ES2606906T3 - Métodos para inhibir la unión de la endosialina a ligandos - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo que se une manera específica a la endosialina, siendo dicho anticuerpo producido por células que tienen el N.º de acceso ATCC PTA-9017, o un fragmento de unión al antígeno que se une de manera específica a la endosialina.

Description

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analizó la capacidad de las células para promover rutas celulares. Una de tales rutas es la ruta de la MMP9, que desempeña una función en la migración celular. Como se indica, la sobreexpresión de la endosialina ocasiona una mayor actividad de la MMP-9, a diferencia de lo que ocurre en las células de control.
La Figura 14 muestra el efecto que tiene, sobre la activación de la integrina β, bloquear la endosialina. Se transfectaron células HEK293 (una línea de células embrionarias de riñón humano) con un vector que expresa la endosialina o ADNc simulado. Se confirmó que dichas células expresaban la endosialina de superficie celular (293TEM1), mientras que las células transfectadas con la simulación (293T) no la expresaban. Se analizó la capacidad de las células para promover rutas celulares. Una de tales rutas es la ruta de las integrinas, que desempeña una función en la migración celular. Como se observa, la sobreexpresión de la endosialina ocasiona una mayor actividad de la integrina β1 (Figura 14B), a diferencia de lo que ocurre en las células de control; en cambio, el efecto directo sobre la expresión de la β1 de superficie celular no cambia (Figura 14A). El tratamiento de las células con el inhibidor de la endosialina anticuerpo M4 suprimió la actividad de las integrinas; en cambio, no se observó efecto alguno sobre los niveles en la superficie celular (Figura 14B). Estos datos muestran que usando inhibidores de la endosialina se puede suprimir la función de las integrinas en células que expresan la endosialina.
La Figura 15 ilustra que el anticuerpo M4.1 reconoce a la TEM-1 no reducida humana en células CHO-TEM-1 y en pericitos primarios humanos, pero que no reconoce a la TEM-1 murina en células 2H11 de ratón. En cambio, el anticuerpo policlonal de conejo anti-TEM-1 humana (rabPAb TEM-1) reconoce a la TEM-1 humana en células CHO-TEM-1 y en pericitos humanos, y también a la TEM-1 murina en células 2H11 de ratón. Ni el M4.1 ni el rabPAb TEM1 reaccionaron contra lisados de células CHO-K1 parentales, ni de células NS0 o MS1 murinas, a raíz de la ausencia de expresión de la TEM-1 en dichas células. Únicamente el rabPAb TEM-1 reaccionó contra la TEM-1 reducida humana, aunque en menor grado en comparación con el caso de la TEM-1 no reducida.
Descripción detallada
En la especificación y en las reivindicaciones se usan diversos términos relacionados con aspectos de la presente invención. A menos que se indique de otro modo, se debe dar a dichos términos el significado que tienen ordinariamente en este campo del conocimiento. Otros términos, definidos específicamente, se deben entender de manera acorde con la definición de ellos que aquí se proporciona.
Debe entenderse que esta invención no se limita a los métodos, reactivos, compuestos, composiciones o sistemas biológicos que se emplean aquí en particular, puesto que, por supuesto, pueden variar. Asimismo, debe entenderse que la terminología aquí empleada se usa con la única finalidad de describir realizaciones concretas, y que no debe interpretarse que limite en modo alguno el ámbito de la presente invención.
Tal y como se usan en esta especificación y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares “uno”, “una”, “el” y “la” engloban también las formas plurales, a menos que se desprenda de otro modo del contenido. Por ejemplo, cuando aquí se hace referencia a “una célula”, ello comprende también una combinación de dos o más células, y así en otros casos en general.
Cada intervalo aquí citado comprende todas las combinaciones y subcombinaciones de intervalos, así como los numerales concretos en ellos contenidos.
En este contexto, el término “aproximadamente” (o “aproximado” o “alrededor de unos” o “en torno a”, etc.) se usa al hacer referencia a un valor medible como, por ejemplo, una cantidad, una duración en el tiempo, y similares, y se debe entender que engloba variaciones del ±20% o del ±10%, más preferiblemente del ±5%, aún más preferiblemente del ±1%, e incluso más preferiblemente del ±0,1%, respecto del valor especificado, dado que tales variaciones resultan apropiadas para la realización/puesta en práctica de los métodos aquí descritos.
“Ensayo específico de endosialina” (ESA, por sus siglas en inglés) se refiere a ensayos o pruebas que pueden usarse para identificar compuestos que pueden desbaratar, directa o indirectamente, la expresión de la endosialina o la actividad biológica que conduce a una modificación de la unión directa o indirecta de las células que expresan la endosialina o de la endosialina en sí a las EMP, mediante mecanismos mediados por la endosialina o por una integrina, o que pueden modificar las rutas endógenas celulares (tales como, entre otras posibles, las de las metaloproteasas de la matriz [MMPs]) y/o la proliferación celular o la supervivencia de las células.
