu prikazani).
Primer 6: Endosijalin posreduje kod vezivanja za fibronektin
Generisane su CHO-TEM1 ćelije koje stabilno eksprimiraju endosijalin (verifikovano od strane FACS sa M4 antitelom; podaci nisu prikazani). CHO-K1 ćelije su održavane u RPMI dopunjenim L-glutaminom, 1% minimalnim esencijalnim aminokiselinama, natrijum piruvatom, neesencijalnim aminokiselinama, i 10% FBS deaktiviranim toplotom (Invitrogen, Carlsbad, CA). Izvršena je elektroporeza CHO-K1 ćelija (3E6) (ATCC, Manassas, VA) pomoću 10 ug linearizovane plazmidne DNK u laboratorij skoj posudi za elektroporaciju od 0,4 mm. Puls od 170 V/1000 uF j e isporučen pomoću GENE PULSER (BioRad, Hercules, CA). Dopušteno je da se elektroporirane ćelije oporave u trajanju od 24 sata, nakon čega su izabrani klonovi otporni na blasticidin (5 iig/ml). Eksprimiranje endosijalina je verifikovano pomoću FACS, a ćelije su razvrstane radi visokog eksprimiranja.
Ćelije (l,5xl0<5>ćelija/čašici) su oprane i suspendovane u PBS koji sadrži Mg<2+>/Ca<2+>, i četvorostruko dodate mikrotitarskoj ploči sa 96 čašica obloženoj fibronektinom i dozvoljeno je da se vezuju u trajanju od 1 h. Onde gde je to naznačeno, ćelije su prethodno inkubirane pomoću antitela (100Ug/ml) M4 ili humanog izotopa (IgG) u trajanju od 1 h pre početka testiranja. Nakon što je dopušteno da se ćelije pričvrste, ploča je oprana 5 puta pomoću PBS-a i održivost je merena pomoću CellTiter-
Glo® (Promega, Madison, WI). Slika 9B pokazuje da preterano eksprimiranje endosijalina izaziva povećano vezivanje ćelija za fibronektin, koje se može blokirati inhibitorima endosijalina, poput antitela M4, za razliku od kontrola, poput nespecifičnog IgG.
Primer 7: Vezivanje endosijalina za fibronektin i fragmente fibronektina
Fibronektin je veliki kompleksni glikoprotein koji postoji kao dimer kovalentno povezan preko mosta disulfida kod C-terminusa proteina (Ruoslahtiet al.(1981)J. Biol. Chem.,256:7277-7281; Wicrzbicka-Patynowski & Schwarzbaucr (2003) J.Cell Sci.,116:3269-3276; Magnusson & Moshcr
(1998)Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 18:1363-1370).Postoje izveštaji da su fragmenti fibronektina, koji su ili izvedeni iz enzimske degradacije ili alternativnog splajsovanja, povezani sa određenim stanjima bolesti i poseduju istaknute biološke funkcije (Magnusson & Mosher (1998)Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol,18:1363-1370; Labat-Robert (2002)Semin. Cancer Biol,12:187-195; Homandberg (1999)Front Bioscl,4:D713-730).
Ispitana je sposobnost Fc-TEM-1 da se vezuje za različite fragmente fibronektina. Ekvimolarne količine proteina su rastvorene u puferu za oblaganje (50 mM karbonat-bikarbonat, pH 9,4), dodate na ELISA ploču (Greiner Bio-one, Monroe, NC) i inkubirane preko noći na 4°C. Sve ploče su blokirane puferom za testiranje (0,5% BSA, 0,5% Tween-20 u PBS) u trajanju od 2h pre dodavanja Fc-TEM-1. Nakon inkubacije na sobnoj temperaturi, ploče su oprane, a HRP kozje anti-humano IgG (H+L) antitelo (Jackson Tmmunoresearch Laboratories, West Grove, PA) dodavano je u trajanju od 1 h. Razvijanje boja je ispitano pomoću SureBlue™ TMB supstrata peroksidaze (KPL, Gaithersburg, MD). Da bi se ispitao integritet obloženih proteina fibronektina, zečje poliklonsko antitelo usmereno nasuprot fibronektinu (FN Ab) korišćeno je da se detektuje da su svi fragmenti FN prepoznatljivi i da su ujednačeno obloženo.
Fibronektin pune dužine purifikovan ljudskom plazmom i proteini 120 kDa vezivanja ćelija FN fragmenata kupljeni su od Chemicon Inti. (Temucula, CA), proteliotski fragmenti 30 kDa, 45 kDa, 70 kDa od Sigma (St. Louis, MO), a fragmenti rekombinantnog humanog fibronektina 2 i 4 (FN2 i FN4, tim redosledom) od R&D Svstems (Minneapolis, MN).
Kao što je prikazano na Slici 7A, Fc-TEMl vezuje amino terminalni 70 kDa fragment FN i proizvode njegovod proteliotskog rascepljivanja (fragmenti 45 kDa i 30 kDa). Stepen vezivanja varirao je među različitim fragmentima i bio je manji od onog viđenog sa celim FN. Suprotno od toga, Fc-TEMl nije vezivao 120 kDa FN fragment ili rekombinantne fragmente Fn2 ili Fn4. Malo je verovatno daje ovaj nedostatak vezivanja usledio usled neujednačenog oblaganja ili degradacije, jer su svi FN fragmenti snažno detektovani pomoću anti-FN poliklonskog antitela. Ovo je dokaz da se FN domen koji učestvuje u interakciji sa endosijalinom nalazi u okviru 70 kDa amino terminalnog dela. Da bi se odredilo da li umanjeni kapacitet vezivanja nakon daljeg cepanja 70 kDa fragmenta ukazuje na to da se Fc-TEMl vezuje za regiju koja se nalazi u blizini mesta proteolitičkog rascepljivanja ili da TEMI prepoznaje konformaciono zavisne epitope u okviru amino terminusa FN koji je promenjen nakon daljeg cepanja, ispitana je sposobnost Fc-TEMl da vezuje redukovane oblike FN proteina. Dokje anti-FN antitelo bilo u stanju da prepozna redukovani FN, čime se ukazuje na ekvivalentno oblaganje, vezivanje Fc-TEMl potpuno je odstranjeno, kao stoje prikazano na Slici 7B. Slično ćelom FN, anti-endosijalinsko antitelo M4 blokiralo je vezivanje Fc-TEMl za 70 kDa fragment na način koji zavisi od doze (Slika 7C), dok izotopsko kontrolno antitelo nije imalo nikakvog dejstva (Slika 7D). Ovi rezultati ukazuju na to da Fc-TEMl prepoznaje konformaciono zavisne epitope koji se nalaze u okviru amino terminusa FN koji se može oslabiti nakon dalje proteolitičke degradacije.
