BRPI0809665B1 - Anticorpo monoclonal que se liga especificamente a endosialina - Google Patents

Abstract

anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação de antígeno. a invenção fornece métodos para a inibição da interação de endosialina com ligantes de endosialina. a inibição é efetuada por bloqueio da interação da endosialina expressa na superfície celular com ligantes como, por exemplo, fibronectina e colágeno, com um anticorpo anti-endosialina.

Description

ANTICORPO MONOCLONAL QUE SE LIGA ESPECIFICAMENTE A ENDOSIALINA REFERÊNCIA CRUZADA COM PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido reivindica o benefício do Pedido U.S. Provisório N° 60/910.362, depositado em 5 de abril de 2007, e do Pedido U.S. Provisório N° 60/980.026, depositado em 15 de outubro de 2007, ambos aqui incorporados por referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção está relacionada de forma geral ao campo de substâncias imunoterapêuticas. Mais especificamente, a invenção está relacionada às composições e aos métodos para a ruptura da interação de endosialina com seus substratos para inibir funções celulares, incluindo angiogênese e motilidade celular.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Várias publicações, incluindo patentes, pedidos publicados, artigos técnicos e artigos científicos são citados ao longo da especificação. Cada uma dessas publicações citadas é aqui incorporada por referência em sua totalidade e para todos os fins.

A angiogênese é um processo regulado que envolve a formação de novos vasos sangüíneos. Ela tem uma participação essencial no crescimento normal, no desenvolvimento embrionário, cicatrização de feridas e outros processos fisiológicos (Yancopoulos e cols. (2000) Nature, 407: 242-8). Dentro do capilar em desenvolvimento, as proteínas da matriz extracelular (ECM) servem como um arcabouço estrutural para os tecidos endoteliais e tumorais em proliferação e fornecem suporte para o crescimento de células tumorais. A angiogênese de novo está envolvida em vários estados de doença, incluindo câncer, em que surge a formação de novos vasos sangüíneos "semelhantes aos embrionários" (aqui denominada neovascularização) que diferem da vasculatura normal com relação à estrutura e função (Hanahan e cols. (2000) Cell, 100: 57-70). Diversos estudos in vivo e in vitro demonstraram diferenças biológicas entre a vasculatura normal e a associada à doença com o uso de vários sistemas de modelo de angiogênese, despertando, dessa forma, a possibilidade de novos compostos antiangiogênicos que possam inibir seletivamente a formação de vasos do tipo embrionário, de células endoteliais associadas ao tumor para a terapia de doença neovascular. À luz dessas oportunidades para terapia, ocorrem atualmente pesquisas intensas em busca de alvos potenciais que possam inibir especificamente o crescimento e a função de células endoteliais ou estromais associadas a tumores e a outras doenças neovasculares (fibroblastos, pericitos etc.).

Em uma tentativa de identificas esses alvos, foram desenvolvidas estratégias para identificar antígenos da superfície celular do estroma tumoral, bem como para isolar proteínas ou RNA específicos que são expressos em células estromais tumorais (Rettig e cols. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10.832-6; St. Croix e cols. (2000) Science, 289: 1.197-1.202). Essas estratégias identificaram uma proteína da superfície celular que parece ser especificamente expressa em células estromais tumorais denominada endosialina (ou marcador endotelial tumoral 1 (TEM1) ou CD248).

O exame dos padrões de expressão gênica em tecido normal e neoplásico indica supra-regulação da expressão do mRNA de endosialina em neovasos tumorais (St Croix e cols. (2000) Science, 289: 1.197-1.202). Foram observados níveis de expressão de endosialina similares em tecidos de câncer cólon-retal humano (Rmali e cols. (2005) World J. Gastroenterol., 11: 1.283-1.286), de câncer de mama (Davies e cols. (2004) Clin. Exp. Metastasis, 21: 31-37) e histiocitomas (Dolznig e cols. (2005) Cancer Immun., 5: 10). A expressão de endosialina humana foi observada em glioblastoma altamente invasivo, astrocitomas anaplásicos e carcinomas metastáticos, incluindo melanomas (Brady e cols. (2004) J. Neuropathol. Exp. Neurol., 63: 1.274-1.283; Huber e cols. (2006) J. Cutan. Pathol., 33: 145-155).

O uso de anticorpos em estudos de imunoistoquímica encontrou uma expressão robusta de endosialina em diversas células endoteliais neovasculares, fibroblastos e/ou pericitos (Virgintino e cols. (2007) Angiogenesis, 10: 35 45) em tecidos malignos, enquanto a expressão em linhagens celulares derivadas de culturas endoteliais semelhantes às embrionárias, por exemplo, sem limitação, HUVEC (células endoteliais da veia umbilical humana) ou HMVEC (células endoteliais microvasculares dérmicas neonatais) é limitada. A análise de anticorpos, polipeptídeos ou ligantes não protéicos que podem se ligar à endosialina identificou um subconjunto dessas moléculas que pode suprimir a habilidade da endosialina para se ligar ao seu substrato e/ou suprimir as atividades intracelulares que levam à estase ou morte celular.

Rettig e cols. descreveram anticorpos monoclonais que reconhecem antígenos em vasos em vários tipos de câncer (Rettig e cols. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10.832-6). Um destes foi designado FB5 e foi gerado por meio da imunização de camundongos com fibroblastos embrionários humanos. FB5 reconhece uma proteína de aproximadamente 100 kDa na superfície de uma linhagem de células de neuroblastoma, LA1-5s (Patente U.S. N° 5.342.757). O FB5 é um anticorpo murídeo (IgG1) que se liga à endosialina e foi demonstrado que reconhece células endoteliais associadas a vários tipos de câncer diferentes. A avaliação estrutural classificou a endosialina como uma proteína integral da membrana lectina-like do tipo C, composta por cinco domínios extracelulares globulares (incluindo um domínio de lectina do tipo C, um domínio com similaridade ao padrão Sushi/ccp/scr, e três repetições EGF). A proteína também contém uma região mucina-like, um segmento transmembrana e uma cauda citoplasmática curta. A proteína parece ser uma glicoproteína. A análise de carboidratos mostra que a proteína central de endosialina possui uma abundância de glicosilação ligada ao O (Christian e cols. (2001) J. Biol. Chem. , 276: 48.58848.595). Um trabalho subseqüente combinou as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) do FBS de camundongo em um arcabouço de IgG1 humana para criar um anticorpo humanizado que se liga aos vasos em tecidos malignos, bem como a um subconjunto de células em culturas de HMVEC.

Camundongos knockout para Term1 desenvolvem normalmente e exibem cicatrização de feridas normal, o que sugere que a endosialina não é necessária para a neovascularização durante o desenvolvimento fetal ou reparo de feridas (Nanda e cols. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103: 3.351-3.356). Quando células de câncer cólon-retal foram implantadas nos locais abdominais de camundongos knockout para Terml, no entanto, a perda de expressão de endosialina foi associada a uma redução do crescimento, invasão e metástases tumorais, comparado com animais parentes. Foi demonstrado que a ausência de expressão de endosialina reduz o crescimento, invasão e metástase de xenoenxertos de tumor humano em um camundongo knockout para endosialina (Nanda e cols. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103: 3.351-3.356). Adicionalmente, a ausência de endosialina levou a um aumento em vasos sangüíneos imaturos pequenos e diminuiu os números de vasos tumorais médios e grandes.

A neovascularização está associada a diversos estados de doença. No câncer, acredita-se que a neovascularização seja importante para suprir sangue aos tumores. Em doenças não oncológicas ou não malignas como, por exemplo, retinopatia e degeneração macular, a neovascularização descontrolada causa perda da visão (Wilkinson-Berka (2004) Curr. Pharm. Des., 10: 3.331-48; Das e McGuire (2003) Prog. Retin. Eye Res., 22: 721-48). Além disso, vários relatos identificaram a participação da neovascularização na doença inflamatória (Paleolog e Miotla (1998) Angiogenesis, 2(4): 295-307). Métodos para melhor compreender as vias moleculares em células endoteliais do tipo embrionárias e precursoras, bem como em células associadas às endoteliais (pericitos, fibroblastos etc.) associadas a esses estados de doença, levarão ao desenvolvimento de novos fármacos para o tratamento dessas doenças. Inversamente, a neovascularização está associada à cicatrização de feridas (Galiano e cols. (2004) Am. J. Pathol., 164: 1.935-47). A identificação das vias moleculares que promovem a vascularização para a cicatrização de feridas pode oferecer a possibilidade de identificar fármacos e fatores que possam promover esses processos para aumentar o tratamento de feridas associadas aos traumas, queimaduras e infecções.

Um problema difícil na terapia antiangiogênica e pró-angiogênica eficaz é a natureza indefinida de processos biológicos de moléculas e vias associadas que são importantes para a ativação de processos celulares associados à neovascularização (Bagley e cols. (2003) Cancer Res., 63: 5.866-73). A habilidade para identificar e elucidar moléculas e sua função na regulação de certa via pode levar ao isolamento de compostos eficazes que possuam atividade estimuladora ou inibidora em doenças associadas à neovascularização, tais como câncer, inflamação, doenças oculares, doenças cardiovasculares e cicatrização de feridas. A habilidade para isolar e estudar esses compostos por meio de ensaios com base molecular forneceria uma utilidade adicional para a avaliação de seus efeitos para suprimir ou estimular especificamente a biologia normal das células envolvidas na neovascularização, em contraste com células endoteliais do tipo adultas associadas aos vasos em tecido adulto normal (Asahara e Kawamoto (2004) Am. J. Physiol. Cell Physiol., 287: C572-9).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A invenção apresenta métodos para a inibição da interação de uma célula que expressa endosialina com um ligante para endosialina.

Em um aspecto, os métodos compreendem a inibição da expressão de endosialina em uma célula que expressa endosialina no nível genético. Ligantes para endosialina podem ser proteínas da matriz extracelular como, por exemplo, colágeno ou fibronectina. Em algumas modalidades, o ligante é colágeno I ou colágeno IV. Em modalidades preferidas, a célula é uma célula de mamífero. A regulação da expressão de endosialina no nível genético pode ser efetuada por qualquer meio adequado na técnica, por exemplo, molécula de ácido nucléico anti-senso, RNA de fita dupla, ribozimas, ribozimas hammerhead, oligonucleotídeos decoy, e semelhantes. A regulação da expressão de endosialina também pode ser obtida por knockout do gene que codifica endosialina.

Em outro aspecto, os métodos compreendem a obstrução física da endosialina expressa na superfície de uma célula que expressa endosialina, inibindo, dessa forma, a interação da célula com um ligante de endosialina. Ligantes para endosialina podem ser proteínas da matriz extracelular como, por exemplo, colágeno (por exemplo, colágeno I ou colágeno IV) ou fibronectina.

A obstrução da endosialina da superfície celular pode ser efetuada por qualquer meio adequado na técnica, por exemplo, inibidores de pequena molécula, inibidores polipeptídicos, anticorpos que se ligam especificamente à endosialina, anticorpos que se ligam especificamente a um ligante de endosialina, e semelhantes. Em algumas modalidades, são empregados inibidores competitivos para inibir a interação da endosialina ou de uma célula que expressa endosialina com um ligante para endosialina. Em algumas modalidades, os inibidores competitivos podem ser ligantes de endosialina, fragmentos de ligação de endosialina de ligantes de endosialina, por exemplo, fragmentos de ligação de endosialina de colágeno ou fibronectina. Inibidores competitivos preferidos são fragmentos de ligação de endosialina de colágeno I, colágeno IV ou fibronectina. Os inibidores competitivos mais preferidos são o fragmento do N-terminal de 70 kDa de fibronectina, o fragmento de ligação de gelatina de 45 kDa de fibronectina e o fragmento de ligação de heparina de 30 kDa de fibronectina.

Anticorpos adequados podem ser anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos totalmente humanos, fragmentos de ligação de antígeno que se ligam especificamente ao antígeno, e semelhantes. Em algumas modalidades, a afinidade do anticorpo pelo antígeno é preferivelmente menor do que cerca de 1 x 10-7 M, mais preferivelmente menor do que cerca de 1 x 10-8 M, ainda mais preferivelmente menor do que cerca de 1 x 10-9 M e, principalmente, menor do que cerca de 1 x 10-10 M. Em algumas modalidades preferidas, o anticorpo é um anticorpo anti-endosialina ou um fragmento de ligação de antígeno que reconhece especificamente endosialina. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno compreende uma cadeia pesada que compreende CDR1, CDR2 e CDR3 do ID. DE SEQ. N°: 28, 30 e 32, respectivamente, e uma cadeia leve que compreende CDR1, CDR2 e CDR3 do ID. DE SEQ. N°: 13, 15 e 17, respectivamente. Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno podem compreender uma cadeia pesada que compreende um domínio variável do ID. DE SEQ. N°: 34 e uma cadeia leve que compreende um domínio variável do ID. DE SEQ. N°: 19. Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno podem compreender uma cadeia pesada que compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 22 ou 26 e uma cadeia leve que compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 11. Anticorpos M4 e M4.1 são anticorpos humanizados para endosialina humana. Embora os anticorpos M4 e M4.1 compartilhem uma seqüência de cadeia leve, eles diferem em sua cadeia pesada por uma única seqüência de aminoácidos mostrada, por exemplo, no resíduo 429 do ID. DE SEQ. N°: 20 em relação ao resíduo 429 do ID. DE SEQ. N°: 24. A alteração de aminoácido é o resultado de uma única alteração de nucleotídeo mostrada, por exemplo, no nucleotídeo 1.286 do ID. DE SEQ. N°: 19 em relação ao nucleotídeo 1.286 do ID. DE SEQ. N°: 23. Em algumas modalidades, os anticorpos que podem ser usados de acordo com a invenção são produzidos por células que possuem N° de Acesso na ATCC PTA-7554 ou N° de Acesso na ATCC PTA-9017.

A inibição de interação de endosialina com ligantes para endosialina pode afetar vias, cascatas, e efeitos downstream causados pela interação normal. Por exemplo, a obstrução ou inibição da interação de uma célula que expressa endosialina com um ligante de endosialina pode inibir a ativação de integrinas, a ativação de metaloproteases da matriz e/ou a expressão de metaloproteases da matriz. A motilidade celular pode ser inibida. Mais preferivelmente ainda, é inibida a angiogênese ou a neovascularização.

Em algumas modalidades, a inibição da interação da célula que expressa endosialina com seu ligante inibe a ativação da integrina β1, β2 ou β3. Em algumas modalidades, a inibição da interação da célula que expressa endosialina com seu ligante inibe a migração da célula. Em algumas modalidades, a inibição da interação da célula que expressa endosialina com seu ligante inibe a ativação ou expressão de uma metaloprotease da matriz. Em modalidades preferidas, a metaloprotease da matriz é MMP-9.

A invenção também apresenta métodos para a inibição de angiogênese ou neovascularização. Os métodos incluem a inibição in vitro e in vivo da angiogênese ou neovascularização. Em alguns aspectos, os métodos compreendem a administração a um indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno que se liga especificamente à endosialina, ou de uma composição que obstrui a endosialina expressa na superfície de uma célula, de tal forma que a interação da célula com um ligante de endosialina seja inibida. Essa inibição suprime a angiogênese e/ou neovascularização de um tecido, um órgão ou uma neoplasia no indivíduo ao qual a composição é administrada. Ligantes para endosialina podem ser proteínas da matriz extracelular como, por exemplo, colágeno (por exemplo, colágeno I ou colágeno IV) ou fibronectina. A composição pode compreender qualquer molécula, tais como aquelas aqui descritas e exemplificadas, que possa obstruir fisicamente a interação de endosialina da superfície celular com pelo menos um ligante de endosialina. Exemplos de tais moléculas incluem, sem limitação, inibidores de pequena molécula, inibidores polipeptídicos, anticorpos que se ligam especificamente à endosialina, anticorpos que se ligam especificamente a um ligante de endosialina, fragmentos de ligação de antígeno, e semelhantes. Anticorpos adequados podem ser anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos totalmente humanos, fragmentos de anticorpo, e semelhantes.

Também são apresentados ensaios e métodos para a identificação de agentes que intensificam ("agonistas") ou reduzem ("antagonistas") a interação de endosialina com um ligante de endosialina. Em um aspecto dos métodos para a identificação desses antagonistas, os métodos compreendem o contato da endosialina com um composto de teste, formando, dessa forma, um complexo endosialina-composto de teste, o contato do complexo endosialina-composto de teste com um ligante para endosialina, e a medida de forma quantificável da interação da endosialina com o ligante na presença e na ausência do composto de teste, em que uma diminuição no nível de interação de endosialina com o ligante na presença do composto de teste indica que o composto de teste é um antagonista da interação de endosialina com o ligante. Em uma modalidade, os métodos para a identificação de agonistas ou antagonistas da interação de endosialina com um ligante para endosialina compreendem o contato da endosialina com um ligante para endosialina na presença e ausência de um composto de teste e a medida quantitativa da interação de endosialina com o ligante, em que um aumento ou uma diminuição no nível de interação de endosialina com o ligante na presença do composto de teste indica que o composto de teste é um agonista ou antagonista, respectivamente, da interação de endosialina com o ligante. Nos ensaios da invenção, a endosialina pode estar ligada a uma membrana celular, a um fragmento da membrana celular, a uma bicamada lipídica artificial ou a um suporte sólido. Em alguns aspectos, o ligante pode estar ligado a um suporte sólido. Ligantes para endosialina podem ser proteínas da matriz extracelular como, por exemplo, colágeno ou fibronectina.