“Polinucleótido” y su sinónimo conocido como “ácido nucleico” o “molécula de ácido nucleico”, se refiere a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN o ADN sin modificar, o ARN o ADN modificado(s). El término “polinucleótidos” comprende, entre otras posibilidades, ADN de cadena única y de cadena doble, ADN que sea una mezcla de regiones de cadena única y de cadena doble, ARN de cadena única y de cadena doble, ARN que sea una mezcla de regiones de cadena única y de cadena doble, y moléculas híbridas que comprendan ADN y ARN que pueden ser de cadena única o, más habitualmente, de cadena doble, o una mezcla de regiones de cadena única y de cadena doble. Además, “polinucleótido” se refiere a regiones de cadena triple que comprendan ARN o ADN o tanto ARN como ADN. El término polinucleótido comprende además ADN o ARN que contengan una o más bases modificadas y ADN o ARN con esqueletos modificados en aras de una mayor estabilidad o por otras razones. Cuando aquí se hace referencia a bases “modificadas”, se entiende que ello incluye, por ejemplo, bases tritiladas y bases inusuales como, por ejemplo, inosina. Se pueden efectuar muy diversas
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modificaciones al ADN y al ARN; por ello, el término “polinucleótido” comprende también formas química, enzimática
o metabólicamente modificadas de polinucleótidos, como los que se encuentran habitualmente en la naturaleza, así como las formas químicas del ADN y del ARN que son características de los virus y de las células. “Polinucleótido” comprende asimismo cadenas de ácidos nucleicos relativamente cortas, que a menudo se denominan “oligonucleótidos”.
Un “vector” es un replicón como, por ejemplo, un plásmido, fago, cósmido o virus en el que se puede insertar operativamente otro segmento de ácido nucleico para poder lograr la replicación o la expresión de dicho segmento.
“Polipéptido”, “péptido” y “proteína” se usan aquí como sinónimos para referirse a un polímero de residuos aminoácido. Dichos términos son aplicables a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos aminoácido son un compuesto químico artificial mimético de un aminoácido correspondiente que se da de forma natural, así como a polímeros de aminoácidos que se dan de forma natural y a polímeros de aminoácidos que no se dan de forma natural. “Polipéptidos” comprende las variantes modificadas conservadoramente. Los expertos en la materia saben que las sustituciones, deleciones o adiciones en la secuencia de un ácido nucleico, un péptido, un polipéptido
o una proteína que alteren, añadan o eliminen un único aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos de la secuencia codificada son una “variante modificada conservadoramente”, en la que la alteración conduce a la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Son bien conocidas, en este campo de la técnica, las tablas de sustituciones conservadoras que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares. Tales variantes conservadoramente modificadas son adicionales a las variantes polimórficas, a los homólogos interespecies y a los alelos de la presente invención, y no los excluyen.
El término “expresar”, “expresado/a/s”, o “expresión” de una molécula de ácido nucleico, se refiere aquí a la biosíntesis de un producto de un gen. Dicho término engloba la transcripción de un gen a ARN.
Por ejemplo, aunque de ninguna manera se debe entender como ejemplo limitador, un gen regulador tal como un ácido nucleico antisense o un ácido nucleico interferente puede expresarse, mediante transcripción, como ARN antisense o como ARNi o ARNsh. El término engloba también la traducción del ARN en uno o más polipéptidos, y engloba todas las modificaciones postranscripcionales y postraduccionales que se dan de forma natural.
Se entiende que una célula ha sido “transformada” o “transfectada” por ácidos nucleicos exógenos o heterólogos como, por ejemplo, ADN, cuando dicho ADN ha sido introducido en la célula. El ADN transformador puede integrarse
o no (mediante enlaces covalentes) en el genoma de la célula. En las células de procariotas, levaduras y mamíferos, por ejemplo, el ADN transformador puede mantenerse en un elemento episomal como, por ejemplo, un plásmido. Con respecto a las células eucarióticas, una célula transformada de manera estable, o “célula estable”, es una en la que el ADN transformador se ha integrado en un cromosoma, de manera que es heredado por las células hijas mediante la replicación cromosómica. Dicha estabilidad es demostrada por la capacidad de la célula eucariótica de establecer líneas celulares o clones que comprendan una población de células hijas que contienen el ADN transformador. Un “clon” es una población de células derivadas de una única célula o ancestro común, mediante mitosis. Una “línea celular” es un clon de una célula primaria que es capaz de crecer de manera estable in vitro durante muchas generaciones.
De la manera en que se usa aquí, el término “compuesto de prueba” se refiere a una molécula purificada, molécula sustancialmente purificada, o moléculas, que son un componente o más de un componente de una mezcla de compuestos o de una mezcla de un compuesto con cualquier otro material que se pueda utilizar. Los compuestos de prueba pueden ser compuestos químicos orgánicos o inorgánicos, o biomoléculas, así como todos los fragmentos, análogos, homólogos, conjugados y derivados de lo anterior. El término “biomoléculas” comprende proteínas, polipéptidos, ácidos nucleicos, lípidos, monosacáridos, polisacáridos, así como todos los fragmentos, análogos, homólogos, conjugados y derivados de lo anterior. Los compuestos de prueba pueden ser de origen natural o sintético, y pueden aislarse de o purificarse a partir de sus fuentes naturales, o bien, pueden sintetizarse de novo. Los compuestos de prueba pueden estar definidos en cuanto a su estructura o su composición, o pueden no estar definidos. El compuesto puede ser un producto aislado de estructura desconocida, una mezcla de varios productos conocidos, o una composición no definida que comprenda uno o más compuestos. Son ejemplos de composiciones no definidas: extractos celulares y tisulares, medio de crecimiento en el que se han cultivado células procarióticas, células eucarióticas y arqueobacterias, caldos de fermentación, bibliotecas de expresión de proteínas y similares.