Primer 8: Vezivanje fibronektina na površini ćelije sa endosijalinom
Generisane su CHO-TEM1 ćelije koje stabilno eksprimiraju endosijalin (verifikovano od strane FACS sa M4 antitelom; podaci nisu prikazani). CHO-K1 ćelije su održavane u RPMI dopunjenim L-glutaminom, 1% minimalnim esencijalnim aminokiselinama, natrijum piruvatom, neesencijalnim aminokiselinama, i 10% FBS deaktiviranim toplotom (Invitrogen, Carlsbad, CA). Izvršena je elektroporeza CHO-K1 ćelija (3E6) (ATCC, Manassas, VA) pomoću 10 ug linearizovane plazmidne DNK u laboratorijskoj posudi za elektroporaciju od 0,4 mm. Puls od 170 V/1000 uF je isporučen pomoću GENE PULSER (BioRad, Hercules, CA). Dopušteno je da se elektroporirane ćelije oporave u trajanju od 24 sata, nakon čega su izabrani klonovi otporni na blasticidin (5 ug/ml). Eksprimiranje endosijalina je verifikovano pomoću FACS, a ćelije su razvrstane radi visokog eksprimiranja.
Nivo FN na površini ćelije jc ispitan pomoću protočne citometrije u roditeljskim CHO-K1 i CHO-TEM1 ćelijama korišćenjem poliklonskog anti-FN antitela. Ćelije su prikupljene u puferu za odvajanje ćelija (Invitrogen, Carlsbad, CA), oprane i ponovo suspendovane u ledeno hladnom PBS + 1% FBS. Ćelije su inkubirane u trajanju od 1 sata na ledu sa primarnim antitelom M4 (10 ug/ml), oprane i inkubirane pomoću FITC-konjugovanog kozjeg anti-humanog sekundarnog antitela (Southern Biotech, Birmingham, AL) i analizirane na EASYCYTE protočnom citometru (Guava Technologies, Hayward, CA). Konstantno su uočavani 15-20% veći nivoi površinskog FN u CHO-TEM1 ćelijama u poređenju sa CHO-K1 ćelijama (podaci nisu prikazani). Ispitano je vezivanje FN na površini ćelije sa endosijalinom.
Korišćenjem anti-FN antitela, izvršenaje imunoprecipitacija FN kako iz CHO-K1, tako i CHO-TEM1 lizata, praćena tehnikom Vestern blot pomoću istog antitela ili anti-TEMl antitela (M4). Ćelije (10E7) su lizirane u puferu za radioimunoprecipitaciju (RIPA) (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1% NP-40, 0,5% natrijum deoksiholat, 150 mM NaCl, 0,1% natrijum dodecil sulfat [SDS]) dopunjen Complete mini koktelom za inhibiranje protcaze (Rochc Diagnostics, Indianapolis, IN) i centrifugiran na 13.000 rotacija u minutu u trajanju od 15 minuta, kako bi se uklonili ostaci. Protein G Sepharose 6 Fast Flow kuglice (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) oprane su 3 puta pomoću PBS, a anti-FN antitelo (1 ug) je uhvaćeno nežnim ljuljanjem na 4°C. Jednake količine proteina po uzorku su prethodno očišćene dodavanjem nevezanog Proteina G. Nakon inkubacije u trajanju od 2 sata, Protein G jc uklonjen a supernatant je dodat antitelo-Sepharose kompleksu i inkubiran preko noći na 4°C. Nakon temeljnog pranja pomoću RIPA pufera, vezani protein je uklonjen ključanjem u trajanju od 10 minuta u NuPAGE® LDS uzorku pufera (Invitrogen) koji sadrži 5% P-merkaptoetanol. Proteini su odvojeni pomoću elektroforeze SDS-poliakrilamid gela na 4-12% Bis-Tris gelu (Invitrogen) i preneseni na PVDF membranu. Imunoblotiranje je sprovedeno pomoću zečjih poliklonskih antitela koja su specifična za fibronektin (Abeam, Cambridge, MA) ili endosijalin (Morphotek, Inc., Exton, PA), detektovanih pomoću kozjeg anti-zec HRP-konjugovanog antitela, i vizualizovani pomoću SUPERSIGNAL West Pico hemijski luminescentnog supstrata (Pierce, Rockford, IL). Integritet i čistoća rastvorljivog Fc-TEMl takođe su praćene pomoću tehnike Vestern blot. Protein (5 jxg) je kuvan u trajanju od 5 minuta u 4x NUPAGE LDS uzorku pufera (Invitrogen) koji sadrži 5% P-merkaptoetanol, podvrgnut elektroforezi na NUPAGE 4-12% Bis-Tris gelu (Invitrogen), i prenesen na PVDF membranu i sprovedeno je imunoblotiranje, kao što je prethodno opisano.