As Figuras 1A e 1B mostram a análise imunoistoquímica de células endosialina-positivas de tecido maligno. Foram isolados tumores de pacientes com câncer cólon-retal e congelados subitamente em nitrogênio líquido. Foram feitos cortes finos das amostras e corados com anticorpo anti-endosialina ou controle de isótipo. Como mostrado, os vasos no tumor (Figura 1A) coraram positivo para endosialina, enquanto os cortes seriais corados com anticorpo de controle de isótipo foram negativos (Figura 1B).
As Figuras 2A e 2B mostram a análise imunoistoquímica de células endosialina-positivas de tecido normal. Os tecidos normais foram isolados de pacientes por biópsia e congelados subitamente em nitrogênio líquido. Foram feitos cortes finos das amostras e coradas com anticorpo anti-endosialina ou controle de isótipo. Como mostrado, o tecido normal continha poucas EPCs (seta, Figura 2A), enquanto os cortes seriais corados com anticorpo de controle de isótipo foram negativos (Figura 2B). Muitos tecidos normais testados tinham poucas EPCs, como determinado in situ ou por coloração de anticorpo.
A Figura 3 mostra o isolamento de células endosialina-positivas de culturas endoteliais primárias. As culturas de HMVEC foram enriquecidas quanto a EPCs por panning. As culturas panned com Endosialina foram então comparadas com culturas de HMVEC parentes quanto à percentagem de células que expressam endosialina. Como mostrado, a cultura panned tinha um número bem maior de células endosialina-positivas, quando comparadas com a parental cultura não panned, como determinado por imunocoloração por meio de anticorpo anti-endosialina seguido por um anticorpo secundário conjugado fluorescente. O número de células de cada campo foi determinado por microscopia óptica.
A Figura 4 mostra que endosialina recombinante (Fc-TEM1) se liga às proteínas da matriz extracelular (EMPs). As placas de ELISA, pré-revestidas com fibronectina EMP (FN), colágeno (COL; incluindo colágeno tipo I (COL I) e colágeno tipo IV (COL IV)), vitronectina (VN), laminina (LN) ou gelatina (Gel), foram bloqueadas com tampão de ensaio de ELISA, antes da adição de proteína Fc-TEM1 purificada em concentrações crescentes. Após uma incubação de duas horas, as placas foram lavadas e testadas quanto à ligação usando um mAb secundário de cabra anticamundongo ligado à HRP (peroxidase de raiz forte) específico para a cauda de Fc usando condições de ELISA padronizadas. As placas foram lavadas e desenvolvidas e depois testadas usando uma leitora de placas a OD 450 nm. Como mostrado na Figura 4A, a Fc-TEM1 se ligou robustamente à FN e COL, enquanto foi observada uma ligação fraca com LM, VN ou Gel. Para a Figura 4B, uma placa de ELISA foi pré-revestida de um dia para o outro com os seguintes antígenos: enterotoxina B de Staphylococcus (STEB), ovalbumina (OVA), gamaglobulina bovina (BGG), antígeno de glicoproteína de 90 kD associado a tumor expresso na maioria das células de melanoma (TA90), lisozima de ovo de galinha (HEL), toxóide tetânico (TT), BSA 1%, mesotelina humana, GM-CSF humano, IgG de cabra e IgG de camundongo. Fc-TEM1 foi adicionada em quantidades crescentes (5, 10, 50 pg/ml) e deixou-se aderir por 2 horas. As placas foram então lavadas e anticorpo de cabra anticamundongo conjugado à HRP foi adicionado para detectar Fc-TEM1 ligada.
A Figura 5 mostra o mapeamento de domínios de ligação de fibronectina (FN) à endosialina. Fragmentos proteolíticos e recombinantes derivados de fibronectina (FN) foram testados quanto à habilidade para suportar a ligação de TEM-1. Os fragmentos de FN avaliados incluem: o fragmento de 70 kDa do N-terminal (Sigma - N° de Catálogo F0287) (obtido por digestão com catepsina D de fibronectina); o fragmento de ligação de 30 kDa de heparina (Sigma - N° de Catálogo F9911); o fragmento de ligação de gelatina de 45 kDa (Sigma - N° de Catálogo F0162) (ambos obtidos por digestão com tripsina do fragmento de 70 kDa); o fragmento de 120 kDa contendo o domínio de adesão celular ("o fragmento de 120 kDa"); e dois fragmentos recombinantes: Fn2, que contém os primeiros 7 domínios de FN do tipo III, e Fn4, que contém o sítio de ligações dissulfeto intercadeias e o domínio de ligação de integrina α4β1. O diagrama da estrutura de FN foi adaptado de Wierzbicka-Patynowski e cols. (2003) J. Cell Sci., 116: 3.269-76.
A Figura 6 mostra a ligação de Fc-TEM1 recombinante à EMP e à fibronectina na presença de inibidores. M4 é um anticorpo humanizado para endosialina humana, enquanto rbtTEMl é um anticorpo de coelho para endosialina humana. O ensaio foi realizado como descrito na Figura 4, exceto que foram adicionados anticorpos para medir a habilidade para perturbar ou bloquear a ligação de Fc-TEMl à FN. Como mostrado nessa figura, M4 foi capaz de inibir a ligação de Fc-TEMl à FN, enquanto um controle não específico (HuIgG) não foi.
A Figura 7 mostra a ligação de endosialina aos fragmentos de EMP e inibição destes por compostos inibidores de endosialina-EMP. Os fragmentos de fibronectina são ilustrados na Figura 5. A Figura 7A mostra a ligação aos fragmentos de proteína derivados de FN nativa. A Figura 7B mostra a ligação aos fragmentos de proteína derivados de FN desnaturada. Para as Figuras 7A e 7B, um fragmento de FN foi revestido em uma placa de ELISA nas concentrações indicadas. Um anticorpo policlonal anti-FN seguido por adição de anticorpo secundário de cabra anticoelho conjugado à HRP foi usado para detectar proteínas ligadas intactas. Fc-TEM1 (1,25 pg/ml) foi adicionada e a ligação foi permitida por 2 horas. As placas foram então lavadas, e anticorpo de cabra anticamundongo conjugado à HRP foi adicionado para detectar Fc-TEM1 ligada. A barra hachurada (Fc-TEM1 nativa) na Figura 7B representa a ligação de Fc-TEM1 à FN não desnaturada. Como mostrado, a endosialina se liga à região do N-terminal de fibronectina, e pouca ou nenhuma ligação foi detectada para a ligação aos fragmentos FN-2, FN-4 ou de 120 kDa. Anticorpos policlonais para fibronectina se ligaram a todos os fragmentos. As Figuras 7C e 7D mostram a ligação de Fc- TEM1 ao fragmento de 70 kDa de FN e a inibição da interação por compostos inibidores de endosialina-EMP. FN inteira e a proteína de FN de 70 kDa foram revestidas sobre uma placa de ELISA em uma concentração fixa de aproximadamente 15 nmol/poço para ambas as proteínas. Fc-TEM1 (1,25 pg/ml) foi pré-incubada a 4°C por 1 hora com quantidades crescentes de anticorpo anti-endosialina M4 ou controle de isótipo IgG. Complexos de Fc-TEM1/M4 (Figura 7C) ou Fc-TEM1/IgG (Figura 7D) foram adicionados aos poços revestidos com FN e 70 kDa, e foram incubados por 2 horas em temperatura ambiente. A proteína Fc-TEM1 ligada foi detectada pela adição de anticorpo secundário de cabra anticamundongo conjugado à HRP.
A Figura 8 ilustra uma mudança na morfologia da célula em uma mistura gelatinosa de proteína vendida sob o nome comercial MATRIGEL (BD Biosciences) mediante expressão de endosialina. 8E4 células de CHO-K1 ou CHO-TEM1 foram semeadas sobre uma placa de 96 poços revestida com MATRIGEL e incubadas a 37°C. Após uma incubação de um dia para o outro, as células foram fotografadas para exame macroscópico da formação de túbulos.
A Figura 9 mostra a ligação celular mediada por endosialina aos fragmentos de EMP. Células CHO foram transfectadas com um vetor que expressa endosialina ou cDNA falso. Foi confirmado que as células expressam endosialina da superfície celular (CHOTEM1), enquanto aquelas transfectadas com o falso (CHOK1) não o fizeram. Para a Figura 9A, células de ovário de hamster chinês (CHO) foram adicionadas a uma placa de 96 poços pré-revestida contendo várias proteínas ECM. Permitiu-se que as células aderissem por 1 hora a 37°C e os poços foram lavados intensamente para remover quaisquer células ligadas frouxamente. O número de células anexadas foi determinado usando o Ensaio Luminescente de Viabilidade Celular CELLTITER-GLO. Abreviações: Col, Colágeno; FN, fibronectina; LN, laminina; TN, tenascina; VN, vitronectina; Neg, albumina sérica bovina. Para a Figura 9B, células de ovário de hamster chinês (CHO) foram transfectadas com um vetor que expressa endosialina ou cDNA falso. Foi confirmado por análise por FACS que as células expressam endosialina da superfície celular (CHOTEM1), enquanto aquelas transfectadas com o falso (CHOK1) não o fizeram. As células foram então testadas quanto à habilidade para se ligar à fibronectina EMP isoladamente ou em combinação com anticorpo anti-endosialina M4 ou IgG de controle. A Figura 9B demonstra que o anticorpo anti-endosialina M4 reduz a adesão celular mediada por endosialina à FN. As células (1.5E5) foram pré-incubadas por 1 hora a 4°C com anticorpo M4 (100 pg/ml) ou um anticorpo IgG de controle de isótipo (100 pg/ml). Para a Figura 9C, as células foram testadas quanto à habilidade para se ligar à FN de comprimento total ou aos fragmentos de fibronectina. Como mostrado na Figura 9A, o número de células CHO-TEM1 aderentes foi 6 vezes maior do que o número de células CHO-K1 parentais em poços revestidos com FN. Não foram observadas diferenças significativas na adesão entre CHO-K1 e CHO-TEM1 em superfícies revestidas com laminina ou vitronectina, enquanto a adesão aos colágenos e à tenascina foi muito fraca para avaliar quaisquer diferenças importantes (Figura 9A). O pré-tratamento de células CHO-TEM1 com anticorpo M4 resultou em uma redução de 50% da adesão celular dependente de TEM1-FN, enquanto o anticorpo IgG de controle não teve nenhum efeito (Figura 9B) . O tratamento com anticorpo M4 não afetou a adesão celular dependente de FN, independente de endosialina (adesão basal) de células CHO-K1 parentais. As células CHO-TEM1 mostraram uma adesão 3 a 5 vezes aumentada aos fragmentos de FN, 7 0 kDa e 30 kDa, comparadas com células CHO-K1 parentais, enquanto não foi observada adesão significativa aos fragmentos de 45 kDa ou Fn2. As células CHO-TEM1 se ligaram ao MATRIGEL cinco vezes melhor do que CHO-K1 (Figura 9C).
A Figura 10 mostra a identificação de compostos inibidores de endosialina-colágeno da EMP. As células CHO foram transfectadas com um vetor que expressa endosialina ou cDNA falso. Foi confirmado que as células expressam endosialina da superfície celular (CHOTEM1), enquanto aquelas transfectadas com o falso (CHOK1) não o fizeram. As células foram então testadas quanto à habilidade para se ligar ao Colágeno Tipo I da EMP (COL I) isoladamente ou em combinação com anticorpo anti-endosialina M4 ou IgG de controle. Como mostrado, a superexpressão de endosialina resulta no aumento da ligação da célula ao COL I que pode ser bloqueada por inibidores de endosialina como, por exemplo, M4, em contraste com a molécula de controle (IgG). RbtTEM1 também suprimiu a ligação de Fc-TEM1 ao COL I (dados não mostrados).
A Figura 11 mostra a ligação celular mediada por endosialina ao colágeno da EMP. As células CHO foram transfectadas com um vetor que expressa endosialina ou cDNA falso. Foi confirmado que as células expressam endosialina da superfície celular (CHOTEM1), enquanto aquelas transfectadas com o falso (CHOK1) não o fizeram. As células foram então testadas quanto à habilidade para se ligar ao colágeno tipo I da EMP. Como mostrado, a superexpressão de endosialina resulta no aumento da ligação da célula ao COL I.
A Figura 12 mostra a mediação da migração celular por endosialina e a inibição desta por anticorpo anti-endosialina M4. A habilidade de M4 para inibir a migração de células CHO-TEM1 e CHO-K1 por meio de membranas revestidas com MATRIGEL (Figura 12A) ou FN (Figura 12B) foi determinada. Células foram adicionadas à câmara superior e permitiu-se a migração por 48 horas a 37°C. A membrana foi removida e o número de células migradas foi determinado usando o Ensaio de Viabilidade Celular por Luminescência CELLTITER-GLO. Onde indicado, as células foram tratadas com M4 ou controle de isótipo de IgG pela duração do experimento. Como mostrado na Figura 12A, as células CHO-K1 exibiram migração celular modesta, enquanto as células CHO-TEM1 mostraram migração >10 vezes aumentada. O tratamento com anticorpo M4, mas não com IgG de controle, aboliu a migração de células CHO-TEM1. Foram observados resultados similares em experimentos de migração que utilizam câmaras trans-poços revestidas com FN (Figura 12B).
A Figura 13 mostra o aumento por endosialina de vias celulares. As células CHO foram transfectadas com um vetor que expressa endosialina ou cDNA falso. Foi confirmado que as células expressam endosialina da superfície celular (CHOTEM1), enquanto aquelas transfectadas com o falso (CHOK1) não o fizeram. As células foram então testadas quanto à habilidade para supra-regular as vias celulares. Uma dessas vias é a via de MMP9, que participa da migração celular. Como mostrado, a superexpressão de endosialina resulta no aumento da atividade de MMP-9, em contraste com células de controle.
A Figura 14 mostra o efeito do bloqueio de endosialina sobre a ativação de integrina β. Células renais embrionárias humanas 293 (HEK293) foram transfectadas com um vetor que expressa endosialina ou cDNA falso. Foi confirmado que as células expressam endosialina da superfície celular (293TEM1), enquanto aquelas transfectadas com o falso (293T) não o fizeram. As células foram então testadas quanto à habilidade para supra-regular as vias celulares. Uma dessas vias é a via de integrina que participa da migração celular. Como mostrado, a superexpressão de endosialina resulta no aumento da atividade de integrina β1 (Figura 14B), em contraste com células de controle, enquanto o efeito direto sobre a expressão de β1 na superfície celular não é alterado (Figura 14A). O tratamento das células com o inibidor de endosialina M4 resultou na supressão da atividade de integrina, enquanto não foram observados efeitos sobre os níveis na superfície celular (Figura 14B). Esses dados mostram a habilidade para a utilização de inibidores de endosialina para suprimir a função de integrina em células que expressam endosialina.
A Figura 15 ilustra que o anticorpo M4.1 reconhece TEM-1 humana não reduzida em células CHO-TEM-1 e pericitos humanos primários, mas não TEM-1 murídea em células 2H11 de camundongo. O policlonal de coelho contra TEM-1 humana (rabPAb TEM-1) reconhece TEM-1 humana em células CHO-TEM-1 e pericitos humanos, mas também TEM-1 murídea em células 2H11 de camundongo. M4.1 e rabPAb TEM-1 não reagiram contra lisados de células CHO-K1 parentais ou células NS0 e MS1 de camundongo em função da ausência de expressão de TEM-1 nessas células. Somente rabPAb TEM-1 reagiu com TEM-1 humana reduzida, embora em um grau menor quando comparado com TEM-1 não reduzida.

DESCRIÇÃO DETALHADA DE MODALIDADES ILUSTRATIVAS

Vários termos relacionados aos métodos e a outros aspectos da presente invenção são usados ao longo da especificação e das reivindicações. Esses termos possuem o significado comum na técnica, a menos que indicado de forma diferente. Outros termos definidos especificamente devem ser considerados de uma forma consistente com a definição aqui fornecida.

Deve-se entender que esta invenção não é limitada aos métodos, reagentes, compostos, composições ou sistemas biológicos em particular, que podem, evidentemente, variar. Deve-se entender também que a terminologia aqui usada tem a única finalidade de descrever modalidades particulares, e não visa ser limitante.

Como usadas nesta especificação e nas reivindicações em anexo, as formas no singular "um", "uma", "o" e "a" incluem referentes no plural, a menos que o conteúdo indique claramente de forma diferente. Dessa forma, por exemplo, referência a "uma célula" inclui uma combinação de duas ou mais células, e semelhantes.

Cada faixa aqui citada inclui todas as combinações e subcombinações de faixas, bem como numerais específicos nelas contidos.

O termo "cerca de", como aqui usado, quando se refere a um valor mensurável como, por exemplo, uma quantidade, uma duração temporal e semelhante, visa englobar variações de ± 20% ou ± 10%, mais preferivelmente ± 5%, ainda mais preferivelmente ± 1% e, ainda mais preferivelmente, ± 0,1% do valor especificado, na medida em que essas variações sejam apropriadas para realizar os métodos revelados.

"Ensaio endosialina-específico" (ESA) refere-se aos ensaios que podem ser usados para identificar compostos que podem, direta ou indiretamente, perturbar a expressão de endosialina ou a atividade biológica que resulta na ligação direta ou indireta modificada de células que expressam endosialina ou de endosialina às EMPs por meio de mecanismos mediados por endosialina ou integrina, bem como modificar as vias celulares endógenas como, por exemplo, sem limitação, metaloprotease da matriz (MMPs) e/ou proliferação ou sobrevida celular.

"Polinucleotídeo", também citado como "ácido nucléico" ou "molécula de ácido nucléico", refere-se a qualquer polirribonucleotídeo ou polidesoxirribonucleotídeo que pode ser RNA ou DNA não modificado ou RNA ou DNA modificado. "Polinucleotídeos" incluem, sem limitação, DNA de fita simples e dupla, DNA que é uma mistura de regiões de fita simples e dupla, RNA de fita simples e dupla, e RNA que é uma mistura de regiões de fita simples e dupla, moléculas híbridas que compreendem DNA e RNA que podem ser de fita simples ou, mais tipicamente, de fita dupla ou uma mistura de regiões de fita simples e dupla. Além disso, "polinucleotídeo" refere-se às regiões de fita tripla que compreendem RNA ou DNA ou tanto RNA quanto DNA. O termo polinucleotídeo também inclui DNAs ou RNAs que contêm uma ou mais bases modificadas e DNAs ou RNAs com estruturas centrais modificadas quanto à estabilidade ou por outras razões. Bases "modificadas" incluem, por exemplo, bases tritiladas e bases incomuns como, por exemplo, inosina. Podem ser feitas diversas modificações ao DNA e ao RNA; dessa forma, "polinucleotídeo" engloba formas química, enzimática ou metabolicamente modificadas de polinucleotídeos tipicamente encontradas na natureza, bem como formas químicas de DNA e RNA características de vírus e células. "Polinucleotídeo" também engloba cadeias de ácidos nucléicos relativamente curtas, freqüentemente denominadas oligonucleotídeos.

Um "vetor" é um replicon, por exemplo, um plasmídeo, fago, cosmídeo ou vírus, ao qual outro segmento de ácido nucléico pode ser operacionalmente inserido, de forma a causar a replicação ou expressão do segmento.

"Polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" são aqui usados de forma intercambiável para se referir a um polímero de resíduos de aminoácidos. Os termos se aplicam aos polímeros de aminoácido nos quais um ou mais resíduos de aminoácido são um mimético químico artificial de um aminoácido de ocorrência natural correspondente, além de polímeros de aminoácidos de ocorrência natural e de polímeros de aminoácidos de ocorrência não natural. Os polipeptídeos da invenção incluem variantes modificadas conservadoramente. Aqueles habilitados na técnica reconhecerão que substituições, eliminações ou adições a uma seqüência de ácidos nucléicos, peptídeos, polipeptídeos ou proteínas que alteram, adicionam ou eliminam um único aminoácido ou uma pequena percentagem de aminoácidos na seqüência codificada são uma "variante modificada conservadoramente" em que a alteração resulta na substituição de um aminoácido com um aminoácido quimicamente similar. Tabelas de substituições conservadoras que fornecem aminoácidos funcionalmente similares são bem conhecidas na técnica. Essas variantes modificadas conservadoramente são adicionais e não excluem variantes polimórficas, homólogos interespécies e alelos da invenção.

O termo "expressar", "expresso" ou "expressão" de uma molécula de ácido nucléico refere-se à biossíntese de um produto gênico. O termo engloba a transcrição de um gene em RNA. Por exemplo, sem limitação, um gene regulador como, por exemplo, um ácido nucléico anti-senso ou ácido nucléico interferente pode ser expresso por transcrição como RNA anti-senso ou RNAi ou shRNA. O termo também engloba a tradução de RNA em um ou mais polipeptídeos, e engloba todas as modificações de ocorrência natural pós-transcrição e pós-tradução.

Uma célula foi "transformada" ou "transfectada" por ácidos nucléicos exógenos ou heterólogos como, por exemplo, DNA, quando esse DNA foi introduzido dentro da célula. O DNA transformante pode ou não ser integrado (ligado covalentemente) no genoma da célula. Em procariotas, leveduras e células de mamíferos, por exemplo, o DNA transformante pode ser mantido em um elemento epissômico como, por exemplo, um plasmídeo. Com relação às células eucarióticas, uma célula transformada estavelmente, ou "célula estável", é aquela cujo DNA transformante se tornou integrado em um cromossomo de tal forma que ele seja herdado por células-filhas através de replicação do cromossomo. Essa estabilidade é demonstrada pela habilidade da célula eucariótica para estabelecer linhagens celulares ou clones compostos por uma população de células-filhas que contêm o DNA transformante. Um "clone" é uma população de células derivadas de uma única célula ou ancestral comum por mitose. Uma "linhagem celular" é um clone de uma célula primária que é capaz de crescimento estável in vitro por muitas gerações.