El término “knockdown” se refiere a una célula u organismo en el que hay una expresión reducida de uno o más genes. Como sabrán los expertos en la materia, una "célula knockdown" muestra como mínimo una reducción de alrededor de un 50% de la expresión; preferiblemente, muestra como mínimo una reducción de alrededor de un 67% de la expresión; y más preferiblemente, muestra como mínimo una reducción de alrededor de un 75% de la expresión, aunque son posibles reducciones mayores, incluidas reducciones de como mínimo alrededor de un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o una reducción aún mayor, de la expresión.
“Inhibir” o “inhibición” o “interferir” significa reducir, disminuir, bloquear, prevenir, retrasar, suprimir, inactivar, desensibilizar, detener o regular a la baja la actividad biológica o la expresión de un gen, del producto de un gen (por
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con proteínas de la matriz extracelular, como, por ejemplo, la fibronectina o el colágeno. También se ha descubierto que dicha interacción promueve la migración celular y, además, que promueve y facilita la angiogénesis. Además, se ha descubierto que el desbaratamiento de la interacción entre la endosialina y las proteínas de la matriz extracelular puede suprimir la migración celular y suprimir la angiogénesis.
La inhibición de la expresión de la endosialina puede producirse a nivel de gen o a nivel de proteína.
Por ejemplo, la inhibición de la expresión de la endosialina puede comprender establecer como diana el ADN que codifica la endosialina, o establecer como diana el transcripto de ARNm del gen de la endosialina.
En este campo del conocimiento se conocen métodos de regulación de genes, y se usan en la práctica sin dificultad; todos ellos resultan adecuados para ser usados en la presente invención. Por ejemplo, en células creadas específicamente para expresar un transgén que codifica la endosialina (por ejemplo, SEC N.º ID: 1, 3 ó 5), el transgén puede ser sometido al control por parte de un promotor inducible. Los promotores inducibles adecuados para ser usados en la presente invención son conocidos por los expertos en la materia.
Los genes que codifican la endosialina pueden ser inhibidos usando diversas otras técnicas de silenciamiento postranscripcional de genes (silenciamiento de ARN). El silenciamiento de ARN comprende procesar el ARN de cadena doble (ARNds) mediante una enzima ARNasa basada en H (“Dicer” o “tipo Dicer”) que lo escinda en fragmentos pequeños de 21-28 nucleótidos. Los productos de la escisión, que son ARNsi (ARN pequeño interferente) o ARNmi (micro-ARN), se incorporan a complejos proteínicos efectores que regulan la expresión génica de una manera específica de secuencia.
La interferencia del ARN (iARN) es un mecanismo de silenciamiento génico postranscripcional mediado por ARN de cadena doble (ARNds); dicho mecanismo es diferente de los enfoques basados en moléculas antisense y ribozimas (véase Jain, Pharmacogenomics (2004) 5:239-42, para una revisión de la iARN y de los ARNsi). La interferencia del ARN resulta útil en un método para inhibir la expresión de la endosialina en una célula o en un animal, tal como un ser humano, mediante transformación de la célula; o bien, mediante administración, a un animal, de un ácido nucleico (por ejemplo, ARNds) que se hibride (en condiciones astringentes) con un gen que codifique la endosialina y que atenúe la expresión del gen diana. La interferencia del ARN proporciona ARNsh o ARNsi que comprende(n) varias secuencias que tienen como diana una o más regiones del gen de la endosialina. Se cree que las moléculas (ARNsh o ARNsi) de ARN de cadena doble (ARNds) dirigen la degradación específica de secuencia del ARNm en células de diversos tipos, tras primero ser procesadas por una enzima tipo ARNasa III llamada "DICER" (Bernstein E et al. (2001) Nature 409:363-366) que las divide en moléculas más pequeñas de ARNds compuestas de dos cadenas de 21 “nt” (nucleótidos), cada una de las cuales tiene un grupo 5’-fosfato y un grupo 3’-hidroxilo e incluye una región de 19 nt que es complementaria, con precisión, de la otra cadena, de manera que hay una región dúplex de 19 nt flanqueada por secuencias sobresalientes -3’ de 2 nt. De este modo, la iARN es mediada por ARN cortos interferentes (ARNsi), que suelen comprender una región de cadena doble de aproximadamente 19 nucleótidos de longitud, con secuencias sobresalientes -3’ de 1-2 nucleótidos en cada cadena, lo que conduce a una longitud total entre 21 y 23 nucleótidos aproximadamente. En las células de mamíferos, el ARNds de más de aproximadamente 30 nucleótidos suele inducir una degradación no específica del ARNm, mediante la respuesta del interferón. Sin embargo, en vez de inducir la respuesta del interferón, en las células de mamíferos la presencia de ARNsi conduce a un silenciamiento génico específico de secuencia.