Ustanovljeno jc da FN može da vrši imunoprecipitaciju endosijalina iz CHO-TEM1 lizata (podaci nisu prikazani). Suprotno od toga, u lizatima ćelija kod kojih je izvršena imunoprecipitacija pomoću normalnog IgG koji nije povukao FN, nije detektovan nikakav endosijalin (podaci nisu prikazani). Najmanje dva različita pristupa (ELISA i koimunoprecipitacija) pružaju jake dokaze interakcije između FN i endosijalina. Slični rezultati su dobijeni pomoću HEK-293T ćelija koje ektopički eksprimiraju endosijalin (podaci nisu prikazani).
Primer 9: Ćelije koje eksprimiraju endosijalin, uzgajane na MATRIGEL- u formiraju strukture
nalik na mrežu
Premda nikakve razlike u rastu ili opstanku nisu uočene između roditeljskih CHO-K1 i CHO-TEM1 čelija kultivisanih na plastičnoj površini, uočena je drastično različita morfologija kada su ove ćelije kultivisane na MATRIGEL-u. Roditeljske CHO-K1 ćelije su urasle u izolovane skupove ćelija sa minimalnim ispupčenjima nakon 2 dana kultivisanja (Slika 8, gornje ploče), dok su CHO- TEMI ćelije urasle u skupove koji obrazuju strukturu nalik mreži (Slika 8, donja leva ploča). Pored toga, CHO-TEM1 ćelije u okviru skupa inhibirale su ispupčenja koja dopiru do drugih skupova (Slika 8, donja desna ploča). Vremenom, CHO-TEM1 ćelije, ali ne i CHO-K1 ćelije pomerale su se bliže jedne drugima kako bi formirale veće skupove (podaci nisu prikazani).
Primer 10: Eksprimiranje endosijalina povećava povezivanje ćelije sa fibronektinom i 70kl) ili
30kDN- terminusom fibronektina
Da bi se ispitalo povezivanje sa FN fragmentima, ekvimolarne količine fragmenata proteina su prethodno obložene preko noći, a zatim blokirane u trajanju od 2 h pomoću PBS-a koji sadrži 10 mg/ml BSA. MATRIGEL je služio kao pozitivna kontrola. CHO-K1 ili CHO-TEM1 ćelije (l,5xl0<5>ćelija/čašici) prikupljene u puferu za odvajanje ćelija oprane su i suspendovane u PBS-u koji sadrži Mg<2+>/Ca<2+>, i četvorostruko dodate ECM Cell Adhesion Array kompletu (Millipore) ili obložene na pojedinačno obloženim FN, LN, Gel, and Col I pločama (BD Biosciences) i dozvoljeno je da se vezuju u trajanju od 1 h. Nakon inkubacije, svaka čašica je oprana 5 puta pomoću PBS-a i održivost je merena pomoću CellTiter- Glo®. Onde gde je to naznačeno, ćelije su prethodno inkubirane pomoću antitela u trajanju od 1 sata pre početka testiranja. Kao što je prikazano na Slici 9A, broj vezanih CHO-TEM1 ćelija bio je šestostruko veći od broja roditeljskih CHO-K1 ćelija u čašicama obloženim FN. Nisu uočene nikakve značajne razlike u vezivanju između CHO-K1 i CHO-TEM1 ćelija za površine obložene lamininom ili vibronektinom, dok je vezivanje na kolagene i tenascin bilo preslabo da bi se procenile ikakve značajne razlike (Slika 9A). Prethodni tretman CHO-TEM1 ćelija pomoću M4 antitela izazvao je 50% smanjenja vezivanja ćelije koje zavisi od TEM1-FN, dok IgG kontrolno antitelo nije imalo nikakvo dejstvo (Slika 9B). Tretman M4 antitelom nije uticao na vezivanje ćelija koje zavisi od FN, a nezavisno je od endosijalina (osnovno vezivanje) roditeljskih CHO-K1 ćelija.
Ploče su prethodno obložene ekvimolarnim količinama celog FN, proleolitskih fragmenata i MATRIGEL-a. CHO-TEM1 ćelije pokazale su trostruko do petostruko uvećano vezivanje za FN, 70 kDa, i 30 kDa fragmente u poređenju sa roditeljskim CHO-K1 ćelijama, a nije uočeno nikakvo značajno vezivanje za 45 kDa ili Fn2 fragmente. CHO-TEM1 ćelije su vezivale MATRIGEL pet puta bolje od CHO-K1 (Slika 9C). Ovi podaci ukazuju na to da endosijalin pojačava vezivanje ćelija za vanćelijske matrice i da amino terminus FN-a učestvuje u ovim interakcijama.
Primer 11: Endosijalin se vezuje za kolagen 1 a M4 inhibira ovo vezivanje
Mikrotitarska ploča sa 96 čašica, prethodno obložena kolagenom I, korišćena je za ispitivanje sposobnosti M4 da blokira vezivanje Fc- TEM-1. Ploča je blokirana puferom za testiranje (0,5% BSA, 0,5% Tween-20 u PBS) u trajanju od 2 h pre dodavanja proteina u naznačenoj koncentraciji (ug/ml). Fc-TEM-1 je prethodno inkubiran u trajanju od 1 h na 4°C pomoću antitela M4 ili humanog izotopa (Human IgG). Kompleks proteina/antitela je zatim dodat ploči obloženoj pomoću Col I i dozvoljeno je da se vezuje u trajaju od 1 h na sobnoj temperaturi, u koje vreme su ploče oprane i HRP kozje anti-humano IgG (H+L) antitelo (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA) je dodavano u trajanju od 1 h. Razvijanje boja je ispitano pomoću SureBlue™ TMB supstrata peroksidaze (KPL, Gaithersburg, MD). Kao što je prikazano na Slici 10, preterano eksprimiranje endosijalina izaziva povećano vezivanje ćelija za COL I, koje se može blokirati inhibitorima endosijalina, poput M4, za razliku od kontrola poput nespecifičnog IgG. RbtTEMl je takođe potisnuo vezivanje Fc-TEMl za Col I (podaci nisu prikazani).