Como aqui usado, o termo "composto de teste" refere-se a qualquer molécula purificada, molécula substancialmente purificada, moléculas que são um ou mais componentes de uma mistura de compostos, ou uma mistura de um composto com qualquer outro material que possa ser utilizado nos métodos da presente invenção. Os compostos de teste podem ser substâncias químicas orgânicas ou inorgânicas, ou biomoléculas, e todos os fragmentos, análogos, homólogos, conjugados e derivados destes. "Biomoléculas" incluem proteínas, polipeptídeos, ácidos nucléicos, lipídeos, monossacarídeos, polissacarídeos, e todos os fragmentos, análogos, homólogos, conjugados, e derivados destes. Os compostos de teste podem ser de origem natural ou sintética, e podem ser isolados ou purificados de suas fontes de ocorrência natural, ou podem ser sintetizados de novo. Os compostos de teste podem ser definidos em termos de estrutura ou composição, ou podem ser indefinidos. O composto pode ser um produto isolado de estrutura desconhecida, uma mistura de vários produtos conhecidos, ou uma composição indefinida que compreende um ou mais compostos. Exemplos de composições indefinidas incluem extratos de células e tecido, meio de crescimento nos quais células procarióticas, eucarióticas e de arquebactérias foram cultivadas, caldos de fermentação, bibliotecas de expressão de proteína, e semelhantes.

"Knockdown" refere-se a uma célula ou organismo que possui expressão reduzida de um ou mais genes. Como será observado por aqueles habilitados na técnica, um knockdown exibirá uma redução de pelo menos cerca de 50% na expressão, de preferência exibirá pelo menos cerca de 67% de redução na expressão e, mais preferivelmente, exibirá uma redução de pelo menos cerca de 75% na expressão, embora sejam possíveis reduções maiores, incluindo uma redução de pelo menos cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais na expressão.

"Inibir" ou "inibição" ou "interferir" significa reduzir, diminuir, bloquear, evitar, retardar, suprimir, inativar, dessensibilizar, interromper ou infra-regular a atividade biológica ou expressão de um gene, um produto gênico (por exemplo, polipeptídeo), ou via de interesse. Em algumas modalidades preferidas da invenção, a inibição da expressão ou atividade biológica de uma proteína ou via de interesse, por exemplo, via de endosialina ou de migração celular, refere-se a uma diminuição (inibição ou infra-regulação) acima de cerca de 50% a cerca de 99% e, mais especificamente, cerca de 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69% 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais. A inibição pode ser direta, ou seja, operar sobre a própria molécula ou via de interesse, ou indireta, ou seja, operar sobre uma molécula ou via que afeta a molécula ou via de interesse.

O termo "recombinante", quando usado com referência, por exemplo, a uma célula, ou a um ácido nucléico, a uma proteína, ou um vetor, indica que a célula, o ácido nucléico, a proteína ou o vetor foi modificado pela introdução de um ácido nucléico ou proteína heteróloga, ou pela alteração de um ácido nucléico ou uma proteína nativa, ou que a célula é derivada de uma célula assim modificada. Dessa forma, por exemplo, células recombinantes expressam genes que não são encontrados na forma nativa (não recombinante) da célula, ou expressam genes nativos que são de algum outro modo expressos anormalmente, subexpressos ou não expressos.

Os termos "quantidade eficaz" e "quantidade terapeuticamente eficaz" são aqui usados de forma intercambiável, e referem-se a uma quantidade de um anticorpo, fragmento de ligação de antígeno ou composição, como aqui descritos, eficaz para obter um resultado biológico em particular como, por exemplo, sem limitação, resultados biológicos aqui revelados, descritos ou exemplificados. Esses resultados podem incluir, sem limitação, o tratamento de doenças associadas à angiogênese ou neovascularização, como determinado por qualquer meio adequado na técnica.

Como aqui usado, o termo "medir" ou "determinar" refere-se a quaisquer determinações qualitativas ou quantitativas.

"Ligante de endosialina" refere-se a qualquer substância química, biomolécula, complexo ou análogo, homólogo ou derivado destes, que pode se ligar a, interagir com, estimular e/ou alterar a expressão de endosialina.

Exceto quando observado, os termos "indivíduo" ou "paciente" são usados de forma intercambiável e referem-se aos mamíferos como, por exemplo, pacientes humanos e primatas não humanos, além de animais experimentais como coelhos, cães, gatos, ratos, camundongos e outros animais. Conseqüentemente, "indivíduo" ou "paciente", como aqui usado, significa qualquer paciente ou indivíduo mamífero ao qual as composições da invenção podem ser administradas.

"Angiogênese" refere-se à formação de novos vasos sangüíneos.

"Neovascularização" refere-se a uma proliferação patológica de novos vasos sangüíneos em um tecido(s) ou órgão(s) que normalmente não contém vasos sangüíneos, ou a proliferação patológica de vasos sangüíneos de um tipo ou quantidade diferente em relação ao normal para um tecido ou órgão em particular.

"Epitopo" refere-se a um determinante imunológico de um antígeno que serve como um sítio de ligação de anticorpo. Como aqui usado, o termo "epitopo conformacional" refere-se a um epitopo descontínuo formado por um relacionamento espacial entre aminoácidos de um antígeno diferente de uma série de aminoácidos não quebrada.

"Isolado" significa alterado "pela mão do homem" em relação ao estado natural. Se uma molécula ou composição ocorre na natureza, ela foi "isolada" caso tenha sido alterada ou removida de seu ambiente original, ou ambos. Por exemplo, um polinucleotídeo ou um polipeptídeo naturalmente presente em uma planta ou animal vivo não é "isolado", mas o mesmo polinucleotídeo ou polipeptídeo separado dos materiais coexistentes de seu estado natural é "isolado", da forma que o termo é aqui empregado.

O termo "substancialmente o mesmo" com relação ao ácido nucléico ou às seqüências de aminoácidos significa pelo menos cerca de 65% de identidade entre duas ou mais seqüências. De preferência, o termo refere-se a pelo menos cerca de 70% de identidade entre duas ou mais seqüências, mais preferivelmente pelo menos cerca de 75% de identidade, mais preferivelmente pelo menos cerca de 80% de identidade, mais preferivelmente pelo menos cerca de 85% de identidade, mais preferivelmente pelo menos cerca de 90% de identidade, mais preferivelmente pelo menos cerca de 91% de identidade, mais preferivelmente pelo menos cerca de 92% de identidade, mais preferivelmente pelo menos cerca de 93% de identidade, mais preferivelmente pelo menos cerca de 94% de identidade, mais preferivelmente pelo menos cerca de 95% de identidade, mais preferivelmente pelo menos cerca de 96% de identidade, mais preferivelmente pelo menos cerca de 97% de identidade, mais preferivelmente pelo menos cerca de 98% de identidade e, mais preferivelmente, pelo menos cerca de 99% ou mais de identidade.

Foi descoberto, de acordo com a presente invenção, que a endosialina interage especificamente com proteínas da matriz extracelular, incluindo fibronectina ou colágeno. Também foi descoberto que essa interação promove a migração celular e ainda promove e facilita a angiogênese. Além dessas observações, foi descoberto que a ruptura da interação entre endosialina e proteínas da matriz extracelular pode suprimir a migração celular e pode suprimir a angiogênese. Conseqüentemente, a invenção apresenta métodos para a inibição da interação de endosialina com ligantes de endosialina.

Em um aspecto, a invenção apresenta métodos para a inibição da interação de endosialina expressa por uma célula que expressa endosialina com um ligante de endosialina. Em algumas modalidades preferidas, os métodos compreendem a inibição da expressão de endosialina pela célula. A inibição da expressão de endosialina pode ocorrer no nível gênico ou no nível de proteína. Por exemplo, a inibição da expressão de endosialina pode compreender o direcionamento do DNA que codifica endosialina, ou do direcionamento do mRNA transcrito do gene de endosialina.

Métodos de regulação gênica são conhecidos e facilmente praticados na técnica, e são todos adequados para uso nos métodos da invenção. Por exemplo, em células especificamente projetadas para expressar um transgene que codifica endosialina (por exemplo, ID. DE SEQ. N°: 1, 3, ou 5), o transgene pode ser colocado sob controle de um promotor indutível. Promotores indutíveis adequados para uso nesta invenção serão conhecidos por aqueles habilitados na técnica.

Em algumas modalidades preferidas, genes que codificam endosialina podem ser inibidos por meio da utilização de várias outras técnicas de silenciamento gênico pós-transcrição (silenciamento de RNA). O silenciamento de RNA envolve o processamento de RNA de fita dupla (dsRNA) em pequenos fragmentos de 21-28 nucleotídeos por uma enzima RNase baseada em H ("Dicer" ou "Dicer-like"). Os produtos de clivagem, que são siRNA (pequeno RNA de interferência) ou miRNA (micro-RNA), são incorporados em complexos efetores de proteína que regulam a expressão gênica de uma forma seqüência-específica.

A interferência de RNA (RNAi) é um mecanismo de silenciamento gênico pós-transcrição mediado por RNA de fita dupla (dsRNA), que é distinto de abordagens anti-senso e baseadas em ribozima (veja Jain, Pharmacogenomics (2004) 5: 239-42 para uma revisão de RNAi e siRNA). A interferência de RNA é útil em um método para a inibição da expressão de endosialina em uma célula ou em um animal como, por exemplo, um ser humano, por transformação da célula, ou por administração ao animal de um ácido nucléico (por exemplo, dsRNA) que hibridiza sob condições estringentes para um gene que codifica endosialina, e atenua a expressão do gene-alvo. A interferência de RNA fornece shRNA ou siRNA que compreende múltiplas seqüências que visam uma ou mais regiões do gene de endosialina. Acredita-se que as moléculas de RNA de fita dupla (dsRNA) (shRNA ou siRNA) dirijam a degradação seqüência-específica de mRNA em células de vários tipos após inicialmente passarem por processamento por uma enzima RNase III-like denominada DICER (Bernstein E. e cols. (2001) Nature 409: 363-366) em moléculas de dsRNA menores compostas por duas fitas de 21 nucleotídeos, cada um delas possuindo um grupo fosfato 5' e um grupo hidroxil 3', e inclui uma região de 19 nucleotídeos precisamente complementar à outra fita, de forma que haja uma região dúplex de 19 nucleotídeos flanqueada por protuberâncias 3’ de 2 nucleotídeos. Dessa forma, o RNAi é mediado por RNAs de interferência curtos (siRNA), que tipicamente compreendem uma região de fita dupla de aproximadamente 19 nucleotídeos de comprimento com protuberâncias 3’ de 1-2 nucleotídeos em cada fita, resultando em um comprimento total entre aproximadamente 21 e 23 nucleotídeos. Em células de mamíferos, dsRNA mais longo do que aproximadamente 30 nucleotídeos tipicamente induz degradação de mRNA inespecífica por meio da resposta de interferon. No entanto, a presença de siRNA em células de mamíferos, em vez de induzir a resposta de interferon, resulta em silenciamento gênico seqüência-específico.

Vetores virais ou vetores de DNA codificam RNAs hairpin curtos (shRNA) que são processados no citoplasma da célula em RNA de interferência curto (siRNA). Em geral, um RNA de interferência curto (siRNA) compreende um dúplex de RNA que preferivelmente possui comprimento de aproximadamente 19 pares de bases e, opcionalmente, ainda compreende uma ou duas protuberâncias ou alças de fita simples. Um siRNA pode compreender duas fitas de RNA hibridizadas em conjunto ou pode, alternativamente, compreender uma única fita de RNA que inclui uma porção auto-hibridizante. siRNAs podem incluir uma ou mais extremidades de fita livres, que podem incluir grupos fosfato e/ou hidroxil. siRNAs tipicamente incluem uma porção que hibridiza sob condições estringentes com um transcrito-alvo. Uma fita do siRNA (ou a porção auto-hibridizante do siRNA) é tipicamente precisamente complementar a uma região do transcrito-alvo, o que significa que o siRNA hibridiza para o transcrito-alvo sem uma única não combinação. Em certas modalidades da invenção nas quais a complementaridade perfeita não é obtida, prefere-se geralmente que quaisquer não combinações estejam localizadas nos terminais do siRNA ou próximos a eles.

Foi demonstrado que siRNAs infra-regulam a expressão gênica quando transferidos para células de mamíferos por métodos como transfecção, eletroporação, transfecção catiônica mediada por lipossomo, ou microinjeção, ou quando expressos em células por meio de diversas abordagens baseadas em plasmídeo. A interferência de RNA usando siRNA é revisada, por exemplo, em Tuschl (2002) Nat. Biotechnol. 20: 446-8; Yu J-Y e cols. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99: 6.047-52; Sui G. e cols. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99: 5.515-20; Paddison e cols. (2002) Genes and Dev., 16: 948-58; Brummelkamp e cols. (2002) Science, 296: 550-3, 2002; Miyagashi e cols. (2002) Nat. Biotechnol., 20: 497-500; e Paul e cols. (2002) Nat. Biotechnol., 20:505-8. Como descrito nessas e em outras referências, o siRNA pode consistir em duas fitas individuais de ácido nucléico ou em uma única fita com uma região auto-complementar capaz de formar uma estrutura em hairpin (haste-alça). Diversas variações em termos de estrutura, comprimento, número de não combinações, tamanho da alça, identidade de nucleotídeos em protuberâncias etc. são consistentes com silenciamento gênico eficaz desencadeado por siRNA. Sem se prender a uma teoria, acredita-se que o processamento intracelular (por exemplo, por DICER) de vários precursores diferentes resulta na produção de siRNA capaz de mediar eficazmente o silenciamento gênico. Geralmente, prefere-se ter como alvo éxons em vez de íntrons, e também pode ser preferível selecionar seqüências complementares às regiões dentro da porção 3’ do transcrito-alvo. Geralmente, prefere-se selecionar seqüências que contêm uma proporção aproximadamente eqüimolar dos diferentes nucleotídeos e evitar trechos nos quais um único resíduo é repetido várias vezes.

Dessa forma, siRNAs podem compreender moléculas de RNA que possuem uma região de fita dupla com comprimento de aproximadamente 19 nucleotídeos com protuberâncias 3’ de 12 nucleotídeos em cada fita, resultando em um comprimento total entre aproximadamente 21 e 23 nucleotídeos. Como aqui usados, siRNAs também incluem várias estruturas de RNA que podem ser processadas in vivo para gerar essas moléculas. Essas estruturas incluem fitas de RNA que contêm dois elementos complementares que hibridizam entre eles para formar uma haste, uma alça e, opcionalmente, uma protuberância, de preferência uma protuberância 3’. De preferência, a haste possui comprimento de aproximadamente 19 bp, a alça de cerca de 1-20, mais preferivelmente cerca de 4-10 e, principalmente, de 6-8 nucleotídeos, e/ou a protuberância possui comprimento de cerca de 1-20 e, mais preferivelmente, cerca de 2-15 nucleotídeos. Em certas modalidades da invenção, a haste possui comprimento mínimo de 19 nucleotídeos e pode ter aproximadamente até 29 nucleotídeos de comprimento. Alças de 4 nucleotídeos ou maiores possuem uma menor probabilidade de serem submetidas às restrições estéricas do que as alças mais curtas e, portanto, podem ser preferidas. A protuberância pode incluir um fosfato 5’ e um hidroxil 3’. A protuberância pode compreender, não necessariamente, diversos resíduos U, por exemplo, entre 1 e 5 resíduos U. siRNAs clássicos como descritos acima desencadeiam a degradação de mRNAs aos quais se destinam, também reduzindo, dessa forma, a taxa de síntese de proteína. Além de siRNAs que atuam por meio da via clássica, certos siRNAs que se ligam à UTR 3’ de um transcrito-modelo podem inibir a expressão de uma proteína codificada pelo transcrito-modelo por um mecanismo relacionado, mas distinto, da interferência de RNA clássica, por exemplo, por redução da tradução do transcrito, e não por diminuição de sua estabilidade. Esses RNAs são denominados microRNAs (miRNAs) e possuem tipicamente um comprimento entre aproximadamente 20 e 26 nucleotídeos, por exemplo, um comprimento de 22 nucleotídeos. Acredita-se que sejam derivados de precursores maiores conhecidos como pequenos RNAs temporais (stRNAs) ou precursores de mRNA, que possuem tipicamente um comprimento de aproximadamente 70 nucleotídeos, com uma alça de aproximadamente 4-15 nucleotídeos (Grishok e cols. (2001) Cell, 106: 23-4; Hutvagner e cols. (2001) Science, 293: 834-8; Ketting e cols. (2001) Genes Dev., 15: 2.654 9). RNAs endógenos desse tipo foram identificados em diversos organismos incluindo mamíferos, sugerindo que esse mecanismo de silenciamento gênico pós-transcrição pode ser disseminado (Lagos-Quintana e cols. (2001) Science, 294: 853-8, 2001; Pasquinelli (2002) Trends Gen., 18: 171-3). Foi demonstrado que microRNAs bloqueiam a tradução dos transcritos-alvo que contêm sítios-alvo em células de mamíferos (Zeng e cols. (2002) Mol. Cell, 9: 1.327-33).

siRNAs, tais como mRNAs de ocorrência natural ou artificiais (ou seja, projetados por seres humanos), que se ligam dentro da UTR 3’ (ou em qualquer outro lugar em um transcrito-alvo) e inibem a tradução, podem tolerar um número maior de não combinações no dúplex siRNA/modelo e, particularmente, podem tolerar não combinações dentro da região central do dúplex. Na verdade, há evidências de que algumas não combinações podem ser desejáveis ou necessárias, na medida em que stRNAs de ocorrência natural freqüentemente exibem essas não combinações, assim como mRNAs que comprovadamente inibem a tradução in vitro. Por exemplo, quando hibridizados com o transcrito-alvo, esses siRNAs freqüentemente incluem dois trechos de complementaridade perfeita separados por uma região de não combinação. São possíveis diversas estruturas. Por exemplo, o mRNA pode incluir múltiplas áreas de não identidade (não combinação). As áreas de não identidade (não combinação) não precisam ser simétricas no sentido em que tanto o alvo quanto o mRNA incluem nucleotídeos não pareados. Tipicamente, os trechos de complementaridade perfeita têm um comprimento de pelo menos 5 nucleotídeos, por exemplo, 6, 7 ou mais nucleotídeos de comprimento, enquanto as regiões de não combinação podem ter um comprimento, por exemplo, de 1, 2, 3 ou 4 nucleotídeos.

Estruturas em hairpin projetadas para simular siRNAs e precursores de mRNA são processadas intracelularmente em moléculas capazes de reduzir ou inibir a expressão de transcritos-alvo (McManus e cols. (2002) RNA 8: 842-50). Essas estruturas em hairpin, que são baseadas em siRNAs clássicos que consistem em duas fitas de RNA que formam uma estrutura dúplex de 19 bp, são classificadas como hairpins de classe I ou de classe II. Hairpins de classe I incorporam uma alça na extremidade 5’ ou 3’ da fita de siRNA anti-senso (ou seja, a fita complementar ao transcrito-alvo cuja inibição é desejada), mas fora isso são idênticos aos siRNAs clássicos. Hairpins da classe II são semelhantes aos precursores de mRNA, na medida em que incluem uma região dúplex de 19 nucleotídeos e uma alça na extremidade 3’ ou 5’ da fita anti-senso do dúplex, além de uma ou mais não combinações de nucleotídeos na haste. Essas moléculas são processadas intracelularmente em pequenas estruturas de dúplex de RNA capazes de mediar o silenciamento. Elas parecem exercer seus efeitos por meio da degradação do mRNA-alvo, e não por meio da repressão da tradução, como se acredita que ocorra para mRNAs e siRNAs de ocorrência natural.