Los vectores víricos o los vectores de ADN codifican el denominado "ARN tipo horquilla corto" (ARNsh, un ARN en forma de pequeña horquilla), que es procesado en el citoplasma celular de modo tal que se produce ARN corto interferente (ARNsi). En general, un ARN corto interferente (ARNsi) comprende un dúplex de ARN que, preferiblemente, tiene aproximadamente 19 pares de bases de longitud, y que opcionalmente comprende, asimismo, uno o dos secuencias sobresalientes o bucles de una sola cadena. Un ARNsi puede comprender dos cadenas de ARN hibridadas entre sí, o bien, puede comprender una sola cadena de ARN que incluya una porción autohibridante. Los ARNsi pueden incluir uno o más extremos de cadena libre, que pueden incluir grupos fosfato y/o hidroxilo. Por lo general, los ARNsi incluyen una porción que se hibrida en condiciones astringentes con un transcripto diana. Por lo general, una cadena del ARNsi (o la porción autohibridante del ARNsi) es complementaria, con precisión, de una región del transcripto diana, lo que significa que el ARNsi se hibrida con el transcripto diana sin un solo emparejamiento dispar (sin una sola “discordancia”). No obstante, es posible que no se logre una complementariedad perfecta; las discordancias que haya pueden estar situadas en los extremos del ARNsi o cerca de ellos.
Se ha demostrado que los ARNsi regulan a la baja la expresión génica cuando son transferidos al interior de células de mamíferos mediante métodos tales como transfección, electroporación (electropermeabilización), transfección mediada por liposomas catiónicos, o microinyección, o cuando se expresan en las células a través de cualquiera de diversos métodos basados en plásmidos. La interferencia del ARN usando ARNsi se trata en, por ejemplo, Tuschl (2002) Nat. Biotechnol. 20:446-8; Yu J-Y et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:6047-52; Sui G et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:5515-20; Paddison et al. (2002) Genes and Dev., 16:948-58; Brummelkamp et al. (2002) Science, 296:550-3, 2002; Miyagashi et al. (2002) Nat. Biotechnol., 20:497-500; y en Paul et al. (2002) Nat. Biotechnol., 20:505-8. Como se describe en esas y otras referencias bibliográficas, el ARNsi puede constar de dos cadenas individuales de ácido nucleico o de una sola cadena con una región autocomplementaria capaz de formar
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Asimismo, conforme a la presente invención se presentan vectores y kits para la producción de células huésped transgénicas que comprenden un polinucleótido que codifica una secuencia reguladora para la inhibición de la expresión de la endosialina, o un homólogo, análogo o variante de dicho polinucleótido en orientación sense o antisense, o un constructo controlado por promotores específicos de célula o de tejido y/o por otras secuencias reguladoras. Tales vectores son adecuados para modular, y preferiblemente, para inhibir, la expresión de la endosialina.
Son células huésped adecuadas, entre otras posibles: células de plantas, células bacterianas, células de levaduras y otras células fúngicas, células de insectos y células de mamíferos que expresan la endosialina. Las células pueden transformarse neoplásicamente. Se prefieren más las células humanas.
Son conocidos por los expertos en la materia vectores para la transformación de una amplia gama de dichas células huésped. Dichos vectores pueden ser, por ejemplo: plásmidos, fagémidos, cósmidos, baculovirus, bácmidos, cromosomas artificiales bacterianos (BACs, por sus siglas en inglés), cromosomas artificiales de levaduras (YACs, por sus siglas en inglés), así como otros vectores bacterianos, vectores víricos y vectores de levaduras.
La región codificadora de una secuencia reguladora se puede colocar bajo el control de un promotor constitutivo potente; por ejemplo, los promotores de los siguientes genes: hipoxantina fosforribosiltransferasa (HPRT, por sus siglas en inglés), adenosina desaminasa, piruvato quinasa, beta-actina, miosina humana, hemoglobina humana, creatina muscular humana, y otros. Además, muchos promotores víricos funcionan constitutivamente en células eucarióticas y son adecuados para su uso en la presente invención. Algunos de dichos promotores víricos son: promotor temprano inmediato del citomegalovirus (CMV), los promotores temprano y tardío del SV40, el promotor del virus del tumor mamario murino (MMTV), las repeticiones terminales largas (LTR, por sus siglas en inglés) del virus de la leucemia de Maloney, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de Epstein-Barr (EBV), virus del sarcoma de Rous (RSV), y otros retrovirus, así como el promotor de la timidina quinasa del virus Herpes Simplex. Hay otros promotores que son conocidos por los expertos en la materia. En una realización, la región codificadora de la secuencia reguladora se coloca bajo el control de un promotor inducible tal como el promotor de las metalotioneínas, el promotor inducible mediante tetraciclina, el promotor inducible mediante doxiciclina, promotores que contienen uno o más elementos de respuesta estimulados por interferón (ISRE, por sus siglas en inglés), tales como la proteína quinasa R, las 2',5'-oligoadenilato sintetasas, los genes Mx, ADAR1, y similares. Los expertos en la materia conocen otros promotores inducibles adecuados.