Primer 12: Endosijalin povećava vezivanje ćelije za kolagen
CHO-K1 ili CHO-TEM1 ćelije (l,5x IO<5>ćelija/čašici) su oprane i suspendovane u PBS-u koji sadrži Mg<2+>/Ca<2+>, i četvorostruko dodate mikrotitarskoj ploči sa 96 čašica, obloženoj kolagenom I, i dopušteno je da se vezuju tokom naznačenog vremena. Nakon što je dopušteno da se ćelije vezuju, ploča je oprana 5 puta pomoću PBS-a i merena i održivost pomoću CellTiter-Glo®. Kao što je prikazano na Slici 11, preterano eksprimiranje endosijalina izaziva povećano vezivanje ćelija za COL
I.
Primer 13: Testiranje migracije ćelija
BD BioCoat Tumor Invasion Svstem™ (BD Bioscience) i Human Fibronectin Cell Culture umeci (BD Bioscience) korišćeni su za ispitivanje migracije ćelija posredstvom TEMI. Ćelije su prikupljene pomoću neenzinskog pufera za odvajanje ćelija i razblažene do koncentracije od 4E5 ćelija/ml u medijima za rast pomoću 2% fetalnog goveđeg seruma (FBS), i 500 ul suspenzije ćelije je dodato u gornju komoru membranskog umetka. Da bi se napravio gradijent, mediji rasta koji sadrže 20% FBS su dodati na dno komore. Ćelije su inkubirane u trajanju od 48 sati, nakon čega je umetak uklonjen, a ćelije koje su migrirale kroz obloženu membranu su prebrajane pomoću CELLTITER-GLO (Promega). Ćelije su prethodno tretirane antitelom, kao što je naznačeno u opisu Slike 12, a migracija je ispitana u stalnom prisutvu antitela. Da bi se ispitalo formiranje tubula na MATRIGEL-u, ćelije (8E4 čelija/čašici) su dodate mikrotitarskoj ploči od 96 čašica, obloženoj MATRIGEL-om (BD Bioscience), inkubirane preko noći i fotografisane sa uveličanjem od 200-400x.
Kao što je prikazano na Slici 12A, CHO-K1 ćelije su ispoljile skromnu ćelijsku migraciju, dok su CHO-TEM1 ćelije pokazale više nego desetostruko pojačanu migraciju. Tretman M4 antitelom, ali ne kontrolnim IgG, poništio je migraciju CHO-TEM1 ćelija. Slični rezultati su uočeni u eksperimentima migracije pomoću transwell komora obloženim FN-om (Slika 12B).
Primer 14: Endosijalin uvećava aktivnost MMP- 9
Pokazalo se da se endosijalin, MMP-2 i COL IV kolonizuju u područjima tkiva koja se odlikuju ispupčenjima ranih angiogenetskih procesa nalik na prste (Virgintinoet al.(2007)Angiogenesis,10:35-45). Da bi sc ispitala aktivnost MMP, ćelije su zascjanc na mikrotitarsku ploču sa 6 čašica i uskraćen im je serum u trajanju od 48 sati. Supernatant kulture je prikupljen i izbistren centrifugacijom (13.000 rotacija u minutu, u trajaju od 15 minuta) na 4°C kako bi se uklonili bilo kakvi ostaci. Jednake količine proteina su podvrgnute zimografiji želatina i kaseina u neredukujućim uslovima (Invitrogen), u skladu sa protokolom proizvođača. Pozitivne kontrole humanih MMP-2 i 9 (Chemicon, International) korišćene su da bi se ukazalo na migraciju MMP-2 i MMP-9 i korišćene su kao referenca za naše CHOK1 i CHO-TEM-1 supernatante. Kao što je prikazano na Slici 13, aktivnost MMP-9 je značajno pojačana u CHO-TEM1 ćelijama u poređenju sa roditeljskim CHO-K1 ćelijama. Pojačana aktivnost MMP-9 korelirala je sa povećanom sekrecijom MMP-9 proteina u supernatantu CHO-TEM1 ćelija, kao što jc izmereno pomoću ELISA testa specifičnog za MMP (podaci nisu prikazani). Ovi podaci ukazuju da indukovana sekrecija MMP-9 doprinosi pojačanoj sposobnosti migracije CHO-TEM1 ćelija kroz transwell komore obložene MATRIGEL-om i FN-om koje su opisane u ovom dokumentu.
Primer 15:Endosijalin povećava aktivnost B- integrina
Integrini( npr.a4pi, a5pi) su jasno izraženi receptori koji posreduju kod povezivanja ćelija koje zavisi of FN (Wierzbicka-Patynowski & Schvvarzbauer 2003; Magnusson & Mosher 1998). Pored toga, opisan je neidentifikovani ćelijski receptor koji vezuje N-tenninalnu 70 kDa regiju FN (McKeown-Longo & Mosher (1983)J. Cell. Biol.,97:466-472) i potrebno je da se izloži mesto kriptičkog vezivanja integrina (RGD motiv) rastvorljivog FN koji učestvuje u interakcijama FN-integrin i FN-FN (Tomasini-Johanssonet al.(2006)Matrvc Biol,25:282-293; McKeown-Longo & Mosher (1985)J. Cell Biol, 100:364-374).Endosijalin je identifikovan u ovom dokumentu kao novi receptor koji interaguje sa N-terminalnom 70 kDa FN regijom i pojačava povezivanje ćelija koje zavisi od FN. Pojačano FN vezivanje izmereno u ovim ćelijskim sistemimain vitromoglo bi da bude rezultat sekvencijalne interakcije sa endosijalinom i integrinima.