Dessa forma, é evidente que um conjunto diverso de moléculas de RNA contendo estruturas em dúplex é capaz de mediar o silenciamento por meio de vários mecanismos. Para os objetivos da presente invenção, qualquer um desses RNAs, cuja porção se liga a um transcrito-alvo e reduz sua expressão, seja por desencadeamento da degradação, por inibição da tradução ou por outros meios, é considerado como sendo um siRNA, e qualquer estrutura que gere esse siRNA (ou seja, que sirva como um precursor para o RNA) é útil na prática da presente invenção.

Um método adicional de interferência de RNA para uso na presente invenção é o uso de RNAs curtos em hairpin (shRNA). Um plasmídeo contendo uma seqüência de DNA que codifica uma seqüência de siRNA desejada em particular é liberado em uma célula-alvo por meio de transfecção ou infecção com mediação viral. Dentro da célula, a seqüência de DNA é transcrita continuamente em moléculas de RNA que se enovelam e formam estruturas em hairpin através do pareamento de bases intramolecular. Essas estruturas em hairpin, uma vez processadas pela célula, são equivalentes às moléculas de siRNA transfectado, e são usadas pela célula para mediar RNAi da proteína desejada. O uso de shRNA possui uma vantagem em relação à transfecção de siRNA, na medida em que o primeiro pode levar à inibição estável de longo prazo da expressão de proteína. A inibição da expressão de proteína por siRNAs transfectados é um fenômeno transitório que não ocorre por períodos de tempo maiores do que vários dias. Em alguns casos, isso pode ser preferível e desejado. Em casos em que são necessários períodos mais longos de inibição de proteína, a inibição mediada por shRNA é preferível. O uso de shRNA é particularmente preferido. Tipicamente, são construídos vetores que codificam siRNA que compreendem um promotor, uma seqüência do gene-alvo a ser silenciada na orientação "senso", um espaçador, o anti-senso da seqüência do gene-alvo e um finalizador.

A inibição da expressão de endosialina também pode ser efetuada por outros meios que são conhecidos e facilmente praticados na técnica. Por exemplo, podem ser usados ácidos nucléicos anti-senso. Transcritos de RNA anti-senso possuem uma seqüência de base complementar a parte ou todo o outro transcrito de RNA na mesma célula. Foi demonstrado que esses transcritos modulam a expressão gênica por meio de vários mecanismos, incluindo a modulação do splicing de RNA, a modulação do transporte de RNA e a modulação da tradução de mRNA (Denhardt (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci., 660: 70-6, 1992; Nellen e cols. (1993) Trends Biochem. Sci., 18: 419-23; e, Baker e cols. (1999) Biochim. Biophys. Acta., 1.489: 3-18). Conseqüentemente, em certas modalidades da invenção, a inibição de endosialina em uma célula é obtida pela expressão de uma molécula de ácido nucléico anti-senso na célula.

Ácidos nucléicos anti-senso são geralmente ácidos nucléicos de fita simples (DNA, RNA, DNA modificado ou RNA modificado) complementares a uma porção de um ácido nucléico-alvo (por exemplo, um transcrito de mRNA) e, portanto, são capazes de se ligar ao alvo para formar um dúplex. Tipicamente, eles são oligonucleotídeos que possuem um comprimento que varia de 15 a 35 nucleotídeos, mas podem variar de 10 até aproximadamente 50 nucleotídeos de comprimento. A ligação tipicamente reduz ou inibe a função do ácido nucléico-alvo, por exemplo, um gene que codifica endosialina. Por exemplo, oligonucleotídeos anti-senso podem bloquear a transcrição quando ligado ao DNA genômico, inibir a tradução quando ligados ao mRNA e/ou levar à degradação do ácido nucléico. A inibição da expressão de endosialina pode ser obtida pela administração de ácidos nucléicos anti-senso ou de ácidos nucléicos peptídicos que compreendem seqüências complementares àquelas do mRNA que codifica a proteína de endosialina. A tecnologia anti-senso e suas aplicações são bem conhecidas na técnica e são descritas em Phillips (ed.) "Antisense Technology, Methods Enzymol", 2000, Volumes 313 e 314, Academic Press, San Diego, e referências nele citadas. Veja também Crooke (ed.) "ANTISENSE DRUG TECHNOLOGY: PRINCIPLES, STRATEGIES, AND APPLICATIONS" (1a Edição) Marcel Dekker e referências nele citadas.

Oligonucleotídeos anti-senso podem ser sintetizados com uma seqüência de base que seja complementar a uma 5 porção de qualquer transcrito de RNA na célula. Oligonucleotídeos anti-senso podem modular a expressão gênica por meio de vários mecanismos, incluindo a modulação do splicing de RNA, a modulação do transporte de RNA e a modulação da tradução de mRNA. Várias propriedades de 10 oligonucleotídeos anti-senso, incluindo estabilidade, toxicidade, distribuição em tecidos e captação celular e afinidade de ligação, podem ser alteradas por meio de modificações químicas, que incluem: (i) a troca do arcabouço de fosfodiéster (por exemplo, ácido nucléico 15 peptídico, oligonucleotídeos de fosforotioato, e oligonucleotídeos de fosforamidato), (ii) a modificação da base de açúcar (por exemplo, 2’-O-propilribose e 2’-metoxietoxirribose) e (iii) a modificação do nucleosídeo (por exemplo, C-5 propinil U, C-5 tiazol U, e fenoxazina C) 20 (Wagner (1995) Nat. Medicine, 1: 1.116-8; Varga e cols.(1999) Immun. Lett., 69: 217-24; Neilsen (1999) Curr. Opin. Biotech., 10: 71-5; e Woolf (1990) Nucleic Acids Res., 18:1.763-9).

A inibição de expressão de endosialina gênica também 25 pode ser efetuada pelo de ribozimas. Foi demonstrado que certas moléculas de ácido nucléico denominadas ribozimas ou desoxirribozimas catalisam a clivagem seqüência-específica de moléculas de RNA. O sítio de clivagem é determinado por pareamento complementar de nucleotídeos na enzima de RNA ou 30 DNA com nucleotídeos no RNA-alvo. Dessa forma, podem ser projetadas enzimas de RNA e DNA para clivar qualquer molécula de RNA, aumentando, dessa forma, sua taxa de degradação (Cotten e cols. (1989) EMBO J., 8: 861-6; e, Usman e cols. (1996) Curr. Opin. Struct. Biol., 1: 527-33). Ribozimas hammerhead também são usadas rotineiramente na regulação gênica (Lyngstadaas (2001) Crit. Rev. Oral Biol. Med., 12: 469-78).

Em aspectos preferidos da invenção, as células visadas pelos métodos da invenção podem ser especificamente transformadas com ácidos nucléicos de silenciamento da transcrição como, por exemplo, shRNA ou siRNA, ou podem ser transformadas com vetores que codificam esses ácidos nucléicos, de tal forma que a célula expresse as moléculas do ácido nucléico inibidor. A transformação das células pode ser realizada de acordo com qualquer meio adequado na técnica, incluindo aqueles aqui descritos e exemplificados.

Oligonucleotídeos decoy também são adequados à regulação da expressão de genes que codificam endosialina. Experimentos clínicos recentes testaram a habilidade de oligonucleotídeos decoy para seqüestrar proteínas patogênicas. Oligonucleotídeos decoy geralmente contêm um elemento intensificador que pode penetrar nas células e, uma vez dentro das células, os oligonucleotídeos decoy se ligam às proteínas de ligação de DNA seqüência-específicas e interferem com a transcrição (Fichou e cols. (2006) Trends Biotechnol., 24: 563-70; Nakamura e cols. (2002) In Vivo, 16: 45-8; Tomita e cols. (1997) Exp. Nephrol., 5: 429-34).

A regulação genética da expressão de endosialina também pode ser efetuada por knockdown do gene que codifica endosialina. Como será observado por aqueles habilitados na técnica, a seqüência do gene de endosialina (de qualquer organismo de interesse), por exemplo, o ID. DE SEQ. N°: 1, 3 ou 5, pode ser usada para gerar moléculas de ácido nucléico e vetores para knockdown da expressão do gene de endosialina. Consideradas em termos de suas seqüências, as moléculas de ácido nucléico que codificam seqüências reguladoras, particularmente inibidoras, derivadas dos IDS. DE SEQ. Nos: 1, 3 e 5, incluem variantes alélicas, homólogos e mutantes naturais dos IDS. DE SEQ. Nos: 1, 3 e 5. Como se espera que essas variantes e homólogos possuem algumas diferenças na seqüência de nucleotídeos, esta invenção fornece polinucleotídeos isolados que possuem pelo menos cerca de 60%, de preferência pelo menos cerca de 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69% ou 70%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% ou 80%, ainda mais preferivelmente 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% e, ainda mais preferivelmente, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% e, principalmente, 96%, 97%, 98% e 99% ou mais de identidade com qualquer ácido nucléico knockdown derivado dos IDS. DE SEQ. Nos: 1, 3 ou 5. Como provavelmente existe uma variação de seqüências natural entre genes que codificam essas seqüências reguladoras em diferentes organismos, aqueles habilitados na técnica esperariam encontrar esse nível de variação, embora ainda mantendo as propriedades únicas dos polinucleotídeos knockdown. Conseqüentemente, essas variantes e esses homólogos são considerados substancialmente iguais entre eles e são incluídos dentro do escopo da presente invenção.

Moléculas de ácido nucléico knockdown podem ser preparadas por dois métodos gerais: (1) elas podem ser sintetizadas a partir de trifosfatos de nucleotídeos apropriados, ou (2) elas podem ser isoladas de fontes biológicas. Ambos os métodos utilizam protocolos bem conhecidos na técnica.

A disponibilidade de informações de seqüências de nucleotídeos como, por exemplo, de toda a seqüência de ácidos nucléicos de endosialina, por exemplo, os IDS. DE SEQ. Nos: 1, 3 e 5, permite a preparação de uma molécula de ácido nucléico isolado da invenção por síntese de oligonucleotídeo. Oligonucleotídeos sintéticos podem ser preparados pelo método de fosforamadita empregado no sintetizador de DNA 38A de Applied Biosystems ou em dispositivos similares. A construção resultante pode ser purificada de acordo com métodos conhecidos na técnica, por exemplo, cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC). Uma molécula de DNA sintético assim construída pode então ser clonada e amplificada em um vetor apropriado.

Ácidos nucléicos knockdown podem ser mantidos como DNA em qualquer vetor de clonagem conveniente. Em alguns aspectos preferidos, os clones são mantidos em vetor de plasmídeo de clonagem/expressão, qualquer um deles podendo ser propagado em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica adequada.

Moléculas de ácido nucléico knockdown incluem cDNA, DNA genômico, RNA e fragmentos destes que podem ser de fita simples, dupla ou até mesmo tripla. Dessa forma, esta invenção fornece oligonucleotídeos (fitas senso ou anti-senso de DNA ou RNA) que possuem seqüências capazes de hibridizar com pelo menos uma seqüência de uma molécula de ácido nucléico da presente invenção, em particular, os IDS. DE SEQ. Nos: 1, 3 ou 5. Esses oligonucleotídeos são úteis como sondas para a detecção de genes que codificam endosialina, ou para a regulação positiva ou negativa da expressão de genes que codificam endosialina na tradução ou antes da tradução do mRNA na proteína. Métodos nos quais oligonucleotídeos ou polinucleotídeos podem ser utilizados como sondas para esses ensaios incluem, sem limitação: (1) hibridização in situ; (2) hibridização southern; (3) hibridização northern; e (4) reações variadas de amplificação como, por exemplo, reações em cadeia de polimerase (PCR) e reação em cadeia de ligase (LCR).

Também são apresentados de acordo com a presente invenção vetores e kits para a produção de células hospedeiras transgênicas que compreendem um polinucleotídeo que codifica uma seqüência reguladora para a inibição da expressão de endosialina, ou homólogo, análogo ou variante desta, em uma orientação senso ou anti-senso, ou uma construção sob controle de uma célula ou de promotores tecido-específicos e/ou outras seqüências reguladoras. Esses vetores são adequados à modulação e, preferivelmente, inibição da expressão de endosialina.

Células hospedeiras adequadas incluem, sem limitação, células de plantas, células bacterianas, leveduras e outras células fúngicas, células de insetos e células de mamíferos que expressam endosialina. As células podem ser transformadas de forma neoplásica. Preferem-se células humanas.

Vetores para a transformação de uma ampla variedade dessas células hospedeiras são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Eles incluem, sem limitação, plasmídeos, fagomídeos, cosmídeos, baculovírus, bacmídeos, cromossomos artificiais bacterianos (BACs), cromossomos artificiais de levedura (YACs), bem como quaisquer outros vetores bacterianos, de levedura e virais.

A região codificadora de uma seqüência reguladora pode ser colocada sob um promotor constitutivo poderoso, tais como os promotores para os seguintes genes: hipoxantina fosforibosil transferase (HPRT), adenosina desaminase, piruvato quinase, beta-actina, miosina humana, hemoglobina humana, creatina muscular humana, e outros. Além disso, muitos promotores virais funcionam constitutivamente em células eucarióticas e são adequados para uso na presente invenção. Esses promotores virais incluem, sem limitação, promotor precoce imediato do citomegalovírus (CMV), os promotores precoces e tardios de SV40, o promotor do vírus do tumor mamário do camundongo (MMTV), as repetições terminais longas (LTRs) do vírus da leucemia de Maloney, o vírus da imunodeficiência humana (HIV), o vírus de Epstein-Barr (EBV), o vírus do sarcoma de Rous (RSV), e outros retrovírus, e o promotor de timidina quinase do vírus do herpes simples. Outros promotores são conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Em uma modalidade, a região codificadora da seqüência reguladora é colocada sob um promotor indutível como, por exemplo, o promotor de metalotioneína, promotor indutível de tetraciclina, o promotor indutível de doxiciclina, promotores que contêm um ou mais elementos de resposta estimulada por interferon (ISRE) como, por exemplo, proteína quinase R 2',5'-oligoadenilato sintetases, genes Mx, ADAR1, e semelhantes. Outros promotores indutíveis adequados serão conhecidos por aqueles habilitados na técnica.

Os vetores de knockdown podem ser usados para transformar várias células que expressam endosialina com seqüências reguladoras de ácidos nucléicos. Diversas metodologias são conhecidas na técnica para a introdução de genes estranhos em células, e podem ser usadas para construir células recombinantes com a finalidade de realizar os métodos da invenção, de acordo com as várias modalidades da invenção. A técnica usada deve permitir a transferência estável da seqüência gênica heteróloga para a célula hospedeira, de tal forma que a seqüência gênica heteróloga seja herdável e expressável pela prole da célula e, portanto, as funções de desenvolvimento e fisiológicas necessárias das células receptoras não sejam rompidas. As técnicas que podem ser usadas incluem, sem limitação, transferência de cromossomo (por exemplo, fusão de célula, transferência gênica mediada por cromossomo, transferência gênica mediada por microcélula), métodos físicos (por exemplo, transfecção, fusão de esferoplasto, microinjeção, eletroporação, transportador de lipossomo), transferência de vetor viral (por exemplo, vírus de DNA recombinante, vírus de RNA recombinante), e semelhantes (descritas em Cline (1985) Pharmac. Ther., 29: 69-92).

Células kockdown com a expressão de endosialina inibida podem ser criadas por inibição da tradução do mRNA que codifica a proteína de transporte por "silenciamento gênico pós-transcrição".

O gene da espécie visada para infra-regulação, ou um fragmento deste, pode ser utilizado para controlar a produção da proteína codificada. Moléculas anti-senso de comprimento total podem ser usadas para essa finalidade. Alternativamente, oligonucleotídeos anti-senso direcionados a regiões específicas do mRNA que são críticas para a tradução podem ser utilizados. Moléculas anti-senso podem ser fornecidas in situ por transformação de células com uma construção de DNA que, mediante transcrição, produz as seqüências de RNA anti-senso. Essas construções podem ser projetadas para produzir seqüências anti-senso de comprimento total ou parcial. Esse efeito de silenciamento gênico pode ser aumentado por superprodução transgênica de RNA senso e anti-senso da seqüência gênica codificadora, de tal forma que seja produzida uma quantidade elevada de dsRNA (por exemplo, veja Waterhouse e cols. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 95: 13.959-64). A esse respeito, verificou-se que seqüências que contêm dsRNA que correspondem a parte ou todo (pelo menos) um íntron são particularmente eficazes. Em uma modalidade, parte ou toda a fita anti-senso da seqüência codificadora é expressa por um transgene. Em outra modalidade, as fitas senso e anti-senso de hibridização de parte ou de toda a seqüência codificadora por uma endosialina são expressas transgenicamente.

Células que podem ser direcionadas ou de algum outro modo usadas nos métodos da invenção incluem células que expressam endosialina que expressam endosialina naturalmente ou células transfectadas com um plasmídeo recombinante que expressa endosialina. As células primárias que expressam endosialina da invenção podem ser isoladas de tecidos ou adquiridas de vários vendedores que comercializam células endoteliais como, por exemplo, sem limitação, HUVEC ou HMVEC, além de fibroblastos primários e cultivados. As células transfectadas da invenção incluem qualquer linhagem de células de expressão de inseto conhecida como, por exemplo, células de Spodoptera frugiperda. As linhagens de células de expressão também podem ser linhagens de células de levedura como, por exemplo, células de Saccharomyces cerevisiae e de Schizosaccharomyces pombe. As células de expressão também podem ser células de mamíferos como, por exemplo, células de ovário de hamster chinês, células de rim de filhote de hamster, linhagem de células de rim embrionário humano 293, linhagens de células do rim normal do cão, linhagens de células do rim normal do gato, células do rim de macaco, células do rim de macaco verde africano, células COS e células mioblásticas não tumorigênicas de camundongo G8, linhagens celulares de fibroblasto, linhagens de células de mieloma, células de camundongo NIH/3T3, células LMTK, células de Sertoli de camundongo, células de carcinoma cervical humano, células do fígado de rato búfalo, células pulmonares humana, células hepáticas humanas, células de tumor mamário de camundongo, células TRI, células MRC 5 e células FS4.

A inibição da expressão de endosialina inibe a interação de endosialina com qualquer ligante de endosialina. Ligantes de endosialina incluem proteínas da matriz extracelular como, por exemplo, fibronectina e colágeno.

Também são apresentados de acordo com a presente invenção métodos para a inibição da interação de endosialina expressa por uma célula que expressa endosialina com um ligante de endosialina, que compreendem o bloqueio ou obstrução da expressão de endosialina pela célula. Dessa forma, por exemplo, uma barreira física serve para inibir, impedir ou de algum outro modo impedir a interação de endosialina expressa com um ligante de endosialina. Qualquer substância química ou biomolécula pode servir para obstruir essa interação. Por exemplo, pequenas moléculas, polipeptídeos, anticorpos, e fragmentos de ligação de antígeno destes que se ligam especificamente à endosialina ou, na alternativa, se ligam especificamente a um ligante de endosialina, pode ser usada nesses métodos.

Em algumas modalidades preferidas, a inibição da interação de uma célula que expressa endosialina com um ligante para endosialina compreende a inibição da ligação do ligante de endosialina à endosialina expressa. Por exemplo, a interação entre endosialina e seu ligante é evitada, bloqueada, impedida, ou de alguma outra forma obstruída com uma barreira molecular. Dessa forma, o acesso à célula pelo ligante é, dessa forma, evitado, inibido, bloqueado, impedido, obstruído ou prevenido.

A obstrução da endosialina pode ocorrer por qualquer meio adequado na técnica, por exemplo, com uma substância química ou biomolécula.