Se pueden usar vectores knockdown (reductores de la expresión) para transformar diversas células que expresan la endosialina mediante secuencias de ácidos nucleicos reguladoras. En este campo del conocimiento se conocen numerosas técnicas para la introducción de genes foráneos en células, y pueden usarse para construir células recombinantes conforme a las diversas realizaciones de la invención. La técnica que se use debería hacer posible la transferencia estable de la secuencia génica heteróloga a la célula huésped, de modo que dicha secuencia génica heteróloga sea heredable y expresable por la progenie de la célula huésped, y de modo, también, que no se desbaraten las funciones fisiológicas y de desarrollo necesarias de las células receptoras. Algunas de las técnicas que se pueden usar son: transferencia cromosómica (por ejemplo, fusión de células, transferencia de genes mediada por cromosomas, transferencia de genes mediada por microcélulas), métodos físicos (por ejemplo, transfección, fusión de esferoplastos, microinyección, electroporación, liposomas transportadores), transferencia de vectores víricos (por ejemplo, virus con ADN recombinante, virus con ARN recombinante), y similares (véase una descripción en Cline (1985) Pharmac. Ther., 29:69-92).
Se pueden crear células knockdown con inhibición de la expresión de la endosialina, mediante la inhibición, por “silenciamiento génico postranscripcional”, de la traducción del ARNm que codifica la proteína de transporte. Puede utilizarse el gen de la especie establecido como diana para la regulación a la baja, o un fragmento del mismo, para controlar la producción de la proteína codificada. Para ello pueden emplearse moléculas antisense, en la totalidad de su longitud (moléculas antisense “de longitud completa”). En otra opción, pueden utilizarse oligonucleótidos antisense que tengan como diana regiones concretas del ARNm que resultan cruciales para la traducción. Pueden obtenerse in situ moléculas antisense, de células transformadas con un constructo de ADN que, cuando es transcrito, produce las secuencias antisense de ARN. Pueden diseñarse tales constructos de manera tal que produzcan secuencias antisense de longitud completa o parcial. Este efecto de silenciamiento génico puede aumentarse sobreproduciendo, de manera transgénica, ARN tanto sense como antisense de la secuencia codificadora del gen, de modo que se produzca una cantidad alta de ARNds (véase, por ejemplo, Waterhouse et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 95:13959-64). En este aspecto, se ha observado que son particularmente eficaces los ARNds que contienen secuencias correspondientes a parte de al menos un intrón o correspondientes a la totalidad al menos un intrón. En una realización, parte o la totalidad de la cadena antisense de la secuencia codificadora es expresada por un transgén. En otra realización, se expresan transgénicamente las cadenas sense y antisense hibridadoras de parte o la totalidad de la secuencia codificadora de una endosialina.
Algunas de las células que se pueden establecer como diana o pueden de otro modo usarse en la invención son las células que expresan de manera natural la endosialina, o células transfectadas con un plásmido recombinante que expresa la endosialina. Las células primarias que expresan la endosialina, conforme a la invención, pueden aislarse de tejidos o comprarse a proveedores que venden células endoteliales como, entre otras posibles, células HUVEC o HMVEC, así como fibroblastos primarios y cultivados. Las células transfectadas de la invención comprenden
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cualquier línea celular de expresión de insecto conocida, como, por ejemplo, células de Spodoptera frugiperda. Las líneas celulares de expresión pueden también ser líneas celulares de levaduras, como, por ejemplo, células de Saccharomyces cerevisiae y de Schizosaccharomyces pombe. Las células de expresión pueden ser también células de mamífero, como, por ejemplo, células ováricas de hámster chino, células de riñón de hámster bebé, línea de células embrionarias de riñón humano 293, líneas de células normales de riñón de perro, líneas de células normales de riñón de gato, células de riñón de mono, células de riñón de mono verde africano, células COS, así como mioblastos no tumorigénicos murinos G8, líneas celulares de fibroblastos, líneas celulares de mieloma, células NIH/3T3 de ratón, células LMTK, células de Sertoli de ratón, células de carcinoma cervical humano, células de hígado de rata Buffalo, células de pulmón humano, células de hígado humano, células de tumor mamario de ratón, células TRI, células MRC-5, y células FS4.
La inhibición de la expresión de la endosialina inhibe la interacción de la endosialina con cualquier ligando de la endosialina. Los ligandos de la endosialina comprenden proteínas de la matriz extracelular como la fibronectina y el colágeno.
En la presente invención se describen también métodos para inhibir la interacción entre la endosialina expresada por una célula que expresa la endosialina y un ligando de la endosialina, y dichos métodos comprenden bloquear u obstruir la expresión de endosialina por parte de la célula. Así, por ejemplo, una barrera física sirve para inhibir, impedir o, de otro modo, dificultar la interacción entre la endosialina expresada y un ligando de la endosialina. Cualquier compuesto químico o biomolécula puede servir para obstruir dicha interacción. En estos métodos se pueden usar, por ejemplo, moléculas pequeñas, polipéptidos, anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno que se unan de manera específica a la endosialina o, como alternativa, que se unan de manera específica a un ligando de la endosialina.