Izvršenaje transfekcija ćelija humanog embrionskog bubrega 293 (HEK293) pomoću vektora koji eksprimira endosijalin ili probnu kDNK. Potvrđeno je da ćelije eksprimiraju endosijalin na površini ćelija (293TEM1), dok one kod kojih je izvršena transfekcija pomoću probnog (293T) ne eksprimiraju. Zatim je testirana sposobnost ćelija da povećavaju eksprimiranje i aktivnost integrina u prisustvu antitela M4. Slika 14B pokazuje da preterano eksprimiranje endosijalina izaziva povećanu aktivnost integrina pi u odnosu na kontrolne ćelije. Slika 14A pokazuje da eksprimiranje integrina pi na površini ćelije nije promenjeno. Tretman ćelija pomoću inhibitora endosijalina M4 izazvao je potisnutu aktivnost integrina, a nije uočeno nikakvo dejstvo na nivoe površina ćelija (Slika 14B). Iako ne postoji želja za vezivanjem za bilo koju teoriju, interakcija između endosijalina i N-terminalni 70 kDa fragment rastvorivog FN može da bude odgovorna za iniciranje skupljanja FN u multimetrični oblik visokog afiniteta, koji je u stanju da vezuje integrine.
Primer 16:M4. 1 prepoznaje neredukovani humani TEM- 1 ali ne i mišji TEM- 1
CHO-TEM-1 ćelije, mišje 2H11 ćelije, roditeljske CHO-K1 ćelije, mišje NSO ćelije, i mišje MSI ćelije su kultivisane u kompletnom RPMI1640 (RPMI1640; natrijum piruvat; neesencijalne aminokiseline; L-glutamin, i FBS; Invitrogen Corp.). Humani primarni periciti su kultivisani u pericitnom medijumu (500 ml baznog medijuma (Cat# 1201), 10 ml (2%) fetalnog goveđeg seruma (FBS, kat. br. 0025), 5 ml suplementa za rast pericita (PGS, kat. br. 1252) i 5 ml rastvora penicilina/streptomicina (P/S, kat. br. 0503); Invitogen Corp.). Ćelije su uzgajane na 37°C i 5% CO2u inkubatoru sa povećanom vlažnošću. Ćelije su razdvojene pomoću TrvpLE™ Select (Invitrogen Corp., kataloški br. 12563-011), oprane i prebrajane. Ćelije su lizirane na 2 x IO<7>ćelija u RIPA lizis puferu koji sadrži inhibitore proteaze i inkubirane na ledu u trajanju od 10 minuta. Nerastvorljivi materijal je peletiran na 10.000xG u trajanju od 10 minuta na 4°C, a supernatanti su preneseni u nove tube. Alikvotovi su povešani sa jednakom količinom 2X pufera za punjenje proteina sa ili bez 10% 2-merkaptoetanola (agens za redukovanje). 15 uL (1,5 x 10<5>ćelija) lizata je napunjeno u 4-12% Bis/Tris SDS-PAGE gel od 15 čašica i izvršenaje elektroforeza u trajanju od 30 minuta na 200 V u MES radnom puferu. Gel je elektroblotovan na PVDF, zatim blokiran u trajanju od 1 sata na sobnoj temperaturi ljuljanjem u 5% mlečnom-TBST (5% M-TBST). M4.1 blotovi su ispitivani pomoću M4.1 u 5% M-TBST pri 3.3 iig/ml preko noći na 4°C.
Blotovi zečjeg anti-tem-1 poliklonskog antitela su ispitivani pomoću 1:300 rastvora (4,5 mg/ml latera Šarža #: NB487-76) antitela u 5% M-TBST preko noći na 4°C. Antitelo M4.1, poput antitela M4, je humanizovano antitelo za humani endosijalin. Membrane su oprane 5 puta u trajanju od 5 minuta, svaka pomoću 30 ml TBST na sobnoj temperaturi. HRP-konjugovani kozji anti-humani IgG (H+L)
(Jackson Immuno, 1 mg/ml lager) je razblažen 1:20.000 u 5% M-TBST kao sekundarno antitelo za ispitivanje M4.1 blotova u trajanju od 30 minuta na sobnoj temperaturi. HRP-konjugovano kozje anti-zec (H+L) sekundarno antitelo je korišćeno da se blotuju poliklonski anti-TEM-1 blotovi u trajanju od 30 minuta na sobnoj temperaturi. Membrane su oprane 5 puta u trajanju od 5 minuta, svaka pomoću 30 ml TBST na sobnoj temperaturi. Signal je detektovan hemijskom luminescencijom pomoću Femto sistema za detekciju Vestern blota (Picrcc) u skladu sa uputstvom.
Kao što je prikazano na Slici 15, M4.1 prepoznaje neredukovani humani TEM-1 u CHO-TEM-1 ćelijama i humanim primarnim pericitima, ali ne i mišje TEM-1 (SEQ ID NO:2) u mišjim 2H11 ćelijama (Slika 15). Zečji poliklonski nasuprot humanom TEM-1 (rabPAb TEM-1) prepoznaje humani TEM-1 u CHO-TEM-1 ćelijama i humanim pericitima, ali takođe i mišji TEM-1 u mišjim 2H11 ćelijama. Ni M4.1 niti rabPAb TEM-1 nisu reagovali protiv lizata iz roditeljskih CHO-K1 ćelija ili mišjih NS0 i MSI ćelija usled nedostatka eksprimiranja TEM-1 u ovim ćelijama. Samo rabPAb TEM-1 je reagovao sa regukovanim humanim TEM-1, premda u menjoj meri u poređenju sa neredukovanim TEM-1.
Ovaj pronalazak nije ograničen na oblike opisane i navedene kao primer u gornjem tekstu, ali podleže varijacijama i modifikacijama u okviru obima priloženih patentnih zahteva.