Por exemplo, substâncias químicas adequadas para uso nos métodos da invenção incluem, sem limitação, estruturas de aminoácido, esteróides, ciclinas, antracenos, metais pesados, quinilona, terpenos, fenólicos, glicosídeos, alcalóides, lipídeos etc., ou misturas destes, que possam exercer um efeito biológico sobre células que expressam endosialina. Substâncias químicas podem ser geradas por síntese química ou derivadas de biocatálise ou derivadas de líquidos biológicos. As substâncias químicas podem ser derivadas do ser humano, de mamíferos não humanos, de plantas, leveduras, fungos e/ou de fontes procarióticas.

Em algumas modalidades, são empregados inibidores competitivos para inibir a interação de endosialina ou de uma célula que expressa endosialina com um ligante para endosialina. Um "inibidor competitivo" compete com o ligante pelo sítio de ligação à endosialina. Em algumas modalidades, os inibidores competitivos são ligantes de endosialina, por exemplo, colágeno (por exemplo, colágeno I ou IV) ou fibronectina, ou fragmentos de ligação de endosialina destes. Os inibidores competitivos mais preferidos são o fragmento do N-terminal de 70 kDa de fibronectina, o fragmento de ligação de gelatina de 45 kDa de fibronectina e o fragmento de ligação de heparina de 30 kDa de fibronectina.

Em modalidades altamente preferidas, anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno destes são usados para obstruir a interação de endosialina expressa com ligantes de endosialina. Os anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno podem ser específicos para um epitopo na endosialina, ou podem ser específicos para um epitopo em um ligante de endosialina. Anticorpos e fragmentos de ligação de antígeno destes específicos para endosialina são mais preferidos. Anticorpos para os ligantes como, por exemplo, fibronectina, colágeno, e semelhantes, são disponíveis comercialmente.

Anticorpos adequados podem ser policlonais ou monoclonais, ou podem ser derivados ou fragmentos de anticorpos que retêm especificidade por endosialina ou por um ligante de endosialina. Os anticorpos podem ser de qualquer uma das cinco classes de anticorpos, ou seja, os isótipos IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Anticorpos adequados também incluem o isótipo IgY geralmente encontrado no soro de galinha ou peru e na gema do ovo de galinha ou peru.

Derivados e fragmentos de ligação de antígeno de anticorpos são adequados para uso nos métodos da invenção, e esses derivados compreendem porções de anticorpos intactos que retêm especificidade de ligação de antígeno da molécula de anticorpo parente. Por exemplo, derivados podem compreender pelo menos uma região variável (uma região variável de cadeia pesada ou de cadeia leve). Exemplos de derivados e fragmentos de anticorpo adequados incluem, sem limitação, anticorpos com especificidade poliepitópica, anticorpos biespecíficos, diabodies e moléculas de cadeia única, bem como moléculas Fab, F(ab’)2, Fd, Fabc e Fv, anticorpos de cadeia única (Sc), cadeias leves individuais de anticorpo, cadeias pesadas individuais de anticorpo, fusões quiméricas entre cadeias de anticorpo e outras moléculas, monômeros ou dímeros de cadeia pesada, monômeros ou dímeros de cadeia leve, dímeros que consistem em uma cadeia pesada e uma cadeia leve, e semelhantes. Todos os isótipos de anticorpos podem ser usados para produzir derivados e fragmentos de anticorpos. Derivados e fragmentos de anticorpos podem ser produzidos de forma recombinante.

Anticorpos adequados para uso nos métodos da invenção podem ser derivados de qualquer espécie. Por exemplo, os anticorpos podem ser de camundongo, rato, cabra, cavalo, suínos, bovinos, de galinha, coelho, macaco, humanos, e semelhantes. Para uso em métodos de tratamento, ou para administração a seres humanos, anticorpos derivados não humanos podem ser alterados estruturalmente para serem menos antigênicos mediante a administração a um paciente humano.

Dessa forma, em algumas modalidades da invenção, os anticorpos usados nos métodos da invenção são anticorpos quiméricos. Anticorpos quiméricos e métodos para sua produção são bem conhecidos e estabelecidos na técnica. Por exemplo, um anticorpo quimérico pode compreender um domínio de ligação de antígeno de camundongo com um domínio Fc humano ou outro domínio estrutural desse tipo.

Em algumas modalidades, os anticorpos são anticorpos humanizados. Anticorpos humanizados podem ser imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulinas ou fragmentos destas (por exemplo, Fv, Fab, Fab’, F(ab’)2 ou outras subseqüências de ligação de antígeno de anticorpos) que contêm uma seqüência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Em sua maior parte, anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) nas quais resíduos de uma complementaridade (CDR) do receptor são substituídos por resíduos de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo doador) como, por exemplo, de camundongo, rato ou coelho, que possui a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, resíduos da região Fv framework (FWR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor nem na CDR ou nas seqüências framework importadas. Essas modificações são feitas para refinar e otimizar ainda mais o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente tudo de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana, e todas ou substancialmente todas as regiões FWR são aquelas de uma seqüência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado otimamente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para mais detalhes, veja Jones e cols. (1986) Nature, 321: 522-5; Reichmann e cols. (1988) Nature, 332: 323-9; e Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-6.

Em aspectos preferidos da invenção, os anticorpos são totalmente humanos. Isso significa que o anticorpo é de origem unicamente humana, ou de algum outro modo consiste em uma seqüência de aminoácidos idêntica a uma forma humana do anticorpo.

Os anticorpos da invenção podem ser marcados ou de algum outro modo conjugados a várias porções químicas ou de biomolécula, por exemplo, para aplicações terapêuticas ou diagnósticas. As porções podem ser citotóxicas, por exemplo, toxinas bacterianas, toxinas virais, radioisótopos, e semelhantes. As porções podem ser marcadores detectáveis, por exemplo, marcadores fluorescentes, marcadores radioativos, biotina, e semelhantes. Porções adicionais incluem, sem limitação, glicosilação, acetilação, peguilação, fosforilação e amidação. Os anticorpos úteis nos métodos da invenção podem, eles próprios, ser derivatizados por grupos de proteção/bloqueio conhecidos, clivagem proteolítica, ligação a um ligante celular ou a outras proteínas, e semelhantes.

Aqueles habilitados na técnica reconhecerão que a especificidade de anticorpo é determinada primariamente pelas seis regiões CDR, especialmente a CDR3 da cadeia H (Kala e cols. (2002) J. Biochem., 132: 535-41; Morea e cols. (1998) J. Mol. Biol., 275: 269-94; e, Chothia e cols. (1987) J. Mol. Biol., 196: 901-17). Regiões framework do anticorpo, no entanto, podem ter uma participação nas interações antígeno-anticorpo (Panka e cols. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 3.080-4), particularmente com relação à sua participação na conformação de alças de CDR (Foote e cols. (1992) J. Mol. Biol., 224: 487-99). Dessa forma, anticorpos adequados para uso nos métodos da invenção podem compreender qualquer combinação de CDR da cadeia H ou L ou regiões FWR que conferem especificidade de anticorpo para endosialina ou ligantes de endosialina.

Em algumas modalidades, a invenção contempla o uso de anticorpos humanos isolados e fragmentos de ligação de antígeno destes que se ligam especificamente à endosialina. Em algumas modalidades, anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno adequados podem compreender uma cadeia pesada que compreende CDR1, CDR2 e CDR3 do ID. DE SEQ. N°: 28, 30 e 32, respectivamente, e uma cadeia leve que compreende CDR1, CDR2 e CDR3 do ID. DE SEQ. N°: 13, 15 e 17, respectivamente. Em algumas modalidades, as CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada são codificadas por seqüências de nucleotídeos do ID. DE SEQ. N°: 27, 29 e 31, respectivamente. Em algumas modalidades, as CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve são codificadas por seqüências de nucleotídeos do ID. DE SEQ. N°: 12, 14 e 16, respectivamente. Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno podem compreender uma cadeia pesada que compreende um domínio variável do ID. DE SEQ. N°: 34 e uma cadeia leve que compreende um domínio variável do ID. DE SEQ. N°: 19. Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia pesada é codificado pela seqüência de nucleotídeos do ID. DE SEQ. N°: 33. Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia leve é codificado pela seqüência de nucleotídeos do ID. DE SEQ. N°: 18. Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno podem compreender uma cadeia pesada que compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 22 ou 2 6 e uma cadeia leve que compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 11.

Em algumas modalidades, a cadeia pesada é codificada pela seqüência de nucleotídeos do ID. DE SEQ. N°: 21 ou 25 e a cadeia leve é codificada pela seqüência de nucleotídeos do ID. DE SEQ. N°: 10. Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno compreendem uma cadeia pesada que compreende o ID. DE SEQ. N°: 20 ou 24 e uma cadeia leve que compreende o ID. DE SEQ. N°: 9. Em algumas modalidades, os anticorpos compreendem uma cadeia pesada codificada pela seqüência de ácidos nucléicos do ID. DE SEQ. N°: 8 ou 23. Anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno podem compreender uma cadeia leve codificada pela seqüência de ácidos nucléicos que compreende o ID. DE SEQ. N°: 7.

Células produtoras de anticorpos que produzem anticorpos que podem ser usados de acordo com a invenção foram depositadas na "Amer. Type Cult. Coll." (10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209) em 24 de abril de 2006 e em 11 de março de 2008 e receberam os Nos de Acesso PTA-7554 e PTA-9017, respectivamente.

Deve-se entender que, por causa da variação de seqüências natural que provavelmente existe entre cadeias pesadas e leves e os genes que as codificam, aqueles habilitados na técnica esperariam encontrar algum nível de variação dentro das seqüências de aminoácidos ou dos genes que as codificam, embora ainda mantendo as propriedades de ligação únicas (por exemplo, especificidade e afinidade) dos anticorpos da presente invenção. Essa expectativa é causada, em parte, pela degeneração do código genético, bem como pelo sucesso evolucionário conhecido de variações conservadoras de seqüências de aminoácidos, que não alteram apreciavelmente a natureza da proteína codificada. Conseqüentemente, essas variantes e esses homólogos são considerados substancialmente iguais entre eles e são incluídos dentro do escopo da presente invenção.

Variantes que possuem substituições, eliminações, adições ou trocas de aminoácidos únicas ou múltiplas que retenham as propriedades biológicas (por exemplo, afinidade de ligação ou atividade imune efetora) dos anticorpos aqui descritos são contempladas para uso na invenção. Aqueles habilitados na técnica podem produzir variantes que possuam substituições, eliminações, adições ou trocas de aminoácidos únicas ou múltiplas. Essas variantes podem incluir, por exemplo: (a) variantes nas quais um ou mais resíduos de aminoácidos são substituídos com aminoácidos conservadores ou não conservadores, (b) variantes nas quais um ou mais aminoácidos são adicionados ou eliminados do polipeptídeo, (c) variantes nas quais um ou mais aminoácidos incluem um grupo substituinte, e (d) variantes nas quais o polipeptídeo é fundido com outro peptídeo ou polipeptídeo como, por exemplo, um parceiro de fusão, um tag de proteína ou outra porção química, que podem conferir propriedades úteis ao polipeptídeo como, por exemplo, um epitopo para um anticorpo, uma seqüência de polihistidina, uma porção de biotina, e semelhantes. Os anticorpos da invenção podem incluir variantes nas quais resíduos de aminoácidos de uma espécie são substituídos pelos resíduos correspondentes em outra espécie, nas posições conservadas ou não conservadas. Em outras modalidades, resíduos de aminoácidos em posições não conservadas são substituídos com resíduos conservadores ou não conservadores. As metodologias para obtenção dessas variantes, incluindo técnicas genéticas (supressões, eliminações, mutações etc.), químicas e enzimáticas, são conhecidas por aqueles habilitados na técnica.

A presente invenção contempla anticorpos, ou fragmentos de ligação de antígeno destes, que possuem seqüências de aminoácidos que são substancialmente iguais às seqüências de aminoácidos descritas previamente. Por exemplo, esses anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno podem incluir aqueles nos quais as CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada são pelo menos 90% idênticas ao ID. DE SEQ. N°: 28, 30 e 32, respectivamente, e/ou nos quais as CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve são pelo menos 90% idênticas ao ID. DE SEQ. N°: 13, 15 e 17, respectivamente. Em algumas modalidades, esses anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno podem incluir aqueles nos quais o domínio variável da cadeia pesada é pelo menos 90% idêntico ao ID. DE SEQ. N°: 34 e/ou nos quais o domínio variável da cadeia leve é pelo menos 90% idêntico ao ID. DE SEQ. N°: 19. Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno podem incluir aqueles nos quais a cadeia pesada é pelo menos 90% idêntica ao ID. DE SEQ. N°: 22 ou 26 e/ou nos quais a cadeia leve é pelo menos 90% idêntica ao ID. DE SEQ. N°: 11. Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno podem incluir aqueles nos quais a cadeia pesada é pelo menos 90% idêntica ao ID. DE SEQ. N°: 20 ou 24 e/ou nos quais a cadeia leve é pelo menos 90% idêntica ao ID. DE SEQ. N°: 9. Por exemplo, os anticorpos M4 e M4.1 são anticorpos humanizados para endosialina humana. Embora os anticorpos M4 e M4.1 compartilhem uma seqüência de cadeia leve, eles diferem em sua cadeia pesada por uma única seqüência de aminoácidos mostrada, por exemplo, no resíduo 429 do ID. DE SEQ. N°: 20 em relação ao resíduo 429 do ID. DE SEQ. N°: 24. A invenção ainda contempla anticorpos, ou fragmentos de ligação de antígeno destes, que competem quanto à ligação à endosialina com o anticorpo M4 ou M4.1. A invenção ainda contempla anticorpos, ou fragmentos de ligação de antígeno destes, que se ligam ao mesmo epitopo de endosialina que o anticorpo M4 ou M4.1.

Anticorpos adequados para uso nos métodos da invenção podem ter afinidades de ligação pelo antígeno-alvo como, por exemplo, endosialina ou um ligante de endosialina, que incluem uma constante de dissociação (Kd) de menos de 1 x 10-2 M. Em algumas modalidades, a Kd é de menos de 1 x 10-3 M. Em outras modalidades, a Kd é de menos de 1 x 10-4 M. Em algumas modalidades, a Kd é de menos de 1 x 10-5 M. Ainda em outras modalidades, a Kd é de menos de 1 x 10-6 M. Em outras modalidades, a Kd é de menos de 1 x 10-7 M. Em outras modalidades, a Kd é de menos de 1 x 10-8 M. Em outras modalidades, a Kd é de menos de 1 x 10-9 M. Em outras modalidades, a Kd é de menos de 1 x 10-19 M. Ainda em outras modalidades, a Kd é de menos de 1 x 10-11 M. Em algumas modalidades, a Kd é de menos de 1 x 10-12 M. Em outras modalidades, a Kd é de menos de 1 x 10-13 M. Em outras modalidades, a Kd é de menos de 1 x 10-14 M. Ainda em outras modalidades, a Kd é de menos de 1 x 10-15 M.

A especificidade e/ou a afinidade de anticorpos que se ligam à endosialina podem opcionalmente ser otimizadas por evolução dirigida das células que produzem o anticorpo, pela utilização de um alelo negativo dominante de um gene de reparo de não combinação como, por exemplo, PMS1, PMS2, PMS2-134, PMSR2, PMSR3, MLH1, MLH2, MLH3, MLH4, MLH5, MLH6, PMSL9, MSH, e MSH2, introduzido nas células produtoras de anticorpo. As células que contêm o mutante negativo dominante se tornarão hipermutáveis e acumularão mutações em uma taxa mais elevada do que células de controle não transfectadas. Um pool das células mutantes pode ser pesquisado em busca de clones que produzam afinidade/especificidade maior de anticorpos ou proteínas de ligação, ou que produzam titulações maiores de anticorpos ou proteínas de ligação, ou que simplesmente cresçam mais rápido ou melhor sob certas condições. A técnica para a geração de células hipermutáveis com o uso de alelos negativos dominantes de genes de reparo de não combinação é descrita na Patente U.S. N° 6.146.894. Alternativamente, o reparo de não combinação pode ser inibido com o uso de inibidores químicos do reparo de não combinação descritos em WO 02/054856. A técnica para o aprimoramento de anticorpos usando os alelos negativos dominantes de genes de reparo de não combinação ou inibidores químicos de reparo de não combinação pode ser aplicada às células de expressão de mamíferos, levedura, planta ou procarióticas que também expressam genes clonados de imunoglobulina ou proteína. As células que expressam os alelos negativos dominantes ou pequena molécula podem ser "curadas", em que o alelo negativo dominante pode ser desligado, se indutível, eliminado da célula, enquanto a pequena substância química pode ser removida da cultura de crescimento, o que resulta em células que são mais uma vez geneticamente estáveis e não acumulam mais mutações na taxa anormalmente elevada.

A inibição da expressão de endosialina inibe a interação de endosialina com qualquer ligante de endosialina. Ligantes de endosialina incluem proteínas da matriz extracelular como, por exemplo, fibronectina e colágeno. Qualquer subtipo de colágeno pode servir como um ligante para endosialina. Colágeno I e Colágeno IV são mais preferidos.

A inibição da interação de endosialina com ligantes de endosialina inibe vias e cascatas que são supra-reguladas ou de alguma outra forma ativadas em conseqüência dessa interação. Por exemplo, a interação de endosialina com ligantes de endosialina pode promover a expressão e/ou ativação de moléculas de adesão como, por exemplo, integrinas, que medeiam a adesão da célula à matriz extracelular ou a outras células, e que medeiam as vias de sinalização celular, entre outras coisas.

As integrinas tendem a existir como heterodímeros que contêm duas cadeias distintas, uma subunidade α (alfa) e uma subunidade β (beta). Há aproximadamente 18 subunidades α e 8 subunidades β que foram caracterizadas. Além disso, diversas subunidades de integrina existem como variantes por meio de splicing diferencial. As várias combinações de subunidades de integrina alfa e beta resultam em mais de 24 complexos ativos de integrina únicos (Hynes (2002) Cell, 110: 673). As subunidades de integrina penetram na membrana plasmática e, em geral, contêm domínios citoplasmáticos curtos de cerca de 40-70 aminoácidos. Fora da membrana plasmática da célula, as cadeias alfa e beta se situam bem próximas entre elas ao longo de um comprimento de cerca de 23 nm. Os terminais amino de cada cadeia de integrina estão justapostos em 5 nm entre eles para formar uma região de ligação de ligante para interação de EMP. As integrinas são categorizadas com o uso de vários critérios. As cadeias alfa são classificadas como tal porque um subconjunto das cadeias α possui elementos estruturais inseridos perto do terminal amino denominado domínio alfa-A, pois ele possui um motivo estrutural similar aos domínios A dentro do fator de von Willebrand. As integrinas que carregam esse domínio podem se ligar aos colágenos (complexos de integrina α1β1 e α2β1), ou atuar como moléculas de adesão célula-célula com aqueles complexos que contêm integrinas da família β2. As duas funções principais das integrinas são a adesão da célula às proteínas da matriz extracelular e a transdução de sinal mediado pela ligação de EMP-integrina à célula. Além disso, as integrinas também estão envolvidas em uma ampla gama de outras atividades biológicas, incluindo ligação de vírus, por exemplo, adenovírus, vírus Echo, vírus Hanta, vírus da febre aftosa, bem como ligação às células envolvidas no patrulhamento imunológico e contato célula-célula para migração celular. As integrinas acoplam EMPs (o que depende do complexo de integrina) ao citoesqueleto dentro da célula. Foram identificados vários ligantes de integrinas. Os ligantes mais comuns são fibronectina, vitronectina, colágeno e laminina. As interações entre integrina, uma EMP e os microfilamentos dentro da célula estão ligadas por meio de proteínas do arcabouço que incluem talina, paxilina e alfa-actinina. Essas interações resultam na regulação de quinases como FAK (quinase de adesão focal) e membros da família Src quinase para a fosforilação de substratos como, por exemplo, p130CAS, recrutando, dessa forma, adaptadores da sinalização como, por exemplo, Crk, para mediação de respostas celulares que incluem ativação da via, proliferação e/ou sobrevida celular. Qualquer uma dessas funções associadas à integrina pode ser montada como um ensaio de rastreamento para monitorar a atividade de integrina como uma função da atividade de endosialina para ensaios a fim de identificar agentes farmacológicos ou moléculas de direcionamento de endosialina eficazes desta invenção. Além disso, à luz do que foi revelado pela invenção, o direcionamento de integrinas com agentes farmacológicos à endosialina em células que expressam endosialina possui oportunidades amplas na supressão de infecções virais e outras patologias mediadas pelas integrinas.