En algunas realizaciones preferidas, la inhibición de la interacción de una célula que expresa la endosialina con un ligando de la endosialina comprende inhibir la unión del ligando de la endosialina a la endosialina expresada. Por ejemplo, la interacción entre la endosialina y su ligando se dificulta, bloquea, impide u obstruye mediante una barrera molecular. De ese modo, queda dificultado, inhibido, bloqueado, impedido, obstruido o evitado el acceso del ligando a la célula. La obstrucción de la endosialina puede producirse mediante cualquier medio adecuado de este campo del conocimiento, tales como un compuesto químico o una biomolécula.
Por ejemplo, son compuestos químicos adecuados, entre otros posibles, las estructuras de aminoácidos, los esteroides, las ciclinas, los antracenos, los metales pesados, la quinolona, los terpenos, los compuestos fenólicos, los glucósidos, los alquiloides, los lípidos, etc., o mezclas de lo anterior, que puedan ejercer un efecto biológico sobre las células que expresan la endosialina. Pueden generarse compuestos químicos mediante síntesis química u obtenerse mediante biocatálisis o de líquidos biológicos. Pueden obtenerse/derivarse compuestos químicos de las siguientes fuentes: seres humanos, mamíferos no humanos, plantas, levaduras, hongos y/o procariotas.
Los inhibidores competitivos inhiben la interacción de la endosialina o de una célula que expresa la endosialina con un ligando de la endosialina. Un “inhibidor competitivo” compite con el ligando por el lugar de unión a la endosialina. Los inhibidores competitivos son ligandos de la endosialina; por ejemplo, el colágeno (por ejemplo, colágeno I o colágeno IV) o la fibronectina, o fragmentos de dichas moléculas que se unen a (“fijan”) la endosialina. Son inhibidores competitivos, asimismo, el fragmento N-terminal de 70 kDa de la fibronectina, el fragmento de 45 kDa de la fibronectina que se une a la gelatina, y el fragmento de 30 kDa de la fibronectina que se une a la heparina.
En realizaciones muy preferidas, se usan los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de la invención para obstruir la interacción entre la endosialina expresada y los ligandos de la endosialina.
Los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno pueden ser específicos de un epítopo situado en la endosialina, o pueden ser específicos de un epítopo situado en un ligando de la endosialina. Los más preferidos son los anticuerpos, o fragmentos (de anticuerpos) de unión al antígeno, específicos de la endosialina. Están disponibles comercialmente anticuerpos contra ligandos tales como la fibronectina, el colágeno y similares.
Los anticuerpos adecuados pueden ser policlonales o monoclonales, o pueden ser derivados o fragmentos de anticuerpos, que retengan la especificidad por la endosialina o por un ligando de la endosialina. Los anticuerpos pueden ser de cualquiera de las cinco clases de anticuerpos; es decir, de los isotipos IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Los anticuerpos adecuados pueden ser también del isotipo IgY, que se encuentra generalmente en el suero de gallina o de pavo o en la yema de huevo de gallina o de pavo.
Los derivados de los anticuerpos y los fragmentos de unión al antígeno son adecuados para su uso en la invención, y dichos derivados comprenden porciones de anticuerpos intactos que retienen la especificidad fijadora de antígeno de la molécula de anticuerpo progenitora. Por ejemplo, los derivados pueden comprender al menos una región variable (una región variable de una cadena pesada o de una cadena ligera). Son ejemplos de derivados y fragmentos de anticuerpos adecuados, entre otros posibles, los siguientes: anticuerpos con especificidad poliepitópica, anticuerpos biespecíficos, diacuerpos, moléculas de una sola cadena (cadena única), así como moléculas Fab, F(ab’)2, Fd, Fabc y Fv, anticuerpos de cadena única (Sc), cadenas ligeras individuales de anticuerpos, cadenas pesadas individuales de anticuerpos, fusiones quiméricas entre cadenas de anticuerpos y
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membrana”) son las que se unen a la membrana celular externa. Comprenden: la MMP-23 con ordenamiento (“array”) cisteína transmembrana de tipo-II; las MMPs 17 y 25 (MT4-MMP y MT6-MMP, respectivamente) unidas a glicosilfosfatidilinositol; y las MMPs transmembranales de tipo-I 14, 15, 16, 24 (MT1-MMP, MT2-MMP, MT3-MMP y MT5-MMP, respectivamente). Todas estas MMPs tienen un sitio de escisión por furina en el propéptido, que es una característica que comparten con la MMP-11.
Inhibir la interacción de la endosialina con un ligando de la endosialina inhibe la expresión y/o la activación de las MMPs en la célula que expresa la endosialina; la expresión o la activación de MMP-1, MMP-2, MMP8, MMP-9, MMP-12, MMP-13 o MMP-18 puede ser suprimida por dicha inhibición.
Sin ánimo de limitación a una teoría o un mecanismo de funcionamiento concretos, se cree que la endosialina funciona directa o indirectamente en la angiogénesis; en particular, con respecto a la neovascularización y a enfermedades tales como el cáncer. Por lo tanto, se cree que el desbaratamiento de la unión de la endosialina o de las células que expresan la endosialina a los ligandos de la endosialina, o el desbaratamiento de la activación mediada por endosialina de las integrinas, de la expresión de las MMPs y/o de la proliferación/supervivencia celular, puede suprimir la vascularización asociada a las enfermedades neovasculares.