Claims (12)

1. Antitelo koje specifično vezuje endosijalin, a proizvode ga ćelije koje imaju ATCC pristupni broj PTA-9017 ili njegov antigen-vezujući fragment.
2. Antitelo ili antigen-vezujući fragment iz patentnog zahteva I sadrži detektabilni marker.
3. Antitelo ili antigen-vezujući fragment iz patentnog zahteva 1 u kojem pomenuti detektabilni marker sadrži fluorescentni marker, radiološki marker ili biotin.
4. Antitelo ili antigen-vezujući fragment iz patentnog zahteva I konjugiran je na citotoksin.
5. Antitelo ili antigen-vezujući fragment iz patentnog zahteva 4 u kojem pomenuti citotoksin sadrži bakterijski toksin, virusni toksin ili radioizotop.
6. Rekombinantna ćelija eksprimira antitelo koje specifično veže endosijalin. a pomenuto antitelo proizvode ćelije koje imaju ATCC pristupni broj PTA-9017 ili njegov antigen-vezujući fragment.
7. Izolovani polinukleotid koji kodira teški lanac i laki lanac antitela ili antigen-vezujući fragment iz patentnog zahteva 1.
8. Preparat za davanje ispitaniku sadrži antitelo ili antigen-vezujući fragment u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva l do 5.
9. Antitelo ili antigen-vezujući fragment u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva I do 5, za upotrebu u medicini, uključujući lečenje i dijagnostiku.
10. Antitelo ili antigen-vezujući fragment u skladu sa patentnim zahtevom 1,4 ili 5, za upotrebu u lečenju karcinoma.
11. Antitelo ili antigen-vezujući fragment za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 10, u kojem pomenuto antitelo ili antigen vezujući fragment inhibira interakciju endosijalina eksprimiranog na površinu ćelije s kolagenom ili fibronektinom.
12. Upotreba antitela ili antigen-vezujući fragmenta iz patentnog zahteva 1,4 ili 5, u kojem pomenuto antitelo ili antigen-vezujući fragment inhibira interakciju endosijalina eksprimiranog na površinu ćelije s kolagenom ili fibronektinom, za proizvodnju medikamenta za upotrebu u lečenju karcinoma kod ispitanika.
RS20161097A 2007-04-05 2008-04-04 Metode za inhibiranje vezivanja endosijalina za ligande RS55447B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US91036207P 2007-04-05 2007-04-05
US98002607P 2007-10-15 2007-10-15
EP13162773.9A EP2620451B1 (en) 2007-04-05 2008-04-04 Methods for inhibiting the binding of endosialin to ligands

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS55447B1 true RS55447B1 (sr) 2017-04-28

Family

ID=39714208

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20161097A RS55447B1 (sr) 2007-04-05 2008-04-04 Metode za inhibiranje vezivanja endosijalina za ligande
RS20140299A RS53362B (sr) 2007-04-05 2008-04-04 Postupak inhibiranja vezivanja endosijalina na ligande

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20140299A RS53362B (sr) 2007-04-05 2008-04-04 Postupak inhibiranja vezivanja endosijalina na ligande

Country Status (20)

Country Link
US (4) US7807382B2 (sr)
EP (2) EP2620451B1 (sr)
JP (2) JP5825784B2 (sr)
KR (1) KR101529334B1 (sr)
CN (1) CN101918446B (sr)
AU (1) AU2008237296B2 (sr)
BR (1) BRPI0809665B8 (sr)
CA (1) CA2682726C (sr)
CY (2) CY1115370T1 (sr)
DK (2) DK2620451T3 (sr)
ES (2) ES2606906T3 (sr)
HR (2) HRP20140266T1 (sr)
HU (1) HUE031269T2 (sr)
LT (1) LT2620451T (sr)
MX (1) MX2009010701A (sr)
PL (2) PL2620451T3 (sr)
PT (2) PT2137217E (sr)
RS (2) RS55447B1 (sr)
SI (2) SI2137217T1 (sr)
WO (1) WO2008124570A1 (sr)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006116451A2 (en) 2005-04-22 2006-11-02 Morphotek, Inc. Antibodies with immune effector activity and that internalize in endosialin-positive cells
CA2682726C (en) 2007-04-05 2017-05-09 Morphotek, Inc. Methods for inhibiting the binding of endosialin to ligands
US8697081B2 (en) * 2008-04-09 2014-04-15 The Regents Of The University Of Michigan Method of modulating neovascularization
WO2010118203A2 (en) * 2009-04-09 2010-10-14 Morphotek, Inc. Endosialin binding molecules
WO2011060233A1 (en) 2009-11-11 2011-05-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Anti-tem1 antibodies and uses thereof
US20130305396A1 (en) 2010-09-29 2013-11-14 Luigi Grasso Engineered human endosialin-expressing rodents
AU2013240281B2 (en) * 2012-03-30 2017-12-21 Eisai R&D Management Co., Ltd. TEM-1 diagnostic antibodies
US9783610B2 (en) * 2012-04-27 2017-10-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Anti-tumor endothelial marker-1 (TEM1) antibody variants and uses thereof
WO2014164544A1 (en) 2013-03-09 2014-10-09 Baylor College Of Medicine Vascular-targeted t-cell therapy
GB201702926D0 (en) * 2017-02-23 2017-04-12 Univ Birmingham Modulators
IL272246B2 (en) 2017-07-28 2026-01-01 Applied Therapeutics Inc History of 2-(4-oxo/thioketone/azo-3-((substituted)benzo[d]thiazol-2-yl)methyl)- 3,4-dihydrothieno[3,4-d]pyridazin-1-yl)acetic acid for use as an aldose reductase inhibitor for the treatment of galactosemia or prevention of galactosemia-related complications
CN110531077B (zh) * 2018-05-25 2023-07-07 荣昌生物制药(烟台)股份有限公司 间皮素免疫组化检测试剂盒
US12331320B2 (en) 2018-10-10 2025-06-17 The Research Foundation For The State University Of New York Genome edited cancer cell vaccines
KR20220003529A (ko) 2019-04-01 2022-01-10 어플라이드 테라퓨틱스 인크. 알도스 리덕타제의 억제제
MX2021013511A (es) 2019-05-07 2022-02-23 Univ Miami Tratamiento y deteccion de neuropatias heredadas y trastornos asociados.