Dessa forma, a inibição da interação de endosialina com um ligante de endosialina inibe a expressão e/ou ativação das moléculas de integrina na célula que expressa endosialina. Em algumas modalidades preferidas, a expressão ou ativação da integrina β1, β2 ou β3 é suprimida pela inibição.

Outras moléculas e vias cuja expressão e/ou ativação são afetadas pela inibição da interação de endosialina com ligantes de endosialina incluem metaloproteinases da matriz (MMPs). MMPs são proteases dependentes de zinco que participam, entre outras coisas, da degradação de proteínas da matriz extracelular, receptores da superfície celular, e semelhantes. MMPs participam da migração celular, proliferação e angiogênese, entre outras coisas. A família de enzimas MMP possui um motivo de ligação de zinco comum (HExxHxxGxxH) dentro de seu sítio ativo, e uma metionina conservada após o sítio ativo. MMPs são classificadas por sua homologia entre elas, especificidade de substrato e parcialmente quanto à sua localização celular. Elas são agrupadas de forma ampla em 4 classes: colagenase, estromelisinas, gelatinase e as MMPs do tipo membrana (MT-MMPs). MMPs do tipo colagenase são capazes de degradar colágenos fibrilares de hélice tripla em fragmentos distintos. Esses colágenos são os componentes principais do osso e cartilagem, e essa classe de MMPs forma as únicas enzimas de mamíferos conhecidas capazes de degradá-los. Elas incluem MMP-1 (colagenase intersticial); MMP-8 (colagenase de neutrófilo); MMP-13 (Colagenase 3); e MMP-18. As enzimas MMP do tipo estromelisina exibem uma ampla habilidade para clivar EMPs, mas são incapazes de clivar os colágenos fibrilares de hélice tripla. Essa classe inclui MMP-3 (estromelisina 1); MMP-10 (estromelisina 2); MMP-11 (estromelisina 3); MMP-12 (metaloelastase de macrófago); MMP-19 (RASI-1, também denominada estromelisina-4); e MMP-20 (enamelisina); MMP-22 (C-MMP) e MMP-27. MMPs do tipo gelatinase degradam principalmente colágeno do tipo IV e gelatina, e são distinguidas pela presença de um domínio adicional inserido no domínio catalítico. Essa região de ligação de gelatina está posicionada imediatamente antes do motivo de ligação de zinco, e forma uma unidade de dobragem separada que não rompe a estrutura do domínio catalítico. Essa classe inclui MMP-2 (gelatinase de 72 kDa, gelatinase-A); MMP-9 (gelatinase de 92 kDa, gelatinase-B). Finalmente, as MMPs ligadas à membrana são aquelas que estão anexadas à membrana celular externa. Elas incluem: o arranjo de cisteína transmembrana do tipo II MMP-23; as MMPs anexadas ao glicosil fosfatidilinositol 17 e 25 (MT4-MMP e MT6-MMP, respectivamente),· e as MMPs transmembrana do tipo I 14, 15, 16, 24 (MT1-MMP, MT2-MMP, MT3-MMP e MT5-MMP, respectivamente). Todas essas MMPs possuem um sítio de clivagem de furina no pró-peptídeo, que é uma característica também compartilhada por MMP-11.

Dessa forma, a inibição da interação de endosialina com um ligante de endosialina inibe a expressão e/ou ativação de MMPs na célula que expressa endosialina. Em algumas modalidades preferidas, a expressão ou ativação de MMP-1, MMP-2, MMP-8, MMP-9, MMP-12, MMP-13, ou MMP-18 é suprimida pela inibição.

Sem se prender a uma teoria ou mecanismo de operação em particular, acredita-se que a endosialina funcione direta ou indiretamente na angiogênese, particularmente com relação à neovascularização e doenças como o câncer. Portanto, acredita-se que a ruptura da ligação de endosialina ou de células que expressam endosialina aos ligantes de endosialina, ou a ruptura da ativação de integrinas, expressão de MMPs e/ou proliferação/sobrevida celular mediadas por endosialina, possa suprimir a vascularização associada à doença neovascular.

Conseqüentemente, a invenção também apresenta métodos para a inibição de angiogênese. Os métodos podem ser realizados in vitro ou in vivo. Em um aspecto, os métodos para a inibição de angiogênese compreendem a administração a um indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição que obstrui a endosialina expressa na superfície de uma célula, em que a referida obstrução inibe a interação da referida célula com um ligante para endosialina, e em que a inibição da referida interação da referida célula com o referido ligante inibe a angiogênese de um tecido, um órgão ou uma neoplasia no indivíduo.

Em outro aspecto, os métodos para a inibição de angiogênese compreendem o contato de uma célula, cultura de células, tecido ou órgão com uma composição que obstrui a endosialina expressa na superfície de uma célula, em que a referida obstrução inibe a interação da referida célula com um ligante para endosialina, e em que a inibição da referida interação da referida célula com o referido ligante inibe a angiogênese pela referida célula, cultura de células, tecido, ou órgão.

Em algumas modalidades preferidas, a composição compreende pelo menos um inibidor competitivo aqui descrito. Em algumas modalidades, os inibidores competitivos são ligantes de endosialina, por exemplo, colágeno, fibronectina ou fragmentos de ligação de endosialina destes. Inibidores competitivos preferidos são fragmentos de colágeno I, colágeno IV ou fibronectina. Os inibidores competitivos mais preferidos são o fragmento do N-terminal de 70 kDa de fibronectina, o fragmento de ligação de gelatina de 45 kDa de fibronectina e o fragmento de ligação de heparina de 30 kDa de fibronectina.

Em modalidades preferidas, a composição compreende pelo menos um anticorpo que se liga especificamente à endosialina. Esses anticorpos preferivelmente possuem uma afinidade por endosialina que é menor do que cerca de 1 x 10-7 M, mais preferivelmente menor do que cerca de 1 x 10-8 M, mais preferivelmente menor do que cerca de 1 x 10-9 M e, mais preferivelmente, menor do que cerca de 1 x 10-10 M. Anticorpos que se ligam especificamente à endosialina podem incluir aqueles anticorpos cujas características são aqui descritas e exemplificadas. Por exemplo, em alguns aspectos preferidos, o anticorpo que se liga especificamente à endosialina compreende uma cadeia pesada que compreende CDR1, CDR2 e CDR3 do ID. DE SEQ. N°: 28, 30 e 32, respectivamente, e uma cadeia leve que compreende CDR1, CDR2 e CDR3 do ID. DE SEQ. N°: 13, 15 e 17, respectivamente. Em algumas modalidades, as CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada são codificadas por seqüências de nucleotídeos do ID. DE SEQ. N°: 27, 29 e 31, respectivamente. Em algumas modalidades, as CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve são codificadas por seqüências de nucleotídeos do ID. DE SEQ. N°: 12, 14 e 16, respectivamente. Em algumas modalidades, os anticorpos podem compreender uma cadeia pesada que compreende um domínio variável do ID. DE SEQ. N°: 34 e uma cadeia leve que compreende um domínio variável do ID. DE SEQ. N°: 19. Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia pesada é codificado pela seqüência de nucleotídeos do ID. DE SEQ. N°: 33. Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia leve é codificado pela seqüência de nucleotídeos do ID. DE SEQ. N°: 18. Em algumas modalidades, os anticorpos podem compreender uma cadeia pesada que compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 22 ou 26 e uma cadeia leve que compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 11. Em algumas modalidades, a cadeia pesada é codificada pela seqüência de nucleotídeos do ID. DE SEQ. N°: 21 ou 25, e a cadeia leve é codificada pela seqüência de nucleotídeos do ID. DE SEQ. N°: 10. Em algumas modalidades, os anticorpos compreendem uma cadeia pesada que compreende o ID. DE SEQ. N°: 20 ou 24 e uma cadeia leve que compreende o ID. DE SEQ. N°: 9. Em algumas modalidades, os anticorpos compreendem uma cadeia pesada codificada pela seqüência de ácidos nucléicos do ID. DE SEQ. N°: 8 ou 23. Anticorpos podem compreender uma cadeia leve codificada pela seqüência de ácidos nucléicos que compreende o ID. DE SEQ. N°: 7. As células produtoras de anticorpos que produzem os anticorpos que podem ser usados de acordo com a invenção foram depositadas na "Amer. Type Cult. Coll." (10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209) em 24 de abril de 2006 e em 11 de março de 2008, e receberam os Nos de Acesso PTA-7554 e PTA-9017, respectivamente. Os anticorpos podem ser policlonais, monoclonais, fragmentos de ligação de antígeno, quiméricos, humanizados, totalmente humanos, e semelhantes, como aqui descrito.

A inibição da expressão de endosialina inibe a interação de endosialina com qualquer ligante de endosialina. Ligantes de endosialina incluem proteínas da matriz extracelular como, por exemplo, fibronectina e colágeno.

A invenção também apresenta métodos para a inibição de neovascularização. Os métodos podem ser realizados in vitro ou in vivo. Em um aspecto, os métodos para a inibição de neovascularização compreendem a administração a um indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição que obstrui a endosialina expressa na superfície de uma célula, em que a referida obstrução inibe a interação da referida célula com um ligante para endosialina, e em que a inibição da referida interação da referida célula com o referido ligante inibe a neovascularização de um tecido, um órgão ou uma neoplasia no indivíduo.

Em outro aspecto, os métodos para a inibição de neovascularização compreendem o contato de uma célula, cultura de células, tecido ou órgão com uma composição que obstrui a endosialina expressa na superfície de uma célula, em que a referida obstrução inibe a interação da referida célula com um ligante para endosialina, e em que a inibição da referida interação da referida célula com o referido ligante inibe a neovascularização da referida célula, cultura de células, tecido, ou órgão.

Em algumas modalidades preferidas, a composição compreende pelo menos um inibidor competitivo aqui descrito. Em algumas modalidades, os inibidores competitivos são ligantes de endosialina, por exemplo, colágeno, fibronectina ou fragmentos de ligação de endosialina destas. Inibidores competitivos preferidos são fragmentos de colágeno I, colágeno IV ou fibronectina. Os inibidores competitivos mais preferidos são o fragmento do N-terminal de 70 kDa de fibronectina, o fragmento de ligação de gelatina de 45 kDa de fibronectina e o fragmento de ligação de heparina de 30 kDa de fibronectina.

Em modalidades preferidas, a composição compreende pelo menos um anticorpo que se liga especificamente à endosialina. Esses anticorpos preferivelmente possuem uma afinidade por endosialina que é menor do que cerca de 1 x 10-7 M, mais preferivelmente menor do que cerca de 1 x 10-8 M, mais preferivelmente menor do que cerca de 1 x 10-9 M e, mais preferivelmente, menor do que cerca de 1 x 10-10 M. Anticorpos que se ligam especificamente à endosialina podem incluir aqueles anticorpos cujas características são aqui descritas e exemplificadas. Por exemplo, em alguns aspectos preferidos, o anticorpo que se liga especificamente à endosialina compreende uma cadeia pesada que compreende CDR1, CDR2 e CDR3 do ID. DE SEQ. N°: 28, 30 e 32, respectivamente, e uma cadeia leve que compreende CDR1, CDR2 e CDR3 do ID. DE SEQ. N°: 13, 15 e 17, respectivamente. Em algumas modalidades, as CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada são codificadas por seqüências de nucleotídeos do ID. DE SEQ. N°: 27, 29 e 31, respectivamente. Em algumas modalidades, as CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve são codificadas por seqüências de nucleotídeos do ID. DE SEQ. N°: 12, 14 e 16, respectivamente. Em algumas modalidades, os anticorpos podem compreender uma cadeia pesada que compreende um domínio variável do ID. DE SEQ. N°: 34 e uma cadeia leve que compreende um domínio variável do ID. DE SEQ. N°: 19. Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia pesada é codificado pela seqüência de nucleotídeos do ID. DE SEQ. N°: 33. Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia leve é codificado pela seqüência de nucleotídeos do ID. DE SEQ. N°: 18. Em algumas modalidades, os anticorpos podem compreender uma cadeia pesada que compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 22 ou 26 e uma cadeia leve que compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 11. Em algumas modalidades, a cadeia pesada é codificada pela seqüência de nucleotídeos do ID. DE SEQ. N°: 21 ou 25 e a cadeia leve é codificada pela seqüência de nucleotídeos do ID. DE SEQ. N°: 10. Em algumas modalidades, os anticorpos compreendem uma cadeia pesada que compreende o ID. DE SEQ. N°: 20 ou 24 e uma cadeia leve que compreende o ID. DE SEQ. N°: 9. Em algumas modalidades, os anticorpos compreendem uma cadeia pesada codificada pela seqüência de ácidos nucléicos do ID. DE SEQ. N°: 8 ou 23. Anticorpos podem compreender uma cadeia leve codificada pela seqüência de ácidos nucléicos que compreende o ID. DE SEQ. N°: 7. As células produtoras de anticorpos que produzem os anticorpos que podem ser usados de acordo com a invenção foram depositadas na "Amer. Type Cult. Coll." (10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209) em 24 de abril de 2006 e em 11 de março de 2008, e receberam os Nos de Acesso PTA-7554 e PTA-9017, respectivamente. Os anticorpos podem ser policlonais, monoclonais, fragmentos de ligação de antígeno, quiméricos, humanizados, totalmente humanos, e semelhantes, como aqui descrito.

A inibição da expressão de endosialina inibe a interação de endosialina com qualquer ligante de endosialina. Ligantes de endosialina incluem proteínas da matriz extracelular como, por exemplo, fibronectina, por exemplo, fibronectina humana (ID. DE SEQ. N°: 35) e colágeno.

A invenção também apresenta ensaios e métodos para a identificação de agonistas e antagonistas da interação de endosialina com um ligante para endosialina. Em algumas modalidades, os métodos compreendem o contato da endosialina com um composto de teste, o contato do complexo endosialina-composto de teste com um ligante para endosialina, e a medida quantificável da interação de endosialina com o ligante na presença e na ausência do composto de teste. Um aumento ou uma diminuição no nível de interação de endosialina com ligante na presença do composto de teste indica que o composto de teste é um agonista ou antagonista, respectivamente, da interação de endosialina com o ligante.

Em algumas modalidades, os métodos compreendem o contato de uma célula que expressa endosialina com um composto de teste, o contato da célula que expressa endosialina com um ligante para endosialina, e a medida quantificável da expressão ou ativação das moléculas de integrina como, por exemplo, integrina β1, β2 ou β3, na célula na presença e na ausência do composto de teste. Um aumento ou uma diminuição no nível de expressão ou ativação das moléculas de integrina na célula na presença do composto de teste indica que o composto de teste é um agonista ou antagonista, respectivamente, da interação de endosialina com o referido ligante.

Nos ensaios da invenção, a endosialina pode estar ligada a uma membrana celular, de preferência a uma membrana celular de mamífero, a um fragmento da membrana celular, a uma bicamada lipídica artificial ou a um suporte sólido adequado. O ligante de endosialina pode ser uma proteína da matriz extracelular, incluindo, sem limitação, fibronectina ou colágeno.

Uma estratégia para a geração de compostos de teste com atividade biológica potencial contra endosialina ou células que expressam endosialina, ou seja, interação potencial com endosialina envolve, sem limitação, a avaliação de bibliotecas em fago que produzem peptídeos revestidos em fago que podem ser avaliados para a identificação de polipeptídeos em uma biblioteca que possam potencialmente servir para inibir a interação entre a endosialina e um ligante de endosialina.

Os exemplos a seguir são fornecidos para descrever a invenção em mais detalhes. Eles visam ilustrar, e não limitar, a invenção.

Exemplo 1 Análise imunoistoquímica da expressão de endosialina em tecido maligno

Uso de anticorpos para detectar células que expressam endosialina foi demonstrado por imunoistoquímica de tecidos malignos. O anticorpo anti-endosialina ou IgG normal foi aplicado a tecidos recém congelados de câncer cólon-retal humano em duas concentrações (0,5 µg/ml e 2,5 pg/ml). Solução salina tamponada com fosfato [PBS (NaCl 0,15 M, pH 7,2)] + albumina sérica bovina 1% serviram como diluente para os anticorpos primários. Os tecidos foram embebidos em meio de tecido Tissue-Tek® O.C.T., congelados em gelo seco, e armazenados em sacos plásticos lacrados abaixo de -70°C. Os tecidos foram cortados a aproximadamente 5 pm, e fixados por 10 minutos em acetona na temperatura ambiente. As lâminas foram armazenadas abaixo -70°C até a coloração. Imediatamente antes da coloração, as lâminas foram fixadas por 10 segundos em formalina 10% tamponada neutra.

Os cortes congelados foram enxaguados duas vezes em solução salina tamponada com fosfato (PBS [NaCl 0,15 M, pH 7,2]). Peroxidase endógena foi bloqueada por incubação das lâminas com a solução de peroxidase fornecida no kit EnVisionTM Dako por 5 minutos, e enxágüe duas vezes em PBS (NaCl 0,15 M, pH 7,2). A seguir, as lâminas foram tratadas com um bloqueio de proteína projetado para reduzir a ligação não específica por 20 minutos. O bloqueio de proteína foi preparado da seguinte forma: PBS (NaCl 0,15 M, pH 7,2); caseína 0,5%; albumina sérica bovina 1% (BSA); e soro de cabra normal 1,5%. Após o bloqueio de proteína, o anticorpo primário (artigo de teste M4, anticorpo de controle negativo, ou nenhum [somente tampão como o controle do ensaio]) foi aplicado em temperatura ambiente por uma hora. A seguir, as lâminas foram enxaguadas duas vezes com PBS (NaCl 0,15 M, pH 7,2), tratadas com o polímero anti-IgG de cabra marcado com peroxidase fornecido no kit EnVision™ Dako por 30 minutos (polímero EnVision™ usado na concentração fornecida pelo fabricante), enxaguadas duas vezes com PBS (NaCl 0,15 M, pH 7,2) e tratadas com a solução de substrato-cromógeno (DAB) fornecida no Kit EnVision™ Dako por 8 minutos. Todas as lâminas foram enxaguadas em água, contracoradas com hematoxilina, desidratadas e cobertas com lamínulas para interpretação. Como mostrado, os vasos no tumor (Figura 1A) coraram positivo para endosialina, enquanto os cortes seriais corados com anticorpo de controle de isótipo foram negativos (Figura 1B).

Exemplo 2 Análise imunoistoquímica da expressão de endosialina em tecido saudável

O uso de anticorpos para detectar células que expressam endosialina foi demonstrado por imunoistoquímica de tecidos normais. Resumidamente, amostras de tecido normal foram cortadas por cryostat e analisadas quanto à expressão de endosialina como descrito acima. Os tecidos normais continham muito poucos fibroblasto/células dendríticas-like que expressavam endosialina, embora de forma não tão robusta ou homogênea quanto observada nos vasos dentro de tumores (Figura 2A e B). Essas células são úteis para estudar os efeitos da neovascularização e podem ser isoladas para expressão gênica para estudar os perfis de crescimento celular, diferenciação, migração ou identificação de assinatura. Elas podem ser estudadas in vivo, ex vivo ou in vitro com o uso de métodos conhecidos por aqueles habilitados na técnica, bem como com aqueles listados abaixo.