Por eso, la presente invención describe métodos para inhibir la angiogénesis. Dichos métodos pueden llevarse a cabo in vitro o in vivo. Los métodos para inhibir la angiogénesis pueden comprender administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que obstruye la endosialina expresada en la superficie de una célula, y dicha obstrucción inhibe la interacción de dicha célula con un ligando de la endosialina, y la inhibición de dicha interacción de dicha célula con dicho ligando inhibe la angiogénesis de un tejido, un órgano o un neoplasma en dicho sujeto.
Los métodos para inhibir la angiogénesis pueden también comprender poner en contacto una célula, un cultivo celular, un tejido o un órgano con una composición que obstruye la endosialina expresada en la superficie de una célula, y dicha obstrucción inhibe la interacción de dicha célula con un ligando de la endosialina, y la inhibición de dicha interacción de dicha célula con dicho ligando inhibe la angiogénesis por dicha célula, dicho cultivo celular, dicho tejido o dicho órgano.
La composición puede comprender al menos uno de los inhibidores competitivos aquí descritos. En algunas realizaciones, los inhibidores competitivos son ligandos de la endosialina; por ejemplo, colágeno, fibronectina, o fragmentos de dichas moléculas que se unen a la endosialina. Son inhibidores competitivos preferidos: fragmentos de colágeno I, fragmentos de colágeno IV o fragmentos de fibronectina. Los inhibidores competitivos más preferidos son: el fragmento N-terminal de 70 kDa de la fibronectina, el fragmento de 45 kDa de la fibronectina que se une a la gelatina y el fragmento de 30 kDa de la fibronectina que se une a la heparina.
La composición comprende al menos un anticuerpo que se une de manera específica a la endosialina. Los anticuerpos con esa característica tienen preferiblemente una afinidad por la endosialina inferior a 1 x 10-7 M aproximadamente, más preferiblemente inferior a 1 x 10-8 M aproximadamente, más preferiblemente inferior a 1 x 109 M aproximadamente, y más preferiblemente inferior a 1 x 10-10 M aproximadamente. Los anticuerpos que se unen de manera específica a la endosialina pueden comprender los anticuerpos cuyas características se describen y ejemplifican en la presente invención. Las células productoras de anticuerpos que producen anticuerpos que se pueden usar conforme a la invención se han puesto a la disposición de la Colección estadounidense de cultivos celulares (Amer. Type Cult. Coll., 10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209, Estados Unidos) el 11 de marzo de 2008, y se les ha asignado el N.º de acceso: PTA-9017. Los anticuerpos pueden ser policlonales, monoclonales, fragmentos de unión al antígeno, quiméricos, humanizados, totalmente humanos y similares, conforme a los que aquí se describen.
La inhibición de la expresión de la endosialina inhibe la interacción de la endosialina con cualquier ligando de la endosialina. Los ligandos de la endosialina comprenden proteínas de la matriz extracelular como la fibronectina y el colágeno.
La invención describe también métodos para inhibir la neovascularización. Dichos métodos pueden llevarse a cabo in vitro o in vivo. Los métodos para inhibir la neovascularización pueden comprender administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que obstruye la endosialina expresada en la superficie de una célula, y dicha obstrucción inhibe la interacción de dicha célula con un ligando de la endosialina, y la inhibición de dicha interacción de dicha célula con dicho ligando inhibe la neovascularización de un tejido, un órgano o un neoplasma en dicho sujeto.
Los métodos para inhibir la neovascularización pueden comprender poner en contacto una célula, un cultivo celular, un tejido o un órgano con una composición que obstruye la endosialina expresada en la superficie de una célula, y dicha obstrucción inhibe la interacción de dicha célula con un ligando de la endosialina, y la inhibición de dicha interacción de dicha célula con dicho ligando inhibe la neovascularización de dicha célula, dicho cultivo celular, dicho tejido o dicho órgano.
La composición comprende al menos uno de los inhibidores competitivos que aquí se describen. Los inhibidores competitivos pueden ser ligandos de la endosialina; por ejemplo, colágeno, fibronectina, o fragmentos de dichas
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moléculas que se unen a la endosialina. Son inhibidores competitivos preferidos: fragmentos de colágeno I, fragmentos de colágeno IV, o fragmentos de fibronectina. Los inhibidores competitivos más preferidos son: el fragmento N-terminal de 70 kDa de la fibronectina, el fragmento de 45 kDa de la fibronectina que se une a la gelatina y el fragmento de 30 kDa de la fibronectina que se une a la heparina.