CN111026023A (zh) * 2020-01-12 2020-04-17 安徽楚江科技新材料股份有限公司 基于s7-400控制系统的铜带轧机PLC组态方法
CN116790744B (zh) * 2023-06-30 2024-04-26 浙江大学 一种缺血性心脏病晚期纤维化干预靶点及其应用

Family Cites Families (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5789650A (en) * 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5965132A (en) * 1992-03-05 1999-10-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for targeting the vasculature of solid tumors
US5342757A (en) * 1992-11-13 1994-08-30 Ludwig Institute For Cancer Research Monoclonal antibodies which specifically binds to endosialin, a 165 Kd glycoprotein found on tumor vascular endothelium, and uses thereof
ATE244888T1 (de) * 1993-02-05 2003-07-15 Epigen Inc Humanes carcinoma-antigen (hca), hca antikörper, hca immunoassays, aufzeichnungsmethoden und therapy
CA2185116A1 (en) * 1994-03-08 1995-09-14 Thomas P. Wallace Recombinant humanized anti-fb5 antibodies
DE19541844C1 (de) * 1995-11-09 1997-07-24 Gsf Forschungszentrum Umwelt Verfahren zur Herstellung von menschlichen Antikörpern und deren Verwendung
US6146894A (en) 1998-04-14 2000-11-14 The Johns Hopkins University Method for generating hypermutable organisms
CA2355337A1 (en) 1998-09-09 2000-03-16 U.S. Army Institute Of Surgical Research Method for monitoring arterial oxygen saturation
AU2001250381A1 (en) * 2000-03-15 2001-09-24 Epigenomics Ag Diagnosis of diseases associated with tumor suppressor genes and oncogenes
US7402660B2 (en) * 2000-08-02 2008-07-22 The Johns Hopkins University Endothelial cell expression patterns
JP5036119B2 (ja) 2001-01-15 2012-09-26 モーフオテク・インコーポレーテツド ミスマッチ修復の化学阻害剤
US20040043928A1 (en) * 2001-08-02 2004-03-04 Ramesh Kekuda Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use
US20030124579A1 (en) * 2001-09-05 2003-07-03 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosis of ovarian cancer, compositions and methods of screening for modulators of ovarian cancer
US20040014058A1 (en) * 2001-10-05 2004-01-22 Alsobrook John P. Novel human proteins, polynucleotides encoding them and methods of using the same
EP1576131A4 (en) * 2002-08-15 2008-08-13 Genzyme Corp EXPRESSION PATTERN IN BRAIN DENTHELIC CELLS
WO2004048938A2 (en) * 2002-11-26 2004-06-10 Protein Design Labs, Inc. Methods of detecting soft tissue sarcoma, compositions and methods of screening for soft tissue sarcoma modulators
KR20060003860A (ko) * 2003-03-04 2006-01-11 기린 비루 가부시키가이샤 내피 세포 특이적 항체 및 그의 용도
WO2005086713A2 (en) * 2004-03-04 2005-09-22 Kirin Brewery Co., Ltd. Role of human endothelial precursor cells and vascular pericytes tumor in angiogenesis
WO2006017759A2 (en) 2004-08-05 2006-02-16 Kirin Brewery Co., Ltd. Tumor endothelial marker-1 (tem1) binding antibodies and uses thereof
WO2006029045A2 (en) 2004-09-03 2006-03-16 Kirin Brewery Co., Ltd. Endothelial cell specific antibodies and uses thereof
DE602005025659D1 (sr) * 2004-09-23 2011-02-10 Guerbet Sa
ATE476449T1 (de) 2004-12-03 2010-08-15 Morphotek Inc Verwendung von endosialinbindenden proteinen zum isolieren endosialinpositiver zellen
EP2295601A1 (en) * 2005-02-10 2011-03-16 Oncotherapy Science, Inc. Method of diagnosing bladder cancer
WO2006116451A2 (en) 2005-04-22 2006-11-02 Morphotek, Inc. Antibodies with immune effector activity and that internalize in endosialin-positive cells
US7315372B1 (en) * 2005-09-29 2008-01-01 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Instrument using near-field intensity correlation measurements for characterizing scattering of light by suspensions
DE102005050933A1 (de) * 2005-10-21 2007-04-26 Justus-Liebig-Universität Giessen Erfindung betreffend Expressionsprofile zur Vorhersage von septischen Zuständen
US7908090B2 (en) * 2005-11-30 2011-03-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Signatures for human aging
BRPI0620695A2 (pt) * 2005-12-16 2011-11-22 Genentech, Inc método para tratar um tumor do tipo glioma, métodos de prognóstico e/ou diagnóstico de glioma, método de monitoramento ou diagnóstico, método para inibir o tamanho ou crescimento de um tumor do tipo glioma, métodos para tratar terapeuticamente, método para determinar o nìvel de expressão de marcadores determinantes de glioma ("gdm") de pn, prolif ou mes, método para prognosticar o tempo de sobrevida, método para diagnosticar a severidade de um tumor do tipo glioma e uso
WO2008084331A2 (en) 2006-06-21 2008-07-17 Hopitaux Universitaires De Geneve Biomarkers for renal disorders