Exemplo 3 Isolamento e enriquecimento de células que expressam endosialina

Para demonstrar que proteínas que podem se ligar à endosialina servem como uma forma eficaz para enriquecer células endoteliais ou fibroblasto-like que expressam endosialina, células endoteliais microvasculares humanas (HMVECs) foram estudadas com o uso de um anticorpo que pode se ligar à endosialina para isolar uma população enriquecida de células que expressam endosialina a partir de um pool de partida contendo 5-10% de células que expressam endosialina. Sem se prender ao método ou aos reagentes específicos abaixo, esse exemplo demonstra o uso de anticorpos de endosialina que podem isolar células que expressam endosialina.

Resumidamente, placas de 96 poços foram revestidas em condições estéreis com Fcy de cabra anti-IgG humana. A seguir, 20 µg/ml de um anticorpo humano anti-endosialina M4 foram adicionados às placas e três poços (A, B, C) como controles sem o anticorpo, e incubados por 1 hora a 4°C. as HMVECs foram coletadas de culturas de placas de Petri de 10 cm com DPBS/EDTA em vez de tripsina para evitar qualquer dano às membranas celulares deixando, dessa forma, as proteínas endosialina da superfície celular intatas. As células em pool foram plaqueadas em duas concentrações diferentes, 100.000 células/poço ou 50.000 células/poço nas placas de 96 poços após aspiração e remoção por lavagem de qualquer anticorpo anti-endosialina não lavado. As células foram incubadas em placas por uma hora a 4°C. As placas foram então lavadas com DPBS/FBS quatro vezes (até que os poços de controle A, B e C não mostrassem células dentro dos poços). A placa com 50.000 células/poço mostraram muito poucas células, enquanto os poços com 100.000 células/poço continham diversas células anexadas às placa. As células foram então incubadas por três dias em meio de crescimento apropriado. Os poços de controle B e C foram retirados das placas de 100.000 células/poço para imunocoloração. Calceína, corante AM, foi usado para corar as células para visualização usando um microscópio de fluorescência Nikon® Eclipse TS 100. As culturas positivas foram expandidas para crescimento e análise posterior quanto à expressão homogênea de endosialina como descrito abaixo.

Para determine ainda a habilidade para o isolamento de células que expressam endosialina, células HMVEC tratadas com anticorpo anti-endosialina e culturas de HMVEC não tratadas foram preparadas para imunocoloração usando um anticorpo anti-endosialina fluorescente ou anticorpo α-β1-integrina fluorescente como controle. Como esperado, mais do que 90% das células coraram positivas para α-β1-integrina em culturas tratadas e não tratadas (não mostrado), enquanto mais de 90% das células coraram positivas para endosialina das culturas tratadas, enquanto somente 5-7% das células coraram positivas para endosialina em culturas de HMVECs não tratadas. Esses dados demonstram a habilidade para isolar e enriquecer células viáveis que expressam endosialina com a utilização de proteínas de ligação de endosialina como, por exemplo, anticorpos.

Como mostrado na Figura 3, a cultura tratada teve um número bem maior de células positivas para endosialina, quando comparada com a cultura parental não tratada, como determinado por imunocoloração por meio de anticorpo anti-endosialina seguido por um anticorpo secundário conjugado fluorescente. O número de células de cada campo foi determinado por microscopia óptica.

Exemplo 4 Interação de endosialina com proteínas da matriz extracelular

Construção de plasmídeos de expressão de TEM1 e Fc-TEM-1. PCR foi usada para amplificar um fragmento de DNA que representa os aminoácidos 1-685 do quadro de leitura aberta de TEM1 (GenBank # AF279142) do DNA genômico de LA1-5S. Os amplicons resultantes foram digeridos com EcoRI e XbaI e ligados em pEF6-V5-HisA (Invitrogen). Para gerar Fc-TEM-1, a região extracelular de TEM1 foi fundida ao domínio Fcy de IgG2b monomérico murídeo e ligada no vetor derivado pEF6-EK-Mm-IgG2b-Fcy-ND que contém uma região de reconhecimento de enteroquinase (DDDD), seguido por um domínio Fcy de IgG2b murídeo modificado (dobradiça até CH3). Para evitar a dimerização, os quatro resíduos de cisteína responsáveis pela ligação dissulfeto intercadeias pesadas foram trocados por serina. A proteína de fusão secretada monomérica resultante consiste no domínio extracelular de comprimento total de TEM1 e na Fcy de IgG2b murídea. A integridade de todas as seqüências de plasmídeos foi verificada usando a química DTCS de Beckman® (Beckman Coulter, Fullerton, CA). Os dados brutos foram adquiridos com um seqüenciador de DNA CEQ 8 000 e analisados usando o software VectorNTI® (Invitrogen).

Purificação de Fc-TEM-1. Células CHO-TEM1-Fcy foram cultivadas em escala de 25 litros em meio IS-CHO-CD (Irvine Scientific, Santa Ana, CA), suplementado com L-glutamina 2 mM, penicilina/estreptomicina, 6 g/l de hidrolisado de soja e 2,2 g/l de bicarbonato de sódio (Irvine Scientific), em uma plataforma Wave20/50EH adaptada com um Cellbag50® (GE Healthcare, Piscataway, NJ), até que a viabilidade da cultura alcançasse 50-70%. O meio extracelular conditionado foi clarificado usando um Sistema de Fibra Oca Flexstand® Benchtop Pilot (GE Healthcare) equipado com um cartucho de fibra oca de 0,2 gm (GE Healthcare) até que 0,5 l de cultura permanecesse no vaso de recolhimento. Nesse ponto, a massa de células concentradas foi lavada com 4 litros de solução salina tamponada com fosfato (PBS, K Fosfato 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2), para recuperar o líquido extracelular restante. A lavagem de 4 litros foi reunida em pool com a matéria-prima clarificada. O meio de cultura clarificado foi então concentrado doze vezes (29 litros até 2,5 litros); usando um cartucho de ultrafiltração Prep/Scale® Spiral Wound de 0,232 m2 e 100 k adaptado em um suporte de Prep/Scale® (Millipore, Billerica, MA), e movido por uma bomba peristáltica em uma pressão de entrada de 137,89 kPa, e uma taxa de recirculação de aproximadamente 400 ml/min. A material-prima concentrada resultante foi esterilizada por filtração através de filtros superiores de garrafa equipados com uma membrana de 0,2 pm (Nalgene). TEM1-Fcy foi capturado por cromatografia por afinidade por proteína A, em uma coluna ProSep-vA® (Millipore) de 10 x 100 mm, e eluído por adição de 5 volumes de coluna de tampão de eluição (citrato 100 mM/acetato 10 mM, pH 3,0). O material eluído foi dialisado contra tampão QA (Tris-Cl 20 mM, pH 8,0), e ainda purificado por cromatografia por troca iônica em uma coluna Q-FF de 5 ml HiTrap® (GE Healthcare). As proteínas ligadas foram lavadas com tampão QB 15% (Tris-Cl 20 mM, NaCl 1 M, pH 8,0), seguido por eluição de Fc-TEM-1 ligada usando tampão QB 35%. As proteínas eluídas foram concentradas por ultrafiltração em um módulo de ultrafiltração de pressão positiva Modelo 8400 (Millipore) adaptado com uma membrana MWCO de 100 kDa (Millipore), até um volume final de aproximadamente 5 ml. Fc-TEM-1 concentrada foi purificada por cromatografia preparativa por exclusão de tamanho em uma coluna Sephacryl® S-300HR 26 x 60 (GE Healthcare), equilibrada com PBS. As frações contendo Fc-TEM-1 purificada foram reunidas em pool, concentradas até uma faixa nominal entre 0,1-1 mg/ml por ultrafiltração usando uma membrana MWCO de 100 kDa e armazenadas em alíquotas de uso único a -80°C.

Fc-TEM-1 purificada (2,9 μg) foi carregada em um gel de Bis-Tris 4-12% (Invitrogen, Inc.) e submetido à eletroforese em Tampão de Processamento MOPS (MOPS 50 mM, Tris 50 mM, SDS 3,5 mM, EDTA 1 mM, pH 7,7), por 40 minutos. Para coloração, o gel foi fixado por 15 minutos em solução de fixação (metanol 50%, ácido acético 10%), lavado duas vezes por 10 minutos em água deionizada e corado por pelo menos uma hora usando o corante Azul Coomassie coloidal GelCode (Pierce). O gel foi descorado por lavagem repetida com água deionizada.

Placas de 96 poços pré-revestidas com Fibronectina (FN), Colágeno I (Col I), Colágeno IV (Col IV), Laminina (LN) (BD Biosciences, San Diego CA), Vitronectina (VN) ou Gelatina (Gel) (Chemicon Intl.) foram usadas para avaliar a ligação de Fc-TEM-1. A ligação de TEM1 ao Col I, Col IV e FN não foi causada por contaminantes residuais na proteína purificada do plasma humano, já que nem Col I nem Col IV foi detectado em FN por ELISA com anticorpo anti-Col, nem FN foi detectada em Col (dados não mostrados). Todas as placas foram bloqueadas com tampão de ensaio (BSA 0,5%, Tween-20 0,5% em PBS) por 2 horas, antes da adição da proteína de fusão Fc-TEM-1, uma endosialina solúvel gerada por fusão da seqüência líder do N-terminal e todo o domínio extracelular de endosialina a uma cadeia pesada gama murídea. Após uma incubação de 1 hora em temperatura ambiente, as placas foram lavadas e o anticorpo de cabra anti-IgG humana (H+L) conjugado à HRP (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA) foi adicionado por 1 hora. O desenvolvimento de cor foi avaliado usando o Substrato de Peroxidase SureBlue™ TMB (KPL, Gaithersburg, MD). Tanto BSA quanto um anticorpo de controle de isótipo humano foram usados como controles negativos. Fc-TEM-1 não se ligou à BSA, e o isótipo humano não se ligou a qualquer uma das proteínas ECM (dados não mostrados).

Como mostrado na Figura 4A, o Fc-TEM1 ligou-se à fibronectina e ao colágeno I e IV de uma forma dose-dependente, enquanto não foi observada ligação em toda a faixa de doses à LN ou VN. Curiosamente, embora Fc-TEM1 se ligou ao colágeno, não foi observada ligação detectável à gelatina (colágeno desnaturado por aquecimento). Nenhum dos quatro anticorpos de IgG isótipo murídeo testados pode se ligar a qualquer uma das proteínas ECM, excluindo a possibilidade de que as interações fossem mediadas pelo arcabouço de Fc murídeo da proteína de fusão Fc-TEM1 (dados não mostrados). Uma proteína de fusão contendo a cadeia pesada gama murídea e somente o domínio de lectina de endosialina também se liga à FN (dados não mostrados).

Para confirmar a seletividade da Fc-TEM1 e da interação da proteína ECM, Fc-TEM1 foi aplicado às placas de ELISA revestidas com diferentes proteínas purificadas. Foram realizadas ELISAs antígeno-específicas por revestimento de placas de ELISA TP Immunomini com 1 gg/ml de STEB (vacina de enterotoxina B de Staphylococcus), 2 µg/ml de gamaglobulina bovina, 2 µg/ml de antígeno de glicoproteína de 90 kD associado a tumores expresso na maioria das células de melanoma (TA90), 2 µg/ml de lisozima de ovo de galinha, diluição 1:500 de toxóide tetânico, BSA 1%, 0,2 µg/ml de mesotelina humana, 2 µg/ml de ovalbumina (OVA), 1 µg/ml de GM-CSF humano, 2 µg/ml de IgG de cabra, 2 μg/ml de IgG de camundongo dissolvidos em tampão de revestimento de bicarbonato (pH 9,6) (Sigma) de um dia para O outro a 4°C. As placas foram lavadas três vezes com tampão de lavagem (contendo TWEEN-20 0,5%), bloqueadas com tampão de ensaio 1x por 2 horas em temperatura ambiente, e a ELISA foi realizada como descrito acima. Como mostrado na Figura 4B, Fc-TEM1 não se ligou a qualquer uma das proteínas testadas, exceto para o Fc de anticamundongo usado como controle positivo.

Exemplo 5 Inibição da ligação de TEM1 à fibronectina do plasma humano

Placas de 96 poços foram pré-revestidas com Fibronectina (FN), e a habilidade de anticorpos anti-TEM-1 para bloquear a adesão mediada por Fc-TEM-1 foi avaliada por ELISA. Resumidamente, a placa revestida com FN foi bloqueada com tampão de ensaio (BSA 0,5%, Tween-20 0,5% em PBS) por 2 horas, antes da adição de proteínas de fusão. Fc-TEM-1 foi pré-incubada por 1 hora a 4°C com os anticorpos M4 (um anticorpo anti-endosialina humanizado descrito como ES1 na Publicação de Patente U.S. N° 20060239911), isótipo humano (HuIgG) ou anticorpo anti-TEM- 1 desenvolvido em coelhos (RbtTEM1). M4 não se liga aos homólogos de espécie de endosialina, com exceção de primatas não humanos. O epitopo de ligação para M4 foi mapeado para o domínio extracelular de lectina de endosialina. O complexo proteína/anticorpo foi adicionado à placa revestida com FN e deixou-se aderir por 1 hora em temperatura ambiente, quando então as placas foram lavadas e o anticorpo de cabra anti-IgG humana (H+L) conjugado à HRP (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA) foi adicionado por 1 hora. O desenvolvimento de cor foi avaliado usando o Substrato de Peroxidase SureBlue™ TMB (KPL, Gaithersburg, MD). Como mostrado na Figura 6, M4 suprimiu a ligação de Fc-TEM1 à fibronectina, enquanto um controle não específico (HuIgG) não suprimiu a ligação. RbtTEM1 também suprimiu a ligação de Fc-TEM1 à fibronectina (dados não mostrados).

Exemplo 6 Endosialina media a adesão à fibronectina

Células CHO-TEM1 que expressam estavelmente endosialina (verificado por FACS com anticorpo M4; dados não mostrados) foram geradas. As células CHO-K1 foram mantidas em RPMI suplementado com L-glutamina, aminoácidos essenciais mínimos 1%, piruvato de sódio, aminoácidos não essenciais e FBS 10% inativado por aquecimento (Invitrogen, Carlsbad, CA). As células CHO-K1 (3E6) (ATCC, Manassas, VA) foram submetidas à eletroporação com 10 pg de DNA de plasmídeo linearizado em uma cubeta de eletroporação de 0,4 mm. Um pulso de 170V/1000 pF foi liberado usando um GENE PULSER (BioRad, Hercules, CA). Deixou-se que as células eletroporadas se recuperassem por 24 horas, quando então foram selecionados clones resistentes à blasticidina (5 pg/ml). A expressão de endosialina foi verificada por FACS e as células foram separadas quanto à expressão elevada.

As células (1,5 x 105 células/poço) foram lavadas e suspensas em PBS contendo Mg2+/Ca2+, e adicionadas em quadruplicata a uma placa de 96 poços revestida com fibronectina, e foi permitido que aderissem por 1 hora. Onde indicado, as células foram pré-incubadas com anticorpo (100 pg/ml) M4 ou isótipo humano (IgG) por 1 hora, antes do início dos ensaios. Após as células terem aderido, a placa foi lavada 5 vezes com PBS, e a viabilidade foi medida usando CellTiter-Glo® (Promega, Madison, WI). A Figura 9B mostra que a superexpressão de endosialina resulta no aumento da ligação da célula à fibronectina, que pode ser bloqueada por inibidores de endosialina como, por exemplo, anticorpo M4, em contraste com controles como, por exemplo, IgG não específica.

Exemplo 7 Ligação de endosialina à fibronectina e aos fragmentos de fibronectina

A fibronectina é uma glicoproteína complexa grande que existe como um dímero ligado covalentemente por uma ponte dissulfeto no terminal C da proteína (Ruoslahti e cols. (1981) J. Biol. Chem. , 256: 7.277-7.281; Wierzbicka- Patynowski e Schwarzbauer (2003) J. Cell Sci., 116: 3.269 3.276; Magnusson e Mosher (1998) Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol.,18: 1.363-1.370). Foi relatado que fragmentos de fibronectina derivados de degradação enzimática ou por splicing alternativo estão associados a certos estados de doença, e possuem funções biológicas distintas (Magnusson e Mosher (1998) Arterioscler. Thromb. Vasc. Riot., 18: 1.3631.370; Labat-Robert (2002) Semin. Cancer Riot., 12: 187 195; Homandberg (1999) Front Biosci., 4: D713-730).

A habilidade de Fc-TEM-1 para se ligar a diferentes fragmentos de fibronectina foi avaliada. Quantidades eqüimolares de proteínas foram diluídas em tampão de revestimento (carbonato-bicarbonato 50 mM, pH 9,4), adicionadas a uma placa de ELISA (Greiner Bio-one, Monroe, NC) e incubadas de um dia para o outro a 4°C. Todas as placas foram bloqueadas com tampão de ensaio (BSA 0,5%, Tween-20 0,5% em PBS) por 2 horas, antes da adição de Fc-TEM-1. Após incubação de 1 hora em temperatura ambiente, as placas foram lavadas e o anticorpo de cabra anti-IgG humana (H+L) conjugado à HRP (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA) foi adicionado por 1 hora. O desenvolvimento de cor foi avaliado usando o Substrato de Peroxidase SureBlueTM TMB (KPL, Gaithersburg, MD). Para avaliar a integridade de proteínas de fibronectina revestidas, o anticorpo policlonal de coelho dirigido contra fibronectina (Ab FN) foi usado para detectar se todos os fragmentos de FN eram reconhecíveis e estavam revestidos igualmente.

A fibronectina de comprimento purificada do plasma humano total e as proteínas do fragmento de adesão celular FN de 120 kDa foram adquiridos de Chemicon Intl. (Temucula, CA), fragmentos proteolíticos de 30 kDa, 45 kDa, 70 kDa de Sigma (St. Louis, MO) e os fragmentos recombinantes humanos de fibronectina 2 e 4 (FN2 e FN4, respectivamente) de R&D Systems (Minneapolis, MN).

Como mostrado na Figura 7A, Fc-TEM1 se liga ao fragmento do terminal amino de 70 kDa de FN e aos seus produtos de clivagem proteolítica (fragmentos de 45 kDa e 30 kDa). A extensão da ligação variou entre os diferentes fragmentos, e foi menor do que aquela observada com FN inteira. Em contraste, Fc-TEM1 não se ligou ao fragmento de FN de 120 kDa ou aos fragmentos recombinantes Fn2 ou Fn4. Era pouco provável que essa ausência de ligação fosse causada por revestimento desigual ou degradação, já que todos os fragmentos de FN foram detectados fortemente por um anticorpo policlonal anti-FN. Isso é uma evidência de que o domínio de FN envolvido na interação com endosialina reside dentro da porção do terminal amino de 70 kDa. Para determinar se a capacidade de ligação reduzida mediante digestão adicional do fragmento de 70 kDa indica que Fc-TEM1 se liga a uma região localizada muito próximo do sítio de clivagem proteolítica ou que TEM1 reconhece epitopos conformacionalmente dependentes dentro do terminal amino de FN que é alterado após digestão adicional, foi examinada a habilidade de Fc-TEM1 para se ligar às formas reduzidas de proteínas de FN. Embora o anticorpo anti-FN fosse capaz de reconhecer FN reduzida, indicando revestimento equivalente, a ligação de Fc-TEM1 foi completamente abolida, como mostrado na Figura 7B. Similar à FN inteira, o anticorpo anti-endosialina M4 bloqueou a ligação de Fc-TEM1 ao fragmento de 70 kDa de uma forma dose-dependente (Figura 7C), enquanto um anticorpo de controle de isótipo não teve nenhum efeito (Figura 7D). Esses resultados indicam que Fc-TEM1 reconhece epitopos conformacionalmente dependentes localizados dentro do terminal amino de FN que podem ser prejudicados mediante degradação proteolítica.