En realizaciones preferidas, la composición comprende al menos un anticuerpo que se une de manera específica a la endosialina. Los anticuerpos con esa característica tienen preferiblemente una afinidad por la endosialina inferior a 1 x 10-7 M aproximadamente, más preferiblemente inferior a 1 x 10-8 M aproximadamente, más preferiblemente inferior a 1 x 10-9 M aproximadamente, y más preferiblemente inferior a 1 x 10-10 M aproximadamente. Los anticuerpos que se unen de manera específica a la endosialina pueden comprender los anticuerpos cuyas características se describen y ejemplifican en la presente invención. Las células productoras de anticuerpos que producen anticuerpos que se pueden usar conforme a la invención se han puesto a la disposición de la Colección estadounidense de cultivos celulares (Amer. Type Cult. Coll., 10801 University Blvd., Manassas, Virginia 201102209, Estados Unidos) el 11 de marzo de 2008, y se les ha asignado el N.º de acceso: PTA-9017. Los anticuerpos pueden ser policlonales, monoclonales, fragmentos de unión al antígeno, quiméricos, humanizados, totalmente humanos y similares, conforme a los que aquí se describen.
La inhibición de la expresión de la endosialina inhibe la interacción de la endosialina con cualquier ligando de la endosialina. Los ligandos de la endosialina comprenden proteínas de la matriz extracelular tales como la fibronectina; por ejemplo, fibronectina humana (SEC N.º ID: 35) y colágeno humano.
Para que esta invención puede ser entendida y puesta en práctica con mayor facilidad, a continuación se hará referencia a uno o más ejemplos; en dicho o dichos ejemplos, al menos parte de la presente invención se describe a partir del trabajo experimental llevado a cabo durante el desarrollo de la misma.
Cualesquiera ejemplos que no estén incluidos dentro del ámbito de las reivindicaciones se proporcionan únicamente como información complementaria.
Ejemplo 1
Análisis inmunohistoquímico de la expresión de la endosialina en tejido maligno
Mediante inmunohistoquímica de tejidos malignos, se mostró el uso de anticuerpos para la detección de células que expresan la endosialina. Se aplicó anticuerpo anti-endosialina o anticuerpo IgG normal a tejidos de cáncer colorrectal humano recién congelado, a dos concentraciones (0,5 µg/ml y 2,5 µg/ml). Una solución salina tamponada con fosfato [PBS, por sus siglas en inglés (NaCl 0,15M, pH 7,2)] + 1% seroalbúmina bovina sirvió de diluyente de los anticuerpos primarios. Los tejidos se incluyeron en medio Tissue-Tek® O.C.T., se congelaron sobre hielo seco, y se almacenaron en bolsas de plástico selladas a una temperatura inferior a -70 °C. Se realizaron cortes de dichos tejidos a intervalos de aproximadamente 5 µm, y se fijaron durante 10 minutos en acetona a temperatura ambiente. Los cortes se almacenaron a una temperatura inferior a -70 °C hasta su tinción. Justo antes de la tinción, los cortes se fijaron durante 10 segundos en formol al 10% tamponado neutro.
Los criocortes se enjuagaron dos veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS [NaCl 0,15M, pH 7,2]). Se bloqueó la peroxidasa endógena mediante incubación de los cortes con la solución de peroxidasa presente en el kit Dako EnVision™ Kit, durante 5 minutos y enjuagando dos veces en PBS (NaCl 0,15M, pH 7,2]). Después, los cortes se trataron durante 20 minutos con un bloqueo proteico diseñado para reducir la unión no específica. El bloqueo proteico se preparó de la siguiente manera: PBS (NaCl 0,15M, pH 7,2); caseína al 0,5%; seroalbúmina bovina (BSA, por sus siglas en inglés) al 1%; y suero normal de cabra al 1,5%. Después del bloqueo proteico, se aplicó el anticuerpo primario (elemento de ensayo M4, anticuerpo de control negativo, o ninguno [solo el tampón, como control del ensayo]) a temperatura ambiente durante una hora. Después, los cortes se enjuagaron dos veces con PBS (NaCl 0,15M, pH 7,2), se trataron con el polímero de anti-IgG de cabra marcada con peroxidasa, presente en el kit Dako EnVision™ Kit, durante 30 minutos (polímero EnVision™ usado a la concentración proporcionada por el fabricante), se enjuagaron dos veces con PBS (NaCl 0,15M, pH 7,2), y se trataron con la solución de sustratocromógeno (DAB), presente en el kit Dako EnVision™ Kit, durante 8 minutos. Todos los cortes se enjuagaron en agua, se sometieron a contratinción con hematoxilina, se deshidrataron y se cubrieron con cubreobjetos, para su interpretación. Como se puede observar, los vasos sanguíneos del tumor (Figura 1A) dieron positivo a endosialina, mientras que los cortes en serie teñidos con anticuerpo isotipo de control dieron negativo (Figura 1B).
Ejemplo 2
Análisis inmunohistoquímico de la expresión de la endosialina en tejido sano
Mediante inmunohistoquímica de tejidos normales, se mostró el uso de anticuerpos para la detección de células que expresan la endosialina. Descrito brevemente, se realizaron cortes de especímenes de tejidos normales, mediante criostato, y se analizó su expresión de la endosialina, de la manera descrita en el Ejemplo 1. Los tejidos normales contenían muy pocos fibroblastos y células tipo célula dendrítica que expresasen la endosialina, y no tan intensa ni homogéneamente como lo observado en los vasos sanguíneos de los tumores (Figuras 2A y B). Estas células resultan útiles para estudiar los efectos de la neovascularización y pueden aislarse para ver su expresión génica, a
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