EP2041307A2 (en) * 2006-07-13 2009-04-01 Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Prediction of breast cancer response to taxane-based chemotherapy
EP2049713A4 (en) * 2006-07-21 2010-06-16 Univ Alberta tissue rejection
WO2008021288A2 (en) 2006-08-11 2008-02-21 Johns Hopkins University Consensus coding sequences of human breast and colorectal cancers
US20080300170A1 (en) * 2006-09-01 2008-12-04 Cohava Gelber Compositions and methods for diagnosis and treatment for type 2 diabetes
US20100092476A1 (en) * 2006-11-17 2010-04-15 Hanash Samir M Pancreatic cancer biomarkers
US20110119776A1 (en) 2007-02-05 2011-05-19 Wong Kwok-Kin Methods of diagnosing and prognosing lung cancer
WO2008101118A2 (en) 2007-02-14 2008-08-21 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services A gene expression signature identifying pro-angiogenic genes in ovarian tumor endothelial cell isolates
EP1986010A1 (en) 2007-04-05 2008-10-29 Vereniging voor christelijk hoger onderwijs, wetenschappelijk onderzoek en patiëntenzorg Methods and tools for discriminating colorectal adenomas and adenocarcinomas
CA2682726C (en) * 2007-04-05 2017-05-09 Morphotek, Inc. Methods for inhibiting the binding of endosialin to ligands
JP5769417B2 (ja) 2007-08-16 2015-08-26 ザ ロイヤル インスティチューション フォー ザ アドバンスメント オブ ラーニング／マギル ユニバーシティ 腫瘍細胞由来微小胞
CN105734128B (zh) * 2008-02-01 2021-05-18 总医院有限公司 微泡在医学疾病和病况的诊断、预后以及治疗中的用途
US20110117551A1 (en) 2008-02-19 2011-05-19 Oncomethylome Sciences Sa Detection and prognosis of lung cancer
US20110117111A1 (en) 2008-03-26 2011-05-19 Johns Hopkins University Microrna-based diagnostic testing and therapies for inflammatory bowel disease and related diseases
US20100136584A1 (en) * 2008-09-22 2010-06-03 Icb International, Inc. Methods for using antibodies and analogs thereof
US20100092470A1 (en) * 2008-09-22 2010-04-15 Icb International, Inc. Antibodies, analogs and uses thereof
US20110256560A1 (en) 2008-10-20 2011-10-20 University Health Network Methods and compositions for the detection of ovarian cancer
CA2749601C (en) 2009-01-14 2020-07-21 Stephen M. Hewitt Ratio based biomarkers and methods of use thereof
WO2010118203A2 (en) * 2009-04-09 2010-10-14 Morphotek, Inc. Endosialin binding molecules

Also Published As

Publication number Publication date
PT2137217E (pt) 2014-03-20
CY1118592T1 (el) 2017-07-12
HUE031269T2 (en) 2017-06-28
SI2620451T1 (sl) 2017-01-31
EP2620451A1 (en) 2013-07-31
RS53362B (sr) 2014-10-31
US8895000B2 (en) 2014-11-25
CY1115370T1 (el) 2017-01-04
ES2606906T3 (es) 2017-03-28
BRPI0809665B1 (pt) 2021-03-23
US9505842B2 (en) 2016-11-29
US10053509B2 (en) 2018-08-21
CA2682726A1 (en) 2008-10-16
BRPI0809665B8 (pt) 2021-05-25
KR101529334B1 (ko) 2015-06-16
SI2137217T1 (sl) 2014-07-31
CN101918446A (zh) 2010-12-15
PL2620451T3 (pl) 2017-06-30
JP2013150618A (ja) 2013-08-08
DK2137217T3 (en) 2014-03-17
JP5825784B2 (ja) 2015-12-02
US20150079104A1 (en) 2015-03-19
WO2008124570A1 (en) 2008-10-16
ES2452929T3 (es) 2014-04-03
BRPI0809665A2 (en) 2018-12-04
HRP20161715T1 (hr) 2017-02-10
PL2137217T3 (pl) 2014-08-29
US20170029509A1 (en) 2017-02-02
DK2620451T3 (da) 2017-01-02
EP2137217B1 (en) 2014-03-05
PT2620451T (pt) 2016-12-20
LT2620451T (lt) 2017-01-10
AU2008237296A1 (en) 2008-10-16
CA2682726C (en) 2017-05-09
EP2137217A1 (en) 2009-12-30
JP2010523592A (ja) 2010-07-15
EP2620451B1 (en) 2016-09-14
CN101918446B (zh) 2014-06-18
AU2008237296B2 (en) 2013-07-04
HRP20140266T1 (hr) 2014-04-25
US20110033455A1 (en) 2011-02-10
US20080248034A1 (en) 2008-10-09
US7807382B2 (en) 2010-10-05
MX2009010701A (es) 2010-01-20
WO2008124570A8 (en) 2008-11-27
KR20100016221A (ko) 2010-02-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RS55447B1 (sr) Metode za inhibiranje vezivanja endosijalina za ligande
JP4628679B2 (ja) Ｇｄｐ−フコースの輸送に関与する蛋白質の活性が低下または欠失した細胞
JP6538707B2 (ja) 免疫応答を調節するための方法及び組成物
JP2013126418A (ja) Ａ３３抗原およびｊａｍ−ｉｔの使用
JP2006501862A5 (sr)
EP4596580A1 (en) Antibody for specifically recognizing light and use thereof
JP5704722B2 (ja) 細胞接着阻害剤およびその用途
JPWO2007018316A1 (ja) 癌の予防・治療剤
WO2021259160A1 (en) Antibodies specifically recognizing c5a and uses thereof
WO2023129870A2 (en) ANTIBODIES SPECIFICALLY RECOGNIZING C5aR1 AND USES THEREOF
WO2006093337A1 (ja) 癌の予防・治療剤
TW202544044A (zh) 靶向ｓｌｃ３４ａ２及ｔｍｐｒｓｓ４之系統及其使用方法
HK1126796A (en) Antibodies against insulin-like growth factor i receptor and uses thereof