Exemplo 8 Associação de fibronectina da superfície celular à endosialina

Células CHO-TEM1 que expressam estavelmente endosialina (verificados por FACS com anticorpo M4; dados não mostrados) foram geradas. As células CHO-K1 foram mantidas em RPMI suplementado com L-glutamina, aminoácidos essenciais mínimos 1%, piruvato de sódio, aminoácidos não essenciais e FBS 10% inativado por aquecimento (Invitrogen, Carlsbad, CA). As células CHO-K1 (3E6) (ATCC, Manassas, VA) foram submetidas à eletroporação com 10 μg de DNA de plasmídeo linearizado em uma cubeta de eletroporação de 0,4 mm. Um pulso de 170V/1000 μΕ foi liberado usando um GENE PULSER (BioRad, Hercules, CA). Deixou-se que as células eletroporadas se recuperassem por 24 horas, quando então foram selecionados clones resistentes à blasticidina (5 μg/ml). A expressão de endosialina foi verificada por EACS e as células foram separadas quanto à expressão elevada.

O nível de EN da superfície celular foi examinado por citometria de fluxo em células CHO-K1 e CHO-TEM1 parentais usando um anticorpo policlonal anti-EN. As células foram coletadas em Tamapão de Dissociação de Células (Invitrogen, Carlsbad, CA), lavadas e ressuspensas em PBS gelado + EBS 1%. As células foram incubadas por 1 hora no gelo com anticorpo primário, M4 (10 μg/ml), lavadas e incubadas com anticorpo secundário de cabra anti-humano conjugado à EITC (Southern Biotech, Birmingham, AL) e analisadas em um Citômetro de Eluxo EASYCYTE (Guava Technologies, Hayward, CA). Eoram observados constantemente Níveis 15-20% maiores de EN de superfície em células CHO-TEM1, comparadas com células CHO-K1 (dados não mostrados). A associação de EN da superfície celular com endosialina foi examinada.

Usando um anticorpo anti-EN, EN foi imunoprecipitada em lisados de CHO-K1 e CHO-TEM1, seguido por Western blot usando o mesmo anticorpo ou um anticorpo anti-TEM1 (M4). As células (10E7) fora lisadas em tampão de radioimunoprecipitação (RIPA) (Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, NP-40 1%, desoxicolato de sódio 0,5%, NaCl 150 mM, dodecil sulfato de sódio 0,1% [SDS]) suplementado com Coquetel Inibidor de Protease Completo Mini (Roche Diagnostics, Indianápolis, IN) e centrifugadas a 13.000 rpm por 15 minutos para remover os restos. Glóbulos de Proteína G Sefarose 6 de Fluxo Rápido (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) foram lavados 3 vezes com PBS, e o anticorpo anti-FN (1 pg) foi capturado por agitação suave a 4°C. Quantidades iguais de proteína por amostra foram pré-clarificadas pela adição de Proteína G não ligada. Após 2 horas de incubação, a Proteína G foi removida e o sobrenadante foi adicionado ao complexo de anticorpo-Sefarose e incubado de um dia para o outro a 4°C. Após lavagem intensa com tampão RIPA, a proteína ligada foi removida por fervura por 10 minutos em tampão de amostra NuPAGE® LDS (Invitrogen) contendo β-mercaptoetanol 5%. As proteínas foram separadas usando SDS-eletroforese em gel de poliacrilamida em um gel de Bis-Tris 4-12% (Invitrogen) e transferidas para uma membrana de PVDF. O imunoblotting foi realizado com o uso de anticorpos policlonais de coelho específicos para fibronectina (Abcam, Cambridge, MA) ou endosialina (Morphotek, Inc., Exton, PA), detectado com um anticorpo de cabra anticoelho conjugado à HRP, e visualizado usando o substrato quimioluminescente SUPERSIGNAL West Pico (Pierce, Rockford, IL). A integridade e a pureza de Fc-TEM1 solúvel também foram monitoradas por Western blot. A proteína (5 pg) foi fervida por 5 minutos em tampão de amostra 4x NUPAGE LDS (Invitrogen) contendo β-mercaptoetanol 5%, submetida à eletroforese em um gel de Bis-Tris 4-12% NUPAGE (Invitrogen), e transferida para uma membrana de PVDF, e o imunoblotting foi realizado como descrito acima.

Foi verificado que FN pode imunoprecipitar endosialina de lisados de CHO-TEM1 (dados não mostrados). Em contraste, em lisados de células imunoprecipitados com uma IgG normal que não precipitaram FN, não pode ser detectada nenhuma endosialina (dados não mostrados). Pelo menos duas abordagens diferentes (ELISA e co-imunoprecipitação) fornecem fortes evidências de FN e de interação de endosialina. Foram obtidos resultados similares usando células HEK-293T que expressam ectopicamente endosialina (dados não mostrados).

Exemplo 9 Células que expressam endosialina cultivadas em MATRIGEL formam estruturas em forma de teia

Embora não tenham sido observadas diferenças no crescimento ou na sobrevida entre células CHO-K1 e CHO-TEM1 parentais cultivadas em uma superfície plástica, foi observada uma morfologia drasticamente diferente quando essas células foram cultivadas em MATRIGEL. Células CHO-K1 parentais cresceram em agrupamentos isolados de células com protrusões mínimas após 2 dias de cultivo (Figura 8, painéis superiores), enquanto células CHO-TEM1 cresceram em agrupamentos que formam uma rede em forma de teia (Figura 8, painel inferior esquerdo). Além disso, as células CHO-TEM1 dentro do agrupamento exibiram protrusões que alcançam outros clusters (Fig. 8, painel inferior direito). Ao longo do tempo, as células CHO-TEM1, mas não as células CHO-K1, se aproximaram entre elas para formar agrupamentos maiores (dados não mostrados).

Exemplo 10 A expressão de endosialina aumenta a adesão celular à fibronectina e ao N-terminal de 70 kD ou 30 kD de fibronectina

Para avaliar a adesão aos fragmentos de FN, quantidades eqüimolares de fragmentos de proteína foram pré- revestidos de um dia para o outro, e depois bloqueadas por 2 horas com PBS contendo 10 mg/ml de BSA. MATRIGEL serviu como controle positivo. Células CHO-K1 ou CHO-TEM1 (1,5 x 105 células/poço) coletadas em tampão de dissociação de células foram lavadas e suspensas em PBS contendo Mg2+/Ca2+, e adicionadas em quadruplicata a um Kit de Arranjo de Adesão Celular ECM (Millipore) ou plaqueadas em placas revestidas individualmente com FN, LN, Gel e Col I (BD Biosciences), e foi permitida a adesão por 1 hora. Após incubação, cada poço foi lavado 5 vezes com PBS, e a viabilidade foi medida usando CellTiter-Glo®. Onde indicado, as células foram pré-incubadas com anticorpo por 1 hora, antes do início do ensaio. Como mostrado na Figura 9A, o número de células CHO-TEM1 aderentes foi 6 vezes maior do que o número de células CHO-K1 parentais em poços revestidos com FN. Não foram observadas diferenças significativas na adesão entre CHO-K1 e CHO-TEM1 em superfícies revestidas com laminina ou vitronectina, enquanto a adesão aos colágenos e à tenascina foi muito fraca para avaliar quaisquer diferenças importantes (Figura 9A). O pré-tratamento de células CHO-TEM1 com anticorpo M4 resultou em uma redução de 50% da adesão celular dependente de TEM1-FN, enquanto o anticorpo IgG de controle não teve nenhum efeito (Figura 9B) . O tratamento com anticorpo M4 não afetou a adesão celular dependente de FN, independente de endosialina (adesão basal) de células CHO-K1 parentais.

As placas foram pré-revestidas com quantidades eqüimolares de FN inteira, fragmentos de FN proteolíticos e MATRIGEL. As células CHO-TEM1 mostraram uma adesão 3 a 5 vezes aumentada aos fragmentos de FN, 7 0 kDa e 30 kDa, comparadas com células CHO-K1 parentais, enquanto não foi observada adesão significativa aos fragmentos de 45 kDa ou Fn2. As células CHO-TEM1 se ligaram ao MATRIGEL cinco vezes melhor do que CHO-K1 (Figura 9C). Esses dados indicam que a endosialina aumenta a adesão de células às matrizes extracelulares e que o terminal amino de FN está envolvido com essas interações.

Exemplo 11 Endosialina se liga ao Colágeno I e M4 inibe essa ligação

Uma placa de 96 poços pré-revestida com Colágeno I foi usada para avaliar a M4 habilidade para bloquear a ligação de Fc-TEM-1. A placa foi bloqueada com tampão de ensaio (BSA 0,5%, Tween-20 0,5% em PBS) por 2 horas, antes da adição de proteína na concentração indicada (µg/ml). Fc-TEM-1 foi pré-incubada por 1 hora a 4°C com os anticorpos M4 ou isótipo humano (IgG humana). O complexo de proteína/anticorpo foi então adicionado à placa revestida com Col I e foi permitida a aderência por 1 hora em temperatura ambiente, quando então as placas foram lavadas e o anticorpo de cabra anti-IgG humana (H+L) conjugado à HRP (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA) foi adicionado por 1 hora. O desenvolvimento de cor foi avaliado usando o Substrato de Peroxidase SureBlueTM TMB (KPL, Gaithersburg, MD). Como mostrado na Figura 10, a superexpressão de endosialina resulta no aumento da ligação da célula ao COL I, que pode ser bloqueada por inibidores de endosialina como, por exemplo, M4, em contraste com controles como, por exemplo, IgG não específica. RbtTEMl também suprimiu ligação de Fc-TEM1 ao Col I (dados não mostrados).

Exemplo 12 Endosialina aumenta a adesão celular ao colágeno

Células CHO-K1 ou CHO-TEM1 (1,5 x 105 células/poço) foram lavadas e suspensas em PBS contendo Mg2+/Ca2+, e adicionadas em quadruplicata a uma placa de 96 poços revestida com Colágeno I, e foi permitida a aderência pelos pontos do tempo indicados. Após as células terem aderido, a placa foi lavada 5 vezes com PBS, e a viabilidade foi medida usando CellTiter-Glo®. Como mostrado na Figura 11, a superexpressão de endosialina resulta no aumento da ligação da célula ao COL I.

Exemplo 13 Ensaio de migração celular

O Sistema de Invasão Tumoral BioCoatTM BD (BD Bioscience) e insertos de cultura de células de fibronectina humana (BD Bioscience) foram usados para avaliar a migração de células mediada por TEM1. As células foram coletadas com tampão de dissociação não enzimática de células e diluídas até uma concentração de 4E5 células/ml em meio de crescimento suplementado com soro bovino fetal 2% (FBS), e 500 µl de suspensão de células foram adicionados à câmara superior do inserto de membrana. Para criar um gradiente, meio de crescimento contendo FBS 20% foi adicionado à câmara inferior. As células foram incubadas por 48 horas, quando então o inserto foi removido e as células que migraram através da membrana revestida foram contadas usando CELLTITER-GLO (Promega). As células foram pré-tratadas com anticorpo, como indicado na descrição da Figura 12, e a migração foi avaliada na presença contínua de anticorpo. Para examinar a formação de túbulos em MATRIGEL, células (8E4 células/poço) foram adicionadas a uma placa de 96 poços revestida com MATRIGEL (BD Bioscience), incubadas de um dia para o outro e fotografadas com uma ampliação de 200-400 x.

Como mostrado na Figura 12A, as células CHO-K1 exibiram migração celular modesta, enquanto as células CHO-TEM1 mostraram migração aumentada >10 vezes. O tratamento com anticorpo M4, mas não IgG de controle, aboliu a migração de células CHO-TEM1. Foram observados resultados similares em experimentos de migração usando câmaras transpoços revestidas com FN (Figura 12B).

Exemplo 14 Endosialina aumenta a atividade de MMP-9

Foi demonstrado que endosialina, MMP-2 e COL IV se co-localizam em áreas de tecido caracterizadas por protrusões em forma de dedo de processos angiogênicos iniciais (Virgintino e cols. (2007) Angiogenesis, 10: 35-45). Para avaliar a atividade de MMP, as células foram semeadas em uma placa de 6 poços e ficaram privadas de soro por 48 horas. O sobrenadante da cultura foi coletado e clarificado por centrifugação (13.000 rpm, 15 minutos) a 4°C para remover quaisquer restos. Quantidades iguais de proteína foram submetidas à zimografia com gelatina e caseína sob condições não redutoras (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante. Controles positivos de MMP-2 e 9 humanos (Chemicon, International) foram usados para indicar a migração de MMP-2 e MMP-9 e usados como uma referência para os sobrenadantes de CHOK1 e CHO-TEM-1. Como mostrado na Figura 13, a atividade de MMP-9 estava significativamente aumentada em células CHO-TEM1, comparadas com células CHO-K1 parentais. A atividade de MMP-9 aumentada estava correlacionada com secreção aumentada de proteína MMP-9 no sobrenadante de células CHO-TEM1, como medida por um ELISA MMP-específica (dados não mostrados). Esses dados indicam que a secreção induzida de MMP-9 contribui para o aumento da capacidade de migração de células CHO-TEM1 através de MATRIGEL e transpoços revestidos com FN aqui demonstrada.

Exemplo 15 Endosialina aumenta a atividade de β-integrina

Integrinas (por exemplo, α4β1, α5β1) são receptores bem caracterizados que medeiam a adesão celular dependente de FN (Wierzbicka-Patynowski e Schwarzbauer 2003; Magnusson e Mosher 1998). Além disso, foi descrito funcionalmente um receptor celular não identificado que se liga à região do N-terminal de 70 kDa de FN (McKeown-Longo e Mosher (1983) J. Cell Biol., 97: 466-472) e é necessário expor o sítio de ligação de integrina críptico (motivo RGD) de FN solúvel envolvido nas interações FN-integrina e FN-FN (Tomasini- Johansson e cols. (2006) Matrix Biol., 25: 282-293; McKeown-Longo e Mosher (1985) J. Cell Biol., 100: 364-374). A endosialina é aqui identificada como um novo receptor que interage com a região do N-terminal de 7 0 kDa de FN e aumenta a adesão celular dependente de FN. A ligação de FN aumentada medida nesses sistemas celulares in vitro poderia resultar de interação seqüencial com endosialina e integrinas.

Células renais embrionárias humanas 293 (HEK293) células foram transfectadas com um vetor que expressa endosialina ou cDNA falso. Foi confirmado que as células expressam endosialina da superfície celular (293TEM1), enquanto aquelas transfectadas com o falso (293T) não o fizeram. As células foram testadas quanto à habilidade para supra-regular a expressão e atividade de integrina na presença de anticorpo M4. A Figura 14B mostra que a superexpressão de endosialina resulta em atividade aumentada de integrina β1 em relação às células de controle. A Figura 14A mostra que a expressão de integrina β da superfície celular não está alterada. O tratamento das células com o inibidor de endosialina M4 resultou na supressão da atividade de integrina, enquanto não foram observados efeitos sobre os níveis da superfície celular (Figura 14B). Sem se prender a uma teoria, a interação entre endosialina e o fragmento de 70 kDa do N-terminal de FN solúvel pode ser responsável pela iniciação da montagem de FN em uma forma multimérica de afinidade elevada capaz de se ligar às integrinas.

Exemplo 16 M4.1 reconhece TEM-1 humana não reduzida, mas não TEM-1 murídea

Células CHO-TEM-1, células 2H11 de camundongo, células CHO-K1 parentais, células de camundongo NSO e células de camundongo MS1 foram cultivadas em RPMI1640 completo (RPMI1640; piruvato de sódio; aminoácidos não essenciais; L-glutamina, e FBS; Invitrogen Corp.). Pericitos primários humanos foram cultivados em Meio de Pericito (500 ml de meio basal (Cat # 1201), 10 ml (2%) de soro bovino fetal (FBS, N° de Catálogo 0025), 5 ml de suplemento de crescimento de pericitos (PGS, N° de Catálogo 1252) e 5 ml de solução de penicilina/estreptomicina (P/S, N° de Catálogo 0503); Invitogen Corp.). As células foram desenvolvidas a 37°C e CO2 5% em, uma incubadora umidificada. As células foram descoladas com TrypLETM Select (Invitrogen Corp., N° de Catálogo 12563-011), lavadas e contadas. As células foram lisadas a 2 x 107 células em tampão de lise RIPA contendo inibidores de protease, e incubadas no gelo por 10 minutos. O material insolúvel foi peletizado a 10.000 xG por 10 minutos a 4°C, e sobrenadantes foram transferidos para tubos frescos. As alíquotas foram misturadas com um volume igual de tampão de carga de proteína 2X com ou sem 2-mercaptoetanol 10% (agente redutor). 15 ql (1,5 x 105 células) de lisado foram carregados em um gel de SDS-PAGE de Bis/Tris 4-12% de 15 poços e submetidos à eletroforese por 30 minutos a 200 V em tampão de processamento MES. O gel foi eletroblotted em PVDF, e depois bloqueado por 1 hora em temperatura ambiente com agitação em leite 5% -TBST (M 5%-TBST). Os resquícios (blots) de M4.1 foram sondados com M4.1 em M 5%-TBST a 3,3 qg/ml de um dia para o outro a 4°C.

Os resquícios de anticorpo policlonal de coelho anti-TEM-1 foram sondados com uma diluição de 1:300 (4,5 mg/ml de estoque Lote #: NB487-76) de anticorpo em M 5%-TBST de um dia para o outro a 4°C. O anticorpo M4.1, como o anticorpo M4, é um anticorpo humanizado para endosialina humana. As membranas foram lavadas 5 vezes por 5 minutos cada, com 30 ml de TBST em temperatura ambiente. O anti-IgG humana (H+L) de cabra conjugado à HRP (Jackson Immuno, 1 mg/ml de estoque) foi diluído a 1:20.000 em M 5%-TBST como anticorpo secundário para a sondagem dos resquícios de M4.1 por 30 minutos em temperatura ambiente. Anticorpo secundário de cabra anticoelho (H+L) conjugado à HRP foi usado para blot dos resquícios policlonais anti-TEM-1 por 30 minutos em temperatura ambiente. As membranas foram lavadas 5 vezes por 5 minutos cada com 30 ml de TBST em temperatura ambiente. O sinal foi detectado por quimioluminescência usando o Sistema de Detecção de Western Blot Femto (Pierce) de acordo com o manual.

Como ilustrado na Figura 15, M4.1 reconhece TEM-1 humana não reduzida em células CHO-TEM-1 e em pericitos humanos primários, mas não TEM-1 murídea (ID. DE SEQ. N°: 2) em células 2H11 de camundongo (Figura 15). O policlonal de coelho contra TEM-1 humana (rabPAb TEM-1) reconhece TEM-1 humana em células CHO-TEM-1 e em pericitos humanos, mas também TEM-1 murídea em células 2H11 de camundongo. M4.1 e rabPAb TEM-1 não reagiram contra lisados de células CHO-K1 parentais ou células NS0 e MS1 de camundongo em função da ausência de expressão de TEM-1 nessas células. Somente rabPAb TEM-1 reagiu com TEM-1 humana reduzida, embora em um grau menor quando comparado com TEM-1 não reduzida.

A presente invenção não se limita às modalidades descritas e exemplificadas acima, mas é passível de variações e modificações dentro do escopo das reivindicações em anexo.

Claims (2)

1. Anticorpo monoclonal que se liga especificamente a endosialina, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ. ID NO: 2 6 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ. ID NO: 11.
2. Anticorpo monoclonal que se liga especificamente a endosialina, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é produzido por células possuindo n° de acesso ATCC PTA n-9017 .

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